( PDF ) Estudos moleculares dos genes XYL1 e XYL2 de Candida tropicalis visando a produção

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

Estudos moleculares dos genes XYL1 e XYL2

de Candida tropicalis visando a produção de xilitol

Luanne Helena Augusto Lima

Orientador: Prof. Dr. Fernando Araripe Gonçalves Torres

Co-orientadora: Maria das Graças de Almeida Felipe

BRASÍLIA - DF - BRASIL

Março, 2006

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

Estudos moleculares dos genes XYL1 e XYL2

de Candida tropicalis visando a produção de xilitol

Tese desenvolvida no laboratório de

Biologia Molecular e apresentada à

Universidade de Brasília – UnB, como

requisito parcial para obtenção do título

de doutor em Ciências Biológicas –

Biologia Molecular.

Luanne Helena Augusto Lima

Orientador: Prof. Dr. Fernando Araripe Gonçalves Torres

Co-orientadora: Maria das Graças de Almeida Felipe

BRASÍLIA - DF - BRASIL

Março, 2006

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As nossas teorias talvez reflitam mais as

nossas próprias limitações na busca da

verdade do que a verdadeira natureza da

realidade.

Stephen Jay Gould

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AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente ao Prof. Fernando Araripe Gonçalves Torres por ter

aceito o desafio deste projeto, pelo apoio e orientação; a Profa. Maria Sueli Soares

Felipe, a Profa. Lídia Maria Pepe de Moraes e aos demais professores do

Laboratório pelas preciosas recomendações e sugestões. Também agradeço a

Profa. Maria das Graças de Almeida Felipe pela co-orientação, colaboração e por

viabilizar este estudo cedendo a levedura Candida guilliermondii FTI 20037 para os

experimentos. A Profa. Sonia Maria de Freitas e ao Cristiano Guimarães do Amaral

Pinheiro pela colaboração na modelagem da proteína Xyl2.

Agradeço especialmente ao Christian Niel Berlinck pelo incomensurável apoio,

pelo esforço em me acalentar durante os momentos de frustração e por compartilhar

a euforia dos resultados positivos.

Agradeço aos meus pais, porque sem eles, indiscutivelmente, esta tese não

seria defendida, e a todos aqueles que compartilham genes comigo.

Agradeço a coordenadora do Programa de Pesquisa em Biociências Raquel

de Andrade Lima Coelho e aos coordenadores do PADCT, Tarciso José de Lima e

Paulo Ricardo Dimas Luz Cunha pelo apoio e pela complacência.

Manifesto minha gratidão a todos os companheiros do lab, por compartilhar

muito mais que pipetas e soluções, por dividir sentimentos e repartir conhecimentos.

Agradeço a Vivis, sempre disposta a colaborar, fornecendo protocolos e soluções,

dando dicas, discutindo resultados, analisando géis e etc... Agradeço a querida Paty

Vet e ao João Ricardo por me guiar nos primeiros passos; ao Saulo pela mãozinha,

preparando géis, aliquotando enzimas e segurando pedras. Agradeço também a

Nádia (minha parceira de roubadas, lembre-se se a vida te der um limão...), Camila e

Janice pelas árvores e galhos quebrados, tirando digestões, PCRs, placas entre

outros, e também à Vera pelas células realmente competentes. Ao Luciano pelo

programas culturais, culinários e alternativos. Ao Túlio pela amizade, mesmo a

10.000 km de distancia. A Karen por suportar as minhas manias e pela ajuda em

vários momentos periclitantes. Ao Hugo pela consultoria em línguas estrangeiras. A

todos os amigos, efêmeros ou não, que comemoraram e festejaram várias vezes

durante todo este tempo (Indra, Carine, Bruno Benoliel, Chrisinha, Carmela, Oscar

(Popó), Marciano, Henrique, Ceci, Pedro, Lelê, Alê, Rose, Paty Lu, Vanessinha, Didi,

Livônios, Patty Girl, André - Médico, Loise, Pollyanna, Marianna, Juju (Recife),

Andrelisse, Fabrício, Mauro, Alexsandro, Mariana, Fábio, Helga, Daniel, Marília,

Larissa, Simoneide, Hernandez, Gina, Flávia, Bárbara, Gaby, Liz, Luana, Rafael

Ajuz, Rafael Gaúcho, Thiago, Sérgio, Glória, Isabella, Maria José, Bruno Daher,

Tatiane, Mauro MX, Eduardo, Sócrates entre outros).

Agradeço carinhosamente a Fátima, Ivonildes e Conceição, por todo apoio

logístico, porque sem elas nosso laboratório entraria em colapso. Agradeço a Marísia

e a Margarete por sempre me socorrerem em momentos de emergência.

Eu não poderia deixar de agradecer a todas bactérias e leveduras que se

ofereceram em sacrifício para realização deste trabalho.

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO 1

1. Xilitol 1

1.1. Propriedades e Aplicações 1

1.2. Toxicidade e Tolerância 4

2. Obtenção de Xilitol 5

3. Bioconversão de Xilose em Xilitol 8

3.1. Xilose Redutase 10

3.2. Xilitol Desidrogenase 12

3.3. Repressão do Metabolismo de Xilose 14

3.4.Transporte de Xilose 15

4. Leveduras do Gênero Candida 17

4.1. Candida tropicalis 19

5. Engenharia Metabólica 21

JUSTIFICATIVA 27

ESTRATÉGIA 28

OBJETIVOS 31

Objetivo Geral 31

Objetivos Específicos 31

MATERIAIS E MÉTODOS 32

1. Microrganismos 32

2. Extração de DNA de Leveduras 33

3. Purificação de DNA Plasmidial 33

4. Transformação Genética 34

4.1. Bactéria 34

4.2. Leveduras 35

5. PCR 35

5.1. Purificação 37

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Análise de Ácidos Nucléicos em Gel de Agarose 37

6.1. Purificação de Fragmentos de DNA 37

7. Seqüenciamento e Análise de DNA 38

8. Digestão de DNA com Enzimas de Restrição 39

8.1. Purificação do Sistema de Digestão 39

9. Conversão de Extremidades Protuberantes em Abruptas 39

10. Defosforilação de Vetor Linearizado 40

11. Ligação 40

12. Extração de RNA 40

13. Southern e Northern Blotting 41

13.1. Sistema de Transferência para Membrana 41

13.2. Marcação da Sonda, Pré-Hibridização e Hibridização 41

13.3. Geração e Detecção do Sinal 41

14. Seleção e Análise dos Transformantes 42

15. Medida de Atividades Enzimáticas 42

15.1 Rompimento Celular 42

15.2 Determinação de Proteína Solúvel e Atividade Enzimática 42

16. Análise de Domínios, Alinhamento de Seqüências e Análise e Comparação Estrutural 43

RESULTADOS E DISCUSSÃO 45

1. Reclassificação da levedura C. guilliermondii FTI 20037 45

2. Clonagem e análise do gene XYL1 47

3. Clonagem e análise do gene XYL2 52

3.1. Clonagem das Regiões 5’ e 3’ do Gene XYL2 55

3.1.1. Uso de Primers Internos 55

3.1.2. PCR Inverso 56

3.2. Análise da Seqüência de XYL2 58

3.3. Número de cópias do gene XYL2 63

3.4. Padrão de Expressão do gene XYL2 64

3.5. Análise da Proteína Predita 65

3.5.1 Participação de Zinco na Catálise 68

3.6. Modelagem de Xyl2 69

4. Expressão de XYL1 e XYL2 em S. cerevisiae 72

5. Transformação de C. tropicalis 76

5.1. Marca de Seleção para o Sistema de Transformação 76

5.2. Construção dos cassetes para transformação 79

5.2.1. Cassete da Marca de Seleção 79

5.2.2. Cassete para Ruptura Gênica de XYL2 84

5.2.2.1. Marca Dominante 84

______________________________________________________________________________________________________________

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5.2.2.2. Marca Auxotrófica 86

5.2.3. Cassete para Múltiplas Integrações da Marca de Seleção 87

5.2.4. Cassete para Super Expressão de XYL1 88

6. Transformação Genética de C. tropicalis 93

CONCLUSÕES 95

PERSPECTIVAS 96

REFERÊNCIAS 97

ANEXO 1 117

ANEXO 2 122

ANEXO 3 156

ANEXO 4 161

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fórmula química da molécula de xilitol..................................................................................... 1

Figura 2. Metabolismo de xilose e regeneração de cofatores. Adaptado de BARBOSA et al. (1988) e

DAHIYA (1991) ................................................................................................................................. 7

Figura 3. Estratégia para obtenção de transformantes expressando múltiplas cópias de XYL1. ......... 29

Figura 4. Esquema para obtenção de transformantes com XYL2 rompido........................................... 30

Figura 5. Estrutura do cluster gênico que codifica o RNA ribossomal, evidenciando os genes

correspondentes as subunidades 18S, 5,8S e 28S, além das regiões internas ITS1 e ITS2. Acima

estão os níveis taxonômicos que cada região define, abaixo localização da região do rDNA

amplificada com os primers ITS1 e ITS4 (ITS) e da região da subunidade maior (5’ LSU)

amplificada com os primers UNIF e UNIR...................................................................................... 46

Figura 6. Reações de amplificação de regiões do rDNA analisadas em gel de agarose 1%. 1:marcador

λ EcoR I/Hind III, 2 e 3: região ITS, 4 e 5: região 5'LSU. ............................................................... 46

Figura 7. Reações de amplificação de XYL1 analisadas em gel de agarose 1%. 1: marcador 1 kb DNA

ladder (New England Biolabs), 2 e 3: amplificação com 5XRORF/3XRORF, DNA molde de C.

guilliermondii (UFRJ) e C. guilliermondii FTI 20037, respectivamente........................................... 48

Figura 8. Esquema mostrando as posições relativas de anelamento dos primers utilizados para

amplificação e confirmação de XYL1.............................................................................................. 48

Figura 9. Reações de amplificação de XYL1 e regiões internas do gene, analisadas em gel de agarose

1%. 1: marcador 1 kb DNA ladder (New England Biolabs), 2: amplificação com 5xyl1a/3xyl1, 3:

5xyl1a/3xyl1int, 4: 5xyl1int/3xyl1, 5: 5xylint/3xyl1int. ...................................................................... 49

Figura 10. Alinhamento da seqüência de XYL1 de C. tropicalis e de C. guilliermondii FTI 20037, com

as divergências sublinhadas........................................................................................................... 50

Figura 11. Alinhamento da seqüência de XYL1 com a seqüência do projeto genoma de C. tropicalis.51

Figura 12. Alinhamento entre a seqüência da proteína Xyl1 de C. guilliermondii FTI 20037 e C. tenuis

(1JEZ). Os aminoácidos dentro do quadrado hachurado representam as assinaturas das

aldocetoredutases, os resíduos envolvidos na catálise são indicados por setas, os resíduos

envolvidos no sítio de ligação à coenzima são indicados por asteriscos e os resíduos que

participam na dimerização estão indicados por quadrados............................................................ 52

Figura 13. Alinhamento das seqüências de XYL2 de P. stipitis e G. mastotermitis, evidenciando a

localização dos primers desenhados para amplificar a seqüências XYL2 de C. tropicalis............ 53

Figura 14. Reações de amplificação de XYL2 analisadas em gel de agarose 1%. 1: marcador 100 bp

DNA ladder (Invitrogen), 2: 5XDH2, 3: 3XDH3, 4: 5XDH2/3XDH3................................................. 54

Figura 15. Esquema mostrando as posições relativas de anelamento dos primers utilizados para

buscar as porções 5' e 3' de XYL2. ............................................................................................... 56

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Figura 16. Reações de amplificação utilizando o primer 221 analisadas em gel de agarose 1%. 1:

221/xyl2-F2, 2: 221/xyl2-R2, 3: xyl2-R2, 4: xyl2-F2, 5: 221, 6: marcador 1 kb DNA ladder (New

England Biolabs)............................................................................................................................. 56

Figura 17. Esquema da técnica de PCR inverso, onde o DNA genômico total é digerido com uma

enzima de restrição (EcoR I), religado formando fitas circulares que são usadas como molde em

uma reação de PCR, utilizando primers internos (R e F). .............................................................. 57

Figura 18. Reações do PCR inverso analisadas em gel de agarose 1%. Amplificação com xyl2-R2 e

xyl2-F2, utilizando DNA total digerido e religado como molde, digestão com 1: BamH I, 2: EcoR I,

3: Hind III e 4: TopoXYL2 como controle........................................................................................ 58

Figura 19. Seqüência de nucleotídeos do gene XYL2 de C. tropicalis e a estrutura primária predita da

proteína. Seqüência de nucleotídeos nas UTR - letras minúsculas, na ORF - letras maiúsculas,

TATA Box - cinza na região 5’,possível sinal de poliadenilação - sublinhado na região

3’,seqüência deduzida de aminoácidos é mostrada sobre a seqüência de nucleotídeos da ORF.60

Figura 20. Alinhamento da seqüência de XYL2 com a seqüência do projeto genoma de C. tropicalis.61

Figura 21. Alinhamento entre a seqüência predita a partir do gene XYL2 e as seqüências primárias de

xilitol desidrogenases de diferentes organismos. ........................................................................... 62

Figura 22. Southern blotting com DNA genômico de C. tropicalis. Digestão com 1: EcoR I, 2: EcoR V,

3: Hind III, utilizando XYL2 como sonda. ........................................................................................ 63

Figura 23. Análise da expressão de XYL2 por Northern blotting em diferentes fontes de carbono. 1:

xilose, 2: glicose e 3: glicerol utilizando XYL2 como sonda, RNA ribossômico 28s como controle

da quantidade de RNA total utilizada.............................................................................................. 64

Figura 24. Alinhamento entre a seqüência da proteína Xyl2 e membros da família de cadeia média que

possui sítio de ligação a zinco. Os aminoácidos dentro do quadrado hachurado representam a

assinatura das álcool desidrogenases, os resíduos envolvidos do sítio catalítico ligado a zinco são

indicados por setas, O segundo sítio de ligação a zinco da 1E3J está dentro de quadrado e os

resíduos que estão envolvidos no sítio de ligação da coenzima são indicados por asteriscos. .... 66

Figura 25. Elementos estruturais encontrados na seqüência de Xyl2 e sua localização, segundo

análise no InterPro.......................................................................................................................... 67

Figura 26. Efeito do EDTA na atividade de Xyl2. A: Acompanhamento da redução de NAD

(340 nm)

na ausência (círculos) ou na presença de EDTA 1mM (triângulos). B: Atividade de XDH em

diferentes concentrações de EDTA. ...............................................................................................69

Figura 27. Modelo tridimensional de Xyl2 gerado pelo programa Pymol. ............................................. 70

Figura 28. Estrutura terciária predita dos domínios de ligação a NAD

e zinco. A: Domínio de ligação

ao NAD

com o sítio de ligação em cinza escuro, composto por motivos α e β em um padrão

Rossman fold; B: sítio de ligação à coenzima, destacando o resíduos que participam da interação

Val

187

, Asp

207

, Lys

212

, Cys

252

Asp

277

e Ser

299

; C: Domínio de ligação do sítio ativo representado

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pelo resíduos em cinza escuro; D: sítio ativo ligado a zinco destacando os resíduos que

participam da interação His

, Glu

e Glu

159

. ................................................................................. 71

Figura 29. Mapa dos vetores YEp351PGK e YEp352PGK. .................................................................. 73

Figura 30. Reações de PCR para confirmação da clonagem de XYL1 (1-4) e XYL2 (6-9) em vetores de

expressão de S. cerevisiae analisadas em gel de agarose 1%.1 e 6: controle, 2 e 7: YEp352PGK,

3: YPGKxyl1, 4 e 9: YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2, 5: marcador 1 kb DNA ladder (Invitrogen), 8:

Y2PGKxyl2...................................................................................................................................... 73

Figura 31. Clones transformantes de S. cerevisiae expressando os genes XYL1 e XYL2. 1:

Y2PGKxyl2, 2: YPGKxyl1, 3: YEp352PGK e 4: YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2 em A: meio mínimo sem

leucina, B: meio mínimo sem uracila, C: meio mínimo sem uracila e leucina)............................... 74

Figura 32. Seqüência do gene ZeoCan sintetizado de novo, ressaltando os sítios de BamH I e Nco I

(em negrito) e a localização dos códons CTG substituídos por TTG (sublinhado)........................ 77

Figura 33. Mapa do plasmídio ClpACT-CYC. ........................................................................................79

Figura 34. Reação de PCR utilizando os primers 5PROACT e 3PROACT analisada em gel de agarose

1%. 1: ClpACT-CYC como molde e 2: 1 kb DNA ladder (New England Biolabs). ......................... 80

Figura 35. Estratégia para clonagem das regiões promotora (ACT1p) e terminadora (CYC1t) do vetor

ClpACT-CYC para a construção de um novo cassete de expressão. Etapa 1: reação de PCR

utilizando como molde a banda referente à região promotora obtida pela digestão do plasmídio

ClpACT-CYC com as enzimas Xho I e Cla I e os primers 5PROACT e 3PROACT, etapa 2:

clonagem do produto de PCR no vetor pGEM

-T Easy, etapa 3: reação de PCR utilizando o

plasmídio contendo as regiões ACT1p e CYC1t como molde e os primers 5PROACT e 3CYCTT.

........................................................................................................................................................ 81

Figura 36. Esquema da construção do cassete de expressão do gene ZeoCan o qual foi clonado no

sítio de Bcl I entre a região promotora ACT1p e terminadora CYC1t. ........................................... 82

Figura 37. Digestão do plasmídio contendo o cassete da marca de seleção analisada em gel de

agarose 1%. 2-8/10-13: plasmídios pPZeo de diferentes clones digeridos com BamH I e 1/9: 1 kb

DNA ladder (New England Biolabs)................................................................................................ 83

Figura 38. Reações de PCR para selecionar os clones com plasmídio pPZeo na orientação correta

analisadas em gel de agarose 1%.1/5: 1 kb DNA ladder (New England Biolabs), 2-4: reações com

os primers 5PROACT e 5Zeo, 6-8: reações com os primers 5PROACT/3Zeo.............................. 83

Figura 39. Esquema da contrução do cassete de ruptura de XYL2 (pPZeoXYL2) a partir da obtenção

do cassete da marca de seleção pela digestão do plasmídio pPZeo com BamH I e posterior

clonagem no sítio interno de Bcl I do gene XYL2........................................................................... 84

Figura 40. Esquema mostrando os sítios de Nco I e a combinação de primers utilizados para confirmar

a clonagem e a orientação do cassete da marca de seleção na seqüência de XYL2. .................. 85

Figura 41. Análise da digestão e de reações de PCR para confirmar a clonagem correta do plasmídio

pPZeoXyl2 em gel de agarose 1%. 1: digestão com Nco I, 2: 1 kb DNA ladder (New England

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Biolabs), 3-7: reações com os primers 5Zeo/3xyl2, 5PROACT/3xyl2, 5xyl2/3Zeo, 5xyl2/3CYCTT e

5xyl2/3xyl2, respectivamente.......................................................................................................... 85

Figura 42. Análise de digestões para confirmar a clonagem do plasmídio ClpXyl2 em gel de agarose

1%.1: plasmídio intacto, 2: digestão com EcoR V, 3: digestão com BamH I, 4: 1 kb DNA ladder

(Promega). ...................................................................................................................................... 86

Figura 43. Esquema da construção do cassete de múltiplas integrações da marca de seleção a partir

da clonagem do cassete de expressão de ZeoCan dentro da seqüência ITS do rDNA. ............... 87

Figura 44. Análise de digestão e reações de PCR para confirmar a clonagem correta do plasmídio

pITSpZeo em gel de agarose 1%. 1: digestão com BamH I, 2: 1 kb DNA ladder (Promega), 3-5:

reações com os primers ITS1/ITS4, 5PROACT/3zeo, 5zeo/3CYCTT, respectivamente............... 88

Figura 45. Esquema mostrando as posições relativas de anelamento dos primers utilizados para

amplificação do gene PGK.............................................................................................................. 89

Figura 46. Reações de amplificação de regiões do gene PGK1 analisadas em gel de agarose 1%.

DNA molde de C. maltosa 1: PPGK/TPGK, 2: PPGK/P2PGK e de C. tropicalis 3: PPGK/TPGK, 4:

PPGK/P2PGK e 5: marcador λ EcoR I/Hind III............................................................................... 89

Figura 47. Reação de PCR confirmando a clonagem do plasmídio pGEM-T EasyPGK analisadas em

gel de agarose 1%. 1: marcador λ EcoR I/Hind III e 2: amplificação utilizando os primers

P2PGK/T2PGK e pGEM-T EasyPGK como molde. ....................................................................... 90

Figura 48. Esquema da obtenção do plasmídio contendo as regiões promotora e terminadora do gene

PGK1 de C. maltosa. O plasmídio contendo o gene PGK1 foi utilizado como molde em uma

reação de PCR com os primers P2PGK e T2PGK, o amplicom obtido foi religado originando o

plasmídio pGEMpPGK.................................................................................................................... 90

Figura 49. Reações de PCR utilizando os primers PPGK/TPGK analisadas em gel de agarose 1%.1:

pGEMpPGK como molde, 2: 1 kb DNA ladder (Promega) e 3: pGEMPGK como molde. ............. 91

Figura 50. Esquema mostrando a clonagem de XYL1 entre as regiões promotora e terminadora do

gene PGK1 para obtenção do plasmídio pPGKxyl1....................................................................... 92

Figura 51. Reação de PCR utilizando os primers PPGK/3xyl1 analisada em gel de agarose 1%. 1: 1 kb

DNA ladder (Promega), 2: pPGKxyl1 como molde......................................................................... 92

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Produção de xilitol a partir de xilose por diferentes espécies de Candida spp. ...................... 8

Tabela 2. Especificidade pelos cofatores das enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase

(XDH) em diferentes leveduras......................................................................................................... 9

Tabela 3. Espécies de Candida spp. com aplicação na indústria de alimentos.................................... 18

Tabela 4. Linhagens de leveduras utilizadas......................................................................................... 32

Tabela 5. Linhagens de Escherichia coli utilizadas. .............................................................................. 32

Tabela 6. Seqüência dos primers utilizados em reações de PCR, com suas respectivas seqüências,

temperaturas de anelamento e sítios de restrição (sublinhados)................................................... 36

Tabela 7. Resultados de homologia para as seqüências ITS e 5'LSU do DNA ribossomal,utilizadas na

identificação de espécies................................................................................................................ 47

Tabela 8. Identidade e semelhança estrutural da Xyl2 com outras enzimas desidrogenase. .............. 72

Tabela 9. Atividade específica (UI/mg) de xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) para os

clones de Saccharomyces cerevisae: YEp352PGK (controle); YPGKxyl1, Y2PGKxyl2 e YPGKxyl1

+ Y2PGKxyl2................................................................................................................................... 75

Tabela 10. Avaliação da concentração letal de zeocina em meio YM (pH 7.5) a 30°C para diferentes

leveduras......................................................................................................................................... 78

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RESUMO

O xilitol é um adoçante natural, anticariostático, utilizado principalmente na

indústria de alimentos, com consumo anual estimado em 500.000 toneladas. O seu

valor econômico, aliado a suas diversas aplicações, impulsionam pesquisas

biotecnológicas para aumentar sua produção. A Candida guilliermondii FTI 20037 é

uma das mais promissoras leveduras para produção de xilitol com rendimento acima

de 0,5 g/Lh. Além disso, é capaz de produzir xilitol a partir de hidrolisado

hemicelulósico de diversos resíduos agrícolas. A partir do seqüenciamento de

regiões do DNA ribossômico de C. guilliermondii FTI 20037 foi demonstrado que

esta levedura deve ser re-classificada como Candida tropicalis. O presente estudo

representa uma das primeiras iniciativas para se desenvolver um sistema que

permita a transformação genética de C. tropicalis com a finalidade de potencializar a

produção de xilitol através da manipulação dos genes XYL1 (xilose redutase) e XYL2

(xilitol desidrogenase). Estes genes foram clonados e suas seqüências analisadas. O

gene XYL2 por não ter sido ainda caracterizado, foi objeto de estudos mais

detalhados. XYL2 é representado por uma ORF (open reading frame) de 1092 pb,

que potencialmente codifica um polipeptídeo de 364 resíduos de aminoácidos, com

~40 kDa. XYL2 não possui íntrons, apresenta-se em única cópia no genoma de C.

tropicalis e é controlado em nível transcricional pela presença de xilose. A seqüência

primária da ORF XYL2 é idêntica à publicada no projeto genoma de C. tropicalis.

Estudos de modelagem molecular demonstraram que a proteína Xyl2 pertence à

família MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) contendo sítios para ligação a

zinco e NAD

. Para demonstrar sua funcionalidade, os genes XYL1 e XYL2 foram

expressos com sucesso em S. cerevisiae. Visando o estabelecimento de um sistema

de transformação para espécies de Candida um gene sintético (ZeoCan) que confere

resistência a zeocina foi desenvolvido com o codon preferencial de C. tropicalis.

Todavia, os resultados de transformação mostraram que a resistência a zeocina não

é indicada como marca de seleção para C. tropicalis uma vez que esta levedura deve

possuir mecanismos genéticos para anular o efeito do antibiótico.

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ABSTRACT

Xylitol is a natural sweetener mainly used in the food industry with an annual

estimated consumption of 500.000 tons. The high ecomonic value of xylitol together

with its multiple applications have driven many biotechnological studies in order to

improve its production. The Candida guilliermondii FTI 20037 is one of the most

promising yeast of xilitol production with yields over 0.5 g/Lh. In addition, it is capable

of producing xylitol from hemicellulosic hydrolysate derived from several raw

materials. From the sequencing of ribossomal DNA regions from C. guilliermondii FTI

20037 we have shown that this yeast should be re-classified as Candida tropicalis.

The present work represents one of the first initiatives towards the development of a

system which would allow the genetic transformation of C. tropicalis with the goal of

improving xylitol production through the manipulation of the genes XYL1 (xylose

reductase) and XYL2 (xylitol dehydrogenase). These genes were cloned and the

sequences were analyzed. Since XYL2 had not yet been characterized it was the

focus of more detailed studies. XYL2 is represented by a 1092 pb open reading frame

which potentially codes for a 364 residues polypeptide with ~40 kDa. XYL2 does not

have introns, it is present as a single copy in the C. tropicalis genome and is

controlled at the transcriptional level by the presence of xylose. The primary

sequence of the XYL2 ORF is identical to the published sequence from the C.

tropicalis genome project. Molecular modeling studies showed that the Xyl2 protein

belongs to the MDR (medium chain alcohol dehydrogenase) family containing binding

sites for zinc and NAD

. In order to functionally analyze the cloned genes, XYL1 and

XYL2 were successfully expressed in S. cerevisiae. In order to establish a

transformation system for Candida species a synthetic gene (ZeoCan) which confers

zeocin resistance was developed with the C. tropicalis codon usage. However, the

results from transformation experiments showed that the zeocin resistance gene

should not be employed as selective marker in C. tropicalis since this yeast must

display genetic mechanisms to counteract the effects the antibody.

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_______________________________________________________________________________________ 1

INTRODUÇÃO

1. Xilitol

1.1. Propriedades e Aplicações

O xilitol (Figura 1) é um poliol que ocorre na natureza em diversos vegetais,

líquens e algas, aparecendo também como um intermediário no metabolismo de

carboidratos em animais e, inclusive, humanos (PEPPER e OLINGER, 1988;

HEIKKILA et al., 1992; WINKELHAUSEN et al., 1996). Em alguns organismos os

polióis podem ser acumulados até altas concentrações constituindo uma proteção

contra estresse ambiental, tais como choque osmótico (YANCEY et al., 1982;

KARLGREN et al., 2005), altas ou baixas temperaturas (CZAJKA e LEE, 1990;

WOLFE et. al., 1999).

Figura 1. Fórmula química da molécula de xilitol.

Em relação à sacarose, o xilitol é um terço menos calórico (2,4 calorias/g)

(BÄR, 1991) e possui poder adoçante equivalente, o que é superior ao de outros

polióis como manitol e sorbitol. Devido à doçura e ao baixo valor calórico, o xilitol

vem sendo utilizado como edulcorante em diversos produtos desde os anos 60.

Aliadas a estas características, outras propriedades apresentadas a seguir,

proporcionam aumento no valor econômico deste poliol.

O xilitol é um composto cariostático por não ser metabolizado por

microrganismos da microbiota bucal, principalmente Streptococcus mutans, o que

impossibilita a proliferação de bactérias e, conseqüentemente, impede a produção de

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_______________________________________________________________________________________ 2

ácidos que atacam o esmalte dos dentes. Além disto, também pode ser classificado

como anticariogênico, pois estimula a produção de saliva, que possui capacidade

tamponante, o que, juntamente com o aumento na concentração de íons cálcio e

fosfato, induz a remineralização, revertendo lesões de cáries recém formadas

(BIRKHED, 1994; MAKINEN et al., 1998; MAKINEN, 2000, van LOVEREN, 2004).

Outra vantagem do consumo de xilitol é sua ajuda na prevenção da transmissão de

S. mutans de mãe para filho durante os seis primeiros anos (ISOKANGAS et al.,

2000; SODERLING, et al., 2000; SODERLING, et al., 2001).

Diversos estudos já demonstraram que o consumo regular de chicletes

contendo xilitol reduz a incidência de cáries (MAKINEN et al., 1998; HUJOEL et al.,

1999; ALANEN et al., 2000; AUTIO, 2002). Os efeitos cariostático e anticariogênico

impulsionam o uso de xilitol em cremes dentais, pastilhas, gomas de mascar e outros

produtos para controle e prevenção às cáries. Estas aplicações já geraram diversas

patentes em diferentes países, tais como US4000320 (1976), US5376389 (1994) e

JP10165103 (1998) que descrevem o uso de xilitol em chicletes, US3970747 (1976),

US5424059 (1995), PI9805385 (1998) e JP2003081795 (2003) uso em creme dental,

US5560906 (1996) e PI0206087 (2002) uso em anti-séptico bucal, entre outras.

Em alguns países europeus, o xilitol já vem sendo utilizado como adoçante,

tendo a vantagem de não apresentar sensação desagradável após o uso. No Brasil,

sua utilização se limita à composição de produtos como creme dental, gomas de

mascar e pastilhas.

O xilitol é apropriado para o uso em produtos alimentícios processados em

temperaturas elevadas quando reações de Maillard não são desejadas. Estas

reações podem ocorrer quando proteínas são aquecidas na presença de açúcares

redutores, resultando na glicosilação do resíduo de aminoácido terminal ou de

resíduos de lisina, que resultam no escurecimento do produto. O xilitol, devido à

ausência de grupos aldeídicos ou cetônicos em sua molécula, não participa destas

reações, o que potencializa sua aplicação na indústria alimentícia (MANZ et al.,

1973; SIRENIUS et al., 1979; BÄR, 1991).

Outra vantagem do xilitol é não ser fermentado por muitos microrganismos, o

que viabiliza o uso em xaropes e refrescos sem a necessidade de pasteurização e da

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_______________________________________________________________________________________ 3

adição de conservantes quando o produto é estocado por quatro ou cinco meses em

frascos fechados (MANZ et al., 1973).

A sensação de vaporização nas cavidades oral e nasal é outra característica

importante do xilitol. Esta sensação é proporcionada pelo valor negativo do calor de

dissociação e é explorada em produtos farmacêuticos (vitaminas e expectorantes) e

confeitos (pastilhas e balas). Nestes produtos, o xilitol é usualmente combinado a

manitol, sorbitol ou ácido cítrico (PARAJÓ et al., 1998a).

Clinicamente, o xilitol é indicado para obesos por ser menos calórico e por

diminuir o nível de ácidos graxos livres no sangue, além de promover a mobilização e

a oxidação de gorduras (MANZ et al., 1973, GEORGIEFF et al., 1985); para

diabéticos, em substituição aos açúcares uma vez que seu metabolismo não ocorre

por vias dependentes de insulina (PEPPER e OLINGER, 1988). O xilitol também

pode ser empregado no tratamento de desordens metabólicas, como em casos de

anemia hemolítica presente em indivíduos com deficiência na enzima glicose-6-

fosfato desidrogenase, ou em casos de miopatias originadas pela deficiência em

mioadenilato desaminase. O xilitol ainda facilita a absorção de certas vitaminas e

cátions metálicos como cálcio, cobre e ferro (MAKINEN, 2000).

A utilização de xilitol em nutrição parenteral vem sendo amplamente aceita no

Japão e em alguns países da Europa. Estudos mostraram que a administração

hipocalórica de xilitol juntamente com aminoácidos preserva as proteínas do paciente

mais eficientemente que a infusão apenas de aminoácidos ou em combinação com

glicose (WAITZBERG, 1995). Além disto, comparado à glicose, o uso de xilitol reduz

a secreção de insulina e a lipogênese hepática, como também garante o fluxo de

aminoácidos dos tecidos periféricos para os órgãos, provendo precursores para a

síntese de proteínas (MAKINEN, 2000).

Pesquisas estão cada vez mais encontrando novas aplicações para o xilitol,

principalmente em uso clínico. O xilitol pode ser utilizado para a prevenção de otite

média aguda, pois inibe o crescimento e a adesão de espécies de Pneumococcus

spp. e a adesão de Haemophilus influenzae em células da nasofaringe. Ele foi

testado na forma de xarope, goma de mascar e pastilha diminuindo em 40% a

ocorrência de otite em crianças (UHARI et al., 1998). Outra aplicação do xilitol é a

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_______________________________________________________________________________________ 4

proteção contra osteoporose como demonstrado por MATTILA et al. (1998) em que

ratos submetidos a ovariectemia com uma dieta suplementada com 10% de xilitol,

apresentaram maior densidade óssea e volume trabecular, além de manter a

constituição mineral dos ossos. Estes efeitos protegem contra o enfraquecimento das

propriedades biomecânicas dos ossos, causado pela osteopenia (redução da

calcificação ou da densidade óssea) devido à falta de estrógenos, situação similar a

que acontece na menopausa em mulheres.

O xilitol em aerossol pode prevenir infecções pulmonares, inclusive em

pacientes com fibrose cística, pois reduz a concentração salina do líquido que cobre

as células do revestimento interno dos pulmões, aumentando a atividade antibiótica

corpórea natural contra as bactérias (ZABNER et al., 2000). Para o controle do

balanço da microbiota da pele, MASAKO et al. (2005) observaram que o uso da

combinação de xilitol com farnesol inibe a formação de biofilme de Staphylococcus

aureus além de dissolver o biofilme já existente.

Atualmente, o xilitol já é utilizado em produtos alimentícios, farmacêuticos ou

de saúde oral em mais de 35 países (CCC, 2006) com produção anual acima de

500.000 toneladas. As principais empresas que produzem este insumo são Xyrofin

Company, na Finlândia (Functional Foods from Finland, 2006), Danisco A/S, no

Reino Unido e na China (Danisco, 2006), Towa Chemical Industry Co. Ltd., na

Indonésia e Tailândia (Mitsubish Corporation, 2006), Roquette Frères S.A., na França

(Roquette Frères, 2006) e Bolak Co. Ltd., na Coréia (Bolak, 2006).

1.2. Toxicidade e Tolerância

Em organismos superiores, o metabolismo do xilitol ocorre principalmente no

fígado onde pode ser transformado em glicose a uma taxa entre 20 e 80%,

dependendo da necessidade. Sua absorção é lenta e, por isso, também pode ser

metabolizado indiretamente pela biota intestinal. O xilitol é bem tolerado pelo corpo

humano com consumo de até 0,5 g/kg de peso corpóreo por dia. Em alguns casos, o

consumo acima desta proporção pode apresentar efeito laxativo devido ao

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_______________________________________________________________________________________ 5

desbalanço osmótico causado no intestino grosso pela baixa taxa de assimilação

(PARAJÓ et al., 1998a; MAKINEN, 2000).

Quanto à segurança do consumo e utilização por humanos, o xilitol é aceito

pela Comunidade Econômica Européia - European Economic Community desde

1984, enquanto a Agência de Controle de Alimentos e Medicamentos dos EUA - U.S.

Food and Drug Administration (FDA) o classifica como “geralmente reconhecido

como seguro” (Generally Recognized as Safe - GRAS) desde 1986 e “seguro para os

dentes” (Safe for Teeth) desde 1994. O Comitê de aditivos alimentares - Joint Expert

Committee on Food Additives da Organização Mundial de Saúde, confirmou os

estudos de toxicidade e o classificou como aceitável para consumo diário

(Acceptable Daily Intake - ADI). No Brasil, o xilitol foi aprovado como produto

dietético pelo Ministério da Saúde em 1980 (AGUIAR et al., 1999).

2. Obtenção de Xilitol

O xilitol pode ser recuperado de fontes naturais como vegetais, fungos e

líquens por extração sólido-líquido, porém como está presente em pequena

proporção, menos de 0,9 g/100g, este processo se torna economicamente inviável

(PARAJÓ et al., 1998a).

A produção de xilitol em larga escala ocorre pelo processo químico, que

consiste na redução de xilose, derivada principalmente de hidrolisados de materiais

lignocelulósicos ricos em xilana. O processo convencional inclui quatro passos

básicos: i) hidrólise ácida de material vegetal, ii) purificação do hidrolisado até

obtenção de xilose pura, iii) hidrogenação catalítica da xilose a xilitol e, iv) purificação

e cristalização do produto. Este processo está patenteado desde 1977 por MELAJA e

HAMALAINEN.

O rendimento do processo químico, bem como a qualidade do xilitol, são

dependentes da pureza da solução inicial de xilose uma vez que a presença de

impurezas interfere na redução catalítica. Para a obtenção de uma solução de xilose

de elevada pureza, são necessários operações de troca-iônica, descoloração e

fracionamento cromatográfico. Além disto, após a remoção do catalisador por

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_______________________________________________________________________________________ 6

filtração e troca-iônica, a solução de xilitol é concentrada, sofre fracionamento

cromatográfico utilizando resinas catiônicas e é cristalizada para obtenção do

produto puro (AGUIAR et al., 1999). As diversas etapas de purificação para remoção

de resíduos e sub-produtos resultam no aumento de tempo de processamento e

encarecimento do produto. O alto custo de produção de xilitol, dez vezes maior ao da

sacarose ou sorbitol, limita a sua utilização em larga escala (PARAJÓ et al., 1998a).

Como alternativa a este processo, o xilitol pode ser produzido

microbiologicamente a partir da xilose obtida na hidrólise de materiais

lignocelulósicos, sem a necessidade de purificação da matéria prima (ONISHI e

SUZUKI, 1971; SILVA et al., 1996; FELIPE et al., 1997; PARAJÓ et al., 1998a, b, c).

Este processo, que utiliza microrganismos fermentadores de xilose para produção de

xilitol foi patenteado na Finlândia em 1992 (HEIKKILA et al., 1992) e é utilizado pela

indústria Bolak Co. Ltd. na Coréia (BOLAK, 2006). A presença de compostos

orgânicos como xilose, arabinose, arabitol, manose, manitol entre outros, e a baixa

concentração de xilitol no final da fermentação dificultam as etapas de separação,

purificação e cristalização. Porém, DE FAVERI et al. (2002) demonstraram através

de estudos de cristalização de xilitol que é possível obter um produto altamente puro

(grau de pureza > 90%) utilizando hidrolisado hemicelulósico fermentado por

Debaryomyces hansenii.

Vários microrganismos já foram identificados como fermentadores de xilose a

xilitol. Dentre os fungos filamentosos pode-se citar espécies dos gêneros Penicillium,

Aspergillus, Rhizopus, Glicocladium, Byssochlamys, Myrothecium, Neurospora,

Rhodotorula, Torulopsis (CHIANG e KNIGHT, 1960); Mucor e Fusarium (PARAJÓ et

al. 1998a); além de Petromyces albertensis (DAHIYA, 1991). Poucas bactérias, como

Corynebacterium sp., Enterobacter liquefaciens e Mycobacterium smegmatis,

formam xilitol (WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998) porque, geralmente,

convertem xilose diretamente em xilulose sem os passos de oxirredução (Figura 2).

Porém, um screening realizado por RANGASWAMY e AGBLEVOR (2002) identificou

espécies dos gêneros Serratia, Cellulomonas e Corynebacterium que foram capazes

de produzir xilitol com rendimento de até 0,57g xilitol/g xilose.

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Entre os microrganismos identificados pela maior eficiência de conversão de

xilose em xilitol destacam-se as leveduras, especialmente às pertencentes ao gênero

Candida (Tabela 1). A produção de xilitol por fermentação é regulada por diversos

parâmetros como oxigênio disponível, pH, temperatura, nível inicial de xilose,

presença de outros açúcares e inóculo inicial. Para cada microrganismo utilizado

estes parâmetros devem ser otimizados.

Figura 2. Metabolismo de xilose e regeneração de cofatores. Adaptado de BARBOSA et al. (1988) e

DAHIYA (1991)

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Tabela 1. Produção de xilitol a partir de xilose por diferentes espécies de Candida spp.

Levedura Xilose (g/L) Xilitol (g/L) Q

(g/L.h) Y

P/S

(g/g) t(h)

Candida sp. L-102 114 100 1,53 0,88 66

C. guilliermondii 300 221 0,54 0,74 406

C. parapsilosis 300 210 3,18 0,70 66

C. tropicalis IFO-0618 150 94 2,94 0,63 32

C. tropicalis KFCC-10960 300 246 3,62 0,82 68

: produtividade, Y

P/S

: rendimento.

Fonte: OH e KIM (1998)

Existem ainda microorganismos que, por possuírem a enzima arabitol

desidrogenase, formam xilitol a partir de arabinose ou arabitol. Dentre eles destaca-

se Aspergillus niger (WITTEVEEN et al., 1994), Pichia stipitis (HALLBORN et al.,

1995) e Gluconobacter oxydans, que alcançou o rendimento de 0,98 g xilitol/ g

arabitol, quando etanol e glicose também estavam presentes no meio de cultura

(SUZUKI et al., 2002). Estes microrganismos possivelmente participam do processo

fermentativo, ou mesmo fornecem alternativas para engenharia metabólica, porém

novos estudos ainda estão sendo conduzidos.

A enzima arabitol desidrogenase de Candida tropicalis já foi caracterizada e

seu gene foi clonado por MURRAY et al. (1995), indicando que esta levedura

também pode utilizar arabinose para formar xilitol.

3. Bioconversão de Xilose em Xilitol

Geralmente, em microrganismos, o xilitol é um intermediário do metabolismo

da xilose, porém, na maioria das bactérias e em algumas leveduras, a xilose é

convertida diretamente em xilulose pela enzima xilose isomerase

(EC 5.3.1.5) sem a formação de xilitol (YOKOYAMA et al. 1995a). Já a maioria das

leveduras metabolizam xilose pela redução a xilitol catalisada pela enzima xilose

redutase (EC 1.1.1.21) na presença de cofatores reduzidos: NADPH e/ou NADH.

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O xilitol formado durante o metabolismo de xilose pode ser exportado ou

oxidado a xilulose, esta reação é catalisada pela enzima xilitol desidrogenase

(EC 1.1.1.9) dependente de cofatores oxidados NADP

e/ou NAD

(JEFFRIES, 1983;

SLININGER et al., 1987). A xilulose é então fosforilada no carbono 5 pela xilulose

quinase e metabolizada pela via pentose fosfato, além de poder sofrer isomerização

a xilose e reiniciar a seqüência de reações (DAHIYA, 1991). O esquema do

metabolismo inicial de xilose em microrganismos é apresentado na Figura 2.

Tabela 2. Especificidade pelos cofatores das enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase

(XDH) em diferentes leveduras.

Cofator

Levedura

XR XDH

Referência

Candida utilis NADPH NAD

BRUINENBERG et. al. (1984)

Pichia stipitis NADPH* ou NADH NAD

ou NADP

HAHN-HAGERDAL et al. (1994)

Candida shehatae NADPH* ou NADH NAD

ou NADP

HAHN-HAGERDAL et al. (1994)

Pachysolen tannophilus NADPH* ou NADH NAD

ou NADP

HAHN-HAGERDAL et al. (1994)

Kluyveromyces lactis NADPH n.a.

BILLARD et al. (1995)

Debaryomyces hansenii n.a. NAD

GIRIO et al.,(1996)

Candida tropicalis NADPH NAD

* ou NADP

YOKOYAMA et al. (1995a)

TAKAMIZAWA et al. (2000)

Candida guilliermondii NADPH NAD

ou NADP

SILVA et al. (1996)

Candida intermedia NADPH* ou NADH n.a.

MAYR et al. (2000)

Candida tenuis NADPH* ou NADH n.a.

KAVANAGH et al. (2003)

Candida parapsilosis NADPH ou NADH* n.a.

LEE et al. (2003)

Cryptococcus flavus NADPH n.a.

MAYR et al. (2003)

n.a.: não apresentado, *: preferencialmente

As enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) podem ter

diferentes especificidades por cofatores (Tabela 2) e ainda podem se apresentar em

mais de uma forma no mesmo organismo. VERDUYN et al. (1985a,b) demonstraram

que P. stipitis possui somente uma forma de XR com especificidade para o cofator

fosfatado ou não, enquanto Pachysolen tannophilus possui duas formas de XR com

diferentes especificidades. Em Candida intermedia, foram isoladas duas formas de

XR: uma com especificidade apenas por NADPH, e outra que pode usar NADH ou

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NADPH como cofator. Neste caso, a razão de NADH/NADPH disponível no citossol

deve determinar qual das duas formas será utilizada para conversão de xilose em

xilitol (MAYR et al., 2000).

A produção de xilitol por leveduras está intimamente relacionada à

regeneração de cofatores reduzidos (BRUINENBERG et al., 1984; BARBOSA et al.,

1988). Pela via pentose fosfato, 1 mol de glicose-6-fosfato é completamente oxidado

a H

O e CO

gerando 12 moles de NADPH a partir de NADP

. A fim de manter o

balanço de cofatores, o NADPH produzido é usado para reduzir xilose a xilitol, sendo

assim, o xilitol é catabolizado para produzir glicose-6-fosfato e regenerar suficiente

NADP

para manter o ciclo (BARBOSA et al., 1988).

A partir da análise das constantes cinéticas K

e V

max

das enzimas XR e XDH

é possível explicar o acúmulo de xilitol em C. guilliermondii FTI 20037. O K

de XR

(0,18 M) é quatro vezes menor que o K

de XDH (0,75 M), enquanto a V

max

para XR

(243 U/mL) é maior que a V

max

de XDH (168 U/mL) - isto mostra que a formação de

xilitol é mais rápida do que sua conversão em xilulose (SILVA et al.,1996).

3.1. Xilose Redutase

As XR de leveduras pertencem à família das aldoredutases, superfamília

aldocetoredutases, e catalisam a redução reversível de aldeído e cetona em seus

álcoois correspondentes. Estas enzimas estão presentes no citoplasma de

microrganismos capazes de metabolizar xilose como fonte de carbono e, devido ao

interesse em aproveitar esta pentose em processos fermentativos, diversas

pesquisas vêm sendo desenvolvidas.

As enzimas XR de diferentes leveduras e fungos já foram purificadas e

caracterizadas, sendo em sua maioria monoméricas, com massa molecular entre 33

e 40 kDa, porém em P. stipitis, Neurospora crassa, C. tropicalis e Candida

parapsilosis, a enzima apresenta duas subunidades (LEE, 1998; LEE et al., 2003).

Como pode ser observado na Tabela 2, algumas enzimas possuem especificidade

unicamente por NADPH - monoespecífica, e outras podem utilizar tanto NADPH

como NADH - duplo-específica. Já C. intermedia apresenta isoenzimas, onde uma é

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monoespecífica e a outra é duplo-específica (NIDETZKY et. al, 2003). A maioria das

leveduras já estudadas apresenta XR duplo-específicas e estas preferem NADPH

como cofator, excepcionalmente C. parapsilosis apresenta uma enzima que prefere

NADH (LEE et al., 2003). YOKOYAMA et al. (1995a) sugerem que microrganismos

que apresentam XR-NADH dependente são melhor produtores de etanol, ao

contrário daqueles que apresentam XR-NADPH dependente que produzem xilitol ao

invés de etanol.

O gene XYL1, que codifica XR, de P. stipitis foi clonado e expresso na

levedura Saccharomyces cerevisiae, porém, esta não pôde utilizar xilose como fonte

de carbono. Este gene não apresenta íntrons e a proteína de 318 resíduos de

aminoácidos (aa), com massa molecular de 35,8 kDa, é codificado por uma ORF de

954 pb. (AMORE et al., 1991). O gene que codifica para XR de P. tannophilus foi

isolado e caracterizado por BOLEN et al. (1996). Em Kluyveromyces lactis, o gene

XYL1 foi isolado, apresentando uma ORF de 987 pb, que codifica um polipeptídeo de

329 aa, com 62% de identidade com o homólogo em P. stipitis. Este gene está

presente em única cópia no cromossomo V e codifica para uma enzima com

atividade dependente de NADPH sendo expressa constitutivamente (BILLARD et al.,

1995).

O gene XYL1 de C. guilliermondii foi clonado e expresso em Pichia pastoris

sob controle do promotor induzido AOX1, a proteína produzida apresentou tamanho

de 318 aa, com massa molecular de 36 kDa, igual à proteína nativa de P. stipitis,

porém, com 70,4% de identidade (HANDUMRONGKUL et al., 1998). O gene XYL1

de C. parapsilosis foi clonado e expresso em C. tropicalis, sob controle do promotor

da álcool desidrogenase, o polipeptídeo de 324 aa e 36,6 kDa é produto de uma

ORF de 975 pb (LEE et al., 2003).

Em C. tropicalis, YOKOYAMA et al. (1995b), identificaram dois genes que

codificam XR, que apresentam uma ORF de 972 pb, que codifica um polipeptídeo de

324 aa com 73% de identidade com o homólogo em P. stipitis. O seqüenciamento

destes genes revelaram que as seqüências de aminoácidos preditas diferem em

apenas 3 aa. Estes genes foram clonados e expressos em Escherichia coli. SUZUKI

et al. (1999) expressaram o gene de xilose redutase de C. tropicalis em E. coli e

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_______________________________________________________________________________________ 12

obtiveram pH ótimo de 6,0, temperatura ótima de 55°C a 60°C e K

para xilose igual

a 38,2 mM para a enzima recombinante e 26,9 mM para nativa, enquanto para

NADPH foram observados os valores de K

de 14,1 µM e 9,1 µM para a

recombinante e a nativa, respectivamente. Além de xilose, a enzima foi capaz de

utilizar como substrato arabinose, gliceraldeído e galactose.

LEE (1998), comparando as seqüências primárias de XR de diferentes

leveduras, observou que são conservados em todas elas, os resíduos Asp

, Tyr

Lys

, His

110

, Lys

262

, que participam diretamente na catálise ou na ligação do cofator.

3.2. Xilitol Desidrogenase

A enzima xilitol desidrogenase (XDH), pertencente à família álcool

desidrogenase é encontrada em microrganismos que metabolizam xilose pela

formação de xilitol, sendo que a enzima catalisa a oxidação do álcool em cetona

utilizando NAD

como cofator, porém já foram isoladas formas de enzimas que são

capazes de utilizar as duas formas do cofator: fosforilada ou não (Tabela 2).

TAKAMIZAWA et al. (2000) purificaram parcialmente a enzima xilitol

desidrogenase de C. tropicalis IFO 0618 com a finalidade de desenvolver um

biosensor de xilitol. Eles observaram que o pH ótimo (8,0) foi semelhante ao de XDH

de Candida shehatae, P. stipitis e P. tannophilus, mas a temperatura ótima (50°C) foi

superior. Comparada com enzimas de outras leveduras, o K

de XDH de C. tropicalis

para xilitol é maior (49,8 µM) e portanto como biosensor é menos sensível, porém

este pode ser um dos motivos que explicam porque C. tropicalis é uma das melhores

espécies de levedura para produção de xilitol. Dos álcoois testados, xilitol foi oxidado

mais rapidamente, apresentando atividade também por sorbitol e ribitol, a enzima

não mostrou atividade em arabitol, glicerol e etanol.

Em A. niger, foram caracterizadas duas formas de XDH: uma NAD

dependente já isolada em diferentes leveduras, como xilitol:NAD

2-oxidoredutase

DXDH (EC 1.1.1.9), e outra, NADP

dependente, que atuaria principalmente na

redução de xilulose, identificada como xilitol:NADP

4-oxidoredutase LXDH

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_______________________________________________________________________________________ 13

(EC 1.1.1.10) permitindo a formação de xilitol a partir de arabinose (WITTEVEEN et

al., 1994).

Na levedura P. stipitis, também foram encontradas duas formas de XDH: uma

pertencente à família das álcool desidrogenases de cadeia média, correlacionada a

sorbitol desidrogenase (EC 1.1.1.14) pela presença do sítio de ligação a zinco; e

outra, da família das desidrogenases de cadeia curta com dois resíduos

característicos no seu sítio ativo, uma tirosina e uma leucina (PERSSON et al., 1993;

JORNVALL et al.,1995). Recentes estudos com proteínas da família das

desidrogenases de cadeia curta mostraram um padrão de α/β, com uma folha β

central correspondente ao domínio Rossman-fold. Além disto, foi proposto um

mecanismo de reação com o envolvimento da tétrade Asn-Ser-Tyr-Lys

(OPPERMANN et al., 2003).

GIRIO et al. (1996) sugerem que os valores de K

de XDH para o substrato e

o cofator podem mostrar qual levedura acumularia maior concentração de xilitol. A

enzima de D. hansenii apresenta K

na mesma ordem de magnitude para xilitol e K

de 2 a 5 vezes maior para NAD

, quando comparado ao de outras leveduras. Assim

sendo, diminuindo a concentração do cofator, a oxidação de xilitol cessaria havendo

acúmulo deste intermediário no meio. PHADTARE et al. (1997) consideram a XDH

como a enzima chave na fermentação de xilose para formação de etanol já que sua

atividade determina a eficiência da conversão do substrato. WALFRIDSSON et al.

(1997) transformaram S. cerevisiae, com genes de xilose redutase (XYL1) e xilitol

desidrogenase (XYL2) de P. stipitis e analisaram o produto formado durante a

utilização de xilose. Quando a razão entre as atividades específicas das duas

enzimas (XR:XDH) foi igual a 17,5, formou-se 0,82 g de xilitol por grama de xilose

consumida; quando a razão foi igual a 5,0, formou-se 0,58 g de xilitol e, quando a

razão foi igual a 0,06, nenhum xilitol foi formado, porém, observou-se maior produção

de etanol.

As enzimas XDH de C. shehatae, P. tannophilus, N. crassa e Galactocandida

mastotermitis foram purificadas e caracterizadas, apresentando subunidades com

massa molecular de cerca de 40 kDa. As enzimas de C. shehatae e N. crassa se

apresentam com duas subunidades, enquanto que, nas de P. tannophilus e G.

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_______________________________________________________________________________________ 14

mastotermitis, existem quatro subunidades (PHADTARE et al., 1997, LUNZER et al.,

1998).

Até hoje, o gene XYL2 foi isolado de poucos organismos. Em 1990, KOTTER

et al. isolaram o gene XYL2 de P. stipitis e o expressaram em S. cerevisiae. Para

Trichoderma reesei, o gene foi isolado de uma biblioteca de cDNA e apresentou 1,3

kb codificando uma proteína de massa molecular de 40 kDa (WANG et al., 1998). O

gene de G. mastotermitis com cerca de 1,1 kb foi expresso em E. coli por

HABENICHT et al. (1999). Apesar de S. cerevisiae não ser capaz de fermentar

xilose, RICHARD et al., (1999) identificaram que a ORF YLR070c codifica para uma

proteína com atividade de xilitol desidrogenase. A levedura Arxula adeninivorans

possui o gene XYL2 (1107 pb) codificando uma proteína de 368 resíduos de

aminoácidos e 40.3 kDa (BÖER et al., 2005). O gene XYL2 da bactéria G. oxidans

apresentou 798 pb, codificando uma proteína de 27 kDa, confirmada com a

purificação e caracterização da enzima que pode ser classificada como da família

das desidrogenases de cadeia curta (SUGIYAMA et al., 2003).

3.3. Repressão do Metabolismo de Xilose

Glicose é a fonte de carbono preferencial na grande maioria dos organismos e

quando está presente no meio de cultura o consumo de outros açúcares, como a

xilose, é impedido por repressão catabólica. A expressão das enzimas envolvidas no

catabolismo de xilose é geralmente inibida por glicose e induzida por xilose, este

padrão foi observado para xilitol desidrogenase de Hypocrea jecorina (SEIBOTH et

al., 2003), A. adeninivorans (BÖER et al., 2005) e C. tropicalis (LIMA et al., 2006,

submetido), e para xilose redutase e xilulose-5P quinase de A. niger (HASPER et al.,

2000; van PEIJ et al., 1998).

PRATHUMPAI et al. (2004), demonstraram em Aspergillus nidulans que a

repressão por glicose no metabolismo de xilose é mediado pela proteína CreA

(proteína responsiva a cAMP). Esta proteína se liga ao promotor de genes, como os

das enzimas XR e XDH, e desta forma reprime a transcrição. Na linhagem

desreprimida (∆creA), quando comparada à linhagem selvagem, glicose e xilose

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 15

foram consumidas ao mesmo tempo na mesma proporção e as atividades de xilose

redutase e xilitol desidrogenase foram maiores na presença de glicose.

Para estudar a influência da repressão catabólica mediada por Mig1 e Mig2 no

metabolismo de xilose, foram construídas duas linhagens mig1∆ e mig1∆ mig2∆ a

partir de S. cerevisiae TMB3001, que expressa XYL1 e XYL2 de P. stipitis e

superexpressa xiluloquinase. Os melhores resultados foram obtidos para linhagem

∆mig1, onde se observou um aumento de 25% no consumo de xilose durante

fermentação contínua e o aumento da produtividade de etanol de 0,475 g/L.h para

0,6 g/L.h, porém foi concluído que a repressão por glicose não parece ser o maior

obstáculo para o eficiente metabolismo de xilose (ROCA et al.,2004).

3.4.Transporte de Xilose

O transporte de xilose através da membrana pode ser uma das etapas

limitantes do metabolismo deste açúcar, sendo assim, para viabilizar o processo

fermentativo este fator também deve ser considerado. Estudos de transportadores

de xilose e glicose foram realizados em diferentes microrganismos: S. cerevisiae

(LAGUNAS, 1993), C. shehatae (LUCAS e van UDEN, 1986), Schizosaccharomyces

pombe (HÖFER e NASSAR, 1987), P. stipitis (KILLIAN e van UDEN, 1988); K. lactis

(WESOLOWSKI-LOUVEL et al., 1992), Candida utilis (KILLIAN et al., 1993), D.

hanseinii (NOBRE et al., 1999) Candida succiphila e Kluyveromyces marxianus

(STAMBUK et al., 2003). Em todos esses modelos são descritos dois tipos de

transporte: por difusão facilitada e/ou simporte de prótons H

Diversos transportadores de hexoses têm sido identificados em S. cerevisiae.

Eles podem ser de alta (Hxt2, Hxt6 e Hxt7) ou baixa afinidade (Hxt1, Hxt3 e Hxt4)

para glicose e a expressão de Hxt1, Hxt2, Hxt4, Hxt6 e Hxt7 é regulada pelos

sensores Snf3 e Rgt2 (ÖZCAN et al., 1996; BOLES e HOLLENBERG, 1997). Os

mesmos transportadores também transportam xilose, mas com menor afinidade do

que para glicose, frutose ou manose, que quando utilizados como co-substratos

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saturam o sistema e inibem o transporte de xilose. (MEINANDER e HAHN-

HAGERDAL, 1997).

LUCAS e van UDEN (1986) estudaram o transporte de monômeros de

hemicelulose em C. shehatae e constataram, que tanto glicose, como xilose são

transportadas por sistema de difusão facilitada e também por simporte de prótons.

Quando crescida sob condições de supressão de fontes de carbono, esta levedura

produz um sistema de difusão facilitada que reconhece glicose, D-manose e D-

xilose. Glicose e xilose são mutuamente inibidores não competitivos indicando que

as duas atividades nos sistemas de afinidade correspondem a dois simportes

distintos com K

e V

max

próprios (K

entre 1,0-3,4 mM para glicose e 100-153 mM

para xilose; V

max

entre 2,0-2,6 mmols/g.h para glicose e 20-25 mmols/g.h para

xilose). O mesmo comportamento de inibição foi observado em P. stipitis (KILIAN et

al., 1988) e para C. intermedia, para a qual também foram propostos dois sistemas

de transporte de xilose: um com alta afinidade, porém com baixa capacidade e

fortemente inibido por glicose, provavelmente por difusão facilitada, e outro por

simporte de prótons, com baixa afinidade, porém com alta capacidade de transporte

(GARDONYI et al., 2003a

). STAMBUK et al. (2003) analisando a cinética e a

regulação da assimilação de xilose por C. succiphila e K. marxianus, concluíram que,

em leveduras, existe uma grande variedade de transportadores de D-xilose com

diferentes padrões de expressão regulados tanto pela disponibilidade de açúcares,

quanto pelas condições de crescimento.

A enzima XR possui baixa afinidade por xilose (K

> 50–100mM), sendo

necessária alta concentração intracelular para sua eficiente utilização (RIZZI et al.,

1988). ELIASSON et al. (2000) demonstraram que, em S. cerevisiae recombinante

contendo as enzimas para o metabolismo de xilose, o transporte desta pentose limita

o seu fluxo e seu metabolismo, diminuindo o rendimento da fermentação.

GARDONYI et al. (2003b) propuseram que S. cerevisiae, mesmo expressando os

genes do metabolismo de xilose, utiliza menos este açúcar do que outras leveduras,

tais como

P. stipitis ou C. shehatae, porque estas possuem transportadores

específicos, enquanto S. cerevisiae transporta xilose por transportadores de hexose

de alta afinidade.

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LEE et al. (2002) estudando a afinidade dos transportadores, observaram que

xilose pode ser internalizada por transportadores de glicose de alta e baixa afinidade

e que existe outro sistema de transporte de açúcares além dos transportadores de

glicose. Os autores propõem que a expressão do transportador de alta afinidade de

glicose e do transportador de xilose pode ser uma estratégia para aumentar a

produtividade de xilitol por S. cerevisiae recombinante. Uma linhagem de S.

cerevisiae recombinante capaz de metabolizar xilose, porém deficiente em 18

transportadores de monossacarídeos, não foi capaz de crescer em xilose como única

fonte de carbono. Quando alguns genes de transportadores (HXT4, HXT5, HXT7 e

GAL2) foram reintroduzidos, a levedura restabeleceu o metabolismo de xilose

(HAMACHER et al., 2002).

Apesar da importância do transporte de xilose para o seu metabolismo,

comparando-se recombinantes de Lactococcus lactis expressando XYLT

(transportador simporte xilose-H

) de Lactobacillus brevis, foi observado que não

houve diferença de produtividade entre o que expressava ou não o transportador de

xilose (NYYSSOLA et al., 2005). Em S. cerevisiae a superexpressão de

transportadores de xilose não aumentou o seu crescimento, nem a taxa de

fermentação em condições aeróbicas, indicando que o transporte de xilose não

determina o seu fluxo (HAMACHER et al., 2002).

4. Leveduras do Gênero Candida

Candida é um gênero de ascomicetos que se apresenta, geralmente, na forma

unicelular, porém, muitas espécies também se desenvolvem como hifas, como as

que podem desenvolver infecções oportunistas. A espécie patogênica ao homem

mais conhecida é C. albicans que se desenvolve na pele, na mucosa oral ou vaginal.

Em indivíduos imunocomprometidos, em adição às lesões superficiais, podem-se

desenvolver esofagites ou endocardites e outras espécies podem se desenvolver

além de C. albicans. A virulência de espécie de Candida spp. é atribuída ao

dimorfismo, a aderência, secreção de enzimas, diversidade de fenótipos,

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_______________________________________________________________________________________ 18

variabilidade de antígenos e receptores que se ligam ao sistema do complemento

(GILFILLAN et al., 1998).

Além da importância para a saúde pública, o gênero Candida apresenta

diversos outros interesses. Por exemplo, C. guilliermondii pode ser usada em

biorremediação por ser capaz de assimilar e metabolizar hidrocarbonetos

(ISMAILOV, 1985), e C. antartica e C. tropicalis são empregadas na produção de

ácidos dicarboxílicos, matéria-prima para produção de perfumes, poliamida, poliéster,

adesivos e antibióticos (PICATAGGIO et al., 1991; CRAFT et al., 2003). Contudo,

uma das principais áreas de aplicação de leveduras do gênero Candida é na

indústria alimentícia (Tabela 3). Mesmo podendo ser patogênicas oportunistas, a

Agência de Controle de Alimentos e Medicamentos dos EUA - US Food and Drug

Administration

(FDA) tem permitido o uso de C. guilliermondii e C. lipolytica na

produção de ácido cítrico.

Tabela 3. Espécies de Candida spp. com aplicação na indústria de alimentos.

Processo Microrganismo Referência

Glutamato Monosódico C. utilis, C. lipolytica e C. krusei Oki et al. (1971)

Ácido Cítrico C. lipolytica Pazouki et al. (2000)

Acido Ascórbico (vitamina C) C. norvegensis e C. antarctica

Cayle et al. (1986)

Yan et al. (1999)

Riboflavina (vitamina B2) C. guilliermondii Ghanem et al. (1992)

L-Arabitol C. entomaea Saha e Bothast (1996)

Xilitol C. tropicalis e C. guilliermondii

Meyrial et al. (1991)

Yahashi et al. (1996)

As leveduras do gênero Candida são conhecidas também como produtoras de

xilitol. Dentre as espécies já estudadas, C. tropicalis e C. guilliermondii são as mais

promissoras, apresentando produtividade acima de 0,7 g de xilitol/g de xilose. O

processo de produção de xilitol por C. tropicalis foi patenteado nos EUA e no Japão

por KIM et al. (1999a e 2000).

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GRANSTRÖM e LEISOLA (2002), estudaram o metabolismo de xilose em C.

tropicalis e C. guilliermondii e demonstraram que a primeira apresentou taxa de

produção de xilitol máxima igual a 196 C-mmol/Cmol CDW/h após 6h de

fermentação, enquanto a segunda apresentou 92,3 C-mmol/Cmol CDW/h após 10h

de fermentação. Analisando os trabalhos publicados nos últimos cinco anos, nota-se

que a melhor condição para produção de xilitol por C. tropicalis foi estabelecida por

SHEU et al. (2003) que alcançou rendimento igual a 0,95 g xilitol/ g xilose e

produtividade igual 4,68 g/L.h, em fermentação com baixa aeração (0,2 L/min) e com

o potencial oxi-redoxi igual a -180 mV, controlado pela alimentação com glicose.

Para C. guilliermondii, a melhor condição apresentou rendimento igual a 0,76 g

xilitol/g xilose e rendimento igual a 1,55 g/L.h, utilizando fermentação em condições

de baixa aeração (GIMENES et al., 2002).

Os estudos utilizando C. guilliermondii FTI 20037 apresentam parâmetros

fermentativos superiores quando comparados aos obtidos por GIMENES et al.

(2002), porém estes não foram considerados, pois, segundo LIMA et al. (2003), esta

levedura é, na verdade, uma linhagem de C. tropicalis como demonstrado

posteriormente nesse trabalho.

4.1. Candida tropicalis

C. tropicalis é uma levedura dimórfica, esporogênica, diplóide, que tem sido

estudada quanto a sua fisiologia e suas aplicações práticas. Esta levedura possui

importantes aplicações industriais por ser capaz de assimilar n-alcanos produzindo

ácidos dicarboxílicos de cadeia longa para produção de poliamida, poliéster e

perfume (PICATAGGIO et al., 1991), bem como por fermentar xilose formando xilitol.

DOI et al. (1992), avaliando o tamanho de cromossomos de diversas espécies do

gênero Candida, confirmaram que C. tropicalis é diplóide, estimando o tamanho do

genoma em 30 Mb, com número de cromossomos total igual a 12. BLANDIN et al.

(2000) apresentaram os primeiros resultados do projeto genoma de C. tropicalis, as

seqüências foram inicialmente depositadas no EMBL Nucleotide Sequence

Database.

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Para transformação de C. tropicalis, já foram utilizados diferentes métodos,

tais como cloreto de lítio, formação de esferoplastos (HAAS et al., 1990; KANAYAMA

et al., 1998), acetato de lítio (LEE et al., 2003) e eletroporação (ROHRER e

PICATAGGIO, 1992). Para se estabelecer um sistema de transformação é

preponderante encontrar uma marca de seleção adequada, tendo em vista que

muitas espécies do gênero Candida traduzem CUG, um códon universal de leucina,

como serina (SUGITA e NAKASE, 1999), o que inviabiliza o uso de marcas

dominantes de outros organismos. HARA et al. (2000) construíram um vetor

utilizando o gene de resistência a higromicina (HYG), alterando todos os nove

códons CTG para CTC por mutagênese sítio-dirigida.

Zeocina é um antibiótico, membro da família de bleomicina/fleomicina, isolado

de Streptomyces verticillus que apresenta alta toxicidade contra bactérias, fungos,

plantas e células de mamíferos (BARON et al., 1992; DROCOURT et al., 1990;

MULSANT et al., 1988; PEREZ et al., 1989). Proteínas que conferem resistência a

zeocina têm sido isoladas e caracterizadas, como por exemplo, o produto do gene

ble de Streptoalloteichus hindustanus (CALMELS et al., 1991; DROCOURT et al.,

1990). Esta proteína apresenta 13,7 kDa e tem a capacidade de se ligar a zeocina,

inibindo sua atividade de quebra do DNA. A expressão desta proteína em

hospedeiros procarióticos e eucarióticos confere resistência a zeocina. TANG et al.

(2003) sintetizaram o gene ble trocando os códons CUG para códons de leucina a

fim de utilizar zeocina como marca de seleção no sistema de transformação de

Candida rugosa. LEE et al. (2003) obtiveram transformantes de C. tropicalis

utilizando um vetor com resistência a aureobasidina A como marca de seleção.

Aureobasidina A é um peptídeo cíclico, produzido por Aureobasidium pullulans, que é

inibidor do gene da enzima inositol fosfoceramida sintetase (AUR1), impedindo a

síntese de esfingolipídeos (ZHONG et al., 2000). A construção de um sistema de

transformação para leveduras utilizando o gene de resistência a aureobasidina foi

primeiramente descrito por HASHIDA-OKADO et al. (1998).

Com a finalidade de utilizar a marca auxotrófica URA3, o gene que codifica

para enzima orotidina 5’-monofosfato descarboxilase, em C. tropicalis, HAAS et al.

(1990) e HARA et al. (1999) geraram mutantes ura3

. Para tanto, utilizaram meio

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contendo 5-FOA (ácido 5-fluorótico) uma droga que permite a contra-seleção.

Contudo a exposição a este ácido pode gerar rearranjos cromossomais e outras

anormalidades genéticas (WELLINGTON e RUSTCHENKO, 2005) e além disto

C. tropicalis apresenta dois alelos para este gene (HAAS et al.,1990) e por ser

diplóide (DOI et al., 1992) são necessários pelo menos quatro eventos de mutação.

Uma linhagem de C. tropicalis auxotrófica para uracila está disponível na American

Type Culture Collection (ATCC), porém o seu uso está patenteado nos EUA

(US5254466). HARA et al. (1999) construíram um vetor de replicação autônoma para

C. tropicalis utilizando sua seqüência ARS (Autonomously Replicating Sequence),

cuja utilização está patenteada no Japão (JP2000078980-A).

5. Engenharia Metabólica

O aumento das atividades celulares pela manipulação de funções enzimáticas,

regulatórias e de transporte na célula com o uso da tecnologia do DNA recombinante

é referido como engenharia metabólica (BAYLEY, 1991). Esta área multidisciplinar

utiliza princípios de engenharia química, ciência computacional, bioquímica e biologia

molecular. O objetivo da alteração de vias metabólicas pode ser o aumento de

produtividade de um processo ou o aumento da capacidade metabólica com a

introdução de atividades extrínsecas (YANG et al., 1998). A engenharia metabólica

consiste em duas partes: análise do sistema celular e construção da linhagem

recombinante, que interagem e se desdobram em diversos rounds até a obtenção da

linhagem recombinante ótima (OSTERGAARD et al., 2000) compreendendo as

etapas de análise, planejamento e síntese (NIELSEN, 2001),

Por engenharia metabólica pode-se alterar o transporte de açúcares e sua

assimilação, a via pentose fosfato, a glicólise, os passos finais da fermentação e o

balanço redox intracelular (JEFFRIES e JIN, 2004). Diversas modificações genéticas

enfocando o metabolismo de xilose já foram realizadas, porém o principal objetivo

destes estudos é, principalmente, a fermentação de xilose para obtenção de etanol.

A estratégia mais utilizada para viabilizar o consumo de xilose por S. cerevisiae

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envolve a introdução de genes de leveduras capazes de utilizar xilose, por exemplo,

C. shehatae, P. tannophilus e P. stipitis.

KOTTER et al. (1990) isolaram o gene XYL2 de P. stipitis e transformaram S.

cerevisiae obtendo transformantes capazes de metabolizar xilose e produzir etanol.

AMORE et al. (1991) clonaram o gene XYL1 de P. stipitis e expressaram em S.

cerevisiae, porém, os transformantes não foram capazes de utilizar xilose, uma vez

que a levedura já possui outra aldose redutase. Em 1998, HO et al. transformaram S.

cerevisiae com os genes XYL1 e XYL2 de P. stipitis e aumentaram a expressão de

xiluloquinase (XKS1) homóloga e obtiveram transformantes capazes de co-fermentar

xilose e glicose. A superexpressão de XKS1 em S. cerevisiae contendo os genes

XYL1 e XYL2, resultou no aumento da produção de etanol a partir de xilose

(JOHANSSON et al., 2001). Quando XYL2 foi superexpresso em S. cerevisiae,

xilulose foi secretada, indicando que nesta situação, a atividade de xiluloquinase

limita o metabolismo de xilose (JIN e JEFFRIES, 2003). WALFRIDSSON et al. (1997)

expressaram em S. cerevisiae diferentes níveis de XYL1 e XYL2 de P. stipitis,

quando a razão entre as atividades específicas das duas enzimas (XR:XDH) foi de

0,06, nenhum xilitol foi formado e observou-se o aumento de 10% na produção de

etanol em relação à razão de 5,00. Outra tentativa de melhorar a produtividade de

etanol, foi a expressão das enzimas XR e XDH de P. stitpis fusionadas, porém

apesar do aumento nas atividades destas enzimas, não foi observada alteração na

produtividade em etanol (ANDERLUNG et al., 2001). TOIVARI et al. (2004)

estudando os genes endógenos de S. cerevisiae que participam do metabolismo de

xilose, superexpressaram GRE3 e XYL2 que codificam para uma aldose redutase

não específica e XDH, respectivamente. Comparada à linhagem que expressa XYL1

e XYL2 de P. stipitis, esta cresceu mais lentamente em xilose e acumulou mais xilitol,

chegando a 55% de rendimento, porém sem produção de etanol.

Foram realizadas também, modificações utilizando os genes TKT

(transcetolase) e TAL (transaldolase): expressão de TKT, XYL1 e XYL2 (METZGER

e HOLLENBERG, 1994), e expressão de TKT, TAL, XYL1 e XYL2 (WALFRIDSSON

et al., 1995), porém, estes trabalhos demonstraram que estas transformações não

resultaram em significantes efeitos nas linhagens de S. cerevisiae recombinante, o

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_______________________________________________________________________________________ 23

que indica que a porção não-oxidativa da via da pentose fosfato não é limitante para

o metabolismo de xilose nesta levedura.

Tendo em vista que a formação de etanol a partir de xilose por S. cerevisiae

recombinante é lenta e com baixa produtividade devido ao desbalanço redox gerado

no catabolismo, JEPPSSON et al. (2002) deletaram o gene ZWF1, que codifica a

enzima glicose-6P desidrogenase a fim de diminuir o fluxo da via das pentoses. Com

esta alteração, alcançou-se o rendimento de 0,41 g etanol/ g xilose porém isto

prejudicou o consumo de xilose por ser dependente de NADPH. A fim de recuperar o

consumo de xilose, JEPPSSON et al. (2003) superexpressaram o gene XYL1 sob

controle do promotor glicolítico PGK1 na linhagem de S. cerevisiae zwf1∆ que, além

de aumentar o consumo de xilose, diminuiu a produção de xilitol, porém, com maior

produção de glicerol, o rendimento diminuiu para 0,34 g etanol/ g xilose. VERHO et

al. (2003) deletaram o gene ZWF1, combinando a superexpressão de GDP1

(gliceraldeído-3P desidrogenase), que aumenta a regeneração de NADPH. Tais

modificações estimularam a fermentação de xilose, diminuindo a formação de xilitol e

, não afetando a produtividade de etanol, porém com um melhor rendimento

(0,4 g etanol/g xilose).

Na tentativa de se obter melhores parâmetros fermentativos, novas técnicas

estão sendo utilizadas associadas à engenharia metabólica. SONDEREGGER e

SAUER (2003) usaram a combinação de três modificações genéticas:

superexpressão de XR e XDH heterólogas e de xiluloquinase endógena, além de

mutagênese química e evolução dirigida para obter uma linhagem de S. cerevisiae

capaz de crescer em condições anaeróbicas e metabolizar xilose. Estes autores

conseguiram alcançar o rendimento de 0,24 g etanol/ g xilose, porém, ainda houve

produção de xilitol como subproduto. WAHLBOM et al. (2003a) conciliando

engenharia metabólica e mutagênese randômica, a partir de uma linhagem de S.

cerevisiae expressando XYL1 e XYL2 de P. stipitis e superexpressando

xiluloquinase, gerou mutantes por mutagênese química que foram selecionados

quanto à utilização de xilose e taxa de crescimento. O mutante selecionado

apresentou taxa de crescimento cinco vezes maior e menor produção de xilitol como

subproduto, com rendimento igual a 0,25 g etanol/ g xilose. Experimentos de

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_______________________________________________________________________________________ 24

microarray para esta linhagem mostraram alta expressão de HXT5 (transportador de

hexose), XKS1 (xiluloquinase), SOL3, GND1, TAL1, e TKL1, enzimas da via pentose

fosfato, além dos reguladores de transcrição codificados pelos genes YCR020c,

YBR083w e YPR199c que foram diferencialmente expressos (WAHLBOM et al.,

2003b).

Para viabilizar a fermentação de xilose por S. cerevisiae, já foram realizadas

diversas tentativas de expressar a enzima xilose isomerase de bactérias, tais como

de Actinoplanes missouriensis, Bacillus subtilis (AMORE et al., 1989), Clostridium

thermosulfurogenes (MOES et al., 1996) e E. coli (HO et al., 1983 e SARTHY et al.,

1987), porém, nestes casos as enzimas se mostraram inativas. Todavia,

WALFRIDSSON et al. (1996) expressaram o gene da xilose isomerase (XYLA) da

bactéria termófila T. thermophilus e a linhagem foi capaz de produzir etanol a partir

de xilose, com rendimento igual a 0,12 g etanol/ g xilose, além de xilitol e ácido

acético. A partir desta linhagem, LONN et al. (2003) expressaram XYLA em múltiplas

cópias em plasmídio além de uma cópia extra do gene XKS1 (xiluloquinase) e

também foi deletado o gene GRE3 (aldose redutase). Com estas modificações

alcançou-se o valor de rendimento de 0,43 g etanol/ g xilose e concluiu-se que a

deleção de GRE3 foi crucial, uma vez que a redução de xilitol causa menor inibição

da atividade de xilose isomerase. KUYPER et al. (2004) demonstraram que S.

cerevisiae expressando xilose isomerase de Piromyces sp. em fermentação

anaeróbica, produz etanol a partir de xilose, com produtividade igual a 0,42 g etanol/

g xilose (80% do rendimento máximo teórico), também com produção de xilitol pela

xilose redutase da própria levedura. Esta estratégia de expressão de xilose

isomerase está protegida pela patente registrada por RAJGARHIA et al. (2004).

A enzima XR de P. stipitis possui especificidade para NADH e NADPH. O

mutante de S. cerevisiae expressando esta enzima produz glicerol como subproduto,

sendo assim, a enzima glicerol 3-fosfato desidrogenase pode estar competindo pelo

cofator não fosforilado. LINDEN et al. (1996) expressaram XYL1 em uma linhagem

gdp1∆ gdp2∆ e verificaram que o rendimento de etanol foi maior (0,38 g/g.h) em

comparação a linhagem expressando XYL1 e os dois genes (0,12 g/g.h), mas traços

de glicerol ainda foram obtidos, talvez produto da própria xilose redutase. P. stipitis

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 25

possui duas formas de álcool desidrogenase codificadas pelos genes ADH1 e ADH2;

CHO e JEFFRIES (1998) demonstraram que o rompimento de ADH1 resultou em

acúmulo de xilitol, porém, o rompimento de ADH2 não gerou efeitos significativos em

células cultivadas em xilose sob condições limitantes de oxigênio. Como a enzima

álcool desidrogenase oxida NADH durante a fermentação, o rompimento de ADH1

causou o aumento da concentração intracelular do cofator reduzido e conseqüente

acúmulo de xilitol, tendo em vista que a XR de P. stipitis utiliza NADH como cofator.

JIN et al. (2002) romperam o gene XYL3, que codifica para a enzima xiluloquinase

em P. stipitis, e observaram que isto prejudicou o consumo de xilose, porém não o

interrompeu, além de se observar acúmulo de arabitol e xilitol sem a produção de

etanol.

Uma vez que a hemicelulose é um dos principais componentes da biomassa

vegetal e que a xilana é o polímero predominante nesta fração, KATAHIRA et al.

(2004) viabilizaram a formação de etanol a partir deste carboidrato. Foi construída

uma linhagem de S. cerevisiae expressando os genes xynII (xilanase II) de T. reesei,

xylA (β-xylosidase) de Aspergillus oryzae na superfície celular, além de XYL1 e XYL2

de P. stipitis, obtendo após 62 horas o rendimento de 0,11 g/L.h, com produtividade

de 0,30 g/g, utilizando xilana como única fonte de carbono.

Visando a produção de xilitol a partir de xilose utilizando S. cerevisiae

algumas estratégias já foram utilizadas. HALLBORN et al. (1991) expressou XYL1 de

P. stipitis e obteve 95% de rendimento teórico, porém, não foi considerada a

produtividade. KIM et al. (1999b) introduziram múltiplas cópias deste gene e a

produtividade máxima encontrada foi de 0,18 g/L.h após 72 horas. GOVINDEN et al.

(2001) expressaram o gene XYL1 de P. stipitis e C. shehatae sob o controle dos

promotor/terminador ADH2 e PGK1, a maior produtividade alcançada foi de 8,24

g/L.h após 70 horas, com o clone expressando XYL1 de C. shehatae sob o controle

dos promotor/terminador PGK1. A limitação da superexpressão de XYL1 é a

regeneração do cofator NAD(P)H utilizado pela enzima XR, JANG et al. (2003)

expressando formato desidrogenase concomitante a XR e otimizando as condições

do processo alcançaram 99% de conversão de xilose.

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_______________________________________________________________________________________ 26

HANDUMRONGKUL et al. (1998) clonaram o gene de XYL1 de

C. guilliermondii e o expressaram em P. pastoris, mas a produtividade, após 72 horas

de fermentação, foi de apenas 0,11 g/L.h. LEE et al. (2003) expressaram em C.

tropicalis, XR de C. parapsilosis, que apresentou aumento de 5% no rendimento de

xilitol (0,92 g xilitol/ g xilose) e de 25% na produtividade (5,09 g/L.h), com diminuição

da produção de etanol e glicerol.

Outra estratégia já utilizada para aumentar a produtividade de xilitol foi a de

criar mutantes para XDH. KIM et al. (2001) cresceram mutantes de P. stipitis xyl2

meio contendo ácido glucônico como co-substrato e obtiveram 100% de rendimento

na formação de xilitol baseado na quantidade de xilose consumida.

NYYSSOLA et al. (2005) com a preocupação de produzir xilitol por espécies

do gênero Candida que são patogênicas, desenvolveu recombinantes de L. lactis

expressando XYL1 de P. stipitis e um transportador simporte xilose-H

(XylT) de L.

brevis. Utilizando o processo descontínuo alimentado com glicose e xilose, não

houve diferença de produtividade entre o que expressava ou não o transportador de

xilose. A produtividade máxima alcançada foi de 2,72 g/L.h após 20 horas, porém

34% da xilose inicial foi consumida.

Como descrito anteriormente, a engenharia metabólica requer o emprego de

abordagens de engenharia genética para gerar linhagens modificadas geneticamente

de um dado microrganismo. No caso específico da engenharia metabólica para a

produção de xilitol, estas abordagens podem ser voltadas para a hiper-expressão

e/ou repressão de certos genes, como os que codificam as enzimas XR (XYL1) e

XDH (XYL2), respectivamente. Em ambos os casos, haverá um acúmulo de xilitol na

célula, havendo a possibilidade de combinar os dois efeitos em uma única célula

para atingir níveis ainda maiores de produtividade. Diante dos avanços obtidos

quanto a engenharia metabólica do metabolismo de xilose, HARKKI et al. (2004)

registraram uma patente (US6723540) nos EUA para a produção de xilitol por

fermentação utilizando microrganismos recombinantes.

Para se realizar qualquer destas modificações metabólicas, algumas

ferramentas genéticas devem estar disponíveis como existência de cepas mutantes,

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 27

sistema de transformação genético e sistema que possibilite a expressão da

mensagem genética exógena.

JUSTIFICATIVA

A levedura C. guilliermondii FTI 20037 foi identificada como produtora de xilitol

em 1988 por BARBOSA et al., época em que se iniciaram os estudos do

melhoramento do processo fermentativo para sua produção. A fim de diminuir os

custos de produção, diversos substratos têm sido testados destacando-se o

hidrolisado de bagaço de cana de açúcar. Apesar da otimização do processo, ainda

não é possível viabilizá-lo uma vez que a concentração final de xilitol é limitante para

as etapas downstream, ou seja, purificação e cristalização. Diante deste cenário a

melhor alternativa é a modificação genética da levedura, que por evidências

moleculares mostrou-se ser na verdade uma linhagem de C. tropicalis.

Como apresentado anteriormente, a genética molecular de C. tropicalis foi

pouco desenvolvida, o que representa um entrave para o pleno desenvolvimento da

engenharia metabólica neste microrganismo. Contudo, a genética das leveduras

comumente chamadas de “não-Saccharomyces” ou “não-convencionais”, pode ser

desenvolvida aplicando-se as técnicas e princípios estabelecidos em S. cerevisiae. O

presente estudo representa uma das primeiras iniciativas para se desenvolver um

sistema que permita a transformação genética de C. tropicalis com a finalidade de

aumentar a produção de xilitol através da manipulação dos genes XYL1 e XYL2

isolados deste mesmo organismo. Estas manipulações podem ser tanto voltadas

para a diminuição da atividade XDH quanto para o aumento da atividade XR. Em

qualquer um dos casos, pretende-se que haja um incremento nos níveis internos de

xilitol. Dentro das etapas previstas no processo de engenharia metabólica: análise,

planejamento e síntese (NIELSEN, 2001), este trabalho parte da análise da fisiologia

da levedura desenvolvida na Faculdade de Engenharia Química de Lorena, para

propor a primeira iniciativa de modificação genética visando aumentar o rendimento

de xilitol durante a fermentação.

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ESTRATÉGIA

As etapas iniciais do metabolismo de xilose em leveduras podem ser assim

resumidas:

Para que haja um maior acúmulo de xilitol no interior célula, pelo menos duas

estratégias podem ser propostas: aumento da atividade XR e redução da atividade

XDH. A fim de aumentar a atividade de XR, idealizou-se uma levedura

superexpressando XYL1. Esta estratégia é baseada em múltiplas integrações

utilizando do gene usando seqüências de DNA ribossomal (rDNA) para direcionar os

cassetes de expressão para os clusters de rDNA que estão arranjados em

repetições idênticas in tandem no genoma. Inicialmente, o gene XYL1 pode ser

clonado num vetor contendo uma marca de seleção dominante, como a do gene que

confere resistência a zeocina. A seguir, uma região do rDNA seria clonada neste

mesmo vetor. Para transformar levedura, basta linearizar o vetor resultante, com uma

enzima que cliva dentro da seqüência do rDNA, desta forma, todo o vetor se integra

por recombinação homóloga nos loci de rDNA (Figura 3). O transformante seria

selecionado em meio contendo zeocina e para estimar o número de cópias seriam

plaqueados em concentrações crescentes deste antibiótico.

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Figura 3. Estratégia para obtenção de transformantes expressando múltiplas cópias de XYL1.

Para diminuir a atividade de XDH, pode-se eliminar/reduzir a atividade

endógena pela ruptura do gene XYL2 ou de um de seus alelos. Primeiramente, o

gene XYL2 é clonado em um plasmídio e linearizado com uma enzima que cliva em

regiões internas do gene. Uma marca de seleção é clonada dentro da seqüência do

gene interrompendo, dessa forma, a fase de leitura. Utilizando sítios de restrição nas

extremidades de XYL2, o cassete de ruptura gênica estaria pronto para a

transformação da levedura. Por recombinação homóloga o cassete se integraria no

locus XYL2 promovendo a ruptura gênica (Figura 4). Os transformantes seriam

______________________________________________________________________________________________________________

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selecionados em meio contendo antibiótico e o rompimento de XYL2 seria

confirmado por Southern blotting.

Figura 4. Esquema para obtenção de transformantes com XYL2 rompido.

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OBJETIVOS

Objetivo Geral

Estudar os genes envolvidos no metabolismo de xilose em C. guilliermondii

FTI 20037 e desenvolver ferramentas genéticas que permitam realizar engenharia

metabólica nesta levedura visando o aumento da produtividade e rendimento em

xilitol.

Objetivos Específicos

• Clonagem molecular e análise dos genes que codificam xilose redutase (XYL1) e

xilitol desidrogenase (XYL2) de C. guilliermondii FTI20037,

• Análise estrutural da proteína Xyl2,

• Expressão heteróloga dos genes XYL1 e XYL2 em S. cerevisiae,

• Construção de vetores para transformação de leveduras do gênero Candida,

• Transformação genética de C. guilliermondii FTI 20037,

• Interrupção gênica de XYL2 e integração em múltiplas cópias de XYL1,

• Análise da produção de xilitol nas leveduras transformadas.

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MATERIAIS E MÉTODOS

1. Microrganismos

As leveduras utilizadas neste trabalho, listadas na Tabela 4, bem como os

transformantes foram estocados a -80°C em glicerol 25% e mantidas em meio YPD

(extrato de levedura 1%, peptona de caseína 2%, glicose 2%) imersos em óleo

mineral.

Tabela 4. Linhagens de leveduras utilizadas.

Linhagem Genótipo Procedência

Candida guilliermondii FTI 20037 Selvagem

Faculdade de Engenharia

Química de Lorena

Candida guilliermondii Selvagem

Universidade Federal do Rio

de Janeiro

Candida maltosa ATCC 38042 Selvagem

National Institute of Diabetes

and Digestive and Kidney

Diseases

Saccharomyces cerevisiae RE1006

MATa can1-100 his3-11,15

leu2-3,112 trp1-1 ura3-52

Universidade de Brasília

* Reclasssificada por Lima et al. (2003).

As linhagens de E. coli utilizadas neste trabalho, listadas na Tabela 5

(SAMBROOK et al., 2001), bem como os transformantes, foram cultivados em meio

Luria-Bertani - LB (extrato de levedura 0,5%, peptona de caseína 1%, cloreto de

sódio 1%, pH 7,2) e estocadas a -80°C em glicerol 25%.

Tabela 5. Linhagens de Escherichia coli utilizadas.

Linhagem Genótipo

DH5α

supE44 ∆lacU169 (

80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1

gyrA96 thi-1 relA1

JM110

dam dcm supE44 hsdR17 thi leu rpsL lacY galK galT ara tonA

thr tsx∆(lac-proAB) F’ [traD36 proAB

lacI

lacZ ∆m15]

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2. Extração de DNA de Leveduras

Para extração do DNA total de leveduras foi utilizado o método descrito por

AZEVEDO et al. (2003) para fungos filamentosos, que se baseia na quebra mecânica

da parede celular por maceração.

3. Purificação de DNA Plasmidial

O protocolo de extração de plasmídios de E. coli foi baseado na técnica de lise

alcalina descrita por BIRNBOIN e DOLY (1979). As células foram cultivadas durante

cerca de 18 horas em 5 mL de meio LB com antibiótico (ampicilina 100 µg/mL) e

coletadas por centrifugação (3.000 x g/ 2 min), depois o sedimento foi ressupendido

em 200 µL de solução I (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM, pH 8,0; glicose 50

mM), a seguir foi adicionado 360 µL de solução II (hidróxido de sódio 0,2 M; SDS 1%

p/v). Depois de inverter o tubo delicadamente algumas vezes, o sistema foi incubado

durante 5 min. Posteriormente, 300 µL de solução III (acetato de potássio 3M, pH

5,0) foram adicionados e o tubo foi invertido gentilmente ficando 5 min incubados no

gelo. Depois de centrifugado (10.000 x g/ 5 min), o sobrenadante foi transferido para

um novo tubo, no qual foram adicionados 750 µL de isopropanol, procedendo mais

uma centrifugação nas condições anteriores. O sedimento foi ressuspendido em 200

µL de TE (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM, pH 8,0), foi adicionado 110 µL de

acetato de amônio 7,5 M e misturado no vortex, a seguir foi centrifugado (10.000 x g/

10 min). O sobrenadante foi transferido para um novo tubo onde se adicionou 750 µL

de etanol e novamente submetido à centrifugação (10.000 x g/ 5 min). O precipitado

foi lavado com etanol 70% v/v e centrifugado mais uma vez. Descartou-se o

sobrenadante e após a secagem, o precipitado foi ressuspendido em 50 µL de TE e

adicionado 0,5 µL de RNAse A (4 µg/mL).

Em alguns casos, o protocolo descrito por STEMMER (1991), utilizando

brometo de etídio e acetato de amônio, também fora utilizado como mais uma etapa

de purificação a fim de melhorar a digestão com enzimas de restrição.

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Para o seqüenciamento, a purificação de plasmídios foi realizada utilizando o

kit Wizard

Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) seguindo as

recomendações do fabricante.

4. Transformação Genética

4.1. Bactéria

Para transformação de E. coli por choque térmico foi adaptado o método de

indução do estado de competência por tratamento com RbCl descrito por HANAHAN

(1983). Primeiramente, foi preparado um pré-inóculo a partir de uma colônia,

inoculada em 30 mL de meio SOB (triptona 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl

0,6 g/L, KCl 0,5 g/L MgCl

10 mM, MgSO

10 mM) durante a noite a 37°C em

incubadora tipo shaker a 250 rpm. Foram adicionados 2 mL do pré-inóculo em 50 mL

de meio SOB e depois incubados a 37°C, sob agitação 250 rpm até densidade

óptica, a 600 nm, igual a 0,3. A cultura foi transferida para um tubo de centrífuga e

mantida em gelo por 15 min. Depois da centrifugação a

3000 xg por 5 min a 4°C, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas

em 16 mL de tampão de transformação I (RbCl 12 g/L, MnCl

·4H

O 9,9 g/L,

CaCl

·2H

O 1,5 g/L, glicerol 150 mL, acetato de potássio 30 mL de solução 1 M, pH

7,5) pH 5,8 ajustado com ácido acético 0,2 M e esterilizado por filtração (membrana

0,22 µm). Depois de 15 min no gelo, as células foram coletadas por centrifugação,

nas condições acima. Foram utilizados 4 mL de tampão de transformação II (RbCl

1,2 g/L, CaCl

·2H

O 11 g/L, glicerol 150 mL, MOPS 20 mL de solução 1 M, pH 6,8)

esterilizado por filtração (membrana 0,22 µm) para ressupender as células. Alíquotas

de 100 µL foram estocadas a -80°C. Para cada alíquota de células competentes

foram adicionados até 10 µL de DNA, mantidos no gelo por 30 minutos. Após este

período, as células foram submetidas a um choque térmico de 37°C por 5 min ou

42°C por 90s, depois foram adicionados 500 µL de meio LB ou SOB e incubadas a

37°C por 1 h. Foram plaqueados 100 µL em placas de petri com meio LB-ágar

contendo antibiótico (ampicilina 100 µg/mL) e X-Gal (30 µg/mL) quando necessário.

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4.2. Leveduras

A transformação de S. cerevisiae foi baseada em um protocolo rápido

utilizando acetato de lítio e polietilenoglicol - PEG descrito por ELBLE (1992), Já

C. tropicalis e C. guilliermondii foram transformadas por eletroporação e por

formação de esferoplastos. Para a eletroporação foi utilizada a metodologia descrita

por TANG et al. (2003) para C. rugosa e para formação de esferoplastos a descrita

por HAAS et al. (1990).

5. PCR

Os primers utilizados, apresentados na Tabela 6, foram ressuspendidos em

água MilliQ ou tampão Tris-HCl pH 8,0, 4 mM. As reações de PCR contendo DNA

template 10 a 100 ng, dNTPs 0,2 mM, tampão da Taq DNA polimerase, cloreto de

magnésio 2 a 3 mM, Taq DNA polimerase 1U, primers 5' e 3' 10 a 30 pmol, foram

realizadas nas seguintes condições: desnaturação inicial (94°C – 1min),

desnaturação (94°C – 30s a 1 min), anelamento (50 a 60°C – 30s a 1 min), extensão

(72°C – 30s a 2min), extensão final (72°C – 5min), sendo que o número de ciclos de

desnaturação/anelamento/extensão variou de 30 a 45 ciclos. As reações de PCR

com Platinum

Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), Elongase

Amplification System (Invitrogen) e Vent

DNA Polimerase (New England Biolabs)

foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Para o PCR de

colônia, substituindo o DNA template, foi utilizando sobrenadante de uma colônia

fervida em água por 5 min.

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Tabela 6. Seqüência dos primers utilizados em reações de PCR, com suas respectivas seqüências,

temperaturas de anelamento e sítios de restrição (sublinhados).

Primer

Seqüência (5' → 3')

Tm sítio

5XR TCGTSGGTTTCGGCTGTTGG 64°C -

3XR AATSTTGTCCCAGTCCCAWGG 64°C -

5XRORF CAGATCTGCTATGTCTATCAAGTTAAACTCTG 68

C Bgl II

3XRORF CAGATCTTAGATGAAAGTTGGAATCTTGTC 56

C Bgl II

5xyl1A CAGATCTACCATGTCTACTACTCCTACT 60°C Bgl II

3xyl1 CAGATCTTTAAACAAAGATTGGAATGTTG 56

C Bgl II

5xyl1int TACAGATTATTTGATGGTGCTG 60°C -

3xyl1int GGTTGTTGCAAGTATGGGTG 56°C -

ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 58°C -

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 58°C -

ITS1Bam GGATCCGTAGGTGAACCTGCGG 58°C BamH I

ITS4Bam GGATCCTCCGCTTATTGATATGC 58°C BamH I

UNIF (CTB6) GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 68°C -

UNIR (TW13) GGTCCGTGTTTCAAGACG 56°C -

5XDH1 CAACTTGTGTCCTCACATGGC 64°C -

3XDH1 TTACTCAGGGCCGTYAATGA 58°C -

5XDH2 CAATGGTCYTKGGTCACGAATC 64°C -

3XDH2 CSWTACCRACTTGAACG(W)AA 58°C -

5XDH3 GTCAAGAARACYGGTATCTGTGGT 68°C -

3XDH3 GWAWCCRTATCTGAAAGAWCC 58°C -

5XDH4 CCWGAAGACTTCTKKGTCAAGTT 70°C -

3XDH4 TTACTCAGGGCCGTYAATGAKRCACTTGA 82°C -

5xyl2 CGGATCCGTCATGACTGCAAACCCATC 60°C BamH I

3xyl2 CGGATCCCTATTCTGGACCATCAATTAAAC 62°C BamH I

PPGK GGATCCGGTTACATACGACATTTG 50°C BamH I

TPGK GGATCCAAATACCAAGAATTGACGGCTG 62°C BamH I

P2PGK AGATCTTGGATAATGACATTCTAGTTAAGGCAATTG 56°C Bgl II

T2PGK AGATCTCTAACAAAGCCTAAAATTGATTTTTTATGA 52°C Bgl II

Universal Forward GTTTTCCCAGTCACGAC 52°C -

Universal Reverse CAGGAAACAGCTATGACC 54°C -

5PROACT GGATCCAAGCTTCTATTAAGATCACCAGCCTC 58°C

BamH I

Hind III

3PROACT

GGATCCAAGCTT

AATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAAC

ATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACTGATCA

TTGAATGATTATAT

TTTTTTAATATTAATATCGA

76°C

Bam HI

Hind III

Bcl I

3CYCTT CGGATCCAAGCTTAATTTGAAATATAAATAACGTTCT 96°C BamH I

5Zeo CCAAGCTTATAATGGCTAAGTTGACCTCC 60°C Hind III

3Zeo CGTCGACTCAGTCTTGTTCTTCAGCAACG 62°C Sal I

221 AATCGGGCTG 32°C -

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5.1. Purificação

Para purificação dos produtos de PCR foram utilizados os kits QIAquick PCR

Purification (Qiagen) ou Wizard

SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)

seguindo as recomendações do fabricante.

6. Análise de Ácidos Nucléicos em Gel de Agarose

A eletroforese em gel de agarose foi utilizada para análise e avaliação do

tamanho de DNA ou fragmentos de DNA, conforme descrito em AZEVEDO et al.

(2003). A agarose foi preparada em solução tampão TEB (Tris-Borato 45 mM, EDTA

1 mM pH 8,2) ou TAE (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1mM pH 8,5) em concentração de

0,8 ou 1,0% p/v. Como marcadores moleculares para DNA foram utilizados 1 kb

ladder (Invitrogen, New England Biolabs ou Promega), 100 bp DNA ladder (Promega)

ou DNA de fago λ digerido com EcoR I e Hind III.

6.1. Purificação de Fragmentos de DNA

A região do gel que continha o fragmento de interesse foi excisada e

submetida à purificação utilizando os kits QIAEX II (Qiagen), Concert™ Rapid Gel

Extraction System (Gibco) ou Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System

(Promega) ou ainda pelo protocolo GeneClean modificado: a porção retirada do gel

foi pesada, posteriormente foi adicionado solução de iodeto de sódio 6M, na

proporção de 300 µL por 100 mg de gel, e incubou-se a 55°C agitando-se

freqüentemente até a completa dissolução da agarose. Adicionou-se posteriormente

5 µL de solução glassmilk (sílica em água na proporção 1:1 v/v), agitado no vortex,

incubado no gelo 5 min e centrifugado a 10.000 x g por 30 s. O precipitado foi

ressuspendido em 500 µL de solução de iodeto de sódio e novamente centrifugado

(30 s/10.000 x g), a seguir o precipitado foi outra vez ressuspendido em 250 µL de

solução de iodeto de sódio e centrifugado (30 s/10.000 x g). Em seguida o

precipitado foi lavado três vezes, em cada vez o pellet foi ressuspendido com 300 µL

de solução New Wash (Etanol 50%; NaCl 0,1M; Tris 10 mM, pH 7,5; EDTA 1 mM),

______________________________________________________________________________________________________________

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agitado no vortex e centrifugado (30 s/10.000 xg). Após a última lavagem, o

precipitado foi ressuspendido em 10 µL de TE (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0; EDTA 10

mM, pH 8,0) e incubado a 55 °C por 3 min, após foi submetido à centrifugação

(30 s/10.000 xg), o sobrenadante foi reservado e o precipitado foi novamente

ressuspendido em 10 µL de TE, incubado a 55 °C por 3 min e depois centrifugado. O

sobrenadante foi adicionado ao anterior e outra vez centrifugado para assegurar a

inexistência sílica e estocado a -20°C.

7. Seqüenciamento e Análise de DNA

As reações de seqüenciamento foram realizadas com 80 a 100 ng de

plasmídios, quantificados por espectrofotometria utilizando o GeneQuant RNA/DNA

Calculator pro (Biochrom, UK) e analisados no seqüenciador automático MegaBACE

1000 (Amersham Biosciences



). A qualidade do seqüenciamento foi analisada pelo

programa PHRED (EWING et al., 1998) e a análise das seqüências foi realizada pela

comparação com as de bancos de dados pelo BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (ALTSCHUL et al., 1990).

Para análise da seqüência do gene XYL2, foram preditos os putativos

elementos TATA utilizando o programa HCtata - Hamming-Clustering Method for

TATA Signal Prediction in Eukaryotic Genes

(http://l25.itba.mi.cnr.it/~webgene/wwwHC_tata.html); os sinais de poliadenilação

pelo programa HCpolya - Hamming Clustering poly-A prediction in Eukaryotic Genes

- (http://l25.itba.mi.cnr.it/~webgene/wwwHC_polya.html) e os possíveis fatores de

transcrição foram identificados pelo TFSEARCH

(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) ou pelo MatInspector

(http://www.genomatix.de/shop/index.html) .

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 39

8. Digestão de DNA com Enzimas de Restrição

As digestões de moléculas de DNA com enzimas de restrição foram

realizadas em sistemas de 10 a 100 µL, durante 1 a 16h, de acordo com as

condições indicadas pelos fabricantes (tampão, BSA e temperatura) utilizando-se

10 a 20 U de enzima para cada 1 µg de DNA.

8.1. Purificação do Sistema de Digestão

O volume do sistema de digestão foi ajustado para 100 µL, adicionado um

volume de clorofane (fenol:clorofórmio, 1:1, pH 6,0), agitado vigorosamente no vortex

durante 3 min e centrifugado (30 s/10.000 xg). A fase aquosa foi coletada em um

novo tubo e o procedimento foi repetido. Novamente, a fase aquosa foi coletada e

adicionou-se um volume de clorofil (clorofórmio:isoamil álcool, 24:1, pH 6,0) agitado

vigorosamente no vortex durante 3 min e centrifugado (30 s/10.000 xg). Depois de

coletar a fase aquosa adicionamos-se 5 µL de glicogênio 20 mg/mL, 0,1 volume de

NaCl 3M e 2,5 volumes de etanol 100%, agitado no vortex e mantido a -20°C por

pelo menos 30 min. O sistema foi centrifugado (15 min/10.000 xg/ 4°C), descartado o

sobrenadante e ao precipitado foi adicionado 500 µL de etanol 70% v/v e outra vez

centrifugado (15 min/10.000 xg/ 4°C). Este precipitado depois de seco foi

ressuspendido em 10 µL de água MilliQ.

9. Conversão de Extremidades Protuberantes em Abruptas

Quando foram utilizadas enzimas que deixam extremidades coesivas 3’ ou 5’

protuberantes incompatíveis, utilizou-se tratamento com T4 DNA Polimerase (New

England Biolabs) para gerar extremidades abruptas de acordo com as

recomendações do fabricante.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 40

10. Defosforilação de Vetor Linearizado

Os vetores linearizados utilizando-se apenas uma enzima foram defosforilados

com a enzima fosfatase alcalina de camarão (SAP) da Boehringer Mannheim. O

sistema de defosforilação contendo vetor 50 ng, enzima 1U e tampão, foi incubado a

37°C por 10 min e a seguir, para inativação da enzima, a 65°C por 15 min.

11. Ligação

Nos sistemas de ligação, as concentrações de DNA (razão molar

vetor:inserto) variaram entre 1:3, no caso de ligações de extremidades coesivas, e

1:5 em ligações com extremidades abruptas, contendo também tampão e T4 DNA

ligase 1U (Promega). O sistema foi incubado a 16°C por pelo menos 14 h ou no caso

de sistemas comerciais, de acordo com as recomendações do fabricante.

12. Extração de RNA

Uma colônia de C. guilliermondii FTI 20037 foi inoculada em meio YPD e

cultivada em incubadora tipo shaker durante a noite (30°C/200 rpm). A cultura foi

transferida para meio YP (extrato de levedura 1%, peptona de caseína 2%),

suplementado com glicerol, glicose ou xilose (2%) até a fase exponencial

(OD

600

~0,9). As células foram recolhidas por centrifugação, lavadas com água estéril

(4°C) e congeladas em nitrogênio líquido. O RNA total foi extraído usando RNeasy

mini kit (Qiagen) e ~10 µg foi analisado em gel de agarose-formaldeído (1% p/v).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 41

13. Southern e Northern Blotting

13.1. Sistema de Transferência para Membrana

A transferência das amostras de DNA digerido para o Southern Blot ou do

RNA total para o Northern Blot, do gel de agarose para membrana de nitrocelulose

(Hybond-N) foi utilizado o sistema de transferência por capilaridade descrito em

AZEVEDO et al. (2003). Os ácidos nucleicos foram fixados à membrana por meio de

exposição à luz ultravioleta utilizando a condição de ajuste ótimo para fixação no UV

Crosslinker (Fisher Biotech).

13.2. Marcação da Sonda, Pré-Hibridização e Hibridização

A marcação da sonda e as fases da pré-hibridização, a hibridização, a

lavagem e a detecção foram realizadas segundo o protocolo do kit AlkPhos Direct

(Amersham Biosciences



) baseado na marcação com fosfatase alcalina, conforme

recomendações do fabricante.

13.3. Geração e Detecção do Sinal

Para a geração do sinal quimioluminescente, foi utilizado o reagente CDP-Star

(Amersham Biosciences



), colocado sobre a membrana por aproximadamente 5

minutos. Após a reação, a membrana foi envolta em plástico (Saran Wrap) e exposta

a filme auto-radiográfico (Hyperfilm ECL – Amersham Biosciences



). O filme foi

revelado em câmara escura com solução reveladora Dektol-76 (Kodak), interrupção

em água destilada, fixação em solução fixadora (Kodak) por 5 min e lavagem

exaustiva em água corrente.

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_______________________________________________________________________________________ 42

14. Seleção e Análise dos Transformantes

Os clones transformantes foram selecionados em meio contendo o antibiótico

apropriado em concentração letal, testada previamente com a linhagem selvagem.

Os transformantes foram analisados por PCR utilizando-se os primers 5Zeo e 3Zeo e

para os clones xyl2

os primers 5xyl2 e 3xyl2.

15. Medida de Atividades Enzimáticas

15.1 Rompimento Celular

A fim de obter as enzimas intracelulares xilose redutase e xilitol

desidrogenase, foi realizado o rompimento celular utilizando pérolas de vidro

conforme ELIASSON et al. (2000).

Uma colônia foi inoculada em 5 mL de meio e cultivada em incubadora tipo

shaker durante a noite (30°C/200 rpm). A cultura foi transferida para 500 mL de meio

até a fase exponencial (OD

600

~0,9). Para os clones de S. cerevisiae foi utilizado

meio mínimo (glicose 2%, Yeast Nitrogen Base-YNB e aminoácidos) e para C.

tropicalis meio YP suplementado com xilose 2%. As células foram recolhidas por

centrifugação, lavadas com tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,2 (4°C) e

ressuspendidas no mesmo tampão para submeter ao rompimento celular. Os restos

celulares foram separados por centrifugação (12.000 xg por 20 min a 4

recolhendo-se o sobrenadante para determinação de atividade de xilose redutase e

xilitol desidrogenase e proteína solúvel.

15.2 Determinação de Proteína Solúvel e Atividade Enzimática

A determinação de concentração de proteína no extrato livre de células foi

feita conforme método BRADFORD (1976), empregando-se albumina sérica bovina

(BSA) como padrão e reagente de Bradford (Azul-Brilhante de Coomassie G-250)

como cromóforo.

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_______________________________________________________________________________________ 43

As atividades enzimáticas foram determinadas em extratos celulares

preparados a partir de suspensão de células, realizadas segundo método utilizado

por LIMA et al. (2004), com modificações. O meio padrão para reação para xilose

redutase foi composto por β-mercaptoetanol 10 mM, tampão fosfato de potássio

8 mM pH 7,2, NADPH 100 µM, e xilose 100 mM, no volume total de 1,0 mL. Para

xilitol desidrogenase, o meio padrão para reação foi constituído de

β-mercaptoetanol 10 mM, tampão TRIS 100 mM pH 8,6, NAD

150 µM e xilitol

75 mM em 1,0 mL.

As reações foram iniciadas com a adição de xilose ou xilitol e a variação da

absorbância a 340 nm, decorrente da oxidação do NADPH ou da redução do NAD

foi acompanhada por espectrofotômetro durante 2 minutos. Uma unidade

internacional de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima

que catalisa a formação de um micromol por minuto de NADP

no caso de xilose

redutase ou NADH

para xilitol desidrogenase, à temperatura ambiente, utilizando-se

o coeficiente de extinção para os cofatores a 340 nm de 6220 M

-1

. Os ensaios

foram realizados em triplicata com coeficiente de variação menor que 5%.

16. Análise de Domínios, Alinhamento de Seqüências e Análise e

Comparação Estrutural

A organização dos domínios estruturais de Xyl2 foi determinada pela utilização

dos sites PFAM (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), CATH

(http://cathwww.biochem.ucl.ac.uk/latest) e INTERPRO

(http://www.ebi.ac.uk/interpro). A classificação da família foi confirmada utilizando-se

o servidor PROSITE (http://www.expasy.ch). A estrutura secundária foi predita pelo

algorítmo do programa NPS@ (http://pbil.ibcp.fr). Alinhamentos de seqüências foram

realizados utilizando-se a ferramenta Blastp (http://www.expasy.org/tools/blast/),

considerando-se proteínas com estruturas depositadas no PDB – Protein Data Bank

(http://www.rcsb.org/pdb). Para se obter o modelo estrutural, alinhamentos múltiplos

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_______________________________________________________________________________________ 44

de seqüência foram gerados pelo ClustalW (EMBL-EBI,

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Os modelos estruturais foram obtidos a partir de

modelagem molecular por homologia, realizada pelo servidor EsyPred-3D

(http://www.fundp.ac.be/urbm/bioinfo/esypred/) (LAMBERT et al., 2002). As

características estruturais desses modelos foram analisadas pelos visualizadores

moleculares Pymol (http://pymol.sourceforge.net) e VMD

(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/).

O complexo Xyl2/NAD

/zinco foi modelado pela sobreposição da estrutura

tridimensional de hSDH complexado com NAD

e íon de zinco. O refinamento

energético do modelo foi realizado utilizando ferramentas de mecânica molecular

disponíveis no SPDBV, que utiliza o pacote de minimização de energia do Gromos96

(GUEX e PEITSCH, 1997). Este procedimento é necessário para minimizar os efeitos

de choques esteroquímicos e para acomodação energética das cadeias laterais,

principalmente daqueles aminoácidos na interface do complexo com o NAD

e com o

zinco.

Estruturas tridimensionais conservadas e semelhantes à estrutura da Xyl2

foram selecionadas por meio do programa VAST - Vector Alignment Search Tool -

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml) (GIBRAT et al., 1996). As

estruturas tridimensionais selecionadas do PDB (1PL8, 1PL6, 1E3J, 1RJW, e 1LLU)

foram utilizadas para a sobreposição das cadeias principais e dos domínios de

ligação ao NAD

e de ligação ao zinco. Esta etapa foi realizada utilizando-se o

servidor MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt). As saídas dos programas de

alinhamento estrutural mostram as estruturas sobrepostas e calcula os valores dos

deslocamentos estruturais na cadeia principal, conhecidos como r.m.s.d. (root mean

square deviation). Adicionalmente, para analisar as mudanças estruturais dos

domínios envolvidos no complexo com NAD

e zinco, tais domínios foram

sobrepostos considerando os resíduos de Xyl2 com 5 Å de distância da coenzima e

do íon. Para este fim foi utilizado o pacote de programas CCP4

(http://www.ccp4.ac.uk/main.html) (Collaborative computational project, 1994).

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Reclassificação da levedura C. guilliermondii FTI 20037

No início deste trabalho, foram realizadas várias tentativas, sem sucesso, para

se amplificar toda a região codante do gene XYL1 de C. guilliermondii, apesar dos

primers 5XRORF e 3XRORF terem sido desenhados baseados na seqüência deste

gene publicada por HANDUMRONGKUL et al. (1998). Utilizando-se outros pares de

primers degenerados 5XR e 3XR, desenhados a partir das seqüências de xilose

redutase dos organismos P. stipitis, C. tropicalis, C. guilliermondii, P. tannophilus e

K. lactis, foi possível clonar uma parte do gene. A análise pelo BLASTx (seqüência

traduzida versus banco de dados de seqüência de proteínas) revelou que a

seqüência guardava mais identidade com o homólogo de C. tropicalis do que com o

de C. guilliermondii, indicando que a linhagem de C. guilliermondii originada da

FAENQUIL poderia ter sido erroneamente classificada.

Para confirmar esta suspeita, decidiu-se investigar as seqüências intergênicas

do DNA ribossomal (rDNA), que são regiões transcritas porém perdidas durante o

processamento do RNA. Por serem regiões conservadas durante a evolução entre os

organismos, estas são comumente utilizadas para identificação de microrganismos

em nível de gênero, espécie ou variedade (GUARRO et al., 1999; FUNGARO, 2000).

Para atingir esse fim, foram utilizados dois pares de primers, que amplificam

duas regiões do rDNA. A primeira região é chamada ITS (Internal Transcribed

Spacers), amplificada com os primers ITS1 e ITS4 que compreende uma região do

18S, os espaçadores internos ITS1 e ITS2, o gene da subunidade 5.8S e uma região

da 28S, como ilustrado na Figura 5. A segunda região - 5’ LSU (Large Subunit) – é

amplificada com os primers UNIF e UNIR, e compreende uma porção do gene da

subunidade rDNA 28S (Figura 5).

Os amplicons, com tamanho de ~540 pb para região ITS e ~650 pb para

região 5’ LSU (Figura 6), foram clonados no vetor pCR

2.1 TOPO

(Invitrogen).

Após a transformação de E. coli DH5α, transformantes foram selecionados para

extração de plasmídios. Posteriormente, procedeu-se a análise da presença de

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_______________________________________________________________________________________ 46

inserto a partir da digestão com EcoR I. Um clone positivo foi escolhido para ser

submetido a minipreparação com kit e posterior seqüenciamento do plasmídio.

Figura 5. Estrutura do cluster gênico que codifica o RNA ribossomal, evidenciando os genes

correspondentes as subunidades 18S, 5,8S e 28S, além das regiões internas ITS1 e ITS2. Acima

estão os níveis taxonômicos que cada região define, abaixo localização da região do rDNA

amplificada com os primers ITS1 e ITS4 (ITS) e da região da subunidade maior (5’ LSU) amplificada

com os primers UNIF e UNIR.

Figura 6. Reações de amplificação de regiões do rDNA

analisadas em gel de agarose 1%. 1:marcador λ EcoR I/Hind III,

2 e 3: região ITS, 4 e 5: região 5'LSU.

Os resultados da análise das seqüências obtidas usando o BLASTn estão

apresentados na Tabela 7. O valor de “E” foi igual a zero para as duas regiões

estudadas quando comparadas com a região homóloga em C. tropicalis, enquanto o

valor foi maior que zero para C. guilliermondii, demonstrando assim que estas

seqüências teriam maior identidade com a de C. tropicalis e que a levedura utilizada

havia sido classificada erroneamente. Baseados nestes resultados e nos dados da

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clonagem de XYL1, foi publicado o artigo intitulado “Reclassification of Candida

guilliermondii FTI 20037 as Candida tropicalis based on molecular phylogenetic

analysis”, na revista Brazilian Journal of Microbiology, em novembro de 2003

(Anexo 1). Estes resultados também foram divulgados em apresentação oral no XXII

Congresso Brasileiro de Microbiologia, Florianópolis - SC em novembro de 2003.

Tabela 7. Resultados de homologia para as seqüências ITS e 5'LSU do DNA

ribossomal,utilizadas na identificação de espécies.

Seqüência BLAST Identidade E-value

C. tropicalis

(acession # 12698685)

99% 0.0

ITS

C. guilliermondii

(acession # 21666929)

96% 1e-89

C. tropicalis

(acession # 2062274)

100% 0.0

5' LSU

C. guilliermondii

(acession # 14150789)

94% e-166

2. Clonagem e análise do gene XYL1

Como a levedura foi inicialmente identificada como C. guilliermondii, foram

desenhados os primers 5XRORF e 3XRORF baseados na seqüência do gene XYL1

desta levedura publicada por HANDUMRONGKUL et al. (1998). Porém, não foram

obtidas amplificações nas reações de PCR com DNA de C. guilliermondii FTI 20037,

apenas com o controle positivo, uma linhagem de C. guilliermondii cedida pela UFRJ

(Figura 7). O fato de o PCR ter funcionado somente com a linhagem da UFRJ

classificada como C. guilliermondii, fortalece as evidências de que a linhagem da

FAENQUIL fora erroneamente classificada.

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Figura 7. Reações de amplificação de XYL1 analisadas em gel de

agarose 1%. 1: marcador 1 kb DNA ladder (New England Biolabs), 2 e 3:

amplificação com 5XRORF/3XRORF, DNA molde de C. guilliermondii

(UFRJ) e C. guilliermondii FTI 20037, respectivamente.

Com a reclassificação da levedura, foram desenhados primers baseados na

seqüência do gene que codifica a enzima xilose redutase I,II de C. tropicalis

disponível no GenBank (banco de dados do NCBI - National Center for Biotechnology

Information), descrita por YOKOYAMA et al. (1995b), onde 5xyl1A e 3xyl1 se

localizam nas extremidades amplificando todo o gene e dois outros 5xyl1int e 3xyl1int

que amplificam uma região interna para confirmação. A posição dos primers na

seqüência está representado na Figura 8. O resultado da reação de PCR com a

combinação destes primers está apresentado na Figura 9, e os produtos obtidos

apresentaram exatamente os tamanhos esperados, a saber: 5xyl1a/3xyl1: 978 pb,

5xyl1a/3xyl1int: 611 pb, 5xyl1int/3xyl1: 843 pb e 5xylint/3xyl1int: 476 pb.

Figura 8. Esquema mostrando as posições relativas de anelamento dos primers utilizados para

amplificação e confirmação de XYL1.

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_______________________________________________________________________________________ 49

Figura 9. Reações de amplificação de XYL1 e regiões internas do

gene, analisadas em gel de agarose 1%. 1: marcador 1 kb DNA

ladder (New England Biolabs), 2: amplificação com 5xyl1a/3xyl1, 3:

5xyl1a/3xyl1int, 4: 5xyl1int/3xyl1, 5: 5xylint/3xyl1int.

O produto obtido da reação de PCR com Platinum® Taq DNA Polymerase

High Fidelity, usando os primers 5xyl1a/3xyl1 foi ligado ao vetor pCR® 2.1 TOPO®

(INVITROGEN). Após a transformação de E. coli DH5α com o sistema de ligação,

analisou-se a presença de inserto a partir da digestão com EcoR I. O clone escolhido

(Topoxyl1) foi amplificado e o inserto seqüenciado. A seqüência de cerca de ~950 pb

obtida foi analisada pelo BLASTx e apresentou 98% de identidade com a seqüência

de xilose redutase I,II de C. tropicalis com E = e-180 e 77% com a de C.

guilliermondii, com E = 3e-11. No alinhamento da seqüência de XYL1 de C. tropicalis

e de C. guilliermondii FTI 20037, apresentado na Figura 10, foram encontradas 11

divergências entre as seqüências, porém a maioria delas no terceiro nucleotídeo do

códon. Dos nove códons divergentes, apenas dois ocasionaram mudança no

aminoácido correspondente, a saber: na posição 76 (AAT Æ ACC) Asn para Thr,

porém ambos são aminoácidos polares neutros e na posição 82 (GAA Æ GCC) Glu

para Ala, essa é uma modificação importante porque envolve a substituição de um

aminoácido carregado negativamente por um apolar. Diante destas modificações

pode-se interpretar que estas variações se tratam de polimorfismo entre as linhagens

de C. tropicalis ou ainda algum erro induzido pela reação de PCR.

A partir da ferramenta BLAST disponível no site do projeto genoma de C.

tropicalis - Broad Institute of Harvard and MIT

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(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/candida_tropicalis/) foi encontrada uma

seqüência (supercont3.11 of C. tropicalis T1) com 98% de identidade (Figura 11).

C.tropicalis ATG TCT ACT ACT CCT ACT ATT AAA TTA AAC TCT GGT TAT GAA ATG CCA TTA GTT GGT TTC 60

FTI20037 ATG TCT ACT ACT CCT ACT ATT AAA TTA AAC TCC GGT TAT GAA ATG CCA TTA GTT GGT TTC 60

C.tropicalis GGA TGT TGG AAA GTC AAT AAT GAA ACT GCT GCT GAC CAA ATC TAC AAT GCT ATC AAA ACT 120

FTI20037 GGA TGT TGG AAA GTC ACC

AAT GCC ACT GCC GCT GAC CAA ATC TAC AAT GCC ATT AAA ACT 120

C.tropicalis GGT TAC AGA TTA TTT GAT GGT GCT GAA GAT TAC GGT AAT GAA AAA GAA GTT GGT GAA GGT 180

FTI20037 GGT TAC AGA TTA TTT GAT GGT GCT GAA GAT TAC GGT AAC GAA AAA GAA GTT GGT GAA GGT 180

C.tropicalis ATT AAC AGA GCC ATT AAA GAA GGA TTA GTT AAA AGA GAA GAA TTA TTC ATC ACT TCT AAA 240

FTI20037 ATC

AAC AGA GCC ATT AAA GAA GGA TTA GTT AAA AGA GAA GAA TTA TTC ATC ACT TCT AAA 240

C.tropicalis TTA TGG AAC AAT TTC CAT GAT CCA AAG AAT GTT GAA ACT GCT TTA AAC AAA ACT TTA AGT 300

FTI20037 TTA TGG AAC AAT TTC CAT GAT CCA AAG AAT GTT GAA ACT GCT TTA AAC AAA ACT TTA AGT 300

C.tropicalis GAC TTG AAC TTG GAC TAT GTT GAT TTA TTC TTG ATT CAT TTT CCA ATT GCT TTT AAA TTT 360

FTI20037 GAC TTG AAC TTG GAC TAT GTT GAT TTA TTC TTG ATT CAT TTT CCA ATT GCT TTT AAA TTT 360

C.tropicalis GTT CCA ATT GAA GAA AAA TAC CCA CCT GGT TTC TAC TGT GGT GAT GGT GAT AAC TTC CAC 420

FTI20037 GTT CCA ATT GAA GAA AAA TAC CCA CCT GGT TTC TAC TGT GGT GAT GGT GAT AAC TTC CAC 420

C.tropicalis TAT GAA GAT GTT CCA TTA TTA GAT ACT TGG AAA GCT TTG GAA AAA TTG GTT GAA GCT GGT 480

FTI20037 TAT GAA GAT GTT CCA TTA TTA GAT ACT TGG AAA GCT TTG GAA AAA TTG GTT GAA GCT GGT 480

C.tropicalis AAG ATC AAA TCT ATT GGT ATT TCC AAT TTT ACT GGT GCT TTG ATT TAC GAT TTG ATC AGA 540

FTI20037 AAG ATC AAA TCT ATT GGT ATT TCC AAT TTT ACT GGT GCT TTG ATT TAC GAT TTG ATC AGA 540

C.tropicalis GGT GCT ACT ATC AAA CCA GCT GTT TTA CAA ATT GAA CAT CAC CCA TAC TTG CAA CAA CCA 600

FTI20037 GGT GCT ACT ATC AAA CCA GCT GTT TTA CAA ATT GAA CAT CAC CCA TAC TTG CAA CAA CCA 600

C.tropicalis AAA TTG ATT GAA TAT GTT CAA AAA GCT GGT ATT GCC ATT ACT GGT TAC TCT TCA TTT GGT 660

FTI20037 AAA TTG ATT GAA TAT GTT CAA AAA GCT GGT ATT GCC ATT ACT GGT TAC TCT TCA TTT GGT 660

C.tropicalis CCA CAA TCA TTC TTG GAA TTG GAA TCC AAG AGA GCT TTG AAC ACC CCA ACT TTA TTT GAA 720

FTI20037 CCA CAA TCA TTC TTG GAA TTA

GAA TCC AAG AGA GCT TTG AAT ACC CCA ACT TTA TTT GAA 720

C.tropicalis CAT GAA ACT ATT AAA TCA ATT GCT GAT AAA CAT GGT AAA TCC CCA GCT CAA GTT TTA TTA 780

FTI20037 CAT GAA ACT ATT AAA TCA ATT GCT GAT AAA CAT GGT AAA TCC CCA GCT CAA GTT TTA TTA 780

C.tropicalis AGA TGG GCT ACT CAA AGA AAT ATT GCT GTT ATT CCA AAA TCA AAC AAT CCA GAA AGA TTA 840

FTI20037 AGA TGG GCT ACT CAA AGA AAT ATT GCT GTT ATT CCA AAA TCA AAC AAT CCA GAA AGA TTA 840

C.tropicalis GCT CAA AAC TTG TCT GTT GTT GAC TTT GAC TTG ACT AAG GAT GAT TTG GAC AAT ATT GCT 900

FTI20037 GCT CAA AAC TTG TCT GTT GTT GAC TTT GAC TTG ACT AAG GAT GAT TTG GAC AAT ATT GCT 900

C.tropicalis AAA TTG GAC ATT GGT TTG AGA TTC AAT GAT CCA TGG GAC TGG GAC AAC ATT CCA ATC TTT 960

FTI20037 AAA TTG GAC ATT GGT TTG AGA TTC AAT GAT CCA TGG GAC TGG GAC AAC ATT CCA ATC TTT 960

C.tropicalis GTT TAA 966

FTI20037 GTT TAA 966

Figura 10. Alinhamento da seqüência de XYL1 de C. tropicalis e de C. guilliermondii FTI 20037, com

as divergências sublinhadas.

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_______________________________________________________________________________________ 51

Figura 11. Alinhamento da seqüência de XYL1 com a seqüência do projeto genoma de C. tropicalis.

Usando Blastp, a seqüência predita de Xyl1 mostrou maior identidade com a

xilose redutase I,II de C. tropicalis (98%), porém a Figura 12 mostra o alinhamento

com a xilose redutase de Candida tenuis (79% de identidade) pois esta proteína

possui estrutura terciária determinada e depositada no PDB. A partir deste

alinhamento, foi possível identificar os resíduos envolvidos no sítio catalítico, no sítio

de ligação à NADH e os que participam da formação de dímero (KAVANAGH et al.,

2002) (Figura 12). O sítio catalítico envolve os aminoácidos Asp

, Tyr

, Lys

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_______________________________________________________________________________________ 52

conforme sugerido por Lee (1998). A seqüência apresentou ainda três assinaturas da

família de aldocetoredutases. A enzima XR de C. tropicalis possui especificidade por

NADPH, sendo assim, esta levedura é considerada como uma boa produtora de

xilitol (YOKOYAMA et al, 1995a).

Figura 12. Alinhamento entre a seqüência da proteína Xyl1 de C. guilliermondii FTI 20037 e C. tenuis

(1JEZ). Os aminoácidos dentro do quadrado hachurado representam as assinaturas das

aldocetoredutases, os resíduos envolvidos na catálise são indicados por setas, os resíduos envolvidos

no sítio de ligação à coenzima são indicados por asteriscos e os resíduos que participam na

dimerização estão indicados por quadrados.

3. Clonagem e análise do gene XYL2

Um vez que o gene XYL2 de C. tropicalis ainda não havia sido caracterizado

antes deste trabalho, decidiu-se cloná-lo por PCR a partir do alinhamento de genes

homólogos de P. stipitis e G. mastotermitis (Figura 13) disponíveis no GenBank. Para

tanto, foram desenhados quatro primers para a região 5' (5XDH1, 5XDH2, 5XDH3,

5XDH4) e quatro para região 3' (3XDH1, 3XDH2, 3XDH3, 3XDH4), a partir do

alinhamento das seqüências de XYL2 de P. stipitis e G. mastotermitis (Figura 13)

disponíveis no GenBank.

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_______________________________________________________________________________________ 53

P. stipitis ------ATGACTGCTAACCCTTCCTTGGTGTTGAACAAGATCGACGACATTTCGTTCGAA 54

G. mastotermitis ATGTCTACTCCTGAAAACTTATCTTTTGTTTTACAAAAGCCTTTTGACGTCAAGTTCGAG 60

* *** *** ** ** ** ** * *** *** * ******

→5XDH3

P. stipitis ACTTACGATGCCCCAGAAATCTCTGAACCTACCGATGTCCTCGTCCAGGTCAAGAAAACC 114

G. mastotermitis GATAGACCCATCCCCAAGTTGTCTGATCCTTACTCTGTCAAGATCCAAGTCAAGAAGACT 120

* *** * * ***** *** * **** **** ******** **

P. stipitis GGTATCTGTGGTTCCGACATCCACTTCTACGCCCATGGTAGAATCGGTAACTTCGTTTTG 174

G. mastotermitis GGTATCTGTGGTAGTGATGTTCATTACTTCACCCATGGAGCTATTGGTGACTTTGTCGTC 180

************ ** * ** * ** * ******* ** *** **** ** *

→5XDH2

P. stipitis ACCAAGCCAATGGTCTTGGGTCACGAATCCGCCGGTACTGTTGTCCAGGTTGGTAAGGGT 234

G. mastotermitis AAGGCCCCAATGGTCCTTGGTCACGAATCCAGTGGTGTTGTCTTGGAAGTCGGTAGCGAG 240

* ********* * ************ *** *** * * ** **** *

P. stipitis GTCACCTCTCTTAAGGTTGGTGACAACGTCGCTATCGAACCAGGTATTCCATCCAGATTC 294

G. mastotermitis GTCAAGTCACTCAAGGTTGGTGACAGAGTCGCTATGGAGCCTGGTGTTCCCAGCAGACAC 300

**** ** ** ************* ******** ** ** *** **** **** *

→5XDH1

P. stipitis TCCGACGAATACAAGAGCGGTCACTACAACTTGTGTCCTCACATGGCCTTCGCCGCTACT 354

G. mastotermitis TCTGATGAATACAAGTCCGGTAGATACAACTTGTGTCCTCACATGGCATTTGCTGCTACT 360

** ** ********* **** *********************** ** ** ******

P. stipitis CCTAACTCCAAGGAAGGCGAACCAAACCCACCAGGTACCTTATGTAAGTACTTCAAGTCG 414

G. mastotermitis CCTCCTTATGATG---------------------GTACTCTTTGTAAATACTATATTCTT 399

*** * * * **** * ***** **** *

→5XDH4

P. stipitis CCAGAAGACTTCTTGGTCAAGTTGCCAGACCACGTCAGCTTGGAACTCGGTGCTCTTGTT 474

G. mastotermitis CCTGAAGACTTCTGTGTCAAGTTACCTGAGCACGTTTCTTTGGAAGAGGGTGCTTTAGTT 459

** ********** ******** ** ** ***** ****** ****** * ***

P. stipitis GAGCCATTGTCTGTTGGTGTCCACGCCTCCAAGTTGGGTTCCGTTGCTTTCGGCGACTAC 534

G. mastotermitis GAACCTTTAAGTGTTGCGGTTCACTCCTCTAAGTTGGGTAACATTAAGCCCGGTAGCCAT 519

** ** ** ***** ** *** **** ********* * ** *** * *

P. stipitis GTTGCCGTCTTTGGTGCTGGTCCTGTTGGTCTTTTGGCTGCTGCTGTCGCCAAGACCTTC 594

G. mastotermitis GTTGCCATTTACGGTGCAGGACCTGTTGGTTTGTTAGTTGCCGCAGTCGCCAGTGCTTTT 579

****** * * ***** ** ********* * ** * *** ** ******* * **

P. stipitis GGTGCTAAGGGTGTCATCGTCGTTGACATTTTCGACAACAAGTTGAAGATGGCCAAGGAC 654

G. mastotermitis GGTGCTGAATCTGTTACTATTATTGATCTTGTTGAATCTAGACTTAACCTTGCCAAGGAG 639

****** * *** * * **** ** * ** * * ** * ********

P.stipitis ATTGGTGCTGCTACTCACACCT---TCAACTCCAAGACCGGTGGTTCTGAAGAATTGATC 711

G. mastotermitis TTAGGTGCTACTGCCACTGTTCAAGTTGATTTCAAG---GATACTCCTAAGGAGTCTGCT 696

* ****** ** * * * * **** * * * ** * ** *

P. stipitis ---AAGGCTTTCGGTGGTAAC---------GTGCCAAACGTCGTTTTGGAATGTACTGGT 759

G.mastotermitis GCTAAGGTTGTTGCCGCTAACAACGGAATTGCCCCTGATGTTGTCATTGATGCTTCTGGT 756

**** * * * * **** * ** * ** ** * ** * *****

P. stipitis GCTGAACCTTGTATCAAGTTGGGTGTTGACGCCATTGCCCCAGGTGGTCGTTTCGTTCAA 819

G. mastotermitis GCTGAGGCTTCCATTAATAGTGCTATCAATGCCATCAGACCTGGTGGCACTTACGTTCAA 816

***** *** ** ** * * * * ***** ** ***** ** *******

←3XDH2

P. stipitis GTTGGTAACGCTGCTGGTCCAGTCAGCTTCCCAATCACCGTTTTCGCCATGAAGGAATTG 879

G. mastotermitis GTCGGTATGGGTAAGCCTGATGTCTCTTTCCCCATTGCTACTTTAATTGGTAAGGAGCTT 876

** **** * * * *** ***** ** * *** ***** *

←3XDH3

P. stipitis ACTTTGTTCGGTTCTTTCAGATACGGATTCAACGACTACAAGACTGCTGTTGGAATCTTT 939

G. mastotermitis ACTGTTAAGGGATCTTTCAGATATGGTTACGGTGACTACCCTCTTGCTGTCAGCTTGCTT 936

*** * ** *********** ** * * ****** ****** * * **

P. stipitis GACACTAACTACCAAAACGGTAGAGAAAATGCTCCAATTGACTTTGAACAATTGATCACC 999

G. mastotermitis GCTA---------------GTGGAAAAG---------TCAATGTTAAAAAGTTGATTACC 972

* * ** ** ** * * ** ** * ***** ***

P. stipitis CACAGATACAAGTTCAAGGACGCTATTGAAGCCTACGACTTGGTCAGAGCCGGTAAGGGT 1059

G. mastotermitis CATGAAGTCAAGTTTGAGGATGCTGCTGAAGCTTTCCAATTGGTTAGAGATGGAAAGG-- 1030

** * ****** **** *** ****** * * * ***** **** ** ****

←3XDH4

←3XDH1

P. stipitis GCTGTCAAGTGTCTCATTGACGGCCCTGAGTAA 1092

G. mastotermitis -CTATCAAGTGCATCATTAACGGCCCTGAGTAA 1062

** ******* ***** **************

Figura 13. Alinhamento das seqüências de XYL2 de P. stipitis e G. mastotermitis, evidenciando a

localização dos primers desenhados para amplificar a seqüências XYL2 de C. tropicalis.

Nas reações de PCR utilizou-se como molde o DNA total de C. tropicalis;

dentre as combinações de primers que resultaram em amplificação positiva,

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 54

destacamos as que apresentaram produto com tamanho próximo ao esperado

calculado a partir da seqüência de P. stipitis, a saber: 5XDH1/3XDH2 - 511 pb,

5XDH2/3XDH3 - 728 pb, 5XDH2/3XDH1 - 911 pb, 5XDH3/3XDH1 - 989 pb (dados

não mostrados). Porém, estas duas últimas foram produtos de apenas um dos

primers, ou seja, o produto de 5XDH2/3XDH1 era resultado da amplificação de

apenas 5XDH2, enquanto o de 5XDH3/3XDH1 era produto de apenas 3XDH1.

Dentre as duas combinações possíveis, foi utilizada a que gerava o maior produto,

ou seja 5XDH2/3XDH3. O resultado da reação de PCR está apresentado na Figura

14.

Figura 14. Reações de amplificação de XYL2 analisadas

em gel de agarose 1%. 1: marcador 100 bp DNA ladder

(Invitrogen), 2: 5XDH2, 3: 3XDH3, 4: 5XDH2/3XDH3.

O fragmento de ~750 pb amplificado usando os primers 5XDH2 e 3XDH3 foi

ligado ao vetor pCR

2.1 TOPO

(Invitrogen). Após a transformação de E. coli DH5α

com o sistema de ligação, selecionou-se transformantes para extração de

plasmídios. Foi analisada a presença de inserto com digestão com EcoR I, o clone

escolhido (Topoxyl2) foi submetido a uma minipreparação de plasmídios com kit e

seqüenciado.

O plasmídio foi seqüenciado com os primers universal e reverso e a seqüência

obtida apresentou 732 pb que quando analisada pelo BLASTx, apresentou 67% de

identidade com o homólogo XYL2 de P. stipitis e 48% com o de G. mastotermitis.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 55

Os resultados referentes à clonagem do gene XYL2 de C. tropicalis e a

análise destes resultados foram divulgados em apresentação oral no 6° Seminário

Brasileiro de Tecnologia Enzimática, Rio de Janeiro – RJ em abril de 2004.

3.1. Clonagem das Regiões 5’ e 3’ do Gene XYL2

3.1.1. Uso de Primers Internos

A primeira estratégia para obter as porções 5' e 3' do gene a partir de

seqüências conhecidas de XYL2 foi baseada no trabalho de LORITO et al. (1996) no

qual foi isolado o promotor do gene ech-42 de Trichoderma harzianum. Foram

desenhados primers, xyl2-R2 e xyl2-F2 (Figura 15), que se anelam dentro da

seqüência obtida, Outro primer sintetizado foi 221 (Tabela 6) utilizado por LORITO et

al. (1996). Nesta estratégia, os primers específicos se anelam em regiões internas do

gene enquanto que o primer 221, por ser pequeno, se anela randomicamente nas

regiões 5´e 3´. Desta forma, é possível obter, sob condições especiais de estrigência,

produtos de PCR a partir do primer 221 e os primers específicos.

Dos produtos da reação de PCR, foram selecionados o amplicon de ~400 pb

da amplificação com os primers 221 e xyl2-R2, e o de cerca de 900 pb para a

amplificação com os primers 221 e xyl2-F2, por se apresentarem como produtos

específicos em comparação com as amplificações utilizando cada um dos primers

sozinhos (Figura 16). Estes produtos foram utilizados em uma reação de PCR para

confirmação da amplificação da região de XYL2: produto 221/xyl2-R2 confirmado

com 3XDH3/xyl2-R2 e produto 221/xyl2-F2 confirmado com 5XDH2/xyl2-F2, porém,

só foi confirmado o amplicon obtido do PCR usando 221/xyl2-R2 (dados não

mostrados).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 56

Figura 15. Esquema mostrando as posições relativas de anelamento dos primers utilizados para

buscar as porções 5' e 3' de XYL2.

Figura 16. Reações de amplificação utilizando o primer 221 analisadas em gel de

agarose 1%. 1: 221/xyl2-F2, 2: 221/xyl2-R2, 3: xyl2-R2, 4: xyl2-F2, 5: 221, 6:

marcador 1 kb DNA ladder (New England Biolabs).

O produto amplificado com os primers 221 e xyl2-R2 foi clonado no vetor

pCR

2.1 TOPO

(Invitrogen) e posteriormente seqüenciado. Porém, a seqüência de

nucleotídeos obtida não continha a porção coincidente entre 3XDH3 e xyl2-R2,

portanto, a região amplificada não correspondia ao gene XYL2 e, assim, decidiu-se

utilizar a estratégia de PCR inverso.

3.1.2. PCR Inverso

A estratégia de PCR inverso, inicialmente descrito por TRIGLIA et al. (1988) e

esquematizada na Figura 17, foi utilizada para encontrar as regiões 5' e 3' que não

foram amplificadas com os primers 5XDH2

e 3XDH3.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 57

Figura 17. Esquema da técnica de PCR inverso, onde o DNA genômico total é digerido com uma

enzima de restrição (EcoR I), religado formando fitas circulares que são usadas como molde em uma

reação de PCR, utilizando primers internos (R e F).

Primeiramente, o DNA total de C. tropicalis foi digerido com as enzimas de

restrição BamH I, EcoR I e Hind III, cujos sítios não estão presentes na região

clonada do gene XYL2 obtida. Depois da extração da enzima com clorofane/clorofil

seguido de precipitação de DNA, o sistema de digestão foi ressuspendido em 25µL

de água MilliQ para ser quantificado. Após a ligação do sistema montado com 100 ng

de DNA digerido; precipitou-se com NaCl/etanol e ressuspendeu-se em 20µL de

água MilliQ. Posteriormente, foram utilizados 2 µL (~10ng) como template numa

reação de PCR utilizando Elongase

Amplification System, e como controle, foi

utilizado o plasmídio Topoxyl2. O único produto de amplificação obtido foi o do

sistema contendo DNA digerido com EcoR I (Figura 18). O produto amplificado foi

clonado no vetor pGEM

-T Easy (Promega) e após a transformação de E. coli DH5α

com o plasmídio, a presença de inserto foi analisada a partir de digestão com EcoR I.

O clone escolhido foi submetido a uma minipreparação de plasmídios com kit para

ser seqüenciado.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 58

Figura 18. Reações do PCR inverso analisadas em

gel de agarose 1%. Amplificação com xyl2-R2 e xyl2-

F2, utilizando DNA total digerido e religado como

molde, digestão com 1: BamH I, 2: EcoR I, 3: Hind III

e 4: TopoXYL2 como controle.

Com a técnica de PCR inverso foram obtidas 357 pb da porção 3' e 623 pb da

porção 5’ que, quando analisadas pelo BLASTx, apresentaram maior identidade com

uma proteína hipotética de C. albicans, 90% e 73% respectivamente, que,

provavelmente, trata-se da enzima xilitol desidrogenase, e 66% e 64% de identidade

com a enzima xilitol desidrogenase de P. stipitis.

A partir desta seqüência foram desenhados os primers 5xyl2 e 3xyl2 que se

anelam nas extremidades e amplificam toda a região codante. O produto da

amplificação por PCR foi clonado no vetor pGEM®-T Easy (Promega) e o vetor

resultante

(pGEMXyl2) foi seqüenciado para confirmação dos resultados. A

seqüência completa foi depositada no GenBank com o número de acesso DQ220745

(Anexo 4).

3.2. Análise da Seqüência de XYL2

Analisando a seqüência completa do gene XYL2 de C. tropicalis (

Figura

19), unindo o produto obtido da amplificação com 5XDH2/3XDH3 com as

seqüências obtidas pelo PCR inverso, observa-se que foi isolado um fragmento de

DNA com aproximadamente 1,5 kb, que compreende a fase aberta de leitura de

1092 pb, sem íntrons, que potencialmente codifica um polipeptídeo de 364 resíduos

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 59

de aminoácidos. A partir da ferramenta BLAST disponível no site do projeto genoma

de C. tropicalis - Broad Institute of Harvard and MIT

(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/candida_tropicalis/) foi encontrada uma

seqüência (supercont3.10 of C. tropicalis T1) com 99% de identidade, sendo que a

região da ORF e a região 3’ são idênticas, com divergência na região 5’ em uma

região de timinas (Figura 20).

A massa molecular (40 kDa) e o ponto isoelétrico (6,81), calculados a partir da

seqüência de aminoácidos predita, coincidem com as subunidades das enzimas

xilitol desidrogenase isoladas de C. shehatae, P. tannophilus, N. crassa, G.

mastotermitis e A. adeninivorans (PHADTARE et al., 1997; LUNZER et al.,1998;

BÖER et al., 2005). A seqüência de aminoácidos predita possui homologia com

XDHs de P. stipitis (84%), G. mastotermitis (68%), A. adeninivorans (65%), A.

oryzae, fumigatus e niger (64%), S. cerevisiae (62%) e H. jecorina (61%), o

alinhamento destas seqüências está apresentado na Figura 21.

A seqüência consenso, TATAAA, responsável pela correta iniciação da

transcrição (RATHJEN e MELLOR, 1990), está presente na posição -100 em relação

ao códon de iniciação ATG. Na região 5’ UTR foram localizados quatro possíveis

seqüências para Mig1 (GGGG). Mig1 é uma proteína Cys2-His2 zinc finger que

media a repressão por glicose de diversos genes pela ligação aos seus promotores,

recrutando um complexo de repressão (DE VIT et al., 1997). Outros relevantes

motivos encontrados foram sítios de ligação pra Gcr1 (ACCTTCCT) e Rap1(ACCCA),

essas seqüências são essenciais para ativação de genes glicolíticos e de proteínas

ribossomais em S. cerevisiae (TORNOW et al., 1993

; SASAKI et al., 2005). São

observadas na região 3’ UTR após o códon de finalização (UAG), seqüências

similares ao sinal típico de poliadenilação (GAAAAAGAAT) encontrado em genes de

leveduras (GUO e SHERMAN, 1995).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 60

-342 accttcctattgtttggaaaccggaaaaaaataatattttgtatggagatcctcaaattt

-282 cggggaaattgtagatttaccttcctcttgcaattacgcattgctactattttgtttttt

-222 agtttgggttttcttttgtattgcttcacgtatggtgattatactttgtgtacacttgtt

-162 catttactcccccaagttttcctctccccctccatttataatgtatgaattaattatata

-102 aatactgccgcaaatttccccaggttgaaattttttttgttacttctaaagtttcttatt

M T A N P S

-42 tcttttcattcaataactttcaattctacaaatacaaaagtcATGACTGCAAACCCATCA

7 L V L N K V D D I S F E E Y E A P K L E

19 TTAGTTCTTAACAAAGTTGACGATATTTCCTTTGAAGAATACGAAGCTCCAAAACTCGAA

27 S P R D V I V E V K K T G I C G S D I H

79 TCACCAAGAGATGTCATTGTTGAAGTTAAGAAAACTGGTATCTGTGGATCAGATATCCAT

47 Y Y A H G S I G P F I L R K P M V L G H

159 TACTATGCCCATGGTTCAATTGGTCCATTTATTTTAAGAAAACCAATGGTTTTAGGTCAC

67 E S A G V V S A V G S E V T N L K V G D

219 GAATCAGCAGGTGTTGTTTCTGCTGTCGGAAGTGAAGTTACCAACTTGAAGGTTGGTGAT

87 R V A I E P G V P S R F S D E T K S G H

279 AGAGTTGCCATTGAACCTGGTGTACCTTCAAGATTTAGTGATGAGACCAAATCTGGTCAT

107 Y H L C P H M S F A A T P P V N P D E P

339 TATCATTTGTGCCCACATATGTCTTTTGCCGCCACCCCACCAGTTAACCCAGATGAACCA

127 N P Q G T L C K Y Y R V P C D F L F K L

399 AATCCTCAAGGTACTTTATGTAAATACTACAGAGTCCCATGTGACTTTTTATTCAAATTA

147 P D H V S L E L G A M V E P L T V G V H

459 CCAGATCATGTTTCTTTGGAGTTGGGTGCTATGGTTGAACCATTAACTGTTGGTGTCCAC

167 G C K L A D L K F G E D V V V F G A G P

519 GGTTGTAAATTGGCTGATTTGAAATTTGGTGAAGACGTTGTTGTTTTTGGTGCCGGTCCA

187 V G L L T A A V A R T I G A K R V M V V

579 GTTGGTTTGTTGACCGCTGCCGTTGCTAGAACAATTGGTGCTAAAAGAGTCATGGTTGTT

207 D I F D N K L K M A K D M G A A T H I F

639 GATATTTTTGACAACAAATTGAAGATGGCAAAAGATATGGGTGCTGCCACTCATATTTTC

227 N S K T G G D Y Q D L I K S F D G V Q P

699 AACTCAAAAACCGGTGGTGATTATCAAGATTTGATCAAGAGTTTTGATGGTGTTCAACCT

247 S V V L E C S G A Q P C I Y M G V K I L

759 TCAGTTGTTTTGGAATGTAGTGGTGCTCAACCATGTATCTATATGGGTGTTAAAATCTTG

267 K A G G R F V Q I G N A G G D V N F P I

819 AAAGCTGGTGGTAGATTTGTTCAAATTGGTAATGCCGGTGGTGATGTCAATTTCCCAATT

287 A D F S T R E L A L Y G S F R Y G Y G D

879 GCTGATTTCTCAACCAGAGAATTGGCATTATATGGTTCTTTCAGATATGGTTACGGTGAC

307 Y Q T S I D I L D R N Y V N G K D K A P

939 TACCAAACTTCAATTGATATTTTAGACAGAAACTACGTCAATGGTAAAGACAAAGCACCA

327 I N F E L L I T H R F K F K D A I K A Y

999 ATTAATTTCGAATTGTTGATTACTCACAGATTCAAGTTTAAAGATGCCATCAAAGCCTAT

347 D L V R A G N G A V K C L I D G P E -

1059 GATTTGGTCAGAGCAGGAAATGGTGCTGTCAAATGTTTAATTGATGGTCCAGAATAGagg

1109 tatatagtattagaaaaagaat

atacagtatatatatatatatatgtgaataattcatgc

1169 ttaagtttaatatcagtaaagcatctactataaatcca

Figura 19. Seqüência de nucleotídeos do gene XYL2 de C. tropicalis e a estrutura

primária predita da proteína. Seqüência de nucleotídeos nas UTR - letras minúsculas,

na ORF - letras maiúsculas, TATA Box - cinza na região 5’, possível sinal de

poliadenilação - sublinhado na região 3’, a seqüência deduzida de aminoácidos é

mostrada sobre a seqüência de nucleotídeos da ORF.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 61

Figura 20. Alinhamento da seqüência de XYL2 com a seqüência do projeto genoma de C. tropicalis.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 62

C.tropicalis ------------------------MTANPSLVLNKVDDISFEEYEAPKLESPRDVIVEVK

P.stipitis ------------------------MTANPSLVLNKIDDISFETYDAPEISEPTDVLVQVK

G.mastotermitis ----------------------MSTPENLSFVLQKPFDVKFEDRPIPKLSDPYSVKIQVK

A.adenovirans ---------MAAQVEEQVLNLRAQADHNPSFVLKKPLELGFEERPVPVITDPRDVKIQVK

A.fumigatus MAFTETLVRPKSVPVNELPDQTSFQNVNHAFILSPGGTFCYKERPTPKIESERDVIVRVV

A.oryzae ---------------MGAPPKT---AQNLSFVLEGIHKVKFEDRPIPQLRDAHDVLVDVR

A.niger ---------------MSTQNTN---AQNLSFVLEGIHRVKFEDRPIPEINNPHDVLVNVR

S.cerevisiae ---------------------MTDLTTQEAIVLERPGKITLTNVSIPKISDPNEVIIQIK

H.jecorina ---------------MATQTINKDAISNLSFVLNKPGDVTFEERPKPTITDPNDVLVAVN

: :::*. . * : . .* : :

C.tropicalis KTGICGSDIHYYAHGSIGPFILRKPMVLGHESAGVVSAVGSEVTNLKVGDRVAIEPGVPS

P.stipitis KTGICGSDIHFYAHGRIGNFVLTKPMVLGHESAGTVVQVGKGVTSLKVGDNVAIEPGIPS

G.mastotermitis KTGICGSDVHYFTHGAIGDFVVKAPMVLGHESSGVVLEVGSEVKSLKVGDRVAMEPGVPS

A.adenovirans KTGICGSDVHFWQHGRIGDYVVEKPMVLGHESSGVVVEVGSEVTSLKVGDRVAMEPGVPD

A.fumigatus ATGLCGSDVHYWQHGRIGRYAVNRPIVLGHESSGVIVACGSNVDGLKVGDRVALEPGISC

A.oryzae FTGICGSDVHYWEHGSIGQFVVKDPMVLGHESSGVISKVGSAVTTLKVGDHVAMEPGIPC

A.niger FTGICGSDVHYWEHGSIGQFIVKDPMVLGHESSGVVSKVGSAVTSLKVGDCVAMEPGIPC

S.cerevisiae ATGICGSDIHYYTHGRIANYVVESPMVLGHESSGIVALIGENVKTLKVGDRVALEPGIPD

H.jecorina YTGICGSDVHYWVHGAIGHFVVKDPMVLGHESAGTVVEVGPAVKSLKPGDRVALEPGYPC

**:****:*:: ** *. : : *:******:* : * * ** ** **:*** .

C.tropicalis RFSDETKSGHYHLCPHMSFAATPPVNPDEPNPQGTLCKYYRVPCDFLFKLPDHVSLELGA

P.stipitis RFSDEYKSGHYNLCPHMAFAATPNSKEGEPNPPGTLCKYFKSPEDFLVKLPDHVSLELGA

G.mastotermitis RHSDEYKSGRYNLCPHMAFAATPPYD-------GTLCKYYILPEDFCVKLPEHVSLEEGA

A.adenovirans RRSKEYKMGRYHLCPHVRFAACPPTD-------GTLCKYYTLPEDFCVKLPENVDFEEGA

A.fumigatus NTCKYCRSGHYNLCKSMVFAATPPYD-------GTLSTFYKVPAECCYKLPVHISLRDGA

A.oryzae RRCEPCKEGKYNLCEKMAFAATPPYD-------GTLAKYYVLPEDFCYKLPENINLQEAA

A.niger RRCEPCKAGKYNLCVKMAFAATPPYD-------GTLAKYYVLPEDFCYKLPESITLQEGA

S.cerevisiae RFSPEMKEGRYNLDPNLKFAATPPFD-------GTLTKYYKTMKDFVYKLPDDVSFEEGA

H.jecorina RRCSFCRAGKYNLCPDMVFAATPPYH-------GTLTGLWAAPADFCYKLPDGVSLQEGA

. . : *:*:* : *** * . ..... *** : : *** : :. .*

C.tropicalis MVEPLTVGVHGCKLADLKFGEDVVVFGAGPVGLLTAAVARTIGAKRVMVVDIFDNKLKMA

P.stipitis LVEPLSVGVHASKLGSVAFGDYVAVFGAGPVGLLAAAVAKTFGAKGVIVVDIFDNKLKMA

G.mastotermitis LVEPLSVAVHSSKLGNIKPGSHVAIYGAGPVGLLVAAVASAFGAESVTIIDLVESRLNLA

A.adenovirans LVEPLSVAVHTARLLGIYPGSKVVVFGAGPIGQLCIGVCKAFGASIIGAVDLFEQKLETA

A.fumigatus LVEPLSVAVHACRLAGDMQNKSVVVFGAGPVGLLCCSVASAFGAAKVVAVDVVKTRLATA

A.oryzae VMEPLSVAVHIVKQANVAPGQSVVVFGAGPVGLLCCAVARAFGSPKVIAVDIQKGRLEFA

A.niger IMEPLSVAVHIVKQAGINPGQSVVVFGAGPVGLLCCAVAKAYGASKVIAVDIQKGRLDFA

S.cerevisiae LIEPLSVAIHANKLAKIKFGARCVVFGAGPIGLLAGKVASVFGAADVVFVDLLENKLETA

H.jecorina LIEPLAVAVHIVKQARVQPGQSVVVMGAGPVGLLCAAVAKAYGASTIVSVDIVQSKLDFA

::***:*.:* : . .: ****:* * *. . *: : :*: . :* *

C.tropicalis KDMGAATHIFNS---KTGGDYQDLIK-SFDGVQPSVVLECSGAQPCIYMGVKILKAGGRF

P.stipitis KDIGAATHTFNS---KTGGS-EELIK-AFGGNVPNVVLECTGAEPCIKLGVDAIAPGGRF

G.mastotermitis KELGATATVQVDFKDTPKESAAKVVAAN-NGIAPDVVIDASGAEASINSAINAIRPGGTY

A.adenovirans KEFGASHTYVPQKGDSHDETAHKILELLPNKQAPDVVIDASGAEQSINAGIELLERGGTF

A.fumigatus TKYGATHRYEMD---AEKKNAEELSATAALEDGADIILDATGAEPCLNCGLDILRSGGTF

A.oryzae KKYAATAIFEPS-KVSALENAERIVNENDLGRGADIVIDASGAEPSVHTGIHVLRPGGTY

A.niger KKYAATATFEPA-KAAALENAQRIITENDLGSGADVAIDASGAEPSVHTGIHVLRAGGTY

S.cerevisiae RQFG-ATHIVNSGDLPHGVTVDSVIKKAIGKKGADVVFECSGAEPCVRAGIEVCKAGGTI

H.jecorina RGFCSTHTYVSQ-RISAEDNAKAIKELAGLPGGADVVIDASGAEPSIQTSIHVVRMGGTY

:: : ..: ::.:**: .: .:. **

C.tropicalis VQIGNAGGD-VNFPIADFSTRELALYGSFRYGYGDYQTSIDILDRNYVNGKDKAPINFEL

P.stipitis VQVGNAAGP-VSFPITVFAMKELTLFGSFRYGFNDYKTAVGIFDTNYQNGRENAPIDFEQ

G.mastotermitis VQVGMGKPD-VSFPIATLIGKELTVKGSFRYGYGDYPLAVSLLAS--------GKVNVKK

A.adenovirans GQVAMGRTDYIQFAVSRMAMKEIRFQGVFRYTYGDYELATQLIGD--------GKIPVKK

A.fumigatus VQVGLGNPT-LMFPVGQVCDKEVVFKGSFRYGPGDYALAIGLLES--------RRVQLDG

A.oryzae VQGGMGRNE-ITFPIMAACTKELNVRGSFRYGSGDYKLAVNLVAS--------GKVSVKE

A.niger VQGGMGRSE-ITFPIMAACTKELNVKGSFRYGSGDYKLAVSLVSA--------GKVNVKE

S.cerevisiae VQVGMGQEE-IQFPISIIPTKELTFQGCFRYCQGDYSDSIELVSS--------RKLSLKP

H.jecorina VQGGMGKSD-ITFPIMAMCLKEVTVRGSFRYGAGDYELAVELVRT--------GRVDVKK

* . . : *.: :*: . * *** .** : :. . .. .. : ..

C.tropicalis LITHRFKFKDAIKAYDLVRAG-NGAVKCLIDGPE----------

P.stipitis LITHRYKFKDAIEAYDLVRAG-KGAVKCLIDGPE----------

G.mastotermitis LITHEVKFEDAAEAFQLVRDG--KAIKCIINGPE----------

A.adenovirans LVTHRRPFEKAEEAYELVKSG--VAVKCIIDGPE----------

A.fumigatus MVTHEFSFWKAQEAFQNVVHR--QGIKCIIYGPGIDEEWARIAD

A.oryzae LITGVVSFEDAEQAFHEVKAG--KGIKTLIAGVDV---------

A.niger LITGVVKFEDAERAFEEVRAG--KGIKTLIAGVDS---------

S.cerevisiae FITHRYSFKDAVEAFEETSHHPLNNIKTIIEGPE----------

H.jecorina LITGTVSFKQAEEAFQKVKSG--EAIKILIAGPNEKV-------

::* * .* .*:. . :* :* *

Figura 21. Alinhamento entre a seqüência predita a partir do gene XYL2 e as

seqüências primárias de xilitol desidrogenases de diferentes organismos.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 63

3.3. Número de cópias do gene XYL2

Para determinar o número de cópias do gene XYL2 no genoma de C.

tropicalis, realizou-se um experimento de Southern blotting. O DNA total da levedura

foi digerido com as enzimas de restrição EcoR I, EcoR V e Hind III. A sonda

homóloga foi amplificada por PCR utilizando os primers 5xyl2 e 3xyl2

correspondendo a toda região codante do gene XYL2 (1092 pb), e depois marcada

com fosfatase alcalina.

De acordo com a Figura 22 a sonda hibridizou uma única vez com o DNA

genômico de C. tropicalis digerido com EcoR I, EcoR V e Hind III, revelando

fragmentos com tamanhos aproximados de 2,5 kb, 3,0 kb e 5,0 kb, respectivamente.

Na digestão com EcoR V, a sonda deveria hibridizar em duas bandas porque há um

sítio desta enzima (GATATC) na seqüência do gene XYL2 na posição 150 pb, porém

como a intensidade da banda está maior que as obtidas com a digestão com outras

enzimas, pode-se sugerir que o tempo de corrida da eletroforese não tenha sido

suficiente para resolver as duas bandas. Esses resultados sugerem fortemente que,

assim como em A. adeninivorans (BOËR et al., 2005), em C. tropicalis o gene XYL2

é representado por uma única cópia no genoma.

Figura 22. Southern blotting com DNA genômico de C.

tropicalis. Digestão com 1: EcoR I, 2: EcoR V, 3: Hind III,

utilizando XYL2 como sonda.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 64

3.4. Padrão de Expressão do gene XYL2

O experimento de Northern blotting foi realizado com a finalidade de analisar a

regulação da expressão do gene XYL2 em nível transcricional com diferentes fontes

de carbono. Para o experimento, utilizou-se RNA total de C. tropicalis extraído de

células crescidas em xilose, glicose e glicerol. O gene XYL2, produto da reação de

PCR com os primers 5xyl2 e 3xyl2, foi utilizado como sonda para detecção do mRNA

durante a hibridação.

Como mostrado na Figura 23, foram detectados transcritos em células

crescidas em glicerol e xilose, sendo que em xilose houve maior intensidade e em

glicose não houve detecção, mesmo contendo maior quantidade de RNA total. Esses

resultados sugerem que a expressão de XYL2 é adaptativa uma vez que xilose é

capaz de induzir a expressão em comparação a glicerol, já a falta de transcritos em

glicose pode ser um indicativo da repressão mediada por Mig1p, encontrada na

região promotora.

O mesmo padrão de expressão foi observado para XYL2 de H. jecorina

(SEIBOTH et al., 2003) e de A. adeninivorans (BÖER et al., 2005) além de outros

dois genes, xilose redutase e xilulose 5-fosfato quinase, envolvidos no metabolismo

de xilose em A. niger (HASPER et al., 2000 e van PEIJ et al., 1998).

Figura 23. Análise da expressão de XYL2 por Northern blotting em

diferentes fontes de carbono. 1: xilose, 2: glicose e 3: glicerol

utilizando XYL2 como sonda, RNA ribossômico 28s como controle

da quantidade de RNA total utilizada.

Os resultados obtidos relacionados ao gene XYL2, como a seqüência

completa obtida através da estratégia de PCR inverso, o número de cópias no

genoma, o padrão de expressão e alguns dados gerados a partir da seqüência

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 65

primária predita foram apresentados no XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia,

Santos – SP em novembro de 2005.

3.5. Análise da Proteína Predita

A partir da seqüência de nucleotídeos foi predita a seqüência primária da

proteína (

Figura 19), chamada de Xyl2, que permitiu diversas análises que

corroboraram sua atividade como xilitol desidrogenase. Estes resultados foram

gerados no Laboratório de Biofísica, sob orientação da Profa. Sonia Maria de Freitas

e com a participação do seu aluno Cristiano Guimarães do Amaral Pinheiro.

Inicialmente a seqüência foi alinhada com a seqüência de outras

desidrogenases, conforme apresentado na Figura 24. A proteína que apresentou

maior homologia foi a sorbitol desidrogenase humana - hSDH (EC 1.1.1.14) com

55% de homologia. A estrutura tridimensional desta enzima foi resolvida por

cristalografia de raios-X e o arquivo de coordenadas atômicas está depositado no

banco de dados do PDB com as seguintes denominações, PDB ID: 1PL6, 1PL7 e

1PL8. Esta enzima catalisa a oxidação do sorbitol a frutose usando NAD

como

coenzima (PAULY et al., 2003), semelhante a xilitol desidrogenase que catalisa a

oxidação do xilitol formando xilulose, utilizando a mesma coenzima. Nas

desidrogenases, como na proteína Xyl2, são encontrados aminoácidos conservados

que se ligam aos complexos NAD

/NADH ou NADP

/NADPH e outros que se ligam a

sítios de ligação a zinco. A enzima cetona redutase - KR (EC 1.1.1.184), uma álcool

desidrogenase de cadeia média – família MDR, que utiliza o NADP

, apresenta dois

sítios de ligação para o zinco (BANFIELD et al., 2001). Estes sítios estão

apresentados na Figura 24.

A maioria dos aminoácidos envolvidos no sítio de ligação da coenzima,

mostrados na Figura 24 com um asterisco, são conservados. Um destes resíduos é

fundamental para determinar a especificidade da enzima por NAD

(Asp) ou por

NADP

(Ala). O resíduo Asp

207

em Xyl2, equivalente ao Asp

203

na hSDH

(Figura 24), é conservado entre os membros da família MDR, faz uma ligação de

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 66

hidrogênio com o anel ribosídico do NAD

(Figura 28B). A cadeia lateral deste

aminoácido ocupa o espaço correspondente ao grupo fosfato que está ligado à

região 2´hidroxila do NAPDH

(Figura 28B). A presença deste aminoácido nesta

região estrutural é responsável por um potencial eletrostático negativo no sítio de

ligação ao NAD

(PAULY et al., 2003).

Figura 24. Alinhamento entre a seqüência da proteína Xyl2 e membros da família de cadeia

média que possui sítio de ligação a zinco. Os aminoácidos dentro do quadrado hachurado

representam a assinatura das álcool desidrogenases, os resíduos envolvidos do sítio catalítico

ligado a zinco são indicados por setas, O segundo sítio de ligação a zinco da 1E3J está

dentro de quadrado e os resíduos que estão envolvidos no sítio de ligação da coenzima são

indicados por asteriscos.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 67

A seqüência da Xyl2, conforme apresentado na Figura 24, apresenta a

assinatura [GHE]xx[G]xxxxx[G]xx[V] das álcool desidrogenase, o sítio de ligação para

o zinco (Cys

, His

, Glu

, e Glu

159

) e o sítio de ligação para o NAD

(Val

187

, Asp

207

Lys

212

, Cys

252

, Asn

277

e Ser

299

). Estas características estruturais foram consideradas

para a classificação da Xyl2 como um membro da família MDR.

Figura 25. Elementos estruturais encontrados na seqüência de Xyl2 e sua localização, segundo

análise no InterPro.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 68

Pela análise no InterPro (InterPro - Integrated Resource Of Protein Domains

seqüência de aminoácidos predita, foram identificadas as seguintes características

estruturais (Figura 25): sítio de ligação ao NAD com o padrão de dobramento do tipo

Rossmann fold, domínio de ligação ao zinco da família das álcool desidrogenase e o

domínio GroES-like. A presença destes domínios reforça os resultados obtidos pela

análise da seqüência a partir do alinhamento. A Xyl2 utiliza preferencialmente NAD

como cofator (TAKAMIZAWA et al., 2000) e é membro da família das enzimas do tipo

álcool desidrogenases. O domínio GroES-like é comumente encontrado na porção N-

terminal das proteínas desta família, que também apresentam um domínio com

padrão de dobramento do tipo Rossman-fold no C-terminal.

3.5.1 Participação de Zinco na Catálise

Geralmente, o meio de reação para medir a atividade de XDH não possui

zinco (TAKAMIZAWA, et al. 2000; ELIASSON et al. 2000; LIMA et al., 2004),

provavelmente porque este íon se complexa com a enzima mantendo-se ligado após

a extração. Diante deste fato, para comprovar a participação de zinco na reação de

catálise, realizou-se o ensaio enzimático com EDTA, um quelante de íons divalentes.

O efeito do EDTA foi acompanhado pela absorbância a 340nm que correspondente à

redução do NAD

(Figura 26A). Observa-se na Figura 26B que 1 mM de EDTA é

capaz de reduzir a atividade em ~90%, indicando sua competição pelo zinco

complexado com a enzima. O mesmo comportamento foi observado para XDH de G.

mastotermitis, uma enzima zinco dependente (LUNZER et al., 1998).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 69

0,5

1,5

012345

EDTA (mM)

Atividade de XDH (U/mg)

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00

tempo (min)

ABS

340nm

Figura 26. Efeito do EDTA na atividade de Xyl2. A: Acompanhamento da redução de NAD

(340 nm)

na ausência (círculos) ou na presença de EDTA 1mM (triângulos). B: Atividade de XDH em diferentes

concentrações de EDTA.

3.6. Modelagem de Xyl2

O modelo tridimensional de Xyl2, apresentado na Figura 27, foi obtido pelo

método de modelagem molecular por homologia, realizado pelo servidor EsyPred 3D.

A estrutura de Xyl2 possui 364 resíduos de aminoácidos organizados em um padrão

de dobramento do tipo α/β Rossmann fold, comumente encontrado em proteínas da

família MDR. Todas as enzimas desta família se ligam a NAD

ou NADP

, no mesmo

sítio e a maioria contém um íon de zinco ligado, o que é essencial para catálise. Na

Xyl2, o domínio de ligação à coenzima apresenta as características deste padrão α/β

Rossmann fold. O modelo consiste de dois motivos β-barril que correspondem aos

domínios catalítico (resíduos 1-162, 301-364) e ao domínio de ligação à coenzima

(resíduos 163-300), separados por uma fenda (Figura 27).

Os modelos de Xyl2 ligada a NAD

e ao íon zinco foram obtidos por

sobreposição de estruturas apresentando o NAD

ligado e estão apresentados na

Figura 28. Estes domínios apresentaram padrão estrutural bastante similar aos das

álcool desidrogenases relacionadas a família MDR. A análise dos alinhamentos

estruturais desses domínios, obtidos pelo VAST, confirmou a similaridade estrutural

dos modelos devido aos baixos valores de r.m.s.d (desvios de mínimos quadrados)

de 0.5-1.2 Å (NAD

) e 0.3-2.0 Å (zinco).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 70

Figura 27. Modelo tridimensional de Xyl2 gerado pelo programa Pymol.

A interação com NAD

em Xyl2 ocorre na superfície da fenda formada pelas

alças que saem do alto das seis folhas β, um domínio formado pelos resíduos 180 a

310 (Figura 28A e B). Os resíduos que fazem parte desta ligação são Val

187

, Asp

207

Lys

212

, Cys

252

, Asn

277

e Ser

299

. Entre as desidrogenases existem poucas diferenças

nos aminoácidos que formam o sítio de ligação à coenzima. O resíduo de ácido

aspártico, que determina a especificidade por NAD

nos membros da família MDR, é

conservado na Xyl2 na posição 207 (Fig. 3 e 5B). A especificidade de Xyl2 por NAD

foi anteriormente determinada por ensaios enzimáticos por SILVA et al. (1996) e

TAKAMIZAWA et al. (2000).

O domínio catalítico de Xyl2 apresenta um único sítio de ligação para o zinco

e apresenta um dobramento α/β semelhante ao das proteínas da família MDR. A

ligação ao íon de zinco ocorre na região próxima à fenda entre os dois domínios. Os

resíduos conservados que participam desta interação em hSDH são Cys

, His

Glu

, Glu

155

e uma molécula de água (PAULY et al., 2003). Na Xyl2 o íon de zinco

apresenta uma coordenação com os resíduos His

, Glu

, e Glu

159

. A molécula de

água que participa desta interação não foi evidenciada neste modelo, uma vez que

este modelo foi obtido após a minimização de energia sem a presença da água

(Figura 28C e D). Neste caso, a ponte de hidrogênio entre Glu

159

e o átomo de zinco

ocorre diretamente sem a participação da cisteína.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 71

Figura 28. Estrutura terciária predita dos domínios de ligação a NAD

e zinco. A: Domínio de ligação

ao NAD

com o sítio de ligação em cinza escuro, composto por motivos α e β em um padrão Rossman

fold; B: sítio de ligação à coenzima, destacando o resíduos que participam da interação Val

187

, Asp

207

Lys

212

, Cys

252

Asp

277

e Ser

299

; C: Domínio de ligação do sítio ativo representado pelo resíduos em

cinza escuro; D: sítio ativo ligado a zinco destacando os resíduos que participam da interação His

Glu

e Glu

159

As similaridades estruturais entre as proteínas da mesma família da Xyl2 e

entre os domínios que formam estas estruturas foram calculados pelo programa

VAST (GIBRAT et al., 1996). As principais semelhanças estruturais evidenciadas

pela sobreposição de modelos do C

e dos valores de r.m.s.d. estão apresentados

na Tabela 8. A maior similaridade estrutural foi observada com a hSDH/NAD

, com o

complexo hSDH/NADH/inibidor e com a KR, indicada pelos valores do r.m.s.d. de

0.6-0.8 Å. A menor similaridade foi observada para a ADH de Bacillus

stearothermophilus e para a ADH NAD

/substrato de Pseudomonas aeruginosa,

com

r.m.s.d. of 1.7 Å.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 72

Estes resultados também sugerem que o sitio de ligação a NAD

e o sítio de

ligação ao zinco mantém o arranjo tridimensional e as distâncias requeridas para

interação destes componentes. Baseado na similaridade estrutural destes modelos,

foi proposto que a Xyl2 é um membro da família MDR e, portanto, pode apresentar a

mesma função catalítica dos membros desta família.

Tabela 8. Identidade e semelhança estrutural da Xyl2 com outras enzimas desidrogenase.

4. Expressão de XYL1 e XYL2 em S. cerevisiae

Com a finalidade de verificar a funcionalidade dos genes XYL1 e XYL2 de C.

tropicalis, os mesmos foram clonados nos vetores de expressão YEp351PGK

(MORAES et al., 1995) e YEp352PGK (Figura 29) sob a regulação do promotor

PGK1. Os vetores YEp351PGK e YEp352PGK são derivados dos vetores

epissomais YEp351 e YEp352 (HILL et al., 1986) e possuem o cassete de expressão

PGK do vetor pMA99. A principal vantagem de vetores epissomais em relação ao

integrativo é o alto número de cópias (UGOLINI et al., 2002) e, no caso dos vetores

YEp351PGK e YEp352PGK, a presença do promotor PGK1 favorece a expressão

forte e constitutiva de genes heterólogos.

Os genes XYL1 e XYL2 foram obtidos da digestão de Topoxyl1 com Bgl II e

pGEMXyl2 com BamH I, respectivamente, e clonados nos plasmídios YEp351PGK e

Código

PDB

Proteínas

Identidade

(%)

Resíduos

Conservados (%)

RMSD

1PL8-D

hSDH/NAD+

(PAULY et al., 2003)

36 55 0.6

1PL6-D

hSDH/NADH/Inhibitor complex

(PAULY et al., 2003)

36 54 0.6

1E3J-A

KR (Bemisia Argentifolli)

(BANFIELD et al., 2001)

36 55 0.8

1RJW-B

ADH (Bacillus stearothermophilus)

(CECCARELLI et al., 2004)

27 43 1.7

1LLU-H

NAD+/substrate ADH

(Pseudomonas aeruginosa)

(LEVIN et al., 2004)

24 39 1.7

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 73

YEp352PGK linearizados com Bgl II, gerando os plasmídios YPGKxyl1 e Y2PGKxyl2.

A orientação correta no vetor YPGKxyl1 foi verificada por digestão com BamH I e

Nco I, enquanto no vetor Y2PGKxyl2 a orientação foi verificada por digestão com

EcoR V (dados não mostrados). A S. cerevisiae linhagem RE1006 foi transformada

com o vetor sem inserto (YEp352PGK), como controle, YPGKxyl1, Y2PGKxyl2 e com

ambos (YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2). Após a transformação, a presença do inserto foi

confirmada com reações de PCR utilizando os primers 5xyl1A e 3xyl1 para amplificar

XYL1 e os primers 5xyl2 e 3xyl2 para xyl2, os resultados estão apresentados na

Figura 30.

Figura 29. Mapa dos vetores YEp351PGK e YEp352PGK.

Figura 30. Reações de PCR para confirmação da clonagem de XYL1 (1-4) e XYL2 (6-9) em vetores

de expressão de S. cerevisiae analisadas em gel de agarose 1%.1 e 6: controle, 2 e 7: YEp352PGK,

3: YPGKxyl1, 4 e 9: YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2, 5: marcador 1 kb DNA ladder (Invitrogen), 8:

Y2PGKxyl2.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 74

Os clones selecionados, um de cada transformação, foram semeados em

placas com os seguintes meios seletivos: meio mínimo contendo xilose como fonte

de carbono e todos os aminoácidos requeridos pela linhagem, onde todos os clones

cresceram (dado não mostrado); meio mínimo sem uracila, onde cresceram os

clones contendo os vetores YEp352PGK, Y2PGKxyl2 e YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2;

meio mínimo sem leucina, onde cresceram os clones YPGKxyl1 e YPGKxyl1 +

Y2PGKxyl2; e meio mínimo sem uracila e sem leucina onde cresceu apenas o clone

YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2 (Figura 31). Todos os transformantes de S. cerevisiae foram

capazes de metabolizar xilose porque esta levedura, apesar de ser classificada como

organismo que não utiliza xilose, possui enzimas que possibilitam metabolizar este

açúcar (TOIVARI et al., 2004).

Figura 31. Clones transformantes de S. cerevisiae expressando os genes

XYL1 e XYL2. 1: Y2PGKxyl2, 2: YPGKxyl1, 3: YEp352PGK e 4: YPGKxyl1

+ Y2PGKxyl2 em A: meio mínimo sem leucina, B: meio mínimo sem

uracila, C: meio mínimo sem uracila e leucina).

As atividades de XR e XDH medidas para os clones contendo os vetores

YEp352PGK (controle), YPGKxyl1, Y2PGKxyl2 e YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2 estão

apresentadas na Tabela 9. Observou-se que como houve aumento da atividade

enzimática em relação ao controle, tanto de XR como de XDH, ocorreu a expressão

dos genes XYL1 e XYL2, apresentando valores de atividade para XR superior ao

encontrado para a própria C. tropicalis (0,173 U/mg), porém inferior para XDH (0,237

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 75

U/mg) (LIMA et al., 2004). A atividade de XDH pode ser comparada à atividade

encontrada em extrato bruto de P. tannophilus (0,140 U/mg) obtida por BOLEN et al.

(1986).

ELIASSON et al. (2000) expressando XYL1 e XYL2 de P. stipitis em S.

cerevisae obteve 0,52 U/mg para XR e 3,37 U/mg para XDH, porém o vetor utilizado

foi integrativo e XYL1 estava sob controle do promotor/terminador ADH1, enquanto

XYL2 estava sob o controle do promotor/terminador PGK1. Outra distinção foi a

fermentação, o meio de cultura continha glicose (10 g/L) e xilose (10 g/L) em

condições anaeróbicas e além disto o meio de reação para o cálculo de atividade era

diferente do utilizado neste trabalho. JEPPSON et al. (2003) utilizando esta mesma

linhagem de S. cerevisae (TMB3001) obteve 0,32 U/mg para XR e superexpressando

XYL1, a partir de uma construção que emprega o sistema Cre/loxp de recombinação,

alcançou 6,07 U/mg. Comparativamente, a atividade obtida para o clone

expressando XYL1 é cerca de 5 vezes maior, indicando que esta construção poderia

ser utilizada para produção de etanol sem a necessidade de superexpressão, pois os

vetores epissomais podem chegar a mais de 70 cópias por célula (UGOLINI et al.,

2002). Porém a construção de uma linhagem mais estável com um vetor integrativo

talvez fosse recomendável para estabelecer comparações.

Tabela 9. Atividade específica de xilose redutase (XR) e xilitol

desidrogenase (XDH) para os clones de Saccharomyces cerevisae:

YEp352PGK (controle); YPGKxyl1, Y2PGKxyl2 e YPGKxyl1 +

Y2PGKxyl2.

Atividade Específica

(U/mg de proteínas totais)

Vetor usado na

transformação

XR XDH

YEp352PGK 0,009 0,018

YPGKxyl1 1,519 n.d.

Y2PGKxyl2 n.d. 0,159

YPGKxyl1 + Y2PGKxyl2 0,772 0,068

n.d.: não determinado

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 76

5. Transformação de C. tropicalis

5.1. Marca de Seleção para o Sistema de Transformação

Inicialmente propôs-se utilizar o gene que confere resistência a higromicina B

(higromicina fosfotransferase) como marca de seleção para o sistema de

transformação, porém, com a constatação de que a levedura C. tropicalis traduz um

códon universal de leucina (CTG) como serina, esta possibilidade foi descartada,

pois este gene possui 8 códons CTG e 1026 pb.

Outra possibilidade seria a utilização de uma marca auxotrófica. Tentou-se

gerar mutantes ura3

seguido de seleção em 5-FOA, como utilizado por HAAS et al.

(1990). Porém nem tratamento com agente mutagênico EMS (etil-metano sulfonato),

nem exposição à radiação UV geraram mutantes ura3

, possivelmente pelo fato

desta levedura apresentar dois alelos do gene ura3 (HAAS et al., 1990), além de ser

diplóide (DOI et al., 1992), necessitando assim de pelo menos quatro eventos de

mutação.

Contudo, com a publicação de um trabalho descrevendo a transformação de

C. tropicalis utilizando um vetor com a marca de resistência a aureobasidina A (LEE

et al., 2003) decidiu-se optar por esta abordagem. Para atingir esse fim, foi obtido o

vetor PYC070 descrito por HANSEN et al. (2003) a partir do qual o gene AUR1-C

seria isolado por digestão com enzima de restrição para depois ser clonado

internamente na seqüência do gene XYL2, porém devido à indisponibilidade de

aureobasidina A esta estratégia também foi abandonada.

Assim sendo, considerou-se utilizar o gene de resistência a zeocina, gene ble

de S. hindustanus, que possui apenas cinco códons CTG e 374 pb. Estes códons

poderiam ser corrigidos por mutação sítio-dirigida em conjunto com estratégias de

recombinação e reparo em S. cerevisiae, porém optou-se por sintetizar todo o gene

substituindo os códons CTG por TTG, que é o preferencial para leucina em C.

tropicalis. Esta abordagem já foi utilizada por WANG et al. (2006) para estabelecer

um sistema de integração para a levedura Pichia farinosa.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 77

O gene sintético, ZeoCan, teve seu códon preferencial adequado a C.

tropicalis e o conteúdo de CG foi otimizado para 48%. Antes do códon de iniciação

ATG, foi adicionado um contexto Kozac (ATAA) de levedura para assegurar a

eficiente iniciação de tradução. Além disto, foram inseridos no início e no final da

seqüência sítios de BamH I, para facilitar a clonagem em vetores de expressão. Um

sítio para Nco I foi introduzido na porção 5´ do gene a fim de permitir a seleção de

clones com a orientação desejada no vetor de expressão. O gene ZeoCan foi

sintetizado de novo pela empresa Epoch Biolabs (Texas, EUA) e enviado clonado no

vetor pBlueScript SK (Stratagene). A seqüência do gene ZeoCan está apresentada

na Figura 32 e suas características são:

• Códon preferencial de C. tropicalis

• Identidade de 75,2% com a região codante original

• Modificação de 5 codons de leucina para TTG

• Remoção de um sítio de Sma I original

• Introdução de um sítio de Nco I na posição 103 que permite verificar a

orientação da clonagem

• Sítios de BamH I nas extremidades 5´ e 3´

• Redução do conteúdo de G+C de 70% para 48%

• Introdução de um contexto Kozak de levedura perto do ATG

M A K L T S A V P V L T A R D V A G A V E F W T D R L

CGGATCCATAATGGCTAAGTTGACCTCCGCTGTTCCAGTTTTGACCGCTAGAGACGTTGCTGGTGCTGTTGAATTTTGGACCGACAGATTG 91

BamHI

G F S R D F V E D D F A G V V R D D V T L F I S A V Q D Q V

GGTTTCTCCAGAGACTTCGTTGAAGACGACTTCGCTGGTGTTGTTAGAGACGACGTTACCTTGTTCATTTCCGCTGTTCAAGACCAAGTT 181

V P D N T L A W V W V R G L D E L Y A E W S E V V S T N F R

GTTCCAGACAACACCTTGGCTTGGGTTTGGGTTAGAGGTTTGGACGAATTGTACGCTGAATGGTCCGAAGTTGTTTCCACCAACTTCAGA 271

D A S G P A M T E I G E Q P W G R E F A L R D P A G N C V H

GACGCTTCCGGTCCAGCTATGACCGAAATTGGTGAACAACCATGGGGTAGAGAATTTGCTTTGAGAGACCCAGCTGGTAACTGTGTTCAC 361

NcoI

F V A E E Q D -

TTCGTTGCTGAAGAACAAGACTGAGGATCCG 392

BamHI

Figura 32. Seqüência do gene ZeoCan sintetizado de novo, ressaltando os sítios de BamH I e Nco I

(em negrito) e a localização dos códons CTG substituídos por TTG (sublinhado).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 78

Para o estabelecimento da concentração ideal de antibiótico para a seleção de

transformantes, as leveduras C. tropicalis, C. guilliermondii, Candida maltosa e P.

stipitis foram plaqueadas em meio YM (pH 7,5) contendo zeocina em diferentes

concentrações de 100, 200, 300, 400 e 500 µg/mL. Foi observado que este

antibiótico é letal para C. tropicalis em concentrações acima de 300 µg/mL e para C.

guilliermondii acima de 200 µg/mL (Tabela 10). Porém como observado por TANG et

al. (2003) para C. rugosa e MOORE (1982) para S. cerevisiae, a densidade celular

interfere na efetividade deste antibiótico. Variando a quantidade de células

inoculadas, observou-se que tanto para C. guilliermondii, como para C. tropicalis a

densidade celular ideal é de 1,0 10

celulas/mL, uma vez que nenhuma colônia foi

obtida após 72 h de incubação a 30°C, nas concentrações de zeocina mencionadas

anteriormente.

Tabela 10. Avaliação da concentração letal de zeocina em meio YM (pH 7.5) a 30°C para

diferentes leveduras.

Tempo (h)

Levedura

[zeocina]

(µg/mL)

24 48 72

100 + ++ ++

200 - + +

300 - - -

400 - - -

C. tropicalis

500 - - -

100 - - +

200 - - -

C. guilliermondii

300 - - -

100 + + ++

200 + + ++

C. maltosa

300 - + +

100 - + +

200 - + +

P. stipits

300 - - +

Crescimento celular: - nenhuma colônia, +: menos de 20 colônias, ++: mais de 20 colônias observadas.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 79

5.2. Construção dos cassetes para transformação

5.2.1. Cassete da Marca de Seleção

A fim de possibilitar a identificação de eventos de integração de múltiplas

cópias em meio de cultura contendo concentrações crescentes de zeocina, escolheu-

se um promotor fraco para regular a expressão do gene ZeoCan. A região promotora

escolhida foi a do gene ACT1 (actina) de Candida albicans, um promotor fraco e

constitutivo, e a região terminadora de transcrição do gene CYC1 (Citocromo C) de

S. cerevisiae, constantes no plasmídio ClpACT-CYC (BLACKWELL et al., 2003)

cedido pelo Dr. Jeremy D. Brown (University of Newcastle) (Figura 33).

Figura 33. Mapa do plasmídio ClpACT-CYC.

Para a amplificação das regiões promotora e terminadora de transcrição e

para facilitar a construção de um novo cassete de expressão foram utilizados os

primers 5PROACT e 3PROACT, contendo sítios de BamH I e Hind III nas

extremidades e de Bcl I entre a região promotora e terminadora. O amplicom obtido

da reação de PCR utilizando Vent

DNA Polimerase apresentou o tamanho

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 80

esperado conforme apresentado na Figura 34 e foi clonado no vetor pGEM

-T Easy

(Promega).

Após a transformação em E. coli DH5α, os clones positivos foram

selecionados por digestão com a enzima EcoR I. Observou-se que quando o

plasmídio fora digerido com as enzimas que possuíam sítio dentro da seqüência dos

primers, BamH I e Hind III não houve a liberação do inserto. Mesmo quando o

plasmídio com o inserto foi utilizado para transformar E. coli JM110, os padrões de

digestão com BamH I e Hind III correspondiam a linearização, enquanto a digestão

utilizando Bcl I liberava um fragmento mesmo não havendo sítios no vetor. O

seqüenciamento revelou que o fragmento amplificado e clonado tratava-se do gene

URA3 de C. albicans, possivelmente pelo anelamento de um dos primers nesta

região do plasmídio ClpACT-CYC.

Figura 34. Reação de PCR utilizando os primers 5PROACT

e 3PROACT analisada em gel de agarose 1%. 1: ClpACT-

CYC como molde e 2: 1 kb DNA ladder (New England

Biolabs).

Diante deste fato, optou-se por utilizar como molde para reação de PCR

apenas a região promotora (ACT1p), obtida da digestão do plasmídio ClpACT-CYC

com as enzimas Xho I e Cla I. O produto amplificado utilizando os primers 5PROACT

e 3PROACT foi clonado no vetor pGEM

-T Easy (Promega), confirmada a clonagem

com a digestão com EcoR I, porém a liberação do fragmento com BamH I não foi

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 81

obtida, apenas a linearização. Supondo que o problema no sítio de BamH I estava no

primer 3PROACT por ser muito grande (112 mer) e possivelmente por ter havido

algum problema durante sua síntese, foi utilizado o primer 3CYCTT junto com o

5PROACT para reamplificar a região promotora e terminadora em uma reação de

PCR com o plasmídio como molde. O amplicom obtido foi clonado no vetor pGEM

-T

Easy (Promega).

Confirmada a clonagem com EcoR I, o fragmento foi obtido pela

digestão com BamH I. Depois de passar pela linhagem de E. coli JM 110, o

plasmídio foi linearizado com Bcl I. A cepa JM110 tem a mutação dam e, portanto,

não metila o sítio de restrição para Bcl I. Esta etapa foi necessária uma vez que a

enzima Bcl I é sensível a metilação em seu sítio (metilação dam). O resultado do

seqüenciamento do plasmídio PGEMPROACT demonstrou que se tratava da região

promotora do gene da actina de C. albicans e a região terminadora do gene do

citocromo c de S. cerevisiae. Esta estratégia está apresentada na Figura 35.

Figura 35. Estratégia para clonagem das regiões promotora (ACT1p) e terminadora (CYC1t) do vetor

ClpACT-CYC para a construção de um novo cassete de expressão. Etapa 1: reação de PCR

utilizando como molde a banda referente à região promotora obtida pela digestão do plasmídio

ClpACT-CYC com as enzimas Xho I e Cla I e os primers 5PROACT e 3PROACT, etapa 2: clonagem

do produto de PCR no vetor pGEM

-T Easy, etapa 3: reação de PCR utilizando o plasmídio contendo

as regiões ACT1p e CYC1t como molde e os primers 5PROACT e 3CYCTT.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 82

Figura 36. Esquema da construção do cassete de expressão do gene ZeoCan o qual foi

clonado no sítio de Bcl I entre a região promotora ACT1p e terminadora CYC1t.

Na construção do cassete da marca de seleção, o gene ZeoCan obtido da

digestão do plasmídio com BamH I foi clonado no sítio de Bcl I do plasmídio

contendo as regiões promotora e terminadora da transcrição, gerando o plasmídio

pPZeo (Figura 36). Para seleção dos clones utilizou-se digestão com BamH I que

deveria liberar um fragmento de ~1500 pb (região promotora: 1024 pb, ZeoCan:

392 pb, região terminadora: 80 pb), conforme a Figura 37.

Para selecionar os clones com o gene ZeoCan clonado na orientação correta

entre as regiões promotora e terminadora da transcrição, realizou-se uma reação de

PCR com a combinação de primers 5PROACT/3Zeo que deveria amplificar, caso a

orientação estivesse correta e a combinação 5PROACT/5Zeo que amplificaria se o

gene estivesse na orientação invertida (Figura 38). O clone selecionado foi digerido

com a enzima Nco I que por apresentar sítios na seqüência de ZeoCan e no vetor

liberou um fragmento de ~190 pb (dados não mostrados).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 83

Figura 37. Digestão do plasmídio contendo o cassete da marca de

seleção analisada em gel de agarose 1%. 2-8/10-13: plasmídios pPZeo

de diferentes clones digeridos com BamH I e 1/9: 1 kb DNA ladder (New

England Biolabs).

Figura 38. Reações de PCR para selecionar os clones com plasmídio

pPZeo na orientação correta analisadas em gel de agarose 1%.1/5: 1 kb

DNA ladder (New England Biolabs), 2-4: reações com os primers

5PROACT e 5Zeo, 6-8: reações com os primers 5PROACT/3Zeo.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 84

5.2.2. Cassete para Ruptura Gênica de XYL2

5.2.2.1. Marca Dominante

Figura 39. Esquema da contrução do cassete de ruptura de XYL2 (pPZeoXYL2) a partir da obtenção

do cassete da marca de seleção pela digestão do plasmídio pPZeo com BamH I e posterior clonagem

no sítio interno de Bcl I do gene XYL2.

A fim de construir o cassete de ruptura gênica para o gene XYL2, o plasmídio

pGEMXyl2, que contém o gene XYL2 clonado, foi linearizado com Bcl I. O cassete da

marca de seleção foi retirado com BamH I e então clonado dentro da seqüência de

XYL2 originando o plasmídio pPZeoXyl2 (Figura 39). Selecionou-se os clones que

continham a seqüência pela digestão com BamH I, liberando o fragmento de ~2600

bp (dados não mostrados). O clone selecionado foi confirmado com digestão com

Nco I, que por possuir sítios na seqüência de XYL2, de ZeoCan e no vetor deveria

liberar fragmentos de 1990 pb e 550 pb, conforme esquema apresentado na

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 85

Figura 40 e resultados na Figura 41. Além disto para confirmar a clonagem e a

orientação correta foram utilizadas 5 combinações de primers que se anelavam em

diferentes regiões do cassete (Figura 40). Conforme a Figura 41, todas as

combinações amplificaram produtos nos tamanhos esperados, a saber: 5xyl2/3xyl2 -

2594 pb, 5xyl2/3CYCTT - 2202 pb, 5xyl2/3Zeo - 2130 pb, 5PROACT/3xyl2 - 1874 pb,

5Zeo/3xyl2 - 854pb.

Figura 40. Esquema mostrando os sítios de Nco I e a combinação de primers utilizados para

confirmar a clonagem e a orientação do cassete da marca de seleção na seqüência de XYL2.

Figura 41. Análise da digestão e de reações de PCR para confirmar a

clonagem correta do plasmídio pPZeoXyl2 em gel de agarose 1%. 1:

digestão com Nco I, 2: 1 kb DNA ladder (New England Biolabs), 3-7:

reações com os primers 5Zeo/3xyl2, 5PROACT/3xyl2, 5xyl2/3Zeo,

5xyl2/3CYCTT e 5xyl2/3xyl2, respectivamente.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 86

5.2.2.2. Marca Auxotrófica

Na tentativa de transformar C. tropicalis utilizando a marca auxotrófica URA3,

foi construído o vetor ClpXyl2, clonando-se no sítio de BamH I do vetor ClpACT-CYC

(Figura 33) o gene XYL2 obtido da digestão com BamH I do vetor pGEMXyl2. A

clonagem foi confirmada a partir da digestão BamH I liberando-se um fragmento

~1100pb (Figura 42). O plasmídio foi linearizado (Figura 42) com EcoR V, sítio

presente na seqüência de XYL2, estando assim o cassete pronto para transformação

de C. tropicalis e rompimento de XYL2.

Figura 42. Análise de digestões para confirmar a

clonagem do plasmídio ClpXyl2 em gel de agarose

1%.1: plasmídio intacto, 2: digestão com EcoR V, 3:

digestão com BamH I, 4: 1 kb DNA ladder (Promega).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 87

5.2.3. Cassete para Múltiplas Integrações da Marca de Seleção

Figura 43. Esquema da construção do cassete de múltiplas integrações da

marca de seleção a partir da clonagem do cassete de expressão de ZeoCan

dentro da seqüência ITS do rDNA.

A construção do cassete de múltiplas integrações baseou-se na estratégia de

utilização do cluster de rDNA que compreende os genes que codificam os rRNAs.

Estes clusters são arranjados repetidamente in tandem de idênticas unidades. O

número e o tamanho destes rDNA repetidos podem variar de acordo com a espécie

(MALESKA e CLARK-WALKER, 1993), C. tropicalis apresenta 80 cópias de 10,7 kb

(BLANDIN et al., 2000). Esta estratégia já foi utilizada para transformação de

diferentes leveduras, como S. cerevisiae (LOPES et al., 1989), C. utilis (KONDO et

al., 1995),

Pichia ciferrii (BAE et al., 2003) e Hansenula polymorpha (LIU et al., 2005).

Para a transformação de C. tropicalis foi utilizada a seqüência ITS do rDNA

(Figura 5), amplificada por PCR utilizando os primers ITS1Bam e ITS4Bam. Estes

primers possuem na suas extremidades sítios de BamH I utilizados para liberar o

cassete de integração. O produto de ~540 pb foi clonado no vetor pGEM®-T

(Promega) e a clonagem foi confirmada pela digestão com BamH I. O plasmídio

resultante foi linearizado com digestão com Sma I (posição 341), e a ele foi

adicionado um linker de Bgl II. Este sítio foi utilizado para clonar o cassete da marca

de seleção, obtido pela digestão do plasmídio pPZeo com BamH I, gerando o

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 88

plasmídio pITSpZeo (Figura 43). Confirmou-se a clonagem pela digestão com BamH

I e por reações de PCR com os primers ITS1/ITS4, 5PROACT/3zeo, 5zeo/3CYCTT,

gerando os fragmentos de tamanhos esperados: 2028 pb (ITS: 532 pb, pZeo: 1496

pb), 1416 pb e 472 pb (Figura 44).

Figura 44. Análise de digestão e reações de PCR para confirmar

a clonagem correta do plasmídio pITSpZeo em gel de agarose

1%. 1: digestão com BamH I, 2: 1 kb DNA ladder (Promega), 3-

5: reações com os primers ITS1/ITS4, 5PROACT/3zeo,

5zeo/3CYCTT, respectivamente.

5.2.4. Cassete para Super Expressão de XYL1

Com a intenção de expressar o gene XYL1 em múltiplas-cópias em

C. tropicalis, construiu-se um cassete de expressão com as regiões promotoras e

terminadoras de transcrição do gene PGK1 a fim de garantir altos níveis de

expressão. O gene PGK1 codifica para a enzima 3-fosfoglicerato quinase da via

glicolítica que é expressa constitutivamente em altos níveis. A seqüência promotora

deste gene é largamente empregada em construções genéticas para diversos

microrganismos, inclusive para C. maltosa (MASUDA et al., 1994).

A fim de amplificar as regiões promotora e terminadora de transcrição foram

desenhados primers a partir da seqüência do gene PGK1 de C. maltosa, conforme

esquema apresentado na Figura 45. Os primers PPGK e TPGK amplificam a região

promotora, a porção codante e a região terminadora. Após a clonagem do produto de

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 89

PPGK e TPGK em um vetor, a amplificação com P2PGK e T2PGK retira a porção

codante.

Figura 45. Esquema mostrando as posições relativas de anelamento dos primers utilizados

para amplificação do gene PGK.

As reações de PCR utilizando como molde DNA de

C. maltosa apresentaram produtos com o tamanho aproximado, a saber:

PPGK/TPGK – 2265 pb, PPGK/P2PGK – 740 pb, conforme Figura 46. O amplicon

obtido com o conjunto de primers PPGK/TPGK a partir do DNA de C. maltosa foi

clonado no vetor pGEM®-T Easy

(Promega), o clone positivo (pGEMPGK) foi

escolhido digerindo-se com EcoR I. Para a clonagem do gene XYL1 entre as regiões

promotora e terminadora de transcrição realizou-se uma amplificação com Vent

DNA Polimerase utilizando os primers P2PGK/T2PGK, com a finalidade de eliminar a

região codante do gene PGK1, o que resultou em um amplicom com cerca de 4 kb

(Figura 47).

Figura 46. Reações de amplificação de regiões do gene

PGK1 analisadas em gel de agarose 1%. DNA molde de

C. maltosa 1: PPGK/TPGK, 2: PPGK/P2PGK e de C.

tropicalis 3: PPGK/TPGK, 4: PPGK/P2PGK e 5: marcador

λ EcoR I/Hind III.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 90

Figura 47. Reação de PCR confirmando a clonagem do plasmídio pGEM-T

EasyPGK analisadas em gel de agarose 1%. 1: marcador λ EcoR I/Hind III e

2: amplificação utilizando os primers P2PGK/T2PGK e pGEM-T EasyPGK

como molde.

Figura 48. Esquema da obtenção do plasmídio contendo as regiões promotora e

terminadora do gene PGK1 de C. maltosa. O plasmídio contendo o gene PGK1

foi utilizado como molde em uma reação de PCR com os primers P2PGK e

T2PGK, o amplicom obtido foi religado originando o plasmídio pGEMpPGK.

O produto de PCR utilizando pGEM-T EasyPGK como molde foi religado e

utilizado na transformação de E. coli DH5α, conforme mostrado na Figura 48. Os

plasmídios (pGEMpPGK) foram analisados digerindo-os com EcoR I liberando o

inserto e com Bgl II, sítio presente nos primers P2PGK e T2PGK, além de reações de

PCR utilizando os primers PPGK e TPGK e os plasmídios pGEMPGK – com o gene

PGK e pGEMpPGK – sem a região codante do gene PGK. O resultado da

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 91

amplificação (Figura 49) confirma que o gene PGK foi excluído do plasmídio, pois a

amplificação utilizando pGEMPGK como molde apresenta um produto de cerca de

2300 pb, que corresponde a 744 pb da região promotora, 293 da região terminadora

e 1227 da região codante, enquanto com pGEMpPGK foi obtido um produto de

~1000 pb, que corresponde as regiões promotora e terminadora.

Figura 49. Reações de PCR utilizando os primers PPGK/TPGK

analisadas em gel de agarose 1%.1: pGEMpPGK como molde,

2: 1 kb DNA ladder (Promega) e 3: pGEMPGK como molde.

Para clonagem do gene XYL1 entre as regiões promotora e terminadora de

transcrição os plasmídios pGEMpPGK e Topoxyl1 foram digeridos com Bgl II para

linearização do vetor e liberação do gene XYL1 com extremidades coesivas. Após a

ligação, realizou-se a transformação de E. coli DH5α e os clones foram selecionados

por PCR de colônia utilizando os primers 5xyl1A e 3xyl1. Após a seleção fez-se

minipreparações dos plasmídios (pPGKxyl1) que apresentavam inserto. O esquema

da clonagem está apresentado na Figura 50. Para confirmar a orientação correta

realizaram-se digestões com a enzima Nco I, onde foi obtido um fragmento de cerca

de 1700 pb e reações de PCR com os primers PPGK e 3xyl1 utilizando os plasmídios

selecionados pela digestão anterior. Como pode ser observado na Figura 51, obteve-

se um produto de cerca de 1700 pb, que corresponde a 744 pb da região promotora

e 978pb da região codante, confirmando que a clonagem foi realizada no sentido

correto.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 92

Figura 50. Esquema mostrando a clonagem de XYL1 entre as

regiões promotora e terminadora do gene PGK1 para

obtenção do plasmídio pPGKxyl1.

Figura 51. Reação de PCR utilizando os

primers PPGK/3xyl1 analisada em gel de

agarose 1%. 1: 1 kb DNA ladder (Promega), 2:

pPGKxyl1 como molde.

O vetor de expressão contaria ainda com seqüências de rDNA já clonadas a

fim de propiciar múltiplos eventos de integração no genoma de C. tropicalis, além da

marca de seleção ZeoCan, porém como o antibiótico zeocina havia se mostrado

ineficaz na seleção, a construção foi interrompida.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 93

6. Transformação Genética de C. tropicalis

Os protocolos de transformação empregados para a transformação de C.

tropicalis foram o de eletroporação e por formação de esferoplastos. Para a

eletroporação foi utilizada a metodologia descrita por TANG et al. (2003) para C.

rugosa e para formação de esferoplastos o descrito por HAAS et al. (1990). Os

cassetes utilizados foram o de ruptura de XYL2 e o de múltiplas integrações da

marca de seleção ZeoCan.

Após a transformação, foram obtidos diversos clones que, quando analisados

por PCR de colônia, não mostraram ser transformantes autênticos, mas

possivelmente, mutantes gerados pela presença de zeocina que é genotóxica. A

reação de PCR mostrou que nem houve integração no locus de XYL2 (utilizando os

primers 5xyl2 e 3xyl3) nem na região ITS (utilizando os primers ITS1 e ITS4).

Também não foi detectada a presença do gene ZeoCan utilizando os primers 5Zeo e

3Zeo. Estes resultados indicam que, possivelmente, as leveduras do gênero Candida

possuem mecanismos para anular os efeitos da zeocina.

Zeocina ou bleomicina é um antibiótico que apresenta propriedades

genotóxicas, uma vez que a molécula de zeocina, quando ligada a ferro (Fe II) na

forma reduzida e na presença de oxigênio, forma um complexo reativo como radical

livre que pode atacar diversas macromoléculas na célula, incluindo DNA e RNA. No

DNA as lesões incluem oxidação de sítios apurínico/apirimidínico e quebras em fita

simples, onde a extremidade 3’ forma 3’-fosfoglicolato que efetivamente bloqueia a

síntese de DNA (AOUIDA et al., 2004). Além destes efeitos, a zeocina também

aumenta a fragilidade da parede celular, facilitando a formação de esferoplastos e

aumentando a susceptibilidade da célula a peróxidos e radiação ionizante

(GRAYBILL et al.,1996).

GRAYBILL et al. (1996) estudando a efetividade da terapia de zeocina em

ratos com candidíase, verificou que mesmo a C. albicans mostrando-se susceptível

in vitro a este antibiótico, in vivo não mostrou a mesma efetividade. Em S. cerevisiae

foram caracterizados diversos mecanismos de proteção a zeocina: AOUIDA et al.,

(2004) propôs uma via de transporte e detoxificação, onde o antibiótico é

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 94

internalizado por um transportador de membrana e seqüestrado no interior do

vacúolo; MASSON e RAMOTAR (1996) propuseram que o gene IMP2 previne danos

oxidativos pela regulação da expressão de genes que são requeridos para o reparo

de DNA; XU e JOHNSTON (1994) e ZHENG e JOHNSTON (1998) identificaram e

caracterizaram a enzima bleomicina hidrolase capaz de inativar este antibiótico.

Podem-se citar como formas de proteção à zeocina: alteração do seu

transporte, aumento do reparo das lesões induzidas no DNA e inativação do

antibiótico (RAMOTAR e WANG, 2003), desta forma para utilização da marca de

resistência a zeocina em um sistema de transformação para C. tropicalis, deve-se

estudar detalhadamente a efetividade deste antibiótico para esta levedura.

Uma opção de marca dominante que poderá ser utilizada para

estabelecimento do sistema de transformação é o gene de resistência a higromicina

B, como já utilizado para transformação de C. tropicalis por HARA et al. (2000).

Outras marcas alternativas à zeocina podem ser resistência a MPA (ácido

micofenólico) dada pela mutação do gene IMH3 que codifica a enzima inosina-

monofosfato desidrogenase (BECKERMAN et al., 2001) ou resistência a

nourseothricin utilizando o gene nat1 de Streptomyces noursei que codifica

nourseothricin acetiltransferase, porém com os códons CUG modificados (SHEN et

al., 2005).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 95

CONCLUSÕES

• A levedura C. guilliermondii FTI 20037 apresenta maior identidade das regiões

ITS e 5’LSU do DNA ribossomal e do gene XYL1 com as de C. tropicalis em

comparação a C. guilliermondii, o que permite sua reclassificação como C.

tropicalis.

• O gene XYL1 foi clonado e apresentou 98% de identidade com a seqüência

de xilose redutase I,II de C. tropicalis, com apenas 11 divergências entre as

seqüências. A partir do alinhamento da seqüência de aminoácidos predita com

a de XR de Candida tenuis, foram identificados os resíduos envolvidos no sítio

catalítico, no sítio de ligação à NADPH e os que participam da formação de

dímero.

• O gene XYL2 foi isolado, apresentando uma fase aberta de leitura de 1092 pb,

que potencialmente codifica um polipeptídeo de 364 resíduos de aminoácidos,

com aproximadamente 40 Kda. Este gene não possui íntrons, se apresenta

em única cópia no genoma de C. tropicalis e é controlado em nível

transcricional pela presença de xilose. A seqüência primária da ORF XYL2 é

idêntica à publicada no projeto genoma de C. tropicalis

• A proteína Xyl2 pertence à família MDR contendo sítios para ligação a zinco e

NAD

• Os genes XYL1 e XYL2 foram expressos com sucesso em S. cerevisiae.

•

Foi construído o gene ZeoCan que potencialmente confere resistência a

zeocina e possui codon preferencial de C. tropicalis.

•

A resistência ao antibiótico zeocina não é indicada como marca de seleção em

vetores de transformação para C. tropicalis, uma vez que esta levedura deve

possuir mecanismos para anular o efeito do antibiótico.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 96

PERSPECTIVAS

• Testar possíveis marcas de seleção a fim de estabelecer um sistema de

transformação para C. tropicalis.

• Expressão de XYL2 em E. coli para purificação e cristalização da proteína

com a finalidade de determinar sua estrutura por cristalografia de raios-X

(trabalho em andamento).

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 97

REFERÊNCIAS

Aguiar CL, Oetterer M, Menezes TJB. 1999. Caracterização e aplicações do xilitol na

indústria alimentícia. Boletim SBCTA 33(2): 184-193

Alanen P, Isokangas P, Gutmann K. 2000. Xylitol candies in caries prevention: results

of a field study in Estonian children. Community Dentistry and Oral Epidemiology

28(3): 218-224

Amore R, Wilhelm M, Hollenberg CP. 1989. The fermentation of xylose - an analysis

of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast.

Applied Microbiology and Biotechnology 30:351–357

Amore R, Kötter P, Küster C, Ciriacy M, Cornelis PH. 1991. Cloning and expression

in Saccharomyces Cerevisiae of NAD(P)H-dependent Xylose Reductase enconding

gene (xyl1) form the xylose-assimilating yeast Pichia stipitis. Gene 109: 89-87

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment

search tool. Journal of Molecular Biology 215(3):403-10

Anderlund M, Radström P, Hahn-Hägerdal B. 2001. Expression of bifunctional

enzymes with xylose reductase and xylitol dehydrogenase activity in Saccharomyces

cerevisiae alters product formation during xylose fermentation. Metabolic Engineering

3: 226-235

Aouida M, Leduc A, Wang H, Ramotar D. 2004. Characterization of a transport and

detoxification pathway for the antitumour drug bleomycin in Saccharomyces

cerevisiae. The Biochemical Journal 384: 47-58

Autio JT. 2002. Effect of xylitol chewing gum on salivary Streptococcus mutans in

preschool children. ASDC Journal of Dentistry for Children 69(1): 81-86

Azevedo MO, Felipe MSS, Brigido MM, Maranhão AQ, Souza MT. 2003. Técnicas

Básicas em Biologia Molecular. Brasília: Editora Universidade de Brasília.

Bae JH, Sohn JH, Park CS, Rhee JS, Choi ES. 2003. Integrative transformation

system for the metabolic engineering of the sphingoid base-producing yeast Pichia

ciferrii. Applied and Environmental Microbiology 69(2): 812-9

Bailey JE. 1991. Toward a science of metabolic engineering. Science 252(5013):

1668-75

Blandin G, Ozier-Kalogeropoulos O, Wincker P, Artiguenave F, Dujon B. 2000.

Genomic exploration of the hemiascomycetous yeasts: 16. Candida tropicalis.

FEBS Letters 487(1):91-4

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 98

Banfield MJ, Salvucci ME, Baker EN. 2001. Crystal structure of the NADP(H)

dependent ketose reductase from Bemisia argentifolii at 2.3 Å resolution. Journal of

Molecular Biology 306: 239-250.

Bär A. 1991. Xylitol in: Nabors LB, Gelardi, RC Alternative Sweeteners. 2 Ed. New

York: Marcel Dekker, ISBN: 0824704371

Barbosa MFS, Medeiros MB, Mancilha IM, Schneider H, Lee H. 1988. Screening of

yeasts for production of xylitol from D-xylose and some factors which affect xylitol

yield in Candida guilliermondii. Journal of Industrial Microbiology 3: 241-251

Baron M, Reynes JP, Stassi D, Tiraby G. 1992. A selectable bifunctional β-

galactosidase: phleomycinresistance fusion protein as a potential marker for

eukaryotic cells. Gene 114: 239-243

Beckerman J, Chibana H, Turner J, Magee PT. 2001. Single-copy IMH3 allele is

sufficient to confer resistance to mycophenolic acid in Candida albicans and to

mediate transformation of clinical Candida species. Infectio and Immunity 69(1): 108-

Billard P, Menart S, Fleer R, Fukuhara MB. 1995. Isolation and characterization of the

gene encoding xylose reductase from Kluyveromyces lactis. Gene 162: 93-97

Birnboin HC, Doly J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening

recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523

Birkhed D. 1994. Cariologic aspects of xylitol and its use in chewing gum: A Review.

Acta Odontologica Scandinavica 52(2): 116-127

Blackwell C, Russell CL, Argimon S, Brown AJ, Brown JD. 2003. Protein A-tagging

for purification of native macromolecular complexes from Candida albicans. Yeast

20(15): 1235-1241

Blandin G, Ozier-Kalogeropoulos O, Wincker P, Artiguenave F, Dujon B. 2000.

Genomic exploration of the hemiascomycetous yeasts: 16. Candida tropicalis.

FEBS Letters 487(1): 91-4

Böer E, Wartmann T, Schmidt S., Bode R., Gellissen G, Kunze G. 2005.

Characterization of the AXDH gene and the encoded xylitol dehydrogenase from the

dimorphic yeast Arxula adeninivorans. Antonie van Leeuwenhoek 87:233–243

Bolak Co. Ltd. [Online] Disponível na Internet via WWW. Url:

http://www.bolak.co.kr/english/ps_xilitol_e.htm. Arquivo capturado em 06 de fevereiro

de 2006

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 99

Bolen PL, Hayman GT, Shepherd HS.1996. Sequence and analysis of an aldose

(xylose) reductase gene from the xylose-fermenting yeast Pachysolen tannophilus.

Yeast 12(13): 1367-75

Bolen PL, Roth KA, Freer SN.1986. Affinity Purifications of Aldose Reductase and

Xylitol Dehydrogenase from the Xylose-Fermenting Yeast Pachysolen tannophilus.

Applied and Environmental Microbiology 52(4): 660-664

Boles E, Hollenberg CP. 1997. The molecular genetics of hexose transport in yeasts.

FEMS Microbiology Review 21: 85-111

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle for protein-dye binding. Analytical

Biochemistry 72:248-254

Bruinenberg PM, de Bot PH, van Dijken JP, Scheffers SA. 1984. NADH-linked aldose

reductase: the key to anaerobic alcoholic fermentation of xylose by yeasts. Applied

Microbiology and Biotechnology 19(4): 256-260

Calmels T, Parriche M, Burand H, Tiraby G. 1991. High efficiency transformation of

Tolypocladium geodes conidiospores to phleomycin resistance. Current Genetic 20:

309-314

Cayle T, Roland J, Mehnert D, Dinwoodie R, Larson R, Mathers J, Raines M, Alm W,

Ma’ayeh S, Kiang S, Saunders R. 1986. Production of L-ascorbic acid from whey, In:

Harlander SK, Labuza TP Biotechnology in Food Processing, New Jersey: Noyes

Publication, 157 – 169

CCC - Calorie Control Council. Reduced-Calorie Sweeteners: Xylitol. [Online]

Disponível na Internet via WWW. Url: http://www.caloriecontrol.org/xylitol.html.

Arquivo capturado em 05 de fevereiro de 2006

Ceccarelli C, Liang ZX, Strickler M, Prehna G, Goldstein BM, Klinman JP, Bahnson

BJ. 2004. Crystal structure and amide H/D exchange of binary complexes of alcohol

dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus: insight into thermostability and

cofactor binding. Biochemistry 11:5266-5277

Chiang C, Knight SS. 1960. Metabolism of D-Xylose by moulds. Nature 188(4744):

78-81

Cho JY, Jeffries TW. 1998. Pichia stipitis genes for alcohol dehydrogenase with

fermentative and respiratory functions. Applied and Environmental Microbiology 64:

1350-1358

Collaborative computational project, number 4. 1994. The CCP4 Suite: Programs of

Protein Crystallography. Acta Crystallographica D50: 760-763.

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 100

Craft DL, Madduri KM, Eshoo M, Wilson CR. 2003. Identification and characterization

of the CYP52 family of Candida tropicalis ATCC 20336, important for the conversion

of fatty acids and alkanes to alpha, omega-dicarboxylic acids. Applied and

Environmental Microbiology 69: 5983-5891

Czajka MC, Lee RE Jr. 1990. A rapid cold-hardening response protecting against cold

shock injury in Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology 148,

245–254

Dahiya JS. 1991. Xylitol production by Petromyces albertensis grown medium

containing d-xylose. Canadian Journal of Microbiology 37: 14-18

Danisco A/S [Online] Disponível na Internet via WWW. Url:

http://www.danisco.com/cms/connect/corporate/home/index_en.htm. Arquivo

capturado em 06 de fevereiro de 2006

De Faveri D, Perego P. Converti A, Del Borghi M. 2002. Xylitol recovery by

crystallization from synthetic solutions and fermented hemicellulose hydrolyzates.

Chemical Engineering Journal 90: 291-298

De Vit MJ, Waddle JA, Johnston M. 1997. Regulated nuclear translocation of the

Mig1 glucose repressor. Molecular Biology of the Cell 8: 1603-1618

Doi M, Homma M, Chindamporn A, Tanaka K. 1992. Estimation of chromosome

number and size by pulse-field gel electrophoresis (PFGE) in medically important

Candida species. Journal of General Microbiology 138: 2243-2251

Drocourt D, Calmels TPG, Reynes JP, Baron M, Tiraby G. 1990. Cassettes of the

Streptoalloteichus hindustanus Ble gene fortransformation of lower and higher

eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic Acids Research 18: 4009

Elble R. 1992. A simple and efficient procedure for transformation of yeasts.

Biotechniques 13: 18-20

Eliasson A, Christensson C, Wahlbom CF, Hahn-Hägerdal B.

2000. Anaerobic Xylose

fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2, and

XKS1 in mineral medium chemostat cultures. Applied and Environmental

Microbiology 66: 3381–3386

Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P. 1998. Base-calling of automated sequencer

traces using Phred. I. Accuracy assessment. Genome Research 8:175-185

Felipe MGA, Vitolo M, Mancilha IM, Silva SS. 1997. Fermentation of sugar cane

bagasse hemicellulosic hydrolysate for xylitol production: effect of pH. Biomass and

Bioenergy 13(1-2): 11-14

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 101

Functional Foods from Finland [Online] Disponível na Internet via WWW. Url:

http://virtual.finland.fi/finfo/english/funcfood.html. Arquivo capturado em 06 de

fevereiro de 2006

Fungaro MHP. 2000. PCR na micologia. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

14: 12-16

Gardonyi M, Osterberg M, Rodrigues C, Spencer-Martins I, Hahn-Hägerdal B. 2003a.

High capacity xylose transport in Candida intermedia PYCC 4715. FEMS Yeast

Research 3: 45-52

Gardonyi M, Jeppsson M, Liden G, Gorwa-Grauslund MF, Hahn-Hagerdal B. 2003b.

Control of xylose consumption by xylose transport in recombinant Saccharomyces

cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering. 82(7): 818-24

Georgieff M, Moldawer LL, Bistrian BR, Blackburn GL. 1985. Xylitol, an energy source

for intravenous nutrition after trauma. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 9:

199-209

Ghanem KM, Sabry SA, Gamati SY. 1992. Physiological study on riboflavin

production by hydrocarbon-utilizing Candida guilliermondii. Zentralblatt Fuer

Mikrobiologie 147(3-4): 283-287

Gibrat JF, Madej T, Bryant SH. 1996. Surprising similarities in structure comparison.

Current Opinion in Structural Biology 6: 377-385

Gilfillan GD, Sullivan DJ, Haynes K, Parkinson T, Coleman DC, Gow NAR. 1998.

Candida dubliniensis: phylogeny and putative virulence factors. Microbiology, 144:

829–838

Gimenes MA, Carlos LC, Faria LF, Pereira N Jr. 2002. Oxygen uptake rate in

production of xylitol by Candida guilliermondii with different aeration rates and initial

xylose concentrations. Applied Biochemistry and Biotechnology 98-100: 1049-1059

Girio MF, Pelica F, Amaral-Collaço MT. 1996. Characterization of xylitol

dehidrogenase from Debaryomyces hansenii. Applied Biochemistry and

Biotechnology 56: 79-88

Govinden R, Pillay B, van Zyl WH, Pillay D. 2001. Xylitol production by recombinant

Saccharomyces cerevisiae expressing the Pichia stipitis and Candida shehatae xyl1

genes. Applied Biochemistry and Biotechnology, 55: 76-80.

Granström T, Leisola M. 2002. Controlled transient changes reveal differences in

metabolite production in two Candida yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology

58(4): 511-516

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 102

Graybill JR, Bocanegra R, Fothergill A, Rinaldi MG. 1996. Bleomycin therapy of

experimental disseminated candidiasis in mice. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy 40(3): 816-8.

Guarro J, Gené J, Stchigel A. M. 1999. Developments in Fungal Taxonomy Clinical.

Microbiology Reviews 12(3): 454–500

Guex N, Peitsch MC. 1997. Swiss-Model and the Swiss-PdbViewer: An environment

for comparative protein modeling. Electrophoresis 18: 2714-2723

Guo Z, Sherman F. 1995. 3’-end-forming signals of yeast mRNA. Molecular and

Cellular Biology, 15: 5983–5990

Haas LOC, Cregg JM, Gleeson MAG. 1990. Development of an integrative DNA

transformation system for the yeast Candida tropicalis. Journal of Bacteriology

172(8): 4571-4577

Habenicht A, Motejadded H, Kiess M, Wegerer A, Mattes R. 1999. Xylose utilisation:

cloning and characterisation of the xylitol dehydrogenase from Galactocandida

mastotermitis. Biological Chemistry 380(12): 1405-1411

Hahn-Hägerdal B, Jeppsson H, Skoog K, Prior BA. 1994. Biochemistry and

physiology of xylose fermentation by yeasts. Enzyme Microbial Technology 16: 933-

943

Hallborn J, Walfridsson M, Airaksinen U, Ojamo H, Hahn-Hagerdal B, Penttila M,

Kerasnen S. 1991. Xylitol production by recombinant Saccharomyces cerevisiae.

Biotechnology, 9(11): 1090-5

Hallborn J, Walfridsson M, Penttila M, Keranen S, Hahn-Hägerdal B. 1995. A short-

chain dehydrogenase gene from Pichia stipitis having D-arabinitol dehydrogenase

activity. Yeast 11: 839-847

Hamacher T, Becker J, Gardonyi M, Hahn-Hagerdal B, Boles E. 2002.

Characterization of the xylose-transporting properties of yeast hexose transporters

and their influence on xylose utilization. Microbiology 148(9): 2783-2788

Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.

Journal of Molecular Biology 66: 557-580

Handumrongkul C, Ma D-P, Silva JL. 1998. Cloning and expression of Candida

guilliermondii xylose reductase gene (xyl1) in Pichia pastoris. Applied Microbiology

and Biotechnology 49: 399-404

Hansen J, Felding T, Johannesen PF, Piskur J, Christensen CL, Olesen K. 2003.

Further development of the cassette-based pyc plasmid system by incorporation of

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 103

the dominant hph, nat and aur1-C gene markers and the lacz reporter system. FEMS

Yeast Research 4: 323-327

Hara A, Ueda M, Matsui T, Furuhashi K, Kanayama N, Tanaka A. 1999. Construction

of an autonomously replicating plasmid in n-alkane-assimilating yeast Candida

tropicalis. Journal of Bioscience and Bioengineering 87: 717–720

Hara A, Ueda M, Misawa S, Matsui T, Furuhashi K, Tanaka A. 2000. Mutated

hygromycin b resistance gene is functional for the n-alkane-assimilating yeast

Candida tropicalis. Archives of Microbiology 173: 187–192

Harkki AM, Myasnikov AN, Apajalahti JHA, Pastinen OA. 2004. Manufacture of xylitol

using recombinant microbial hosts. US N. 6723540

Hashida-Okado T, Ogawa A, Kato I, Takesako K. 1998. Transformation system

forprototrophic industrial yeasts using the aur1 gene as a dominant selection marker.

FEBS Letters 425: 117-122

Hasper, A. A., J. Visser, and L. H. de Graaff. (2000) The Aspergillus niger

transcriptional activator XlnR, which is involved in the degradation of the

polysaccharides xylan and cellulose, also regulates D-xylose reductase gene

expression. Molecular Microbiology 36: 193–200

Heikkila H, Nurmi J, Rahkila L, Toyryla M. 1992. Method for the production of xylitol.

US N. 5081026

Hill JE, Myers AM, Koerner TJ, Tzagoloff A. 1986. Yeast/E. coli shuttle vectors with

multiple unique restriction sites. Yeast 2(3): 163-7

Ho NWY, Stevis P, Rosenfeld S, Huang JJ, Tsao GT. 1983. Expression of the

Escherichia coli isomerase gene by a yeast promoter. Biotechnology and

Bioengineering Symposium 13:245–250

Ho NWY, Zhengdao C, Brainard AP. 1998. Genetically engineered Saccharomyces

yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose. Applied and

Environmental Microbiology 64(5): 1852-1859

Höfer M, Nassar FR. 1987. Aerobic and anaerobic uptake of sugars in

Schizosaccharomyces pombe. Journal General Microbiology 133: 2163-2172

Hujoel PP, Makinen KK, Benett CA, Isotupa KP, Isokangas PJ, Allen P, Makinen PL.

1999. The optimum time to initiate habitual xylitol gum-chewing for obtaining long-

term caries prevention. Journal of Dental Research 78(3): 797-803

Ismailov NM. 1985.

Biodegradation of petroleum hydrocarbons in soil inoculated with

yeast. Mikrobiologia 54: 835-841

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 104

Isokangas P, Soderling E, Pienihakkinen K, Alanen P. 2000. Occurrence of dental

decay in children after maternal consumption of xylitol chewing gum, a follow-up from

0 to 5 years of age. Journal of Dental Research 79(11): 1885-1889

Jang SH, Kang HY, Kim GJ, Seo JH, Ryu YW. 2003. Complete in vitro conversion of

D-xylose to xylitol by coupling xylose reductase and formate dehydrogenase. Journal

of Microbiology and Biotechnology 13(4): 501-508

Jeffries TW. 1983. Utilization of xylose by bacteria, yeasts and fungi. Advances in

Biochemical Engineering 27: 1-32

Jeffries TW, Jin YS. 2004.

Metabolic engineering for improved fermentation of

pentoses by yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology 63: 495-509

Jeppsson M, Johansson B, Hahn-Hagerdal B, Gorwa-Grauslund MF. 2002. Reduced

oxidative pentose phosphate pathway flux in recombinant xylose-utilizing

Saccharomyces cerevisiae strains improves the ethanol yield from xylose. Applie and

Environmental Microbiology 68(4):1604-1609

Jeppsson M, Traff K, Johansson B, Hahn-Hagerdal B, Gorwa-Grauslund MF. 2003.

Effect of enhanced xylose reductase activity on xylose consumption and product

distribution in xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae. FEMS

Yeast Research 3(2):167-75

Jin YS, Jones S, Shi NQ, Jeffries TW. 2002.

Molecular cloning of xyl3 (D-

xylulokinase) from Pichia stipitis and characterization of its physiological function.

Applied and Environmental Microbiology 68(3): 232–1239

Jin YS, Jeffries TW. 2003. Changing flux of xylose metabolites by altering expression

of xylose reductase and xylitol dehydrogenase in recombinant Saccharomyces

cerevisiae. Applied Biochenistry and Microbiology 105-108: 277-285

Johansson B, Christensson C, Hobley T, Hahn-Hägerdal B. 2001. Xylulokinase

overexpression in two strains of Saccharomyces cerevisiae also expressing xylose

reductase and xylitol dehydrogenase and its effect on fermentation of xylose and

lignocellulosic hydrolysate. Applied and Environmental Microbiology 67(9): 4249-4255

Jornvall H, Persson B, Krook M, Atrian S, Gonzalez-Duarte R, Jeaery J, Ghosh D.

1995. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR). Biochemistry 34(18): 6003-

6013

Kanayama N, Atomi H, Ueda M, Tanaka A. 1998. Genetic evaluation of physiological

functions of thiolase isozymes in n-alkane-assimilating yeast Candida tropicalis.

Journal of Bacteriology 180: 690–698

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 105

Karlgren S, Pettersson N, Nordlander B, Mathai JC, Brodsky JL, Zeidel ML, Bill RM,

Hohmann S. 2005. Conditional osmotic stress in yeast: a system to study transport

through aquaglyceroporins and osmostress signaling. The Journal of Biological

Chemistry 280(8): 7186-7193

Katahira S, Fujita Y, Mizuike A, Fukuda H, Kondo A.2004. Construction of a xylan-

fermenting yeast strain through codisplay of xylanolytic enzymes on the surface of

xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae cells. Applied and Environmental

Microbiology 70(9): 5407-5414

Kavanagh KL, Klimacek M, Nidetzky B, Wilson DK. 2002. The structure of apo and

holo forms of xylose reductase, a dimeric aldo-keto reductase from Candida tenuis.

Biochemistry 41(28): 8785-8795

Kavanagh KL, Klimacek M, Nidetzky B, Wilson DK. 2003. Structure of xylose

reductase bound to NAD

and the basis for single and dual co-substrate specificity in

family 2 aldo-keto reductases. The Biochemical Journal

373: 319–326

Kilian SG, van Uden N. 1988. Transport of xylose and glucose in the xylose-

fermenting yeast Pichia stipitis. Applied Microbiology and Biotechnology 27: 545-548

Kilian SG, Prior BA, Dupreez JC, 1993 The kinetics and regulation of D-xylose

transport in Candida utilis. World Journal of Microbiology & Biotechnology 9(3): 357-

360

Kim SY, Oh DK, Jung SR.

1999a. Fermentation process for preparing xylitol using

Candida tropicalis. US N. 5.998.181

Kim YS, Kim SY, Kim JH, Kim SC. 1999b. Xylitol production using recombinant

Saccharomyces cerevisiae containing multiple xylose reductase genes at

chromosomal

-sequences. Journal of Biotechnology 67: 159-171

Kim SY, Oh DK, Jung SR.

2000. Fermentation for production of xylitol using Candida

tropicalis. Japão N. 2000-093188-A.

Kim MS, Chung YS, Seo JH, Jo DH, Park YH, Ryu YW. 2001. High-yield production

of xylitol from xylose by a xylitol dehydrogenase defective mutant of Pichia stipitis.

Journal of Microbiology and Biotechnology 11(4): 564-569

Kondo K, Saito T, Kajiwara S, Takagi M, Misawa NA. 1995. Transformation system

for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as

a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA.

Journal of Bacteriology 177(24): 7171-7177

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 106

Kotter P, Amore R, Hollenberg CP, Ciriacy M. 1990. Isolation and characterization of

the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene xyl2 and construction of a xylose-

utilizing Saccharomyces cerevisiae transformant. Current Genetic 18: 493-500

Kuyper M, Winkler AA, van Dijken JP, Pronk JT. 2004. Minimal metabolic engineering

of Saccharomyces cerevisiae for anaerobic xylose fermentation: a proof of principle.

FEMS Yeast Research 4: 655–664

Lagunas R. 1993. Sugar transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology

Review 104: 229–242

Lambert C, Leonard N, De Bolle X, Depiereux E. 2002. ESyPred3D: Prediction of

proteins 3D structure. Bioinformatics 18: 1250-1256

Lee H. 1998. The structure and function of yeast xylose (aldose) reductases. Yeast

14(11): 977-984

Lee W-J, Kim M-D, Ryu Y-W, Bisson LF, Seo J-H. 2002. Kinetic studies on glucose

and xylose transport in Saccharomyces Cerevisiae. Applied Microbiology and

Biotechnology 60: 186–191

Lee W-J, Koo B, Kim M-D. 2003. Cloning and characterization of the xyl1 gene

encoding an NADH-preferring xylose reductase from Candida parapsilosis, and its

functional expression in Candida tropicalis. Applied and Environmental Microbiology

69 (10): 6179–6188

Levin I, Meiri G, Peretz M, Burstein Y, Frolow F. 2004. The ternary complex of

Pseudomonas aeruginosa alcohol dehydrogenase with NADH and ethylene glycol.

Protein Science 13:1547-1556

Liden G, Walfridsson M, Ansell R, Anderlund M, Adler L, Hahn-Hagerdal B. 1996. A

glycerol-3-phosphate dehydrogenase-deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae

expressing the heterologous xyl1 gene. Applied and Environmental Microbiology

62(10): 3894–3896

Lima LHA, Felipe MGA, Torres FAG. 2003. Reclassification of Candida guilliermondii

FTI 20037 as Candida tropicalis based on molecular phylogenetic analysis. Brazilian

Journal of Microbiology 34(1): 96-98

Lima LHA, Felipe MGA, Vitolo M, Torres FAG. 2004 Effect of acetic acid present in

bagasse hydrolysate on the activities of xylose reductase and xylitol dehydrogenase

in Candida guilliermondii. Applied Microbiology and Biotechnology 65(6): 734-738

Lima LHA, Pinheiro CGA, Moraes LMP, Freitas SM, Torres FAG. 2006. Molecular

cloning of the xylitol dehydrogenase gene (XYL2) from the yeast Candida tropicalis.

Archives of Microbiology (submetido)

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 107

Liu Y, Li Y, Liu L, Hu X, Qiu B. 2005. Design of Vectors for Efficient Integration and

Transformation in Hansenula polymorpha. Biotechnology Letters 27(19): 1529-34

Lonn A, Traff-Bjerre KL, Otero RRC, van Zyl WH, Hahn-Hagerdal B. 2003. Xylose

isomerase. activity influences xylose fermentation with recombinant Saccharomyces

cerevisiae strains expressing mutated xylA from Thermus thermophilus. Enzyme and

Microbial Technology 32(5): 567-573.

Lopes TS, Klootwijk J, Veenstra AE, van der Aar PC, van Heerikhuizen H, Raue HA,

Planta RJ 1989. High-copy-number integration into the ribosomal DNA of

Saccharomyces cerevisiae: a new vector for high-level expression. Gene 79: 199-206

Lorito M, Mach RL, Sposato P, Strauss J, Peterbauer CK, Kubicek CP. 1996.

Mycoparasitic interaction relieves binding of the Cre1 carbon catabolite repressor

protein to promoter sequences of the ech42 (endochitinase-encoding) gene in

Trichoderma harzianum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America 93(25): 14868-14872

Lucas C, van Uden N. 1986. Transport of hemicellulose monomers in the xylose-

fermeting yeast Candida shehatae. Applied Microbiology and Biotechnology 23: 491-

495

Lunzer R, Mamnun Y, Haltrich D, Kulbe KD, Nidetzky B. 1998. Structural and

functional properties of a yeast xylitol dehydrogenase, a Zn

-containing

metalloenzyme similar to medium-chain sorbitol dehydrogenases. Biochemichal

Journal 1: 91-99

Makinen KK, Chiego DJ, Allen P, Bennett C, Isotupa KP, Tiekso J, Makinen PL. 1998.

Physical, chemical and histologic changes in dentin caries lesions of primary teeth

induced by regular use of polyol chewing gums. Acta Odontologica Scandinavica

56(3): 148-156

Makinen KK. 2000. Can the pentitol-hexitol theory explain the clinical observations

made with xylitol? Medical Hypotheses 54(4): 603–613

Maleszka R. and Clark-Walker GD. 1993. Yeasts have a four-fold variation in

ribosomal DNA copy number. Yeast 9: 53-58

Manz U, Vanninen E, Voirol F. 1973. Xylitol – its properties and use as a sugar

substitute in foods. In: Food R.A. Symp. Sugar and Sugar Replacements.

Masako K, Yusuke K, Hideyuki I, Atsuko M, Yoshiki M, Kayoko M, Makoto K. 2005. A

novel method to control the balance of skin microflora: Part 2. A study to assess the

effect of a cream containing farnesol and xylitol on atopic dry skin.

Journal of Dermatological Science, 38(3): 207-213

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 108

Masson JY, Ramotar D. 1996. The Saccharomyces cerevisiae IMP2 gene encodes a

transcriptional activator that mediates protection against DNA damage caused by

bleomycin and other oxidants. Molecular and Cellular Biology 16(5): 2091-2100

Masuda Y, Park SM, Ohkuma M, Ohta A, Takagi M. 1994. Expression of an

endogenous and a heterologous gene in Candida maltosa by using a promoter of a

newly-isolated phosphoglycerate kinase (PGK) gene. Current Genetics 25(5): 412-

417

Mattila P, Svanberg J, Pökkä P, Knuuttila M. 1998. Dietary xylitol protects against

weakening of bone biomechanical properties in ovariectomized rats. The Journal of

Nutrition 128 (10): 1811-1816

Mayr P, Bruggler K, Kulbe KD, Nidetzky B. 2000. D-Xylose metabolism by Candida

intermedia: isolation and characterisation of two forms of aldose reductase with

different coenzyme specificities. Journal of Chromatography 737: 195-202

Mayr P, Petschacher B, Nidetzky B. 2003. Xylose reductase from the basidiomycete

fungus Cryptococcus flavus: purification, steady-state kinetic characterization, and

detailed analysis of the substrate binding pocket using structure-activity relationships.

Journal of Biochemistry 133(4): 553-62

Meinander N, Hahn-Hägerdal B. 1997. Influence of cosubstrate concentration on

xylose conversion by recombinant XYL1-expression in Saccharomyces cerevisiae: a

comparison of diferent sugars and ethanol as cosubstrates. Applied Environmental

Microbiology 63: 1959-1964

Melaja AJ, Hamalainen L. 1977. Process for making xylitol. US N.4.008.285

Metzger MH, Hollenberg CP. 1994. Isolation and characterization of the Pichia stipitis

transketolase gene and expression in a xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae

transformant. Applied Microbiology and Biotechnology 42: 319-325

Meyrial V, Delgenes JP, Moletta R, Navarro JM. 1991. Xylitol production from D-

Xylose by Candida guilliermondii: fermentation behaviour. Biotechnology Letters 13:

281 – 286

Mitsubish Corporation [Online] Disponível na Internet via WWW. Url:

http://www.mitsubishicorp.com/en/bg/chemicals/investments.html. Arquivo capturado

em 06 de fevereiro de 2006

Moes CJ, Pretorius IS, van Zyl WH. 1996. Cloning and expression of the Clostridium

thermosulfurogenes D-xylose isomerase gene (xylA) in Saccharomyces cerevisiae.

Biotechnology Letters 18:269–274

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 109

Moore CW. 1982. Modulation of bleomycin cytotoxicity. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy 21(4): 595–600

Moraes LM, Astolfi-Filho S, Oliver SG. 1995. Development of yeast strains for the

efficient utilisation of starch: evaluation of constructs that express alpha-amylase and

glucoamylase separately or as bifunctional fusion proteins. Applied Microbiology and

Biotechnology 43: 1067-1076

Mulsant P, Tiraby G, Kallerhoff J, Perret J. 1988. Phleomycin resistance as a

dominant selectable marker in CHO cells. Somatic Cell and Molecular Genetics 14:

243-252

Murray J, Wong ML, Miyada CG, Switchenko AC, Goodman TC, Wong B. 1995.

Isolation, characterization and expression of the gene that encodes D-arabinitol

dehydrogenase in Candida tropicalis. Gene 155: 123-128

Nidetzky B, Bruggler K, Kratzer R, Mayr P. 2003. Multiple forms of xylose reductase

in Candida intermedia: comparison of their functional properties using quantitative

structure-activity relationships, steady-state kinetic analysis, and ph studies. Journal

of Agricultural and Food Chemistry

51: 7930-7935

Nielsen J. 2001. Metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology

55(3): 263-83

Nobre A, Lucas C, Leao C. 1999. Transport and utilization of hexoses and pentoses

in the halotolerant yeast Debaryomyces hansenii. Applied and Environmental

Microbiology 65 (8): 3594-3598

Nyyssola A, Pihlajaniemi A, Palva A, von Weymarn N, Leisola M. 2005. Production of

xylitol from d-xylose by recombinant Lactococcus lactis. Journal of Biotechnology

118(1): 55-66

Oh DK, Kim SY. 1998. Increase of xylitol yield by feeding xylose and glucose in

Candida tropicalis. Applied Microbiology and Biotechnology 50(4): 419-25

Oki T, Fujisawa-Shi, Nishimura Y, Yashiroshi, Sayama Y, Takemi H. 1971. Process for

production L-glutamic acid by fermentation. US N. 3563857

Onishi H, Suzuki T. 1971. Process for producing xylitol by fermentation.

US N. 3619369

Oppermann U, Filling C, Hult M, Shafqat N, Wua X, Lindh M, Shafqat J, Nordling E,

Kallberg Y, Persson B, Jornvall H. 2003. Short-chain dehydrogenases/ reductases

(SDR): the 2002 update. Chemico-Biological Interactions 143-144: 247-253

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 110

Ostergaard S, Olsson L, Nielsen J. 2000. Metabolic engineering of Saccharomyces

cerevisiae. Microbioloby and Molecular Biology Reviews 64: 34-50

Özcan S, Dover J, Rosenwald AG, Wöl flS, Johnston M. 1996. Two glucose

transporters in Saccharomyces cerevisiae are glucose sensors that generate a signal

for induction of gene expression. Proceedings of The National Academy of Sciences

(USA) 93: 12428-12432

Parajó JC, Dominguez H, Dominguez JM. 1998a. Biotechnological production of

xylitol. Part 1: Interest of xylitol and fundamentals of its biosynthesis. Bioresource

Technology 65: 191-201

Parajó JC, Dominguez H, Dominguez JM. 1998b. Biotechnological production of

xylitol. Part 2: Operation in culture media made with commercial sugars. Bioresource

Technology 65: 203-212

Parajó JC, Dominguez H, Dominguez JM. 1998c. Biotechnological production of

xylitol. Part 3: Operation in culture media made from lignocellulose hydrolysates.

Bioresource Technology 66: 25-40

Pauly TA, Ekstrom JL, Beebe DA, Chrunyk B, Cunningham D, Griffor M, Kamath A,

Lee SE, Madura R, Mcguire D, Subashi T, Wasilko D, Watts P, Mylari BL, Oates PJ,

Adams PD, Rath VL. 2003. X-Ray Crystallographic and kinetic studies of human

sorbitol dehydrogenase. Structure 11: 1071-1085

Pazouki M, Felse PA, Sinha J, Panda T. 2000. Comparative Studies on citric acid

production by Aspergillus niger and Candida lipolytica using molasses and glucose.

Bioprocess Engineering 22(4): 353-361

Pepper T, Olinger PM. 1988. Xylitol in sugar – free confections. Food Technology 42:

Perez P, Tiraby G, Kallerhoff J, Perret J. 1989. Phleomycin resistance as a dominant

selectable marker for plant cell transformation. Plant Molecular Biology 13: 365-373

Persson B, Hallborn J, Walfridsson M, Hahn-Hägerdal B, Keranen S, Penttila M,

Jornvall H. 1993.

Dual relationships of xylitol and alcohol dehydrogenases in families

of two protein types. Febs Letters 324(1): 9-14

Phadtare SU, Rawat UB, Rao MB. 1997. Purification and characterization of xylitol

dehydrogenase from Neurospora crassa. FEMS Microbiology Letters 146: 79-83

Picataggio S, Deanda K, Mielenz J. 1991. Determination of Candida tropicalis acyl

coenzyme a oxidase isozyme function by sequential gene disruption. Molecular and

Cellular Biochemistry 11(9): 4333-4339

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 111

Prathumpai W, McIntyre M, Nielsen J. 2004. The effect of CreA in glucose and xylose

catabolism in Aspergillus nidulans. Applied Microbiology and Biotechnology 63: 748–

753

Rajgarhia V, Koivuranta K, Penttilae M, Ilmen M, Suominen P, Aristidou A, Miller C,

Olson S, Ruohonen L. 2004. Novel genetically modified yeast cell e.g.,

Kluyveromyces or Candida cell, having xylose isomerase gene linked to promoter and

terminator sequences, integrated into its genome, useful for producing ethanol.

WO2004099381-A2

Ramotar D, Wang H. 2003 Protective mechanisms against the antitumor agent

bleomycin: lessons from Saccharomyces cerevisiae. Current Genetics 43(4): 213-224

Rangaswamy S, Agblevor FA. 2002. Screening of facultative anaerobic bacteria

utilizing D-xylose for xylitol production. Applied Microbiology and Biotechnology 60:

88–93

Rathjen J, Mellor J. 1990. Characterisation of Sequences required for RNA initiation

from the PGK promoter of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research 18:

3219-3225

Richard P, Toivari MH, Penttila M. 1999. Evidence that the gene YLR070c of

Saccharomyces cerevisiae encodes a xylitol dehydrogenase. FEBS Letters 457(1):

135-8

Rizzi M, Erlemann P, Bui-Thanh NA, Dellweg H. 1988. Xylose fermentation by yeasts.

4. Purification and kinetic studies of xylose reductase From Pichia stipitis. Applied

Microbiology and Biotechnology 29(2-3): 148-154

Roca C, Haack MB, Olsson L. 2004. Engineering of carbon catabolite repression in

recombinant xylose fermenting Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and

Biotechnology 63: 578–583

Rohrer TL, Picataggio SK. 1992. Targeted integrative transformation of Candida

tropicalis by electroporation. Applied Microbiology and Biotechnology 36(5): 50-54

Roquette Frères S.A. [Online] Disponível na Internet via WWW. Url:

http://www.roquette.com/eng/sites.htm. Arquivo capturado em 06 de fevereiro de

2006

Saha BC, Bothast RJ. 1996. Production of xylitol by Candida peltata. Journal of

Industrial Microbiology 22: 633 – 636

Sambrook J, Russell Dw, Sambrook J. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. New York, NY, USA., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 999 p. ISBN:

0879695773

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 112

Sarthy AV, McConaughy BL, Lobo Z, Sundstrom JA, Furlong CL, Hall BD. 1987.

Expression of the Escherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces

cerevisiae. Applied Environmenta Microbiology 53:1996–2000

Sasaki H, Kishimoto T, Mizuno T, Shinzato T, Uemura H. 2005. Expression of GCR1,

the transcriptional activator of glycolytic enzyme genes in the yeast Saccharomyces

cerevisiae, is positively autoregulated by Gcr1p. Yeast 22: 305-319

Seiboth B, Hartl L, Pail M, Kubicek CP. 2003. D-Xylose metabolism in Hypocrea

jecorina: loss of the xylitol dehydrogenase step can be partially compensated for by

lad1-encoded l-arabinitol-4-dehydrogenase. Eukaryotic Cell 2, 867–875.

Shen J, Guo W, Kohler JR. 2005. CaNAT1, a heterologous dominant selectable

marker for transformation of Candida albicans and other pathogenic Candida species.

Infection and Immunity 73(2): 1239-1242

Sheu DC, Duan KJ, Jou SR, Chen YC, Chen CW. 2003. Production of xylitol from

Candida tropicalis by using an oxidation-reduction potential-stat controlled

fermentation. Biotechnology Letters 26(4): 2065-2069

Silva SS, Vitolo M, Pessoa Junior A, Felipe MGA. 1996. Xylose reductase and xylitol

dehydrogenase activities by xylose fermeting Candida guilliermondii. Journal Basic

Microbiology 363: 187-191

Sirenius I, Krogerus VE, Leppanen T. 1979.Dissolution rate of p-aminobenzoates

from solid xylitol dispersions. Journal of Pharmaceutical Sciences 1979 68(6): 791-

792

Slininger PJ, Bolen OL, Kurtzman CP. 1987. Pachysolen tannophilus: properties and

process consideration for ethanol production form D-xylose. Enzyme and Microbial

Technology 9: 5-15

Soderling E, Isokangas P, Pienihakkinen K, Tenovuo J. 2000. Influence of maternal

xylitol consumption on acquisition of mutans Streptococci by infants. Journal of Dental

Research 79(3): 882-887

Soderling E, Isokangas P, Pienihakkinen K, Tenovuo J, Alanen P. 2001. Influence of

maternal xylitol consumption on mother-child transmission of mutans Streptococci: 6-

year follow-up. Caries Research 35(3): 173-177

Sonderegger M, Sauer U. 2003. Evolutionary engineering of Saccharomyces

cerevisiae for anaerobic growth on xylose. Applied and Environmental Microbiology

69: 1990–1998

Stambuk BU, Franden MA, Singh A, Zhang M. 2003. D-xylose transport by Candida

succiphila and Kluyveromyces marxianus. Applied Biochemistry and Biotechnology

105–108: 255-263

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 113

Stemmer WP. 1991. A 20-minute ethidium bromide/high-salt extraction protocol for

plasmid DNA. Biotechniques 10(6): 726

Sugiyama M, Suzuki S, Tonouchi N, Yokozeki K. 2003. Cloning of the xylitol

dehydrogenase gene from Gluconobacter oxydans and improved production of xylitol

from D-arabitol. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67(3):584-91

Sugita T, Nakase T.1999. Nonuniversal usage of the leucine CUG codon in yeasts:

Investigation of basidiomycetous yeast. The Journal of General and Applied

Microbiology 45(4): 193-197

Suzuki T,Yokoyama S, Kinoshita Y,Yamada H, Hatsu M, Takamizawa K, Kawai K.

1999. Expression of xyrA Gene Encoding for D-Xylose Reductase of Candida

tropicalis and Production of Xylitol in Escherichia coli. Journal of Bioscience and

Bioengineering 87(3): 280-284

Suzuki S, Sugiyama M, Mihara Y, Hashiguchi K, Yokozeki K. 2002. Novel enzymatic

method for the production of xylitol from D-arabitol by Gluconobacter oxydans.

Bioscience Biotechnology and Biochemistry 66(12): 2614–2620

Tang SJ, Sun KH, Sun GH, Chang TY, Wu WL, Lee GC. 2003. A transformation

system for the nonuniversal CUG (SER) codon usage species Candida rugosa.

Journal of Microbiological Methods 52(2): 231-238

Takamizawa K, Uchida S, Hatsu M, Suzuki T, Kawai K. 2000. Development of a

xylitol biosensor composed of xylitol dehydrogenase and diaphorase. Canadian

Journal of Microbiology

46: 350–357

Triglia T, Peterson MG, Kemp DJ. 1988. A procedure for in vitro amplification of DNA

segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids

Research 16(16): 8186

Toivari MH, Salusjärvi L, Ruohonen L, Penttila M. 2004. Endogenous xylose pathway

in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology 70(6): 3681–

3686

Tornow J, Zeng X, Gao W, Santangelo GM. 1993. GCR1, a transcriptional activator

in Saccharomyces cerevisiae, complexes with RAP1 and can function without its DNA

binding domain. EMBO Journal 12: 2431-2437

Ugolini S, Tosato V, Bruschi CV. 2002. Selective fitness of four episomal shuttle-

vectors carrying HIS3, LEU2, TRP1, and URA3 selectable markers in

Saccharomyces cerevisiae. Plasmid 47(2): 94-107

Uhari M, Kontiokari T, Niemela M. 1998. A novel use of xylitol sugar in preventin

acute otitis media. Pediatrics 102(4): 879-884

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 114

van Loveren C. 2004. Sugar alcohols: what is the evidence for caries-preventive and

caries-therapeutic effects? Caries Research 38: 286–293

van Peij, N. N.,. Gielkens M. M, de Vries R. P., Visser J., de Graaff L. H. 1998. The

transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene

expression in Aspergillus niger. Applied Environmental Microbiology 64: 3615–3619.

Verduyn C, Frank J, van Dijken JP, Scheffers. 1985a. A multiple forms of xylose

reductase in Pachysolen tannophilus CBS4044. FEMS Microbiology 30: 313-317

Verduyn C, van Kleef R, Frank J, Schereuder H, van Dijken JP, Scheffers WA.

1985b. Properties of the NAD(P)H-dependent xylose reductase from the xylose-

fermeting yeast Pichia stipitis. The Biochemical Journal 226: 667-669

Verho R, Londesborough J, Penttila M, Richard P. 2003. Engineering redox cofactor

regeneration for improved pentose fermentation in Saccharomyces cerevisiae.

Applied and Environmental Microbiology 69(10): 5892–5897

Wahlbom FC, Otero RRC, van Zyl WH, Hahn-Hägerdal B, Jonsson LJ. 2003a.

Molecular analysis of a Saccharomyces cerevisiae mutant with improved ability to

utilize xylose shows enhanced expression of proteins involved in transport, initial

xylose metabolism, and the pentose phosphate pathway. Applied and Environmental

Microbiology 69(2): 740–746

Wahlbom FC, van Zyl WH, Jonsson LJ, Hahn-Hägerdal B, Otero RRC. 2003b.

Generation of the improved recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae

TMB 3400 by random mutagenesis and physiological comparison with Pichia stipitis

CBS 6054. FEMS Yeast Research 3: 319-326

Waitzberg DL. 1995. Nutrição Enteral e Parenteral na Prática Clínica. 2ed. São

Paulo: Atheneu, 434 p. ISBN: 8573792558

Walfridsson M, Hallborn J, Penttila M, Keranen S, Hahn-Hägerdal B. 1995.

Xylose-

metabolizing Saccharomyces Cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1

genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and

transaldolase.

Applied and Environmental Microbiology 61(12):4184-4190

Walfridsson M, Bao X, Anderlund M, Lilius G, Bulow L, Hahn-Hagerdal B. 1996.

Ethanolic fermentation of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the

Thermus thermophilus xylA gene, which expresses an active xylose (glucose)

isomerase. Applied and Environmental Microbiology 62(12): 4648-51

Walfridsson M, Anderlund M, Bao X, Hahn-Hägerdal B. 1997. Expression of different

levels of enzymes from the Pichia stipitis xyl1 and xyl2 genes in Saccharomyces

cerevisiae and its effects on product formation during xylose utilisation. Applied

Microbiology Biotecnology 48: 218-224

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 115

Wang T, Penttila M, Gao P, Wang C, Zhong L. 1998. Isolation and identification of

xylitol dehydrogenase gene from Trichoderma reesei. Chinese Journal Biotechnology

14(3): 179-185

Wang X, Li G, Deng Y, Yu X, Chen F. 2006. A site-directed integration system for the

nonuniversal CUG(Ser) codon usage species Pichia farinosa by electroporation.

Archives of Microbiology184(6): 419-24

Wellington M, Rustchenko E. 2005. 5-Fluoro-orotic acid induces chromosome

alterations in Candida albicans. Yeast 22: 57-70

Winkelhausen E, Pittman P, Kuzmanova S, Jeffries TW. 1996. Xylitol formation by

Candida boidinii in oxygen limited chemostat culture. Biotechnology Letters 18(7):

753-758

Winkelhausen E, Kuzmanova S. 1998. Microbial conversion of D-xylose to xylitol.

Journal of Fermentation and Bioengineering 86(1): 1-14

Witteveen CFB, Weber F, Busink R, Visser J. 1994. Isolation and characterization of

two xylitol dehidrogenases from Aspergillus niger. Microbiology, 140 (7) 1679-1685

Wesolowski-Louvel M, Goffrini P, Ferrero I, Fukuhara H. 1992. Glucose transport in

the yeast Kluyveromyces lactis. I. Properties of an inducible low-affinity glucose

transporter gene. Molecular and General Genetics 233(1-2): 89-96

Wolfe GR, Smith CA, Hendrix DL, Salvucci ME. 1999. Molecular basis for

thermoprotection in Bemisia: structural differences between whitefly ketose reductase

and other mediumchain dehydrogenases/reductases. Insect Biochemistry Molecular

Biology 29, 113–120

Xu HE, Johnston SA. 1994. Yeast bleomycin hydrolase is a DNA-binding cysteine

protease. Identification, purification, biochemical characterization. The Journal of

Biological Chemistry 269: 21177–21183

Yahashi Y, Horitsu H, Kawai K, Suzuki T, Takamizawa K. 1996. Production of xylitol

from D-xylose by Candida tropicalis: the effect of D-glucose feeding. Journal of

Fermentation and Bioengineering 81: 148-152

Yan Y, Bornschreuer UT, Schmidt RD. 1999. Lipase-catalysed synthesis of vitamin C

fatty acid esters. Biotechnology Letters 21: 1051 – 1054

Yancey, P.H., Clark, M.E., Hand, S.C., Bowlus, R.D., Somero, G.N. 1982. Living with

water stress: evolution of osmolyte systems. Science 217, 1214–1222

Yang Y-T, Bennett GN, San K-Y. 1998. Genetic and metabolic engineering.

Electronic Journal of Biotechnology 1(3): 1-8

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 116

Yokoyama S, Suzuki T, Kawai K, Horitsu H, Takamizawa K. 1995a. Purification,

characterization and structure analysis of NADPH-dependent D-xylose reductases

from Candida tropicalis. Journal of Fermentation and Bioengineering 79: 217-223

Yokoyama S, Kinoshita Y, Suzuki T, Kawai K, Horitsu H, Takamizawa R. 1995b.

Cloning and sequencing of two D-xylose reductase genes (xyra and xyrb) from

Candida tropicalis. Journal of Fermentation and Bioengineering 80(6) 603-605

Zabner J, Seiler MP, Launspach JL, Karp PH, Kearney WR, Look DC, Smith JJ,

Welsh MJ. 2000. The osmolyte xylitol reduces the salt concentration of airway surface

liquid and may enhance bacterial killing. Proceedings of The National Academy of

Sciences (USA) 97(21): 11614-11619

Zheng W, Johnston SA. 1998 The nucleic acid binding activity of bleomycin hydrolase

is involved in bleomycin detoxification. Molecular and Cellular Biology

18(6): 3580-

3585

Zhong W, Jeffries MW, Georgopapadakou NH. 2000. Inhibition of inositol

phosphorylceramide synthase by aureobasidin A in Candida and Aspergillus species.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44(3): 651–653

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 117

ANEXO 1

Artigo Científico Publicado

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 122

ANEXO 2

Artigo Científico Submetido

For Peer Review

Manuscript for review

Xylitol dehydrogenase from Candida tropicalis: molecular cloning of the

gene and structural analysis of the protein

Journal: Applied Microbiology and Biotechnology

Manuscript ID: AMB-06-13260

Manuscript Category: Original Paper

Date Submitted by the

Author:

07-Mar-2006

Complete List of Authors: Lima, Luanne Helena

Pinheiro, Cristiano

Moraes, Lídia Maria

Freitas, Sonia Maria

Torres, Fernando

Keyword:

xylitol dehydrogenase, Candida tropicalis, molecular modeling,

protein structure, medium chain dehydrogenase family

Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Xylitol dehydrogenase from Candida tropicalis: molecular cloning

of the gene and structural analysis of the protein

Luanne Helena Augusto Lima, Cristiano Guimarães do Amaral Pinheiro, Lídia Maria Pepe

de Moraes, Sonia Maria de Freitas, Fernando Araripe Gonçalves Torres

Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Brasília, DF, 70910-900,

Brazil.

*Corresponding author

e-mail: [email protected], phone: +55-061-33072423, fax: +55-061-33498411

Abstract

Yeasts can metabolize xylose by the action of two key enzymes: xylose reductase and

xylitol dehydrogenase. In this work we present data concerning the cloning of the XYL2

gene encoding xylitol dehydrogenase from the yeast Candida tropicalis. The gene is

present as a single copy in the genome and is controlled at the transcriptional level by the

presence of the inducer xylose. XYL2 was functionally tested by heterologous expression in

Saccharomyces cerevisiae in order to develop a yeast strain capable of producing ethanol

from xylose. Structural analysis of C. tropicalis xylitol dehydrogenase, Xyl2, suggests that

it is a member of the medium chain dehydrogenase (MDR) family. This is supported by the

Page 1 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

presence of the amino acid signature [GHE]xx[G]xxxxx[G]xx[V] in its primary sequence

and a typical alcohol dehydrogenase Rossmann fold pattern composed by NAD

and zinc

ion binding domains.

Keywords: xylitol dehydrogenase; Candida tropicalis; molecular modeling; protein

structure; medium chain dehydrogenase family.

Abbreviation: ORF (open reading frame)

Introduction

Yeasts of the genus Candida have been considered of great biotechnological value for more

than 30 years (Wolf, 1996). Candida tropicalis has gained much interest due to its ability to

convert n-alkanes or fatty acids into dicarboxylic acids which can be used for the

preparation of perfumes, polymers, adhesives, and macrolide antibiotics (Craft et al., 2003).

In addition, C. tropicalis has also been considered for the production of xylitol (Kim et al.,

2004) a pentahydroxy sugar alcohol intermediate of xylose catabolism which is used in

food and confectionery industries as a natural sweetener (Makinen, 2000).

The pathway of

D-xylose metabolism in yeast comprises the action of three cytosolic

enzymes. First, xylose is reduced to xylitol by xylose reductase (XR) and then xylitol is

oxidized to xylulose by xylitol dehydrogenase (XDH). Xylulose is then phophorylated by

xylulokinase (XK) to xylulose 5-phosphate which can be channeled through the pentose

phosphate pathway (Webb and Lee, 1990). Unlike yeasts, the anaerobic fungus Piromyces

Page 2 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

sp. metabolizes xylose via xylose isomerase (XI) which converts

D-xylose to xylulose, a

pathway that resembles xylose catabolism in bacteria. (Harhangi et al., 2003).

Since

D-xylose is one of the most abundant sugars present in the plant biomass, there is

great interest in improving its utilization through metabolic engineering of yeasts. This may

be accomplished by the heterologous expression of genes involved in

D-xylose metabolism.

For example, it has been shown that recombinant Saccharomyces cerevisiae transformed

with heterologous genes for XR, XDH and XK is capable of fermenting xylose to ethanol

(Hahn-Hägerdal et al., 2001). Likewise, XI has also been expressed in S. cerevisiae for the

same purpose (Kuyper et al., 2005). The genes encoding the enzymes involved in fungal

D-

xylose catabolism have been isolated from different yeasts (Jeffries and Shi, 1999). In C.

tropicalis, only the gene for XR has been cloned so far (Yokoyama et al., 1995). The gene

encoding XDH has been cloned from other yeasts: Galactocandida mastotermitis

(Habenicht, et al., 1999), Pichia stipitis (Shi et al., 2000), Arxula adeninivorans (Böer et

al., 2005) and S. cerevisiae (Richard et al., 1999).

XDH (xylitol:NAD

-2-oxidoreductase; EC 1.1.1.9) is a member of the medium chain

dehydrogenase (MDR) family and the polyol dehydrogenase (PDH) subfamily. Most PDHs

catalyze strict NAD

(H)-dependent interconversion between alcohols and their corresponding

ketones or aldehydes (Watanabe et al., 2005). XDHs from some filamentous fungi and yeasts

have already been studied (Persson et al., 1993; Phadtare et al., 1997; Richard et al., 1999;

Yablochkova et al., 2003; Seiboth et al. 2003) however the structural and functional

properties of yeast XDH have not yet been investigated in detail.

Here we present the results on the cloning and characterization of the C. tropicalis

XYL2 gene encoding XDH, hereafter named Xyl2. Furthermore, we provide the structural

analysis of Xyl2 based on the three-dimensional model obtained by molecular modeling.

Page 3 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

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Materials and Methods

Strains and media

The yeast C. tropicalis FTI 20037, previously Candida guilliermondii FTI 20037 (Lima et

al., 2003), was used as a source of genomic DNA. C. tropicalis was routinely cultivated on

YP medium (yeast extract 1 %, peptone 2 %) supplemented with the appropriate carbon

source at the concentration of 2 %. The S. cerevisiae strain used as a host to express XYL2

was RE1006 (MATa can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52). S. cerevisiae was

cultivated on YPD (YP plus dextrose 2 %) or minimum medium (yeast nitrogen base

without amino acids 0.67 %, dextrose 2 % supplemented with the required amino acids)

media. Escherichia coli DH5α was used as host for molecular cloning procedures. E. coli

transformed with plamids was cultivated on LB medium (tryptone 1 %, yeast extract 0.5 %,

NaCl 1 %) containing ampicillin (100 µg/mL).

PCR

Primers used for amplification of C. tropicalis XYL2 gene sequences are listed in Table 1.

PCR was carried out in a 25 µL volume with: 0.2 mM dNTP, 3.5 mM MgCl

, 3 µM each

primer, Taq polymerase buffer 1X, 2U Taq polymerase (Cenbiot, Brazil) and 0.5 µg yeast

genomic DNA as template. Reaction mixtures were subjected to 30 amplification cycles,

Page 4 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

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each cycle being: 95 °C/1 min; 55 °C/90 s; 72 °C/90 s. Amplicons were visualized by

electrophoresis on agarose gel (1 % w/v). Inverse PCR was used for the amplification of the

5´ and 3´ regions of XYL2. Briefly, total genomic DNA was digested with EcoRI (Promega)

followed by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation. Digested DNA was self-

ligated at a concentration of 0.5 µg/mL with 0.01 Weiss unit of T4 DNA ligase (Promega)

for 16 hours at 16 °C. The ligation mixture was extracted with phenol/chloroform,

precipitated with ethanol, and resuspended in sterile distilled water to the concentration of 20

ng/µL. Inverse PCR was carried out with primers xyl2F2 and xyl2R2 (Table 1).

Southern and Northern blotting

Southern and Northern blotting were carried out as described previously (Sambrook et al.,

1989). A single colony of C. tropicalis was inoculated in 5 mL YPD and grown for 16 hr at

30 °C and subsequently shifted to 50 mL YP supplemented with glycerol, glucose or xylose

and grown until exponential phase (OD

600

~ 0,9). Cells were harvested, washed in sterile

water, frozen, and ground in liquid nitrogen. Total RNA was purified using RNeasy mini kit

(Qiagen Inc.) and ~10 µg were analyzed by electrophoresis in an agarose-formaldehyde gel

(1 % w/v). Genomic DNA for Southern blotting was extracted as described previously

(Burke et al., 2000). Briefly, 10 µg of genomic DNA were digested with different restriction

enzymes and separated in an agarose gel (1 % w/v). Both digested DNA and total RNA were

transferred to a nitrocellulose membrane (Hybond-N) and hybridization was carried out at 55

°C. For both Southern and Northern blotting a ~1.1 kb DNA fragment containing the entire

Page 5 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

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XYL2 ORF was used as a probe. DNA probe labeling was performed using the AlkPhos

Direct kit (GE Healthcare) and detection was done using CDP-Star (GE Healthcare).

DNA sequencing and gene analysis

PCR products were cloned into the commercial vector pCR

2.1-TOPO

(Invitrogen).

Plasmid DNA was prepared with the Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega). Cycle

sequencing was performed using the MegaBACE Dye Terminator procedure (GE

Healthcare) and reactions were analyzed in a MegaBACE 1000 automatic DNA sequencer

(GE Healthcare). The web interfaces at the National Center for Biotechnology Information

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and Broad Institute

(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/candida_tropicalis/ ) were used to conduct the

search for database similarity using BLAST search tools (Altschul et al., 1990). TATA-like

elements prediction was made using the HCtata program - Hamming-Clustering Method for

TATA Signal Prediction in Eukaryotic Genes

(http://l25.itba.mi.cnr.it/~webgene/wwwHC_tata.html). Poly(A) signal prediction was made

using the program HCpolya - Hamming Clustering poly-A prediction in Eukaryotic Genes -

(http://l25.itba.mi.cnr.it/~webgene/wwwHC_polya.html). Putative transcription factor motifs

were identified using TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) and

MatInspector (http://www.genomatix.de/shop/index.html) tools.

Heterologous expression of XYL2 and enzymatic assays

Page 6 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

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In order to express XYL2, the entire ORF was amplified by PCR from the C. tropicalis

genome using primers 5xyl2 and 3xyl2 which contain BamHI sites at their ends (Table 1 and

Fig.1). The resulting amplicon was also used as probe in the Northern and Southern blotting

experiments. The XYL2 ORF amplicon was cloned into pCR

2.1-TOPO

(Invitrogen)

resulting in plasmid pCRXYL2. This vector was cut with BamHI and the ~1.1 kb XYL2 ORF

was gel-purified and cloned into the yeast expression vector YEp352PGK (Xavier, 2003)

linearized with BglII. YEp352PGK is YEp352 with the PGK1 expression cassette from

pMA91cloned into the HindIII site. S. cerevisiae RE1006 was transformed as previously

reported (Elble, 1992). Transformed cells were selected on minimum medium plates lacking

uracil and supplemented with the appropriate amino acids. Transformed cells were grown to

exponential phase in 50 mL SD medium and crude extracts for enzyme measurements were

made according to Eliasson et al. (2000). C. tropicalis extracts were derived from cells

grown in 50 mL YP-xylose until exponential phase. Protein concentration was measured

according to Bradford (1976). XDH activity was measured as described by Lima et al.

(2004). Enzyme units were defined as µmol of NAD

reduced per minute at room

temperature.

Domain analysis and sequence alignment

Domain organization and protein classification of Xyl2 were checked using the tools

available at the PFAM (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) and PROSITE

(http://www.expasy.ch) websites, respectively. The secondary structure predictions used as

additional information to check the sequence alignments were obtained from NPS

(http://pbil.ibcp.fr). Homologous proteins were found from an extensive sequence

Page 7 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

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alignment against the protein data bank (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb) using Blastp

software (http://www.expasy.org/tools/blast). Multiple sequence alignment was performed

using ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw) with selected homologous proteins and

analyzed according to features of medium-chain and short-chain alcohol dehydrogenases.

The structural model for Xyl2 was obtained by homology modeling using the EsyPred-3D

server (http://www.fundp.ac.be/urbm/bioinfo/esypred/) (Lambert et al., 2002). All

structural features were analyzed using the Pymol (http://pymol.sourceforge.net) and VMD

(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) programs. The Xyl2/NAD

/zinc complex was

modeled by superimposing the three-dimensional structure of human sorbitol

dehydrogenase (hSDH) in complex with NAD

and a zinc ion. The energy refinement of

the Xyl2/NAD

/zinc complex model was performed using molecular mechanics tools

available on SPDBV (Swiss PDB Viewer) with Gromos96 package (Guex and Peitsch,

1997). Steepest descent (SD) and conjugate gradients (CG) algorithms were used

successively in eight minimization steps with 10,000 iterations each: three steps of SD

followed by five steps of CG, using the maximum derivative of 0.050 kJ/mol.

Structural comparisons and analyses

Xyl2 structural neighbors search was performed with the Vector Alignment Search Tool

(VAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml] - Gibrat et al., 1996).

The selected three-dimensional structures of alcohol dehydrogenases from PDB (1PL8,

1PL6, 1E3J, 1RJW, and 1LLU [Pauly et al., 2003; Banfield et al., 2001; Ceccarelli et al.,

2004; Levin et al., 2004]) were superimposed to Xyl2 according to the backbone of the

entire chain, and the NAD

and zinc binding domains using MultiProt server

Page 8 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

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(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt) and the r.m.s.d. family of overall was generated.

Additionally, in order to analyze the structural changes of the domains involved in the

complex with NAD

and zinc, the three-dimensional structures were superimposed

considering the assembly of Xyl2 residues with a cut-off of approximately 5 Å around the

coenzyme and ion. For this purpose we used the CCP4 (Collaborative Computational

Project, 1994) program package (http://www.ccp4.ac.uk/main.html).

Results

Isolation of the C. tropicalis XYL2 gene

In order to obtain a fragment of the XYL2 gene from C. tropicalis genomic DNA,

degenerated primers 5XDH and 3XDH (Table 1) were designed based on the sequence

alignment of homologous genes from the yeasts G. mastotermitis and P. stipitis. A ~700 bp

amplicon was cloned and the identity of the XYL2 gene was confirmed by DNA

sequencing. The sequence obtained showed identities of 67 % and 48 % to the XYL2 genes

from P. stipitis and G. mastotermitis, respectively. Based on the obtained sequence, a pair

of primers (xyl2F2 and xyl2R2; Table 1) specific to the XYL2 gene was synthesized. These

primers were used to clone the 5´ and 3´ sequences of XYL2 by the inverse PCR procedure

using ligated EcoRI-fragments derived from C. tropicalis genomic DNA as template. An

amplification product of 980 bp was obtained and DNA sequencing analysis showed that it

contained the remaining flanking sequences of XYL2. The C. tropicalis XYL2 gene consists

of a 1092-pb intronless ORF which codes for a 364 residues polypeptide (Fig. 1) with a

predicted molecular mass of 40 kDa and isoelectric point of 6.8. The complete XYL2 ORF

Page 9 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

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sequence is identical to a sequence not yet annotated from the C. tropicalis genome

database (Broad Institute). The predicted primary sequence of the protein exhibits high

identity to the XDHs from P. stipitis (84 %); G. mastotermitis (68 %); A. adeninivorans (65

%); Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger (64 %); S. cerevisiae (62

%) and Hypocrea jecorina (61 %).

The XYL2 flanking regions presented several motifs frequently found in other yeast

genes (Fig. 1). The consensus sequence TATAAA responsible for correct transcription

initiation in S. cerevisiae (Rathjen and Mellor, 1990) is present at position -100 relative to

the initiation codon. Four putative target sequences for Mig1 (GGGG) were observed in the

XYL2 5´ upstream sequence. Other relevant motifs detected were the binding sites for Gcr1

(ACCTTCCT) and Rap1 (ACCCA). A sequence similar to the typical polyadenylation

signal TCAGTAAAGC found in yeast genes (Guo and Sherman, 1995) was observed in the

3' UTR region. A Southern blotting analysis using genomic DNA digested with different

restricition enzymes and probed with XYL2 showed that the resulting band pattern is

consistent with XYL2 being a single-copy gene (Fig. 2a).

XYL2 regulation and heterologous expression

Transcriptional regulation of XYL2 by the carbon source was investigated in C. tropicalis

by Northern blotting analysis. The data shows that the expression of XYL2 is adaptive with

xylose as the prime inducer of XYL2 expression. Glycerol promoted basal levels of

expression and whereas glucose repressed XYL2 expression (Fig. 2b). The in vivo

functional analysis of XYL2 was performed in S. cerevisiae. The XYL2 ORF was cloned

into YEpPGK resulting in plasmid YEpXYL2 (Fig. 3). The gene was placed under the

Page 10 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

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control of the strong constitutive PGK1 promoter from S. cerevisiae and XDH activity was

determined in crude yeast extracts. The XDH activity for a control S. cerevisiae strain

transformed with YEpPGK was 0.018 U/mg whereas a recombinant strain expressing XYL2

showed activity of 0.159 U/mg.

Structural and functional analysis of Xyl2

Using the VAST search tool, an amino acid sequence alignment with selected structural

templates related to Xyl2 was obtained (Fig. 4 and Table 2). According to this alignment,

hSDH (1PL6 and 1PL8) and KR (1E3J-A) show more sequence identity with Xyl2 (Table

2). In addition, PROSITE sequence analysis indicated that Xyl2 presents the zinc-

containing alcohol dehydrogenases signature [GHE]xx[G]xxxxx[G]xx[V], the active site

for one zinc ion (residues Cys

, His

, Glu

, and Glu

159

) and the active site for NAD

binding (residues Val

187

, Asp

207

, Lys

212

, Cys

252

, Lys

, Asn

277

and Ser

299

) (Fig. 4). The

structural model of Xyl2 obtained by molecular homology modeling in the EsyPred 3D

server is presented in Fig. 5 with both NAD

and zinc domains presented separately. This

model consists of one polypeptide chain with 364 residues structurally organized in a

classical α/β Rossmann fold pattern - commonly found in the MDR family (Pauly et al.,

2003) - organized in two β-barrel domains: the coenzyme binding (residues 163-300) and

catalytic (residues 1-162, 301-364) domains (Fig. 5a and 5c). The close three-dimensional

structural relationship between Xyl2 and all analyzed structures calculated by VAST

algorithm was evidenced by the C

superimposed models (data not shown) and the r.m.s.d.

values presented in Table 2.

Page 11 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

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The NAD

and zinc ion bound to Xyl2 model obtained by docking and minimization

procedures (Fig. 5b and 5d) is similar to ADHs related to the MDR family as judging by

the low r.m.s.d. values of 0.5-1.2 Å (NAD

) and 0.3-2.0 Å (zinc), respectively. All MDR

selected by VAST search bind NAD

or NADP

in the same structural region and most

contain a bound zinc ion that is essential for catalysis. The highest structural similarity is

observed for hSDH/NAD

, hSDH/NADH/Inhibitor complex and KR, with r.m.s.d. of 0.6-

0.8 Å, whereas the ADH from Bacillus stearothermophilus and the NAD

/substrate ADH

from Pseudomonas aeruginosa shared the lowest structural similarity, with r.m.s.d. of 1.7

Å (Table 2). NAD

interaction in Xyl2 could occur mainly with the side chains of the

Val

187

, Asp

207

, Lys

212

, Cys

252

, Asn

277

and Ser

299

into a surface crevice formed by loops

protruded from the top of six β-strands, a domain formed by parallel β-strand sheets

(residue 180 to 310) (Fig. 5a). As proposed by the Xyl2 structural model, the interface

between NAD

and Xyl2 (Fig. 5b) is characterized by the following interaction: the critical

conserved Asp

207

residue, which determines the specificity for NAD

in all members of the

MDR family, makes hydrogen bonds to the nitrogen AN3 of the adenine ribose; the amino

group of Lys

212

binds to the 3’ oxygen of the ribose ring; the NH group and carbon CG2 of

Val

187

neutralize two of the phosphate oxygens in NAD

; the Cys

252

interacts with the NC4

of the ribose ring and the oxygen group of Ser

299

as well the nitrogen group of Ans

277

bind

to the NN7 of nicotinamide amine group of the coenzyme.

As shown in the sequence alignment (Fig. 4) and in the structural model (Fig. 5), the

catalytic domain of Xyl2 contains a single zinc ion binding site located at the bottom of the

cleft between the NAD

binding and catalytic domains. The conserved residues

participating in this interaction in hSDH are Cys

, His

, Glu

155

, and a water

molecule (Pauly et al., 2003). In Xyl2, the zinc ion presents coordination with His

, Glu

Page 12 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

and Glu

159

without the water molecule since the minimized model was obtained in a

vacuum system (Fig. 5c). In this case, the hydrogen bond between Glu

159

and the zinc atom

occurs directly without the participation of related Cys found in hSDH. The

superimposition of Xyl2 to these structural neighbors indicates that the active binding site

for NAD

and zinc ion in both coenzyme binding and catalytic domains retains identical

three-dimensional arrangement and fulfils the distance requirements for interaction of both

components.

The structural features proposed above were corroborated by experimental data

obtained from enzymatic assays in which it was demonstrated the requirements of NAD

(Silva et al., 1996) and zinc (Fig. 6a and 6b) for Xyl2 activity in C. tropicalis. The XDH

assay is normally carried out without zinc since it is assumed that the enzyme is already

complexed with this ion in crude extracts. The effect of EDTA, a divalent chelating agent,

was followed by measuring the reduction of NAD

at 340 nm (Fig. 6a). EDTA 1 mM had a

strong effect on Xyl2 decreasing its activity by ~90 % (Fig. 6b).

Discussion

In this work we have presented data concerning the cloning of the C. tropicalis XYL2 gene

which codes for a key enzyme in xylose metabolism in yeasts. The gene showed several

features in common with other fungal XDHs. The protein coded by XYL2 is closely related

to its functional homologue from P. stipitis (84 % similarity) molecular mass and

isoelectric point quite similar to those of other fungal XDHs (Shi et al., 2000; Seiboth et al.,

2003). The XYL2 gene is present as a single copy in the C. tropicalis genome, an

observation also reported for the homologous genes from A. adeninivorans (Böer et al.,

Page 13 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

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2005) and H. jecorina (Seiboth et al., 2003). Several regulatory protein binding sites were

identified in the XYL2 promoter region including those for Gcr1 and Rap1 - which are

essential to achieve high-level activation of glycolytic genes in S. cerevisiae (Sasaki et al.,

2005) - and Mig1, a Cys2-His2 zinc finger protein that mediates glucose repression of

several genes by binding to their promoters and recruiting the general repression complex

(De Vit et al., 1997).

It has previously been shown that XR and XDH activities are induced by xylose and

inhibited by hexoses (Skoog and Hahn-Hägerdal, 1988; Webb and Lee, 1992). In C.

tropicalis, XYL2 was induced by xylose and repressed by glucose (Fig 2b), an expression

pattern also described for the XDH genes from H. jecorina and A. adeninivorans (Seiboth

et al., 2003; Böer et al., 2005) and for two other genes of the xylose catabolic pathway from

A. niger: XR and xylulose-5-phosphate kinase (Hasper et al., 2000; van Peij et al., 1998).

The lack of XYL2 expression on glucose is an evidence of glucose repression, which is

supported by the presence of Mig1 binding sites in the 5´ region of XYL2.

The cloning and successful heterologous expression of XYL2 represent the first steps

towards metabolic engineering in S. cerevisiae using genes derived from C. tropicalis.

Walfridsson et al. (1997) have expressed in S. cerevisiae the genes for XR and XDH from

P. stipitis and the resulting strain was able to produce ethanol from xylose. The gene coding

XR from C. tropicalis FTI 20037 has recently been cloned in our lab (data not shown) and

the construction of a S. cerevisiae strain expressing both XR and XDH is currently

underway. Furthermore, the production of xylitol in C. tropicalis FTI 20037 - which is

recognized as one of the most promising systems for the production of xylitol (Silva et al.,

1996; Oh and Kim, 1998) - could be further improved by manipulating the expression of

XR and XDH in this organism.

Page 14 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

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Structural neighbors search revealed that Xyl2 is structurally related to dehydrogenases

which catalyze the oxidation of sorbitol to fructose using NAD

as a coenzyme. Sequence

alignment also showed that Xyl2 has the typical signature of alcohol dehydrogenases

belonging to the MDR family and the binding sites for NAD

and one zinc ion. In general,

dehydrogenases have different but conserved amino acids that bind NAD

/NADH or

NADP

/NADPH coenzyme complexes, and differ in the number of zinc-binding sites. In

KR (Banfield et al., 2001), which binds NADP

, there are two zinc-binding sites instead of

one as identified in Xyl2 and in all members of the MDR family (Fig. 4). Moreover, Asp

207

in Xyl2, and Ala

199

, in KR, are crucial to determine the coenzyme specificity for NAD

and

NADP

, respectively (Fig. 4).

The predicted specificity for NAD

proposed in this model is in agreement with the

biochemical characterization of Xyl2 which showed that it has higher affinity for NAD

over NADP

(Silva et al., 1996; Takamizawa et al., 2000). The requirement for zinc was

demonstrated by enzymatic assays in the presence of EDTA which showed strong

inhibition on Xyl2 activity. The same feature was observed with XDH from G.

mastotermitis, a zinc-dependent tetrameric polyol dehydrogenase (Lunzer et al., 1998).

Based on the high structural similarities of the models presented on Table 2 and the

previously and current experimental data which showed that Xyl2 is a NAD

/zinc-binding

protein (Fig. 6a and 6b), we propose that Xyl2 from C. tropicalis belongs to the MDR

family.

Acknowledgments

Page 15 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

The authors thank PIBIC/CNPq for partial support of this work and Hugo Costa Paes for

text draft revision.

References

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic local alignment

search tool. J Mol Biol 215:403-410

Banfield MJ, Salvucci ME, Baker EN (2001) Crystal structure of the NADP(H) dependent

ketose reductase from Bemisia argentifolii at 2.3 Å resolution. J Mol Bio 306: 239-250

Böer E, Wartmann T, Schmidt S, Bode R, Gellissen G, Kunze G (2005) Characterization of

the AXDH gene and the encoded xylitol dehydrogenase from the dimorphic yeast

Arxula adeninivorans. Antonie van Leeuwenhoek 87:233-243

Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle for protein-dye binding. Anal Biochem

72:248-254

Burke D, Dawson D, Stearns T (2000) Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor

Laboratory Course Manual, 205 pp Cold Spring Harbor Laboratory Press. Peter

Sudbery, New York

Page 16 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Ceccarelli C, Liang ZX, Strickler M, Prehna G, Goldstein BM, Klinman JP, Bahnson BJ

(2004) Crystal structure and amide H/D exchange of binary complexes of alcohol

dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus: insight into thermostability and

cofactor binding. Biochem 11:5266-5277

Collaborative computational project, number 4 (1994) The CCP4 Suite: Programs of

Protein Crystallography. Acta Cryst D50:760-763

Craft DL, Madduri KM, Eshoo M, Wilson CR (2003) Identification and characterization of

the CYP52 family of Candida tropicalis ATCC 20336, important for the conversion of

fatty acids and alkanes to alpha,omega-dicarboxylic acids. Appl Environ Microbiol

69:5983-5891

De Vit MJ, Waddle JA, Johnston M (1997) Regulated nuclear translocation of the Mig1

glucose repressor. Mol Biol Cell 8:1603-1618

Eliasson A, Christensson C, Wahlbom CF, Hahn-Hägerdal B (2000) Anaerobic Xylose

fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae carrying XYL1, XYL2, and

XKS1 in mineral medium chemostat cultures. Appl Environ Microbiol 66:3381-3386

Elble R (1992) A simple and efficient procedure for transformation of yeasts.

Biotechniques 13:18-20

Page 17 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Gibrat JF, Madej T, Bryant SH (1996) Surprising similarities in structure comparison. Curr

Opin Struct Biol 6:377-385

Guo Z, Sherman F (1995) 3’-end-forming signals of yeast mRNA. Mol Cell Biol 15:5983-

5990

Guex N, Peitsch MC (1997) Swiss-Model and the Swiss-PdbViewer: An environment for

comparative protein modeling. Electrophoresis 18:2714-2723

Habenicht A, Motejadded H, Kiess M, Wegerer A, Mattes R (1999) Xylose utilization:

cloning and characterization of the xylitol dehydrogenase from Galactocandida

mastotermitis. Biol Chem 380:1405-1411

Hahn-Hägerdal B, Wahlbom CF, Gardonyi M, van Zyl WH, Cordero Otero RR, Jonson LJ

(2001) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization. Adv

Biochem Eng Biotechnol 73:53-84

Harhangi HR, Akhmanova AS, Emmens R, van der Drift C, de Laat WT, van Dijken JP,

Jetten MS, Pronk JT, Op den Camp HJ. (2003) Xylose metabolism in the anaerobic

fungus Piromyces sp. strain E2 follows the bacterial pathway. Arch Microbiol 180:134-

141

Page 18 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Hasper AA, Visser J, de Graaff LH (2000) The Aspergillus niger transcriptional activator

XlnR, which is involved in the degradation of the polysaccharides xylan and cellulose,

also regulates

D-xylose reductase gene expression. Mol Microbiol 36:193-200

Jeffries TW, Shi NQ (1999) Genetic engineering for improved xylose fermentation by

yeasts. Adv Biochem Eng Biotechnol 65:117-161

Kim TB, Lee YJ, Kim P, Kim CS, Oh DK. (2004) Increased xylitol production rate during

long-term cell recycle fermentation of Candida tropicalis. Biotechnol Lett 26:623-627

Kuyper M, Hartog MM, Toirkens MJ, Almering MJ, Winkler AA, van Dijken JP, Pronk JT

(2005) Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces

cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation. FEMS Yeast Res 5:399-409

Lambert C, Leonard N, De Bolle X, Depiereux E (2002) ESyPred3D: Prediction of proteins

3D structure. Bioinformatics 18:1250-1256

Levin I, Meiri G, Peretz M, Burstein Y, Frolow F (2004) The ternary complex of

Pseudomonas aeruginosa alcohol dehydrogenase with NADH and ethylene glycol.

Protein Sci 13:1547-1556

Lima LHA, Felipe MGA, Torres FAG (2003) Reclassification of Candida guilliermondii

FTI 20037 as Candida tropicalis based on molecular phylogenetic analysis. Braz J

Microbiol 34:96-98

Page 19 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Lima LHA, Felipe MGA, Vitolo M, Torres FAG (2004) Effect of acetic acid present in

bagasse hydrolysate on the activities of xylose reductase and xylitol dehydrogenase in

Candida guilliermondii. Appl Microbiol Biotechnol 65:734-738

Lunzer R, Mamnun Y, Haltrich D, Kulbe KD, Nidetzky B (1998) Structural and functional

properties of a yeast xylitol dehydrogenase, a Zn

-containing metalloenzyme similar to

medium-chain sorbitol dehydrogenases. Biochem J 336:91-99

Makinen KK (2000) Can the pentitol-hexitol theory explain the clinical observations made

with xylitol? Med Hypotheses 54:603-613

Oh DK, Kim SY (1998) Increase of xylitol yield by feeding xylose and glucose in Candida

tropicalis. Appl Microbiol Biotechnol 50:419-25

Pauly TA, Ekstrom JL, Beebe DA, Chrunyk B, Cunningham D, Griffor M, Kamath A, Lee

SE, Madura R, Mcguire D, Subashi T, Wasilko D, Watts P, Mylari BL, Oates PJ,

Adams PD, Rath VL (2003) X-Ray crystallographic and kinetic studies of human

sorbitol dehydrogenase. Structure 11:1071-1085

Persson B, Hallborn J, Walfridsson M, Hahn-Hägerdal B, Keranen S, Penttila M, Jornvall

H (1993) Dual relationships of xylitol and alcohol dehydrogenases in families of two

protein types. FEBS Lett 324:9-14

Page 20 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Phadtare, S.U., Rawat, U.B., Rao, M.B. (1997) Purification and characterization of xylitol

dehydrogenase from Neurospora crassa. FEMS Microbiol Lett 146, 79-83.

Rathjen J, Mellor J (1990) Characterization of sequences required for RNA initiation from

the PGK promoter of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 18:3219-3225

Richard P, Toivari MH, Penttila M (1999) Evidence that the gene YLR070c of

Saccharomyces cerevisiae encodes a xylitol dehydrogenase. FEBS Lett 457:135-138

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.

Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NewYork

Sasaki H, Kishimoto T, Mizuno T, Shinzato T, Uemura H (2005) Expression of GCR1, the

transcriptional activator of glycolytic enzyme genes in the yeast Saccharomyces

cerevisiae, is positively autoregulated by Gcr1p. Yeast 22:305-319

Seiboth, B, Hartl, L, Pail, M, Kubicek CP (2003)

D-Xylose metabolism in Hypocrea

jecorina: loss of the xylitol dehydrogenase step can be partially compensated for by

lad1-encoded l-arabinitol-4-dehydrogenase. Eukaryot Cell 2:867-875

Shi NQ, Prahl K, Hendrick J, Cruz J, Lu P, Cho JY, Jones S, Jeffries T (2000)

Characterization and complementation of a Pichia stipitis mutant unable to grow on D-

xylose or L-arabinose. Appl Biochem Biotechnol 84-86:201-216

Page 21 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Silva SS, Vitolo M, Pessoa-Junior A, Felipe MGA (1996) Xylose reductase and xylitol

dehydrogenase activities by xylose-fermenting Candida guilliermondii. J Basic

Microbiol 36:187-191

Skoog K, Hahn-Hägerdal B (1988) Xylose fermentation. Enzyme Microb Technol 10:66-80

Takamizawa K, Uchida S, Hatsu M, Suzuki T, Kawai K (2000) Development of a xylitol

biosensor composed of xylitol dehydrogenase and diaphorase. Can J Microbiol 46:350-

357

van Peij NN, Gielkens MM, de Vries RP, Visser J, de Graaff LH (1998) The transcriptional

activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in

Aspergillus niger. Appl Environ Microbiol 64:3615-3619

Walfridsson M, Anderlund M, Bao X, Hahn-Hägerdal B (1997) Expression of different

levels of enzymes from the Pichia stipitis xyl1 and xyl2 genes in Saccharomyces

cerevisiae and its effects on product formation during xylose utilisation. Appl

Microbiol Biotechnol 48:218-224

Watanabe S, Kodaki T, Makino K (2005) Complete reversal of coenzyme specificity of

xylitol dehydrogenase and increase of thermostability by the introduction of structural

zinc. J Biol Chem 280:10340-10349

Page 22 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Webb SR, Lee H (1990) Regulation of D-xylose utilization by hexoses in pentose-

fermenting yeasts. Biotechnol Adv 8:685-697

Webb SR, Lee H (1992) Characterization of xylose reductase from the yeast Pichia stipitis:

evidence for functional thiol and histidyl groups. J Gen Microbiol 138:1857-1863

Wolf K (ed) (1996) Nonconventional yeasts in biotechnology. A handbook. Springer-

Verlag. Berlin and Heidelberg

Xavier MAS (2003) Desenvolvimento de tecnologia para produção de calcitonina humana

por engenharia genética. PhD thesis. Universidade de Brasília. Brazil

Yablochkova EN, Bolotnikova OI, Mikhailova NP, Nemova NN, Ginak A (2003) The

activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase in yeasts. Microbiology 72:414-

417

Yokoyama S, Kinoshita Y, Suzuki T, Kawai K, Horitsu H, Takamizawa R (1995) Cloning

and sequencing of two D-xylose reductase genes (xyra and xyrb) from Candida

tropicalis. J Ferment Bioeng 80:603-605

Page 23 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Figure Legends

Fig. 1 Nucleotide sequence of the XYL2 gene from C. tropicalis and its deduced amino acid

sequence. The 5´/3´ untranslated and coding regions are represented by small letters and

capital letters, respectively, and the asterisk indicates the stop codon. Arrows indicate the

annealing position and direction of extension of the primers used in this work. Nucleotides

in the filled box represent the proposed TATA box in the 5’ region, and the polyadenylation

site in the 3’ region. The putative zinc-ADH signature (positions 65-79) and the NAD

binding site (positions 179-208) are in bold. Binding sites for transcriptional regulators are

indicated by the underlines. The sequence was deposited on GenBank under the Accession

No. DQ220745.

Fig. 2 Copy number and expression analysis of XYL2. a Southern blotting of C. tropicalis

DNA digested with EcoRI (lane 1), EcoRV (lane 2), HindIII (lane 3). b Northern blotting

analysis of XYL2 expression in different carbon sources. 28S ribosomal RNA was used as a

loading control.

Fig. 3 Physical map of plasmid YEpXYL2 used to express XYL2 in S. cerevisiae RE1006.

Only relevant restriction sites are shown. p

PGK

and TT represent the promoter and

transcription terminator sequences of the yeast PGK1 gene, respectively.

Page 24 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig. 4 Sequence alignment of Xyl2 and members of the medium-chain zinc-binding family.

Amino acids within the gray box represent the signature of alcohol dehydrogenases

belonging to the MDR family. The residues involved in binding the catalytic zinc are

indicated by arrows. The second structural zinc binding residues of KR (1E3J) are shown

within squares and those residues involved in the coenzyme binding, for all MDR

members, are indicated by asterisks. 1PL8-D: hSDH/NAD

; 1PL6-D:

hSDH/NADH/Inhibitor complex; 1E3J-A: Ketone Reductase (KR); 1RJW-D: Alcohol

Dehydrogenase (ADH); 1LLU-H: ADH/NAD

/Substrate complex.

Fig. 5 Three-dimensional model for Xyl2 obtained by molecular modeling. a NAD

domain, represented in cartoon diagram, constituted by motifs α and β in a typical Rossman

fold pattern. b Detail of the NAD

binding site in which residues participating in the

interaction are Val

187

, Asp

207

, Lys

212

, Cys

252

Asp

277

and Ser

299

. c Zinc binding domain with

residues interacting with the zinc represented in dark gray. d Detail of the zinc binding-site

showing the coordination of zinc with Glu

, His

and Glu

159

residues.

Fig 6 Effect of EDTA on the activity of Xyl2. a Measurement of NAD

reduction (A

340nm

)

in the presence (closed triangles) or absence (closed circles) of EDTA 1mM. b XDH

activity in different concentrations of EDTA.

Page 25 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig. 1 Nucleotide sequence of the XYL2 gene from C. tropicalis and its deduced amino acid

sequence. The 5´/3´ untranslated and coding regions are represented by small letters

and capital letters, respectively, and the asterisk indicates the stop codon. Arrows

indicate the annealing position and direction of extension of the primers used in this

work. Nucleotides in the filled box represent the proposed TATA box in the 5' region, and

the polyadenylation site in the 3' region. The putative zinc-ADH signature (positions 65-

79) and the NAD

-binding site (positions 179-208) are in bold. Binding sites for

transcri

tional re

ulators are indicated b

the underlines. The se

uence was de

osited on

GenBank under the Accession No. DQ220745.

Page 26 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig. 2 Copy number and expression analysis of XYL2. a Southern blotting of C. tropicalis

DNA digested with EcoRI (lane 1), EcoRV (lane 2), HindIII (lane 3). b Northern blotting

analysis of XYL2 expression in different carbon sources. 28S ribosomal RNA was used as

a loading control.

Page 27 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig. 3 Physical map of plasmid YEpXYL2 used to express XYL2 in S. cerevisiae RE1006.

Only relevant restriction sites are shown. p

PGK

and TT represent the promoter and

transcription terminator sequences of the yeast PGK1 gene, respectively.

Page 28 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig. 4 Sequence alignment of Xyl2 and members of the medium-chain zinc-bindin

famil

Amino acids within the gray box represent the signature of alcohol dehydrogenases

belonging to the MDR family. The residues involved in binding the catalytic zinc are

indicated by arrows. The second structural zinc binding residues of KR (1E3J) are shown

within squares and those residues involved in the coenzyme binding, for all MDR

members, are indicated by asterisks. 1PL8-D: hSDH/NAD

; 1PL6-D:

hSDH/NADH/Inhibitor complex; 1E3J-A: Ketone Reductase (KR); 1RJW-D: Alcohol

Dehydrogenase (ADH); 1LLU-H: ADH/NAD

/Substrate complex

Page 29 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig. 5 Three-dimensional model for Xyl2 obtained by molecular modeling. a NAD

domain,

represented in cartoon diagram, constituted by motifs and in a typical Rossman fold

pattern. b Detail of the NAD

binding site in which residues participating in the

interaction are Val

187

,Asp

207

,Lys

212

,Cys

252

Asp

277

and Ser

299

. c Zinc binding domain with

residues interacting with the zinc represented in dark gray. d Detail of the zinc binding-

site showing the coordination of zinc with Glu

,His

and Glu

159

residues.

Page 30 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Fig 6 Effect of EDTA on the activity of Xyl2. a Measurement of NAD

reduction (A

340nm

)

in the presence (closed triangles) or absence (closed circles) of EDTA 1mM. b XDH

activity in different concentrations of EDTA.

Page 31 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Table 1 Primers used for XYL2 amplification

Primer Sequence (5’→3’)

5XDH CAATGGTCYTKGGTCACGAATC

3XDH GWAWCCRTATCTGAAAGAWCC

xyl2F2 CAGTTGTTTTGGAATGTAGTGG

xyl2R2 TGGGGTGGCGGCAAAAGACA

5xyl2 CGGATCC

GTCATGACTGCAAACCCATC

3xyl2 CGGATCC

CTATTCTGGACCATCAATTAAAC

BamHI restriction sites are underlined

Page 32 of 33Applied Microbiology and Biotechnology

For Peer Review

Table 2 Structural neighbors of Xyl2 from Vector Alignment Search Tool (VAST)

PDB CODE

Identity

(%)

Conserved

residues (%)

RMSD

1PL8-D hSDH/NAD

(Pauly et al., 2003) 36 55 0.6

1PL6-D hSDH/NADH/Inhibitor complex (Pauly et

al., 2003)

36 54 0.6

1E3J-A KR (Bemisia argentifolli) (Banfield et al.,

2001)

36 55 0.8

1RJW-B ADH (Bacillus stearothermophilus)

(Ceccarelli et al., 2004)

27 43 1.7

1LLU-H NAD

/substrate ADH (Pseudomonas

aeruginosa) (Levin et al., 2004)

24 39 1.7

Page 33 of 33 Applied Microbiology and Biotechnology

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 156

ANEXO 3

Artigo de Divulgação

66 • CIÊNCIA HOJE • vol. 33 • nº 195

PRIMEIRA

LINHA

aumento do consumo de açúcares, em especial

na forma de sacarose (extraída basicamente

da cana-de-açúcar e da beterraba), foi uma das prin-

cipais mudanças nos hábitos alimentares da espé-

cie humana nos últimos séculos. Antes que esse no-

vo item entrasse na dieta cotidiana, a humanidade

consumia açúcares presentes em frutas e outros

alimentos, mas em quantidade muito menor que a

atual. O excessivo volume de açúcar consumido

atualmente vem provocando vários problemas de

saúde, entre os quais se destacam as cáries dentárias

e a obesidade.

Em função desses problemas, muitos estudos vêm

sendo realizados, nos últimos 50 anos, para encon-

trar substitutos que evitem os efeitos indesejáveis

dos açúcares, principalmente da sacarose. Hoje,

muitos adoçantes alternativos, naturais ou artifi-

ciais, já são empregados em variados tipos de ali-

mentos. Um desses compostos é o xilitol, apontado

por muitos pesquisadores como uma opção adequa-

da para substituir a sacarose, pois apresenta doçura

equivalente, tem 33% a menos de calorias e, prin-

cipalmente, não produz cáries e pode ainda rever-

ter lesões iniciais nos dentes.

Adoçante com muitas vantagens

O xilitol é um composto do grupo dos polióis, ou

seja, é um álcool que apresenta, ligado a cada átomo

de carbono (C) de sua molécula, um grupo hidroxila,

formado por um átomo de oxigênio (O) e um de hi-

drogênio (H). Esse álcool tem a fórmula química

(figura 1) e pode ser encontrado em liquens,

fungos, algas e vegetais, e também como um inter-

mediário do metabolismo de carboidratos em ani-

mais, inclusive no homem.

O xilitol foi descoberto em 1891 pelos químicos

Emil Fischer (alemão, 1852-1919) e Gabriel Ber-

trand (francês, 1867-1962), que o prepararam, na

forma de xarope, a partir da reação da xilose (açú-

car obtido da madeira) com amálgama sódica (liga

de mercúrio e sódio). Esse álcool apresenta-se como

Os problemas de saúde associados ao açúcar comum vêm provocando há décadas a busca por substitutos.

Um dos mais pesquisados atualmente é o xilitol, um álcool com o mesmo poder adoçante da sacarose e

sem os seus aspectos inconvenientes. Além disso, diversos estudos têm mostrado que esse composto é

capaz de evitar e até reverter cáries e apresenta outras propriedades benéficas. Por Luanne Helena A.

Lima ([email protected]), do Departamento de Biologia Molecular (doutoranda), e Christian N. Berlinck

([email protected]), do Departamento de Ecologia (mestrando), ambos da Universidade de Brasília.

NUTRIÇÃO Substituto do açúcar apresenta muitas vantagens para consumidores

Xilitol, o adoçante do futuro

PRIMEIRA

LINHA

Figura 1. Esquema da molécula de xilitol (C

)

66 • CIÊNCIA HOJE • vol. 33 • nº 195

PRIMEIRA

LINHA

julho de 2003 • CIÊNCIA HOJE • 67

xilitol pelas mães, durante os últimos meses de

gravidez e amamentação, ajuda a prevenir a trans-

missão de S. mutans para a criança nos seus pri-

meiros seis anos de vida.

O xilitol tem ainda várias aplicações clínicas. É

indicado para substituir os açúcares na dieta de

diabéticos, já que seu metabolismo não ocorre por

vias dependentes de insulina. Também é recomen-

dado para obesos, por ser menos calórico e diminuir

o nível de ácidos graxos livres no sangue. Pode ser

usado no tratamento de desordens metabólicas, como

a anemia hemolítica (causada por deficiência da

enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase). Sua utili-

zação em nutrição parenteral (intravenosa) já é aceita

em muitos países: estudos mostraram que a admi-

nistração de xilitol associado a aminoácidos preser-

va as proteínas do paciente de modo mais eficiente

que o uso apenas de aminoácidos ou destes combi-

nados com glicose.

Outras pesquisas vêm descobrindo novas aplica-

ções para o xilitol. Foi demonstrado que esse álcool

pode ser usado para a prevenção de otite média agu-

da (infecção aguda do ouvido médio) por inibir o

crescimento e a adesão de espécies de Pneumococcus

e a adesão de Haemophilus influenzae em células

da nasofaringe. Testado na forma tanto de xarope

um pó cristalino e branco, sem odor. Suas caracte-

rísticas químicas proporcionam sensação de frescor

quando dissolvido na saliva, efeito explorado em

pastilhas, chicletes e balas. Sua doçura relativa é

igual à da sacarose e superior à de outros polióis,

como sorbitol e manitol, também usados como

adoçantes.

Devido à doçura e ao baixo valor calórico (apenas

2,4 calorias por grama), o xilitol vem sendo usado

como adoçante desde os anos 60 no Japão e em al-

guns países da Europa. Uma vantagem desse com-

posto, em relação a outros adoçantes, é o fato de não

apresentar sensação desagradável após o uso.

Seu emprego também oferece importantes van-

tagens para a indústria alimentícia. Quando proteí-

nas são aquecidas na presença de açúcares reduto-

res, em altas temperaturas, ocorrem reações de

Maillard (caramelização), que provocam o escure-

cimento do produto. O xilitol, por não apresentar

grupos redutores em sua molécula, não participa

dessas reações, evitando assim o efeito do escureci-

mento. Além disso, ele não é fermentado por diver-

sos microrganismos, possibilitando seu uso em pro-

dutos, como refrescos, sem a necessidade de pasteu-

rização e de adição de conservantes, quando este é

estocado por até cinco meses em frascos fechados,

representando uma redução nos custos do processo.

Ainda em relação à indústria alimentícia, esse com-

posto pode substituir a lactose em alimentos infan-

tis, permitindo seu consumo por crianças intoleran-

tes a esse açúcar.

A propriedade cariostática (prevenção de cáries)

desse álcool deve-se ao fato de não ser metabolizado

por microrganismos da biota bucal, principalmen-

te a bactéria Streptococcus mutans (figura 2), o que

impossibilita a proliferação das bactérias e, em con-

seqüência, impede a produção de ácidos que ata-

cam o esmalte dos dentes. Além disso, também pode

ser classificado como anticariogênico, por estimu-

lar a produção de saliva, que possui capacidade

tamponante (manutenção do pH), o que, juntamente

com o aumento na concentração de íons cálcio e

fosfato, induz a remineralização (figura 3), rever-

tendo lesões de cáries recém-formadas.

Pesquisas revelam benefícios

Estudos do finlandês Pentti Alanen e colaboradores,

em 2000, constataram que o consumo diário de chi-

cletes contendo xilitol por crianças de 10 anos redu-

ziu em 53,5% a incidência de cáries (figura 4). Os

efeitos cariostático e anticariogênico vêm impul-

sionando o uso do composto em cremes dentais, an-

ti-sépticos bucais, pastilhas, gomas de mascar e ou-

tros produtos para controle e prevenção de cáries.

Outra pesquisa, realizada por Eva Soderling e co-

laboradores em 2001, descobriu que o consumo de



Figura 2. Efeito do xilitol na inibição do crescimento

Streptococcus mutans

na placa bacteriana

Figura 3. Capacidade de remineralização de lesões

nos dentes pelo uso de chicletes com diferentes

adoçantes

FONTE: ADRIAN MANNING E COLABORADORES, 1992 FONTE: KAUKOMAKINEN E COLABORADORES, 1989

68 • CIÊNCIA HOJE • vol. 33 • nº 195

PRIMEIRA

LINHA

quanto de goma de mascar e pastilhas, o composto

reduziu em 40% a ocorrência de otite em crianças.

Estudos realizados por Pauli Mattila e colabora-

dores em 1998 demonstraram que, graças a uma

dieta suplementada com 10% de xilitol, os ossos de

ratas que tiveram os ovários retirados mantiveram

sua constituição mineral e mostraram densidade e

volume trabecular maiores que animais sem o su-

plemento. O resultado evidenciou que o composto

protege contra a osteoporose (fragilidade dos ossos,

causada pela redução de sua calcificação ou de sua

densidade) decorrente da ausência dos estrógenos

(hormônios produzidos nos ovários), situação simi-

lar à que acontece na menopausa, em mulheres.

A aplicação de xilitol em forma de aerosol tam-

bém pode ajudar a prevenir infecções pulmonares,

inclusive em pacientes com fibrose cística (como a

maioria dos fumantes). Ele reduz o teor de sais no

líquido que recobre as células do revestimento in-

terno dos pulmões, aumentando a atividade antibió-

tica natural do corpo contra as bactérias.

Em organismos superiores o metabolismo do

xilitol ocorre principalmente no fígado, onde, de-

pendendo da necessidade, de 20% a 80% do total

consumido podem ser transformados em glicose.

Como sua absorção é lenta, também pode ser

metabolizado indiretamente pelos microrganismos

presentes no intestino grosso. Geralmente é bem

tolerado pelo organismo humano em doses elevadas

(acima de 200 g por dia), embora em alguns casos

tenha efeito laxativo.

Quanto à segurança do consumo e utilização por

humanos, o xilitol já é aceito pela Comunidade Eco-

nômica Européia desde 1984, enquanto a agência

que regula alimentos e medicamentos nos Estados

Unidos (Food and Drug Administration) o classifica

como “geralmente reconhecido como seguro” (status

GRAS) desde 1986 e “seguro para os dentes” desde

1994. O Comitê de Especialistas em Aditivos Ali-

mentares da Organização Mundial da Saúde confir-

mou os estudos de toxicidade de xilitol e o classifi-

cou como “aceitável para consumo diário”. No Bra-

sil, o Ministério da Saúde aprovou o composto, como

produto dietético, em 1980.

Os métodos de produção do xilitol

Utilizado atualmente em produtos alimentícios, far-

macêuticos ou de saúde oral em mais de 35 países, o

xilitol pode ser recuperado de fontes naturais como

vegetais (banana, alface, morango, cenoura, espina-

fre e berinjela, entre outros), fungos ou liquens por

extração sólido-líquido (separação de um componen-

te sólido solubilizado por um solvente líquido), mas

como ele está presente em pequena proporção (me-

nos de 900 mg em cada 100 g de matéria-prima),

esse processo torna-se inviável economicamente.

A produção de xilitol em larga escala ocorre pelo

processo químico (figura 5), que consiste na reação

de hidrogenação de xilose, um açúcar comumente

encontrado na parede de células vegetais na forma

do polímero xilana.

Esse processo, patenteado em

1977 por Asko Melaja e Lauri

Hamalainen, inclui quatro etapas

básicas: 1. obtenção da xilose a

partir da hidrólise ácida (quebra

de moléculas por adição de água

promovida por ácidos) de mate-

rial vegetal rico em xilana; 2. pu-

rificação do material resultante

até a xilose pura; 3. hidrogenação

catalítica (adição de hidrogênios

Figura 4. Efeitos do xilitol na prevenção das cáries,

inibindo o crescimento da bactéria S. mutans e aumentando

a remineralização dos dentes

Figura 5. Processo de obtenção

de xilitol a partir da xilana

PRIMEIRA

LINHA

julho de 2003 • CIÊNCIA HOJE • 69

a certas ligações da molécula) da xilose, formando

xilitol; e 4. cristalização do composto.

O rendimento do processo químico e a qualidade

do xilitol dependem da pureza da solução inicial de

xilose, já que a presença de impurezas interfere na

reação catalítica. São necessárias operações de mé-

todos de purificação (como troca iônica, descolora-

ção e fracionamento cromatográfico) para obtenção

de uma solução de xilose de elevada pureza. Após

a remoção do catalisador por filtração e troca iônica,

a solução de xilitol é concentrada, fracionada por

cromatografia, e cristalizada para obtenção do pro-

duto puro. Essas diversas etapas de purificação au-

mentam o tempo de processamento e encarecem o

produto.

Como alternativa ao processo convencional, o

xilitol pode ser obtido microbiologicamente a par-

tir da fermentação de soluções ricas em xilose, sem

a necessidade de purificação prévia do substrato.

Vários outros produtos comerciais são obtidos por

fermentação, destacando-se o etanol, utilizado in-

clusive como combustível.

Entre as vantagens apresentadas pelos processos

biotecnológicos destaca-se a redução dos custos em

relação aos processos químicos, além de apresentar

características que minimizam o impacto ambien-

tal, como diminuição da toxicidade dos efluentes e

o uso de recursos renováveis (biomassa vegetal). No

caso da via biotecnológica proposta para a produção

de xilitol, utilizam-se resíduos agroindustriais como

bagaço de cana, palha de arroz, palha de trigo e so-

bras de eucaliptos, potencializando o caráter de re-

dução de custos financeiros e ambientais.

Vários microrganismos já foram identificados

como fermentadores de xilose em xilitol, em sua

maioria fungos. Ching Chiang e S. Knight precurso-

res da pesquisa de obtenção de xilitol, identifica-

Figura 6. Metabolismo da xilose na maioria

das bactérias (à esquerda) e nos fungos usados

em sua produção (à direita)

ram em 1960 espécies dos gêneros Penicillium, As-

pergillus, Rhizopus, Glicocladium, Byssochlamys,

Myrothecium, Neurospora, Rhodotorula, Torulopsis.

Poucas bactérias formam xilitol, porque geralmen-

te convertem xilose diretamente em xilulose por

possuírem a enzima xilose isomerase (figura 6).

Quanto às leveduras (fungos anamorfos), várias es-

pécies foram identificadas como produtoras de

xilitol, destacando-se as do gênero Candida, pela

maior eficiência de conversão (figura 7).

Apesar das diversas pesquisas desenvolvidas na

produção biotecnológica via fermentação, ainda não

foi possível obter concentrações de xilitol suficien-

tes para a etapa de cristalização. Para aumentar a

produtividade desse processo, estão sendo aplica-

das estratégias de engenharia metabólica, que con-

sistem no desvio do metabolismo para aumentar a

formação desse poliol e diminuir o seu consumo pelo

próprio microrganismo.

■

Leveduras Xilitol (g/l)

Candida boidinii

(NRRL Y-17213) 2,9

Candida guilliermondii

(FTI-20037) 37

Candida intermedia

(RJ-248) 5,7

Candida mogii

(ATCC 18364) 31

Candida parapsilosis

(ATCC 34078) 20

Candida pseudotropicalis

(IZ-431) 4,3

Candida tropicalis

2,1

Candida tropicalis

(HXP 2) 4,8

Candida tropicalis

(1004) 17

Candida tropicalis

(ATCC 7349) 20

Candida tropicalis

(ATCC 20240) 5,5

Candida utilis

(ATCC 22023) 1,8

Candida utilis

(C-40) 3

Debaryomyces hansenii

(C-98, M-21) 0,8

Hansenula anomala

(IZ-1420) 6,1

Kluyveromyces fragilis

(FTI-20066) 4,6

Kluyveromyces marxianus

(IZ-1821) 6,1

Pichia (Hensenula) anomala

(NRRL Y-366) 2

Pachysolen tannophilus

(NRRL Y-2460) 2,2

Saccharomyces

(SC-13) 0,7

Saccharomyces

(SC-37) 2,3

Schizosaccharomyces pombe

(16979) 0,2

Figura 7. Leveduras produtoras de xilitol

(os códigos indicam diferentes linhagens dos fungos,

e a produção é por litro de meio de cultura)

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 161

ANEXO 4

Seqüência depositada no GenBank

______________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________ 162

LOCUS DQ220745 1538 bp DNA linear PLN 19-OCT-2005

DEFINITION Candida tropicalis xylitol dehydrogenase (xyl2) gene, complete cds.

ACCESSION DQ220745

VERSION DQ220745.1 GI:77732525

KEYWORDS .

SOURCE Candida tropicalis

ORGANISM Candida tropicalis

Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Saccharomycotina; Saccharomycetes;

Saccharomycetales; mitosporic Saccharomycetales; Candida.

REFERENCE 1 (bases 1 to 1538)

AUTHORS Lima,L.H., Pinheiro,C.G., Freitas,S.M. and Torres,F.A.

TITLE Cloning and structural analysis of the xyl2 gene encoding xylitol

dehydrogenase from Candida tropicalis

JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 1538)

AUTHORS Lima,L.H., Pinheiro,C.G., Freitas,S.M. and Torres,F.A.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (23-SEP-2005) Departamento de Biologia Celular,

Universidade de Brasilia, Campus Universitario Darcy Ribeiro,

Brasilia, DF 70910-900, Brazil

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..1538

/organism="Candida tropicalis"

/mol_type="genomic DNA"

/db_xref="taxon:5482

gene

<343..>1437

/gene="xyl2"

mRNA

<343..>1437

/gene="xyl2"

/product="xylitol dehydrogenase"

CDS

343..1437

/gene="xyl2"

/EC_number="1.1.1.9

/note="oxidoreductase"

/codon_start=1

/transl_table=12

/product="xylitol dehydrogenase"

/protein_id="ABB01368.1

/db_xref="GI:77732526"

/translation="MTANPSLVLNKVDDISFEEYEAPKLESPRDVIVEVKKTGICGSD

IHYYAHGSIGPFILRKPMVLGHESAGVVSAVGSEVTNLKVGDRVAIEPGVPSRFSDET

KSGHYHLCPHMSFAATPPVNPDEPNPQGTLCKYYRVPCDFLFKLPDHVSLELGAMVEP

LTVGVHGCKLADLKFGEDVVVFGAGPVGLLTAAVARTIGAKRVMVVDIFDNKLKMAKD

MGAATHIFNSKTGGDYQDLIKSFDGVQPSVVLECSGAQPCIYMGVKILKAGGRFVQIG

NAGGDVNFPIADFSTRELALYGSFRYGYGDYQTSIDILDRNYVNGKDKAPINFELLIT

HRFKFKDAIKAYDLVRAGNGAVKCLIDGPE"

ORIGIN

1 accttcctat tgtttggaaa ccggaaaaaa ataatatttt gtatggagat cctcaaattt

61 cggggaaatt gtagatttac cttcctcttg caattacgca ttgctactat tttgtttttt

121 agtttgggtt ttcttttgta ttgcttcacg tatggtgatt atactttgtg tacacttgtt

181 catttactcc cccaagtttt cctctccccc tccatttata atgtatgaat taattatata

241 aatactgccg caaatttccc caggttgaaa ttttttttgt tacttctaaa gtttcttatt

301 tcttttcatt caataacttt caattctaca aatacaaaag tcatgactgc aaacccatca

361 ttagttctta acaaagttga cgatatttcc tttgaagaat acgaagctcc aaaactcgaa

421 tcaccaagag atgtcattgt tgaagttaag aaaactggta tctgtggatc agatatccat

481 tactatgccc atggttcaat tggtccattt attttaagaa aaccaatggt tttaggtcac

541 gaatcagcag gtgttgtttc tgctgtcgga agtgaagtta ccaacttgaa ggttggtgat

601 agagttgcca ttgaacctgg tgtaccttca agatttagtg atgagaccaa atctggtcat

661 tatcatttgt gcccacatat gtcttttgcc gccaccccac cagttaaccc agatgaacca

721 aatcctcaag gtactttatg taaatactac agagtcccat gtgacttttt attcaaatta

781 ccagatcatg tttctttgga gttgggtgct atggttgaac cattaactgt tggtgtccac

841 ggttgtaaat tggctgattt gaaatttggt gaagacgttg ttgtttttgg tgccggtcca

901 gttggtttgt tgaccgctgc cgttgctaga acaattggtg ctaaaagagt catggttgtt

961 gatatttttg acaacaaatt gaagatggca aaagatatgg gtgctgccac tcatattttc

1021 aactcaaaaa ccggtggtga ttatcaagat ttgatcaaga gttttgatgg tgttcaacct

1081 tcagttgttt tggaatgtag tggtgctcaa ccatgtatct atatgggtgt taaaatcttg

1141 aaagctggtg gtagatttgt tcaaattggt aatgccggtg gtgatgtcaa tttcccaatt

1201 gctgatttct caaccagaga attggcatta tatggttctt tcagatatgg ttacggtgac

1261 taccaaactt caattgatat tttagacaga aactacgtca atggtaaaga caaagcacca

1321 attaatttcg aattgttgat tactcacaga ttcaagttta aagatgccat caaagcctat

1381 gatttggtca gagcaggaaa tggtgctgtc aaatgtttaa ttgatggtcc agaatagagg

1441 tatatagtat tagaaaaaga atatacagta tatatatata tatatgtgaa taattcatgc

1501 ttaagtttaa tatcagtaaa gcatctacta taaatcca

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