( PDF ) Composição química e atividade alelopática de extratos foliares de Leonurus sibiricus L. (Lamiaceae)

Download PDF

ads:

UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

CÂMPUS DE BOTUCATU

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ALELOPÁTICA DE

EXTRATOS FOLIARES DE Leonurus sibiricus L. (Lamiaceae)

LUIZ FERNANDO ROLIM DE ALMEIDA

Tese apresentada ao Instituto de

Biociências, Câmpus de Botucatu,

UNESP, para obtenção do título de

Doutor em Ciências Biológicas

(Botânica), AC: Fisiologia Vegetal

BOTUCATU - SP

- 2006 -

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

CÂMPUS DE BOTUCATU

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ALELOPÁTICA DE

EXTRATOS FOLIARES DE Leonurus sibiricus L. (Lamiaceae)

LUIZ FERNANDO ROLIM DE ALMEIDA

Profª Drª Maria Elena Aparecida Delachiave

Orientadora

Prof Dr Wagner Vilegas

Co-Orientador

Tese apresentada ao Instituto de

Biociências, Câmpus de Botucatu,

UNESP, para obtenção do título de

Doutor em Ciências Biológicas

(Botânica), AC: Fisiologia Vegetal

BOTUCATU - SP

- 2006 -

ads:

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS

Almeida, Luiz Fernando Rolim.

Composição química e atividade alelopática de extratos foliares de

Leonurus sibiricus L. (Lamiaceae) – Luiz Fernando Rolim de Almeida, 2006.

107p.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências

de Botucatu, 2004.

Orientadora: Maria Elena Aparecida Delachiave

Co-orientador: Wagner Vilegas

Assunto CAPES: 20303009

1. Fisiologia vegetal

CDD 581.1

Palavras-chave: alelopatia, Leonurus; plantas medicinais; óleo essencial;

flavonóides, fitoquímica

Dedico

A DEUS.

EFÍGRAFE

“ (....) Essa é a oportunidade histórica da docência, oportunidade que

não existe fora de nós próprios, num certo compartimento do tempo, à espera

que vamos a seu encalço, mas nas relações entre nós e o tempo, na intimidade

dos acontecimentos, no jogo das contradições. Oportunidade que vamos

criando, fazendo na própria história nossa biografia. A história nos castiga

quando não aproveitamos a oportunidade de termos algum compromisso com

as teias sociais que criam e recriam a ciência e a educação. (....)”

Paulo Freire

Pedagogia da Esperança, 1992.

Agradecimentos

Á Prof

. Maria Elena Aparecida Delachiave pela confiança e paciência nesses

anos onde pude imaginar e depois vislumbrar os possíveis caminhos a seguir. Obrigado

minha amiga e mestre.

Ao Prof. Wagner Vilegas por ter dado a oportunidade de aprender a fitoquímica

e ter possibilitado a realização de um sonho...saber o que as plantas produzem e como

estudar tudo isso.

Ao Prof. Vincenzo De Feo, pelo apoio e paternalismo ao me receber num país

desconhecido até então, apaixonante por natureza e por conseqüência, obrigado por sua

paixão a botânica e por sua atenção ao brasiliano.

Á Prof

. Lourdes Campaner dos Santos, á Dr

. Miriam Sannomiya e á Dr

Emilia Quaranta pela orientação de bancada e pela sinceridade espontânea

imprescindíveis para uma boa Ciência.

Ao Clenílson Rodrigues e Daniel Rinaldi, amigos novos e irmãos de ciência, por

terem me ensinado os passos de um bom fracionamento inerentes de qualquer

fitoquímico.

Aos meus pais, Mario e Mariângela, que ensinaram a olhar pra frente, a

agradecer a Deus e a confiar que meu caminho estava ali do meu lado. Obrigado por

todos esses anos de aprendizado. Amo Vocês...

Aos meus irmãos, Telma, Marinho e Ado, pela lição que deram ao irmão mais

velho de que a construção de uma família vale á pena. Deus abençoe vocês as suas

famílias recém nascidas.

A Bruna, minha noiva e mulher, agradeço pela compreensão, afeto e carinho

nesses anos.

Aos amigos de laboratório. Em Botucatu, João, Yara, Mônica, Camilla, Andréa,

Rodrigo...Em Araraquara, Roberto, Tamara, Juliana Severi, Marcelo, Marcio, Maria

Eloísa, Ana Elisa, Juliana Rodrigues,...Em Salerno, Francesco, Antonio, Angeline,

Carolina, Nillia, Emilia e Laura.

Aos amigos de Botucatu, das repúblicas e dos bares....seria irresponsabilidade

citar todos aqui....obrigado pelas conversas, dúvidas e desafios vividos.

E a todos que de certa maneira me ajudaram a ser mais lúcido, mais sincero,

mais amigo...

PREFÁCIO

Grande número de substâncias químicas oriundas de vegetais foi catalogado

e relacionado com atividades biológicas, em decorrência do aumento de estudos com

plantas medicinais. A Química de Produtos Naturais, como linha de pesquisa, colaborou

para o avanço do conhecimento da flora brasileira, desenvolvendo importantes

metodologias e tecnologias, principalmente nos estudos das plantas medicinais. Ao

mesmo tempo, os avanços da Fisiologia Vegetal, especialmente na ecofisiologia,

levantaram aspectos importantes sobre as relações entre as plantas e as implicações com

fatores bióticos e abióticos. Também, o desenvolvimento de abordagens

interdisciplinares na área de Botânica colaboraram para o reconhecido status científico

da área de ecofisiologia, fato esse que facilitou o acesso a recursos financeiros e

intercâmbio entre pesquisadores de outros países. A alelopatia, interação química entre

plantas e microorganismos, é uma área relativamente nova da ecofisiologia e requer

abordagem interdisciplinar, possibilitando que os trabalhos científicos sobre o assunto

estejam presentes nos mais diferentes periódicos, mostrando a importância e o

crescimento desta área de estudo.

Os estudos interdisciplinares sobre os potenciais alelopáticos vegetais, têm

possibilitado a inclusão de novas teorias químico-ecológicas nas linhas de pesquisa em

Fisiologia Vegetal. As interações entre as plantas e o solo, os mecanismos de defesa

contra patógenos e herbívoros e os fatores ambientais que modulam a produção das

substâncias do metabolismo secundário reforçam a necessidade da abordagem

interdisciplinar.

O presente trabalho procurou colocar em prática os ensinamentos postulados

na literatura pelos demais pesquisadores e buscou aprender a investigar as interações

químicas entre plantas. Ao tentar entender tais relações, a pesquisa nos levou aos

universos desconhecidos da ciência e nos trouxe velhas inquietações sobre novas

dúvidas inerentes do processo de investigação científica. É pela evolução da química de

produtos naturais, aumento de trabalhos publicados em alelopatia, interação entre as

áreas de conhecimentos, entre outros, que este autor agradece aos pesquisadores e

professores que auxiliaram, mesmo às vezes sem tomar conhecimento, na busca

inquieta pelas respostas. Ás tentativas e aos acertos dos que escreveram sobre alelopatia

ofereço esta investigação inicial em Fisiologia Vegetal. Que as velhas moléculas

oriundas de milhões de anos atrás nos permitam conhecer novos caminhos para algumas

áreas da ecofisiologia.

Luiz Fernando Rolim de Almeida

S U M Á R I O

Resumo ........................................................................................................... 2

Abstract .......................................................................................................... 4

Introdução ........................................................................................................ 6

Revisão Bibliográfica ..................................................................................... 8

Leonurus sibiricus ..................................................................................... 8

Alelopatia ................................................................................................. 9

Flavonóides ............................................................................................... 12

Capítulo 1- Composição do óleo essencial de Leonurus sibiricus L. .............

Resumo .......................................................................................................

Abstract ......................................................................................................

Introdução ...................................................................................................

Material e Método .....................................................................................

Resultado e Discussão ................................................................................

Referência Bibliográfica.............................................................................

Capítulo 2- Potencial alelopático de folhas de Leonurus sibiricus L. .............

Resumo .......................................................................................................

Abstract ......................................................................................................

Introdução ...................................................................................................

Material e Método .....................................................................................

Resultado e Discussão ................................................................................

Referência Bibliográfica ............................................................................

Considerações Finais ...................................................................................... 54

Referências Bibliográficas ............................................................................. 56

Anexo .............................................................................................................. 63

ALMEIDA, LUIZ FERNANDO ROLIM. COMPOSIÇÃO QUÍMICA E

ATIVIDADE ALELOPÁTICA DE EXTRATOS FOLIARES DE Leonurus

sibiricus L. (LAMIACEAE) 2006. 96p. TESE (DOUTORADO) –

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL

PAULISTA, BOTUCATU.

Resumo: A erva-macaé ou rubim (Leonurus sibiricus L.) pertence à família Lamiaceae da

ordem Lamiales. A planta é considerada invasora em lavouras agrícolas, presente em áreas

abandonadas, com crescimento espontâneo em quase todo território brasileiro. Exudatos

radiculares dessa espécie aumentam a germinação de arroz, trigo e mostarda, mas o extrato

aquoso de folhas inibe a germinação de milho e o crescimento de plântulas de tomate. A

utilização como erva medicinal é indicada, com base na tradição popular, para resfriado,

bronquite e reumatismo; utilizada também na forma de chás, nos casos de sangramento pós-

parto, menstruação excessiva, bem como, edema, abscessos e problemas renais. As folhas e

flores, em infusão, são capazes de combater vômitos e diarréias. Os extratos metanólicos de

folhas demonstram atividade antiinflamatória e combatem células neoplásicas de glândulas

mamárias, o que justifica diversos estudos etnofarmacológicos realizados com esta espécie no

Brasil. Em relação à composição química, a literatura relata que L. sibiricus apresenta

alcalóides, mono, sesqui e diterpenos, e furano-lactonas. Os extratos polares apresentam

majoritariamente rutina, derivados e flavonas metoxiladas, além disso, o gênero apresenta as

flavonas como marcadores taxonômicos. Outras espécies como L. cardiaca, L. persicus e L.

glaucescens também apresentam iridóides e flavonóides que demonstram expressivo potencial

medicinal. Os objetivos deste trabalho foram determinar os compostos majoritários das folhas

de Leonurus sibiricus; estudar o efeito alelopático dos extratos por infusão e metanólico, das

frações flavonoídicas e substâncias isoladas presentes no extrato metanólico. Para

determinação do perfil químico do óleo essencial foi utilizado Cromatógrafo Gasoso acoplado

a Espectrômetro de Massas (CG-MS) e para a separação das substâncias presentes em extratos

e frações foi utilizada Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Os terpenos

identificados por CG-MS foram sesquiterpenos trans-cariofileno (33,43%), alfa-humuleno

(21,49%) e germacreno-D (24,95%) que são responsáveis por, aproximadamente, 70% da

composição do óleo. O rendimento deste óleo foi baixo, fato que impossibilitou a avaliação

alelopática. Os compostos majoritários encontrados nos extratos (infusão e metanólico) foram

flavonóides biglicosilados e monoglicosilados derivados da quercetina. Nos ensaios

biológicos foram realizadas avaliações alelopáticas dos extratos (por infusão e metanólico),

frações (fracionadas em coluna Sephadex) e substâncias isoladas. Para a avaliação da

germinação e crescimento inicial de raiz, os extratos por infusão e metanólico foram

preparados nas concentrações de 50, 100, 200, 400 e 800mg L

-1

; as 12 frações obtidas por

separação em Sephadex na concentração de 1g L

-1

e os flavonóides isolados (7) nas

concentrações de 10

-4

, 10

-5

, 10

-6

e 10

-7

M. O controle do extrato por infusão foi água destilada

e para o extrato metanólico água destilada com 0,01% de acetona. Para verificar o possível

efeito alelopático dos extratos e das frações foram utilizadas sementes de Raphanus sativum,

Lactuca sativa e Lepidium sativum e, para as substâncias puras isoladas, sementes de Lactuca

sativa. As sementes (10 de cada espécie) foram colocadas para germinar em condição de luz

contínua por 4 dias em placas de Petri, com 3 repetições e tendo como substrato papel de

filtro umedecido com 5mL de solução; sendo a mesma metodologia para extratos, frações e

substâncias isoladas. Os resultados mostraram que os extratos por infusão e metanólico

reduziram significativamente apenas a germinação das sementes de Lactuca sativa, enquanto

o crescimento inicial das raízes de Raphanus sativum, Lactuca sativa e Lepidium sativum foi

afetado pelos extratos, principalmente, nas concentrações mais altas, sendo que o extrato

metanólico acarretou redução mais drástica. As frações de Sephadex consideradas

flavonoídicas (5, 6, 7, 10, 11 e 12) mostraram atividade, principalmente, no crescimento

inicial de raiz das espécies estudadas enquanto a germinação foi pouco afetada. Os compostos

majoritários encontrados nos extratos e frações ativas foram os flavonóides quercetina-3-O-β-

D-galactopiranosil (1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo; quercetina-3-O-β-D-glucopiranosil (1-6)-

O-α-L-rhamnopiranosideo (Rutina); quercetina-3-O-β-D- galactopiranosideo (Hiperina) e

quercetina-3-O-β-D-glucopiranosideo (Isoquercetrina), além das agliconas genkanina-3´-

hidroxi, genkanina e quercetina que também estão presentes, porém em menor quantidade.

Pelos resultados, pode-se concluir que o uso de extratos com perfil químico semelhante

podem propiciar respostas alelopáticas diferentes, pois existe forte correlação com a

concentração utilizada e estrutura das moléculas; as agliconas dos flavonóides demonstraram

maior atividade alelopática (inibição ou promoção) em relação aos glicosídeos, talvez devido

a relação com o número de moléculas de açúcares presentes nos esqueletos flavonoídicos.

Palavras-chave: alelopatia, Leonurus, plantas medicinais, fitoquímica, flavonóides, terpenos.

Abstract: Chemical compounds and allelopathic activities of Leonurus sibiricus leaves

The medicinal plant motherwort or rubim (Leonurus sibiricus L.) belongs to the family

Lamiaceae and the order Lamiales; it is considered invasive in crops and is present in

abandoned areas, it presents spontaneous growth in great part of Brazil. This vegetal group

produces terpenoids and phenolic substances with allelopathic effects, what explains its

invasive behaviour in coffee plantations and orchards. Radicular exudates of this species

increase the germination of rice, wheat, and mustard, but the aqueous extract inhibits the

germination of corn and the growth of tomato plantules. Its use as medicinal herb (medicinal

plant) is indicated, based on the folk tradition, for colds, bronchitis, and rheumatism. This

plant is used also for teas in cases of after-birth bleeding, excessive menstruation as well as

oedema, abscesses, and renal problems. The leaves and flowers are also indicated to combat

vomits and diarrhoea when used through infusions. The leaf methanolic extract has also

demonstrated anti-inflammatory activity and it combats neoplasic cells of mammary glands,

what justifies several ethnopharmacological studies accomplished with this species in Brazil.

With regard to the chemical composition, the literature indicates that L. sibiricus presents

alkaloids, mono, sesquiterpenes, and diterpenes, and furano-lactones. The polar extract

present mainly rutin and its derivates, besides the methoxylated flavones; furthermore, the

genus is rich in flavones that are considered taxonomic markers. The phenylpropanoids are

present in L. heterophyllus mainly as bi-glycosylated flavonoids. Other genera as L. cardíaca,

L. persicus, and L. glaucescens also present iridoids and flavonoids that have demonstrated

expressive medicinal potential of this genus. The work aimed at the investigation of the

chemical composition of the majority compounds of the Leonurus sibiricus leaves using

chromatographic techniques (CG-MS and HPLC) to identify and isolate such substances.

Hence, there was performed the essential oil extraction through the method of Clevenger and

used the gaseous chromatograph connected with mass spectrometer for the separation of

substances. The identification was done through the calculus of indexes of eluid compound

retention in the chromatographic system, caparison with the mass spectra. The identified

terpenes were the trans-caryophyllene sesquiterpenes (33.43%), alpha-humulene (21.49%),

and germacrene-D (24.95%), which are responsible for, approximately 70% of the oil

composition. The performance of this oil was low, fact that has made impossible its

allelopathic evaluation. On the other hand, the phenylpropiods were extracted through

infusion and percolation (in this case, using methanol as solvent). Additionally, there was

fractioned, through Sephadex LH-20, the metanolic extract obtaining, therefore, 12 fractions.

The isolated flavonoids from the active fractions of Sephadex were mono and bi-glycosylated,

besides the aglycone with methyl radicals. The flavonoids are the followings: quercetin-3-O-

β-D-galactopyranosyl (1-6)-O-α-L-rhamnopyranoside; quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl (1-

6)-O-α-L-rhamnopyranoside (Rutin); quercetin-3-O-β

-D-galactopyranoside (Hyperine) and

quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (Isoquercetrin), genkanin-3´-hydroxy, genkanin, and

quercetin. There were performed biological assays for the allelopathic evaluation of extracts,

fractions, and isolated substances. With regard to the germinantion and initial root growth

evaluations, there were prepared the extracts through infusion and methanolic in the following

concentrations: 50, 100, 200, 400, and 800mg L

-1

; for the fractions of Sephadex in the

concentration of 1g L

-1

, and the isolated flavonoids in the concentration 10

-4

, 10

-5

, 10

-6

, and

-7

M. Distilled water was used as check for the extract through infusion, and for the

methanolic extract, there was used distilled water with 0.01% of acetone. Seeds of Raphanus

sativum, Lactuca sativa, and Lepidium sativum were used for the verification of the

allelopahic effect of the extract and flavonoid fractions; for the isolated, pure substances, there

was used Lactuca sativa for being considered a sensitive species as well as a indicator of

allelopathic activity. The seeds (10 of each species) were placed to germinate under

continuous light for 4 days on Petri dishes having as substrate filter paper moisten with 5mL

of solution, the same methodology used for extracts and isolated substances.The results

demonstrate that the germination was affected only in the first day by the aglycones. With

regard to the root initial growth, the activity of tested substances has presented relation with

the used concentration, where in the highest concentration (10

-4

M) the aglycones were

responsible for the reduction in the growth and in the other tested concentrations (10

-5

M, 10

-6

and 10

-7

M), the glycosylated flavonoids have demonstrated their stimulation on the root

growth. Similarly, the substances of the secondary methabolism of the leaves of L. sibiricus

have presented relation with the biological activity (inibition or promotion), where the release

and concentration of theses compounds might be related with the allelopathic effect.

Key words: allelopathy, Leonurus, medicinal plants, phytochemistry, flavonoids, terpenes.

INTRODUÇÃO

As propriedades medicinais de L. sibiricus estão presentes em diferentes órgãos, tais

como folhas, que combatem reumatismo crônico e possuem atividade antibacteriana, evitando

dermatites e outros problemas dermatológicos. Na medicina chinesa, as sementes são

consideradas afrodisíacas e a planta seca é prescrita como tonificante e usada em disfunções

menstruais. As folhas e flores são capazes de combater vômitos e diarréias, além de serem

eficientes contra resfriado, bronquite e reumatismo.

A alelopatia é importante fenômeno presente nos agrossistemas, o qual implica em

ampla influência e interação das plantas nas comunidades bióticas. Os efeitos alelopáticos

podem ser diretos ou indiretos nos vegetais, incluindo microrganismos, através da liberação

de produtos naturais para o ambiente (Rice, 1984). Os aleloquímicos sintetizados pelas rotas

do metabolismo secundário de plantas superiores influenciam o estabelecimento e

desenvolvimento de culturas agrícolas e comunidades vegetais (Torres et al., 1996).

Pesquisadores e agricultores reconhecem os aleloquímicos como alternativa viável para

substituir os pesticidas sintéticos, podendo reduzir a poluição ambiental e aumentar a

produtividade agrícola (Qasem & Foy, 2001; Duke et al., 2002).

A riqueza química dos extratos de plantas aromáticas e medicinais faz com que sejam

reconhecidos como fontes de compostos biologicamente ativos, sendo que as substâncias

alelopáticas podem apresentar características químicas semelhantes às das substâncias com

efeitos terapêuticos (Mathela, 1991; Cutler & Cutler, 1999).

A germinação de sementes e o desenvolvimento inicial de plântulas são utilizados para

avaliar o efeito alelopático, sendo freqüentemente usados extratos vegetais ou aleloquímicos

isolados (Friedman, 1995). A sensibilidade a estes compostos varia de acordo com a

concentração aplicada e composição química do extrato (Perez, 1990; Rimando et al., 2001).

Essas substâncias com efeitos alelopáticos podem estar presentes nos diferentes órgãos

vegetais tais como folhas, flores, frutos e gemas (May & Ash, 1990; Larcher, 2000), podendo

ser flavonóides, fenóis, terpenóides, alcalóides, poliacetilenos, ácidos graxos, peptídeos e

outros (Rice, 1984).

Assim, o estudo das plantas medicinais, e respectivos aleloquímicos com a atividade

alelopática, podem representar significativo potencial para a busca de produtos naturais. O

conhecimento dessas substâncias do metabolismo secundário, portanto, é importante para

diferentes áreas do conhecimento científico, dentre elas destacam-se agronômica, taxonômica,

etnobotânica, farmacológica e fitoquímica.

Portanto, os objetivos deste trabalho foram investigar a composição química dos

compostos majoritários das folhas de Leonurus sibiricus; estudar o efeito alelopático dos

extratos aquoso (infusão) e metanólico, e também das frações flavonoídicas presentes no

extrato metanólico; e, de acordo com as atividades biológicas em sementes de Lepidium

sativum, Lactuca sativa e Raphanus sativus, identificar e testar as substâncias puras presentes

nas frações ativas em sementes de Lactuca sativa.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Leonurus sibiricus (L.)

Leonurus sibiricus é planta arbustiva, apresenta flores labiadas e inflorescência

axilares fasciculadas. Pertence a família Lamiaceae e a ordem Lamiales, originária da Índia e

ocorre em regiões tropicais da Ásia, África e América (Lorenzi, 2002). As plantas desta

família produzem terpenóides e substâncias fenólicas com efeitos alelopáticos (Larcher,

2000), o que talvez explique o comportamento de ser invasora (não desejável) em pomares e

cafezais (Lorenzi, 2002). Exudatos radiculares dessa espécie aumentam a germinação de

arroz, trigo e mostarda (Mandal, 2001), mas o extrato aquoso foliar inibe a germinação de

milho e o crescimento de plântulas de tomate (Almeida et al., 2003).

A utilização medicinal das folhas dessa espécie pode prevenir reumatismo crônico,

apresenta atividade antibacteriana e evita dermatites e outros problemas dermatológicos. Na

medicina chinesa, as sementes são consideradas afrodisíacas e a planta seca é prescrita como

tonificante e usada em disfunções menstruais (Bown, 1995). Folhas e flores são capazes de

combater vômitos e diarréias (Hoehne, 1939), além de serem eficientes contra resfriado,

bronquite e reumatismo (Castellucci et al., 2000). O extrato metanólico de folhas, também,

demonstra atividade antiinflamatória (Islam et al., 2005) e combate células neoplásicas de

glândulas mamárias (Nagasawa et al., 1990), o que justifica diversos estudos

etnofarmacológicos realizados com esta espécie no Brasil (Souza et al., 2004).

Em relação à composição química, a literatura relata que L. sibiricus apresenta

alcalóides (Murakami, 1943), mono, sesqui e diterpenos (Savona et al., 1982; Almeida et al.,

2005) e furano-lactonas (Satoh et al., 2003). Os extratos polares apresentam majoritariamente

rutina e seus derivados, além de flavonas metoxiladas (Almeida et al., 2006), as quais são

consideradas marcadores taxonômicos (Giang et al., 2005).

Os fenilpropanóides estão presentes em L. heterophyllus principalmente na forma de

flavonóides glicosilados e recentemente foi isolado a quercetina-3-O-[3-(4-hidroxi-3,5-

dimetoxibenzil) - α - L - rhamnopiranosil] - (1-6) - β - D - galactopiranosideo, um composto

biglicosilado (Cong et al., 2005). Outras espécies como L. cardiaca, L. persicus e L.

glaucescens também apresentam iridóides e flavonóides, o que demonstra expressivo

potencial medicinal deste gênero (Karting et al., 1985; Tasdemir et al., 1999; Milkowska-

Leyck et al., 2002). Estes dados mostram a importância do estudo químico de L. sibiricus,

associando o efeito de extrato e substância isolada em espécies vegetais sensíveis.

ALELOPATIA

Os primeiros relatos sobre a capacidade que certas espécies vegetais possuem de

interferir na fisiologia de outras foram feitos por Theophrastus (300 a.C.), seguindo os

trabalhos de Plínio (1 d.C.), Culpeper (1633), Young (1804), De Candolle (1832), Beobachter

(1845), Stickney & Hoy (1881), citados por Rice (1984).

Alelopatia pode ser definida como o efeito de uma planta no crescimento e

estabelecimento de outra (incluindo microrganismos) através da liberação de compostos

químicos para o ambiente (Rice, 1984). Essa interação acarreta resposta, positiva ou negativa,

da planta sensível a tais substâncias chamadas de aleloquímico, as quais são produzidas no

metabolismo secundário (Torres et al., 1996; Inderjit & Nilsen, 2003). Ainda, segundo

Gottlieb (1982), os aleloquímicos são sinais químicos transmitidos ao ambiente, geralmente

em pequena quantidade, e são responsáveis pelas múltiplas interações químicas entre os

diferentes organismos. As interações positivas (promoção, atração, etc) e negativas (inibição,

repelência, etc) indicam funções ecológicas dessas substâncias, importantíssimas para a

evolução e co-evolução das espécies vegetais e animais.

No âmbito da ecologia, o fenômeno da alelopatia pode explicar os mecanismos da

sucessão vegetal, onde espécies invasoras podem excluir espécies nativas a partir de resíduos

e substâncias liberados para o ambiente (Hierro & Callaway, 2003). Neste caso, a atividade

dos aleloquímicos é apenas inibitória e pouco relacionada com a competição por recursos

abióticos (Callaway, 2002). Portanto, a presença dessas espécies numa área de plantio pode

apresentar significativa influência no desenvolvimento de culturas (Batish et al., 2001; Singh

et al., 2001; Qasem & Foy, 2001), como também, no padrão natural de formação e sucessão

das populações e comunidades vegetais (Ferreira & Aquila, 2000).

Desta forma, a alelopatia é importante na resposta ecológica, pois pode interferir nas

populações vegetais tanto em ecossistemas agrícolas, quanto nos naturais. Uma das técnicas

mais utilizadas para estudar a alelopatia envolve o preparo de extratos aquosos foliares ou de

sistema radicular, observando a influência desses extratos na germinação e no crescimento da

raiz (Putnam, 1985; Inderjit & Dakshini, 1990).

Estudos comprovam a ação de aleloquímicos presentes nos extratos de diferentes

espécies vegetais, como de folhas de Triticum sativus, que afeta o crescimento de Gossypium

hirsutum (Hicks et al., 1989) e Oriza sativa (Alsaadawi, 1999), além de inibir a germinação

das próprias cariopses (Kalburtji, 1999). Extratos de Hordeum vulgare afetam a germinação e

crescimento de Triticum durum (Ben-Hammouda et al. 2001), segundo Oudhia & Tripathi

(2000), a planta invasora, Parthenium hysterophorus, tem ação alelopática na germinação de

Oriza sativa e, de acordo com Delachiave et al. (1999), Cynodon dactylon afeta a germinação

e desenvolvimento inicial de Lactuca sativa e Lycopersicum esculentum. Outras atividades de

extratos vegetais têm sido demonstradas por outros autores (Nakano et al., 2002; Singh et al.,

2001; Mazzafera, 2003; De Feo et al., 2004), onde ocorre promoção ou inibição do

crescimento, dependendo da concentração utilizada.

Segundo Inderjit (1996), a atividade alelopática na natureza envolve fatores bióticos,

como densidade vegetal, estádios de crescimento e microrganismos, e também fatores

abióticos, como solo, disponibilidade de água, temperatura e incidência de raios UV, dentre

outros. Tais fatores, podem afetar a liberação, disponibilidade, composição química e o modo

de ação das substâncias alelopáticas. A liberação dos compostos ocorre através da

volatilização das substâncias alelopáticas para a atmosfera, como também, o acúmulo destes

aleloquímicos nas fases aquosa e sólida do solo (Rizvi & Rizvi, 1992), os quais podem ser

metabolizados por microorganismos e, portanto, estar presentes na matéria orgânica das

camadas de serrapilheira sujeitos aos processos naturais de lixiviação (Inderjit et al., 2001).

O modo de ação dos aleloquímicos pode ser indireto, quando o composto alelopático

altera, primeiramente, algumas propriedades químicas do solo ou direto quando a substância

interfere no metabolismo vegetal (Ferreira & Aquila, 2000). Segundo Rizvi & Rizvi (1992),

os compostos alelopáticos podem afetar a estrutura e ultra-estrutura celulares; concentração e

balanço hormonal; permeabilidade das membranas afetando a absorção de minerais;

movimento dos estômatos influenciando a fotossíntese; síntese de pigmentos e proteínas;

atividade enzimática; relações hídricas e condução de seiva, como também podem alterar

DNA e RNA.

Harbone (1988) afirma que muitos compostos secundários sintetizados pelas plantas

inibem a germinação de sementes e o crescimento inicial de plântulas. A diversidade química

das substâncias produzidas pelas plantas pode ter origem na evolução vegetal, como resposta

à ação de microrganismos, insetos e vírus. Assim, os compostos com atividades alelopáticas

podem ser usados como alternativa ao uso de herbicidas e fungicidas, além de atuarem como

reguladores exógenos no desenvolvimento de plantas (Waller, 1999).

Técnicas como Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) e Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (CLAE) são ferramentas analíticas eficientes para identificar a

presença de compostos naturais em extratos brutos, possibilitando a obtenção do perfil

cromatográfico de frações ativas isoladas (Branco & Pizzolatti, 2002). Nos estudos de

alelopatia, para conhecer a composição dos extratos e associar os efeitos, é necessário isolar e

identificar a(s) substância(s) que acarreta(m) o efeito tóxico (Inderjit & Del Moral, 1997) ou

benéfico (Macias et al., 1997).

Muitas das substâncias envolvidas na alelopatia são metabólitos secundários que tem

origem na via do ácido chiquímico a qual origina os flavonóides, compostos fenólicos e

taninos (Elliott & Cheng, 1987; Einhellig, 1995), sendo que as concentrações podem ser

influenciadas pelo estresse biótico e abiótico. Os fenilpropanóides têm mostrado influenciar a

absorção de nutrientes (Bergmark et al., 1992; Booker et al., 1992), atividades enzimáticas

relacionadas ao metabolismo oxidativo (Devi & Prasad, 1992), relações hídricas (Barkosky &

Einhellig, 1993), fotossíntese e a respiração (Einhellig & Rasmussen, 1993).

Muitos compostos flavonoídicos, em condições naturais, mostram propriedades

alelopáticas e os mais conhecidos são hesperitina 7-O-rutinosideo, taxifolina 7-O-

arabinosideo e formononetina 7-O-glucosideo (Tomita-Yokotani, 2004) presentes em extratos

e resíduos de Pluchea lanceolata (DC) (Inderjit & Dakshini, 1994, Rice-Evans & Packet,

1998). Recentemente, dois flavonóides, a isorhamnetina 3-O-rutinosideo e a isorhamnetina 3-

O-robinobiosideo, foram isolados do pericarpo de cactus (Hylocereus undaus) e

demonstraram atividade alelopática em Celosia cristata e Neurospora crassa (Tomita-

Yokotani et al., 2004).

Os flavonóides possuem importante papel como compostos de defesa e moléculas

sinalizadoras dos processos de reprodução, patogênese e simbiose, que são produzidas pelas

plantas em grande escala, e no ambiente, têm efeito significativo na composição química do

solo, tendo importância nas interações planta-planta e planta-microrganismo (Rice, 1984;

Shirley, 1996).

Os efeitos desses compostos em plantas incluem diminuição da entrada de oxigênio

nas mitocôndrias e, nos cloroplastos, redução do transporte de elétron e eficiência do

fotossistema II (Moreland & Novitzky, 1988). Essas múltiplas atividades resultam em amplo

espectro de fitotoxicidade (Einhellig, 2004) ou, dependendo da concentração dos flavonóides,

estimulam o crescimento de raízes (Webster et al., 1998).

De modo geral, os flavonóides protegem as células do estresse oxidativo pela

quelação, inativação ou captação de radicais livres, produzidos pelo sistema de transporte de

elétrons (Harbone, 1994). Devido as suas características químicas, capazes de captar elétrons,

atuam como catalisadores na fase fotoquímica da fotossíntese e/ou como reguladores de

canais iônicos envolvidos na fosforilação oxidativa do processo de obtenção de energia

fotossintética (Piettá & Simonetti, 1999). Em função dessas características químicas, os

flavonóides estão envolvidos com os processos relacionados à absorção iônica que prejudicam

o padrão de despolarização das membranas celulares das raízes, levando a disfunções no

equilíbrio de íons (Glass & Dunlop, 1974). Os danos metabólicos acarretados pelos

flavonóides, segundo Macias et al. (1997), dependem da esterioquímica das moléculas e

concentração utilizada as quais podem promover ou inibir o crescimento de raízes, sendo no

entanto, pouco esclarecidos os mecanismos de ação destes compostos.

Os compostos fenólicos são considerados potentes inibidores da germinação de

sementes, crescimento da parte aérea e alongamento das raízes (Rice, 1984), como por

exemplo os ácidos p-hidroximandélico; 3,4-dihidroxifenilacético e mandélico, que inibem o

crescimento da parte aérea de arroz. Em relação ao metabolismo enzimático, os fenólicos

presentes em extratos de Pinus laricio inibiram as enzimas glicose-6-fosfato dehidrogenase,

glicose-fosfato isomerase e aldolase que estão relacionadas com a síntese de açúcares

(Muscolo et al., 2001). Ainda, segundo Inderjit & Dakshini (1992), os compostos fenólicos

solúveis em água, oriundos da planta daninha Pluchea lanceolata, influenciaram o teor de

clorofila e a taxa fotossintética líquida de folhas de aspargo, em casa de vegetação.

Em extrato de folhas de Triticum aestivum, Perez (1990) isolou os ácidos

hidroxâmicos DIMBOA e DIBOA, os quais a partir de 2mM reduziram a porcentagem de

germinação e o desenvolvimento inicial de Avena fatua. Da mesma maneira, outros estudos

têm demonstrado que ácidos hidroxâmicos cíclicos, do tipo 4-hidróxi-1,4-benzoxazin-3-onas,

presentes em cereais na forma de glicosídeos, atuam inibindo o crescimento de fungos,

bactérias e vegetais (Kruse et al., 2000).

FLAVONÓIDES

Os flavonóides são pigmentos naturais presentes nos vegetais, capazes de conferir

proteção aos organismos em relação aos danos produzidos pelos agentes antioxidantes, tais

como a radiação ultravioleta, poluição ambiental, substâncias químicas presentes no solo ou

nos alimentos, dentre outros fatores. O organismo humano não produz essas substâncias

protetoras e por isso deve obtê-las através de dieta específica, com alimentos que as

apresentem nas folhas, flores e frutos das plantas (Singleton, 1981; Aheme & O´Brien, 2002).

Os flavonóides foram descobertos por Nobel Szent-Gyorgy, em 1930, que isolou da

casca de limão uma substância, a citrina, que regulava a permeabilidade dos capilares

sanguíneos e denominados, a princípio, por vitamina P (devido à ação na permeabilidade) e

também vitamina C2 (porque se comprovou que alguns flavonóides tinham propriedades

similares à da vitamina C). No entanto, por volta de 1950, o efeito dos flavonóides como

vitaminas não foram comprovados e tais denominações foram abandonadas (Martinez-Flórez

et al., 2002).

A estrutura química dos flavonóides apresenta número variável de grupos hidroxilas e

fenóis, com excelentes propriedades de quelação de ferro e outros metais, o que lhes conferem

grande capacidade antioxidante (Havsteen, 1983; Bors et al., 1990; Peres, 1994). Portanto,

desempenham papel essencial de proteção aos fenômenos que provocam danos oxidativos às

células, e têm efeitos terapêuticos em número elevado de patologias incluindo cardiopatia,

isquemia, arterioesclerose e diabete (Jang et al., 1997; Jovanovic et al., 1998).

As propriedades antioxidativas captam radicais livres, como grupos hidroxilas e

superóxido, altamente reativos e relacionados com o início da cadeia de peroxidação lipídica

(Pace-Asciak et al., 1995). Além destes efeitos conhecidos de atividade antioxidante, os

flavonóides apresentam propriedades como estimulação da comunicação entre membranas,

regulação do crescimento celular, indução de enzimas de detoxificação, inibição da

germinação e crescimento de plântulas (Macias et al., 1997;Yang et al., 2000; Igura et al.,

2001; Hoagland & Williams, 2004).

Os flavonóides são compostos de baixo peso molecular que apresentam um esqueleto

carbônico básico (C6-C3-C6), formado por dois anéis fenólicos (A e B) ligados por anel

pirano heterocíclico (C). Os átomos de carbono dos anéis C e A são numerados de 2 a 8 e do

anel B de 2´ a 6´ (Kühnau, 1976). A atividade biológica dos flavonóides como antioxidantes

depende da propriedade redox dos grupos hidroxifenólicos e da relação estrutural entre as

diferentes partes da estrutura química (Bors et al., 1990). Esta estrutura básica permite uma

diversidade de padrões de substituições e variações do anel C e em função das características

estruturais podem ser classificados em 4 grupos (Letan, 1966): 1) Flavanóis, como a catequina

com grupo -OH na posição 3 do anel C; 2) Flavonols, representados pela quercetina, que

possuem grupo carbonila na posição 4 e grupo -OH na posição 3 do anel C; 3) Flavonas,

como a diosmetina, que posuem grupo carbonila na posição 4 do anel C e grupo hidroxila na

posição 3; e 4) Antocianidinas, que possuem grupo -OH na posição 3, mas também possuem

uma dupla ligação entre os carbonos 3 e 4 do anel C. Portanto, as três características

estruturais importantes para a função antioxidante são a presença no anel B do grupo catecol

ou orto-dihidroxi; de dupla ligação na posição 2,3 do anel C e de grupos hidroxilas na posição

3 e 5 do anel A.

Muitos autores relatam que o arranjo do anel B dos flavonóides é provavelmente

responsável pela atividade alelopática e a relação estrutura-atividade está relacionada com a

fitotoxidade destes compostos (Macias et al, 1997; Bais et al., 2003; Parvez et al., 2004;

Beninger & Hall, 2005). Evidências de que a atividade dos flavonóides depende da estrutura e

dos radicais substituintes do anel B são demonstradas por Bors et al. (1990). Essas

características estruturais contribuem para aumentar a estabilidade do radical livre e portanto,

conferem a atividade antioxidante. Assim, flavonols são mais potentes do que flavonas devido

à presença do grupo hidroxila na posição 3 do anel A.

Por outro lado, a glicosilação dos flavonóides como ocorre na síntese de rutina, reduz

fortemente a capacidade de remoção dos radicais livres. As moléculas de açúcar podem se

unir às estruturas dos flavonóides, preferencialmente na posição 3 do anel C e com menor

freqüência na posição 7 do anel A, de forma que estes compostos são encontrados como orto-

glucosídeos, sendo a glicose o resíduo de açúcar mais freqüente. Outros açúcares também

presentes nos compostos glicosilados são galactose, ramnose, arabinose e xilose. O esqueleto

cabônico básico dos flavonóides, com os três anéis (A, B C), sem a molécula de açúcar é

conhecido como aglicona. Os glicosídeos são mais solúveis em água e menos reativos frente

aos radicais livres que as agliconas. A adição de um grupo hidroxila no anel B aumenta a

capacidade antioxidante como acontece na miricetina. No entanto, a presença apenas de uma

hidroxila no anel B não é suficiente para conferir atividade biológica ao flavonóide (Piettá,

2000).

Fenilpropanóides, entre eles os flavonóides, são produtos naturais derivados do

aminoácido fenilalanina que sofre desaminação pela enzima fenilalanina amonialiase (PAL).

O exemplo mais simples dessas substâncias são aquelas que contêm somente esqueleto

fenilpropano C6-C3, como os ácidos hidroxicinâmicos, bem como o ácido sináptico, e os

monolignols como os coniferil álcool (Heller & Forkmann, 1993). Fenilpropanóis mais

complexos são formados pela condensação das unidades de fenilpropanos com uma unidade

derivada da via acetato, a malonil coenzima A, gerando outros grupos de flavonóides,

isoflavonóides e stilbenos (Wagner & Farkas, 1975; Midleton et al., 2000).

Os compostos fenilpropanóicos não são encontrados em todas as espécies vegetais,

desta forma as classes de acido hidroxi-cinâmico e flavonóides são características de plantas

superiores, sendo que tais compostos apresentam padrões específicos de substituições

químicas que são peculiares em gêneros e espécies vegetais (Gottlieb, 1982).

Capítulo 1

Composição do óleo essencial de rubim (Leonurus sibiricus L.)

Publicado na Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 8, n.1, p.31-35, 2005.

Composição do óleo essencial de rubim (Leonurus sibiricus L. – Lamiaceae)

Resumo: Os óleos voláteis são encontrados na maioria das famílias do reino vegetal dentre

elas, Lamiaceae. As flores e folhas de Leonurus sibiricus têm uso medicinal em resfriados,

bronquite e reumatismo, sendo de fundamental importância a caracterização fitoquímica.

Tendo em vista a importância dessa espécie e a escassez de estudos sobre seus componentes

voláteis, neste trabalho foi identificada a composição do óleo essencial de L. sibiricus L.

(rubim). Para tanto, foi utilizada a técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massa. Os resultados indicaram que aproximadamente 70% dos compostos voláteis dessa

espécie são constituídos por trans-cariofileno, alfa-humuleno e germacreno – D. Os outros

compostos também identificados no óleo foram gama-cadineno, beta-bourboreno e alfa-

humuleno.

Palavras-chave: Leonurus sibiricus; Lamiaceae; óleo essencial; plantas medicinais; trans-

cariofileno; germacreno-D; alfa-humuleno

Abstract: Composition of the essencial oil of rubim (Leonurus sibiricus L. – Lamiaceae).

The essential oils are found in a great number of Lamiaceae family species, but few

researches were carried out on this subject. This work had as a goal to identify the Leonurus

sibiricus L. (rubim) essential oil composition. Rubim leaves and flowers in infusion are able

to avoid vomit, diarrhea, and are also indicated in cold, cough, bronchitis and rheumatisms

cases. In order to know what are the phytochemical compositions involved, gas

cromatography techniques with mass spectrometry (GC-MS) was the methodology used. The

results showed 70% volatility compound by trans-cariophylene, alpha-humulene and

germacrene-D. Other substances like gama-cadinene, beta-bourborene and alpha-copaene

were found like compounds of this essential oil species.

Key words: Leonurus sibiricus; Lamiaceae; essential oil; medicinal plants; trans-

cariophylene; germacrene-D; alpha-humulene.

INTRODUÇÃO

A erva-macaé ou rubim (Leonurus sibiricus L.) pertence à família Lamiaceae e ordem

Lamiales, a qual produz terpenóides e substâncias fenólicas com efeitos alelopáticos (Larcher,

2000). Segundo Lorenzi (2002), a planta é considerada invasora em lavouras agrícolas,

presente em áreas abandonadas e apresenta crescimento espontâneo em quase todo território

brasileiro.

A utilização como erva medicinal é indicada, com base na tradição popular, para casos

de resfriado, bronquite e reumatismo (Castellucci et al., 2000). A planta é usada na medicina

popular, que recomenda as partes verdes na forma de chás, nos casos de sangramento pós-

parto, menstruação excessiva, bem como contra edema, abscessos e problemas renais (Bown,

1995). De acordo com Hoehne (1939), as folhas e flores, em infusão, também são capazes de

combater vômitos e diarréias. Enquanto, as espécies Leonurus cardiaca e L. japonica são

eficazes no controle de disfunções cardíacas e anti-trombóticas (Bown, 1995).

Nos primeiros estudos fitoquímicos de Leonurus sibiricus foi isolado o alcalóide

estaquidrina (Murakami, 1943), posteriormente, diterpenos (Savona et al., 1982) e furano-

lactonas (Satoh et al., 2003) em suas folhas. Os compostos fenólicos, como o ácido cafeíco,

também foram encontrados nas folhas, raízes e sementes (Almeida et al., 2002), que segundo

Mandal (2001), aumenta a germinação de arroz, trigo e mostarda. Da mesma maneira, frações

flavonoídicas de extrato hidroalcoólico reduzem a germinação e inibem o crescimento de

raízes de pepino (Almeida, et al., 2003). Estudos mostram que a diversidade de estruturas

químicas possibilita diferentes atividades biológicas, através do arranjo entre hidroxilas e

carbonilas com esqueletos carbônicos (Bradow, 1991).

Os óleos voláteis que são liberados para o ambiente apresentam importante função no

ecossistema, agindo como substâncias de sinalização, como defesa e inibição de crescimento.

Para o reconhecimento desses compostos, é indispensável a realização de estudos

fitoquímicos, o que possibilita maior compreensão das relações dos vegetais com o ambiente

(Larcher, 2000). Nesse sentido, muitas espécies aromáticas são estudadas quimicamente por

terem importância nas indústrias de perfume, cosmético e condimento (Endenshaw et al.,

2000).

O estudo das substâncias voláteis, da família Lamiaceae pode colaborar para o

conhecimento fitoquímico das plantas, bem como para evidenciar a diversidade biológica e

química presentes nos vegetais. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o de identificar a

composição química dos compostos voláteis de folhas de rubim (L. sibiricus).

MATERIAL E MÉTODO

O presente estudo foi realizado no Departamento de Horticultura da UNESP, Campus

de Botucatu e no Centro de Genética, Biologia Molecular e Fitoquímica do Instituto

Agronômico de Campinas (IAC).

A espécie Leonurus sibiricus foi coletada e identificada em Botucatu e está depositada

no herbário Botu com número 23-706. As folhas foram separadas, pesadas e colocadas em

estufa de secagem a 40ºC por 48 horas (40g). Esse material foi submetido a hidro-destilação

em aparelho tipo Clevenger, por 60 min.

A extração dos compostos voláteis foi realizada com a adição de 0,5mL de Acetato de

Etila (“Dinâmica”; lote 7705), seguido do acondicionamento em frasco, contendo sulfato de

sódio (P. A.; “Ecibra”; lote 1951).

Para análise cromatográfica dos constituintes identificados foi utilizada amostra de

100μL em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM, Shimadzu,

QP-5000), operando em 70 eV, equipado com coluna capilar de sílica fundida DB-5 (J &

Wiley Scientific, 30m x 0,25mm x 0,25μm), injetor e detector em 240ºC e 230ºC, com gás de

arraste Hélio (1,0 mL min

-1

), modo split 1/20 e gradiente de temperatura 60ºC-240ºC com

3ºC/min. Através do cálculo dos índices de retenção dos compostos eluídos no sistema

cromatográfico, comparação com os espectros de massas da biblioteca Nist 62:librar do

sistema e dados da literatura (Mc Lafferty & Stauffer, 1989; Adams, 1995) foi possível

identificar os constituintes do óleo de L. sibiricus.

RESULTADO E DISCUSSÃO

A análise por CG-EM do óleo de Leonurus sibiricus mostrou a presença de 13

compostos, sendo que dentre os identificados pode se observar a predominância dos

sesquiterpenos trans-cariofileno (33,43%), alfa-humuleno (21,49%) e germacreno-D (24,95%)

que são responsáveis por, aproximadamente, 70% da composição do óleo (Tabela 1 e Figura

1). Esses sesquiterpenos também foram encontrados, porém em pequenas quantidades, em

Ocimum selloi em diferentes épocas do ano (Moraes et al., 2002). Essas substâncias

apresentam esqueletos carbônicos com ampla atividade antibacteriana, antifúngica e

inibidores enzimáticos (Abraham, 2001).

*N. I. = substância não identificada pelas bibliotecas consultadas.

Ikcal = índice de retenção de Kovats calculado; Iklit = índice de retenção de Kovats da literatura

A presença do trans-cariofileno (pico 4) foi observada anteriormente no óleo essencial

de Phlomis lanata (Couladis et al., 2000), Cannabis sativa (Novak et al., 2001) e Piper duckei

(Abraham, 2001). Estudos comprovam a atividade dessa substância como antimicrobiana,

principalmente em fungos patogênicos e bactérias gram (+/-). A substância alfa-humuleno

(pico 5) encontrada na maioria das espécies aromáticas, apresenta ampla atividade biológica

como inseticida (Yang et al., 2003; Kim et al., 2003), antioxidante (Weel et al., 1999),

antimicrobiano (Bougatsos et al., 2003), como também anticancerígena (Legault et al., 2003).

Germacreno D (pico 6) foi encontrado também em Artemisia parviflora (Rana et al., 2003),

Piper friedrichsthalli e P. pseudollindeni (Vila et al., 2003), Mangifera indica (Lalel et al.,

2003) e em Jupinerus turbinata (Consentino et al., 2003). A literatura relata sua atividade

antibacteriana e fungicida (Ngassapa et al., 2003).

Pico Substância % composição

IKcal IKlit

tricicleno 1,01 932 926

α-copaeno 1,55 1377 1376

β-bourboreno 0,80 1386 1384

τ-cariofileno 33,43 1422 1418

α-humuleno 21,49 1456 1454

germacreno D 24,95 1484 1480

N. I.* 3,38 X X

γ-cadineno 0,99 1516 1513

N. I.* 1,28 X X

N. I.* 0,87 X X

N. I.* 5,67 X X

N. I.* 1,87 X X

N. I.* 2,22 X X

TABELA 1. Composição do óleo essencial de folhas de Leonurus sibiricus.

Estudos fitoquímicos realizados com espécies da família Lamiaceae indicam grande

diversidade química, sendo que Mentha piperita (Gershenzon et al., 2000), Ocimum sp

(Zabaras & Wyllie, 2001) e Mentha arvensis (Mattos & Innecco, 2002) foram recentemente

estudadas no âmbito fitoquímico e apresentaram quantidades expressivas de substâncias

voláteis.

FIGURA 1. Cromatograma do óleo essencial em folhas de Leonurus sibiricus, onde os picos

4, 5 e 6 são: trans-cariofileno (33,43%), alfa-humuleno (21,49%), germacreno-D

(24,95%) respectivamente.

A abundância destes compostos provém da rota metabólica dos isoprenóides, que

culmina na formação do sesquiterpeno cujo precursor é o farnesil-difostato. Esse precursor,

com a ação de monoxigenases (enzimas ativadas pelo oxigênio) formam trans-cariofileno,

germacreno-D, alfa-humuleno, entre outros (Bucchanam et al., 2002) e compõem a maioria

dos compostos voláteis de Leonurus sibiricus, os quais segundo a literatura apresentam

atividades antibacterianas, fungicidas e inseticidas.

As outras substâncias identificadas no óleo essencial de L sibiricus como alfa-

copaeno, beta-bourboreno e gama-cadineno, também foram observadas em Cananga

latifolium (Idris & Toha, 1999), Prangos heyniae e Chaerophyllum aksekiense (Baser et al.,

2000 a, b), Cedrela odorata e C. fissilis (Maia et al., 2001), Calophyllum inophyllum

(Samsudin et al., 1999) e Salvia schimperi (Endenshaw et al., 2000).

(%)

25 50

Tempo de retenção

1, 2 e 3

5 6

8 e 9

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ABRAHAM, W.R. Bioactive sesquiterpenes produced by fungi: are they useful for humans as

well? Current Medicinal Chemistry, v.8, p.583-606, 2001.

ADAMS, R.P. Identification of essential oil components by gas chromatography / mass

spectroscopy, 4. ed., Illinois: Allured Publishing Corporation, 1995, 659p.

ALMEIDA, L.F.R.; VILEGAS, W.; DELACHIAVE, M.E.A. Investigação química do rubim

(Leonurus sibiricus) In: SIMPÓSIO BRASILEIRO DE PLANTAS MEDICINAIS, 17,

2002, Cuiabá, Anais .... Cuiabá, 2002. p.79

ALMEIDA, L.F.R. et al. Atividade alelopática de extratos e frações de folhas de Leonurus

sibiricus na germinação e desenvolvimento inicial de pepino. Brazilian Journal of Plant

Physiology, v.13 (suplemento), p.351, 2003.

BASER, K.H.C. et al. Composition of the essential oil of Prangos heyniae, a new endemic

from Turkey. Flavour and Fragrance Journal, v.15, p.47-49, 2000a.

BASER, K.H.C. et al. Composition of the essential oil of Chaerophyllum aksekiense, a

recently described endemic from Turkey. Flavour and Fragrance Journal, v.15, p.43-44,

2000b.

BOUGATSOS, C. et al. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of

Helichrysum kraussi SCH. BIG. and H. rugulosum LEBS. from South Africa, Flavour and

Fragrance Journal, v.18, p.48-51, 2003.

BOWN, D. The Herb Society of America: Encyclopedia of Herbs and their Uses. 1.ed.,

New York: Darling Kindersley Publ., 1995, 225p.

BRADOW, J.M. Relationships between chemical structure and inhibitory activity of C6

through C9 volatiles emitted by plant residues. Journal of Chemical Ecology, v.17, p.2193-

2212, 1991.

BUCCHANAM, B.B.; GRUISSEN, W.; JONES, R.L. Biochemistry and Molecular Biology

of Plants. 4. ed., Maryland: John Wiley & Sons, 2002, 1367p.

CASTELLUCCI, S. et al. Plantas medicinais relatadas pela comunidade residente na estação

ecológica de Jataí, município de Luís Antônio/SP: uma abordagem etnobotânica. Revista

Brasileira de Plantas Medicinais, v.3, p.51-60, 2000.

CONSENTINO, S. et al. Composition and antimicrobial properties of Sardinian Juniperus

essential oils against foodborne pathogens and spoilage microorganisms. Journal of Food

Protection, v.66, p.1288-1291, 2003.

COULADIS, M. et al. Essential oil Plhomis lanata growing in Greece: chemical composition

and antimicrobial activity. Planta Medica, v.66, p.670-672, 2000.

ENDENSHAW, M.M. et al. Volatile oil constituents of the Ethiopian plant Salvia schimperi

Benth. Flavour and Fragrance Journal, v.15, p.27-30, 2000.

GERSHENZON, J.; Mc CONKEY, M.E.; CROTEAU, R.B. Regulation of monoterpene

accumulation in leaves of peppermint. Plant Physiology, v.122, p.205-213, 2000.

HOEHNE, F.C. Plantas e Substâncias Vegetais Tóxicas e Medicinais. 2.ed., São Paulo:

Graphicars, 1939, 355p.

IDRIS, M.S.H.; TOHA, M.Y. Essential oil from flowers of two Cananga species. Review of

Biodiversity and Environmental Conservation, p.1-4, 1999.

KIM, E.H. et al. Acaricidal activity of clave bud oil compounds against Tyrophagus

putrescentiae (Acari-Acaridae). Applied Entomology and Zoology, v.38, p.261-266, 2003.

LALEL, H.J.D.; SINGH, Z.; TAN, B.C. Distribution of aroma volatile compounds in

different parts of mango fruit. Journal Horticultural Science and Biotechnology, v.78,

p.131-138, 2003.

LARCHER, W. Ecofisiologia Vegetal. 2. ed., Stuttgart: Eugen Ulmer, 2000, 531p.

LEGAULT, J. et al. Antitumor activity of balsam oil: production of reactive oxygen species

induced by alpha-humulene as possible mechanism of action. Planta Medica, v.69, p.402-

407, 2003.

LORENZI, H. Plantas Daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas, tóxicas e

medicinais. 2.ed., São Paulo: Nova Odessa, 2002. 425p.

MAIA, B.H.L. et al. Essential oils of Toona and Cedrela species (Meliaceae): taxonomic and

ecological implications. Journal of Brazilian Chemistry, v.11, p.629-639, 2001.

MATTOS, S.H.; INNECCO, R. Idade ideal de corte de Mentha arvensis como produtora de

óleo essencial de mentol para o Estado de Ceará, Brasil. Revista Brasileira de Plantas

Medicinais, v.5, p.15-18, 2002.

Mc LAFFERTY, F.W.; STAUFFER, D. Registry of spectral data. 3ed., New York: John

Wiley & Sons, 1989, 354p.

MORAES, L.A.S. et al. Phytochemical characterization of essential oil from Ocimum selloi.

Anais da Academia Brasileira de Ciências, v.74, p.183-186, 2002.

MURAKAMI, S. Stachydrim in Leonurus sibiricus L. Acta Phytochemichal, v.13, p.161-

184, 1943.

NGASSAPA, O. et al. Composition and antimicrobial activity of essential oils of two

populations of Tanzanian Lippia javanica (Burm. f.) Spreng. (Verbenaceae). Flavour and

Fragance Journal, v.18, p.221-224, 2003.

NOVAK, J. et al. Essential oils of different cultivars of Cannabis sativa L. and their

antimicrobial activity. Flavour and Fragrance Journal, v.16, p.259-262, 2001.

RANA, V.S. et al. Essential oil composition of Artemisia parviflora aerial parts. Flavour and

Fragance Journal, v.14, p.342-344, 2003.

SAMSUDIN, M.W.; IBRAHIM, M.N.; SAID, I. Composition of the steam volatile oil from

Calophyllum inophyllum. Review of Biodiversity and Environmental Conservation, p.1-3,

1999.

SATOH, M. et al. Studies on the constituents of Leonurus sibiricus L. Chemical

Pharmaceutical Bulletin, v.51, p.341-342, 2003.

SAVONA, G. et al. Diterpenoids from Leonurus sibiricus. Phytochemistry, v.21, p.2699-

2701, 1982.

VILA, R. et al. Constituents of the essential oils from Piper friedrichsthalii C.DC. and P.

pseudolindenii C.DC. from Central America. Flavour and Fragrance Journal, v.18, p.198-

201, 2003.

ZABARAS, D.; WYLLIE, S.G. The effect of mechanical wounding of the composition

essential oil from Ocimum minimum L. leaves. Molecules, v.6, p.79-86, 2001.

YANG, Y.C. et al. Ovicidal and adulticidal effects od Eugenia caryophyllata bud and leaf oil

compond on Pedicilus capitatus. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51,

p.4884-4888, 2003.

WEEL, K.G.C. et al. Antioxidant activity of horehound (Massubium vulgare) grown in

Lithuania. Fett-Lipid, v.101, p.395-400, 1999.

Capítulo 2

Potencial alelopático de folhas de Leonurus sibiricus L.

Enviado para Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006.

POTENCIAL ALELOPÁTICO DE FOLHAS DE Leonurus sibiricus (Lamiaceae)

Resumo: A interação química entre as plantas é conhecida como alelopatia e está relacionada

com a liberação de substâncias para o ambiente. Os aleloquímicos são produzidos pelo

metabolismo secundário e podem ser, principalmente, terpenos, alcalóides e fenilpropanóides,

substâncias presentes em Leonurus sibiricus, conhecida erva medicinal com ampla atividade

biológica. O presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade alelopática de folhas de L.

sibiricus na germinação e desenvolvimento inicial de Raphanus sativus, Lactuca sativa e

Lepidium sativus. Para tanto, foram utilizados extratos por infusão e metanólico, além das

frações do extrato metanólico. As frações com atividade alelopática foram refracionadas em

HPLC com detector de UV, obtendo-se sete flavonóides. Nos extratos por infusão e

metanólico, as concentrações utilizadas nos testes biológicos, foram de 50, 100, 200, 400 e

800 mg L

-1

; para as 12 frações do Sephadex foram de 1g L

-1

e para os flavonóides de 10

-4

-5

, 10

-6

e 10

-7

M. Em todos os testes foi utilizada água destilada como controle e os

flavonóides testados em Lactuca sativa. Os resultados indicaram que as folhas de L. sibiricus

possuem quatro flavonóides majoritários, que são quercetina-3-O-β-D-galactopiranosil(1-6)-

O-α-L-rhamnopiranosideo; quercetina-3-O-β-D-glucopiranosil (1-6)-O-α-L-

rhamnopiranosideo (Rutina); quercetina-3-O-β-D- galactopiranosideo (Hiperina) e quercetina-

3-O-β-D-glucopiranosideo (Isoquercetrina). Além dessas substâncias foram também isoladas

e testadas genkanina-3´-hidroxi, genkanina e quercetina. Os extratos por infusão e metanólico

de folhas de Leonurus sibiricus acarretaram redução significativa apenas na germinação das

sementes de Lactuca sativa, porém não afetaram o processo germinativo de Raphanus sativus

e Lepidium sativum. Por outro lado, o crescimento inicial das raízes de Raphanus sativus,

Lactuca sativa e Lepidium sativum foi mais afetado pelo extrato metanólico, principalmente,

nas concentrações mais altas. As frações de sephadex, consideradas flavonoídicas, mostraram

atividade de redução, principalmente, do crescimento inicial de raiz das espécies estudadas,

sendo que a germinação foi pouco afetada na maioria das concentrações, da mesma forma

quando utilizado extrato. As agliconas foram responsáveis pela inibição da germinação, bem

como do crescimento inicial de raiz na concentração mais elevada (10

-4

). A genkwanina-

3´hidroxi e quercetina apresentaram maior atividade herbicida na germinação, na

concentração de 10

-4

M, por outro lado, o comprimento inicial de raiz foi reduzido quando

utilizadas quercetina-3-O-glucose-ramnose, quercetina-3-O-glucose e genkwanina-3´hidroxi.

Nas concentrações de 10

-5

, 10

-6

e 10

-7

M todas as substâncias isoladas acarretaram estímulo de

crescimento inicial de raiz. Pelos resultados conclui-se que o uso de extratos com perfil

químico semelhante pode propiciar respostas alelopáticas diferentes, devido a correlação com

a concentração utilizada e estrutura das moléculas, onde as agliconas demonstraram maior

atividade (inibição ou promoção).

Palavras-chave: alelopatia, Leonurus, plantas medicinais, flavonóides, fitoquímica.

Abstract: Allelopathic potential of Leonurus sibiricus leaves. The chemical interaction

between plants is known as allelopathy and it is related to the release of substances to the

environment. The allelochemicals are produced by the secondary metabolism and they can

belong principally to the following classes of substances: terpenes, alkaloid, and

phenylpropanoids; substances present in Leonurus sibiricus, renowned medicinal herb with

wide biological activity. The present study aimed at the evaluation of the allelopathic activity

of the leaves of L. sibiricus in the germination and initial development of Raphanus sativus,

Lactuca sativa, and Lepidium sativus. Thus, there were used extracts through infusion and

methanolic . The fractions with allelopathic activities were refractioned in HPLC with UV

detectors, obtaining seven flavonoids. The concentrations used in the biological tests for the

extracts through infusion and methanolic were the followings: 50, 100, 200, 400, and 800 mg

-1

; for the 12 Dephadex fractions the concentration was 1g L

-1

; and for the flavonoids, the

concentrations were the followings: 10

-4

, 10

-5

, 10

-6

, and 10

-7

M. In all of the tests, there were

used distilled water as check and the tested flavonoids in Lactuca sativa. The results indicated

that the leaves of L. sibiricus have four majority flavonoids, which are quercetin-3-O-β-D-

galactopyranosyl(1-6)-O-α-L-rhamnopyranoside; quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl (1-6)-O-

α-L-rhamnopyranoside (Rutin); quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside (Hiperine), and

quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (Isoquercetrin). Besides these substances, there were

isolated and tested the genkanin-3´-hydroxy, genkanin, and quercetin. The extracts through

infusion and methanolic of leaves of Leonurus sibiricus caused significative reduction only in

the germination of the seeds of Lactuca sativa, but it has not affected the germinative process

of Raphanus sativus and Lepidium sativum. On the other hand, the initial root growths of

Raphanus sativus, Lactuca sativa, and Lepidium sativum were more affected by the

methanolic extract, principally, in the highest concentrations. The Sephadex fractions, which

are considered flavonoidic have shown activity of reduction, principally, in the initial root

growth of the studied species, being the germination, in the same way when used the extracts,

less affected in the majority of concentrations. The aglycones were responsible for the

inhibition of the germination as well as the root initial growth in the most elevated

concentration (10

-4

). The genkwanin-3´hydroxy and quercetin have presented the highest

herbicide activity in the germination at the concentration of 10

-4

M, on the other hand, the root

initial length was reduced when used quercetin-3-O-glucose-rhamnose, quercetin-3-O-glucose

and genkwanin-3´hydroxy. In the concentrations of 10

-5

, 10

-6

and 10

-7

M, all isolated

substances caused initial root growth stimulus. Based on the results, it concluded that the use

of the extracts with chemical profile similar may propitiate different allelopathic responses

due to the correlation to the used concentration and the molecule structure, where the

algycones have demonstrated high activity (inhibition or promotion).

Key words: allelopathy, Leonurus, medicinal plants, flavonoids, phytchemistry.

INTRODUÇÃO

Os aleloquímicos sintetizados pelas rotas do metabolismo secundário influenciam

no desenvolvimento e estabelecimento das culturas agrícolas e comunidades vegetais (Torres,

et al., 1996). Pesquisadores e agricultores reconhecem os aleloquímicos como alternativa

viável para substituir os pesticidas sintéticos, visando reduzir a poluição ambiental e aumentar

a produtividade agrícola (Qasem & Foy, 2001; Duke et al., 2002).

A riqueza química dos extratos de plantas aromáticas e medicinais é reconhecida

fonte de compostos biologicamente ativos, sendo que as substâncias alelopáticas podem

apresentar também características semelhantes às das substâncias com efeitos terapêuticos

(Mathela, 1991; Cutler & Cutler, 1999).

A espécie Leonurus sibiricus, originária da Índia, produz terpenóides e substâncias

fenólicas com efeitos alelopáticos (Larcher, 2000) o que explica o comportamento de ser

planta invasora (não desejável) em pomares e cafezais (Lorenzi, 2002). Entretanto, essa

espécie libera exudatos radiculares que aumentam a germinação de arroz, trigo e mostarda

(Mandal, 2001), mas o extrato aquoso de folhas inibe a germinação de milho e o crescimento

de plântulas de tomate (Almeida et al., 2003).

As atividades medicinais de L. sibiricus estão presentes em diferentes órgãos, tais

como folhas, que combatem reumatismo crônico, possuem atividade anti bacteriana, evitam

dermatites e outros problemas dermatológicos. Na medicina chinesa, as sementes são

consideradas afrodisíacas e a planta seca é prescrita como tonificante e usada em disfunções

menstruais (Bown, 1995). Folhas e flores são capazes de combater vômitos e diarréias

(Hoehne, 1939), além de serem eficientes contra resfriado, bronquite e reumatismo

(Castellucci et al., 2000).

O extrato metanólico de folhas, também, demonstrou atividade antiinflamatória

(Islam et al., 2005) e combateu células neoplásicas de glândulas mamárias (Nagasawa et al.,

1990), o que justifica diversos estudos etnofarmacológicos realizados com esta espécie no

Brasil (Souza et al., 2004).

Em relação à composição química, a literatura relata que L. sibiricus apresenta

alcalóides (Murakami, 1943), monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos (Savona et al., 1982;

Boalino et al., 2004; Almeida et al., 2005) e furano-lactonas (Satoh et al., 2003). Os extratos

polares apresentam majoritariamente rutina e seus derivados, além de flavonas metoxiladas

(Almeida et al., 2006).

Os fenilpropanóides estão presentes em L. heterophyllus principalmente na forma

de flavonóides glicosilados e recentemente foi isolado a quercetina-3-O-[3-(4-hidroxi-3,5-

dimetoxibenzil)-α-L-rhamnopiranosil]-(1-6)-β-D-galactopiranosideo, um composto

biglicosilado (Cong et al., 2005). Outros gêneros como L. cardíaca, L. persicus e L.

glaucescens também apresentam iridóides e flavonóides que conferem expressivo potencial

medicinal deste gênero (Karting et al., 1985; Tasdemir et al., 1999; Calis et al., 2000;

Milowska-Leyck et al., 2002). Dentro do grupo das substâncias químicas conhecidas como

fenilpropanóide, as flavonas metoxiladas são importantes marcadores quimiotaxonômicos

para o gênero (Giang et al., 2005).

Os flavonóides possuem importante papel como compostos de defesa e são

moléculas sinalizadoras da reprodução, patogênese e simbiose. Os flavonóides são produzidos

pelas plantas em grande escala e quando liberados para o ambiente têm evidente papel na

interação planta-planta e planta-microorganismo (Rice, 1984; Shirley, 1996). Muitos autores

mostram que o arranjo estrutural das moléculas de flavonóides é provavelmente responsável

pela atividade alelopática e esse arranjo está relacionado com a fitotoxidade destes compostos

(Macias et al., 1997; Bais et al., 2003; Parvez et al., 2004; Beninger & Hall, 2005).

Dada a importância medicinal do gênero, os objetivos foram estudar o efeito

alelopático dos extratos por infusão e metanólico; das frações flavonoídicas presentes no

extrato metanólico na germinação de sementes de Raphanus sativus, Lactuca sativa e

Lepidium sativum, além de identificar e testar as substâncias puras presentes nas frações

flavonoídicas ativas, na germinação de sementes de Lactuca sativa.

MATERIAL E MÉTODO

Material vegetal

Folhas de Leonurus sibiricus foram coletadas em Botucatu, Estado de São Paulo,

e identificada por Clemente José Campos, sendo a exsicata depositada no Herbário (BOTU)

do Departamento de Botânica, IB-UNESP com o número 12-706.

Preparo dos extratos

Os extratos foram preparados e analisados no Laboratório de Fitoquímica do

Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da UNESP de Araraquara.

Para a extração por infusão, 620g de folhas secas foram colocados em 5 litros de

água em ebulição por 5 minutos, filtrada em papel de filtro e após atingir temperatura

ambiente, a amostra foi submetida a liofilizador, sendo obtido 8,79g de extrato.

Para obtenção do extrato metanólico, 2300g de folhas secas foram submetidos a

extração com metanol (100%) à temperatura ambiente, por percolação durante 5 dias. O

solvente foi evaporado a 40˚C sob pressão reduzida em rotavapor, obtendo-se 389,63g de

extrato.

Quantificação dos compostos majoritários

Extrato por infusão: 1g de folhas secas, com três repetições, foi colocado em

50mL de água fervente por 5 minutos e filtrada em papel de filtro, após atingir temperatura

ambiente. Em seguida, a solução foi submetida a liofilizador, a quantidade de 20mg diluída

em 15mL de metanol: água (1:1), filtrada em filtro de membrana 0,22μm PFE (Millex) e

analisada diretamente em CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência).

Extrato metanólico: Para a preparação de amostras utilizadas na quantificação de

substâncias químicas majoritárias, três repetições com 2g de folhas secas foram

acondicionados com 50mL de clorofórmio e submetidas a banho ultrassônico por 4 horas.

Após esse período foi filtrado e o solvente evaporado a 35˚C, sob pressão reduzida em

rotavapor. Em 1g de resíduo, resultante da primeira filtragem, foi adicionado 25mL de

metanol (100%), também em banho ultrassônico por 4 horas, obtendo-se o extrato seco após

evaporação deste solvente. A seguir, esse extrato foi colocado em cartucho (SPE) SEP PAK

(360g). A sílica desses cartuchos foi ativada com 10mL de metanol e 20mL de água

deionizada, com graus de pureza CLAE. A quantidade de 20mg do extrato seco foi colocado

no cartucho de sílica C

e a amostra adsorvida foi eluída com 15mL de metanol (100%) e

seca usando N

Para quantificar os flavonóides majoritários nos extratos, foi utilizada a curva de

calibração com padrão rutina nas concentrações de 10, 20, 50, 100, 200, 300 e 500 μg mL

-1

relacionando a área dos picos do cromatograma do CLAE com a concentração dos

flavonóides.

Fracionamento

Uma porção (5g) do extrato metanólico foi submetida a coluna de Sephadex LH-

20 de 1,2m x 0,06m com coletor automático, fluxo 250 gotas por minuto com metanol P.A.,

originando 201 frações que foram estudadas em Cromatografia de Camada Delgada (CCD)

em placas de sílica gel 20x20 com fase móvel 75:25 (Hexano: Acetato de Etila) e 80:18:2

(Clorofórmio:Metanol:Água) e reveladas com anisaldeído e NP-PEG. Em seguida, foram

reunidas as frações que apresentaram rf (fator de retenção) semelhantes de acordo com as

revelações químicas em CCD, originando 12 novas frações (fluxograma abaixo), sendo as

frações 2, 3 e 4 terpênicas. As frações majoritárias em flavonóides foram submetidas a novo

fracionamento por CLAE para isolamento das substâncias.

Fluxograma para obtenção do extrato metanólico, frações em Sephadex e substâncias puras.

Fr = Frações

* = Frações ativas e re-fracionadas em HPLC

A a G = Substâncias isoladas, onde A e B são flavonóides biglicosídeos; C e D flavonóides

monoglicosídeos e E, F e G agliconas.

Coluna de Sephadex

LH-20 (4,6g)

Extrato Metanólico (389,63g)

Fr 12

174 - 201

Fr 11

160 - 173

Fr 10

135 - 159

Fr 9

129 - 134

Fr 8

123 - 128

Fr 7

104 - 122

Fr 6

78 - 103

Fr 5

62-77

Fr 4

39-61

Fr 3

28-38

Fr 2

16-27

Fr 1

1 - 15

* * * * * *

A (7mg)

B (8mg)

A, B,

C e D

C (10mg)

D (6mg)

(6mg)

(9mg)

Folhas secas de Leonurus

sibiricus (2300g)

Característica do CLAE

Para fracionamento em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), foi

utilizado filtro de membrana 0,22μm PFE (Millex) na preparação das amostras que foram

submetidas a HPLC Varian Pro-Star equipado com coluna de sílica em fase reversa (250mn x

460 mm i.d., 10μm, Phenomenex Luna). A fase móvel usada foi gradiente linear de aceto

nitrila : água com 28-35% (30min.), aumentando 35-70% (60min), 70-100% (65min) em

fluxo de 1,0mL min

-1

, e monitorado usando detector ultravioleta com fotodiodo Pro Star 330

em comprimento de onda de 254nm. Os flavonóides isolados foram identificados por análise

de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de

H e

C em equipamento Varian INOVA 300

e 500MHz, utilizando como solvente dimetil-sulfoxi deuterado.

Ensaios biológicos

Os extratos por infusão e metanólico, com base na literatura, foram diluídos nas

concentrações de 50, 100, 200, 400 e 800mg L

-1

; as 12 frações obtidas do Sephadex foram

diluídas na concentração de 1g L

-1

e os flavonóides isolados nas concentrações de 10

-4

, 10

-5

-6

e 10

-7

M. Para o controle do extrato por infusão empregou-se água destilada e para o

extrato metanólico água destilada com 0,01% de acetona. Para verificar o possível efeito

alelopático dos extratos e das frações flavonoídicas, foram utilizadas sementes de Raphanus

sativum, Lactuca sativa e Lepidium sativum e, para as substâncias puras isoladas, sementes de

Lactuca sativa por ser considerada espécie sensível e indicadora de atividade alelopática. As

sementes (10 de cada espécie) foram colocadas para germinar em condição de luz contínua

por 4 dias em placas de Petri, tendo como substrato papel de filtro umedecido com 5mL de

cada solução, sendo a mesma metodologia para extratos, frações e substâncias isoladas. Os

parâmetros avaliados foram porcentagem de germinação e crescimento de raiz (medida

direta), com delineamento inteiramente casualizado com 3 repetições. Os dados obtidos foram

submetidos a análise de variância e regressão polinomial.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Os resultados indicaram que a extração por infusão e metanólica de folhas de

Leonurus sibiricus reduziram de forma marcante apenas a germinação das sementes de

Lactuca sativa, porém não afetaram o processo germinativo de Raphanus sativus e Lepidium

sativum (Tabela 1). Por outro lado, o crescimento inicial das raízes de Raphanus sativus

(Figura 1), Lactuca sativa (Figura 2) e Lepidium sativum (Figura 3) foi mais afetado pelo

extrato metanólico, principalmente, nas concentrações mais altas.

As plântulas de Raphanus sativus apresentaram maior redução no crescimento

inicial de raiz no extrato metanólico (Figura 1B) do que na extração por infusão (Figura 1A),

porém nas concentrações de 50 e 100mg L

-1

do extrato metanólico observou-se um aumento

no comprimento de raiz (Figura 1B).

Em Lactuca sativa, as raízes foram afetadas tanto com extração por infusão

(Figura 2A) bem como por extração metanólica (Figura 2B), ocorrendo redução no

crescimento a partir da concentração de 50mg L

-1

, com maior inibição na concentração de

800mg L

-1

. Os resultados indicaram que L. sativa foi mais sensível aos compostos presentes

nos extratos utilizados, conforme citado na literatura (Macias et al., 1997; Ferreira & Áquila,

2000; Hoagland & Williams, 2004).

Para as sementes de Lepidium sativum, verificou-se que, a germinação não foi

afetada (Tabela 1), mas a extração por infusão (Figura 3A) e o extrato metanólico (Figura 3B)

acarretaram redução no crescimento inicial das raízes, nas concentrações de 400 e 800mg L

-1

No extrato metanólico, nas concentrações de 50 e 100mg L

-1

, o crescimento foi,

aproximadamente, 10mm maior em relação ao controle (Figura 3B).

As equações (Figuras 1, 2 e 3) com ajuste linear, obtidas para os experimentos

com extração por infusão, indicam que a atividade dos compostos químicos tem velocidade

constante de inibição, exceto em Lactuca sativa. Por outro lado, as equações de segundo grau

mostram um ponto de estímulo de crescimento, tendo aumentado a atividade inbitória em

concentrações anteriores e posteriores. Os resultados encontrados apresentaram tal

comportamento nas espécies Raphanus sativus e Lepidium sativum, no extrato metanólico,

mostrando pequena atividade estimulatória nas baixas concentrações e em seguida, atividade

inibitória nas concentrações mais elevadas. Para o crescimento inicial das raízes de Lactuca

sativa, espécie comumente conhecida como sensível aos compostos alelopáticos, o ajuste dos

dados observados mostrou função exponencial a qual indica atividade inibitória, tanto do

extrato metanólico, como da extração por infusão (Figura 2), devendo-se estabilizar e manter-

se paralela ao eixo X a partir da concentração de saturação.

Tabela 1- Germinação de sementes de Raphanus sativus, Lactuca sativa e Lepidium sativum

em diferentes concentrações do extrato por infusão e metanólico.

Raphanus sativus Lactuca sativa Lepidium sativum

mg L

-1

Infusão Metanólico Infusão Metanólico Infusão Metanólico

94±8,94 92 ±8,36 94 ±5,47 94 ±5,47 96 ±5,47 96 ±4,47

88±8,36 92 ±8,36 86 ±8.94 86 ±8,94 98 ±4,47 100 ±5,47

100

92 ±8,36 90 ±7,07 80 ±12,24 80 ±12,24 94 ±5,47 96 ±0

200

90 ±7,07 92 ±8,36 74 ±5,47 76 ±5,47 94 ±5,47 96 ±5,47

400

92 ±8,36 88 ±8,36 66 ±8,94 74 ±8,94 92 ±8,36 98 ±4,47

800

92 ±8,94 90 ±7,07 66 ±8,94 76 ±5,47 92 ±8,36 96 ±5,47

Modelos de ajustes matemáticos, segundo Stebbing (1982); An et al. (1993); An

& Wagga (2005), demonstram que em concentrações baixas, dependendo da espécie, ocorre

sensível estímulo da resposta biológica seja na germinação, desenvolvimento ou até mesmo

na atração por polinizadores. Por outro lado, em concentrações elevadas é visível a inibição

dos processos biológicos.

A presença majoritária dos mesmos flavonóides nos dois tipos de extração sugere

atividade biológica semelhante, porém os resultados de germinação e crescimento inicial de

raiz mostraram maior inibição quando no extrato metanólico nas concentrações mais elevadas

(Figuras 1, 2 e 3). O uso de chás ou infusões é recomendado para ensaios biológicos, desde

que apresentem o mesmo perfil químico e concentração quando comparados com outros

métodos de extração, por reduzirem o uso de solventes orgânicos e aproximarem ao que

ocorre na natureza.

Figura 1- Crescimento inicial de raiz de Raphanus sativus em diferentes concentrações de

extratos foliares de L. sibiricus, por infusão (A) e extrato metanólico (B).

(

)

y = -0,016x + 61,751

= 0,8692

0 200 400 600 800

Concentração (m g L-1)

Comprimento raiz (mm)

y = -4E-05x

- 0,0037x + 64,982

= 0,9418

0 200 400 600 800

Concentração (m g L-1)

Comprimento raiz (mm)

(mg L

)

(mg L

)

Figura 2- Crescimento de raiz de Lactuca sativa em diferentes concentrações de extratos

foliares de L. sibiricus, por infusão (A) e extrato metanólico (B).

y = 46,16e

-0,0009x

= 0,9324

0 200 400 600 800

Concentração (m g L-1)

Comprimento raiz (mm)

y = 43,889e

-0,0017x

= 0,953

0 200 400 600 800

Concentração (m g L-1)

Comprimento raiz (mm)

(

)

(

)

Figura 3- Crescimento de raiz de Lepidium sativum em diferentes concentrações de extratos

foliares de L. sibiricus, por infusão (A) e extrato metanólico (B).

y = -0,0187x + 63,92

= 0,9464

0 200 400 600 800

Concentração (m g L-1)

Comprimento raiz (mm)

y = -5E-05x

+ 0,0095x + 67,178

= 0,9394

0 200 400 600 800

Concentração (m g L-1)

Comprimento raiz (mm)

(

)

(

)

TABELA 2- Quantificação dos flavonóides majoritários da extração por infusão e do extrato

metanólico (± desvio padrão; valores expressos em mg g

-1

de folhas secas).

Quercetina 3-O-β-D-

galactopiranosil

(1-6)-O-α-L-

rhamnopiranosideo

(A)

Quercetina 3-O-β-

D- glucopiranosil

(1-6)-O-α-L-

rhamnopiranosideo

(B)

Quercetina 3-O-β-

D-galactopiranosil

(C)

Quercetina 3-O-β-D-

glucopiranosil

(D)

Infusão

4,97 ±0,11 3,47 ±0,30 3,53 ±0,24 4,27 ±0,45

Metanólico

14,72 ±2,86 11,90 ±2,27 13,39 ±2,54 14,71 ±2,78

Os resultados encontrados (Figura 4) mostram que tanto a água quente (infusão)

quanto o metanol (solventes com alta polaridade) são capazes de extrair as mesmas

substâncias majoritárias, mas com diferentes concentrações, que podem acarretar diferentes

níveis de inibição e\ou promoção de crescimento (Macias et al., 1997). Da mesma maneira, as

frações hexânicas e acetato de etila de extratos foliares de Lactuca sativa, acarretaram maior

redução na germinação e crescimento de raiz de Raphanus sativus, quando comparadas com

frações butanólicas e aquosas (Chon et al., 2005). Esses resultados corroboram com os

encontrados, pois sugerem que as substâncias, dependendo do solvente, estão presentes em

diferentes concentrações ativas.

Portanto, as atividades biológicas, além de variarem com a espécie vegetal são

decorrentes da concentração das substâncias encontradas e da variação de esqueletos

carbônicos ativos de flavonóides, que estão relacionados com a atividade alelopática (Figura

5).

As frações consideradas flavonoídicas (5, 6, 7, 10, 11 e 12) mostraram atividade,

principalmente, no crescimento inicial de raiz das espécies estudadas, sendo que a

germinação, da mesma forma quando utilizados extratos (Tabela 1), foi pouco afetada na

maioria das concentrações, nas sementes de Raphanus sativus e Lepidium sativum, embora L.

sativum, nas frações 3 e 4, apresentaram 100% de inibição de germinação (Tabela 4). No

entanto, a germinação de sementes de Lactuca sativa foi afetada mostrando inibição maior

que 50%, nas frações 3, 4, 6, 10, 11 e 12.

FIGURA 4- Perfil cromatográfico da extração por infusão (I) e extrato metanólico (II),

mostrando os compostos majoritários A, B, C e D.

FIGURA 5- Estrutura química dos flavonóides isolados de folhas de Leonurus sibiricus.

2´

3´

4´

5´

6´

Galactose - Rhamnose

2´

3´

4´

5´

6´

Galactose - Rhamnose

(A) Quercetina 3-O-β-D-galactopiranosil(1-6)-

O-α-L-rhamno

iranosideo

2´

3´

4´

5´

6´

Galactose

2´

3´

4´

5´

6´

Galactose

(hiperina)

2´

3´

4´

5´

6´

MeO

2´

3´

4´

5´

6´

MeO

(E) Genkanina -3´- hidroxi

2´

3´

4´

5´

6´

MeO

2´

3´

4´

5´

6´

MeO

2´

3´

4´

5´

6´

Glucose

2´

3´

4´

5´

6´

Glucose

2´

3´

4´

5´

6´

Glucose - Rhamnose

2´

3´

4´

5´

6´

Glucose - Rhamnose

(B) Quercetina 3-O-β-D-glucopiranosil(1-6)-O-

α-L-rhamno

iranosideo

(

rutina

)

(D) Quercetina 3-O-β-D-glucopiranosil

(

iso

uercetrina

)

(F) Genkanina

2´

3´

4´

5´

6´

2´

3´

4´

5´

6´

(G) Quercetina

Tabela 4- Atividade das frações (g L

-1

) na germinação e desenvolvimento inicial de raiz de

Raphanus sativus, Lactuca sativa e Lepidium sativum (± desvio padrão)

Germinação (%) Inibição em relação

ao controle (%)

Comprimento da

raiz (mm)

Inibição em relação

ao controle (%)

Raphanus sativus

controle

100 ± 0

63,4 ± 2,5

Fração 1

90,0 ± 5,7 10,0 62,3 ± 1,7 1,6

Fração 2

86,7 ± 5,7 13,3 49,0 ± 3,0 22,7

Fração3

86,7 ± 0 13,3 28,3 ± 2,6 55,3

Fração4

90,0 ± 11,5 10,0 22,0 ± 5,0 65,3

Fração5

80,0 ± 5,7 20,0 30,0 ± 4,0 52,6

Fração 6

83,3 ± 11,5 16,7 24,0 ± 1,5 62,1

Fração 7

90,0 ± 5,7 10,0 21,6 ± 2,8 65,8

Fração 8

96,7 ± 11,5 3,3 45,0 ± 5,5 29,0

Fração 9

93,3 ± 0 6,7 43,6 ± 5,0 31,1

Fração 10

100 ± 0 0 36,3 ± 5,0 42,7

Fração 11

100 ± 0 0 35,0 ± 5,0 44,7

Fração 12

100 ± 0 0 22,0 ± 3,8 65,3

2,435 38,9

<0,05 <0,001

Lactuca sativa

controle

96,6 ± 0 61,9 ± 5,5

Fração 1

90,0 ± 5,7 6,25 53,3 ± 5,0 13,9

Fração 2

73,3 ± 5,7 23,6 33,3 ± 0 46,2

Fração3

6,7 ± 1,0 93,0 30,0 ± 5,0 51,5

Fração4

30,0 ± 0 68,7 43,3 ± 5,0 30,0

Fração5

70,0 ± 12,5 27,0 33,3 ± 7,1 46,2

Fração 6

46,7 ± 5,7 51,3 31,7 ± 5,0 48,8

Fração 7

76,7 ± 11,5 20,1 26,7 ± 5,5 56,9

Fração 8

86,7 ± 5,7 9,6 36,7 ± 5,0 40,7

Fração 9

73,3 ± 0 23,6 43,3 ± 5,5 30,0

Fração 10

0 ± 0 100 0 ± 0 100

Fração 11

6,7 ± 12,5 93,0 10 ± 0 83,8

Fração 12

0 ± 0 100 0 ± 0 100

87 35,374

<0,001 <0,001

Tabela 4- continuação

Lepidium sativum

controle

100 ± 0

64,0 ± 2,5

Fração 1

100 ± 5,7 0 62,0 ± 5,7 3,0

Fração 2

70,0 ± 0 26,7 56,0 ± 5,7 12,3

Fração3

0 ± 0 100 0 ± 0 100

Fração4

0 ± 0 100 0 ± 0 100

Fração5

100 ± 0 0 33,1 ± 2,8 48,4

Fração 6

100 ± 5,7 0 31,9 ± 1,1 51,5

Fração 7

96,7 ± 5,7 3,3 30,8 ± 5,7 53,5

Fração 8

100 ± 0 0 36,4 ± 5,0 42,2

Fração 9

100 ± 0 0 53,0 ± 5,7 17,4

Fração 10

100 ± 0 0 26,9 ± 2,8 58,7

Fração 11

100 ± 0 0 22,1 ± 2,0 65,9

Fração 12

100 ± 0 0 38,0 ± 2,8 40,6

800,864 85,924

<0,001 <0,001

Apesar das frações 3 e 4 mostrarem forte atividade alelopática em Raphanus

sativus, Lactuca sativa e Lepidium sativum, principalmente na inibição de crescimento inicial

de raiz, não foram re-fracionadas por apresentarem composição majoritária de terpenos

(dados não mostrados) e não de flavonóides.

As frações flavonoídicas 5 a 7 e 10 a 12 foram re-fracionadas em CLAE e isoladas

sete substâncias (fluxograma e Figura 5), sendo duas biglicosídeos (A e B) nas frações 5 e 6;

duas substâncias com apenas uma molécula de açúcar (C e D) no esqueleto flavonoídico das

frações 6 e 7; duas agliconas metoxiladas (E e F) das frações 10 e 11, além da quercetina (G)

que foi isolada da fração 12. Metodologias de fracionamento auxiliam no estudo guiado de

substâncias ativas e o estudo das frações de Sephadex pode auxiliar no isolamento e

determinação dos aleloquímicos (Hoagland & Williams, 2004), bem como suas atividades

específicas, sendo possível verificar a sensibilidade e seletividade destes compostos. Da

mesma maneira, pesquisas realizadas com Ailanthus altissima determinaram o aleloquímico

alcaloídico ailantona, a partir do estudo prévio das frações do Sephadex do extrato butanólico

e respectivas atividades biológicas (De Feo et al., 2004). Como realizadas neste trabalho,

outras técnicas de cromatografia também foram usadas para verificar o perfil e

comportamento cromatográfico dos flavonóides, como por exemplo a CCD, com fases

móveis de diferentes polaridades (Onyikagha & Grotewold, 2004).

Tendo em vista a atividade biológica das frações do Sephadex ter sido mais

evidente nas sementes de Lactuca sativa (Tabela 4), após o re-fracionamento as substâncias

isoladas foram testadas somente em alface, buscando relacionar a estrutura da molécula e

atividade biológica.

Pela Tabela 5, verifica-se que os flavonóides acarretaram maior redução da

porcentagem de germinação de sementes de L. sativa, em relação ao controle, no primeiro dia

nas concentrações mais elevadas. No entanto, a porcentagem final de germinação, com 4 dias,

não foi alterada, em relação ao terceiro dia, independente da concentração e estrutura dos

flavonóides. Portanto, a maior atividade alelopática foi verificada no primeiro e segundo dias,

com a seguinte ordem decrescente genkwanina-3´hidroxi (E) > quercetina (G) > quercetina-3-

O-glucose (D) > quercetina-3-O-glucose-ramnose (B) > genkwanina (F) > quercetina-3-O-

galactose (C) > quercetina-3-O-galactose-ramnose (A).

A genkwanina-3´hidroxi (E) e quercetina (G) apresentaram maior atividade

herbicida na germinação, na concentração de 10

-4

M, a qual devido a estrutura química, com

grupos catecol nos anéis A, B e C e na posição orto do anel B, respectivamente, podem ter

alterado a permeabilidade das membranas celulares e afetado o alongamento radicular,

necessário a protusão da raiz (Martinez-Flores et al., 2002; Einhellig, 2004; Glass & Dunlop,

1974). Os flavonóides, quercetina-3-O-glucose (D) e quercetina-3-O-glucose-ramnose (B)

reduziram a germinação, devido talvez a presença dos açúcares glucose e glucose-ramnose em

relação as substâncias sem moléculas de açúcar. Por outro lado, a quercetina-3-O-galactose

marcante quanto as substâncias que apresentavam molécula de glucose na estrutura (B e D).

Os resultados encontrados, nos primeiros dias, indicaram que provavelmente os

flavonóides tenham afetado os mecanismos de alongamento celular (Hoagland & Williams,

2004). Enquanto, no final do experimento, possível processo de detoxificação celular, tenha

ocorrido impedindo o efeito de substâncias inibitórias através de ativação de enzimas do

metabolismo oxidativo.

Tabela 5- Germinação de sementes de Lactuca sativa, em diferentes concentrações dos

flavonóides isolados das frações ativas.

dia 2

dia 3

dia 4

dia

Germinação

Promoção

( + )

Inibição

( - )

Germinação

Promoção

( + )

Inibição

( - )

Germinação

Promoção

( + )

Inibição

( - )

Germinação

Promoção

( + )

Inibição

( - )

Quercetina -3-O-β-D-galactopiranosil(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo (A)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

93,3 ± 11,5 0,0 96,6 ± 0 3,6 100 ± 0 3,4 100 ± 0 3,4

-6

86,6 ± 5,7 -7,1 96,6 ± 11,5 3,6 96,6 ± 17,3 0,0 96,6 ± 17,3 0,0

-5

83,3 ± 11,5 -10,7 96,6 ± 15,7 3,6 96,6 ± 17,3 0,0 96,6 ± 10 0,0

-4

90,0 ± 5,7 -3,6 90,0 ± 5,7 -3,6 90,0 ± 5,7 -6,9 90,0 ± 5,7 -6,9

0,654 0,4 0,722 0,722

>0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Quercetina -3-O-β-D-glucopiranosil(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo (B)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

86,6 ± 11,5 -7,1 90,0 ± 5,7 -3,6 90,0 ± 0 -6,9 90,0 ± 0 -6,9

-6

70,0 ± 5,7 -24,9 83,3 ± 5,7 -10,7 90,0 ± 5,7 -6,9 90,0 ± 5,7 -6,9

-5

73,3 ± 11,5 -21,4 90,0 ± 5,7 -3,6 90,0 ± 11,5 -6,9 90,0 ± 11,5 -6,9

-4

56,6 ± 5,7 -39,3 70,0 ± 10,0 -24,9 80,0 ± 10 -17,2 80,0 ± 10 -17,2

7,192 2,786 0,842 0,842

0,005 >0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Quercetina-3-O-β-D-galactopiranosil (C)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

86,6 ± 11,5 -7,1 90,0 ± 10 -3,6 90,0 ± 10 -6,9 90,0 ± 10 -6,9

-6

90,0 ± 10 -3,6 93,3 ± 10 0 93,3 ± 5,7 -3,4 93,3 ± 5,7 -3,4

-5

80,0 ± 0 -14,3 100 ± 11,5 7,1 100 ± 11,5 3,4 100 ± 11,5 3,4

-4

90,0 ± 0 -3,6 96,6 ± 5,7 3,6 96,6 ± 5,7 0 96,6 ± 5,7 0

1,045 0,542 0,722 0,722

>0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Quercetina-3-O-β-D-glucopiranosil (D)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

93,3 ± 11,5 0 100 ± 0 7,1 100 ± 0 7,1 100 ± 0 7,1

-6

80,0 ± 0 -14,3 96,6 ± 5,7 3,6 96,6 ± 5,7 3,6 96,6 ± 5,7 3,6

-5

60,0 ± 10 -35,7 90,0 ± 10 -3,6 90,0 ± 10 -3,6 90,0 ± 10 -3,6

-4

43,3 ± 5,7 -53,6 86,6 ± 5,7 -7,1 90,0 ± 10 -6,9 90,0 ± 10 -6,9

14,4 1,389 1,125 1,125

<0,001 >0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Tabela 5- continuação

Genkanina 3´ hidroxi (E)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

73,3 ± 11,5 -21,4 93,3 ± 5,7 0 93,3 ± 5,7 -3,4 93,3 ± 5,7 -3,4

-6

63,3 ± 20,8 -32,1 83,3 ± 15,2 -10,7 90,0 ± 10,0 -3,6 93,3 ± 11,5 -3,4

-5

63,3 ± 15,2 -32,1 90,0 ± 17,3 -3,6 90,0 ± 17,3 -3,6 90,0 ± 17,3 -3,6

-4

10,0 ± 5,7 -89,3 66,6 ± 11,5 -28,6 80,0 ± 0 -17,2 86,6 ± 5,7 -10,4

13,823 2,26 1,25 0,531

<0,001 >0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Genkanina (F)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

90,0 ± 0 -3,6 93,3 ± 5,7 0 93,3 ± 5,7 -3,4 93,3 ± 5,7 -3,4

-6

83,3 ± 10,0 -10,7 90,0 ± 10,0 -3,6 90,0 ± 10,0 -3,6 90,0 ± 10,0 -3,6

-5

70,0 ± 11,5 -24,9 83,3 ± 5,7 -10,7 86,6 ± 11,5 -10,3 86,6 ± 11,5 -10,3

-4

73,3 ± 5,7 -21,4 86,6 ± 11,5 -7,1 86,6 ± 11,5 -10,4 86,6 ± 11,5 -10,4

3,875 0,654 0,654 0,654

0,037 >0,05 (ns) >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Quercetina (G)

controle

93,3 ± 11,5

96,6 ± 5,7

-7

80,0 ± 1,0 -14,3 90,0 ± 0 -3,6 93,3 ± 5,7 -3,4 93,3 ± 5,7 -3,4

-6

83,3 ± 5,7 -10,7 93,3 ± 5,7 0 93,3 ± 5,7 -3,4 93,3 ± 5,7 -3,4

-5

76,6 ± 20,8 -17,8 90,0 ± 0 -3,6 90,0 ± 0 -3,6 93,3 ± 5,7 -3,4

-4

10,0 ± 17,3 -89,3 56,6 ± 5,7 -39,3 83,3 ± 5,7 -13,8 83,3 ± 5,7 -13,8

16,717 18,583 2,875 2,3

<0,001 <0,001 >0,05 (ns) >0,05 (ns)

Na avaliação do desenvolvimento de Lactuca sativa, o comprimento inicial de raiz

foi forte indicador da atividade alelopática de flavonóides foliares de L. sibiricus (Figura 6). O

comprimento inicial de raiz, quando na concentração de 10

-4

M, foi reduzido quando utilizadas

quercetina-3-O-glucose-ramnose (B) em 70%, quercetina-3-O-glucose (D) em 54% e

genkwanina-3´hidroxi (E) em 45%, porém nesta concentração ocorreu o crescimento da raiz

quando utilizadas as agliconas genkwanina (F) e quercetina (G), em até 50%

aproximadamente, e em menor grau a quercetina-3-O-galactose (C), enquanto que quercetina-

3-O-galactose-rhamnose (A) não apresentou atividade (Figura 6).

Na concentração de 10

-5

M, todas as substâncias isoladas acarretaram estímulo de

crescimento inicial de raiz, na seguinte ordem decrescente genkwanina (F) > genkwanina-

3´hidroxi (E) > quercetina (G) > quercetina-3-O-galactose (C) = quercetina-3-O-glucose (D)

> quercetina-3-O-galactose-ramnose (A) > quercetina-3-O-glucose-ramnose (B). Nesta

concentração, as agliconas (E, F e G) podem promover o crescimento de raiz mais

efetivamente que os flavonóides glicosilados e dentre estes, talvez, aqueles que apresentam

apenas uma molécula de açúcar (galactose ou glucose) nos esqueletos carbônicos tem maior

atividade.

Atividade semelhante à concentração anterior foi encontrada para 10

-6

M, com

exceção da ordem decrescente de atividade no crescimento, onde quercetina-3-O-glucose (D)

> genkwanina-3´hidroxi (E) > genkwanina (F) > quercetina-3-O-galactose (C) > quercetina

(G) > quercetina-3-O-galactose-ramnose (A) > quercetina-3-O-glucose-ramnose (B). Nas

concentrações utilizadas, os biglicosídeos (A e B) apresentaram baixa atividade no

crescimento das raízes, quando comparados com as demais substâncias.

As agliconas (F e G) apresentaram menor atividade de promoção de crescimento

na concentração de 10

-7

M (Figura 6), com seqüência decrescente de quercetina-3-O-galactose

ramnose (B) > quercetina-3-O-galactose-ramnose (A) > genkwanina (F) > quercetina (G).

Comportamento inibitório constante foi verificado nas frações flavonoídicas

(Tabela 4) devido, talvez, as maiores concentrações e efeito sinergístico, quando comparado

com os flavonóides isolados (Tabela 5 e Figura 6), porém quando em menores concentrações

(Figura 6), promoveram o crescimento inicial da raiz (Macias et al., 1997; Hoagland &

Williams, 2004). Esse crescimento, provavelmente, também seja resposta do contato direto

dos extratos, frações e flavonóides com as raízes, por isso mais efetivos neste órgão vegetal

(Nishida et al., 2005).

A quercetina-3-O-glucose-ramnose (B) e o derivado quercetina-3-O-glucose (D)

foram ativos, tanto na germinação (Tabela 5) quanto no crescimento inicial de raiz de

plântulas de L. sativa (Figura 6), inibindo esses processos fisiológicos na maior concentração

testada (10

-4

M). Resultados semelhantes foram descritos por Basile et al. (2000) e Parvez et

al. (2004) na germinação e crescimento inicial de Raphanus sativus e Arabidospsis thaliana,

respectivamente. Desta forma, os flavonóides glicosilados são conhecidos compostos

alelopáticos e os encontrados em L. sibiricus, também acarretaram estímulo do crescimento

de raízes quando testados isoladamente, nas concentrações de 10

-7

a 10

-5

M (Figura 6).

Figura 6. Crescimento de raiz de Lactuca sativa em diferentes concentrações de flavonóides

isolados de folhas de L. sibiricus. (A) quercetina-3-O-galactose-ramnose; (B)

quercetina-3-O-glucose-ramnose; (C) quercetina-3-O-galactose; (D) quercetina-3-O-

glucose; (E) genkwanina-3´-hidroxi; (F) genkwanina; (G) quercetina.

Outros compostos, também, flavonoídicos glicosilados demonstraram

propriedades alelopáticas, dependendo da concentração utilizada, como hesperitina-7-O-

rutinosideo, taxifolina-7-O-arabinosideo e formononetina-7-O-glucosideo (Inderjit &

Dakshini, 1994) presentes em extratos e resíduos de Pluchea lanceolata, considerados

flavonóides monoglicosilados, mas com os açúcares ligados no carbono 7 do anel A (Bors et

al., 1990; Rice-Evans & Packer, 1998). Por outro lado, recentemente dois flavonóides,

isorhamnetina-3-O-rutinosideo e isorhamnetina-3-O-robinobiosideo, foram isolados de

pericarpo de cactus (Hylocereus undaus) que mostraram atividade alelopática em Celosia

cristata e fungo Neurospora crassa (Tomita-Yokotani et al., 2004), também são compostos

C-glicosilados como os identificados em extratos foliares de L. sibiricus.

Em relação as agliconas, os resultados encontrados indicaram que as metoxiladas

(E e F) e a quercetina (G), apesar de não serem compostos majoritários, acarretaram maior

10-7 10-6 10-5 10-4

-150

-100

-50

100

150

% em relação ao controle

Concetração (M)

-7

-6

-5

-4

Concentração (M)

atividade biológica quanto maior número de grupos catecol (Macias et al., 1997; Einhellig,

2004; Piettá, 2000), além do grupo metoxila no anel A, que também, confere atividade

alelopática (Parvez et al., 2004).

A influência das substâncias isoladas no crescimento inicial das raízes (Figura 6),

talvez seja devido a presença dos radicais no anel B dos flavonóides (Figura 5) o provável

responsável pela atividade alelopática das agliconas (E, F e G), pois a estrutura – atividade

estão relacionadas com a fitotoxicidade destes compostos (Macias et al., 1997; Bais et al.,

2003; Beninger & Hall, 2005; Parvez et al., 2004). Isso porque na substância E tem duas

hidroxilas no anel B, em F apenas uma e em G, embora também apresente duas hidroxilas no

anel B, o anel A deixa de apresetar o radical metoxila presente em E e F.

Especificamente, os fatores determinantes para que esses flavonóides apresentem

atividade antioxidante e alelopática deve-se a um conjunto de fatores relacionados com a a

presença do grupo catecol. O anel B, apresenta características químicas capazes de interagir

com o radical livre (atividade antioxidante), além da presença de dupla ligação na posição 2, 3

conjugadas com o oxigênio na posição 4 do anel C. A presença do grupo hidroxila ou

metoxila nas posições 3, 5 e 7 do anel A, parecem ter menor atividade quando comparada

com os substituintes no anel B e C, no entanto tal atividade pode ser alterada quando outras

substituições estiverem presentes nestes anéis. Essas características estruturais contribuem

para aumentar a estabilidade eletrônica do radical livre e portanto conferirem atividade

antioxidante dos flavonóides (Martinez-Flores et al., 2002; Bors et al., 1990).

Os resultados de crescimento inicial de raiz (Tabela 4 e Figura 6) podem ser

devido às moléculas dos flavonóides apresentarem atividade antioxidante, capaz de capturar

radicais livres, principalmente no meio intracelular onde as moléculas flavonoídicas assumem

cargas negativas em pH neutro (Martinez-Flores et al., 2000) e em baixas concentrações

podem acarretar efeitos promotores de crescimento (Macias et al., 1997; Parvez et al., 2004;

Worsham, 1987), talvez devido ao melhor reaproveitamento de substâncias vitais para a

célula como enzimas, co-enzimas, transportadores de elétrons e proteínas. Altas

concentrações dos flavonóides, por outro lado, podem agir como agente hiperpolarizador de

membrana e alterarem os mecanismos das bombas atepeásicas, tornando os flavonóides

tóxicos para as células, reduzindo o crescimento.

Outra explicação para as mudanças na germinação das sementes e

desenvolvimento inicial das raízes poderia ser devido ao efeito osmótico, em relação às

substâncias presentes nas soluções testadas (Ferreira & Áquila, 2000; Hoagland & Williams,

2004; Bell & Charlwood, 1980). A presença de flavonóides na solução, embora pequena,

poderia ter acarretado diminuição do potencial osmótico causando, portanto, diminuição no

crescimento de raiz por dificultar o alongamento celular causado pela entrada de solução.

Além disso, como não ocorreu mudança do Índice Refratométrico da solução inicial e final do

experimento (dados não mostrados), seria pouco provável que os resultados encontrados

sejam devido ao efeito osmótico das soluções.

Pode-se concluir que o uso de extratos com perfil químico semelhante podem

propiciar respostas alelopáticas diferentes, devido a correlação com a concentração utilizada e

estrutura das moléculas, onde as agliconas demonstraram maior atividade (inibição ou

promoção).

Agradecimentos

A Faculdade de Farmácia de Salerno (UNISA) pela disponibilidade do RMN

500MHz e aos pesquisadores Emilia Mancini, Laura Di Martini e Emilia Quaranta, Antonio

Bracci e Francesco Arminante. Ao Instituto de Química da UNESP-Araraquara e os

pesquisadores Daniel Rinaldi e Prof

Lourdes Campaner dos Santos.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ALMEIDA, L.F.R.; DELACHIAVE, M.E.A.; MARQUES, M.O.M. Composição química do

óleo essencial de Leonurus sibiricus. Brasilian Journal of Medicinal Plants, v.8, p.31-35,

2005.

ALMEIDA, L.F.R. et al. Ação alelopática de extratos aquosos de rubim (Leonurus sibiricus)

na germinação e desenvolvimento inicial de alface, tomate e milho. In: IX CONGRESSO

BRASILEIRO DE FISIOLOGIA VEGETAL, 9, 2003, Atibaia-SP. Resumos... Atibaia-SP,

2003. p.56.

ALMEIDA, L.F.R. et al. Constituintes químicos de Leonurus sibiricus (LAMIACEAE). In:

CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 24, 2006, Águas de

Lindóia-SP. Anais ... Águas de Lindóia-SP, 2006. p.94.

AN, M.; WAGGA, W. Mathematical modeling of dose-response relationship (Hormesis) in

allelopathy and its application. Nonlinearity in Biology, Toxicology and Medicine, v.3,

p.153-172, 2005.

AN, M.; JOHNSON, I.R.; LOVETT, J.V. Mathematical modeling of allelopathy: Biological

response to alelochemicals and its interpretation. Journal of Chemical Ecology, v.19,

p.2374-2388, 1993.

BAIS, H.P. et al. Allelopathy and exotic plants: from genes to invasion. Science, v.301,

p.1377–1380, 2003.

BASILE, A. et al. Antibacterial and allelopathic activity of extract from Castanea sativa

leaves, Fitoterapia, v.71, p.8110-8116, 2000.

BELL, E.A.; CHARLWOOD, B.V. Secondary plant products. In: BELL, E.A.;

CHARLWOOD, B.V. Encyclopedia of Plant Physiology, New York: Springer–Verlag,

1980, v.8, 674p.

BENINGER, C.W.; HALL, J.C. Allelopathic activity of luteolin 7-O-β-glucuronide isolated

from Chrysanthemum morifolium L. Biochemical Systematics and Ecology, v.33, p.103–

111, 2005.

BOALINO, D.M. et al. Labdane Diterpenes of Leonurus sibiricus. Journal of Natural

Products, v.67, p.714-717, 2004.

BORS, W. et al. Flavonoids as antioxidants: Determination of radical scavenging efficiencies.

Methods Enzymology, v.186, p.343-355,1990.

BOWN, D. The herb society of America: encyclopedia of herbs and their uses. New York:

Darling Kindersley Publ., 1995, 314p.

CALIS, I. et al. Phenylpropanoid glycosides from Leonurus glaucescens. Phytochemistry,

v.61, p.324-329, 2000.

CASTELLUCCI, S. et al. Plantas medicinais relatadas pela comunidade residente na estação

ecológica de Jataí, município de Luís Antônio/SP: uma abordagem etnobotânica. Revista

Brasileira de Plantas Medicinais, v.3, p.51-60, 2000.

CHON, S.U-K. et al. Allelopathic potential in lettuce (Lactuca sativa L.) plants. Scientia

Horticulturae, v.106, p.309–317, 2005.

CONG, Y.; WANG, J.-H.; LI, X. A new flavonoside from Leonurus heterophyllus. Journal

of Asian Natural Products Research, v.7, p.273-277, 2005.

CUTLER, H.G.; CUTLER, S.J. Agrochemicals and Pharmaceuticals: The connection. In:

CUTLER, H.G.; CUTLER, S.J. (Eds) Biologically active natural products: Agrochemicals.

Boca Raton, Florida: CRC Press, 1999, p.1-14.

DE FEO, V. et al. Isolation of phytotoxic compounds from Tree-of-Heaven (Ailanthus

altissima Swingle). Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51, p.1770-1802, 2003.

DUKE, S.O. et al. Strategies for the use of natural products for weed management. Journal of

Pesticide Science, v.27, p.298-306, 2002.

EINHELLIG, F.A. Mode of allelochemical action of phenolic compounds. In: MACIAS, F.A.

et al. (Eds.) Allelopathy: Chemistry and mode of action of allelochemicals. Boca Raton,

Florida: CRC Press, 2004, p.217-238.

FERREIRA, A.G.; AQUILA, M.E.A. Alelopatia: Uma área emergente da ecofisiologia.

Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.12 (ed. esp.), p.175-204, 2000.

GIANG, P.M. et al. New Labdane-Type Diterpenoids from Leonurus heterophyllus SW.

Chemical Pharmaceutical Bulletin, v.53, p.938-941, 2005.

GLASS, A.D.M.; DUNLOP, J. Influence of phenolic acids on ion uptake: 4. Depolarization

of membrane potentials. Plant Physiology, v.54, p.855-858, 1974.

HOAGLAND, R.E.; WILLIAMS, R.D. Bioassays-useful tolls of the study of allelopathy. In:

MACIAS, F.A. et al. (Eds.) Allelopathy: Chemistry and mode of action of allelochemicals.

Boca Raton, Florida: CRC Press, 2004, p.315-41.

HOEHNE, F.C. Plantas e Substâncias Vegetais Tóxicas e Medicinais. São Paulo:

Graphicars, 1939, 355p.

INDERJIT; DAKSHINI, K.M.M. Allelopathic potential of the phenolics from the roots of

Pluchea lanceolata. Physiologia Plantarum, v.92, p.571–576, 1994.

ISLAM, M.A. et al. Analgesic and anti-inflammatory activity of Leonurus sibiricus.

Fitoterapia, v.76, p.359-362, 2005.

KARTING, T.; GRUBER, A.; MENZINGER, S. Flavonoid-O-Glycosides from the Herbs of

Leonurus cardiaca. Journal of Natural Products, v.48, p.494-495, 1985.

LARCHER, W. Ecofisiologia vegetal. Sttuttgard: Eugen Ulmer, 2000, 315p.

LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas, tóxicas e

medicinais. São Paulo: Nova Odessa, 2002, 278p.

MACIAS, F.A. et al. Bioactive flavonoids from Helianthus annuus cultivars.

Phytochemistry, v.45, p.683-687, 1997.

MANDAL, S. Allelopathic activity of root exudates from Leonurus sibiricus L. (Raktodrone).

Weed Biology and Management, v.1, p.170-175, 2001.

MARTÍNEZ-FLÓREZ, S.J. et al. Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes.

Nutricion Hospitalaria, v.6, p.271-278, 2002.

MATHELA, C.S. Allelochemicals in Medicinal and Aromatic Plants. In: NARWAL, S.S.;

TAURO, P. (Eds.) Allelopathy in Agriculture and Forestry. Jodhpur, India: Scientific

Publishers, 1991, p.213-228.

MILKOWSKA-LEYCK, K.; FILIPEK, B.; STRZELECKA, H. Pharmacological effects of

lavandulifolioside from Leonurus cardiaca locomotor activity. Journal of

Ethnopharmacology, v.80, p.85-90, 2002.

MURAKAMI, S. Stachydrim in Leonurus sibiricus L. Acta Phytochemichal, v.13, p.161-

184, 1943.

NAGASAWA, W. et al. Effects of Motherwort (Leonurus sibiricus L) on Preneoplastic and

Neoplastic Mammary-Gland Growth in Multiparous Gr/A Mice Anticancer Research, v.10,

p.203-211, 1990.

NISHIDA, N. et al. Allelopathic effects of volatile monoterpenoids produced by Salvia

leucophylla inhibition of cell proliferation and DNA synthesis in the root apical meristem of

Brassica campestris seedlings. Journal of Chemical Ecology, v.31, p.1187-1203, 2005.

ONYIKAGHA, J.C.; GROTEWOLD, E. The biological and structural distribuition of surface

flavonoids. Recent Research Development Plant Science, v.2, p.1-18, 2004.

PARVEZ M.M. et al. Effects of quercetin and its seven derivatives on the growth of

Arabidopsis thaliana and Neurospora crassa. Biochemical Systematic and Ecology, v.32,

p.631–635, 2004.

PIETTÁ, G.P. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, v.63, p.1035-1042,

2000.

QASEM, J.R.; FOY, C.L. Weed allelopathy, its ecological impacts and future prospects: a

review. Journal of Crop Production, v.4, p.43-119, 2001.

RICE, E.L. Allelopathy. New York: Academic Press, 1984, 422p.

RICE-EVANS, C.A.; PACKER, L. Flavonoids in Health and Disease. New York: Marcel

Dekker, 1998, p.447-467.

SATOH, M. et al. Studies of the constituents of Leonurus sibiricus. Chemical

Pharmaceutical Bulletin, v.51, p.341-342, 2003.

SAVONA, G. et al. Diterpenoids from Leonurus sibiricus. Phytochemistry, v.21, p.2699-

2701, 1982.

SHIRLEY, B.W. Flavonoid biosynthesis: new functions for an old pathway. Trends Plant

Science, v.31, p.377-382, 1996.

SOUZA, G.C. et al. Ethnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the south of

Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v.90, p.135-43, 2004.

STEBBING, A.R.D. Hormesis – the stimulation of growth by low levels of inhibitors.

Science Total Environmental, v.22, p.213-234, 1982.

TASDEMIR, D. et al. Iridoid glycosides of Leonurus persicus. Journal of Natural Products,

v.62, p.811-816, 1999.

TOMITA-YOKOTANI, K. et al. Flavonoids isolated from pericarps of Hylocereus undatus

(Cactaceae) as allelochemicals, Plant and Cell Physiology, v.45, p.181-188, 2004.

TORRES, A. et al. A science of the future. In: First World Congress of Allelopathy, (SAI).

Annals… University of Cadiz, 1996, 278p.

WORSHAM, A.D. Germination of wicthweed seeds. In: MUSSELMAN, L. (ED.) Parasitic

Weeds in Agriculture, Boca Raton, Florida: CRC Press, 1987, p.45-61.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As folhas de Leonurus sibiricus apresentaram significativa diversidade química,

tanto de componentes voláteis quanto de flavonóides. Em relação aos terpenos, a presença

majoritária foi de sesquiterpenos, moléculas provavelmente oriundas da rota do ácido

mevalônico que apresentam 15 carbonos na estrutura e que são responsáveis pelo aroma e

atividade biológica do óleo essencial. Por outro lado, os flavonóides majoritários são

derivados da quercetina e apresentam de uma a duas moléculas de açúcar ligadas no carbono

3 do anel heterocíclico; além dessas substâncias majoritárias, as folhas também apresentaram

monoterpenos e agliconas. Essa composição química explica as atividades biológicas

discutidas na literatura e provavelmente, são responsáveis pelas atividades alelopáticas

mencionadas.

Os experimentos de germinação e crescimento inicial em raiz das três diferentes

espécies demonstraram que a atividade alelopática, inicialmente, depende da concentração

utilizada, fato esse verificado nos testes com extratos por infusão e metanólico. Além disso, as

diferentes substâncias isoladas de frações ativas mostraram que a ação alelopática, também,

está relacionada com a estrutura molecular e a presença de grupos químicos específicos,

capazes de alterar o crescimento das raízes. Não foi investigado os locais de ação dessas

substâncias ou delas em conjunto, porém foi observado que a alteração no alongamento e/ou

divisão celular de raízes podem ser em função das características eletrofílicas das moléculas

dos flavonóides. Em outras palavras, a capacidade antioxidante, geralmente benéfica nas

concentrações baixas dos flavonóides, deve ter propiciado melhor funcionamento das células

e portanto, conferido maior crescimento inicial das raízes. Por outro lado, quando em

concentração mais elevada, os flavonóides devem ter alterado os mecanismos celulares de

alongamento e/ou divisão celular, levando a visível inibição do crescimento das raízes.

Essas atividades alelopáticas, positivas (promoção) e negativas (inibição), estão de

acordo com critérios utilizados por muitos autores para definir o termo aleloquímico. Embora

as moléculas encontradas não sejam inéditas, é o primeiro relato da existência e atividade

alelopática de folhas de L. sibiricus, acarretando questionamentos sobre a função e

respectivos sítios de ação dos flavonóides. Não se pode deixar de mencionar que o efeito dos

extratos, os quais apresentam majoritariamente flavonóides glicosilados, pode ser devido ao

efeito de sinergismo destas substâncias, fato que poderá ser comprovado com o estudo em

fatoriais dos sete flavonóides isolados de folhas de L. sibiricus.

A espécie L. sibiricus, por estar amplamente distribuída no território brasileiro,

com fácil e rápido crescimento, pode ser um modelo de estudo para observações no âmbito

ecológico, possibilitando a compreensão das interações químicas entre os vegetais. Contudo,

as atividades de extratos e frações ativas, embora distante do que ocorre em condições de

campo, pôde evidenciar e comprovar as observações ocorridas na natureza.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AHERNE, S.A.; O'BRIEN, N.M. Dietary flavonols: chemistry, food content, and metabolism.

Nutrition, v.18, p.75-81 , 2002.

ALMEIDA, L.F.R.; DELACHIAVE, M.E.A.; MARQUES, M.O.M. Composição química do

óleo essencial de Leonurus sibiricus. Brasilian Journal of Medicinal Plants, v.8, p.31-35,

2005.

ALMEIDA, L.F.R.et al. Ação alelopática de extratos aquosos de rubim (Leonurus sibiricus)

na germinação e desenvolvimento inicial de alface, tomate e milho. In: CONGRESSO

BRASILEIRO DE FISIOLOGIA VEGETAL, 9, Resumos... Atibaia-SP, Brasil, p.56, 2003.

ALMEIDA, L.F.R. et al. Constituintes químicos de Leonurus sibiricus (LAMIACEAE). In:

CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, SBQ, 24, Anais.... Águas

de Lindóia-SP, p.94, 2006.

ALSAADAWI, I.S. Research on allelopathy in Iraq. In: NARWAL, S.S. (Ed.). Allelopathy

Update. Enfield: Science Publishers, 1999, v.1, p.185-197.

BAIS, H.P. et al. Allelopathy and exotic plants: from genes to invasion. Science, v.301,

p.1377–1380, 2003.

BARKOSKY, R.R.; EINHELLIG, F.A. Effect of a simple phenol on plant water relationships

of soybean Glycine max. Plant Physiology, v.2, p.155-155 (suppl), 1993.

BATISH, D.R. et al., Crop allelopathy and its role in ecological agriculture. Journal of Crop

Production, v.4, p.121-161, 2001.

BEN-HAMMOUDA, M.; GHORBAL, H.; OUESLATI, O. Allelopathic effects of barley

extracts on germination and seedlings growth of bread and durum wheats. Agronomie, v.21,

p.65-71, 2001.

BENINGER, C.W.; HALL, J.C. Allelopathic activity of luteolin 7-O-b-glucuronide isolated

from Chrysanthemum morifolium L. Biochemical Systematics and Ecology, v.33, p.103–

111, 2005.

BERGMARK, C.L.; JACKSON, W.A.; VOLK, R.J. Differential inhibition by ferulic acid of

nitrate and ammonium uptake in Zea mays. Plant Physiology, v.98, p.639-645, 1992.

BOOKER, F.L.; BLUM, U.; FISCUS, E.L. Short-term effects of ferulic acid on ion uptake

and water relations in cucumber seedlings. Journal of Experimental Botany, v.43, p.649-

655, 1992.

BORS, W. et al., Flavonoids as antioxidants: Determination of radical scavenging

efficiencies. Methods Enzymology, v.186, p.343-355, 1990.

BOWN, D. The herb society of America: encyclopedia of herbs and their uses. New York:

Darling Kindersley Publ. 1995, 314p.

BRANCO, A.; PIZZOLATTI, M.G. CGAR e CGAR-EM na análise dos constituintes

químicos isolados do extrato hexânico de Sabastiania argutidens (Euphorbiaceae). Química

Nova, v.25, p.15-19, 2002.

CALLAWAY, R.M. The detection of neighbors by plants. Trends in Ecology & Evolution,

v.17, p.104-105, 2002.

CASTELLUCCI, S. et al. Plantas medicinais relatadas pela comunidade residente na estação

ecológica de Jataí, município de Luís Antônio/SP: uma abordagem etnobotânica. Revista

Brasileira de Plantas Medicinais, v.3, p.51-60, 2000.

CONG, Y.; WANG, J.H.; LI, X. A new flavonoside from Leonurus heterophyllus. Journal of

Asian Natural Products Research, v.7, p.273-277, 2005.

CUTLER, H.G.; CUTLER, S.J. Agrochemicals and Pharmaceuticals: The connection. In:

CUTLER, H.G.; CUTLER, S.J. (Eds.). Biologically active natural products:

Agrochemicals, Boca Raton, Florida: CRC Press, 1999, p.1-14.

DE FEO, V. et al. Isolation of Phytotoxic compounds from Tree-of-Heaven (Ailanthus

altissima Swingle). Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51, p.1770-1802, 2004.

DELACHIAVE, M.E.A.; ONO, E.O.; RODRIGUES, J.D. Efeitos alelopáticos de grama-seda

(Cynodon dactylon) na germinação de sementes de pepino, milho, feijão e tomate. Revista

Brasileira de Sementes, v.21, p.194-197, 1999.

DEVI, S.R.; PRASAD, M.N.V. Effect of ferulic acid on growth and hydrolytic enzyme

activities of germinating maize seeds. Journal of Chemical Ecology, v.18, p.1981-1990,

1992.

DUKE, S.O. et al. Strategies for the use of natural products for weed management. Journal of

Pesticide Science, v.27, p.298-306, 2002.

EINHELLIG, F.A. Mode of allelochemical action of phenolic compounds. In: MACIAS, F.A.

et al. (Eds.) Allelopathy: Chemistry and mode of action of allelochemicals. Boca Raton,

Floridaa: CRC Press: 2004, p.217-238.

EINHELLIG, F.A. Allelopathy: Current Status and Future Goals. Acs Symposium Series,

v.582, p.1-24, 1995.

EINHELLIG, F.A.; RASMUSSEN, J.A. Effects of root exudate sorgoleone on

photosynthesis. Journal of Chemical Ecology, v.19, p.369-375, 1993.

ELLIOTT, L.F.; CHENG, H.H. Assessment of allelopathy among microbes and plants. ACS

Symposium Series, v.330, p.504-515, 1987.

FERREIRA, A.G.; AQUILA, M.E.A. Alelopatia: Uma área emergente da ecofisiologia.

Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.12 (ed. esp.), p.175-204, 2000.

FRIEDMAN, J. Allelopathy, Autotoxicity, and Germination. In: ZIGEL, J.; GALILI, G.

(Eds.) Seed development and germination. New York: Marcel Dekker, 1995, 853p.

GIANG, P.M. et al. New Labdane-Type Diterpenoids from Leonurus heterophyllus SW.

Chemical Pharmaceutical Bulletin, v.53, p.938-941, 2005.

GLASS, A.D.M.; DUNLOP, J. Influence of phenolic acids on ion uptake: 4. Depolarization

of membrane potentials. Plant Physiology, v.54, p.855-858, 1974.

GOTTLIEB, O.R. Micromolecular, evolution, systematics and ecology: an essay into a

novel botanical discipline, Berlin: Springer-Verlag, 1982, 170p.

HARBONE, J.B. Chemotaxonomy of the Leguminosae. In: CODY, V.; MIDDLETON, E.;

HARBONE, J.B. (Eds.), The Flavoniods Advances in Research Since 1980. London:

Chapman & Hall, 1988, p.367-462.

HARBORNE, J.B. The Flavonoids: Advances in Research Since 1986, London: Chapman &

Hall, 1994, p.589-618.

HAVSTEEN, B. Flavonoids: A class of natural products of high pharmacological potency.

Biochemical Pharmacology, v.32, p.1141-1148, 1983.

HELLER, W.; FORKMANN, G. Biosynthesis, In: HARBONE, J.B. (Ed.) The Flavonoids.

Advances in Research since 1986. London: Chapman & Hall, 1993, p.499-535.

HICKS, S.K. et al. Allelopathic effects of wheats straw on cotton germination, emergence and

yield. Crop Science, v.29, p.1057-1061, 1989.

HIERRO, J.L.; CALLAWAY, R.M. Allelopathy and exotic plant invasion. Plant and Soil,

v.256, p.29-39, 2003.

HOAGLAND, R.E.; WILLIAMS, R.D. Bioassays-useful tolls of the study of allelopathy. In:

MACIAS, F.A. et al. (Eds.) Allelopathy: Chemistry and mode of action of allelochemicals.

Boca Raton, Florida: CRC Press, 2004, p.315-41.

HOEHNE, F.C. Plantas e Substâncias Vegetais Tóxicas e Medicinais. São Paulo:

Graphicars, 1939, 355p.

IGURA, K. et al. Resveratrol and quercetin inhibit angiogenesis in vitro. Cancer Letterts,

v.171, p.11-16, 2001.

INDERJIT. Plant phenolics in allelopathy. Botanical Review, v.62, p.186-202, 1996.

INDERJIT; DAKSHINI, K.M.M. The nature of the interference potential of Pluchea

lanceolata (DC) Clarke,C.B. (Asteraceae). Plant and Soil, v.122, p.298-302, 1990.

INDERJIT; DAKSHINI, K.M.M. Interference potencial of Pluchea lanceolata (Asteraceae):

growth and physiological responses of asparagus bean, Vigna unguiculata var. sesquipedalis.

American Journal of Botany, v.79, p.977-981, 1992.

INDERJIT; DAKSHINI, K.M.M. Allelopathic potential of the phenolics from the roots of

Pluchea lanceolata. Physiologia Plantarum, v.92, p.571–576, 1994.

INDERJIT; DEL MORAL, R. Is separating resource competition from allelopathy realistic?

Botanical Review, v.63, p.221-230, 1997.

INDERJIT; NILSEN, E.T. Bioassays and field studies for allelopathy in terrestrial plants:

Progress and problems. Critical Reviews in Plant Sciences, v.22, p.221-238, 2003.

INDERJIT; KAUR, M.; FOY, C.L. On the Significance of Field Studies in Allelopathy.

Weed Technology, v.15, p.792–797, 2001.

ISLAM, M.A. et al. Analgesic and anti-inflammatory activity of Leonurus sibiricus.

Fitoterapia, v.76, p.359-362, 2005.

JANG, M.; CAI, L.; UDEANI, G.O. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural

product derived from grapes. Science, v.275, p.218-221, 1997.

JOVANOVIC, S.V. et al. Antioxidant properties of flavonoids: reduction potentials and

electron transfer reactions of flavonoid radicals. In: RICE-EVANS C.; PARKER, L. (Eds.)

Flavonoids in health and disease, Nova York: Marcel Dekker, 1998, p.137-161.

KALBURTJI, K.L. Research on allelopathy in Greece. In: NARWAL, S.S. (Ed.) Allelopathy

Update, Enfield: Science Publishers, 1999, v.1, p.37-47.

KARTNIG, T.; GRUBER, A.; MENZINGER, S. Flavonoid-O-Glycosides from the Herbs of

Leonurus cardiaca. Journal of Natural Products, v.48, p.494-495, 1985.

KÜHNAU, J. The Flavonoids: a class of semi-essential food components: their role in human

nutrition. World Revision Nutrition Diet, v.24, p.117-190, 1976.

KRUSE, O. et al. Phosphatidylglycerol is involved in the dimerization of photosystem II.

Journal of Biology Chemistry, v.275, p.6509-6514, 2000.

LARCHER, W. Ecofisiologia vegetal, Sttuttgard: Eugen Ulmer, 2000, 315p.

LETAN, A. The relation of structure to antioxidant activity of quercitin and some of its

derivates. Journal of Food Science, v.31, p.518-523, 1966.

LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas, tóxicas e

medicinais. São Paulo: Nova Odessa, 2002, 278p.

MACIAS, F.A. et al. Bioactive flavonoids from Helianthus annuus cultivars.

Phytochemistry, v.45, p.683-687, 1997.

MANDAL, S. Allelopathic activity of root exudates from Leonurus sibiricus L. (Raktodrone).

Weed Biology and Management, v.1, p.170-175, 2001.

MARTÍNEZ-FLÓREZ, S.J. et al. Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes.

Nutricion Hospitalaria, v.6, p.271-278, 2002.

MATHELA, C.S. Allelochemicals in medicinal and aromatic plants. In: NARWAL, S. S.;

TAURO, P. (Eds.) Allelopathy in Agriculture and Forestry. Jodhpur, India: Scientific

Publishers, 1991, p.213-228.

MAY, F.E.; ASH, J.E. An assessment of allelopathic potential of Eucalyptus. Australian

Journal of Botany, v.38, p.245-254, 1990.

MAZZAFERA, P. Efeito alelopático do extrato alcoólico do cravo-da-índia e eugenol.

Revista Brasileira de Botânica, v.26, p.231-238, 2003.

MIDDLETON, E. JR.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T.C. The effects of plant

flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer.

Pharmacological Revision, v.52, p.673-751, 2000.

MILKOWSKA-LEYCK, K.; FILIPEK, B.; STRZELECKA, H. Pharmacological effects of

lavandulifolioside from Leonurus cardiaca locomotor activity. Journal of

Ethnopharmacology, v.80, p.85-90, 2002.

MORELAND, D.E.; NOVITZKY, W.P. Interference by flavone and flavonols with

chloroplast-mediated electron transport and phosphorylation. Phytochemistry, v.27, p.3359-

3366, 1988.

MURAKAMI, S. Stachydrim in Leonurus sibiricus L. Acta Phytochemichal, v.13, p.161-

184, 1943.

MUSCOLO, A.; PANUCCIO, M.R.; SIDARI, M. The ascorbate system during the early

stage of germination in Pinus laricio seeds treated with extracts from two different sources of

humus. Seed Science and Technology, v.29, p.275-279, 2001.

NAGASAWA, W. et al. Effects of Motherwort (Leonurus sibiricus L) on Preneoplastic and

Neoplastic Mammary-Gland Growth in Multiparous Gr/A Mice. Anticancer Research, v.10,

p.203-211, 1990.

NAKANO, H. et al. Isolaton and identification of plant growth inhibitors as candidates of

allelopathic effects substances, from aqueous leachate from mesquite (Prosopis juliflora)

leaves. Plant Growth Regulation, v.37, p.113-117, 2002.

ONYILAGHA, J.C.; GROTEWOLD, E. The biological and structural distribuition of surface

flavonoids. Recent Research Development Plant Science, v.2, p.1-18, 2004.

OUDHIA, P.; TRIPATHI, R.S. Allelopathic effects of an obnoxious weed Parthenium

hysterophorus on germination and seedling vigour of rice var, Mahamaya. Research on

Crops, v.1, p.111-115, 2000.

PACE-ASCIAK, C.R. et al. The red wine phenolics trans-resveratrol and quercitin block

human platelet aggregation in eicosanoid synthesis implication for protection against coronary

heart disease. Clinical Chemistry Acta, v.235, p.207-219, 1995.

PARVEZ M.M. et al. Effects of quercetin and its seven derivatives on the growth of

Arabidopsis thaliana and Neurospora crassa. Biochemical Systematics and Ecology, v.32,

p.631–635, 2004.

PERES, W. Radicais Livres em níveis biológicos. Pelotas: Ed. Universidade Católica, 1994,

p.49-81.

PEREZ, F.J. Allelopathic effect of hydroxamic acids from cereals on Avena sativa e A. fatua.

Phytochemistry, v.29, p.773-776, 1990.

PIETTÁ, G.P. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, v.63, p.1035-1042,

2000.

PIETTA, P.G.; SIMONETTI, P. Antioxidant Food Supplements in Human Health. San

Diego: Academic Press, 1999, p.283-308.

PUTNAM, A.R. Weed allelopathy. In: DUKE, S.O (Ed.) Weed Physiology: Reproduction

and Ecophysiology. Boca Raton, Florida: CRC Press, 1985, p.131–155.

PUTNAM, A.R.; DUKE, W.B. Allelopathy in agro-ecosystems. Annual Review of

Phytopathology, v.16, p.431-451, 1978.

QASEM, J.R.; FOY, C.L. Weed allelopathy, its ecological impacts and future prospects: a

review. Journal Crop Production, v.4, p.43-119, 2001.

RICE, E.L. Allelopathy. New York: Academic Press, 1984, 422p.

RICE-EVANS, C.A.; PACKER, L. Flavonoids in Health and Disease. New York: Marcel

Dekker, 1998, p.447-467.

RIMANDO, A.M. et al. Searching for rice allelochemicals: an exemple of bioassay-guided

isolation. Agronomy Journal, v.93, p.16-20, 2001.

RIZVI, S.J.H.; RIZVI, V. Exploration of allelochemicals in improving crop productivity. In:

RIZVI, S.J.H.; RIZVI, V. (Eds.). Allelopathy: Basic end applied aspects. London: Chapman

& Hall, 1992, p.443-472.

SATOH, M. et al. Studies of the constituents of Leonurus sibiricus. Chemical

Pharmaceutical Bulletin, v.51, p.341-342, 2003.

SAVONA, G. et al. Diterpenoids from Leonurus sibiricus. Phytochemistry, v.21, p.2699-

2701, 1982.

SHIRLEY, B.W. Flavonoid biosynthesis: new functions for an old pathway. Trends Plant

Science, v.31, p.377-382, 1996.

SINGH, H.P.; BATISH, D.R.; KOHLI, R.K. Allelopathy in agroecosystems: a overview.

Journal of Crop Production, v.4, p.1-41, 2001.

SINGLETON, V.L. Flavonoids. In: CHILDESTER, C.O.; MRAK, E.M.; STEWART, G.F.

(Eds.). Advances in Food Research, New York: Academic Press, 1981, p.149-242.

SOUZA, G.C. et al. Ethnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the south of

Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v.90, p.135-43, 2004.

STOWE, L.G. Allelopathy and its influence on the distribution of plants in an Illinois old

field. Journal of Ecology, v.67, p.1065-1085, 1979.

TASDEMIR, D. et al. Iridoid glycosides of Leonurus persicus. Journal of Natural Products,

v.62, p.811-816, 1999.

TOMITA-YOKOTANI, K. et al. Flavonoids isolated from pericarps of Hylocereus undatus

(Cactaceae) as allelochemicals, Phytochemistry, v.65, p.1247-1253, 2004.

TORRES, A. et al. A science of the future. In: FIRST WORLD CONGRESS OF

ALLELOPATHY. (SAI). Annals… University of Cadiz, 1996, 278p.

WAGNER, H.; FARKAS, L. Síntesis of flavonoids. In: HARBORNE, J.B.; MABRY, T.J.;

MABRY, H. (Eds). The Flavonoids. New York: Academic Press, 1975, p.127-213.

WALLER, G.R. Introduction. In: MACIAS, F.A. et al. (Eds.) Recent advances in

allelopathy. Cadiz: Serv. Publisher Univesity of Cadiz, v.1, 1999, p.231.

WEBSTER, J. et al. Induction of Acclimative Proteolysis of the Light-Harvesting Chlorophyll

a/b Protein of Photosystem II in Response to Elevated Light Intensities. Plant Physiology,

v.118. p.827-834, 1998.

YANG, K.; LAMPRECHT, S.A.; LIU, Y. Chemoprevention studies of the flavonoids

quercetin and rutin in normal and azoxymethane-treated mouse colon. Carcinogenesis, v.21,

p.1655-1660, 2000.

A N E X O

Capítulo 1

Composição do óleo essencial de Leonurus sibiricus L.

A. Espectro de massa em CG-MS de alfa-copaeno

B. Espectro de massa em CG-MS de beta-bouboreno.

C. Espectro de massa em CG-MS de trans-cariofileno.

D. Espectro de massa em CG-MS de alfa-humuleno.

E. Espectro de massa em CG-MS de germacreno-D.

F. Espectro de massa em CG-MS de gama-cadieno.

Capítulo 2

Potencial alelopático de folhas de Leonurus sibiricus L.

Tabela 1. Dados originais de porcentagem de germinação de sementes de Raphanus sativus,

em diferentes concentrações do extrato por infusão.

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800

dia

r1 70 60 70 20 10 20

r2 60 20 30 30 30 20

r3 60 20 50 30 10 10

dia

r1 90 80 70 70 50 60

r2 80 50 60 80 40 60

r3 90 60 80 80 60 40

dia

r1 100 90 80 80 80 70

r2 90 70 90 90 70 90

r3 90 90 90 90 90 100

dia

r1 100 90 80 90 80 70

r2 90 80 90 90 80 100

r3 90 90 100 90 100 100

5,77 5,77 10 0 11,55 17,32

93,33 86,67 90 90 86,67 90

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 2. Dados originais de porcentagem de germinação de sementes de Lactuca sativa, em

diferentes concentrações do extrato por infusão.

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800

dia

r1 70 30 40 20 10 20

r2 70 60 30 50 30 20

r3 70 70 30 40 30 10

dia

r1 90 80 60 40 30 40

r2 80 70 50 50 40 40

r3 80 80 70 60 40 20

dia

r1 100 90 70 70 50 60

r2 90 90 100 70 70 60

r3 90 80 70 70 70 50

dia

r1 100 90 70 70 50 70

r2 90 90 100 70 70 80

r3 100 80 70 80 80 50

5,77 5,77 17,32 5,77 15,27 15,27

96,67 86,67 80 73,33 66,67 66,67

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 3. Dados originais de porcentagem de germinação de sementes de Lepidium sativum,

em diferentes concentrações do extrato por infusão.

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800

dia

r1 50 60 40 50 20 20

r2 60 50 40 20 20 10

r3 40 50 60 50 50 20

dia

r1 70 60 60 70 30 50

r2 70 70 70 40 50 50

r3 90 90 60 50 60 30

dia

r1 90 90 90 90 80 80

r2 90 100 80 90 80 90

r3 100 90 90 100 80 80

dia

r1 90 100 100 90 100 100

r2 100 100 90 90 90 100

r3 100 90 90 100 80 80

5,77 5,77 5,77 5,77 10 11,55

96,67 96,67 93,33 93,33 90 93,33

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 4. Dados originais de porcentagem de germinação de sementes de Raphanus sativus,

em diferentes concentrações do extrato metanólico.

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800 água + acetona 0,01%

dia

r1 70 50 40 40 30 20 20

r2 60 60 30 40 50 50 60

r3 60 60 50 50 50 50 50

dia

r1 90 70 50 60 50 60 70

r2 80 70 80 50 60 60 60

r3 90 80 60 70 70 80 90

dia

r1 100 90 80 80 80 80 80

r2 90 100 90 90 90 90 100

r3 90 90 90 100 90 90 100

dia

r1 100 90 80 80 100 90 80

r2 90 100 100 100 90 90 100

r3 90 90 90 100 90 90 100

5,77 5,77 10 11,55 5,77 0 11,55

93,33 93,33 90 93,33 93,33 90 93,33

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 5. Dados originais de porcentagem de germinação de sementes de Lactuca sativa, em

diferentes concentrações do extrato metanólico.

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800 água + acetona 0,01%

dia

r1 70 50 40 30 40 10 60

r2 70 50 50 50 40 40 70

r3 70 40 30 20 10 20 50

dia

r1 90 70 60 40 50 30 80

r2 80 70 70 50 50 60 80

r3 80 70 70 60 40 50 80

dia

r1 100 80 70 60 80 70 90

r2 90 90 100 80 70 80 90

r3 90 80 80 70 60 70 100

dia

r1 100 80 70 70 80 80 90

r2 90 100 100 80 70 80 90

r3 100 80 80 80 70 70 100

5,77 11,55 15,27 5,77 5,77 5,77 5,77

96,67 86,67 83,33 76,67 73,33 76,67 93,33

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 6. Dados originais de porcentagem de germinação de sementes de Lepidium sativum,

em diferentes concentrações do extrato metanólico.

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800 água + acetona 0,01%

dia

r1 50 50 40 50 30 30 50

r2 60 50 50 50 30 20 40

r3 40 60 40 30 50 40 50

dia

r1 70 70 50 70 50 50 60

r2 70 60 70 60 40 40 70

r3 90 60 70 60 70 70 60

dia

r1 90 90 80 100 100 90 80

r2 90 100 90 90 90 80 90

r3 100 100 100 100 90 90 100

dia

r1 90 100 90 100 100 100 90

r2 100 100 100 90 100 100 100

r3 100 100 100 100 90 90 100

5,77 0 5,77 5,77 5,77 5,77 5,77

96,67 100 96,67 96,67 96,67 96,67 96,67

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 7. Dados originais de crescimento inicial de raiz de Raphanus sativus em diferentes

concentrações de extratos por infusão e metanólico.

INFUSÃO

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800

r1 59 65 55 54 61 44

r2 53 57 60 66 49 49

r3 65 61 64 58 45 57

6,00 4,00 4,51 6,11 8,33 6,56

59,00 61,00 59,67 59,33 51,67 50,00

METANÓLICO

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800 água + acetona 0,01%

R1 58 66 74 70 50 29 61

R2 63 61 70 58 60 36 68

R3 69 73 59 64 53 48 59

5,51 6,03 7,77 6,00 5,13 9,61 4,72

63,33 66,67 67,67 64,00 54,33 37,67 62,67

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 8. Dados originais de crescimento inicial de raiz de Lactuca sativa em diferentes

concentrações de extratos por infusão e metanólico.

INFUSÃO

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800

r1 46 43 34 33 25 19

r2 55 45 46 36 34 26

r3 49 51 38 45 31 28

4,58 4,16 6,11 6,25 4,58 4,72

50,00 46,33 39,33 38,00 30,00 24,33

METANÓLICO

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800 água + acetona 0,01%

R1 46 31 26 22 20 9 50

R2 55 45 29 29 28 16 59

R3 49 38 41 35 18 11 41

4,58 7,00 7,94 6,51 5,29 3,60 9,00

50,00 38,00 32,00 28,67 22,00 12,00 50,00

r = repetição DP = desvio padrão M = média

Tabela 9. Dados originais de crescimento inicial de raiz de Lepidium sativum em diferentes

concentrações de extratos por infusão e metanólico.

INFUSÃO

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800

r1 58 57 60 49 44 40

r2 63 68 69 68 59 51

r3 69 65 63 62 61 58

5,51 5,69 4,58 9,71 9,29 9,07

63,33 63,33 64,00 59,67 54,67 49,67

METANÓLICO

Concentração (mg L

-1

)

controle 50 100 200 400 800 água + acetona 0,01%

r1 58 74 77 61 50 36 71

r2 63 68 70 70 69 40 60

r3 69 66 63 75 59 45 59

5,51 4,16 7,00 7,09 9,50 4,51 6,66

63,33 69,33 70,00 68,67 59,33 40,33 63,33

r = repetição DP = desvio padrão M = média

CURVA DE CALIBRAÇÃO DE RUTINA (µg mL

-1

)

Figura 1. Quantificação dos flavonóides majoritários

y = ax + b

a b R

-481357,70 191362,31 0,99997

0 100 200 300 400 500

0,0

2,0x10

4,0x10

6,0x10

8,0x10

1,0x10

Area (Contagens)

[Rutina]

g ml

-1

y = ax + b

Tabela 10. Dados originais da quantificação de flavonóides, nos extratos por infusão e

metanólico.

INFUSÃO

flavonóides

(A) (B) (C) (D)

tempo de

retenção 39,52 40,18 41,57 42,33

Área 1 18190228 13730299 11802077 13831717

Área 2 17850696 12443194 11897688 14715451

Média 18020462 13086747 11849883 14273584

Área 1 19126224 14341862 13073976 14811251

Área 2 19018868 13690813 13036328 15196325

Média 19072546 14016338 13055152 15003788

Área 1 18700010 11790870 14096425 17911712

Área 2 18267936 10789640 14300216 18678032

Média 18483973 11290255 14198321 18294872

f (x) ug mL

-1

(A) (B) (C) (D)

R 1

96,68476 70,9027 64,43923 77,10474

R 2

102,1826 75,76045 70,7376 80,92056

R 3

99,10693 61,51479 76,71144 98,11874

massa extraída de 2 g de folhas secas (g)

R 1

0,9969

R 2

0,9999

R 3

1,0019

(A) Quercetina 3O-β-D-galactopiranosil(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo

(B) Quercetina 3O-β-D-glucopiranosil(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo

(D) Quercetina 3O-β-D-glucopiranosil

R 2

R 3

Tabela 10. continuação

METANÓLICO

flavonóides

(A) (B) (C) (D)

tempo de retenção 39,59 40,44 41,57 42,38

Área 1 16329543 13258994 14927990 16557570

Área 2 16492712 13193164 15339926 16865444

Média 16411128 13226079 15133958 16711507

Área 1 20198498 16599490 17980172 19790756

Área 2 19770450 15538734 17815856 19586612

Média 19984474 16069112 17898014 19688684

Área 1 24888738 19623454 22496314 24919614

Área 2 25145870 20480624 22866900 24996628

Média 25017304 20052039 22681607 24958121

f (x) ug mL

-1

(A) (B) (C) (D)

R 1

88,27488 71,63081 81,60079 89,84457

R 2

106,9481 86,48761 96,04489 105,4024

R 3

133,2481 107,3012 121,0425 132,9388

massa extraída de 2g de folhas secas com clorofórmio (g)

R 1

1,0077

R 2

1,0009

R 3

1,003

massa extraída de 1g de folhas secas com metanol (mg)

R 1

109

R 2

110

R 3

118

massa usada na SPE (mg)

R 1

20,8124

R 2

20,5923

R 3

21,2614

Figura 2. Espectro de RMN de

H do flavonoide isolado quercetina-3-O-galactose-

rhamnose

Figura 3. Espectro de RMN do flavonóide isolado quercetina-3-O-glucose-rhamnose.

Figura 4. Espectro de RMN do flavonóide isolado quercetina-3-O-galactose.

Figura 5. Espectro de RMN do flavonóide isolado quercetina-3-O-glucose.

Figura 6. Espectro de RMN do flavonóide isolado Genkanina-3-hidroxi.

Figura 7. Espectro de RMN do flavonóide isolado Genkanina.

Figura 8. Espectro de RMN do flavonóide isolado quercetina.

Tabela 11. Dados originais de número de sementes germinadas de Lactuca sativa, em

diferentes concentrações dos flavonóides isolados das frações ativas.

T0 = controle T1= 10

-7

T2 = 10

-6

T3 = 10

-5

T4 = 10

-4

(A) quercetina-3-O-β-D-galactopiranosil-(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 8 9 10 0,6 9,0 9 10 10 1,0 9,7 8 10 10 1,0 9,3 8 10 10 1,0 9,3

T3 9 8 8 1,0 8,3 10 8 9 0,6 9,0 10 8 9 0,6 9,0 10 8 9 0,6 9,0

T2 9 9 8 0,6 8,7 10 10 9 0,6 9,7 10 10 9 0,6 9,7 10 10 9 0,6 9,7

T1 10 10 8 1,2 9,3 10 10 9 0,6 9,7 10 10 10 0,6 10,0 10 10 10 0,6 10,0

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 1,2 9,7 9 10 10 1,2 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 2,3 0,6 0,7 0,6 4 1,1 0,3 0,4 0,8 4 1,1 0,3 0,8 0,6 4 1,1 0,3 0,4 0,6

R 10 8,7 0,9 10 6,7 0,7 10 6,7 0,7 10 6,7 0,7

T 14 11,0 14 7,7 14 7,7 14 7,7

(B) quercetina-3-O-β-D-glucopiranosil-(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m R1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 5 7 5 1,2 5,7 7 7 7 0,0 7,0 8 7 9 1,0 8,0 8 7 9 1,0 8,0

T3 7 8 7 0,6 7,3 10 9 8 1,0 9,0 10 8 9 1,0 9,0 10 8 9 1,0 9,0

T2 7 7 7 0 7,0 9 7 9 1,2 8,3 10 7 10 1,7 9,0 10 7 10 1,7 9,0

T1 8 10 8 1,2 8,7 8 9 10 1,0 9,0 8 9 10 1,0 9,0 8 9 10 1,0 9,0

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 25 6,2 7,2 0,01 4 10 2,6 2,8 0,09 4 4,3 1,1 0,8 0,53 4 4,3 1,1 0,8 0,53

R 10 8,7 0,9 10 9,3 0,9 10 13 1,3 10 13 1,3

T 14 34 14 20 14 17 14 17

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m R1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 9 9 9 0,0 9,0 10 9 10 0,6 9,7 10 9 10 0,6 9,7 10 9 10 0,6 9,7

T3 8 8 8 0,0 8,0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3

T2 10 9 8 1,0 9,0 10 10 10 0,0 10,0 10 10 10 0,0 10,0 10 10 10 0,0 10,0

T1 8 10 8 1,2 8,7 9 10 8 1,0 9,0 9 10 8 1,0 9,0 9 10 8 1,0 9,0

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 3,1 0,8 1,0 0,4 4 1,7 0,4 0,5 0,7 4 1,7 0,4 0,7 0,6 4 1,7 0,4 0,7 0,6

R 10 7,3 0,7 10 8,0 0,8 10 6,0 0,6 10 6,0 0,6

T 14 10 14 9,7 14 7,7 14 7,7

Tabela 11. continuação

(D) quercetina-3-O-β-D-glucopiranosil

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m R1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 3 5 5 1,2 4,3 8 9 9 0,6 8,7 8 9 10 1,0 9,0 8 9 10 1,0 9,0

T3 5 7 6 1,0 6,0 9 8 10 1,0 9,0 9 8 10 1,0 9,0 9 8 10 1,0 9,0

T2 8 8 8 0,0 8,0 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

T1 10 10 8 1,2 9,3 10 10 10 0,0 10,0 10 10 10 0,0 10,0 10 10 10 0,0 10,0

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 58 14 14,4 <10

-3

4 3,3 0,8 1,4 0,3 4 2,4 0,6 1,1 0,4 4 2,4 0,6 1,1 0,4

R 10 10 1 10 6 0,6 10 5,3 0,5 10 5,3 0,5

T 14 68 14 9,3 14 7,7 14 7,7

(E) Genkanina-3´- hidroxi

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m R1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 0 1 2 1 1 6 6 8 1,2 6,7 8 8 8 0,0 8,0 9 9 8 0,6 8,7

T3 6 8 5 1,5 6,3 7 10 10 1,7 9,0 7 10 10 1,7 9,0 7 10 10 1,7 9,0

T2 4 7 8 2,1 6,3 7 8 10 1,5 8,3 9 8 10 1,0 9,0 8 8 10 1,2 8,7

T1 6 8 8 1,2 7,3 9 10 9 0,6 9,3 9 10 9 0,6 9,3 9 10 9 0,6 9,3

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 114 29 13,8 <10

-3

4 15 3,8 2,4 0,1 4 4,7 1,2 1,2 0,3 4 2,3 0,6 0,5 0,7

R 10 21 2,1 10 17 1,7 10 9,3 0,9 10 11 1,1

T 14 135 14 32 14 14 14 13

(F) genkanina

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m R1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 8 7 7 0,6 7,3 10 8 8 1,2 8,7 10 8 8 1,2 8,7 10 8 8 1,2 8,7

T3 7 6 8 1,0 7,0 8 9 8 0,6 8,3 8 10 8 1,2 8,7 8 10 8 1,2 8,7

T2 7 9 9 1,2 8,3 9 8 10 1,0 9,0 9 8 10 1,0 9,0 9 8 10 1,0 9,0

T1 9 9 9 0,0 9,0 9 10 9 0,6 9,3 9 10 9 0,6 9,3 9 10 9 0,6 9,3

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 12 3,1 3,9 0,04 4 2,3 0,6 0,6 0,64 4 2,3 0,6 0,6 0,64 4 2,3 0,6 0,6 0,64

R 10 8 0,8 10 8,7 0,9 10 8,7 0,9 10 8,7 0,9

T 14 20 14 11 14 11 14 11

Tabela 11. continuação

(G) quercetina

dia 2

dia 3

dia 4

dia

r1 r2 r3 SD m R1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m r1 r2 r3 SD m

T4 0 3 0 1,7 1,0 6 6 5 0,6 5,7 9 8 8 0,6 8,3 9 8 8 0,6 8,3

T3 7 10 6 2,1 7,7 9 9 9 0,0 9,0 9 9 9 0,0 9,0 9 10 9 0,6 9,3

T2 8 9 8 0,6 8,3 9 10 9 0,6 9,3 9 10 9 0,6 9,3 9 10 9 0,6 9,3

T1 9 7 8 1,0 8,0 9 9 9 0,0 9,0 10 9 9 0,6 9,3 10 9 9 0,6 9,3

T0 8 10 10 1,2 9,3 8 10 10 1,2 9,3 9 10 10 0,6 9,7 9 10 10 0,6 9,7

DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P DF SS MS F P

BM 4 134 33 16,7 <10

-3

4 30 7,4 18,6 <10

-3

4 3,1 0,8 2,9 0,08 4 3,1 0,8 2,3 0,13

R 10 20 2 10 4 0,4 10 2,7 0,3 10 3,3 0,3

T 14 154 14 34 14 5,7 14 6,4

BM = entre médias

r = repetição

DF = grau de liberdade

F = test F

R = Resíduo

SD = desvio padrão

SS = qui quadrado

P = probabilidade

T = Total

m = média

MS = média quadrada

Tabela 12. Dados originais de comprimento de raízes (cm) de Lactuca sativa, em diferentes

concentrações dos flavonóides isolados das frações ativas.

T1 = 10

-7

T2 = 10

-6

T3 = 10

-5

T4 = 10

-4

(A) quercetina-3-O-β-D-galactopiranisil-(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo

T1 T2 T3 T4 Controle Controle + Acetona

n r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3

1 4,0 3,9 3,5 3,0 2,0 3,5 3,1 2,2 3,5 2,5 2,6 4,7 2,5 3,1 1,9 2,3 2,1 2,5

2 2,3 2,7 2,0 4,0 5,0 5,5 3,5 4,5 3,3 5,7 2,6 3,9 2,0 2,4 3,3 2,4 2,4 2,2

3 2,5 2,1 2,5 3,4 2,4 2,8 4,7 2,5 3,7 2,3 3,5 3,0 2,9 2,3 2,5 1,7 1,9 3,5

4 2,0 2,0 2,0 2,8 1,4 2,5 2,0 2,6 4,2 4,0 6,1 6,7 2,1 2,4 2,0 2,3 2,0 2,0

5 2,4 2,2 2,5 4,5 3,8 4,7 3,1 5,7 3,6 4,5 5,5 5,0 2,1 2,4 2,9 2,2 1,9 1,8

6 2,5 2,0 2,1 2,9 2,2 6,3 2,5 3,0 3,6 2,0 2,7 2,0 2,0 2,5 2,2 2,2 1,7 2,3

7 2,2 2,1 2,2 2,8 2,4 5,7 0,5 2,0 4,7 2,7 4,5 4,0 2,2 2,7 2,3 2,4 2,2 2,5

8 1,8 1,7 1,8 4,5 3,0 3,8 0,7 23 3,2 2,7 28 0,5 0,5 2,3 2,0 2,0 2,2 2,9

9 20 1,8 1,9 28 2,3 2,7 0,5 2,3 0,5 0,5 1,0 1,5 1,8 2,3 0,5 1,0

10 21 1,0 25 2,5 21 1,4 27 30 17 0,5 3,2 3,4 17 1,1

M 4,4 4,1 2,2 6,2 4,9 4 4,1 5,6 3,4 5,4 6,9 6,1 3,5 2,2 2,4 2,3 3,4 2,2

(B) quercetina-3-O-β-D-glucopiranisil-(1-6)-O-α-L-rhamnopiranosideo

T1 T2 T3 T4 Controle Controle + Acetona

n r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3

1 0,9 0,8 0,5 5,5 1,5 2,8 3,1 1,9 2,4 2,1 9,8 2,1 2,5 3,1 1,9 2,3 2,1 2,5

2 0,7 0,7 0,8 2,6 1,8 2,8 1,5 4,0 2,5 5,2 8,2 4,9 2,0 2,4 3,3 2,4 2,4 2,2

3 0,5 0,8 0,4 2,3 1,9 2,0 3,2 2,1 3,9 5,4 3,0 2,1 2,9 2,3 2,5 1,7 1,9 3,5

4 0,8 0,8 0,5 4,1 1,9 2,4 2,2 2,1 3,5 4,8 4,1 3,5 2,1 2,4 2,0 2,3 2,0 2,0

5 0,7 0,9 0,5 2,5 1,7 7,2 3,2 2,0 3,0 5,1 3,0 3,0 2,1 2,4 2,9 2,2 1,9 1,8

6 0,7 0,5 0,5 3,3 2,5 2,7 3,0 2,5 2,5 4,3 3,0 2,2 2,0 2,5 2,2 2,2 1,7 2,3

7 0,5 0,6 0,6 2,4 2,4 3,0 1,8 3,4 2,7 5,7 2,0 2,0 2,2 2,7 2,3 2,4 2,2 2,5

8 0,6 0,5 0,4 2,8 2,0 3,7 2,1 1,8 3,6 3,6 2,6 3,0 0,5 2,3 2,0 2,0 2,2 2,9

9 1,3 0,8 2,7 1,0 2,1 2,2 2,8 5,4 2,2 3,1 1,0 1,5 1,8 2,3 0,5 1,0

10 0,2 0,5 0,5 1,9 1,8 5,7 2,6 2,5 17 0,5 3,2 3,4 17 1,1

M 0,7 0,7 0,6 3,2 1,9 3,1 2,4 2,4 3,0 4,7 4,1 2,8 1,9 2,2 2,4 2,3 3,4 2,2

Tabela 12. continuação

T1 T2 T3 T4 Controle Controle + Acetona

n r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3

1 2,5 2,1 2,4 2,5 2,4 2,9 5,6 3,9 2,4 1,9 7,2 2,9 2,5 3,1 1,9 2,3 2,1 2,5

2 1,5 2,2 3,2 4,5 3,6 2,4 2,3 3,6 2,4 2,8 5,3 2,7 2,0 2,4 3,3 2,4 2,4 2,2

3 2,3 2,0 2,1 3,4 1,8 2,7 2,5 2,3 3,5 3,1 4,1 6,3 2,9 2,3 2,5 1,7 1,9 3,5

4 1,6 2,0 5,1 3,5 5,3 5,0 9,2 2,7 6,8 2,1 4,4 3,4 2,1 2,4 2,0 2,3 2,0 2,0

5 1,7 3,9 6,0 2,9 2,6 5,1 2,4 2,7 3,8 2,7 6,3 11 2,1 2,4 2,9 2,2 1,9 1,8

6 2,3 2,9 4,3 2,9 2,5 2,5 4,5 2,8 7,0 2,9 5,5 2,2 2,0 2,5 2,2 2,2 1,7 2,3

7 1,7 2,6 2,3 2,6 3,9 2,8 2,4 2,7 2,6 2,4 7,8 4,8 2,2 2,7 2,3 2,4 2,2 2,5

8 1,8 2,7 2,7 4,3 3,2 2,4 2,6 2,7 4,0 2,3 6,2 3,2 0,5 2,3 2,0 2,0 2,2 2,9

9 2,2 2,5 3,7 3,4 2,4 2,1 2,4 1,5 6,7 6,4 1,0 1,5 1,8 2,3 0,5 1,0

10 1,9 4,3 2,0 2,2 0,1 4,8 17 0,5 3,2 3,4 17 1,1

M 2 2,5 3,6 3,3 3,1 3,1 3,7 2,8 4,1 2,2 5,9 4,7 3,5 2,2 2,4 2,3 3,4 2,2

(D) quercetina-3-O- β-D-glucopiranosideo

T1 T2 T3 T4 Controle Controle + Acetona

n r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3

1 3,2 3,8 6,5 1,0 1,2 1,0 2,5 1,1 2,8 3,5 3,5 2,7 2,5 3,1 1,9 2,3 2,1 2,5

2 3,5 7,2 8,5 0,9 1,2 1,3 2,5 1,3 2,7 5,8 5,7 5,2 2,0 2,4 3,3 2,4 2,4 2,2

3 3,5 8,0 4,5 0,9 1,1 1,0 2,8 4,8 3,4 2,4 2,4 2,4 2,9 2,3 2,5 1,7 1,9 3,5

4 4,0 2,4 3,0 1,1 1,0 1,3 2,4 1,8 2,2 2,3 2,5 3,2 2,1 2,4 2,0 2,3 2,0 2,0

5 3,4 6,1 5,6 0,9 1,0 0,9 2,1 2,6 4,6 2,5 4,5 5,4 2,1 2,4 2,9 2,2 1,9 1,8

6 4,3 4,7 3,5 1,0 1,0 1,1 7,1 1,5 5,0 2,1 3,5 2,5 2,0 2,5 2,2 2,2 1,7 2,3

7 6,7 3,1 7,4 0,9 1,1 1,4 2,6 1,0 3,0 2,8 2,5 3,0 2,2 2,7 2,3 2,4 2,2 2,5

8 3,1 7,2 1,1 0,9 0,5 6,0 1,6 5,0 2,3 6,8 4,5 0,5 2,3 2,0 2,0 2,2 2,9

9 4,4 6,3 0,7 0,7 1,2 4,0 7,1 2,8 3,6 3,1 1,0 1,5 1,8 2,3 0,5 1,0

10 6,9 0,7 1,0 4,6 8,1 5,5 4,5 17 0,5 3,2 3,4 17 1,1

M 4,1 4,8 5,9 0,9 1,0 1,1 3,6 2,0 4,0 3,5 4,1 3,7 3,5 2,2 2,4 2,3 3,4 2,2

Tabela 12. continuação

(E) genkanina-3´-hidroxi

T1 T2 T3 T4 Controle Controle + Acetona

n r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3

1 1,0 0,9 1,5 5,0 3,2 2,8 4,5 6,2 8,1 4,8 1,9 7,6 2,5 3,1 1,9 2,3 2,1 2,5

2 1,3 1,7 1,1 3,4 4,7 4,8 2,2 2,6 2,8 7,3 3,4 5,4 2,0 2,4 3,3 2,4 2,4 2,2

3 1,0 0,8 1,4 3,8 3,8 1,5 4,5 4,1 9,8 3,6 1,6 3,7 2,9 2,3 2,5 1,7 1,9 3,5

4 1,1 1,2 1,1 2,5 3,8 2,5 3,2 5,6 7,3 4,0 1,8 4,6 2,1 2,4 2,0 2,3 2,0 2,0

5 0,9 1,6 1,6 4,8 3,6 1,8 4,5 4,1 3,2 3,6 4,5 2,1 2,1 2,4 2,9 2,2 1,9 1,8

6 1,2 1,1 2,0 4,2 4,4 3,1 4,8 3,0 4,6 4,2 2,5 4,1 2,0 2,5 2,2 2,2 1,7 2,3

7 0,9 0,7 1,6 4,4 4,2 3,2 1,3 3,9 8,4 6,1 3,2 4,7 2,2 2,7 2,3 2,4 2,2 2,5

8 1,2 1,3 0,6 4,6 1,6 2,5 4,8 7,1 3,7 6,5 2,5 2,0 0,5 2,3 2,0 2,0 2,2 2,9

9 0,5 2,0 1,8 4,9 3,5 4,0 2,9 1,0 1,5 1,8 2,3 0,5 1,0

10 0,8 1,5 4,1 17 0,5 3,2 3,4 17 1,1

M 1,0 1,2 1,4 3,8 3,7 2,9 3,7 4,6 6,0 4,9 2,7 4,3 3,5 2,2 2,4 2,3 3,4 2,2

(F) genkanina

T1 T2 T3 T4 Controle Controle + Acetona

n r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3 r1 r2 r3

1 4,3 2,5 2,5 3,7 3,5 4,6 7,5 4,4 4,2 2,9 2,4 3,7 2,5 3,1 1,9 2,3 2,1 2,5

2 4,5 5,4 2,4 3,5 2,8 8,4 5,2 4,0 3,0 2,1 1,7 7,5 2,0 2,4 3,3 2,4 2,4 2,2

3 2,7 4,0 3,1 4,2 4,6 2,6 4,7 2,3 4,7 7,5 2,1 4,3 2,9 2,3 2,5 1,7 1,9 3,5

4 2,8 3,7 4,2 7,6 4,0 3,4 3,3 4,1 4,9 2,2 2,7 6,1 2,1 2,4 2,0 2,3 2,0 2,0

5 2,8 3,0 2,3 4,2 2,0 5,7 3,9 5,9 2,7 2,8 2,0 6,3 2,1 2,4 2,9 2,2 1,9 1,8

6 4,4 3,1 2,5 6,0 8,2 3,3 4,8 2,4 2,5 2,5 5,3 2,9 2,0 2,5 2,2 2,2 1,7 2,3

7 3,1 3,5 3,7 0,5 5,3 4,8 4,5 3,3 2,4 2,6 2,3 2,0 2,2 2,7 2,3 2,4 2,2 2,5

8 2,7 3,2 2,1 3,5 8,3 3,7 3,6 3,7 2,6 3,1 0,5 2,3 2,2 2,0 2,2 2,9

9 1,7 2,5 2,1 6,3 2,3 4,7 1,0 1,5 1,8 2,3 0,5 1,0

10 4,3 6,1 2,4 17 0,5 3,2 3,4 17 1,1

M 3,2 3,4 2,9 4,2 4,0 5,4 4,8 3,8 3,4 3,3 2,8 4,5 3,5 2,2 2,4 2,3 3,4 2,2

n = número de raízes M = média

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 