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RONNEY ADRIANO RIBEIRO
CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO DO GENE QUE CODIFICA A
NITRATO REDUTASE EM Colletotrichum lindemuthianum, PATÓGENO DO
FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia Agrícola, para obtenção do título
de “Magister Scientiae”
APROVADA: 28 de agosto de 2006
Prof
a
Elza Fernandes de Araújo Prof
a
Célia Alencar de Moraes
(Co-Orientadora) (Co-orientadora)
Prof
a
Denise Mara Soares Bazzoli Prof
a
Andréa de Oliveira Barros
Ribon
Prof
a
Marisa Vieira de Queiroz
(Orientadora)
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ii
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Aos meus queridos pais, José e Joana,
pelo amor incondicional,
Dedico
iii
AGRADECIMENTOS
Para mim, talvez, esta seja a parte mais importante da tese. Não
consigo imaginar a realização deste trabalho sem o alicerce que tive
durante toda minha graduação e pós-graduação, onde a família, os
professores e amigos foram peças fundamentais.
Por isso agradeço:
Antes de qualquer coisa, a Deus, por não somente ter me dado
habilidades vitoriosas, mas também pela oportunidade de conhecer todas
as pessoas que de alguma forma me ajudaram a crescer e pular obstáculos.
Aos meus pais que sempre estavam presentes, mesmo que não de
corpo presente, nos momentos difícieis dessa história, sempre me apoiando
e confortando.
À Universidade Federal de Viçosa por ter me proporcionado os
melhores anos de minha vida.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
À professora Marisa que mais do que orientadora, foi parte da minha
família durante os cinco anos e meio de convivência.
À professora Elza pelo apoio, confiança, exemplo de trabalho e
competência.
À professora Célia principalmente pelo incentivo, amizade e
confiança.
iv
Às professoras Denise (a nossa eterna Dedê) e Andréa pela
participação na banca de defesa.
Aos demais professores do Departamento de Microbiologia, que
contribuíram para minha formação profissional.
Aos meus amigos funcionários do Bioagro Evandro, Danilo, Toninho,
Raimundo, Paulo e José Reinaldo pelos serviços prestados.
Aos “GRANDES” amigos do Laboratorio de Genética, de hoje e para
a vida toda: João Batista, Jildete, Klédna, Rodrigo Barros, Gilvan, Ximena,
Marcos, Ireninha, Vivi, Mariana, Janaína, Leonardo, Daniel, Júnio, Michelle,
Leandro, Swiany, Maycon, Rodrigo BQI, Rafael, Guilherme, Lara, Tati loira e
Darlene, além de todos aqueles que já passaram por aqui.
Aos Amigos dos Laboratórios de Fisiologia, Micorrizas, Petróleo,
Micro industrial, Micro de Alimentos, Anaeróbio e agora Ecologia
Microbiana.
Ao grande amigo Gilvan, que ajudou a trilhar meu caminho com
ensinamentos me apoiando a todo instante e não me deixando desistir
nunca.
À minha chefinha de laboratório mais querida e amável com a qual
tenho o maior carinho do mundo, Ireninha.
Ao João Batista por ter agido como “pai” nas horas de necessidade.
Ao casal do laboratório Maycon e Swiany pela verdadeira amizade e
total confiança.
À Lara pela grande amizade.
Ao amigo Daniel pelas companhias nas festas, choradeiras,
bebedeiras e por guardar segredos que somente ele sabe (os seus estão
guardados comigo).
Á todos os demais “doenças” da bioquímica: Marcão, Sávio,
Guilherme e Rodrigo BQI.
Ao amigo Zé Carlos pelas palavras de incentivo nas horas de
indecisão.
E por fim a todos que, de alguma forma, contribuíram para que este
trabalho se concretizasse, amenizando as dificuldades encontradas no
caminho.
v
BIOGRAFIA
Ronney Adriano Ribeiro, Filho de José Ribeiro neto e Joana D’arc Dias
Ribeiro, nasceu no dia 13 de novembro de 1981 em Ubá, Estado de Minas Gerais.
Em fevereiro de 2000 ingressou no curso de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Viçosa, graduando-se como Bacharel em julho de 2004.
Iniciou os estudos em nível de Mestrado, no Programa de Pós-Graduação
em Microbiologia Agrícola também pela Universidade Federal de Viçosa, em
agosto de 2004, defendendo a dissertação em agosto de 2005.
vi
CONTEÚDO
RESUMO................................................................................................................viii
ABSTRACT..............................................................................................................x
1- Introdução.........................................................................................................01
2- Revisão da Literatura.......................................................................................03
3. Material e Métodos...........................................................................................11
3.1. Microrganismos..........................................................................................11
3.2- Isolamento do DNA total dos fungos..........................................................11
3.3- Seleção de fagos recombinantes contendo o gene nit1 do isolado
LV49 de Colletotrichum. lindemuthianum.........................................................12
3.4- Clonagem, sequenciamento e análise das seqüências do gene
nit1 de C. lindemuthianum ..............................................................................12
3.5. Análise filogenética da proteína NIT1 de C. lindemuthianum....................13
3.6- Avaliação da regulação do gene nit1 de C.lindemuthianum......................13
3.6.1- Condições de cultivo..........................................................................13
3.6.1. Extração de RNA total e análise por RT-PCR...................................14
4-Resultados e Discussão...................................................................................16
4.1- Isolamento do gene nit1 de C. lindemuthianum........................................16
4.2- Caracterização do gene nit1 de C. lindemuthianum..................................19
4.3- Análise filogenética da proteína nitrato redutase em C.
lindemuthianum.......................................................................................................30
vii
4.4- Estudo da regulação do gene nit1 em C. lindemuthianum.........................32
5. Conclusões…………………………………………........................……...……….36
6. Referências bibliográficas………………………………………………...……….38
viii
RESUMO
RIBEIRO, Ronney Adriano. M.S., Universidade Federal de Viçosa, agosto de
2006. Clonagem e caracterização do gene que codifica a nitrato redutase
em Colletotrichum lindemuthianum, patógeno do feijoeiro (Phaseolus
vulgaris). Orientadora: Marisa Vieira de Queiroz. Co-Orientadoras: Elza
Fernandes de Araújo e Célia Alencar de Moraes.
O gene que codifica para a nitrato redutase de Colletotrichum
lindemuthianum, nit1, foi isolado e caracterizado. Sua seqüência e regulação em
resposta a diferentes fontes de nitrogênio foram analisadas. A análise da
seqüência do gene nit1 indicou que ele possui 2.787 pb com um único íntron de 69
pb iniciando no nucleotídeo 1.808. Este íntron está localizado numa região
conservada de íntrons presentes no gene da nitrato redutase em outros fungos.
No entanto, a identidade entre eles se restringe às regiões consenso responsáveis
pela excisão. A região reguladora do gene nit1, além das seqüências consenso
gerais, apresenta quatro seqüências TATC responsáveis pela ligação da proteína
reguladora geral positiva NIT2. Um possível sítio da ligação da proteína reguladora
da via específica, NIT4, também foi localizado nessa região, na posição -340.
Além disso, na região 3’ não traduzida foi encontrado um possível sítio para
poliadenilação do mRNA localizado na posição 2.826. A proteína deduzida do
gene nit1 gerou uma seqüência de 905 aminoácidos com massa molecular de
101,1 kDa e apresentou alta identidade com as proteínas correspondentes em
Metarhizium anisopliae (62,43%), Magnaporthe grisea (62,27%), Verticillium
fungicola (60,15%), Botryotinia fuckeliana (58,30%) e Aspergillus fumigatus
(51,93%). A expressão do gene nit1 em C. lindemuthianum foi avaliada em
ix
micélios cultivados em diferentes fontes de nitrogênio, em condições de ativação e
repressão. O gene foi expresso na presença de nitrato a partir de 15 minutos após
entrar em contato com esta fonte de nitrogênio, tendo atingido a expressão
máxima com 360 minutos. A transcrição foi reprimida em micélios cultivados em
amônio, uréia e glutamina. Em glutamina, após 60 minutos de repressão, não foi
possível detectar a presença de transcritos desse gene.
x
ABSTRACT
RIBEIRO, Ronney Adriano, M.S., Universidade Federal de Viçosa, August, 2006.
Cloning and characterization of the gene encoding nitrate reductase in
Colletotrichum lindemuthianum, a bean (Phaseolus vulgaris) pathogen.
Adviser: Marisa Vieira de Queiroz. Co-Advisers: Elza Fernandes de Araújo and
Célia Alencar de Moraes.
The gene encoding nitrate reductase in Colletotrichum lindemuthianum, nit1,
was isolated and characterized. Its nucleotide sequence and regulation in
response to different nitrogen sources were analyzed. The gene nit1 has 2,787
base pairs (bp) bearing a single 696 bp intron starting at nucleotide 1,808. This
intron is localized in a conserved region when compared to introns present in
nitrate reductase genes of other fungi. Hovever, its similarity with them is restricted
to the consensus splicing regions. Four TATC sequences, possibly related to
binding of the general positive regulatory protein NIT2, were found in the upstream
regulatory region of nit1, as well as other consensus sequences such as TATA and
GC boxes. A putative binding site for NIT4, a specific regulatory protein, was also
found in the – 340 position. There is a putative mRNA polyadenilation site at the
downstream 2,826 position. The protein translated from nit1 comprises 905 amino
acid residues with a molecular mass of 101,1 kDa and presents high degree of
identity with the cognate proteins in Metarhizium anisopliae (62,43 %),
Magnaporte grisea (62,27%), Verticillium fungicola (60,15%), Botryotinia
fuckchiana (58,30%), and Aspergillus fumigatus (51,93%). In mycelia cultivated in
the presence of nitrate, nit1 was expressed after 15 min. Transcription was
xi
repressed in mycelia grown in medium containing either ammonium, urea, or
glutamine. On glutamine, the level of transcription was apparently basal.
xii
1. Introdução
Colletotrichum é um gênero de fungo pertencente ao filo Ascomycota que
contém muitas espécies causadoras antracnose ou ferrugem em uma grande
variedade de importantes culturas e plantas ornamentais (Bailey e Jeger, 1992).
Dentre as doenças provocadas por esse gênero de fungo, a antracnose no
feijoeiro, que tem como agente etiológico Colletotrichum lindemuthianum, constitui
uma das enfermidades mais graves dessa cultura e que em determinadas
condições, pode levar até 100% de perdas no campo.
Devido à sua importância, estudos genéticos sobre esse fungo são
imprescindíveis para o entendimento do seu modo de vida e de sua relação com o
hospedeiro. Um dos pré-requisitos para esses estudos é o desenvolvimento de
sistemas de transformação eficientes e de baixo custo. O sistema de
transformação baseado no gene nit1 é simples e rápido, permite uma seleção
positiva dos transformantes sem o emprego de agentes mutagênicos, reduzindo
assim a possibilidade de mutações secundárias. Além disso, esse gene tem sido
utilizado também como alvo para o isolamento de elementos transponíveis, cujos
estudos apresentam grande importância para o entendimento da variabilidade
genética não somente de fungos, mas de organismos de forma geral. O gene nit1
também pode ser utilizado como marcador genético em cruzamentos para a
designação de grupos de compatibilidade vegetativa, no estudo do ciclo
parasexual e no caso de fungos que apresentem algum interesse industrial no
melhoramento genético.
xiii
Portanto, devido à importância e ao grande potencial de utilização do gene
nit1 como ferramenta genética, este trabalho reporta o seu isolamento e
caracterização, o que abrirá caminho para novos estudos em C. lindemuthianum,
permitindo, assim, o desenvolvimento de estratégias eficazes no combate à
antracnose.
xiv
2. Revisão da Literatura
O crescimento celular é um fenômeno que só ocorre quando há
disponibilidade de nutrientes no meio que proporcionem todos os elementos que
compõem a célula, como carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo, entre outros.
Dentre tais elementos, o nitrogênio é um dos mais importantes, podendo ser
encontrado em muitos compostos simples e em quase todos os complexos
formados por macromoléculas presentes em células vivas. Especialmente
proteínas e ácidos nucléicos, duas das mais importantes classes de
macromoléculas, são ricas em nitrogênio, o que faz que ocorra alto investimento
celular, em termos energéticos, para o funcionamento da maquinaria metabólica
que compreende as vias assimilatórias e dissimilatórias do nitrogênio, mantendo,
dessa forma, um fluxo constante (Marzluf, 1981).
A assimilação do nitrogênio em fungos filamentosos pode ocorrer de duas
formas distintas, dependendo se fontes de nitrogênio prontamente disponíveis,
como amônia e glutamina, estão ou não presentes. Isso ocorre porque, como no
metabolismo de açúcares, existe um mecanismo de repressão catabólica para a
utilização do nitrogênio. Quando fontes primárias deste estão presentes no meio, a
assimilação é feita pela enzima NADP-GDH (glutamato desidrogenase
dependente de NADP), que tem um papel na formação de glutamato por meio da
aminação redutiva do α-cetoglutarato (Marzluf, 1981; Brun et al.,1992). Além da
xv
assimilação por meio da enzima NADP-GDH, o nitrogênio amoniacal também
pode ser assimilado por meio da ação conjunta das enzimas glutamina sintetase
(GS) e glutamina oxoglutarato aminotransferase ou glutamato sintase (GOGAT)
(Marzluf, 1981). Na presença de fontes secundárias de nitrogênio como nitrato,
nitrito, purinas ou aminoácidos e ausência de fontes primárias, a assimilação é
feita por uma série de enzimas geralmente sintetizadas “de novo”, como nitrato e
nitrito redutases, várias enzimas catabólicas de purinas, L-aminoácidos oxidases,
aminoácidos permeases e uma protease extracelular envolvida no uso de
proteínas (Fu e Marzluf, 1987).
Em vários fungos filamentosos, como em Aspergillus nidulans (Cove e
Paterman, 1969), Neurospora crassa (Fu et al., 1989), Penicillium chrysogenum
(Haas e Marzluf, 1995), Aspergillus oryzae (Christensen et al., 1998) e Aspergillus
niger (Lenavel et al., 2001), entre outros, o metabolismo do nitrogênio é um
processo altamente regulado de maneiras positiva e negativa, existindo um
sistema de controle global e um específico. Os genes nit-2 de N. crassa, areA de
Aspergillus sp. e nre de P. chrysogenum são reguladores globais positivos
capazes de sofrer influência do meio externo em relação à presença de fontes
preferenciais de nitrogênio. As proteínas NIT2, AREA e NRE se ligam a
seqüências específicas de uma grande rede de genes estruturais Dentre esses,
vários genes relacionados com o metabolismo do nitrogênio, promovendo a
desrepressão deles (Fu e Marzluf, 1987; Haas e Marzluf, 1995; Christensen et al.,
1998). Apesar destes reguladores globais apresentarem identidade de
aproximadamente 30% entre si, quando é considerado apenas o domínio de
ligação ao DNA, essa identidade entre eles chega a 98% (Haas e Marzluf, 1995).
A regulação negativa do metabolismo do nitrogênio ocorre por intermédio
da proteína NMR (para regulação metabólica do nitrogênio) que apresenta massa
molecular de 54,8 Kda e não possui domínio de ligação ao DNA, mas é capaz de
se ligar a uma pequena região do domínio de ligação ao DNA e à região carboxi-
terminal da proteína NIT-2 e possivelmente de AREA, tendo a glutamina como o
possível sinal para essa ligação, o que impede que NIT-2 realize sua função.
Supõe-se que a região de ligação da proteína NMR se localize próxima a um sinal
xvi
de localização nuclear da proteína NIT-2, prevenindo a entrada desta no núcleo
em condições de repressão pela fonte de nitrogênio, o que garantiria a repressão
metabólica (Xiao et al., 1995). Além da regulação por intermédio da proteína NMR,
pelo menos para AREA existem dois outros níveis de regulação, que são a
regulação da transcrição do gene areA pela própria proteína AREA e a baixa
estabilidade dos mRNA de areA em células que crescem em fontes de nitrogênio
preferenciais (Platt et al., 1996).
O nitrato (NO
3
-
), que é considerado excelente fonte secundária de
nitrogênio, pode ser incorporado quando reduzido a amônio (NH4
+
) no interior
celular. Para que essa conversão ocorra, o íon NO
3
-
deve entrar na célula, por
meio de uma nitrato permease, em que é convertido em nitrito (NO
2
-
) pela ação
redutiva da nitrato redutase e dois eletrons são consumidos. O NO
2
-
, então,
rapidamente sofre a ação da nitrito redutase, com o consumo de mais seis
elétrons, que o convertem em NH4
+
, que é posteriormente incorporado a
moléculas orgânicas (Pereira et al., 2003).
A nitrato redutase de fungos é um grande complexo multi-redox que possui
duas subunidades idênticas, cada uma composta de três grupos prostéticos em
domínios separados. Na extremidade C-terminal, localiza-se o domínio FAD, no
centro da proteína, o domínio heme e, na extremidade N-terminal, o domínio
molibdênio. A reação catalítica envolve a transferência de um par de elétrons do
NADH ou NADPH para os domínios FAD, heme, molibdênio e, então, para o
nitrato (Pereira et al., 2003). Esses domínios se apresentam conservados e
essenciais em diversos organismos filogeneticamente distintos.
Dependendo do organismo, a nitrato redutase pode variar de localização no interior celular. Em N. crassa, a nitrato
redutase encontra-se localizada na membrana plasmática, na parede celular e na membrana do tonoplasto, porém na
alga verde Monoraphidium braunii esta situa-se na região pirenoidal do cloroplasto, região geralmente associada com a
síntese do amido. Em decorrência dessa variação quanto à localização intracelular, a nitrato redutase em diferentes
espécies pode apresentar diferentes isoformas (Campbell et al., 1988).
Além da regulação existente em nível global para a utilização do nitrogênio,
a via específica para a utilização do nitrato também sofre uma regulação positiva
que depende de um indutor, que no caso é o próprio nitrato (Cove e Pateman,
1969). Essa regulação é feita em A. nidulans e N. crassa, respectivamente, pelos
produtos dos genes nirA e nit-4. Em N. crassa, uma interação específica entre as
xvii
proteínas NIT-2 e NIT-4 é requerida para o reconhecimento de cis-elementos e
expressão do gene da nitrato redutase (Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997).
Dessa forma, parece existir a necessidade da interação entre o regulador geral e o
específico para desencadear a expressão dos genes relacionados à utilização do
nitrato (Feng e Marzluf, 1998). Até a presente data, apenas um relato foi
encontrado na literatura, segundo o qual o basidiomiceto Hebeloma
cylindrosporum possivelmente não apresente regulação específica para os genes
da nitrato e nitrito redutases e da nitrato permease, pois os genes que codificam
essas proteínas são transcritos em presença de diferentes fontes de nitrogênio.
Entretanto, a repressão por amônio parece ser característica geral entre fungos,
indicando a presença de um sistema de regulação geral (Jargeat et al., 2000).
Em relação à análise de seqüências, o gene nit de diversos fungos
filamentosos revela variação quanto à presença ou não de íntrons e o tamanho
destes, apesar de no geral eles serem pequenos, variando de 46 pb a 98 pb.
Quanto à posição dos íntrons, existe uma tendência de conservação de suas
posições dentro de um mesmo reino, o que não acontece entre reinos diferentes
(Zhou e Kleinhofs, 1996). Suas seqüências, por não interferirem em regiões
importantes do gene nit, apresentam baixa identidade entre si, com exceção das
regiões 5’ GTPu e 3’ AG e das regiões internas como TAAG e CAAT, que estão
envolvidas no processamento dos introns (Gurr et al.,1987). Alguns fungos não
apresentam íntrons no gene nit, como é o caso de Ustilago maydis (Banks et al.,
1993) e Botryotinia fuckeliana (Levis et al., 1997), já para Hebeloma
cylindrosporum (Jargeat et al., 2000) foi relatada a presença de 12 íntrons, que é o
máximo de íntrons presentes nesse gene em fungos. Em fungos A. nidulans, A.
niger, A. orizae, Aspergillus parasiticus, P. chrysogenum e Penicillium
griseoroseum ocorre a presença de seis íntrons que, embora possuam tamanhos
diferentes, estão localizados nas mesmas posições (Johnstone et al., 1990;
Unkles et al., 1992; Kitamoto et al., 1995; Chang et al., 1996; Haas et al., 1996;
Amaar e Moore, 1998; Pereira et al., 2004). Em Leptosphaeria maculans e
Stagonospora nodorum, esse gene é interrompido por quatro íntrons que
correspondem aos íntrons II, III, IV e VI de Aspergillus e Penicillium (Williams et
xviii
al., 1994; Cutler et al., 1998), enquanto em Beauveria bassiana, F. oxysporum,
Gibberella fujikuroi, Metarhizium anisopliae e N. crassa apenas um íntron está
presente na mesma posição do íntron VI de Aspergillus e Penicillium (Pereira et
al., 2003). Nesses fungos, a organização dos genes que codificam nitrato e nitrito
redutases e nitrato permease pode variar dentro dos genomas. Por isso, as
diferentes organizações foram separadas em quatro grupos denominados A a D.
Dentro do grupo A estão aqueles fungos como A. nidulans, A. niger, A. parasiticus,
A. fumigatus e P. chrysogenum, que apresentam os três genes ligados, sendo os
genes da nitrato e nitrito redutase transcritos em direções opostas e o gene da
nitrato permease transcrito na mesma direção do gene da nitrito redutase. O
tamanho da região intergênica é de 1.262 pb em A. nidulans, 1.668 em A. niger,
1670 em A. parasiticus, 1.229 em A. fumigatus e 661 em P. chrysogenum
(Johnstone et al., 1990; Unkles et al., 1992; Haas e Marzluf, 1995, Chang et al.,
1996; Amaar e Moore, 1998). No grupo B, os três genes também estão ligados,
mas o gene da nitrato permease está entre os da nitrato e nitrito redutase, sendo
transcritos na mesma direção que os genes do grupo A. Essa organização é
encontrada em H. cylindrosporum (Jargeat et al., 2003). No grupo C, os genes da
nitrato e nitrito redutase estão ligados, são transcritos na mesma direção, mas o
gene da nitrato permease se encontra em outra região do genoma, como é
observado nos fungos Leptosphaeria maculans e Stagonospora nodorum, sendo
os tamanhos das regiões intergênicas de 1.438 pb em L. maculans e 829 pb em S.
nodorum (Williams et al., 1994; Cutler e Caten, 1999). No Grupo D, os genes não
estão ligados, como ocorre em N. crassa e Gibberella fujikuroi (Exley et al., 1993;
Tudzynski et al., 1996).
O gene da nitrato redutase, apesar de exibir regiões comprovadamente
funcionais e por isso conservadas, apresenta algumas entre os domínios em que
mudanças não causam alterações em sua função. Essa característica é
interessante para o estudo de filogenia e para análise de agrupamento entre
indivíduos de mesmo gênero. Zhou e Kleinhofs (1996) identificaram uma região N-
terminal e duas regiões curtas, uma localizada entre os domínios molibdênio e
xix
heme e a outra entre os domínios heme e FAD, que apresentaram menor
identidade entre 17 proteínas nitrato redutases de plantas, algas e fungos.
Estudar a regulação e a organização do gene nit tem uma importância
especial, pois diversas técnicas de transformação baseadas na complementação
de mutantes nit
-
foram descritas. Tais protocolos são fundamentais para a
introdução de genes de interesse em determinado organismo, adição ou
supressão de rotas metabólicas, estudo da função gênica, obtenção de linhagens
superprodutoras de enzimas e isolamento de genes de patogenicidade, entre
outras (Fincham, 1989). Utilizar um sistema de transformação baseado no gene nit
apresenta vantagens, como a fácil obtenção de mutantes espontâneos nit
-
por
seleção positiva via resistência ao clorato, o que extingue a possibilidade de
mutações secundárias em genes importantes devido ao tratamento com agentes
mutagênicos; além da obtenção de mutantes com fenótipo único, não utilizar
nitrato como única fonte de nitrogênio, sendo esse fenótipo dispensável, não
alterando o crescimento ou fluxos metabólicos relevantes (Pereira, 2003).
Além disso, já foi demonstrado que o gene nit pode ser de grande importância para a patogênese, já que doenças
causadas por Pythium, Phymatotrichum, Pseudomonas e Colletotrichum são favorecidas pela presença de nitrato
(Huber e Watson, 1974). Outra informação interessante é a de que os patógenos necrotróficos são capazes de utilizar
maior espectro de fontes de nitrogênio do que patógenos biotróficos, os quais obtêm nutrientes de tecidos vivos e
somente têm acesso a fontes de nitrogênio disponíveis no apoplasto e, ou na matriz do haustório (Snoeijers et al.,
2000).
Colletotrichum é um gênero de fungos da classe Ascomicetos contendo
muitas espécies que causam antracnose ou ferrugem em grande variedade de
importantes culturas e plantas ornamentais (Bailey e Jeger, 1992). Esse fungo
apresenta ciclo de vida com duas fases, uma biotrófica e outra necrotrófica, sendo
por isso classificado como hemibiotrófico (Perfect et al., 1999).
O início da colonização por esse fungo se dá com a germinação do conídio
que lança um tubo germinativo cerca de 18 h após a sua deposição sobre a folha
do hospedeiro. Um apressório, de cor escura por causa de sua melanização, é
formado na ponta do tubo (Bailey et al., 1992). A partir dessa estrutura, diferencia-
se o peg de penetração que atravessa a parede celular da primeira célula vegetal.
Enzimas hidrolíticas devem estar envolvidas nesse processo, uma vez que
ocorrem modificações químicas nas regiões da parede celular próximas ao peg. O
xx
fungo deve ter forte controle na secreção de tais enzimas, pois a atuação destas é
localizada (O’Connell et al, 1985). Uma estrutura globosa, chamada de vesícula de
infecção, é diferenciada entre a parede celular e a membrana plasmática da célula
epidermal. A formação dessa vesícula não ocasiona a morte da célula infectada.
Sua função exata ainda não foi elucidada, mas pode estar envolvida com a
manutenção da célula vegetal infectada e, ou, suprimindo as respostas de defesa
do hospedeiro compatível (O’Connell et al., 1985).
A partir da vesícula de infecção, diferencia-se uma hifa que tem seu
crescimento entre a parede celular vegetal e a membrana plasmática das células
epidermais e corticais, que permanecem vivas apesar de sofrerem modificações
estruturais no citoplasma. Cerca de 48 h após a infecção observam-se rupturas no
tonoplasto e plasmalema, culminando com a completa desorganização do
citoplasma dentro de 60 h, restando apenas debris de membranas (O’Connell et
al., 1985).
Esse padrão de colonização das células do hospedeiro, no qual a célula
vegetal é mantida inicialmente viva (fase biotrófica) seguida de degeneração
celular, repete-se à medida que as hifas primárias vão crescendo e invadindo as
demais células vegetais (O’Connell et al., 1985).
A antracnose, causada pelo fungo C. lindemuthianum, tem-se constituído
na doença mais importante do feijoeiro, pela sua ocorrência nas três épocas de
cultivo (1º, 2º e 3º safras), causando redução na produção e qualidade do feijão
(Pompeu, 1982.). Trabalhos têm demonstrado que as perdas devidas a esse
agente chegaram, em determinadas condições, até 100% (Chaves, 1980). Pelo
fato de os brasileiros serem os maiores consumidores mundiais de feijão, o Brasil
se destaca na sua produção, que em 2005 totalizou 3.021.495 t, um incremento de
1,8% em relação ao ano anterior. Isso foi conseqüência do aumento no
rendimento médio, de 745 kg/ha em 2004 para 806 kg/ha em 2005, uma vez que a
área colhida, de 3.748.407 ha, foi inferior à do ano anterior (3.978.660 ha). Em
2005, Minas Gerais (559.570 t) suplantou o Paraná (557.019 t), até então o maior
produtor nacional de feijão. Este produto é cultivado em todos os estados, sendo
xxi
que cinco deles (MG, PR, BA, GO e SP) foram responsáveis por cerca de 69% da
safra total (dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE).
Com isso, e em razão da importância desse patógeno para o Brasil, e
especialmente para Minas Gerais, é que se faz necessário seu estudo genético,
seja por meio de genes importantes para o metabolismo, seja por meio do
desenvolvimento de ferramentas que propiciem sua manipulação genética ou,
ainda, pela determinação de fatores de patogenicidade.
xxii
3. Material e Métodos
Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Genética
Molecular e de Microrganismos, do Departamento de Microbiologia/BIOAGRO da
Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa Minas Gerais.
3.1. Microrganismos
Foram utilizados neste trabalho os isolados LV49 (raça 81) e LF (raça 89)
do fungo C. lindemuthianum. O isolado LV49 pertence à Micoteca do Laboratório
de Resistência de Plantas a Doenças do Departamento de Biologia da
Universidade Federal Lavras e o isolado LF, à coleção do Laboratório de Genética
Molecular de Plantas do Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal
de Viçosa.
3.2. Isolamento do DNA total dos fungos
A extração de DNA total dos isolados de Colletotrichum foi feita seguindo-se
o protocolo estabelecido para fungos do gênero Aspergillus (Prebble e Anderson,
1998).
xxiii
3.3. Seleção de fagos recombinantes contendo o gene nit1 do isolado LV49 de C.
lindemuthianum
Esta seleção foi feita a partir de um banco genômico construído por Marcos
Antônio Soares a partir do isolado LV49 construido no vetor Lambda EMBL3 e que
pertencente ao Laboratório de Genética Molecular e de Microrganismos do
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa. Como sonda
foi utilizado o plasmídeo pNIT2.1, gentilmente cedido pelo pesquisador Thierry
Langin do “Institut de Biotechnologie des Plantes, Université Paris, France”, e que
contém um inserto genômico com parte do gene nit1 de C. lindemuthianum. Para
essa seleção foi utilizada a metodologia descrita por Benton e Davis (1977). As
hibridizações foram feitas a 65 ºC, utilizando-se o “Gene Images
TM
Random primer
Labeling Module” e CDP-Star Detection Module” (Amersham), de acordo com
instruções do fabricante. As placas de lise contendo os fagos positivos foram
coletadas individualmente e eluídas. Para confirmação dos sinais positivos,
diluições de cada eluição foram feitas, e mais duas etapas de hibridização nas
mesmas condições foram realizadas. O DNA dos fagos positivos foi extraído de
acordo com o protocolo descrito por Felipe et al. (1992). A clivagem do DNA do
fago foi feita com diferentes enzimas de restrição, conforme as instruções dos
fabricantes.
3.4. Clonagem, seqüenciamento e análise das seqüências do gene nit1 de C.
lindemuthianum
Fragmentos originados das clivagens do DNA do fago foram clonados no
vetor pZero (Invitrogen
®
). O seqüenciamento do DNA foi realizado pelo método de
terminação de cadeia por didesoxirribonucleotídeos (Sanger et al., 1977) utilizando
o seqüenciador MegaBace 500 (Amersham Pharmacia Biotech). As seqüências de
DNA resultantes foram comparadas com seqüências depositadas no GenBank,
usando-se o programa Blast (Basic Local Alignment Search Tool), na página do
National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nlh.gov/blast).
xxiv
3.5. Análise filogenética da proteína NIT1 de C. lindemuthianum
A seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase de diversos
fungos e plantas foi obtida a partir do GenBank. Os números de acesso são:
Phytophtora infestans (AAA86681), Hebeloma cylindrosporum (CAB60010.1),
Ustilago maydis (71019527), Tuber borchii (AAN64993.1), Botryotinia fuckeliana
(AAC02633.1), Magnaporthe grisea (XP_369402.1), Metarhizium anisopliae
(CAA04554.1), Verticillium fungicola (AAO63560.1), Aspergillus fumigatus
(AAL85636.1), Aspergillus oryzae (BAA08551.1), Penicillium griseoroseum
(AAP12556.1), Arabidopsis thaliana (NP_177899.1) e Nicotiana tabacum
(CAA32217.1). O alinhamento, feito por meio do programa CLUSTAL W, foi
utilizado para análises filogenéticas pelo método de neighbor-joining no programa
PAUP* versão 4.0, com valores de bootstrap utilizando 5.000 replicatas.
3.6. Avaliação da regulação do gene nit1 de C. lindemuthianum
3.6.1. Condições de cultivo
A metodologia empregada para estudar a regulação deste gene foi baseada
nos trabalhos realizados por Haas et al. (1996) e Pereira et al. (2004). Nos
experimentos de ativação do gene nit1, esporos do fungo foram cultivados em
caldo BD (batata-dextrose), e, após o crescimento do micélio, este foi transferido
para o meio mínimo (Pontecorvo et al., 1953) sem nitrato contendo glutamina (25
mM) como única fonte de nitrogênio, sob agitação de 150 RPM, a 24 ºC, por 36 h.
Esse micélio foi novamente transferido para Erlenmeyers contendo meio mínimo
com nitrato (25 mM) como única fonte de nitrogênio e coletado nos tempos 0, 5,
15, 60 e 360 minutos.
Nos experimentos de repressão do gene nit1, uma ordem inversa foi
seguida. Micélios do fungo cultivados em caldo BD foram transferidos para o meio
xxv
mínimo contendo nitrato (25 mM) como única fonte de nitrogênio sob agitação de
150 RPM a 24 ºC, por 36 h. Em cada Erlenmeyer onde os micélios estavam
acondicionados foi adicionada uma solução de glutamina a uma concentração final
de 25 mM, para que as coletas fossem realizadas nos tempos de 0, 5, 15, 60 e
360 minutos. Além dessas condições, o fungo cultivado em caldo BD também foi
transferido para o meio mínimo contendo amônio ou uréia como únicas fontes de
nitrogênio para verificar a repressão do gene nit1 nessas condições.
3.6.2. Extração de RNA total e análise por RT-PCR
A metodologia de extração de RNA total foi baseada na extração por fenol
utilizada para batata com modificações, em que 1,6 g de micélio triturado com
nitrogênio líquido foi utilizado. Nesse micélio foram adicionados 4 mL de tampão
de extração e 4 mL de fenol pH 4,3 (Sigma, Cat. # P 4682), aquecido a 60 ºC.
Essa mistura foi agitada e deixada no banho a 60 ºC, por 20 minutos, até a etapa
de centrifugação, quando a mistura foi centrifugada por 10 minutos, a 9.000 RPM.
Ao sobrenadante recolhido, adicionaram-se 4 mL de clorofórmio:álcool isoamílico
(24:1, Sigma, Cat # C 0549), cuja mistura foi fortemente agitada e centrifugada
novamente nas mesmas condições descritas anteriormente, para transferência do
sobrenadante. Este foi tratato com mais 4 mL de fenol:clorofórmio:álcool
isoamílico (25:24:1, Sigma, Cat # P 2069), foi fortemente agitado por 30 segundos
e centrifugado. O material recolhido dessa fase foi tratado com mais 4 mL de
clorofórmio:álcool isoamílico e novamente centrifugado. Após essa etapa, o RNA
foi precipitado a partir do sobrenadante com 1 volume de LiCl 4 M durante
aproximadamente 8 h a 4 ºC. O protocolo original dessa técnica pode ser
encontrado no site: <www.tigr.org/tdb/potato/microarray_SOPs.shtml>. Nas
reações de transcrição reversa, 10 μg do RNA total foram tratados com DNAse
RQI RNAse-free (Promega) e quantificados a 260 nm. Para gerar a primeira fita de
cDNA, utilizaram-se misturas de reação contendo 5 μg de RNA, tampão RT 1x
(Promega), 0,5 mM de cada desoxinucleosídeo trifosfatado, 500 ng de oligo (dT)
oligonucleotídeo (Promega), 20 U de inibidor de ribonuclease RNasin® (Promega)
xxvi
e 10 U de “AMV reverse transcriptase” (Promega). O volume da reação foi
ajustado para 20 μL e incubado a 25 ºC por 5 minutos e, então, a 42 ºC por 60
minutos. Reações de PCR foram feitas para detectar os ciclos correspondentes à
fase logaritmica de amplificação e determinar quantos ciclos seriam utilizados nos
experimentos subseqüentes. Os oligonucleotídeos EF1 e EF2 (que amplificam
uma região de um fator de elongação ribossomal de Colletotrichum) foram
utilizados como controle interno neste experimento, enquanto os oligonucleotídeos
CLPCR1 e Niacol2 (Tabela1) o foram utilizados para avaliar a expressão do gene.
O programa empregado foi 23 ciclos de: 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 57 ºC e 1
minuto a 72 ºC, com extensão final de 7 minutos a 57 ºC.
xxvii
4. Resultados e Discussão
4.1. Isolamento do gene nit1 de C. lindemuthianum
O gene que nit1 C. lindemuthianum foi isolado a partir do banco genômico
construído no vetor λEMBL3, utilizando-se como sonda o pNIT2.1, que contém um
inserto genômico de 3,1 Kb, com parte do gene da nitrato redutase de C.
lindemuthianum.
Um fago recombinante contendo o gene nit1 foi isolado e denominado λ NIT
2.1.1. O DNA desse fago foi extraído e clivado com cinco diferentes enzimas de
restrição, Apa I, Bam HI, Eco RI, Eco RV e Pst I, e hibridizado com o pNIT2.1, com
o objetivo de verificar o padrão de restrição do fragmento de DNA genômico
clonado no fago. A escolha das enzimas de restrição para a análise do fago
recombinante foi feita de acordo com a presença de sítios para essas enzimas na
região de policlonagem do vetor pZero (Invitogen), objetivando-se a posterior
clonagem e o sequenciamento das bandas correspondentes ao gene nit1. O
resultado da hibridização evidenciou que essas enzimas apresentam pelo menos
um sítio de restrição dentro do gene nit1, uma vez que não houve o aparecimento
de banda única em nenhuma das cinco reações referentes à clivagem do fago
com essas enzimas (Figura 1B).
xxviii
21,2
5,1
4,9
4,2
2,0
1,9
1,5
1,3
0,9
0,8
0,5
Mkb
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
0,5
0,8
1,1
1,9
2,7
3,5
6,5
21,2
5,1
4,9
4,2
2,0
1,9
1,5
1,3
0,9
0,8
0,5
Mkb
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
21,2
5,1
4,9
4,2
2,0
1,9
1,5
1,3
0,9
0,8
0,5
Mkb
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
0,5
0,8
1,1
1,9
2,7
3,5
6,5
A)
B)
Figura 1 – Análise do padrão de restrição do fago λ NIT 2.1.1. A) DNA do fago recombinante λ NIT
2.1.1 clivado com as enzimas de restrição Apa I (1), Bam HI (2) , Eco RI (3) , Eco RV (4) e Pst I (5).
B) Hibridização do DNA do fago com o pNIT2.1. As setas indicam algumas bandas que
hibridizaram com pNIT2.1, e os números representam o tamanho aproximado de cada banda. M –
DNA do fago λ clivado com Eco RI e Hind III.
O tamanho de alguns fragmentos de DNA foi estimado e estão
representados na Figura 1B. Os fragmentos escolhidos para serem clonados no
vetor pZero foram os obtidos com a enzima Pst I, pois estes, juntos, apresentaram
um tamanho que comportava todo o gene da nitrato redutase. Além disso, bandas
maiores que apareceram na hibridização, quando o DNA do fago foi clivado com
as outras enzimas são mais difíceis de serem clonadas e podem carregar
fragmentos contendo parte do vetor EMBL3.
xxix
Na Figura 2, mostra-se o resultado da hibridização, em que o DNA do fago
λ NIT 2.1.1 e de dois plasmídeos contendo os fragmentos de 6,5 Kb e 0,8 Kb
oriundos do fago λ NIT 2.1.1 foram clivados com Pst I e hibridizados com o
pNIT2.1. Tais plasmídeos foram denominados, respectivamente, pNIT11 e pNIT20
e utilizados no seqüenciamento do gene.
1
23 1
23
M
23,1
9,4
6,5
4,3
2,3
2,0
0,56
kb
1
23 1
23
M
23,1
9,4
6,5
4,3
2,3
2,0
0,56
kb
Vetor
B)
A)
Figura 2 – Análise dos plasmídeos recombinantes. A) DNA do fago recombinante λ NIT 2.1.1 (1),
do plasmídeo pNIT11 (2) e do plasmídeo pNIT20 (3) clivados com
Pst I. B) Hibridização dos DNAs
com o pNIT2.1. M – DNA do fago
λ clivado com Hind III.
xxx
4.2. Caracterização do gene nit1 de C. lindemuthianum
Os plasmídeos pNIT11 e pNIT20 contendo os fragmentos Pst I oriundos do
fago λ NIT 2.1.1 e que hibridizam com o pNIT2.1 foram seqüenciados dentro da
região que corresponde ao gene da nitrato redutase de C. lindemuthianum. A
Figura 3 ilustra a estratégia de sequenciamento dos fragmentos de DNA de 6,5 e
0,8 kb.
pNIT20
pNIT11
ATG
PstI
PstI
PstI
PstI
1
3
2
4
5
6
7
89
10
11
10 11
pNIT20
pNIT11
ATG
PstI
PstI
PstI
PstI
1
3
2
4
5
6
7
89
10
11
10 11
Figura 3 –
Estratégia de seqüenciamento do gene nit1 de C. lindemuthianum subclonado do fago λ
NIT 2.1.1
nos plasmídeos pNIT20 e pNIT11. As barras hachuradas representam as regiões
estrutural e promotora do gene
nit1. As setas menores indicam os oligonucleotídeos utilizados no
seqüenciamento descrito na Tabela 1, e as setas maiores apontam o sentido da transcrição do
gene
nit1.
xxxi
Tabela 1 – Descrição dos oligonucleotídeos utilizados no seqüenciamento e estudo da regulação
do gene
nit1
Primer Seqüência
1 Niacl1 GGTTATTATGGGAAACGAGC
2 Niacl2 GCAATTTGGGGTTATCTGG
3 Niacl3 CTATAAGACTGACCTTCCCTC
4 Niacl4 CGCAGAAGCCAAGTTTCT
5 Niacl3b CCGTTAGTCGTATTAGTCTGG
6 Niacol2 GTCAGTGAAGAGGGGTTCAGG
7 Niacol1 GGTACTCGGGCATCATCGGC
8 Clpcr1 AAGATTTTGGTGTCGGAGGA
9 Clpcr2 CGTCTTGGACAGGTCTCAAG
10 T7 For TAATACGACTCACTATAGGG
11 M13 Rer GGATAACAATTTCACACAGG
12 EF1 GAAGACTCACATCAACGTCG
13 EF2 TTGAAGGAACCCTTGCCGAG
O seqüenciamento da região correspondente ao gene nit1 presente nos
plasmídeos pNIT11 e pNIT20 não foi suficiente para completar toda a seqüência
do gene, uma vez que o pNIT20, que contém a região final do gene, estava
truncado e não continha os últimos nucleotídeos. O resto da seqüência do gene e
uma pequena região 3’ não traduzida foram obtidos por meio do seqüenciamento
direto do fragmento do DNA genômico presente no fago λ NIT 2.1.1. Com isso
todo o gene da nitrato redutase de C. lindemuthianum foi seqüenciado (Figura 4).
A região estrutural desse gene foi determinada e apresenta 2.787 pb. Além disso,
foram seqüenciados 640 pb da região promotora do gene (Figura 5) e 263 pb da
região 3’ não traduzida contendo o sinal para poliadenilação.
O alinhamento do gene nit1 com seqüências depositadas no “GenBank”
utilizando o programa Blast evidenciou as seqüências que correspondem aos três
domínios característicos de todas as nitrato redutases. Com esse alinhamento,
também foi possível deduzir a presença de um possível intron que apresenta as
seqüências conservadas 5’ GT e 3’ AG envolvidas no processo de excisão
(Ballance 1986). Além disso, um consenso interno mais próximo à região 3’,
CTGAC, está presente nesse íntron (Unkles, 1992).
xxxii
1 ATGTGCTTGC ACCTCCCGTC CCCTTCCCCT CGAGGGATGC CATGTCGAAG ACGGAGTTGT
61 CTTTTCCTCC TAGCCCAGCC ACAACTGTGG GGGAAGGTCA GTCTTATAGC GTCAAACGGC
121 GGATCCGATT CCTCGCTGGT CGCGGGCCTC CTTGACGAGC CGGGCGCCGA GGGACCTCGC
181 ACATATGCCC TGCCGCCAAA CTCGAAAGCC AACAGAGTTC TCCCAGAAGA CCTAAGAACA
241 CCAGACAGCC ACGTACCCCG GGATTCCAGA CTAATACGAC TAACGGGAGT TCACCCTTTC
301 AACGTCGAGG CCCCGTTGAG CGAGCTGTAC AACGAGGGCT TCATCACCAC CAGAGACTTG
361 CACTATGTCC GAAACCACGG CGCCGTGCCC AAATGCGACG ATGATGACAT GTTCGACTGG
421 CAGTTCACCG TCGAGGGCGA GGTCGAGAAC CCCATCACCA TGAACCTCAG AGACCTCATC
481 TCCGATTACG AACAGGTCAC TTACCCAGTC ACGCTTGTGT GCGCTGGCAA CCGCCGGAAA
541 GAGCAGAACG TCGTCCGCAA GACCAAAGGC TTCTTCTTGG GCCCCCACAG GCTTGTCGGA
601 CCGCCCCTGT GGACCGGTTG TGCCCATCGG ATCCCTCGCT TGGCCCGGCC ATGCCCAAAA
661 CGGGGAGCAC GCTACGTCTG CTTGGAAGGC GCCGACAAAC TGCCCAATGG TTATTATGGA
721 ACGAGCATCA AGCTCAACTG GTGTATGGAT CGTGACCGGG GGGTCACCGT ATGTTACCGC
781 ATGAACGGCG AGTTGCTCCC TCCGGACCAT GGGAAGCCCG TTCGCATCAT CATCCCAGGA
841 CAAATCGGCG GAAGAAGTGT CAAGTGGTTA AAGAAAATCA TTGTGACAAA GGAGCCAAGC
901 TCCAACTGGT ACCACATTTA CGACAACCGA GTCCTACCCA CCATGGTCTC TCCCGAGGCC
961 AGCGCGGACC TGCCAGACAC ATGGAAGGAT GAGCGCTACG CTATCTACGA CTTGAACACG
1021 AATAGCGTCA CCGCATTCCC TGCCCATGAC GAGGTGCTTT CTTTGGTCGA CGGCCCCAAG
1081 TCCTACAGAA TCCGCGGTTA CGCCTACGGC GGCGGCGGCA GACGCATCAC GCGGGTCGAG
1141 CTGACGCTGG ATCGCGGAAA GACGTGGGTG CTCGCCAATG TCAACTATCC CGAAGACGAA
1201 TATCGGTTCG CGCCCGAGGG CGAGACCCTA TACGGTGGGA GAGTCGACAT GGATTGGAGA
1261 GAAACTTGGC TTCTGCGTGG TGCTTCTGGG ACCTTGACGT GCCAGGTCGC ACAACTCGCC
1321 GACGCAGCCG ATGTCATGGT CCGCGCCATG GACGAGGGCA TGATGGTGCA ACCTAGAGAT
1381 ATGTACTGGA GCGTCCTGGG CATGATGAAC AACCCGTGGG TCAGAGTCAT CATCCACAGG
1441 GAGGGTCACA GTCTCCGCTT TGAACACCCT ACCCAGCCCA TGCTGGGCGG TGGCGGTTGG
1501 ATGGAGAGGG TGAAAAAAGC TGGCGGCAAT CTCACCAACG GCTTCTGGGG AGAGAAGATC
1561 GAAGGAGAGA GCGAAAACAC CGTCAGTGAA GAGCCGTTCA GGGAGATTTG CATGACGAGG
1621 GAAAGCGTCA AGCGAGTCAT TGCCATGGAC GAGCTTCGCC AGCACGGCGG TGAGACAGAT
1681 CCCTGGTTCG TCATCAACGG CGAGGTATAC GACGGCACCC CTTTCTTGGA AGGCCACCCA
1741 GGCGGCGCAG CCTCCATCTT CGGGGCCGCT GGCCAGGACG TATCTGAGGA GTTTGTGACT
1801 ATCCGTAAgt tctccccatg aagcgcagtg ttgcctggag gccacataga ctgaccaacc
1861 ttcggctgtg cagacagTGA AAACGCCAAG GCGATGATGC CCGAGTACCA TATCGGCAGC
1921 ATGGACGAGG CCGGCAACAA AACACTTGCG TTGGGGGTTG TCGTCGAGGA CGACCCGGAG
1981 AAGCGGCCGC GGCCAGTATT CCTGCAGTCC AAGGCGTGGA CCAAGGGCAT TCTGAACGCG
2041 AGGCGGATGA TATCCTCCGA CACCAAAATC TTCACCTTCA GTCTCCAACA TCCGGAGCAA
2101 AGCATTGGCT TGCCTGTCGG ACAGCATCTG ATGATGCGGC TTCGCGACCC GGTCACCCGC
2161 GAAGCCATCA TCCGCGCGTA CACGCCCATT TCGGAAGGGT CCGACAAGGG CAAGCTACAT
2221 GTTCTGGTCA AGATATATTA CGACACTCCA GAACGCAAGG GCGGCAGGAT GACCCAGGCT
2281 CTTGACTCGA TACCTTTAGG TCACTGGGTA GACTTCAAAG GTCCGGTCGG CAAGTTTGAG
2341 TATCTTGGCG GCGGTCTTTG CTCGATTGCG GGTAAGCAAC GGCGCGTGAA GCGGTTCGTC
2401 ATGATTTGCG CCGGCTCCGG CATCACACCC ATCTTTCAAG TCCTCCGGGC CGTATTGAAG
2461 AACGTCCAAG ACCCGACGCG GTGCCTGGTG CTCGACGGCA ACCGTGTGGA GGAGGACATA
2521 CTCTGCCGCG AGGACTTGGA CGACATGGCC AGCGCCAACC CGGACAGGTG CAGACTACTG
2581 CACACCCTGA GCAAGCCGGC ATCGTCTTGG ACAGGTCTCA AGGGGCGAAT CGACGCCGCC
2641 TTCTTGGAGA CGGAGGTTGG CGCTCGGCGC AGCGATAGCG ACGGCGAAGA ATTGGTGCTG
2701 GTGTGCGGCC CGGAACCGCT GGAGAAAAGT GTCCGAAGCA CGCTGCTCGA TCTAGGCTGG
2761 AAGGGGGATG ACTTGCTGTT CTTCTGAGCG CGTAGTCACC CGGCTTCATC CAAGCCCGGA
2821 TTTACAAAAT ATTTTTGGAC GCTGTCACAA CGCCGTCCCG CGAACGGGGT CGCCGACCTC
2881 GGGTCTCGGC AAAGCAGAGT CGCTACCCCG TCTCGGGCCG TCGTGGCGCC CAACTGCCAG
2941 CGAATTCTCC CGCTCGTGCT CAAAGTGACG CCGATTGAGA CAATAGGACC AGAGAGAGAT
3001 GACACGCGAG GTTTTGGTGT ACATTTGAAA GTGGGGGGGG GGTGGCGGG
Figura 4 – Seqüência de nucleotídeos do gene nit1 de C. lindemuthianum e suas regiões
flanqueadoras. O possível códon de início do gene, o códon de parada e o sinal para
poliadenilação estão em negrito. O único íntron do gene está em letras minúsculas, com as
seqüências consensos 5’gt e 3’ag e a seqüência consenso interna ctgac em negrito.
xxxiii
Em fungos filamentosos, a análise de seqüências do gene da nitrato
redutase revela variação quanto à presença de íntrons e ao tamanho destes,
embora eles sejam pequenos (Pereira et al., 2003). Já em relação à posição
desses íntrons dentro do gene, eles tendem a se localizarem em regiões
conservadas dentro de um mesmo reino, mas divergem entre os reinos Fungi e
Plantae (Zhou e Kleinhofs, 1996). Nos fungos Ustilago maydis (Banks et al., 1993)
e Botryotinia fuckeliana (Levis et al., 1997) não houve relato da presença de
íntrons dentro do gene da nitrato redutase, enquanto no fungo Hebeloma
cylindrosporum (Jargeat et al., 2000) foram registrados 12 íntrons. Em fungos do
gênero Aspergillus e Penicillium foi mencionada a presença de seis íntrons que,
embora apresentassem tamanhos diferentes, estavam localizados em regiões
conservadas.
O íntron putativo do gene nit1 de C. lindemuthianum inicia no nucleotídeo
1808 (em relação ao ATG) e possui 69 pb de tamanho, sendo similar aos
relatados em outras espécies de fungos filamentosos, como Aspergillus nidulans
com íntrons variando de 48 a 67 pb (Johnstone et al., 1990) e Penicillium
griseoroseum com variação de 51 a 72 pb (Pereira et al., 2004). Outros fungos
filamentosos como Crinipellis perniciosa (Silva, 2005), A. oryzae (Kitamoto et al.,
1995) e Hebeloma cylindrosporum (Jargeat et al., 2000) possuem íntrons maiores,
que chegam a 98, 98 e 92 pb, respectivamente.
Em relação ao número de íntrons, foi verificada a presença de um único
íntron no gene que codifica a nitrato redutase para os fungos C. lindemhutianum,
Beauveria bassiana, Fusarium oxysporum, Gibberella fujikuroi, Metarhizium
anisopliae e Verticillium fungicola, sendo que a localização desse íntron nessas
espécies é a mesma e corresponde à localização do íntron VI presente em
Aspergillus sp. e Penicillium sp. A localização desse íntron, dentro do domínio
heme da proteína nitrato redutase, é relatada de forma geral para todos os fungos
filamentosos, com exceção daqueles que não possuem íntrons e, dessa forma,
parece ser uma característica ancestral desse grupo de indivíduos. Apesar disso,
nenhuma similaridade, além dos consensos relacionados à excisão do íntron, foi
encontrada entre o íntron da nitrato redutase de C. lindemuthianum e dos demais
xxxiv
fungos filamentosos. Nos fungos filamentosos é observado que a maioria dos
íntrons está localizada na região que corresponde ao domínio de ligação do co-
fator molibdênio e que esses introns estão em regiões conservadas. Com exceção
de H. cylindrosporum (Jargeat et al., 2000) e C. perniciosa (Silva, 2005) não
existem relatos sobre a presença de íntrons dentro da região que corresponde ao
domínio FAD para qualquer outro fungo filamentoso.
Em plantas como Lycopersicum esculentum, Nicotiana tabacum, Oryzae
sativa e Phaseolus vulgaris, os três íntrons presentes nessas espécies ocupam a
mesma posição. Em geral, esses íntrons tendem a ocupar regiões dentro e não
entre os domínios funcionais. Os genes da nitrato redutase de algas como
Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reihardtii e Volvox carteri apresentam mais
íntrons em relação aos dos demais eucariotos, de 10 a 15. As posições de 8 dos
10 íntrons de Volvox são idênticas às de Chlamydomonas (Zhou e Kleinhofs,
1996).
Na região promotora do gene nit1 de C. lindemuthianum (Figura 5) foi
possível identificar regiões que podem funcionar como cis-elementos para a
expressão do gene. Esses cis-elementos incluem três possíveis regiões TATA Box
localizadas a -105, -271 e -477 pb em relação ao ATG proposto e duas possíveis
regiões GC Box localizadas a -366 e -452 pb. Nessa região puderam ainda ser
identificadas quatro seqüências TATC localizadas a -184, -189, -220 e a – 319 pb.
Esses cis-elementos são sítios de ligação do regulador geral positivo AREA em A.
nidulans, NIT-2 em N. crassa e NRE em P. chrysogenum (Caddick et al., 1994;
Marzluf, 1997; Haas e Marzluf, 1995). Elementos com pelo menos duas cópias de
seqüências GATA, que podem estar na mesma direção, ou opostas, e com
espaço de aproximadamente 30 pb, são considerados fortes sítios de ligação para
NIT-2 (Chiang e Marzluf, 1994). Em P. chrysogenum, sítios fortes de ligação de
NRE foram descritos por Haas e Marzluf (1995) como regiões com pelo menos
duas seqüências GATA com espaçamento entre 5 e 27 pb, configuradas na
mesma direção ou em direções opostas. Elementos GATA separados por 74 ou
96 pb não constituíram fortes sítios de ligação NRE (Haas e Marzluf, 1995). Em C.
lindemuthianum, duas regiões TATC localizadas a -184 e -220 são separadas por
xxxv
32 nucleotídeos e podem constituir uma forte região de ligação da proteína
reguladora geral para assimilação do nitrogênio. Outra possibilidade de ligação
para essa proteína seria entre os cis-elementos localizados nas posições -189 e -
220, que estão separados por 23 nucleotídeos. A forte ligação de NRE de P.
chrysogenum a dois elementos GATA talvez esteja relacionada a um
funcionamento da proteína em forma dimérica, também sugerido para NIT-2 em N.
crassa (Feng et al., 1993; Haas e Marzluf, 1995).
-640 TCGTGGAAAG TATGTTCCAG ATTATGCCCG AGTCTCTTTG TCGTGAGCCT GCTACCCGCC
-580 GGCTCTATTC CATCTTCTGC TCTTTTGATG GAGGGAACTG GCTGGCTTAG TCTACGACTC
-520 TAGTGCCGTG CGGGTTCTGC GATGGAGATG CCGCATGG
TA ATAGTGTGCT TTCCATCTCA
-460 TC
CCGCCCCA TCCCGTCCCA TCCTGTCCCC ATGCCGGTCG GCACGTCTCC CTTCCACGTC
-400 CTTTGCCCCC GTTCGGTGCG CTTGCGTT
CC GCCCACACCA CAGACGTGAC AACTCCGTGT
-340 CTAGGAAGTG CAGTTTCTAT CCACGAGCAG GCCTTACTTA TTCGATTGTC ACCCCCAGCG
-280 TTTCGTATAG GATCCTTCTC TTTCCTCTGA ACTCTTCTGT CAAGCCTTCA TCCCACTATC
-220 GTTCTGTTCA TACGTCGAAC GGTTATCAGC CTTATCGGTT CCACTGATTC GTCAACGCTC
-160 GTGTTTTGGA CTCACAAGTG ACGTCGTGGG CACTCACTGC CAGACAACCT CTATACGGCA
-100 CAAGCCATCA TCCAACCCAC CCACCCACCT GCTTCAGAAC TAGAACATTT GGCCTCGCAT
-40 AGCACATTCT GGAATTCGAC ACTGCTGCGC GACGTGATGG ATG
Figura 5
– Seqüência de nucleotídeos do promotor do gene nit1 obtida por meio do
seqüenciamento do fragmento subclonado no plasmídeo pNIT11. O possível códon de inicio do
gene está em negrito, os possíveis cis-elementos (TATA Box e CG Box) estão sublinhados e os
possíveis sítios de ligação das proteínas reguladoras geral (TATC) e específica (CTCCGTGT)
estão delimitadas por retângulos.
No promotor do gene nit1 de C. lindemuthianum nenhum cis-elemento para
a ligação da proteína reguladora específica da via de assimilação do nitrato
(NIT4), similar àquele encontrada por Fu et al. (1995) em N. cassa (TCCGCGGA),
pôde ser identificado. Entretanto, foi encontrada uma seqüência localizada a -340
pb (CTCCGTGT), que pode ser uma possível região de ligação para NIT4, uma
xxxvi
vez que ela só difere em sua última base do consenso CTCCGHGG descrito por
Punt et al. (1995), que mostraram ser esse o sítio de ligação de NirA na região
intergênica dos genes niaD-niiA de A. nidulans. Além disso, seqüências
palindrômicas parciais similares ao fraco sítio de ligação da proteína NIT-4
TCCGTGGC (Fu et al., 1995) tais como CCGCCGGC ou CTTCCGTGT, foram
encontradas.
Essa região reguladora de C. lindemuthianum não apresentou identidade a
nenhuma outra região correspondente em outros fungos. É esperado que
espécies relacionadas apresentem alta identidade na região estrutural dos genes,
mas pouca ou nenhuma na região reguladora. Entretanto, há alguns casos na
literatura em que ocorre alta identidade entre tais seqüências, como a região
intergênica dos genes para a nitrato e nitrito redutase de A. fumigatus, que
apresenta 42% de identidade com a mesma região de A. nidulans, 37% com a de
A. parasiticus e com a região promotora do gene nit-3 de N. crassa (Amaar e
Moore, 1998). Valores altos são relatados nas regiões correspondentes de A.
parasiticus e A. oryzae, com identidade de 95% (Chang et al., 1996), e em G.
fujikuroi e F. oxysporum, com identidade de 91,2% (Tudzynski et al., 1996).
Na região 3’ não traduzida do gene foi identificado um possível sinal para a
poliadenilação (AAAATA) que é bem semelhante àquele encontrado por Pereira et
al. (2004), ao descrevererem a seqüência do gene niaD de P. griseoroseum
(AAAAATA).
Com a remoção do íntron putativo do gene nit1 de C. lindemuthianum foi
possível deduzir a seqüência de aminoácidos (aa) da proteína NIT1 e compará-la
com nitrato redutase de outros fungos. A seqüência da proteína deduzida
apresenta 905 aa com uma massa molecular estimada de 101,1 KDa. Este é o
tamanho aproximado das proteínas deduzidas para M. anisopliae com 892 aa e
massa molecular de 99,5 KDa, M. grisea com 911 aa e massa molecular de 101,7
KDa, V. fungicola com 893 aa e massa molecular de 99,1 KDa e B. fuckeliana
com 907 aa e massa molecular de 101,7 KDa. Com relação à identidade da nitrato
redutase de C. lindemuthianum com a de outros fungos, este possui 62,43% de
identidade com M. anisopliae, 62,27% com M. grisea, 60,15% com V. fungicola,
xxxvii
58,30% com B. fuckeliana e 51,93% com A. fumigatus. Valores mais altos de
identidade são encontrados em fungos do mesmo gênero a exemplo de P.
chrysogenum e P. griseoroseum, que compartilham 92% de identidade entre suas
proteínas. Além disso, tem sido relatado na literatura que, por causa da
conservação dos domínios da proteína nitrato redutase, grande identidade pode
ser observada entre proteínas de fungos e de plantas e com proteínas
funcionalmente relacionadas, como sulfito oxidase, citocromo b5 e NADH-
citocromo b5 redutase de mamíferos (Campbell e Kinghorn, 1990).
A Figura 6 ilustra onde iniciam e terminam os domínios de ligação do
cofator molibdênio, de Heme e de FAD. O domínio de ligação do co-fator
molibdênio se localiza próximo à extremidade N-terminal da proteína e inicia no
resíduo de aa Asp
77
,
estendendo-se até o resíduo Val
450
. Dentro desse domínio, é
encontrado o resíduo de Cys
174
, que corresponde ao resíduo Cys
150
de A.
nidulans, demonstrado por Garde et al. (1995) em experimentos de mutagênese
sítio direcionada ser essencial para a ligação do co-fator molibdênio. O domínio de
ligação a Heme se inicia no resíduo Arg
516
e termina no resíduo Asn
593
. Nesse
domínio está presente o único íntron da proteína NIT1, de C. lindemuthianum
(indicado por uma seta na Figura 6), e também o resíduo His
579
correspondente ao
resíduo His
547
de A. nidulans, que também foi demonstrado por Garde et al. (1995)
ser essencial para o funcionamento da proteína nitrato redutase. Entretanto, essa
mesma substituição feita em N. crassa por Okamoto e Marzluf (1993) não diminuiu
grandemente a atividade da nitrato redutase desse fungo. O domínio de FAD que
se estende do resíduo Glu
638
até o final da proteína estão localizados dois outros
aminoácidos importantes para o funcionamento da proteína, o Trp
651
e a His
687
. A
substituição do aa Trp
618
da proteína nitrato redutase de A. nidulans, que é
correspondente ao Trp
651
de C. lindemuthianum, por um resíduo Lys, fez com que
transformantes contendo essa modificação crescessem a 30 ºC, mas não a 37 ºC,
quando a única fonte de nitrogênio foi o nitrato. Já o aminoácido His
654
da proteína
NIAD de A. nidulans, que corresponde a His
687
de C. lindemuthianum, demonstrou
ser importante para o funcionamento da proteína, mas não essencial (Garde et al.;
1995).
xxxviii
Cl ..MCLHLPSPSPRGMP.CRR.RSC.LFLLAQPQLWGKVSL 35
Ma ......MPQSESNSEPGFQQ.KTV.VFPPSPPSTVGRSRR 32
Mg MGTIVGLPPIPTEAPPSYTTVKKLDIFPPSPPDT.AKESR 39
Vf .........MVVRAGT.ATR.NNC.TLPPSPPRTVGNSRA 28
Bf MASAQFMNEHSSEADA.EMS.KMIPQLPQTPPDS..NEN. 35
Af .................................MATITQV 7
Cl IASN.GGSDSSLVAGLLDEPG.A..EGPR..TYALPP..N 67
Ma CSAD.GNSND.ITFPV..SPTIA..NNDAL.IYPLPP.TN 64
Mg QHSR.RSSIS.VGTGLVEDVDCAVVNDEASRPYPLPP..P 75
Vf GSDDEGGTFD..NSPP..TPPVEKITNLLK.PYALPP.QN 62
Bf SSDE.LGSLS..SYSS..STS.L..SLQR...YTLPPPTN 64
Af QTQETHTVLPKSLTVVPGQITVKEISNLDLPDIPLPP.PS 46
Cl SKANRVLPEDLRTPDSHVPRDSRLIRLTGVHPFNVEAPLS 107
Ma SQKS.VRPEDLKTPDSHVERDARLIRLTGTHPFNCEPPLR 103
Mg TRQNNVLPQDLKTPDSHVERDPRLIRLTGIHPFNTEAPLS 115
Vf TPTQ.VLPEDLKTPDSHVPRDPRLIRLTGVHPFNVEPPLT 101
Bf PPTE.ILKEDLKTPDNQVPRDPRLIRLTGIHPFNVEPPLS 103
Af TNPTEILAQDKGTPDNHVPRDPRLIRLTGVHPFNVEPPLT 86
Cl ELYNEGFITTRDLHYVRNHGAVPKCDDDDMFD.WQFTVEG 146
Ma DLYDEGFLTSEDLHYVRNHGPVPQCDDGDM.DHWTFTVDG 142
Mg DLFDEGFINSKDLHYVRNHGAVPRVEDADMMD.WEFTVEG 154
Vf DLYDEGFLTSENLHYVRNHGPVPECSDDESLS.WTFAVDG 140
Bf ALYDEGFLTSPELFYVRNHGAVPHVEDSSIPD.WEFSVEG 142
Af ALFNEGFLTSPELFYVRNHGPVPLVRDEDIPN.WEISIEG 125
Cl EVENPITMNLRDLISDYEQVTYPVTLVCAGNRRKEQNVVR 186
Ma LVENPFTLSVRELIASYEQVTYPITLVCAGNRRKEQNVVR 182
Mg MVESPMKLTLRTLMKDFAQATYPVTLVCAGNRRKEQNVVR 194
Vf LVEKPFTITVRDLIETHDQLTYPVTLVCAGNRRKEQNIVR 180
Bf LVKKPFTLTLKDLLREYEQITVPITLVCAGNRRKEQNQVR 182
Af LVERPVVLNFRQILQKFNQITAPITLVCAGNRRKEQNTVR 165
Cl KTKGFFLGPHRLVGPPLWTGCAHRIPRLARPCPKRGARYV 226
Ma KSKGFSWGSAGL.STALWTGVALG.DLIAKAKPRRGARYV 220
Mg KTKGFSWGAAGL.STALWTGVPLG.DLLARAMPKRGARYV 232
Vf KSKGFSWGAAGL.STALWTGVPIG.ALLRIAKPKRGARYV 218
Bf KSKGFSWGAAGV.STALWTGVPMY.ELIRKAMPMRGAKYV 220
Af KSKGFSWGPAGL.STALFTGPLMA.DVLRYAKPLRQAKYV 203
Cl CLEGADKLPNGYYGTSIKLNWCMDRDRGVTVCYRMNGELL 266
Ma CFEGADKLPNGYYGTSVKLNWCLDPNRGIMVAHKMNGCVL 260
Mg YFEGADKLPNGYYGTSIKLNWVVDPNRGIMVAHRMNGEAL 272
Vf CFEGADKLPNGYYGTSVKLNWCLDENRGIMVAHKMNGQSL 258
Bf CMEGADKLPNGYYGTSLKLNWVMDPNRGIMVAHKMNGEML 260
Af CMEGADKLPNGYYGTSVKLNWAMDPNKLIMLAHKMNGEPL 243
Figura 6 – Alinhamento da proteína nitrato redutase de C. lindemuthianum com proteínas de outros fungos
filamentosos. Aminoácidos destacados em cinza são conservados. Os três domínios da proteína MoCo,
Heme e FAD estão sublinhados, respectivamente, com uma, duas ou três linhas. Aminoácidos destacados
em preto indicam resíduos conservados que foram mostrados serem importantes em experimentos de
mutagênese direcionada na proteína NIAD de
A. nidulans (Garde et al., 1995), e a seta indica o possível
íntron em
nit1 de C. lindemuthianum. Cl -C. lindemuthianum, Ma -M. anisopliae, Mg -M. grisea, Vf -V. fungicola, Bf -
B. fuckeliana e Af - A. fumigatus.
Continua...
xxxix
Cl PPDHGKPVRIIIPGQIGGRSVKWLKKIIVTKEPSSNWYHI 306
Ma HPDHGKPVRVVIPGQIGGRSVKWLKRITVTEKPSDNWYHI 300
Mg HPDHGKPLRIVIPGQIGGRSVKWLKRIVVTSEPSDNWYHI 312
Vf HPDHGKPVRIVIPGQIGGRSVKWLKKITITAEPSDNWYHI 298
Bf RPDHGKPLRAVVPGQIGGRSVKWLKKIIVTAAPSDNWYHI 300
Af RPDHGRPLRAVVPGQIGGRSVKWIKKLILTDAPSDNWYHI 283
Cl YDNRVLPTMVSPEASADLPDTWKDERYAIYDLNTNSVTAF 346
Ma YDNRVLPTMVTPEASADLPDTWKDERYAIYDLNTNSVICY 340
Mg YDNRVLPTMVTPEASADLPDTWKDERYAIYDLNTNSATCY 352
Vf YDNRVLPTTISPEASADLPNVWKDEKYAIYDLNVNSAICY 338
Bf YDNRVLPTMISPEQSANEPKWWTDERYAIYDLSTNSATAY 340
Af YDNRVLPTTVSPEMAASDPMWWRDERYAIYDLNVNSAAAY 323
Cl PAHDEVLSLVDGPKS.YRIRGYAYGGGGRRITRVELTLDR 385
Ma PAHNETL.LLNGDSSTYKVRGYAYGGGGKRITRIEVTLDK 379
Mg PAHDEKVPITAG.AGVYKFRGYAYAGGGKRVTRMEVTLDK 391
Vf PQHDELIMLESAPET.YKVRGYAYGGGGKRITRLEITLNK 377
Bf PEHEERLSLVSGQQT.YRAKGYAYGGGGRRVTRVEVTLDK 379
Af PQHNEVLDLATAGPS.YTAKGYAYAGGGRRVTRVEISLNK 362
Cl GKTWVLANVNYPEDEYR.FAPEGETLYGGRVDMDWRETWL 424
Ma GKTWRLANIDYPEDRYR.LAPDGERLYGGRVDMWWRETSF 418
Mg GKSWRLAKMIYPEDDYR.LASVDDTLYGGKVDLSWREASF 430
Vf GKSWLLAGIRYPEDDYR.RAPDGDVLYGGSTDMWWREACF 416
Bf GKSWALLDIRYHEDDYRDRAYENETLFGGKLDMEWRETCF 419
Af GKSWRLANIQYAEDRYR...DFDGELFGGKVDMPWRETCY 399
Cl LRGASGTLTCQVAQLADAADVMVRAMDEGMMVQPRDMYWS 464
Ma C.WCFWELDVDIGDLKTTTDIMVRAMDESLMVQPRDMYWS 457
Mg C.WCFWELDIPTTDLVAADDVMIRAMDDSMMVQPRDMYWS 469
Vf C.WCFWEIDIPVSDLCESDDMMIRAMDEGMMVQPRDMYWS 455
Bf T.WCFWEVDLDVQDLAMSGDIMVRAMDESMNVQPRDMYWS 458
Af C.WCFWSLDIPVPDLEASDALLVRSMDEAMSVQPRDMYWS 438
Cl VLGMMNNPWVRVIIHREGHSLRFEHPTQPMLGGGGWMERV 504
Ma VLGMMNNPWFRVVVHDIGHALQFEHPTQPALIPGGWMERI 497
Mg VLGMMNNPWYRVMIHKEGHDLRFEHPTQPALIPGGWMERV 509
Vf VLGMMNNPWFRVVIHRENGVLRFEHPTRPALQAGGWMERV 495
Bf VLGMMNNPWYRVTITKEGDYLRFEHPTQPALMPGGWMERV 498
Af VLGMMNNPWFRVTITKQNGTLLFEHPTHPVMAGG.WMERV 477
Cl KKAGGNLTNGFWGEKIEG.ESEN.TVSEEPFREICMTRES 542
Ma KKAGGNLTNGSWGEKLAG.QTED.VMGQEPEQDVCMTNPR 535
Mg KKAGGDLSNGFWGERVAGDEEESAAVAEEPANEICMTNPS 549
Vf KASGGNLANGFWGEKTSS.EAVE.A.PKEPEKDICMTNPK 532
Bf KSAGGNLANGFWGEKM.GTEDES.VALVEVKQEIKMTKDD 536
Af KKAGGDLTNGNWGERQEGEILAE....PEPVKEINMKKEG 513
Cl VKRVIAMDELRQHGGETDPWFVINGEVYDGTPFLEGHPGG 582
Ma ADRLVTMCELKSHSGEQEPWFIVDGQVYDGTPFLEGHPGG 575
Mg VNKTITLDELKAHDSESQPWFVVDGQVYDGIKFLEGHPGG 589
Vf IDRVIKLEELKAHSGETEPWFVIKGHVYDGTPYLDGHPGG 572
Bf VKREISIEELRQHDNEKEPWFVLNGEVYDGAPFLEGHPGG 576
Af LNRTISLEEFKKSNEEGAQWFIVKGEVYDGKPFLEGHPGG 553
Continua...
xl
Cl AASIFGAAGQDVSEEFVTIR.NENAKAMMPEYHIGSMDEA 622
Ma SASIFGAAGQDVTEEFVTIH.SENAKAMMPAYHIGKLDED 614
Mg AASIIGAAGQDCSEEFLTIH.SENAKAMMPEYHIGSLDEK 628
Vf ATSIINAAGQDTTEEFITIH.SENAKAMMPKYHIGTLDAA 611
Bf ATSITGAA.EDSTDEFMAIH.SETAKAMMPAYHIGTLSPS 614
Af AQSIISSIGLDVTEDFSEIH.SETAKAMMPDYHIGTMDEA 592
Cl GNKTLALGVVVED..DPEKRPRPVFLQSKAWTKGILNARR 660
Ma ALAQLS.GETNEC..DPS...RSVFLDSKVWTKATLQEKI 648
Mg SRSLLAEPESTQP..ESTE.PRPVFLQSRTWSKALLQEKI 665
Vf SLKALEGGDEDESVNDPT...RPVFLQPKTWSKAILKSKT 648
Bf AFTSLLNPEPLSS..SSQS.LRPIFLQPKSWQKAVLTAKK 651
Af SLKMLKEARKEEE...PSK.PRALFLQPRSWTKAKLAAKR 628
Cl MISSDTKIFTFSLQHPEQSIGLPVGQHLMMRLRDPVTREA 700
Ma SVSSDSKIFRFKLDHAEQEVGLPVGQHLMMRLRDPVTRES 688
Mg SVSGDSKIFSFKLDHAEQAIGLPVGQHLMMRLRDPATREA 705
Vf DVSSDSKIFSFRLDHPNQSIGLPTGQHLLMRLRDPATREA 688
Bf VISSDTRIFSFTLDHAEQVIGLPVGQHLMMRLRDPVTREA 691
Af DVSWDTRIFTFELEHQKQKLGLPIGQHMMIRVQDSTTKEK 668
Cl IIRAYTPISE.GSDKGKLHVLVKIYYDTPERKGGRMTQAL 739
Ma IIRAYTPISE.GTDRGCLDVLIKIYHGTPERRGGKMTQAL 727
Mg IIRAYTPLSDCVVEKGLLRVLVKIYYKSAGMEGGKMTQAL 745
Vf IIRAYTPLSE.THAKGQLDVLIKIYRDSPGQPGGKMTQAL 727
Bf IIRSYTPLSL.GTDKGVLDILIKIYLKNEKGPGGKMTMAL 730
Af IIRSYTPLSD.PNKEGSVDVLIKVYFPTPLVPGGKMTMAL 707
Cl DSIPLGHWVDFKGPVGKFEYLGGGLCSIAGKQRRVKRFVM 779
Ma DSIPVGHFVDFKGPVGKFEYLGRGLCSISGKPRHVSRFNM 767
Mg DHLPVGHWVDFKGPVGRFEYLGKGKCRVSGKERSVRRFIM 785
Vf DSIPLGHFIDIKGPVGKFEYIGRGQCTVSGVRRHVRRFIM 767
Bf ESIPVGHSIDFKGPIGKFEYVAKGECVIGGKKRRVKRFVM 770
Af DQLPLGSMIECKGPTGRFEYLGNGRVIISGKERRVRSFKM 747
Cl ICAGSGITPIFQVLRAVLKNVQ..DPTRCLVLDGNRVEED 817
Ma ICGGSGITPIFQVFRAMIKGAD..DSTECVILDGNRVEED 805
Mg ICGGSGVTPIFQVFRAVMQDKE..DQTRCLVLDGNRTEED 823
Vf ICAGSGVTPIFQVLRAVTSAAE..DETECLVLDGNRFEED 805
Bf ICGGSGVTPIFSVLRAVLNEEEVGGAPKCIVLDGNRREED 810
Af ICGGTGITPIFQVLRAVMQDPQ..DPTSCVVLFGNRQEED 785
Cl ILCREDLDDMASANPDRCRLLHTLSKPASSWTGLKGRIDA 857
Ma ILCRLELDQMASSAKHRCSLLHCLSRPSSTWEGRTGRIDK 845
Mg ILCKDELDKLAVGNEDRCRLVYSLSKPSESWTGAKGRMDR 863
Vf ILCKAELDAMVARAPSRTTVLYKLSRPTETWQGLRGRMNK 845
Bf ILCREELDDLVKGNEQRCRLVHALSQPTEEWKGLRGRLGK 850
Af ILCRAELDAFEASDKNKCKIVHTLSKAPDTWAGRRGRIGE 825
Cl AFLETEVGA.RR.SDSDGE...E...LVLVCGPEPLEKSV 889
Ma DLISSEIGS.PR.LDKD.....D...IVLVCGPEQMEKGV 875
Mg ALFEKELGV.SG.SNSQ.....D...MVLICGPESMEKSV 893
Vf DFLEESIGAFGK.SDGQ.....E...MVLVCGPGALEATV 876
Bf EVLEKEVGRFEMDMDGEGNGYRDGEQLVLICGPEALEKNV 890
Af ALLKEFAVP....DDES.........MVLICGPEAMENSA 852
Cl RSTL.LDLGWKGDDLLFF 898
Ma CETL.RVLGWPDENIVVF 892
Mg KQILTQELGWKDDDLLFF 911
Vf REVL.GGIGWKAEDLLFF 893
Bf HGIL.SDLGWKDQDILFF 907
Af KTIL.LAQGWKESNLHFF 869
xli
4.3. Análise filogenética da proteína nitrato redutase em C. lindemuthianum
A análise filogenética da proteína NIT1 de C. lindemuthianum foi realizada
por meio do alinhamento de diversas seqüências da proteína de diferentes
espécies de fungos e plantas. Os programas computacionais utilizados para o
alinhamento e a construção da árvore filogenética foram, respectivamente, o
ClustalX, empregando-se o método de neighbor-joining, e o PAUP*, versão 4.0. A
árvore filogenética consenso mostrada na Figura 7 apresenta índice de
consistência de 0,78, e os valores de bootstrap são baseados em 5.000 replicatas,
o que indica confiabilidade dos dados da análise filogenética. O alto índice de
consistência da árvore indica que os diferentes genes da nitrato redutase
analisados provavelmente tiveram origem em comum e, dessa forma, podem ser
ditos homólogos entre si. Ao observar essa árvore, nota-se uma clara divisão entre
grupos distintos diretamente correlacionados com a categoria taxonômica a qual
eles pertencem, refletindo, dessa maneira, sua possível história evolutiva.
Além disso, uma correlação pode ser feita entre as características do gene
da nitrato redutase de cada indivíduo e a divisão em grupos observada na árvore.
Pereira et al. (2004) e Zhou (1996) relataram o número de íntrons como
importante correlação no agrupamento de ascomicetos. É interessante notar que
todos os indivíduos do ramo onde A. fumigatus está presente possuem seis
íntrons em regiões conservadas e são correlacionados entre si, pertencendo à
mesma ordem taxonômica. Outro ramo de ascomicetos que se destaca na árvore
é o ramo em que B. funckeliana está presente. Nesse ramo estão os fungos que
apresentam nenhum ou apenas um íntron. Apesar de H. cylindrosporum e U.
maydis divergirem em relação ao número de íntrons, com 12 e nenhum intron,
respectivamente, a identidade na seqüência da proteína nitrato redutase foi
grande suficiente para estes serem agrupados em um mesmo ramo refletindo
assim, o táxon ao qual pertencem. Os fungos C. lindemuthianum e M. anisopliae,
que apresentam maior identidade na seqüência de aa da proteína nitrato redutase
ficaram próximos na árvore, como esperado.
xlii
Phytophthora infestans
Hebeloma cylindrosporum
Ustilago maydis
Tuber borchii
Botryotinia fuckeliana
Magnaporthe grisea
Colletotrichum lindemuthianum
Metarhizium anisopliae
Verticillium fungicola
Aspergillus fumigatus
Penicillium griseoroseum
Penicillium chrysogenum
Arabidopsis thaliana
Nicotiana tabacum
Aspergillus oryzae
Oomiceto
Basidiomiceto
Ascomiceto
Planta
Figura 7 – Analise filogenética da proteína nitrato redutase. A árvore enraizada foi baseada na
comparação da seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase de
C. lindemuthianum com
outros fungos filamentosos. Os valores em porcentagem de
bootstrap são mostrados em cada
ramo e baseados em 5.000 replicatas.
xliii
Muitas moléculas têm sido utilizadas para estudos filogenéticos em
espécies de fungos, entretanto, nem todas as moléculas possuem igual valor na
análise de eventos evolutivos e nas relações filogenéticas. Segundo Zhou e
Kleinhofs (1996), a molécula a ser utilizada deve ser suficientemente grande e
consistir de um número razoável de unidades funcionais, as quais, de alguma
forma devem ser independentes uma das outras no sentido evolutivo. Baseado
nessas especificações, a proteína nitrato redutase pode ser usada para o estudo
da evolução molecular de plantas, fungos e bactérias. Os genes da nitrato
redutase têm evoluído a uma taxa constante e consistem de três domínios
altamente conservados separados por três regiões. Essas regiões têm evoluído a
taxas variáveis e, por conseqüência disso, podem ser utilizadas como ferramenta
para estudar as relações evolutivas entre grupos mais próximos ou distantes entre
si (Silva et al., 1995). Além disso, a presença de íntrons na seqüência do gene da
nitrato redutase e a conservação dos domínios funcionais (Campbell e Kinghorn,
1990) podem ser consideradas na analise se houve perda ou ganho de íntrons
durante a evolução.
4.4. Estudo da regulação do gene nit1 em C. lindemuthianum
Fungos filamentosos, de forma geral, apresentam forte regulação para a via
de assimilação do nitrato, por meio de reguladores positivos e negativos que
garantem a repressão metabólica quando fontes primárias de nitrogênio como
glutamina ou amônio estão presentes. Para verificar se em C. lindemuthianum
ocorre regulação dessa via, experimentos de indução e repressão do gene da
nitrato redutase foram feitos, e RT-PCR semiquantitativo utilizando 23 ciclos de
amplificação (na fase logarítmica de amplificação) foi empregado para avaliar a
presença de transcritos do gene nit1 nas diferentes condições de cultivo a que o
fungo foi submetido. Os resultados da análise de seqüência da região promotora
desse gene já trouxeram indícios de que o gene nit1 podia ser regulado de
maneira positiva, uma vez que cis-elementos consensos para a ligação de
reguladores positivos foram encontrados.
xliv
A transcrição do gene nit1 de C. lindemuthianum é ativada por NaNO
3
e
reprimida por glutamina, NH
4
+
e uréia (Figura 8). Neste experimento foram
utilizados os oligonucleotídeos CLPcr1 e Niacol-2 (Tabela1) que flanqueiam o
íntron do gene nit1 e são capazes de amplificar uma região genômica de 491 pb.
No cDNA, o tamanho da região amplificada foi menor, o que comprova a presença
do íntron nessa região. Nos experimentos de repressão, onde o micélio do fungo
foi crescido em meio mínimo (MM) contendo nitrato como única fonte de nitrogênio
e a glutamina foi adicionada nos tempos de 0, 5, 15, 60 e 360 minutos (Haas et al.,
1996), não houve diferença na quantidade de cDNA amplificado nos tempos de 0
e 5 minutos, uma vez que as bandas obtidas por meio da amplificação dele estão
semelhantes. No tempo de 15 minutos após a adição de glutamina, é perceptível
uma redução na quantidade de cDNA amplificado, o que indica uma menor
transcrição do gene nessa condição. Nos tempos de 60 e 360 minutos, não foi
possível detectar a presença de cDNA amplificado (Figura 8A). Resultados
semelhantes foram obtidos por Haas et al. (1996) e Pereira et al. (2004), ao
estudarem a regulação do gene da nitrato redutase para nos fungos P.
chrysogenum e P. griseoroseum. Em N. crassa, a meia-vida estimada para o
mRNA nit-3 foi de apenas 5 minutos (Okamoto et al., 1991). Essa acentuada
queda no nível de mRNA do gene da nitrato redutase é um mecanismo que
permite à célula rápida resposta à condição nutricional do meio e garante grande
economia em termos de energia, visto que ocorre a assimilação de uma fonte de
nitrogênio mais prontamente metabolizável. Em N. crassa, a atividade da enzima
NIT-3 cai relativamente rápida em micélio crescendo em fontes de nitrogênio
primárias, sendo a meia-vida da atividade da enzima de cerca de 15 minutos
(Okamoto et al., 1991). Segundo esses autores, esse declínio relativamente rápido
da atividade enzimática ajuda a assegurar o uso preferencial das fontes de
nitrogênio primárias.
xlv
Figura 8 – Análise por RT-PCR da transcrição do gene nit1 de C. lindemuthianum. A) Análise da
repressão do gene feita a partir de micélio cultivado em meio contendo nitrato como única fonte de
nitrogênio e coletado após a adição de glutamina nos tempos indicados sobre cada canaleta.
Repressão também foi analisada em micélios cultivados em NH4
+
e uréia. B) Análise da ativação
do gene feita a partir de micélios cultivados em glutamina e coletados após a transferência para
meio contendo nitrato como única fonte de nitrogênio nos tempos indicados sobre as canaletas.
Controles internos positivos para a detecção da presença de cDNA em cada reação de RT foram
feitos por meio da amplificação do cDNA com os oligonucleotídeos EF1 e EF2 que amplificam uma
região de aproximadamente 400 pb do gene constitutivo que codifica para o fator de elongação
ribossomal.
400 pb
400 pb
A)
B)
Glutamina
C
0’
5’
15’
60’
360’
NH
4
+
Uréia
36hs
36hs
491 pb
Glutamina
NH
4
+
Uréia
36hs
36hs
C
0’
5’
15’
60’
360’
491 pb
C
0’
5’
15’
60’
360’
NaNO
3
491 pb
C
0’
5’
15’
60’
360’
NaNO
3
491 pb
xlvi
Nos experimentos de ativação do gene nit1, o micélio do fungo foi cultivado
em glutamina por 36 horas e transferido para MM contendo nitrato como única
fonte de nitrogênio nos tempos de 0, 5, 15, 60 e 360 minutos (Haas et al., 1996).
No tempo 0, ou seja, antes da transferência do micélio para o MM contendo nitrato
como única fonte de nitrogênio, não foi observado qualquer produto de
amplificação, indicando que o gene não foi expresso nessa condição como
aconteceu nos tempos de 60 e 360 minutos após a adição de glutamina nos
experimentos de repressão do gene. No tempo de 15 minutos, já foi verificada
uma banda de amplificação indicando a expressão do gene nit1. Uma rápida
resposta a essa condição também é reportada para N. crassa (Okamoto et al.,
1991), P. chrysogenum (Haas et al., 1996) e P. griseoroseum (Pereira et al.,
2004). Em N. crassa, em apenas 15 minutos de indução por NO
3
-
a quantidade de
mRNA nit-3 é máxima, sendo que a atividade da proteína NIT-3 aumenta
rapidamente nos primeiros 15-20 minutos, atingindo um nível máximo a 60
minutos (Okamoto et al., 1991). No tempo de 60 minutos após a transferência para
o meio MM com nitrato, transcritos do gene nit1 foram observado numa condição
quase máxima, tendo atingindo esse estado aos 360 minutos.
Como visto, a regulação do gene nit1 de C. lindemuthianum parece não
diferir da regulação para esse gene em outros fungos filamentosos, concluindo-se
ser esse um mecanismo geral e importante para evitar gastos energéticos
desnecessários. A única exceção para esse tipo de mecanismo de regulação do
gene da nitrato redutase descrito na literatura é o H. cylindrosporum, que quando
cultivado em fontes de nitrogênio, como uréia, serina e glicina, apresenta altas
taxas de transcritos do gene da nitrato redutase, sugerindo a presença de um
regulador geral e a possível ausência de fatores de transcrição específicos para a
ativação desse gene. Jargeat et al. (2000) sugerem que fatores homólogos a
nirA/nit4 poderiam estar presentes, porém expressos de forma constitutiva,
mascarando o requerimento de nar1 para indução. O interessante é que outros
basidiomicetos, como U. maydis (Banks et al., 1993) e Crinipellis perniciosa (Silva
et al., 1995), apresentam regulação para o gene da nitrato redutase similar à dos
outros fungos.
xlvii
5. Conclusões
A caracterização do gene nit1 de C. lindemuthianum indicou que a região
estrutural desse gene possui 2.787 pb em tamanho com um único íntron
localizado a partir do nucleotídeo 1.808 e que apresenta tamanho de 69 pb. A
seqüência de aminoácidos deduzida a partir da ORF desse gene revelou uma
proteína com 905 aminoácidos e massa molecular estimada de 101,1 KDa. Essa
proteína demonstrou alta similaridade com a mesma proteína de outros fungos
ascomicetos, como: Beauveria bassiana, Fusarium oxysporum, Gibberella
fujikuroi, Metarhizium anisopliae e Verticillium fungicola. Além disso foram
localizadas na região reguladora deste gene quatro seqüências TATC, que são
sítios de ligação da proteína reguladora geral positiva e uma seqüência
CTCCGTGT, que é um possível sítio da ligação da proteína reguladora positiva
específica para a via de assimilação do nitrato. A presença desses cis-elementos
na região promotora do gene nit1 foi indicativo de uma possível regulação desse
gene em C. lindemuthianum, como acontece com outros fungos relacionados, e
que foi comprovada com os experimentos de regulação. Esses experimentos
evidenciaram que transcritos do gene da nitrato redutase de C. lindemuthianum
não puderam ser detectados quando o fungo foi cultivado em meio contendo NH
4
+
,
ou uréia, como únicas fontes de nitrogênio e que bastaram 15 minutos após a
repressão do gene com glutamina para que a quantidade do transcrito do gene
xlviii
diminuísse praticamente pela metade, 15 minutos também foi o tempo que levou
para que transcritos do gene pudessem ser detectados durante a indução do gene
com NaNO
3
.
As características de seqüência do gene nit1, a alta identidade de sua
proteína deduzida com a proteína de outros fungos e o modelo de regulação que
ele apresenta levam a conclusão de que esse gene é altamente conservado
quando comparado com o gene da nitrato redutase de outros fungos e que a via
de assimilação do nitrato em C. lindemuthianum aparentemente é semelhante à
de outros fungos, o que comprova, de forma geral, que a repressão metabólica do
nitrogênio nesses organismos é regra.
xlix
5. Referências Bibliográficas
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