( PDF ) Atividade biológica de Lentinula edodes e produção de shiitake em substrato enriquecido com selênio

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REGIANE GONÇALVES FEITOSA LEAL NUNES

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Lentinula edodes E PRODUÇÃO DE

SHIITAKE EM SUBSTRATO ENRIQUECIDO COM SELÊNIO

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

graduação em Microbiologia Agrícola,

para obtenção do título de Doctor

Scientiae

VIÇOSA

MINAS GERAIS - BRASIL

2005

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Milhares de livros grátis para download.

Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

Nunes, Regiane Gonçalves Feitosa Leal, 1966-

N972a Atividade biológica de Lentinula edodes e produção de

2005 shiitake em substrato enriquecido com selênio. / Regiane

Gonçalves Feitosa Leal Nunes. – Viçosa: UFV, 2005.

xv, 127f. : il. ; 29cm.

Inclui apêndices.

Orientador: Maria Cristina Dantas Vanetti.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Viçosa.

Inclui bibliografias.

1. Cogumelos shiitake – Efeito de selênio. 2. Cogume-

los shiitake – Crescimento. 3. Cogumelos shiitake – Es-

curecimento enzimático. 4. Lentinula edodes. I. Univer-

sidade Federal de Viçosa. II.Título.

CDD 22.ed. 635.8

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REGIANE GONÇALVES FEITOSA LEAL NUNES

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Lentinula edodes E PRODUÇÃO DE

SHIITAKE EM SUBSTRATO ENRIQUECIDO COM SELÊNIO

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-graduação

em Microbiologia Agrícola, para

obtenção do título de Doctor Scientiae

APROVADA: 18 de março de 2005

________________________________ ________________________________

Prof. Maurício Dutra Costa Dra. Virgínia Maria Chaves Alves

(Conselheiro)

_________________________________ ________________________________

Prof

Neuza Maria Brunoro Costa Prof. Eustáquio Souza Dias

_________________________________

Profª Maria Cristina Dantas Vanetti

(Orientadora)

iii

Aos meus pais, Benjamim e Rda Gonçalves

Aos meus irmãos, Régio Luís, Ricardo Wagner, Regina Fátima e Reginaldo

Pelo apoio e incentivo constantes

Ao meu esposo, Luis Alfredo

“Que me completa”

As minhas filhas, Carolina, Camila e Cecília

“Que dão sentido à minha vida”

DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela minha existência e por se fazer presente em todos os momentos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pelo auxílio financeiro com a concessão de bolsa em nível de Doutorado.

À Universidade Federal de Viçosa (UFV), em especial ao Departamento de

Microbiologia, pela oportunidade de realização do Doutorado.

À professora Maria Cristina Dantas Vanetti, pelos ensinamentos, incentivo e

precisa orientação.

À professora Maria Catarina Megumi Kasuya por está sempre à disposição

em colaborar para o andamento deste trabalho e pelas valiosas sugestões.

Ao professor Maurício Dutra Costa pelas sugestões e ensinamentos que

foram de extrema importância na realização deste trabalho.

Aos demais professores do Departamento de Microbiologia, pelos valiosos

ensinamentos.

A Doutora Virgínia Maria Chaves Alves, a professora Neuza Maria Brunoro

Costa do Departamento de Nutrição, a professora Margarida Matos de Mendonça da

Universidade Federal de Santa Catarina e ao professor Eustáquio Souza Dias da

Universidade Federal de Lavras pelas valiosas sugestões.

À Ângela Sayaka Higuchi, a quem eu tenho enorme gratidão, que tornou meu

trabalho menos árduo com sua presença e ajuda constantes.

Ao Rodrigo de Barros Freitas, pela sua preciosa ajuda, apoio e estímulo

durante a realização dos trabalhos no laboratório.

A todos os colegas do Laboratório de Associações Micorrízicas pela alegre

convivência, em especial a Cristiane Santana, pela presteza em colaborar no

andamento deste trabalho, ao Akihiko Manabi pelo apoio e ajuda quando necessário

e a Daniela Campos pelo apoio constante e a todos os colegas do curso pelo

companheirismo.

A todos os funcionários do Departamento de Microbiologia, sem distinção,

por estarem sempre prontos a colaborar.

A minha querida amiga Silvia Rosane Colodeti Yokota, pela maravilhosa

convivência, pelo incentivo e apoio constantes.

A Selene pela calorosa acolhida, pelo apoio e incentivo. Ao Paulo Henrique

pelo apoio e colaboração constantes. A Cláudia Macedo pelos momentos de

descontração, pelo incentivo e ajuda. A Mauren, Ivaneide e Gisele pela amizade.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho,

a minha sincera gratidão.

ÍNDICE GERAL

Página

LISTA DE TABELAS viii

LISTA DE FIGURAS ix

RESUMO xii

ABSTRACT xiv

REVISÃO DE LITERATURA 1

1. IMPORTÂNCIA DO SELÊNIO PARA O ORGANISMO HUMANO 1

2. SUPLEMENTAÇÃO DE ALIMENTOS COM SELÊNIO 7

2.1. Enriquecimento de cogumelos com selênio 7

3. COGUMELO SHIITAKE 10

4. EFEITO DO SELÊNIO SOBRE FUNGOS FILAMENTOSOS 12

4.1. Efeito do selênio sobre a atividade enzimática de fungos produtores de

cogumelos

4.2. Efeito do selênio sobre a morfologia dos fungos 14

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 16

CAPÍTULO 1 - CRESCIMENTO E MORFOLOGIA MICELIAL DE Lentinula

edodes CULTIVADO EM SUBSTRATOS COM DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE SELENITO DE SÓDIO

1. INTRODUÇÃO 28

2. MATERIAL E MÉTODOS 30

2.1. Crescimento de L. edodes em meios de cultura com diferentes concentrações de

selênio

2.2. Morfologia micelial 31

2.3. Análise estatística 32

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 33

3.1. Crescimento de L. edodes em meios de cultura com diferentes concentrações de

selênio

3.2. Morfologia da colônia 40

3.3. Morfologia micelial 42

4. CONCLUSOES 45

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46

vii

CAPÍTULO 2 - ATIVIDADES ENZIMÁTICA E RESPIRATÓRIA DO FUNGO

Lentinula edodes CULTIVADO EM SUBSTRATO

LIGNINOCELULÓSICO COM DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE SELENITO DE SÓDIO

1. INTRODUÇÃO 49

2. MATERIAL E MÉTODOS 52

2.1. Atividade enzimática específica 52

2.1.1. Lacase 52

2.1.2. Celulase 53

2.1.3. Xilanase 54

2.2. Atividade respiratória 54

2.3. Análise estatística 55

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 56

3.1. Atividade enzimática específica 56

3.2. Atividade respiratória 63

4. CONCLUSÕES 68

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69

CAPÍTULO 3 - ENRIQUECIMENTO DE COGUMELO SHIITAKE (Lentinula

edodes) COM SELÊNIO

1. INTRODUÇÃO 75

2. MATERIAL E MÉTODOS 77

2.1. Isolados e inóculo 77

2.2. Enriquecimento de cogumelo shiitake com Se 77

2.3. Análises físico-químicas do substrato ligninocelulósico e da água de

umidificação desse substrato

2.4. Análises físico-químicas do cogumelo 78

2.4.1. Tamanho 79

2.4.2. Cor 79

2.4.3. Umidade 79

2.4.4. Proteínas solúveis 79

2.4.5. Minerais e selênio 80

2.5. Produtividade 80

2.6. Eficiência biológica 80

2.7. Análise estatística 80

viii

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 81

3.1. Análises físico-químicas do substrato ligninocelulósico e da água de umidificação

desse substrato

3.2. Análises físico-químicas do cogumelo 81

3.3. Produtividade 89

3.4. Eficiência biológica 90

4. CONCLUSÕES 92

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 93

APÊNDICE 99

LISTA DE TABELAS

TABELAS Página

Revisão de Literatura

Tabela 1 – Ingestão Diária Recomendada dos elementos traços durante o

ciclo de vida de uma pessoa

Capítulo 3

Tabela 1 – Eficiência Biológica de cogumelos shiitake enriquecidos com

Se, produzidos pelos isolados UFV16 e UFV52 em toras

artificiais imersas em 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem Se

LISTA DE FIGURAS

FIGURAS Página

Capítulo 1

Figura 1 – Curvas de crescimento de 12 isolados do fungo L. edodes UFV11,

UFV16, UFV53, UFV62, UFV63, UFV73, UFV74, UFV75, UFV78,

UFV80, UFV81, UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC, em BDA

acrescido de quatro concentrações de selenito de sódio, A= 0,32 mmol

-1

; B= 0,64 mmol L

-1

; C= 0,96 mmol L

-1

; D= 1,28 mmol L

-1

e E=

controle sem selênio

Figura 2 – Aspecto das colônias do isolado UFV53 cultivado, a 25 ºC por 12 dias,

em BDA (A) ou em substrato ligninocelulósico (B) com concentrações

crescentes de selenito de sódio

Figura 3 – Curvas de crescimento de 12 isolados do fungo L. edodes, UFV11,

UFV16, UFV53, UFV62, UFV63, UFV73, UFV74, UFV75, UFV78,

UFV80, UFV81, UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC, em substrato

ligninocelulósico acrescido de quatro concentrações de selenito de

sódio, A= 0,32 mmol L

-1

; B= 0,64 mmol L

-1

; C= 0,96 mmol L

-1

;

D= 1,28 mmol L

-1

e E= controle sem selênio

Figura 4 – Taxas específicas de crescimento de 12 isolados do fungo L. edodes,

UFV11, UFV16, UFV53, UFV62, UFV63, UFV73, UFV74, UFV75,

UFV78, UFV80, UFV81, UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC,

em BDA (A) ou em substrato ligninocelulósico (B) acrescidos de

quatro concentrações de selenito de sódio e controle sem selênio

Figura 5 – Massa seca de 12 isolados do fungo L. edodes, UFV11, UFV16,

UFV53, UFV62, UFV63, UFV73, UFV74, UFV75, UFV78, UFV80,

UFV81, UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC, em BDA

acrescido de quatro concentrações de selenito de sódio e controle sem

selênio

Figura 6 – Aspecto da colônia do isolado UFV74 de L. edodes cultivado, por 12

dias a 25 °C, em substrato ligninocelulósico não adicionado (controle)

ou adicionado de 0,32 mmol L

-1

de selenito de sódio

Figura 7 – Distribuição dos pares de núcleos no micélio do isolado UFV11,

cultivado por 6 dias a 25 ºC, em BDA acrescido de quatro

concentrações de selenito de sódio, A= 0,32 mmol L

-1

(100x);

B= 0,64 mmol L

-1

(100x); C= 0,96 mmol L

-1

(100x); D= 1,28 mmol

-1

(100x) e E= controle sem selênio (100x). As setas exemplificam

alguns núcleos onde suas distâncias foram determinadas

Figura 8 - Diâmetro das hifas (A), distância entre septos (B), distância entre núcleos

cultivados em BDA com diferentes concentrações de selenito de sódio

Capítulo 2

Figura 1 - Atividade enzimática da lacase dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e

21 dias, em diferentes concentrações de selenito de sódio e controle sem

selênio

Figura 2 - Atividade enzimática da celulase dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e

21 dias, em diferentes concentrações de selenito de sódio e controle sem

selênio

Figura 3 - Atividade enzimática da xilanase dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e

21 dias, em diferentes concentrações de selenito de sódio e controle sem

selênio

Figura 4 - Atividade respiratória medida do quinto ao décimo segundo dia de

crescimento, dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e (C) UFV53 do

fungo L. edodes, cultivados a 25 ºC, em substrato ligninocelulósico

acrescido de 0,32 mmol L

-1

; 0,64 mmol L

-1

; 0,96 mmol L

-1

; 1,28 mmol

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Figura 5 - Atividade respiratória medida do décimo ao décimo sétimo dia de

crescimento, dos isolados (A) UFV11 (B) UFV16 e (C) UFV53 do

fungo L. edodes, cultivados a 25 ºC, em substrato ligninocelulósico

acrescido de 0,32 mmol L

-1

; 0,64 mmol L

-1

; 0,96 mmol L

-1

; 1,28 mmol

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Figura 6 - Atividade respiratória acumulada, medida do quinto ao décimo segundo

dia de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L.

edodes, cultivados, a 25 ºC, em substrato ligninocelulósico

Figura 7 - Atividade respiratória acumulada medida do décimo ao décimo sétimo dia

de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L.

edodes, cultivados a 25 ºC, em substrato ligninocelulósico

Capítulo 3

Figura 1 – Valores L (A), a (B) e b (C) referentes à cor dos cogumelos shiitake

produzidos pelos isolados UFV16 e UFV52 em toras artificiais imersas

em diferentes concentrações de selenito de sódio

Figura 2 – Teor de umidade dos cogumelos shiitake produzidos pelos isolados

UFV16 e UFV52, em toras artificiais imersas em diferentes

concentrações de selenito de sódio

xii

Figura 3 – Teor de Ca (A), Mg (B), P (C) e K (D) dos cogumelos shiitake

produzidos pelos isolados UFV16 e UFV52 em toras artificiais imersas

em diferentes concentrações de selenito de sódio

Figura 4 – Teor de selênio dos cogumelos shiitake produzidos pelos isolados

UFV16 e UFV52 em toras artificiais imersas em diferentes

concentrações de selenito de sódio

Figura 5 – Produtividade dos cogumelos shiitake produzidos pelos isolados UFV16

e UFV52 em toras artificiais imersas em diferentes concentrações de

selenito de sódio

xiii

RESUMO

NUNES, Regiane Gonçalves Feitosa Leal, D.S. Universidade Federal de Viçosa,

março de 2005. Atividade biológica de Lentinula edodes e produção de

shiitake em substrato enriquecido com selênio. Orientadora: Maria Cristina

Dantas Vanetti. Conselheiros: Maria Catarina Megumi Kasuya, Maurício Dutra

Costa e Margarida Matos de Mendonça.

O enriquecimento do cogumelo shiitake com selênio (Se) pode ser uma

alternativa para elevar seu valor nutricional e funcional. O objetivo deste trabalho foi

avaliar o efeito do Se sobre o crescimento e atividade biológica do fungo Lentinula

edodes e produzir shiitake enriquecido com esse elemento. O crescimento de doze

isolados de L. edodes, cultivados em ágar batata dextrose (BDA) e em substrato

ligninocelulósico, contendo 0,32; 0,64; 0,96; 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e

controle sem Se, variou com o substrato, com o isolado e com a concentração de Se.

A matéria seca fúngica da maioria dos isolados cultivados em BDA diminuiu com o

aumento da concentração de Se no meio de cultivo. Foram selecionados os isolados

UFV11, UFV16 e UFV53, para continuidade do estudo, com base no crescimento da

colônia, na biomassa seca e no potencial de produção de cogumelos. Os diâmetros

das hifas, as distâncias entre septos e entre núcleos tenderam a diminuir nas maiores

concentrações de Se. A atividade da lacase foi crescente com o aumento da dose de

selenito de sódio enquanto que as atividades da celulase e xilanase diminuíram. A

taxa respiratória acumulada variou com o isolado e foi maior no isolado UFV11. A

morfologia e o tamanho dos cogumelos, cultivados em substratos enriquecidos com

0,08; 0,16 e 0,32 mmol L

-1

de selenito de sódio, não variaram com a presença de Se e

nem entre os isolados. Os valores de L, a e b, referentes à cor dos cogumelos foram

menores nos tratamentos com Se quando comparados com o controle. O teor de

umidade dos cogumelos variou de 89 a 91 % e aumentou na maior dose de Se. Os

xiv

valores de proteínas solúveis foram em média 22,3 mg g

-1

de matéria seca e não

variaram com a presença de Se e nem com o isolado. Os teores de cálcio e de fósforo

não variaram com o aumento da concentração de Se enquanto que os de magnésio

tenderam a aumentar e os de potássio a diminuir. As concentrações de Se dos

cogumelos aumentaram linearmente com o aumento da dose de selenito de sódio,

sendo encontrado valores superiores a 17 mg 100 g

-1

de cogumelos desidratados no

tratamento com 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio. Nos cogumelos do tratamento

controle não foi detectado Se. A produtividade dos cogumelos aumentou até a

concentração 0,32 mmol L

-1

de selenito de sódio. O isolado UFV16 foi o que

apresentou maior eficiência biológica em doses mais elevadas de Se.

ABSTRACT

NUNES, Regiane Gonçalves Feitosa Leal, D.S. Universidade Federal de Viçosa,

March 2005. Biological activity of Lentinula edodes and mushroom

production in substrate enriched by Selenium. Adviser: Maria Cristina Dantas

Vanetti. Committee Members: Maria Catarina Megumi Kasuya, Maurício Dutra

Costa and Margarida Matos de Mendonça.

Enrichment of shiitake mushroom by selenium (Se) can be an alternative to

elevate it nutritional and functional value. The objective of this work was to evaluate

the effect of Se on the growth and biological activity of fungus Lentinula edodes and

to produce shiitake enriched with that element. The growth of 12 isolates of L.

edodes, cultivated in Potato Dextrose Agar (PDA) and in ligninocelulosic substrate,

containing 0.32; 0.64; 0.96; 1.28 mmol L

-1

of sodium selenite and control without Se,

varied according to substrate, to fungus isolate and to Se concentration. Fungal dry

matter of most of the isolates cultivated in PDA decreased with the increase of the Se

concentration in the cultivation medium. Isolates UFV11, UFV16 and UFV53 were

selected, for the continuity of the study, based in the growth of the colony, in the dry

biomass and in the potential of mushrooms production. Hyphae diameters, distances

between septa and between nuclei tended to decrease in higher Se concentrations.

Laccase activity was growing with the increase of sodium selenite while celulase and

xilanase activities decreased. The accumulated respiratory rate varied with the isolate

and was higher in Isolate UFV11. Mushrooms morphology and size, cultivated in

substrate enriched with 0.08; 0.16 and 0.32 mmol L

-1

of sodium selenite, did not

varied according to Se concentration and neither among isolates. L, a and b values,

regarding the mushroom’s color were lower in treatments by Se compared with

control. Mushrooms humidity varied from 89 to 91% and increased in the higher Se

xvi

concentration. Soluble proteins were 22.3 mg g

-1

of dry matter on average and did

not varied with Se presence neither among isolate. Calcium and phosphorus did not

varied with the increase of Se concentration while magnesium tended to increase and

potassium to decrease. Se concentrations of the mushrooms increased lineally with

the increase of the sodium selenite, being found values above to 17 mg 100 g

-1

mushrooms dehydrated in the treatment with 0.64 mmol L

-1

sodium selenite. In the

mushrooms of the treatment control Se was not detected. Mushroom productivity

increased until 0.32 mmol L

-1

sodium selenite. Isolate UFV16 was the one presented

greater biological efficiency in higher Se concentration.

REVISÃO DE LITERATURA

1. IMPORTÂNCIA DO SELÊNIO PARA O ORGANISMO HUMANO

A utilização de nutrientes pelo organismo é comprometida pela deficiência de

vitaminas e de minerais. Os minerais desempenham funções importantes nas células,

seja na forma iônica ou como constituintes de compostos vitais (Mahan e Escott-

Stump, 2002). Os autores afirmam que de modo geral, os minerais regulam a

atividade de diversas enzimas, mantêm o equilíbrio ácido-básico, a pressão osmótica,

facilitam a transferência de compostos essenciais através das membranas, mantêm a

estabilidade muscular e nervosa e, em alguns casos, fazem parte dos elementos

constituintes dos tecidos do organismo. A ingestão inadequada desses elementos

pode impedir a função celular ou causar doenças. A carência de nutrientes como

ferro (Fe), iodo (I), zinco (Zn), cálcio (Ca), vitaminas A e B

prejudica a nutrição, a

saúde, a resistência às infecções, o desenvolvimento físico, o aprendizado e a

capacidade de trabalho de seus portadores (Neumann et al., 2002) e a deficiência

de selênio (Se) pode levar a formação de câncer, doenças cardiovasculares e muitas

outras doenças endêmicas (Min et al., 2004). A baixa ingestão de Se tem sido

relacionada com o aumento da incidência de várias doenças (Pagmantidis et al.,

2005).

O Se é um micronutriente essencial em baixas concentrações (μg), mas é

tóxico ao homem e animais em altas doses (Brätter et al., 1984; Simonoff e

Simonoff, 1991; Viñas et al., 2005). Recentemente, o Se tem despertado interesse na

pesquisa médica e nutracêutica, bem como na indústria de alimentos (Werner e

Beelman, 2002). É um mineral presente em todas as células e em todos os tecidos do

organismo animal, em concentrações que variam com o tecido e a forma química do

elemento na dieta (Martin, 1993). Quimicamente, é classificado como metalóide,

com propriedades tanto de metal como de não metal. Está diretamente relacionado

com o enxofre (S) em estrutura e função e forma compostos inorgânicos, como o

selenito e o selenato e compostos orgânicos, como os selenoaminoácidos, que

correspondem aos sulfitos, sulfatos e aminoácidos sulfurados (Reilly, 1998).

Os sais de Se inibem a peroxidação de lipídios e, desta forma, atuam na

proteção da integridade das membranas biológicas, das mitocôndrias, de

microssomos e de lisossomos (Martin, 1993). Participa, ainda, juntamente com o

tocoferol, na proteção das células e organelas contra lesões oxidativas, possibilitando

a união entre o oxigênio e hidrogênio no final da cadeia respiratória, na transferência

de íons através das membranas celulares e auxilia a síntese de imunoglobulinas e

ubiquinona (Mahan e Escott-Stump, 2002; Czajka-Narins, 1995).

Tolonen (1990) atribuiu ao Se as seguintes funções e importância fisiológica:

imunidade orgânica, prevenção de mutações e neoplasias e inibição da agregação

plaquetária, além de ser antioxidante. A atividade biológica do Se se deve à ação de

selenoenzimas. Embora o Se tenha numerosas funções fisiológicas, sua função mais

conhecida é como cofator necessário ao sistema glutationa peroxidase, responsável

pela remoção dos radicais livres do organismo, reduzindo o dano oxidativo. O Se

participa da estrutura de alguns aminoácidos, como os sulfurados, que são

precursores da glutationa peroxidase (GSH-Px) (Martin, 1993).

Diversas funções biológicas importantes do Se dependem da atividade de

certas proteínas contendo esse elemento. As primeiras selenoproteínas funcionais

identificadas foram as enzimas GSH-Px, que são parte do sistema de defesa

antioxidante do corpo (Reilly, 1998). O autor afirma que a função destas enzimas é

degradar peróxidos de hidrogênio e hidroperóxidos de lipídeo gerados por radicais

livres que podem danificar membranas celulares e interromper as funções das

células. Neste estudo foi informado que mais de 30 selenoproteínas foram

identificadas e suas estruturas, pelo menos em parte, determinadas, sendo que essa

variedade indica a larga gama de vias bioquímicas e funções fisiológicas para as

quais o Se contribui. O autor comenta que quando as estruturas e funções das

selenoproteínas se tornarem conhecidas, é provável que problemas clínicos que não

têm até agora sido relacionados ao Se, sejam revelados.

Doenças causadas pela deficiência de Se têm sido relatadas em muitos países

(Tinggi, 2003). A deficiência de Se causa a doença de Kaschim-Beck que afeta

juntas e cartilagens, aumentando o risco de doenças cardíacas e câncer (Tolonen,

1990; Werner e Beelman, 2002). O Se atenua os efeitos tóxicos do arsênio (Tolonen,

1990; Miyazaki, 2005) e pode também proteger contra imunossupressão relacionada

à idade (Turner e Finch, 1991).

Manifestações constatadas de deficiência de Se incluem mialgia, músculos

flácidos, miopatia cardíaca, aumento de fragilidade das células vermelhas sangüíneas

e degeneração pancreática (Mahan e Escott-Stump, 2002). Doenças relacionadas com

o funcionamento da glândula tireóide, doenças degenerativas (National Research

Council-NRC 1989) e outras, como artrite e diabetes também estão associadas com a

deficiência de Se no organismo humano (Reilly, 1998). Reilly (1998) considerou que

existe uma possível relação entre ingestão dietética de Se e doenças cardiovasculares

e câncer, pois há evidências de um efeito protetor do Se contra essas doenças em

humanos. Além disso, o Se parece desempenhar função importante no sistema imune

e na resposta do corpo a infecções.

Certos compostos derivados do Se vem sendo usados com sucesso no

tratamento de câncer (Gaso et al., 2000). Além disso, tem sido verificado que uma

dieta suplementada com Se pode inibir a incidência e o número de tumores que

ocorrem em vários modelos experimentais de câncer, em estudos epidemiológicos

usando cobaias em laboratório (Spolar et al., 1999). Sieja e Talerczyk (2004) e Sieja

e Talerczyk (2005) atribuíram à suplementação de Se, os benefícios observados em

mulheres em tratamento quimioterápico contra câncer de ovário. Neste estudo, foi

observado que a atividade antioxidante do Se é 200 % maior do que a da vitamina C,

que é considerada um excelente antioxidante. A suplementação com Se pode

aumentar a eficácia da substância usada em tratamento de câncer coloretal em estado

avançado (Altundag et al., 2005). A conseqüência mais severa da deficiência de Se

em humanos é a doença de Keshan, uma cardiomiopatia fatal que afeta crianças e

gestantes. Esta doença é prevalente em regiões da China, onde a ingestão média de

Se é da ordem de 3 μg/dia a 22 μg/dia, de acordo com Yang et al. (1983) e 4 μg/dia a

11 μg/dia de acordo com Robinson (1989).

Em crianças alimentadas com nutrição parenteral sem suplementação com Se,

foi observada redução no crescimento, peso elevado em relação à estatura,

despigmentação da pele e cabelos e perda de cabelos (Newly, 1989). Os dois últimos

problemas foram corrigidos com dois meses de tratamento constituído da

administração de 2 μg/kg de Se na forma de ácido selenoso.

A necessidade de Se pelo organismo está relacionada com o peso corporal. O

IOM (2000a) recomenda uma ingestão de 55 μg/dia para os norte-americanos adultos

do sexo masculino e feminino. Recomenda ainda, um acréscimo de 5 μg/dia durante

a gestação e 15 μg adicionais durante a lactação. Os requerimentos podem aumentar

quando se eleva o conteúdo de ácidos graxos insaturados na dieta em razão da

necessidade da atividade antioxidante do Se (Mahan e Escott-Stump, 2002).

A Ingestão Diária Recomendada (IDR) é a quantidade de vitaminas, minerais

e proteínas que deve ser consumida diariamente para atender às necessidades

nutricionais da maior parte dos indivíduos e grupos de pessoas de uma população

sadia. A IDR de Se (Tabela 1) do brasileiro toma como referências a Resolução

GMC nº 18/94 - Mercosul e Committee on Dietary Allowances, Food and Nutrition

Board. Recommended Dietary Allowances (RDA), 10

revised edition, National

Academy of Science (NAS), Washington D.C., 1989 (Brasil, 1998).

Robinson e Thomson (1983) verificaram que o Se foi absorvido sob

condições de alimentação normal no organismo humano, pois a absorção não é fator

limitante para a biodisponibilidade. Estudos que compararam o destino metabólico

do Se consumido na forma de sal, como selenito ou selenato ou na forma orgânica,

como selenometionina, mostraram que a forma química do Se ingerido afeta

diretamente seu metabolismo (Finley, 1999; Viñas et al., 2005). A selenometionina é

mais bem absorvida que o selenito e pode ser ativamente absorvida pelo mesmo

mecanismo da metionina e, presumivelmente, o mesmo é verdadeiro para a

selenocisteína (Robinson e Thomson, 1983). Este estudo comprovou que o selenito é

absorvido passivamente mas, rapidamente, evidenciando o seu aparecimento no

plasma 30 min após sua ingestão.

A selenometionina ingerida substitui a metionina em várias proteínas,

especialmente proteínas do músculo esquelético e, particularmente, quando grandes

doses de selenometionina são ingeridas. Entretanto, a extensão desta substituição

depende da proporção selenometionina/metionina na dieta e não parece estar sob

controle homeostático (Burk e Hill, 1993). Neste estudo foi ainda observado que a

selenometionina pode ser metabolizada a selenocisteína pelas vias da transaminação

da metionina e transsulfuração, quando quantidades adequadas de metionina estão

disponíveis.

Tabela 1 – Ingestão Diária Recomendada dos elementos traços durante o ciclo de

vida de uma pessoa

FERRO ZINCO IODO SELÊNIO GRUPO IDADE

(anos)

(mg/dia) (µg/dia)

Bebês 0 - 0,5

0,5 - 1,0

0,27

110

130

Crianças 1 - 3

4 - 8

Homens 9 - 13

14 - 18

19 - 30

31 - 50

51 - 70

> 70

120

150

Mulheres 9 - 13

14 - 18

19 - 30

31 - 50

51 - 70

> 70

120

150

Gestantes

≤ 18

19 – 30

31 - 50

220

Lactantes

≤ 18

19 – 30

31 - 50

290

FONTES: IOM (2000a); IOM (2000b)

Por meio da determinação da atividade da GSH-Px verificou-se que em

humanos, a selenometionina é absorvida e retida mais eficientemente que o selenato

ou selenito, pois as formas orgânicas de Se são melhor retidas do que o Se

inorgânico, embora todas as formas causaram aumentos similares na atividade da

GSH-Px (Levander, 1983). O selenato foi absorvido mais eficientemente que o

selenito, neste estudo, mas não foi tão efetivo para manter o Se no organismo. O

selenato pode compartilhar a mesma via de absorção do enxofre e tem uma absorção

de 95 % quando comparado ao selenito, com 62 % (Robinson e Thomson, 1983). O

Se orgânico parece ser prontamente armazenado por incorporação não específica

dentro do músculo esquelético enquanto o Se inorgânico pode não ser prontamente

armazenado, mas permanecer em um pool no corpo e ser utilizado na síntese

imediata de selenoproteínas funcionais (Daniels, 1996).

O metabolismo do Se, particularmente a reutilização da forma orgânica, está

intrinsecamente ligada ao metabolismo dos aminoácidos e depende, em grande parte,

da forma de Se ingerida ou usada como suplementação (Daniels, 1996). O

metabolismo do Se é também afetado pela quantidade de Se ingerido na dieta diária e

tais diferenças também estão parcialmente relacionadas à incorporação de Se nas

proteínas (Finley, 1999). De acordo com o autor, a forma de Se fornecido na dieta

também pode influenciar a propriedade anticarcinogênica desse elemento traço.

Alimentos marinhos, rins e fígado e, em menor quantidade, outras carnes, são

boas fontes de Se, enquanto que em grãos e outras sementes o teor de Se é variável e

depende do teor desse mineral no solo em que foram produzidos (WHO, 1987). Os

alimentos de origem vegetal contêm maior proporção de selenometionina que o

tecido animal. O teor de Se nos alimentos depende, em grande parte, de fatores

ambientais, incluindo o teor de Se do solo e a porosidade do mesmo (Geering et al.,

1988). De acordo com Ferreira (1995), o Se é um mineral deficitário na alimentação

básica do brasileiro, provavelmente, em razões das baixas concentrações desse

elemento nos solos do Brasil o que impossibilita que os alimentos tenham teores

suficientes para atender aos requerimentos humanos, inclusive, a população com

poder econômico mais elevado.

Os alimentos constituem a principal via de entrada dos elementos essenciais

ao homem e, o conteúdo de nutrientes destes, é um fator importante no seu valor

nutricional (Tannenbaum et al., 1993). Portanto, a adição de nutrientes aos alimentos

poderá constituir-se um procedimento recomendável para garantir o suprimento

nutricional adequado desses elementos.

2. SUPLEMENTAÇÃO DE ALIMENTOS COM SELÊNIO

Diversos produtos alimentícios suplementados com Se estão disponíveis no

mercado de certos países. Formulações infantis enriquecidas com Se são alimentos

funcionais ou alimentos produzidos para propósitos fisiológicos especiais (Reilly,

1998). Embora a forma química do Se nos alimentos seja o determinante primário da

sua absorção e subseqüente utilização pelo organismo humano (Levander, 1983),

vários fatores da dieta afetam a biodisponibilidade do Se ingerido (Coombs, 1988).

Dentre as substâncias que aumentam a disponibilidade desse elemento, estão:

metionina/proteína, vitamina E, concentrações elevadas de vitamina A,

antioxidantes, substâncias inibidoras incluindo metais pesados e dieta rica em

enxofre (Fairweather-Tait, 1997).

O enriquecimento de alimentos com Se pode reduzir a incidência de má

formação fetal e de doenças crônico-degenerativas, próprias da idade adulta, e

proporcionar maior resistência às infecções em indivíduos de todas as idades

(Ferreira, 1999). A modificação do conteúdo de Se dos alimentos também pode ser

uma estratégia efetiva para reduzir o risco de câncer em humanos (Spolar et al.,

1999).

2.1. Enriquecimento de cogumelos com selênio

Nos últimos anos, a produção e o consumo de cogumelos vêm aumentando e

ganhando destaque, em razão do reconhecimento das suas características nutricionais

e sensoriais e por apresentarem propriedades benéficas à saúde (Diez e Alvarez,

2001). A possibilidade da reciclagem de resíduos agrícolas e agroindustriais é outro

fator determinante no aumento do interesse no cultivo de cogumelos comestíveis e

medicinais.

A composição do substrato utilizado no cultivo dos fungos produtores de

cogumelos é fator importante na absorção de alguns nutrientes pelo fungo, mas

existem diferenças individuais na absorção desses elementos (Michelot et al., 1998).

O substrato usado para o cultivo de cogumelos, bem como seu estádio de

desenvolvimento e as condições pré e pós-colheita podem influenciar a composição

química e conseqüentemente, o valor nutricional dos cogumelos cultivados nesse

substrato (Bano e Rajarathnam, 1988; Bento, 2001). O acúmulo de um elemento,

essencial ou não, pelo fungo é atualmente uma questão relevante nos aspectos

relacionados à poluição ambiental, toxicologia de alimentos e, principalmente, do

ponto de vista nutricional (Kalac et al., 1996). Alguns estudos demonstraram que os

fungos são capazes de acumular P, K, Ca e metais pesados como cádmio (Cd),

chumbo (Cu) e mercúrio (Hg) presentes no substrato (Kalac et al., 1991). As análises

da composição química de cogumelos mostram grande variação de todos os

constituintes que pode ser causada por diferenças na espécie, substrato de cultivo e

estádio de desenvolvimento (Miles e Chang, 1997). Chang e Miles (1989),

comentaram que os cogumelos são fontes de minerais, pois estes são absorvidos

pelo micélio em crescimento e translocados para os corpos de frutificação.

Organismos como os fungos reduzem o Se biologicamente disponível a

formas insolúveis elementares ou produzem formas orgânicas voláteis de Se os quais

são perdidos na atmosfera (Girling, 1984). Os cogumelos têm alta capacidade de

acumular Se o que, em parte, depende da espécie (Simonoff e Simonoff, 1991) e

portanto, podem servir como uma fonte dietética de Se suprindo o organismo com

esse elemento traço essencial e escasso nas dietas.

Os cogumelos são fonte de Se, mas o conteúdo desse elemento é variável e

dependente do substrato usado no crescimento do fungo (Spolar et al., 1999; Kalac e

Svoboda, 2000). A análise da distribuição de Se no cogumelo Agaricus bisporus

mostrou que uma proporção desse elemento está localizada em (i) compostos

inorgânicos e orgânicos de baixa massa molecular enquanto pequenas proporções

estão localizadas em (ii) lipídeos e lipoproteínas, (iii) ácidos nucléicos e (iv)

proteínas, quitinas e polissacarídeos (Piepponen et al., 1990). Segundo Spolar et al.

(1999), a ingestão de cogumelos enriquecidos com Se pode suprimir a carcinogênese

experimental resultando em efeitos benéficos à saúde. Esses autores observaram que

a ingestão de cogumelos enriquecidos com Se altera, de forma benéfica, o processo

de formação de câncer. Portanto, o enriquecimento de cogumelos com Se, em

concentrações adequadas para que possam ser utilizados como alimentos funcionais

ou nutracêuticos, tem sido uma estratégia adotada (Spolar et al., 1998: Werner e

Beelman, 2001, 2002).

Durante o cultivo do fungo produtor de cogumelos, A. bisporus, foi

observado que compostos voláteis do Se podem ser adsorvidos ou absorvidos pelo

corpo de frutificação (van Elteren et al., 1998). Os resultados de enriquecimento de

A. bisporus com Se, mostraram o potencial destes cogumelos em absorver esse

elemento. A adição de Se na forma de selenito de sódio, nas concentrações 0,01g/L,

0,02 g/L e 0,05 g/L na água de irrigação resultou em cogumelos com concentrações

de Se que variaram de 3,58 mg/kg a 52,84 mg/kg do peso da matéria seca (Spolar et

al., 1998). Esses mesmos autores constataram que, nos cogumelos não enriquecidos

com Se, as concentrações de Se variaram de 0,60 mg/kg a 2,46 mg/kg de peso da

matéria seca. Werner e Beelman (2001) acrescentaram 3,0 mg/kg de selenito de

sódio ao composto para a produção de A. bisporus e obtiveram cogumelos com uma

concentração, em média, de 12,1 mg de Se por kg da matéria seca. A adição de 30,1

mg/kg; 82,5 mg/kg e 197,1 mg/kg de selenito de sódio ao composto seco resultou

em 89,4 mg/kg a 1.304 mg/kg de Se no cogumelo A. bisporus (Werner e Beelman,

2002). Quando se adicionou Se ao inóculo de A. bisporus, observou-se aumento da

concentração deste elemento no cogumelo (Werner e Beelman, 2001) mas, quando o

Se foi adicionado ao composto, a concentração desse elemento no cogumelo foi

duplicada (Werner e Beelman, 2002). Esses autores sugeriram que o Se contido no

inóculo é incorporado em compostos orgânicos durante o crescimento micelial e não

se encontra disponível para ser absorvido pelo corpo de frutificação.

O teor de Se em cogumelos A. bisporus cultivados em substrato não

suplementado com esse elemento, diminuiu significativamente durante todo o ciclo

de colheita. O estudo demonstrou que o acúmulo de Se foi diretamente dependente

da concentração de selenito de sódio, do estádio do ciclo da colheita e do número de

irrigação total com Se (Spolar et al., 1998). Verificou-se ainda, que o Se também foi

acumulado durante os subseqüentes fluxos de colheita, quando o selenito de sódio foi

adicionado à água de irrigação durante toda a produção dos cogumelos. Além disso,

o número de irrigações com selenito de sódio aplicadas durante o cultivo do fungo

também afetou o acúmulo de Se nos cogumelos. Esse resultado foi observado após a

aplicação de concentrações elevadas de até 197,1 mg/L de selenito de sódio na água

de irrigação. Werner e Beelman (2001) confirmaram que as variações no conteúdo de

Se acumulado pelos cogumelos são dependentes da composição do substrato usado

no cultivo do fungo, da quantidade desse substrato e das práticas utilizadas para a

produção dos cogumelos.

3. COGUMELO SHIITAKE

Atualmente, as quatro espécies de cogumelos comestíveis mais cultivadas no

mundo são A. bisporus (champignon), Lentinula edodes (shiitake), Volvariella

volcacea e Pleurotus sp. (Chang, 1980). Dentre esses, o shiitake é um dos mais

explorados por ser usado também como nutracêutico ou alimento funcional, pois

pode ser consumido como parte da dieta normal ou pode ser modificado e, ou

enriquecido para aumentar os benefícios à saúde. Pode também ser considerado um

nutricêutico, ou seja, consumido em forma de cápsulas ou tabletes, com fins

terapêuticos e, ainda, ser usado em preparações farmacêuticas, quimicamente

definidas e com propriedades específicas (Chang e Buswell, 1996). L. edodes

pertence ao filo Basidiomycota, ordem Agaricales, classe Hymenomycetes, família

Tricholomataceae (Tsuneda, 1994; Alexopoulos et al., 1996, Campbell e Racjan,

1999). Decompositor primário, habita naturalmente a madeira morta de várias

espécies de árvores sob diferentes condições climáticas (Przybylowicz e Donoghue,

1990; Ohga, 1992). No ano de 1992, foram produzidas 1.123 toneladas de shiitake e,

em 1999, a produção atingiu 3.914 toneladas, aumentando cerca de 3,5 vezes

(USDA, 1999). O shiitake é o cogumelo comercial mais consumido no Japão,

representando mais de 60 % dos cogumelos comercializados nesse país (Manzi et al.,

2001) e é o segundo cogumelo mais consumido no mundo (Chang e Buswell, 1996).

No Brasil também se tem evidenciado o aumento do consumo do shiitake, seguindo a

tendência mundial de consumo de alimentos saudáveis e de alta qualidade.

O shiitake apresenta propriedades medicinais pela presença de compostos

biologicamente ativos, com atividade hipolipidêmica, hipocolesterolemiante,

antitrombótica, antiviral, antibacteriana, anticarcinogênica, imunopotenciadora,

hepatoprotetora (Przybylowicz e Donoghue, 1990), antimutagênica (Lima et al.,

2001) e antitumoral (Miles e Chang, 1997). A substância hipocolesterolemiante ativa

no shiitake foi isolada e identificada como um derivado da adenosina chamado de

lentinacina ou lentisina conhecido como eritadenina e que atua baixando os níveis de

todos os tipos de lipoproteínas, ou seja, as lipoproteínas de alta densidade bem como

as de baixa densidade (Breene 1990). O agente ativo antitumor é o polissacarídeo β-

1,3 glucano, conhecido como lentinano, que também aumenta a resistência do

hospedeiro contra infecções causadas por bactérias, fungos e vírus, incluindo os

agentes da AIDS. O mecanismo de ação da atividade antiviral é, em muitos casos,

via indução do interferon (Miles e Chang, 1997). Acredita-se que o cogumelo

shiitake também tenha sido usado na cura de resfriados comuns por centenas de anos

e na prevenção da multiplicação do vírus da poliomielite (Johl et al., 1995).

A composição nutricional do cogumelo shiitake varia de acordo com o

substrato onde o fungo é cultivado. Przybylowicz e Donoghue (1990) encontraram

no cogumelo shiitake fresco cerca de 85 % a 95 % de água e de 43 % a 78 % da

matéria seca do shiitake constituem carboidratos. Seu valor protéico é relativamente

alto, representando entre 10 % e 29 % de sua matéria seca, sendo esse valor

semelhante, ou até maior, ao encontrado em muitos grãos (Pascholati et al., 1998).

De acordo com Chang (1980) e Chang e Buswell, (1996) as proteínas do shiitake

contêm a maioria dos aminoácidos essenciais em concentrações adequadas para a

nutrição humana. Przybylowicz e Donoghue (1990) sugerem que, do total de

aminoácidos presentes no cogumelo shiitake, 39 % são representados pelos

essenciais e que a metionina é o aminoácido limitante. Longvah e Deosthale (1998)

encontraram no cogumelo shiitake, 23 % de proteína de alta digestibilidade, 2 % de

lipídios, dos quais, 72 % a 77 % são constituídos de ácidos oléico e linoléico.

O shiitake é rico em vitaminas, como tiamina, riboflavina, niacina, biotina,

ácido fólico (Chang e Buswell, 1996) e ergocalciferol (Takamura e Hoshino, 1991).

Segundo Parrish (1979), a origem do ergosterol e vitamina D

(ergocalciferol) está

no reino Fungi. O ergosterol é submetido a fotólise quando exposto a luz ultravioleta,

de comprimento de onda de 280 nm a 320 nm, formando uma variedade de produtos,

como taquisterol, lumisterol e provitamina D

que, após rearranjo térmico

espontâneo, forma a vitamina D

. A vitamina D é um componente essencial ao ser

humano que pode ser produzida na pele pela ação da luz do sol ou absorvida da dieta

no trato intestinal (Mattila et al., 2002).

Os minerais no cogumelo shiitake constituem uma fração de 2,6 % a 6,5 %

(Przybylowicz e Donoghue, 1990). Cálcio (Ca), fósforo (P), ferro (Fe), sódio (Na),

potássio (K) e magnésio (Mg) estão presentes em concentrações significantes neste

cogumelo (Kurtzman, 1997; Bento, 2001). O teor de selênio (Se) no shiitake é baixo:

39 μg/kg de cogumelo seco (Mattila et al., 2001). O composto contendo Se

encontrado em maior quantidade, no cogumelo shiitake enriquecido com Se, foi

selenometionina ligada a proteínas (Ogra et al., 2004). Bento (2001) verificou que a

qualidade nutricional do cogumelo shiitake é maior quando o fungo é cultivado em

substrato à base de serragem e quando enriquecido com farelo de cereais porque os

nutrientes estão disponíveis em maiores quantidades do que em toras de madeira,

facilitando a sua absorção. Em razão do alto rendimento e custo, o cultivo desse

cogumelo pode ser uma alternativa promissora para os agricultores brasileiros e, a

possibilidade de enriquecer nutricionalmente esse cogumelo deve ser considerada.

A produção de shiitake é um exemplo de bioconversão da madeira e de outros

materiais ligninocelulósicos, que constituem grande parte da biomassa renovável

(Buswell et al., 1995). Esse fungo é um organismo ligninocelulolítico ativo capaz de

degradar componentes individuais de ligninocelulose, como lignina, celulose e

hemicelulose, secretando uma série de enzimas oxidativas e hidrolíticas incluindo

lacase, xilanase, celulase, hemicelulase, manganês peroxidase, fosfatase ácida, dentre

outras que contribuem para a degradação e reciclagem (Leatham, 1985; Buswell et

al., 1993; Buswell et al., 1995; Lee et al., 1999; Cavallazzi et al., 2004).

4. EFEITO DO SELÊNIO SOBRE FUNGOS FILAMENTOSOS

4.1. Efeito do selênio sobre a atividade enzimática de fungos produtores de

cogumelos

A serragem é o ingrediente básico mais popular usado nas formulações

sintéticas do substrato para produzir shiitake (Royse, 1997a). Adiciona-se a esta,

suplementos à base de cereais, como farelo de trigo, farelo de arroz, milho e centeio,

correspondendo entre 20 % e 60 % da massa seca do substrato, os quais podem ser

adicionados à mistura e servir como nutrientes para favorecer o crescimento do

fungo (Royse, 1997b).

A lignina é um polímero de fenilpropanóide que tem uma estrutura altamente

complexa e variável e é conhecida por ter baixa degradabilidade comparada a outros

componentes das folhas (Stott et al., 1983). Somente um número restrito de

organismos, como Basidiomicetos, é capaz de metabolizar a molécula de lignina

intacta (Swift et al., 1979). Em razão da natureza e do tamanho da molécula de

lignina, as enzimas responsáveis pela sua hidrólise inicial são extracelulares e não

específicas (Kirk e Farrell, 1987). Porém, a degradação da lignina é um processo

complexo e as enzimas têm, provavelmente, efeitos sinergísticos entre si (Tuomela et

al., 2000).

A lacase (benzenodiol: oxigênio oxidoredutase) é uma enzima extensamente

estudada em razão do seu uso potencial em várias áreas tais como têxtil, de papel,

indústria de polpa e de alimentos (Thurston, 1994). O autor descreve esta enzima

como um tipo de polifenoloxidase contendo cobre (p-difenoloxidase) que oxida

polifenóis, fenóis metoxi substituídos, diaminas e uma considerável variedade de

outros compostos. Yaropolov et al. (1994) descreveram a lacase como uma

glicoproteína da família de oxidases azuis contendo cobre que varia entre 10 % a 45

%, e com o tipo de carboidrato de sua composição, entre espécies e entre isozimas da

mesma espécie. De acordo com os autores, essas enzimas têm especificidade pelo

substrato, e não atuam sobre o produto reduzido por elas. A afinidade da lacase ao

substrato pode ser estendida às subunidades não fenólicas de lignina. Kahraman e

Gurdal (2002) afirmaram que muitos fungos produzem altas quantidades de lacase

extracelular. Nos estádios iniciais do período de crescimento vegetativo de L. edodes,

foram constatadas altas taxas de degradação da lignina (Leatham, 1985). Este

resultado pode indicar uma atividade significante da lacase.

A degradação natural completa de materiais de plantas lenhosas é resultante

da ação de fungos, dentre os quais basidiomicetos formadores de cogumelos

(Kvesitadze et al., 1999). A capacidade de degradação resulta da presença e da

atividade de um sistema de enzimas que agem por mecanismos de despolimerização

diferenciados e degradam todos biopolímeros de plantas superiores como a celulose,

a hemicelulose e a lignina. A ação de enzimas como as celulases e as xilanases

permite que os fungos usem materiais lenhosos como fonte de carbono e energia.

Assim, a colonização eficiente pelo fungo e a utilização de toras de madeira e toras

artificiais, à base de serragem de madeira, usualmente usadas como substratos de

crescimento dependem da capacidade do fungo para produzir as enzimas

extracelulares requeridas para degradar os componentes principais de

ligninocelulose, tais como, celulose, hemicelulose e lignina (Kirk, 1983). Entretanto,

na parede celular de plantas lenhosas, estes materiais estão intimamente associados

na forma de uma matriz complexa onde a lignina pode atuar como uma barreira para

a degradação de polissacarídeos pelo micélio do fungo, restringindo a

disponibilidade de nutrientes requerida para o crescimento.

4.2. Efeito do selênio sobre a morfologia dos fungos

Não se têm informações do efeito do Se sobre a morfologia do micélio de L.

edodes e sobre os eventos de desenvolvimento dos primórdios do corpo de

frutificação. Porém, alguns elementos, como metais pesados, podem interferir na

morfologia das células de diversos grupos de fungos. Darlington e Rauser (1988)

verificaram que, no fungo ectomicorrízico Paxillus involutus, a adição de Cd

aumentou a densidade das hifas evidenciada pelo aumento no número de

ramificações e uma diminuição da distância entre os pontos das ramificações. Gildon

e Tinker (1981) verificaram que o excesso de Cu e Zn interferiu na morfologia do

micélio que apresentou comprimento irregular e pouca ramificação.

Lilly et al. (1992) observaram que uma diminuição na taxa de crescimento do

fungo Schizophyllum commune causada por metais pesados é freqüentemente

acompanhada por mudanças morfológicas do micélio. Nesse estudo, constatou-se

que o crescimento desse fungo em meio sólido contendo Cd, levou a um aumento na

formação da hifa aérea e a mudanças morfológicas durante o crescimento da hifa e a

extensão dessas mudanças reflete o aumento na concentração do metal. O cultivo de

Daedalea quercina em meio líquido com Cd resultou em encurtamento da hifa e

aparência irregular na superfície da mesma (Gabriel et al., 1996). Os mecanismos

relacionados à ramificação das hifas não são conhecidos (Müller et al., 2000). No

entanto, de acordo com os autores, o diâmetro da hifa, a freqüência e o padrão de

ramificação são influenciados pela taxa específica de crescimento. Estas mudanças

indicam que a morfologia do fungo é cuidadosamente ajustada em resposta às

condições de crescimento (Dynesen e Nielsen, 2003).

Culturas fúngicas cultivadas na presença de metais pesados podem também

mudar sua coloração. O fungo Stereum hirsutum produziu um pigmento amarelo-

laranja, extracelularmente e no micélio, quando cultivado na presença de 0,25 mol

-1

ou mais de Cd (Baldrian et al., 1996).

O núcleo, como outras organelas nas células, é dinâmico e pode se mover no

citoplasma (Morris, 2003). O autor afirma que em muitas células, movimentos

nucleares estão relacionados com mitose ou meiose; em outras, estão relacionados

com divisões nucleares e, em outras ainda, eles estão relacionados com distribuição

do mesmo pelo citoplasma. Ainda de acordo com o autor, a movimentação dos

núcleos pode ser afetada por diversos fatores, como presença de alguns elementos

minerais no meio de crescimento.

Investigar o crescimento micelial e atividades metabólicas do fungo L. edodes

na presença de Se, é de fundamental importância, pois disponibiliza informações

para otimizar técnicas de cultivo, tornando o sistema mais confiável e eficiente. Os

dados obtidos podem ser úteis no desenvolvimento de processos para o

enriquecimento de cogumelos shiitake com Se, buscando suprir uma proporção

significante da ingestão dietética recomendada desse elemento.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO 1

CRESCIMENTO E MORFOLOGIA MICELIAL DE Lentinula edodes

CULTIVADO EM SUBSTRATOS COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES

DE SELENITO DE SÓDIO

1. INTRODUÇÃO

Íons metálicos são de fundamental importância para microrganismos

filamentosos, como oomicetos e fungos, com funções no metabolismo e crescimento

(Lundy et al., 2001). Certos metais como potássio (K), sódio (Na), manganês (Mg),

ferro (Fe), zinco (Zn), e cobre (Cu) são considerados essenciais pois são necessários

para funções metabólicas. Outros elementos, como por exemplo o selênio (Se), são

também essenciais para humanos, animais e muitas espécies de microrganismos (Tan

et al., 2002).

Os fungos filamentosos são morfologicamente complexos, exibindo

diferentes formas estruturais ao longo do seu ciclo de vida, o que é determinado

também por diversos fatores. Os fatores que afetam a morfologia e a coloração das

estruturas fúngicas incluem a natureza do inóculo, as características químicas e

físicas do meio, tais como a temperatura, o pH, as forças mecânicas, o oxigênio e o

gás carbônico dissolvido, entre outros (Kossen, 2000; Papagianni, 2004). No

ambiente natural, as limitações para o crescimento do fungo são principalmente

impostas pelas condições nutricionais (Ramsay et al., 1999; Gadd, 2001).

A colônia do fungo é formada pela ramificação das hifas. Em geral, a taxa de

crescimento da colônia não é constante, diminuindo ao longo do crescimento do

fungo em razão da exaustão de nutrientes e aglomeração das hifas (Boddy, 1993).

Quando o fungo cresce em meio de cultura, a taxa de crescimento é muito

dependente da quantidade de nutrientes. Em meio com teor de nutrientes elevado, a

produção de hifas e a taxa de crescimento do fungo são maiores e o micélio formado

é mais denso, enquanto que, em meio com poucos nutrientes, as colônias

desenvolvem-se cobrindo quase toda a superfície do meio com hifas mais distantes e

menos densas (Matsuura, 2002). Metais essenciais, como o Cu e o Zn e metais não

essenciais como o Cd, podem exercer toxicidade e serem acumulados pelo fungo

quando presentes em concentrações elevadas e sob formas disponíveis (Stijve e

Besson, 1976; Gadd, 1992; Gadd, 1993), afetando também o crescimento micelial.

Como o núcleo é uma organela dinâmica que pode se mover no citoplasma e

os movimentos nucleares estão relacionados com mitose ou meiose, com divisões

nucleares ou com distribuição do núcleo pelo citoplasma, a movimentação dos

núcleos pode ser afetada por diversos fatores como a presença de alguns elementos

minerais no meio de crescimento (Morris, 2003), sendo portanto, uma variável que se

deve avaliar para verificar o efeito de determinados nutrientes no crescimento de

fungos. Considerando o efeito do ambiente na morfologia da hifa e da colônia de

fungos, este trabalho teve como objetivo, observar o efeito do selênio no crescimento

micelial e na morfologia do micélio de isolados de L. edodes cultivados em

substratos acrescidos de diferentes concentrações de selenito de sódio.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Associações

Micorrízicas do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO) da

Universidade Federal de Viçosa – UFV, em Viçosa – Minas Gerais.

2.1. Crescimento de L. edodes em meios de cultura com diferentes concentrações

de selênio

Doze isolados de L. edodes (Berk.) Pegler pertencentes à coleção do

Departamento de Microbiologia da UFV foram utilizados para a avaliação do

crescimento em meio semi-sintético e em substrato ligninocelulósico contendo

diferentes concentrações de selenito de sódio. Os isolados utilizados foram UFV11,

UFV16, UFV53, UFV62, UFV63, UFV73, UFV74, UFV75, UFV78, UFV80,

UFV81 e UFV82.

Para reativação das culturas, transferiu-se um disco de ágar batata dextrose

(BDA, Merck

) de 8 mm de diâmetro, contendo micélio das bordas das colônias das

culturas estoques, para o centro de placas de Petri de 90 mm de diâmetro contendo

20 mL de BDA. As placas foram incubadas por 15 dias a 25 °C.

Substrato ligninocelulósico à base de serragem de eucalipto (Eucalyptus

grandis) foi preparado com 78 % de serragem, 20 % de farelo de arroz, 0,4 % de

CaCO

e 1,6 % de CaSO

de acordo com Bento (2001) e umidificado com água de

torneira. O substrato foi autoclavado a 120 °C por 60 minutos e, após resfriamento,

adicionou-se selenito de sódio (Na

SeO

) nas concentrações de 0,32; 0,64; 0,96 ou

1,28 mmol L

-1

. O tratamento controle consistiu dos mesmos meios de cultura sem a

adição de Se.

Os isolados cultivados em BDA foram transferidos com um disco de ágar de

8 mm de diâmetro contendo micélio das bordas das colônias para o centro de placas

de Petri de 90 mm de diâmetro contendo 20 mL de BDA (Merck

) ou 20 g de

substrato ligninocelulósico suplementados com selenito de sódio. As placas foram

incubadas foi a 25 ºC por 12 dias em estufas tipo BOD. A cada três dias mediu-se,

com régua, o diâmetro da colônia, em milímetros, em duas posições representativas

da margem da área colonizada. Esses dados foram utilizados para a elaboração das

curvas de crescimento. Calculou-se a taxa especifica de crescimento pela inclinação

da curva de crescimento obtida.

Ao final do período de incubação, determinou-se a massa micelial seca dos

isolados cultivados em BDA. Para essa avaliação, todo o conteúdo da placa foi

colocado em béquer contendo cerca de 300 mL de água destilada, e levado ao forno

microondas até a dissolução completa do ágar. Utilizando-se peneira com malha

correspondente a 400 mesh, o material foi separado e levado à estufa a 105 ºC com

circulação forçada de ar, por 48 horas. Este ensaio foi realizado em triplicata.

2.2. Morfologia micelial

Para a avaliação da morfologia micelial na presença de selênio, três isolados

de L. edodes foram selecionados, levando em consideração, o crescimento micelial,

em diâmetro e em biomassa seca, comparando-se o crescimento na maior

concentração de selenito de sódio e no controle. Esses isolados foram cultivados pela

técnica de microcultivo sobre lâminas de microscopia contendo 100 μL de meio

BDA acrescido de selenito de sódio (Na

SeO

) nas concentrações 0,32; 0,64; 0,96 ou

1,28 mmol L

-1

e o controle, em BDA sem Se. As lâminas foram mantidas dentro de

placas de Petri contendo papel de filtro umedecido em água destilada esterilizada e

incubadas em estufa tipo BOD a 25

C. Após seis dias foram medidos os diâmetros

das hifas e as distâncias entre os septos em várias áreas de cada lâmina, fazendo-se

seis medidas em cada lâmina, em microscópio de luz PGH Rundfunk-Fernsehen

IP20 com micrômetro acoplado a ocular. A medida dos diâmetros das hifas e das

distâncias entre os septos foi realizada em triplicata.

Para avaliação da distância entre os núcleos, o micélio cultivado sobre a

lâmina foi corado com 10 μL do corante SYBR

Green I diluído 1.000 vezes em 10

mol L

-1

de KH

contendo 18 % de glicerol de acordo com Meinhardt et al.

(2001). Após cinco minutos de contato com a solução, o micélio foi observado sob

microscópio Nikon E600 com um sistema Y-FL epi-fluorescente acoplado. O

micélio corado foi fotografado onde se puderam observar os núcleos. Em cada

lâmina, foram medidas dez distâncias entre os núcleos, próximos entre si, na mesma

hifa, com lâmina micrométrica. Esta medida foi realizada em triplicata.

2.3. Análise estatística

Adotou-se o delineamento em fatorial com doze isolados (UFV11, UFV16,

UFV53, UFV62, UFV63, UFV73, UFV74, UFV75, UFV78, UFV80, UFV81 e

UFV82), 5 níveis de concentração de Se com três repetições para a taxa específica de

crescimento e massa seca e com quatro níveis de tempo para as curvas de

crescimento em BDA e substrato ligninocelulósico. Os dados obtidos para a

elaboração das curvas de crescimento, foram transformados em logaritmo neperiano

(Ln) para ajuste dos dados à curva. Para as análises de variância e de regressão

utilizou-se o programa estatístico SAS.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Crescimento de L. edodes em meios de cultura com diferentes concentrações

de selênio

Todos os isolados do fungo L. edodes cultivados em BDA e em substrato

ligninocelulósico, suplementados com Se, apresentaram crescimento que foi

observado pelo aumento no diâmetro da colônia ao longo do tempo (Figuras 1 e 2).

O padrão de crescimento micelial observado foi semelhante durante a colonização

dos substratos enriquecidos com Se, constatando-se uma redução do crescimento à

medida que se aumentou a dose de Se (Figuras 1 e 2). No tratamento controle, apenas

os isolados UFV53, UFV73, UFV81 colonizaram completamente os substratos no

período avaliado de 12 dias. Os demais isolados colonizaram quase toda a placa,

apresentando uma diminuição na colonização com o aumento da dose de selenito de

sódio adicionada ao substrato (Figura 2).

Os isolados UFV11 e UFV74 apresentaram maior tolerância ao Se, quando se

comparou o diâmetro da colônia em meio BDA com 1,28 mmol L

-1

de selenito de

sódio com o tratamento controle (Figura 1). Essa redução no diâmetro da colônia foi

menor do que 6 % no último tempo avaliado, enquanto que os isolados mais

sensíveis foram UFV62, UFV78 e UFV82 que apresentaram diâmetro da colônia 53

%, 59 % e 52 % menor do que o controle, respectivamente. Nos demais isolados, a

redução dessa taxa variou de 30 % a 43 %.

A diminuição no tamanho da colônia e no padrão de ramificação em presença

de micronutrientes também foi observada por Gadd et al. (2001) em Trichoderma

viride e Rhizopus arrhizus. Esses autores constataram que o estresse do fungo em

razão da toxicidade desses metais depende da disponibilidade de nutrientes e do meio

de crescimento, pois, em ambientes com baixos teores de nutrientes, ocorre limitação

na expressão dos mecanismos de tolerância à toxicidade. Considerando que as

condições nutricionais e ambientais, nesse estudo, foram as mesmas, então, as

características genéticas de cada isolado influenciaram o crescimento fúngico,

mostrando que apesar de pertencerem à mesma espécie, os isolados apresentam

algumas características distintas.

Figura 1 – Curvas de crescimento de 12 isolados do fungo L. edodes UFV11 UFV16

UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78

UFV80 UFV81 UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC, em BDA

acrescido de quatro concentrações de selenito de sódio, A= 0,32 mmol L

-1

;

B= 0,64 mmol L

-1

; C= 0,96 mmol L

-1

; D= 1,28 mmol L

-1

e E= controle sem

selênio

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

Figura 2 – Aspecto das colônias do isolado UFV53 cultivado, a 25 ºC por 12 dias,

em BDA (A) ou em substrato ligninocelulósico (B) com concentrações

crescentes de selenito de sódio

O diâmetro das colônias dos isolados avaliados em meios livres de Se

(controle) e naqueles adicionado de baixa concentração de selenito de sódio (0,32

mmol L

-1

) aumentou mais rápido, em relação àqueles cultivados em meios

suplementados com concentrações maiores de Se, e o micélio tomou toda ou quase

toda a superfície do meio no décimo segundo dia de incubação (Figura 2). No

entanto, houve uma tendência gradual de declínio da taxa de crescimento das

colônias, conforme se aumentou a dose de selenito de sódio no meio, mostrando que

doses elevadas de Se afetam negativamente o crescimento micelial desse fungo

(Figura 2) e pode ser atribuída à reconhecida toxicidade do Se em doses elevadas

(Bennett, 2001; Viñas, et al., 2005). O efeito de toxicidade de outros elementos

como o cobalto (Co) e o magnésio (Mg) sob a célula fúngica de Psathyerella

atroumbonata foi verificado por Jonathan e Fasidi (2001).

A composição do meio de cultura também afetou o crescimento micelial.

Quando cultivados em substrato ligninocelulósico, os isolados UFV53, UFV63 e

UFV81 foram os que apresentaram maior tolerância ao Se com redução no diâmetro

das colônias inferior a 30 % quando se comparou a concentração 1,28 mmol L

-1

relação ao meio sem adição do selenito de sódio (Figura 3). Nesse substrato, o

isolado UFV78 foi o mais sensível ao Se e apresentou redução no crescimento maior

do que 60 %.

controle

0,32 mmol L

0,64 mmol L

1,28 mmol L

controle

0,32 mmol L

0,64 mmol L

0,96 mmol L

1,28 mmol L

0,96 mmol L

Figura 3 – Curvas de crescimento de 12 isolados do fungo L. edodes UFV11 UFV16

UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78

UFV80 UFV81 UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC, em substrato

ligninocelulósico acrescido de quatro concentrações de selenito de sódio,

A= 0,32 mmol L

-1

; B= 0,64 mmol L

-1

; C= 0,96 mmol L

-1

; D= 1,28 mmol L

-1

E= controle sem selênio

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

36912

Tempo (dias)

Ln do diâmetro da colônia

Entretanto, os isolados UFV16 e UFV81 apresentaram redução menor do que

15 % na taxa específica de crescimento ao longo do período de incubação quando se

comparou com a maior concentração de selenito de sódio (1,28 mmol L

-1

) adicionada

ao BDA em relação ao controle (Figura 4A), demonstrando que esses isolados são

menos afetados, nesses substratos, pelos efeitos tóxicos do Se. Por outro lado, nestas

mesmas condições, a taxa de crescimento do isolado UFV78 reduziu mais do que 60

%, demonstrando maior sensibilidade à presença desse elemento. Nos demais

isolados, a redução na taxa específica de crescimento variou de 22 % a 46 %. A taxa

específica de crescimento de todos os isolados avaliados e em ambos os substratos

diminuiu à medida que se aumentou a concentração de Se (Figura 4). A taxa de

crescimento de Paxillus involutus também foi reduzida em 45% quando 1 mmol de

Cd/m

foi adicionado ao meio de cultura (Darlington e Rauser, 1988). Os metais e

seus compostos podem interagir com o fungo de várias maneiras dependendo do

metal, da espécie do organismo e das condições ambientais, enquanto que a atividade

metabólica do fungo influencia a disponibilidade e a mobilidade do metal (Gadd,

1993; Gadd e Sayer, 2000). Para Valix e Loon (2003), o efeito de metais pesados

sobre o crescimento varia com a estirpe do fungo, sendo que o comportamento

adaptativo dos fungos a esses metais, refletidos na taxa de crescimento e de morte,

pode ser usado para indicar a tolerância ou adaptação do fungo ao aumento da

concentração do metal.

A taxa específica de crescimento dos isolados UFV53, UFV63 e UFV81 em

substratos ligninocelulósicos reduziu menos do que 8 % ao longo do período de

incubação, quando se comparou o resultado obtido na maior concentração de

selenito de sódio (1,28 mmol L

-1

) (Figura 4B) em relação ao meio controle. Este

resultado pode indicar uma maior tolerância desses isolados à presença de doses

maiores de Se nesse substrato. Por outro lado, os isolados UFV74 e UFV78

apresentaram redução da taxa específica de crescimento superior a 35 % e portanto,

foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos do Se. Darlington e Rauser (1988)

trabalhando com P. involutus cultivado em ágar MMN observaram que existe relação

inversa entre a taxa de crescimento (mm/dia) e a concentração de Cd, porém, não foi

observada nenhuma relação entre a duração da fase lag e a concentração desse

elemento.

Figura 4 – Taxas específicas de crescimento de 12 isolados do fungo L. edodes,

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74

UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82 cultivados, por 12

dias a 25 ºC, em BDA (A) ou substrato ligninocelulósico (B) acrescidos

de quatro concentrações de selenito de sódio e controle sem selênio

0,08

0,11

0,14

0,17

0,20

0,23

0,26

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Taxa específica de crescimento dias

-1

0,08

0,11

0,14

0,17

0,20

0,23

0,26

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Taxa específica de crescimento dias

-1

A massa seca fúngica da maioria dos isolados cultivados em BDA diminuiu à

medida que se aumentou a dose de selenito de sódio (Figura 5). De acordo com

Darlington e Rauser (1988), a massa micelial de P. involutus foi reduzida quase pela

metade na presença de metal, como o Cd,

em relação ao meio controle sem Cd.

Figura 5 – Massa seca de 12 isolados do fungo L. edodes UFV11 UFV16 UFV53

UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81

UFV82 cultivados, por 12 dias a 25 ºC, em BDA acrescido de quatro

concentrações de selenito de sódio e controle sem selênio

A diminuição no diâmetro da colônia à medida que se aumentou a

concentração de Se nem sempre significou menor massa micelial ou menor

crescimento. Esta afirmação é proveniente da observação dos dados quando se

constatou a redução do diâmetro das colônias dos isolados UFV11, UFV16 e UFV73

na presença de 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio, as massas secas obtidas desses

isolados foram maiores nessa concentração (Figuras 1 e 5). Este resultado pode ser

atribuído ao fato do Se ter promovido um crescimento micelial mais compacto o que

não é determinado pela medida do diâmetro da colônia e sim, quando se avalia a

massa seca. Os demais isolados mostraram reduções na massa seca à medida que se

aumentou a concentração de Se.

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Massa seca micelial (mg)

Resultados semelhantes foram encontrados por Gadd et al. (2001) que

observaram que o tamanho das colônias de T. viridae, em substrato pobre em

nutrientes e na presença de 0,1 mol L

-1

de Cd, Cu e Zn reduziu-se a um terço nos

tratamentos que foram adicionados esses metais em relação o tratamento controle.

No entanto, na presença de metais, as ramificações foram apenas ligeiramente

menores, mas orientadas para o interior da colônia. O mesmo aconteceu com a

distribuição da biomassa que foi pouco densa e concentrada no interior da colônia.

Para os autores, o padrão de distribuição de biomassa observado no T. viridae sugere

que a presença dos metais altera a alocação de nutrientes dentro do micélio e tem

efeito individual e específico sobre o crescimento do fungo. Por sua vez, Chen et al.

(2003) observaram uma duplicação da biomassa do fungo Volvariella volvacea

cultivado na presença de Cu, quando se adicionaram ao meio de crescimento doses

elevadas de nitrogênio (N) em relação ao tratamento com baixo teor desse elemento.

Considerando os resultados obtidos, foram selecionados para a continuidade

deste trabalho, os isolados UFV11, UFV16 e UFV53 por apresentarem maior

tolerância ao Se durante o crescimento nos substratos avaliados (Figuras 1 e 3), pela

maior taxa específica de crescimento (Figura 4) e maior produção de massa seca na

concentração de 1,28 mmol L

-1

Se (Figura 5). Foram consideradas também as

informações disponíveis no Laboratório de Associações Micorrízicas da

Universidade Federal de Viçosa – UFV, de que o isolado UFV16 apresenta elevada

frutificação e, conseqüentemente, alta produção de cogumelos.

Embora tenham apresentado tolerância ao Se nos substratos avaliados, os

isolados UFV63 e UFV81 (Figuras 1, 3, 4A e 4B) mostraram redução superior a 40%

na massa seca na concentração 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio em relação ao

controle (Figura 5). Este resultado justifica a não seleção destes isolados para a

continuidade do presente trabalho.

3.2. Morfologia da colônia

A morfologia das colônias dos isolados de L. edodes em BDA foi similar,

independente da presença de Se. Foram observadas colônias circulares, porém com

hifas menos densas à medida que se aumentou a dose de Se (Figura 2). Em substrato

ligninocelulósico, dois tipos morfológicos de colônia foram observados. Uma colônia

com aspecto uniforme em todas as concentrações de Se, e outra, exibindo mudanças

morfológicas à medida que se aumentou a concentração de Se. O isolado UFV74

apresentou colônia altamente condensada na presença de Se (Figura 6). A

composição do meio é um dos fatores que influencia a agregação celular, visto que as

colônias mudam de compactas para ramificadas com a diminuição de nutrientes no

meio (Papagianni et al., 1999). Segundo Matsuura (2002), quando ocorrem

mudanças nas condições ambientais, podem ocorrer mudanças na morfologia da

colônia de fungos em razão da aglomeração de células, ou seja, quando ocorre

aglomeração da população, a colônia torna-se mais compacta. De acordo com o

mesmo autor, a diversidade morfológica depende da estirpe e das condições de

cultivo e a taxa de extensão da hifa é enormemente diminuída pelo efeito da

aglomeração da hifa. Tal efeito é aparente quando a concentração de nutrientes é alta.

As desvantagens do crescimento micelial disperso incluem a redução na eficiência do

suprimento de oxigênio bem como um aumento na parede celular (Papagianni,

2004).

O efeito de metais pesados sobre o diâmetro da colônia de fungo também foi

observado por Darlington e Rauser (1988) que registraram redução no diâmetro da

colônia de P. involutus cultivado em ágar Melin-Norkrans modificado (MMN), à

medida que se aumentou a concentração de cádmio (Cd).

Figura 6 – Aspecto da colônia do isolado UFV74 de L. edodes cultivado, por 12 dias

a 25 °C, em substrato ligninocelulósico não adicionado (controle) ou

adicionado de 0,32 mmol L

-1

de selenito de sódio

controle

controle 0,32 mmol L

-1

3.3. Morfologia micelial

O diâmetro das hifas, distância entre septos e distância entre núcleos (Figura

7) apresentaram diferença (p < 0,05) entre os três isolados (UFV11, UFV16 e

UFV53) e entre as concentrações de Se testadas.

A distância entre septos tendeu a diminuir nos tratamentos que receberam

1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio em todos os isolados estudados (Figura 8),

podendo ser atribuída ao efeito tóxico do Se, em altas doses.

A Figura 7 ilustra a distribuição de núcleos do isolado UFV11 nas quatro

concentrações de selenito de sódio e no controle sem Se.

Figura 7 – Distribuição dos pares de núcleos no micélio do isolado UFV11, cultivado por 6

dias a 25 ºC, em BDA acrescido de quatro concentrações de selenito de sódio, A=

0,32 mmol L

-1

(100x); B= 0,64 mmol L

-1

(100x); C= 0,96 mmol L

-1

(100x); D=

1,28 mmol L

-1

(100x) e E= controle sem selênio (100x). As setas exemplificam

alguns núcleos onde suas distâncias foram determinadas

Figura 8 - Diâmetro das hifas (A), distância entre septos (B), distância entre núcleos

cultivados em BDA com diferentes concentrações de selenito de sódio

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Distância entre núcleos

(

)

200

400

600

800

1000

1200

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Distância entre septos (μm)

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Diâmetro da hifa (μm)

O Se influenciou o diâmetro das hifas do isolado UFV53 mas não afetou a

distância entre septos e entre núcleos. No entanto, os isolados UFV11 e UFV16

apresentaram comportamento oposto, visto que o Se influenciou a distância entre

septos e entre núcleos, mas não modificou o diâmetro das hifas (Figura 8). Segundo

Papagianni (2004), a extensão e o comprimento da hifa varia consideravelmente com

o fungo e depende do suprimento de nutrientes e da área de superfície dessa hifa, o

que aumentará o seu diâmetro e o estreitamento de sua extremidade. Para o autor,

existem poucas pesquisas mostrando a relação entre a forma da extremidade da hifa e

a taxa de extensão, mas essa aumenta geralmente com o diâmetro da hifa em um

único organismo. Zhu e Gooday (1992) encontraram uma relação direta entre a

extensão da hifa e o quadrado do diâmetro da hifa em Botrytis cinerea, sugerindo que

a extensão da hifa é dependente do suprimento de material para a extremidade da

hifa. De acordo com os autores, em Mucor rouxii, porém, embora a taxa de extensão

da hifa tenha aumentado com o diâmetro, nenhuma relação quantitativa precisa, entre

esses dois parâmetros, pôde ser identificada.

4. CONCLUSOES

O selenito de sódio afetou o crescimento micelial do fungo L. edodes.

O crescimento de alguns isolados é estimulado nas concentrações 0,32 mmol

-1

de selenito de sódio no meio de cultura, enquanto outros são inibidos com as

concentrações 0,96 e 1,28 mmol L

-1

desse composto no meio.

O aumento da massa seca não está diretamente relacionado com o diâmetro

da colônia, pois a extensão da hifa pode aumentar pouco quando o crescimento do

fungo ocorre com micélio mais compacto. Este resultado permite concluir que o

método usado para determinar o crescimento fúngico pode afetar os resultados.

Sugere-se que para determinar esse crescimento deve-se usar mais de um método

para que os resultados sejam comparados.

A morfologia da colônia e do micélio foi alterada pela presença de Se com

micélio mais compacto em menores concentrações desse elemento e com

diminuição, no diâmetro das hifas, nas distâncias entre os septos e distância entre

núcleos, na maior dose de Se aplicada.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO 2

ATIVIDADES ENZIMÁTICA E RESPIRATÓRIA DO FUNGO Lentinula

edodes CULTIVADO EM SUBSTRATO LIGNINOCELULÓSICO COM

DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SELENITO DE SÓDIO

1. INTRODUÇÃO

O crescimento e a atividade dos microrganismos pode variar em função de

modificações do meio ambiente, a exemplo da presença de metais ou metalóides. Em

solos contaminados por metais ocorre diminuição significativa na evolução de CO

(Hattori, 1992; Rajapaksha, 2004). Entretanto, Flieûbach et al. (1994) reportaram

aumentos na evolução de CO

em solos poluídos com metais. Por outro lado, alguns

metais e metalóides podem ser considerados micronutrientes pelos microrganismos,

ou mesmo para os animais. Entre esses elementos, necessários para a viabilidade

celular em pequenas concentrações, está o selênio (Se).

O Se é um metalóide encontrado naturalmente no solo e está presente em

várias enzimas, dentre elas a glutationa peroxidase, responsável pela redução de

hidroperóxidos livres ou ligados à membrana celular (Wendel, 1981); a deiodinase,

envolvida no metabolismo da tireóide (Koehrle, 1999); a tioredoxina redutase que

está envolvida na regulação redox de grupos dissulfetos em diversas enzimas e

fatores de transcrição (Holmgren, 1977) e a selenoproteína P que é abundante no

plasma (Allan et al., 1999). A redução de selenato (Se(VI)) e selenito (Se(IV)) a

selênio elementar (Se°) pode ser catalisada por numerosos fungos e bactérias

(Gharieb et al., 1995; Stolz e Oremland, 1999).

Os fungos têm função importante na decomposição da matéria orgânica como

celulose e hemicelulose (Zelles e Alef, 1995). L. edodes é um fungo formador de

cogumelo que utiliza resíduos ligninocelulósicos, fonte abundante e renovável de

energia na terra. Além de converter esses resíduos, que potencialmente poderiam

poluir o ambiente, em cogumelos para o consumo humano, o substrato resultante

pode ser empregado na alimentação animal (Zhang et al., 1995). O uso da

ligninocelulose como fonte de carbono depende da capacidade do fungo em produzir

enzimas ligninocelulolíticas e excretá-las ao meio extracelular (Mata e Savoie, 1998;

Villas-Bôas et al., 2002). As principais enzimas ligninocelulolíticas encontradas no

substrato colonizado por L. edodes incluem lacase, manganês peroxidase, celulase e

xilanase (Leatham, 1985; Tokimoto et al., 1987; Ohga, 1992; Buswell, et al., 1995;

Cavallazzi, 2004). Além de produção das enzimas hidrolíticas, a capacidade de um

isolado converter o substrato ligninocelulósico em cogumelo comestível é outra

característica que deve ser observada na seleção de estirpes para produção comercial

(Ohga, 1992; Shearer, 1995).

O crescimento de um fungo filamentoso pode ser avaliado de maneira direta

com base no crescimento linear, na biomassa fresca, na massa seca ou pela

quantidade de alguns constituintes miceliais (Tan e Moore, 1995). Outra alternativa

para a determinação do crescimento fúngico é o uso de medidas indiretas, baseadas

em atividades metabólicas como, atividade enzimática específica e atividade

respiratória representada pelo consumo de O

ou liberação de CO

A importância de usar atividade enzimática para monitorar o crescimento

vegetativo de L. edodes vem sendo considerada. De acordo com Silva et al. (2005), o

estudo envolvendo a produção de enzimas que degradam celulose, hemicelulose e

lignina permite acompanhar diretamente a colonização do substrato, constatando-se

uma correlação entre o crescimento fúngico e a produção de enzima o que pode ser

um parâmetro adequado para avaliar o período entre inoculação do substrato e

frutificação Assim, afirmam os autores, a determinação da atividade enzimática,

pode substituir as metodologias laboriosas para quantificação do crescimento fúngico

em substratos sólidos.

A medida da atividade respiratória ou respirometria constitui-se um

procedimento para avaliar a calibração de modelos cinéticos microbianos, o estado

da atividade microbiana (Marsili-Libelli e Tabani, 2002), monitorar o

desenvolvimento da colônia e avaliar a utilização pelo fungo de substratos

específicos (Tan e Moore, 1995). Por se tratar de uma técnica não destrutiva e por

permitir avaliações contínuas, os dados da respirometria resultam em curvas de

crescimento mais detalhadas que as obtidas pela análise da produção da biomassa

(Braga et al., 1999). Os autores afirmam que a resposta da respiração microbiana a

exposição a metais tem sido medida pela alteração na liberação de CO

pelo

microrganismo.

No presente estudo, objetivou-se avaliar o efeito do selenito de sódio sobre as

atividades das enzimas ligninocelulósicas, do fungo L. edodes, que têm estreita

relação com a produção de cogumelos e avaliar também o efeito desta substância na

atividade respiratória desse fungo.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Associações

Micorrízicas do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO) da

Universidade Federal de Viçosa – UFV, em Viçosa – Minas Gerais.

2.1. Atividade enzimática específica

Os isolados UFV11, UFV16 e UFV53 de L. edodes foram cultivados em 20 g

de substrato à base de serragem de eucalipto, preparado de acordo com Bento (2001)

e adicionado de selenito de sódio (Na

SeO

) nas concentrações de 0,32; 0,64; 0,96 e

1,28 mmol L

-1

O substrato foi acondicionado em frascos com tampa metálica com

um orifício selado com fita crepe para troca gasosa, a 25 ºC por 21 dias. Como

controle, cultivou-se o L. edodes em substrato não adicionado de Na

SeO

A cada

sete dias de incubação foram retiradas amostras do composto miceliado para análises

da atividade das enzimas lacase, celulase e xilanase e para a determinação da

proteína solúvel. A proteína solúvel foi determinada pelo método colorimétrico

descrito por Bradford (1976) e utilizada para cálculo da atividade específica das

enzimas. O experimento foi conduzido em triplicata.

2.1.1. Lacase

A atividade da lacase (Lac, EC 1.10.3.2) foi determinada pela oxidação de

2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonato) (ABTS) a 37 ºC (Buswell et al.,

1996), em 1 mL de mistura de reação contendo 0,6 mL de tampão acetato de sódio

(0,1 mol L

-1

), pH 5,0; 0,3 mL de extrato fúngico e 0,1 mL de ABTS (1,0 mol L

-1

O extrato fúngico foi preparado pesando-se 3 g do substrato colonizado pelo

fungo, em erlenmeyer e adicionando-se 10 mL de tampão acetato de sódio 0,1 mol

-1

(pH 5,0). Agitou-se em shaker a 100 RPM / 19 ºC por 15 min. Após agitação o

extrato fúngico foi filtrado com papel de filtro Whatman

n° 01. Após filtração,

preparou-se a mistura de reação e fez-se a leitura imediata da absorbância a 420 nm a

37 °C em espectrofotômetro, modelo DU

640 Beckman, com controle de

temperatura. A oxidação do ABTS foi medida pelo monitoramento do aumento da

absorbância Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de

enzima capaz de oxidar 1 μmol L

-1

de ABTS por minuto (ε

420

= 3,6 x 10

-1

2.1.2. Celulase

A atividade da celulase (Cel, EC 3.2.1.4) foi determinada pelo método do

papel de filtro, de acordo com Mandels et al. (1976). O método baseia-se na

determinação de glicose liberada a partir do papel de filtro (substrato enzimático)

pela ação do caldo enzimático.

O extrato fúngico foi preparado pesando-se 4 g de substrato colonizado pelo

fungo, adicionando-se 20 mL de tampão citrato de sódio 50 mmol L

-1

, pH 4,8 e

agitando-se em shaker a 100 rpm por 15 min. Após agitação o extrato fúngico foi

filtrado com papel de filtro Whatman

n° 01. Após filtração, transferiram-se 2,5 mL

do extrato fúngico, 2,5 mL de tampão citrato de sódio 50 mmol L

-1

, pH 4,8 para

tubos de ensaio contendo tiras de papel de filtro Whatman

n° 01 (1 cm x 6 cm). Os

tubos foram agitados manualmente e incubados a 50

C por 4 horas, em banho-maria.

Para o branco, adicionou-se o DNS antes da incubação, para parar a reação

enzimática. Após a incubação, transferiu-se 1 mL do extrato fúngico para tubos de

ensaio contendo 1 mL de solução de DNS (ácido dinitrosalicílico) previamente

preparada. Essa mistura ficou em banho-maria, a 100 °C por 5 minutos e após esta

etapa, adicionaram-se 8 mL de água destilada para completar o volume para 10 mL.

Os açúcares foram determinados como açúcares redutores totais pelo método

do ácido dinitrosalicílico (DNS) em espectrofotômetro (modelo DU

640 Beckman)

a 540 ηm segundo Miller (1959) e quantificados pela relação obtida com uma curva

padrão de glicose. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a

quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 mmol de glicose por minuto

a 50 °C.

2.1.3. Xilanase

A atividade da xilanase (Xyl, EC 3.2.1.8/EC 3.2.1.32/EC 3.2.1.136) foi

determinada pela medida da quantidade de açúcares redutores liberados a partir de

xilana (Barley et al., 1992).

O extrato fúngico foi preparado pesando-se 4 g de substrato colonizado pelo

fungo, adicionando-se 20 mL de tampão citrato de sódio 50 mmol L

-1

, pH 4,8 e

agitando-se em shaker a 100 rpm por 15 min. Após agitação o extrato fúngico foi

filtrado em papel de filtro Whatman

n° 01. Após filtração, transferiram-se 2,5 mL

do extrato fúngico e 2,5 mL da solução de xilana para tubos de ensaio. Os tubos

foram homogeneizados agitando-se manualmente e incubados a 50

C por 30

minutos, em banho-maria. Para o branco, adicionou-se o DNS antes da incubação,

para parar a reação enzimática. Após a incubação, transferiu-se 1 mL do extrato

fúngico para tubos de ensaio contendo 1 mL de solução de DNS (ácido

dinitrosalicílico) previamente preparada. Essa mistura ficou em banho-maria, a 100

°C por 5 minutos e depois desta etapa, adicionou-se 8 mL de água destilada para

completar o volume para 10 mL.

Para o preparo da solução de xilana utilizou-se 1 g de xilana dissolvida em 50

mL de tampão acetato de sódio 50 mmol L

-1

, pH 5,3. A solução foi aquecida até a

ebulição e, depois de resfriada à temperatura ambiente, o volume foi completado

para 100 mL com o mesmo tampão. Os açúcares foram determinados como açúcares

redutores totais pelo método do DNS em espectrofotômetro (modelo DU

640

Beckman) a 540 ηm de acordo com Miller (1959) e quantificados pela relação obtida

com uma curva padrão de xilose. Uma unidade da atividade enzimática foi definida

como a quantidade de enzima capaz de catalisar a liberação de 1 mmol de xilose por

minuto a 50 ºC.

2.2. Atividade respiratória

Para avaliação da atividade respiratória do fungo L. edodes, dez gramas do

substrato à base de serragem de eucalipto preparado de acordo com Bento (2001),

foram acondicionadas em frascos de vidro Gibco

, adicionadas de 0,32; 0,64; 0,96 e

1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio. O tratamento controle consistiu do mesmo

substrato não adicionado de selenito de sódio.

Um disco de ágar de 8 mm de

diâmetro contendo micélio retirado das bordas das colônias das culturas estoques,

mantidas em BDA, dos isolados UFV11, UFV16 e UFV53, foi usado para a

inoculação. Os frascos foram incubados a 25 ºC em estufas tipo BOD. No quinto dia

de crescimento do fungo, os frascos foram acoplados ao respirômetro de fluxo

contínuo (TR – RM8 Respirometer Multiplexer – Sable Systems), onde a taxa de

liberação de CO

foi medida por meio de detectores de infravermelho e a atividade

respiratória determinada a cada sete horas pela produção de CO

, (Heinemeyer et al.,

1989). Os frascos permaneceram acoplados ao aparelho até o décimo segundo dia de

crescimento do fungo.

O experimento foi repetido com os mesmos isolados acoplando-se os frascos

ao respirômetro no décimo dia de crescimento onde permaneceram até o décimo

sétimo dia de crescimento. Os dois experimentos foram realizados com triplicatas.

2.3. Análise estatística

Adotou-se o delineamento em fatorial com três isolados (UFV11, UFV16 e

UFV53), cinco níveis de concentração de Se, três níveis de tempo para a atividade

enzimática e oito níveis de tempo para a atividade respiratória, em três repetições. Os

dados foram analisados pela análise de variância e de regressão, utilizando-se o

programa estatístico SAS versão 8.0.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Atividade enzimática específica

Os resultados obtidos indicam um efeito ativador (p < 0,05) do Se sobre a

atividade específica da lacase dos três isolados de L. edodes avaliados (Figura 1).

Embora não tenham sido encontrados relatos sobre o efeito do Se na atividade dessa

enzima em microrganismos, foi observado que metais, como o cobre, podem

aumentar a estabilidade da lacase por inibirem uma protease extracelular

responsável pela degradação dessa enzima (Palmieri et al., 2001). Chen et al. (2003)

também verificaram que a lacase é influenciada, positivamente, por doses elevadas

de cobre onde atividade detectável de lacase foi observada em culturas

suplementadas com 50 a 300 μM CuSO

, com o máximo da atividade da enzima

registrado em concentrações de 200 μM e nenhuma atividade dessa enzima foi

detectada quando o elemento não foi adicionado. Baldrian e Gabriel (2002)

concluíram que o Cu não somente induz a lacase, pela expressão de seus genes, mas

também afeta positivamente, a atividade e estabilidade dessa enzima. Outros metais

também influenciam a atividade de lacase. Em substrato suplementado com cátions

metálicos para o crescimento de Chalara (syn. Thielaviopsis) paradoxas CH32, foi

verificado que a atividade da lacase foi completamente inibida por mercúrio (Hg

)

em concentrações de 0,01 mol L

-1

e por sais de Fe

e Ag

, além de Cu

(Robles et

al., 2002). A atividade da lacase pode também ser aumentada pelo aumento da

concentração de nitrogênio em meios de cultura (Buswell et al. 1995). Chen et al.

(2003) demonstraram que a atividade de lacase em V. volvacea foi afetada tanto pela

concentração de nitrogênio como pelo período de incubação. Os autores observaram

ainda que a atividade dessa enzima aumentou acentuadamente durante o período de

iniciação do corpo de frutificação até a fase de maturação quando a produção de

biomassa fúngica tinha alcançado o máximo. Para Hatvani e Mécs (2003), a adição

de metais como, cobre, cádmio, zinco, chumbo e mercúrio, resulta em aumento na

atividade de lacase.

Figura 1 - Atividade enzimática da lacase dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e (C)

UFV53, do fungo L. edodes, cultivados a 25 ºC por 7 dias; 14 dias e

x 21 dias, em diferentes concentrações de selenito de sódio e controle sem

selênio

-40

120

160

0 0,320,640,961,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Lacase (U mg

-1

proteína)

-40

120

160

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Lacase (U mg

-1

proteína)

-40

120

160

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Lacase (U mg

-1

proteína)

A indução da enzima lacase é considerada uma resposta protetora a

compostos tóxicos produzidos durante a degradação dos componentes da lignina de

resíduos ligninocelulósicos que servem como um substrato natural de crescimento do

fungo ou como agentes antimicrobianos secretados por microrganismos

competidores (Thurston, 1994; Eggert et al., 1996; Collins e Dobson, 1997).

A atividade específica da lacase variou entre os isolados (p < 0,05) e atingiu

valores maiores no UFV11, na concentração 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio,

enquanto que o isolado UFV53 foi o que apresentou menores valores da atividade

dessa enzima. Este resultado indica a maior sensibilidade desta enzima do isolado

UFV53 à presença de selenito de sódio (Figura 1). Alta atividade específica da

enzima lacase, durante o cultivo do fungo L. edodes em substratos a base de casca de

eucalipto, foi observada por Cavallazzi et al. (2004) que verificaram que a atividade

dessa enzima é diferente entre os três isolados avaliados. Entretanto, nesse trabalho,

os autores avaliaram a atividade da lacase em cultivos com períodos de incubação

superiores há 21 dias e essa atividade decresceu com o tempo. Resultado semelhante

foi obtido por Silva et al. (2005) ao considerarem que a atividade de lacase variou

significativamente entre nove isolados de L. edodes, indicando, para os autores, que a

natureza da estirpe influencia principalmente a atividade das enzimas oxidativas.

Para Ohga e Royse (2001), a atividade da lacase em L. edodes, foi alta durante o

crescimento micelial, diminuindo rapidamente no início da frutificação. De acordo

com os autores, este comportamento se deve ao fato que, a expressão dos genes da

lacase, medida como níveis de mRNA, é máxima na fase de completa colonização do

substrato por este fungo e declina a baixos níveis durante a frutificação. Wood

(1980) também registrou atividade elevada de lacase durante o crescimento micelial

de Agaricus bisporus, levando a uma grande degradação de lignina e

conseqüentemente, na fase de produção do esporóforo houve maior disponibilização

de fonte de carbono necessária para a frutificação.

A atividade específica da celulase foi baixa para os três isolados avaliados e

diferiu (p < 0,05) com a concentração de selenito de sódio e com o isolado (Figura

2). A baixa atividade da enzima celulase observada neste experimento, pode ter sido

em razão do tempo de reação de quatro horas de reação enzimática usado na análise.

Entretanto, baixa atividade de celulase em isolados de L. edodes foi registrada por

Cavallazzi et al. (2004) que verificou que essa atividade também foi influenciada

Figura 2 - Atividade enzimática da celulase

dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16

e (C) UFV53, do fungo L edodes, cultivados a 25 ºC por 7 dias;

14 dias e

x 21 dias, em diferentes concentrações de selenito de sódio

e controle sem selênio

-1

0 0,320,640,961,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Celulase (U mg

-1

proteína)

-1

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Celulase (U mg

-1

proteína)

-1

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Celulase (U mg

-1

proteína)

pelo isolado. Atividades baixas de celulase também foram registradas em micélio do

fungo Ceriporiopsis subvermispora por Ferraz et al. (2003). Em contraste, Silva et

al. (2005) encontraram altos valores de celulase, e essa atividade foi bastante

uniforme entre os isolados de L. edodes, afirmaram os autores.

A atividades da xilanase foi alterada (p < 0,05) com a adição de selenito de

sódio, com o isolado e com o tempo de cultivo (Figura 3). Em função da variação

dos dados da atividade da xilanase do isolado UFV16 no décimo quarto dia de

crescimento do fungo, não foi possível fazer o ajuste estatístico adequado dos dados.

A atividade da xilanase foi baixa para todos os três isolados de L. edodes testados em

todos os tratamentos, inclusive no controle (Figura 3). Este resultado está em acordo

com Cavallazzi et al. (2004) que observaram, durante o cultivo de um isolado de L.

edodes, uma baixa atividade de xilanase e esta atividade diminuiu com o tempo de

cultivo. De acordo com Silva et al. (2005), a atividade da xilanase foi a mais alta

entre as enzimas hidrolíticas estudadas em nove estirpes de L. edodes, com valores

variando de 12.958,3 a 16.101,8 UI kg

-1

. De acordo com esses autores, o fungo L.

edodes é considerado como um produtor moderado de celulase por ele hidrolisar

xilana mais eficientemente que carboximetilcelulose. Os autores afirmaram ainda

que os resultados indicam que resíduos de eucalipto misturado com farelo de arroz,

usado demonstrou ser ideal para a produção de enzima extracelular por L. edodes,

mas também para cultivo da biomassa micelial. A xilanase foi a principal enzima

hidrolítica no fungo Ceriporiopsis subvermispora cultivado em serragem de

Eucalyptus grandis com atividade máxima de 960 UI por cultura no décimo quinto

dia de biodegradação (Ferraz et al., 2003).

Os resultados evidenciaram que a atividade das enzimas celulase (Figura 2) e

xilanase (Figura 3) foi maior no sétimo e décimo quarto dia de análise, enquanto que

a atividade da lacase (Figura 1) foi maior no vigésimo primeiro dia de crescimento

do fungo. Como a lacase é uma enzima que degrada a lignina, deveria ser a enzima a

agir primeiro na degradação do substrato à base de serragem de eucalipto. Pode-se

supor que houve uma hidrólise ácida parcial da lignina durante o tratamento térmico

do substrato, pois o pH do mesmo foi 4,5. Segundo Franzidis e Proteus (1981), na

hidrólise ácida dos materiais celulósicos a molécula de ácido, sendo pequena, penetra

na lignina e rapidamente hidrolisa a hemicelulose e as regiões não cristalinas da

celulose. Posteriormente, ocorre o ataque sobre a celulose cristalina numa taxa 100

Figura 3 - Atividade enzimática da xilanase

dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e

x 21 dias, em diferentes concentrações de selenito de sódio e controle

sem selênio

-1

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Xilanase (U mg

-1

proteína)

-1

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Xilanase (U mg

-1

proteína)

-1

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

Xilanase (U mg

-1

proteína)

vezes menor que a taxa inicial de hidrólise. A hemicelulose hidrolisada resulta,

principalmente, em pentoses, das quais a mais comum é a xilose. Fengel e

Wegener (1989) afirmaram que durante a hidrólise ácida de materiais

ligninocelulósicos, os polissacarídeos reagem com a água liberando os seus

monômeros, como glicose, xilose, e outros e os ácidos agem como catalisadores,

podendo, assim, promover ou intensificar a hidrólise de alguns constituintes. De

acordo com Blanchette et al. (1997) a ocorrência da degradação da lignina durante o

primeiro estádio de decomposição não erosiva da madeira, quando a baixa

permeabilidade da parede celular não permite difusão de enzimas, indica claramente

que alguns agentes de baixa massa molecular atuam.

A baixa atividade inicial da lacase verificada nos isolados de L. edodes pode

ser justificada também pela adição de farelo de arroz ao substrato, que segundo

Cavallazzi et al. (2004), é uma fonte de carbono prontamente utilizada pelo fungo

para o seu crescimento micelial e as enzimas ligninolíticas, como lacase e manganês

peroxidase, que são produzidas para a hidrólise dos polímeros de lignina e dos

compostos fenólicos, promovendo uma rápida e eficiente colonização do substrato.

Lee et al. (1978) sugeriram que sendo a hemicelulose hidrolisada mais rapidamente

que a celulose, quando a reação ocorre em condições que favorecem a hidrólise

desta, a maior parte da xilose é decomposta. Isto possibilita a fração hemicelulósica

ser hidrolisada seletivamente da biomassa. De acordo com Mata e Saivoie (1998), a

atividade das carboidrases usualmente aumenta durante a frutificação visto que a

produção do esporóforo é, provavelmente, dependente da capacidade do fungo em

metabolizar novas fontes de carbono de polissacarídeos e os melhores rendimentos

na produção de cogumelo foram obtidos por meio das estirpes com menores

atividades de carboidrases durante a colonização do substrato.

Os três isolados apresentaram baixa atividade da lacase (Figuras 1) no meio

sem Se nos três tempos avaliados e a atividade dessa enzima foi aumentando ao

longo do tempo nos meios com Se. As atividades da celulase e xilanase (Figuras 2 e

3) diminuíram à medida que se aumentou a dose de Se e ao longo do tempo de

avaliação, o que pode ser uma indicação de alta eficiência durante a frutificação.

Silva et al. (2005) observaram boa correlação entre o crescimento do isolado de L.

edodes e a produção de algumas enzimas, entre elas a xilanase e a celulase, o que

pode ser um bom parâmetro para avaliar o período entre a inoculação do substrato e a

frutificação, afirmam os autores. De acordo com Cavallazzi et al. (2004), isolados de

L. edodes, a exemplo do UFV53 que possui alta atividade de manganês peroxidase e

baixa atividade de lacase, durante a colonização do substrato, tem potencial para ser

utilizado em substrato à base de eucalipto, pois apresenta característica que o torna

capaz de degradar os compostos fenólicos presentes nesse substrato.

3.2. Atividade respiratória

A atividade respiratória dos três isolados estudados foi influenciada pela

presença de Se no substrato ligninocelulósico, apresentando-se decrescente à medida

que se aumentou a dose desse elemento (Figuras 4 e 5). Na primeira etapa de

avaliação da respiração, os isolados UFV11 e UFV16 apresentaram redução na taxa

respiratória em torno de 30 % quando se adicionou 1,28 mmol L

-1

de selenito de

sódio ao substrato. No isolado UFV53, a redução dessa taxa alcançou cerca de 40 %,

o que sugere que esse isolado é menos tolerante a adição de Se ao substrato de

crescimento do que o UFV11 e UFV16. Neste isolado UFV53, a taxa respiratória foi

reduzida não apenas na concentração máxima de 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio

utilizada, mas a partir da concentração 0,96 mmol L

-1

(Figura 4).

O decréscimo da taxa respiratória dos isolados avaliados, constatado ao longo

do tempo de cultivo encontra explicação na literatura científica. Estudos

comprovaram que a atividade de microrganismos, principalmente fungos,

normalmente decresce após algum tempo de incubação por exaustão de nutrientes e a

partir de certo ponto, a respiração micelial acontece às custas de suas reservas

endógenas acumuladas durante a fase de crescimento (Hill et al., 1992; Braga et

al.,1999; Lin e Brookes, 1999).

Além do efeito da exaustão de nutrientes, a presença de Se no substrato

também pode ter contribuído para a redução da taxa respiratória. West e Sparling

(1986) verificaram que a produção de CO

no solo aumentou significativamente com

a adição de glicose acima de 60 mg mL

–1

de água. Drobinik (1960) reportou que o

aumento logarítmico na evolução de CO

em substrato adicionado de glicose, foi

atribuído à síntese de enzimas induzidas pela adição dessa substância. O efeito de

metais na taxa respiratória de microrganismos foi verificado por Rajapaksha et al.

(2004) que observaram que durante a primeira semana após a adição de zinco (Zn) e

cobre (Cu) ao solo, a taxa respiratória de fungos do solo diminuiu em 30 % e

permaneceu estável durante os sessenta dias de incubação.

Figura 4 - Atividade respiratória medida do quinto ao décimo segundo dia de

crescimento, dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e (C) UFV53 do fungo

L. edodes, cultivados a 25 ºC, em substrato ligninocelulósico acrescido

de 0,32 mmol L

-1

; 0,64 mmol L

-1

; 0,96 mmol L

-1

; 1,28 mmol L

-1

e controle sem selênio

110

140

170

56789101112

Tempo (dias)

mg CO

-1

substrato

110

140

170

56789101112

Tempo (dias)

mg CO

-1

substrato

110

140

170

56789101112

Tempo (dias)

mg CO

-1

substrato

Figura 5 - Atividade respiratória medida do décimo ao décimo sétimo dia de

crescimento, dos isolados (A) UFV11; (B) UFV16 e (C) UFV53 do fungo

L. edodes, cultivados em substrato ligninocelulósico a 25 ºC, acrescido de

0,32 mmol L

-1

; 0,64 mmol L

-1

; 0,96 mmol L

-1

; 1,28 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

100

150

200

10 11 12 13 14 15 16 17

Tempo (dias)

mg CO

-1

substrato

100

150

200

10 11 12 13 14 15 16 17

Tempo (dias)

mg CO

-1

substrato

100

150

200

10 11 12 13 14 15 16 17

Tempo (dias)

mg CO

-1

substrat

A respiração do fungo L. edodes diminuiu à medida que se aumentou a

concentração de selenito de sódio (Figuras 6 e 7). Observou-se que a taxa respiratória

acumulada variou com o isolado, no período correspondente do décimo ao décimo

sétimo dia de crescimento do fungo, sendo que o isolado UFV11 apresentou maior

taxa respiratória acumulada e o isolado UFV53 a menor na maior dose de 1,28 mmol

-1

de selenito de sódio (Figura 7).

Os resultados encontrados nestes experimentos indicam que o Se, em doses

elevadas, pode ser tóxico ao fungo, comprometendo seu crescimento e promovendo a

redução na taxa respiratória. A influência do Se na taxa respiratória foi observada

também em porcos, onde estes apresentaram uma redução de 38,8 % da taxa

respiratória após inalação de Se0

(Nonavinakere et al., 1999).

Porém, quando o Se

foi inalado na forma de selenometionina não houve diminuição significativa dessa

taxa. Esses autores afirmam, ainda, que a respiração é afetada pela forma inorgânica

de Se, como por exemplo, selenito de sódio e não pela forma orgânica desse

elemento. Uma provável explicação para o efeito diferenciado entre forma orgânica e

inorgânica deste elemento pode ser a solubilidade que influencia a liberação,

retenção e absorção do elemento. No entanto, na avaliação de atividade respiratória

deve-se ter cuidados na interpretação dos resultados, uma vez que valores de

respiração elevados podem ser resultantes de condições favoráveis do meio ou pode

ser reflexo de um consumo intenso de carbono oxidável, pela população microbiana,

em ambientes que causem estresse aos microrganismos (Tótola e Chaer, 2002).

Portanto, a redução na atividade respiratória, observada neste estudo, pode ter sido

em razão da redução no tamanho da célula fúngica pelo efeito da presença de

selenito de sódio, já que em condições de estresse, a atividade respiratória deveria

aumentar.

A redução da taxa respiratória dos isolados UFV11, UFV16 e UFV53

observada com o aumento da concentração de selenito de sódio no substrato (Figuras

4 e 5) nem sempre foi acompanhada pela redução da atividade das enzimas lacase,

celulase e xilanase (Figuras 1 a 3) e, pode-se sugerir que as reduções no crescimento

e na atividade respiratória de L. edodes causadas pela presença de Se levaram a

maior atividade metabólica do fungo e, conseqüentemente, maior atividade de suas

enzimas extracelulares para o crescimento.

1200

1400

1600

1800

2000

2200

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

mg CO

-1

substrato

Figura 6 - Atividade respiratória acumulada medida do quinto ao décimo segundo

dia de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do

fungo L. edodes cultivados em substrato ligninocelulósico a 25 ºC

1300

1600

1900

2200

2500

2800

3100

0 0,32 0,64 0,96 1,28

Selenito de sódio (mmol L

-1

)

mg CO

-1

substrato

Figura 7 - Atividade respiratória acumulada medida do décimo ao décimo sétimo dia

de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L.

edodes, cultivados a 25 ºC, em substrato ligninocelulósico

4. CONCLUSÕES

O selenito de sódio afetou, de maneira variável, as atividades da lacase,

celulase e xilanase em micélio de L. edodes e este efeito foi dependente do isolado,

da concentração de selenito de sódio e do tempo de avaliação da atividade.

O aumento da concentração de selenito de sódio adicionado ao substrato

reduziu a atividade respiratória. Entretanto, menor atividade respiratória, nem sempre

resultou em menor atividade das enzimas avaliadas.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO 3

ENRIQUECIMENTO DE COGUMELO SHIITAKE

(Lentinula edodes) COM SELÊNIO

1. INTRODUÇÃO

Os fungos formadores de cogumelos são importantes nos ecossistemas porque

são eficientes na decomposição de substratos ligninocelulósicos sem a necessidade

de pré-tratamentos (Ruegger et al., 2001). Esta característica permite a utilização dos

resíduos da produção agrícola para o cultivo de cogumelos.

A produtividade do cogumelo depende do substrato empregado no seu

cultivo. A natureza química do substrato usado para o cultivo de Lentinula edodes, o

shiitake, tem notável influência na produção dos cogumelos (Ohga, 1992; Shearer,

1995). O cogumelo shiitake é cultivado tradicionalmente em toras de madeira,

porém, ultimamente têm sido utilizadas toras artificiais à base de serragem de

madeira como alternativa para produção em menor tempo e em substratos mais

definidos. Este sistema é baseado em um suporte ligninocelulósico suplementado

com farelo de cereais como fonte de nutrientes, principalmente o nitrogênio

(Cavallazzi, 2004).

O selênio (Se), classificado como um metalóide, é elemento traço essencial ao

homem (Wu, 2004). Pelo menos quinze diferentes selenoproteínas e, ou

selenoenzimas já foram encontradas (Birringer et al., 2002). Esse elemento tem

numerosas funções fisiológicas, mas é melhor reconhecido como cofator para o

sistema da enzima glutationa peroxidase, responsável pela remoção de radicais livres

reduzindo, assim, os danos oxidativos à célula (Werner e Beelman, 2002). Em razão

deste efeito antioxidante, o Se tem sido associado com a cura de várias doenças

crônicas degenerativas, inclusive vários tipos de câncer (Clark et al., 1996; Spolar et

al., 1999) e a manutenção da fertilidade (Rayman, 2000).

A forma química do Se ingerido é um importante fator que determina sua

toxicidade, importância nutricional e fator metabólico (Shiobara et al., 1998). Vários

alimentos, cosméticos e suplementos fortificados com Se já estão disponibilizados no

mercado (Reilly, 1998). Selenometionina (SeMet), na forma de tabletes

suplementados com vitamina E, tem sido clinicamente aplicada no tratamento de

artrite reumatóide em humanos (Aaseth et al., 1998). O enriquecimento de alimentos

com Se pode reduzir a incidência de várias doenças e proporcionar maior resistência

às infecções em indivíduos de todas as idades (Ferreira, 1999).

Os microrganismos podem incorporar oxiânions de Se inorgânico em seus

tecidos por redução assimilatória, como nas selenocisteínas (Stolz e Oremland,

1999). Brady et al. (1996) sugeriram que microrganismos podem transformar

metalóide como o Se, por oxidação, redução, metilação e dealquilação. Esses autores

afirmaram ainda que os processos de transformação têm significância

biogeoquímica, visto que modificam a mobilidade e toxicidade dos metalóides e

possuem também um potencial biotecnológico na biorremediação.

Os cogumelos são conhecidos por acumular Se em seu ambiente de

crescimento (Reilly, 1996). Em particular, a espécie L. edodes (Ogra, 2004) e os

corpos de frutificação de muitas espécies de cogumelos contêm metalóides como

potássio (K), ferro (Fe), cobre (Cu), zinco (Zn) ou Se (Falandysz et al., 2001). Isso

sugere que os fungos possuem mecanismos efetivos que os capacitam absorver

alguns elementos traços do substrato de crescimento (Lepsova e Mejstrik, 1998). A

concentração desses elementos depende da fisiologia da espécie e do ecossistema em

que vivem (Lepsova e Mejstrik, 1998).

O enriquecimento de cogumelos, como o Agaricus bisporus, com Se, tem.

sido uma estratégia adotada para fornecimento desse elemento na dieta humana

(Spolar et al., 1998: Werner e Beelman, 2001; Werner e Beelman, 2002).

Considerando que os solos brasileiros são pobres em Se e, conseqüentemente, a

alimentação básica do brasileiro tem deficiência desse elemento (Ferreira, 1995), o

enriquecimento do cogumelo shiitake com esse elemento pode ser uma alternativa

para o enriquecimento nutricional. Diante do exposto, objetivou-se enriquecer

cogumelos shiitake com Se, para que o consumo desses possa suprir parte da

ingestão diária recomendada desse elemento ou reduzir a carência de Se em pessoas

com deficiência desse elemento ou ainda, ser utilizado no tratamento de muitas

doenças.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Associações

Micorrízicas do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO) da

Universidade Federal de Viçosa – UFV, em Viçosa – Minas Gerais.

2.1. Isolados e inóculo

Foram utilizados os isolados UFV16 e UFV52 de L. edodes (Berk.) Pegler

pertencentes à coleção do Departamento de Microbiologia da UFV para avaliação do

potencial de absorção de Se pelo fungo e, conseqüente enriquecimento dos

cogumelos com esse elemento. O isolado UFV52 foi utilizado em substituição aos

isolados UFV11 e UFV53 que foram selecionados para continuidade do estudo,

porém, não apresentaram frutificação. Além disso, o isolado UFV52 é produzido em

escala comercial.

Os isolados foram inoculados utilizando-se três discos de ágar de 8 mm de

diâmetro contendo micélio retirado das bordas das colônias das culturas cultivadas

em BDA, em placas de Petri de 90 mm de diâmetro contendo 20 mL de ágar batata

dextrose (BDA) - MERCK

, e incubados a 25 ºC por 15 dias, para reativar as

culturas.

Após este período, preparou-se substrato à base de serragem de eucalipto

(Eucalyptus grandis), contendo 78 % de serragem, 20 % de farelo de arroz, 0,4 % de

CaCO

e 1,6 % de CaSO

, umedecido a 65 % com água de torneira e acondicionou-

se em frascos com tampa metálica contendo um furo coberto com fita crepe, para

troca gasosa. Os frascos com o substrato, foram autoclavados por 60 minutos a 121

ºC e, após resfriamento, inocularam-se os isolados do fungo em condições assépticas,

com oito discos de ágar de 8 mm de diâmetro contendo micélio retirado das bordas

das colônias crescidas em BDA e incubou-se a 25 ºC com três horas de luz ao dia,

durante 30 dias.

2.2. Enriquecimento de cogumelo shiitake com Se

Para o cultivo do fungo L. edodes para a produção de cogumelos foi utilizado

o mesmo substrato à base de serragem de eucalipto descrito acima. Cerca de 700 g

do substrato foram acondicionadas em sacos de polipropileno, fechados com papel

com o auxílio de dois anéis de PVC concêntricos. Os sacos foram autoclavados por

120 minutos a 121 ºC e inoculados com 30 g do inóculo, em condições assépticas. A

incubação foi a 25 ºC com três horas de luz ao dia por aproximadamente 90 dias. Aos

45 dias de crescimento do fungo, foram feitos 25 cortes de aproximadamente 5 mm,

com bisturi, em toda a extensão dos sacos, para troca gasosa. Esse procedimento foi

repetido após 15 dias. Quando o substrato tornou-se marrom, os sacos foram

removidos e as toras artificiais submetidas a choque frio em água a 15 °C ± 2 °C

contendo soluções de selenito de sódio (Na

SeO

) nas concentrações de 0,08; 0,16;

0,32 e 0,64 mmol L

-1

, por 24 horas, para indução da frutificação. No tratamento

controle não foi adicionado Se à água do choque. Após o choque, as toras artificiais

foram mantidas em uma sala com temperatura de 23 ºC e umidade de 85 % até a

frutificação dos cogumelos. Os cogumelos foram colhidos aproximadamente, cinco

dias após a indução da frutificação, quando rompeu o véu e as lâminas estavam

completamente expostas. O experimento foi realizado em triplicata.

2.3. Análises físico-químicas do substrato ligninocelulósico e da água de

umidificação desse substrato

O teor de umidade do substrato ligninocelulósico foi determinado colocando-

se amostras em estufa com circulação forçada de ar, a 105 ºC por 48 horas. Foram

também determinados, o pH em potenciômetro (DM 20 Digimed), a atividade de

água - a

em analisador automático (Aqualab, Decagon, Inc.) e a concentração de

Se, por espectrometria de emissão atômica com plasma induzido (EEA-PI) (Optima

3300 Perkin Elmer), após digestão nítrico-perclórica de 0,5 g da amostra desidratada

e moída em moinho tipo Wiley modelo EDB-5, de acordo com Bataglia et al. (1983).

A determinação de Se da água utilizada para o preparo do substrato foi feita

em 0,5 mL de amostra, utilizando-se o mesmo procedimento para o substrato

ligninocelulósico, em EEA-PI (Optima 3300 Perkin Elmer).

2.4. Análises físico-químicas do cogumelo

Logo após a colheita, os cogumelos foram contados e pesados para o cálculo

da eficiência biológica, os diâmetros dos píleos e das hastes foram medidos e foi

realizada a determinação da cor. O material foi desidratado para a determinação da

umidade, proteínas solúveis, cálcio (Ca), magnésio (Mg), fósforo (P), K, Se e massa

seca para o cálculo da produtividade. Todas as análises foram realizadas em

triplicata.

2.4.1. Tamanho

O diâmetro do píleo e o diâmetro e comprimento da haste dos cogumelos

foram medidos com paquímetro, em duas posições representativas de suas margens.

2.4.2. Cor

A medida da cor superficial dos cogumelos de todos os tratamentos foi

determinada pela leitura direta de reflectância das coodernadas L

, a

, b

empregando a escala Hunter Lab, em equipamento ColorQuest II Sphere

(HunterLab, Reston, VA). O sistema Hunter Lab é um sistema de coordenadas

retangulares que define a cor em termos de luminosidade (L), vermelho versus verde

(a) e amarelo versus azul (b).

2.4.3. Umidade

A umidade dos cogumelos foi determinada em estufa com circulação de ar

forçada a 80 ºC até peso constante.

2.4.4. Proteínas solúveis

O teor de proteínas solúveis foi determinado pelo método Bradford (Bradford,

1976).

2.4.5. Minerais e selênio

O teor de Ca, Mg, P e do Se foi determinado por EEA-PI (Optima 3300

Perkin Elmer) após digestão nítrico-perclórica (Mattila et al., 2001). O K foi

determinado por fotometria de chama no mesmo extrato (Bataglia et al., 1983).

2.5. Produtividade

A produtividade (P) foi calculada, em cada tratamento, a partir da massa seca

dos cogumelos e a massa seca do substrato ligninocelulósico, pela seguinte fórmula:

P = massa seca dos cogumelos / massa seca do substrato ligninocelulósico x 100

2.6. Eficiência biológica

A eficiência biológica (EB) foi calculada, em cada tratamento, a partir da

massa dos cogumelos frescos e a massa seca do substrato ligninocelulósico por meio

da relação (Chang et al., 1981):

EB = massa dos cogumelos frescos / massa seca do substrato ligninocelulósico x 100

2.7. Análise estatística

Adotou-se o delineamento em fatorial com 2 isolados (UFV16 e UFV52) e 5

níveis de concentração de Se em três repetições. Os dados foram analisados,

estatisticamente, por análises de variância e de regressão, utilizando-se o programa

estatístico SAS.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dois isolados do fungo L. edodes avaliados apresentaram padrão de

crescimento semelhante durante a colonização do substrato ligninocelulósico e o

substrato só foi completamente colonizado pelo fungo no 45º dia de crescimento em

todos os tratamentos com Se e no controle.

3.1. Análises físico-químicas do substrato ligninocelulósico e da água de

umidificação desse substrato

O teor de umidade do substrato ligninocelulósico, após esterilização em

autoclave foi de 41 %, o pH de 4,6 e a atividade de água (a

) de 0,988. Pela

metodologia utilizada não foi possível detectar o Se no substrato ligninocelulósico e

nem na água utilizada para umedecer o substrato.

3.2. Análises físico-químicas do cogumelo

Observou-se que o diâmetro do píleo, o comprimento e o diâmetro da haste

dos cogumelos não variaram (p ≥ 0,05) entre os cogumelos dos diferentes

tratamentos com Se e nem entre os isolados. O diâmetro médio do píleo dos

cogumelos produzidos pelo isolado UFV16 foi de 4,75 cm, sendo o comprimento e o

diâmetro médio das hastes de 2,42 cm e 0,82 cm, respectivamente. Os cogumelos

produzidos pelo isolado UFV52 apresentaram píleo com diâmetro médio de 4,51 cm

e o comprimento e o diâmetro das hastes foram, 2,09 cm e 0,88 cm,

respectivamente. Estes dados contrastam com os obtidos com o cogumelo Pleurotus

cornucopiae, que teve o tamanho do cogumelo alterado conforme a composição do

substrato e com o número da colheita, ou seja, se primeira ou segunda (Royse, 2002;

Royse et al., 2004).

Foi observado que nos cogumelos produzidos nas toras tratadas com as

maiores concentrações de Se (0,32 mmol L

-1

e 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio), o

véu demorou mais para romper do que os submetidos ao choque frio apenas com

água ou com água adicionada de 0,08 mmol L

-1

e 0,16 mmol L

-1

de selenito de sódio.

Este resultado permite sugerir que o Se em doses mais elevadas retarda a frutificação

de cogumelos. Não houve frutificação de nenhum dos isolados tratados com as

concentrações de 0,96 mmol L

-1

e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio. Por esta razão,

optou-se por continuar os experimentos usando-se concentrações mais baixas desse

elemento adicionada na água usada para o choque frio.

Os resultados mostraram que os cogumelos enriquecidos com Se cultivados

em toras artificiais apresentaram valores de L, a e b referentes à cor, inferiores (p <

0,05) nos tratamentos em que se adicionou selenito de sódio em relação ao controle

(Figura 1). Menores valores de L, indicam escurecimento, embora, visualmente

nenhuma mudança de cor tenha sido observada. No entanto, essa variável não foi

influenciada pelo isolado. Este efeito do selenito de sódio sobre a cor do shiitake

difere dos resultados obtidos com o A. bisporus enriquecidos com selenito de sódio

por Spolar et al. (1998) e Werner e Beelman (2001) que verificaram que os

cogumelos não apresentaram diferenças significativas do valor L quando se

comparou ao tratamento controle, sem adição de Se.

O teor de umidade dos cogumelos variou de 89 % a 91% em todos os

tratamentos avaliados e, um aumento significativo de umidade foi constatado na

maior concentração (0,64 mmol L

-1

) de selenito de sódio (p < 0,05) demonstrando

um efeito do selênio sobre esta variável. O teor de umidade dos cogumelos não

variou entre os isolados (p ≥ 0,05).

Os resultados de umidade dos cogumelos encontrados no presente estudo

foram em torno de 90 % e se assemelham aos apresentados por Manzi et al. (2001),

que foram cerca de 92,8 % para o cogumelo A. bisporus e 91,34 % para o Pleurotus

ostreatus. Manzi et al. (2004) encontraram em cogumelos comerciais do gênero

Boletus, valores de umidade variando de 86,6 % a 87,4 %. Esses autores relataram

que o teor de umidade para outros cogumelos varia de 88,2 % a 94,1 %.

O teor de proteínas solúveis não foi afetado pela presença de Se e nem variou

com o isolado (p ≥ 0,05). Os valores de proteínas solúveis de 22,3 mg.g

-1

de massa

seca encontrados foram próximos ao valor de 22,8 mg relatado por Longvah e

Deosthale (1998) para L. edodes. Manzi et al. (2001) observaram que os valores de

proteínas para os cogumelos A. bisporus e P. ostreatus variaram de 16,3 mg.g

-1

16,1 mg.g

-1

de massa seca, respectivamente.

Figura 1 – Valores de L (A), a (B) e b (C) referentes à cor dos cogumelos shiitake

produzidos pelos isolados UFV16 e UFV52 em toras artificiais

imersas em diferentes concentrações de selenito de sódio

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Valores de L

Selenito de sódio na água do choque frio (mmol L

-1

)

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Valores de a

Selenito de sódio na água do choque frio (mmol L

-1

)

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Valores de b

Selenito de sódio na água do choque frio (mmol L

-1

)

100

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na água do choque frio (mmol L

-1

)

Umidade (%)

Figura 2 – Teor de umidade dos cogumelos shiitake produzidos pelos isolados

UFV16 e UFV52, em toras artificiais imersas em diferentes

concentrações de selenito de sódio

Dos minerais avaliados, apenas a concentração de Ca não variou entre os

isolados e nem com a presença de Se (p ≥ 0,05) nos tratamentos avaliados, incluindo

o controle. Resultados diferentes foram encontrados por Bento (2001) que registrou

uma grande variação no conteúdo em Ca entre diferentes estirpes de cogumelos

shiitake produzidos em toras artificiais e naturais, com valores entre 3,92 mg.100 g

-1

a 958,9 mg.100 g

-1

. Mattila et al. (2001) encontraram valores de Ca de 13 mg.100 g

-1

e 25 mg.100 g

-1

de massa seca nas duas estirpes de A. bisporus, enquanto que para as

espécies P. ostreatus e L. edodes esses valores de Ca foram de 0,4 mg.100 g

-1

e 1

mg.100 g

-1

de massa seca, respectivamente. Por outro lado, Manzi et al. (1999a)

observaram teores de Ca de 42,3 mg.g

-1

de massa seca e Longvah e Deosthale

(1998) de 127 mg.g

-1

de massa seca em espécies de cogumelos L. edodes.

Os teores de Mg foram influenciados pela adição de selenito de sódio (p <

0,05) porém, não variou entre os isolados (p ≥ 0,05) e mostraram uma tendência a

aumentar conforme se aumentou a dose de Se em ambos os isolados (Figura 3). Os

cogumelos dos isolados UFV16 e UFV52, do tratamento controle, apresentaram

valores de 142 mg.100 g

-1

e 184 mg.100 g

-1

de massa seca, respectivamente. Estes

valores foram próximos aos encontrados por Mattila et al. (2001) e Longvah e

Deosthale (1998) que verificaram um teor de 155 mg.100 g

-1

e 200 mg.100 g

-1

massa seca, respectivamente, em cogumelos L. edodes, e superiores ao valor de

116,5 mg.100 g

-1

de massa seca verificado por Manzi et al. (1999b), para a mesma

espécie de cogumelo.

O selenito de sódio adicionado ao substrato, influenciou (p < 0,05) o

conteúdo de P nos isolados estudados, porém o teor desse elemento não variou entre

os isolados (p ≥ 0,05) que apresentaram na dose 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio

valores de 1023 mg.100 g

-1

e 920 mg.100 g

-1

de massa seca para os isolados UFV16 e

UFV52, respectivamente (Figura 3). Os valores de P nos cogumelos dos tratamentos

controle variaram de 641 a 842 mg/100 g de massa seca, nos isolados estudados.

Longvah e Deosthale (1998) observaram teor de P em cogumelos L. edodes na faixa

de 493 mg/100 g de massa seca, enquanto Bento (2001) encontrou um valor desse

elemento em torno de 3822 mg/100 g de massa seca em cogumelos dessa mesma

espécie.

O teor de K variou (p < 0,05) de 830 mg.100 g

-1

a 1940 mg.100 g

-1

de massa

seca entre os isolados e com a adição de selenito de sódio e tendeu a diminuir à

medida que se aumentou a dose de selenito de sódio (Figura 3). Estes resultados

indicam que o teor de K em cogumelos shiitake enriquecidos com Se é alto.

Resultados semelhantes foram encontrados por Bento (2001) que observaram um

teor de K de 979 mg.100 g

-1

de massa seca em L. edodes cultivados no mesmo

substrato sem adição de Se. Por sua vez, Manzi et al. (1999b) e Mattila et al. (2001)

verificaram teores de K em L. edodes de 2647 mg.100 g

-1

e 2270 mg.100 g

-1

massa seca, respectivamente, valores considerados altos pelos autores. Esses

resultados também foram semelhantes aos relatados por Aletor e Aladetimi (1989)

que afirmaram que a concentração de K em cogumelos shiitake é superior ao

encontrado em feijão. Aletor (1995) encontrou o valor de K de 1.600 mg.100 g

-1

massa seca em cogumelos da espécie Lentinus subnudus.

Os altos valores de minerais em cogumelos comestíveis indicam o potencial

para seu uso como uma fonte alimentar de boa qualidade (Aletor, 1995) e a

concentração de minerais, principalmente K, nitrogênio (N), sódio (Na) e ferro (Fe)

em alguns cogumelos são altos (Aletor e Aladetimi, 1989). A alta correlação entre

pares de elementos indica que eles podem ter uma relação forte e proporcional, onde

a presença de um elemento pode facilitar ou dificultar a absorção de outro.

Figura 3 – Teor de Ca (A), Mg (B), P (C) e K (D) dos cogumelos shiitake produzidos

pelos isolados UFV16 e UFV52 em toras artificiais imersas em

diferentes concentrações de selenito de sódio

Os resultados do experimento revelaram que os valores de Se nos cogumelos

enriquecidos com esse elemento aumentaram linearmente com o aumento da dose de

selenito de sódio adicionado à água do choque frio e, valores de Se superiores a 17

mg.100 g

-1

foram encontrados nos cogumelos tratados com 0,64 mmol L

-1

de selenito

de sódio (Figura 4). Os teores de Se nas concentrações 0,08; 0,16 e 0,32 mmol L

-1

selenito de sódio, foram 1,0 mg.100 g

-1

; 3,0 mg.100 g

-1

e 5,0 mg.100 g

-1

de massa

seca, respectivamente. Estes resultados estão de acordo com Spolar et al. (1998) e

Werner e Beelman (2002) que verificaram que a adição de selenito de sódio na água

100

200

300

400

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na á

ua do choque frio

(mmol L

-1

)

Teor de Ca (mg 100 g

-1

cogumelo

desidratado)

100

200

300

400

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na á

ua do choque frio

(mmol L

-1

)

Teor de Mg (mg 100 g

-1

cogumelo

desidratado)

200

400

600

800

1000

1200

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na á

ua do choque frio

(mmol L

-1

)

Teor de P (mg 100 g

-1

cogumelo

desidratado)

-500

500

1000

1500

2000

2500

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na água do choque frio

(mmol L

-1

)

Teor de K (mg 100 g

-1

cogumelo

desidratado)

de irrigação dos cogumelos A. bisporus causou um aumento de Se nesses cogumelos

e o grau de acúmulo foi diretamente dependente da concentração de selenito de sódio

adicionada. Ogra et al. (2004), analisando o cogumelo shiitake enriquecido com Se

na forma de selenito de sódio, observaram que o conteúdo de Se dos cogumelos

shiitake liofilizados foi 355,7 µg Se g

-1

de cogumelo desidratado. Para Werner e

Beelman (2002), a adição de dose elevada de Se (197,1 mg.kg

-1

) apresentou

concentrações acima de 1300 mg.kg

-1

desse elemento nos cogumelo.

0,00 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na água do choque frio (mmol L

-1

)

Teor de Se (mg 100 g

-1

cogumelo

desidratado)

Figura 4 – Teor de selênio dos cogumelos shiitake produzidos pelos isolados

UFV16 e UFV52 em toras artificiais imersas em diferentes

concentrações de selenito de sódio

Nos cogumelos do tratamento controle, não foi detectada a presença de Se.

Esse resultado está em concordância com Spolar et al. (1998) e Werner e Beelman

(2002) que enriqueceram cogumelos A. bisporus com Se e observaram que o

tratamento controle, sem adição de Se, mostrou valores desprezíveis desse elemento.

Mattila et al. (2001) encontraram teor de Se no cogumelo shiitake não enriquecido

em torno de 3,9 μg.100 g

-1

de cogumelo seco, valores considerados baixos pelos

autores. Porém, Werner e Beelman (2001) enriqueceram o cogumelo A. bisporus e

observaram valores expressivos de Se no controle, provavelmente devido à presença

desse elemento no substrato. O substrato utilizado para o cultivo do cogumelo A.

bisporus é à base de bagaço de cana-de-açúcar, capim ou feno, diferente do substrato

utilizado para o cultivo do cogumelo shiitake. Os teores de Se encontrados nos

cogumelos produzidos pelos dois isolados avaliados foram idênticos, significando

que não houve influência do isolado (p ≥ 0,05) na absorção desse elemento (Figura

4). Kalac e Svoboda (2000) encontraram valores de Se em cogumelos comestíveis

variando de 1 a 2 mg.100 g

-1

de matéria seca, embora outros autores afirmam que os

valores de Se em cogumelos variam de 0,1 mg.100 g

-1

a 0,5 mg.100 g

-1

de matéria

seca (Piepponen et al., 1990). Mattila et al. (2001) afirmaram que os valores de Se

em cogumelos do gênero Agaricus são altos e estão entre 0,32 mg.100 g

-1

e 0,14

mg.100 g

-1

de massa seca, nas variedades marrom e branca, respectivamente. Porém,

o cogumelo P. ostreatus apresentou um conteúdo de Se 20 vezes menor do que o

Agaricus e o L. edodes apresentou valores mais inferiores chegando à cerca de 80

vezes menos que o Agaricus (Mattila et al., 2001).

Os teores de Se, em torno de 17 mg.100 g

-1

de cogumelo desidratado,

encontrados nos cogumelos shiitake enriquecidos com a concentração 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio, correspondem a 309 % da RDA (Recommended Dietary

Allowances), para uma mulher e um homem adultos. O consumo de 4 g de

cogumelos fresco supre as necessidades diárias desse elemento indicando que o

cogumelo shiitake enriquecido com Se pode ser considerado uma excelente fonte

desse elemento. De fato, Werner e Beelman (2001) afirmaram que para ser excelente

fonte de um elemento, o alimento tem que suprir acima de 20 % da RDA. Esses

autores encontraram em cogumelos A. bisporus cultivados em composto adicionado

de 1,8 mg.kg

-1

de Se um conteúdo médio de Se de 126 % da RDA com uma variação

de 100 % a 145 %, enquanto que o controle apresentou uma concentração natural de

Se equivalente a 12,4 % de RDA com uma variação de 10 % a 14,8 %.

Os resultados obtidos demonstram que o fungo L. edodes é um bom

acumulador de Se e os cogumelos shiitake enriquecidos com esse elemento podem

ser usados como alimento com alegação de propriedade funcional ou como alimento

com alegação de propriedade de saúde. O cogumelo shiitake pode ser utilizado

também para o enriquecimento de minerais, como o fósforo (Queiroz, 2004).

3.3. Produtividade

A produtividade dos cogumelos shiitake enriquecidos com Se variou

significativamente (p < 0,05) com a adição de selenito de sódio, porém, não foi

observada nenhuma diferença quando se comparou os isolados avaliados (p ≥ 0,05).

Os cogumelos shiitake enriquecidos com Se apresentaram aumento na

produtividade até a concentração 0,32 mmol L

-1

de selenito de sódio, tendo havido

diminuição dessa característica na concentração 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio.

Este resultado pode indicar que, a partir dessa dose o Se é tóxico ao fungo L. edodes

(Figura 6). Spolar (1997) citado por Spolar et al. (1998) também demonstrou que

concentrações elevadas de Se adicionadas ao composto podem diminuir a produção

de cogumelos A. bisporus. Entretanto, em concentrações baixas de selenito de sódio,

os cogumelos A. bisporus têm a capacidade de crescer sem efeitos negativos à

qualidade e à produtividade (Spolar, 1998; Hartman, 2000).

0,00

0,40

0,80

1,20

1,60

2,00

0 0,16 0,32 0,48 0,64

Selenito de sódio na água do choque frio (mmol L

-1

)

Produtividade (%)

Figura 5 – Produtividade dos cogumelos shiitake produzidos pelos isolados

UFV16 e UFV52 em toras artificiais imersas em diferentes

concentrações de selenito de sódio

A produtividade baixa, em torno de 1 %, do cogumelo shiitake obtida neste

experimento, inclusive nos substratos não enriquecidos com Se não foi devida ao

selênio, já que houve aumento da produtividade nas menores doses de selenito de

sódio pesquisadas. Esta baixa produtividade pode estar relacionada ao fato de que se

trabalhou apenas com um fluxo de colheita, tendo sido dado apenas um choque para

induzir a frutificação. Geralmente, a produção de shiitake pode ser feita em até

quatro colheitas, com boa produtividade. Queiroz et al. (2004) observaram um

aumento da produtividade dos cogumelos shiitake após o primeiro e o segundo fluxo

de colheita e a maior produtividade foi encontrada no quarto fluxo. Para os autores, o

primeiro fluxo de colheita a produtividade dos cogumelos foi desprezível. Os autores

afirmaram que a suplementação com fonte de fósforo e nitrogênio tem efeito positivo

na produtividade dos cogumelos. Werner e Beelman (2002) avaliando o crescimento

de A. bisporus em substratos com adição de Se, encontraram que o aumento da

concentração de selenito de sódio (30,1; 82,5 e 197,1 mg.kg

-1

) no substrato de

crescimento do fungo, provocou uma diminuição linear na produção dos corpos de

frutificação dos cogumelos à medida que se aumentou a dose desse elemento. Esses

autores sugerem que a adição de doses altas de Se ao cogumelo podem originar

produtos que poderiam ser usados em dietas suplementares ou como um ingrediente

para a formulação de alimentos de propriedades nutricêuticas e, para compensar a

baixa produtividade pelo efeito tóxico do Se no desenvolvimento de cogumelos, esse

produto necessitaria ser comercializado por um preço mais elevado.

3.4. Eficiência biológica

A conversão da percentagem de massa seca para massa fresca de cogumelo é

chamada de eficiência biológica (EB). A Tabela 1 apresenta os resultados da

eficiência biológica para os isolados estudados. O isolado UFV16 mostrou uma

maior EB em doses mais elevadas de Se, enquanto que o isolado UFV52 não

apresentou melhorias na EB pelo aumento de doses de Se. Ruegger et al. (2001)

encontraram uma EB de 55,66 % ± 20,41 % em cogumelos Oudemansiella canarri

(Jungh.) cultivado em bagaço de cana-de-açúcar e suplementado com 50 g de farelo

de trigo. Royse (2002) avaliando o cogumelo comercial Pleurotus cornucopiae,

encontrou EB de 81,7 % na primeira colheita e de 92,2 % na segunda colheita

quando utilizou 5 % de inóculo, enquanto que nos tratamentos que receberam apenas

1,25 % de inóculo a EB ficou pouco acima de 50 %. A EB do fungo P. cornucopiae

formador de cogumelo que cresceu em substrato acrescido de 6 % de suplemento

com produto comercial (Campbell’s S-41), foi de 61,7 % e 80,6 % na primeira e na

segunda colheita, respectivamente, valores superiores aos tratamentos que não

receberam suplemento (Royse et al., 2004) mostrando que a EB é influenciada pela

composição do meio de cultivo de fungos formadores de cogumelos.

Tabela 1 – Eficiência Biológica de cogumelos shiitake enriquecidos com Se,

produzidos pelos isolados UFV16 e UFV52 em toras artificiais

imersas em 0,08; 0,16; 0,32; e 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio e

controle sem Se

Eficiência Biológica (%)

Concentração

de selênio

UFV16 UFV52

Controle 12,27 9,97

0,08 mmol L

-1

6,48 13,32

0,16 mmol L

-1

13,25 12,06

0,32 mmol L

-1

17,92 8,58

0,64 mmol L

-1

11,31 11,31

4. CONCLUSÕES

O padrão de crescimento do fungo L. edodes foi uniforme nas diferentes

concentrações de Se avaliadas. A produção de cogumelos teve influência positiva

com a presença de Se, apresentando-se redução na produtividade apenas na dose 0,64

mmol L

-1

de selenito de sódio o que leva a se supor que essa dose tem efeito negativo

na produção do cogumelo estudado.

A produtividade foi baixa, porém, não se pode relacionar com a presença de

Se, já que o controle apresentou baixos valores de produtividade e essa produtividade

aumentou com a dose de Se, sendo verificado efeito negativo apenas na última dose.

Os dois isolados avaliados apresentaram comportamento semelhante em todas

as variáveis testadas, com exceção do teor de potássio, que foi diferente para os dois

isolados, demonstrando que esses isolados não interferiram nestas características.

O cogumelo shiitake pode ser enriquecido com Se pela adição desse elemento

na água utilizada para o choque frio aplicado nas toras artificiais, para indução da

formação do corpo de frutificação dos cogumelos.

Os cogumelos shiitake enriquecidos com Se, podem ser considerados

excelente fonte desse elemento e podem ser utilizados como alimento com alegação

de propriedade funcional ou ainda ser utilizado como alimento com alegação de

propriedade de saúde na fórmula de cápsulas ou tabletes já que a forma de Se

absorvida pelos cogumelos shiitake é biodisponível ao organismo humano.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE

100

CAPÍTULO 1

Quadro 1 – Resumo da análise de variância para as curvas de crescimento de doze

isolados do fungo L. edodes cultivados em BDA e substrato

ligninocelulósico adicionados de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L. QM

BDA Substrato

Ligninocelulósico

Isolados 11 4,4556* 1,5106*

[selênio] 4 2,7978* 4,9967*

Tempo 3 84,6338* 118,7043*

Isolado * [selênio] 44 0,1579* 0,085982*

Isolado * tempo 33 0,3494* 0,1785*

[selênio]*tempo 12 0,42277* 0,2803*

Isolado*[selênio]*tempo 132 0,02870* 0,01680*

Resíduo 480 0,0146830 0,01263*

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

101

Quadro 2 – Resumo da análise de regressão para as curvas de crescimento de doze isolados do fungo L. edodes cultivados em BDA

adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Controle

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 6,3044* 2,8667* 5,2688* 5,5322* 5,3074* 8,4180* 3,8913

7,4526* 7,7976* 6,6813* 8,1660* 3,5085*

Falta de ajustamento 2 0,0621

n.s.

0,1121

n.s.

0,0618

n.s.

0,0113

n.s.

0,0511

n.s.

0,1021

n.s.

0,0121

n.s.

0,0375

n.s.

0,0253

n.s.

0,0118

n.s.

0,3247 0,1588

n.s.

Tempo (3) 2,1429* 1,0303* 1,7955* 1,8516* 1,8032* 2,8741* 1,3052 2,5091* 2,6161* 2,2350* 2,9385* 1,2754*

0,32 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 6,4033* 3,0677* 3,7250* 5,8263* 5,4234* 7,4047* 3,6803* 7,0288* 6,3395* 5,2138* 7,3430* 5,1439*

Falta de ajustamento 2 0,0415

n.s.

0,1276

n.s.

0,0724

n.s.

0,0388

n.s.

0,0634

n.s.

0,0666

n.s.

0,0187

n.s.

0,0552

n.s.

0,1009

n.s.

0,0120

n.s.

0,3330

n.s.

0,0804

n.s.

Tempo (3) 2,1621* 1,1076* 1,2899* 1,9679* 1,8501* 2,5127* 1,2393* 2,3797* 2,1804* 1,7459* 2,6700* 1,7682*

0,64 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 5,7524* 1,8943* 3,8583* 3,7395* 4,1929* 6,0636* 1,8484* 5,0721* 5,1176* 4,3578* 6,8865* 2,6988*

Falta de ajustamento 2 0,0981

n.s.

0,0255

n.s.

0,0774

n.s.

0,0074

n.s.

0,0212

n.s.

0,0733

n.s.

0,0394

n.s.

0,0261

n.s.

0,0393

n.s.

0,0153

n.s.

0,4142

n.s.

0,0866

n.s.

Tempo (3) 1,9501* 0,6484* 1,3377* 1,2514* 1,4118* 2,0701* 0,6424* 1,7081* 1,7302* 1,4628* 2,5716* 0,9573*

102

Continuação do Quadro 2

...

0,96 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 4,4467* 2,3956* 3,5124* 2,7482* 3,2798* 4,3632* 1,7695* 4,5111* 1,4267* 4,0068* 5,8269* 1,6998*

Falta de ajustamento 2 0,0491

n.s.

0,0593

n.s.

0,1074

n.s.

0,0061

n.s.

0,0258

n.s.

0,0194

n.s.

0,0315

n.s.

0,0323

n.s.

0,0149

n.s.

0,0213

n.s.

0,2522

n.s.

0,0531

n.s.

Tempo (3) 1,5190* 0,8380* 1,2424* 0,9201*

1,1101* 1,4673* 0,6108* 1,5252* 0,4855* 1,3450* 2,1101* 0,6020*

1,28 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 3,5873* 2,4693* 3,1405* 1,6010* 3,0142* 4,6054* 2,2434* 3,2578* 1,0381* 3,4182* 6,0414* 2,0115*

Falta de ajustamento 2 0,0107

n.s.

0,0495

n.s.

0,0643

n.s.

0,0072

n.s.

0,0490

n.s.

0,0333

n.s.

0,0060

n.s.

0,0301

n.s.

0,1527

n.s.

0,0481

n.s.

0,1841

n.s.

0,1413

n.s.

Tempo (3) 1,2029* 0,8561* 1,0897* 0,5384* 1,0374* 1,5573* 0,7518* 1,1060* 0,4478* 1,1714* 2,1365* 0,7647*

Resíduo 480 0,146830

G.L. - Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo a 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

103

Quadro 3 – Equações estimadas para as curvas de crescimento de doze isolados do fungo L. edodes cultivados em BDA adicionado de

0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Isolados Controle 0,32 mmol L

-1

Equação R

CV (%) Equação R

CV (%)

UFV11

=1,751+0,216*tempo

98,068 3,821

=1,772+0,218*Tempo

98,720 3,377

UFV16

=1,619+0,146*tempo

92,743 5,644

=1,546+0,151*Tempo

92,319 7,536

UFV53

=2,188+0,197*tempo

97,704 3,088

=2,303+0,166*Tempo

96,260 7,311

UFV62

=1,619+0,202*tempo

99,703 2,573

=1,525+0,208*Tempo

98,687 4,778

UFV63

=1,806+0,198*tempo

98,112 3,297

=1,702+0,200*Tempo

97,714 5,385

UFV73

=1,530+0,249*tempo

97,631 4,477

=1,554+0,234*Tempo

98,232 3,642

UFV74

=1,560+0,169*tempo

99,382 2,525

=1,530+0,165*Tempo

98,992 2,973

UFV75

=1,454+0,235*tempo

99,005 2,808

=1,487+0,228*Tempo

98,453 3,643

UFV78

=1,372+0,240*tempo

99,355 3,786

=1,311+0,217*Tempo

96,915 5,286

UFV80

=1,419+0,222*tempo

99,649 2,212

=1,458+0,197*Tempo

99,543 5,547

UFV81

=1,629+0,246*tempo

92,633 7,630

=1,711+0,233*Tempo

91,683 7,597

UFV82

=1,669+0,161*tempo

91,700 7,988

=1,613+0,195*Tempo

96,970 5,272

104

Continuação do Quadro 3...

CV – Coeficiente de variação

Isolados 0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Equação R

CV (%) Equação R

CV (%)

UFV11

=1,810+0,206*Tempo

98,324 3,125

=1,916+0,181*Tempo

97,838 3,253

=1,905+0,163*Tempo

99,404 4,647

UFV16

=1,771+0,118*Tempo

97,379 6,613

=1,697+0,133*Tempo

95,285 4,696

=1,699+0,135*Tempo

96,147 4,534

UFV53

=2,295+0,169*Tempo

96,144 3,601

=2,244+0,161*Tempo

94,236 4,457

=2,263+0,153*Tempo

96,068 3,944

UFV62

=1,685+0,166*Tempo

99,608 1,407

=1,750+0,143*Tempo

99,559 3,397

=1,833+0,109*Tempo

99,112 12,367

UFV63

=1,599+0,176*Tempo

98,997 6,589

=1,627+0,156*Tempo

98,479 3,575

=1,984+0,149*Tempo

96,849 3,384

UFV73

=1,623+0,212*Tempo

97,639 3,943

=1,607+0,179*Tempo

99,119 3,303

=1,608+0,185*Tempo

98,574 3,965

UFV74

=1,645+0,117*Tempo

95,910 7,567

=1,701+0,114*Tempo

96,562 4,237

=1,671+0,129*Tempo

99,465 4,074

UFV75

=1,562+0,194*Tempo

98,980 3,405

=1,597+0,183*Tempo

98,587 3,056

=1,549+0,155*Tempo

98,185 3,675

UFV78

=1,514+0,195*Tempo

98,489 6,143

=1,729+0,103*Tempo

97,950 11,264

=1,672+0,088*Tempo

77,261 10,533

UFV80

=1,496+0,179*Tempo

99,305 6,269

=1,569+0,172*Tempo

98,948 2,690

=1,555+0,159*Tempo

97,266 4,475

UFV81

=1,686+0,226*Tempo

89,261 8,569

=1,714+0,208*Tempo

92,033 7,0075

=1,625+0,212*Tempo

94,256 6,806

UFV82

=1,901+0,141*Tempo

93,969 6,953

=1,962+0,112*Tempo

94,123 4,121

=1,771+0,122*Tempo

87,682 6,257

105

Quadro 4 – Resumo da análise de regressão para as curvas de crescimento de doze isolados do fungo L. edodes cultivados em substrato

ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Controle

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 8,1763* 6,3629* 7,6855* 7,6377* 7,7185* 6,8290* 4,7850* 7,4450* 7,0500* 7,0042* 7,8056* 8,0227*

Falta de ajustamento 2 0,2498

n.s.

0,3001

n.s.

0,2609

n.s.

0,2772

n.s.

0,2371

n.s.

0,1994

n.s.

0,0196

n.s.

0,2858

n.s.

0,2032

n.s.

0,1689

n.s.

0,2619

n.s.

0,2616

n.s.

Tempo (3) 2,8920 2,3211 2,7358 2,7307 2,7309 2,4092 1,6080 2,6721 2,4855 2,4473 2,7764 2,8486

0,32 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 7,6384* 6,8499* 7,7933* 6,0643* 7,4758* 6,6247* 3,3616* 7,4935* 6,2876* 6,8324* 7,5530* 5,3653*

Falta de ajustamento 2 0,2009

n.s.

0,1755

n.s.

0,2156

n.s.

0,2543

n.s.

0,1976

n.s.

0,1303

n.s.

0,0226

n.s.

0,2087

n.s.

0,1584

n.s.

0,2149

n.s.

0,1914

n.s.

0,1581

n.s.

Tempo (3) 2,6800 2,4003 2,7415 2,1909 2,6237 2,2951 1,1356 2,6370 2,2014 2,4208 2,6452 1,8939

0,64 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 6,1960* 4,6437* 7,2266* 5,2493* 4,7281* 4,7281* 2,6730* 5,1545* 5,3372* 5,8188* 6,8432* 6,7637*

Falta de ajustamento 2 0,0855

n.s.

0,1602

n.s.

0,1411

n.s.

0,1833

n.s.

0,0902

n.s.

0,0902

n.s.

0,0258

n.s.

0,1180

n.s.

0,1044

n.s.

0,1201

n.s.

0,1589

n.s.

0,1864

n.s.

Tempo (3) 2,1223 1,6547 2,5029 1,8719 1,6362 1,6362 0,9082 1,7968 1,8487 2,0196 2,3870 2,3788

106

Continuação do Quadro 4 ...

0,96 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 6,8438* 4,5183* 6,5300* 4,7557* 4,8116* 4,77760* 1,4623* 6,0694* 4,2236* 5,4174* 7,1415* 5,3575*

Falta de ajustamento 2 0,0612

n.s.

0,0949

n.s.

0,1037

n.s.

0,0712

n.s.

0,0461

n.s.

0,0481

n.s.

0,0127

n.s.

0,1412

n.s.

0,0130

n.s.

0,1031

n.s.

0,1628

n.s.

0,1722

n.s.

Tempo (3) 2,3221 1,5694 2,2458 1,6327 1,6346 1,6241 0,4959 2,1173 1,4165 1,8746 2,4890 1,9006

1,28 mmol L

-1

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53 UFV62 UFV63 UFV73 UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 1 5.988* 4.1328* 6,549* 3,8476* 6,6061* 3,8042* 1,6567* 4,7861* 2,9000* 4,9916* 6,9728* 4,6448*

Falta de ajustamento 2 0,0448

n.s.

0,0524

n.s.

0,1046

n.s.

0,0258

n.s.

0,1841

n.s.

0,0468

n.s.

0,0375

n.s.

0,0813

n.s.

0,0266

n.s.

0,0312

n.s.

0,4582

n.s.

0,3454

n.s.

Tempo (3) 2,0259 1,4126 2,2528 1,2997 2,3248 1,2993 0,5772 1,6495 0,9844 1,6847 2,6297 1,7785

Resíduo 480 0, 01263

G.L. - Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

107

Quadro 5 – Equações estimadas para as curvas de crescimento de doze isolados do fungo L. edodes cultivados em substrato

ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Isolados Controle 0,32 mmol L

-1

Equação R

CV (%) Equação R

CV (%)

UFV11

=1,759+0,246*Tempo

94,240 6,257

=1,691+0,238*Tempo

95,004 6,006

UFV16

=1,912+0,217*Tempo

91,379 7,210

=1,730+0,225*Tempo

95,126 6,281

UFV53

=1,804+0,239*Tempo

93,641 6,633

=1,704+0,240*Tempo

94,756 6,191

UFV62

=1,842+0,238*Tempo

93,233 6,693

=1,879+0,212*Tempo

92,262 7,789

UFV63

=1,795+0,239*Tempo

94,211 6,110

=1,670+0,235*Tempo

94,980 6,441

UFV73

=1,969+0,225*Tempo

94,483 5,788

=1,808+0,222*Tempo

96,215 5,445

UFV74

=1,70+0,188*Tempo

99,188 2,464

=1,704+0,158*Tempo

98,676 4,498

UFV75

=1,889+0,235*Tempo

92,870 6,605

=1,783+0,236*Tempo

94,722 6,570

UFV78

=1,889+0,229*Tempo

94,550 6,611

=1,786+0,216*Tempo

95,204 6,220

UFV80

=1,857+0,228*Tempo

95,398 5,370

=1,809+0,225*Tempo

94,080 6,473

UFV81

=1,823+0,240*Tempo

93,712 6,366

=1,798+0,237*Tempo

95,176 5,642

UFV82

=1,78+0,244*Tempo

93,878 6,677

=2,046+0,199*Tempo

94,433 5,320

108

Continuação do Quadro 5 ...

Isolados 0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Equação R

CV (%) Equação R

CV (%)

UFV11

=1,686+0,214*Tempo

97,314 5,392

=1,561+0,225*Tempo

98,244 3,794

=1,498+0,211*Tempo

98,527 7,886

UFV16

=1,876+0,185*Tempo

93,547 6,805

=1,808+0,183*Tempo

95,968 6,256

=1,747+0,175*Tempo

97,526 4,380

UFV53

=1,643+0,231*Tempo

96,242 5,181

=1,660+0,220*Tempo

96,922 5,420

=1,660+0,220*Tempo

96,905 6,800

UFV62

=1,809+0,197*Tempo

93,473 5,994

=1,733+0,188*Tempo

97,094 4,230

=1,774+0,169*Tempo

98,676 3,193

UFV63

=1,837+0,187*Tempo

96,325 5,533

=1,740+0,189*Tempo

98,120 3,433

=1,712+0,221*Tempo

94,722 4,477

UFV73

=1,837+0,187*Tempo

96,325 5,533

=1,743+0,188*Tempo

98,025 3,508

=1,648+0,168*Tempo

97,598 4,202

UFV74

=1,874+0,141*Tempo

98,109 5,550

=2,005+0,104*Tempo

98,293 5,002

=1,808+0,111*Tempo

95,668 5,157

UFV75

=1,828+0,195*Tempo

95,623 5,012

=1,750+0,212*Tempo

95,553 6,273

=1,769+0,188*Tempo

96,716 5,355

UFV78

=1,835+0,199*Tempo

96,235 7,902

=1,750+0,212*Tempo

99,388 3,553

=1,74+0,147*Tempo

98,202 3,379

UFV80

=1,820+0,208*Tempo

96,037 4,842

=1,832+0,200*Tempo

96,333 4,429

=1,626+0,192*Tempo

98,767 2,696

UFV81

=1,791+0,225*Tempo

95,560 5,583

=1,733+0,230*Tempo

95,639 5,758

=1,713+0,227*Tempo

88,385 9,900

UFV82

=1,778+0,224*Tempo

94,777 6,440

=1,780+0,199*Tempo

93,959 6,197

=1,823+0,185*Tempo

87,053 9,816

CV – Coeficiente de variação

109

Quadro 6 – Resumo da análise de variância para a massa seca de doze isolados

do fungo L. edodes cultivados em BDA e substrato

ligninocelulósico adicionados de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de Variação G.L. QM

Isolados 11 3217,6889*

Dose 4 1795,1250*

Isolados*dose 44 466,0462*

Resíduo 120 27,5667

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

Quadro 7 – Resumo da análise de regressão para a massa seca de doze isolados

do fungo L. edodes cultivados em BDA e substrato

ligninocelulósico adicionados de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de

variação

G.L QM

UFV11 UFV16

Regressão 1 691,2* 1070,7302*

Falta de

ajustamento

3 18,8

n.s.

1,5428

n.s.

[Selênio] (4) 186,9* 803,4333*

UFV53 UFV62 UFV63 UFV73

Regressão 2 164,1270* 1280,1905* 1874,8492* 317,7778*

Falta de

ajustamento

2 24,6857

n.s.

134,2762* 1,7191

n.s.

14,9333

n.s.

[Selênio] (4) 129,2667* 707,2333* 1406,5667* 242,0667*

UFV74 UFV75 UFV78 UFV80 UFV81 UFV82

Regressão 3 7,5

n.s.

1503,857* 833,5906* 523,4* 256,9444* 1578,6984*

Falta de

ajustamento

1 86,2556

n.s.

29,2762

n.s.

16,5428

n.s.

1023,0667*

145,8333* 6,1714

n.s.

[Selênio] (4) 66,5667

n.s.

766,5667* 425,0667* 773,2333* 229,1667* 1185,5667*

Resíduo 120 27,5667

G.L. - Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

110

Quadro 8 – Equações estimadas para o teor de massa seca de doze isolados do fungo

L. edodes cultivados em BDA e substrato ligninocelulósico adicionados

de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem

selênio

Isolados Equação R

CV (%)

UFV 11

= 5,467 +15 *[selênio]

92,456 18,749

UFV16

= 22,914+134,077*[selênio]-338,309*[selênio]

+198,364*[selênio]

99,952 15,055

UFV 53

= 19,324+76,587*[selênio]-163,458*[selênio]

+79,685*[selênio]

95,226 21,668

UFV 62

= 64,210-73,810*[selênio]+38,132*[selênio]

90,507 18,150

UFV 63

= 50,090+206,014*[selênio]-467,820*[selênio]

+229,730*[selênio]

99,969 12,234

UFV 73

= 53,067+108,681*[selênio]-216,471*[selênio]

+113,593*[selênio]

98,458 15,817

UFV 74

= Y=13,733 (nenhuma equação ajustada)

- -

UFV 75

= 44,743-80,060*[selênio]+41,387*[selênio]

98,090 18,873

UFV 78

= 36,391-32,649*[selênio]+7,441*[selênio]

98,054 23,452

UFV 80

= 51,867-53,854*[selênio]+30,925*[selênio]

33,845 38,419

UFV 81

= 44,5-111,372*[selênio]+193,685*[selênio]

-92,400*[selênio]

84,091 18,327

UFV 82

= 52,171-5,134*[selênio]-112,769*[selênio]

+71,208*[selênio]

99,870 12,825

CV – Coeficiente de variação

Quadro 9 – Resumo da análise de variância para o diâmetro das hifas, distância

entre septos, distância entre núcleos dos isolados UFV11; UFV16 e

UFV53 do fungo L. edodes cultivados em BDA adicionado de 0,32;

0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem

selênio

Fonte de variação G.L. QM

Diâmetro das

hifas

Distância entre

septos

Distância entre

núcleos

Isolados 2 267,0845* 376799,7170* 60,6671*

[selênio] 4 116,7538* 123897,7056* 32,5336*

Isolados* [selênio] 8 51,5115

n.s.

28379,3207

n.s.

47,9668*

Resíduo 30 31,0339 27164,0820 11,8781

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

111

Quadro 10 – Resumo da análise de regressão para o diâmetro das hifas, distância

entre septos e distância entre núcleos dos isolados UFV11; UFV16 e

UFV53 do fungo L. edodes cultivados em BDA adicionado de 0,32;

0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem

selênio

Diâmetro das hifas

Fonte de variação G.L QM

UFV 11 UFV 16

Regressão 1 20,6073

n.s.

112,1875

n.s.

Falta de ajustamento 3 19,5853

n.s.

95,8990

n.s.

[ selênio ] (4) 19,8408

n.s.

99,9711

n.s.

UFV 53

Regressão 3 124,4577*

Falta de ajustamento 1 26,4922

n.s.

[ selênio ] (4) 99,9649*

Resíduo 30 31,0339

Distância entre septos

Fonte de variação G.L QM

UFV 11 UFV 16

Regressão 2 90487* 125007*

Falta de ajustamento 2 50970,6734

n.s.

18800,4128

n.s.

[ selênio ] (4) 70728,9125

n.s.

71903,9552

n.s.

UFV 53

Regressão 1 311,60609

n.s.

Falta de ajustamento 3 505694,1037

n.s.

[ selênio ] (4) 38023,4793

n.s.

Resíduo 30 27164,0820

Distância entre núcleos

Fonte de variação G.L QM

UFV 11 UFV 53

Regressão 1 56,4578* 9,5057

n.s.

Falta de ajustamento 3 34,4728

n.s.

20,8291

n.s.

[ selênio ] (4) 39,9690*

17,9982

n.s.

UFV 16

Regressão 3 45,5193*

Falta de ajustamento 1 145,4419*

[ selênio ] (4) 70,4999*

Resíduo 30 11,8781

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

112

Quadro 11 – Equações estimadas para o diâmetro das hifas, distâncias entre septos e

distância entre núcleos dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do

fungo L. edodes cultivados em BDA adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e

1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Diâmetro das hifas

Isolados Equação R

CV (%)

UFV 11

= Y =30,939

- -

UFV 16

= Y =36,464

- -

UFV 53

=41,792+28,810*[selênio] -61,663*[selênio]

+25,760*[selênio]

93,375 12,998

Distância entre septos

Isolados Equação R

CV (%)

UFV 11

=354,722+818,782*[selênio] -641,022*[selênio]

63,967 31,223

UFV 16

=645,883+966,975*[selênio] -753,426*[selênio]

86,927 23,230

UFV 53

= Y =647,882

- -

Distância entre núcleos

Isolados Equação R

CV (%)

UFV 11

=17,681-4,287*[selênio]

35,313 34,283

UFV 16

=14,961-45,293*[selênio]+99,968*[selênio]

-53,127*[selênio]

48,425 36,900

UFV 53

= Y =10,936

- -

CV – Coeficiente de variação

113

CAPÍTULO 2

Quadro 1 – Resumo da análise de variância da atividade enzimática dos isolados

UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato

ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L. QM

Lacase Celulase Xilanase

Isolados 2 10836,2172* 4,9258* 0,8374*

[selênio] 4 8650,7238* 7,5016* 2,4958*

Tempo 2 33980,7865* 43,8276* 4,8005*

Isolado*[selênio] 8 3128,6861* 12,0367* 13,6870*

Isolado*tempo 4 4274,8476* 5,7388* 6,79298*

[selênio]*tempo 8 6112,3737* 21,3208* 10,4642*

Isolados*[selênio]*tempo 16 2817,6446* 63,2716* 29,4642*

Resíduo 90 58,4499 0,1024 0,02758

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

114

Quadro 2 – Resumo da análise de regressão para a atividade enzimática dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L.

edodes cultivados em substrato ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de

sódio e controle sem selênio

1º grau

Fonte de variação G.L. QM

UFV 11

7 dias - Lacase

UFV 11

21 dias - Xilanase

UFV 16

7 dias - Lacase

UFV 16

14 dias - Lacase

UFV 16

14 dias -Celulase

UFV 53

7 dias - Lacase

Regressão 1 0,09419

n.s.

0,0000768

n.s.

0,1221

n.s.

1012,0905* 1,1098* 0,2517

n.s.

Falta de ajustamento 3 3,4296

n.s.

0,0000256

n.s.

0,5858

n.s.

358,7634* 3,1733* 9,9377

n.s.

[Selênio] (4) 2,5957

n.s.

0,0000384

n.s.

0,1776

n.s.

522,09552* 2,6574* 7,5162

n.s.

Resíduo 90 58,4499 0,02758 58,4499 58,4499 0,1024 58,4499

2º grau

Fonte de variação G.L. QM

UFV 11

7 dias – Celulase

UFV 11

14 dias - Celulase

UFV 11

7 dias – Xilanase

UFV 16

21 dias – Lacase

UFV 16

7 dias - Xilanase

Regressão 2 0,65431* 13,3078* 0,5376* 3249,0048* 1,6535*

Falta de ajustamento 2 1,6066* 0,10999

n.s.

0,1151* 6251,4708* 0,1795*

[Selênio] (4) 1,1304* 1,1304* 0,3263* 6077,8100* 0,9165*

Resíduo 90 0,1024 0,1024 0,02758 58,4499 0,02758

Fonte de variação G.L QM

UFV 16

21 dias - Xilanase

UFV 53

14 dias - Lacase

UFV 53

21 dias – Lacase

UFV 53

7 dias – Xilanase

UFV 53

21 dias - Xilanase

Regressão 2 2,9689* 589,9206* 6066,3456* 1,2278* 0,1324*

Falta de ajustamento 2 1,0982* 2277,4960* 12442,2282* 0,4339* 2,2248*

[Selênio] (4) 2,0335* 1433,7083* 9254,2869* 0,8308* 1,1786*

Resíduo 90 0,02758 58,4499 58,4499 0,02758 0,02758

115

Continuação do Quadro 2 ...

3º grau

Fonte de variação G.L. QM

UFV 11

14 dias - Xilanase

UFV 11

14 dias - Lacase

UFV 11

21 dias - Celulase

UFV 11

21 dias - Lacase

UFV 16

7 dias - Celulase

Regressão 3 4,1178* 17078* 2,39267* 10395* 6,0679*

Falta de ajustamento 1 3,2079* 2544,1028* 1,2483* 4765,6769* 0,003772

n.s.

[Selênio] (4) 3,8903* 13444,7064* 2,1066* 8987,8205* 0,1608

n.s.

Resíduo 90 0,02758 58,4499 0,1024 58,4499 0,1024

Fonte de variação G.L QM

UFV 16

21 dias - Celulase

UFV 53

7 dias - Xilanase

UFV 53

14 dias - Xilanase

UFV 53

14 dias - celulase

UFV 53

21 dias - celulase

Regressão 3 1,8293* 0,8669* 0,7129* 2,1027* 2,9181*

Falta de ajustamento 1 4,9911* 0,7227* 0,6792* 0,005121

n.s.

0,3016

n.s.

[Selênio] (4) 2,6197* 0,8308* 0,7045* 1,5783* 2,2640*

Resíduo 90 0,1024 0,02758 0,02758 0,1024 0,1024

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

116

Quadro 3 – Equações estimadas para atividade enzimática dos isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato

ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Xilanase – UFV 11

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

=0,518-0,421*[selênio]+0,736*[selênio]

82,367 27,668

=1,441-13,008*[selênio]+27,554*[selênio]

-13,517*[selênio]

79,385 48,363

= 0,0016

- -

Xilanase – UFV 16

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

=0,432-0,991*[selênio]+1,460*[selênio]

90,207 37,566

=1,625-2,343*[selênio]+0,768*[selênio]

72,997 80,134

Xilanase – UFV 53

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

= 1,015+1,551*[selênio]-4,061*[selênio]

+1,769*[selênio]

78,255 48,843

= 0,0128+1,410*[selênio]-2,936*[selênio]

+1,956*[selênio]

75,896 68,080

= 0,6985-0,8638*[selênio]+0,4995*[selênio]

7,967 135,568

Celulase – UFV 11

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

=2,314-1,922*[selênio]+1,650*[selênio]

28,940 27,622

=0,540+0,855*[selênio]+1,583*[selênio]

99,180 24,812

= 0,615+8,382*[selênio]-18,304*[selênio]

+8,927*[selênio]

85,185 61,190

Celulase – UFV 16

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

= 1,791-6,210*[selênio]+13,037*[selênio]

-5,32023*[selênio]

99,979 16,361

= 2,609-0,601*[selênio]

10,440 39,210

= 1,060+5,348*[selênio]-10,218*[selênio]

+4,287*[selênio]

52,370 69,757

117

Continuação do Quadro 3 ...

Celulase – UFV 53

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

= 1,398+1,575*[selênio]-1,808*[selênio]

32,256 61,375

= 0,900+7,522*[selênio]-9,202*[selênio]

+3,027*[selênio]

99,919 18,648

= 0,428-4,659*[selênio]+10,342*[selênio]

-4,512*[selênio]

96,669 25,471

Lacase – UFV 11

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

= 0,941

- -

=7,011-246,501*[selênio]+739,769*[selênio]

-367,857*[selênio]

80,332 32,784

=-4,764+636,778*[selênio]-1032,358*[selênio]

+478,221*[selênio]

86,745 30,001

Lacase – UFV 16

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

= 1,421

- -

= 5,167+18,151*[selênio]

48,463 55,480

=24,517+161,816[selênio]-114,070*[selênio]

26,728 56,664

Lacase – UFV 53

Tempo (dias) Equação R

CV (%)

= 6,604

- -

=13,189+49,02 *[selênio]-45,516*[selênio]

- -

= -10,982+221,457*[selênio]-157,701*[selênio]

32,776 136,353

CV – Coeficiente de variação

118

Quadro 4 – Resumo da análise de variância da atividade respiratória dos isolados

UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L. edodes, em dois experimentos,

cultivados em substrato ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96

e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de Variação G.L. QM

Respiração 1 * Respiração 2 **

Isolados 2 7619,1068*** 4368,2083***

[selênio] 4 4189,0473*** 39304,9620***

Tempo 7 33111,7252*** 4262,2160***

Isolados*[selênio] 14 319,6589*** 337,8594***

Isolados*tempo 8 1455,4440*** 868,2490***

[selênio]*tempo 28 728,2949*** 374,3630***

Isolados*[selênio]*Tempo 56 192,0614

n.s.

90,5856

n.s.

Resíduo 240 160,7484 182,7813

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

* Taxa respiratória medida do quinto ao décimo segundo dia de crescimento do fungo

** Taxa respiratória medida do décimo ao décimo sétimo dia de crescimento do fungo

*** Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

n.s. – Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

119

Quadro 5 – Resumo da análise de regressão da atividade respiratória do quinto ao

décimo segundo dia de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e

UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato ligninocelulósico

adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio de e

controle sem selênio

Fonte de

variação

UFV11 – Controle UFV11– 0,64 mmol L

-1

UFV53 – Controle

Regressão 1 31353* 1540* 39883*

Falta de

ajustamento

6 38,4784

n.s.

53,6930

n.s.

46,8964

n.s.

Tempo (7) 4511,9793* 2194,5407* 5737,7313*

UFV11

Controle 0,32 mmol L

-1

0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Regressão 2 - 13226* - 8751,0410* 7850,7534*

Falta de

ajustamento

5 - 66,3807

n.s.

- 70,2654

n.s.

125,6528

n.s.

Tempo (7) - 3826,2158* - 2550,4870* 2332,8244*

UFV16

Controle 0,32 mmol L

-1

0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Regressão 2 10810* 10252* 4549,1803* 7265,5037* 1149,8893*

Falta de

ajustamento

5 307,9209

n.s.

116,9815

n.s.

50,5496

n.s.

140,9112

n.s.

415,5234*

Tempo (7) 3308,6599* 3012,6613* 1335,8726* 2176,5091* 625,3422*

UFV53

Controle 0,32 mmol L

-1

0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

Regressão 2 - 7871,8021* 7751,5013* 3316,3634* 3419,3996*

Falta de

ajustamento

5 - 22,2806

n.s.

23,6924

n.s.

198,5845

n.s.

35,0022

n.s.

Tempo (7) - 2265,0011* 2231,6378* 1089,3785* 1001,9729*

Resíduo 240 160,7484

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

120

Quadro 6 - Equações estimadas para a atividade respiratória do quinto ao décimo segundo dia de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e

UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito

de sódio de e controle sem selênio

[Selênio] UFV11 UFV16

Equação R

CV (%) Equação R

CV (%)

Controle

=-56,425+15,774*Tempo

99,269 15,741

=-124,782+40,484*Tempo-1,635*Tempo

93,351 18,059

0,32 mmol L

-1

=-109,453+31,844*Tempo-1,029*Tempo

98,762 17,334

=-157,084+49,462*Tempo-2,205*Tempo

97,228 13,334

0,64 mmol L

-1

=-27,139+10,925*Tempo

97,905 17,527

=-137,166+44,241*Tempo-2,173*Tempo

97,297 15,348

0,96 mmol L

-1

=-186,716+56,433*Tempo-2,704*Tempo

98,032 14,393

=-123,949+41,361*Tempo-1,840*Tempo

95,376 13,059

1,28 mmol L

-1

=-178,723+52,781*Tempo-2,519*Tempo

96,156 16,124

=-20,740+21,251*Tempo-1,030*Tempo

52,538 21,552

UFV53

Equação R

CV (%)

Controle

=-42,594+17,791*Tempo

99,300 3,555

0,32 mmol L

-1

=-109,063+41,164*Tempo-1,799*Tempo

99,300 9,745

0,64 mmol L

-1

=-124,896+42,456*Tempo-1,884*Tempo

99,242 6,735

0,96 mmol L

-1

=-124,318+44,386*Tempo-2,279*Tempo

86,979 22,446

1,28 mmol L

-1

=-52,676+27,174*Tempo-1,188*Tempo

97,505 12,952

CV – Coeficiente de variação

121

Quadro 7 - Resumo da análise de regressão atividade respiratória do décimo ao

décimo sétimo dia de crescimento dos isolados UFV11; UFV16 e

UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato ligninocelulósico

adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio de e

controle sem selênio

Fonte de variação G.L QM

UFV11

Controle 0,32 mmol L

-1

0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Regressão 2 4410,8042* 1948,0852* 1610,1582* 930,1537* 869,1104*

Falta de

ajustamento

5 133,3049

n.s.

173,2028

n.s.

95,2515

n.s.

83,1600

n.s.

131,9851

n.s.

Tempo (7) 1355,4475* 680,3121* 528,0820* 325,1582

n.s.

342,5923

n.s.

UFV16

Controle 0,32 mmol L

-1

0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Regressão 2 4705,0602* 656,0439* 562,0301* 1594,0525* 93,0242

n.s.

Falta de

ajustamento

5 120,6694

n.s.

31,5780

n.s.

64,3302

n.s.

34,6839

n.s.

33,5152

n.s.

Tempo (7) 1430,4954* 209,9968

n.s.

260,5302

n.s.

480,2178* 50,5178

n.s.

UFV53

Controle 0,32 mmol L

-1

0,64 mmol L

-1

0,96 mmol L

-1

1,28 mmol L

-1

Regressão 3 1251,8868* 531,7047* 1018,3085* 187,8326

n.s.

89,4928*

Falta de

ajustamento

4 223,3897

n.s.

95,0404

n.s.

38,7969

n.s.

13,6362

n.s.

33,4809

n.s.

Tempo (7) 664,1742* 282,1822

n.s.

458,5876* 88,2918

n.s.

57,4860

n.s.

Resíduo 240 182,7813

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

122

Quadro 8 - Equações estimadas para a atividade respiratória do décimo ao décimo sétimo dia de crescimento de três isolados do

fungo L. edodes (UFV11, UFV16 e UFV53) cultivados em substrato ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96

e 1,28 mmol L

-1

de selenito de sódio de e controle sem selênio

[Selênio] UFV11 UFV16

Equação R

CV (%) Equação R

CV (%)

Controle

=-443,370+83,537*Tempo-2.868*Tempo

92,975 3,844

=-346,988+66,927*Tempo-2,203*Tempo

93,975 12,908

0,32 mmol L

-1

=-367,100+74,960*Tempo-2,780*Tempo

81,815 6,199

=-94,391+29,800*Tempo-1,011*Tempo

89,259 11,599

0,64 mmol L

-1

=188,414+50,242*Tempo-1,977*Tempo

87,116 6,878

=-110,442+31,419*Tempo-1,088*Tempo

77,751 8,234

0,96 mmol L

-1

=-239,164+51,967*Tempo-1,908*Tempo

81,732 18,659

=-180,652+35,162*Tempo-1,136*Tempo

94,841 15,296

1,28 mmol L

-1

=-226,920+49,418*Tempo-1,795*Tempo

72,482 9,324

=84,843

- -

UFV53

Equação R

CV (%)

Controle

=-1543,855+356,890*Tempo-24,597*Tempo

+0,559*Tempo

80,780 5,258

0,32 mmol L

-1

=-1325,320+312,880*Tempo-22,055*Tempo

+0,510*Tempo

80,754 7,995

0,64 mmol L

-1

=-1675,009+381,455*Tempo-26,740*Tempo

+0,617*Tempo

95,166 7,394

0,96 mmol L

-1

=93,474

- -

1,28 mmol L

-1

= Y =86,423

- -

CV – Coeficiente de variação

122

Quadro 9 – Resumo da análise de variância da atividade respiratória acumulada dos

isolados UFV11; UFV16 e UFV53 do fungo L. edodes cultivados em

substrato ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol

-1

de selenito de sódio de e controle sem selênio

Fonte de Variação G.L. QM

ACUMULADA 1* ACUMULADA 2**

Isolados 2 128734,1040

n.s.

149529,0630***

[selênio] 4 418301,9000*** 1392929,691***

Isolados*[selênio] 8 86969,4420

n.s.

63292,409

n.s.

Resíduo 30 64386,4870 38030,8980

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

*Taxa respiratória acumulada medida no quinto ao décimo segundo dia de crescimento do fungo

**Taxa respiratória acumulada medida no décimo ao décimo sétimo dia de crescimento do fungo

*** Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

n.s – Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

Quadro 10 – Resumo da análise de regressão da atividade respiratória acumulada do

quinto ao décimo segundo dia de crescimento dos isolados UFV11;

UFV16 e UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato

ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

selenito de sódio de e controle sem selênio

Fonte de variação G.L QM

Regressão 2 692841*

Falta de ajustamento 2 143762,412

n.s.

Dose (4) 418301,900

Resíduo 40 72120,459

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

Quadro 11 –

Resumo da análise de regressão da atividade respiratória acumulada do

décimo ao décimo sétimo dia de crescimento dos isolados UFV11;

UFV16 e UFV53 do fungo L. edodes cultivados em substrato

ligninocelulósico adicionado de 0,32; 0,64; 0,96 e 1,28 mmol L

-1

selenito de sódio de e controle sem selênio

Fonte de variação G.L QM

UFV11 UFV16 UFV53

Regressão 2 503098* 831788* 1539974*

Falta de ajustamento 2 21032,2941

n.s.

142114,057* 1021,4440

n.s.

Dose (4) 262065,3200

486951,230* 770497,960*

Resíduo 30 38030,898

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

123

CAPÍTULO 3

Quadro 1 – Resumo da análise de variância para o diâmetro do píleo, diâmetro e

comprimento da haste dos cogumelos shiitake produzidos a partir dos

isolados UFV16 e UFV52 em toras artificiais adicionadas de 0,08;

0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem

selênio

Fonte de variação G.L. QM

Diâmetro

do píleo

Comprimento

da haste

Diâmetro

da haste

Isolados 1 0,4330

n.s.

0,7683

n.s.

0,0289

n.s.

[selênio] 4 1,5209

n.s.

0,6208

n.s.

0,0141

n.s.

Isolados*[selênio] 4 2,2175

n.s.

0,9991

n.s.

0,0641

n.s.

Resíduo 20 3,7709 0,5308 0,0621

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

Quadro 2 – Resumo da análise de variância para os valores de L, a e b referente à

cor dos cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e

UFV52 em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L. QM

L a b

Isolados 1 7,8643

n.s.

0,00012

n.s.

20,2541

n.s.

[selênio] 4 83,9323* 10,6046* 64,2710*

Isolados*[selênio] 4 17,8355* 10,9463* 19,1230*

Resíduo 20 4,5744 2,0107 5,3327

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

124

Quadro 3 – Resumo da análise de regressão para os valores de L, a e b referente

à cor dos cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados

UFV16 e UFV52 em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32

e 0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L QM

L a B

Regressão 3 111,8220* 12,8090* 84,3003*

Falta de ajustamento 1 0,2634

n.s.

3,9913

n.s.

40,1831

n.s.

[selênio] (4) 83,9323* 10,6046* 64,2710*

Resíduo 20 4,5744 2,0107 5,3327

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

n.s. -

Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

Quadro 4 – Equações estimadas para os valores de L, a e b referente à cor dos

cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e UFV52

em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

Variáveis

Da cor

Equação R

CV (%)

Valor L

= 50,590-107,833*[selênio]+366,148*[selênio]

-340,459*[selênio]

99,922 5,808

Valor a

= 22,734-105,257*[selênio]+379,378*[selênio]

-359,663*[selênio]

98,373 16,424

Valor b

= 13,631-37,0159*[selênio]+126,852*[selênio]

-111,429*[selênio]

90,591 15,493

CV – Coeficiente de variação

Quadro 5 – Resumo da análise de variância para a concentração de proteína dos

cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e UFV52

em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L. QM

Proteína

Isolados 1 0,0441

n.s.

[selênio] 4 27,6868

n.s.

Isolados*[selênio] 4 14,3480

n.s.

Resíduo 20 28,5974

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

125

Quadro 6 – Resumo da análise de variância dos minerais e do selênio dos

cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e UFV52

em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de

variação

G.L. QM

Ca Mg P K Se

Isolados 1 0,7489

n.s.

1,9253

n.s.

191,4203

n.s.

1169014,644*

0,1414

n.s.

[selênio] 4 285,9259

n.s.

4881,6328* 69418,9272*

365853,701* 311,9023*

Isolados*[selênio] 4 79,7966

n.s.

1617,0759

n.s.

35395,3480*

342949,154

n.s.

0,2280

n.s.

Resíduo 20 106,0488 1503,0827 6509,2522 125967,708 4,5583

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

Quadro 7 – Resumo da análise de regressão da concentração de minerais e do

selênio

dos cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados

UFV16 e UFV52 em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e

0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L QM

K - UFV 16

Regressão 1 77,299

n.s.

Falta de ajustamento 3 5010,1436

n.s.

[selênio] (4) 23082,3204

n.s.

Resíduo 20 125967,708

Regressão 2 621,6455*

Falta de ajustamento 2 2,1592

n.s.

[selênio] (4) 311,9023*

Resíduo 20 4,5583

Mg P K - UFV52

Regressão 3 6498,6157*

92479* 873485*

Falta de ajustamento 1 30,6839

n.s.

237,2982

n.s.

122426,981

n.s.

[selênio] (4) 4881,6328*

69418,9272* 685720,534*

Resíduo 20 1503,0827 6509,2522 125967,708

G.L. – Graus de liberdade

QM: Quadrado médio.

n.s. - Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

126

Quadro 8 – Equações estimadas para os minerais e para o selênio dos cogumelos

shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e UFV52 em toras

artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

de selenito de

sódio e controle sem selênio

Elemento Equação R

CV (%)

= Y= 22,285

- -

= 163,897+378,835*[selênio]-2262,649*[selênio]

+2836,68*[selênio]

99,844 21,000

= 743,674+1698,158*[selênio]-9649,294*[selênio]

+11801*[selênio]

99,914 12,658

K - UFV16

= Y= 940,369

- -

K - UFV52

= 1033,310+15102*[selênio]-75783*[selênio]

+82174*[selênio]

95,537 36,279

= 0,215+7,938*[selênio]+30,285*[selênio]

99,654 34,917

CV – Coeficiente de variação

Quadro 9 – Resumo da análise de variância para o teor de umidade e a

produtividade dos cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados

UFV16 e UFV52 em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e

0,64 mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L. QM

Umidade Produtividade

Isolados 1 0,5133

n.s.

0,02144

n.s.

[selênio] 4 2,7500* 0,20764*

Isolados*[selênio] 4 3,1139* 0,3308*

Resíduo 20 0,7257 0,007299

G.L. – Graus de liberdade

QM - Quadrado médio

n.s. - Não significativo ao nível de 5 % de probabilidade

* Significativo ao nível de 5 % de probabilidade

127

Quadro 10 – Resumo da análise de regressão para o teor de umidade e produtividade

dos cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e

UFV52 em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64

mmol L

-1

de selenito de sódio e controle sem selênio

Fonte de variação G.L QM

Umidade Produtividade

Regressão 2 5,3671*

0,2895*

Falta de ajuste 2 0,13292

n.s.

0,1258*

[selênio[ (4) 2,74999*

0,2076*

Resíduo 20 0,7257 0,007299

G.L. – Graus de liberdade

QM – Quadrado médio

n.s.

- Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* Significativo ao nível de 5% de probabilidade

Quadro 11 – Equações estimadas para o teor de umidade e produtividade dos

cogumelos shiitake produzidos a partir dos isolados UFV16 e UFV52

em toras artificiais adicionadas de 0,08; 0,16; 0,32 e 0,64 mmol L

-1

selenito de sódio e controle sem selênio

Variável Equação R

CV (%)

Umidade

= 90,203-4,951*[selênio]+10,350*[selênio]

97,583 1,125

Produtividade

= 1,012+1,923*[selênio]-3,223*[selênio]

69,717 22,630

CV – Coeficiente de variação

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