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UFSM
Dissertação de Mestrado
CONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO DE EMBRIÕES
BOVINOS COM ETILENOGLICOL ASSOCIADO OU NÃO A
TREALOSE
_____________________________________________
Luiz Fernando Cáceres Pilla
PPGMV
Santa Maria, RS, Brasil
2005
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ii
CONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO DE EMBRIÕES
BOVINOS COM ETILENOGLICOL ASSOCIADO OU NÃO A
TREALOSE
_____________________________________________
Por
Luiz Fernando Cáceres Pilla
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do programa
de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de
concentração em Fisiopatologia da Reprodução, da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Medicina Veterinária.
PPGMV
Santa Maria, RS, Brasil
2005
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iii
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, Abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
CONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO DE EMBRIÕES
BOVINOS COM ETILENOGLICOL ASSOCIADO OU
NÃO A TREALOSE
elaborada por
Luiz Fernando Cáceres Pilla
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
____________________________
Mara Iolanda Batistella Rubin
(Presidente/ Orientadora)
____________________________
Alceu Mezzalira
___________________________
Maria Gabriela Tavares Rheingantz
Santa Maria, 24 de fevereiro de 2005.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais pelo total apoio que recebi na execução
desse trabalho. Pelo carinho e compreensão nos momentos difíceis.
Vocês que se dedicaram junto comigo, muito obrigado!
À Profª. Drª. Mara Rubin, minha orientadora, pelos ensinamentos e
pelo imensurável auxílio na elaboração e execução desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Carlos Antonio Mondino Silva, pela orientação e
execução desse trabalho, bem como pela gentileza ao ceder as doadoras
para o presente experimento.
Aos veterinários Cyro da Porciúncula Dias da Costa e Fabrício
Desconsi Mozzaquatro, que tiveram participação decisiva nesse trabalho.
À Profª Drª. Mari Lourdes Bernardi, pelo constante apoio e
sugestões na elaboração da dissertação.
Aos colegas do Embryolab, estagiários e pós-graduandos, em
especial ao Juliano Calegari e Márcia V. dos Santos, que fizeram mais do
que o trivial. Sem vocês eu não teria alcançado esse objetivo. Muito
Obrigado!
Aos funcionários da Fazenda Invernada Grande, em especial ao
Sr. Roni Bitencourt, que ultrapassaram suas obrigações diárias para que
todo o trabalho transcorresse adequadamente. Muito Obrigado!
Ao CNPq pela bolsa de estudos.
À OURO FINO SAÚDE ANIMAL pela cedência de parte das
prostaglandinas utilizadas no experimento.
v
SUMÁRIO
FOLHA DE ROSTO.............................................................. ii
FOLHA DE APROVAÇÃO................................................... iii
AGRADECIMENTOS........................................................... iv
SUMÁRIO............................................................................. v
LISTA DE TABELAS............................................................ vi
RESUMO.............................................................................. vii
ABSTRACT.......................................................................... viii
1. INTRODUÇÃO.................................................................. 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................. 3
3. CAPÍTULO 1. Congelamento ultra-rápido de embriões
bovinos com etilenoglicol associado ou não a trealose
..........................................................................
7
1.1 Resumo.......................................................................... 8
1.2 Abstract.......................................................................... 8
1.3 Introdução...................................................................... 9
1.4 Material e Método.......................................................... 10
1.5 Resultados e discussão............................................... 13
1.6 Referências.................................................................... 16
4. CONCLUSÕES................................................................. 21
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................. 22
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Índice de prenhez por ultra-sonografia, aos 28 dias, de
embriões bovinos produzidos in vivo e congelados
pelo método ultra-rápido...............................................
13
Tabela 2.
Prenhez de acordo com o estádio de desenvolvimento
dos embriões bovinos produzidos in vivo e congelados
pelo método ultra-rápido............................
14
vii
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
CONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO DE EMBRIÕES
BOVINOS COM ETILENOGLICOL ASSOCIADO OU NÃO A
TREALOSE.
AUTOR: Luiz Fernando Cáceres Pilla
Orientadora: Mara Iolanda Batistella Rubin
Santa Maria, 24 de fevereiro de 2005.
A criopreservação tem fundamental importância na armazenagem,
transporte, controle sanitário e comércio de embriões. O método de
congelamento rápido convencional de embriões bovinos ainda apresenta
entraves como o tempo de execução e o alto valor comercial do
equipamento. Com a finalidade de minimizar tempo de congelamento e os
custos, avaliou-se o efeito da trealose no congelamento ultra-rápido de
embriões bovinos com etilenoglicol. Noventa e sete (n=97) embriões
bovinos produzidos in vivo foram congelados pelo método ultra-rápido
com 3,0M de etilenoglicol e 3,0M de etilenoglicol + 0,3M de trealose. Os
embriões foram distribuídos aleatóriamente em dois tratamentos. No
tratamento 1 (T1) quarenta e seis (n= 46) embriões foram expostos à
solução de 3,0M de etilenoglicol em solução de manutenção
Emcare(ICP) e cinqüenta e um (n= 51) embriões foram congelados com
3,0M de etilenoglicol associado a 0,3M de trealose em solução de
manutenção Emcare. Os embriões foram mantidos na solução de
congelamento por 2 minutos, envasados em palhetas de 025cc, expostos
ao vapor de nitrogênio por 20 segundos e submersos no nitrogênio
líquido. Após o descongelamento, os embriões foram transferidos para
receptoras previamente sincronizadas, resultando aos 28 dias, em 7
(15,21%) gestações no T1 e 7 (13,72%) no T2. Não houve diferença
(P>0,05) entre os tratamentos. O acréscimo de trealose ao etilenoglicol
mostrou-se viável para a transferência direta dos embriões, porém o
índice de concepção obtido ainda não permite sua indicação no
congelamento comercial de embriões bovinos.
Palavras-chave: Congelamento, ultra-rápido, embriões bovinos,
transferência direta.
viii
ABSTRACT
Master’s Dissertation in Veterinary Medicine
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brazil.
ULTRA-RAPID FREEZING OF BOVINE EMBRYOS WITH ETHYLENE
GLYCOL WITH OR WITHOUT TREHALOSE.
Author: Luiz Fernando Cáceres Pilla
Adviser: Mara Iolanda Batistella Rubin
Santa Maria February 24, 2005.
Cryopreservation is currently the universal method for embryo storage,
transport, sanitary control and trading. The conventional bovine embryo
freezing method still has some drawbacks such as the freezing period and
costs of the freezing equipment. In order to decrease costs and time, the
effect of thealose on ultra-rapid freezing with ethylene glycol was
evaluated. Ninety seven in vivo produced bovine embryos were randomly
distributed in two treatments for ultra-rápid deep freezing with 3.M
ethylene glycol (T1; n= 46) and 3.M ethylene glycol + 0.3M trehalose (T2;
n= 51). In T1, embryos were exposed to a 3.0M ethylene glycol in
Emcare (ICP) holding media and in T2 to a 3.0M ethylene glycol plus
0.3M trehalose in Emcare holding media. Embryos of both treatments
were kept for 2 minutes in the freezing solutions; loaded in 0,25cc straws
and there after they were exposed to N
2
vapor during 20 seconds to be
plunged immediately into liquid nitrogen. After thawing, embryos were
transferred to previously synchronized recipients resulting at 28 days in 7
(15.21%) pregnancies in T1 and also 7 (13.72%) in T2. No significant
difference was detected between treatments (P>0.05). The trehalose and
ethylene glycol solution is suitable for direct transfer of bovine embryos.
However, the conception rate obtained in this study do not allow its
indication for commercial embryo freezing.
Key Words: freezing, ultra-rapid, bovine embryos, direct transfer.
1. INTRODUÇÃO
Nos programas de transferência de embriões (TE), a
criopreservação tem fundamental importância na armazenagem,
transporte, controle sanitário e comércio de embriões.
A experiência alcançada em pesquisas com o congelamento ultra-
rápido de embriões de ratos (CHUPIN & DE REVIERS, 1986) e
camundongos (RAYOS et al., 1992; BERNARDI et al, 1990/1992,
MEZZALIRA & RUBIN, 1992), permitiu que protocolos similares de
criopreservação fossem aplicados para embriões bovinos produzidos in
vivo.
No procedimento rápido (convencional) de congelamento, a
velocidade do abaixamento da temperatura é um fator importante (LEIBO
et al., 1978; LEIBO & MAZUR, 1978; LEIBO, 1989). Este método de
congelamento apresenta entraves como o tempo de execução do
procedimento e o alto valor comercial do equipamento de congelamento.
Nos casos do uso do glicerol 1,5M, necessita-se controle pós-
descongelamento sob estereomicroscópico em placas de Petri, além do
tempo para a rehidratação dos embriões.
O método de congelamento convencional em bovinos teve um
importante avanço com o uso do etilenoglicol (EG) na concentração de
1,8M (SUZUKI et al., 1993) para embriões produzidos in vitro; 1,5M
(VOELKEL & HU, 1992) e 1,8M (DOCHI, 1995); ou 1,5M e 1,8M
(McINTOCH & HAZELEGER, 1994) para embriões produzidos in vivo. O
EG possui alta permeabilidade e baixa toxicidade permitindo a
transferência direta, sem a necessidade do descongelamento em etapas,
2
simplificando a metodologia nos programas comerciais de transferência
de embriões.
A trealose é um dissacarídeo formado por 1,1 ligação de duas
moléculas de D-glucose (BIRCH, 1963), encontrada numa variedade de
organismos biológicos (BIRCH, 1963; ELBEIN, 1974) e que preserva a
estrutura e funcionalidade das membranas durante desidratação
(RUDOLPH & CROWE, 1985).
A literatura mundial referente ao congelamento pelo método ultra-
rápido de embriões bovinos produzidos in vivo é extremamente escassa
(CHUPIN, 1986/1987; BERNARDI et al., 1991; MEZZALIRA et al., 1996;
ALMEIDA, 2001)., principalmente pelo custo elevado dos programas de
superovulação e sincronização das receptoras. Já ALMEIDA (2001)
obteve 40% de prenhez com embriões produzidos in vivo congelados com
3,0M de etilenoglicol associado a 0,3M de trealose, porém com reduzido
número de embriões transferidos (2/5). A eficiência do método permanece
na dependência da continuidade do estudo e incremento no número de
embriões transferidos.
Assim, avaliou-se o efeito da solução de 3,0M de etilenoglicol
associado ou não a 0,3M de trealose, em meio de manutenção ECHM-
100 Emcare, no congelamento ultra-rápido de embriões bovinos
produzidos in vivo sobre a taxa de concepção.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Na criopreservação de embriões, busca-se manter em inércia o
metabolismo, tornando viável a conservação celular em temperaturas
extremamente baixas por um período de tempo indeterminado (RALL,
1992). No processo de congelamento, os embriões devem ser
transferidos de uma solução isotônica para uma solução hipertônica,
crioprotetora. Em conseqüência do gradiente de pressão osmótica, ocorre
a saída de água do interior celular para que ocorra o equilíbrio osmótico.
A redução do tamanho das células ocorre quando o equilíbrio é refeito,
entre a saída de água e a entrada do crioprotetor (GORDON, 1994).
A água é o principal constituinte celular e uma adequada
desidratação é importante para que não ocorra formação de grandes
cristais de gelo, bem como para prevenir a excessiva concentração de
solutos intracelulares (MAZUR et al., 1972). Já o choque osmótico pode
ocorrer se o crioprotetor intracelular que entrou na célula embrionária não
pode difundir-se para o meio extracelular rapidamente, como
conseqüência, ocorre o edemaciamento excessivo após a exposição ao
meio isotônico ou ao útero da receptora (DOCHI et al., 1995).
O congelamento utilizado para embriões bovinos é um processo
lento controlado (VAN WAGTENDONK DE LEEUW et al., 1995). Nesse
sistema, a velocidade de congelamento é inferior a 1°C/minuto e permite
a desidratação progressiva das células (WHITTINGHAM, 1972; WILMUT
& ROWSON, 1973; LEHN-JENSEN, 1980). Com a indução da
cristalização entre -5 a -7°C, o processo de desidratação é iniciado,
procedimento este que evita o super-resfriamento (LEIBO et al., 1978;
LEIBO & MAZUR, 1978; LEIBO, 1989) e, conseqüentemente, a formação
de gelo intracelular (SCHNEIDER, 1986).
No processo de congelamento ultra-rápido não há a necessidade de
um abaixamento lento da temperatura, pois a desidratação ocorre
4
osmoticamente durante o tempo de equilíbrio (RENARD et al., 1984;
LANGIS & STEPONKUS, 1990), devido a maior concentração dos
crioprotetores, que são responsáveis pela menor formação de cristais de
gelo intracelular (TAKEDA et al., 1984; RALL, 1987).
As soluções crioprotetoras são solutos orgânicos que protegem as
organelas celulares durante o congelamento (HOTAMISLIGIL et al.,
1996). Segundo WOLFE & BRYANT (1999), os solutos podem ser
classificados em três grandes categorias: (1) sais, (2) açúcares e outras
moléculas de médio tamanho e em (3) macromoléculas. A sobrevivência
dos embriões depende do tipo de crioprotetor, da espécie e da idade de
desenvolvimento, bem como do tipo de embrião produzido (in vivo ou in
vitro). A toxicidade dos crioprotetores é proporcional ao aumento da
concentração e ao tempo de exposição dos embriões aos mesmos, este
fato é mais evidente em função da alta concentração requerida nos
protocolos para vitrificação (HOTAMISLIGIL et al., 1996). Os
crioprotetores são também diferenciados pela sua atividade intra- e
extracelular. Aqueles com ação intracelular são representados
principalmente pelo glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) e etilenoglicol. Como
substâncias não permeáveis à célula pode-se citar as proteínas (albumina
sérica bovina), os açúcares (sacarose, lactose e trealose, entre outros) e
o ácido hialurônico (glicosaminoglicano).
Os açúcares são freqüentemente utilizados na criopreservação,
tornando-se um importante componente do tampão osmótico.
Usualmente, os dissacarídeos são usados para o congelamento e
descongelamento de embriões e oócitos (KULESHOVA et al., 1999).
Segundo SCHNEIDER & MAZUR (1984) a sacarose atua como uma
contraforça osmótica para restringir o movimento de água através das
membranas. Se a sacarose está presente numa concentração isomolar, o
embrião não irá intumescer, mas irá retrair progressivamente como um
crioprotetor que deixa a célula.
5
A trealose foi utilizada em soluções crioprotetoras (KRAG et al.,
1985; SCHELLANDER et al, 1994; SAHA et al., 1996) por manter uma
alta pressão osmótica no meio extracelular durante a entrada e a remoção
do crioprotetor, desse modo são prevenidos o choque osmótico e a lise
celular. A desidratação é uma característica comum durante o processo
de congelamento de embriões ou sistemas biológicos e a água é
fundamental para manter a estabilidade da estrutura molecular, assim
como a formação das proteínas e lipídeos das membranas biológicas ou
de lipossomos (TANFORD, 1980; HVIDT & WESTH, 1992). Segundo
NICOLAJSEN & HVIDT (1994), a trealose em baixas concentrações
diminui a extensão dos danos aos lipossomos a temperaturas abaixo de -
15°C.
Duas pesquisas realizadas nesta década demonstraram que uma
pequena quantidade de trealose pode incrementar significativamente a
viabilidade de células de mamíferos, congeladas ou dissecadas (EROGLU
et al., 2000; GUO et al., 2000). Sua presença restringe o movimento de
água através das membranas, prevenindo a lise dos blastômeros na
difusão do crioprotetor para o espaço extracelular (MASSIP et al., 1987).
Os protocolos de congelamento ultra-rápido descritos até o momento
empregam soluções altamente concentradas de crioprotetores e açúcares
que induzem a desidratação rápida das células. Este fato permite a
imersão direta no vapor de nitrogênio ou no nitrogênio líquido
(SCHNEIDER & MAZUR, 1984; VAJTA et al., 1998).
O etilenoglicol por possuir baixo peso molecular, é um crioprotetor
efetivo para embriões bovinos, pela sua menor toxicidade associada a
uma rápida permeabilidade (FAHY et al., 1987), quando comparado com
o glicerol e propilenoglicol (VOELKEL & HU, 1992). Na década passada, o
etilenoglicol, que possui rápida difusão através da membrana celular
(SOMMERFELD & NIEMANN, 1999; KULESHOVA et al., 1999), passou a
ser utilizado comercialmente por permitir a transferência direta de
embriões bovinos.
6
O êxito obtido com congelamento ultra-rápido de embriões tem sido
inconstante e ainda carece de estudos. MEZZALIRA et al. (1996)
obtiveram 19,2% (5/26) de prenhez com a transferência de embriões
bovinos produzidos in vivo congelados pelo método ultra-rápido com 3,0M
de glicerol e 0,25M de sacarose em meio DPBSm (Dulbeccos phosphate-
buffered saline modified) Posteriormente, ALMEIDA (2001) alcançou 14%
(1/7); 40% (2/5) e 43% (3/7) de gestações congelando embriões bovinos
também pelo método ultra-rápido com 2,0M de EG e 0,3M trealose; 3,0M
de EG e 0,3M trealose e pelo método rápido (convencional) com 1,5M de
etilenoglicol em DPBSm, respectivamente.
MOZZAQUATRO (2004) expôs embriões bovinos produzidos in vitro
ao etilenoglicol 3,0M, acrescido ou não de diferentes concentrações (0,1,
0,3 e 0,5M) de trealose reidratando-os imediatamente. No estudo
nenhum efeito tóxico foi observado.
A uso do etilenoglicol (EG) possibilitou a transferência direta de
embriões bovinos obtendo índices de gestações entre 50 a 60%. O uso
deste método para oócitos associado ou não a carboidratos (SAHA &
SUZUKI, 1997; BAUTISTA & KANAGAWA, 1998; KULESHOVA et al.,
1999), tem despertado um interesse crescente para o comércio nacional e
internacional. Os equipamentos de congelamento à disposição no
mercado oferecem a praticidade necessária para a rotina comercial de
embriões bovinos, porém os mesmos ainda continuam tendo um custo
extremamente elevado.
7
3- Capítulo 1
CONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO DE EMBRIÕES
BOVINOS COM ETILENOGLICOL ASSOCIADO OU NÃO A
TREALOSE
(Ultra-rapid freezing of bovine embryos with ethylene glycol with or
without trehalose)
PILLA, L.F.C.
12
, MOZZAQUATRO, F.D.
2
, CALEGARI, J.
3
, SANTOS,
M.V.
3
, BERNARDI, M. L.
4
, SILVA, C.A.M.
5
, RUBIN, M.I.B
51
.
1
MV, Rua Visconde de Pelotas, 1623/301. 97015-140 Santa Maria RS.
2
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM/RS.
3
Bolsista de Iniciação Científica, UFSM/RS
4
Dept° de Zootecnia, Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre RS.
Brasil
5
DVM, Embryolab – Departamento de Clínica de Grandes Animais,
Centro de Ciências Rurais Universidade Federal de Santa Maria 97.105-
900 – Santa Maria RS. Brasil.
AGRADECIMENTOS
Á OURO FINO SAÚDE ANIMAL pelo fornecimento de
prostaglandinas, ao Prof. Carlos Augusto Mallmann do LAMIC/UFSM,
pelo constante apoio, ao Centro de Tecnologia Cruz de Pedra de
Uruguaiana/RS pela cedência das doadoras utilizadas nesse trabalho e
ao CNPq pela bolsa de estudos.
1
Autor para correspondência E-mail:
[email protected] ou [email protected]
8
CONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO DE EMBRIÕES BOVINOS COM
ETILENOGLICOL ASSOCIADO OU NÃO A TREALOSE
(Ultra-rapid freezing of bovine embryos with ethylene glycol with or without
trehalose)
RESUMO
A criopreservação tem fundamental importância na armazenagem,
transporte, controle sanitário e comércio de embriões. O método de
congelamento rápido convencional de embriões bovinos ainda apresenta
entraves como o tempo de execução e o alto valor comercial do
equipamento. Com a finalidade de minimizar tempo de congelamento e os
custos, avaliou-se o efeito da trealose no congelamento ultra-rápido de
embriões bovinos com etilenoglicol. Noventa e sete (n=97) embriões
bovinos produzidos in vivo foram congelados pelo método ultra-rápido
com 3,0M de etilenoglicol e 3,0M de etilenoglicol + 0,3M de trealose. Os
embriões foram distribuídos aleatóriamente em dois tratamentos. No
tratamento 1 (T1) quarenta e seis (n= 46) embriões foram expostos à
solução de 3,0M de etilenoglicol em solução de manutenção
Emcare(ICP) e cinqüenta e um (n= 51) embriões foram congelados com
3,0M de etilenoglicol associado a 0,3M de trealose em solução de
manutenção Emcare. Os embriões foram mantidos na solução de
congelamento por 2 minutos, envasados em palhetas de 025cc, expostos
ao vapor de nitrogênio por 20 segundos e submersos no nitrogênio
líquido. Após o descongelamento, os embriões foram transferidos para
receptoras previamente sincronizadas, resultando aos 28 dias, em 7
gestações no T1 (15,21%) e 7 (13,72%) no T2. Não houve diferença
(P>0,05) entre os tratamentos. O acréscimo de trealose ao etilenoglicol
mostrou-se viável para a transferência direta dos embriões, porém o
índice de concepção obtido ainda não permite sua indicação no
congelamento comercial de embriões bovinos.
Palavras-chave: Congelamento, ultra-rápido, embriões, bovinos,
transferência direta.
ABSTRACT
Cryopreservation is currently the universal method for embryo storage,
transport, sanitary control and trading. The conventional bovine embryo
freezing method still drawbacks such as the freezing period and costs of
the freezing equipment. In order to decrease costs and time, the effect of
trehalose on ultra-rapid freezing with ethylene glycol was evaluated.
Ninety seven in vivo produced bovine embryos were randomly distributed
9
in two treatments for ultra-rapid deep freezing with 3.M ethylene glycol
(T1; n= 46) and 3.M ethylene glycol + 0.3M trehalose (T2; n= 51). In T1,
embryos were exposed to a 3.0M ethylene glycol in Emcare (ICP)
holding media and in T2 to a 3.0M ethylene glycol plus 0.3M trehalose in
Emcare holding media. Embryos of both treatments were kept for 2
minutes in the freezing solutions; loaded in 0,25cc straws and there after
they were exposed to N
2
vapor during 20 seconds to be plunged
immediately into liquid nitrogen. After thawing, embryos were transferred
to previously synchronized recipients resulting at 28 days in 7 (15.21%)
pregnancies in T1 and also 7 (13.72%) in T2. No significant difference was
detected between treatments (P>0.05). The trehalose and ethylene glycol
solution is suitable for direct transfer of bovine embryos. However, the
conception rate obtained in this study do not allow its indication for
commercial embryo freezing.
Key Words: freezing, ultra-rapid, bovine embryos, direct transfer.
Introdução
O método de congelamento convencional em bovinos teve um
importante avanço com o uso do etilenoglicol para embriões produzidos in
vitro (SUZUKI et al., 1993) ou produzidos in vivo (VOELKEL & HU, 1992;
DOCHI, 1995; McINTOSH & HAZELEGER, 1994). A alta permeabilidade
e baixa toxicidade do etilenoglicol permitiu a transferência direta
simplificando a metodologia nos programas comerciais de transferência
de embriões.
Os crioprotetores possuem atividade intra- (glicerol, dimetilsulfóxido
e etilenoglicol) e extracelular (albumina sérica bovina, sacarose, lactose,
trealose e ácido hialurônico). A trealose é comumente utilizada nas
soluções de congelamento (SAHA et al., 1996), pois mantém uma alta
pressão osmótica no meio extracelular durante e entrada e a remoção do
crioprotetor (YOON et al., 1998).
O método ultra-rápido foi desenvolvido e testado com notável
eficiência em ratos (CHUPIN & DE REVIERS,1986), e camundongos
10
(RAYOS et al., 1992; BERNARDI et al, 1990/1992, MEZZALIRA & RUBIN,
1992), justificando o uso do método no congelamento de embriões
bovinos (CHUPIN, 1986/1987; BERNARDI et al., 1991; MEZZALIRA et al.,
1996; ALMEIDA, 2001).
No processo de congelamento ultra-rápido não há a necessidade de
um abaixamento lento da temperatura, pois a desidratação ocorre
osmoticamente durante o tempo de equilíbrio (RENARD et al., 1984;
LANGIS & STEPONKUS, 1990), devido a maior concentração dos
crioprotetores, que são responsáveis pela menor formação de cristais de
gelo intracelular (TAKEDA et al. 1984; RALL, 1987).
BERNARDI et al. (1991), utilizando glicerol e sacarose com
protocolo similar a suas pesquisas in vitro com embriões de
camundongas, desenvolveram um protocolo de congelamento ultra-rápido
para embriões bovinos, que resultou no nascimento do primeiro produto
deste método no Brasil. O êxito obtido com congelamento ultra-rápido de
embriões tem sido inconstante e ainda carece de estudos. MEZZALIRA et
al. (1996) obtiveram 19,2% (5/26) de prenhez com a transferência de
embriões bovinos produzidos in vivo congelados pelo método ultra-rápido
com 3,0M de glicerol e 0,25M de sacarose em meio DPBSm (Dulbeccos
phosphate-buffered saline modified). Já ALMEIDA (2001) alcançou 14%
(1/7) e 40% (2/5) de gestações congelando embriões bovinos, também
pelo método ultra-rápido com 2,0M de EG e 0,3M trealose; 3,0M de EG e
0,3M trealose e pelo método rápido (convencional) com 1,5M de
etilenoglicol em DPBSm, respectivamente. O reduzido número (2/5) de
embriões transferidos por ALMEIDA (2001) não permitiu comprovar a
eficiência do método, permanecendo na dependência da continuidade do
estudo e do incremento no número de embriões transferidos.
Assim, avaliou-se o efeito da solução de 3,0M de etilenoglicol
associado ou não a 0,3M de trealose, em meio de manutenção ECHM-
100 Emcare, no congelamento ultra-rápido de embriões bovinos
produzidos in vivo sobre a taxa de concepção.
11
Material e Método
Vacas da raça Red Angus (n=11) com idade entre 4 e 7 anos,
selecionadas quanto a saúde geral e genital e mantidas em pastagem
cultivada, serviram como doadoras dos embriões.
A sincronização do ciclo estral das doadoras foi efetuada com
implante auricular com Norgestomet
2
, por 8 dias consecutivos, associado
à aplicação de 5mg de valerato de estradiol e 3mg de norgestomet IM. A
superovulação foi iniciada no 5° dia após a aplicação do implante, com
300UI de FSHp
3
, em doses decrescentes, por via IM, duas vezes ao dia,
com intervalo de 12h, por 4 dias consecutivos. No 8° dia, juntamente com
a sétima dose de FSH aplicou-se 0,5mg de um análogo de prostaglandina
F
2
alfa
4
. Os implantes de progesterona foram retirados no 8°dia,
imediatamente após a aplicação da 8ª dose de FSH. As inseminações
foram efetuadas 12 e 24h após o início do cio, com sêmen congelado de
um touro Red Angus com fertilidade comprovada. A coleta dos embriões
foi realizada pelo método não-cirúrgico, 7 dias após a inseminação
artificial.
A coleta dos embriões foi efetuada via não-cirúrgica, com DMPBS
modificado e auxilio de equipo e filtro
5
. A identificação embrionária foi
conduzida em estereomicroscópio
6
. Para lavagem e classificação adotou-
se os critérios recomendados pela IETS (STRINGFELLOW & SEIDEL,
1998). Embriões de qualidade excelente (I) e boa (II) foram congelados
2
Crestar – Intervet International B.V. Boxmmer – Holland. Representante no Brasil – AKZO NOBEL LTDA –
Divisão Intervet. Rua Cel. Bento Soares, 530 Cruzeiro/SP. Brasil
3
PLUSET – Calier do Brasil - Av. Manoel Pedro Pimentel, 15 Osasco/SP. Brasil
4
Sincrocio – OUROFINO SAÚDE ANIMAL – Rua Marechal Mascarenhas de Moraes, 200 Ribeirão Preto/SP.
Brasil
5
Milipore - Nutricell Nutrientes Celulares - Rua Dimas de Toledo Piza, 521, Jardim Nossa Senhora Auxiliadora
– Campinas/SP. Brasil
6
Wild Heerbrugg Ltd – CH – 9495 Heerbrugg, Suíça.
12
em solução de manutenção ECHM-100 Emcare
7
+ etilenoglicol
associado ou não a trealose.
Congelamento e transferência dos embriões
Para o congelamento ultra-rápido, os embriões foram distribuídos
aleatoriamente nos tratamentos e expostos às soluções crioprotetoras de
3,0M de etilenoglicol em solução Emcare ECHM-100 (Tratamento 1; n=
46) e 3,0M etilenoglicol + 0,3M de Trealose em solução Emcare ECHM-
100 (Tratamento 2; n= 51), por 2 minutos. Durante este período, os
embriões foram envasados individualmente em palhetas de 0,25cc, cujas
extremidades foram preenchidas com meio de manutenção Emcare
ECHM-100, lacradas em seladora pelo calor e identificadas. As palhetas
foram expostas por 20 segundos ao vapor do nitrogênio líquido (N
2
) sobre
uma plataforma de isopor com 1cm de altura, submersas imediatamente
no N
2
líquido e mantidas em raques identificadas e armazenadas em
containers de N
2
líquido. As soluções crioprotetoras utilizadas nos
tratamentos 1 e 2 (técnica ultra-rápida) foram preparadas no Laboratório
de Embriologia Animal – Embryolab, adicionando-se à solução de
manutenção Emcare ECHM-100 etilenoglicol
8
e trealose
9
.
Como receptoras, foram selecionadas novilhas e vacas cruza Nelore,
com um escore corporal médio 3,0 (escala de 1 a 5 sendo
1=extremamente magra e 5=obesa). A sincronização foi efetuada com
pessários intravaginais (PV) de progesterona
10
e aplicação de estrógeno
11
(=D0) via IM, na dose de 2mg. Decorridos 9 dias (D9), os animais
receberam um análogo da prostaglandina
12
na dose de 0,5mg, via IM,
7
Emcare – ECHM-100, Immuno-Chemical Products LTD. Nova Zelândia.
8
Sigma Chemical CO. P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178 USA. Ref. E-9129
9
Sigma Chemical CO. P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178 USA. Ref. E-5251
10
EMBRAPA Pecuária Sul – BR 153, Km 595 Caixa Postal 242 Bagé/RS. Brasil
11
EMBRAPA Pecuária Sul – BR 153, Km 595 Caixa Postal 242 Bagé/RS. Brasil
12
Sincrocio - OUROFINO SAÚDE ANIMAL – Rua Marechal Mascarenhas de Moraes, 200, Ribeirão Preto/SP. Brasil
13
concomitante à retirada dos PV. A observação do rebanho iniciou-se em
36h para identificação dos sinais de cio.
Todas as receptoras receberam anestesia epidural com lidocaína a
2% sem vasoconstritor, na dose de 100mg/animal. Os embriões foram
descongelados por 12 segundos no ar e 12 segundos em banho-maria a
30
o
C, em três datas distintas, na primavera/2004 e verão/2005.
A transferência embrionária (TE) foi efetuada por 2 profissionais,
para as receptoras com assincronia máxima de cio de ±24h, no dia 7 (D7),
considerando-se D0, o dia da identificação do cio. A técnica de TE foi a
não-cirúrgica transcervical, com inovulador, bainha de TE
13
e camisa
sanitária
14
. Os embriões foram depositados no corno uterino Ipsis lateralis
ao ovário com corpo lúteo num período não superior a 4 minutos, após
descongelamento.
O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia
15
aos 21
dias pós-transferência embrionária.
Análise Estatística
Os dados foram processados pelo programa estatístico SAS (SAS,
1998) e os resultados foram submetidos ao teste X
2
. Para comparação
das médias foi utilizado o nível de significância de 5%.
13
Cultilab – Materiais para cultivo celular Ltda. Av. Barão de Itapuna, 703 – Botafogo 13020-431 Campinas/SP. Brasil.
14
Overleeve sanitary chemise (IMV) – 11725 95
th
Avenue North, Maple Grove MN 55369. USA.
15
Pie Medical Imaging – Becanusstraat 13D, Maastricht Zip 6216BX. Holanda.
14
Resultados e Discussão
Os resultados de prenhez após transferência direta dos embriões
descongelados no experimento são apresentados na tabela 1. Não houve
diferença (P>0,05) entre os tratamentos.
Tabela 1. Índice de prenhez por ultra-sonografia, aos 28 dias, de
embriões bovinos produzidos in vivo e congelados pelo
método ultra-rápido
Tratamentos
Embriões
transferidos
n
Receptoras
prenhes aos 28
dias
n(%)
Solução ECHM-100 Emcare +
Etilenoglicol 3,0M
46
7 (15,21)ª
Solução ECHM-100 Emcare +
Etilenoglicol 3,0M + Trealose 0,3M
51
7 (13,72)ª
a
Valores seguidos de letras iguais, na coluna, não diferem entre si
(P>0,05).
Na tabela 2 estão relacionados os resultados do congelamento
quanto ao estádio de desenvolvimento embrionário, cuja codificação
segue os critérios da IETS, ou seja: Estádio 4 (mórulas), 5 (blastocistos
iniciais), 6 (blastocistos) e 7 (blastocistos expandidos).
15
Tabela 2. Prenhez de acordo com o estádio de desenvolvimento dos
embriões bovinos produzidos in vivo e congelados pelo método
ultra-rápido
Estádio
embrionário
Tratamento
Receptoras
prenhes aos
28 dias
n(%)
4
Solução ECHM-100 Emcare* + Etilenoglicol
3,0M
0/10 (0,0)
ECHM-100 +Etilenoglicol 3,0M+Trealose 0,3M
5 ECHM-100 + Etilenoglicol 3,0M 7/51 (13,72)
ECHM-100 + Etilenoglicol 3,0M+Trealose 0,3M
6 ECHM-100 + Etilenoglicol 3,0M 2/24 (8,33)
ECHM-100 + Etilenoglicol 3,0M+Trealose 0,3M
7 ECHM-100 + Etilenoglicol 3,0M 5/12 (41,66)
ECHM-100 + Etilenoglicol 3,0M+Trealose 0,3M
* Solução ECHM-100 Emcare = ECHM-100
Trounson et al. (1976) constataram que blastocistos bovinos são
menos sensíveis do que mórulas, ao resfriamento até 0°C, por 24 horas.
De fato, embriões bovinos contêm uma grande quantidade de gotas
lipídicas nos estágios mais precoces de desenvolvimento e à medida que
os embriões se desenvolvem e alcançam o estádio de blastocisto, o teor
de lipídios diminui, conferindo menor sensibilidade ao congelamento para
os estádios mais avançados (MOHR & TROUNSON, 1981). Quando
comparou o índice de sobrevivência e desenvolvimento, nos diferentes
estádios embrionário pós-descongelamento, Chupin (1986) obteve 17,3%
(n=75) de viabilidade para blastocistos iniciais e 56,4% (n=78) para
blastocistos expandidos, utilizando no congelamento 2,8M de glicerol +
0,25M de sacarose em PBS.
O índice gestacional obtido com blastocistos expandidos destacou-
se sobre os demais estádios de desenvolvimento embrionário (Tabela 2).
Neste estudo, fica a esclarecer, se a fase de desenvolvimento embrionário
16
foi responsável pela maior concepção. Deve-se, considerar que número
de embriões transferidos no estádios de mórula e blastocisto expandido
não é representativo para uma análise definitiva. No futuro, este
parâmetro deverá ser avaliado para otimização do resultados.
SOMMERFELD & NIEMANN (1999) testaram várias concentrações
de etilenoglicol (entre 3,6M a 7,2M), constatando que 3,6M de etilenoglicol
foi atóxico e compatível com taxas de sobrevivência adequadas, enquanto
que concentrações maiores de etilenoglicol (7,2M) prejudicaram o
desenvolvimento embrionário bovino.
A presença de trealose na solução crioprotetora restringe o
movimento de água através das membranas, prevenindo a lise dos
blastômeros na difusão do crioprotetor para o espaço extracelular
(MASSIP et al., 1987). Os protocolos de congelamento ultra-rápido,
descritos na literatura, empregam soluções concentradas de
crioprotetores e açúcares que promovem desidratação rápida das células,
que ficariam suficientemente permeadas pelo crioprotetor para tolerar a
exposição ao vapor de nitrogênio ou a imersão direta no nitrogênio líquido
(SCHNEIDER & MAZUR, 1984; VAJTA et al., 1998).
ALMEIDA em 2001 expôs embriões bovinos por 2min às soluções
de 2,0M EG + 0,3M trealose e 3,0M EG + 0,3M trealose e 2min ao vapor
de N
²
líquido obtendo 17% (n=5/25) e 13% (n=3/24) de gestações,
respectivamente. Ao reduzir a exposição dos embriões ao vapor de N
²
líquido para 20s, o referido autor obteve 40% de gestação com os 5
embriões congelados em 3,0M EG + 0,3M trealose. No presente
experimento (Tabela 1), os índices foram menores aos 40% obtidos por
ALMEIDA (2001), que não transferiu um número expressivo de embriões.
Se avaliarmos os resultados de BERNARDI et al. (1991) com 20%
e MEZZALIRA et al. (1996) com 19,2% de gestações com o
congelamento ultra-rápido de embriões bovinos em glicerol e sacarose, os
índices foram aproximados. Em ambos estudos, a rehidratação foi
efetuada em sacarose, diferentemente do presente experimento.
17
Embora o índice de gestações tenha sido relativamente baixo, o
método permitiu viabilidade embrionária pós-transferência. O método
deve ser aprimorado antes de indicar seu uso no congelamento comercial
de embriões bovinos.
Conclusões
O protocolo de congelamento ultra-rápido utilizado mostrou-se
viável para a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vivo
para transferência direta.
O índice de gestação obtido com 3,0M de etilenoglicol, associado
ou não, a 0,3M de trealose na solução de congelamento de embriões
bovinos produzidos in vivo, foi similar.
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22
4 – CONCLUSÕES
O protocolo de congelamento ultra-rápido mostrou-se viável
para a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vivo para
transferência direta.
O índice de gestação obtido com 3,0M de etilenoglicol, associado
ou não, a 0,3M de trealose na solução de congelamento de embriões
bovinos produzidos in vivo, foi similar.
23
5- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, N.V. Congelamento ultra-rápido de embriões bovinos com
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