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Zeila Pinheiro Lima
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DOS
EXTRATOS E FRAÇÕES DE Alchornea glandulosa E Alchornea
triplinervia.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. CLÉLIA AKIKO HIRUMA-LIMA
CO-ORIENTADORA: PROFA.DRA.CLAUDIA HELENA PELLIZZON
BOTUCATU-SP
2006
Disser
tação apresentada ao Institudo de
Biociências de Botucatu da Universidade
Estadual Paulista –
UNESP, para obtenção
do título de mestre em Ciências Biológicas
(área de concentração: Farmacologia) .
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UM MANUAL DE SOBREVIVÊNCIA
“Depois de algum tempo você aprende a diferença, a sutil diferença entre dar a mão e
acorrentar uma alma. E você aprende que amar não significa apoiar-se. E que companhia nem
sempre significa segurança. E começa aprender que beijos não são contratos e nem
promessas. E começa a aceitar suas derrotas com a cabeça erguida e olhos adiante, com a
graça de um adulto e não com a tristeza de uma criança.
E aprende a construir todas as suas estradas no hoje, porque o terreno do amanhã é incerto
demais para os planos, e o futuro tem o costume de cair em meio ao vão. Depois de um tempo
você aprende que o sol queima se ficar exposto por muito tempo. E aprende que não importa
o quanto você se importe, algumas pessoas simplesmente não se importam... e aceita que não
importa quão boa seja uma pessoa, ela vai feri-lo de vez em quando e você precisa perdoá-la
por isso. Aprende que falar pode aliviar dores emocionais.
Descobre que leva-se um certo tempo para construir confiança e apenas segundos para
destruí-la, e que você pode fazer coisas em um instante, das quais se arrependerá pelo resto da
vida.
Aprende que verdadeiras amizades continuam a crescer mesmo a longas distâncias. E o que
importa não é o que você tem na vida, mas quem você tem na vida. E que bons amigos são a
família que nos permitem escolher.
Aprende que não temos que mudar de amigos se compreendemos que os amigos mudam,
percebe que seu melhor amigo e você podem fazer qualquer coisa, ou nada e terem bons
momentos juntos. Descobre que as pessoas com quem você mais se importa na vida são
tomadas de você muito depressa... Por isso, sempre devemos deixar as pessoas que amamos
com palavras amorosas, pode ser a última vez que as vejamos.
Aprende que as circunstâncias e os ambientes têm influência sobre nós, mas nós somos
responsáveis por nós mesmos. Começa a aprender que não se deve comparar com os outros,
mas com o melhor que pode ser. Descobre que se leva muito tempo para se tornar a pessoa
que quer ser, e que o tempo é curto.
Aprende que não importa aonde já chegou, mas onde está indo, mas se você não sabe onde
está indo, qualquer lugar serve. Aprende que, ou você controla seus atos ou eles o controlarão.
E que ser flexível não significa ser fraco ou não ter personalidade, pois não importa quão
delicada e frágil seja uma situação sempre existem dois lados.
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Aprende que heróis são pessoas que fizeram o que era necessário fazer, enfrentando as
conseqüências. Aprende que paciência requer muita prática. Descobre que algumas vezes, a
pessoa que você espera que o chute quando você cai, é uma das poucas que o ajudam a
levanta-se.
Aprende que maturidade tem mais a ver com os tipos de experiência que se teve e o que você
aprendeu com elas, do que com quantos aniversários você celebrou.
Aprende que há mais dos seus pais em você do que você supunha.
Aprende que nunca se deve dizer a uma criança que sonhos são bobagens, poucas coisas são
tão humilhantes e seria uma tragédia se ela acreditasse nisso.
Aprende que quando está com raiva tem o direito de estar com raiva, mas isso não te dá o
direito de ser cruel.
Descobre que só porque alguém não o ama do jeito que você quer que ame, não significa que
esse alguém não o ama com tudo o que pode, pois existem pessoas que nos amam. Mas
simplesmente não sabem como demonstrar ou viver isso.
Aprende que nem sempre é suficiente ser perdoado por alguém, algumas vezes você tem que
aprender a perdoar-se a si mesmo.
Aprende que com a mesma severidade com que julga, você será em algum momento
condenado.
Aprende que não importa em quantos pedaços seu coração foi partido, o mundo não pára para
que você o conserte.
Aprende que o tempo não é algo que possa voltar para trás. Portanto, plante seu jardim e
decore sua alma, ao invés de esperar que alguém lhe traga flores.
E você aprende que realmente pode suportar...
Que realmente é forte, e que pode ir muito mais longe... depois de pensar que não se pode
mais. E que realmente a vida tem valor e que você tem valor diante da vida”.
(W. Shakespeare)
4
Auxílio financeiro : CAPES
5
DEDICATÓRIAS E AGRADECIMENTOS:
Tentar e falhar é, pelo menos, aprender. Não chegar a tentar é sofrer a inestimável perda do
que poderia ter sido. (Geraldo Eustáquio
)
6
A DEUS:
Por acreditar que DEUS sempre escreve certo por linhas tortas...
À MEUS PAIS:
“Bondade é amar as pessoas mais do que elas merecem. (Joseph Joubert)”
Que durante toda a minha vida forneceram uma base sólida para que eu pudesse ser o que
quisesse... Por me sentir amparada e protegida, pois me apoiaram e me ajudaram e estiveram
presentes em todos os momentos...Amo vocês!
AO “MEU” MARCELO:
“Mas o teu amor me cura de uma loucura qualquer, encostar no teu peito esse isso for algum
defeito por mim tudo bem...”
Por me amar do jeito que eu sou... Por estar presente na minha vida em todos os momentos
bons e ruins, ajudando ou simplesmente não atrapalhando, mas sempre se esforçando pra me
fazer feliz, por mais que isso signifique me ver fazer tudo errado e me esperar voltar e
procurar teu colo. Seu companheirismo e carinho têm me ajudado e fortalecido. Te amo !
AOS FAMILIARES:
Agora que estou escrevendo estou me dando conta de quanta gente se preocupa comigo,
minhas tias queridas, primas, primos e avós...Gente valeu a força!
À MINHAS IRMÃS:
“Amigo é coisa pra se guardar debaixo de sete chaves, dentro do coração.” (Fernando
Brant)
Minha irmã de verdade Lizia, minha prima Ludmila e minha grande amiga Juliana, que
sempre estiveram do meu lado desde o vestibular...E sempre vão estar, agradeço pelo apoio e
pelas conversas...
AOS AMIGOS:
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“Aqueles que passam por nós”.
não nos deixam sós.
Deixam um pouco de si,
levam um pouco de nós“
Antoine de Sant-Exupery
AOS AMIGOS DO LABORATÓRIO:
Aos meus amigos do laboratório, os antigos: Gaiz, Melada, Enxente, Kenny, Bruna. Aos
atuais Thiago, Vítor, Pompom, Renata, Paty, Fábio, Catharine e Pocotó. Agradeço por
escutarem os meus problemas, compartilharem dificuldades e tornarem o ambiente de
trabalho agradável.
Agradeço ao pessoal de Campinas: Maíra, Vítor, Elis pela ajuda nos experimentos.
Em especial ao VÍTOR (CEBÓLA) obrigada pela amizade, pelos chocolates e por todos os
ratos...
AS MINHAS AMIGAS DA FACULDADE:
Relaxo, Melão, Erva e Tarada... Pelas baladas, pelos conselhos, conversas e pelo bolo de
chocolate que cura tudo!
AS MINHAS AMIGAS DA FARMACO:
Aline, Carol, Claudinha, Débora e Érika, por partilharmos nossas inseguranças não só sobre a
dissertação, qualificação, mas sobre a vida. Beijos meninas se cuidem!
À PROFESSORA LUCIA ROCHA
Pela ajuda na qualificação. Obrigada!
À PROFESSORA MARIA DE LURDES
Por tornar o estágio de docência realmente proveitoso.
À PROFESSORA CLAUDIA HELENA PELLIZZON
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina. (Cora Coralina)”
8
Por ser responsável por grande parte do trabalho. Agradeço a paciência que sempre teve e
pelas conversas...
À MINHA CHEFE ! CLÉLIA AKIKO HIRUMA-LIMA
“Ninguém é tão grande que não possa aprender, nem tão pequeno que não possa ensinar.”
Que bom que tem os agradecimentos pra gente dizer o que sente... Sei que muitas vezes fui
teimosa, mas tudo que eu fiz foi querendo agradar por te admirar muito! Aprendi que nem
sempre o que é bom pra mim é bom pros outros e o que parece óbvio pode não ser! Muito
obrigada por tudo, estou mais madura agora, nunca vou esquecer as coisas que aprendi.
OUTROS AGRADECIMENTOS:
Aos animais e plantas que foram utilizados neste trabalho.
A Luis Fernando Rolim por me ajudar na coleta e trazer os extratos .
A todos os professores dos departamentos de farmacologia e fisiologia que contribuíram para
minha formação.
Aos funcionários do departamento e da seção de pós-graduação, pela ajuda.
A todos que contribuíram para realização deste trabalho.
9
I
II
I-
--
- SUMÁRIO
SUMÁRIO SUMÁRIO
SUMÁRIO
10
SUMÁRIO
Página
RESUMO
I-INTRODUÇÃO 18
1.1Considerações gerais sobre úlcera gástrica 18
a) A fisiopatologia da úlcera: H.pylori e DAINEs 22
b) Modulação da secreção ácida 23
c) Fatores protetores 25
d) Tratamento clínico 25
1.2 Plantas medicinais 29
1.3 As espécies estudadas 31
a) O gênero Alchornea 31
b) Alchornea glandulosa 32
c) Alchornea triplinervia 34
II-OBJETIVOS 37
III- MATERIAL E MÉTODOS 39
IV- RESULTADOS 50
Artigo Alchornea glandulosa 50
Artigo Alchornea triplinervia 85
Resumos dos resultados 131
IV- DISCUSSÃO 133
V- CONCLUSÃO 144
VI- REFERENCIAS 146
VII-ANEXOS E COMPLEMENTOS 158
11
RESUMO
RESUMORESUMO
RESUMO
12
Espécies do gênero Alchornea foram citadas num levantamento realizado por E.S. Costa
e C.A. Hiruma-Lima no estado do Tocantins, Brasil em dezembro de 2000. Várias espécies
deste gênero são conhecidas popularmente como tapiá, tanheiro-de-folha-redonda, iporuru e
tem seus usos medicinais amplamente explorados. Considerando-se o uso popular avaliou-se
as atividades gastroprotetora e cicatrizante dos extratos metanólicos de Alchornea glandulosa
e Alchornea triplinervia. As frações também foram avaliadas com o objetivo de descobrir
novos compostos com atividade antiúlcera e bem como seus prováveis mecanismos de ação.
Nenhum dos extratos mostrou toxicidade aguda na dose de 5000 mg/Kg. Nos modelos de
úlceras agudas induzidas por etanol e HCl-etanol, foi possível constatar que ambos os
extratos reduziram significantemente as lesões gástricas em relação aos seus respectivos
grupos controles. No modelo de úlceras induzidas por piroxicam houve aumento das lesões
gástricas nos animais tratados com extrato metanólico de ambas espécies. A partir destes
resultados selecionou-se a dose mais efetiva para investigação do possível mecanismo de ação
dos extratos. Os parâmetros de secreção gástrica foram avaliados para Alchornea glandulosa e
Alchornea triplinervia em camundongos submetidos à ligadura do piloro, onde se observou
uma redução da concentração de íons H+ do conteúdo gástrico em animais pré-tratados com
extratos metanólicos pelas vias oral e intraduodenal. Não foi constatado envolvimento do
óxido nítrico ou do grupamento sulfidrila na gastroproteção de ambos extratos. As frações
aquosa e acetato de Alchornea triplinervia foram avaliadas quanto ao seu efeito gastroprotetor
frente ao etanol absoluto. A fração acetato se mostrou mais eficaz do que a aquosa, em
exercer a gastroproteção. A dose de 100mg/Kg foi selecionada para a realização dos
experimentos, sendo realizada a quantificação de PGE
2
da mucosa gástrica. Houve um
aumento na produção/síntese de PGE
2
da mucosa gástrica dos animais pré-tratados com a
fração acetato de A. Triplinervia em relação aos controles. O extrato de Alchornea glandulosa
(250 mg/Kg) e a fração de Alchornea triplinervia (100 mg/Kg) foram avaliados quanto ao seu
13
efeito cicatrizante das úlceras induzidas por ácido acético, onde se realizou análises
histológicas e imunohistoquímicas. Os tratamentos não mostraram diferenças significativas
nas áreas de cicatrização em uma análise macroscópica. Na análise histológica apontou um
aumento nas áreas de regeneração da mucosa gástrica dos animais tratados com relação aos
controles. Na análise imunohistoquímica de Alchornea triplinervia são observados os
aumentos de células positivas marcadas para a enzima COX-2, aumento de células produtoras
de somatostatina e diminuição de células produtoras de gastrina. Os resultados obtidos
justificam o uso popular de ambas as espécies, com efeito, gastroprotetor e cicatrizante da
mucosa gástrica e o principal mecanismo de ação da fração acetato de Alchornea triplinervia
está na modulação de PG endógenas.
14
ABSTRACT
ABSTRACTABSTRACT
ABSTRACT
15
Species of the Alchornea genus had been cited in a survey carried through for E.S. Costa
and C.A. Hiruma-Lima in the state of the Tocantins, Brazil in December of 2000. Some
species of this genus are known how iporuru, tapiá, popularly tanheiro de folha redonda and
have its widely explored medicinal uses. Considering the popular use we had evaluated the
activities gastroprotective and healing of metanolhic extracts of Alchornea glandulosa and
Alchornea triplinervia. The fractions had been also evaluated with the objective to discover
new composites with activity antiulcer and its probable mechanisms of action. None of
extracts showed acute toxicity in the dose of 5000 mg/Kg. In the models of induced acute
ulcers for ethanol and HCl-ethanol, it was possible to evidence that both the extracts had
significantly reduced the gastric injuries in relation to its respective groups controls. In the
model of induced ulcers for NSAID it had increase of the gastric injuries in the animals
treated with methanolic extract of both species. From these results the more effective dose
was selected for inquiry of the possible mechanism of action of extracts. The gastric secretion
parameters had been evaluated for Alchornea glandulosa and Alchornea triplinervia in mice
submitted to the ligature of piloro, where was observed a reduction of the concentration of H+
íons of the gastric content in animals treated with methanolic extracts for oral and
intraduodenal routes. Envolvement of nitric oxide or the endogenous sulphydryl compounds
was not evidenced in the mechanism of gastroprotection of both extracts. The aqueous and
acetate fractions of Alchornea triplinervia had been evaluated for its gastroprotetor effect
front to absolute ethanol. The acetate fraction acetate showed more efficient than the aqueous
fraction , in exerting the gastroprotection in this model. The dose of 100mg/Kg was selected
for the segment of the experiments, being carried through the quantification of PGE2 of the
gastric mucosa. It had an increase in production of PGE2 of the gastric mucosa of the animals
treated with the fraction acetate of the A. Triplinervia in relation to the control ones. The
extract of Alchornea glandulosa (250 mg/Kg) and the fraction of Alchornea triplinervia (100
16
mg/Kg) had been evaluated for this healing effect of the induced ulcers for acetic acid, where
if it carried through histologys and imunohistochemical analysis. The treatments had not
shown significant differences in the in healing areas in a macrocospic analysis. In the
histologic analysis it pointed an increase in the areas of regeneration of the gastric mucosa of
the treated animals in the relation to the controls ones. In imunohistochemical analysis we
observed a large number of COX
2
cells main in the submucosa and the results shows that G
cells declined while D cells increased. The results justify the popular use of both species with
gastroprotective and healing effects and the main mechanism of action of the acetate fraction
of Alchornea triplinervia is in the modulation of endogenous PG.
17
I
I I
I –
––
– INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
18
I.1- Considerações Gerais sobre úlcera gástrica
Antigamente a dispepsia, era atribuída unicamente ao excesso de comida, porém
apenas em 1900 foi levado em conta que úlcera gástrica, tem sido uma das maiores causas de
morbidade e mortalidade. O desenvolvimento de tecnologias levou a um aumento dos
diagnósticos (Grob, 2004). Distúrbios gastrointestinais como as úlceras pépticas ocorrem em
número expressivo tanto em países desenvolvidos quanto naqueles em desenvolvimento
(Dayal e Delellis, 1991). As úlceras são tão comuns que, cerca de 10% da população,
carregam ao longo de suas vidas, esta patologia ou seqüelas deixadas por ela (Lewis e
Hanson, 1991).
Atualmente considera-se que 25% da população dos EUA já tiveram alguma desordem
relacionada à acidez gástrica e o custo de medicamentos para suprimir a acidez chega a U$
1.3 bilhões por ano (Manjumdar et al., 2003). Apesar da ausência de registros
epidemiológicos, existem estimativas no Brasil de centenas de milhares de casos envolvendo
esse tipo de patologia por isso as drogas antiulcerogênicas possuem tanto importância de
utilização, quanto mercadológica (Alper, 1993).
a) A fisiopatologia das úlceras
A fisiopatologia da úlcera gástrica está centrada em um desbalanço entre fatores
agressores e protetores no estômago (Chan e Leung, 2002). Os fatores agressores incluem
ácido clorídrico juntamente com bile e enzimas pancreáticas, os fatores de defesa incluem
muco, bicarbonato secretado pelas células epiteliais superficiais, prostaglandinas, compostos
sulfidrila e a manutenção do fluxo sanguíneo da mucosa (Coelho, 1998).
19
Atualmente sabe-se que uma das causas principais para o surgimento de úlceras
gástricas é a infecção por uma bactéria chamada Helicobacter pylori (H. pylori). A segunda
causa é o uso constante ou indiscriminado de medicações para dor chamado de
antiinflamatórios não esteróides (DAINEs). Estudos relacionam que 80% das úlceras na
população estão relacionadas a H.pylori e ao uso de DAINEs. Existem ainda outros fatores
envolvidos como cigarro, personalidade, estresse psicológico, alimentação ou fatores
genéticos (Konturek et al., 2003). Fumantes são mais propensos a úlceras, estudos realizados
por Bielansky. (1990) demonstrou que a infecção por H.pylori aumenta em fumantes.
- Helicobacter pylori
O prêmio Nobel de fisiologia e medicina 2005 foi para os cientistas Robin Warren e
Barry Marshall, pela descoberta da influência do Helicobacter pylori em úlceras gástricas;
reconhecendo que o trabalho afeta a saúde de milhares de pessoas pelo mundo e incentivando
ao estudo da microbiota humana (Hassan, 2005).
Existem hoje várias evidências que conferem à infecção pelo H. pylori um papel
importante na etiopatogenia da doença ulcerosa gastroduodenal. O microorganismo está
presente em aproximadamente 95% dos casos de úlcera gastroduodenal e em 80% dos
pacientes portadores de úlcera gástrica. Há uma variação da prevalência da infecção H. pylori
entre diferentes países, faixas etárias e níveis sócio-econômicos. Nos países desenvolvidos,
existe um progressivo aumento da infecção com a idade, sendo pouco freqüente na infância e
acometendo cerca de 50% da população na velhice. A infecção do antro gástrico pelo H.pylori
induz a uma hipersecreção ácida através da inibição das células produtoras de somatostatina e
conseqüente aumento da liberação de gastrina pelas células G do antro gástrico (El-Omar et
al., 1995).
20
Atualmente o grande avanço na área das úlceras é o uso de antibióticos para combater o
H.pylori. Estudos demonstram que atualmente com o uso de medicações para bloquear a
produção de ácido do estômago associado a antibióticos para erradicação do H.pylori, pode-se
obter uma cura de 80-90 %. Vários outros estudos mostram que um número considerável de
pessoas têm a bactéria no estômago, mas não desenvolvem úlceras. A explicação encontrada
por alguns cientistas é que além da infecção pela bactéria o paciente tem uma predisposição
genética a ter úlcera; 30 a 40% dos pacientes portadores de úlcera péptica têm familiares de
primeiro grau acometidos pela doença (Coelho, 1998).
-DAINEs
Drogas antiinflamatórias não esteroidais (DAINEs), por exemplo, aspirina; estão entre
as drogas mais consumidas mundialmente por suas propriedades analgésicas, antipiréticas e
antiinflamatórias; entretanto apesar dos ótimos benefícios associados com as DAINEs, mais
de 25% dos pacientes que usam DAINEs cronicamente têm efeitos adversos no trato
gastrointestinal, pois estas drogas levam a inibição de prostaglandinas (Chan e Graham,
2004).
DAINEs são hoje considerados como uma causa estabelecida de úlcera péptica,
podendo ocorrer após administração oral ou sistêmica das drogas (Singh e Tradafilopoulos,
2005). Acredita-se que as DAINEs promovam lesão gastroduodenal por dois mecanismos
independentes, ou seja, diretamente por efeito tóxico direto, ao nível do epitélio mucoso e
sobre os mecanismos de defesa da mucosa gastroduodenal, resultando em aumento da
permeabilidade celular, inibição do transporte iônico e da fosforilação oxidativa, e,
sistematicamente, enfraquecendo os mecanismos de defesa através a inibição da cicloxigenase
(Wallace, 2000).
21
A identificação de duas isoformas levou a idéia de que apenas a supressão da COX-2,
poderia exercer efeitos antiinflamatórios sem causar irritação no estômago (Wallace, 2003). O
que levou ao desenvolvimento dos inibidores de COX-2 altamente seletivos, que são uma
nova classe de medicamentos que causa menos danos gástricos quando comparados aos
inibidores não seletivos (Chan e Graham, 2004). Entretanto, há evidências que COX-2
também contribuem para a defesa da mucosa gástrica (Wallace, 2005).
FIGURA 1- Mecanismo pelo qual DAINEs causam úlceras, adaptado de Gudis e Sakamoto,2005.
DAINES
INIBIÇÃO COX-2
INIBIÇÃO COX-1
INIBIÇÃO DA BARREIRA DE
MUCO-BICARBONATO
DANO NA
MUCOSA
DANO NO
EPITÉLIO
INIBIÇÃO FATOR
DE CRESCIMENTO
ATIVAÇÃO DE
MECANISMOS DE
REPARO EPITELIAIS
FORMAÇÃO DE
ÚLCERAS
ATIVAÇÃO DE
NEUTRÓFILOS E
RADICAIS LIVRES
DANO MICROVASCULAR
22
b) Modulação da secreção ácida
O estômago em condições normais, secreta ácido continuamente, numa média de 15%
de sua capacidade secretora máxima sendo evidenciada num ciclo circadiano, com um pico
máximo de secreção próximo à meia-noite e um pico mínimo ao amanhecer. A secreção basal
de acido clorídrico é estimulada pela ação da histamina, acetilcolina e gastrina, e inibida pelos
bloqueadores da histamina e da acetilcolina. Após a ingestão de um alimento, o aumento da
secreção acida é observada antes do alimento atingir o estômago. O ato de mastigar ou mesmo
de pensar num alimento – através do reflexo vagal – estimula principalmente as células
parietais e atua secundariamente sobre as células G do antro gástrico, liberando pequenas
quantidades de gastrina, o que por sua vez, irá provocar aumento da secreção ácida (Guyton,
2002).
A presença de alimentos no estomago causa distensão gástrica e estímulo do reflexo
vasovagal, provocando aumentos da secreção ácida. Além disso, os produtos da digestão de
proteínas desses alimentos atuam diretamente sobre as células G, liberando gastrina e,
conseqüentemente, aumentando a secreção ácida gástrica (Aihara et al., 2003).
As glândulas oxínticas da mucosa gástrica do mamífero correspondem às unidades
secretoras do estômago e são formadas por diferentes tipos celulares: células parietais, células
principais, células secretoras de muco, células endócrinas (G e D) que secretam o ácido
clorídrico, pepsinogênio, muco, gastrina e somatostatina respectivamente. Na célula parietal
existem duas principais vias de sinalização: a via dependente do AMP cíclico e a via
dependente do Ca²
+
. A histamina utiliza a primeira via, enquanto a gastrina e a acetilcolina
exercem seus efeitos por meio da última. A via dependente do AMP cíclico resulta na
fosforilação de proteínas efetoras da célula parietal e a via dependente do Ca²
+
leva a um
aumento do cálcio citosólico. Ambas as vias ativam a H+, K+ ATPase (Brunton, 2005). A
23
célula parietal também possui receptores inibitórios para EGF e PGE2 (prostaglandina E
2
),
baixas concentrações de PGs do subtipo E
2
inibem a secreção ácida. Foi também demonstrado
que receptores para EGF (fator de crescimento epidermal) inibem seletivamente a liberação
de histamina em células de coelho (Hirchowitz et al.,1995).
FIGURA 2- Regulação fisiológica e farmacológica das secreções gástricas: a base para o tratamento da doença
ulcerosa péptica (Bruntom, 2002 in:Goodman e Gilman, 2005).
c) Fatores protetores
A proteção pré-epitelial é feita pela barreira de muco-bicarbonato, secretada pelas
células mucosas, mantendo a superfície epitelial próxima de um pH neutro. Em humanos a
secreção de bicarbonato é um processo ativo e ativado pela estimulação vagal e distenção
fúndica. Muitos mecanismos no nível epitelial celular contribuem para manter a barreira
mucosa intacta. O fluxo sanguíneo é essencial em suprir os epitélios via nutrientes e oxigênio.
24
Prostaglandinas podem manter o fluxo sanguíneo da mucosa e prevenir o dano vascular
epitelial causado por etanol (OH et al., 2005).
Muitos agentes têm se estabelecido como fatores protetores da mucosa. PGs possuem
ações citoprotetoras, enquanto sucralfato, antiácidos contendo alumínio, carbenoxolona e
bismuto e induzem a liberação de PGs na mucosa ( Forssel, 2003).
A síntese de PGs depende da atividade da ciclooxigenase (COX), uma enzima
responsável pela produção de prostanóides. Duas isoformas de COX foram identificadas nas
células; uma enzima constitutiva designada como COX-1 e uma isoforma induzível como
COX-2. COX-1 parece ser responsável pela produção de PG que é fisiologicamente
importante em funções homeostáticas, como manter a integridade da mucosa e o fluxo
sanguíneo (Brzozowski, 2005). COX-2 parece representar uma segunda linha de defesa, que é
ativada durante a cicatrização da úlcera para compensar a perda temporária de COX-1.
(Villegas, 2004). A COX-2 é expressa em células inflamatórias e fibroblastos na mucosa
gástrica, e através da produção de vários fatores de crescimento incluindo fator de
crescimento de hepatócitos (HGF) e crescimento vascular endotelial (VEGF), têm um papel
chave na reparação de tecidos (Gudis, 2005).
O óxido nítrico (NO) tem adquirido cada vez mais atividade; o óxido nítrico tem
promovido aumentar o fluxo sanguíneo do local de estimulação da secreção de muco e inibir a
aderência de neutrófilos (Chan e Leung, 2002). O NO é sintetizado a partir do aminoácido L-
arginina pela NO-sintase (Tsukimi e Okabe, 2000). Ele regula a secreção de muco, aumenta a
motilidade gástrica e melhora a microcirculação (Tsukimi e Okabe, 2000). A citoproteção
gástrica em decorrência de um agente agressor é mediada, em parte, pelo NO endógeno e
pelas interações entre essas substâncias vasoativas, neuropeptídeos e prostaglandinas (Holzer,
1998).
25
O óxido nítrico tem um importante papel na barreira gástrica, entretanto a interação
entre espécies reativas de oxigênio e NO tem sido pouco estudada (Kwiecen et al., 2002).
Compostos sulfidrílicos estão envolvidos na manutenção da integridade gástrica,
particularmente quando espécies reativas de oxigênio estão envolvidas na patofisiologa do
dano (Kimura, 2001). O mecanismo de gastroproteção das sulfidrilas é similar ao das
prostaglandinas endógenas. Compostos sulfidrílicos sequestram radicais livres e
consequentemente previnem danos causados pela peroxidação lipídica (Lopez et al., 1996).
d) Tratamento Clínico
O tratamento de a úlcera péptica objetiva restabelecer o equilíbrio da mucosa
gastroduodenal rompido, seja por aumento dos fatores agressivos – ácido clorídrico, pepsina,
bile, medicamentos ulcerogênicos e H. pylori – seja por redução dos fatores defensivos locais
– secreção de muco, bicarbonato e prostaglandinas – ou, ainda, por ambos os desvios.
A terapêutica ideal é aquela que:
Alivia a dor e induz cicatrização mais rápida da úlcera (terapêutica sintomática) e
previne as recidivas, promovendo a cura definitiva da doença (terapêutica curativa)
(Proclim, 2004).
A solução terapêutica para as úlceras pépticas, foi durante séculos a restrição alimentar,
repouso, neutralização do suco gástrico com antiácidos e em último caso a intervenção
cirúrgica (Weir, 1988).
26
A compreensão da fisiologia da secreção ácida gástrica contribui para o entendimento
dos vários caminhos que promovem a inibição da secreção ácida. Farmacologicamente,
podemos utilizar antiácidos, inibir a capacitação da acetilcolina por receptores muscarínicos,
inibição da histamina pela ação de bloqueadores de H
2
, inibição da gastrina por ação de um
antagonista do receptor de gastrina, inibição da secreção gástrica por aumento das defesas
mucosas principalmente por prostagandinas E
2
e inibição do passo final da secreção, que são
os mais potentes inibidores,por exemplo, o omeprazol e lansoprazol (Mossner e Caca, 2005).
A estratégia utilizada hoje, com o reconhecimento da importância do H.pylori, consiste
na utilização de um anti-secretor, usualmente um inibidor da bomba de prótons associado a
um antibacteriano por um período de 7 a 10 dias (Malfertheiner, 2000).
Drogas inibidoras da secreção ácida têm sido largamente usadas. A introdução de
antagonistas de receptor de histamina H
2
(cimetidina, ranitidina) em 1970 marcou uma nova
era no tratamento de desordens relacionadas ao ácido gástrico. Nos anos 80 os inibidores da
bomba de prótons foram introduzidos no mercado, com resultados mais efetivos mais
efetivoso que possibilita a abolição da secreção ácida completamente. Muitos estudos
sugerem que doses normais de antagonistas H
2
podem prevenir úlceras duodenais, mas que o
efeito em úlceras gástricas é muito limitado (Hawkey, 2000). Os bloqueadores H
2
inibem a
secreção do ácido clorídrico através da ligação com os receptores H
2
localizados na
membrana basolateral das células parietais. A sua administração contínua parece promover
um efeito mais estável da supressão ácida. Apesar de sua eficácia comprovada, estas drogas
apresentam vários efeitos colaterais como hipotensão, arritmias cardíacas, interação
medicamentosa com benzodiazepínicos, teofilina, lidocaína, fentanil, midazolam, anemia,
granulocitopenia, trombocitopenia, alteração do nível de consciência, entre outros (Beejav e
Wolf, 2000). Esses agentes têm relativamente curta duração de ação, seus efeitos sofrem
interferência da secreção gástrica estimulada por alimentos, além disso, a tolerância pode ser
27
desenvolvida em poucos dias de uso de doses contínuas, um fenômeno clinicamente relevante
em alguns pacientes (Andersson, 2005).
Bloqueadores da bomba de prótons têm se mostrado efetivos em prevenir o
desenvolvimento de úlceras gástricas e duodenais em pacientes que utilizam DAINEs, e
também são eficazes para cicatrizar e prevenir as recidivas (Singh e Triadafilopoulos, 2005).
São reconhecidos por serem superiores aos antagonistas H
2.
Essa superioridade é atribuída ao
fato de inibir a H
+
K
+
-ATPase independente da natureza dos estímulos. Esta droga é instável
em pH baixo, como o do estômago e precisa estar protegido em cápsulas de absorção entérica,
o que dificulta muitas vezes a administração (Andersson, 2005).
Os inibidores da bomba de próton são substâncias precursoras que são metabolizadas
em uma sulfonamida ativa no meio extremamente ácido dos canalículos secretores das células
parietais. Atuam inibindo especificamente a enzima H
+
K
+
-ATPase nas células parietais,
diminuindo a secreção ácida do estômago. Em adultos, têm mostrado uma maior eficácia em
relação aos bloqueadores H
2
, porém em crianças a dose e a segurança ainda não estão bem
estabelecidas (Beejav e Wolf, 2000). Atualmente, existem quatro tipos de inibidores da
bomba de prótons: o omeprazol, lansoprazol, pantoprazol e rabeprazol, sendo que somente os
dois primeiros estão disponíveis comercialmente no Brasil (Gurgueira e Maranhão, 2000).
Dentre os efeitos colaterais relatados, destacam-se: diarréia, cefaléia e reações cutâneas (Fox,
2000).
O tratamento descontinuado e a suspensão abrupta dos medicamentos podem levar a
recidivas graves de doença ulcerosa. Dados clínicos revelam aumento da secreção logo após a
parada do tratamento com antagonistas de receptor H
2
ou com inibidores da bomba de
prótons, como resultado de um mecanismo compensatório da elevação de gastrina, mas
apenas poucos estudos se dedicam à conseqüências dessa hipersecreção rebote, sendo ainda
necessários maiores esclarecimentos (Qvigstad e Waldum, 2004).
28
Outros fármacos, agentes citoprotetores, também foram desenvolvidos, em virtude do
papel desempenhado pelas prostaglandinas no estômago; estes, além de inibirem a secreção
ácida-gástrica, estimulam os mecanismos de proteção da mucosa, ou seja, a proteção de muco
e bicarbonato, o que produz uma barreira física sobre a superfície da úlcera (Robert et al.,
1981). Um análogo das prostaglandinas: misoprostol é teoricamente uma “reposição
fisiológica”, mas seus efeitos prolongam-se além do estômago. Os efeitos adversos do
misoprostol como seus benefícios são dose-dependentes, eles incluem diarréia e dor
abdominal que comprometem sua eficácia e tolerância; além de alto custo (Hawkey, 2000;
Beejav e Wolf, 2000, 2000). Outra droga citoprotetora é a carbenoxolona, que atua inibindo
enzimas que inativam prostaglandinas e suprimindo a ativação de pepsinogênio (Brunton,
1996).
Apesar de todo o histórico, ainda não há uma droga que produza 100% de remissão das
úlceras gastroduodenais com reduzido efeito colateral que não comprometa o paciente que
geralmente faz uso deste tipo de medicamento cronicamente (Alper, 1993).
Borelli e Izzo (2000) apresentaram uma grande variedade de substâncias químicas
isoladas de plantas que apresentam experimentalmente atividade antiulcerogênica indicando o
importante potencial destes princípios ativos na descoberta de novas terapêuticas para as
úlceras pépticas.
29
I.2- Plantas medicinais
A Utilização das plantas medicinais é uma das mais antigas práticas medicinais da
humanidade, onde se constata que 25% dos fármacos prescritos em todo mundo são de origem
vegetal. No início da década de 90, a organização mundial de saúde (OMS) divulgou que 65-
80% da população de países em desenvolvimento dependiam das plantas medicinais como
única forma de acesso aos cuidados básicos da saúde (Akerele, 1993).
Apesar do grande avanço da medicina alopática, existem obstáculos básicos na sua
utilização pela população carente, que vão desde o acesso aos centros de atendimento
hospitalares, até a obtenção de exames e medicamentos (Veiga Junior et al., 2005).No Brasil,
as plantas medicinais da flora nativa são consumidas com pouca ou nenhuma comprovação de
suas propriedades farmacológicas e tóxicas, sendo o seu consumo mais propagado por
usuários ou comerciantes (Veiga Junior et al., 2005).
Quando comparada com medicamentos alopáticos, a toxicidade de plantas medicinais e
fitoterápicos pode parecer trivial, mas isto não é verdadeiro, pois as plantas medicinais
podem promover problemas sérios de saúde pública, quando se sabe que as pesquisas
realizadas para avaliação do uso seguro de plantas ainda são incipientes (Veiga Junior et al.,
2005).
Atualmente, é consenso que a pesquisa envolvendo plantas medicinais é muito
complexa, envolve diversas variáveis que somente um grande conhecimento acerca de todas
as etapas deste tipo de pesquisa poderiam resultar em sucesso neste tipo de abordagem. Para
tanto, Di Stasi (1998), sugere uma seleção criteriosa das espécies a serem estudadas, sempre
levando em consideração a indicação popular de uso medicinal (etnofarmacologia) e
principalmente a participação de uma equipe multidisciplinar que realize,em conjunto, um
biomonitoramento químico e farmacológico das substâncias biologicamente ativas. Segundo
30
Souza-Brito e Souza-Brito. (1996) a pesquisa com plantas medicinais geralmente é cara e em
países como o Brasil o investimento em pesquisa geralmente é pequeno e a pesquisa fica
restrita a pequenos grupos. É um consenso entre as pessoas da área e segundo Elisabetsky e
Wannmacher, (1993) que através da informação etnofarmacológica a chance de obter sucesso
na pesquisa é maior.
A investigação etnofarmacológica no Brasil apresenta um grande desafio. A flora
brasileira rica e diversificada é destruída progressivamente e a medicina do povo, uma mistura
rica dos conhecimentos índígenas, africanos, e europeus baseados em plantas medicinais
tropicais, é modificada contantemente através de cultura moderna (Souza-Brito e Souza-Brito,
1996).
As maiores porcentagens no uso de plantas são para resfriados (66 %) ou para doenças
do trato digestivo ou intestinal (25%) e úlcera estomacal (36%) (Calixto, 2000) e segundo e
Borrelli e Izzo. (2000) e Hiruma-Lima et al. (2001) existe uma variedade de produtos
botânicos com atividade antiúlcera; que são fontes potenciais de novas drogas e tem mostrado
resultados promissores no tratamento de úlceras gástricas.
31
I.3- As espécies estudadas
a) O gênero Alchornea
Espécies do gênero Alchornea foram citadas num levantamento realizado por E.S. Costa
e C.A. Hiruma-Lima no estado do Tocantins, Brasil em dezembro de 2000.
Várias espécies são conhecidas popularmente como tapiá, tanheiro-de-folha-redonda,
iporuru e dezenas de outras denominações, de acordo com suas localizações geográficas. Em
geral, são árvores de 10 a 30 m de altura e ocorrem em vários estados brasileiros, incluindo o
estado de São Paulo (Lorenzi, 1998).
Várias espécies do gênero Alchornea também têm seus usos medicinais explorados:
Alchornea cordata é usada como abortivo (Luna,1984); Alchornea cordifolia usada para
disenteria e como emenagoga, para amenorréia, como abortivo, para úlceras e infecções em
geral (Le Grand,1989) e Alchornea rugosa, é utilizada como abortivo (Kelly,1985); Tona et
al., (1998) isolou flavonóides, taninos, esteróides, terpenos, saponinas e alcalóides em A.
cordifolia e Osabede, (2003) caracterizou os efeitos antiinflamatórios das folhas e frações desta
mesma espécie.
Triterpenóides como taraxerona, friedelina, epifriedelinol, taraxerol, seco-3,4-friedelina e
secos-3,4-taraxerona foram isolados do extrato clorofórmico de Alchornea latifolia. Estes dois
últimos triterpenóides apresentam um anel aberto; demonstrando citotoxicidade in vitro em
células cancerosas em humanos, bem como inibição da Topoisomerase II (Setzer et al., 2000).
Atualmente nosso grupo caracterizou o efeito antiulcerogênico do extrato hidroalcoólico das
folhas e casca de Alchornea castaneaefolia em modelos experimentais agudos e crônicos da
úlcera gástrica em roedores (Hiruma-Lima et al., 2006).
32
b) Alchornea glandulosa Poepp. & Endl.
Possui a sinonímia botânica de Alchornea iricurana Casar e é conhecida popularmente
como tapiá, tanheiro-de-folha redonda, tanheiro, maria-mole, iricurana, boleiro, araribá, bugé,
tamanqueiro, tapiá-guaçu, tapiá-mirim, caixeta, canela-raposa. É encontrada nos estados do
Rio de Janeiro, Minas Gerais até o Rio Grande do Sul; principalmente na Floresta Pluvial da
Encosta Atlântica (Lorenzi, 1998).
Alchornea glandulosa é uma árvore de 10-20 m de altura, com tronco de 50 a 70 cm
de diâmetro. É uma planta dióica, perenifólia, heliófita, seletiva higrófita, pioneira,
característica de beira de rios e planícies aluviais da Floresta Pluvial Atlântica (Fig. 1). Ocorre
também com menor freqüência na floresta latifoliada da bacia do Paraná. É particularmente
freqüente nas formações secundárias como capoeiras e capoeirões. Ocorre também na mata
primária, principalmente nas beiradas e clareiras. Floresce pelo menos duas vezes ao ano,
durante os meses de maio-junho e outubro-novembro. Os frutos, por conseguinte,
amadurecem em setembro até meados de outubro e dezembro-janeiro (Lorenzi, 1998).
Sua madeira é leve (densidade 0,40 g/cm
3
), mole, bastante porosa, resistente, pouco
elástica, de baixa durabilidade quando em ambientes externos. Podendo ser empregada em
carpintaria, para confecção de caixas de embalagens, tabuado para divisões internas, lenha,
etc. A árvore, de copa densa, proporciona ótima sombra, podendo ser empregada no
paisagismo rural. Como planta pioneira e rústica, não pode faltar nos plantios mistos
destinados à recomposição de áreas degradadas de preservação permanente. A filotaxia é
definida por folhas subcoriáceas, inteiras, simétricas e pilosas, com forma ovalada, 8-16 cm
de comprimento e 6-12 cm de largura e pecíolo de 2-4 cm. O ápice foliar é cuspidado e com
margem foliar serrada. Possuem três venações principais características saindo da base obtusa,
sendo actinódromas (Lorenzi, 1998).
33
De A. glandulosa foram isolados os esteróides sitosterol e campesterol, além do terpeno
loliolida, o alcalóide guanidínico N-1,N-2,N-3-triisopentenilguanidina e o tanino corilagina.
Ensaio biológico para avaliação da atividade antimicrobiana mostrou resultados significativos
para o extrato MeOH e para a fração alcaloidal. Atividade antifúngica moderada foi
observada para o extrato CHCl
3
. O extrato também possui também atividade antiproliferativa,
e o extrato bruto de A. glandulosa apresentou efeito citostático, concentração-dependente,
para linhagens de melanoma, mama e pulmão (Conegero et al., 2003).
Figura 3: Alchornea glandulosa (Lorenzi, 1998).
34
c) Alchornea triplinervia (spreng.) M. Arg.
A espécie Alchornea triplinervia possui várias sinonímias botânicas, sendo elas
Andistema triplinervium Spreng., Alchornea nemoralis Mart. e Alchornea janeirensis Casar.
É conhecida popularmente como tanheiro, tapiá, boleiro, tanaeiro, tapiá-guaçu, tapiá-guaçu-
branco, tapiá-mirim, tapiá-vermelho, caixeta, jangada, pau-jangada, algodoeiro, tapiaeiro,
canela-raposa, tamanqueiro, pau-de-tamanco e pau-do-tanho. No Brasil, é encontrada da
Bahia ao Rio Grande do Sul, na Floresta Pluvial da Encosta Atlântica. Menos comum nas
demais florestas pluviais do interior, desde o nível do mar até 1000 m de altitude (Lorenzi,
1998).
É uma árvore de 15-30m de altura, com tronco de 40 a 100 cm de diâmetro, com copa
ampla e densa (Fig. 2). Casca externa 19 mm, acinzentada, áspera com fissuras pequenas e
pouco profundas, interna fibrosa, marrom-rosada. Alburno indistinto do cerne, bege e
uniforme (EUPHORBIACEAE, www.ipef.br /identificação /nativas/ detalhes).
Sua madeira é leve (densidade 0,49 g/cm
3
), macia, mole, sem cheiro, de baixa
resistência mecânica, fácil de trabalhar, de alburno e cerne indistintos, de baixa resistência ao
ataque de insetos (cupins) e de rápido apodrecimento quando em condições externas e em
contato com o solo. A madeira somente encontra aplicação em caixotaria leve, miolo de
portas, cepas de tamanco, muletas e painéis. A árvore pode ser utilizada para reflorestamentos
heterogêneos de áreas degradadas de preservação permanente (Lorenzi, 1998). É uma planta
dióica, perenifólia, heliófita, pioneira e praticamente indiferente às condições físicas do solo.
É característica da Floresta Pluvial Atlântica que sofreu interferência do homem, sendo pouco
comum nas florestas clímaxes e abundante nas capoeiras. Produz anualmente moderada
quantidade de sementes, amplamente disseminadas por pássaros (Lorenzi, 1998). Floresce
durante os meses de outubro-novembro. Inflorescência em forma de panículo, com estrutura
35
de cacho. Apresentam 4 pétalas, tendo flores amarelas de cerca de 0,3 cm. Possui rácemos
laxiflorais axilares, simples ou raramente compostas com até 20 cm de comprimento. As
flores masculinas são curtas e pedunculadas e as femininas possuem 3 a 6 sépalas densamente
pilosas. Os frutos deiscentes e carnosos amadurecem a partir de dezembro, estendendo-se até
janeiro. São de coloração esverdeada com média de 0,8 cm de tamanho, com estrutura
capsular bivalve, arredondada, formando sulcos e com estiletes persistentes. A semente
(sempre duas) em formato de arilo é castanho-clara com 0,5 cm. A filotaxia é definida por
folhas subcoriáceas, inteiras, palminérvias e pouco pilosas, com forma oblonga a elíptica, 3-6
cm de comprimento e 4-8 cm de largura e pecíolo de 2-4 cm. O ápice foliar é obtuso e com
margem foliar serrada. Possuem três venações principais características saindo da base obtusa,
sendo actinódromas e apresentamestípulas verdes-claras (EUPHORBIACEAE, disponível em
www.ipef.br /identificacao/ nativas/detalhes).
Há apenas um artigo descrevendo os dados fitoquímicos de A. triplinervia onde de suas
folhas foi isolada a amentoflavona (extrato CHCl
3
/MeOH 9:1) e do extrato MeOH foram
obtidos a isocorilagina, ácido gálico e metil galato, todas as substâncias foram isoladas por
CC em Sephadex LH-20 (Braca et al., 2002).
Figura 4: Alchornea triplinervia (Lorenzi,1998)
36
II
IIII
II-
--
-OBJETIVOS:
OBJETIVOS:OBJETIVOS:
OBJETIVOS:
37
A alta incidência de úlceras gástricas na população associado a crescente pesquisa de
plantas medicinais, como fonte de substãncias com atividade terapêutica, estimularam o
interesse acadêmico em estudar estas duas espécies do gênero Alchornea. Portanto, os
objetivos deste trabalho:
Avaliaras potenciais atividades antiulcerogênicas dos extratos metanólico e frações
orgânicas de Alchornea glandulosa (Ag) e Alchornea triplinervia (At).
Determinar os prováveis mecanismos das frações, envolvidos no efeito
antiulcerogênico das espécies vegetais.
38
III
IIIIII
III-
--
- MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL E MÉTODOS
39
III.1-ANIMAIS
Para os experimentos de indução de lesões gástricas experimentais, foram utilizados
camundongos Swiss albinos machos (25-30g) e ratos machos Wistar (150 a 200g),
provenientes do Biotério Central da UNESP-Botucatu, aclimatados às condições do biotério
setorial (Departamento de Fisiologia, UNESP, Botucatu) por pelo menos sete dias antes da
manipulação experimental, sob temperatura (23 ± 2
°
C) e ciclo claro-escuro de 12 horas
controlados. Os animais foram alimentados com ração Guabi
destrusada e água ad libitum.
Todos os experimentos obedeceram aos protocolos experimentais n°17, 18, 19, 20, 21 e
22/04-CEEA submetidos e aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal, do
Instituto de Biociências da UNESP - Botucatu.
III.2-ATIVIDADE GASTROPROTETORA
A) Lesões gástricas - Para avaliar a atividade antiulcerogênica foram realizados
experimentos de indução de úlcera gástrica com base nos maiores agentes etiológicos da
doença no homem, a saber: HCl/etanol, DAINEs (piroxicam), etanol absoluto e ligadura de
piloro. Cada modelo experimental apresentou os seus respectivos grupos controle positivo
(droga antiulcerogênica, lansoprazol, cimetidina ou carbenoxolona) e negativo (salina ou
Tween 80 a 8%) dependendo da especificidade de cada modelo. Os animais antes do
tratamento, foram mantidos em gaiolas metabólicas para evitar coprofagia e com água ad
libitum. O veículo usado foi Salina ou Tween 80 a 8% por via oral de acordo com a
solubilização dos extratos, para os extratos metanólico e fração aquosa foi utilizado como
veículo a salina e para a fração acetato de etila Tween 80 a 8%. Foram utilizados extratos
avaliados nas doses de 250, 500 e 1000mg/Kg e as frações nas doses de 50, 100 e 200mg/Kg.
Em todos os experimentos de indução de úlcera, as lesões ulcerativas foram classificadas de
40
acordo com a severidade, segundo Szelenyi e Thiemer (1978), em lesões de nível 1 (pontos
hemorrágicos < 1mm), nível 2 (úlceras de 1 a 3 mm de extensão) e nível 3 (úlceras profundas
>3mm de extensão). Para cada grupo de tratamento foi calculado um índice de lesões
ulcerativas (I.L.U.) obtido através da equação:
I.L.U. = (∑
∑∑
∑ lesões nível 1) + (2 X ∑
∑∑
∑ lesões nível 2) + (3 X ∑
∑∑
∑ lesões nível 3)
B) Indução de úlceras pelo uso do Etanol absoluto e etanol/HCl - Este método foi
baseado nas metodologias descritas por Morimoto et al., (1991) e Mizui e Doteuchi (1983).
Após 24 horas de jejum, os grupos experimentais foram submetidos aos tratamentos com
veículo (10 mL/Kg), lansoprazol (30 mg/Kg) e com a droga-teste por via oral (doses
variadas), 50 min. antes da indução de lesão gástrica por HCl/etanol (camundongos Swiss) ou
1h para indução por etanol absoluto (ratos Wistar). Todos os tratamentos foram feitos por via
oral, em dose volume final de 10 mL/Kg e os agentes lesivos foram administrados em volume
de 0,2 mL da solução de 0,3M HCl/etanol 60%, em camundongos, e 1mL de etanol, para
ratos. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 1 hora após a administração
do agente lesivo, os estômagos foram retirados, o pH do suco gástrico foi determinado e os
estômagos abertos ao longo da grande curvatura. Em seguida os estômagos foram dispostos
em placas de vidro, escaneados e realizados os procedimentos de medida do I.L.U., como
descrito anteriormente.
C) Indução de úlceras pelo uso de Piroxicam - O experimento foi realizado segundo a
metodologia descrita por Puscas et al. (1997), com modificações. Foram utilizados
camundongos Swiss, machos, pesando acima de 30g, submetidos a jejum por um período de
36 horas. As lesões gástricas foram induzidas pela administração subcutânea de piroxicam 30
mg/Kg. Os tratamentos com a droga-teste (doses variadas), cimetidina 100 mg/Kg e veículo
41
por via oral (10mL/Kg), foram realizados 30 minutos antes da administração dos agentes
indutores, por via oral. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 4 horas após
o estímulo lesivo. Os estômagos foram removidos e abertos ao longo da maior curvatura, o
pH do suco gástrico determinado e a contagem e classificação das lesões gástricas
determinadas.
D) Úlceras induzidas pela Ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco
gástrico - Foi adotado o modelo descrito por Shay (1945) com modificações, os parâmetros
do suco gástrico (pH, volume e concentração de íons H
+
) foram avaliados pelo efeito do(s)
extrato(s) administrado pela via intraduodenal, no intuito de avaliar o efeito sistêmico do óleo
essencial. Após 24 horas de jejum os camundongos sob anestesia, sofreram uma incisão
longitudinal, logo abaixo da apófise xifóide para a amarradura de piloro. A administração da
droga-teste, cimetidina 100mg/Kg e veículo todos em dose volume final de 10 mL/Kg, foi
realizada logo após a amarradura do piloro. As incisões foram suturadas e quatro horas após a
cirurgia os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e a incisão reaberta.
Logo em seguida, foi realizada uma ligadura da cárdia (para preservação do conteúdo
gástrico) e o estômago foi retirado. O conteúdo estomacal foi coletado e, em seguida foi
determinado o volume do suco gástrico, o pH e a concentração de hidrogeniônica da secreção
gástrica através de titulação com NaOH 0,01N em bureta digital modelo EM-burete,
utilizando-se fenolftaleína como indicador. A concentração total de ácido foi expressa em
mEq/mL/4h. e o pH foi determinado. Quando possível, as lesões gástricas foram avaliadas
segundo o I.L.U., como descrito anteriormente.
E) Avaliação do envolvimento do Óxido Nítrico (NO) O método utilizado foi o
descrito por Arrieta et al. (2003). Foram utilizados ratos Wistar machos (cerca de 200g), que
42
ficaram de jejum por 24h, com água ad libitum. Foram divididos em 6 grupos. Os ratos foram
pré-tratados ou com L-NAME (N-nitro-L-arginina metil ester) 70 mg/Kg ou com veículo (10
mL/Kg), por via intraperitonial. Trinta minutos depois receberam por via oral veículo (10
mL/Kg), controle positivo (carbenoxolona, 100 mg/Kg) ou com a droga-teste. Depois de 60
min todos os grupos foram tratados com 1 mL de etanol absoluto, via oral, para a indução de
úlceras gástricas. Uma hora depois da administração do etanol os animais foram sacrificados
por deslocamento cervical e os estômagos retirados para a determinação do I.L.U.
F) Avaliação da participação do grupamento Sulfidrila - Neste modelo foi
utilizada a metodologia descrita por Arrieta et al., 2003. Ratos Wistar machos foram divididos
em grupos. Após jejum de 24h (água ad libitum), os grupos foram pré-tratados com salina ou
com a droga NEM (N-etilmaleimida, 10 mg/Kg), via intraperitoneal.Trinta minutos depois
receberam os tratamentos, por via oral: veículo (10mL/Kg), carbenoxolona (100 mg/Kg) e
com a droga-teste. Uma hora após essa administração, os grupos foram tratados oralmente
com 1 mL de etanol absoluto, para indução de úlceras gástricas. Após 1h os animais foram
sacrificados por deslocamento cervical, os estômagos retirados e abertos na curvatura maior.
Foram colocados em placas de vidro para determinação do I.L.U., conforme descrito
anteriormente.
G) Dosagem de prostaglandinas da mucosa gástrica de ratos (Curtis et al., 1995).
Ratos foram divididos em grupos que jejuaram por 24 horas e foram tratados com as segintes
soluções: Tween 80 8%(veículo), indometacina (20mg/kg, s.c) usada como um controle
positIvo e , fração acetato de Alchornea triplinervia (100mg/kg p.o.). Foram administrados
os tratamentos e 30 min depois indomethacina, esta foi dissolvida em uma solução 5% de
bicarbonato e sódio. Trinta minutos após o tratamento, os animais são sacrificados e o abdome
43
exposto para a retirada do estômago, que foi aberto no sentido da maior curvatura. A mucosa
s raspada com o auxílio de um bisturi, pesada e, então ressuspensa em 1 ml de tampão fosfato
de sódio (10 mM; pH 7,4). O tecido foi finamente picado com o auxílio de tesoura e, então
incubado a 37 ºC por 20 min. A PGE
2
no tampão foi determinada por um kit de
radioimunoensaio (Amersham) e todos os dados sobre a capacidade de síntese de PGE
2
serão
expressos em pg/miligrama de peso de tecido glandular. A absorbância foi lida em 450nm .
III.3- MOTILIDADE INTESTINAL
Este experimento seguiu a metodologia descrita no artigo de Baggio et al., (2002),
com algumas modificações. Foram utilizados camundongos fêmeas Swiss, pesando cerca de
30g, submetidas a um jejum de 6h (água ad libitum). Primeiramente, foram realizados os
tratamentos com: veículo; atropina 15mg/Kg (controle positivo) e com a droga-teste todos por
via oral. Depois de 30 minutos o carvão ativado foi administrado em todos os grupos, também
por via oral. Após 30 minutos foi feito o sacrifício dos animais, por deslocamento cervical. O
intestino dos animais foi retirado e, com a ajuda de um peso fixado em sua porção inferior,
foram colocados em uma régua vertical, para determinação do comprimento total do intestino
e da distância percorrida pelo carvão ativado, ambos em cm. A porcentagem percorrida foi
calculada e transformada em arc sen para análise estatística.
III.4- TOXICIDADE AGUDA E “SCREENING” HIPOCRÁTICO
Este experimento seguiu a metodologia descrita por (Souza-Brito, 1995). Foram
utilizados camundongos machos Swiss e divididos em 2 grupos: um grupo tratado com o
veículo (salina) e os demais tratados com a dose 5000 mg/Kg do extrato. Os tratamentos
foram realizados oralmente e os parâmetros comportamentais, observados aos 30, 60, 90, 120,
44
240 e 360 minutos após a realização dos tratamentos, bem como o número de mortes. O peso
corporal dos animais foi avaliado diariamente por 14 dias após o início dos experimentos. No
décimo quarto dia, os animais foram sacrificados e os seguintes órgãos retirados: coração,
fígado, pulmões e rins. Eles foram pesados para se realizar uma determinação analítica e
comparativa dos órgãos em relação aos animais submetidos ao tratamento com salina
indicando possíveis efeitos tóxicos agudo do extrato vegetal.
III.5- ATIVIDADE CICATRIZANTE:
O experimento foi realizado segundo metodologia de Takagi et al., (1969) e Okabe e
Amagase (2005). Ratos foram submetidos a jejum de 24 horas, em seguida foram pesados e
anestesiados para o procedimento de indução de úlcera gástrica. Foi feita uma incisão
longitudinal logo abaixo da apófise xifóide, a parede anterior do estômago foi exposta e um
volume de 0,02 mL de ácido acético a 20% foi injetado na camada submucosa da junção do
fundo com o antro, onde imediatamente formou-se a úlcera. Em seguida, realizou-se a sutura
e os animais foram mantidos em caixas de contenção normais, com alimento e água ad
libitum. A contar do dia seguinte desta operação e durante 14 dias, animais foram tratados
com veículo (controle negativo), com Cimetidina (droga antagonista do receptor H
2
) 100
mg/Kg (controle positivo) e foram tratados com a droga-teste, uma vez por dia. No 15° dia,
todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e tiveram seus estômagos
retirados para avaliação da área de cicatrização.
A) Análise morfológica:
Os estômagos foram abertos no sentido da maior curvatura, de modo que permitiu a
medição da área relativa à lesão de acordo com a fórmula A = πRr (onde R = raio maior da
45
lesão e r = raio menor da lesão). Avaliaram-se também os possíveis efeitos tóxicos através de
análise macroscópica e pesagem de órgãos vitais como baço, coração, fígado, pulmões e rins.
Após cuidadosa fixação em placa de isopor com alfinetes, o material foi fixado em
solução de ALFAC (formalina, álcool 80%, ácido acético), onde ficou imerso por 24 horas a 4
ºC. As peças foram desidratadas e incluídas em paraplast. Posteriormente, os blocos de
paraplast foram cortados em 7 µm de espessura em micrótomo de maneira semi-seriada. As
lâminas obtidas segundo esse processo foram submetidas à coloração por ácido periódico de
Schiff (P.A.S.) (Vacca, 1985) hematoxilina, hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson
(Behmer et al., 1976), para análises morfológica e morfométrica em microscopia de luz.
B) Imunohistoquímica:
Para análise imunohistoquímica foi utilizada uma lâmina representativa de cada
tratamento que foi desparafinizada, re-hidratada e destinada a imunohistoquímica com método
de revelação para peroxidase. O bloqueio de reação inespecífica foi feito com leite desnatado
e soro normal de carneiro, posteriormente à recuperação antigênica conforme indicação da
tabela 1 e as amostras foram incubadas com aos anticorpos específicos (ver tabela 1) em
solução de bloqueio “overnight”. Posteriormente, as amostras foram lavadas em tampão
fosfato (0.01 mol/L, pH 7.4) e incubadas em anticorpo secundário (Kit ABC Vector) e
revelado com o Avidina-Biotina associado com 3-3`diaminobenzina tetrahydrochloride
(DAB, Sigma), e analisadas posteriormente no microscópio LEICA DM acoplado com o
software de captura de imagens Leica QWin Standard Versão 3.1.0 Abril de 2004, Reino
Unido.
Tabela 1: Anticorpos e diluições específicas para as reações imunohistoquímicas
46
Anticorpo Código Empresa Titulação Recuperação
antigênica
Referência
PCNA NCL-PCNA Novo Castra 1:100 Citrato+ MW Kitajima et
al., 1993
HSP70 SC-1060 Santa Cruz
Biotechnology
1:100 Não necessita Guo et al.,
2002
COX 2 160106 Cayman
Chemical
1:200* Citrato+ MW Berenguer
et al., 2002
Gastrina SC-7783 Santa Cruz
Biotechnology
1:20 Não necessita Ku et al.,
2005
Somatostatina SC-7819 Santa Cruz
Biotechnology
1:20 Não necessita Ku et al.,
2005
*= Recomendado pela empresa
Citrato+ MW= Tampão citrato 0,01 M com irradiação em forno de microondas.
PCNA – antígeno nuclear de células em proliferação, usado para determinação de
células em divisão, principalmente na fase S do ciclo celular.
HSP70 - HEAT SHOCK PROTEIN 70 – é uma proteína da família HSP presente nas
células de mamíferos, com peso molecular aproximado de 70 kDa.
COX 2- é uma enzima induzida e expressa em lesões por algumas células do processo
inflamatório ou agentes mitogênicos (Halter et al., 2001; De Maria et al., 2003; Motilva et al.,
2005).
Gastrina e Somatostatina são hormônios que regulam a secreção, motilidade, absorção,
fluxo sanguíneo e nutrição das células do sistema digestório (Mao et al., 2005).
47
C) Análise morfométrica (Ishirara e Ito, 2002)
Essa análise foi realizada no analisador de imagens Leica Q-Win Standard Versão 3.1.0
(Reino Unido) no laboratório de imagens do Departamento de Morfologia. Foram feitas
medidas lineares da luz até a muscular da mucosa na área de transição da lesão e na área
normal.
ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Os resultados foram expressos na forma de média ± erro-padrão) dos parâmetros
obtidos. Os valores médios obtidos foram submetidos à análise de variância de uma via
(ANOVA), seguido pelo teste de Dunnett ou Tukey, com nível de significância mínimo de P
< 0,05. Em experimentos com dois grupos, o teste T de Student foi aplicado.
48
IV
IVIV
IV-
--
-RESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOS
49
Alchornea glandulosa
Atigo redigido sob as
normas e submetido ao
Biological & Pharmaceutical Bulletin
04/2006
50
Regular Article
Constituents and antiulcer effect of Alchornea glandulosa: Activation of
proliferation cell in gastric mucosa during healing process
Tamara Regina Calvo,
a
Zeila Pinheiro Lima,
b
Janaina Scaramelo Silva,
b
Kátia Verônica Rodrigues Ballesteros,
b
Cláudia Helena Pellizzon,
c
Clélia Akiko Hiruma-Lima,
b
Jorge Tamashiro,
d
Alba Regina Monteiro Souza Brito,
e
Regina Kiomi Takahira,
f
Wagner Vilegas.
(*), a
Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, c.p. 355, CEP 14800-900, UNESP, Araraquara,
SP, Brasil;
a
Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, c.p. 510, CEP 18618-000 UNESP,
Botucatu, SP, Brasil;
b
Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, c.p. 6109, CEP 13083-
970, UNICAMP, Campinas, SP, Brasil;
c
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, c.p. 510,
CEP 18618-000 UNESP, Botucatu, SP, Brasil;
d
Departamento de Botânica, Instituto de Biologia, c.p. 6109,
CEP 13083-970, UNICAMP, Campinas, SP, Brasil;
e
Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, c.p. 560, CEP 18618-000 UNESP, Botucatu, SP, Brasil.
f
To whom correspondence should be addressed: Prof. Dr. W. Vilegas. Fax: +55-16-3332 7932. E-mail:
(*)
51
Summary: Alchornea glandulosa (Euphorbiaceae) is a plant used in folk medicine as
antiulcer. Rats pretreated with methanolic extract obtained from the leaves of A. glandulosa
(AG) showed a dose-dependent effect and significant reduction of gastric ulcers induced by
absolute ethanol at the doses of 500 (57%) and 1000 mg/Kg (85%) in relation to control
group. Pretreatment of mice with AG (500 and 1000 mg/Kg, p.o.) showed dose-dependent
activity and significantly decreased the severity of lesions caused by HCl/ethanol and by non-
steroidal anti-inflammatory drug-induced gastric lesions. Pretreament with AG also induced
antisecretory action by local and systemic route and significant decreased of the total gastric
acid content of the animals. The gastroprotective effect of AG doesn’t involve the
participation of nitric oxide and increased the endogenous sulphydryl compounds, which are
defensive mechanisms of the gastrointestinal mucosa against aggressive factors. The ability of
AG healing gastric ulcer was evaluated after 14 consecutive days of treatment. Results show
that single oral administrations of AG (250mg/Kg/once day) presents a potent stimulation of
gastric epithelial cell proliferation that contributed to the acceleration of gastric ulcer healing
induced by acetic acid. In addition, no subacute toxicity (body weight gain, vital organs and
serum biochemical parameters) was observed during all treatment with AG. Phytochemical
investigation of AG led to the isolation of the myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside,
quercetin-3-α-L-arabinopyranoside, quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside, quercetin,
amentoflavone, methyl gallate, gallic acid and pterogynidine. We also established the
phytochemical profile of AG, with the quantification of the total phenolic compounds. These
compounds may contribute to the observed antiulcerogenic effect of A. glandulosa.
Keywords Alchornea glandulosa; PCNA; antiulcer activity; phenolic compounds.
52
Alchornea glandulosa Poepp. & Endl. (Euphorbiaceae) is a tree of 10-20 m popularly
known as tapiá, tanheiro-de-folha redonda, tanheiro or canela-raposa. It is found in the South
and Southwest regions of Brazil, mainly in the Atlantic pluvial forest.
1)
.
Ethnopharmacological survey indicated that species from the genus Alchornea are commonly
used for the treatment of gastric diseases.
2)
Despite the popular use of this species as a
medicinal plant, there are no data about its pharmacological effects on the gastrointestinal
system or its possible toxic property.
Literature reports that A. glandulosa contains sitosterol, stigmasterol, the terpenoid
loliolide, the guanidine alkaloid N-1,N-2,N-3-triisopentenylguanidine, the tannin corilagin,
gallic acid, ethyl gallate, the flavonoids quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, kaempferol-3-O-α-L-
rhamnoside and myricetin-3-O-α-L-rhamnoside.
3,4)
Concerning the pharmacological effects, crude extracts of A. cordifolia demonstrated
antimicrobial, antiamoebic, antispasmodic and antidiarrheic activities.
5, 6,7,8)
It was also
detected activity against Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Escherichia coli in
the methanolic extract of the leaves of A. cordifolia, which contains phenolic compounds and
terpenoids.
9)
The chloroformic fraction from the methanolic extract of the leaves of A.
sidifolia showed the presence of triterpenoids and steroids with antifungic activity.
10)
A.
cordifolia presented trypanocidal activity and activity against Plasmodium falciparum.
11,12)
The observed effect was correlated to the presence of ellagic acid.
13)
Besides flavonoids with
muscular relaxing activity, A. latifolia possesses pentacyclic triterpenoids with citotoxic
activity against cancerous cells Hep-G2 and A-431 and presented potent inhibition of the
topoisomerase II.
14)
From A. laxiflora it was isolated sulphated quercetin derivatives with
activity against Gram positive and Gram negative as well as against mushrooms.
15)
53
The present study has been conducted to evaluate the antiulcer activity of the methanolic
extract from the leaves of Alchornea glandulosa (AG) using different in vivo experimental
models in rodents followed by its phytochemical investigation.
Results and Discussion
Peptic ulcers are illnesses that affect a considerable number of people in the word. After
1900, physicians realized that the incidence of peptic ulcer was more prevalent than
previously supposed.
16)
Stress, smoking, nutritional deficiencies and ingestion of nonsteroidal-
antiinflammatory drugs grow the gastric ulcer incidences.
17)
Products in the market for the
treatment of gastric ulcers, including antacids, proton pump inhibitors, anticholinergics and
histamine H
2
-antagonists, can produce several adverse reactions.
18)
Brazil has a large biodiversity still underexplored. Based on a previous survey, in this
work we investigated the effect of extracts of A. glandulosa over gastric lesions induced by
several agents.
Fractionation of the methanolic extract of A. glandulosa (AG) by GPC followed by
purification by HPLC led to the isolation of the gallic acid 1, methyl gallate 2, the flavonoids
myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside 3, quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside 4, quercetin-
3-O-α-L-arabinopyranoside 5, quercetin 6, the biflavonoid amentoflavone 7 and of the
alkaloid pterogynidine 8, identified by comparison of their spectroscopic data to those
reported in the literature (Fig. 1).
19,20,21,22)
Figure 2 presents the chromatogram and UV spectra of a fraction containing mainly
phenolic compounds from AG using High Performance Liquid Chromatography - Ultraviolet
- Photodiode Array Detector (HPLC-UV-PDA). The identification of the peaks was
performed using co-injection of the standards available from a collection of our laboratory
and also by comparing with the ultraviolet spectra data obtained from literature.
23)
The
54
analysis of the retention time of the compounds compared to the respective standards and UV
data (Fig. 2) suggested that peaks 1 (16.69 ± 0.09%) and 2 (10.99 ± 0.18%) are gallic acid and
methyl gallate, respectively. Peaks 7 (5.99 ± 0.08%) and 9 (7.34 ± 0.04%) were
amentoflavone and amentoflavone derivative, peaks 3 (16.22 ± 0.12%), 4 (17.25 ± 0.03%), 5
(21.07 ± 0.12%) and 6 (3.25 ± 0.13%) were myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside, quercetin
3-O-β-D-galactopyranoside, quercetin 3-O-α-L-arabinopyranoside and quercetin respectively.
The amount of the total phenolic compounds was 10% (98.81 ± 0.05 mg/g) in the methanolic
extract. Peaks 8 and 10 correspond to pterogynidine and a guanidine alkaloid derivative.
As part of this pharmacological study, the acute toxicity in mice of the AG was first
investigated. A single administration of the AG by the oral route up to a dose of 5000 mg/Kg
did not produce any signs or symptom of acute toxicity in the treated animals. During the
following 14 days after the administration of AG, no animal died and no significant changes
in daily body or organ weight were observed until the end of this period (Table 1). In autopsy,
no significant change or lesions were observed in the internal organs of each animal. These
findings indicate that acute administration of AG (5000 mg/Kg, p.o) in mice is safe.
Ethnopharmacological information about the posology of A. glandulosa used in folk
medicine is confused. Souza-Brito related that active principles from medicinal plants are
generally found in low concentrations.
24)
Amounts higher than 1% are the exception. Since
the maximum dose used to perform the acute toxicity assay was 5000 mg/Kg of AG, a five-
fold lower dose (1000 mg/Kg) was selected as the maximum amount to evaluate the antiulcer
activity of AG.
The intestinal motility is one of the factors that may affected the intensity of luminal
absorption of drugs administered orally and probably regulated their bioavailability. Tsukimi
et al., observed that motility changes play a role in the development and prevention of gastric
lesions.
25)
Under the conditions used in our experiments, pretreatment with different doses
55
AG was unable to change the propulsion of the charcoal meal (P> 0.05) when compared to
atropine (Table 2).
The antiulcerogenic activity was assayed in distinct acute and subacute models of
ulcerative gastric in mice and rats. Rats pretreated with AG showed a dose dependent effect
with significant reduction of gastric lesions induced by absolute ethanol at the doses of 500
(57%) and 1000 mg/Kg (85%) (Table 3). These lesions were characterized by numerous
hemorrhagic red bands of different sizes along the long axis of the glandular stomach. The
pathogenesis of ethanol-induced gastric mucosal damage is still unknown but the formation of
oxygen-derived free radicals and a neutrophil infiltration into the gastric mucosa are
considered main reasons of mucosa damage.
26)
Plants containing substances like quercetin
and gallic acid are also effective in preventing this kind of lesion, mainly because of their
antioxidant properties.
27)
Kahraman et al.,. reveals that quercetin inhibited the development of
mucosal gastric ulcers induced by the administration of ethanol and products of the lipid
peroxidation, protein carbonyl compounds, histamine levels and MPO (myeloperoxidase)
activities were significantly decrease after treatment with quercetin.
28)
Hydrochloric acid is a necrotic agent that induces wide hemorrhage bands in gastric
corpus 60 min after HCl administration.
29)
Pretreatment with AG 50 min before HCl/ethanol
solution increased the severity of lesions in a dose-dependent manner by 64% (250 mg/Kg) and
46% (500 mg/Kg), in relation to mice treated with vehicle (Table 3). We also observed that the
lowest dose of AG presented the highest activity.
Piroxicam is a preferential COX-1 inhibitor. Cyclooxigenase was constitutively expressed
in the gastrointestinal tract in large amounts and has been suggested to maintain mucosal
integrity through continuous generation of prostaglandins.
30)
We observed that pretreatment
with AG showed a significant (P<0.01) gastroprotection at doses of 250 (78%) and 500
mg/Kg (33%). Again, we observed a decrease of the gastroprotection when we used higher
56
doses of AG. Actually, pre-treatment with AG at the highest dose (1000 mg/Kg) presents
more gastric damage than vehicle pre-treatment.
These results suggest that compounds present in AG may be involved with inflammation
precursors. In fact, Gracioso et al.,. described that increasing amounts of flavonoids may
change their properties from antioxidant to pro-oxidant.
31)
Repetto et al..
reported that low
concentrations of phenolic compounds stimulated the PGHS (prostaglandin H-synthase),
whereas high concentration inhibited the production of PGHS.
32)
Thus, the diminution of the
gastroprotective activity observed with increasing doses of AG probably was due the
chemical profile of this species that induced modulation of endogenous PGs. Our data was in
accordance to those obtained from Banerjee et al., which has shown that amentoflavone and
quercetin exerted suppression of PGE
2
biosynthesis via downregulation of COX-2/iNOS
expression.
33)
Gastric juice obtained from pylorus-ligated mice was used to analyze the gastric
biochemical parameters (Table 4). Animals pretreated with AG by both route (oral or
intraduodenal) increased the gastric volume and decreased the total gastric acid content when
compared with the control group. This result indicated that the antisecretory property was
involved into the antiulcer activity of AG. This effect observed after treatment with AG
indicated that compounds presents in AG, such as quercetin derivatives, may inhibit histamine
release from mast cells in gastric tissues. Kimata et al.,. reported that quercetin suppress Ca
2+
influx and protein kinase activity.
34)
Furthermore, the increase of gastric volume observed
after pre-treatment with AG indicates enhancement of the mucous-alkaline secretion.
Analysis of the crude methanolic extract and of the isolated substances from AG by TLC
followed by revelation with DPPH and β-carotene solutions evidenced the presence of typical
yellowish spots for all tested compounds, indicating their free radical scavenging effect,
except for the alkaloid pterogynidine.
57
Szabo reported that SH compounds might scavenge free radicals and consequently prevent
membrane damage brought about by lipid peroxidation.
35)
The role of endogenous SH
(sulphydryl compounds) in mucosal protection has been demonstrated in ethanol-induced
gastric injury, where the development of damage was accompanied by a lowering of mucosal
SH compounds. The sulphydryl compounds bind to free radicals that form after tissue injury
by noxious agents. These agents may also protect mucus, since mucus subunits are joined by
disulfide bridges that, if reduced, render mucus water-soluble.
36)
We investigated the possible involvement of endogenous SHs in the gastroprotective
effect of AG by pretreatment of the animals with N-ethylmalimide (NEM), a blocker of SHs
(Fig. 3). For ethanol-induced model, animal pre-treatment with NEM increased the severity of
gastric lesions. Hence animals treated with AG (1000 mg/Kg) showed attenuation of the
gastroprotection (11 ± 2.28 with saline vs. 58 ± 11.83 with NEM). This significant (P<0.001)
reduction of the gastroprotection observed by AG indicated the strong participation of
endogenous SHs in the gastroprotection effects of this extract.
The next step was to check the probable involvement of NO on the AG gastroprotection.
NO is a molecule implicated in mechanisms that control the integrity of the gastric
epithelium, regulation of the gastric blood flow and stimulation of the gastric mucus secretion
due to the activation of the enzime guanylate cyclase.
Therefore, in order to investigate the role of endogenous NO in cytoprotection, we used
the NOS inhibitor L-NAME to check the protective effect of AG on ethanol-induced gastric
hemorrhagic lesions (Fig. 4). Oral administration of AG to animals pre-treated with L-NAME
produced a raise in the gastric damage when compared with the L-NAME-pre-treated with
saline. Therefore, the gastroprotective effect of AG observed by pre-treatment with saline
(74%) was reduced when compared with the protective activity by pre-treatment with L-
NAME (64%) however this difference was not significant (P>0.05).
58
The ulcer produced by the injection of acetic acid into the rat stomach wall was assumed
to be similar to the human chronic ulcer, since it is difficult to be treated and it takes a long
time to be healed.
37)
Oral administration of AG for 14 consecutive days accelerated the
healing of gastric mucosa in rats producing a 43% cure rate when compared to control group
treated with vehicle (Table 5). Heal of the gastric ulcer was not observed by macroscopic
analysis of injuries but it was evidenced by morphometric analyses. The comparative measure
of the normal and regenerated areas of the gastric mucosa shows an increase of the transition
area due to the treatment with both cimeditine and AG (250 mg/Kg). Subacute treatment with
AG increased the regenerated area almost twice compared to the control group, thus
indicating that AG stimulated proliferative factors that lead to healing. The organization of the
glands is not observed in the mucosa of the stomach. However, glands apparently show
mucous secretion, with similar appearance to those treated with cimetidine (Fig. 5).
PCNA is a highly conserved 36kDa nuclear polypeptide identified as the auxiliary protein
of DNA polymerase delta.
38,39,40)
PCNA is expressed throughout the cell cycle and its
concentration is increased further in the S-phase of the cell cycle.
41)
Szabo et al., and
Tarnawski et al.,. have demonstrated the capacity of accelerating the ulcer healing process
depends on many factor, like a PDGF, FGF, VEGF stimulation of angiogenesis and cell
proliferation.
42,43,44)
Kitajima et al.,. demonstrated proliferative activity during healing of
gastric ulcers by PCNA method. In the morphologic analysis of PCNA immunohistochemical,
it can be noticed that the three treatments promote the proliferation of the cells.
45)
However,
only in the cells treated with AG the proliferation occurred in the basal region of the glandule
(Fig. 6F). Cimetidine significantly inhibited cell proliferation in three out of the five cell lines,
which may indicate the dependence of proliferation of these cell lines on stimulation of the H
2
receptor.
46)
59
This possibly occurs because the stem cell re-organizes from the base of the gland,
indicating the unidirectional character of the cell proliferation, which is different from the
normal region, which has a two directional proliferation.
44)
Cell proliferation also denotes that
AG induces the expression of the growth factor in the gastric mucosa, thus leading to the
gastric ulcer healing activity.
The healing experiment induced by acetic acid in rats also supports the accompaniment of
the evolution of the corporal weight of the animals submitted to the different treatments. This
method also indicates the possible presence of subacute toxicity after a treatment during 14
days, when parameters such as body weight gain, relative weight of the vital organs and
serum biochemical parameters are evaluated (Table 6). No animal mortality due to toxicity
and no significant differences in body weight gain were observed at the end of the 14 days of
treatment (data not shown). Moreover, the average weights of most vital organs and visceral
conditions were normal and comparable to the controls (Table 6). The 14 days treatment with
oral AG did not elicit changes in serum biochemical parameters related to renal (urea and
creatinine) and hepatic toxicity (AST and ALT). Although these results did not suggest any
significant adverse effects of Alchornea glandulosa in the used dose during 14 days, further
studies will be carried out to determine the absence of chronic toxicity.
The AG did not show acute toxicity and exhibited antisecretory and gastroprotective
activities. The observed effects probably involve the participation of NO as well as an
increase of endogenous SHs, which are related to the protective mechanisms of the
gastrointestinal mucosa against aggressive factors. Oral administration of the AG for 14 days
accelerated the healing of gastric ulcer in rats by promoting epithelial cells proliferation and
acceleration of gastric ulcer healing. Phytochemical evaluation carried out on the AG afforded
quercetin and myricetin derivatives, the biflavonoid amentoflavone, gallic acid, methyl gallate
60
and the alkaloid pterogynidine. These compounds probably contribute to the antiulcerogenic
effect of the polar extract of A. glandulosa leaves.
Experimental
Biological material. Leaves of Alchornea glandulosa Poepp & Endl were collected at
Piracicaba city, São Paulo State, Brazil, in June 2003 and authenticated by Prof. Jorge
Tamashiro. A voucher specimen (n
o
132828) was deposited at the Herbarium of the Campinas
University.
Apparatus. Compounds were identified by their 1D- and 2D-NMR (
1
H-
1
H COSY,
HMQC, HMBC and TOCSY) spectra in DMSO-d
6
using a Varian INOVA 500 spectrometer,
operating at 500 MHz for
1
H and 150 MHz for
13
C. Chemical shifts were given as δ (ppm)
using TMS as an internal standard. pH units were measured using a digital pH meter (PA 200,
Marconi S.A, Brazil). The acid content was measured using a digital burette. (E.M.,
Hirschmann Technicolor, Germany). Serum biochemical parameters were measured using an
automated biochemical analyzer (SBA-200, CELM, Brazil). Histological samples and
morphometric analyses were performed using a Leica microscope associated with Leica Qwin
Software (Leica-England).
Extraction and isolation. Leaves (500 g) of Alchornea glandulosa were air dried (7
days at 40
o
C) and powdered. The powdered dried leaves were exhaustively extracted with
chloroform and methanol successively at room temperature (3 times, 48 h each solvent).
Extracts were concentrated in vacuum, yielding 21 g (4.2%) and 59 g (11.8%) of residues,
respectively. An aliquot of the methanol extract from A. glandulosa (AG) (3 g) was further
dissolved in 10 ml methanol, centrifuged and the supernatant was submitted to Sephadex LH-
61
20 (Pharmacia) column chromatography (100 x 5 cm) using methanol as eluent. Fractions of
8 ml were collected and combined after thin layer chromatography (TLC) analysis to yield 24
fractions. Silica gel SiF254 (Merck) plates were eluted with chloroform:methanol (8:2, v/v)
and visualized using UV light (254 and 365 nm) and further sprayed with
anisaldehyde/sulfuric acid solution.
47)
An aliquot of the methanol extract (30 mg) was dissolved in 5 ml water:methanol (8:2,
v/v) and filtered in Sep-Pak cartridge (Sigma, C
18
). The cartridge was washed with 5 ml
water:methanol (1:1, v/v) and methanol, successively. Fractions were analyzed by TLC using
silica gel plates on glass (SiF254 , Merck) developed with a solvent mixture composed of
chloroform:methanol:n-propanol:water (5:6:1:4, v/v/v/v lower phase). The spots on the TLC
plates were observed under ultraviolet (UV) light (254 nm). The methanol fraction contained
mainly phenolic compounds, especially flavonoids. The methanolic fraction was filtered in a
Millex filter (0,45 µm) and analyzed using a Varian ProStar HPLC system equipped with an
RP-18 column (250 x 4.60 mm i.d., 5 µm, Phenomenex Luna). The mobile phase was water
(A) and acetonitrile (B), both with 0.05% trifluoracetic acid, in linear gradient elution of 30 to
70% of B in 60 min at a flow-rate of 1.0 ml/min. The effluent was monitored using a ProStar
330 photodiode-array ultraviolet detection (UV-PDA) system at 210 nm.
The total phenolic compounds of AG were quantitatively determined with HPLC
analysis. A stock solution (1 mg/ml) of rutin was prepared in methanol. The calibration curve
was build with seven different concentrations (10, 20, 50, 100, 200, 300 and 500 µg/ml in
rutin) and analyzed in duplicate. The peak areas were correlated with the concentrations
according to the calibration curve.
Calibration curve using the external standard rutin was constructed for the
determination of the total concentration of flavonoids. The calibration curve was linear over
62
the range of 10-500 µg/ml with a correlation coefficient of 0.9999. All data presented are
mean ± standard deviation of four independent experiments (n = 4).
Animals. Male Swiss albino mice (25-35 g) and male Wistar albino rats (150-250 g)
from the Central Animal House of the UNESP were used. The animals were fed a certified
Nuvilab
(Nuvital) diet with free access to tap water under standard conditions of 12 h dark-
12 h light, humidity (60 ± 1.0%) and temperature (21 ± 1.0%). Fasting was used prior to all
assays because standard drugs and extract were always administered orally (by gavage) or by
intraduodenal route using a saline solution (10 ml/kg) as the vehicle. Animals were kept in
cages with raised floors of wide mesh to prevent coprophagy. All experiments were
performed in the morning, and following the recommendations of the Canadian Council on
Animal Care, The UNESP Institutional Animal Care and Use Committee, approved all of the
employed protocols.
48)
Drugs and chemicals. Ethanol absolute, hydrochloric acid, acetic acid (Sinth, Brazil),
N-omega-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), carbenoxolone, cimetidine, N-
ethylmaleimide (NEM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), lansoprazole and
piroxicam (Hexal, Brazil), PCNA mouse monoclonal antibody (Novo Castra NCL-PCNA)
(1:100) and ABC (avidine and biotine complex) reagents (ABC kit – Vector) were used in
this study. All drugs and reagents were prepared immediately before use, and the reagents
used were of analytical grade.
Antioxidant activity. The antioxidant activity of the AG was evaluated by TLC under
the conditions described above. Plates were revealed with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) reagent as well as β-carotene solution.
49)
63
Acute toxicity. The acute toxicity studies were performed in mice. In this assay, a
single dose of the AG was orally administered to groups of ten animals after a 12 h fast.
Another group of animals receiving the vehicle (saline) served as control. The sings and
symptoms associated with the AG administration (5g/kg, p.o.) were observed at 0, 30, 60,
120, 180 and 240 min after and then once a day for the next 14 days. The mortality, measured
body weight, and behaviour screening were recorded for 24 hours and for 14 days after the
treatment. The macroscopic analyses and weight of vital organs such as liver, kidney, heart
and lung were compared between the animals treated with AG and vehicle. The acute
toxicological effect was estimated by the method described by Souza Brito.
50)
Intestinal motility. Swiss mice were fast for 6 h with water ad libitum. The experimental
group was treated with AG at the doses of 250, 500 and 1000 mg/Kg; the control group was
treated with saline (10 ml/kg) and the positive control with atropine (5mg/Kg). Thirty min
after the treatments animals received suspension from active charcoal 10% in water. After 30
min animals were sacrificed and intestines removed. The total length of the intestine and the
distance covered by the charcoal suspension was measured.
51)
Antiulcerogenic activity.
Ethanol-induced ulcer: This experiment was performed as described by Morimoto et
al.,.
52)
Rats were divided in 5 groups of 4-5 animals fasted 24 h prior to receiving an oral dose
of the vehicle, saline (10 ml/kg), lansoprazole (30 mg/Kg), AG (250, 500 and 1000 mg/Kg
body wt.). After 60 min, all groups were orally treated with 1 ml of absolute ethanol for
gastric-ulcer induction. Animals were killed 1 h after the administration of ethanol. The extent
of the lesions was measured and the lesion index expressed as the sum of all lesions as described
by Szelenyi et al.,.
53)
64
HCl/ethanol-induced ulcer: The experiments were performed as described by Mizui et
al.,.
with modification.
54)
Mice were divided into groups of 5-8 animals that were fasted 24 h
prior to receiving an oral dose of the vehicle, saline (10 ml/kg), lansoprazole (30 mg/Kg), AG
(250, 500 and 1000 mg/Kg). After 50 min, all groups were orally treated with 0.2 ml of a 0.3
mol/l HCl/60% ethanol solution (HCl/ethanol) for gastric-ulcer induction. Animals were
killed 1 h after the administration of HCl/ethanol and the gastric damage was determined as
described above.
NSAID gastric ulcers in mice: In this model gastric lesions were induced with piroxicam
(30 mg/Kg, s.c.) administered to mice (n=5) after a 36 h fast. AG (250, 500 and 1000 mg/Kg),
cimetidine (100 mg/Kg) and saline were orally administered 30 min before the induction of
the gastric lesions. Animals were killed 4 h after treatment with the ulcerogenic agent. The
stomachs were removed and gastric lesion determined as described above.
55)
Shay ulcer: Mice were randomly divided in three groups (n=7-8) that were fasted for 24 h
with free access to water. Thirty min or immediately after oral administration of a single dose
of AG (1000 mg/Kg), cimetidine (100 mg/Kg) as positive control or vehicle (saline), pylorus
ligature was performed as described by Shay et al.
56)
The animals were killed 4 h later, the
abdomen opened and another ligature placed around the esophagus close to the diaphragm.
The stomach was removed, inspected internally; its content was drained into a graduated tube
and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The supernatant volume and pH were recorded with a
digital pH meter. The total acid content of gastric secretion was also determined by titration to
pH 7.0 with 0.01 N NaOH using a digital burette.
Determination of Gastric Secretion: The assay was performed by the method of Shay et
al., with a few modifications.
56)
All groups of mice (n=5-9) fasted for 24 h, with free access to
water. Immediately after pylorus ligature, AG (1000 mg/Kg), cimetidine (100 mg/Kg) as
positive control, or the vehicle (saline 10 ml/kg) was administered intraduodenally. The
65
animals were killed 4 h later by cervical dislocation; the abdomen was opened and another
ligature placed around the esophagus close to the diaphragm. The stomachs were removed
and the gastric content collected to determine the total amount of gastric-juice acid (ml) and
pH values. Distilled water was added and the resultant solution centrifuged at 3000 rpm for 10
min. Total acid in the gastric secretion was determined in the supernatant volume by titration
to pH 7.0 with 0.01 N NaOH.
Ethanol-induced gastric lesions in NEM-pretreated rats:
57)
Rats were divided into groups
with 4-5 animals that were fasted 24 h. They were previously treated intraperitoneally with
NEM (N-ethylmaleimide 10 mg/Kg) or saline; and thirty minutes later received an oral dose
of the vehicle (10 ml/kg), AG (1000 mg/Kg) or carbenoxolone (100 mg/Kg). After 60 min, all
groups were orally treated with 1 ml of absolute ethanol for gastric-ulcer induction. Animals
were killed 1 h after the administration of ethanol, and the stomachs excised and the gastric
damage determined as described above.
Ethanol-induced gastric lesions in L-NAME-pretreated rats:
Rats were divided into
groups (7 animals) that were fasted 24 h. Animals were treated with L-NAME (N-nitro-L-
arginine methyl ester-70 mg/Kg) or saline by i.p. route, and thirty minutes later received an
oral dose of the vehicle (10 ml/kg), AG (1000 mg/Kg) or carbenoxolone (100 mg/Kg). After
60 min, all groups were orally treated with 1 ml of absolute ethanol for gastric-ulcer
induction. Animals were killed 1 h after the administration of ethanol, and the stomachs
excised and the gastric lesion was determined.
57)
Healing in acetic acid-induced gastric lesion: The experiments were performed according
to the method described by Takagi et al., with some modifications.
37)
Three groups of male
Wistar rats fasted for 24 h were used in this experiment (n=6-8). Under anaesthesia, a
laparotomy was done in all animals through a midline epigastric incision. After exposing the
stomach, 0.05 ml (v/v) of a 30% acetic acid solution was injected into the subserosal layer in
66
the glandular part of the anterior wall. The stomach was bathed with saline (20 °C) to avoided
adherence to the external surface of the ulcerated region. The abdomen was then closed and
all the animals were fed normally. We selected the lower dose of AG (250 mg/Kg), cimetidine
(100 mg/Kg) or vehicle (10 ml/kg) for the determination of the healing effects by the subacute
treatment. All treatments were done orally once a day during 14 consecutive days beginning
one day after surgery. Body weight was recorded daily throughout the experiments and the
macroscopic analyses and weight of vital organs (liver, kidney, heart spleen and lung) were
compared between the different treatments to evaluate the possible subacute toxicity induced
by the treatments.
On the day after the last drug administration, the rats were killed and the stomachs were
removed. The gastric lesions were evaluated by examining the inner gastric surface with a
dissecting magnifying glass. The macroscopic ulcer area (mm
2
) and curative ratio (%) were
subsequently determined as described by Takagi et al..
37)
Biochemical analysis: The blood of rats submitted to different treatments was collected
immediately after the sacrifice and centrifugued (3000 rpm by 10 min). After centrifugation,
the serum obtained was kept frozen at – 20 ºC until the biochemical analyses. Serum
biochemical parameters such as urea, creatinin, aspartate aminotransferase (AST) alanine
aminotransferase (ALT) were measured by an automated biochemical analyzer .
Histology methods: The stomach of the rats submitted by to gastric ulcers in the acid
acetic model with different treatments were pushed off and opened by the large curves and the
lesion was localized. The lesion was sectioned, and fixed in ALFAC solution (alcohol,
chloroform and acetic acid) for 24 h in 4 ºC. Then the samples were routine processed for
embedding in paraplast, and cut into 7 µm thick section. These sections were stained with
hematoxylin and eosin and observed under a microscope.
67
Morphometric analyses: For the morphometric analyses a slice of stomach was examined
under a microscope, using the method described by Ishihara et al.,
58)
Immunohistochemistry: PCNA - Proliferating cell nuclear antigen was using to
determinate proliferating cells, for this we take the representative slices was deparaffinized,
rehydrated and immunostained with the peroxidase anti-peroxidase method. High temperature
antigen unsmasking technique in 0.01 mol/l citrate buffer pH 6.0 in microwave oven, for two
times at 5 min. Blocking of nonspecific reaction was performed with 1% normal goat serum
and 3% not-fat milk, and PCNA mouse monoclonal antibody. After rising in phosphate
buffered saline (0.01 mol/l PBS pH 7.4), the sections were incubated in secondary antiserum.
They were then washed in PBS and incubate in ABC (avidine and biotine complex) reagents
and incubate in peroxidase reaction (3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochoridle containing
0.01% H
2
O
2
in PBS buffer). After immunostainied, the sections were lightly counterstained
with Mayer´s hematoxylin. The slides were observed under light microscope.
Statistical analysis. Results were expressed as mean ± S.E.M. Statistical significance was
determined by one-way analysis of variance followed by Dunnett's or Tukey’s test, with the
level of significance at P< 0.05.
Acknowledgements. We thank the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP) for grants to T.R.C. and J.S.S. and for fundings from Biota-Fapesp Program
and to (Capes) for a grant to Z.P.L.
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72
Table 1: Evaluation of the acute toxicity of the methanolic extract of Alchornea glandulosa
(AG) (5 g/kg, p.o.) in mice.
Weight Control
AG
Body (g) 41.00 ± 2.40 41.71 ± 3.07
Kidney (mg) 514.98 ± 32.08 582.95 ± 49.57
Liver (mg) 2187 ± 146.28 2211.82 ± 176.12
Heart (mg) 202.08 ±12.70 203 ± 15.03
Spleen (mg) 183.60 ± 18.95 197.51 ± 12.46
Mortality 0/7 0/7
Results are mean ± S.E.M.; n=7. Student’s test. No significant P >0.05.
73
Table 2: Effects of the methanolic extract of Alchornea glandulosa (AG) on intestinal
propulsion induced by charcoal activated in mice.
Treatment
(p.o.)
Dose
(mg/Kg)
n
Distance moved by charcoal
(arcsine)
Control 10 7 57.85 ± 2.57
Atropine 5 6 40.16 ± 2.74*
250 7 56.0 ± 2.47
500 7 56.57 ± 4.29
AG
1000 7 60.57 ± 2.95
Results are mean ± S.E.M. Dunnet´s test, represents significantly different from the control
group. arcsine * P P <0.01 F
(4;29)
= 6.84
74
Table 3: Effects of different doses of the methanolic extract of Alchornea glandulosa (AG) on
models of gastric lesions induced in mice and rats.
Method
Treatment
(p.o.)
Dose
(mg/Kg)
n U.L.I.
Inhibition
(%)
Ethanol Control - 5
89.0 ± 6.70 -
(Rats) Lansoprazole
30 5
35.40 ± 8.26* 60
AG
250 4
79.25 ± 8.91 11
500 4
37.75 ± 6.0* 57
1000 4
13.0 ± 5.84* 85
HCl/Ethanol
Control -
8 71.0 ± 10.03
-
(Mice) Lansoprazole
30
6 30.0 ± 3.81**
58
AG
250
5 25.80 ± 3.86**
64
500
5 38.40 ± 5.58*
46
1000
5 48.60 ± 9.88
32
NSAID Control - 5
50.80 ± 5.67
-
(Mice) Cimetidine 100 5
12.80 ± 1.93**
75
AG
250 5
11.20 ± 1.59**
78
500 5
33.80 ± 3.38**
34
1000 5
58.0 ± 2.34
-14
Results are mean ± S.E.M. Ethanol: ANOVA, Dunnett test * P <0.01, F
(4,27)
=8.63;
HCl/ethanol: Dunnett test* P <0.05, ** P <0.01, F
(4;24)
= 5.9; F
(4;28)
= 7.54; NSAID:
Dunnett ** P <0.01F
(4,20)
=41.06 for U.L.I.
75
Table 4: Effects of a single dose of the methanolic extract of Alchornea glandulosa (AG)
given by oral (p.o.) or intraduodenal (i.d.) route on the parameters of gastric juice obtained
from pylorus-ligated mice.
Treatment Route n
Dose
(mg/Kg )
Total Acid
(µ
µµ
µEq/mL/4h)
pH
Gastric Volume
(mL)
Control 7 -
7.46 ± 0.72 2.14 ± 0.26
0.66 ± 0.07
Cimetidine 7 100
4.91 ± 0.80* 3.14 ± 0.34
0.63 ± 0.10*
AG
i.d.
8 1000
4.57 ± 0.47* 2.0 ± 0.29 1.10 ± 0.07*
Control 8 -
6.86 ± 0.51 3.33 ± 0.37
0.63 ± 0.08
Cimetidine 9 100
4.28 ± 0.45** 3.66 ± 0.28
0.56 ± 0.06
AG
p.o.
5 1000
4.45 ± 0.35** 2.50 ± 0.18
1.33 ± 0.23**
Results are mean ± S.E.M. i.d route: ANOVA, Dunnett test *P<0.05, F
(2;21)
= 4.84 (Volume);*
P<0.05 F
(2;25)
= 5.79 (Total Acid); P>0.05 n.s. F
(2;22)
= 2.5 (pH). P.o. route: ANOVA, Dunnett
test ** P <0.01, F
(2;22)
= 4.93 (Total Acid); ** P <0.01: F
(2;22)
= 12.73 (Volume); P >0.05 N.S. F
(2;22)
= 4.2 (pH).
76
Table 5: Effects of the treatment by 14 consecutive days with extract of Alchornea glandulosa
(250mg/Kg/day) on healing of ulcer produced by acetic acid solution into the stomachs of
rats.
Macroscopic analyses Histological analyses
Treatment
(p.o)
n
Dose
(mg/Kg)
Lesion area
Extern
(mm
2
)
Lesion area
Intern
(mm
2
)
Curative
ratio
(%)
Normal
( um)
Regeneration area
(um)
Control
6 -
1.10 ± 0.10 0.44 ± 0.07
- 563.2 ± 34.35 566.07 ± 73.82
Cimetidine
7 100
1.01 ± 0.18 0.37 ± 0.04
16 461.75 ± 38.05 748.25 ± 117.53
AG
8 250
1.01 ± 0.05 0.25 ± 0.04
43 513.97 ± 16.78 931.07 ± 42.52**
Results are mean ± S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s test. ** P<0.01 F
(2,15)
= 7.2.
77
Table 6: Evaluation of the toxicity of methanolic extract (AG) obtained from leaves of A.
glandulosa in rats. Effects on body organ weight, relative weight of the vital organs and
serum biochemical parameters of a single dose (250 mg/Kg, p.o.) of AG administered during
14 consecutive days after ulcer formation.
Treament (p.o.) Control
Cimetidine AG
Weight (g)
Body
237.45 ± 6.67 250.72 ± 7.64 250.36 ± 7.52
Kidney
1.81 ± 0.08 2.02 ± 0.07 2.04 ± 0.11
Lungs
1.43 ± 0.04 1.57 ± 0.14 1.73 ± 0.25
Liver
7.42 ± 0.17 8.18 ± 0.30 8.4 ± 0.48
Heart
1.23 ± 0.06 1.18 ± 0.06 1.3 ± 0.07
Spleen
0.69 ± 0.04 0.67 ± 0.04 0.62 ± 0.04
Biochemistry
Urea (mg/dl) 108.5 ± 2.91 115.6 ± 2.89 120 ± 6.16
Creatinin
(mg/dl)
1.86 ± 0.04 1.86 ± 0.09 1.75 ± 0.08
AST(UI/L) 222.80 ± 7.10 267.00 ± 16.68 202.83 ± 25.38
ALT(UI/L) 93.76 ± 5.01 87.5 ± 5.44 71.66 ± 7.16
Results are mean ± S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s test. No significant P>0.05.
78
Fig. 1. Chemical structure of Alchornea glandulosa constituents.
O
OH
OH
R
2
O
OH
OH
OR
1
O
OH
OH
R
2
O
OH
OH
OR
1
O
OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
COOR
OH
OH
OH
COOR
OH
OH
OH
R
1
R
2
(3)
α
αα
α
-L-rhamnopyranoside OH
(4)
β
ββ
β
-D-galactopyranoside H
(5)
α
αα
α
-L-arabinopyranoside H
(6)
OH H
R
(1) H
(2) CH
3
(8) (7)
CH
3
CH
3
NH
NH CH
3
CH
3
NH
79
Fig. 2. HPLC profile and UV spectra (210 nm) of the methanolic extract of Alchornea
glandulosa (AG): gallic acid 1, methyl gallate 2, myricetin 3-O-
α
-L-rhamnopyranoside 3,
quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside 4, quercetin 3-O-
α
-L-arabinopyranoside 5, quercetin 6,
amentoflavone 7, guanidine alkaloid pterogynidine 8, amentoflavone derivative 9 and
guanidine alkaloid derivative 10. Chromatographic conditions: see text.
50
100
150
200
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
250
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
250
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
250
mAU
200 250 300 350
nm
50
100
150
200
250
mAU
200 250 300 350
nm
100
200
300
400
500
mAU
200 250 300 350
nm
nm mAU nm mAU nm mAU nm mAU nm mAU nm mAU
100
200
300
400
500
mAU
200 250 300 350
nm
nm mAU nm mAU nm mAU nm mAU nm mAU nm mAU
0
100
200
300
400
500
600
mAU
200 250 300 350
nm
0
100
200
300
400
500
600
mAU
200 250 300 350
nm
1, 2 7, 9
8, 103, 4, 5, 6
10 20 30 40 50
Min
0.0
0.2
0.5
0.7
1.0
AU
1
2
3
4
5
8
7
10
9
6
10 20 30 40 50
Min
0.0
0.2
0.5
0.7
1.0
AU
1
2
3
4
5
8
7
10
9
6
80
Fig. 3.
Effects of methanolic extract of Alchornea glandulosa (AG) on gastric lesions induced
by ethanol in different combinations of NEM (N-ethylmaleimide) on pretreated rats.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Ulcer Index
Saline
Carbenoxolone
Ag1000mg/kg
**
89%
**
87%
**
58% **
71%
Saline NEM
Pre-treatments
(P < 0.001)
(P < 0.01)
(P < 0.001)
Results are mean ± S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s test **P<0.01 represents
significant from the control group saline_saline F
(2,12)
=185.4; and NEM_saline F
(2,12)
=
91.78.
81
Fig. 4.
Effects of the methanolic extract of Alchornea glandulosa (AG) on gastric lesions
induced by ethanol in different combinations of L-NAME (N-nitro-L-arginine methyl ester)
on pretreated rats.
0
50
100
150
200
250
300
Ulcer Index
Saline
Carbenoxolon
e
Ag 1000mg/kg
Saline
L- NAME
Pre-treatments
**
62
%
**
74%
**
64%
(P < 0,001)
(P < 0,001)
(P > 0,05)
Results are mean ± S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s test **P<0.01 represents
significant from the control group saline_saline F
(2,18)
=24.97; and L-NAME_saline F
(2,17)
=
19.97.
82
Fig. 5. Slides of stomach of rat treatment saline (A, D, G), cimetidine (B, E, H) and Alchornea
glandulosa (C, F, I) stained with hematoxilyne and eosine. The head arrow indicates the
lesion area. Note the difference of mucus inside the lumen (*).
83
Fig. 6. Slides of stomach of rat treatment saline (A, D), cimetidine (B, E) and Alchornea
glandulosa (C, F) immunohistochemistry to PCNA immunostained with peroxidase method.
Note the organize in the glandule, and the nucleus PCNA positive in the Alchornea
glandulosa (arrow).
84
Alchornea triplinervia
Artigo redigido
Sob as normas
da revista Life Science.
85
ORIGINAL RESEARCH ARTICLE
Gastroprotective and Healing effects of Alchornea triplinervia on
enhance the COX
2
and prostaglandin E
2
expression
Zeila Pinheiro Lima
a
, Tamara Regina Calvo
b
, Elisangela Farias Silva
c
, Claudia Helena
Pellizzon
d
, Wagner Vilegas
b
, Alba Regina Monteiro Souza Brito
c
, Regina Kiomi Takahira
e
,
Clélia Akiko Hiruma-Lima
a*
a
Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, c.p. 510, CEP 18618-000, UNESP,
Botucatu, SP, Brasil.
b
Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, c.p. 355, CEP 14800-900,
UNESP, Araraquara, SP, Brasil.
c
Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, c.p. 6109, CEP 13083-970,
UNICAMP, Campinas, SP, Brasil.
d
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, c.p. 510, CEP 18618-000 UNESP,
Botucatu, SP, Brasil.
e
Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, c.p.
560, CEP 18618-000 UNESP, Botucatu, SP, Brasil.
*
Corresponding author: Clélia Akiko Hiruma-Lima.
Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista
(UNESP), Rubião Junior s/n, CP 510, CEP 18618-000, Botucatu, SP, Brasil. Phone -
00+5501438116077; fax - 00+551438116251; e-mail: [email protected]
86
ABSTRACT
This study was designed to discover compounds with anti-ulcer activity and their
mechanisms of action. A single administration of MeOH extract of A. triplinervia (At) to a
dose of 5g/kg (p.o.) did not produce any signs or symptom of toxicity in the treated animals.
The oral pre-treatment with At (250, 500 and 1000 mg/kg) in rats and mice with gastric
lesions induced by ethanol (30, 85 and 89%) and HCl/ethanol (78, 86 and 89%) decreased the
gastric lesions in relation to control group, respectively. In the NSAID-induced gastric
lesions, the gastroprotection effects of At decreased with the increase of the dose. In mice
pylorus-ligature, administration of At by oral route resulted in a decrease in the total acid and
reduction of ulcer index. So the pretreatment with N-nitro-L-arginine methyl ester (an
inhibitor of NO synthase), or N-ethylmalimide (a blocker of SHs), not abolished the
gastroprotection effects against ethanol-induced damage observed antiulcer effects probably
not involve the participation of nitric oxide (NO) or endogenous sulphydryl compounds
(SHs). The substances responsible for the protection action are concentrated in the ethyl
acetate fraction (FA) that has showed more efficient (50%) than aqueous fraction (AQF) at
dose of 100mg/kg (20%). FA exerts gastroprotection by increase prostaglandins levels. FA
was also effective in promoting the healing process in chronic gastric ulcer induced by acetic
acid in rats. FA shows how a potent stimulator of gastric epithelial cell proliferation that
contributed to acceleration of gastric ulcer healing induced by acetic acid. In addition, no
subacute toxicity was observed during all treatment. In imunohistochemical analysis we
observed a large number of marked COX 2 cells main in the submucosa and the results shows
that G cells declined while D cells increased. We also established the phytochemical profile of
At, with the quantification of the total phenolic compounds. The FA contains flavonoids and
these compounds may contribute to the observed antiulcerogenic effect of At.
Keywords
: Alchornea triplinervia; antiulcer activity; prostaglandin E
2
; COX
2
.
87
INTRODUCTION
For more than a century, peptic ulcer disease has a major cause of morbid and mortality.
The pathophysiology of peptic ulcer disease has centered on imbalance between aggressive
and protective factors in the stomach (Chan and Leung, 2002). Despite the progress in
conventional chemistry and pharmacology in producing effective drugs, the plant kingdom
might provide a useful source of new anti-ulcer compounds for development as
pharmaceutical entities or, alternatively, as simple dietary adjuncts to existing therapies
(Borelli and Izzo 2000).
The selection of plants is made on the grounds of their traditional use, the chances for
research success is greater (Elisabetsky and Wannmacher, 1993). An ethnopharmacological
inventory made in the Cerrado formation of the Central region of Brazil showed a high
number of medicinal plants used to treat gastric pain and gastritis (Silva et al., 2000). Based
on this inventory we selected species of genus Alchornea to study its antiulcer property
indicated by traditional use of Alchornea triplinervia (Spreng.) Muell. Arg. is known
popularly as tapiá, caixeta, tapia-guaçu, tapiá-mirim, folha-de-bolo, tamanqueira and canela-
samambaia.
In literature it has only one article of the Alchornea triplinervia, had been isolated of his
leaves amentoflavone (extract CHCl
3
/MeOH 9:1) and of the MeOH extract they had been
gotten the isocorilagine, gallic acid and methil galate, all the substances had been isolated for
CC in Sephadex LH-20 (Braca et al., 2002). Other species of the Alchornea genus had
antiinflammatory activity such as Alchornea cordifolia (Manga et al., 2004). Ebi (2001)
detected antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and
Escherichia coli in methanolic extract of A. cordifolia that contains phenolic compounds and
terpenoids.
88
The present work was carried out to investigate the anti-ulcer activity and their
mechanisms of action against acute and chronic experimental models of gastric ulcer in
rodents and the phytochemical investigation of methanolic extract of Alchornea triplinervia
leaves and their fractions.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Drugs and chemicals
The chemicals used and other solutions were all of analytical grade. All drugs and reagents
were prepared immediately before use. The following drugs were used: ethanol absolute,
hydrochloric acid, L-NAME (N-nitro-L-argininemethyl ester), cimetidine, N-ethylmaleimide
(NEM) (Sigma Chemical Co.), lansoprazole and piroxicam (Hexal, Brazil), carbenoxolone
(Sigma Chemical Co., U.S.A.) and Tween
80. The chemicals used and other solutions were
all of analytical grade. All drugs and reagents were prepared immediately before use. The
methanolic extract and aqueous fraction were solved in saline 0.9% and ethyl acetate fraction
in Tween 80 at 8%.
2.2. Plant material
Leaves of Alchornea triplinervia were collected at Botucatu, São Paulo State, Brazil,
in August 2003 and the vegetal species is identified by Prof. Dr. Jorge Tamashiro from
Institute of Biology of the University of Campinas, São Paulo State, Brazil. A voucher
specimen (BOTU: 14873) was deposited at the Herbarium of the Universidade Estadual
Paulista, Campus Botucatu, Brazil.
2.3. Extraction and isolation of the compounds
89
The leaves (500 g) of A. triplinervia were air dried (7 days at 40
o
C) and powdered.
The powdered aerial parts were exhaustively extracted with chloroform and methanol
successively at room temperature (3 times, 72 h for each solvent). MeOH extract (75 g,
15.0%). A portion (28 g) of the MeOH extract was partitioned among EtOAc/H
2
O (1:1, v/v)
leading to 7.5 g (27%) of the ethyl acetate fraction and 15 g (54%) of the aqueous fraction.
2.4. Analytical and quantitative measurement of total phenolic compounds by HPLC-UV-
PDA
In the aqueous and ethyl acetate fractions the flavonoids concentration was determined as
follows: An aliquot of each fraction (30 mg) was filtered in Sep-Pak cartridge (Sigma, C
18
)
and analyzed using a Varian ProStar HPLC system equipped with an RP-18 column (250 x
4.60 mm i.d., 5 µm, Phenomenex Luna). The mobile phase was water (A) and acetonitrile (B),
both with 0.05% trifluoracetic acid, in linear gradient elution of 30 to 70% of B in 60 min at a
flow-rate of 1.0 mL/min. The effluent was monitored using a ProStar 330 photodiode-array
ultraviolet detection (UV-PDA) system at 360 nm.
A stock solution (1 mg/mL) of rutin was prepared in methanol. The calibration curve
was build with seven different concentrations (10, 20, 50, 100, 200, 300 and 500 µg/mL in
rutin) and analyzed in duplicate. The peak areas were correlated with the concentrations
according to the calibration curve.
Calibration curve using the external standard rutin was constructed for the
determination of the total concentration of flavonoids. The calibration curve was linear over
the range of 10-500 µg/mL with a correlation coefficient of 0.9999. All data presented are
mean ± standard deviation of four independent experiments (n = 4).
2.5. Animals
90
Male Swiss albino mice (25-35 g) and male Wistar albino rats (150-250 g) from the
Central Animal House of the UNESP were used. The animals were fed a certified Nuvilab
(Nuvital) diet with free access to tap water under standard conditions of 12 h dark-12 h light,
humidity (60 ± 1.0%) and temperature (21 ± 1%). Fasting was used prior to all assays because
standard drugs were always administered orally (by gavage) or by intraduodenal route using a
saline solution (10 mL/kg) as the vehicle. Moreover, the animals were kept in cages with
raised floors of wide mesh to prevent coprophagy. All experiments were performed in the
morning, and following the recommendations of the Canadian Council on Animal Care
(Olfert et al. 1993), The UNESP Institutional Animal Care and Use Committee, approved all
of the employed protocols.
2.6. Acute toxicity
The acute toxicity studies were performed in mice. In this assay, a single dose of At were
orally administered to groups of animals after a 12 h fast. Animals receiving the vehicle
(saline) served as control. The sings and symptoms associated with the At administration
(5g/kg, p.o.) were observed at 0, 30, 60, 120, 180 and 240 min after and then once a day for
the next 14 days. At the end of the period the number of survivors was recorded. The acute
toxicological effect was estimated by the method described by Souza Brito, 1995.
2.7. Antiulcerogenic activity
HCl/ethanol-induced ulcer: The experiment was done as described by Mizui and Doteuchi,
1983
(10)
. Mice were divided into groups at 7-9 animals that were fasted 24 h prior to
receiving an oral dose of the vehicle, saline (10 mL/kg), lansoprazole (30 mg/kg), At (at the
doses of 250, 500 and 1000 mg/kg body wt.). After 50 min, all groups were orally treated
with 0.2 mL of a 0.3
M HCl/60% ethanol solution (HCl/ethanol) for gastric-ulcer induction.
91
Animals were killed 1 h after the administration of HCl/ethanol, and the stomachs excised .The
extent of the lesions was measured and the lesion index expressed as the sum of all lesions as
described by Szelenyi and Thiemer, 1978.
Ethanol-induced ulcer: Rats were fasted 24 h prior to receiving an oral dose of the vehicle,
saline (10 mL/kg), lansoprazole (30 mg/kg), At (at the doses of 250, 500 and 1000 mg/kg),
FA (50, 100 and 200mg/kg) and FAQ (100mg/kg). After 60 min, all groups were orally
treated with 1 mL of ethanol solution for gastric-ulcer induction. Animals were killed 1 h after
the administration of ethanol, and the stomachs excised and gastric damage determined as
described above. This experiment was done as described by Morimoto et al, 1991.
NSAID gastric ulcers in mice: In this model, described by Puscas et al, 1997 with
modification, gastric lesions were induced with piroxicam (30 mg/kg, s.c.) administered to
mice after a 36h fast. At (250, 500 and 1000 mg/kg), cimetidine (100 mg/kg) and saline were
administered orally 30 min before the induction of gastric lesions. The animals were killed 4 h
after treatment with the ulcerogenic agent. The stomachs were removed and gastric damage
determined as described above.
Shay ulcer: Mice were randomly divided in groups that were fasted for 24 hours with free
access to water. Thirty min after oral or immediately after intraduodenal administration of
single dose of At (500 mg/kg), cimetidine (100 mg/kg) as positive control or vehicle (saline,
10 mL/kg), pylorus ligature was performed as described by Shay et al, 1945. Four hours later
the animals were killed, the abdomen opened and another ligature placed around the
esophagus close to the diaphragm. The stomach was removed, inspected internally, and its
content drained into a graduated centrifuge tube and centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The
supernatant volume and pH were recorded with a digital pH meter (PA 200, Marconi S.A,
Brazil). The total acid content of gastric secretion was also determined by titration to pH 7.0
with 0.01 N NaOH using a digital burette (E.M., Hirschmann Technicolor, and Germany).
92
Ethanol-induced gastric lesions in L-NAME-pretreated rats: This method was
performed as described by Arrieta et al. (2003)
.
The rats were divided into six groups with 7
rats that were fasted 24 h. The animals were treated with L-NAME (N-nitro-L-arginine
methyl ester) 70 mg/kg or saline i.p., and thirty minutes later, received an oral dose of the
vehicle (10 mL/kg), At (500 mg/kg), FA (100mg/kg) or carbenoxolone (100 mg/kg). After 60
min, all groups were orally treated with 1 mL of ethanol solution for gastric-ulcer induction.
Animals were killed 1 h after the administration of ethanol, and the stomachs excised and
gastric damage determined as described above.
Ethanol-induced gastric lesions in NEM-pretreated rats (Arrieta et al., 2003): Rats
were divided into six groups that were fasted 24 h. They were previously treated
intraperitoneally with NEM (N-ethylmaleimide) 10mg/kg or saline; and thirty minutes later,
received an oral dose of the vehicle (10 mL/kg), At (500 mg/kg) or carbenoxolone (100
mg/kg). After 60 min, all groups were orally treated with 1 mL of ethanol solution for gastric-
ulcer induction. Animals were killed 1 h after the administration of ethanol, and the stomachs
excised and gastric damage determined as described above.
Prostaglandin synthesis determination: Rats were divided into groups that were fasted
24 h. Groups consisting of six rats received one of the following solutions: 8% Tween 80
solution (vehicle), indomethacin (20mg/kg, s.c) used as a positive control, and ethyl acetate
fraction of Alchornea triplinervia (FA=100mg/kg p.o.). The combination of FA and
indomethacin was assayed when FA administration was followed 30 min later by
indomethacin treatment. Indomethacin was dissolved in 5% sodium bicarbonate solution.
Thirty minutes after treatment, all the animals were killed by cervical dislocation and the
abdomen was opened. A sample of the corpus (full thickness) was excised, weighed and
suspended in 1ml of 1 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4. The tissue was finely minced
with a scissor and then incubated at 37°C for 20 min. PGE
2
in the buffer was measured by the
93
enzyme immunoassay (Amersham). The absorbance was read at 450 nm as previously
described by Curtis et al, 1995.
2.8 Healing in acetic acid-induced gastric lesion:
The experiments were done according to the method described by Takagi et al. (1969)
with some modifications Okabe and Amagase (2005). Three groups of male Wistar rats fasted
for 24 h were used in this experiment (n=6-8). Under anaesthesia, a laparotomy was done in
all animals through a midline epigastric incision. After exposing the stomach, 0.05 mL (v/v)
of a 30% acetic acid solution was injected into the subserosal layer in the glandular part of the
anterior wall. The stomach was bathed with saline (20°C) to avoid adherence to the external
surface of the ulcerated region. The abdomen was then closed and all the animals were fed
normally. We selected the lower effective dose of ethyl acetate fraction of Alchornea
triplinervia (F=100 mg/kg); cimetidine (100 mg/kg) or vehicle (10 mL/kg) for the
determination of the healing effects by the subacute treatment. All treatments were done
orally once a day during 14 consecutive days beginning one day after surgery. Body weight
was recorded daily throughout the experiments and the macroscopic analyses and weight of
vital organs (liver, kidney, heart spleen and lung) were compared between the different
treatments to evaluate the possible subacute toxicity induced by the treatments.
On the day after the last drug administration, the rats were killed and the stomachs
were removed. The gastric lesions were evaluated by examining the inner gastric surface with
a dissecting magnifying glass. The macroscopic ulcer area (mm
2
) and curative ratio (%) were
subsequently determined as described by Takagi et al. (1969).
Biochemistry analysis: The blood of rats submitted from different treatments was
collected immediately after the sacrifice and was submitted to centrifugation (3000 rpm by
10min). After the centrifugation, the serum obtained was reserved in – 20º C until the
94
biochemical analyses. Automated biochemical analyzer (SBA-200, CELM, BRAZIL)
measured serum biochemical parameters such as urea, creatinin, aspartate aminotransferase
(AST) alanine aminotransferase (ALT).
Histology methods: The stomach of the rats submitted by different treatment of gastric
ulcers in the acid acetic model with different treatments were pushed off and opened by the
large curves and the lesion was localized. The lesion was sectioned, and fixed in ALFAC
solution (alcohol, chloroform and acetic acid) for 24 h in 4º C. Then the samples were routine
processed for embedding in paraplast, and cut into 7 µm thick section. hematoxylin and eosin
and PAS (Behmer et al, 1976, Vacca, 1995). The samples were analysed with a Leica
microscope associated with Leica Qwin Software (Leica-England).
Morphometric analyses: For the morphometric analyses slices of stomachs were
examined in a Leica microscope associated with Leica Qwin Software (Leica-England),
where we realized measure in area of regeneration mucosa, variation of method used by
Ishihara and Ito (2002).
Immunohistochemistry: The representative slices was deparaffinized, rehidrated and
immunostained with the peroxidase anti-peroxidase method. For COX
2
and PCNA- High
temperature antigen unsmasking technique in 0,01M citrate buffer pH6, 0 in microwave oven,
for two times at 5 min. Blocking of nonspecific reaction was performad with 1% normal goat
serum and 3% not-fat milk. After each reaction was performed with normal goat serum prior
to incubation with the specific antiserum (Table 1). After rising in phosphate buffered saline
(0,01 mol/L PBS pH 7,4), the sections were incubated in secondary antiserum. They were
then washed in PBS and incubate in ABC (avidine and biotine complex) reagents (ABC kit –
Vector) and incubate in peroxidase reaction (3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochoridle
containing 0,01% H
2
O
2
in PBS buffer. After immunostained, the sections were lightly
counterstained with Mayer´s hematoxylin. The slides were observed under Leica light
95
microscope. For positive control we use the region of stem cell in mucosa stomach and for
negative control the primary and secondary antibody were omitted.
Table 1
: Antiserum used in this study
Antiserum Code Source Dilution
PCNA NCL-PCNA Novo Castra 1:100
Somatostatin SC-7819 Caymann chemical 1:20
Gastrin SC-7783 Santa Cruz 1:20
COX
2
160106 Santa Cruz 1:200
All antiserum were produce in rabbits. PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen, COX
2
-
Cyclooxygenase 2 polyclonal antibody.
2.9- Statistical analysis
Results were expressed as mean ± S.E.M. Statistical significance was determined by one-
way analysis of variance followed by Dunnett's, Tukey’s test or Student´s test, with the level
of significance at P< 0.05.
3 -RESULTS AND DISCUSSION
The balance between the therapeutic versus the toxicological effects of is an important
parameter in assessing its applicability as an antiulcer or any pharmacological agent (Ekwall
and Ekwall, 1988). At first we investigated the acute toxicity in mice, a single administration
methanolic extract of Alchornea triplinervia (At) by the oral route to a dose of 5 g/kg did not
produce any signs or symptom of toxicity in the treated animals and in the following 14 days
after the administration. In autopsy, no significant change was observed in the vital organs of
96
each animal and no significant changes in daily body gain weight (Figure 1) or organ weight
at the end of this period were observed when compared with group treated with vehicle (Table
2).
Since there is no acute toxicity was observed using the At, we continued our studies
evaluating the effect of At administered to rodents using different standard experimental
models of induced gastric ulcer. In order to establish a general profile of the antiulcerogenic
activity of extract, we performed the dose-response curve using three oral doses of 250, 500
and 1000 mg/kg (p.o.) to select the dose that produce the best effect.
Ethanol can stimulate the gastric and oral secretion of gastrin and release of histamine
via a reflex both way involving sensory terminals in the gastric and oral mucosa (Tarnawski et
al., 1983). The results obtained with ethanol and HCl-ethanol models get similar results with
85% and 89% of gastroprotection at the doses of 500 and 1000 mg/kg of At (Figure 2).
COX
1
(cyclooxigenase-1) inhibition resulting in gastric prostaglandin suppression and
it is commonly postulated mechanism of gastro duodenal damage (Peng and Duggan, 2005).
Deficiency of endogenous PGs is widely accepted as a major factor in the pathogenesis of
gastric lesions caused by NSAIDs. PGs, especially PGE
2
, and their analogues inhibit the
formation of gastric mucosal necrosis induced by necrotizing agents. Prostaglandins (PGs) are
involved in the regulation of a variety of gastrointestinal functions, including blood flow,
acid, mucus and HCO
3
secretion (Wolfe et al, 2000). This protective action of PGs against the
direct injuries of gastric necrotizing agents is apparently unrelated to their antisecretory
properties and has generally been called cytoprotection (Peskar and Maricic, 1998).
However, in the NSAID-induced gastric lesions the animals treated with different
doses of At exhibited an unexpected result, i.e., the cytoprotection decreased with the increase
of the dose. Animals pretreated with the highest dose did not present cytoprotection (Figure
3). At this model, the At showed absence of gastroprotective effect (P> 0.05) at doses of 250
97
mg/kg and 500 mg/kg, while the dose of 1000 mg/kg induced significant increasing of gastric
lesion (P<0.01). It is highly probable that At contains different active substance(s), i.e., the
substance(s) that protected the gastric mucosa against the damage induced by ethanol and
HCl/ethanol is/are different from this/those that presented cytoprotection in the NSAID-
induced gastric lesions. In the last case, the substance that habitually presents this kind of
pharmacological behavior could be flavonoids; the increase of the flavonoid dose changes the
antioxidant activity to a pro-oxidant activity increasing the gastric damage (Gracioso et al.,
2002). The literature indicated that other species of the Alchornea genera had
antiinflammatory activity (Manga et al., 2004). Thus, this result indicates a possible
mechanism of action of this plant that was due by chemical composition of this plant that
modulation of endogenous prostaglandins. Our results are in concordance with Reppeto and
Llesuy (2002)
that shown that phenols compounds have a dual effect on prostaglandin
biosynthesis, modulating prostaglandin H synthase (PGHS), with low concentrations
stimulant and high concentration inhibit PGHS.
Since the most promising result were obtained until this moment, we continued our
studies using only a single dose (500 mg/kg) in the next assays, with the purpose of
investigating the probable antiulcerogenic mechanisms involved with the action promoted by
this extract. It is well known that pylorus ligature causes gastric hypersecretion, but the
reasons are not completely explained yet. Brodie (1966) describes that due to the surgery
stomach becomes larger, the pressure on sensitive receptors in the antral gastric mucosa
increases and activates the vagus-vagal reflex, causing increase of the gastric secretion.
Besides, neutrophil migration in the mucosa following pyloric ligation suggests that these
cells might be involved in gastric mucosal injury, possibly by releasing free radicals that
cause lipid peroxidation and damage in cell membrane (Rastogi et al., 1998). Gastric juice
obtained from pylorus-ligated mice was used to analyze the gastric biochemical parameters
98
(Table 2). Animals pretreated with At by oral route presented decreased ulcerative index and
the total gastric acid value. The intraduodenal administration of the At did not change any
biochemical parameter of the gastric juice but decreased ulcerative index. Therefore, this
result indicated that At presents antisecretory property only when this extract was given by
oral route.
Ethanol-induced gastric damage is also associated with a significant decrease in
mucosal sulphydryls level such as GSH (glutatione), and pre-treatment with SH-blockers
prevents gastroprotection of SH-containing compounds (Szabo et al., 1981). Gastric mucosal
SHs including GSH act as antioxidant and are important for maintenance of mucosal integrity
in the stomach (Lopez et al, 1996)
.
Pre-treatment with a SH-blocker NEM, not reduced the
mucosal protection observed by treatment with At. These findings suggest that an increase
endogenous SHs is not involved in the gastroprotective effect of At as shown in the Figure 4.
Vascular changes in gastric mucosa appear to be the most pronounced feature of
absolute ethanol-induced injury, maintenance of mucosal vasculature and normal blood flow
may be the major mechanism of cytoprotection. It has be demonstrated that the gastric
mucosa produces endogenous NO derived from L- arginine and NO participates in gastric
defense mechanisms by regulating the gastric defense mechanisms by regulating the gastric
mucosal blood flow and gastric mucus secretion (Szalassi et al., 1998). As show in the Figure
5, a NO synthase inhibitor (L-NAME) also did not attenuate the gastroprotection observed by
At, suggesting the endogenous NO not participate in the protect effect of At.
The gastroprotective effect of At was also investigated using two fractions (aqueous and
ethyl acetate) obtained from methanolic extract. The pre-treatment with fractions were
evaluated against the ethanol gastric lesion because this model presents the best results with
extract and with the dose of 100mg/kg in accordance with Schmeda-Hirschmann, 2005 that
says the doses in the range 100-300mg/kg is a multiple of traditional doses. The substances
99
responsible for the protection action are concentrated in the ethyl acetate fraction (FA) that
has showed more efficient than aqueous fraction at dose of 100mg/kg. Promising results can
be observed from the pre-treatment with ethyl acetate fraction, since it exerted protective
effect higher than those obtained with methanolic extract using lower dose (Table 3) and
obtained with cimetidine (100 mg/kg) or lansoprazole (30 mg/kg), standard antiulcer drugs in
the market.
We determined spectrophotometrically the total flavonoids concentration in the leaves
from A. triplinervia based on rutin as standard. Figures 7 and 8 presents the chromatogram
and UV spectra of a fraction containing mainly phenolic compounds from the leaves of At
using High Performance Liquid Chromatography - Ultraviolet - Photodiode Array Detector
(HPLC-UV-PDA). The flavonoids content expressed in mg/g were 19.73 % (197.3 ± 0.19
mg/g) in the ethyl acetate fraction and 1.3 % (13.1 ± 0.04 mg/g) in the aqueous fraction from
At.
Several flavonoids has been shown to display gastroprotective activity (Schmeda-
Hirschmann, 2005). Although the highest amount of flavonoids presents in the ethyl acetate
fraction, we observed that pre-treatment with L-NAME did not change the cytoprotection
induced by ethyl acetate fraction. Oral administration of ethyl acetate fraction (100mg/kg) to
L-NAME (70mg/kg, i.p.) pre-treated animals produced a reduction in the gastric hemorrhagic
lesions when compared with the L-NAME-pre-treated control value (Figure 6). The
gastroprotection effect of the acetate fraction observed by pre-treatment with L-NAME (52%)
was similar to the protective activity observed by pre-treatment with saline (42%). This result
indicates that pre-treatment with L-NAME did not alter the acetate fraction-induced
cytoprotection of ethanol-induced gastric lesions and hence excludes the role of endogenous
NO in mediating the protective effect of ethyl acetate fraction from Alchornea triplinervia.
100
To confirm the involvement of ethyl acetate fraction of At in the PGE
2
synthesis, data
were obtained for detection of PGE
2
production using EIA by gastric tissue. Prostaglandins
play an important role in modulating gastric mucosal integrity and in regulating gastric acid
secretion, but little is known regarding regulation of prostaglandin synthesis by the stomach
(Curtis, 1995). Arakawa et al. (1998) suggest that PGs accelerate ulcer healing possibly via
angiogenesis, epithelial cell proliferation, and production of growth factors such hepatocyte
growth factor and transforming growth factor beta, reconstruction of extracellular matrices,
and suppression of inflammatory cell infiltration, in addition to gastroprotective mechanisms.
The treatment with ethyl acetate fraction of At induced an increase on PGE
2
production was
significantly higher than the basal and control levels. The pre-treatment with indomethacin,
inhibitor of cyclooxygenase enzyme, was efficient to inhibit this increase on PGE
2
production
induced by ethyl acetate fraction of At. These results show that ethyl acetate fraction of At
causes increase in PGE
2
production by activation of cyclooxygenase enzyme (table 4).
Hiruma-Lima et al., (2006) clearly indicate the involvement of PGE
2
in the gastroprotective
mechanism of the Alchornea castaneaefolia.
In the next step, we carried out the histological investigation of the healing effect of
FA (100 mg/kg) in ulcers induced by acetic acid, since this fraction was effective in the model
of ethanol.
In the past, were only a few acute gastric ulcer models routinely used in the laboratory,
such as pylorus-ligation ulcers (Shay ulcers) and stress-induced ulcers. From a pathological
point of view, however, these ulcer models were inappropriate for the study of human gastric
ulcers, which penetrate the muscular layer of glandular area and occasionally relapse after
healing (Okabe and Amagase, 2005). Researchers gradually began to recognize the potential
of the method, as there was no alternative way to both study the healing process of ulcers and
screen anti-ulcer drugs (Okabe, 1972).
101
The body weight taken daily before treatments indicated no toxicity sign in the
animals treated with FA (100mg/kg), cimetidine and vehicle during 14 days (Figure 9). At the
end of the experiment, the relative weight of the vital organs was observed (heart, lung, liver,
kidneys and spleen). None of the groups presented significant difference from control group,
in relation to the organs weight, suggesting no significant adverse effects in the used dose
(Table 6). The treatment during 14 day with FA (100mg/kg/day) did not elicit changes in the
evaluated of some serum biochemical parameters related to renal (urea and creatinine) and
hepatic toxicities (AST and ALT) (Table 8).
This healing effect of FA on gastric ulcer was not observed by macroscopic analysis of
injuries but some differences were doesn’t evidence by morphometric analyses (Table 6 and
Figure 10). Histologically, an ulcer consists of two major structures; a distint ulcer margin
formed by the adjacent non-necrotic mucosal-the epithelial component, and the granulation
tissue at ulcer base- the connective tissue component, mucosal of the ulcer margins forms a
characteristic “ healing zone” (Tarnawski, 2005). The increased gastric mucus production
using FA was verified via an increase in PAS-positive mucus (Figure 15) and it is an
indicative of a gastroprotection a number of factors appear to influence ulcer healing; but
mucus and bicarbonate secretion may be important in the ulcer healing process. Since the
mucus/bicarbonate layer protects newly formed cells from acid and peptic injury (Tarnawski
et al., 2001).
The comparative measure of the normal and regeneration areas had shown the
increased of the transition area for the three groups (Table 8).In the sections of animals treated
with FA we observed a large proliferation of granulation tissue and a cell proliferation by the
PCNA analyze, that consists in an important component of the ulcer healing process because
it supplies connective tissue cells (synthesizing extracellular matrix for restoring the lamina
102
propria) and microvessels for the restoration of the microvasculature with ulcer scar
(Tarnawski, 2005).
Szabo and Vincze (2000) and Tarnawski et al. (2001) have demonstrated the capacity
of accelerate the ulcer healing process depends of the many factor like a PDGF (platelet
derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), VEGF (vascular endothelial growth
factor), stimulation of angiogenesis and cell proliferation. Kitajima et al. (1993) demonstrated
the proliferation activity during healing of gastric ulcers by PCNA method. In the
morphologic analysis of the submitted blades with PCNA where it can be noticed that the 3
treatments promote the proliferation of the cells; but in stomach submitted with FA was
observed PCNA immunohistochemical positive in the lesion area in the base of glands
(Figure 11), this possible occurs because the stem cell re-organize for base of gland,
indication the unidirectional for the cell proliferation, differ of normal region that have a two
direction proliferation (Helander and Hi, 2005).
Gastrin is a hormone secreted by G cells, while somatostatin in secreted by D cells.
Gastrin, somatostatin and other hormones regulate the function of gastrointestinal tract such
as secretion, movement, absorption, circulation and nutrition of cells (Peng Sun et al, 2002).
We used the immunohistochemical method to identify the G and D cells, the results show that
G cells declined while D cells increased (Figure 12). Gastrin is an important hormone that
plays a central role in the regulation of gastric stimulating acid secretion. The acid inhibition
of gastrin is mainly mediated by the release of somatostatin from D-cells when intragastric pH
is low (Mccoll et al, 2000). Our results are in accordance with Hiruma-Lima et al., (2006)
showing that pretreatment of rats with Alchornea castaneifolia marked decrease in the serum
gastrin level when compared to the negative control, and, the serum level of somatostatin
hormone in rats pretreated increased almost 3 times when compared to the negative control,
reaching the same serum level of those rats treated with lansoprazole.
103
HSP 70 in both isoforms (inducible-HSP 72 or constitutive-HSP 73) exerts a
cytoprotective role by interference with stress-induced apoptosis. HSPs may contribute to
mucosal protection and ulcer healing by regulating the activity of enzymes such as
cyclooxigenase (COX) and nitric oxide synthase (NOS) (Rokutan et al., 2000). HSP70
expression in the ulcer margin was gradually increased with ulcer healing (Tsukimi, 2001).
The immunohistochemistry analyses of sections were incubated with specific antibody for
HSP70 and animals treated with vehicle or cimetidine presents the marked cells for HSP 70
were situated in submucosa layer. The sections of animals treated with FA was evidenciated
a large number of marked cells in mucosa and submucosa layers indicated the strong
influence of HSPs in healing process induced by FA (Figure 13).
In the stomach, the highest grade of COX
2
expression was observed in the apical
lamina propria of the fundus adjacent to the junctional ridge (Haworth, 2005). COX
2
are
important for epithelial cell proliferation, migration re-epithelization and reconstruction of
gastric glands (Tarnawski et al, 2004). COX
2
not only plays important regulative roles in
gastric mucosal defense mechanism but also is pivotal in the process of gastric ulcer healing
and produces prostaglandins, which exerts anti-inflammatory actions (Poonam, 2005). The
sections of animals treated with FA (Figure 13) demonstrated a large number of COX
2
cells
main in the submucosa (Figure 14). These data indicate that FA activates COX
2
and enhances
prostaglandin generation such as previously demonstrated in Table 5. Poonam (2005) says
that drugs that can lead to an elevation in the expression of COX
2
remain more sucessful in
ulcer healing while its inhibition produces a downward effect.
104
5-CONCLUSION
In conclusion, all these results taken together suggest that methanolic extract from the
leaves of Alchornea triplinervia did not show acute toxicity exhibited antisecretory property
and gastroprotective activity. The observed effects probably not involved the participation of
NO or endogenous SHs and the ethyl acetate fraction showed more efficient gastroprotective
effect than methanolic extract with lower dose and protecting the gastric mucosal by an
increase of PGE
2
. The oral administration ethyl acetate fraction (FA) for 14 days accelerated
the healing of gastric ulcer in rats by promotes epithelial cells proliferation and acceleration of
gastric ulcer healing. In imunohistochemical analysis we observed a large number of COX
2
cells main in the submucosa and the results shows that G cells declined while D cells
increased.
ACKNOWLEDGEMENTS
We grateful to Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) and
FUNDUNESP (Fundação para o Desenvolvimento da UNESP) for grants to T.R.C. and J.S.S.
and for fundings from Biota-Fapesp Program and to Capes for a grant to Z.P.L.
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110
TABLES AND FIGURES
Figure 1.
Body gain weight after acute treatment with Alchornea triplinervia extract
(At) in mice.
Results are mean ± S.E.M.; n=7 Student’s test. No significant p>0.05.
Figure 2.
Effects of lansoprazole and the methanolic extract of leaves of A. triplinervia (At)
on ethanol and HCl/ethanol induced gastric lesions in mice.
Results are mean ± SEM; HCl-ethanol Anova Dunnett ** p<0.01, F
(4;31)
= 138.55; . Ethanol:Anova Dunnett *
p<0.05 / ** p<0.01, F
(4;34)
= 28,56 .
HCl/ethanol gastric lesions
Ethanol gastric lesions
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4
D a ys
Corporal weight (g)
sa lina A t 5 g/kg
0
20
40
60
80
100
120
Ulcer index
control
lansoprazole
At 250mg/kg
At500mg/kg
At1000mg/kg
control
lansoprazole
At250mg/kg
At500mg/kg
At1000mg/kg
**
82%
**
78%
**
86%
**
89%
*
55%
**
85%
**
89%
111
Figure 3.
Effects of cimetidine and the methanolic extract of leaves of A. triplinervia (At) on
gastric lesions in mice induce by NSAID´s.
Results are mean ± S.E.M. ANOVA Dunnett´s test ** p<0.01, F
(4;34)
= 27.17.
Figure 4.
Effects of carbenoxolone and the methanolic extract of leaves of A. triplinervia (At)
on ethanol gastric lesions in rats pre-treated with NEM.
Results are mean ± S.E.M. ANOVA. Anova Turkey test U.L.I; ; **p<0,001; ***p<0,001, F
(5;37 )
= 41.37.
0
50
100
150
200
250
300
Ulcer index
Saline Carbenoxolone At 500mg/kg
**
57%
***
64%
***
73%
**
28%
Saline NEM
Pre-treatment
(P < 0.001)
(P < 0.001)
(P > 0.05)
0
20
40
60
80
ulcer index
control
cimetidine
At250mg/kg
At500mg/kg
At1000mg/kg
* *
-76%
**
80 %
112
Figure 5.
Effects of carbenoxolone and the methanolic extract of leaves of A. triplinervia (At)
on ethanol gastric lesions in rats pre-treated with L-NAME
Results are mean ± S.E.M. ANOVA Turkey test U.L.I ***p<0,001, F
(5;35 )
= 28.09
0
50
100
150
200
250
300
350
Ulcer Index
Saline Carbenoxolone At 500mg/kg
***
85%
***
82%
***
79%
***
58%
Saline L.NAME
Pre-treatament
(P < 0.05)
(P < 0.05)
(P > 0.05)
113
Figure 6.
Effects of cimetidine and the ethyl acetate fraction of A. triplinervia (FA) on ethanol
gastric lesions in rats.
0
50
100
150
200
250
300
Ulcer Index
Saline
Carbenoxolone
FA 100mg/kg
**
81%
**
42%
**
68%
**
52%
Saline L-name
Pre-treatments
(P < 0.001)
(P < 0.01)
(P > 0.05)
Results are mean ± S.E.M. Anova Turkey test U.L.I.; ** p< 0,01 , F
(5;32 )
= 77.95.
114
Figure 7.
HPLC profile of the ethyl acetate fraction Alchornea triplinervia (At).
Chromatographic conditions: RP-18, 250 x 4,6 mm d.i. x 5µm, [H
2
O (TFA 0,05%)/ACN
(TFA 0,05%)] 30-70 % in 60 min, 1,0 mL/min, λ 360 nm.
1
2
5
0
100
200
300
mAU
10 20 30 40 50
Min
0
100
200
300
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27.5 30.0 32.5 35.0
Min
0
100
200
300
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10 20 30 40 50
Min
0
100
200
300
mAU
27.5 30.0 32.5 35.0
Min
0
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200
300
mAU
27.5 30.0 32.5 35.0
Min
3
4
2-4
1
0.25
0.50
0.75
1.00
AU
200 250 300 350
nm
0.25
0.50
0.75
1.00
AU
200 250 300 350
nm
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
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3
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2-4
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Min
3
4
2-4
1
0.25
0.50
0.75
1.00
AU
200 250 300 350
nm
0.25
0.50
0.75
1.00
AU
200 250 300 350
nm
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
115
Figure 8.
HPLC profile of the aqueous fraction of Alchornea triplinervia (At).
Chromatographic conditions: RP-18, 250 x 4,6 mm d.i. x 5µm, [H
2
O (TFA 0,05%)/ACN
(TFA 0,05%)] 30-70 % in 60 min, 1,0 mL/min, λ 360 nm.
0
25
50
75
100
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27 28 29 30 31 32 33 34 35
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2
3
2-3
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
0
25
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10 20 30 40 50
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50
75
100
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150
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10 20 30 40 50
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50
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2-3
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75
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10 20 30 40 50
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10 20 30 40 50
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50
75
100
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mAU
10 20 30 40 50
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0
25
50
75
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mAU
27 28 29 30 31 32 33 34 35
Min
0
25
50
75
100
125
mAU
27 28 29 30 31 32 33 34 35
Min
2
3
2-3
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
0.25
0.50
0.75
1.00
200 250 300 350
nm
Au
116
Figure 9:
Effects on body organ weight and mortality of a single dose (100 mg/kg, p.o.)/day
of ethyl acetate fraction of Alchornea triplinervia leaves (FA) administered during 14
consecutive days after ulcer formation. Results are mean ± SEM.
100
150
200
250
300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
DAYS
Corporal weight (g)
Control Cimetidine FA100mg/kg
117
Table 2
: Evaluation of the acute toxicity of methanolic extract of Alchornea triplinervia (At) in
mice.
Weight (g) Control
At
5g/kg
Corporal 43.86 ± 3.08 43.00 ± 5.96
Kidney 5.87 ± 0.0 26 5.43 ± 0.03
Lungs 2.72 ± 0.08 2.96 ± 0.02
Liver 23.93 ± 0.65 242.9 ± 1.19
Heart 1.90. ± 0.10 2.17 ± 0.02
Spleen 1.87 ± 0.11 1.62 ±0.24
Mortality 0/7 0/7
Results are mean ± S.E.M.; n=7 Student’s test. No significant p>0.05.
118
Table 3
: Effects of cimetidine and a single dose of methanolic extract leaves of A. triplinervia
(At) administered orally (p.o.) or intraduodenally (id) on gastric juice parameters in pylorus-
ligature-induced gastric lesions in mice.
Treatment
N
Dose
mg/k
g
Total acid
(µEq/mL/4h)
pH Gastric
Volume
(mL)
U.L.I
Control 9 -
32.11 ± 1.18 2.50 ± 0.34 0.98 ± 0.07 49.72 ± 4.86
Cimetidine 8 100
18.77 ± 2.22** 3.90 ± 0.43*
0.82 ± 0.06 12.50 ± 1.95**
At
i.d
8 500
29.72 ± 1.98 1.70 ± 0.26 1.12 ± 0.03 19.80 ± 1.63**
Control
Cimetidine
At
oral
7
8
8
-
100
500
46.57± 3.50
16.87 ± 2.25**
4.00 ± 0.50**
3.00 ± 0.26
2.50 ± 0.19
3.30 ± 0.37
0.90 ± 0.09
1.09 ± 0.08
1.05 ± 0.11
46.57 ± 3.52
22.14 ± 3.32**
9.25 ± 1.16**
Results are mean ± SEM; .
i.d route
ANOVA, Dunnett test ** p<0.01
for a [H
+
] F
(2;22)
=
15.37; Dunnett test p.>0.05 gastric volume: F
(2,22)
= 13.95 for pH: *p<0.05 F
(2,22.)
= 9.99; for
U.L.I ** p<0.01 F
(2;22)
= 39.01.
p.o route
: ANOVA, Dunnett test ** p<0.01
for a [H
+
] F
(2;23)
= 93.11; Dunnett test p.>0.05 gastric volume: F
(2,20)
= 0.94, for pH: *p<0.05 F
(2,20)
= 2.03;
for U.L.I ** p<0.01 F
(2;20)
= 47.47.
119
Table 4-
Effects of aqueous and ethyl acetate fractions (FA) obtained from methanolic extract
of A. triplinervia on gastric lesion induced by ethanol in rats.
Treatments
(p.o.)
Dose
(mg/kg)
N pH
U.L.I
(mm)
%
protection
Control 10ml/kg
6 4.66 ± 0.76 100.66 ± 11.9 ----
Lanzoprazole 30 6 7.33 ± 0.20** 21.33 ± 5.65** 79
50 6 6.4 ± 0.40 88.40 ±18.44 12
100 5 5.16 ± 0.54 50.50 ± 2.50** 50
Ethyl acetate
Fraction
(FA) 200 5 5.33 ± 0.42 11.83 ± 2.79** 88
Control 10ml/kg
6 6.00 ± 0.25 92.83 ±16.17 -
Lanzoprazol 30 6 6.15 ± 0.35 31.34 ± 5.00** 60
Aqueous
Fraction (FAQ)
100 5 5.40 ± 0.23 71.80 ±10.12 22
Results are mean ± S.E.M; Anova Dunnett´s **p<0,01, F
(4,24)
=17.88 for U.L.I. e F
(4,24)
= 4.5
for pH.
ANOVA**p<0,01 F
(3,15)
=5.06.
120
Table 5.
Effect of ethyl acetate fraction from Alchornea triplinervia extract (FA) on PGE
2
levels in gastric mucosal from rats.
Treatments Dose
N
[PGE
2
] ng/ g tissue
Control (p.o) 10ml/kg 6 1.86 ± 0.34
Control (p.o) +
Indomethacin (s.c)
10ml/kg +
30 mg/kg
6 1.36 ± 0.20
FA (p.o) 100 mg/kg 6 6.50 ± 0.90*
FA (p.o) + Indomethacin
(s.c)
100 mg/kg +
30 mg/kg
6 4.30 ± 0.60
Results are mean ± S.E.M; Anova Dunnett´s, *p<0,05 F
(3,19)
=17.76.
Table 6 -
Effects of the treatment by 14 consecutive days with ethyl acetate fraction of
Alchornea triplinervia (FA) 100mg/kg and cimetidine on healing of ulcer produced by acetic
acid solution into the stomachs of rats. The ulceration was score on the 15
th
day after surgery.
Treatment
(p.o)
N
Dose
(mg/kg)
Lesion Extern area
AE (mm
2
)
Lesion Intern area
AI (mm
2
)
Control 4 -
62.00 ± 20.80 21.25 ± 4.08
Cimetidine 4 100
110.25 ± 18.39 31.50 ± 7.28
FA
5 100
71.80 ± 13.39 21.00 ± 2.58
Results are mean ± SEM p>0.05 AE F
(2,11)
=2.06; AI F
(2,11)
=1.42.
121
Table 7-
Evaluation of the subacute toxicity. Effects on body organ weight, relative weight of
the vital organs and serum biochemical parameters of a single dose of ethyl acetate fraction
(FA) of Alchornea triplinervia leaves (100 mg/kg, p.o.) Administered during 14 consecutive
days after ulcer formation.
Weight (g)
Control
10ml/kg
Cimetidine
FA
Corporal 235.05 ± 9.65 250.82 ± 10.22 228.48 ± 10.90
Kidney 1.69 ± 0.09 1.85 ± 0.06 1.72 ± 0.06
Lungs 1.54 ± 0.10 1.47 ± 0.04 1.52 ± 0.12
Liver 6.24 ± 0.86 6.86 ± 0.70 6.07±0.75
Heart 0.91 ± 0.05 1.00 ±0.06 0.94±0.04
Spleen 0.65 ± 0.08 0.73 ± 0.08 0.64 ± 0.04
Mortality 0/5 0/5 0/5
Results are mean ± SEM; n=5 Dunnet´s test.
No significant p>0.05.
Table 8-
Effects on epithelia height of a single dose (100 mg/kg, p.o.) of ethyl acetate fraction
of Alchornea triplinervia leaves (FA) administered during 14 consecutive days after ulcer
formation.
Epithelia height
Normal
Area of regeneration
Control
437.64± 60.96 859.98 ± 53.56
Cimetidine 464.06±39.94 858.87±62.30
FA 545.61±71.86 740.99±34.70
Results are mean ± SEM; area normal no significant p>0.05 F
(2,11)
= 2.79
Dunnet´s test.
122
Table 9 -
Effects on serum biochemical parameters of a single dose (100 mg/kg, p.o.) of ethyl
acetate fraction of Alchornea triplinervia leaves (FA) administered during 14 consecutive
days after ulcer formation.
Serum biochemical
parameters
Control Cimetidine
FA
ALT (UI/L) 150.00± 8.60 112.82 ± 23.82
115.20 ± 3.90
AST (UI/L) 222.55± 11.23 244.57 ± 20.99
264.66 ± 18.03
Urea (mg/dl) 45.29 ± 1.75 41.83 ± 1.10
48.16 ± 4.03
Creatinin (mg/dl) 0.88 ± 0.04 0.63 ± 0.04
0.72 ± 0.06
Results are mean ± S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s test. No significant p>0.05. AST p>0.05, F
(2,16)
=0.17;
ALT p>0.05, F
(2,14)
= 3.20; Uréia p>0.05, F
(2,17)
= 0. 31; Creatinina p>0.05, F
(2,17)
= 1.28.
123
Control
Cimetidine
Alchornea triplinervia
Figure 10: Histo
logical analyses of stomach of rat treatment Tween 80 at 8% (10 mL/kg),
cimetidine (100 mg/kg) and acetate fraction of Alchornea triplinervia
(100 mg/kg)
stained with hematoxilyne and eosine. The head arrow indicates the lesion area.
124
125
Gastrine
Somatostatin
Figure 12: Histological analyses of stomach of rat Tween 80 8% (10 mL/kg),
cimetidine (100 mg/kg) and acetate fraction of Alchornea triplinervia
(100 mg/kg) and
area without lesion, immunohistochemistry to gastrin, somatostatin imm
unostained
with peroxidase method. Arrow to indicate nucleus or immunolabel.
Tween 8%
Cimetidine
Alchornea
triplinervia
Control
126
Figure 13: Histological analyses of stomach of rat Tween 80 at 8% (10 mL/kg),
cimetidine (100 mg/kg) and acetate fraction of Alchornea triplinervia
(100 mg/kg)
and area without lesion, immunohistochemistry to HSP and COX2 immunostained
with peroxidase method. The head arrow indicates the cells COX2 ad HSP
positive.
Tween 8%
Cimetidine
Alchornea
triplinervia
Negative
Control
HSP
-
70
COX
-
2
127
Figure 14: Histological analyses of stomach of rat treatment acetate
fraction of Alchornea triplinervia (100 mg/kg) .The head arrow
indicates immunolabel COX-2 in submucosa.
128
Figure 15: Histological analyses of stomach of rat Tween 80 8% (10 mL/kg), cimetidine
(100 mg/kg) and acetate fraction of Alchornea triplinervia (100 mg/kg) i to PAS method.
Cimetidine
Alchornea
triplinervia
Tween 8%
129
RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS
Planta Alchornea
glandulosa
Alchornea
triplinervia
Parte
Folhas
Folhas
Extrato
MeOH
MeOH
Fração
acetato
Toxicidade Aguda
- -
Etanol
*500mg/kg =57%
*1000mg/kg=85%
**500mg/kg=85%
** 1000mg/kg=89%
**100mg/kg=50%
**200mg/kg=90%
Hcl-Etanol
**250mg/kg=64%
**250mg/kg =78%
**500mg/kg=86%
** 1000mg/kg=89%
DAINE
**250mg/kg =78%
**500mg/kg=34%
** 1000mg/kg=-76%
Piloro Oral
1000mg/kg
*V↑, pH-,*↓ [H+]
500mg/kg
V -, pH-, **↓ [H+] -
Piloro
intraduodenal
1000mg/kg
**V ↑+,pH-,**↓
[H+]-
500mg/kg
V -,pH-,[H+] -
Òxido Nítrico
1000mg/kg –
500mg/kg - 100mg/kg -
Sulfidrila
1000mg/kg +
500mg/kg -
Motililidade
- -
Cicatrização
250mg/kg +
100mg/kg +
Bioquímicos
séricos
Uréia-, creatinina-
AST-, ALT-
Uréia-, creatinina-
AST-, ALT
Imunohistoquímica
PCNA+
PCNA+,
COX +
HSP+
GAST-,
SOMAT+
Porcentagem de proteção:*= P<0.05,**= P,0.01. Única dose testada:+ apresentou atividade,
- não possui atividade. Para piloro V (volume) H+ ( concentração de íons H+) .
PCNA=antígeno nuclear de células em proliferação; COX=COX2; HSP70= Heat shock protein
70; GAST=gastrina; SOMAT=Somatostatina.
130
IV
IVIV
IV-
--
- DISCUSSÃO
DISCUSSÃO DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
131
O processo de seleção é certamente de extrema importância para o sucesso do estudo
farmacológico de plantas medicinais. Vários métodos têm sido descritos e empregados para a
seleção de plantas, todavia a literatura mostra com certa freqüência que os resultados mais
satisfatórios são geralmente obtidos quando a seleção é feita com base nos estudos
etnofarmacológicos e posteriormente por taxonomia química (Yunes e Calixto, 2001). A
quimiotaxonomia foi utilizada neste trabalho e mostrou que plantas do mesmo gênero têm
propriedades farmacológicas semelhantes. Os resultados obtidos com Alchornea triplinervia
(At) e Alchornea glandulosa (Ag) levando-se em consideração diferentes doses e frações
utilizadas, se mostraram bastantes semelhantes aos obtiods com Alchornea castanaefolia
(Hiruma-Lima et al., 2006).
Primeiramente, foi realizado o ensaio de toxicidade aguda; que foi analisado de acordo
com Souza-Brito (1995), forneceu informações dos riscos resultantes de uma exposição a
curta duração pela via escolhida; no caso a via oral. A administração da dose de 5000 mg/Kg
de ambos os extratos não promoveu mortalidade, nem alteração do peso corporal e dos órgãos
vitais, nenhum animal morreu, durante os 14 dias de observação. Portanto, os extratos de
ambas as plantas estudadas não apresentaram efeito tóxico agudo aparente. Estes resultados
são considerados importantes, pois demonstraram segurança na utilização dos extratos
vegetais para a realização dos ensaios biológicos em que a dose máxima utilizada de
1000mg/Kg é cinco vezes menor do que aquela utilizada no ensaio de toxicidade.
Após a verificação da ausência de toxicidade dos extratos polares de Ag e At foram
realizados os primeiros testes para avaliação do efeito gastroprotetor em modelos de úlcera
gástrica em ratos e camundongos.
Os modelos de indução de úlceras por HCl/Etanol e Etanol absoluto provocam as
lesões de maneira multifatorial e formam lesões necróticas na mucosa. A patogênese das
úlceras induzidas por etanol ainda é desconhecida, estas lesões são caracterizadas por
132
múltiplas bandas hemorrágicas de diferentes tamanhos, mas a formação de radicais livres e a
infiltração de neutrófilos são consideradas promotores destes danos na mucosa gástrica (Chow
et al.,1998). Os resultados do experimento de indução de úlcera por HCl/Etanol e etanol
absoluto indicam uma similaridade de efeito entre At e Ag. Para At no modelo de indução de
úlceras por HCl/etanol, houve redução da lesão ulcerativa (I.L.U.) em todas as doses
utilizadas (P<0.01). As doses de 250, 500 e 1000mg/Kg reduziram as lesões em 77%, 86% e
90%, respectivamente em relação aos animais submetidos ao tratamento com o veículo. Para
o modelo de etanol At também promoveu redução das lesões gástricas nas três doses
utilizadas sendo que na dose de 250 mg/Kg (P<0.05) houve redução de 28% das lesões e nas
doses de 500 e 1000mg/Kg (P<0.01) observou-se 85 e 89% de redução das lesões,
respectivamente.
No modelo de lesão gástrica induzida por etanol os ratos pré-tratados com Ag
apresentaram uma redução significante em relação aos animais tratados com salina nas doses
de 500 (57%) e 1000mg/Kg (85%). O efeito observado foi dose-dependente e o pré-tratamento
com Ag 50 min antes da administração da solução de HCl/etanol diminuiu significantemente as
lesões em 64, 40 e 32% em relação ao veículo nas doses de 250, 500 e 1000mg/Kg
respectivamente. Este experimento resultou em uma curva dose-resposta inversa, sendo que a
dose de 250mg/Kg de Ag foi a mais eficaz. Estes resultados são indicadores de um possível
mecanismo de ação da planta. Segundo Sawaoka et al., (1997) as lesões gástricas se
desenvolvem 60min depois da administração do HCl, onde esta provoca uma significante
diminuição na PG em animais no primeiro período e é revertida após 7 horas (Villegas et al.,
2004). Em visto dos resultadosobtidos considera-se que a atividade gastroprotetora de Ag
observada na menor dose seja devida a este extrato, provavelmente ser um modulador de PGs
endógenas.
133
O modelo de úlcera induzida por DAINEs nos sugere provável envolvimento com
precursores da inflamação. Piroxicam é um inibidor preferencialmente da COX-1. Esta
enzima se expressa em grandes quantidades no trato gastrintestinal e sugere-se que esta
mantenha a integridade da mucosa (Halter et al., 1995). As prostaglandinas possuem efeitos
na síntese de muco e bicarbonato, na regulação da secreção ácida e do fluxo sangüíneo da
mucosa gástrica. A redução dos níveis de prostaglandina compromete a barreira mucosa que é
composta de muco e bicarbonato e facilita a formação de lesões causadas pelas secreções
gástricas (ácida e enzimática) (Halter et al., 2001).
Nenhuma dose do extrato de At foi efetiva em reduzir as lesões gástricas induzidas por
este agente, o extrato não só não protegeu nas doses de 250 e 500mg/Kg como At aumentou
significativamente (76%) as lesões gástricas nas doses de 1000mg/Kg. Já o extrato de Ag
reduziu as lesões nas doses de 250 (78%) e 500 mg/Kg (33%). As substâncias que
habitualmente apresenta este tipo de comportamento farmacológicoobservado em At são os
flavonóides; que com o aumento da dose promovem uma mudança da sua atividade
antioxidante para uma atividade pró-oxidante (Gracioso et al., 2002). Reppeto et al., (2002)
diz que compostos fenólicos têm efeito dualístico na síntese de prostaglandina, modulando a
prostaglandina sintetase, em baixas concentrações ou estimulando e em altas concentrações
por inibição da prostaglandina sintetase. Nossos resultados estão de acordo com os
encontrados na literatura de plantas do mesmo gênero Alchornea, como A. cordifolia já teve
suas propriedades antiinflamatórias descritas por Manga et al.,(2004) o que reforça nossas
suposições a respeito do extrato principalmente de At ser detentor de propriedades
antiinflamatórias e modular a síntese de PGs.
Nos experimentos seguintes foram investigados os possíveis mecanismos de ação dos
extratos de At e Ag avaliando o papel do óxido nítrico e dos compostos sulfidrila na
gastroproteção. Avaliou-se também os parâmetros de suco gástrico de animais tratados oral ou
134
sistematicamente com os extratos. Para a caracterização do mecanismo de ação dos extratos ,
foi utilizado uma única dose caracterizada como a dose mais efetiva de cada extrato sendo a
de 1g/Kg para Ag e 500mg/Kg para At.
A inibição da síntese de prostaglandinas é provavelmente o maior mecanismo
ulcerogênico dos DAINEs, mas não é apenas o único fator. O papel do óxido nítrico tem
ganhado importância e como as PGs, o óxido nítrico promove o aumento do fluxo sanguíneo,
estimula a secreção de muco e inibe a aderência de neutrófilos (Chan e Leung, 2002). Estudos
indicam que o NO está envolvido na preservação da mucosa em modelos experimentais de
úlcera por promover vasodilatação, redução da peroxidação lipídica e também por uma ação
antiinflamatória nos tecidos (Cho, 2001). Para investigar o envolvimento de NO, L-Name
(inibidor de NO sintase) foi administrado em ratos antes do tratamento oral com etanol. Para
At, não houve diferença entre os animais pré-tratados com salina e tratados com At
(porcentagem de proteção, 85%) e pré-tratados com L-Name e tratados com At (porcentagem
de proteção, 70%) (p>0.05). Estes resultados indicam portanto que a influência do NO no
mecanismo de ação do extrato de At é pequena. Já os animais pré-tratados com L-NAME e
tratados com Ag mostraram uma pequena atenuação (p>0.05, não significativa) da
gastroproteção de 76% para 64% em animais pré-tratados com L-NAME sugerindo também
pouca participação do NO no mecanismo de gastroproteção de Ag.
O possível envolvimento de sulfidrilas endógenas nos efeitos gastroprotetores foi
também investigado em animais que foram pré-tratados com N-etillmalimida (NEM), um
bloqueador de sulfidrilas endógenas. Os animais tratados com Ag (1000 mg/Kg) mostraram
atenuação da ação gastroprotetora em relação aos animais pré-tratados com salina (87% vs.
34% com NEM). Esta signifivcante atenuação (p<0.01) indica que SHs; compostos que
sequestram radicais livres e conseqüentemente previnem danos na membrana causados por
peroxidação lipídica (Szabo et al.,1987) podem estar envolvidos no mecanismo de
135
gastroproteção de Ag. Para At não houve diferença significativa (p>0.05) entre os grupos pré-
tratados com salina e tratados com o extrato de At e o grupo pré-tratado com NEM e o pré-
tratado com extrato de At que apresentou 64% vs. 73% de proteção gástrica.
O suco gástrico obtido da ligadura do piloro é utilizado para analisar os parâmetros
bioquímicos. Neste modelo, ocorre um aumento na concentração de HCl e,
conseqüentemente, de pepsina (Rastogi et al., 1998). Isto ocorre em decorrência de um
aumento da pressão sobre receptores sensíveis localizados na região antral, ativando o reflexo
vago-vagal (Baggio et al., 2002). Embora ocorra este aumento da concentração ácida no
estômago, esse fator agressor nem sempre é suficiente para a causa do surgimento das úlceras
gástricas, sugerindo o envolvimento de outros fatores (Rastogi et al., 1998). Por isso, são
analisados também outros parâmetros do suco gástrico como concentração de H+ e volume. A
administração das drogas-teste se deve ao fator de possibilitar a observar dos efeitos locais
(pela via oral) ou sistêmicos (pela via intraduodenal) de sua administração. Por ambas as
vias: oral e intraduodenal o houve um aumento do volume de secreção gástrica acumulado
por 4 horas e do total de conteúdo ácido nos animais pré-tratados com Ag diminuiu
significantemente quando comparado com o grupo controle. Para At os parâmetros como
concentração de H+, volume gástrico e pH, administração intraduodenal do extrato não
demonstrando portanto o pequeno efeito sistêmico do extrato. Mas houve proteção no índice
de lesão ulcerativa em relação à salina. A ligadura do piloro com administração oral dos
extratos promoveu diminuição no conteúdo de total ácido indicando, portanto forte efeito anti-
secretor de ambos os extratos. Estes dados indicam que também além das propriedades anti-
secretórias envolvidas no mecanismo de ação de Ag e At, o aumento de volume do suco
gástrico e ambos representa o aumento de secreção mucosa alcalina, estimulada por PGs
endógenas (Tsukumi et al., 2001).
136
Em vista dos resultados obtidos até o presente, optou-se por avaliar as frações
orgânicas destas espécies e escolhemos Alchornea triplinervia que tem um rendimento
umpouco maior. O rendimento da fração acetato de etila de A. triplinervia é de 27,6% e
rendimento fração acetato de etila deA. glandulosa é de 20%.
Foram avaliadas as frações aquosa (FAQ) e acetato (FA) obtidas do extrato
metanólico de A. triplinervia. A fração aquosa reduziu os índices de lesão em apenas 20%
enquanto a fração acetato reduziu os índices de lesão em 50% na mesma dose. A fração
acetato foi avaliada nas doses de 50, 100 e 200mg/Kg para confirmação da curva dose-
resposta e se obteve proteção de 12, 50 e 88%. Com base nos resultados obtidos optou-se por
continuar os demais experimentos com a dose de 100mg/Kg; para efeito comparativo a
mesma dose da droga-padrão cimetidina.
Com a FA na dose de 100mg/Kg foi realizado o experimento para quantificação da
quantidade de prostaglandinas da mucosa gástrica. Neste experimento, os animais tratados
com FA promoveram um aumento na quantidade de PGE
2
em relação ao controle. Já os
animais tratados com FA associado a indometacina não tiveram a quantidade de PGE2
reduzida em relação aos tratados apenas com FA. Este resultado pode ser considerado, pois a
expressão de COX-2 na manutenção da homeostase ainda é controversa. Por exemplo, uma
indução significante de COX-2 em estômagos de ratos foi detectada uma hora após
administração de aspirina ou indometacina (Davies et al., 1997). Com estes resultados
confirmamos nossa hipótese do envolvimento com precursores inflamatórios na ação de
A.triplinervia. Estes resultados obtidos com a fração são promissores, pois já é conhecido que
COX-2 é um importante mediador de defesa mucosa, por contribuir para a diminuição da
inflamação no trato gastrointestinal e tem um importante papel na cicatrização de úlceras
(Wallace e Devchand, 2005).
137
O modelo de úlcera induzida por ácido acético é o modelo no qual a úlcera mais se
aproxima da humana (Takaki et al., 1969), já que o tratamento é feito após a lesão ter sido
instalada. Neste modelo, o efeito cicatrizante das lesões gástricas é caracterizado enquanto
que nos modelos anteriormente avaliados, observa-se a ação gastroprotetora dos extratos.
Nestes últimos modelos, danos no epitélio gástrico geralmente ocorrem, mas úlceras (que
penetrem mais profundo na camada muscular) são mais difíceis de desenvolver em todos os
modelos. Quando as lesões penetram na submucosa e muscular, a reconstituição pode levar
várias semanas e envolvem formação de tecido de granulação na base da úlcera, formação de
vasos sanguíneos (angiogênese) e restabelecimento da arquitetura das glândulas (Mizuno et
al.,1997).
Para o mesmo modelo experimental de indução de úlceras por ácido acético a dose
utilizada de FA foi de 100mg/Kg, devido a curva dos efeitos no modelo de etanol. O mesmo
modelo também foi realizado com a dose de 250mg/Kg para o extrato de Ag, desde que esta
dose é eficaz nos modelos de úlceras anteriormente testados. O modelo de ácido acético não
pode ser considerado como um modelo de toxicidade propriamente dita, já que os animais
estão com a mucosa gástrica lesionada e podem sofrer efeitos decorrentes da cirurgia. Mas a
avaliação diária do peso corporal dos animais tratados tanto com Ag como com FA não
indicou qualquer alteração significativa que indique algum sinal de toxicidade pelo
tratamento durante 14 dias. Durante o sacrifício dos animais os principais órgãos foram
retirados; observados quanto as alterações macroscópicas, pesados e comparados aos
controles e também não foram observadas alterações significativas nem constatada nenhuma
alteração com relação ao peso dos órgãos. O sangue dos animais foi coletado e analisou-se
também parâmetros bioquímicos de uréia, creatinina, AST, ALT e todos os valores se
mostraram normais e não diferiram dos controles. Com estes resultados podemos inferir que
os tratamentos se mostraram seguros com até 14 dias de administração contínua. Estes dados
138
são considerados importantes já que o uso milenar de plantas medicinais mostrou, ao longo
dos anos, que determinadas plantas apresentam substâncias potencialmente perigosas. Do
ponto de vista científico, pesquisas mostraram que muitas delas possuem substâncias
potencialmente agressivas e, por esta razão, devem ser utilizadas com cuidado, respeitando
seus riscos toxicológicos (Veiga Junior et al., 2005).
A área da lesão foi determinada inicialmente com paquímetro assim que os animais
foram sacrificados e não houve diferença significativa na área da lesão dos animais tratados
com relação aos controles para nenhum dos tratamentos com Ag ou FA. Para Ag houve uma
redução da área interna da lesão em 43% dos animais tratados em relação aos controles. Os
animais tratados com FA mostraram valores da área de lesão bem próximos aos controles.
Porém, na análise histológica das lesões nota-se bastantes semelhanças entre os tratamentos
com Ag e FA, com relação a grande quantidade de células em proliferação. Fatores de
crescimento podem estimular importantes elementos celulares de cicatrização das úlceras,
como angiogêneses, formação de tecido de granulação e reepitelização, mas sua
especificidade e potencia são variáveis (Szabo e Vincze, 2000). A organização das glândulas
não é observada na mucosa do estômago, mas estas apresentam um certo grau de muco no
interior das glândulas, similarmente aos animais tratados com cimetidina. A coloração de
PAS que evidencia glicoproteínas, demonstrou o aumento de muco para os animais tratados
com FA em relação aos controles.
Vários fatores estão envolvidos na cicatrização, em particular, contração da área
ulcerada, reepitelização da base da úlcera e formação de tecido de granulação em torna da
área, apresentando o principal passo na cicatrização (Okabe e Agamase, 2005). As medidas
das áreas de regeneração e da mucosa normal foram feitas por medidas lineares da luz até a
muscular da mucosa. Nos animais tratados com Ag nota-se um aumento da área de
regeneração (um), porém os tratamentos com FA não apresentaram diferença significativa
139
entre os grupos tratados com o veículo. Foi observado um aumento da área de transição para
os 3 grupos. Sabe-se que o maior estímulo para a proliferação celular, divisão, migração e re-
epitelização são promovidos pelos os fatores de crescimento, estes podem ser estimulados por
citocinas, óxido nítrico e prostaglandinas da série E (Ferrara, 2005).
Para complementar os resultados obtidos até o presente, análises imunohistoquímicas
foram realizadas. O uso de técnicas de imunohistoquímica possibilitam a visualização de
células específicas nos tecidos com a vantagem de preservar a orientação espacial das células
(Wong e Wright, 2005).
Com o extrato de Ag foi feita a marcação de proliferação celular por PCNA. Optamos
por realizar as outras análises com anticorpos para HSP,COX-2, gastrina e somatostatina com
FA que é uma amostra mais purificada.
O PCNA é um polipeptídeo nuclear de 36kDa altamente conservado identificado como
proteína auxiliar da DNA polimerase delta (Bravo et al., 1987; Prelich et al., 1988; Nanji e
Tahan, 1996). Ele é expresso principalmente durante a fase S do ciclo celular, portanto, em
células em divisão (Celis e Celis, 1985). Finn et al., (1996) demonstrou que a cimetidina
inibiu significativamente a proliferação de três em cinco linhas de células, podendo indicar
uma dependência da proliferação dessas linhas na ativação de receptores H
2
. Os resultados
obtidos neste trabalho para PCNA mostraram grande quantidade de células em divisão, o que
reforça a hipótese de celularização aumentada tanto para At quanto FA principalmente na
base das glândulas, diferindo do padrão que encontramos na cimetidina. Tanto Ag como FA
promovem uma aceleração no processo de cicatrização pela proliferação celular da mucosa
gástrica.
HSPs estão relacionadas com proliferação, migração e diferenciação de queratinócitos
na pele, no trato digestivo são induzidas por vários tratamentos principalmente por estresse,
sugerindo que HSP estão relacionadas à proteção mucosa. Baseado nisso, sugere-se que as
140
proteínas HSP 70 são expressas nas células em proliferação e estão envolvidas na regeneração
da mucosa na última fase da cicatrização. Nas lâminas incubadas com anticorpos HSP-70 a
expressão de HSP 70 nos grupos tratados com FA está aumentado em relação aos controles,
com poucas células HSP 70 positivas. Tal resultado pode ser explicado por Tsukimi et al.,
(2001), que descreveram que o nível de HSP 70 expresso na mucosa normal é pequeno,
entretanto durante a cicatrização da úlcera a HSP 70 é expressa na base dela.
O antro gástrico tem um papel importante em manter a integridade do trato
gastrointestinal pela secreção endógena do hormônio gastrina. È bem conhecido que gastrina
tem um efeito trófico sobre as células da mucosa gastrointestinal, incluindo a superfície
epitelial. Nas lâminas marcadas imunohistoquímicamente com gastrina, foi observado poucas
células G marcadas. Isso se deve não somente só pela localização das células de gastrina, mas
também pela possível regulação já que notamos aumento do número de célula marcadas com
relação ao controle negativo.
Ciclooxigenase-2 (COX-2) é uma enzima chave na biosíntese de PGs e é um mediador
de reações patofisiológicas como inflamação. A expressão de COX-2 é aumentada em úlceras
experimentais onde a síntese de PGE
2
é estimulada. PGs aceleram a cicatrização, a produção
de fatores de crescimento, e a reconstrução da matriz extracelular (Peskar et al., 2001). Nas
lâminas incubadas com anticorpos para COX-2 nota-se aumento das células marcadas no
tratamento com FA; o que está de acordo com nossos resultados anteriores onde já foi
demonstrado o aumento de PGE2.
Resultados obtidos com a imunohistoquímica de gastrina, somatostatina e COX-2 estão
de acordo com Hiruma-Lima et al., 2006 que avaliou a ação de com Alchornea
castaneaefolia, outra espécie do mesmo gênero Alchornea, só que nesta foram avaliados
níveis séricos em experimentos agudos. Aqui podemos concluir que o principal mecanismo
de ação de Alchornea triplinervia é dependente de COX-2 o que denota resultados
141
promissores, de acordo com Poonam et al., (2005) que diz que drogas que levam a elevação
da expressão de COX-2 têm mais chances de sucesso na cicatrização de úlceras em
comparação com as que produzem um efeito contrário.
142
V
VV
V-
--
-CONCLUSÃO
CONCLUSÃOCONCLUSÃO
CONCLUSÃO
143
Em conclusão a este estudo, até o momento, é possível atribuir:
Ausência de efeito tóxico agudo dos extratos metanólicos de Alchornea glandulosa e
Alchornea triplinervia.
Presença de substâncias potencialmente antiulcerogênicas em ambos extratos.
A fração acetato de etila de Alchornea triplinervia se mostra mais ativa que as frações
aquosas, concentrando possivelmente as substâncias ativas.
O mecanismo de ação da fração acetato de etila de Alchornea triplinervia se dá através
do aumento de PGE
2
, o que foi confirmado também na análise imunohistoquímica.
144
VI
VIVI
VI-
--
- REFERÊNCIAS
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156
VII
VIIVII
VII-
--
- Anexos e Complementos
Anexos e Complementos Anexos e Complementos
Anexos e Complementos
157
Trabalhos apresentados em congresso:
Ação antiulcerogênica e tóxica das flores da Mangifera indica L.(XII Simpósio de
Plantas Medicinais - 11/2002) .
Mangifera indica L. (flores): Efeitos antiulcerogênicos (Fesbe 9/2003).
Avaliação da atividade antiulcerogênica do óleo essencial de Citrus limon burn.
(Rutaceae) (Simpósio de óleos essenciais –11/2003).
Efeitos tóxicos e atividade antiulcerogênica das folhas da Mangifera indica L .(Jornada
paulista de plantas medicinais-11/2003).
Investigação química do extrato hidroalcoólico de Mangifera indica L. (jornada paulista
de plantas medicinais-11/2003).
Análise morfológica da ação do extrato hidroalcoólico de flores de Mangifera indica (
manga) em lesões estomacais (V Congresso De Anatomia Del Cono Sur, 11/2003 ).
Alchornea triplinervia (Euphorbiaceae): a Brazilian “Cerrado” medicinal plant source of
antiulcer compounds (Silae-Itália setembro de 2004).
Efeitos antiulcerogênicos da Alchornea glandulosa SBFTE-(outubro de 2004).
Antiulcerogenic effects of aqueous decoction from mango flowers (mangifera indica l.) in
rodents- outubro de 2004. Reunião de integração da morfologia panamericana (outubro de
2004).
Avaliação da ação antiulcerogênica e da toxicidade do extrato metanólico das partes
aéreas de Byrsonima crassa nied.(FESBE 2005).
Investigação do mecanismo de ação envlvido na atividade antiúlcera de Alchornea
glandulosa.(FESBE 2005).
158
Avaliação da atividade cicatrizante do extrato metanólico de Byrsonima fagifolia.( FESBE
2005).
Effect of mouriri pusa extract,“ cerrado” plant in the cicatrization process of gastric ulcers
experimental.(XX Congresso brasileiro de microscopia e microanálise, 2005).
Trabalhos publicados:
CAN THE AQUEOUS DECOCTION OF MANGO FLOWERS BE USED AS AN
ANTIULCER AGENT?
Zeila P. Lima; Clélia A. Hiruma-Lima; Cláudia H. Pellizzon; Alba
R.M. Souza Brito; Pablo N. Solis; Armando Cáceres; Wagner Vilegas. Journal of
Ethnopharmacology in press.
Constituents and
antiulcer effect of
Alchornea glandulosa
: Activation of proliferation
cell in gastric mucosa during healing process.
Tamara Regina Calvo, Zeila Pinheiro Lima,
Janaina Scaramelo Silva, Kátia Verônica Rodrigues Ballesteros, Cláudia Helena Pellizzon,
Clélia Akiko Hiruma-Lima, Jorge Tamashiro, Alba Regina Monteiro Souza Brito, Regina
Kiomi Takahira, Wagner Vilegas. Submetido ao chemical and pharmaceutical bulletin em
09/2005.
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