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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS E CARDIO-RESPIRATÓRIAS DE
TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) FRENTE À EXPOSIÇÃO SUB-LETAL
AO SULFATO DE COBRE
Lyandra Mara Zanatta Neder
SÃO CARLOS
2005
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS E CARDIO-RESPIRATÓRIAS DE
TILÁPIA DO NILO (Oreochromis niloticus) FRENTE À EXPOSIÇÃO SUB-LETAL
AO SULFATO DE COBRE
LYANDRA MARA ZANATTA NEDER
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Fisiológicas
do Centro de Ciências Biológicas e da
Saúde – Universidade Federal de São
Carlos, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Ciências Fisiológicas, tendo como
orientador o Prof. Dr. Francisco Tadeu
Rantin e co-orientadora Dra. Cheila de
Lima Boijink.
SÃO CARLOS – SP
2005
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
N371ab
Neder, Lyandra Mara Zanatta.
Alterações bioquímicas e cardio-respiratórias de Tilápia
do Nilo (Oreochromis niloticus) frente à exposição sub-letal
ao sulfato de cobre / Lyandra Mara Zanatta Neder. -- São
Carlos : UFSCar, 2006.
66 p.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2005.
1. Fisiologia comparada. 2. Sulfato de cobre. 3.
Oreochromis niloticus. 4. Respirometria. I. Título.
CDD: 591.1 (20
a
)
Dedico esse trabalho à minha mãe.
Por tudo o que ela é pra mim.
“Nem olhos viram, nem ouvidos ouviram,
nem jamais penetrou em coração humano o que
Deus tem preparado para aqueles que O amam."
(I Coríntios 2:9)
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus! Creio que tudo o que tenho passado, não só nos
últimos tempos, mas desde que decidi segui-Lo, são presentes dos quais eu nem sou digna,
mas como diz a Sua própria palavra, essa é a graça de Deus: embora não sejamos
merecedores de coisa alguma, Ele nos dá porque se alegra em nos abençoar! E eu tenho
provado isso a cada dia! Obrigada, Senhor, por sua fidelidade e amor sobre a minha vida!
Um muito obrigada extremamente especial ao professor Tadeu por ter me dado essa
chance e por ter acreditado em mim! Por ter confiado ao ponto de me aceitar como
orientada sem mesmo me conhecer... Obrigada pela oportunidade, Tadeu.
A próxima pessoa é a minha mãe! Tenho infinitamente a agradecer a essa super-
mãe, que desde os meus três aninhos, é pai e mãe! E faz isso tão bem! Eu sempre digo às
pessoas que se algum dia eu conseguir ser pelo menos metade do que ela é já me darei por
satisfeita! Eu acredito também que foi ela quem me ensinou sobre a essência da vida,
porquê para saber abraçar, é preciso antes, saber amar! Eu te amo muito, mãe! Obrigada
por sempre me apoiar tanto em tudo!
Dando prosseguimento a minha família, agradeço aos meus irmãos, Cláudia e
Marcos, simplesmente por existirem! Ainda que distantes, o amor que nos une é tão
imenso! Sei bem que em todas as dificuldades sofremos juntos! Assim como também em
todas as bênçãos, nos alegramos e glorificamos a Deus, juntos! Obrigada a vocês também
pela extensão da família e alegria que me dão meus sobrinhos: Beto, Duda e Ana Júlia! E
também meus cunhados Edson, por todo apoio e preocupação e à Cássia, pelas orações...
Sintam-se abraçados agora!
Agradeço às minhas avós, tios e primos, que sempre torceram tanto por mim!
À minha família CEM também só tenho a agradecer! A Comunidade Evangélica
Missionária tem sido também minha grande família! Especialmente aos pastores Alexandre
e Maria Alice, que acabaram me adotando aqui! Por onde eu for jamais esquecerei vocês!
Vocês são mesmo a minha família de São Carlos! Seria impossível citar nesse texto a razão
de tanto amor, pois aprendi a amá-los de forma indescritível! Estarei sempre pronta para
um forte abraço!
Às grandes amizades que se destacaram em meio à multidão: Gi, Sandrinha, Cheila,
Carol Zak, Clene, Fer Sampaio, Fabinho, Rô Botelho, Rô Bela, Sany! Obrigada, gente! Um
abração “daqueles”!
Às pessoas da célula de estudo bíblico em família, por sempre orarem por mim e
por participarem de cada fase que passo! Eu nem imagino como poderia ser, caso vocês
não existissem na minha vida! Sentirei falta dos abraços!
À equipe de trabalho de aconselhamento voluntário da escola Juliano Neto:
Wagney, Sarinha, Lucas, Nayra, Bruno e Tamara - foi muito gratificante ver todos os
frutos e desenvolver esse trabalho com vocês, aprendendo a lidar com as pessoas e os seus
problemas, nos lembrando sempre de que não importa o quão grande eles pareçam, Deus é
sempre maior!
Ao grupo da Aliança Bíblica Universitária (ABU) por toda amizade, apoio, força e
compreensão e... abraços! Ah! E também pelo carinhoso apelido de “Felícia”! Eu amo
vocês!
Ao grupo de início da ABP (Aliança Bíblica de Profissionais): Anderson, Cynthia,
Igor, Raquel e Rafa: obrigada pelos momentos e palavras de tanta sabedoria! Obrigada por
me auxiliarem “na travessia da ponte”! E também pelos abraços!
Aos meus grandes amigos ausentes, mas, sempre presentes: Lígia, Pepinho e
Humberto, por serem tão essenciais pra mim! Um forte abraço pra vocês!
Ao pessoal do lab: André, Cheila, Cláudia, Cláudio, Cléo, Cleoni, Débora, Diana,
Eli, Fabinho, Fer, Guilherme, Jackie, Jane, Jeane, José Roberto, Kátia, Lailinha, Lenise,
Marina, Marise, Mônica, Tiago, Thiago, Wagner e também às professoras Ana e Marisa...
Obrigada pelo tanto que pude aprender com vocês todos! Desejo que a “terapia do abraço”
seja imortalizada entre vocês! Um grande e especial abraço a Cheila, a Fer, a Eli e a
Lailinha por terem me auxiliado durante os experimentos!
Aos funcionários envolvidos na manutenção do departamento, especialmente à
Selminha e à Carmem. Merecem um abraço!
Aos professores convidados para compor a banca examinadora, Cleoni e Luiz
Henrique, obrigada pelas sábias sugestões e correções dadas ao trabalho!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS....................................................................................................... iii
RESUMO............................................................................................................................ iv
ABSTRACT......................................................................................................................... v
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1
1.1 - A contaminação do ambiente aquático................................................................. 1
1.2 - Os efeitos tóxicos no organismo............................................................................. 2
1.3 - OBJETIVOS ........................................................................................................... 5
2.0 - MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 2
2.1 - Os animais............................................................................................................... 2
2.1.1 - Breves considerações sobre a espécie ....................................................... 2
2.1.2 – Posição Sistemática da espécie ................................................................. 8
2.1.3 - Coleta e Manutenção em Laboratório ..................................................... 8
2.2 - Delineamento experimental................................................................................... 9
2.2.1 - Primeira etapa: Determinação daCL
50
.................................................... 9
2.2.2 - Segunda etapa: Análises realizadas........................................................ 12
2.2.2.a - Determinações Hematimétricas ............................................... 12
2.2.2.b - Concentração de íons................................................................ 14
2.2.2.c - Proteína total.............................................................................. 14
2.2.2.d - Intermediários Metabólicos ..................................................... 15
2.2.2.e – Enzima: Na
+
/ K
+
- ATPase branquial ..................................... 17
2.2.2.f - Metalotioneína (MT) branquial................................................ 18
2.2.2.g - Acúmulo de cobre nas brânquias............................................. 19
2.2.3 - Terceira etapa: Avaliação dos parâmetros cardio-respiratórios......... 19
2.2.3.a - Parâmetros cardio-respiratórios.............................................. 20
3.0 - Análise Estatística ..................................................................................................... 23
4.0 - RESULTADOS.......................................................................................................... 25
4.1 - Hematologia, íons e amônia plasmática......................................................... 25
4.2 - Intermediários Metabólicos ............................................................................ 27
4.3 - Na
+
/ K
+
- ATPase branquial............................................................................ 29
4.4 - Metalotioneína.................................................................................................. 31
4.5 - Acúmulo de cobre nas brânquias ................................................................... 33
4.6 - Respirometria................................................................................................... 35
4.6.1 - Freqüência Respiratória (ƒ
R
) ............................................................. 35
4.6.2 - Extração de Oxigênio.......................................................................... 37
4.6.3 - Consumo de Oxigênio ......................................................................... 39
4.6.4 - Ventilação Branquial .......................................................................... 41
4.6.5 - Volume ventilatório (V
T
) .................................................................... 43
4.6.7 - Freqüência Cardíaca (ƒ
H
)................................................................... 45
5.0 - DISCUSSÃO.............................................................................................................. 47
6.0 - CONCLUSÕES ......................................................................................................... 57
7.0 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 58
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Exemplar de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus. ........................................... 7
Figura 2 – percentagem de mortalidade de Oreochromis niloticus frente a diferentes
concentrações de CuSO
4
(mg.L
-1
), na determinação da CL
50
– 48 h.................. 11
Figura 3. Valores médios ± S.E.M. da atividade da Na
+
/K
+
- ATPase branquial de de
tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus. Grupo controle (T1) e sob exposição ao
CuSO
4
(T2), por 48 h (T1, representado por coluna branca e T2, representado
por coluna preta). * representam diferenças significativas entre os grupos. Teste t
(P< 0,05). ............................................................................................................ 30
Figura 4. Valores médios ± S.E.M. da metalotioneína branquial de tilápia do Nilo,
Oreochromis niloticus. Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), por
48 h. (T1, representado por coluna branca e T2, representado por coluna preta). *
representam diferenças significativas entre os grupos teste t (P< 0,05). ............ 32
Figura 5. Valores médios ± S.E.M. do acúmulo de cobre em tecido branquial de tilápia do
Nilo, Oreochromis niloticus. Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), por 48 h. (T1, representado por coluna branca e T2, representado por
coluna preta). * representam diferenças significativas entre os grupos teste t (P<
0,05). ................................................................................................................... 34
Figura 6. Valores médios ± S.E.M. da ƒ
R
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus. Grupo
controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos, durante 48
h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por colunas pretas).
* representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os demais tempos
em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05). ...................................................... 36
Figura 7. Valores médios ± S.E.M. da EO
2
de tilápia, Oreochromis niloticus, grupo
controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos, durante 48
h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por colunas pretas).
* representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os demais tempos
em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05). ...................................................... 38
Figura 8. Valores médios ± S.E.M. da
&
VO
2
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus.
Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os
demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05). ............................. 40
Figura 9. Valores médios ± S.E.M. da
&
V
G
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus.
Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os
demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05). ............................. 42
Figura 10. Valores médios ± S.E.M. do V
T
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus,
grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
ii
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por colunas
pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os demais
tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05)........................................... 44
Figura 11. Valores médios ± S.E.M. da ƒ
H
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus,
grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os
demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05). ............................. 46
iv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Valores médios ± S.E.M. dos parâmetros hematológicos, iônicos e
concentração de amônia do plasma de tilápia do Nilo, Oreochromis
niloticus. T1 = grupo controle; T2 grupo tratado com CuSO
4
por 48 h......26
TABELA 2. Valores médios ± S.E.M. de lactato, piruvato, glicogênio e glicose em fígado,
em músculos branco e vermelho e em plasma tilápia do Nilo, Oreochromis
niloticus. T1 = grupo controle; T2 = grupo tratado com CuSO
4
por 48 h....28
v
RESUMO
O presente trabalho avaliou os efeitos da toxicidade do sulfato de cobre (CuSO
4
) sobre as
respostas bioquímicas e cardio-respiratórias da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).
Para isso, um grupo de animais foi exposto a 50% da CL
50
(48 h) de CuSO
4
, e o grupo
controle foi submetido às mesmas condições de qualidade da água sem CuSO
4
. Foram
realizadas coletas de sangue, brânquias, fígado e músculos branco e vermelho no final do
período experimental para as seguintes determinações: hematócrito (Hct), hemoglobina
(Hb), contagem de eritrócitos (RBC), volume corpuscular médio (VCM), concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM), Na
+
/K
+
-ATPase, grupamentos- SH, glicose,
lactato, piruvato, glicogênio, concentrações iônicas (Na
+
, K
+
e Cl
-
) e amônia plasmática.
Para determinação dos parâmetros cardio-respiratórios, no decorrer de 48 h, foram feitas as
seguintes medidas: tomada de O
2
(taxa metabólica –
&
VO
2
), extração de O
2
da corrente
ventilatória (EO
2
), freqüência respiratória (ƒ
R
), ventilação branquial (
&
V
G
), volume
ventilatório (V
T
) e freqüência cardíaca (ƒ
H
). Observou-se que no tratamento com CuSO
4
,
houve aumento significativo de Hct, Hb, RBC e VCM com relação ao grupo controle.
Houve aumento de lactato no fígado e músculo vermelho, de glicose no fígado e
diminuição nos músculos, e redução de glicogênio em todos os tecidos analisados. Com
relação à respirometria, durante as 48 h de monitoramento, o grupo tratado com CuSO
4
apresentou redução da EO
2
após 3 h de exposição, redução da
&
VO
2
após 6 h, aumento da
&
V
G
e ƒ
R
após 1 h e sem alteração significativa no V
T
em relação ao grupo controle. A ƒ
H
apresentou bradicardia após 12 h.
v
ABSTRACT
The present study evaluated the biochemical, hematological and cardio-respiratory
responses of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) to copper sulfate (CuSO
4
). A group of
fish (T2; n = 8) was exposed to 50% of a CL
50
(48 h) of CuSO
4
, while the control group
(T1; n = 8) was submitted to the same conditions of water quality without CuSO
4
. Samples
of blood, gills, liver, white and red muscles were collected at the end of the experimental
period for the following determination: Hematocrit (Hct), hemoglobin (Hb), red blood cells
(RBC), mean corpuscular volume (VCM), mean corpuscular hemoglobin (HCM), mean
corpuscular hemoglobin concentration (CHCM), Na
+
/K
+
-ATPase, metalothionein (MT),
glucose, lactate, pyruvate, glycogen, ionic concentrations (Na
+
, K
+
e Cl
-
) and plasmatic
ammonia. The cardio-respiratory parameters (oxygen uptake -
&
VO
2
, O
2
extraction from
the ventilatory current - EO
2
, respiratory frequency - f
R
, gill ventilation -
&
V
G
, ventilatory
tidal volume - V
T
, and heart rate - f
H
). were also measured in both experimental groups
during 48 h: When compared to the control group, fish treated with CuSO
4
showed a
significant increase in Hct, Hb, RBC and VCM. Lactate concentration increased in liver
and red muscle. Glucose increased also in liver, but decreased in the muscles, and a
reduction on glycogen was observed in all the tissues analyzed. Fish exposed to CuSO
4
presented a reduction in EO
2
after 3 h and in
&
VO
2
after 6 h. An increase in
&
V
G
was
detected after 1 h of exposure to CuSO
4
. This hiperventilation was mainly due to increases
in the f
R
, since the V
T
remained constant during all the experimental time. Fish treated with
CuSO
4
also displayed a significant bradycardia after 12 hours of exposure.
1. INTRODUÇÃO
1.1 - A contaminação do ambiente aquático
Nas últimas décadas, uma das atividades que mais cresceram no país foi o cultivo
intensivo e semi-intensivo de peixes, consolidando-se como um setor de grande importância
econômica (NEWMAN, 1993). Dentre as espécies comumente cultivadas, a tilápia do Nilo,
(Oreochromis niloticus), é considerada uma das mais importantes para consumo humano em
muitos países e seu cultivo tem crescido exponencialmente em aqüiculturas, inclusive no
Brasil (ÇOĞUN & KARGIN, 2003).
Como todo setor de crescimento lucrativo, observam-se características desenfreadas
de recursos mal-utilizados, sem serem avaliadas as conseqüências que estas podem trazer para
o meio, afetando diretamente os animais aquáticos e indiretamente seus consumidores.
Portanto, paralelamente a esse desenvolvimento, houve um aumento de doenças nos peixes
cultivados. Assim, importantes intervenções têm sido realizadas com produtos tóxicos a fim
de atenuar um aumento na incidência e severidade de ictiopatologias (PAVANELLI et al.,
1998). Na tentativa de solucionar estes problemas, produtos químicos, como o sulfato de
cobre (CuSO
4
), têm sido não raramente, erroneamente utilizados (KUBITZA, 1998).
Em pisciculturas o CuSO
4
é aplicado por ser um importante algicida, agindo na
redução da floração de algas, cujo consumo excessivo de O
2
pode levar a um déficit desse gás
para os demais organismos aquáticos. É também utilizado com finalidade terapêutica,
diminuindo a incidência de endoparasitas em espécies cultivadas (SHELENK et al. 1999).
A aplicação usual de CuSO
4
na piscicultura varia de 0,025 a 2,00 mg. L
-1
; contudo, a
administração desses produtos nem sempre é efetuada de forma controlada, sendo que seu uso
Introdução_______________________________________________________________2
indiscriminado, mesmo de forma profilática, pode trazer conseqüências gravíssimas ao meio
ambiente (BOYD, 1990).
Além disso, nos últimos anos, a poluição por agrotóxicos e metais pesados aumentou,
como conseqüência do grande volume desses, lançados no ambiente aquático. No Brasil, a
agroindústria é uma atividade em franco desenvolvimento e é responsável por boa parte da
balança comercial do país. Para garantir a eficiência dessa atividade, os empresários da
agroindústria e mesmo pequenos produtores rurais, muitas vezes utilizam produtos químicos
com o intuito de garantir e maximizar suas produções (KUBITZA, 1998).
Sendo assim, além do uso de produtos químicos diretamente nas pisciculturas, podem
ser encontrados também na natureza, como conseqüência de outras vias de aplicação
(HEATH, 1995).
Os metais de transição (cobre, zinco, ferro, cobalto, selênio, manganês) têm grande
significado biológico e são importantes ao bom funcionamento dos organismos, onde
desempenham valiosas funções. Esses metais interagem com muitos tipos celulares e, assim,
desempenham importante papel na respiração celular, no transporte de oxigênio, na
estabilidade protéica, entre outros. Entretanto, em excesso, tornam-se tóxicos, pois se ligam
inapropriadamente a moléculas ou formam radicais livres. Altas concentrações de cobre
também afetam a função branquial através da perturbação da homeostase do sódio (LARÉN
& McDONALD, 1985).
1.2 - Os efeitos tóxicos no organismo
Quando o cobre é utilizado indevidamente, pode apresentar efeitos tóxicos nas
espécies aquáticas (BEAUMONT et al., 2000; NOVELLI FILHO et al., 2000; STRAUS,
2003). As substâncias tóxicas tendem a inibir ou acelerar o metabolismo (DANG, 2000),
Introdução_______________________________________________________________3
sendo que esses efeitos iniciam-se primeiramente nas células e podem alterar a
permeabilidade de membranas (NRIAGU & PACINA, 1988), afetando a integridade celular,
tanto estrutural quanto fisiologicamente, resultando em lesões histológicas e levando ao
comprometimento da função de um ou mais órgãos (HEATH, 1995).
Na maioria dos casos, os metais são transportados pelo sangue (SIMKISS &
TAYLOR, 1981). Desta forma, podem ter efeitos nocivos nos mais variados órgãos. Os
parâmetros hematológicos expressam processos corporais e servem como indicadores da
condição geral ou dos distúrbios metabólicos (JYOTHI & NARAYAN, 1999). Distúrbios
metabólicos em resposta ao estresse (JYOTHI & NARAYAN, 1999) podem promover
alterações na concentração de amônia plasmática, mecanismo este que assegura o
abastecimento e redistribuição de energia para manutenção da homeostase (WENDELAAR
BONGA, 1997; VAN WEERD & KOMEN, 1998).
Durante a desintoxicação do organismo após exposição a metais, o fígado é o principal
responsável pela retirada do excesso de tóxicos, sendo estes acumulados e concentrados na
bile (SØRENSEN, 1991). Este excesso de metais para espécies aquáticas resulta em
toxicidade, perda de íons, redução no crescimento e na sobrevivência dos organismos
expostos (HOLGSTRAND & WOOD, 1996; TAYLOR et al., 1996; SCHERER et al., 1997;
MAZON & FERNANDES, 2001).
O cobre também pode circular no organismo e se ligar à albumina e outras proteínas
de pequeno peso molecular (HARRIS & BIRD, 2000). O principal local de excreção do
excesso de cobre em peixes teleósteos é a bile (GROSELL et al., 2002). As brânquias de
peixes também estão implicadas na excreção de cobre (ÇOĞUN & KARGIN, 2004).
Conforme o período de exposição e as concentrações de cobre impostas, podem
ocorrer alterações nos intermediários metabólicos, o que permite verificar os ajustes no
metabolismo energético (HEATH, 1995). A estimulação do metabolismo pode ser claramente
Introdução_______________________________________________________________4
refletida nas mudanças no consumo de O
2
durante exposição ao cobre (McGEER et al., 2000)
ou pelo aumento de excretas metabólicas como, por exemplo, a amônia (TAYLOR et al.,
1996). No âmbito bioquímico, estas excretas podem refletir as mudanças nas enzimas
envolvidas no metabolismo e aquelas funções críticas para a sobrevivência da célula, como a
regulação iônica e atividade da Na
+
/K
+
-ATPase (McGEER et al., 2000).
Como as brânquias dos peixes recebem um fluxo constante de água, são o primeiro
contato com o meio aquático contaminado e podem acumular altas concentrações desses
metais (ÇOĞUN & KARGIN, 2003). Além disso, desempenham um papel fundamental na
respiração e no balanço hidro-eletrolítico (PINHEIRO, 2004). O cobre liga-se aos sítios ativos
da Na
+
/K
+
-ATPase, resultando em uma diminuição na sua atividade, desestabilizando o
equilíbrio iônico e/ou osmótico do animal (GROSELL et al., 2002).
Para minimizar a extensão dos distúrbios causados pelos metais, o primeiro sistema de
defesa da célula é o aumento da proteína metalotioneína (MT) que é um marcador bioquímico
em potencial na contaminação de metais (OLSVIK et al., 2000; BRAGIGAND & BERTHET,
2003). Alem disso, a MT apresenta diversas funções, como controle homeostático dos metais
de transição e a desintoxicação de metais pesados (CARVALHO, 2003).
Além de avaliar as conseqüências relativas ao mecanismo interno do organismo do
animal mediante aos metais ou aos produtos utilizados na piscicultura, é extremamente
necessário analisar o comportamento fisiológico referente a tais alterações. A medida do
consumo de O
2
torna-se, portanto, um instrumento eficiente para avaliar como os animais
respondem às alterações tóxicas do meio a fim de manterem a homeostase interna. DALZELL
et al. (2002) mostraram que a respirometria é um método eficaz para a avaliação da toxicidade
de metais. A
2
OV
&
tem sido utilizada como uma medida quantitativa para avaliar a atividade
geral dos peixes (JAGER & DEKKERS, 1975). Respostas distintas normalmente são
encontradas para uma mesma espécie, devido a diferentes condições experimentais, como
Introdução_______________________________________________________________5
temperatura da água, metodologia, tamanho e estado fisiológico do animal (TORT et al.,
1986; RUS, 2000).
Altas concentrações de metais causam um aumento da camada de muco nas brânquias,
dificultando a difusão do O
2
da água para o sangue (PLAYLE, 1998). Como conseqüência,
um dos maiores efeitos tóxicos desses contaminantes é a diminuição da capacidade das
brânquias em realizar com eficiência suas funções de trocas de gases respiratórios e íons
(BEAMOUNT et al., 2002; MAZON et al., 2004).
1.3 - OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivos:
a) Avaliar as possíveis alterações hematológicas (hematócrito - Hct, hemoglobina -
Hb, contagem de eritrócitos - RBC, volume corpuscular médio - VCM, hemoglobina
corpuscular média- HCM, concentração de hemoglobina corpuscular média - CHCM).
b) avaliar a atividade da enzima Na
+
/K
+
-ATPase, da metalotioneína - MT -
(grupamentos- SH), nas concentrações dos intermediários metabólicos (glicose, lactato,
piruvato, glicogênio), concentrações iônicas (Na
+
, K
+
e Cl
-
) e da amônia plasmática frente à
exposição a concentrações sub-letais de CuSO
4
.
b) Avaliar as respostas e adaptações dos parâmetros cardio-respiratórios (tomada de
O
2
ou taxa metabólica –
&
VO
2
, extração de O
2
da corrente ventilatória - EO
2
, freqüência
respiratória - ƒ
R
, ventilação branquial -
&
V
G
, volume ventilatório - V
T
e freqüência cardíaca
- ƒ
H
) da tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus, frente à exposição a concentrações sub-
letais de CuSO
4
.
2.0 - MATERIAL E MÉTODOS
2.1 - Os animais
2.1.1 - Breves considerações sobre a espécie
A tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus é uma espécie nativa da África onde
encontra-se amplamente distribuída. Todavia, por ser um animal bastante rústico, resistente
às doenças e ao manejo e devido à suas características agradáveis ao paladar e ao consumo
humano, já destaca-se como um dos principais peixes cultivados em pisciculturas em
regiões tropicais e sub-tropicais. Primeiramente, foi introduzida na América do Sul, parte
da Índia e Ceilão. No Brasil foram introduzidas em 1971, na região Nordeste pelo
Departamento de Obras Contra a Seca – DNOCS/Fortaleza, CE, provenientes da Costa do
Marfim (DELAVECHIA, 1994). A partir daí, a espécie foi adotada em cultivos intensivos
e semi-intensivos de várias regiões do Brasil, além de ter sido introduzida em vários corpos
d’água naturais onde podem ser facilmente coletadas. A espécie se reproduz rapidamente e
seu cultivo tem crescido exponencialmente em muitos países (ÇOĞUN & KARGIN,
2003).
Material e Métodos_______________________________________________________7
Figura 1. Exemplar de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus. Fonte:
http://www.fishbase.org/Photos/ThumbnailsSummary.cfm?ID=2
Material e Métodos_______________________________________________________8
2.1.2 – Posição Sistemática da espécie
Segundo TREWAVAS (1983) a tilápia do Nilo ocupa a seguinte posição
sistemática:
Classe: OSTECHTHYES
Subclasse: ACTINOPTERYGII
Superordem: TELEOSTEI
Ordem: PERICIFORMES
Família: CICHLIDAE
Gênero: Oreochromis
Espécie: niloticus
2.1.3 - Coleta e Manutenção em Laboratório
Exemplares de Oreochromis niloticus foram obtidos na Piscicultura Visconde, nas
proximidades do município de São Carlos, SP, e transportados para o Laboratório de
Zoofisiologia e Bioquímica Comparativa do DCF/UFSCar em sacos plásticos contendo
água aerada com ar comprimido. No laboratório os animais foram aclimatados por 30 dias
em tanques de 1000 L dotados de fluxo constante de água não clorada, aeração constante
(PwO
2
> 130 mmHg), fotoperíodo natural, a uma temperatura de 25 ± 1°C; pH ~ 7,30;
alcalinidade CaCO
3
~ 10 mg. L
-1
; dureza CaCO
3
~ 35 mg. L
-1
; Na
+
~ 1,6 mEq. L
-1
; K
+
~
3,8 mEq. L
-1
; amônia ~ 0,021 mg. L
-1
.
Material e Métodos_______________________________________________________9
2.2 - Delineamento experimental
A experimentação foi subdividida em três etapas: a. determinação da CL
50
-48 h; b.
análises bioquímicas e; c. análise dos parâmetros fisiológicos. Estas etapas são descritas a
seguir:
2.2.1 - Primeira etapa: Determinação daCL
50
A primeira etapa constou da determinação da concentração letal para 50% dos
organismos em estudo (CL
50
-48 h) na densidade de 5 g de peixe L
-1
.
Exemplares de O. niloticus com peso médio de 116,80 ± 3,02 g, e comprimento
total de 16,73 ± 1,87 cm, foram submetidos a diferentes doses de cobre, na forma de
sulfato de cobre (CuSO
4
). Para isso, os animais foram transferidos para aquários de vidro
com volume de água de 180 L (sistemas estáticos), com aeração constante mantendo-se nas
condições ideais os parâmetros físico-químicos da água, onde permaneceram por 24 h.
Após esse período de recuperação do manuseio, era iniciada a contaminação por 48 h.
Foram distribuídos 8 exemplares de O. niloticus em cada aquário, com a finalidade de
simular a densidade de estocagem utilizada em sistemas de cultivo intensivo, que varia de
50 a 600 Kg de peixe .m
-3
(FURTADO, 1995; SCHMITTOU, 1995). Os animais não
foram alimentados nas 24 horas prévias a transferência ou durante o período de exposição.
As definições das concentrações em cada teste, foram determinadas à partir de
análises de outros trabalhos realizados com a mesma espécie, ou em condições
semelhantes. Para cada concentração imposta, haviam dois aquários (réplica).
Material e Métodos_______________________________________________________10
Os animais foram expostos a dosagens de 6, 8, 10, 12, 12,5, 13, 13,5, 14 e 16 mg
.L
-1
de CuSO
4
, durante 48 h, onde foi observada a mortalidade em cada concentração
dentro desse período. Para cada teste realizado, havia um grupo controle nas mesmas
condições e sem a contaminação; nesses grupos não houve mortalidade. Durante este
processo foram observadas alterações de comportamento, tais como letargia, perda de
equilíbrio e aumento na produção de muco na brânquias e na superfície do corpo dos
animais.Após as exposições às diferentes concentrações de CuSO
4
, os dados foram
processados pelo programa JSpear para o cálculo da CL
50
. O valor determinado para
CL
50
-48 h foi de 13,05 mg de Cu.L
-1
, com intervalo de confiança entre 12,71 a 13,42. Esse
valor equivale a 47, 14 mg de CuSO
4
.L
-1
.
Material e Métodos_______________________________________________________11
02468101214161820
0
20
40
60
80
100
CL
50
- 48 h = 13,05 mg Cu
2+
. L
-1
Mortalidade (%)
Concentração de cobre (mg . L
-1
)
Figura 2 – Percentagem de mortalidade de Oreochromis niloticus frente a diferentes
concentrações de CuSO
4
(mg.L
-1
), na determinação da CL
50
– 48 h.
Material e Métodos_______________________________________________________12
2.2.2 - Segunda etapa: Análises realizadas
Para realização da segunda etapa, foi calculada uma concentração sub-letal, a partir
da determinação da concentração letal, ficando assim estabelecido o valor de 50% da
mesma. Portanto, os animais foram expostos uma concentração de 23,57 mg.L
-1
de CuSO
4
,
na densidade de animais de 5g.L
-1
.
Para a realização desses experimentos, os peixes foram transferidos para aquários
de vidro, de volume 180 L. Após 24 h da recuperação do manuseio, uma solução estoque
de CuSO
4
foi preparada e o volume adequado acrescentado cuidadosamente nos aquários
experimentais (T2), os quais mantinham as mesmas características dos do grupo controle
(T1), no qual não houve mortalidade.
Após 48 h de exposição, todos os animais foram sacrificados e os órgãos
(brânquias, fígado e músculos branco e vermelho) foram dissecados, retirados, lavados
com solução salina (0,09%) e congelados (-80°C) para posterior análise.
2.2.2.a - Determinações Hematimétricas
As amostras de sangue foram coletadas por punção caudal, com seringas de 5 mL
previamente heparinizadas. Foram realizadas as seguintes medições:
Hematócrito
A determinação do hematócrito (Hct = %) foi realizada em réplicas, pela técnica de
centrifugação em capilares de vidro (GOLDENFARB et al., 1971). Os tubos capilares
foram fechados em uma das extremidades com massa apropriada e centrifugados a 10.000
Material e Métodos_______________________________________________________13
rpm, por 5 min. Os valores foram calculados a partir de um cartão de leitura padronizado e
os valores foram expressos em %.
Taxa de hemoglobina
A concentração de hemoglobina (Hb = g.mL
-1
) foi determinada pela formação de
cianometahemoglobina como descrito por COLLIER (1944), onde 10 µL de sangue foi
adicionado a 2 mL de solução Drabkin (KCN, KH
2
PO
4
, K
3
[Fe( CN)
6
] em água destilada),
homogeinizado em agitador Vórtex e a leitura óptica foi feita em espectrofotômetro
(Spectronic Genesys 5, Milron Roy, U.S.A.) à 540 nm.
Contagem de eritrócitos
A contagem do número de eritrócitos (RBC), foi feita com microscópio óptico, em
câmara de Neubauer após a diluição de 10 µL de sangue em 2 mL de solução de citrato
formol 4%, misturando-se sem hemolisar. A contagem foi feita em microscópio óptico,
utilizando câmara de contagem e lamínula especial (Câmara de Neubauer).
Índices Hematimétricos
Os índices hematimétricos foram calculados a partir dos valores determinados para
Hct, [Hb] e RBC, aplicando-se as seguintes fórmulas:
VCM (Volume Corpuscular Médio) = Hct . 10/ RBC
Material e Métodos_______________________________________________________14
HCM (Hemoglobina Corpuscular Média) = Hb . 10/ RBC
CHCM (Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média) = Hb . 10/ Hct
2.2.2.b - Concentração de íons
Sódio e Potássio
As concentrações de Na
+
e K
+
foram medidas por fotometria de chama, após
diluição 1: 100 em água destilada.
Cloreto
A concentração de íon Cl
-
foi medida pelo kit reagente comercial Labtest, cujo
princípio é: o cloreto reage com tiocianato de mercúrio formando cloreto de mercúrico e
tiocianato. O tiocianato quando combinado com os íons férricos forma tiocianato férrico,
de coloração amarela com intensidade proporcional à concentração de cloretos que é
medida em espectrofotômetro (Spectronic Genesys 5, Milron Roy, U.S.A.) à 570 nm.
2.2.2.c - Proteína total
A proteína total foi determinada pelo método de BRADFORD (2000), utilizando-se
como padrão protéico a albumina sérica bovina. As concentrações foram determinadas em
espectrofotômetro a 595 nm em leitura de microplaca (Dynex Technologies, Inc.).
Material e Métodos_______________________________________________________15
2.2.2.d - Intermediários Metabólicos
Preparação dos extratos ácidos
Os tecidos hepático e musculares, foram amostrados sobre superfície gelada, e
pesados em quantidades apropriadas para as determinações das concentrações dos
intermediários metabólicos, mantida a proporção de 100 mg de tecido/ml de ácido
tricloroacético (TCA) a 20 %. Após a homogeneização, os extratos eram centrifugados a
3.000 rpm e os sobrenadantes utilizados como extratos celulares nas determinações de
intermediários metabólicos.
Amônia total
A amônia total foi determinada por nesslerização (GENTZKON & MASEN, 1942),
pela transferência de um volume de extrato plasmático, ao qual se adicionou reativo
Nessler. A leitura óptica foi realizada em 420 nm e a concentração, estimada contra um
padrão contendo 100 nM de cloreto de amônio, expressa em µM.mL
-1
de plasma.
Glicose
A glicose foi determinada pelo método hidrolítico ácido de DUBOIS et al. (1956),
realizada em ácido sulfúrico. O método baseia-se no uso de um volume de extrato (plasma
= 100µL; fígado = 2 µL, músculos = 50 µL) adicionado de 500 µL de fenol 4,1 % e 2,0
mL de H
2
SO
4
concentrado, rapidamente adicionado ao meio de reação. Os tubos de reação
Material e Métodos_______________________________________________________16
foram imediatamente resfriados em banho de água e a leitura óptica realizada por
espectrofotometria em 480 nm. A concentração de glicose foi estimada contra um padrão
de glicose contendo 100 nM.
Glicogênio
O glicogênio foi determinado pelo método de BIDINOTTO et al. (1998) seguido
pela determinação de glicose por DUBOIS et al. (1956). As amostras (50 mg de fígado ou
100 mg de músculos) foram dissolvidas em 1mL de KOH 6 N. Foi utilizada uma alíquota
desse extrato (fígado = 50 µL ou músculos = 250 µL) e acrescentado à solução álcool
etílico e H
2
SO
4
(10%). As amostras foram então centrifugadas a 3000 rpm durante 3 min e
o precipitado dissolvido em água destilada. As amostras foram lidas em espectrofotômetro
a 480 nm e os resultados expressos em µM de unidades glicosil-glicose. g
-1
.
Lactato
O lactato foi determinado segundo o método de HARROWER & BROWN (1972).
Um volume de extrato (plasma = 50 µL; fígado = 20 µL ou músculos = 10 µL) foi
adicionado de 20 µl de CuSO
4
, 5 H
2
O 4 %, 2,5 ml de H
2
SO
4
concentrado e 50 µl de
solução de p-fenilfenol (1,5 g de p-fenilfenol em solução aquosa de NaOH 2 %)
lentamente adicionado. Após 15 min de repouso, os tubos foram fervidos por 90 s e em
seguida imediatamente resfriados em banho de água com gelo. A leitura óptica foi
realizada em 750 nm e a concentração foi estimada contra um padrão de lactato contendo
50 nM de lactato.
Material e Métodos_______________________________________________________17
Piruvato
O piruvato foi determinado segundo o método de LU (1939). Um volume de extrato
(plasma = 400 µL ou músculos = 500 µL) foi adicionado a 250 µL de dinitrofenilhidrazina
0,1% em HCl 2,0 N. Após 30 minutos em banho-maria a 37
o
C foi adicionado à mistura de
reação 3,0 mL de NaOH 1,3 N e a leitura óptica foi realizada em 440 nm. A concentração
foi determinada contra um padrão de piruvato.
2.2.2.e – Enzima: Na
+
/ K
+
- ATPase branquial
Foi realizada previamente a padronização da técnica para espécie. A padronização
consistiu da otimização da atividade da enzima e foi realizada através do ensaio e variação
de cada um dos componentes:
- NaCl (10, 25, 50, 100, 200, 250 e 300 mM)
- MgCl
2
(3, 5, 8, 1, 24, 48 E 60 mM)
- Na
2
ATP (1, 2, 3, 5 e 10 mM)
- KCl (5, 9, 13, 18, 25, 50, 70 e 80 mM)
- ouabaína (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3 mM)
- tempo de incubação (10, 20, 30, 45 e 60 minutos)
- concentração de proteína do substrato (2 a 10 µg . µL
-1
)
Após as brânquias terem sido congeladas em tampão SI (Sacarose 0,3 M;Imidazol
30 mM) (2:1), a -80°C, para a determinação da atividade da Na
+
/ K
+
- ATPase utilizou-se o
Material e Métodos_______________________________________________________18
método de QUARBIUS et al. (1997), modificado para leitora de microplaca por NOLAN
(2000) e padronizada para a espécie em estudo.
O tecido branquial, depois de descongelado, foi homogeneizado em tampão SI, pH
7,4 e centrifugado em centrifuga refrigerada à -4°C. O sobrenadante de cada amostra foi
colocado em seis poços da microplaca (quantidade que tinha 10 µg.µL
-1
de proteína) e
adicionado 100 µL de tampão (NaCl 250 mM; MgCl
2
10 mM; Imidazol 10 mM, pH 7,6)
com 3 mM de Na
2
ATP (Vanadium free). Nos 3 primeiros poços, foi adicionado 100 µL de
tampão contendo KCl (5 mM) e nos 3 restantes, tampão contendo ouabaína (2,5 mM).
Após serem incubados durante 30 min a 25
o
C, no escuro, a reação foi interrompida pela
adição de 200 µL de uma mistura de 1:1 de 8,6% de TCA e o reagente de cor (H
2
SO
4
0,66
mM + molibdato de amônia 9,2 mM + FeSO
4
7 H
2
O 0,33 mM) e a leitura
espectrofotométrica foi feita em 595 nm. A atividade da enzima foi expressa em µM Pi.
mg.h
-1
. O conteúdo de proteína total foi determinado de acordo com o método descrito por
BRADFORD (2000).
2.2.2.f - Metalotioneína (MT) branquial
A MT branquial foi determinada pela concentração de grupamentos sulfidrilas
(SH), segundo a metodologia descrita por VIARENGO et al. (1997), utilizando-se como
padrão a glutationa reduzida (GSH). Cerca de 200 mg de brânquias foram homogeneizadas
em tampão Tris-HCl 20 mM (pH 8,6) contendo sacarose 0,5 M e 0,01% de β-
mercaptoetanol em Ultraturrax a 20.000 rpm. As amostras foram centrifugadas e o
sobrenadante utilizado. A concentração de metalotioneína foi avaliada no sobrenadante
utilizando-se uma fração parcialmente purificada de metaloproteína obtida em várias
etapas de uma solução de etanol/clorofórmio. As amostras foram secas em um speed vac
Material e Métodos_______________________________________________________19
por aproximadamente 4-6 h e ressuspendidas em uma solução de NaCl 0,25 M e HCl 1 N
contendo EDTA 4 mM. A concentração de metalotioneína dos extratos, desnaturada em
pH ácido e elevado comprimento iônico, foi quantificada espectrofotometricamente
utilizando-se do Reagente de Ellman contendo NaCl 2 M, DTNB 0,43 M em tampão
fosfato 0,2 M (pH 8,0). As leituras foram feitas em espectrofotômetro em 412 nm.
2.2.2.g - Acúmulo de cobre nas brânquias
Após a dissecção o tecido branquial foi pesado (aproximadamente 1 g) e mantido
em estufa (60
o
C) para determinação do peso seco, foram feitas pesagens até que o peso se
mantivesse constante. Adicionou-se ao tecido 10 mL H
2
SO
4
concentrado a quente e após a
dissolução acrescentou-se 10 ml de H
2
O
2
. O volume foi levado a 50 mL com água
destilada. A análise do acúmulo de cobre foi efetuada utilizando-se o espectrofotômetro de
absorção atômica (AA 12/1475 GEMINI).
2.2.3 - Terceira etapa: Avaliação dos parâmetros cardio-respiratórios
Estes parâmetros foram obtidos utilizando-se cânulas de polietileno e eletrodos
implantados de acordo com os procedimentos cirúrgicos abaixo descritos.
Procedimentos Cirúrgicos
Os animais foram previamente anestesiados em solução de benzocaína (0,1g.L
-1
) e
transferidos para uma mesa cirúrgica onde suas brânquias foram ventiladas artificialmente
com uma solução menos concentrada de benzocaína (0,05 g. L
-1
) equilibrada com o ar
Material e Métodos_______________________________________________________20
atmosférico. Cirurgias distintas foram realizadas em todos os animais para a respirometria
e a eletrocardiografia. Para a primeira foi usada uma furadeira Dremel® e feito um orifício
na região dorsal do palato, através do qual foi fixada uma cânula de polietileno flangeada
(PE-100). Da mesma forma, outras duas cânulas foram fixadas, uma em cada borda dos
opérculos (RANTIN et al, 1993). Após estes procedimentos, os animais foram inseridos
dentro de um respirômetro e este dentro do tanque experimental. Para os registros da
freqüência cardíaca, foram implantados dois eletrodos de ECG, um na posição ventral,
entre as brânquias e o coração, e outro na posição ventrocaudal, próximo à nadadeira
pélvica. Um terceiro eletrodo, o de referência, foi colocado na água do tanque experimental
(GLASS et al., 1991). Este tipo de preparação fornece traçados eletrocardiográficos
equivalentes aos da derivação DI da eletrocardiografia padrão.
Protocolo experimental
Em ambos os casos, antes dos experimentos, os animais foram acompanhados por
24 h após a cirurgia ou até quando os parâmetros cardio-respiratórios apresentassem
valores basais. Então, o sistema experimental era fechado para adição de CuSO
4
correspondente a 50% da CL
50
– 48 h, apenas em T2, no recipiente anexo ao circuito de
circulação do sistema. O sistema que continha o respirômetro apresenta um volume de 40
L, portanto, foi adicionado o CuSO
4
, de maneira a permanecer a concentração de 50% da
CL
50
– 48 h. Foram realizados registros 10 min antes do início do período experimental e
10 min no final de 1, 2, 3, 6, 12, 24 e 48 h para cada animal após a contaminação. O grupo
controle recebeu o mesmo tratamento, mas sem adição de CuSO
4
.
2.2.3.a - Parâmetros cardio-respiratórios
Material e Métodos_______________________________________________________21
Freqüência respiratória (ƒ
R
)
A freqüência respiratória (ƒ
R
) foi registrada conectando-se o cateter bucal a um
transdutor de pressão Narco P-1000B e este a um acoplador universal (Narco 7198) de um
fisiógrafo Narco Narcotrace 40 (Narco Bio-Systems, Houston, TX, USA). Tal preparação
permite registros e medidas das variações da pressão intrabucal durante o ciclo
respiratório. Os valores de f
R
foram expressos em resp. min
-1
.
Extração de O
2
(EO
2
)
A porcentagem de extração de O
2
da corrente ventilatória (EO
2
) foi expressa em
porcentagem (%), conforme a seguinte equação descrita por HUGHES et al.(1983):
EO
2
= 100 (PinspO
2
- PexpO
2
)/P
insp
O
2
onde: PinspO
2
= pressão parcial de O
2
da água inspirada e PexpO
2
= pressão parcial
da água expirada.
Consumo de Oxigênio (
&
VO
2
)
As medidas do consumo de oxigênio (
&
VO
2
) foram realizadas de acordo com a
metodologia empregada por FERNANDES & RANTIN (1989), adaptada de HUGHES et
al. (1983) e RANTIN & JOHANSEN (1984). Essa metodologia consiste em utilizar um
respirômetro de fluxo constante, cujo fluxo é ajustado por gravidade utilizando-se uma
proveta graduada e um cronômetro. As tensões de O
2
da água que entra (PeO
2
) e que sai
Material e Métodos_______________________________________________________22
(PsO
2
) do respirômetro em cada condição experimental foram monitoradas constantemente
com amostras de água coletadas por catéteres de polietileno que passavam, por gravidade,
através de uma cubeta contendo um eletrodo de O
2
(FAC 001) e este conectado a um
analisador de O
2
(FAC-204A).
A
&
VO
2
foi calculada empregando-se a seguinte equação:
&
VO
2
= (PeO
2
-PsO
2
) αO
2
V
R
/W
T
onde: P
in
O
2
= tensão de O
2
da água de entrada no respirômetro, P
out
O
2
= tensão de O
2
da
água da saída do respirômetro, αO
2
= coeficiente de solubilidade do O
2
na água (mL O
2
. L
-
1
. mmHg
-1
), V
R
= fluxo de água através do respirômetro, W
T
= peso fresco do animal
Os valores de
&
VO
2
foram expressos em mLO
2
. kg
-1
.h
-1
.
Ventilação branquial (
&
V
G
)
A ventilação branquial foi obtida pelo método descrito por SAUNDERS (1962) e
adaptado por FERNANDES & RANTIN (1989). Esse método, baseado no princípio de
Fick, utiliza as medidas das tensões de O
2
da água de entrada (PeO
2
) e de saída (PsO
2
) do
respirômetro, bem como da água inspirada (PinspO
2
) e da expirada (PexpO
2
) pelo animal.
Os valores da ventilação branquial (
&
V
G
)foram expressos em mLH
2
O kg
-1
min
-1
e
calculados de acordo com a seguinte equação:
&
V
G
= V
R
(PeO
2
- PsO
2
)/(PinspO
2
- PexpO
2
)/W
T
Material e Métodos_______________________________________________________23
Volume ventilatório (V
T
)
O volume ventilatório (V
T
) foi calculado através do quociente entre os valores de
&
V
G
e os seus respectivos valores de f
R
(
&
V
G
/f
R
) nas diferentes condições estudadas. Os
valores de V
T
foram expressos em mlH
2
O.kg
-1
.resp.min
-1
.
Freqüência cardíaca (f
H
)
A freqüência cardíaca foi expressa em batimentos por minutos (bpm), pela
contagem dos complexos QRS por unidade de tempo nos registros eletrocardiográficos.
3.0 - Análise Estatística
Os dados são apresentados como média ± S.E.M. Para se detectar a diferença entre
os grupos com relação aos parâmetros bioquímicos, utilizou-se a análise de variância com
médias repetidas (ANOVA), seguida pelo teste t, quando necessário. Para os parâmetros
cardio-respiratórios utilizou-se o teste t entre os grupos T1 e T2 e Dunnet comparando os
valores basais em relação aos diferentes tempos de exposição. Todos os testes estatísticos,
incluindo determinação da normalidade e análise de variância, foram executados usando-se
o Software GraphPad Instat. O nível de significância máxima adotada foi de 5% (P < 0,05).
Resultados______________________________________________________________25
4.0 - RESULTADOS
4.1 - Hematologia, íons e amônia plasmática
Observando-se a tabela 1 verifica-se aumento significativo de Hct, [Hb], RBC e
VCM nas tilápias expostas ao CuSO
4
por 48 h em relação ao grupo controle. Os índices de
HCM, CHCM e a proteína plasmática não foram significativamente diferentes entre T1 e
T2. Houve diminuição na concentração plasmática dos íons Na
+
e Cl
-
e aumento de K
+
. Os
níveis plasmáticos de amônia mostraram um aumento em T2, de mais de 10 vezes com
relação a T1.
Resultados______________________________________________________________26
TABELA 1. Valores médios ± S.E.M. dos parâmetros hematológicos, iônicos e
concentração de amônia do plasma de tilápia do Nilo, Oreochromis
niloticus. T1 = grupo controle; T2 grupo tratado com CuSO
4
por 48 h.
P
arâmetros T1 T2
Hct (%) 26,06 ± 0,690 36,25 ± 1,319
*
[Hb] (g/dL) 7,27 ± 0,04 10,08 ± 0,05
*
RBC (x 10
6
/µL) 1,46 ± 0,064
1,71± 0,061
*
VCM (fL) 181,04 ± 9,095 213,43 ± 10,396
*
HCM (µm
3
) 50,62 ± 3,39 59,42 ± 3,49
CHCM (%) 28,43 ± 0,90 28,11 ± 1,80
Proteína (mg/mL) 10,53 ± 1,330 9,11 ± 1,696
[Na
+
] (mEq. L
-1
) 156,00 ± 7,36
*
110,16 ± 8,3
[K
+
] (mEq. L
-1
) 4,14 ± 0,17
6,32 ± 1,02
*
[Cl
-
] (mEq. L
-1
) 0,0307 ± 0,0006
*
0,0161 ± 0,0008
Amônia (nM/mL) 0,049 ± 0,012
0,583 ± 0,079
*
Médias ± S.E.M. seguidas por * na linha diferem entre si pelo
teste t (P< 0,05)
Resultados______________________________________________________________27
4.2 - Intermediários Metabólicos
Analisando-se a tabela 2, nota-se aumento significativo das concentrações de
glicose plasmática e hepática no grupo T2 em relação ao T1, enquanto que no músculo
vermelho houve diminuição, mantendo-se inalterado no músculo branco. O glicogênio
apresentou redução tanto no fígado, quanto no músculo branco nos animais submetidos ao
cobre em relação ao grupo controle e sem alterações no músculo vermelho (Tabela 2). Já o
piruvato permaneceu sem alterações significativas tanto no plasma quanto no fígado e nos
músculos branco e vermelho no grupo T2 em relação ao grupo T1. O lactato aumentou
significativamente no fígado e no músculo vermelho no grupo T2, não ocorrendo o mesmo
para o músculo branco (Tabela 2).
Resultados______________________________________________________________28
TABELA 2. Valores médios ± S.E.M. de lactato, piruvato, glicogênio e glicose em fígado,
em músculos branco e vermelho e em plasma tilápia do Nilo, Oreochromis
niloticus. T1 = grupo controle; T2 = grupo tratado com CuSO
4
por 48 h.
FÍGADO MÚSCULO BRANCO
T1 T2 T1 T2
Lactato (µM/g) 28,91 ± 2,03 45,46 ± 5,62* 73,97 ± 4,10 68,01 ± 2,70
Piruvato
(µmol/mL)
1,16 ± 0,06 1,20 ± 0,07 1,55 ± 0,32 1,11 ± 0,11
Glicogênio
(µM unidades
glicosil-glicose/g
tecido)
162,61 ± 28,54* 73,38 ± 18,47 18,76 ± 0,69* 14,01 ± 1,15
Glicose
(µmol/mL)
960,88 ± 97,40
1379,99 ±
72,71*
27,06 ± 1,11* 21,95 ± 1,75
MÚSCULO VERMELHO PLASMA
T1 T2 T1 T2
Lactato (µM/g) 65,18 ± 3,62 81,37 ± 4,34*
- -
Piruvato
(µmol/mL)
1,38 ± 0,08
1,21 ± 0,07
0,12 ± ,02 0,15 ± 0,02
Glicogênio
(µM unidades
glicosil-glicose/g
tecido)
28,63 ± 1,05 24,84 ± 2,47
- -
Glicose
(µmol/mL)
28,57 ± 1,77* 22,78 ± 1,70 0,13 ± 0,04 0,54 ± 0,09*
Médias ± S.E.M. Valores seguidos por * na linha diferem entre si (teste t; P< 0,05).
Resultados______________________________________________________________29
4.3 - Na
+
/ K
+
- ATPase branquial
Com relação à atividade da enzima Na
+
/ K
+
- ATPase, houve uma redução
significativa no grupo exposto ao cobre, quando comparado ao grupo controle, como
demonstrado na Figura 3. Com essa redução, o grupo T2 apresentou somente 24% da
atividade obtida por T1.
Resultados______________________________________________________________30
Figura 3. Valores médios ± S.E.M. da atividade da Na
+
/K
+
- ATPase branquial de de
tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus. Grupo controle (T1) e sob exposição ao
CuSO
4
(T2), por 48 h (T1, representado por coluna branca e T2, representado
por coluna preta). * representam diferenças significativas entre os grupos.
Teste t (P< 0,05).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
T1 T2
TRATAMENTOS
Na
+
/K
+
- ATPase (µM Pi.mg. h
–1
)
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
T1 T2
TRATAMENTOS
Na
+
/K
+
- ATPase (µM Pi.mg. h
–1
)
*
Resultados______________________________________________________________31
4.4 - Metalotioneína
A MT é uma proteína que seqüestra os metais, permitindo ao animal uma maior
resistência à exposição ao tóxico. Assim, quando comparados os grupos com e sem adição
de cobre, o último apresentou menos MT por peso de tecido branquial. Isso indica que o
cobre induz a produção de MT, já que o aumento em T2 foi significativamente maior do
que em T1, como pode ser observado na Figura 4.
Resultados______________________________________________________________32
Figura 4. Valores médios ± S.E.M. da metalotioneína branquial de tilápia do Nilo,
Oreochromis niloticus. Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2),
por 48 h. (T1, representado por coluna branca e T2, representado por coluna
preta). * representam diferenças significativas entre os grupos teste t (P< 0,05).
4,5
4,7
4,9
5,1
5,3
5,5
T1 T2
T RATAMENT O
S
MT/
g
tecido
*
4,5
4,7
4,9
5,1
5,3
5,5
T1 T2
T RATAMENT O
S
MT/
g
tecido
*
Resultados______________________________________________________________33
4.5 - Acúmulo de cobre nas brânquias
Pode-se observar um aumento importante do acúmulo de cobre nas brânquias dos
animais expostos a 23,57 g .L
-1
CuSO
4
, em relação ao grupo controle, onde não houve
adição do composto (Figura 5). Esse aumento foi diretamente proporcional ao aumento da
MT e inversamente em relação à atividade da enzima Na
+
/K
+
- ATPase branquial.
Resultados______________________________________________________________34
Figura 5. Valores médios ± S.E.M. do acúmulo de cobre em tecido branquial de tilápia do
Nilo, Oreochromis niloticus. Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), por 48 h. (T1, representado por coluna branca e T2, representado por
coluna preta). * representam diferenças significativas entre os grupos teste t (P<
0,05).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
T1 T2
TRATAMENTOS
mg cobre / g tecido
*
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
T1 T2
TRATAMENTOS
mg cobre / g tecido
*
Resultados______________________________________________________________35
4.6 - Respirometria
A respirometria apresentou diferentes tendências nos diversos parâmetros
monitorados.
4.6.1 - Freqüência Respiratória (ƒ
R
)
Avaliando-se os resultados obtidos após a exposição e monitoramento dos animais
durante 48 h, observou-se que o grupo contaminado (T2), quando comparado ao grupo
controle (T1), apresentou aumento da ƒ
R
à partir da segunda hora de exposição ao CuSO
4
,
mantendo-se significativamente mais elevada em T1 e também em relação ao período
prévio à exposição, em todos os tempos de aferição (Figura 6). No grupo T1 não observou-
se alterações significativas na f
R
durante todo o período experimental.
Resultados______________________________________________________________36
Figura 6. Valores médios ± S.E.M. da ƒ
R
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus. Grupo
controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos, durante 48
h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por colunas pretas).
* representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os demais tempos
em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05).
40
50
60
70
80
01236122448
TEMPO (h)
ƒ
R
(
resp. min
-1
)
T1 T2
**
*
*
*
*
*
**
*
*
*
40
50
60
70
80
01236122448
TEMPO (h)
ƒ
R
(
resp. min
-1
)
T1 T2
****
**
**
**
**
*
**
*
*
*
Resultados______________________________________________________________37
4.6.2 - Extração de Oxigênio
Quando comparados os resultados obtidos para o grupo controle (T1) e o tratado
com CuSO
4
(T2), após o período de monitoramento dos animais durante 48 h, observou-se
que o grupo T2 apresentou redução da EO
2
à partir da terceira hora de exposição ao
CuSO
4
, mantendo-se sempre menor do que no grupo T1 e também em relação ao período
prévio à exposição, em todos os tempos de aferição posteriores (Figura 7). A EO
2
do grupo
T1 permaneceu constante durante todo o período experimental de 48 h.
Resultados______________________________________________________________38
Figura 5. Valores médios ± S.E.M. da extração de oxigênio (EO
2
) de tilápia, Oreochromis
niloticus, grupo controle (T1, representado por colunas claras) e sob exposição ao CuSO4
(T2, representado por colunas escuras). * representam diferenças significativas entre os
grupos.
Figura 7. Valores médios ± S.E.M. da EO
2
de tilápia, Oreochromis niloticus, grupo
controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos, durante
48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por colunas
pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e os
demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05).
50
60
70
80
90
01236122448
TEMPO (h)
EO
2
(
%
)
T1 T2
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
50
60
70
80
90
01236122448
TEMPO (h)
EO
2
(
%
)
T1 T2
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
Resultados______________________________________________________________39
4.6.3 - Consumo de Oxigênio
Dentre os resultados obtidos após o período de monitoramento dos animais durante
48 h, observou-se que o grupo contaminado (T2), quando comparado ao grupo controle
(T1), apresentou redução da
2
OV
&
a partir da segunda hora de exposição ao CuSO
4
,
mantendo-se reduzida comparado a T1 e também em relação ao período prévio à
exposição, em todos os tempos de aferição (Figura 8). A
2
OV
&
do grupo T1 permaneceu
inalterada durante as 48 h de experimentação.
Resultados______________________________________________________________40
Figura 6. Valores médios ± S.E.M. do consumo de oxigênio (
&
VO
2
) de tilápia,
Oreochromis niloticus, grupo controle (T1, representado por colunas claras) e sob
exposição ao CuSO4 (T2, representado por colunas escuras). * representam diferenças
significativas entre os grupos.
3.5.4 Ventilação Branquial (
&
V
G
)
Figura 8. Valores médios ± S.E.M. da
&
VO
2
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus.
Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e
os demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05).
80
100
120
140
01236122448
TEMPO (h)
VO2
(
mL O2. K
g
-1
. mmH
g
-1
)
T1 T2
*
*
*
*
*
*
*
*
80
100
120
140
01236122448
TEMPO (h)
VO2
(
mL O2. K
g
-1
. mmH
g
-1
)
T1 T2
**
*
*
*
*
**
**
**
Resultados______________________________________________________________41
4.6.4 - Ventilação Branquial
Houve aumento da
&
V
G
em T2 a partir da primeira hora (Figura 9). A
&
V
G
aumentou
gradualmente até o final do período experimental, desde a primeira hora em que os animais
do grupo T2 foram expostos ao CuSO
4
, permanecendo com diferenças significativas com
relação ao grupo controle e também quando comparado ao período anterior a contaminação
do mesmo grupo.
Resultados______________________________________________________________42
Figura 9. Valores médios ± S.E.M. da
&
V
G
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus.
Grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e
os demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05).
250
350
450
550
650
0 1 2 3 6 122448
TEMPO (h)
V
G
(
mL H
2
O K
g
-1
min
-1
)
T1 T2
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
250
350
450
550
650
0 1 2 3 6 122448
TEMPO (h)
V
G
(
mL H
2
O K
g
-1
min
-1
)
T1 T2
*
*
*
*
*
**
**
**
**
**
*
*
**
**
Resultados______________________________________________________________43
4.6.5 - Volume ventilatório (V
T
)
Houve aumento no V
T
do grupo T2 a partir de décima segunda hora de exposição
(Figura 10). Enquanto o V
T
do grupo T1 permaneceu constante durante todo o período
experimental, o V
T
do grupo T2 apresentou tendência ao aumento desde o início da
exposição ao cobre. Entretanto esse parâmetro só apresentou diferença estatisticamente
significativa com relação ao grupo controle após 12 h de exposição ao CuSO
4
.
Resultados______________________________________________________________44
Figura 10. Valores médios ± S.E.M. do V
T
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus,
grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e
os demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05).
2
4
6
8
10
01236122448
TEMPO (h)
V
T
(mL H
2
O Kg
-1
resp
-1
)
T1 T2
* *
*
*
*
*
2
4
6
8
10
01236122448
TEMPO (h)
V
T
(mL H
2
O Kg
-1
resp
-1
)
T1 T2
** **
*
*
*
**
Resultados______________________________________________________________45
4.6.7 - Freqüência Cardíaca (ƒ
H
)
Os animais do grupo T1 apresentaram bradicardia a partir da décima segunda hora
de exposição ao CuSO
4
. A ƒ
H
apresentou redução em T2 quando comparado ao seu
controle (T1) e também ao seu próprio tempo inicial, antes de ser adicionado o sulfato de
cobre, conforme observado na Figura 11. No grupo controle (T1) a f
H
permaneceu
constante durante todo o período experimental de 48 h.
Resultados______________________________________________________________46
Figura 11. Valores médios ± S.E.M. da ƒ
H
de tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus,
grupo controle (T1) e sob exposição ao CuSO
4
(T2), em diferentes tempos,
durante 48 h. (T1, representado por colunas brancas e T2, representado por
colunas pretas). * representam diferenças significativas entre o tempo inicial e
os demais tempos em T2, e entre os grupos T1 e T2 (P< 0,05).
0
20
40
60
0 1 2 3 6 122448
TEMPO (h)
batimentos. min
-1
T1 T2
*
*
*
*
* *
Discussão_______________________________________________________________47
5.0 - DISCUSSÃO
Durante os experimentos, foram observados letargia e aumento da produção de
muco dos animais expostos ao cobre. Segundo SØRENSEN, (1991), alterações
comportamentais são as primeiras a ocorrerem quando os animais detectam a presença de
metais na água. Uma elevada produção de muco é uma resposta comum quando os peixes
são expostos a maioria dos poluentes (MALLATT, 1985), e, em geral, serve para proteger
as superfícies epidérmicas como brânquias e pele. Além disso, o muco contém cargas
negativas que podem atrair os íons de cobre e, em seguida liberá-los durante a eliminação
de água pelo opérculo, durante o ciclo respiratório (HEATH, 1995).
Como pode ser observado na tabela 1, houve relevantes alterações nos parâmetros
hematológicos da tilápia do Nilo após exposição ao CuSO
4
.
O aumento no Hct acompanhado pelo aumento do RBC, no grupo T2, deve-se
provavelmente ao aumento de células eritrocitárias na circulação e não somente ao
aumento do VCM. Este aumento do Hct, caracterizado pela elevação do volume
eritrocitário (VCM), pode ser uma conseqüência da entrada de água na célula, sendo este
um mecanismo comum frente ao estresse ambiental em peixes. O aumento no RBC e [Hb],
pode indicar tentativa do animal em elevar a captação de O
2
, garantindo a oxigenação
adequada aos tecidos (HEATH, 1995).
Segundo CYRIAC et al., (1989) e NUSSEY et al., (1995) os metais, como cobre e
mercúrio, estimulam a eritropoiese em peixes. WANG et al. em 1998, ao exporem a truta
arco-íris, Oncorhynchus mykiss, à concentração de 0,6 mg Cu
2+
. L
-1
, observaram um
aumento no RBC e nenhum efeito no Hct e na [Hb] que foram devido ao aumento no
volume das células devido ao conteúdo de água. A mesma espécie exposta a 3,82 e 10,06
µg Cu
2+
. L
-1
apresentou valores de Hct diminuídos, enquanto que a exposição prolongada
Discussão_______________________________________________________________48
ao Cu
2+
diminuiu o volume dos eritrócitos reduzindo a capacidade de captação do O
2
(DETHLOFF et al., 2001).
NUSSEY et al., (1995) ao estudarem os efeitos da exposição a 0,40 mg Cu
2+
. L
-1
na
tilápia mossâmbica, Orechromis mossambicus, observaram que os valores de Hct e [Hb]
mantiveram-se constantes, mas o RBC diminuiu, atribuindo essas respostas à destruição de
eritrócitos ou à inibição de sua síntese.
Houve também, no presente estudo, um aumento acentuado na concentração de
amônia plasmática do grupo exposto ao cobre em relação ao grupo controle (tabela 1).
Esse aumento pode ser devido à condição adversa ao que o animal foi exposto, levando a
um possível aumento da produção de amônia interna. A maioria dos produtos nitrogenados
é originada do catabolismo das proteínas e, em peixes a amônia é o principal produto final
a ser excretado, principalmente pelas brânquias. A “queima” de proteínas, lipídeos e
carboidratos como energia, pode ser influenciado por fatores internos e externos
(DEVLIN, 1997).
Segundo BEAUMONT et al., (2002), o cobre não apenas aumenta a concentração
de amônia plasmática e cortisol, mas também inibe o mecanismo excretório (trocador Na
+
/
NH
4
+
), embora esses autores não tenham observado acúmulo de amônia plasmática quando
expuseram Salmo trutta ao cobre, provavelmente devido à baixa dosagem (0,08 µg. L
-1
).
De acordo com VAN WAARDE et al (1983), o aumento do catabolismo de proteínas tem
como conseqüência um aumento nos teores de amônia plasmática. Em algumas espécies,
quando em situações ambientais que dificultam a excreção de amônia, pode ocorrer um
aumento desta, entretanto, em condições normais, esse excesso de amônia produzido pelo
catabolismo de proteínas é prontamente excretado pelas brânquias. Segundo WILSON &
TAYLOR (1993), a excreção de amônia pode ser passiva ou ativa, utilizando-se de um
trocador, mas o cobre dificulta esse processo, por reduzir também o influxo de Na
+
.
Discussão_______________________________________________________________49
Aumentos de amônia plasmática também foram observados em Oreochromis mossambicus
(PELGROM et al., 1995), em truta arco-iris, Oncorhyncus mykiss (LAURÉN &
McDONALD, 1985; CUSIMANO et al., 1986; WILSON & TAYLOR, 1993) em Salmo
salar (MATEY & KOMOV, 1992) e em Salmo trutta (DAY & BUTLER, 1996;
BEAUMONT et al., 2000; 2002), frente a exposição ao cobre em diferentes concentrações
e períodos.
No presente estudo, observou-se uma diminuição na concentração plasmática dos
íons Na
+
e Cl
-
e aumento de K
+
. PELGROM et al., (1995), observaram uma diminuição na
concentração dos íons Na
+
e Cl
-
e aumento na concentração de K
+
, após exporem
exemplares de Oreochromis mossambicus a concentrações sub-letais de cobre. NUSSEY et
al. (1995), estudando a mesma espécie, observaram que houve alterações morfológicas nas
brânquias quando expostas ao CuSO
4
, que refletiu na diminuição do Na
+
e do Cl
-
e no
aumento do K
+
. Segundo WILSON & TAYLOR, (1993); PILGAARD et al. (1994) e
LARSEN et al. (1997), a exposição ao Cu
2+
pode induzir mudanças no equilíbrio osmótico,
no entanto, estas mudanças são algumas vezes pequenas ou até ausentes. Significantes
distúrbios no transporte dos íons plasmáticos têm sido observados em estudos de avaliação
da toxicidade do Cu
2+
(CERQUEIRA & FERNANDES, 2002; GROSSELL et al., 2002).
A atividade da Na
+
/K
+
- ATPase tem uma relação direta no transporte dos íons
nas brânquias. Uma inibição dessa atividade com conseqüente diminuição no transporte
ativo dos íons, altera as concentrações plasmáticas de Na
+
e de K
+
, como observado no
presente trabalho, em que houve redução da atividade da enzima em T2 em relação a T1
(Figura 3). A Na
+
/K
+
ATPase transporta Na
+
e K
+
em seqüência; o transporte de Na
+
precede o transporte de K
+
e o transporte de cada íon requer um cátion específico para
catalisar as ligações de cada passo da catálise e a conformação da molécula. O Na
+
catalisa
a fosforilação e é transportado e o K
+
catalisa a desfosforilação e é transportado. O
Discussão_______________________________________________________________50
processo de transporte move 3 íons sódio para fora e 2 íons potássio para dentro da célula
por molécula de ATP consumida. Assim, como pôde ser evidenciado nesse estudo, houve
redução da atividade da enzima, com conseqüente diminuição de íons Na
+
livre no plasma
e aumento de íons K
+
.
A determinação da atividade da Na
+
/ K
+
- ATPase em um tecido indica o
transporte ativo de Na
+
e K
+
ocorrendo nesse tecido. Variações da atividade da Na
+
/ K
+
-
ATPase frente a alterações que ocorrem no meio interno ou externo, podem sugerir a
necessidade de um maior ou menor transporte ativo desses íons (EVANS, 1993).
Entretanto, alterações que ocorrem nesses meios, como por exemplo, uma diminuição da
atividade da Na
+
/ K
+
- ATPase influenciada pela presença do cobre, não obrigatoriamente
sugere uma redução na necessidade de transporte ativo para a manutenção do equilíbrio
iônico, mas, nesse caso, pode indicar quebra na estrutura da membrana biológica.
Assim, esta redução de atividade encontrada no presente estudo, pode ter sido
causada, provavelmente, por danos estruturais nas brânquias, em resposta a exposição ao
cobre, conforme observado anteriormente em truta arco-íris por GROSSEL & WOOD
(2002). Segundo esses mesmos autores, essa inibição da atividade da Na
+
/K
+
- ATPase, é
devido ao fato do cobre ligar-se aos sítios ativos da enzima inibindo o transporte iônico nas
brânquias ou em outros órgãos envolvidos nos processos de iono e/ou osmorregulação,
desestabilizando o equilíbrio iônico e/ou osmótico do animal. REID & McDONALD
(1988), também postulam que o aumento da perda passiva dos íons nas brânquias seja
decorrente às alterações na permeabilidade do epitélio, ocasionado pelo efeito do Cu
2+
. Em
truta arco-íris, o cobre induz distúrbios osmorregulatórios pela diminuição da captação
ativa de íons devido à inibição direta da atividade de enzimas específicas para o transporte
iônico, tal como a Na
+
/K
+
-ATPase (LI et al., 1998; DE BOECK et al., 2000). Uma inibição
paralela entre a captação de Na
+
e a atividade da Na
+
/K
+
-ATPase, foi observado por SOLA
Discussão_______________________________________________________________51
et al. (1995) em truta arco-íris e por LI et al., (1998) em tilápia mossâmbica, durante a
exposição desses animais ao cobre. Entretanto, McGEER et al. (2000) observaram que a
truta arco-íris quando exposta cronicamente ao cobre apresenta uma atividade aumentada
da Na
+
/K
+
-ATPase branquial.
Foi observado no presente estudo, um aumento nos níveis de glicose plasmática e
hepática, com diminuição nos músculos em resposta a exposição ao cobre, 48 h (tabela 2).
A glicose é, quantitativamente, o principal substrato oxidável utilizado para a maioria dos
organismos como fonte de energia (DEVLIN, 1997). Esse aumento é necessário para
disponibilizar ATP para o processo de desintoxicação de metais. A hiperglicemia já foi
reportada em muitos teleósteos como uma resposta comum ao estresse, considerada como
principal efeito imediato da liberação de catecolaminas (HATTINGH, 1976, PINHEIRO,
2004). Este aumento da demanda energética exigida numa situação de estresse é requerido
inclusive nos sistemas respiratório e cardiovascular (RANDALL & PERRY, 1992;
PINHEIRO, 2004).
O piruvato manteve-se constante em todos os tecidos sem diferenças entre os
grupos experimentais (tabela 2). A conversão da glicose a piruvato, permite aproveitar
somente uma pequena parcela (menos de 10%) da energia total da glicose, ficando a maior
parte convertida em piruvato. Em aerobiose o piruvato é oxidado a CO
2
, pelas
mitocôndrias no Ciclo de Krebs, havendo maior produção de energia; em anaerobiose,
entretanto, o piruvato é convertido em lactato (DEVLIN, 1997). Assim, a manutenção de
níveis constantes do piruvato do grupo T2 em relação ao T1, nesse estudo, pode refletir o
aumento de lactato no fígado e no músculo vermelho de T2. Segundo HEATH (1995), a
exposições a substâncias tóxicas pode criar uma condição hipóxica tecidual pela
diminuição do fluxo de oxigênio da água para o sangue, produzido por um aumento da
barreira difusiva na superfície branquial, resultando num aumento de acido lático,
Discussão_______________________________________________________________52
indicador da glicólise anaeróbia.
As concentrações de glicogênio hepático e do músculo branco diminuíram
significativamente no grupo T2 em relação ao controle (tabela 2). Esta resposta pode estar
relacionada a glicogenólise induzida pelas catecolaminas em curtos períodos de estresse,
para possível demanda de energia usada na tentativa de desintoxicação (VIJAYAN et al.,
1994; FABBRI et al., 1998; MOMMSEN et al., 1999). A gliconeogênese também pode ser
responsável pelo aumento da glicose plasmática quando o glicogênio hepático já tiver sido
exaurido (JANSSENS & WATERMAN, 1988).
Ao expor exemplares de tilápia do Nilo a concentração de cobre por 48 h, houve
elevação significativa da MT no tecido branquial (Figura 4). O aumento de concentração
desse composto, tanto nas brânquias quanto no fígado ocorre devido às metalotioneínas se
ligarem aos metais, inclusive ao cobre, pois o seqüestram e servem como um mecanismo
de proteção, mantendo a concentração de metal livre extremamente baixa, e, assim,
evitando as alterações induzidas por este agente estressor (BRAGIGAND & BERTHET,
2003; MAYER et al., 2003; RYU et al., 2003), e aumentando a tolerância dos peixes aos
metais (SCHLENK et al., 1999; AHMAD et al., 2000; CAJARAVILLE et al., 2000;
LINDE et al., 2001). McCARTER & ROCH (1983, 1984) relataram em coho salmon
(Oncorhynchus kisutch), um aumento da MT com um aumento na concentração de cobre
na água. OLSVIK et al. (2000) relataram um aumento na indução da MT em Salmo trutta
de rios contaminados por metais acompanhados de aumento na concentração de metal na
água. Além disso, a MT parece estar envolvida no transporte intracelular de cobre e zinco
participando no metabolismo de metais essenciais e também pode ser induzida por
situações estressantes, não somente metais (CAJARAVILLE et al., 2000; LINDE et al.,
2001). A indução da MT simultaneamente com aumento de glicocorticóides,
lipopolissacarídeos, interleucina-1 e -interferem durante a maturação sexual e condições de
Discussão_______________________________________________________________53
estresse fortalece o papel desta proteína na regulação da homeostase de metais (SIMKISS
& TAYLOR, 1981; DUTTON et al., 1993; SCHLENK et al., 1999; OLSVIK et al., 2000).
No presente estudo, observou-se um acúmulo importante de cobre nas brânquias
dos animais do grupo T2 (Figura 5). Normalmente, o cobre se acumula no fígado e a sua
presença em outros órgãos ocorre somente quando a capacidade de estoque do metal neste
órgão torna-se saturada (CARVALHO et al, 2004). O acúmulo de metais em órgãos como
brânquias e rins também pode ser observado em peixes contaminados, porém em menor
intensidade (PILGAARD et al, 1994; PELGROM et al, 1995; CERQUEIRA &
FERNANDES, 2002). ÇOĞUN & KARGIN (2004), observaram que, em Oreochromis
niloticus expostas a diversas concentrações de cobre, o acúmulo nos tecidos apresenta-se
maior no fígado, brânquias e músculos, respectivamente, tendo relação direta ao tempo de
exposição e inversa aos valores pH. Segundo esses mesmos autores, quanto maior o
acúmulo de cobre nas brânquias, menor a atividade da enzima Na
+
/K
+
- ATPase branquial e
maior a indução da MT nesse tecido, dados esses que corroboram com os do presente
estudo (Figuras 3 e 4, respectivamente).
Os parâmetros cardio-respiratórios apresentaram adaptações diferenciadas em cada
tempo monitorado de exposição. No presente estudo, observou-se que a EO
2
no grupo
contaminado com CuSO
4
diminuiu significativamente em relação ao grupo controle. Tal
diminuição ocorreu a partir da terceira hora (Figura 7), provavelmente devido a um
aumento da barreira água-sangue, em conseqüência ao espessamento da camada de muco
nas brânquias para dificultar a entrada de cobre (SØRENSEN, 1991).
Assim, este mecanismo de defesa pode acarretar também um prejuízo na função
respiratória, já que dificulta a difusão dos gases através do epitélio branquial (HINTON &
LAURÉN, 1990; FERNANDES & MAZON, 2003), podendo levar o peixe a uma situação
de hipoxemia.
Discussão_______________________________________________________________54
No presente estudo, os animais expostos ao cobre, também deram início a uma
compensação hematológica confirmada pelo aumento significativo do número de
eritrócitos na circulação (tabela 1), conforme também observado por CYRIAC et al. (1989)
e NUSSEY et al. (1995) em Oreochromis mossambicus.
O grupo T2 apresentou uma diminuição na
&
VO
2
a partir de 6 horas de exposição ao
CuSO
4
(Figura 8). Uma redução na
&
VO
2
não indica necessariamente uma hipóxia tecidual,
mas ambas podem estar relacionadas (ULTSCH et al., 1980). O suprimento de O
2
para os
tecidos é que determina a taxa do metabolismo aeróbico (GRIGG, 1969). Falhas nos
mecanismos cardio-respiratórios compensatórios ou uma hipoxemia podem acarretar um
deslocamento da “cascata de O
2
” para baixo e, como conseqüência, um débito no
suprimento de O
2
para as mitocôndrias, causando uma situação de anaerobiose. Assim, são
as vias metabólicas anaeróbicas que gerarão energia para o animal. Este fato foi
corroborado, no presente estudo, pelo aumento dos níveis de lactato nos tecidos (TABELA
2).
BEAUMONT et al., (1995; 2000), observaram uma diminuição no consumo de O
2
em Salmo trutta , quando expuseram os animais a baixas concentrações de cobre, sendo
compensado por outras alterações no sistema de transporte de O
2
, como aumento no RBC.
Observou-se no presente estudo, uma hiperventilação nos peixes do grupo T2 a
partir da terceira hora de exposição ao CuSO
4.
O aumento na
&
V
G
ocorreu devido a
aumentos tanto da f
R
quanto do V
T
(Figuras 6 e 10, respectivamente). Estes mecanismo
tem por finalidade compensar o déficit de O
2
imposto por uma hipóxia ambiental ou por
um ambiente contaminado (BEAUMONT et al., 2002). WILSON & TAYLOR (1993),
observaram, em Oncorhynchus mykiss, que alterações na morfologia das brânquias
causadas pelo efeito do Cu
2+
podem prejudicar as trocas gasosas, mas estes autores não
avaliaram as respostas respiratórias apresentadas pelos peixes durante a exposição.
Discussão_______________________________________________________________55
Segundo IWAMA et al. (1997), a assimilação de altas concentrações de Cu
2+
leva a
alterações na liberação de catecolaminas e cortisol, sendo esses efeitos considerados efeitos
primários em resposta ao estresse e que podem estimular os efeitos secundários. Esses
efeitos secundários, por sua vez, alteram parâmetros fisiológicos, como a respiração. As
catecolaminas aumentam a permeabilidade das membranas branquiais, alterando a perda
difusiva de íons, aumentando, como conseqüência, a taxa de ventilação (SØRENSEN,
1991). O aumento da f
R
também pode indicar uma reação do animal à hipoxemia
ocasionada pelo cobre (HEATH, 1995). Assim o animal tenderia a ter uma maior oferta de
O
2
ao nível dos tecidos.
No presente estudo a ƒ
H
se alterou no grupo T2 apenas a partir de 12 h de exposição
ao CuSO
4
(Figura 11) RANDALL & PERRY (1992) e WENDELAAR BONGA (1997)
observaram que a f
H
, o débito cardíaco e a resistência vascular se elevam em Tilápia
mossâmbica quando a expuseram a concentrações sub-letais de cobre (3,2µM). No entanto,
BEAUMONT et al. (2002) observaram que em Salmo trutta exposta ao cobre, mesmo em
situação de exercício, não apresentaram alteração na freqüência cardíaca, possivelmente
devido à baixa dosagem de cobre (0,08µL). A bradicardia é uma resposta reflexa à
hipoxemia causada pelo espessamento da camada de muco que recobre as brânquias,
dificultando a difusão do O
2
da água para o sangue, um aumento na viscosidade do sangue,
ou o início de uma falência do animal frente à exposição ao tóxico (HEATH, 1995). Com o
aumento na
&
V
G
, a tendência é da água da corrente ventilatória passar mais rapidamente
através das lamelas secundárias, diminuindo o tempo de difusão do O
2
da água para o
sangue. Essa bradicardia hipóxica, além de poder ser acompanhada de um aumento do
volume sistólico, o que faz com que um maior número de lamelas secundárias seja
recrutado, diminui o tempo de passagem do sangue pelos sítios de troca gasosa,
Discussão_______________________________________________________________56
melhorando a relação perfusão-difusão e, conseqüentemente, a captação do O
2
pelas
brânquias.
6.0 - CONCLUSÕES
Pelos dados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que uma concentração
sub-letal de CuSO
4
(23,57mg. L
-1
) provoca variadas alterações na tilápia do Nilo:
a) leva a um aumento de Hct, tanto devido a estimular a eritropoiese, verificada
pelo aumento do RBC, quanto pelo aumento do VCM dado pela entrada d’água na célula;
b) aumenta a concentração de hemoglobina - Hb, provavelmente para otimizar a
tomada de O
2
dificultada pelo espessamento da camada de muco das brânquias;
c) inibe a atividade da enzima Na
+
/K
+
-ATPase branquial, tanto por agir diretamente
no sítio ativo dessa enzima, quanto por reduzir o influxo de Na
+
;
d) induz a síntese da MT nas brânquias, seqüestrando o Cu
+
, fato comprovado pelo
acúmulo de cobre nesse tecido;
e) altera as concentrações dos intermediários metabólicos (glicose, lactato, piruvato,
glicogênio), para atender a elevada demanda energética na tentativa de desintoxicação;
f) provoca uma hipoxemia tecidual, confirmado pelo acúmulo de lactato no MV
g) modifica as concentrações iônicas (Na
+
, K
+
e Cl
-
) em virtude de uma provável
quebra na membrana plasmática e/ou outras alterações morfológicas;
h) aumenta a concentração da amônia plasmática, por ser um fator estressante para
o animal e também por inibir o seu mecanismo excretório;
i) provoca alterações dos parâmetros cardio-respiratórios, como hiperventilação
(aumento da V
G
devido a um maior aumento no V
T
) e minimizar o déficit de O
2
, causado
pelo espessamento da camada de muco nas brânquias e, conseqüentemente, aumento da
barreira água-sangue e diminuição da difusão do O
2
para o sangue;
j) leva a uma bradicardia na tentativa de maximizar o tempo de passagem do
sangue pelas brânquias melhorando a relação perfusão-difusão.
Referências Bibliográficas_________________________________________________58
7.0 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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