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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
(Convênio UFSCar – UNESP Araraquara)
EFEITOS DOS ESTERÓIDES ANABÓLICOS-ANDROGÊNICOS
(EAA) ASSOCIADOS AO EXERCÍCIO DE CARGA NO
REMODELAMENTO DO TENDÃO DE AQUILES EM RATOS
Rita de Cássia Marqueti
São Carlos - SP
2005
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ii
EFEITOS DOS ESTERÓIDES ANABÓLICOS-ANDROGÊNICOS
(EAA) ASSOCIADOS AO EXERCÍCIO DE CARGA NO
REMODELAMENTO DO TENDÃO DE AQUILES EM RATOS
Rita de Cássia Marqueti
Dissertação de Mestrado apresentada ao
programa de Pós-Graduação de Ciências
Fisiológicas do Centro de Ciências Biológicas e
da Saúde da Universidade Federal de São
Carlos como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Ciências Fisiológicas
.
São Carlos – SP
2005
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
M357ee
Marqueti, Rita de Cássia.
Efeitos dos esteróides anabólicos-androgênicos (EAA)
associados ao exercício de carga no remodelamento do
tendão de Aquiles em ratos / Rita de Cássia Marqueti. --
São Carlos : UFSCar, 2005.
106 p.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2005.
1. Medicina experimental - rato. 2. Esteróides anabólicos.
3. Tendão de Aquiles. 4. Metalopeptidases de matrizes. I.
Título.
CDD: 619.93 (20
a
)
iii
_______________________
Orientadora
Profª. Drª. Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo
iv
Ando devagar porque já tive pressa
E levo esse sorriso porque já chorei demais.
Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe
Eu só levo a certeza de que muito pouco eu sei
Nada sei.
Conhecer as manhas e as manhãs
O sabor das massas e das maçãs
É preciso amor pra poder pulsar
É preciso paz pra poder sorrir
É preciso chuva pra florir.
Penso que cumprir a vida seja simplesmente
Conduzir a marcha, ir tocando em frente
Como um velho boiadeiro levando a boiada
Eu vou tocando os dias pela longa estrada
Eu vou, estrada eu sou.
Conhecer as manhas e as manhãs...
Todo mundo ama um dia, todo mundo chora
Um dia a gente chega, no outro vai embora
Cada um de nós compõe a sua história
E cada ser em si carrega o dom de ser capaz
De ser feliz.
(Renato Teixeira)
v
Dedicatória
Aos meus amados pais, Alfério e Terezinha
por serem os alicerces de cada
etapa sonhada e cumprida
em minha vida...
a infinita gratidão...
vi
Agradecimentos
A conquista de mais uma etapa em minha vida faz parte de um sonho que nasceu
desde que vim Santa Catarina para São Carlos em agosto de 2001. No entanto, este sonho
não é só meu, é também das pessoas amadas que acreditaram em mim e respeitaram a minha
escolha. Este sonho não é só meu, porque não vim sozinha. Além da amiga Araceli, de quem
nunca esquecerei (juntas compartilhamos grandes momentos de nossa vida, fáceis e
difíceis), veio comigo a esperança, a perseverança, a fé, o desejo, a coragem, o desafio, a
saudade... Muita saudade... Viemos encontrar uma oportunidade, procurar uma “porta”...
Que surpresa! Havia uma “porta”... E mais que isso, ao adentrar nesta porta, encontramos
verdadeiros amigos, mãos que se estenderam, braços que aqueceram, palavras que
acalmaram... Mesmo com a vasta bagagem não foi fácil... Momentos difíceis fizeram com
que muitas lágrimas caíssem... Mas confesso, quanto aprendizado! Quanto fortalecimento!
É como a frase que nunca esqueço: ”A vida não é tudo o que se espera, pena de quem não se
considera um aprendiz, tudo vale nada se até o fim da estrada não se chega a ser feliz...” e
como valeu a pena, gostaria de transmitir meus agradecimentos a todos que fazem parte
desta história:
A Deus:
“Por me dar a serenidade para aceitar as coisas que não posso mudar, a coragem para
modificar as coisas que posso e a sabedoria para distinguir a diferença”.
Aos meus pais,
Que são meus queridos mestres...
Aos meus irmãos,
Donaldo e Rafael que estão sempre no meu coração...
Ao Armando,
Pela convivência, amor e paciência e me fazer acreditar que sempre posso ir além daquilo
que planejo...
À minha orientadora,
Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo por ter me acolhido e depositado sua confiança. Pelo
incentivo ao crescimento profissional, pela paciência, amizade e companheirismo em todo
este período. Mulher admirável.
Ao professor,
Sérgio Eduardo de Andrade Perez, pela parceria com o Laboratório de Fisiologia do
Exercício que contribuiu para a realização da pesquisa, pela sua atenção e lições
compartilhadas.
vii
Ao professor,
Nivaldo Antônio Parizotto, do Departamento de Fisioterapia, pela sua grande contribuição
nas análises morfológicas, e acima de tudo pela amizade, dedicação e disponibilidade.
Ao “Cacau”,
Técnico do Laboratório de Fisiologia do Exercício, além da amizade, por todo auxílio,
competência e sua “maravilhosa técnica” de extrair tendões.
Ao Departamento de Hidrobiologia,
Especialmente aos técnicos Amábile e Laércio pela colaboração e dedicação em me ensinar
um pouco de “arte”.
À professora Adriana Carmona e sua aluna Patrícia Bersanetti
Do Departamento de Biofísica e Biologia Molecular – UNIFESP – SP:
Pela colaboração na determinação das concentrações de ECA.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular,
Pela compreensão, carinho, auxílio e troca de experiências. Sou imensamente grata.
A todos que de uma forma ou de outra participaram desta minha trajetória, mesmo de
longe...
Aquele abraço de gratidão...
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS. ........................................................................................ . xi
LISTA DE TABELA............................................................................................ xiii
LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................. xiv
RESUMO ... .................................................................................................... xvii
ABSTRACT... .................................................................................................... xviii
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 4
2.1Histórico dos EAA e sua incidência ............................................................. 4
2.2 Características farmacológicas dos EAA .................................................... 8
2.3 Uso terapêutico dos EAA ............................................................................ 13
2.4 Forma de uso por atletas ............................................................................ 15
2.5 Efeitos desejáveis pelos usuários de EAA .................................................. 17
2.6 Principais efeitos adversos provocados pelos EAA .................................... 20
2.6.1 Efeitos endócrino/reprodutivos em homens e mulheres .......................... 21
2.6.2 Efeitos comportamentais ......................................................................... 21
2.6.3 Efeitos cardiovasculares .......................................................................... 22
2.6.4 Efeitos hepáticos ...................................................................................... 24
2.6.5 Efeitos músculos-esqueléticos ................................................................ 25
2.6.6 Outros efeitos .......................................................................................... 25
2.6.7 Efeitos dos EAA nos tendões .................................................................. 26
2.7 Estrutura e composição dos tendões ......................................................... 28
2.8 Metalopeptidases (MMPs) .......................................................................... 33
ix
2.9 Atividade do Sitema Renina Angiotensina (SRA)........................................ 38
2.9.1 Ang II e homeostasia da MEC ................................................................. 41
2.9.2 Ang II e fibrose ........................................................................................ 42
3 OBJETIVO .................................................................................................... 44
4 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 45
4.1 Animais .................................................................................................... 45
4.2 Plano experimental ..................................................................................... 45
4.2.1 Grupo sedentário ..................................................................................... 46
4.2.2 Grupo treinado ........................................................................................ 46
4.3 Tratamento com EAA ................................................................................. 48
4.4 Protocolo de treinamento ............................................................................ 49
4.5 Sacrifício dos animais, extração do soro e retirada do tendão calcâneo .... 54
4.6 Processamento das amostras .................................................................... 55
4.7 Separação do soro e armazenamento ....................................................... 55
4.8 Análise morfológica e documentação ......................................................... 55
4.9 Dosagem de proteínas ............................................................................... 56
4.10 Determinação da atividade de MMPs por zimografia ............................... 57
4.11 Preparação dos géis de poliacrilamida e de empilhamento ..................... 58
4.12 Determinação de ECA no tendão e no soro ............................................. 59
4.13 Análise estatística .................................................................................... 60
5 RESULTADOS............................................................................................... 61
5.1 Análise morfológica .................................................................................... 61
5.2 Zimografia .................................................................................................. 71
5.3 Concentração de ECA nos tendões e no soro sanguíneo de ratos ............ 74
x
6 DISCUSSÃO .................................................................................................. 75
7 CONCLUSÕES .............................................................................................. 89
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 90
9 ANEXO 1 .................................................................................................... 103
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 – Estrutura hierárquica do tendão. O diagrama mostra a relação
entre moléculas de colágeno, fibrilas, fibras, fascículos e
unidade de tendão....................................................................... 30
Figura 4.1 – Demonstração de uma gaiola comportando cinco animais
durante o período experimental................................................... 46
Figura 4.2 – Demonstração do sistema para o treinamento dos animais;
observa-se um rato durante o treino e que as paredes lisas não
facilitam a realização dos saltos.................................................. 47
Figura 4.3 – Amostra do colete confeccionado para ser utilizado no treino
dos animais, com a carga ajustada de acordo como peso do
animal.......................................................................................... 50
Figura 4.4 – Demonstração do colete acoplado ao corpo do animal de modo
especial para que este não escorregue durante o treinamento... 51
Figura 4.5 – Demonstração do período de repouso entre cada série do
protocolo de treinamento ............................................................ 53
Figura 4.6 – Método de pesagem dos animais em balança digital ................. 54
Figura 5.1 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato,
corado com hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal
do grupo sedentário (GI) ............................................................ 62
Figura 5.2 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato,
corado com hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal
do grupo que recebeu somente EAA (GII) ................................. 64
Figura 5.3 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato,
corado com hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal
do grupo treinado (GIII) .............................................................. 66
xii
Figura 5.4 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato,
corado com hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal
do grupo que associou EAA e exercício (GIV) ........................... 68
Figura 5.5 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato,
corado com hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal
do grupo que associou EAA e exercício (GIV) ............................ 69
Figura 5.6 – Análise da atividade proteolítica do extrato de tendão de rato
por zimografia ............................................................................. 71
Figura 5.7 – Representação gráfica da intensidade média das bandas de
zimografia em unidade arbitrária (UA)......................................... 73
Figura 5.8 – Concentração de ECA (U/µg de proteína) em extrato de
tendão, em 20 minutos de incubação com o Abz........................ 74
xiii
LISTA DE TABELA
Tabela 2.1 – A família das metalopeptidases de matriz ................................... 38
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
µg
µl
µm
α-SMA
Abz
ADH
Ang I
Ang II
AT
1
AT
2
APS
BSA
°C
COFEN
COI
DHEA
DHT
DNA
EAA
– micrograma
– microlitros
– micrômetros
– α actina de músculo liso
– ácido ortoamino benzóico
– hormônio antiduirético
– angiotensina I
– angiotensina II
– receptor de angiotensina tipo 1
– receptor de angiotensina tipo 2
– persulfato de amônia
– soro albumina bovina
– grau Celsius
– Conselho Federal de Entorpecentes
– Comitê Olímpico Internacional
– desidroepiandosterona
– diidrotestosterona
– ácido desoxirribonucléico
– esteróides anabólicos androgênicos
xv
ECA
EDTA
FSH
GnRH
h
HE
HIV
KD
LDL
LH
MEC
mg
min
ml
mM
MMPs
nm
PDGF
PGs
RNA
rpm
SDS-PAGE
SRA
– enzima conversora de angiotensina
– ácido etilenodiaminotetracético
– hormônio folículo estimulante
– hormônio liberador de gonadotrofinas
– horas
– hematoxilina e eosina
– vírus da imunodeficiência humana
– kilo Dalton
– lipoproteína de baixa densidade
– hormônio luteinizante
– matrix extracelular
– miligrama
– minutos
– mililitros
– milimolar
– metalopeptidases de matriz
– nanômetro
– fator de crescimento derivado de plaquetas
– proteoglicanas
– ácido ribonucléico
– rotações por minuto
– sódio dodecil sulfato-poliacrilamida gel eletroforese
– sistema renna angotensina
xvi
TEMED
TIMPs
TGF-β
TRIS
Triton X-100
VEGF
U
UA
UAF
– tetrametiletilenodianina
– inibidores teciduais de metalopeptidases
– fator de crescimento de transformação β
– tris-(hidroximetil)-aminometano
– octilfenoxipolietoxietanol
– fator de crescimento de endotélio vascular
– unidade
– unidade arbitrária
– unidade arbitrária de fluorescência
xvii
RESUMO
O uso indiscriminado de esteróides anabólicos-androgênicos (EAA) tem
sido descrito em diversas situações como causadores de patologias em tendão. O
objetivo deste trabalho foi avaliar o remodelamento de tendão em ratos tratados
com EAA associando exercício de alta intensidade. Os animais foram divididos em
quatro grupos: Grupo I (GI) (sedentário); GII (não treinado, mas recebia injeção de
EAA); GIII (treinado sem EAA) and GIV (treinado e também com injeção de EAA).
O treinamento foi constituído por saltos em meio líquido à 32°C: 4 séries de 10
saltos cada, com intervalo de 30 segundos entre as séries, em 5 dias da semana,
durante 6 semanas, com carga variando de 50 -70 % da massa corporal do
animal. Os EAA (Decadurabolin
®
e Durateston
®
– 5 mg/kg) foram injetados via
subcutânea atravessando o tríceps sural, na pata direita posterior do animal. As
análises morfológicas dos cortes de tendões mostraram que no grupo somente
com administração de EAA a camada mais externa que reveste o tendão ficou
mais espessa apresentando também uma mistura de fibras e fibrose. No grupo
treinado, visualiza-se um grande número de fibroblastos no epitendão. Nos
animais que fizeram associação de EAA e exercício foi encontrado infiltrado
inflamatório na região que recobre o tendão, bem como, áreas com fibrose. O
protocolo de treinamento aumenta a atividade de MMPs (metalopeptidases)
enquanto o tratamento com EAA induz a uma significante diminuição na atividade
de MMPs. Em ambos os grupos que receberam injeção de EAA (GII e GIV),
observou-se aumento na concentração da ECA (enzima conversora de
angiotensina) no soro dos animais. Em conclusão o tratamento com EAA pode
induzir severas lesões no tendão, principalmente quando associado ao exercício,
alterando a quantidade de MMPs e atrapalhando o remodelamento do tecido.
Palavras-chave: esteróides anabólicos-androgênicos, tendão, metalopeptidases,
enzima conversora de angiotensina, remodelamento.
xviii
ABSTRACT
The indiscriminate use of anabolic-androgenic steroids (AAS) is very spread out in
the sportive world. The AAS have been described to induce tendon pathology in
some situations. The aim of this work was to evaluate the tendon remodeling in
rats treated with AAS associated with physical exercise. Male Wistar rats were
divided into four groups: Group I (GI) (sedentary); G II (not trained, but injected
with AAS); G III (trained without AAS) and G IV (both trained and injected with
AAS). The trained groups have carried out jumps in water at 32°C: 4 series of 10
jumps each, with a 30-second interval among series, for 6 weeks, with 50-70%
overload of the animal corporal mass. The AAS (Decadurabolin® and Durateston®
- 5mg/Kg) were injected via subcutaneous intersect the triceps sural on the
posterior right paw. Morphological analyses of the excised tendons showed that in
the group with AAS, the most external layer that covers the tendon was thicker.
Can be a mix interspersed fibers and fibrotic tissue next to the epitendon. In the
trained group, a greater number of young fibroblasts in the region that covers the
tendon was observed. In the group with association of the AAS and exercise an
inflammatory infiltrate was found in the region that surrounds the tendon as well as
some fibrosis areas. By means of zymography of tendon extracts, it was observed
that the exercise up-regulated MMP (metallopeptidases) activity whereas AAS
treatment down-regulated most MMP activity. In both groups had received injection
from EAA(GII and GIV) increase the ACE (angiotensin converting enzyme) level in
the serum of the animals was observed. In conclusion, the AAS treatment can
induce to severe tendon injuries mainly when associated to the exercise modifying
the expression of MMPs and an impaired tissue remodeling.
Keywords: androgenic-anabolic steroids, tendon, metallopeptidases, angiotensin
converging enzyme, remodeling.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
1
1 INTRODUÇÃO
A cada ano os níveis de capacidade dos atletas em vários esportes vêm
melhorando. Os recordes atléticos atingem novas marcas, e as margens entre o
sucesso e o fracasso no mundo do esporte tornam-se cada vez mais estreitas. Na
busca interminável pela glória, os atletas freqüentemente desejam testar qualquer
coisa para melhorar seu desempenho. Muitas substâncias ou fenômenos que
melhoram o desempenho de um atleta são denominados auxílios ergogênicos
(McARDLE, W. et al, 1998; WILMORE & COSTILL, 2001).
Dentre esses recursos, estão os esteróides anabólicos-androgênicos (EAA),
que além de ofuscar o brilho do esporte vêm colocando em risco a saúde de
muitos atletas. Neste contexto, os EAA são os instrumentos para a realização do
presente trabalho já que seu uso indiscriminado está muito difundido no mundo
esportivo.
Os EAA tornaram-se com o passar de vários anos, um método particular na
tentativa de aumentar a força, a massa muscular e a performance atlética. São
usados principalmente por classes de atletas mundiais de competitividade,
halterofilistas ou atletas que desejam melhorar a aparência corporal buscando
continuamente ultrapassar seus rivais (LaBREE, 1991; Miles et al, 1992, LABRE,
2002).
No entanto, o uso de drogas para melhorar a performance não é limitado
somente à elite atlética; muitos adolescentes usam EAA na ilusão de adquirir “o
corpo ideal”. Evidências recentes também sugerem que os EAA estão entre as
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
2
três drogas mais oferecidas para crianças no Reino Unido, perdendo só para a
maconha e anfetaminas (Dawson, 2001).
O uso dos EAA a longo prazo traz um alto risco de doenças somáticas e
efeitos psicológicos adversos. Experimentos evidenciam que a combinação dos
EAA com o exercício pode induzir alterações patológicas em tendões (HATFIELD,
1986; MICHNA, 1987; MILES et al, 1992; MOTRAM; GEORGE, 2000; BAHRKE;
YESALIS, 2004). Alguns casos de ruptura de tendão já foram relatados em
associação com os EAA (STANDART; BUCKNELL, 1993; VISURI; LINDHOLM,
1993, EVANS; BOWREY; NEWMAN, 1998;). Mudanças da morfologia da junção
musculotendínea, similares também às alterações na ruptura de tendão, foram
encontradas quando exercícios eram associados ao uso concomitante de EAA
(LASETER & RUSSELL, 1990). Dosagens suprafisiológicas de EAA parecem
resultar em alterações musculares, ósseas e do metabolismo do colágeno de
tendões (PÄRSSINEN et al, 2000).
Apesar de haver vários estudos mostrando alterações e em geral, o
comprometimento de tendões quando da associação de EAA, é importante
ressaltar que este trabalho se dispõe a estudar aspectos ainda não relatados pela
literatura. Os estudos referentes ao remodelamento do tendão ainda são limitados
e as informações são inconsistentes pela falta da associação de várias variáveis.
Baseado nestas evidências, este trabalho teve por finalidade avaliar o
remodelamento do tendão de Aquiles de ratos submetidos a um treinamento de
alta intensidade associado à administração de EAA (Deca-Durabolin e
Durateston). Introduzimos um protocolo experimental ainda não relatado na
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
3
literatura. Além disso, foi analisado a estrutura do tendão relacionando a
expressão de metallopeptidases (MMPs), que são descritas pela literatura como
principais agentes do remodelamento de tecidos ricos em colágeno como os
tendões (KOSKINEN et al, 2003). É importante ressaltar que ainda não havia
achados científicos que demonstrassem a interação de EAA e MMPs, e neste
aspecto nosso estudo é inovador. Foram analisadas também a ação dos EAA e as
alterações de concentração de ECA no tendão e soro, estes relatos também não
são descritos na literatura, no que diz respeito ao remodelamento do tendão.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico dos EAA e sua incidência
Nos desportos, a constante busca por melhores resultados induz técnicos e
atletas a procurarem formas diversas de melhora da performance. Com isso, os
treinadores buscam constantemente o aprimoramento das formas de treino, bem
como, dos recursos ergogênicos utilizados para tais fins. O uso de alguns destes
recursos são permitidos, outros não, por poderem levar à morte como é o caso
dos EAA (RASSIER et al, 1996).
Além da performance, como diz Pires (2000), a contínua profissionalização
do desporto em todos os níveis, com crescente projeção financeira e social,
propiciada pela prática desportiva, também tem sido valorizada em seus extremos.
O que vem estabelecer a necessidade de um amplo aperfeiçoamento
organizacional, tecnológico, teórico-prático e metodológico. pela comunidade
desportiva.
Os hormônios esteróides são produzidos pelo córtex da glândula supra-
renal e pelas gônadas (ovário e testículo). Os esteróides anabolizantes ou
esteróides anabólicos androgênicos (EAA) referem-se aos hormônios sexuais
masculinos que promovem e mantém as características sexuais associadas à
masculinidade (incluindo o trato genital, características sexuais secundárias e
fertilidade) (SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2004).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
5
Os EAA são um grupo de compostos formados pela testosterona e seus
derivados, que apresentam efeitos anabolizantes e androgênicos (LISE et al,
1999; FONSECA; THIESEN, 2000; MOTTRAM; GEORGE, 2000, SHAHIDI, 2001).
A testosterona é sintetizada desde 1935, e durante a 2ª Guerra Mundial, foi
utilizada pelas tropas alemãs para aumentar a agressividade dos soldados e sua
hostilidade. Até essa época, seu uso terapêutico restringia-se ao tratamento de
pacientes queimados, deprimidos ou em recuperação de grandes cirurgias (LISE
et al 1999, FONSECA; THIESEN 2000).
Em 1939, foi sugerido que sua administração poderia melhorar a
performance de atletas (LISE et al, 1999). Na década de 50, os russos já faziam
uso de EAA no esporte, por levantadores de peso (MOTTRAN; GEORGE, 2000),
mas a primeira referência ao uso de hormônios sexuais para melhorar o
desempenho de atletas ocorreu em 1954, em um campeonato de levantamento de
peso em Viena, sendo que seu uso tornou-se difundido com este fim a partir de
1964 (LISE et al, 1999).
Estudos relatam que os melhores atletas aderiram aos EAA por volta de
1960, nas modalidades de força, como arremessadores e lançamentos no
atletismo. Nos anos 70, o uso já havia se difundido entre velocistas e corredoras
de meia-distância (TODD apud PIRES, 2000). Em 1975, a COI (Comitê Olímpico
Internacional) adicionou os EAA em sua lista de substâncias banidas (MOTTRAN;
GEORGE, 2000).
Os EAA na realidade começaram a ser usados a partir de 1990,
expandindo-se e efetivando-se em várias outras modalidades desportivas tais
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
6
como: voleibol, basquetebol, handebol, ciclismo, natação, ginástica e futebol
(LaBREE, 1991).
Há mais de 30 anos os EAA penetraram em outros esportes olímpicos. O
controle de dopagem para detecção de EAA foram feitos a partir da Olimpíada de
Montreal, em 1976. O caso mais conhecido de uso de EAA foi o do corredor
canadense Ben Johnson, medalha de ouro nos 100m rasos nas Olimpíadas de
Seul, em 1988, cujo exame detectou a presença dos metabólitos do anabolizante
estanozolol (SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2002). No entanto, os primeiros
testes não conseguiam distinguir as diferenças entre os esteróides sintéticos e
endógenos. Este problema foi resolvido nos Jogos Olímpicos de 1984, quando
amostras contendo EAA foram detectadas com auxílio de cromatografia a gás e
espectrometria de massa e razões de testosterona/epitestosterona foram
introduzidos como um indicador do uso de testosterona (MOTTRAN; GEORGE,
2000).
O termo “doping” deriva de um dialeto africano e refere-se a uma bebida
estimulante usada em cerimônias religiosas. O Comitê Olímpico Internacional
define “doping” como o uso de qualquer substância exógena ou endógena em
quantidades anormais com a finalidade de aumentar o desempenho do atleta em
competições. No Brasil, os EAA são considerados “doping” segundo os critérios da
Portaria 531, de 10 de julho de 1985 do MEC (LISE et al, 1999).
Nos Estados Unidos, em 1985, o FDA (Food and Drug Admnistration),
juntamente com o Departamento de Justiça e a Agência Federal de Investigação
Norte-Americana, iniciou suas investigações criminais a respeito do mercado
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
7
negro desses medicamentos (Council on Scientific Affairs). No Brasil, o Conselho
Federal de Entorpecentes (Cofen), que se preocupa com esta questão, em 1995
pediu providências à Secretaria de Vigilância Sanitária, pois os EAA chegavam de
muitas partes do mundo sem qualquer fiscalização (LISE et al, 1999).
Contudo, infelizmente pode-se constatar falhas nesse mecanismo de
fiscalização, já que os EAA podem ser adquiridos facilmente no comércio e em
academias de ginástica. Há vários anos, os EAA junto com os narcóticos, são
utilizados indiscriminadamente por atletas, praticantes de atividade física, e por
adolescentes e crianças para a prática esportiva e recreativa. Isso ocorre devido
ao comércio livre (mercado negro, farmácias de manipulação, farmácias
veterinárias), e à obtenção sem prescrição médica ou com prescrição médica
indevida (SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2004).
Atualmente os maiores usuários são atletas jovens, principalmente homens
com idades entre 18 e 34 anos, que desejam incrementar seu desempenho,
aumentar sua massa muscular e resistência e melhorar a aparência física. Para
isso, usam dosagens muito elevadas, superiores àquelas recomendadas pelos
clínicos, sendo consideradas de grande risco e trazendo sérias conseqüências
para a saúde. Este fato impede os pesquisadores de realizarem estudos com
humanos, pois teriam que aplicar doses muito elevadas. Aparentemente os EAA
aumentam a massa corporal magra, a força e a agressividade, mas muitos
estudos bem controlados não provam essa teoria (FONSECA; THIESEN, 2000).
Muitas evidências que concernem à eficácia dos EAA na melhora da performance
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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são “anedotas”. O potencial ergogênico sugerido para os EAA parece ser ainda
inconclusivo (MOTTRAN; GEORGE, 2000).
De acordo com The National Institute on Drug Abuse (2002), desde a
década de 50, alguns atletas têm usado EAA para aumento da massa muscular e
melhora da performance. Outros segmentos da população também têm usado
estas substâncias. Estudos mais recentes nos Estados Unidos demonstraram
abuso entre estudantes de segundo grau (adolescentes), principalmente no final
da década de 90. Durante este período, a porcentagem dos estudantes que
acreditavam que os EAA causavam grandes riscos à saúde, decaiu de 68% para
62%.
Segundo Lise et al (1999), o maior consumo ocorre entre indivíduos do
sexo masculino, e há relação com a progressão da escolaridade, o que pode ser
devido a mudança de nível de competição. Os atletas semiprofissionais de nível
universitário fazem uso mais intenso de EAA.
2.2 Características farmacológicas dos EAA
A testosterona é o hormônio esteróide androgênico mais importante
produzido pelas células de Leydig nos testículos. No sexo feminino, ela é
produzida em pequena quantidade pelos ovários. No entanto, também pode ser
sintetizado pelo córtex supra-renal em ambos os sexos. No homem adulto normal,
a concentração plasmática de testosterona varia de 300 a 1000 ng/dl e a taxa de
produção diária está entre 2,5 e 11 mg (SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI,
2002).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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Nos mamíferos, a secreção de testosterona é pulsátil e regulada por
retroalimentação negativa. Quando ocorre deficiência de testosterona, há um
estímulo do hipotálamo que, através da secreção de hormônio liberador de
gonadotrofina (GnRH), estimula a glândula hipófise anterior a liberar hormônio
folículo estimulante (FSH), bem como o hormônio luteinizante (LH), que estimula a
secreção de androgênios. O excesso de testosterona suprime a secreção dos
hormônios gonadotróficos e, com isso, ocorre diminuição da produção endógena
de testosterona e da espermatogênese, levando a uma atrofia testicular (LISE et
al, 1999; SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2002).
A síntese dos hormônios androgênios se dá a partir do colesterol, que irá
formar, após sucessivas oxidações, a pregnenolona. A pregnenolona é o principal
precursor dos hormônios esteróides. A conversão do colesterol em pregnenolona
ocorre na mitocôndria, daí a pregnenolona é transportada ao retículo
endoplasmático, onde três etapas de síntese a convertem em testosterona.
Durante o processo de conversão da pregnenolona em testosterona, ocorre a
formação de desidroepiandosterona (DHEA) e androstenediona (SILVA;
DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2002).
A diidrotestosterona (DHT), principal androgênio intracelular presente nos
tecidos reprodutivos, é mais potente que a testosterona. A DHEA, o sulfato de
DHEA e androstenediona são androgênios fracos produzidos pela glândula
adrenal, e exercem uma função menor na manutenção das características sexuais
no homem (FONSECA; THIENSEN, 2000). Aproximadamente 95 % da
testosterona no sangue é ligada à proteína β-globulina e é biologicamente
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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inativa, somente a testosterona livre (2-3% da que está concentrada no sangue) é
ativa (MOTTRAN; GEORGE, 2000). A testosterona é uma molécula com 19
átomos de carbono sintetizada a partir do colesterol (FONSECA; THIENSEN,
2000). A testosterona não é uma substância ativa; na circulação, como já
salientado, age como pró-hormônio para a formação de duas classes de
esteróides: andrógenos 5-α-reduzidos (diidrotestosterona), que são mediadores
intracelulares da maioria das ações androgênicas, e estrógenos (estradiol) que
potencializam alguns efeitos androgênicos, enquanto bloqueiam outros (WU,1997;
LISE et al, 1999).
A testosterona livre pode ter outras ações como, penetrar nas células por
difusão simples e ligar-se a um receptor de esteróide no citosol, o qual é
transportado para o núcleo, onde inicia a transcrição do DNA. Dependendo do tipo
de célula em que se encontra, ela pode na sua forma original sofrer a ação de
enzimas (FONSECA; THIESEN, 2000; MOTTRAN; GEORGE, 2000).
Todos os esteróides anabolizantes sintéticos e semi-sintéticos
comercializados são derivados da testosterona (LISE et al, 1999). Os EAA
possuem dois tipos de efeitos no organismo: promovem o desenvolvimento das
características sexuais secundárias masculinas (efeito androgênico) e aceleram o
crescimento de tecidos incluindo músculos e células sanguíneas (efeito
anabolizante) (FONSECA; THIESEN, 2000; WILMORE; COSTILL, 2001; WOOD,
2004). Os usuários de EAA desejam maximizar seus efeitos anabólicos e limitar
suas ações androgênicas (WOOD, 2004). A diferença entre os diversos esteróides
anabolizantes é a proporção de efeitos androgênicos e anabolizantes
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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apresentada. Estes apresentam várias ações no organismo, classificadas
conforme o local em que são exercidas (MILES et al, 1992; FONSECA; THIESEN,
2000). Os derivados sintéticos da testosterona são modificados estruturalmente
para aumentar as ações anabólicas mais que as ações androgênicas deste
hormônio (MOTTRAM; GEORGE, 2000).
O mecanismo das ações anabolizantes e androgênicas é semelhante,
sendo vários os resultados apresentados pelo órgão onde se processa a atividade
hormonal. Assim, nenhum agente pode ser considerado exclusivamente
anabolizante. Porém, foram feitas muitas alterações na molécula de testosterona
para diminuir os efeitos androgênicos e manter ou aumentar os efeitos
anabolizantes (MILES et al, 1992; FONSECA; THIESEN, 2000).
Os esteróides anabólicos, denominados compostos químicos de derivação
sintética, imitam os efeitos anabólicos da testosterona, enquanto ao mesmo
tempo, minimizam os efeitos androgênicos. Isso só é possível através da
manipulação, em diversas formas, da estrutura da molécula base de
hidrocarboneto da testosterona. A extensão de alterações da relação anabólico-
androgênica é chamada de “índice terapêutico” (HATFIELD, 1986).
De acordo com o The National Institute on Drug Abuse (2002), hoje são
desenvolvidos mais de 100 tipos de esteróides anabolizantes. Nos Estados Unidos
eles requerem prescrição para serem usados legalmente. Porém, muitos EAA são
usados ilegalmente e são sintetizados em laboratórios clandestinos.
Muitos laboratórios ilegais suprem o “mercado negro”. Para fins de doping,
os EAA são usados geralmente por via oral ou parenteral, mas há outras formas
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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de administração destas drogas: via retal, implante de cápsulas, nasal,
transdérmica para suplantar o metabolismo de primeira passagem para o fígado
(LISE et al, 1999; SHAHIDI, 2001). Cientistas alemães desenvolveram um
androgênio nasal spray para aumentar a agressão e a competitividade atlética
sem efeitos sistêmicos (WOOD, 2004)
A indústria farmacêutica, para minimizar ou excluir o metabolismo hepático,
também estudou modificações na estrutura molecular dos compostos, dando
origem a 3 grupos derivados ou 3 classes: Classe A- comporta os EAA produzidos
via esterificação do grupo17β-hidroxil como o propionato, cipionato e enantato de
testosterona. Estes derivados andrógenos são mais solúveis em veículo lipídico,
como aqueles usados para injeções. A testosterona quando injetada em uma
solução de óleo é rapidamente absorvida, metabolizada e excretada. Classe B-
estes análogos são aqueles que tem sido alquilados na posição do carbono 17α,
como a metiltestosterona. Classe C- são EAA produzidos via modificação dos
anéis da classe A ou B como a mesterolona. As duas últimas são usadas nas
preparações via oral e a primeira retarda a metabolização hepática e aumenta a
atividade oral. Estes derivados têm boa absorção gástrica, são excretados
rapidamente, por causa de sua meia-vida curta, sendo altamente potentes, porém
mais tóxicos ao fígado que os injetáveis (LISE et al, 1999; BASARIA;
WAHLSTROM; DOBS, 2001; SHAHIDI, 2001).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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2.3 Uso terapêutico dos EAA
Relatos indicam que na antiguidade, os órgãos sexuais e suas secreções
eram utilizados para o tratamento da impotência e como afrodisíaco. No Final do
século XIX, o fisiologista francês Charles Eduard Brown Séquard experimentou
uma terapia de rejuvenescimento, administrando, em si mesmo, injeções de
extrato líquido derivados de testículos de cães e porcos da índia, e relatou
aumento da sua energia intelectual e força física. (LANCHA JUNIOR., 2002;
BASARIA, WAHTLSTROM; DOBS, 2001; SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI,
2002).
No término da 2ª Guerra Mundial, os androgênios eram utilizados no
tratamento de pacientes em condições terminais relacionadas à debilidade
crônica, bem como no tratamento de queimaduras, na depressão e na
recuperação de grandes cirurgias (SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2002).
Um grande número de estudos clínicos desenvolvidos em diversos desenhos
experimentais mostra que os potentes efeitos dos EAA têm beneficiado vários
pacientes da população (EVANS, 2004).
Um limitado número de esteróides tem sido aprovado para o uso médico e
veterinário. A princípio, o legítimo uso destas drogas em humanos é para
reposição quando há inadequados níveis de testosterona. Também são indicados
para o tratamento de anemia aplásica. Essa aplicação provém de observações de
que o hipogonadismo e a castração estão associados à redução de células
vermelhas, sendo corrigida com a reposição de androgênios. A hemoglobina e o
hematócrito aumentam com a administração de anabolizantes em homens e
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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mulheres eugonadais. O efeito primário dos androgênios sobre a massa de células
vermelhas é o aumento de produção de eritropoietina, mediada por receptores
androgênicos nos rins (LISE et al, 1999; FONSECA; THIESEN, 2000; SHAHIDI,
2001) e aumento da atividade eritropoiética pela medula óssea (SHAHIDI, 2001).
Estudos mostram que análogos da testosterona 5β-reduzidos estimulam a
produção de hemoglobina por mecanismo independente da eritropoietina. Os EAA
mais usados para o tratamento de anemia são: oximetolona, fluoximesterona,
noratandolona, estanozolol e decanoato de nandrolona (FONSECA; THIESEN,
2000)
A Federal Drug Administration, permite que os EAA sejam usados além do
tratamento de certos tipos de anemia, em câncer de mama, angioedema
hereditário, em reações alérgicas provocadas por insetos e em certas viroses
(LaBREE, 1991)
Os EAA são utilizados também em indivíduos masculinos com deficiência
androgênica para a manutenção das características sexuais masculinas, em
crianças com retardo de puberdade e adultos com insuficiência testicular (LISE et
al, 1999; LaBREE, 1991; MOTTAM, 2000; SHAHIDI, 2001). São utilizados no
tratamento da anemia por falência de medula óssea, como já salientado,
mielofibrose e insuficiência renal. Também são úteis na endometriose e
tratamento de osteoporose. Na insuficiência renal aguda causa diminuição da
produção de uréia e, conseqüentemente diminuição da diálise, em alguns
pacientes (LISE et al, 1999; LaBREE, 1991; SHAHIDI, 2001).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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Experimentalmente, os EAA têm sido usados no tratamento de inúmeras
outras desordens, incluindo enfraquecimento progressivo causado pela AIDS.
Também são usados perante sintomas de caquexia, cânceres terminais, para
promover a sensação de bem estar e aumentar o apetite e força (LaBREE, 1991;
BASARIA; WAHLSTROM; DOBS, 2001; SHAHIDI, 2001).
Doses fisiológicas administradas a homens hipogonádicos causam, além de
virilização, ganho de peso e musculatura. O uso de EAA no monitoramento da
hepatite alcoólica leva ao balanço positivo de nitrogênio (FONSECA; THIESEN,
2000).
Outros estudos indicam que o uso de EAA a longo prazo não demonstrou
benefícios em estados catabólicos para a promoção de anabolismo em trauma
grave e depleção protéica associada a doenças crônicas. Por outro lado, é contra-
indicado o uso de EAA em homens portadores de câncer sensíveis (dependentes)
de andrógenos, como câncer prostático e o câncer de mama (que se contradiz
com outros estudos já explanados), e em mulheres gestantes, uma vez que estes
fármacos atravessam a placenta e podem causar masculinização em fetos
femininos (LISE et al, 1999).
2.4 Forma de uso por atletas
A maioria dos usuários (fora dos casos clínicos) acredita que os vários EAA
são diferentes quanto a sua ação e então combinam múltiplas preparações na
forma oral e injetável (visando maiores efeitos). Essa prática denomina-se
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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combinação, acúmulo ou empilhamento (BACURAU, 2001). Outra forma é a
“pirâmide”, onde o EAA é iniciado em baixa dosagem aumentando até atingir um
pico, e depois há um retorno gradual às doses iniciais (HATFIELD, 1987; LISE et
al, 1999). Outros métodos usados são os chamados “ciclos”, onde ocorre o uso
por 6 a 12 semanas (DAWSON, 2001), com interrupção por 3 – 4 semanas e
repetição do ciclo com suspensão do uso semanas antes da competição. Há
também as formas mistas, que é a combinação destes esquemas (LISE et al,
1999). É fundamental salientar que os usuários de EAA, cuja administração é a
injetável, correm o risco de formação de abscessos, de adquirir hepatites B e/ou
C, além da transmissão do HIV (DAWSON, 2001).
Além dos efeitos deletérios atribuídos ao uso/abuso de EAA e seus
similares veterinários, a maioria dos usuários obtém a droga através do “mercado
negro”, cuja origem, qualidade e pureza são questionáveis, sendo alguns tipos de
EAA indicados para uso exclusivamente veterinário (YESALIS, apud PIRES,
2000).
Os pesquisadores WU (1997) e LISE et al (1999), relatam que o padrão de
abuso dos EAA por atletas excede de 10 a 100 vezes os níveis fisiológicos ou as
doses terapêuticas, o que caracteriza dosagens suprafisiológicas, justificando
assim, os efeitos tóxicos adicionais, uma vez que os receptores farmacológicos
específicos são saturados com doses bem inferiores a estas.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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2.5 Efeitos desejáveis pelos usuários de EAA
Estudos indicam que o livre uso de EAA normalmente está relacionado ao
aumento da performance atlética ou melhora de sua aparência física (SILVA;
DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2002; EVANS, 2004; WOOD, 2004), não só de
atletas como de adolescentes, pois estes desejam o “corpo ideal” apresentado
pela televisão, filmes e revistas (LABRE, 2002).
A concentração de receptores androgênicos varia de um grupo muscular
para outro. Em humanos, os músculos da parte superior do braço, peito e costas
são mais responsivos aos EAA que outros músculos (SILVA; DANIELSKI;
CZEPIELEWSKI, 2002).
Apesar de não haver EAA puros, como já salientado, a separação dos
efeitos androgênicos e anabólicos pode ser feita com objetivos didáticos. Dentre
os efeitos anabólicos, destacam-se: o aumento da massa muscular, aumento da
concentração da hemoglobina, do hematócrito, da retenção de nitrogênio, da
deposição de cálcio nos ossos e diminuição das reservas de gordura do corpo
(LISE et al, 1999).
A administração de EAA aumenta a massa muscular isenta de gordura e a
força. Os mecanismos propostos para explicar as ações dos EAA sobre a força e
massa muscular são: aumento da síntese de proteínas; diminuição da degradação
de proteínas, inibição dos efeitos catabólicos dos glicocorticóides; aumento da
taxa de transcrição gênica; efeito sobre o sistema nervoso central e a junção
neuromuscular; melhoria da capacidade de recuperação após exercício intenso
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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(LISE et al, 1999; BACURAU, 2001; WILMORE; COSTILL, 2001) bem como, por
promoverem aumento da eritropoiese, da agressividade e a motivação (SILVA;
DANIELSKI; CZEPIELEWSKI, 2002). Estudos relatam que doses suprafisiológicas
de testosterona podem aumentar o tamanho e massa do músculo e a força em
homens saudáveis quando combinado com treinamento de força (SHAHIDI, 2001).
O aumento da força e massa muscular deveria ser estimulado com exercícios
específicos, treinamento intensivo antes do regime com EAA e continuar o
treinamento durante o uso mantendo uma dieta hipercalórica e hiperprotéica
(MOURA,1984; LISE et al, 1999).
Trabalhos recentes têm demonstrado que os androgênios podem aumentar
a síntese protéica, através da estimulação intramuscular da expressão do gene
para IGF-I (insulin-like growth factor-I) e ainda, que o decanoato de nandrolona
promove aumento da expressão da proteína do choque térmico hsp72 em fibras
musculares de contração rápida, o que contribui para o aumento da tolerância do
músculo ao treinamento de alta intensidade. Essa proteína é usualmente
sintetizada em resposta ao estresse, inclusive o que é causado pelo exercício
físico. Silva; Danielski e Czepielewski (2002) e Lise et al, (1999) salientam ainda
que os efeitos anabólicos ocasionam retenção de nitrogênio, que é um constituinte
básico da proteína, promovendo assim o crescimento e desenvolvimento da
massa muscular através de uma melhor utilização da proteína ingerida. Em
relação aos efeitos anti-catabólicos sobre os tecidos corporais, ocorre porque os
EAA competem pelos receptores dos glicocorticóides que são liberados durante
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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momentos de estresse nos exercícios intensos. Este efeito contribui para o
aumento da massa muscular através da inibição da degradação protéica.
Alguns estudos chamam a atenção quando alegam que com o uso de EAA
ocorre melhora da capacidade aeróbia, bem como facilitam a recuperação de
períodos pós treinamento, permitindo aos atletas treinarem intensamente nos dias
subseqüentes (WILMORE; COSTILL, 2001).
A questão mais difícil em relação aos EAA é se eles realmente funcionam
principalmente em relação ao ganho de força muscular, pois há muitos mitos por
trás desta questão. Muitos dos estudos realizados pertinentes ao assunto
apresentam deficiências quanto à sua elaboração/execução. Assim, muitas
questões sobre os EAA são bastante complexas. A comunidade médica, por muito
tempo, se recusou a reconhecer que essas substâncias possuíam algum efeito
positivo, enquanto defendem a existência dos efeitos colaterais. No entanto, os
atletas possuíam opinião contrária. Isso se dá pelas diferenças das doses
analisadas nos estudos e as utilizadas pelos usuários de EAA, sendo que os
usuários consomem doses até 100 vezes maiores do que as avaliadas nos
estudos. Sendo assim, muitos estudos demonstraram efeitos positivos dos EAA
sobre força e massa muscular Outros, entretanto, demonstraram não haver efeito
algum (BACURAU, 2001).
LaBree (1991) salienta que os efeitos positivos (reais ou imaginários) dos
EAA são controversos. O que é evidente para os atletas não tem sido
substancialmente evidente para os testes científicos.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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Também, Lise et al (1999) ressaltam as discussões quanto à eficácia dos
efeitos dos EAA em aumentar a força física, pois é reconhecido que estes
aumentam a força muscular através de efeitos psicológicos, e há dúvida de que os
EAA melhorem a força na ausência de exercícios concomitantes.
2.6 Principais efeitos adversos provocados por EAA
Os efeitos adversos físicos e psicológicos dos EAA permanecem
incompletamente documentados, havendo mais comumente envolvimento
hepático, endócrino, músculo-esquelético, cardiovascular, imunológico,
reprodutivo e psicológico que podem ser divididos em efeitos virilizantes,
feminilizantes e tóxicos, mediados por mecanismos incertos (LISE et al, 1999).
Estudos relacionados ao mau uso destas drogas a mudanças súbitas de
temperamento e síndromes comportamentais há muito tempo vem sendo
pesquisadas dentro e fora dos esportes (SILVA; DANIELSKI; CZEPIELEWSKI,
2002).
Para Wu (1997), os efeitos adversos do abuso dos EAA dependem da
idade e sexo dos indivíduos, da duração e exposição total da dose e do tipo de
esteróide usado. Além do mais, com o uso prolongado das doses farmacológicas
dos EAA pode se considerar o aparecimento das mais sérias conseqüências.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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2.6.1 Efeitos endócrinos/reprodutivos em homens e mulheres
Dentre os efeitos colaterais citados pela literatura, destaca-se em homens
adultos e adolescentes a redução da produção de espermatozóides, atrofia dos
testículos, impotência, dificuldade ou dor ao urinar, alopecia, ginecomastia,
priapismo, acne, hipertrofia prostática, carcinoma prostático. Em garotas e
mulheres adultas observa-se desenvolvimento de características masculinas,
como diminuição da gordura corporal e tamanho dos seios, voz mais grave,
hirsutismo, irregularidades menstruais, aumento do clitóris, alteração na
libido,alteração do metabolismo glicídico (resistência à insulina, intolerância à
glicose), alteração do perfil tireóideo (diminuição T
3
, T
4
, TSH). Em adolescentes de
ambos os sexos: fechamento prematuro das epífises ósseas, virilização
irreversível (MOURA,1984; HATFIELD, 1986; LaBREE, 1991; WU,1997; LISE et
al, 1999; BACURAU, 2001; DAWSON, 2001; The National Institute on Drug
Abuse, 2002).
2.6.2 Efeitos comportamentais
Estudos clínicos têm descrito que o abuso de EAA em humanos, pode
causar severos efeitos físicos, porém a literatura tem relatado também efeitos
adversos à saúde mental como: euforia, irritabilidade, hiperatividade, tensão
nervosa, mudanças na libido, hipomania, mania, psicose (MARTÍNEZ-
SANCHIS, 1998; LINDQVIST et al, 2002).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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Esteróides aumentam a agressividade e a excitabilidade, aumentam a
energia, evocam euforia sexual, mudanças dramáticas no humor, distração e
problemas cognitivos relacionados com a memória e orientação (VETULANI,
2001). Corrigan (1996) divide os efeitos psicológicos em três grupos
representando efeitos continuados provocados por EAA: a) de imediato são vistas
a mudança de humor e a euforia: há melhora da confiança, energia e auto-estima,
com aumento da motivação e do entusiasmo. Ocorre diminuição da fadiga, insônia
e habilidade para treinar com dor, irritação, raiva, agitação; b) depois de altas
doses de EAA ocorre a perda da inibição, com alterações no humor; c) os efeitos
graves se manifestam quando esses sentimentos de agressividade evoluem para
comportamentos violentos, hostis e anti-sociais. Os ataques de fúria vão desde o
abuso infantil até os suicídios e assassinatos.
2.6.3 Efeitos cardiovasculares
De acordo com Evans (2004), severos efeitos adversos induzidos pelos
EAA tem sido reportados na literatura, incluindo a hipertensão, hipertrofia do
ventrículo esquerdo, pressão diastólica alterada, arritmias, eritropoiese, perfil das
lipoproteínas alterado e trombose. Entretanto, segundo este autor, parece que a
incidência de eventos cardiovasculares induzidos por EAA não é bem conhecida,
sugerindo que os riscos podem ser ainda maiores.
Trabalhos na literatura têm relacionado o abuso de EAA por atletas jovens,
do sexo masculino, com diversos eventos cardiovasculares adversos, como
predisposição ao mecanismo de hipercoagulabilidade, ao aumento da agregação
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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plaquetária e à diminuição da fibrinólise; alargamento da parede ventricular
esquerda; aumento da espessura do septo interventricular e do índice da massa
do ventrículo esquerdo, porém com preservação das funções sistólicas e
diastólicas normais; trombose ventricular e embolismo sistêmico; cardiomiopatia
dilatada, infarto agudo do miocárdio por oclusão da artéria descendente anterior e
morte súbita por hipertrofia ventricular esquerda (SILVA; DANIELSKI;
CZEPIELEWSKI, 2002). Os fatores de risco cardiovasculares podem levar a
alterações deletérias. Em ecocardiografia, estudos em animais têm demonstrado
que os EAA induzem alterações na estrutura e função do coração (HARTGENS,
2004).
Os efeitos fisiológicos e farmacológicos dos EAA na estrutura e função
arterial também têm sido evidenciados, como as implicações pró-aterogênicas.
Evidências sugerem que os andrógenos provocam adesão de monócitos em
células endoteliais, além de alterações na parede de artérias (SADER et al, 2001).
A retenção hidrosalina é um mecanismo freqüente na utilização de
corticóides e anabolizantes. Os anabolizantes provocam uma redução da
eliminação urinária de sódio, de potássio, de cloro e água. Os efeitos da retenção
hidrosalina causam hipertensão arterial e a insuficiência cardíaca. A insuficiência
cardíaca provocada por anabolizantes é certamente favorecida por uma fibrose
miocárdica induzida (GAUTHIER, 2001; HATFIELD, 1986).
O uso abusivo de EAA causando efeitos crônicos como, hipertrofia da
musculatura cardíaca é bem conhecida. Estudos revelam casos de morte por
parada cardíaca de halterofilistas que fizeram uso de EAA. A autópsia mostrou
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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principalmente hipertrofia cardíaca, mudanças estruturais nas artérias coronárias;
trombose intracoronariana e infarto do miocárdio, trombose ventricular e
embolismo sistêmico (TISCHER; HAUSSEN; DOENECKE, 2003). Além disso,
Zaugg et al (2001) constataram que os EAA induziam apoptose em miócitos
ventriculares, de ratos adultos in vitro.
Outros pesquisadores observaram uma inflamação significante no
pericárdio e miocárdio com a administração de EAA e que este fator pode causar
arritmia cardíaca em atletas que fazem uso destas drogas, além de grandes
alterações deletérias no coração. Há evidências de que a capilaridade cardíaca é
afetada aumentando ainda mais os danos ao miocárdio e ao pericárdio
(TAKAHASHI; TATSUGI; KOHNO, 2004),
2.6.4 Efeitos hepáticos
A estrutura do fígado e sua função também podem ser alteradas pela
administração de EAA; estas mudanças incluem icterícia colestática, peliose
hepática, hiperplasia hepatocelular e adenomas hepatocelular (HATFIELD, 1986;
LABREE, 1991; LISE et al, 1999; MOTTRAN; GEORGE, 2000; SHAHIDI, 2001;
BAHRKE; YESALIS, 2004). Os EAA podem induzir um aumento das enzimas no
fígado como: alanina e aspartato-aminotransferase, mas estes efeitos são
tipicamente vistos com a administração oral dos EAA 17α- alquilados (PAVLATOS
et al, 2001). Quando a molécula de testosterona é modificada para 17α-
alquilados, um grupo metil (CH
3
) é introduzido na posição do C17α. São produtos
que iniciam sua atividade oralmente (SHAHIDI, 2001). Estes compostos são
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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altamente hepatotóxicos. Podem ser observadas falhas na função do fígado e
necrose hepática quando da administração destas drogas. O índice tumoral
aparece com o aumento da duração e extensão da exposição (PAVLATOS et al,
2001).
2.6.5 Efeitos músculoesqueléticos
Outros efeitos são relatados, como nos músculoesqueléticos, necrose
avascular da cabeça do fêmur e aumento de lesões músculotendíneas
(HATIFIELD, 1986; LASETER; RUSSELL, 1990; VISURI; LINDHOLM, 1993;
BEINER, 1999; EVANS, 1998; LISE et al, 1999; BACURAU, 2001; DAWSON,
2001). Ao interromper o uso de EAA, geralmente ocorre o enrijecimento da
articulação acompanhado de fortes dores. Muitos usuários de EAA passam a
experimentar um número de lesões acima do normal, alguns estudos
eletromiográficos indicam que os aumentos de volume produzidos por esteróides
resultam em um tecido “anormal” que pode ser estruturalmente mais fraco
(HATFIELD, 1986).
2.6.6 Outros efeitos
É possível a transmissão de HIV e hepatite por compartilhar agulhas, maior
risco para doenças malignas, bem como, os EAA podem piorar ou induzir apnéia
obstrutiva do sono (LISE et al, 1999).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
26
2.6.7 Efeitos dos EAA em tendões
Muitos estudos evidenciam que a combinação de EAA e exercícios pode
induzir patologia de tendão (VISURI; LINDHOLM, 1993; INHOFE, 1995). Miles et
al (1992) trataram ratos com EAA associando ao exercício (corrida). Eles
mostraram através da microscopia eletrônica, displasia do colágeno nos grupos
tratados com exercício e EAA associados, a presença de um tendão mais rígido e
com menor alongamento.
Experimentos indicam que a administração de EAA com exercícios produz
aumento da área de secção transversa e reduz a flexibilidade dos tendões por
diminuir o limite de alongamento e aumentar a rigidez na região. A máxima força
que o tendão pode suportar parece não ser afetada. Porém a energia que o
tendão pode absorver antes da falha é diminuída devido à redução da
flexibilidade. Este estudo mostrou um aumento do diâmetro das fibrilas de
colágeno e maior síntese de colágeno, o que pode aumentar a rigidez (MILES et
al, 1992).
Mottran e George (2000) citam que o aumento da força é muito maior no
músculo do que nos tendões, já que estes respondem lentamente ao regime de
força, e que os EAA têm pouco ou nenhum efeito sobre a força nos tendões.
Conferem ainda que os EAA podem inibir a síntese de colágeno tanto em
ligamentos quanto em tendões, e induzir mudanças no arranjo das fibrilas de
colágenos nestes últimos, levando a alterações críticas da plasticidade tendínea.
Moura (1984), salienta que o aumento da ocorrência de traumatismos nos
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
27
ligamentos e tendões resulta de um desenvolvimento insuficiente destes com
relação ao rápido aumento de força do músculo.
Rupturas de tendões têm sido evidenciadas nas extremidades superiores e
inferiores de atletas e levantadores de peso que usam EAA. Novamente é
sugerido que o risco de lesões nos tendões está associado ao aumento da massa
e força muscular que aumenta a sobrecarga sobre tendões (MILES et al, 1992).
Visuri e Lindholm (1993) e Evans; Bowrey e Newman (1998), também
relatam evidências experimentais que a associação de exercícios com EAA
induzem patologia de tendão e ruptura do mesmo associado ao uso de EAA.
A literatura confere que os EAA administrados em altas doses associados a
exercícios promovem displasia nas fibras de colágeno (KARPAKKA; PESOLA;
TAKALA, 1992; EVANS; BOWREY; NEWMAN, 1998) e que o grau da displasia
pode indicar lesões caracterizadas pela redução da força de tensão do tecido
afetado (MICHNA, 1987).
Outros estudos indicam que tratamento com EAA em animais estimula a
síntese de colágeno, além de proporcionar aumento do diâmetro da fibrila do
mesmo e acentua a acumulação de colágeno na matriz extracelular (MICHNA,
1986).
De acordo com Pärssinen et al (2000), altas doses de EAA parecem
diminuir a degradação e aumentar a síntese de colágeno tipo I. Os EAA podem se
ligar a receptores glicocorticosteróides. O aumento da síntese de colágeno
principalmente em tecido conectivo frouxo ocorre possivelmente pela reversão da
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
28
ação dos glicocorticosteróides no metabolismo do colágeno. Os corticosteróides
inibem a síntese de colágeno tipo I e III.
2.7 Estrutura e composição dos tendões
A maioria dos tendões é constituída por feixes de fibras colágenas
predominantemente do tipo I, densamente agrupadas e organizadas
(SUMMERS; KOOB, 2002) Fileiras de fibroblastos se alinham entre os feixes de
colágenos (KESSEL, 2001). Tendões são tecidos que transmitem tensão dos
músculos para ossos, ou seja, são condutores de força, e assim produzem o
movimento (ALTER, 1996; KER, 2002; KOOB; SUMMERS, 2002; MAGANARIS;
PAUL, 2002; RITTY; HERZOG, 2003), ou ainda, o tendão é um feixe inelástico
de fibras de colágeno arranjadas paralelamente na direção da aplicação da
força do músculo (HAMILL; KNUTZEN, 1999).
As fibrilas que formam o tendão são virtualmente orientadas em uma
direção, ou seja, são direcionadas ao longo do eixo que é também a direção do
estresse fisiológico normal. Dessa forma, o tendão é especialmente adaptado
para resistir ao movimento em uma direção (ALTER, 1996). Os fibroblastos
(tenócitos) continuamente monitoram a magnitude e a direção desta força
(KOOB; SUMMERS, 2002) sintetizando e mantendo vários elementos da MEC,
incluindo colágeno, proteoglicanos e outras proteínas (MAGNUSSON;
HANSEN; KJÆR, 2003).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
29
Os tendões consistem em uma estrutura hierárquica de tecido conjuntivo
que contém moléculas de colágeno, fibrilas, fibras, fascículos e unidades de
tendões (SILVER; FREEMAN; SEEHRA, 2003; KJÆR, 2004). O tecido
conjuntivo dos tendões tem um arranjo similar ao arranjo dos músculos (Fig.
2.1) com nomes análogos: endotendão, que circula a fibra de colágeno;
peritendão, que circula o fascículo do tendão e o epitendão que circula o tendão
inteiro (ALTER, 1996).
F
Figura 2.1 Estrutura hierárquica do tendão. O diagrama acima
mostra a relação entre moléculas de colágeno, fibrilas, fibras,
fascículos e unidade de tendão. Modificado da fonte: SILVER;
FREEMAN; SEEHRA. Journal of biomechanics. v. 36, 2003.
Molécula colágeno Fibrila colágeno Fibra colágeno Fascículo Tendão
Fibroblasto
Nervo e vaso
sanguíneo
Endotendão
α2
α1
280nm
Crimp
Molécula colágeno Fibrila colágeno Fibra colágeno Fascículo Tendão
Fibroblasto
Nervo e vaso
sanguíneo
Endotendão
α2
α1
280nm
Crimp
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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Os tendões são constituídos de 55-70% de água, e uma substancial parte
desta está associada com proteoglicanos (PGs) na matriz extracellular (MEC).
No tendão seco, cerca de 60-85% é de colágeno (predominantemente do tipo I)
arranjado em fibras resistentes à tensão e composto de 2 cadeias α
1
e uma
cadeia α
2
. O tendão também contém colágeno do tipo III (0-10%), IV (∼ 2%), V e
VI. Há elastina (∼ 2% do peso seco) e muito pouca substância inorgânica (<
0,2%). O restante das substâncias (∼ 4,5 %) consiste de diferentes proteínas
(KJÆR, 2004).
O tecido tendíneo tem suas células cercadas por matriz extracelular (ECM)
(WAGGETT et al, 1998) descrita como um gel aquoso dominado por colágeno
(KER, 2002).
Em relação a muitos tecidos orgânicos, os tendões têm baixa celularidade e
a força é transmitida através de uma rede densa de fibras de colágeno do tipo I,
altamente alinhada ao longo do eixo de força, suplementado por várias PGs e
outras proteínas não colagenosas (RITTY; HERZOG, 2003).
O tendão contém uma variedade de PGs incluindo decorim e outras
pequenas PGs ricas em leucina, bem como hialuronam, biglicanas,
fibromodulinas luminicanas e queratocanas. Estudos indicam que as interações
entre o colágeno e as PGs são um importante aspecto para o desenvolvimento
do tendão. Recentemente tem sido proposto que pequenas proteoglicanas
atuam na organização do tecido, orientação e ordenamento das fibrilas de
colágeno (BUCHANAN; MARSH, 2002; SILVER; FREEMAN; SEEHRA, 2003).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
31
As PGs nos tecidos têm ainda um papel de lubrificar e de dar espaçamento,
bem como permitir a fusão fibrilar (KJÆR, 2004). Essa lubrificação é importante
para permitir o livre deslizamento das fibras e fibrilas próximas umas das outras
e talvez previna a formação excessiva de ligações cruzadas (ALTER, 1996).
Comparando com os músculos, os tendões possuem uma vasculatura
relativamente limitada, a área ocupada por vasos sanguíneos representa ∼1-2%
de toda a MEC. Os vasos emanam principalmente para o epitendão, os vasos
longitudinais correm pelo epitendão. Estudos em humanos têm demonstrado
que o exercício físico pode aumentar o fluxo sanguíneo dentro e ao redor do
tecido conjuntivo de tendões (KJÆR, 2004). Durante longo período de
treinamento um dos maiores papeis do fluxo sanguíneo está no reparo do
tendão atuando como mediador inflamatório (MAGNUSSON; HANSEN; KJÆR,
2003).
O estresse tênsil máximo que um tendão pode suportar na vida depende da
sua área de secção transversa. Os tendões sujeitos a estresse intenso são os
que atuam durante os saltos em animais e humanos (KER, 2002) e aqueles
sujeitos a baixo estresse funcionam como transmissores de força
(MAGANARIS; PAUL, 2002).
As propriedades mecânicas dos tendões são uma conseqüência direta dos
componentes constituintes e de como estes são arranjados (SILVER;
FREEMAN; SEEHRA, 2003). As fibras dos tendões e ligamentos contém
principalmente colágeno do tipo I, que é altamente resistente à tensão. As fibras
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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32
de colágeno resistem à tensão de deformação e são responsáveis pela força e
rigidez do tecido.
As moléculas de colágeno se alinham para produzir as características do
arranjo alternado e formar ligações cruzadas entre as moléculas com o
aumento da estabilidade. Este auto-alinhamento das moléculas de colágeno
forma fibras que originam tecidos fortes e rígidos (CAWSTON, 1996).
Em relação ao tipo de ligações cruzadas, foram encontradas oito ligações
aldeminas ou cetoaminas entre duas moléculas paralelas de colágeno de
tendões em cultura. Em tendões, as ligações aldeminas são as predominantes
(KER, 2002). A habilidade das moléculas do colágeno se reunirem dentro de
fibrilas em ligações cruzadas é um importante requerimento para o
desenvolvimento da força tecidual (SILVER; FREEMAN; SEEHRA, 2003;
KJÆR, 2004).
Pesquisadores especulam que o número de ligações cruzadas está
relacionado com a renovação do colágeno. Se a produção de colágeno excede
a decomposição, mais ligações cruzadas são estabelecidas e a estrutura torna-
se mais resistente ao alongamento. Estudos afirmam ainda que o exercício ou a
mobilização pode diminuir o número de ligações cruzadas, aumentando a taxa
de renovação do colágeno (ALTER, 1996).
A maior diferença entre a cartilagem e o tendão ou ligamento é o arranjo de
suas fibras colágenas. Nos tendões as fibras colágenas se encontram juntas
em paralelo e nos ligamentos estão menos alinhadas. O arranjo paralelo produz
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
33
uma estrutura muito resistente e com alta força de tensão, porém pouco
resistente à compressão ou cisalhamento. As fibras colágenas possuem uma
aparência ondulada. Quando um tendão é puxado com uma força tênsil baixa, é
alongado facilmente e se comporta como um bom material elástico (McGINNIS,
1999). Em níveis baixos de tensão, a estrutura ondulada dos feixes de colágeno
do tendão ajusta-se, permitindo uma deformação rápida e leve. Dentro desse
limite de cargas, o tendão irá retornar para seu comprimento original quando
descarregado. Porém em cargas maiores que esses limites, mudanças
permanentes no comprimento irão ocorrer, acompanhadas de microtrauma para
a integridade da estrutura do tendão (ALTER, 1996).
Embora as fibras sejam inelásticas, o tendão pode responder de modo
elástico pelo recuo e elasticidade do tecido conjuntivo. Os tendões podem
suportar altas forças tensoras produzidas pelos músculos e apresentar um
comportamento viscoelástico em resposta à carga. O tendão de Aquiles, de
acordo com relatos, pode resistir a cargas tensivas iguais ou maiores que o aço
de dimensões similares (HAMIL; KNUTZEN,1999).
2.8 Metalopeptidases (MMPs)
Uma variedade de enzimas tem o papel de promover o turnover da MEC de
todos os tecidos ricos em colágeno como os tendões (KOSKINEN et al, 2004).
A manutenção da integridade da matriz envolve a síntese e a degradação da
maioria de seus componentes incluindo, colágeno, glicoproteínas,
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
34
glicosaminoglicanos e proteoglicanos (GONZÁLEZ et al, 2002). A organização
da MEC envolve um equilíbrio entre fatores estimuladores e inibidores,
operando para governar o comportamento celular e o remodelamento da MEC
que inclui funções metabólicas integrais para o turnover do colágeno fibrilar e a
deposição e reabsorção de tecido (WEBER, 1999).
Um sistema descrito como essencial para todos os tecidos, é a expressão
de destas enzimas proteolíticas extracelulares que efetuam o remodelamento
tecidual. Estas proteínas possuem uma série de funções como defesa
antimicrobiana, liberação de fatores de crescimento e modulação e renovação
da MEC. Uma classe destas enzimas é a das metalopeptidases de matriz
(MMPs). Já foram descritos 25 genes de MMPs, a maioria delas com o
potencial de atuar sobre a MEC rica em colágeno como a encontrada nos
tendões (RITTY; HERZOG, 2003).
As metalopeptidases são uma família de proteinases que regulam eventos
fisiológicos e relacionados ao desenvolvimento. São enzimas importantes para
a migração, invasão, proliferação e apoptose celular. Elas regulam muitos
processos incluindo morfogênese, angiogênese, cicatrização de feridas e
degradação da MEC (VU; WERB, 2000). Também desenvolvem um papel
importante durante os processos inflamatórios na tentativa de combater a lesão
e manter a homeostasia do tecido (SZABO; ABLIN; SINGH, 2004).
Ainda, as MMPs são um grupo de endopeptidases dependentes de cálcio
(Ca
2+
) ou zinco (Zn
2+
) que participam da degradação e remodelamento da MEC
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
35
(BIRKEDAL-HANSEN, 1995; CAWSTON, 1996; VU; WERB, 2000; OSHIRO, et
al 2003; MOTT; WERB, 2004; GEORGE; DWIVEDI, 2004; ORTEGA, 2004;
COLLINS et al, 2005). As MMPs podem alterar as funções biológicas das
moléculas da ECM (SZABO; ABLIN; SINGH, 2004). São consideradas como
“enzimas de limpeza” da MEC, papel muito importante durante a migração
celular, pois, degradam uma grande variedade de substratos da MEC, incluindo
moléculas colagenosas e não colagenosas (VU; WERB, 2000).
Assim como outras enzimas proteolíticas, as MMPs são primeiramente
sintetizadas como pró-enzimas inativas ou zimogênios (STERNLICHT; WERB,
2001, JACOB, 2003, OSHIRO et al, 2003) e secretadas por vários tipos de
células, incluindo células mesenquimais, células T, monócitos, macrófagos,
neutrófilos, queratinócitos e células tumorais (PENDER; MacDONALD, 2004).
As MMPs podem ser ativadas por clivagem do pró-peptídeo por membros da
família das MMPs ou por outras proteases e podem ser inibidas por inibidores
teciduais de MMPs (TIMPs) (VU; WERB, 2000; NGUYEN et al, 2001), que se
ligam aos domínios catalíticos das MMPs. As MMPs possuem três domínios:
um peptídeo sinal que direciona o produto translacional para o retículo
endoplasmático para a secreção; um domínio pró-peptídeo que é removido
quando a enzima é ativada e um domínio catalítico que contém 2 íons Zn
2+
e
um íon Ca
2+
, que são envolvidos nos processos catalíticos. O domínio C-
terminal tem um importante papel na ligação com o seu substrato e/ou interação
com os TIMPs (NGUYEN; ARKELL; JACKSON, 2001).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
36
No tendão, as MMPs são produzidas pelos fibroblastos do epitendão. A
degradação do colágeno é iniciada na MEC por metalopeptidases que estão
presentes nos tecidos quase sempre na forma latente de pró-MMPs (KJÆR,
2004).
A excessiva ou inapropriada expressão de MMPs pode contribuir com
patogêneses em processos de destruição tecidual (PENDER; MacDONALD,
2004), incluindo artrites, esclerose múltipla, cárie dentária, bem como, levar a
morte por desenvolvimento de doenças cardiovasculares (aterosclerose,
rupturas de placas e formação de aneurismas), progressão de tumores e
doença pulmonar obstrutiva crônica (SHAPIRO, 1998).
Mais de 25 MMPs humanas foram identificadas e podem ser divididas
em subclasses de acordo com o seu substrato específico: colagenases (MMP-
1, -8, -13 e -18), gelatinases (MMP-2 e -9), estromelisinas (MMP-3, -7, -10 e -
11), elastase (MMP-12), tipo membrana (MMP-14, -15, -16, -17, -24 e -25) e
outras (MMP-19, -20, -23, -26, -27 e -28) (PENDER; MacDONALD, 2004). Os
substratos e a produção de células (Tabela 1) indica que quase todos os
componente da MEC podem ser degradados por MMPs produzidas localmente
(KATSUDA et al, 2003).
As gelatinases (MMP-2 e MMP-9) hidrolisam colágeno tipo IV não fibrilar
e outros componentes da MEC. No entanto, a MMP-2 pode também degradar
colágeno tipo I. Recentemente, estudos demonstraram que o exercício físico
agudo resultou numa elevada quantidade intersticial de MMP-2 e MMP-9 em
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
37
tecidos peritendíneos humanos, sugerindo que as MMPs possuem um
importante papel na adaptação da MEC ao exercício em tedões. Exercício e
treinamento envolvem adaptações relacionadas às respostas das MMPs em
tecido conjuntivo(KJÆR, 2004).
Tabela 2.1 A família das Metalopeptidases de Matriz
Nome do grupo Número da
MMP
Substratos Fontes celulares
I. Colagenase
Colagenase-1 MMP-1 Colágeno I, II, III, VII, X, gelatina
proteoglicana, proteína símili,
entactina, tenascin
Macrófagos, células do
músc. liso, células
endoteliais
Colagenase-2 MMP-8 Colágeno I, II, III, gelatina,
proteoglicana, proteína símili
Neutrófilos,
macrófagos, células do
músc. liso, células
endoteliais
Colagenase-3 MMP-13 Colágeno I, II, III,IV, IX, XVI,
proteoglicana, fibronectina, tenascin
Macrófagos, células do
músc. liso, células
endoteliais
II. Gelatinase
Gelatinase-A MMP-2 Gelatina, colágeno I, IV, V, VII, X, XI,
laminina, fibronectina, elastina,
proteoglicana, proteína símili
Células do músc. liso,
macrófagos, células
endoteliais, linfócitos T
Gelatinase-B MMP-9 Gelatina, colágeno III, IV, V, elastina,
entactina, proteína símili
Macrófagos, células do
músc. liso, células
endoteliais, linfócitos T
III. Stromelisinas
Stromelisinas-1 MMP-3 Proteoglicanas, colágeno III, IV, IX, X,
laminina, fibronectina, gelatina,
tenascin, proteína símili, elastina
Macrófagos, células do
mús. liso
Stromelisinas-2 MMP10 Colágeno III, IV, V, fibronectina,
laminina, proteoglicanas, proteína
símili, elastina
-
Stromelisinas-3 MMP-11 Fibronectina, laminina, proteoglicanas,
gelatina
-
IV. Tipo membrana
MT1-MMP MMP-14 Colágeno I, II, III, gelatina,
proteoglicanas, fibronectina, laminina
Células do músc. liso,
células endoteliais,
macrófagos
MT2-MMP MMP-15 Fibronectina, tenascin, entactina,
agrecana, perlecana, laminina
-
MT3-MMP MMP-16 Colágeno III, gelatina, fibronectina -
MT4-MMP MMP-17 ? -
MT5-MMP MMP-24 Proteoglicanas -
MT6-MMP MMP-25 Gelatina -
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
38
V. Outras
Matrilisina MMP-7 Proteoglicanas, gelatina, fibronectina,
tenascin, elastina, colágeno IV,
laminina, proteína símili
Macrófagos
Metaloelastase MMP-12 Elastina Macrófagos
Colagenase 4 MMP-18 Colágeno I -
RAS I-1 MMP-19 Tenascin, gelatina, agrecana -
Enamelisina MMP-20 Enamela, gelatina -
XMMp MMP-21 ? -
Nome não comum MMP-23 ? -
Matrilisina 2 MMP-26 Colágeno IV, fibronectina, gelatina -
Nome não comum MMP-27 ? -
Epilisina MMP-28 Caseína -
Estudos com microdiálises indicam que os mecanismos de carga em
tendões humanos durante o exercício ou treinamento pode afetar a síntese e a
degradação local de colágeno tipo I em tecidos peritendíneos como o tendão de
Aquiles. Este estudo sugeriu que a MMP-9 tem um papel importante no
potencial da reação inflamatória em tecido conectivo peritendíneo induzido por
exercício intenso, pois observaram que a MMP-9 foi liberada após a ativação
neutrofílica por mediadores inflamatórios. A atividade gelatinolítica de extratos
de tendão obtidos em cadáveres tem mostrado que, a MMP-2 também é uma
especial candidata para ser ativada em tendões após o exercício (KOSKINEN
et al, 2003).
2.9 Atividade do Sistema Renina-Angiotensina
Recentes estudos têm aprimorado nosso conhecimento a respeito das
ações do sistema renina-angiotensina (SRA), revelando novas dimensões para
este sistema além de um regulador hemodinâmico (SUZUKI et al, 2003).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
39
O SRA caracteriza-se por um complexo sistema hormonal, cujo principal
papel está relacionado com o controle da pressão arterial e homeostasia
hidroeletrolítica do organismo. O SRA é reconhecido como um sistema
endócrino onde a Ang II é o principal efetor hormonal responsável pela maioria
dos efeitos fisiológicos (WEBER, 1999; OLIVEIRA, ALVES; BARAUNA, 2003). O
SRA atua precisamente na regulação do volume circulante e pressão sanguínea
em resposta à hipotensão, hipovolemia, hemorragia e falhas cardíacas (HOBBS;
THOMAS; BRADBURY, 2004).
A renina é uma enzima proteolítica secretada na circulação por células
justaglomerulares dos rins. Esta enzima é sintetizada e armazenada de forma
inativa, denominada pró-renina. Quando a pressão arterial cai, várias reações
intrínsecas nos próprios rins fazem com que muitas das moléculas de pró-
renina sejam clivadas, liberando a renina. A renina atua enzimaticamente sobre
uma proteína plasmática produzida no fígado, a globulina denominada de
substrato de renina (ou angiotensinogênio), liberando o peptídeo de 10
aminoácidos, a angiotensina I (Ang I) que tem propriedades vasoconstrictoras
leves (GUYTON; HALL, 2002).
A Angiotensina I (Ang I) é convertida pela ação da enzima conversora de
angiotensina (ECA – uma ectoenzima ligada à membrana plasmática de células
endoteliais, particularmente da circulação pulmonar) num octapeptídeo, a
angiotensina II (Ang II), que é um potente vasoconstrictor (WEBER et al, 1999).
A Ang II pode ser degradada por enzimas que removem aminoácidos
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
40
individuais de modo seqüencial a partir da extremidade N-terminal, produzindo
angiotensina III e IV (RANG, DALE, RITTER, 2001).
Nos últimos anos, a significância fisiológica e patológica da Ang II tem se
expandido além dessas ações clássicas. Isso, devido o reconhecimento desta
enzima ser gerada dentro de outros tecidos e estar envolvida com uma grande
variedade de células e com alta afinidade pelos seus receptores de membrana
predominantemente do tipo AT
1
. As ações autócrinas/parácrinas nos sítios
teciduais geram Ang II localmente, que atua independentemente dos papéis
deste hormônio no plasma, regula o crescimento celular, e o comportamento
metabólico do tecido conjuntivo frouxo e denso e sítios de reparo tecidual
(WEBER, 1999).
A Ang II tem ações sistêmicas (vasoconstrictor sistêmico, vasoconstrictor de
arteríolas eferentes, promove absorção de sódio nos túbulos retorcidos
proximais dos rins, promove liberação de aldosterona e hormônio antidiurético
(ADH)) e pró-aterogênicas, especialmente na presença de hiperlipidemia
(estimula a migração, proliferação e hipertrofia de células do músculo liso,
promove o recrutamento de monócitos e macrófagos dentro dos vasos, estimula
o acúmulo da matriz extracelular através da produção de fatores de
crescimento, estimula a oxidação do LDL) (HOBBS; THOMAS; BRADBURY,
2004).
A ECA tem papel também de catalisar a inativação ou degradação da
bradicinina (que é um potente vasodilatador atuando na liberação de óxido
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
41
nítrico - NO), gerando simultaneamente uma potente ação vasoconstrictora
(JONES, WOODS, 2003; HOBBS; THOMAS; BRADBURY, 2004).
2.9.1 Ang II e homeostasia da MEC
A homeostasia é definida como um estado de equilíbrio que existe entre os
diferentes, mas interdependentes elementos ou grupos de elementos
encontrados num organismo. O conceito de homeostasia do tecido conjuntivo
emerge e é descrito a partir da própria regulação da estrutura e composição
celular da MEC, bem como, da determinação da mobilidade de suas células,
replicação, apoptose e crescimento e regressão de suas proteínas estruturais
(WEBER et al, 1999).
A manutenção da integridade da MEC envolve a síntese e a degradação da
maioria dos seus componentes, incluindo colágeno, glicoproteínas,
glicosaminoglicanos e proteoglicanos (GONZÁLEZ et al, 2002).
Estudos têm revelado que a Ang II regula (via autócrina) a elaboração da
TGF-β (fator de crescimento de transformação-β) uma citocina fibrogênica
responsável pela formação de tecido conjuntivo em condições normais e
patológicas nos sítios de turnover do colágeno. A Ang II induz a diferenciação
de fibroblastos em um fenótipo miofibroblasto ativo (que expressa α actina de
músculo liso - α-SMA e vimentina) para a formação da MEC (WEBER et al,
1999).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
42
2.9.2 Ang II e fibrose
A Ang II, o maior peptídeo efetor do SRA, é agora reconhecida como um
fator que regula o crescimento celular e a fibrose. Há poucos anos um grande
número de estudos demonstrou que a Ang II está envolvida também nos
eventos do processo inflamatório aumentando a permeabilidade vascular,
fundamental para iniciar este processo (SUZUKI et al, 2003).
Em relação à fibrose, a literatura descreve principalmente o que acontece
no coração. A fibrose miocárdica está associada à hipertrofia cardíaca, necrose
de miócitos e hipertensão. A Ang II tem sido descrita como estimuladora da
síntese de colágeno e da proliferação (via receptores AT
1
) de fibroblastos
cardíacos (HAFIZI et al, 2004). Sun et al (1998) cita que a ECA é um marcador
que se encontra elevado nos sítios de fibrose, bem como marcadores de Ang II,
que também estão aumentados. A expressão de ECA e receptores de Ang II
foram encontrados predominantemente em miofibroblastos, fenotipicamente
diferenciados.
A literatura tem evidenciado que a resposta de proliferação dos fibroblastos
pela Ang II é mediada pela estimulação da síntese de substâncias promotoras
de crescimento e inflamatórias como o PDGF (fator de crescimento derivado de
plaquetas), citocinas, pela ativação de integrinas ou pela combinação destes
mecanismos (GONZÁLEZ et al, 2002).
Um aumento fisiopatológico de Ang II em um determinado tecido parece
promover um evento crítico de iniciação e progressão de fibrose (SUN et al,
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
43
1993, 1997). O tecido fibrótico é composto predominantemente de colágeno tipo
I e III (WEBER et al, 1999). Um acúmulo desproporcional de colágeno fibrilar no
espaço extracelular de um órgão altera não só sua estrutura como sua função
(BRILLA et al, 1994), acarretando anormalidades na estrutura da MEC
alterando assim, a rigidez miocárdica, levando à disfunção diastólica (SUN et al,
1998).
Estudos relatam que a Ang II inibe a atividade da colagenase em cultura de
fibroblastos, acarretando o acúmulo do colágeno alterando sua síntese e
degradação (BRILLA et al, 1994).
Pouco se sabe sobre os efeitos dos EAA sobre a ECA em tendões, na
verdade, não foi encontrado nenhum estudo que comente esta interação.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
44
3 OBJETIVO
Uma vez expressa a necessidade de conhecimentos em relação ao
remodelamento dos tendões quando associado drogas como os EAA e a interação
destas com o exercício de carga, o objetivo deste trabalho foi:
Analisar o remodelamento dos tendões de ratos com a administração de
doses suprafisiológicas de EAA (Decadurabolin e Durateston), associando
exercício de alta intensidade na água.
Para tal foram analisados:
• As diferenças morfológicas dos tendões entre os grupos de animais
estudados.
• A expressão de MMPs no tecido tendíneo e a importância destas enzimas
para o remodelamento do tendão sob a influência dos EAA.
• A ação da ECA junto à suplementação de EAA e seus efeitos no
remodelamento dos tendões.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
45
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizados 40 ratos machos
com 43 dias, da linhagem Wistar, com peso de aproximadamente 200 g,
provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de São Carlos
(UFSCar). Os ratos foram agrupados em gaiolas plásticas coletivas (contendo
cinco ratos cada – Fig. 4.1), e mantidos no Biotério do laboratório de Fisiologia do
Exercício do Departamento de Ciências Fisiológicas da UFSCar, à temperatura
ambiente, com acesso a ração e água ad libitum.
O experimento foi conduzido segundo as normas internacionais de ética na
experimentação animal (National Research Council, 1996).
4.2 Plano experimental
Os animais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos
experimentais, cada qual com 10 ratos na seguinte ordem:
- sedentários (GI)
- sedentários que receberam somente administração de EAA (GII)
- treinados (GIII)
- treinados que receberam associação de EAA (GIV)
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
46
Figura 4.1. Demonstração de uma gaiola comportando cinco
animais no período do protocolo experimental.
4.2.1 Grupo sedentário
Os animais denominados sedentários foram assim classificados por não
realizarem qualquer tipo de atividade física, permanecendo durante o período de
seis semanas em suas respectivas gaiolas, período que corresponde ao
treinamento dos grupos exercitados.
4.2.2 Grupo treinado
Os animais classificados como treinados foram submetidos a um programa
específico de saltos em um tubo de PVC de 25 cm de diâmetro contendo água,
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
47
objetivando limitar a alternativa do animal em ir para outra direção ou agarrar-se
para subir, favorecendo o salto apropriado, como demonstrado na figura abaixo
(Fig. 4.2).
Figura 4.2 – Demonstração do sistema para o treinamento
dos animais; observa-se um rato durante o treino e que as
paredes lisas facilitam a realização dos saltos sem que o
rato se agarre às paredes.
A altura da água contida nos tanques foi aproximadamente equivalente ao
dobro do comprimento do corpo do rato, com temperatura mantida
aproximadamente em 32 °C por ser considerada termicamente neutra em relação
à temperatura corporal do rato (PERES & LUCIANO, 1995). Foram realizadas
cinco sessões de treinamento semanais, durante um período de seis semanas. O
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
48
treinamento era realizado aproximadamente no mesmo horário sempre ao
entardecer.
4.3 Tratamento com EAA
Os animais tratados receberam administração das seguintes drogas:
- Deca-durabolin® (decanoato de nandrolona, Organon, 50 mg/ml) e
- Durateston® (decanoato de testosterona, fenilpropionato de testosterona,
isocanoato de testosterona, propionato de testosterona, Organon, 50 mg/ml).
Foi usado mais que uma droga para simular o “efeito empilhamento” de
EAA que é bastante comum entre os atletas (BACURAU, 2001).
As doses foram da ordem de 5 mg/kg de massa corporal do rato (dose
suprafisiológica). A administração de EAA foi realizada duas vezes na semana
aplicando em um dos dias Decadurabolin
no outro Durateston
. A aplicação foi
feita via subcutânea atravessando o músculo tríceps sural da pata direita
traseira dos animais, já que é uma região de maior concentração de massa
muscular facilitando assim a aplicação dos EAA que eram injetados do
subcutâneo oposto ao perfurado. Convencionou-se usar uma única pata
(traseira direita) para a injeção, pois, sabendo que a agulha lesa as fibras
musculares por onde a mesma atravessa, somente um músculo estaria
comprometido, logo, sempre foi utilizada para fins de análises a amostra da
pata contra-lateral, isolando qualquer possibilidade de lesão.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
49
Em relação à execução da atividade, como já experimentado em um estudo
piloto, observou-se que as injeções de EAA não atrapalham a realização e o
apuro dos saltos.
Os animais treinados sem a administração de EAA, bem como os do grupo
sedentário, receberam uma injeção veículo composta de uma solução contendo
óleo de amendoim (1ml) e álcool benzílico (50µl) que é o mesmo veículo dos
EAA administrados. A dose do veículo aplicada estava de acordo com os
mesmos critérios dos animais que receberam os EAA.
O tratamento teve início na 2ª semana de treinamento, momento em que
iniciou o treino específico, propriamente dito, totalizando 5 semanas de
tratamento com 5 sessões por semana.
4.4 Protocolo de treinamento
O treinamento constituiu de saltos em meio líquido, sendo ajustada uma
sobrecarga de acordo com o peso do animal (Fig. 4.2). O protocolo está de acordo
com Silva; Marcondes; Mello (1999), modificado por Marqueti et al, 2003.
A sobrecarga foi acoplada ao tórax dos animais através de um colete
especial que permitiu a execução dos saltos sem que a carga escorregasse do
corpo dos mesmos (Fig. 4.3 e 4.4).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
50
Figura 4.3 – Amostra do colete confeccionado para ser
utilizado no treino dos animais, com a carga ajustada de
acordo como peso do animal.
Uma sobrecarga a mais correspondente ao peso do colete quando molhado
(20 g), foi considerada e debitada da carga específica correspondente à massa
corporal do animal para uma melhor precisão do treinamento.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
51
Figura 4.4 – Demonstração do colete acoplado ao
corpo do animal de modo especial para que este
não escorregue durante o treinamento.
A atividade de treino foi desenvolvida, como já citado, num período de 6
semanas descritas a seguir:
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
52
- 1ª semana (semana de adaptação dos animais ao exercício, neste período não
foi feita a aplicação de EAA): foi utilizada uma sobrecarga equivalente a 50% do
peso do animal, com um número de séries e repetições ajustadas diariamente, e
um intervalo de 30 segundos para repouso entre as séries (Fig.4.5):
1º dia: 2 séries X 5 saltos,
2º dia: 3 séries X 5 saltos,
3º dia: 4 séries X 5 saltos,
4º dia: 4 séries X 7 saltos,
5º dia: 4 séries X 9 saltos.
- 2ª semana: marcou o início do treino específico, os animais realizaram a
atividade física proposta em 4 séries de 10 saltos, com 30 segundos de repouso
entre as séries e sobrecarga equivalente a 50% do peso corporal do animal.
- 3ª e 4ª semana: foi realizado 4 séries de 10 saltos, com 30 segundos de intervalo
entre as séries e sobrecarga de 60% do peso do animal.
- 5ª e 6ª semana: composta também de 4 séries de 10 saltos, com 30 segundos
de repouso entre as séries, porém com sobrecarga de 70% do peso do animal.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
53
Figura 4.5 – Demonstração do período de repouso entre cada série
do protocolo de treinamento.
OBS: Todos os animais foram pesados na 2ª, 4ª e 6ª- feira, para que o protocolo
de treinamento pudesse ser desenvolvido (Fig. 4.6). A tabela de peso pode ser
visualizada no anexo 1. É importante salientar que este protocolo experimental foi
desenvolvido duas vezes. O primeiro resultou nas análises histológicas, e o
segundo resultou nas demais análises, pois, requeriam outro procedimento de
armazenagem deste tecido.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
54
Figura 4.6 Método de pesagem dos
animais em balança digital.
4.5 Sacrifício dos animais e retirada do tendão calcâneo.
Ao término do período experimental, os animais foram sacrificados por
decapitação em guilhotina. Após, os animais foram posicionados em uma mesa
cirúrgica em decúbito dorsal, com as patas presas e mantidas em extensão, para
assim efetuar a retirada do tendão calcâneo de ambas as patas posteriores de
cada animal.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
55
4.6 Processamento das amostras
Para a análise morfológica os tendões foram mantidos em fixação na
solução de formol, por aproximadamente 72 horas, e após foram lavados com
salina e transferidos para uma solução de álcool a 70% para sua conservação até
a etapa de preparo das lâminas histológicas.
Para as demais análises, após a remoção dos tendões, estes foram
pesados e armazenados em nitrogênio líquido e em seguida colocados em freezer
com temperatura constante de -84 °C.
4.8 Análise morfológica e documentação
Para a análise morfológica foi necessária a elaboração das lâminas
histológicas que seguiu várias etapas. Os tendões foram rotineiramente
processados para inclusão em blocos de parafina. Os tendões foram
longitudinalmente cortados em secções de 10 µm de espessura para montagem
das lâminas.As mesmas foram coradas com hematoxilina e eosina (HE)
A análise do tecido tendíneo foi realizada com o auxílio de um microscópio
de luz. As características morfológicas foram avaliadas de forma qualitativa.
4.9 Dosagem de proteínas
Para a dosagem de proteínas de acordo com BRADFORD (1976), foi
utilizado o kit Bio-Rad que consistiu dos seguintes procedimentos:
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
56
Foi preparada uma solução de BSA em água que resultou em D. O. 280 nm
= 0,667. Esta solução corresponde a 1mg/ml de BSA. A partir desta, foram
preparadas as demais diluições do padrão (4 - 6 pontos; de 0,2 – 1mg/ml).
O “Dye Reagente Concentrate” foi diluído na proporção de 1 parte do
reagente (corante) para 4 partes de água.
Cada tubo de reação continha 1,25 ml da solução contendo o reagente e 25
µl da amostra de extrato de tendão. Isso foi realizado tanto para as diluições do
padrão como para as amostras.
Os tubos foram agitados com a finalidade de misturar a amostra com o
corante.
Após foi feita a leitura no espectrofotômetro com o D.O.595nm e os valores
foram documentados.
A curva padrão necessária para quantificação das amostras foi construída
com diluições do padrão (abaixo), e a partir da equação da reta foi determinada a
concentração das amostras com auxílio de software específico.
Preparações das diluições do BSA:
0,2 mg/ml: 400 µl (1 mg/ml) + 1,6 ml de água
0,4 mg/ml: 800 µl (1 mg/ml) + 1,2 ml de água
0,6 mg/ml: 1,2 ml (1 mg/ml) + 800 µl de água
0,8 mg/ml: 1,6 ml (1 mg/ml) + 400 µl de água
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
57
4.10 Determinação da atividade de MMPs por zimografia
O extrato tecidual foi testado para verificar a presença de atividade de
proteases através da técnica de zimografia, conforme descrito por CLEUTJENS
(1995). Para tal, as amostras de tendão extraídas foram devidamente congeladas
com uso de nitrogênio líquido e pesadas. A amostra do tendão (inteiro) foi lavada
de 3 a 4 vezes em solução salina. Após a limpeza foi feita a remoção de qualquer
tipo de tecido periférico, como células musculares e demais membranas visíveis.
As amostras foram grosseiramente homogeneizadas com auxílio de
nitrogênio líquido em um “Eppendorf” e um bastão adaptado, onde manualmente
era feito o homogeneizado. Essa técnica foi desenvolvida para isolar qualquer
possibilidade de perda da atividade enzimática por aquecimento o que
supostamente poderia ocorrer com um homogeneizador elétrico. Posteriormente,
a amostra foi incubada em 0,3 ml de tampão de extração [10 mM de ácido
cacodílico (pH 5,0), 0,15 M NaN
3
e 0,01% de Triton X-100] a 4 °C por um período
de 24 horas. Após este tempo o tampão de extração foi coletado por centrifugação
(10 minutos, 4°C em 13000 rpm) e o pH foi elevado a 7,4 pela adição de 4 µl de
solução de NaOH 0,5 M.
O teor de proteínas das amostras foi dosado conforme a metodologia
descrita no item acima. As amostras foram concentradas de maneira que cada
poço do gel de zimografia continha 20 µg de proteína e 10 µl de tampão de
amostra sem β-mercapto (agente redutor), totalizando 30 µl de solução por poço.
As amostras foram resolvidas por eletroforese em gel de policriamida contendo
SDS e gelatina na concentração final de 2mg/ml. Após a corrida, o gel foi lavado
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
58
uma vez durante 30 minutos em solução 2,5% de Triton X-100 para remoção do
SDS.
O gel foi incubado no tampão de substrato (Tris-HCI 50mM pH 8,0, CaCl
2
mM e NaN
3
0,02%), a 37°C, durante aproximadamente 20 horas. Após este
tempo, o gel foi corado com Coomassie Blue Brilliant R-250 (Bio-Rad) por 1 h e 30
minutos, descorado com ácido acético:metanol:água (1:4:5) para visualização das
áreas de atividade.
Para diferenciar a expressão de metalopeptidases ou de serinoproteinases,
foi adicionado EDTA às amostras (concentração final de 15mM), pois as
metalopeptidases têm sua atividade inibida na presença de EDTA.
Foi utilizado o software “Kodak Digital Science 1D” para fotografar o gel e
visualizar a atividade proteolítica das bandas. As bandas de atividade de todos os
grupos foram comparadas entre si.
4.11 Preparação dos géis de poliacrilamida e de empilhamento
O perfil eletroforético das amostras foi obtido através de géis de
poliacrilamida preparados de acordo com o protocolo de Cleutjens et al, (1995)
modificado descrito a seguir:
Reagentes 10 ml (1 gel)
Tris HCl 1,5 M pH 8,8 1,875 ml
Acrilamida/ Bis 4,0 ml
SDS 10 %
100 µl
H
2
O Mili-Q 3,75 ml
Gelatina 100mg/ml [ ] final de 2mg/ml
250 µl
TEMED
15 µl
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
59
APS
120 µl
O gel de empilhamento foi preparado conforme a seguir:
Reagentes 1 gel
Tris HCl 1,25 M pH 6,8
86,4 µl
SDS 10%
9 µl
Acrilamida/ Bis 135 µl
H
2
O Mili-Q
660 µl
TEMED
6 µl
APS
40 µl
4.12 Determinação de ECA no tendão e no soro
A enzima conversora de angiotensina (ECA) foi detectada por análise de
fluorescência, utilizando um fluorímetro. Primeiramente foi determinada a
constante de fluorescência do aparelho para o ABZ (ácido ortoamino benzóico –
marcador para a ECA). Foram feitas análises de 40 amostras em duplicatas em
placa de 96 poços. Em cada poço foi colocado 300 µL de tampão de ECA (Tris
100 mM pH 7,0; ZnCl
2
10 µM; NaCl 50 mM), 2,5 µL de substrato para ECA (ABZ
YRK(Dnp)P 10 µM; 5 µL de amostra tecidual de tendão. A placa foi incubada por
20 minutos em estufa a 37°C. Após, foi feito a leitura de placa no fluorímetro com
auxílio do programa SOFTmax PRO, considerando o comprimento de onda para o
ABZ de 320 (excitação) e 420 (emissão). Foi calculada uma média a partir do valor
das duplicatas de cada amostra. A partir dos valores obtidos foi possível
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
60
determinar as Unidades de Fluorescência Arbitrárias (UAF) de ECA em 1 µg de
proteína (UAF/µg de proteína).
Para certificar que a enzima marcada nos experimentos anteriores era
mesmo a ECA, foi feito um teste aplicando-se um inibidor de ECA (Lisinopril) no
substrato de tendão. Foi feita uma leitura de placa no fluorímetro com 4 amostras
de cada grupo em duplicata. Colocou-se em cada poço 300 µL de tampão para
ECA; lisinopril 2 µL (2 µM) 5 µL de amostra tecidual. A placa foi incubada por 5
min. a 37°C e após foi adicionado o substrato para ECA.
4.13 Análise estatística
Os resultados quantitativos, como a zymography, ECA no tendão, foram
analisados pela analise de variância (ANOVA), usando o programa INSTAT
comparando todos os grupos contra todos. Foi considerado o erro padrão para
obtenção dos valores. O valor de p< 0,05 foi aceito como significância estatística.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
61
5. RESULTADOS
5.1 Análise morfológica
Os animais do grupo sedentário (Fig. 5.1) apresentaram alinhamento em
paralelo das fibras longas de colágeno, em seu trajeto ondulado (crimp) entre as
quais estão situadas fileiras de fibroblastos. Pode-se observar a presença de
fibroblastos velhos (mais alongados e achatados) e alguns fibroblastos jovens
(mais arredondados). Observa-se que a bainha que reveste o tendão é fina, as
fibras de colágeno que formam o epitendão apresentam-se pouco espessas e com
baixa ordenação. Nestes cortes histológicos não foi detectada qualquer alteração
morfológica.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
62
Figura 5.1 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato, corado com
hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal do grupo sedentário (GI). Foi
observado: trajeto ondulado das fibras de colágeno (t); fileiras de fibroblastos (t );
fibroblastos velhos (t ) e jovens (t) e a membrana que reveste o tendão (t ),
visualizada também na seta de pontas duplas ( ). Aumento de 188 vezes. Barra =
68 µm
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
63
O grupo de animais que só recebeu EAA apresentou alterações
morfológicas visíveis (Fig. 5.2) quando comparado com o grupo sedentário (Fig.
5.1). Observa-se um número menor de fibroblastos com aparência de células
velhas, caracterizando um tecido já maduro. Um aspecto importante deste corte, e
que se repete em todo o grupo em geral, é a maior espessura da bainha que
reveste o tendão e uma mistura de fibras colágenas e tecido fibrótico formando
uma espessa camada na periferia do tendão; visualiza-se também, o maior
“empacotamento” das fibras colágenas do epitendão tornando este tecido mais
condensado e conferindo um revestimento mais espesso a este tecido.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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64
Figura 5.2 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato, corado com
hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal do grupo que recebeu somente
EAA (GII), onde foi observado: fibroblastos velhos (t); a espessa camada que
reveste o tendão ( ); observa-se o empacotamento das fibras de colágeno que
formam o epitendão ( ). Aumento de 188 vezes. Barra = 68 µm.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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65
Os animais que realizaram somente o exercício (Fig. 5.3) demonstraram
uma característica especial: a região do epitendão apresenta uma maior
celularidade, ou seja, é nítida uma grande quantidade de fibroblastos enquanto há
menos fibras colágenas, observa-se que os fibroblastos desta região são jovens.
Na região mais interna, observa-se que a quantidade de fibroblastos
diminui, comparado com a região mais externa, e possuem características de
células mais maduras, além de haver mais fibras colágenas que na região do
epitendão.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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66
Figura 5.3 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato, corado com
hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal grupo treinado (GIII). Os
seguintes aspectos foram constatados: região externa do tendão apresentando um
grande número de fibroblastos e de característica jovem região melhor visualizada
pela disposição da seta de pontas duplas ( ); região interna do tendão com poucos
fibroblastos e mais fibras colágenas ( ), observa-se também que os fibroblastos
desta camada são velhos (t).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
67
Os animais que fizeram associação de EAA e exercício apresentaram
cortes histológicos com graves alterações morfológicas (Fig. 5.4) em relação aos
demais grupos. Visualiza-se um extenso infiltrado inflamatório na periferia do
tendão tornando a bainha que o reveste bastante espessa, além de conferir
regiões com fibrose (melhor visualizado na Fig. 5.5) nas porções de revestimento
do tendão, juntamente com a presença de células inflamatórias. Observam-se
fibroblastos jovens na extensão do tendão, porém não tanto quando se compara a
fotomicrografia com a dos animais do grupo exercitado.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
68
Figura 5.4 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato, corado com
hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal do grupo que associo EAA e
exercício (GIV). Observa-se neste corte a presença de células inflamatórias (t)
formando um extenso infiltrado caracterizado pelas regiões escuras. Aumento de
188 vezes. Barra = 68 µm.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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69
Figura 5.5 – Fotomicrografia de um corte longitudinal de tendão de rato, corado com
hematoxilina e eosina (HE). Refere-se a um animal do grupo de associação de EAA
e exercício (GIV). Observa-se neste corte: áreas de fibrose (t), presença de células
inflamatórias (t), além de fibroblastos jovens na extensão do tendão (t). Aumento
de 188 vezes. Barra = 68 µm.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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70
5.2 Zimografia
Através da realização da zimografia ilustrando a atividade proteolítica de
extrato de tendão em gel de SDS-PAGE 10% com gelatina 2% (Fig. 5.6), foi
possível observar que os extratos de tendões de animais sedentários (GI) têm
algum nível de atividade de gelatinase (Fig.5.6 A), essa expressão foi claramente
aumentada nos animais que realizavam somente exercício (GIII) (Fig.5.6 C). Por
outro lado, no grupo que tive somente a administração de EAA (GII) (Fig. 5.6 B)
bem como, a associação de EAA e exercício (GIV) (Fig. 5.6 D), foi observado uma
considerável diminuição ou inibição da atividade de proteolítica que pode ser vista
claramente.
Cada número no gel representa uma amostra de um animal do mesmo
grupo. Observa-se nos géis, a expressão de mais de uma banda, próximas no
mesmo poço, talvez seja nesta ordem, a pró-enzima, a enzima ativa propriamente
dita, e produtos de degradação.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
71
Figura 5.6 – Análise da atividade proteolítica do extrato de tendão de rato
por zimografia. Cada número representa uma amostra de um animal do
mesmo grupo e cada gel representa um grupo diferente. SDS-PAGE 10%
contendo 2% de gelatina. Após a corrida o gel foi incubado por 20 h em um
tampão a 37°C. Gel corado com Coomassie Blue Briliant. GI (sedentário),
GII (somente EAA), GIII (somente exercício), GIV (associação EAA e
exercício).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MMP
D
GI
GII
GIII
GIV
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
72
Infelizmente, não foi possível identificar o tamanho das bandas usando
padrões de MMPs mas com um marcador de proteína de 66 KD pode-se sugerir
que a banda seja de uma MMP-2 (66KD).
Embora, as diferenças na intensidade das bandas de atividade proteolítica
serem facilmente visualizadas nos géis (Fig. 5.6) estas foram também
quantificadas (Fig. 5.7), através de uma leitura da intensidade média das bandas
em unidades arbitrárias (UA) com auxílio do software Adobe Photoshop.
Através dessa uma leitura foram observadas diferenças de significância
estatística entre todos os grupos de animais, exceto entre os dois grupos que
fizeram uso de EAA (GII e GIV). Há uma tendência do grupo que fez associação
de EAA e exercício (GIV), ter uma inibição proteolítica ainda maior em relação ao
grupo que fez somente uso de EAA (GII).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
73
Figura 5.7 Representação gráfica da intensidade média das
bandas de zimografia em unidade arbitrária (UA). GI
(sedentário), GII (somente EAA), GIII (somente exercício),
GIV (associação de EAA e exercício) Os valores com
significância estatística foram atribuídos para p<0,05, sendo
*p<0,05 e ***p<0,001.
GI GII GIII GIV
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
*
***
***
***
***
Intensidade Bandas - UA
Grupos
GI GII GIII GIV
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
*
***
***
***
***
Intensidade Bandas - UA
Grupos
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
74
5.3 Concentração de ECA no extrato de tendões de ratos
Os resultados da concentração de ECA nos tendões (Fig. 5.8) não
mostraram diferenças significativas entre os grupos estudados.
Figura 5.8 Concentração de ECA (U/µg de proteína) em
extrato de tendão, após 20 min. de incubação com o Abz. GI
(sedentário), GII (somente EAA), GIII (somente exercício),
GIV (associação de EAA e exercício).
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
GIV
GIII
GI
Grupos
[ ] ECA tendão (U/ug)
GII
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
75
6 DISCUSSÃO
Muitos relatos científicos descrevem a carência de análises histológicas e
alterações estruturais que estejam correlacionadas com rupturas de tendões em
associação com o uso de EAA. Porém, não discordam, que estas drogas causem
efeitos deletérios na biomecânica do tendão (EVANS et al, 1998). Evidências
mostram que o uso de EAA leva à displasia das fibrilas de colágeno, resultando
em uma diminuição da força tênsil do tendão (LASSETER; RUSSELL 1991,
MILES et al, 1992). Neste estudo, que teve por finalidade analisar o
remodelamento de tendões de ratos tratados com EAA e exercício de carga, foi
constatado que a administração de EAA acarreta alterações morfológicas de
caráter significativo no tecido tendíneo, tais como, um aumento da síntese de
colágeno e/ou diminuição de sua degradação afetando o remodelamento.
Mudanças na morfologia crimp dos tendões foram evidenciadas com
freqüência, podendo acarretar o rompimento total do tendão e alteração das
propriedades biomecânicas normais das extremidades deste tecido quando
associado o uso de EAA (LASSETER; RUSSELL 1991).
Michna; Stang-Voss (1986), descreveram mudanças morfológicas na
junção musculotendínea, semelhantes às alterações observadas na ruptura de
tendões, quando da combinação de exercícios com EAA.
Em nosso trabalho, os animais sedentários não apresentaram alterações
morfológicas ou mudanças na organização estrutural nem na celularidade dos
tendões, acrescentando que não foi observado qualquer infiltrado inflamatório. As
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
76
fibras de colágeno estão em paralelo e alinhadas, apresentando um trajeto
ligeiramente ondulado. As fibras colágenas que formam o epitendão não estão
muito ordenadas. Aparecem fibroblastos velhos (forma de fuso) e alguns jovens
(forma oval) e a bainha que reveste o tendão é fina. Estas características parecem
ser típicas de um tecido tendíneo em estado normal. A forma dos fibroblastos
relacionada com a idade é descrita por Alberts et al, (2004).
Ao microscópio de luz, as fibras colágenas apresentam ondulação típica, de
largura variável e comprimento indeterminado. Este tecido possui células
residentes, dentre elas os fibroblastos, que são as células responsáveis pela
produção de fibras extracelulares do tecido conjuntivo. Os fibroblastos estão
situados em fileiras por entre os feixes paralelos das fibras de colágeno (ROSS;
ROMRELL; 1993). Os fibroblastos são células especializadas equipadas com um
maquinário enzimático. Essa maquinaria auxilia no turnover de todos os
componentes da matriz (HAYEM, 2001).
Em relação à ondulação das fibras de colágeno, pesquisas confirmam que
é preciso que o tendão resista à tração, sem se desprender do osso. Isso é
possível graças à ligação íntima entre as fibras musculares, bem como, à forma
ligeiramente ondulada das fibrilas de colágeno em estado de repouso e à
interposição de fibras elásticas; esta resistência elástica primeiramente precisa ser
vencida no momento em que o tendão é distendido, evitando-se assim que as
forças de tração atuem de forma abrupta (WEINECK, 1990).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
77
No grupo de animais que recebeu somente administração de EAA, quando
comparado como o grupo sedentário, algumas mudanças estruturais e celulares
foram observadas ao microscópio de luz, como um menor número de fibroblastos
em estado de maturação mais avançado, mostrando um aspecto de tecido já
maduro. A camada externa que reveste o tendão apresenta-se mais espessa que
a do grupo sedentário com aparente infiltrado inflamatório, e as fibras de colágeno
do epitendão estão mais empacotadas, exibindo uma camada mais densa. Isso
sugere um possível aumento de síntese de colágeno e/ou, uma diminuição da
degradação do mesmo, alterando o remodelamento deste tecido. Esta última
observação parece ser verdade já que a atividade das MMPs foi severamente
diminuída neste grupo.
Michna (1987) observou que a administração de EAA em ratos causa um
acúmulo de colágeno na matrix extracelular e desordens no tecido conjuntivo, ao
avaliar o diâmetro das fibras de colágeno e do tendão como um todo. Pärssinen et
al, (2000) também evidenciou, porém em humanos, o aumento da síntese de
colágeno principalmente no tecido conjuntivo frouxo, e paralelo a esta resposta
(KJÆR et al, 2003) descreve um decréscimo da degradação do colágeno tipo I e
aumento da síntese de colágeno tipo III.
A unidade músculo-tendínea com o uso de EAA pode entrar em falência
quando do aumento da força de contração muscular. Nesta região o tendão torna-
se rígido e capaz de absorver menos energia. Essa situação é mais comum
durante uma atividade física intensa (MILES et al, 1992). Inhofe et al (1995),
também estudaram o efeito dos EAA em tendões de ratos, e obteve-se
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
78
semelhantes, atribuindo ao uso de esteróides o aumento da rigidez, a diminuição
do alongamento e a absorção de energia, provocando a falha. E estes efeitos são
potencializados pela associação de EAA com exercícios. Outros estudos
evidenciam que os EAA podem promover mudanças no arranjo e contratilidade
das fibrilas de colágeno do tendão, levando à alterações críticas na plasticidade
deste tecido (MOTTRAN; GEORGE, 2000).
É importante salientar que a rigidez previamente relatada pode ser
conseqüência do maior empacotamento das fibras de colágeno do epitendão,
podendo afetar a passagem ou deslizamento de tecidos circunjacentes, e assim,
esta região pode ter sua função limitada.
De acordo com a literatura, os feixes colágenos do tendão formam
conjuntos envolvidos por tecido conjuntivo frouxo, que contém vasos sangüíneos e
nervos. O tendão também é envolvido por uma bainha de conjuntivo denso. Em
alguns tendões essa bainha é dividida em duas camadas: uma presa ao tendão e
a outra ligada às estruturas vizinhas. Forma-se, assim, uma cavidade revestida
por células mesenquimatosas, que contém um líquido viscoso semelhante ao
líquido sinovial das articulações, composto por água, proteínas,
glicosaminoglicanos e íons (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995). Esta cápsula de
tecido conjuntivo serve de proteção e promove o deslizamento do tendão dentro
da sua bainha através da lubrificação promovida pelo líquido sinovial existente
nesta camada. Este líquido sinovial parece também suprir o tendão de nutrientes
(HAYEM, 2001).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
79
Em relação aos animais que realizaram somente o treinamento, resultados
interessantes foram obtidos comparando com o grupo sedentário. A região mais
externa do tendão apresentou um maior número de fibroblastos com forma oval e
poucas fibras colágenas que aparecem menos organizadas do que no interior do
mesmo. Por outro lado, na região mais interna do tendão há maior quantidade de
fibras colágenas do que de fibroblastos.
Esta maior celularidade da região externa do tendão pode ser entendida
como uma situação de maior demanda metabólica local devido à maior tensão
provocada pela contração muscular em função da hipertrofia. De acordo com
Oliveira; Ramires e Lancha Junior (2004) o termo hipertrofia refere-se ao aumento
da massa muscular como um dos mecanismos de adaptação do músculo frente a
uma sobrecarga imposta pelo treinamento físico. Um grande número de
fibroblastos com alta atividade metabólica sugere uma atividade de fibroplasia por
parte destas células. Kjær (2000) e Mangnusson; Hansen e Kjær (2003),
descrevem que o tecido peritendíneo em humanos é metabolicamente mais ativo
em resposta à atividade física, possuindo também maior capacidade de captação
de oxigênio. Conforme Kjær (2004), esta região é mais irrigada que a região
interna. Chiquet (1999) também descreve uma importante resposta dos
fibroblastos ao estímulo tênsil onde a força aplicada ao tendão pode alterar a
expressão gênica destas células. Outros estudos indicam que o aumento do
turnover do colágeno está associado com exercício resultando em um acúmulo de
colágeno imaturo e poucas ligações cruzadas (BUCHANAN; MARSH, 2002).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
80
Experimentos in vivo mostram que tendões mantidos em cultura têm sua atividade
celular estimulada por força tênsil (KER, 2002).
Estudos indicam ainda que o tendão sofre remodelamento em resposta ao
exercício, ocorre também aumento de força tênsil e rigidez que pode ser atribuída
à hipertrofia do tendão como adaptação ao regime de treinamento. A
concentração de proteoglicanos e de colágeno pode aumentar. As fibras de
colágeno ficam mais densas alinhadas e intensamente empacotadas
(BUCHANAN; MARSH, 2002). Por outro lado, estudos que verificaram mudanças
nas propriedades viscoelásticas do tendão depois do alongamento e contrações
musculares isométricas, mostraram que em ambos os casos ocorrem aumento do
alongamento e diminuição da rigidez (KUBO; KANEHISA; FUKUNAGA, 2002). A
atividade física regular aumenta não só a resistência do tendão, mas também suas
propriedades elásticas (HAYEM, 2001).
Souminen et al (1980) descreveram os efeitos do treinamento físico no
metabolismo de tecidos conjuntivos em ratos jovens, salientando que o treino
pode acelerar o metabolismo do colágeno. Estudos recentes têm evidenciado que
o turnover do tecido conectivo aumenta em resposta ao exercício em maior
proporção que o acúmulo deste tecido, ocorrendo uma reorganização e assim,
aprimorando sua força e resistência ao estresse provocado pelo músculo (KJÆR,
2004).
Estudos recentes indicam que o TGF-β1 é um potente estimulador da
síntese de colágeno tipo I em tecidos peritendíneos humanos em resposta ao
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
81
exercício de carga, a hipótese é de que o aumento local de TGF-β1 seja causado
pelo estímulo mecânico sobre os fibroblastos do tendão (HEINEMEIER;
LANGBERG; OLESEN; KJÆR, 2003).
O menor número de fibroblastos no interior do tendão do grupo treinado
indica que nesta região o estímulo para a síntese de colágeno é menor. De acordo
com Weineck (1990), na região interna do tendão as fibras de colágeno estão
muito bem orientadas e são responsáveis pela resistência às forças de tração. O
autor menciona ainda ainda, que é essa disposição especial das fibras de
colágeno que asseguram estas características (de resistir à força de tração) e
assim são necessárias a esta função.
Com a associação de EAA e treinamento, sérias alterações morfológicas
foram encontradas e podem colocar em risco a estrutura do tendão. Aparece um
extenso infiltrado inflamatório na região externa próxima à camada que reveste o
tendão, tornando-a muito espessa e, em muitas regiões, observou-se a formação
de tecido fibroso. Isso parece indicar a ocorrência de lesão local importante,
trauma este, que pode ter sido causado pelo estresse ocasionado pela contração
muscular dos músculos posteriores da pata, já que o tipo de treino desenvolvido
neste trabalho solicitava mais essa musculatura gerando maior tensão sobre os
tendões. Esta hipótese foi mencionada por Evans (2004), relatando que o
aumento de força induzido pelos EAA pode resultar da hipertrofia da fibra
muscular. Conforme Mottran e George (2000), a força muscular aumenta mais que
a força do tendão e este pode sofrer lesão.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
82
Além disso, outros estudos consideram que as ações anabólicas dos EAA
são mediadas pela ligação dos EAA aos receptores de glicorticóides diminuindo o
catabolismo das proteínas. Mas quando os EAA foram associados com
treinamento de força ocorre um significante aumento na massa, tamanho e força
muscular (BASARIA; WAHLSTROM; DOBS, 2001; SHAHIDI, 2001).
Em relação à resposta inflamatória, esta é uma reação defensiva celular e
vascular contra elementos estranhos que penetram no conjuntivo, seja uma
reação a bactérias patogênicas ou a substâncias químicas irritantes. Na
inflamação ocorre um aumento do fluxo sangüíneo e da permeabilidade dos
capilares, com saída de macromoléculas, e liberação de histamina pelos
mastócitos. Ocorre quimiotaxia sobre o local afetado, as células que se acumulam
na área inflamada fagocitam restos de células e fibras alteradas pela inflamação e
produzem anticorpos contra os microorganismos invasores. Quando o agente
causador da lesão não é destruído, o tecido conjuntivo ao redor forma um
espessamento fibroso, que tende a circunscrever a inflamação (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 1995),
Michna (1987) demonstrou que o tratamento com EAA em ratos aumenta a
displasia de colágeno, especialmente quando associado ao exercício. Evidenciou
também mudanças significativas no tamanho dos diâmetros das fibras de
colágeno, além de uma leve desorganização das mesmas. Os EAA associados ao
exercício aumentam a área transversal do tendão e reduzem sua flexibilidade por
diminuir o limite de alongamento e aumentar a rigidez (MILES et al, 1992).
Karpakka et al (1992), conclui em seu estudo que os EAA podem levar ao
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
83
decréscimo da biossíntese de colágeno em músculos e tendões principalmente
quando administrado altas doses.
Alguns outros estudos com ratos têm demonstrado que altas doses de EAA
produzem alterações biomecânicas em tendões de ratos, levando à diminuição da
força tênsil (MICHNA, 1987; LASETER; RUSSELL, 1991 e INHOFE et al 1995).
Para Pärssinen et al (2000), os efeitos dos EAA em relação ao metabolismo do
colágeno têm sido menos estudados, contudo, estes efeitos podem estar
associados com patologia de tendão e fibrose tecidual.
A atividade das MMPs, estavam aumentadas somente no grupo de animais
submetidos ao treinamento (GIII). Isso indica um maior remodelamento deste
tecido em resposta ao exercício, pois o aumento da atividade proteolítica local é
fundamental para o crescimento tecidual.
Estudos relatam que o exercício agudo e o treinamento físico causam um
aumento da síntese de colágeno do tipo I em tecido conjuntivo peritendíneo no
tendão de Aquiles em humanos (LANGBERG et al, 2001; KJÆR, 2004). O
exercício crônico parece aumentar a síntese de colágeno e elevar também a sua
degradação (MAGNUSSON, HANSEN, KJÆR, 2003), as qualidades dinâmicas
deste tecido aumentam e várias evidências sugerem que as células do tendão
podem modular sua MEC de acordo com a carga ou níveis de exercício
(BENJAMIM, 2002).
A degradação do colágeno, bem como do grande número de outros
componentes da matrix extracelular, é iniciado pelas MMPs. Foi observado que
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
84
três dias após exercício de corrida, a atividade da pró-MMP2 estava elevada em
tendões humanos (KOSKINEN et al, 2004). Mecanismos de alongamento sugerem
um aumento na expressão gênica de MMPs, e o exercício resulta em um aumento
intersticial de MMP-2 e MMP-9 em tecido peritendíneo de tendões humanos.
Parece que o aumento da produção de MMP-2 é fundamental para formação de
novos capilares durante estímulos mecânicos (KJÆR, 2004). Nossos resultados
sugerem que a MMP identificada nos géis de zimografia a MMP-2 pela sua massa
molecular de 66 KD. Conforme Nguyen; Arkell; Jackson (2001), a massa
molecular da MMP-2 é de 72 KD na forma inativa e 66KD quando na forma ativa.
De todas as funções das MMPs uma das mais importantes é o
remodelamento da matriz extracelular (BIRKEDAL-HANSEN, 1995) bem como,
dos tecidos ricos em colágeno como os tendões. Um aumento da atividade na
rede de MMPs é indicativo de degradação da matriz (RYLEY et al, 2002;
KOSKINEN et al, 2004).
Por outro lado, nossos resultados mostram uma severa diminuição do
remodelamento do tendão nos grupos de animais que receberam EAA (GII e GIV),
indicado pelas bandas de atividade das MMPs que ficaram visivelmente
diminuídas nestes grupos. Aqui, é de importância ressaltar que o benefício do
exercício não altera os danos ocasionados pelo uso de EAA. Estes resultados
estão de acordo com a literatura quando relata que os EAA promovem aumento
da síntese de colágeno e diminuição da degradação (PÄRSSINEN, 2000). Riley et
al (1999) descreve que a menor remoção do colágeno pelas MMPs resulta em
uma rede de colágeno maduro e pode predispor rupturas do tendão.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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85
Em relação à ECA, primeiramente é importante ressaltar que estudos
recentes com a utilização de métodos bioquímicos aliados a técnicas modernas de
biologia molecular permitiram evidenciar a existência de muitos componentes do
SRA (sistema renina angiotensina) em tecidos periféricos. A detecção de mRNAs
destes componentes (angiotensinogênio, renina e ECA) em vários tecidos
(cérebro, vasos sanguíneos, glândulas adrenais, coração e rins), deram suporte à
existência de SRA locais. Hoje, é aceitável que estes componentes circulantes
possam ser absorvidos pelos tecidos e que estes tecidos também têm a
capacidade de gerar Ang II com concentrações e cinéticas ainda pouco
conhecidas (OLIVEIRA, ALVES; BARAUNA, 2003; OLIVEIRA; RAMIRES;
LANCHA JUNIOR, 2004).
Nossos resultados mostram a presença de ECA nos tendões, embora, não
haja diferenças significativas entre os grupos de animais. É de importância relatar
que se obteve inibição da fluorescência no substrato de tendão e no soro quando
da incubação das amostras com lisinopril, indicando a presença de ECA nos
extratos de tendões, pois conforme Cooke (2002) o lisinopril é um inibidor
especifico da ECA. O maior desafio é tentar compreender a interação entre a ECA
e os EAA.
A Ang II influencia na síntese e degradação do colágeno fibrilar
(GONZÁLEZ, et al, 2002). O acúmulo de colágeno fibrilar no espaço extracelular
de um órgão altera não só a estrutura, bem como, sua função (BRILLA et al,
1994). De acordo com os resultados deste trabalho é possível evidenciar um
acúmulo de colágeno em função da diminuição do remodelamento do tendão
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
86
indicado pela inibição da expressão de MMPs nos animais que fizeram uso de
EAA. Observaram-se também, regiões com fibrose e infiltrado inflamatório
presente nos cortes histológicos de animais com associação de EAA e exercício.
Brilla et al (1994) acreditam que o colágeno fibrilar é resultado de eventos
mediados por células inflamatórias. Observaram que a fibrose foi estimulada em
órgãos sistêmicos e no miocárdio quando o SRA é ativado. As alterações no
remodelamento alteram o comportamento mecânico do miocárdio, incluindo
rigidez sistólica. Sun et al (1998) relatam que o aumento da concentração de
colágeno na matriz altera a rigidez miocárdica, levando à disfunção ventricular.
Nossos resultados também sugerem rigidez tecidual, em vista do maior
empacotamento de fibras de colágenas na periferia do tendão de animais que
fizeram uso de EAA. Embora a maioria dos estudos esteja relacionada com a
fibrose cardíaca, não é descartada a hipótese de que a rigidez dos tendões possa
estar envolvida com os efeitos locais provocados pela ECA. Weber (1999)
descreve que deve haver um equilíbrio entre a estimulação e a inibição dos fatores
que promovem o turnover do tecido conjuntivo. Se esta razão estiver a favor dos
estimuladores, ocorre acúmulo de tecido conjuntivo, segundo o que acontece em
estados patológicos como a fibrose, esclerose ou cirrose, dependendo do órgão
envolvido.
Outros estudos in vitro com fibroblastos cardíacos de ratos e humanos,
mostram que a Ang II estimula a proliferação e a síntese de colágeno fibrilar via
receptores AT
1
. Esta resposta parece ser mediada pelo aumento de fatores de
crescimento e mediadores inflamatórios ou pela combinação destes fatores
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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(GONZÁLES et al, 2002). Conforme Jones e Woods (2003), a ECA pode degradar
a bradicinina. Hsieh et al (2004) descreveram que a bradicinina, um mediador
inflamatório, aumenta a expressão de MMPs em estudos feito em cérebro de
ratos. Fazendo uma analogia aos resultados do presente estudo, se a bradicinina
é degradada, ela pode estar interferindo na diminuição da expressão de MMPs
resultando em um maior acúmulo de colágeno.
Sadoshima, Malhotra e Izumo (1996) relatam a ocorrência de hipertrofia
cardíaca induzida pela Ang II, estimulando a síntese de colágeno em miócitos e
fibroblastos cardíacos, com aumento de fibronectina, colágeno tipo I e III na MEC.
No entanto, outros pesquisadores citam que a regulação desse sistema não
permite que essa hipertrofia se torne patológica, ao contrário do que se observa
quando se associa treinamento físico e anabolizantes. Além dos efeitos benéficos
promovidos pelo exercício serem perdidos, ocorre uma acentuada ativação do
SRA levando a uma maior deposição de colágeno no miocárdio (OLIVEIRA;
RAMIRES; LANCHA JUNIOR, 2004).
Além disso, nosso estudo mostra a presença de infiltrado inflamatório
acometendo os tendões do grupo com associação de exercício e EAA. De acordo
com a literatura a ECA parece estar envolvida com a inflamação. A Ang II aumenta
a permeabilidade vascular do endotélio independente das mudanças
hemodinâmicas. A ECA induz essa permeabilidade através de mediadores com as
prostaglandinas e o fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF). O SRA
também tem efeitos sobre a adesão e quimiotaxia de células inflamatórias. Por
fim, prepara o reparo tecidual envolvendo dois processos: a regeneração de
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
88
células lesadas por células do mesmo tipo e a reposição do tecido conjuntivo,
também chamado de fibrose. O TGF-β parece ser o candidato mais importante,
mediado pela Ang II, para sintetizar matriz e promover a hipertrofia em cada
órgão. (SUZUKI, 2003).
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
89
7 CONCLUSÕES
A administração de EAA provoca alterações morfológicas deletérias
importantes nos tendões que são pioradas quando associado exercício de alta
intensidade com carga, resultando em severas lesões, com o aparecimento de
infiltrado inflamatório e fibrose o que podem comprometer ou limitar a função do
tendão.
Provável ocorrência de uma disparidade entre a velocidade de ajuste
fisiológico do músculo em relação à do tendão que pode ser lesado pelo fato deste
não suportar a maior tensão produzida pelo músculo.
Os EAA inibem a expressão de MMPs, que são fundamentais para o
remodelamento tecidual, desta forma, estas drogas interferem neste processo
fisiológico, o que só vem a comprometer ainda mais a estrutura tecidual. Enquanto
o exercício eleva a expressão destas enzimas aumentando o remodelamento a
associação com os EAA. Os EAA promovem efeito negativo sobre os benefícios
do exercício.
Os EAA promovem um aumento nas concentrações séricas de ECA que
pode estar envolvida nas alterações morfológicas encontradas nos animais que
receberam administração destes esteróides, e também influenciar na diminuição
do remodelamento do tecido tendíneo.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
90
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da célula. 4.ed. Porto Alegre: Arts
Medica, 2004.
ALTER, M. J. Connective tissue: a limiting factor of flexibility. Science of
Flexibility. Champaign: US. Human Kinetics,
1996. p.39 -58.
BACURAU, R. F. Hipertrofia hiperplasia: fisiologia, nutrição e treinamento do
crescimento do músculo. São Paulo: Phorte editora., 2001.
BAHRKE, M. S.; YESALIS, C. Abuse of androgenic steroids and related
substances in sport and exercise. Curr. Opin. Pharmacol., v. 4, p. 614 – 620,
2004.
BASARIA, S.; WAHLSTROM, J. T.; DOBS, A. Anabolic steroid therapy in the
treatment of chronic diseases. Clin. Rev., v. 86, n. 11, p. 5108 – 5117, 2001.
BEINER, J. M. et al. The effect of anabolic steroids and corticosteroids on
heling of muscle contusion injury. Am. J. Sport Med., v. 27, n. 1, p. 02 – 09,
1999.
BENJAMIM, M. Tendons are dynamic structures that respond to changes in
exercise levels. Scand. J. Méd. Sci. Sports., v. 12, p. 63 – 64, 2002.
BIRKEDAL-HANSEN, H. Proteolytic remodeling of extracellular matrix. Curr. Opin.
Cell Biol., v. 7, p. 728-735, 1995.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
91
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem., v.
72, p. 248 – 254, 1976.
BRILLA, C. G. et al. Collagen metabolism in culture adult rat cardiac fibroblasts:
response to angiotensin II and aldosterone. J. Mol. Cell Cardiol., v. 26, p. 809 –
820, 1994.
BUCHANAN, C. I.; MARSH, R.L. Effects of execise on the biomechanical,
biochemical and structural properties of tendons. Com. Biochem. Phys. A., v.133,
p. 1101 - 1107, 2002.
CAWSTON, T. E. Metalloproteinase inhibitors and the prevention of connective
tissue breakdown. Pharmacol. Ther., v. 70, n. 3, p. 163 – 182, 1996.
CHIQUET, M. Regulation of extracellular matrix gene expression by mechanical
stress. Matrix Biol., v. 18, p. 417 – 426, 1999.
CLEUTJENS, J. P. M. et al. Regulation of collagen degradation in rat myocardium
after infarction. J. Mol. Cell. Cardiol.,
v. 27, p. 1281 –1292, 1995.
COLLINS, J. M. et al. Expression of matrix metalloproteinase genes in the rat
intramembranous bone during postnatal growth and upon mechanical stresses. J.
Biomech., v. 38, p. 485 – 492, 2005.
COOKE, G. A. et al. A mechanistic investigation of ACE inhibitor dose effects on
aerobic exercise capacity in heart failure patients. Eur. Heart J., v. 23, p. 1360 –
1368, 2002.
CORRIGAN B. Anabolic steroids and mind. Med J. Aust., v. 165, p.222-226, 1996.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
92
DAWSON, R.T. Hormones and sport: drugs in sport - the role of the physician. J.
Endocrinol., v. 170, p. 55 – 61, 2001.
EVANS, N. A.; BOWREY, D. J.; NEWMAN, G. Ultra structural analysis of ruptured
tendon from anabolic steroid users. Injury.,
v. 29, n. 10, p. 769 – 773, 1998.
EVANS, N.A. Current concepts in anabolic-androgenic steroids. Am. J. Sport
Med., v.32, p. 534 – 538, 2004.
FONSECA, E. P.; THIESEN, F. V. Esteróides anabólicos e suas alterações em
análises clínicas. RBAC, (PUCRS) Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande
do Sul v. 32, n. 4, p. 255 – 260, 2000.
GAUTHIER, J. Effects cardiovasculaires du dopage. Ann. Cardiol. Angéiol., v.
50, p. 293 – 298, 2001.
GEORGE, S. J.; DWIVEDI, A. MMPs, cadherins, and cell proliferation. TCM, v.14,
p. 100 – 105, 2004.
GONZÁLEZ, A. et al. Regulation of myocardial fibrillar collagen by angiotensin II. A
role in hypertension heart disease? J. Mol. Cell Cardiol., v. 34, p. 1585 – 1593,
2002.
GUYTON, A. C.; HALL, E. J. Fisiologia humana e mecanismos das doenças.
10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
HAFIZI, S.; CHESTER, A. H.; YACOUB, M. H. Differential response of human
cardiac fibroblasts to angiotensin I and angiotensin II. Peptides, v. 25, p. 1031 –
1033, 2004.
HAMILL, J.; KNUTZEN, K. M. Bases biomecânicas do movimento humano.
São Paulo: Manole, 1999.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
93
HARTGENS, F.; KUIPERS. Effects of androgenic-anabolic steroids in athletes. H.
Sports Méd., v. 34,p. 513 – 554, 2004.
HATFIELD, F. C. Esteróides anabólicos. Sprint, v. 4, n. 6, p. 04 – 14, 1987.
_______.Esteróides anabólicos. Sprint, v. 4, n. 6, p. 246 - 256, 1986.
HAYEM, G. Tenology: a new frontier. Jointe Bone Spin., v. 68, p. 19 – 25, 2001.
HEINEMEIER, K. et al. Role of TGF –β1 in relation to exercise-induced type I
collagen synthesis in human tendinous tissue. J. Appl. Physiol., v. 95, p. 2390 –
2397, 2003.
HOBBS, S. D.; THOMAS, M. E.; BRADBURY, A. W. Manipulation of the rennin
angiotensin system in peripheral arterial disease. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg.,
v. 28, p. 573 – 582, 2004.
HSIEH, H. L.; YEN, M. H.; JOU, M. J.; YANG, C. M. Intracellular signalings
underlying bradykinin-induced matrix metalloproteinase-9 expression in rat brain
astrocyte-1. Cell Signal, v. 16, p. 1163 – 1176, 2004.
INHOFE, E. D. et al. The effects of anabolic steroids on rat tendon. J. Sport Med.,
v. 23, n. 2, p. 227 – 231, 1995.
IRELAND, D. et al. Multiple changes in gene expression in chronic human Aquilles
tendinopathy. Matrix Biol., v. 20, p. 159 – 160, 2001.
JACOB, M. P. Extracellular matrix remodeling and matrix metalloproteinases in
the vascular wall during aging in pathological conditions. Biomed. Pharmacother.,
v. 57, p. 195 – 202, 2003.
JONES, A.; WOODS, D. R. Skeletal muscle RAS and exercise performance. Int. J.
Biochem. Cell B., v. 35, p. 855 – 866, 2003.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
94
JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J. Histologia básica. 8. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1995.
KARPAKKA, J. A.; PESOLA, M.; TAKALA, T. E. S. The effects of anabolic steroids
on collagen synthesis in rat skeletal muscle and tendon. Am. J. Sport Med., v. 20,
n. 3, p. 262 – 265, 1992.
KATSUDA, S.; KAJI, T. Atherosclerosis and extracellular matrix. J. Atheroscler.
Thromb., v. 10, n. 5, p. 267 -274, 2003.
KER, R. F. The implications of the adaptable fatigue quality of tendons for their
construction, repair and function. Comp. Biochem. Phys., v. 133, p. 987 – 1000,
2002.
KESSEL, R. G. Histologia médica básica: a biologia das células, tecidos e
órgãos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
KJÆR, M. et al. In vivo studies of peritendinous tissue in exercise. Scand. J. med.
Sci. Sports., v. 10, p. 326 – 331, 2000.
KJÆR, M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal muscle
to Mechanical loading. Physiol. Rev., v. 84, p. 649-698, 2004.
KOOB, T. G.; SUMMERS, A. P. Tendon – bridging the gap. Comp. Biochem.
Phys. A., v. 133, p. 905 - 909, 2002.
KOSKINEN, S. O. A.; et al. Physical exercise can influence local levels of matrix
metalloproteinases and their inhibitors in tendon-related connective tissue. J. Appl.
Physiol., v. 96,p. 861 -864, 2004.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
95
KUBO, K.; KANEHISA, H.; FUKUNAGA, T. Effects of transient muscle contractions
and stretching on the tendon structures in vivo. Acta. Physiol. Scand., v. 175, p.
157 – 164, 2002.
LABRE, M. P. Adolescent boys and the muscular male body ideal. J. Adolescent
Health, v.30, p. 233 –242, 2002.
LaBREE, M. A review of anabolic steroids: uses and effects. J. Sport Med. Phys.
Fit., v. 31, n. 4, p. 618 – 626, 1991.
LANCHA JUNIOR, A. H. Nutrição e metabolismo aplicados à atividade motora.
São Paulo: Atheneu, 2002.
LANGBERG, H.; ROSENDAL, L.; KJÆR, M. Training induced changes in
peritendinous type I collagen turnover determined by microdialysis in humans J.
Physiol. I., v. 534, p. 397 – 402, 2001.
LASETER, J. T.; RUSSELL, J. A. Anabolic steroid: induced tendon pathology a
review of the literature. Med. Sci. Sport Exer., v. 23, n. 1, p. 1 – 3, 1990.
LINDQVIST, A. S. et al. Anabolic androgenic steroids affects competitive
behaviour, behavioural response to ethanol and brain serotonin levels. Behav.
Brain Res., v. 133, p. 21 – 29, 2002.
LISE, M. L. Z. et al. O abuso de esteróides anabólicos androgênicos em atletismo.
Rev. Ass. Med. Brasil, Rio Grande do Sul, v. 45, n. 4, p. 364 – 370, 1999.
MAGANARIS, C. N.; PAUL, J. Tensile properties of the in vivo human
gastrocnemius tendon. J. Biomech., v. 35, p. 1639 -1646, 2002.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
96
MAGNUSSON, S. P.; HANSEN, P.; KJÆR, M. Tendon properties in relation to
muscular activity and physical training. Scand. J. Méd. Sci. Sports., v. 13, p. 211
– 223, 2003.
MARQUETI, R. C. et al. Análise qualitativa dos tendões de ratos submetidos à
terapia com EAA associada ao exercício físico de alta intensidade. Motriz: Rev.
Ed. Fís. – UNESP, v. 9, n. 1, p. S109 – S200, jan/abr: 2003. Suplemento.
MARTÍNEZ-SANCHIS, S. et al. Effects of chronic treatment with testosterone
propionate on aggression and hormonal levels in intact male mice.
Psychoneuroendocrino, v. 23. p. 275 – 293, 1998.
McARDLE, W. D.; KATCH, F. I.; KATCH, V. L. Fisiologia do exercício: energia,
desempenho e nutrição humana. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998.
McGINNIS, P.M. Biomech. Sport Exer. Champaign US: Human Kinetics, 1999.
MICHNA, H. Tendon injuries induced by exercise and anabolic steroids in
experimental mice. Int. Orthop., v. 11, p. 157 – 162, 1987.
MICHNA , H. Organization of collagen fibrils in tendon:changes induced by an
anabolic steroids. Virchows Arch., v. 52, p. 87 – 98, 1986.
MICHNA , H.; STANG-VOSS. The predisposition to tendon rupture after dopig with
anabolic steroids. Int. J. Sports Med., v. 4, p.59, 1986.
MILES, J. W. et al. The effect of anabolic steroids on the biomechanical and
histological properties of rat tendon. J. Bone Joint Surg., v. 74, p. 411 – 422,
1992.
MOTT, J. D.; WERB, Z. Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases.
Curr. Opin. Cell Biol., v. 16, p. 558 – 564, 2004.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
97
MOTTRAM, D. R.; GEORGE, A. J. Anabolic steroids. Bailliere Clin. Endoc.
Metab., v.14, n.1, p. 55 – 69, 2000.
MOURA, N. A. Esteróides anabólicos androgênicos e esportes: uma breve
revisão. Rev. Bras. de Ciências do Esporte, v. 6, n.1, p. 101 – 109, 1984.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Guide for the care and use of laboratory
animals. Washington, D. C: National Academy Press, 1996.
NGUYEN, M.; ARKELL, J.; JACKSON, C. J. Human endothelial gelatinases and
angiogenesis. Int. J. Biochem. Cell B., v. 33, p. 960 – 970, 2001.
OLIVEIRA, E. M; ALVES, G. B.; BARAUNA, V. G. Sistema renina-angiotensina:
interação gene-exercício. Rev. Bras. Hipertens., v. 10, p. 125 – 129, 2003.
OLIVEIRA, E. M.; RAMIRES, P. R.; LANCHA JUNIOR, A. H.; Nutrição e
bioquímica do exercício. Rev. Paul. Educ. Fís., v. 18, p. 7 – 19, ago. 2004.
ORTEGA, N.; BEHONICK, D. J.; WERB, Z. Matrix remodeling during endochondral
ossification. Trends Cell Biol., v. 14, n.2, p. 86 – 94, 2004.
OSHIRO, W. et al. Flexor tendon healing in rat: a histologic and gene expression
study. The Journal of Hand Surgery, v. 28a, n. 5, p. 814 – 823, 2003.
PÄRSSINEN, M. et al. The effect of supraphysiological doses of anabolic
androgenic steroids on collagen metabolism. Int. Sports Med., v.21, p. 406 – 411,
2000.
PAVLATOS, A. M. et al. Review of oxymetholone: a 17α-alkylated anabolic-
androgenic steroids. Clin. Ther., v. 23, n. 6, p. 789 – 801, 2001.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
98
PENDER, S. L. F.; Mac DONALD, T. T. Matrix metalloproteinases and gut: new
roles for old enzymes. Curr. Opin. Pharmacol., v. 4, p. 546 -550, 2004.
PERES, S. B.; LUCIANO, E. Influência de esteróide anabólico ( deca-durabolin)
sobre o metabolismo de ratos submetidos ao treinamento físico. Rev. Paul. Educ.
Fís., São Paulo, v. 9, n. 2, p. 131 – 137, jul/dez, 1995.
PIRES. C. M. R. Estudos dos efeitos da administração de esteróides
anabólico androgênico e do exercício físico sobre o diâmetro das fibras
musculares esqueléticas de ratos jovens. (Mestrado em Ciências Fisiológicas).
Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2000.
RANG. H. M.; DALE, M. M.; RITTER, J. M. Farmacologia. 4.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001.
RASSIER, D. J. E.; NATALI, A. J.; DE ROSE, E. H. Doping sanguíneo no
esporte. Departamento de Educação Física. Universidade Federal de Viçosa.
Minas Gerais, 1996.
RILEY, G. P. et al. Matrix metalloproteinase activities and their relationship with
collagen remodeling in tendon pathology. Matrix Biol., v.21, p.185-195, 2002.
RITTY, T. M.; HERZOG, J. Tendon cells produce gelatinases in response to type I
collagen attachment. J. Orthopaed. Res., v. 21, p. 442 – 450, 2003.
ROSS, M. H.; ROMRELL. Histologia: texto e atlas. 2.ed. São Paulo:
Panamericana, 1993.
SADOSHIMA, J.; MALHOTRA, R.; IZUMO, S. The role of the cardiac renin-
angiotensin sistem in load-induced cardiac hypertrophy. J. Cardiac Fail., v. 2, n.
4S, p. S1 – S6, 1996.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
99
SADER, M. A. et al. Androgenic anabolic steroids and arterial structure function in
male bodybuilders. J. Am. Coll. Cardiol., v. 37, n.1, p. 224 – 230, 2001.
SHAHIDI, N. T. A review of the chemistry, biological action, and clinical
applications of anabolic – androgenic steroids. Clin. Ther., v. 23, n. 9, p. 1355 –
1384, 2001.
SHAPIRO, S. D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix:
biological consequences. Curr. Opin. Cell Biol., v. 10, p. 602-608, 1998.
SILVA, P. R. P.; DANIELSKI, R.; CZEPIELEWSKI, M. A. Esteróides anabolizantes
no esporte. Rev. Bras. Méd. Esporte., v. 8, n. 6, p. 235 – 243, nov./dez. 2002.
SILVA, M.P.; MARCONDES, M.C.C.G.; MELLO, M.A.R. Exercício aeróbio e
anaeróbio: efeitos sobre a gordura sérica e tecidual de ratos alimentados com dieta
hiperlipídica. Rev. Bras. Ativ. Fís. Saúde, Londrina, v. 4, n. 3, p. 3-56, 1999.
SILVER, F. H.; FREEMAN, J. W.; SEEHRA, G. P. Collagen self-assembly and the
development of tendon mechanical properties. J. Biomech., v. 36, p. 1529 - 1553,
2003.
SANDART, J. P.; BUCKNELL, A. L.; Rupture of the triceps tendon associated with
steroid injections. Am. J. Sport Med., v. 21, n. 3, p. 482 – 485, 1993.
STERNLICHT, M. D.; WERB, Z. How matrix metalloproteinases regulate cell
behavior. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., v. 17, p. 463 – 516, 2001.
SUMMERS, A, P.; KOOB, T. J. The evolution of tendon: morphology and material
properties. Com. Bioch. Phys. A., v. 133. p. 1159 – 1170, 2002.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
100
SUN, Y. et al. Angiotensin converting enzyme and myocardial fibrosis in the rat
receiving angiotensin II or aldosterona. J. Lab. Clin. Med. v. 122, p. 395 – 403,
1993.
SUN, Y.; RAMIRES, F. A.; ZHOU, G.; GANJAM, V. K.; WEBER, K. T. Fibrous
tissue and angiotencin II. J. Mol. Cell Cardiol., v. 29, p. 2001-2002, 1997.
SUN, Y. et al. Angiotensin II, transforming growth factor-β, and repair in the
infracted heart. J. Mol. Cell Cardiol., v. 30, p. 1559 – 1569, 1998.
SUOMINEN, H.; KHSKINEN, A.; HEIKKNEN. Effects of physical training on
metabolism of connective tissues in young mice. Acta. Physiol. Scand., v 108, p.
17 – 22, 1980.
SUZUKI, Y. et al. Inflamation and angiotensin II. The Int. J. Biochem. Cell B., v.
35, p. 881 – 900, 2003.
SZABO, K. A; ABLIN, R. J.; SINGH, G. Matrix metalloproteinases and immune
response. Clin. Appl. Immun. Rev., v. 4, p. 295 – 319, 2004.
TAKAHASHI, M.; TATSUGI, Y.; KOHNO, T. Endocrinological and pathological
effects of anabolic-androgenic steroid in male rats. Endocr. J., v. 51, n. 4, p. 425 -
434, 2004.
TISCHER, K. H.; HAUSSEN, R. H.; DOENECKE, P. M.G. Coronary thrombosis
and ectasia of coronary auteries after long-term use of anabolic steroids. Z.
Kardiol., v. 92, n. 4, p. 326 – 331. 2003.
TOMASEK, J. The effects of anabolic steroids on rat tendon. Am. J. Sport Med.,
v. 23, n. 2, p. 227 – 232, 1995.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
101
THE NATIONAL INSTITUTE ON DRUG ABUSE. National Institutes of Health.
Anabolic Steroids: Commun. Drug Alert Bulltin.,
U. S. Department of Health and
Human Services. FEB/2002.
VENTULANI, J. Drug addition. Part 1. Psychoative substances in the past and
presence. Pol. J. Pharmacol., v. 53, p. 201 – 214, 2001.
VISURI, T.; LINDHOLM, H. Bilateral distal bíceps tendon avulsions with use of
anabolic steroids. Med. Sci. Sport Exer., v. 26, n. 8, p. 941 – 944, 1993.
VU, T. H.; WERB, Z. matrix metalloproteinases: effectors of development and
normal physiology. Gene. Dev., v. 14, p. 2123 – 2133, 2000.
ZAUGG, M. Anabolic-androgenic steroids induce cell death in adult rat ventricular
myocytes. J. Cell Physiol., v. 187, n. 1, p. 90 – 95, 2001.
WAGGETT, A. D. et al. Characterization of collagen and proteoglycans at the
insertion of the human Achilles tendon. Matrix Biol., v. 16, p. 457 – 470, 1998.
WEBER, K. T.; Angiotensin II and connective tissue: homeostasis and reciprocal
regulation. Regul. Peptides., v. 82, p. 1 – 17, 1999.
WEBER, K. T. et al. Angiotensin II and extracellular matrix homeostasis. Int. J.
Biochem.Cell Biol., v. 31, p. 395 – 403, 1999.
WEINECK J. Anatomia aplicada ao esporte. 3.ed. São Paulo: Manole, 1990.
WILMORE, J. H.; COSTILL, D. L. Fisiologia do esporte e do exercício. 2ed.
Manole: São Paulo, 2001.
WOOD, R. I.; Reinforcing aspects of anabolic androgens. Phys. Behav., v. 83, p.
279 -289, 2004.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
102
WU, F. W. Endocrine aspects of anabolic steroids. Clin. Chem., v. 43, n. 7, p.
1289 – 1292, 1997.
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
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Anexo 1. Tabela de peso dos animais do protocolo experimental
TABELA DE PESO - GRUPO IA (sedentário)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D.
2/fev 167 146 127 145 151
4/fev 179 167 142 162 170
6/fev 195 184 155 176 181
9/fev 202 203 170 187 202 Veíc. 10/02
11/fev 228 219 182 203 214 Veíc.12/02
13/fev 246 234 190 220 226
16/fev 268 256 212 237 242 Veíc. 17/02
18/fev 285 270 223 244 251 Veíc. 19/02
20/fev 297 281 235 257 261
23/fev 307 284 244 260 279 Veíc. 24/02
25/fev 321 312 255 275 289 Veíc. 26/02
27/fev 327 319 266 281 301
1/mar 338 331 269 287 300 Veíc. 02/03
3/mar 343 342 274 298 315 Veíc. 04/03
5/mar 351 349 285 305 323
8/mar 357 359 296 336 334 Veíc. 09/03
10/mar 336 367 340 320 340 Veíc. 11/03
12/mar 366 379 302 320 344
15/mar 377 382 307 330 352
GRUPO IB (sedentário)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D.
2/fev 153 150 130 149 150
4/fev 169 170 148 170 170
6/fev 175 179 162 180 179
9/fev 200 208 182 216 201 Veíc. 10/02
11/fev 217 224 202 232 216 Veíc. 12/02
13/fev 219 231 207 240 224
16/fev 235 249 225 258 241 Veíc. 17/02
18/fev 241 260 236 270 256 Veíc. 19/02
20/fev 253 268 255 275 266
23/fev 260 280 261 280 279 Veíc. 24/02
25/fev 269 289 275 301 294 Veíc. 26/02
27/fev 273 298 284 310 297
1/mar 286 306 292 318 309 Veíc. 02/03
3/mar 290 315 297 323 318 Veíc. 04/03
5/mar 296 326 307 333 332
8/mar 306 334 317 341 344 Veíc. 09/03
10/mar 308 342 326 346 349 Veíc. 11/03
12/mar 316 346 326 352 354
15/mar 323 356 330 359 363
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
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104
GRUPO IIA (recebeu somente EAA)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D.
2/fev 133 157 134 154 151
4/fev 148 175 152 176 170
6/fev 161 192 163 190 183
9/fev 179 219 184 220 202 Deca Durabolin 10/02
11/fev 191 241 200 235 222 Durateston 12/02
13/fev 204 254 215 250 233
16/fev 218 272 227 267 248 Deca Durabolin 17/02
18/fev 229 281 245 273 255 Durateston 19/02
20/fev 235 291 249 281 267
23/fev 244 300 260 290 276 Deca Durabolin 24/02
25/fev 267 309 308 296 289 Durateston 26/02
27/fev 260 317 275 306 294
1/mar 310 319 281 310 299 Deca Durabolin 02/03
3/mar 268 326 281 314 300 Durateston 04/03
5/mar 274 332 290 224 305
8/mar 275 326 295 322 303 Deca Durabolin 09/03
10/mar 276 326 291 327 308 Durateston 11/03
12/mar 281 335 300 328 311
15/mar 281 333 302 335 310
GRUPO IIB (recebeu somente EAA)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D.
2/fev 146 164 139 166 161
4/fev 163 180 149 183 180
6/fev 180 200 165 200 194
9/fev 200 219 179 225 225 Deca Durabolin 10/02
11/fev 212 234 201 211 237 Durateston 12/02
13/fev 233 249 213 209 247
16/fev 247 261 226 242 267 Deca Durabolin 17/02
18/fev 256 272 239 256 277 Durateston 19/02
20/fev 267 284 247 274 291
23/fev 275 291 257 285 297 Deca Durabolin 24/02
25/fev 283 290 264 300 299 Durateston 26/02
27/fev 293 305 266 303 318
1/mar 295 308 272 317 322 Deca Durabolin 02/03
3/mar 300 309 269 318 334 Durateston 04/03
5/mar 306 316 277 322 335
8/mar 312 315 279 327 337 Deca Durabolin 09/03
10/mar 315 319 280 335 341 Durateston 11/03
12/mar 322 327 282 333 344
15/mar 325 330 282 337 346
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
105
GRUPO IIIA (somente treinado)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D. ESTEPE
2/fev 162 140 168 146 158 124 adaptação
4/fev 171 149 181 153 163 133 50% peso
6/fev 186 163 197 165 171 143
9/fev 213 190 216 186 190 172 Veíc. 10/02 50% peso
11/fev 228 200 220 195 200 179 Veíc. 12/02
13/fev 242 214 245 201 213 191
16/fev 261 230 265 220 232 210 Veíc. 17/02 60% peso
18/fev 266 240 272 224 245 217 Veíc. 19/02
20/fev 277 251 282 233 256 230
23/fev 288 265 292 244 273 248 Veíc. 24/02
25/fev 305 275 300 254 285 257 Veíc. 26/02
27/fev 308 273 316 258 283 270
1/mar 321 281 321 269 305 277 Veíc. 02/03 70% peso
3/mar 321 291 331 270 306 286 Veíc. 04/03
5/mar 332 298 341 320 321 293
8/mar 346 304 327 287 329 300 Veíc. 09/03
10/mar 351 308 363 290 331 301 Veíc. 11/03
12/mar 355 313 368 292 337 305
15/mar 363 318 380 302 350 314
GRUPO IIIB (somente treinado)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D.
2/fev 142 164 172 170 177 adaptação
4/fev 156 172 182 178 191 50% peso
6/fev 171 189 191 193 208
9/fev 194 207 218 216 235 veículo 10/02 50% peso
11/fev 204 224 232 230 252 veículo 12/02
13/fev 213 232 241 238 264
16/fev 233 249 265 256 285 veículo 17/02 60% peso
18/fev 237 261 270 269 286 veículo 19/02
20/fev 249 278 278 272 300
23/fev 255 285 297 291 310 veículo 24/02
25/fev 270 299 305 295 319 veículo 26/02
27/fev 270 302 307 305 323
1/mar 286 316 332 318 337 veículo 02/03 70% peso
3/mar 288 322 343 319 344 veículo 04/03
5/mar 290 330 347 329 353
8/mar 304 337 367 342 368 veículo 09/03
10/mar 310 348 371 348 374 veículo 11/03
12/mar 305 350 373 350 376
15/mar 314 359 384 361 384
Efeito dos EAA no remodelamento do tendão de rato
__________________________________________________________________
106
GRUPO IVA (treinado e com suplementação de EAA)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D. ESTEPE
2/fev 134 157 157 147 156 132 adaptação
4/fev 148 165 137 178 150 147 50% peso
6/fev 164 176 152 191 162 160
9/fev 187 194 171 212 180 181 Deca Durab. 10/02 50% peso
11/fev 194 210 184 231 200 193 Durateston 12/02
13/fev 204 216 187 230 203 201
16/fev 222 237 209 255 231 222 Deca Durab. 17/02 60% peso
18/fev 236 247 218 266 242 232 Durateston 19/02
20/fev 242 256 225 270 252 237
23/fev 253 264 233 278 256 248 Deca Durab. 24/02
25/fev 259 267 240 289 268 252 Durateston 26/02
27/fev 268 280 245 293 272 263
1/mar 280 284 251 301 280 268 Deca Durab. 02/03 70% peso
3/mar 281 288 253 306 289 272 Durateston 04/03
5/mar 287 292 258 308 293 274
8/mar 291 297 267 312 300 282 Deca Durab. 09/03
10/mar 294 300 266 314 302 287 Durateston 11/03
12/mar 294 298 267 323 307 287
15/mar 301 301 275 326 310 294
GRUPO IVB (treinado e com suplementação de EAA)
DATA CABEÇA RABO DORSO BARRIGA PATA D.
2/Fev 137 156 124 166 140 adaptação
4/Fev 143 173 168 160 174 50% peso
6/Fev 159 180 185 164 188
9/Fev 178 199 206 182 211 Deca Durab. 10/02 50% do peso
11/Fev 192 211 221 194 227 Durateston 12/02
13/Fev 196 227 233 204 240
16/Fev 213 250 258 222 266 Deca Durab.17/02 60% do peso
18/Fev 217 264 268 224 270 Durateston 19/02
20/Fev 223 276 280 232 276
23/Fev 229 289 286 240 289 Deca Durab. 24/02
25/Fev 231 296 291 243 297 Durateston 26/02
27/Fev 233 296 297 248 300
1/Mar 246 306 306 255 310 Deca Durab. 02/03 70% do peso
3/Mar 244 312 312 254 308 Durateston 04/03
5/Mar 247 316 316 255 316
8/Mar 253 322 319 260 318 Deca Durab. 09/03
10/Mar 256 325 322 261 316 Durasteson 11/03
12/Mar 256 333 326 264 317
15/Mar 258 338 325 266 327
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