Download PDF
ads:
CaracterizaçãodoSistemaPurinérgico
naFormaçãoHipocampaldeRatosSubmetidos
aoModelodeEpilepsiadoLobo Temporal
InduzidaporPilocarpina
FláviaDoná
SãoPaulo
2006
TeseapresentadaàUniversidadeFederal
de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
DoutoremCiências.
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
FLÁVIA DONÁ
CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA PURINÉRGICO NA FORMAÇÃO
HIPOCAMPAL DE RATOS SUBMETIDOS AO MODELO DE EPILEPSIA DO
LOBO TEMPORAL INDUZIDA POR PILOCARPINA
São Paulo
2006
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Doutor em Ciências
.
ads:
FLÁVIA DONÁ
CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA PURINÉRGICO NA FORMAÇÃO
HIPOCAMPAL DE RATOS SUBMETIDOS AO MODELO DE EPILEPSIA DO
LOBO TEMPORAL INDUZIDA POR PILOCARPINA
São Paulo
2006
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Doutor em Ciências
Orientador
:
Profa. Dra. Maria José da Silva Fernandes
Co-orientador:
Prof. Dr. Isaltino Marcelo Conceição
Doná, Flávia
Caracterização do Sistema Purinérgico na Formação Hipocampal de
Ratos Submetidos ao Modelo de Epilepsia do Lobo Temporal Induzida
por Pilocarpina. / Flávia Doná. -- São Paulo, 2006.
xvii, 83f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina. Programa de pós-graduação em
Neurologia/Neurociências.
Título em Inglês: Characterization of the Purinergic System in the
Hippocampal Formation
of Rats Submitted to Pilocarpine-Induced
Temporal Lobe Epilepsy.
1. Epilepsia. 2. Hipocampo. 3. Purinérgico. 4. ATP
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA
Chefe do Departamento
Profa. Dra. Débora Amado Scerni
Coordenador do Curso de Pós Graduação
Profa. Dra. Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti
iv
FLÁVIA DONÁ
CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA PURINÉRGICO NA FORMAÇÃO
HIPOCAMPAL DE RATOS SUBMETIDOS AO MODELO DE EPILEPSIA DO
LOBO TEMPORAL INDUZIDA POR PILOCARPINA
Presidente da Banca
Profa. Dra. Maria José da Silva Fernandes
Banca Examinadora
Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich
Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza
Prof. Dr. João Pereira Leite
Profa. Dra. Patrícia Castelucci
Suplentes
Profa. Dra. Eliane Beraldi Ribeiro
Profa. Dra. Zulma Felisbina da Silva Ferreira
Aprovada em: / /
v
Esta tese foi realizada na Disciplina de Neurologia Experimental do Departamento de
Neurologia e Neurocirurgia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, durante o curso de pós-graduação em Neurologia/Neurociências. Auxílio
financeiro: CNPq, FAPESP e CAPES.
vi
vii
AGRADECIMENTOS
Meus agradecimentos em especial a DEUS, o qual me iluminou nos momentos
difíceis, me dando coragem, força e muita fé.
“Os que confiam no Senhor serão como monte Sião,
que não se abala, mas permanece para sempre.”
Salmo 125,1
A Profa. Dra. Maria José da Silva Fernandes, pelos seus ensinamentos,
dedicação, competência, amizade, e, sobretudo pela brilhante orientação, apoio e
carinho na realização desse trabalho. Zezé meus sinceros agradecimentos.
A Profa. Dra. Débora Amado Scerni, Chefe do Departamento de Neurologia e
Neurocirurgia, pela sua competência, dedicação, incentivo e oportunidade concedida.
Ao Prof. Dr. Lineu dos Santos Calderazzo Filho, Chefe da Disciplina de
Neurologia Experimental, pela oportunidade concedida.
Ao Prof. Dr. Isaltino Marcelo Conceição, do Laboratório de Farmacologia do
Instituto Butantan, pela co-orientação e ensinamentos que permitiram a realização
desse trabalho.
A Profa. Dra. Eliane Beraldi Ribeiro, do Laboratório de Fisiologia da Nutrição da
UNIFESP, pela colaboração e pela rica convivência profissional e humana.
Aos professores do Departamento de Neurologia e Neurocirurgia: Dra. Maria da
Graça Naffah-Mazzacoratti, Dr. Esper A. Cavalheiro, Dr. Ricardo Arida, Dr. Fúlvio A.
Scorza e Dr. Alexandre Valotta, pela disponibilidade, atenção e incentivo.
As professoras do Laboratório de Farmacologia do Instituto Butantan, Dra. Ana
L.A. Nencioni e Dra. Valquíria A.C. Dorce, pelo incentivo e pela excelente
colaboração no trabalho de microdiálise.
viii
A Profa. Dra. Iracema Sena Andrade pela amizade, carinho e apoio.
Aos amigos e colegas de pós-graduação, pelo convívio e conhecimentos
transmitidos, em especial Sandra Perosa, Érika, Iara e Tiago.
A Maria Fernanda da S.P. Mello, pela amizade, carinho, incentivo durante toda
a pós-graduação.
Aos ex-alunos, recentes doutores, do Laboratório de Fisiologia da Nutrição da
UNIFESP, em especial ao Anderson, Lila, Mônica e Kelse, pela amizade e pelos
ensinamentos nas técnicas de western blotting e microdiálise.
A Thalma, do Laboratório de Farmacologia do Instituto Butantan pela amizade,
competência, incentivo e pela excelente participação no trabalho de microdiálise e
análise das purinas no HPLC.
A Hilda Reis, pelo auxílio na histologia e amizade.
Aos funcionários da UNIFESP, em especial ao Silvando, Luizinho e Marco
Aurélio.
As agências de fomento CNPq, CAPES e FAPESP, pelo apoio financeiro.
ix
De tudo ficaram três coisas:
De tudo ficaram três coisas:De tudo ficaram três coisas:
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda, um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...
Fernando Sabino
x
SUMÁRIO
Dedicatória.................................................................................... vi
Agradecimentos.............................................................................. vii
Lista de Figuras.............................................................................. xii
Lista de Abreviaturas e Símbolos......................................................... xiv
Resumo........................................................................................ xvi
1. INTRODUÇÃO
1.1 Epilepsia do Lobo Temporal.............................................. 1
1.2 Sistema Purinérgico........................................................ 11
1.3 Sistema Purinérgico e Epilepsia ......................................... 22
2. OBJETIVO
2.1 Objetivos.....................................................................
25
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais....................................................................... 26
3.2 Modelo de Epilepsia Induzida por Pilocarpina ......................... 26
3.3 Microdiálise.................................................................. 27
3.4 HPLC.......................................................................... 29
3.5 Imunoblot e Imuno-histoquímica......................................... 30
3.6 Análise Estatística.......................................................... 33
4. RESULTADOS
xi
4.1 Análise Comportamental.................................................. 34
4.2 Liberação de Purinas....................................................... 34
4.3 Imunoblot.................................................................... 40
4.4 Imuno-histoquímica........................................................ 42
4.5 Resumo dos Resultados.................................................... 48
5. DISCUSSÃO
5.1 Liberação de ATP e seus Metabólitos.................................... 49
5.2 Receptores Purinérgicos: P2X
2
, P2X
4
e P2X
7
............................ 56
6. CONCLUSÃO
6.1 Conclusões................................................................... 66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
Abstract
Apêndice
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ilustração da via tri-sináptica................................................. 4
Figura 2: Evolução cronológica na Epilepsia do Lobo Temporal humana e no
modelo da pilocarpina...................................................................... 6
Figura 3: Demonstração esquemática da fisiopatogenia da Epilepsia do Lobo
Temporal......................................................................................
8
Figura 4: Teorias do brotamento de fibras musgosas e das células em cesto
“dormentes”................................................................................. 9
Figura 5: Produção e Consumo do ATP intracelular................................... 12
Figura 6: Fontes de liberação de ATP................................................... 13
Figura 7: Esquema da hidrólise do ATP intra e extracelular pelas endo e
ectonucleotidases, respectivamente..................................................... 14
Figura 8: Distribuição de receptores A1 e A2
A
no sistema nervoso central........ 15
Figura 9: Distribuição de receptores P2X e P2Y no sistema nervoso central...... 17
Figura 10: Sistema de microdiálise...................................................... 27
Figura 11: Concentração extracelular de ATP na formação hipocampal,
durante o status epilepticus e condição controle......................................
35
Figura 12: Concentração extracelular de ADP na formação hipocampal,
durante o status epilepticus e condição controle......................................
36
Figura 13: Concentração extracelular de AMP na formação hipocampal,
durante o status epilepticus e condição controle......................................
36
Figura 14: Concentração extracelular de Adenosina na formação hipocampal,
durante o status epilepticus e condição controle......................................
37
xiii
Figura 15: Concentração extracelular de purinas totais na formação
hipocampal, durante o status epilepticus e condição controle......................
37
Figura 16: Concentração extracelular de purinas durante a crise espontânea... 39
Figura 17: Posicionamento da Sonda de Microdiálise, coloração de Cresil
Violeta........................................................................................ 39
Figura 18: Densidade óptica dos receptores P2X
2
na formação hipocampal...... 41
Figura 19: Densidade óptica dos receptores P2X
4
na formação hipocampal...... 41
Figura 20: Densidade óptica dos receptores P2X
7
na formação hipocampal...... 42
Figura 21: Fotomicrografia dos receptores P2X
2
no hipocampo..................... 44
Figura 22: Fotomicrografia dos receptores P2X
4
na formação hipocampal........ 45
Figura 23: Fotomicrografia dos receptores P2X
7
na região CA1 do hipocampo... 46
Figura 24: Fotomicrografia dos receptores P2X
7
na formação hipocampal........ 47
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ADP – Adenosina 5’-difosfato
AMP – Adenosina 5’- monofosfato
AMPA - Alfa-amino3-hidroxil-5-metil-4isoxazole-4-propionato
ATP - Adenosina 5´-trifosfato
ADE - Adenosina
BSA – Albumina do soro bovino (Bovine Serum Albumin)
Ca
2+
- íons cálcio
CA – Corno de Amon
ECL – Quimioluminescência (Enhanced Chemiluminesce)
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylenediaminetetracetic acid)
ELT - Epilepsia do Lobo Temporal
ELTM – Epilepsia do Lobo Temporal Mesial
G12H - Grupo de animais sacrificados com 12 horas de SE
GABA - Ácido gama-aminobutírico
GCro- Grupo crônico
GCt - Grupo controle
GLat - Grupo latente
K
+
- íons potássio
KA - Cainato
KDa – Quilodaltons
LTP - potenciação a longo prazo (Long-term potentiation)
ME – Nitrato de metilescopolamina
Mg
2+
- íons magnésio
xv
Na
+
- íons sódio
NaF - Fluoreto de sódio
NFκB - Fator Nuclear κappa-B
NMDA - N-metil-D-aspartato
NP-40 - Nonidet P-40
NTPDase -
E
cto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase
PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida (Polyacrilamide Gel Electrophoresis)
PMSF – Fenilmetilsulfonilflorideo (phenylmethylsulphonyl fluoride)
SDS - Dodecilsulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate)
SE – Status Epilepticus
SNC / SNP - Sistema Nervoso Central / Sistema Nervoso Periférico
SPECT - Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único
TF - Tampão Fosfato
UTP – Uridina 5’- trifosfato
UDP – Uridina 5’- difosfato
xvi
RESUMO
A pilocarpina é um agonista colinérgico que, quando injetada em altas doses
(i.p.) a ratos, reproduz as principais características da epilepsia do lobo temporal
(ELT) humana. O animal exibe diferentes padrões de comportamentos, incluindo
status epilepticus (fase aguda), normalização comportamental (fase latente) e
finalmente crises espontâneas e recorrentes (fase crônica).
Os objetivos desse estudo foram analisar por microdiálise e HPLC a
concentração de ATP e seus metabólitos na formação hipocampal de ratos que se
encontram nas fases aguda e crônica do modelo experimental de ELT induzida por
pilocarpina, e avaliar através de imunoblot e imuno-histoquímica, os receptores
P2X
2
,
4
,
7
na formação hipocampal desses animais, incluindo o grupo latente.
O procedimento de microdiálise foi aplicado para determinação da
concentração de purinas liberadas durante o status epilepticus (SE) em amostras
coletadas nos seguintes tempos: Basal (3 amostras antes de qualquer tratamento),
após a administração de metilescopolamina (usada para minimizar os efeitos
periféricos da pilocarpina) e 30 min. 1H, 2H, 3H e 4H após a aplicação da pilocarpina.
Os animais crônicos foram estudados nos períodos interictal e ictal. As amostras foram
analisadas por HPLC com detecção por fluorescência.
Animais de três grupos experimentais (G12H; GLat; GCro) e respectivos
controles, foram empregados para o estudo dos receptores P2X
2
,
4,7
, através de
imunoblot e imuno-histoquímica. O imunoblot foi revelado por quimiluminescência. A
imuno-histoquímica foi feita com cortes fixados e flutuantes em tampão, usando
anticorpo biotinilado e kit ABC e revelação com diaminobenzidina.
O estudo bioquímico revelou um aumento de ADP, AMP e adenosina durante
o SE. Na fase crônica, evidenciou-se uma redução de todas as purinas no período
interictal, e um aumento das mesmas no período ictal, sendo significante para o ATP
e adenosina. Em relação aos receptores estudados por imuno-histoquímica e
imunoblot, observou-se uma intensa redução dos P2X
4
versus CT no período crônico
(35%, p<0.001, ANOVA), um aumento do P2X
7
nas fases aguda e crônica (G12H: 20%,
p<0,05; GCRO: 18% p<0,05, ANOVA).
xvii
Com base nos resultados, conclui-se que o metabolismo das purinas está
alterado na fisiopatologia da ELT induzida por pilocarpina, por exemplo, na fase
aguda o aumento na concentração de ADP, AMP e de adenosina, pode estar refletindo
um aumento na taxa metabólica do ATP pelas ectonucleotidases, como um mecanismo
compensatório inibitório. No entanto, o ATP antes de ser metabolizado pode estar
ativando receptores P2X
7
, e exercendo um papel importante na citotoxicidade. Já na
fase crônica, a redução das purinas, infere principalmente um comprometimento na
atividade inibitória mediada pela adenosina, que por sua vez pode facilitar a
susceptibilidade às crises epilépticas.
1
1.1 Epilepsia do Lobo Temporal
E
pilepsia é um distúrbio crônico da função cerebral caracterizado pela
presença de crises epilépticas espontâneas e recorrentes, que ocorrem na ausência de
condição tóxico-metabólica ou febril (Guerreiro et al., 2000). As crises epilépticas
acontecem devido à disfunção temporária de grupos neuronais, podendo acometer
parte do encéfalo (crises focais) ou abranger áreas mais extensas envolvendo
simultaneamente os dois hemisférios (crises generalizadas). A epilepsia é considerada
uma condição neurológica grave e com alta prevalência, atingindo 1% da população
mundial, que corresponde a aproximadamente 60 milhões de pessoas, e, a cada ano
somam-se cerca de 3 milhões de casos novos (Li e Sander, 2003).
A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais freqüente dentre as
epilepsias focais (ou parciais) em adultos, representando 40% de todos os casos
(Gastaut et al., 1975; Regesta e Tanganelli, 1999). A implantação de novos métodos
diagnósticos de imagem, como a ressonância magnética, tomografia por emissão de
pósitrons (em inglês PET, Positrons Emission Tomography) ou de fóton único (em
inglês SPECT, Single Photon Emission Computer Tomography), juntamente com dados
do eletrencefalograma e anamnese adequada, têm auxiliado o processo de
classificação das epilepsias. Atualmente a ELT está subdividida em mesial, neocortical
ou lateral, dependendo da origem e semiologia das crises (Engel Jr., 2001).
Quanto à epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) vê-se que constitui 60%
dos casos de ELT, cujas crises se originam em estruturas límbicas, particularmente no
complexo hipocampal e amígdala (Engel Jr., 1992; French et al., 1993). A alta
prevalência e refratariedade ao tratamento farmacológico são os principais fatores
que fazem desta síndrome epiléptica alvo de grande interesse clínico-científico. De
maneira geral a ELTM se caracteriza por crises focais simples ou complexas (perda da
consciência), e as crises com generalização secundária (crises tônico-clônicas) menos
freqüentes (Cendes e Kobayashi, 2000).
2
Na maioria dos pacientes, a semiologia ictal consiste em uma aura (mais
freqüentemente sensações epigástricas e alterações dismnésticas) seguida por olhar
fixo não responsivo, automatismos oroalimentares, postura distônica da mão
contralateral à descarga ictal e automatismos motores estereotipados da mão
ipsilateral (French et al., 1993; Guedes et al., 2006). A fase pós-ictal inclui
desorientação, déficit de memória recente, amnésia do evento, e afasia se as crises
começam no hemisfério dominante (Engel Jr., 1996).
Na avaliação clínica os pacientes normalmente apresentam exame
neurológico normal, exceto nos casos de refratariedade que podem ter déficit de
memória recente, disfunção da memória verbal ou não-verbal (espacial), e distúrbios
cognitivos de acordo com o lado acometido (Jones-Gotman et al., 1993; Jones-
Gotman et al., 1997). Na ressonância magnética de crânio geralmente há alterações
sugestivas de esclerose mesial temporal (Cendes et al., 1993; Watson et al., 1997) e
no SPECT observa-se uma redução do fluxo sanguíneo/metabolismo de glicose no
período interictal e um aumento dramático do mesmo durante as crises espontâneas e
recorrentes (Lee et al., 1988; Rowe et al., 1989; Duncan et al., 1993).
A esclerose hipocampal é a anormalidade estrutural mais comumente
identificada (65%) nos pacientes com ELT refratários ao tratamento farmacológico
(Babb et al., 1984; de Lanerolle et al., 1989; Mathern et al., 1996). Esta é
caracterizada por proeminente perda celular e gliose, principalmente das células do
setor de Sommer (região CA1) e dos neurônios do hilo do giro denteado, resultando
em cicatrização e atrofia do tecido (Babb et al., 1984; Blumcke et al., 1999).
Fenômenos de reorganização sináptica proveniente de brotamentos de axônios, por
exemplo, das fibras musgosas, e processos de dispersão de células granulares do giro
denteado também são observados nesses casos (Houser et al., 1990; Babb et al.,
1991). Além da formação hipocampal, alterações podem ser encontradas em outras
regiões do lobo temporal mesial, como o córtex entorrinal e substância branca
(Kasper et al., 1999).
Apesar dos mecanismos fisiopatológicos da ELTM constituírem o alvo de
constantes investigações, há várias evidências de que as alterações observadas no
complexo hipocampal estejam criticamente envolvidas com o processo epileptogênico
(de Lanerolle et al., 1989; revisão, de Lanerolle e Lee, 2005). Uma forte evidência é
3
que a remoção cirúrgica da formação hipocampal e amígdala resulta em uma melhora
considerável ou mesmo remissão das crises na maioria dos pacientes (Engel Jr. 1992).
O conhecimento da anatomia da formação hipocampal normal é
fundamental para a compreensão da sua participação na gênese da epilepsia.
1.1.1 Anatomia e os principais circuitos da formação hipocampal
A
formação hipocampal é composta de quatro sub-regiões que incluem:
o Corno de Amon (CA) ou hipocampo propriamente dito, o giro denteado ou fáscia
denteada, o complexo subicular (subículo, para-subículo e pré-subículo) e o córtex
entorrinal.
O hipocampo, segundo o anatomista Lorente de Nó (1934), está subdividido
em áreas CA1 (a, b, c), CA2, CA3 (a, b, c) e CA4. A região CA4 posteriormente foi
incorporada ao giro denteado, e constitui com ele o hilo hipocampal. O hipocampo é
composto por três camadas: molecular, polimórfica e de células piramidais e, devido
às diferenças na organização dos axônios e dendritos, estas camadas são subdivididas
em seis lâminas (Lopes da Silva et al., 1990; Lorente de No, 1934): 1 - epêndima ou
zona epitelial, que forma o revestimento da superfície ventricular do hipocampo; 2 -
alveus, constituído por fibras aferentes e principalmente eferentes da formação
hipocampal que originam a fímbria e o fórnix; 3 – estrato oriens, formado por axônios
e dendritos basais de células piramidais, e outros tipos celulares como as células em
cesto que são interneurônios (inibitórios); 4- estrato piramidal, composto por
agrupamento denso de células piramidais, principal tipo celular do CA; 5 – estrato
radiado, é a camada que se caracteriza por corpos celulares esparsos e dendritos
apicais finos de células piramidais organizadas de forma regular, com aspecto
radiado; 6 – estrato lacunoso molecular, formado pelas ramificações dos dendritos
apicais das células piramidais.
O giro denteado também possui três camadas: camada molecular, granular
(células granulares e células em cesto) e hilo (camada polimórfica), que, contêm
interneurônios inibitórios e células musgosas (O Keefe, 1978).
4
As células granulares do giro denteato recebem dois tipos de projeções
aferentes: uma glutamatérgica que se origina nas camadas superficiais do
córtex entorrinal (via perfurante) e termina nos dois terços externos da camada
molecular (sinapses excitatórias); e outra colinérgica, proveniente do núcleo
septal medial que termina de forma difusa. As principais eferências do giro
denteado são os axônios de células granulares, comumente denominados de
fibras musgosas, que liberam principalmente glutamato, e fazem sinapses com
neurônios piramidais de CA3, interneurônios e células musgosas no hilo. Dos
neurônios piramidais de CA3 emergem axônios, denominados Colateral de
Schaffer, que terminam em neurônios piramidais em CA1, efetuando a terceira
sinapse do circuito hipocampal. Este circuito e suas conexões formam a clássica via
tri-sináptica hipocampal (Andersen et al., 1969), conforme ilustra a Figura 1. As
sinapses desta circuitaria são predominantemente excitatórias, sendo que a inibição
se faz principalmente por interneurônios localizados no hilo e na região do Corno de
Ammon. Os principais neurotransmissores envolvidos neste circuito são o glutamato e
o ácido gama-aminobutírico (GABA).
A via de saída das informações processadas pelo hipocampo ocorre
através dos neurônios piramidais de CA1, que projetam seus axônios para o
subículo ipsilateral, de forma lamelar, e para o córtex entorrinal ipsilateral,
com as conexões sinápticas ocorrendo predominantemente na camada IV (Lopes
da Silva et al., 1990).
Figura 1:
Ilustração da
via tri
-
sináptica. Córtex Entrorrinal (CE); Via
Perfurante (VP); Giro denteado (GD); Fibras Musgosas (FM); Colaterais
de Schaffer (CS).
5
1.1.2 Modelo de epilepsia induzida por pilocarpina
P
ara compreender os aspectos fisiopatológicos e responder à questão sobre
a participação da esclerose hipocampal na geração de crises os epileptologistas têm
empregado diversos modelos experimentais. Um bom modelo experimental é aquele
que reproduz os principais aspectos comportamentais, eletrencefalográficos e
fisiopatogênicos das epilepsias humana. Os modelos da pilocarpina e do ácido caínico
foram descritos nas décadas de 80 e 90, e são os que melhor replicam as
características fenomenológicas da ELT (Ben-Ari, 1985; Turski et al., 1983).
A pilocarpina é um alcalóide extraído da planta Pilocarpus jaborandi
que age como agonista em receptores colinérgicos muscarínicos no cérebro,
sendo capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica quando administrada
por via sistêmica.
O uso da pilocarpina como indutor de epilepsia em ratos foi proposto
por Turski et al. em 1983. Os autores descrevem que a injeção sistêmica de
altas doses de pilocarpina (300-380 mg/kg, i.p.), induz um quadro de
alterações comportamentais e eletrográficas, com excitação difusa, marcado
pelo comprometimento hipocampal decorrente de liberação excessiva de
glutamato após estimulação colinérgica, e conseqüente hiperestimulação de
receptores glutamatérgicos (Cavalheiro et al., 1991; Cavalheiro, 1995).
Uma descrição detalhada do modelo da pilocarpina revela que, 5-10
minutos após a administração do agente colinérgico, o rato apresenta
automatismos faciais, mastigatórios e de vibrissas, tremores de cabeça e movimentos
táxicos. Dentro de aproximadamente 15 a 25 minutos, essas alterações progridem
para crises motoras límbicas, tônicas, clônicas ou tônico-clônicas, momento em que
os animais apresentam intensos movimentos mastigatórios, salivação, clonia de patas
anteriores e quedas sucessivas. Essas crises se tornam contínuas, caracterizando o
status epilepticus ou estado de mal epiléptico, que persiste por aproximadamente
12-18 horas, tipificando o período agudo do modelo. Os animais sobreviventes
ao insulto apresentam normalização comportamental e eletrencefalográfica,
permanecendo nesse quadro durante 7 a 44 dias (média de 14 dias), que
identifica o período latente do modelo. Esse período termina com o
aparecimento de uma crise espontânea (crises focais límbicas, com ou sem
6
generalização secundária), que normalmente é recorrente durante toda a vida do
animal (2 a 15 crises por mês), constituindo o período crônico do modelo (Leite et
al., 1990; Arida et al., 1999).
A história natural dos animais tratados com pilocarpina assemelha-se
àquela descrita em pacientes com ELT que apresentaram crises prolongadas nos
primeiros anos de vida. Esse insulto inicial funciona como um fator precipitante
das crises espontâneas que ocorrem em fases mais tardias, conforme
representado na Figura 2 (Cavalheiro et al., 1991; Gloor, 1991). Dentre as
alterações anatomopatológicas evidenciadas nesse modelo, destaca-se a
esclerose hipocampal, que aparece como uma das principais características da
ELTM.
Este modelo tem contribuído muito para o conhecimento dos
mecanismos fisiopatogênicos envolvidos com a ELTM.
1.1.3 Esclerose hipocampal
A
etiologia da esclerose hipocampal é desconhecida. Entretanto, insultos
como crises febris complexas (crises febris prolongadas ou com sinais focais) nos
primeiros anos de vida têm sido citadas como sua possível causa (Falconer et al.,
1964; Bou-Khail et al., 1993; Cendes et al., 1993; French et al., 1993; Mathern et al.,
2002).
Figura 2:
Evolução cronológica na Epilepsia do Lobo Temporal humana e
no modelo experimental de epilepsia induzida por pilocarpina.
7
O mecanismo fisiopatogênico, pelo qual o status epilepticus levaria ao
processo esclerótico, não está completamente esclarecido. Entretanto, existem
evidências de que crises epilépticas de longa duração podem promover uma alta
liberação glutamatérgica e gerar hiperexcitabilidade e processos de citotoxicidade
(Cavalheiro et al., 1994; Smolders et al., 1997). O glutamato liberado em excesso
ativa receptores cainato (KA), α-amino3-hidroxil-5-metil-4isoxazole-4-propionato
(AMPA) e N-metil-D-aspartato (NMDA), e, consesqüentemente, conduz a uma entrada
maciça de íons cálcio na célula (DeLorenzo e Sun, 2006). O aumento na concentração
intracelular de íon cálcio ([Ca
2+
]
i
), por sua vez, ativa proteases, lipases e
endonucleotidases, compromete a atividade mitocondrial e promove alteração no
potencial de membrana, que culmina em morte celular (DeLorenzo et al., 2005;
DeLorenzo e Sun, 2006).
Estudos realizados no modelo experimental de ELT induzida por
pilocarpina, têm revelado que a maioria das alterações neuropatológicas
observadas na formação hipocampal aparece imediatamente após o insulto e
consiste em anormalidades dendrítica e do corpo neuronal, com relativa perda
de axônios e reação gliótica, fundamentalmente nas regiões mais vulneráveis à
condição epiléptica (Clifford et al., 1987). A severidade dos achados patológicos
está diretamente associada à duração do status epilepticus (Lemos e
Cavalheiro, 1995).
Presumi-se que, após o insulto, caracterizado por processos
excitotóxicos, ocorra uma reorganização da formação hipocampal (estrutural e
molecular), que, possivelmente, seja responsável pela hiperexcitabilidade
neuronal e pela presença de uma condição epileptogênica permanente
(Figura 3).
Um outro ponto importante a ser destacado é que crises recorrentes,
dependendo da freqüência e duração, podem causar danos adicionais e
desorganização dos circuitos neuronais na formação hipocampal,
independentemente do quadro patológico subjacente, indicando que a ELTM é
uma condição crônica e progressiva (Tasch et al., 1999; Fuerst et al., 2001;
Pitkänen e Sutula, 2002; Bernasconi et al., 2005). Muitos pacientes resistentes
8
aos tratamentos farmacológicos apresentam comprometimento progressivo de
memória e cognição, e alterações psiquiátricas (Cendes e Kobayashi, 2000).
1.1.4 Esclerose hipocampal e epileptogênese
U
ma questão de grande interesse dos epileptologistas é compreender
como o tecido esclerótico, com perda neuronal e cicatricial, é capaz de gerar
crises epilépticas. Alguns estudos realizados em modelos experimentais nas
décadas de 80 e 90, com base em achados anatômicos, especialmente
envolvendo a perda de células musgosas no hilo do giro denteado (Figura 4),
formularam duas teorias como sendo responsáveis pelo processo epileptogênico.
A primeira, denominada teoria da reorganização sináptica ou axonal, foi
formulada por Tauck e Nadler (1985), que observaram o brotamento de axônios de
células granulares, as fibras musgosas, em direção aos dendritos proximais das células
granulares do giro denteado, em decorrência da perda de células musgosas presentes
no hilo. Esse brotamento resultaria em um circuito reverberante, excitatório, uma vez
que as células granulares são glutamatérgicas, como ilustra a Figura 4-b.
Essa teoria tem sido muito contestada por alguns autores que acreditam
que o brotamento de fibras musgosas seja apenas um mecanismo fisiológico
adaptativo e compensatório (Longo e Mello, 1998; Longo e Mello, 2002; Harvey
Sloviter, 2005). As muitas divergências fazem com que o papel da reorganização
sináptica no processo epileptogênico permaneça em constante debate.
Figura 3
: Demonstração esquemática da fisiopatogenia da ELTM
associada à um insulto precipitante. Após o insulto, o cérebro
reorganizar-se-á durante uma fase latente, que culminará em crises
espontâneas e recorrentes. Figura modificada: Salmenperä, 2001.
9
A outra teoria denominada células em cesto “dormentes”
(GABAérgicas) foi proposta por Sloviter et al. (1991), e afirmava que a morte de
células musgosas no hilo, removeria as afêrencias excitatórias das células em
cesto, que ficariam então “dormentes” (Figura 4–c). Traduzindo, os neurônios
GABAérgicos (inibitórios) preservados no hipocampo epiléptico, estariam
hipofuncionantes devido à perda de aferências excitatórias, reduzindo a
neurotransmissão GABAérgica e contribuindo para o processo de
hiperexcitabilidade.
Vários aspectos desta teoria têm sido revisados (Jeffers et al., 1998;
Bernard et al., 1998), pois estudos eletrofisiológicos mostram que aferências
inibitórias em células granulares está aumentada ou inalterada no hipocampo
epiléptico em modelos experimentais ou em pacientes com ELT (Buckmaster et
al., 1997; Nusser et al., 1998; Dalby e Mody, 2001), e que aproximadamente 90%
dos contatos sinápticos de células musgosas são realizados com dendritos de
células granulares e não com interneurônios (Buckmaster et al., 1996).
Contrapondo-se a teoria das células “dormentes”, também foi proposto a
hipótese das células musgosas “irritáveis”, a qual propõe que a intensidade da
perda de células musgosas, após o insulto, não é significativa, e que essas
células poderiam fazer parte de um circuito excitatório, uma vez que a sua
deleção promove uma redução da excitabilidade de células granulares
(Santhakumar et al., 2000; Ratzliff et al., 2004).
Figura 4
: Teorias do brotame
nto de fibras musgosas e das células em cesto
“dormentes”. I – interneurônios (células em cestos); HILO – células musgosas; CP -
células piramidais; fm - fibras musgosas; bfm – brotamento de fibras musgosas; (a)
hiperexcitabilidade de células granulares; (b) brotamento de fibras musgosas
(glutamatérgica) sobre os dendritos das células granulares; (c) perda de aferência para
as células em cesto (células em cesto “dormentes”). [Figura adaptada: Morimoto et al.,
(2004); McNamara (1994)].
10
Além desses achados, outros autores ressaltam a redução da atividade
inibitória mediada pelo sistema GABAérgico na ELT, decorrente de alterações
funcionais e estruturais de transportadores de GABA (During et al., 2002) e das
subunidades que compõem os receptores GABA
A
(Gibbs et al., 1997; Leroy et al.,
2004). Recentemente, tem se discutido a ação despolarizante do GABA e o
envolvimento deste na geração de atividade ictal e interictal (Cohen et al., 2002;
Fujiwara-Tsukamoto et al., 2003; Cossart et al., 2005).
Abordagens neuroquímicas e moleculares no hipocampo epiléptico também
têm revelado um aumento na concentração de glutamato e aspartato (Cavalheiro et
al., 1994; Glass et al., 1995; Thomas et al., 2003), além de alterações funcionais e
aumento na densidade de receptores ionotrópicos (NMDA, AMPA e cainato) e
metabotrópicos do glutamato, em pacientes com ELT e modelos experimentais
(Mathern et al., 1997; Chapman et al., 2000; Dalby e Mody, 2001). Esses achados
confirmam a existência de uma hiperatividade da sinalização glutamatérgica,
podendo ser responsável pela geração de crises e hiperexcitabilidade neuronal.
Outros estudos, empregando modelos experimentais de epilepsia, referem
à participação do cálcio na epileptogênese, como um mensageiro secundário (revisão
DeLorenzo et al 2005). O cálcio elevado na célula pode influenciar a transcrição
gênica, expressão de proteína, neurogênese, brotamento neuronal e reorganização
sináptica (DeLorenzo et al., 1998; Raza et al., 2004), além de causar
hiperexcitabilidade neuronal e favorecer a manutenção de crises espontâneas e
recorrentes (DeLorenzo et al 1998; Pal et al., 2001; Raza et al., 2001; Raza et al.,
2004). Vários fatores podem contribuir para o desequilíbrio na homeostase do cálcio
intracelular na epilepsia, como o aumento na neurotransmissão glutamatérgica,
comprometimento nos sistemas de tamponamento de cálcio intracelular e alterações
nas subunidades que compõem os canais de cálcio dependentes de voltagem (Jones,
2002).
Com base nessas pesquisas, podemos considerar que a ELT está associada a
processos de morte neuronal, reorganização sináptica e hiperexcitabilidade,
envolvendo distúrbios de diferentes sistemas de neurotransmissão e elevação de
cálcio. Nesse sentido, a sinalização excitatória mediada pelo ATP e seus receptores
P2X poderia ter grande importância no processo epileptogênico, uma vez que modula
11
a liberação de glutamato e promove o influxo de íon cálcio na célula. Uma breve
revisão da sinalização purinérgica no sistema nervoso central é feita a seguir.
1.2 Sistema Purinérgico
1.2.1 Histórico da sinalização purinérgica
O
papel das purinas na sinalização intercelular surgiu da observação de
Drury e Szent-Györgyi, em 1929, de que o nucleosídeo adenosina e o nucleotídeo
monofosfato de adenosina (AMP) podiam reduzir a contratilidade cardíaca, aumentar
a vasodilatação coronariana, inibir a contração intestinal e promover sedação em
roedores.
Em 1934, Gillespie foi o primeiro a descrever uma relação entre a atividade
das purinas e a sua estrutura, demonstrando que a deaminação reduzia a atividade e
que a defosforilação influenciava não somente a potência, mas também o tipo de
resposta, sendo que ATP induzia a um aumento da pressão sangüínea, enquanto
adenosina produzia hipotensão, indicando, pela primeira vez, a existência de
diferentes receptores purinérgicos, com efeitos até antagônicos.
Somente a partir de 1978, após a demonstração por Burnstock da existência
de distintos receptores purinérgicos denominados P1 (adenosina) e P2 (ATP, ADP,
UTP), é que se concretiza a hipótese da transmissão purinérgica. Atualmente está
bem estabelecido que as purinas (ATP, AMP, ADP e adenosina) e pirimidinas (UTP e
UDP) extracelulares são importantes moléculas sinalizadoras, mediando seus efeitos
biológicos através de purinoceptores (Ralevic e Burnstock, 1998). Essas moléculas
possuem características em comum com outros sinalizadores, e têm tamanho
relativamente reduzido, visto que são provenientes de moléculas abundantes dentro
da célula, o que facilita sua biodisponibilidade, porém exigindo mecanismos de
degradação e liberação muito eficientes.
12
1.2.2 Produção, liberação e metabolismo extracelular do ATP
O
ATP é uma substância de distribuição ubíqua no sistema nervoso central e
periférico, sendo fundamental à atividade celular. No neurônio esse é gerado através
da glicólise e do ciclo do ácido cítrico, embora a fosforilação oxidativa na mitocôndria
seja responsável pela maior parte gerada. Desse modo, a produção de ATP, via
fosforilação oxidativa, é diretamente proporcional ao consumo de oxigênio e à
demanda metabólica da célula (Sperlágh e Vizi, 1996).
Sob condição metabólica normal, a concentração citoplasmática de ATP é
de 10 mM, que é essencial para a realização de todas as funções neuronais. O ATP
citoplasmático é usado como fonte de energia na manutenção de funções importantes
na célula, como da ATPase-Na
+
/K
+
, por exemplo, uma enzima responsável por manter
o potencial de membrana em repouso, da ATPase-Ca
2+
, responsável pela homeostase
de íon cálcio no citoplasma, da ATPase-H
+
, presente na membrana da vesícula
sináptica e responsável por acidificar o lúmen vesicular e gerar um gradiente de
prótons necessário para a captação de neurotransmissores, de várias proteínas cinases
envolvidas na transdução de sinal, dentre outras (Figura 5).
O ATP pode também mediar diferentes funções, agindo como
neurotransmissor ou co-transmissor (Burnstock, 1970). No terminal do neurônio, o ATP
Figura 5:
Ilustra a produção de ATP através da (
a
) glicólise, (
b
) ciclo do
ácido cítrico e (c) fosforilação oxidativa, e o seu consumo intracelular pela
(d) Na+/K+ATPase, (e,f) Ca2+ ATPase na membrana plasmática e no
retículo endoplasmático, (g) na atividade de proteína G e (h) proteínas
cinases, (i) H+ ATPase (Figura adaptada: Sperlágh e Vizi, 1996).
13
é armazenado em vesícula sináptica e liberado por exocitose, dependente de íon
cálcio, como na via clássica de liberação de neurotransmissores (Zimmermann, 1994;
revisão Pankratov et al., 2006). Geralmente é co-liberado com outros
neurotransmissores, tais como a acetilcolina, o glutamato, a noradrenalina e o GABA
(revisão Burnstock 2006; Pankratov et al., 2006), embora Robertson et al., (1998)
tenham evidenciado na habenula medial a liberação de ATP independentemente da
liberação glutamatérgica.
Estudos em células neuronais e não neuronais (β-pancreática, astrócito,
epitelial, cromafins etc.) mostram que o ATP pode ainda ser liberado por
transportadores protéicos e canais específicos, ou por citólise após quadros de
hipóxia, trauma e processos inflamatórios (Sperlágh e Vizi, 1996; Bodin e Bursnstock,
2001; Sabirov e Okada, 2005), conforme ilustra a Figura 6.
Uma vez liberado no meio extracelular, o ATP interage com receptores
presentes na superfície da membrana celular (P2) e é rapidamente transformado em
adenosina pela ação das ectonucleotidases (Zimmermann, 2000). Esse processo é
decorrente de uma cascata enzimática, que inclui a ecto-ATPase e ectonucleotidases
(NTPDases, pirofosfatase nucleotídeo, fosfatase alcalina, ecto-5´- nucleotidase). A
ecto-ATPase, por exemplo, converte o ATP em ADP, as ectonucleotidases hidrolizam o
ADP em AMP, e a ecto-5´- nucleotidase converte o AMP em adenosina. A adenosina
Figura 6
: Fontes de liberação de ATP: exocitose, citólise, e por canais
e transportadores específicos na membrana plasmática (Figura
adaptada: Sabirov e Okada, 2005).
14
produzida é transformada em inosina pela a ação da adenosina deaminase (Meghji e
Newby, 1990), como ilustra a Figura 7.
Além de ser formada a partir da hidrólise do ATP através da ação das
ectonucleotidases, a adenosina extracelular pode ser produzida no meio intracelular e
transportada para o meio extracelular através de transportadores específicos
bidirecionais, que mantêm os níveis intra e extracelulares de adenosina em equilíbrio.
A adenosina extracelular também pode ser formada a partir da degradação do
monofosfato cíclico de adenosina (Latini e Pedata, 2001).
1.2.3 Receptores purinérgicos P1 e P2
A adenosina age em receptores denominados P1, enquanto o ATP e o ADP
agem em receptores específicos denominados P2 (Abbracchio e Burnstock, 1994,
Fredholm et al., 1997).
Figura 7:
Esquema da hidrólise do ATP intracelular e extracelular pelas
endo e ectonucleotidases, respectivamente, e a formação de seus
metabólitos. Figura modificada: Wittendorp, Maria Catharina, 2004.
15
a) Receptor P1 ou de Adenosina
Os receptores de adenosina são do tipo metabotrópicos e estão
subdivididos em A1, A2
A
, A2
B
e A3, os quais se diferenciam pelo tipo de proteína G e
pela transdução de sinais que desencadeiam (Palmer e Stiles, 1995; Brundege e
Dunwiddie, 1997). Esses quatro subtipos de receptores já foram clonados e
caracterizados em várias espécies de mamíferos, inclusive em seres humanos
(Fredholm et al, 2000).
Os receptores A1 são amplamente distribuídos no cérebro, com localização
pré e pós-sinápticas em neurônios, também presentes em glias, e com alta densidade
no córtex cerebral, tálamo, cerebelo, hipocampo e medula, e baixa densidade no
núcleo estriado e globo pálido (Fastbom et al., 1987). Os receptores A2
A
encontram-
se principalmente em neurônios GABAérgicos presentes nos núcleos estriados,
acumbens e globo pálido (Sebastião e Ribeiro, 1996) e em menor densidade no
córtex cerebral, amígdala, tubérculo olfatório, hipotálamo, cerebelo e hipocampo
(Moreau e Huber, 1999). Ambos os receptores A1 e A2
A
apresentam alta afinidade pela
adenosina e estão envolvidos na maioria das atividades fisiológicas do sistema nervoso
central, através da modulação da neurotransmissão sináptica e do metabolismo
celular. A Figura 8 ilustra a distribuição desses receptores no cérebro de rato.
Os receptores A2
B
e A3 são pouco expressos no cérebro, possuem baixa
afinidade pela adenosina e podem ser relevantes em processos patológicos (Dixon et
al., 1996; Fredholm et al., 2001).
Figura 8
: Distribuição de receptores A1 e A2
A
em
diferentes regiões do sistema nervoso central (Figura
adaptada: Ribeiro et al., 2003).
16
b) Receptor P2
Os nucleotídeos das purinas (ATP e ADP) e os nucleotídeos das pirimidinas
(UTP, uridina trifosfato, e UDP, uridina difosfato) modulam funções celulares através
da ativação de receptores P2. Em 1985 Burnstock e Kenedy propuseram uma
subclassificação, em que os purinoceptores P2 foram divididos em P2X (receptores
ionotrópicos) e P2Y (receptores metabotrópicos). Ambos os receptores são
distribuídos no sistema nervoso central e exibem vários efeitos fisiológicos em células
gliais e neuronais. A Figura 9 ilustra a distribuição desses receptores no cérebro de
rato.
Os receptores ionotrópicos são ativados predominantemente por ATP. Até
recentemente, foram clonados sete receptores (P2X
1-7
), sendo que um receptor
funcional é formado por 3 subunidades, possibilitando a formação de receptores
homoméricos ou heteroméricos. Considerando que muitos desses receptores são
expressos na mesma célula, a formação de receptores heterotriméricos pode produzir
um grande número de receptores com características farmacológicas e funcionais
diferenciadas (Ralevic, Burnstock, 1998; Roberts et al., 2006).
Os receptores P2X são acoplados a canais iônicos, com a seguinte
permeabilidade iônica: Ca
2+
>>Na
+
>K
+
. Dessa forma, a principal via de sinalização
ativada por esses receptores é o aumento da concentração intracelular de Ca
2+
, tanto
pela via direta como através de canais de Ca
2+
dependentes de voltagem. Esses
receptores são os responsáveis pela sinalização rápida (em aproximadamente 10 ms)
em comparação à sinalização lenta mediada pelos receptores P2Y, que é de
aproximadamente 100 ms (Ralevic, Burnstock, 1998).
Quanto à expressão e distribuição dos receptores P2X no sistema nervoso
central, observa-se o seguinte quadro: os P2X
2
estão presentes no córtex cerebral,
hipocampo, habenula, substância negra compacta, hipotálamo, medula e núcleos do
trato solitário (Xiang et al., 1998; Kanjhan et al., 1999); os receptores P2X
3
estão
localizados em estruturas relacionadas com a dor, como o núcleo do trato solitário,
trato solitário e núcleo trigeminal (Vulchanova et al., 1996; Vulchanova et al., 1997);
os receptores P2X
4
são fortemente expressos no cerebelo, medula, córtex cerebral,
tálamo, tronco cerebral e hipocampo (Le, et al., 1998; Bo, et al., 1995; Rubio e Soto,
2001); os receptores P2X
6
são altamente expressos no cerebelo e hipocampo (Rubio e
Soto, 2001); e os P2X
7
são localizados no córtex, hipocampo e medula (Sperlágh et al.,
17
2002; Atkinson et al., 2004; Wang et al., 2004; Deng et al., 2004; Franke et al.,
2004).
Os receptores metabotrópicos são membros de uma grande família de
receptores acoplados à proteína G, e vários subtipos já foram clonados e
caracterizados, sendo que oito deles estão presentes em tecido humano, dos quais
P2Y
1
, P2Y
6
, P2Y
11,
P2Y
12
, P2Y
13
e P2Y
14
são expressos no sistema nervoso central
(Moore et al., 2001; Illes e Ribeiro, 2004). Os receptores P2Y
1,
P2Y
12
e P2Y
13
são
ativados somente por nucleotídeos de adenina, especialmente pelo ADP, enquanto, os
P2Y
6
, são sensíveis aos nucleotídeos de pirimidinas (Ralevic e Burnstock. 1998;
Communi et al., 2001; Hollopeter et al., 2001). A transdução de sinal de todos os
receptores P2Y (exceto o P2Y
12
), envolve a ativação da fosfolipase C, fosfolipases A2 e
D, bem como a ativação ou inibição da adenilato ciclase (Ralevic e Burnstock. 1998).
A distribuição dos receptores P2Y é a seguinte: P2Y
1
encontra-se em alta
densidade nos núcleos basais incluindo estriado, acumbens e globo pálido,
hipocampo, cerebelo e córtex cerebral (Moore et al., 2000; Moran-Jimenez e Matute,
2000); P2Y
13
é expresso no tálamo, núcleo caudado, substância negra, hipocampo e
cerebelo (Communi et al., 2001). Os receptores P2Y
14
foram detectados em seres
humanos, com alta densidade de expressão na placenta e tecido adiposo, e
moderados no sistema nervoso central (Chambers et al., 2000).
A Tabela 1 mostra um resumo dos subtipos de receptores P1 e P2 e suas
respostas biológicas frente a um estímulo no sistema nervoso.
Figura 9:
Distribuição de receptores P2X e P2Y no
sistema nervoso central.
18
Tabela 1: Receptores purinérgicos encontrados no sistema nervoso central.
1.2.3 Função do ATP e seus metabólitos no sistema nervoso central
Dentre os metabólitos do ATP, a adenosina tem sido a mais investigada,
devido à sua ação inibitória no sistema nervoso central. Dunwiddie et al. (1980),
através de estudos eletrofisiológicos in vitro, demonstraram que a aplicação de
adenosina em diferentes áreas do sistema nervoso central, inclusive no hipocampo,
causa hiperpolarização neuronal e inibe disparos espontâneos, sugerindo um
importante papel modulatório na transmissão sináptica.
Estudos posteriores mostraram que a adenosina, através da ativação de
receptor A1, inibe a liberação de uma variedade de neurotransmissores, incluindo a
acetilcolina, serotonina, noradrenalina e o glutamato (Brundege e Dunwiddie 1997;
Ribeiro et al., 2003a). Esses receptores são acoplados as proteínas G
i
e G
0
, promovem
inibição da adenilato ciclase e canais de cálcio dependentes de voltagem (tipos N, P e
Q), além de ativação das fosfolipases C/D e de vários tipos de canais de K
+
(Brundege
e Dunwiddie 1997).
Receptor
Subtipo Efetores Bioquímicos Tipo Celular
P1 A
1
G
i
/ G
o
↓adenilato ciclase
↑ K
+
↓ Ca
2+
↑ fosfolipase C / proteína
cinase C
Neurônios, astrócitos, micróglia e células
endoteliais.
P1 A
2A
G
s
↑adenilato ciclase
↑IP3
Neurônios, astrócitos, micróglia e nervos
periféricos.
P1 A
2B
G
s
↑adenilato ciclase
P1 A
3
G(?)
↑fosfolipase C
↑IP3
Astrócitos e neurônios
P2 P2X
1-6
Canais iônicos (Na
+
,K
+
,Ca
2+
)
Neurônios e glias.
P2 P2X
7
Canais iônicos (Na
+
,K
+
,Ca
2+
)
Poros não seletivos (900Da)
Neurônios e glias.
P2 P2Y
1
P2Y
2
Proteína G
↑fosfolipase C – IP3
↑fosfolipase A
2
Neurônios, astrócitos, micróglia e
oligodendroglia.
19
Embora os receptores A1 sejam os principais alvos da adenosina na
modulação de funções cerebrais, o receptor A2
A
tem também recebido destaque por
modular algumas áreas como os núcleos caudado-putamen, acumbens e tubérculo
olfatório (Sebastião e Ribeiro, 1996; Ribeiro et al., 2003a). Esses receptores são
acoplados às proteínas G
s
e G
olf
, ativam a adenilato ciclase e, conseqüentemente, a
formação de AMPc, e com isso, facilitam a liberação de acetilcolina, glutamato,
noradrenalina e GABA (Cunha et al., 1994; Brundege e Dunwiddie 1997; Rebola et al.,
2003).
Alguns trabalhos têm apresentado que a adenosina pode exercer funções
opostas ao ativar distintos receptores, por exemplo, os receptores A1 e A2
A,
e, que
essa ativação está na dependência da intensidade do estímulo (freqüência e duração)
nos terminais nervosos e da atividade das ectonucleotidases. Em condição normal, a
adenosina parece ativar preferencialmente o receptor A1, mas, quando acumulada
durante estimulação de alta freqüência, parece ativar especialmente os receptores
A2
A
. Esse mecanismo é alvo de constantes estudos e necessita de melhor compreensão
(Cunha et al.,1996; Cunha, 2001).
A investigação das funções do ATP no sistema nervoso central tem sido
crescente, apesar das dificuldades que se têm quando se quer determinar a ação
específica dessa molécula. A escassez de antagonistas seletivos aos variados subtipos
de receptores P2 e a rápida degradação do ATP pelas ectonucleotidases em substratos
neuroativos constituem as principais dificuldades.
Apesar disso, estudos in vitro indicam que o ATP pode ser liberado após
estimulação com KCL em sinaptossoma cerebral (White, 1978) ou após estimulação
elétrica de colaterais de Schaffer, em fatias hipocampais, (Wierazko et al., 1989), e
que esse pode induzir correntes sinápticas excitatórias no sistema nervoso central,
muito provavelmente através dos receptores acoplados a canais iônicos P2X (Edwards,
Gibbs, 1993; Zimmermann, 1994).
No hipocampo, o ATP promove despolarização neuronal (Inoue et al., 1992)
e aumento na concentração de íons cálcio em cultura de neurônios, através da
ativação de receptores pós-sinápticos (Inoue et al., 1995; Inoue et al., 1996),
indicando a participação do ATP no fenômeno de plasticidade sináptica (Wieraszko et
al., 1994; O’Kane et al., 2000; Inoue et al., 1996; Pankratov et al 1999), denominado
potenciação a longo prazo (em inglês LTP, long-term potentiation). Segundo
20
Pankratov et al., (2002), o ATP exerce um importante papel modulatório na LTP,
através da ativação de receptores P2X localizados em células piramidais da região CA1
do hipocampo. O exato mecanismo pelo qual o ATP participa da LTP ainda não foi
completamente esclarecido.
Estudos têm mostrado que a ação do ATP em receptores P2, dependendo da
localização, é capaz de modular os principais sistemas de neurotransmissão no
sistema nervoso central: excitatório (glutamato) e inibitório (GABA). No hipocampo,
por exemplo, os receptores P2X
2
e P2X
4
localizados em células piramidais de CA1
podem agir em sinergia com o receptor AMPA e facilitar a neurotransmissão
glutamatérgica (Rubio et al., 2001). Os receptores P2X
7
estão localizados
predominantemente em terminais glutamatérgicos, especialmente de fibras musgosas
(Sperlágh et al., 2002; Atkinson et al., 2004), e sua ativação promove liberação de
glutamato e indiretamente de GABA dos próprios terminais glutamatérgicos ou de
células alvos (Sperlágh et al., 2002). A ativação de receptores P2X
7
em células gliais
também pode contribuir para a liberação de glutamato (Duan et al., 2003). Ao
contrário dos P2X, a ativação dos receptores P2Y por ATP ou ADP, modula
negativamente a neurotransmissão glutamatérgica no hipocampo (Illes et al., 2004).
Os receptores P2X e P2Y distribuídos em diferentes regiões do sistema
nervoso central são localizados predominantemente na superfície da membrana
celular (revisão, Roberts et al., 2006). Entretanto, Atkinson et al. (2002) observaram
por imuno-histoquímica e PCR a presença de receptores P2X
7
no envelope nuclear de
neurônios no hipocampo, sugerindo que a ativação desses receptores possa promover
um aumento na permeabilidade de íon cálcio intranuclear e interferir na transcrição
de vários genes implicados na plasticidade neuronal.
Vários trabalhos têm revelado que, em grandes concentrações, o ATP ativa
cascatas citotóxicas e processos inflamatórios. A citotoxicidade ocorre
predominantemente através da ativação de receptores P2X
7
, que além de modularem
a entrada de íon cálcio, permitem a passagem de moléculas de até 900 Da através de
poros que se formam na membrana plasmática, levando ao desequilíbrio na
homeostase celular (Surprenant et al., 1996; Di Virgílio et al., 1998; Virginio et al.,
1999; Adinolfi et al., 2005).
Esses receptores na micróglia, astrócitos e macrófagos (entre outras células
do sistema imune) também possuem a capacidade de regular a produção e liberação
21
de citocinas (principalmente da interleucina 1β), além de ativar cascatas apoptóticas
(Ferrari et al., 1999; Brough et al., 2002), proteínas cinases ativadas por mitógenos
(MAP cinases), fatores de transcrição (Ferrari et al., 1997; Ferrari et al.,1999) e da
forma induzida da enzima óxido nítrico sintetase (iNOS), levando a processos
degenerativos e morte celular (Feuvre et al., 2002; Gendron et al., 2003).
Apesar de pouco se conhecer a ação dos metabólitos ADP e AMP no sistema
nervoso central, estudos recentes revelam que esses nucleotídeos também ativam
receptores P2X
7
,
podendo induzir a liberação de citocinas, porém sem causar
citotoxicidade (Chakfe et al., 2002). Os receptores P2X
4
e P2Y presentes na micróglia,
também podem ativar a produção e liberação de mediadores inflamatórios (Franke et
al., 2004).
Outros estudos ainda têm revelado que o ATP pode agir em combinação com
vários fatores de crescimento e estimular a proliferação de astrócitos, contribuindo
para o processo de astrogliose reativa, uma resposta hipertrófica e hiperplástica que
está freqüentemente associada com trauma cerebral, isquemia, crises e outras
doenças neurodegenerativas (Burnstock et al., 2000).
Contrastando com os efeitos citados para os nucleotídeos de adenina, em
condições patológicas, a adenosina, exerce efeito neuroprotetor e antiinflamatório,
especialmente através da ativação de receptor A1 (Dunwiddie e Mansino, 2001).
A adenosina tem sido reconhecida como um importante modulador da
neurotransmisão excitatória e agente neuroprotetor em diferentes patologias que
acometem o sistema nervoso central, tais como, na isquemia ou hipóxia (Rudolphi et
al., 1992; Fredholm et al., 1997; Ribeiro et al. 2003b), Coréia de Huntington (Blum et
al., 2002; Ribeiro et al.,2003b) e Epilepsia (Cavalheiro et al., 1989; Vianna et al.,
2005).
O equilíbrio entre a liberação de ATP e produção de adenosina no meio
extracelular por ação enzimática, consiste em um dos mecanismos de controle dos
processos citotóxicos e degenerativos, capaz de evitar a morte celular.
22
1.3 Sistema Purinérgico e Epilepsia
As evidências de que a adenosina inibe a liberação de neurotransmissores
excitatórios no cérebro e o fato de seus antagonistas, como as metilxantinas naturais
cafeína e teofilina, serem pró-convulsivantes fazem da adenosina um importante
agente inibitório e anticonvulsivante endógeno (Chu, 1981; Dunwiddie et al., 1981;
Ault et al., 1987).
A adenosina exerce efeitos inibitórios sobre uma grande variedade de
modelos experimentais, incluindo o modelo de crises audiogênicas (Maitre et al.,
1974), do abrasamento (Cavalheiro et al, 1987; Berman et al., 1990), do ácido
caínico e da pilocarpina (Dunwiddie et al., 1982; Cavalheiro et al, 1987; George et al,
1997; Vianna et al., 2005). Além disso, um aumento na atividade de ecto-apirases e
ecto-5'-nucleotidases tem sido apontado como mecanismo compensatório para reduzir
a excitabilidade neuronal e promover neuroproteção em modelos experimentais de
epilepsia (Bonan et al. 2000; Nicolaidis et al. 2005).
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a ação
anticonvulsivante da adenosina, e, neste contexto, destaca-se o potente efeito
depressor na transmissão sináptica excitatória no cérebro, especialmente no
hipocampo, através da ativação do receptor A1 (Dunwiddie e Fredhom, 1989;
Dunwiddie, 1999). Esses receptores localizados em especializações pré e pós-
sinápticas, são capazes de inibir a liberação de neurotransmissores excitatórios, como
o glutamato, e deprimir a excitabilidade neuronal, por inibição de canais de cálcio,
ativação de canais de potássio e estabilização do Mg
2+
no receptor NMDA (Palmer e
Stiles, 1994; Dunwiddie e Masino, 2001).
Além da ação anticonvulsivante, a adenosina também tem sido reconhecida
como um importante agente neuroprotetor contra os efeitos excitotóxicos
desencadeados pela alta liberação de glutamato em processos isquêmicos (Rudolphi
et al., 1997; Fredholm, 1997) e na epilepsia (MacGregor et al., 1996; Vianna et al.,
2005).
23
O efeito anticonvulsivante e neuroprotetor do receptor adenosinérgico A1
foi evidenciado com o uso de agonistas e antagonistas no modelo da pilocarpina
(Vianna et al., 2005), do ácido caínico (MacGregor et al., 1996) e em crises induzidas
pelo ácido 3-nitropropiônico (Zuchora et al., 2001). Corroborando com esses achados,
Berman et al. (2000) constataram um aumento na liberação de adenosina durante o
status epilepticus induzido pelo ácido caínico, bicuculina e pentilenotetrazol. Um
aumento na liberação de adenosina extracelular também foi reportado no hipocampo
de pacientes epilépticos, durante o período ictal, que se mantêm em níveis elevados
até o período de depressão pós-ictal, refletindo um mecanismo adaptativo envolvido
na terminação da descarga epileptiforme e na depressão pós-ictal (During e Spencer,
1992).
Vianna et al. (2005) empregando o método histoquímico para analisar a
intensidade e localização da atividade da ecto-5'-nucleotidase no hipocampo de ratos
submetidos à ELT induzida por pilocarpina, observaram um aumento nos períodos
latente e crônico, principalmente no subcampo CA3 e hilo do giro denteado. O
aumento da marcação na região de brotamento de fibras musgosas na fáscia denteada
gerou a hipótese de que existe um aumento na formação de adenosina extracelular
para controlar a excitabilidade neuronal e os processos epileptogênicos, além do fato
da ecto-5'-nucleotidase também participar de processos de plasticidade sináptica
favorecendo o brotamento de fibras musgosas.
São evidentes os efeitos benéficos da adenosina em modular crises e
promover neuroproteção, e tais achados têm contribuído para se considerar a
adenosina como uma opção terapêutica no tratamento das epilepsias (Wiesner et al.,
1999; Güttinger et al., 2005; Boison, 2005). Por outro lado, pouco se conhece sobre o
papel do ATP na epileptogênese.
Os achados de que o ATP, através da ativação de receptores P2X, é capaz
de induzir despolarização, causar aumento na concentração de cálcio intracelular,
além de facilitar a neurotransmissão glutamatérgica, têm levado alguns autores a
sugerir um papel pró-convulsivante para o ATP. Segundo Knutsen e Murray (1997)
agonistas de receptores purinérgicos ativados pelo ATP podem gerar crises
generalizadas, quando infundidos diretamente no córtex prepiriforme. Interessante é
24
que a administração direta de antagonistas adenosinérgicos como o 8-(p-sulfofenil),
teofilina (8-PST), aumenta o efeito pró-convulsivante do ATP nesta região do cérebro.
Um dos estudos pioneiros, ressaltando a participação do ATP e seus
receptores na fisiopatologia da ELT, foi o trabalho realizado por Vianna et al., (2002).
Esses autores, empregando a técnica de fluorimetria, para medir o influxo de Ca
2+
,
mediante a estimulação com ATP em fatias de hipocampo de ratos epilépticos e
controle, verificaram a presença de uma resposta bifásica, marcada por um aumento
(200%) na [Ca
2+
]i seguida de perda na resposta de fluorescência do fura-2. Este dado
foi indicativo da presença de receptor P2X
7
que formam poros capazes de permitir a
perda do marcador. Tal fato foi confirmado com as técnicas de imuno-histoquímica e
imunoblot, que revelaram um aumento na expressão desses receptores no hipocampo
de ratos epilépticos. Tais dados foram sugestivos de que o ATP, diferente da
adenosina, poderia estar contribuindo para a hiperexcitabilidade e manutenção de
crises espontâneas e recorrentes.
Os processos patogênicos responsáveis pela ELT permanecem indefinidos.
No entanto, há várias evidências de que a excitotoxicidade, hiperatividade
glutamatérgica, aumento na concentração de íons cálcio intracelular e a
reorganização de circuitos neuronais estejam envolvidos e o sistema purinérgico pode
contribuir para esses processos.
25
2. OBJETIVOS
O presente estudo teve como principais objetivos investigar o metabolismo
das purinas durante o período agudo (estado de mal epiléptico) e crônico do modelo
de epilepsia lesional induzida por pilocarpina, e a expressão dos receptores
purinérgicos P2X na formação hipocampal de ratos, nas mesmas condições
experimentais, incluindo o período latente.
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
1 - Quantificar por HPLC, as concentrações de ATP, ADP, AMP e adenosina
em amostras coletadas por microdiálise na formação hipocampal de ratos durante o
estado de mal epiléptico e no período interictal de ratos crônicos, ambos tratados
com pilocarpina para indução do modelo experimental de ELT.
2 – Avaliar por imuno-histoquímica a distribuição e localização da expressão
de receptores P2X (P2X
2
, P2X
4
e P2X
7
) no cérebro de ratos, fundamentalmente na
formação hipocampal, durante os períodos agudo, latente e crônico do modelo
experimental, e por imunoblot, a densidade de receptores P2X (P2X
2
, P2X
4
e P2X
7
) na
formação hipocampal nos mesmos períodos.
26
3.1 Animais
Ratos Wistar, adultos (~250 g), provenientes do biotério central da UNIFESP
(Escola Paulista de Medicina) foram trazidos para o biotério local da Disciplina de
Neurologia Experimental e mantidos sob ciclo claro/escuro de 12 horas e com livre
acesso à água e à ração. Todos os procedimentos experimentais descritos neste
trabalho foram realizados de acordo com as normas do Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade Federal de São Paulo / Hospital São Paulo, protocolo no Comitê de
Ética e Pesquisa (CEP) nº. 0636/04.
3.2 Modelo de Epilepsia Induzida por Pilocarpina
O
cloridrato de pilocarpina (Merck, USA), um agonista muscarínico
colinérgico, foi administrado por via intraperitoneal, na dose de 360 mg/kg em
animais pré-tratados 30 minutos antes com 1,0 mg/kg de nitrato de
metilescopolamina (Sigma), por via subcutânea, usada para minimizar os efeitos
colinérgicos periféricos da pilocarpina. Após injeção de pilocarpina, e na dependência
do quadro de alterações comportamentais obtidas, os animais foram divididos em
grupos (G) para serem estudados.
3.3 Microdiálise
3.3.1 Cirurgia para implantação da cânula guia
O
s animais foram anestesiados com ketamina/Xilazina (66,6 e 13,3 mg/Kg,
respectivamente i.p.) e submetidos à tricotomia da região superior da cabeça e
27
fixados ao aparelho esterotáxico através dos meatos auditivos externos e incisivos
superiores. Foi realizada incisão longitudinal da pele da região craniana, que foi
rebatida lateralmente. Após a remoção do periósteo, limpeza da área e total
exposição da tábua óssea, uma cânula guia foi implantada na formação hipocampal
(subcampo CA1 + giro denteado) de acordo com as coordenadas esterotáxicas do Atlas
Paxinos (antero-posterior = -5,3 do Bregma; latero-lateral = 4,0 e profundidade = 2,0).
3.3.2 Procedimento de microdiálise
A
pós 24 horas da implantação da cânula guia, os animais foram colocados
em gaiolas plásticas individuais onde permaneceram cerca de 30 minutos para
habituação (Figura 10). A sonda de microdiálise (probe em inglês, CMA11/ 2,0 mm de
membrana de microdiálise) foi conectada através de cateteres de polietileno (~90 cm
de comprimento) a uma microseringa (Hamilton) de 2,5 ml, previamente preenchida
com solução Ringer Lactato de Sódio, e posicionada na bomba de microinfusão com o
fluxo fixado em 1,5 µl/min. A coleta dos perfusatos teve início 180 minutos após
inserção da sonda na cânula guia, tempo necessário para a estabilização da
neurotransmissão local. Aproximadamente 50 µl foram coletados em tubos através de
catéter (~10 cm de comprimento) inserido na posição de saída da sonda, e esses
mantidos em gelo.
3.3.3 Formação dos grupos para o estudo de microdiálise
Q
uatro grupos de animais foram empregados neste estudo:
Figura 10
: Sistema de microdiálise:
A
: 1
-
Bomba; 2
-
Cuba; 3
-
Swivel (
haste móvel);
B
: 4
-
sonda de microdiálise.
28
Grupo SE (N=6): composto por animais tratados com nitrato de
metilescopolamina e pilocarpina para indução do status epilepticus. As amostras
foram coletadas em diferentes períodos antes e após os tratamentos: três amostras
imediatamente após o tempo de estabilização da sonda para o cálculo do valor médio
basal (BASAL); uma amostra foi coletada 30 minutos após a administração do nitrato
de metilescopolamina (ME), e as demais coletas, a partir da administração de
pilocarpina nos seguintes tempos: 30 minutos, 1 h, 2 h, 3 h e 4 h.
Grupo Crônico (N=6): animais tratados com nitrato de metilescopolamina e
pilocarpina, estudados após um período de 90 dias, quando apresentavam crises
espontâneas e recorrentes. Quinze amostras de 50 µl foram coletadas do hipocampo.
O valor basal das purinas no período interictal foi obtido pela média dos três
primeiros dialisatos, período em que nenhum dos animais apresentou crise
espontânea. Durante o experimento, três animais apresentaram crises espontâneas e
as amostras obtidas para a dosagem de purinas no período ictal.
Grupo Controle: ratos foram submetidos ao tratamento com nitrato de
metilescopolamina e salina (0,9%), em vez de pilocarpina, e estudados nas mesmas
condições descritas para os grupos agudo (N=5) e crônico (N=5). Animais do grupo
controle crônico foram estudados 90 dias após a administração de salina.
3.3.4 Análise histológica para avaliação do posicionamento da sonda
A
o término de cada experimento os animais foram sacrificados, os cérebros
removidos e congelados em isopentano (-30ºC). Em seguida, estes foram cortados em
criostato (-18 ºC) em secções de 40 µm, e usados para avaliação do posicionamento da
sonda. Os cortes foram transferidos para lâminas gelatinizadas, e após secagem em
temperatura ambiente, foram submetidos ao método de coloração de cresil violeta.
Após imersão em solução de cresil violeta (0,5%) por 2 a 7 minutos os cortes foram
desidratados por sucessivas passagens em banhos de álcool com concentrações
crescentes (70-100%), imersos em xilol e montados com entelan e lamínulas.
29
3.4 Análise de Purinas por HPLC
O
conteúdo das purinas dos microdialisatos foi quantificado segundo o
método descrito por Levitt et al. (1984), com pequenas modificações. Imediatamente,
após a perfusão, os microdialisatos coletados foram derivatizados em tampão fosfato
citrato 0,1 M e 2-cloro-acetaldeído nas seguintes proporções: 50 µl de amostra:
22,3 µl tampão: 2,5 µl de 2-cloro-acetaldeído. A mistura foi aquecida por 40 minutos
a 80
o
C para a obtenção dos compostos eteno-derivatizados.
As ε-purinas obtidas foram separadas através de um sistema de
cromatografia líquida de alta pressão (em inglês HPLC, High Performance Liquid
Chormatography, Shimadzu), utilizando-se uma coluna analítica Chromolith C18
(Merck), medindo 4,6X10 cm, com partículas de 5 µm de diâmetro. A detecção foi
feita por fluorescência (RF-10 AXL, Shimadzu), utilizando-se para excitação o
comprimento de onda de 230 nm e o de 420 nm para emissão. O sistema de HPLC era
acoplado a um PC contendo um programa específico (Software Class VP, versão 2,0)
que permitia a coleta dos registros e a análise dos dados.
Condições cromatográficas: A fase móvel foi composta por duas soluções: A
– tampão fosfato citrato 0,1 M, pH 6,0; B – tampão fosfato citrato 0,1 M, pH 6,0,
acrescido de 25% de metanol. Método: eluição isocrática utilizando a mistura de 83%
da solução A, com 17% da solução B; fluxo 0,6 ml/minuto; tempo de corrida - 35
minutos.
Concentrações conhecidas de ATP, ADP, AMP e adenosina foram
derivatizadas, de modo semelhante às amostras, sendo injetadas a cada cinco
amostras para obtenção da curva padrão. Esta foi obtida plotando-se a concentração
versus a área do pico de cada componente e, por regressão linear, calculava-se a
concentração das purinas presentes nas amostras.
30
3.5 Eletroforese e Imuno-histoquímica:
P2X
2
, P2X
4
e P2X
7
3.5.1 Formação dos Grupos
O
s grupos de animais empregados nesses estudos foram:
Grupo Agudo (G12H): ratos sacrificados 12 horas após o início do status
epilepticus.
Grupo Latente (GLat): ratos sacrificados 7 dias após o status epilepticus.
Grupo Crônico (GCro): ratos sacrificados 90 dias após o status epilepticus,
período em que apresentam crises espontâneas e recorrentes;
Grupo Controle (GCts): ratos tratados com metilescopolamina e solução salina
0,9% ao invés de pilocarpina, que foram estudados nas mesmas condições descritas
para os grupos experimentais.
3.5.2 Eletroforese – Imunoblot (análise semi-quantitativa)
A
pós o sacrifício dos animais por decapitação, os hipocampos foram
rapidamente retirados e congelados em gelo seco para posterior processamento
(N=4/grupo). Os tecidos foram homogeneizados em tampão Tris-HCl (10 mM, pH 7,6)
contendo: 0,1 M de NaCl, 10% de Glicerol, 1% de NP-40, 0,001 M de EDTA e diferentes
inibidores de proteases (10 µM de PMSF, 1mM de metavanadato de sódio, 2 nM de
ácido okadaíco, 2 g de NaF, 10 mg/ml de aprotinina e 20 µM de leupeptina, Sigma).
Uma alíquota do homogeneizado foi usada para a dosagem de proteína pelo Método
de Lowry (1951).
A mistura (1:1) do homogeneizado com tampão de amostra (Tris HCl 115 mM
pH 6,8, SDS 15%, glicerol 10%, 2-β-mercaptoetanol 100 mM e azul de bromofenol 0,1%)
foi fervida a 100 ºC por 5 minutos. Volumes de amostras contendo 40 µg de proteína
foram aplicados ao gel de eletroforese SDS-PAGE (acrilamida/bis-acrilamida, 29:1),
montado com o gel de separação a 8%, preparado com tampão Tris HCl 1,5 M, pH 8,8
e 0,4% de SDS, e o gel de empilhamento (“stacking gel”) a 4%, preparado com tampão
Tris HCl 0,5 M, pH 6,8 e 0,4% de SDS. Uma solução padrão contendo proteínas com
diferentes pesos moleculares (Rainbow, GE) foi aplicada ao gel para identificação das
bandas de interesse. O tampão de corrida foi composto de 25 mM Tris HCl (pH 8,3),
31
200 mM de glicina (USB) e 1% de SDS. O sistema de eletroforese (Bio-Rad: Mini
Protean, 7,5 X 10 cm) foi ajustado para trabalhar a 100 V e o experimento durava
cerca de 3 horas. Ao término da corrida eletroforética, as bandas protéicas foram
transferidas para membranas de nitrocelulose (GE) utilizando-se tampão Tris (25 mM,
pH 8,3), contendo 193 mM de glicina e 20% de metanol. A transferência foi realizada
a 100 Volts, com duração de 50 minutos (Bio-Rad: Mini Trans-Blot cell 7,5 X 10 cm).
Após a transferência, as membranas de nitrocelulose foram incubadas por 2
horas, a temperatura ambiente em uma solução de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4
contendo 5% de leite em pó desnatado mantida sob agitação leve, para bloqueio dos
sítios inespecíficos. Em seguida, tais membranas foram incubadas por 24 horas à 4ºC
com os respectivos anticorpos primários, os policlonais anti-coelho para P2X
2
(Alomone, 62 KDa, 1:300), P2X
4
(Chemicon, 64 KDa, 1:300) e P2X
7
(Chemicon, 70-72
KDa, 1:1000), diluídos na mesma solução de bloqueio com titulações determinadas por
estudo piloto para cada anticorpo. Após incubação, as membranas foram lavadas (três
vezes de 5 minutos) em tampão fosfato contendo 0,2% de tween e incubadas com os
respectivos anticorpos secundários conjugados com a enzima peroxidase (anti-coelho –
Vectastain/Vector) durante 2 horas, a temperatura ambiente e sob leve agitação. Ao
final, as membranas foram novamente lavadas e submetidas ao procedimento para
imunodetecção das bandas empregando o kit de quimioluminescência ECL (GE) e os
filmes de raios-X (Hyperfilm-GE) cujo tempo de exposição variava entre 3 e 5
minutos. A revelação dos filmes foi feita através de soluções reveladora e fixadora da
Kodak.
Em seguida, as membranas previamente incubadas com os anticorpos foram
submetidas ao procedimento de “stripping”, destinado a extrair os anticorpos
anteriormente ligados e permitir a re-hibridização com o anticorpo anti-β-actina,
utilizado como controle da reação. Para o “stripping” a membrana foi incubada com
uma solução de 0,2 M de 2β-mercaptoetanol, 8 M de Uréia, 0,05% de albumina bovina
(BSA) e 1 M de Trizma base (pH 7,5), e mantida sob agitação por 1 hora em banho-
maria a 60º C. A seguir, a membrana foi neutralizada com 1 M de Trizma-HCl (pH 7,5)
durante 30 minutos a temperatura ambiente e sob agitação. Ao final, as membranas
foram novamente submetidas ao bloqueio de sítios inespecíficos e incubadas com o
anticorpo monoclonal anti-β-actina (Sigma, 42-45 KDa, 1:1000) por 1 hora, em seguida
lavadas com solução tampão fosfato 0,1 M e incubadas por 1 hora com o anticorpo
32
secundário conjugado à peroxidase (Sigma) e reveladas com o kit ECL, seguindo os
mesmos protocolos já descritos.
As respectivas bandas identificadas nos filmes foram quantificadas por
densitometria óptica, através do sistema de análise de imagem com o programa
Densirag (Biocom, França), e os dados plotados fazendo-se a relação entre a
densidade óptica (D.O.) de cada receptor P2X com a D.O. da β-actina correspondente,
para corrigir possíveis erros durante o procedimento.
3.5.3 Imuno-histoquímica
A
nimais dos grupos G12H, GLat, GCro e GCts (N=3/grupo) foram
anestesiados com hidrato de cloral (0,3 mg/100 g rato, i.p) e perfundidos por via
transcardíaca com ~200 ml de solução salina 0,9% seguido de 300 ml da solução de
paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M usada como fixador do tecido. Ao final
da perfusão, os cérebros foram retirados e pós-fixados na mesma solução por 6 horas
e, a seguir, transferidos para um recipiente contendo a mesma solução acrescida de
sacarose (30% w/v), usada como crioprotetor, e ali permaneceram por períodos de no
mínimo 48 horas. Após este procedimento, os cérebros foram fatiados através de
micrótomo de congelação, em cortes coronais de 40 µm que foram coletados em
tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4).
A reação teve início com o bloqueio dos sítios inespecíficos, com os cortes
mergulhados em uma solução de tampão fosfato 0,1 M acrescida de 5-10% de soro
normal não imune e 0,3% de Triton X-100. Sem lavagem, os cortes foram colocados
em contato, durante uma noite, com os respectivos anticorpos primários, policlonais
anti P2X
2
(Alomone, 1:100), P2X
4
(Chemicon, 1:100) e P2X
7
(Chemicon, 1:500) diluídos
na mesma solução de bloqueio, com titulação determinada previamente por estudo
piloto.
Após sucessivas lavagens, os cortes foram incubados durante 1 hora e meia
com os respectivos anticorpos secundários biotinilados, e após lavagens, foram
incubados com solução do kit ABC (VECTOR/USA) para formar complexo com a
peroxidase. A diaminobenzidina (DAB/ SIGMA), usada como substrato da peroxidase,
foi diluída em tampão fosfato 0,1 M (1,0mg/ml) e adicionada às fatias a fim de
revelar a marcação específica, que foi obtida pelo aparecimento da cor acastanhada
nos cortes, na presença do peróxido de hidrogênio. Após o bloqueio da reação pela
33
transferência dos cortes para tampão fosfato, estes foram montados em lâminas
gelatinizadas, desidratados com sucessivas passagens em solução de etanol (70%, 90%
e 100%) e diafanizados em xilol e fixados com entelan.
A análise da marcação foi feita com a utilização de um sistema
computadorizado de análise de imagem acoplado a um microscópio (Nikon, Eclipse
E600 com CCD VIDEO CAMERA, EXWAVE HD, SONY - USA) para captura e
armazenamento das imagens, que foram usadas nas figuras. O controle negativo de
cada reação foi obtido pela incubação dos cortes na ausência do anticorpo primário,
mas mantendo-se todas as demais etapas do procedimento.
3.6 Análise Estatística
A
análise dos resultados de microdiálise foi feita através dos seguintes
testes estatísticos: 1- ANOVA de uma via (medidas dependentes) seguido de pós-teste
de Newman Keuls para comparar as variações da concentração extracelular de purinas
entre os diferentes tempos estudados (BASAL, ME, 30 min, 1h, 2h, 3h e 4h) no rato
com status epilepticus e controle; 2- o teste “t” de Student (não pareado), foi usado
para a comparação da concentração de purinas entre os grupos SE e controle em cada
período, e entre o GCro versus controle.
A análise dos resultados obtidos por eletroforese/imunoblot dos
purinoceptores entre os grupos SE, GLat, GCro e GCts foram avaliados pelo teste de
ANOVA de uma via (medidas independentes), seguido de pós-teste Newman Keuls.
Em todos os testes estatísticos fixamos em 5% o nível de rejeição da
hipótese de nulidade. O programa PRISMA 3.0 foi empregado para a realização das
análises.
34
4.1 Análise Comportamental
A
manifestação das crises após a injeção de pilocarpina, foi a mesma
descrita previamente por Turski et al. (1983). Resumidamente, após 10 minutos da
aplicação sistêmica de pilocarpina os animais apresentaram tremores generalizados
com “scratching” (ato de coçar), clonias de orelhas, movimentos mastigatórios, e
status epilepticus, identificado pela ocorrência ininterrupta das crises por períodos
de, no mínimo, 15 minutos. Em geral, o status epilepticus do ponto de vista
comportamental, teve duração de aproximadamente 15 horas, após as quais os
animais apresentavam-se comatosos, sendo necessários cuidados especiais de re-
hidratação e alimentação até a completa recuperação. Os animais controles tratados
com salina não apresentaram alteração comportamental.
4.2 Liberação de Purinas nas Diferentes Fases do Modelo
4.2.1 Liberação de purinas durante o status epilepticus (fase aguda)
A
s concentrações basais de ATP, ADP, AMP e adenosina dos grupos status
epilepticus e controle foram obtidas a partir da média dos três primeiros
microdialisatos coletados antes da aplicação do nitrato de metilescopolamina e
encontram-se representadas na Tabela 2.
O estudo não revelou alteração significativa na concentração basal das
purinas entre os grupos (p>0,05). A comparação de valores da concentração das
purinas, obtidos nos diferentes períodos da coleta no grupo controle, não revelou
alterações significativas, conforme mostram as Figuras 11-15. Por outro lado, essa
mesma análise entre as amostras colhidas em diferentes períodos nos animais do
grupo status epilepticus, mostrou que a concentração das purinas altera a partir da
segunda hora do insulto, em relação à condição basal. Houve um aumento
significativo de AMP (183%, p<0,05), ADP (~250%, 3ª e 4ª hora, p<0,05) e adenosina
(208%, 4ª hora,
p<0,01), como mostram as Figuras 12-14.
35
Comparando-se os valores da concentração de purinas entre os animais do
grupo status epilepticus versus o grupo controle, observou-se uma redução na
concentração de ATP (~100%, p<0,02) na 4ª hora do estado de mal epiléptico, e
aumento na concentração de AMP e adenosina (~ 200%, p<0,01) na 2ª e 4ª hora,
respectivamente, conforme mostram as Figuras 11, 13 e 14.
Tabela 2 – Concentração basal de purinas na formação hipocampal de ratos em diferentes grupos.
Valores expressos como Média ± Erro Padrão Médio.
Purinas Controle
(pmol/ 50µl) N = 5
Status Epilepticus
(pmol/ 50µl) N = 6
ATP
0,7 ± 0,1 1,5 ± 0,5
ADP 0,36 ± 0,12
0,3 ± 0,08
AMP 0,5 ± 0,12
0,43 ± 0,1
Adenosina (ADE) 0,17 ± 0,03
0,32 ± 0,07
Purinas Totais (ATP+AMP+ADP+ADE)
1,73 ± 0,1
2,5 ± 0,7
Figura 11:
Concentra
ção extracelular de ATP na formação hipocampal de ratos dos
grupos status epilepticus e controle, expressa em porcentagem da concentração
basal. #p<0,02 versus grupo controle no mesmo período (teste “t” Student).
36
Figura 12
: Concentração extracelular de ADP na formação hipocampal de ratos dos
grupos status epilepticus e controle, expressa em porcentagem da concentração
basal. *p<0,05, ANOVA.
Figura 13:
Concentração extracelular de AMP
na formação hipocampal de ratos dos
grupos status epilepticus e controle, expressa em porcentagem da concentração
basal. *p<0,05, ANOVA; # p<0,05 versus grupo controle no mesmo período (teste “t”
Student).
37
Figura 15:
Concentração extracelular de Purinas Tot
ais (ATP+ADP+AMP+adenosina) na
formação de ratos dos grupos status epilepticus e controle, expressa em porcentagem
da concentração basal. P>0,05, ANOVA.
Figura 14:
Concentração extracelular de adenos
ina na formação hipocampal de ratos
dos grupos status epilepticus e controle, expressa em porcentagem da concentração
basal. *p<0,01, ANOVA; # p<0,01 versus grupo controle no mesmo período (teste “t”
Student).
38
4.2.2 Liberação de purinas durante o período interictal (fase crônica)
A
pós confirmar a presença de crises espontâneas e recorrentes, os animais
crônicos foram submetidos à microdiálise para quantificação da concentração de
purinas na formação hipocampal. Inicialmente comparou-se a concentração de cada
purina obtida no período interictal do rato crônico com os valores do animal controle.
Esta análise mostrou uma redução variando entre 61-82% na concentração de ATP,
ADP, AMP e adenosina no dialisato de animais epilépticos, conforme mostra a
Tabela 3.
Tabela 3 – Concentração de ATP, ADP, AMP, Adenosina e purinas totais no dialisato hipocampal de
animais epilépticos estudados no período interictal e controles.
Valores expressos como Média ± Erro Padrão Médio. Teste “t” Student, ***p<0,007, *p<0,03; ∆ % corresponde a variação
percentual do valor das purinas no grupo crônico em relação ao valor controle.
A análise da liberação de purinas durante o período ictal (crises
espontâneas) em animais crônicos não era objetivo do presente trabalho, uma vez
que é muito difícil prever a ocorrência de uma crise espontânea. No entanto, no
decorrer do experimento de microdiálise, três, dentre os seis animais estudados,
apresentaram crises no momento da coleta, tornando possível quantificar as purinas
nessa condição. A aplicação do teste “t” de Student na comparação entre a
concentração de purinas obtida durante a crise espontânea com os valores obtidos no
período pré-crise, revelou que a crise causa um aumento significativo de ATP (303%,
p<0,009), adenosina (230%, p<0,04) e purinas totais (203%, p<0,02) na formação
hipocampal.
As concentrações de ADP e AMP também aumentaram (147% e 145%,
respectivamente), porém os resultados não foram estatisticamente significativos
(ADP, p = 0,21/AMP, p = 0,28). A Figura 16 mostra a variação percentual de purinas
Purinas Controle
(pmol/ 50µl) N = 6
Crônico
(pmol/ 50µl) N = 6
∆ %
ATP 2,8 ± 0,6 1,1 ± 0,3 * - 60,7 %
ADP 1,5 ± 0,4 0,42 ± 0,07 *** - 72,0 %
AMP 0,84 ± 0,2 0,3 ± 0,06 * - 64,3 %
Adenosina (ADE) 0,72 ± 0,2 0,13 ± 0,01 * - 82,0 %
Purinas Totais
(ATP+AMP+ADP+ADE)
5,9 ± 1,0 2,0 ± 0,3 * - 66,1 %
39
durante a crise espontânea, calculadas em relação ao valor basal, ou seja, relativos
ao período interictal.
4.2.3 Avaliação do posicionamento da sonda de microdiálise
T
odos os animais submetidos ao procedimento de microdiálise tiveram suas
sondas de microdiálise posicionadas corretamente em CA1 + giro denteado, conforme
ilustra a Figura 17.
Figura 16:
Concentração extracelular de ATP, A
DP, AMP, ADE e purinas totais
na formação hipocampal de ratos epilépticos durante uma crise espontânea. Os
valores representam porcentagens do valor basal. **p<0,008, *P<0,04 , Teste
“t” de Student.
Figura 17:
Posicionamento da Sonda de Microdiálise, no subcampo CA1
do hipocampo + giro denteado de ratos. Coloração histológica de cresil
violeta.
40
4.3 Eletroforese - Imunoblot para Quantificação dos
Purinoceptores
4.3.1 Quantificação de proteínas
O
s
valores de proteínas
quantificadas através do método de Lowry
(1951)
na formação hipocampal
dos grupos
G12H, GLat e GCro e respectivos controles, estão
descritos na Tabela 4.
Tabela 4 – Quantidade de proteínas no hipocampo dos diferentes grupos estudados.
Valores expressos como Média ± desvio padrão.
4.3.2 Análise semi-quantitativa de receptores purinérgicos
A
quantificação da densidade das bandas protéicas reveladas nos filmes,
mostra uma redução na densidade de receptores P2X
4
na formação hipocampal do
grupo crônico
(-35%, p<0,01), e um aumento na densidade dos receptores P2X
7
nos
grupos G12H (+24%, p<0,01) e GCro (+34%, p<0,001), em relação aos GCts (Figuras 19
e 20). Comparando-se a densidade de receptores P2X
2
entre os grupos experimentais e
controles, não se observou alteração significativa (p = 0,1), Figura 18. Os grupos
controles também não diferiram entre si (p = 0,1).
Nenhuma variação significativa foi observada na quantificação da β-actina
entre os grupos experimentais e controles (p = 0,5), conforme mostram as Figura 18-
20.
Grupos Proteína (mg/ml)
G12H
GCt
30,4 ± 0,8
27,0 ± 0,9
GLat
GCt
31,5 ± 1,0
27,0 ± 0,9
GCro
GCt
31,9 ± 0,5
32,6 ± 0,6
41
Figura 18:
Valores expressando a relação entre a densidade óptica
(D.O.) dos receptores P2X
2
e da -actina na formação hipocampal de
ratos pertencentes aos diferentes grupos, (média /desv. padrão),
p > 0,05, ANOVA (N = 4).
Figura 19:
Valores expressando a relação entre a densidade óptica (D.O.)
dos receptores P2X
4
e da -actina na formação hipocampal de ratos
pertencentes aos diferentes grupos, (média / desv. padrão) *p < 0,01,
ANOVA (N = 4).
42
4.4 Imuno-histoquímica: P2X
2
P2X
4
e P2X
7
A
especificidade da imunomarcação dos anticorpos primários aos receptores
P2X
2,
P2X
4
e P2X
7
no cérebro de ratos foi confirmada pela ausência de marcação no
controle negativo. O estudo confirma a presença desses receptores em várias regiões
do sistema nervoso central, tais como córtex entorrinal, tálamo, amígdala e formação
hipocampal em todos os grupos estudados (GCts, G12H, GLat e GCro). Entretanto, nós
fizemos uma análise detalhada na formação hipocampal por ser a região de interesse.
a) Receptor P2X
2
A marcação dos receptores P2X
2
ocorreu principalmente na camada de
células piramidais dos subcampos CA1, CA2 e CA3 do hipocampo e na camada de
células granulares e hilo do giro denteado. Não foram observadas diferenças na
marcação entre os grupos G12H e GLat com os seus respectivos controles. Entretanto,
uma leve redução foi detectada na camada de células piramidais dos subcampos CA1
e CA3 do hipocampo de ratos crônicos (GCro), quando comparado ao grupo controle
(Figura 21-D e F).
Figura 20:
Valores expressando a relaç
ão entre a densidade óptica (D.O.) dos
receptores P2X
7
e da -actina na formação hipocampal de ratos pertencentes aos
diferentes grupos, (média /desv. padrão) *p < 0,01, **p<0,001, ANOVA (N = 3).
43
b) Receptor P2X
4
A distribuição dos receptores P2X
4
na formação hipocampal foi similar a dos
P2X
2,
porém, a marcação desses receptores foi mais intensa na camada de células
piramidais dos subcampos CA1, CA2 e CA3 do hipocampo e no giro denteado. A
imunomarcação em células piramidais estendeu-se do corpo celular aos dendritos,
incluindo espinhos dentríticos nos estratos radiado de CA1 e lúcido de CA3. Não foram
detectadas alterações significativas na marcação de receptores P2X
4
nas fases aguda e
latente do modelo, quando comparadas ao grupo controle. Entretanto, no GCro
evidenciou-se uma redução da marcação dos receptores P2X
4
em todas as subáreas da
formação hipocampal, especialmente nos subcampos CA1 e CA3 (Figura 22- B e D) e
no giro denteado (Figura 22- F) em relação ao grupo controle e aos demais grupos
(G12H e GLat). Nenhuma mudança significativa foi evidenciada entre os grupos
controles.
c) Receptor P2X
7
A marcação dos receptores P2X
7
foi diferente entre os grupos. No grupo
controle, o receptor P2X
7
teve uma marcação em forma de puncta, localizada no
estrato radiado de CA1, no estrato lúcido de CA3 e no hilo do giro denteado (Figuras
23 e 24). No estrato radiado de CA1 também se observou marcação em dendritos de
células piramidais, como mostra a Figura 23-B. Nenhuma marcação somática (corpo
celular) foi observada na formação hipocampal do grupo controle (Figuras 23-B e 24-
A). O G12H, diferentemente do controle, apresentou uma difusa marcação de células
piramidais na região de CA1, intensa marcação em puncta no subcampo CA3 e a
presença de células positivas, que pela localização (estrato radiado, oriens e lúcido) e
aspecto, parecem ser gliais (astrócitos e micróglias), conforme ilustram as Figuras
23(C-D) e 24 (B). No grupo GLat a marcação de células piramidais e gliais foi reduzida,
embora presentes, e houve uma difusa marcação em puncta na região CA3,
envolvendo toda a camada de células piramidais (Fig. 24 C).
O grupo crônico é desprovido de marcação de células piramidais e gliais,
porém o padrão de marcação em puncta está bastante aumentado na região de CA3 e
hilo. Além disso, observou-se uma intensa marcação na região supragranular do giro
denteado, coincidindo com o local de brotamento de fibras musgosas, conforme
mostra a Figura 24 (D-F).
B
A
C
D
E
F
CA3
CA1
CA1CA1
CA1
CA3
CA3
100µm
750µm
Figura 21: Imunomarcação de receptor P2X
2
no hipocampo de ratos submetidos ao modelo de
ELT induzida por pilocarpina. Corte coronal do cérebro de rato controle (A); Subcampo CA1 do
GCT (B), GLat (C) e GCro (D). Subcampo CA3 do GCT (E) e GCro (F). Notar redução de células
marcadas nas regiões CA1 (D) e CA3 (F, seta) do GCro. Barra de Calibração: A: 750 µm; B-F:
100 µm.
A
B
44
D
A
A
CA1
B
C
CA1
CA3 CA3
F
E
100µm
50µm
50µm
Hilo
CG
CG
Hilo
Figura 22: Imunomarcação de receptor P2X
4
na formação hipocampal de ratos submetidos ao
modelo de ELT induzida por pilocarpina. Subcampo CA1 do GCT (A), com destaque de marcação
em células piramidais e dendritos apicais (quadrado) e GCro (B). Subcampo CA3 do GCT (C) e
GCro (D). Giro Denteado do GCT (E) e GCro (F). Observar redução de células marcadas em CA1
(B), CA3 (D) e hilo (F) em relação aos respectivos controles (A,C,E). Barra de Calibração: A-B: 50
µm; a - 20 µm; C-F: 100 µm.
45
A
E
CA1
CA1
CA1
C
F
CA1
B
ER
CA1
ER
CA1
D
ER
ER
ER
ER
100µm
20µm
50µm
50µm
c
Figura 23: Imunomarcação de receptor P2X
7
na região CA1 do hipocampo de ratos submetidos
ao modelo de ELT induzida por pilocarpina. GCT (A), com detalhe em maior aumento em B,
G12H (C,D), GLat (E) e GCro (F). Observar marcação difusa na camada de células piramidais do
G12H (C, quadrado), e de inúmeras células gliais mostradas também em maior aumento no
quadrante D. O GLat (E), exibe pouca marcação em células gliais no estrato radiado (ER). No
GCro (F) não se observa marcação de células piramidais (seta), apenas em puncta. Barra de
Calibração: A,C,E e F:100 µm; B-D: 20 µm; C: 50 µm.
46
B
C
A
D
CG
CG
E
F
CA3 CA3
CA3
CA3
EL
EL
EL
EL
50µm
100µm
f
b
Hilo
Hilo
20µm
100µm
Figura 24: Imunomarcação de receptor P2X
7
na formação hipocampal de ratos
submetidos ao modelo de ELT induzida por pilocarpina. Subcampo CA3 do GCT (A)
mostrando intensa marcação em puncta no estrato lúcido (EL). No G12H (B), a marcação
é difusa na camada de células piramidais (CP), e pode-se notar a presença de células
gliais (em detalhe no quadrado pontilhado), mostradas em maior aumento em “b”. No
GLat(C) as células gliais marcadas tornam-se esparsas, e uma difusa marcação em puncta
pode ser observada na camada de células piramidais (seta). No GCro (D e F) a marcação
é basicamente em puncta no estrato lúcido (EL) de CA3 (D) e hilo do giro denteado (F).
Uma intensa marcação de fibras musgosas pode ser observada na região supragranular do
giro denteado do GCro (F, com destaque em f), mas não no GCT (E). Barra de Calibração:
A-E, f: 100 µm; E-F: 50 µm; b: 20 µm.
CP CP
CP
CP
47
48
4.5 Resumo dos Resultados
Tabela 5: Resumo dos resultados obtidos no metabolismo das purinas e dos receptores
GRUPOS Concentração de purinas Receptores
ATP ADP AMP ADENOSINA
P2X
2
P2X
4
P2X
7
Agudo
↓* ↑# ↑*# ↑*#
= =
↑
Latente NR NR NR NR = = =
Crônico
Interictal
↓* ↓* ↓* ↓*
=
↓ ↑
Crônico
ictal
↑# = = ↑#
Obs: (*) significativo em relação ao grupo controle; (#) significativo em relação ao valor basal; (NR) não realizado; (=) Sem
significância.
49
O
envolvimento da sinalização purinérgica mediada pela ação do ATP sobre
os receptores P2 em processos epileptogênicos é pouco discutido na literatura
científica. O presente estudo empregou as técnicas de microdiálise e análise
cromatográfica para quantificar o ATP e seus metabólitos em perfusatos de
hipocampo de ratos colhidos em diferentes períodos após o estabelecimento do
estado de mal epiléptico induzido pela aplicação sistêmica de pilocarpina. Além disso,
empregou-se as técnicas de imuno-histoquímica (análise qualitativa) e imunoblot
(análise semi-quantitativa) para determinar a localização, distribuição e densidade
dos principais receptores purinérgicos ionotrópicos ativados pelo ATP (P2X
2
, P2X
4
e
P2X
7
) no cérebro de ratos nas três diferentes fases que caracterizam o modelo da
pilocarpina: aguda, latente e crônica.
5.1 Liberação de ATP e seus Metabólitos
Não encontramos na literatura valores de referência para a concentração
extracelular de ATP, ADP e AMP no hipocampo de ratos, porém, em relação a
adenosina verificamos valores menores, quando comparados aos descritos por
Carswell et al. (1997) e Berman et al. (2000), os quais dosaram a concentração desse
nucleosídeo nos perfusatos colhidos por microdiálise no hipocampo de ratos sob
anestesia, após 100-180 minutos da implantação cirúrgica da sonda de microdiálise.
A técnica de microdiálise é invasiva e com muitas variáveis a serem
controladas. Alterações aguda ou crônica no tecido cerebral em decorrência da
implantação da cânula, como o fluxo sangüíneo, metabolismo celular, danos celular,
gliose reativa e processos inflamatórios são alguns dos fatores limitantes do método,
que podem promover alterações na liberação de neurotransmissores e até mesmo a
obstrução da membrana da sonda de microdiálise (Ballarin et al., 1991; Grabb et al.,
1997). No entanto, essas dificuldades têm sido atenuadas através da padronização do
protocolo que deve ser aplicado com rigor na condição controle e experimental.
O presente estudo adotou o tempo de início da coleta dos perfusatos após
24 horas da implantação da cânula guia, com um tempo adicional de 3 horas de
diálise, contadas a partir da inserção da sonda na cânula guia, para a estabilização da
50
neurotransmissão local. Este protocolo foi determinado com base no trabalho de
Ballarin et al. (1991), os quais demonstraram que após a implantação da sonda de
microdiálise a concentração extracelular de adenosina é elevada, e gradualmente
diminui, estabilizando em torno de 24 horas após o procedimento cirúrgico. Esse
tempo foi considerado condizente à condição experimental do presente trabalho, que
requer boa condição do animal para a indução do estado de mal epiléptico pela
aplicação de pilocarpina. O estado de mal epiléptico é bastante debilitante para o
animal causando alta mortalidade.
Após a segunda hora do início do status epilepticus, houve um aumento na
concentração extracelular de AMP (183%), ADP (~250%) e adenosina (208%) em relação
à condição basal. Apesar do aumento na concentração extracelular dos metabólitos
do ATP, nenhuma mudança significativa foi evidenciada na concentração desse
nucleotídeo, a não ser uma redução (~100%) em relação ao grupo controle na 4ª hora
do status epilepticus. Esses resultados indicam que o estado de mal epiléptico
induzido por pilocarpina promove alterações no metabolismo do ATP, podendo ser
parte de processos patogênicos manifestados neste período.
Há várias evidências na literatura, oriundas de estudos in vitro e in vivo, do
aumento na liberação de ATP e adenosina após insultos no sistema nervoso central,
como na anóxia-isquêmica, no trauma cerebral e na epilepsia (Lutz e Kabler 1997;
Wieraszko et al., 1989; Berman et al., 2000; Melani et al., 2005; Franke et al., 2006).
As funções desempenhadas pelo ATP e seus metabólitos nessas condições patológicas
não são completamente elucidadas, especialmente as do ADP e AMP. Entretanto,
estudos têm revelado que o ATP e a adenosina podem mediar ações antagônicas no
sistema nervoso central, por exemplo: 1- o ATP pode facilitar a liberação de
glutamato, enquanto a adenosina inibe; 2- o ATP promove desequilíbrio na
homeostase celular de íons cálcio, podendo em condições patológicas induzir
processos citotóxicos, enquanto, a adenosina inibe canais de cálcio e receptores do
tipo NMDA; 3- o ATP pode induzir neurodegeneração, ativar processos inflamatórios e
promover morte celular por necrose ou apoptose, enquanto, a adenosina induz
neuroproteção e tem ação antiinflamatória e anticonvulsivante (revisões, Mendonça
et al., 2000; Latini et al., 2001; Le Feuvre et al., 2002).
Alguns autores têm demonstrado que o ATP liberado, em grandes
quantidades, pode exercer papel citotóxico por ativar receptores do tipo P2X,
51
especialmente do P2X
7
(Franceschi et al., 1996; Di Virgilio et al., 1999; Le Feuvre et
al., 1999; Cavaliere et al., 2001; Wang et al., 2004). Esses estudos têm sido
confirmados pelo uso de antagonistas de receptores P2 que promove neuroproteção
em cultura primária de neurônios cerebelar, estriatal, cortical e hipocampal
estimulada com ATP (Amadio et al., 2002) e glutamato (Volonté et al., 1999; Lin et
al., 2005), ou em processos degenerativos causados por hipoglicemia, anóxia ou
isquemia e trauma medular (Cavaliere et al., 2001; Wang et al., 2004). Nenhuma
menção foi feita em relação à epilepsia.
O presente estudo não revelou alteração significativa na concentração
extracelular do ATP na formação hipocampal durante o status epilepticus, mas
mostrou um aumento concomitante na concentração dos metabólitos ADP, AMP e
adenosina indicando rápida metabolização do ATP. Trabalhos prévios mostraram que
o ATP extracelular é hidrolisado a adenosina em segundos pela atividade das
ectonucleotidases (Zimmerman et al., 2000), e um aumento na atividade dessas
enzimas (ATPase, ADPase, ecto-5’nucleotidase) foi observado no hipocampo de ratos
nas primeiras horas de crises epilépticas induzidas pelo ácido quinolínico (Nicolaidis et
al., 2005).
Uma outra evidência de que o ATP esteja sendo liberado durante as crises
no presente estudo, advém de sua co-localização com o glutamato, que normalmente
é liberado em grandes quantidades durante as crises epilépticas em humanos e em
modelos experimentais de epilepsia (Smolders et al., 1997; Chapman, 2000). Estudos
in vitro mostraram que ratos propensos às crises audiogênicas liberam maiores
quantidades de ATP após estimulação das fibras colaterais de Schaffer (subcampo CA1
do hipocampo), em relação aos animais controles (Wieraszko et al., 1989).
Considerando essas evidências, o presente trabalho não descarta a hipótese
de que o ATP tenha sido liberado em grandes quantidades durante o estado de mal
epiléptico induzido por pilocarpina, e que a diferença não foi detectada pelo fato do
ATP ter sido rapidamente convertido em adenosina. Por ser um neurotransmissor de
ação rápida, o ATP pode ter ativado receptores P2 e disparado processos citotóxicos,
inflamatórios e degenerativos antes da ação das ectonucleotidases.
Os metabólitos ADP e AMP estão aumentados durante as crises e também
exercem funções no sistema nervoso central, que ainda não estão claramente
elucidadas. Há trabalhos mostrando que o ADP, através da ativação de receptores P2Y
52
em especializações pré ou pós-sinápticas, pode inibir a neurotransmissão
glutamatérgica no córtex cerebral (Luthardt et al., 2003) e hipocampo de ratos
(Rodrigues et al., 2005). Ativação de micróglia e liberação de citocinas, como a
interleucinas-1β, também são processos modulados pelo ADP e AMP (Honda et al.,
2001; Chakfe et al., 2002), sugerindo a participação de ambos os nucleotídeos na
ativação de processos inflamatórios no sistema nervoso. Deste modo, o aumento na
concentração extracelular de ADP e AMP, encontrado no presente estudo, pode
exercer um papel significativo nos processos inflamatórios e na modulação da
neurotransmissão glutamatérgica.
Ao contrário dos nucleotídeos, o aumento na concentração de adenosina
durante o estado de mal epiléptico pode ter uma ação anticonvulsivante e
neuroprotetora, como demonstrado por diversos autores (MacGregor et al., 1996;
Dunwiddie, 1999; Zuchora et al., 2001; Vianna et al., 2005). Os estudos têm mostrado
que a adenosina exerce seu efeito inibitório no sistema nervoso central, por ativar
receptor A1. A ativação desses receptores inibe a liberação de vários
neurotransmissores, incluindo o glutamato, acetilcolina, aspartato, noradrenalina e
dopamina (Fredhom et al., 1985; Palmer e Stiles, 1994;
Dunwiddie e Masino, 2001).
Funções como vasodilatação, inibição do influxo de íons cálcio, ativação de canais de
potássio, aumento da produção de energia através de transporte de glicose e ativação
de enzimas anti-oxidantes são algumas das funções desempenhadas pela adenosina
(Ramkumar et al., 1995).
O efeito inibitório da adenosina tem sido evidenciado em vários modelos
experimentais de epilepsia (Maitre et al., 1974; Dunwidde et al., 1982; Cavalheiro et
al., 1989; Berman et al., 1990; Vianna et al., 2005).
Vianna et al. (2005), por exemplo, demonstraram que a ativação de
receptor A1 promove neuroproteção, aumenta o limiar para o desencadeamento do
status epilepticus e reduz a mortalidade de ratos submetidos ao modelo da
pilocarpina. Os autores ainda verificaram que o receptor A2
A
apesar de não exercer
modulação sobre as crises como o A1, também induz neuroproteção, reduzindo o
número de células apoptóticas durante o status epilepticus. Deste modo, os autores
apontam a adenosina como um importante agente neuroprotetor e anticonvulsivante
endógeno no modelo da pilocarpina, estando de acordo com a maioria dos autores que
53
investiga o seu papel na epilepsia (Maitre et al., 1974; Dunwidde et al., 1982;
Cavalheiro et al., 1989; MacGregor et al., 1996; George et al., 1997).
Berman et al. (2000), empregando o método de microdiálise em diferentes
modelos experimentais de epilepsia, observaram um aumento da adenosina
extracelular e seus metabólitos no hipocampo de ratos com crises induzidas pelo
ácido caínico, bicuculina e pentilenotetrazol, e ressaltaram o importante papel
modulatório da adenosina durante as crises epilépticas, que corrobora com os nossos
achados no presente estudo.
Além da hidrólise do ATP no meio extracelular, o aumento na concentração
de adenosina durante o status epilepticus, pode ser proveniente de outras vias
ativadas durante as crises, ou ainda da redução da atividade da adenosina cinase.
Evidências de que a adenosina possa ser formada no meio intracelular
durante o estado de mal epiléptico são mostradas pelo aumento do metabolismo de
glicose e do fluxo sanguíneo cerebral (Fernandes et al., 1999; Scorza et al., 2002),
que reflete um aumento no consumo de ATP, com conseqüente formação de
adenosina. Estando aumentada no meio intracelular, a adenosina poderia estar sendo
liberada para o meio extracelular, por difusão facilitada (Thorn e Jarvis, 1996),
intensificando o mecanismo de contenção das crises.
Com relação a adenosina cinase, sabe-se que essa é uma enzima presente
no citosol, e que reduz a concentração de adenosina intracelular, por catalizar à
conversão deste nucleosídeo em AMP (Latini e Pedata, 2001). Uma redução na
expressão desta enzima tem sido evidenciada no hipocampo de camundongos após
indução de status epilepticus pelo ácido caínico, que segundo os autores pode
resultar em um aumento na concentração extracelular de adenosina, e por sua vez,
no controle das crises epilépticas (Gouder et al., 2004; Boison et al., 2005).
Ao contrário dos resultados obtidos na fase aguda, a análise dos perfusatos
colhidos durante o período interictal de ratos crônicos mostra uma redução de
aproximadamente 60% na concentração extracelular de ATP, ADP, AMP e adenosina,
em relação aos ratos controles de mesma idade (6-7 meses). Essa reduzida
concentração de ATP, no hipocampo epiléptico, pode ser decorrente de um
comprometimento no metabolismo celular.
São muitos os estudos realizados em animais experimentais (Scorza et al.,
1998; Dubé et al., 2000) e em pacientes com epilepsia do lobo temporal de difícil
54
controle (Engel et al. 1982; Guerreiro et al., 2000) que confirmam um distúrbio no
metabolismo de glicose, especialmente um hipometabolismo, presente, porém não
exclusivamente, no hipocampo esclerótico. Fatores como perda neuronal, redução do
fluxo sangüíneo e do transporte de glicose, e disfunção da atividade mitocondrial
(Kann et al., 2005), têm sido citados como possíveis causas desse hipometabolismo, e
a redução na atividade da ATPase Na
+
/K
+
ocorre como um reflexo dessas alterações
metabólicas (Rapport et al., 1975; Grisar et al., 1992; Anderson et al., 1994). Tal
comprometimento resulta em baixa produção de ATP, e conseqüentemente, pode
diminuir a sua liberação para o fluido extracelular.
Uma outra possibilidade para explicar essa redução na concentração de ATP
no hipocampo epiléptico, é que o ATP estaria sendo metabolizado no meio
extracelular, pela ação das ectonucleotidases. Vários autores têm demonstrado um
aumento na atividade de ecto-apirases e ecto-5’nucleotidase em sinaptossomas de
hipocampo e córtex de ratos submetidos ao modelo da pilocarpina ou ácido caínico,
indicando um aumento dos níveis de adenosina, a partir do metabolismo do ATP
extracelular, como um mecanismo compensatório inibitório (Bonan et al., 2000;
Vianna et al., 2005).
De acordo com essa hipótese, a concentração de adenosina deveria estar
elevada, o que não se evidencia no presente estudo. Ao contrário, a concentração de
adenosina está reduzida cerca de 60% em relação ao grupo controle, podendo facilitar
o desencadeamento e a progressão das crises epilépticas espontâneas e recorrentes.
Mediante esse fato, como então explicar o aumento na expressão das
ectonucleotidases, com uma redução de ATP, ADP e AMP, sem haver um aumento na
concentração extracelular de adenosina? Uma hipótese seria através do aumento na
captação de adenosina extracelular para o citosol.
Gouder et al. (2004) observaram um aumento na expressão de adenosina
cinase, principalmente em astrócitos, no hipocampo epiléptico de animais submetidos
ao ácido caínico. O aumento da atividade dessa enzima pode ocasionar uma redução
da adenosina citoplasmática e um aumento na captação de adenosina extracelular, no
sentido de promover a homeostase entre a adenosina citosólica e a extracelular.
Conforme proposto pelos autores o aumento na expressão de adenosina cinase no
hipocampo de ratos epilépticos pode ocasionar uma redução de adenosina
55
extracelular, facilitando o desenvolvimento e disparo de crises epilépticas, o que
corrobora com os nossos dados.
Além da baixa concentração de adenosina, alguns autores observaram uma
redução na densidade de receptor A1 no hipocampo de ratos submetidos ao ácido
caínico (Ekonomou et al., 2000) e ao abrasamento amigdaliano (Rebola et al., 2003),
e em tecido de pacientes com ELT (Glass et al., 1996), indicando um distúrbio na
atividade inibitória mediada pela adenosina, que pode contribuir para a
susceptibilidade as crise epiléticas.
No decorrer do experimento de microdiálise, três ratos crônicos
desencadearam crises espontâneas no momento das coletas, permitindo-nos a analisar
a concentração de purinas no período ictal. Observou-se um aumento significativo na
concentração de ATP (303%) e adenosina (230%), em relação ao período interictal,
indicando o envolvimento dessas purinas na atividade epileptiforme. Esse aumento
provavelmente esteja relacionado com as alterações metabólicas transitórias que
ocorrem durante as crises epilépticas, como hipermetabolismo, por exemplo.
As crises geralmente são acompanhadas de hipermetabolismo e liberação
de neurotransmissores, ambos os processos responsáveis pela liberação de ATP. O ATP
liberado em grandes quantidades pode ativar receptores P2X e intensificar a liberação
de glutamato, contribuindo para o processo de hiperexcitabilidade neuronal e disparo
de crises espontâneas e recorrentes. No entanto, observou-se um concomitante
aumento na concentração de adenosina, indicando que o ATP é rapidamente
hidrolisado, sendo esse processo importante para a contenção da crise. During e
Spencer (1992), também observaram um aumento dos níveis de adenosina no
hipocampo de pacientes epilépticos no período ictal, e sugeriram o envolvimento da
adenosina no controle da crise e na depressão pós-ictal.
O estudo da expressão dos receptores nos diferentes períodos do modelo,
pode nos auxiliar na interpretação dos dados, pois amplia as informações acerca das
alterações no sistema purinérgico durante o processo epileptogênico induzido pela
pilocarpina.
56
5.2 Receptores Purinérgicos: P2X
2
, P2X
4
e P2X
7
a) Receptores P2X
2
e P2X
4
O estudo imuno-histoquímico mostrou que o padrão de distribuição dos
receptores P2X
2
e P2X
4
na formação hipocampal é similar ao descrito por outros
autores (Rubio et al., 2001; Kang et al., 2003). Observou-se uma marcação positiva na
camada de células piramidais (soma e dendritos) e na camada de células granulares
do giro denteado nos diferentes períodos após a aplicação de pilocarpina ou salina
(G12H, GLat, GCro e GCt).
De acordo com as análises qualitativas e semi-quantitativas não se observou
alteração significativa na expressão/densidade de receptores P2X
2
e P2X
4
na formação
hipocampal de ratos sacrificados durante os períodos agudo e latente do modelo,
quando comparado ao grupo controle. Entretanto, na fase crônica houve uma intensa
redução de marcação dos receptores P2X
4
na camada de células piramidais do
hipocampo e hilo do giro denteado, que foi confirmada por imunoblot. Em relação aos
P2X
2
, não se observou alterações significativas, na fase crônica, apenas uma discreta
redução na expressão nos subcampos CA1 e CA3 do hipocampo.
Os receptores P2X
2
e P2X
4
pertencem a um grupo de receptores que são
ativados predominantemente pelo ATP, e quando ativados, promovem despolarização
neuronal devido à alta permeabilidade aos Na
+
e Ca
2+
(North e Verkhratsky, 2006). De
acordo com Rubio et al. (2001), esses receptores no hipocampo estão localizados
preferencialmente em especializações pós-sinápticas de neurônios glutamatérgicos,
podendo agir em sinergia com os receptores AMPA, e modular as sinapses
glutamatérgicas. Pouco se conhece do papel desses receptores em patologias que
acometem o sistema nervoso central.
O status epilepticus induzido por altas doses de pilocarpina (modelo
experimental de ELT) promove mudanças significativas na formação hipocampal,
devido ao aumento na liberação de glutamato (Smolders et al., 1997; Cavalheiro et
al., 1994). O glutamato, em altas concentrações, ativa cascatas excitotóxicas
induzindo desequilíbrio da homeostase celular e morte neuronal (Fountain, 2000;
DeLorenzo et al., 2006). Os subcampos CA1 e CA3 do hipocampo e hilo do giro
57
denteado são altamente vulneráveis a esse processo excitotóxico (Babb et al., 1984;
de Lanerolle et al., 1989).
O presente estudo não evidenciou alterações na expressão dos receptores
P2X
2
e P2X
4
durante o status epilepticus, assim como, no período latente, indicando
que esses receptores talvez não participem de processos de morte neuronal e
neuroplasticidade, os quais estão associados com o aparecimento das crises
espontâneas, em fases mais tardias. No entanto, a redução na densidade de
receptores P2X
4
na fase crônica do modelo, período em que os animais apresentam
crises espontâneas e recorrentes, pode estar refletindo perda neuronal ou integrar o
quadro de processos envolvidos com hiperexcitabilidade presente no hipocampo
epiléptico.
Alguns trabalhos têm revelado um aumento na expressão de receptores
P2X
2
e P2X
4
em processos patológicos, que diferem dos nossos resultados. Por
exemplo, os estudos de Cavaliere et al. (2003) empregando o modelo de
anóxia/isquemia (in vitro e in vivo) demonstram que, após vinte horas da indução do
quadro isquêmico, os danos hipocampais são acompanhados por um aumento na
expressão de receptores P2X
2
e P2X
4
. Através de análise imuno-histoquímica com
dupla marcação, os autores mostram a co-localizacão de receptores P2X
4
com
marcadores específicos de célula microglial, indicando o envolvimento desses
receptores com processos inflamatórios (liberação de citocinas). Utilizando o mesmo
modelo, os autores administraram antagonistas não seletivos de receptores P2X, como
o suramin, e observaram neuroproteção hipocampal acompanhada de uma expressão
normal dos receptores P2X
2
e P2X
4
, sugerindo a participação desses receptores
purinérgicos em processos inflamatórios e de morte neuronal após a privação de
oxigênio/glicose.
Além do envolvimento com processos de morte neuronal, os receptores P2X
parecem participar de processos de plasticidade neuronal, incluindo regeneração e
proliferação celular. D’Ambrosi et al. (2001), investigando a atividade de receptores
P2 em neurite e processos regenerativos (in vitro) observaram, por imunoblot e
imuno-histoquímica, um aumento na expressão de receptores P2X
2
,
P2X
3
,
P2X
4
e P2Y
2
após o tratamento com ATP e de fatores de crescimento neuronal. Esses autores
atribuíram ao ATP, funções tróficas de reparação e regeneração neuronal, mediadas
pela a ativação de receptores P2.
58
Corroborando com esses achados, Florenzano et al. (2002) utilizando o
modelo experimental de axotomia por hemicerebelotomia em ratos, observaram por
imunoblot e imuno-histoquímica um aumento na expressão de receptores P2X
1
e P2X
2
em neurônios pré-cerebelares como, por exemplo, nos núcleos pontino e olivar
inferior, ipsilateral a lesão, após 15 a 35 dias do insulto. Os autores observaram que o
aumento na expressão de receptores P2X
1
e P2X
2
foi acompanhado da ausência de
processos degenerativos, sugerindo a participação desses receptores com processos de
regeneração neuronal.
Essa discrepância entre os achados de Cavaliere, D’Ambrosi e Florenzano
com os do presente estudo, provavelmente esteja relacionada ao fato de empregarem
diferentes modelos lesionais. Esses achados nos levam a questionar quais seriam os
fatores ativados durante os diferentes processos patogênicos que poderiam modular a
expressão e a função dos receptores purinérgicos no sistema nervoso central e
periférico.
A primeira idéia que surge, diante da redução dos receptores P2X no
hipocampo epiléptico de ratos submetidos ao modelo da pilocarpina, é que tal
redução seria decorrente da perda celular presente nesta região. Entretanto, a
redução da marcação em áreas não vulneráveis ao dano celular como, por exemplo,
no subcampo CA2 e camada de células granulares, sugere que a redução da marcação
não esteja apenas relacionada com perda celular, mas pode refletir uma mudança
funcional dos neurônios remanescentes ao insulto inicial.
Kang et al. (2003), empregando imuno-histoquímica e hibridização in situ,
mostraram uma redução na expressão de receptores P2X
4
, bem como dos P2X
2
no
hipocampo de gerbilos Mongolianos. Esses animais são propensos a apresentarem
crises epilépticas e exibem anormalidades no sistema GABAérgico. Os autores
demonstraram uma modulação entre o sistema GABAérgico e purinérgico, quando
usaram agonista e antagonista de receptores GABA
A
, e observaram um aumento e uma
redução, respectivamente, na densidade de receptores P2X
2
e P2X
4
no hipocampo de
gerbilos. Daí a hipótese de que uma redução na atividade inibitória mediada pelo
GABA pode causar redução na expressão de receptores P2X
2
e P2X
4
como forma
compensatória, uma vez que esses receptores exercem atividades excitatórias.
Contrariamente, um aumento na ativação de receptores GABA
A
pode levar ao aumento
na expressão de receptores P2X
2
e P2X
4
para elevar a excitação, e assim, evitar a
59
hiperinibição ou dessensibilização dos receptores GABA
A
. Com esses resultados, os
autores concluem que a modulação da expressão de receptores P2X
2
e P2X
4
mediada
pelos receptores GABA
A
pode ter um papel significativo no controle da excitabilidade
neuronal. Mediante esses achados, podemos inferir que um distúrbio na
neurotransmissão GABAérgica poderia contribuir para a redução na marcação de
receptores P2X
4
nos ratos epilépticos.
Distúrbios na neurotransmissão inibitória mediada pelo GABA têm sido
evidenciados em diferentes modelos experimentais e na ELT humana, através de
estudos histológicos, neuroquímicos e eletrofisiológicos. Os trabalhos mais recentes
mostram que essas alterações não se limitam apenas à perda de estímulo para os
interneurônios GABAérgicos, como proposto na teoria de Sloviter (1991), também
conhecida como teoria das células em cesto “dormentes”, mas apontam para
alterações moleculares e funcionais dos receptores GABAérgicos no tecido epiléptico
(Dalby et al., 2001; Cossart et al., 2005; Ben Ari et al., 2005).
Alguns autores têm observado um aumento na expressão de diferentes
subunidades α1, α2, α3, α4, α5, β2, β3 e γ2 que compõem os receptores GABA
A
em
células granulares do giro denteado de pacientes com ELT e em modelos
experimentais. Essas alterações estão associadas com aumento da freqüência e
amplitude de potenciais inibitórios pós-sinápticos, da sensibilidade ao zinco e
mudança na modulação alostérica de receptores GABA
A
como, por exemplo, a baixa
afinidade aos benzodiazepínicos (Gibbs et al., 1997; Leroy et al., 2004) Populações
distintas de células granulares do giro denteado e de outras regiões como CA1 e hilo,
podem exibir diferentes subunidades de receptores GABA
A
, mostrando que a
composição desses receptores difere entre as sub-regiões da formação hipocampal. A
implicação funcional dessas mudanças é tema de constante investigação, mas em
linhas gerais, estas parecem prejudicar a inibição GABAérgica e favorecer a condição
de hiperexcitabilidade presente no tecido epiléptico (Dalby e Mody, 2001).
Considerando uma modulação direta do receptor GABA
A
na expressão de
receptores P2X
2
e P2X
4
, podemos sugerir que a redução na expressão de receptores
P2X
4
na formação hipocampal de ratos epilépticos, principalmente em especializações
pós-sinápticas de neurônios glutamatérgicos, pode também representar uma resposta
compensatória frente à reduzida inibição GABAérgica. Menor densidade de receptor
P2X pode se traduzir em menor resposta excitatória via ATP. Além da modulação dos
60
receptores P2X
4
pelo GABA, não se pode excluir a possibilidade de modulação por
outros fatores, inclusive pelo próprio ATP, mas estes necessitam de estudos futuros.
Já a redução na expressão dos receptores P2X
2
evidenciada
por imuno-histoquímica
na
fase crônica do modelo, por limitar-se nos subcampos CA1 e CA3 do hipocampo e não
ser significativa na análise semi-quantitativa, sugere-se que essa seja decorrente do
processo degenerativo e não da modulação GABAérgica.
b) Receptor P2X
7
Diferentemente do observado para os receptores P2X
2
e P2X
4,
o estudo
imuno-histoquímico revelou mudanças significativas na marcação de receptor P2X
7
na
formação hipocampal, quanto ao fenótipo celular (neurônios e glias), localização
(corpo celular, dendritos e terminais pré-sinápticos) e intensidade, durante as
diferentes fases do modelo: aguda, latente e crônica. Essas alterações sugerem
funções distintas para esses receptores na fisiopatologia da ELT induzida por
pilocarpina.
Estudos recentes têm revelado a presença de receptores P2X
7
em terminais
excitatórios de CA1, CA3 e giro denteado (Sperlágh et al., 2002), terminais de fibras
musgosas (Atkinson et al., 2002), no soma de células piramidais e interneurônios de
CA1 (Kang et al., 2001), intranuclear (Atkinson et al., 2002), e em células glias (Collo
et al., 1997; Duan et al., 2003; Franke et al., 2004). Entretanto, a função desses
receptores na formação hipocampal, principalmente em condições patológicas, ainda
não foi completamente compreendida.
Na fase aguda do modelo da pilocarpina, o estudo imuno-histoquímico
mostrou um padrão de marcação dos receptores P2X
7
, destacando-se a presença em
células piramidais de CA1, difusa marcação puncta em CA3 e em glias, que não foi
evidenciado nos animais controles. A análise semi-quantitativa revelou um aumento
na densidade desses receptores na formação hipocampal no mesmo período, em
relação ao grupo controle. Esses achados apontam para o envolvimento de receptores
P2X
7
nos processos patogênicos manifestados durante o estado de mal epiléptico
induzido por pilocarpina, período em que o metabolismo de ATP também se encontra
aumentado.
61
Os receptores P2X
7
, quando ativados em altas concentrações de ATP, além
de promover despolarização neuronal e influxo de íon cálcio na célula, formam poros
de 900 Da na membrana citoplasmática (Surprenant et al., 1996), ocasionando um
desequilíbrio na homeostase celular pela perda de conteúdo citoplasmático, sendo
esses processos associados com citotoxicidade e apoptose (Ferrari et al., 1997; Ferrari
et al., 1999; Wang et al., 2004). Esses receptores aumentados na fase aguda do
modelo da pilocarpina, principalmente em região de células piramidais de CA1 e CA3,
indica a participação desses receptores na vulnerabilidade dessas células ao processo
de excitotoxicidade durante estado de mal epiléptico.
A presença de receptores P2X
7
em células gliais, com características de
astrócitos e micróglias, também sugere uma relação positiva entre esses receptores e
processos inflamatórios na fase aguda do modelo experimental. Esses dados
corroboram com os estudos realizados no modelo experimental de ELT induzido pelo
ácido caínico, que evidenciaram por dupla marcação, um aumento na expressão
desses receptores em micróglias ativadas no hipocampo de ratos após 6 e 24 horas da
indução do status epilepticus (Rappold et al., 2006). Um aumento na
imunorreatividade de receptores P2X
7
em micróglias também foi observado na região
de penumbra após isquemia cerebral em roedores (Collo et al., 1997; Franke et al.,
2004), e em espécime de medula espinhal de pacientes (pós-morten) com esclerose
múltipla e esclerose lateral amiotrófica (Yango-Yangou et al., 2006).
A ativação de receptores P2X
7
na micróglia tem sido associada com
inúmeros processos relacionados com respostas inflamatórias no sistema nervoso
central (Le Feuvre et al., 2002), incluindo a produção e liberação de citocinas,
especialmente da interleucina- 1β e interleucina-18 (Mehta et al 2001), TNF-α (Hide
et al., 2000), NF-κβ (Ferrari et al., 1997), além de ativação da oxido nítrico sintetase,
formação de radicais livres e de fatores de transcrição pró-apoptóticos, e liberação
plasminogênio (Ferrari et al., 1997; Inoue et al., 1998; Le Feuvre et al., 2002). Muitos
desses fatores têm sido citados como causadores de processos degenerativos no
sistema nervoso central (Le Feuvre et al., 2002; Brough et al., 2002).
Além disso, tem sido demonstrado que a ativação de receptores P2X
7
em
astrócitos pode facilitar a liberação de glutamato e ATP (Fellin et al., 2006), e é
considerado um fator importante na comunicação intercelular, especialmente entre
astrócito-micróglia (Verderio et al., 2001) e na ativação de proteínas cinases ativadas
62
por mitógenos (MAP cinases), e produção de mediadores inflamatórios (Panenka et
al., 2001).
As micróglias e os astrócitos são as primeiras células a produzirem
mediadores inflamatórios durante crises epilépticas, e representam a maior fonte de
moléculas pró-inflamatórias no cérebro (Vezzani, 2005).
A intensa marcação de receptores P2X
7
em células gliais, principalmente no
período agudo, com poucas células marcadas no período latente, indica a participação
desses receptores na liberação de citocinas pró-inflamatórias pelas micróglias e
astrócitos ativados durante o insulto. Vários autores empregando modelos
experimentais de epilepsia têm mostrado um aumento na liberação de citocinas após
a indução do estado de mal epiléptico, principalmente da interleucina 1β, fator de
necrose tumoral-α e interleucina-6, que quando liberado em excesso podem
intensificar o quadro epiléptico e promover dano neuronal (Vezzani et al., 2002;
Voutsinos-Porche et al., 2004; Vezzani et al., 2005).
Uma outra evidência que atesta o papel citotóxico dos receptores P2X
7
é
obtida através do trabalho de Wang et al. (2004) que, ao administrarem tratamentos
prévios com antagonistas desses receptores (OxATP ou PPADS) a ratos submetidos à
lesão traumática de medula espinhal, mostram uma redução do número de células
apoptóticas pelo método de túnel, redução de caspase 3 e uma melhora considerável
na recuperação da função motora após o trauma. Com base nesses achados, é possível
sugerir que a regulação da atividade desses receptores durante o status epilepticus
induzido por pilocarpina, pode representar uma oportunidade terapêutica importante.
Analisando a expressão desses receptores após sete dias do insulto (período
latente) foi possível observar normalização na densidade, ausência de marcação em
células piramidais de CA1 e uma marcação residual em células gliais, tendo essas
contribuído para o processo inflamatório agudo. Entretanto, no período latente,
parece que os receptores P2X
7
, assim como os P2X
2
e P2X
4
talvez não estejam
diretamente envolvidos com os processos de neuroplasticidade desencadeados
durante esse período, que inclui modificações moleculares, bioquímicas, neurogênese
e reorganização axonal e dendrítica (Cavalheiro et al., 1994; Parent et al., 1997;
Bonan et al., 2000; Raza et al., 2004; Boison et al., 2005). Muitas dessas alterações
têm sido associadas com o aparecimento de crises espontâneas e recorrentes.
63
Na fase crônica do modelo, a análise semi-quantitativa revelou um
aumento na densidade de receptores P2X
7
na formação hipocampal, lembrando-se
que o ATP e seus metabólitos ADP, AMP e adenosina encontram-se reduzidos. O
estudo imuno-histoquímico mostrou que esses receptores estão localizados
predominantemente em terminais de fibras musgosas no estrato lúcido de CA3, hilo e
na região supragranular do giro denteado, e não em glias. Esses achados podem
sugerir uma função ao receptor P2X
7
na facilitação da liberação de glutamato, no
aumento de cálcio intracelular e, conseqüentemente, na hiperexcitabilidade do
hipocampo de ratos epilépticos.
Sperlágh et al. (2002) demonstraram in vitro que a ativação de receptores
P2X
7
em terminais glutamatérgicos no hipocampo de ratos controles facilita a
liberação de glutamato. Assim, o aumento na expressão desses receptores no estrato
lúcido de CA3 e no giro denteado de ratos epilépticos pode contribuir para a liberação
de glutamato. Vários estudos neuroquímicos e moleculares têm confirmado o aumento
na neurotransmissão glutamatérgica no hipocampo epiléptico, inclusive no modelo da
pilocarpina (Cavalheiro et al.,1994), provavelmente associado com o aumento da
susceptibilidade às crises epilépticas (de Lanarolle e Lee, 2005).
A ativação de receptores P2X
7
também pode contribuir para o aumento na
concentração de íon cálcio na célula. Trabalhos prévios realizados em nosso
laboratório (Vianna
et al., 2002) demonstraram, por fluorimetria e Fura-2, um
aumento na concentração intracelular de íons cálcio em fatias de hipocampo de ratos
epilépticos após estimulação com o ATP. Ao estimularem essas fatias, os autores
observaram uma resposta bifásica, marcada por um aumento seguido de uma queda
brusca da fluorescência, tendo sido sugerida a presença de receptores P2X
7
. Esse
receptor é o único capaz de abrir poros de 900 Da quando ativado pelo ATP, o que
seria suficiente para permitir a perda do marcador fluorescente do meio intracelular.
Nesse trabalho, os autores também constataram, por imuno-histoquímica e
imunoblot, um aumento na expressão de receptores P2X
7
na formação hipocampal de
ratos epilépticos, sendo consistente com os nossos dados.
Levando em consideração esses achados, além de hiperexcitabilidade
neuronal (aumento na liberação de glutamato e na concentração intracelular de íons
cálcio), a marcação de receptores P2X
7
na região supragranular do giro denteado,
64
coincidindo com o local de brotamento de fibras musgosas, sugere o envolvimento
desses receptores com a epileptogênese.
Há dados conflitantes sobre o papel do brotamento de fibras musgosas na
epilepsia (Sloviter et al., 1991; Mello et al., 2002; Harvey e Sloviter, 2005; Mello et
al., 2005). Entretanto, apesar dessas controvérsias, os nossos resultados sugerem uma
correlação positiva entre o brotamento de fibras musgosas e epilepsia, uma vez que
revela a presença de receptores P2X
7
, e esses desempenham um importante papel na
modulação da excitabilidade neuronal.
5.2 Considerações Gerais
Para resumir, o presente estudo mostrou alterações importantes no
metabolismo das purinas nas fases aguda e crônica do modelo experimental. A alta
taxa de metabolização do ATP durante o estado de mal epiléptico indica que ao ser
liberado o ATP é rapidamente hidrolisado, podendo, antes disso, ser responsável pela
ativação de processos citotóxicos e inflamatórios ao ativar receptores P2X
7
, os quais
estão aumentados neste período. Esta rápida degradação aumenta a formação de
adenosina, considerada um importante agente neuroprotetor e anticonvulsivante
endógeno. Os receptores P2X
2
e P2X
4
parecem não participar desses processos.
Na fase crônica do modelo a redução na concentração de ATP, ADP, AMP e
adenosina, no período interictal, pode estar refletindo um importante distúrbio no
metabolismo das purinas, que possivelmente seja decorrente do hipometabolismo
celular, perda neuronal e redução na atividade da adenosina cinase.
A baixa concentração de adenosina observada nesse período indica uma
redução na sua atividade inibitória, que pode favorecer a susceptibilidade às crises
epilépticas. Em contraste, o ATP mesmo em baixas concentrações pode ativar os
receptores P2X
7
(Adinolfi et al., 2005), os quais estão aumentados nesse período,
promovendo despolarização, e assim, contribuindo para o processo de
hiperexcitabilidade. Os receptores P2X
2
e P2X
4
não estão relacionados com esse
processo. Ao contrário, a redução dos P2X
4
parece ser decorrente da perda neuronal
65
e/ou da modulação GABAérgica, como um mecanismo compensatório para reduzir a
excitabilidade.
Quanto à análise das purinas no período ictal observou-se um aumento nas
concentrações de ATP e adenosina, que provavelmente esteja relacionado com o
aumento do metabolismo celular e da liberação de neurotransmissores como, por
exemplo, do glutamato. Esse aumento na concentração das purinas sugere o
envolvimento dessas com a atividade epileptiforme, sendo que o ATP, nesse caso,
pode estar intensificando o disparo das crises, e ao mesmo tempo, por ser
rapidamente convertido em adenosina, pode colaborar para o bloqueio das mesmas,
uma vez que a adenosina exerce um potente efeito inibitório. O aumento na
concentração de adenosina durante as crises também pode contribuir para a
depressão pós-ictal (During e Spencer, 1992).
O potencial anticonvulsivante da adenosina faz dela um alvo terapêutico
importante no tratamento das epilepsias. No entanto, o fato de promover efeitos
periféricos indesejáveis como hipotensão, bradicardia e depressão motora (Dunwiddie
e Worth 1982; Philips e Wu et al., 1983), seu uso tem se limitado a estudos
experimentais. O desenvolvimento de intervenções terapêuticas que facilitem a
liberação de adenosina diretamente no foco epiléptico, por exemplo, pela
implantação de células desprovidas de adenosina cinase, pode representar uma
possibilidade no controle das crises, sem os efeitos colaterais periféricos promovidos
pela aplicação sistêmica de adenosina ou análogos (James et al., 1999; Kowaluk et
al., 2000; Bheemarao et al., 2000; Gouder et al., 2004; Boison et al., 2005).
O presente estudo fortalece a linha de investigação sobre a participação do
sistema purinérgico na epilepsia do lobo temporal desenvolvida pelo nosso grupo, no
Laboratório de Neurobiologia das Epilepsias da Unifesp (Vianna et al., 2002; Vianna et
al., 2005) e ressalta a importância desse sistema na modulação do sistema nervoso
central. Uma única via, pode gerar moléculas com ação pró ou anticonvulsivantes,
podendo ser pró ou anti-apoptóticas e pró ou antiinflamatórias, assim, a sinalização
que favorece uma ou outra ação necessita de melhores esclarecimentos para que
possa auxiliar no avanço do conhecimento do processo epileptogênico na epilepsia do
lobo temporal.
66
Com base nos resultados obtidos conclui-se que:
1- O status epilepticus induzido pela pilocarpina causa aumento no
metabolismo das purinas, detectado por um aumento na concentração de ADP, AMP e
adenosina, talvez como um mecanismo compensatório.
2- O aumento na densidade do receptor P2X
7
no G12H, em neurônios e
células com características gliais, indica sua participação em processos excitotóxicos,
inflamatórios e degenerativos desencadeados durante o insulto.
3- Os receptores P2X
2
e P2X
4
parecem não estar diretamente envolvidos
com os processos patogênicos desencadeados nas fases aguda e latente do modelo. A
redução dos receptores P2X
4
na fase crônica pode ser decorrente da perda neuronal
ou ser parte de mecanismo compensatório frente à hiperexcitabilidade e ao
comprometimento da atividade inibitória.
4- A redução na concentração extracelular de ATP, ADP, AMP e adenosina
na fase crônica, pode estar refletindo um distúrbio metabólico permanente no
cérebro epiléptico, contribuindo para a facilitação da ocorrência de crises
espontâneas, pela queda na produção de adenosina.
5- O aumento na concentração de ATP e adenosina durante crises
espontâneas pode representar aumento na liberação de glutamato pelas fibras
musgosas e ativação de mecanismo inibitório compensatório, respectivamente.
6- O aumento na expressão de receptores P2X
7
nos terminais de fibras
musgosas em CA3 e no giro denteado indica a participação do ATP em processos
envolvendo aumento de cálcio intracelular, hiperexcitabilidade neuronal e
epileptogênese.
67
Abbrancchio MP, Burnstock G. Purinoceptors: Are there families of P2X and P2Y
Purinoceptors? Pharmac Ther. 1994;64:445-475.
Adinolfi E, Pizzirani C, Idzko M, Panther E, Norgauer J, Di Virgilio F, Ferrari D. P2X
7
receptor:
Death or life? Purinergic Signalling 2005;1:219-227.
Amadio S, D’Ambrosi N, Cavaliere F, Murra B, Sancesario G, Bernardi G et al. P2 receptor
modulation and cytotoxic function in cultured CNS neurons. Neuropharmacology 2002;42:489-
501.
Andersen P, Bliss TV, Lomo T, Olsen LI, Skrede KK. Lamellar organization of hippocampal
excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 1969;76(1):4A-5A.
Anderson WR, Franck JE, Stahl WL, Maki AA. Na,K-ATPase is decreased in hippocampus of
kainate-lesioned rats. Epilepsy Res. 1994;17(3):221-231.
Arida RM, Scorza FA, Peres CA, Cavalheiro EA. The course of untreated seizures in the
pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 1999; 34(2-3):99-107.
Atkinson L, Batten TFC, Moores TS, Varoqui H, Erickson JD, Deuchars J. Differntial co-
localisation of the P2X7 receptor subunit wlth vesicular glutamate transporters VGLUT1 and
VGLUT2 in rat CNS. Neuroscience 2004;123:761-768.
Atkinson L, Milligan CJ, Buckley NJ, Deuchars J. An ATP-gated ion channel at the cell nucleus.
Natures 2002;420:2.
Ault B, Wang CM. Adenosine inhibits epileptiform activity arising in hippocampal area CA3. Br
J Pharmacol. 1986;87:695-703.
Babb TL, Kupfer WR, Pretorius JK, Crandall PH, Levesque MF. Synaptic reorganization by
mossy fibers in human epileptic fascia dentata. Neuroscience 1991;42(2):351-63.
Babb TL, Lieb JP, Brown WJ, Pretorius J, Crandall PH. Distribution of pyramidal cell density
and hyperexcitability in the epileptic human hippocampal formation. Epilepsia
1984;25(6):721-8.
Ballarin M, Fredholm BB, Ambrosio S, Mahy N. Extracellular levels of adenosine and its
metabolites in the striatum of awake rats: inhibition of uptake and metabolism. Acta Physiol
Scand 1991;142:97-103.
Ben-Ari Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid: mechanisms and
relevance to human temporal lobe epilepsy. Neuroscience 1985;14(2):375-403.
Berman R, Fredholm BB, Aden U, O’Connor WT. Evidence for increased dorsal hippocampal
adenosine release and metabolism during pharmacologically induced seizures in rats. Brain
Research 2000;872:44-53.
Berman RF, Jarvis MF, Lupica CR. Adenosine involvement in Kindling seizures, in: Wada JA.
(ed), Kindling 4, New York Plenum, 1990;p423-440.
Bernard C, Esclapez M, Hirsch JC, Ben Ari Y. Interneurones are not so dormant in temporal
lobe epilepsy: a critical reappraisal of the dormant basket cell hypothesis. Epilepsy Res
1998;32:93-103.
68
Bernasconi N, Natsume J, Bernasconi A. Progression in temporal lobe epilepsy: differential
atrophy in mesial temporal structures. Neurology 2005;65(2):223-8.
Blum D, Gall D, Galas MC, d’Alcantara P, Bantubungi K,Schiffman SN. The adenosine A1
receptor agonist adenosine amine congener exerts a neuroprotective effect against the
development of striatal lesions and motor impairments in the 3-nitropropionic acid model of
neurotoxicity. J Neurosci. 2002;22:9122-9133.
Blumcke I, Zuschratter W, Schewe JC, Suter B, Lie AA, Riederer BM, et al. Cellular pathology
of hilar neurons in Ammon's horn sclerosis. J Comp Neurol. 1999;414(4):437-53.
Bo X, Zhang Y, Nassar M, Burnstock G, Schoepfer R. A P2X purinoceptor cDNA conferring a
novel pharmacological profile. FEBS Lett, 1995;375:129-133.
Bodin P, Burnstock G. Purinergic Signalling: ATP release. Neurochemical Research 2001;26(8-
9):959-969.
Boison D. Adenosine and Epilepsy: from therapeutic rationale to new therapeutic strategies.
The Neuroscientist 2005;11(1):25-35.
Bonan CD, Walz R, Pereira GS, Worm PV, Battastini AMO, Cavalheiro EA, et al. Changes in
synaptosomal ectonucleotidase activities in two rat models of temporal lobe epilepsy.
Epilepsy Res. 2000;39:229-238.
Bou-Khalil B, Andermann E, Andermann F, Olivier A, Quesney LF. Temporal lobe epilepsy after
prolonged febrile convulsions: excellent outcome after surgical treatment. Epilepsia
1993;34(5):878-83.
Brough D, Le Feuvre AL, Iwakura Y, Rothwell AJ. Purinergic (P2X7) receptor activation of
microglial induces cell death via an interleukin-1-independent mechanism. Molecular and
Cellular Neuroscience 2002;19:272-280.
Brundege JM, Dunwiddie TV. Role of adenosine as a modulator of synaptic activity in the
central nervous system. Advances in Pharmacology 1997;39:353-391.
Buckmaster PS, Dudek FE. Neuron loss, granule cell axon reorganization, and functional
changes in the dentate gyrus of epileptic kainate-treated rats. J Comp Neurol 1997;385:385-
404.
Buckmaster PS, Wenzel HJ, Kunkel DD, Schwartzkroin PA. Axon arbors and synaptic
connections of hippocampal mossy cells in the rat in vivo. J Comp Neurol. 1996;366:271-292.
Burnstock G, Campbell G, Satchell D, Smythe A. Evidence that adenosine triphosphate or a
related nucleotide is the transmitter substance released by non-adrenergic inhibitory nerves
in the gut. Br J Pharmacol. 1970;40:668-688.
Burnstock G, Kennedy C. Is there a basis for distinguishing two types of P2-purinoceptor? Gen
Pharmacol. 1985;16:433-440.
Burnstock G, Williams M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic
potential. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutic 2000;295(3):862-869.
Burnstock G. Cotransmission. Current Opinion in Pharmacology 2004;4:47-52.
69
Burnstock G. Historical review: ATP as a neurotransmitter. Trends in Pharmacological
Sciences 2006;27(3)166-175.
Carswell HV, Graham DI, Stone TW. Kainate-evoked release of adenosine from the
hippocampus of the anaesthetised Rat: possible involvement of free radicals. J Neurochem.
1997;68:240-247.
Cavalheiro EA, Calderazzo LS, Bortolotto ZA, Mello L, Turski L. Anticonvulsivant role of
adenosine. J Pharmacol Pharm. 1987;39:537-544.
Cavalheiro EA, Fernandes MJ, Turski L, Naffah-Mazzacoratti MG. Spontaneous recurrent
seizures in rats: amino acid and monoamine determination in the hippocampus. Epilepsia
1994;35(1):1-11.
Cavalheiro EA, Leite JP, Bortolotto ZA, Turski WA, Ikonomidou C, Turski L. Long-term effects
of pilocarpine in rats: structural damage of the brain triggers kindling and spontaneous
recurrent seizures. Epilepsia 1991;32(6):778-82.
Cavalheiro EA. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 1995;16(1-2):33-7.
Cavaliere F, D’Ambrosi N, Ciotti MT, Mancino G, Sancesario G, Bernardi G, et al. Glucose
deprivation and chemical hypoxia: neurprotection by P2 receptor antagonists. Neurochemistry
international 2001;38:189-197.
Cavaliere F, Dinkel K, Reymann K. Microglia response and P2 receptor participation in
oxygen/glucose deprivation-induced cortical damage. Neuroscience 2005;136:615-623.
Cavaliere F, Florenzano F, Amadio S, Fusco FR, Viscomi MT, D’Ambrosi N. et al. Up-regulation
of P2X
2
and P2X
4
receptor and ischemic cell death: prevention by P2 antagonists.
Neuroscience 2003;120:85-98.
Cendes F, Andermann F, Dubeau F, Gloor P, Evans A, Jones-Gotman M, et al. Early childhood
prolonged febrile convulsions, atrophy and sclerosis of mesial structures, and temporal lobe
epilepsy: an MRI volumetric study. Neurology 1993;43(6):1083-7.
Cendes F, Kobayashi E. Epilepsia de Lobo Temporal. Epilepsia. 2 ed. São Paulo: Lemos
Editorial; 2000. p. 201-13.
Chakfe Y, Seguin R, Antel JP, Morissette C, Malo D, Henderson D, et al. ADP and AMP induce
interleukin-1β release from microglial cells through activation of ATP-primed P2X
7
receptor
channels. The Journal of Neuroscience 2002;22(8):3061-3069.
Chambers JK, Macdonald LE, Sarau HM, Ames RS, Freeman K, Foley JJ, et al. A G protein-
coupled receptor for UDP-glucose. J Biol Chem. 2000;275:10767-10771.
Chapman AG. Glutamate and Epilepsy. J Nutr. 2000;130:1043s-1045s.
Chu NS. Caffeine and aminophylline induced seizures. Epilepsia 1981;22:85-94.
Clifford DB, Olney JW, Maniotis A, Collins RC, Zorumski CF. The functional anatomy and
pathology of lithium-pilocarpine and high-dose pilocarpine seizures. Neuroscience
1987;23(3):953-68.
Cohen I, Navarro V, Clemenceau S, Baulac M, Miles R. On the origin of interictal activity in
human temporal lobe epilepsy in vitro. Science 2002;15(298):1418-21.
70
Collo G, Neidhart S, Kawashima E, Kosco-Vilbois M, North RA, Buell G. Tissue distribuition of
the P2X
7
receptor. Neuropharmacology 1997;36:1277-1283.
Communi D, Suarez Gonzalez N, Detheux M, Brezillon S, Lannoy V, Parmentier M, Boeynaems,
JM. Identification of a novel human ADP receptor coupled to G
i
. J Biol Chem. 2001;276:41479-
41485.
Cossart R, Bernard C, Ben-Ari Y. Multiple facets of GABAergic neurons and synapses: multiple
fates of GABA signalling in epilepsies. Trends in Neurosciences 2005;28(2):109113.
Cunha RA, Johanson B, Ploeg I, Sebastião AM, Ribeiro JA, Fredholm BB. Evidence for
functionally important adenosine A2
A
receptorss in the rat hippocampus. Brain Research
1994;649:208-216.
Cunha RA. Vizi ES, Ribeiro JA, Sebastião AM. Preferential release of ATP and its extracellular
catabolism as source of adenosine upon high- but not low-frequency stimulation of rat
hippocampal slices. Journal of Neurochemistry 1996;67:2180-2187.
Cunha RA. Adenosine as a neuromodulator and as a homeostatic regulator in the nervous
system: diferent roles, diferent sources and diferent receptors. Neurochemistry International
2001;38: 107-125.
D’Ambrosi N, Murra B, Cavaliere F, Amadio S, Bernardi G, Burnstock G et al. Interaction
between ATP and nerve growth factor signalling in the survival and neuritic outgrowth from
PC12 cells. Neuroscience 2001;108(3):527-534.
Dalby NO, Mody I. The process of epileptogenesis: a pathophysiological approach. Curr Opin
Neurol. 2001;14:187-192.
de Lanerolle NC, Kim JH, Robbins RJ, Spencer DD. Hippocampal interneuron loss and
plasticity in human temporal lobe epilepsy. Brain Res. 1989;495(2):387-95.
de Lanerolle NC, Lee TS. New facets of the neuropathology and molecular profile of human
temporal lobe epilepsy. Epilepsy Behav. 2005;7(2):190-203.
DeLorenzo RJ, Sun DA, Deshpande LS. Cellular mechanisms underlying acquired epilepsy: the
calcium hypothesis of the induction and maintainance of epilepsy. Pharmacol Ther.
2005;105(3):229-66.
DeLorenzo RJ, Sun DA. Basic mechanisms in status epilepticus: role of calcium in neuronal
injury and the induction of epileptogenesis. Adv Neurol. 2006;97:187-97.
DeLorenzo, RJ, Pal S, Sombati S. Prolonged activation of the N-methyl-D-aspartate receptor-
Ca
2+
transduction pathway causes spontaneous recurrent epileptiform discharges in
hippocampal neurons in culture. Proc Natl Acad Sci.1995;95(24):14482-14487.
Deng Z, Fyffe R. Expression of P2X7 receptor immunoreactivity in distinct subsets of synaptic
terminals in the ventral horn of rat lumbar spinal cord. Brain Research 2004;1020:53-61.
Di Virgilio F, Chiozzi P, Falzoni S, Ferrari D, Sanz JM, Venketaraman V, et al. Cytolytic P2X
purinoceptors. Cell Death Differ 1998;5:191-199.
Di Virgilio F. The P2Z purinoceptor: an intriguing role in immunity, inflammation and cell
death. Immunol. Today 1995;16:524-528.
71
Dixon AK, Gubitz AK, Siriinathsinghji DJ, Richardson PJ, Freeman TC. Tissue distribuition of
adenosine receptor mRNAs in the rat. Br Pharmacol. 1996;118:1461-1468.
Drury NA and Szent-Györgyi A. The physiological activity of adenine compounds with special
reference to their action upon the mammalian. J Physiol. 1929;68:213-237.
Duan S, Anderson CM, Keung EC, Chen Y, Chen Y, Swanson RA. P2X
7
receptor-mediated
release of excitatory amino acids from astrocytes. The Journal of Neuroscience
2003;23(4):1320-1328.
Dubé C, Boyet S, Marescaux C. Relationship between neuronal loss and interictal glucose
metabolism during the chronic phase of the lithium-pilocarpine model of epilepsy in the
immature and adult rat. Exp Neurol. 2001;167:227-41.
Duncan R, Patterson J, Roberts R, Hadley DM, Bone I. Ictal/postictal SPECT in the pre-surgical
localisation of complex partial seizures. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1993;56(2):141-8.
Dunwiddie TV, Fredholm BB. Adenosine A1 receptors inhibit adenylate cyclase activity and
neurotransmitter release and hyperpolarize pyramidal neurons in rat hippocampus. J
Pharmacol Exp Ther. 1989;249:31-37.
Dunwiddie TV, Hoffer BJ, Fredholm
BB. Alkylxanthines elevate hippocampal excitability.
Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 1981;316(4):326-330.
Dunwiddie TV, Hoffer BJ. Adenine nucleotides and synaptic transmission in the in vitro
hippocampus. Br J Pharmacol. 1980;69:59-68.
Dunwiddie tv, Masino SA. The role and regulation of adenosine in the central nervous system.
Ann Rev. Neurosci. 2001;24:31-55.
Dunwiddie TV, Worth T. Sedative and anticonvulsivant effects of adenosine analogs in mouse
and rat. J Pharmacol Exp Ther. 1982;2002:70-6.
Dunwiddie TV. Adenosine and Supression of Seizures. Advances in Neurology. 3 ed.
Philadelphia: WA Wilson; 1999.p. 1001-1010.
During MJ, Ryder KM, Spencer DD. Hippocampal GABA transporter function in temporal-lobe
epilepsy. Nature 2002;13:376:174-177.
During MJ, Spencer DD. Adenosine: a mediator of seizure arrest and postictal refractoriness.
Ann Neurol. 1992;32:618-624.
Edward FA, Gibbs AJ, Colquhoum D. ATP receptor-mediated synaptic current in the central
nervous system. Nature 1992;359:145-147.
Ekonomou A, Sperk G, Kotopoulos G, Angelatou F. Reduction of A1 adenosine receptors in rat
hippocampus after kainic acid-induced limbic seizures. Neurosci Lett 2002;284:49-52.
Engel J Jr. Recent advances in surgical treatment of temporal lobe epilepsy. Acta Neurol
Scand 1992;86(Suppl 140):S71-S80.
Engel J, Jr. A proposed diagnostic scheme for people with epileptic seizures and with
epilepsy: report of the ILAE Task Force on Classification and Terminology. Epilepsia
2001;42(6):796-803.
72
Engel J, Jr. Introduction to temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 1996;26(1):141-50.
Engel J, Jr. Recent advances in surgical treatment of temporal lobe epilepsy. Acta Neurol
Scand. 1992;140:71-80.
Falconer MA, Serafetinides EA, Corsellis JA. Etiology and Pathogenesis of temporal lobe
epilepsy. Arch Neurol. 1964;10:233-48.
Fastbom J, Pazos A, Palacios JM. The distribution of adenosine A1 receptors and 5’-
nucleotidase in the brain of some commonly used experimental animals. Neuroscience
1987;22:813-826.
Fellin T, Pozzan T, Carmignoto G. Purinergic receptors mediate two distinct glutamate
release pathways in hippocampal astrocytes. The journal of Biological Chemistry
2006;281(7):4274-4284.
Fernandes MJS, Dubé C, Boyet S, Marescaux C, Nehlig A. Correlation between
hypermetabolism and neuronal damage during status epilepticus induced by lithium and
pilocarpine in immature and adult rats. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism
1999;19(2):195-199.
Ferrari D, Los, M, Bauer MK, Vandenabeele P, Wesselborg S, Schlze-Osthoff K. P2Z
purinoreceptor ligation induces activation of caspases with distinct roles um apoptotic and
necrotic alterations of cell death. FEBS Lett. 1999;447:71-75.
Ferrari D, Stroh C, Schulze-Osthoff H. P2X7/P2Z purinoreceptor-mediated activation of
transcription facto NFAT in microglial cells. J Biol Chem. 1999;274:13205-13210.
Ferrari D, Wesselborg S, Bauer MKA, Schulze-Osthoff K. Extracellular ATP activates
transcription factor NF-κβ p65. J Cell Biol. 1997;139:1635-1643.
Florenzano F, Viscomi MT, Cavaliere F, Volonté C, Molinari M. Cerebellar lesion up-regulates
P2X
1
and P2X
2
purinergic receptors in precerebellar nuclei. Neuroscience 2002;115(2):425-
434.
Fountain NB. Status epilepticus: risk factors and complications. Epilepsia 2000;41(2):S23-S30.
Franceschi C, Abbracchio MP, Barbieri DB, Ceruti S, Ferrari D, Iliou JP, et al. Purines and cell
death. Drug Development Research 1996;39:442-449.
Franke H, Grummich B, Härtig W, Grosche J, Regenthal R, Edwards RH, et al. Changes in
purinergic signaling after cerebral injury – involvement of glutamatergic mechanisms? Int J
Devl Neuroscience 2006 (in press).
Franke H, Günther A, Grosche J, Schmidt R, Rossner S, Reinhardt R, et al. P2X
7
receptor
expression after ischemia in the cerebral córtex of rats. Journal of neuropathology and
experimental neurology 2004;63(1):686-699.
Fredholm BB, Arslan G, Halldner L, Kull B, Schutte G, Wasserman W. Structure and function of
adenosine receptors and their genes. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. 2000;362:364-
374.
Fredholm BB, Ljzerman AP, Jacobson KA, Klotz KN, Linden J. International Union of
Pharmacology XXV Nomenclature and classification of adenosine receptors. Pharmacol Rer.
2001;53:527-552.
73
Fredholm BB. Adenosine and neuroprotection. In Green, AR and Cross AJ., eds –
Neuroprotective agents and Cerebral ischemia, San Diego, Academic Press, 1997;259-280.
French JA, Williamson PD, Thadani VM, Darcey TM, Mattson RH, Spencer SS, et al.
Characteristics of medial temporal lobe epilepsy: I. Results of history and physical
examination. Ann Neurol. 1993;34(6):774-80.
Fuerst D, Shah J, Kupsky WJ, Johnson R, Shah A, Hayman-Abello B, et al. Volumetric MRI,
pathological, and neuropsychological progression in hippocampal sclerosis. Neurology
2001;57(2):184-8.
Fujiwara-Tsukamoto Y, Isomura Y, Nambu A, Takada M. Excitatory GABA input directly drives
seizure-like rhythmic synchronization in mature hippocampal CA1 pyramidal cells.
Neuroscience 2003;119:265-275.
Gastaut H, Gastaut JL, Goncalves e Silva GE, Fernandez Sanchez GR. Relative frequency of
different types of epilepsy: a study employing the classification of the International League
Against Epilepsy. Epilepsia 1975;16(3):457-61.
Gendron FP, Chalimoniuk M, Strosznajder J, Shen S, González FA, Weisman A, et al. P2X7
nucleotide receptor activation enhances IFNγ-induced type II nitric oxide synthase activity in
BV-2 microglial cells. Journal of Neurochemistry 2003;87:344-352.
George B, Kulkarni SK. Modulation of lithium-pilocarpine-induced status epilepticus by
adenosinergic agents. Meth Find Exp Clin Pharmacol.1997;19(5):329-333.
Gibbs JW, Shumate M, Coulter DA. Differential Epilepsy-Associated Alterations in Postsynaptic
GABA
A
Receptor Function in Dentate Granule and CA1 neurons. J Neurophysiol. 1997;77:1924-
1938.
Gillespie JH. The biological significance of the linkages in adenosine triphosphoric acid. J
Physiol. 1934;80:345-349.
Glass M, Dragunow M. Neurochemical and morphological changes associated with human
epilepsy. Brain Research Reviews 1995;21:29-41.
Gloor P. Mesial temporal sclerosis: historical background and an overview from a modern
perspective. In: H.Luders, editor. Epilepsy Surgery. Raven Press; 1991. p. 689-703.
Gouder N, Fritschy JM, Boison D. Seizure supression by adenosine A1 receptor activation in a
mouse model of pharmacoresistant epilepsy. Epilepsia 2003;44(7):877-885.
Gouder N, Scheurer L, Fritschy JM, Boison D, Overexpression of adenosine kinase in epileptic
hippocampus contributes to epileptogenesis. The Journal of Neuroscience 2004;24(3):692-701.
Grabb MC, Sciotti VM, Gidday JM, Cohen SA, Van Wylen DGL. Neurochemical and
morphological responses to acutely and chronically implanted brain microdialysis probes.
Journal of Neuroscience Methods 1998;82:25-34.
Grisar T, Guillaume D, Delgado-Escueta, AV. Contribution of Na
+
/K
+
-ATPase to focal epilepsy:
brief review. Epilepsy Res. 1992;12:141-149.
74
Guedes FA, Galvis-Alonso OY, Leite JP. Plasticidade Neuronal Associada à Epilepsia do Lobo
Temporal Mesial: Insights a partir de Estudos em Humanos e em Modelos Animais. J Epilepsy
Clin Neurophysiol. 2006;12(1):10-7.
Guerreiro CA, Guerreiro MM, Cendes F, Lopes-Cendes. Considerações Gerais. Epilepsia. 2 ed.
São Paulo: Lemos Editorial; 2000. p. 1-10.
Güttinger M, Padrum V, Pralong WF, Boison D. Seizure suppression and lack of adenosine A1
receptor desensitization after focal long-term delivery of adenosine by encapsulated
myoblast. Exp Neurol. 2005;193:53-64.
Harvey BD, Sloviter RS. Hippocampal granule cell activity an c-fos expression during
spontaneous seizures in awake, chronically epileptic, pilocarpine-treated rats: implications
for hippocampal epileptogenesis. J Comp Neurol. 2005;488(4):442-463.
Hide I, Tanaka M, Inoue A, Nakajima K, Kohsaka S, Inoue K, et al. Extracellular ATP triggers
tumor necrosis factor-alpha release from rat microglia. J Neurochem. 2000;75:965-972.
Honda S, Sasaki Y, Ohswa k, Imai Y, nakamura Y, Inoue K, et al. Extracellular ATP or ADP
induce chemotaxis of cultured microglia through G
i/o
– Coupled P2Y receptors. The Journal of
Neuroscience 2001;21(6):1975-1982.
Houser CR, Miyashiro JE, Swartz BE, Walsh GO, Rich JR, gado-Escueta AV. Altered patterns of
dynorphin immunoreactivity suggest mossy fiber reorganization in human hippocampal
epilepsy. J Neurosci. 1990;10(1):267-82.
Illes P, Ribeiro JA. Molecular physiology of P2 receptors in the central nervous system.
European Journal of Pharmacology 2004;483:5-17.
Inoue K, Koizumi S, NaKazawa K. Glutamate-evoked release of adenosine 5-triphosphate
causing na increase in intracellular calcium in hippocampal neurons. NeuroReport 1995;6:437-
440.
Inoue K, Nakazawa K, Fujimori W, Takanaka A. Extracellular adenosine 5’-triphosphate-
evoked glutamate release in culture rat hippocampal neurons. Neurosci Lett. 1992;134:215-
218.
Inoue K, Schuichi K, Ueno S. Implication of ATP receptors in brain functions. Progress in
Neurobiology 1996;50:483-492.
Jefferys JG, Traub RD. “Dormant”inhibitory neurons: do they exist and what is their
functional impact? Epilepsy Res. 1998;32:104-113.
Jones OT. Ca
2+
channels and epilepsy. European Journal of Pharmacology 2002;447:211-225.
Jones-Gotman M, Brulot M, McMackin D, et al. Word and design list learning deficits related to
side of hippocampal atrophy as assessed by volumetric MRI measurements. Epilepsia
1993;34(6):71.
Jones-Gotman M, Zatorre RJ, Olivier A, Andermann F, Cendes F, Staunton H, et al. Learning
and retention of words and designs following excision from medial or lateral temporal-lobe
structures. Neuropsychologia 1997;35:963-973.
75
Kang TC, An SJ, Park SK, Hwang IK, Won MH. P2X
2
and P2X
4
receptor expression is regulated
bu a GABA
A
receptor-mediated mechanism in the gerbil hippocampus. Molecular Brain
Research 2003;116:168-175.
Kang TC, Park SK, Hwang IK, An SJ, Won MH. GABA
B
receptor-mediated regulation of P2X
7
receptor expression in the gerbil hippocampus. Molecular Brain Research 2004;121:12-18.
Kann O, Kovács R, Njunting M, Behrens CJ, Otáhal J, Lehmann TN, et al. Metabolic
dysfunction during neuronal activation in the ex vivo hippocampus from chronic epileptic rats
and humans. Brain 2005;128:2396-2407.
Kasper BS, Stefan H, Buchfelder M, Paulus W. Temporal lobe microdysgenesis in epilepsy
versus control brains. J Neuropathol Exp Neurol. 1999;58(1):22-8.
Knutsen LJS, Murray TF. Adenosine and ATP in epilepsy. Purinergic Approaches in
Experimental Therapeutic. New York: Wiley-Liss; 1997.p423-447.
Latini S, Pedata F. Adenosine in the central nervous system: release mechanism and
extracellular concentrations. Journal of Neurochemistry 2000;79:463-484.
Le Feuvre R, Brough D, Rothwell N. Extracellular ATP and P2X7 receptors in
neurodegeneration. Eur J Pharmacol. 2002;447:261-269.
Le KT, Villeneuve P, Ramjaun AR, McPherson OS, Beaudet A, Seguela P. Sensory presynaptic
and widespread somatodendritic immunolocalization of central ionotropic P2X ATP receptors.
Neuroscience 1998;83:177-190.
Lee BI, Markand ON, Wellman HN, Siddiqui AR, Park HM, Mock B, et al. HIPDM-SPECT in
patients with medically intractable complex partial seizures. Ictal study. Arch Neurol.
1988;45(4):397-402.
Leite JP, Bortolotto ZA, Cavalheiro EA. Spontaneous recurrent seizures in rats: an
experimental model of partial epilepsy. Neurosci Biobehav Rev. 1990;14(4):511-7.
Lemos T, Cavalheiro EA. Suppression of pilocarpine-induced status epilepticus and the late
development of epilepsy in rats. Exp Brain Res.1995;102(3):423-8.
Leroy C, Poisbeau P, Keller AF, Nehlig A. Pharmacological plasticity of GABAA receptors at
dentate gyrus synapses in a rat model of temporal lobe epilepsy. J Physiol. 2004;557(2):473-
487.
Levitt B, Head RJ, Westfall DP. High-pressure liquid chromatographic-fluorometric detection
of adenosine and adenine nucleotides: application to endogenous content and electrically
induced release of adenyl purines in guinea pig vas deferens. Anal Biochem. 1984;137(1):93-
100.
Li LM, Sander JW. [National demonstration project on epilepsy in Brazil]. Arq Neuropsiquiatr.
2003;61(1):153-6.
Lin Y, Desbois A, Jiang S, Hou ST. P2 receptor antagonist PPADS confers neuroprotection
against glutamate/NMDA toxicity.Neuroscience Letters 2005;377:97-100.
Longo BM, Mello LE. Blockade of pilocarpine- or kainate-induced mossy fiber sprouting by
cycloheximide does not prevent subsequent epileptogenesis in rats. Neurosci Lett
1997;226(3):163-6.
76
Longo BM, Mello LE. Supragranular mossy fiber sprouting is not necessary for spontaneous
seizures in the intrahippocampal kainate model of epilepsy in the rat. Epilepsy Res.
1998;32(1-2):172-82.
Longo BM, Mello LE. Supragranular mossy fiber sprouting is not necessary for spontaneous
seizures in the intrahippocampal kainate model of epilepsy in the rat. Epilepsy Res,
1998;32:172-82.
Longo BM, Sanabria ERG, Gabriel S, Mello LE. Electrophysiologic abnormalities of the
hippocampus in the pilocarpine/cycloheximide model of chronic spontaneous seizures.
Epilepsia 2002;43(5):203-208.
Lopes da Silva FH, Witter MP, Boeijinga PH, Lohman AH. Anatomic organization and
physiology of the limbic cortex. Physiol Rev. 1990;70(2):453-511.
Lorente de No R. Studies on the structure of the cerebral cortex II. Journal fur Psycholigie
und Neurologie 1934;46:113-74.
Lowry, Rosebrough OHNJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin-phenol
reagents. J Biol Chem. 1951;193:265-275.
Luthardt J, Borvendeg SJ, Sperlagh B, Poelchen W, Wirkner K, Illes P. P2Y1 receptor
activation inhibits NMDA receptor-channels in layer V pyramidal neurons of the rat prefrontal
and parietal cortex. Neurochemistry International 2003;42:161-172.
Lutz PL, Kabler S. Release of adenosine and ATP in the brain of the freshwater turtle
(Trachemys scripta) during long-term anoxia. Brain Research 1997;769:281-286.
MacGregor DG, Stones TW. Inhibition by adenosine analogue, (R)-N6-
phenylisopropiladenosine, of kainic acid neurotoxicity in rat hippocampus after systemic
administration. Br J Pharmacol. 1993;109:316-321.
Maitre M, Ciesielski L, Lehmann A, Kempf E, Mandel P. Protective effect of adenosine and
nicotinamide against audiogenic seizure. Biochem Pharmacol. 1974;23:2807-16.
Mathern G, Pretorius JK, Kornblum HI, Mendonza D, Lozada A, Leite JP, et al. Human
hippocampal AMPA and NMDA mRNA levels in temporal lobe epilepsy patients. Brain
1997;120:1937-1959.
Mathern GW, Adelson PD, Cahan LD, Leite JP. Hippocampal neuron damage in human
epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 2002;135:237-51.
Mathern GW, Babb TL, Leite JP, Pretorius K, Yeoman KM, Kuhlman PA. The pathogenic and
progressive features of chronic human hippocampal epilepsy. Epilepsy Res. 1996;26(1):151-61.
McNamara J. Cellular and Molecular Basis of Epilepsy. The Journal of Neuroscience
1994;14(6):3413-3425.
Meghji P, Newby A. Sites of adenosine formation, action and inactivation in the brain.
Neurochem Int. 1990;16:227-232.
Mehta V, Hart J, Wewers M. ATP-stimulated release of interleukin (IL)-1β and IL-18 requires
priming by lipopolysaccharide and is independent of caspase cleavage. J Biol Chem.
2001;276:3820-3826.
77
Melani A, Turchi D, Vannucchi MG, Cipriani S, Gianfriddo M, Pedata F. ATP extracellular
concentrations are increased in the rat striatum during in vivo ischemia. Neurochemistry
International 2005:1-7.
Mello LEAM, Cavalheiro EA, Tan AM, Kupfer WR, Pretorius JK, Babb T, et al. Circuit
mechanisms of seizure in the pilocarpine model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber
sprouting. Epilepsia 1993;34(6);985-995.
Mendonça A, Sebastião AM, Ribeiro JA. Adenosine: does it have a neuroprotective role after
all? Brain Research Reviews 2000;33:258-274.
Moore D, Chambers J, Waldvogel H, Faull R, Emson P. Regional and cellular distribution of the
P2Y1 purinergic receptor in the human brain: striking neuronal localization. J Comp Neurol.
2000;421:374-384.
Moore DJ, Chambers JK, Wahlin JP, Tan KB, Moore GB, Jenkins et a., Expression pattern of
human P2Y receptor subtypes: a quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction
study. Biochem Biophys Acta 2001; 1521:107-119.
Moran-Jimenez MJ, Matute C. Immunohistochemical localization of the P2Y1 purinergic
receptor in neurons and glial cels of the central nervous system. Mol Brain Res. 2000;78:50-
58.
Moreau JL, Huber G. Central adenosine A2A receptors: na overview. Brain Res. 1999;31:65-82.
Morimoto K, Fahnestock M, Racine R. Kindling and status epilepticus models of epilepsy:
rewiring the brain. Progress in Neurobiology 2004;73:1-60.
Nicolaidis R, Bruno NA, Sarkis JJF, Souza DO. Increase of adenine nucleotide hydrolysis in rat
hippocampal slices after seizures induced by quinolinic acid. Neurochemical Research
2005;30(3):385-399.
North RA, Verkhratsky A. Purinergic transmission in the central nervous system. Eur J Physiol.
2006;452:479-485.
Nusser A, Hajos N, Somogyi P, Mody I. Increased number of synaptic GABA(A) receptors
underlies potentiation at hippocampal inhibitory synapses. Nature 1998;395:172-177.
O` Keefe J. The hippocampus as Cognitive MAp. In: O`Keefe, editor. Anatomy.Oxford: Oxford
University Press; 1978. p. 103-40.
O’Kane EM, Stone T. Characterisation of ATP-induced facilitation of transmission in rat
hippocampus. European Journal of Pharmacology 2000;409:159-166.
Pal S, Sun D, Limbrick D, Rafiq A, DeLorenzo RJ. Epileptogenesis induces long-term alterations
in intracellular calcium release and sequestration mechanisms in the hippocampal neuronal
culture model of epilepsy. Cell Calcium 2001;30(4):285-296.
Palmer TM, Stiles GL. Review: neurotransmitter receptors, VII. Adenosine receptors.
Neuropharmacology 1995;34:683-694.
Palmer TM, Stiles GL. The new biology of adenosine receptors. Adv Enzymol Relat Areas Mol
Biol. 1994;69:83-120.
78
Panenka W, Jijon H, Herx LM, Armstrong JN, Feighan D, Wei T, et al. P2X7-like receptor
activation in astrocytes increases chemokine monocyte chemoattractant protein-1 expression
via mitogen-activated protein kinase. The Journal of Neuroscience 2001;21(18):7135-7142.
Pankratov Y, Lalo U, Castro E, Miras-Portugal MT, Krishtal O. ATP receptor-mediated
component of the excitatory synaptic transmission in the hippocampus. In Progress in Brain
Research 1999;120:237-249.
Pankratov Y, Lalo U, Verkhratsky A, North AR. Vesicular release of ATP at central synapses.
Eur J Physiol. 2006;452:589-597.
Pankratov Y, Lalo UV, krishtal AO. Role for P2X Receptors in Long-term Potentiation. The
Journal of Neuroscience 2002;22(19):8363-8369.
Parent JM, Yu TW, Leibowitz RT, Geschwind DH, Sloviter RS, Lowenstein DH. Dentate Granule
cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization
in the adult rat hippocampus. The Journal of Neuroscience 1997;17(10):3727-3738.
Pitkänenand A, Sutula T. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic
approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lance Neurology 2002;1:173-81.
Ralevic V and Burnstock. Receptors for Purines and Pyrimidines. Pharmacol Rev. 1998;50: 413-
492.
Ramkumar V, Nie Z, Rybak L, Maggirwar SB. Adenosine, antioxidant enzymes and
cytoprotection. TiPS 1995;16:283-285.
Rappold PM, Lynd-Balta E, Joseph SA. P2X
7
receptor immunoreactive profile confined to
resting and activated microglia in the epileptic brain. Brain Research 2006;1089:171-178.
Rapport RL, Harris AB, Friel N, Ojemann GG. Human epilepstic brain: Na
+
/K
+
ATPase activity
and phenytoin concentrations. Arch Neurol., 1975;32:549-554.
Rathbone MP, Middlemiss PJ, Gysbers JW, Andrew G, Herman MAR, Reed JK, et al. Trophic
effects of purines in neurons and glial cells. Progress in Neurobiology 1999;59:663-690.
Ratzliff AdH, Howard AL, Santhakumar V, Osapay I, Soltesz I. Rapid Deletion of Mossy Cells
Does Not Result in a Hyperexcitable Dentate Gyrus: Implications for Epileptogenesis. The
Journal of Neuroscience, 2004;24(9):2259 –2269.
Raza M, Blair R, Sombati S, Carter D, Deshpande L, DeLorenzo RJ. Evidence that injury-
induced changes in hippocampal neuronal calcium dynamics during epileptogenesis cause
acquired epilepsy. PNAS 2004;101(50);17522-17527.
Raza M, Pal S, Rafiq A, DeLorenzo RJ. Long-term alteration of calcium homeostatic
mechanism in the pilocarpine model of temporal epilepsy. Brain Research 2001;903:1-12.
Rebola N, Coelho JE, Costenla AR, Lopes LV, Parada A, Oliverira CR, et al. Decrease of
adenosine A1 receptor density and of adenosine neuromodulation in the hippocampus of
kindled rats. European Journal of Neuroscience 2003;18:820-828.
Rebola N, Pinheiro PC, Oliveira CR, Malva JO, Cunha RA. Subcellular localization of adenosine
A1 receptors in nerves terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Research
2003;987:49-58.
79
Regesta G, Tanganelli P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies.
Epilepsy Res. 1999;34(2-3):109-22.
Ribeiro JA, Sebastião AM, Mendonça A. Adenosine receptors in the nervous system:
pathophysiological implications. Progress in Neurobiology 2003a;68:377-392.
Ribeiro JA, Sebastião AM, Mendonça A. Participation of adenosine receptors in
neuroprotection. Drug News Perspect 2003b;16(2):80-6.
Roberts JA, Vial C, Digby HR, Agboh KC, Wen H, Atterbury-Thomas A, et al. Molecular
properties of P2X receptors. Eur J Physiol. 2006;452:486-500.
Robertson SJ, Edwards FA. ATP and glutamate are released from separate neurons in the rat
medial habenula nucleus: frequency dependence and adenosine-mediated inhibition of
release. J Physiol. 1998;508:691-701.
Rodrigues R, Almeida T, Richardson PJ, Oliveira CR, Cunha RA. Dual presynaptic control by
ATP of glutamate release via facilitatory P2X
1
, P2X
2/3
and P2X
3
and inhibitory P2Y
1
, P2Y
2
and
/or P2Y
4
receptors in the rat hippocampus. The Journal of Neuroscience 2005;25(27):6286-
6295.
Rowe CC, Berkovic SF, Sia ST, Austin M, McKay WJ, Kalnins RM, et al. Localization of epileptic
foci with postictal single photon emission computed tomography. Ann Neurol. 1989;26(5):660-
8.
Rubio ME, Soto F. Distinct localization of P2X receptors at excitatory postsynaptic
specializations. J Neurosci. 2001;21:641-653.
Rudolphi KA, Schubert P, Parkinson FE, Fredholm BB. Neuroprotective role of adenosine in
cerebral ischemia. Trends in Pharmacological Science 1992;13:439-445.
Sabirov R, Okada Y. ATP release via anion channels. Purinergic Signalling 2005;1:311-328.
Salmenperä T. Damage in the hippocampus, amygdala, entorhinal and perirhinal cortex of
adults with partial epilepsy. Kuopio;2001. Available from:
http://www.uku.fi/neuro/55the.pdf.
Santhakumar V, Bender R, Frotscher M, Ross ST, Hollrigel GS, Toth Z, et al. Granule cell
hyperexcitality in the early post-traumatic rat dentate gyrus: the “irritable mossy cell”
hypothesis. Journal of Physiology 2000;524(1):117-134.
Scorza FA. Sanabria ERG, Cavalheiro EZ. Glucose utilization during interictal intervals in an
epilepsy model induced by pilocarpine: a qualitative study. Epilepsia 1998;39(10):1041-1045.
Scorza FA, Arida RM, Priel MR, Calderazzo L, Cavalheiro EA. Glucose utilization during status
epilepticus in an epilepsy model induced by pilocarpine. Arq Neuropsiquiatr. 2002;60(2):198-
203.
Sebastião AM, Ribeiro JA. Adenosine A2 receptor-mediated excitatory actions on the nervous
system. Prog Neurobiol. 1996;48:167-189.
80
Sloviter RS. Permanently altered hippocampal structure, excitability, and inhibition after
experimental status epilepticus in the rat: the "dormant basket cell" hypothesis and its
possible relevance to temporal lobe epilepsy. Hippocampus 1991;1(1):41-66.
Smolders I, Khan GM, Manil J, Ebinger G, Michotte Y. NMDA receptor-mediated pilocarpine-
induced seizures: characterization in freely moving rats by microdialysis. Br J Pharmacol.
1997;121(6):1171-9.
Sperlágh B and Vizi ES. Neuronal synthesis, storage and release of ATP. The Neurosciences
1996;8:175-186.
Sperlágh B, Köfalvi A, Deuchars J, Atkinson L, Milligan CJ, Buckley NJ, Vizi ES. Involvement of
P2X7 receptors in the regulation of neurotransmitter release in the rat hippocampus. J
Neurochem. 2002;81:1-16.
Surprenant A, Rassendren F, Kawashima E, North RA, Buell G. The cytolytic P2Z receptor for
extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X
7
). Science 1996;272:735-738.
Tasch E, Cendes F, Li LM, Dubeau F, Andermann F, Arnold DL. Neuroimaging evidence of
progressive neuronal loss and dysfunction in temporal lobe epilepsy. Ann Neurol.
1999;45(5):568-76.
Tauck DL, Nadler JV. Evidence of functional mossy fiber sprouting in hippocampal formation
of kainic acid-treated rats. J Neurosci. 1985;5(4):1016-22.
Thomas PM, Phillips JP, Delanty N, O’Connor WT. Elevated extracellular levels of glutamate,
aspartate and gama-aminobutyric acid within the intraoperative, spontaneously epileptiform
human hippocampus. Epilepsy Research 2003;54:73-79.
Thorn M, Yoshikawa H. Adenosine transporters. Gen Pharmacol. 1996;27(4):613-20.
Turski WA, Czuczwar SJ, Kleinrok Z, Turski L. Cholinomimetics produce seizures and brain
damage in rats. Experientia 1983;39(12):1408-11.
Verderio C, Matteoli M. ATP mediates calcium signaling between astrocytes and microglial
cells: modulation by IFN-γ. The Journal of Immunology 2001;166:6383-6391.
Vezzani A, Moneta D, Richichi C, Aliprandi M, Burrows SJ, Ravizza T, et al. Functional role of
inflammatory cytokines and antiinflamatory molecules in seizures and epileptogenesis.
Epilepsia 2002;43(5):30-35.
Vezzani A, Granata T. Brain inflammation in epilepsy: experimental and clinical evidence.
Epilepsia 2005;46(11)1724-1743.
Vianna EPM, Ferreira AT, Naffah-Mazzacoratti MG, Sanabria ERG, Funke M, Cavalheiro EA,
Fernandes MJS. Evidence that ATP participates in the pathophysiology of pilocarpine-induced
temporal lobe epilepsy: fluorometric, immunohistochemical, and western blot studies.
Epilepsia 2002;43(5):227-229.
Vianna EPM, Ferreira AT, Doná F, Cavalheiro EA, Fernandes MJ. Modulation of seizures and
synaptic plasticity by adenosinergic receptors in an experimental model of temporal lobe
epilepsy induced by pilocarpine in rats. Epilepsia 2005;46(5):166-173.
Virginio C, Mackenzie A, Rassendren FA, North RA, Surprenant A. Pore dilation of neuronal
P2X receptor channels. Nat Neurosci. 1999;2:315-321.
81
Volonté C, Ciotti MT, D’Ambrosi N, Lockhrt B, Spedding M. Neuroprotective effects of
modulators of P2 receptors in primary culture of CNS neurones. Neuropharmacology
1999;38:1335-1342.
Voutsinos-Porche B, Koning E, Kaplan H, Ferrandon A, Guenounou M, Nehlig A, et al.
Temporal patterns of the cerebral inflammatory response in the rat lithium-pilocarpine model
of temporal lobe epilepsy. Neurobiology of Disease 2004;17:385-402.
Vulchanova L, Arvidsson U, Riedl M, Wang J, Buell G, Surprenant A, et al. Differential
distribution of two ATP-gated channels (P2X receptors) determined by immunocytovhemistry.
Proc Natl Acad Sci, 1996;93:8063-8067.
Vulchanova L, Riedl MS, Schuster SJ, Buell G, Surorenant A, North RA et al.,
Immunohidtochemical study of P2X2 and P2X3 receptor subunits in rat and monkey sensory
neurons and their central terminals. Neuropharmacology 1997;36:1229-1242.
Wang X, Arcuino G, Takano T, Lin J, Peng WG, Wan P, et al. P2X7 receptor inhibition
improves recovery after spinal cord injury. Nature Medicine 2004;10(8):821-827.
Watson C, Jack CR, Jr., Cendes F. Volumetric magnetic resonance imaging. Clinical
applications and contributions to the understanding of temporal lobe epilepsy. Arch Neurol.
1997;54(12):1521-31.
White TD. Release of ATP from a synaptosomal preparation by elevated extracellular K
+
and
by veratridine. J Neurochem. 1978;30:329-336.
Wieraszko A, Ehrkich, YH. On the role of extracellular ATP in the induction of long-term
potentiation in the hippocampus. J Neurochem 1994;63:1731-1738.
Wieraszko A, Seyfried TN. ATP-induced synaptic potentiation in hippocampal slices. Brain Res.
1989;491:356-359.
Wieraszko A, Seyfried TN. Increased amount of extracellular ATP in stimulated hippocampal
slices of seizure prone mice. Neurosci Lett 1989;4:106(3):287-93.
Wiesner JB, Ugarkar BG, Castellino AJ, Barankiewicz J, Dumas DP, Gruber HE, et al.
Adenosine kincase inhibitors as a novel approach to anticonvulsant therapy. The Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 1999;289(3):1669-1677.
Wittendorp MC. Adenosine-induced neuroprotection: involvement of glia cells and cytokines.
University of Groningen; 2004. Available from: http://irs.ub.rug.nl/ppn/267770863.
Xiang Z, Bo X, Oglesby I, Ford A, Burnstock G. Localization of ATP-gated P2X
2
receptor
immunoreactivity in the rat hypothalamus. Brain Res. 1998;813:390-397.
Yiangou Y, Facer P, Durrenberger O, Chessel IP, Naylor A, Bountra C, et al. COX-2, CB2 and
P2X7-immunoreactivities are increased in activated microglial cells/macrophages of multiple
sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis spinal cord. BMC Neurology 2006;6(12):1-14.
Zimmermann H. Extracellular metabolism of ATP and other nucleotides. Arch Pharmacol.
2000;362:299-309.
Zimmermann H. Signalling via ATP in the nervous system. Trends neurosci. 1994;17:420-426.
82
Zuchora B, Wielosz M, Urbanska EM. Adenosine A1 receptors and the anticonvulsivant
potential of drugs efeective in the modelo f 3-nitropropionic acid –induced seizures in mice.
European Neuropsychopharmacology 2005;15:85-93.
83
Abstract
Pilocarpine, a muscarinic cholinergic agonist when inject at high doses (i.p.)
in rats, reproduces the main characteristics of Human Temporal Lobe Epilepsy (TLE).
The animal exhibits different patterns of behavior, including status epilepticus (acute
phase), electrophysiological and behavioral normalization (latent phase) and
spontaneous recurrent seizures (chronic phase). The objectives of this study were to
analyze by means of microdyalysis and HPLC, the concentration of ATP and its
metabolites ADP, AMP and adenosine in the hippocampal formation of rats during the
acute and chronic phases of pilocarpine model, and evaluating by western blotting
and immunohistochemistry, the receptors P2X
2,4,7
in the hippocampal formation of
these animals.
The microdyalysis procedure used to determine the purines concentration in
the acute period, was taken according to the following periods of time: Basal (three
samples before treatment onset), after methylscopolamine injection (used in order to
minimize the peripheral effects of pilocarpine) and 30 min. 1h, 2h, 3h and 4h after
pilocarpine injection. Chronic animals were studied during the interictal and ictal
period. The samples were analyzed by a fluorescence detector coupled to HPLC.
Animals from three different experimental groups (Group 12h = G 12h, Latent Group =
G Lat, Chronic Group = G Cro) and their respective controls were utilized to analyze
the purinergic receptors P2X
2,4,7
, by means of western blotting and
immunohistochemistry. The immunohistochemistry was achieved with fixated slices
floating on buffer solution, using biotinylated antibody, ABC kit and development with
diaminobenzidine.
The biochemical study revealed an increase of ADP, AMP and adenosine
concentrations during the SE. In contrast, a reduction of all purines was detected in
the hippocampal formation during the interictal period of chronic rats. Rats studied
during the ictal phase, exhibited high concentrations of ATP and adenosine. The
immunohistochemistry and western blotting analysis showed a great reduction of
P2X
4
, versus CT in the chronic period (35%, p<0.001, ANOVA), and an increase of P2X
7
,
in the acute and chronic phases (G12H: 20%, p<0.05; GCRO: 18% p<0.05, ANOVA).
According to these findings, we can conclude that the metabolism of
purines is altered in the hippocampal formation of rats in pilocarpine-induced
84
epilepsy. In the acute phase, the increase of ATP metabolites may reflect an increase
in the metabolism rates of ATP by the ectonucleotidases, possibly as a compensatory
inhibitory mechanism. On the other hand, before ATP is hydrolyzed, it may activate
P2X
7
purinoceptor, and consequently, intensify hyperexcitability and cytotoxicity
cascades. A decrease in all purines analyzed in the chronic phase could suggest an
energy metabolism dysfunction in the epileptic hippocampus. The decrease in the
adenosine concentrations might facilitate the onset of spontaneous and recurrent
seizures.
Epilepsia, 46(Suppl. 5):166–173, 2005
Blackwell Publishing, Inc.
C
International League Against Epilepsy
Modulation of Seizures and Synaptic Plasticity by Adenosinergic
Receptors in an Experimental Model of Temporal Lobe Epilepsy
Induced by Pilocarpine in Rats
∗
Eduardo Paulo Morowsky Vianna, †Alice Teixeira Ferreira,
∗
Fl´avia Don´a,
∗
Esper Abr˜ao Cavalheiro, and
∗
Maria Jos´edaSilva Fernandes
∗
Departamento de Neurologia e Neurocirurgia, Disc. Neurologia Experimental; and †Departamento de Biof
´
ısica, Universidade
Federal de S
˜
ao Paulo, SP, Brasil
Summary: Purpose: Adenosine is a major negative neuromod-
ulator of synaptic activity in the central nervous system and
can exert anticonvulsant and neuroprotective effects in many
experimental models of epilepsy. Extracellular adenosine can be
formed by a membrane-anchored enzyme ecto-5
-nucleotidase.
The purposes of this study were to characterize the role of adeno-
sine receptors in modulating status epilepticus (SE) induced
by pilocarpine and evaluate its neuroprotective action. Ecto-5
-
nucleotidase activity was studied during the different phases of
pilocarpine-induced epilepsy in rats.
Methods: Adult rats were pretreated with different adenosin-
ergic agents to evaluate the latency and incidence of SE in-
duced by pilocarpine in rats. The neuroprotective effect also was
evaluated.
Results: A proconvulsant effect was observed with DPCPX
and DMPX that reduced the latency of SE in almost all rats.
Pretreatment with the MRS 1220 did not alter the incidence of
SE but reduced the latency to develop SE. An anticonvulsant and
neuroprotective effect was detected with R-PIA. Rats pretreated
with R-PIA had a decreased number of apoptotic cells in the hip-
pocampus, whereas pretreatment with DPCPX did not modify
the hippocampal damage. An intensification of neuronal death
was observed in the dentate gyrus and CA3 when rats were pre-
treated with DMPX. MRS-1220 did not modify the number of
apoptotic cells in the hippocampus. An increase in the ecto-5´-
nucleotidase staining was detected in the hippocampus during
silent and chronic phases.
Conclusions: The present data show that adenosine released
during pilocarpine-induced SE via A1-receptor stimulation
can exhibit neuroprotective and anticonvulsant roles. Similar
effects could also be inferred with A2a and A3 adenosinergic
agents, but further experiments are necessary to confirm their
roles. Ecto-5´-nucleotidase activity during silent and chronic
phases might have a role in blocking spontaneous seizures by
production of inhibitory neuromodulator adenosine, besides
taking part in the mechanism that controls sprouting. Key
Words: Adenosine receptors—Ecto-5´-nucleotidase—Status
epilepticus—Pilocarpine model—Temporal lobe epilepsy.
Adenosine is an endogenous neuromodulator with an
important role in different physiologic functions in the
brain (1). This purine can be released from the cyto-
plasm through a nucleoside transporter or be formed by the
breakdown of adenosine triphosphate (ATP) released by
cells into the extracellular space by a membrane-anchored
enzyme, ecto-5
-nucleotidase (2). Besides acting as the
rate-limiting enzyme for the hydrolysis of 5´adenosine
monophosphate (AMP) within the extracellular space, this
membrane-bound enzyme participates in synaptic plastic-
ity in both developing and regenerating adult brain (3). In
the central nervous system, adenosine can modulate neu-
Address correspondence and reprint requests to Dr. M. J. S.
Fernandes at Departamento de Neurologia e Neurocirurgia, Uni-
versidade Federal de S˜ao Paulo (UNIFESP), S˜ao Paulo, Brasil,
Rua Botucatu 862 – Edf. Leal Prado, CEP: 04023-900. E-mail:
[email protected]
ronal activity through four specific cell-surface receptors
A1, A2a, A2b, and A3 (4).
The A1 adenosine receptors are widely distributed
throughout the brain, with a high density in the hippocam-
pus, where they mediate a modulatory effect on neuronal
hyperexcitability (4–6). The A1 receptors can render hip-
pocampal neurons less excitable and less responsive to ex-
citatory synaptic input by activating a guanosine triphos-
phate (GTP)-binding protein coupled to a K
+
channel and
by inhibiting the release of different neurotransmitters,
mainly glutamate (7–9). In contrast, the distribution of
A2a adenosine receptors is more concentrated in the nu-
cleus accumbens, olfactory tubercle, and striatum, with a
low density in the hippocampus (10,11). In the hippocam-
pus, A2a receptors are colocalized and coexpressed with
A1, indicating that functionally one can interfere with the
other (12,13). It has been demonstrated that A2a activation
166
PROTECTIVE EFFECT OF ADENOSINE IN THE PILOCARPINE MODEL 167
can induce facilitatory responses in the hippocampus (14).
The mechanisms by which A2a receptor exert its excita-
tory action are not completely elucidated, but It has been
postulated that A2a agonists can facilitate glutamate and
acetylcholine release (12,15,16). Besides, A2a can atten-
uate the inhibitory action of A1 receptors (12).
An excitatory role has been associated with the activa-
tion of adenosine receptors A2b and A3. The A3 receptors
exhibit low affinity for adenosine, and a high concentra-
tion of adenosine is required to activate these receptors
(8). Thus the anticonvulsant and neuroprotective effect of
adenosine has been attributed to A1 receptors, whereas
A2a and A3 have a proconvulsant action and might be
related to cell death (8,17–19).
Adenosine is a potent anticonvulsant in many exper-
imental models of epilepsy, including the pilocarpine
model (7,9,19–23). The antiepileptic properties of adeno-
sine are mostly due to the inhibitory action of A1 receptors
on synaptic transmission in the hippocampus (8,24). In-
creases in brain adenosine levels have been reported dur-
ing seizures (21).
Cavalheiro et al. (29), in a previous study using 2-
chloroadenosine, a metabolically stable adenosine ana-
logue, and the methylxanthine aminophyline, showed an
anticonvulsant effect of adenosine in limbic seizures in-
duced by pilocarpine and kindling. The pilocarpine model
is a useful animal model to investigate the pathophysio-
logic mechanisms of temporal lobe epilepsy (TLE) (2,26).
Pilocarpine injection (i.p.) induces a sequence of behav-
ioral alterations that progressively culminate in limbic sta-
tus epilepticus (SE). Prolonged SE in rats causes neuronal
death, hippocampal mossy fiber sprouting, and sponta-
neous recurrent seizures (27,28). Here, our purpose was
to characterize the role of adenosine receptors in modu-
lating seizures induced by pilocarpine, as well as to eval-
uate the neuroprotective action of pharmacologic treat-
ments using adenosine-receptor agonists and antagonists.
We also studied the brain’s ecto-5
-nucleotidase activity
in the three phases of this model (i.e., acute, silent, and
chronic).
METHODS
Pilocarpine model
Male Wistar rats, weighing ∼280 g, were housed in
groups of five rats, with free access to food and water,
and kept under a continuous 12 h/12 h light/dark cycle.
The pilocarpine model has been previously described by
Cavalheiro (25). In brief, 30 min after s.c. pretreatment
with N-methyl-scopolamine, 1 mg/kg (used to minimize
the peripheral effect of pilocarpine), a dose of 380 mg/kg
of pilocarpine was injected i.p. After pilocarpine injec-
tion, three phases were observed: (a) acute with SE that
occurred 40–80 min after injection; (b) latent with nor-
mal behavior and EEG (ranging from 4 to 44 days); and
(c) chronic: including rats with spontaneous and recurrent
seizures (60 days). All animal procedures were conducted
in accordance with the local ethics committee for experi-
mental animals.
Pharmacologic treatments
Afirst set of experiments was devoted to investigate
the modulatory effect of adenosinergic agents on SE
occurrence in rats treated with pilocarpine. All drugs were
dissolved in 20% dimethylsulfoxide (DMSO) in sterile
saline, and injected i.p. 15 min before pilocarpine. The
A1 agonist R-PIA [R-N6-(2-phenylisopropyladenosine)],
wasgiven at the dosage of 25 µg/kg (n = 33), and the
antagonist DPCPX (8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine)
wasgiven at the dosage of 50 µg/kg (n = 15). The A2a
agonist CGS 21680 [2-p(-carboxyethyl)phenethylamino-
5`-N-ethylcarboxamidoadenosine] was given at a dosage
of 0.1 mg/kg (n = 20), and the antagonist DMPX
(3,7-dimethyl-1-propargylxanthine) was given at the
dosage of 10 mg/kg (n = 15). The A3 antagonist
MRS-1220 {[9-chloro-2-(2-furanyl)-5-phenylacetyl]-
amino[1,2,4]triazolo[1,5-c]quinazoline} was injected at
a dosage of 1 mg/kg (n = 23). The control group received
only pilocarpine preceded by the vehicle DMSO/saline
(n = 50). After pharmacologic treatments, the behavioral
pattern of the SE (latency and occurrence) was deter-
mined, and the rat’s brains evaluated for apoptosis by the
TUNEL method.
TUNEL method
Forty-eighthours after the adenosinergic treatments, the
animals were anesthetized with pentobarbital and perfused
intracardially with 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS)
followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M sodium phos-
phate monobasic (pH 7.4). The brains were removed and
embedded in paraffin wax and sliced coronally at 8 µm
intervals. We used TUNEL assay to detect apoptotic cells
on brain sections that were visualized by light microscopy
(ApopTag Kit; Intergen Co., U.S.A.). Sections for anal-
ysis were taken from horizontal stereotaxic coordinates
−3.8 mm from bregma, interaural 5.2 (David Kopf In-
struments, Tujunga, CA, U.S.A.), according to the atlas
of Paxinos and Watson (30). Cell counts were performed
within CA1, CA3, and hilus using the Abercrombie (31)
correction.
Measurement of ecto-5
-nucleotidase
We used the pilocarpine model to evaluate the ecto-5´-
nucleotidase activity by histochemistry. After pilocarpine
injection (380 mg/kg),threegroupswithfive rats per group
were studied: 5HSE, silent (7 days), and chronic (60 days).
The control group (n = 5) received saline instead of pilo-
carpine. The ecto-5
-nucleotidase protocol was previously
described by Bailly et al. (32) and Schoen and Kreutzberg
(3). In brief, rats were anesthetized with ether, and their
brains were rapidly removed and frozen in dry ice. Coronal
sections (20 µm) were cut with a cryostat and dried (1
h, room temperature) before fixation for 2 min in 4%
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
168 E. P. M. VIANNA ET AL.
paraformaldehyde diluted in 0.05 M sodium cacodylate
buffer (pH 7.4). The sections were incubated (1 h) in a
solution of Tris-maleate buffer (pH 7.0, 50 mM),1mM
adenosine-5-monophosphate, 2 mM lead nitrate, 5 mM
manganous nitrate, and 0.25 M sucrose. Electron-dense
lead orthophosphate, which precipitates as a result of en-
zyme action, was visualized as a brown deposit, by pro-
cessing for 20 min in 0.2 M trismaleate-sucrose buffer
adjusted to pH 6.5 with 6% aqueous sodium sulfide. Af-
ter rinses in the same buffer, the sections were dehydrated
and mounted for light microscopy. Semiquantitative anal-
ysis of labeled sections was obtained by using a subjective
score: weak, moderate, and intense staining.
RESULTS
Pharmacologic treatments
Behavior analysis
The present study showed that pilocarpine induced SE
in 53% of the animals within 37 min after the injection. A
proconvulsant effect was observed when the animals were
pretreated with DPCPX and DMPX, A1 and A2a antag-
onists, respectively. The antagonists DPCPX and DMPX
precipitated SE in almost all rats injected with pilocarpine
(100% DPCPX; 87% DMPX; p < 0.05) with a reduced
latency (∼11 min; p < 0.01). Pretreatment with the A3
antagonist MRS1220 did not alter the number of rats to
reach SE, but reduced significantly the latency to develop
SE (∼26 min; p < 0.05), showing a proconvulsant effect.
Conversely, the anticonvulsant effect was detected only
with the A1 agonist R-PIA. R-PIA treatment increased
the latency to the appearance of SE (∼57 min) and re-
duced to 26% the number of rats with SE (p < 0.05).
The pretreatment with the agonist A2a CGS21680 did not
modify either the SE-onset latency or the number of rats
with SE. The results can be seen in Fig. 1A and B.
Apoptosis
The neuroprotective effect was observed as the A1 ago-
nist R-PIAdecreasedsignificantly the number of apoptotic
cells in the hippocampal formation, whereas the antago-
nist DPCPX did not show a protective effect. Rats pre-
treated with R-PIA had ∼80% fewer apoptotic cells in all
hippocampal analyzed when compared with pilocarpine-
treated rats. A moderate neuroprotective effect was ob-
served on the CA1 subfield when rats were pretreated with
the A2a agonist CGS21680 (28%; p < 0.05), whereas an
intense neuronal death was observed in CA1 and CA3
(∼80%; p < 0.01) with the A2a antagonist DMPX. Pre-
treatment with the A3 antagonist MRS-1220 did not mod-
ify the number of apoptotic cells in the hippocampus. All
results can be seen in Fig. 2A–C and Fig. 3.
Ecto-5
-nucleotidase activity
Positive ecto-5
-nucleotidase staining was detected dur-
ing silent and chronic phases and was located mainly in
0
20
40
60
80
100
120
Pilo R-PIA DPCPX CGS21680 DMPX MRS1220
Seizure occurrence (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
Pilo R-PIA DPCPX CGS21680 DMPX MRS1220
SE latency (min)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
A
B
FIG. 1. Effects of adenosine agents on status epilepticus in-
duced by pilocarpine in rats. Adenosine agonists (A1: R-PIA;
A2a: CGS21680) and antagonists (A1: DPCPX; A2a: DMPX;
A3: MRS1220) were administered i.p., 15 min before pilocarpine.
A: Occurrence of seizures after pilocarpine injection (percentage
of rats displaying seizures). B: Data showing SE latency (mean ±
SD) in minutes after pilocarpine injection. Statistical compar-
isons were performed based on one-way analysis of variance
(ANOVA) followed by Scheff´e test.
∗
p < 0.05;
∗∗
p < 0.001 vs. Pilo
group.
the hippocampal formation (subfields CA3 and dentate
gyrus), thalamus, and amygdala (Fig. 4C and D). Gen-
erally, ecto-5
-nucleotidase staining seems to be located
in neuropil. The somata are devoid of enzymatic activity.
Most intense staining was observed in the chronic group
and was located mainly in the infra- and suprapyramidal
region of CA3 and in mossy fibers present in the inner
molecular layer of the dentate gyrus (Fig. 4D). Moder-
ate staining can be seen at the same subareas during the
silent phase, whereas a diffuse background staining was
detected in the hilar region of dentate gyrus during the
acute phase (Fig. 4B and C).
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
PROTECTIVE EFFECT OF ADENOSINE IN THE PILOCARPINE MODEL 169
FIG. 2. Apoptotic cells stained by TUNEL
method in CA1 (A), hilus of dentate gyrus
(B), and CA3 (C) of rats submitted to pi-
locarpine (a,e,h) or pilocarpine preceded
by adenosinergic agents R-PIA (b,f,i);
DPCPX (c); DMPX (d,g,j). An increase in
the number of apoptotic cells compared
with control can be seen after DMPX
treatment (d,g,j), whereas a protective ef-
fects was obtained with R-PIA treatment
(b,f,i). Calibration bar, 100 µm.
DISCUSSION
It is thought that adenosine is responsible for inhibiting
seizures because an increased release of adenosine occurs
during seizures (19,33). The present study was done with
the objective of understanding the role of each adenosine-
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
PILO R_PIA DPCPX CGS21680 DMPX MRS-1220
Apoptotic Cell (N∫/mm2)
Hilus
CA1
CA3
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
FIG. 3. Histogram to summarize the
quantitative data of apoptotic cells
in different hippocampal areas (hilus,
CA1, and CA3) of rats submitted
to pilocarpine injection after pre-
treatment with different adenosinergic
agents: R-PIA, DPCPX, CGS21680,
DMPX, and MRS1220. The results
are expressed as means ± SD
(n = 3/group). Statistical analysis was
performed by using analysis of vari-
ance followed by Scheff ´e test.
∗
p <
0.05;
∗∗
p < 0.01 vs. Pilo group.
receptor subtype in pilocarpine-induced seizure modula-
tion. Adenosine receptors A1, A2, and A3 agonists and
antagonists were used for this purpose. The dosage of
each drug was determined in previous studies (34,35). De-
spite the fairly good inverse relation between R-PIA and
DPCPX treatment, the results show that activation of A1
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
170 E. P. M. VIANNA ET AL.
FIG. 4. Histochemical ecto-5´-nucleoti-
dase activity in coronal sections of the
hippocampus of rats processed at dif-
ferent periods after pilocarpine injec-
tion: acute (B), silent (C), and chronic
(D). The arrows (C, D) indicate ecto-
5
-nucleotidase staining coincident with
mossy fiber sprouting. Calibration bar,
100 µm.
receptors has an anticonvulsant and neuroprotective effect
in the pilocarpine model. The pretreatment with R-PIA,
an A1 agonist, reduced SE occurrence and increased its
latency, whereas the antagonist DPCPX was effective in
precipitating SE in almost all rats, with a reduced latency.
This agrees with previously reported data showing an in-
hibitor effect of A1 receptors (22). Khan et al. (22), with
the A1 receptor agonist 2-CADO (2-chloroadenosine), ob-
served a decrease of seizures as well as a decrease of glu-
tamate and dopamine release during seizures induced by
pilocarpine. Other authors showed the anticonvulsant and
neuroprotective effect of A1 adenosine receptor activation
(35–38). The inhibition of glutamate release by presynap-
tic A1-receptor activation and the control of N-methyl-
D-
aspartate (NMDA) receptor by postsynaptic A1 receptors
have been considered the main mechanisms for blocking
seizures and neuroprotection of the hippocampus (22,23).
Conversely, the results of inhibition of A2a receptors
with DMPX increased the occurrence of SE after pilo-
carpine injection. It also decreased the time elapsed for the
SE occurrence. Even though the A2a agonist CGS21680
did not change behavioral patterns, these data suggest a
modulatory role of the receptor A2a on seizures.
Besides the neuroprotective action obtained with the
pretreatment with the A1 agonist receptor R-PIA, a small
neuroprotective effectcouldalso be demonstrated by mod-
ulation of the A2a receptor. Pretreatment with the agonist
CGS 21680 reduced the number of apoptotic cells in CA1
field, whereas the antagonist DMPX increased the cell
death in CA1 and CA3. The results after pretreatment with
A2a-receptor agonists and antagonists are complex and
difficult to understand because A2a receptors have a pro-
convulsant effect and can induce cell death (19,34,39,40).
Cunha et al. (12) showed that CGS 21680 increases
hyperexcitability in the hippocampus. The activation of
A2a receptors has been associated with an increase
of the seizure duration, and evidence indicates that
the antagonists of A2a receptors are potent neuropro-
tectors in different animal models (34,41,42). A2a-
receptors knockout mice have fewer neurologic problems
and strokes (38) and confirm the excitatory and cyto-
toxic effects of A2a receptors. In opposition, injection
of A2a-agonist receptors CPCA [5´-(N-cyclopropryl)-
carboxamido-adenosine] was able to suppress audiogenic
seizures in rats (43), whereas CGS21680 was either not
effective or had weak activity in suppressing bicuculline
seizures (44), and the discrepancies may be due to the
poor permeability of CGS21680 through the blood–brain
barrier, as suggested by Huber et al. (43).
Some authors have suggested that the postsynaptic A1
inhibition could represent one of the main mechanisms by
which A2a receptors induce proconvulsant and cytotoxic
effects (12,40,45). The presence of A1 receptors in the
presynaptic component of the active zone (46) indicates
a strategic role of these receptors in modulation of neuro-
transmitter release and control of NMDA-receptor activa-
tion. However, the neuroprotective effect of A2a antago-
nists seems to be dose dependent. For instance, nanomolar
doses SCH 58261 induce neuroprotection in mice when
the excitotoxin quinolinate is injected (47) and in ischemia
models (41,48). Conversely, if SCH 58261 is administered
at higher concentrations, a blockade of A1 receptors can
occur and cause cell death (49). Because of this mecha-
nism, an increase in hippocampal damage in rats treated
with CGS 21680 before injection of pilocarpine would be
expected. However, our results show neuroprotection with
pretreatment of A2a-receptor agonist CGS21680. Block-
age of peripheral adenosine receptors was not performed
in the present study, and therefore we cannot exclude the
cardiovascular effect on the obtained results.
The role of A2a receptors is more complex than the
role A1 receptors because the former have multiple ben-
eficial and detrimental effects (34). In a literature review,
Mendon¸ca et al. (38) proposed that possible mechanisms
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
PROTECTIVE EFFECT OF ADENOSINE IN THE PILOCARPINE MODEL 171
of ischemic or seizure neuroprotection are the hypoten-
sive and hypothermic effects of adenosine. CGS21680
decreases cerebral glucose utilization in the hippocampus
and in other areas (50), an effect that might be considered
neuroprotective by limiting nutrients during seizures. This
information permits us to hypothesize a similar mech-
anism as responsible for the neuroprotective effect of
CGS21680 in the hippocampus because, as previously
demonstrated, more intense glucose utilization was ob-
served in brain areas exhibiting more vulnerability to dam-
age induced by lithium-pilocarpine (51). An increase in
the number of apoptotic cells was observed with pretreat-
ment with the A2a antagonist DMPX. Therefore in the
present study, the dosage of DMPX used (10 mg/kg) could
be blockingA1receptors.Hence, the observed effect could
be due to this blockage.
Pretreatment with MRS1220, an A3 antagonist, had
a proconvulsant effect because it reduced the time un-
til SE onset. However, A3 antagonist did not change the
hippocampal lesion pattern caused by pilocarpine. Con-
flicting results have been reported regarding A3-receptor
activation. Studies in vitro have shown that these recep-
tors induce or inhibit apoptosis, depending on the dosage
used (52). Conversely, the prolonged use of A3-agonist
IB-MECA in an experimental ischemic paradigm in ger-
bils had a neuroprotective effect (53).
Adenosine has low affinity for A3 receptors, activated
only by high concentrations of adenosine. During seizures,
adenosine can reach very high concentrations (8). Func-
tionally, this is very important, as activation of A3 recep-
tors can reduce adenosine affinity for A1 receptors (18).
The decrease of adenosine affinity for A1 receptors can
contribute to the neuronal excitability during seizures and
can be critical for neuronal damage.
Activation of A3 receptors also is associated with re-
lease inhibition of proinflammatory tumor necrosis factor
(TNF)-α cytokines (54). TNF-α is a mediator of inflam-
matory reaction of the brain and has been released in the
hippocampus after seizures or excitotoxic neuronal dam-
age after ischemia (55–58). Moreover, inhibitor of TNF-α
converting enzyme can attenuate seizure injury of cortex
after pneumococcal meningitis (59). Thus specific A3 an-
tagonist might be very useful in pharmacologic studies
aimed to elucidate the neuroprotective effect of adeno-
sine. In the present study, we used MRS1220 pretreat-
ment in pilocarpine-treated rats to define the role of A3
receptors in modulating seizures and neuronal damage,
and we were unable to detect neuroprotection. Maybe the
small selectivity of MRS1220 to rat A3 receptors can ex-
plain the lack of changes in the lesion pattern observed
in the present study. The drugs MRS1191 and MRS1220
are described as human A3-receptor antagonists. How-
ever, MRS1191 is described as the most selective for A3
receptors (60). New studies with more selective A3 antag-
onists and A3 agonists are under way to understand the
role of adenosine receptors in the pilocarpine model of
epilepsy.
In this study, we also localized by histochemistry the
ecto-5´-nucleotidase activity in the rat brain after SE in-
duced by pilocarpine. The occurrence of positive ecto-
5´-nucleotidase staining was detected during silent and
chronic phases and was located in the hippocampal for-
mation (subfields CA3 and dentate gyrus), thalamus, and
amygdala. In the chronic period rats, histochemical reac-
tion product was detected in the infra- and suprapyramidal
regions of CA3 and in mossy fibers present in the inner
molecular layer of the dentate gyrus. A diffusebackground
staining was detected in the hilar region of the dentate
gyrus during the acute phase. Our results are in accor-
dance with those of Bonan et al. (61), who also detected an
increase in the ecto-5´-nucleotidase in the synaptosomes
of rats during silent period of the pilocarpine model, and
they indicate that the enzyme could contribute to the pro-
duction of extracellular adenosine, as cited previously by
other authors (24).
Wierazco and Seyfried (62) demonstrated in an in vitro
study that ATP is released by electrical stimulation of
Scheffer collateral-commissural afferents. ATP can in-
crease intracellular Ca
2+
in rat brain and can be cytotoxic
by activating microglia (63). In a previous study, we were
able to demonstrate an increase in the expression of the
purinergic P2X7 receptor in the hippocampus of chronic
period rats treated with pilocarpine. This increase was lo-
calized on mossy fibersprouting (64). These data permit us
to hypothesize an interactive mechanism involving ATP,
adenosine, and ecto-5
-nucleotidase on sprouting devel-
opment in the hippocampus of chronic epileptic rats.
These data show that adenosine released during
pilocarpine-induced SE through A1-receptor stimulation
can exhibit neuroprotective and anticonvulsant effects.
Obtained data with A2a and A3 adenosinergic agents
CGS21680, DMPX, and MRS-1220, suggesting similar
effects, must be confirmed by further experiments. Ecto-
5´-nucleotidase activity during silent and chronic phases
might have a role blocking spontaneous seizures by pro-
duction of inhibitory neuromodulator adenosine, besides
taking part in the mechanism that controls sprouting. Ac-
cording to a majority of the authors, the aforementioned
neuroprotective and anticonvulsant effects of adenosiner-
gic agents support a potential role of adenosine as a ther-
apeutic strategy in epilepsy as well as in other neurologic
diseases.
Acknowledgment: The study was supported by funds from
FAPESP, CNPq, CAPES, and PRONEX, Brazil. We thank Hilda
S. Reis for excellent technical assistance.
REFERENCES
1. Abbracchio MP, Cattabeni F. Brain adenosine receptors as targets
for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases. Ann N Y
Acad Sci 1999;890:79–92.
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
172 E. P. M. VIANNA ET AL.
2. Zimmermann H, Braun N. Ecto-nucleotidases: molecular structures,
catalytic properties, and functional roles in the nervous system. Prog
Brain Res 1999;120:371–85.
3. Schoen SW, Kreutzberg GW. Evidence that 5’-nucleotidase is as-
sociated with malleable synapses: an enzyme cytochemical investi-
gation of olfactory bulb of adult rats. Neuroscience 1995;65:37–50.
4. Dunwiddie TV, Masino SA. The role and regulation of adeno-
sine in the central nervous system. Annu Rev Neurosci 2001;24:31–
55.
5. Fastbom J, Pazos A, Palacios JM. The distribution of adenosine A1
receptors and 5´nucleotidase in the brain of some commonly used
experimental animals. Neuroscience 1987;22:813–26.
6. Thompson SM, Haas HL, Gahwiller BH. Comparison of the actions
of adenosine at pre and postsynapticreceptorsin the rat hippocampus
in vitro. J Physiol 1992;451:347–63.
7. Dunwiddie TV. The physiological role of adenosine in the central
nervous system. Int Rev Neurobiol 1985;27:63–139.
8. Dunwiddie TV. Adenosine and suppression of seizures. Adv Neurol
1999;79:1001–10.
9. Fredholm BB, Dunwiddie TV. How does adenosine inhibit trans-
mitter release? Trends Pharmacol 1988;9:130–4.
10. Jarvis MF, Williams M. Direct autoradiographic localization of
adenosine A2 receptors in the rat brain using A2-selective agonist,
[3H]CGS 21680. Eur J Pharmacol 1989;168:243–6.
11. Weiss SM, Benwell K, Cliffe IA, et al. Discovery of nonxanthine
adenosine A2a receptor antagonists for the treatment of Parkinson’s
disease. Neurology 2003;61:S101–6.
12. Cunha RA, Johansson B, Van Der Ploeg I, et al. Evidence for func-
tionally important adenosine A2a receptor in the rat hippocampus.
Brain Res 1994;649:208–16.
13. Lopes LV, Cunha RA, Ribeiro JA. Crosstalk between A1 and A2a
adenosine receptors in the hippocampus and cortex of young adult
and aged rats. J Neurophysiol 1999;82:3196–203.
14. Cunha RA, Ribeiro JA. Adenosine A2a receptor facilitation of
synaptic transmission in the CA1 area of the rat hippocampus re-
quires protein kinase C but not protein kinase A activation. Neurosci
Lett 2000;289:127–30.
15. Richardson PJ, Cunha RA. Extracellular metabolism and function of
purines in immunoisolated cholinergic nerve terminals. Neurochem
Int 1992;21(suppl):Q10.
16. Sebasti˜ao AM, Ribeiro JA. A2 receptor mediated excitatory actions
of adenosine in the nervous system. Prog Neurobiol 1996;48:167–
89.
17. von Lubitz DK, Lin RC, Popik P, et al. Adenosine A3 receptor
stimulation and cerebral ischemia. Eur J Pharmacol 1994;263:59–
67.
18. Dunwiddie TV, Diao L, Kim HO, et al. Activation of hippocampal
adenosine 3 receptors produces a heterologous desensitization of
A1 receptor mediated responses in rat hippocampus. J Neurosci
1997;17:607–14.
19. Etherington LAV, Frenguelli BG. Endogenous adenosine modu-
lates epileptiform activity in rat hippocampus in a receptor subtype-
dependent manner. Eur J Neurosci 2004;19:2539–50.
20. During MJ, Spencer DD. Adenosine: a potential mediator of seizure
arrest and postictal refractoriness. Ann. Neurol 1992;32:618–24.
21. George B, Kulkarni SK. Modulation of lithium-pilocarpine-induced
status epilepticus by adenosinergic agents. Methods Find Exp Clin
Pharmacol 1997;19:329–33.
22. Khan GM, Smolders I, Ebinger G, et al. Anticonvulsant ef-
fect and neurotransmitter modulation of focal and systemic 2-
chloroadenosine against the development of pilocarpine-induced
seizures. Neuropharmacology 2000;39:2418–32.
23. Gouder N, Fritschy JM, Boison D. Seizure suppression by adeno-
sine A1 receptor activation in a mouse model of pharmacoresistant
epilepsy. Epilepsia 2003;44:877–85.
24. Dragunow M. Adenosine and epileptic seizure. In: Phillis JW, ed.
Adenosine and adenine nucleotides as regulators of cellular func-
tion. Boca Raton: CRC Press; 1991:367–79.
25. Cavalheiro EA. Pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci
1995;16:33–7.
26. Mello LEAM, CavalheiroEA, Tan AM, et al. Granule cell dispersion
in relation to mossy fiber sprouting, hippocampal cell loss, silent
period and seizure frequency in the pilocarpine model of epilepsy.
In: Engel J Jr, Wasterlain C, Cavalheiro EA, et al, eds. Molecular
neurobiology of epilepsy. Amsterdam: Elsevier; 1992:51–61.
27. Turski WA, Cavalheiro EA, Schwarz M, et al. Limbic seizures pro-
duced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic
and neuropathological study. Behav Brain Res 1983;9:315–35.
28. Leite JP, Bortolotto ZA, Cavalheiro EA. Spontaneous recurrent
seizures in rats: an experimental model of partial epilepsy. Neurosci
Biobehav Rev 1990;14:511–7.
29. Cavalheiro EA, Calderazzo-Filho LS, Bortolotto ZA, et al. Anticon-
vulsant role of adenosine. PolJPharmacol 1987;39:537–44.
30. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Syd-
ney: Academic; 1986.
31. Abercrombie M. Estimation of nuclear population from microtome
sections. Anat Rec 1946;94:239–47.
32. Bailly YL, Schoen SW, Mariani J, et al. Immature chemodifferen-
tiation of Purkinje cell synapses revealed by 5`nucleotidase ecto-
enzyme activity in the cerebellum of the reeler mouse. Synapse
1998;29:279–92.
33. Rebola N, Coelho JE, Costenla AR, et al. Decrease of adenosine
A1 receptor density and of adenosine neuromodulation in the hip-
pocampus of kindled rats. Eur J Neurosci 2003;18:820–8.
34. Jones PA, Smith RA, Stone TW. Protection against kainite-induced
excitotoxicity by adenosine A2a receptor agonists and antagonists.
Neuroscience 1998;85:229–37.
35. MacGregor DG, Jones PA, Maxwell WL, et al. Prevention by a
purine analogue of kainite-induced neuropathology in rat hippocam-
pus. Brain Res 1996;725:115–20.
36. Brundege JM, Dunwiddie TV. Role of adenosine as a modulator
of synaptic activity in the central nervous system. Adv Pharmacol
1997;39:353–91.
37. Moreau JL, Huber G. Central adenosine A2a receptors: an overview.
Brain Res Rev 1999;31:65–82.
38. Mendon¸ca A, Sebasti˜ao AM, Ribeiro JA. Adenosine does it have a
neuroprotective role after all? Brain Res Rev 2000;33:258–74.
39. Chen JF, Huang Z, Ma J, et al. A2a adenosine receptor deficiency
attenuates brain injury induced by transient focal ischemia in mice.
J Neurosci 1999;19:9192–200.
40. Sebastiao AM, Ribeiro JA. Fine-tuning neuromodulation by adeno-
sine. Trends Pharmacol Sci 2000;21:341–6.
41. Monopoli A, Lozza G, Forlani A, et al. Blockade of adenosine A2a
receptors results in neuroprotective effects in cerebral ischemia in
rats. Neuroreport 1998;9:3955–9.
42. Schwarzchild MA, Xu K, Oztas E, et al. Neuroprotection by caffeine
and more specific A2a receptor antagonists in animal models of
Parkinson’s disease. Neurology 2003;61:S55–61.
43. Huber A, Guttinger M, Mohler H, et al. Seizure suppression by
adenosine A2a receptor activation ina rat model of audiogenic brain-
stem epilepsy. Neurosci Lett 2002;329:289–92.
44. Zhang JM, Wang HK, Ye CQ, et al. Activation of adenosine A1
receptors underlies anticonvulsant effect of CGS21680. Eur J Phar-
macol 1994;255:239–43.
45. Cunha RA, Ribeiro JA. Purinergic modulation of [
3
H]GABA re-
lease from rat hippocampal nerve terminals. Neuropharmacology
2000;39:1156–67.
46. Rebola N, Pinheiro PC, Oliveira CR, et al. Subcellular localization
of adenosine A1 receptors in nerve terminals and synapses of the rat
hippocampus. Brain Res 2003;987:49–58.
47. Popoli P, Pintor A, Domenici MR, et al. Blockade of adenosine A2a
receptors reduces, through a pre-synaptic mechanism, quinolinic
acid-induced excitotoxicity: possible relevance to neuroprotective
interventions in neurodegenerative diseases of the striatum. J Neu-
rosci 2002;22:1967–75.
48. Bona E, Ad´en U, Giland E, et al. Neonatal cerebral hypoxia-
ischemia: the effect of adenosine receptor antagonists. Neurophar-
macology 1997;36:1327–38.
49. Ongini E, Schubert P. Neuroprotection induced by stimulating A1
or blocking A2a adenosine receptors: an apparent paradox. Drug
Dev Res 1998;45:387–93.
50. Nehlig A, Daval JL, Boyet S. Effects of selective adenosine A1
and A2 receptor agonists and antagonists on local rates of energy
metabolism in the rat brain. Eur J Pharmacol 1994;258:57–66.
51. Fernandes MJS, Dub´eC,Boyet S, et al. Correlation between hyper
metabolism and neuronal damage during status epilepticus induced
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
PROTECTIVE EFFECT OF ADENOSINE IN THE PILOCARPINE MODEL 173
by lithium and pilocarpine in immature and adult rats. J Cereb Blood
Flow Metab 1999;19:195–209.
52. Ceruti S, Barbieri D, Franceschi C, et al. Effects of adenosine
A3 receptor agonists on astrocytes: induction of cell protection at
low and cell death at high concentrations. Drug Dev Res 1996;3:
177.
53. von Lubitz DKJE, Lin RCS, Boyd M, et al. Chronic administration
of adenosine A3 receptor agonist and cerebral ischemia: neuronal
and glial effects. Eur J Pharmacol 1999;367:157–63.
54. Sajjadi FG, Takabayashi K, Foster AC, et al. Inhibition of TNF-
alpha expression by adenosine: role of A3 adenosine receptors. J
Immunol 1996;156:3435–42.
55. Lehtimaki KA, Peltola J, Koskikallio E, et al. Expression of cy-
tokines and cytokine receptors in the rat brain after kainic-induced
seizures. Brain Res Mol Brain Res 2003;110:253–60.
56. Vezzani A, Moneta D, Richichi C, et al. Functional role of inflam-
matory cytokines and anti-inflammatory molecules in seizures and
epileptogenesis. Epilepsia 2002:43(suppl 5):30–5.
57. Shandra AA, Godlevsky LS, Vastyanov RS, et al. The role of
TNF-alpha in amygdale kindled rats. Neurosci Res 2002;42:147–
53.
58. De Simoni MG, Perego C, Ravizza T, et al. Inflammatory cytokines
and related genes are induced in the rat hippocampal limbic status
epilepticus. Eur J Neurosci 2000;12:2623–33.
59. Meli DN, Loeffler JM, Baumann P, et al. In pneumococcal menin-
gitis a novel water-soluble inhibitor of matrix metalloproteinases
and TNF-alpha converting enzyme attenuates seizure injury of the
cerebral cortex. J Neuroimmunol 2004;151:6–11.
60. Jacobson KA, Park KS, Jiang JL, et al. Pharmacological character-
ization of novel A3 adenosine receptor-selective antagonists. Neu-
ropharmacology 1997;36:1157–65.
61. Bonan CD, Walz R, Pereira GS, et al. Changes in synaptosomal ec-
tonucleotidase activities in two rat models of temporal lobe epilepsy.
Epilepsy Res 2000;39:229–38.
62. Wierazko A, Seyfried TN. ATP-induced synaptic potentiation in
hippocampal slices. Brain Res 1989;491:356–9.
63. Banati RB, Gerhmann J, Schubert P, et al. Cytotoxicity of microglia.
Glia 1993;7:111–8.
64. Vianna EPM, Ferreira AT, Naffah-Mazzacoratti MG, et al. Evi-
dence that ATP participates in the pathophysiology of pilocarpine-
induced temporal lobe epilepsy: fluorimetric, immunohistochemical
and Western blot studies. Epilepsia 2002:43(suppl 5):227–9.
Epilepsia, Vol. 46, Suppl. 5, 2005
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo