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LEONARDO COUTINHO FARIA
Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de
Epilepsia Induzido pela Pilocarpina
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO
2005
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ii
LEONARDO COUTINHO FARIA
Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de
Epilepsia Induzido pela Pilocarpina
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro.
Co-Orientador: Profa. Dra. Margareth Rose Priel
SÃO PAULO
2005
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iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA
Chefe de Departamento:
Profa. Dra. Débora Amado Scerni
Coordenador do Curso de Pós Graduação:
Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro
iv
LEONARDO COUTINHO FARIA
Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de
Epilepsia Induzido pela Pilocarpina
PRESIDENTE DA BANCA
Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Istvan Mody
Profa. Dra. Elza Márcia Yacubian
Prof. Dr. Fernando Cendes
Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa
SUPLENTES
Prof. Dr. Ricardo Mário Arida
Profa. Dra. Maria José Fernandes
Aprovada em: / /
v
Esta tese foi realizada na Disciplina de Neurologia Experimental do
Departamento de Neurologia e Neurocirurgia da Universidade Federal de São
Paulo – Escola Paulista de Medicina, durante o curso de pós-graduação em
Neurologia – Neurociências, com o auxílio financeiro de CNPq, FAPESP,
PRONEX e CAPES. O autor foi bolsista do CNPq.
Agradeço a bolsa de doutorado “sanduíche” concedida pela CAPES.
Uma parte do trabalho experimental realizou-se na University of California at Los
Angeles – UCLA, USA.
vi
A toda minha família e meus amigos que sempre me apoiaram.
Agradeço especialmente a minha esposa Viviane e ao Darwin pelo amor e por
me aturarem esse tempo todo. Vocês estão sempre em primeiro plano.
Aos meus pais, Sonia e Marcio, que sempre me incentivaram e aos meus avós
Antonio, Ecilda, Hilton (em memória) e Maria Zoelinda.
Um agradecimento enorme a minha dupla de irmãos Lipe e Lele e também a Kiki
pelos sábios conselhos.
A meus tios Joyce, Alexandre, Márcia e Paulo. Um grande agradecimento
também a meus primos jovens Bernardo e Bruno e aos mais experientes: Gui,
Gu e Té.
Agradeço também a TODA a família da Vi, que me recebeu de braços abertos.
vii
AGRADECIMENTOS
- Ao Dr. Esper Abrão Cavalheiro por ter acreditado e me dado a
oportunidade de fazer exatamente o que eu queria: ciência.
- A Dra. Margareth Priel pelo exemplo de dedicação e pela paciência na
minha co-orientação durante esses anos.
- To Dr. Istvan Mody and people from Modylab for all the support and
friendship.
- Ao Dr. Emilio Sanabria que me trouxe a UNIFESP e foi fundamental para
a realização deste trabalho.
- Aos professores Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti, Débora Amado,
Maria José Fernandes, Ricardo Arida e Fulvio Scorza.
- Aos demais alunos, companheiros de pós-graduação, em especial ao
André, Sandra Valente, Leandro e Alexandre.
- Aos funcionários da UNIFESP, em especial Marco Aurélio, Edvaldo,
Luizinho, Silvando e D. Hilda.
- As agências de fomento CNPq, CAPES e FAPESP pela imprescindível
ajuda financeira.
- A todos os amigos que fiz por onde passei, seja no Rio de janeiro, São
Paulo ou Los Angeles.
viii
SUMÁRIO
1. DEDICATÓRIA............................................................................................vi
2. AGRADECIMENTOS..................................................................................vii
3. LISTA DE FIGURAS...................................................................................ix
4. LISTA DE TABELAS...................................................................................xi
5. LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................xii
6. RESUMO...................................................................................................xiii
7. INTRODUÇÃO.............................................................................................1
5. OBJETIVOS...............................................................................................25
6. MATERIAL E MÉTODOS. ........................................................................26
7. RESULTADOS...........................................................................................43
8. DISCUSSÃO..............................................................................................61
9. CONCLUSÕES..........................................................................................75
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................76
11. ABSTRACT..............................................................................................96
ix
LISTA DE FIGURAS
1 - Esquema feito por Camilo Golgi do córtex cerebelar humano....................9
2 - Esquema representativo das principais conexões do cerebelo................10
3 - Neurônio de Purkinje impregnado pela técnica de Golgi..........................11
4 - Câmara de registro eletrofisiológico in vitro, micromanipuladores e
microeletrodos................................................................................................29
5 - Isolamento do cerebelo e plano de corte das fatias horizontais...............31
6 - Setup de registro eletrofisiológico in vitro. Sistema de registro
eletrofisiológico in vitro...................................................................................32
7 - Registro de potenciais de ação espontâneos e do potencial de campo...35
8 – Plano de corte do cerebelo utilizado na histologia...................................38
9 - Traçado representativo do disparo espontâneo de alta freqüência
registrado nos NP...........................................................................................45
10 - Efeito do análogo de GMPc, 8p-CPT-GMPc (50µm) na freqüência de
disparos espontâneos em animais controle e com epilepsia....................47;48
11 - Fatias horizontais do cerebelo................................................................51
12 - Registro eletrofisiológico em fatia cerebelar horizontal: potencial de
campo e registro intracelular de PA...............................................................51
13 - Gráfico do tipo Input-Output mostrando os registros de potenciais de
campo.............................................................................................................52
x
14 - Amplitude do potencial de campo nos grupos controle, latente e com
epilepsia crônica.............................................................................................52
15 - Duração do potencial de campo nos grupos controle, latente e com
epilepsia crônica.............................................................................................53
16 - Limiar para obtenção dos registros de potenciais de campo..................53
17 - Traçados sobrepostos do potencial de campo na camada de NP..........54
18 - Gráfico ilustrando a morte dos neurônios de Purkinje nos diferentes
grupos.............................................................................................................57
19 - Neurônios de Purkinje em ratos Wistar controle e com epilepsia do lobo
temporal.........................................................................................................57
20 - Densidade de espinhos dendríticos nos NP...........................................58
21 - Alterações nas concentrações de aminoácidos no cerebelo de ratos
submetidos às fases aguda e crônica do modelo de ELT induzido pela
pilocarpina..................................................................................................... 60
xi
LISTA DE TABELAS
1 - Drogas utilizadas nos registros de eletrofisiologia in vitro..............................36
2 - Disparo espontâneo em animais controle e com epilepsia e efeito do análogo
de cGMP, 8p-CPT-cGMP (50µm)........................................................................45
3 - Densidade dos neurônios de Purkinje nos diferentes grupos estudados......56
4 - Comparação dos valores absolutos de aminoácidos dosados no cerebelo de
ratos controle e experimentais............................................................................60
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazole
propionato
CNQX 6-ciano-7-nitro-quinoxalina-2,3-dione
DP Desvio padrão
ELT Epilepsia do Lobo Temporal
GABA Ácido y-aminobutírico
GMPc Guanosina monofosfato
IC Índice de confiança
LCRa Líquido Cefalorraquiano Artificial
MED Média
NMDA N-metil-D-aspartato
NP Neurônio (s) de Purkinje
PA Potencial (ais) de ação
PEPS Potencial pós sináptico excitatório
PIPS Potencial pós sináptico inibitório
PILO Pilocarpina
PTZ Pentilenetetrazol
SE Status epilepticus
TTX Tetrodo toxina
xiii
A epilepsia do lobo temporal vem sendo amplamente investigada com diferentes
técnicas tanto em pacientes como em modelos experimentais, entre os quais se
destaca aquele induzido pela pilocarpina. Assim como as estruturas
hipocampais têm sido apontadas como responsáveis pela gênese do foco
epiléptico, o cerebelo vem sendo considerado como uma importante estrutura de
caráter inibitório, desde a primeira observação feita por Russel em 1894. Este
papel se deve à presença abundante de neurônios GABAérgicos no córtex e
núcleos cerebelares, com função inibitória, entre os quais se destacam os
neurônios de Purkinje (NP).
Os estudos eletrofisiológicos in vitro demonstraram uma alteração no padrão de
disparos espontâneos dos animais com epilepsia. Contrariamente aos controles,
freqüentemente as células de animas com epilepsia não disparavam potencias
de ação (PA) de forma espontânea. Outro fator importante foi à diferença de
potenciação dos disparos espontâneos nos grupos controle e portador de
epilepsia em resposta a análogo de óxido nítrico (NO). Camundongos
portadores de epilepsia aumentaram a sua freqüência de disparo em relação à
linha de base, porém, este aumento foi significativamente menor do que o
observado no grupo controle. A concentração dos principais aminoácidos foi
quantificada pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os
resultados revelaram diferenças significativas no cerebelo entre as fases aguda
e crônica do modelo. As concentrações de aspartato (ASP), glutamato (GLU),
taurina (TAU) e GABA, aumentaram na fase aguda. Durante a fase crônica do
modelo, houve diminuição significativa das concentrações de todos os
xiv
aminoácidos testados. Também podemos observar um comportamento distinto
ao compararmos as análises dos aminoácidos realizadas no cerebelo e as de
estudo prévio no hipocampo. Através dos estudos anatômicos, constatamos que
a fase silenciosa do modelo já induz perda dos neurônios de Purkinje, que é
agravada pelo aparecimento das crises espontâneas recorrentes. Essas células
também comprovaram ser bastante susceptíveis aos efeitos do envelhecimento
e quando este se encontra associado à epilepsia, ocorre a morte de um número
próximo a 50% do total de neurônios de Purkinje.
De uma maneira geral, os resultados demonstram alterações estruturais e
eletrofisiológicas no cerebelo de roedores com epilepsia. Estas lesões
cerebelares são posteriormente agravadas pela ação das crises epilépticas
recorrentes, o que possivelmente compromete a capacidade inibitória do
cerebelo.
xv
Faria, Leonardo Coutinho
Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de Epilepsia Induzido
pela Pilocarpina. / Leonardo Coutinho Faria. – São Paulo, 2005.
P:117
Tese (Doutorado – Ciências) – Universidade Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina.
Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em
Neurologia/Neurociências
Título em Inglês: Study of Cerebellar Alterations in the Model of Epilepsy
Induced by Pilocarpine.
Palavras-chave: 1. Epilepsia. 2. Cerebelo. 3. Pilocarpina. 4. Neurônios de
Purkinje. 5. Eletrofisiologia in vitro.
xvi
A epilepsia do lobo temporal (ELT)
A epilepsia é considerada um distúrbio cujo principal sintoma é a presença de crises
epilépticas recorrentes e espontâneas. As crises per se são eventos comuns que
acometem cerca de 10% da população pelo menos uma vez na vida (Hauser et al.,
1996). Como fenômeno isolado, as crises não são classificadas como epilepsia. As
epilepsias têm um alto custo sócio-econômico e, somente nos Estados Unidos,
estima-se que 2.5 milhões de pessoas são portadoras de epilepsia, das quais 30%
(750.000) são de difícil controle medicamentoso. Entre estas, a metade é
diagnosticada como portadora de epilepsia do lobo temporal (Engel, 2003).
As diferentes formas de epilepsia apresentam características próprias, dependendo
das diferentes áreas cerebrais envolvidas em sua origem. Particularmente, a
epilepsia do lobo temporal (ELT) tem como características a possibilidade de ter
diferentes e múltiplas etiologias e apresentar diversos substratos anatômicos e
moleculares. A ELT é considerada uma síndrome crônica que afeta mais de 1% da
população mundial, podendo ter maior incidência nos países em desenvolvimento
(Sander e Shorvon, 1996). As crises epilépticas na ELT são geralmente parciais,
simples ou complexas, e podem evoluir para a generalização secundária. Uma
porcentagem considerável de pacientes portadores de ELT não consegue melhorar
ou ficar livres das crises, mesmo com o uso de drogas anti-epilépticas atuais
(Mukahira et al., 1998; Wolf, 1998; Ojemann, 1997; Engel, 1992). Muito comumente,
e devido a esse difícil controle medicamentoso, o tratamento cirúrgico com remoção
da área considerada epileptogênica tem sido eficaz em reduzir as crises epilépticas
(Spencer, 2002).
Este fato tem levado os centros de pesquisa de todo o mundo, inclusive no Brasil, a
investir pesadamente no estudo deste tipo específico de epilepsia, na procura de
entender melhor sua fisiopatologia. Os mecanismos básicos de epileptogênese
crônica no tecido cerebral de pacientes portadores de epilepsia ainda permanecem
em fase de elucidação. O avanço no conhecimento dos mesmos permitirá a adoção
de terapêuticas mais racionais e específicas.
Foco Epileptogênico na Epilepsia do Lobo Temporal
Uma questão fundamental na ELT é a identificação da estrutura cerebral que dá
origem às crises epilépticas, bem como os fatores responsáveis pela sua
generalização, duração e evolução temporal. Como a atividade epileptiforme tem a
capacidade de se alastrar rapidamente em direção às estruturas adjacentes, a
identificação do seu local de origem pode ser uma tarefa difícil. As estruturas
hipocampais parecem ter uma sensibilidade aumentada para a gênese de atividade
epileptiforme e tem sido uma das regiões mais estudadas por meio de diferentes
técnicas eletrofisiológicas. Investigações por meios não invasivos
xvii
(eletrencefalografia) e invasivos (registros profundos) têm verificado a presença de
espículas interictais e atividade ictal em estruturas temporais mesiais (Sano, 1997;
Brooks et al., 1992) em pacientes portadores de epilepsia. Esses achados foram
recentemente confirmados em estudos in vitro (Cohen et al., 2002; Gabriel et al.,
2004) realizados no hipocampo de pacientes submetidos à cirurgia para o
tratamento da epilepsia. Em casos de pacientes com ELT refratários à medicação
antiepiléptica e submetidos ao tratamento cirúrgico (ex: lobectomia temporal e/ou
hipocampectomia), foi observada uma melhora significativa das crises nos casos em
que o estudo pré-operatório tinha comprovado o início das crises ou atividade
interictal em estruturas temporais (Brooks et al., 1992; Sano et al., 1997). Mais
recentemente, Cohen et al. (2002) demonstraram que a atividade interictal poderia
ser gerada no subículo após serem registrados disparos em forma de “burst”
somente nesta região. Estes autores observaram, também, que o subículo, quando
isolado das demais estruturas límbicas, mantinha a atividade rítmica e sincrônica
associada à atividade interictal. Foi então sugerido que o foco epileptogênico
poderia originar-se nesta estrutura e rapidamente alastrar-se às demais regiões.
Entretanto, mais estudos científicos e maior desenvolvimento tecnológico são
necessários para que se possa determinar, com maior precisão, qual ou quais os
locais de origem da atividade epileptogênica.
Alterações da neurotransmissão na Epilepsia do Lobo Temporal.
Hiperfunção dos receptores glutamatérgicos tipo NMDA e AMPA
Tem se proposto, nos últimos anos, que alterações sinápticas glutamatérgicas na
circuitaria hipocampal podem causar hiperexcitabilidade (Mody et al., 1992). Mais
especificamente tem-se sugerido um aumento exagerado do número de receptores
pós-sinápticos glutamatérgicos (Mathern et al., 1996). Dentre os mecanismos
responsáveis pela gênese da atividade epileptiforme, têm sido proposta à
participação de redes neuronais nas quais os potenciais dependentes de receptores
tipo NMDA e AMPA atuariam com cinética alterada. Estudos em modelos agudos de
crises epilépticas in vitro (aplicação de convulsivantes ou aumento de potássio
extracelular) mostraram que a gênese da atividade interictal poderia ser bloqueada
pela aplicação de antagonistas dos receptores glutamatérgicos (Baldino et al., 1986;
Hoffman e Haberly, 1989). Em relação à participação dos receptores
glutamatérgicos nas sinapses da rede hipocampal epileptogênica, diferentes
modelos e hipóteses têm sido propostos, todos baseados em experimentos
realizados em tecido epiléptico humano ex vivo obtido de cirurgias para o tratamento
de ELT ou em modelos experimentais de epilepsia.
Alterações na estrutura molecular dos receptores glutamatérgicos se associam a
mudanças nas propriedades cinéticas (condutância, permeabilidade a íons, etc),
ficando difícil separar ou classificar essas alterações. De forma geral essas
alterações são compatíveis com a idéia da existência de canais iônicos epilépticos
na gênese da atividade epileptiforme crônica.
xviii
Alterações dos mecanismos inibitórios dependentes de GABA
A atividade epileptiforme está amplamente associada a uma hipofunção dos
sistemas inibitórios, fundamentalmente daqueles de neurotransmissão mediados por
GABA. A facilidade em localizar neurônios inibitórios GABAérgicos, por detecção da
enzima descarboxilase do ácido glutâmico (GAD), levou muitos autores a pesquisar
se as epilepsias se acompanham da perda de neurônios GAD-positivos (Ribak, et
al., 1979). Um estudo imunohistoquímico para GAD demonstrou uma diminuição
significativa de terminais GAD-positivos no foco epiléptico induzido
experimentalmente em macacos por aplicação cortical de gel de AlCl
3
(Ribak et al.,
1979). Esses estudos levaram a hipótese de que existe uma redução do controle
sináptico inibitório de neurônios piramidais do hipocampo proporcionando uma
hipersensibilidade dos mesmos ao influxo excitatório normal. Esta hipótese tem sido
considerada a base da teoria do GABA na epilepsia (Avanzini et al., 1985). Neste
sentido, vários trabalhos mostraram diminuição da inibição sináptica hipocampal
tanto na fase aguda como na crônica do modelo de epilepsia induzido pelo ácido
caínico (Sloviter e Damiano, 1981; Fisher e Alger, 1984; Cornish e Wheal, 1989).
Apesar das diversas observações de hipofunção GABAérgica, algumas
investigações têm demonstrado que muitos interneurônios inibitórios GABAérgicos
sobrevivem na ELT humana e em modelos experimentais. Especificamente, no
modelo de ELT induzido pela pilocarpina, um estudo imunocitoquímico para GAD,
na fase crônica do modelo, demonstrou a preservação de alguns neurônios GAD-
imunoreativos no hipocampo de ratos com epilepsia (Cavalheiro, 1990). Esses
dados são corroborados por trabalhos em hipocampo humano ressecado de
pacientes com epilepsia, onde existe uma perda acentuada de neurônios piramidais,
porém muitos interneurônios inibitórios estão, de certa forma, preservados (Babb et
al., 1989; Lanerolle et al., 1989). O fato de neurônios GABAérgicos estarem
preservados em tecido com comprovada epileptogenicidade levou muitos autores a
pensar sobre a existência da hipofunção dos mesmos. Diferentes hipóteses foram
propostas para explicar tal déficit inibitório GABAérgico na ELT, desde alterações
funcionais no transportador de GABA (During et al., 1995) até alterações nas
subunidades do receptor de GABA
A
(Gibbs et al., 1996). Realmente, as epilepsias
como processo de plasticidade neuronal alterada produz mudanças significativas a
longo prazo no sistema GABAérgico, as quais podem participar na epileptogênese
crônica (Houser e Esclapez, 1996).
Apesar do importante papel da inibição GABAérgica, mais recentemente, vem
crescendo o número de evidências de sua ação despolarizante. A despolarização
induzida por GABA tem sido apontada com papel de destaque na geração de
atividade interictal e ictal em modelos experimentais (Higashima et al., 1996;
Fujiwara-Tsukamoto et al., 2003) e em tecido humano proveniente de cirurgia de
epilepsia (Cohen et al., 2002). Foi proposto que a sincronização das crises poderia
ser gerada pela transmissão GABAérgica excitatória num foco epileptogênico que
seria propagado sincronicamente para regiões corticais (Isomura et al., 2003). Esta
xix
proposta foi baseada em observações prévias que demonstraram que a atividade
interictal seria mediada por ação despolarizante GABAérgica em cooperação com a
transmissão glutamatérgica em neurônios do subículo de pacientes com ELT
(Cohen et al., 2002).
Atividade Inibitória GABAérgica do cerebelo
O papel inibitório do cerebelo nas crises e nas diferentes formas de epilepsias vem
sendo abordado há um tempo considerável, valendo-se de diferentes técnicas e
modelos experimentais. Geralmente, os estudos são conduzidos lesando e/ou
estimulando áreas específicas do cerebelo e verificando, posteriormente, os efeitos
facilitadores ou inibitórios sob a atividade epiléptica.
Assim como as estruturas hipocampais têm sido apontadas como responsáveis pela
gênese da atividade epiléptica, o cerebelo tem sido apontado como elemento
importante no controle das crises, como observado em diversos estudos
experimentais. O estudo pioneiro de Russel, em 1894, verificou em cães os efeitos
da ablação cerebelar nas crises clônicas generalizadas induzidas pela injeção de
absinto. Foi observado que os movimentos convulsivos foram de maior intensidade
no lado correspondente ao hemisfério cerebelar que foi removido.
Como já mencionado, o GABA é o principal neurotransmissor usado nas sinapses
com ação inibitória. No cerebelo, os neurônios dos núcleos profundos recebem
aferências GABAérgicas dos neurônios de Purkinje (NP) (Ito et al., 1964). A ativação
desta via induz potenciais pós-sinápticos inibitórios (PIPS) mediados por receptores
tipo GABA
A
nos núcleos profundos do cerebelo. Esta via cortico-nuclear é a principal
eferência do córtex cerebelar. Para podermos compreender melhor as bases
fisiológicas que têm fundamentado a noção de que o cerebelo tem função inibitória
sobre a atividade epiléptica, passaremos, a seguir, a rever, ainda que brevemente, a
estrutura e as principais conexões cerebelares.
A estrutura cerebelar
Juntamente com o cérebro, o cerebelo faz
parte do sistema nervoso supra-segmentar. O
cerebelo, assim como o cérebro, apresenta um
córtex que envolve um centro de substância
branca (corpo medular) onde são observadas
xx
massas de substância cinzenta (núcleos
centrais).
A citoarquitetura do córtex cerebelar é a
mesma em todas as folhas e lóbulos, sendo
constituída de cinco tipos básicos de células:
as granulares e as de Purkinje e três tipos de
interneurônios, as células de Golgi, as
estreladas e as “em cesto”. O córtex cerebelar
recebe três tipos de aferências extra-
cerebelares: as fibras musgosas e trepadeiras,
ambas excitatórias, além de aferências difusas
(monoaminérgicas e colinérgicas). Na figura 1
podemos observar o esquema original do
córtex cerebelar humano feito por Camilo
Golgi. As principais conexões cerebelares
estão ilustradas na fig 2 (adaptado de Carulli et
al., 2004).
As células granulares são pequenos neurônios
(os menores do corpo humano)
glutamatérgicos que são, ao mesmo tempo, os
mais numerosos do sistema nervoso central.
Os terminais das fibras musgosas fazem
contato com os dendritos de diversas células
xxi
granulares em sinapses complexas chamadas
de glomérulos. Os axônios das células
granulares não possuem mielina e ascendem
à camada molecular, onde se bifurcam e
fazem sinapse com os dendritos das células
de Purkinje e com interneurônios inibitórios.
Os neurônios de Purkinje são células piriformes e grandes, GABAérgicas,
responsáveis pela eferência do córtex cerebelar. Seus axônios mielinizados são
responsáveis pela via eferente do córtex cerebelar e terminam em neurônios dos
núcleos cerebelares e do tronco cerebral, enquanto seus dendritos se ramificam na
camada molecular. Na figura 3, observamos um neurônio de Purkinje em uma
lâmina original de Camilo Golgi.
xxii
Fig1. Esquema feito por Camilo Golgi do córtex cerebelar humano.
Nesta figura, pode-se distinguir as três camadas do córtex cerebelar: a camada de
células granulares, a dos neurônios de Purkinje e a camada molecular (mais
externa). Também pode ser notada a presença de diferentes tipos de interneurônios
inibitórios, alguns deles fazendo sinapse com os neurônios de Purkinje.
xxiii
Fig 2. Esquema representativo das principais conexões do cerebelo.
Os neurônios de Purkinje (NP) formam a via de saída do córtex cerebelar. Seus
axônios se projetam aos núcleos intra-cerebelares (NC) que, por sua vez, recebem
duas vias aferentes principais.
As fibras musgosas (FM) projetam-se em direção às
células granulares (CG) cujos axônios, que em conjunto são denominados de fibras
paralelas, terminam nos compartimentos dendríticos dos NP. As fibras trepadeiras
(FT) projetam-se diretamente aos NP. Os interneurônios “em cesto” (CC) e
estrelados (CE) são excitados pelas fibras paralelas e inibem os NP. As fibras
paralelas (FP) e trepadeiras enviam axônios colaterais para os núcleos profundos do
cerebelo. Outro interneurônio, as células de Golgi (G), são excitadas pelas fibras
musgosas e paralelas e inibem as células granulares.
Os núcleos profundos enviam
seus axônios para diversas regiões do tronco encefálico e possuem projeções
inibitórias para a oliva inferior.
xxiv
Fig 3. Neurônio de Purkinje impregnado pela técnica de Golgi.
Esta foto pertence a uma lâmina original guardada no instituto de patologia da
Universidade de Pavia, Itália. Pode-se observar a ampla extensão dos dendritos dos
NP projetando-se para a camada molecular onde recebem sinapses excitatórias das
fibras paralelas.
Conexões aferentes ao cerebelo
xxv
1) Fibras de origem vestibular.
Essas fibras chegam ao cerebelo pelo fascículo vestíbulo-cerebelar, cujas
fibras têm origem nos núcleos vestibulares e se distribuem para o
arquicerebelo. As informações são trazidas da parte vestibular do ouvido
interno e são importantes para a manutenção do equilíbrio e da postura.
2) Fibras medulares.
São compostas por dois tractos principais, o espino-cerebelar anterior e o
espino-cerebelar posterior. Ambos chegam ao cerebelo pelos pedúnculos
cerebelares (superior e inferior, respectivamente) e terminam no córtex do
paleocerebelo. Através do tracto espino-cerebelar posterior, o cerebelo
recebe, principalmente, sinais sensoriais originados em receptores
proprioceptivos que permitem avaliar o grau de contração muscular e a
tensão nas cápsulas articulares e tendões. As fibras do tracto espino
cerebelar anterior são ativadas por sinais motores que chegam à medula
pelo tracto cortico-espinhal, permitindo ao cerebelo avaliar o grau de
atividade desse tracto.
3) Fibras de origem pontina:
As fibras pontinas ou ponto-cerebelares se originam nos núcleos da ponte e
chegam ao cerebelo pelo pedúnculo cerebelar médio, distribuindo-se,
principalmente, para o córtex do neocerebelo.
Conexões eferentes
1) Zona medial (vermis).
Os axônios dos neurônios de Purkinje, com origem predominante
arquicerebelar, fazem sinapses principalmente nos núcleos fastigiais. Destes
núcleos sai o tracto fastigio-bulbar, com 2 tipos de fibras diferentes. As fibras
fastígio-vestibulares fazem sinapse nos núcleos vestibulares, local de origem
do tracto vestíbulo-espinhal que se projeta para os neurônios motores. Já as
fibras fastígio-reticulares chegam à formação reticular e, através do tracto
retículo-espinhal, terminam nos neurônios motores.
xxvi
2) Zona intermédia.
Os axônios dos neurônios de Purkinje da zona intermédia cerebelar fazem
sinapse no núcleo interpósito, de onde saem fibras para o núcleo rubro e
para o tálamo contralateral. Pelo tracto rubro-espinhal, o cerebelo age sobre
os neurônios motores através do circuito interpósito-rubro-espinhal. As
eferências talâmicas se dirigem para as áreas motoras do córtex cerebral,
constituindo o circuito interpósito-tálamo-cortical.
3) Zona lateral.
Os axônios das células de Purkinje fazem sinapse no núcleo denteado, de
onde partem fibras para o núcleo rubro. Daí, os impulsos vão ao tálamo
contralateral de onde partem fibras para as áreas motoras do córtex cerebral.
Estas conexões formam o tracto córtico-espinhal, através do qual o núcleo
denteado exerce seu controle sobre a musculatura distal, responsável pelos
movimentos finos.
Núcleos profundos cerebelares
Os núcleos profundos do cerebelo estão divididos em três grupos: núcleo medial ou
fastigial, núcleo interpósito (anterior e posterior) e núcleo lateral ou denteado. Estas
estruturas são simétricas e estão contidas em cada hemisfério cerebelar. O núcleo medial
encontra-se próximo à linha média do Vérmis; o núcleo lateral está localizado nos
hemisférios, enquanto o interpósito se situa entre os núcleos medial e lateral. Juntos, eles
se localizam abaixo do córtex cerebelar e podem ser observados através de cortes
xxvii
coronais do lobo posterior do cerebelo. Os neurônios destes núcleos podem disparar PA
de forma espontânea ou através de despolarização de membrana induzida por injeção de
corrente (Gardette et al., 1985). O significado dos disparos espontâneos nessas células
pode ser interpretado como função da saída contínua de informação. O padrão de disparo
pode modular a ação inibitória dos axônios dos NP, bem como os efeitos de excitação
promovidos pelas fibras musgosas e trepadeiras (Jahnsen, 1986).
Projeções aferentes aos núcleos profundos do cerebelo
Há três aferências bem estabelecidas aos núcleos profundos: projeções diretas
dos NP, axônios colaterais vindos da oliva inferior e aferências de neurônios
extra-cerebelares.
Axônios dos NP: esses axônios fornecem projeções diretas córtico-nucleares
para todas as divisões dos núcleos profundos. Os terminais desses neurônios
fazem sinapse com o soma e com os dendritos de todos os tipos celulares
contidos nesses núcleos. Diversos estudos apontam que esses terminais e o
soma dos NP contém GABA (Chan-Palay, 1977). Ito et al. (1964) demonstraram
que a ativação dos axônios dos NP gera potenciais pós-sinápticos inibitórios
(PIPSs) nos neurônios dos núcleos profundos.
Através do seu curso, da oliva inferior até os NP, as fibras trepadeiras projetam
axônios colaterais que contactam vários tipos celulares, incluindo os neurônios
dos núcleos profundos onde fazem sinapse no soma e nos dendritos (Ikeda e
Matsushita, 1974). Os três núcleos profundos recebem projeções da oliva
inferior. É estabelecido que a ativação desta projeção induz potencial pós-
xxviii
sináptico excitatório (PEPSs) nos neurônios dos núcleos profundos (Ito et al.,
1970).
Por último, as fibras musgosas se projetam ao cerebelo vindo de diversas áreas
extra-cerebelares como o núcleo reticular lateral, a ponte e a rafe. Assim como
nas fibras trepadeiras, a ativação das fibras musgosas evoca respostas
excitatórias nos neurônios dos núcleos profundos cerebelares (Llinás e
Muhlethaler, 1988).
Projeções eferentes dos núcleos profundos cerebelares
Os neurônios dos núcleos profundos projetam seus axônios para diversas áreas
do sistema nervoso central, incluindo os núcleos olivares e o córtex cerebral. As
eferências núcleo-olivares são compostas por fibras provenientes dos três
núcleos cerebelares e constituem uma via recíproca das projeções olivo-
nucleares.
Os axônios dos três núcleos cerebelares projetam-se para diferentes áreas do
córtex cerebelar. Dentre essas áreas, há projeções para a camada de células
granulares, aonde se formam os terminas musgosos. Tem sido observado uma
via recíproca formada com os axônios dos NP originados na área de projeção
dos núcleos profundos. Os núcleos profundos também formam vias não
recíprocas em áreas aonde recebem inervação dos NP fora da região cortical.
Esses dados indicam que além de formar um ciclo de retroalimentação, as
projeções núcleo-corticais constituem vias nas quais diferentes áreas corticais
podem comunicar-se com os núcleos profundos do cerebelo.
Papel funcional do cerebelo na epilepsia do lobo temporal
Vários trabalhos têm sugerido que o cerebelo exerce ação inibitória sobre as
crises epilépticas, quer em humanos como em modelos animais (Cooke e
Snider, 1955; Davis e Emmonds, 1992; Specht et al., 1997; Bohnen et al.1998).
Os mecanismos através dos quais o cerebelo exerce seu papel inibitório sobre
xxix
as crises epilépticas ainda não são bem conhecidos. Acredita-se que os
neurônios de Purkinje tenham papel importante no controle das crises
epilépticas. A chegada da atividade epiléptica ao córtex cerebelar poderia ativar
estas células que, por sua vez, exerceriam sua atividade inibitória sobre as
crises. Alguns autores têm relatado a ocorrência de perda de NP em pacientes
portadores de epilepsia. Entretanto, de forma contrastante, Rajjoub et al., (1976)
não encontraram relação entre a densidade de NP e incidência de crises
epilépticas.
Considerando a circuitaria cerebelar discutida anteriormente, podemos observar
que vários interneurônios presentes no córtex cerebelar são, também, do tipo
inibitório. Entre eles, destacam-se as células “em cesto”, as estreladas e as
células de Golgi. No entanto, poucos são os trabalhos que tentam relacionar o
papel desses circuitos inibitórios com a ocorrência de crises epilépticas. Como
mencionado, estas células exibem ação inibitória sobre os NP. Caso estas
sinapses sejam ativadas durante as crises epilépticas, poderíamos considerar
que, nestas circunstâncias, a diminuição da inibição tônica exercida pelas
eferências do NP seria a responsável pela ação inibitória do cerebelo sobre as
crises epilépticas.
Desta forma, a riqueza de conexões inibitórias, principalmente GABAérgicas,
existentes no cerebelo pode ser importante para a extinção ou o atenuamento
das crises epiléticas e as duas possibilidades colocadas acima, isto é, ativação
direta dos NP ou sua inibição pelos interneurônios, não podem ser facilmente
responsabilizadas pela ação final. A morte celular causada pela liberação
xxx
exagerada de glutamato decorrente da hiperexcitação neuronal comandada a
partir de um foco distante, principalmente em estruturas límbicas, poderia
contribuir adicionalmente para o comprometimento da função cerebelar
(Stubgen, 1995).
Patologia Cerebelar na Epilepsia do Lobo Temporal
A primeira observação de alteração cerebelar em crises epilépticas foi um
estudo experimental pioneiro realizado por Russel (1894). Posteriormente, a
relação do cerebelo com as epilepsias foi reforçada por estudos experimentais
usando diferentes modelos, tais como, o dos babuínos fotossensíveis
(Brailowsky et al., 1975), gerbilos (Dam et al., 1984), o modelo induzido pela
pilocarpina (Smolders et al., 1997) e o induzido pelo cobalto (Dow et al., 1962).
As primeiras alterações da morfologia cerebelar encontradas em pacientes
portadores de epilepsia foram atribuídas a anóxia presente durante as
convulsões (Spielmeyer, 1927, Liebers, 1929). Mais recentemente, a ação
inibitória do cerebelo sob as crises epilépticas também pode ser verificada em
humanos (Hori et al., 1987; Specht et al., 1997; Vander et al., 2004).
As alterações morfológicas do cerebelo observadas em portadores de epilepsia
são, atualmente, consideradas como conseqüência de uma ampla gama de
xxxi
eventos que incluem, além da anóxia, o uso prolongado de fenitoína e o papel
exercido pelas próprias crises epilépticas.
Estimulação cerebelar
A técnica de estimulação das estruturas cerebelares para obter o bloqueio ou a
atenuação da atividade epiléptica é relativamente antiga e já foi, inclusive, utilizada
para tratar pacientes portadores de epilepsia. Os estudos iniciais ocorreram em
animais e foi observado que a estimulação cerebelar pode suprimir,
temporariamente, a atividade epiléptica em um foco induzido experimentalmente
(Cooke e Snider, 1955; Hutton et al., 1972). Esses resultados foram confirmados
posteriormente quando se demonstrou que o cerebelo poderia abolir crises
evocadas em estruturas hipocampais de gatos (Iwata e Snider, 1959).
Contrariamente, um trabalho conduzido por Hablitz et al. (1975) mostrou, em
macacos, que a estimulação cerebelar poderia deflagrar crises a partir de um foco
latente.
Após os pioneiros estudos em humanos publicados por Cooper et al. (1973 a, b), a
estimulação de estruturas cerebelares começou a ser testada com sucesso para o
controle das crises epilépticas (Cooper et al., 1973 a, b, 1974,1976; Davis, 2000;
Davis e Emmonds, 1992; Davis et al., 1983), apesar das observações feitas por
Moruzzi (1941 a,b,c de acordo com Dow et al., 1962) de que a estimulação do
paleocerebelo poderia induzir tanto a facilitação quanto à inibição das crises
clônicas induzidas por estriquinina.
Entretanto, outras investigações não confirmaram o efeito inibitório do cerebelo (Van
Burenet al., 1978; Wright et al., 1984) e esses resultados conflitantes geraram
dúvidas sobre a eficácia do tratamento. Hoje, a estimulação cerebelar não vem
sendo utilizada na clínica, porém investigações complementares podem fazer com
que este procedimento seja revisto e novamente utilizado no tratamento de
pacientes com epilepsia (Karceski, 2002). Como apresentado acima, os exatos
mecanismos de ação da estimulação cerebelar ainda não são completamente
conhecidos. Entretanto acredita-se que a riqueza de interconexões inibitórias do
cerebelo com áreas cerebrais, principalmente tálamo, tronco cerebral e córtex
cerebral seja uma condição fundamental para o controle da hiperexcitabilidade
presente na atividade epiléptica (Bloedel, 1985).
Efeito da cerebelectomia em modelos experimentais de epilepsia
As propriedades inibitórias do cerebelo também foram estudadas através de lesões
ou pela própria remoção, total ou parcial, desta estrutura. A hipótese testada nessas
xxxii
investigações era observar se, contrariamente a estimulação, a lesão do cerebelo
facilitaria a dispersão das descargas epilépticas. Nesse sentido, em um dos
primeiros trabalhos conduzidos por Van den Driessche e Trebaul (1958), foi relatado
que, em coelhos submetidos à ablação total do neocerebelo e com destruição
parcial do paleocerebelo, observou-se mudanças no padrão clínico das convulsões
induzidas por estimulação elétrica ou pela injeção de pentilenetetrazol. Da mesma
forma, um trabalho posterior (Dow et al., 1962) onde certas áreas do cerebelo foram
lesadas pelo método do resfriamento, observou-se uma facilitação das crises
convulsivas induzidas pelo cobalto. Outro estudo experimental conduzido por
(Fadiga et al., 1966) demonstrou que, após remoção dos hemisférios cerebelares,
houve tendência a hipersincronização cortical. Adicionalmente, observou-se que a
ablação total do cerebelo foi capaz de aumentar a duração da atividade
epileptiforme induzida pela penicilina em ratos anestesiados (Gartside, 1978).
Contrastando com essas evidências, uma investigação realizada no modelo de
epilepsia em babuínos fotossensíveis comparou diferentes tipos de lesões, tanto no
vermis como nos hemisférios cerebelares (Brailowsky et al., 1975). Os resultados
variaram dependendo do tipo de lesão, porém nenhum animal apresentou crises
espontâneas o que levou os autores a considerarem o papel inibitório do cerebelo
como secundário.
Atrofia cerebelar nas epilepsias
Trabalhos recentes mostram que existem diversas alterações cerebelares
crônicas em pacientes portadores de epilepsia e que a atrofia do cerebelo é
freqüentemente observada (Ney et al., 1994; Bohnen et al., 1998; Sandok et al.,
2000). A atrofia cerebelar tem sido considerada como conseqüência das crises
recorrentes, do uso de altas doses de fenitoína e de outros fatores relacionados
à epilepsia (Botez et al., 1988; Specht et al., 1997).
Estudos in vivo em pacientes portadores de epilepsia, por meio de tomografia
computadorizada, têm demonstrado que a atrofia do cerebelo pode estar
relacionada com a intoxicação por fenitoína (Koller, 1981; Claus, 1982; Masur,
1989). Ney et al. (1994) demonstraram que a atrofia cerebelar ocorre com
xxxiii
freqüência mais significativa nos portadores de epilepsia do que em indivíduos
não portadores. Entretanto, esses autores não observaram relação entre a
atrofia cerebelar e a freqüência de crises ou o uso de fenitoína. Esse trabalho
corrobora um estudo clínico anterior, que não encontrou associação entre
tratamento com fenitoína e atrofia cerebelar (Ballenger et al., 1982). Outros
estudos conduzidos por Luef et al. (1993; 1996) com pacientes portadores de
atrofia cerebelar também não estabeleceram qualquer relação seja com a
gravidade da epilepsia ou com a administração de fenitoína. De acordo com
esses trabalhos, pacientes com epilepsia podem apresentar vários graus de
dano cerebelar (perda de células de Purkinje, atrofia e gliose), sem que a causa
esteja plenamente identificada. Ainda há muita discussão se a magnitude desse
fenômeno pode depender da intensidade e duração das crises epilépticas, do
uso de altas doses de fenitoína ou de ambos. Neste sentido, Botez et al (1988)
sugere que a atrofia cerebelar seja primariamente induzida pela fenitoína, porém
as crises epilépticas podem contribuir com papel secundário. O fenômeno da
diásquise, que consiste na capacidade de um foco epiléptico causar lesões à
distância (cerebelo, no caso) tem, também, sido considerado causa importante
de atrofia cerebelar (Tien e Ashdown, 1992).
Há evidencias mostrando que a atrofia de estruturas cerebelares tem um
importante papel na clínica neurológica, pois tais pacientes apresentam menor
controle das crises epilépticas após serem submetidos a lobectomia temporal
(Specht et al., 1997). Esse estudo sugere que a presença de atrofia cerebelar
xxxiv
deve ser considerada na avaliação para a indicação de neurocirurgia para
pacientes portadores de epilepsia de difícil controle medicamentoso.
Diásquise cerebelar: estudo das conexões aferentes e eferentes do cerebelo na
epilepsia crônica.
Como já mencionado, a diásquise consiste no distúrbio de função em uma determinada
área cerebral resultante da atividade de um foco situado numa região fisicamente
distante, mas anatomicamente interconectada (Sandok et al., 2000). Este fenômeno foi
primeiramente descrito por von Monakow, em 1914 (de acordo com Meyer et al.,
1993). A diásquise no cerebelo foi descrita pela primeira vez em um paciente portador
de epilepsia por Baron et al. (1980). Nos anos seguintes, diversos estudos confirmaram
o fenômeno da diásquise cerebelar (Lenzi et al., 1982; Martin e Raichle, 1983;
Meneghetti et al., 1984). Um dos eventos que se postula como causa do dano
cerebelar na epilepsia é o influxo de atividade epiléptica através das conexões
aferentes ao cerebelo, principalmente pela via córtico-ponto-cerebelar (Pantano et al.,
1986). Nesse contexto, a diásquise cerebelar contralateral é um fenômeno intrigante.
Trabalhos realizados com PET (tomografia por emissão de pósitrons), demonstraram
que a diásquise cerebelar contralateral afeta tanto o consumo de oxigênio quanto à taxa
de utilização da glucose (Lenzi et al, 1982; Martin e Raichle, 1983; Baron et al., 1984;
Kushner et al 1984; Patronas et al 1984). Estudos clássicos realizados por Baron et al.
(1980) e Biersack et al. (1984) demonstraram uma associação significativa entre a
xxxv
ocorrência de déficit motor em portadores de epilepsia e a diásquise cerebelar
contralateral. Por outro lado, Kushner et al. (1984) observaram que dois de quatro
pacientes com epilepsia, mas sem déficit motor, apresentaram diásquise contralateral
significativa. Este fenômeno tem sido estudado tanto em humanos (Lenzi et al., 1982;
Celesia et al., 1984; Stubgen, 1995) como em animais (Ginsberg et al; 1977; Smolders
et al., 1997), mas os resultados têm sido conflitantes em relação à ocorrência e ao
curso de tempo. A diásquise contralateral pode, em alguns poucos casos, desaparecer
com o tempo (Meneghetti et al., 1984; Kushner et al., 1984). Mesmo sendo um
fenômeno com importantes implicações, ainda hoje o seu significado clínico ou
fisiopatogênico não é bem compreendido.
Atividade Espontânea nos Neurônios de Purkinje
A atividade neuronal tem que começar em alguma área e, conseqüentemente, alguns
neurônios disparam potenciais de ação espontâneos, na ausência de qualquer estímulo
externo. Este padrão de atividade pode ser observado em vários tipos de neurônios no
sistema nervoso central (Llinás, 1988). O cerebelo é rico em neurônios com essa
propriedade, isto é, disparos espontâneos são observados em diversos tipos celulares
incluindo os neurônios de Purkinje (Llinás e
Sugimori, 1980), neurônios dos núcleos
profundos (Gardette et al., 1985; Sastry et al., 1997) e interneurônios cerebelares
(Häusser e Clark, 1997). As primeiras evidências de potenciais de ação espontâneos, na
xxxvi
ausência de qualquer estímulo externo, originaram-se em experimentos com Aplysia sp
(Alving, 1968). Estes PA têm origem em propriedades intrínsecas da membrana celular
que ocorrem em determinados neurônios (Llinás, 1988). Como exemplo, os neurônios de
Purkinje são capazes de disparar potenciais de ação espontâneos tanto in vivo como in
vitro (Granit e Phillips,
1956; Thach, 1968; Bell e Grimm, 1969; Latham e Paul, 1971
Häusser e Clark, 1997). Após o preparo das fatias cerebelares, os neurônios aí presentes
podem permanecer disparando ritmicamente por períodos prolongados, muitas vezes
superiores a 24 h. Além disso, um único neurônio de Purkinje pode manter seu padrão de
disparo espontâneo sem alterações significativas por cerca de três h. (Llinás e
Sugimori,
1980).
Os mecanismos pelos quais os NP regulam seus disparos espontâneos não são
completamente entendidos. Enquanto alguns neurônios dispararam com freqüência
aproximada de 1Hz, outros mostram uma alta freqüência, chegando a 150 Hz (Häusser e
Clark, 1997). De uma maneira geral, as freqüências de disparo dos NP são elevadas, por
volta de 50 Hz (Häusser e Clark, 1997; Womack e Khodakhah, 2002). Estudos iniciais
sugeriram que os disparos espontâneos eram causados por PA iniciados nos dendritos
(Llinás e
Sugimori, 1980b). Entretanto, neurônios de Purkinje em cultura são capazes de
apresentar PA espontâneos antes da formação dos dendritos (Gruol et al., 1991). Estudos
subseqüentes demonstraram que o disparo espontâneo continuava presente mesmo em
corpos celulares dissociados (Nam e Hockberger, 1997; Raman e Bean, 1997). Neste
estudo, a atividade espontânea dos neurônios de Purkinje foi utilizada como referência da
atividade da circuitaria cerebelar. A atividade neuronal espontânea tem papel crucial na
transformação da entrada da informação sináptica em uma resposta em forma de disparo,
xxxvii
além de promover mecanismos plásticos numa ampla gama de circuitos neurais (Hausser
et al., 2004).
Este estudo teve como objetivo principal avaliar as alterações estruturais e
eletrofisiológicas no cerebelo de animais com epilepsia do lobo temporal
induzida pela pilocarpina. A hipótese de que o cerebelo poderia atuar como uma
estrutura inibitória da atividade epiléptica foi testada, com enfoque concentrado
nos seguintes aspectos:
- Quantificar através de coloração de Nissl a perda dos NP durante o
período silencioso, assim como na fase crônica do modelo de ELT
induzido pela pilocarpina em ratos adultos jovens e idosos.
- Verificar alterações nas propriedades dos disparos espontâneos
(freqüência, duração, etc.) dos NP na fase crônica do modelo de ELT
utilizando a técnica de eletrofisiologia in vitro “patch-clamp”.
xxxviii
- Avaliar, pela coloração de Golgi, se ocorre alteração do número de botões
sinápticos nos dendritos dos NP em decorrência do aumento na
excitabilidade neuronal induzida pelas crises epilépticas.
- Quantificação das concentrações dos aminoácidos presentes no cerebelo
de animais submetidos ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina.
1. Animais
Na primeira série de experimentos realizados no Laboratório de Neurologia
Experimental da UNIFESP/EPM foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos,
com peso variando entre 200 e 250g, provenientes do biotério central da
UNIFESP/EPM, mantidos com livre acesso à água e comida, ciclo claro-escuro
de 12 horas (claro das 7:00 às 19:00 h) e temperatura controlada (22 - 24° C).
A segunda série de experimentos foi realizada na University of Califórnia at Los
Angeles – UCLA. Exclusivamente para os registros eletrofisiológicos do tipo
patch clamp, foram utilizados camundongos machos adultos, C57BL6 (Harlan,
San Diego, CA), mantidos nas mesmas condições descritas previamente para
os ratos Wistar. Conforme amplamente descrito na literatura, o modelo de ELT
induzido pela pilocarpina em camundongos se desenvolve de maneira similar ao
observado em ratos. O uso de camundongos nestes experimentos deve-se a
xxxix
maior facilidade de manutenção destes animais e, também, por proverem um
número de fatias cerebelares já suficientes para a realização dos protocolos.
Esta segunda fase de experimentação contou com a orientação do Dr. Istvan
Mody.
2. Modelo de ELT induzido pela Pilocarpina
O modelo de ELT induzido pela pilocarpina foi utilizado de acordo com
procedimentos estabelecidos em nosso laboratório (Cavalheiro, 1995;
Cavalheiro et al., 1991,1996). Foi administrada uma injeção intra-peritonial de
Hidrocloreto de Pilocarpina (PILO) 4% (Merk) na dose de 350 mg/kg, precedida
30 minutos por uma injeção subcutânea de Nitrato de Metilescopolamina
(Sigma), na dose de 1mg/kg, para reduzir os efeitos colinérgicos periféricos
(estresse respiratório, salivação, espasmos abdominais). O SE perdurou
aproximadamente 8 horas, sendo bloqueado por Diazepam (1-2mg/kg, sub-
cutâneo) com a finalidade de minimizar as crises comportamentais, buscando
uma maior sobrevida dos animais.
Após a fase aguda os animais foram mantidos em observação em uma sala de
vídeo-monitoração, nas mesmas condições ambientais do biotério da disciplina,
e observados 24h/dia para a detecção da 1ª crise espontânea.
Estes animais foram divididos nos seguintes grupos:
xl
Grupo crônico adulto jovem - animais que apresentaram SE e evoluíram com
crises espontâneas, estudados em torno do 4º mês de vida.
Grupo crônico idoso - animais que apresentaram SE e evoluíram com crises
espontâneas, estudados entre o 12º e o 23º mês de vida.
Grupo controle - animais submetidos aos mesmos procedimentos do grupo
anterior, exceto pela aplicação de solução salina 0.9%, ao invés de pilocarpina e
pareados em idade com os animais crônicos.
Grupo agudo - animais que receberam aplicação de pilocarpina, e foram
utilizados 6 horas após o início do SE.
Grupo silencioso - animais adultos jovens, que apresentaram SE e foram
utilizados antes do aparecimento da primeira crise espontânea.
3. Eletrofisiologia in vitro do Cerebelo
3.1 Preparação das fatias cerebelares sagitais
Os estudos eletrofisiológicos “in vitro” do tipo “patch clamp”, foram
desenvolvidos em fatias cerebelares, especificamente na camada de células de
Purkinje. A técnica de preparação dessas fatias foi desenvolvida de acordo com
procedimentos amplamente descritos por Llinás e Sugimori (1980). Para este
fim, os animais foram anestesiados profundamente com halotano (Sigma
Aldrich) numa câmara apropriada e, posteriormente, decapitados mediante o
xli
uso de uma guilhotina. O crânio foi então rapidamente aberto para retirada do
cerebelo, num procedimento de duração total menor que 2 min. O tecido foi
imediatamente submerso em líquido cefalorraquiano artificial (LCRa) a 0.5
0
C,
contendo 5mM de ácido quinurênico para bloquear receptores tipo NMDA e
AMPA/cainato e oxigenado com uma mistura gasosa de 95% O
2
e 5% CO
2
na
cuba do vibrátomo. Fatias sagitais de tecido contendo o córtex cerebelar foram
cortadas com espessura de 300 μm, dissecadas manualmente com agulhas
próprias de dissecção em meio iluminado com luz fria (iluminador marca Schott).
As fatias prontas foram colocadas posteriormente num recipiente com LCRa
regular de perfusão (sem a presença do ácido quinurênico). Após 30 minutos de
incubação, 2-3 fatias foram colocadas na câmara de registro (especial para
fatias cerebrais) (ver fig 4) com perfusão contínua de LCRa oxigenado com a
mistura 95% O
2
/5% CO
2
. A temperatura na câmara foi mantida a 33
o
C por meio
de um termoregulador acoplado à mesma.
xlii
Fig 4. Câmara de registro eletrofisiológico in vitro, micromanipuladores e
microeletrodos. Vista superior da câmara utilizada nos registros
eletrofisiológicos. Pode ser observado em: (1) microeletrodo de registro
extracelular, (2) micromanipulador mecânico, (3) câmara de registro (contendo
fatias cerebrais), (4) câmara de estabilização (contendo fatias cerebrais), (5)
microeletrodo de registro intracelular, (6) microeletrodo de estimulação e (7)
sistema de iluminação por fibra óptica. O sistema está montado sobre uma
mesa antivibracional (TMC, MA – USA) e envolto por gaiola de Faraday (não
mostrado).
xliii
3.2 Fatias cerebelares horizontais
A preparação das fatias cerebelares horizontais foi obtida com procedimentos
semelhantes aos indicados para os cortes sagitais, variando apenas a secção
de corte. Na fig 5, podemos observar que após o tecido ser removido e
separado das demais estruturas, foi feito um corte na ponte e no tronco com a
finalidade de fornecer uma superfície plana para a fixação do cerebelo na cuba.
Com o cerebelo fixado a cuba de corte, um pequeno bloco de agarose foi
utilizado para dar sustentação ao tecido, enquanto a lâmina cortava as fatias.
xliv
Fig 5. Isolamento da estrutura cerebelar e plano de corte das fatias horizontais.
O cerebelo, intacto, é rapidamente isolado das demais estruturas (A, B), fixado
numa cuba acoplada ao vibrátomo e cortado horizontalmente (C). Essas fatias
cerebelares contêm ambos os hemisférios e a porção medial (vérmis). Figura
adaptada de Paxinos e Watson (1982).
A)
B)
C)
xlv
Fig 6 Setup de registro eletrofisiológico in vitro. Sistema de registro
eletrofisiológico in vitro, composto por: (1) computador PC, (2) caixa de
estimulação, (3) programador de estímulos Master 8, (4) Axopatch 1-D (Axon
Instuments), (5) amplificador Axoclamp 2B (Axon Instruments), (6) osciloscópio
(Tektronix), (7) termostato, (8) pré-amplificador Neurolog (Digitimer) (9) vídeo
cassete.
xlvi
3.3 Estimulação para obtenção de respostas tipo potencial de campo
Os potenciais evocados foram obtidos na região do vérmis cerebelar devido a
maior densidade de NP encontrada nessa região. Para evocar esses potenciais,
um eletrodo nicromado, bipolar, isolado por teflon foi posicionado na camada
molecular aonde as fibras paralelas (axônios das células granulares) foram
estimuladas. O eletrodo de registro foi posicionado a aproximadamente 70μm
da região estimulada. Este procedimento garante um espaço mínimo entre o
eletrodo de registro e o de estimulação, evitando a contaminação da resposta
eletrofisiológica pelo artefato de estímulo.
3.4 Microeletrodos para registros eletrofisiológicos “in vitro”
Os registros de potenciais de campo extracelular foram obtidos usando
micropipetas (ou capilares) de vidro (estiradas no equipamento - “puller” -
Modelo P-97, Sutter Instruments). Os microeletrodos para registro extra celular
do potencial de campo apresentaram resistência de 5-10 mOhm (após serem
preenchidos com solução de NaCl 1M). Os eletrodos para registro tipo patch
clamp (loose patch), apresentaram resistência variando entre 15-200 mΩ,
impedância de 1-3 mΩ, foram preenchidos com 119 mM NaCl e posteriormente
tamponados com 10mM HEPES.
xlvii
3.5 Captação de sinais eletrofisiológicos
O presente trabalho foi desenvolvido em sistema de eletrofisiologia “in vitro”
(setup) dentro de gaiola de Faraday para melhor isolamento da interferência
elétrica. O setup de registro foi instalado em mesa antivibracional, com o intuito
de evitar instabilidade dos registros. Os sinais eletrofisiológicos foram captados
e pré-amplificados inicialmente com microamplificadores (“headstages”),
acoplados a amplificador AXOCLAMP-2B (2 canais), e pré-condicionados com
pré-amplificador diferencial (NL-106, Neurolog, Digitimer, Ltd.). O sinal foi
posteriormente digitalizado utilizando a interface (12 bit) DIGIDATA 1200 (Axon
Instruments, Inc) e captado no microcomputador do tipo PC, através de um
circuito de interface para digitalização acoplada ao programa PCLAMP versão 6
(CLAMPEX) (Axon Instruments, Inc). Para a análise posterior (“off-line”) do sinal
digital foi usado os softwares CLAMPFIT do Pclamp 6 (Axon Instruments, Inc) e
EVAN (National instruments).
3.6 Protocolos de estimulação elétrica.
Os protocolos de estimulação elétrica extracelular foram realizados através do
sistema MASTER 8 (AMPI), sincronizado a saída digital do computador (via
interface DIGIDATA 2000). Antes de chegar nos microestimuladores
posicionados nas fibras paralelas, o estímulo foi condicionado em caixa
isoladora de ruído elétrico modelo DS2A, da Digitimer. Foram aplicados pulsos
de correntes retangulares, de intensidade variável (30-35mA), a cada 15 seg.
3.7 Análise dos PA espontâneos e dos p
otenciais de campo (População de
espículas).
Excluído: P
xlviii
Os potenciais de ação espontâneos foram analisados levando-se em
consideração a sua freqüência em Hz (eventos por segundo)
conforme o exemplo na fig 7A. Os potenciais de campo (fig 7B)
foram analisados em relação aos parâmetros amplitude (mV) e
duração (ms). Para este tipo de análise foram utilizados os
programas previamente descritos. Ambos os
tipos de registros,
assim como suas análises, foram realizados com os programas
CLAMPEX, Pclamp 6 com freqüência de amostragem de 1-50 kHz ou
utilizando o software EVAN (National Instruments, USA).
Fig 7. Registro de
potenciais de ação espontâneos e do potencial de campo. A) neste
registro tipo loose patch, observa-se os PA espontâneos (traços verticais) registrados no
soma dos NP. Pode se observar a linha de base (1) e os PA (2).
B) Nota-se o artefato de
estimulação (normalmente retirado na edição da imagem) (1), o início do potencial (2),
B
A
1
2
1
4
3
2
Excluído: Na fig XXX A,
observa-se, como exemplo, um
traçado contendo a linha de
base (horizontal) e os PA
(traços verticais).¶
xlix
o ponto de maior amplitude (
3) e o término da atividade (4). Para cálculo da amplitude,
foi feita uma média entre as amplitudes dadas por (2-3) e (3-4).
3.8 Drogas e sustâncias químicas utilizadas nos experimentos
eletrofisiológicos.
Droga
Solvente Concentração Fornecedor
Drogas aplicadas ao banho das fatias cerebrais
Ácido quianurênico Etanol 5 mM Tocris
Picrotoxina
Água 0.1 mM Sigma
8pCPT-GMPc Água
50 μM
Sigma
CNQX 0.1 NaOH
10 μM
Sigma
Tabela 1. Drogas utilizadas nos registros de eletrofisiologia in vitro.
Formatado
Formatado
Formatado
Excluído:
Traçados
exemplificando os registros dos
potenciais de ação (configuração
loose patch) e de potenciais de
campo.
Excluído: A Parâmetros dos
registros de potenciais de ação.
Pode se observar, na horizontal, a
linha de base (a). Cada traço
vertical representa o disparo de
um único PA. B Registro de
potencial de campo. Nota-se o
artefato de estimulação
(normalmente retirado na edição
da imagem) (a), o início do
potencial (b), o ponto de maior
amplitude (c) e o término da
atividade (d). Para cálculo da
amplitude, foi feita uma média
entre as amplitudes dadas por (b-
c) e (c-d).
Excluído: Tabela.
l
4. ESTUDO HISTOLÓGICO
4.1 Protocolo para método de Golgi
Para a marcação dos neurônios pelo método de Golgi, foi utilizado protocolo
amplamente divulgado em trabalhos anteriores (Shimono e Tsuji, 1987). Para
diminuir a quantidade de precipitados, o tecido permaneceu sob agitação
constante (mesa agitadora orbital Tecnal TE 141) durante todo o protocolo.
Inicialmente, os animais foram perfundidos com solução de bicromato de potássio
3,5% e Formaldeído 10%, na proporção de 4:1. Após a decapitação, os cerebelos
foram isolados e retirados da caixa craniana. Em seguida, o tecido foi incubado em
solução de Bicromato de Potássio 3% (150ml) + Álcool Etílico 96% (50 ml) + Ácido
Acético (50ml), à 37C, durante 24 horas.
No 2° e 4° dia - A solução foi trocada e mantida por mais dois dias em
temperatura ambiente. Após este procedimento, a solução foi incubada em
Bicromato de Potássio 3% por cinco dias em temperatura ambiente.
No 11° dia de protocolo, as fatias ficaram estabilizando em água bi-destilada
durante o dia e foram lavadas por três vezes também em água bi destilada. Em
seguida, o tecido foi impregnado com Nitrato de Prata 0.5% por uma hora e
mantido por quatro dias no Nitrato de Prata 1%. Em seguida, foi feita nova
lavagem com água bi destilada por três vezes e em seguida impregnação com
Nitrato de Prata 2% por cinco dias. No 20° dia, o tecido permaneceu
estabilizando em água bi destilada durante o dia, sendo lavado também com
li
água bi destilada por três vezes. Ao final do processo, o tecido foi
embebido em
sacarose 20 % por um dia.
Ao final do protocolo, o cerebelo
foi cortado manualmente e as lâminas foram
montadas com Bálsamo do Canadá.
4.2
Quantificação dos neurônios de Purkinje e de seus espinhos dendríticos.
Para realizar a contagem dos NP, foi utilizado o método descrito em estudo
prévio (Dam et al., 1984). De forma breve, o cerebelo de ratos Wistar foram
perfundidos e fixados (salina e paraformaldeido 4%). O cerebelo foi então
dividido em 6 blocos, três de cada hemisfério, por cortes sagitais conforme
ilustrado na fig 8. Fatias com 8-10 μm foram cortadas com um criostato e
coradas com a técnica de Violeta de cresila (Nissl). Os NP nucleados foram
contados utilizando-se um microscópio de luz (Nikon – Eclipse), sob aumento de
400X. A extensão da camada de NP foi medida e a densidade celular calculada.
O microscópio estava conectado a um sistema de vídeo (Sony exwave HAD)
acoplado a um computador PC. O software Image tool (versão 2.0 para
Windows, University of Texas, Center of Health and Sciences. USA), foi utilizado
para a contagem neuronal, assim como para a determinação da extensão do
perímetro da camada celular de Purkinje.
No caso da contagem dos espinhos dendríticos, o procedimento foi o descrito
acima, apenas com o diferencial de um aumento maior no campo (1000 X) e a
marcação pelo método de Golgi (descrita anteriormente) ao invés da coloração
Formatado
Excluído: será
Excluído: tecido
Excluído: ¶
lii
de Nissl. Devido à dificuldade na visualização de determinados espinhos
dendríticos, a contagem foi realizada independente de seus subtipos.
Fig
8 Posição dos cortes sagitais através do cerebelo de ratos Wistar para quantificação
dos NP e de seus espinhos dendríticos. Ambos os hemisférios cerebelares foram
divididos em 3 blocos e fatias de 8-10
μ
m foram coradas pela técnica de Nissl e,
posteriormente, os NP foram quantificados.
5
. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
5.1
Preparação das amostras
Excluído: Fig XXX. Posição dos
cortes sagitais através do cerebelo
de ratos Wistar para quantificação
dos NP e de seus espinhos
dendríticos.
liii
Com o intuito de comparar as concentrações dos principais aminoácidos, foi
utilizada a técnica de HPLC. Para tal, foi seguido protocolo amplamente descrito
na literatura. Os animais foram decapitados e os cerebelos, rapidamente
removidos, pesados, e armazenados a – 80 °C . O tecido foi homogeneizado
(sonicado) numa solução 0.1 M de ácido perclórico (HCLO
4
) contendo 0.02% de
dissulfito de sódio (Na
2
S
2
O
5
), e homoserina (HSER) 10 mg/ml (solução interna
para aminoácidos). Para a homogeneização foi utilizado 15 ml de solução para
cada mg de tecido úmido. As amostras ficaram em repouso durante uma noite
a 0°C para precipitação das proteínas e, posteriormente foram centrifugadas a
11.000 X g durante 50 min. O sobrenadante foi filtrado e submetido a uma
derivatização com o-oftaladeido (OPA) e injetado no HPLC para quantificação
das amostras.
A derivatização dos aminoácidos foi feita dissolvendo-se 27mg de OPA em 1 ml
de metanol, adicionando 5 μl de 2-mercaptoetanol (BME) e 9 ml 0.1 M de
tetraborato de sódio (pH 9.3). Antes da análise das amostras, uma solução foi
preparada diluindo-se 1 ml da solução estoque com 2 ml da solução de
tetraborato de sódio 0.1M. A derivatização pré-coluna se completa reagindo-se
100μl desta solução com 50μl da amostra ou da solução padrão de
aminoácidos, por exatamente 2 min antes da injeção na coluna analítica
(Donzanti et al., 1988).
5.2
Padronização da técnica para análise de aminoácidos
Excluído: ¶
Excluído: e pesados
liv
O sistema de HPLC utilizado consistiu em um modelo isocrático que possui uma
bomba da marca Milton Roy, modelo constametric 3000, um detector de
fluorescência marca Shimadzu RF-10AxL, um injetor de amostras para HPLC
marca Rheodyne mod 7125 com loop de 20 μl, uma coluna RP-18 50 X 4.6 mm
marca Merck chromolith SpeedROD, um degasificador Shimadzu modelo DGU-
4A, um módulo de comunicação Shimadzu CBM-101, um programa de análise
de cromatogramas Shimadzu Class-LC10, acoplado a um microcomputador tipo
PC.
A fase móvel foi constituída por uma mistura de tampão fosfato de sódio 0,04 M
(pH 5,5) com metanol 11,5%. As condições do sistema de HPLC nesse método
foram: fluxo de 1.5 ml por minuto, detecção com excitação de 348 nm e emissão
de 460 nm.
Para estabelecermos o cromatograma padrão, todos os aminoácidos foram
testados (alanina, aspartato, arginina, asparagina, cisteína, fenilanina, GABA,
glutamina, glutamato, glicina, homoserina, histidina, isoleucina, lisina, leucina,
metionina, prolina, serina, taurina, tirosina, treonina, triptofano e valina) e o
tempo de retenção na coluna foi avaliado para cada aminoácido. Desta forma,
pudemos verificar que nas condições empregadas não havia sobreposição de
picos na saída das amostras. Assim a seqüência de aminoácidos que
padronizou este método, por ordem de tempo de retenção, foi o ASP, GLU,
GLN, GLI, TAU e GABA. Foram então feitas soluções estoques contendo ASP,
GLU, GLN, GLI, TAU, ALA e GABA de concentração 1 mg/ml diluídos em ácido
perclórico 0.1M, e a solução de uso foi diluída cem vezes para ser derivatizada.
Excluído: ¶
lv
5.3
Cálculo das concentrações de aminoácidos
As concentrações foram obtidas pela aplicação da fórmula descrita abaixo,
obtendo-se os resultados em nanograma por miligrama de tecido (C):
Onde: h= altura; AAS = aminoácido; [ ] = concentração; A = fator de diluição e B =
diluição OPA.
6
. Análise estatística
Os resultados foram avaliados de acordo com os seguintes testes estatísticos:
ANOVA, teste-T e teste do qui-quadrado. Quando encontramos diferenças
significantes esta análise foi complementada pelo teste Post-hoc de Scheffé. Em
todos os testes fixamos em 5% o nível para rejeição da hipótese nula e
assinalamos com um asterisco os valores significantes nos gráficos e tabelas.
Nas tabelas, o resultado da análise foi apresentado como média ± desvio
padrão
(n), onde “n” é o número de observações.
C =
h
AAS
h
SER
/
h
AAS
h
SER
.
[
]
A
AS .
A
. B
Excluído: ¶
Excluído: ¶
lvi
A organização dos dados obtidos e análise estatística realizou-se mediante o
uso de diferentes programas: EXCEL, SIGMA PLOT (Jandel Scientific),
STATISTICA, MICROCAL ORIGIN 7.0 –Módulo para PCLAMP.
7.
Ética dos procedimentos experimentais
Os protocolos experimentais utilizados neste trabalho foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital São Paulo / Universidade Federal de
São Paulo, CEP N
o
1134/01. Os experimentos conduzidos na University of
Califórnia at Los Angeles, também seguiram os padrões do comitê de ética da
UNIFESP, assim como os critérios do conselho da UC e do National Institute of
Health (NIH). O número de animais utilizados para esse estudo foi reduzido ao
mínimo possível para gerar os resultados de forma segura.
Excluído: ¶
¶
lvii
1. Eletrofisiologia in vitro
A técnica não invasiva de patch clamp loose patch, foi aplicada com o objetivo
de monitorar a geração de PA espontâneos originados no soma de neurônios de
Purkinje, continuamente banhados em antagonistas de GABA
A
, AMPA e cainato.
Quando diretamente visualizados, os neurônios de Purkinje de animais
portadores de epilepsia crônica apresentavam aspecto saudável, sem alterações
morfológicas e demonstrando as mesmas características observadas nas
células de animais controle. Entretanto, os registros in vitro demonstraram
diferenças significativas relacionadas às propriedades de disparo de PA
espontâneos. Devido a uma pequena variação (inerente à técnica) na distância
entre a ponta do micro-eletrodo e o neurônio, a amplitude dos PA dos NP variou
levemente e, portanto, este parâmetro não foi analisado.
lviii
1.1 Neurônios de Purkinje irresponsivos em animais com
epilepsia
Como pode ser observado na tabela 2, grande parte dos neurônios de Purkinje
pertencentes ao grupo com ELT não dispararam PA espontâneos na presença
de 50 μm picrotoxina e 5mM ácido quianurênico. O número de NP responsivos
em camundongos com ELT diferiu significativamente quando comparado ao
grupo controle (Teste-Qui
2
, p< 0.001). Para ser classificado como responsivo,
um dado neurônio deveria manter seu padrão de disparo por um período mínimo
de 5 min. No grupo submetido ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina, a
maioria dos neurônios inicialmente responsivos, não mantiveram o padrão de
disparo de PA espontâneos estável durante o protocolo farmacológico. Este
resultado é contrastante com o obtido em animais controle, cujos NP, na sua
maioria dispararam PA espontâneos que permaneceram estáveis por um
período significativo (ver tabela 2). Nos NP estáveis de ambos os grupos, o
padrão regular de disparo espontâneo de alta freqüência, foi mantido durante o
período de registro aproximado de 50 min.
1.2 A freqüência de disparos dos PA espontâneos não é alterada em
camundongos com epilepsia induzida pela pilocarpina.
Foram observados disparos de espículas simples de PA numa freqüência que
variou entre 36-63 Hz no grupo controle e entre 33-61 Hz no grupo com
epilepsia (tabela 2). A análise estatística não demonstrou diferenças nas
freqüências de disparo entre ambos os grupos. Durante os experimentos, não
lix
foram observados PA em forma de ”burst” ou surto, característicos da ativação
das fibras trepadeiras.
Em poucas células de ambos os grupos foram registrados PA de freqüência
mais elevada que a média, com cerca de 150 Hz, como é mostrado na fig 9.
Entretanto, nenhum desses neurônios manteve o padrão de alta freqüência
estável pelo período mínimo estabelecido (5 min) e foram desconsiderados em
termos estatísticos.
Grupo controle Grupo com ELT
Número de animais 5 7
Células testadas 13 61
Células responsivas 11 (84.6%) 9 * (14.8%)
Células estáveis 7 (53.8%) 5 (8.2%)
ACSF controle
Freqüência média (Hz)
44.9 (9.3) 45.6 (10.5)
8p-CPT-GMPc (50µm)
Freqüência média (Hz)
67.4 (13) 51* (12.5)
lx
Tabela 2. Disparo espontâneo em animais controle e com epilepsia e efeito do
análogo de GMPc, 8p-CPT-GMPc (50µm). * Difere significativamente (p< 0.005)
Fig 9. Traçado representativo do disparo espontâneo de alta freqüência
registrado nos NP. Ambos os traçados correspondem ao mesmo registro,
apresentando uma escala de duração menor no registro inferior. Este padrão foi
observado tanto no grupo controle como em animais experimentais.
1.3 Freqüência de disparo de PA espontâneos em resposta a análogo do GMPc.
Em camundongos controles, a perfusão de 8p-CPT-GMPc (50µm), um análogo
do GMPc, no LCRa por 10 min. induziu um aumento de longa duração na
freqüência de disparo espontâneo de PA. Esta condição de hiper-excitabilidade
foi mantida por um período superior a 20 min após o início da lavagem da droga,
chegando a um pico, com aumento médio de aproximadamente 50% (animais
50 ms
200 ms
50
lxi
controle). Nos animais com ELT também se observou uma potenciação em
resposta ao 8p-CPT-GMPc (50µm). Entretanto, o aumento na freqüência de
disparo foi sutil, conforme pode ser visto na fig. 10 A e B.
Quando os grupos são comparados entre si, após 10 min de perfusão do
análogo de GMPc, observa-se que os camundongos com epilepsia crônica
apresentaram uma resposta significativamente menor que no grupo controle
(Teste-T, duas amostras, p<0.001). O aumento médio na freqüência de disparo
de PA nos animais com ELT foi cerca de 12% em relação à linha de base.
lxii
-10
0
10
20
30
Tempo (min)
1
1.2
1.4
1.6
Freqüência de disparos espontâneos
de potenciais de ação
8p-CPT-cGMP (50µm)
Controle
Pilo
1.8
-10
0
10
20
30
Tempo (min)
1
1.2
1.4
1.6
Freqüência de disparos espontâneos
de potenciais de ação
8p-CPT-cGMP (50µm)
Controle
Pilo
1.8
A
lxiii
Fig 10. Efeito do análogo de GMPc, 8p-CPT-GMPc (50µm) na freqüência de
disparos espontâneos em animais controle e com epilepsia. A) Dados referentes
à média normalizada de disparo de PA espontâneos nos grupos controle
(círculos pretos) e com epilepsia crônica (círculos brancos). Pode-se notar que
após a perfusão da droga há uma diferença significante na potenciação das
respostas entre os grupos. Camundongos com ELT não tiveram um aumento da
freqüência de disparo de PA tão expressivo como observado no grupo controle
(MED ± dp). B) Traçados exemplificando o comportamento de animais controle e
com ELT após 10 min da adição de 8p-CPT-GMPc (50µm) ao LCRa. 1- traçado
obtido previamente à aplicação da droga em animal controle (LCRa regular). 2-
Traçado obtido em animal controle após 10 min de perfusão de 8p-CPT-GMPc
(50µm). Nota-se que os PA estão mais freqüentes no registro 2 quando
comparado ao traçado 1. 3 PA obtidos em animal crônico previamente a
perfusão da droga (LCRa regular). 4 – Registro em animal crônico, após a
adição de 8p-CPT-GMPc. A potenciação dos disparos de PA espontâneos não é
tão expressiva em animais com ELT como o observado em fatias de animais
controle.
B
lxiv
2. Fatias cerebelares horizontais
Registros evocados de potencial de campo são difíceis de serem obtidos no
cerebelo sem a significativa ativação de outros elementos neurais. Esta
dificuldade técnica faz com que os registros extracelulares de campo não sejam
muito utilizados para a investigação da circuitaria cerebelar. Para resolver esta
questão, utilizamos um plano de corte horizontal que até então não havia sido
implementado (fig 11 e 12).
As fatias cerebelares mantiveram resposta estável por longos períodos de até 15
horas, porém, os registros mostrados neste estudo foram obtidos com um tempo
de até 9 h após o término de sua preparação. Para demonstrar o
comportamento dos potenciais de campo nessas fatias foram construídas curvas
de estímulo/resposta – Input/Output (I/O), com duração fixa (pulsos retangulares,
duração de 0.2 ms e intensidade de 30mA) e voltagem variante, como pode ser
observado na fig 13. O valor limiar de voltagem para se obter resposta foi de,
aproximadamente, 5V e as fibras paralelas foram estimuladas até 50V. Com
esta máxima estimulação, foram gravados potenciais de campo com amplitudes
entre 8.63 e 10.08 mV em ratos controle (9.73 ± 0.96 mV [média ± dp]).
Potenciais de campo evocados no grupo controle foram comparados aos grupos
latente e crônico. Com parâmetros de 0.2 ms, 30 mA e 50V de estimulação,
lxv
animais na fase latente e crônica do modelo de ELT apresentaram médias de
potenciais de campo com menor valor que o observado no grupo controle
(ANOVA, IC = 95%, ver fig 14).
A duração destes potenciais também foi analisada nos três grupos (ver fig 15).
Os valores médios obtidos foram (em ms): grupo controle 4.07 ± 0.53; latente
4.15 ± 0.54; crônico 3.58 ± 0.71. A análise estatística (ANOVA IC = 95%,
p=0.29) não demonstrou haver diferenças significativas. Como pode ser
observado na fig 16, os valores para o limiar da resposta extracelular não
variaram entre os três grupos (ANOVA, p=0.16). Observou-se uma média (em
mV, ± dp) de 6,8 ± 2,2 nos animais controle, 6,8 ± 1,7 no grupo latente e 9,2 ±
2,2.
Para a obtenção dos registros intracelulares, os NP foram empalados e após 20-
30 min, o que foi considerado como período de estabilização, os registros se
mantiveram constante, tendo seu potencial de repouso em torno de -65mV,
como pode ser observado na fig 12 B.
Com o intuito de demonstrar que as sinapses entre as fibras paralelas e os
dendritos dos NP permaneceram preservados, 6-ciano-7-nitro-quinoxalina-2,3-
dione (CNQX), foi adicionado ao LCRa. Conforme mostrado na fig 17, após 15
min de perfusão de 10μM CNQX, houve uma diminuição da amplitude do
potencial de campo.
lxvi
Fig 11. Fatias horizontais do cerebelo. Visão da fatia cerebelar contendo o
Vérmis e ambos os hemisférios observados sob um microscópio de luz num
aumento de 100X, coloração de Nissl (A). As três camadas do córtex cerebelar
podem ser claramente distinguíveis. Camada molecular (ML), camada das
células de Purkinje (PC) e camada granular (GL), vistas sob microscopia de luz,
aumento de 200X.
2mV
5 ms
20 mV
10 ms
2mV
5 ms
20 mV
10 ms
A
B
A B
lxvii
Fig12. Registro eletrofisiológico em fatia cerebelar horizontal: potencial de
campo e registro intracelular de PA. Registros in vitro obtidos em resposta a
estimulação das fibras paralelas. Potencial extracelular de campo (A), espícula
simples registrada no soma dos NP (B).
Fig 13. Gráfico do tipo Input-Output mostrando os registros de potenciais de
campo. O potencial de campo nas fatias cerebelares horizontais tem
comportamento semelhante ao observado em outros estudos, demonstrando
que a resposta é voltagem-dependente, tendo maior amplitude conforme o
aumento da estimulação (duração do estímulo = 0.2 ms. Média ± dp).
0 1020304050
0
2
4
6
8
10
Amplitude (mV)
Estimulo (V)
0 1020304050
0
2
4
6
8
10
Amplitude (mV)
Estimulo (V)
Controle Latente Crônico
5,0
7,5
10,0
Controle Latente Crônico
5,0
7,5
10,0
A
m
p
l
i
t
u
d
e
(
m
V
)
Estímulo
*
lxviii
Fig 14. Amplitude do potencial de campo nos grupos controle, latente e com
epilepsia crônica.
* A resposta extracelular (média ± dp) foi significativamente
menor nos animais com ELT (ANOVA, IC = 95%).
Fig 15. Duração do potencial de campo nos grupos controle, latente e com
epilepsia crônica. A duração dos potenciais de campo foi similar nos três grupos.
Não foi observada significância estatística (méd ± dp, ANOVA).
Controle Latente Cronico
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Duracao (ms)
CrônicoLatenteControle
Duração (ms )
lxix
Controle Latente Cronico
2
4
6
8
10
12
Amplitude (mV)
Fig 16. Limiar para obtenção dos registros de potenciais de campo. Os valores
obtidos para o limiar do potencial de campo foram semelhantes nos grupos
controle, latente e crônico (Méd ± dp, ANOVA, IC = 95%).
Fig 17. Traçados sobrepostos do potencial de campo na camada de NP.
Pode-se observar o potencial de campo com LCRa controle (traçado preto) e
sobreposto, o registro após 15 min de perfusão de 10μM CNQX (traçado cinza).
O bloqueio da transmissão glutamatérgica mediada por receptores tipo
AMPA/cainato é responsável pela diminuição de amplitude. Barra de escala
vertical = 2mV, escala horizontal = 4ms.
3. Perda Neuronal
Crônico
lxx
A contagem de células de Purkinje no cerebelo foi realizada com o intuito de verificar
os efeitos da ELT sobre estas. Não foi observada diferença entre os hemisférios
cerebelares em nenhum dos grupos estudados.
Em ratos controle, foi observada uma densidade celular média (± dp) de 15.03 ± 0.72
cel/mm. Todos os demais grupos variaram significativamente em relação ao controle
(ANOVA, IC 95%), conforme mostra a fig 18. Na fig 19-A, podemos ver a camada
celular de Purkinje com a sua densidade normal, formando um cinturão compacto,
sem espaços significativos entre os neurônios.
Nos ratos estudados durante a fase latente do modelo, foi observada uma
discreta perda neuronal na camada de Purkinje (ver tabela 3 e fig 19-B). A morte
celular pode ser vista na forma de “clusters” e espaços vazios estão presentes
ao longo da camada. Nestes animais a densidade dos NP variou entre 11.5 e
13.2 células/mm. Neste grupo, a perda neuronal foi significativamente maior que
a observada em animais controle (ANOVA, IC 95%, p = 0.00032). Também foi
obtida significância entre este grupo e os demais grupos experimentais (latente-
crônico p = 0,0028; latente-idoso p = 0,00165; latente-idoso crônico p =
0,00002).
A perda dos NP foi ainda mais acentuada nos ratos adultos jovens com ELT, com uma
média (dp) de 9.97 (± 0.58) cel/mm, conforme a indicado na tabela 3. Este grupo teve
morte neuronal significativamente maior que os animais controle (ANOVA, IC 95%, p
= 0,0028) assim como os experimentais estudados ainda na fase latente (ANOVA, IC
95%, p = 0,00032) e idosos com ELT (p = 0,020). Entretanto, não foi observada
variação estatística em relação ao grupo idoso (ANOVA, IC 95%, p = 0,759).
lxxi
Ratos Wistar idosos (entre 12 e 15 meses) apresentaram uma expressiva perda dos
neurônios de Purkinje, confirmando a hipótese destas células serem susceptíveis aos
efeitos do envelhecimento. A média de NP foi de 10.09 ± 0.86 células/mm. Esse
resultado foi estatisticamente semelhante ao grupo crônico. Quando comparado aos
demais grupos, foram obtidos os seguintes valores de p: idoso-controle = 0.00012;
Idoso-latente =0, 0051; idoso-crônico adulto jovem = 0,76 e idoso-idoso crônico =
0,020.
Entre os animais idosos (12-23 meses) com ELT observamos que todos
apresentaram significativa perda dos NP. Este grupo apresentou a mais
expressiva morte celular conforme pode ser observado na tabela 3 e na fig 18. O
número de NP variou entre 7,06 e 9,01células/mm. Houve diferença significativa
(descrita acima) em relação a todos os demais grupos.
Grupo (n) Neurônios / mm
(Média ± DP)
Idade (meses) mm contados
Controle (5)
15.03 ± 0.72
2-3 520
Latente (5)
12.40 ± 0.67 ∗
2-3 515
Crônico (5)
9.97 ± 0.58 ∗∗
4 491
Idoso (3)
10.09 ± 0.86 ∗∗
12-15 612
Idoso Crônico (6)
8.36 ± 0.94 ∗∗∗
12-23 590
lxxii
Tabela 3. Densidade dos neurônios de Purkinje nos diferentes grupos
estudados. * Difere significativamente do grupo controle; ** difere
significativamente dos grupos controle e latente; *** difere significativamente do
grupo controle, latente, crônico e idoso.
.
Latente Crônico Idoso Idoso cro
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% do controle
Latente Crônico Idoso Idoso cro
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% do controle
*
**
**
***
Latente Crônico Idoso Idoso cro
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% do controle
Latente Crônico Idoso Idoso cro
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% do controle
*
**
**
***
lxxiii
Fig 18. Gráfico ilustrando a morte dos neurônios de Purkinje nos diferentes
grupos. Todos os grupos diferem significativamente dos animais controle (p <
0.05).* Difere significativamente do grupo controle; ** difere significativamente
dos grupos controle e latente; *** difere significativamente do grupo controle,
latente, crônico e idoso.
Fig 19 Neurônios de Purkinje em ratos Wistar controle e com epilepsia do lobo
temporal. Os neurônios de Purkinje podem ser claramente observados sob
microscopia óptica, aumento de 200x. No grupo controle (A), essa camada
celular apresenta uma densidade regular, compactada. Os neurônios estão
perfeitamente dispostos, formando um cinturão entre a camada granular e a
molecular. Nos animais com epilepsia crônica (B) as setas indicam os neurônios
de Purkinje remanescentes. Pode se notar um grande espaçamento entre as
células.
4. Densidade de espinhos dendríticos nos neurônios de Purkinje
Os espinhos dendríticos dos NP localizados nos segmentos terminais foram
quantificados nos grupos: controle e adulto jovem com ELT. No grupo controle
foi observada uma densidade média (dp) de 1.65 ± 0.53 espinhos /10
micrômetros. Nos animais com ELT a média equivaleu a 1.36 ± 0.40células/10
A
B
lxxiv
micrômetros. Não foi observada alteração significativa do número de espinhos
dendríticos conforme indicado na fig 20.
Fig 20. Densidade de espinhos dendríticos nos NP. Os grupos não diferem
estatisticamente (ANOVA, IC = 95%, p = 0.36).
5. Dosagens de aminoácidos
Controle Crônico
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Densidade de espinhos dendriticos dos NP
(media/10micras)
Controle Crônico
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Densidade de espinhos dendriticos dos NP
(media/10micras)
lxxv
Através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), foram
quantificados os níveis de aminoácidos presentes no cerebelo durante as fases
aguda e crônica do modelo de ELT induzido pela pilocarpina assim como em
ratos controle. Conforme mostrado na fig 21 e na tabela 4, pode-se observar
alterações significativas durante a fase aguda assim como na fase crônica do
modelo.
Os valores absolutos, referentes às concentrações de aminoácidos obtidas nos
grupos controle, agudo e crônico podem ser observadas na tabela 4. No grupo
agudo, ocorreu aumento da concentração dos aminoácidos ASP, GLU, TAU e
de GABA. Por outro lado, não houve variação significativa nas concentrações
dos demais aminoácidos: GLN e GLI (ANOVA, IC = 95%).
De forma contrastante, no grupo crônico, foi observada uma diminuição
significante na concentração de todos os aminoácidos testados.
Tabela 4. Comparação dos valores absolutos de aminoácidos dosados no
cerebelo de ratos controle e experimentais. As concentrações estão
representadas em nM/g de tecido úmido (média ± dp). Significância estatística
Aminoácidos Controle
(n = 9; méd ± dp).
Agudo
(n = 6; méd ± dp).
Crônico
(n = 10; med ± dp).
ASP
3351.83 ± 259.42
4211.5 ± 278.76 * 2100.73 ± 77.07**
GLU
9760.97 ± 532.52
10799.83 ± 811.63 * 6281.16 ± 901.55**
GLI
6546.2 ± 318.76
7387.09 ± 929.55 4699.58 ± 759.27**
GLN
1684.9 ± 346.99
1749.98 ± 388.55 1003.3 ± 318.12**
TAU
5260.36 ± 664.77
6712.44 ± 964.10 * 3196.25 ± 443.27**
GABA
2357.80 ± 207.14
2583.58 ± 224.47 * 1360.75 ± 293.45**
lxxvi
dada pela ANOVA, IC = 95%. * Difere somente do controle; ** difere do controle
e do agudo.
Fig 21. Alterações nas concentrações de aminoácidos no cerebelo de ratos
submetidos às fases aguda e crônica do modelo de ELT induzido pela
pilocarpina. Significância estatística dada pela ANOVA, IC = 95%. * Difere
somente do controle; ** difere do controle e do agudo.
Nossos resultados sugerem que a ELT induzida pelo modelo da pilocarpina gera lesão,
dano e disfunção no cerebelo de roedores. Esta conclusão está embasada em nossos
experimentos utilizando diferentes técnicas como os registros eletrofisiológicos,
abordagem neuroquímica (HPLC), e protocolos anatômicos.
Através dos registros tipo patch clamp, foram observadas alterações nas propriedades de
disparo espontâneo de PA nos NP de camundongos com ELT.
ASP GLU GLN GLI TAU GABA
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Controle
Agudo
Cronico
Concentração dos aminoácidos (nM/g) de tecido
ASP GLU GLN GLI TAU GABA
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Controle
Agudo
Cronico
Concentração dos aminoácidos (nM/g) de tecido
**
*
**
*
*
*
**
**
**
**
ASP GLU GLN GLI TAU GABA
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Controle
Agudo
Cronico
Concentração dos aminoácidos (nM/g) de tecido
ASP GLU GLN GLI TAU GABA
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Controle
Agudo
Cronico
Concentração dos aminoácidos (nM/g) de tecido
**
*
**
*
*
*
**
**
**
**
Controle
Agudo
Crônico
lxxvii
Nesse sentido, observamos que nos animais com epilepsia induzida pela pilocarpina, um
número significativo de NP não apresentou disparo espontâneo de PA. Quando
diretamente visualizados esses neurônios tinham as mesmas características morfológicas
amplamente conhecidas: células grandes e piriniformes, distribuídas em uma camada
bem definida, criando um cordão celular entre as camadas molecular e granular. Ainda
que estas células estejam aparentemente preservadas, a ELT, por algum mecanismo não
completamente compreendido, deve gerar nesses neurônios uma alteração nas correntes
iônicas ou nas propriedades de membrana que impeça a geração dos PA espontâneos.
Os mecanismos biofísicos pelos quais os neurônios disparam PA de forma
espontânea ainda não são plenamente conhecidos. Recentemente, foi sugerido
que o primeiro nódulo de Ranvier seria o local de deflagração (Clark et al.,
2005). Entretanto, é sabido que para sustentar esta atividade, as correntes
intrínsecas devem interagir para despolarizar a membrana celular até o limiar,
gerar um PA, e em seguida repolarizá-la novamente até potenciais negativos,
possibilitando que a próxima espícula possa ser deflagrada. No caso de
neurônios como os de Purkinje, que apresentam altas freqüências de disparo, a
disponibilidade dos canais de sódio tem um papel importante. Nesses tipos de
neurônios, a recuperação após o disparo de um potencial deve ser rápida o
bastante para compensar o período de inativação. Esta questão é ao menos
parcialmente resolvida pela ação dos canais de Na
+
possuidores da chamada
“cinética ressurgente” (Raman e Bean, 1997). Com a despolarização, esses
canais de Na
+
dependentes de voltagem sensíveis a tetrodotoxina, abrem-se
brevemente e então se tornam bloqueados. Este bloqueio, feito por proteína
lxxviii
endógena, não somente limita a inativação através da competição pelo sistema
de inativação rápida, como também se desacopla rapidamente em potenciais
negativos. Conseqüentemente, as correntes de Na
+
ressurgentes fluem
brevemente enquanto o canal abre com a repolarização. Os canais então,
passam a estar fechados e podem ser reativados rapidamente diminuindo o
período refratário e facilitando o disparo de potenciais espontâneos de alta
freqüência (Raman e Bean, 2001; Grieco et al., 2002; Khaliq et al., 2003).
É estabelecido que os NP disparam PA espontâneos em alta freqüência quando
expostos a antagonistas de GABA
A
, e de receptores tipo AMPA/cainato. Em
nosso estudo com o grupo controle, observamos a presença desses potenciais
espontâneos em uma grande porcentagem de NP. Esse dado está de acordo
com estudos prévios nos quais a atividade espontânea foi registrada em todas
as células de Purkinje testadas provenientes de animais controle (Raman e
Bean, 1999) ou em cerca de 90% delas (Smith e Otis, 2003).
Em uma outra série de experimentos com registros do tipo patch clamp, a
aplicação de doadores de NO nos animais com epilepsia, resultou em uma sutil
potenciação da freqüência de disparo. Por outro lado, este aumento foi
significativamente menor que o observado no grupo controle. Sabe-se que
doadores de NO podem induzir uma potenciação de longo prazo na freqüência
de disparo de PA espontâneos (Smith e Otis, 2003). Esses resultados foram
reproduzidos no grupo controle, onde foi observado um aumento na freqüência
de até 50% de disparo de PA durante o pico máximo. É sabido que a elevação
da concentração de GMPc poderia agir em 3 diferentes áreas: modulando as
lxxix
concentrações de AMPc, abrindo os canais tipo CNG (importantes na retina e no
sistema olfatório) e ativando as proteínas quinases (Hofmann et al., 2000).
Estes, por sua vez, atuariam na cascata de NO-GMPc, induzindo aumento na
freqüência de disparos. Foi demonstrado, também, que a ativação da PKG
aumenta a probabilidade de abertura do canal e esta modificação tende a
aumentar a excitabilidade, gerando um maior número de PAs em reposta a uma
dada injeção de corrente (Klyachko et al., 2001). Para se obter aumento na
freqüência de disparos espontâneos, é necessário que as condutâncias iônicas
estejam alteradas na membrana celular. Para tal, dois canais são fortes
candidatos: os canais de K
+
(BK) ativados por alta condutância de Ca
2+
e os
canais ressurgentes de Na
+
(Smith e Otis, 2003).
Investigações utilizando diferentes modelos vem demonstrando diminuição e até
desaparecimento dos níveis cerebelares de GMPc. Utilizando o modelo “nervous
mutant mice” que apresenta perda genética dos NP, Mao et al., (1975)
observaram o desaparecimento do GMPc no cerebelo. Neste sentido, um
estudo experimental posterior, com o modelo do ácido caínico, também mostrou
uma queda brusca nos níveis de GMP cíclico (Biggio et al., 1978). Uma hipótese
a ser considerada seria que um efeito semelhante poderia ocorrer no cerebelo
de animais submetidos ao modelo de ELT induzida pela pilocarpina, o que
responderia pela baixa potenciação dos PA de animais com epilepsia na
presença de análogos de GMPc. Esse resultado sugere que a epilepsia do lobo
temporal induzida pela pilocarpina promova alterações nas funções de 2º
mensageiros nos NP, comprometendo sua atividade.
Entretanto, quando consideramos a freqüência de disparo dos poucos NP
pertencentes ao grupo com ELT que foram registrados com sucesso, não
observamos diferença em relação ao grupo controle. Em LCRa regular, ambos
os grupos demonstram alta freqüência de disparo espontâneo de PA in vitro. Foi
observada nos NP (dos grupos controle e experimental crônico) uma variação de
disparo aproximada entre 30 e 60 Hz. Estes resultados estão de acordo com
investigações preliminares onde a freqüências de disparo vaiaram entre 40-50
Hz (Häusser e Clark, 1997; Womack e Khodakhah, 2002), valores muito
próximos aos registrados em nosso estudo.
Devido à estrutura da circuitaria cerebelar e as complicações decorrentes para
se conseguir a estimulação das fibras desejadas sem a ativação significativa de
lxxx
outros elementos neurais, o estudo eletrofisiológico in vitro vem sendo feito
principalmente com técnicas de patch clamp.
Para tentar viabilizar o registro in vitro dos potenciais de campo, desenvolvemos
um novo plano de corte do tecido. Numa fatia de corte sagital, que é
amplamente utilizada, as fibras paralelas ficam bastante reduzidas. Em
contrapartida, toda a extensão dos dendritos dos NP está preservada. Por outro
lado, ao cortar o tecido no plano horizontal, todo o comprimento das fibras
paralelas, cerca de 1.5 mm, é preservado. Entretanto, inevitavelmente, parte da
arborização dendrítica é perdida, comprometendo as sinapses entre as fibras
paralelas e os NP. É sabido que esta transmissão é mediada, principalmente,
através de receptores do tipo AMPA e cainato. A preservação destas sinapses
em fatias cerebelares horizontais foi comprovada em nosso estudo pela adição
de 10 μM CNQX ao LCRa. A imediata diminuição da amplitude dos potenciais de
campo indica o bloqueio da transmissão nessas sinapses e sua conseqüente
preservação nas fatias cerebelares horizontais.
Para complementar os estudos com a técnica de patch clamp, registros
extracelulares de campo foram comparados entre os três grupos: controle,
latente e com epilepsia crônica. Foi observado que animais com epilepsia
apresentavam uma amplitude significativamente menor em relação ao grupo
controle. Porém os valores para o limiar e a duração do potencial de campo não
variaram significativamente. Esses resultados eram esperados devido à prévia
observação da morte dos NP no modelo de ELT induzida pela pilocarpina. Os
registros de potencial de campo são uma referência do número de neurônios
que estão disparando PA na área adjacente ao microeletrodo. Uma densidade
celular menor geraria uma diminuição na amplitude da espícula extracelular.
Esses dados complementam estudos prévios no modelo de ELT induzido pela
pilocarpina (Sanabria, 1999). Nesta investigação foi verificada a perda celular no
hipocampo de animais com ELT crônica, que também apresentavam uma menor
amplitude do potencial de campo. Entretanto, ao contrário do que é vastamente
notado em fatias hipocampais, não foi observada a presença de espículas
recorrentes no córtex cerebelar. Esses potenciais com espículas recorrentes
lxxxi
caracterizam áreas associadas ao foco epileptogênico tanto em modelos
animais como em pacientes com ELT e o cerebelo, mesmo lesado, parece não
os apresentar. Esse resultado era esperado uma vez que o cerebelo é rico em
transmissão sináptica inibitória, principalmente mediada por receptores
GABAérgicos.
Em uma segunda série de experimentos utilizamos a técnica de cromatografia
líquida de alta eficiência, HPLC, para o estudo neuroquímico do cerebelo. A
análise da concentração dos aminoácidos durante o período agudo do modelo
demonstrou um aumento na concentração de ASP e GLU, TAU e GABA. De
maneira contrastante, na fase crônica observamos uma redução de todos os
aminoácidos testados. Os resultados (em valores absolutos) obtidos no grupo
controle estão de acordo com aqueles já descritos em estudo anterior (Eloqayli
et al., 2003).
Estudo prévio do nosso grupo, efetuado no hipocampo de ratos submetidos ao
modelo de ELT induzido pela pilocarpina (Cavalheiro et al., 1994), mostrou uma
diminuição da concentração dos níveis de ASP e GLU associados com um
aumento de GABA na fase aguda do modelo. A diminuição da concentração dos
aminoácidos foi considerada como indicação do aumento de liberação destes
neurotransmissores, responsáveis pela geração do status epilepticus
(Cavalheiro et al., 1994). No período crônico, caracterizado pelas crises
espontâneas e recorrentes, todos os aminoácidos testados (ASP, GLU, GLN,
GLI e GABA) tiveram sua concentração aumentada.
De forma contrastante ao hipocampo, observamos no cerebelo um aumento na
concentração dos aminoácidos ASP e GLU durante a fase aguda do modelo. O
GABA também aumentou sua concentração, porém este resultado está de
acordo com o observado no hipocampo. Podemos interpretar este aumento nas
concentrações dos aminoácidos excitatórios e inibitórios como um aumento na
produção desses neurotransmissores. Outra possibilidade é a redução da
liberação sináptica durante o SE. Este fenômeno estaria provavelmente
relacionado a uma tentativa de conter a hiper-excitabilidade desencadeada pela
pilocarpina em estruturas límbicas.
lxxxii
Durante a fase crônica, caracterizada pela presença de crises espontâneas e
recorrentes, todos os aminoácidos tiveram diminuição de concentração no
cerebelo, sugerindo um aumento na liberação ou redução de síntese desses
aminoácidos. Este quadro é exatamente o oposto ao previamente observado na
fase aguda, mostrando que durante o SE ou durante o período crises
espontâneas vias diferentes de ativação e inibição cerebelares são ativadas.
As células granulares do cerebelo, predominantemente glutamatérgicas fazem
sinapse com as células de Purkinje, que são predominantemente GABAérgicas.
Conforme já discutido, a fase crônica é caracterizada por uma expressiva morte
das NP. Como esses neurônios possuem um papel de destaque na circuitaria
cerebelar, esta perda neuronal comprometeria significativamente a via
GABAérgica. Entretanto, os NP sobreviventes podem ter um aumento na
liberação de GABA, na tentativa de conter a excitação, o que justificaria os
níveis de GABA diminuídos. As células granulares projetam seus axônios (fibras
paralelas) em direção aos dendritos dos NP. No caso de morte dos NP, as fibras
paralelas não encontram seu alvo o que pode induzir a morte das células
granulares (Selimi et al. 2000). Além disso, uma diminuição dos níveis de GLU
no cerebelo também pode significar um aumento da liberação desse
neurotransmissor. De forma complementar, é possível ainda que haja uma
proliferação das células da glia, que captam GLU da fenda sináptica e o
transformam em GLN, que de volta ao neurônio seria transformado em mais
GLU e esse seria então liberado, ativando assim os NP e conseqüentemente a
liberação de GABA. Entretanto, a dosagem desses aminoácidos na fase
lxxxiii
silenciosa do modelo poderá vir a dar indicações importantes de como e quando
a liberação de ASP e GLU ocorreram de modo a promover excitotoxidade e a
morte de NP. Essa fase do trabalho já está em andamento.
De qualquer forma, esses resultados refletem diferenças importantes nas
funções exercidas pelas áreas hipocampais e cerebelares durante o
desenvolvimento da ELT. O hipocampo é considerado como uma área de
gênese da atividade epiléptica, enquanto o cerebelo atuaria como um agente
inibitório, devido à riqueza de suas conexões GABAérgicas.
Posteriormente, realizamos uma investigação anatômica do cerebelo. A análise
da morfologia cerebelar em nosso estudo demonstrou que o SE induzido pela
pilocarpina, resulta na morte dos NP. Durante a fase latente do modelo foi
observada perda desses neurônios, a qual foi agravada no período crônico do
modelo, onde há crises espontâneas e recorrentes. O efeito do envelhecimento
também foi observado e mostrou ser um indutor de morte neuronal no cerebelo,
a qual, é significativamente potencializada quando associada à epilepsia.
A perda celular inicial poderia ser causada pela excitotoxidade e anóxia,
resultante das 6 h contínuas de SE a que esses animais foram submetidos. Este
evento seria então agravado na fase crônica do modelo, aonde ocorrem crises
espontâneas e recorrentes. A partir deste período os animais poderiam começar
um ciclo de déficits dos mecanismos de inibição GABAérgica. O sutil decaimento
do número de NP após o SE levaria a um leve prejuízo da capacidade de
inibição do cerebelo. A partir desse momento cada crise teria uma facilidade
maior de propagação com maior intensidade, lesando mais NP e
comprometendo ainda mais a capacidade de extinção das crises espontâneas e
recorrentes.
Além disso, estudos experimentais e em seres humanos têm demonstrado que
os NP são bastante vulneráveis aos efeitos do envelhecimento (Pentney, 1986;
Dlugos e Pentney, 1994; Woldenberg et al., 1993; Woodruff-Pak e Trojannowski,
1996). O envelhecimento em humanos começa a induzir perda de NP somente
em indivíduos acima de 60 anos (Woodruff-Pak e Trojanowski, 1996), porém
este fenômeno pode ser observado em roedores com 12 meses de idade
(Rogers et al., 1984). Investigamos a densidade dos NP em animais idosos e,
sobretudo, quando a epilepsia estava associada ao envelhecimento. Nossos
lxxxiv
resultados corroboraram trabalhos prévios indicando a morte de um grande
número de NP em roedores idosos, com idade superior a 12 meses.
O grupo formado por animais idosos com ELT obteve a mais expressiva morte
neuronal entre todos os grupos, tendo sido observada em todos os animais que
compuseram esse grupo. Este resultado era previsível, visto que esses animais
acumularam os efeitos induzidos pelo status epilepticus, pelas crises
espontâneas recorrentes e pelo envelhecimento.
A morte dos NP é uma das principais características de dano na circuitaria
cerebelar seja induzido pelas epilepsias, crises ou demais fatores. Tem sido
observado que este fenômeno pode ocorrer geneticamente em diversos
modelos de camundongos como nervous (nr/nr), leaner (Cacna1ala/la) (Zanjani
et al., 2004) e toppler (Duchala et al., 2004) ou ainda em ratos CC (Ando et al.,
2004). Também pode ser observado mediante a aplicação de ácido caínico,
sugerindo que diferentes mecanismos podem gerar dano às células de Purkinje,
(Herdon e Coyle, 1977; Biggio et al., 1978).
A morte dos NP pode acarretar também em alterações nas células granulares. É
bem estabelecido que a população destas células seja regulada pelos NP e
quando ocorre a sua morte, as células granulares diminuem proporcionalmente
o seu número. Tem sido especulado que esse fenômeno possa ocorrer por duas
vias: pela indução direta de morte celular através da remoção de fatores tróficos
ou pela inibição da mitose (Goldowitz e Hamre, 1998).
De forma complementar à contagem neuronal, estudamos também a densidade
dos espinhos dendríticos localizados nos NP. A quantificação dos espinhos
dendríticos foi realizada com o intuito de verificar possíveis alterações
decorrentes da indução da epilepsia. O método de marcação neuronal utilizado
neste trabalho e desenvolvido por Camilo Golgi, é classicamente utilizado para
visualização dos dendritos desde a primeira descrição feita por Ramon y Cajal
(1888), de acordo com Lee et al., (2004). Não observamos alteração significativa
na densidade de espinhos dendríticos terminais dos NP, porém, vale a pena
ressaltar que não procedemos à caracterização de seus subtipos. A perda dos
espinhos dendríticos nos NP ocorre devido à ausência das sinapses com as
fibras paralelas. Com a morte dos NP, as células granulares, cujos axônios
formam as fibras paralelas, perdem seu alvo e conseqüentemente também
podem morrer.
lxxxv
Os espinhos dendríticos têm uma capacidade de recuperação relativamente
rápida quando expostos a diferentes condições. Esta poderia ser uma hipótese
para explicar nosso resultado, e neste caso, as crises recorrentes que estão
sempre presentes, não teriam influência ou esta seria apenas secundária.
Recentemente, vêm sendo desenvolvidos alguns modelos de camundongos
mutantes com diferentes tipos de alteração cerebelar. A disfunção ou morte dos
NP parece ser uma condição se não necessária, ao menos uma característica
importante para o aparecimento de epilepsia nesses modelos. Nesse sentido
podemos observar a freqüente combinação entre ataxia e epilepsia em
camundongos mutantes (Fletcher et al., 1996; Barclay et al., 2001; Ivanov et al.,
2001). Até recentemente, sete mutações diferentes em camundongos
apresentam ataxia associada à epilepsia de ausência (tottering, leaner, rolling
Nagoya, rocker, lethargic, ducky e stargazer). O modelo leaner (Fletcher et al.,
1996) apresenta epilepsia associada a uma dramática diminuição na ativação de
correntes de Ca
2+
tipo P nos NP (Dove et al., 2000). Estas correntes são
responsáveis por 90% do fluxo de Ca
2+
nos NP e possuem funções importantes
como o controle da excitabilidade (Dove et al., 1998). No modelo de
neurodegeneração em camundongos Lurcher, ocorre à morte de praticamente
todos os NP. Estudo conduzido por Zuo et al., (1997) utilizando esse modelo
identificou uma mutação no gen δ2 para os receptores glutamatérgicos como
responsável pela morte dos NP. Como conseqüência da mutação, os receptores
glutamatérgicos formados permanecem ativos por um período maior permitindo
um influxo exagerado de cálcio, gerando excitotoxidade e perda neuronal. Como
um mecanismo subseqüente à perda do input GABAérgico nos NP, os neurônios
dos núcleos cerebelares profundos têm sua condutância sináptica aumentada
neste modelo (Linnemann, 2003).
Ao analisarmos nossos resultados em conjunto, estes demonstram diferentes
graus de lesão e alteração cerebelar induzidos exclusivamente pela ELT.
Conforme mostramos indícios de que o envelhecimento per se também teria
esta capacidade, esta conclusão não invalidaria as evidências de morte de NP
por intoxicação pela fenitoína e outros agentes. Entretanto sugerimos que a
epilepsia per se seja o principal responsável pelos danos ao cerebelo, que seria
agravado conforme o aumento da intensidade e freqüência das crises.
Crises recorrentes podem induzir lesão no tecido nervoso e os danos foram
inicialmente observados experimentalmente no hipocampo (Sommer, 1880). O
termo excitotoxidade é atribuído a liberação exagerada de glutamato durante as
crises e induz a uma hiper-expressão dos receptores glutamatérgicos. Em
desordens do sistema nervoso central, como nas epilepsias, é estabelecido que
lxxxvi
a excitotoxidade tenha um papel importante na morte celular (Aarts e Tymianski,
2003). Ocorre então um influxo de altas concentrações de Ca
2+
que ativa uma
cascata envolvendo enzimas de Ca
2+
dependentes (fosfatases, proteases e
lípases). A oxidação de lipídeos também pode levar a produção de radicais livres
e conseqüente morte neuronal. O padrão de morte celular foi inicialmente
identificado como necrose, porém recentemente há indícios de que a apoptose
também possa atuar. Os NP recebem aferências excitatórias tanto das fibras
paralelas quanto das fibras trepadeiras. No caso de uma descarga epiléptica,
essas sinapses poderiam liberar uma quantidade excessiva de glutamato
induzindo a morte dos NP. Este mecanismo de lesão não seria difícil de ser
previsto uma vez que cada NP possui múltiplas sinapses excitatórias com cada
fibra trepadeira e também é excitado em pontos mais específicos por diversas
fibras paralelas.
Assim como os mecanismos de excitotoxidade tem comprovada ação lesiva nas áreas
hipocampais, o mesmo deve acontecer no cerebelo. Pacientes submetidos a esta condição
poderiam perder a capacidade de inibição das crises. Isto explicaria os resultados
controversos que levaram a não utilização da estimulação cerebelar para controle das
epilepsias. Podemos sugerir a hipótese de que pacientes com ELT, durante as crises
iniciais, não apresentem comprometimento da circuitaria cerebelar. Neste sentido seria
interessante estudar os efeitos da estimulação cerebelar nesse grupo.
Grande parte dos aspectos abordados no decorrer desta investigação faz
referência à perda do tênue equilíbrio entre os níveis de excitação e inibição no
SNC desencadeados pela epilepsia. Esta condição reflete o comprometimento
de uma característica fundamental para o desenvolvimento dos seres vivos: a
manutenção da homeostase.
lxxxvii
Sistemas homeostáticos podem manter um contínuo balanço interno através de
reações específicas a cada mudança no ambiente. Esta capacidade
compensatória é necessária para o desenvolvimento de sistemas complexos
(Mody, 2004). Os resultados obtidos nesse estudo sugerem que no modelo de
ELT induzido pela pilocarpina, haja uma quebra da homeostase GABAérgica no
cerebelo. A significativa morte dos NP deve levar a um déficit na produção de
GABA. Soma-se a isso o mau funcionamento de alguns neurônios que apesar
de estarem preservados não disparavam PA e conseqüentemente não exercem
qualquer influência inibitória.
Seguindo um mecanismo de feedback, distúrbios na homeostase permitem uma
resposta através da regulação da freqüência de disparo de PA (Stemmler e
Koch, 1999). Conforme demonstrado nos resultados, esse mecanismo de ação
poderia não estar sendo acionado nos animais com ELT. Para a compreensão
das anormalidades que poderiam estar ocorrendo é necessário primeiro abordar
os mecanismos responsáveis pela manutenção da homeostase. Frente a uma
mudança no estímulo de entrada (input), os neurônios poderiam atuar alterando
as propriedades das condutâncias tipo voltagem-dependentes ou ajustar a
transmissão sináptica, controlando o número e as propriedades de
neurotransmissores e receptores (Turrigiano e Nelson, 2000). Os ajustes nas
condutâncias de canais voltagem-dependentes são geralmente chamados de
“plasticidade intrínseca da homeostase” enquanto o ajuste das sinapses chama-
se “plasticidade sináptica da homeostase” (Turrigiano, 2000). Com os dados
disponíveis não é possível especificar em que nível a ELT estaria agindo sobre a
homeostase GABAérgica. Neste sentido, estudos futuros com a técnica de patch
clamp na configuração whole cell poderiam, através do registro das correntes
iônicas, fornecer maiores indícios. Este será o principal objetivo de nossos
futuros estudos.
lxxxviii
- O modelo de ELT induzido pela pilocarpina provocou diferentes formas de
lesão e dano celular no cerebelo de roedores. Podemos destacar a
significativa morte dos Neurônios de Purkinje, que são indicadores da
viabilidade da circuitaria cerebelar. Os neurônios remanescentes
possuíam alterações nas propriedades de disparo, caracterizadas pela
ausência de potenciais de ação espontâneos e baixa potenciação a
análogos de GMPc.
- Animais idosos também foram avaliados e confirmou-se o resultado de
trabalhos prévios que demonstraram uma importante influência do
envelhecimento nos neurônios de Purkinje. Quando o envelhecimento
estava associado à epilepsia, esses resultados foram ainda mais
expressivos.
- Um foco epiléptico originado em estruturas hipocampais, se propagaria
para o cerebelo gerando uma quebra do estado de homeostase
GABAérgca em animais com ELT. Este quadro levaria a um ciclo aonde
lxxxix
o déficit na inibição facilitaria as crises recorrentes, que por sua vez
atuariam com maior intensidade induzindo dano e lesão às demais
estruturas.
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Due to the exuberance of its inhibitory output toward deep cerebellar nuclei and
extracerebellar structures, the cerebellum has been postulated to act inhibiting
epileptic activity. However, and depending on the intensity and frequency of the
seizures, such inhibitory capacity may be compromised by epilepsy. Epileptic
cx
activity generated in limbic structures could reach the cerebellum, via
anatomically distant but interconnected areas, and induce severe degrees of
damage. This investigation is aimed at to study the physiological and structural
properties of Purkinje neurons (PN) in the model of temporal lobe epilepsy
induced by pilocarpine in rodents.
In the present study, using patch clamp recordings, we show differences in the
spontaneous firing rate pattern of PNs recorded in adult male mice with temporal
lobe epilepsy (TLE). Most PN of this group did not fire spontaneously in the
presence of 50μm picrotoxin and 5mM kynurenic acid. In addition, mice with
epilepsy did not show the same potentiation in spontaneous firing rate in
response to NO donor analog 8p-CPT-cGMP (50µm). In addiction, the
concentrations of main aminoacids were quantified trough HPLC technique. The
concentrations of all aminoacids tested decreased significantly in the chronic
phase of the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. PN loss was also
investigated, the cerebellum of adult male Wistar rats were cut at 8-10 μm,
stained in Nissl preparation and nucleated cells were counted during the silent
and chronic phase of the pilocarpine model of TLE. The status epilepticus per se
was sufficient to induce neuronal loss, which was aggravated after the beginning
of spontaneous recurrent seizures. In addiction, we quantified the dendrite spines
in PNs during the chronic phase of the model, however no alteration in density
was observed.
Taken together, the results showed different levels of alterations and damage to
the cerebellar circuitry. As PNs are considered the main element in cerebellar
cortex this may represent a larger cascade of events in the whole cerebellum
induced by temporal lobe epilepsy.
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