Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
COMPARAÇÃO ENTRE TESTES BIOQUÍMICOS E
ANÁLISE DA SEQUÊNCIA PARCIAL DO GENE hsp60
PARA A IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS DE
Streptococcus equi
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Mariana Sá e Silva
Santa Maria, RS, Brasil
2005
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
COMPARAÇÃO ENTRE TESTES BIOQUÍMICOS E ANÁLISE
DA SEQUÊNCIA PARCIAL DO GENE hsp60 PARA A
IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS DE Streptococcus equi
por
Mariana Sá e Silva
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-graduação
em Medicina Veterinária, Área de concentração Medicina Veterinária
Preventiva, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM,RS), como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária
Orientador: Agueda Castagna de Vargas
Santa Maria, RS, Brasil
2005
ads:
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
Comparação entre testes bioquímicos e análise da seqüência parcial do gene
hsp60 para a identificação de isolados de Streptococcus equi
Elaborada por
Mariana Sá e Silva
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
Agueda Castagna de Vargas, Dr. (UFSM)
(Presidente/Orientador)
Eduardo Furtado Flores, PhD. (UFSM)
Odir Antônio Dellagostin, Dr. (UFPEL)
Santa Maria, 29 de agosto 2005.
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Ademar e Olirdes e minha irmã Caro e minha
sobrinha Marina, que apesar da enorme distância sempre se fizeram presentes,
me apoiando em todas as etapas de minha vida.
A professora Agueda, que foi muito mais que orientadora desta
dissertação, foi também um exemplo de pessoa e profissional, e quem despertou
em mim o interesse pela pesquisa.
A todos os professores do mestrado, Rudi, Eduardo, Bayard, Agueda, que
foram essenciais para minha formação e aprendizado nesta etapa importante da
vida profissional.
A todos os colegas e amigos do Laboratório de Bacteriologia de Santa
Maria: Dani, Niura, Lissa, Chica, Dalile, Angela, Angelo, Rodrigo, Denis, Lu,
Sil, Fran, Soninha e as Super Ana e Cris, por todos os momentos vividos, de
trabalho e de amizade.
Ao Mateus, que foi um excelente amigo e professor, me ajudando e
orientando em todas as etapas na execução deste trabalho.
A Dani, Posse e Marcelo, que muito mais que colegas de Pós-graduação,
foram amigos de todas as horas, fundamentais para enfrentar todos os problemas
e foram o incentivo crucial nos momentos de desânimo.
Ao Dan, que foi o amigo, companheiro, meu amor e conselheiro de todas
as horas, servindo de apoio e auxílio para todos os momentos da minha vida.
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
COMPARAÇÃO ENTRE TESTES BIOQUÍMICOS E ANÁLISE DA
SEQUÊNCIA PARCIAL DO GENE hsp60 PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
ISOLADOS DE Streptococcus equi
AUTOR: MARIANA SÁ E SILVA
ORIENTADOR: AGUEDA CASTAGNA DE VARGAS
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 29 de agosto de 2005.
Streptococcus equi subesp. equi é o agente etiológico da adenite eqüina. Outros agentes
pertencentes ao mesmo grupo, como S. equi subesp. zooepidemicus são freqüentemente
isolados de animais com sinais de adenite, podendo originar diagnósticos equivocados. As
diferenças bioquímicas são pequenas para as subespécies de S. equi, enquanto o potencial
virulento é muito diferenciado, havendo, portanto, necessidade de uma correta diferenciação
entre os isolados. O presente trabalho teve como objetivo realizar a comparação fenotípica e
molecular de isolados de S. equi, obtidos de casos de adenite eqüina, pela análise de
seqüências parciais do gene hsp60. De 26 amostras de Streptococcus sp. analisadas, 18 foram
bioquimicamente identificadas como S. equi subesp. equi, cinco como S. equi subesp.
zooepidemicus, dois isolados S. dysgalactiae subesp. equisimilis e para um isolado não foi
possível determinar a espécie. Pela análise das seqüências, 21 isolados foram identificados
como S. equi subesp. equi e cinco como S. equi subesp. zooepidemicus. Dentre os isolados
utilizados, quatro apresentaram divergência entre os métodos utilizados. A análise de
seqüências do gene hsp60 possui um bom poder discriminatório e pode ser um importante
método auxiliar na diferenciação de isolados de Streptococcus equi, especialmente para
isolados com padrão atípico de fermentação de açucares.
Palavras-chave:
Streptococcus equi, hsp60, caracterização, identificação.
ABSTRACT
Master’s Dissertation
Postgraduate Program in Veterinary Medicine
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
A COMPARISON BETWEEN BIOCHEMICAL TEST AND THE
PARTIAL ANALYSIS OF SEQUENCES OF THE HSP60 GENE FOR
THE IDENTIFICATION OF Streptococcus equi ISOLATES
AUTHOR: Mariana Sá e Silva
ADVISER: Agueda Palmira Castagna de Vargas
Data and place of the defense: August, 29
th
, 2005, Santa Maria
Streptococcus equi is the etiological agent of strangles. Opportunistic agents from the same
group are frequently isolated from horses with strangles and may induce mistake diagnostic.
Among the subspecies of S. equi the phenotypic characteristics are almost undistinguishable;
however the pathogenic potential is widely differentiated. The objective of this study was to
determine the phenotypic and molecular characteristics of S. equi isolates obtained from
samples of clinical cases of strangles by sequencing the hsp60 gene. By phenotypical assays
26 strains of Streptococcus sp. were identified, 18 were characterized as S. equi subsp. equi,
five as S. equi subsp. zooepidemicus, two as S. dysgalactiae subsp., equisimilis, and one as
Streptococcus sp.; However using molecular characterization, 21 isolates were identified as S.
equi subsp. equi and five as S. equi subsp. zooepidemicus. The analysis of the hsp60 sequence
is a good discriminatory tool and can be useful as a method of differentiation, principally for
the characterization of atypical isolates.
Key-words: Streptococcus equi, hsp60, characterization, identification
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
ºC Graus Celsius
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTPs Mistura de desoxirribonucleotídeos (A, C, G e T)
Kb Quilobase
kDa Quilodalton
nmol nanomolar
M Molar
min minuto
mL Mililitro
mM Milimolar
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
PCR polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
pb pares de base
pH Potencial de hidrogênio
RNA Ácido Ribonucléico
rpm Rotações por minuto
rRNA RNA ribossomal
Taq Thermus aquaticus
U Unidade
v Volume
µ
µµ
µg Micrograma
µ
µµ
µl Microlitro
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A
Fatores de virulência e patogenicidade de
Streptococcus sp. do grupo C de La
ncefield em
animais
45
ANEXO B
Características fenotípicas de Streptococcus sp.do
grupo C de Lancefield
46
ANEXO C
Alinhamento das seqüências de hsp60 de S. equi
subesp. equi e S. equi subesp. zooepidemicus
obtidas no GenBank
47
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.....................................................................................4
RESUMO..........................................................................................................5
ABSTRACT.........................................................................................................6
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES.........................7
LISTA DE ANEXOS........................................................................................8
SUMÁRIO........................................................................................................9
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................11
2. Revisão de Literatura ................................................................................13
2.1 - Streptococcus sp....................................................................................................13
2.1.1 - Streptococcus equi subesp. equi.................................................................14
2.1.2 - Streptococcus equi subesp. zooepidemicus..................................................16
2.1.3 - Streptococcus dysgalactiae subesp. equisimilis..........................................17
2.1.4 - Streptococcus equi subesp. ruminatorum....................................................17
2.2 - Adenite eqüina......................................................................................................18
2.3 - Chaperonina HSP60.............................................................................................21
2.4 - Métodos descritos para a identificação de S. equi ............................................22
3. Capítulo 1 -
A comparison between biochemical test and the partial analysis of
sequences of the hsp60 gene for the identification of Streptococcus
equi....................
......................................................................................................25
Abstract……………......................................................................................................27
Introduction...................................................................................................................28
Materials and Methods….............................................................................................29
Bacterial isolates.................................................................................................29
Phenotypic characterization…………………………………………………...29
Molecular characterization.................................................................................29
Results and Discussion.................................................................................................30
Acknowledgements………………………………………….…………......……….…32
Reference………………………………………………………………………………32
TABLE 1.........................................................................................................................36
4. CONCLUSÃO ............................................................................................ 37
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 38
6. ANEXOS.....................................................................................................45
11
1. INTRODUÇÃO
A criação de eqüinos no Brasil é uma atividade em crescimento constante,
apresentando um plantel de 5,9 milhões de animais (FAO, 2002), que gera empregos e renda
para a população. O elevado número de animais, associado à necessidade de produção
crescente, gera um aumento no número de enfermidades, levando a prejuízos econômicos
significativos para a atividade.
Dentre as enfermidades que afetam eqüinos, o segundo grupo com maior prevalência
são as associadas ao trato respiratório, que afetam animais de diversas habilidades,
implicando em importantes perdas no rendimento, gastos com o tratamento, e em alguns
casos, morte. Entre as enfermidades respiratórias que afetam eqüinos, as mais freqüentes são
causadas por agentes bacterianos, como a adenite eqüina, responsável por aproximadamente
30% das notificações de enfermidades em eqüinos em todo o mundo (CHANTER et al.,
1997a).
A adenite eqüina é uma doença infecto-contagiosa aguda caracterizada por inflamação
mucopurulenta do trato respiratório superior dos eqüinos (SCHILD et al., 2001). É causada
pela bactéria β-hemolítica Streptococcus equi subesp. equi do grupo C Lancefield. Também
pertencem a esse grupo, o S. equi subesp. zooepidemicus e S. dysgalactiae subesp. equisimilis,
microrganismos relacionados geneticamente, porém com potencial patogênico muito
diferenciado e freqüentemente isolados de amostras clínicas como contaminantes secundários
(TIMONEY, 2004).
A diferenciação fenotípica entre essas subespécies é pequena e tradicionalmente
realizada através de testes de fermentação de açúcares como lactose, trealose e sorbitol
(KUWAMOTO et al., 2001; QUINN et al., 1994). Entretanto, relatos da existência de cepas
de S. equi subesp. equi atípicas com diferentes padrões de fermentação podem gerar
diagnósticos errôneos (GRANT et al., 1993). Devido aos problemas relacionados com a
diferenciação fenotípica dessas subespécies, são conhecidos vários métodos moleculares de
caracterização, como seqüenciamento de regiões intergênicas do gene 16S-23S (CHANTER
et al., 1997b), polimorfismo de DNA através de RAPD-PCR (DUARTE et al., 2004) e
eletroforese em campo pulsado (PFGE) associada a técnicas de RAPD (GONZALEZ-REY et
12
al., 2003), entre outros. Considerando que os métodos citados nem sempre apresentam um
grau de diferenciação satisfatória entre as subespécies, o seqüenciamento parcial do gene da
chaperonina HSP60 (WONG, et al., 2002) é uma alternativa importante a ser estudada para a
realização do diagnóstico diferencial entre subespécies de S. equi.
As chaperoninas são famílias de proteínas conservadas, responsáveis pela manutenção
de funções celulares essenciais a vida, como o empacotamento protéico. As chaperoninas da
família HSP, como as Hsp60 utilizadas neste trabalho, são proteínas de choque térmico
associadas ao estresse, também conhecidas como “heat shock proteins” (FINK, 1999).
Com base na semelhança fenotípica e genotípica das subespécies de S. equi e suas
importantes diferenças na patogenicidade, este trabalho teve por objetivo relatar a
utilização da análise da seqüência parcial do gene hsp60 na caracterização de isolados
identificados bioquimicamente como Streptococcus equi. A técnica de análise da seqüência
parcial do gene hsp60 pode permitir o diagnóstico seguro, a fim de orientar a adoção de
medidas eficazes para o controle e prevenção da enfermidade.
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Streptococcus sp.
O Streptococcus sp. e Enterococcus sp. abrangem os cocos gram-positivos catalase
negativos mais importantes em medicina humana e animal. São heterogêneos quanto ao
ambiente que são isolados, pois estão presentes na flora normal do corpo humano e animal,
principalmente nas vias aéreas superiores e aparelho digestivo (BROOKS et al., 2000). Esses
agentes possuem metabolismo fermentativo que gera como produto final o ácido lático a
partir de glicose. São classificados sorologicamente através de características antigênicas de
um polissacarídeo de composição variável, denominado carboidrato C, detectável por técnicas
imunológicas. A classificação sorológica de Streptococcus spp. nos grupos de Lancefield se
baseia nesse polissacarídeo e é designado por letras do alfabeto de A até V (TEIXEIRA &
TRABULSI, 2004). O grupo C de Lancefield é dividido em três espécies, baseado na
hemólise e capacidade de fermentação de sorbitol e trealose. Streptococcus dysgalactiae
subesp. equisimilis, beta hemolítico, não fermenta sorbitol e fermenta trealose; Streptococcus
equi, beta hemolítico, não fermenta sorbitol nem trealose; e Streptococcus zooepidemicus,
beta hemolítico, fermenta sorbitol e não fermenta trealose.
Os componentes do grupo C de Lancefield produzem uma cápsula de ácido
hialurônico, mais evidente em culturas jovens, com objetivo de impedir a fagocitose. A
parede celular contém antígenos M, T, R, carboidratos específicos para cada grupo
sorológico, e peptidoglicanos. Muitos possuem fímbrias compostas em parte por proteína M e
recobertas por ácido lipoteicóico, com função de fixação (BROOKS et a., 2000).
O carboidrato grupo-específico da parede celular é responsável pelo agrupamento dos
Streptococcus spp. em grupos sorológicos de Lancefield. A especificidade sorológica do
carboidrato é determinada por um amino açúcar, que para Streptococcus spp. do grupo C é
ramnose-N acetilgalactosamina (BROOKS et al., 2000).
As bactérias do gênero Streptococcus patogênicas para eqüinos incluem S. equi
subesp. equi, o agente da adenite eqüina, S. equi subesp. zooepidemicus, importante agente
14
causador de metrite e doenças respiratórias, e o S. dysgalactiae subesp. equisimilis, agente
pouco freqüente, causador de linfadenite e placentite. Todos estes microrganismos pertencem
ao grupo C de Lancefield (TIMONEY, 2004).
2.1.1. Streptococcus equi subesp. equi
O Streptococcus equi subesp. equi, é um agente β-hemolítico pertencente ao grupo C
Lancefield, envolvido nos casos de adenite eqüina. É fenotipicamente e geneticamente
relacionado com S. equi subesp. zooepidemicus, sendo até 1984 considerados espécies
distintas. Entretanto, após estudos de homologia de DNA, demonstrou-se sua semelhança
genética e fenotípica e as espécies forma reclassificadas formando S. equi subesp. equi e S.
equi subesp. zooepidemicus (FACKLAM et al., 2002; EUZÉBY, 2005). A análise de regiões
intergênicas do rRNA entre 16S-23S sugere que S. equi subesp. equi seja um biovar originado
de S. equi subesp. zooepidemicus (CHANTER et al., 1997b; FACKLAM et al., 2002;
TIMONEY, 2004).
O S. equi subesp. equi causa doença somente em membros da família Equidae, nunca
tendo sido relatado casos de infecções em humanos. Por este fato, a distribuição do agente e
da enfermidade está relacionada à população de eqüinos (TIMONEY et al., 1993b). Além dos
casos típicos de adenite, foram relatados casos de encefalites em eqüinos causadas por
infecções disseminadas de S. equi subesp. equi (GOEHRING et al., 2005).
Esse agente possui fatores de virulência que auxiliam na patogenia da enfermidade,
como a cápsula de ácido hialurônico, hialuronidase, estreptolisinas, estreptoquinases e a
proteína M antifagocítica (HARRINGTON et al., 2002).
A cápsula de ácido hialurônico é um polímero de alta massa molecular, formado por
resíduos de N-acetilglucosamina e ácido glicurônico, conferindo o aspecto mucoso às
colônias produtoras dessa estrutura, e um maior potencial de virulência a isolados que a
produzem (TIMONEY 1993a; TIMONEY, 2004). Culturas jovens de S. equi subesp. equi têm
uma maior quantidade de cápsula e são mais virulentas que culturas velhas, nas quais a
cápsula não está presente em grandes quantidades, demonstrando o potencial virulento dessa
estrutura (ANZAI et al., 1999; HARRINGTON et al., 2002). A hialuronidase é uma enzima
com aproximadamente 55 kDa de massa molecular, com atividade na penetração nas mucosas
do hospedeiro e difusão tecidual (HARRINGTON et al., 2002).
15
A proteína M antifagocítica é uma molécula ácido-resistente com aspecto de fímbria
que se projeta a partir da parede celular bacteriana. Apresenta entre 50 e 60 nm de
comprimento (TIMONEY 1993a) foi clonada e expressa em Escherichia coli em 1987 por
Galan & Timoney.
A estreptolisina O, produzida por agentes dos grupos A, C e G de Lancefield, é uma
proteína de 53 kDa altamente antigênica (TIMONEY, 1993a). É o peptídeo responsável pela
hemólise beta produzida por S. equi subesp. equi e S. equi subesp. zooepidemicus. A ligação
da estreptolisina O nos eritrócitos leva à formação de poros na membrana, produzindo lise
osmótica celular (FLANAGAN et al., 1998; TIMONEY, 2004). Além da ação hemolítica em
eritrócitos, a estreptolisina O é tóxica para outras células como polimorfonucleares, células do
miocárdio e plaquetas (TIMONEY 1993a).
A estreptoquinase produzida pelo S. equi subesp. equi interage com o plasminogênio
eqüino para formar plasmina ativa, que hidrolisa fibrina. A ação de lise da fibrina auxilia a
disseminação e invasão tecidual pelo agente (TIMONEY, 2004).
O peptidoglicano que forma a parede celular tem atividade pirógena pela indução de
citocinas pirogênicas como interleucina 6 e o fator de necrose tumoral de leucócitos, sendo o
responsável pelos sinais de hipertermia observados em animais com sinais clínicos de adenite
eqüina. Esse componente age ainda como ativador da rota alternativa do complemento,
levando às alterações patológicas encontradas na enfermidade (TIMONEY, 1993a).
A enzima superóxido dismutase (SOD), que converte ânions superóxido em peróxido
de hidrogênio e água, foi identificada em S. equi. Esse processo de detoxificação contribui
para a habilidade do microrganismo em sobreviver dentro de células fagocíticas (POYART et
al., 1998).
A aquisição de nutrientes por S. equi é realizada por um conjunto de enzimas como as
fosfatases ácidas, que hidrolisam fosfomonoésteres em pH ácido, e outras enzimas
extracelulares, capazes de degradar diferentes substratos como fibrinogênio, gelatina e
caseína. Além das enzimas, S. equi apresenta um sistema de transportadores ABC (ATP-
binding cassete) que são sistemas de busca de nutrientes para a bactéria (HARRINGTON et
al., 2002).
Uma nova proteína chamada CNE (collagen-biding protein), que pode ser um novo
fator de virulência para S. equi, foi descrita, tendo sido encontrada em isolados de S. equi
subesp. equi e S. equi subesp. zooepidemicus. Essa proteína possui a capacidade de se ligar ao
colágeno em soluções de forma específica (LANNERGARD et al., 2003).
16
2.1.2. Streptococcus equi subesp. zooepidemicus
Apesar da grande homologia de DNA entre S. equi subesp. equi e S. equi subesp.
zooepidemicus, existem grandes diferenças quanto à patogenicidade. O S. equi subesp.
zooepidemicus é um importante agente zoonótico para humanos que são eventualmente
infectados através do contato com eqüinos portadores (TIMONEY, 2004). Esse agente é
freqüentemente isolado de eqüinos saudáveis, causando pneumonias e outras enfermidades
leves do trato respiratório superior. S. equi subesp. equi possui um maior impacto econômico
por seu maior potencial patogênico para eqüinos (WELSH, 1984; KOWALSKI, et al., 2000).
O agente já foi isolado de suínos e macacos na Indonésia causando poliartrite,
broncopneumonia, pleurite, epicardite, endocardite e meningite (SOEDARMANTO, 1996;
SALASIA et al., 2004) e também da nasofaringe de camelos saudáveis e enfermos no Kenya
e Somália (YOUNAN et al., 2005).
O S. equi subesp. zooepidemicus é um microrganismo comensal das tonsilas e mucosa
da nasofaringe de eqüinos saudáveis. Entretanto está associado a enfermidades do trato
respiratório em potros, eqüinos jovens e pneumonia pós-transporte em adultos (OIKAWA et
al., 1995), sendo também associado à formação de abscessos pulmonares (LAVOIE et al.,
1994). Pode ainda ser isolado de animais com pleuropneumonia, endometrite, septicemia
neonatal e mastite. Eqüinos adultos que morrem de pneumonia associada ao transporte
freqüentemente apresentam S. equi subesp. zooepidemicus em culturas de lesões pulmonares,
o que demonstra sua associação com enfermidades respiratórias. Entretanto não é evidente se
o agente é causador primário ou um contaminante secundário (RADOSTITS et al., 2002).
S. equi subesp. zooepidemicus e Rhodococcus equi são os agentes mais isolados de
casos de pneumonia em potros, sendo encontrados em culturas puras ou como parte de uma
infecção mista (LÉGUILLETTE, 2002). Pneumonia por S. equi subesp. zooepidemicus é a
principal causa de mortes em animais entre 32 e 180 dias de vida no Texas (COHEN, 1994) e
a morbidade em Ontário, Canadá, chega a 71% em potros (HOFFMAN, 1993)
Os sinais clínicos da infecção do trato respiratório inferior de potros por S. equi
subesp. zooepidemicus são tosse, febre leve, corrimento nasal mucopurulento e aumento da
freqüência respiratória (RADOSTITS et al., 2002).
17
Já foram relatados casos em humanos de sepse multifocal, artrite séptica, endocardite (LEE
& DYER, 2004) e meningite estreptocócica (DOWNAR, 2001) e surtos de
glomerulonefrite (NICHOLSON et al., 2000), todos associados ao contato com eqüinos.
2.1.3. Streptococcus dysgalactiae subesp. equisimilis
O Streptococcus dysgalactiae subesp. equisimilis é um agente beta-hemolítico
pertencente ao grupo C Lancefield, porém com baixa homologia de DNA com as espécies S.
equi subesp. equi e S. equi subesp. zooepidemicus. São habitantes normais da pele e
superfícies mucosas. Podem ser isolados de placentas de fetos abortados e raramente de
abscessos em linfonodos. A patogenia é pouco entendida e as infecções por estes agentes são
raras e oportunistas (TIMONEY, 2004).
S. dysgalactiae subesp. equisimilis foi reclassificado em duas subespécies, S.
dysgalactiae subesp. equisimilis e S. dysgalactiae subesp. dysgalactiae, que não é β-
hemolítico mas pertence ao mesmo grupo C de Lancefield (KAWATA et al., 2003). Esse
agente já foi envolvido em casos de mortalidade de peixes no Japão, em 2004 (NOMOTO et
al., 2004), e casos de faringite aguda em crianças (BISNO et al., 1996; ZAOUTIS et al.,
2004). Também foi identificado em suínos abatidos com endocardite, linfadenite e poliartrite
(KAWATA et al., 2003).
2.1.4. Streptococcus equi subesp. ruminatorum
A partir de novembro de 2004, outra nova subespécie foi identificada e classificada
como S. equi subesp. ruminatorum, isolado de casos de mastite em pequenos ruminantes. O
agente foi classificado no grupo C de Lancefield e apresentou 98% de homologia de rRNA
16S com Streptococcus equi subesp. equi, sendo classificado como Streptococcus equi
subesp. ruminatorum. As características bioquímicas são teste positivo para glicose, lactose e
sorbitol e negativo para trealose (FERNANDEZ et al., 2004).
2.2 Adenite eqüina
18
A adenite eqüina é uma doença contagiosa aguda caracterizada por inflamação
mucopurulenta do trato respiratório superior dos eqüinos, conhecida popularmente como
garrotilho, devido às manifestações clínicas de aumento de volume na região do pescoço,
formando um “garrote” no animal afetado (SHILD et al., 2001). Possui distribuição mundial e
é responsável por perdas econômicas importantes, considerando-se os custos com tratamento,
medidas de controle e eventuais perdas de animais (WALLACE et al., 1995). Dentre os casos
de enfermidade infecciosas de eqüinos que são notificadas ao International Collating Centre,
30% são casos de adenite eqüina (CHANTER et al., 1997a). A enfermidade é conhecida
desde 1251 e o agente causal foi identificado pela primeira vez em 1873, sendo
posteriormente utilizado para a reprodução da doença em eqüinos, em 1888 (WILKENS,
1994). A infecção é fatal em apenas 10% dos casos, e a morte ocorre por disseminação dos
abscessos ou por púrpura hemorrágica, causada pelo acúmulo de complexos formados por
anticorpos e a proteína M (CHANTER et al., 2000).
O período de incubação varia de 3 a 14 dias e os animais apresentam febre, apatia,
descarga nasal, inicialmente mucosa progredindo para mucopurulenta, tosse, anorexia,
dificuldade de deglutição e edema submandibular, dificultando a respiração (TIMONEY et
al., 1993b). O curso clínico é de duas a quatro semanas, com recuperação espontânea da
maioria dos animais após drenagem do conteúdo dos abscessos (SCHILD, 2001). A
transmissão ocorre por contato direto nasal ou oral, ou indireto, através de aerossóis, fômites
contaminados e insetos. Alguns fatores podem aumentar o risco de infecção, como o frio, falta
de higiene nas instalações e o excesso de animais (TIMONEY et al., 1993a).
S. equi penetra pela boca ou narinas e a bactéria se adere a receptores específicos em
células das criptas das tonsilas e linfonodos adjacentes. Em poucas horas, o organismo atinge
os linfonodos regionais, onde se multiplica no meio extracelular. O peptidoglicano da parede
celular ativa o componente C3 do complemento que atrai neutrófilos para o local. A falha
destas células em fagocitar e destruir estas bactérias parece ser devido a uma combinação da
cápsula de ácido hialurônico e a proteína M. A ação antifagocítica da proteína M ocorre pela
inibição do fator H do complemento e pela ligação com o fibrinogênio, o que impede o
reconhecimento da bactéria como estranha pelo sistema imune do hospedeiro (TIMONEY,
1993a).
Outros fatores como estreptolisina e estreptoquinase contribuem para a formação dos
abscessos. À medida que estes progridem, há formação de edema submandibular devido à
19
obstrução do fluxo de fluido linfático. O processo de destruição de fagócitos atrai outras
células inflamatórias que fagocitam algumas bactérias e são destruídas por outras, levando à
formação de pus em um processo contínuo que pode ter várias resoluções (BROOKS et al,
2000).
Na maioria dos casos da enfermidade, o animal apresenta apenas aumento dos
linfonodos, com formação de abscessos e rápida resolução sem auxílio terapêutico.
Aproximadamente 20% dos eqüinos afetados permanecem portadores crônicos, disseminando
o agente por vários meses e servindo como uma importante fonte de infecção na população
(NEWTON et al., 2000).
A disseminação do agente via linfática ou hematógena pode levar à formação de
abscessos bastardos em cavidades (abdominal e torácica), podendo, em casos menos
freqüentes, atingir o cérebro (RADOSTITS et al., 2002). KOL et al., (2003) relataram a
ocorrência de dois casos de adenite bastarda em Israel. O primeiro caso foi de um poney de
um ano de idade com a presença de uma massa de 18 cm x 10 cm na cavidade torácica, caudal
ao coração, que resultou na morte do animal. O segundo caso relatado ocorreu em um potro
de 15 meses, onde foi relatada a presença de um abscesso de 25 cm de diâmetro na cavidade
abdominal, próxima ao reto, que após a drenagem apresentou uma redução no tamanho e
recuperação do animal. A causa da disseminação do agente ainda é desconhecida, entretanto
suspeita-se que a inadequada antibioticoterapia em eqüinos com secreção nasal e aumento de
volume nos linfonodos pode contribuir para a ocorrência desses casos (KOL et al., 2003). Os
sinais clínicos apresentados pelos animais com abscessos bastardos variam de acordo com o
tamanho e localização dos abscessos. O agente pode ainda atingir válvulas cardíacas, cérebro,
olhos, articulações e bainhas tendinosas (RADOSTITS et al., 2002).
Quadros de púrpura hemorrágica têm sido descritos em eqüinos com exposição prévia a
S. equi subesp. equi que apresentam altos títulos de anticorpos contra a proteína M de S. equi.
Os eqüinos com púrpura apresentam infartos na musculatura esquelética, pele, trato
gastrointestinal, pâncreas e pulmão. Lesões histológicas como vasculite leucocitoclástica e
necrose aguda coagulativa são descritas para estes casos (KAESE et al., 2005).
Além de casos de adenite bastarda e púrpura hemorrágica, os eqüinos afetados podem
desenvolver complicações mais brandas e não fatais, tais como miocardites, celulite
purulenta, hemiplegia laríngea e empiema de bolsas guturais (PRESCOTT & WRIGHT,
2000)
Aproximadamente 75% dos eqüinos desenvolvem sólida e duradoura imunidade à
adenite eqüina que parece ser mediada por IgG e IgA produzidas na mucosa local. O colostro
20
de éguas que se recuperaram da doença contém IgG e IgA, fornecendo assim (se ingerido nas
primeiras 24 horas de vida) proteção aos potros até o período de desmame. Acredita-se que a
proteína M seja o principal antígeno protetor de S. equi (JACOBS et al., 2000).
O diagnóstico é geralmente realizado de acordo com os sinais clínicos e também pela
demonstração do agente em esfregaço de exsudato nasal ou pus. A confirmação é feita pelo
isolamento e cultura de S. equi a partir do material proveniente das lesões ou órgãos afetados
(SCHILD, 2001).
O tratamento é indicado nos casos em que o animal apresenta sinais sistêmicos de
infecção como febre, depressão e alterações no hemograma entretanto ainda não apresenta os
sinais de aumento de volume nos linfonodos. O S. equi subesp. equi é muito sensível à
penicilina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina e lincomicina. O tratamento deve ser
realizado de 5-10 dias, com penicilina (18.000 a 22.000 UI/kg) ou trimetoprim associado à
sulfa (20 mg/kg) (PRESCOTT & WRIGHT, 2000).
Vacinas utilizadas para adenite eqüina são constituídas de proteína M e têm sido
associadas a reações adversas como edema e aumento de volume dos linfonodos regionais em
72% dos casos. Também são relatados sinais sistêmicos como artrite, laminite e letargia em
24% (SMITH, 1994). As vacinas inativadas como Strepguard TM
®
(Bayer) e a Strepvax II
®
(Boehringer Ingelheim) são administradas via intramuscular com reforço anual. Essas vacinas
geralmente não resultam em uma completa proteção por não levarem a um estímulo
antigênico eficiente sem a formação de imunidade na nasofaringe (PRESCOTT & WRIGHT,
2000).
Tendo em vista que a imunidade local é a mais importante para a proteção contra o
agente, uma vacina atenuada de S. equi, Pinnacle TM
®
(Fort Dodge), com aplicação local, que
apresenta resultados melhores que os obtidos com vacinas inativadas de aplicação
intramuscular (PRESCOTT et al., 2000; WALKER et al., 2002). A vacinação intranasal de
uma mistura de Proteína M ligada a uma toxina colérica foi testada por Sheoran et al. (2002),
resultando na indução de resposta específica de anticorpos IgG no soro e IgA na mucosa.
Entretanto, os resultados de proteção clínica não foram satisfatórios. Estudos recentes têm
utilizado a proteína HAP (proteína associada ao hialuronato), apresentando resultados
satisfatórios experimentalmente, (CHANTER et al., 1999; HARRINGTON et al., 2002).
Entretanto até o momento não existem formulações comerciais com esta proteína.
Flock et al., (2004) avaliaram a eficácia de uma vacina recombinante contendo partes
das proteínas FNZ (proteína ligante de fibronectina), SFS (proteína ligante de fibronectina
secretada) e EAG (proteína ligante de α2 macroglobulina, albumina e imunoglobulina G). A
21
vacina apresentou taxas satisfatórias de IgA de mucosa, e IgG de soro quando administrada
via intranasal e subcutânea.
2.3. Chaperoninas - HSP60
As chaperoninas, também conhecidas como chaperonas, são uma família de proteínas
conservadas que têm habilidade de reconhecer e se ligar de forma seletiva a proteínas não
ativas em condições fisiológicas e situações de estresse (BUCHNER et al., 1996). São
proteínas que atuam na montagem correta de proteínas alvo, ligando-se a superfícies reativas
da proteína alvo que estão expostas durante os processos de montagem, impedindo a interação
destas regiões com outras da mesma proteína, induzindo a uma conformação incorreta
(LEWIN, 2001). São divididas em dois grupos: grupo I, das chaperoninas encontradas em
bactérias, mitocôndrias, cloroplastos; e o grupo II, presentes em eucariotos e Archaea (LUND
et al., 2003).
O grupo de chaperonas mais estudado são as heat-shock proteins, que são chaperonas
que atuam na célula em situação de estresse, impedindo o desempacotamento irreversível das
proteínas. Os principais membros deste grupo são as Hsp104, Hsp90, Hsp70, Hsp60/GroEL e
as pequenas chaperonas (BUCHNER, 1996).
A família das HSP60 inclui as famílias complexas GroEL e TCP-1. As GroEL são
encontradas em procariotos, cloroplastos e mitocôndrias, enquanto as TCP-1 são encontradas
no citosol de células eucariotas (FINK, 1999). Os genes que codificam para a Hsp60 são
extremamente conservados e vitais para a célula, sendo encontrados em quase todos os
organismos, com exceção dos micoplasmas (LUND et al., 2003). Além do importante papel
no folding protéico, as chaperonas possuem capacidade de estimular o sistema imune,
aumentando a produção de citocinas em resposta a uma infecção por Mycobacterium
tuberculosis (QAMRA & MANDE, 2004).
A maioria das HSP60, também conhecidas como Cpn60, são proteínas oligoméricas
complexas, com uma cavidade central onde se ligam proteínas não ativas. Em bactérias as
HSP60 precisam de uma chaperonina GroEL (cpn10) para que sua função seja completa
(FINK, 1999). Estudos sugerem que as heat shock proteins são essenciais para o processo de
agregação e empacotamento ou folding protéico, levando à formação de corpúsculos de
inclusão em Escherichia coli mutantes defeituosas para o gene da hsp60, também conhecido
como GroEL em E. coli (GRAGEROW et al., 1991).
22
Pelo fato de serem encontradas em praticamente todos os microrganismos, essa região
têm sido muito utilizada para caracterização de agentes através de técnicas moleculares (GOH
et al., 1996; GOH et al., 1998; QAMRA & MANDE, 2004; WONG et al., 2002).
2.4. Métodos descritos para a identificação de Streptococcus equi
Agentes pertencentes ao mesmo grupo C Lancefield, como S. equi subesp.
zooepidemicus são freqüentemente isolados de amostras clínicas como contaminantes
secundários de casos de adenite eqüina, sendo portanto necessário que se faça a correta
diferenciação entre essas subespécies. Para esta diferenciação podem ser utilizadas técnicas
baseadas em características fenotípicas dos agentes ou técnicas moleculares.
As diferenças fenotípicas (Anexo B) entre as subespécies de S. equi são pequena e
tradicionalmente é realizada baseada em testes de fermentação de açúcares (KUWAMOTO et
al., 2001), entretanto existem cepas de S. equi subesp. equi atípicas que apresentam
fermentação de trealose, lactose ou ambos, dificultando ainda mais sua diferenciação
fenotípica (GRANT et al., 1993). Ainda dentre as técnicas fenotípicas, existem kits
comerciais de fermentação de açúcares em microplaca, como o API 20 STREP, um sistema
de diferenciação entre os membros da família Streptococcaceae, constituído por 20 testes
bioquímicos com alto poder discriminatório (BioMérieux, 1997).
Devido aos problemas relacionados com a diferenciação fenotípica destas subespécies,
métodos moleculares de caracterização são estudados constantemente. As técnicas
moleculares são descritas para a maioria dos gêneros bacterianos, com a utilização de
seqüência espécie-específicas de DNA como na PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
(McPHERSON & MOLLER, 2000).
O teste de PCR baseado na seqüência SeM, que codifica para a proteína M de S. equi
subesp. equi é até três vezes mais sensível que a cultura (TIMONEY & ARTIUSHIN, 1997a),
entretanto este gene pode ser eventualmente identificado em isolados de S. equi subesp.
zooepidemicus. A cultura de swab nasal, lavados nasais e pus de abscesso pode ser realizada
em agar Columbia CNA (colistina, ácido nalidixico) acrescido de 5% de sangue ovino ou
eqüino (TIMONEY, 2004). Entre 24 e 48 horas após o início da febre, S. equi subesp. equi
pode não ser isolado da mucosa nasal (TIMONEY, 2004).
Recentemente foi descrito um PCR multiplex baseado no gene sodA e exotoxinas
SeeH e SeeI para diferenciação entre S. equi subesp. equi e S. equi subesp. zooepidemicus. As
23
seqüências internas do gene sodA não são suficientes para a diferenciação entre as
subespécies, identificando apenas as espécies de S. equi. Entretanto, os genes seeH e seeI
estão presentes apenas nos isolados de S. equi subesp. equi, servindo como diferenciação. O
uso dessa técnica pode ser restrita em casos de mutações nos genes que codificam as toxinas
SeeH e SeeI, levando a erros no diagnóstico (ALBER et al., 2004a).
A utilização da técnica de PCR tem especial importância na identificação de animais
portadores e apresenta uma maior sensibilidade comparada ao isolamento de material de
bolsas guturais, com detecção de 76% dos portadores enquanto a cultura detectou 59%
(NEWTON et al., 2000).
Seqüências de rRNA 16S espécie-específicos são utilizadas por diversos autores para
muitas espécies de Streptococcus (KAWAMURA et al., 1995; ABDULMAWJOOD &
LÄMMLER, 2000), entretanto as seqüências de regiões internas do gene rRNA 16S de S. equi
subesp. equi e S. equi subesp. zooepidemicus são praticamente idênticas, indicando que essa
região não é suficiente para a identificação e diferenciação entre as espécies
(ABDULMAWJOOD & LÄMMLER, 2000).
Sechi et al., (1999) estudaram técnicas moleculares de ribotipificação para o estudo de
isolados de S. equi subesp. equi obtidos de camelos da Etiópia, com a finalidade de
estabelecer uma relação clonal entre as cepas de camelos e eqüinos, demonstrando que existe
uma variação genética entre estes isolados. O uso de seqüências repetitivas como ERIC
(Enterobacterial repetitive intergenic consensus) foram descritas para o estudo de variações
entre isolados de S. equi (AL-GHAMDI et al., 2000).
A utilização de seqüências baseadas na proteína M-like foi descrita para diferenciação
entre as subespécies, entretanto cepas de S. equi subesp. zooepidemicus possuem genes que
codificam proteínas M-like com alto grau de homologia com as proteínas produzidas por S.
equi subesp. equi, não sendo portanto uma técnica confiável para a correta diferenciação
(TIMONEY et al., 1997b).
O seqüenciamento de regiões intergênicas do gene 16S-23S nem sempre é suficiente
para a diferenciação entre as subespécies pela existência de poucas regiões de divergência e
com poucos nucleotídeos (CHANTER et al., 1997b). Técnicas de análise de polimorfismo de
DNA através de RAPD-PCR (DUARTE et al., 2004) e eletroforese em campo pulsado
(PFGE) associada a técnicas de RAPD (GONZALEZ-REY et al., 2003) também têm sido
relatadas.
Além dos métodos citados, que nem sempre apresentam um grau de diferenciação
satisfatória entre as subespécies, a análise parcial do gene que codifica para a chaperonina
24
HSP60 é uma alternativa importante a ser estudada na caracterização e diferenciação
molecular de espécies bacterianas com divergência genética recente (WONG et al., 2002). Os
genes que codificam para a chaperonina HSP60 são extremamente conservados entre as
espécies bacterianas e podem ser utilizados em estudos de evolução molecular e taxonomia.
Métodos baseados no seqüenciamento de regiões parciais do gene hsp60 já demonstraram alto
poder discriminatório em espécies como Staphylococcus coagulase-negativa (GOH et al.,
1996), enterobactérias (WONG et al., 2002), sorotipos de Streptococcus suis (BROUSSEAU
et al., 2001), e entre Streptococcus uberis e Streptococcus parauberis (ALBER et al., 2004b).
25
3. CAPÍTULO 1
A comparison between biochemical test and the partial analysis of
sequences of the hsp60 gene for the identification of Streptococcus equi
isolates
A ser submetido à revista Current Microbiology
26
A comparison between biochemical test and the partial analysis of sequences of the
hsp60 gene for the identification of Streptococcus equi isolates
Running head: Identification of S. equi by sequencing of hsp60 gene
Mariana Sá e Silva
1,2
, Mateus Matiuzzi da Costa
3, 4
, Clarissa Barretta
1
, Ana Cláudia Mello
Groff
1
, Agueda Castagna de Vargas
1
*
Postal addresses of affiliation:
¹ Laboratório de Bacteriologia, DMVP, Universidade Federal de Santa Maria, UFSM
² Pontifícia Universidade Católica do Paraná – PUCPR, Campus Toledo
³ Universidade do Oeste de Santa Catarina, UNOESC, Campus Xanxerê
4
Centro de Biotecnologia, CBIOT, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
Agueda Castagna de Vargas*: Phone: (55) 3220 8107
Corresponding author:
Agueda Castagna de Vargas
Universidade Federal de Santa Maria
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva
Prédio 44, sala 5137
CEP: 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil
agueda@ccr.ufsm.br
27
Abstract
Streptococcus equi is the etiological agent of strangles. Opportunistic agents from the same
group are frequently isolated from horses with strangles and may induce mistake diagnostic.
Among the subspecies of S. equi the phenotypic characteristics are almost undistinguishable;
however the pathogenic potential is widely differentiated. The objective of this study was to
determine the phenotypic and molecular characteristics of S. equi isolates obtained from
samples of clinical cases of strangles by sequencing the hsp60 gene. By phenotypical assays
26 strains of Streptococcus sp. were identified, 18 were characterized as S. equi subsp. equi,
five as S. equi subsp. zooepidemicus, two as S. dysgalactiae subsp., equisimilis, and one as
Streptococcus sp.; However using molecular characterization, 21 isolates were identified as S.
equi subsp. equi and five as S. equi subsp. zooepidemicus. The analysis of the hsp60 sequence
is a good discriminatory tool and can be useful as a method of differentiation, principally for
the characterization of atypical isolates.
Keywords: Streptococcus equi, hsp60, characterization, strangles.
28
Introduction
Strangles is an acute contagious disease characterized by inflammation of the superior
respiratory tract of horses [18]. S. equi subsp. equi pertains to the Lancefield group C, which
includes other agents such as S. equi subsp. zooepidemicus and S. dysgalactiae subsp.
equisimilis, that are frequently isolated from clinical samples of horse as secondary
contaminants [14, 23]. The term bastard strangles reefers to the dissemination of S. equi
subsp. equi to lymph nodes and other organs such as the lungs, spleen, liver, kidneys, and
brain. In 10% of sick horses rupture of abscesses may lead to the dissemination of the agent,
resulting in mortality [14, 19, 23].
There are few phenotypic features capable of distinguishing between the subspecies of
S. equi. These are based on sugar fermentation tests, mainly using lactose, trehalose, and
sorbitol [6, 15]. Laboratory diagnosis of strangles is often difficult because strains of S. equi
subsp. equi demonstrate atypical biochemical fermentation [12]. Due to the problems related
with the phenotypic differentiation of these subspecies, various molecular methods of
characterization have been used, e.g., the sequencing of intergenic regions of 16S-23S genes
[4], DNA polymorphic using RAPD-PCR [5], Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
associated to RAPD techniques [11], and the utilization of repetitive sequences [2]. However,
these methods are unable to differentiate between the subspecies of S. equi. Thus, the partial
sequencing of the chaperonin hsp60 gene may be an important alternative to differentiate
between these subspecies.
The objective of this study was to evaluate the hsp60 gene as a secure alternative
method to identify and differentiate between the subspecies of S. equi. Additionally, this
technique could be used for the diagnosis as well as for the elaboration of control measures of
this disease.
29
Materials and Methods
Bacterial isolates. Samples from horses with clinical signs of strangles or bastard strangles
used in this study were obtained from the Laboratory of Bacteriology of the Federal
University of Santa Maria and the Federal University of Pelotas. All samples were grown in
sheep blood agar. Plates were incubated at 37ºC for 48 h; colonies were observed for staining
characteristics and the production or not of hemolysis. Colonies of Gram-positives rods were
recultured in sheep blood agar plates.
Phenotypic characterization. The pure plate cultures of Streptococcus spp. were suspended
in saline solution and used for the biochemical fermentation sugar tests for the phenotypic
differentiation of Streptococcus sp. isolates [16].
Molecular characterization. Colonies of Streptococcus sp. were emulsified in 1mL of Mili-
Q sterile water and the DNA extracted using the CTAB method [17], modified by digestion
with Proteinase-K. For fragment amplification, the degenerate primers HSP 279 5'-
GAATTCGAIIIIGCIGGIGA(TC)GGIACIACIAC-3', and HSP 280 5'-
CGCGGGATCC(TC)(TG)I(TC)(TG)ITCICC(AG)AAICCIGGIGC(TC)TT-3' previously
described by GOH [9], were used. The reaction contained 2 µl of DNA and 48 µl of master
mix (15 pmol of primers, 200 µM of deoxirribonucleotides, Taq 1 X buffer and 5 U of Taq
DNA polymerase (Cenbiot). The thermal cycle conditions were: 94°C for 5 min, 95°C for 30
s, 37°C for 30 s, and 72°C for 1 min (30 cycles), followed by 75°C for 5 min. The amplified
30
products were purified by QIAquick Gel Extration Kit (Quiagen) and sequenced in an
automatic DNA sequencer (MEGABACE 1000) at the Molecular Biology Laboratory,
Federal University of Santa Maria. Sequences were aligned by adequate software (Bioedit),
and were edited manually when necessary. The sequence data were further aligned with the
computer program ClustalW [20] and compared with the hsp60 gene of S. equi subsp. equi
and S. equi subsp. zooepidemicus sequences (GenBank accession numbers AY123646 and
AY123645, respectively).
Results and Discussion
Strangles is an important disease that affects the superior respiratory tract of horses.
For the implantation of efficient prophylactic and control measures it is necessary to have a
correct differentiation between S. equi subsp. equi and from other agents of the Lancefield
group C, that may be less pathogenic [21].
By phenotypical characterization 26 isolates were separated in four biotypes: a)
biotype I (S. equi subsp. equi), non-fermentors of trehalose, sorbitol and lactose, 18 isolates;
b) biotype II (S. dysgalactiae subsp. equisimilis), ferments trehalose but does not ferment
sorbitol and lactose, two isolates; c) biotype III (S. equi subsp. zooepidemicus), ferments
lactose and sorbitol and does not trehalose, five isolates; and d), biotype IV (Streptococcus
sp.), that ferments lactose and trehalose, but does not ferment sorbitol, one isolate (Table 1).
During this study it was observed that four isolates were divergent by phenotypical
and molecular characterization. Two isolates were classified phenotypical as S. dysgalactiae
subsp. equisimilis. However, during molecular characterization of these two isolates, one was
identified as S. equi subsp. equi and the other as S. equi subsp. zooepidemicus. One isolate
grouped into biotype IV, where it was not possible to identify the subspecie, was
31
characterized as S. equi subsp. equi by molecular analysis. Another isolate classified as S.
equi subsp. zooepidemicus by phenotypical characteristics was characterized as S. equi subsp.
equi by molecular analysis. Atypic fermentation parameters described in isolates from the
Lancefield group C, have resulted in erroneous diagnoses [12, 13]. S. equi subsp.
zooepidemicus is considered as a normal microorganism from the nasopharynx of horses, and
is frequently isolated from health horses [22]. During this study, samples were obtained from
animals with clinical manifestations of strangles, but the results obtained did not correspond
to a normal distribution of S. equi subsp. zooepidemicus in a healthy population of horses.
The use of the PCR technique for the diagnosis of bacterial diseases has frequently
been used as an alternative to phenotypical analysis, which is based on the metabolism of
normal bacterial [4]. The target-regions frequently used in PCR studies of the taxonomy of S
equi are based on the 16S rRNA region or the intergenic (16S – 23S) regions [4]. The hsp60
region has several advantages, such as being a gene that is common to all microorganisms,
codifying for a highly conserved protein family [7, 25]. The degenerated primers of the hsp60
region that were used during this study amplified a 600 pb fragment in all isolates. The use of
hsp60 specific primers were described in S. parauberis and S. uberis with satisfactory results
[1]; however, the small number of divergences of bp between subspecies of S. equi, makes it
difficult to design specific primers to be used in diagnostic tests.
The alignment of S. equi subsp. equi and S. equi subsp. zooepidemicus by the hsp60
gene demonstrated 16 different nucleotides, presenting 2.89% of divergence among the
subspecies, similar results were reported for the 16 S – 23 S rRNA intergenic region from the
same subspecies. However, only 169 nucleotides were analyzed in this intergenic region [4],
while in the hsp60 gene analyzed 552 nt were observed, resulting in more accurate results.
WONG [24], analyzing sequences of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli, indicated
that the hsp60 region was more discriminatory when compared to the 16S rRNA sequence.
32
Similar results with the hsp60 were described by BROUSSEAU [3], who partially sequenced
serotypes of Streptococcus suis with high DNA homology. Additionally, the same method
was used as an alternative for the molecular identification of other microorganisms such as
Staphylococcus sp. [8, 9], enteric pathogens [24], and other Streptococcus sp. [1, 8, 10].
During this study six of the 26 isolates were from clinical diagnosed cases of bastard
strangles, with the formation of rectal abscesses. Five of these were identified as S. equi
subsp. equi by phenotypical characterization and one demonstrated an atypical biochemical
pattern that was confirmed by sequencing as S. equi subsp. equi.
The results of this study have demonstrated that phenotypical tests commonly used for
S. equi identification may produce diagnostic mistake. The analysis of the hsp60 partial gene
favors the differentiation of S. equi subspecies and can be useful during molecular diagnosis,
mainly in the characterization of atypical isolates.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Dr Elgion Loreto from the Molecular Biology laboratory of
UFSM, the financial support from CAPES, FAPERGS, collaborators from the
LABAC⁄UFSM, where the experiment was carried out, and Sônia Botton for review of this
manuscript.
Reference
1.ALBER, J. et al.(2004) Polymerase chain reaction mediated identification of Streptococcus
uberis and Streptococcus parauberis using species-specific sequences of the genes encoding
superoxide dismutase A and chaperonin 60. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.
51:180-184
33
2. AL-GHAMDI, G.M. et al.(2000) Use of repetitive sequence-based polimerase Chain
reaction for molecular epidemiologic analysis of Streptococcus equi subspecies equi. Am J
Vet Res, 61:699-705.
3. BROUSSEAU, R. et al. (2001) Streptococcus suis serotypes characterized by analysis of
chaperonin 60 gene Sequences. App Env Microb, 67:4828-4833.
4. CHANTER, N. et al.(1997) Characterization of the Lancefield group C Streptococcus 16S-
23S RNA gene intergenic spacer and its potential for identification and sub-specific typing.
Epidemiol Infect,118:125-135.
5. DUARTE, R.S. et al.(2004) Phenotypic and molecular characteristics of Streptococcus
agalactiae isolates recovered from milk of dairy cows in Brazil. J Clin Microbiol, 42:4214-
4222.
6. EUZÉBY, J.P.(2005) Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire. 18 Jan 2005. On-line:
http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ss/equi.html
7. FINK, A.L.(1999) Chaperone-Mediated Protein Folding. Phys Rev, 79:425-442.
8. GOH, S.H. et al.(1996) HSP60 gene sequences as universal targets for microbial species
identification: Studies with coagulase-negative Staphylococci. J Clin Microb, 34:818-823.
9. GOH, S.H. et al.(1997) Identification of Staphylococcus species and subspecies by the
chaperonin 60 gene identification method and reverse checkerboard hybridization. J Clin
Microb, 35:3116-3121.
10. GOH, S.H. et al. (1998) Streptococcus iniae, a human and animal pathogen: specific
identification by the chaperonin 60 gene identification method. J Clin Microb, 36: 2164-
2166.
11. GONZALES-REY, C. et al. (2003) RAPD-PCR and PFGE as tools in the investigation of
an outbreak of beta-hemolytic Streptococcus group A in a Swedish hospital. Comp Immunol
Microbiol Infect Dis, 26:25-35.
34
12. GRANT, S.T.; EFSTRATION, A.; CHANTER, N.(1993) Laboratory diagnosis of
strangles and the isolation of atypical Streptococcus equi. Vet Rec, 133:215-216.
13. JORM, L.R. et al.(1994) Genetic structure of populations of beta-hemolytic Lancefield
group C Streptococci from horses and their association with disease. Res Vet, 57:292-299.
14. KOL, A., et al. (2003) Complicated strangles: Two case reports and a literature review.
Israel J Vet Med, 58.
15. KUWAMOTO, Y. et al. (2001) Microplate Sugar-Fermentation assay distinguishes
Streptococcus equi from other Streptococci of Lancefield’s Group C. J. Equine Sci. 12:47-
49.
16. QUINN, P.J. et al.(1994) Clinical Veterinary Microbiology, Spain: Wolfe, 648p.
17. SAMBROOK, J., RUSSELL, D.W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. 3
ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York.
18. SCHILD, A.L. Infecção por Streptococcus equi (Garrotilho). In: RIET-CORREA, F. et al.
(2001) Doenças de Ruminantes e Eqüinos. São Paulo: Varela, p.265-269, v.1.
19. SWEENEY, C.R. Streptococcus equi. In: SMITH, B.P. (1993) Tratado de Medicina
Interna de Grandes Animais. São Paulo : Manole, p.531-533.
20. THOMPSON, J.D. et al.(1994) Clustal W: Improving the sensitivity of progressive
multiple sequence alignment through sequence weighting, positions specific gap penalties and
weight matrix choice. Nucl Ac Res, 22:4673-4680.
21. TIMONEY, J.F. (2004) The pathogenic equine streptococci. Vet. Res, 35:397-409.
22. WELSH, R.D. (1984) The significance of Streptococcus zooepidemicus in the horse. Eq
Pract, 6:6-16.
23. WILKENS, C.A. Strangles. In: COETZER, J.A.W. et al. (1994) Infectious diseases of
livestock – With special reference to Southern Africa. Oxford University Press, v. 2, Cap.
149, p.1248-1251.
35
24. WONG, R.S.Y. & CHOW, A.W. (2002) Identification of enteric pathogens by heat shock
protein 60kDa (HSP60) gene sequences. FEMS Microbiol Lett, 206:107-113.
25. YURA, T.; NAGAI, H.; MURI, N. (1993) Regulation of the heat shock response in
bacteria. Annu Rev Microbiol, 47:321-350.
36
TABLE 1. Phenotypical and genotypical profile of Streptococcus strains isolated from horses.
n. source Biochemistry biotype
Sequencing
1 A S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
2 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
3 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
4 B
S. equi subesp. zooepidemicus III S. equi subesp. zooepidemicus
5 B S. dysgalactiae subesp. equisimilis II S. equi subesp. equi
6 B S. equi subesp. zooepidemicus III S. equi subesp. zooepidemicus
7 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
8 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
9 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
10 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
11 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
12 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
13 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
14 B S. equi subesp. zooepidemicus III S. equi subesp. zooepidemicus
15 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
16 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
17 B S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
18 C S. equi subesp. zooepidemicus III S. equi subesp. equi
19 D S. dysgalactiae subesp. equisimilis II S. equi subesp. zooepidemicus
20 D S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
21 D S. equi subesp. zooepidemicus III S. equi subesp. zooepidemicus
22 E S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
23 E S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
24 E S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
25 E S. equi subesp. equi I S. equi subesp. equi
26 E Streptococcus sp. IV S. equi subesp. equi
A: Parotid Lymph node; B: Retropharyngeal Lymph node; C: sub-mandibular lymph node; D: Nasal
Swab; E: Bastard abscess
37
4 . CONCLUSÕES
Os resultados deste trabalho evidenciam que apesar de freqüentemente utilizados, os
teste fenotípicos conduzem a erros no diagnóstico de alguns isolados. Nos casos em que a
caracterização fenotípica não é eficaz, principalmente na identificação de isolados atípicos, o
uso da análise da seqüência parcial do gene hsp60, apresenta um alto poder discriminatório e
pode ser útil no estabelecimento do diagnóstico molecular e como método de diferenciação
entre as subespécies de Streptococcus equi.
O custo da técnica ainda é alto o que dificulta sua utilização em rotinas laboratoriais,
entretanto sua utilização deve ser uma alternativa para casos de isolados atípicos, formas
clínicas severas e que envolvam animais de alto valor zootécnico.
38
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDULMAWJOOD, A. & LÄMMLER, C. Determination of intra-species variations of the
V2 region of the 16S rRNA gene of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Res Vet Sci, v.
68, p.33-39, 2000.
ALBER, J., et al. Multiplex polymerase chain reaction for identification and differentiation of
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus and Streptococcus equi subsp. equi. J Vet Med,
v.51, p.455-458, 2004a.
ALBER, J. et al. Polymerase chain reaction mediated identification of Streptococcus uberis
and Streptococcus parauberis using species-specific sequences of the genes encoding
superoxide dismutase A and chaperonin 60. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.
v.51, n.4, p.180-184, 2004b.
AL-GHAMDI, G.M., et al. Use of repetitive sequence-based polimerase Chain reaction for
molecular epidemiologic analysis of Streptococcus equi subspecies equi. Am J Vet Res,
v.61, n. 6, p.699-705, 2000.
ANZAI, T. et al. In vivo pathogenicity and resistance to phagocytosis of Streptococcus equi
strains with different levels of capsule expression. Vet Microbiol, v.67, p.277-286, 1999.
BIO MERIEUX. Api 20 Strep Catalogue Analytique. Bio Mérieux, Marcy-l´Etoile, França,
1997, 278 p.
BISNO, A.L.; COLLINS, C.M.; TURNER, J.C. M Proteins of group C Streptococci isolated
from patients with acute pharyngits. J Clin Microbiol, v.34, n10, p.2511-2515, 1996.
BROOKS, G.F.; BUTEL, J.S.; MORSE, S.A. Jawetz, Melnick & Adelberg Microbiologia
Médica. Cap. 15: Os Estreptococos. 21ªed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2000, p.163-
174.
BROUSSEAU, R. et al. Streptococcus suis serotypes characterized by analysis of chaperonin
60 gene sequences. Appl Environ Microbiol, v.67. n.10, p. 4828-4833, 2001.
39
BUCHNER, J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones. The
FASEB J, v.10, p.10-19, 1996
CHANTER, N. et al. Streptococci and enterococci as animal pathogens. J Appl Microbiol
Symp Suppl, 82, 110-109, 1997a.
CHANTER, N. et al. Characterization of the Lancefield group C Streptococcus 16S-23S RNA
gene intergenic spacer and its potential for identification and sub-specific typing. Epidemiol
Infect, n.118, p.125-135, 1997b.
CHANTER, N. et al. Recombinant hyaluronate associated protein as a protective immunogen
against Streptococcus equi and Streptococcus zooepidemicus challenge in mice. Microbiol
Pathogen, v.27, p.133-143, 1999.
CHANTER, N. et al. Streptococcus equi with truncated M-proteins isolated from
outwardly healthy horses. Microbiol, n. 146, p. 1361-1369, 2000.
COHEN, N.D. Causes of and farm management factors associated with disease and death in
foals. J Am Vet Med Assoc, n. 204, p.1644-54, 1994.
DOWNAR, J. et al. Streptococcal meningitis resulting from contact with an infected horse. J
Clin Microbiol, v. 39, n.6, p. 2358-2359, 2001.
DUARTE, R.S. et al. Phenotypic and molecular characteristics of Streptococcus agalactiae
isolates recovered from milk of dairy cows in Brazil. J Clin Microbiol, v.42, n.9, p.4214-
4222, 2004.
EUZÉBY, J.P. Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire. Capturado em 18/01/2005.
Disponível on-line: http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ss/equi.html
FACKLAM, R. What happened to the Streptococci: Overview of taxonomic and
nomenclature changes, Clin Microbiol Rev, v. 15, n.4, p.613-630, 2002.
FAO - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS.
Capturado em 23/10/2004. Disponível on-line: 2002 http://www.fao.org/
FERNANDEZ, E. et al. Streptococcus equi subsp. ruminatorum subsp. nov., isolated from
mastitis in small ruminants. J Syst Evol Microbiol, v.54, p.2291-2296, 2004.
40
FINK, A.L. Chaperone-mediated protein folding. Physiol rev. v.79, n.2, p.425-442, 1999.
FLANAGAN, J. et al. Characterization of the haemolytic activity of Streptococcus equi.
Microbiol Pathogen, v.24, p. 211-221, 1998.
FLOCK, M. et al. Recombinant Streptococcus equi proteins protect mice in challenge
experiments and induce immune response in horses. Infect and Immun, v. 72, n.6, p.3228-
3236, 2004.
GALAN J.E. & TIMONEY J.F. Molecular analysis of the M protein of Streptococcus equi
and cloning and expression of the M protein gene in Escherichia coli. Infect and Immun,
v.55, n 12, p.3181-3187, 1987.
GOEHRING, L.S. et al. Neurological syndromes among horses in The Netherlands. A 5 year
retrospective survey (1999-2004). Vet Q, v.27, n.1, p.11-20, 2005.
GOH, S.H. et al. HSP60 gene sequences as universal targets for microbial species
identification: Studies with coagulase-negative Staphylococci. J Clin Microbiol, v.34, n.4,
p.818-823, 1996.
GOH, S.H. et al. Streptococcus iniae, a human and animal pathogen: specific identification by
the chaperonin 60 gene identification method. J Clin Microbiol, v.36, p.2164-2166, 1998.
GONZALES-REY, C. et al. RAPD-PCR and PFGE as tools in the investigation of an
outbreak of beta-haemolytic Streptococcus group A in a Swedish hospital. Comp Immunol
Microbiol Infect Dis, v. 26, n.1, p.25-35, 2003.
GRAGEROW, A. et al. Protein aggregation and inclusion body formation in Escherichia coli
rpoH mutant defective in heat shock protein induction. FEBS Lett, v.291, p. 222-224, 1991.
GRANT, S.T.; EFSTRATION, A.; CHANTER, N. Laboratory diagnosis of strangles and the
isolation of atypical Streptococcus equi. Vet Rec, v. 133, p.215-216, 1993.
HARRINGTON, D.J.; SUCLIFFE, I.C.; CHANTER, N. The molecular basis of
Streptococcus equi infection and disease. Microbiol and Infect, v. 4, p.501-510, 2002.
41
HOFFMAN, A.M. et al. Clinical and endoscopic study to estimate the incidence of distal
respiratory tract infection in thoroughbred foals on Ontario breeding farms. Am J Vet Res, v
54, p. 1602-1607, 1993.
JACOBS, A.A.C. et al. Investigations towards an efficacious and safe strangles vaccine:
submucosal vaccination with a live attenuated Streptococcus equi. Vet Rec, n.147, p.563-
567, 2000.
KAESE, H.J. et al. Infective purpura hemorrhagic in five horses. J Am Vet Med Assoc., n.
226, v. 11, p.1893 – 1898, 2005.
KAWAMURA, Y. et al. Determination of 16S rRNA sequences of Streptococcus mitis and
Streptococcus gordonii and phylogenetic relationships among members of the genus
Streptococcus, Int J Syst Bacteriol, v. 45, p. 406-408, 1995.
KAWATA, K. et al. rDNA sequence analyses of Streptococcus dysgalactiae subsp.
equisimilis isolates from pigs. Int J Syst Evol Microbiol, v. 53, p.1941-1946, 2003.
KOL, A., et al. Complicated strangles: two case reports and a literature review. Israel J Vet
Med, v.58, 2003.
KOWALSKI, J.J. Mecanismo da doença Infecciosa. In: REED, S.M & BAYLY, W.M.
Medicina Interna Eqüina. Rio de Janeiro: Rio de Janeiro, p.5456, 2000.
KUWAMOTO, Y.; ANZAI, T.; WADA, R. Microplate sugar-fermentation assay
distinguishes Streptococcus equi from other Streptococci of Lancefield’s Group C. J Equine
Sci, v. 12, n.2, p.47-49, 2001.
LANNERGARD et al. CNE, a collagen-biding protein of Streptococcus equi. FEMS
Microbiol Letter, v.222, p.69-74, 2003.
LAVOIE J.P.; FISET, L.; LAVERTY, S. Review of 40 cases of lung abscesses in foals and
adult horses. Equine Vet J, v.26, p.348-352, 1994.
LEE, A.S; DYER, J.R. Severe Streptococcus zooepidemicus infection in a gardener, MJA,
v.180, n.7, p. 366, 2004.
LÉGUILLETTE, R.; ROY, M.F.; LAVOIE, J.P. Foal Pneumonia. Equine Respiratory
Diseases. 21-Jan-2002. Disponível on-line: www.ivis.org . Capturado em 15/01/2005.
42
LEWIN, B. Genes VII. Parte 2 – Proteínas, cap.8, p.184-188. Artmed, Porto Alegre, 2001.
LUND, P.A. et al. The chaperonins: Perspectives from the archaea, Bioch Society Trans,
v.31, p.684-685, 2003.
McPHERSON, M.J. & MOLLER, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers: Oxford, 2000, p.9-
19.
NEWTON, J.R. et al. Control of strangles outbreaks by isolation of guttural pouch carriers
identified using PCR and culture of Streptococcus equi. Equine Vet J, v.32, p.515-523,
2000.
NICHOLSON, M.L. et al. Analysis of Immunoreactivity to a Streptococcus equi subsp.
zooepidemicus M-like protein to confirm an outbreak of post streptococcal
glomerulonephritis, and sequences of M-like proteins from isolates obtained from different
host species. J Clin Microbiol, v.38, n 11, p.4126-4130, 2000.
NOMOTO, R. et al. Lancefield group C Streptococcus dysgalactiae infection responsible for
fish mortalities in Japan.
J Fish Dis, v.27, n.12, p.679-86, 2004.
OIKAWA, M. et al. Pathology of equine respiratory disease occurring in association with
transport. J Comp Pathol., v. 113, p. 29-43, 1995.
POYART, C. et al. Identification of Streptococci to species-level by sequencing the gene
encoding the manganese-dependent superoxide dismutase. J Clin Microbiol .36, p.41-47,
1998.
PRESCOTT, J. & WRIGHT, B. Strangles in Horses. Ministry of Agriculture and Food.
Ontário, September 2000. Disponível Online
http://www.gov.on.ca/OMAFEA/english/livestock/horses/fact/info_strangles.htm. Capturado
em 08/04/2003.
QAMRA, R. & MANDE, S.C. Crystal structure of the 65-kilodalton Heat shock protein,
chaperonin 60.2 of Mycobacterium tuberculosis, J Bacteriol, v.188, n.23, p.8105-8113, 2004.
QUINN, P.J. et al. Clinical Veterinary Microbiology, Spain: Wolfe, 1994. 648p.
43
RADOSTITS, O. M. et al. Clínica Veterinária – Um Tratado de Doenças dos Bovinos,
Ovinos, Suínos, Caprinos e Equinos. 9ª ed, Guanabara Koogan: Rio de Janeiro. Doenças
Causadas por Bactérias – I. 2002, p.632-636.
SALASIA, S.I.O. et al. Persistent occurrence of a single Streptococcus equi subsp.
zooepidemicus clone in the pig and monkey population in Indonesia, J Vet Sci, v.5, n.3,
p.263-265, 2004.
SCHILD, A.L. Infecção por Streptococcus equi (Garrotilho). IN: RIET-CORREA, F. et al..
Doenças de Ruminantes e Equinos. Ed. Varela : São Paulo. v 1, p.265-269, 2001.
SECHI, L.A. et al. Molecular characterization of Streptococcus equi subspecies equi isolated
from an Ethiopian camel by ribotyping and PCR-ribotyping, New Microbiol, v.22, n.4,
p.383-387, 1999.
SHEORAN, A.S.; ARTIUSHIN, S.; TIMONEY, J.F. Nasal mucosal immunogenicity for the
horse of a SeM peptide of Streptococcus equi genetically coupled to cholera toxin. Vac, v.20,
p.1653-1659, 2002.
SOEDARMANTO, I. et al. Identification and molecular characterization of serological group
C Streptococci isolated from diseased pigs and monkeys in Indonesia. J Clin Microbiol, v.34,
p. 2201-2204, 1996.
SMITH, H. Reaction to strangles vaccination. Aust Vet J, v.71 n.8, p.257-258, 1994.
TEIXEIRA, L.M.; TRABULSI, L.R. Cap 22: Streptococcus, Enterococcus e gêneros
relacionados. IN: TRABULSI, L.R. & ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4ª ed. Atheneu, São
Paulo, 2004. p.189-193.
TIMONEY, J.F. Streptococcus. IN: GYLES, C.L. & THOEN, C.O. Pathogenesis of
Bacterial Infections in Animals. 2 ed. Iowa Press, 1993a, p.3 – 20.
TIMONEY, J.F. & MUKHTAR, M.M. The protective M proteins of the equine group C
streptococci. Vet Microbiol, v.37, p.389-395, 1993b.
TIMONEY, J.F.; ARTIUSHIN, S.C.; BOSCHWITZ, J.S. Comparison of the Sequences and
Functions of Streptococcus equi M-Like SeM and SzPSe. Infect and Immun, v.65. n 9,
p.3600-3605, 1997.
44
TIMONEY, J.F. & ARTIUSHIN, S.C. Detection of Streptococcus equi in equine nasal swabs
and washes by DNA amplification. Vet Rec, v.141, p.446-447, 1997
TIMONEY, J.F. The pathogenic equine streptococci. Vet Res, v. 35, p.397-409, 2004.
WALKER, J.A.; TIMONEY, J.F. Construction of a stable non-mucoid deletion mutant of the
Streptococcus equi Pinnacle vaccine strain. Vet Microbiol, v.6, n 89, p.311-321, 2002.
WALLACE, F.J. et al. An assessment of mucosal immunization in protection against
Streptococcus equi (‘strangles’) infections in horses. Vet Immun and Immunopathol, v.48,
p.139-154, 1995.
WELSH, R.D. The significance of Streptococcus zooepidemicus in the horse. Equine Pract,
v.6, p.6-16, 1984.
WILKENS, C.A. Strangles. In: COETZER, J.A.W. et al. Infectious diseases of livestock –
With special reference to Southern Africa. Oxford University Press, v. 2, Cap. 149,
p.1248-1251, 1994.
WONG, R.S.Y. & CHOW, A.W. Identification of enteric pathogens by heat shock protein
60kDa (HSP60) gene sequences. FEMS Microbiol Lett, v.206, p.107-113, 2002.
YOUNAN, M. et al. Identification and molecular characterization of Streptococcus equi
subsp. zooepidemicus isolated from camels (Camelus dromedarius) and camel milk in Kenya
and Somalia. J Vet Med, v. 52, p.142-146, 2005.
ZAOUTIS, T; ATTIA, M.; GROSS, R.; KLEIN, J. The role of group C and group G
streptococci in acute pharyngits in children. Clin Microbiol Infect, v.10, n.1, p.37-40, 2004.
45
ANEXO A – Fatores de Virulência e patogenicidade de Streptococcus do
grupo C de Lancefield em animais.
Espécie Grupo
de Lancefield
Fatores de Virulência Doença
S. equi subesp. equi C
Cápsula de ácido hialurônico,
proteína M, hemolisina e
estreptoquinase, toxina leucocidina
Adenite eqüina
S. equi subesp.
zooepidemicus
C
Cápsula de ácido hialurônico,
proteína M, hemolisina e
estreptoquinase
Infecções oportunistas
de trato respiratório
S. dysgalactiae
subesp. equisimilis
C Hialuronidase, estreptoquinase,
proteína ligante da fibronectina
(FBP) e proteína M
Metrites, e placentite
em eqüídeos, artrite em
suínos e mastites em
pequenos ruminantes
S. equi subesp.
ruminatorum
C Mastite em pequenos
ruminantes
Fonte: GYLES, 1993 – adaptada
46
ANEXO B – Características fenotípicas de Streptococcus do grupo C de
Lancefield.
Trealose Sorbitol Lactose Maltose
Streptococcus equi subesp. equi
- - - +
Streptococcus equi subesp. zooepidemicus
- + + + (-)
Streptococcus dysgalactiae subesp. equisimilis
+ - V +
Streptococcus equi subesp. ruminatorum
- + + +
Fonte: QUINN, 1994 – adaptada
47
ANEXO C – Alinhamento das seqüências de hsp60 de S. equi subesp. equi e
S. equi subesp. zooepidemicus obtidas no GenBank
Sequiequi :
Sequizooe :
* 20 * 40 * 60
GCTACTGTTTTGACCCAAGCGATTGTGCGTGAAGGGCTTAAAAATGTAACAGCAGGTGCT
GCTACTGTTTTGACCCAAGCGATTGTGCGTGAAGGGCTTAAAAATGTAACAGCAGGTGCT
GCTACTGTTTTGACCCAAGCGATTGTGCGTGAAGGGCTTAAAAATGTAACAGCAGGTGCT
: 60
: 60
Sequiequi :
Sequizooe :
* 80 * 100 * 120
AACCCAATTGGTATTCGTCGTGGGATTGAAGCAGCGACAACGACAGCTGTCGAGGCCTTA
AACCCAATTGGTATTCGTCGTGGGATTGAAGCAGCAACAACGACAGCTGTTGAGGCCTTA
AACCCAATTGGTATTCGTCGTGGGATTGAAGCAGC ACAACGACAGCTGT GAGGCCTTA
: 120
: 120
Sequiequi :
Sequizooe :
* 140 * 160 * 180
AAGGCTGTTGCTCAACCAGTATCTGGAAAAGAAGCTATTGCTCAAGTAGCTTCGGTGTCA
AAGGCTGTTGCTCAACCAGTATCTGGAAAAGAAGCGATTGCTCAAGTAGCTTCGGTGTCA
AAGGCTGTTGCTCAACCAGTATCTGGAAAAGAAGC ATTGCTCAAGTAGCTTCGGTGTCA
: 180
: 180
Sequiequi :
Sequizooe :
* 200 * 220 * 240
TCACGTTCTGAAAAGGTTGGTGACTATATTTCTGAAGCTATGGAGCGCGTGGGAAATGAT
TCACGTTCTGAAAAGGTTGGTGACTATATTTCTGAAGCTATGGAGCGCGTGGGAAATGAT
TCACGTTCTGAAAAGGTTGGTGACTATATTTCTGAAGCTATGGAGCGCGTGGGAAATGAT
: 240
: 240
Sequiequi :
Sequizooe :
* 260 * 280 * 300
GGTGTGATTACTATTGAGGAATCACGTGGTATGGAAACAGAGCTTGAGGTTGTTGAGGGA
GGTGTTATCACTATTGAGGAATCACGTGGTATGGAAACAGAGCTTGAGGTTGTTGAGGGA
GGTGT AT ACTATTGAGGAATCACGTGGTATGGAAACAGAGCTTGAGGTTGTTGAGGGA
: 300
: 300
Sequiequi :
Sequizooe :
* 320 * 340 * 360
ATGCAGTTTGACCGCGGCTATTTGTCACAATACATGGTCACTGACAATGAAAAAATGGTT
ATGCAGTTTGACCGCGGCTATTTGTCACAATACATGGTTACTGACAATGAAAAAATGGTT
ATGCAGTTTGACCGCGGCTATTTGTCACAATACATGGT ACTGACAATGAAAAAATGGTT
: 360
: 360
Sequiequi :
Sequizooe :
* 380 * 400 * 420
GCTGATCTTGAAAACCCATTTATCCTGATTACTGATAAGAAAATTTCTAATATCCAAGAC
GCTGATCTTGAAAACCCATTTATCCTGATTACTGATAAGAAAATTTCTAATATCCAGGAT
GCTGATCTTGAAAACCCATTTATCCTGATTACTGATAAGAAAATTTCTAATATCCA GA
: 420
: 420
Sequiequi :
Sequizooe :
* 440 * 460 * 480
ATTCTTCCATTGCTTGAGGAGGTGCTTAAGACTAGCCGTCCATTGTTGATCATTGCTGAT
ATTCTTCCTTTGCTTGAGGAGGTGTTGAAAACAAGCCGTCCATTGCTGATCATTGCTGAT
ATTCTTCC TTGCTTGAGGAGGTG T AA AC AGCCGTCCATTG TGATCATTGCTGAT
: 480
: 480
Sequiequi :
Sequizooe :
* 500 * 520 * 540
GATGTTGATGGCGAAGCCCTTCCGACCCTAGTGCTTAATAAAATTCGTGGTACCTTCAAT
GATGTTGATGGCGAAGCCCTTCCGACCTTAGTGCTTAATAAAATTCGTGGGACCTTCAAT
GATGTTGATGGCGAAGCCCTTCCGACC TAGTGCTTAATAAAATTCGTGG ACCTTCAAT
: 540
: 540
Sequiequi :
Sequizooe :
*
GTTGTAGCGGTT
GTTGTAGCGGTT
GTTGTAGCGGTT
: 552
: 552
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo