( PDF ) Estudo do "genomic imprinting" na placenta de clones bovinos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

ESTUDO DO “GENOMIC IMPRINTING” NA PLACENTA DE

CLONES BOVINOS

Walt Yamazaki

Orientador: Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e

Veterinárias – Unesp, Campus de Jaboticabal, como

parte das exigências para obtenção do título de Doutor

em Medicina Veterinária (Reprodução Animal).

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL

Julho de 2006

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DADOS CURRICULARES DO AUTOR

WALT YAMAZAKI – nascido no município de São Paulo – SP, aos 30 dias

do mês de dezembro de 1974, concluiu o curso colegial no “Colégio Integral”, na

cidade de Campinas – SP, em dezembro de 1992. Ingressou no curso de

graduação em Medicina Veterinária na Faculdade de Ciências Agrárias e

Veterinárias – FCAV, Campus de Jaboticabal da Universidade Estadual Paulista –

UNESP, em fevereiro de 1993. Concluiu, em dezembro de 1998, o curso superior

de Medicina Veterinária; ingressou, em março de 1999, no programa de pós-

graduação, ao nível de Mestrado, sob orientação do Prof. Dr. Joaquim Mansano

Garcia, no Programa de Medicina Veterinária, Área de Concentração em

Reprodução Animal, na FCAV – UNESP de Jaboticabal, com bolsa de Mestrado

da FAPESP e concluiu, em dezembro de 2001, com a defesa da Dissertação

“Clonagem em bovinos utilizando-se células somáticas de animais adultos:

avaliação comparativa da reconstituição de citoplastos pelas técnicas de

transferência nuclear e injeção nuclear intracitoplasmática”; ingressou, em março

de 2002, no programa de pós-graduação, ao nível de Doutorado, sob orientação

do Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia, no Programa de Medicina Veterinária, Área

de Concentração em Reprodução Animal, na FCAV – UNESP de Jaboticabal, com

bolsa de Doutorado da FAPESP.

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iii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS.........................................................................................

LISTA DE FIGURAS..........................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................

viii

RESUMO...........................................................................................................

ABSTRACT.......................................................................................................

I. INTRODUÇÃO...............................................................................................

II. OBJETIVOS .................................................................................................

2.1. Objetivos Gerais......................................................................................

2.2. Objetivos Específicos..............................................................................

III. HIPÓTESES.................................................................................................

IV. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................

4.1. Produção de Indivíduos Geneticamente Idênticos..................................

4.2. Histórico da Clonagem............................................................................

4.3. A Técnica de Transferência Nuclear.......................................................

4.3.1. Obtenção e Maturação dos Oócitos Doadores de Citoplasma.......

4.3.2. Células Doadoras de Núcleo...........................................................

4.3.3. Coordenação do Ciclo Celular da Célula Doadora de Núcleo e do

Citoplasma Recipiente....................................................................

4.3.4. Enucleação Oocitária......................................................................

4.3.5. Introdução do Núcleo Doador..........................................................

4.3.6. Ativação Oocitária...........................................................................

4.4. Cultivo in Vitro dos Embriões Reconstituídos..........................................

4.5. Aplicações da Clonagem por Transferência Nuclear..............................

4.6. “Genomic Imprinting”...............................................................................

4.6.1. “Genomic Imprinting” e a Reprogramação Epigenética no

Desenvolvimento............................................................................

4.6.2. “Genomic Imprinting” na Gestação..................................................

4.6.3. Regulação da Expressão dos Genes “Imprinted” Igf2-H19 e Igf2r..

4.7. Reprogramação do Núcleo......................................................................

4.8. Falhas no Processo de Clonagem..........................................................

4.9. Problemas da Clonagem durante a Gestação........................................

V. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................

5.1. Produção de Gestações a Termo de Clones Bovinos Reconstituídos

por Transferência Nuclear......................................................................

5.2. Obtenção das Amostras de Placenta......................................................

5.3. Extração de RNA e Transcrição Reversa (RT-PCR)...............................

5.4. Avaliação dos Genes “Imprinted” pela PCR em Tempo Real.................

5.5. Análise Estatística...................................................................................

VI. RESULTADOS.............................................................................................

VII. DISCUSSÃO...............................................................................................

VIII. CONCLUSÕES..........................................................................................

IX. REFERÊNCIAS............................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Componentes utilizados para a PCR em tempo real para

avaliação da especificidade da amplificação dos “primers” dos genes

GAPDH, Igf2, Igf2r e H19..................................................................................

Tabela 2: Componentes utilizados para a PCR em tempo real para

avaliação da expressão dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19..........................

Tabela 3: Eficiência média da reação, desvio padrão, limites inferior e

superior e determinação do “threshold” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e

H19....................................................................................................................

Tabela 4: Taxas de estabelecimento de gestação (30d), mortalidade

embrionária (30-60d), abortos (60d-nascimento), nascimentos, mortalidade

pós-nascimentos e eficiência da técnica de clonagem por transferência

nuclear para cada uma das linhas celulares utilizadas como fonte doadora

de núcleo (*)......................................................................................................

Tabela 5: Dados dos clones bovinos nascidos vivos: identificação,

sobrevivência neonatal, sexo e peso ao nascimento (kg) (*)............................

Tabela 6: Dados dos neonatos bovinos do grupo controle concebidos por

monta natural: identificação, sexo e peso ao nascimento (kg) (*).....................

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Curva de Dissociação para avaliação da especificidade da

amplificação dos “primers” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.....................

Figura 2: Avaliação de amplificação específica de um único produto da PCR

em tempo real dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19 (eletroforese em gel de

agarose a 1,2%)................................................................................................

Figura 3: Curva padrão correspondente aos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e

H19 em diferentes diluições..............................................................................

Figura 4: Exemplo da determinação da eficiência das reações de PCR em

tempo real para o gene GAPDH, utilizando o programa LinRegPCR:

determinação dos limites superior e inferior (a), presença mínima de 4

pontos na curva de regressão (b) e alta correlação (r

) das amostras (c)........

Figura 5: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones em comparação a placentas de animais de monta natural (controle).

(*, p<0,05)..........................................................................................................

Figura 6: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones fêmeas em comparação a placentas de animais de monta natural

(controle). (*, p<0,05).........................................................................................

Figura 7: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones machos em comparação a placentas de animais de monta natural

(controle)...........................................................................................................

Figura 8: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones fêmeas em comparação a placentas de clones machos (controle).

(*, p<0,05)..........................................................................................................

Figura 9: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones vivos em comparação a placentas de animais de monta natural

(controle)...........................................................................................................

Figura 10: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones mortos em comparação a placentas de animais de monta natural

(controle)...........................................................................................................

Figura 11: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones vivos em comparação a placentas de clones mortos (controle)............

vii

Figura 12: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones nascidos com peso < 40kg em comparação a placentas de animais

de monta natural (controle)...............................................................................

Figura 13: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones nascidos com peso > 40kg em comparação a placentas de animais

de monta natural (controle).(*, p<0,05)..............................................................

Figura 14:

xpressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de

clones nascidos com peso > 40kg em comparação a placentas clones

nascidos com peso < 40kg (controle)...............................................................

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

6-DMAP 6-Dimetilaminopurina

bp pares de base

BSA Albumina Sérica Bovina

cDNA DNA complementar

Cálcio

CIV Cultivo in Vitro

COC Complexo cumulus-oócito

CSF Fator Citostático

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DEPC Dietilpolicarboneto

DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”

DMRs “Differential Methylated Regions”

Dnmt DNA metiltransferases

ES Cells “Embryonic Stem Cells” (Células Tronco Embrionárias)

F Fêmea

FIV Fertilização in Vitro

FSH Hormônio Folículo Estimulante

GAPDH “Glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase”

(Glutaraldeído-2-fosfato desidrogenase)

hCG Gonadotrofina Coriônica Humana

HSOF meio SOF com tampão Hepes

IC Centro “Imprint” Intergênico

ICSI Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide

ID Identificação

Igf2 “Insulin-like growth factor II”

(Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 2)

Igf2r “Insulin-like growth factor II receptor” ou “cation-

independent mannose 6-phosphate receptor”

(Receptor do Fator de Crescimento Semelhante à

Insulina Tipo 2 ou Receptor Cátion-Independente

Manose-6-Fosfato)

InsP

Inositol 1,4,5-Trifosfato

kg quilos

LH Hormônio Luteinizante

LinRegPCR Analysis of Real Time PCR Data

LOS ”Large Offspring Syndrome” (Síndrome da Cria Gigante)

M Macho

M.E. Mortalidade Embrionária

MII Metáfase II

MCI Massa Celular Interna

MIV Maturação in Vitro

morta/e Mortalidade

MPF Fator Promotor de Maturação

L Nitrogênio Líquido

nc/o Nascimento

PBS Solução salina com tampão fosfato

PCR Reação em Cadeira da Polimerase

PIV Produção in Vitro

RNA Ácido Ribonucléico

RT-PCR Transcrição Reversa por PCR

mRNA RNA mensageiro

SFB Soro Fetal Bovino

SOF “Synthetic Oviduct Fluid”

TCM-199 “Tissue Culture Medium 199”

TN Transferência Nuclear

UV Ultra-violeta

Xist “X-Inactivate Specific Transcript”

ESTUDO DO “GENOMIC IMPRINTING” NA PLACENTA DE CLONES BOVINOS

RESUMO – Embora a transferência nuclear com células somáticas tenha sido

usada com êxito para produção de animais viáveis, a eficiência desta técnica

ainda é baixa. Diversos problemas no desenvolvimento têm sido observados nos

clones, com alta mortalidade embrionária, fetal e mesmo pós-natal. A principal

causa das mortes tem sido atribuída a distúrbios placentários e fetais. Uma vez

que os genes “imprinted” são importantes para o desenvolvimento da placenta e

do feto, o objetivo deste estudo foi avaliar os padrões de expressão dos genes

Igf2, H19 e Igf2r na placenta de clones bovinos recém-nascidos, em comparação

com animais controles produzidos por monta natural. Fragmentos da placenta

foram coletados de 15 clones (6 machos e 9 fêmeas) e de 3 animais controles.

Após a extração de RNA e RT-PCR, a amplificação dos transcritos dos genes Igf2,

Igf2r, H19 e GAPDH (controle endógeno) foi realizado em PCR em tempo real. A

placenta dos clones apresentou diminuição da expressão relativa dos genes H19

(41,5%) e Igf2 (42,9%) em comparação ao grupo controle. A placenta de clones

fêmeas apresentou diminuição de 72,6% dos transcritos de H19 quando

comparados a clones machos. Não houve diferença significativa entre clones vivos

e mortos. Na placenta de clones pesando mais que 40kg, uma diminuição da

expressão relativa do H19 (40,1%) e Igf2 (36,3%) foi observada, em comparação

ao grupo controle. Nossos resultados indicam que, mesmo em clones recém-

nascidos, uma reprogramação nuclear incompleta é observada na placenta dos

clones. Alterações no padrão de expressão dos genes “imprinted” H19 e Igf2

podem provocar distúrbios na placenta e no desenvolvimento do feto, o que pode

contribuir para a mortalidade pós-natal. Uma diminuição da regulação do gene

H19 na placenta de clones fêmeas, sugere que o processo de reprogramação em

alguns genes pode ser influenciado pelo sexo.

palavras-chave: clonagem, bovino, genes “imprinted”, transferência nuclear

STUDY OF “GENOMIC IMPRINTING” IN THE PLACENTA OF BOVINE CLONES

ABSTRACT - Although somatic cell nuclear transfer has been successfully used to

produce viable offspring, the efficiency of this technique remains low. Several

developmental problems have been observed in clones, with high embryonic, fetal

and even postnatal mortality. The main cause of deaths has been attributed to

placental and fetal disturbs. As imprinted genes are important in the placenta and

fetal development, the aim of this study was to evaluate the expression patterns of

Igf2, H19 and Igf2r genes in the placenta of newborn bovine clones, in comparison

with control animals produced by natural mating. Fragments from the placenta

were collected from 15 cloned animals (6 males and 9 females) and from 3 control

animals. After RNA extraction and RT-PCR, the amplification of the transcripts of

Igf2, Igf2r, H19 and GAPDH genes (endogen control) were performed by real-time

PCR. Placenta of cloned animals presented a decrease in relative expression of

H19 (41.5%) and Igf2 (42.9%) genes in comparison with the control group.

Placenta of female clones presented a decrease of 72.6% in the frequency of H19

transcripts when compared with males. No significant differences were observed

between live and dead newborn clones. In the placenta of cloned animals weighing

over 40kg, a decrease in relative expression of H19 (40.1%) and Igf2 (36.3%) was

observed, in comparison with the control groups. Our results indicate that even in

newborn cloned animals, an incomplete nuclear reprogramming is observed in the

placenta of the clones. Alterations in the expression patterns of imprinted genes

H19 and Igf2 may cause disturbs in the placenta and in fetal development, which

may contribute to the postnatal mortality. Downregulation of H19 gene in the

placenta of female clones, in comparison to males, suggests that the process of

reprogramming in some genes could be influenced by the sex.

keywords: cloning, bovine, imprinted genes, nuclear transfer

I. INTRODUÇÃO

Nos mamíferos domésticos, o aumento dos índices produtivos bem como a

maior disseminação de material genético superior nos rebanhos tem sido alvo de

intensos estudos e investimentos, o que tem permitido um grande avanço e

desenvolvimento de diversas biotecnologias ligadas à reprodução animal. Desde o

relato do nascimento da ovelha Dolly (WILMUT et al., 1997), a clonagem passou a

ser uma das biotécnicas mais discutidas e estudadas, com um crescente interesse

tanto da comunidade científica como da indústria, uma vez que fora demonstrado

ser possível a produção de cópias genômicas a partir de células obtidas de um

animal adulto. Este grande interesse no desenvolvimento desta biotecnologia,

denominada de transferência nuclear, pode ser explicado devido às suas

potenciais aplicações, como a produção e multiplicação de animais geneticamente

idênticos e superiores, a preservação de espécies ameaçadas de extinção e a

produção de órgãos e tecidos para xenotransplantes (clonagem terapêutica). Além

disso, uma vez que as células doadoras podem ser mantidas em cultivo celular, a

clonagem possibilitou um grande avanço na produção de animais transgênicos, já

que as células podem ser modificadas geneticamente ainda durante o processo de

cultivo celular, antes da utilização destas células para reconstituição.

Embora a clonagem seja uma realidade, com vários animais clonados a

partir desta técnica em diferentes espécies, verifica-se ainda uma baixa eficiência

quanto à capacidade de desenvolvimento in vitro dos embriões reconstituídos e

obtenção de gestações de clones a termo, com altos índices de mortalidade

embrionária, fetal, peri e pós-natal. Dentre os diversos fatores que podem estar

contribuindo para estes baixos resultados envolvendo a clonagem, tem-se

atentado para questões ligadas à reprogramação do núcleo, especialmente ao

“genomic imprinting”. Os genes “imprinted” são caracterizados por apresentarem

expressão de apenas um dos alelos parentais em estádios específicos do

desenvolvimento. Uma vez que os genes “imprinted” são importantes no

desenvolvimento fetal e placentário, como o Igf2, Igf2r e H19, aliado ao fato de

que vários distúrbios placentários têm reflexo direto na taxa de sobrevivência fetal

e neonatal, torna-se importante investigar qual o comportamento destes genes

não apenas nos clones bovinos, mas também em sua placenta. Embora os

distúrbios placentários e fetais tenham sido bem caracterizados em bovinos, ainda

há uma carência de informações sobre a regulação e os padrões de expressão

destes genes “imprinted” nesta espécie.

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivos Gerais

Avaliar o padrão transcripcional de genes “imprinted” na placenta de

neonatos bovinos clonados com células somáticas em comparação a placenta de

neonatos produzidos por monta natural (grupo controle).

2.2. Objetivos Específicos

Estimar a freqüência dos transcritos dos genes “imprinted” Igf2 (“imprint” do

alelo materno e expresso pelo alelo paterno), H19 e Igf2r (“imprint” do alelo

paterno e expresso pelo alelo materno) em placentônios de animais clonados e

animais controle (monta natural), que se desenvolveram a termo.

Verificar a existência de correlação entre os genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e

H19 na placenta de clones.

Avaliar a existência de relação entre modificações dos padrões de

expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19 em placentônios de clones

bovinos e a mortalidade neonatal.

Verificar se a diferença de sexo entre os clones pode influenciar a

freqüência dos transcritos do Igf2r, Igf2 e H19 nas placentas destes animais.

Estudar se clones classificados em diferentes faixas de peso ao nascimento

podem apresentar modificação da expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e

H19 em suas respectivas placentas.

III. HIPÓTESES

1) Mesmo em clones bovinos produzidos a termo com sucesso, ocorrem

modificações na transcrição placentária dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19;

2) Assim como descrito em clones murinos, existe uma correlação entre os

genes “imprinted” Igf2 e H19 na placenta de neonatos clones bovinos;

3) Alterações placentárias dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19 estão

relacionadas à mortalidade neonatal;

4) O sexo do clone influencia o padrão de expressão dos genes “imprinted”

Igf2r, Igf2 e H19 na placenta;

5) Animais clonados classificados em diferentes faixas de peso apresentam

modificação placentária do padrão de expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2

e H19.

IV. REVISÃO DE LITERATURA

4.1. Produção de Indivíduos Geneticamente Idênticos

A palavra clone é originária do grego “klôn” e tem por significado “broto”,

sendo sinônimo de “indivíduo ou população de indivíduos proveniente da

reprodução vegetativa ou assexuada de um único indivíduo”. Inicialmente definida

para representar as técnicas assexuadas de enxertia e brotamento para a

multiplicação de plantas, a clonagem passa a ter um outro significado com o

aprimoramento das técnicas de manipulação de embriões.

No início da década de 80, com o objetivo de aumentar a eficiência nos

programas de transferência de embriões e propiciar a rápida multiplicação de

indivíduos valiosos, gêmeos monozigóticos foram produzidos através da bipartição

de embriões (WILLADSEN, 1979). Estes indivíduos geneticamente idênticos

foram, em essência, os primeiros clones produzidos utilizando-se técnicas

artificiais de reprodução em laboratório. Entretanto, após inicial entusiasmo

(WILLADSEN, 1980), dificuldades técnicas e comprometimento das taxas de

prenhez limitaram sua aceitação nos meios acadêmicos, embora tenha sido ainda

posteriormente aplicada em outras espécies (OZIL et al., 1982; LEIBO & RALL,

1987; LEWIS, 1994). Mesmo com aprimoramento da técnica e melhora dos

índices de gestação, a simples limitação matemática de criar, no máximo, quatro

indivíduos geneticamente idênticos, fizeram com que os cientistas concentrassem

seus estudos em uma outra técnica, denominada de “transferência nuclear”.

4.2. Histórico da Clonagem

Baseado no conceito de “equivalência nuclear”, proposto por SPEEMANN

(1938) num modelo auto-denominado de “fantástico”, devido às dificuldades

técnicas, foi possível obter clivagens de um citoplasma enucleado de um zigoto de

anfíbio contendo o núcleo de um embrião de 8 a 16 células. Amarrando um fio de

cabelo de uma boneca ao redor de um zigoto, houve a constrição do citoplasma

em duas metades: uma contendo núcleo e outro “enucleado”. A porção do

citoplasma contendo o núcleo se dividiu até 8-16 células, quando se desfez a

constrição e o núcleo deste blastômero passou então para a porção do citoplasma

“enucleado”, tendo ocorrido, posteriormente, a clivagem. O questionamento de

que “se o núcleo de células diferenciadas poderia retornar ao estádio funcional de

zigoto após transferência manual para um óvulo fecundado enucleado”, no

entanto, parecia algo impossível.

BRIGGS & KING (1952), em seu clássico trabalho de investigação da

totipotência nuclear, foram os pioneiros na microcirurgia e transferência de núcleo

em eucariotos. Através da enucleação de um zigoto de anfíbio seguido da injeção

do núcleo de uma célula embrionária no estádio de blástula diretamente no

citoplasma do óvulo fecundado, foi possível a retomada do desenvolvimento até o

estádio larval de girino. A totipotência destas células embrionárias foi comprovada

posteriormente com a repetição da experimentação e obtenção de anfíbios adultos

(Xenopus laevis, GURDON, 1961; Rana pipiens, McKINNELL, 1962). Embora

fêmeas adultas férteis tenham sido produzidas a partir da reconstituição com

células da endoderme do intestino de girinos (GURDON & UEHLINGER, 1966),

ainda não foi comprovada a viabilidade da técnica com células diferenciadas de

anfíbios adultos (DIBERARDINO, 1987; GURDON, 1999).

O nascimento dos primeiros mamíferos clonados com êxito utilizando-se

células embrionárias como fonte doadora de núcleo foi descrita por ILLMENSEE &

HOPPE (1981), com o nascimento de três clones de camundongos reconstituídos

a partir de direta introdução do núcleo de células da massa celular interna no

citoplasma de zigotos, que tiveram posteriormente removidos ambos os pró-

núcleos. Entretanto, como nenhum outro grupo de cientistas conseguiu repetir tal

experimento, o mesmo passou a ser questionado e dado como fraudulento,

levando a comunidade científica a declarar que a clonagem por microcirurgia seria

biologicamente impossível (MARX, 1983; McGRATH & SOLTER, 1984b;

McLAREN, 1984).

Foi somente após o aperfeiçoamento da técnica, passando-se a adotar um

método não invasivo de introdução do núcleo doador (fusão celular), denominado

de transferência nuclear (McGRATH & SOLTER, 1983), e, principalmente, em

decorrência da substituição de zigotos por oócitos em estádio de metáfase II como

fonte doadora de citoplasma, que os primeiros mamíferos clonados foram

produzidos (WILLADSEN, 1986) em ovinos. Seguido deste primeiro sucesso, o

uso de células embrionárias no processo de reconstituição também mostrou ser

viável na clonagem em outras espécies, como em bovinos (PRATHER et al.,

1987), coelhos (STICE & ROBL; 1988), suínos (PRATHER et al., 1989b), e

posteriormente em camundongos (KONO et al., 1991; CHEONG et al., 1993),

macacos (MENG et al., 1997) e caprinos (YONG & YUQIANG, 1998).

Avanços das técnicas de cultivo permitiram o estabelecimento de linhas

celulares, que mais tarde, mostrar-se-iam importantes na manutenção de células

doadoras de núcleo, podendo ser estocadas e guardadas mesmo após a morte do

animal. A partir de células da massa celular interna mantidas em cultivo in vitro por

quatro semanas, foi possível a obtenção de clones viáveis por transferência

nuclear (SIMS & FIRST, 1994). Posteriormente, com o estabelecimento de linhas

celulares a partir do disco embrionário de embriões de 9 dias e induzidas à

quiescência por privação de soro do meio de cultura por um período de 3 a 4 dias

antes da reconstituição, gestações a termo foram produzidas (CAMPBELL et al.,

1996a). Com base nestes resultados e observações, WILMUT e colaboradores

(1997) provocaram uma das maiores revoluções da ciência contemporânea

recente: utilizando linhas celulares estabelecidas de células da glândula mamária

de uma ovelha de 6 anos de idade, sincronizadas em fase G

-G

do ciclo celular

pela privação de soro, foi possível, muito mais do que responder ao

questionamento de SPPEMANN (1938), demonstrar a viabilidade da clonagem de

indivíduos adultos para todo o mundo.

Desde então, a clonagem utilizando-se células somáticas adultas

diferenciadas já foi relatada com êxito em diversas outras espécies, como em

bovinos (KATO et al., 1998), camundongos (WAKAYAMA et al., 1998), caprinos

(BAGUISI et al, 1999; ZOU et al., 2001), suínos (BETTHAUSER et al., 2000;

ONISHI et al., 2000; POLEJAEVA et al., 2000), gatos (SHIN et al., 2002; YIN et al.,

2005), cães (LEE et al., 2005), coelhos (CHESNE et al., 2002), ratos (ZHOU et al.,

2003), mulas (WOODS et al., 2003) e eqüinos (GALLI et al., 2003).

4.3. A Técnica de Transferência Nuclear

A técnica de reconstituição por transferência nuclear envolve, basicamente,

as seguintes etapas: obtenção das células doadoras de núcleo, obtenção oócitos

doadores de citoplasto, sincronização do ciclo celular, maturação in vitro, remoção

da cromatina do oócito (enucleação oocitária), introdução do núcleo doador no

citoplasto, ativação do oócito reconstituído, cultivo in vitro e inovulação dos

embriões. Como se trata de uma técnica relativamente complexa, com grande

número de variações entre cada uma das etapas envolvidas decorrentes de

diferentes metodologias empregadas pelos diversos grupos de pesquisa que tem

trabalhado com a clonagem, aliado ao fato de que existem diferenças espécies-

específicas, há uma ampla variação dos resultados no que diz respeito ao

desenvolvimento até o estádio de blastocisto (ROBL, 1999; WELLS, 1999;

WESTHUSIN et al., 2001). As variações existentes entre os métodos, células e

espécies empregados na clonagem dificultam a comparação entre os diferentes

resultados, o que, em muitas vezes, torna mais difícil o refinamento da técnica.

Deste modo, tem-se como importante avaliar e diferenciar os efeitos da técnica

com os eventos biológicos que ocorrem durante o desenvolvimento dos embriões

reconstituídos, para que seja possível uma correta interpretação dos resultados.

4.3.1. Obtenção e Maturação dos Oócitos Doadores de Citoplasma

De modo geral, têm-se utilizado no processo de reconstituição, oócitos

maturados in vitro em estádio de metáfase II. Nas espécies domésticas,

principalmente em bovinos, devido à disponibilidade de ovários de abatedouro,

usados nos procedimentos de fertilização in vitro, o emprego deste tipo de fonte

doadora de citoplasma tem sido rotina na grande maioria dos centros de pesquisa.

Em animais de laboratório, oócitos maturados in vivo de boa qualidade podem ser

obtidos de animais superovulados, mas no caso de grandes animais, como ovinos

e suínos, torna-se um procedimento muito caro, e em bovinos e eqüinos, embora

seja tecnicamente possível, é economicamente inviável. Acredita-se que oócitos

maturados in vivo sejam a melhor fonte doadora de citoplasma sob o ponto de

vista da qualidade, a partir de comparações de oócitos maturados in vitro ou in

vivo que se desenvolveram ao estádio de blastocisto após a fertilização

(DIELEMAN et al., 2002). Em contrapartida, o uso de oócitos maturados in vitro

oferece algumas vantagens técnicas, além de econômicas, incluindo a

possibilidade de escolher o tempo de maturação (MIYOSHI et al., 2002) e o uso

de oócitos em diferentes estágios do ciclo meiótico (MIYOSHI et al., 2001).

A heterogeneidade dos oócitos maturados in vitro é um ponto negativo do

uso de ovários de matadouro, pois variáveis como origem dos ovários (animal,

raça, condição nutricional) e estágio do ciclo estral podem ter influência sobre a

competência oocitária (HAGEMANN, 1999) e, deste modo, interferir no processo

de reprogramação nuclear. Problemas de implantação de blastocistos, bem como

desenvolvimento fetal anormal, podem ser reflexo de uma inapropriada maturação

oocitária (MOOR et al., 1998). A ocorrência de interações entre o oócito recipiente

e o núcleo doador a ser reprogramado são importantes para o início do

desenvolvimento embrionário de clones (FULKA Jr et al., 2001).

Além disso, deve-se atentar para as condições de homoplasmia ou

heteroplasmia que podem se estabelecer no novo indivíduo produzido pela

clonagem, uma vez que, no oócito receptor, existem mitocôndrias (mtDNA) que

podem diferir do haplótipo daqueles encontrados na célula doadora de núcleo

(EVANS et al., 1999; MEIRELLES et al., 1999, 2001; SMITH et al., 2000b;

TAKEDA et al., 1999; HIENDLEDER et al., 1999; FERREIRA, 2002) e, como

conseqüência, problemas de interação núcleo-citoplasmática podem implicar em

falhas no desenvolvimento embrionário e fetal (HIENDLEDER et al., 2005; LU et

al., 2005).

Considerando-se que no oócito existam estoques maternos de RNAm e

proteínas, bem como o ambiente citoplasmático é responsável pelo processo de

reprogramação nuclear, a identificação e seleção do mais apropriado oócito

doador de citoplasma certamente irá melhorar a eficiência da clonagem.

4.3.2. Células Doadoras de Núcleo

Atualmente, na clonagem somática, tem-se utilizado como fonte doadora de

núcleo, células obtidas de vários tecidos (OBACK & WELLS, 2002) e de animais

de várias idades (fetos, recém-nascidos, jovens, idosos e até mesmo de animais

mortos após um período relativamente curto). Uma ampla variedade de tipos de

células já foi empregada na clonagem, como por exemplo: células da glândula

mamária (WILMUT et al, 1997), leucócitos (GALLI et al., 1999), linfócitos B e T

(HOCHEDLINGER & JAENISCH, 2002), condrócitos (BEYHAN et al., 2000),

células do cumulus (WAKAYAMA et al., 1998; TAMASHIRO et al., 2000), da

granulosa (WELLS et al., 1999; POLEJAEVA et al., 2000), do oviduto (KATO et al.,

1998), de Sértoli (OGURA et al., 2000a), do fígado e uterinas (KATO et al., 2000),

dentre outras (BREM & KUHHOLZER, 2002; OBACK & WELLS, 2002). Entretanto,

tem-se verificado diferenças quanto às taxas de desenvolvimento dos embriões

reconstituídos de acordo com a célula doadora de núcleo utilizada (KATO et al.,

2000), indicando que algumas células são mais facilmente reprogramadas do que

outras. As células podem ser usadas diretamente após a coleta do animal doador

(GALLI et al., 1999) ou seguido de um período de cultivo celular (WILMUT et al.,

1997; KUBOTA et al., 2000), bem como frescas ou após criopreservação. Na

prática, diferenças entre os tipos células não seria maior do que a diferença entre

população de células originárias de um mesmo tecido (KUHHOLZER et al., 2001),

indicando que o status da cromatina é mais importante do que a origem do tecido

(GALLI et al., 2002). Sabe-se que o genoma da célula pode passar por

modificações que podem interferir no êxito da técnica antes de sua utilização na

reconstituição, tais como: recombinação genética (que ocorre em linfócitos B e T,

o que pode explicar sua baixa eficiência como fonte doadora de núcleo;

HOCHEDLINGER & JAENISCH, 2002), espontâneas mutações, alteração de

ploidia (KING et al., 2006), danos genéticos promovidos por stress oxidativo e

envelhecimento da cromatina. Estas modificações podem ser influenciadas pelas

condições de cultivo celular bem como pelo número de passagens (RENARD et

al., 2002).

Uma vez que a estrutura da cromatina e as modificações epigenéticas são

consideradas os principais fatores determinantes do sucesso da clonagem, parece

que quanto maior o estádio de diferenciação celular de uma célula, mais difícil e

complexo seria o processo de reprogramação do núcleo a um estádio embrionário

de zigoto. Mas as razões para estas diferenças ainda não são conclusivas.

O que se verifica na rotina, no entanto, é o uso de linhas celulares

estabelecidas de fibroblastos coletados da pele, principalmente devido a sua maior

praticidade, possibilidade de clonagem tanto de machos como de fêmeas,

condições de cultivo celular bem conhecidas com produção de linhas primárias

estáveis, homogêneas, de alta capacidade mitótica e resistentes ao processo de

congelação (HEYMAN et al., 2000).

4.3.3. Coordenação do Ciclo Celular da Célula Doadora de Núcleo e do

Citoplasma Recipiente

A sincronização do ciclo celular entre o núcleo da célula doadora com o

citoplasto do oócito receptor é importante para assegurar que seja mantida a

correta ploidia após a reconstrução. Esses conceitos foram fundamentados

inicialmente na clonagem utilizando-se células embrionárias como fonte doadora

de núcleo, baseados no efeito que o Fator Promotor de Maturação (MPF) teria

sobre o núcleo. O MPF é um complexo protéico composto por duas subunidades

catalíticas (proteína quinase p34

cdc2

, regulada por eventos de fosforilação e

desfosforilação de seus sítios catalíticos, e a ciclina B

, subunidade regulatória), e

na sua forma ativa, regula o processo de duplicação e divisão celular, numa

cascata de eventos (quebra do envelope nuclear, condensação dos cromossomos,

reorganização do citoesqueleto e alterações na morfologia da célula) que permite

que a célula entre em mitose ou meiose (NURSE, 1990; MASUI, 1992).

Na clonagem embrionária, onde há uma contínua duplicação do DNA dos

blastômeros para as sucessivas clivagens, o fato de que a maioria das células

encontra-se em fase S do ciclo celular (80%) exige um citoplasto pré-ativado

(oócitos enucleados em telófase II e, portanto, com baixos níveis do MPF) para

que a ploidia do embrião reconstituído seja mantida (CAMPBELL et al., 1996b), já

que em oócitos em metáfase II (alta atividade do MPF), a manutenção de um

núcleo diplóide só é possível com o uso de blastômeros em fase G

do ciclo

celular. A sincronização do ciclo celular do núcleo doador pode ser realizada nas

fases G

, S ou G

utilizando-se, respectivamente, as drogas afidicolina (inibidor

específico da DNA polimerase α que impede a replicação do DNA e início da fase

S; SAMAKÉ & SMITH, 1997b), nocodazole (inibidor da polimerização dos

filamentos de tubulina e interrompe o ciclo celular em metáfase; KATO &

TSUNODA, 1992; SAMAKÉ & SMITH, 1996) e 6-Dimetilaminopurina (6-DMAP;

inibidor de fosforilação que inibe a formação do complexo ativo do MPF; SAMAKÉ

& SMITH, 1997a).

Na clonagem envolvendo a transferência nuclear de células somáticas,

baseado nos experimentos que deram origem a ovelha Dolly (CAMPBELL et al.,

1996a; WILMUT et al., 1997), passou-se a adotar tal protocolo como rotina: uso de

citoplastos com alta atividade do MPF (enucleados em metáfase II) e células

doadoras de núcleo sincronizadas em presuntivo estádio G

do ciclo celular,

mantidas em quiescência no cultivo celular por privação de soro (BAGUISI et al.,

1999; WELLS et al., 1998, 1999; TANI et al., 2001; DANIELS et al., 2000, 2001).

Acreditava-se que, com a quebra da vesícula germinativa e prematura exposição

da cromatina do núcleo doador ao citoplasma, a reprogramação do núcleo

ocorreria mais cedo e que a sincronização em fase G

facilitaria a reprogramação

em decorrência de alterações na estrutura nuclear e redução da atividade

transcripcional.

Embora existam evidências de que a utilização de citoplastos não ativados

(oócitos enucleados em metáfase II) e células doadoras sincronizadas antes da

fase S proporcionam melhores taxas de desenvolvimento, corroborando com a

proposição de que quanto maior o tempo de exposição do núcleo doador ao

ambiente citoplasmático, melhor seria a reprogramação nuclear (TANI et al.,

2001), não se pode descartar a possibilidade do uso de citoplastos com baixos

níveis do MPF na clonagem, uma vez que já foi demonstrado sua viabilidade, com

a produção de clones a termo, utilizando-se oócitos envelhecidos (VIGNON et al.,

1998) ou pré-ativados (BAGUISI et al., 1999).

A sincronização do ciclo celular em fase G

, embora seja eficiente para

manutenção da ploidia, com desenvolvimento de embriões ao estádio de

blastocisto e obtenção de gestações a termo, parece não ser essencial para o

desenvolvimento (WILMUT et al., 1997), uma vez que, estudos posteriores

utilizando-se células em fase G

, pela manutenção das linhas celulares até

apresentarem-se sub-confluentes, tiveram êxito na produção de clones a termo

(CIBELLI et al., 1998; KASINATHAN et al., 2001). Células sincronizadas em outras

fases que não em G

-G

também podem ser usadas na clonagem, como em fase

M, com tratamento por nocodazole (WAKAYAMA et al., 1999; ONO et al., 2001;

TANI et al., 2001) ou G2/M, com tratamento com colchicina (LAI et al., 2002).

4.3.4. Enucleação Oocitária

Para que o núcleo doador possa iniciar seu desenvolvimento no citoplasto,

é necessário a prévia remoção do DNA dos oócitos. Este processo, denominado

de “enucleação oocitária”, tem-se mantido ao longo dos anos, consistindo

basicamente de uma microcirurgia com auxílio de micropipetas acopladas a

microinjetores e micromanipuladores em meio contendo inibidores do

citoesqueleto (citocalasina B ou D), pré-incubação com um corante de DNA

(Hoechst 33342), com a aspiração, para o interior de uma micropipeta, do primeiro

corpúsculo polar e parte adjacente do citoplasma do oócito em metáfase II. A

confirmação da enucleação se faz através da exposição do material aspirado à luz

ultra-violeta (UV), permitindo a visualização da cromatina. Ao contrário da

enucleação de oócitos de camundongos, espécie onde não é necessário o uso de

corantes de DNA (WAKAYAMA et al., 1998), tal procedimento é adotado

especialmente em bovinos e suínos, em decorrência da presença de maior

quantidade de lipídeos no oócito, que dificultam a visualização da placa

metafásica. A irradiação de UV diretamente do oócito pode ser efetiva na

destruição dos cromossomos em metáfase, não havendo a necessidade de

removê-la, como descrito em anfíbios. No entanto, em mamíferos, procedimentos

semelhantes podem provocar danos às organelas citoplasmáticas e à membrana

plasmática, prejudicando a competência oocitária (SMITH, 1993; BRADSHAW et

al., 1995; LEAL et al., 1999).

A bissecção dos oócitos (WILLADSEN, 1986) não se mostrou eficaz, pois

há grande comprometimento do volume de citoplasma, com reflexos na

capacidade de desenvolvimento (ZAKHARTCHENKO et al., 1997) e qualidade dos

embriões reconstituídos (WESTHUSIN et al., 1996). Recentemente, utilizando-se

a bissecção de oócitos, uma nova técnica de enucleação foi proposta sem o

auxílio de micromanipuladores, denominada de “Handmade Cloning” (BOOTH et

al., 2001; VAJTA et al., 2001, 2003): fusão de duas metades de oócitos bipartidos

sem a placa metafásica juntamente com a célula doadora de núcleo, utilizando-se

fitohemaglutinina.

Um método alternativo à enucleação de oócitos em metáfase II e o uso de

corante de DNA, seria utilizar oócitos em telófase II, removendo-se o segundo

corpúsculo polar em processo de extrusão (BORDIGNON & SMITH, 1998). Menor

quantidade de citoplasma seria removida do oócito bem como se evitaria o uso de

corantes de DNA. Inicialmente desenvolvida para solucionar os problemas de

sincronização dos blastômeros na clonagem embrionária, a enucleação em

telófase II já foi utilizada com sucesso na clonagem somática (BAGUISI et al.,

1999). No entanto, citoplastos pré-ativados possuem níveis baixos de MPF, o que

poderia prejudicar o processo de reprogramação nuclear (TANI et al., 2001).

Oócitos de mamíferos podem também ser enucleados por ultra-

centrifugação, com remoção da placa metafásica após seu deslocamento para a

periferia do oócito (TATHAM et al., 1995). A enucleação química pode também ser

empregada utilizando-se etoposide, agente inibidor da enzima DNA-

topoisomerase II, que atua impedindo a separação das cromátides, sendo a

cromatina removida juntamente com o segundo corpúsculo polar após ativação

oocitária (FULKA Jr & MOOR, 1993; ELSHEIKH et al., 1997, 1998; KÁRNÍKOVÁ

et al., 1998). Outro agente químico, a demecolcine (despolimerizador de

microtúbulos), já foi usado para induzir a completa enucleação em oócitos pré-

ativados em camundongos (BAGUISI & OVERSTROM, 2000) e parcial

enucleação em coelhos (YIN et al., 2002a), suínos (YIN et al., 2002a) e bovinos

(RUSSELL et al., 2005), induzindo-se a protusão de membrana contendo toda

cromatina condensada, com subseqüente remoção mecânica. Utilizando-se a

demecolcine, clones viáveis já foram produzidos em camundongos, na enucleação

química completa (BAGUISI & OVERSTROM, 2000; GASPARRINI et al., 2003), e

em suínos, na enucleação química parcial (YIN et al., 2002b; KAWAKAMI et al.,

2003).

4.3.5. Introdução do Núcleo Doador

A introdução do núcleo doador no interior do citoplasto pode ser realizada

de duas maneiras: através de fusão celular ou por injeção nuclear

intracitoplasmática (YAMAZAKI, 2001). Na reconstituição por fusão celular, após a

transferência da célula doadora de núcleo para o espaço perivitelíneo do oócito

enucleado, deve ocorrer a fusão entre ambas as membranas citoplasmáticas,

permitindo que o núcleo, juntamente com o citoplasma da célula, seja introduzido

no citoplasma do oócito. Neste sentido, é importante a manutenção da integridade

e viabilidade das membranas, e que estas estejam em íntimo contato. Embora a

fusão celular possa ser realizada por outros métodos (vírus Sendai,

polietilenoglicol e lisolecitina; EGLITIS, 1980; SPLINDE, 1981; McGRATH &

SOLTER, 1983, 1984a), a eletrofusão tem sido a técnica mais rotineiramente

usada na clonagem animal, com exceção dos camundongos. Pulsos elétricos de

corrente direta promovem desestabilização temporária das membranas

citoplasmáticas da célula doadora e do citoplasto em sua região de contato,

induzindo a formação de poros nas membranas, que se reorganizam

posteriormente já fundidas (ZIMMERMANN & VIENKEN, 1982; SMITH, 1992).

Uma vez que, na fusão celular, juntamente com o núcleo doador é

introduzido todo o citoplasma da célula, incluindo todas as organelas, proteínas,

RNAs e mitocôndrias, deve-se atentar para os efeitos que esta nova condição de

interação núcleo-citoplasmas possa exercer sobre o potencial de desenvolvimento

do embrião reconstituído (SMITH & ALCIVAR, 1993; MEIRELLES & SMITH, 1998;

NAGAO et al., 1998; YAMAZAKI et al., 1999; FERREIRA, 2002).

Sob este ponto de vista de interação núcleo-citoplasmática, a injeção

nuclear intracitoplasmática seria mais vantajosa, pois é introduzido apenas o

núcleo no interior do citoplasto. Para tanto, o núcleo é isolado com ruptura da

membrana citoplasmática da célula doadora, e introduzido diretamente no interior

do citoplasma do oócito enucleado, em procedimento semelhante à injeção

intracitoplasmática de espermatozóide – ICSI (PALERMO et al., 1995). Os

primeiros camundongos clonados a partir de células somáticas foram produzidos

utilizando-se esta técnica (WAKAYAMA et al. 1998), além dos primeiros clones

machos (WAKAYAMA & YANAGIMACHI, 1999), bem como produzido por células

tronco embrionárias (WAKAYAMA et al., 1999). O uso de um sistema piezoelétrico

facilita o processo de isolamento do núcleo e a injeção intracitoplasmática

(WAKAYAMA et al. 1998; GALLI et al., 1999; ONISHI et al., 2000), embora não

seja essencial (ZHOU et al., 2000; LOI et al., 2001). Em bovinos, a direta

comparação entre as técnicas demonstrou menor taxa de desenvolvimento a

blastocistos com o uso da injeção nuclear intracitoplasmática (YAMAZAKI, 2001;

GALLI et al., 2002), mas com mesmo potencial de desenvolvimento a termo

(GALLI et al., 2002).

Recentemente, uma terceira técnica foi relatada não envolvendo

prolongada manipulação dos oócitos (fusão) ou células doadoras (isolamento do

núcleo doador). Nas duas técnicas anteriores, a eficiência da clonagem pode ser

afetada negativamente devido a baixos índices de fusão celular bem como a

danos nucleares provocados no momento do isolamento do núcleo. A direta

injeção citoplasmática de toda célula doadora de núcleo intacta mostrou-se viável

na produção de clones em suínos, demonstrando que, ao contrário do que

acreditava-se anteriormente, o ambiente citoplasmático é capaz de promover a

dissolução da membrana citoplasmática da célula doadora, permitindo que o

núcleo passe para o interior do citoplasto (LEE et al., 2003).

4.3.6. Ativação Oocitária

Na maioria dos mamíferos, oócitos são ovulados e mantidos em metáfase II

até a fertilização. Durante o processo de maturação, ocorre uma específica

reorganização e redistribuição das organelas citoplasmáticas, com uma série de

alterações morfofisiológicas complexas de moléculas sinalizadoras para assegurar

que o desenvolvimento embrionário prossiga após a fecundação (MIYAZAKI et al.,

1993; CARROLL, 2001). Com a fecundação, os oócitos retomam a meiose e

iniciam o desenvolvimento em decorrência de uma cascata de eventos celulares,

num processo denominado de ativação oocitária. Elevações transitórias e

periódicas do Ca

livre intracelular, permitem que o oócito saia do bloqueio da

meiose em decorrência da inativação do MPF e do fator citostático (CSF) (LORCA

et al., 1991, 1993; COLLAS et al., 1993), com exocitose de grânulos corticais,

descondensação do núcleo espermático, recrutamento de mRNA materno,

formação dos pró-núcleos e início da síntese de DNA.

Na clonagem, os atuais protocolos de ativação oocitária estão geralmente

fundamentados na indução da ativação partenogenética do oócito em metáfase e

nos dados do subseqüente desenvolvimento embrionário (FISSORE et al., 1999).

Diversas combinações de agentes indutores de ativação já foram testadas na

produção de partonotos em bovinos (MÉO, 2002, 2005; MÉO et al., 2004, 2005) e

subsequentemente avaliados na clonagem (YAMAZAKI, 2001; YAMAZAKI et al.,

2005). Ativações ineficientes ou não-fisiológicas podem levar a falhas do

desenvolvimento mesmo após a implantação, tornando-se importante avaliar qual

o efeito da adoção destes métodos de ativação partogenética na clonagem, no

que diz respeito à manutenção da competência oocitária na reprogramação

nuclear.

Diversos agentes de ativação têm sido empregados na clonagem, sendo os

principais:

• pulsos elétricos de corrente direta de alta voltagem e curta duração:

promovem aumento do Ca

intracelular através da abertura temporária de

poros na membrana plasmática do oócito, permitindo trocas de íons e

macromoléculas, com entrada de Ca

extracelular (ZIMMERMANN &

VIENKEN, 1982);

• ionóforos de Ca

A23187 ou ionomicina: aumentam o influxo de Ca

meio extracelular bem como mobiliza Ca

dos estoques citoplasmáticos

intracelulares (KLINE & KLINE, 1992; NAKADA & MIZUNO, 1998);

• etanol (7%): promovem uma rápida potencialização da liberação de Ca

mediado pela estimulação da formação de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP

) na

membrana plasmática (ILYIN & PARKER, 1992). No entanto, a exposição a

soluções diluídas de etanol podem promover danos ao citoesqueleto

(O’NEILL et al., 1989) com aumento da taxa de aneuploidia em partenotos

(KAUFMAN, 1982; O’NEILL & KAUFMAN, 1989);

• injeção intracelular de CaCl

no citoplasma: induz a exocitose de grânulos

corticais e declínio da atividade da histona quinase H1 (MACHATY et al.,

1996);

• cicloheximide e puromicina: inibidores de síntese protéica que atuariam em

conjunto (ativação combinada) no processo de ativação do oócito

prevenindo a produção da ciclina B

, componente do MPF, fazendo com

que este permaneça inativo (PRESICE & YANG, 1994; NUSSBAUM &

PRATHER, 1995; TANAKA & KANAGAWA, 1997);

• 6-Dimetilaminopurina (6-DMAP): inibidor de fosforilação de proteínas, atua

inativando a c-mos e a MAP kinase, reduzindo as atividades do MPF e do

CSF (VERLHAC et al., 1993, 1994). No entanto, pode aumentar a

incidência de poliploidia e mixoploidia por inibir, inespecificamente, a

fosforilação de proteínas kinases necessárias para a formação dos

microtúbulos (De La FUENTE & KING, 1998);

• estrôncio: induz repetitivos aumentos da concentração de Ca

livre

intracelular (KLINE & KLINE, 1992) de modo semelhante ao que ocorre na

ativação dos oócitos após a fertilização (BOS-MIKICH et al., 1997).

Rotineiramente usado na clonagem em camundongos (KISHIKAWA et al.,

1999; WAKAYAMA & YANAGIMACHI, 1999, 2000; WAKAYAMA et al.,

1998, 1999, 2000, 2001; OGURA et al., 2000a, 2000b; AMANO et al., 2001;

ONO et al., 2001; ZHOU et al., 2001), mostrou ser viável na clonagem em

bovinos (YAMAZAKI et al., 2005).

4.4. Cultivo in Vitro dos Embriões Reconstituídos

Após a reconstituição embrionária e ativação, tem-se adotado,

basicamente, as mesmas condições de cultivo de embriões produzidos in vitro

(PIV). O método de cultivo in vitro bem como o estádio de desenvolvimento no

qual os embriões reconstituídos são transferidos para receptoras é variável de

acordo com a espécie. Embora comparações entre embriões produzidos in vitro e

in vivo mostrem que existem diferenças significativas na morfologia dos embriões,

com reflexo nas taxas de prenhezes (FARIN et al., 2001), o cultivo in vitro ainda se

faz necessário devido às dificuldades técnicas e econômicas da implantação

prematura no oviduto. Mesmo sendo viável a produção de clones de suínos após

imediata transferência de embriões reconstituídos recém-fundidos para o oviduto

(POLEJAEVA et al. 2000), evitando-se assim, as possíveis influências negativas

que os sistemas de cultivo possam exercer sobre o potencial de desenvolvimento,

o alto custo inviabiliza esta tentativa, sendo os embriões geralmente mantidos em

cultivo in vitro até atingirem o estádio de blastocisto.

Apenas uma proporção dos embriões reconstituídos atinge o estádio de

blastocisto, e esta taxa é geralmente inferior em comparação a embriões PIV

(YAMAZAKI, 2001). Em bovinos, as taxas de desenvolvimento dos embriões

reconstituídos ainda durante o período de cultivo in vitro tem-se mostrado bastante

variáveis, desde inferiores a 5% até maiores que 65% de produção de blastocisto

(WESTHUSIN et al., 2001). Esta ampla variação de resultados é reflexo dos

diversos sistemas de cultivo in vitro atualmente existentes, bem como das

múltiplas variações que a técnica de clonagem pode apresentar em suas diversas

etapas para a reconstituição do embrião. Deste modo, é necessário uma análise

mais ampla e geral frente aos resultados da clonagem, para que seja possível

distinguir o que poderia ser um efeito da técnica e o que seria realmente um

evento biológico.

Sabe-se que o metabolismo embrionário de embriões PIV pode ser alterado

de acordo com as condições de cultivo empregadas, como: temperatura, pH,

osmolaridade, atmosfera, co-cultivo, fonte protéica e energética (THOMPSON et

al., 1990; THOMPSON, 1996, 2000; BAVISTER, 2000; KRUIP et al., 2000; FARIN

et al., 2001), refletindo-se em problemas durante a gestação, como hidroalantóide,

mortalidade embrionária precoce, mortalidade neonatal, aumento do peso ao

nascimento bem como má-formações fetais (KRUIP & DEN DAAS, 1997;

HASLER, 2000; JACOBSEN et al., 2000; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al.,

2000; FARIN et al., 2006). Isto mostra que, embora tenha havido significativo

avanço nas pesquisas em embriões em estádio de pré-implantação bem como

sobre as condições de cultivo utilizadas, problemas ainda ocorrem, principalmente

de ordem gênica, com reflexos principalmente no estabelecimento de gestações e

produção de animais a termo. Considerando-se que a reprogramação nuclear é

um fenômeno complexo que tem seu início neste período do desenvolvimento

embrionário, aliado aos problemas ainda persistentes da PIV, embriões clones

reconstituídos devem ser muito mais susceptíveis a alterações gênicas, que

podem ser agravadas frente às condições de cultivo atualmente utilizadas.

4.5. Aplicações da Clonagem por Transferência Nuclear

Do ponto de vista científico, o sucesso da clonagem por transferência

nuclear utilizando-se células somáticas como fonte doadora de núcleo tem

contribuído com a ciência básica, no que diz respeito a melhor compreensão e

elucidação dos mecanismos genéticos e epigenéticos envolvidos na

embriogênese, bem como a complexa interação envolvendo a remodelação da

cromatina, metilação do DNA e expressão gênica durante o desenvolvimento

embrionário e fetal. Além disso, novos desafios no estudo da reprogramação das

células surgiram com o advento da clonagem somática, e estes conhecimentos

gerados com estas investigações podem ter importantes implicações no processo

de diferenciação celular, e transplante de órgãos e tecidos, importante ferramenta

na clonagem terapêutica e os xenotrasplantes (KIND & COLMAN, 1999; LANZA et

al., 1999; CAMPBELL, 2002; NIEMAMAN et al., 2003).

A clonagem pode ser usada comercialmente em rebanhos para produzir

cópias de animais de alto mérito genético, como vacas leiteiras de alta produção

ou touros com boa composição de carcaça (GALLI et al., 1999; PATERSON et al.,

2003; FABER et al., 2004). Além disso, esta biotecnologia tem sido usada na

tentativa de preservação de espécies ameaçadas de extinção (WELLS et al.,

1998; CORLEY-SMITH & BRANDHORST, 1999; WHITE et al., 1999; LOI et al.,

2001). No entanto, a grande aplicação da clonagem está aliada à modificação do

núcleo doador para produção de animais transgênicos (CIBELLI et al., 1998;

CHAN, 1999; PIEDRAHITA, 2000; POLEJAEVA & CAMPBELL, 2000), através da

modificação genética dos núcleos doadores, visando à produção de proteínas

específicas no sangue e no leite (BRINK et al., 2000), maior eficiência na

produção de carne e leite (PIEDRAHITA, 2000), produção de modelos animais

para estudo de doenças (KENT & LEWIS, 1998, PATERSON et al., 2003).

4.6. “Genomic Imprinting”

O “genomic imprinting” é caracterizado por uma expressão gênica

diferencial dos alelos parentais, determinada por modificações epigenéticas da

transcrição gênica sem que ocorram alterações na seqüência do DNA. O “genomic

imprinting” diferencia-se da genética clássica Mendeliana uma vez que regiões de

cromossomos homólogos não apresentam equivalência funcional. Embora tanto o

alelo materno como o alelo paterno estejam presentes, um estará funcionalmente

ativo enquanto que o outro silenciado ou inativo.

Diversas teorias foram sugeridas para explicar a ocorrência do “genomic

imprinting”. Uma das hipóteses mais aceitas é a chamada teoria do conflito,

também conhecida como “batalha dos sexos” (MOORE & HAIF, 1991; HURST &

McVEAN, 1997, 1998). Esta teoria baseia-se no interesse tanto do macho como

da fêmea em obter o número máximo de proles viáveis a fim de que fossem

mantidos seus genes na população. Quando a reprodução é poligâmica, o macho

teria o interesse em assegurar o máximo crescimento de sua prole, e assim

recrutaria o máximo de recursos da fêmea quanto possível visando beneficiar a

progênie, para que a mesma fosse maior e mais forte, aumentando as chances de

sobrevivência no ambiente, mesmo que isso ocorresse em detrimento da fêmea

pela utilização de mais nutrientes maternos. Em contrapartida, a fêmea deve

limitar o crescimento embrionário e fetal para que a mesma esteja apta a

reproduzir-se novamente, com outro macho. Isto necessitaria dividir seus recursos

em diferentes gestações. As fêmeas que conseguissem restringir o crescimento

fetal e produzir maior número de proles com a limitação de recursos conseguiriam,

a longo prazo, ter mais êxito em suas vidas reprodutivas. Além da teoria do

conflito, um “modelo de desenvolvimento” sugere que o “genomic imprinting”

ocorreria em resposta à pressão ambiental, induzindo a rápidas mudanças de

expressão ou inativação dos alelos parentais de acordo com a necessidade

(BEAUDET & JIANG, 2002). Existe ainda o conceito de “ovário bomba relógio”, o

qual propõe que o “genomic imprinting” protegeria a fêmea de patologias

ovarianas, limitando a partenogênese e prevenindo a formação de tumores

malignos do trofoblasto (VARMUZA & MANN, 1994).

A assimetria funcional dos genomas parentais foi descoberta em

experimentos realizados na década de 80 utilizando a transferência pró-nuclear

em camundongos para a produção de embriões ginogenéticos ou androgenéticos,

possuindo apenas cromossomos maternos ou paternos, respectivamente. Embora

fossem diplóides, falhas e mortalidade no desenvolvimento embrionário e no

estabelecimento de gestações foram verificadas em ambos os casos. No entanto,

diferenças marcantes foram descobertas: os ginogenéticos morreram antes da

metade da gestação, com poucos dias da implantação, com retardo de

crescimento devido a falhas no desenvolvimento dos tecidos extra-embrionários,

enquanto que os androgenéticos apresentaram um potencial de desenvolvimento

muito mais restrito, com melhor formação dos componentes extra-embrionários

(McGRATH & SOLTER, 1984a; SURANI et al., 1984, 1986; SOLTER, 1988). A

partir das evidências verificadas nestes experimentos, com a aparente

contribuição materna para o desenvolvimento fetal e paterna para o

desenvolvimento das estruturas extra-embrionárias, surgiu a proposta de que um

específico “imprinting” do genoma paterno e materno ocorreria durante o

desenvolvimento do oócito e do espermatozóide, sendo necessário a contribuição

de ambos os genomas parentais após a fertilização para um desenvolvimento a

termo normal.

Embora a ocorrência do “genomic imprinting” tenha sido relatada em outros

grupos, como plantas angiospérmicas e alguns marsupiais (TODER et al., 1996;

KILLIAN et al., 2000; O’NEIL et al., 2000; SPIELMAN et al., 2001), com a

descrição de fenômenos regulatórios epigeneticamente semelhantes de expressão

gênica restrita a alguns genes, parece que os mecanismos de controle gênico

usados em organismos inferiores adquiriram funções adicionais em organismos

superiores ao longo da evolução filogenética, incluindo o controle do “genomic

imprinting”. Em mamíferos eutérios, os genes “imprinted” representam menos que

0,1% dos genes em todo genoma, mas possuem funções determinantes de

restringir e alterar a expressão de um dos alelos parentais, importantes nos

mecanismos de desenvolvimento embrionário, fetal, placentário e mesmo pós-

natal. Aproximadamente 80 genes “imprinted” já foram identificados em

camundongos e cerca de 50 em humanos, espécies onde o “genomic imprinting”

tem sido mais estudado. No entanto, nas espécies de produção, poucos genes

foram identificados, sendo necessário o aprofundamento dos estudos ligados ao

“imprinting” em animais com placentação distintas.

A regulação epigenética diferenciada da atividade gênica do DNA para os

genes “imprinted” é caracterizada por uma série de modificações complexas, que

incluem a metilação do DNA em regiões do genoma geralmente ricas em

dinucleotídeos CpG (FERGUSON-SMITH & SURANI, 2001; BIRD, 2002) e

modificações das histonas, com acetilação ou metilação (RICHARDS & ELGIN,

2002), associadas com transcritos antisenso e RNA não codificado incluindo

microRNAs (SPAHN & BARLOW, 2003). Estas modificações conferem um estádio

diferenciado nos cromossomos homólogos, afetando a interação entre o genoma e

moléculas regulatórias da atividade gênica, permitindo a ativação ou inativação de

um dos alelos parentais.

4.6.1. “Genomic Imprinting” e a Reprogramação Epigenética no

Desenvolvimento

O DNA genômico passa por significativas mudanças de metilação do DNA

durante a embriogênese, reflexo da necessidade de que alterações de controle da

expressão gênica devam ocorrer no espermatozóide, oócito e embrião para que

seja possível o posterior desenvolvimento embrionário e fetal no que diz respeito

ao estabelecimento de padrões tecido-específicos no processo de diferenciação.

Estas modificações são estádio de desenvolvimento e sexo dependentes, sendo

importantes do estabelecimento e controle dos genes “imprinted”.

A gametogênese e o estádio de zigoto da embriogênese correspondem aos

únicos momentos em que os genomas paternos e maternos apresentam-se

separados. Uma vez que os alelos “imprinted” são diferentemente marcados para

permitir sua expressão sexo-específica, deve ser nestes dois períodos que os

eventos de marcação dos “imprints” ocorram. Antes que do estabelecimento

destas marcações sexo-específicas nas linhas germinativas, os “imprints” são

apagados. Uma ampla demetilação de todo genoma ocorre no início do

desenvolvimento das linhas primordiais germinativas. Em camundongos, esta

demetilação completa-se aproximadamente entre os dias 10,5 a 12,5 de

desenvolvimento, momento correspondente à entrada das células primordiais

germinativas na gônada (SZABO & MANN, 1995; KATO et al., 1999; REIK &

WALTER, 2001; HAJKOVA et al., 2002; LEE et al., 2002b, SZABO et al., 2002).

Esta fase de reprogramação coincide com o momento em que as marcações

específicas de origem parentais são apagadas, que incluem a demetilação do

DNA das regiões diferencialmente metiladas (DMRs – “differential methylated

regions”), associadas com expressão gênica de alelos específicos (TUCKER et

al., 1996).

Subseqüente a este evento de demetilação, o momento de aquisição dos

“imprints” genômicos é significativamente diferente entre as duas linhas

germinativas. Nos machos, o período de restabelecimento dos “imprints” ainda

não está muito bem definido, mas evidências indicam que ocorra em gonócitos

diplóides. A metilação do H19 em murinos, por exemplo, inicia-se no estádio pré-

natal de pró-espermatogônia e é completada no estádio pós-natal de paquíteno da

meiose (UEDA et al., 2000). Entretanto, ao contrário do que se acreditava

anteriormente, em que a remetilação ocorreria ao mesmo tempo para ambos os

alelos parentais, estudos realizados com o gene H19 mostraram que o alelo

paterno sofre metilação anteriormente ao alelo materno, sugerindo-se que outros

eventos epigenéticos além da metilação do DNA devam estar presentes (DAVIS et

al., 1999, 2000).

Nas linhas germinativas das fêmeas, diversos estudos mostram que a

aquisição do “imprint” pela metilação do DNA estaria restrita à fase pós-natal de

crescimento do oócito na foliculogênese, não estando relacionada à duplicação do

DNA, uma vez que as mudanças epigenéticas ocorrem no estádio de diplóteno da

prófase I da meiose (CHAILLET et al., 1991; UEDA et al., 1992; BRANDEIS et al.,

1993; STOGER et al., 1993; KONO et al., 1996; OBATA et al., 1998, 2002; BAO et

al., 2000; LUCIFERO et al., 2002; OBATA & KONO, 2002). Diversos genes

“imprinted” recebem a marcação “imprint” de metilação do DNA de modo

assincrônico em diferentes estádios do desenvolvimento folicular. Os padrões de

estabelecimento das metilações nos genes “imprinted” dos espermatozóides e

oócitos depende da atividade das DNA metiltransferases (Dnmt). A correta

regulação da atividade das Dnmts, como Dnmt1, Dnmt1

, Dnmt3a e Dnmt3b, no

estabelecimento do status alelo específico de expressão em DMRs (LI et al., 1993)

dos alelos parentais torna-se importante para que não haja prejuízo do potencial

de desenvolvimento embrionário e fetal.

Uma vez que o genoma dos espermatozóides e oócitos maturos

apresentam-se altamente metilados, em comparação a metilação de células

somáticas, após a fertilização, o zigoto conterá, portanto, DNA metilado localizado

em genes “imprinted” (tanto paternos como maternos) e a maior parte posicionado

em seqüências não-“imprinted”. No início do desenvolvimento, o embrião perderá

sua metilação em seqüências de DNA não-“imprinted”. Entretanto, os eventos de

demetilação do DNA não ocorrerão de modo equivalente nos genomas parentais,

uma vez que no embrião as duas linhas germinativas (alelos parentais) possuem

diferenças de reprogramação epigenética. Enquanto que o genoma paterno pró-

nuclear é demetilado rapidamente no zigoto após a fertilização num mecanismo

ativo (MAYER et al., 2000; OSWALD et al., 2000; SANTOS et al., 2002), o

genoma materno permanecerá aparentemente protegido deste processo inicial,

sendo gradualmente demetilado durante as primeiras clivagens num processo

passivo de demetilação (MONK et al., 1987; ROUGIER et al., 1998; MAYER et al.,

2000). Embora haja no espermatozóide características que afetam os níveis de

demetilação, os principais fatores que determinam o momento em que o genoma

parental torna-se demetilado são oócito-específicos (BEAUJEAN et al., 2004b).

Neste início de desenvolvimento embrionário, enquanto ocorre uma extensiva

demetilação em seqüências de DNA não-“imprinted”, os genes “imprinted” seriam

resistentes a esse processo de demetilação, mantendo o estado inicial dos

“imprints” estabelecidos nos gametas. As células da linhagem germinativa deste

embrião irão perder estas metilações dos genes “imprinted” durante o

desenvolvimento gonadal, enquanto que as células somáticas manterão estes

padrões de metilação durante o desenvolvimento embrionário e fetal, e a maioria

se estenderá durante a vida do novo organismo formado (embora os padrões dos

“imprints” de alguns genes sejam perdidos ou alterados em alguns tecidos, como

por exemplo, no fígado; McLAREN & MONTGOMERY, 1999). As taxas de

metilação de genes não-“imprinted” atingirão seus níveis mínimos entre os

estádios de mórula a blastocisto, quando um novo processo de metilação (“de

novo methylation”) tem início. Este segundo evento de metilação varia de acordo

com a espécie: em camundongos, coincide com a primeira diferenciação celular

no estádio de blastocisto, enquanto que em bovinos esta nova metilação tem início

entre 8 a 16 células, na ativação do genoma embrionário (REIK et al., 2001). O

estabelecimento destas duas linhagens de células no embrião resulta em outra

assimetria: as células da massa celular interna (MCI), que darão origem a todos os

tecidos do novo indivíduo, tornam-se hipermetiladas, enquanto que as células que

compõem o trofectoderma, que formarão as estruturas placentárias, apresentam

menor metilação (DEAN et al., 2001; SANTOS et al., 2002). Esta diferença reflete-

se nos tecidos somáticos (altamente metilados) e tecidos extra-embrionários da

placenta (hipometilados).

A ampla demetilação do genoma parental durante o desenvolvimento

embrionário após a fecundação, verificada em estudos realizados em

camundongos e humanos, não é representativo de todos os mamíferos. Maior

limitação do evento global de demetilação ocorre no genoma de ovinos, bovinos e

coelhos entre o estádio de zigoto e 8-células (BOURC’HIS et al. 2001a;

BEAUJEAN et al. 2004a; SHI et al. 2004). A razão pela qual em algumas espécies

exista uma necessidade de rápida demetilação do pró-núcleo masculino no

estádio de zigoto ainda é uma questão a ser respondida, mas pode estar

relacionada à ativação do genoma embrionário, à composição do genoma,

diferentes estratégias reprodutivas ou mesmo ligadas ao “genomic imprinting”

(YOUNG & BEAUJEAN, 2004).

4.6.2. “Genomic Imprinting” na Gestação

A placenta de mamíferos eutérios possui células derivadas de dois

indivíduos: o concepto e a mãe. Durante o desenvolvimento da placenta, células

de origem embrionária e materna formam vários tipos celulares de íntima

associação anatômica, resultando em regiões especializadas conhecidas como

interface materno-fetal. Em decorrência da interação entre células desta interface

ocorrerão as trocas entre o feto e a mãe, necessárias para a viabilidade e

crescimento fetal. Estudos dos genes “imprinted” mostram que os mesmos são

importantes no desenvolvimento fetal, placentário e mesmo comportamental, com

expressão monoalélica sendo identificada durante o desenvolvimento pré-natal

(REIK et al., 2003). Dentre os diversos genes “imprinted” já descritos, o Igf2, o H19

e o Igf2r tem sido os mais estudados em camundongos devido à importância dos

mesmos durante o desenvolvimento da gestação.

O gene “imprinted” Igf2 (fator de crescimento semelhante à insulina tipo 2)

possui “imprint” materno e é expresso pelo alelo paterno (DINDOT et al. 2004). O

Igf2 é um potente mitógeno que desempenha importante função na diferenciação

celular, comportamento pós-natal, desenvolvimento do cérebro (REIK & WALTER,

2001) no crescimento fetal (De CHIARA et al., 1999; EFSTRATIADIS, 1998) e

desenvolvimento da placenta (CONSTANCIA et al., 2002), e está localizado no

cromossomo 29 em bovinos (GOODALL & SCHMUTZ, 2003). O Igf2 é altamente

conservado, e serve como um ligante para o receptor de Ifg1 e o receptor de

insulina tipo A (MURPHY & JIRTLE, 2003), atuando em uma regulação

autócrina/parácrina dose dependente. Estas funções de ligação ocorrem para

iniciar e propagar os sinais que induzem o crescimento e bloquear a apoptose.

Além de ser o principal fator de crescimento fetal, o Igf2 expresso na placenta

regularia a difusão e trocas de nutrientes com o feto, a disponibilidade de

glicogênio e o transporte de aminoácidos aniônicos e catiônicos (BAKER et al.,

1993; LOPEZ et al., 1996; MATTHEWS et al., 1999; SIBLEY et al., 2004).

Em contraste ao Igf2, o gene “imprinted” Igf2r (receptor do M6P/Igf2 –

manose-6-fosfato/fator de crescimento semelhante à insulina tipo 2) possui

“imprint” paterno e é expresso pelo alelo materno. A proteína do Igf2r não está

envolvida na tradução de sinais, mas atua seqüestrando o excesso de Igf2 (e

outras proteínas), evitando sua ligação ao receptor do tipo 1, principal via de

atividade (KENDREW, 1994). O Igf2r ligaria-se ao Igf2, transportando-o para o

interior de lisossomos para sua degradação (MURPHY & JIRTLE, 2003; JOHN &

SURANI, 2000). Desta maneira, corroborando com a teoria do conflito, o Igf2r,

expresso materno, atua restringindo o crescimento fetal enquanto que o Igf2,

expresso paterno, o promove, e o equilíbrio entre a expressão e disponibilidade de

proteínas para estes dois genes “imprinted” é que regula o desenvolvimento

embrionário e fetal (MOORE, 2001). Além disso, o Igf2r interage com VEGF

promovendo a neovascularização (VOLPERT et al., 1996).

Assim como detectado em outras espécies (camundongos, BARTOLOMEI

& TILGHAMN, 1997; humanos, RACHMILEWITZ et al., 1992), em bovinos, o gene

H19 é caracterizado por apresentar expressão do alelo materno e “imprint” do

alelo paterno (ZHANG et al., 2004). O gene H19 codifica uma molécula de RNA

não traduzida (VERONA et al., 2003; ZHANG et al., 2004). A conservação do gene

H19 dentre diferentes grupos de mamíferos, e seu padrão similar de expressão

durante o desenvolvimento em ovinos e murinos (SASAKI et al., 1995; NAIMEH et

al., 2001; LEE et al., 2002b), sugere que seu RNA seria funcional (HURST &

SMITH, 1999). Estudos indicam que o RNA do H19 poderia atuar na regulação da

tradução de outro RNA, possivelmente o Igf2 (LI et al., 1998; RUNGE et al., 2000).

4.6.3. Regulação da Expressão dos Genes “Imprinted” Igf2-H19 e Igf2r

A regulação do H19 está relacionada com a do Igf2, uma vez que ambos

genes “imprinted” estão localizados no mesmo locus. A atividade recíproca

“imprint” do Igf2 e do H19 é regulada por um centro “imprint” intergênico (IC) ou

DMR, localizado numa região de 2 a 4kb upstream do H19. Este centro “imprint”

intergênico é diferencialmente metilado no alelo paterno durante a

espermatogênese (THORSVALDSEN et al., 1998). O fato de que seu alelo

materno não está metilado na sua região regulatória leva os promotores próximos

ao H19 a permanecerem em uma conformação aberta, permitindo que o mesmo

seja ativado por enhancers de cadeia longa localizados downstream (DAVIES et

al., 2002). Esta mesma DMR do alelo materno não metilada contém elementos de

marcação onde se ligam um fator protéico (CTFC), impedindo que os mesmos

enhancers de cadeia longa localizados downstream ativem os promotores do Igf2

localizados upstream. A metilação do DNA no alelo paterno impede a ligação de

CTCF a DMR localizada upstream do H19, permitindo que os enhancers

downstream interajam com os promotores do gene “imprinted” Igf2 paterno (BELL

& FELSENFELD, 2000; HARK et al., 2000).

O gene “imprinted” Igf2r é caracterizado por apresentar uma regulação a

partir de um RNA anti-senso alelo específico (REIK & WALTER, 2001). A

expressão deste gene é regulada por uma DMR intrônica. No alelo paterno não

metilado na DMR intrônica, a transcrição anti-senso se extende até o promotor ao

Igf2, reprimindo sua transcrição (WUTZ et al., 1997). No alelo materno, a

transcrição anti-senso é reprimida pela metilação intrônica da DMR, permitindo,

desta maneira, a transcrição materna a partir do promotor do Igf2r.

4.7. Reprogramação do Núcleo

Embora a produção de clones a partir de células de animal adulto tenha

sido devidamente comprovada em diversas espécies, sua eficiência ainda é

extremamente baixa, tendo já sido relatadas diversas anormalidades e problemas

durante todo o desenvolvimento embrionário, fetal e mesmo pós-natal. Não se

sabe exatamente se esses problemas são decorrentes da reprogramação nuclear

incompleta ou da técnica propriamente dita. A clonagem por transferência nuclear

envolve uma série de procedimentos técnicos complexos, que incluem o cultivo

das células doadoras de núcleo, sincronização do ciclo celular, maturação in vitro

dos oócitos doadoras de citoplasma, enucleação oocitária, introdução do núcleo

doador no citoplasto por fusão celular ou injeção nuclear intracitoplasmática,

ativação do oócito reconstituído, cultivo in vitro e transferência dos embriões.

Sendo a reprogramação nuclear um processo complexo e pouco compreendido, a

otimização de toda a técnica torna-se importante, pois qualquer alteração em um

desses procedimentos poderá influenciar negativamente a produção de embriões

e animais clonados (WELLS, 1999; WESTHUSIN et al., 2001; EDWARDS et al.,

2003; THIBAULT et al., 2003; CAMPBELL et al., 2005).

O termo reprogramação nuclear tem sido amplamente utilizado e, em linhas

gerais, indica o término de um “programa de expressão gênico somático” e início

de um “programa de expressão gênico embrionário”. Tudo isto se torna mais

complexo à medida que o ambiente citoplasmático está inicialmente programado

para promover todas as modificações epigenéticas de genomas parentais,

formados durante a gametogênese, necessárias para que o desenvolvimento

embrionário prossiga. A remodelação do núcleo, após sua introdução no

citoplasto, inclui uma fase de quebra do envelope nuclear com a condensação dos

cromossomos (BARNES et al., 1993; COLLAS & ROBL, 1991), descondensação

da cromatina após a ativação do oócito e reorganização do envelope nuclear

(STICE & ROBL, 1988). A ativação de genes durante o desenvolvimento ocorre

mediante a modificações epigenéticas, tais como: alteração dos padrões de

metilação do genoma, modificação e troca de histonas (somáticas por isoformas

embrionárias; GAO et al., 2004) e suas variantes nos nucleossomos (acetilação,

metilação, fosforilação, ubiquitinação e poli-ADP ribolisação), alterações na

morfologia nucleolar (CZOLOWSKA et al., 1984; KANKA et al., 1999),

modificações de lâmina nuclear (PRATHER et al., 1989a, 1991) e remodelação da

cromatina e de outras proteínas associadas à mesma (LATHAM, 1999;

CAMPBELL et al., 2005).

Na clonagem com células somáticas, espera-se que o núcleo seja

reprogramado ao estádio de zigoto, ou seja, o padrão de expressão gênica de

uma célula adulta diferenciada deve ser modificado no citoplasto, assumindo um

estado desdiferenciado, coerente com o estádio de desenvolvimento do embrião

reconstituído. Como a partir da transição materno-zigótica ocorre a ativação do

genoma embrionário, não dependendo mais apenas dos estoques de transcritos

de RNA e proteínas do citoplasma do oócito para prosseguir seu desenvolvimento

(MEIRELLES et al., 2004), é necessário que esta reprogramação nuclear ocorra

rapidamente, com a ativação dos genes ocorrendo tempo-padrão de expressão

semelhantes ao de um embrião produzido por fecundação normal. Para tanto, a

reprogramação nuclear necessita de grandes mudanças no padrão de expressão

de inúmeros genes, com reorganização da cromatina e reaquisição dos padrões

de metilação adequados para um embrião, já que este padrão de metilação do

espermatozóide (genoma paterno) e do oócito (genoma materno) durante a

fertilização normal não é análogo àquele encontrado no núcleo de uma célula

somática.

Numa contextualização teórica da reprogramação nuclear, esta pode ser

classificada em três níveis (RIDEOUT III et al., 2001): (i) sem reprogramação do

genoma, resultando na imediata morte do embrião; (ii) parcial reprogramação

nuclear, permitindo uma sobrevivência inicial dos clones, mas resultando em

fenótipos anormais e/ou apresentando mortalidade em vários estádios do

desenvolvimento embrionário/fetal/neonatal; (iii) completa reprogramação, com a

produção de clones normais e saudáveis. O que se verifica, no entanto, é que

mesmo com modificações da técnica propriamente dita e a experimentação da

clonagem em diversas espécies, a baixa eficiência e os inúmeros problemas

fenotípicos e genéticos dos clones sugerem que a reprogramação nuclear

completa é uma exceção.

Embora pesquisas tenham sido realizadas avaliando-se os efeitos nas

proteínas da matrix nuclear (MOREIRA et al., 2003), componentes do envelope

nuclear (KUBIAK et al., 1991), componentes nucleolares (KANKA et al., 1999) e

nas histonas (GAO et al., 2004), bem como estudos recentes mostram que vários

mecanismos epigenéticos, os quais desempenham importante função no

desenvolvimento normal, são interrompidos nos clones. O mecanismo preciso

molecular que envolve a base da reprogramação nuclear responsável pela

específica ativação e repressão dos genes nos embriões reconstituídos ainda é

um mistério a ser esclarecido (RIDEOUT III et al., 2001; HAN et al., 2003; SHI et

al., 2003; JOUNEAU & RENARD, 2003).

4.8. Falhas no Processo de Clonagem

Além da influência que variações da técnica de reconstituição oocitária para

a produção de embriões reconstituídos possam exercer sobre o potencial de

desenvolvimento dos mesmos (técnica de reconstituição empregada para

enucleação e introdução do núcleo doador, sincronização do ciclo celular do

núcleo doador com o citoplasto, método de ativação oocitária e condições de

cultivo in vitro), variações com o uso de diferentes tipos celulares em diferentes

estádios de diferenciação, número de passagens do cultivo celular das células

doadoras de núcleo e uso de citoplastos contendo mtDNA (DNA mitocondrial)

diferente do animal doador, podem ter reflexos na eficiência final do processo de

clonagem (WELLS, 1999; SMITH et al., 2000a, 2000b; WESTHUSIN et al., 2001;

FERREIRA, 2002; YAMAZAKI, 2002; EDWARDS et al., 2003; THIBAULT et al.,

2003; CAMPBELL et al., 2005).

Diversos estudos têm demonstrado que a reprogramação do núcleo doador

ocorre de maneira incompleta. A simples preferência dos embriões reconstituídos

(camundongos) por meios de cultura de células somáticas, apresentando

melhores taxas de desenvolvimento do que nos meios padrões rotineiramente

usados no cultivo in vitro, indicam que os embriões clones possuem

características que se assemelham mais a células somáticas do que a embriões

em processo de divisão celular (HEINDRYCKX et al., 2001; CHUNG et al., 2002;

GAO et al., 2003). Em clones murinos reconstituídos com células de mioblasto,

houve uma contínua expressão de transportadores de glicose (GLUT4), que é

tipicamente expresso no músculo, mas não em embriões em estádio de pré-

implantação (GAO et al., 2003). Outros estudos ainda mostraram que o gene

Oct4, que é expresso em células embrionárias pluripotentes e nas linhas

germinativas, mas é silenciado em células doadoras somáticas (PESCE &

SCHOLER, 2001), apresenta-se com alta variação nas células dos embriões

reconstituídos e padrão de expressão alterado, indicativo de falhas de

reprogramação em algumas células ou temporal heterogeneidade no processo de

reprogramação entre os blastômeros (BOIANI et al., 2003; BORTVIN et al., 2003;

ECKARDT & McLAUGHLIN, 2004). A presença de fatores de transcrição, como a

proteína de ligação TATA-box, associadas à cromatina da célula doadora após o

processo de reconstrução embrionária pela transferência nuclear é indicativo de

que alguns genes devem ainda permanecer “programados” para a expressão

gênica (SULLIVAN et al., 2004). Problemas no transporte citoplasmático-nuclear

de proteínas pode ainda afetar a reprogramação do núcleo (PARK et al., 2002).

Além dessas alterações, problemas com relação à inativação do

cromossomo X, regulado pelo gene “imprinted” Xist (EGGAN et al., 2000; XUE et

al., 2002; EGGAN & JAENISCH, 2004; SENDA et al., 2004), bem como o

restabelecimento do comprimento dos telômeros, progressivamente diminuídos

nas células somáticas em decorrência das divisões mitóticas, que pode não

ocorrer completamente, dependendo da espécie, do tipo celular usado para

reconstituição e da progênie dos clones (SHIELDS et al., 1999a, 1999b; LANZA et

al., 2000; BETTS et al., 2001, 2005; KÜHHOLZER-CABOT & BREM, 2002;

MIYASHITA et al., 2002; JIANG et al., 2004; JEON et al., 2005), evidenciam a

complexidade da reprogramação de todos os genes do núcleo doador.

Considerando-se que os eventos de demetilação e metilação do DNA são

importantes na regulação da expressão gênica, o que se tem observado na

clonagem são alterações significativas dos padrões de metilação do DNA em

análises de metilação global ou em regiões particulares do genoma, como as

regiões diferencialmente metiladas dos genes “imprinted” (KANG et al., 2001a,

2001b, 2001c, 2002; BOURC’HIS et al., 2001b, DEAN et al., 2001; OHGANE et

al., 2001, SHIOTA & YANAGIMACHI, 2002; CEZAR et al., 2003; CHUNG et al.,

2003; SANTOS et al., 2003; BEAUJEAN et al., 2004b; CHEN et al., 2004; SHI et

al., 2004b). Problemas ligados à localização e expressão de DNA

metiltransferases (ex: Dnmt1) aberrante nos embriões reconstituídos podem

contribuir para os problemas de metilação e aumentar as anormalidades

verificadas no desenvolvimento de clones (CHUNG et al., 2003). Como

conseqüência desta aparente resistência à reprogramação epigenética do núcleo

doador em decorrência destas alterações, genes podem manter sua atividade de

transcrição enquanto que outros apresentarem padrão de expressão anormal.

Problemas ligados à expressão errônea em momentos e padrões não

correspondentes àqueles verificados durante o desenvolvimento normal de

embriões produzidos por fecundação têm sido relatados para diversos genes e em

diferentes espécies, sendo estes genes “imprinted” (HUMPHERYS et al., 2001;

INOUE et al., 2002; MANN et al., 2003; OGAWA et al., 2003; YOUNG et al., 2001,

2003; YANG et al., 2005) ou não-“imprinted” (De SOUSA et al., 1999; DANIELS et

al., 2000, 2001; WRENZYCKI et al., 2001, 2002; NIEMANN, 2002; RAVELICH et

al., 2004a, 2004b, 2006). A alteração do padrão de expressão destes genes tem

levado a problemas de mortalidade embrionária, fetal e pós-natal, contribuindo

para diminuição da eficiência da técnica.

Além destes problemas verificados na reprogramação nuclear incompleta e

da influência que modificações da técnica possam exercer sobre o

desenvolvimento de clones, distúrbios cromossômicos com relação à incorreta

manutenção da ploidia (SLIMANE-BUREAU & KING, 2002; BOOTH et al., 2003;

BHAK et al, 2006; KING et al., 2006), alteração da relação entre as células da

massa celular interna e do trofectoderma (KOO et al., 2002, 2004), problemas na

organização de microtúbulos, fibras do áster e centrossomos (SIMERLY et al.,

2003, 2004; MIKI et al., 2004; ZHONG et al., 2005; MIYARA et al., 2006) nos

embriões reconstituídos podem contribuir negativamente nos resultados da

clonagem.

Como conseqüência de todas estas alterações verificadas nos embriões

reconstituídos com células somáticas, apenas uma pequena proporção dos

embriões manipulados atingem o estádio de blastocisto durante o processo de

cultivo in vitro, sendo estas taxas de desenvolvimento geralmente inferiores

àquelas alcançadas por embriões produzidos in vitro (YAMAZAKI, 2001). Embora

tenha-se usado as taxas de desenvolvimento ao estádio de blastocisto para

avaliação e comparação entre diferentes metodologias na reconstituição, não

significa que seja o melhor indicador para qualidade embrionária, especialmente

no caso de embriões clones. Muitas das alterações epigenéticas e de

reprogramação nuclear incompleta não podem ser detectadas apenas baseando-

se na avaliação morfológica do embrião. Infelizmente, devido à complexidade e

dificuldades técnicas que envolveriam uma avaliação mais detalhada do embrião

no que diz respeito à manutenção de um correto padrão de expressão gênica,

sem que haja prejuízo em relação à sua viabilidade, muitos embriões

considerados morfologicamente “normais” que atingem o estádio de blastocisto,

mas que apresentam problemas de reprogramação, acabam sendo transferidos

para receptoras. Problemas de reprogramação de alguns genes podem se

manifestar somente na gestação, como é o caso, por exemplo, dos genes

“imprinted” Igf2, Igf2r e H19, importantes na regulação do crescimento e

desenvolvimento fetal e placentário.

4.9. Problemas da Clonagem durante a Gestação

Como conseqüência de todos estes problemas detectados nos embriões

em estádio de pré-implantação, as taxas de mortalidade embrionária e fetal são

significativamente mais altas em clones em comparação aos controles,

independentemente da espécie (WELLS et al., 2004). Em camundongos, estudos

mostram uma alta taxa de implantação embrionária (57-71%), mas baixas taxas

de nascimentos (2-3% ou menos) na transferência nuclear com células somáticas

(WAKAYAMA et al., 1998; YANAGIMACHI, 2002). Em embriões clones bovinos,

espécie onde é mais fácil o monitoramento da gestação, os índices de

implantação, estabelecimento de prenhezes e desenvolvimento até os 30-35 dias

de gestação é quase semelhante a embriões fertilizados normalmente (GALLI et

al., 1999). Entretanto, no diagnóstico aos 90 dias de gestação, em mais da metade

das prenhezes estabelecidas ocorre o aborto (CIBELLI et al., 1998), e até o

nascimento a termo, mais de 40% das gestações restantes são perdidas

(HEYMAN et al., 2002a), limitando seu sucesso a 5-6% (CHAVATTE-PALMER et

al., 2004; WELLS et al., 2004).

Na espécie bovina, a alta taxa de mortalidade embrionária e fetal no terço

inicial de gestação de clones está geralmente relacionada à má formação da

placenta. Diversos distúrbios placentários já foram verificados, como:

anormalidades na vascularização dos tecidos extra-embrionários

(hipovascularização), principalmente dos vasos do cório-alantóide, reduzido

número de cotilédones associado com aumento de tamanho dos placentomas e

hidropsia das membranas fetais (HILL et al., 2000; HEYMAN et al., 2002b;

HASHIZUME et al., 2002). Estas anormalidades placentárias são provavelmente

as principais causas das perdas no período pré-implantação de fetos clonados,

devido à severa deficiência nutricional que acomete o feto, induzindo a retardo do

crescimento e finalmente à morte por restrição de nutrientes (HEYMAN et al.,

2002b). Problemas similares com alteração da função placentária e alta taxa de

aborto também já foram relatados em ovinos (DE SOUZA et al., 2001).

Problemas de placentomegalia têm sido marcantes na clonagem em

camundongos (WAKAYAMA et al., 1999, 2000, TANAKA et al., 2001, OGURA et

al., 2002; SINGH et al., 2004), com aumento da placenta de duas a quatro vezes

em comparação com grupo controle, independentemente da fonte doadora de

núcleo, tipo celular ou protocolo de reconstituição utilizado nesta espécie

(WAKAYAMA et al., 1999; OGURA et al., 2000a).

No terço final da gestação, a freqüência de aborto, limitada a menos que

5% na reprodução sexual de bovinos, é significativamente mais alta no caso de

clones (CIBELLI et al., 1998; VIGNON et al., 1998; WELLS et al., 1999; HEYMAN

et al., 2002a), e ocorreria devido a disfunções placentárias. Aumento do cordão

umbilical e de seus vasos, edemaciação das membranas placentárias e aumento

dos placentomas, que apresentam-se em menor número, são algumas das

alterações encontradas na gestação de clones (KRUIP & Den DAAS, 1997;

WELLS et al., 1999; HEYMAN et al., 2002a). Avaliações dos níveis plasmáticos da

PSP60 (“pregnancy serum protein 60”), secretada pelas células binucleadas da

placenta e um marcador de gestação em bovinos (MIALON et al., 1993), mostram

um aumento significativo nos primeiros quatro meses de gestação em receptoras

onde foram detectadas anormalidades no final da gestação (HEYMAN et al.,

2002a), indicativo de ocorrência de problemas placentários. As perdas neste

período da gestação ocorrem principalmente em decorrência de hidroalantóide

(KRUIP & Den DAAS, 1997; WELLS et al., 1999; HEYMAN et al., 2002a),

patologia que está frequentemente relacionada com hipóxia fetal seguido de

distúrbios hematológicos. As alterações placentárias, com redução da

vascularização podem estar relacionados com este desbalanceamento de fluídos.

Dificuldades no parto também são relatadas na clonagem, e estariam

relacionadas a distúrbios endocrinológicos com diminuição das concentrações

plasmáticas de cortisol, que seriam insuficientes para desencadear o sistema IGF

ligado à sinalização para a indução do parto (MATSUZAKI & SHIGA, 2002). A

administração de corticosteróides pode aumentar as chances de sobrevivência,

induzindo o parto ou em preparação à cesareana, bem como pode ser importante

na maturação pulmonar dos clones (WELLS et al., 1999; PTAK et al., 2002).

O nascimento e o período pós-natal também são críticos no processo de

obtenção de animais clones normais. Gestações prolongadas e distocia são

frequentemente relatadas na clonagem em bovinos (KATO et al., 1998; WELLS et

al., 1999; RENARD et al., 1999) e podem ser responsáveis por perdas pós-natais

durante os primeiros dias de vida do clone. Além das anormalidades placentárias,

verifica-se um aumento da mortalidade pós-natal de clones bovinos durante os

dois primeiros dias após o parto, com grande variação nas disfunções e

anormalidades observadas e confirmadas na necrópsia: problemas respiratórios,

alterações circulatórias, cardiopatologias, problemas de controle da temperatura

com casos de hipertermia e hipotermia, disfunções renais (hidronefrose),

hipertrofia do fígado, má formação cerebral, anemia, atrofia tímica, hipoplasia

linfóide, disfunções imunes, problemas gastrointestinais, deformações da

musculatura esquelética, etc (HILL et al., 1999, 2000; JONES et al., 2001;

HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-PALMER et al., 2004).

Um outro problema verificado na clonagem é a “Síndrome da Cria Gigante”

(LOS – “Large Offspring Syndrome”, YOUNG et al., 1998). Essencialmente, esta

síndrome é caracterizada pelo aumento do peso corpóreo do animal recém-

nascido e já foi relatada em clones de ovinos e bovinos (CHAVATTE-PALMER et

al., 2002; PACE et al., 2002; HEYMAN et al., 2002a). Embora a LOS tenha sido

relatada em animais produzidos in vitro, tendo sido atribuída às condições de

cultivo os distúrbios que levariam a este aumento do peso ao nascimento, está

claro que a taxa de ocorrência em clones é significativamente mais alta. Estudos

em ovinos que apresentavam a LOS mostraram uma correlação entre problemas

de metilação e expressão aberrante do gene “imprinted” Igf2r (YOUNG et al.,

2001). Em camundongos, embora tenham nascido com peso normal, alguns

clones apresentaram maior ganho de peso, com descrição de casos de obesidade

em decorrência de hiperleptinemia e hiperinsulinemia (TAMASHIRO et al. 2000,

2002, 2003).

Como evidenciado pelo grande número de problemas verificados durante

toda a gestação, com alta mortalidade embrionária e fetal em decorrência de

alterações placentárias e no próprio feto, a eficiência da técnica tem-se mostrado

muito baixa, indicando que a reprogramação do núcleo é incompleta. Mesmo após

o nascimento, a mortalidade de neonatos é alta. As alterações dos padrões de

metilação e de DNA metiltransferases nos clones só reforçam a idéia de que

genes essenciais para o crescimento e desenvolvimento podem ter seu padrão de

expressão e regulação comprometidos por falhas na reprogramação (KANG et al.,

2001a, 2001b, 2001c, 2002; BOURC’HIS et al., 2001b, DEAN et al., 2001;

OHGANE et al., 2001, SHIOTA & YANAGIMACHI, 2002; CEZAR et al., 2003;

CHUNG et al., 2003; SANTOS et al., 2003; BEAUJEAN et al., 2004b; CHEN et al.,

2004; SHI et al., 2004b). Uma vez que os genes “imprinted” são importantes no

desenvolvimento fetal e placentário, como o Igf2, Igf2r e H19, aliado ao fato de

que vários distúrbios placentários tem reflexo direto na taxa de sobrevivência fetal

e neonatal, torna-se importante investigar qual o comportamento destes genes

não apenas nos clones bovinos, mas também em suas placentas. Embora os

distúrbios placentários e fetais tenham sido bem caracterizados em bovinos, ainda

há uma carência de informações sobre a regulação e os padrões de expressão

destes genes “imprinted” nesta espécie.

V. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Produção de Gestações a Termo de Clones Bovinos Reconstituídos por

Transferência Nuclear

A produção in vitro de embriões reconstituídos por transferência nuclear

bem como a obtenção das amostras utilizadas para a avaliação da expressão

gênica foi realizada pelo laboratório do Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP-

Pirassununga-SP).

De modo resumido, no processo de reconstrução embrionária, oócitos

bovinos obtidos de ovários de matadouro foram utilizados como fonte doadora de

citoplasma enquanto que linhas celulares de fibroblastos, estabelecidas a partir de

biópsias de pele de cinco animais adultos da raça Nelore (2 machos e 3 fêmeas),

foram usadas como fonte doadora de núcleo. Após a maturação in vitro (MIV), os

complexos cumulus-oócitos foram desnudos em hialuronidase, incubados por

30min em 5µg/mL de bisbenzimide (Hoechst 33342) e 7,5µg/mL de citocalasina B,

enucleados em estádio de metáfase II em microscópio óptico invertido equipado

com luz epifluorescente, removendo-se o primeiro corpúsculo polar e parte do

citoplasma adjacente, confirmando-se a enucleação expondo-se o material

aspirado no interior da pipeta à luz ultra-violeta. Oócitos enucleados com êxito

tiveram inserido no espaço perivitelíneo uma célula somática (fibroblasto). O

processo de fusão celular da célula doadora de núcleo com o citoplasto foi

realizado por eletrofusão em solução de mannitol (0,28M) utilizando-se eletrofusor

da Eppendorf. Oócitos reconstituídos foram ativados em protocolo padrão de

ionomicina (5µM / 5min) e cicloheximide (10µg/mL / 4h). Após o cultivo in vitro, no

sétimo dia de desenvolvimento, foram inovulados para receptoras previamente

sincronizadas, embriões no estádio de blastocisto. As gestações foram

monitoradas em intervalos de 30 dias através de ultra-sonografia e palpação

transretal até o momento do parto.

5.2. Obtenção das Amostras de Placenta

Imediatamente após o parto (cesariana), placentônios foram colhidos em

condições assépticas (fragmentos de aproximadamente 1cm

), preservando-se a

interface materno-fetal, depositados em criotubos e submersos em nitrogênio

líquido, sendo posteriormente estocados a -80ºC, onde permaneceram até a

extração de RNA.

Para avaliação da expressão dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19, foram

utilizadas amostras de 15 clones e de 3 animais concebidos por monta natural,

sendo estes últimos usados como grupo controle.

5.3. Extração de RNA e Transcrição Reversa (RT-PCR)

A extração de RNA das amostras de placentônios do grupo clonado e do

grupo controle (monta natural) foram desenvolvidas a partir do método fenol-

clorofórmio, utilizando-se o reagente Trizol

(Invitrogen, EUA), seguindo as

recomendações do fabricante: imersão da amostra em nitrogênio líquido,

pulverização com pistilo, homogeneização com 1mL de Trizol, centrifugação a

12.000xg por 10min a 4ºC, nova centrifugação após acréscimo de 0,2mL de

clorofórmio, remoção da fase aquosa superior do gradiente formado, precipitação

em 0,5mL de álcool isopropílico, lavagem em etanol 75% e ressuspensão em

50µL de água tratada com DEPC.

Após a extração de RNA, procedeu-se a síntese de DNA complementar

(cDNA) por transcrição reversa (RT-PCR), utilizando-se alíquota de 3µg de RNA

total em reação de 20µL contendo tampão 1X RT (Invitrogen), oligo(dT) (5mmol/L),

dNTPs (1,25mmol/L cada), RNAse OUT (40UI – Invitrogen) e Superscript II (200UI

- Invitrogen). A reação foi realizada a 42ºC por 50min, seguido por desnaturação a

70ºC por 15min, sendo as amostras de cDNA armazenadas a -20ºC.

5.4. Avaliação dos Genes “Imprinted” pela PCR em Tempo Real

Para avaliação da expressão dos genes imprinted H19, Igf2 e Igf2r, foram

realizadas análises de quantificação relativa de expressão gênica através de PCR

em tempo real utilizando o sistema de detecção ABI Prism

7500 e tecnologia

SYBR

Green (Applied Biosystems

), molécula fluorescente empregado nos kits

de amplificação que emitem sinal de fluorescência ao intercalar com DNA dupla-

fita. O corante ROX foi usado como referência passiva do equipamento.

Uma vez que a quantificação relativa baseia-se na freqüência relativa dos

transcritos do gene alvo em comparação com um gene de expressão constitutiva,

foi utilizado o gene GAPDH (“glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase”) como

controle endógeno para normalização dos dados. Para amplificação dos genes,

foram empregados os seguintes “primers” ou seqüência de oligonucleotídeos

iniciadores (5’• 3’):

• GAPDH: 118 pares de base (Genbank: AB098979)

♣

GCGTGAACCACGAGAAGTATAA

♣

CCCTCCACGATGCCAAAGT

• Igf2: 323 pares de base (YASEEN et al., 2001; Genbank: X53553)

♣

CTTCAGCCGACCATCCAGCCGCATAAAC

♣

TCAGCGGACGGTGACTCTTGGCCTCTCT

• Igf2r: 293 pares de base (YASEEN et al., 2001; Genbank: JO3527)

♣

CGCCTACAGCGAGAAGGGGTTAGTC

♣

AGAAAAGCGTGCACGTGCGCTTGTC

• H19: 156 pares de base (Genbank: AY849926)

♣

GACACCCAGAACCCTCAAGA

♣

CCTTCCAGAGCTCATTCCTG

Para avaliar a especificidade da amplificação com os “primers” acima

descritos, foi utilizado cDNA de placentônio de um dos animais clonados para a

PCR em tempo real, analisando-se a Curva de Dissociação. A PCR em tempo real

foi realizada em volume de 20µL para cada gene, sendo que a composição final

dos reagentes está descrita conforme a Tabela 1.

Tabela 1:

Componentes utilizados para a PCR em tempo real para avaliação da especificidade da

amplificação dos “primers” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.

GAPDH Igf2 Igf2r H19

Água

4,0

L 4,2

L 3,0

L 4,0

Master Mix

10,0

L 10,0

“Primer” F

0,5

(0,25

0,4

(0,20

1,0

(0,50

0,5

(0,25

“Primer” R

0,5

(0,25

0,4

(0,20

1,0

L (0,50

M) 0,5

(0,25

cDNA

5,0

(535ng)

5,0

(535ng)

5,0

(535ng)

5,0

(535ng)

Total

20,0

L 20,0

As condições de amplificação empregadas na PCR em tempo real foram: 1

ciclo inicial de 2min a 50°C (etapa 1), 1 ciclo de 10min a 95°C (etapa 2), seguido

de 45 ciclos de 30seg a 95°C (desnaturação) e 1min a 60°C (anelamento e

extensão) (etapa 3). Os valores de emissão de fluorescência foram determinados

ao término de cada ciclo. A Curva de Dissociação foi realizada após o último ciclo

de amplificação normal: 15seg a 95°C, 1min a 60°C e 15seg a 95°C (etapa 4). A

Curva de Dissociação de cada um dos genes está apresentada na Figura 1.

Com o aumento gradual de temperatura de 60°C para 95°C, verificou-se

que a emissão da fluorescência do SYBR

Green diminuiu em um único

momento, com a desnaturação dos produtos da PCR em tempo real ocorrendo

quando atingiu uma temperatura específica para cada um dos genes, não

havendo, portanto, amplificação inespecífica. Tal afirmativa pôde ser comprovada

submetendo-se os produtos da PCR a eletroforese em gel de agarose (1,2%)

corado com brometo de etídio (Figura 2).

Após a confirmação de que os “primers” eram específicos para amplificação

dos transcritos dos genes de interesse, procedeu-se a determinação da

concentração de cDNA para a reação, avaliando-se a eficiência da amplificação

utilizando-se diferentes diluições de cDNA (curva padrão). Foram feitas cinco

diluições seriadas para cada gene, partindo de uma concentração inicial de cDNA

de 270ng/ì L (mistura de cDNA de 3 clones): 1:1 (270ng), 1:2 (135ng), 1:4

(67,5ng), 1:8 (33,75ng) e 1:16 (16,875ng).

GAPDH

Igf2

Igf2r H19

Figura 1:

Curva de Dissociação para avaliação da especificidade da amplificação dos “primers”

dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.

Após a PCR em tempo real (mesmas condições da reação anterior),

estabeleceu-se uma curva padrão para cada um dos genes com base nos C

(“threshold cycle”: ponto de cruzamento na curva de amplificação que atravessa a

linha arbitrária na fase exponencial ou “threshold”, onde todas as amostras

possuem a mesma intensidade fluorescente/mesma quantidade de produto de

PCR). Com base na análise da curva padrão (Figura 3) e da curva de dissociação

dos genes, definiu-se a concentração de 40ng/

ì L para as rea

ções.

350

125

GAPDH

Igf2

Igf2r

H19

25bp

350

125

GAPDH

Igf2

Igf2r

H19

25bp

Figura 2:

Avaliação de amplificação específica de um único produto da PCR em tempo real dos

genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19 (eletroforese em gel de agarose a 1,2% corado com

brometo de etidio).

Para a análise de quantificação relativa dos transcritos dos genes Igf2, Igf2r

e H19 nos placentônios dos clones e dos animais controle, quantificou-se

inicialmente o cDNA de todas as amostras em Biofotômetro (Eppendorf),

ajustando-se a concentração final para 40ng/ì L. A compos ição final da reação

está descrita na Tabela 2. Cada amostra analisada foi conduzida em duplicata,

seguindo as mesmas condições da reação anterior: 1 ciclo inicial de 2min a 50°C ,

1 ciclo de 10min a 95°C, seguido de 45 ciclos de 30seg a 95°C (desnaturação) e

1min a 60°C (anelamento e extensão) (etapa 3). O nível de expressão relativa

para cada gene foi calculado baseado na expressão de um calibrador, no caso

amostra do animal controle N3, que foi usado em todas as placas.

GAPDH

Ifg2r

Ifg2

H19

GAPDH

Ifg2r

Ifg2

H19

GAPDH

Ifg2r

Ifg2

H19

Figura 3:

Curva padrão correspondente aos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19 em diferentes

diluições.

Tabela 2:

Componentes utilizados para a PCR em tempo real para avaliação da expressão dos

genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.

GAPDH Igf2 Igf2r H19

Água

6,6

L 6,6

Master Mix

10,0

L 10,0

“Primer” F

1,2

(0,60

1,2

(0,20

1,2

(0,50

1,2

(0,25

“Primer” R

1,2

(0,60

1,2

(0,20

1,2

(0,50

1,2

(0,25

cDNA

1,0

(40ng/

1,0

(40ng/

1,0

(40ng/

1,0

(40ng/

Total

20,0

L 20,0

Figura 4:

Exemplo da determinação da eficiência das reações de PCR em tempo real para o

gene GAPDH, utilizando o programa LinRegPCR: determinação dos limites superior e

inferior (a), presença mínima de 4 pontos na curva de regressão (b) e alta correlação

) das amostras (c).

Tabela 3:

Eficiência média da reação, desvio padrão, limites inferior e superior e determinação do

“threshold” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.

GAPDH Igf2 Igf2r H19

eficiência média da reação 0,93 0,825 0,719 1,0

desvio padrão da eficiência 0,055 0,045 0,053 0,056

limite inferior 0,020 0,020 0,020 0,010

limite superior 0,590 0,300 0,780 0,490

“threshold” 0,305 0,160 0,400 0,250

(a)

(limite inferior)

(limite superior)

(b)

(c)

Ao término das reações, com base nos valores detectados de fluorescência

de cada ciclo das amostras analisadas para cada gene, determinou-se a eficiência

média da reação de cada amostra utilizando-se o programa LinRegPCR –

Analysis of Real Time PCR Data, versão 7.5 (RAMARKERS et al., 2003),

estabelecendo-se limites inferior e superior (“janela de linearidade”) em que as

amostras estejam em fase logarítmica, mínimo de 4 pontos incluídos na regressão

e alta correlação (Figura 4). A partir dos dados da eficiência da reação de cada

uma das amostras, calculou-se a média da eficiência da PCR para cada gene bem

como a “threshold”, pela média do limite inferior e superior (Tabela 3).

Com base na eficiência média da reação para cada gene e da “threshold”,

determinou-se os valores dos C

s de cada amostra em cada ciclo no programa

“7500 System SDS Software”. A quantificação final da expressão relativa dos

genes de interesse foi realizada utilizando-se a de comparação dos C

s de acordo

com a eficiência da reação, conforme descrito por PFAFFL e colaboradores

(2001). Os cálculos foram realizados pelo método REST

- “Relative Expression

Software Tool” (Pfaffl et al., 2002), baseado na razão da expressão do gene alvo

(Igf2, Igf2r e H19) e do gene controle endógeno (GAPDH), com normalização dos

dados realizada com os transcritos do gene GAPDH, de acordo com a seguinte

fórmula:

Razão de expressão =

)

(

)

(

amostra

controle

ref

amostra

controle

alvo

ref

alvo

−

∆

−

∆

onde: E = eficiência da reação;

= ciclo em que cada curva de amplificação passa pelo “threshold”,

servindo como base para comparação entre as amostras;

= diferença entre amostra versus controle.

5.5. Análise Estatística

A expressão relativa dos genes de interesse Igf2, Ifg2r e H19, bem como do

controle endógeno GAPDH foram comparadas utilizando-se um teste não

paramétrico de modo pareado fixo de relocação ao acaso (“Pair Wise Fixed

Reallocation Randomisation Test

”), descrito por PFAFFL e colaboradores (2002),

considerando-se p<0,05 como nível de significância.

VI. RESULTADOS

As taxas de nascimentos de clones, eficiência da técnica e de mortalidade

pós-nascimento, obtidas das cinco linhas celulares empregadas como fonte

doadora de núcleo, assim como os dados dos clones (identificação, origem da

linha celular, sexo, peso ao nascimento e sobrevivência neonatal), estão

apresentados nas Tabela 4 e 5, respectivamente. Com base nas diferenças de

peso ao nascimento, bem como das variações encontradas nos resultados de

sobrevivência neonatal de acordo com o sexo (eficiência da técnica foi 123%

superior na clonagem de machos do que em clones fêmeas), além da análise

individual de cada clone bem como de todo grupo clonado em comparação ao

grupo controle concebido por monta natural (Tabela 6), avaliou-se também a

influência do sexo (macho ou fêmea), da sobrevivência neonatal (morto ou vivo) e

do peso ao nascimento (maior ou menor que 40kg).

Tabela 4:

Taxas de estabelecimento de gestação (30d), mortalidade embrionária (30-60d),

abortos (60d-nascimento), nascimentos, mortalidade pós-nascimentos e eficiência da

técnica de clonagem por transferência nuclear para cada uma das linhas celulares

utilizadas como fonte doadora de núcleo (*).

ID do animal

gestação

30d

M.E.

30-60d

abortos 60d-

nc/o

nasci-mentos

morta/e

pós-nc/o

Eficiência

clonagem

linha 2 F 33,3% 71,4% 75,0% 02,4% 00,0% 2,4%

linha 3 M 21,9% 00,0% 14,3% 18,8% 50,0% 9,4%

linha 4 M 38,2% 61,5% 60,0% 05,9% 00,0% 5,9%

linha 5 F 26,4% 21,4% 45,5% 11,3% 66,7% 3,8%

linha 6 F 18,0% 11,1% 62,5% 06,0% 33,3% 4,0%

média 27,0% 38,6% 48,6% 08,5% 44,4% 4,7%

Linhas F 25,5% 25,5% 37,8% 06,9% 50,0% 3,4%

linhas M 30,3% 30,3% 40,0% 12,1% 37,5% 7,6%

ID = identificação; F = fêmea; M = macho; M.E. =mortalidade embrionária; nc/o = nascimento;

morta/e = mortalidade.

(*) dados gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP/Pirassununga-SP).

Avaliando-se a expressão relativa dos transcritos dos genes “imprinted” nas

placentas dos clones em comparação ao grupo controle concebido por monta

natural (Figura 5), verificou-se diferença significativa nos valores encontrados para

os genes Igf2 e H19. As placentas de animais clonados apresentaram redução na

expressão relativa de 41,5% para o H19 (P<0,03) e de 42,9% para o Igf2 (P<0,05),

quando comparada ao grupo controle. Não houve diferença (P>0,05) com relação

à expressão de Igf2r, que se mostrou similar entre o grupo clonado e o grupo de

monta natural.

Tabela 5:

Dados dos clones bovinos nascidos vivos: identificação, sobrevivência neonatal, sexo e

peso ao nascimento (kg) (*).

linha celular Identificação do

clone

sobrevivência

neonatal

sexo peso ao nascimento

(kg)

linha celular 2 2.1 vivo fêmea 42,0

linha celular 3 3.1 morto macho 51,0

linha celular 3 3.3 vivo macho 37,0

linha celular 3 3.4 morto macho 14,0

linha celular 3 3.5 morto macho 56,0

linha celular 3 3.6 vivo macho 37,0

linha celular 4 4.1 vivo macho 57,0

linha celular 6 6.1 morto fêmea 62,0

linha celular 6 6.3 morto fêmea 29,2

linha celular 6 6.4 morto fêmea 51,0

linha celular 6 6.5 vivo fêmea 43,0

linha celular 6 6.6 vivo fêmea 48,5

linha celular 7 7.1 vivo fêmea 39,0

linha celular 7 7.2 morto fêmea 37,0

linha celular 7 7.3 vivo fêmea 50,0

(*) dados gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP/Pirassununga-SP).

Tabela 6:

Dados dos neonatos bovinos do grupo controle concebidos por monta natural:

identificação, sexo e peso ao nascimento (kg) (*).

Identificação do clone sexo peso ao nascimento (kg)

N2 macho 40,0

N3 fêmea 36,0

N4 fêmea 35,2

(*) dados gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP/Pirassununga-SP).

0,756

0,571

0,585

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone

0,756

0,571

0,585

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone

Figura 5:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones em comparação

a placentas de animais de monta natural (controle). (*, p<0,05).

Uma vez que acredita-se que o H19 regule a expressão de Igf2 em

camundongos e humanos, determinou-se a correlação entre a expressão destes

dois genes, além do Igf2r (Correlação de Pearson). A expressão de Igf2 e de H19

apresentou uma correlação positiva de 0,96 (P<0,001). No entanto, não foi

possível estabelecer uma correlação significativa entre as expressões relativas de

Igf2r-H19 (0,63) bem como de Igf2r-Igf2 (0,62).

Quando separou-se o grupo clonado por sexo (placenta de clones machos

e fêmeas), verificou-se diferença significativa na expressão dos genes Igf2 e H19

nas placentas de clones fêmeas em comparação com o grupo controle por monta

natural (Figura 6). Houve uma diminuição da expressão relativa de 64,6% para o

H19 e de 56,5% para o Ifg2 nas placentas de clones fêmeas. Não houve diferença

para os valores de expressão relativa de Igf2r (P>0,05). De modo interessante,

quando comparou-se a expressão relativa dos genes “imprinted” nas placentas de

clones machos em relação ao controle por monta natural, a diferença significativa

verificada nas placentas de clones fêmeas não foi detectada no caso dos machos,

nem para o gene Ifg2 bem como para o gene H19 (P>0,05; Figura 7).

Comparando-se os grupos clonados entre si separados por sexo (Figura 8), o

gene H19 mostrou-se cerca de 3,6 vezes mais expresso nas placentas de clones

machos em relação à placenta de clones fêmeas (P<0,05). Esta diminuição

significativa na expressão do gene H19 nas fêmeas clonadas (72,6%) em relação

aos clones machos não foi verificada para os genes Igf2 e Igf2r (P>0,05). Esta

diferença com relação à expressão do gene H19 entre os grupos clonados macho

e fêmea foi detectada na avaliação individual da expressão relativa de cada clone

em comparação com o grupo controle por monta natural. Das nove fêmeas

clonadas analisadas, nada menos que oito placentas (88,9%) apresentaram

diminuição significativa para a expressão do H19. Em todas estas oito fêmeas, o

gene H19 manteve-se sempre pelo menos 3 vezes menos expresso nas placentas

destes animais em relação ao grupo controle. Apenas uma fêmea clonada (clone

2.1) não teve alteração em relação à expressão dos genes “imprinted” (P>0,05).

Já na análise individual dos clones machos em relação ao grupo controle,

não houve diminuição significativa da expressão gênica relativa para o H19 em

nenhum caso, pelo contrário. Das seis placentas de clones machos analisadas,

em dois animais (clones 3.3 e 3.5) houve aumento significativo da expressão do

gene H19.

Na análise realizada em que o grupo de clones são separados de acordo

com a sobrevivência neonatal, não houve alteração na expressão dos genes

“imprinted” Igf2, Igf2r e H19 tanto no grupo de clones vivos (Figura 9) bem como

no grupo de clones mortos (Figura 10) em comparação ao grupo controle por

monta natural (p>0,05). Do mesmo modo, não foi detectada variação significativa

na expressão relativa dos mesmos genes entre os grupos de clones vivos (8

animais, sendo 3 machos e 5 fêmeas) em comparação ao grupo de clones mortos

(7 animais, sendo 3 machos e 4 fêmeas), como mostra a Figura 11.

Tomando-se como referência o peso ao nascimento dos clones, verificou-se

que nos clones nascidos com menos de 40kg (6 clones, sendo 3 machos e 3

fêmeas), nenhuma alteração na expressão dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19

(P>0,05) foi detectada na placenta destes clones em comparação a placenta dos

animais do grupo controle por monta natural (Figura 12). Já no caso dos clones

com peso ao nascimento superior a 40kg (9 clones, sendo 3 machos e 6 fêmeas),

a análise da expressão relativa dos genes “imprinted” de interesse em

comparação ao grupo controle mostrou uma diminuição significativa para os genes

Igf2 e H19 (Figura 13), sendo, respectivamente, de 40,1% e 36,3%. Não houve

diferença com relação à expressão do gene Igf2r (P>0,05). Quando comparou-se

a expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 entre o grupo de clones com peso

inferior e superior a 40kg, não foi possível detectar nenhuma alteração significativa

com relação à expressão destes genes “imprinted” (Figura 14).

0,699

0,435

0,354

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone fêmea

0,699

0,435

0,354

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone fêmea

Figura 6:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones fêmeas em

comparação a placentas de animais de monta natural (controle). (*, p<0,05).

0,821

0,879

1,292

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone macho

0,821

0,879

1,292

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone macho

Figura 7:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones machos em

comparação a placentas de animais de monta natural (controle).

0,850

0,495

0,274

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

clone macho (controle) x clone fêmea

0,850

0,495

0,274

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

clone macho (controle) x clone fêmea

Figura 8:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones fêmeas em

comparação a placentas de clones machos (controle). (*, p<0,05).

Figura 9:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones vivos em

comparação a placentas de animais de monta natural (controle).

Figura 10:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones mortos em

comparação a placentas de animais de monta natural (controle).

Figura 11:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones vivos em

comparação a placentas de clones mortos (controle).

0,688

0,583

0,600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone vivo

0,825

0,559

0,571

0,0

0,5

1,0

1,5

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone morto

1,119

0,959

0,952

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

clone vivo (controle) x clone morto

Figura 12:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones nascidos com

peso < 40kg em comparação a placentas de animais de monta natural (controle).

Figura 13:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones nascidos com

peso > 40kg em comparação a placentas de animais de monta natural (controle).

(*, p<0,05).

Figura 14:

Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones nascidos com

peso > 40kg em comparação a placentas clones nascidos com peso < 40kg (controle).

0,861

0,582

0,510

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone < 40kg

0,832

1,029

1,250

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

clone < 40kg (controle) x clone > 40kg

0,637

0,599

0,716

0,0

0,5

1,0

1,5

Igf2

Igf2r

H19

Fator de Expressão

monta natural (controle) x clone > 40 kg

VII. DISCUSSÃO

Contrastando com o grande interesse e as intensas pesquisas realizadas

no uso da técnica de transferência nuclear para a produção de clones a partir de

células somáticas adultas, os resultados da clonagem ainda são extremamente

ineficientes (SOLTER, 2000; WESTHUSIN et al., 2001, THIBAULT et al., 2003;

CAMPBELL et al., 2005). Altas taxas de perdas durante toda a gestação e mesmo

após o nascimento têm sido observadas em diversas espécies clonadas devido a

anormalidades fetais e placentárias (HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-PALMER

et al., 2004; WELLS et al., 2004), indicativo de falhas no processo de

reprogramação nuclear. Os genes “imprinted”, caracterizados por apresentarem

um padrão de expressão gênico diferenciado de seus alelos parentais, devem

também ser corretamente reprogramados, pois estes mesmos genes exercem

função essencial na regulação do crescimento e desenvolvimento do feto, bem

como da placenta (REIK et al., 2003).

Em nosso estudo, avaliamos o padrão de expressão dos genes “imprinted”

Igf2, Igf2r e H19 na placenta de clones nascidos a termo em comparação à

placenta de animais controle produzidos por monta natural, uma vez que a

estrutura placentária tem grande importância no que diz respeito ao processo de

implantação, estabelecimento de uma interface para troca de nutrientes e gases

entre a circulação materna e fetal, início do reconhecimento materno da gestação,

alteração imunológica do ambiente uterino bem como em funções metabólicas

através de produção de hormônios endócrinos e fatores parácrinos (CROSS,

2006). Além disso, distúrbios placentários na gestação de clones têm sido

frequentemente relatados, como hipovascularização (cório-alantóide), redução do

número de cotilédones, hidroalantóide, edemaciação das membranas placentárias

e hipertrofia dos placentomas (HILL et al., 1999; De SOUSA et al., 2001;

HASHIZUME et al., 2002; HEYMAN et al., 2002a).

Na avaliação do gene “imprinted” Igf2r, caracterizado por apresentar

“imprint” do alelo paterno e expressão do alelo materno, e que atua inibindo o

crescimento fetal mediante seqüestro de Igf2 para o interior de lisossomos, onde é

degradado (MURPHY & JIRTLE, 2003; JOHN & SURANI, 2000), verificou-se que

não houve alteração em seu padrão de expressão, detectado na placenta de

clones nascidos, em comparação à placenta de animais do grupo controle. Em

estudos anteriores realizados em camundongos, o padrão de expressão do gene

“imprinted” Igf2r na placenta de clones apresentou-se de modo semelhante ao

controle, utilizando-se como fonte doadora de núcleo, tanto células somáticas

(INOUE et al., 2002), como células tronco embrionárias - “ES cells” (HUMPHERYS

et al., 2002), corroborando com nossos resultados. Na espécie bovina, até o

momento, não há relatos da descrição deste gene na placenta de clones nascidos.

Em estudo recente realizado por YANG e colaboradores (2005), não houve

alteração dos níveis de expressão do gene “imprinted” IGF2r em tecidos coletados

pós-mortem de neonatos bovinos clonados com células somáticas em

comparação ao grupo de recém-nascidos controle.

Importante fator de crescimento fetal (De CHIARA et al., 1999;

EFSTRATIADIS, 1998) e desenvolvimento placentário (CONSTANCIA et al.,

2002), o gene “imprinted” Igf2 (“imprint” do alelo materno e expressão do alelo

paterno; CURCHOE et al., 2005) mostrou-se sub-expresso na placenta dos clones

neonatos quando comparado ao grupo por monta natural. Diminuição dos níveis

de RNAm de Igf2 também já foram detectados na placenta de camundongos

clonados a partir de células tronco embrionárias (OGAWA et al., 2003). Já em

placenta de clones murinos reconstituídos com células somáticas, não houve

diferença nos níveis de expressão deste mesmo gene em comparação com grupo

controle reproduzido naturalmente (INOUE et al., 2002). Embora não haja relato

do estudo deste gene na placenta de neonatos bovinos clonados, a análise de

tecidos de clones recém-nascidos e mortos logo após o nascimento nesta espécie

revelam que os padrões de expressão do gene “imprinted” Igf2 encontravam-se

significativamente mais elevados do que nos bezerros controles (YANG et al.,

2005). Em clones murinos, os dados são conflitantes em estudos envolvendo o

Igf2: alguns animais clonados com células tronco embrionárias apresentando

aumento dos níveis de expressão (HUMPHERYS et al., 2001), redução em fetos

reconstituídos com estas mesmas células (OGAWA et al., 2003) e sem alteração

dos padrões de expressão em clones reconstituídos com células somáticas

(INOUE et al., 2002). A alta variação verificada tanto na placenta como nos fetos e

clones murinos produzidos a partir de células tronco embrionárias pode estar

ligada à maior instabilidade epigenética destas células doadoras de núcleo

(HUMPHERYS et al., 2001). Em ovinos nascidos clonados com células somáticas,

não foi detectada diferença para expressão deste gene “imprinted”.

O gene “imprinted” H19, expresso alelo materno e “imprint” do alelo paterno

(ZHANG et al., 2004), apresentou diminuição significativa dos níveis de expressão

na placenta dos clones em relação ao grupo controle. Assim como no caso do

gene “imprinted” Igf2, verifica-se uma alta variação em estudos realizados em

placentas e animais clonados a termo. Em clones murinos reconstituídos com

células tronco embrionárias, observou-se diminuição dos valores de expressão do

H19 tanto na placenta como em fetos (OGAWA et al., 2003). Em outro relato em

camundongos utilizando esta mesma fonte doadora de núcleo, alguns clones

apresentaram expressão anormal (diminuição da expressão na detecção em

fígado), sendo o gene “imprinted” H19 até mesmo “silenciado” em alguns casos

(HUMPHERYS et al., 2001). Na clonagem com células somáticas, não houve

diferença em relação aos valores encontrados na placenta de clones murinos em

comparação ao controle (INOUE et al., 2002). Em estudos realizados em clones

bovinos nascidos com mortalidade neonatal, metade dos animais apresentou

aumento significativo do padrão de expressão do H19 (YANG et al., 2005), bem

como expressão bialélica deste mesmo gene já foi relatada (ZHANG et al., 2004).

Em ovinos, no entanto, a avaliação em tecidos de animais clonados produzidos a

termo a partir de células somáticas não revelou alteração no nível de expressão

do gene “imprinted” H19 (YOUNG et al., 2003).

Esta alta variação dos resultados em estudos realizados para avaliação dos

genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19 na placenta e animais clonados a termo, indica

a ocorrência de uma incompleta reprogramação gênica. Diferentes tipos de linhas

celulares utilizadas como fonte doadora de núcleo podem ter reflexo sobre a

reprogramação nuclear (RIDEOUT III et al., 2003; ECKARDT et al., 2004), com

sensíveis alterações dos padrões de expressão gênica ocorrendo mesmo em

neonatos vivos após o nascimento bem como em seus anexos placentários, de

acordo com a estabilidade genética e epigenética da célula doadora

(HUMPHERYS et al., 2001). Além da influência do núcleo doador, existem

divergências nos resultados em diferentes espécies clonadas. Em nosso estudo,

observou-se diminuição dos valores de expressão detectados na placenta de

neonatos clones bovinos, para os genes “imprinted” H19 e Igf2, não sendo

detectada tal sub-expressão destes mesmos genes na placenta de clones murinos

igualmente reconstituído com células somáticas (INOUE et al., 2002), o que indica

que diferenças espécies específicas devam existir, já que o processo de

placentação também difere entre bovinos e camundongos.

Em humanos e camundongos, o gene “imprinted” H19 contém elementos

que controlam a regulação do gene Igf2 (WUTZ et al., 1997; YOUNG et al., 2003).

Em bovinos, embora se saiba que o gene H19 também apresenta-se ligado

próximo ao gene Igf2 (LARKIN et al., 2003), ainda não foi estabelecido o

mecanismo de controle entre estes dois genes “imprinted” nesta espécie. Uma

correlação negativa é verificada entre o H19 e o Igf2 em camundongos na

reprodução natural (LI et al., 1993). Em clones murinos reconstituídos com células

tronco embrionárias, esta mesma relação negativa foi detectada na maioria dos

animais, mas não em todos (indicativo de variação individual da reprogramação

nuclear), com aumento da expressão relativa do Igf2 e sub-expressão do gene

H19 (HUMPHERYS et al., 2001). Em nosso estudo, foi possível estabelecer uma

correlação entre os genes Igf2 e H19, mas ambos apresentaram-se sub-expressos

na placenta de clones nascidos em comparação ao valores encontrados na

placenta de animais controle produzidos por monta natural. Uma correlação

positiva foi estabelecida também em animais clonados produzidos a termo, mas

com aumento dos padrões de expressão do Igf2 e H19 (YANG et al., 2005). Estes

resultados da correlação positiva entre estes dois genes, verificados tanto na

placenta de clones como nos neonatos produzidos por transferência nuclear com

células somáticas na espécie bovina, sugerem que, possivelmente, exista

diferença no mecanismo de regulação do gene “imprinted” Igf2, não sendo

regulado apenas pelo H19, mas provavelmente por outros fatores, já que a

diminuição do H19 não leva a um aumento dos valores de Igf2, como ocorre nos

modelos de regulação Igf2-H19 existente em camundongos (BELL &

FELSENFELD, 2000; HARK et al., 2000).

Em análise realizada separando-se o grupo de clones de acordo com o

sexo, notada diferença foi verificada na placenta de fêmeas em relação à de

machos. Assim como em todos as análises feitas nos diferentes sub-grupos de

placentas de clones, o gene “imprinted” Igf2r não mostrou alteração em seu

padrão de expressão. No entanto, avaliando-se os genes H19 e Igf2, uma

significativa diminuição foi verificada na placenta de clones fêmeas em relação ao

grupo controle, o que não foi observado no caso da placenta de clones machos. O

gene “imprinted” H19 apresentou-se pelo menos três vezes menos expresso na

placenta de clones fêmeas em comparação à de machos. Embora diferenças

entre gestações de machos e fêmeas já tenham sido verificadas, com maior média

de período de gestação para machos Nelore do que fêmeas (ROCHA et al., 2005),

bem como recente estudo mostrou que a expressão de alguns genes ocorre

diferencialmente na placenta, em humanos, em gestações com sexos diferentes

(SOOD et al., 2006), a avaliação do grupo controle por monta natural não mostrou

diferença significativa nos valores de expressão destes genes “imprinted” quando

separados por sexo, o que mostra que esta diferença não ocorre na placenta de

bovinos em gestações normais. Esta variação verificada especificamente no caso

do gene “imprinted” H19 na placenta de clones fêmeas, sub-expressa em relação

aos valores detectados na placenta de clones machos, indica que fatores ligados

ao sexo podem influenciar a reprogramação nuclear. Entretanto, as razões para

esta diferença ainda não são claras, em virtude do desconhecimento dos

mecanismos envolvidos na regulação deste gene “imprinted” em bovinos bem

como dos eventos controladores da reprogramação do núcleo.

Mesmo sendo possível a produção de clones nascidos, verifica-se ainda

uma alta mortalidade de neonatos logo após o nascimento (HEYMAN et al.,

2002a; CHAVATTE-PALMER et al., 2004; WELLS et al., 2004). Das 15 placentas

analisadas neste trabalho de clones produzidos a termo, houve uma taxa de

46,6% de mortalidade neonatal. Entretanto, nenhuma alteração significativa no

que diz respeito aos padrões de expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19

foi detectada na análise separando-se o grupo de placentas de clones de acordo

com a sobrevivência dos animais, tanto para clones vivos como para mortos. As

altas taxas de mortalidade pós-nascimento (HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-

PALMER et al., 2004) devem ser resultado de problemas na reprogramação de

diversos genes, “imprinted” e não-“imprinted”, que se refletem em diversas

anomalias descritas tanto na placenta como nos neonatos clonados (HILL et al.,

1999, 2000; JONES et al., 2001; HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-PALMER et

al., 2004).

A diferença verificada na expressão dos genes “imprinted” H19 e IgfF2, com

diminuição do padrão de expressão de ambos os genes na placenta de neonatos

clones, em nosso trabalho, comparado ao aumento do Igf2 e H19 em clones

bovinos nascidos (YANG et al., 2005), indicam possível diferença no mecanismo

de reprogramação nuclear de acordo com o tipo celular (células da placenta e do

concepto/neonato), já que um comportamento oposto destes genes é observado

na placenta e nos neonatos (tecidos coletados pós-mortem). As alterações e

patologias, verificadas em necrópsias de neonatos clones, podem ser agravadas

devido aos problemas placentários, e consequentemente, promover maior

comprometimento da regulação gênica bem como da reprogramação nuclear no

feto. Isto torna-se mais evidente à medida que em clones quimeras, onde

blastômeros tetraplóides foram misturados a embriões reconstituídos, com a

contribuição das células tetraplóides na formação do trofoblasto, houve uma

melhora das taxas de gestação bem como da condição de alguns clones, tanto em

estudos em camundongos (EGGAN et al., 2001) como em bovinos (IWASAKI et

al., 2000).

Na avaliação das placentas de clones separados por peso ao nascimento,

não foi possível detectar diferenças entre os padrões de expressão dos genes

“imprinted” Igf2r, Igf2 e H19. Comparando-os com o grupo controle, houve

diminuição da expressão do gene Igf2 e H19 em ambas as faixas de peso, sendo

significativo, porém, apenas no grupo em que os clones pesavam acima de 40kg.

Esta diminuição da expressão do gene Igf2 na placenta de animais mais pesados

não deve estar correlacionada com o peso do neonato, já que haveria menor

quantidade de Igf2, que é um dos principais fatores de crescimento fetal (De

CHIARA et al., 1999; EFSTRATIADIS, 1998). Talvez o Igf2 produzido na placenta

possa ter um efeito mais parácrino, localizado, do que sobre o feto propriamente

dito, já que o mesmo atua também regulando o crescimento e o desenvolvimento

placentário (CONSTANCIA et al., 2002) Esta diminuição do Igf2 na placenta dos

clones poderia resultar em distúrbios placentários, como hipovascularização da

placenta, diminuição do número de placentomas bem como desenvolvimento

rudimentar de alguns anexos placentários. Os problemas fetais devem ser

resultado da reprogramação nuclear incompleta das células que compõem o feto,

de genes importantes no crescimento e desenvolvimento, bem como devem ser

influenciados pelos problemas detectados na placenta, os quais, por não serem os

ideais, comparado a uma gestação normal, podem agravar ou prejudicar ainda

mais o processo envolvido na regulação da expressão gênica e reprogramação do

núcleo no feto, resultado de uma troca ineficiente de metabólitos e fluídos entre o

concepto e a mãe.

Problemas associados com aumento do peso ao nascimento fazem parte

da “Síndrome da Cria Gigante” (LOS – “Large Offspring Syndrome”, YOUNG et al.,

1998). Em ovinos produzidos por fertilização in vitro que apresentavam LOS, foi

verificado uma redução da expressão do Igf2r em diversos órgãos (YOUNG et al.,

2001), mas não do Igf2, e esta diminuição do Igf2r diminuiria seu efeito inibitório

de crescimento fetal, contribuindo para o aumento do peso ao nascimento. Em

bovinos clonados recém-nascidos que apresentavam sintomatologia semelhante à

LOS, houve um aumento da expressão do Igf2, mas não do Igf2r (YANG et al.,

2005). Em nosso estudo, embora alguns animais clones tenham morrido

apresentando alguns sinais semelhantes àqueles descritos na LOS, não houve

alteração para o gene “imprinted” Igf2r na placenta. Estes resultados indicam que

a LOS deve ocorrer em decorrência da alteração de diversos genes de modo

complexo, não podendo-se atribuir tal síndrome a desregulação de apenas poucos

genes.

Nossos resultados confirmam a hipótese de que mesmo em clones viáveis

bovinos nascidos a termo, uma reprogramação nuclear incompleta ocorre na

placenta destes animais clonados com células somáticas. Uma significativa

alteração no padrão de expressão foi verificada em genes “imprinted” importantes

no crescimento e desenvolvimento placentário e fetal, com sub-expressão dos

genes Igf2 e H19 na placenta dos clones neonatos, o que pode contribuir para

aumento da mortalidade pós-natal devido a distúrbios placentários. Ao contrário do

que foi observado em camundongos, em que há uma correlação negativa entre os

genes Igf2 e H19, nosso estudo mostra que esta correlação não ocorre na

clonagem em bovinos, indicativo de que diferenças espécies-específicas possam

existir no mecanismo de regulação destes genes “imprinted”. Além disso, maiores

alterações foram detectadas no padrão de expressão do gene “imprinted” H19 em

placentas de clones fêmeas do que em machos, apresentando-se três vezes

menos expresso no caso das fêmeas, o que sugere que o processo de

reprogramação e controle da expressão de alguns genes pode ser influenciado

pelo sexo.

VIII. CONCLUSÕES

Mesmo em clones nascidos com êxito pela técnica de transferência nuclear,

ocorre uma reprogramação nuclear incompleta nos placentônios destes animais.

Genes “imprinted”, importantes no desenvolvimento da placenta e no

crescimento fetal, apresentam diferenças com relação aos padrões de expressão

gênica na placenta em relação a animais produzidos sob condições naturais.

Os genes “imprinted” H19 (“imprint” paterno) e Igf2 (“imprint” materno) são

expressos diferencialmente em placentas de clones recém-nascidos em relação à

placenta de animais não clonados, indicativo de erros de expressão gênica.

Há uma correlação positiva dos genes “imprinted” Igf2 e H19 na placenta de

clones bovinos, indicativo de que diferenças espécies-específicas, com relação a

camundongos, deve existir no mecanismo de regulação destes genes “imprinted”.

O gene “imprinted” Igf2r (“imprint” paterno) foi expresso corretamente na

placenta de clones recém-nascidos.

Alterações placentárias dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19 não estão

relacionados à mortalidade neonatal.

O gene “imprinted” H19 não foi reprogramado adequadamente na placenta

de clones fêmeas em comparação a placenta de clones machos, indicativo de que

alguns eventos ligados ao processo de reprogramação e controle da expressão de

alguns genes podem estar ligados ao sexo.

Não há uma relação direta aparente entre modificações do padrão de

expressão dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19, detectado em placentônios,

com relação ao peso dos clones.

IX. REFERÊNCIAS

BAGUISI, A.; OVERSTRÖM, E.W. Induced enucleation in nuclear transfer procedures to produce

cloned animals.

Theriogenology

, v.53, p.209, 2000 (abstract).

BAGUISI, A.; BEHDOODI, E.; MELICAN, D.T.; POLLOCK, J.S.; DESTREMPES, M.M.;

CAMMUSO, C.; WILLIAMS, J.L.; NIMS, S.D.; PORTER, C.A.; MIDURA, P.; PALACIOS, M.J.;

AYRES, S.L.; DENNISTON, R.S.; HAYES, M.L.; ZIOMEK, C.A.; MEADE, H.M.; GODKE, R.A.;

GAVIN, W.G.; OVERSTRÖM, E.W.; ECHELARD, Y. Production of goats by somatic cell nuclear

transfer.

Nat. Biotechnol.

v.17, p.456-461, 1999.

BAKER, J;. LIU, J-P.; ROBERTSON, E.J.; EFSTRATIADIS, A. Role of insulin-like growth factors in

embryonic and postnatal growth.

Cell

, v.75, p.73-82, 1993.

BAO, S.; OBATA. Y.; CARROLL, J.; DOMEKI, I.; KONO, T. Epigenetic modifications necessary for

normal development are established during oocyte growth in mice.

Biol. Reprod.

, v.62, p.616-621,

2000.

BARNES, F.L.; COLLAS, P.; POWELL, R.; KING, W.A.; WESTHUSIN, M.; SHEPERD, D. Influence

of recipient oocyte cell cycle stage on DNA synthesis, nuclear envelope breakdown, chromosome

constitution and development in nuclear transplant bovine embryos.

Mol. Reprod. Dev.

, v.36, p.33-

41, 1993.

BARTOLOMEI, M.S.; TILGHMAN, S.M. Genomic imprinting in mammals.

Annu. Rev. Genet.

, v.31,

p.493-525, 1997.

BAVISTER, B.D. Interactions between embryos and the culture milieu.

Theriogenology

, v.53,

p.619-626, 2000.

BEAUDET, A.L.; JIANG, Y.H. A rheostat model for a rapid and reversible form of imprinting-

dependent evolution.

Am. J. Hum. Genet.

, v.70, p.1389-1397, 2002.

BEAUJEAN, N.; HARTSHORNE, G.; CAVILLA, J.; TAYLOR, J.; GARDNER, J.; WILMUT, I.;

MEEHAN, R.; YOUNG, L. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics.

Curr. Biol.

, v.14, p.R266-R267, 2004a.

BEAUJEAN, N.; TAYLOR, J.E.; McGARRY, M.; GARDNER, J.O.; WILMUT, I.; LOI, P.; PTAK, G.;

GALLI, C.; LAZZARI, G.; BIRD, A.; YOUNG, L.E.; MEEHAN, R.R. The effect of interspecific oocytes

on demethylation of sperm DNA.

Proc. Natl. Acad. Sci.

v.101, p.7636–7640, 2004a.

BEAUJEAN, N.; TAYLOR, J.; GARDNER, J.; WILMUT, I.; MEEHAN, R.; YOUNG, L. Effect of

limited DNA methylation reprogramming in the normal sheep embryo on somatic cell nuclear

transfer.

Biol. Reprod.

, v.71, p.185-193, 2004b.

BELL, A.C.; FELSENFELD, G. Methylation of a CTCFdependent boundary controls imprinted

expression of the Igf2 gene.

Nature

, v.405, p.482-485, 2000.

BETTHAUSER, J.; FORSBERG, E.; AUGENSTEIN, M.; CHILDS, L.; EILERTSEN, K.; ENOS, J.;

FORSYTHE, T.; GOLUEKE, P.; JURGELLA, G.; KOPPANG, R.; LESMEISTER, T.; MALLON, K.;

MELL, G.; MISICA, P.; PACE, M.; PFISTER-GENSKOW, M.; STRELCHENKO, N.; VOELKER, G.;

WATT, S.; THOMPSON, S.; BISHOP, M. Production of cloned pigs from in vitro systems.

Nat.

Biotechnol.

, v.18, p.1055-1059, 2000.

BETTS, D.H.; BORDIGNON, V.; HILL, J.R.; WINGER, Q.; WESTHUSIN, M.E.; SMITH, L.C.; KING,

W.A. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle.

Proc.

Natl. Acad. Sci.

, v.98, n.3, p.1077-1082, 2001.

BETTS, D.H.; PERRAULT, S.D.; PETRIK, J.; LIN, L.; FAVETTA, L.A.; KEEFER, C.L.; KING, W.A.

Telomere length analysis in goat clones and their offspring.

Mol. Reprod. Dev.

, v.72, p.1-10, 2005.

BEYHAN, Z.; MITALIPOVA, M.; CHANG, T.; FIRST, N.L. Developmental potential of bovine nuclear

transfer embryos produced using different types of adult donor cells.

Theriogenology

, v.53, p.210,

2000.

BHAK, J.S., LEE, S.L., OCK, S.A., MOHANA KUMAR, B., CHOE, S.Y., RHO, G.J. Developmental

rate and ploidy of embryos produced by nuclear transfer with different activation treatments in

cattle.

Anim. Reprod. Sci.

, v.92, p.37-49, 2006.

BIRD, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory.

Genes Dev.,

v.16, p.6-21, 2002.

BOIANI, M.; ECKARDT, S.; SCHOLER, H.R.; MCLAUGHLIN, K.J. Oct4 distribution and level in

mouse clones: consequences for pluripotency.

Genes Dev.

, v.16, p.1209-1219, 2003.

BOOTH, P.J.; TAN, S.J.; REIPURTH, R.; R., HOLM, P.; CALLESEN, H. Simplification of bovine

somatic cell nuclear transfer by application of a zona-free manipulation technique.

Cloning Stem

Cells

, v.3, p.139-150, 2001.

BOOTH, P.J.; VIUFF, D.; TAN, S.; HOLM, P.; GREVE, T.; CALLESEN, H. Numerical chromosome

errors in day 7 somatic nuclear transfer bovine blastocysts.

Biol. Reprod.

, v.68, p.922-928, 2003.

BORDIGNON, V.; SMITH, L.C. Telophase enucleation: an improved method to prepare recipient

cytoplasts for use in bovine nuclear transfer.

Mol. Reprod. Dev.

, v.49, p.29-36, 1998.

BORTVIN, A.; EGGAN, K.; SKALETSKY, H.; AKUTSU, H.; BERRY, D.L.; YANAGIMACHI, R.;

PAGE, D.C.; JAENISCH, R. Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos

cloned from somatic nuclei.

Development

, v.130, p.1673-1680, 2003.

BOS-MIKICH, A.; WHITTINGHAN, D.G.; JONES, K.T. Meiotic and mitotic Ca

oscilations affect

cell composition in resulting blastocysts.

Dev. Biol.

, v.182, p.172-179, 1997.

BOURC’HIS, D.; XU, G.L.; LIN, C.S.; BOLLMAN, B.; BESTOR, T.H. Dnmt3L and the establishment

of maternal genomic imprints.

Science

, v.294, p.2536-2539, 2001a.

BOURC’HIS, D.; LE BOURHIS, D.; PATIN, D.; NIVELEAU, A.; COMIZZOLI, P.; RENARD, J.;

VIEGAS-PEQUIGNOT, E. Delayed and incomplete reprogramming of chromosome methylation

patterns in bovine cloned embryos.

Curr. Biol.

, v.11, p.1542-1546, 2001b.

BRADSHAW, J.; JUNG, T.; FULKA, J., JR; MOOR, R.M. UV irradiation of chromosomal DNA and

its effect upon MPF and meiosis in mammalian oocytes.

Mol. Reprod. Dev.

, v.41, p.503–512,

1995.

BRANDEIS, M.; KAFRI, T.; ARIEL, M.; CHAILLET, J.R.; McCARREY, J.; RAZIN, A. The ontogeny

of allele-specific methylation associated imprinted genes in the mouse.

EMBO J.

, V.12, p.3669-

3677, 1993.

BREM, G.; KUHHOLZER, B. The recent history of somatic cloning in mammals.

Cloning Stem

Cells

, v.4, p.57-63, 2002.

BRIGGS, R.; KING, T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’

eggs.

Proc. Natl. Acad. Sci.

v.38, p.455-463, 1952.

BRINK, M.F.; BISHOP, M.D.; PIEPER, F.R. Developing efficient strategies for the generation of

transgenic cattle which produce biopharmaceuticals in milk.

Theriogenology

, v.53, p.139-148,

2000.

CAMPBELL, K.H.S. A background to nuclear transfer and its applications in agriculture and human

therapeutic medicine.

J. Anat.

, v.200, p.267-275, 2002.

CAMPBELL, K.H.S.; McWHIR, J.; RITTCHIE, W.A.; WILMUT, I. Sheep cloned by nuclear transfer

from a cultured cell line.

Nature

v.380, p.64-66, 1996a.

CAMPBELL, K.H.S.; LOI, P.; OTAEGUI, P.J.; WILMUT, I. Cell cycle co-ordination in embryo

cloning by nuclear transfer.

Rev. Reprod.

v.1, p.40-46, 1996b.

CAMPBELL, K.; ALBERIO, R.; CHOI, I.; FISHER, P.; KELLY, R.; LEE, J.H.; MAALOUF, W.

Cloning: eight years after Dolly.

Reprod. Domest. Anim.

, v.40, p.256-268, 2005.

CARROLL, J. The initiation and regulation of Ca2+ signalling at fertilization in mammals.

Semin.

Cell Dev. Biol.

, v.12, p.37-43, 2001.

CHAN, A.W.S. Transgenic animals: current and alternative strategies.

Cloning

v.1, p.25-46, 1999.

CHAILLET, J.R.; VOGT, T.F; BEIER, D.R.; LEDER, P .Parental-specific methylation of an imprinted

transgene is established during gametogenesis and progressively changes during embryogenesis.

Cell

, v.66,p. 77-83, 1991.

CEZAR, G,G.; BARTOLOMEI, M.S.; FORSBERG, E.J.; FIRST, N.L.; BISHOP, M.D.; EILERTSEN,

K.J. Genome-wide epigenetic alterations in cloned bovine fetuses.

Biol. Reprod.

, v.68, p.1009-

1014, 2003.

CHAVATTE-PALMER, P.; REMY, D.; CORDONNIER, N. Health status of cloned cattle at different

ages.

Cloning Stem Cells

, v.6, p.94-100, 2004.

CHEN, T.; ZHANG, Y.L.; JIANG, Y.; LIU, S.Z.; SCHATTEN, H.; CHEN, D.Y.; SUN, Q.Y. The DNA

methylation events in normal and cloned rabbit embryos.

FEBS Letters

, v.578, p.69-72, 2004.

CHEONG, H.; TAKAHASHI, Y.; KANAGAWA, H. Birth of mice after transplantation of early cell-

cycle-stage embryonic nuclei intro enucleated oocytes.

Biol. Reprod.

, v.48, p.958-963, 1993.

CHESNE, P.; ADENOT, P.G.; VIGLIETTA, C.; BARATTE, M.; BOULANGER, L.; RENARD, J.P.

Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells.

Nat. Biotechnol.

, v.20, p.366-

369, 2002.

CHUNG, Y.G.; MANN, M.R.; BARTOLOMEI, M.S.; LATHAM, K.E. Nuclear-cytoplasmic ‘tug-of war’

during cloning: effects of somatic cell nuclei on culture medium preferences in the preimplantation

cloned mouse embryo.

Biol. Reprod.

, v.66, p.1178-1184, 2002.

CHUNG, Y.G.; RATNAM, S.; CHAILLET, J.R.; LATHAM, K.E. Abnormal regulation of DNA

methyltransferases expression in cloned mouse embryos.

Biol. Reprod.

, v.69, p.146-153, 2003.

CIBELLI, J.B.; STICE, S.L.; GOLUEKE, P.J.; KANE, J.J.; JERRY, J.; BLACKWELL, C.; PONCE DE

LEON, F.A.; ROBL, J.M. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts.

Science

v.280, p.1256-1258, 1998.

COLLAS, P.; ROBL, J.M. Relationship between nuclear remodeling and development in nuclear

transplant rabbit embryos.

Biol. Reprod.

, v.45, p.455-465, 1991.

CONSTANCIA, M.; HEMBERGER, M.; HUGHES, J.; DEAN, W.; FERGUSON-SMITH, A.;

FUNDELE, R.; STEWART, F.; KELSEY, G.; FOWDEN, A.; SIBLEY, C. Placental-specific IGF-II is a

major modulator of placental and fetal growth,

Nature

, v.417, p.945-948, 2002.

CORLEY-SMITH G.E.; BRANDHORST, B.P. Preservation of endangered species and populations:

a role for genome banking, somatic cell cloning, and androgenesis?

Mol. Reprod. Dev.

, v.53,

p.363-367, 1999.

CROSS, J.C. Placental function in development and disease.

Reprod. Fert. Dev.

, v.18, p.71-76,

2006.

CURCHOE, C.; ZHANG, S.; BIN, Y.; ZHANG, X.; YANG, L.; FENG, D.; O’NEILL, M.; TIAN, X.C.

Promoter-specific expression of the imprinted IGF2 gene in cattle (

Bos taurus

Biol. Reprod.

, v.73,

p.1275-1281, 2005.

CZOLOWSKA, R.; MODLINSKI, J.A.; TARKOWSKI, A.K. Behavior of thymocyte nuclei in non

activated and activated mouse oocytes.

J. Cell Sci.

, v.69, p.19-34, 1984.

DANIELS, R.; HALL, V.; TROUNSON, A.O. Analysis of gene transcription in bovine nuclear transfer

embryos reconstructed with granulosa cell nuclei.

Biol. Reprod.

, v.63, p.1034-1040, 2000.

DANIELS R., HALL V.J., FRENCH A.J., KORFIATIS N.A., TROUNSON A.O. Comparison of gene

transcription in cloned bovine embryos produced by different nuclear transfer techniques.

Mol.

Reprod. Dev.

, v.60, n.3, p.281-288, 2001.

DAVIES, K,; BOWDEN, L,; SMITH, P,; DEAN, W,; HILL, D,; FURUUMI, H,; SASAKI, H,;

CATTANACH, B,; REIK, W. Disruption of mesodermal enhancers for Igf2 in the minute mutant.

Development

, v.129, p.1657-1668, 2002.

DAVIS, T.L.; TRASLER, J.M.; MOSS, S.B.; YANG, G.J.; BARTOLOMEI, M.S. Acquisition of the

H19 methylation imprint occurs differentially on the parental alleles during gametogenesis.

Genomics

, v.58, p.18-28, 1999.

DAVIS, R.L.; YANG, G.J.; McCARREY, J.R., BARTOLOMEI, M.S. The H19 methylation imprint is

earesd nad re-established differentially on the parental alleles during male germ cell development.

Hum. Mol. Genet.

, v.9, p.2885-2894, 2000.

De CHIARA, T.M.; EFSTRATIADIS, A.; ROBERTSON, E.J. A growth-deficiency phenotype in

heterozygous mice carrying an insulin-like growth factor II gene disrupted by targeting,

Nature

v.345, p78-80, 1990.

De LA FUENTE, R.; KING, W.A. Developmental consequences of karyokinesis during the first

mitotic cell cylce of bovine parthenotes.

Biol. Reprod.

, v. 58, p.952-962, 1998.

De SOUSA, P.A.; WINGER, Q.; HILL, J.R.; JONES, K.; WATSON, A.J.; WESTHUSIN, M.E.

Reprogramming of fibroblast nuclei after transfer into bovine oocytes.

Cloning

v.1., n.1, p.63-69,

1999.

De SOUSA, P.A.; KING, T.; HARKNESS, L.; YOUNG, L.E.; WALKER, S.K.; WILMUT, I. Evaluation

of gestational deficiencies in cloned sheep fetuses and placentae.

Biol. Reprod.

, v.65, p.23-30,

2001.

DEAN, W.; SANTOS, F.; STOJKOVIC, M.; ZAKHARTCHENKO, V.; WALTER, J.; WOLF, E.; REIK,

W. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrant

reprogramming in cloned embryos.

Proc. Natl. Acad.

Sci.

v.98, p.13734–13738, 2001.

DIBERARDINO, M.A. Genomic potential of differentiated cells analysed by nuclear transplantation.

Am.

Zool.

v.27, p.623-644, 1987.

DIELEMAN, S.J.; HENDRIKSEN, P.J.; VIUFF, D.; et al. Effects of in vivo prematuration and in vivo

final maturation on developmental capacity and quality of preimplantation embryos.

Theriogenology

, v.57, p.5-20, 2002.

DINDOT, S.V.; FARIN, P.W.; FARIN, C.E.; ROMANO, J.; WALKER, S.; LONG, C. Epigenetic and

genomic imprinting analysis in nuclear transfer derived Bos gaurus/Bos taurus hybrid fetuses.

Biol.

Reprod.

, v.71, p.470-478, 2004.

ECKARDT, S; MCLAUGHLIN, KJ. Interpretation of reprogramming to predict the success of

somatic cell cloning.

Anim. Reprod. Sci.

, v.82-83, p.97-108, 2004.

EDWARDS, J.L.; SCHRICK, F.N.; MCCRACKEN, M.D.; VAN AMSTEL, S.R.; HOPKINS, F.M.;

WELBORN, M.G.; DAVIES, C.J. Cloning adult farm animals: a review of the possibilites and

problems associated with somatic cell nuclear transfer.

Am. J. Reprod. Immun.

, v.50, p.113-123,

2003

EFSTRATIADIS, A. Genetics of mouse growth.

Int. J. Dev. Biol.

, v.42, p.955-976, 1998.

EGGAN, K.; JAENISCH, R. Micromanipulating dosage compensation: understanding X-

chromosome inactivation through nuclear transplantation.

Semin. Cell. Dev. Biol.

, v.14, p.349-358,

2004.

EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT III, W.; YANAGIMACHI, R.;

JAENISCH, R. X-chromosome inactivation in cloned mouse embryos.

Science

, v.290, p.1578-

1581, 2000.

EGGAN, K.; AKUTSU, H.; LORING, J.; JACKSON-GRUSBY, L.; KLEMM, M.; RIDEOUT III, W.M.;

YANAGIMACHI, R.; JAENISCH, R. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by

nuclear cloning and teraploid embryo complementation.

Proc. Natl. Acad. Sci.

, v.98, p.6209-6214,

2001.

EGLITIS, M. Formation of tetraploid mouse blastocysts following blastomere fusion with

polyethylene glycol.

J. Exp. Zool.

, v.213, p.309-313, 1980.

ELSHEIKH, A.S.; TAKAHASHI, Y.; KATAGIRI, S.; KANAGAWA, H. Developmental ability of mouse

late 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro.

J. Vet. Med. Sci.

v.59, p.107-113, 1997.

ELSHEIKH, A.S.; TAKAHASHI, Y.; KATAGIRI, S.; KANAGAWA, H. Functional enucleation of

mousemetaphase II oocytes with ectoposide.

Jpn. J. Vet. Res.

, v.45, p.217-220, 1998.

EVANS, M.J.; GURER, C.; LOIKE, J.D.; WILMUT, I.; SCHNIEKE, A.E.; SCHON, E.A. Mitochondrial

DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep.

Nat. Genetics

, v.

23, p.90-93, 1999.

FABER, D.C.; MOLINA, J.A.; OHLRICHS, C.L.; VANDER ZWAAG, D.F.; FERRÉ, L.B.

Commercialization of animal biotechnology.

Theriogenology

, v.59, p.125-138, 2003.

FARIN, P.W.; CROSIER, A.E.; FARIN, C.E. Influence of in vitro systems on embryo survival and

fetal development in cattle.

Theriogenology

, v.55, p.151-170, 2001.

FARIN, P.W.; PIEDRAHITA, J.A.; FARIN, C.E. Errors in development of fetuses and placentas from

in vitro-produced bovine embryos.

Theriogenology

, v.65, p.178-191, 2006.

FERGUSON-SMITH, A., SURANI; M.A. Imprinting and the epigenetic asymmetry between parental

genomes.

Science,

v.293, p.1086-1089, 2001.

FERREIRA, C.R.

Produção de embriões bovinos com mtDNA heterólogo de B.t.indicus e

B.t.taurus e estudo da segregação mitocondrial durante a pré-implantação.

2002. 93f.

Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,

Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2002.

FISSORE, R.A.; LONG, C.R.; DUNCAN, R.P.; ROBL, J.M. Initiation and organization of events

during the first cell cycle in mammals: applications in cloning.

Cloning

, v.1, p.89-100, 1999.

FULKA Jr, J.; MOOR, R.M. Noninvasive chemical enucleation of mouse oocytes.

Mol. Reprod.

Dev.

, v.34, p.427-430, 1993.

FULKA Jr, J.; LOI, P.; LEDDA, S.; MOOR, R.M.; FULKA, J. Nucleus transfer in mammals: how the

oocyte cytoplasm modifies the transferred nucleus.

Theriogenology

, v.55, p.1373-1380, 2001.

GALLI, C.; DUCHI, R.; MOOR, R.M.; LAZZARI, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic

information necessary for the development of a new individual.

Cloning

v.1, n.3, p.161-170, 1999.

GALLI, C.; LAGUTINA, I.; CROTTI, G.; COLLEONI, S.; TURINI, P.; PONDERATO, N.; DUCHI, R.;

LAZZARI, G. Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin.

Nature

, v.424,p.635, 2003.

GALLI, C.; LAGUTINA, I.; LAZZARI, G.

Introduction to Cloning by Nuclear Transplantation.

Cloning

Stem Cells

, v.5, p.223-232, 2002.

GALLI, C.; LAGUTINA, I.; VASSILIEV, I.; DUCHI, R.; LAZZARI, G.

Comparison of microinjection

(piezo-electric) and cell fusion for nuclear transfer success with different cell types in cattle.

Cloning

Stem Cells

, v.4, p.189-196, 2002.

GAO, S.; CHUNG, Y.G.; WILLIAMS, J.W.; RILEY, J.; MOLEY, K.; AND LATHAM, K.E. Somatic cell-

like features of cloned mouse embryos prepared with cultured myoblast nuclei.

Biol. Reprod.

, v.69,

p.48-56, 2003.

GAO, S.; CHUNG, Y.G.; PARSEGHIAN, M.H.; KING, G.J.; ADASHI, E.Y.; LATHAM, K.E. Rapid H1

linker histone transitions following fertilization or somatic cell nuclear transfer: evidence for a

uniform developmental program in mice.

Dev. Biol.

, v.266, p.62-75, 2004.

GASPARRINI, B.; GAO, S.; AINSLIE, A.; FLETCHER, J.; McGARRY, M.; RITCHIE, W.A.;

SPRINGBETT, A.J.; OVERSTROM, E.W.; WILMUT, I.; DE SOUSA, P.A. Cloned mice derived from

embryonic stem cell karyoplasts and activated cytoplasts prepared by induced enucleation.

Biol.

Reprod.

, v.68, p.1259-1266, 2003.

GOODALL, J.J.; SCHMUTZ, S.M. Linkage mapping of IGF2 on cattle chromosome 29.

Anim.

Genet.

, v.34, p.313, 2003.

GURDON, J.B. The transplantation of nuclei between two subspecies of

Xenopus laevis

Heredity

v.16, p.305-315, 1961.

GURDON, J.B. Genetic reprogramming following nuclear transplantation in amphibia.

Semin. Cell

Dev. Biol.

, v.10, p.239-243, 1999.

GURDON, J.B.; UEHLINGER, V. ‘Fertile’ intestine nuclei.

Nature

v.210, p.1240-1241, 1966.

HAGEMANN, L.J. Influence of the dominant follicle on oocytes fom subordinate follicles.

Theriogenology

, v.51, p.449-459, 1999.

HAJKOVA, P.; ERHARDT, S.; LANE, N.; HAAF, T.; EL MAARRI, O.; REIK, W.; WALTER, J.;

SURANI, M.A. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells.

Mech. Dev.

, v.117, p.15-

23, 2002.

HAN, Y.M.; KANG, Y.K.; KOO, D.B.; LEE, K.K. Nuclear reprogramming of cloned embryos

produced in vitro.

Theriogenology

, v.59, p.33-44, 2003.

HARK, A.T.; SCHOENHERR, C.J.; KATZ, D.J.; INGRAM, R.S.; LEVORSE, J.M.; TILGHMAN, S.M.

CTCF mediates methylation-sensitive enhancer blocking activity at the H19/Igf2 locus.

Nature

v.405, p.486-489, 2000.

HASHIZUME, K.; ISHIWATA, H.; KIZAKI, K. Implantation and placental development in somatic cell

clone recipient cows.

Cloning Stem Cells

, v.4, p.197-209, 2002.

HASLER, J.F. In vitro culture of bovine embryos in ménézo's B2 medium with or without coculture

and serum: the normalcy of pregnancies and calves resulting from transferred embryos.

An.

Reprod. Sci.,

v.60-61, p.81-91, 2000.

HEINDRYCKX, B.; RYBOUCHKIN, A.; VAN DER ELST, J.; DHONT, M. Effect of culture media on

in vitro development of cloned mouse embryos.

Cloning

, v.3, p.41-50, 2001.

HEYMAN, Y.; CHAVATTE-PALMER, P.; LEBOURHIS, D.; CAMOUS S.; VIGNON, X.; RENARD,

J.P. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos.

Biol. Reprod.

v.66, p.6-13, 2002a.

HEYMAN, Y.; ZHOU, Q.; LEBOURHIS, D.; CHAVATTE-PALMER, P.; RENARD, J.P.; VIGNON, X.

Novel approaches and hurdles to somatic cloning in cattle.

Cloning Stem Cells

, v.4, p.47-53,

2002b.

HEYMAN, Y.; VIGNON, X.; RENARD, J.P. Manipulação e estocagem de linhagens celulares para

clonagem somática em bovinos. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE

TECNOLOGIA DE EMBRIÕES, 15, Rio Quente, 2000.

Arq. Fac. Vet. UFRGS, Porto Alegre - RS

v.28 (Supl.), n.1, p.72-84, 2000.

HIENDLEDER, S.; SCHMUTZ, S.M.; ERHARDT, G.; GREEN, R.D.; PLANTE, Y.

Transmitochondrial differences and varying levels of heteroplasmy in nuclear transfer cloned cattle.

Mol. Reprod. Dev.

, v.54, p.24-31, 1999.

HIENDLEDER, S.; ZAHKARTCHENKO, V., WOLF, E. Mitochondria and the success of somatic cell

nuclear transfer cloning: from nuclear-mitochondrial interactions to mitochondrial complementation

and mitochondrial DNA recombination.

Reprod. Fert. Dev.

, v.17, p.69-83, 2005.

HILL, J.R.; ROUSSEL, A.J.; CIBELLI, J.B.; EDWARDS, J.F.; HOOPER, N.L.; MILLER, M.W.;

THOMPSON, J.A.; LOONEY, C.R.; WESTHUSIN, M.E.; ROBL, J.M.; STICE, S.L. Clinical and

pathologic features of cloned transgenic calves and fetuses (13 case studies).

Theriogenology

v.51, p.1451-1465, 1999.

HILL, J.R.; BURGHARDT, R.C.; JONES, K.; LONG, C.R.; LOONEY, C.R.; SHIN, T.; SPENCER,

T.E.; THOMPSON, J.A.; WINGER, Q.A.; WESTHUSIN, M.E. Evidence for placental abnormality as

the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses.

Biol. Reprod.

v.63, p.1787-1794, 2000.

HOCHEDLINGER, K.; JAENISCH, R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature

B and T donor cells.

Nature

, 415, 1035–1038, 2002.

HUMPHERYS, D.; EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT III, W.M.;

BINISZKIWICZ, D.; YANAGIMACHI, R.; JAENISCH, R. Epigenetic instability in ES cells and cloned

mice. Science, v.293, p.95-97, 2001.

HURST, L.D.; McVEAN, G.T. Growth effects of uniparental disomies and the conflict theory of

genomic imprinting.

Trends Genet.

, v.13, p.436-443, 1997.

HURST, L.D.; McVEAN, G.T. Do we understand the evolution of genomic imprinting?

Curr, Opin.

Genet. Dev.

, v.8, p.701-708, 1998.

HURST, L.D.; SMITH, N.G. Molecular evolutionary evidence that H19 RNA is functional.

Trends

Genet.

, v.15, p.134-135, 1999.

ILLMENSEE, K.; HOPPE, P.C. Nuclear transplantation in

Mus musculus:

Developmental potential

of nuclei from preimplantation embryos.

Cell

v.23, p.9-18, 1981.

ILYIN, V.; PARKER, I. Effects of alcohols on responses evoked by inositol trisphosphate in

Xenopus

oocytes.

J. Physiol.

, v.448, p.339-354, 1992.

INOUE, K.; KOHDA, T.; LEE, J.; OGONUKI, N.; MOCHIDA, K.; NOGUCHI, Y.; TANEMURA, K.;

KANEKO-ISHINO, T.; ISHINO, F.; OGURA, A. Faithful expression of imprinted genes in cloned

mice.

Science

, v.295, p.297, 2002.

IWASAKI, S.; CAMPBELL, K.H.; GALLI, C., AKIYAMA, K. Production of live calves derived from

embryonic estem-like cells aggregated with tetraploid embryos.

Biol. Reprod.

, v.62, p.470-475,

2000.

JACOBESEN, H.; SCHMIDT, M.; HOLM, P.; ANGILD, P.T.; VAJTA, G.; GREEVE, T.; CALLESEN,

H. Body dimensions and birth and organ weights of calves derived from in vitro produced embryos

cultured with oe without serum and oviduct epithelium cells.

Theriogenology

, v.53, p.1761-1769,

2000.

JEON, H.Y.; HYUN, S.H.; LEE, G.S.; KIM, H.S.; KIM, S.; JEONG, Y.W.;, KANG, S.K.; LEE, B.C.;

HAN, J.Y.; AHN, C.; HWANG, W.S. The analysis of telomere length and telomerase activity in

cloned pigs and cows.

Mol. Reprod. Dev.

, v.71, p.315-320, 2005.

JIANG, L.; CARTER, D.B.; XU, J.; YANG, X.; PRATHER, R.S.; TIAN, X.C. Telomere lengths in

cloned transgenic pigs.

Biol. Reprod.

, v.70, p.1158-1593, 2004.

JOHN, R.M.; SURANI, M.A. Genomic imprinting, mammalian evolution, and the mystery of egg-

laying mammals.

Cell

, v.101, p.585-588, 2000.

JONES, K.L.; HILL, J.; SHIN, T.Y.; LUI, L.; WESTHUSIN, M. DNA hypomethylation of karyoplasts

for bovine nuclear transplantation.

Mol. Reprod. Dev.

, v.60, p.208-213, 2001.

JOUNEAU, A.; RENARD, J.P. Reprogramming in nuclear transfer.

Curr. Opin. Genet. Dev.

, v.13,

p.486-491, 2003.

KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y.H.; LEE, K.; HAN, Y. Influence of the oocyte nuclei on

demethylation of donor genome in cloned bovine embryos.

FEBS Lett.

, v.499, p.55-58, 2001a.

KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y. H.; CHUNG, A.S.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. Aberrant

methylation of donor genome in cloned bovine embryos.

Nat. Genet.

, v.28, p.173-177, 2001b.

KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y. H.; KIM H.N.; CHANG, W.K.; LEE, K.K.; HAN, Y.M.

Typical demethylation events in cloned pig embryos. Clues on speciesspecific differences in

epigenetic reprogramming of cloned donor genome.

J. Biol. Chem.

, v.27, p.27, 2001c.

KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y. H.; KIM H.N.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. Limited

demethylation leaves mosaic-type methylation states in cloned bovine pre-implantation embryos.

EMBO J.

, v.21, p.1092–1100, 2002.

KANG, Y.K.; KOO, D.B.; PARK, J.S.; ET AL. Aberrant methylation of donor genome in cloned

bovine embryos.

Nat. Genet.

, v.28, p.173-177, 2001.

KANKA, J.; SMITH, S.D.; SOLOY, E.; HOLM, P.; CALLESEN, H. Nucleolar ultrastructure in bovine

nuclear transfer embryos.

Mol. Reprod. Dev.

, v.52, n.3, p.253-263, 1999.

KÁRNIKOVÁ, L.; HORSKÁ, M.; TOMÁNEK, M.; KANKA, J.; URBAN, F.; MOOR, R.; FULKA Jr, J.

Chemically enucleated mouse oocytes: ultrastructure and kinetics of histone H1 kinase activity.

Reprod. Nutr. Dev.

, v.38, p.643-651, 1998.

KASINATHAN, P.; KNOTT, J.G.; WANG, Z.; JERRY, D.J.; ROBL, J.M. Production of calves from

G1 fibroblasts.

Nat. Biotechnol.

, v.19, p.1176-1178, 2001.

KATO, Y.; TSUNODA, Y. Synchronous division of mouse two-cell embryos with nocodazole

in vitro

J. Reprod. Fert.

, v.95, p.39-43, 1992.

KATO, Y.; TANI, T.; SOTOMARU, Y.; KUROKAWA, K.; KATO, J-Y.; DOGUCHI, H.; YASUE, H.;

TSUNODA, Y. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult.

Science

, v.282, p.2095-

2098, 1998.

KATO, Y.; TANI, T.; TSUNODA, Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male and

female adult, newborm and fetal cows.

J. Reprod. Fert.

, v.120, p.231-237, 2000.

KAUFMAN, M.H. The chromosome complement of single-pronuclear haploid mouse embryos

following activation by ethanol treatment.

J. Embryo. Exp. Morphol.

, v.71, p.139-154, 1982.

KAWAKAMI, M.; TANI, T.; YABUUCHI, A.; KOBAYASHI, T.; MURAKAMI, H.; FUJIMURA, T.;

KATO, Y.; TSUNODA, Y. Effect of demecolcine and nocodazole on the efficiency of chemically

assisted removal of chromosomes and the developmental potential of nuclear transferred porcine

oocytes.

Cloning Stem Cells,

v.5, p.379-387, 2003.

KENT, S.J.; LEWIS, I.M. Genetically identical primate modelling systems for HIV vaccines.

Reprod.

Fert. Dev.

, v.10, p.651-657, 1998.

KILLIAN, J.K.; BYRD, J.C.; JIRTLE, J.V.; MUDAY, B.L.; STOSKOPF, M.K.; MacDONALDS, R.G.;

JIRTLE, R.L. M6P/IGF2R imprinting evolution in mammals.

Mol. Cell

, v.5, p.707-716, 2000.

KIND, A.; COLMAN, A. Therapeutic cloning: needs and prospects.

Sem. Cell Dev. Biol.

, v.10,

p.279-286, 1999.

KING, W.A., COPPOLA, G., ALEXANDER, B., MASTROMONACO, G., PERRAULT, S., NINO-

SOTO, M.I., PINTON, A., JOUDREY, E.M., BETTS, D.H. The impact of chromosomal alteration on

embryo development.

Theriogenology

, v.65, p.166-1772, 2006.

KISHIKAWA, H.; WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Comparison of oocyte-activating agents for

mouse cloning.

Cloning

v.1., n.3, p.153-160, 1999.

KLINE, D.; KLINE, J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell

cycle activation in the mouse egg.

Dev. Biol.

, v.149, p.80-89, 1992.

KONO, T.; OBATA, Y.; YOSHIMZU, T.; NAKAHARA, T.; CARROLL, J. Epigenetic modifications

during oocyte growth correlates with extended parthenogenetic development in the mouse.

Nature

Genet.

, v.13, p.91-94, 1996.

KONO, T.; KWON, O.Y.; NAKAHARA, T. Development of enucleated mouse oocytes reconstituted

with embryonic nuclei.

J. Reprod. Fertil.

, v.93, p.165-172, 1991.

KOO, D.B.; KANG, Y.K.; CHOI, Y.H.; PARK, J.S.; KIM, H.N.; OH, K.B.; SON, D.S.; PARK, H.P.;

LEE, K.K.; HAN, Y,M. Aberrant allocations of inner cell mass and trophectoderm cell in bovine

nuclear transfer blastocysts.

Biol. Reprod.

, v.67, p.487-492, 2002.

KOO, D.B.; KANG, Y.K.; PARK, J.S.; PARK, J.K.; CHANG, W.K.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. A paucity

of structural integrity in cloned porcine blastocysts produced in vitro.

Theriogenology

, v.62, p.779-

789, 2004.

KRUIP, T.A.M.; DEN DAAS, J.H.G.

In vitro

produced and cloned embryos: effects on pregnancy,

parturition and offspring.

Theriogenology

, v.47, n.1, p.43-52, 1997.

KRUIP, T.A M.; BEVERS, M.M.; KEMP, B. Environment of oocyte and embryo determines health of

IVP offspring.

Theriogenology

, v.53, p.611-618, 2000.

KUBIAK, J.Z.; PRATHER, R.S.; MAUL, G.G.; SCHATTEN, G. Cytoplasmic modification of the

nuclear lamina during pronuclear-like transformation of mouse blastomere nuclei.

Mech. Dev.

, v.35,

p.103-111, 1991.

KUBOTA, C.; YAMAKUCHI, H.; TODOROKI, J.; MIZOSHITA, K.; TABAR, N.; BARBER, M.; YANG,

X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture.

Proc. Natl. Acad.

Sci.

v.97, p.990-995, 2000.

KÜHHOLZER-CABOT, B; BREM, G. Aging of animals produced by somatic cell nuclear transfer.

Exper. Gerontology

, v.37, p.1315-1321, 2002.

KUHHOLZER, B.; HAWLEY, R.J.; LAI, L.; KOLBER-SIMONDS, D.; PRATHER, R.S. Clonal lines of

transgenic fibroblast cells derived from the same fetus result in different development when used for

nuclear transfer in pigs.

Biol. Reprod.

, v.64, p.1695-1698, 2001.

LAI, L.; PARK, K.W.; CHEONG, H.T.; KUHHOLZER, B.; SAMUEL, M.; BONK, A.; IM, G.S.; RIEKE,

A.; DAY, B.N.; MURPHY, C.N.; CARTER, D.B.; PRATHER, R.S. Transgenic pig expressing the

enhanced green fluorescent protein produced by nuclear transfer using colchicine-treated

fibroblasts as donor cells.

Mol. Reprod. Dev.

, v.62, p.300-306, 2002.

LANZA, R.P.; CIBELLI, J.B.; WEST, M.D. Human therapeutic cloning.

Nat. Med.

, v.5, p.975-977,

1999.

LANZA, R.P.; CIBELLI, J.B.; BLACKWELL, C.; CRISTOFALO, V.J.; FRANCIS, ,K.; BAERLOCHER,

G.M.; MAK, J.; SCHERTZER, M.; CHAVEZ, E.A.; SAWYER, N.; LANSDORP, P.M.; WEST, M.D.

Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells.

Science

, v.288, p.665-669, 2000.

LARKIN, D.M.; EVERTS-VAN DER WIND, A.; REBEIZ, M.; SCHWEITZER, P.A.; BACHMAN, S.;

GREEN, C.; WRIGHT, C.L.; CAMPOS, E.J.; BENSON, L.D.; EDWARDS, J.; LIU, L.; OSOEGAWA,

K.; WOMACK, J.E.; DE JONG, P.J.; LEWIN, H.A. A cattle-human comparative map built with cattle

BAC-ends and human genome sequence.

Genome Res.

, v.13, p.1966-1972, 2003.

LATHAM, K.H. Epigenetic modification and imprinting of the mammalian genome during

development.

Curr. Top. Dev.

Biol.

v.43, p.1-49, 1999.

LEAL, C.L.; LEE, C.; MOOR, R.M. UV irradiation of pig metaphase chromosomes: maturation-

promoting factor degradation, nuclear cytology and cell cycle progression.

J. Reprod. Fertil.

, v.116,

p.363-371, 1999.

LEE, B.C.; KIM, M.K.; JANG, G.; OH, H.J.; YUDA, F.; KIM, H.J.; SHAMIM, M.H.; KIM, J.J.; KANG,

S.K.; SCHATTEN, G.; HWANG, W.S. Dogs cloned from adult somatic cells.

Nature

, v.426, p.641,

2005.

LEE, J.; INOUE, K.; ONO, R.; OGONUKI, N.; KOHDA, T.; KANEKO-ISHINO, T.; OGURA, A.;

ISHINO, F. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5

primordial germ cells.

Development

, c.129, p.1807-1817, 2002b.

LEE, J.W.; WU, S.C.; TIAN, X.C.; BARBER, M.; HOAGLAND, T.; RIESEN, J.; LEE, K.H.; TU, C.F.;

CHENG, W.T.K.; YANG, X. Production of cloned pig by whole-cell intracytoplasmic microinjection.

Biol. Reprod.

, v.69, p.995-1001, 2003.

LEE, R.S.; DEPREE, K.M.; DAVEY, H.W. The sheep (ovis aries) H19 gene: genomic structure and

expression patterns, from the preimplantation embryo to adulthood.

Gene

, v.301, p.67-77, 2002a.

LEIBO, S.P.; RALL, W.F. Increase in production of pregnancies by bisection of bovine embryos.

Theriogenology

v.27, p.245, 1987.

LEWIS, I.M. Splitting cattle embryos: effect of sucrose, embryo stage, and duration between

embryo recovery and bissection.

Theriogenology

v.41, p.237, 1994.

LI, E.; BEARD, C.; JAENISCH, R. Role for DNA methylation in genomic imprinting.

Nature

, v.366,

p.362–365, 1993.

LI, Y.M.; FRANKLIN, G.; CUI, H.M.; SVENSSON, K.; HE, X.B.; ADAM, G.; et al. The H19 transcript

is associated with polysomes and may regulate IGF2 expression in trans.

J. Biol. Chem.

, v.273,

p.28247-28252, 1998.

LOI, P.; PTAK, G.; BARBONI, B.; FULKA, J. JR; CAPPAI, P.; CLINTON, M. Genetic rescue of an

endangered mammal by cross-species nuclear transfer using post-mortem somatic cells.

Nat.

Biotechnol.

, v.19, p.962–964, 2001.

LOPEZ, M.L.; DIKKES, P.; ZURAKOWSKI, D.; VILLA-KOMARKOFF, L. Insulin-like growth factor II

affects the appearance and glycogen content of glycogen cells in the murine placenta.

Endocrinology

, v.137, p.2100-2108, 1996.

LU, F.; SHI, D.; WEI, J.; YANG, S.; WEI, Y. Development of embryos reconstructed by interspecies

nuclear transfer of adult fibroblasts between buffalo (Bubalus bubalis) and cattle (Bos indicus).

Theriogenology

, v.64, p.

1309-1319, 2005.

LUCIFERO, D.; MERTINEIT, C.; CLARKE, H.J.; BESTOR, T.H.; TRASLER, J.M. Methylation

dynamics of imprinted genes in mouse germ cells.

Genomics

, v.79, p.530-538, 2002.

MACHATY, Z.; FUNAHASHI, H.; MAYES, M.A.; DAY, B.N.; PRATHER, R.S. Effects of injecting

calcium chloride into in vitromatured porcine oocytes.

Biol. Reprod.

, v.54, p.316-322, 1996.

MANN, M.R.W.; CHUNG, Y.G.; NOLEN, L.D.; VERONA, R.I.; LATHAM, K.E.; BARTOLOMEI, M.S.

Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned preimplantation stage mouse

embryos.

Biol. Reprod.

v.69, p.902-914, 2003.

MARX, J.L. Swiss research questioned.

Science

v.220, p.1023, 1983.

MASUI, Y. Towards understanding control of the division cycle in animal cells.

Biochem. Cell Biol.

v.70, p.920-945, 1992.

MATSUZAKI ,M.; SHIGA, K. Endocrine characteristics of cloned calves.

Cloning Stem Cells

, v.4,

p.261-267, 2002.

MATTHEWS, J.C.; BEVERIDGE, M.J.; DIALYNAS, E.; BARTKE, A.; KILBERG, M.S.; KAUFMAN,

P. Placental anionic and cationic amino acid transporter expression in growth hormone

overexpressing and null IGF-II or null IGF-I receptor mice.

Placenta

, v.20, p.639-650, 1999.

MAYER, W.; NIVELEAU, A.; WALTER, J.; FUNDELE, R.; HAAF, T. Demethylation of the zygotic

paternal genome.

Nature

, v.403, p.501-502, 2000.

McGRATH, J.; SOLTER, D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microcirurgy and cell

fusion.

Science

v.220, p.1300-1302, 1983.

McGRATH, J.; SOLTER, D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and

paternal genomes.

Cell

v.37, p.179-183, 1984a.

McGRATH, J.; SOLTER, D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes

to support development

in vitro.

Science

v.226, p.1317-1319, 1984b.

McLAREN, A. Methods and success of nuclear transplantation in mammals.

Nature

v.309, p.671-

672, 1984.

McLAREN, R.J.; MONTGOMERY, G.W. Genomic imprinting of the insulin-like growth factor 2 gene

in sheep.

Mammalian Genome

, v.10, p.588–591, 1999.

MEIRELLES, F.V.; SMITH, L.C. Mitochondrial genotype segregation during preimplantation

development lineage produced by embryonic karyoplast transplantation.

Genetics

v.148, p.877-

883, 1998.

MEIRELLES, F.V.; BORDIGNON, V.; WATANABE, Y.F.; WATANABE, M.R.; DAYAN, A.; GARCIA,

J.M.; LÔBO, R.B.; SMITH, L.C. Troca completa do genoma mitocondrial em um bezerro Nelore

produzido por transferência interespecífica de núcleo. Implicações na interação núcleo-

citoplasmática e seleção genética.

Rev.

Bras. Reprod.

Anim.

v.23, n.3, p.250-252, 1999.

MEIRELLES, F.V.; BORDIGNON, V.; WATANABE, Y.; WATANABE, M.; DAYAN, A.; LOBO, R.B.;

GARCIA, J.M.; SMITH, L.C. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a

Bos indicus

calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte.

Genetics

, v.158, n.1, p.351-356,

2001.

MEIRELLES, F.V.; CAETANO, A.R.; WATANABE, Y.F.; RIPAMONTE, P.; CARAMBULA, S.F.;

MERIGHE, G.K.; GARCIA, S.M. Genome activation and developmental block in bovine embryos.

Anim. Reprod. Sci.

, v.82-83, p.13-20, 2004.

MENG, L.; ELY, J.J.; STOUFFER, R.L.; WOLF, D.P. Rhesus monkeys produced by nuclear

transfer.

Biol.

Reprod.

v.57, p.454-459, 1997.

MÉO, S.C.

Ativação partogenética e desenvolvimento embrionário inicial de oócitos bovinos

tratados com estrôncio, ionomicina e 6-dimetilanopurina

. 2002. 86f. Dissertação (Mestrado em

Medicina Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual

Paulista, Jaboticabal, 2002.

MÉO, S.C.

Interação núcleo-citoplasmática em embriões e expressão de genes “imprinted”

em fetos bovinos produzidos in vivo, in vitro e partenogenéticos

. 2005. 115f. Tese (Doutorado

em Medicina Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual

Paulista, Jaboticabal, 2005.

MÉO, S.C.; LEAL, C.L.V.; GARCIA, J.M. Activation and early parthenogenesis of bovine oocytes

treated with ethanol and strontium.

Anim. Reprod. Sci.

, v.81, p.35-46, 2004.

MÉO, S.C.; YAMAZAKI, W.; LEAL, C.L.V.; OLIVEIRA, J.A. DE; GARCIA, J.M. Use of strontium for

bovine oocyte activation.

Theriogenology

, v.8, p.2089–2102, 2005.

MIALON, M.M.; CAMOUS, S.; RENAND, G.; MARTAL, J.; MENISSIER, F. Peripheral concentration

of a 60-kDa pregnancy specific protein during gestation and after calving in relationship to

embryonic mortality in cattle.

Reprod. Nutr. Dev.

, v.33, p.269-282, 1993.

MIKI, H.; INOUE, K.; OGONUKI, N.; MOCHIDA, K.; NAGASHIMA, H.; BABA, T.; OGURA, A.

Cytoplasmic Asters Are Required for Progression Past the First Cell Cycle in Cloned Mouse

Embryos.

Biol. Reprod.

, v.71, p.2022-2028, 2004.

MIYARA, F.; HAN, Z.; GAO, S.; VASSENA, R.; LATHAM, K.E. Non-equivalence of embryonic and

somatic cell nuclei affecting spindle composition in clones.

Dev. Biol.

, v.289, p.206-217, 2006.

MIYASHITA, N.; SHIGA, K.; YONAI, M.; KANEYAMA, K.; KOBAYASHI, S.; KOJIMA, T.; GOTO, Y.;

KISHI, M.; ASO, H.; SUZUKI, T.; SAKAGUCHI, M.; NAGAI, T. Remarkable differences in telomere

lengths among cloned cattle derived from different cell types.

Biol. Reprod.

, v.66, p.1649-1655,

2002.

MIYAZAKI, S.; SHIRAKAWA, H.; NAKADA, K.; HONDA, Y. Essential role of the inositol 1-4-5-

triphosphate receptor/Ca

release channel in Ca

-waves and Ca

oscillations at fertilization of

mammalian eggs.

Dev. Biol.

, v.158, p.62-78, 1993.

MIYOSHI, K.; RZUCIDLO, S.J.; GIBBONS, J.R.; ARAT, S.; STICE, S.L. Development of porcine

embryos reconstituted with somatic cells and enucleated metaphase I and II oocytes matured in a

protein-free medium.

BMC Dev. Biol.

, .v.1, p.12, 2001.

MIYOSHI, K.; RZUCIDLO, S.J.; PRATT, S.L.; et al. Utility of rapidly matured oocytes as recipients

for production of cloned embryos from somatic cells in the pig.

Biol. Reprod.

, v.67, p.540–545,

2002.

MONK, M.; BOUBELIK, M.; LEHNERT, S. Temporal and regional changes in DNA methylation in

the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development.

Development

, v.99, p.371-382, 1987.

MOOR, R.M.; DAI, Y.; LEE, C.; FULKA Jr, J. Oocyte maturation and embryonic failure.

Hum.

Reprod. Update

, v.4, p.223-236, 1998.

MOORE, T. Genetic conflict, genomic imprinting and establishment of the epigenotype in relation to

growth.

Reproduction

, v.122, p.185-193, 2001.

MOORE, T.; HAIG, D. Genomic imprinting in mammalian development: a parental tug-of-war.

Trends Genet.

, v. 7, p.45-49, 1991.

MOREIRA, P.N.; ROBL, J.M.; COLLAS, P. Architectural defects in pronuclei of mouse nuclear

transplant embryos.

J. Cell Sci.

, v.116, p.3713-3720, 2003.

MURPHY, S.K.; JIRTLE, R.L. Imprinting evolution and the price of silence.

BioEssays

, v. 25,

p.577-588, 2003.

NAGAO, Y.; TOTSUKA, Y.; ATOMI, Y.; KANEDA, H.; LINDAHL, K.F.; IMAI, H.; YONEKAWA, H.

Decreased physical performance of congenic mice with mismatch between the nuclear and

mitochondrial genome.

Genes Genet. Syst.

v.73, p.21-27, 1998.

NAIMEH, L.G.; SCHUTTE, B.C.; HAMILTON, W.S.; TSALIKIAN, E. Ontogeny of the H19 gene in

sheep and effect of maternal fasting on its expression in the fetus.

Endocr. Res.

, v.27, p.417-431,

2001.

NAKADA, K.; MIZUNO, J. Intracellular calcium responses in bovine oocytes induced by

spermatozoa and by reagents.

Theriogenology

, v.50, p.269-282, 1998.

NIEMANN, H.; WRENZYCKI, C.; LUCAS-HAHN, A.; BRAMBRINK, T.; KUES,W.A.; CARNWATH,

J.W. Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos

and their implications for early development.

Cloning Stem Cells

, v.4, p.29-38, 2002.

NIEMANN, H.; RATH, D.; WRENZYCKI, C. Advances in biotechnology: newtools in future pig

production for agriculture and biomedicine.

Reprod. Dom. Anim.

, v.38, p.82–89, 2003.

NURSE, P. Universal control mechanism regulating onset of M-phase.

Nature

, v. 344, p.503-508,

1990.

NUSSBAUM, D.J.; PRATHER, R.S. Differential effects of protein synthesis inhibitors on porcine

oocyte activation.

Mol. Reprod. Dev.

, v.41, p.70-75, 1995.

O’NEILL, G.T.; KAUFMAN, M.H. Cytogenetic analysis of ethanol induced parthenogenesis.

J. Exp.

Zool.

, v.249, p.182-192, 1989.

O’NEILL, G.T.; McDOUGALL, R.D.; KAUFMAN, M.H. Ultrastructural analysis of abnormalities in the

morphology of the second meiotic splindle in ethanol-induced parthenogenones.

Gam. Res.

, v.22,

p.285-299, 1989.

O’NEILL, M.J.; INGRAM, R.S.; VRANA, P.B.; TILGHMAN, S.M. Allelic expression of IGF2 in

marsupials and birds.

Dev. Genes Evol.

, v.210, p.18-20, 2000.

OBACK, B.; WELLS, D. Donor cells for nuclear cloning: many are called, but few are chosen.

Cloning Stem Cells

, v.4, p.147-168, 2002.

OBATA, Y.; KONO, T. Maternal primary imprinting is established at a specific time for each gene

throughout oocyte growth.

J. Biol. Chem.

, v.277, p.5285-5289, 2002.

OBATA, Y.; KANEKO-ISHINO. T.; KOIDE, T.; TAKAI, Y.; UEDA, T.; DOMEKI, I.; SHIROISHI, T.;

ISHINO, F.; KONO, T. Disruption of primary imprinting during oocyte growth leads to the modified

expression of imprinted genes during embryogenesis.

Development

, v.125, p.1553-1560, 1998.

OBATA, Y.; KONO, T.; HATADA, I. Gene silencing: maturation of mouse fetal germ cells in vitro.

Nature

, v.418, p.497, 2002.

OGAWA, H.; ONO, Y.; SHIMOZAWA, N.; SOTOMARU, Y.; KATSUZAWA, Y.; HIURA, H.; ITO, M.;

KONO, T. Disruption of imprinting in cloned mouse fetuses from embryonic stem cells.

Reproduction

, v.126, p.549-557, 2003.

OGURA, A.; INOUE, K.; OGONUKI, N.; NOGUCHI, A.; TAKANO, K.; NAGANO, R.; SUZUKI, O.;

LEE, J.; ISHINO, F.; MATSUDA, J. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and

cryopreserved immature Sertoli cells.

Biol. Reprod.

, v.62, p.1579-1584, 2000a.

OGURA, A.; INOUE, K.; TAKANO, K.; WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Birth of mice after

nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells.

Mol. Reprod. Dev.

, v.57, p.:55-59, 2000b.

OGURA, A.; INOUE, K.; OGONUKI, N. Phenotypic effects of somatic cell cloning in the mouse.

Cloning Stem Cells,

v.4, p.397–405, 2002.

OHGANE, J.; WAKAYAMA, T.; KOGO, Y.; SENDA, S.; HATTORI, N.; TANAKA, S.;

YANAGIMACHI, R.; SHIOTA, K. DNA methylation variation in cloned mice.

Genesis

, v.30, p.45-50,

2001.

ONISHI, A.; IWAMOTO, M.; AKITA, T.; MIKAWA, S.; TAKEDA, K.; AWATA, T.; HANADA, H.;

PERRY, A.C.F. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei.

Science

, v.289, p.1188-1190,

2000.

ONO, Y.; SHIMOZAWA, N.; ITO, M.; KONO, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at

metaphase by a serial nuclear transfer.

Biol. Reprod.

, v.64, n.1, p.44-50, 2001.

OSWALD, J.; ENGEMANN, S.; LANE, N.; MAYER, W.; OLEK, A.; FUNDELE, R.; DEAN, W.; REIK,

W.; WALTER, J. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote.

Curr. Biol.

v.10, p.475-478, 2000.

OZIL, J.P.; HEYMAN, Y.; RENARD, J.P. Production of monozygotic twins by micromanipulation and

cervical transfer in the cow.

Vet. Rec.,

v.110, p.126-127, 1982.

PACE, M.M.; AUGENSTEIN, M.L.; BATTHAUSER, J.M.; CHILDS, L.A.; EILERTSEN, K.J.; ENOS,

J.M.; FORSBERG, E.J.; GOLUEKE, P.J.; GRABER, D.F.; KEMPER, J.C.; KOPPANG, R.W.;

LANGE, G.; LESMEISTER, T.L.; MALLON, K.S.; MELL, G.D.; MISICA, P.M.; GENSKOW, M.P.;

STRELCHENKO, N.S.; VOELKER, G.R.; WATT, S.R. Ontogeny of cloned cattle to lactation.

Biol.

Reprod.

, v.67, p.334-339, 2002.

PALERMO, G.D.; COHEN, J.; ALIKANI, M.; et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel

treatment for all forms of male factor infertility.

Fertil. Steril.

, v.63, p.1231-1240, 1995.

PARK, K.W.; LAI, L.; CHEONG, H.T.; CABOT, R.; SUN, Q.Y.; WU, G.; RUCKER, E.B.; DURTSCH,

D.; BONK, A.; SAMUEL, M.; RIEKE, A.; DAY, B.N.; MURPHY, C.N.; CARTER, D.B.; PRATHER,

R.S. Mosaic gene expression in nuclear transferderived embryos and the production of cloned

transgenic pigs from ear-derived fibroblasts.

Biol. Reprod.

, v.66, p.1001-1005, 2002.

PATERSON, L.; DE SOUSA, P.; RITCHIE, W.; KING, T.; WILMUT, I. Application of reproductive

biotechnology in animals: implications and potentials. applications of reproductive cloning.

Anim.

Reprod. Sci.

, v.79, p.137-143, 2003.

PESCE, M.; SCHOLER, H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development.

Stem

Cells

, v.19, p.271-278, 2001.

PEURA, T.T.; LEWIS, I.M.; TROUNSON, A.O. The effect of recipient oocyte volume on nuclear

transfer in cattle.

Mol. Reprod. Dev.

, v.50, p.185-191, 1998.

PIEDRAHITA, J.A. Targeted modification of the domestic animal genome.

Theriogenology

, v.53,

p.105-116, 2000.

POLEJAEVA, I.A.; CAMPBELL, K.H.S. New advances in somatic cell nuclear transfer: application

in transgenesis.

Theriogenology

, v.53, p.117-126, 2000.

POLEJAEVA, I.A.; CHEN, S-H.; VAUGHT, T.D.; PAGE, R.L.; MULLINS, J.; BALL, S.; DAI, Y.;

BOONE, J.; WALKER, S.; AYARES, D.L.; COLMAN, A.; CAMPBELL, K.H.S. Cloned pigs produced

by nuclear transfer from adult somatic cells.

Nature

, v.407, p.505-509, 2000.

PRATHER, R.S.; BARNES, F.L.; SIMS, M.M.; ROBL, J.M.; EYESTONE, W.H.; FIRST, N.L. Nuclear

transfer in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte.

Biol. Reprod.

v.37, p.859-866, 1987.

PRATHER, R.S.; SIMS, M.M.; MAUL, G.G.; FIRST, N.L.; SCHATTEN, G. Nuclear laminin antigens

are developmentally regulated during porcine and bovine early embryogenesis.

Biol. Reprod.

, v.41,

p.123-132, 1989a.

PRATHER, R.S.; SIMS, M.M.; FIRST, N.L. Nuclear transplantation in early pig embryos.

Biol.

Reprod.

v.41, p.414-419, 1989b.

PRATHER, R.S.; KUBIAK, J.; MAUL, G.G.; FIRST, N.L.; SCHATTEN, G. The expression of nuclear

lamin A and C epitopes is regulated by the developmental stage of the cytoplasm in mouse oocytes

or embryos.

J. Exp. Zool.

, v.257, p.110-114, 1991.

PRESICCE, G.A.; YANG, X. Parthenogenetic development of bovine oocytes matured in vitro for 24

hr and activated by ethanol and cycloheximide.

Mol. Reprod. Dev.

, v.38, p.380-385, 1994.

PTAK, G.; CLINTON, M.; TISCHNER, M. Improving delivery and offspring viability of in vitro–

produced and cloned sheep embryos.

Biol. Reprod.

, v.67, p.1719-1725, 2002.

RACHMILEWITZ, J.; GOSHEN, R.; ARIEL, I.; SCHNEIDER, T.; DE GROOT, N.; HOCHBERG, A.

Parental imprinting of the human H19 gene.

FEBS Lett.

, v.309, p.25-28, 1992.

RAVELICH, S.R.; BREIER, B.H.; REDDY, S.; KEELAN, J.A.; WELLS, D.N.; PETERSON, A.J.; LEE,

R.S.F. Insulin-like growth factor-I and binding proteins 1,2 and 3 in bovine nuclear transfer

pregnancies.

Biol. Reprod.

, v.70, p.430-438, 2004a.

RAVELICH, S.R.; SHELLING. A.N.; RAMACHANDRAN, A.; REDDY. S.; KEELAN, J.A.; WELLS,

D.N.; PETERSON, A.J.; LEE, R.S.; BREIER, B.H. Altered Placental Lactogen and Leptin

Expression in Placentomes from Bovine Nuclear Transfer Pregnancies.

Biol. Reprod.

, v.71,

p.1862-1869, 2004b.

RAVELICH, S.R.; SHELLING. A.N.; WELLS, D.N.; PETERSON, A.J.; LEE, R.S.F. Expression of

T GF-â1, T GF-â2, T GF-â3 and the receptors TGF-âR1 and T GF - âRII in

placentomes of artificially

inseminated and nuclear transfer derived bovine pregnancies.

Placenta

, v.27, p.307-316, 2006.

REIK, W.; DEAN, W.; WALTER, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development.

Science

, v.293, 1089-1093, 2001.

REIK, W.; WALTER, J. Genomic imprinting: parental influence on the genome.

Nat. Rev. Genet.

v.2, p.21-32, 2001.

REIK, W.; CONSTANCIA, M.; FOWDEN, A.; ANDERSON, N.; DEAN, W.; FERGUSON-SMITH, A.;

TYCKO, B.; SIBLEY, C. Regulation of supply and demand for maternal nutrients in mammals by

imprinted genes.

J. Physiol.

, v.547, p.35-44, 2003.

RENARD, J.P.; CHASTANT, S.; CHESNÉ, P.; RICHARD, C.; MARCHAL, J.; CORDONNIER, N.;

CHAVATTE, P.; VIGNON, X. Lymphoid hypoplasia and somatic cloning.

The

Lancet

v.353,

p.1489-1491, 1999.

RENARD, J.P.; ZHOU, Q.; LEBOURHIS, D.; CHAVATTE-PALMER, P.; HUE, I.; HEYMAN, Y.;

VIGNON, X. Nuclear transfer technologies: between successes and doubts.

Theriogenology

, v.57,

p.203-222, 2002.

RICHARDS, E.J.; ELGIN, S.C. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing:

rounding up the usual suspects.

Cell,

v.108, p.489-500, 2002.

RIDEOUT III, W.M.; EGGAN, K.; JAENISCH, R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of

the genome.

Science

, v.293, 1093-1098, 2001.

ROBL, J.M. Development and application of technology for large scale cloning of cattle.

Theriogenology

v.51, p.499-508, 1999.

ROCHA, J.C.M.C.; TONHATI, H.; ALENCAR, M.M.; LÔBO, R.B. Genetic parameters estimates for

gestation length in beef cattle.

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec.

, v.57, p.784-791, 2005.

ROUGIER, N.; BOURC'HIS, D.; GOMES, D.M.; NIVELEAU, A.; PLACHOT, M.; PALDI, A.;

VIEGAS-PEQUIGNOT, E. Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation

development.

Genes Dev.

, v.12, p.2108-2113, 1998.

RUNGE, S.; NIELSEN, F.C.; NIELSEN, J.; LYKKE-ANDERSEN, J.; WEWER, U.; CHRISTIANSEN,

J. H19 RNA binds four molecules of insulin-like growth factor II mRNA-binding protein.

J. Biol.

Chem.

, v.275, p.29562-29569, 2000.

RUSSELL, D.F.; IBANEZ, E.; ALBERTINI, D.F.; OVERSTROM, E.W. Activated bovine cytoplasts

prepared by demecolcine-induced enucleation support development of nuclear transfer embryos in

vitro.

Mol. Reprod. Dev.

, v.72, p.161-170, 2005.

SAMAKÉ, S.; SMITH, L.C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced

vitro

: effects of nocodazole.

Mol. Reprod. Dev.

, v.44, p.486-492, 1996.

SAMAKÉ, S.; SMITH, L.C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced

vitro

: effects of 6-dimethylaminopurine.

J. Reprod. Fert.

, v.110, p.21-27, 1997a.

SAMAKÉ, S.; SMITH, L.C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced

vitro

: effects of aphidicolin.

Theriogenology

, v.48, p.969-976, 1997b.

SANTOS, F.; HENDRICH, B.; REIK, W.; DEAN, W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in

the early mouse embryo.

Dev. Biol.

, v.241, p.172-182, 2002.

SANTOS, F.; ZAKHARTCHENKO, V.; STOJKOVIC, M.; PETERS, A.; JENUWEIN, T.; WOLF, E.;

REIK, W.; DEAN, W. Epigenetic marking correlates with developmental potential in cloned bovine

preimplantation embryos.

Curr. Biol.

, v.13, p.1116-1121, 2003.

SASAKI, H.; FERGUSON-SMITH, A.C.; SHUM, A.S.W.; BARTON, S.C.; SURANI, M.A. Temporal

and spatial regulation of H19 imprinting in normal and uniparental mouse embryos.

Development

v.121, p.4195-4202, 1995.

SENDA, S.; WAKAYAMA, T.; YAMAZAKI, Y.; OHGANE, J.; HATTORI, N.; TANAKA, S.;

YANAGIMACHI, R.; SHIOTA, K. Skewed X-inactivation in cloned mice.

Bioch. Bioph. Res.

Comm.

, v.321, p.38-44, 2004.

SHI, W.; ZAKHARTCHENKO, V.; WOLF, E. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear

transfer.

Differentiation

, v.71, p.91-113, 2003.

SHI, W.; DIRIM, F.; WOLF, E.; ZAKHARTCHENKO, V.; HAAF, T. Methylation reprogramming and

chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos.

Biol.

Reprod.

, v.71, v.340-347, 2004.

SHIELS, P.G.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.; WADDINGTON, D.; WILMUT, I.; COLMAN, A. .;

SCHNIEKE, A.E. Analysis of telomere lengths in cloned sheep.

Nature

, v.399, p.316-317, 1999a.

SHIELS, P.G.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.S.; WILMUT, I.; WADDINGTON, D.; COLMAN, A.;

SCHNIEKE, A.E. Analysis of telomere length in Dolly, a sheep derived by nuclear transfer.

Cloning

, v.1, p.119-125, 1999b.

SHIN, T.; KRAEMER, D.; PRYOR, J.; LIU, L.; RUGILA, J.; HOWE, L.; BUCK, S.; MURPHY, K.;

LYONS, L.; WESTHUSIN, M. A cat cloned by nuclear transplantation.

Nature

, v.415, p.859, 2002.

SHIOTA, K.; YANAGIMACHI, R. Epigenetics by DNA methylation for development of normal and

cloned animals.

Differentiation

, v.69, p.162-166, 2002.

SIBLEY, C.P.; COAN, P.M.; FERGUSON-SMITH, A.C.; DEAN, W.; HUGHES, J.; SMITH, P., et al.

Placental-specific Igf-2 regulates the diffusional exchange characteristics of the mouse placenta.

Proc. Natl. Acad.

Sci.

v.101, p.8204-8208, 2004.

SIMERLY, C.; DOMINKO, T.; NAVARA, C.; PAYNE, C.; CAPUANO, S.; GOSMAN, G.; CHONG,

K.Y.; TAKAHASHI, D.; CHACE, C.; COMPTON, D.; HEWITSON, L.; SCHATTEN, G. Molecular

correlates of primate nuclear transfer failures.

Science

, v.300, p.297, 2003.

SIMERLY, C.; NAVARA, C.; HYUN, S.H.; LEE, B.C.; KANG, S.K.; CAPUANO, S.; GOSMAN, G.;

DOMINKO, T.; CHONG, K.Y.; COMPTON, D.; HWANG, W.S.; SCHATTEN, G. Embryogenesis and

blastocyst development after somatic cell nuclear transfer in nonhuman primates: overcoming

defects caused by meiotic spindle extraction.

Dev. Biol.

, v.276, p.237–252, 2004.

SIMS, M.; FIRST, N.L. Production of calves by nuclear transfer of nuclei from cultured inner cell

mass cells.

Proc. Natl. Acad. Sci.

, v.91, p.6143-6147, 1994.

SINGH, U.; FOHN, L.E.; WAKAYAMA, T., Different molecular mechanisms underlie placental

overgrowth phenotypes caused by interspecies hybridization, cloning, and Esx1 mutation.

Dev.

Dyn.

, v.230, p.149-164, 2004.

SLIMANE-BUREAU, W.C.; KING, W.A. Chromosomal abnormalities: a potential quality issue for

cloned cattle embryos.

Cloning and Stem Cells

, v.4, p.319-329, 2002.

SMITH, L.C. Membrane and intracellular effects of ultraviolet irradiation with Hoechst 33342 on

bovine secondary oocytes matured

in vitro

J. Reprod.Fert.

, v.99, p.39-44, 1993.

SMITH, L.C.; ALCIVAR, A.A. Cytoplasmic inheritance and its effects on development and

performance.

J. Reprod. Fert. Supplement

v.48, p.31-43, 1993.

SMITH, L.C.; BORDIGNON, V.; BABKINE, M.; FECTEAU, G.; KEEFER, C. Benefits and problems

with cloning animals.

Can. Vet. J.

, v.41, p.919-924, 2000a.

SMITH, L.C.; BORDIGNON, V.; GARCIA, J.M.; MEIRELLES, F.V. Mitochondrial genotype

segregation and effects during mammalian development: applications to biotechnology.

Theriogenology

v.53, p.35-46, 2000b.

SOLTER, D. Differencial imprinting and expression of maternal and paternal genomes.

Annu. Rev.

Genet.

, v.22, p.127-146, 1988.

SOLTER, D. Mammalian cloning: advances and limitations.

Nat. Rev. Genet.

, v.1, p.199-207, 2000.

SOOD, R.; ZEHNDER, J.L.; DRUZIN, M.L.; BROWN, P.O. Gene expression patterns in human

placenta.

Proc. Natl. Acad. Sci.

, v.103, p.5478-5483, 2006.

SPAHN, L.; BARLOW, D.P. An ICE pattern crystallizes.

Nature Genet.

, v.35, p.11-12, 2003.

SPEEMANN, H. ‘Embryonic Development and Induction’. 1938.

Yale University Press: New

Haven, Conn.

SPIELMAN, M.; VINKENOOG, R.; DICKINSON, H.G.; SCOTT, R.J. The epigenetic basis of gender

in flowering plants and mammals.

Trends Genet.

, v.17, p.705-711, 2001.

SPINDLE, A. Polyethylene glycol-induced fusion of two-cell mouse blastomeres.

Exp. Cell Res.

v.131, p.465-470, 1981.

STICE, S.L.; ROBL, J.M. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos.

Biol.

Reprod.

v.39, p.657-664, 1988.

STOGER, R.; KUBICKA, P.; LIU, C.G.; KAFRI, T.; RAZIN, A.; CEDAR, H.; BARLOW, D.P.

Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus as

carrying the imprinting signal.

Cell

, v.73, p.61-71, 1993.

SULLIVAN, E.J.; KASINATHAN, S.; KASINATHAN, P.; ROBL, J.M.; COLLAS, P. Cloned calves

from chromatin remodeled in vitro.

Biol. Reprod.

, v.70, p.146-153, 2004.

SURANI, M.A.H.; BARTON, S.C.; NORRIS, M.L. Development of reconstituted mouse eggs

suggests imprinting of the genome during gametogenesis.

Nature

v.308, p.548-550, 1984.

SURANI, M.A.H.; REIK, W.; NORRIS, M.L. Influence of germline modifications of homologous

chromosomes on mouse development.

J. Embryol. Exp. Morphol.

v.97(suppl.), p.123-146, 1986.

SZABO, P.E.; MANN, J.R. Biallelic expression of imprinted genes in the mouse germ line:

implications for erasure, establishment, and mechanisms of genomic imprinting.

Genes Dev.

, v.9,

p.1857-1868, 1995.

SZABO, P.E.; HUBNER, K.; SCHOLER, H.; MANN, J.R. Allele-specific expression of imprinted

genes in mouse migratory primordial germ cells.

Mech. Dev.

, v.115, p. 157-160, 2002.

TAKEDA, K.; TAKAHASHI, S.; ONISHI, A.; GOTO, Y.; MIYAZAWA, A.; IMAI, H. Dominant

distribution of mitochondrial DNA from recipient oocytes in bovine embryos and offspring after

nuclear transfer.

J. Reprod. Fert.

, v.116, p.253-259, 1999.

TAMASHIRO, K.L.; WAKAYAMA, T.; BLANCHARD, R.J.; BLANCHARD, D.C.; YANAGIMACHI, R.

Postnatal growth and behavioral development of mice cloned from adult cumulus cells.

Biol.

Reprod.

, v.62, p.1579-1584, 2000.

TAMASHIRO, K.L.; WAKAYAMA, T.; AKUTSU, H.; YAMAZAKI, Y.; LACHEY, J.L.; WORTMAN,

M.D.; SEELEY, R.J.; D’ALESSIO, D.A.; WOODS, S.C.; YANAGIMACHI, R.; SAKAI, R.R. Cloned

mice have an obese phenotype not transmitted to their offspring.

Nat. Med.

, v.8, p.262-267, 2002.

TAMASHIRO, K.L.; WAKAYAMA, T.; YAMAZAKI, Y.; AKUTSU, H.; WOODS, S.C.; KONDO, S.;

YANAGIMACHI, R.; SAKAI, R.R. Phenotype of cloned mice: development, behavior, and

physiology.

Exp. Biol. Med.

, v.228, p.

1193-1200, 2003.

TANAKA, H; KANAGAWA, H. Influence of combined activation treatments on the success of bovine

nuclear transfer using young or aged oocytes.

Anim. Reprod. Sci.

, v.49, p.113-123, 1997.

TANAKA, S.; ODA, M.; TOYOSHIMA, Y.; WAKAYAMA, T.; TANAKA, M.; YOSHIDA, N.; HATTORI,

N.; OHGANE, J.; YANAGIMACHI, R.; SHIOTA, K. Placentomegaly in cloned mouse concepti

caused by expansion of the spongiotrophoblast layer.

Biol. Reprod.

, v.65, p.1813-1821, 2001.

TANI, T.; KATO, Y.; TSUNODA, Y. Direct exposure of chromosomes to nonactivated ovum

cytoplasm is effective for bovine somatic cell nucleus reprogramming.

Biol. Reprod.

, v.64, p.324-

330, 2001.

TATHAM, B.G.; DOWSING, A.T.; TROUNSON, A.O. Enucleation by centrifugation of

in vitro

matured bovine oocytes for use in nuclear transfer.

Biol. Reprod.

, v.53, p.1088-1094, 1995.

THIBAULT C. Recent data on the development of cloned embryos derived from reconstructed eggs

with adult cells.

Reprod. Nutr. Dev.

, v.43, p.303-324, 2003

THOMPSON, J.G. Defining the requirements for bovine embryo culture.

Theriogenology

, v.45,

p.27-40, 1996.

THOMPSON, J.G.

In vitro

culture and embryo metabolism of cattle and sheep embryos - a decade

of achievement.

An. Reprod. Sci.

, v.60-61, p.263-275, 2000.

THOMPSON, J.G.E.; SIMPSON, A.C.; PUGH, P.A.; DONNELLY, P.E.; TERVIT, H.R. Effect of

oxygen concentration on

in-vitro

development of preimplantation sheep and cattle embryos.

Reprod. Fert.,

v.89, p.573-578, 1990.

THORVALDSEN, J.L.; DURAN, K.L.; BARTOLOMEI, M.S. Deletion of the H19 differentially

methylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2.

Genes Dev.

, v.1,

p.3693-3702, 1998.

TODER, R.; WILCOX, S.A.; SMITHWICK, N.; GRAVES, J.A. The human/mouse imprinted genes

IGF2, H19, SNRPN and ZNF127 map to two conserved autosomal clusters in marsupial.

Chromosome Res.

, v.4, p.295-300, 1996.

TUCKER, K.L.; BERAD, C.; SAYSMANN, J., JACKSON-GRUSBY, L.; LAIRD, P.W.; LEI, H.; LI, E.;

JAENISCH, R. Germ-line passage is required for establishment of methylation and expression

patterns of imprinted but not of nonimprinted genes.

Gen. Dev.

, v.10, p.1008-1020, 1996.

UEDA, T.; YAMAZAKI. K.; SUZUKI, R.; FUJIMOTO, H.; SASAKI, H.; SAKAKI, Y.;

HIGASHINAKAGAWA, T. Parental methylation patterns of a transgenic locus in adult somatic

tissues are imprinted during gametogenesis.

Development

, v.116, p.831-839, 1992.

UEDA, T.; ABE, K.; MIURA, A.; YUZURIHA, M.; ZUBAIR, M.; NOGUCHI, M.; NIWA, K.; KAWASW,

Y.; KONO, T.; MATSUDA, Y.; FUJIMOTO, H.; SHIBATA, H.; HAYASHIZAKI, Y.; SASAKI, H. The

paternal methylation imprint of the mouse H19 locus is acquired in the gonocyte stage during fotal

testis development.

Genes Cells

, v.5, p.649-659, 2000.

VAJTA, G.; LEWIS, I.M.; HYTTEL, P.; THOUAS, G.A.; TROUNSON, A.O. Somatic cell cloning

without micromanipulators.

Cloning

, v.3, p.89-95, 2001.

VAJTA, G.; LEWIS, I.M.; TROUNSON, A.O.; PURUP, S.; MADDOX-HYTTEL, P.; SCHMIDT, M.;

PEDERSEN, H.G.; GREVE, T.; CALLESEN, H. Handmade somatic cell cloning in cattle: analysis of

factors contributing to high efficiency in vitro.

Biol. Reprod.

, v.68, p.571-578, 2003.

VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, A.M.; MULLAART, E.; DE ROOS, A.P.W.; MERTON, J.S.;

DEN DAAS, J.H.G.; KEMP, B.; DE RUIGH, L. Effects of different reproduction techniques: AI,

MOET or IVP, on health and welfare of bovine offspring.

Theriogenology

, v.53, p.575-597, 2000.

VARMUZA, S.; MANN, M. Genomic imprinting-defusinf the ovarian time bomb.

Trends Genet.

v.10, p.118-123, 1994.

VERLHAC, M.H.; PENNART, H.; MARO, B.; COBB, M.H.; CLARKE, H.J. MAP Kinase becomes

stably activated at metaphase and is associated with microtubule-organizing centers during meiotic

maturation of mouse oocytes.

Dev. Biol.

, v.158, p.330-340, 1993.

VERLHAC, M.H.; KUBIAK, J.Z.; CLARKE, H.J.; MARO, B. Microtubule and chromatin behavior

follow MAP kinase activity but not MPF activity during in mouse oocytes.

Development

, v.120,

p.1017-1025, 1994.

VERONA, R.I.; MANN, M.R.W.; BARTOLOMEI, M.S. Genomic imprinting: intricacies of epigenetic

regulation in clusters.

Annu. Rev. Cell Dev. Biol.

, v.19, p.237-259, 2003.

VIGNON, X.; CHESNE, P.; Le BOURHUIS, D.; FLECHOM J.E.; HEYMAN, Y.; RENARD, J.P.

Development potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused

with cultured somatic cells

. C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life Sciences

v.321, p.735-

745, 1998.

VOLPERT, O.; JACKSON, D.; BOUCK, N.; LINZER, D.I. The insulin-like growth factor II/mannose

6-phosphate receptor is required for proliferatin-induced angiogenesis.

Trends Genet.

, v.10,

p.3871-3876, 1996.

WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells.

Nat.

Genet.

v.22, p.127-128, 1999.

WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Effect of cytokinesis inhibitors, DMSO and the timing of oocyte

activation on mouse cloning using

cumulus

cell nuclei.

Reproduction

, v.233, p.49-60, 2000.

WAKAYAMA, T.; PERRY, A.C.F.; ZUCCOTTI, M.; JOHNSON, K.R.; YANAGIMACHI, R. Full-term

development of mice enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.

Nature

v.394, p.369-

374, 1998.

WAKAYAMA, T.; RODRIGUEZ, I.; PERRY, A.C.F.; YANAGIMACHI, R.; MOMBAERTS, P. Mice

cloned from embryonic stem cells.

Proc. Natl. Acad. Sci.

v.96, p.14984-14989, 1999.

WAKAYAMA. T.; SHINKAI, Y.; TAMASHIRO, K.L.; YANAGIMACHI, R. Cloning of mice to six

generations.

Nature

, v.407, p.318-319, 2000.

WAKAYAMA, T.; TABAR, V.; RODRIGUEZ, I.; PERRY, A.C.; STUDER, L.; MOMBAERTS, P.

Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer.

Science

, v.292, p. 740-743, 2001.

WELLS, D.N. Animal cloning: current progress, challenges and future prospects.

Rev. Bras.

Reprod. Anim.

v.23, n.2, 86-97, 1999.

WELLS, D,N.; FORSYTH, J.T.; MCMILLAN, V.; OBACK, B. The health of somatic cell cloned cattle

and their offspring.

Cloning Stem Cells

, v.6, p.101-110, 2004.

WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; TERVIT, H.R.; VIVANCO, W.H. Adult somatic cell nuclear transfer is

used to preserve the last surviving cow of the Enderby Island cattle breed.

Reprod. Fert. Dev.

v.10, p.369-378, 1998.

WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; TERVIT, H.R. Production of cloned calves following nuclear transfer

with cultured adult mural granulosa cells.

Biol. Reprod.

v.60, p.996-1005, 1999.

WESTHUSIN, M.E.; COLLAS, P.; MAREK, D.; SULLIVAN, E.; STEPP, P.; PRYOR, J.; BARNES, F.

Reducing the amount of cytoplasm available for early embryonic development decreases the quality

but not quantity of embryos produced by

vitro

fertilization and nuclear transplantation.

Theriogenology

, v.46, p.243-252, 1996.

WESTHUSIN, M.E.; LONG, C.R.; SHIN, T.; HILL, J.R.; LOONEY, C.R.; PRYOR, J.H.;

PIEDRAHITA, J.A. Cloning to reproduce desired genotypes.

Theriogenology

, v.55, p.35-49, 2001.

WHITE, K.L.; BUNCH, T.D.; MITALIPOV, S.; REED, W.A. Establishment of pregnancy after transfer

of nuclear transfer embryos produced from fusion of Argali (

Ovis ammon

) nuclei into domestic

sheep (

Ovis aries

) enucleated oocytes.

Cloning

, v.1, p.47-54, 1999.

WILLADSEN, S.M. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce

monozygoytic twins.

Nature,

v.277, p.298-300, 1979.

WILLADSEN, S.M. The viability of early cleavage stages containing half the normal number of

blastomeres in the sheep.

J. Reprod. Fert.

v.59, 357-362, 1980.

WILLADSEN, S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos.

Nature

v.320, p.63-65, 1986.

WILMUT, I.; SCHNIEKE, A.E.; McWHIR, J.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.S. Viable offspring

derived from fetal and adult mammalian cells.

Nature

v.385, p.810-813, 1997.

WOODS, G.L.; WHITE, K.L.; VANDERWALL, D.K.; LI, G.P.; ASTON, K.I.; BUNCH, T.D.; MEERDO,

L.N.; PATE, B.J. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer.

Science

, v.301, p.1063, 2003.

WRENZYCKI, C.; WELLS, D.; HERRMANN, D.; MILLER, A.; OLIVER, J.; TERVIT, R.; NIEMANN,

H. Nuclear transfer protocol affects messenger RNA expression patterns in cloned bovine

blastocysts.

Biol. Reprod.

, v.65, p.309-317, 2001.

WRENZYCKI, C.; LUCAS-HAHN, A.; HERRMANN, D.; LEMME, E.; KORSAWE, K.; NIEMANN, H.

In vitro production and nuclear transfer affect dosage compensation of the X-linked gene transcripts

G6PD, PGK, and Xist in preimplantation bovine embryos.

Biol. Reprod.

, v.66, p.127-134, 2002.

WUTZ, A.; SMRZKA, O.W.; SCHWEIFER, N.; SCHELLANDER, K.; WAGNER, E.F.; BARLOW,

D.P. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island.

Nature

, v.389,

p.745-749, 1997.

XUE, F.; TIAN, X.C.; DU, F.; KUBOTA, C.; TANEJA, M.; DINNYES, A.; DAI, Y.; LEVINE, H.;

PEREIRA, L.V.; YANG, X. Aberrant patterns of X chromosome inactivation in bovine clones.

Nat.

Genet.

, v.31, p.216-220, 2002.

YAMAZAKI, W.

Clonagem em bovinos utilizando-se células somáticas de animais adultos:

avaliação comparativa da reconstituição de citoplastos pelas técnicas de transferência

nuclear e injeção nuclear intracitoplasmática.

2001. 132f. Dissertação (Mestrado em Medicina

Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista,

Jaboticabal, 2001.

YAMAZAKI, W.; FERREIRA, C.R.; MEO, S.C.; LEAL, C.L.; MEIRELLES, F.V.; GARCIA, J.M. Use

of strontium in the activation of bovine oocytes reconstructed by somatic cell nuclear transfer.

Zygote

, v.13, p.295-302, 2005.

YAMAZAKI, W.; MEIRELLES, F.V.; BORDIGNON, V.; GARCIA, J.M.; SMITH, L.C. Effect of

mitochondrial DNA (mtDNA) on nucleocytoplasmic interaction of mouse embryos reconstituted by

cytoplast transfer. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDDE BRASILEIRA DE TECNOLOGIA DE

EMBRIÕES, 26, Campos do Jordão, 1999.

Arq. Fac. Vet. UFRGS , Porto Alegre - RS

, v. 27

(Supl.), n. 1, p. 310, 1999.

YANAGIMACHI R. Cloning: experience from the mouse and other animals.

Mol. Cell Endocrinol.

v.187, p.241-248, 2002.

YANG, L.; CHAVATTE-PALMER, P.; KUBOTA, C.; O'NEILL, M.; HOAGLAND, T.; RENARD, J.P.;

TANEJA, M.; YANG, X.; TIAN, X.C. Expression of imprinted genes is aberrant in deceased

newborn cloned calves and relatively normal in surviving adult clones.

Biol. Reprod.

, v.71, p.431-

438, 2005.

YASSEN, M.A.; WRENZYCKI, C.; HERRMANN, D.; CARNWATH, J.W.; NIEMANN, H. Changes in

the relative abundance of mRNA transcripts for insulin0lie growth factor (IFG-I and IGF-II) ligands

and their receptors (IGF-IR/IGR-IIR) in preimplantation bovine embryos derived from different

vitro

systems.

Reproduction

, v.122, p. 601-610, 2001.

YIN, X.J.; KATO, Y.; TSUNODA, Y. Effect of enucleation procedures and maturation conditions on

the development of nuclear-transferred rabbit oocytes receiving male fibroblast cells.

Reproduction

, v.124, p.41-47, 2002a.

YIN, X.J.; TANI, T.; YONEMURA, I.; KAWAKAMI, M.; MIYAMOTO, K.; HASEGAWA, R.; ATO, Y.;

TSUNODA, Y. Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of

maternal chromosomes.

Biol. Reprod.

, v.67, p.442-446, 2002b.

YIN, X.J.; LEE, H.S.; LEE, Y.H.; SEO, Y.I.; JEON, S.J.; CHOI, E.G.; CHO, S.J.; CHO, S.G.; MIN,

W.; KANG, S.K.; HWANG, W.S.; KONG, I.K. Cats cloned from fetal and adult somatic cells by

nuclear transfer.

Reproduction

, v.129, p.245-249, 2005.

YONG, Z.; YUQIANG, L. Nuclear-cytoplasmic interaction and development of goat embryos

reconstructed by nuclear transplantation: production of goats by serially cloning embryos.

Biol.

Reprod.

v.58, p.266-269, 1998.

YOUNG, L.E.; BEAUJEAN, N. DNA methylation in the preimplantation embryo: the differing stories

of the mouse and sheep.

An. Reprod. Sci.

, v.82, p.61-78, 2004.

YOUNG, L.E.; SINCLAIR, K.D.; WILMUT, I. Large offspring syndrome in cattle and sheep.

Rev.

Reprod.

, v.3, p.155-163, 1998.

YOUNG, L.E.; FERNANDES, K.; MCEVOY, T.G.; BUTTERWITH, S.C.; GUTIERREZ, C.G.;

CAROLAN, C.; BROADBENT, P.J.; ROBINSON, J.J.; WILMUT, I.; SINCLAIR, K.D. Epigenetic

change in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture.

Nat. Genet.

, v.27,

p.153-154

2001.

YOUNG, L.E.; SCHNIEKE, A.E.; MCCREATH, K.J.; WIECKOWSKI, S.; KONFORTOVA, G.;

FERNANDES, K.; PTAK, G.; KIND, A.J.; WILMUT, I.; LOI, P.; FEIL, R. Conservation of IGF2-H19

and IGF2R imprinting in sheep: Effects of somatic cell nuclear transfer.

Mech. Dev.

, v.120, p.1433-

1442, 2003.

ZHANG, S.; KUBOTA, C.; YANG, L.; ZHANG, Y.; PAGE, R.; O’NEILL, M.; YANG, X.; TIAN, X.C.

Genomic Imprinting of H19 in Naturally Reproduced and Cloned Cattle.

Biol. Reprod.

, v.71, p.540-

1544, 2004.

ZHONG, Z.S.; ZHANG, G.; MENG, X.Q.; ZHANG, Y.L.; CHEN, D.Y.; SCHATTEN, H.; SUN, Q.Y.

Function of donor cell centrosome in intraspecies and interspecies nuclear transfer embryos.

Exp.

Cell Res.

, v.306, p.35-46, 2005.

ZHOU, Q.; BOULANGER, L.; RENARD, J.P. A simplified method for the reconstruction of fully

competent mouse zygotes from adult somatic donor nuclei.

Cloning

, v.2, p.35-44, 2000.

ZHOU, Q.; RENARD, J.P.; LE FRIEC, G.; BROCHARD, V.; BEAUJEAN, N.; CHERIFI, Y.;

FRAICHARD, A.; COZZI, J. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation.

Science

, v.302, p.1179, 2003.

ZOU, X.; CHEN, Y.; WANG ,Y.; LUO, J.; ZHANG, Q.; ZHANG, X.; YANG, Y.; JU, H.; SHEN, Y.;

LAO, W.; XU, S.; DU, M. Production of cloned goats from enucleated oocytes injected with cumulus

cell nuclei or fused with cumulus cells.

Cloning

, v.3, p.31-37, 2001.

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