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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ESTUDO DA FERMENTAÇÃO RUMINAL POR BOVINOS
CONSUMINDO FENO DE TIFTON 85 E CONCENTRADO COM
ADITIVOS
Astrid Rivera Rivera
Médica Veterinária
JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL
2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ESTUDO DA FERMENTAÇÃO RUMINAL POR BOVINOS
CONSUMINDO FENO DE TIFTON 85 E CONCENTRADO COM
ADITIVOS
Astrid Rivera Rivera
Orientadora: Prof
a
. Dra. Telma Teresinha Berchielli
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Zootecnia (Nutrição e
Alimentação Animal).
JABOTICABAL-SÃO PAULO- BRASIL
Julho de 2006
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ii
SUMÁRIO
Página
RESUMO......................................................................................................................
iii
SUMMARY...................................................................................................................
iv
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS…………………………………………….
1
1 Introdução…………………………………………………………………………….........
1
2 Generalidades sobre a produção de metano............................................................
2
3 Metabolismo ruminal.................................................................................................
4
4 Manipulação ruminal.................................................................................................
6
4.1Aditivos....................................................................................................................
6
5 Estimativa de metano pela técnica de produção de gases in vitro...........................
9
6 Objetivos
13
CAPITULO 2 –
EFEITO DO USO DE ADITIVOS NA FERMENTAÇÃO RUMINAL
DA DIETA COMPOSTA POR VOLUMOSO E CONCENTRADO................................
14
Resumo........................................................................................................................
14
1 Introdução.................................................................................................................
15
2 Material e métodos....................................................................................................
17
3 Resultados e discussão............................................................................................
21
4 Conclusões...............................................................................................................
27
CAPITULO 3 - ESTIMATIVA IN VITRO
DA PRODUÇÃO DE GÁS METANO,
USANDO ADITIVOS EM UM
SUBSTRATO COMPOSTO POR VOLUMOSO E
CONCENTRADO.........................................................................................................
28
Resumo........................................................................................................................
28
1 Introdução.................................................................................................................
29
2 Material e métodos....................................................................................................
31
3 Resultados e discussão............................................................................................
35
4 Conclusões................................................................................................................
38
CAPITULO 4 – IMPLICAÇÕES...................................................................................
39
REFERÊNCIAS...........................................................................................................
40
APÊNDICE..................................................................................................................
51
iii
ESTUDO DA FERMENTAÇÃO RUMINAL POR BOVINOS CONSUMINDO FENO DE
TIFTON 85 E CONCENTRADO COM ADITIVOS
RESUMO – O trabalho teve como objetivos avaliar o efeito do uso de monensina e
de um complexo de leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos (LAA) no
consumo de matéria seca e nutrientes, na estimativa da digestibilidade ruminal, nos
parâmetros de fermentação ruminal (pH, concentração de nitrogênio amoniacal e de
ácidos graxos de cadeia curta), na população de protozoários e na produção de
metano. Foram realizados dois experimentos, no primeiro com seis bovinos
anelorados, com peso médio de 530 kg, que foram tratados com 5g dia
-1
de LAA ou
monensina ou caulim usado como controle, adicionados à dieta base composta por feno
de Tifton 85 (Cynodon Spp.) e concentrado, em uma relação 80:20. No segundo
experimento foram testados os mesmos aditivos, usando a técnica de produção de
gases in vitro para estimar a produção de gás metano. O delineamento experimental
usado foi em blocos casualizados. Entre os resultados houve menor consumo de
matéria seca e dos nutrientes (P<0,05) e maior produção de ácido propiônico (P<0,05)
efeito da monensina. A digestibilidade da matéria seca e dos nutrientes não foi
influenciada pela utilização dos aditivos. O pH e a concentração de nitrogênio
amoniacal foram adequadas para o crescimento microbiano. A produção de metano não
foi alterada usando aditivos.
Palavras-chave:
ácidos graxos poliInsaturados, bovino, leveduras, metano, monensina.
iv
STUDY OF RUMINAL FERMENTATION BY CATTLE FEEDING HAY (Cynodon Spp.)
AND CONCENTRATE WITH ADDITIVES
SUMMARY - The objetives of this work were to evaluate the effect of additives:
monensin and yeas cells, insatured fatty acid, aminoacid complex on nutrient intake,
nutrient digestibilities, ruminal parameters, protozoa population and methane production.
Two experiments were conducted. One experiment, six beef cattle, 530 kg live weight,
feeding hay (Cynodon Spp.) and concentrate (porportion 80:20) were used. Monensin
or yeast cells, insatured fatty acid, aminoacid complex or caulim (control) were given
daily (5g). Two experiment, same additives were used to estimate methane production
using the gas production technique. The statistics model was random block. The
nutrient intake decreased (P<0.05) and propionic acid increased (P<0.05) using
monensin. There were no effect of additives on nutrient digestibilities. Ammonia
nitrogen and pH were adequated for microorganisms growth. There were no effect of
additives on methane production.
KEYWORDS: bovine, insaturated fatty acid, methane, monensin, yeast cells.
5
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 Introdução
No Brasil, a pecuária tem potencial para se estabelecer como uma
atividade competitiva nos mercados nacional e internacional, especialmente
porque os sistemas de produção são quase que exclusivo de pastagens.
O problema da sazonalidade da produção forrageira é conhecido e
intensificado pelo fato de que as forrageiras tropicais, mesmo no período das
chuvas, não serem capazes de produzir, durante muito tempo, alimento com
qualidade que possibilite o atendimento das exigências para crescimento dos
animais, em especial, aqueles de alto potencial genético (CEZAR & EUCLIDES
FILHO, 1996). Além disso, é conhecido que as forragens tropicais podem gerar
mais metano durante o processo fermentativo ruminal do que as plantas de clima
temperado, pelo fato de apresentarem altos teores de parede celular. Atualmente
este é um ponto importante tratado pelos pesquisadores, tanto porque o metano
representa perda de energia dos alimentos quanto pelo impacto ambiental.
O processo de fermentação ruminal e a decomposição anaeróbia dos
dejetos dos ruminantes, bem como o uso agrícola dos solos, são consideradas
importantes fontes de emissão de gases de efeito estufa geradas pelo setor
agropecuário. O Brasil comprometeu-se no Protocolo de Kioto, assinado em
2005, na Convenção das Nações Unidas sobre mudanças do clima a avaliar e
executar alternativas para reduzir a emissão dos denominados gases de efeito
estufa.
Portanto, é importante nortear pesquisas que melhorem a eficiência na
utilização dos alimentos consumidos pelos animais e, ao mesmo tempo, reduzam
a emissão de metano para a atmosfera.
6
2 Generalidades sobre a produção de metano
O metano (CH
4
) é um gás composto de carbono e hidrogênio e que, de
acordo com o levantamento (Figura 1) realizado pela US EPA (2003), é
considerado, após dióxido de carbono (CO
2
) (84.7%), como o maior responsável
do efeito estufa (7.9%) e junto a outros gases de menor emissão como óxido
nitroso (N
2
O), hidrofluorocarbonos (HFC), perfluorocarbonos (PFC) e
hexafluoreto de enxofre (SF
6
). O aumento na emissão desses gases produz o
aquecimento da superfície terrestre e destruição da camada de ozônio na
estratosfera (PRIMAVESI et al., 2004).
84,7
7,9
5,4
2,0
Dióxido de carbono
Metano
Óxido Nitroso
HFC,PFC,SF6
Figura 1. Levantamento das fontes de emissão dos gases de efeito estufa
Fonte: US EPA (2003).
Da produção total de metano, 30% estão relacionados com fontes
de emissão naturais e 70% provêm de fontes antrópicas (Figura 2), das
quais a atividade agropecuária é responsável por 67 - 70% das
emissões (IPCC,2001). Estima-se que a fermentação ruminal contribui com 33-
39% desta atividade (TEDESCHI et al., 2003). De acordo com estas estatísticas
e na tentativa de diminuir a emissão dos gases poluidores, na Convenção das
Nações Unidas sobre a mudança do clima foi assinado o Protocolo de Kioto em
7
2005, e que segundo o Artigo No. 2 e 3 os países envolvidos, comprometem-
se a limitar e diminuir a emissão dos gases de efeito estufa como mínimo em 5%
(baseados no registro de emissões de 1990), no período compreendido entre
2008 e 2012 (PROTOCOLO DE KIOTO, 2005).
70%
30%
Fontes antrópicas
Fontes naturais
Figura 2. Fontes de emissão de metano
Fonte: IPCC (2001)
O Brasil comprometido com as disposições do protocolo, deve estabelecer
programas que conduzam a diminuir as emissões dos gases de efeito estufa.
Considerado como o país com o maior rebanho bovino comercial do mundo, com
170.153.901 milhões de cabeças em 2004 (ANUALPEC, 2005), e com
dependência quase exclusiva de volumosos, torna-se um significativo contribuinte
na emissão de CH
4,
produto da fermentação entérica (PRIMAVESI et al., 2004).
Tem sido estabelecido que, a intensidade da emissão do CH
4
na pecuária
está relacionada com fatores dependentes do tipo de animal, do consumo de
alimento e do grau de digestibilidade das dietas fornecidas (JOHNSON &
JOHNSON, 1995). Considerando que as dietas nos países tropicais estão
baseadas em volumosos, o valor nutritivo da planta forrageira é relevante na
produção de CH
4.
As forrageiras tropicais apresentam menor valor nutritivo,
quando comparadas com as de clima temperado. De maneira geral, o decréscimo
no valor nutritivo está associado às condições climáticas (precipitação,
8
intensidade luminosa, temperatura, etc.) e ao manejo, determinando a taxa de
crescimento das plantas (MINSON, 1990 citado por McCRAB & HUNTER, 1999).
A Embrapa Pecuária Sudeste, quantificou a taxa de emissão de metano
entérico de bovinos leiteiros em condições tropicais, determinando emissão de
CH
4
superior por bovinos alimentados com forrageiras tropicais (PRIMAVESI et
al., 2004). Portanto, o aumento na digestibilidade das dietas fornecidas, além de
melhorar a produção de carne e do leite, ajuda a diminuir a emissão de CH
4
.
3 Metabolismo Ruminal
Os ruminantes possuem a capacidade para converter alimentos de baixa
qualidade em proteína de alta qualidade (VARGA & KOLVER, 1997). O rúmen é
considerado um ecossistema microbiano diverso e único. Composto por três tipos
de microrganismos ativos no seu interior: bactérias, protozoários e fungos, sendo
as bactérias constituintes de 60 a 90% da biomassa microbiana com cerca de 200
espécies (KOZLOSKI, 2002). A fermentação anaeróbia do alimento
principalmente de tipo fibroso é possível devido ao sinergismo existente entre a
população microbiana, permitindo a degradação pela ação de complexos de
enzimas, como a ß 1-4 celulase, agindo sobre a parede celular das plantas. No
entanto, a fermentação do alimento e conversão em carne e leite pode ser pocuo
eficiente devido a fatores associados a digestibilidade das forrageiras (VARGA &
KOLVER, 1997).
A maior parte dos nutrientes do alimento, principalmente as fontes
energéticas e protéicas, são transformados em ácidos graxos de cadeia curta
(AGCC), em massa microbiana e em gases como metano (CH
4
), dióxido de
carbono (CO
2
) e hidrogênio (H
2
) (BAKER, 1999). Os AGCC podem ser
considerados um resíduo da fermentação para os microrganismos, entretanto
para o ruminante, representam a principal fonte de energia. A energia presente
nos AGCC representa em torno de 75 a 80% da energia originalmente presente
9
nos carboidratos fermentados e, normalmente, contribuem em 50 a 70% da
energia digestível do alimento (KOZLOSKI, 2002).
A estequiometria (Tabela 1) da conversão de um mol de glicose para
AGCC e a proporção em que cada ácido é produzido, depende da espécie
bacteriana, que pode ser especializada em produzir um tipo ou outro e
principalmente da concentração de nicotinamida adenosina difosfato (NADH) e H
2
na célula (KOZLOSKI, 2002). O excesso de H
2
no rúmen, é eliminado pelas
bactérias metanogênicas, principalmente do gênero Archae (BAKER, 1999),
utilizando-o para reduzir CO
2
e formar CH
4
(KOZLOSKI, 2002). De acordo com
o balanço estequiométrico, a produção de acetato e de butirato promovem maior
produção de CH
4
pela maior produção de H
2
(WOLIN, 1960 citado por
TEDESCHI et al., 2003).
Tabela 1. Estequiometria da conversão de glicose em AGCC
GLICOSE = 2 acetato + 2 CO
2
+ 8 H (H= -251 kcal mol
-1
)
GLICOSE = butirato + 2 CO
2
+ 4 H (H= -118 kcal mol
-1
)
GLICOSE+4H = 2 propionato (H= + 60 kcal mol
-1
)
GLICOSE = 2 lactato (H= - 16 kcal mol
-1
)
Fonte: KOZLOSKI (2002)
A produção de CH
4
no rúmen está diretamente relacionada com a
concentração de H
2
(CHAUCHEYRAS et al., 1995).
Na medida que ocorre a
fermentação dos carboidratos no rúmen, aumentam-se os teores de H
2
que, se
não forem removidos, inibem os sistemas enzimáticos que envolvem o NADH,
enzima importante na fermentação dos carboidratos (PEDREIRA, 2004).
De outra parte, sabe-se que do balanço entre o aprte de energia e proteína
vai depender a eficiência no prcesso de fermentação ruminal. Assim o aporte de
nitrogênio amoniacal pode servir como a principal fonte de N para a síntese de
proteína microbiana, em bactérias fermentadoras de carboidratos estruturais,
entretanto, algumas espécies, como as bactérias fermentadoras de carboidratos
10
não-estruturais, requerem aminoácidos e peptídeos (NRC, 1986). As bactérias
ruminais podem incorporar aminoácidos em proteína microbiana ou fermentá-los
como fonte de energia. A fermentação de aminoácidos também origina amônia
ruminal. Como o crescimento microbiano é dependente do suprimento de
carboidratos fermentáveis, os produtos finais do metabolismo de proteínas são
influenciados pela disponibilidade de carboidratos (RUSSEL & STROBEL, 1989).
Com base no conhecimento dos processos fermentativos e da microflora
do rúmen, têm sido desenvolvidas alternativas orientadas a manipular a
fermentação no rúmen, para aumentar a digestibilidade das dietas, principalmente
daquelas ricas em volumosos, fonte predominante na pecuária das regiões
tropicais.
4 Manipulação Ruminal
O metabolismo no rúmen pode ser alterado de maneira direta ou indireta
para melhorar a digestibilidade do alimento fornecido. A manipulação indireta está
relacionada com as características do alimento, sendo assim que, o uso de
suplementos como minerais, ou fontes de energia e nitrogênio aumentam a
atividade metabólica dos microrganismos (McSWEENEY et al., 1999).
Adicionalmente, o tipo de carboidrato suplementado influi no pH do rúmen e na
população microbiana, incidindo na produção dos AGCC principalmente na
relação acetato:propionato e por sua vez na produção de H
2.
(HEGARTY, 1999).
Além disso, a fermentação do carboidrato solúvel e do amido produz menos CH
4
do que a parede celular, devido à baixa tolerância das bactérias metanogênicas
ao decréscimo do pH (BLAXTER & CLAPPERTON, 1965).
A manipulação direta do rúmen relaciona-se com o uso de aditivos
biológicos ou químicos, que modificam a fermentação ao terem efeito sobre a
microflora ruminal (DOMINGUEZ & ESCOBAR, 1997). A adição de soluções
11
tampão, de ionóforos ou de leveduras, entre outros, têm sido usados para
favorecer a digestibilidade de alimentos fibrosos (VARGA & KOLVER, 1997).
4.1 Aditivos
O uso de ionóforos como monensina na alimentação de gado foi descrito
desde 1975, em gado de corte (SCHELLING, 1984). O mecanismo de ação está
relacionado com a capacidade dos ionóforos em se ligar a cátions, como sódio, e
formar complexos lipofílicos para atravessar a membrana celular das bactérias
gram positivas e de protozoários (BERGEN & BATES, 1984; CHOW et al. 1994).
O sódio transportado ao interior da célula precisa ser trocado pelo potássio e,
assim, retornar ao meio externo, neste processo há gasto de ATP provocando
queda da reserva energética, alterando a divisão celular e possivelmente
conduzindo à morte dos microrganismos (RUSSEL & STROBEL, 1989).
Efeitos da monensina no metabolismo ruminal estão associados ao
aumento da proporção molar de ácido propiônico (BERGEN & BATES, 1984).
Efeito atribuído ao decréscimo na população de bactérias gram positivas,
produtoras de acido láctico, acético, butírico, fórmico e hidrogênio, enquanto que,
as bactérias gram negativas, que produzem ácido propiônico e succínico são
resistentes. O decréscimo na produção de CH
4,
também é evidente (CHEN &
WOLIN, 1979).
Têm sido determinado que, com o uso de monensina, há aumento da
população de Selenomonas, Succinomonas, Megasphaera e Veillonella e inibição
no crescimento de bactérias produtoras de acetato como Ruminococcus e
Butyrivibrio (CHEN & WOLIN, 1979). Simultaneamente a maior concentração de
NADH/NAD+, favorece a síntese de propionato pela reoxidase do NADH,
limitando o H
2
para a produção do acetato (HEGARTY, 1999). De outra parte, a
fumarato redutase, enzima que permite a transformação do fumarato a succinato,
que posteriormente vai se transformar no propionato, encontra-se em bactérias
12
gram negativas, resistentes à monesina (BERGEN & BATES, 1984). Com o
aumento do ácido propiônico há maior eficiência no metabolismo energético,
devido a que este é usado potencialmente na gliconeogênese pela incorporação
direta ao ciclo de Krebs (SCHELLING, 1984).
A maior produção de propionato concorre diretamente com a produção de
CH
4
, ou seja, quanto maior a produção de acido propiônico, menor a produção de
CH
4
(JOHNSON & JOHNSON, 1995). O efeito da monensina na redução da
metanogênese relaciona-se com o decréscimo de H
2
e de formato, substrato
necessário na formação de CH
4
e não pelo efeito direto nas bactérias
metanogênicas (CHEN & WOLIN, 1979). Outro mecanismo relacionado ao
decréscimo de CH
4
é a redução no número de protozoários. Como já
estabelecido, os protozoários fornecem H
2
às bactérias metanogênicas que
mantêm com eles uma relação de simbiose (RUSSEL & STROBELL, 1989).
Outro aditivo atualmente usado é a levedura, que como probiótico tem
mostrado efeito positivo na fermentação ruminal, principalmente na maior
atividade bacteriana (NEWBOLD et al., 1995), e na digestibilidade da matéria
seca e da fibra das forrageiras, além de induzir decréscimo na concentração de
ácido láctico (CHAUCHEYRAS et al., 1995).
Leveduras como o Saccharomyces
cerevisiae, foram usadas desde 1925 por ECKLES & WILLIAMS citados por
NEWBOLD et al. (1995), com resultados positivos no metabolismo ruminal.
Aumento na taxa de digestão da fibra, e na produção de AGCC têm sido
observados (ERASMUS et al., 1992). Estudos in vitro, realizados por ERASMUS
et al. (2005) demonstraram que as leveduras reduzem a produção de ácido
acético favorecendo a síntese de propiônico. De outra parte, determinou-se que
estimulam a germinação de zoósporos do fungo Neocallimastix frontalis e o
crescimento de bactérias celulolíticas, principalmente, Fibrobacter succinogenes e
Ruminococcus (CHAUCHEYRAS & FONTY, 2001). Assim, o efeito sinérgico de
bactérias e fungos age em tecidos lignificados da parede celular permitindo maior
área de colonização bacteriana (SINGH & SAINI, 2002).
13
WALLACE (1994), associou o uso efeito das leveduras à remoção de
oxigênio do ambiente ruminal, mantendo condições adequadas para o
crescimento de bactérias anaeróbias estritas. Além disso, observou aumento na
ingestão do alimento. Estudos similares de ERASMUS et al. (1992), determinaram
diferenças significativas na ingestão de alimento e na produção de leite em vacas
holandesas suplementadas com leveduras. Menor concentração de ácido láctico
foi associado ao aumento na atividade de Selenomonas ruminantium.
Suplementação das dietas com ácidos graxos polinsaturados têm
demonstrado efeito na produção de CH
4
(MACHMÜLLER et al., 1998). A menor
produção de CH
4
, tem sido atribuída à ação sobre microrganismos que direta ou
indiretamente contribuem à formação de CH
4
(HENDERSON, 1973 citado por
FAICHNEY et al., 2002). Estudo realizado por MACHMÜLLER et al. (1998)
demonstraram menor número de protozoários como efeito da suplementação com
ácidos graxos e decréscimo de H
2
. Os protozoários no rúmen agem em simbiose
com as bactérias metanogênicas aumentando a produção de CH
4
devido à
transferência de H
2
entre as duas espécies (McALLISTER et al., 1996). Tem sido
observado grande número de bactérias metanogênicas associadas a protozoários
após períodos de alimentação, assim conseguem captar H
2
para posterior síntese
de ATP (HEGARTY, 1999). Na ausência de protozoários o H
2
pode ser
incorporado na formação de AGCC (MACHMÜLLER et al., 1998), ou para saturar
ácidos graxos polinsaturados com decréscimo do substrato que precisam as
bactérias metanogênicas para produzir CH
4
(FIEVEZ et al., 2003).
UNGERFELD et al. (2005) observaram inibição no crescimento de
Methanobrevibacter ruminantium, Mb. Ruminantium, efeito da suplementação
com ácidos polinsaturados. No entanto, segundo FAICHNEY et al. (2002) deve
ser considerado o efeito negativo dos lipídeos na digestibilidade dos constituintes
fibrosos das forrageiras, quando fornecidos em mais de 4%.
O interesse sobre o emprego do crômio como fonte suplementar na dieta
de animais destinados à produção é devido a possíveis fatores como
desempenho, taxa de crescimento, resposta imune e alteração metabólica. A
14
suplementação com crômio influencia a liberação de insulina e captação de
glicose nas primeiras fases de vida de bezerros. Adicionalmente, pode imelhorar a
capacidade imunológica de animais estressados. Em confinamento, nos primeiros
30 dias observa-se um maior ganho de peso e eficiência alimentar em bovinos
recebendo crômio na dieta. Têm efeito no metabolismo de carboidratos, lipídios e
proteínas (OLIVEIRA & SORES, 2005).
5 Estimativa de metano pela técnica de produção de gases in vitro
A técnica de produção de gases in vitro, foi descrita há mais de meio
século, tempo durante o qual se desenvolveram várias metodologias aceitas e
usadas atualmente em vários grupos de pesquisa. As primeiras mensurações de
gases obtidas da incubação de um substrato foram realizadas por McBEE (1953)
e HUNGATE (1966) citados por RYMER et al. (2005), para avaliar o potencial de
degradação no rúmen. Posteriormente, implementou-se o uso de seringas para
incubar o substrato, sendo este o princípio do “Hohenheim Gas Test”
desenvolvido por MENKE et al. (1979). THEODOROU et al. (1994)
desenvolveram o uso transdutores de pressão manual, para assim estimar os
gases produzidos e inferir à cinética de fermentação no rúmen. Atualmente, as
metodologias existentes variam de acordo a fatores como: tipo de transdutor
usado; tamanho e quantidade de amostra usada; composição do meio de cultura;
preparação e proporção do inoculo; volume incubado, entre outros (RYMER et al.,
2005).
O princípio da técnica baseia-se na simulação dos processos metabólicos
que acontecem normalmente no rúmen, onde a degradação do alimento depende
dos microrganismos e do ambiente ruminal adequado para se manterem ativos e
fermentar o alimento. Sob essas condições, há formação de AGCC, além de CO
2
,
CH
4
e produção de massa microbiana (BLÜMMEL et al., 2005).
15
Na técnica in vitro, é usado um recipiente de incubação, que varia de
acordo com a metodologia. As condições ambientais do rúmen como temperatura
e anaerobiose são mantidas, sendo os gases produto da fermentação do
substrato relacionado com a digestão microbiana e com a produção de AGCC, de
CO
2
e de CH
4
. THEODOROU et al. (1994) determinaram que, os gases diretos
são produto da fermentação do carboidratos estruturais, enquanto que, os
carboidratos soluveis e o amido geram gases indiretos, que são produzidos ao
reagir o ácido propiônico, produto da fermentação com a solução tampão para
manter o pH do meio. Assim, variações na proporção de AGCC associadas às
características bioquímicas do substrato incidem no volume de gases produzidos
(GETACHEW et al., 1998).
A técnica de produção de gases in vitro tem sido avaliada para determinar
as principais fontes de variação. Assim, BUENO et al. (2005) avaliaram o efeito
da espécie do animal doador (bovino versus ovino) do líquido ruminal na
produção de gases de algumas forrageiras tropicais. Os resultados não
mostraram diferença na estimativa de produção de gases, embora a taxa de
fermentação tenha sido maior com líquido ruminal de origem bovino. No entanto,
CONE et al. (2002), indicaram que o volume total de gases produzido usando
fluido ruminal de bovinos, foi maior do que o fluido de ovelhas, quando
alimentadas com dietas similares. CALABRÒ et al. (2004), compararam o uso de
líquido ruminal de bovino e de búfalo determinando que há maior produção total
de gases usando fluido ruminal de bovino, concluindo que a espécie do animal
doador do fluido ruminal tem efeito na produção de gases.
Em outro estudo, BUENO et al. (2005) avaliaram o efeito do uso de
diferentes proporções de fase líquida e sólida do inóculo, determinando que não
há efeito da proporção de fase sólida na taxa de produção de gás. Embora, a
contribuição de microrganismos da fase sólida do liquido ruminal seja importante
para avaliar forrageiras com alto conteúdo de fibra. De outra parte, TREI et al.
(1970) observaram maior volume de gases quando coletado fluido ruminal de
novilhos alimentados com grão, do que daqueles alimentados com feno, sendo o
16
grão o substrato incubado. NAGADI et al. (2000) observaram que quando usado
fluido ruminal de animais adaptados ao substrato incubado, apresentam-se
diferenças no volume de gases produzidos quando comparado com animais não
adaptados.
THEODOROU et al. (1994), observaram que aumentando a quantidade de
substrato incubado, há acréscimo linear do volume total de gases, embora a taxa
de produção não seja alterada. Alimentos fibrosos ou de lenta degradação
aumentam a taxa de produção de gases conforme diminui o tamanho da partícula,
possivelmente pela maior área de aceso para as bactérias atuarem (MENKE &
STEINGRASS, 1988; LOWMAN et al., 2002).
A liberação dos gases acumulados em tempos predeterminados é outro
fator que deve ser considerado. De acordo com THEODOROU et al. (1994),
pressão maior de 7 psi (48kpa), interfere no crescimento bacteriano. Assim,
liberando os gases a pressão decresce, mantendo as condições adequadas para
o crescimento dos microrganismos. Este efeito pode ser corrigido com o uso de
menor quantidade de substrato ou aumentando o tamanho do recipiente de
incubação. LOWMAN et al., 1998 citados por RYMER et al. (2005) observaram
que, o intervalo de liberação dos gases influi na estimativa do volume, sendo
menor quando liberado a cada 6h e maior a cada 2h.
RYMER & GIVENS (1997) citados por RYMER et al. (2005) compararam
três tipos de aparelhos usando a mesma metodologia da técnica de produção de
gás. Os aparelhos comparados foram o transdutor de pressão automático e
manual. Observando maior produção de gás quando usado o transdutor
automático. Embora, estudo realizado por THEODOROU et al. (1994) mostraram
maior volume de gás e menor taxa de produção usando transdutor manual.
Diferença na produção de gases pode acontecer por mudanças de pressão
atmosférica, fator que deve ser considerado ao comparar resultados entre
laboratórios.
17
6 Objetivos
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da suplementação com
monensina ou com um complexo de leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e
aminoácidos sobre o consumo de matéria seca e dos nutrientes, na estimativa da
digestibilidade ruminal, nos parâmetros de fermentação ruminal (pH,
concentração de nitrogênio amoniacal e de ácidos graxos de cadeia curta) e na
população de protozoários. Adicionalmente, estimou-se a produção de metano,
usando a técnica de produção de gases in vitro
18
CAPÍTULO 2 – EFEITO DO USO DE ADITIVOS NA FERMENTAÇÃO RUMINAL
DA DIETA COMPOSTA POR VOLUMOSO E CONCENTRADO
Resumo - Avaliou-se o efeito da adição de monensina e de um complexo
contendo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos (LAA) sobre o
consumo de matéria seca e nutrientes, na estimativa da digestibilidade ruminal,
nos parâmetros de fermentação ruminal: pH, concentração de nitrogênio
amoniacal (N-NH3) de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e na população de
protozoários. Foram utilizados seis bovinos anelorados, castrados, canulados no
rúmen, dispostos em um delineamento experimental em blocos casualizados com
três períodos (blocos), três tratamentos e duas repetições dentro do bloco. Os
tratamentos consistiram em: 5g dia
-
1 de LAA; 5g dia
-1
monensina sódica 5%; 5g
dia
-1
de caulim usado como controle. O coeficiente de digestibilidade foi
determinado através do marcador interno fibra em detergente ácido indigestível.
Foram tomadas amostras de conteúdo ruminal para determinação de pH, AGCC,
N-NH
3
e para contagem de protozoários. Houve efeito da monensina reduzindo
significativamente (P<0,05) o consumo da matéria seca, dos nutrientes, observou-
se aumento na produção de ácido propiônico e decréscimo na relação de ácido
acético e propiônico (P<0,05). Não foi evidente o efeito dos aditivos na
digestibilidade da dieta. A população de protozoários foi menor usando
monensina (P<0,05).
Palavras-chave: ácidos graxos poliinsaturados, digestibilidade, FDAi, leveduras,
monensina.
19
1 Introdução
Devido à deficiência, tanto de qualidade, quanto de quantidade das forrageiras
tropicais, a produção de carne e leite é limitada. O pobre valor energético do
alimento consumido, além da parede celular rica em lignina, dificulta a
fermentação ruminal e a produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e de
proteína de origem microbiana. Sendo alimento de baixa digestibilidade, tem
maior tempo de retenção no rúmen, decrescendo a taxa de passagem e o
consumo. Assim, estratégias descritas por JOHNSON & JOHNSON (1995), como
o aumento na qualidade da forragem fornecida, o uso de carboidratos não
estruturais e o uso de aditivos como os ionóforos, leveduras, ácidos graxos
poliinsaturados, entre outros, são alternativas para melhorar a digestibilidade das
dietas e a eficiência do metabolismo energético.
Ionóforos como a monensina, foram liberados para uso nas dietas de bovinos
de corte desde 1976, nos Estados Unidos com a finalidade de aumentar a
eficiência na produção de carne (DOMESCIK & MARTIN, 1999). O modo de ação
está associado ao transporte de sódio no interior da membrana celular das
bactérias, principalmente gram positivas mobilizando potássio ao exterior,
induzindo decréscimo do pH no interior da célula. A bactéria dissipa o excesso de
prótons com gasto de energia, conduzindo ao decréscimo no crescimento e
replicação (RUSSEL & STROBEL, 1989). Os ionóforos são inibitórios no
crescimento de bactérias produtoras de ácido láctico, acético, butírico, fórmico e
hidrogênio, enquanto que aquelas que produzem ácido succínico e propiônico são
resistentes (CHEN & WOLIN, 1979). Embora, o uso de monensina por períodos
prolongados induz resistência e adaptação das bactérias sensíveis (McALLISTER
et al., 1996).
Os ácidos graxos poliinsaturados, usados como aditivos, têm sido associados
à menor perda de energia metabolizável ao diminuírem a produção de metano
(CH
4
). A menor produção de CH
4
, tem sido atribuída à ação sobre
20
microrganismos que direta ou indiretamente contribuem à formação de CH
4
(HENDERSON, 1973 citado por FAICHNEY et al., 2002). O mecanismo proposto
é o uso de hidrogênio livre para saturar os ácidos, limitando o substrato para as
bactérias metanogênicas produzir CH
4
(JOHNSON & JOHNSON, 1995; FIEVEZ et
al., 2003). Estudo realizado por MACHMÜLLER et al. (1998), mostrou menor
número de protozoários como efeito da suplementação com ácidos graxos
polinsaturados com decréscimo de H
2
e menor produção de CH
4
.
De outra parte, a suplementação com probióticos, como as leveduras, associa-
se ao crescimento de bactérias celulolíticas e à maior produção de AGCC
(CHAUCHEYRAS et al., 1995; NEWBOLD et al., 1996; NAGARAJA et al., 1997).
Conseqüentemente, tem sido demonstrado aumento na digestibilidade da
forragem, no entanto, o mecanismo pelo qual a população de bactérias aumenta
ainda não tem sido estabelecido (NEWBOLD et al., 1996). Tem sido sugerido que
a captação de oxigênio pelas leveduras mantêm a anaerobiose, induzindo
crescimento de bactérias anaeróbias estritas (WALLACE,1994). Além disso,
MARTIN & STREETER (1995) observaram aumento no número de Selenomonas
ruminantium. Estas bactérias usam o ácido láctico como substrato, mantendo o
pH no rúmen. Outros estudos demonstraram menor concentração de amônia em
animais suplementados com leveduras, refletindo o uso na síntese de proteína
microbiana (HARRISON et al., 1988).
O presente trabalho teve como objetivos determinar o efeito da adição de
monensina ou de um complexo contendo leveduras, ácidos graxos
poliinsaturados e aminoácidos sobre o consumo de matéria seca e dos nutrientes,
na estimativa da digestibilidade ruminal, nos parâmetros de fermentação ruminal
(pH, concentração de nitrogênio amoniacal e de ácidos graxos de cadeia curta) e
na população de protozoários.
21
2 Material e métodos
O trabalho foi desenvolvido na Fazenda Experimental da Empresa Premix em
Patrocínio Paulista e na Universidade Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de
Jaboticabal – SP. Foram utilizados seis bovinos, anelorados, machos, castrados,
canulados no rúmen, com peso corporal médio de 530 kg e idade média de 4,5
anos, alojados em baias individuais, cobertas e providas de bebedouros e
comedouros. Os tratamentos consistiram em: 5g dia
-1
do complexo de leveduras,
ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos (LAA) (Tabela 1); 5g dia
-1
de
monensina sódica 5%; 5g dia
-1
de caulim usado como controle, que foram
fornecidos com a dieta base composta por feno de Tifton 85 (Cynodon Spp.) e
concentrado, em uma relação 80:20, balanceada para atender as exigências de
mantença dos animais (NRC, 1996).
Tabela 1. Composição do complexo de leveduras, ácidos graxos poliinsaturados
e aminoácidos, conforme níveis de garantia fornecido pelo fabricante.
Ácido Oléico 12 mg*
Ácido Linoléico 12.000 mg
Metionina 2.400 mg
Lisina 11.400 mg
Tirosina 4.850 mg
Crômio 285 mg
Probiótico (Leveduras) 0,3 x 10
8
UFC **
* **
A composição porcentual e químico-bromatológica dos alimentos fornecidos
encontram-se na Tabela 2. Foi avaliado o efeito dos aditivos sobre o consumo de
22
matéria seca e dos nutrientes, na estimativa da digestibilidade ruminal, nos
parâmetros de fermentação ruminal (pH, concentração de nitrogênio amoniacal e
de ácidos graxos de cadeia curta) e na população de protozoários, durante três
períodos de 21 dias de duração, sendo 14 dias para adaptação dos animais à
dieta e sete dias para a coleta das amostras.
Tabela 2 - Composição porcentual e químico-bromatológica da dieta
Ingredientes (%MS)
Nutrientes Feno Tifton 85
Concentrado
80
20
Matéria seca 88,98 89,08
Matéria orgânica 94,63 82,66
Proteína Bruta 13,20 21,71
Fibra insolúvel em detergente neutro
80,75 45,08
Fibra insolúvel em detergente ácido 39,76 20,24
Lignina 5,17 4,75
Matéria mineral 5,36 17,33
EB (Mcal kg
-1
MS) 4,19 3,76
Composição do concentrado (%)
Polpa cítrica desidratada 29,91
Gérmen de milho 30
Levedura seca 1
Farelo de amendoim 20
Casca de soja 6
Farelo de algodão 0,97
Farelo de trigo 6,27
Carbonato de cálcio 2,81
Uréia 1,39
Cloreto de sódio 0,18
Premix mineral* 1,47
23
*Fósforo 0,36%; Cálcio 1,7%; Enxofre 1,6g; Magnésio 1,7g; Potássio 8g; Zinco 52mg; Cobre 14,46mg; Manganês 25,41mg;
Cobalto 0,32mg; Iodo 1mg; Selênio 0,5mg; Crômio 0,340mg; Sódio 1,2 mg; Metionina 700mg; Tirosina 1300mg; Lisina
4600 mg.
Durante cada período experimental a dieta foi fornecida duas vezes ao dia,
às 7:30 e às 16:30. As sobras foram mensuradas para determinação do consumo
de matéria seca. Foram coletadas amostras do alimento para posterior avaliação
da composição química e digestibilidade.
As amostras pré-secas foram encaminhadas ao Laboratório de Nutrição
Animal (LANA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade
Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de Jaboticabal. Para determinação do
conteúdo de matéria seca (MS) as amostras foram colocadas em estufa de ar
forçado a 105°C durante 12h e para matéria mineral (MM) foram colocadas em
mufla a 550°C durante 3h. A energia bruta (EB) foi determinada em bomba
calorimétrica adiabática PARR Instruments e a fibra em detergente neutro (FDN),
a fibra em detergente ácido (FDA), e a lignina adaptado de VAN SOEST et al.
(1991).
Para a estimativa da produção fecal foram coletadas amostras de fezes
durante sete dias. As coletas foram realizadas duas vezes ao dia, ás 7:30 e
16:30, e congeladas para ao final do período formar uma amostra composta por
animal. A estimativa da produção fecal foi realizada utilizando a fibra em
detergente neutro indigestível (FDAi) como indicador interno com base na
equação: Produção fecal (g dia
-1
) = gramas de indicador ingerido/concentração do
indicador nas fezes
A técnica de incubação in situ foi utilizada para obtenção da FDAi.
Amostras em triplicata do alimento e das fezes foram incubadas no rúmen de
bovinos, durante 144 horas, usando bolsas de tecido de náilon. Após a incubação,
as bolsas foram lavadas e submetidas à secagem em estufa com ventilação
forçada a 55°C durante 72 horas. A determinação de fibra em detergente ácido
(FDA) foi realizada segundo VAN SOEST et al. (1991).
24
O coeficiente de digestibilidade no rúmen foi determinado através da
equação:
Coeficiente de digestão da MS = 100 x [MS ingerida - MS fecal/ MS
ingerida]
Para determinação de pH e da concentração dos ácidos graxos de cadeia
curta (AGCC) e do nitrogênio amoniacal (N-NH
3
) foram realizadas coletas de
conteúdo ruminal no 5º dia de cada período experimental. Para a coleta foi usada
uma bomba de vácuo aspiradora NEVONI ® Ref. 5005-BR. As amostragens
ocorreram nos períodos 0, 2, 4, 8, 12 horas após a alimentação, sendo tomada
uma amostra para realizar a leitura de pH, através de um potenciômetro digital
PHTEK – PH – 100 LIO SERUM ®. Duas alíquotas foram armazenadas e
congeladas, a primeira alíquota foi usada para determinação de AGCC, a
segunda foi acidificada com acido clorídrico para posterior determinação de
nitrogênio na forma de amônia (N-NH
3
).
Para determinar a concentração de AGCC, as amostras foram
descongeladas e centrifugadas a 10.000g durante 15 minutos, aliquotas de 1 mL
foram tratadas com acido fórmico 88%, para protonar os ácidos associados e
garantir a volatilização dos AGCC no injetor do cromatógrafo. Amostras de 1 µm
foram analisadas em cromatógrafo a gás (CG 270) com detector de ionização de
chama, empregando coluna capilar empacotada (4% CW 20M Carbopack B-DA,
2.0mx1/8 “). A determinação de N-NH
3
foi realizada conforme metodologia
descrita por CHANEY & MARBACH (1962).
Para a contagem de protozoários foram coletadas amostras de conteúdo
ruminal antes de fornecer o alimento no 5° e 6° dia de cada período experimental.
A amostra foi transferida para um recipiente junto com uma solução de
formaldeído 40% na proporção de 1:1. A metodologia utilizada para a avaliação
quantitativa e qualitativa dos gêneros de ciliados foi de acordo a DEHORITY
(1984).
O delineamento experimental foi de blocos casualizados com duas
repetições dentro do bloco e três tratamentos. Para a análise de concentração de
ácidos graxos de cadeia curta, de nitrogênio amoniacal e pH foi usado o
25
delineamento em parcelas sub-divididas. As análises de variância foram
realizadas utilizando o procedimento GLM do programa SAS
®
(LITTELL et al.,
2002), e em caso de diferenças significativas (P<0,05) as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey.
3 Resultados e discussão
Consumo e digestibilidade
O consumo de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), proteína bruta
(PB), fibra em detergente neutra (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) e o
coeficiente de digestibilidade matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), fibra em
detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA), proteína bruta (PB)
são apresentados na Tabela 3. Menor consumo de matéria seca (MS), matéria
orgânica (MO), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA)
e proteína bruta (PB) foram evidentes no tratamento com monensina.
Tabela 3 - Consumos médios diários de matéria seca (CMS), matéria orgânica (CMO), proteína
bruta (CPB), fibra em detergente neutro (CFDN), energia bruta (CEB) e coeficiente de
digestibilidade (%) da matéria seca (DMS), da matéria orgânica (DMO), da fibra em detergente
neutro (DFDN) da proteína bruta (DPB), e da energia bruta (DEB), de bovinos recebendo
volumoso, concentrado e aditivos
Tratamentos
1
Variáveis
LAA Monensina Controle
CV(%)
Consumo diário
CMS, %PC 1,52
A
1,40
B
1,51
A
5,20
CMS, kg PC
-0,75
73,45
A
67,43
B
73,04
A
4,69
CMS, kg dia
-1
8,23
A
7,53
B
8,15
A
4,04
CMO, kg dia
-1
7,59
A
6,95
B
7,51
A
4,13
CFDN, kg dia-1
CFDA, kg dia
-1
6,06
A
2,95
A
5,54
B
2,70
B
5,99
A
2,92
A
4,18
4,32
CPB, kg dia
-1
1,17
A
1,06
B
1,15
A
4,43
Digestibilidade ruminal (%)
DMS 54,40 55,04 56,33 4,08
DMO 52,02 53,28 54,59 5,19
DFDN 54,93 55,39 55,99 3,77
DFDA 53,34 53,83 53,81 4,57
DPB 58,87 61,15 60,02 6,57
26
1
LAA =complexo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos
CV= Coeficiente de variação, PC=peso corporal
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes, nas linhas, diferem estatisticamente pelo
teste Tukey (P<0,05).
Efeitos similares foram descritos em gado de corte quando as dietas
suplementadas com monensina, embora o efeito tenha sido evidente em dietas
baseadas em concentrados (BERGEN & BATES, 1984). O efeito da monensina
no menor consumo de alimento é atribuído à maior eficiência no metabolismo
energético, devido ao aumento na produção de ácido propiônico, único ácido
graxo de cadeia curta usado potencialmente na gluconeogênese pela
incorporação direta ao ciclo de Krebs (SCHELLING, 1984).
Neste trabalho a relação volumoso:concentrado da dieta foi de 80:20, com
predomínio de volumoso e considerando o alto teor de FDN o consumo pode ter
sido limitado pelo enchimento do rúmen, no entanto considera-se que o
concentrado ao ser fonte de carboidratos solúveis, rapidamente degradáveis e de
proteína supre às bactérias, principalmente aquelas que degradam fibra para se
manterem ativas e melhorar a taxa de passagem e o consumo.
Os coeficientes de digestibilidade ruminal não diferiram estatisticamente.
Esperava-se aumento na digestibilidade aparente da fibra pela suplementação
com monensina, como descrito por TEDESCHI et al. (2003) e do LAA ao conter
leveduras, como observado por MIRANDA et al. (1996). Sabe-se que estes
aditivos melhoram as condições ambientais no rúmen e estimulam o crescimento
da população bacteriana, principalmente de bactérias celulolíticas (ERASMUS et
al., 1992; HEGARTY, 1999; CHAUCHEYRAS & FONTY, 2001).
SILVA (2004) avaliou a digestibilidade de dieta com base em feno de
capim-Tifton 85 (99,2%), observando coeficientes de digestibilidade ruminal da
matéria seca de 57,72%, superior ao observado neste trabalho. FEITOSA
(2003), determinou que a degradabilidade da matéria seca, fibra em detergente
neutro e fibra em detergente ácido do feno de capim-Tifton 85 com 10% de
proteína bruta não foi afetada pela qualidade do feno. Outros estudos mostraram
altos coeficientes de digestibilidade de dietas quando usada esta gramínea
(HATFIELD et al., 1997; WEST et al., 1998). Assim, sugere-se que o indicador
27
usado (fibra em detergente ácido indigestível) para determinar a digestibilidade
ruminal do feno de capim-Tifton 85 pode ter interferido nos resultados. ATAÍDE et
al., (2001) observaram baixos coeficientes de digestibilidade em novilhos
alimentados com feno de Tifton 85, atribuído à baixa recuperação do indicador
interno FDA indigestível nas fezes.
Parâmetros ruminais: pH, nitrogênio amoniacal e ácidos graxos de cadeia curta
Os valores médios dos parâmetros ruminais são apresentados na Tabela 3.
Menores valores de pH foram observados 12 horas após alimentação associado à
produção dos AGCC produto da fermentação dos carboidratos solúveis (Figura 1).
Não houve interação entre tratamento e período.
Figura 1 – Valores médios de pH ruminal antes (0) e 2, 4, 8 e 12
horas após
alimentação, de bovinos recebendo dieta com e sem aditivos
6,55
6,60
6,65
6,70
6,75
6,80
6,85
6,90
6,95
0 2 4 6 8 10 12 14
Horas após alimentação
pH ruminal
LAA
Monensina
Controle
28
Evidenciou-se que o pH manteve-se na faixa considerada adequada para
os microrganismos manterem a fermentação ruminal, como esperado para dietas
ricas em volumosos, sendo que o pH regula a afinidade dos microrganismos ao
substrato e que, de acordo com ALLEN & MERTENS (1988), valores próximos a
pH neutro melhoraram a capacidade de adesão das bactérias à fibra.Em relação
aos tratamentos, os animais suplementados com LAA apresentaram valor médio
de pH de 6,75, valor este que diferiu (P<0,05) do tratamento com monensina
(6,81). Menor produção de H
2
tem sido associado ao uso de monensina, devido à
maior produção de ácido propiônico, ao ser transformado o fumarato a succinato,
pela ação da fumarato redutase, enzima que encontra-se em bactérias gram
negativas, resistentes à monesina (BERGEN & BATES, 1984).
Tabela 3 – Parâmetros ruminais de bovinos recebendo dieta com e sem aditivos.
Tratamentos
1
Parâmetros ruminais
LAA Monensina Controle
CV (%)
pH
N-NH3
AGCC total (mmol L
-1
)
6,75
B
7,38
90,35
A
6,81
A
6,61
81,16
B
6,76
A B
7,65
88,40
A
1,27
40,12
7,13
Acético (A) 68,75
A
67,48
A
58,60
B
6,75
Propiônico (P)
Butírico (B)
Relação A:P
14,37
B
7,21
A
3,78
B
16,71
A
5,83
B
3,05
A
13,20
B
7,11
A
3,62
B
9,58
11,87
7,50
1
LAA =complexo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos
AGCC=ácido graxo de cadeia curta, CV= Coeficiente de variação.
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes, nas linhas, diferem estatisticamente pelo teste d
e Tukey
(P<0,05).
As concentrações de N-NH
3
ruminal são apresentados na Tabela 3. Não
houve diferença significativa (P>0,05) nas médias entre tratamentos. Não houve
interação entre tratamento e período. O valor de máxima concentração observou-
se 2 horas após alimentação (Figura 2), associada à degradação das fontes
protéicas provenientes do concentrado. A menor concentração (P<0,05) foi
29
evidente às 8 horas após alimentação, correspondendo à utilização pelos
microrganismos.
F
igura 2
– Valores médios de nitrogênio amoniacal (N-NH
3
) antes (0) e 2, 4, 8 e
12h após alimentação, de bovinos recebendo dieta com e sem aditivos
Não houve diferença significativa entre tratamentos, no entanto observou-
se que a concentração de N-NH
3
manteve-se acima de 5mg dL
-1
, concentração
mínima para suprir as necessidades para o crescimento da população microbiana
(SATTER & SLYTER, 1974). Sendo que as bactérias celulolíticas são capazes de
utilizar N-NH
3
como fonte de nitrogênio para a síntese de proteína microbiana.
As médias da concentração total e de AGCC apresentam-se na Tabela 3.
Observou-se menor concentração total de AGCC no tratamento com monensina
(Figura 3), no entanto, houve maior concentração de ácido propiônico e menor
relação acético:propiônico, efeito que coincide com o maior valor de pH (6,81)
observado neste trabalho, e que conforme descrito por ZHEN-HU et al. (2004),
valores de pH 6,8 além de outros fatores favorecem a produção de ácido
propiônico. Assim, mudanças moderadas de pH regulam a afinidade das
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14
Horas após alimentação
Concentração de N-NH3 (mg/dL)
LAA
Monensina
Controle
30
bactérias ao substrato favorecendo um grupo específico de bactérias (ALLEN &
MERTENS, 1988) e permitindo maior degradação da fibra (BERGEN & BATES,
1984).
Figura 3 – Valores médios da concentração total de AGCC antes (0) e 2, 4, 8 e
12h após alimentação, de bovinos recebendo dieta com e sem aditivos
Além disso, tem sido estabelecido que a monensina aumenta a população
de Selenomonas, Succinomonas, Megasphaera e Veillonella (CHEN & WOLIN,
1979), assim aumentam a produção de ácido propiônico. No entanto, o
predomínio na concentração de acetato observado neste trabalho mostra que
quando a dieta é rica em volumoso, a fermentação ruminal ocorre
preferencialmente por esta via.
Contagem de Protozoários
O valor médio da população de protozoários são apresentados na Tabela
4. Diferença significativa (P<0,05) na população total de protozoários evidenciou-
se no tratamento com LAA, quando comparado com monensina, embora estes
valores não tenham diferido do controle.
30
60
90
120
0 2 4 6 8 10 12 14
Horas após alimentação
Concentração total de AGCC
(mmol/L)
LAA
Monensina
Controle
31
Tabela 4
-
Contagem de protozoários de bovinos recebendo dieta com e sem aditivos
Tratamentos
1
Protozoários
(N° x 10
3
mL
-1
)
LAA Monensina Controle
CV (%)
Entodinium 628,08 516,56 442,8 22,19
Diplodiniinae 287,5 234,39 217,95 29,40
Isotricha 109,40 88,28 134,72 37,96
Dasytricha 115,55
AB
80,78
B
128,38
A
23,29
Charonina 166,86 126,22 117,01 34,13
Total 706,49
A
531,82
B
632,60
AB
13,80
1
LAA =complexo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos
CV= Coeficiente de variação.
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes, nas linhas, diferem estatisticamente pelo
teste de Tukey (P<0,05).
O menor número de protozoários associado ao efeito da monensina pode
ser ocasionado pela instabilidade da membrana celular conduzindo à morte
BERGEN & BATES (1984). No entanto, a população de protozoários não
decresceu de maneira significativa.
Assim, neste trabalho evidenciou-se que a digestibilidade da dieta não
aumentou pelo uso de aditivos como esperado, além disso, o pH foi favorável
para manter a atividade dos protozoários sugerindo que se houve acréscimo da
população bacteriana não foi evidente pela possível predação por parte dos
protozoários.
4 Conclusões
A suplementação com monensina influiu no menor consumo de matéria
seca e dos nutrientes, na maior formação de ácido propiônico e na menor
população de protozoários. Não foram evidentes os efeitos dos aditivos na
digestibilidade da dieta. O pH e o nitrogênio amoniacal permaneceram na faixa
ideal para manter a atividade dos microrganismos ruminais.
32
CAPÍTULO 3 – ESTIMATIVA
IN VITRO
DA PRODUÇÃO DE GÁS METANO,
USANDO ADITIVOS EM UM SUBSTRATO COMPOSTO POR VOLUMOSO E
CONCENTRADO.
Resumo -
Estimou-se a produção de metano ao adicionar monensina ou um
complexo contendo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos (LAA)
no substrato composto por feno Tifton 85 e concentrado, usando a técnica de
produção de gases in vitro. Os tratamentos consistiram na adição de 0,1875 mg
dos aditivos: LAA, monensina ou caulin (usado como controle) em 300 mg do
substrato base composto por feno Tifton 85 e concentrado na relação 80:20. Para
a obtenção do inóculo foram adaptados três bovinos, anelorados, com feno de
Tifton 85 e concentrado na relação 80:20. Foram realizadas três incubações, cada
uma com 24 horas de duração. Os períodos de leitura, registro e amostragem dos
gases produzidos foram às 9, 12 e 24 horas. Amostras dos gases foram usadas
para leitura de metano. Às 24 horas de incubação, amostras da fase líquida foram
coletadas para determinação da concentração de ácidos graxos de cadeia curta.
O delineamento experimental foi em blocos ao acaso com parcelas subdivididas,
sendo as parcelas os tratamentos, distribuídos ao acaso com três repetições e
nas sub-parcelas o tempo de leitura do volume de gases totais e de metano. O
volume de gases produzido foi similar entre tratamentos. Não houve efeito do LAA
e de monensina na produção de metano.
Palavras-chave: aditivos, bovinos, metano, produção de gases in vitro.
33
1 Introdução
Atualmente, o metano (CH
4
), gás derivado de atividades naturais e
antrópicas, é considerado gás de efeito estufa, junto com outros gases como o
dióxido de carbono e óxido nitroso, apresentando acréscimo na concentração
nos últimos 150 anos (IPCC, 2001). Portanto, há interesse mundial na redução
da emissão destes gases nos próximos anos, para mitigar a mudança no clima e
as conseqüências desta.
A pecuária, considerada como uma fonte antrópica na produção de CH
4
,
apresenta variações na intensidade de emissão associada a fatores tais como tipo
de animal, nível no consumo de alimento e grau de digestibilidade das dietas
fornecidas (JOHNSON & JOHNSON, 1995). Além disso, nos sistemas de
produção de carne e leite, a emissão de CH
4
representa perda de energia
metabolizável refletida em menor produtividade. Seria importante aumentar a
eficiência na utilização dos nutrientes no rúmen, principalmente a energia, para
atingir maior produção por unidade de alimento consumido e simultaneamente
contribuir com o decréscimo de CH
4
(GETACHEW et al., 2005).
O CH
4
é mais intensamente produzido quando fornecidas dietas fibrosas,
sendo o produto da fermentação o ácido acético ou butírico (WOLIN, 1960 citado
por BLÜMMEL et al., 2005). Durante a síntese de ácido acético e ácido butírico é
produzido hidrogênio, usado pelas bactérias metanogênicas para formar CH
4
,
para posterior liberação do rúmen (BAKER, 1999).
O uso de aditivos é uma alternativa para melhorar a digestibilidade dos
alimentos fibrosos. Efeitos dos ionóforos como monensina no metabolismo
ruminal têm sido associados ao decréscimo na população de bactérias gram
positivas e a menor produção de CH
4
(BERGEN & BATES, 1984). De outra parte,
aumento na população bacteriana e na digestibilidade têm sido demonstradas
quando suplementadas as dietas com leveduras (CHAUCHEYRAS et al., 1995;
ERASMUS et al., 2005). Adicionalmente, decréscimo na produção de CH
4
tem
34
sido observado quando usados ácidos graxos poliinsaturados, ao serem
saturados com hidrogênio livre, limitando o substrato para as bactérias
metanogênicas (CZERKAWISKI et al., 1966; BROUDISCOU et al., 1994).
Assim, os aditivos apresentam-se como uma alternativa viável para
aumentar a eficiência do metabolismo ruminal e para reduzir a emissão de CH
4
.
No entanto, para determinar a eficiência do metabolismo ruminal e estimar a
produção de CH
4
, é importante o uso de técnicas laboratoriais confiáveis e
reproduzíveis. No percorrer do tempo, diversas pesquisas visando buscar
técnicas para avaliar a digestibilidade dos alimentos foram desenvolvidas.
A técnica de “produção de gases in vitro”, tem demonstrado ser uma
opção viável e confiável na avaliação do valor nutritivo e digestibilidade dos
alimentos usados nas dietas e para estimar a produção de CH
4
(RYMER et al.,
2005)
A técnica foi reportada a primeira vez em 1953 por MCBEE & HUNGATE
citados por RYMER et al. (2005), que mensuraram os gases produzidos ao
incubar o alimento em banho-maria, e avaliaram o potencial de degradação no
rúmen. A partir daí, diversas metodologias foram desenvolvidas durante vários
anos e atualmente são aceitas e aplicadas na pesquisa (THEODOROU et al.,
1994; MAURICIO et al., 1999; RYMER et al., 2005).
A metodologia de THEODOROU et al. (1994), tem sido avaliada como
versátil, permitindo trabalhar simultaneamente com um número indeterminado de
amostras. O princípio está baseado na mensuração dos gases produzidos pela
fermentação dos componentes solúveis e não solúveis do substrato, incubado em
frascos de vidro sob condições que simulam o rúmen (temperatura, pH,
anaerobiose). A pressão interna dos frascos é registrada em tempos
predeterminados, usando um transdutor de pressão semi-automático. O resultado
é obtido da regressão do volume de gás produzido no tempo de incubação
(THEODOROU et al., 1994). Os gases produzidos podem ser um indicador da
digestibilidade aparente do alimento no rúmen (BLÜMMEL & ØRSKOV, 1994).
35
Na estimativa de CH
4
a técnica de produção de gases in vitro tem
apresentando resultados confiáveis quando comparada com técnicas in vivo como
a calorimetria respiratória (BLÜMMEL et al., 2005). Além disso, apresenta
vantagens tais como o maior controle sobre as condições experimentais e o
menor tempo experimental (FONDEVILLA & BARRIOS, 2001). Vários estudos
para estimar a produção de CH
4
, usando a técnica têm sido descritos,
demonstrando aplicabilidade (MOHAMMED et al., 2004; BLÜMMEL et al., 2005;
GETACHEW et al., 2005; UNGERFELD et al., 2005).
O presente estudo teve como objetivo estimar a produção de metano ao
adicionar monensina ou um complexo contendo leveduras, ácidos graxos
poliinsaturados e aminoácidos no substrato incubado, usando a técnica de
produção de gases in vitro.
2 Material e métodos
O trabalho foi desenvolvido o Laboratório de Nutrição Animal (LANA) e no
Laboratório do Departamento de Engenharia Rural da Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (UNESP).
Foi estimada a produção de gás metano avaliando o efeito do complexo de
leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos (LAA) (Tabela 1) ou de
monensina no substrato composto por feno Tifton 85 e concentrado, usando a
técnica de produção de gases in vitro, de acordo com a metodologia de
THEODOROU et al. (1994) e modificada por MAURICIO et al. (1999).
Os tratamentos consistiram na adição de 0,1875mg de LAA ou monensina
ou caulim (usado como controle) em 300mg do substrato base composto de feno
de Tifton 85 e concentrado, em uma relação 80:20. Cada tratamento foi incubado
em frascos de vidro (100mL) com três repetições, e uma réplica por repetição,
além disso, foram usados três brancos e um substrato padrão, para um total de
36
22 frascos incubados. Foram realizadas três incubações, cada uma com 24 horas
de duração. Amostras dos gases produzidos foram registradas e coletadas nos
períodos 9, 12 e 24 horas.
Tabela 1.Composição do complexo de leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e
aminoácidos, conforme níveis de garantia fornecido pelo fabricante.
Ácido Oléico 12 mg*
Ácido Linoléico 12.000 mg
Metionina 2.400 mg
Lisina 11.400 mg
Tirosina 4.850 mg
Crômio 285 mg
Probiótico (Leveduras) 0,3 x 10
8
UFC **
* mg kg
-1
, ** UFC unidades formadoras de colônia
Amostras do feno de Tifton 85 (Cynodon Spp.) e do concentrado foram
tomadas para posterior avaliação da composição química, no Laboratório de
Nutrição Animal (LANA). As amostras pré-secas foram utilizadas na
determinação do conteúdo de matéria seca (MS), matéria mineral (MM), proteína
bruta (PB) de acordo com AOAC (1990), e fibra em detergente neutro (FDN) e
fibra em detergente ácido (FDA), segundo VAN SOEST et al. (1991). A energia
bruta (EB) foi determinada em bomba calorimétrica adiabática PARR Instruments.
Para a produção de gases in vitro foi usada a metodologia de
THEODOROU et al. (1994) modificada por MAURICIO et al. (1999). No dia
anterior de cada incubação foi preparado o meio de cultura (Apêndice A1)
composto por: solução de macrominerais; solução de microminerais; solução
tampão; solução de resarzurina; meio “B” e água destilada. O meio foi preparado
sob fluxo contínuo de CO
2
e após do preparo foi mantido em estufa a 39ºC.
Previamente, amostras do feno Tifton 85 (240mg) e de concentrado (60mg)
foram pesadas e colocadas em cada frasco, posteriormente foram mantidas em
37
estufa a 39ºC. O dia da incubação os frascos foram retirados da estufa e foram
adicionados 30mL de meio de cultura, 15mL de inóculo e o aditivo correspondente
ao tratamento. Foi mantido o um espaço livre de 55mL para o acúmulo dos gases
produzidos. Após o pré-enchimento dos frascos, foram injetados com CO
2
,
vedados com rolhas de borracha e selados com anilhas de alumínio e incubados
em estufa a 39ºC durante 24 horas. Foram usados três brancos e um substrato
padrão.
Para a obtenção do inóculo foram usados como doadores do líquido
ruminal três novilhos anelorados, castrados, canulados no rúmen, com peso
corporal médio de 278 kg e idade média de 24 meses, adaptados durante 10 dias
à dieta com volumoso (feno Tifton 85) e concentrado na relação 80:20,
balanceada para atender as exigências de mantença dos animais (NRC, 1996). O
conteúdo ruminal foi coletado nas primeiras horas da manhã, antes de ser
fornecido o alimento. Após a retirada uma porção de conteúdo do rúmen, foi
filtrado em duas camadas de gaze para separar a fase sólida da fase liquida,
sendo armazenadas em garrafas térmicas, previamente aquecidas, para serem
transportadas ao laboratório no menor tempo possível.
No laboratório, 50% da fase sólida e 50 % da fase líquida foram misturadas
em liquidificador durante 15 segundos, posteriormente o inóculo foi filtrado em
gaze e colocado em bequer ao banho maria a 39ºC e gasificado com CO
2
até ser
colocado em cada frasco.
Durante cada período de incubação, leituras de pressão (psi = pressão por
polegada quadrada) originadas dos gases acumulados no espaço livre do frasco
foram registradas no transdutor de pressão PressDATA 800 ®. O transdutor foi
conectado a uma válvula de três saídas. A primeira saída foi conectada ao
transdutor de pressão, a segunda à agulha Nº 22 para ser introduzida na tampa
de borracha do frasco e a terceira a uma seringa plástica para mensurar o
volume. Os períodos de leitura foram 9, 12 e 24 horas. Em cada período,
amostras de gás foram coletadas na seringa acoplada à válvula e posteriormente
transvazadas a tubos de vacutainer de 5mL sem aditivo, para serem analisadas
38
no Laboratório de Biomassa e Biodigestão Anaeróbia do Departamento de
Engenharia Rural da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da
Universidade Estadual Paulista (UNESP).
Após amostragem, os gases acumulados foram liberados e a pressão
interna foi zerada. As leituras de pressão registradas foram usadas para calcular o
volume de gás produzido. Às 24 horas de incubação, amostras de 3mL foram
coletadas de cada frasco e congeladas para posterior determinação da
concentração de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC).
A leitura de CH
4
foi realizada em cromatógrafo de fase gasosa Finigan GC-
2001, equipado com as colunas Porapack Q e Peneira Molecular e detector de
condutividade térmica.
Para determinar a concentração de AGCC, as amostras foram
descongeladas e centrifugadas a 10.000g durante 15 minutos, aliquotas de 1mL
foram tratadas com acido fórmico 88%, para protonar os ácidos associados e
garantir a volatilização dos AGCC no injetor do cromatógrafo. Amostras de 1µm
foram analisadas em cromatógrafo a gás (CG 270) com detector de ionização de
chama, empregando coluna capilar empacotada (4% CW 20M Carbopack B-DA,
2.0 m x 1/8 “).
O delineamento experimental foi em blocos ao acaso com parcelas
subdivididas, tendo nas parcelas os tratamentos distribuídos ao acaso com três
repetições e nas sub-parcelas o tempo de leitura do volume de gases totais e de
metano. As análises de variância foram realizadas utilizando o procedimento GLM
do programa SAS
®
(LITTELL et al., 2002), e em caso de diferenças significativas
(P< 0,05) as médias foram comparadas pelo teste de Tukey.
39
3 Resultados e discussão
Produção de gases
Os resultados de produção de gases e de CH
4
são apresentados na
Tabela 2.
Tabela 2 - Valores médios do volume de gases totais e de metano (CH
4
), produzidos por grama
de matéria seca (MS) incubada com e sem aditivos.
Tratamentos
1
Volume de gás
(mL g
-1
MS)
LAA Monensina Controle
CV(%)
Total
62,33
61,67
63,05
17,48
CH
4
21,04 22,29 23,78 31,87
1
LAA =complexo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos
CV= Coeficiente de variação.
A produção total de gases e de metano não foi estatisticamente
significativo. Observou-se curva de produção de gases similar entre tratamentos
durante o período de incubação (Figura 1), indicando que o padrão de
fermentação não diferiu.
40
Figura 1- Produção de gás obtida pela incubação do substrato e aditivos durante 24 horas.
Observou-se que nos horários 9 e 12 de incubação houve acréscimo na
produção de gases, devido ao acúmulo do gás indireto produto da reação entre o
tampão e o ácido propiônico gerado da fermentação dos carboidratos
rapidamente degradáveis e o gás indireto que começa ser porduzido ao serem
degradados os carboidratos estruturais. CHAI et al. (2004) sugeriram que, os
gases produzidos nas três primeiras horas de incubação correspondem à
fermentação dos componentes solúveis. Na medida que o tempo de incubação
aumenta, o volume de gases produzido é maior, efeito da fermentação de
carboidratos estruturais do substrato (THEODOROU et al., 1994). O padrão de
fermentação entre tratamentos foi similar, sendo que, a curva de produção de
gases corresponde ao padrão de fermentação para um substrato com predomínio
de volumoso como descrito por GETACHEW et al. (2004), onde inicialmente são
fermentados os açúcares e posteriormente os componentes estruturais. Assim, a
taxa de produção e o volume total de gases, são correlacionados à composição
química do substrato.
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Horas de incubação
Volume de gases (mL/g MS)
LAA
Monensina
Controle
41
O volume de CH
4
foi similar entre tratamentos durante o período de
incubação (Figura 2).
Figura 2- Produção de CH
4
obtida da incubação do substrato e aditivos durante 24 horas.
Não houve efeito dos aditivos na produção de CH
4.
Observou-se menor
volume de CH
4
no período de 9 a 12 horas após incubação do substrato, período
no qual há menor produção de H
2
, devido à maior produção de propionato,
portanto o acúmulo de gases corresponde em parte ao gás indireto ou gás que é
gerado ao reagir o bicarbonato de sódio com o propionato e assim manter o pH
do meio onde está sendo fermentado o substrato. A maior produção de
propionato concorre diretamente com a produção de CH
4
, ou seja, quanto maior a
produção de acido propiônico, menor a produção de CH
4
(JOHNSON &
JOHNSON, 1995). O acréscimo linear no volume de CH
4,
a partir das 12 horas até
o período final de incubação, associa-se à fermentação dos carboidratos
estruturais e consequentemente à produção de ácido acético e butírico.
Estudos in vitro, têm demonstrado produção de CH
4
de 33 mL g
-1
MS, com
acréscimo ao aumentar o teor de FDN (GETACHEW et al., 2005). Neste estudo
os valores observados foram menores e sem diferir entre tratamentos. Sabe-se
10
15
20
25
30
35
40
45
3 6 9 12 15 18 21 24 27
Horas de incubação
Volume de CH4 (mL/g MS)
LAA
Monensina
Controle
42
que quando maior o teor de fibra de um ingrediente maior será a porcentagem de
CH
4
liberado.
Relacionando o gás produzido com o CH
4
observa-se acréscimo de volume
a partir do horário 12 de incubação, e que de acordo com FONDEVILA &
BARRIOS (2001), corresponde à somatória do gás direto e indireto, sendo maior
o indireto. O gás direto, produto da decarboxilação oxidativa do piruvato e o
indireto produto da reação entre o tampão e os AGCC para manter o pH do meio.
E como descrito anteriormente, a maior produção de gases está correlacionado à
formação de ácido acético e butírico.
Concentração de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC)
A concentração média dos ácidos graxos de cadeia curta são apresentados
na Tabela 3. A concentração de AGCC não foi estatisticamente significativa. No
entanto, têm sido estabelecido que às 24 horas de incubação, o substrato produz
a maior quantidade de AGCC, associado à fermentação dos carboidratos do
substrato (GETACHEW et al., 2004).
Tabela 3 - Concentração de AGCC (mmol L
-1
) às 24 h de incubação do substrato com e
sem
aditivos
Tratamentos
1
Concentração de AGCC
(mmol L
-1
)
LAA Monensina
Controle
CV (%)
Total 77,26 78,54 78,73 6,98
Acético 56,34 56,16 57,12 7,00
Propiônico 13,12 14,29 13,36 10,28
Butírico 7,79 8,08 8,25 9,1
1
LAA =complexo leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos
CV= Coeficiente de variação.
Neste trabalho, a concentração de ácido acético foi numericamente maior,
mostrando a correlação para um substrato com 80% de volumoso, no entanto
esperava-se maior produção de AGCC totais efeito dos aditivos.
43
Esperava-se que os aditivos agissem sobre a microbiota para favorecer a
produção de ácido propiônico e, porém decrescesse a produção de CH
4
. No
entanto verificou-se que as condições foram favoráveis para fermentação do
substrato ao evidenciar produção de gases e de AGCC. Sugere-se realizar mais
estudos usando a técnica de produção de gases in vitro para estimar CH
4
,
avaliando outros substratos, proporções de inóculo e concentração dos aditivos.
4 Conclusões
A produção de metano não foi alterada adicionando o complexo de
leveduras, ácidos graxos poliinsaturados e aminoácidos e de monensina no
substrato incubado.
CAPITULO IV. IMPLICAÇÕES
O desenvolvimento de estratégias como o uso de aditivos alimentares nas
dietas para melhorar a digestibilidade, principalmente daquelas baseadas em
volumosos, são importantes para aumentar a eficiência no aproveitamento da
energia e diminuir a emissão de metano. A preocupação mundial pelo
aquecimento da terra, como consequência da emissão de gases de efeito estufa
como o metano, têm motivado aos países comprometidos com a proteção do
meio ambiente, a criar programas orientados a uma produção sustentável.
Adicionalmente, considerando a participação do Brasil no mercados externo de
produtos como a carne, induz a produzir para suprir as necessidades e as
exigências de consumidores, principalmente da Comunidade Econômica Européia
que optam por produtos orgânicos, ao serem saudáveis e produzidos sem
detrimento do meio ambiente
44
Dessa forma, pesquisas na área de nutrição de ruminantes que conduzam
a maior eficiência na produção de carne e de leite, à menor emissão de metano e
à conservação do meio ambiente devem ser de relevência. Assim, o uso de
técnicas como a produção de gases in vitro é uma alternativa na pesquisa, que
pode ser correlacionada e/ou associada a experimentos in vivo, para avaliar os
alimentos usados nas dietas e assim determinar a eficiência na produção e o
impacto ambiental.
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APÊNDICE
Apêndice 1-
Composição do meio de cultura para produção de gases in vitro
Ingredientes Quantidades (g L
-1
)
Solução de macrominerais
CaCl
2
2H
2
O 132,00
MnCl
2
4H
2
O 100,00
CoCl
2
6H
2
O 10,00
FeCoCl
2
6H
2
O
80,00
Solução de microminerais
Na
2
HPO
4
3,75
KH
2
HPO
4
3,32
MgSO
4
7H
2
O 0,60
56
Solução tampão
NH
4
HCO
3
4,00
Na HCO
3
35,00
Resarzurina
0,10
Meio B
Cysteine HCl 625,00
NaOH 1M 4,00
Na
2
SO
3
328,13
água destilada 95,00
Livros Grátis
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