Download PDF
ads:
“ESTUDO DA BIORREMEDIAÇÃO DO HERBICIDA VELPAR K®
IN VITRO EM MEIO AQUOSO COM O USO DO INOCULANTE
MICROBIANO EM-4 (Microrganismos Eficazes)”
Márcio Antônio Gomes Ramos
ORIENTADOR: Prof. Dr. Sergio Akinobu Yoshioka
São Carlos
2005
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Instituto de Química de São Carlos,
da Universidade de São Paulo, como
parte dos requisitos para obtenção do
titulo de Mestre em Ciências Química
Analítica.
Este exemplar foi revisado e alterado em relação à
versão original, sob a exclusiva responsabilidade do autor.
São Carlos, 26 de Maio de 2005
Márcio Antônio Gomes Ramos
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
“Agradeço
a Deus, pelas constantes
bênçãos e proteções recebidas”.
“Nobre é o homem que tem seu pensamento
dirigido, a todo momento, para a Causa Divina,
orando pelo bem do mundo e do próximo”
MOKITI OKADA
“O progresso da sociedade não depende apenas
da ciência material. É preciso começar a
desenvolver, o quanto antes a
ciência do espírito”
NIDAI-SAMA
Aos meus antepassados,
“Sem a existência de meu pai e de minha mãe,
não existiria neste mundo, meu corpo e minha alma”
MOKITI OKADA
ads:
MEUS AGRADECIMENTOS:
“A minha família, Landinha, amiga, companheira, esposa, que sempre me
apoiou em todos os momentos, e em todas as situações, aos meus filhos Március e
Tárcius que sempre estiveram presentes, participando, colaborando e descontraindo-me
o tempo todo, à minha irmã Maria Inês e ao meu cunhado Gastão, pela amizade, apoio e
ajuda que sempre me deram”.
Aos professores e funcionários do Instituto de Química de São Carlos,
responsáveis pela minha formação.
“Ao Prof. Dr Sérgio Akinobu Yoshioka, pela amizade, paciência, dedicação ao
longo das orientações e dos desenvolvimentos deste trabalho.”
À Prof
a
Dr
a
Eny Maria Vieira pelas orientações, apoio e materiais.
À Lidiane M. Andrade, pelo trabalho experimental na purificação dos
compostos ativos.
Aos funcionários do CAQI – IQSC.USP, Mauro e Paulo pelos treinamentos
em análises instrumentais.
Aos colegas Ricardo Reis, Juliana e a Diva, pela amizade e apoio.
À Prof
a
Angela, pelas aulas de inglês, e a todos que, de alguma forma,
contribuíram para a realização deste trabalho.
“Ao Centro de Pesquisa Mokiti Okada, a Sakae e ao Ota, pelo apoio, ao
pessoal do Laboratório de Microbiologia; Luiz Augusto Mendes, por ter realizado as
análises microbiológicas, que foi muito importante para a concretização deste
trabalho, à Josbel, Julio e Hélen, pela ajuda nas análises microbiológicas e ao pessoal
do Laboratório Químico; Luciano Matheus e Isabel Cristina, pelas constantes ajuda no
decorrer deste trabalho.
Aos consultores do Centro de Pesquisa Mokiti Okada, Prof.Dr.Hashime
Tokeshi e Prof.Dr.Paulo R.R.Chagas, pelos materiais didáticos, incentivos e
orientações. Ao Prof.Dr.Paulo R.R.Chagas, pelas orientações, materiais didáticos,
apoio e ajuda nos trabalhos de revisão bibliográfica do EM-4, e à Eng.Agrônoma
Keiko Takahashi, pelo apoio e ajuda nos trabalhos de revisão bibliográfica do EM-4.”
“A FUNDAÇÃO MOKITI OKADA”, pelo apoio e pela bolsa concedida.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................. iii
LISTA DE TABELAS................................................................................................ vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................. vii
RESUMO.................................................................................................................... viii
ABSTRACT................................................................................................................. ix
I. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1
I.1. Biorremediação microbiana ................................................................................. 4
I.1.1. Técnicas de biorremediação.............................................................................. 6
A) “Landfarming” ...................................................................................................... 8
B) “Biorremediação fase sólida” ................................................................................ 11
C) Tratamento “in situ” .............................................................................................. 12
D) Bioaumento............................................................................................................ 12
E) Fitorremediação...................................................................................................... 13
I.2. Pesticidas............................................................................................................... 15
I.2.1. Pesticidas de primeira e segunda gerações......................................................... 17
I.2.2. Velpar K® ......................................................................................................... 20
I.2.2.A) Diuron ............................................................................................................ 20
I.2.2.B) Hexazinona ................................................................................................... 23
I.3. EM-4 (Microrganismos Eficazes) ...................................................................... 26
II. OBJETIVOS........................................................................................................... 32
III. EXPERIMENTAL................................................................................................. 33
III.1. Reagentes e Solventes......................................................................................... 33
III. 2. Crescimento do inoculante microbiano EM-4 em meio de cultura ágar-ágar
com herbicida Velpar K
®
.............................................................................................
33
III.3. Separação por cromatografia iônica dos princípios ativos do herbicida
comercial Velpar K........................................................................................
36
A) Retirada do material inerte do Velpar K..................................................
36
B) Separação dos princípios ativos do Velpar K por cromatografia de troca
iônica.......................................................................................................
37
C) Caracterização dos princípios ativos do Velpar K separados...................
38
III.4. Estudo de Espectrofometria no ultravioleta das soluções aquosas
contendo Velpar K e EM-4...........................................................................
39
III.5. Quantificação cromatográfica da biorremediação do Velpar K® pelo
EM-4.................................................................................................................
40
a) Curva de padronização do diuron e da hexazinona...................................... 40
b) Estudo de quantificação da biorremediação................................................. 40
IV. RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................. 43
IV.1 Observação da biodegradação do Velpar K
®
com EM-4........................ 43
IV.1.1 Contagem das células nas placas........................................................... 43
A) Separação do material inerte....................................................................... 44
B)Separação,purificação e caracterização dos princípios ativos do Velpar K
®
44
IV.1.2. Espectrofometria no ultravioleta (U.V.) das soluções aquosas
contendo Velpar K
®
e EM-4..............................................................................
49
A) Sem agitação das soluções............................................................................ 49
B) Sob agitação constante de 100rpm das soluções........................................... 50
IV.1.3. Quantificação por cromatografia líquida de alta performance HPLC
da biorremediação do Velpar K
®
pelo EM-4 em meio aquoso..........................
52
A) Curva padrão do Diuron e Hexazinona......................................................... 53
B) Estudo da Biorremediação do Velpar K®.................................................... 55
V. CONCLUSÕES............................................................................................. 59
VI. PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS................................. 60
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 61
SUMÁRIO_____ ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Acúmulo de inseticida diclorodifeniltricloroetano (DDT) na cadeia alimentar.
(fonte:RAVEN,P.et al,1993)...............................................................................16
Figura 2: Estruturas de N´-(4-Clorofenil)-N,N-dimetiluréia (Monuron) (a) e do
N´-(3,4-diclorofenil)-N,N-dimetiluréia (Diuron) (b)..........................................22
Figura 3: Degradação parcial do diuron para 3,4-dicloroanilina (DCA)........................22
Figura 4: Estruturas molecular da hexazinona e produtos de sua biodegradação...........25
Figura 5: Inoculação do EM-4 em placa de Petri, realizado no Laboratório de
Microbiologia do Centro de Pesquisa da Fundação Mokiti Okada, Ipeúna /
SP........................................................................................................................34
Figura 6: Distribuição do meio de cultura sólido Ágar-Velpar K em placa de Petri,
realizado no Laboratório de Microbiologia do Centro de Pesquisa Fundação
Mokiti Okada, Ipeúna / SP..................................................................................34
Figura 7: Incubação das placas de Petri em câmara incubadora a 35ºC, realizado no
Laboratório de Microbiologia do Centro de Pesquisa Fundação Mokiti Okada,
Ipeúna / SP..........................................................................................................35
Figura 8: Contagem de Colônias em placas, realizado no Laboratório de
Microbiologia do Centro de Pesquisa Fundação Mokiti Okada, Ipeúna /
SP.........................................................................................................................36
Figura 9: Placas de petri contendo ágar-ágar com concentrações do Velpar K (0,625%
m.v
-1
) de: 0%(a), 0,2%(b), 0,8%(c) e 1,0%(d), e com inoculação com 1,0 mL de
EM-4 (5x102 células.mL
-1
) em profundidade.....................................................43
Figura 10: Espectro na região do ultravioleta da substância após a passagem na
cromatografia de troca iônica..............................................................................45
Figura 11: Cromatograma de HPLC da purificação inicial do Velpar K® por
precipitação em meio aquoso..............................................................................46
Figura 12: Cromatograma do produto obtido após a separação por cromatografia de
troca iônica..........................................................................................................47
Figura 13: Espectro no infravermelho das amostras separadas por cromatografia de troca
iônica a pH 6,0 em tampão fosfato: Diuron (a) e Hexazinona + resíduo
(b)........................................................................................................................48
Figura 14: Espectros no ultravioleta das soluções aquosas das proporções entre 1:1 e 9:1
de Velpar K® (0,625%, m.v
-1
):EM-4(500ufc.mL
-1
) em tempos variáveis entre 0
e 21dias................................................................................................................49
LISTA DE FIGURAS_______________________ ___________________iv
Figura 15: Espectros no ultravioleta das soluções aquosas das proporções entre 1:1 e 9:1
de Velpar K® (0,625%, m.v
-1
) / EM-4 (500ufc.mL
-1
) em tempos variáveis entre
0 e 21dias sobre agitação constante de 100rpm com e sem
diluição................................................................................................................51
Figura 16: Cromatograma das soluções padrão de hexazinona (a) e diuron (b) com
aplicação de 20µL na concentração de 1,0 µg.mL
-1
............................................53
Figura 17: Curva de calibração das soluções padrão de diuron e hexazinona com
aplicação de 20µL nas concentrações entre 0,5 e 3,0mg.L
-1
...............................54
Figura 18: Cromatogramas das soluções aquosas de EM-4 (500ufc.mL
-1
) (a) e Velpar
K® (b).................................................................................................................56
Figura 19: - Análise por HPLC da biodegradação do composto ativo Diuron do Velpar
K® pelo inoculante microbiano EM-4 (Microrganismos Eficazes) em intervalos
entre 0 e 21dias....................................................................................................58
LISTA DE FIGURAS_______________________ _______________________________v
Lista de Tabelas
Tabela I: Tipos e estratégias para biorremediação no solo, Skipper (1998)......................7
Tabela II: Principais dificuldades para o sucesso dos tratamentos biológicos de solos
contaminados, Sklandany et al (1992)................................................................8
Tabela III: Proporções das soluções diluídas em partes por 50 partes para estudo de
espectrofotometria no ultravioleta (200-350nm)...............................................39
Tabela IV: Proporções de diluições das soluções aquosa diluidas de Velpar K® / EM-
4.........................................................................................................................41
Tabela V: Soluções diluídas nas proporções para análise em HPLC, da
biorremediação..................................................................................................42
Tabela VI: Áreas e concentrações das curvas dos padrões Diuron e Hexazinona obtidas
por HPLC..........................................................................................................54
Lista de Abreviaturas e Siglas
DDT - Difenildiclorotriacetico
2,4-D - 2,4-Dichlorophenoxyacetico
2,4,5-T - 2,4,5 ácido trichlorophenoxyacetico
EUA – Estados Unidos da América
IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada
EPA - Agência de proteção ambiental
EM - Microrganismos Eficazes
DQO – Demanda Química de Oxigênio
DBO – Demanda Bioquímica de Oxigênio
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Performance
ufc – Unidade Formadora de Colônia
rpm – Rotação por Minuto
U-V – Ultravioleta
I.V. - Infravermelho
3,4-DCA – 3,4 Dicloroanilina
RESUMO
Um processo recente que vem apresentando resultados satisfatórios é o
uso de microrganismos presentes na Natureza para a biodegradação ou
biorremediação de materiais tóxicos.
Neste trabalho estudou-se a biorremediação do herbicida comercial
Velpar K®, in vitro em meio aquoso, utilizado contra ervas invasoras em canaviais
no estado de São Paulo.
Cujos princípios ativos são: Hexazinona e Diuron, com o uso do
inoculante microbiano EM-4 (Microrganismos Eficazes), um consórcio de
microrganismos retirados do solo constituído de bactérias láticas e fotossintéticas,
fungos filamentosos, leveduras e actinomicetos. Dados do cultivo por profundidade
em ágar-ágar inoculado com EM-4 mostraram o crescimento dos microrganismos
na presença de concentrações entre 0,2% e 1,0% de Velpar K® no gel. Os
resultados de espectrofotometria no ultravioleta das soluções aquosas contendo nas
proporções entre 1:1 a 9:1 de Velpar K®/EM-4 mostraram diminuição da
absorbância entre 200 e 260nm, principalmente, para proporção de 1:1 sob agitação
de 100 rpm.
As análises em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
mostraram que o EM-4 reduziu até cerca de 42,1% do Diuron e 29,7% da
Hexazinona presente no Velpar K® na proporção 2:1 (Velpar K®/EM-4), após 3
dias de inoculação. Estes dados mostram que o EM-4 poderá ser utilizado para
biorremediar águas de lagoas e rios contaminadas com o Velpar K®.
ABSTRACT
A recent process that has presented satisfactory results is the use of
microorganisms present in nature for the biodegradation or bioremediation of toxic
materials.
This paper presents the study of the bioremediation of Velpar K
®
herbicide
in vitro in aqueous medium used against weed in sugar cane culture in São Paulo
state.
Its active principles are Hexazinone and Diuron, with the use of the
microbial innoculant EM-4 (Efficient Microorganisms), a microorganisms
consortium extracted from the ground which consists of lactic and photosynthetic
bacteria, filamentous fungi, yeast and actinomicets. The microbiological data in
culture medium for depth in agar-agar in concentrations between 0,2% and 1,0%
(m/v) of Velpar K
®
in the gel innoculated with EM-4 show the growth of
microorganisms. The spectrophotometrical results in the ultraviolet of aqueous
solutions under 100 rpm agitation and containing ratios between 1:1 and 9:1 of
Velpar K
®
/ EM-4 showed a reduction in the absorbance between 200 and 260 nm
for ratio of 1:1.
However, the analyses in high-efficiency liquid chromatography (HPLC)
showed that EM-4 reduced about 42.1% and 29.7% of the Diuron and Hexazinone
present in Velpar K
®
in the aqueous solution of ratio 2:1 (Velpar K
®
/ EM-4) after
innoculation of 3 days. These data showed that EM-4 may be used to bioremediate
water contaminated by Velpar K
®
in lakes and rivers.
INTRODUÇÃO
I.
INTRODUÇÃO
Com o objetivo principal de aumentar a quantidade dos produtos agrícolas,
cada vez mais se empregam agrotóxicos, substâncias tóxicas as quais provocam
problemas de saúde ambiental e pública. A biodegradação destes resíduos perigosos,
orgânicos ou inorgânicos, para reduzí-los ou eliminá-los do ambiente é denominada de
biorremediação. Este sistema de tratamento biológico tem diversas aplicações em locais
contaminados, tais como água, solo, sedimentos de lagoas e oceanos.
No decorrer do milênio, a ciência vem evoluindo na utilização de meios para
o uso de microrganismos naturais, como por exemplo, alguns antibióticos. Sendo que nos
dias atuais, com a evolução dos conhecimentos científicos sobre os processos
microbianos, permite-nos à utilização das atividades biossintéticas e degradativas destes
organismos. Esta utilização, em alguns casos, poderá ser direcionada intencionalmente
através das suas atividades microbianas, constituindo a base da biotecnologia em
ambiente natural ou artificial com diferentes objetivos, como biorremediação de
ambientes impactados, (SILVA, et al 1999).
O tratamento biológico efetuado em 1989, no Alaska, após o derramamento de
óleo do navio-petroleiro Exxon Valdez, foi um exemplo do uso de métodos de
biorremediação, apresentando resultados de redução ou eliminação dos resíduos orgânicos
perigosos presentes no ambiente.
Vazamentos ou derramamentos ou ainda a liberação em rios, mares e solos de
efluentes tanto domésticos como industriais tóxicos, tanto de esgotos quanto de óleo de
motores ou gasolina entre outros, atualmente adquiriu grande popularidade.
Como podemos observar atualmente, a contaminação de solos, ar e águas por
substâncias tóxicas é um dos grandes problemas a ser enfrentado no Mundo
Industrializado (BOOPATHY,R. 2002), a presença dessas substâncias nos vários
ecossistemas representa sempre um risco aos seres vivos não existindo, praticamente
aquilo que se poderia chamar de “risco zero”, ou seja 100% de segurança quando ocorre
exposição a estas substâncias (CAIRNS, 1980).
Com a complexidade do próprio ambiente onde ocorre a contaminação, assim
como a biorremediação, sendo dependente das aproximações interdisciplinares,
envolvendo a química, microbiologia, bioquímica, engenharia, ecologia, geologia e
outras, as tecnologias de biorremediação podem ser classificadas como tratamento in situ
(no local) ou ex situ (fora do local) de contaminação, (MOREIRA, et al 2002).
No momento, as contaminações do ambiente geralmente estão relacionadas
com escoamento de resíduos sem tratamentos adequados nos rios e solos, aplicações
excessivas de pesticidas nas lavouras, geração de produtos químicos industriais
indesejados e formação de estoques de produtos químicos não reaproveitáveis
(radioativos ou não), acúmulo nos lençóis freáticos. Este desenvolvimento de processos
de descontaminação por biorremediação de pesticidas apresenta método alternativo de
redução dos seus efeitos colaterais futuros na cadeia alimentar natural.
I.INTRODUÇÃO 2
Diversos trabalhos estão sendo realizados para minimizar, reduzir ou até
eliminar a presença de materiais tóxicos no ambiente, tais como a biodegradação dos
organoclorados, carbamatos e organofosforados. A fisiologia biodegradativa microbiana
no processo de biorremediação é baseada nas atividades dos microrganismos
heterotróficos aeróbios e anaeróbios, sendo que a atividade microbiana é afetada por
grande número de parâmetros físicos e químicos ambientais.
Os fatores que afetam diretamente na biorremediação são: fontes de energia
(doadores de elétrons), receptores de elétron, nutrientes, pH, temperatura e metabólitos
inibitórios. Distinção preliminar entre os diversos tipos de solos vem a ser o índice de
material orgânico na classificação de solos. O solo superficial recebe a deposição de
folhas, caules, restos de corpos de animais, fezes, dentre outros, naturalmente este
horizonte apresentará maior índice de material orgânico. Este alto índice está associado
geralmente com os números microbianos elevados e maior biodiversidade de populações
microbianas.
A matéria orgânica serve como fonte de carbono e de energia, assim como
fontes de outros macronutrientes, tais como: nitrogênio, fósforo, potássio e enxofre. No
subsolo e em sedimentos de água possuem níveis mais baixos de matéria orgânica
diminuindo assim os números e a biodiversidade da população microbiana em relação
aos solos superficiais Adriaens e Hikey, (1993). Destes microrganismos, os mais
dominantes no perfil do solo são as bactérias em comparação a outros microrganismos,
tais como fungos ou actinomicetos, devido a sua habilidade de utilizar receptores
alternativos de elétrons além do oxigênio, tais como nitratos e sulfatos, (BOOPATHY,R.
2002).
I.INTRODUÇÃO 3
I.1. Biorremediação Microbiana
Biorremediação é definida como uma estratégia ou processo que emprega
microrganismos ou suas enzimas para desintoxicar contaminantes no solo ou água.
Esta consiste basicamente na transformação do contaminante em formas que
não oferecem riscos de contaminação, (MOREIRA, et al 2002).
Portanto, é fundamentada nos processos de degradação microbiana e reações
químicas combinadas com processos de engenharia, criando condições para maximizar
as transformações dos contaminantes orgânicos do ambiente.
De acordo com a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA), as
principais categorias de contaminantes do solo estão apresentadas na seguinte ordem
decrescente: cloroalifáticos > pesticidas > hidrocarbonetos aromáticos > cloroaromáticos
> aromáticos simples e outros. Estes se originam da industrialização do petróleo bruto,
industrias químicas diversas e atividades agrícolas, sendo muitos destes produtos de
difícil decomposição e por isso, causam sérios impactos ambientais.
Alguns representantes mais importantes no âmbito da biorremediação são:
a) Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), que são orgânicos
voláteis com várias ligações tipo benzeno condensadas, representam mais de 100
diferentes compostos de usos diversos como antraceno e benzopireno. Os PAHs são em
sua maioria lipofílicos e adsorvem fortemente a superfícies hidrofóbicas. O interesse na
biorremediação destes compostos é crescente devido aos efeitos mutagênicos e
carcinogênicos dos mesmos. Conforme discutido por Accioly, et al (2000), quando as
I.INTRODUÇÃO 4
concentrações no solo atingem valores acima de 100 mg.Kg
-1
tornam-se necessárias
ações mitigadoras;
b) Os hidrocarbonetos halogenados, especialmente os clorados, são os
xenobióticos de maior persistência no solo devido à sua baixa degradabilidade que é
resultante da baixa solubilidade, configuração e tamanho molecular, toxidade e elevada
energia química de ligação. Os contaminantes mais estudados são: PCP
(Pentaclorofenol), TCE (Tricloroetileno) e os PCB’s (bifenis policlorados);
c) Os derivados nitrogenados do nitrotolueno empregados na confecção de
materiais explosivos como o TNT (2,4 – trinitrotolueno).
Do ponto de vista prático, a biorremediação é fundamentada em três aspectos
principais:
1) Existência de microrganismos com capacidade catabólica para degradar o
contaminante;
2) O contaminante tem que estar disponível ou acessível ao ataque microbiano ou
enzimático;
3) Condições ambientais adequadas para o crescimento e atividade do agente
biorremediador.
Microrganismos com as mais diversas capacidades metabólicas são
empregados na biorremediação. Alguns destes são pertencentes aos gêneros de bactérias
e fungos, muito mencionados como: Azospirillum, Pseudomonas, Alcaligenes,
Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Serratia. Bacillus, Arthrobacter, Nocardia,
I.INTRODUÇÃO 5
Streptomyces, Mucor, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete e Trametes. A rota
metabólica da degradação dependerá do microrganismo envolvido e do ambiente.
I.1.1. Técnicas de Biorremediação
Apesar de fundamentada em um único processo básico (biodegradação), as
técnicas de biorremediação, como mencionado, ocorrem em variações de tratamentos “in
situ” (no local) e “ex situ” (fora do local) que podem envolver inúmeros procedimentos
listados na Tabela I.
A maioria dessas estratégias se aplica aos tratamentos de superfície, enquanto
algumas são específicas para a biorremediação em sub-superfície como é o caso da
bioventilação, que consiste na injeção de ar no solo (ou camada) contaminado para
estimular a atuação dos microrganismos de ação degradadora do contaminante,
(BOOPATHY,R. 2002).
O sucesso de qualquer um desses procedimentos depende de vários aspectos,
os quais acham-se resumidos na Tabela II. A natureza química, bioatividade,
distribuição na matriz do rejeito ou de solo e a concentração do contaminante são fatores
decisivos da biotratabilidade do rejeito. Esta, em última análise, determinará o sistema a
ser empregado, assim como as possíveis limitações, riscos e eficácia do tratamento.
I.INTRODUÇÃO 6
Tabela I: Tipos e estratégias para biorremediação no solo, (SKIPPER 1998).
Biorremediação Fundamentos e Definições
Passiva
Consiste na degradação intrínseca ou natural pelos
microrganismos indígenas do solo.
Bioestimulada
Consiste na adição de nutrientes, como N e P, para
estimular os microrganismos indígenas.
Bioventilação
É uma forma de bioestimulação por meio da adição
de gases estimulantes, como O
2
e CH
4
, para
aumentar a atividade microbiana decompositora.
Bioaumento
É a inoculação do local contaminado com
microrganismos selecionados para degradação do
contaminante.
“Landfarming”
É a aplicação e incorporação de contaminantes ou
rejeitos contaminados na superfície de solo não
contaminado para degradação. O solo é arado e
gradeado para promover a mistura uniforme do
contaminante e aeração.
Compostagem
É o uso de microrganismo termofílicos, aeróbios em
pilhas construídas para degradar o contaminante.
Vários contaminantes podem ser tratados biologicamente com sucesso. Estes
incluem petróleo bruto, hidrocarbonetos do petróleo como gasolina (que contém
benzeno, xileno, tolueno e etilbenzeno), óleo diesel, combustíveis de avião, preservativos
de madeira, solventes diversos, lodo de esgoto urbano ou industrial, e outros compostos
xenobióticos ou biogênicos, existindo mais de 300 compostos individuais passíveis de
destoxicação por biorremediação.
I.INTRODUÇÃO 7
Os aspectos biológicos das técnicas mais comumente empregadas são
apresentados, resumidamente a seguir:
Tabela II. Principais dificuldades para o sucesso dos tratamentos biológicos de solos
contaminados, (SKLANDANY, et al 1992).
Principais aspectos Comentários
Heterogeneidade do rejeito Os rejeitos são distribuídos de modo heterogêneo
no solo e o contaminante pode ocorrer em formas
não acessíveis.
Concentração do contaminante
Contaminantes podem estar presentes em
concentrações variadas (de muito baixa a muito
alta). Se muito baixa, pode não garantir o
crescimento microbiano, e se muito alta, pode ser
tóxica e inibir o crescimento.
Persistência e toxicidade
Tratamentos biológicos são eficientes para remover
materiais biodegradáveis e de baixa toxicidade.
Contaminantes resistentes a biodegradação exigem
adequação nutricional do solo (como fonte de C) e
consórcio microbiano.
Condições adequadas para o
crescimento microbiano
Atividade microbiana suficiente para promover
adequada degradação exige condições ambientais
favoráveis.
A) “Landfarming”
Consiste na aplicação do contaminante em forma líquida ou sólida na camada
arável do solo, onde se concentram 90% dos microrganismos que usam os contaminantes
como fonte de energia e que podem transformá-los geralmente, mas não exclusivamente
por co-metabolismo.
I.INTRODUÇÃO 8
A matriz (rejeito) contaminada é misturada ao solo por aração e gradagem e
as condições físico-químicas do solo (água, aeração e nutrientes) ajustadas para
maximizar a atividade heterotrófica. Cria-se assim a camada reativa “zona de tratamento”
fazendo com que esta camada de solo atue como bioreator natural. Esta camada pode
atingir 50cm, dependendo da profundidade de incorporação dos resíduos. Abaixo desta
zona situa-se uma camada de solo ainda não saturada, acima do lençol freático.
Uma variação do “landfarming” convencional inclui a presença do
contaminante. A pulverização do solo pela aração e gradagem facilita o espalhamento do
solo com contaminante pelo vento. Para que isso seja evitado, o solo deve ser mantido
úmido. Ele é empregado com elevada eficiência no tratamento de rejeitos industriais,
especialmente na indústria petroquímica, , (BEWLEY, et al 1996).
Concentrações de petróleo de até 7% (70.000 mg.Kg
-1
) são reduzidas para
100 – 200 mg.Kg
-1
em poços meses, desde que as condições físicas (umidade e aeração),
químicas (presença de aceptores de elétrons) e biológicas (elevada atividade
heterotrófica), sejam adequadas.
Para a degradação de 100 unidades de C são necessárias, em média, 2
unidades de N para as bactérias, 3 a 4 para fungos e 3 a 6 para os actinomicetos.
Assim, para se obter sucesso com esse processo, além da boa aeração para
que o O
2
não seja limitante, garantindo assim o fluxo de elétrons da bioxidação, a
disponibilidade de N e P e outros nutrientes no solo é essencial, assim como é importante
a relação C/N de 9:1.
I.INTRODUÇÃO 9
Por isso, o tipo de solo e seu teor de matéria orgânica, assim como a aplicação
de N, são fatores que precisam ser controlados. A matéria orgânica do solo é importante
para a população microbiana co-metabolizante que, também, atua na biodegradação de
certos componentes do petróleo e de outros resíduos.
Muitos contaminantes apresentam baixa degradabilidade e neste caso, o
tratamento do rejeito com surfactante ou agentes pré-oxidantes, reduz a recalcitrância e
acelera a degradação destes pelos microrganismos. Em condições ótimas de nutrientes
(e.g. relação C:N:P 70:5:1) a biodegradação de petróleo bruto ou lodo de refinaria atinge
de 60 a 86% em menos de um ano.
A composição química do resíduo, também, determina a velocidade de sua
decomposição. A fração de compostos saturados de petróleo degrada-se mais facilmente
do que a insaturada, exercendo grande influência na tratabilidade dos resíduos de
refinarias. No Brasil, as condições climáticas são muito favoráveis ao uso desse processo,
um exemplo é a refinaria da Petrobrás em Curitiba (PR), onde o solo com biota adaptada
para biodegradação destes rejeitos, pode tratar de 0,5 a 1,0 m
3
de óleo por m
2
de solo por
ano ao custo de R$ 9,00 a 12,6, (MOREIRA, et al 2002).
Um outro exemplo interessante ocorreu no tratamento de solo contaminado
com atrazina na fábrica da Ciba-Geigy Corp no estado de Louisiana – EUA. O solo, além
de arado e gradeado, recebeu 880 Kg de fertilizante 13-13-13 (NPK) e aplicação de
culturas de Pseudomonas degradadoras de atrazina. Após 20 semanas a concentração do
contaminante reduziu de 100 mg.Kg
-1
para apenas 10 mg.Kg
-1
, uma redução de 90% da
concentração original.
I.INTRODUÇÃO 10
Para área de 1,9 ha de solo contaminado a empresa gastou US$ 1,05 milhão,
enquanto para outro procedimento, como escavação e disposição apropriada do solo
contaminado, seriam gastos US$ 5,3 milhões. Com a biorremediação US$ 4,25 milhões
foram economizados pela empresa. Portanto, o “landfarming” representou uma economia
de US$ 2,3 milhões de dólares no tratamento de 1 ha de solo poluído, neste caso. Apesar
de ser um processo simples, para a implantação do “landfarming”, devem-se observar
critérios técnicos para a seleção de locais apropriados, pois há formação de gases e
materiais lixiviáveis que oferecem riscos ao ambiente.
A topografia do solo, a localização em relação aos cursos d’água, o tipo e a
profundidade do solo, são alguns aspectos importantes na definição da área destinada a
esse processo. Os órgãos reguladores e de gestão ambiental possuem as instituições
normativas para a implementação do processo.
B) “Biorremediação fase sólida”
É baseada nos mesmos princípios do método anterior, porém constitui-se de
pilhas de solo, que funcionam como células de tratamento. Nestas células, realiza-se
controle mais rigoroso da volatilização, lixiviação e escoamento superficial de material
contaminado, o que não ocorre no “landfarming”, sendo, portanto, mais seguro e
apropriado para tratamento de solos contendo compostos que oferecem elevado risco
ambiental. Na biorremediação fase sólida pode-se, também, optar pela compostagem que
consiste no tratamento controlado pela geração de calor pelos aeróbios termofílicos.
I.INTRODUÇÃO 11
A elevação da temperatura na massa contaminada é ideal para tratamento de
rejeitos e lodos diversos, incluindo contaminantes explosivos. É um processo barato e
fácil de ser monitorado.
C) Tratamento “in situ”
Os tratamentos “in situ” são baseados na manipulação da fase aquosa e
estímulo da decomposição pela injeção de ar (bioventilação) e suplementação com
nutrientes em galerias e poços de infiltração. É comum o uso de plantas nesse tipo de
tratamento, as quais fornecem substratos à atividade microbiana, enquanto os
microrganismos transformam os contaminantes. Além da biodegradação, os
microrganismos atuam direta ou indiretamente na biosorção, reduzindo a ação dos
contaminantes no ambiente.
D) Bioaumento
A biorremediação envolve ainda a inoculação do solo com culturas puras ou
consórcio microbiano contendo microrganismos selecionados para degradação de
contaminantes específicos. Esses processos são conhecidos por bioaumento que tem sido
bastante estudada para vários herbicidas, hidrocarbonetos clorados e carbamatos através
do emprego de populações indígenas aclimatadas, isolados selecionados e até mesmo
microrganismos transgênicos contendo plasmídeos degradadores, (STRUTHERS, et al
1998), (BEWEY 1996).
Para isto, recorre-se a populações aclimatadas através de mutação direta ou
transformação genética, para degradação acelerada de determinado composto (FELSOT,
et al 1993). Isolados indígenas, bem como microrganismos modificados geneticamente,
I.INTRODUÇÃO 12
contendo plasmídeos catabólicos, têm sido empregados na produção de inoculantes
comerciais para biorremediação.
Várias bactérias e fungos, compreendendo dezenas de formulações
comerciais, são vendidos nos EUA a preços que variam de US$ 3.6 a US$ 18.0 Kg
-1
(GLASS 1992).
Entretanto, existem poucas evidências definitivas de sucesso dessa técnica,
exceto em algumas situações específicas, como se verifica com o Agrobacterium
radiobacter J14a, que possui elevada capacidade de degradar a atrazina e o fungo
Phanerochaete chrysosporum, o qual degrada mais que 60 xenobióticos, incluindo 12
aromáticos policíclicos, 12 aromáticos clorados, 9 policíclicos aromáticos, 3 alquil-
clorado, 6 biopolímeros e 16 corantes diversos, (BUMPUS, et al 1993). P.chrysosporum
for capaz de degradar entre 15 a 98% de vários xenobióticos em menos de 60 dias.
Em geral, o bioaumento é mais apropriado para tratamentos de contaminantes
muito recalcitrantes, em contaminações recentes e onde se pretende aplicar a degradação
acelerada.
E) Fitorremediação
Uma estratégia que vem ganhando espaço na biorremediação é o uso de
plantas para acelerar o processo de degradação. As plantas, além de atuarem diretamente
sobre vários tipos de contaminantes, contribuem indiretamente através do efeito
rizosférico sobre a microbiota biodegradadora. Tratamento de solo contaminado com
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPA’s) em concentração de 185 mg.Kg
-1
de
HAPs total e 50 mg.Kg
-1
de HAP’s carcinogênicos, poderá sofrer redução de 26% após
I.INTRODUÇÃO 13
180 dias de tratamento sem planta e de 57% quando o solo for semeado com Panicum
virgatum (switchgrass), (PRADHAN, et al 1998).
Em fração carcinogênica poderá ocorrer redução apenas nas parcelas com
planta, sendo esta redução da ordem de 30%. Várias outras plantas e contaminantes têm
sido estudadas na biorremediação, evidenciando a importância dos processos
microbianos influenciados por estas. Processos com emprego das plantas na remediação
do solo, denominado como fitorremediação, é citado por Accioly et al (2000).
A biorremediação microbiana têm concepção muito antiga, mas só
recentemente evoluiu de estudos pilotos para aplicação em larga escala. No momento,
representa a principal tecnologia de remediação de solo por ser:
a) De baixo custo (US$ 13 a 1.500 por tonelada de solo tratado) em relação a
outras técnicas;
b) Ser uma solução permanente;
c) Fundamentada em processos naturais;
d) Aplicável a ampla variedade de contaminante e;
e) De grande aceitação pública.
No Brasil a biorremediação é, ainda, muito pouca praticada, exceto
“landfarming”, que é praticado com sucesso, principalmente na indústria petroquímica
brasileira. É claro que a biorremediação está sendo desenvolvida geralmente para reduzir
a presença de substâncias perigosas que podem ser ingeridas ou inaladas pelo ser humano
ou, ainda, que possam provocar grandes catástrofes ambientais, tais como mortandades
I.INTRODUÇÃO 14
de peixes ou animais, por exemplo na poluição de rios pelos pesticidas ou agrotóxicos.
I.2. Pesticidas
Os pesticidas têm salvado milhares de vidas pela morte de insetos que
transportam doenças e pelo aumento da quantidade dos alimentos.
A agricultura moderna utiliza pesticidas para produzir vegetais e frutas
visando produção de ganho na quantidade e no lucro. Entretanto, os pesticidas, também,
podem causar problemas à saúde humana, a flora, fauna e ao ambiente em geral.
Sabe-se que os efeitos danosos em muitos casos suplantam os seus efeitos
benéficos, por exemplo o BHC (benzeno hexaclorado), utilizado no controle dos
mosquitos-hospedeiros da malária, agindo de maneira eficaz, entretanto observa-se que
este produto acumula-se nas células adiposas de humanos. Raramente os pesticidas
afetam apenas uma determinada peste, mas sim toda cadeia alimentar da relação
presa/predador, como no caso do DDT, conforme apresentação na figura 1. Pessoas que
aplicam e trabalham com os pesticidas, possuem risco maior de envenenamento (efeito
agudo) e câncer (efeito crônico); e as pessoas que se alimentam de produtos com traços
de pesticidas podem estar sendo contaminadas e adquirindo o efeito crônico do produto.
Pesticidas são todos os produtos tóxicos que ajudam reduzir a população de
pestes, tais como roedores, insetos, bactérias, fungos e outros organismos que competem
ou trazem doenças ao homem. Os pesticidas podem ser agrupados pelo seu organismo
alvo, isto é, as quais eles supõem eliminar. Logo, inseticidas matam insetos, herbicidas
matam plantas, fungicidas matam fungos e os raticidas matam os ratos.
I.INTRODUÇÃO 15
A agricultura é o setor que utiliza a maioria dos pesticidas, nos E.U.A.,
aproximadamente 74% dos 430 mil toneladas métricas estimadas utilizadas a cada ano.
Os fazendeiros dos E.U.A. gastam em torno de US$ 4,1 bilhões de dólares por ano na
aplicação dos pesticidas nas colheitas.
Figura 1: Acúmulo de inseticida diclorodifeniltricloroetano (DDT) na cadeia
alimentar.(fonte:RAVEN,P.,et al 1993).
O “pesticida ideal” seria aquele de uso específico para determinada praga
(peste), que matasse, somente, o organismo para que se pretendeu e, não prejudicasse
nenhuma outra espécie. O “pesticida ideal” seria degradado também prontamente, ou
I.INTRODUÇÃO 16
quebrado em moléculas menores pela decomposição química natural ou pela ação dos
microrganismos, em materiais seguros ou não perigosos, tais como a água, dióxido de
carbono e o oxigênio.
Finalmente, o pesticida ideal permaneceria exatamente no lugar aonde foi
posto e não transportado para o ambiente. Infelizmente, não existe pesticida ideal; a
maioria dos pesticidas são de largo espectro, isto é, que matam ampla variedade de
organismos vivos além da praga-alvo.
Entretanto, muitos pesticidas não degradam prontamente ou degradam-se em
compostos que são igualmente tão perigosos quanto o pesticida original; além disso, os
pesticidas podem transferir-se para todo ambiente, bem como no entorno de onde foram
aplicados.
I.2.1) Pesticidas de primeira e segunda gerações
Anteriormente a 1940, existiam dois grupos principais de pesticidas: os
compostos inorgânicos (chamados também de minerais) e os compostos orgânicos. O
primeiro grupo continha o mercúrio e o arsênio, que são extremamente tóxicos às pestes
e felizmente hoje não são mais utilizados. Ressalta-se que estes compostos persistem e
acumulam-se no solo e na água, não sendo degradados por processos naturais, e que
ameaçam os seres humanos e animais selvagens.
O segundo grupo era representado por compostos orgânicos naturais
provenientes de plantas que eram venenosas principalmente as plantas, denominadas de
produtos botânicos, podendo ser citados como a nicotina do tabaco, piretrina das flores
do crisântemos e a rotenona das raízes do Timbó. Estes compostos são facilmente
I.INTRODUÇÃO 17
degradados por organismos vivos e conseqüentemente, não persistem no ambiente. A
partir da década de 1940, grande número de novos pesticidas orgânicos começaram a ser
produzidos, de forma sintética. O primeiro grupo de pesticida foi citado, com a finalidade
de diferenciá-los dos produzidos atualmente, denominados de segunda geração.
Atualmente existem milhares de pesticidas compostos de diversos produtos
químicos diferentes. Novos compostos organoclorados foram sintetizados após o
reconhecimento dos efeitos nocivos do DDT à saúde humana e aos animais.
Contudo os organoclorados são inseticidas de largo espectros, lentos para
degradar e persistentes no ambiente durando meses ou anos contínuos. Estes compostos
foram utilizados largamente entre os anos de 1940 e 1960, mas o seu uso foi restringido,
principalmente pela sua persistência no ambiente.
Tornou-se público os problemas que estes pesticidas causavam após a
publicação do livro “Silent Spring
” (Primavera Silenciosa) em 1963, de Rachel Carlson,
desta maneira, movimentos da sociedade civil e científica contestaram o uso de tais
compostos. Existem 3 grupos importantes de inseticidas de segunda geração, que são os
hidrocarbonetos clorados ou organoclorados, organofosfatos e os carbamatos,
sintetizados, (RAVEN, et al. 1993).
Os organofosfatos, compostos que possuem o fósforo, foram desenvolvidos
durante a II Guerra Mundial, como subproduto da pesquisa alemã do gás do nervo. Os
organofosfatos são mais venenosos do que outros tipos de inseticidas, e são também
tóxicos aos animais além dos insetos. A toxicidade dos organofosforados são
I.INTRODUÇÃO 18
comparáveis ao arsênio e a estriquinina, contudo ambientalmente menos persistente que
os organoclorados, visto que são degradados mais facilmente por microrganismos, e
conseqüentemente os organofosforados substituíram os organoclorados em grande escala
na agricultura.
O grupo dos inseticidas carbamatos, que são de largo espectro, derivados do
ácido carbâmico, não são tão tóxicos quanto os organofosforados. Dois carbamatos mais
comuns são Carbaryl (Sevin, nome comercial) e Propoxur (Baygon, nome comercial).
Como inseticidas, os herbicidas, também, são classificados de acordo com a
estrutura química, contudo este método é incômodo porque há pelo menos 12 grupos
diferentes em uso comercial. O método mais comum é classificá-los de acordo com a
ação e a espécie atingida. Os herbicidas seletivos matam somente determinados tipos de
plantas, enquanto que os herbicidas não seletivos matam todo o tipo de vegetação.
Os herbicidas seletivos podem ser classificados de acordo com os tipos de
plantas que afetam, assim temos os herbicidas que matam as plantas de folhas largas, mas
não as de folhas estreitas (espécies das gramíneas); e os herbicidas empregados no
controle plantas de folhas estreitas.
Dois herbicidas mais comuns com estruturas similares são o ácido 2,4-
dichlorophenoxyacetic (2,4-D) e o ácido 2,4,5,-trichlorophenoxyacetic (2,4,5-T), ambos
desenvolvidos nos EUA nos 1940. Estes herbicidas de folhas largas são similares a
estrutura de um hormônio natural do crescimento em determinadas plantas, que rompe
conseqüentemente os processos naturais do crescimento das plantas; matam plantas, tais
como, dente-de-leão, mas não prejudicam as gramíneas.
I.INTRODUÇÃO 19
Atualmente, muitas das colheitas importantes do mundo, incluindo o trigo, o
milho, e o arroz, são grãos de cereais, que são gramíneas. O 2,4-D e o 2,4,5-T podem ser
usados para matar as ervas daninhas que competem com estas colheitas, embora 2,4,5-T
não seja mais utilizado nos EUA. No Brasil, são utilizados em grandes quantidades o
Velpar K®, no cultivo da cana-de-açúcar, principalmente no estado de São Paulo.
Existe, atualmente, grande consumo de pesticidas não apenas na agricultura,
mas, também, como uso doméstico, que se não fossem biodegradados teríamos grande
acúmulo destes pesticidas no ambiente que poderiam contaminar os alimentos e todos os
seres vivos. Contudo, a Natureza reduz esta grande quantidade de pesticidas pela
biodegradação natural, apesar de alguns inconvenientes.
I.2.2) Velpar K®
O produto comercial Velpar K®, fabricado pela DU PONT, é um herbicida
seletivo no controle de ervas invasoras nas culturas de cana-de-açúcar no estado de São
Paulo, o produto é comercializado em forma de grânulos auto-dispersíveis em água,
cujos ingredientes ativos pertencem aos grupos das Uréias substituídas e das Triazinonas,
cujos nomes da IUPAC são: 3-(3,4-(diclorofenil)-1,1-dimetiluréia ou Diuron (46,8%) e
3-ciclohexil-6(dimetilamino)-1metil-1,3,5,triazina-2,4(1H,3H)diona ou Hexazinona
(13,2%) e o restante de ingredientes inertes (40%).
A) DIURON
É um composto do grupo da uréia bi-substituída, que foi utilizada como
herbicida em 1951, quando as propriedades herbicidas do Monuron foram descritas.
I.INTRODUÇÃO 20
Vários outros compostos foram introduzidos subseqüentemente. Estes
compostos são derivados da uréia com substituições dos hidrogênios amídicos.
A substituição dos hidrogênios da uréia somente por radicais alifáticos dá
origem a herbicidas com baixa atividade. Os derivados tri-substituídos são os que
apresentam a mais alta atividade herbicida. O subgrupo mais conhecido é o das
feniluréias e inclui os derivados N
,
-aril–N,N–dimetiluréia (Monuron, Diuron,
Isoproturon, Metoxuron, Clortoluron, Cloroxuron, Fluometuron e Difenoxuron) e N’-
aril–N–metoxi-N–metiluréia (Monolinuron, Metobromuron, Linuron e Clorbromuron).
Estes últimos apresentam seletividade e atividade herbicida maiores que os
primeiros. A substituição de um dos radicais metila nos derivados N
’
-aril–N,N-
dimetiluréia por radicais maiores dá origem a compostos com menor atividade herbicida,
porém, com maior seletividade (Neburon e Buturon).
Derivados da uréia contendo substituintes heterocíclicos têm sido estudados
recentemente para propostas de utilização herbicida. Entre estes, destacam-se: as 1,3,4-
tiadiazoliluréias (Tidiazurona). A clorsulfurona e Clorimurona etílica são herbicidas
representantes do subgrupo das sulfoniluréias, uréias com substituição do hidrogênio
amídico por um grupo sulfonila. As uréias herbicidas agem inibindo a fotossíntese.
A seletividade deste grupo é determinada por fatores toxicocinéticos, tais
como absorção e transporte pela planta, translocado para a parte aérea através do xilema,
marcadamente no sentido acrópoto e, também, por fatores bioquímicos, como por
exemplo à degradação de uréias substituídas a compostos não fitotóxicos pela planta do
algodão. Nesta classe, o composto mais importante foi o Monuron, figura 2(a), hoje de
I.INTRODUÇÃO 21
uso proscrito, graças à sua comprovada carcinogenicidade para animais, (MÍDIO, A.F
1997).
Cl N C N
CH
3
CH
3
HO
Cl N C N
CH
3
CH
3
HO
Cl
(a)
(b)
Figura 2: Estruturas de N´-(4-Clorofenil)-N,N-dimetiluréia (Monuron) (a) e do N´-(3,4-
diclorofenil)-N,N-dimetiluréia (Diuron) (b).
O Diuron conforme a figura 2(b), apresenta-se como um sólido branco com
ponto de fusão de 158
o
C, pressão de vapor de 412mPa (50
o
C) e solúvel em água
(42mg.L
-1
) e em acetona (53mg.L
-1
) a 25
o
C e baixa solubilidade em hidrocarbonetos.
Apresenta-se estável à oxidação e à umidade, bem como de compostos não
corrosivos; decompõe-se a 189-190ºC. A proporção do composto hidrolisado é
aumentada frente a condições de altas temperaturas e meio fortemente ácido ou alcalino,
segundo o esquema de degradação conforme mostra a figura 3.
NC
H
O
N
CH
3
CH
3
Cl
Cl
NC
O
-
N
+
CH
3
CH
3
Cl
Cl
NCl
Cl
CO
+
HN
CH
3
CH
3
Diuron
Íon dipolar
3,4diclorofenilisocianato
3,4diclo
r
oanilina (DCA)
NCl
Cl
CO
+
H
2
O
+
CO
2
NH
2
Cl
Cl
Figura 3: Degradação parcial do diuron para 3,4-dicloroanilina (DCA).
I.INTRODUÇÃO 22
A degradação do diuron pode formar compostos mais perigosos como no caso
da dicloroanilina, que é mais perigoso e com pouco efeito herbicida, com os efeitos
similares ao cloroaromático. Os principais nomes comerciais do Diuron: Karmex (Du
Pont de Nemours), Diuron (Hoechst), Diuron Nortox (Nortox), Diuron Centralsul
(Defensa), Cention (Rhodia Agro), Herburon (Herbitécnica).
B) HEXAZINONA
Pertence aos grupos dos herbicidas triazínicos que vem sendo empregados na
agricultura para o controle de ervas invasoras, devido à capacidade destes compostos
orgânicos em inibir a fotossíntese. Dentre eles destacam-se a atrazina, simazina,
propazina e ametrina. A atrazina em uso há mais de 30 anos, representa 12% de todos os
pesticidas empregados nos Estados Unidos em culturas de milho, sorgo, cana e abacaxi
como também é largamente empregada nos estados do centro e moderadamente em
estados do leste.
O Brasil com as culturas da cana e milho, emprega também elevadas
quantidades de herbicidas triazínicos. Das 150.000 toneladas/ano dos pesticidas
consumidos, cerca de 33%, são herbicidas; somente a cultura da cana-de-açúcar, vem
consumindo em torno de 13% do total de pesticidas.
As propriedades fitotóxicas das triazinas são derivadas à inibição da
fotossíntese. Algumas espécies vegetais, como por exemplo, o milho, apresenta alta
tolerância a estes compostos. Porém a causa deste fenômeno não é esclarecida, podendo
estar relacionada com uma inativação enzimática ou não pela planta.
I.INTRODUÇÃO 23
As triazinonas, triazinas que apresentam funções cetônicas, têm alcançado
aplicação prática recentemente e são representadas pela hexazinona, metamitrona e
metribuzina. Esta última é sintetizada a partir da tiocarboidrazida. A condensação de
metribuzina com 2-metil-propanal dá origem a outro representante das triazinonas, a
isometiozina. A grande maioria das triazinas utilizadas como herbicidas apresentam anel
simétrico (1,3,5-triazinas ou s-triazinas).
Estas triazinas são estáveis em meio neutro, levemente ácido ou básico, os
ácidos minerais ou bases às altas temperaturas hidrolisam-nas produzindo o derivado
hidroxilado sem atividade herbicida; são ainda não-corrosivo, que possuem diversos
nomes comerciais: Gesaprim (J.R.Geigy S.A.), Atrazinax (Rhodia Agro), Primoleo
(Ciba-Geigy) e outros. Elas são herbicidas seletivas no controle pré e pós-emergente de
ervas invasoras.
Hexazinona é um herbicida muito utilizado no combate de ervas invasoras em
culturas anuais e perenes, atuando na inibição da formação de fotossíntese. É solúvel em
água, e não liga fortemente ao solo. Por esta razão, há interesse no monitoramento de
contaminação em águas subterrâneas por este herbicida. Hexazinona pode incorporar em
sistemas aquáticos através de cursos parados de superfície e sub-superficie depois da sua
aplicação. É degradado pelo metabolismo microbiano, mas não prontamente decomposto
quimicamente ou pela luz solar, podendo persistir em sistemas aquáticos.
O hexazinona possui meia-vida no solo de 90 dias, podendo ser encontrado às
vezes no período de até 6 meses após a sua aplicação.
I.INTRODUÇÃO 24
Embora seja de toxicidade baixa aos pássaros e aos mamíferos, as taxas legais
da aplicação podem deixar os resíduos que excedem os níveis de EPA do interesse para
plantas aquáticas e terrestre e em pequenos mamíferos. Com toxicidade relativamente
baixa a pesca e a invertebrados aquáticos, mas pode ser altamente tóxicos a alguma
espécie de algas, visto que a biodegradação é muito lenta podendo ter acúmulo na cadeia
alimentar e quando ocorre, forma compostos triazínicos conforme mostra na figura 4.
: via principal
: via secundária
N
N
N
O
O
CH
3
N(CH
3
)
2
N
N
N
O
NHCH
3
CH
3
O
N
N
N
O
O
O
CH
3
N
N
N
N(CH
3
)
2
O
O
H
N
N
N
NHCH
3
O
O
H
N
N
N
O
O
O
CH
3
HO
N
N
N
O
O
CH
3
N(CH
3
)
2
HO
N
N
N
O
O
CH
3
NHCH
3
HO
Fotólise
Micróbios,
fotólise
metabolismo
de plantas
metabolismo
de plantas
Micróbios,
fotólise
metabolismo
de plantas animais
Micróbios,
metabolismo de
plantas animais
metabolismo
de plantas
Micróbios,
fotólise
metabolismo de plantas
Micróbios,
fotólise
metabolismo
de plantas animais
Micróbios,
metabolismo
de plantas animais
Hexazinona
Figura 4: Estruturas molecular da hexazinona e produtos de sua biodegradação.
I.INTRODUÇÃO 25
A contaminação do hexazinona, foi detectada em corpos pequenos de água
nos pulsos esporádicos, de baixo nível que foram diluídos rapidamente nos fluxos da
corrente principal. As concentrações elevadas do hexazinona, entretanto, poderiam
produzir efeito alternado na cadeia alimentar que finalmente poderia impactar a espécies
de peixes e dos animais silvestres.
Embora, o hexazinona possa acumular em colheitas tratadas, as concentrações
na vegetação podem não alcançar níveis tóxicos para animais forrageiros quando o
hexazinona for aplicado corretamente. Cuidado deve ser tomado no preparo e na
aplicação do hexazinona, pois pode causar severos danos aos olhos humanos.
I.3. EM-4 (Microrganismos Eficazes)
A utilização do inoculante microbiano EM-4 (Microrganismo Eficazes) foi
iniciada pelo Prof. Dr. Teruo Higa, da Universidade de Ryukyus, Japão, na década de
1970, impulsionado pelas práticas da Agricultura Natural dentro da filosofia de Mokiti
Okada, referentes ao mundo isento de doença, pobreza e conflito, no qual preconiza a
preservação ambiental, e agricultura sem o uso de pesticidas ou fertilizantes artificiais.
O inoculante microbiano EM-4 (Microrganismos Eficazes), é um consórcio
(pool) de microrganismos retirados do solo constituído de bactérias láticas e
fotossintéticas, leveduras, actinomicetos e fungos filamentosos, que aceleram a
biodedagração de resíduos de culturas, melhoram o equilíbrio do solo. Diversos trabalhos
desenvolvidos e publicados pela Fundação Mokiti Okada, no Brasil, mostram a eficiência
do EM-4 na Agricultura Natural e, também, no monitoramento em tratamento de
efluentes agroindustriais e domésticos.
I.INTRODUÇÃO 26
Vários trabalhos estão sendo realizados utilizando actinomicetos, fungos,
bactérias e leveduras, na forma individual ou em consórcio, para a biorremediação de
pesticidas presentes no solo com a finalidade de reduzir ou eliminar os seus efeitos
maléficos.
O uso inicial do EM foi para agricultura. Conseqüentemente o EM foi
aplicado para aumentar produtividade de cultivos no sistema orgânico ou natural, sendo
utilizado diretamente sobre material orgânico, ou sobre compostagem, reduzindo o tempo
requerido para a preparação deste biofertilizante. O EM também vem sendo utilizado na
forma de Bokashi (composto orgânico), feito com material de restos de vegetais como
casca de arroz, e na forma pó como um portador, misturado com fontes de nitrogênio em
material rico como arroz, milho ou farelo de trigo, refeição de peixe ou bolos de óleo.
Estudos demonstrado o sucesso do EM na produção de culturas agrícolas são
muitos. Pesquisa em mamão, pimentão, café, controle de Colletotrichum gloeosporioides
(Chagas et al., 2001; Chagas e Tokeshi, 1996a,b; Chagas et al., 1997; Machado, et al.,
2003; Tokeshi e Chagas, 1997) no Brasil, pastagem na Holanda e Áustria (Bruggenwert,
2001, Hader, 2001), legumes em Nova Zelândia e Sri Lanka (Daly e Stewart, 1999,
Sangakkara e Higa, 2000) e maçãs no Japão (Fujita, 2000) ilustram este fenômeno muito
claramente. Todos estes estudos são exemplos de um grande número de projetos e eles
realçam claramente que o uso de EM ou de produtos a base de EM aumentam
rendimentos de sistemas orgânicos tradicionais durante certo tempo.
I.INTRODUÇÃO 27
O fenômeno causal destes resultados foi atribuído a muitos fatores. Estes
incluem maior liberação de nutrientes de material orgânico quando compostado com EM
Sangakkara, et al (2001) aumentou a fotossíntese, Xu, et al (2001) e atividade de
proteína, Konoplya, et al (2001). Estudos também identificam maior resistência ao
estresse hídrico, Xu, (2000), maior mineralização de carbono, Daly, et al (1999) e
aumentando as propriedades do solo, Hussein, et al (2000) e melhor penetração de
raízes, In Ho, et al (2000) com o uso do EM.
Estudos na Ásia onde EM foi introduzido vem sendo extensivamente usado
Chantsawang, et al (1999) e em Belarus, Konoplya, et al (2000) relatam o uso próspero
do EM em avicultura e suinocultura na alimentação e sanitização das unidades. Unidades
integradas na África do Sul, e na Áustria, Hanekon, et al (2001), Safalaoh, et al (2001)
usam o EM para aumentar produtividade na suinocultura e de piscicultura Hader (2001).
Como citado anteriormente, os relatos com EM aumentando a produtividade
na pecuária são numerosos.
O papel do EM no controle ambiental é de importância significativa. Esta
solução microbiana que foi desenvolvida originalmente para o uso em sistemas de
agricultura orgânico ou natural, foi ampliada para superar assuntos ambientais mais
adiante.
O primeiro conceito do uso do EM, em gerenciamento ambiental apresentou
no processo de compostagem de resíduos de colheitas e esterco de animal que eram
efetivamente compostados para produzir biofertilizantes. Pesquisa na Holanda, van
I.INTRODUÇÃO 28
Bruchem et al., (1999), e Shintani et al. (2000) na Costa Rica, realçam o potencial de
fazer composto com esterco animal ou restos de colheita, estes rendimentos crescentes de
produção prouveram com este material, comparados à produtividade de sistemas
orgânicos tradicionais. O uso do EM em compostagem de lixo, desenvolvidos em
meados da década de 1990, e vários projetos bem sucedidos tem sido desenvolvidos na
Ásia. Um bom exemplo é o projeto de Hanoi Vietnã, Quang (2000), sob a supervisão do
Ministério de Ciência, Tecnologia e meio Ambiente daquele país. O lixo produzido na
cidade é compostado com EM e vendido como fertilizantes. Um projeto semelhante está
sendo desenvolvido em Yangon, Myanmar. A cidade de Pusan, na Coréia, usa EM para
compostar restos de cozinha, em mais de 500 apartamentos, que é reciclado e usado em
jardins de casa, em um projeto desenvolvido pela Cruz Vermelha. A cidade de
Christchurch em Nova Zelândia também desenvolveu um projeto semelhante, no local
realizado a Conferência Internacional sobre o EM, em janeiro de 2002.
No Brasil, Gregório, et al (2004), trabalharam na biotransformação de resíduo
vegetal em composto orgânico, à serem utilizados na manutenção de jardinagem, na
agricultura natural e orgânica. EM também está sendo efetivamente usado em
tratamentos de água.
O melhor exemplo disto está em Okinawa, a origem do EM. A biblioteca da
cidade de Gushikawa usa EM muito efetivamente no tratamento da água de esgoto que é
reciclada para o uso no jardim e em banheiros. A DQO e o DBO da água são
significativamente reduzidos quando tratados com EM, Okuda, et al (1999) sendo
reutilizada, reduzindo custos com energia.
I.INTRODUÇÃO 29
Um projeto muito recente em usar EM em tratamento de água está na Gold
Coast da Austrália, na cidade de Mc Kay. O sistema de esgoto da cidade é tratado com
EM e o oxigênio e a qualidade da água aumentada antes da descarga. Um resort usa EM
para seu tratamento de água, reduzindo o cheiro e sendo reutilizada em jardins. Também
pesquisa na África do Sul realça o potencial do uso do EM para tratar esterco de suíno
antes de alimentar peixe, (HANEKON, et al 2001). Adição de EM na alimentação de
suínos tem promovido o crescimento dos animais. Aplicação de EM sobre o esterco de
suíno reduz o conteúdo bacteriano das fezes e este composto para alimentar peixe
aumentando o ganho de peso final.
Embora não registrado, há muitos projetos que usam EM para o manejo de
resíduos em muitos países. Entre todos os usuários do EM, o melhor exemplo está na
Agricultura Natural em Sara Buri, Tailândia onde EM é usado na agricultura, pecuária e
manejo de resíduo orgânico. Infelizmente estes resultados não foram registrados como
uma forma prática usada extensivamente para treinar pessoas da Tailândia e de outros
países sobre a tecnologia do EM, sem nenhum custo para os aprendizes.
Os mais recentes estudos com EM em gerenciamento ambiental produziram
resultados muito interessantes. Se repetíveis estes resultados, teriam um impacto positivo
e significativo na melhoria de qualidade ambiental. O primeiro é um estudo de Belarus
que ilustra a habilidade do EM para reduzir contaminação radioativa em terras afetadas,
(KONOPLYA, 1999). Aplicação do EM aumentou redução de Cs137 das terras
contaminadas de Chernobyl. A destruição de culturas contaminadas reduziria o nível de
contaminação no solo. Além disso, o uso de EMx, um derivado de EM que tem
I.INTRODUÇÃO 30
propriedades de antioxidante foi observado como um agente que atua como
radioprotetor.
O segundo e terceiro estudos relacionam à redução de produção de dioxina.
Um estudo piloto no E.U.A. (KOZAWA, 2000) mostrou que o uso de EM poderia
reduzir produção de dioxina. Mais importantemente, um estudo conduzido por, Miyajima
et al (2001), em Okinawa, relata que usando EM em um incinerador comercial reduziu a
produção de dioxina. Estes resultados sugerem valiosas linhas de pesquisa no futuro.
O potencial do EM na agricultura e gerenciamento ambiental é significativo.
A tecnologia pode ser usada facilmente e economicamente para aumentar a
produtividade de sistemas agrícolas, especialmente sistema orgânico e como atenuante da
poluição ambiental.
Embora projetos bem sucedidos estão sendo implantados em muitos países até
mesmo em escala nacional como em Myanmar, D a P R Coréia, o Vietnã e Tailândia, e
por organizações não governamentais como no Sri Lanka, Índia e Indonésia ou numa
escala mais localizada por organizações privadas tais como Sociedade de Agricultura
Natural da Nova Zelândia, Agriton da Holanda, EMROSA da África, um retrocesso foi a
falta de exposição registrando os resultados. Nesta história de sucesso, trabalhos deverão
ser efetuados com critérios científicos, permitindo a sua comprovação de uso nos
diversos campos de pesquisa, embora tenha um papel significativo na agricultura e no
controle ambiental.
I.INTRODUÇÃO 31
OBJETIVOS
II.
OBJETIVOS
Existem diversas formas para reduzir a presença de agrotóxicos ou pesticidas
no ambiente (solo e água), contudo nenhum tem efeito satisfatório.
Porem, um método, que possui baixo custo e aplicação in locu está sendo
desenvolvido com uso de microrganismos da Natureza, para reduzir ou degradar
totalmente estes pesticidas. Assim, este trabalho tem o objetivo de verificar e estudar por
HPLC a biorremediação do Velpar K®, cujos princípios ativos Diuron e Hexazinona, em
doses normais de aplicação podem ter sérias conseqüências se liberadas no ambiente
(água e solo), com o uso do inoculante microbiano EM-4, (Microrganismos Eficazes)
desenvolvidos pela Fundação Mokiti Okada, Ipeúna / SP.
EXPERIMENTAL
III.
PARTE EXPERIMENTAL
III.1. Reagentes e Solventes
Os reagentes empregados neste experimento foram de grau PA, exceto o
Velpar K
®
produto comercial da marca Du Pont, fabricado e embalado pela Du Pont
Brasil Produtos Agrícolas, adquirido em loja de produtos agropecuários.
III.2. Crescimento do inoculante microbiano EM-4 em meio de
cultura ágar-ágar com herbicida Velpar K
®
.
Foram plaqueadas,utilizando-se a técnica de inoculação por profundidade
(pour plate), na qual 1mL do inoculante microbiano EM-4, com a concentração de
células (5x10
2
UFC.mL
-1
), previamente ativado com melaço, foi colocado em placas de
Petri. Em seguida foram vertidos na placa com o inoculante microbiano, 15-20 mL de
meio de cultura sólido ágar-Velpar K
®
, previamente fundido e resfriado a 45ºC, contendo
2% de ágar (Merck, purificado e isento de inibidores para microbiologia) e concentrações
variáveis de 0,0; 0,2; 0,4; 0,8 e 1,0% (v/v) de uma solução estoque do herbicida Velpar
K
®
0,625% (m.v
-1
), com a finalidade de verificar o possível crescimento dos
microrganismos contidos no inoculante microbiano EM-4, utilizando o herbicida Velpar
K
®
como fonte de carbono e energia.
Em seguida o inoculo foi misturado com o meio de cultura, com movimentos
circulares e suaves de 8 a 10 vezes, no sentido horário e anti-horário. (Fig.5 e 6).
Figura 5: Inoculação do EM-4 em placa de Petri, realizado no Laboratório de
Microbiologia do Centro de Pesquisa da Fundação Mokiti Okada, Ipeúna / SP.
Figura 6: Distribuição do meio de cultura sólido Ágar-Velpar K em placa de Petri,
realizado no Laboratório de Microbiologia do Centro de Pesquisa Fundação Mokiti
Okada, Ipeúna / SP.
III. PARTE EXPERIMENTAL 34
Após a solidificação do meio de cultura, as placas foram invertidas e
incubadas a 35ºC ± 0,2 por 48 horas em câmara termostática (Tecnal – modelo TE 390),
conforme figura 7.
Figura 7: Incubação das placas de Petri em câmara incubadora a 35ºC, realizado no
Laboratório de Microbiologia do Centro de Pesquisa Fundação Mokiti Okada,
Ipeúna / SP.
Após o crescimento, a contagem de unidades formadoras de colônias
(UFC), foi realizada em um contador de colônias (Phoenix – modelo EC 589) com
auxílio de uma lupa (Kiowa – modelo Alphaphot YS2-H) com aumento de 45x,
conforme figura 8.
III. PARTE EXPERIMENTAL 35
Figura 8: Contagem de Colônias em placas, realizado no Laboratório de Microbiologia
do Centro de Pesquisa Fundação Mokiti Okada, Ipeúna / SP.
III.3. Separação por cromatografia iônica dos princípios ativos
do herbicida comercial Velpar K
O produto comercial Velpar K possui grande quantidade de material inerte
cerca de 40%, que necessita ser retirado.
Neste caso foi utilizado inicialmente o princípio da decantação de uma
pequena amostra (em torno de 1,0g) de Velpar K (esferas sólidas de cor marrom-
acinzentadas), que em meio aquoso torna-se marrom, e a seguir utilizou-se o princípio da
cromatografia de troca iônica.
A) Retirada do material inerte do Velpar K
A amostra comercial cerca de 1,0g foi suspensa em volume de cerca de 12,0
mL e centrifugada a 2.000 rpm, por 2 minutos em centrífuga da marca HITASHI, modelo
CR 20B2. Após este período o sobrenadante foi retirado e descartado. Repetiu-se o
procedimento anterior mais duas vezes obtendo precipitado branco (princípios ativos do
Velpar K).
III. PARTE EXPERIMENTAL 36
B) Separação dos princípios ativos do Velpar K por
cromatografia de troca iônica
Como um dos princípios ativos possui um grupo ionizável, no caso
Hexazinona, cujo pKa é de 9,6, utilizou-se 100mL da solução tampão de fosfato de sódio
a pH 6,0, 0,1mol.L
-1
para dissolver amostra de 50,0mg do sólido branco.
A seguir foi adicionada 30g de resina tipo Amberlite IR-120, e ajustado a pH
6,0, com solução tampão fosfato de sódio. Após 30 min de agitação, foi separado a
resina em peneira de 2 mesh e o líquido sobrenadante por filtração, com 3 lavagens
utilizando solução tampão fosfato.
O sobrenadante foi separado e obtido espectro no ultravioleta entre 200 e
340nm, sendo a seguir secado todo líquido com uso de rota-vapor e sendo guardado em
dessecador com pastilha de NaOH e ou sílica gel até o seu uso. A resina IR-120 de troca
catiônica, foi tratada com solução de NaOH (0,2M) para a recuperação do princípio ativo
preso, sendo a seguir separado o sobrenadante e neutralizado com HCl (0,2M) até pH
neutro. Após a neutralização, a solução foi seca em rota-vapor e guardada em dessecador
em balão de fundo redondo como do anterior.
Após a sua secagem, foi adicionado 25 mL de MeOH em um dos balões e o
sobrenadante filtrado em papel de filtro. Repetiu-se esse procedimento mais 3 vezes,
sendo o sobrenadante filtrado no mesmo papel de filtro. Após a filtragem, o solvente do
filtrado foi evaporado em corrente de ar com banho de água a 40
o
C até a secura e
guardado em frasco escuro com tampa rosqueável. Repetiu-se os procedimentos
anteriores em outro balão até a obtenção de um sólido branco.
III. PARTE EXPERIMENTAL 37
C) Caracterização dos princípios ativos do Velpar K separados
Solução diluída do herbicida Velpar K®, na proporção de 1:1000 para análise
da cinética de biodegradação em espectrofotometria no ultravioleta (U-V).
a) Espectroscopia no ultravioleta (U-V); os espectros no ultravioleta entre
(200-350nm) foram obtidos das soluções aquosas para o acompanhamento da presença
dos princípios ativos do Velpar K com uso de cubeta de quartzo em espectrofotômetro
de UV-Visível HITACHI modelo U3000;
b) Espectroscopia no Infra-vermelho (I.V.); foram obtidas os espectros no
infravermelho das pastilhas preparadas de KBr com as amostras secas, utilizando
espectrofotômetro BOMEM MB-120, no intervalo de 400 e 4000 cm
-1
, com resolução de
4,0 cm
-1
;
c) Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC): os cromatogramas
foram obtidos das soluções metanólicas para verificar a presença dos princípios ativos
nas amostras separadas e a presença de possíveis contaminantes nos comprimentos de
onda entre 210 e 254nm, na concentração de 1µg.mL
-1
em Cromatógrafo Líquido da
marca SHIMADZU, modelo CPM10, Controlador modelo CBM10A, com detector
modelo SPDM10AVP, Bomba modelo LC10ADVP, utilizando coluna Hewlett Packard
modelo HP de 20 cm – RP-18 – D.I. 4,6 mm. Tamanho de Partícula de 5 µm. Ajustado
para uma taxa de fluxo de 1mL.min
.-1
. Utilizando como fase móvel 28% de metanol e
72% de água.
III. PARTE EXPERIMENTAL 38
III.4. Estudo de Espectrofometria no ultravioleta das soluções
aquosas contendo Velpar K e EM-4.
Foram realizadas medidas espectrofotométricas no U.V. (200-350nm) de
diversas soluções com diversas proporções de Velpar K® (0,625%, m.v
-1
) e de EM-4
(500ufc.mL
-1
), conforme mostra a Tabela III, com a finalidade de verificar o efeito da
agitação a 100rpm e sem agitação na biorremediação dos princípios ativos do Velpar K®
pelo EM-4, com retiradas de alíquotas de 5,0mL em intervalos entre 0 e 30 dias.
Tabela III: Proporções das soluções diluídas em partes por 50 partes para estudo de
espectrofotometria no ultravioleta (200-350nm).
Solução
Nº
Proporção
Velpar K®:EM-4
Velpar K K®
(mL)
EM-4
(mL)
Água
(mL)
a
1 50:0 50,0 0,0 0,0
2 9:1 45,0 5,0 0,0
3 ----- 0,0 5,0 45,0
4 3:1 37,5 12,5 0,0
5 ----- 0,0 12,5 37,5
6 1:1 25,0 25,0 0,0
7 ----- 0,0 25,0 25,0
8 2:1 25,0 12,5 12,5
9 ------ 0,0 12,5 37,5
10 1:3 12,5 37,5 0,0
11 ------ 0,0 37,5 12,5
III. PARTE EXPERIMENTAL 39
III.5. Quantificação cromatográfica da biorremediação do
Velpar K® pelo EM-4
a) Curva de padronização do Diuron e da Hexazinona
Previamente foi construída curva de padronização a partir das aplicações de
20µL das soluções dos padrões de diuron e hexazinona com concentrações de 6 pontos,
sendo 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 mg.mL
-1
em Cromatógrafo Líquido da marca
SHIMADZU, modelo C-R4A, acoplado a Bomba LC 9A e Detetor UV (SPD – 6 AV),
Controlador SCC-6B, com coluna da marca Hewlett Packard, modelo HP - RP18 de 20
cm de comprimento e diâmetro interno de 4,6mm e tamanho de partícula de 10µm.
Ajustado para taxa de fluxo de 1mL.min
.-1
, utilizando como fase móvel 55% de
acetonitrila e 45% de água.
b) Estudo de quantificação da biorremediação
Foi realizada a biorremediação ou biodegradação in vitro em meio aquoso,
sob agitação, adicionando inoculante microbiano EM-4 na proporção de 1:1000
(500ufc.mL
-1
), conforme a Tabela IV de soluções diluídas, na adição da solução aquosa
do Velpar K® (0,625%, m.v
-1
), para verificar a biodegradação dos princípios ativos do
Velpar K com inoculante microbiano EM-4 (Microrganismos Eficazes), sob agitação
constante de 100 rpm, com as seguintes proporções em meio aquoso.
III. PARTE EXPERIMENTAL 40
Tabela IV: Proporções de diluições das soluções aquosa diluidas de
Velpar K® /EM-4.
Solução
Proporção de
Velpar K® 0,625% (m.v
-1
)
Proporção de
EM-4 (500ufc.mL
-1
)
Solução A 2 0
Solução B 1 1
Solução C 2 1
Solução D 9 1
Solução E 0 1
Após período entre 0 e 21 dias, procedeu-se amostragens das alíquotas de
10,0mL de cada solução acima conforme a Tabela IV, foram retiradas, sendo análisadas
após diluições entre 25 e 100 vezes com água Milli-Q, a presença dos princípios ativos
Velpar K® (diuron e hexazinona), utilizando cromatógrafo SHIMADZU C-R4A,
acoplada a Bomba LC 9A e Detetor UV (SPD – 6 AV) em 254nm, Controlador SCC-6B,
com coluna da HP – C-18 de 20 cm de comprimento e diâmetro interno de 4,6mm e
tamanho de partícula de 10 µm. Ajustado para uma taxa de fluxo de 1mL.min
.-1
.
Utilizando como fase móvel 55% de acetonitrila e 45% de água. As concentrações das
diversas soluções de Velpar K® foram diluídas conforme tabela V, permitindo as
quantificações dentro da sensibilidade do aparelho de HPLC (BRONDI, S.H.G., 2000).
III. PARTE EXPERIMENTAL 41
Tabela V: Soluções diluídas nas proporções para análise em HPLC, da biorremediação.
Soluções /
Concentrações
A
B
C
E
F
Velpar K®
0,625% (p.v
-1
)
1 : 1 2 : 1 9 : 1
EM-4
1:1000
Volume
200 : 0
(1,0)
100 : 100
(2,0)
100 : 50
(1,5)
180 : 20
(1,1111)
0 : 200
(1,0)
13,2%
Hexazinone
0,0825%
825ppm
0,04125%
412,5ppm
0,0550%
550ppm
0,0743%
742ppm
-
46,8%
Diuron
0,2925%
2.925ppm
0,1463%
1.462,5ppm
0,1950%
1.950ppm
0,2633%
2.632ppm
-
III. PARTE EXPERIMENTAL 42
RESULTADOS E DISCUSSÕES
IV. RESULTADOS E DISCUSSÕES
IV.1 Observação da biodegradação do Velpar K ® com EM-4
IV.1.1 Contagem das células nas placas
A figura 9 mostra os perfis das placas de petri com inoculação por
profundidade do inoculante microbiano EM-4, com cerca de 500cfc.mL
-1
, adicionadas
por placa, no ágar-ágar com concentrações de Velpar K® entre 0 e 1,0% (m.v
-1
), na
verificação do crescimento dos microrganismos existentes nestes meios.
Figura 09: Placas de petri contendo ágar-ágar com concentrações do Velpar K
(0,625% m.v-1) / inoculação com 1,0 mL de EM-4 (5x102 células.mL-1) em
profundidade.
0%(a) 0,2%(b)
0,8%(c) 1,0%(d)
As contagens de células UFC (Unidade Formadora de Colônia) nas placas,
após 5
o
dia de cultivo, mostraram também o aumento significativo do número de células
presentes, isto é, multiplicação no meio de cultura com Velpar K cerca de 60 vezes (em
torno de 1,4 x10
5
UFC.mL
-1
) para todas concentrações utilizadas de Velpar K, em
comparação ao branco (EM-4 ativado com melaço), que tinha apenas cerca de 2,3 x10
3
UFC.mL
-1
. Isto mostra que o Velpar K, foi utilizado como fonte de energia e de
carbono pelos microrganismos do EM-4. Contudo, este método não mostra
completamente o crescimento daqueles microrganismos que liberam as enzimas para fora
das células como no caso dos fungos e leveduras ou mesmo para aquelas que são móveis.
A) Separação do material inerte
Dados iniciais de separação por precipitação e centrifugação mostram
rendimento em torno de 90% de um pó branco em comparação a quantidades presentes
no produto comercial dos princípios ativos, que era inicialmente pó marron-acinzentado
(Velapr K comercial). Esta coloração marro-acinzentada se deve a melhor dissolução,
assim como uma forma de prevenir a sua deglutição pelas crianças no campo, visto que
os princípios ativos após as suas dissoluções apresentaram-se com a cor comparável a
leite de vaca.
B) Separação, purificação e caracterização dos princípios
ativos do Velpar K®
Dados de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) com detector no
ultravioleta (U.V.) deste pó branco dissolvido em MeOH, mostrou apenas presença de
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 44
dois picos nos comprimentos de onda de 210 e 250nm, que foi determinado por
espectrofotometria no (U.V.), conforme a figura 10.
Figura 10: Espectro na região do ultravioleta da substância após a passagem na
cromatografia de troca iônica.
Contudo apesar da ausência dos padrões tanto do Diuron como da
Hexazinona, foi quantificado o percentual presente tanto do Diuron e Hexazinona.
Entretanto, o percentual dos princípios ativos na primeira purificação com a retirada dos
materiais inertes foi cerca de 67,75%, com aproximadamente de 39,64% do diuron e
28,11% do hexazinona.
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 45
Figura 11: Cromatograma de HPLC da purificação inicial do Velpar K® por
precipitação em meio aquoso.
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 46
Figura 12: Cromatograma do produto obtido após a separação por cromatografia de
troca iônica.
Cromatograma do produto obtido a partir da purificação em cromatografia
iônica, verificamos um pico a 51,484 min que pode corresponder à dicloroanilina. Este
pico pode ser analisado pela técnica de cromatografia líquida acoplado ao espectrômetro
de massa futuramente.
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 47
Os espectros no infravermelho (I.V.) após a separação por cromatografia
iônica a pH 6,0 em tampão fosfato mostraram a presença apenas de um dos princípios
ativos, mostrando possivelmente a separação do diuron da hexazinona, que é ionizável
nas condições empregadas, isto é pH 6,0. Contudo a separação apenas do hexazinona não
foi eficiente, devido a possível degradação do diuron para 3,4-dicloroanilina (que é
ionizável nas condições da separação cromatográfica), o que pode ser comprovado pelo
espectro onde continha a hexazinona, já que o diuron não possui grupos ionizáveis
presentes. A presença deste composto ionizável se deve provavelmente pela degradação
natural do diuron.
Figura 13: Espectro no infravermelho das amostras separadas por cromatografia de
troca iônica a pH 6,0 em tampão fosfato: Diuron (a) e Hexazinona +
resíduo (b).
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 48
IV.1.2. Espectrofotometria no ultravioleta (U.V.) das soluções
aquosas contendo Velpar K® e EM-4
A) Sem agitação das soluções
Estudos espectrofotométricos no ultravioleta (U.V.) das soluções aquosas de
Velpar K® inoculado com EM-4 ativado sem agitação, conforme figura 14, não mostrou
variações significativas nas absorbâncias na região do espectro no (U.V.).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
(a) Vel par K
(di lui ção 25x)
Ab so r b ân c i a
(b) Velpar K/EM-4(2:1)
(diluição de 10x)
20 0 25 0 30 0 35 0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Soluções dilu ídas de velparK/EM-4 apó s: 0 ( ), 7 ( ) e 21 di as ( )
Compr imento d e o nda (nm)
(c) Velpar K/EM-4 (3:1)
(diluição de 15x)
Ab so r b â n c ia
20 0 25 0 30 0 35 0
Comprimento de onda (nm)
(d) Velpar K/EM-4 (9: 1)
(d ilui ção de 20x)
Figura 14: Espectros no ultravioleta das soluções aquosas das proporções entre 1:1 e 9:1
de Velpar K® (0,625%, m.v-1)/EM-4(500UFC.mL-1) em tempos variáveis
entre 0 e 21dias.
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 49
Pode-se verificar que algumas variações nos espectros se devem a linha de
base que não é a mesma, isso ocorreu provavelmente, devido a presença de
microrganismos presentes na solução de comparação (branco instrumento), que contém
apenas os microrganismos do EM-4.
B) Sob agitação constante de 100rpm das soluções
Os espectros no (U.V.), conforme figura 15, mostram variações nas
absorbâncias na região entre 200 e 270 nm, correspondentes aos princípios ativos
presentes no Velpar K® (Diuron e Hexazinona), das soluções aquosas das proporções de
1:1, 2:1, 3:1, e 9:1 de Velpar K® (0,625%, m.v-1) e EM-4 (500UFC.mL-1) com
intervalos entre 0 e 21 dias.
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 50
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
(a) Velpar K/EM-4(1:1)
(sem diluição)
Absor bânc ia
Soluções diluídas de velparK/EM-4 após: 0 ( ), 7 ( ) e 21 dias ( )
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
(b) Velpar K/EM-4(2:1)
(dil uição de 3x)
20 0 25 0 30 0 35 0 40 0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
(c) Velpar K/EM-4 (3:1)
(d ilui ção de 10x)
Absor bânc ia
Comprimento de onda (nm)
200 250 300 350 400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
(d) Velpar K/EM-4 (9:1)
(d ilui ção de 20x)
Comprimento de onda (nm)
Figura 15: Espectros no ultravioleta das soluções aquosas das proporções entre 1:1 e 9:1
de Velpar K® (0,625%, m.v-1) / EM-4 (500ufc.mL-1) em tempos variáveis
entre 0 e 21dias sobre agitação constante de 100rpm com e sem diluição.
Nos espectros da figura 15, verifica-se diminuição dos valores de
absorbância na faixa estudada após 7dias e que após este período se mantém
constante (21dias), principalmente para a proporção de 1:1 do Velpar K®
(0,625%)/EM-4 (500UFC.mL
-1
) conforme a figura 14. Esta redução se deve
provavelmente a absorção e biodegradação pelos microrganismos presentes no
EM-4, contudo após 7 dias ocorre uma estabilização nesta absorção ou
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 51
biodegradação devido a formação de compostos orgânicos que podem estar matando
alguns microrganismos presentes no EM-4, principalmente 3,4-dicloroanilina (3,4-DCA),
um organoclorado proveniente da degradação do diuron, que além de ser relativamente
mais estável que o diuron, pode interferir mortalmente no metabolismo dos
microrganismo do EM-4.
Os aumentos nos espectros de absorbância para as outras proporções maiores
de Velpar K®, provavelmente se devem a formação mais rápida do 3,4-DCA que é
formado a partir do diuron, devido a sua maior concentração no meio, por isso as
diluições, e a pouca estabilidade química em meio aquoso, facilitando assim a sua
formação.
Estudos mais detalhados para verificar a ocorrência ou não da biodegradação
dentro dos microrganismos serão abordados futuramente com a extração do diuron e 3,4-
DCA presentes internamente nos microrganismos, assim como as possíveis espécies de
microrganismos que poderiam degradá-los.
IV.1.3. Quantificação por cromatografia líquida de alta performance
HPLC da biorremediação do Velpar K® pelo EM-4 em meio aquoso.
Os compostos analisados, hexazinona e diuron por cromatografia líquida de
alta performance HPLC, conforme cromatogramas da figura 16, foram analisados através
da obtenção das curvas padrão de concentrações entre 0,5 a 3,0 µg.mL
-1
conforme
apresentado na Tabela VI.
A determinação por Cromatografia líquida de Alta Performance, foi utilizado
um cromatógrafo SHIMADZU modelo - C-R4A – Bomba modelo - LC 9A
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 52
– Detetor UV – modelo SPD – 6 AV – Controlador modelo SCC-6B, Coluna HP – C-18
20 cm / DI 4,6mm T.Part. 10 µm, como fase móvel 55% de acetonitrila e 45% de
água,um fluxo de 1mL.min
-1
e detecção em comprimento de onda de 254 nm.
Figura 16: Cromatograma das soluções padrão de hexazinona (a) e diuron (b) com
aplicação de 20µL na concentração de 1,0 µg.mL
-1
.
A) Curva padrão do Diuron e do Hexazinona
A curva de padronização foi obtida, pelo método de padrão externo, com
curva analítica de 6 pontos, para cada um dos compostos, analisados com as misturas dos
padrões,nas concentrações de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 µg.mL
-1
,conforme tabela VI e
figura 17.
(a) (b)
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 53
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
A=508,4
B=47420,34
R=0,99895
SD=2269,63
A=1218,66
B=88702
R=0,99903
SD=4089,09
( ): Diuron
(
): Hexazinona
Unidade de Área
Concentração (mg.L
-1
)
Tabela VI: Áreas e concentrações das curvas dos padrões Diuron e Hexazinona obtidas
por HPLC.
Concentração
mg. L
-1
Unidade de Área
Diuron
Unidade de Área
Hexazinona
0,5 46235 24791
1,0 87684 46663
1,5 132988 70571
2,0 185304 99040
2,5 219082 117082
3,0 267390 142817
Figura 17: Curva de calibração das soluções padrão de diuron e hexazinona com
aplicação de 20µL nas concentrações entre 0,5 e 3,0mg.L
-1
.
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 54
A equação da reta para a calibração foi aplicado o método de regressão
linear, mostrando que o detector apresentou boa correlação entre as
concentrações injetadas, como pode ser visto pelos valores do fator de regressão linear
(R
hexazinona
= 0,99805 e R
diuron
= 0,99903), já comprovados por outros pesquisadores
conforme a figura 17, sendo assim é possível quantificar a presença do diuron e da
hexazinona presente na solução aquosa de Velpar K® biorremediado com EM-4, apesar
das diluições realizadas. Os picos dos dois padrões diuron e hexazinona apareceram no
HPLC utilizado em torno de 4,47 min e 3,70 min, respectivamente conforme a figura 16.
Estes resultados comprovam, conforme trabalhos já publicados, da eficiência
analítica da técnica em HPLC para quantificar os compostos diuron e hexazinona,
permitindo avaliação analítica da biorremediação do Velpar K® pelo EM-4 de acordo
com as condições utilizadas.
B) Estudo de biorremediação do Velpar K ®
A Figura 18 mostra as curvas cromatográficas do EM-4 sem diluição,
conforme a figura 18 (a) e o Velpar K® (0,625%) com diluição de 100x em água Milli-
Q, conforme a figura 18 (b). Esta figura, além de mostrar a não existência dos dois
princípios ativos do Velpar K® no EM-4, mostra também que as quantidades obtidas dos
princípios ativos do Velpar K®, nesta análise foi de 40,4% para o composto diuron,
sendo que o valor declarado no rótulo é de 46,8%, e de 14,0% para
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 55
o Hexazinona, sendo que o valor declarado no rótulo é de 13,2%, de acordo com os
cálculos de área, plotados para as curvas de calibrações conforme a figura 17.
Figura 18: Cromatogramas das soluções aquosas de EM-4 (500UFC.mL
-1
) (a) e Velpar
K® (b).
Isto mostra que os princípios ativos já podem estar provavelmente
biodegradados ou foram adicionados quantidades menores dos princípios ativos, só uma
análise mais precisa poderia estar confirmando. Verifica-se que o uso da cromatografia
líquida de alta eficiência é muito bom para determinação destes dois componentes ativos
do Velpar K®, contudo deixa muito a desejar em relação aos compostos formados pelas
suas biodegradações. É claro que estas análises da presença destes componentes em
outros equipamentos foram testados e verificados também em literatura, contudo nenhum
foi tão satisfatório quanto o HPLC.
A Figura 19 mostra o comportamento das biodegradações com EM-4
(500UFC.mL
-1
) dos princípios ativos do Velpar K®, hexazinona e diuron, em
(a)
(b)
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 56
tempos, variáveis entre 0 a 21 dias, analisadas por HPLC. Verifica-se a ocorrência da
biodegração, principalmente para a proporção da solução Velpar K®/EM-4 de 2:1,
chegando nos primeiros 5 dias em torno de 45% para a hexazinona e de 65% para o
diuron. Esses valores apesar de serem expressivos tem-se que levar em conta futuramente
o quanto que os microrganismo do EM-4 estão absorvendo e degradando realmente, visto
que pode ter havido acúmulo dos princípios ativos do Velpar K® em seus interiores sem
a biodegradação, pela provável possibilidade de formação de produtos concomitantes,
assim como a formação, como possivelmente o 3,4-DCA, internamente das células,
podendo matar estes microrganismos.
Verifica-se que após 21dias de biodegração temos em torno de 80% de
biodegração do diuron e cerca de 65% para a hexazinona. Seria interessante que a
biodegração aeróbia fosse mais rápida para não fazer efeito algum nos fitoplanctons ou
nas algas fotossintetizantes de rios eu lagoas ou até dos oceanos para poderem realizar a
sua fotossíntese, já que este tipo de herbicida afeta principalmente a fotossíntese.
Visto que o efeito herbicida ocorre nos primeiros 7 dias da aplicação,
seria interessante que a biodegradação ocorresse após o 7
o
dia da aplicação, e que
pudesse ser misturado o EM-4 conjuntamente com o herbicida, visto que
economicamente seria relativamente inviável aplicar duas vezes consecutivas (uma
vez o herbicida e depois o EM-4), aumentando assim o custo de produção da cana-
de-açúcar. Assim, observando os gráficos da figura 19, seria mais interessante
aplicar apenas uma proporção que poderá biodegradar os componentes após o 7
o
dia,
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 57
0 5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
60
70
Percentual de degradação (%)
Tempo (dias)
Velpar K:EM-4: ( ): 1:1, ( ): 2:1, ( ): 9:1
o que não existe ainda. É claro que o meio aqui estudado é o meio aquoso e não em
condições in locu (superfície do solo)
Figura 19: Análise por HPLC da biodegradação do composto ativo Diuron do Velpar
K® pelo inoculante microbiano EM-4(Microrganismos Eficazes) em intervalos
entre 0 e 21dias.
Hexazinona
Diuron
0 5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Percentual de degradação (%)
Tempo (dias)
: 1:1, : 2:1, : 9:1
IV. RESULTADOS E DISCUSÃO 58
CONCLUSÕES
V.
CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que:
1) O processo de purificação dos princípios ativos do Velpar K®, diuron e
hexazinona, desenvolvido neste trabalho (decantação e cromatografia de troca iônica ),
pode ser empregado satisfatoriamente para se ter alto grau de pureza dos padrões do
Velpar K®;
2) O uso do EM-4 pode ser utilizado para biorremediar inicialmente as águas
de rios e lagoas contaminados por Velpar K®;
3) A determinação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) dos
princípios ativos do Velpar K®, após a biorremdiação em meio aquoso, mostrou-se
satisfatório para as condições normais de uso do Velpar K® in vitro.
PERSPECTIVAS PARA
TRABALHOS FUTUROS
VI.
PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS
Afim de finalizar completamente este trabalho, os projetos futuros consistirão
da biorremediação do Velpar K® in locu, assim como o método de aplicação do EM-4
nas culturas canavieiras:
1) Para reduzir a presença dos ativos princípios ativos, não só na cana-de-
açúcar mas também no solo e nos lençóis freáticos, rios e lagoas;
2) Verificar os compostos formados desta biorremediação em meio aquoso e
no solo;
3) Verificar o efeito do EM-4 em outros tipos de agrotóxicos mais perigosos
(organofosforados ou organoclorados).
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
VII.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALFOELDI, T .,et al (Ed). FiBL, Basel, Switzerland: 267.
ALTMAN, J. Plant Pathology and Weed Science – Colorado State University Fort
Collins, Colorado. Pesticide Interactions in Crop Production.
AGRICULTURA NATURAL DA MOA – Associação Mokita Okada do Brasil- Boletín
nº 1 – Série – Agr.Natural MOA.
BRUGGENWERT, M. G. M. 2001. EM research in the Netherlands. In Proceedings of
the 6th International Conference on Kyusei Nature Farming, South Africa, 1999
Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed) (In Press)
BEWLEY, R.J.F.; STOTZKY, G.; BOLLAG, J.M. Field implementation of in situ
bioremediation: Key physicochemical and biological factors. Soil Biochemistry.
N.Y. 1996.
BOOPATHY R. Factors limiting bioremediation techologies. Bioresource Tecnology 74
(2002) 63-67.
BOOK REVIEWS – Reaction Enginnering for Pollution Prevention – Journal of
Hazardous Material 82 (2001) 91-92.
BUMPUS, J.A.; BOLLAG, J.M.; STOTZKY,G. White rot fungi and their potencial use
in soil biorremediation processes. Soil enzymes. London: Academia Press, 1978.
BRONDI, S.H.G. Detertminação de multiresíduos de agrotóxicos em águas de
abastecimento do município de Araraquara: Ribeirao das Cruzes, Ribeirao das
Inhumas e Córrego do Paiól. São Carlos, 2000. 133p. Tese Doutorado (EESC).
CETKAUSKAITIÊ, A.;GRIGONIS,U,; BERZINSKIÊNEJ. (1996). Biodegradation:
Selection of Suitable Model. Environ. Ecotoxicol.40, 19-28 (1998)
art.no.ES981637.
CHAGAS, P.R.R.; TOKESHI,H.; ALVES, M.C. Efficiency of lime-sulfur in the control
of mite in papaya in conventional and organic (Bokashi-EM) systems. (In Press).
Sixth International Conference on Kyusei Nature Farming. October 28-31 1999.
Proceedings on Kyusei Nature Farming and Effective Microorganisms for
Agricultural and Environmental Sustainability. Pretoria. South Africa. Ed.
Senanayake, Y.D.A.; U.R. Sangakkara, APNAN, Thailand.
CHAGAS,P.R.R.; TOKESHI,H. 1996a. Controle da antracnose em pimentão, com
Microorganismos Eficazes (EM), em casa de vegetação. In: XXIX Congresso
Brasileiro de Fitopatologia, Campo Grande, MS, v.21, p.352, (Suplemento).
CHAGAS, P.R.R.; TOKESHI,H.; 1996b. Controle da antracnose em frutos de pimentão,
com Microorganismos Eficazes (EM), em pós-colheita. In: XXIX Congresso
Brasileiro de Fitopatologia, Campo Grande, MS, v.21, p.352, (Suplemento).
CHAGAS, P.R.R.; TOKESHI,H.; ZANOTTI, N.H. 1997. Production of plants of
Coffea canephora cv. Conilon with conventional fertilizer (chemical) and
Bokashi plus Effective Microorganisms, 79-83p. Fifth International Conference
on Kyusei Nature Farming. October 23-26 1997. Proceedings on Kyusei
Nature Farming and Effective Microorganisms for Agricultural and
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62
Environmental Sustainability. Bangkok, Thailand. Ed. Senanayake, Y.D.A.; U.R.
Sangakkara, APNAN, Thailand.
CHANTSAWANG, S.; WATCHARANGUL, P. 1999. Influence of EM on quality of
poultry production. In Proceedings of the 5th International Conference on Kyusei
Nature Farming, Thailand, 1998 Senanayake, Y. D. A.; Sangakkara, U. R., (Ed)
APNAN, Thailand: 133 – 150.
CHEN, W.; BRÜHLMANN,F.; RICHINS, R.D.; MULCHANDANI, A. Enginnering of
improved microbes and enzymes for bioremediation – Department of Chemical
and Environmental Engineering, University of California, Riverside, CA 92521,
USA – Current Opinión in Biotechnology 1999, 10:137 – 141.
COMPÊNDIO DE DEFENSIVOS AGRÍCOLAS 4ª Edição – Organização Andrei
Editora 1993.
DALY, M.J.;STEWART, D. P. C. 1999. Influence of Effective Microorganisms (EM) on
vegetable production and carbon mineralization – A preliminary investigation.
Journal of Sustainable Agriculture 14: 15 – 25.
DANKWARDT, A. Immunochemical Assay in Pesticide Análisis – Immunochemical
Assays in Pesticide Analysis – Enciclopedia of Alalytical Chemistry.
DIAGNÓSTICO DO USO DE AGROTÓXICOS NO ESTADO DE SÃO PAULO –
CETESB- 1984.
DU PONT BRASIL - Produtos Agrícolas (Boletim técnico), 1989.
EXPERIMENTOS SOBRE USO DOS MICROGANISMOS EFICAZES (EM) NO
BRASIL. Trabalhos apresentados na Terceira Conferência Internacional de
Agricultura Natural Mesiánica. Santa Bárbara, Califórnia – 5 a 7 de outubro de
1993.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63
ELANGO, F.; TABORA, P.; VEGA, J.M. 1999. Control of black sigatoka disease using
Effective Microorganisms In Proceedings of the 5th International Conference on
Kyusei Nature Farming, Thailand, 1998 Senanayake, Y.D.A.; Sangakkara, U.R.
(Ed) APNAN, Thailand: 226 – 232.
ESPOSITO, E.; PAULINO, S. M.; MANFIO, G.P. Biodegradation of the Diuro in soil
by indigenous actinonicetes. Chemosphere, vol.37, no.3,pp. 541-548 (1998).
FUJITA, M. 2000. Nature farming practices for apple production in Japan. In Nature
farming and microbial applications. H L Xu et al (Ed) Journal of Crop Production
3: 119 – 126.
GREGÓRIO, M. Z.; CHAGAS, P. R. R.; OTA, H.; KINJO, S. Eficiência do EM e do
Bokashi no controle da temperatura em processo de biotransformação de resíduos
orgânicos e restos de poda de vegetais urbanos. ICTR 2004 – Congresso
Brasileiro de Ciência e Tecnologia e Resíduos e Desenvolvimento Sustentável &
NISAM 2004 – Ciclo de Conferências sobre Gestão de Política Ambiental,
realizados de 17 a 20 de novembro de 2004. Florianópolis, SC, 2004, 7p. il:
Aguardando publicação dos Anais em CD-rom.
GUEST, D. 1999. Bokashi (EM) as a biocontrol agent to suppress the growth of
Phytopthora cinnamomi. In Proceedings of the 5th International Conference on
Kyusei Nature Farming, Thailand, 1998 Senanayake, Y D A and Sangakkara U R
(Ed) APNAN, Thailand: 216 – 218.
HADER, U. 2001. Influence of EM on the quality of grass/hay for milk production. In
Proceedings of the 6th International Conference on Kyusei Nature Farming,
South Africa, 1999 Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed) (In Press).
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 64
HUSSEIN, T.; JILANI, G.M.; ANJUM, S.; ZIA, M.H. 2000. Effect of EM application on
soil properties. In Proceedings of the 13th International Scientific Conference of
IFOAM.
HANEKON, D.; PRINSLOO, J. F.; SCHOONBEE, H. J. 2001. A comparison of the
effect of anolyte and EM on the faecal bacterial loads in the water and on fish
produced in pig cum fish integrated production units. In Proceedings of the 6th
International Conference on Kyusei Nature Farming, South Africa, 1999
Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed) (In Press).
HO IN HO.; HWAN,J.I.K. 2000. The study on the plant growth hormones in EM – A
Case study. Paper presented at the International Conference on EM Technology
and Nature Farming, October 2000, Pyongyang, DPR Korea.
INDICADORES DE DESEMPENHO DA AGROINDUSTRIA CANAVIEIRA – Safra
1999 – 2000 – IDEA – Instituto de Desenvolvimento Agroindustrial Ltda..
KREMER, R J, ERVIN.; WOOD, E. H.; ABUCHAR,M.T. 2001. Control of Sclerotinia
homoeocarpa in turf grass using Effective Microorganisms. In Proceedings of the
6th International Conference on Kyusei Nature Farming, South Africa, 1999
Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed) (In Press).
Kyusei Nature Farming, Thailand, 1998 Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed)
APNAN, Thailand: 207 – 215.
KONOPLYA, E. F. 1999. Prospects of using Effective microorganisms (EM and EMX)
in the liquidation of nuclear accident consequences. In Proceedings of the 5th
International Conference on Kyusei Nature Farming, Thailand, 1998 Senanayake,
Y D A and Sangakkara U R (Ed) APNAN, Thailand: 372 – 378.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 65
KOZAWA, G. 2000. Dioxin bioremediation. Paper presented at the International
Conference on EM Technology and Nature Farming, October 2000, Pyongyang,
DPR Korea.
KONOPLYA, E. F.; HIGA, T. 2000. EM application in animal husbandry – Poultry
farming and its action mechanisms. Paper presented at the International
Conference on EM Technology and Nature Farming, October 2000, Pyongyang,
DPR Korea.
KONOPLYA, E.F.; HIGA, T. 2001. Mechanisms of EM 1. Effect on the growth and
development of plants and its application in agricultural production. In
Proceedings of the 6th International Conference on Kyusei Nature Farming,
South Africa, 1999 Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed) (In Press).
KYUSEI NATURE FARMING, Thailand, 1998 Senanayake, Y D A and Sangakkara U
R (Ed) APNAN, Thailand: 207 – 215.
LANÇAS, F.M.; RISSATO, S.R. – Influence of Temperatura, Pressure, Modifier, and
Collection Mode on Supercritical CO2 Extration Efficiencies of Diuron from
Sugar Cane and Orange Simples. J.Microcolumn Separations, 10 (6) 473-478
(1998) John Wiley & Sons, Inc.
LANÇAS, F.M.; DÓREA, H. S. - MSPD – Técnica Moderna para Extração de Resíduos
de Pesticidas – Caderno UFS – Química e Meio Ambiente.
LIWAS, M.; SELIM, H.M. Atrazine Retention and Transport in Soils.
MACHADO, C. A.; TAKASHI,K.; CHAGAS, P. R. R. Avaliação in vitro do efeito do
EM-4 no controle de Colletotrichum gloeosporioides. Summa Phytopatologica, v.
29. n.1. 2003. p78.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66
MARENGO, M.C. Determinação dos pesticidas paration etil e metil em amostras da
água e dos sedimentos da bacia de cabeceira do Rio Mogi-Guaçu. São Carlos,
2003. 93p Dissertação Mestrado (IQSC).
MELO, I.S.; SILVA, C.M.M.S.; FAY, E.F.; MONTEIRO, R.R.; ROSAMIGLIA, A.C.
Degradação de Atrazina por Fungos Filamentosos EMBRAPA – MEIO
AMBIENTE (1999).
MIDIO A.F.; MARTINS.D.I.; Herbicida em Alimentos 1997 109p.
MIYAJIMA, M, NAGANO, N and HIGA, T. 2001. Suppression of Dioxin generation in
the garbage incinerator using EM (Effective Microorganisms), EMX and EM Z
ceramic powder. In Proceedings of the 6th International Conference on Kyusei
Nature Farming, South Africa, 1999 Senanayake, Y D A and Sangakkara U R
(Ed) (In Press).
MORAES, S. L.; REZENDE, M.O.O. Análise de Residuos de Pesticidas em Tomate por
Cromatografía em Camada Delgada. Química Nova v.25 n.2 São paulo abr/maio
2002.
MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O. Microbiologia e Bioquímica do Solo; UFLA
(2002).
OKUDA, A.; HIGA, T. 1999. Purification of wastewater with Effective Microorganisms
and is utilization in agriculture. In Proceedings of the 5th International
Conference on Kyusei Nature Farming, Thailand, 1998 Senanayake, Y D A and
Sangakkara U R (Ed) APNAN, Thailand: 246 – 253.
PRADHAN, S.P.; CONRAD, J.R.; PATEREK, J.R.; SRIVASTAVA, V.J. Potential of
Phytoremediation for treatment of PAHs in soil at MGP sites. Journal of Soil
Contamination, Boca Raton, v.7, n.4, p.467-480, 1998.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
PRIVMAN, M.; ZUMAN, P. The role of protonation, hydration, elimination, and ring
opening in the electroreduction of hexazinone. Journal of Electroanalytical
Chemistry 455 (1998) 235-246.
RADOSEVICH, M.; TRAINA, S.J. Degradation and Mineralization of Atrazine by a
Soil Bacterial Isolate. Appied and Environmental Microbiology, Jan 1995, p.297-
302.
RAVEN P.; BERG, L. R.; JOHNSON, G. B. The Pesticide Dilemma. In:
Environment, cap. 22, p. 493-517, cap 23, p. 519 – 544. Saunders Colllege
Publishing, New Work. 1993.
RAJ.G.; WOLT, J.D.; CESSNA, A.J.; SCHIEFER, H.B. Environmental Fate of
Trifluralin.
ROUMSIA,T.V.;STEIMAN,R.;SIGLE-MURANDI,F.;BENOTT-
GUYOD,J.L.;HADRANI, A. Biodegradation of therre Susbtituted Phenylurea
Herbicidfes ( Chlortoluron, Diuron, and Isoproturon) by Soil Fungi. A
Comparative Study. Chemosphere, Vol 33, n.10, pp.2045-2046, 1996 Elsevier
Science Ltda..
ROQUE, M.R.A.; FERRACINI, V.L.; MELO, I.S. Avaliação da degradação do herbicida
Diuron utilizando extração em fase sólida - EMBRAPA CNPMA (1998).
SANGAKKARA, U. R.; HIGA, T. 2000. Kyusei Nature Farming and EM for enhanced
smallholder production in organic systems. In Proceedings of the 13th
International Scientific Conference of IFOAM. Alfoeldi, T et al (Ed). FiBL,
Basel, Switzerland: 268.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68
SANGAKKARA, U R; WEERASEKERA, P. 2001. Impact of EM on nitrogen
utilization efficiency in food crops. In Proceedings of the 6th International
Conference on Kyusei Nature Farming, South Africa, 1999 Senanayake, Y D A
and Sangakkara U R (Ed) (In Press).
STRAALEN, N.M. van; RIJIN, J.P.van.; Ecotoxicological Risk Assessment of Soil
Fauna Recovery from Pesticide Application.
SILVA, C.M.M.S.; ROQUE, M.R.A., MELO,I.S. Microbiologia Ambiental – Manual de
Laboratorio EMBRAPA MEIO AMBIENTE (1999).
SKIPPER, H.D.; SYLVIA, D.M.; FUHRMANN, J.J.; HARTEL, P.G.; ZUBERER,D.A.
Biorremediation of contaminated soils. Principles and applications of soil
microbiology, 1998.
SKLADANY, G.J.; METTING-JR.,F.B. Biorremediation of contaminadet soil. Soil
microbial ecology: applications in agricultural and environmental management.
N.Y. Marcel Dekker, 1992. p.483-514.
STICHER L.; MAUCH-MANI, B.; MÉTRAUX, J.P. Systemic Acquired Resistance.
SAFALAOH, A. C. L.; SMITH, G. A. 2001. Effective Microorganisms (EM) as an
alternative to antibiotics in broiler diets: Effects on broiler performance, feed
utilization and serum cholesterol. In Proceedings of the 6th International
Conference on Kyusei Nature Farming, South Africa, 1999 Senanayake, Y D A
and Sangakkara U R (Ed) (In Press)
TOKESHI, H.; CHAGAS,P.R.R. 1997. Hormonal effect of EM on citrus germination,
55-61p.: Fifth International Conference on Kyusei Nature Farming.
October 23-26 1997. Proceedings on Kyusei Nature Farming and Effective
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69
Microorganisms for Agricultural and Environmental Sustainability. Bangkok,
Thailand. Ed. Senanayake, Y.D.A.; U.R. Sangakkara, APNAN, Thailand.
UETA.J.; PEREIRA N.L.; SHURAMA I.K.; CERDEIRA A.L. Biodegradação de
herbicidas e Biorremediação. Bioteclologia Ciência & Desenvolvimento.
VARIAN Application Note 735 – HPLC – Pesticides – Analysis of polar pesticides in
Rhinewater.
VARIAN Application Note 1211 – HPLC – Pesticides – Analysis of pesticides in driking
water.
VARIAN Application Note 911 – GC – Pesticides and herbicides accordling to EPA
method 507.
WOLT, J.D. Environmental Fate of Ethalfluralin.
WALKER, A. Rapid biodegradation of diuron and other phenylurea herbicides by a soil
bacterium. Soil Biology and Biochemistryu 31 (1999) 677-686.
WARE, G.W. - Reviews of Environmental Contamination and Toxicology – Volume 140
– Springer-Verlag – N.Y. Berlin Heidelberg London Paris.
WIDEHEM P.; AÏT-AÏSSA S., TIXIER C., SANCELME M., VESCHAMBRE H.,
TRUFFFAUT N. Isolation, Characterization and diuron transformation capacities
of bacterial strain Arthrobacter sp.N2. Chemosphere 46 (2002) 557-534.
WANG, R. XU. H. L.; MRIDHA, M. A. U. 2000. Phytopthora resistance of organic
fertilized tomato. In Nature farming and microbial applications. H L Xu et al (Ed)
Journal of Crop Production 3: 77 – 84.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70
WOOD, M. T., MILES, R.; TABORA,P. 1999. Plant extracts and EM5 for controlling
pickleworm Diapharina nitidalis. In Proceedings of the 5th International
Conference on.
Xu, H. L., WANG, R.; MRIDHA, M. A. U.; KATO, S., KATASE,K.;UMEMURA, H.
2001. Effect of organic fertilization and EM inoculation on leaf photosynthesis
and fruit yield and quality of tomato plants. In Proceedings of the 6th
International Conference on Kyusei Nature Farming, South Africa, 1999
Senanayake, Y D A and Sangakkara U R (Ed) (In Press).
XU, H.L. 2000. Effect of microbial inoculation, organic fertilization and chemical
fertilization on water stress resistance of sweet corn. In Nature farming and
microbial applications. H L Xu et al (Ed) Journal of Crop Production 3: 223 –
234.
YATES, S.R.; SPENCER, W.F.; CLIATH, M.M. Comparasion between measured and
predicted rates of pesticide volatilization from an agricultural field. Univ. Of
California, Riversade, CA 92521, USA – American Institute of Hydrology–
Water Environment Federation 1993.
ZHANG, W.; HAN,D.Y. DICK ,W.A.; DAVIS K.R.; HOITINK H.A.J., Compost and
Compost Water Extract-Induced Systemic Acquired Resistente in Cucumber and
Arabidopsis.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo