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Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Estudo da leishmaniose visceral canina e dos
vetores de leishmanioses no município de
Mirandópolis, região noroeste do Estado de São
Paulo.
Rosa Maria Ferreira Noguerol Odorizzi
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação, para obtenção do título de
Mestre em Saúde Pública.
Área de concentração: Epidemiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Eunice Aparecida
Bianchi Galati
São Paulo
2006
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2
Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Estudo da leishmaniose visceral canina e dos
vetores de leishmanioses no município de
Mirandópolis, região noroeste do Estado de São
Paulo.
Rosa Maria Ferreira Noguerol Odorizzi
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em saúde pública da
Faculdade de Saúde Pública da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Mestre em Saúde Pública.
Área de concentração: Epidemiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Eunice Aparecida
Bianchi Galati
São Paulo
2006
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3
É expressamente proibida a comercialização deste documento tanto na sua forma
impressa como eletrônica. Sua reprodução total ou parcial é permitida exclusivamente
para fins acadêmicos e científicos, desde que na reprodução figure a identificação do
autor, título, instituição e ano da tese/dissertação.
4
DEDICATÓRIA
“... E a vida vai tecendo laços
Quase impossíveis de romper:
Tudo o que amamos são pedaços
Vivos do nosso próprio ser...”
Manuel Bandeira
À minha para sempre adorada mãe Dina.
Ao Adans meu amado marido e companheiro nessa jornada.
A Andréa, Lucas e Pedro Paulo meus filhos queridos.
5
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Eunice Aparecida Bianchi Galati, do Departamento de Epidemiologia da
FSP/USP, pelo incentivo, confiança, amizade e orientação para a realização deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Carlos Noryuki Kaneto, do Departamento de Apoio, Produção e Saúde
Animal do Curso de Medicina Veterinária de Araçatuba – UNESP, pelo auxílio
confiança por permitir a utilização de instalações sob sua responsabilidade para a
realização dos trabalhos de identificação dos flebotomíneos e preparação dos materiais
coletados.
A Profa. Dra. Kátia Denise Saraiva Brescian, do Departamento de Apoio, Produção e
Saúde Animal do Curso de Medicina Veterinária de Araçatuba – UNESP, por permitir a
utilização de instalações sob sua responsabilidade para a realização dos trabalhos de
identificação dos flebotomíneos e preparação dos materiais coletados.
À Profa. Dra. Marcia D Laurentti do Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas
da FM/USP pelo incentivo, amizade e colaboração na realização dos testes ELISA.
A Profa. Dra. Vera Lúcia Pereira Chioccola, do Instituto Adolfo Lutz pela realização
das PCR.
6
À Daniela Larangeira, Thaise do Laboratório da FM/USP pelo auxílio na realização dos
testes ELISA.
Ao Médico Veterinário Nilton Moraes Gonçalves diretor do Centro de Controle de
Zoonoses do Município de Mirandópolis pelo auxílio na coleta de material.
Aos senhores José Dias, José Pardo e Nilton, funcionários do Centro de Controle de
Zoonoses de Mirandópolis pela colaboração nas coletas de sangue e na manipulação dos
animais.
Ao senhor Nogueira funcionário do Centro de Controle de Vetores do município de
Mirandópolis pelas informações a cerca das aspersões de inseticida no município.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio
financeiro concedido.
Aos colegas da Pós-graduação pelos momentos de descontração sem os quais essa
jornada teria sido mais difícil.
Aos meus Tios Lena e Floriano pelo carinho, apoio e abrigo.
A minha amiga Mirna pelo carinho e abrigo.
A todas as pessoas que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho.
7
RESUMO
Odorizzi, RMFN. Estudo da leishmaniose visceral canina e de vetores de
leishmanioses no município de Mirandópolis, região noroeste do Estado de São
Paulo. São Paulo; 2005, [Dissertação de Mestrado – Faculdade de Saúde Pública da
USP].
Objetivos - Identificar a soro prevalência da leishmaniose canina atual e realizar estudo
da bio-ecologia de vetores de leishmanioses em área urbana e rural e em áreas de várzea
do rio Feio do município de Mirandópolis. Métodos - Os flebotomíneos foram
capturados com armadilhas automáticas luminosas, instaladas das 18:00 às 7:00 horas,
durante um ano, em 10 peridomicílios distribuídos nas zonas urbana e rural e em dois
locais(varanda e mata) localizados às margens do rio Feio no município de
Mirandópolis. As capturas nas zonas urbana e rural foram realizadas duas vezes por mês
e no rio Feio foram mensais. Amostras de sangue de 240 cães foram coletadas e
acondicionadas em tubo seco e em tubo contendo EDTA e mantidas a -20ºC até o
processamento por teste imunoenzimático (ELISA) e reação em cadeia pela polimerase
(PCR). Apenas 24 amostras de creme leucocitário, das 240 mencionadas anteriormente,
foram testadas por PCR Resultados - Nas áreas urbana e rural, um total de 84 espécimes
de flebotomíneos foram capturados, destes apenas 55 foram identificados como
Lutzomyia longipalpis, sendo estes mais freqüente no verão e apresentou correlação
positiva (Pearson) para o índice pluviomético (r =0,51) e temperatura (r = 0,56),
respectivamente. Um total de 35.995 espécimes foram capturados na várzea do rio Feio,
representado quase que exclusivamente por Nyssomyia neivai, que apresentou a média
8
de Williams mais elevada no inverno. Neste local, capturou-se também um espécime de
Psathyromyia (Xiphomyia) hermelenti, sendo este o primeiro registro dessa espécie no
Estado de São Paulo. O teste ELISA revelou um alto índice de animais soro reagentes
(60,8%) e a grande maioria destes 73,9% eram assintomáticos. Leishmania (Leishmania)
chagasi foi identificada por PCR em creme leucocitário de quatro cães. Conclusões -
Embora no presente estudo a soro-prevalência canina tenha sido trinta e cinco vezes
maior do que a obtida em 2000, a densidade de Lutzomyia longipalpis durante o período
de mostrou-se bastante reduzida, sugerindo que outros mecanismos de transmissão
possam estar envolvidos. Além disto, a alta densidade de Nyssomyia neivai, um dos
vetores suspeitos de transmitir a leishmaniose tegumentar americana nas regiões Sudeste
e Sul do Brasil, na várzea do rio Feio apontam para o risco de transmissão noturna dessa
doença, para humanos, principalmente nos períodos mais secos do ano.
Descritores: Leishmaniose visceral americana. Leishmaniose tegumentar americana.
Leishmania (Leishmania) chagasi. Lutzomyia longipalpis. Nyssomyia neivai. Soro
prevalência canina.
9
Abstract
Odorizzi, RMFN. A study of canine visceral leishmaniasis and vectors of leishmaniases
in Mirandópolis county, at north-west region of São Paulo State, Brazil (Estudo da
leishmaniose visceral canina e de vetores de leishmanioses no município de
Mirandópolis, região noroeste do Estado de São Paulo). [Master Dissertation. Faculdade
de Saúde Pública da USP].
Objective -To identify the canine leishmaniasis sero-prevalence and study the bio-
ecology of phlebotomine sandflies in urban and rural areas as well as on the Feio river
flood-plain of in Mirandópolis county. Methodology - The sandflies were captured with
automatic light traps, installed between 18:00 and 07:00 hours, over a period of one year
at 10 peridomiciles distributed in the urban and rural areas and two sites (veranda of a
domicile and forest) on the Feio river’s in Mirandopolis county. The captures in the
urban and rural areas were undertaken twice monthly and once a month on the Feio
river. Blood samples were collected from 240 dogs and stored in dry tubes and tubes
with ETDA at -20
o
C until enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the
polymerase chain reaction (PCR) could be performed. Of this latter just 24 of the above
mentioned 240 samples were tested, using buffy coat. Results - In the urban and rural
areas, a total of 84 san fly specimens were collected, 55 of them belonging to Lutzomyia
longipalpis, that presented its highest frequency during the summer and showed a
positive correlation (Pearson’s correlation Index) with the rainfall indexe (0.51) and
temperature (0.56), respectively. A total of 35,995 specimens were captured on the Feio
river flood-plain, almost exclusively of Nyssomyia neivai which presented the highest
10
Williams’ average in the winter. In this area, one specimen of Psathyromyia
(Xiphomyia) hermanlenti was captured, this being the first record of this species in São
Paulo State.The Elisa test showed a high prevalence of sero-reactive dogs (60.8%) the
large majority (73,9%) were asymptomatic. Leishmania (Leishmania) chagasi was
identified by PCR using the by buffy coat of four dogs. Conclusions - A although in the
present study the canine sero-prevalence of the Leishmania infection was 35 times
higher than that obtained in 2000, the densities of Lutzomyia longipalpis during this
study period were greatly reduced, suggesting that other transmission mechanisms may
be involved. Further, the high density of Nyssomyia neivai, one of the suspect vectors of
Cutaneous Leishmaniasis in the Southeastern and Southern regions of Brazil, on the
Feio river flood-plain points to the possible risk of nocturnal transmission of this
disease, especially in the drier periods of the year to humans in the area.
Descritores: American Visceral Leishmaniasis. Cutaneous Leishmaniasis. Leishmania
chagasi. Lutzomyia longipalpis. Nyssomyia neivai. Vector. Canine sero-prevalence.
11
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 11
1.1 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA) 13
1.2.LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA (LVA) 14
2 OBJETIVOS 17
2.1 OBJETIVO GERAL 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17
3 MÉTODO 18
3.1 ÁREA DE ESTUDO 18
3.2 DADOS CLIMATOLÓGICOS 18
3.3 ESTUDOS ENTOMOLÓGICOS 19
3.4 RESERVATÓRIOS
20
3.5. TESTES ESTATÍSTICOS 24
4. RESULTADOS 25
4.1 DADOS ENTOMOLÓGICOS 25
4.2 DADOS DOS RESERVATÓRIOS 31
12
5. DISCUSSÃO 36
6. CONCLUSÕES 43
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 43
8. REFERÊNCIAS 45
ANEXO
Anexo I - Localização do município de Mirandópolis, no Estado de
São Paulo. 55
Anexo II - Dados Climatológicos 56
Anexo III - Localização dos pontos de captura
dos flebotomíneos nas áreas urbana e rural 58
Anexo IV – Localização dos setores de coleta de sangue dos cães 59
Anexo V – Localização do rio feio em relação à sede do município 60
Anexo VI – Ficha para identificação dos cães 61
13
1 INTRODUÇÃO
Leishmanioses são agravos à saúde, provocados por cerca de 20 espécies de
protozoários tripanosomatídeos do gênero Leishmania Ross, 1903. São importantes
zoonoses parasitárias, largamente difundidas em 88 países, dos quais 72 deles em
desenvolvimento. Noventa por cento dos casos de Leishmaniose Visceral (LV) estão
concentrados em cinco países: Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal e Sudão (WHO, 2004).
Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde, 350 milhões de pessoas
vivem em áreas de risco de adquirir leishmaniose de forma geral, com cerca de 12
milhões infectadas. Globalmente ocorrem 1,5 a 2 milhões de novos casos de
leishmaniose tegumentar e 500 mil novos casos de leishmaniose visceral anualmente
(WHO, 1990; 2004).
A importância dessas zoonoses no Brasil está baseada na sua ampla distribuição
geográfica, na gravidade das manifestações clínicas da leishmaniose visceral americana
(LVA), principalmente em crianças desnutridas e em adultos imunodeprimidos (co-
infecção HIV/LV) e na morbidade das formas clínicas das leishmanioses tegumentares
(LT) que envolvem lesões cutâneas e destruição ou mutilação de mucosas. Com o
aumento da incidência e da disseminação de algumas formas de leishmaniose para novas
áreas geográficas e a tendência à urbanização, essa importância vem crescendo nos
últimos anos (NUNES, 2001).
A maioria das leishmânias é considerada parasita de animais silvestres: roedores,
canídeos, edentados, marsupiais, procionídeos, ungulados e primatas, apenas uma
pequena parcela delas são parasitas dos animais domésticos (LAINSON, 1983; MELLO,
1988).
Na América, atuam como agentes etiológicos na forma tegumentar, pelo menos,
dez espécies. No Brasil, compreendem sete: Leishmania (Leishmania) amazonensis
Lainson & Shaw, 1972, de ocorrência na região amazônica, Nordeste, Sul e Centro-
Oeste do país; Leishmania (Viannia) guyanensis Floch, 1954; Leishmania. (Viannia)
lainsoni Silveira, Shaw, Braga & Ishikawa, 1987; Leishmania (Viannia) naiffi Lainson
& Shaw, 1989 e Leishmania (Viannia) shawi Lainson, Braga, Souza, Povoa & Ishikawa,
14
1989, Leishmania (Viannia) lindembergi Silveira, Ishikawa, Souza, Lainson, 2002 as
cinco encontradas na região amazônica e Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna,
1911, com a mais ampla distribuição no Brasil (DEDET, 1993; SILVEIRA et al., 2002;
DORVAL, 2006).
Atribui-se a Leishmania (Leishmaia) chagasi Cunha & Chagas, 1937 a maioria
dos casos da forma visceral na América. Entretanto, Leishmania (Leishmania)
amazonensis Lainson & Shaw, 1972 foi isolada de medula óssea de caso humano na
Bahia (BARRAL et al., 1986).
Análises de DNA indicaram que a Leishmania (Leishmania) infantum, espécie
responsável pela leishmaniose visceral na Europa, e a Leishmania (Leishmania) chagasi
apresentam tanta semelhança, que só poderiam ser separadas em nível sub-específico
(MAURÍCIO et al., 1999). Conseqüentemente, são adotadas agora por alguns autores as
subespécies Leishmania. (Leishmania) infantum infantum e Leishmania. (Leishmania)
infantum chagasi. (LAINSON e RANGEL, 2003).
Seus vetores compreendem insetos hematófagos, nematóceros, de diferentes
gêneros e várias espécies, conhecidos como flebotomíneos (DEDET, 1993) e pertencem
à família Psychodidae. Apresentam portes reduzidos, cujo comprimento raramente
ultrapassa 0,5 cm. São densamente pilosos e esse aspecto constitui característica geral do
grupo (FORATTINI, 1973).
O habitat das formas imaturas dos flebotomíneos é terrestre desenvolvendo-se
estas em locais ricos em matéria orgânica em decomposição, especialmente de natureza
vegetal (AGUIAR e MEDEIROS, 2003).
Algumas espécies de flebotomíneos alimentam-se somente em determinadas
espécies de vertebrados, porém, outras têm hábitos ecléticos, picando indiferentemente
várias espécies de mamíferos (SHERLOCK, 2003).
Nas Américas, são conhecidas cerca de 470 espécies de flebotomíneos (GALATI
2003), das quais aproximadamente 40 foram relatadas como possíveis vetores das
leishmanioses (PIMENTA et al., 2003).
Entre os inúmeros flebotomíneos que têm sido incriminados e/ou comprovados
como vetores de leishmânia no Brasil, destaca-se para a leishmaniose visceral a espécie
15
Lutzomyia longipalpis, como a mais importante; seguida da espécie Lutzomyia cruzi
(GALATI et al., 1997; SANTOS et al., 1998) e em Corumbá, suspeita-se de Lutzomyia
forattinii (GALATI et al., 1997). E para as leishmanioses tegumentares, espécies que de
acordo com a nomenclatura de GALATI (2003) pertencem aos gêneros Bichromomyia,
Migonemyia, Nyssomyia, Pintomyia, Psychodopygus e Trichophoromyia (RANGEL e
LAINSON, 2003).
1.1 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA)
A modalidade clássica da transmissão da LTA é a silvestre, na qual o homem
adquire a infecção ao adentrar nas matas, onde interage com seus reservatórios naturais e
vetores (PESSÔA e BARRETTO, 1948; LAINSON e SHAW, 1987). Nesta
circunstância, a doença atinge predominantemente o sexo masculino e em faixa etária
produtiva. Manifesta-se na forma endêmica em quase todos os estados brasileiros.
Ocasionalmente na forma de surtos epidêmicos (JONES et al., 1987; GOMES, 1992).
No entanto, em regiões do país com maior influência antrópica, sobretudo na Sudeste e
na Nordeste, a Leishmania (Leishmania) braziliensis encontra-se adaptada a
ecossistemas alterados e a sua transmissão vem ocorrendo em áreas há muito
colonizadas (GOMES, 1992; MARZOCHI ,1992).
1.1.1. LTA no Estado de São Paulo
No Estado de São Paulo, a transmissão da LTA seguia as principais estradas de
ferro, a Alta Paulista, a Noroeste e a Alta Sorocabana, em nível endêmico elevado, até
meados do século XX. Nas demais áreas, a ocorrência se dava em casos esporádicos ou
era inexistente (PESSÔA e BARRETTO 1948).
Atualmente a doença encontra-se em expansão, porém os níveis de incidência
mostram-se distintos em diferentes áreas. A região sudoeste do Estado, na margem
esquerda do rio Tietê, responsável na década de 30 por 91,6% dos casos segundo
PESSÔA e PESTANA (1940) (apud TOLEZZANO, 1994), no período de 1979-1992,
registrou apenas 16,2% dos casos. Por sua vez, a região sul do Estado, compreendida
pelas regiões de Sorocaba e do Vale do Ribeira (consideradas como não endêmicas até
16
meados do século XX) no período compreendido entre 1979-1992, foi responsável por
60,2% dos casos autóctones do Estado (TOLEZANO, 1994).
De 1999 até a presente data, o Estado de São Paulo contabilizou 2.932 casos
notificados de LTA (CVE, 2006), atingindo ambos os sexos e as várias faixas etárias.
No município de Mirandópolis, ocorreram dois casos (CVE, 2006).
Os conhecimentos sobre os seus vetores no Estado de São Paulo alicerçam-se em
áreas de transmissão da LTA e ainda estão em estreita dependência de matas.
A ocorrência da LTA, até os meados do século XX, se associava às matas
primitivas, com os seus vetores numa estreita dependência das mesmas. Com o
extensivo desmatamento que o Estado vinha sofrendo julgava-se que o fim das florestas
levaria à eliminação da doença (SAMPAIO, 1951). Até esta época, destacavam-se como
espécies de flebotomíneos predominantes e antropofílicas nas áreas de ocorrência da
doença a Nyssomyia whitmani (Antunes & Coutinho 1939) Pintomyia pessoai (Coutinho
& Barretto 1940) e Pintomyia fischeri e, embora a Nyssomyia intermedia (Lutz & Neiva,
1912) não se apresentasse em abundância, chamava a atenção a sua grande dispersão
(BARRETTO, 1943).
Recentemente, se identificou que o táxon Nyssomyia intermedia, na realidade,
compreende duas espécies crípticas: Nyssomyia intermedia, s. str. distribuída na área
litorânea do Estado e Nyssomyia neivai (Pinto, 1926), até então considerada na
sinonímia da primeira, em área do Planalto Paulista, com ocorrência em simpatria em
municípios não litorâneos do Vale do Ribeira e Vale do Paraíba (MARCONDES, 1997).
Embora em níveis inferiores ao de Nyssomyia intermedia s. lat., a espécie Migonemyia
migonei (França 1920) vem assumindo importância na transmissão da LTA por todo o
Estado (NEVES 1999).
1.2. LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA (LVA)
Segundo o Ministério da Saúde no período de 1984 a 2002 foram notificados
48.455 casos de LVA, destes 66% ocorreram nos Estados da Bahia, Ceará, Maranhão e
Piauí. Nos últimos 10 anos a média anual de casos no Brasil foi de 3156 casos
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003). O município de Mirandópolis contabilizou trinta e
sete casos de LV com dois óbitos, entre 2001 até 9/01/2006 (CVE, 2006).
17
Na leishmaniose visceral americana, o cão tem sido apontado como o mais
importante reservatório doméstico, principalmente por sua proximidade com o homem
(DEANE, 1955).
Pesquisas realizadas por Chagas e colaboradores em 1938, no município de
Abaeté (PA), já relatavam uma incidência de 1,48% no homem; 4,49% no cão e 2,63%
no gato. Há citações também de que Rattus rattus e R. norvegicus foram encontrados
naturalmente infectados por L.(L.) infantum no Mediterrâneo e no Oriente Médio, em
áreas endêmicas (SHERLOCK, 1996). ALENCAR (1974/1975) encontrou a forma
amastigota em Rattus rattus no Estado do Ceará (SHERLOCK, 1996).
Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da LVA tem a capacidade de adaptar-se
facilmente ao peridomicílio, residências e abrigos de animais. É considerada uma
espécie com características antropozoofílicas e a prática da criação de animais
domésticos no peridomicílio parece ter influenciado, favoravelmente, a manutenção de
sua relação biológica com esses animais (KANETO, 2001).
A densidade populacional de L. longipalpis parece aumentar logo após a estação
chuvosa (FORATTINI, 1973). Os indivíduos desta espécie tendem a não se afastar
muito de seus abrigos, como se deduz através de pesquisa realizada por MORRISON et
al. (1993) sobre captura, marcação, soltura e recaptura, sendo esta obtida, na grande
maioria das vezes, até 250m do ponto de soltura. Porém, nesta mesma pesquisa,
observou-se que alguns indivíduos foram recapturados a 1000 m do local de soltura.
1.2.1. A Leishmaniose Visceral Americana no Estado de São Paulo
No Estado de São Paulo, a Leishmaniose Visceral Americana (LVA) vem se
apresentando como grave problema de saúde pública na região noroeste, desde o final da
década de 90 e nas áreas de transmissão para a população humana, apenas Lutzomyia
longipalpis tem sido pontada como vetor (SUCEN 2006).
1.2.1.1.As Leishmanisoes no município de Mirandópolis
Mirandópolis, município localizado na região noroeste do Estado de São Paulo,
foi alvo de estudo no ano de 2001. Naquela ocasião, identificaram-se todos os elos da
cadeia de transmissão da LVA, mas sem registro de casos humanos da doença. Todavia,
18
no período de 2001 a presente data o município contabilizou 37 casos humanos de LVA,
com dois óbitos e dois casos de LTA (CVE, 2006).
Segundo a classificação adotada pelo Ministério da Saúde (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2003), o município de Mirandópolis estaria classificado como área de
transmissão intensa para a LVA, com média igual a 7,4 casos por ano no período de
2001 a 2005.
Diante destes fatos, julgou-se oportuna uma nova pesquisa para identificar a
situação epidemiológica das leishmanioses no município, considerando-se os
reservatórios domésticos, vetores e agentes em ambiente urbano e rural e, também, em
resquício de mata às margens do rio Feio, dado que é muito freqüentado para atividade
de pesca e lazer pela população local.
19
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Identificar a atual soro prevalência da leishmaniose canina nas áreas urbana e
rural e realizar estudo da bio-ecologia de vetores de Leishmania nas mesmas áreas,
bem como na várzea do Rio Feio do município de Mirandópolis.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Identificar a prevalência de anticorpos anti-Leishmania em cães.
2.2.2 Identificar os possíveis focos de incidência de leishmaniose a partir
dos casos confirmados da doença em cães.
2.2.3 Identificar a presença de flebotomíneos em peridomicílios de área
urbana, rural e área de várzea do Rio Feio.
2.2.4 Identificar a sazonalidade dos flebotomíneos.
2.2.5
Identificar as espécies de Leishmania circulantes na população
canina do município de Mirandópolis
.
20
3. MÉTODO
3.1 ÁREA DE ESTUDO
Os trabalhos foram realizados no município de Mirandópolis, localizado na
região noroeste do Estado de São Paulo, distante 608 km da capital e 80 km de
Araçatuba (Anexo I). O município faz divisa ao norte com o município de Irapuru,
Pacaembu, Flórida Paulista e Junqueirópolis; ao Sul com Lavínia, a leste com Guaraçaí e
a oeste com Pereira Barreto (KANETO, 2001; PREFEITURA MUNICIPAL DE
MIRANDÓPOLIS, 2006).
O município de Mirandópolis ocupa uma área de 918 km², cujo relevo varia de
suave ondulado a ondulado, com solo podzolizado Lins-Marília. Situa-se a 21°12’LS e
51°1’LW, com altitude de 430 m acima do nível do mar (KANETO, 2001; IBGE, 2006)
O clima é do tipo Aw,
segundo classificação de Koeppen, com inverno seco e o mês
mais frio com temperatura média superior a 18ºC e precipitação inferior a 60mm.
Geralmente, a estação chuvosa e quente inicia-se em outubro e vai até abril. O período
seco e frio inicia-se em maio, tornando-se mais acentuado nos meses de junho a agosto.
(CEPAGRI, METEOROLOGIA UNICAMP, 2006).
A população atual do município é de 25.928 habitantes, dos quais 22.279 vivem
na área urbana e 3.649 na área rural (PREFEITURA DO MUNICÍPIO DE
MIRANDÓPOLIS, 2006). Apresenta ainda uma população carcerária de
aproximadamente 2.000 detentos instalada no complexo penitenciário na periferia da
cidade (comunicação pessoal).
A economia do município está baseada na agricultura e pecuária, tendo a cana-
de-açúcar, pecuária de corte e de leite, avicultura de postura e fruticultura como as
principais explorações, além de um pequeno comércio, indústrias e prestação de serviço
(IBGE, 2006).
3.2 DADOS CLIMATOLÓGICOS (Anexo II)
Os dados climatológicos foram obtidos “on line” do Instituto Agronômico de
Campinas IAC (CIIAGRO, 2006).
21
3.3 ESTUDOS ENTOMOLÓGICOS
3.3.1 Captura de flebotomíneos
As capturas dos flebotomíneos foram realizadas com armadilhas automáticas
luminosas em miniatura, tipo CDC modificada (NATAL et al., 1991) instaladas a 1,5m
do solo, em áreas urbana, rural e em uma área de preservação ambiental distando 30 km
da cidade, localizada às margens do rio Feio (Anexos III e V).
Na área urbana, foram instaladas em ambiente peridomiciliar de cinco moradias
selecionadas seguindo o critério de alta, média e baixa prevalência de leishmaniose
visceral em cães, de acordo com informações do Centro de Controle de Zoonoses do
município de Mirandópolis (Anexo II).
Na área rural, as armadilhas foram instaladas próximas a abrigo de animais
domésticos (curral, chiqueiro, galinheiro ou poleiro) e embaixo de árvores, de quatro
pequenas propriedades típicas da região, as quais foram escolhidas de maneira que
distassem aproximadamente 3 km do centro da cidade de Mirandópolis (Anexo III).
Além destas, amostrou-se um ponto representado por um clube de lazer, escolhido
devido à sua proximidade (500m) do complexo penitenciário. A armadilha foi instalada
embaixo de uma árvore.
No rio Feio, inicialmente, a armadilha foi instalada na varanda de um rancho de
pesca. Posteriormente, uma outra armadilha foi instalada no interior da mata ciliar,
distante cerca de 500m do rancho.
Todas as capturas foram realizadas das 18:00 às 07:00 horas, não obedecendo ao
horário de verão. Nas zonas urbana e rural, as capturas foram feitas duas vezes por mês,
durante o período de junho de 2004 a maio de 2005. No rio Feio, as armadilhas foram
instaladas uma vez por mês. No rancho, durante o período de junho de 2004 a setembro
de 2005 e na mata, de outubro de 2004 a setembro de 2005.
Os flebotomíneos capturados após serem mortos em atmosfera com clorofórmio,
foram acondicionados em caixas entomológicas devidamente identificadas. Em seguida,
foram encaminhados ao Laboratório de Phlebotominae da FSP/USP ou ao Laboratório
de Entomologia da UNESP – Araçatuba. Após serem submetidos ao processo de
22
clarificação, foram identificados adotando-se a nomenclatura para as espécies de acordo
com a classificação de GALATI (2003).
3.3.2 Investigação da infecção natural de flebotomíneos por flagelados
Algumas fêmeas de flebotomíneos capturadas no rio Feio foram separadas para,
futuramente, desenvolver análise por reação em cadeia pela polimerase (PCR) para
investigação de infecção natural por leishmânias.
3.4 RESERVATÓRIOS
3.4.1 Inquérito sorológico canino
Amostras de sangue foram obtidas de animais acima de três meses de idade, das
áreas urbana e rural, cujos proprietários consentiram com a pesquisa e de animais que
foram enviados ao Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) para eutanásia. As coletas
foram efetuadas entre setembro e outubro de 2005 e processadas em novembro do
mesmo ano
.
A área urbana do município foi dividida por setores (Anexo IV), o cálculo da
amostra foi realizado levando-se em consideração a densidade populacional dos cães,
nestes setores e na zona rural, com base em informação obtida junto ao CCZ de
Mirandópolis, durante as campanhas de vacinação. Os cães foram escolhidos de forma
aleatória para coleta de sangue e uma ficha de identificação foi preenchida, com dados
dos animais e sinais ou sintomas mais comuns para a leishmaniose visceral (Anexo VI).
As amostras de sangue foram obtidas através de punção da veia cefálica ou da
jugular, dependendo do porte do animal, e foram acondicionadas em dois tubos, um
contendo EDTA, para obtenção do creme leucocitário e o outro, seco, para obtenção do
soro.
O tubo contendo EDTA foi centrifugado em centrifuga tipo Baby II a 4000rpm
por 10 minutos e a retirada do creme foi realizada com pipeta automática.
Do tubo seco, obteve-se o soro após a coagulação do sangue e centrifugação. Foi
então, retirada a parte líquida com o auxílio de pipetas automáticas.
23
As amostras de soro e creme leucocitário foram estocadas a -20°C até o seu
processamento.
Para o diagnóstico sorológico utilizou-se o teste imunoenzimático ELISA
padronizado no Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas da Faculdade de
Medicina da USP, onde as amostras foram processadas em duplicata segundo protocolo
transcrito abaixo.
O antígeno utilizado foi promastigota de L. (L.) chagasi, gentilmente cedido pela
Profa. Dra. Márcia D. Laurenti.
3.4.2 ELISA para pesquisa de IgG anti-Leishmania em soro de cão
Determinação de IgG nos soros testes
1. Microplacas de poliestireno de fundo plano de 96 poços foram sensibilizadas com um
volume de 100µL de antígeno solúvel de promastigotas de L. (L.) chagasi, na
concentração de 10µg/mL de proteína, em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M, pH
9.5, e incubadas em câmara úmida durante a noite a 4°C.
2. As placas foram lavadas três vezes com 200µL por poço de Solução Tampão Fosfato
0,15M, pH 7.2, contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T).
3. Bloqueio de ligações inespecíficas foi feito com solução de leite em pó desnatado
(MOLICO®) a 10% em PBS-T (200µL por poço) e as placas incubadas em câmara
úmida durante 2 horas a 37°C.
4. As placas foram lavadas novamente três vezes com PBS-T.
5. Amostras de soros teste e de controles positivos e negativos foram adicionadas à
placa, em duplicata, no volume de 100µL por poço, na diluição de 1:400 em PBS-T e
incubadas a 37°C durante 1 hora em câmara úmida.
6. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T.
7. Conjugado anti-IgG de cão ligado a fosfatase alcalina (BETHIL, USA) foi adicionado
no volume de 100µL por poço, na diluição de 1:2000 em PBS-T, sendo as placas
incubadas a 37°C, durante 45 minutos em câmara úmida.
8. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T.
24
9. O revelador contendo o substrato e o cromógeno (1,0 mg/mL de PNPP em tampão
carbonato-bicarbonato 0,1M, pH 9,5) foi adicionado no volume de 100µL por poço e
incubado à temperatura ambiente por 30 minutos.
10. A reação foi interrompida com 50µL de NaOH 3M por poço, sendo a leitura da
absorbância feita em filtro de 405nm (Multiskan EX da Labsystems®).
3.4.3 Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
Das amostras de creme leucocitário obtido de sangue, apenas 24 foram
submetidas à PCR para identificação das espécies de Leishmania circulante no
município.
O critério de escolha dessas amostras foi o que se segue: 3 amostras cuja
absorbância relativa no teste ELISA foi maior do que 6,000; 4 amostras (absorbância
relativa > 4,000); 6 amostras (absorbância relativa > 2,000); 3 amostras (absorbância
relativa >1,500), 5 amostras consideradas “border line” (1,500 < absorbância relativa >
1,000) e 4 amostras (absorbância relativa< 1,000) que são consideradas não reagentes ao
teste ELISA.
O teste foi realizado no Instituto Adolfo Lutz, segundo protocolo utilizado pela
pesquisadora Dra. Vera Lúcia Pereira Chioccola.
3.4.3.1 Extração de DNA a partir do creme leucocitário:
1. O creme leucocitário foi digerido com 300µl de proteinase K em 10Mm Tris_HCl
pH 8.0, 10mM EDTA, 0,5% SDS, 0,01% Sarcozil e foi incubado a 56°C até a
completa lise das células.
2. Após a incubação, foi centrifugado por 5 minutos a 10.000rpm.
3. Retirado o sobrenadante e acondicionado em outro microtubo, foi a ele adicionado
300µl de fenol. Centrifugou-se por 10 minutos a 10.000rpm transferindo a fase
aquosa.
4. Em outro microtubo, à fase aquosa foram adicionados 200µl de solução de
clorofórmio + isopropanol e centrifugou-se por 10 minutos a 10.000rpm. A seguir
foi transferida a fase aquosa.
25
5. O produto da fase anterior foi acondicionado em um novo microtubo, sendo a ele
adicionado 3 vezes o volume de isopropanol e centrifugou-se por 10 minutos a
10.000rpm.
6. Descartado o sobrenadante, os sedimentos foram lavados com 200µl de etanol 70% e
centrifugados a 14.000rpm por 10 minutos.
7. Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos foram secos a 4
º
C em câmara
científica (INDREL® RC 330 – ED).
8. Os sedimentos foram hidrolisados com 50µl de H2O + RNAse e estocados a –20
º
C.
3.4.3.2. PCR
As reações de amplificação foram realizadas com o auxílio de um kit puRe Taq®
Ready-To-Go® PCR Beads (Amersham-Pharmacia-Biotech) que contém quando
reconstituído com 25µl de volume final, em temperatura ambiente: 1,5 unidades de Taq
DNA polimerase, 200µM de cada dNTP, 10mM Tris-HCl pH 9.0, 50mM KCL e 1,5
mM MgCl2 .
L.(L.) chagasi é determinada pelo par de primers (RV1/RV2) que amplifica uma
seqüência de 145 pares de base de uma região específica do minicírculo do kDNA de
L.(L.) donovani a uma temperatura de anelamento de 60
º
C.
1µl do primer RV1, 1µl do primer RV2, 5µl de DNA teste, 18µl de H2O PCR,
totalizando 25µl por microtubo.
No termociclador (Techne Progene®) a amplificação se deu nos ciclos que se seguem:
- Desnaturação: 1 ciclo de 5 minutos a 95°C
- Anelamento: 30 ciclos com 3 fases, a saber: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C e
30 segundos a 72°C.
- Extração: 1 ciclo de 5 minutos a 72°C.
Então, 5µl do produto resultante da PCR foi corado e disposto em gel de agarose
a 2%, juntamente com o controle positivo e o peso molecular (PM) de 100 pb. A seguir,
o gel foi levado a cuba de eletroforese por 40 minutos a 100v e 400Ω .
Os géis foram então visualizados em um transiluminador de ultravioleta a uma
longitude de onda de 302nm (Syngene®).
26
Os “primers” utilizados na PCR para a identificação do gênero Leishmania foram
Leish150 e Leish 152 que amplificam um seqüência conservada do minicírculo kDNA
120pb em temperatura de anelamento de 55
º
C.
3.5 TESTES ESTATÍSTICOS
Utilizou-se o teste de Correlação de Pearson com a finalidade de avaliar a
correlação entre o número de insetos e temperatura, e numero de insetos e precipitação
pluviométrica na planilha EXCEL.
A média geométrica de Williams (Haddow 1960) foi utilizada para o cálculo da
sazonalidade dos flebotomíneos capturados no rio Feio.
Na comparação entre os resultados obtidos no teste de Elisa, segundo
procedência, sexo e animais amostrados da população ou enviados à eutanásia, utilizou-
se o teste do χ
2
(SIEGEL 1975).
Foi calculada a absorbância relativa para poder comparar os valores obtidos dos
240 soros examinados. Essa absorbância foi calculada dividindo-se a média das
absorbâncias observadas em duplicata por animal pelo “cut off” da placa. Consideraram-
se soro reagentes aqueles soros cuja absorbância relativa foi maior do que 1,0, sendo
esse o valor do novo “cut off”.
Absorbância relativa = média da.absorbância do soro do animal
“Cut off” da placa
27
4. RESULTADOS
4.1 DADOS ENTOMOLÓGICOS
Os rendimentos mensais das capturas de flebotomíneos, com armadilha luminosa
automática tipo CDC em 5 pontos fixos de captura na zona urbana, estão dispostos na
Tabela 1.
Tabela 1- Número e espécies de flebotomíneos capturados, duas vezes por mês, com
armadilha automática luminosa, segundo local e sexo, no município de Mirandópolis
(área urbana) de junho de 2004 a maio de 2005.
Local Rua Pedro
II
Rua
Macoto
Ono
Rua
Bahia
Rua Antônio
Nozela
Rua São
João
Total
Espécie m f m f m f m f m f m f m/f
L. longipalpis
16 5 4 - - 1 - 2 2 1 22 9 31
N. neivai
- 1 2 2 - - - - - - 2 3 5
E. cortelezzii
- 2 - 3 - - - - - - - 5 5
B. avellari
1 - - - - - - - - - 1 - 1
Total 17 8 6 5 - 1 - 2 2 1 25 17 42
m= macho; f = fêmea
B. Brumptomyia; E. = Evandromyia; L. = Lutzomyia; N. = Nyssomyia.
Do total de flebotomíneos capturados na zona urbana,
houve um predomínio da
espécie Lutzomyia longipalpis com 73,8% dos espécimes, seguido de 11,9% de
Nyssomyia neivai, 11,9% de Evandromyia (Barrettomyia) cortelezzii e 2,4% de
Brumptomyia avellari.
Os rendimentos mensais das capturas de flebotomíneos, com armadilha luminosa
automática luminosa em 5 pontos fixos de captura na zona rural, estão dispostos na
Tabela 2.
28
Tabela 2 - Número de espécimes de flebotomíneos capturados, duas vezes por mês com
armadilha automática luminosa, segundo local e sexo, no município de Mirandópolis
(área rural) de junho de 2004 a maio de 2005.
Local Chácara
Madri
Sítio Sr
Paulo
Sítio Santa
Rosa
Clube do
Hospital
Rancho
Alegre
Total
Espécie m f m f m f m f m f m f m/f
L. longipalpis
- - - 1 19 3 - - - 1 19 5 24
B. avellari
- - 1 - 3 - 1 - 1 - 6 - 6
N. neivai
1 - 1 1 1 - - - - - 3 1 4
B. sp - - - 1 - - - 1 - - - 2 2
N. whitmani
- - - - - - 1 - 1 - 2 - 2
E. lenti
1 - 1 - - - - - - - 2 - 2
E. cortelezzii
- - - 1 - - - - - 1 - 2 2
Total 2 - 3 4 23 3 2 1 2 2 32 10 42
m = macho; f = fêmea
B. = Brumptomyia, E. = Evandromyia; L. Lutzomyia; N. = Nyssomyia.
Na zona rural, do total de flebotomíneos capturados, houve também um
predomínio de L. longipalpis com 57,1%, porém ocorreu uma maior riqueza de espécies
do que a observada na zona urbana. As demais espécies que ocorreram foram: B.
avellari (14,3%), N. neivai (9,5%) e B. sp., N. whitmani (4,8%), E. (Aldamyia) lenti
(4,8%) e E. cortelezzii (4,8%).
A relação macho/fêmea nas zonas urbana e rural foi de 2:1 (Figura 1)
29
Zona Urbana
60%
40%
macho
fêmea
Zona Rural
74%
26%
Figura 1 – Distribuição de flebotomíneos segundo sexo nas zonas urbana e rural do
município de Mirandópolis de junho de 2004 a maio de 2005.
Do conjunto de dados obtidos das capturas de flebotomíneos nos meios, urbano e
rural no município, os rendimentos mais expressivos ocorreram entre os meses de
novembro de 2004 e fevereiro de 2005.
O Coeficiente de correlação de Pearson entre nº de insetos obtidos do conjunto de
dados urbano e rural e as variáveis temperatura e índice pluviométrico encontra-se na
tabela 5.
As Figuras 2 e 3 ilustram a distribuição do número de flebotomíneos (somatória dos
ambientes urbano e rural) e do indicie pluviométrico e da temperatura média do
município de Mirandópolis.
Tabela 3 - Coeficiente de correlação de Pearson entre as variáveis.
Variável
Coeficiente de correlação
Nº de insetos e temperatura do ar 0,563298
Nº de insetos e precipitação
pluviométrica
0,514721
30
0
2
4
6
8
10
12
14
16
jun/04
jul/04
ago/04
set/04
out/04
nov/04
dez/04
jan/05
fev/05
mar/05
abr/05
mai/05
N de insetos
0
50
100
150
200
250
300
350
mm
n.º de insetos pluviosidade
Figura - 2. Distribuição mensal de flebotomíneos e precipitação pluviométrica nas
zonas urbana e rural do município de Mirandópolis no período de junho de 2004 a
maio de 2005.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
jun/04
jul/04
ago/04
set/04
out/04
nov/04
dez/04
jan/05
fev/05
mar/05
abr/05
mai/05
N.º de insetos
0
5
10
15
20
25
30
º C
n.º de insetos temperatura
Figura 3 - Distribuição mensal de flebotomíneos e temperatura nas zonas urbana e
rural do município de Mirandópolis no período de junho de 2004 a maio de 2005.
31
O número de insetos capturados no rio Feio no período de junho de 2004 a setembro
de 2005 está exposto na Tabela 4.
Tabela 4. Número de espécimes de flebotomíneos capturados uma vez por mês com
armadilhas automáticas luminosas, segundo local e sexo, no município de Mirandópolis,
às margens do Rio Feio, de junho de 2004 a setembro de 2005.
Local Varanda Mata Total
Mês/ Sexo
m
f m f m f m/f
Jun/04 2934 5286 … … 2934 5286 8220
jul/04 5 6 … … 5 6 11
ago/04 1602 9619 … … 1602 9619 11221
Set/04 4424 9279 … … 4424 9279 13703
Out/04 158 445 - 8 158 453 611
nov/04 10 42 8 28 18 70 88
dez/04 17 53 - 4 17 57 74
Jan/05 - 5 10 36 10 41 51
Fev/05 - - 12 15 12 15 27
mar/05 - - - - - - -
Abr/05 10 38 1 4 11 42 53
mai/05 18 298 3 9 21 307 328
Jun/05 7 14 0 3 7 17 24
jul/05 33 305 2 9 35 314 349
ago/05 65 260 0 3 65 263 328
Set/05 57 836 5 9 62 845 907
Total 9340 26486 41 128 9381 26614 35995
… capturas não realizadas; - capturas negativas
Dos 35.995 espécimes de flebotomíneos capturados no Rio Feio, um macho
pertence a Psathyromyia(Xiphomyia) hermanlenti; cinco exemplares, sendo três machos
e duas fêmeas, são de Brumptomyia avellari; o restante, ou seja, 35.989 são de N. neivai.
32
A relação macho/fêmea foi 1: 2,8 diferente da observada nas capturas da zona
urbana e rural.
O espécime de P. (X.) hermanlenti foi coletado em junho de 2004 na varanda e
os de B. avellari (manchos e fêmeas) também na varanda, em setembro de 2004.
A distribuição da média de Williams dos flebotomíneos por estação do ano está
representada na tabela 5.
Na figura 4, pode-se observar a distribuição de insetos capturados por mês no rio
Feio entre junho de 2004 e setembro de 2005
Tabela 5 – Média de Williams do número de flebotomíneos capturados por estação do
ano no rio Feio, no município de Mirandópolis, entre outubro de 2004 e setembro de
2005.
Estações Média de Williams
Primavera 159,85
Verão 11,33
Outono 76,29
Inverno 471,10
33
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
jun/04
jul/04
ago/04
set/04
out/04
nov/04
dez/04
jan/05
fev/05
mar/05
abr/05
mai/05
jun/05
jul/05
ago/05
set/05
insetos
0
50
100
150
200
250
300
350
mm
n.º de insetos pluviosidade
Figura 4 - Distribuição de insetos por mês, de junho de 2004 a setembro de 2005, no rio
Feio, Mirandópolis – SP.
4.2 DADOS DOS RESERVATÓRIOS
4.2.1 Teste ELISA
A prevalência de animais soro-reagentes para Leishmania pelo teste ELISA na
amostra obtida em 2005 no município de Mirandópolis foi de 60,8% (147/240). Destes,
68,5% eram da zona urbana e 31,5% da rural.
Na figura 5 observa-se a distribuição do percentual de animais soro-reagentes por
setor na área urbana do município.
34
65,2%
57,9%
70,6%
64,0%
82,4%
Setor 1
Setor 2
Setor 3
Setor 4
Setor 5
Figura –5. Percentual de cães soro-reagentes por setor na área urbana do município de
Mirandópolis, 2005.
Na Tabela 6 observa-se a distribuição de número e percentual de cães
examinados pelo teste ELISA segundo local de procedência.
Tabela 6. Número e percentual de cães examinados pelo teste ELISA segundo
procedência urbana ou rural do município de Mirandópolis, no ano de 2005.
Reagente Não reagente Total
Procedência
N % N % N %
Urbano 136 68 64 32 200 100,0
Rural 10 25 30 75 40 100,0
Total 146 60,8 94 39,2 240 100,0
χ
2
= 25,87; P ≤ 0,001.
A absorbância relativa entre os valores obtidos dos 240 soros examinados das
zonas urbana e rural estão demonstrados nas Figuras 6 e 7 respectivamente.
35
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
ANIMAIS
CUT OFF
Figura –6. Absorbância relativa por animal na zona urbana de Mirandópolis 2005
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 10203040
CUT OFF
Figura 7 - Absorbância relativa por animais e na zona rural, Mirandópolis 2005.
36
Na tabela 5, pode-se observar o número e percentual de animais nos quais foram
realizados testes sorológicos e sua classificação quanto a sintomas.
Tabela 5. Número e percentual de animais nos quais foram realizados testes sorológicos,
e suas condições clínicas, em outubro e novembro 2005, no município de Mirandópolis.
Sintomáticos* Assintomáticos Total
Sintomas
N % N % N %
Reagentes 41 28,1 105 71,9 146 100,0
Não reagentes 11 11,7 83 88,3 94 100,0
Total 52 21,7 188 78,3 240 100,0
* Animais que apresentavam pelo menos um sintoma dos descritos a seguir: emagrecimento, perda de
pelos, feridas, conjuntivite e unhas crescidas.
χ
2
= 9,03 (P ≤ 0,01)
4.2.2 PCR
Das 240 amostras de creme leucocitário obtidas, apenas 10% (24 amostras)
foram analisadas por PCR e o resultado encontra-se na tabela 6.
37
Tabela 6. Resultados do PCR para identificação do gênero Leishmania e de Leishmania
(L.) chagasi nas 24 amostras de creme leucocitário dos cães, segundo a absorbância
relativa.
Animal Absorbância
Relativa
ELISA*
PCR Gênero
Leishmania
PCR L (L.)
chagasi
Sinais e
Sintomas
1 3,453 Negativo Negativo Sintom. E,QP,C
11 1,619 Negativo Negativo assintomático
19 4,449
Positivo Positivo
Sintom:E,QP,U,F
37 2,403 Negativo Negativo Assintomático
43 2,836 Negativo Negativo Assintomático
55 1,825 Negativo Negativo Assintomático
56 1,597 Negativo Negativo Assintomático
63 2,655 Negativo Negativo Sintom:
E, QP
77 2,707
Positivo Positivo
Sintom:
E,QP,U,F C
83 0,788 Negativo Negativo Assintomático
95 4,019
Positivo Positivo
Assintomático
100 4,846 Negativo Negativo Sintom:
E QP U F C
103 4,718 Negativo Negativo Assintomático
116 0,302 Negativo Negativo Assintomático
118 0,779 Negativo Negativo Assintomático
120 0,550 Negativo Negativo Assintomático
139 1,106 Negativo Negativo Assintomático
151 1,047 Negativo Negativo Assintomático
163 6,469 Negativo Negativo Sintom
E QP U F
164 6,306
Positivo Positivo
Sintom:
E QP U F C
169 1,421 Negativo Negativo Assintomático
191 7,196 Negativo Negativo Assintomático
192 1,495 Negativo Negativo Assintomático
196 3,289 Negativo Negativo Sintom
QP, U.
*Absorbância relativa acima de 1,0 foi considerada soro-reagente.
Sintom.= Sintomático; E = emagrecimento; QP = queda de pelo; U = unhas crescidas; F = feridas; C =
conjuntivite.
38
5. DISCUSSÃO
A política de controle da LVA no Brasil tem como base o controle dos
reservatórios urbanos, com a identificação e sacrifício de cães soro positivos. Essa
política esbarra em alguns problemas, tais como, a demora entre a coleta do soro dos
animais e a execução dos testes sorológicos e o retorno desses resultados para os
municípios. Esse tempo é muito longo e os animais permanecem no ambiente infectando
flebotomíneos e disseminando o problema (REITHINGER, et al. 2002).
Outro ponto importante do controle da LVA no Brasil consiste no tratamento das
pessoas acometidas e o uso de inseticidas para o controle das formas adultas do vetor,
em área de transmissão, focando principalmente o domicílio e o peridomicílio de
residências onde há a confirmação de casos de LVA em humanos. Essas medidas, no
entanto, não foram suficientes para impedir o avanço da LVA no país (COSTA et al.,
2001).
Em 2001, o Ministério da Saúde convocou um grupo de consultores para avaliar
as medidas de controle que estavam sendo utilizadas e propor modificações. A
recomendação principal foi dar maior ênfase ao controle e identificação de vetores ao
invés do controle de reservatórios (COSTA et al., 2001).
Atualmente, o Ministério da Saúde preconiza a vigilância epidemiológica que
compreende a vigilância entomológica, de casos humanos e casos caninos. A análise da
situação epidemiológica indicará as ações de prevenção e controle a serem adotadas
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).
A situação de Mirandópolis, segundo a classificação proposta pelo Ministério da
Saúde, é de área com transmissão intensa, média de 7,4 casos por ano entre 2001 e 2005.
Em estudo realizado por KANETO (2001), o município de Mirandópolis
apresentava todos os elos da cadeia de transmissão da LVA, não havendo ainda registro
de caso humano.
Naquela ocasião KANETO contabilizou um total de 549 espécimes de L.
longipalpis que foram capturados durante um ano de coleta nas zonas urbana e rural.
39
No presente estudo, observamos apenas 84 flebotomíneos nas zonas urbana e
rural, destes 55 eram da espécie L. longipalpis, considerado o vetor da LVA. Essa baixa
densidade de flebotomíneos pode ser atribuída a diversos fatores dentre eles o
climatológico. Durante o período de coleta de flebotomíneos, a precipitação
pluviométrica apresentou um comportamento atípico. No verão que antecedeu o início
das capturas, as chuvas foram menos intensas do que a média histórica do período e o
outono foi mais chuvoso.
No presente estudo, as capturas iniciaram-se no inverno de 2004 que apresentou
precipitação pluviométrica maior do que a esperada, seguida de uma seca intensa. A
primavera foi também mais chuvosa e no verão de 2005,
a chuva se concentrou no
primeiro mês, seguido de uma menor precipitação nos demais meses do período
(ANEXO II). Talvez esse índice pluviométrico atípico tenha influenciado de forma
desfavorável o desenvolvimento das formas imaturas dos flebotomíneos e por isso, foi
baixo o rendimento observado nas capturas.
Outro fator que pode ter influenciado desfavoravelmente o rendimento das
capturas dos flebotomíneos foi que, durante os meses de novembro de 2004 a março de
2005, a Secretaria municipal de Saúde promoveu aspersão de permetrinas
(Alfacypermetrina, Fersol 400 pó molhável, Fersol 300 líquido), em 937 domicílios
(comunicação pessoal).
Apesar da baixa densidade, os flebotomíneos em geral, e em particular, o
Lutzomyia longipalpis, capturados nas zonas urbana e rural foram constantes durante
todo o ano e segundo o teste de correlação de Pearson, a temperatura e a precipitação
pluviométrica influenciaram positivamente na densidade desses insetos (r = 0,563298e r
= 0,514721 respectivamente). Há muito se conhece o comportamento do Lutzomyia.
longipalpis que tende a apresentar uma maior densidade nos períodos mais quentes e
úmidos. Isso tem sido constatado em diversas áreas endêmicas, como no Ceará
(DEANE, 1956), na Bahia (SHERLOCK e GUITTON, 1969), no Maranhão (REBELO,
2001), no Mato Grosso do Sul (GALATI et al., 1997) e no Rio de Janeiro (AGUIAR e
SOUCASAUX, 1984).
40
Observou-se no presente estudo que a razão sexual macho/fêmea de
flebotomíneos nas zonas urbana e rural foi menor do que a observada por KANETO em
2001, contabilizando 2:1 e 4:1, respectivamente.
No rio Feio, ocorreu uma acentuada densidade de N. neivai, sendo essa espécie
quase absoluta nas coletas. Observou-se também um melhor rendimento das armadilhas
que foram colocadas no rancho de pesca sobre as colocadas na mata, demonstrando
assim sua predileção por ambiente antrópico, sobretudo domicílio. Resultado semelhante
foi observado em Itupeva, região sudeste do Estado de São Paulo, por MAYO et al.
(1998) que à época era denominada de L. intermedia.
Recentemente, assumiu-se que a N. intermedia s. lat. é a mais importante vetora
da L.(V) braziliensis no Estado de São Paulo. Devido, principalmente, à sua
predominância e capacidade de adaptação em áreas antrópicas e no peridomicílio
(TOLEZANO, 1994).
Entre dezembro de 1950 e outubro de 1953, Forattini empreendeu estudo da
fauna flebotomínica no Estado de São Paulo, na região que se estende entre 21º e 24º
latitude sul e 51º e 53º longitude. Naquela ocasião, o pesquisador observou diversas
espécies, porém, chamou-lhe a atenção N. intermedia s. lat., por ter sido a mais
comumente encontrada nas capturas, com 63,39% da totalidade do material coletado e
esteve presente em 13 dos 15 municípios pesquisados (FORATTINI, 1954).
BARRETTO (1943) assinala que N. intermedia s. lat. parece ser a espécie de
maior dispersão no Estado de São Paulo, estando presente em 44 municípios dos 68 cuja
fauna foi estudada.
No presente estudo, ocorreram explosões de população de Nyssomyia neivai nos
meses de junho, agosto e setembro de 2004 que correspondem aos meses mais frios e
secos do ano. No ano seguinte, os melhores rendimentos das armadilhas também foram
nos meses correspondentes ao inverno, mostrando assim a preferência dessa espécie
pelos meses mais secos e frios. Resultados semelhantes foram observados por
CONSOLIN et al. (1990), MAYO et al. (1998) e CONDINO et al. (1998). Essa
sazonalidade apresentada por N. neivai se assemelha também à de N. whitmani na
Região Centro-Oeste (GALATI et al., 1996; 2006).
41
Apenas um indivíduo macho da espécie P. (X.) hermanlenti foi observado
durante as capturas, sendo esse o primeiro registro dessa espécie no Estado de São
Paulo.
O número de indivíduos de Nyssomyia neivai (13.703) capturados em uma única
armadilha automática luminosa durante uma noite de coleta também chama atenção, não
sendo encontrado outro registro de tamanha densidade. Possivelmente, esta espécie
esteja transmitindo a leishmaniose tegumentar nesta área, pois em 2004, um colega
pesquisador adquiriu leishmaniose tegumentar às margens do rio Feio no município de
Castilho, que fica a aproximadamente 60 km de Mirandópolis (informação pessoal).
A importância do cão como reservatório doméstico da leishmaniose visceral
americana no Brasil tem sido redimensionada. Além do homem, principalmente crianças
desnutridas, canídeos silvestres e marsupiais têm sido demonstrados como fonte de
infecção de Leishmania (Leishmania) chagasi para os flebotomíneos, o que faz ressaltar
a necessidade de se desenvolver pesquisas para esclarecer quais são de fato as principais
fontes de Leishmania (Leishmania) chagasi para a população humana (COSTA ,1997;
COSTA et al., 1999).
O ensaio imunoenzimático (ELISA) que utiliza como antígeno promastigota de
Leishmania (Leishmania) chagasi tem se mostrado um bom teste para ser utilizado em
estudo de prevalência canina, identificando animais infectados, por sua alta sensibilidade
(98%) e especificidade (100%). Porém, alguns autores relatam a ocorrência de reação
cruzada com outras enfermidades parasitárias comuns nos cães (ROSARIO et al.,2005)
ROSARIO et al (2005) analisaram 74 soros de animais com diferentes
enfermidades para testar a reação cruzada do ELISA. Naquela ocasião foram testados os
antígenos L.(L.) amazonensis e L. (L.) chagasi. Ocorreram reações cruzadas do antígeno
de L. (L.) amazonensis com Trypanosoma cruzi (25/40) e Dirofilaria immitis (6/10) e do
antígeno de L. (L.) chagasi com Trypanosoma cruzi (34/40) e Dirofilaria immitis (4/10)
e Babesia canis (1/24).
No presente estudo, a taxa de cães soro reagentes observada foi de 60,8% (146
animais soro reagentes em 240 examinados), estimada pelo teste ELISA. Essa taxa pode
ser considerada alta, quando comparada com a taxa de positividade encontrada por
42
KANETO, em 2001. Naquela ocasião, o pesquisador observou uma taxa de 1,7% de
animais positivos estimada pela imunofluorescência indireta (IFI). Fato semelhante foi
observado por SILVA et al. (2001), na região metropolitana de Belo Horizonte, onde
observou 64,6% de positividade contra 3,6% estimada pela Secretaria de Saúde de Belo
Horizonte entre 1994 e 1998.
Em relação à infecção de cães por Leishmania (Leishmania) chagasi não foi
encontrada diferença estatisticamente significativa entre os animais quanto ao sexo,
idade e raça, fato também observado por outros pesquisadores (NOLI, 1999;
BANDEIRA, 1999; KANETO, 2001). Mas quanto ao local de procedência dos cães,
observou-se um maior percentual de cães soro reagentes procedentes de área urbana em
relação aos da área rural, diferença esta, estatisticamente significativa (χ
2
= 25,87; P ≤
0,001). Isso pode ter ocorrido devido à maior disponibilidade de outras fontes de
alimentação para os flebotomíneos da zona rural e do ecletismo alimentar da espécie
Lutzomyia longipalpis.
Na área urbana também não foi observada diferença estatisticamente significativa
entre os setores para a prevalência da infecção canina pela Leishmania (Leishamania)
chagasi.
Dos animais soro reagentes observados, no presente estudo, 71,9% eram
assintomáticos (105 assintomáticos em 146 animais soro reagentes) similar ao observado
em Belo Horizonte por SILVA et al. em 2001 (68%) e no Rio de Janeiro, por
MARZOCHI et al. em 1985 (63,2%). Essa elevada prevalência de assintomáticos e por
outro lado, a alta taxa de animais soro reagentes é preocupante, uma vez que esses
animais podem servir de fonte de infecção para os flebotomíneos.
É ainda importante ressaltar que das amostras submetidas ao PCR que
apresentavam o resultado do ELISA acima do ponto de corte, apenas 20% (4/20) foram
positivas, isso pode ter acontecido devido a menor sensibilidade do teste quando
realizado a partir de creme leucocitário. REITHINGER et al. (2000; 2003), em pesquisa
realizada em área endêmica para leishmaniose tegumentar americana (LTA), detectaram
taxas de positividade de 8,5 a 9% em creme leucocitário e 16,7 a 17,4% em aspirado de
medula óssea. Outra explicação seria a de que no momento da coleta da amostra, o
43
animal não estivesse em parasitemia; ou ainda, é possível que alguns animais
apresentem sorologia positiva, mas devido a sua competência imunológica obtiveram
cura e estão livres do parasito (MORENO et al., 2002).
Assim, seria necessário um acompanhamento destes animais para melhor avaliar
sua real condição. Para manter este animal no ambiente, seria recomendável utilizar
coleiras impregnadas com deltametrina a 4% como medida individual de controle, tendo
em vista que se mostrou eficiente e conferiu prolongada proteção aos cães contra a
picada de flebotomíneos (KILLICK-KENDRICK
et al., 1997).
CAMARGO NEVES (2004) promoveu em Andradina um estudo de coorte com
a finalidade de verificar a eficiência da utilização desta coleira em nível populacional.
Os resultados obtidos na pesquisa convergem para uma efetividade da utilização da
coleira associada a outras medidas de controle.
Embora a transmissão da L. (L.) chagasi ocorra principalmente por meio da
picada de L. longipalpis, outros mecanismos podem estar envolvidos, tendo em vista o
baixo índice de infecção natural pelo agente observado nesses dípteros em alguns paises
da América do Sul, como na Venezuela (0,28%) (FELICIANGELI et al., 1999) e
Colômbia (0,29 – 0,9%) (CORREDOR et al., 1989; FERRO et al., 1995). No Brasil,
excepcionalmente, LAINSON (1985) encontrou uma taxa de infecção natural de 7,1%
em Santarém no Para. Porém, outros pesquisadores encontraram apenas valores entre 0,2
e 0,5% (SHERLOCK, 1999; RYAN et al., 1984).
Em Mirandópolis, pudemos observar, com freqüência, carrapatos em cães, os
quais foram identificados como Rhipicephalus sanguineus. Segundo relato de
funcionários do serviço de controle de vetores do município, tem sido observado grande
quantidade de carrapatos em cães e em paredes das casas na cidade, com diversas
reclamações de moradores. Vale ainda ressaltar que o Rhipicephalus sanguineus é o
hospedeiro invertebrado da Babesia canis (FORTES, 1997).
Na ausência dos flebotomíneos, a transmissão da LVA poderia ser mantida por
outros ectoparasitos de cães, particularmente a pulga Ctenocephalides felis felis e o
carrapato Rhipicephalus sanguineus devido à freqüência e intensidade com que ambos
ocorrem em cães (COUTINHO et al., 2005).
44
Segundo COUTINHO et al. (2005), em 1930, Blanc e Caminopetros
demonstraram experimentalmente a capacidade do Rhipicephalus sanguineus de se
infectar e manter a Leishmania. Nesse experimento os pesquisadores inocularam ratos
com macerado de carrapatos e os animais desenvolveram a leishmaniose. No Brasil,
SHERLOCK (1964), encontrou formas morfologicamente semelhantes a Leptomonas
em carrapatos, mas não pôde observar o desenvolvimento das formas flageladas no
interior do intestino desses artrópodes. COUTINHO et al. (2005), em experimento,
conseguiram infectar hamsters com a inoculação por via intraperitonial e por via oral de
macerado de carrapatos provenientes de cães sintomáticos para LVA.
Outro fator que leva a suspeitar de outros mecanismos de transmissão é a alta
prevalência de cães soro-reagentes e o baixo índice de infecção humana como foi
observado no presente estudo e em Belo Horizonte em 2001(SILVA et al. 2001).
O objetivo da pesquisa por PCR, no creme leucocitário dos cães, no presente
estudo foi identificar a espécie de Leishmania circulante em Mirandópolis, este objetivo
foi alcançado com a identificação da Leishmania. (Leishmania) chagasi, fato que está de
acordo com o observado por KANETO em 2001. Mas não se pode descartar a presença
de outras espécies de Leishmania no município, tendo em vista a elevada freqüência nas
margens do rio Feio de Nyssomyia. neivai, suspeito vetor da Leishmania (Viannia)
braziliensis. Além disso, TOLEZANO et al. (1999), em estudo conduzido em
Araçatuba, identificou, por PCR, a presença de duas espécies de Leishmania circulando
no município Leishmania (Leishmania) chagasi e Leishamania (Leishmania)
amazonensis. A proximidade de Mirandópolis com Araçatuba e o constante trânsito de
animais e pessoas entre os municípios, talvez, possa favorecer a presença de Leishmania
(Leishmania) amazonensis, no município estudado. Por outro lado, o encontro de
Lutzomyia longipalpis com infecção natural por esta Leishmania por SAVANI et al.
(2005) no Mato Grosso do Sul, Estado vizinho ao de São Paulo reforça este ponto de
vista.
45
6. CONCLUSÕES
Considerando:
• A presença de Lutzomyia longipalpis, mesmo em baixa densidade,
durante todo o ano;
• A alta prevalência de cães soro reagentes (60,8%);
• A alta prevalência de cães assintomáticos (71,9%);
• A circulação no município de Leishmania (Leishmania) chagasi.
Podemos concluir que, elos da cadeia de transmissão da LVA se mantêm no
município, tanto em área urbana como rural, apesar da diminuição do número de casos
humanos observada entre os anos de 2004 (12 casos) e 2005 (5 casos).
A elevada densidade de Nyssomyia neivai no rio Feio, espécie considerada como
suspeita de transmitir a leishmaniose tegumentar na região do Planalto do Estado de São
Paulo, aponta para o risco de transmissão da doença na área entre seus freqüentadores
noturnos, sobretudo nos períodos mais secos do ano, quando coincide com a abertura do
período de pesca.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Aparentemente as aspersões de inseticida que foram realizadas no município
podem ter influenciado na redução da densidade de Lutzomyia longipalpis. Porém seria
importante um constante monitoramento entomológico para melhor utilização dos
recursos disponíveis.
A baixa freqüência de Lutzomyia longipalpis durante o período de estudo e por
outro lado, a prevalência elevada da infecção canina no município, sugere que a maciça
infecção na população canina antecedeu ao período deste estudo ou outros mecanismos
de transmissão possam estar atuando. Nesse sentido, o relato pelos funcionários do
Centro de Controle de Vetores do município da elevada infestação nos cães pelo
46
Rhipicephalus sanguineus, associado à capacidade destes carrapatos de se infectarem
experimentalmente pela Leishmania, suscitam a necessidade de investigações sobre o
possível envolvimento desses artrópodes na epidemiologia da LVA. O Rhipicephalus
sanguineus pode estar atuando como vetor mecânico na transmissão da Leishmania
(Leishmania) chagasi entre os cães ou influenciando nos resultados dos testes
sorológicos, uma vez que este carrapato é o hospedeiro intermediário da Babesia. canis,
agente da babesiose em cães, que pode apresentar reação cruzada no ELISA para
Leishmania.
47
8. REFERÊNCIAS
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57
Anexo I - Localização do município de Mirandópolis, no Estado de São Paulo.
58
Anexo II - Dados Climatológicos
0
5
10
15
20
25
30
jan
fev
mar
abr
mai
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
C
2004 2005 Média Histórica
Fonte: CIIAGRO, 2006
Gráfico 1 – Temperatura média nos anos de 2004, 2005 e média histórica dos últimos 5
anos.
59
0
50
100
150
200
250
300
350
jan
fev
mar
abr
mai
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
mm
2004 2005 Série histórica
Fonte: CIIAGRO, 2006
Gráfico 2 . Precipitação pluviométrica série histórica, janeiro de 2000 a dezembro de
2005 e os anos de 2004 e 2005, Mirandópolis SP.
60
Anexo III - Localização dos pontos de captura de flebotomíneos nas áreas urbana
e rural do município de Mirandópolis.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Zona Urbana
1 - r: Mizael Alves
2 - r: Macoto Ono
3 - r: Bahia
4 - r: Antônio Nozela
5 - r: São João
Zona Rural
1 - Chácara Madri
2 - Sítio do Sr. Paulo
3 - Sítio Santa Rosa
4 - Clube do Hospital
5 - Rancho Ale
g
re
61
Anexo IV - Localização por setores dos pontos de coleta de sangue dos cães no
município de Mirandópolis SP.
.
S 1
S 2
S3
S 4
S 5
62
Anexo V - Localização do rio Feio em relação à sede do município de
Mirandópolis
.
Fonte: Google Earth, 2006
63
Anexo VI - Ficha para identificação dos cães.
Proprietário: _______________________________________________________
Endereço: __________________________________________________________
Animal:______________ Idade: ________________ Sexo: ___________________
Raça: ________________
Sintomas Sim Não
Emagrecimento
Perda de pelo
Unhas crescidas
Feridas
Conjuntivite
Livros Grátis
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