( PDF ) Evidências da participação da anexina A2 na interação entre a trans-sialidase inativa do Trypanosoma cruzi e a célula endotelial

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Fernanda Diaz Fajardo

Evidências da participação da anexina A2 na interação entre

a trans-sialidase inativa do Trypanosoma cruzi e a célula

endotelial

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFISICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2006

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Evidências da participação da anexina A2 na

interação entre a trans-sialidase inativa do

Trypanosoma cruzi e a célula endotelial

Fernanda Diaz Fajardo

Dissertação de Mestrado submetida ao programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas (Biofísica) da Universidade Federal do Rio de

Janeiro visando a obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas

(Biofísica).

Orientadores: Prof. José Osvaldo Previato

Prof

. Adriane Regina Todeschini

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

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Evidências da participação da anexina A2 na interação entre a trans-

sialidase inativa do Trypanosoma cruzi e a célula endotelial

Fernanda Diaz Fajardo

Orientadores: Prof. Dr. José Osvaldo Previato / Prof

. Dr

. Adriane Regina Todeschini

Dissertação de Mestrado submetida ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a

obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).

Banca Examinadora:

Prof. Dr. José Osvaldo Previato

Professor Titular, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS – UFRJ

Orientador

Prof. Dr. Ronaldo da Silva Mohana Borges

Professor Adjunto, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS – UFRJ

Presidente

Prof. Dr. George Alexandre dos Reis

Professor Titular, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS – UFRJ

Prof

. Dr

Leila Maria Lopes Bezerra

Professor Adjunto, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Departamento de

Biologia Celular e Genética - UERJ

Prof

. Dr

Cerli Rocha Gattass

Professor Adjunto, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS – UFRJ

Revisor e Suplente

Prof

. Dr

Ligia Maria Torres Peçanha

Professor Adjunto, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Goes, CCS – UFRJ

Suplente Externo

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

FICHA CATALOGRÁFICA

Fajardo, Fernanda Diaz

Evidências da participação da anexina A2 na interação entre a trans-sialidase inativa do

Trypanosoma cruzi e a célula endotelial / Fernanda Diaz Fajardo. Rio de Janeiro: UFRJ

/ IBCCF, 2006.

xvii, 80f.: il.: 31cm.

Orientadores: José Osvaldo Previato

Adriane Todeschini

Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Pós-graduação em Ciências Biológicas

(Biofísica), 2006.

Referências Bibliográficas: f 73-80.

1. trans-Sialidase. 2. Trypanosoma cruzi. 3. Doença de Chagas. 4. Anexina A2.

I. Previato, José Osvaldo

II. Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Biofísica Carlos Cha

as Filho.

iii

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Glicobiologia do Programa de

Parasitologia e Biologia Celular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da

Universidade Federal do Rio de Janeiro sob a orientação dos professores José Osvaldo

Previato e Adriane Regina Todeschini, na vigência dos auxílios concedidos pelo Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq), Coordenadoria de Aperfeiçoamento de

Pessoal do Ensino Superior (CAPES) e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a

Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

Dedico esta dissertação aos meus pais, Denise e Fernando.

“...ainda que eu falasse a língua dos homens e falasse a língua dos anjos, sem amor, eu nada seria...”

Agradecimentos:

→ Aos meus pais, responsáveis por tudo de bom que tem acontecido na minha vida, me

incentivando em todas as minhas escolhas, sempre prontos a me ajudar.

→ A vó Mara, por sempre ter estado ao meu lado, em todos os momentos. Muito mais que uma

vó.

→ A vó Lygia, que apesar da distância, está sempre presente.

→ Ao meu namorado, Felipe, por ter passado comigo por tantos momentos, sempre com muito

carinho e compreensão, e por estarmos começando, juntos, esta nova fase.

→ Aos meus tios e primos, Flávia, Heleno, Kklo, Lili, Kaka, Gabi e Felipe, por todo carinho e

confiança.

→ A Bela e André FM, amigos de faculdade, mestrado, 15 minutos...

→ Aos meus amigos, Marcela, Carol, Vinicius, João, Diogo, Tchu, Ada, Ana, Carla, Gabiru,

Mari, Vivi, Titi, Thadeo, Fê e Leo por tornarem o caminho mais agradável.

→ A amiga Mônica Faragasso pela ajuda, sempre, e pela amizade.

→ Ao Wagner, que apesar de estar longe, sempre será meu chefe “quirido”!!!!!!

→ A minha chefusca linda, Adriane, por ter dado sentido a muitas coisas, em momentos muito

cruciais. Por ter sido além de orientadora, amiga e não desistir dessa função nunca!!!

→ A Prof. Lucia, pelo exemplo profissional, pela ajuda constante, principalmente nesta última

fase e por todo apoio e carinho.

→ Ao Prof. José Osvaldo pela confiança e oportunidade de ser sua aluna.

→ Ao pessoal da Fiocruz, sempre solícitos, em especial ao Prof. Richard por todo carinho e

ensinamentos e ao amigo Frank, por toda ajuda e amizade.

→ Aos amigos do laboratório de Glicobiologia.

Resumo:

Evidências da participação da anexina A2 na interação entre a trans-sialidase inativa

do Trypanosoma cruzi e a célula endotelial

Fernanda Diaz Fajardo

Orientadores: Prof. Dr. José Osvaldo Previato e Prof

. Dr

. Adriane Regina Todeschini

A interação entre o Trypanosoma cruzi (agente etiológico da doença de Chagas) e

células do hospedeiro mamífero é iniciada através do contato entre moléculas presentes na

superfície do parasita e do hospedeiro. Previamente, nós demonstramos que uma forma

enzimaticamente inativa da trans-sialidase do T. cruzi (TSi) atua como uma lectina,

ligando-se e desencadeando ativação, contato-dependente, da via de NF-κB em células

endoteliais. A TSi aumenta a expressão de moléculas de adesão e salva as células

endoteliais da morte celular por apoptose, através do aumento da expressão da proteína

anti-apoptótica Bcl-2. Nesta tese, nós demonstramos que a TSi regula a invasão da célula

hospedeira pelo parasita e obtivemos resultados sobre um dos possíveis receptores

envolvidos na interação entre a TSi e células de medula óssea humana (HBMEC). Usando

cromatografia de afinidade, nós demonstramos que a TSi se liga especificamente a uma

proteína de 36 kDa presente no extrato celular de HBMEC. O seqüênciamento de

aminoácidos de peptídeos trípticos, seguido da análise por espectrometria de massas

(ionização por electrospray / ION TRAP) mostrou um co-receptor para TSi que foi

identificado como anexina A2 humana, com níveis de confiança de aproximadamente 100

%. Experimentos de citometria de fluxo demonstraram que anticorpos anti-anexina A2

marcaram a superfície externa das células HBMEC e a pré-incubação dessas células com

TSi bloqueou esta ligação. Além disso, anticorpos anti-anexina A2 diminuíram a ligação da

TSi-PE às células HBMEC. Para confirmar a interação TSi-anexina A2, nós usamos ensaio

imunoenzimático (ELISA). Juntos, estes resultados fortemente sugerem que TSi interage

com anexina A2 presente na superfície das células endoteliais. A habilidade da TSi em

reconhecer anexina A2, uma molécula abundantemente expressa em células endoteliais,

pode mediar a injúria vascular observada durante a infecção pelo T. cruzi.

Palavras Chave: trans-sialidase; Trypanosoma cruzi; doença de Chagas; anexina A2.

vii

Abstract:

Evidences of the participation of the anexina A2 in the interaction between trans-

sialidase inactive of the Trypanosoma cruzi and the endotelial cell

Fernanda Diaz Fajardo

Orientadores: Prof. Dr. José Osvaldo Previato e Prof

. Dr

. Adriane Regina Todeschini

Communication between Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas’

disease) and mammalian cells is initiated by contact of parasite surface and cognate host

cell molecules. Previously, we have demonstrated that an enzymatically inactive form of T.

cruzi trans-sialidase (iTS) behaves as a lectin which binds and triggers contact-dependent

activation of NF-κB pathway on endothelial cells. iTS increases expression of adhesion

molecules and rescues endothelial cells from apoptosis by over expression of Bcl-2. In this

work we demonstrated that iTS up regulates parasite invasion of host cells, and we aimed

at identifying the receptor(s) involved in the interaction between iTS and human bone

marrow endothelial cells (HBMEC). Using affinity purification, we demonstrate that iTS

specifically binds to a 36 kDa protein from HBMEC lysate. Amino acid sequencing of

tryptic peptides, followed by analysis by mass spectrometry (electron spray ionization/ion

TRAP), showed an iTS co-receptor which was identified as human annexin A2 with a

confidence level approaching 100 %. Flow cytometry studies demonstrated that anti-

annexin A2 antibodies prominently stained the external surface of HBMEC and pre-

incubation of these cells with iTS abrogated the binding. Furthermore, antibodies against

annexin A2 decreased iTS-PE binding to HBMEC. To confirm iTS-annexin A2 binding,

we used enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA). Together, these results strongly

suggest that iTS interacts with annexin A2 on the endothelial cell surface. The ability of

iTS to recognize annexin A2, a molecule abundantly expressed on endothelial cells, may

mediate vascular injury observed during T. cruzi infection.

Keywords: trans-sialidase; Trypanosoma cruzi; Chagas disease; annexin A2.

viii

Índice

Lista de siglas e abreviaturas............................................................................................xii

Lista de figuras...................................................................................................................xvi

1 - Introdução.......................................................................................................................01

1.1. Doença de Chagas e o Trypanosoma cruzi......................................................01

1.1.1. Principais conceitos..........................................................................01

1.1.2. Fase aguda........................................................................................02

1.1.3. Fase crônica......................................................................................03

1.1.4. Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi...............................................04

1.1.4.1. Hospedeiro vertebrado..................................................................04

1.1.4.2. Hospedeiro invertebrado...............................................................05

1.1.5. Tratamento.......................................................................................06

1.1.6. Interação parasita/célula hospedeira.................................................07

1.2. trans Sialidase (TS) ......................................................................................10

1.2.1. Definição e estrutura........................................................................10

1.2.2. Funções biológicas...........................................................................14

1.2.3. Interação TSi / célula endotelial.......................................................15

1.3. Anexinas.........................................................................................................17

1.3.1. Características gerais........................................................................17

1.4. Anexina A2....................................................................................................18

1.4.1. Estrutura e definição.........................................................................18

1.4.2. Função da anexina A2t.....................................................................21

2 – Objetivos.........................................................................................................................24

3 – Metodologia....................................................................................................................25

3.1. Linhagem de células endoteliais de medula óssea humana

(HBMEC)................................................................................................................25

3.2. Obtenção da TSi..............................................................................................25

3.3. Biotinilação da TSi..........................................................................................26

3.4. Mucina..............................................................................................................27

3.5. Parasitas...........................................................................................................27

3.6. Avaliação do efeito da TSi na adesão de formas tripomastigotas do T. cruzi

às células HBMEC..................................................................................................28

3.7. Avaliação do efeito da TSi na infecção de células HBMEC por formas

tripomastigotas do T. cruzi e no número de parasitas liberados por estas

células.....................................................................................................................28

3.8. Análise do efeito da TSi na adesão de formas tripomastigotas do T. cruzi

às células HBMEC..................................................................................................29

3.9. Obtenção de extrato total de HBMEC..........................................................29

3.10. Obtenção de anticorpos policlonais contra a TSi.......................................30

3.11. Isolamento do(s) ligante(es) para TSi na superfície de células

HBMEC...................................................................................................................30

3.12. Eletroforese bidimensional (2D)..................................................................31

3.13. Eletroforese unidimensional (1D)...............................................................33

3.14. Digestão enzimática em gel..........................................................................34

3.15. Identificação das proteínas por espectrometria de

massas...................................................................................................................36

3.16. Confirmação da interação entre a TSi e anexina A2 através de

ELISA...................................................................................................................37

3.17. Ensaio de competição entre anti-anexina A2 e TSi..................................38

3.18. Análise estatística........................................................................................39

4 - Resultados......................................................................................................................40

4.1 Obtenção da TSi............................................................................................40

4.2 Estímulo das células HBMEC com TSi antes da infecção com T. cruzi

aumenta adesão, infecção e número de parasitas liberado pelas células.......40

4.3 TSi compete com tripomastigotas do T. cruzi por sítios de ligação às células

HBMEC................................................................................................................42

4.4 Isolamento do(s) ligante(es) para TSi nas células HBMEC estimuladas com

a enzima...............................................................................................................44

4.5 Análise dos ligantes da TSi por espectrometria de massas.......................47

4.6 Análise da interação entre a TSi e anexina A2t por ELISA......................55

4.7 TSi se liga a anexina A2 na superfície das células HBMEC......................56

5 - Discussão........................................................................................................................59

6 - Conclusões......................................................................................................................71

7 – Perspectivas...................................................................................................................72

8 – Referências bibliográficas............................................................................................73

Lista de siglas e abreviaturas:

→ 1D – Unidimensional

→ 2-AEP – Ácido 2-aminoetilfosfórico

→ 2D – Bidimensional

→ Anexina A2d – Anexina A2 dimérica

→ Anexina A2m – Anexina A2 monomérica

→ Anexina A2t – Anexina A2 tetramérica

→ β

GPI – β

glicoproteína I

→ BSA – Albumina de soro bovino

→ Ca

– Íon cálcio

→ CD - Cluster of diferentiation

→ CHAPS – 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato

→ CO

– Dióxido de carbono

→ DMEM – Dulbecos modified eagles medium

→ DMPC – Dimetil pimelimidato dihidroclorido

→ DTT – Ditiotreitol

→ E. coli – Escherichia coli

→ EA-PE – Estreptavidina-ficoeritrina

→ EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético

→ ELISA – Enzyme-linked immunosorbant assay

→ ESI-MS – Electrospray ionization – mass spectrometry

→ GalNAc – N-acetil galactosamina

→ Galp – Galactopiranose

xii

→ GIPL – Glicoinositolfosfolipídio

→ GlcN – N-glucosamina

→ GPI – Glicosilfosftidilinositol

→ HBMEC – Célula endotelial de medula óssea humana

→ HCl – Ácido clorídrico

→ HCMV – Citomegalovírus humano

→ HEPES – N-[hidroxietil] piperazina-N’-[2ácido etanosulfônico]

→ His – Histidina

→ HRP – Peroxidase

→ ICAM-1 – Molécula de adesão intercelular-1

→ IL-1β – Interleucina 1β

→ IL-6 – Interleucina 6

→ IL-8 – Interleucina 8

→ LPS – Lipopolissacarídeo

→ Lys – Lisina

→ m-Ins – Mio-inositol

→ Man – Manose

→ MS/MS – Mass spectrometry-mass spectrometry

→ MucY – Mucina de Trypanosoma cruzi cepa Y

→ NaCl – Cloreto de sódio

→ NaN

– Azida

→ NaOH – Hidróxido de sódio

→ NCBI – National Center for Biotechnology Information

→ Neu5Ac – Ácido N-acetil neuramínico

xiii

→ NF-κB – Fator nuclear κB

→ NH

Cl – Cloreto de amônia

→ Ni

– Íon Níquel

→ NO – Óxido Nítrico

→ NOSi – Óxido Nítrico sintase induzida

→ NP40 – Nonidet P40

→ PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida

→ PBS – Tampão fosfato de sódio

→ PBST – Tampão fosfato de sódio-Tween

→ PE – Ficoeritrina

→ Pept – Peptídeo

→ PFA – Paraformaldeído

→ PI – Ponto isoelétrico

→ PM – Peso molecular

→ PMSF – Fluoreto de fenilmetilsulfonila

→ Prob – Probabilidade

→ RPMI – Meio Roswell Park Memorial Institute

→ S.D.M. – Desvio padrão da média

→ SAPA – shed acute-phase antigen

→ SDS – Dodecilsulfato de sódio

→ SDS-PAGE – Eletroforese em gel de acrilamida na presença de SDS

→ SFB – Soro fetal bovino

→ T. cruzi – Trypanosoma cruzi

→ TB – Terrific broth

→ TCA – Ácido Tricloroacético

xiv

→ TL-PBS – Tampão de lavagem- Tampão fosfato de sódio

→ TLR-4 – Toll like receptor 4

→ TN-C – Tenascina C

→ TNF-α – Fator de necrose tumoral α

→ tPA – Ativador de plasminogênio tecidual

→ Tris – (Tris hidroximetil)-aminometano

→ TS – trans-Sialidase

→ TSa – trans-Sialidase ativa

→ TSi – trans-Sialidase inativa

→ TSi-b – trans-Sialidase-biotina

→ TSi-PE – trans-sialidase inativa-ficoeritrina

→ Tyr – Tirosina

→ VCAM-1 – molécula de adesão vascular-1

→ VERO – Célula epitelial de rim de macaco verde africano

Lista de figuras:

Figura 01: Foto ilustrativa de um tripomastigota no momento em que invade a célula

hospedeira.............................................................................................................05

Figura 02: Representação esquemática das formas evolutivas do T. cruzi e seus

Hospedeiros...........................................................................................................06

Figura 03: Desenho esquemático das várias fases da interação do T. cruzi com a célula do

hospedeiro vertebrado............................................................................................09

Figura 04: Representação esquemática dos 3 principais glicoconjugados da superfície do T.

cruzi ......................................................................................................................10

Figura 05: Representação da estrutura protéica da TS...........................................................12

Figura 06: Representação esquemática da organização estrutural da anexina A2.................19

Figura 07: SDS-PAGE da TSi do T. cruzi..............................................................................40

Figura 08: Adesão e invasão de tripomastigotas após estímulos............................................42

Figura 09: Competição entre a TSi e formas tripomastigotas do T. cruzi.............................43

Figura 10: Eletroforese bidimensional do material ligado à coluna de afinidade com

TSi.........................................................................................................................45

Figura 11: Eletroforese bidimensional do material ligado à coluna de afinidade em coluna

controle (sem TSi).................................................................................................46

Figura 12: Eletroforese unidimensional do material eluido após cromatografia de afinidade

com TSi e cromatografia de troca iônica com coluna Mono-Q............................47

xvi

Figura 13: Representação da seqüência peptídica (K)GLGTDEDSLIEIIcSR(T) identificada

através da espectrometria de massas.....................................................................49

Figura 14: Representação da seqüência peptídica (K)TDLEKDIISDTSGDFR(K)

identificada através da espectrometria de massas.................................................50

Figura 15: Representação da seqüência peptídica (K)TPAQYDASELK(A) identificada

através da espectrometria de massas.....................................................................51

Figura 16: Representação da seqüência peptídica (R)TNQELQEINR(V) identificada através

da espectrometria de massas.................................................................................52

Figura 17: Representação da seqüência peptídica (K)TPAQYDASELK(A) identificada

através da espectrometria de massas......................................................................53

Figura 18: Representação da seqüência peptídica (K)DIISDTSGDFR(K) identificada através

da espectrometria de massas..................................................................................54

Figura 19: Representação esquemática dos 6 peptídeos identificados como anexina A2....55

Figura 20: Avaliação da interação entre a TSi e anexina A2 por ELISA...............................56

Figura 21: Demonstração entre a TSi e a anexina A2 na superfície das células HBMEC

através de citometria de fluxo................................................................................57

Figura 22: Resumo de um possível mecanismo de ligação e sinalização induzidas por

anticorpos circulantes anti-β

GPI em células endoteliais......................................65

Figura 23: Representação esquemática do modelo proposto para a sinalização desencadeada

pela interação TSi / anexina A2.............................................................................66

Figura 24: Representação esquemática da invasão do T. cruzi..............................................68

Tabela 01: Proteínas identificadas por MS/MS como ligantes da TSi...................................48

xvii

Fajardo FD INTRODUÇÃO

1.1 Doença de Chagas e o Trypanosoma cruzi

1.1.1 Principais conceitos

A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é causada pelo hemoflagelado

Trypanosoma cruzi, representando, segundo dados da Organização Mundial de Saúde, a quinta

maior doença tropical em morbidade (WHO, 2002). Aproximadamente, 20 milhões de pessoas

estão contaminadas na América Latina (WHO, 2002) e 25 % da população desta área geográfica

corre risco de adquirir a doença (Moncayo, 2003).

A doença de Chagas foi descoberta pelo médico sanitarista Dr. Carlos Justiniano Ribeiro

das Chagas em 1909. Este brasileiro, além de descobrir a doença, descreveu praticamente todos

os seus aspectos biológicos e clínicos. Carlos Chagas realizava uma campanha contra a malária,

uma doença que atingia operários na construção de um trecho da Estrada de Ferro Central do

Brasil, ao norte de Minas Gerais quando, ao fazer exames em uma menina doente, encontrou

microrganismos em seu sangue. Ao examinar, posteriormente, as fezes de insetos e o sangue de

animais mamíferos existentes na região, constatou também a presença de microrganismos

semelhantes. Dessa forma, Carlos Chagas pode descrever o agente causador, o vetor e o modo de

transmissão da doença, como também comprovar a existência de vertebrados mamíferos

considerados reservatórios silvestres e domésticos do parasita, evidenciando os aspectos básicos

da epidemiologia da doença (Elizari, 1999).

A doença de Chagas, primitivamente uma zoonose, passou a representar um problema de

saúde humana a partir da domiciliação dos triatomíneos, os insetos vetores da infecção (Brener et

al., 2000).

Fajardo FD INTRODUÇÃO

A forma de transmissão mais importante é a via vetorial (80 a 90 %) mas outras vias são

possíveis, como a via transfusional (5 a 20 %) e a via congênita (0,5 a 8 %). As demais vias são

raras, não representando importância significativa em saúde pública (Brener et al., 2000).

A infecção pelo T. cruzi é caracterizada por 2 fases, a fase aguda que ocorre logo após a

infecção e a fase crônica que ocorre após um período de latência que pode durar vários anos. As

lesões causadas durante a fase crônica afetam irreversivelmente órgãos do sistema nervoso

periférico, digestivo e principalmente o coração, onde fibras musculares são rompidas causando

insuficiência e arritmia cardíacas que podem levar à morte (Brener et al., 2000).

1.1.2 Fase aguda

No local da picada, a área torna-se vermelha e endurecida, constituindo o chamado

chagoma, nome dado à lesão causada pela entrada do T. cruzi. Quando esta lesão ocorre próxima

aos olhos, chama-se de sinal de Romaña. O chagoma acompanha-se em geral de ínguas próximas

à região (Dias et al., 1956).

Após um período variável de incubação (mas de não menos que uma semana) sem

sintomas, ocorre febre, ínguas por todo o corpo, inchaço do fígado e do baço e uma vermelhidão

no corpo semelhante a uma alergia, que persiste por pouco tempo. Nos casos mais graves da fase

aguda, podem ocorrer inflamação do coração com alterações no eletrocardiograma do paciente e

aumento do número de batimentos por minuto; além de outros problemas clínicos como a

inflamação das meninges e sintomas de encefalite. A morte súbita é rara, mas quando ocorre é

decorrência da inflamação do coração ou do cérebro. No entanto, na maioria dos casos, mesmo

sem tratamento, a doença fica mais branda e os sintomas desaparecem após algumas semanas,

desaparecendo o quadro febril e a parasitemia. Em paralelo, decrescem os níveis de

Fajardo FD INTRODUÇÃO

imunoglobulinas (Ig) de classe M e sobem os níveis de IgG. Esses elementos praticamente

definem a transição para a doença de Chagas crônica (Brener et al., 2000).

1.1.3 Fase crônica

A maioria dos casos agudos não tratados evolui para a chamada fase crônica

indeterminada. Consiste na presença de infecção (revelada por sorologia e/ou métodos

parasitológicos indiretos - xenodiagnóstico), associada à ausência de sintomatologia e à

normalidade dos exames clínicos, eletrocardiográficos e radiológicos (área cardíaca, esôfago e

cólon). A forma indeterminada, também conhecida como laboratorial, assintomática ou

subclínica é a mais freqüente forma clínica na população das áreas endêmicas e o prognóstico a

médio e longo prazos é excelente. No entanto, entre 40 e 50 % dos casos, a forma indeterminada

pode persistir por toda vida do indivíduo (Brener et al., 2000).

A evolução da fase crônica indeterminada para a fase crônica é uma possibilidade que

ocorre, em geral de maneira insidiosa nas áreas endêmicas em aproximadamente 2 a 3 % dos

casos por ano, em geral entre 10 e 28 anos após a fase aguda, resultando em comprometimento

cardíaco e/ou do trato gastrointestinal. Os fatores envolvidos nessa evolução não estão

estabelecidos, podendo estar relacionados ao esforço físico, nutrição, raça, idade, intercorrências

clínicas como a cardioangioesclerose, a hipertensão arterial, o diabetes mellitus e, até mesmo,

pelo uso de medicamentos.

Na fase crônica da doença as manifestações clínicas são: lesões do músculo do coração,

resultando em batimentos cardíacos descompassados (arritmias) e perda da capacidade de

“bombeamento” até causar desmaios, podendo finalmente evoluir para arritmias cardíacas fatais.

O coração sofre hipertrofia (cardiomegalia) tornando inviável seu funcionamento. Outras

manifestações dessa fase podem ser o aumento do esôfago e do intestino grosso, causando

Fajardo FD INTRODUÇÃO

dificuldades de deglutição, engasgos e pneumonia por aspiração e constipação crônica e dor

abdominal (Brener et al., 2000).

1.1.4 Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi

1.1.4.1 Hospedeiro vertebrado

O ciclo evolutivo do T. cruzi no hospedeiro vertebrado inicia-se quando formas

tripomastigotas metacíclicas eliminadas nas fezes e urina do inseto vetor, hemípteros da família

Reduviidae, são inoculadas na pele ou mucosa do vertebrado mamífero (Andrade e Andrews,

2005). As formas tripomastigotas metacíclicas podem, potencialmente, penetrar em qualquer tipo

de célula nucleada (figura 01). Logo após a penetração, a forma tripomastigota metacíclica pode

ser encontrada no interior do vacúolo parasitóforo, sendo capaz de destruir a membrana, atingir o

citoplasma e diferenciar-se em amastigota que se replica no citoplasma da célula hospedeira por

divisões binárias (Dvorak e Hyde,1973) que prosseguem por vários dias, dependendo das

características da cepa do T. cruzi e da célula hospedeira. Após, aproximadamente, 5 dias a célula

hospedeira contém em torno de 500 amastigotas, inicia-se um processo quase que sincrônico de

transformação de formas amastigotas em tripomastigotas não replicativas, havendo então o

rompimento da membrana plasmática da célula hospedeira e a liberação dos tripomastigotas. Esse

processo de amplificação parasitária é responsável pela fase aguda da infecção. A forma

tripomastigota tem capacidade de infectar outras células no mesmo ambiente onde foi liberada ou

atingir a corrente sanguínea e infectar novas células distantes do local da infecção, conforme

demonstrado na figura 02 (Brenet et al., 2000).

Fajardo FD INTRODUÇÃO

Figura 01: Foto ilustrativa de um tripomastigota no momento em que invade a

célula hospedeira (http://www.iq.usp.br/wwwdocentes/walcolli/).

1.1.4.2 Hospedeiro invertebrado

O ciclo biológico do T. cruzi no hospedeiro invertebrado tem início quando os

tripomastigotas sangüíneos são ingeridos durante o repasto do inseto. Mesmo quando o nível de

parasitemia é baixo, não se detectando o parasita por microscopia óptica, é possível encontrar o

parasita no hospedeiro invertebrado. Ao chegar à porção anterior do trato intestinal, as formas

tripomastigotas diferenciam-se gradualmente em formas arredondadas, algumas com um longo

flagelo colado ao corpo e outras com flagelo curto denominadas, respectivamente,

esferomastigotas e epimastigotas. Posteriormente, os parasitas migram para a porção posterior do

trato intestinal, multiplicam-se como formas epimastigotas (o que pode ser observado 25 horas

após o repasto sanguíneo), migram para a parte mais posterior, atingindo o reto, diferenciando-se

em tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados nas fezes e urina durante o repasto

sangüíneo completando assim o ciclo de vida do parasita (Brener et al., 2000).

Fajardo FD INTRODUÇÃO

Figura 02: Representação esquemática das formas evolutivas do T. cruzi e seus

hospedeiros (http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Chagas_ciclo_de_doen%C3%A7a.JPG#file).

1.1.5 Tratamento

Várias drogas já foram testadas no tratamento da doença de Chagas, sendo os

nitroderivados os compostos mais ativos contra o T. cruzi (5-nitrofuranos, os nitroimidazóis e os

nitrotiazóis). Nos ensaios clínicos, que vêm sendo realizados desde o final da década de 70,

apenas dois medicamentos vêm sendo utilizados no tratamento (Lelchuk et al., 1977; Raaflaub,

1980). O Nifurtimox (Bayer®), retirado do mercado no Brasil nos anos 80, e o Benzonidazol

(Roche®) único, atualmente, à disposição dos pacientes. Esses compostos são eficientes apenas

Fajardo FD INTRODUÇÃO

na fase aguda da doença e depende da cepa infectante, pois algumas são resistentes a estas drogas

(Teixeira et al., 2001). Há diversas evidências de que esses compostos produzem efeitos

colaterais, sendo consideradas drogas teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas (Andrade et

al., 1992; Lauria-Pires et al., 2001).

1.1.6 Interação parasita/célula hospedeira

Por ser um parasita com replicação intracelular obrigatória, vários grupos de

pesquisadores têm concentrado seus estudos na caracterização de mecanismos celulares e

moleculares envolvidos na adesão, interação e penetração do T. cruzi com a célula hospedeira.

O processo de adesão (figura 03-A) parece envolver o reconhecimento celular entre

moléculas do tipo lectina da superfície da célula hospedeira e/ou do parasita (Andrews e

Burleigh, 1995). Após a adesão, modificações ocorrem na membrana do parasita e da célula

hospedeira. Na fase inicial de interação ocorre mobilização de lisossomas da célula hospedeira

para a área de adesão, provendo membrana para a formação do vacúolo parasitóforo (Tardieux et

al., 1992) (figura 03-B). A invasão da célula hospedeira, além de ser uma estratégia de evasão do

sistema imune, é essencial para a replicação do T. cruzi (Zhang e Tarleton, 1999). À medida que

o parasita vai penetrando e sendo envolvido pela membrana plasmática da célula hospedeira, os

lisossomos são recrutados para o sítio de entrada do tripomastigota e gradualmente são

fusionados com a membrana plasmática, formando o vacúolo parasitóforo que envolverá o T.

cruzi (figura 03-C). Este mecanismo de entrada é ativo e independente de actina, uma vez que

não foi inibido por Citocalasina D, uma droga que bloqueia a fagocitose e a polimerização de

actina (Schenkman et al., 1991). Após o processo de invasão, quando a forma tripomastigota

encontra-se no interior do vacúolo parasitóforo, ocorre uma mudança gradual da forma do

parasita, que se inicia pelo arredondamento, fazendo com que o flagelo fique todo junto ao corpo,

Fajardo FD INTRODUÇÃO

seguido pelo encurtamento do flagelo e mudança da estrutura do cinetoplasto (figura 03-D).

Aproximadamente 2 horas após o contato inicial, a membrana do vacúolo parasitóforo é lisada.

Com a fragmentação da membrana e sua posterior total desintegração, a forma arredondada do T.

cruzi passa a viver em contato direto com os componentes citoplasmáticos da célula hospedeira.

Uma vez no citoplasma, o T. cruzi, agora na forma amastigota, permanece por muitas horas

(variável de 24 a 35 horas, de acordo com a cepa) quiescente, seguindo-se o processo de divisão

binária (figura 03-E). Após sucessivas divisões no interior da célula hospedeira, as formas

amastigotas iniciam um processo de transformação para formas tripomastigotas, que dura

algumas horas. Este mecanismo, aparentemente, tem início com o crescimento do flagelo,

acompanhado de mudanças de forma dos parasitas que se tornam alongados (Andrade e

Andrews, 2005) (figura 03-F).

Ao final do ciclo intracelular quando um grande número de tripomastigotas é formado no

citoplasma da célula hospedeira, eles apresentam intenso movimento, ocorrendo a ruptura brusca

da célula hospedeira e a liberação dos parasitas no espaço intercelular (figura 03-G).

Fajardo FD INTRODUÇÃO

Figura 03: Desenho esquemático das várias fases da interação do T. cruzi com a célula do

hospedeiro vertebrado (Fajardo, 2004b).

Nos últimos anos, o T. cruzi tem sido objeto de intenso estudo sob diferentes aspectos.

Muitos destes estudos visam elucidar a estrutura e a composição da membrana plasmática do

parasita, primeiro componente a entrar em contato com a célula do hospedeiro, iniciando a

adesão e a interação parasita/hospedeiro, podendo resultar no estabelecimento da infecção.

Três famílias de glicoconjugados expressos na superfície celular de formas

tripomastigotas do T. cruzi, que são ligadas à membrana celular via âncoras

glicosilfosfatidilinositol (GPI) (figura 04), vêm sendo estudadas e consideradas fundamentais no

processo de interação e invasão do parasita na célula hospedeira e no controle da ativação e

supressão de diversas células do sistema imune. As moléculas são: trans-sialidases (TS),

Fajardo FD INTRODUÇÃO

sialoglicoproteínas (moléculas semelhantes a mucinas) e os glicoinositolfosfolipídeos (GIPL)

(Colli, 1993; Burleigh e Andrews, 1995; Gazzinelli et al, 1999; Almeida et al, 2000; DosReis et

al., 2002; Todeschini et al., 2002a e b; Previato et al., 2004; Buscaglia et al., 2006).

Neu5AcNeu5Ac

β-Galβ-Gal

α-GlcNAcα-GlcNAc

α-Manα-Man

α-GlcNα-GlcN

m-Insm-Ins

2-AEP2-AEP

trans-sialidase

ativa

Tyr

342

trans-sialidase

inativa

Hys

342

-glicana

Sialoglicoproteinas

Aceptoras de ácido siálico

GIPL

-glicana

Sialoglicoproteinas

Aceptoras de ácido siálico

GIPL

Figura 04: Representação esquemática dos 3 principais glicoconjugados da superfície do T. cruzi.

1.2 trans Sialidase (TS)

1.2.1 Definição e estrutura

Os ácidos siálicos são uma família de açúcares carboxilados com 9 átomos de carbono,

podendo ser encontrados no terminal não redutor de cadeias oligossacarídicas nas configurações

α2-3 e α2-6, ligados à unidade de β-galactopiranose (β-Galp) ou N-acetilgalactosamina

Fajardo FD INTRODUÇÃO

(GalNAc) ou formando polímeros de unidades de ácido siálico com ligações α2-8 ou α2-9

(Varki, 1992). O ácido siálico mais comum é o ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac).

No T. cruzi o ácido siálico foi primeiramente descrito na superfície de formas

epimastigotas através do uso de lectinas e por métodos colorimétricos (Pereira et al., 1980),

sendo posteriormente comprovado por cromatografias em camada delgada e gás-líquida acoplada

à espectometria de massas (Schauer et al., 1983). No entanto, quando o parasita foi incubado com

precursores radioativos, o ácido siálico ancorado nas sialomoléculas da superfície do T. cruzi não

apareceu radiativamente marcado (Schauer et al., 1983).

Previato e colaboradores (1985) descreveram a capacidade do T. cruzi de transferir o

ácido siálico de sialoglicoconjugados exógenos para moléculas aceptoras presentes em sua

superfície. Esses resultados sugeriam que a incorporação do ácido siálico às sialoglicoproteínas

da superfície do T. cruzi não se processava pela via biossintética conhecida, dependente de CMP-

Neu5Ac, mas através de uma nova rota metabólica, envolvendo uma reação de transglicosilação

para ácido siálico.

A capacidade de incorporação de ácido siálico em tripomastigotas foi demonstrada in

vitro por Zingales e colaboradores (1987) e in vivo por Previato e colaboradores (1991).

Posteriormente, a atividade enzimática de glicosilase para ácido siálico foi denominada trans-

sialidase (TS) (Schenkman et al., 1991).

O ácido siálico tem sido descrito como um importante mediador envolvido na interação

de muitos agentes patogênicos com receptores em diversas células hospedeiras (Weis et al.,

1988). A sialilação de moléculas aceptoras na superfície é crucial para a viabilidade e propagação

do parasita (Buscaglia et al., 2006). Em T. cruzi, as moléculas semelhantes a mucinas (também

Fajardo FD INTRODUÇÃO

denominadas sialoglicoproteínas ou simplesmente mucinas do T. cruzi) são os únicos aceptores

de ácido siálico em uma reação catalisada pela TS (Colli, 1993; Parodi, 1993).

A TS pertence a uma grande família de proteínas (Uemura et al., 1992; Cremona et al.,

1995) e muitos outros membros desta família são expressos na superfície do T. cruzi sem

atividade enzimática (Cremona et al., 1995).

A TS da forma tripomastigota consiste de duas regiões majoritárias (figura 05) uma

responsável pela atividade enzimática, o domínio N-terminal, contendo aproximadamente 680

aminoácidos resultando em massa molecular aproximada de 60 kDa (Schenkman et al., 1992;

Campetella et al., 1994) e o domínio C-terminal, formado pela repetição de 12 aminoácidos D-S-

S-A-H-(S/G)-T-P-S-T-P-(A/V) denominado SAPA (shed acute-phase antigen) que não é

necessário para a atividade enzimática (Pollevick et al., 1991; Cazzulo e Frasch, 1992), no

entanto induz a produção de anticorpos direcionados ao SAPA, que estão presentes em

abundância na fase aguda da doença de Chagas (Cazzulo e Frasch, 1992). A porção C-terminal da

TS permite a oligomerização e a ligação da enzima à superfície do parasita via âncora GPI

(Schenkman et al., 1994).

DSSAHGTPSTPV

GPI COOH

100 aa

Sítio catalítico

SAPA

Figura 05: Representação da estrutura protéica da TS

A TS encontrada em epimastigotas apresenta as mesmas especificidades e propriedades

cinéticas que a enzima expressa em tripomastigotas (Chaves et al., 1993) porém, apresenta

Fajardo FD INTRODUÇÃO

diferenças estruturais significantes. A enzima é monomérica, não apresenta a porção C-terminal,

sendo uma proteína transmembrânica (Chaves et al., 1993).

A TS transfere o ácido siálico de sialoglicoconjugados exógenos para glicoconjugados

contendo β-Galp terminal sintetizando exclusivamente ligações α2-3Galp. Na ausência de

substrato aceptor a TS catalisa a transferência do ácido siálico para uma molécula de água,

atuando como uma sialidase semelhante às sialidases virais e bacterianas (Scudder et al., 1993).

A TS é produto de uma família de aproximadamente 140 genes que codificam tanto

proteínas com atividade enzimática (TSa) quanto proteínas sem atividade enzimática (TSi) mas

capazes de se ligar a unidades de ácido siálico α2-3Galp (Todeschini et al., 2002a, 2004). A

comparação das seqüências de aminoácidos da TSa e da TSi mostrou que as diferenças são

restritas a aproximadamente 20 posições de aminoácidos, mas apenas um é essencial para a

atividade enzimática. Os membros ativos desta família apresentam uma Tyr na posição 342

enquanto que os membros não ativos apresentam uma His na mesma posição (Cremona et al.,

1995; Cremona et al., 1999).

Apesar da TSi ser expressa por um número de genes semelhante ao que expressa a enzima

ativa e ter propriedade de adesina (Todeschini et al., 2004), a importância da TSi para a biologia

do parasita ou para a patogênese da doença de Chagas não é conhecida e tem sido pouco estudada

(Campetella et al., 1992; Cremona et al., 1999; Buschiazzo et al., 2000).

As TS das formas tripomastigotas, como demonstrado na figura 4, são ancoradas à

superfície do parasita através de uma âncora GPI, podendo ser liberadas para a corrente

sangüínea, pela ação da fosfatidilinositol-fosfolipase C (PI-PLC) já descrita no T. cruzi, sendo

encontrada no sangue de animais experimentais e em humanos infectados (Buscaglia et al., 1999)

podendo agir sem a presença do parasita e exercer efeitos biológicos diferentes em muitos tipos

Fajardo FD INTRODUÇÃO

celulares, provavelmente através da alteração do perfil de sialilação de sua superfície (Buscaglia

et al., 2006).

1.2.2 Funções biológicas

O sistema biológico TS x sialoglicoproteínas desempenha um importante papel na adesão

e invasão da célula hospedeira pelo T. cruzi (Burleigh e Andrews, 1995) bem como na modulação

do sistema imune do hospedeiro (Chuenkova e Pereira, 1995, 2000; Todeschini et al., 2002b).

Chuenkova e Pereira (1995) demonstraram que injeção in vivo de pequenas quantidades

de TS nativa aumenta a parasitemia e a mortalidade em camundongos infectados com T. cruzi.

As TSa e TSi ligam-se à sialomucina CD43 na superfície de células T CD4+. Esta ligação

desencadeia uma resposta coestimulatória levando a mitogênese, secreção de citocinas e à

inibição da morte por apoptose, induzindo alterações no sistema imune do hospedeiro que podem

ser responsáveis pelos efeitos imunopatológicos da infecção pelo T. cruzi (Todeschini et al.,

2002b). O efeito co-mitogênico da TSi em células T é reduzido pela adição de N-

acetillactosamina, sugerindo uma função de adesina para a TSi (Todeschini et al., 2004; Paris et

al., 2005). Outros estudos demonstraram que a Tsi, além de apresentar o sítio de ligação para α 2-

3 ácido siálico, contém um sítio adicional para β-galactosídeos (Todeschini et al., 2004).

Todeschini e colaboradores (2004) utilizando espectroscopia de ressonância magnética nuclear

demonstraram que a interação do sialosídeo com a TSi desencadeia uma mudança

conformacional na estrutura da proteína, permitindo a interação com uma unidade de β-galp

terminal. Esses resultados sugerem que a TSi pode desempenhar um papel significativo em

alguma etapa do mecanismo molecular envolvido nos processos de adesão, invasão do T. cruzi e

na imunoregulação do hospedeiro, permitindo que a infecção seja estabelecida.

Fajardo FD INTRODUÇÃO

1.2.3 Interação TSi/célula endotelial

Por funcionar como uma adesina, a TSi é um bom alvo para estudos moleculares que

visem elucidar os mecanismos de interação do T. cruzi com as células do hospedeiro.

O endotélio vascular (as células endoteliais) é um alvo na infecção pelo T. cruzi, por

representar uma barreira para que o parasita possa atingir órgãos e tecidos preferenciais, como

coração e trato digestivo. As células endoteliais desempenham um papel fundamental no

desenvolvimento do processo inflamatório observado durante a cardiopatia chagásica. Apesar do

endotélio do miocárdio normal expressar molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), biópsias

de pacientes com cardiopatia chagásica crônica apresentaram um aumento na expressão de várias

moléculas de adesão como ICAM-1, molécula de adesão vascular-1 (VCAM-1) e E-Selectina,

contribuindo para o tráfego de leucócitos para a região inflamada, causando a progressão da

doença (Higuchi et al., 2003). O aumento nos níveis de moléculas de adesão também é observado

no sangue de pacientes chagásicos. Laucella e colaboradores (1999) observaram uma diminuição

nos níveis séricos de VCAM-1 e P-selectina após a quimioterapia com benzonidazol em crianças

chagásicas. Anteriormente, Tanowitz e colaboradores (1990) demonstraram que a infecção de

células endoteliais pelo T. cruzi aumenta a adesão e agregação de plaquetas contribuindo para a

trombose observada durante a doença de Chagas.

A ativação de NF-κB é um passo essencial na resposta imune inata a patógenos (Elewaut

et al., 1999). Huang e colaboradores (1999) observaram que a infecção de células endoteliais pelo

T. cruzi ativa a via de NF-κB, induzindo a expressão de moléculas de adesão, que estão

diretamente relacionadas com os eventos de agregação plaquetária. Também foi demonstrado que

o NF-κB modula a infecção pelo T. cruzi, além de regular a expressão da óxido nítrico sintase

Fajardo FD INTRODUÇÃO

induzida (NOSi), produzindo óxido nítrico (NO) (Xie et al. 1994) e sendo também responsável

pela expressão de interleucina-6 (IL-6) e de moléculas de adesão como ICAM-1, VCAM-1 e E-

selectina (Zhang e Tarleton, 1996; Huang et al., 1999), sugerindo um provável mecanismo para o

recrutamento de leucócitos circulantes, importantes no início da resposta inflamatória (Tanowitz et

al., 1992). Não só a forma tripomastigota do parasita, mas também o meio condicionado, ou seja,

meio obtido através da incubação overnight com tripomastigotas e posterior retirada destes, foi

capaz de induzir a translocação de NF-κB para o núcleo em até 80 % das células, níveis similares

aos obtidos no controle positivo, onde foi utilizado TNF-α (Hall et al., 2000). Estes resultados

sugerem que o material solúvel liberado pelo tripomastigota poderia estimular a ativação de NF-

κB. Já a forma epimastigota não tem efeito na ativação de NF-κB. Na infecção pelo T. cruzi, a

ativação de NF-κB é, portanto, específica para o estágio do parasita que invade células de

mamíferos durante a infecção natural (Hall et al., 2000). Como mencionado acima, a TS da forma

epimastigota é uma proteína transmembrana e na forma tripomastigota a enzima está ancorada via

GPI à superfície do parasita e é liberada no meio, podendo atuar sem a presença do parasita.

Estudos prévios em nosso laboratório demonstraram que a depleção de TS do meio

condicionado, obtido a partir de forma tripomatigotas do T. cruzi, utilizando anticorpos anti-TS

suprime a ativação de NF-κB em células endoteliais sugerindo que a TS seja uma das moléculas

do parasita responsáveis pela ativação celular (Fajardo, 2004). De fato, a TSi é capaz de se ligar à

superfície das células endoteliais e esta ligação desencadeia uma série de eventos moleculares,

como ativação da via de NF-κB, expressão de moléculas de adesão como ICAM-1, V-CAM e E-

selectina e a inibição da morte celular por apoptose (Fajardo et al., 2004a). Dessa forma, nosso

grupo vem trabalhando com a TSi, visando identificar moléculas na célula endotelial que sejam

capazes de interagir com esta enzima do parasita.

Fajardo FD INTRODUÇÃO

Através de eletroforese e espectrometria de massas, foi identificada uma proteína de 36

kDa como sendo uma das moléculas da superfície das células endoteliais que poderia interagir

com a TSi. Esta proteína apresentou 100 % de homologia com Anexina A2 humana (resultados

apresentados nesta tese).

1.3 Anexinas

1.3.1 Características gerais

As anexinas começaram a ser estudadas no final dos anos 70 e início dos anos 80. Esses

estudos levaram a identificação de aproximadamente 160 proteínas, presentes em mais de 65

espécies diferentes, de fungos e protistas a plantas e vertebrados superiores (Rescher e Gerke,

2004). Até o momento, 12 subfamílias de anexinas já foram identificadas em vertebrados, e

dessas, 10 já foram descritas em mamíferos. Em humanos já foram identificadas as anexinas A1-

A8, A11 e A13 (Gerke e Moss, 2002).

Bioquimicamente, as anexinas são definidas como proteínas hidrofílicas solúveis que se

ligam a fosfolipídios carregados negativamente de forma Ca

-dependente. Essa ligação é

reversível e a remoção de Ca

por agentes quelantes de Ca

leva à liberação das anexinas da

matriz de fosfolipídios (Gerke e Moss, 2002).

A maioria das anexinas é formada por proteínas intracelulares abundantes, podendo

compreender até 2 % do total das proteínas celulares. São monoméricas, de 30-40 kDa, com

exceção da anexina A6 que possui 68 kDa. No entanto a anexina A2 pode apresentar-se nas

formas monomérica e oligomérica (Waisman, 1995).

A porção N-terminal de todas as anexinas caracterizadas até o momento, possui tamanho

e composição variável, possivelmente determinando as funções específicas de cada anexina. A

porção N-terminal é seguida por uma região relativamente conservada, a região C-terminal, (ou

Fajardo FD INTRODUÇÃO

“core” protéico). Esta porção conservada consiste de 4 ou 8 (no caso da anexina A6) motivos

homólogos, denominados endonexinas, que contêm uma sequência consenso geral: (L/M)-K-G-

X-G-T- 38 resíduos-(D-E) (Hajjar et al., 1996).

A habilidade das anexinas de ligarem-se aos fosfolipídios das membranas biológicas, de

maneira Ca

-dependente, levou à especulação de que essas proteínas poderiam estar envolvidas

nos processos de tráfego de membranas como endocitose e exocitose, mas suas funções precisas

permanecem não esclarecidas (Waisman, 1995; Gerke e Moss, 2002).

1.4 Anexina A2

1.4.1 Estrutura e definição

A anexina A2 é uma proteína abundante, podendo ser encontrada na forma de monômero

(A2m, com 36 kDa), heterodímero (A2d) e heterotetrâmero (A2t). O heterodímero é composto de

uma subunidade de anexina A2m e uma subunidade de 3-fosfogliceratoquinase. O

heterotetrâmero é composto de duas subunidades de anexina A2m e duas subunidades de p11,

uma proteína de 11 kDa. A anexina A2m (monomérica) é majoritariamente citosólica. O

heterodímero (A2d) está associado ao núcleo, onde já foi mostrado, regular a DNA polimerase α.

Já a formação do heterotetrâmero pode resultar na sua associação com membranas biológicas,

inclusive com a membrana plasmática. A presença de um membro da família das anexinas na

superfície celular não era esperada, pois estas proteínas não possuem a sequência sinal

hidrofóbica que tem sido caracterizada em muitas proteínas secretadas (Waisman, 1995).

Não está esclarecido se a ligação de anexina A2t à membrana plasmática envolve a

interação da proteína com receptores específicos, se é feita entre a anexina A2t e os fosfolipídeos

da membrana, sendo mediada por Ca

(Waisman, 1995), ou ainda, se esta ligação é feita através

da interação da anexina A2t com o colesterol presente nessas membranas (Zobiack et al., 2003).

Fajardo FD INTRODUÇÃO

A anexina A2 consiste de dois domínios funcionais (figura 06): o domínio N-terminal,

que contém os sítios de fosforilação serina e tirosina e o sítio para ligação da subunidade p11, e o

domínio C-terminal, que compreende os sítios de ligação com Ca

e com as membranas

celulares. Os domínios N- e C-terminal, podem ser separados proteoliticamente. A proteólise por

quimiotripsina cliva a proteína em uma região N-terminal de 3 kDa e um domínio C-terminal,

(“core” protéico) de 33 kDa (Chung e Erickson, 1994).

Core protéico

Figura 06: Representação esquemática da organização estrutural da anexina A2. A porção

N-terminal contém uma região α-hélice única. O “core” protéico possui quatro regiões

homólogas (1-4), cada uma das quais consiste de cinco regiões α -hélice (A-E). Possíves sítios de

ligação com Ca

estão demonstrados entre as α-hélices A e B, nas quatro repetições, e seus

aminoácidos reguladores, 38 resíduos abaixo, entre as hélices D e E (Hajjar et al., 1996).

O “core” protéico da anexina A2 humana possui de 39 a 61 % de homologia com outras

anexinas descritas em humanos, enquanto que a região N-terminal, apresenta de 3 a 25 % de

homologia e é variável nos sítios de fosforilação de tirosina e serina-treonina (Rescher e Gerke,

2004).

Fajardo FD INTRODUÇÃO

Anexina A2 pode sofrer pelo menos quatro modificações pós-traducionais: miristoilação,

glicosilação, fosforilação e clivagem proteolítica (Hajjar et al., 1996).

A subunidade p11 (também denominada S100A10), integrante do complexo formado pela

anexina A2 que está presente na superfície celular (A2t), pertence a uma família de pequenas

proteínas (aproximadamente 10 kDa) denominada S100. Outras proteínas desta família, S100A6

e S100A11, já foram descritas como capazes de se ligar, especificamente, a outras duas anexinas

diferentes, A11 e A1, respectivamente (Gerke e Moss, 2002).

Estudos recentes mostraram que a translocação de anexina A2 para a superfície celular

está diretamente relacionada com a presença da proteína p11 (Deora et al., 2004). Nesse trabalho

os autores demonstram que a translocação da anexina A2t ocorre independente da via clássica

retículo endoplasmático-Golgi e não envolve síntese de novo da proteína e sugerem que p11 pode

direcionar anexina A2 para a face interna da membrana plasmática, onde a anexina A2 é

fosforilada. A fosforilação da anexina A2 pode induzir um acoplamento mais ávido dessa

molécula a fosfolipídios aniônicos presentes na face interna da membrana plasmática e pode levar

a uma mudança conformacional que potencialize sua inserção na membrana e sua extrusão

através da bicamada (Deora et al., 2004).

1.4.2 Função da anexina A2t

Hajjar e Krishnan (1999) observaram que a expressão in vivo de anexina A2 é

especialmente rica nos tecidos do intestino, pulmão e tecido vascular e pode desempenhar, in

vitro, várias funções biológicas, todas dependentes de Ca

Fajardo FD INTRODUÇÃO

Apesar de não possuir a seqüência peptídica sinal, anexina A2t é constitutivamente

translocada para a membrana plasmática da superfície de células endoteliais 16 h após sua

biossíntese, onde constitui aproximadamente 5 % do total de anexina A2 dessas células

(Waisman, 1995; Hajjar e Krishnan, 1999).

Nas células endoteliais, anexina A2t já foi demonstrada como receptor para diversas

moléculas. Sua função melhor descrita é como acelerador do processo de formação da Plasmina

através da atuação do ativador de Plasminogênio tecidual (tPA) sobre o Plasminogênio. A

anexina A2t é capaz de se ligar ao Plasminogênio e à tPA, acelerando a formação de Plasmina

(Hajjar e Krishnan, 1999).

Outra molécula capaz de se ligar à anexina A2t é Tenascina C (TN-C), uma proteína

solúvel envolvida no processo de migração celular. Chung e colaboradores (1994) demonstraram

que TN-C é capaz de se ligar à superfície de células endoteliais e que esta ligação é feita através

de um receptor na superfície de células endoteliais, identificado como anexina A2.

Outra função bem descrita para anexina A2t é ser receptor de β

-glicoproteína I (β

GPI).

A β

GPI é uma glicoproteína plasmática que recentemente foi descoberta como importante auto-

antígeno na síndrome do anticorpo anti-fosfolipídio (Ma et al., 2000). A β

GPI liga-se às células

endoteliais através da interação de alta afinidade com anexina A2t. Estudos preliminares

sugerem um importante papel para anexina A2t, induzindo respostas de sinalização em células

endoteliais que levam à ativação celular, através da formação do complexo anti-β

GPI – β

GPI –

anexina A2t (Ma et al., 2000; Zhang e McCrae, 2005).

Além de receptor para diversas moléculas na superfície de células endoteliais, anexina

A2t também foi identificada como receptor para citomegalovírus humano (HCMV) na superfície

dessas células (Wright et al., 1994). Em 1999, Raynor e colaboradores demonstraram que além

Fajardo FD INTRODUÇÃO

de se ligar à HCMV, a anexina A2 também promove a fusão desta partícula às membranas de

fosfolipídios.

Além de células endoteliais, anexina A2t foi identificada como receptor para patógenos na

superfície de células epiteliais. Kirschnek e colaboradores (2005) demonstraram que anexina A2t

é receptor para Pseudomonas aeruginosa. Nesse estudo, a anexina A2 funcionou como receptor e

pelo menos, parcialmente, requerida para internalização da bactéria.

Também em células epiteliais, a anexina A2t parece exercer função de receptor para

Helicobacter pylori (Das et al., 2005). Além disso, foi demonstrado que anexina A2t possui seu

nível de expressão aumentado em até 2,5 vezes em células infectadas com a bactéria, quando

comparadas às células não infectadas.

Em monócitos, a anexina A2t presente na superfície dessas células, é capaz de mediar a

sinalização pró-inflamatória desencadeada pela plasmina, levando à ativação da via de NF-κB

(Syrovets et al., 2001).

Como demonstrado acima, a anexina A2t é capaz de interagir com moléculas solúveis e

participar de eventos de adesão célula-célula, atuando como um receptor na superfície de

diversos tipos celulares. Nesta dissertação demonstramos, pela primeira vez, que anexina A2 é

capaz de atuar como receptor para uma molécula expressa em um tripanosomatídeo. Devido ao

importante papel que vem sendo descrito para TSi na patogênese da doença de Chagas, a

identificação de moléculas que atuam como ligantes para esta enzima é de fundamental

importância para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos contra o T. cruzi.

Fajardo FD OBJETIVOS

2. Objetivos

Isolamento e identificação de molécula(s) que atue(m) como ligante(s) da TSi do T.

cruzi na superfície de células endoteliais de medula óssea humana (HBMEC).

Fajardo FD METODOLOGIA

3.1 Linhagem de células endoteliais de medula óssea humana (HBMEC).

A linhagem de células HBMEC foi estabelecida por Schweitzer e colaboradores (1997) e

gentilmente cedida pela Dra. M. Girard do Institut D’Èpidémiologie Neurologique et de

Neurologie Tropicale da Faculté de Médecine da Université de Limoges, França.

As HBMEC foram mantidas e cultivadas em garrafas de cultivo com uma superfície

contendo gelatina de porco (Sigma) 0,5 %, mantidas em DMEM suplementado com 10 % de

soro fetal bovino, penicilina-estreptomicina 100 µg/mL, fungizona 100 µg/mL, L-glutamina 2

mM e piruvato de sódio 1 mM.

Schweitzer e colaboradores (1997) demonstraram que a linhagem de células HBMEC

apresentou similaridade com a cultura primária, mantendo a expressão de moléculas de adesão,

capacidade proliferativa e de transdução de sinais até a 30

passagem. Em todos os nossos

experimentos, as células foram utilizadas entre as passagens 19 e 23.

3.2 Obtenção da TSi

A proteína recombinante foi obtida a partir de E. coli MC 1061 eletrotransformada com o

plasmídeo contendo o inserto da TSi (Tyr342-His no vetor TrcHisA) cedido pelo Prof. C.A.

Frasch do Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, Universidade Nacional de General San

Martin, San Martin, Província de Buenos Aires, Argentina. As bactérias foram crescidas em

meio TB com ampicilina (100 µg/mL) a 37

C. Quando a cultura atingiu uma densidade óptica

de 1.0 a 600 nm, a expressão da enzima foi induzida com a adição de 30 mg/l de

isopropiltiogalactosídeo e incubada overnigth sob agitação (110 g). As bactérias foram lisadas a

C em tampão Tris-HCl 20 mM, contendo lisozima 2 mg/ml, triton X-100 2 %, fluoreto de

fenilmetilsulfonila (PMSF) 0,1 mM, leupeptina 5 µg/mL, iodoacetamida 0,1 mM e inibidor de

tripsina 1 mg/L. Deoxiribunuclease I foi adicionada para reduzir a viscosidade. A suspensão foi

Fajardo FD METODOLOGIA

centrifugada a 15.000 x g/10 min a 4 °C e o pellet descartado. A TSi foi purificada em

cromatografia de afinidade em coluna agarose-Ni

(Buschiazzo et al., 1996) e eluída em

gradiente de imidazol (0-1 M). Após diálise, a TSi foi purificada por cromatografia de troca

iônica em colunas Mono-Q e Mono-S e eluída em gradiente linear de NaCl (0-1 M). A

homogeneidade da enzima foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10 %) na

presença de SDS-PAGE. A quantidade de proteína presente em cada preparação de enzima foi

dosada utilizando-se o método de Folin-Lowry (Lowry et al., 1951). Depois de filtrada em filtro

MilliQ, a TSi foi estocada em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 a 4

C. Para a obtenção de

preparações livres de lipopolisacarídeos (LPS) a TSi foi aplicada em uma coluna de polimixina-

B imobilizada em agarose (Sigma Chemical Co.). A possível contaminação por LPS foi

verificada através do método do lisado de amebócito de Limulus (LAL) seguindo as

recomendações do fabricante.

3.3 Biotinilação da TSi

A TSi foi biotinilada conforme descrito por Harlow e Lane (1988). Ester de biotina3-

sulfo-N-hidroxisucinamida (1 mg) foi adicionado a 2 mL de uma solução contendo 2 mg de TSi,

dialisada contra tampão borato de sódio pH 8,8. Após 4 h a reação foi interrompida com a

adição de 40 μL de NH

Cl (1 M) por 10 min. O produto biotinilado foi dialisado por 48 h a 4

filtrado em filtro MilliQ e submetido à dosagem de proteína pelo método de Folin-Lowry et al.

(1951).

Fajardo FD METODOLOGIA

3.4 Mucina

A mucina (mucY) de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) utilizada nesta tese faz

parte das facilidades de nosso laboratório e foi obtida conforme descrito por Previato e

colaboradores (1995).

3.5 Parasitas

O T. cruzi cepa Y foi utilizado neste estudo. Formas tripomastigotas sangüíneas obtidas a

partir de punção cardíaca de camundongos Balb/c infectados foram utilizadas na infecção de

monocamadas confluentes de células VERO (células de rim de macaco verde africano) em uma

proporção de tripomastigota metacíclico:VERO de 5:1. A cultura de células VERO infectada foi

mantida em meio RPMI 1640 (Gibco BRL®, Grand Island, NY, U.S.A.) pH 7,2 contendo (g/L):

L-glutamina 0,3; carbonato de sódio 2,0; piruvato de sódio 0,1; HEPES 2,4; gentamicina 0,01 e

suplementado com 5 % de soro fetal bovino (SFB) sob atmosfera de 5 % de CO

a 37 °C. Após

um período de 6-7 dias de incubação as formas tripomastigotas liberadas no sobrenadante foram

coletadas e recuperadas por centrifugação (1.500 x g/15 min) para a remoção dos debris

celulares. O sobrenadante obtido foi coletado, centrifugado (1.000 x g/15 min) e mantido a 37 °C

por 1 h. Durante este período, as formas tripomastigotas que porventura sedimentaram no

precipitado deslocam-se para o sobrenadante, enriquecendo esta fase. O sobrenadante foi

coletado e novamente centrifugado (2.500 x g/20 min) e o precipitado formado foi ressuspendido

em 10 mL de meio RPMI contendo 5 % de SFB.

Fajardo FD METODOLOGIA

3.6 Avaliação do efeito da TSi na adesão de formas tripomastigotas do T. cruzi às células

HBMEC

Para o experimento de adesão das formas tripomastigotas às células HBMEC, as células

foram cultivadas em lamínulas em placas de 24 poços na presença de 10 % de SFB. Quando

atingiram a confluência, as células foram lavadas e estimuladas com TSi, LPS ou mucY

acrescidas de nutridoma, mantidas overnight. Após esse período, as células HBMEC, lavadas

com PBS, foram incubadas com 1x10

tripomastigotas/poço a 37 °C por 2 h, lavadas com PBS,

fixadas com metanol e coradas com Giemsa. A lamínula foi retirada da placa e o número de

parasitas aderidos foi avaliado por microscopia óptica.

3.7 Avaliação do efeito da TSi na infecção de células HBMEC por formas tripomastigotas

do T. cruzi e no número de parasitas liberados por estas células

Na avaliação do número de células HBMEC infectadas e do número de parasitas

liberados, as células foram cultivadas em placas de 24 poços na presença de 10 % de SFB.

Quando atingiram a confluência, as células foram lavadas com PBS e estimuladas com TSi, LPS

ou mucY acrescidas de nutridoma, overnight, lavadas com PBS e posteriormente incubadas com

1x10

tripomastigotas/ poço por 2 h a 37 °C. As células foram lavadas com PBS e foi acrescido

meio de cultura com 10 % de SFB. A porcentagem de células infectadas foi contada 3 dias após

a infecção, através de microscopia óptica. O número de parasitas liberados foi contado 5 dias

após a infecção em microscópio óptico, utilizando-se câmara de neubauer.

Fajardo FD METODOLOGIA

3.8 Análise do efeito da TSi na adesão de formas tripomastigotas do T. cruzi às células

HBMEC

Para verificação da importância da TSi no processo de adesão das formas tripomastigotas

do T. cruzi às células HBMEC, as células foram cultivadas em lamínulas em placas de 24 poços

na presença de 10 % de SFB. Quando atingiram a confluência, as células foram lavadas e

estimuladas com TSi, LPS ou mucY, acrescidas de nutridoma, mantidas overnight e lavadas com

PBS. Neste caso, antes da adição do parasita, as células foram incubadas com TSi 50 μg/ml por

30 min e lavadas com PBS. As células HBMEC foram incubadas com 1x10

tripomastigotas/

poço a 37 °C por 2 h, lavadas com PBS, fixadas e coradas com Giemsa. A lamínula foi retirada

da placa e o número de parasitas aderidos foi avaliado por microscopia óptica.

3.9 Obtenção de extrato total de HBMEC

As células HBMEC foram cultivadas como descrito anteriormente, em discos de cultura

de células, de 10 cm de diâmetro. Quando atingiram a confluência, as células foram lavadas com

PBS 3 vezes e cultivadas overnight em meio DMEM, contendo nutridoma, acrescido de TSi 10

µg/mL. A monocamada celular foi lavada com PBS e deixada em PBS por 2 h em banho de gelo,

para que as células fossem soltas da superfície do disco. As células em suspensão foram contadas

em câmara de neubauer e 1x10

células foram incubadas com 500 µl de tampão de lise (PBS

acrescido de Triton X-100 1 %, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidina, 1 µM leupeptina, 1

µg/mL

inibidor de tripsina, e 0.1 µM iodoacetamida) por 1 h a 4

C, sob intensa agitação. O lisado foi

centrifugado a 10.000 x g/10 min e o pellet descartado.

Fajardo FD METODOLOGIA

3.10 Obtenção de anticorpos policlonais contra a TSi

Os anticorpos policlonais anti-TSi foram obtidos da seguinte forma:

1- Foi feita emulsão com 0,5 mL de antígeno (TSi recombinante obtida a partir de E. coli, como

descrito no item 3.12, contendo os repeats de aminoácidos na região C-terminal, 500 μg/mL)

com 0,5mL de adjuvante de Freud completo;

2- O volume obtido (1mL) foi inoculado na pata (injeção subcutânea) de coelho (pesando 2 kg);

3- Após 30 dias foi feita uma sangria teste, para verificar a produção do anticorpo;

4- Foi aplicado um reforço, fazendo a emulsão com adjuvante incompleto de Freud e TSi (500

μg/mL), através de injeção intra muscular;

5- Após 7 dias foi feita a sangria total do coelho. O soro foi separado por centrifugação (2500 x

g/10 min). A separação das imunoglobulinas (IgG) foi feita através de uma coluna de afinidade

com proteína A (Pierce Biotechnology, Inc. USA);

6- A verificação da especificidade e a titulação do anticorpo foram feitas através de ensaio

imunoenzimático (ELISA).

3.11 Isolamento do(s) ligante(es) para TSi na superfície de células HBMEC

As moléculas ligantes da TSi foram isoladas através de cromatografia de afinidade. Cinco

mg/mL de proteína A foram lavados 3 vezes com tampão borato de sódio (0,1 M pH 8,2) e

incubados com 10 mg de anticorpo policlonal anti-TSi por mL de proteína A, em tampão borato

de sódio por 2 h à temperatura ambiente sob agitação. A suspensão foi centrifugada a 3.000 x g/5

min, lavada 2 vezes com tampão borato de sódio e incubada com TSi (10 mg/mL) por 2 h em

tampão borato de sódio. Após lavagem com tampão borato de sódio e com trietanolamina (0,2 M

pH 8,2) o material foi incubado com 15 mM de dimetil pimelimidato dihidroclorido (DMPC,

Fajardo FD METODOLOGIA

SIGMA) por 45 min em trietanolamina. Após 5 min à temperatura ambiente a reação foi parada

com 10 mL de etanolamina (0,2 M pH 8,2). O produto obtido, contendo TSi covalentemente

ligada ao anti-TSi/proteína A (TSi/agarose) foi lavado com tampão glicina (100 mM pH 2,5)

seguido de lavagem com tampão borato de sódio. O complexo TSi/agarose foi incubado

overnight a 4 °C na presença do extrato celular obtido como descrito anteriormente. O produto

foi acondicionado em uma coluna de 4 cm de altura e 0,5 cm de diâmetro em um volume final de

2 ml. A coluna foi lavada 2 vezes com PBS-NP40 0,1 % e 2 vezes com PBS-NP40 0,1 % - NaCl

1 M. As moléculas ligantes da TSi foram então eluídas com glicina (100 mM pH 2,5) e

dialisadas em água overnight a 4 °C. O material dialisado foi concentrado no Speed Vac até

obter o volume de 1 mL (modificado a partir de Schneider et al., 1982). Para descartar qualquer

possibilidade de interações inespecíficas entre o extrato celular obtido como descrito

anteriormente e a coluna de afinidade, fizemos um experimento controle, omitindo a etapa de

adição da TSi à coluna. As etapas anteriores e subseqüentes à adição da TSi, foram realizadas

seguindo o protocolo descrito acima.

3.12 Eletroforese bidimensional (2D)

Na eletroforese bidimensional, o material obtido como descrito anteriormente, passou por

duas etapas distintas de separação:

Primeira dimensão (focalização isoelétrica) – Após dosagem de proteína pelo método de

Folin-Lowry (Lowry et al., 1951) e precipitação com TCA, 18 μg de proteína foram dissolvidos

em 100 μL de uréia 9,5 M, CHAPS 2 % (p/v), IPG buffer 3-10 0,5 % (v/v), DTT 20mM, azul de

bromofenol 0,002 % (p/v) por 30 min. Aplicou-se toda a amostra utilizando a técnica de cup

loading no anodo em uma fita de focalização isoelétrica de 18 cm, com gradiente imobilizado de

Fajardo FD METODOLOGIA

pH no intervalo de 3-10 (linear) que havia sido previamente reidratada, por 12 h à temperatura

ambiente, em Uréia 8 M, CHAPS 2 % (p/v), IPG buffer 3-10 0,5 % (v/v), DTT 20 mM, azul de

bromofenol 0,002 % (p/v) . A fita de focalização foi coberta com 3 mL de óleo mineral (DryStrip

cover fluid – GE Healthcare) para que não houvesse ressecamento do gel e cristalização da uréia.

Foram colocados pequenos pedaços de papel de filtro embebidos em água destilada sobre os 2

eletrodos. As condições elétricas da corrida foram: 200 V por 1 h, 500 V por 1 h, 1000 V por 1 h,

de 1000 até 8000 V em 30 min, 8000 V por 4 h (focalização). Os papéis de filtro foram trocados

quando se atingiu 8000 V e após 3 h nesta voltagem.

Segunda dimensão (SDS-PAGE) - Após a focalização, as proteínas foram submetidas a

tampão de equilíbrio [Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, uréia 6 M, glicerol 30 % (v/v), SDS 2 % (p/v) e

azul de bromofenol 0,002 % (p/v)] contendo agente redutor [Ditiotreitol a 1 % (p/v)] por 15 min

à temperatura ambiente sob agitação branda. A solução foi descartada e repetiu-se o

procedimento com tampão de equilíbrio contendo agente alquilante [Iodoacetamida a 4 % (p/v)].

Após o equilíbrio a fita foi transferida para um gel de poliacrilamida a 10 % T e selado com

solução de agarose a 0,5 % (p/v) com azul de bromofenol a 0,002 % (p/v), sendo submetida à

segunda dimensão no sistema ETTAN DALT Six a 2,5 W/gel por 30 min, para que a amostra

entrasse no gel e, após este período, 100 W até o final da corrida. O gel foi então corado através

de impregnação por prata da seguinte forma (protocolo Amershan Biosciences Corp. USA, com

modificações):

1- O gel foi fixado overnight em etanol 40 % em água, sob agitação moderada. Esta etapa foi

repetida uma vez, por 30 min e a solução foi desprezada;

2- O gel foi sensibilizado em etanol 30 %, tiossulfato de sódio 0,2 % (p/v), acetato de sódio

anidro 7 % (p/v) em água, sob agitação moderada. Após 30 min o gel foi lavado 3 vezes por 5

min com água Milli-Q;

Fajardo FD METODOLOGIA

3- Foi adicionado nitrato de prata 0,25 % (p/v) por 20 min, sob agitação moderada e o gel foi

lavado 2 vezes por 1 min com água Milli-Q;

4- Para a revelação foi utilizado carbonato de sódio 2,5 % (p/v), formaldeído (37 % p/v) 0,02 %

(v/v), tiossulfato de sódio 0,001 % (p/v) em água, por 2 a 5 min, agitando na mão.

5- A solução foi descartada e foi adicionada solução de EDTA-Na

.2H

O 1,5 % (p/v) em água,

por 10min, sob agitação moderada. Após 3 lavagens de 5 min com água Milli-Q, o gel foi

guardado em ácido acético a 1 % em água.

A imagem do gel foi adquirida utilizando um sistema ImageScanner associado ao

software Image Master 2D platinum (GE Healthcare). As bandas foram então excisadas do gel,

para posterior digestão enzimática.

3.13 Eletroforese unidimensional (1D) (Laemmli, 1970)

Antes da eletroforese unidimensional, o material obtido por cromatografia de afinidade

com TSi (item 3.11) foi desta vez submetido à cromatografia de troca iônica com coluna Mono-

Q, eluído com um gradiente linear de NaCl (0-1 M) e dialisado em água overnight a 4 °C. O

material dialisado foi concentrado no Speed Vac até obter o volume de 1 mL (Schneider et al.,

1982). Este material foi submetido à dosagem de proteína pelo método de Folin-Lowry (Lowry

et al., 1951). As proteínas foram precipitadas com ácido tricloroacético (TCA) seguindo o

seguinte protocolo: para 1 mL de amostra foram adicionados 278 µL de TCA 50 % (p/v) e 139

µL de Triton X-100 1 % (v/v) em água (concentração final de TCA ≈10 % e Triton ≈0,1 %).

Após incubação no gelo por 60 min, o material foi centrifugado a 16.000 x g/10 min a 4 °C e o

sobrenadante foi removido. O precipitado foi lavado com 500 µL de acetona 90 % em água,

centrifugado a 16.000 x g/10 min a 4 °C. O sobrenadante foi novamente removido e a lavagem

Fajardo FD METODOLOGIA

com acetona 90 % foi repetida. Após estar seco, o precipitado foi ressuspenso em Tris-HCl 0,06

M pH 6,8, glicerol 10 % (v/v), SDS 2 % (p/v), 2-β-mercaptoetanol 5 % (v/v) e azul de

bromofenol 0,025 % (p/v). A desnaturação das proteínas foi concluída em banho-maria, a 100

°C, por 5 min. Em um dos poços, aplicou-se 52,5 µg de proteína do material referente às

moléculas ligantes da TSi. Em outro poço foram aplicados 5µL de uma solução de marcadores

de massa molecular (14,4; 20,1; 30; 43; 67 e 94 kDa) preparada de acordo com o fabricante (GE

Healthcare, EUA). A corrida foi efetuada em gel de poliacrilamida (0,75 mm de espessura)

composto por um gel de empilhamento (4 % T) e um gel de separação (15 % T) a 200 V

constantes. Após a eletroforese, o gel foi fixado overnight em etanol 40 %, ácido acético 10 %

em água, sob agitação moderada. Após fixação, foi adicionado Coomassie Blue R-250 0,2 %

(p/v) em etanol 40 %, ácido acético 10 % em água, sob agitação moderada por 3 h. O gel foi

descorado com etanol 40 %, ácido acético 10 % em água, sob agitação moderada por 3 h. Após

descartar a solução descorante, a imagem do gel foi adquirida utilizando um sistema

ImageScanner associado ao software Image Master 2D platinum (GE Healthcare). As bandas

foram então excisadas do gel, para posterior digestão enzimática.

3.14 Digestão enzimática em gel (Modificado a partir de Shevchenko et al., 1996)

Após a eletroforese unidimensional, as bandas reveladas nos gel através da coloração por

Coomassie blue foram excisadas e colocadas separadamente em tubos siliconizados de 500 µL,

previamente lavados com metanol, água e metanol, separadamente. Estes pedaços de gel de

poliacrilamida contendo as proteínas de interesse foram tripsinizadas, para que os fragmentos

protéicos fossem retirados do gel e pudessem ser analisados no espectrômetro de massas. Esta

digestão seguiu as seguintes etapas:

Fajardo FD METODOLOGIA

1- O gel foi descorado, para que o Coomassie blue e o SDS não interferissem na digestão

enzimática, com solução de acetonitrila 50 %, bicarbonato de amônio 20 mM pH 8,0. Foram

feitas 3 lavagens de 15 min com 400 µL, sob agitação;

2- O descorante foi removido e o gel foi desidratado com 200 µL de acetonitrila por 5 min;

3- após retirar a acetonitrila, o gel foi seco no Speed Vac (Thermo Corp., EUA) por cerca de 15

min;

4- Os pedaços de gel foram tratados com 100 µL de DTT 10 mM por 30 min à temperatura

ambiente. A solução foi removida e os pedaços de gel foram alquilados com 100 µL de IAA 50

mM por 30 min à temperatura ambiente. Os géis foram lavados com 200 µL de bicarbonato de

amônio 100 mM por 10 min;

5- Após lavagem, os géis foram desidratados com 200 µL de acetonitrila por 5 min, rehidratados

com 200 µL de bicarbonato de amônio 100 mM por 10 min e desidratados novamente com 200

µL de acetonitrila (duas vezes);

6- Os géis foram secos no Speed Vac por 15 min;

7- Adicionou-se, 10 µL de tripsina 20 ng/µL (Promega Corp., EUA – Num. Catálogo V511) em

banho de gelo por 10 min para que a tripsina penetrasse no gel sem que a digestão fosse iniciada.

O excesso de tripsina foi removido e foram adicionados 20 µL de bicarbonato de amônio 50

mM, e a mistura foi incubada overnight a 37 °C;

8- Todo volume foi retirado e colocado em um tubo novo de 500 µL. Aos géis foram

adicionados 30 µL de ácido fórmico 5 %, acetonitrila 50 % em água por 30 min sob agitação

constante. Esta solução foi removida e adicionada ao tubo novo com a solução retirada

anteriormente. Este processo foi repetido mais uma vez e todos os extratos foram combinados no

mesmo tubo;

9- As amostras foram concentradas até atingirem o volume de 20 µL no Speed Vac.

Fajardo FD METODOLOGIA

Para o gel 2D, as bandas reveladas através da impregnação por prata, foram excisadas e

colocadas separadamente em tubos siliconizados de 500 µL, previamente lavados com metanol,

água e metanol, separadamente. Estes pedaços de gel de poliacrilamida contendo as proteínas de

interesse foram tripsinizados seguindo o protocolo descrito para a eletroforese unidimensional,

omitindo-se as etapas 1, 4, 5 e 6.

3.15 Identificação das proteínas por espectrometria de massas

Os peptídeos obtidos seguindo o protocolo descrito acima foram submetidos ao

seqüenciamento por espectrometria de massas em um LCQ DECA XP PLUS (Thermo Corp.,

EUA) tendo fonte de ionização do tipo electrospray (ESI-MS) e analisador do tipo ion-trap

acoplado a um cromatógrafo líquido de alta performance Surveyor (Thermo Corp., EUA).

Inicialmente, os peptídeos foram submetidos à separação em cromatografia de fase reversa em

coluna capilar C

(15 cm x 300 µm; 300 Å; 3µm) (SGE, Austrália). A fase móvel A foi ácido

fórmico a 0,1 % (v/v) em água e a fase móvel B foi ácido fórmico a 0,1 % (v/v) em acetonitrila.

O gradiente empregado para a separação dos peptídeos foi 5 % B em 5 min, 40 % B em 35 min,

60 % B em 45 min e 80 % B em 48 min. Nesta separação, os peptídeos mais hidrofílicos foram

pouco retidos na coluna sendo eluídos rapidamente e os mais hidrofóbicos foram retidos sendo

posteriormente eluídos pelo gradiente crescente de acetronitrila. À medida que os peptídeos

foram elúidos da coluna de fase reversa, fluíram por uma agulha, foram vaporizados e

subseqüentemente ionizados pelo uso de um forte potencial elétrico (electrospray). Essa

ionização gerou íons de múltiplas cargas que foram injetados no analisador do tipo íon-trap, e

dessa forma, os valores de massa/carga observados foram multiplicados pela carga e

correlacionados com o número de átomos observados, podendo-se calcular a massa molecular de

Fajardo FD METODOLOGIA

um dado peptídeo. Cada peptídeo observado foi isoladamente submetido a uma fragmentação

com um gás inerte (hélio) gerando um espectro de fragmentação (espectro MS/MS).

Os espectros MS/MS obtidos foram analisados com o software Bioworks Browser 3.1

SR1 (Thermo Corp., EUA) contra o banco de dados não-redundante do NCBI utilizando o

algoritmo SEQUEST (Yates et al., 1995). Considerou-se como identificação positiva todas

aquelas que atenderam aos critérios de valores de XCorr para cargas iguais ou superiores a 1,8

(carga +1) e 2,5 (carga +2). Essas identificações foram confirmadas pela análise manual dos

espectros e submissão das seqüências obtidas à busca no banco não-redundante do NCBI

utilizando o algorítmo Blastp (Altschul et al., 1997).

3.16 Confirmação da interação entre a TSi e anexina A2 através de ELISA (enzyme-linked

immunosorbant assay)

Para demonstrar a ligação da TSi à anexina A2, utilizamos ensaio imunoenzimático

(ELISA).

Os poços da placa de cultura foram incubados com TSi (50 µg/mL) overnight a 37 °C em

câmera úmida. Após este período, os poços foram lavados extensivamente com PBS acrescido de

0,05 % de Tween 20 (PBST) e bloqueados com tampão de bloqueio por 1 h (Gelatina SIGMA 1

% em PBS acrescido de 0,05 % de Tween 20). Os poços foram incubados com anexina A2t (50

µg/mL) (USBiological, United States Biological Inc., USA) overnight a 37 °C em câmera úmida.

Estes poços foram lavados extensivamente com PBST. Foi adicionado anticorpo anti-anexina A2

(5µg/mL) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) overnight a 37 °C em câmera úmida. Após

lavagens com PBST, foi adicionado aos poços anticorpo anti-cabra conjugado a peroxidase

(HRP) (1:5000), por 1 h a 37 °C em câmera úmida. Como controles positivos, fixamos os poços

da placa com TSi (50 µg/mL) ou com anexina A2t (50 µg/mL) overnight a 37 °C em câmera

Fajardo FD METODOLOGIA

úmida. Após lavagens com PBST, estes poços foram bloqueados com tampão de bloqueio e os

poços que foram fixados com TSi foram então incubados com anticorpo anti-TSi (5µg/mL)

(obtidos como descrito no item 3.10) e os poços que foram fixados com anexina A2t foram

incubados com anticorpo anti-anexina A2 (5µg/mL) overnight a 37 °C em câmera úmida. Todos

os poços foram lavados com PBST. Os poços que foram fixados com TSi foram incubados com

anticorpo anti-coelho HRP (1:5000) e os poços que foram fixados com anexina A2t foram

incubados com anticorpo anti-cabra HRP (1:5000). Nos poços relativos aos controles negativos,

foi utilizado anticorpo secundário anti-camundongo HRP (1:5000) ou omitidas algumas

moléculas da reação. Para a revelação, foi utilizado ácido 2,2-azino-bis (3-etil-benzotiazolina-6-

sulfônico) como substrato.

3.17 Ensaio de competição entre anti-anexina A2 e TSi

As células HBMEC cultivadas em discos de 10 cm de diâmetro (item 3.9) quando

atingiram a confluência, foram lavadas com PBS e deixadas em PBS por 2 h em banho de gelo

para que fossem soltas da superfície do disco. As células em suspensão foram contadas em

câmara de neubauer. Após lavagem com tampão de lavagem (TL-PBS, BSA 2 %, NaN

0,02 %)

1x10

células HBMEC foram centrifugadas a 1.500 x g/5 min. As células do primeiro ponto

experimental, obtidas após centrifugação, foram incubadas por 30 min em banho de gelo com

anti-anexina A2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) (1:200) seguida de lavagem com PBS;

incubação com TSi-b (1:1000) por 30 min; lavagem com PBS; incubação com estreptavidina

conjugada a ficoeritrina (EA-PE) (1:1000) por 30 min e lavagem com PBS. As células do

segundo ponto experimental, obtidas após centrifugação, foram incubadas por 30 min em banho

de gelo com TSi (1:100) seguida de: lavagem com PBS; incubação com anti-anexina A2 (1:200)

Fajardo FD METODOLOGIA

por 30 min; lavagem com PBS; incubação com anti-cabra conjugado a ficoeritrina (PE) (1:1000)

por 30 min e lavagem com PBS.

Para os controles positivos, as células foram incubadas, em banho de gelo, com TSi-b

(1:100) seguida de lavagem com PBS; incubação com EA-PE (1:1000) por 30 min e lavagem

com PBS ou incubadas, em banho de gelo, com anti-anexina A2 (1:200) seguida de: lavagem

com PBS; incubação com anti-cabra PE (1:1000) por 30 min e lavagem com PBS. Para os

controles negativos foram utilizadas células incubadas somente com as marcações secundárias

(anti-cabra PE ou EA-PE).

Após estas incubações, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e ressuspensas em 0,4

ml de PBS contendo 2 % de paraformaldeído (PFA). Depois de fixadas com PFA, as células

controles e as células do ensaio de competição foram analisadas por citometria de fluxo em

citômetro de Dickinson Xcalibur utilizando o programa Cell Quest.

3.18 Análise estatística

Todos os resultados foram expressos como a média ± o desvio padrão da média (S.D.M.).

A significância estatística foi determinada por ANOVA seguido de teste t. As diferenças foram

consideradas significativamente relevantes com p≤ 0,005.

Fajardo FD RESULTADOS

4.1 Obtenção da TSi

A TSi recombinante foi obtida a partir de E. coli MC 1061 eletrotransformada com o

plasmídeo contendo o inserto da TSi. A figura 07 mostra a homogeneidade da preparação

enzimática da TSi, sendo observada uma banda característica de 90 kDa referente à enzima, em

SDS-PAGE 10 % sob condições desnaturantes.

PM TSi

118

kDa

Figura 07: SDS-PAGE da TSi do T. cruzi. A enzima foi purificada conforme descrito

no item 3.2 da metodologia e 30 µg de proteína foram submetidas à eletroforese em SDS-

PAGE 10 % e coradas com Coomassie Blue. PM: padrão de massa molecular, as setas indicam

os marcadores de massa molecular.

4.2 Estímulo das células HBMEC com TSi antes da infecção com T. cruzi aumenta

adesão, infecção e número de parasitas liberados pelas células

A interação lectina/carboidrato pode resultar no reconhecimento, adesão e invasão do T.

cruzi à célula do hospedeiro (Burleigh e Andrews,1995). A TSi atua como uma lectina ligando-

se a cadeias O-ligadas contendo α2-3 ácido siálico na molécula de CD-43 presente na

superfície de linfócitos (Todeschini et al., 2002b). Estudos prévios em nosso laboratório,

utilizando células endoteliais, demonstram que a TSi é capaz de se ligar a moléculas contendo

Fajardo FD RESULTADOS

α2-3 ácido siálico na superfície das células endoteliais, desencadeando a via de NF-κB, com

aumento da expressão de moléculas de adesão e inibição da morte celular por apoptose

induzida pela depleção de SFB (Fajardo et al., 2004a). Como foi demonstrado que o NF-κB

modula a infecção pelo T. cruzi (Hall et al., 2000; Huang et al., 2003), nós analisamos o efeito

da TSi na adesão e infecção de células endoteliais por formas tripomastigotas do T. cruzi. As

células HBMEC foram estimuladas com TSi, LPS (utilizado como controle positivo, pois é

capaz de ativar células endoteliais) ou mucY, como descrito no item 3.6 da metodologia.

Nossos resultados demonstram que a ativação das células, tanto pela TSi quanto pelo LPS, é

capaz de aumentar significativamente (p> 0,001) a porcentagem de adesão de tripomastigotas à

superfície das células, 18,5 e 25,5 % respectivamente, quando comparada às células não

ativadas (5,0 %) ou incubadas com a mucY (4,3 %), conforme demonstrado na figura 08-A.

O estímulo das células endoteliais pela TSi e pelo LPS aumentou a porcentagem de

invasão da célula hospedeira pelo parasita, 53,7 e 48,7 %, respectivamente (figura 08-B),

quando comparado com o controle (24,0 %), como observado pelo aumento do número de

amastigotas intracelulares 3 dias após a infecção. Estes resultados foram confirmados pelo

aumento do número de tripomastigotas liberados no meio de cultura 5 dias após a infecção,

23,1 % nas culturas ativadas com TSi e 23,4 % nas culturas ativadas com LPS, quando

comparados às células não ativadas (5,0 %) ou incubadas com mucY (7,3 %), p>0.001 (figura

08-C).

Fajardo FD RESULTADOS

(A) (C)

(B)

sãoAde de tripomastigotas

Figura 08: Adesão e invasão de tripomastigotas após estímulos. As células HBMEC

foram ativadas com os estímulos indicados por 16 h e incubadas com 1x10

tripomastigotas/poço por 2 h. O número de parasitas aderidos (A), células infectadas (B) e

parasitas liberados (C) foi contado através de microscopia óptica, logo após a infecção, no

terceiro e no quinto dia após infecção, respectivamente. Os experimentos foram realizados em

triplicata de 5 experimentos diferentes (n=5). * p>0,001.

4.3 TSi compete com tripomastigotas do T. cruzi por sítios de ligação às células HBMEC

Para avaliar a participação da TSi no processo de adesão das formas tripomastigotas do

T. cruzi às células HBMEC, estas células foram estimuladas com TSi, LPS ou mucY overnight.

Neste caso, antes da adição do parasita, as células foram lavadas com PBS e incubadas com

TSi (50 μg/ml) por 30 min. As células HBMEC foram posteriormente incubadas com 1x10

tripomastigotas/poço por 2 h, fixadas e coradas com Giemsa. O número de parasitas aderidos

foi contado logo após a infecção, através de microscopia óptica.

Tripomastigotas/ 100 cels

Cont TSi LPS

MucY

Cont

TSi

LPS

MucY

Cont TSi LPS

MucY

Parasitas/ml x 10

% de células infectadas

Células infectadas Tripomastigotas liberados

Adesão de tripomastigotas

Tripomastigotas/ 100 cels

Cont TSi LPS

MucY

Cont

TSi

LPS

MucY

Cont TSi LPS

MucY

Parasitas/ml x 10

% de células infectadas

Células infectadas Tripomastigotas liberados

Fajardo FD RESULTADOS

Tripomastigotas/ 100 cels

Cont TSi LPS

MucY

Adesão de tripomastigotas

Figura 09: Competição entre a TSi e formas tripomastigotas do T. cruzi. As células

HBMEC foram ativadas com os estímulos indicados por 16 h e incubadas com 1x10

tripomastigotas/poço por 2 h. A adesão de tripomastigotas à HBMEC foi verificada na

ausência (barras cinzas) ou presença (barras azuis) de TSi 50 μg/ml 30 min antes da adição do

parasita. Os experimentos foram realizados em triplicata de 5 experimentos diferentes (n=5). *

p>0,001.

Como pode ser observada na figura 09, a adesão das formas tripomastigotas às células

HBMEC diminuiu quando as células foram pré-incubadas com TSi. Este resultado foi

observado nas células controle (sem adição da TSi = 7,1 %, com TSi antes da infecção = 1,9

%), nas células estimuladas overnight com TSi (18,1 e 6,6 %), nas células estimuladas

overnight com LPS (22,9 e 6,3 %;) e nas células estimuladas overnight com mucY (3,9 e 1,9

%), sugerindo que esta molécula é importante na interação parasita/hospedeiro, competindo

com o parasita pelo sítio de ligação na superfície das células HBMEC.

Com base nestes resultados, demonstramos que a TSi está envolvida na interação do T.

cruzi com as células HBMEC e que existem ligantes para esta enzima na superfície das células

Fajardo FD RESULTADOS

endoteliais estudadas, sugerindo sua significativa importância na modulação da infecção pelo

T. cruzi e consequentemente na patogênese da doença de Chagas.

A elucidação de mecanismos celulares e moleculares envolvidos na interação

parasita/hospedeiro é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias que bloqueiem

a infecção e, desta forma, objetivamos identificar as possíveis moléculas presentes na

superfície da célula do hospedeiro capazes de interagir com a TSi na superfície do T. cruzi.

4.4 Isolamento do(s) ligante(es) para TSi nas células HBMEC estimuladas com a enzima

Como a incubação prévia das células HBMEC com TSi foi capaz de aumentar a

infecção destas células, optamos por estudar o(s) ligante(es) para TSi na superfície das células

ativadas. As células HBMEC foram estimuladas overnight com TSi (10 µg/mL). Após este

período, as células foram lisadas com tampão de lise para obtenção do extrato celular total.

Este extrato celular foi submetido à cromatografia de afinidade com TSi, como descrito no

item 3.11 da metodologia, para que a(s) molécula(s) capaz(es) de se ligar à enzima fosse(m)

separada(s) do restante do material.

O material obtido após a cromatografia de afinidade, foi submetido à eletroforese

bidimensional. Na figura 10, podemos observar o padrão eletroforético obtido. Trinta e cinco

bandas foram identificadas e retiradas do gel e 8 foram analisadas por espectrometria de

massas. A escolha das bandas que foram submetidas à espectrometria de massas foi baseada na

intensidade (quantidade de proteína) das bandas observadas.

Fajardo FD RESULTADOS

kDa

Figura 10: Eletroforese bidimensional do material ligado à coluna de afinidade com

TSi. O material foi eluido como descrito no item 3.11 da metodologia. Dezoito µg de proteína

foram submetidas à eletroforese bidimensional e o gel foi corado através de impregnação por

prata como descrito no item 3.12 da metodologia. Em amarelo estão destacados as bandas que

foram excisadas do gel. PM: padrão de massa molecular, as setas indicam os marcadores de

massa molecular.

Na figura 11 podemos observar uma interação inespecífica insignificante entre a mesma

quantidade de extrato celular e a coluna de afinidade sem a TSi.

Fajardo FD RESULTADOS

kDa

Figura 11: Eletroforese bidimensional do material ligado à coluna de afinidade em

coluna controle (sem TSi). O material foi eluido como descrito no item 3.11 da metodologia. O

gel foi corado através de impregnação por prata como descrito no item 3.12 da metodologia.

PM: padrão de massa molecular, as setas indicam os marcadores de massa molecular.

As proteínas do gel 2D do material eluído após cromatografia de afinidade com TSi

foram separadas de acordo com peso molecular e ponto isoelétrico e foram então excisadas do

SDS-PAGE e submetidas à digestão enzimática com tripsina, como descrito no item 3.14 da

metodologia, para posterior análise por espectrometria de massas. Neste experimento, porém, a

quantidade de proteína presente nas bandas excisadas não foi suficiente para identificação por

espectrometria de massas.

Desta forma optamos por repetir a metodologia, adicionando uma nova etapa de

purificação. Após o material ser eluído da coluna de afinidade com TSi, foi submetido à

cromatografia de troca iônica com coluna Mono-Q. O material obtido após esta nova

purificação, foi submetido desta vez à eletroforese unidimensional em SDS-PAGE 15 %

(figura 12).

Fajardo FD RESULTADOS

20,1 kDa

14,4 kDa

30 kDa

43 kDa

67 kDa

94 kDa

Cont Pos

Cont Neg

kDa

20,1 kDa

14,4 kDa

30 kDa

43 kDa

67 kDa

94 kDa

Cont Pos

Cont Neg

kDa

Figura 12: Eletroforese unidimensional do material eluido após cromatografia de

afinidade com TSi e cromatografia de troca iônica com coluna Mono-Q. O material foi obtido

como descrito no item 3.13 da metodologia. Cinqüenta e duas µg de proteína foram submetidas

à eletroforese unidimensional e o gel foi corado com Coomassie Blue. Em amarelo estão

destacadas as bandas que foram excisadas do gel. PM: padrão de massa molecular, as setas

indicam os marcadores de massa molecular.

Neste gel, 6 bandas foram retiradas para serem posteriormente analisadas por

espectrometria de massas. A escolha das bandas que foram submetidas à espectrometria de

massas foi baseada na intensidade (quantidade de proteína) das bandas observadas

4.5 Análise dos ligantes da TSi por espectrometria de massas

As bandas no gel 1D foram excisadas, tripsinizadas e os peptídeos obtidos foram

submetidos ao seqüenciamento por ESI-MS.

Fajardo FD RESULTADOS

Os espectros MS/MS obtidos foram analisados e considerou-se como identificação

positiva todas aquelas que atenderam aos critérios de valores de XCorr para carga iguais ou

superiores a 1,8 (carga +1) e 2,5 (carga +2). Os resultados revelaram a presença das seguintes

proteínas: ciclofilina A; fosfoglicerato mutase; ubiquitina; triose fosfato isomerase; proteína de

choque térmico; proteína ribossomal S4; anexina A2 humana; gliceraldeído fosfato

desidrogenase e actina. Além dessas proteínas, também foram identificados os controles

positivo, glicogênio fosforilase e negativo, tripsina, listados na tabela 01 juntamente com suas

massas moleculares.

Tabela 01: Proteínas identificadas por MS/MS como ligantes da TSi

29 kDaTRIPSINACONT NEG

397 kDaGLICOGÊNIO FOSFORILASECONT POS

541 kDaACTINA6

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE5

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE

636 kDaANEXINA A24

130 kDaPROTEINA RIBOSSOMAL S4

429 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE3

223 kDaPROTEÍNA CHOQUE TÉRMICO

227 kDaTRIOSEFOSFATO ISOMERASE

125 kDaUBIQUITINA

129 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE2

318 kDaCICLOFILINA A1

PEPTPMPROTEÍNA IDENTIFICADANDA

29 kDaTRIPSINACONT NEG

397 kDaCONT POS

541 kDaACTINA6

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE5

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE

636 kDaANEXINA4

130 kDaPROTEINA RIBOSSOMAL S4

429 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE3

223 kDaPROTEÍNA CHOQUE TÉRMICO

227 kDaTRIOSEFOSFATO ISOMERASE

125 kDaUBIQUITINA

129 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE2

318 kDaCICLOFILINA A1

PEPTPMPROTEÍNA IDENTIFICADANDABA

29 kDaTRIPSINACONT NEG

397 kDaCONT POS

541 kDaACTINA6

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE5

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE

636 kDaANEXINA A24

130 kDaPROTEINA RIBOSSOMAL S4

429 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE3

223 kDaPROTEÍNA CHOQUE TÉRMICO

227 kDaTRIOSEFOSFATO ISOMERASE

125 kDaUBIQUITINA

129 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE2

318 kDaCICLOFILINA A1

PEPTPMPROTEÍNA IDENTIFICADANDABA

29 kDaTRIPSINACONT NEG

397 kDaCONT POS

541 kDaACTINA6

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE5

236 kDaGLICERALDEIDO FOSFATO DESIDROGENASE

636 kDaANEXINA4

130 kDaPROTEINA RIBOSSOMAL S4

429 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE3

223 kDaPROTEÍNA CHOQUE TÉRMICO

227 kDaTRIOSEFOSFATO ISOMERASE

125 kDaUBIQUITINA

129 kDaFOSFOGLICERATO MUTASE2

318 kDaCICLOFILINA A1

PEPTPMPROTEÍNA IDENTIFICADANDABA

Como o material que foi submetido à espectrometria de massas era proveniente do

extrato total de células HBMEC, a maioria das proteínas identificadas são proteínas

intracelulares. Estas proteínas podem ser alvo para a TSi, porém após a internalização do

parasita. Como nesta dissertação temos como objetivo a identificação de possíveis ligantes para

TSi na superfície celular, contribuindo desta forma para a adesão do T. cruzi à membrana

Fajardo FD RESULTADOS

plasmática da célula hospedeira, prosseguimos o estudo apenas com anexina A2 humana, única

entre as proteínas identificadas que pode estar presente na superfície celular.

Na figuras 13 à 18, estão demonstrados os espectros MS/MS obtidos através da

espectrometria de massas do banda 4, referente à anexina A2 humana identificada.

0.37825.063395%(K)GLGTDEDSLIEIIcSR(T)

SEQUEST

SEQUEST XCorrProbSequência

0.37825.063395%(K)GLGTDEDSLIEIIcSR(T)

SEQUEST

SEQUEST XCorrProbSequência

Intensidade relativa

(A)

(B)

(C)

Figura 13: Representação da seqüência peptídica (K)GLGTDEDSLIEIIcSR(T)

identificada através da espectrometria de massas. (A) Estão representados: a probabilidade de o

material analisado ser a proteína identificada (Prob), SEQUEST XCorr e SEQUEST ∆Cn; (B)

Imagem do espectro MS/MS obtido a partir do íon precursor de 1.776,79 Da. Em azul estão

destacados os íons pertencentes à série y, em vermelho os pertencentes à série b e em verde, os

íons pertencentes à série y ou à série b, com redução de uma molécula de água ou de um

grupamento amino. Em (C), estes resultados estão representados em forma de tabela, com o

peso molecular dos íons da série b e da série Y e a sigla dos aminoácidos identificados.

Fajardo FD RESULTADOS

0.40264.935895%(K)TDLEKDIISDTSGDFR(K)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

0.40264.935895%(K)TDLEKDIISDTSGDFR(K)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

Intensidade relativa

(A)

(B)

(C)

Figura 14: Representação da seqüência peptídica (K)TDLEKDIISDTSGDFR(K)

identificada através da espectrometria de massas. (A) Estão representados: a probabilidade de o

material analisado ser a proteína identificada (Prob), SEQUEST XCorr e SEQUEST ∆Cn; (B)

Imagem do espectro MS/MS obtido a partir do íon precursor de 1.811,06 Da. Em azul estão

destacados os íons pertencentes à série y, em vermelho os pertencentes à série b e em verde, os

íons pertencentes à série y ou à série b, com redução de uma molécula de água ou de um

grupamento amino. Em (C), estes resultados estão representados em forma de tabela, com o

peso molecular dos íons da série b e da série Y e a sigla dos aminoácidos identificados.

Fajardo FD RESULTADOS

0.40333.906495%(K)TPAQYDASELK(A)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

0.40333.906495%(K)TPAQYDASELK(A)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

Intensidade relativa

(A)

(B)

(C)

Figura 15: Representação da seqüência peptídica (K)TPAQYDASELK(A) identificada

através da espectrometria de massas. (A) Estão representados: a probabilidade de o material

analisado ser a proteína identificada (Prob), SEQUEST XCorr e SEQUEST ∆Cn; (B) Imagem

do espectro MS/MS obtido a partir do íon precursor de 1.221,54 Da. Em azul estão destacados

os íons pertencentes à série y, em vermelho os pertencentes à série b e em verde, os íons

pertencentes à série y ou à série b, com redução de uma molécula de água ou de um

grupamento amino. Em (C), estes resultados estão representados em forma de tabela, com o

peso molecular dos íons da série b e da série Y e a sigla dos aminoácidos identificados.

Fajardo FD RESULTADOS

0.08533.874595%(R)TNQELQEINR(V)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

0.08533.874595%(R)TNQELQEINR(V)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

Intensidade relativa

(A)

(B)

(C)

Figura 16: Representação da seqüência peptídica (R)TNQELQEINR(V) identificada

através da espectrometria de massas. (A) Estão representados: a probabilidade de o material

analisado ser a proteína identificada (Prob), SEQUEST XCorr e SEQUEST ∆Cn; (B) Imagem

do espectro MS/MS obtido a partir do íon precursor de 1.243,59 Da. Em azul estão destacados

os íons pertencentes à série y, em vermelho os pertencentes à série b e em verde, os íons

pertencentes à série y ou à série b, com redução de uma molécula de água ou de um

grupamento amino. Em (C), estes resultados estão representados em forma de tabela, com o

peso molecular dos íons da série b e da série Y e a sigla dos aminoácidos identificados.

Fajardo FD RESULTADOS

0.38272.972995%(K)TPAQYDASELK(A)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

0.38272.972995%(K)TPAQYDASELK(A)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequência

Intensidade relativa

(A)

(B)

(C)

Figura 17: Representação da seqüência peptídica (K)TPAQYDASELK(A) identificada

através da espectrometria de massas. (A) Estão representados: a probabilidade de o material

analisado ser a proteína identificada (Prob), SEQUEST XCorr e SEQUEST ∆Cn; (B) Imagem

do espectro MS/MS obtido a partir do íon precursor de 1.221,51 Da. Em azul estão destacados

os íons pertencentes à série y, em vermelho os pertencentes à série b e em verde, os íons

pertencentes à série y ou à série b, com redução de uma molécula de água ou de um

grupamento amino. Em (C), estes resultados estão representados em forma de tabela, com o

peso molecular dos íons da série b e da série Y e a sigla dos aminoácidos identificados.

Fajardo FD RESULTADOS

0.26032.521595%(K)DIISDTSGDFR(K)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequence

0.26032.521595%(K)DIISDTSGDFR(K)

SEQUEST ?CnSEQUEST XCorrProbSequence

Intensidade relativa

(A)

(B)

(C)

Figura 18: Representação da seqüência peptídica (K)DIISDTSGDFR(K) identificada

através da espectrometria de massas. (A) Estão representados: a probabilidade de o material

analisado ser a proteína identificada (Prob), SEQUEST XCorr e SEQUEST ∆Cn; (B) Imagem

do espectro MS/MS obtido a partir do íon precursor de 1.224,47 Da. Em azul estão destacados

os íons pertencentes à série y, em vermelho os pertencentes à série b e em verde, os íons

pertencentes à série y ou à série b, com redução de uma molécula de água ou de um

grupamento amino. Em (C), estes resultados estão representados em forma de tabela, com o

peso molecular dos íons da série b e da série Y e a sigla dos aminoácidos identificados.

Fajardo FD RESULTADOS

Como foi ilustrado nas figuras 13 a 18, seis espectros MS/MS foram obtidos na análise

do banda 4 do gel 1D. Esses peptídeos foram identificados com 95 % de confiança e

representam 18 % do total da molécula de anexina A2 humana, como demonstrado na figura

19.

P S A Y G S V K A Y T N F D A E R D A L

Figura 19: Representação esquemática dos peptídeos identificados como anexina A2.

Os peptídeos identificados estão destacados em amarelo e representam 18 % da molécula.

4.6 Análise da interação entre a TSi e anexina A2t por ELISA

Para demonstrar a interação entre a TSi e anexina A2, utilizamos ensaio imunoenzimático

(ELISA) (figura 20). Podemos observar que a anexina A2 foi capaz de se ligar à TSi fixada na

placa (figura 20-E) e o valor de densidade óptica obtido neste ponto (0,6251) foi similar ao

obtido quando a anexina A2 foi fixada (figura 20-D) (0,5795) ou quando o anticorpo anti-TSi

foi adicionado à TSi foi fixada (figura 20-F) (0,3974), mas não quando foi utilizado anticorpo

anti-camundongo (figura 20-C) (0,0652) ou quando a placa foi incubada somente com

anticorpo anti-cabra HRP (figura 20-A) (0,0573) ou com TSi e anti-cabra HRP (figura 20-B)

(0,0899).

Fajardo FD RESULTADOS

TSi + + + +

Anexina A2t + + +

Anti-anexina A2 + + +

Anti-cabra HRP + + + +

Anti-camundongo HRP +

Anti-TSi +

Anti-coelho HRP +

A B C D E F

0.00

0.25

0.50

0.75

DO (460 nm)

Figura 20: Avaliação da interação entre a TSi e anexina A2 por ELISA. A placa de

ELISA com as moléculas indicadas, revelada com ácido 2,2-azino-bis (3-etil-benzotiazolina-6-

sulfônico) como substrato e quantificada a 460 nm.

Através deste experimento demonstramos que a TSi se liga à anexina A2t purificada de

pulmão de boi.

4.7 TSi se liga a anexina A2 na superfície das células HBMEC

Os resultados acima descritos, aliados a estudos demonstrando que a anexina A2 atua

como receptor para a adesão de vários microrganismos à superfície de células endoteliais e

outros tipos celulares (Wright et al., 1994; Kirschnek et al., 2005; Das et al., 2005) nos

estimularam a utilizar citometria de fluxo para verificar a interação entre a TSi e anexina A2

presente na superfície celular das HBMEC.

Fajardo FD RESULTADOS

A comparação dos histogramas apresentados na figura 21-A e C prova que a TSi é

capaz de se ligar à superfície externa das células HBMEC, corroborando resultados

previamente encontrados em nosso laboratório (Fajardo et al., 2004a). A comparação das

figuras 21-B e 21-D comprova a presença da anexina A2 na superfíce celular, conforme

descrito na literatura (Waisman, 1995; Gerke e Moss, 2002; Rescher e Gerke, 2004).

A figura 21-F mostra que a pré-incubação das células com TSi bloqueou a ligação do

anticorpo anti-anexina A2 à superfície celular, sugerindo que as TSi interage com a anexina

A2. Confirmando este resultado, a incubação prévia das células HBMEC com anticorpo anti-

anexina A2, bloqueou a ligação da TSi-b à superfície celular (figura 21-E).

Juntos estes resultados demonstram que a anexina A2 pode atuar como um ligante para

a TSi na superfície das células HBMEC.

(A)

(C)

(E)

(B)

(D)

(F)

Figura 21: Demonstração entre a TSi e a anexina A2 na superfície das células HBMEC

através de citometria de fluxo. As células HBMEC foram incubadas com anti-anexina A2

seguida de TSi-b e EA-PE (E). As células do segundo ponto experimental foram incubadas

com TSi seguida de anti-anexina A2 e posteriormente anti-cabra PE (F). Para os controles

positivos, as células foram incubadas com TSi-b seguida de EA-PE (A) ou com anti-anexina

A2 seguida de anti-cabra PE (B). Para os controles negativos, foram utilizadas células

Fajardo FD RESULTADOS

incubadas somente com as marcações secundárias [EA-PE (C) ou anti-cabra PE (D)]. Depois

de fixadas com PFA, as células controles e as células do ensaio de competição foram

analisadas por citometria de fluxo em citômetro de Dickinson Xcalibur utilizando o programa

Cell Quest.

Fajardo FD DISCUSSÃO

A doença de Chagas ainda é um importante problema de saúde na América Latina, já que

não há drogas efetivas para a infecção crônica (Reyes e Vallejo, 2005). O T. cruzi é o agente

etiológico dessa doença que apresenta como principais características, lesões irreversíveis de

órgãos do sistema nervoso periférico, do trato digestivo e do coração. Apesar de quase cem anos

de pesquisa sobre a doença, muitos aspectos da interação entre o T. cruzi e seu hospedeiro

vertebrado e do estabelecimento da doença ainda permanecem sem explicações.

Como a principal forma de transmissão da doença é a vetorial, através da picada do inseto

hematófago, o T. cruzi encontra-se inicialmente na pele ou mucosa do indivíduo.

Por possuir

replicação intracelular obrigatória, o parasita invade as células do hospedeiro no local da picada,

diferencia-se e multiplica-se, dando origem a formas amastigotas intracelulares, que se

diferenciam em tripomastigotas antes do rompimento da célula hospedeira. Estes parasitas, ainda

presentes no tecido epitelial, atingem a corrente sanguínea, migrando para os tecidos alvos e

podendo estabelecer a infecção. Porém, para que este processo ocorra, o parasita necessita,

primeiramente ultrapassar a barreira endotelial para atingir a corrente sangüínea e,

posteriormente, ultrapassar esta barreira para dirigir-se aos órgãos e tecidos mais comumente

infectados, como trato digestivo e coração (processo este que não está claramente entendido).

Nesta dissertação observamos que o estímulo de células endoteliais HBMEC com TSi é

capaz de provocar o aumento da adesão e infecção dessas células por formas tripomastigotas do

T. cruzi. Além disso, demonstramos que a TSi compete com o parasita pelo sítio de interação

com a célula endotelial utilizada. Estes resultados sugerem que existem receptores para a TSi na

superfície das células estudadas, motivando-nos a estudá-los. Como conseqüência desses

estudos, identificamos, através da técnica de espectrometria de massas, uma proteína de 36 kDa

como um dos possíveis ligantes para a TSi em células endoteliais. Esta proteína foi identificada,

com aproximadamente 100 % de confiança, como a anexina A2 humana. Para confirmar a

Fajardo FD DISCUSSÃO

interação entre a TSi e a anexina A2 utilizamos ensaio imunoenzimático (ELISA) e citometria de

fluxo.

Estudos prévios demonstraram que o T. cruzi é capaz de aderir à membrana plasmática,

invadir, infectar (Mukherjee et al.,2004) e ativar a via de NF-κB (Huang et al., 1999; Hall et al.,

2000), resultando na expressão de moléculas de adesão em células endoteliais (Zhang e Tarleton,

1996; Huang et al., 1999). Nosso grupo demonstrou (Fajardo et al., 2004) que a TSi é capaz de

se ligar à superfície das células HBMEC, levando à ativação da via de NF-κB e ao aumento da

expressão de moléculas de adesão. As moléculas de adesão estão envolvidas no recrutamento de

leucócitos circulantes, um passo importante no início da inflamação e no controle da infecção

(Hall, 2000; Michailowsky et al., 2004). Desta forma, os resultados obtidos nesta dissertação,

demonstrando a importância da TSi nos processos de adesão e infecção da célula do hospedeiro

por formas tripomastigotas do T. cruzi, através do aumento da adesão, número de células

infectadas e parasitas liberados, além da competição com o parasita pelo sítio de interação com a

célula endotelial, sugerem um importante papel para a TSi na modulação da infecção pelo T.

cruzi e conseqüentemente na patogênese da doença de Chagas.

A invasão de células do hospedeiro, além de ser uma estratégia de evasão, é essencial

para a sobrevivência e replicação do T. cruzi no hospedeiro vertebrado (Dvorak e Hyde, 1973). A

identificação de moléculas que possam estar envolvidas nos primeiros estágios do processo de

invasão, como a adesão parasita/hospedeiro, e sinalização, é de grande importância para o

desenvolvimento de novas estratégias que possam inibir a infecção pelo T. cruzi.

Neste estudo, utilizamos a espectrometria de massas para a identificação de moléculas

presentes na superfície das células HBMEC que poderiam atuar como ligantes para a TSi. A

espectrometria de massas baseia-se na determinação precisa da massa molecular de íons em fase

gasosa e possibilita aplicações no estudo de proteínas como a determinação da massa molecular,

Fajardo FD DISCUSSÃO

a quantificação de cisteínas, a localização de pontes dissulfeto, a determinação de modificações

pós-traducionais, a determinação da seqüência de aminoácidos permitindo a identificação de

proteínas (Larsen e Roepstorff, 2000). A espectrometria de massas não mede a massa das

moléculas analisadas, mas sim o seu valor de massa/carga (m/z). A ionização por eletrospray

(ESI-MS) gera íons com múltiplas cargas. Desta forma os valores de massa/carga observados

devem ser multiplicados pela carga e correlacionados com o número de prótons observados,

podendo-se calcular a massa molecular de um dado peptídeo (Steen e Mann, 2004). Na

ionização por eletrospray o tipo de analisador utilizado é o íon trap (armadilha de íons) que

analisa os peptídeos iônicos tripsinizados e protonados, após estes passarem por um campo

elétrico (armadilha de íons) que libera os peptídeos de acordo com os seus valores de m/z

formando, assim, o espectro de massas que será analisado. A utilização de cromatografia de

afinidade aliada à ESI-MS tornou possível identificar com aproximadamente 100 % de

confiança, a anexina A2 humana como uma das proteínas ligantes para TSi na superfície de

células HBMEC. A interação entre estas duas moléculas foi confirmada ELISA.

Corroborando nossos resultados prévios (Fajardo et al., 2004) observamos através de

citometria de fluxo que a TSi foi capaz de se ligar à superfície das células HBMEC.

Comprovamos também a presença da anexina A2 na superfíce celular, conforme descrito na

literatura (Waisman, 1995; Gerke e Moss, 2002; Rescher e Gerke, 2004). Além disso, a

competição entre a TSi e o anticorpo anti-anexina A2 demontra que a anexina A2 pode atuar

como um ligante para a TSi na superfície das células HBMEC.

A anexina A2 é uma proteína pertencente à família das anexinas, que são proteínas

ligadoras de fosfolipídio, Ca

-dependentes (Gerke et al., 2002) e que podem estar presentes na

membrana plasmática. Muitas funções já foram descritas para a anexina A2, por exemplo, como

catalisador do processo Plasminogênio/Plasmina (Hajjar et al., 1999); receptor de β

Fajardo FD DISCUSSÃO

glicoproteína I (β

GPI) (Zhang et al., 2005), Tenascina C (Chung e Erickson, 1994) dentre

outras, na superfície de células endoteliais. Este é o primeiro trabalho em que a anexina A2 é

descrita como receptor para uma molécula presente em um tripanossomatídeo.

Estudos anteriores demonstraram a importância da anexina A2 presente na superfície

celular, nos processos de infecção viral e bacteriana estabelecidos em células epiteliais e

endoteliais. Wright e colaboradores demonstraram (1994) que a anexina A2 presente na

superfície de células endoteliais é capaz de se ligar a citomegalovírus humano (HCMV) e mais

recentemente, Raynor e colaboradores (1999) demonstraram que além de se ligar a HCMV,

anexina A2 também é capaz de aumentar a ligação e fusão do vírus às membranas de

fosfolipídios.

Estudos mais recentes, utilizando células epiteliais, demonstraram que a anexina A2 pode

funcionar como receptor para patógenos bacterianos (Das et al., 2005; Kirschnek et al., 2005).

Kirschnek e colaboradores (2005) demonstram que a anexina A2 funciona como receptor para

Pseudomonas aeruginosa na superfície de células epiteliais e é, pelo menos parcialmente,

requerida para internalização da bactéria por estas células.

Das e colaboradores (2005) demonstraram que a anexina A2 atua como receptor para

Helicobacter pylori e que sua expressão é aumentada em até 2,5 vezes quando as células

epiteliais gástricas são infectadas com a bactéria, em comparação com as células não infectadas.

Existem várias coincidências entre os efeitos biológicos encontrados para a TSi do T.

cruzi (Fajardo et al., 2004) e os descritos para a anexina A2. Além de atuar como receptor para

diversas moléculas solúveis, vírus e bactérias, como descrito anteriormente, a anexina A2 parece

também atuar nos processos de ativação e sinalização celular. Recentemente, Laumonnier e

colaboradores (2006) identificaram a anexina A2t como receptor para plasmina na superfície de

Fajardo FD DISCUSSÃO

monócitos e demonstraram que a sinalização pró-inflamatória desencadeada nestas células,

quando expostas a plasmina, é dependente de anexina A2t. Essa ativação em monócitos estimula

muitas vias de sinalização, incluindo a via de NF-κB que leva à produção de TNF- α (Syrovets et

al., 2001). Como citado anteriormente, a TSi ativa a via de NF-κB e aumenta a expressão das

moléculas de adesão ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina em células endoteliais (Fajardo et al.,

2004). Além disso, Brichory e colaboradores (2001) demonstraram que pacientes com

autoanticorpos anti-anexina A2 possuem níveis, significativamente, mais altos de IL-6 quando

comparados a pacientes sem esses anticorpos, e que o tratamento de uma linhagem de células

epiteliais com IL-6 resulta em um aumento de anexina A2 na superfície celular. Já foi

demonstrado também que a TSi é capaz de aumentar a expressão de IL-6 em células endoteliais

de forma similar à observada quando as células são tratadas com LPS (Saavedra et al., 1999).

Estes dados podem explicar o fato do estímulo das células HBMEC com LPS ter aumentado a

adesão do T. cruzi às células (figura 08) e da TSi, adicionada antes do parasita, ter inibido a

adesão (figura 09), pois o LPS poderia induzir o aumento da expressão de IL-6 nas células

HBMEC, que levaria ao conseqüente aumento de anexina A2 na membrana plasmática,

aumentando desta forma o número de sítios de interação para a TSi, que adicionada antes do

parasita, impede a adesão deste.

A anexina A2t também é capaz de mediar a ativação de células endoteliais desencadeada

por anticorpos β

-glicoproteína I (β

GPI) (Zhang et al., 2005). A anexina A2t atua como receptor

para β

GPI na superfície de células endoteliais. β

GPI é uma glicoproteína plasmática que,

recentemente, foi descoberta como importante auto-antígeno na síndrome do anticorpo

antifosfolipídio. A utilização de anticorpos anti-β

GPI é capaz de ativar células endoteliais,

através da expressão de E-selectina, ICAM-1, VCAM-1, IL-1β, IL-6 e IL-8. A β

GPI liga-se às

Fajardo FD DISCUSSÃO

células endoteliais através da interação de alta afinidade com anexina A2t. Estudos preliminares

sugerem um importante papel para a anexina A2t, induzindo respostas de sinalização em células

endoteliais que levam à ativação celular, através da formação do complexo anti-β

GPI – β

GPI –

anexina A2t (Ma et al., 2000; Zhang et al., 2005). A ativação de células endoteliais, mediada

por anti–β

GPI leva à cascata de sinalização endotelial, similar à cascata ativada por LPS,

envolvendo TRAF-6 e Myd-88. O receptor celular para LPS é o Toll like receptor 4 (TLR-4) e a

sinalização desencadeada por esta molécula leva à ativação da via de NF-κB (Meroni et al.,

2004; Zhang et al., 2005). Devido ao fato de que β

GPI pode interagir com TLR-4 pela sua

homologia com estruturas microbianas e ao fato de que anexina A2 não é uma proteína

transmembrana e, por isto, pode requerer a presença de uma proteína “adaptadora”

transmembrana para desencadear a sinalização celular, Meroni e colaboradores (2004)

especularam que o TLR-4 poderia ser esta proteína “adaptadora” responsável pela sinalização

desencadeada (figura 22). Esta hipótese poderia explicar o aparente paradoxo observado em

recentes estudos que atribuem à anexina A2 um papel importante em diversos modelos de

sinalização, mesmo não possuindo uma seqüência peptídica sinal para inserção na membrana

plasmática.

Fajardo FD DISCUSSÃO

Sinalização

Fosfolipídios

Anexina A2

Figura 22: Resumo de um possível mecanismo de ligação e sinalização induzidas por

anticorpos circulantes anti-β

GPI em células endoteliais. β

GPI pode se ligar a fosfolipídios da

membrana ou ser reconhecida como ligante para anexina A2. Anexina A2 não possui nenhuma

porção citoplasmática para transduzir sinalização. Entretanto β

GPI pode interagir com TLR-4

pela sua homologia com estruturas microbianas, ligantes naturais de TLR-4. Uma vez que o

complexo está formado pelo anti- β

GPI circulante, a polimerização do TLR desencadeia a

sinalização levando a translocação de NF-κB (adaptado de Meroni et al., 2004).

De acordo com esta hipótese podemos propor que a TSi presente na superfície das formas

tripomastigotas do T. cruzi se ligaria à anexina A2, um de seus possíveis ligantes na superfície de

células HBMEC. A anexina A2 estaria associada ao receptor TLR-4 e essa interação

desencadearia uma cascata de sinalização, com subseqüente ativação da via de NF-κB. A

ativação dessa cascata de sinalização levaria à ativação celular, que dentre outros eventos,

culminaria com o aumento na expressão de moléculas de adesão que poderiam atuar na

modulação da resposta imune do hospedeiro e no controle da parasitemia, eventos que são

observados durante a doença de Chagas. Além disso, a expressão de moléculas de adesão poderia

participar do processo de transmigração do parasita para alcançar novos órgãos e tecidos. Essa

Fajardo FD DISCUSSÃO

interação (TSi/anexina A2) também poderia desencadear o aumento da expressão de moléculas

que atuam como ligantes para TSi na superfície da HBMEC, consequentemente aumentando a

adesão e infecção do parasita que o possibilitaria a atingir novos órgãos e tecidos. Neste modelo,

a anexina A2 estaria atuando como uma molécula pró-inflamatória, possibilitando ao hospedeiro

o controle da infecção, ao mesmo tempo em que permitiria ao parasita, sua disseminação. Este

modelo está esquematizado na figura 23.

TSi

TLR4?TLR4?

AIIt

HBMEC

I-κB

NF-κBNF-κB

Núcleo

Ativação celular

Proteína

“adaptadora”

transmembrana

Cascata de sinalização

Expressão de mols

de adesão

Modulação da

resposta imune

Controle da parasitemia

Expressão de mols

receptores para TSi

Adesão e infecção

Alcance de novos

órgãos e tecidos

Transmigração

do parasita

Figura 23: Representação esquemática do modelo proposto para a sinalização

desencadeada pela interação TSi/anexina A2.

Fajardo FD DISCUSSÃO

Além de participar dos eventos de sinalização observados, a interação TSi/anexina A2

também pode atuar na infecção da célula endotelial pelo T. cruzi. Estudos demonstram que a

ligação de produtos do T. cruzi causa um aumento transitório de Ca

intracelular nas células do

hospedeiro que desestabiliza o citoesqueleto cortical de actina, levando à sua ruptura e induzindo

o recrutamento de lisossomos mediado por microtúbulos e a fusão destes à membrana plasmática

no sítio de adesão do parasita para formação do vacúolo parasitóforo que irá envolvê-lo (figura

24) (Tan e Andrews, 2002; Gruenheid e Finlay, 2003). Ainda, foi demonstrado que o aumento de

intracelular em células endoteliais pode levar à associação da anexina A2 com a subunidade

p11, assim como a mobilização para a membrana plasmática do complexo A2t formado (Deora

et al., 2004). Desta forma, um modelo poderia ser proposto, onde a ligação da TSi e/ou de outras

moléculas do T. cruzi à superfície das células endoteliais induziria o influxo de Ca

, levando à

ruptura do citoesqueleto cortical de actina; associação de anexina A2 com a proteína p11 (ambas

intracelulares) e o aumento da expressão deste complexo na membrana plasmática; aumento da

ligação da TSi do T. cruzi à anexina A2 (com conseqüente aumento na adesão do parasita),

recrutamento e fusão dos lisossomas e formação do vacúolo parasitóforo. Não existem, porém,

evidências concretas para estas hipóteses e estudos mais aprofundados devem ser desenvolvidos.

Fajardo FD DISCUSSÃO

Figura 24: Representação esquemática da invasão do T. cruzi. A ligação de

produtos do T. cruzi causa um aumento transitório de Ca

intracelular nas células do hospedeiro

que desestabiliza o citoesqueleto cortical de actina, levando à sua ruptura e induzindo o

recrutamento de lisossomos mediado por microtúbulos e a fusão destes à membrana plasmática

no sítio de adesão do parasita para formação do vacúolo parasitóforo que irá envolvê-lo

(Gruenheid e Finlay, 2003).

Recentemente nosso grupo demonstrou que a TSi atua como uma lectina, sendo

capaz de reconhecer α2-3-sialosídeos e βGalp de uma maneira seqüencial ordenada, onde a

ligação com ácido siálico α2-3-ligado induz uma mudança conformacional da TSi, criando um

segundo sítio de ligação que capacita a interação com o β-galactosídeo (Todeschini et al., 2004).

A existência de dois sítios de ligação na TSi sugere que a enzima seja capaz de se ligar a duas

moléculas na superfície celular da célula hospedeira, propiciando condições para sinalizações

celulares. Poucos estudos, porém, foram feitos sobre a glicosilação e, principalmente, sobre a

sialilação da anexina A2 (Goulet et al., 1992). No entanto, Brichory e colaboradores (2001)

Fajardo FD DISCUSSÃO

demonstraram um possível sítio de N-glicosilação no aminoácido da posição 61 da região N-

terminal da anexina A2. Neste trabalho, a N-deglicosilação, com endoglicosidase F, induziu uma

alteração do PI da anexina A2 para um ponto mais básico, sem uma aparente mudança

significativa no seu peso molecular, sugerindo a presença de ácido siálico em oligossacarídeos

N-ligados. Mais estudos utilizando enzimas, como a endoglicosidase acima citada, sialidases e

estudos de competição com sialosídeos e galactosídeos são necessários para um maior

esclarecimento deste tipo de modificação na anexina A2.

A Tc-85, outro membro da família das trans-sialidases que não possui atividade

enzimática, demonstra atividade adesina para laminina e citoqueratina-18, estabelecendo

interação do tipo proteína-proteína com estas moléculas (Magdesian et al., 2001). Alguns

estudos envolvendo a anexina A2 como receptor para outras proteínas, como por exemplo

plasmina e tPA (Chung e Erickson, 1994; Hajjar e Krishnan, 1999; Laumonnier et al., 2006)

demonstraram que essa interação é do tipo proteína-proteína, como no caso da plasmina, onde

esta molécula interage com a Lys na posição 27 da região N-terminal da anexina A2

(Laumonnier et al., 2006). Desta forma, estudos utilizando sequências peptídicas da anexina A2

são necessários para a elucidação do mecanismo de interação entre esta molécula e a TSi do T.

cruzi.

O fato de que a prévia incubação das células HBMEC com TSi impede quase

completamente a ligação do anticorpo anti-anexina A2 a estas células, mas a incubação prévia do

anticorpo anti-anexina A2 inibe, mas não completamente, a ligação da TSi às células, corrobora

a idéia de que existe mais de uma molécula ligante de TSi na superfície das células HBMEC,

porém também demonstra, devido a grande inibição observada, a relevante importância do

ligante aqui identificado no processo de adesão do parasita.

Fajardo FD DISCUSSÃO

Outras proteínas foram identificadas como possiveis ligantes da TSi através da

espectrometria de massas (ciclofilina A; fosfoglicerato mutase; ubiquitina; triose fosfato

isomerase; proteína de choque térmico; proteína ribossomal S4; gliceraldeído fosfato

desidrogenase; tripsina e actina) porém, essas proteínas não se encontram na superfície celular,

foco deste estudo. Como o parasita é internalizado após a adesão, estudos mais detalhados devem

ser feitos com essas proteínas para identificação de possíveis moléculas às quais o parasita possa

se aderir no interior da célula hospedeira. Além disso, a TSi está associada ao parasita através de

uma âncora de GPI, podendo ser liberada e também poderia atuar distante deste.

Neste trabalho, demonstramos um possível mecanismo de interação entre a TSi e células

endoteliais de medula óssea humana (HBMEC). Observamos a presença de uma proteína de 36

kDa, identificada como anexina A2 humana, na membrana plasmática dessas células e que de

acordo com nossos resultados, poderia ser uma das moléculas responsáveis pela adesão do

parasita a células HBMEC e poderia atuar nos mecanismos moleculares responsáveis pela

cronificação da doença de Chagas.

Fajardo FD CONCLUSÕES

6. Conclusões

• O estímulo de células HBMEC com TSi aumenta a adesão e infecção de células

HBMEC por formas tripomastigotas do T. cruzi, possivelmente pela indução do

aumento da expressão de ligantes para a enzima na superfície destas células;

• A TSi compete com o parasita pelo sítio de interação com a célula endotelial utilizada,

demonstrando que esta enzima está envolvida na interação entre o T. cruzi e células

HBMEC e sugerindo uma significativa importância na modulação da infecção por este

parasita e consequentemente na patogênese da doença de Chagas;

• A anexina A2 pode atuar como um dos ligantes para a TSi na superfície dessas células

e ser uma das moléculas responsáveis pela ativação celular desencadeada pela enzima;

• Pela primeira vez foi demonstrado a anexina A2 atuando como um ligante para uma

molécula expressa em um tripanosomatídeo.

Fajardo FD PERSPECTIVAS

7. Perspectivas

Nossos estudos prévios demonstram que a TSi é capaz de ativar células

HBMEC, desencadeando a via de NF-κB e provocando o aumento da expressão de

moléculas de adesão (Fajardo et al., 2004). Como nesta dissertação identificamos a

anexina A2 como um ligante para a TSi na superfície das células endoteliais estudadas,

visamos agora estudar se os efeitos acima mencionados são desencadeados por essa

interação. Objetivamos também elucidar como essa interação ocorre, estabelecendo os

sítios de ligação para a TSi na molécula de anexina A2.

Além da anexina A2, outras moléculas foram identificadas através da

espectrometria de massas, como sendo capazes de se ligar à TSi. Estas moléculas não

foram estudadas nesta dissertação, pois tínhamos como objetivo a identificação de

moléculas presentes na superfície celular, porém, em futuros estudos estas moléculas

devem ser estudadas para que alvos intracelulares para a TSi também sejam

identificados e suas funções estabelecidas.

Fajardo FD REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8. Referências bibliográficas

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