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AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MÉTODOS DE RECUPERAÇÃO DE
GAMETA MASCULINO EM CÃO DOMÉSTICO (CANIS FAMILIARIS).
LETICIA BROERMAN CAZES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
AGOSTO – 2006
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AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MÉTODOS DE RECUPERAÇÃO DE
GAMETA MASCULINO EM CÃO DOMÉSTICO (CANIS FAMILIARIS).
LETICIA BROERMAN CAZES
Orientadora: Prof
a
. Isabel Candia Nunes da Cunha
Co-Orientador: Dr.Ronaldo Gonsalves Morato
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ
AGOSTO-2006
ii
Dissertação apresentada no Centro de
Ciências e Tecnologia Agropecuária da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense, como parte das exigências
para obtenção do titulo de mestre em
produção animal.
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iii
AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MÉTODOS DE RECUPERAÇÃO DE
GAMETA MASCULINO EM CÃO DOMÉSTICO (CANIS FAMILIARIS).
LETICIA BROERMAN CAZES
Aprovada em ___ de __________________ de 2006.
COMISSÃO EXAMINADORA:
_________________________________________________________________
Prof
a
. Maria Luisa López Alvarez (Doutora, Ciências Biológicas) - UERJ
__________________________________________________________________
Prof. Tarcízio Antônio Rego de Paula (Doutor, Medicina Veterinária) - UFV
___________________________________________________________________
Prof. José Frederico Straggiotti Silva (Doutor, Reprodução Animal) - UENF
__________________________________________________________________
Orientadora: Prof
a
: Isabel Cândia Nunes da Cunha (Doutora, Reprodução
Animal) - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ
AGOSTO-2006
Dissertação apresentada no Centro de
Ciências e Tecnologia Agropecuária da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense, como parte das
exigências para obtenção do titulo de
mestre em produção animal.
iv
AGRADECIMENTOS
Aos meus amigos e ao meu namorado, que me “aturaram” durante estes
dois sofridos e marcantes anos, e não me abandonaram na tristeza e me fizeram rir
quando precisava.....
À minha orientadora, pela paciência e pela oportunidade de realizar esta
dissertação.
Ao meu co-orientador que, mesmo de longe, se fez presente para a
realização deste trabalho.
À FAPERJ, pela concessão da bolsa de estudo.
Aos meus companheiros e amigos de laboratório que não mediram esforços
para me ajudar...
À APA de Teresópolis, ao CCZ (Centro de Controle de Zoonoses de Campos
dos Goytacazes) e.ao hospital veterinário da Universidade e aos médicos
veterinários que cederam espaço e tempo para colaborar com essa pesquisa....
Ao Paulo Sergio de Andrade Junior e Israel Pereira (amigos de verdade),
que me ajudaram a realizar este trabalho com muito boa vontade, adoro vocês....
A todos os animais que me permitiram realizar essa pesquisa e são o motivo
pelo qual continuo e à minha família pelo apoio incondicional.
A Deus por estar sempre presente.....
v
BIOGRAFIA
LETICIA BROERMAN CAZES, filha de Hamilton Leal Cazes e Luiza Eugênia
Broerman Cazes, nasceu em 9 de setembro de 1980, na cidade do Rio de Janeiro -
RJ.
Formada em Medicina Veterinária em 2004 pela Universidade Estadual do
Norte Fluminense (UENF). Admitida em março de 2004, no curso de pós-
graduação em Produção Animal, também da UENF, submetendo-se a defesa de
tese no dia 29 de agosto de 2006.
vi
CONTEÚDO
RESUMO...............................................................................................................viii
ABSTRACT............................................................................................................ ix
1.INTRODUÇÃO.................................................................................................... 01
2.REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 03
2.1 Fisiologia do processo ejaculatório .......................................................... 03
2.1.1.Ereção.............................................................................................. 03
2.1.2. Emissão .......................................................................................... 04
2.1.3. Ejaculação ...................................................................................... 04
2.2.Exame andrológico................................................................................... 05
2.2.1.Exame físico do trato reprodutivo .................................................... 05
2.2.1.1.Escroto.................................................................................. 05
2.2.1.2.Testículos.............................................................................. 05
2.2.1.3.Epidídimo e cordão espermático........................................... 05
2.2.1.4. Pênis e prepúcio .................................................................. 06
2.2.1.5.Glândula prostática ............................................................... 06
2.2.2.Análise de sêmen ............................................................................ 06
2.3.Métodos de coleta de sêmen ................................................................... 08
2.3.1.Estímulo manual e vagina artificial................................................... 08
2.3.2.Eletroejaculação .............................................................................. 10
2.3.3.Recuperação de espermatozóides do epidídimo e ducto deferente 12
2.4.Drogas anestésicas para contenção química e anestesia ....................... 13
2.4.1.Tiletamina e Zolazepan.................................................................... 13
2.4.2. Isoflurano ........................................................................................ 15
3.OBJETIVO.......................................................................................................... 17
4.MATERIAL E MÉTODO...................................................................................... 18
4.1.Animais .................................................................................................... 18
4.2.Procedimentos gerais............................................................................... 20
4.2.1.Procedimento 1................................................................................ 20
4.2.2.Procedimento 2................................................................................ 21
vii
4.2.3.Avaliação da eficiência dos protocolos anestésicos para coleta de
sêmen por eletroejaculação ................................................................................... 24
4.2.4 Avaliação do protocolo de eletrochoques ........................................ 24
4.2.5.Procedimento 3................................................................................ 25
4.3.Avaliação seminal .................................................................................... 27
4.3.1.Avaliação microscópica do sêmen................................................... 27
4.4.Análise estatística da amostra.................................................................. 28
5.RESULTADO...................................................................................................... 29
5.1 Procedimento 1: Avaliação Clínica geral.................................................. 29
5.2.Procedimento 2 : Eletroejaculação........................................................... 30
5.3.Avaliação da Eficiência dos Protocolos anestésicos de eletroejaculação 33
5.4.Avaliação do protocolo de eletrochoques: avaliação da eficiência da
localização da probe durante o procedimento e avaliação da intensidade do
processo de ereção................................................................................................ 35
5.5. Procedimento 3 - Orquiectomia e recuperação de espermatozóides
epididimários .......................................................................................................... 36
5.6.Avaliação da morfologia espermática....................................................... 36
6.DISCUSSÃO....................................................................................................... 38
6.1.Procedimento 1 ....................................................................................... 38
6.2 Procedimento 2 ........................................................................................ 38
6.2.1.Protocolo anestésico 1..................................................................... 38
6.2.2. Protocolo anestésico 2.................................................................... 40
6.3.Comparação entre os protocolos anestésicos 1 e 2................................. 41
6.4. Avaliação do protocolo de eletrochoques................................................ 43
6.4.1. Avaliação da eficiência da localização da sonda ............................ 43
6.4.2. Avaliação da eficiência da voltagem dos estímulos elétricos em
relação ao progresso do processo de ereção ........................................................ 43
6.5 Orquiectomia e recuperação de espermatozóides epididimários............. 44
6.6 Avaliação morfologia espermática .............................................................45
7.CONCLUSÃO..................................................................................................... 46
8.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA........................................................................ 47
APÊNDICES .......................................................................................................... 53
viii
RESUMO
CAZES, Letícia Broerman, Universidade Estadual do Norte Fluminense; agosto de
2006; Avaliação da eficiência de métodos de recuperação de gameta masculino em
cão doméstico (Canis familiares); Professora Orientadora: Isabel Candia Nunes da
Cunha e Co-Orientador: Ronaldo Gonsalves Morato.
Utilizando o cão como modelo experimental, este estudo teve por objetivos: avaliar
a eficiência e funcionalidade do protocolo de eletroejaculação para a coleta de
sêmen de cão doméstico (EJ) e avaliar a eficiência da maceração epididimário para
a obtenção de espermatozóides (REE). Foram utilizados 13 cães machos e
saudáveis, sem alterações clínicas aparentes. Em todas as repetições foram
realizadas avaliações quanto, ao total de espermatozóides (x10
6
), motilidade
espermática (ME 0-100%), vigor espermático (0-5) e também à percentagem de
espermatozóides normais (%EPN). Para o procedimento de EJ, foram testados dois
diferentes protocolos anestésicos: protocolo 1 (Zoletil 50 ® na dose de 5 mg/kg
Intramuscular-IM) (n=8) e protocolo 2 (Zoletil 50
®
-5 mg/kg IM e para manutenção do
plano anestésico foi utilizado Isoflurano)(n=5). O protocolo de EJ foi sugerido por
Morato (2005) com 80 estímulos, variando a intensidades de 3 a 7 volts. Na
comparação entre os protocolos anestésicos, não houve diferença estatística em
relação às características seminais. O método de eletroejaculação se mostrou
viável como método de coleta de espermatozóides, assim como a técnica de
maceração epididimário para a REE, porém ambas devem ser revistas para melhor
resultado futuro.
Palavras-chave: Cão doméstico, eletroejaculação, espermatozóide epididimário.
ix
ABSTRACT
CAZES, Leticia Broerman, Universidade Estadual do Norte Fluminense (Northern
Rio de janeiro State University); August, 2006; Evaluation of the efficiency of
spermatozoa recovery techniques on domestic dogs (Canis familiares);
Adviser/Teacher: Isabel Candia Nunes da Cunha. Co-adviser/Teacher: Ronal
Gonsalves Morato.
Using the dog as a model species, the purpose of this study was to evaluate the
efficiency and functionality of different anesthetic protocol to collect sperm from
domestic dogs and to evaluate the efficiency of shocking the epididymmis to recover
spermatozoa (REE), 13 healthy male dogs were used with no clinal observation. In
all samples obtained during the work, there was a realized evaluation total sperm
count (TE), sperm motility (ME), as well as evaluated sperm morphology (%EPN).
During the EJ, two anesthetic protocols were tested: protocol #1 - (5 mg/kg
Intramuscular-IM Zoletil 50 ®) (n=8) and protocol #2 - (5 mg/kg IM Zoletil 50 ® and
anesthetic supllementation with isofluorane)(n=5). The values were depicted in
mean±SEM. The EJ protocol was described by Morato (2005) and consisted of 80
stimuli with the intensity varying from 3 to 7 volts. The result of the comparison
between the anesthetic protocol shows no statistical difference in any sperm
parameters(p>0,05). The EJ and REE techniques prove to be viable methods for
recovering male gamete from domestic dogs.
Key words: Domestic dogs, electroejaculation, epididymal semen.
1
1.INTRODUÇÃO
Dentro da Classe Mammalia, 24% dos representantes da ordem Carnívora
encontram-se ameaçados de extinção (SILVA et al., 2004). No Brasil, existem 6
representantes da família Canidae e três desses animais estão citados nas
principais listas de espécies ameaçadas, como a elaborada pelo Instituto Brasileiro
de Recursos Naturais Renováveis e do Meio Ambiente (IBAMA, 2003). A
conservação dos carnívoros é importante para a preservação dos ecossistemas em
que estes estão inseridos. Os carnívoros são denominados como espécies
“guarda–chuva”, ou seja, se esses animais forem preservados, diversas espécies e
também o ambiente em que eles vivem estarão protegidos (GITTLEMAN et al.,
2001).
Para aumentar o sucesso dos programas de conservação para as várias
espécies de animais ameaçados de extinção in situ e ex situ são necessários mais
estudos sobre a reprodução (ASA, 1996). Nos últimos 20 anos, as tecnologias
relacionadas à reprodução assistida, como a inseminação artificial, transferência de
embrião, bancos de germoplasma e técnicas não invasivas de monitoramento
endócrino começaram a ter um papel cada vez mais importante nos programas de
conservação. Estes programas servem para manter um reservatório genético para
futuras reintroduções e manutenção da saúde de uma população estável de
animais no cativeiro e para a manutenção da população de animais selvagens
através da infusão de novos genes (WALKER, 1999).
As biotecnologias reprodutivas para canídeos estão menos desenvolvidas
do que para outras espécies. Na prática, as técnicas de reprodução assistida para
2
esses animais têm-se limitado principalmente, à inseminação artificial e à
criopreservação de gametas masculinos. Outras biotecnologias mais avançadas só
têm sido feitas nos laboratórios de pesquisa. Para avançar os estudos nessa área,
o cão doméstico tem sido utilizado como principal modelo experimental para outras
espécies de canídeos (GOBELLLO & CORRADA, 2003). Esses animais foram
selecionados, também, por causa da proximidade filogenética, além da inviabilidade
de usar espécies não-domésticas e algumas ameaçadas de extinção em
experimentos (SILVA et al., 2004).
O primeiro passo para o desenvolvimento e aplicação das biotecnologias é
a obtenção de gametas. Existem varias técnicas para a recuperação de gameta
masculino, como: vagina artificial, estímulo manual, eletroejaculação, recuperação
de espermatozóides da cauda do epidídimo e ducto deferente (SILVA et al., 2004).
A eletroejaculação é a principal técnica utilizada para espécies não-
domésticas devido à segurança e facilidade que essa técnica oferece (WILDT,
1996). Os animais são anestesiados para o procedimento, os protocolos
anestésicos geralmente associam drogas dissociativas a drogas miorrelaxantes,
como a combinação de tiletamina com zolazepan e quetamina com xilazina em
proporções que variam de espécie para espécie. Algumas drogas utilizadas podem
interferir na qualidade seminal devido à contaminação do sêmen com a urina, ao
promoverem o relaxamento da região do colo da bexiga (HOWARD, 1999).
Outro método que pode ser implementado para animais ameaçados ou em
vias de extinção é a recuperação de espermatozóides epididimários. Essa técnica
permite o aproveitamento de material postmortem (HEWITT, 2001; YU & LEIBO,
2002). Existem poucos trabalhos relacionados à obtenção, congelamento,
descongelamento e viabilidade da célula espermática proveniente do epidídimo em
cães. Em humanos, vários estudos conseguiram fertilizar oócitos com
espermatozóides epididimários (HEWITT, 2001).
Utilizando o cão como modelo experimental para os canídeos selvagens,
este estudo avaliou a eficiência e a funcionalidade dos protocolos anestésicos para
a coleta de sêmen de cão doméstico por meio de eletroejaculação e a eficiência da
maceração epididimária para a obtenção de espermatozóides.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Fisiologia do processo ejaculatório
2.1.1. Ereção
A ereção peniana é causada pelo relaxamento das fibras musculares lisas
do tecido erétil e pela dilatação do suplemento sangüíneo no pênis. Esses dois
fenômenos são nervos dependentes e controlados pelo sistema nervoso autônomo
tanto por fibras simpáticas quanto por fibras parassimpáticas (GIULIANO &
RAMPIN, 2000). Existe, ainda, uma interação entre o sistema nervoso central e
estímulos locais. Os andrógenos também exercem papéis importantes durante a
ereção peniana e funções sexuais (NEVES et al., 2004).
O processo de ereção pode der dividido em: fase flácida, sob domínio do
sistema nervoso autônomo simpático; fase latente ou de preenchimento, onde há
um crescente domínio da inervação parassimpática e diminuição da inervação
simpática; fase de intumescência, onde há alterações hemodinâmicas
caracterizadas por um pequeno aumento do fluxo sangüíneo; fase de ereção
completa, onde são observadas alterações hemodinâmicas mais severas, e a
última fase, denominada fase de ereção rígida, onde há o preenchimento total dos
corpos carvenoso e esponjoso do pênis (NEVES et al., 2004).
4
2.1.2. Emissão
A emissão consiste na passagem do fluído espermático ao longo do ducto
deferente para uretra pélvica, onde irá ocorrer a mistura com as secreções das
glândulas acessórias. Está etapa está sob controle do sistema nervoso autônomo
simpático e é motivada por músculos lisos (HAFEZ, 1995).
O reflexo ejaculatório é iniciado, geralmente, por estímulos sensoriais
genitais, assim como estímulos cerebrais e são coordenados no segmento
toracolombar da medula espinhal. Esse reflexo recebe aferências dos estímulos
somatossensoriais via o nervo dorsal peniano. Eferências do reflexo ejaculatório
emergem por via de fibras simpáticas do seguimento toracolombar da medula
espinhal, promovendo o fechamento da região do colo da bexiga e a emissão
seminal (nervo hipogástrico). Enervações eferentes parassimpáticas do segmento
sacral da medula espinhal também parecem estar envolvidos no momento da
emissão, contribuindo para a formação do fluído seminal (SONKSEN & OHL, 2002).
2.1.3. Ejaculação
A ejaculação está sob controle de componentes eferentes somáticos dos
nervos sacros. Este processo consiste da passagem do sêmen ao longo da uretra
peniana, seguida por sua expulsão através do orifício uretral externo. A ejaculação
é provocada por músculos estriados (HAFEZ, 1995).
Durante a ejaculação, a contração do músculo periuretral, músculo estriado
do assoalho pélvico, músculo bulbocavernoso e músculo isquiocavernoso é
necessária para manter as ondas de pressão para permitir a saída do ejaculado
pelo orifício externo uretral. Essas contrações parecem estar sob controle de
componentes somáticos (HAFEZ, 1995).
5
2.2. Exame andrológico
2.2.1. Exame físico do trato reprodutivo
O exame físico do animal permitirá o reconhecimento de problemas crônicos de
outros sistemas e também a presença de doenças congênitas. Todo o trato
reprodutivo deve ser avaliado, incluindo escroto, testículos, epidídimo, pênis,
prepúcio e glândula prostática (FELDMAN & NELSON, 1996 e CUNHA, 2005).
2.2.1.1. Escroto
Deve estar esparsamente recoberto por pêlos e deve apresentar uma
espessura uniforme, fina e macia ao toque. A bolsa escrotal deve ser móvel em
relação ao testículo e não deve haver dor ao toque. Uma visualização direta do
escroto pode revelar sinais de inflamação, trauma, alterações de volume e
cicatrizes (CUNHA, 2005).
2.2.1.2. Testículos
Os testículos são palpados quanto ao tamanho, forma e consistência. O
testículo esquerdo é geralmente caudal ao direito. O testículo deve ser: oval, com
contorno fino e regular e não deve apresentar dor à palpação A consistência é
firme, lembrando a consistência de um bíceps semi-flexionado (CUNHA, 2005).
2.2.1.3. Epidídimo e cordão espermático
O epidídimo encontra-se fixado dorsalmente à superfície do testículo. O
epidídimo continua como ducto deferente que se encontra localizado dentro do
cordão espermático, que contém também o ducto deferente, artéria deferente, veias
do plexo panpiniforme, linfáticos, nervos e músculo cremáster. Para realização da
avaliação clínica do epidídimo, deve-se palpar, quanto a áreas de espessamento e
também quanto ao seu volume (CUNHA, 2005).
6
2.2.1.4. Pênis e prepúcio
O Prepúcio, normalmente, encontra-se recobrindo totalmente o pênis. O
pênis durante o exame físico, deve ser facilmente removido do prepúcio e exposto.
A mucosa peniana normal deve ser: rósea, fina e indolor ao toque. O pênis deve
ser avaliado quanto ao seu tamanho e conformação (CUNHA, 2005).
2.2.1.5. Glândula prostática
A glândula prostática é bilobada e está localizada cranial à pélvis, porém
esta disposição pode estar alterada devido à distensão da bexiga. A glândula
encontra-se rodeando a região do colo da bexiga, a porção uretral da uretra e a
porção terminal do ducto deferente. É possível, eventualmente, palpar a parte
cranial da glândula através do toque retal. A presença de tamanho anormal,
assimetria entre os lobos, consistência anormal ou dor pode ser indicativos de
patologias prostáticas (CUNHA, 2005).
2.2.2. Análise de sêmen
A análise do sêmen deve estar incluída na avaliação andrológica para que
sejam detectados problemas de infertilidade e subfertilidade (FELDMAN &
NELSON, 1996). A análise padrão da amostra espermática do ejaculado do cão
vem sendo realizada rotineiramente para avaliação da qualidade seminal (SILVA et
al., 2003).
O cão ejacula em três frações, sendo que somente a segunda fração é rica
em espermatozóides. A primeira fração ou fração pré-espermática parece estar
relacionada com a limpeza no canal uretral e estabilização do pH para a passagem
da segunda fração, tendo origem prostática. A terceira fração ou pós-espermática
apresenta um aspecto aquoso, origina-se da próstata e sua função é fornecer um
meio diluidor natural, proporcionando o transporte das células espermáticas pelo
trato reprodutivo da fêmea (SILVA et al., 2002). As freqüências recomendadas para
as coletas de sêmen são: a cada 48 horas, uma coleta ao dia durante três dias
consecutivos com 3 dias de repouso e duas coletas em um dia e 2 dias de repouso
(FELDMAN & NELSON, 1996).
7
A avaliação macroscópica do sêmen inclui: observação do volume,
coloração e viscosidade (SILVA et al., 2002). O volume do ejaculado pode variar
com o tamanho, raça, clima e freqüência das coletas. A cor do ejaculado,
normalmente, é branca opalescente, porém, assim como a viscosidade da amostra,
esta coloração está diretamente relacionada com a concentração espermática
(CUNHA, 2005).
A avaliação microscópica do sêmen deve incluir: concentração espermática,
morfologia espermática, a percentagem de células móveis (motilidade) e qualidade
desta motilidade conhecida como vigor (SILVA et al., 2002). As características do
ejaculado normal do cão doméstico, segundo Johnston et al. (2001), estão
representadas na Tabela 1.
Tabela 1-Características do ejaculado normal do cão doméstico (JOHNSTON et al.,
2001).
Para avaliação da motilidade e do vigor, normalmente utiliza-se o método
descrito por Krause (1966), onde uma gota de sêmen é colocada sobre uma lâmina
e recoberta por uma lamínula e o material deve estar de 37° a 40°. A avaliação é
feita utilizando-se um microscópio de contraste de fase e o resultado é expresso em
Características Fração
1
Fração 2 Fração 3 Total do
ejaculado
Volume (ml) 0.5-5.0 1.0-4.0 1.0-80.0 2.5-80.0
Cor Claro Oplascente Claro Oplascente
Concentração(10
6
/ml) - 4-400 - 4-400
Total de
Espermatozóides/
Ejaculado (10
6
/ml)
- 300-2000 - 300-2000
Percentagem de
motilidade progressiva
(%)
- >70% - >70%
Percentagem de
espermatozóides normais
(%)
- >80% - >80%
8
percentagem (0-100%). Para o vigor, Platz & Sager (1978) propuseram uma a
escala, que vai de 0 a 5, onde 0 seria as amostras onde todos os espermatozóides
estariam imóveis e 5 aquelas amostras em que o movimento demonstra-se rápido,
com uma contínua progressão (CUNHA, 2005; FELDMAN & NELSON, 1996).
Para avaliação da concentração espermática, utiliza-se, rotineiramente, o
princípio de contagem celular através da câmara de “Neubauer” (FELDMAN &
NELSON, 1996) e a diluição feita é 1:20 (CUNHA, 2005).
Para a análise da morfologia espermática realiza-se a confecção de um
esfregaço da amostra e, em seguida, a coloração, podendo-se utilizar diversos
corantes (SILVA et al., 2002). Uma metodologia empregada é o vermelho congo e o
cristal de violeta (CBRA, 1998). A leitura da lâmina é feita em microscópio em
campo claro com aumento de 1000x. Duzentos espermatozóides devem ser
contados em cada esfregaço (CUNHA, 2005).
O Colégio Brasileiro de Reprodução Animal classifica as patologias
espermáticas em maiores e menores, conforme sugerido por Blom, em 1973
(CBRA, 1998). As patologias espermáticas podem ser também classificadas em:
primárias, que são aquelas patologias advindas da espermatogênese, secundárias,
que são aquelas causadas durante o trajeto pelas vias seminais superiores ou pela
manipulação da amostra seminal (FELDMAN & NELSON, 1996). A avaliação da
morfologia espermática é o exame que apresenta maior correlação com o índice de
fertilidade. Cães com 60% de espermatozóides normais demonstraram uma taxa de
fertilidade de 61% (OETTLÉ, 1993).
2.3. Métodos de coleta de espermatozóides
2.3.1. Estímulo manual e vagina artificial
A vagina artificial geralmente utiliza fêmeas no cio ou fêmeas impregnadas
com ferormônio para levar à excitação e à ereção do macho. O macho, usualmente,
é treinado e condicionado para este tipo de coleta. O coletor permite que o macho
cheire e lamba a região perianal da fêmea para encorajar a ereção. Neste
momento, o coletor pode massagear gentilmente o pênis através do prepúcio
também para ajudar na excitação e ereção. Quando o animal tentar montar na
fêmea, o coletor deve desviar o pênis para dentro da vagina artificial. A vagina
9
artificial deve passar sobre o bulbo da glande e pressões digitais devem ser feitas
em toda a circunferência do pênis na região do bulbo da glande para ajudar a
manter a ereção. O uso de lubrificante na parte da vagina artificial que vai estar
acoplada no bulbo é recomendado e facilitará a remoção da vagina (FELDMAN &
NELSON, 1996). Esse método para espécies não - domésticas requer longos
períodos de condicionamento, além de não ser considerado seguro (HOWARD,
1999).
O estímulo manual é o método de coleta de sêmen mais utilizado para cães
domésticos, sendo o método mais confiável, mesmo para cães não condicionados
(SILVA et al., 2003). Essa técnica consiste em massagear o prepúcio do cão na
altura do bulbo peniano, até que o animal atinja a ereção parcial. O prepúcio deve
ser então, retraído para trás do bulbo e o manipulador deve exercer uma pequena
pressão no pênis na região posterior ao bulbo. Os movimentos pélvicos serão
coincidentes com a fração pré-espermática. Em seguida, o cão se torna imóvel e é
ejaculada a fração espermática. O cão, então, tenta girar a perna durante a
ejaculação da terceira fração. O material coletado deve ser mantido a 38°C
(FELDMAN & NELSON, 1996)
O ambiente para a realização da coleta deve ser:
calmo, confortável para o
animal, ambiente sem muita gente, barulho e com um piso adequado. No momento
da coleta, podem-se utilizar fêmea no cio e swab de fêmea no cio para facilitar a
excitação e melhorar a qualidade do sêmen coletado (FELDMAN & NELSON,
1996).
Para aplicação dessa técnica nos os animais selvagens, são necessários
animais que possam ser manejados com segurança e um longo período de
treinamento assim como para o uso da vagina artificial (HOWARD, 1999; WILDT,
1996). O estímulo manual vem sendo empregado para algumas espécies de
canídeos selvagens como raposas e lobos (HOWARD, 1999; FARSTAD, 1998). Ao
comparar amostras de sêmen obtidas por eletroejaculação e vagina artificial, foi
observado que, apesar do volume conseguido utilizando-se a vagina artificial ser
menor, essa amostra contem mais espermatozóides por unidade de volume
(HOWARD, 1999).
10
2.3.2. Eletroejaculação
A eletroejaculação é o método de escolha para a coleta de sêmen em
animais selvagens, pois esse método requer que o animal seja anestesiado,
garantindo, assim, a segurança da equipe (WILDT, 1996; MORATO, 1998;
HOWARD, 1999). O procedimento da eletroejaculação consiste na estimulação das
vias nervosas dos órgãos reprodutivos por meio de uma corrente elétrica fraca
(HOWARD, 1999). O princípio desta técnica está no controle do reflexo ejaculatório
através do controle do grau de estimulação elétrica sobre os nervos e a
musculatura envolvida com o processo de ejaculação. Para tal estimulação é
utilizada uma sonda retal com três eletrodos que estão, conseqüentemente,
conectados a uma fonte elétrica de estímulos externa (SILVA et al., 2004).
Para o procedimento de eletroejaculação, os animais monogástricos devem
ser mantidos em jejum por 12 a 24 horas (HOWARD, 1999; WILDT, 1996). O
macho deve ser anestesiado até atingir um plano cirúrgico (HOWARD, 1999). Foi
sugerido por Queiroz (2003), que esses animais sejam mantidos no plano I do
estágio 3 de Guedel (QUEIROZ, 2003), que se inicia com a perda gradativa dos
reflexos, principalmente a perda de reflexos como laringotraqueal e interdigital, a
respiração se torna regular e automática e o animal apresenta movimentos
erráticos no globo ocular (FANTONi et al., 2002).
Os anestésicos utilizados são a quetamina, a combinação de tiletamina-
zolazepan ou a combinação de quetamina com baixas doses de xilazina
(HOWARD, 1999; SILVA et al., 2004).
Durante o procedimento, o animal anestesiado deve ser mantido em
decúbito lateral ou em outra posição que facilite o acesso à área anal e às
glândulas acessórias (WILDT, 1996). O pênis e o prepúcio devem ser limpos,
podendo utilizar substancias como solução fisiológica estéril (KOJIMA et al., 2001).
Deve-se lubrificar a sonda antes da intromissão no reto para manter o contato
elétrico entre os eletrodos e a parede retal (HOWARD, 1999), podendo ser utilizado
corboxi-metil-celulose (MORATO, 1998; QUEIROZ, 2003). Os eletrodos devem
estar posicionados na região ventral da parede retal sobre as glândulas acessórias
(HOWARD, 1999). No caso do cão, sobre a próstata (FELDMAN & NELSON,
1996). A seqüência de choque, freqüência e também a voltagem vão variar de com
a espécie (WILDT, 1996; HOWARD, 1999). Para a coleta do sêmen, utiliza-se um
11
tubo de plástico graduado sobre a glande peniana. O material que irá entrar em
contato com o sêmen deve ser pré-aquecido para evitar o choque térmico (WILDT,
1996), podendo ser aquecido na mão pelo manipulador (MORATO, 1998).
Existem vários modelos de eletroejaculador. Alguns utilizam corrente
elétrica contínua e outros, correntes alternadas (WILDT, 1996). A sonda retal
também varia de modelo. Para os carnívoros, a sonda que permitiu melhores
respostas ejaculatórias foi a que possuía tiras de eletrodos posicionadas
longitudinalmente frente a sondas com tiras circulares (HOWARD, 1999). O
diâmetro da sonda, geralmente, equivale ao diâmetro das fezes do animal e
também deve permitir um contato ideal entre os eletrodos e a mucosa retal (WILDT,
1996).
Os protocolos de estímulos elétricos (número de estímulos e a voltagem)
variam de espécie para espécie e de individuo para individuo (HOWARD, 1999).
Alguns pesquisadores vêm utilizando o protocolo sugerido por Wildt et al. 1983, que
foi padronizado com sucesso para a coleta de sêmen em guepardos (Acinonyx
jubatus) e vem sendo utilizado com sucesso para outros felídeos (QUEIROZ, 2003).
O protocolo recomenda utilizar 80 estímulos elétricos que estão divididos em três
séries. A primeira série consiste de 30 estímulos (10 estímulos de 2 a 4 voltes), a
segunda de 30 estímulos (10 estímulos 3 a 5 voltes) e a última de 20 estímulos (10
estímulos de 5 a 6 voltes). Cada série tem um intervalo de 5 minutos. O animal
responderá ao estímulo com a extensão e rigidez dos membros pélvicos. Se essa
reação não estiver presente na primeira série de estímulos elétricos, provavelmente
a sonda não está na posição correta ou houve uma interferência na transmissão da
corrente elétrica por fezes no reto (HOWARD, 1999).
Outro protocolo utilizado para o lobo vermelho (Canis rufus) que tem obtido
sucesso para a coleta de sêmen, está baseado na metodologia empregada por
Platz & Seager, em 1978. Ele consiste de 3 a 5 períodos com voltagem que vão de
3 a 8 voltes, cada período, consta de 25-30 estímulos. Entre cada período, existe
um descanso de 5 a 7 minutos (GOODROWE et al., 1998).
A eletroejaculação tem enfrentado, em muitas espécies, principalmente os
carnívoros, o problema da contaminação do ejaculado por urina (micção) e a alta
incidência de retroejaculação (HOWARD, 1999).
Durante a ejaculação antrógrada, três seqüências de acontecimentos são
observadas: emissão seminal, fechamento da região do colo da bexiga e expulsão
12
seminal pela uretra peniana. A emissão seminal ocorre quando a estimulação
simpática do epidídimo e vaso deferente causa a liberação de espermatozóides e
fluidos seminais no interior da uretra prostática. A estimulação simpática causa
parcial fechamento do colo da bexiga. A somatória desses eventos causa o
aumento da pressão dentro da uretra, que é o gatilho para a estimulação das fibras
parassimpáticas que causam o completo fechamento do colo da bexiga e contração
prostática. Finalmente, o nervo somático é estimulado a iniciar contrações da
musculatura peniana ocorrendo à expulsão seminal (ROMAGNOLI et al., 1999).
A ejaculação retrógrada ocorre quando há o fechamento inadequado da
região do colo da bexiga. Conseqüentemente, não há aumento de pressão dentro
da uretra prostática e o sêmen segue pelo caminho de menor resistência, ou seja, o
interior da bexiga urinária. Qualquer processo que interfira na inervação simpática
do sistema reprodutor masculino e da bexiga urinária pode resultar em
retroejaculação. A presença de espermatozóide na bexiga é fisiológica em cães. A
média da concentração espermática obtida na urina é significativamente menor nas
amostras pré-ejaculação do que nas amostras pós-ejaculação, no cão saudável
(ROMAGNOLI et al., 1999).
O reflexo de micção requer uma integração complexa e coordenada entre
três sistemas nervosos: simpático parassimpático e somático. A integração destes
sistemas resultará em contração do músculo destrusor da bexiga urinária e
relaxamento da musculatura lisa e estriada da uretra. As vísceras pélvicas têm três
pontos principais de inervação: nervo pélvico, nervo pudendo e nervo hipogástrico,
mesmos nervos envolvidos no processo ejaculatório (TUDURY et al., 2006).
Em canideos, ursídeos e felídeos, Howard (1999) afirma que a contaminação
do sêmen por urina durante a eletroejaculação parece ser independente da escolha
do anestésico e ser conseqüência da proximidade das vias neurais que controlam
as funções da bexiga urinária daquelas que levam à ejaculação.
2.3.3. Recuperação de espermatozóides do epidídimo e ducto deferente
O epidídimo é um componente do trato reprodutivo dos machos e está
inserido na superfície dorsolateral do testículo. Macroscopicamente distinguem-se
três regiões, deniminadas as regiões de cabeça, corpo e cauda epididmárias. O
processo de maturação espermática, responsável pela produção de
13
espermatozóides viáveis capazes de fertilizar os oócitos nas fêmeas, ocorrera
durante a passagem do gameta pelo epidídimo (HAFEZ, 1995).
A recuperação de espermatozóides maduros e viáveis da cauda do
epidídimo e ducto deferente de amostras postmortem e de animais incapazes de
ejacular (SILVA et al., 2004) é possível e representa uma ferramenta importante
para a preservação de gameta (HOWARD, 1999). Esse método envolve a injeção
de solução salina morna ou diluente para criopreservação e a aspiração do
conteúdo tanto da cauda do epidídimo como dos ductos deferentes (WILDT, 1996).
Uma técnica alternativa é a maceração da região da cauda do epidídimo e a
obtenção de fluido luminal liberado pelo procedimento (HOWARD, 1999).
Visando minimizar processos de autólise, após a morte do animal, o
material deve ser rapidamente refrigerado a 5˚C (WILDT, 1996; HOWARD, 1999).
Em certos casos, esse material pode ser mantido no gelo e, posteriormente, ser
refrigerado, desde que ele não entre em contato direto com o gelo. A motilidade
inicial dessas células obtidas do epidídimo é freqüentemente baixa, sendo
necessária a diluição em meio de cultura para tecidos ou meios extensores e
incubação a 21˚C a 37˚C por 10 minutos (WILDT, 1996).
Para canídeos selvagens, não existem informações a respeito da
recuperação de espermatozóides da cauda do epidídimo e ducto deferente (SILVA
et al., 2004). Em cães domésticos, utilizando-se material de orquiectomia que era
mantido refrigerado, observou-se que os espermatozóides do epidídimo mantidos a
4˚C, por 8 dias, conservaram a sua motilidade, morfologia e habilidade de se
ligarem a oócitos (YU & LEIBO, 2002). Para cães foi sugerido que na coleta de
sêmen do epidídimo fosse previamente feito, uma lavagem da região da cauda
epididimária, através da injeção de soro fetal bovino, TCM (meio de cultura para
tecidos)199 ou Tris no vaso deferente visando uma melhor qualidade do material a
ser obtido (SIRIVAIDYAPONG, 2002).
2.4. Drogas anestésicas para contenção química e anestesia
2.4.1. Tiletamina e Zolazepan
O cloridrato de tiletamina é um derivado da fenciclidina, assim como a
quetamina, produzindo, também, um tipo distinto de anestesia, denominado
14
dissociativa. Comercialmente, a tiletamina está associada com o zolazepam, que é
um potente benzodiazepínico (FANTONI et al., 2002).
Durante a anestesia denominada dissociativa, não ocorre a perda de reflexos
protetores, os olhos permanecem abertos, as pupilas midriáticas, e há ausência de
relaxamento muscular (FANTONI et al., 2002). Possui rápido inicio de ação e curta
duração quando administrado por via intravenosa e intramuscular devido à sua alta
lipossolubilidade Essa droga é metabolizada pelo fígado é eliminada pelo rim. A
duração da anestesia é de cerca de 30 a 40 minutos e é dependente do tipo de pré-
medicação anestésica empregada (FANTONI & CORTOPASSI, 2002).
Drogas dissociativas possuem um efeito complexo e não totalmente
elucidado na neurotrasmissão do SNC (Sistema Nervoso Central). Atuam
bloqueando receptores muscarínicos dos neurônios centrais e podem potencializar
os efeitos inibitórios do GABA (Acido –Gama - Aminobutírico). Também atuam
interferindo na neurotransmissão GABAérgica e bloqueiam o processo de
transporte neuronal da seratonina , dopamina e noroadrenalina. Existem evidências
de que as drogas dissociativas atuam potencializando o efeito das catecolaminas
por bloquearem sua recaptação (FANTONI et al., 2002).
A recuperação da anestesia pode ocorrer de forma súbita e acompanhada
de excitação. Como esse tipo de anestésico estimula determinadas áreas do SNC,
são comuns delírios e alucinações ao despertar. Os efeitos colaterais são:
hipertonicidade, excitação e hipertensão (FANTONI et al., 2002).
Os anestésicos dissociativos não devem ser empregados isolados,
podendo, então, estar combinados com agentes sedativos ou tranqüilizantes para
debelar os efeitos colaterais (BENSON, 2004).
A tiletamina produz uma analgesia intensa no sistema muscular
esquelético. Os sinais clínicos exibidos durante a anestesia são semelhantes aos
da quetamina. Na recuperação da anestesia, podem ocorrer delírios e alucinações
(FANTONI & CORTOPASSI, 2002; FANTONI et al., 2002). Quando esse agente é
utilizado isoladamente, dependendo da dose, via de administração e procedimento
cirúrgico, o animal poderá apresentar um quadro de excitação com vocalização,
hipertonia muscular e até convulsões (FANTONI & CORTOPASSI, 2002).
Os benzodiazepínicos são tranqüilizantes com ação ansiolítica,
miorrelaxantes, hipnóticos e provocam amnésia e alterações piscomotoras
(RANKIN, 2004). O zolazepan é um benzodiazepínico que aumenta atividade
15
inibitória Ácido-Gama-Aminobutírico (GABA) no SNC (encéfalo e medula) sendo,
portanto, capaz de debelar os efeitos adversos dos fármacos dissociativos, como a
agitação e rigidez muscular (FANTONI & CORTOPASSI, 2002).
A combinação de tiletamina com zolazepn vem sendo usada pela alta
margem de segurança que oferece, sendo o DL (dose letal) 50 em 200mg por ml do
Zoletil® (Virbac) por via intramuscular (DINIZ, 2002). O zolazepan aumenta a
margem terapêutica dos agentes dissociativos, potencializando a indução, o
miorrelaxamento e a analgesia sem depressão cardiorespiratória e com baixas
incidências de episódios catalépticos (MORATO et al., 2001).
As vantagens para a utilização desta combinação para animais selvagens
são: via de administração intramuscular, pois esses agentes podem ser aplicados
em altas concentrações, utilizando-se um baixo volume com segurança, o pequeno
tempo de indução e o fato dos reflexos protetores permanecerem ativos
(MASSONE, 2002).
2.4.2. Isoflurano
Dentre os anestésicos inalatórios disponíveis para a utilização na clínica
médica veterinária estão: halotano, isoflurano e sevoflurano (KEEGAN, 2004). A
anestesia inalatória vem sendo empregada na medicina veterinária por permitir
maior controle do plano anestésico por parte do anestesista (FANTONI et al.,
2002). A metabolização e a eliminação destes agentes anestésicos são rápidas.
Dependendo do fármaco utilizado para indução e a concentração de anestésico
volátil utilizada durante a manutenção, a recuperação da anestesia é mais rápida
do que quando se emprega agente anestésico intravenoso (FANTONI &
CORTOPASSI, 2002).
O mecanismo de ação envolve a ativação do sistema reticular. Possui
também, ação sobre o hipotálamo e o córtex, bem como sobre a medula espinhal e
pode produzir efeitos pré e pós-sinápticos. Atuam, então, na produção, liberação e
captação de vários neurotransmissores como a noroadrenalina, acetilcolina, GABA,
e outros (FANTONI & CORTOPASSI, 2002).
Os agentes anestésicos inalatórios estão divididos em: não-halogenados e
halogenados. O isoflurano pertence ao grupo dos halogenados e é o agente de
eleição em casos de paciente de risco e também daqueles portadores de
16
nefropatias e hepatopatias. O único fator limitante desse agente está no seu preço
elevado (FANTONI & CORTOPASSI, 2002).
O isoflurano especificamente atua deprimindo a atividade no sistema
nervoso central, causando pequena depressão no débito cardíaco e respiratório e
promove um relaxamento moderado do sistema neuromuscular (MASSONE, 2002).
17
3. OBJETIVOS:
• Avaliar o efeito de dois protocolos anestésicos utilizados nos
procedimentos de eletroejaculação, sobre a qualidade do sêmen em cães
domésticos sem raça definida.
• Avaliar o protocolo de estímulos elétricos proposto para coleta
de sêmen em cães domésticos sem raça definida.
• Avaliar a técnica de recuperação de espermatozóides
epididimário, em cães domésticos.
18
4. MATERIAL E MÉTODO
4.1. Animais
Foram utilizados 13 (treze) cães machos, sexualmente maduros, entre 5 e 40
quilogramas. Os animais eram sem raça definida. Destes, 8 animais passaram
pelos protocolos anestésicos 1 e os demais passaram pelo protocolo 2 de
anestesia. A identificação dos animais, origem e protocolo que passaram neste
experimento estão descritos na tabela 1.
19
Tabela 1 – Identificação, origem dos animais e protocolo anestésico utilizado na
coleta seminal.
Animal Origem Protocolo anestésico
1 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 - Zoletil
2 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 – Zoletil
3 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 – Zoletil
4 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 - Zoletil
5 Centro de controle de zoonoses -
Campos dos Goytacazes
Protocolo 1 - Zoletil
6 Centro de controle de zoonoses -
Campos dos Goytacazes
Protocolo 1 - Zoletil
7 Campos da Universidade Estadual
Norte Fluminense (UENF)
Protocolo 1 - Zoletil
8 Campos da Universidade Estadual
Norte Fluminense (UENF)
Protocolo 1 - Zoletil
9 Proprietários particulares Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
10 Proprietários particulares Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
11 Proprietários particulares Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
12 Proprietários particulares Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
13 Campos da Universidade Estadual
Norte Fluminense (UENF)
Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
20
Os animais provenientes do Centro de Controle de zoonoses e Associação
de Proteção Animal - Teresópolis foram mantidos em canis e alimentados com
ração peletizada industrial e a água era oferecidas ad libitum. Já os animais de
proprietários eram animais que viviam em casa e se alimentavam de ração
peletizada também. Os animais provenientes do campus da universidade eram
animais criados livres.
4.2. Procedimentos gerais
Para o protocolo anestésico 1 foram utilizados 8 animais e para o protocolo 2
foram usados 5 animais. Todos os animais passaram pelo procedimento 1 e, então,
pelos procedimentos 2 e 3. Os procedimentos estão descritos abaixo:
• Procedimento 1- Avaliação Clínica (identificação do animal e o exame
físico)
• Procedimento 2- Contenção química, sondagem vesical, protocolo de
eletroejaculação e avaliação da eficiência dos protocolos anestésicos
para coleta de sêmen por eletroejaculação.
• Procedimento 3- Orquiectomia e recuperação de espermatozóides
epididimários.
Após o termino do experimento os animais foram observados até o total
restabelecimento.
4.2.1. Procedimento 1:
A) Avaliação Clínica
A.1) Exame físico
Foram avaliadas as condições físicas gerais do animal como batimento
cardíaco, freqüência respiratória e a presença de alguma patologia associada ou
não ao trato reprodutivo além da pesagem dos animais.
21
B.1) Exame físico do trato reprodutivo
Os animais foram examinados quanto a:
• Testículos (consistência, simetria, posição, mobilidade, sensibilidade e
volume testicular*)
• Pênis e prepúcio (inspeção)
• Glândula prostática (localização e sensibilidade)
• Cordão espermático (inspeção e palpação)
• Escroto (inspeção)
• Epidídimo (palpação das regiões de cabeça, corpo e cauda)
*Foi realizado o cálculo do volume testicular e do volume testicular médio. As
medidas foram realizadas com o auxílio de um paquímetro. Efetuou-se a aferição
das medidas testiculares e, posteriormente, aplicou-se a seguinte fórmula
apresentada por Oberg et al., (1986):
Volume testicular = [ ¶ largura
2
x ( comprimento – largura/4] + ¶ largura
3
/6
Volume testicular médio = volume do testículo direito + volume do testículo
esquerdo/2
4.2.2. Procedimento 2:
Anestesia, sondagem vesical e protocolo de eletroejaculação.
A) Protocolos anestésicos
A.1) Protocolo 1
Depois de completado o primeiro procedimento, os animais de 1 a 8 foram
submetidos à contenção química, utilizando-se Zoletil
®
50 (VIRBAC) (associação de
hidrocloridrato de tiletamina com zolazepan na proporção de 1:1) na dose de 5 mg
por kg de peso corporal via intramuscular e, em seguida, foram transferidos para o
local onde era realizado o procedimento de eletroejaculação e as cirurgias .
22
A.2) Protocolo 2
Os animais, de 9 a 13, após serem submetidos ao primeiro procedimento,
foram pré-anestesiados com Zoletil® (hidrocloridrato de tiletamina com zolazepan)
na dose de 5 mg por Kg de peso corporal via intramuscular sendo associado o
anestésico volátil isoflurano (concentração alveolar mínima cerca de 3%)( modelo
TK-15, TAKAOKA®). O sistema de anestesia inalatória escolhido foi circular
valvular fechado e semi-fechado. O plano anestésico em que o animal foi mantido é
o plano 1 do terceiro estágio da classificação proposta por Guedel (GUEDEL, apud
SPINOSA et al., 2002).
Durante essa etapa o animal perde gradativamente seus reflexos. Neste
plano ocorre, principalmente, a perda de reflexos como laringotraqueal e interdigital,
a respiração se torna regular e automática, e o animal apresenta movimentos
erráticos no globo ocular. Os animais foram mantidos neste plano porque uma
anestesia em planos mais profundos poderia ocasionar o relaxamento do músculo
que circunda a bexiga urinária e, conseqüentemente, haveria a contaminação do
sêmen pela urina. Para controle da concentração anestésica e manutenção do
plano correto, foram observados o tônus muscular e a resposta ejaculatória aos
estímulos elétricos.
B) Sondagem vesical
Antes do início do procedimento de eletroejaculação, os animais tiveram a
bexiga cateterizada e esvaziada, utilizando-se cateter de polipropileno (sonda
uretral), que variou com o tamanho da abertura do orifício uretral externo. Após
sondagem foi retirado o conteúdo presente na bexiga urinária e a mesma foi lavada
com 20 ml de solução Ringer sem lactato estéril através do próprio cateter para a
realização da lavagem da bexiga.
O material coletado da bexiga urinária foi colocado em tubos plásticos de
14 ml, e centrifugado a 800x g por 5 minutos. O pellet obtido foi homogeneizado e
avaliado quanto ao número total de espermatozóides, motilidade e vigor
espermático.
23
Após o final dos procedimentos de eletroejaculação, os animais eram
novamente sondados para a coleta do material presente na bexiga urinária e todo o
procedimento descrito acima era repetido.
C) Eletroejaculação
A eletroejaculação é uma técnica que envolve a estimulação nos nervos
que atendem os órgãos reprodutores através de uma corrente elétrica fraca. O
aparelho utilizado foi o modelo Torget 65C (Eletrovet), que permite o controle
gradual da voltagem dos eletrochoques entre 0 e 12 V. A sonda retal possui
eletrodo bipolar, apresenta três tiras longitudinais de cobre, seu diâmetro é de 1,6
cm e seu comprimento é de 23 Cm. Previamente ao procedimento:
• Lubrificava-se a sonda com carboxi-metil-celulose antes da intromissão
no reto para manter o contato elétrico entre os eletrodos e a parede retal.
• Posicionavam-se os eletrodos sobre a região ventral da parede retal
sobre a glândula prostática
• Retiravam-se as fezes do reto do animal
• Encaixava-se o pênis no tubo coletor pré-aquecido e graduado (antes dos
estímulos elétricos).
O protocolo da aplicação dos eletrochoques consistiu de uma série de 80
estímulos divididos em três séries:
1. A primeira série de estímulos consistiu de 30 estímulos: 10
estímulos de 3 volts, 10 estímulos de 4 volts e 10 estímulos de 5
volts .
2. A segunda série consistiu de 30 estímulos: 10 estímulos de 4
voltes e 10 estímulos de 5 volts e mais 10 estímulos de 6 volts
3. A terceira série consistiu de 20 estímulos: 10 estímulos de 6 volts
e de 10 estímulos de 7 volts.
24
O intervalo entre as séries foi de 3 minutos e entre as subséries, de 1
minuto (MORATO, 2005, Comunicação pessoal
1
).
4.2.3. Avaliação da eficiência dos protocolos anestésicos para coleta de
sêmen por eletroejaculação
Para a avaliação da eficiência dos protocolos de eletroejaculação foram
utilizados os três resultados do número total de espermatozóides avaliados durante
o experimento (material da bexiga urinária antes e após a eletroejaculação e
material da expulsão seminal durante a eletroejaculação) como parâmetro.
Os protocolos 1 e 2 foram classificados quanto à sua eficiência como:
Protocolo Ineficiente (I): Quando a concentração espermática do material
coletado da bexiga urinária antes da eletroejaculação fosse superior às demais
concentrações avaliadas.
Protocolo eficiente (E): O protocolo eficiente foi classificado em:
• 1. Eficiente com Ejaculação Antrógrada (EJA) - Quando a
concentração espermática encontrada no material expelido
durante a eletroejaculação fosse superior às demais
concentrações.
• 2. Eficiente com Retroejaculação (EJR) - Quando a
concentração espermática do material encontrado na bexiga
urinária após a eletroejaculação fosse superior às demais
concentrações avaliadas.
4.2.4. Avaliação do protocolo de eletrochoques
A) Animais
Foram utilizados 8 animais, sendo eles os animais: 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 e 13
da tabela 1 descritos do item (4.1). Foi avaliada a presença (P) ou ausência (A) de
distensão dos membros pélvicos durante todos os estímulos de eletrochoques para
certificação do correto posicionamento da sonda conforme descrito por Queiroz,
2003).
1
Ronaldo Gonsalves Morato, Co-orientador; CENAP/IBAMA. ronaldo@procarnivoros.org
25
B) Avaliação do desenvolvimento do processo de ereção apresentada ou
ausência desta.
Durante todas as subséries de eletrochoques foram avaliadas: a ausência ou
presença de ereção e a progressão do processo de ereção e este classificado,
conforme proposto na tabela 2.
Tabela 2 – Classificação do processo de ereção durante as subséries de
eletrochoques (GIULIANO & RAMPIN, 2000; NEVES et al., 2004).
.
4.2.5. Procedimento 3
A) Animais
Foram utilizados 11 animais para esta etapa do experimento, sendo os
mesmos animais que estão descritos no item 4.1. (só não foram submetidos à
orquiectomia os animais 3 e 4 por apresentarem alterações clínicas)
Classificação do processo de ereção durante subsérie de estímulos
elétricos
Ausência de ereção (a) – não foi observado relaxamento das fibras musculares
lisas do tecido erétil e a dilatação do suplemento sangüíneo no pênis.
Ereção (e) +
alterações
hemodinâmicas
caracterizada por
um pequeno
aumento do fluxo
sangüíneo
++
observadas
alterações
hemodinâmicas mais
severas
26
B) Orquiectomia
Os animais foram orquiectomizados conforme a técnica de rotina utilizada
no Centro de Controle de Zoonoses e Unidade de Triagem da Universidade
Estadual do Norte Fluminense. O plano anestésico foi aprofundado para o
procedimento de orquiectomia. Após o procedimento cirúrgico, era aplicado e
receitado antibiótico e analgésico para o período pós-operatório dos animais, que
consistia de 7 dias .
C) Recuperação de espermatozóides do epidídimo e ducto deferente
C.1) Maceração epididimária
Após a retirada dos testículos e epidídimos do animal, o material foi
embalado em sacos plásticos com solução salina 0,9% a 37°C e mantidos a
temperatura ambiente durante o transporte para o laboratório ou até serem
avaliadas. O tempo médio até a avaliação foi de 2 horas.
O epidídimo e ducto deferente foram separados por dissecação do testículo
e o epidídimo macerado sobre uma placa de “petri” contendo 10-30 ml de solução
salina 0,9% à temperatura ambiente. Posteriormente, foi obtido, através de
aspiração com seringa plástica, a suspensão de espermatozóides que foram
repassadas para tubos, centrifugadas (800G por 5 minutos) e avaliadas.
Uma alíquota do material era avaliada quanto à motilidade e vigor
espermático, conforme técnicas propostas no item (4.3) antes da centrifugação
C.2) Avaliação das amostras
As amostras foram avaliadas, quanto ao número total de espermatozóides,
motilidade, vigor espermático e percentagem de espermatozóides normais,
utilizando-se as técnicas descritas abaixo.
27
4.3. Avaliação seminal
4.3.1. Avaliação microscópica do sêmen
A) Motilidade e vigor:
As amostras coletadas durante o experimento foram avaliadas colocando-
se uma gota de sêmen sobre uma lâmina aquecida (cerca de 38°C) e recoberta por
uma lamínula. A amostra era observada sob microscopia de contraste de fase.
O resultado da avaliação da motilidade foi avaliado em percentagem de 0 a
100%. Para o vigor, foi utilizado escore de zero a cinco.
B) Total de espermatozóides
Para o cálculo do número total de espermatozóides, foi calculada
primeiramente a concentração espermática. A contagem foi realizada utilizando-se
uma câmera hematimétrica de “Neubauer”.
Para o procedimento de contagem da câmera de “Neubauer” e cálculo da
concentração espermática, o sêmen foi diluído em solução formol - salina –
tamponada. A diluição utilizada para este trabalho foi de 1:20. Após esse
procedimento, o resultado obtido era multiplicado pelo volume total da amostra, e
então, obtido o número total de espermatozóide por ejaculado.
C) Morfologia espermática
O sêmen foi diluído em solução formol – salina - tamponada. A diluição utilizada
para este trabalho foi de 1:20. Então uma gota de sêmen foi colocada sobre uma
lâmina e recoberta por uma lamínula observada sob microscopia de contrate de
fase.
Para a avaliação das características morfológicas dos espermatozóides, foram
avaliadas 100 células de cada cão e os resultados foram expressos em
percentagem de células morfologicamente normais, defeitos maiores e defeitos
menores, segundo Blom (1972).
28
4.4. Análise estatística
Foram estimados as médias e os desvios padrão da média para os parâmetros:
total de espermatozóides, motilidade espermática, vigor espermático e
percentagem de células normais. Foram estabelecidas comparações entre médias
de anestésicos e entre médias de protocolos, por meio do teste t a 5% de
probabilidade.Todas as análises foram feitas utilizando o software SPSS
®
(Statistical
Package for the Social Sciences).
Foram realizadas análises descritivas utilizando-se Windows Excel® 2000 para
avaliação da morfologia e estímulos elétricos, assim como para avaliação da
eficiência dos protocolos anestésicos.
Foi realizada a análise de correlação pelo método dos mínimos quadrados entre
o peso corporal e o volume testicular médio e análise de correlação também pelo
método dos mínimos quadrados entre o volume testicular médio e o total de
espermatozóides do material avaliado da expulsão seminal durante a
eletroejaculação.
Para a descrição dos resultados, foram sempre empregados os desvios padrão
e as médias (média±DPM) dos dados originais.
29
5. RESULTADOS
5.1 Procedimento 1
Durante este procedimento foi realizada a mensuração dos testículos e
cálculo do volume testicular dos animais. O volume testicular médio obtido foi
relacionado com o peso corporal. O animal de maior peso (animal nº 9) apresentou
maior volume testicular médio assim como o de menor peso (animal nº 4)
apresentou o menor volume testicular médio. A correlação entre o volume testicular
médio e o peso vivo dos animais foi positiva (r = 0,87) (figura 1). Também foi
realizada a correlação ente o volume testicular médio e o resultado do número total
de espermatozóides do material ejaculado durante a eletroejaculação, entretanto
não houve correlação entre estes parâmetros (r= 0,14) (Figura 2).
30
Figura 1- Gráfico da correlação entre volume testicular médio (VM) e peso vivo dos
animais (n =13) utilizados para o experimento.
Durante o exame físico externo, somente 4 animais apresentaram alterações
dignas de nota conforme exposto na tabela (anexo 1B). O animal nº 6 apresentou o
testículo com consistência flácida. O animal nº 9 apresentou um aumento da
glândula prostática ao exame retal. O animal nº 10 apresentou um quadro de
inflamação no prepúcio. Já o animal nº 11 apresentou Tumor Venéro Transmissível.
Nenhuma dessas patologias foi correlacionada com a qualidade seminal.
5.2. Procedimento 2 – Eletroejaculação
Na tabela 3, estão expostos os valores em média (± DPM - desvio padrão da
média) das características seminais avaliadas nas amostras do sêmen ejaculado e
amostras recuperadas da bexiga urinária após a realização do procedimento de
eletroejaculação, utilizando-se o protocolo 1 de anestesia.
Na tabela 4 estão expostos os valores em média (±DPM) das características
seminais avaliadas nas amostras do sêmen ejaculado e amostras recuperadas da
bexiga urinária após a realização do procedimento de eletroejaculação, utilizando-
se o protocolo 2 de anestesia.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
0
10 20 30 40 50
PESO
VM
31
Tabela 3 – Médias (±DPM) das características seminais do material ejaculado
durante o procedimento de eletroejaculação, utilizando-se o protocolo
1 de anestesia (n=8) em cães.
Características seminais
Material ejaculado durante
a eletroejaculação
Material recuperado
da bexiga urinária
após procedimento
de eletroejaculação
Total de espermatozóides
( x10
6
)
5,55±4,96
22,09±21,11
Motilidade espermática (%) 2±2,4 1,25±2,18
Vigor espermático (0-5) 0,4±0,48 0,12±0,21
Espermatozóides normais
(%)
34±7 47±10
Tabela 4 - Médias (±DPM) das características seminais do material coletado e
avaliado durante o procedimento de eletroejaculação, utilizando-se o
protocolo 2 de anestesia (n=5) em cães.
Características seminais Material ejaculado
durante a
eletroejaculação
Material recuperado
da bexiga urinária
após procedimento
de eletroejaculação
Total de espermatozóides
( x10
6
)
11,5±5,75
16,85±13,72
Motilidade espermática
(%)
38,2±45,44 12±14,44
Vigor espermático (0-5) 1,25±1,25 0,2±0,32
Espermatozóides normais
(%)
45±18 42±14,8
32
Na tabela 5, foi realizada a comparação entre as médias (±DPM) das
características seminais avaliadas do material ejaculado durante a eletroejaculação
entre os diferentes protocolos anestésicos. Não houve diferença estatística entre as
médias dos parâmetros avaliados (p>0,05).
Na comparação entre as médias das características seminais avaliadas em
relação ao material recuperado da bexiga urinária após a eletroejaculação, entre os
diferentes protocolos anestésicos, também não houve diferença estatística (p>0,05)
(Tabela 6).
Tabela 5 - Comparação entre os protocolos anestésicos 1 e 2 em relação às
médias (±DPM) das características seminais do material ejaculado
durante o procedimento de eletroejaculação em cães.
Características seminais
Material ejaculado
durante a
eletroejaculação –
Protocolo 1
Material ejaculado
durante a
eletroejaculação –
Protocolo2
Total de espermatozóides
( x10
6
)
11,5±5,75
8,91±5,94
Motilidade espermática (%) 2±2,4
38,2±45,44
Vigor espermático (0-5) 0,4±0,48
1,25±1,25
Espermatozóides normais (%) 34±7
45±18
Teste de comparação de médias “teste t” , nível de significância p> 0,05
33
Tabela 6 - Comparação dos protocolos anestésicos 1 e 2 em relação às médias
(±DPM) das características seminais do material recuperado da bexiga
urinária após o procedimento de eletroejaculação em cães.
Características seminais
Material recuperado da
bexiga urinária após
procedimento de
eletroejaculação -
Protocolo 1
Material recuperado da bexiga
urinária após procedimento de
eletroejaculação –
Protocolo 2
Total de Espermatozóides
( x10
6
)
22,09±21,11
16,85±13,72
Motilidade espermática
(%)
1,25±2,18
12±14,44
Vigor espermático (0-5) 0,12±0,21
0,2±0,32
Espermatozóides
normais (%)
47±10
42±14,8
Teste de comparação de médias “teste t” ; nível de significância p> 0,05
5.3. Avaliação da eficiência dos protocolos anestésicos de eletroejaculação
Na tabela 7, foram avaliadas a eficiência e a classificação em categorias,
conforme critério estabelecido, no material e método do protocolo anestésico 1 de
eletroejaculação. Em 87,5 % dos animais, o protocolo se mostrou eficiente, e em
12,5% o protocolo foi ineficiente. Sendo que 100% dos animais apresentaram EJR
(ejaculação retrógrada).
34
Tabela 7 - Classificação da eficiência do protocolo anestésico 1 para
eletroejaculação em cães.
Protocolo
Amostra
bexiga
antes da
EE
(Total de
sptz/x10
6
)
Amostra
expelido
durante a
EE
(Total de
sptz/x10
6
)
Amostra na
bexiga após a
EE
(Total de
sptz/x10
6
)
Avaliação
da
eficiência
do
Protocolo
anestésico
para EE
( I/E)
Classificação
da eficiência
dos
protocolos de
EE
(EJA/EJR)
0,75 2
25
E EJR
0,75 13,75
36,75
E EJR
- -
2,25
E EJR
- -
2,75
E EJR
7,5 -
17
E EJR
0,25 9,75
89
E EJR
1,25 0,75
3,75
E EJR
1
2,25
1,5 0,25 I I
EE (eletroejaculação);Total de SPTZ (número total de espermatozóides por ejaculado); E
(eficiente), I (ineficiente), EJA (ejaculação antrógrada); EJR (ejaculação retrógrada) ** não
foi possível avaliar a concentração, a amostra aglomerou, entretanto foram observados
espermatozóides com motilidade progressiva durante análise.
A avaliação da eficiência do protocolo 2 de anestesia revelou que o mesmo
também foi eficiente em 100% das amostras avaliadas, sendo que não foi possível
realizar a avaliação em dois animais. Assim, observou-se que, 50% dos animais
apresentaram EJA, 25% apresentaram EJR e 25% não puderam ser avaliados por
problemas na amostra (tabela 8).
35
37,50%
62,50%
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
+ ++
Percentagem de (0-100%)
Tabela 8 - Protocolo 2 - avaliação da eficiência do protocolo anestésico 2 em cães.
Protocolo
Amostra
bexiga
antes da
EE
(Total de
sptz/x10
6
)
Amostra
expelido
durante a
EE
(Total de
sptz/x10
6
)
Amostra na
bexiga após
a EE (Total
de sptz/x10
6
)
Avaliação da
eficiência do
Protocolo
anestésico
para EE
(I/E)
Classificação
da eficiência
dos
protocolos
de EE
(EJA/EJR)
- -
39
E *
8 11,75
29
E EJR
2,5
15
11 E EJA
3,25
19,25
5 E EJA
2
1
- 0,25 * **
Total de SPTZ (número total de espermatozóides por ejaculado); E (eficiente), I
(ineficiente), EJA (ejaculação antrógrada); ** não foi possível avaliar a concentração, a
amostra aglomerou, entretanto foram vistos espermatozóides com motilidade progressiva
durante análise.
5.4. Avaliação do protocolo de eletrochoques: avaliação das intensidades do
processo de ereção.
Foram utilizados 8 animais para essa avaliação, independentemente do
protocolo anestésico submetido aos animais. No final de todo o procedimento de
eletroejculação, 62% dos animais apresentaram ereção (++) e 38% ereção (+).
Nenhum animal avaliado deixou de apresentar ereção no final do procedimento
(Figura 2).
Figura 2 - Gráfica da avaliação da intensidade do processo de ereção no final do
procedimento de eletroejaculação de cães.
36
5.5. Procedimento 3- Orquiectomia e recuperação de espermatozóides
epididimário.
Foram utilizados 11 animais para esse experimento. A tabela 10 mostra as
médias (±DPM) das características seminais do material recuperado do epidídimo.
Tabela 10 - Médias (±DPM) das características seminais do material recuperado
dos epidídimos e vaso deferente (REE) durante o experimento (n=11)
de cães.
Características
seminais
REE
Total de espermatozóides
( x10
6
)
65,37±41,90
Motilidade espermática (%) 50±27,27
Vigor espermático (0-5) 2±0,77
Espermatozóides normais (%) 35,54±23,22
5.6.Avaliação da morfologia espermática
As figuras 3, 4 e 5, representam os resultados da morfologia espermática do
material obtido do ejaculado durante o procedimento de eletroejaculação.
39%
61%
Espermatozóides normais
Espermatozóides
com anormalidades
Figura 3 - Valores médios da porcentagem de morfologia espermática encontrada
no material ejaculado durante o procedimento de eletroejaculação
(n=13) de cães.
37
89%
11%
19%
81%
Espermatozóides
com outras
patologias
Espermatozóides com defeitos
de cauda
Figura 4 - Média do resultado de defeitos maiores e menores do material ejaculado
durante o procedimento de eletroejaculação (n=13) de cães.
Figura 5 - Média do resultado de espermatozóides com patologias de cauda e
espermatozóides com a outras patologias do material ejaculado durante
o procedimento de eletroejaculação (n =13) de cães.
Defeitos
maiores
Defeitos
menores
38
6. DISCUSSÃO
6.1. Procedimento 1
A avaliação clínica prévia permitiu selecionar animais que não
apresentaram patologias que pudesse trazer algum efeito não desejado para os
processos de ereção e ejaculação (emissão seminal e expulsão seminal).
A média do peso corporal dos animais utilizados para o experimento foi de
19,27±1,4 e a média do volume testicular foi de 7,01±2,9. Ao se realizar o teste de
correlação entre o peso vivo dos animais e o volume testicular médio, obteve-se
uma correlação positiva onde se pode concluir que nenhum dos animais teve
medidas testiculares discrepantes em relação ao peso vivo.
Não houve correlação do volume testicular médio e o número total de
espermatozóides avaliado do material ejaculado durante a eletroejaculação. Os
resultados assemelham-se aos obtidos por England (1991), o qual verificou baixa
correlação entre volume testicular e total de espermatozóides nos ejaculados.
6.2. Procedimento 2
6.2.1. Protocolo anestésico 1
A combinação de tiletamina com zolazepan, utilizada no protocolo 1 de
anestesia foi escolhida, pela alta margem de segurança que oferece, sendo a DL
39
50 (dose letal) de 200mg por ml de Zoletil® (Virbac) por via intramuscular (DINIZ,
2002).
Como um dos objetivos futuros desta pesquisa é extrapolar os dados
verificados em cães domésticos para canídeos selvagens e de vida livre, a escolha
da droga para a imobilização química dos animais é importante. Conforme Morato
et al., (2001), os fatores a serem considerados durante a seleção de drogas para a
imobilização dos animais selvagens devem ser: a eficiência da droga, a segurança
dos animais e dos humanos envolvidos, a existência de drogas antogonistas e a
disponibilidade e custo da droga e de seu antagonista. Outro fator importante é o
bem-estar do animal durante todo o procedimento, garantindo um grau de
analgesia que permita a execução do procedimento desejado.
As vantagens da utilização da combinação da tiletamina com zolazepam
incluem o pequeno volume de injeção requerida, ampla margem de segurança,
permanência dos reflexos de proteção e uma rápida indução anestésica.
Entretanto, o tempo de retorno e qualidade da recuperação anestésica
idependeram da espécie, idade, peso, estado de saúde e da dose aplicada
(MASSONE, 2002).
A tiletamina e zolazepan vêm sendo empregados com sucesso em diversas
espécies de felídeos para coleta de sêmen por eletroejaculação (HOWARD, 1999;
MORATO, 2001; GOODROWE, 1998).
A dose utilizada durante o experimento foi de 5 mg/kg de peso corporal,
(MORATO, 2005, Comunicação pessoal
2
). Com esta dose, foi possível realizar todo
o procedimento envolvendo a eletroejaculação. A dosagem média recomendada
pelo fabricante para cães domésticos é de 7,5 a 10 mg/kg de peso vivo para
procedimentos como castração, caudectomia, extirpação de tumores, transporte e
outros. O laboratório sugere para outros membros da família Canidae doses entre
3,6 mg/kg a 8,1 mg/kg para aplicação via intramuscular. Durante o protocolo 1, no
qual se utilizou 5mg/kg, os animais não apresentaram alterações cardíacas e
respiratória ao exame clínico.
A perda do reflexo de levantar ocorreu entre 2 e 3 minutos após a aplicação
do fármaco. O retorno à deambulação variou de 2 a 6 horas. Segundo Mello &
Cordeiro (2001) quando se usa a combinação de tiletamina-zolazepan em cães
domésticos na dose de 6,6mg/kg via intramuscular, o tempo de latência (da
2
Ronaldo Gonsalves Morato, Co-orientador; CENAP/IBAMA. ronaldo@procarnivoros.org
40
aplicação até o início dos efeitos farmacológicos) varia de 115 a 82,5 segundos em
filhotes, jovens e adultos e o tempo de deambulação em cães adultos (idade
superior a dois anos de idade) é de 130,7±11,38 minutos (média ± erro padrão da
média) (MELLO & CORDEIRO, 2001).
Quanto à eficiência do protocolo de anestesia, dos animais avaliados
utilizando-se protocolo 1, obtiveram-se os resultados: 87,5% resultado eficiente e
12,5% ineficiente. Dos animais avaliados como eficientes 100% apresentaram EJR
(ejaculação retrógrada), ou seja, o número total de espermatozóides por ejaculado
das amostras coletadas da bexiga após realização da eletroejaculação, foi superior
as demais amostras, mostrando que ocorreu um movimento retrógrado do sêmen
durante o procedimento de coleta.
6.2.2 Protocolo Anestésico 2
Neste protocolo o anestésico volátil foi associado. O plano anestésico em
que o animal foi mantido foi o plano 1 do terceiro estágio da classificação proposta
por Guedel (apud SPINOSA et al., 2002). Em relação à analgesia, a equipe, de
forma empírica, classificou o procedimento como sendo mais confortável para o
animal, quando comparado ao protocolo 1.
Para a contenção inicial, o Zoletil® tem todas as características desejáveis
para a utilização em animais selvagens e de vida livre, como descrito
anteriormente.
O isoflurano é um anestésico seguro e indicado para casos de pacientes
com cardiopatias, hepatopatias e outras patologias, assim como para fêmeas
prenhes, ou seja, um anestésico seguro para quando não conhecemos o caso
clínico do animal (MASSONE, 2002). Outra característica positiva deste tipo de
anestesia é o retorno rápido à deambulação, sem a excitação presente no retorno
da contenção quando é utilizada somente a tiletamina-zolazepan.
Quanto à eficiência do protocolo, dos animais que passaram pelo protocolo
2, 100% dos animais avaliados apresentaram resultado eficiente, sendo que 50%
dos animais apresentaram EJA, 25% EJR e 25% não foram classificados por
problemas na avaliação da amostra. Durante o protocolo 2, além de todas as
tentativas terem sidos sucedidas, em 50% dos casos o número total de
41
espermatozóides das amostras coletadas durante a ejaculação seminal foi superior
as demais amostras, comprovando um maior movimento antrógrado do sêmen.
6.3.Comparação entre os protocolos anestésicos
Comparando-se os resultados das eletroejaculações com os valores normais
para ejaculados da espécie canina descritos por Johnston et at., 2001, obtivemos
qualidade seminal inferior (4-400 x10
6
espermatozóides por ml, motilidade
progressiva 70% e percentagem de espermatozóides normais 80%). Os valores
encontrados no experimento encontravam-se bem abaixo deste padrão.
Ao comparar os dois protocolos anestésicos e o efeito destes sobre as
características seminais, observou-se que não houve diferença estatística (p>0,05)
em relação aos parâmetros, sendo eles: número total de espermatozóides por
ejaculado motilidade espermática, vigor e percentagem de espermatozóides
normais.
Em outra espécie de canídeo, Canis rufus (GOODROWE et al., 1998), os
resultados obtidos usando-se a técnica de eletroejaculação em treze indivíduos
foram melhores do que os verificados neste experimento. Os resultados
encontrados foram: concentração espermática de 146,5± 25,7 x10
6
espermatozóides/ml, 71,2% de espermatozóides móveis e a média da percentagem
de células normais de 73,6±3,2%.
A coleta de sêmen por eletreoejaculação e a criopreservação do material já
foi realizada em Lycaon pictus e raposas (HERMES et al., 2001; BARTA &
JAKUBICKA, 1989; GOODROWE et al., 2001).
Kojima et al., (2001), em um estudo envolvendo cães, comparou as
características seminais das amostras obtidas por eletroejaculação e manipulação
digital (concentração espermática do sêmen coletado por eletroejaculação 10,7±2,2
x10
6
espermatozóides/ml e concentração espermática do sêmen obtido por
manipulação digital 388,7 x10
6
±164,3 espermatozóides/ml) e observou que a
concentração espermática e o total de espermatozóides das amostras era inferior
quando se utilizava a técnica de eletroejaculação para a coleta de sêmen. Em
humanos, foi constatado que a baixa qualidade seminal está relacionada com a
técnica de eletroejaculação (HOVAV et al., 2004).
42
Conforme Seager & Platz (1976); Howard (1993); Settchel et al., (1994);
Dooley & Pineda (1986), as amostras obtidas por eletroejaculação, tendem a ser:
mais volumosas, mais ácidas, com menor concentração espermática e,
eventualmente, contaminadas por urina, nas diferentes espécies estudadas.
O custo financeiro do protocolo 2 foi superior ao protocolo 1, pela utilização
do isoflurano, porém, devido à segurança que este anestésico apresenta a
utilização do mesmo deve ser preconizada quando se trata de espécies selvagens
e, em especial naquelas, ameaçadas de extinção, como os canídeos.
O protocolo 2 de anestesia foi 100% eficiente nos animais avaliados para a
eletroejaculação, enquanto que o protocolo 1 apresentou resultados inferiores
(87,5%). Verificou-se, que quando aplicado o protocolo 2, 50% dos casos
apresentam ejaculação antrógrada e que utilizando o protocolo 1, 100% dos casos
apresentaram ejaculação retrógrada.
Segundo Howard (1999), a utilização do anestésico volátil pode causar o
relaxamento dos músculos que circundam a bexiga urinária, aumentando, assim, a
contaminação pela urina e retroejaculação. Neste trabalho, houve a contaminação
por urina em 100% dos casos. Foi verificado, entretanto, que houve um aumento do
movimento antrógrado do sêmen durante o protocolo 2, que pode estar associado
com uma maior contração da região do colo da bexiga.
Queiroz et al. (2004), ao trabalharem com felídeos selvagens e coleta de
sêmen por eletroejaculação utilizando a suplementação da anestesia com
anestésico volátil, não observaram maior contaminação por urina utilizando neste
tipo de procedimento. Segundo estes autores, é importante manter um plano
anestésico correto que permita menor contaminação do sêmen por urina, já que o
aumento da concentração do anestésico inalatório pode reduzir, marcadamente, a
eferência do sistema nervoso simpático, que possui papel central no mecanismo
fisiológico da ejaculação e, simultaneamente, evita a contaminação do sêmen por
urina. Em relação a essa afirmação, foi verificado, durante nosso experimento, que
os animais que tiveram o plano anestésico aprofundado, urinaram na presença dos
estímulos elétricos.
Os efeitos deletérios da urina sobre as características seminais foram
amenizados pelo procedimento da lavagem da bexiga, que foi realizado antes da
eletroejaculação, com solução de Ringer sem lactato. Segundo Santos et al. (2005),
o pH e a osmolaridade são responsáveis pela redução de motilidade e morte dos
43
espermatozóides que entram em contato com a urina. Santos et al., (2005)
sugerem que a diluição e a lavagem com o diluidor Kenney das amostras
contaminadas podem ajudar a restaurar a motilidade progressiva de uma parte da
amostra. Segundo Hovav et al. (2004), em humanos, o procedimento da
eletroejaculação deve ser iniciado com a cateterização da bexiga e a introdução de
meios diluidores de sêmen e, conforme o mesmo autor, essa etapa diminui os
efeitos deletérios da urina sobre a amostra. Após o término do procedimento de
eletroejaculação, a bexiga deve ser novamente lavada, utilizando-se esses mesmos
meios, para obtenção do material retroejaculado.
Kojima et al. (2001), afirmaram que, tanto nos cães como nos ursos, onde o
sêmen foi coletado por eletroejaculação e ocorreu problema da contaminação do
sêmen por urina, não houve diferença estatística ao comparar as médias das
características seminais do material contaminado por urina e aqueles livres de
urina.
6.4 Avaliação do protocolo de eletrochoques
6.4.1 Avaliação da eficiência da localização da sonda
O correto posicionamento desta deve ser sobre as glândulas acessórias, no
caso do cão, a próstata. Nossos experimentos mostram que, durante o
procedimento de estímulos elétricos, 100% dos animais apresentaram distensão do
membro pélvico, sendo este reflexo considerado como indicativo do correto
posicionamento da sonda (HOWARD, 1999). A localização errada da sonda foi
relacionada, por alguns autores, como sendo uma das causas da contaminação do
sêmen por urina durante a eletroejaculação (KOJIMA et al., 2001; QUEIROZ, 2004;
HOWARD, 1999), sendo, então, importante certificar-se do correto posicionamento
da sonda durante cada estímulo elétrico para garantir o sucesso do procedimento.
6.4.2 Avaliação da eficiência da voltagem dos estímulos elétricos em relação
ao progresso do processo de ereção
No final da terceira série de estímulos elétricos que terminou com 7 volts,
62% dos animais apresentaram ereção ++ e 38% apresentaram ereção +. Ao
44
avaliar outros protocolos de estímulos elétricos utilizados para cães e canídeos
selvagens, verificamos que existem muitas diferenças entre a disposição das séries
de estímulos elétricos além do intervalo entre os estímulos e entre as séries.
Goodrowe et al., 1998, utilizou para Lobo-vermelho (Canis rufus) um protocolo que
variava de 3 a 8 volts (proposto por Platz & Seager, 1978), obtendo uma resposta
satisfatória. Kojima et al., 2001, em cães domésticos, utilizou um protocolo que
variou entre 1 a 10 volts, onde os estímulos elétricos cessavam quando a expulsão
seminal ocorria, obtendo resultados satisfatórios, apesar se serem inferiores ao
sêmen coletado por manipulação digital. Barta & Jakubicka (1989), ao estudarem a
coleta de sêmen em raposas utilizando a técnica de eletroejaculação combinada à
anestesia inalatória, alegaram que a voltagem e o número de estímulos para
produzir a resposta ejaculatória dependeram de fatores individuais das raposas. Em
humanos, a voltagem que tem apresentado resultados positivos varia de 5 a 25
volts, variando, também, a amperagem entre 100 -600mA, respectivamente (OHL et
al., 1989).
O protocolo de estímulos elétrico proposto durante o estudo foi eficiente para a
coleta de amostras de espermatozóides, porém acredita-se que os intervalos e a
voltagem máxima devem ser revistas para que possamos tornar o resultado mais
satisfatório.
6.5 Orquiectomia e recuperação de espermatozóides epididimários
Axner & Fosberg (1999) afirmaram que a preservação de células
espermáticas presentes na cauda do epidídimo pode ser uma alternativa viável
para a preservação de material genético oriundo de animais de coleções de
zoológicos e parques ambientais que vêm a óbito ou castrados por recomendação
clínica. Em humanos, muitos estudos comprovam a capacidade de fertilização
destes espermatozóides e, subseqüentemente, foram verificadas gestações
(HEWITT, 2001).
Durante nossos experimentos as médias (± DPM) para as características
seminais foram: 65,37±41,90x10
6
total de espermatozóides, 50±27,27% motilidade,
2±0,77% vigor espermático e 35,54±23,22% percentagem de espermatozóides
normais. Contudo existem diferenças estruturais que devem ser consideradas entre
45
os espermatozóides presentes no ejaculado e aqueles provenientes do epidídimo
como mudanças morfológicas e estruturais (HAFEZ, 1999; HEWITT, 2001).
6.6. Avaliação da morfologia espermática
Segundo o manual proposto pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
(1998), os reprodutores podem apresentar, no máximo, 20% de defeitos menores e
10% de defeitos maiores em seus ejaculados. Oéttle (1993) afirmou que a
avaliação da morfologia espermática é o teste que apresenta maior correlação com
a fertilidade.
Ao avaliar a percentagem de células com morfologias normais e aquelas que
apresentaram patologias espermáticas nas amostras ejaculadas durante a
eletroejaculação, encontrou-se no presente experimento um alto índice de
espermatozóides anormais (61%). Os defeitos eram, na maioria, defeitos menores
(89%), que estão relacionados com a passagem do ejaculado pelo ducto deferente
ou com fenômenos que ocorreram durante a ejaculação, assim como pela
manipulação do sêmen e pelo choque térmico ou osmótico. Dentre as patologias
mais freqüentes, encontramos os defeitos de flagelo, que foram relacionados com o
contato dos espermatozóides com a urina e a ocorrência do choque osmótico.
Dooley & Pineda (1986), ao estudarem a eletroejaculação em gatos domésticos e
as características seminais dos mesmos, encontraram um efeito significativo da
voltagem sobre a osmolaridade do sêmen obtido. Esta também poderia ser a causa
do número elevado de patologias na cauda do espermatozóide durante o estudo.
46
7. CONCLUSÕES
O método de eletroejaculação, embora produza amostras de sêmen de
menor qualidade seminal, é um método viável para coleta de amostras de
espermatozóides, visando à preservação de canídeos ameaçados de
extinção, que é o objetivo do trabalho.
Os protocolos anestésicos testados não mostram diferenças estatísticas
significativas na qualidade dos espermatozóides coletados como foi
verificado nos espermiogramas de rotina.
A técnica de obtenção de espermatozóides da região da cauda epididimária
pode ser utilizada como uma metodologia alternativa a eletroejaculação
São necessários mais estudos a respeito da técnica de eletroejaculação e o
protocolo proposto neste trabalho deve ser revisto para obtenção de
melhores resultados.
47
8.RFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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53
APÊNDICE
54
Apêndice A
Identificação dos animais quanto à origem e escolha do protocolo anestésico.
Tabela 1A – Identificação, Origem dos animais e protocolo anestésico submetido
aos animais.
Animal
(identificação)
Origem Protocolo anestésico
para coleta seminal
1 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 - Zoletil
2 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 – Zoletil
3 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 – Zoletil
4 Associação de proteção animal -
Teresópolis
Protocolo 1 - Zoletil
5 Centro de controle de zoonoses -
Campos dos Goytacazes
Protocolo 1 - Zoletil
6 Centro de controle de zoonoses -
Campos dos Goytacazes
Protocolo 1 - Zoletil
7 Campos da Universidade Estadual
Norte Fluminense(UENF)
Protocolo 1 - Zoletil
8 Campos da Universidade Estadual
Norte Fluminense(UENF)
Protocolo 1 - Zoletil
9 Animais provenientes de proprietários
particulares
Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
10 Animais provenientes de proprietários
particulares
Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
11 Animais provenientes de proprietários
particulares
Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
12 Animais provenientes de proprietários
particulares
Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
13 Campos da Universidade Estadual
Norte Fluminense(UENF)
Protocolo 2 – Zoletil +
Isoflurano
55
Apêndice B
Resultado da avaliação andrológica clínica externa dos animais.
Tabela 1B – Resultado da avaliação andrológica externa dos animais
EXAME
ANDRLÓGICO
ANIMAL 1 2 345678910 11 12 13
S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A
S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A
S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A I* S/A S/A S/A
S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A TVT S/A S/A
S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A A* S/A S/A S/A S/A
EPIDIDIMO
BOLSA ESCROTAL
PREPÚCIO
PÊNIS
PROSTATA
TESTÍCULO
S/A S/A S/A S/A S/A F* S/A S/A S/A S/A S/A S/A S/A
OS ANIMAIS 1,2,3,4,5.6,7 E 8 FORAM OS ANIMAIS SUBMETIDOS AO PROTOCOLO 1 ANESTÉSICO (ZOLETIL).OS
ANIMAIS 9,10,11,12 E 13, EM NEGRITO ,SÃO AQUELES ANIMAIS QUE PASSARAM PELO PROTOCOLO 2 DE
ELETROEJACULAÇÃO ONDE OS ANESTÉSICOS UTILIZADOS FORAM ZOLETIL E ISOFLURANO. F*= CONSISTÊNCIA
DO TESTÍCULO FLÁCIDO;A=*LEVE AUMENTO DA PROSTATA;I*PREPÚCIO INFLAMADO
56
Apêndice C
Resultados das características seminais do material coletado e avaliado
antes e após a eletroejaculação da bexiga e expelido durante a eletroejaculação
durante o protocolo 1 e 2 de anestesia.
Tabela 1C - Características do material coletado da bexiga antes da coleta por
eletroejaculação utilizando Protocolo 1 de anestesia (zoletil) em
cães.
Animal
Característica avaliada 1 2 3 4 5 6 7 8
Volume (ml) 13 12 14 14 14 14 43 36
Presença de
espermatozóides
S S N N S S S S
Motilidade (%) 1* 0 - - 0 0 0 0
Vigor (0 a 5) 0 0 - - 0 0 0 0
Total de
espermatozóides (10
6
)
0,75 0,75 - - 7,5 0,25 1,25 2,25
Concentração (10
6
/ml) 0,057 0,057 - - 0,53 0,01 0,029 0,062
S= sim; N=não; *motilidade local
57
Tabela 2C - Morfologia Espermática do material coletado da bexiga antes da coleta
por eletroejaculação utilizando Protocolo 1 de anestesia (zoletil) em
cães.
Morfologia Espermática 1 2 3 4 5 6 7 8
Espermatozóide normais(%) 60 46 - 0 34 57 71 15
Cauda enrolada(%) - - - 0 - 33 - 1
Cauda fortemente enrolada
(%)
- 46 - 0 60 - 1
Cauda dobrada (%) 25 - - 0 6 10 26 -
Cauda fortemente dobrada
(%)
11 - - 0 - - 2 -
GCP (%) - 7 - 0 - - - 1
Gota distal (%) - - - 0 - - - -
Pseudogota (%) - 2 - 0 - - - -
Acrossoma (%) 3 - - 0 - - - 1
Cabeça pequena normal (%) - - - 0 - - - -
Cabeça piriforme(%) - - - - - - 1 -
Cabeça isolada normal(%) - - - - - - - 1
Degenerados - - - 0 - - - 80
Total de defeitos 40 54 - 0 66 43 29 85
Tabela 3C Características do material coletado expelido durante a eletroejaculação
utilizando Protocolo 1 de anestesia (zoletil) em cães.
Animal
Característica avaliada 1 2 3 4 5 6 7 8
Volume (ml) 42 12 14* 14* - 5,5 13,5 1,3
Presença de
espermatozóides
S S N N N S S S
Motilidade (%) 5 5 0 - - 1** 1** 0
Vigor (0 a 5) 1 1 0 - - 0 0 0
Total de espermatozóides
(10
6 )
2 13,75 0 - - 9,75 0,75 1,5
Concentração (10
6
/ml) 0,04 1,125 0 - - 1,72 0,05 1,15
S= sim; N=não*animal apresentou reflexo de ereção seguido por micção, animal antes do
procedimento realizou diversas cópulas observadas.** motilidade local
58
Tabela 4C- Morfologia Espermática do material expelido durante a coleta por
eletroejaculação utilizando Protocolo 1 de anestesia (zoletil)
Morfologia Espermática 1 2 3 4 5 6 7 8
Espermatozóide normais(%) 35 23 0 - - 31 47 -
Cauda enrolada(%) - 0 - - 3 - -
Cauda fortemente enrolada
(%)
- - 0 - - 1 - -
Cauda dobrada (%) 59 75 0 - - 64 19 -
Cauda fortemente dobrada
(%)
5 1 0 - - - 34 -
GCP (%) - - 0 - - - - -
Gota distal (%) - - 0 - - - - -
Pseudogota (%) - - 0 - - - - -
Acrossoma (%) - - 0 - - - - -
Knobbed(%) 1 - - -
Cabeça pequena normal (%) - - 0 - - - - -
Cabeça piriforme(%) - - 0 - - - - -
Cabeça isolada normal(%) - - 0 - - - - -
Degenerados - - 0 - - - - -
Teratolólogico(%) 1 - -
Total de defeitos 66 77 0 -- -- 69 53 --
Tabela 5C-Características do material coletado da bexiga após da coleta por
eletroejaculação utilizando Protocolo 1 de anestesia (zoletil) em cães.
Animal
Característica avaliada 1 2 3 4 5 6 7 8
Volume (ml) 14 12 14 14 30 11 25 14
Presença de
espermatozóides
S S S S S S S S
Motilidade (%) 0 0 0 10 0 0 0 0
Vigor (0 a 5) 0 0 0 1 0 0 0 0
Total de espermatozóides
(10
6 )
25 36,75 2,25 2,75 17 89 3,75 0,25
Concentração (10
6
/ml) 1,78 0,036 0,16 0,19 0,56 8,09 0,15 0,01
S= sim; N=não*motilidade local
59
Tabela 6C-Morfologia espermática do material coletado da bexiga após da coleta
por eletroejaculação utilizando Protocolo 1 de anestesia (zoletil) em
cães.
Morfologia Espermática 1 2 3 4 5 6 7 8
Espermatozóide normais(%) 67 20 50 44 61 43 56 41
Cauda enrolada(%) - - - - 61 - - 15
Cauda fortemente enrolada (%) - - - - - 43 - 2
Cauda dobrada (%) 11 77 42 4 7 23 - 2
Cauda fortemente dobrada (%) 1 1 8 5 - - 42 -
GCP (%) 20 - - - - - - 2
Gota distal (%) - 1 - - - - - 5
Pseudogota (%) - 1 - - - - - -
Acrossoma (%) 1 10 - - - -- - -
Knobbed(%) - - - - - - - 2
Cabeça pequena normal (%) - - - - - - - -
Cabeça piriforme(%) - - - - - - 1 -
Cabeça isolada normal(%) - - - - - - 1 -
Degenerados - - - - - - - -
Teratolólogico(%) - - - - - - - 1
Total de defeitos
33 80 50 56 39 57 44 59
Tabela7C - Características do material coletado da bexiga antes da coleta por
eletroejaculação utilizando protocolo anestésico 2 (zoletil + Isoflurano)
em cães.
Animal
Característica avaliada 9 10 11 12 13
Volume (ml) 0 2,5 20 13 46
Presença de
espermatozóides
- S S S S
Motilidade (%) - 1* 0 0 o
Vigor (0 a 5) - 0 0 0 0
Total de espermatozóides
(10
6 )
-
8 2,5 3,5 1
Concentração (10
6
/ml) - 3,4 0,125 0,25 0,02
S= sim; N=não*motilidade local
60
Tabela 8C - Morfologia espermática do material coletado da bexiga antes da coleta
por eletroejaculação utilizando protocolo anestésico 2 (zoletil +
Isoflurano) em cães.
Morfologia Espermática 1 2 3 4 5
Espermatozóide normais(%) 67 20 50 44 61
Cauda enrolada(%) - - - - 61
Cauda fortemente enrolada (%) - - - - -
Cauda dobrada (%) 11 77 42 4 7
Cauda fortemente dobrada (%) 1 1 8 5 -
GCP (%) 20 - - - -
Gota distal (%) - 1 - - -
Pseudogota (%) - 1 - - -
Acrossoma (%) 1 10 - - -
Knobbed(%) - - - - -
Cabeça pequena normal (%) - - - - -
Cabeça piriforme(%) - - - - -
Cabeça isolada normal(%) - - - - -
Degenerados - - - - -
Teratolólogico(%) - - - - -
Total de defeitos
33 80 50 56 39
Tabela 9C - Características do material expelido durante a eletroejaculação
utilizando protocolo anestésico 2 (zoletil + Isoflurano) em cães.
Animal
Característica avaliada 9 10 11 12 13
Volume (ml) 2,5 3 6 23 *
Presença de
espermatozóides
S S S S S
Motilidade (%) 90 1*** 100 0 -
Vigor (0 a 5) 3 0 2 0 -
Total de espermatozóides
(10
6 )
**
11,7
5
15
19,2
5
-
Concentração (10
6
/ml) ** 3,91 2,72 0,83 -
** Não possível realização da contagem porque houve aglutinação
da amostra; *Não foi possível mensurar o volume da amostra
coletada; ***motilidade local; S= sim; N=não
61
Tabela 10C-Morfologia Espermática do material expelido durante a eletroejaculação
utilizando protocolo anestésico 2 (zoletil + Isoflurano) em cães.
Morfologia Espermática 1 2 3 4 5
Espermatozóide de morfologia normal (%) ** 30 33 72 -
Acrossoma danificado (%) - - - - -
Knobed (%) - - - - -
Cabeça delgada (%) - - - - -
Cabeça isolada normal (%) - - - - -
Peça intermediaria(%) - - - -
Cauda fortemente enrolada (%) - - 7 - -
Teratológicos (%) - - - - -
Cauda enrolada (%) - 4 55 20
Cauda dobrada (%) - - 5 8 -
Cauda fortemente dobrada (%) - - - - -
GCP (%) - - - - -
GCD (%) - - - -
Total de defeitos - 70 67 27 -
Tabela 11C- Características do material coletado após a eletroejaculação utilizando
protocolo anestésico 2 (zoletil + Isoflurano) em cães.
Animal
Característica avaliada 9 10 11 12 13
Volume (ml) 12,5 10 18 14 20
Presença de
espermatozóides
S S S S S
Motilidade (%) 20 20 0 0 0
Vigor (0 a 5) 1 1 0 0 0
Total de espermatozóides
(10
6 )
39 29 11 5 0,25
Concentração (10
6
/ml) 3,12 1,11
0,61
1
0,35
7
0,01
S= sim; N=não
62
Tabela 12C- Morfologia espermática do material coletado após a eletroejaculação
utilizando protocolo anestésico 2 (zoletil + Isoflurano) em cães.
Morfologia Espermática 1 2 3 4 5
Espermatozóide de morfologia normal
(%)
30 27 32 69 52
Cauda enrolada (%) 37 31 57 7 -
Cauda fortemente enrolada (%) - 24 4 15 7
Cauda dobrada (%) - 14 7 3 16
Cauda fortemente dobrada (%) 33 4 6 12
GCP (%) - - - - 11
GCD(%) - - - - 1
Pseudogota (%) - - - - 1
Total de defeitos 70 73 68 31 48
63
Apêndice D
Avaliação do protocolo de eletrochoques
Tabela 1D-Reflexo de distensão dos membros pélvicos (RDMP) e ereção dos
animais 5,6,7 durante a eletroejaculação.
Animal Seqüência Voltagem(V) RDMP Ereção
3 P a
4 P p
1ª
5 P p
4 P a
5 P a
2ª
6 P a
6 P t
5 Câo CCZ
Zoletil
3ª
7 P t
3 P a
4 P a
1ª
5 P p
4 P t
5 P t
2ª
6 P t
6 P t
6 Câo CCZ
Zoletil
3ª
7 P t
3 P p
4 P p
1ª
5 P p
4 P p
5 P p
2ª
6 P p
6 P p
7Cão
Campos
Universitário
Zoletil
3ª
7 P p
RDMP = Reflexo de distensão do membro pélvico ,P = presente; a = ausente; p = parcial; t = total.
64
Tabela 2D-Reflexo de distensão dos membros pélvicos (RDMP) e ereção dos
animais 8, 9 e 10 durante a eletroejaculação.
Animal Seqüência Voltagem(V) RDMP Ereção
3 P p
4 P p
1ª
5 P p
4 P p
5 * *
2ª
6 * *
6 * *
8 cão Campos
Universitário
Zoletil
3ª
7 * *
3 P a
4 P a
1ª
5 P a
4 P p
5 P p
2ª
6 P p
6 P t
9 Cão
Proprietário
Zoletil +
Isoflurano
3ª
7 P t
3 P p
4 P p
1ª
5 P p
4 P p
5 P p
2ª
6 P p
6 P p
10 Cão
Proprietário
Zoletil +
Isoflurano
3ª
7 P p
RDMP = Reflexo de distensão do membro pélvico ;P = presente; a = ausente; p = parcial; t
= total; * o animal apresentou cianose a partir da 2ª seqüência e o procedimento foi
interrompido
.
65
Tabela 3D - Reflexo de distensão dos membros pélvicos (RDMP) e ereção dos
animais 11, 12 e 13 durante a eletroejaculação.
Animal Seqüência Voltagem(V) RDMP Ereção
3 P t
4 P t
1ª
5 P t
4 P t
5 P t
2ª
6 P t
6 P t
11 Cão
Proprietário
Zoletil +
Isoflurano
3ª
7 P t
3 P p
4 P p
1ª
5 P t
4 P t
5 P t
2ª
6 P t
6 P t
12 Cão
Proprietário
Zoletil +
Isoflurano
3ª
7 P t
3 P p
4 P p
1ª
5 P p
4 P p
5 P p
2ª
6 P p
6 P p
13 cão
Campos
Universitário
Zoletil+
Isoflurano
3ª
7 P p
RDMP = Reflexo de distensão do membro pélvico;P = presente; a = ausente; p = parcial; t = total
66
Apêndice E
Relação de animais orquiectomizados e características seminais do material
avaliado da recuperação de espermatozóides epididimários.
Tabela 1E – Animais que foram submetidos a orquiectomia durante o experimento.
Animais Orqiectomia
1 R
2 R
3 NR*
4 NR**
5 R
6 R
7 R
8 R
9 R
10 R
11 R
12 R
13 R
R =realizado; NR=não realizado* animal debilitado
para cirurgia a campo
67
67
Tabela 2E -Características do material coletado do epidídimo e vaso deferente durante o experimento em cães.
Características Avaliadas
Animal
Volume
(ml)
Presença de
espermatozóides
Motilidade
(%)
Vigor
(0 a 5)
Total de
espermatozóides
(10
6
)
Concentração (10
6
/ml )
1 24 S 10 3 36,62 2,61
2 14 S 0 0 77,75 5,19
3 - * - - - -
4 - ** - - - -
5 14 S 30 2 77,75 5,55
6 14 S 30 2 112,75 8,05
7 14 S 50 2 10 0,71
8 14 S 70 3 1 0,07
9 14 S 80 1 45,5 3,25
10 10 S 70 3 126,5 12,65
11 14 S 100 2 121,5 8,67
12 14 S 80 1 111,5 7,96
13 14 S 30 1 3,25 0,23
68
68
Tabela 4 E- Morfologia espermática do material coletado do epidídimo e vaso deferente durante o experimento em cães.
Morfologia Espermática
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Espermatozóide de morfologia normal (%) 67 68 0 0 36 46 2 4 72 17 13 14 52
Knobed (%) 1 - - - - - - - - - - - -
Inserção retroaxial(%) - 1 - - - - - - - - - - -
Cabeça Gigante - 2 - - - - - - - - - - -
Cauda fortemente enrolada (%) - - - - 18 - 8 17 - - - - 7
Cauda Dobrada com gota citoplsmática(%) - - - - - - - - - - 3 - 3
Teratológicos (%)
Cauda enrolada (%) - - - - - 10 47 6 - 3 - - 37
Cauda dobrada (%) 11 8 - - - - 29 61 4 - - 11 32
Cauda fortemente dobrada (%) 1 1 - - - 2 - - - - - 1 2
Pseudogotatas(%) - - - - - - - - - - - 6 2
GCP (%) 20 20 - - 47 42 14 12 28 80 84 68 4
GCD (%) - - - - -- - - - - - - - 2
Total de defeitos 33 32 - - 64 54 98 96 28 83 87 86 58
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