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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
ANGIOTENSINA II NO MECANISMO INICIAL DE
OVULAÇÃO, ATRAVÉS DOS RECEPTORES AT
2
, EM
BOVINOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Rogério Ferreira
Santa Maria, RS, Brasil
2006
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ANGIOTENSINA II NO MECANISMO INICIAL DE
OVULAÇÃO, ATRAVÉS DOS RECEPTORES AT
2
, EM
BOVINOS
por
Rogério Ferreira
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Fisiopatologia da Reprodução Animal, da Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária.
Orientador: Prof. João Francisco Coelho de Oliveira
Santa Maria, RS, Brasil
2006
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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
ANGIOTENSINA II NO MECANISMO INICIAL DE OVULAÇÃO,
ATRAVÉS DOS RECEPTORES AT
2
, EM BOVINOS
elaborada por
Rogério Ferreira
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
Paulo Bayard Dias Gonçalves, PhD.
(Presidente/Co-orientador)
José Carlos Ferrugem Moraes, Dr. (EMBRAPA Pecuária Sul)
Eraldo Lourenso Zanella, PhD. (UPF)
Santa Maria, 19 de janeiro de 2006.
AGRADECIMENTOS
Agradeço:
Aos meus pais e meu irmão, que incondicionalmente serviram de apoio e me
incentivaram em mais uma jornada. A eles dedico o fruto do meu esforço;
Àqueles que sempre me incentivaram e fizeram despertar o gosto pela pesquisa, Drs.
Cláudio Alves Pimentel e José Carlos Ferrugem Moraes;
Aos meus orientadores, João Francisco Coelho de Oliveira e Paulo Bayard Dias
Gonçalves, pela dedicação, companheirismo, amizade, e inestimável contribuição à minha
formação pessoal e profissional;
À Vanessa, minha grande companheira, pela amizade, conforto e carinho em todas as
horas.
Aos meus avós,pela amizade e pelo incansável apoio ao meu aprendizado e formação;
Ao Rafael, Jerônimo, Luciano, Felipe Escobar e Rodrigo, que deixaram o conforto de
seus lares, e tiveram contribuição indispensável para a realização dos experimentos;
Ao grande amigo e companheiro de todas as horas, Luciano;
Aos meus irmãos do 31, Bito, Bernardo e Edu, pela amizade e excelente convivência
durante esses dois anos de caminhada;
À grande família BioRep, pela ajuda, companheirismo e amizade;
Ao Fabiano pela amizade e grandes ensinamentos;
Aos grandes amigos que conquistei em Santa Maria, Henrique, Stella, Pati e Lessana,
pela adorável convivência;
Aos vizinhos “dos cavalos”, Henricão e Santiago, pela amizade.
Aos meus amigos Narinha, Kátia e Hidal e Hítalo pela ajuda e amizade;
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos;
Enfim, a todos que contribuíram e torceram por mim.
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
ANGIOTENSINA II NO MECANISMO INICIAL DE OVULAÇÃO,
ATRAVÉS DOS RECEPTORES AT
2
, EM BOVINOS
Autor: Rogério Ferreira
Orientador: João Francisco Coelho de Oliveira
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 10 de fevereiro de 2006.
O presente trabalho teve por objetivo averiguar o papel da angiotensina II (Ang II) no
mecanismo de ovulação em bovinos, utilizando um modelo “in vivo” através da injeção de
inibidores da AngII em folículos pré-ovulatórios. Os animais foram pré-sincronizados e
quando os folículos atingiram um diâmetro mínimo de 12mm, receberam os tratamentos e
foram desafiados com uma aplicação IM de análogo de GnRH. A aplicação intrafolicular de
100μM de saralasina bloqueou a ovulação somente quando realizada antes do início do cio,
ou seja, antes do pico de LH (14,3% e 83,3% das vacas ovularam nos grupos saralasina e
controle, respectivamente; P<0,05). Baseado nesses resultados, foi delineado um segundo
experimento para determinar o momento em que a Ang II desempenha papel crítico na
ovulação. Quando a saralasina foi aplicada 0 e 6 horas após a aplicação do análogo do
GnRH, houve um bloqueio da ovulação (16,7% e 42,9%, para os grupos 0 e 6 horas,
respectivamente), mas não quando esta foi aplicada 12 horas após a aplicação de GnRH
(100%; P<0,001). Para determinar qual receptor está envolvido no mecanismo de ovulação
induzido por Ang II, foi realizada uma aplicação intrafolicular de losartan (inibidor dos
receptores AT
1
de Ang II), PD123,319 (inibidor AT
2
), losartan+PD123,319 ou solução
fisiológica em folículos pré-ovulatórios desafiados com GnRH. A ovulação foi inibida pela
aplicação de PD123,319 e losartan+PD123,319 (50% e 33,3%, respectivamente), mas não
pela aplicação de losartan ou solução fisiológica (100% em ambos os grupos). Os resultados
6
apresentados demonstram que a Ang II desempenha um papel fundamental na regulação da
ovulação em bovinos via receptores AT
2
.
Palavras-chaves: saralasina, losartan, PD123,319, injeção intrafolicular, bovinos,
receptores AT
2
.
ABSTRACT
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
THE ROLE OF ANGIOTENSIN II ON EARLY MECHANISM OF
BOVINE OVULATION VIA AT
2
RECEPTOR SUBTYPE
Autor: Rogério Ferreira
Orientador: João Francisco Coelho de Oliveira
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 10 de fevereiro de 2006.
The aim of this work was to investigate the role of angiotensin II (Ang II) in the
mechanism of ovulation in the bovine, using an “in vivo” model, through the injection of the
Ang II receptor antagonists in mature follicles. The animals were pre-synchronized and when
the follicles reached a minimum diameter of 12mm, they received the treatments and were
challenged with an IM application of GnRH-analogous. The intrafolicular application of 100
μM of saralasin blocked the ovulation only before estrous; therefore, before the LH surge
(14.3% e 83.3% cows ovulated in the saralasin and control group, respectively; P<0.05).
Based in these results, a second experiment was carried out to determine the moment in which
Ang II plays critical role in the ovulation. Saralasin blocked ovulation only when applied at 0
and 6 hours (16.7 e 42.9% in the 0 and 6 hours groups, respectively) but not at 12 hours
(100%) after GnRh-analogous treatment (P<0.001). To determine which Ang II receptor is
involved in the LH-induced ovulation, an intrafolicular application of losartan (AT
1
-Ang II
receptor-antagonist), PD123,319 (AT
2
antagonist), losartan+PD123,319 or saline was
performed at the moment in which the cows were challenged with GnRH-analogous. The
ovulation was inhibited by PD123,319 and losartan+PD123,319 application (50.0 e 33.3%
on ovulation rate, respectively), but not by the application of losartan or saline solution
(100% in both the groups). The results demonstrated that Ang II plays a basic role in the
early mechanism of bovine ovulation via AT
2
receptor subtype.
8
Key words: saralasin, losartan, PD123,319, intrafollicular injection, bovine, AT
2
receptor.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Efeito da injeção intrafolicular de saralasina ou solução fisiológica na
taxa de ovulação de vacas com folículos maiores que 12mm desafiados com análogo do
GnRH de acordo com a manifestação de estro no momento da aplicação dos tratamentos..... 40
FIGURA 2 - Efeito da injeção intrafolicular de saralasina em diferentes horas após a
aplicação de GnRH na taxa de ovulação de folículos tratados com diâmetro >12mm ............ 41
FIGURA 3 - Efeito da injeção intrafolicular de inibidores específicos dos receptores
de Ang II na taxa de ovulação de folículos tratados com diâmetro superior a 12mm e
desafiados com uma aplicação IM de análogo do GnRH......................................................... 42
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.................................................................................................4
RESUMO.......................................................................................................................5
ABSTRACT...................................................................................................................7
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................9
SUMÁRIO...................................................................................................................10
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..............................................................................12
2.1. Ovulação...........................................................................................................12
2.1.1. Prostaglandinas...........................................................................................14
2.2. Angiotensina.....................................................................................................15
2.2.1. Sistema renina-angiotensina .......................................................................15
2.2.2. Receptores da angiotensina II.....................................................................18
2.2.3. Papel da angiotensina na ovulação .............................................................20
2.2.4. Efeito da angiotensina na maturação nuclear do oócito .............................21
2.2.5. Efeito da angiotensina na esteroidogênese .................................................22
3. CAPÍTULO 1..........................................................................................................23
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 44
1. INTRODUÇÃO
A ovulação em bovinos é controlada por uma complexa e dinâmica interação de
fatores, incluindo mecanismos endócrinos e vasoativos, mensageiros celulares, proteases,
quinases e enzimas ativadoras (ESPEY, 1980). Até o presente momento, são conhecidos
muitos eventos envolvidos no processo de síntese dos mediadores inflamatórios e proteases,
indispensáveis para que ocorra a ovulação. No entanto, os mecanismos que controlam e
desencadeiam esses eventos ainda não estão bem esclarecidos.
A angiotensina II (Ang II) está envolvida em uma série de eventos que controlam e
desencadeiam as funções reprodutivas fisiológicas das fêmeas. No entanto, os estudos sobre a
atividade desse peptídeo nessas funções têm se concentrado principalmente em coelhos,
camundongos e humanos. Hoje se sabe que, na espécie bovina, a Ang II aumenta suas
concentrações no fluido folicular após o pico de LH (ACOSTA et al., 2000), existem
receptores para esse peptídeo nas células foliculares (BRUNSWIG-SPICKENHEIER &
MUKHOPADHYAY, 1992; ACOSTA et al., 1999), e que está envolvida na esteroidogênese
(ACOSTA et al., 1999) e na maturação nuclear de oócitos (GIOMETTI et al., 2005).
Entretanto, o envolvimento do sistema renina-angiotensina na ovulação em bovinos não é
conhecido até o presente momento. O objetivo do presente trabalho foi estudar, através de um
modelo in vivo, o envolvimento da Ang II no processo de ovulação em bovinos. Foram
delineados experimentos para verificar se Ang II é indispensável para a ovulação, em que
momento isso ocorre e quais receptores estão envolvidos na ovulação induzida por esse
peptídeo. Para isso, foi adaptado um sistema de injeção intrafolicular, o qual permite
manipular o ambiente folicular, propiciando um melhor entendimento da ovulação nos
bovinos.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Ovulação
A ovulação nos mamíferos é semelhante a um processo inflamatório e culmina com a
ruptura do estigma ovulatório e liberação do oócito. A cascata da ovulação é iniciada no
momento que o tecido folicular é estimulado pelo pico pré-ovulatório de LH ou,
experimentalmente, por eCG e hCG (MCFARLAND et al., 1989), FSH (SCHENKEN et al.,
1984; ARMSTRONG & OPAVSKY, 1988; GALWAY et al., 1990) ou GnRH (EKHOLM et
al., 1981; DAVIS et al., 1986). Esse evento envolve um complexo processo metabólico
regenerativo e degenerativo simultâneo, envolvendo proteases, colagenases e fatores
vasoativos como prostaglandinas (PG) e leucotrienos (ESPEY, 1980). Embora o processo de
luteinização não dependa da ovulação, o processo ovulatório parece ser parte integrante dos
primeiros estágios da luteinização. Portanto, a ovulação e luteinização são dependentes dos
eventos nas células da granulosa e da teca interna, levando à ruptura do folículo, a qual
também depende da ativação de fibroblastos no tecido conjuntivo das células da teca (ESPEY
& LIPNER, 1994).
A parede folicular é constituída de uma matriz rica em colágeno, onde, geralmente,
ocorre a ação de enzimas proteolíticas que atuam no tecido conjuntivo no momento da
ovulação. O ativador do plasminogênio parece ser responsável por mecanismos celulares e
pelo remodelamento da matriz extracelular (CAMPBELL et al., 1987). Do remodelamento da
matriz extracelular participam várias proteases atuando em cascata, incluindo
metaloproteinases e o ativador do plasminogênio. Ativadores do plasminogênio são serinas
que convertem o plasminogênio zimógeno extracelular em plasmina, uma protease ativa que
degrada componentes da matriz extracelular (BLASI et al., 1987).
A ovulação somente ocorre em folículos pré-ovulatórios com concentrações
adequadas de receptores para LH. RAJANIEMI et al. (1974), usando
125
I-hCG, revelaram que
a maioria dos receptores estão localizados na membrana plasmática das células da teca interna
de ovários de ratas, enquanto que as células da granulosa apresentaram-se livres da marcação
do isótopo. No entanto, outros estudos mostraram que apesar de haver uma grande densidade
de receptores nas células da teca, só ocorre a quebra da membrana basal quando as células da
granulosa possuem receptores para LH (AMSTERDAM et al., 1975; UILENBROEK &
RICHARDS, 1979; RICHARDS, 1980). Alguns trabalhos evidenciaram a expressão de
13
receptores para LH nas células da granulosa apenas em folículos com diâmetro superior a
11mm (EVANS & FORTUNE, 1997). No entanto, outros autores verificaram a expressão de
receptores para LH nas células da granulosa em todos os tamanhos de folículos antrais. No
mesmo trabalho, os autores observaram que ocorrem splicing’s alternativos formando cópias
abortivas de mRNA, não levando à formação da proteína (ROBERT et al., 2003).
A ação do LH na luteinização e na esteroidogênese é mediada pelo AMP cíclico
(AMPc). Este segundo mensageiro aumenta em dez vezes após exposição do folículo ao LH
(GOFF & MAJOR, 1975; SELSTAM et al., 1976; WEISS et al., 1976). As células da teca
interna são a principal fonte de AMPc, no entanto as células da granulosa possuem resposta
similar ao estímulo do LH (WEISS et al., 1976; RICHARDS et al., 1986). O AMPc atua
diretamente em proteínas quinase para induzir a expressão do citocromo P450 de clivagem da
cadeia lateral do colesterol (P450
scc
), enzima marca-passo que faz a conversão do colesterol
em pregnolona (RICHARDS et al., 1986).
Quando ocorre a ligação do LH a seus receptores ligados à proteína G, há um estímulo
da adenil ciclase e um aumento nas concentrações de AMPc (MCFARLAND et al., 1989). A
fosforilação dos receptores e de suas proteínas G associada com o aumento intracelular de
AMPc estimulam a ativação de fosfolipases, as quais amplificam o sinal intracelular por
hidrólise de fosfolipídios de membrana, que servem como segundos mensageiros
(ITSKOVITZ et al., 1987; DAUD et al., 1990; ESPEY, 1992). A fosfolipase C e a fosfolipase
A
2
são as principais fosfolipases que participam dos eventos bioquímicos da ovulação. A
fosfolipase C hidrolisa o fosfatidil inositolbifosfato gerando inositol trifosfato (IP
3
) e
diacilglicerol (DAG), os quais são responsáveis pela liberação do Ca
++
do retículo
endoplasmático e ativação da proteína quinase C (LEUNG & STEELE, 1992; ESPEY, 1992).
O estímulo da síntese de progesterona por LH e AMPc é provavelmente afetado pela
concentração intracelular de Ca
++
(VELDHUIS & KLASE, 1982), mas seu papel na
esteroidogênese não foi estabelecido. O DAG pode ser clivado pela DAG lipase, gerando
ácido araquidônico, principal substrato para a síntese de prostaglandinas (ESPEY, 1992). Já a
fosfolipase A
2
é capaz de atuar em cerca de 75% dos fosfolipídios de membrana da maioria
das células dos mamíferos para gerar ácido araquidônico (ESPEY, 1992).
O processo de sinalização induzido pelo pico de LH promove uma intensa atividade de
transcrição e tradução nas células da teca e da granulosa. O aumento da síntese protéica está
associado com o aumento na formação de mRNA, o qual inicia uma hora após o estímulo do
LH e persiste até poucas horas antes da ruptura (BARROS & AUSTIN, 1968; REEL &
GORSKI, 1968). A síntese de mRNA e proteínas parece ser mais intensa nas células da teca
14
interna que nas da granulosa. Alguns estudos têm demonstrado que os mRNA’s produzidos
pelas células foliculares são de enzimas responsáveis pela formação dos esteróides ovarianos
(HEDIN et al., 1987; OONK et al., 1989), calicreína, ativador do plasminogênio
(O'CONNELL et al., 1987; GALWAY et al., 1990), colagenases (REICH et al., 1991) e
inibidores de metaloproteinases (CURRY, JR. ET AL., 1990).
2.1.1. Prostaglandinas
A ação das PGs no processo de ovulação foi inicialmente descrita por
LABHSETWAR (1971/1972), e extensivamente estudada durante as últimas décadas. As PGs
( principalmente a PGE
2
) induzem a vasodilatação tecidual e alterações na região apical do
folículo pré-ovulatório (KITAI et al., 1985; YOSHIMURA et al., 1988). A aplicação
intravenosa de indometacina, um potente antiinflamatório não esteróide, durante o processo
ovulatório determina uma diminuição dos níveis de PGF
2α
e PGE
2
bloqueando, com isso, a
ovulação (ESPEY et al., 1986). YOSHIMURA et al. (1993), através da aplicação de
saralasina (antagonista competitivo da Ang II), provocaram a inibição da produção de PGs
por hCG e conseqüentemente a ovulação.
A primeira etapa da biossíntese ocorre com a hidrólise dos ácidos graxos e
fosfolipídios da membrana celular por meio da fosfolipase A
2
(PLA
2
). O ácido araquidônico
(AA) é o precursor mais importante dos eicosanóides, sendo que a transformação deste
composto pode ocorrer através de três diferentes vias, que implicam cada uma delas a
dependência das seguintes enzimas: cicloxigenase, lipoxigenase e epoxigenase (STRYER,
1996; HINZ & BRUNE, 2002). A PLA
2
pertence à superfamília das enzimas envolvidas no
mecanismo celular de liberação de PGF
2α
e catalisa a hidrólise dos fosfolipídios, gerando
ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. A PLA
2
controla a liberação de PG sendo, neste caso,
dependente da presença de sais de cálcio no espaço intracelular (BALSINDE et al., 2002). A
via cicloxigenase foi a primeira rota do metabolismo do AA a ser descoberta e tem envolvida
a enzima denominada prostaglandina endoperóxido sintetase (PG sintetase) também chamada
de cicloxigenase. Essa enzima catalisa a endoperoxidação do AA em intermediários muito
instáveis, as prostaglandinas endoperóxidos PGG
2
e PGH
2
. Por isomerização, rapidamente,
são formadas algumas prostaglandinas como PGD
2
, PDE
2
e PGF
2α
(STRYER, 1996).
15
2.2. Angiotensina
A Ang II é bem conhecida na regulação da pressão sanguínea e manutenção da
osmolaridade através do sistema renina-angiotensina (RAS). A atividade de Ang II tem sido
relatada em diversos sistemas extra-renais, incluindo o cérebro (GANONG, 1984), o coração
(LINDPAINTNER et al., 1987), as glândulas salivares (WILSON et al., 1977), veias
(CEDARD et al., 1989) e testículos (PANDEY & INAGAMI, 1986). No ovário, a atividade
de Ang II tem sido descrita em algumas espécies com diferentes ações. Em coelhas, sua
atividade está relacionada à maturação do oócito, ovulação e esteroidogênese (YOSHIMURA
et al., 1992; 1993; TANAKA et al., 1995; FERAL et al., 1995; HAYASHI et al., 2000). Em
bovinos a atividade de Ang II está relacionada com o crescimento folicular (NIELSEN et al.,
1994) e com a reversão da inibição nuclear in vivo causada por células foliculares e meios
condicionados (GIOMETTI et al., 2005). Além disso, a Ang II parece ser um peptídeo
vasoativo importante no processo de ovulação, formação do corpo lúteo e luteólise (ACOSTA
& MIYAMOTO, 2004).
2.2.1. Sistema renina-angiotensina
O precursor do RAS é o angiotensinogênio, o qual é clivado pela renina formando a
angiotensina I. Esta por sua vez sofre a ação da enzima conversora de angiotensina (ECA)
transformando-a em Ang II. A ativação da renina se dá pela clivagem de um segmento de 43
aminoácidos da pró-renina (DO et al., 1987) e parece ocorrer somente nos rins, uma vez que
não é detectada em animais com nefrectomia bilateral (SEALEY et al., 1977). A pró-renina é
produzida e secretada principalmente pelos rins, no entanto existem fontes extra-renais de
pró-renina, uma vez que é detectada em machos e fêmeas com nefrectomia bilateral
(SEALEY et al., 1977). As concentrações de pró-renina no fluido folicular são 100 vezes
superiores àquelas encontradas na circulação (SEALEY et al., 1986; GLORIOSO et al.,
1986), e parece ser proporcional ao número de folículos pré-ovulatórios (ITSKOVITZ et al.,
1987). Em mulheres, a concentração plasmática de pró-renina aumenta durante os três dias de
elevação do LH, permanecendo elevada durante a fase luteal e diminui concomitantemente
com a redução dos níveis de progesterona (SEALEY et al., 1985). A secreção ovariana de
pró-renina é regulada por gonadotrofinas, observando-se um pico nas concentrações de pró-
renina 8 horas após o pico pré-ovulatório de LH (SEALEY et al., 1987). Como a pró-renina
16
não tem uma atividade catalítica conhecida no plasma, o significado dessa produção ovariana
ainda não está claro (YOSHIMURA, 1997).
Estudos sobre a possível produção ovariana de renina são bastante controversos.
Níveis plasmáticos de renina não aumentam após o pico de LH, nem aumentam após
administração de hCG quando as concentrações de pró-renina atingem os níveis mais altos
(ITSKOVITZ et al., 1987). Em um estudo com uma mulher nefrectomizada bilateralmente,
não foram detectados níveis plasmáticos de renina, no entanto os níveis de pró-renina
aumentaram antes da elevação de progesterona, concomitantemente com o aumento nos
níveis de LH e estradiol (BLANKESTIJN et al., 1990). A renina está elevada apenas no meio
da fase luteal em mulheres com o ciclo menstrual normal. Estes achados sugerem que a pró-
renina é secretada em resposta ao LH ou hCG, enquanto a renina é secretada pelos rins em
resposta a progesterona luteal (YOSHIMURA, 1997). Formas incompletas de pró-renina
produzidas por ação de peptidases têm mostrado desempenhar uma atividade “semelhante à
renina” (SHINAGAWA et al., 1992). Mulheres com ciclo menstrual normal apresentam
níveis de atividade semelhante à renina no fluido folicular superior à plasmática, sugerindo
uma produção local dessa proteína. Em ovários de coelhas perfundidos in vitro, a atividade
semelhante à renina aumenta 2 a 4 horas após a exposição ao hCG (YOSHIMURA et al.,
1994), sugerindo que as gonadotrofinas desempenham um papel importante na regulação da
atividade de renina. KIM et al. (1987a) detectaram a presença de RNA mensageiro (mRNA)
de renina em ovários de ratas, sugerindo uma produção local dessa proteína. O tratamento de
ratas imaturas com FSH aumentou em três vezes a expressão de mRNA para renina (KIM et
al., 1987b). BRUNSWIG-SPICKENHEIER & MUKHOPADHYAY (1990), em cultura de
células da teca livre de soro, mostraram que o LH estimula a produção de renina e pró-renina
por um mecanismo dependente de AMP cíclico.
O angiotensinogênio é expresso no fígado e em vários tecidos incluindo o ovário.
Durante a exposição à dexametasona ou 17α-etinilestradiol, ocorre um aumento nos níveis de
mRNA para o angiotensinogênio no fígado, sugerindo uma possível regulação pelo ovário
(OHKUBO et al., 1986). THOMAS & SERNIA (1990) detectaram, através de
imunohistoquímica, marcação para o angiotensinogênio nas células da granulosa em folículos
antrais e em início de atresia, enquanto que sua marcação não foi visualizada nas células da
granulosa de folículos primordiais e primários. Estes dados sugerem uma possível relação de
gonadotrofinas com a secreção de angiotensinogênio, podendo a síntese de estrógeno induzida
por gonadotrofina atuar como fator estimulante da síntese hepática de angiotensinogênio
(KRAKOFF & EISENFELD, 1977).
17
A ECA apresenta diferentes níveis de atividade em diferentes locais, sendo que no
ovário sua atividade é moderada (VAN SANDE et al., 1985). No ovário de ratas, a ECA foi
identificada em veias do epitélio germinativo ao redor do corpo lúteo e em células da
granulosa de alguns folículos (SPETH & HUSAIN, 1988). Em células endoteliais, a regulação
da ECA é controlada pelo acúmulo de AMPc (KRULEWITZ & FANBURG, 1986),
sugerindo que essa enzima possa ser controlada por gonadotrofinas. No entanto, a ECA não
apresenta um modelo cíclico de variação durante o ciclo estral (DAUD et al., 1990).
NIELSEN et al. (2002), demonstraram atividade da ECA no fluido folicular de ovários
bovinos, no entanto essa atividade não diferiu em folículos na fase lútea, pré-ovulatórios, de
vacas prenhes ou ovários císticos, tendo, apenas, uma correlação positiva com os níveis
séricos de progesterona. Em tecidos extra-renais existem outras enzimas que podem ser
responsáveis pela produção de Ang II. HUSAIN et al. (1987) obtiveram, in vitro, Ang II a
partir do angiotensinogênio, utilizando como enzima catalisadora o ativador do
plasminogênio.
Diversos fatores evidenciam a produção de Ang II pelo ovário. Animais tratados com
hCG apresentam maior concentração de Ang II no fluido folicular quando comparado às
concentrações plasmáticas, sugerindo uma produção local desse peptídeo (YOSHIMURA et
al., 1994). HUSSAIN et al. (1987) detectaram, no ovário, elevados níveis de Ang II em
animais com nefrectomia bilateral. Após a liberação pré-ovulatória de gonadotrofinas ocorre
aumento nas concentrações de Ang II no tecido ovariano. YOSHIMURA et al. (1994)
verificaram um aumento no grau de secreção de Ang II no líquido folicular em ovários de
coelhas perfundidos in vitro com hCG. Este aumento parece estar relacionado com a elevação
da atividade intrafolicular de renina. Trabalhos mostram elevação nos níveis de renina após
exposição a gonadotrofinas em mulheres (DAUD et al., 1988) e em ovários de coelhas
perfundidos in vitro (YOSHIMURA et al., 1994). Folículos contendo oócitos em estádio de
vesícula germinativa possuem menores níveis de pró-renina que aqueles contendo oócitos
maturos (ITSKOVITZ et al., 1987). Em bovinos, após o pico de LH, ocorre um aumento nas
concentrações de Ang II no fluido folicular (ACOSTA et al., 2000). Nessa mesma espécie, os
níveis de pró-renina aumentam quando as células da teca são estimuladas in vitro pelo LH. No
entanto, células da granulosa inibem essa produção impedindo que o folículo entre em atresia
(MUKHOPADHYAY et al., 1991).
18
2.2.2. Receptores da angiotensina II
Os receptores de Ang II foram descritos em diferentes tipos celulares, de acordo com a
espécie. Segundo suas características bioquímicas e farmacológicas foram classificados como
receptores do tipo 1 (AT
1
) e tipo 2 (AT
2
) (BIRABEAU et al., 1984; CHIU et al., 1989;
BRUNSWIG-SPICKENHEIER & MUKHOPADHYAY, 1992). O receptor AT
1
é
responsável pela maioria dos efeitos conhecidos da Ang II, como vasoconstrição, secreção de
aldosterona e do hormônio anti-diurético e indução da sede (MURPHY et al., 1991; SASAKI
et al., 1991). O receptor AT
2
é descrito na participação de efeitos opostos ao AT
1
,
principalmente induzindo a apoptose (YAMADA et al., 2001) e mediando as funções
reprodutivas (BOTTARI et al., 1992; TAKAHASI et al., 1994).
As descrições sobre a localização de receptores de Ang II no ovário têm distinção de
acordo com a espécie estudada. Esses receptores foram encontrados em ovários de ratas
principalmente nas células da granulosa (HUSAIN et al., 1987; AGUILERA et al., 1989).
Trabalhando com folículos pré-ovulatórios de coelhas tratadas com eCG, FÉRAL et al. (1996)
observaram receptores para Ang II tanto em células da teca quanto nas da granulosa. Outros
autores descreveram receptores para Ang II principalmente nas células da granulosa em
ovários de macacas (AGUILERA et al., 1989) e de bovinos (BRUNSWIG-SPICKENHEIER
& MUKHOPADHYAY, 1992). Já SCHAUSER et al. (2001), encontraram
predominantemente receptores AT
2
nas células da teca externa de folículos bovinos, enquanto
que nas células da teca interna a ligação foi menos intensa e nas células da granulosa estes não
foram encontrados. ACOSTA et al. (1999) determinaram a expressão, tanto de AT
1
quanto de
AT
2
, nas células da teca em bovinos, observando aumento na expressão relativa de AT
2
após
o aumento nas concentrações foliculares de estradiol, enquanto que a expressão relativa de
AT
1
permaneceu constante.
Os receptores AT
1
são bloqueados por bifenil-imidazóis, como o losartan (CASTREN
& SAAVEDRA, 1989; CHANG & LOTTI, 1991; WEXLER et al., 1992; CHANG et al.,
1995). Já os receptores AT
2
são bloqueados por tetrahidroimidapiridinas, como por exemplo o
PD123,177 e o PD123,319 (BUMPUS et al., 1991). Em ovários de coelhas perfundidos na
presença de PD123,319, ocorre inibição da esteroidogênese pelo bloqueio na ação da Ang II
(YOSHIMURA et al., 1996). No entanto, quando estes são perfundidos na presença de CV-
11974, um inibidor seletivo para AT
1
, não ocorre alteração na produção de estrógenos (KUJI
et al., 1996). A saralasina é um potente inibidor da Ang II, atuando em todos os subtipos
conhecidos de receptores. Diversos trabalhos têm utilizado a saralasina com o intuito de
19
promover bloqueio na ação da Ang II no que tange à maturação de oócitos (GIOMETTI et al.,
2005) e à ovulação, tanto in vitro (YOSHIMURA et al., 1992; 1993; PETERSON et al., 1993)
como in vivo (PELLICER et al., 1988).
Os receptores AT
1
e AT
2
têm uma homologia de apenas 34% (ELTON et al., 1992;
KAMBAYASHI et al., 1993). Isso indica uma diferença no processo evolutivo desses
receptores nas diferentes espécies, o que explica o fato de receptores estimulados pelo mesmo
peptídeo desempenharem papéis tão diferentes (YOSHIDA et al., 1992). O receptor AT
1
pertence à família de receptores acoplados à proteína G com sete domínios transmembrana.
Em roedores foram identificadas duas isoformas desse receptor, AT
1A
e AT
1B
, mapeados em
ratos nos cromossomos 17 e 2, e em camundongos nos cromossomos 13 e 3, respectivamente
(ELTON et al., 1992; YE & HEALY, 1992). O receptor AT
2
também pertence à família dos
receptores acoplados à proteína G com sete domínios transmembrana. O gene no receptor AT
2
está presente no cromossomo X e o transcrito de seu gene possui três exons, no entanto a
região que codifica a proteína está presente somente no terceiro exon (KAMBAYASHI et al.,
1993). O mecanismo de sinalização intracelular dos receptores AT
1
foi largamente estudado e
inclui a cascata clássica dos receptores associados à proteína G. Essa cascata, através da
ativação da fosfolipase C, estimula a proteína quinase C e o fosfatidilinositol, promovendo
aumento nas concentrações intracelulares de cálcio (BLUME et al., 1999). Alguns autores têm
evidenciado outras rotas de sinalização intracelular de AT
1
, incluindo a MAP quinase
(mitogen-activated protein kinases), a JAK/STAT (MARRERO et al., 1995) e a ativação da
Jun quinase (JNK) (BLUME et al., 1999). Apesar dos receptores AT
2
fazerem parte da família
dos receptores com sete domínios trans-membrana acoplados à proteína G, suas
características funcionais mostram que sua sinalização intracelular não tem nenhuma relação
com os membros desta família (KAMBAYASHI et al., 1993; MUKOYAMA et al., 1993).
Parece que a sinalização dos receptores AT
2
não promove aumento nas concentrações
intracelulares de Ca
++
e AMPc e a adição de agonistas não induz a internalização dos
receptores (CSIKÓS et al., 1998). O papel da sinalização por AT
2
parece ser a ativação de
fosforilases, as quais inibem as cascatas de fosforilação intracelular (BOTTARI et al., 1992).
O receptor AT
2
é capaz de inibir a ativação da MAP quinase. As fosfatases serina e treonina,
as quais são ativadas pelo estímulo de Ang II via receptores AT
2
, são capazes de inativar a
MAP quinase seguido por um estímulo dos receptores AT
1
. A interação do receptor AT
2
com
outros receptores tem dificultado a elucidação de suas rotas de transdução, gerando muitos
resultados contraditórios. Alguns trabalhos têm mostrado que o receptor AT
2
interfere no
mecanismo de transdução de outros receptores, alterando sua cascata de sinalização
20
intracelular, como por exemplo, os receptores para fatores de crescimento (BEDECS et al.,
1997; MATSUBARA, 1998; STROTH et al., 2000).
2.2.3. Papel da angiotensina na ovulação
Vários trabalhos demonstram que o RAS desempenha um importante papel no
processo de ovulação. PELLICER et al. (1988) bloquearam a ovulação induzida por
gonadotrofinas em ratas imaturas tratadas com hCG e eCG, através da aplicação intra-
peritonial de saralasina. No entanto DAUD et al. (1989) não encontraram evidências que a
Ang II estivesse envolvida no processo de ovulação. Diversos trabalhos com ovários
perfundidos in vitro têm evidenciado a importância da Ang II no processo de ovulação
induzido por gonadotrofinas (PETERSON et al., 1993; KUJI et al., 1996) e na indução da
ovulação por Ang II na ausência de gonadotrofinas (KUO et al., 1991; YOSHIMURA et al.,
1992). A presença de receptores nas células foliculares e o aumento nas concentrações de Ang
II no fluido folicular após a exposição a gonadotrofinas sugerem uma atividade do RAS no
processo de ovulação. No entanto, DAUD et al. (1989) revelaram ausência de receptores para
Ang II em folículos pré-ovulatórios e, portanto, o bloqueio da Ang II não determinou
diminuição na ovulação induzida por gonadotrofinas. Algumas evidências sugerem que as
PGs estejam envolvidas na regulação da ovulação pela Ang II. Em ovários de coelhas
perfundidos in vitro, a Ang II estimula a produção de PGE
2
e PGF
2α
na ausência de
gonadotrofinas (YOSHIMURA et al., 1993). YOSHIMURA et al. (1993) inibiram a produção
de PG induzida por Ang II através da administração de indometacina (um potente
antiinflamatório não esteróide) e, consequentemente a ovulação. No mesmo estudo foi
apontada correlação positiva entre a produção de PG e a eficiência na ovulação. Estes achados
sugerem que a Ang II induz a ovulação por estímulo à produção de PGs, evidenciando que o
RAS pode ser um componente essencial na regulação de eventos ovarianos, sendo o promotor
chave para os eventos pré-ovulatórios (YOSHIMURA, 1997).
SCHAUSER et al. (2001) observaram um aumento de receptores AT
2
em folículos
pré-ovulatórios. Estes dados sugerem que a ação da Ang II no processo de ovulação seja
mediada pelos receptores AT
2
. O bloqueio dos receptores AT
2
utilizando PD123,319, inibiu a
ovulação induzida por hCG em ovários de coelhas perfundidos in vitro (KUJI et al., 1996).
No entanto, no mesmo trabalho, a inibição dos receptores AT
1
pelo CV-11974 não afetou a
ovulação induzida por gonadotrofinas. YOSHIMURA et al. (1996) observaram que a inibição
21
dos receptores AT
2
bloqueou a ovulação in vitro induzida por Ang II e também a síntese de
PG induzida pela administração de hCG. Porém, em ratas, foi necessária a utilização de
saralasina ou de PD123,319 e losartan (antagonista AT
1
) em conjunto para bloquear a
ovulação (MIKUNI et al., 1998). Entretanto, em outro estudo com ratas, o uso de PD123,319
diminuiu, mas não inibiu totalmente, o número de ovulações nesta espécie (MITSUBE et al.,
2003). Esses resultados indicam que o processo ovulatório, pelo menos em ratas, é mediado
pelos dois receptores (AT
1
e AT
2
) de forma cooperativa ou compensatória e que a inibição de
ambos não é suficiente para bloquear totalmente a ovulação.
2.2.4. Efeito da angiotensina na maturação nuclear do oócito
Em ovários de coelhas perfundidos in vitro, a Ang II estimula a maturação nuclear do
oócito na ausência de gonadotrofinas, e a adição de saralasina ao meio promove o bloqueio da
maturação nuclear induzida por hCG (YOSHIMURA et al., 1992). No entanto, KUO et al.
(1991), utilizando o mesmo sistema do trabalho anterior, não verificaram nenhuma evidência
que a Ang II tenha uma participação essencial na maturação nuclear de oócitos. Já a inibição
da ECA pelo captopril bloqueia a maturação nuclear de ovócitos ovulados e oócitos presentes
em folículos estimulados pelo hCG (YOSHIMURA et al., 1994). Recentemente, foi
demonstrado que a Ang II é capaz de reverter o efeito inibitório causado pelas células
foliculares sobre a maturação nuclear de oócitos bovinos (GIOMETTI et al., 2005).
A Ang II parece induzir a maturação nuclear de oócitos via receptores AT
2
. Em
ovários de coelhas perfundidos in vitro, o bloqueio dos receptores AT
2
pelo PD123,319
impediu o reinício da meiose induzido por Ang II (YOSHIMURA et al., 1996). Da mesma
forma, KUJI et al. (1996) verificaram que a administração de PD123,319 bloqueou a
maturação nuclear induzida por gonadotrofinas em ovários de coelhas perfundidos in vitro. A
inibição da maturação do oócito causada pelas células foliculares é realizada, principalmente,
pelas células da teca (RICHARD & SIRARD, 1996). Somado a isso, o aumento de receptores
AT
2
nas células da teca de folículos pré-ovulatórios bovinos (SCHAUSER et al., 2001) e o
fato de que a Ang II só atua na maturação nuclear quando as células da teca estão presentes
(GIOMETTI et al., 2005) evidenciam que Ang II atua nas células da teca através dos
receptores AT
2
induzindo a maturação nuclear de oócitos bovinos.
22
2.2.5. Efeito da angiotensina na esteroidogênese
No córtex adrenal, a Ang II promove a síntese de aldosterona através da conversão do
colesterol em pregnolona (KRAMER et al., 1980). A Ang II promove a associação do
colesterol com o citocromo P450
scc
, enzima responsável pela clivagem da cadeia lateral do
colesterol, gerando a pregnolona. O aumento nas concentrações de estradiol parece ser devido
ao aumento dos níveis de andrógenos, uma vez que a atividade de aromatase parece não ser
influenciada pela presença de Ang II (PUCELL et al., 1988). Experimentos in vitro mostram
que a Ang II tem um efeito positivo na produção de estrógeno, mas não na produção de
progesterona (YOSHIMURA et al., 1993; YOSHIMURA et al., 1996). Associado a isso, a
administração de saralasina bloqueia o aumento nas concentrações de estrógeno induzido por
hCG (YOSHIMURA et al., 1993). Utilizando um sistema in vitro de microdiálise em bovinos,
ACOSTA et al. (1999) demonstraram que a infusão de Ang II promoveu um aumento nas
concentrações de estrógeno e progesterona.
BUMPUS et al. (1988) propuseram, em folículos de ratas, um modelo para um
mecanismo autócrino/parácrino de ação da Ang II, já que a renina está presente na teca
interna e a formação de Ang II se localiza também nessas células. Como os níveis de Ang II
estão elevados nas células da teca, a Ang II pode agir de forma autócrina, elevando a
produção de andrógenos. Os andrógenos, a renina e Ang II podem, então, se difundir pela
membrana basal para as células da granulosa, acelerando a aromatização dos andrógenos em
estrógenos e, assim, aumentando os níveis destes no líquido folicular e na circulação. Um
estudo com suínos demonstrou que a Ang II pode interferir no processo de esteroidogênese
nas células da granulosa, já que há uma redução dos níveis de progesterona dependente da
concentração de gonadotrofinas, induzido pela Ang II. Nesta espécie, a Ang II atua na
esteroidogênese através das células da granulosa, ativando a proteína quinase C (LI et al.,
1995).
Assim como na ovulação, a esteroidogênese parece estar associada aos receptores AT
2.
KUJI et al. (1996) observaram que o bloqueio dos receptores AT
2
pelo PD123,319, em
ovários perfundidos in vitro, determinou uma diminuição nas concentrações de estrógeno,
enquanto que as concentrações de progesterona não foram alteradas. No mesmo trabalho, a
administração do bloqueador específico dos receptores AT
1
, CV-11974, ao meio de perfusão,
não causou nenhuma alteração nos esteróides progesterona e estrógeno. Da mesma forma
YOSHIMURA et al. (1996) observaram uma diminuição na produção de estrógeno induzida
por Ang II após administração, in vitro, de PD123,319.
3. CAPÍTULO 1
TRABALHO A SER ENVIADO PARA PUBLICAÇÃO:
ANGIOTENSINA II NO MECANISMO INICIAL DE
OVULAÇÃO, ATRAVÉS DOS RECEPTORES AT
2
, EM
BOVINOS
Rogério Ferreira, Paulo Bayard Dias Gonçalves, Rafael Fernandes, José
Carlos Ferrugem Moraes, João Francisco Coelho de Oliveira
BIOLOGY OF REPRODUCTION, 2006
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ANGIOTENSINA II NO MECANISMO INICIAL DE OVULAÇÃO, ATRAVÉS
DOS RECEPTORES AT
2
, EM BOVINOS
THE ROLE OF ANGIOTENSIN II ON EARLY MECHANISM OF BOVINE
OVULATION VIA AT
2
RECEPTOR SUBTYPE
Rogério Ferreira
1
, Paulo Bayard Dias Gonçalves
1
, Rafael Fernandes
1
, José Carlos
Ferrugem Moraes
2
, João Francisco Coelho de Oliveira
13
1
Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal, Departamento de Clínica de
Grandes Animais, Universidade Federal de Santa Maria, Brasil.
2
EMBRAPA Pecuária Sul, Brasil
3 Autor para corresponcência: ([email protected])
Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal
Departamento de Clínica de Grandes Animais
Hospital Veterinário
Universidade Federal de Santa Maria
97105-900, Santa Maria, RS, Brasil
Fone: 55-55-3220-8484 ou 55-55-3220-8752 e Fax: 55-55-3220-8484
25
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo averiguar o papel da angiotensina II (Ang
II) no mecanismo de ovulação em bovinos, utilizando um modelo in vivo através da
injeção de inibidores da AngII em folículos pré-ovulatórios. Os animais foram pré-
sincronizados e quando os folículos atingiram um diâmetro mínimo de 12 mm,
receberam os tratamentos e foram desafiados com uma aplicação IM de análogo de
GnRH. A aplicação intrafolicular de 100 μM de saralasina bloqueou a ovulação
somente quando realizada antes do início do cio, ou seja, antes do pico de LH (14,3% e
83,3% das vacas ovularam nos grupos saralasina e controle, respectivamente; n=13; P <
0,05). Baseado nesses resultados, foi delineado um segundo experimento para
determinar o momento em que a Ang II desempenha papel crítico na ovulação. Quando
a saralasina foi aplicada 0 (n=6) e 6 (n=7) horas após a aplicação do análogo do GnRH,
houve um bloqueio da ovulação (16,7% e 42,9%, para os grupos 0 e 6 horas,
respectivamente), mas não quando esta foi aplicada 12 horas (n=7) após a aplicação de
GnRH (100%; P < 0,001). Para determinar qual receptor está envolvido no mecanismo
de ovulação induzido por Ang II, foi realizada uma aplicação intrafolicular de losartan
(inibidor dos receptores AT
1
de Ang II; n=6), PD123,319 (inibidor AT
2
; n=6),
losartan+PD123,319 (n=6) ou solução fisiológica (n=6) em folículos pré-ovulatórios
desafiados com GnRH. A ovulação foi inibida pela aplicação de PD123,319 e
losartan+PD123,319 (50% e 33,3%, respectivamente), mas não pela aplicação de
losartan ou solução fisiológica (100% em ambos os grupos). Os resultados apresentados
demonstram que a Ang II desempenha um papel fundamental na regulação da ovulação
em bovinos via receptores AT
2
.
Palavras-chave: saralasina, losartan, PD123,319, injeção intrafolicular, bovinos,
receptores AT
2
.
26
ABSTRACT
The aim of this work was to investigate the role of angiotensin II (Ang II) in the
mechanism of ovulation in the bovine, using an in vivo model, through the injection of
the Ang II receptor antagonists in mature follicles. The animals were pre- synchronized
and when the follicles reached a minimum diameter of 12 mm, they received the
treatments and were challenged with an IM application of GnRH-analogous. The
intrafolicular application of 100 μM of saralasin blocked the ovulation only before
estrous; therefore, before the LH surge (14.3% e 83.3% cows ovulated in the saralasin
and control group, respectively; n=13; P < 0.05). Based in these results, a second
experiment was carried out to determine the moment in which Ang II plays critical role
in the ovulation. Saralasin blocked ovulation only when applied at 0 and 6 hours (16.7,
n=6 e 42.9%, n=7, in the 0 and 6 hours groups, respectively) but not at 12 hours (100%;
n=7) after GnRh-analogous treatment (P < 0.001). To determine which Ang II receptor
is involved in the LH-induced ovulation, an intrafolicular application of losartan (AT
1
-
Ang II receptor-antagonist, n=6), PD123,319 (AT
2
antagonist, n=6),
losartan+PD123,319 (n=6) or saline (n=6) was performed at the moment in which the
cows were challenged with GnRH-analogous. The ovulation was inhibited by
PD123,319 and losartan+PD123,319 application (50.0 and 33.3% on ovulation rate,
respectively), but not by the application of losartan or saline solution (100% in both the
groups). The results demonstrated that Ang II plays a basic role in the early mechanism
of bovine ovulation via AT
2
receptor subtype.
Key words: saralasin, losartan, PD123,319, intrafollicular injection, bovine, AT
2
receptor.
27
INTRODUÇÃO
A ovulação nos mamíferos assemelha-se a um processo inflamatório e culmina
com a ruptura do estigma ovulatório e liberação do oócito. A cascata da ovulação inicia
no momento que o tecido folicular é estimulado pelo pico pré-ovulatório de LH ou,
experimentalmente, por eCG e hCG [1], FSH [2-4] ou GnRH [5;6]. Esse evento envolve
um complexo processo metabólico regenerativo e degenerativo simultâneo, envolvendo
proteases, colagenases e fatores vasoativos como prostaglandinas (PG) e leucotrienos
[7].
A angiotensina II (Ang II) é um hormônio ativo do sistema renina-angiotensina
que tem uma ação bastante conhecida no que tange a vasoconstrição arterial,
angiogênese e síntese de aldosterona. No entanto, a produção de Ang II pelo ovário [8-
10], associado à presença de receptores nas células foliculares em diversas espécies
[8;11-15] sugerem que a Ang II também desempenha um papel na regulação da função
ovariana. A presença de receptores para a Ang II já foi descrita nas células da teca e da
granulosa em ratas e coelhas [15] e nas células da teca em vacas e macacas [12].
Baseado em suas diferenças farmacológicas e funcionais, os receptores de Ang II são
classificados em dois tipos: AT
1
, responsável pela maioria dos efeitos conhecidos da
Ang II como vasoconstrição arterial, angiogênese e secreção de aldosterona; e AT
2
,
relacionado com efeitos opostos ao AT
1
, principalmente induzindo apoptose e mediando
funções reprodutivas [16;17].
No ovário, a atividade de Ang II tem sido descrita em algumas espécies e em
diferentes ações. Em coelhas, sua atividade foi relacionada à maturação do oócito,
ovulação e esteroidogênese [18-22]. Em bovinos, a atividade de Ang II está relacionada
28
com o crescimento folicular [23], com a reversão da inibição nuclear in vivo causada
por células foliculares em meios condicionados [24] e com a esteroidogênese [10].
Acosta et al. [10], através da técnica de microdiálise, demonstraram que a Ang II,
juntamente com outros peptídeos, tem também um papel vascular na ovulação e na
regressão e formação do corpo lúteo em bovinos. No entanto, outros autores têm
demonstrado que além do papel vascular, a Ang II tem papel indispensável na ovulação
através da produção de PG induzida por gonadotrofinas [21;25].
Algumas evidências sugerem que o sistema renina-angiotensina tem um papel
importante no processo de ovulação em bovinos. Estudos in vitro demonstraram que a
Ang II atua como um intermediário na ovulação induzida por gonadotrofinas em
coelhas [21;26] e ratas [27]. Em bovinos, a presença de receptores para Ang II nas
células foliculares [11;13;14], e o aumento nas concentrações de Ang II no fluido
folicular após a liberação pré-ovulatória de gonadotrofinas [10], sugerem uma atividade
biológica desse peptídeo também nessa espécie. Recentemente, nosso grupo demonstrou
que a Ang II participa da maturação nuclear de oócitos bovinos [24], evento síncrono,
porém independente da ovulação, e que também é desencadeado pelo pico pré-
ovulatório de LH. No presente trabalho, foi adaptado um sistema de injeção
intrafolicular com o propósito de manipular o ambiente folicular, permitindo entender
melhor os eventos que desencadeiam a ovulação nos bovinos. O objetivo foi estudar o
envolvimento da Ang II no processo de ovulação em bovinos, determinando o momento
e os receptores envolvidos no processo de ovulação induzido por Ang II, utilizando um
modelo “in vivo” através da injeção de inibidores dos receptores de AngII em folículos
pré-ovulatórios.
29
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e modelo experimental
Cento e duas vacas Hereford, ciclando, não amamentando, com condição
corporal 3 e 4 (escala de 1 a 5; LOWMAN, 1976), foram pré-sincronizadas com
CIDR® por 9 dias (1,9 g de progesterona; Pharmacia Brasil; sendo o dia da inserção do
pessário definido como dia 0), benzoato de estradiol (5mg, IM, no dia 0; Genix),
cloprostenol sódico (125 μg na submucosa vulvar, no dia 6) e eCG (gonadotrofina
coriônica eqüina, 400 UI, IM, no dia 6, Intervet). Após a remoção dos pessários, o
crescimento folicular foi monitorado por ultra-sonografia transvaginal diária, por um
único operador, utilizando um transdutor setorial de 7,5 MHz e um aparelho de ultra-
som Pie-Medical-Scanner 200. Foram incluídas no estudo somente vacas que atingiram
o diâmetro folicular mínimo de 12 mm após a remoção dos pessários. No momento que
os folículos atingiram 12 mm foi realizada uma injeção intrafolicular de inibidores dos
receptores de Ang II, permitindo estudar a função desse peptídeo e de seus receptores na
ovulação. A injeção intrafolicular foi realizada utilizando-se um sistema adaptado de
Kot et al. [28] com um sistema de duas agulhas, uma externa com calibre de 20G e
outra interna com 25 G. No momento da injeção intrafolicular, foi visualizado na
imagem do ultra-som a entrada do líquido injetado formando um turbilhão no antro
folicular. Duas horas após a realização da injeção intrafolicular, foi realizada uma nova
aferição do diâmetro folicular. As vacas que, durante esse período, tiveram uma
diminuição no diâmetro folicular superior a 2 mm foram excluídas do experimento.
Após a aplicação dos tratamentos, realizou-se um exame ultra-sonográfico a
cada 24 horas, com o objetivo de monitorar o folículo dominante até a ovulação ou
atresia. A ovulação foi caracterizada quando se observou o desaparecimento do folículo
30
tratado entre duas avaliações e, posteriormente, a formação de um corpo lúteo. A
ausência de ovulação por um período de 48 horas, associada com diminuição gradativa
do diâmetro do folículo, foi caracterizada como atresia folicular.
Experimento 1
Vinte e cinco vacas distribuídas em duas replicações, cujo folículo dominante
atingiu um diâmetro mínimo de 12 mm, receberam GnRH (100 μg de acetato de
gonadorelina, IM) e uma injeção intrafolicular de 100 μM de saralasina (potente
inibidor da Ang II; grupo saralasina; Sigma) ou solução fisiológica (grupo controle). A
quantidade injetada foi determinada de acordo com o volume de fluido folicular de
forma a obter-se uma concentração final, dentro do folículo, de 10 μM de saralasina. O
volume de fluido folicular foi estimado pela equação de regressão linear V=-
685,1+120,6D (P = 0,0001), determinada em um pré-experimento; onde V corresponde
ao volume folicular estimado e D ao diâmetro do folículo a ser injetado.
Experimento 2
Com o objetivo de verificar o momento em que a Ang II participa do mecanismo
de ovulação, vinte e cinco vacas Hereford distribuídas em três replicações, em
condições similares às do experimento anterior, foram tratadas com GnRH (100 μg de
acetato de gonadorelina, IM) e aleatoriamente distribuídas para receber uma injeção
intrafolicular de 100 μM de saralasina 0 (grupo 0 h), 6 (grupo 6 h) ou 12 horas (grupo
12 h) após o GnRH. O volume de saralasina injetado foi de acordo com o descrito no
experimento anterior.
31
Experimento 3
Trinta e uma vacas distribuídas em 3 replicações, com diâmetro folicular
mínimo de 12 mm, foram tratadas com GnRH (100 μg de acetato de gonadorelina, IM)
e aleatoriamente distribuídas de acordo com um delineamento fatorial 2x2. Foram
formados quatro grupos experimentais, recebendo uma injeção intrafolicular de 100 μM
de losartan (grupo LO; inibidor específico dos receptores AT
1
de Ang II), 100 μM de
PD123,319 (grupo PD; inibidor dos receptores AT
2
; Sigma), 100 μM de PD123,319 +
100 μM de losartan (grupo PD+LO) ou solução fisiológica (grupo controle). O volume
injetado foi baseado no volume de fluido folicular (estimado conforme experimento 1)
para se obter uma concentração final de 10 μM de ambos os inibidores.
Análise estatística
Para validação dos resultados nos três experimentos, realizou-se uma análise de
variância do diâmetro folicular no momento do tratamento, utilizando-se como fatores
as variáveis de classe tratamento, ovulação e a interação tratamento vs. ovulação. A
comparação da percentagem de ovulação nos diferentes tratamentos foi realizada em
modelo estatístico para dados categóricos, utilizando o PROC CATMOD (Categorical
Data Analysis Procedures) e a diferença entre grupos foi comparada por meio de
contrastes. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa estatístico SAS
(1998), adotando-se como nível de significância 5%.
RESULTADOS
Experimento 1
Nove vacas (9/25) foram diagnosticadas em estro no momento que atingiram o
diâmetro folicular mínimo. Como a percentagem de ovulação se manifestou de maneira
32
distinta nos dois grupos, conforme a manifestação prévia de cio (P = 0,07), os dados
foram analisados separadamente. Naqueles animais em que a aplicação dos tratamentos
foi realizada sem manifestação de estro (antes do pico pré-ovulatório de LH), foi
verificada uma percentagem de ovulação de 14% (1/7) e 83% (5/6), respectivamente
para os grupos saralasina e controle (χ² = 4,89; 1 GL; P < 0,05; Fig. 1). Quando a
aplicação dos tratamentos foi realizada em animais que estavam em cio, a percentagem
de ovulação foi de 67% (4/6) para o grupo saralasina e 100% (3/3) para o controle, não
havendo diferença estatística entre os mesmos (χ² = 0,08; 1 GL; P > 0,05; Fig. 1).
Em três vacas (3/25; 12%) a técnica de injeção intrafolicular não foi realizada
com sucesso, ocorrendo uma diminuição superior a 2 mm no diâmetro folicular nas
primeiras duas horas após injeção intrafolicular. O tamanho folicular médio no
momento em que foi realizada a aplicação dos tratamentos não diferiu estatisticamente
entre os grupos (P > 0,05), sendo de 13,0 ± 0,39 mm (média ± erro padrão da média) e
13,7 ± 0,82 mm para os grupos saralasina e controle, respectivamente. Da mesma
forma, não foi verificada diferença estatística (P > 0,05) do tamanho folicular, no
momento de aplicação dos tratamentos, entre as vacas que não ovularam (12,7 ± 0,32
mm) e as que ovularam (13,7 ± 0,63 mm).
Experimento 2
A ovulação foi influenciada pelo momento de aplicação da saralasina (χ² =
10,76; 2 GL; P = 0,001), sendo maior para o grupo 12 h (100%, 7/7), quando
comparado com os grupos 0 h (16,7%; χ² = 19,6; 1 GL; P < 0,0001; 1/6) e 6 h (42,9%;
χ² = 61,8; 1 GL; P < 0,0001; 3/7); não havendo diferença estatística entre os dois
últimos (χ² = 0,98; 1 GL; P > 0,05; Fig. 2). Em cinco vacas a técnica de injeção
intrafolicular não foi realizada com sucesso caracterizado com uma diminuição no
33
diâmetro folicular superior a 2 mm. Esses animais foram excluídos da análise estatística.
O tamanho folicular médio ± e.p.m. no momento da injeção intrafolicular foi similar
para os grupos 0h (12,8 ± 0,41 mm), 6 h (13,9 ± 0,60 mm) e 12h (14,3 ± 0,57 mm);
assim como semelhante para as vacas que ovularam (14,2 ± 0,48 mm) e não ovularam
(13,1 ± 0,37 mm), não havendo diferença estatística (P > 0,05).
Experimento 3
A taxa de ovulação foi influenciada pela aplicação de PD123,319 (P < 0,0001),
mas não pelo tratamento com losartan (P > 0,05; Fig. 3). Não houve interação entre os
grupos LO e PD (P > 0,05) na taxa de ovulação. Em quatro vacas ocorreu uma
diminuição superior a 2 mm nas duas horas seguintes à injeção intrafolicular e os dados
foram excluídos da análise estatística. O tamanho folicular médio (média ± e.p.m.) no
momento de aplicação dos tratamentos para os grupo LO, PD, PD+LO e controle foi,
respectivamente, 13,1 ± 0,20 mm, 13,0 ± 0,30 mm, 12,8 ± 0,29 mm e 13,0 ± 0,13 mm,
não havendo diferença estatística entre os grupos (P > 0,05). Da mesma forma, não
houve diferença estatística (P > 0,05) no tamanho folicular no momento da injeção
intrafolicular entre as vacas que ovularam (13,1 ± 0,12 mm) e as que não ovularam
(12,7 ± 0,24 mm).
DISCUSSÃO
O modelo in vivo utilizado nos experimentos permitiu demonstrar, pela primeira
vez, que a Ang II é indispensável para que ocorra o evento da ovulação em bovinos.
Acosta et al. [10], através da técnica de microdiálise, evidenciaram que a Ang II,
juntamente com outros peptídeos, tem um papel angiogênico durante o processo de
ovulação. No entanto, a sua função na ativação da cascata não foi demonstrada como na
proposta deste estudo.
34
O diâmetro folicular mínimo para a aplicação dos tratamentos (12mm) foi
baseado na alta taxa de ovulação de folículos acima de 12mm quando aplicado GnRH,
conforme estudos de Sartori et al. [29]. A alta taxa de ovulação nos animais dos grupos
controle (14/15 animais; 93%) demonstra que a lesão ocasionada pela técnica de injeção
intrafolicular não prejudicou o desenvolvimento final do folículo e ovulação, assim
como já tinha sido demonstrado por outros autores [28;30]. A técnica de injeção
intrafolicular foi um método eficiente para determinar o envolvimento da Ang II no
mecanismo de ovulação em bovinos. Em outro estudo [31], para demonstrar essa função
fisiológica em coelhas, foi utilizada uma injeção intraperitonial, procedimento este
inviável em bovinos. A taxa de sucesso da técnica de injeção intrafolicular foi de 81%
(66/81 animais), sendo superior às anteriormente descritas por Kot et al. [28].
Após o pico pré-ovulatório de LH, as concentrações de Ang II aumentam no
fluido folicular [10], concomitante com o início da cascata de ovulação. A inibição da
Ang II pela saralasina foi capaz de inibir a ovulação em 6 de 7 (P = 0,02) animais que
não estavam em estro, ou seja, antes do pico de LH (Fig 1). Nos animais em que foi
observado início do estro antes da aplicação dos tratamentos, a saralasina foi capaz de
inibir a ovulação em apenas duas vacas (2/6 vacas).
Com base nesses resultados, foi delineado o experimento 2 para determinar o
momento em que a Ang II é indispensável na cascata de ovulação. A aplicação
intrafolicular de saralasina 12 horas após a aplicação de GnRH não teve efeito sobre a
ovulação, uma vez que foi observado uma taxa de ovulação de 100%, como era de se
esperar em folículos com diâmetro superior a 12 mm quando tratados com GnRH [29].
No entanto, a aplicação de saralasina nas 6h após o GnRH causou um bloqueio parcial
da ovulação. Yoshimura et al. [21], utilizando ovários de coelhas perfundidos in vitro,
induziu a ovulação com Ang II na ausência de gonadotrofinas. Isso demonstra que a
35
Ang II participa como intermediário da ovulação induzida por gonadotrofinas no início
da cascata de ovulação. Embora as concentrações de Ang II permaneçam elevadas
durante todo o processo de ovulação [10], estes resultados demonstram (Fig. 2) que esse
peptídeo é indispensável apenas nos momentos iniciais do processo de ovulação. Em
ovários de coelhas perfundidos in vitro, as concentrações de Ang II no fluido folicular
aumentam quatro horas após a exposição à gonadotrofinas, provavelmente devido ao
aumento intrafolicular na atividade semelhante à renina [9]. Esses achados suportam os
resultados obtidos neste ensaio, em que foi observado um bloqueio parcial da ovulação
quando a Ang II foi inibida 6 horas após a administração de GnRH, mostrando o
momento em que esse peptídeo desempenha seu papel no processo ovulatório.
A saralasina, peptídeo análogo da Ang II, é um potente antagonista que bloqueia
todos os subtipos de receptores conhecidos para a Ang II. Para este estudo, foi utilizada
uma concentração de saralasina de 10 μM, uma vez que esse peptídeo inibe, em
concentração dependente, a ligação específica da Ang II a seus receptores, causando
uma completa inibição da ligação em concentrações superiores a 1 μM [25]. O efeito
tóxico da saralasina nas células foliculares pode ser descartado, uma vez que este
peptídeo tem sido largamente utilizado para bloquear o efeito do sistema renina-
angiotensina ou estudar a ação da Ang II, tendo demonstrado uma alta especificidade
pelos receptores da Ang II. A alta taxa de ovulação dos animais do grupo saralasina que
receberam o tratamento após o início do estro, também descarta a possibilidade de um
efeito tóxico da saralasina nas células foliculares.
Neste estudo, a presença de PD123,319 (inibidor específico de AT
2
), no fluido
folicular, inibiu a ovulação independente da presença do inibidor AT
1
losartan (Fig. 3).
O PD123,319 é um antagonista não peptídico dos receptores AT
2
, com baixa afinidade
aos receptores AT
1
, que causa uma completa inibição da ligação específica de Ang II a
36
uma concentração de 100 μM [25]. Yoshimura et al. [15], utilizando ovários de coelhas
perfundidos in vitro, bloqueou a ovulação através da administração de PD123,319, o
que não aconteceu pela administração do CV-11974, inibidor específico AT
1
. O losartan
é um antagonista não peptídico dos receptores AT
1
de Ang II com baixa afinidade aos
receptores AT
2
[16;17] e com grande utilização terapêutica para controle da pressão
sanguínea. Schauser et al [14] observaram um aumento na expressão de receptores AT
2
em folículos pré-ovulatórios bovinos, sugerindo uma atividade dos receptores AT
2
no
processo de ovulação induzido por Ang II. Isto evidencia que a Ang II participa da
ovulação em bovinos via receptores AT
2
Pellicer et al. [31] demonstrou que a aplicação intraperitonial de saralasina
bloqueou a ovulação de ratas imaturas tratadas com eCG e hCG. No entanto, em um
estudo semelhante, Daud et al. [32] apontou ausência de receptores para Ang II em
folículos pré-ovulatórios e com isso a aplicação intraperitonial de saralasina não teve
efeito na taxa de ovulação. Já Yoshimura et al. [22], através da aplicação de saralasina,
inibiram a produção de PGs e a conseqüente ovulação induzida por hCG em ovários de
coelhas perfundidos in vitro. Portanto, existe na literatura resultados bastante
contraditórios quanto à localização de receptores para Ang II nas células foliculares de
diferentes espécies e a sua importância no mecanismo de ovulação. No entanto, este
ensaio in vivo demonstra que a Ang II é indispensável para que ocorra a ovulação em
bovinos.
Concluindo, verificou-se que a Ang II é indispensável para a ovulação em
bovinos, uma vez que a inibição desse peptídeo por uma injeção intrafolicular de
saralasina determinou o bloqueio da ovulação. Portanto com base nos resultados
apresentados, este ensaio in vivo demonstrou que a Ang II tem um papel fundamental
nos momentos iniciais da ovulação atuando como um fator chave na ativação da cascata
37
de ovulação induzida por gonadotrofinas. É possível concluir também, que a Ang II
participa desses eventos, na espécie bovina, através dos receptores AT
2
.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Walter Neves Ferreira pela cedência dos animais
utilizados neste estudo e ao CNPq e à FAPERGS pelo suporte financeiro.
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41
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
COM ESTRO SEM ESTRO
MANIFESTAÇÃO PRÉVIA DE ESTRO
OVULAÇÃO (%)
SARALASINA CONTROLE
*
*
Fig. 1 – Efeito da injeção intrafolicular de saralasina (Grupo SARALASINA, n =
13) ou solução fisiológica (Grupo CONTROLE, n = 9) na taxa de ovulação
de vacas com folículos maiores que 12 mm desafiados com análogo do
GnRH (100 μg de gonadorelina) de acordo com a manifestação de estro no
momento da aplicação dos tratamentos. O asterisco indica diferença
significativa entre os tratamentos (P = 0,02).
42
" "
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0h 6h 12h
TEMPO APÓS APLICAÇÃO DE GnRH (horas)
OVULAÇÃO (%) '
a
a
b
Fig. 2 – Efeito da injeção intrafolicular de 100 μM de saralasina em diferentes horas
após a aplicação de análogo do GnRH (100 μg de gonadorelina) na taxa de
ovulação de folículos tratados com diâmetro > 12 mm (n = 20). Letras
diferentes indicam diferença significativa entre os tratamentos (P > 0,001).
43
" "
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
LO PD PD+LO SALINA
GRUPOS
OVULAÇÃO (%) '
b
b
a a
Fig. 3 – Efeito da injeção intrafolicular de inibidores específicos dos receptores de
Ang II na taxa de ovulação de folículos tratados com diâmetro superior a 12
mm e desafiados com uma aplicação IM de análogo do GnRH (100 μg de
gonadorelina). LO, 10 μM de losartan (inibidor específico de AT
1
; n = 6);
PD, 10 μM de PD123,319 (inibidor específico de AT
2
; n = 6); PD+LO, 10
μM de losartan + 10 μM de PD123,319 (n = 6); SALINA, salina a 9% (n =
6). Letras diferentes indicam diferença significativa entre os tratamentos (P
< 0,05).
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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