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CLONAGEM, EXPRESSÃO, CARACTERIZAÇÃO E MODELAGEM ESTRUTURAL DE
UMA ESTERASE TERMOESTÁVEL DE Pyrococcus furiosus
Rodrigo Volcan Almeida
TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS
PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS
PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS EM ENGENHARIA
QUÍMICA.
Aprovada por:
________________________________________________
Prof. Tito Lívio Moitinho Alves, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Orlando Bonifácio Martins, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Rodolpho Mattos Albano, D.Phil.
________________________________________________
Prof
a
. Ana Paula Valente Lacerda de Almeida, Ph.D.
________________________________________________
Prof
a
. Denise Maria Guimarães Freire, D.Sc.
________________________________________________
Prof
a
. Leda dos Reis Castilho, Dr.-Ing.
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
NOVEMBRO DE 2005
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ii
ALMEIDA, RODRIGO VOLCAN
Clonagem, Expressão, Caracterização e Mo-
delagem Estrutural de uma Esterase Termo-
estável de Pyrococcus furiosus [Rio de
Janeiro] 2005
XX, 109p. 29,7 cm (COPPE/UFRJ, D.Sc.,
Engenharia Química, 2005)
Tese - Universidade Federal do Rio de
Janeiro, COPPE
1. Enzimas extremofílicas
2. Esterases
3. Lipases
4. Proteases
I. COPPE/UFRJ II. Título (série)
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iii
Dedico este trabalho à minha esposa.
Uma pessoa muito importante nesta caminhada.
iv
OPERÁRIO EM CONSTRUÇÃO Vinícius de Moraes
Era ele que erguia casas
onde antes só havia chão.
Como um pássaro sem asas
ele subia com as casas
que lhe brotavam da mão.
Mas tudo desconhecia
de sua grande missão
não sabia, por exemplo,
que a casa de um homem é
um templo.
Um templo sem religião
Como tampouco sabia
Que a casa que ele fazia,
sendo sua liberdade,
era a sua escravidão.
De fato, como podia
um operário em construção
compreender por que um
tijolo
valia mais que um pão?
Tijolos ele empilhava
com pá, cimento e esquadria.
Quanto ao pão ele comia.
Mas fosse comer tijolo...
E assim, o operário ia,
com suor e com cimento.
Erguendo uma casa aqui,
adiante um apartamento;
além uma igreja, à frente
um quartel e uma prisão:
prisão de que sofreria
não fosse eventualmente
um operário em construção.
Mas ele desconhecia
esse fato extraordinário:
que o operário faz a coisa
e a coisa faz o operário.
De forma que, certo dia,
à mesa, ao cortar o pão,
o operário foi tomado
de uma súbita emoção
ao constatar assombrado
que tudo naquela mesa
– garrafa, prato, facão –
era ele quem os fazia!
Ele, um humilde operário,
um operário em construção.
Olhou em torno: gamela,
banco, enxerga, caldeirão,
vidro, parede, janela,
casa, cidade, nação!
Tudo, tudo o que existia
era ele quem o fazia!
Ele, um humilde operário um
operário que sabia
exercer a profissão.
Ah! Homens de pensamento,
não sabereis nunca o quanto
aquele humilde operário
soube naquele momento!
Naquela casa vazia
que ele mesmo levantara,
um mundo novo nascia
de que sequer suspeitava.
O operário emocionado
olhou sua própria mão
sua rude mão de operário
de operário em construção.
E olhando bem para ela
teve um segundo a
impressão
de que não havia no mundo
coisa que fosse mais bela.
Foi dentro da compreensão
desse instante solitário
que, tal sua construção,
cresceu também o operário.
Cresceu em alto e profundo,
em largo e no coração.
E como tudo que cresce
E não cresceu em vão.
Pois além do que sabia
- exercer a profissão –
o operário adquiriu
uma nova dimensão:
a dimensão da poesia.
E um fato novo se viu
que a todos adimirava:
o que o operário dizia
outro operário escutava.
E foi assim que o operário
Do edifício em construção
Que sempre dizia sim
Começou a dizer não
E aprendeu a notar coisas
A que não dava atenção:
Notou que sua marmita
Era o prato do patrão
Que sua cerveja preta
Era o uísque do patrão
Que seu macacão de zuarte
Era o terno do patrão
Que o casebre onde morava
Era a mansão do patrão
Que os seus dois pés
andarilhos
Eram as rodas do patrão
Que a sua imensa fadiga
Era amiga do patrão.
E o operário disse: Não!
v
E o operário fez-se forte
Na sua resolução
Como era de se esperar
As bocas da delação
Começaram a dizer coisas
Aos ouvidos do patrão
Mas o patrão não queria
Nenhuma preocupação.
-“Convençam-no” do
contrário-
Disse ele sobre o operário
E ao dizer isso sorria
Dia seguinte, o operário
Ao sair de casa
Viu-se súbito cercado
Dos homens da delação
E sofreu, por destinado
Sua primeira agressão.
Teve seu rosto cuspido
Teve seu braço quebrado
Mas quando foi perguntado
O operário disse: Não!
Em vão sofrera o operário
Sua primeira agressão
Muitas outras se seguiram
Muitas outras seguirão
Porém, por imprescindível
Ao edifício em construção
Seu trabalho prosseguia
E todo o seu sofrimento
Misturava-se ao cimento
Da construção que crescia.
Sentindo que a violência
Não dobraria o operário
Um dia tentou o patrão
Dobra-lo de modo vário
De sorte que foi levando
Ao alto da construção
E num momento de tempo
Mostrou-lhe toda a região
E apontando-a ao operário
Fez-lhe esta declaração:
– Dar-te-ei todo esse poder
E a sua satisfação
Porque a mim me foi
entregue
E dou a quem bem quiser.
Dou-te tempo de lazer
Dou-te tempo de mulher.
Portanto, tudo o que vês
Será teu se me adorares
E, ainda mais, se
abandonares
O que te faz dizer não.
Disse, e fitou o operário
Que olhava e refletia
Mas o que via o operário
O patrão nunca veria.
O operário via as casas
E dentro das estruturas
Via coisas, objetos
Produtos, manufaturas
Via tudo o que fazia
O lucro do patrão
E em cada coisa que via
Misteriosamente havia
A marca de sua mão.
E o operário disse: Não!
– Loucura! – gritou o patrão
Não vês o que te dou eu?
– Mentira! – disse o operário
Não podes darme o que é
meu.
E um grande silêncio fez-se
Dentro do seu coração
Um silêncio de martírios
Um silêncio de prisão
Um silêncio povoado
De pedidos de perdão
Um silêncio apavorado
Como o medo em solidão
Um silêncio de torturas
E gritos de maldição
Um silêncio de fraturas
A se arrastarem no chão.
E o operário ouviu a voz
De todos os seus irmãos
Os seus irmãos que
morreram
Por outros que viverão.
Uma esperança sincera
Cresceu no seu coração
E dentro da tarde mansa
Agigantou-se a razão
De um homem pobre e
esquecido
Razão porém que fizera
Em operário construído
O operário em construção.
vi
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer aos Profs. Tito e Orlando, pela amizade, ensinamentos,
discussões e confiança.
À Sylvia por tudo que temos aprendido juntos com a “lipase-esterase” ou
mesmo “protease” de Pyrococcus. Agora as coisas começam a dar resultados...
Aos amigos Ariane, Alex e Welington pelas discussões e colaborações nos
trabalhos que, mesmo indiretamente, colaboraram muito na consolidação dos
conhecimentos que foram necessários na realização deste.
À Shaila pelos ensinamentos de modelagem comparativa e por ter se tornado,
em sua colaboração, uma excelente colega de trabalho.
À Profa. Maysa Clementino do Instituto Nacional de Controle da Qualidade em
Saúde – FIOCRUZ, pela generosa acolhida em 2000, e pela doação do DNA de
Pyrococcus furiosus.
Ao Núcleo de Estudos de Genoma Johanna Döbenheiner (UFRJ) e ao
Laboratório do Prof. Dr. Rodolfo M. Albano (UERJ) pelos seqüenciamentos.
Aos demais colegas de trabalho do Laboratório de Biologia Molecular: Kahune,
Rebeca, Helen, João, Vânia, Márcio Superman, Ricardo, ao Léo e ao Tiago.
Ao pessoal dos "bichinhos escrotos": Ana Paula, Ana Caroline, Carol, Clarinha,
Flávio, Gabriela, Liliane, Marcos, Marcus, Aurélio, Kathleen, Cristine, Bruno, Patrícia,
Pedro, Vitor, Viviane, Renata e Zé pelo novo e descontraído clima de laboratório.
Às colegas do Jardim Botânico, Hana e Núbia, por terem ajudado a Sylvia com
as clonagens em Gateway.
Ao pessoal do Laboratório de Bioprocessos: as sempre dedicadas Cândida e
Ana Karla, Helen, Herval, Leandro, Luiza, Rossano e Silvia.
Às gurias do Laboratório de Tecnologia Enzimática: Cláudia, Elisa, Fabiane,
Márcia, Melissa e Tânia, pela atenção na luta por um método de determinação de
atividade lipásica.
Às colegas Kátia e Maria de Fátima pela ajuda com o titulador automático e
com os métodos de determinação de atividade.
Às Biocatalític@s Denise, Lúcia, Juliana, Aline e Márcia pelas discussões em
torno das lipases, pelas gargalhadas e descontrações.
Aos companheiros de luta na Associação de Pós-Graduandos (APG-UFRJ):
Ariane (mais uma vez), Magus, Fernanda, Iranaia, Renata, Maurício, Maximiliano,
Leandro, Camila, Raphael, Bitzer, Lúcio, Crisóstomo, e todos os outros... MAIS
VERBAS PARA EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA!!
vii
Ao Centro Cultural Antônio Carlos Carvalho (CeCAC) pela dimensão política e
transformação permanente da minha vida.
Aos meus “pais” Milton e Sandra e ao meu “irmão” Gabriel por me darem a
Romi.
Aos meus pais Cirio e Hilda, às minhas irmãs Dani e Renatinha e aos meus
cunhados Gordo e Diego, por mesmo em distância estarem sempre presentes me
renovando.
À minha esposa, pelo amor, pela grande ajuda, correspondência, atenção,
segurança, entendimento, paciência, pelo exemplo de coragem, em fim por você estar
sempre ao meu lado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
à Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro,
pelas bolsas durante a realização deste trabalho.
viii
Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)
CLONAGEM, EXPRESSÃO, CARACTERIZAÇÃO E MODELAGEM
ESTRUTURAL DE UMA ESTERASE TERMOESTÁVEL DE Pyrococcus furiosus
Rodrigo Volcan Almeida
Novembro/2005
Orientadores: Titio Lívio Moitinho Alves
Orlando Bonifácio Martins
Programa: Engenharia Química
A proteína codificada pelo gene PF2001 de Pyrococcus furiosus foi caracterizada
in silico, e demonstrou possuir os domínios de diamino peptidases, αβ hidrolases e de
esterases/lipases. Para se confirmar esta observação, este gene foi inicialmente
clonado e expresso em Escherichia coli BL21 SI utilizando o vetor de expressão
pDEST17, contudo, não foi detectada a expressão da proteína de interesse. Desta
forma, em uma nova estratégia, o gene PF2001 inteiro e sem os 60 nucleotídeos da
extremidade 5´ (PF2001∆60), os quais foram identificados como responsáveis pela
codificação de um peptídeo sinal, foram clonados utilizado-se o vetor pET32a e a cepa
BL21(DE3) pLysS. Apenas os transformantes com o gene PF2001∆60 produziram a
proteína de interesse, a qual foi posteriormente caracterizada. A enzima recombinante
foi testada nos substratos 4-metil umbeliferil acetato, heptanoato e palmitato,
apresentando maior atividade para o substrato 4-metil umbeliferil heptanoato,
sugerindo se tratar de uma esterase com especificidade para substratos de cadeias
médias. Quando atividade proteásica da enzima foi testada utilizando-se caseína
como substrato, nenhuma hidrólise foi detectada. A enzima recombinante apresentou
atividade ótima a 60°C (pH 7,0) e termoestabilidade a 75°C por 120min. Construiu-se,
por homologia, um modelo estrutural para esta enzima através do qual foram
identificados os resíduos Ser149, Asp233 e His264 como o provável sítio catalítico, o
que foi corroborado pela inibição por 1 mM de PMSF. Além disso, algumas razões
estruturais para termoestabilidade foram apontadas.
ix
Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the
requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)
CLONING, EXPRESSION, CHARACTERIZATION AND STRUCTURAL
MODELING OF A THERMOSTABLE ESTERASE FROM Pyrococcus furiosus
Rodrigo Volcan Almeida
November/2005
Advisors: Tito Lívio Moitinho Alves
Orlando Bonifácio Martins
Department: Chemical Engineering
In this work, the protein codified by PF2001 gene from Pyrococcus furiosus was
analyzed in silico, indicating the conserved domains of dipeptidyl aminopeptidases,
hydrolases of the αβ super family and esterases/lipases. In order to confirm this result,
the gene PF2001 was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 SI using the
vector pDEST17, however with this construct no expression of the recombinant protein
was detected. Using a new strategy, the PF2001 gene was cloned entire and without
the 60 nucleotides of 5´ termini (PF2001∆60), identified as a probable signal peptide, in
pET32a vector and BL21(DE3) pLysS strain. Was observed that only the cells
harboring the PF2001∆60 were capable to produce the recombinant enzyme, which
was characterized. The recombinant enzyme was assayed towards 4-methyl
umbelliferyl acetate, heptanoate and palmitate, presenting highest activity towards 4-
methyl umbelliferyl heptanoate. These data suggest that the enzyme is a esterase with
specificity to medium chain length substrates. When protease activity was tested using
casein as substrate, hydrolysis was not detected. The enzyme presented optimal
activity at 60°C (pH 7,0) and was thermostable for 120 min at 75°C. Furthermore, a
structural model was constructed and the probable catalytic triad, Ser149, Asp233 and
His264, was identified, corroborating the experimental results of inhibition with 1 mM of
PMSF. In addition some structural reasons to thermostability were indicated.
x
ÍNDICE
RESUMO......................................................................................................................viii
ABSTRACT....................................................................................................................ix
ÍNDICE............................................................................................................................ x
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. xiii
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................. xix
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................. xix
LISTA DE ABREVIAÇÕES.......................................................................................... xx
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 3
2.1 Esterases e lipases................................................................................................ 3
2.1.1 Definição....................................................................................................... 3
2.1.2 Mecanismo enzimático.................................................................................. 7
2.1.3 Características estruturais .......................................................................... 11
2.1.3.1 Estruturas primárias e a classificação em famílias ......................... 12
2.1.3.2 Estrutura terciária............................................................................ 13
2.1.3.3 Relações entre esterases, lipases e proteases............................... 15
2.1.4 Aplicações biotecnológicas de esterases e lipases .................................... 17
2.2 Pyrococcus furiosus e suas enzimas................................................................... 20
2.2.1 O gene PF2001 de P. furiosus.................................................................... 22
3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 24
3.1 Bioinformática ...................................................................................................... 24
3.1.1 BLAST – “Basic Local Alignment Sequence Tool”...................................... 24
3.1.2 PSI-BLAST – “Position Sequence Iterated-BLAST”.................................... 25
3.1.3 CD-SEARCH – “Conserved Domain-SEARCH” ......................................... 25
3.1.4 CLUSTAL W ............................................................................................... 25
3.1.5 T-COFFEE – “Tree-based Consistency Objective Function For Alignment
Evaluation”............................................................................................................. 25
3.1.6 SignalP........................................................................................................ 25
3.1.7 THREADER ................................................................................................ 26
3.1.8 MODELLER ................................................................................................ 26
3.1.9 PROCHECK................................................................................................ 27
3.2 Clonagem e expressão do gene PF2001 de Pyrococcus furiosus ...................... 27
3.2.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR).................................................... 29
xi
3.2.2
Eletroforese de DNA ................................................................................... 30
3.2.3 Purificação de DNA em bandas de gel de agarose .................................... 30
3.2.4 Sistema de clonagem de DNA por recombinação sítio-específica (Gateway
Cloning Technology).............................................................................................. 30
3.2.5 Clonagem em pET32a ................................................................................ 33
3.2.6 Cepas utilizadas.......................................................................................... 36
3.2.7 Obtenção de células eletrocompetentes..................................................... 36
3.2.8 Eletroporação.............................................................................................. 37
3.2.9 Mini-preparação de DNA plasmidial............................................................ 37
3.2.10 Digestão dos clones positivos ............................................................. 38
3.2.11 Seqüenciamento.................................................................................. 38
3.2.12 Expressão e preparação dos extratos protéicos ................................. 38
3.2.13 Dosagem de proteínas ........................................................................ 39
3.2.14 Eletroforese (SDS-PAGE) ................................................................... 39
3.2.15 Western Blot ........................................................................................ 40
3.2.16 Planejamento experimental................................................................. 41
3.3 Determinação da atividade de esterase/lipase.................................................... 41
3.4 Determinação da atividade proteásica................................................................. 42
3.5 Purificação da enzima recombinante por cromatografia de afinidade (Ni-NTA).. 43
3.6 Zimograma........................................................................................................... 43
3.7 Modelagem molecular comparativa..................................................................... 44
3.7.1 Identificação do molde ................................................................................ 44
3.7.2 Alinhamentos .............................................................................................. 45
3.7.3 Modelagem, Otimização e Validação.......................................................... 46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 47
4.1 Caracterização in silico do gene PF2001 de Pyrococcus furiosus ...................... 47
4.2 Clonagem e Expressão do gene PF2001............................................................ 50
4.2.1 Isolamento e clonagem do gene PF2001 no sistema Gateway.................. 50
4.2.2 Confirmação dos clones positivos............................................................... 51
4.2.3 Seqüenciamento ......................................................................................... 53
4.2.4 Expressão e caracterização da enzima recombinante ............................... 53
4.3 Clonagem no vetor pET-32a................................................................................ 55
4.3.1 Isolamento e clonagem dos fragmentos de DNA PF2001 e PF2001∆60 ... 57
4.3.2 Confirmação dos clones positivos............................................................... 57
4.3.3 Sequenciamento ......................................................................................... 59
4.3.4 Expressão ................................................................................................... 59
4.4 Caracterização..................................................................................................... 64
xii
4.5
Purificação ........................................................................................................... 69
4.6 Modelagem estrutural comparativa da lipase de Pyrococcus furiosus ................ 70
4.6.1 Escolha do molde ....................................................................................... 70
4.6.2 Alinhamento e Modelagem ......................................................................... 73
4.6.3 Validação .................................................................................................... 77
4.7 Razões estruturais para a termoestabilidade da esterase de P. furiosus............ 78
5 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 82
5.1 Clonagem e expressão do gene PF2001 ............................................................ 82
5.2 Caracterização da enzima ................................................................................... 83
5.3 Modelagem estrutural e razões para a termoestabilidade................................... 83
PERSPECTIVAS.......................................................................................................... 85
5.4 Caracterização da enzima ................................................................................... 85
5.5 Aplicação tecnológica .......................................................................................... 85
BIBLIOGRAFIA............................................................................................................ 86
ANEXOS....................................................................................................................... 99
Anexo I....................................................................................................................... 99
Anexo II.................................................................................................................... 101
Anexo III................................................................................................................... 108
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Reação de hidrólise de ligações éster catilisada por lipases e esterases... 3
Figura 2.2. Reações catalisadas por lipases e esterases em meio com baixa atividade
de água.................................................................................................................... 4
Figura 2.3. Esquema mostrando a atividade catalítica de lipases (a) e esterases (b)
em função da concentração do substrato (u.c. – unidades de concentração). A
linha vermelha tracejada mostra o limite de solubilidade dos substratos................ 4
Figura 2.4. Superposição dos esqueletos das lipases de Rhizomucor miehei (a) e de
pâncreas humano (b), mostrando a mudança conformacional da tampa na
ativação interfacial. As tampas estão destacadas em verde (fechado) e laranja
(aberto). Modificado de PETERSEN et al. (2001)................................................... 5
Figura 2.5. Diferenças entre esterases e lipases com relação à distribuição de
resíduos apolares em diferentes camadas de acessibilidade ao solvente (0% a
100%). (a) Distribuição dos resíduos apolares (Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Tyr e
Cys) em diferentes camadas de acessibilidade ao solvente para lipases e
esterases; o número de resíduos em cada camada também é mostrado; o
retângulo vermelho tracejado evidencia o maior número de resíduos apolares para
as lipases nesta região. (b) Superfície da lipase de Rhizomucor miehei,
com a tampa fechada (esquerda) e aberta (direita); regiões em rosa evidenciam
os resíduos Val, Leu e Ile em regiões altamente expostas (>50%). Modificado de
FOJAN et al. (2000)................................................................................................. 7
Figura 2.6. Mecanismo da reação de hidrólise de ligações éster catalisada por
esterases e lipases. A tríade catalítica e a água são mostradas em preto, os
resíduos do buraco do oxiânion em azul e o substrato em vermelho. (a) ataque
nucleofílico da hidroxila da serina ao carbono suscetível da ligação éster; (b)
intermediário tetraédrico; (c) intermediário acil enzima e ataque nucleofílico da
água; (d) intermediário tetraédrico; (e) enzima livre. Modificado de JAEGER et al.
(1994). ..................................................................................................................... 8
Figura 2.7. Mecanismo da catapulta eletrostática. O sítio ativo com potencial negativo
força, através de repulsão eletrostática, a saída do ácido carboxílico formado, que
também possui carga negativa. Modificado de PETERSEN et al. (2001)............. 11
Figura 2.8. Representação esquemática do dobramento αβ. (a) Em lipases. Folhas β3
a β7 e hélices B e C ocorrem em todas lipases. Aquelas folhas β e α hélices
mostradas em cinza (β2, A, D e F) ocorrem na maioria. As hélices A e F,
xiv
mostradas com linhas tracejadas, estão no lado côncavo e as outras no lado
convexo (modificado de CYGLER e SCHRAG, 1997); (b) dobramento αβ
generalizado (modificado de SCHRAG e CYGLER,1997).................................... 15
Figura 2.9. Resolução do éster metil-3-(4 metoxifenilglicidato)................................... 18
Figura 2.10. Síntese do ácido (R)-β-acetilmercaptoisobutírico catalisado por uma
esterase................................................................................................................. 19
Figura 3.1. Esquema ilustrativo da metodologia utilizada pelo MODELLER para
modelagem comparativa de proteínas. Primeiro é feito um alinhamento entre a
seqüência da proteína que se quer modelar com as seqüências das proteínas
moldes com estruturas já definidas. Em seguida, o programa define as restrições
espaciais. E por último, são satisfeitas as restrições. ........................................... 26
Figura 3.2. Gráfico de Ramachandran e estrutura de uma ligação peptídica mostrando
os átomos e ângulos importantes. (a) Gráfico de Ramachandran, regiões
vermelhas e amarelas são as regiões permitidas. (b) Estrutura de uma ligação
peptídica mostrando os ângulos φ e ψ das ligações do carbono α e os ângulos da
cadeia lateral. ........................................................................................................ 27
Figura 3.3. Estratégias de clonagem do gene PF2001................................................ 28
Figura 3.4. Reação BP. Esquema da obtenção do Clone de Entrada, a partir da
recombinação sítio-específica, attB (produto de PCR contendo sítios attB
terminais) + attP (Donor Vector). Modificado de INVITROGEN (2005)................. 31
Figura 3.5. Reação LR. Esquema da obtenção do Clone de Expressão, a partir da
recombinação sítio-específica, attL (Entry Clone) + attR (Destination Vector).
Modificado de INVITROGEN (2005). .................................................................... 31
Figura 3.6. Mapa do Vetor Doador de sítios attP (pDONR-201). Observação dos sítios
attP1 e attP2, que recombinam com sítios attB1 e attB2, na reação BP; gene de
resistência a canamicina (Kn
r
); origem de replicação (ori). Modificado de
INVITROGEN (2005)............................................................................................. 32
Figura 3.7. Mapa do Vetor de Destino de sítios attR (pDEST-17). Observação dos
sítios attR1 e attR2, que recombinam com sítios attL1 e attL2, na reação LR; gene
de resistência à ampicilina (Ap
r
); origem de replicação (ori). Modificado de
INVITROGEN (2005)............................................................................................. 33
Figura 3.8. Mapa do vetor pGEM-T Easy Vector. Modificado de PROMEGA (2005).. 34
Figura 3.9. Mapa do vetor pET32a (Novagen). Observação do promotor T7, dos tags
de histidina e tioredoxina; gene de resistência à ampicilina (Ap); origem de
replicação (ori); repressor lac (lacI). Modificado de NOVY et al. (1995). .............. 35
Figura 3.10. Esquema ilustrando a metodologia de expressão................................... 39
xv
Figura 3.11. Diagrama esquemático da detecção utilizando o sistema ECL. A proteína
é detectada por quimioluminescência usando anticorpo secundário conjugado
com a peroxidase. ................................................................................................. 40
Figura 3.12. Estruturas dos substratos utilizados para a determinação da atividade.. 42
Figura 3.13. Fluxograma mostrando a seqüência de ações na modelagem
comparativa de estruturas de proteínas................................................................ 44
Figura 4.1. Gene PF2001 de P. furiosus. Pribnow box e início da transcrição (verde);
Sítio de Shine-Dalgarno (vermelho); Códon de ínicio da tradução (azul); Códon de
Terminação (*); Regiões ricas em pirimidinas (destacado em amarelo); regiões de
pareamento invertido (setas)................................................................................. 47
Figura 4.2. Análise dos domínios conservados presentes na proteína codificada pelo
gene PF2001 de P. furiosus, utilizando a ferramenta computacional CD-Search e
o banco de dados cddv2.05. A barra preta numerada na parte superior indica a
seqüência da esterase com seus 288 aminoácidos; mais abaixo, com barras
coloridas, estão mostrados os domínios e, na parte inferior, os domínios são
descritos com seus respectivos Scores e E-values. ............................................. 48
Figura 4.3. Amplificação do gene PF2001 por PCR a partir do DNA genômico de
Pyrococcus furiosus. Gel de agarose a 0,8% em TAE. 1) Padrão de massa
molecular (DNA λ digerido com Pst I), 2) Controle negativo (PCR sem DNA
genômico) e 3) Produto do PCR. A seta indica a banda amplificada de 929pb.... 51
Figura 4.4. Gel de agarose 0,8% em TAE mostrando a digestão do plasmídeo
pDONRPF2001 em diferentes transformantes. (*) plasmídeos digeridos, ( )
plasmídeos não digeridos. PM é o padrão de massa molecular (DNA λ digerido
com Pst I). ............................................................................................................. 52
Figura 4.5. Gel de agarose 0,8% em TAE mostrando digestão do plasmídeo
pDESTPF2001. (*) plasmídeos digeridos, ( ) plasmídeos não digeridos. PM é o
padrão de massa molecular (DNA λ digerido com PstI). ...................................... 52
Figura 4.6. Gel de agarose 0,8% em TAE mostrando digestão do plasmídeo
pDESTPF2001 extraído da célula de expressão BL21-SI. (*) plasmídeos
digeridos, ( ) plasmídeos não digeridos. Os poços 3 e 6 estão vazios. PM é o
padrão de massa molecular (DNA λ digerido com PstI). ...................................... 53
Figura 4.7. Gel desnaturante de poliacrilamida (12%) mostrando o perfil de indução do
clone pDESTPF2001 em E. coli BL21SI. 1 e 8) Padrões de massa molecular; 2) E.
coli BL21SI sem plasmídeo; 3) Clone pDESTPF2001 em E. coli BL21SI sem
indução; 4 ao 7) Clone pDEPF2001 em E. coli BL21SI induzido com 300mM de
xvi
NaCl por 1, 2, 3 e 4h, respectivamente. A seta a direita indica a mobilidade
eletroforética para uma proteína de aproximadamente 35 kDa. ........................... 54
Figura 4.8. Caracterização da região amino terminal da proteína codificada pelo gene
PF2001. (a) Predição do peptídeo sinal utilizando o programa SignalP 3.0 com
rede neural treinada para Gram-negativos. S score (linha verde) mostra a
probabilidade de um certo resíduo participar de um peptídeo sinal, C score e Y
score (linhas vermelha e azul) são valores que indicam onde ocorre o início da
proteína; (b) grau de hidrofobicidade dos resíduos............................................... 56
Figura 4.9. Amplificação dos fragmentos por PCR a partir do DNA genômico de
Pyrococcus furiosus: 1) PF2001 (901 pb); 2) PF2001∆60 (841 pb) e; 3) controle
negativo (PCR sem DNA genômico). Gel de agarose a 1% em TAE. PM é o
padrão de massa molecular (DNA λ digerido com PstI). ...................................... 57
Figura 4.10. Confirmação dos clones pGEMPF2001 e pGEMP2001∆60 através de
PCR de diferentes transformantes, utilizando-se os primers
FpETPF2001/RpETPF2001 e FpETPF2001∆60/RpETPF2001. PM é o padrão de
massa molecular (DNA λ digerido com PstI)......................................................... 58
Figura 4.11. Digestões dos plasmídeos pGEMPF2001 e pGEMP2001∆60 com as
enzimas BglII e SalI. (*) plasmídeos digeridos, ( ) plasmídeos não digeridos. PM é
o padrão de massa molecular (DNA λ digerido com PstI). ................................... 58
Figura 4.12. Confirmação dos clones pETPF2001 e pETP2001∆60 através de PCR de
diferentes transformantes em DH10b, utilizando-se os primers
T7promoter/T7terminator. PM é o padrão de massa molecular (DNA λ digerido
com PstI). .............................................................................................................. 59
Figura 4.13. Eletroforese desnaturante (a) e western blot (b) do extrato protéico total
de E. coli BL21(DE3)pLysS transformada com os plasmídeos pEPF2001 (1) e
pEPF2001∆60 (2), além do controle com a E. coli BL21(DE3)pLysS sem
transformar (3). PM é o padrão de massa molecular............................................ 60
Figura 4.14. Eletroforese desnaturante (a) e western blot (b) do extrato protéico total
da E. coli BL21(DE3)pLysS transformada com o plasmídeo pEPF2001∆60 nas
diversas condições de expressão prevista no planejamento experimental,
variando-se a Abs
600nm
(0,3; 0,6 e 0,9), a temperatura (25; 30 e 35°C) e o tempo
de indução (3 e 21h). PM é o padrão de massa molecular................................... 61
Figura 4.15. Ensaios de especificidade e inibição da enzima recombinante. (a)
Atividade relativa da enzima recombinante em substratos com diferentes
comprimentos de cadeia da porção ácida: MUF-Ace (2 carbonos), MUF-Hep (7
carbonos) e MUF-Pal (16 carbonos); (b) Inibição da atividade esterásica da
xvii
enzima recombinante frente ao substrato MUF-Hep, pela adição de 1mM de
PMSF..................................................................................................................... 65
Figura 4.16. Efeito da temperatura (a) e análise de termoestabilidade (b) da enzima
recombinante......................................................................................................... 67
Figura 4.17. Análise do processo de purificação da esterase recombinante de
Pyrococcus furiosus. Eletroforese desnaturante não redutora em gel de
poliacrilamida 15% corada por prata (a) e revelada pela atividade em MUF-Hep
(b). 1) Fração solúvel aplicada na coluna; 2) Fração não adsorvida; 3) Proteína
recombinante eluída com 150mM de imidazol. PM é o padrão de massa
molecular............................................................................................................... 69
Figura 4.18. Diferentes representações da estrutura da prolil oligo peptidase muscular
de Sus scrofa empregada como molde para a construção do modelo estrutural
neste trabalho. (a) Visão global da enzima mostrando seus dois domínios, o
propulsor β na parte inferior, e o catalítico na superior. Colorida em degradée da
porção amino terminal, em azul, até a carbóxi terminal, em vermelho. (b) Visão do
domínio propulsor β, enfatizando sua semelhança com uma pá propulsora, e a
cavidade central onde o substrato entra para encontrar o sítio ativo. Colorida por
estrutura, magenta (α hélices), amarelo (folhas β) e azul e cinza (alças). (c) Visão
do domínio catalítico enfatizando seu dobramento αβ com as folhas β envoltas
pelas α hélices. Além disso, é ressaltado na representação spacefill a tríade
catalítica Ser554 (vermelho) – Asp641 (azul) – His680 (verde). As cores restantes
representam as mesmas estruturas da figura b. Estas figuras foram construídas
no RasMol v2.7.1 para Windows........................................................................... 72
Figura 4.19. Alinhamento inicial da seqüência compreendida entre os resíduos 428 a
710 da prolil oligo peptidase de Sus scrofa (1qfm-domcat) e a seqüência da
esterase de P. furiosus (pfuqfmt6). Em laranja são mostrados os pentapeptídeos
das duas enzimas e em vermelho os Asp e His das tríades catalíticas. A estrutura
secundária da 1qfm-domcat é mostrada, sendo que setas verdes, retângulos
amarelos e linhas, representam folhas β, α hélices e alças, respectivamente. .... 74
Figura 4.20. Alinhamento da seqüência compreendida entre os resíduos 428 a 710 da
prolil oligo peptidase de Sus scrofa (1qfm-domcat) e a seqüência da esterase de
P. furiosus (pfuqfmt6). Em laranja são mostrados os pentapeptídeos das duas
enzimas e em vermelho os Asp e His das tríades catalíticas. A estrutura
secundária da 1qfm-domcat é mostrada, sendo que setas verdes, retângulos
amarelos e linhas, representam folhas β, α hélices e alças respectivamente. ..... 76
xviii
Figura 4.21. Representações das estruturas e dos sítios catalíticos da prolil oligo
peptidase muscular de Sus scrofa e do modelo da esterase de P. furiosus. (a)
sobreposição entre o domínio catalítico da prolil oligo peptidase (amarelo) e o
modelo da esterase de P. furiosus (verde); (b) sítio catalítico da prolil oligo
peptidase; c) sítio catalítico da esterase de P. furiosus. Em cinza claro estão
representados os átomos de carbono, em azul os de nitrogênio e em vermelho os
de oxigênio. Os números indicam as distâncias em angstrons entre os átomos
ligados por barras. Esta figura foi construída utilizando-se o programa SpdbViewer
v3.7b2.................................................................................................................... 77
Figura 4.22. Interações entre as regiões amino e carbóxi terminais da esterase de P.
furiosus. Pontes de hidrogênio (a); interações hidrofóbicas e atrativas (b). Os
terminais amino e carbóxi, assim como as hélices α1 e α8, estão representados
em ribon (verde), as pontes de hidrogênio com linhas tracejadas em rosa, e os
aminoácidos na figura b foram coloridos conforme suas características químicas:
carregados positivamente (azul); carregandos negativamente (vermelho);
hidrofóbicos (cinza); polares não carregados (amarelo). ...................................... 81
xix
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 2.1. Relação das enzimas estudadas por PETERSEN et al. (2001), seus pHs
ótimos de atuação e respectivas superfícies eletrostáticas (calculadas nos pHs
indicados nas superfícies). Vermelho indica carga negativa, azul positiva e branco
neutra, o círculo amarelo indica o sítio ativo. Todos estes dados foram retirados
de PETERSEN et al. (2001).................................................................................... 9
Tabela 2.2. Enzimas na síntese de NSAIDs (MARGOLIN, 1993)................................ 19
Tabela 2.3. Algumas enzimas de Pyrococcus furiosus de interesse biotecnológico. .. 21
Tabela 3.1. Primers utilizados nas diferentes estratégias de clonagem empregados
neste trabalho........................................................................................................ 29
Tabela 3.2. Variáveis e níveis utilizados no planejamento fatorial 3
2
.2
1
. ..................... 41
Tabela 4.1. Famílias e substratos das dipeptidil aminopeptidases.
(http://us.expasy.org/cgi-bin/get-enzyme-entry-unprecise?3.4.14.-) ..................... 49
Tabela 4.2. Volumes normalizados das bandas de expressão da enzima recombinante
em western blot em diferentes condições de concentração celular, temperatura e
tempo na indução com 0,5 mM de IPTG, calculado em relação à condição padrão
(Abs
600nm
=0,6, Temperatura=35°C e Tempo=3 h)................................................. 62
Tabela 4.3. Especificidade de algumas esterases e lipases de alguns organismos.... 65
Tabela 4.4. Algumas enzimas de Pyrococcus furiosus, temperaturas ótimas de
atuação e termoestabilidade. ................................................................................ 68
Tabela 4.5. Temperatura ótima de atuação e termoestabilidade de algumas esterases
e lipases. ............................................................................................................... 68
Tabela 4.6. Avaliação do processo de purificação da esterase de Pyrococcus furiosus.
............................................................................................................................... 69
Tabela 4.7. Relação das enzimas com estruturas no Lipase Engineering Database que
possuem um Score de alinhamento com a lipase de P. furiosus maior ou igual a
55. Este Score foi obtido pelo alinhamento no T-COFFEE................................... 71
Tabela 4.8. Distâncias entre os átomos Oγ-Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-
Asp233, que participam de pontes de hidrogênio no sítio catalítico, dos modelos
obtidos com os alinhamentos do anexo III, prolil oligo peptidase muscular de Sus
scrofa (1QFM) utilizada como molde e de algumas esterases e lipases. ............. 75
Tabela 4.9. Composição em aminoácidos de proteínas de organismos mesofílicos,
hipertermofílicos, do domínio catalítico da 1QFM e da esterase de P. furiosus...80
xx
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Abs
Variável absorbância a 600nm codificada do modelo
Abs
600nm
Absorbância a 600nm
BLAST Basic Local Alignment Sequence Tool
CD-SEARCH Conserved Domain - SEARCH
DNA
ácido desoxirribonucléico
ee
Excesso enantiomérico (%)
E
Razão enantiomérica
∆G
desn
Variação de energia livre no processo de desnaturação (unidades
de energia)
∆H
desn
Variação de entalpia no processo de desnaturação (unidades de
energia)
IPTG
Isopropil-β-D-tiogalactosídeo
k
cat
Número de turnover da enzima (unidades de tempo
-1
)
Km
Constante de Michaelis-Menten (unidades de concentração)
MUF
4-metil umbeliferona
MUF-Ace
4-metil umbeliferil acetato
MUF-Hep
4-metil umbeliferil heptanoato
MUF-Pal
4-metil umbeliferil palmitato
Ni-NTA
Níquel – Ácido Nitrilo Acético (Nitrile Acetic Acid)
NSAIDs Non Steroidals Antiinflammatory Drugs
ORF Open Reading Frame
PAGE
Gel de Eletroforese Desnaturante de Poliacrilamida
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PDB Protein Data Bank
PSI-BLAST
Position Sequence Iterated - BLAST”
∆S
desn
Variação de entropia no processo de desnaturação (unidades de
energia.K
-1
)
T
Temperatura absoluta (K)
1
1 INTRODUÇÃO
A utilização de enzimas em processos biotecnológicos é anterior à sua
descoberta, pois desde 3000 a.C., quando da produção de pão e vinho, não se tinha
conhecimento destas moléculas, o que só veio a ser conhecido na década de 30 do
século XIX, com a diastase, encontrada na cevada por Anselme Payen e Jean-Franois
Persoz em 1833, e a pepsina encontrada no suco gástrico por Schwann em 1836
(BUCHNER, 1907; NOVOZYMES, 2003). Portanto, a tecnologia enzimática definida
em 1971 por Lemuel Wingard como “aquele ramo da engenharia de processos que se
ocupa da análise, desenho e operação de processos para a produção e utilização de
enzimas” (ILLANES, 1994) precede inclusive a descoberta dos biocatalisadores.
Como se sabe, muito se evoluiu no conhecimento e manipulação das enzimas.
Em 2003, a venda mundial de enzimas foi estimada em 2,3 bilhões de dólares
(LORENZ e ECK, 2005). Hoje, são empregadas técnicas de alta performance (high-
throughput) para descobrimento de novos biocatalisadores, caracterização e
mutagênese (ROBERTSON e STEER, 2004; SCHMIDT e BORNSCHEUER, 2005). A
tendência atual é que novos biocatalisadores serão identificados por metagenômica,
não necessitando cultivar os microrganismos (COWAN et al., 2004; LORENZ e ECK,
2005; RANJAN et al., 2005), ou mesmo criados e modificados para uma determinada
reação específica por modelagem molecular e engenharia de proteínas (DWYER et
al., 2004).
A busca pelo “biocatalisador ideal”, que é definido como aquela enzima que se
enquadra idealmente em um processo otimizado – não mais o processo ficaria restrito
às características e limitações do biocatalisador, mas este seria “projetado por
encomenda” respeitando as características do processo (BURTON et al., 2002;
COWAN et al., 2004; LORENZ e ECK, 2005) – requer a definição das variáveis de
processo, e, portanto, de um conjunto de parâmetros da enzima como: k
cat
, k
cat
/Km, pH
e temperatura ótimos, especificidade por substratos, régio e enantiosseletividade,
estabilidade frente a solventes, pH e temperatura (BURTON et al., 2002; LORENZ e
ECK, 2005). Em última análise, sob o ponto de vista deste novo paradigma de
desenvolvimento de processos enzimáticos, estes parâmetros poderão ser
manipulados até se encontrar ou desenvolver o “biocatalisador ideal”. Dentre estes
parâmetros, a estabilidade é um dos principais, pois, embora algumas vezes seja
desejável se estabelecer o processo em condições amenas, que favoreçam a
utilização de enzimas, o uso de condições mais extremas freqüentemente é desejado,
uma vez que, por exemplo, altas temperaturas podem favorecer a solubilidade de
2
substratos e produtos, diminuir a viscosidade, aumentar a velocidade de reações,
diminuir a contaminação por microrganismos, etc... (EIJSINK et al., 2005)
Segundo EIJSINK et al. (2005), há três diferentes rotas para se obter uma
enzima com maior estabilidade: isolar enzimas de organismos que se desenvolvam
em ambientes extremos, as chamadas extremozimas; projeto racional (rational
design); e evolução dirigida. Geralmente as estratégias mais eficientes na obtenção de
um biocatalisador com alta estabilidade fazem uso das três metodologias.
Embora a pesquisa e o conhecimento das extremozimas tenha aumentado muito
nos últimos anos, poucas enzimas de extremofílicos são comercializadas, sendo as
principais as DNA polimerases, empregadas na engenharia genética. Contudo, por
suas inúmeras vantagens sobre os biocatalisadores convencionais, acredita-se que as
extremozimas possuam um grande potencial de utilização em bioprocessos
(EGOROVA e ANTRANIKIAN, 2005).
Entre as enzimas de grande importância tecnológica estão as lipases e
esterases, pois elas participam de uma variedade de reações, e por isso, diversos
setores da indústria química possuem interesse nestas enzimas.
A indústria de detergentes, responsável por 32% das vendas de lipases, utiliza
estas enzimas em suas formulações (SHARMA et al., 2001). Como algumas
características sensoriais e nutricionais dos alimentos são conferidas por ésteres e
ácidos graxos, a indústria alimentícia utiliza lipases e esterases na produção de
aromas, flavorizantes e na manipulação destes constituintes para melhor formulação
de seus produtos (SAXENA et al. 1999; PANDA e GOWRISHANKAR, 2005). Além
disso, outros dois importantes ramos industriais de utilização destas enzimas são o
farmacêutico e o de química fina, onde elas são utilizadas principalmente na resolução
de misturas racêmicas e na síntese de enantiômeros puros (SCHIMID et al., 2001;
REETZ, 2002; PANDA e GOWRISHANKAR, 2005). Outras aplicações importantes
destes biocatalisadores são: a remoção do pitch (acúmulo de substâncias hidrofóbicas
provenientes da madeira), no processo de polpeamento mecânico na produção de
papel (GUTIERREZ et al., 2001); e na síntese e degradação de polímeros (JAEGER e
EGGERT, 2002).
Em face do exposto acima, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e
expressar uma esterase termoestável de Pyrococcus furiosus em Escherichia coli,
possibilitando sua caracterização quanto à temperatura ótima de atuação,
termoestabilidade e especificidade por substratos. Além disso, objetivou-se apontar,
através da análise de um modelo estrutural, as possíveis razões que contribuem para
estabilidade desta enzima. Desta forma, buscou-se contribuir para identificação de
suas propriedades para futuras aplicações biotecnológicas.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Esterases e lipases
2.1.1 Definição
A definição de uma enzima ou atividade enzimática que, em uma primeira
abordagem, pode parecer uma questão simples, revela-se um tanto quanto complexa
quando se trata de esterases e lipases. Isto se deve ao fato destas duas classes de
enzimas participarem de uma variedade de reações envolvendo inúmeros substratos e
também por possuírem uma diversidade estrutural relativamente alta. Um exemplo da
flexibilidade destas enzimas é a citação de HALDANE (1930): “Os substratos possíveis
para lipases podem ser numerados em milhões”.
Carboxilesterases (E.C. 3.1.1.1) e lipases (E.C. 3.1.1.3) são enzimas da classe
das éster hidrolases que conceitualmente catalisam, em meio aquoso, a hidrólise de
ligações éster gerando um álcool e um ácido carboxílico, como pode ser visualizado
na figura 2.1.
Figura 2.1. Reação de hidrólise de ligações éster catilisada por lipases e esterases.
Contudo, como será visto no item 2.1.2, o mecanismo de hidrólise das lipases e
esterases envolve o ataque nucleofílico da água sobre o intermediário acil enzima,
liberando o ácido carboxílico correspondente. Se a água no meio for substituída por
outros agentes nucleofílicos, como aminas ou álcoois, outras reações são possíveis,
como a aminólise e a alcoólise, como mostrado na figura 2.2(a, b), além de reações de
transesterificação, esterificação e acidólise, mostradas na figura 2.2(c, d, e). Em
resumo, além da hidrólise, esterases e lipases catalisam mais cinco diferentes tipos de
reações, o que pode servir como indicação da dificuldade de classificar estas enzimas.
4
e) acidólise
O
OR
2
R
1
+
O
OH
R
3
enzima
O
OR
2
R
3
+
O
OH
R
1
b) alcóolise
O
OR
2
R
1
OH
R
3
+
enzima
O
OR
3
R
1
OH
R
2
+
c) transesterificação
O
OR
2
R
1
+
enzima
O
OR
4
R
1
+
O
OR
4
R
3
O
OR
2
R
3
a) aminólise
O
OR
2
R
1
+
enzima
O
NH R
3
R
1
+
NH
2
R
3
OH
R
2
d) esterificação
O
OH
R
1
+
OH
R
2
O
OR
2
R
1
+
OH
2
enzima
Figura 2.2. Reações catalisadas por lipases e esterases em meio com baixa atividade
de água.
Uma das primeiras tentativas de diferenciar lipases e esterases, embora já se
soubesse da afinidade das primeiras por substratos de cadeia alifática longa, veio com
o trabalho de SARDA e DESNUELLE (1958) que, ao investigarem a lipase do
pâncreas de porco, descobriram que ocorria um aumento da atividade enzimática
quando os substratos ultrapassavam o limite de solubilidade, como pode ser
visualizado na figura 2.3, fato este que não era verificado para esterases.
0
1
2
3
4
5
01234
substrato (u.c.)
atividade (U)
0
1
2
3
4
5
01234
substrato (u.c.)
atividade (U)
(a) (b)
Figura 2.3. Esquema mostrando a atividade catalítica de lipases (a) e esterases (b)
em função da concentração do substrato (u.c. – unidades de concentração). A linha
vermelha tracejada mostra o limite de solubilidade dos substratos.
Com isto, os autores sugeriram que a enzima, ao entrar em contato com a
interface substrato-água, sofria uma mudança conformacional que aumentava a sua
5
atividade. Este fenômeno foi denominado de ativação interfacial, que mais tarde, com
a elucidação das estruturas terciárias das lipases de Rhizomucor miehei (BRADY et
al., 1990) e de pâncreas humano (WINCKLER et al., 1990) por cristalografia de Raio-
X, veio a ser explicado, pois estas estruturas mostraram em comum a presença de
uma alça polipeptídica anfifílica cobrindo o sítio ativo da enzima em solução, agindo
como uma tampa que, quando em contato com a interface substrato-água, sofreria um
rearranjo estrutural, tornando o sítio ativo acessível ao substrato. Esta mudança
conformacional, que pode ser visualizada na figura 2.4, foi posteriormente comprovada
quando estruturas das lipases foram cocristalizadas com seus inibidores ou em
micelas (VERGER, 1997).
Figura 2.4. Superposição dos esqueletos das lipases de Rhizomucor miehei (a) e de
pâncreas humano (b), mostrando a mudança conformacional da tampa na ativação
interfacial. As tampas estão destacadas em verde (fechado) e laranja (aberto).
Modificado de PETERSEN et al. (2001).
Com o projeto europeu BRIDGE-T-Lipase (Biotechnology Research for
Innovation, Development and Growth in Europe), realizado entre os anos de 1990 e
1994, novas estruturas terciárias, assim como numerosos dados cinéticos e
bioquímicos foram obtidos, provendo novas direções na elucidação das questões
moleculares destas enzimas. Um dos fatos verificados foi que nem todas as lipases
demonstraram ativação interfacial, sendo as principais exceções à regra as lipases de
Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa e Candida antarctica, as quais não
possuem a tampa anfifílica (JAEGER et al., 1994).
Outras lipases que foram posteriormente identificadas, como a de porco da
índia e a de Myocastor coypu, não apresentam ativação interfacial, apesar de
possuírem tampas. No caso da lipase de Myocastor, trata-se de uma tampa de 23
resíduos, homóloga à das clássicas lipases pancreáticas, e, na lipase de porco da
índia de uma pequena tampa de 5 resíduos. Além disso, algumas lipases mostram
ativação interfacial somente com alguns substratos, como a de Staphylococcus hyicus,
a qual é capaz de hidrolisar tanto triacilgliceróis como fosfolipídeos, mas apresenta
6
ativação interfacial com tributirina e não com diheptanoil-fosfocolina (JAEGER et al.,
1994).
Desta forma, a abordagem cinética para a diferenciação entre esterases e
lipases, proposta por SARDA e DESNUELLE (1958), não é suficiente. Assim, lipases
são definidas, atualmente, como carboxil esterases que catalisam a hidrólise de
triacilgliceróis de cadeias alifáticas longas (VERGER, 1997; SHARMA et al., 2001),
sendo que o trioleilglicerol (18:1-18:1-18:1) é o substrato preferencialmente utilizado
na determinação da atividade lipásica (JENSEN, 1983).
Mais recentemente, o trabalho de FOJAN et al. (2000) investigou a natureza da
maior especificidade de lipases por substratos mais alifáticos do que no caso de
esterases. Neste trabalho, os pesquisadores investigaram 9 lipases e 13 esterases,
efetuando principalmente análises estatísticas sobre a composição de aminoácidos em
diferentes camadas de acessibilidade ao solvente, bem como na vizinhança de 10Å do
sítio ativo destas enzimas. Eles não encontraram nenhuma diferença significativa para
resíduos polares (His, Arg, Lys, Gln, Glu, Asn e Asp) e fracamente polares (Gly, Ala,
Pro, Ser, e Thr) nas composições globais das proteínas, bem como na proximidade de
10Å do sítio ativo, que tanto para lipases como para esterases mostraram a mesma
composição para Glu+Asp (3±1) e Arg+Lys (1±1). É importante ressaltar que o número
de tirosinas encontrado nas esterases (4±2) foi maior que nas lipases (1±1), porém
eles concluíram que os centros destas enzimas não apresentam diferenças
significativas. Contudo, ao analisarem a composição de resíduos na região de 50 a
100% de acessibilidade ao solvente, foi verificado que as esterases apresentaram uma
menor quantidade de resíduos apolares do que as lipases, sendo que esta diferença
foi mais pronunciada na região de 50 a 70% de acessibilidade, como pode ser
visualizado na figura 2.5(a). Esta diferença, segundo os autores, foi causada
principalmente por um maior número de aminoácidos como Val, Leu e Ile, que, no
caso das lipases, ainda aumenta quando a enzima muda da conformação com a
tampa fechada (6±2) para aberta (9±3), como pode ser visualizado na figura 2.5(b)
para a lipase de Rhizomucor miehei. O maior número de aminoácidos apolares
encontrado nas lipases, em regiões de maior acessibilidade ao solvente, segundo os
autores poderia explicar a maior especificidade destas enzimas por substratos mais
alifáticos, quando comparadas às esterases.
7
Figura 2.5. Diferenças entre esterases e lipases com relação à distribuição de
resíduos apolares em diferentes camadas de acessibilidade ao solvente (0% a 100%).
(a) Distribuição dos resíduos apolares (Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Tyr e Cys) em
diferentes camadas de acessibilidade ao solvente para lipases e esterases; o número
de resíduos em cada camada também é mostrado; o retângulo vermelho tracejado
evidencia o maior número de resíduos apolares para as lipases nesta região.
(b) Superfície da lipase de Rhizomucor miehei, com a tampa fechada (esquerda) e
aberta (direita); regiões em rosa evidenciam os resíduos Val, Leu e Ile em regiões
altamente expostas (>50%). Modificado de FOJAN et al. (2000).
2.1.2 Mecanismo enzimático
As serino hidrolases, onde se incluem as esterases, as lipases e as serino
proteases, catalisam suas reações de formas similares (KANERVA et al., 1996). Seus
sítios catalíticos são formados por uma serina, uma histidina e um resíduo ácido
(aspártico ou glutâmico), o que vem a compor a denominada tríade catalítica (BRADY
et al., 1990).
A figura 2.6 ilustra o mecanismo da hidrólise de um éster por esterases e
lipases. Em um primeiro passo, o grupamento hidroxila da serina, que está com seu
hidrogênio em uma ponte com a histidina, que age como uma base, ataca o carbono
nível de acessibilidade ao solvente (%)
fração de aminoácidos apolares (%)
8
suscetível da ligação éster, abrindo a ligação C=O, dando origem ao intermediário
tetraédrico. Nesta fase, a histidina da tríade tem um papel fundamental, aceitando, em
seu anel imidazólico, o hidrogênio liberado pela serina. O aspartato ou o glutamato,
não menos importantes, estabilizam a carga positiva que se formou na histidina. O
intermediário tetraédrico é estabilizado por pontes de hidrogênio formadas com as
ligações amida dos resíduos que pertencem ao chamado “buraco do oxiânion”
(representado em azul na figura 2.6), que é constituído de resíduos que estão
localizados de forma apropriada e servem como formadores de pontes de hidrogênio,
estabilizando a carga negativa do oxigênio da carbonila.
O
Ser
H
His
N
N
H
O
-
O
Asp ou Glu
N
O
...
...
H
O
O
R
1
R
2
N
O
...
...
H
R
2
O
-
O
R
1
O
Ser
His
N
N
+
H
O
-
O
Asp ou Glu
H
2+
+
N
O
...
...
H
O
R
1
O
Ser
His
N
N
H
O
-
O
Asp ou Glu
R
2
OH
O
H
H
N
O
...
...
H
O
-
R
1
O
Ser
OH
His
N
N
H
O
-
O
Asp ou Glu
H
2+
+
O
Ser
H
His
N
N
H
O
-
O
Asp ou Glu
N
O
...
...
H
O
OH
R
1
a
b
c
d
e
intermediário
tetraédrico
intermediário
acil enzima
intermediário
tetraédrico
Figura 2.6. Mecanismo da reação de hidrólise de ligações éster catalisada por
esterases e lipases. A tríade catalítica e a água são mostradas em preto, os resíduos
do buraco do oxiânion em azul e o substrato em vermelho. (a) ataque nucleofílico da
hidroxila da serina ao carbono suscetível da ligação éster; (b) intermediário tetraédrico;
(c) intermediário acil enzima e ataque nucleofílico da água; (d) intermediário
tetraédrico; (e) enzima livre. Modificado de JAEGER et al. (1994).
No segundo passo, o intermediário tetraédrico é desfeito, pelo retorno da ligação
C=O e conseqüente clivagem da ligação éster e liberação da porção álcool, cujo
oxigênio recebe um próton proveniente da histidina, que desta vez age como um
9
ácido, formando-se assim o intermediário acil enzima. O álcool produzido na reação de
clivagem é posteriormente difundido pela entrada de água. No terceiro passo, uma
molécula de água, que tem seu caráter nucleofílico acentuado pela ação básica da
histidina protonada, ataca o carbono suscetível do intermediário acil enzima, abrindo a
ligação C=O, formando um segundo intermediário tetraédrico. No último passo, com o
retorno da ligação C=O, desfaz-se o segundo intermediário tetraédrico, com a
liberação do ácido carboxílico e da enzima livre.
PETERSEN et al. (2001) correlacionaram dados práticos referentes a pHs
ótimos de funcionamento de esterases e lipases, com o mapeamento de cargas
eletrostáticas na superfície. Um resumo de seus resultados é mostrado na tabela 2.1.
Neste trabalho, os pesquisadores chegaram à conclusão que todas as esterases e
lipases analisadas apresentam um potencial eletrostático negativo no sítio ativo da
enzima na faixa de atuação ótima de pH (pH 6,0 - 10), como pode ser visualizado na
tabela 2.1.
Tabela 2.1. Relação das enzimas estudadas por PETERSEN et al. (2001), seus pHs
ótimos de atuação e respectivas superfícies eletrostáticas (calculadas nos pHs
indicados nas superfícies). Vermelho indica carga negativa, azul positiva e branco
neutra, o círculo amarelo indica o sítio ativo. Todos estes dados foram retirados de
PETERSEN et al. (2001).
Enzima pH ótimo de atuação Superfície eletrostática no
referido pH
Lipase de Candida
rugosa
6,5-7,5
P
pH=6,0
Esterase de
Pseudomonas
fluorescens
6,5-8,5
P
pH=8,5
Lipase Pseudomonas
glumae
6,0-8,0
P
pH=6,0
10
Tabela 2.1.(cont.) Relação das enzimas estudadas por PETERSEN et al. (2001), seus
pHs ótimos de atuação e respectivas superfícies eletrostáticas (calculadas nos pHs
indicados nas superfícies). Vermelho indica carga negativa, azul positiva e branco
neutra, o círculo amarelo indica o sítio ativo. Todos estes dados foram retirados de
PETERSEN et al. (2001).
Enzima pH ótimo de atuação Superfície eletrostática no
referido pH
Lipase de Candida
antarctica B
7,0-8,0
P
pH=8,5
Cutinase de Fusarium
solani pisi
~8,5
P
pH=8,5
Lipase de pâncreas
humano
8 (sem sais biliares) e
6,5-7,5 (com sais
biliares/colipase)
P
pH=8,5
Lipase de porco da índia
8 (sem sais biliares) e
6,5-7,5 (com sais
biliares/colipase)
P
pH=8,5
Lipase de Rhizomucor
miehei
10,0
p
pH=10,0
Lipase de Humicola
lanuginosa
11,0-12,0
P
pH=12
11
Interpretando estes dados, PETERSEN et al. (2001) propuseram um
mecanismo denominado de "catapulta eletrostática", cujo esquema ilustrativo pode ser
visualizado na figura 2.7. Este mecanismo explica o fato dos sítios ativos destas
enzimas possuírem uma carga negativa na faixa ótima de pH, pois eles concluíram
que esta carga negativa é a responsável pela repulsão do ácido carboxílico produzido
na reação de hidrólise, o qual seria expulso, desbloqueando o sítio ativo para novos
processos catalíticos, aumentando assim a eficiência da enzima.
Cabe ser ressaltado que a carga negativa do sítio ativo aumenta com o
aumento do pH, porém a atividade máxima destas enzimas é obtida na faixa de pH
entre 6 e 10. Neste caso, o que ocorre em pHs superiores ao ótimo é a
desestabilização da estrutura, que, embora possua maior potencial negativo para
expulsar o ácido carboxílico, acaba perdendo a sua funcionalidade (PETERSEN et al.,
2001a).
Figura 2.7. Mecanismo da catapulta eletrostática. O sítio ativo com potencial negativo
força, através de repulsão eletrostática, a saída do ácido carboxílico formado, que
também possui carga negativa. Modificado de PETERSEN et al. (2001).
2.1.3 Características estruturais
Lipases e esterases, como já comentado, são um grupo de enzimas diversas
principalmente em suas estruturas primárias. Contudo, muito esforço tem sido feito na
classificação destas enzimas (CYGLER e SCHRAG, 1997; SCHRAG e CYGLER,1997;
PLEISS et al. 2000; FISCHER e PLEISS, 2003), tentando identificar características
estruturais comuns que possibilitem a inferição de aspectos moleculares que
12
participem da regulação da atividade catalítica, principalmente na determinação da
seletividade destas enzimas.
Abaixo é feita uma revisão sobre os principais aspectos estruturais de lipases e
esterases, abrangendo principalmente as características das estruturas primárias e
terciárias destas enzimas.
2.1.3.1 Estruturas primárias e a classificação em famílias
Alguns trabalhos, nos últimos anos, têm buscado identificar resíduos
(DRABLØS e PETERSEN, 1997) e motivos (PETERSEN et al., 1997) conservados de
lipases e esterases, na tentativa de elucidar questões relativas à especificidade,
estabilidade, entre outras. Um abrangente trabalho vem sendo feito pelo grupo do
Professor Jürgen Pleiss, do Instituto de Bioquímica Tecnológica da Universidade de
Stuttgart (PLEISS et al. 2000; FISCHER e PLEISS, 2003), que organizou um banco de
dados sobre lipases, esterases e enzimas similares, como cutinases, fosfolipases,
peroxidases não-heme, acetilcolina esterases, tioesterases, assim como gliotactina,
glutactina, neurotactina, neuroligina e tiroglobulina.
O Lipase Engineering Database como é denominado, em sua primeira versão
(PLEISS et al. 2000), foi organizado com 92 seqüências de lipases microbianas, que
foram subdivididas em 15 superfamílias e 32 famílias homológas. Neste trabalho, os
pesquisadores, através de alinhamentos globais, identificaram regiões de conhecida
importância na atividade catalítica das lipases, como o pentapeptídeo Gly-X
1
-Ser-X
2
-
Gly (serina pertencente à tríade catalítica), os outros participantes da tríade, o
aspartico e a histidina, bem como regiões da tampa anfifílica e a localização dos
resíduos pertencentes ao buraco do oxiânion.
Como já ressaltado na seção 2.1.2, o buraco do oxiânion tem uma função
importante no mecanismo catalítico destas enzimas, pois estabiliza a carga negativa
de um dos oxigênios pertencentes ao intermediário tetraédrico. Esta estabilização
deve-se à da formação de duas pontes de hidrogênio entre ligações amida dos
resíduos do buraco do oxiânion e o oxigênio carregado negativamente do
intermediário tetraédrico.
PLEISS et al. (2000) conseguiram identificar os resíduos pertencentes ao
buraco do oxiânion, sendo um deles o resíduo X
2
do pentapeptídeo Gly-X
1
-Ser-X
2
-Gly,
que, por estar em uma região bem conservada, faz com que a ligação amida esteja
identicamente posicionada em todas lipases. Por outro lado, o outro resíduo não está
em uma região conservada e sim em uma alça no topo da folha-β central 3. Os
autores verificaram que, em todas as lipases, uma glicina que entra em contato com a
cavidade nucleofílica é conservada. Seis de nove superfamílias com o buraco do
13
oxiânion anotado têm como segundo resíduo do buraco do oxiânion o aminoácido X
adjacente à extremidade carbóxi terminal desta glicina. Este tipo de buraco do
oxiânion foi denominado GlyX, sendo X um resíduo conservado somente entre
superfamílias: hidrofílico para Candida antarctica (Thr), cutinases (Ser, Thr, Arg) e
fungos filamentosos (Ser, Thr), e hidrofóbico em Moraxella 1 (Phe), Mycoplasma (Phe,
Trp) e Pseudomonas (Leu, Phe, Met). As outras três superfamílias restantes possuem
um buraco do oxiânion diferente, pois este se encontra deslocado de uma posição na
direção carbóxi terminal quando comparado ao tipo GlyX. Este deslocamento é, em
geral, notado pela presença de uma glicina antes do resíduo do buraco do oxiânion,
que pode ser outra glicina (para a lipase de Candida rugosa, lipase de Geotrichum
candidum e aceticolina esterase de Torpedo californica) ou alanina (para lipase de Bos
taurus). Este tipo de buraco do oxiânion foi denominado de GlyGlyGlyX, sendo X um
resíduo hidrofóbico, que na maioria das vezes é Phe, Leu ou Tyr (PLEISS et al., 2000).
A identificação destes dois tipos de buraco do oxiânion, aliada à constatação
de que as enzimas com o tipo GlyX estão entre os grupos das que catalisam a
hidrólise de substratos com cadeias alifáticas médias a longas, enquanto as do tipo
GlyGlyGlyX estão entre o grupo das carboxil esterases ou das lipases com
especificidade para substratos com cadeias alifáticas curtas, levou os autores a
proporem uma divisão hierarquicamente anterior às superfamílias. Assim, o banco de
dados, e conseqüentemente, a classificação de lipases e enzimas similares ficaram
então organizados em duas grandes categorias, segundo o tipo de buraco do oxiânion,
seguido da organização em superfamílias e posteriormente em famílias homólogas.
Em 2003, o banco de dados sobre lipases foi reestruturado (FISCHER e
PLEISS, 2003), passando a ser constantemente atualizado, contando com 1367
seqüências, englobando 806 entradas de proteínas, sendo 29% delas putativas. O
número de superfamílias passou para 16 e o de famílias homólogas para 38. A divisão
atual das superfamílias e famílias homológas está descrita no anexo I.
2.1.3.2 Estrutura terciária
A diversidade com relação à estrutura primária reflete-se na estrutura terciária.
Apenas para dar uma noção sobre esta variedade estrutural, basta compar as massas
moleculares das três primeiras estruturas resolvidas, já que as lipases de Rhizomucor
miehei, de pâncreas humano e Geotrichum candidum possuem 27, 46 e 60 kDa
respectivamente (CYGLER e SCHRAG, 1997).
Contudo, embora exista uma certa diversidade tridimensional, algumas
características estruturais mostram-se conservadas, como é o caso da tríade
catalítica, comentada anteriormente, e do dobramento mostrado por estas enzimas.
14
Foi observado que todas as lipases com estruturas terciárias resolvidas possuem o
dobramento chamado αβ hidrolase (SCHMIDT-DANNERT, 1999). Este dobramento foi
identificado em 1992 através da comparação entre dienolactona hidrolase, haloalcano
dehalogenase, serino carboxipeptidase II de trigo, acetilcolinesterase e a lipase de
Geotrichum candidum, cinco enzimas com funções catalíticas totalmente diferentes.
Estas enzimas não possuem qualquer similaridade entre seqüências, não operam com
substratos similares e nem possuem o mesmo nucleófilo, contudo, elas surpreendente
e intrigantemente possuem similaridades estruturais, combinadas com a preservação
do arranjo dos resíduos catalíticos (NARDINI e DIJKISTRA, 1999).
Segundo NARDINI e DIJKISTRA (1999), o grupo de enzimas com o
dobramento αβ hidrolase cresceu e tem englobado enzimas como proteases, lipases,
esterases, dehalogenases, peroxidases e epóxido hidrolases, fazendo deste um dos
mais versáteis e amplamente distribuídos dobramentos de proteínas.
O dobramento αβ, que pode ser visualizado na figura 2.8b, é caracterizado por
apresentar em seu centro oito folhas β, sendo apenas a segunda anti-paralela,
conectadas por seis α hélices, sendo que destas, as hélices A e F empacotam as
folhas β pelo lado côncavo e as hélices B a F, pelo lado convexo (SCHRAG e
CYGLER, 1997).
As enzimas pertencentes ao dobramento αβ apresentam o sítio catalítico
localizado na porção carbóxi terminal das folhas β, sendo que o nucleófilo está
localizado no pentapeptídeo Gly-X-Ser-X-Gly altamente conservado. Embora este
motivo tenha sido freqüentemente tomado como uma seqüência consenso, cabe
ressaltar que algumas enzimas possuem seqüências em torno do nucleófilo que não
se comportam desta forma, e mesmo o nucleófilo nem sempre é uma serina, pois
resíduos de cisteína e aspártico também são encontrados. Além disso, as glicinas são
algumas vezes substituídas por outros aminoácidos pequenos, como por exemplo,
alanina e serina. Este pentapeptídeo forma uma alça rígida em um motivo folha β –
alça – α hélice, o que acaba muitas vezes forçando o nucleófilo adotar uma
conformação dos ângulos φ e ψ, da cadeia principal, desfavorável. A folha β
geralmente envolvida neste motivo situa-se no centro das folhas β do dobramento
inteiro, sendo que no dobramento canônico ela é numerada como a de número 5. A α
hélice pertencente ao motivo é denominada de hélice C no dobramento canônico
(SCHRAG e CYGLER, 1997).
Os resíduos aspartato/glutamato e histidina, também pertencentes ao sítio
ativo, estão localizados nas alças que seguem as folhas β7 e β8, sendo necessário
15
ressaltar que o comprimento e a conformação da alça que contém a histidina é
variável (SCHRAG e CYGLER, 1997).
O fragmento mínimo deste dobramento, comum a todas as lipases, contém
cinco folhas β e duas α hélices (B e C na figura 2.8a). Além disso, a hélice A faz parte
de todas as lipases, exceto das lipases da família de Rhizomucor miehei, e a hélice D
usualmente existe na forma de uma pequena e distorcida volta, como mostrado na
figura 2.8a.
Figura 2.8. Representação esquemática do dobramento αβ. (a) Em lipases. Folhas β3
a β7 e hélices B e C ocorrem em todas lipases. Aquelas folhas β e α hélices
mostradas em cinza (β2, A, D e F) ocorrem na maioria. As hélices A e F, mostradas
com linhas tracejadas, estão no lado côncavo e as outras no lado convexo (modificado
de CYGLER e SCHRAG, 1997); (b) dobramento αβ generalizado (modificado de
SCHRAG e CYGLER,1997).
Embora as características gerais do dobramento αβ sejam mantidas, muitas
diferenças podem ser notadas entre as famílias de enzimas, principalmente no número
de folhas β, na conectividade entre elas e na conformação e comprimento das alças.
2.1.3.3 Relações entre esterases, lipases e proteases
As proteases são uma família de enzimas ainda mais diversa que as esterases
e lipases. São amplamente distribuídas nos três domínios da vida e ainda nos vírus.
Dependendo de como hidrolisam as ligações peptídicas, podem ser classificadas
como endo ou exopeptidases. Também são classificadas conforme seu mecanismo de
16
ação em serina e cisteína proteases, proteases aspárticas e metaloproteases. Além
disso, elas podem ser classificadas como proteases ácidas, neutras ou alcalinas,
dependendo da faixa de pH que atuam. Estão envolvidas em inúmeras funções
metabólicas, sendo que as proteases extracelulares, em geral, estão envolvidas na
hidrólise de grandes proteínas, gerando peptídeos e aminoácidos para serem
posteriormente absorvidos pelas células, e as intracelulares possuem um papel
fundamental na regulação do metabolismo (RAO et al., 1998).
As serino proteases, assim como as esterases e lipases, possuem em seu sítio
catalítico uma serina, um aspartato e uma histidina. Contudo, ao contrário do
verificado para esterases e lipases, a ordem destes aminoácidos na seqüência
primária destas proteínas pode variar, sendo His-Asp-Ser para quimiotripsinas, Asp-
His-Ser para subtilisinas, Ser-Asp-His para carboxipeptidases Y e Ser-His-Asp para
proteases Clp. Além disso, novos tipos de serino proteases, que não contam com uma
tríade catalítica, vêm sendo descritas, como as D-Ala-D-Ala carboxipeptidases A, cujos
sítios envolvem uma serina e uma lisina, as peptidases sinais I que possuem uma
serina e uma lisina ou histidina em seus sítios, uma protease de citomegalovírus
humano, cujo sítio compreende duas histidinas e uma serina, entre outras
(HEDSTROM, 2002).
Como já comentado, além da tríade catalítica, algumas proteases possuem o
dobramento de αβ hidrolases, assim como as lipases e esterases (NARDINI e
DIJKSTRA, 1999), sendo necessário ressaltar a importância das prolil oligo
peptidases, que possuem, além do mesmo enovelamento estrutural, a mesma ordem
na seqüência de aminoácidos da tríade, ou seja, Ser-Asp-His (POLGÁR, 1992).
Como uma conseqüência direta das relações estruturais descritas acima, as
serino proteases são capazes de hidrolisar ligações éster (HEDSTROM, 2002), o que
pode dificultar a caracterização, principalmente de esterases, já que serino proteases
não hidrolisam trioleína, que é o substrato padrão para as lipases. Assim, a
identificação de uma esterase somente será bem conduzida com ensaios paralelos de
atividade proteásica. Mas as esterases e lipases podem catalisar a hidrólise de
ligações peptídicas? Vários estudos demonstram, principalmente com a lipase de
pâncreas de porco (SO et al., 1998; ZHANG et al., 2001), que esta enzima é capaz de
sintetizar ligações peptídicas em meio orgânico, contudo poucos estudos têm sido
feitos sobre o uso de lipases na catálise da hidrólise destas ligações (MARUYAMA et
al., 2003).
MARUYAMA et al. (2003) mediram a hidrólise do substrato N-benzoil-L-tirosina
p-nitroanilina para treze preparações de diferentes lipases, incluindo a cutinase de
Fusarium solani. Destas, apenas as lipases de pâncreas de porco apresentaram
17
atividade de peptidase, porém esta atividade foi associada a impurezas das
preparações comerciais, visto que os autores, ao purificarem tais preparações,
conseguiram separar, em diferentes frações, as atividades lipásica e proteásica.
Assim, concluíram que lipases estudadas são incapazes de catalisar a hidrólise de
ligações peptídicas. Contudo, GAO et al. (2003), ao caracterizarem a esterase de
Aeropyrum pernix, demonstraram que esta enzima apresenta atividade ótima contra p-
nitrofenol caprilato, mas que também apresenta atividade de acilpeptidase, catalisando
a hidrólise de ligações peptídicas, mesmo quando purificada. Um aspecto interessante
desta enzima, a qual BARTLAM et al. (2004) reclassificaram como acilpeptídeo
hidrolase/esterase, incluindo-a na família das prolil oligopeptidases, é que sua
estrutura é extremamente semelhante à da prolil oligo peptidase de porco (BARTLAM
et al., 2004; FÜLÖP et al., 1998).
Desta forma, cada esterase ou lipase deve ser testada quanto a possibilidade
de possuir atividade proteásica.
2.1.4 Aplicações biotecnológicas de esterases e lipases
A utilização de enzimas em processos químicos, embora ainda incipiente, tem
crescido nos últimos anos, nos mais diversos setores industriais como o alimentício, o
de química fina, o farmacêutico, o cosmético, o agrícola, entre outros (SCHIMID et al.,
2002). Indústrias como a BASF (Alemanha), a Lonza (Suíça) e a DSM (Holanda) vêm
desenvolvendo processos, utilizando enzimas e também células, em escalas da ordem
de milhares de toneladas por ano (SCHIMID et al., 2001). Por isso, pode-se observar
que, enquanto a lucratividade da indústria química encontra-se estagnada, a
Novozymes obteve um aumento de 12% em suas vendas em 2003 (MCCOY, 2004).
Deve ser ressaltado que, em todos estes relatos sobre a utilização de enzimas
em processos industriais, as esterases e lipases são citadas como importantes
biocatalisadores (SCHIMID et al., 2001; SCHIMID et al., 2002; MCCOY, 2004). Estas
enzimas são utilizadas para processar gorduras e óleos, na formulação de
detergentes, no processamento de alimentos, na química fina e na indústria
farmacêutica. Além disso, utilizam-se esterases e lipases na indústria de papel e
celulose, no tratamento de efluentes e na degradação de poliuretano (SHARMA, et al.
2001; PANDA e GOWRISHANKAR, 2005).
Campos de aplicação com projeção ampliada para o futuro (SCHMID et al.,
2002), onde tanto esterases como lipases são utilizadas, são a química fina e a
indústria farmacêutica. Em função disto, uma breve análise da utilização de esterases
e lipases para obtenção de fármacos é feita a seguir.
18
A síntese de substâncias bioativas vem sendo praticada ao longo dos anos
através da química orgânica convencional. Contudo, em alguns casos, esta via de
síntese resulta em problemas, como a instabilidade da molécula nas condições de
reação e a formação de mistura racêmica, sendo a molécula de interesse um dos
enantiômeros. Como as esterases e lipases são capazes de catalisar uma gama de
reações e possuem uma boa estabilidade em solventes orgânicos, estas enzimas se
constituem como excelentes biocatalisadores em estágios intermediários de processos
químicos convencionais e na catálise de reações químicas que envolvam substratos
insolúveis em meio aquoso. Além disso, as suas características de químio, régio e/ou
estereosseletividade tornam estes biocatalisadores os mais utilizados na síntese em
química orgânica (REETZ, 2002).
A empresa holandesa DSM vem utilizando uma lipase para resolução cinética
de um intermediário do Diltiazem, que é um derivado benzodiazepínico, anti-
hipertensivo, com ação vaso dilatadora devido a seu antagonismo ao canal de cálcio.
Esta reação, que vem sendo processada em uma escala de centenas de toneladas
por ano (SCHIMID et al., 2002), pode ser visualizada na figura 2.9. Esta reação
também é citada na literatura sendo conduzida pelas lipases de diferentes cepas de
Serratia marcescens (MATSUMAE et al., 1993; GAO et al., 2004).
Figura 2.9. Resolução do éster metil-3-(4 metoxifenilglicidato).
A empresa alemã BASF vem utilizando lipases para a produção de aminas,
álcoois e ácidos quirais em escalas que variam de centenas a milhares de toneladas
de produto por ano (SCHULZE e WULBBOLTS, 1999; SCHIMID et al., 2002;
CHIPROS, 2003).
A Glaxo Welcome vem explorando o potencial de resolução de lipases para a
produção de (1S, 2S)-trans-2metoxiciclohexanol, que é usado para a síntese de
antibióticos β-lactâmicos do tipo Trimens (SCHULZE e WULBBOLTS, 1999).
19
As lipases de Pseudomonas cepacia, lipase lipoprotéica e lipase do pâncreas
de porco podem ser empregadas para a síntese do S-propanolol, uma droga utilizada
no tratamento da hipertensão e angina, através da hidrólise de diferentes ésteres
(MARGOLIN, 1993).
O ácido (R)-β-acetilmercaptoisobutírico é um intermediário chave para a
síntese de inibidores da enzima conversora de angiotensina (ACE – "Angiotensin
Converting Enzyme"), um grupo de compostos empregados com sucesso como
drogas anti-hipertensivas, que podem ser sintetizados utilizando uma esterase, como
mostrado na figura 2.10 (SHELDON, 1996).
COOCH
3
CH
3
A
cS
COOH
CH
3
AcS
esterase + H
2
O
(R)
E>100
Figura 2.10. Síntese do ácido (R)-β-acetilmercaptoisobutírico catalisado por uma
esterase.
NSAIDs, "Non Steroidals Antiinflammatory Drugs", são amplamente utilizadas
para o tratamento de doenças relacionadas ao tecido conjuntivo como, por exemplo, a
artrite. Como estas drogas são ácidos estericamente impedidos, a melhor forma de
obtê-los é através da hidrólise de seus respectivos ésteres (MARGOLIN, 1993). A
Tabela 3 mostra a relação de alguns NSAIDs, bem como a enzima utilizada e
rendimentos obtidos.
Tabela 2.2. Enzimas na síntese de NSAIDs (MARGOLIN, 1993).
Droga Substrato para resolução
enzimática
Enzima Produto;
rendimento
(%); ee (%)
Lipase de Candida
(S)-ácido; 40;
>98
H
3
CO
OCH
3
O
CH
3
Carboxilesterase
NP
(S)-ácido; 45;
>98
Naproxeno
H
3
CO
O
CH
3
O
O
CH
3
Lipase de Candida (S)-ácido; 25;
95
Carboxilesterase
NP
(S)-ácido; - ;
>98
Ibuprofeno
CH
3
CH
3
OCH
3
O
CH
3
Esterase de fígado
de cavalo
(S)-ácido; 31;
>96
20
SEHGAL e KELLY (2003) clonaram e expressaram uma esterase de Sulfolobus
solfataricus P1 e visualizaram que a mesma era capaz de hidrolizar a 50°C o éster
metílico do naproxeno, gerando um excesso enantiomérico maior que 90%. MANCO et
al. (2000) testaram o potencial de resolução de uma esterase de Archaeoglobus
fulgidus (AFEST) contra uma variedade de substâncias de interesse farmacológico e
da química de feromônios, cujo melhor resultado apresentou um excesso
enantiomérico de 60% com uma conversão de 39%, os quais foram considerados
baixos pelos autores, quando comparados com os resultados obtidos para a esterase
de Alicyclobacillus acidocaldarius.
SELLEK e CHAUDHURI (1999), em sua revisão sobre o uso de enzimas de
extremófilos em meio orgânico, apontaram para a alta estabilidade destas enzimas em
uma variedade de solventes, o que, segundo os autores, aponta para um grande
potencial de aplicação destas enzimas.
2.2 Pyrococcus furiosus e suas enzimas
Um dos desafios para a tecnologia enzimática sempre foi a estabilidade dos
biocatalisadores empregados, principalmente pelo fato de que, nas condições de
processo, os tempos de meia vida não são muito longos, quando comparados com os
catalisadores convencionais, o que acaba por onerar o processo. Este problema vem
sendo contornado através da imobilização de enzimas em suportes insolúveis que,
além de aumentar a estabilidade, também possibilita a recuperação do biocatalisador
ao final das reações. Outra alternativa é a utilização de enzimas que são sintetizadas
naturalmente em ambientes extremos de temperatura, pH, força iônica, entre outros, e
que, por isso, são estáveis nestas condições (EICHLER, 2001; CARDOSO et al.,
2003).
Organismos extremófilos, fontes de extremozimas, estão distribuídos nos três
domínios da vida, Archaea, Bacteria e Eukarya, contudo são nas arqueas onde se
encontram os representantes mais extremos (CARDOSO et al., 2003).
Pyrococcus furiosus foi isolado por FIALA e STETTER (1986) de sedimentos
marinhos geotermicamente aquecidos na praia de Porto di Levante, Vulcano, Itália.
Suas células são esferas ligeiramente irregulares com um diâmetro de 0,8 – 2,5 µm,
com flagelos medindo 7 nm de largura e 7 µm de comprimento, o que lhe confere
mobilidade. É Gram-negativo, sendo que o envelope celular não contém ácido
murâmico e sim duas glicoproteínas, configurando-se como uma Archaea. É
hipertermofílico, crescendo em uma faixa de temperatura de 70 a 103
o
C (100
o
C
ótimo), em um pH de 5 – 9 (7,0 ótimo) e em uma concentração de NaCl de 0,5 a 5%; é
heterotrófico, estritamente anaeróbico, crescendo em peptona, triptona, extrato de
21
lêvedo, extrato de carne, extrato de bactérias e arqueas, caseína, maltose, amido e
ácidos casaminos. H
2
e CO
2
são os produtos de seu metabolismo, sendo que em altas
concentrações de H
2
o crescimento é inibido. Nestas condições, porém em presença
de S°, ocorre a detoxificação do hidrogênio com a formação de H
2
S (FIALA e
STETTER, 1986).
Pyrococcus furiosus é um dos hipertermofílicos mais intensamente estudado,
principalmente por se apresentar como fonte de muitas enzimas tecnologicamente
interessantes. Algumas destas enzimas estão descritas na tabela 2.3 e, como se pode
observar, tanto enzimas nativas como heterólogas apresentam temperatura ótima de
100
o
C, ou seja, igual à temperatura ótima de crescimento desta Archaea. Já com
relação ao pH, existe uma maior variação, sendo encontradas atividades ótimas na
faixa que varia de 4,5 a 8.
Tabela 2.3. Algumas enzimas de Pyrococcus furiosus de interesse biotecnológico.
Enzima Expressão Vetor Hospedeiro Tótima pHótimo Referência
DNA
polimerase
nativa N.D. N.D. LUNDBERG
et al. (1991)
β glicosidase
heteróloga
pTTQ19 E. coli
MC1061
105
o
C N.D. VOORHORST
et al. (1995)
α amilase
nativa 100
o
C 5,0
KOCH et al.
(1990)
α amilase
a
heteróloga pTV118N
E. coli
JM109
100
o
C N.D. LADERMAN
et al. (1993)
α amilase
b
heteróloga pSJ1678 E. coli SJ2 –
B. subtilis
DN1881
100
o
C 4,5 JØRGENSEN
et al. (1997)
DNA
polimerase
heteróloga pET30LIC
E. coli
BL21(DE3)
pLysS
N.D. N.D.
DABROWSKI
e KUR (1998)
Hidrogenase nativa ~100
o
C N.D. PEDRONI et
al. (1996)
Pirrolidona
carboxil
peptidase
heteróloga pTV118N
E. coli
JM109
95
o
C 7 – 8,0 TSUNASAWA
et al. (1998)
Esterase heteróloga pBluescript
II SK(+)
E. coli DH5α
100
o
C 7,5 IKEDA e
CLARK (1998)
a
enzima intracelular;
b
enzima extracelular
Somando-se às enzimas comentadas acima, algumas outras podem ser
citadas, tais como pululanase, xilanase, celulase, fosfolipase A2 e protease, todas
apresentando temperatura e pH ótimos dentro da faixa mostrada da tabela 2.3 (HAKI e
RAKISHT, 2003), o que faz desta arquea um excelente microrganismo fonte de
enzimas.
22
Além disso, deve ser ressaltado que, de uma forma geral, as enzimas de
microrganismos termofílicos podem ser expressas em hospedeiros mesofílicos sem
ocorrer diferenças significativas de atividade entre as nativas e as recombinantes
(VIELLE e ZEIKUS, 2001; HAKI e RAKISHT, 2003). Contudo, algumas manipulações
podem aumentar o nível de expressão da proteína de interesse. Por exemplo,
DABROWSKI e KUR (1998), ao clonarem as DNA polimerases de Pyrococcus furiosus
e Pyrococcus woesei utilizando o plasmídeo pET30LIC, o qual fusiona seis histidinas
na porção amino terminal da proteína, observaram que esta construção em células de
E. coli BL21(DE3) era tóxica. Entretanto, ao utilizarem a cepa BL21 (DE3) pLysS, que
possui o plasmídeo pLysS, o qual codifica a T7 lisozima que se liga a T7 RNA
polimerase e diminui a expressão da proteína de interesse, quando esta ainda não
esta sendo induzida por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo), os autores
conseguiram produzir e caracterizar as enzimas. DABROWSKI e AHRING (2003), ao
clonarem a dUTPase de Pyrococcus woesei, a qual apresenta 100% de identidade
com a mesma enzima de Pyrococcus furiosus, conseguiram melhorar os níveis de
expressão transformando células de E. coli Rosetta (DE3)pLysS, a qual, além de
expressar a T7 lisozima, ajudando no controle da expressão, também expressa tRNAs
raros, o que ajuda a evitar problemas com os códons raros usados pelos genes
heterólogos. O mesmo aconteceu na expressão em E. coli BL21(DE3) da enzima
carbamoil-fosfato sintase de Pyrococcus furiosus, a qual teve a expressão aumentada
quando as células recombinantes foram cotransformadas com o plasmídeo pSJS1240,
que codifica os tRNAS para os códons raros AGA e AGG, que codificam para uma
arginina, e ATA que codifica uma isoleucina (URIARTE et al., 1999).
2.2.1 O gene PF2001 de P. furiosus
ALMEIDA (2001) identificou, isolou e clonou o gene PF2001 de Pyrococcus
furiosus, e o expressou em E. coli, sendo que a enzima resultante, em testes
preliminares de atividade, demonstrou estar ativa em temperaturas superiores a 60
o
C.
A identificação do gene PF2001 de Pyrococcus furiosus foi feita através de
experimentos de bioinformática, onde se comparou o gene de uma hipotética 2-acetil-
1-alquilglicerofosfocolina esterase, E.C. 3.1.1.47, de Pyrococcus abyssi, uma enzima
da família das hidrolases que age em ligações éster, com o genoma de P. furiosus.
Nesta comparação, identificou-se uma seqüência com alto grau de homologia, que foi
posteriormente analisada na tentativa de se encontrar as regiões upstream e
downstream deste possível gene. Com isto, foram identificadas possíveis regiões
promotoras de transcrição e tradução, além de uma região terminadora rica em
pirimidinas, bem característica de outras enzimas de P. furiosus. Após a definição do
23
gene, fez-se a análise dos domínios conservados da enzima e foi possível identificar
os domínios de dienolactona hidrolase, lipase e αβ hidrolase (ALMEIDA, 2001). Desta
forma, o gene foi clonado, expresso e a enzima foi parcialmente caracterizada,
demonstrando, a 60ºC, uma preferência por substratos com ácidos graxos de cadeia
longa, como óleo de oliva e babaçu. Além disso, o extrato total de células mostrou-se
ativo na hidrólise de óleo de oliva também a 80
o
C (ALMEIDA, 2001).
ALMEIDA (2001) apontou uma baixa expressão da enzima recombinante, o
que causou dificuldades na caracterização da enzima. Contudo, os resultados obtidos
sugeriam que o gene PF2001 codificava uma lipase verdadeira.
24
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Bioinformática
Para proporcionar um melhor entendimento das ferramentas computacionais,
utilizadas no decorrer deste trabalho, este tópico faz uma breve descrição dos termos
mais comuns na bioinformática, que é a fusão dos conhecimentos acumulados de
biotecnologia e tecnologia da informação, com o objetivo de propiciar uma maior
dinâmica nas ciências fundamentais de bioquímica e biologia, além das que delas
usufruem tecnologicamente.
3.1.1 BLAST – “Basic Local Alignment Sequence Tool”
BLAST (ALTSHUL et al., 1990) é um algoritmo otimizado para fazer
alinhamentos locais entre seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos, procurando o
maior grau de similaridade ou conservação respectivamente, entre a seqüência em
estudo e seqüências depositadas em um determinado banco de dados.
Entende-se por alinhamento o processo de linearizar, comparando duas ou
mais seqüências, buscando o máximo de identidade. Similaridade é a extensão a qual
seqüências de aminoácidos estão relacionadas. Conservações são mudanças em uma
posição específica de uma seqüência de aminoácidos que preservam as
características físico químicas do resíduo original.
Os resultados dos alinhamentos gerados pelo BLAST são avaliados por dois
valores resposta: o “Score” e o “E-value” (valor esperado).
O “Score” é um número constituído pela soma dos pesos atribuídos ao
pareamento entre aminoácidos idênticos (maior peso), similares (peso intermediário) e
diferentes (peso negativo). Logo, quanto maior o “Score”, maior a similaridade entre as
seqüências. Na versão atualizada do BLAST ainda considera-se na contabilização do
“Score” a presença de “gaps” que são espaços introduzidos no alinhamento para
compensar inserções e deleções de uma seqüência relativa à outra.
O “E-value” é um valor calculado a partir do “Score”, que fornece a noção de
qual é a chance de se encontrar um “Score” maior ou igual ao do alinhamento
considerado dentro do banco de dados pesquisado. Desta forma pode-se verificar que
quanto maior o “Score” menor o “E-value”.
25
3.1.2 PSI-BLAST – “Position Sequence Iterated-BLAST”
O PSI-BLAST é uma extensão do BLAST, onde o primeiro alinhamento gerado
é utilizado na construção de um perfil, o qual é utilizado por sua vez para se fazer
novas comparações. Em cada iteração feita, novos perfis são gerados de forma a
aumentar a sensibilidade dos alinhamentos. Perfil é o conjunto de características da
seqüência em estudo, identificadas através da homologia com diversas outras
seqüências do banco de dados.
3.1.3 CD-SEARCH – “Conserved Domain-SEARCH”
O CD-Search permite fazer a busca de domínios conservados de uma
seqüência em um banco de dados de domínios, utilizando o algoritmo do RPS-BLAST
"Reversed Position Sequence -BLAST”. O RPS-BLAST faz o inverso do PSI-BLAST,
visto que procura um perfil estabelecido num banco de dados de seqüências. Os
principais bancos de dados de domínios são o Pfam, Smart, COG e CDD.
3.1.4 CLUSTAL W
CLUSTAL W (THOMPSON et al., 1994) é um programa que executa
alinhamentos globais utilizando programação dinâmica e o método hierárquico. Ou
seja, em um alinhamento de múltiplas seqüências, o primeiro passo é alinhar cada
uma delas entre si através da programação dinâmica, em pares, e assim identificar
pares com as maiores similaridades. Feito isso, o segundo passo na hierarquia é
alinhar os pares mais similares dois a dois, até que todas seqüências sejam alinhadas
(BARTON, 2001).
3.1.5 T-COFFEE – “Tree-based Consistency Objective Function For Alignment
Evaluation”
T-COFFEE (NOTREDAME et al., 2000) é um programa que executa
alinhamentos múltiplos, assim como o CLUSTAL W. Contudo, o algoritmo envolvido no
T-COFFEE realiza um alinhamento que une informações de alinhamentos globais e
locais. Desta forma é possível, através deste programa, reconhecer características
que envolvem as seqüências como um todo (através do alinhamento global), assim
como especificidades de domínios interiores às seqüências (através do alinhamento
local).
3.1.6 SignalP
SignalP 3.0 permite obter a predição de peptídeos sinais e a localização do
sítio de clivagem em seqüências de aminoácidos de diferentes microrganismos: Gram-
26
positivos, Gram-negativos e eucariotos. As predições são feitas através da
combinação de redes neurais e de modelos escondidos de Markov (BENDTSEN et al.,
2004).
3.1.7 THREADER
O THREADER é um programa para análise estrutural que utiliza a metodologia
conhecida como threading, que consiste em ajustar uma seqüência de aminoácidos
em estruturas tridimensionais de proteínas. A sua função é identificar a conformação
de uma seqüência de aminoácidos utilizando estruturas conhecidas que poderão ser
utilizadas como moldes para a construção de um modelo por modelagem comparativa
(RÖSSLE, 2004).
3.1.8 MODELLER
O MODELLER (ŠALI e BLUNDELL, 1993) é um programa para a construção
de modelos tridimensionais de proteínas utilizando a metodologia de modelagem
comparativa. Ele utiliza estruturas de referências, como moldes, para construir um
modelo tridimensional da seqüência de interesse através de um alinhamento. Além
disso, ele gera, a partir da estrutura de referência, um conjunto de restrições que são
aplicadas à seqüência a ser modelada. O cálculo destas restrições é baseado em
análises estatísticas entre estruturas comparativas. Estas restrições limitam, por
exemplo, a distância entre dois resíduos no modelo, sendo esta restrição baseada na
distância entre dois resíduos equivalentes na estrutura molde. Restrições também são
aplicadas nas ligações angulares (entre três átomos) e nos ângulos diedrais (entre
quatro átomos). Além destas restrições, um campo de força controla as propriedades
estereoquímicas entre os átomos, aplicando restrições químicas (RÖSSLE, 2004). Um
resumo da metodologia utilizada pelo MODELLER pode ser visualizado na figura 3.1.
Figura 3.1. Esquema ilustrativo
da metodologia utilizada pelo
MODELLER para modelagem
comparativa de proteínas.
Primeiro é feito um alinhamento
entre a seqüência da proteína
que se quer modelar com as
seqüências das proteínas
moldes com estruturas já
definidas. Em seguida, o
programa define as restrições
espaciais. E por último, são
satisfeitas as restrições.
^
27
3.1.9 PROCHECK
O PROCHEK permite analisar a qualidade de uma estrutura tridimensional
através da estereoquímica da proteína, utilizando principalmente o gráfico de
Ramachandran, sendo um exemplo mostrado na figura 3.2a (RAMACHANDRAN, et al.
1963). Este gráfico relaciona os ângulos φ e ψ, os quais podem ser visualizados na
figura 3.2b, da cadeia carbônica de proteínas. Estes ângulos, devido às cadeias
laterais dos aminoácidos, são restringidos espacialmente e podem apenas ter valores
bem definidos, ocupando as regiões vermelhas e amarelas do gráfico da figura 3.2a. A
diferença entre as regiões vermelhas e amarelas é que estas últimas foram calculadas
levando-se em consideração raios de van der Waals menores para os átomos, de
forma que elas são denominadas regiões permitidas mais restritas. A estrutura de uma
proteína com qualidade estereoquímica tem que possuir mais de 90% dos seus
aminoácidos dentro das regiões permitidas mais restritas.
Figura 3.2. Gráfico de Ramachandran e estrutura de uma ligação peptídica mostrando
os átomos e ângulos importantes. (a) Gráfico de Ramachandran, regiões vermelhas e
amarelas são as regiões permitidas. (b) Estrutura de uma ligação peptídica mostrando
os ângulos φ e ψ das ligações do carbono α e os ângulos da cadeia lateral.
3.2 Clonagem e expressão do gene PF2001 de Pyrococcus furiosus
Neste trabalho, foram utilizadas três diferentes estratégias de clonagem para o
gene PF2001 de P. furiosus, as quais podem ser visualizadas na figura 3.3. Uma das
estratégias utilizou o sistema de recombinação sítio específica (Gateway) e as outras
duas o plasmídeo pET32a (Novagen), através da clonagem clássica utilizando
enzimas de restrição, sendo que em uma das estratégias de clonagem o gene PF2001
foi inserido inteiro no plasmídeo e na outra sem os 60 primeiros nucleotídeos
(PF2001∆60), os quais codificam um possível peptídeo sinal. A seguir é feita uma
28
descrição detalhada das técnicas utilizadas na clonagem e expressão do gene PF2001
de P. furiosus.
Figura 3.3. Estratégias de clonagem do gene PF2001.
29
3.2.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
O gene de interesse foi amplificado por PCR com primers específicos a partir
do DNA genômico de Pyrococcus furiosus (40ng), o qual foi cordialmente cedido pela
Prof
a
Maysa Clementino do INCQS-FIOCRUZ.
Como comentado acima, três estratégias de clonagem foram empregadas
neste trabalho, sendo que, para cada uma destas estratégias, foram utilizados primers
e condições de PCR diferentes. A tabela 3.1 descreve a seqüência dos primers
utilizados para cada uma das clonagens efetuadas.
Tabela 3.1. Primers utilizados nas diferentes estratégias de clonagem empregados
neste trabalho.
Primers utilizados Estratégia
FpDONRPF2001
5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGTGATAATTGAAA
TACTTGTAGCTGCT-3’
RpDONRPF2001
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTATCCCATCCA
CCTTTTAAGGAACTC-3’
Gateway*
FpETPF2001
5’-AGATCT
GGGTACCGACGACGACGACAAGGTGATAATTGAAATAC
TTGTAGCT-3’
RpETPF2001
5’-GTCGAC
TCATCCCATCCACCTTTTAAGGAACTCTC-3’
Clássica
com
peptídeo
sinal**
FpETPF2001∆60
5’-AGATCT
GGGTACCGACGACGACGACAAGGGGTATAAAATGGTA
AATCCACCT-3’
RpETPF2001
5’-GTCGAC
TCATCCCATCCACCTTTTAAGGAACTCTC-3’
Clássica
sem
peptídeo
sinal***
*Em negrito são mostrados os sítios de recombinação attB1 e attB2.
**Sublinhados são mostrados os sítios para as enzimas BglII e SalI respectivamente e em negrito mostra-se o sítio
para Enteroquinase.
***Idem à clonagem clássica com peptídeo sinal.
A reação de amplificação do gene PF2001 para clonagem no sistema Gateway
foi conduzida em um volume final de 50 µL, usando 200 µM de dNTP, 2,5U de Pfx
DNA polimerase, tampão Pfx (Invitrogen), 1,5 µM dos primers FpDONRPF2001 e
RpDONRPF2001, 1 mM de MgSO
4
, e 20% (v/v) de enhancer, com a seguinte
programação: 94ºC por 5 min; 10 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 68ºC;
39 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 65ºC, 1 min a 68ºC; 10 min a 68ºC.
A reação de amplificação para a clonagem clássica, foi conduzida também em
um volume final de 50 µL, usando 200 µM de dNTP, 2,5U de Taq Platinum DNA
polimerase, tampão Taq Platinum (Invitrogen), 1 µM dos primers
FpETPF2001/RpETPF2001 e FpETPF2001∆60/RpETPF2001 e 1 mM de MgCl
2
, com a
30
seguinte programação: 94ºC por 8 min; 29 ciclos de 1,5 min a 94ºC, 1,5 min a 53 ºC,
1,5 min a 72ºC; a 94ºC, 15 min a 72°C.
Os fragmentos amplificados foram então analisados em eletroforese em gel de
agarose 1% (p/v) em TAE (40 mM de Tris-acetato e 1 mM de EDTA), conforme
descrito na seção 3.2.2.
3.2.2 Eletroforese de DNA
Os produtos das reações de PCR, as mini-preparações de DNA plasmidial bem
como as digestões com enzimas de restrição, foram eletroforeticamente separados em
gel de agarose 0,8 a 1% (p/v) preparado em tampão TAE, contendo brometo de etídio
na concentração final de 0,5 mg/mL. Após a corrida, o DNA foi visualizado sob luz
ultravioleta (SAMBROOK et al., 1989).
3.2.3 Purificação de DNA em bandas de gel de agarose
As purificações dos produtos de PCR e de digestões dos plasmídeos foram
feitas utilizando-se o kit GFX (Amersham Biosciences/GE Healthcare) através do
seguinte protocolo: as bandas de DNA foram retiradas do gel utilizando-se um bisturi
estéril de forma que a pequena fatia de gel nunca apresentou massa superior a
300mg. As fatias foram pesadas em um tubo de microcentífuga de 1,5 mL. 10 µL de
Capture Buffer foram adicionados para cada 10 mg das fatias, misturou-se
vigorosamente e incubou-se a 60°C até que a agarose estivesse totalmente
solubilizada. Depois da solubilização, a mistura foi aplicada em uma pequena coluna
(GFX column) por aproximadamente 1 min, ao término do qual a coluna foi
centrifugada por 30 s a 10000.g, e a solução que percolou pela coluna foi descartada.
A coluna foi então lavada com 500 µL de Wash Buffer, centrifugada novamente por 30
s a 10000.g e, novamente, a solução que passou através da coluna foi descartada.
Posteriormente, 30 µL de água ultrapura autoclavada foram aplicados à coluna para
eluição do DNA, deixou-se aproximadamente 1 min em repouso à temperatura
ambiente e centrifugou-se por 1 min a 10000.g, recuperando-se o DNA purificado na
solução aquosa.
3.2.4 Sistema de clonagem de DNA por recombinação sítio-específica (Gateway
Cloning Technology)
O sistema por recombinação sítio-específica é uma técnica de clonagem in vitro
baseada no sistema de recombinação sítio-específica do bacteriófago λ (LANDY,
1989; HARTLEY et al., 2000), na transição entre a via lítica e lisogênica (PTASHNE,
1992).
31
A recombinação é catalisada por um conjunto de enzimas, as quais se ligam em
seqüências específicas (sítios att), reúnem estes sítios, clivam e ligam covalentemente
o DNA (gene de interesse). As proteínas de recombinação envolvidas na reação
diferem dependendo em quais vias o bacteriófago λ as utiliza: a via lítica ou lisogênica
(HARTLEY et al., 2000).
A via lisogênica é catalisada pelas proteínas IHF (Integration Host Factor) e λ
Int (Integrase), encontradas na mistura BP Clonase (Invitrogen), enquanto a via lítica é
catalisada pela mistura LR Clonase (Invitrogen), constituída pelas proteínas λ Int
(Integrase), Excisionase (Xis) e IHF (Integration Host Factor). Duas reações de
recombinação sítio-específica constituem a base da tecnologia de clonagem Gateway:
• ReaçãoBP (catalisada pela mistura BP Clonase) - Recombinação de
um substrato de attB (produto de attB-PCR ou um vetor linearizado attB) com um
substrato de attP (vetor doador – Donor Vector) para criar um Clone de Entrada (Entry
Clone) que contém sítios attL, como mostra a figura 3.4.
Figura 3.4. Reação BP. Esquema da obtenção do Clone de Entrada, a partir da
recombinação sítio-específica, attB (produto de PCR contendo sítios attB terminais) +
attP (Donor Vector). Modificado de INVITROGEN (2005).
• Reação LR (catalisada pela mistura LR Clonase)
- Recombinação de
um substrato de attL (Clone de Entrada) com um substrato de attR (vetor de destino –
Destination Vector) criando um Clone de Expressão (Expression Clone) que contém
sítios attB, como mostra a figura 3.5.
Figura 3.5. Reação LR. Esquema da obtenção do Clone de Expressão, a partir da
recombinação sítio-específica, attL (Entry Clone) + attR (Destination Vector).
Modificado de INVITROGEN (2005).
Estas reações de recombinação são altamente específicas, isto é, os sítios
attB1 recombinam somente com attP1, mas não com attP2; assim como os sítios attL1
recombinam somente com attR1, mas não com attR2, o que orienta os fragmentos de
forma correta durante a clonagem.
produto de PCR
com os sítos attB
sub-produto
sub
-
p
r
oduto
32
Pode ser observado, nos esquemas acima, que os resultados das reações de
LR e BP são o vetor com o qual se deseja trabalhar e um vetor contendo o gene ccdB.
A proteína CcdB tem a peculiaridade de ser altamente tóxica a organismos como
bactérias e leveduras. Desta forma, caso a recombinação não ocorra e o fragmento
que codifica a proteína CcdB não seja eliminado, o organismo não consegue se
desenvolver. Este sistema é uma maneira eficaz de selecionar transformantes.
Desenvolvido para facilitar os processos de clonagem de genes, este sistema
elimina etapas de digestão com endonucleases de restrição, ligações, géis e
amplificações. Permite a inserção de um gene simultaneamente em múltiplos vetores
em paralelo (vetores de E. coli, leveduras, células de mamíferos, baculovírus, vetores
com proteínas de fusão – His-tag, GST-tag, etc.), com eficiência maior que 90%. As
reações são rápidas (~60 min), feitas em temperatura ambiente, sempre mantêm a
orientação do segmento de DNA durante a recombinação e não ocorrem mutações,
isto é, sem ganhos ou perdas de nucleotídeos (INVITROGEN, 2005).
Para a formação do clone de entrada utilizou-se a reação de um produto de
PCR, conforme descrito na seção 3.2.1, com um vetor doador que continha sítios attP.
O fragmento amplificado por PCR foi purificado segundo procedimento descrito
na seção 3.2.3. Do material eluído, 1 µL foi incubado com 1 µL (70 ng) de Vetor
Doador (pDONR-201) contendo os sítios attP para recombinação, como pode ser
visualizado na figura 3.6, 1µl da mistura BP Clonase, 1 µL de Tampão BP e 1µL de
H
2
O ultrapura autoclavada, por 16h a 25
º
C (caracterizando a reação BP).
Figura 3.6. Mapa do Vetor Doador de sítios attP (pDONR-201). Observação dos sítios
attP1 e attP2, que recombinam com sítios attB1 e attB2, na reação BP; gene de
resistência a canamicina (Kn
r
); origem de replicação (ori). Modificado de INVITROGEN
(2005).
33
Após 16 h, 1 µL deste meio reacional (Vetor de Entrada) foi utilizado para
transformar por eletroporação células de E. coli DH5α (ver seção 3.2.8). Algumas
células transformadas, escolhidas ao acaso, foram submetidas à confirmação da
clonagem através da digestão do DNA plasmidial com a enzima de restrição BanII (ver
seção 3.2.10). Após a confirmação dos clones, escolheu-se um, ao acaso, para ser
submetido à reação LR: 1 µL de DNA plasmidial foi incubado com 1 µL (70 ng) do
Vetor de Destino (pDEST-17) contendo os sítios attL para recombinação, conforme
pode ser visualizado na figura 3.7, em presença de 0,5 µL da mistura LR Clonase, 1
µL do Tampão LR e 1,5 µL de H
2
O ultrapura autoclavada, por 16h a 25
º
C. Transcorrido
este tempo, 1µL deste material foi utilizado para transformar células DH5α por
eletroporação (ver seção 3.2.8). Novamente algumas células transformadas,
escolhidas ao acaso, foram submetidas à confirmação através da digestão do DNA
plasmidial com a enzima de restrição BanII (ver seção 3.2.10). Foi escolhido um clone
positivo para transformar as células BL21-SI e BL21(DE3) (ver seção 3.2.8).
Figura 3.7. Mapa do Vetor de Destino de sítios attR (pDEST-17). Observação dos
sítios attR1 e attR2, que recombin am com sítios attL1 e attL2, na reação LR; gene de
resistência à ampicilina (Ap
r
); origem de replicação (ori). Modificado de INVITROGEN
(2005).
3.2.5 Clonagem em pET32a
Para clonagem no vetor pET-32a (Novagen), o gene PF2001 com e sem o
peptídeo sinal (PF2001∆60), foi inicialmente clonado no plasmídeo pGEM-T
(Promega).
O pGEM-T Easy Vector, como mostra a figura 3.8, é linear e suas
extremidades 5´ possuem timidinas, as quais viabilizam a ligação de produtos de PCR
diretamente, pois a enzima Taq polimerase acrescenta uma adenina na extremidade
3´ dos produtos de PCR, que pareiam com as timidinas do vetor, possibilitando a
34
ligação. Além disso, este vetor, como visto na figura 3.8, traz o gene lacZ da β-
galactosidase, possibilitando a identificação das colônias que apresentam o plasmídeo
recombinante de interesse, pois, quando o produto do PCR é ligado ao vetor, o gene
da β-galactosidase fica interrompido e a enzima, por isso, fica inativa, gerando
colônias brancas. Do contrário, o gene fica contínuo e a enzima funcional, de forma
que, quando expressa, catalisa a reação de hidrólise do X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-
indoil-β-D-galactosídeo), um análogo cromogênico da lactose, formando colônias
azuis.
Figura 3.8. Mapa do vetor pGEM-T Easy Vector. Modificado de PROMEGA (2005).
A ligação dos produtos de PCR relativos aos pares de primers
FpETPF2001/RpETPF2001 e FpETPF2001∆60/RpETPF2001 ao pGEM-T foi feita
incubando-se a 25
o
C, por aproximadamente 16 h, 25 ng do vetor, 70 ng de cada
produto de PCR, 3U de T4 DNA ligase mais Rapid Ligation Buffer 1X (30 mM de Tris-
Cl pH 7,9, 10 mM de MgCl
2
, 10 mM de DTT, 0,5 mM de ATP e 5% PEG) em um
volume total de 10 µL em cada reação. Após a ligação, 3µL deste meio reacional foi
utilizado para transformar por eletroporação células de E. coli DH10b (ver seção
3.2.8); que foram plaqueadas em meio Luria Bertani - LB (1% (p/v) triptona, 0,5% (p/v)
extrato de lêvedo e 0,5% (p/v) NaCl) com ampicilina (100 µg/mL), 20 µL de X-Gal (50
mg/mL) e 100 µL de IPTG (100 mM) espalhados sobre o meio. Algumas colônias
brancas, escolhidas ao acaso, foram submetidas à confirmação da clonagem através
da digestão do DNA plasmidial com as enzimas de restrição BglII e SalI (seção
3.2.10). Após a confirmação dos clones, com e sem peptídeo sinal, escolheu-se um de
cada, ao acaso, para ser submetido à clonagem no vetor pET32a.
35
O sistema pET de expressão de proteínas heterólogas em E. coli vem sendo
amplamente utilizado (BANEYX, 1999). Estes plasmídeos possuem o promotor T7,
que é acessado pela T7 RNA polimerase, a qual possui uma alta processividade, ou
seja, que irá gerar altas concentrações de mRNA do gene que estiver sob seu
controle. Contudo, segundo BANEYX (1999), a grande quantidade de mRNA pode
gerar alguns problemas, como a destruição de ribossomos e a morte celular. Além
disso, a expressão basal da T7 RNA polimerase pode levar à instabilidade da
expressão e do plasmídeo. Algumas estratégias foram adotadas para contornar estes
problemas, como a coexpressão da T7 lisozima, uma enzima que degrada a T7 RNA
polimerase. As cepas BL21(DE3)pLysS e BL21(DE3)pLysE já são comercializadas
com um plasmídeo que codifica a T7 lisozima. Além disso, alguns plasmídeos pET
possuem uma seqüência do operador lac depois do promotor T7, o que torna a
expressão mais controlada.
O plasmídeo pET-32a, apresentado na figura 3.9, além do promotor T7, do
operador lac e do tag de histidina (que neste caso pode ser escolhido para ser inserido
upstream ou downstream ao gene de interesse), fusiona à porção amino terminal da
proteína expressa a tioredoxina. A tioredoxina (TrxA) é uma proteína de E. coli
envolvida em uma variedade de funções celulares, incluindo a formação de pontes
dissulfeto, o metabolismo de sulfatos, é cofator para a T7 DNA polimerase e é citado
que, sob certas condições, ela promove a expressão de proteínas sob a forma solúvel
no citoplasma de E. coli (NOVY et al., 1995). Além disso, LOPES (2004), em sua tese
de doutorado, após inúmeras tentativas de clonagem e expressão sem sucesso da
IAPP humana, uma proteína extremamente hidrofóbica, conseguiu expressá-la
utilizando este plasmídeo.
Figura 3.9. Mapa do vetor pET32a (Novagen). Observação do promotor T7, dos tags
de histidina e tioredoxina; gene de resistência à ampicilina (Ap); origem de replicação
(ori); repressor lac (lacI). Modificado de NOVY et al. (1995).
36
Os produtos das digestões dos clones em pGEM-T, com as enzimas BglII e
SalI, referentes aos genes com e sem peptídeo sinal, purificados conforme a seção
3.2.3, foram ligados ao vetor pET-32a digerido com as mesmas enzimas. Para estas
ligações foram incubados por 16 h a 25
o
C, aproximadamente 25 ng de pET-32a
digerido com BglII e SalI conforme descrito no ítem 3.2.10, 20 ng de inserto e 3U de
T4 DNA Ligase.
Após a ligação, 3 µL deste meio reacional foram utilizados para transformar por
eletroporação células de E. coli DH10b (seção 3.2.8). Algumas colônias, escolhidas ao
acaso, foram submetidas à confirmação da clonagem através da digestão do DNA
plasmidial com as enzimas de restrição BglII e SalI (seção 3.2.10). Após a confirmação
dos clones, com e sem peptídeo sinal, escolheu-se um de cada, ao acaso, para serem
submetidos à transformação da cepa BL21(DE3)pLysS, os quais foram confirmados
através de PCR.
3.2.6 Cepas utilizadas
Dentre os vários sistemas de expressão disponíveis para produção de
proteínas heterólogas, a bactéria Gram-negativa E. coli é um dos mais utilizados e
atrativos. Este fato se deve à sua capacidade de crescer rapidamente, com altas
concentrações celulares e em substratos baratos, além de sua genética ser bem
conhecida e haver disponibilidade de muitos vetores de clonagem e cepas mutantes
(BANEYX, 1999). Os microrganismos utilizados neste trabalho foram as cepas de E.
coli DH5α, DH10B, BL21-SI, BL21(DE3) e BL21(DE3)pLysS pertencentes ao banco de
células do Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Bioquímica Médica da
UFRJ.
3.2.7 Obtenção de células eletrocompetentes
Uma colônia isolada da bactéria E. coli da cepa desejada (DH5α, DH10B,
BL21-SI, BL21(DE3) ou BL21(DE3)pLysS), crescida em meio LB (no caso das células
BL21-SI utilizou-se o meio LBON, cuja formulação é idêntica à do LB sem NaCl), foi
inoculada em 5 mL de meio líquido LB ou LBON para a célula BL21-SI. Este pré-
inóculo foi incubado a 37ºC, sob agitação moderada por aproximadamente 16 h. Após
este tempo, foram inoculados 5 mL da cultura em 500 mL do meio específico (LB ou
LBON), incubando-se a 37 ºC sob agitação até atingir uma absorbância a 600 nm
(Abs
600nm
) de aproximadamente 0,5 ~ 0,6 (cerca de 2 h). As células foram colocadas
em banho de gelo por 10 a 15 min, transferidas para dois tubos resfriados e
centrifugadas por 20 min a 5000.g
a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento ressuspendido em 500 mL de água estéril mantida em banho de gelo, e
37
centrifugado novamente. Este procedimento foi repetido 3 vezes, sendo finalmente o
sedimento ressuspendido em 10 mL de uma solução de glicerol 10% (v/v), mantida em
banho de gelo, transferido para um tubo menor e centrifugado a 10000.g por 20 min a
4ºC. O sobrenadante foi descartado e as
células foram, mais uma vez,
ressuspendidas em 1 mL de glicerol 10%, também mantido em banho de gelo,
separadas em alíquotas de 40 µL e armazenadas a –70 ºC (DOWER, 1988).
3.2.8 Eletroporação
40 µL de células eletrocompetentes (10
9
transformantes/µg de DNA) foram
misturadas a 5 µL da reação de recombinação dialisada contra água ultrapura e
incubadas por 10 min no gelo. A mistura da bactéria com o DNA foi colocada em uma
cubeta de eletroporação e submetida a uma capacitância de 25 mF e resistência de
200Ω em um eletroporador Gene Pulser (BioRad). Imediatamente após um choque de
1,8 kV, foram adicionados 450 µL de meio SOC líquido (2% (p/v) de triptona, 0,5%
(p/v) de extrato de lêvedo, 100 mM de NaCl, 25 mM de KCl, 200 mM de Mg
2+
e 200
mM de glicose). As células transformadas foram incubadas a 37ºC por 1 hora sob
agitação constante (150 rpm). Após este procedimento, 100 µL do cultivo da bactéria
foram plaqueados em meio LB ou LBON contendo o antibiótico para o qual o clone
transformado tinha resistência (DOWER, 1988; SAMBROOK et al, 1989).
3.2.9 Mini-preparação de DNA plasmidial
Uma colônia isolada da bactéria, contendo o plasmídeo de interesse, foi
inoculada em 3 mL de meio LB ou LBON, contendo o antibiótico específico. Após
incubação a 37ºC por 16 h sob agitação moderada, a cultura foi centrifugada a 5000.g
por 2 min a 25ºC. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em
200 µL de tampão TEZ (50 mM Tris-Cl pH 8,0, sacarose 15% (p/v), 50 mM EDTA pH
8,0), 200 µL de solução de lise (NaOH 0,2 N e SDS 1% (p/v)) e 200 µL de solução de
neutralização (1,32 M de acetato de potássio, pH 4,8). A mistura foi incubada por 5
min em banho de gelo e posteriormente centrifugada a 5000.g por 10 min a 4ºC. Após
a centrifugação, o sobrenadante foi colocado em um novo tubo contendo 10 µL de
RNAse (10 mg/mL) e incubado por 30 min a 37ºC, sendo então adicionado 1 volume
de fenol (pH 8,0), com posterior centrifugação a 5000.g por 5 min. A fase aquosa foi
transferida para um novo tubo, onde se adicionou 1 volume de clorofórmio/álcool
isoamílico (24:1). A mistura foi agitada e centrifugada a 5000.g por 5 min, à
temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, onde foi
adicionado 1/10 do volume de acetato de sódio (3 M) e 1 volume de isopropanol,
sendo posteriormente agitado e centrifugado por 20 min a 5000.g a 25
º
C. Após a
38
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado com 1 mL de
etanol 70% e colocado em “Speed-vac” até a completa evaporação do etanol. O DNA
foi ressuspendido em 50 µL de água ultrapura autoclavada e quantificado em um
espectrofotômetro (λ=260 nm). Alternativamente, utilizou-se o kit GFX Micro Plasmid
Prep Kit (Amersham Biosciences/GEHealthcare).
3.2.10 Digestão dos clones positivos
Foram feitas mini-preparações dos clones em investigação, seguindo o
protocolo descrito na seção 3.2.9. As digestões dos plasmídeos foram conduzidas por
16 h a 37°C utilizando-se as enzimas BanII, BglII e SalI dependendo do clone. Os
produtos das digestões foram analisados através de eletroforese em gel de agarose
1% (p/v) em TAE.
3.2.11 Seqüenciamento
Os seqüenciamentos foram executados no Núcleo de Estudos de Genoma
Johanna Döbenheiner (UFRJ) e no Laboratório do Prof. Dr. Rodolfo M. Albano (UERJ),
com os seqüenciadores automáticos ABI 377 (Applied Biosystems) e MegaBace
(Amersham Biosciences/GEHealthcare), respectivamente, utilizando-se o método de
terminação de cadeia com dideóxi nucleotídeos fluorogênicos.
3.2.12 Expressão e preparação dos extratos protéicos
Uma colônia isolada da bactéria contendo o plasmídeo de interesse, cultivada
em placas com meio LB ou LBON (quando se utilizou a cepa BL21-SI) com o
antibiótico específico, foi inoculada em 3 mL do respectivo meio líquido também
contendo o antibiótico adequado. Este inóculo foi incubado a 37ºC, sob agitação (150
rpm) por aproximadamente 16-17 h. Após este tempo, esta cultura foi inoculada em
uma concentração de 5% em um novo cultivo, o qual foi também conduzido com os
meios LB ou LBON contendo os antibióticos adequados, a 37°C sob agitação (150
rpm) até atingir uma Abs
600nm
de aproximadamente 0,5~0,6, quando então se
adicionou o indutor, que para cepa BL21-SI é NaCl (concentração final de 300 mM) e
para as cepas BL21(DE3) e BL21(DE3)pLysS é o IPTG (concentração final de 0,5
mM). Amostras de 1 mL foram coletadas antes e 4 h após a indução. Estas amostras
foram centrifugadas por 10 min a 5000.g a 4°C, o sobrenadante foi descartado e as
células foram armazenadas a -20°C. Para análise da expressão, as células estocadas
foram lisadas e submetidas à eletroforese em gel desnaturante, como descrito na
seção 3.2.14. Para lise, as células foram ressuspendidas em 100 µl de tampão fosfato
de sódio 50 mM (pH 7,0) e submetidas a ultra-som a 80 W de potência em 6 ciclos de
39
15 s em sonicador Branson/250. Este procedimento pode ser melhor observado na
figura 3.10. O extrato protéico total obtido também foi analisado por western blot, como
descrito na seção 3.2.15.
Figura 3.10. Esquema ilustrando a metodologia de expressão.
3.2.13 Dosagem de proteínas
A concentração de proteínas foi determinada através do método de Bradford,
utilizando a albumina de soro bovino (BSA) como padrão (BRADFORD, 1976).
Para o preparo da solução de Bradford, 10 mg de Coomassie Brilliant Blue G
250 foram solubilizados em 5 mL de etanol 95%. Após completa homogeneização,
adicionaram-se 10 mL de ácido fosfórico 85%, e o volume foi completado com água
ultrapura até 100mL. Posteriormente, esta solução foi filtrada em papel 3 MM e
estocada ao abrigo da luz.
Para a dosagem de proteínas foram utilizados 850 µL da solução de Bradford
mais 50 µL da amostra diluída, sendo a leitura feita em espectrômetro a 595 nm.
3.2.14 Eletroforese (SDS-PAGE)
Os extratos protéicos foram submetidos à eletroforese desnaturante em gel de
poliacrilamida 10 ou 12% (p/v) a 30 mA, em temperatura ambiente, utilizando o
sistema mini-protean da Bio-Rad, tendo como tampão de corrida 50 mM Tris-HCl;
150 mM Glicina e 0,1% (p/v) SDS (LAEMMLI, 1970).
Após o término da corrida, os géis foram corados com solução de Coomassie
(metanol 40% (v/v); ácido acético glacial 10% (v/v) e Coomassie R-250 a 0,1% (p/v))
por uma hora e descorados em solução de metanol 40% (v/v) e ácido acético 10%
(v/v) por aproximadamente três horas (LAEMMLI, 1970). Alternativamente, os géis
foram corados por prata (MORRISSEY, 1981).
40
3.2.15 Western Blot
Após SDS-PAGE, as proteínas do gel de poliacrilamida foram transferidas
eletroforeticamente (SemiDry, Bio-Rad) para uma membrana de PVDF (Immobilon-P,
Millipore), empregando-se 150 mA por 60 min, utilizando o tampão CAPS (10 mM
CAPS e 10% metanol). Após o término da transferência, a membrana foi lavada com
25 mL de solução TBS (2 mM Tris-HCl pH 7,5; 50 mM NaCl) por 10 min. A membrana
foi então bloqueada com 5% (p/v) de leite em pó desnatado (dissolvido em TBS
contendo 0,01% (p/v) de azida sódica) por 24 h. Após este período, a membrana foi
lavada três vezes por 5 min com 25 mL de TBS, duas vezes por 5 min com 25 mL de
TTBS (TBS com 0,05% (v/v) de Tween-20) e finalmente incubada por 24 h com 10 mL
de anticorpo monoclonal anti-HisTag de camundongo (Amersham Biosciences/GE
Healthcare), o qual reconhece a cauda de seis histidinas que os vetores de expressão
adicionam à proteína, diluído 1:1000 em tampão de anticorpos (leite desnatado 3%
(p/v) em TTBS com 0,01% de azida sódica). A membrana foi então lavada três vezes
com 25 mL de TTBS por 10 min e incubada por 2 h com 10 mL do anticorpo
secundário anticamundongo conjugado com peroxidase. A revelação foi conduzida
com o sistema ECL (Amersham Biosciences/GE Helthcare) de detecção, seguindo as
instruções dos fabricantes. Na figura 3.11 pode-se verificar um esquema explicativo do
sistema ECL de detecção.
Figura 3.11. Diagrama esquemático da detecção utilizando o sistema ECL. A proteína
é detectada por quimioluminescência usando anticorpo secundário conjugado com a
peroxidase.
41
3.2.16 Planejamento experimental
Com o objetivo de se aumentar a quantidade de proteína expressa, foi feito um
planejamento experimental para a expressão do clone sem o peptídeo sinal variando-
se a concentração celular de indução, medida através da Abs
600nm
, a temperatura de
cultivo e o tempo de indução.
Utilizou-se um planejamento fatorial misto 3
2
.2
1
, com os níveis apresentados na
Tabela 3.2, sendo que a variável resposta foi o volume das bandas obtidas pela
análise de densitometria do western blot. A análise densitométrica foi feita utilizando-
se o programa LabImage 2.7.2. O volume calculado foi normalizado considerando-se
100% a condição Abs
600nm
=0,6, 35°C e 3h de expressão.
O tratamento estatístico dos resultados foi executado no programa Statistica 5.0.
Tabela 3.2. Variáveis e níveis utilizados no planejamento fatorial 3
2
.2
1
.
Abs
600nm
Temperatura Tempo
0,3 -1 25
o
C -1 3h -1
0,6 0 30
o
C 0 --- ---
0,9 +1 35
o
C +1 21h +1
3.3 Determinação da atividade de esterase/lipase
As células recombinantes de E. coli, que passaram pelos procedimentos de
expressão e estavam estocadas a -20°C, foram ressuspendidas em tampão fosfato de
sódio (50mM, pH 7,0) e submetidas a ultra-som como descrito na seção 3.2.12. O
extrato protéico total foi então centrifugado a 4000.g por 15 min a 4ºC, sendo que o
precipitado foi descartado e o sobrenadante foi transferido para outro frasco. Este
sobrenadante foi incubado a 90°C por 10 min, resfriado à temperatura ambiente,
centrifugado a 10000.g em 4°C, por 15 min, sendo que o sobrenadante foi utilizado
para todos testes de atividade.
O teste de atividade foi efetuado utilizando-se éster derivados da 4-
metilumbeliferona como substratos (Figura 3.12), em um fluorímetro Varian Cary
Eclipse como descrito por PRIM et al. (2003). A mistura de reação consistiu de 0,6
mL de tampão fosfato de sódio (50mM, pH7,0) contendo 0,1% (v/v) de goma arábica e
0,4% (v/v) de Triton X100, 2,4 µL da solução estoque de substrato (25mM em
etilenoglicol monometil éter). À mistura foram adicionados 10 a 60 µL do extrato
protéico (2-12µg de proteína). A atividade enzimática foi determinada a 37°C,
medindo-se o aumento da emissão de fluorescência (λ
ex
=323nm e λ
em
=448nm) devido
à 4-metilumbeliferona (MUF), liberada na hidrólise dos substratos.
42
Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima
necessária para liberar 1 µmol de MUF por minuto nas condições do ensaio.
Para determinação da temperatura ótima da enzima a reação foi conduzida
com o substrato MUF-Heptanoato em diferentes temperaturas: 40, 50, 60, 70 e 80°C.
A termoestabilidade foi avaliada incubando-se a enzima previamente na
mistura reacional, sem o substrato, a 75 e 100°C, por períodos de 10, 30, 60 e 120
min. Transcorridos estes períodos, alíquotas foram imediatamente resfriadas em
banho de gelo, centrifugadas e foi medida a atividade a 37°C com o substrato MUF-
Heptanoato.
O
O
CH
3
O
H
3
C(H
2
C)n
O
n=0 4-metil umbeliferil acetato
n=5 4-metil umbeliferil heptanoato
n=14 4-metil umbeliferil palmitato
Figura 3.12. Estruturas dos substratos utilizados para a determinação da atividade.
3.4 Determinação da atividade proteásica
A atividade proteásica foi efetuada de acordo com o método de KUNITZ (1947),
onde a 200 µL de uma solução 0,5% (p/v) de caseína em tampão fosfato (50mM,
pH7,0) foram adicionados 60 µL do extrato protéico previamente tratado a 90°C por
10min. A reação foi efetuada a 37°C por 17 h, ao término das quais foi interrompida
com 260 µL de ácido tricloracético (TCA) 10% (p/v), e colocada em banho de gelo por
10min. Esta mistura foi centrifugada a 10000.g por 10min a 4°C e a absorbância do
sobrenadante foi lida a 280 nm. O branco consistiu da caseína incubada a 37°C por
17h sem a enzima, que foi adicionada após o TCA. Uma unidade de atividade
proteásica foi definida como a quantidade de enzima que causa uma diferença unitária
de absorbância entre a amostra e seu respectivo branco por minuto, nas condições do
ensaio.
43
3.5 Purificação da enzima recombinante por cromatografia de afinidade (Ni-
NTA)
Para a purificação da enzima recombinante foi utilizada a coluna Hitrap
Chelating - 1 mL (Amersham Biosciences/GE Helthcare) acoplada ao sistema
GradFrac (Amersham Biosciences/GE Helthcare). Primeiramente, a coluna foi lavada
com 10 mL de água padrão ultra puro, para a retirada do etanol (utiliza-se etanol 30%
(v/v) durante o armazenamento da coluna). Posteriormente, a coluna foi carregada
com 5 ml de sulfato de Níquel 100 mM e lavada com 10 mL de água para a retirada do
excesso de níquel. A coluna foi então equilibrada com 50 mL de tampão fosfato de
sódio (50mM, pH 7,0). As células recombinantes de E. coli, que passaram pelos
procedimentos de expressão e estavam estocadas a -20°C, foram ressuspendidas em
tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,0) e submetidas a ultra-som como descrito na
seção 3.2.12. O extrato protéico total foi então centrifugado a 4000.g por 15 min a 4ºC,
sendo que o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi transferido para outro
frasco e estocado a -20°C. 8 mL deste sobrenadante foram aplicados na coluna (8,32
mg de proteínas totais) a uma vazão de 0,2 mL/min. A coluna foi então lavada com
uma solução de 50 mM NaH
2
PO4 e 300 mM NaCl (pH 8,0). Esta lavagem foi
conduzida até que nenhuma proteína fosse dessorvida. Posteriormente, foi aplicado
tampão com 50 mM NaH
2
PO4, 300 mM NaCl e 150 mM imidazol (pH 8,0). Este
procedimento também foi conduzido até que mais nehuma proteína fosse dessorvida.
Em seguida, repetiu-se este procedimento para tampões com 250 e 500 mM de
imidazol. Alíquotas de 500 µL foram coletadas e armazenadas a -20ºC. Estas
alíquotas foram, posteriormente, analisadas em eletroforese desnaturante e também
com zimograma, utilizando-se MUF-Hep como substrato.
3.6 Zimograma
As alíquotas provenientes da purificação foram eletroforeticamente analisadas
conforme o item 3.2.14 e o gel de poliacrilamida foi então incubado em uma solução
com 2,5% (v/v) de Triton X-100 por 30 min sob agitação suave. Posteriormente, o gel
foi lavado com tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 7,0), colocado em um
transiluminador com luz UV e coberto com uma solução 100 µM de MUF-Hep no
mesmo tampão. As bandas provenientes da hidrólise do substrato pela ação da
enzima surgiram em aproximadamente 10-15 min.
44
3.7 Modelagem molecular comparativa
A modelagem molecular comparativa de proteínas está baseada em alguns
padrões gerais que têm sido observados, em nível molecular, no processo de
evolução biológica (SANTOS FILHO e DE ALENCASTRO, 2003):
- homologia entre seqüências de aminoácidos implica em semelhança
estrutural e funcional;
- proteínas homólogas apresentam regiões internas conservadas,
principalmente constituídas de elementos de estrutura secundária;
- as principais diferenças estruturais entre proteínas homólogas ocorrem nas
regiões externas, constituídas principalmente por alças, as quais ligam os
elementos de estrutura secundária.
Desta forma, a metodologia de modelagem comparativa segue os seguintes
passos seqüenciais: identificação do molde, alinhamento entre as seqüências,
determinação das coordenadas dos átomos da proteína que se está modelando,
alguma otimização e validação do modelo. Deve-se deixar claro que, se o resultado da
validação não for aceitável, ou seja, se a qualidade do modelo não for compatível com
o objetivo que se pretende com a estrutura, deve-se voltar para escolha do molde ou
melhoramento do alinhamento, como pode ser visualizado na figura 3.13.
Identificação de Moldes
Identificação de Moldes
Alinhamento
Alinhamento
Modelagem
Modelagem
Otimização
Otimização
Ok
Ok
?
?
FIM
FIM
Validação
Validação
Identificação de Moldes
Identificação de Moldes
Alinhamento
Alinhamento
Modelagem
Modelagem
Otimização
Otimização
Ok
Ok
?
?
FIM
FIM
Validação
Validação
Figura 3.13. Fluxograma mostrando a seqüência de ações na modelagem
comparativa de estruturas de proteínas.
3.7.1 Identificação do molde
A primeira tentativa de encontrar uma estrutura molde para a modelagem da
enzima de Pyrococcus furiosus foi feita através de uma pesquisa no Lipase
45
Engineering Database (http:\\www.led.uni-stuttgart.de). Nesta pesquisa, foram
retiradas todas as seqüências de aminoácidos das enzimas que possuíam estrutura
tridimensional determinada. Quando mais de uma estrutura havia sido determinada
para a mesma enzima, escolheu-se aquelas sem mutação e sem inibidores. Se a
enzima apresentasse mais de uma subunidade, foi escolhida a subunidade maior.
Após este procedimento, fez-se um alinhamento múltiplo, com o CLUSTAL W,
utilizando todas as seqüências, e verificaram-se aquelas em que o Score de
alinhamento em pares era maior ou igual a 99. Estas foram consideradas seqüências
iguais e, portanto, foram retiradas da análise. Seguindo este procedimento, um total de
41 seqüências foi extraído do banco de dados.
Com estas seqüências, foram feitos dois alinhamentos múltiplos, incluindo a
seqüência da enzima de P. furiosus, um utilizando o CLUSTAL W e outro com o T-
COFFEE. O alinhamento com o CLUSTAL W foi feito nas condições padrão do
programa, ou seja, empregando matriz de substituição GONNET 250, com
penalidades de abertura, extensão e de separação de gaps, foram respectivamente
10, 0,05 e 8. Os Scores dos alinhamentos em pares foram contabilizados em
porcentagem. O alinhamento com o T-COFFEE também foi executado nas condições
padrão do programa, ou seja, não utilizando matriz de substituição e sim uma
biblioteca, com penalidades de abertura, extensão e separação de gaps todas iguais a
zero, pois estes, segundo recomendação dos programadores, não devem ser
utilizados quando se executa o programa com bibliotecas. O parâmetro aplicado, neste
caso, é uma penalidade cosmética (cosmetic penalty) para abertura de gaps de valor
igual a 100. Este valor, segundo os autores do programa, é muito baixo e serve
apenas para evitar extensões prolongadas para resíduos isolados.
Além disso, o TRHEADER foi utilizado para identificar possíveis moldes entre
todas proteínas do PDB (Protein Data Bank).
3.7.2 Alinhamentos
Os alinhamentos entre as seqüências da proteína molde e da enzima de P.
furiosus foram feitos utilizando o T-COFFEE. Este alinhamento foi avaliado fazendo a
sobreposição das estruturas secundárias da proteína molde e da enzima de P.
furiosus, a qual foi obtida como uma média dos resultados dos programas GOR4,
HNN, SOPM e SOPMA. Este alinhamento inicial foi posteriormente ajustado
manualmente para tentar ajustar as distâncias entre os átomos Oγ-Ser149 e Nε-
His264, Nδ-His264 e Oδ-Asp233, que participam de pontes de hidrogênio no sítio
catalítico, e também a orientação das cadeias laterais destes resíduos.
46
3.7.3 Modelagem, Otimização e Validação
A modelagem foi executada no programa MODELLER 6v2, através da rotina
model, que utiliza, para o cálculo das coordenadas atômicas do modelo, o alinhamento
gerado como descrito no item anterior e as coordenadas atômicas do molde.
Os primeiros modelos obtidos tiveram as distâncias entre os átomos Oγ-Ser149
e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-Asp233 muito grandes, de forma que alguns
procedimentos foram tomados para tentar contornar este problema. Primeiro, tentou-
se melhorar o alinhamento, variando-se principalmente a posição do Asp233.
Posteriormente, os rotâmeros dos resíduos Ser149, Asp233 e His264 foram ajustados
no programa SpdbViewer v3.7b2 e, por último, também neste programa, buscou-se
um melhor ajuste da alça que envolve a His264.
A validação foi feita através da análise do gráfico de Ramachandran gerado
pelo programa PROCHECK.
47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização in silico do gene PF2001 de Pyrococcus furiosus
ALMEIDA (2001) identificou o gene de P. furiosus descrito na figura 4.1,
caracterizando suas regiões promotoras e terminadoras. Além disso, foi verificado que
a proteína codificada por este gene possuía os domínios conservados de dienolactona
hidrolases, lipases e αβ hidrolases. Atualmente, este gene encontra-se anotado no
genoma de P. furiosus como PF2001, codificando uma proteína hipotética. Cabe aqui
ressaltar que o gene PF2001 corresponde a um novo gene, diferente do descrito por
IKEDA e CLARCK (1998), o qual codifica uma esterase. Embora estes autores não
tenham seqüenciado o fragmento de DNA responsável por esta enzima, através de
seu mapa de restrição é possível dizer que se trata de um fragmento diferente do gene
PF2001.
1 - CTTTGTACTGGCTGCAATAACCATGCAGTTCGTTAGGAGAGGGGACATCAAGGGTGGAAG - 60
- L Y W L Q * P C S S L G E G T S R V E V
61 - TAGCGATATGTATGAGTACATACCAGATATGGACTAGGGGAGGGAGGTAGGTGATAATTG - 120
- A I C M S T Y Q I W T R G G R * V I I E
121 - AAATACTTGTAGCTGCTTTAGTTCTCTTCCTAGTTTTTACAGCCTTTGTGGGGTATAAAA - 180
- I L V A A L V L F L V F T A F V G Y K M
181 - TGGTAAATCCACCTAGGGTAGTAGGGAATTGGACTCCAAAAGACCTTAGCTTTGAATACA - 240
- V N P P R V V G N W T P K D L S F E Y K
241 - AAGACGTTGAAATCACCACCGAAGACAACGTTAAGCTTAGTGGGTGGTGGATAGATAATG - 300
- D V E I T T E D N V K L S G W W I D N G
301 - GCAGCGACAAAACTGTAATTCCCCTACACGGTTATACCTCGAGCAGATGGGCCGAGCACT - 360
- S D K T V I P L H G Y T S S R W A E H Y
361 - ACATGAGGCCCGTGATAGAGTTCCTCTTAAAAGAAGGGTACAATGTTTTGGCATTTGACT - 420
- M R P V I E F L L K E G Y N V L A F D F
421 - TTAGGGCCCATGGAAAAAGTGGAGGAAAATATACAACTGTTGGAGATAAGGAAATTCTGG - 480
- R A H G K S G G K Y T T V G D K E I L D
481 - ACTTAAAGGCCGGTGTAAAGTGGTTAAAAGATAATTATCCAGAGAAATCTAAGAGAATTG - 540
- L K A G V K W L K D N Y P E K S K R I G
541 - GAGTGATTGGATTTTCAATGGGGGCATTAGTTGCAATTAGGGGATTAAGCGAAGTTAAAG - 600
- V I G F S M G A L V A I R G L S E V K E
601 - AAATTTGTTGCGGAGTTGCAGATTCACCACCAATATACCTAGATAAAACAGGAGCAAGAG - 660
- I C C G V A D S P P I Y L D K T G A R G
661 - GAATGAAGTATTTTGCAAAACTTCCAGAATGGCTTTATTCATTCGTTAAACCTTTTTCAG - 720
- M K Y F A K L P E W L Y S F V K P F S E
721 - AACTATTTTCTGGTGGAAGGCCTATAAATGTTCTTAATTATACAAATAGCATTAAGAAAC - 780
- L F S G G R P I N V L N Y T N S I K K P
781 - CACTCTTTTTGATCATAGGTAGAAGAGATACACTCGTAAAAGTCGAGGAAGTTCAAGAGT - 840
- L F L I I G R R D T L V K V E E V Q E F
841 - TTTACGAGAGAAACAAGCATGTAAATCCGAACGTTGAATTGTGGGTCACAGACGCTCCTC - 900
- Y E R N K H V N P N V E L W V T D A P H
901 - ATGTAAGGACAATTCAAGTCTTTCCAGAAGAGTGGAAAAGTAGAGTTGGAGAGTTCCTTA - 960
- V R T I Q V F P E E W K S R V G E F L K
961 - AAAGGTGGATGGGATAAGTTTTTATTTTTTCATCCTAAATTTATCATCTATGAAAGCCAG - 1020
- R W M G *
Figura 4.1. Gene PF2001 de P. furiosus. Pribnow box e início da transcrição (verde);
Sítio de Shine-Dalgarno (vermelho); Códon de ínicio da tradução (azul); Códon de
Terminação (*); Regiões ricas em pirimidinas (destacado em amarelo); regiões de
pareamento invertido (setas).
48
Refazendo-se a análise de domínios da proteína codificada pelo gene PF2001
através do CD-Search, utilizando o banco de dados cddv2.05, pode-se observar
(figura 4.2) que, dentre os domínios presentes com Scores mais elevados, deve-se
inicialmente destacar os que estão relacionados às proteínas que possuem o
dobramento αβ (COG1073 e COG2945), demonstrando fortemente que a enzima em
estudo faz parte desta família de proteínas. Além disso, pode-se observar que, entre
os primeiros Scores, dois deles, COG1647 e COG2267, dizem respeito a enzimas da
família das éster hidrolases, mais especificamente lipases, esterases e fosfolipases, o
que corrobora os resultados de ALMEIDA (2001).
Figura 4.2. Análise dos domínios conservados presentes na proteína codificada pelo
gene PF2001 de P. furiosus, utilizando a ferramenta computacional CD-Search e o
banco de dados cddv2.05. A barra preta numerada na parte superior indica a
seqüência da esterase com seus 288 aminoácidos; mais abaixo, com barras coloridas,
estão mostrados os domínios e, na parte inferior, os domínios são descritos com seus
respectivos Scores e E-values.
49
Um importante fato que deve ser ressaltado é que o mais alto Score, entre os
encontrados, é o do domínio DAP2, que se refere a diamino peptidases de organismos
celulares, ou seja, pertencentes aos domínios Archaea, Bacteria e Eukarya (exceto
vírus). Embora somente 40,5% deste domínio tenha sido alinhado com a enzima de P.
furiosus, a porção alinhada diz respeito a uma parcela bastante conservada entre as
seqüências que as compõem. Por isto, vale aprofundar a discussão sobre este
domínio em especial.
As dipeptidil aminopeptidases (3.4.14._) dividem-se em quatro famílias, cuja
principal reação catalisada é a liberação de dois aminoácidos na região amino terminal
da proteína. As variações das famílias estão relacionadas com os tipos de
aminoácidos que elas hidrolisam, como mostrado na tabela abaixo.
Tabela 4.1. Famílias e substratos das dipeptidil aminopeptidases.
(http://us.expasy.org/cgi-bin/get-enzyme-entry-unprecise?3.4.14.-)
Enzima (E.C.) Substrato
Dipeptidil aminopeptidase 1
(E.C. 3.14.4.1)
(Xaa-Xbb-|-Xcc) exceto quando Xaa igual a
Arg ou Lys e Xbb ou Xcc igual a Pro.
Também polimeriza amidas dipeptídicas,
arilamidas e ésteres em pH neutro.
Dipeptidil aminopeptidase 2
(E.C. 3.14.4.2)
(Xaa-Xbb-|-Xcc) preferencialmente quando
Xbb é igual a Ala ou Pro. Substratos são
preferencialmente oligopeptídeos com três
aminoácidos.
Dipeptidil aminopeptidase 3
(E.C. 3.14.4.4)
libera um dipeptídeo da região N-terminal de
peptídeos com quatro ou mais resíduos, com
uma larga faixa de especificidade. Também
age em dipeptidil 2-naftilamidas.
Dipeptidil aminopeptidase 4
(E.C. 3.14.4.5)
(Xaa-Xbb-|-Xcc) preferencialmente quando
Xbb é igual a Pro e Xcc é diferente de Pro
ou Hidroxiprolina
O domínio DAP2 das dipeptidil aminopeptidases encontrado pelo CD-Search é
formado por diversas hidrolases que agem em ligações peptídicas, incluindo algumas
proteínas da família das prolil amino peptidases. Estas proteínas, ao contrário das
proteases tipo tripsina, possuem a tríade catalítica na mesma orientação que as
esterases e lipases, ou seja, Ser-Asp-His. Além disso, POLGÁR (1992), ao estudar as
relações estruturais entre lipases e peptidases da família das prolil oligopeptidases, já
50
havia sugerido que estas enzimas poderiam estar evolutivamente relacionadas,
principalmente por possuírem homologia de seqüências dos resíduos catalíticos, uma
topologia da tríade similar e o sítio, para ambas, não estar totalmente acessível ao
substrato. Ele ainda apontou que esta relação se torna ainda mais forte quando as
prolil oligopeptidases são correlacionadas com grupos de lipases microbianas.
Este conjunto de dados pode explicar a presença do domínio de diamino
peptidases, αβ hidrolases e de esterase/lipases na enzima de P. furiosus, visto que
todas estão estruturalmente relacionadas, o que reforça os resultados de ALMEIDA
(2001), caracterizando a referida proteína como uma enzima de grande potencial para
aplicações biotecnológicas.
4.2 Clonagem e Expressão do gene PF2001
4.2.1 Isolamento e clonagem do gene PF2001 no sistema Gateway
Um fragmento de 929 pb foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de
Pyrococcus furiosus, utilizando-se os primers FpDONRPF2001 e RpDONRPF2001
(figura 4.3). Encontrou-se uma dificuldade nesta reação de PCR, pois os primers
possuem uma cauda com os sítios de recombinação attB1 ou attB2. Estas seqüências,
além de não parearem totalmente com o DNA genômico de Pyrococcus furiosus, são
ricas em CG, elevando muito a temperatura de anelamento, e os primers ainda
formam dímeros e alças. Além disso, para evitar erro na reação de PCR, utilizou-se a
enzima Pfx polimerase, que tem temperatura ótima de atividade a 68°C. Desta forma,
a temperatura máxima utilizada para o anelamento não deveria ser muito superior a
esta. Este problema foi contornado, utilizando-se duas temperaturas de anelamento
diferentes: nos dez primeiros ciclos utilizou-se a temperatura de 55°C, necessária para
o anelamento da parte inicial do primer com o DNA genômico. Após esses 10 ciclos,
quando a quantidade do fragmento amplificado (que possuía o sítio de recombinação)
já era significativa, foram efetuados mais 30 ciclos com temperatura de anelamento de
65°C. A quantidade de produto formado tornou-se então suficiente para as etapas
posteriores da clonagem.
51
Figura 4.3. Amplificação do gene PF2001 por PCR a partir do DNA genômico de
Pyrococcus furiosus. Gel de agarose a 0,8% em TAE. 1) Padrão de massa molecular
(DNA λ digerido com Pst I), 2) Controle negativo (PCR sem DNA genômico) e 3)
Produto do PCR. A seta indica a banda amplificada de 929pb.
A banda correspondente ao fragmento amplificado foi então eluída do gel de
agarose e submetida à reação de recombinação sítio-específica BP. Células de E. coli
DH5α foram transformadas por eletroporação. Algumas colônias, que receberam o
plasmídeo, foram selecionadas ao acaso e utilizadas para confirmação da inserção do
fragmento amplificado no vetor pDONR 201, através da digestão do plasmídeo com a
enzima BanII.
4.2.2 Confirmação dos clones positivos
A digestão dos plasmídeos com a enzima Banll deveria gerar três bandas com
os tamanhos de 421, 854 e 1851 pares de base. Este perfil de digestão pode ser
observado na figura 4.4, para os clones escolhidos aleatoriamente. Este resultado
sugere que todos clones investigados receberam o inserto e que este se encontra na
orientação correta.
Após a confirmação da transformação das células de E. coli DH5α pelo
plasmídeo pDONRPF2001, os clones positivos foram cultivados visando à obtenção
de DNA plasmidial para a reação de recombinação sítio-específica LR, onde o gene
PF2001 foi transferido para o plasmídeo de expressão pDEST17, gerando o
plasmídeo recombinante pDESTPF2001. Esse plasmídeo foi então utilizado para a
nova transformação de células E. coli DH5α por eletroporação. A confirmação da
transformação foi feita pela digestão do DNA plasmidial das colônias transformadas
com a enzima BanII. Esta digestão gerou o perfil esperado de bandas com os
929pb
52
tamanhos de 584 e 4975 pb, o qual é mostrado na figura 4.5 para 6 clones escolhidos
ao acaso.
Figura 4.4. Gel de agarose 0,8% em TAE mostrando a digestão do plasmídeo
pDONRPF2001 em diferentes transformantes. (*) plasmídeos digeridos, ( ) plasmídeos
não digeridos. PM é o padrão de massa molecular (DNA λ digerido com Pst I).
Figura 4.5. Gel de agarose 0,8% em TAE mostrando digestão do plasmídeo
pDESTPF2001. (*) plasmídeos digeridos, ( ) plasmídeos não digeridos. PM é o padrão
de massa molecular (DNA λ digerido com PstI).
Após a confirmação da transformação das células DH5α pelo plasmídeo
pDESTPF2001, um clone foi escolhido ao acaso e seu DNA plasmidial foi utilizado
para transformar células de E. coli BL21SI, rotineiramente utilizadas para expressão
no sistema Gateway.
Nesta transformação, foram obtidas apenas quatro colônias. A confirmação da
transformação foi feita pela digestão do DNA plasmidial com a enzima HindIII, de
forma a fornecer fragmentos de tamanhos iguais a 1215 e 4358 pb (figura 4.6).
Ao se observar o poço 2, pode-se sugerir que a digestão não ocorreu, de forma
que apenas um dos clones testados foi confirmado (poço 5 na figura 4.6), o qual foi
submetido aos experimentos de expressão.
1 2* 3 4* 5 6* 7 8* 9 10* 11 12*
PM
1 2* 3 4* 5 6* 7 8* 9 10* 11 12*
PM
53
1 2
* 3 4 5* 6
Figura 4.6. Gel de agarose 0,8% em TAE mostrando digestão do plasmídeo
pDESTPF2001 extraído da célula de expressão BL21-SI. (*) plasmídeos digeridos, ( )
plasmídeos não digeridos. Os poços 3 e 6 estão vazios. PM é o padrão de massa
molecular (DNA λ digerido com PstI).
4.2.3 Seqüenciamento
O seqüenciamento do plasmídeo pDESTPF2001 mostrou que o gene clonado
foi inserido de forma correta e não foi detectada nenhuma mutação.
4.2.4 Expressão e caracterização da enzima recombinante
O clone confirmado contendo o gene de interesse foi cultivado a 37ºC em meio
LBON contendo 100 µg/mL de ampicilina com agitação de 150rpm, até que a Abs
600nm
atingisse aproximadamente 0,5, ou seja, por aproximadamente 2 h. Após este período,
a expressão do gene foi induzida pela adição de 300 mM de NaCl e a produção da
enzima foi acompanhada com a finalidade de se obter a cinética da indução. A Figura
4.7 mostra o perfil protéico das amostras obtidas depois de decorridos os tempos de
indução de 1, 2, 3 e 4 h. Como se pode observar, não ocorre o surgimento nítido de
uma proteína de aproximadamente 35 kDa, que corresponde à massa molecular
esperada da enzima de P. furiosus, deduzida através da seqüência primária da
proteína.
Muito embora os resultados da clonagem pelo sistema Gateway
mostrem que o
gene PF2001 foi clonado satisfatoriamente, a análise de expressão tanto através de
eletroforese como da análise por western blot com o anticorpo anti-His tag não se
detecta nenhuma expressão. Estes resultados também foram encontrados para cepa
BL21(DE3).
4505
p
b
1700
p
b
1159
p
b
PM
54
Figura 4.7. Gel desnaturante de poliacrilamida (12%) mostrando o perfil de indução do
clone pDESTPF2001 em E. coli BL21SI. 1 e 8) Padrões de massa molecular; 2) E. coli
BL21SI sem plasmídeo; 3) Clone pDESTPF2001 em E. coli BL21SI sem indução; 4 ao
7) Clone pDEPF2001 em E. coli BL21SI induzido com 300mM de NaCl por 1, 2, 3 e
4h, respectivamente. A seta a direita indica a mobilidade eletroforética para uma
proteína de aproximadamente 35 kDa.
Considerando-se o trabalho de ALMEIDA (2001), esta foi a segunda estratégia
adotada para a expressão desta enzima de P. furiosus onde foram variados os
vetores, logo seus respectivos promotores, e também as células hospedeiras, contudo
em nenhum sistema foi observado um nível significativo de expressão, que fosse
visível na eletroforese revelada por Coomassie ou por western blot, o que sugere
fortemente que esta proteína requer fatores adicionais para a expressão em altos
níveis.
Uma revisão na literatura aponta que muitos genes de lipases microbianas vêm
sendo clonados, incluindo importantes lipases comerciais como a de Candida rugosa,
Candida antarctica, Termomyces lanuginosa, Rhizomucor miehei, Rhizopus delemar,
Geotrichum candidum, Burkholderia cepacia, Pseudomonas pseudoalcaligenes e
Pseudomonas mendocina. Contudo, a produção de enzimas recombinantes tem sido
limitada às lipases de C. antarctica, R. miehei, T. lanuginosa, P. pseudoalcaligenes e
P. mendocina (SCHMIDT-DANNERT, 1999), o que sugere a dificuldade na obtenção
de altos níveis de expressão de lipases recombinantes, sendo necessárias diversas
etapas de adaptação do método de clonagem para que se consiga aumentar a
quantidade de lipase expressa.
RÚA et al. (1998), ao estudarem a expressão da lipase de Bacillus
thermocatenulatus, observaram a influência positiva da presença da seqüência sinal
ompA upstream ao gene da lipase sob o controle do promotor λP
L
. A adição da
seqüência ompA aumentou os níveis de expressão da lipase em 3,3 vezes, porém,
curiosamente, mesmo a seqüência ompA sendo uma seqüência que sinaliza para o
55
endereçamento ao periplasma, mais de 90% da enzima permaneceu associada ao
debri celular (SCHMIDT-DANNERT, 1999). Além disso, estes pesquisadores
sugeriram que o alto conteúdo de resíduos hidrofóbicos na seqüência sinalizadora da
própria enzima contribuía para a falta de solubilidade da enzima não processada.
Outro estudo, que demonstra a importância de seqüências sinalizadoras na
expressão de lipases, foi o realizado por ALBERGHINA e LOTTI (1997), que
observaram que o gene da lipase de Candida rugosa, quando expresso em
Saccharomyces cerevisiae, não gerava a proteína de interesse, mesmo quando
utilizado western blot para avaliação da expressão e sendo observado seu mRNA por
northern blot. Após várias especulações, como a baixa capacidade de tradução do
mRNA e a instabilidade da proteína, quando os 15 primeiros resíduos da região N-
terminal foram substituídos por um peptídeo sinal da killer toxin de Kluyveromyces
lactis, a enzima passou a ser produzida por S. cerevisiae.
Para o caso da expressão funcional de lipases de Pseudomonas, sabe-se da
necessidade da ação de uma chaperonina para o enovelamento correto da enzima,
antes da mesma ser secretada pela célula (JAEGER e EGGERT, 2002). Neste
contexto, QUYEN et al., (1999) demonstraram duas importantes questões para a
expressão da lipase de Pseudomonas cepacia: a primeira é que, para se conseguir um
alto índice de expressão desta proteína em E. coli, é necessário que, na construção
gênica, seja retirado o peptídeo sinal – desta forma foi possível atingir um nível de
40% da proteína celular total, embora com quase toda proteína sem atividade;
segundo, que esta atividade foi recuperada pela ação de sua chaperonina in vitro.
Assim como as lipases, as proteases também são enzimas extensamente
estudas, sendo que, no desenvolvimento de cepas que super expressem este tipo de
biocatalisador, são geralmente utilizados Bacillus subtillis, E. coli e leveduras como
hospedeiros. Além disso, estas proteínas são geralmente produzidas enquanto pro-
enzimas, ou seja, sem atividade, para que não ocorra o ataque das proteínas do
hospedeiro e também a sua autoproteólise. O uso de seqüências sinalizadoras para
secreção da proteína expressa é também freqüente (RAO, 1998).
Além das dificuldades de expressão apresentadas por algumas lipases, como
discutido no ítem 2.2, muitas proteínas de P. furiosus também apresentam dificuldades
de serem expressas em altos níveis em E. coli.
4.3 Clonagem no vetor pET-32a
Conforme discutido no item anterior, a presença de um peptídeo sinal pode
influenciar diretamente a expressão de lipases. Desta forma, foi efetuada uma análise
da região amino terminal da proteína codificada pelo gene PF2001, utilizando-se o
56
programa SignalP 3.0. Com esta análise, foi possível verificar que os primeiros 20
aminoácidos possuem, segundo a predição do SignalP mostrada na figura 4.8a, uma
alta probabilidade de fazer parte de um peptídeo sinal. Além disso, como pode ser
visualizado na figura 4.8b, estes primeiros aminoácidos possuem um alto grau de
hidrofobicidade, o que poderia estar dificultando a expressão funcional do gene
PF2001, visto os casos de agregação de lipases citados na literatura (RÚA et al.,
1997; SCHLIEBEN et al., 2004).
Desta forma, duas estratégias foram utilizadas para a clonagem do gene
PF2001 no vetor pET32a: uma com o gene inteiro (PF2001) e outra sem os primeiros
60 nucleotídeos (PF2001∆60).
Figura 4.8. Caracterização da região amino terminal da proteína codificada pelo gene
PF2001. (a) Predição do peptídeo sinal utilizando o programa SignalP 3.0 com rede
neural treinada para Gram-negativos. S score (linha verde) mostra a probabilidade de
um certo resíduo participar de um peptídeo sinal, C score e Y score (linhas vermelha e
azul) são valores que indicam onde ocorre o início da proteína; (b) grau de
hidrofobicidade dos resíduos.
57
4.3.1 Isolamento e clonagem dos fragmentos de DNA PF2001 e PF2001∆60
A figura 4.9 mostra o resultado da amplificação dos dois fragmentos PF2001 e
PF2001∆60 conforme as condições descritas na seção 3.2.1. Como pode ser
observado, foi possível isolar os dois fragmentos PF2001 e PF2001∆60 com,
respectivamente, 901pb e 841pb, como esperado.
De posse dos produtos de PCR, partiu-se inicialmente para a clonagem no
vetor de seqüenciamento pGEM-T.
Figura 4.9. Amplificação dos fragmentos por PCR a partir do DNA genômico de
Pyrococcus furiosus: 1) PF2001 (901 pb); 2) PF2001∆60 (841 pb) e; 3) controle
negativo (PCR sem DNA genômico). Gel de agarose a 1% em TAE. PM é o padrão de
massa molecular (DNA λ digerido com PstI).
4.3.2 Confirmação dos clones positivos
A figura 4.10 mostra o resultado das reações de PCR com os primers
FpETPF2001/RpETPF2001 e FpETPF2001∆60/RpETPF2001 para diferentes colônias
transformantes com os plasmídeos pGEMPF2001 e pGEMP2001∆60. Como é
possível observar, várias colônias transformantes do plasmídeo pGEMPF2001
mostraram produtos de 901pb, como o esperado, confirmando a ligação do gene
PF2001 no plasmídeo pGEM-T. Contudo, para os transformantes contendo o
plasmídeo pGEMPF2001∆60, apenas uma colônia resultou no produto de 841 pb. Este
mesmo PCR foi repetido para outros transformantes do plasmídeo pGEMPF2001∆60 e
apenas mais uma colônia demonstrou ter recebido o plasmídeo, o que demonstra uma
grande diferença na eficiência de transformação das duas construções.
58
Figura 4.10. Confirmação dos clones pGEMPF2001 e pGEMP2001∆60 através de
PCR de diferentes transformantes, utilizando-se os primers
FpETPF2001/RpETPF2001 e FpETPF2001∆60/RpETPF2001. PM é o padrão de
massa molecular (DNA λ digerido com PstI).
Além da confirmação através do PCR, extraiu-se o DNA plasmidial de cada
transformante positivo e se fez uma digestão com as enzimas BglII e SalI, para
liberação dos insertos PF2001 e PF2001∆60 de 901 e 841pb, respectivamente. A
figura 4.11 apresenta o resultado destas digestões e a liberação dos respectivos
fragmentos, confirmando que os transformantes realmente receberam os plasmídeos
pGEMPF2001 e pGEMP2001∆60.
Com a confirmação dos clones no vetor pGEM-T, prosseguiu-se com a
clonagem, escolhendo-se um clone de cada estratégia – com e sem peptídeo sinal –
para clonagem no vetor de expressão pET32a.
Figura 4.11. Digestões dos plasmídeos pGEMPF2001 e pGEMP2001∆60 com as
enzimas BglII e SalI. (*) plasmídeos digeridos, ( ) plasmídeos não digeridos. PM é o
padrão de massa molecular (DNA λ digerido com PstI).
A figura 4.12 mostra a confirmação, através de PCR, dos transformantes em E.
coli DH10b, utilizando-se os primers T7promoter/T7terminator, cujos produtos
59
deveriam conter 1579 e 1519pb para os plasmídeos pETPF2001 e pETP2001∆60
respectivamente. Pode ser observada, a eficiência de transformação com a construção
sem o peptídeo sinal foi inferior à do gene inteiro, sugerindo algum tipo de toxidade
dos plasmídeos pGEMP2001∆60 e pETP2001∆60. Outras colônias transformantes
com o plasmídeo pETP2001∆60 foram submetidas à confirmação e apenas mais uma
mostrou resultado positivo.
Figura 4.12. Confirmação dos clones pETPF2001 e pETP2001∆60 através de PCR de
diferentes transformantes em DH10b, utilizando-se os primers
T7promoter/T7terminator. PM é o padrão de massa molecular (DNA λ digerido com
PstI).
4.3.3 Sequenciamento
O seqüenciamento do plasmídeo pETPF2001∆60 mostrou que o fragmento
clonado foi inserido de forma correta. Já a análise do seqüenciamento do plasmídeo
pETPF2001, demonstrou a presença de uma mutação que modifica a ordem de leitura
do gene, inserindo um códon de parada prematuramente, gerando uma proteína com
massa molecular inferior a 25 kDa.
4.3.4 Expressão
As expressões das enzimas recombinantes, utilizando-se as duas construções
no vetor pET32a, foram inicialmente conduzidas a 37
o
C, sendo adicionado 0,5 mM de
IPTG quando as células atingiram uma Abs
600nm
=0,6, por um período de 4 h. O
resultado destas expressões pode ser observado na figura 4.13.
Na figura 4.13a, onde se pode observar o extrato protéico total separado
eletroforeticamente em gel de poliacrilamida e corado com Coomassie, não se
consegue verificar um nítido surgimento da proteína expressa sem o peptídeo sinal,
com uma massa molecular de 47,8 kDa. Já no western blot do extrato protéico total
60
com o anticorpo anti His-tag (figura 4.13b), consegue-se observar o surgimento,
quando comparado com o controle (cepa BL21(DE3)pLysS sem plasmídeo), de uma
proteína com a massa molecular esperada para a construção sem o peptídeo sinal.
Além da proteína expressa com o tamanho de 47,8 kDa, também se pode observar a
produção de outra com uma massa molecular menor, de aproximadamente 38-40 kDa,
o que sugere algum processo de proteólise da enzima expressa.
No processo de expressão utilizando-se o transformante com o plasmídeo
pETPF2001 pode-se observar a produção de uma proteína com massa molecular
inferior a 25,9 kDa. Isto ocorreu devido à mutação detectada no plasmídeo
pETPF2001, comentada na seção 4.3.3, a qual incluiu um códon de parada
prematuramente, gerando uma proteína com tamanho menor.
Em função deste resultado com a enzima recombinante com peptídeo sinal, a
partir deste momento todos os demais experimentos foram conduzidos com a enzima
madura, ou seja, sem o peptídeo sinal.
Figura 4.13. Eletroforese desnaturante (a) e western blot (b) do extrato protéico total
de E. coli BL21(DE3)pLysS transformada com os plasmídeos pEPF2001 (1) e
pEPF2001∆60 (2), além do controle com a E. coli BL21(DE3)pLysS sem transformar
(3). PM é o padrão de massa molecular.
Buscando-se melhorar a expressão da enzima recombinante, principalmente
pelo fato de que nenhuma expressão nítida pode ser observada na eletroforese
revelada com Coomassie, indicando níveis baixos de expressão, desenvolveu-se um
planejamento experimental, variando-se a concentração celular de indução (medida
através da Abs
600nm
), a temperatura e o tempo de cultivo durante a indução com
0,5 mM de IPTG.
Os resultados das diferentes condições de expressão foram analisados através
de eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE) e western blot que podem ser
visualizados nas figuras 4.14a e b, respectivamente. Pode-se notar que, através da
61
eletroforese revelada com Coomassie, não é possível observar o surgimento nítido de
uma proteína com massa molecular de 47,8 kDa, contudo quando se visualiza o
resultado do western blot, o qual foi produzido aplicando-se as mesmas quantidades
de proteínas que na eletroforese, nota-se a influência nítida das variáveis de processo
na quantidade de enzima expressa.
De antemão pode-se ver que, com o tempo de 21 h de indução, nenhuma
expressão foi detectada, mesmo para as condições onde em 3 h a expressão ocorreu,
o que sugere fortemente que ocorre um processo de proteólise em tempos maiores de
cultivo. Quando se analisa o efeito da concentração celular, pode-se observar que, em
média, uma maior expressão ocorreu para menores concentrações celulares de
indução (Figura 4.14b). Já a influência da temperatura foi diferente para cada
concentração celular de indução, demonstrando que a célula responde diferentemente
à temperatura, dependendo do estágio metabólico em que se encontra.
Figura 4.14. Eletroforese desnaturante (a) e western blot (b) do extrato protéico total
da E. coli BL21(DE3)pLysS transformada com o plasmídeo pEPF2001∆60 nas
diversas condições de expressão prevista no planejamento experimental, variando-se
a Abs
600nm
(0,3; 0,6 e 0,9), a temperatura (25; 30 e 35°C) e o tempo de indução (3 e
21h). PM é o padrão de massa molecular.
Na tentativa de condensar a análise dos efeitos isolados, foi feito o ajuste dos
dados experimentais, mostrados na tabela 4.2, ao modelo descrito abaixo.
VN = A1 + A2.Abs + A3.Temp + A4.Tempo + A5.Abs.Temp + A6.Abs.Tempo +
A7.Temp.Tempo + A8.Abs.Temp.Tempo + A9.Abs
2
+ A10.Temp
2
+ A11.Abs
2
.Temp
2
+
A12.Abs.Temp
2
+ A13.Temp.Abs
2
+ A14.Tempo.Abs
2
+ A15.Tempo.Temp
2
+
A16.Tempo.Abs
2
.Temp
2
Onde:
62
VN = volume normalizado da banda obtida no western blot (variável
independente);
Abs = absorbância 600nm codificada;
Temp = temperatura de indução codificada;
Tempo = tempo de indução codificado;
A1 ao A16 = parâmetros do modelo.
Ao se tentar ajustar os dados ao modelo descrito acima, todos os efeitos
isolados ou de interação que envolvem algum termo quadrático não foram
significativos ao nível de 95% de confiança. Desta forma, fez-se uma nova análise com
o seguinte modelo:
VN = A1 + A2.Abs + A3.Temp + A4.Tempo + A5.Abs.Temp + A6.Abs.Tempo +
A7.Temp.Tempo + A8.Abs.Temp.Tempo
Tabela 4.2. Volumes normalizados das bandas de expressão da enzima recombinante
em western blot em diferentes condições de concentração celular, temperatura e
tempo na indução com 0,5 mM de IPTG, calculado em relação à condição padrão
(Abs
600nm
=0,6, Temperatura=35°C e Tempo=3 h).
Abs
600nm
Temperatura (
o
C) Tempo (h) Volume Normalizado
-1 (0,3) -1 (25) -1 (3)
0
-1 (0,3) 0 (30) -1 (3)
145,2
-1 (0,3) 1 (35) -1 (3)
303,4
0 (0,6) -1 (25) -1 (3)
87,7
0 (0,6) 0 (30) -1 (3)
181,8
0 (0,6) 1 (35) -1 (3)
100,0
1 (0,9) -1 (25) -1 (3)
0,0
1 (0,9) 0 (30) -1 (3)
0,0
1 (0,9) 1 (35) -1 (3)
0,0
-1 (0,3) -1 (25) 1 (21)
0,0
-1 (0,3) 0 (30) 1 (21)
0,0
-1 (0,3) 1 (35) 1 (21)
0,0
0 (0,6) -1 (25) 1 (21)
0,0
0 (0,6) 0 (30) 1 (21)
0,0
0 (0,6) 1 (35) 1 (21)
0,0
1 (0,9) -1 (25) 1 (21)
0,0
1 (0,9) 0 (30) 1 (21)
0,0
1 (0,9) 1 (35) 1 (21)
0,0
Com este modelo, a análise mostrou que todos efeitos foram significativos ao
nível de 95%, com um coeficiente de correlação R = 0,93. Desta forma o modelo ficou
assim equacionado:
63
VN = 45,5 - 37,4.Abs + 26,3.Temp - 45,5.Tempo - 37,9.Abs.Temp + 37,4.Abs.Tempo
- 26,3.Temp.Tempo + 37,9.Abs.Temp.Tempo
Inicialmente, podemos verificar que todas as variáveis estão altamente
correlacionadas, pois os parâmetros de interação foram todos significativos e
apresentam valores relativamente elevados. Isto significa dizer que não se pode
manipular apenas uma variável, esperando-se um único efeito isolado, pois cada
variável interage com as outras de forma combinada. Os efeitos das variáveis
concentração celular e tempo foram negativos, ou seja, que uma maior expressão é
obtida quanto menores forem os valores destas variáveis, dentro da faixa testada. O
efeito negativo da variável tempo também foi encontrado na expressão da subunidade
redutase da carbazol 1,9a-dioxigenase (CarAd) de Pseudomonas stutzeri em E. coli
BL21-SI (LARENTIS et al., 2005), evidenciando para estas proteínas, como colocado
anteriormente, que possivelmente esteja ocorrendo a ação de enzimas proteolíticas.
Cabe ressaltar que, como a variável tempo está intimamente relacionada com a
quantidade de células ao final do processo de fermentação e ao mesmo tempo
influencia negativamente a quantidade de proteína expressa, deve-se recorrer a uma
análise de sensibilidade do modelo para se determinar o período pelo qual pode-se
proceder a fermentação, buscando-se uma maior concentração celular, sem que o
efeito de proteólise seja pronunciado. DABROWSKI e KUR (1998), ao expressarem as
DNA polimerases de Pyrococcus furiosus e Pyrococcus woesei em diferentes
concentrações celulares de E. coli BL21(DE3)pLysS recombinantes, também
observaram que a melhor concentração medida pela Abs
660nm
, é 0,3. DABROWSKI e
AHRING (2003), ao expressarem a dUTPase de Pyrococcus woesei encontraram o
mesmo resultado para a melhor concentração celular de expressão, tanto para a cepa
BL21(DE3)pLysS como para Rosetta BL21(DE3)pLysS. O efeito negativo da
concentração celular de indução também foi observado para expressão da subunidade
oxigenase da carbazol 1,9a-dioxigenase (CarAa) de Pseudomonas stutzeri em E. coli
BL21-SI (LARENTIS et al., 2005). Tanto na expressão da CarAa como da CarAd, a
temperatura apresentou efeitos negativos nas expressões, contudo no modelo para
expressão da enzima de P. furiosus o efeito isolado da temperatura foi positivo.
A partir da análise da influência da concentração celular, temperatura e tempo
sobre a expressão da enzima recombinante de P. furiosus e do modelo obtido, pode-
se prever experimentos que busquem a otimização da expressão desta proteína. O
modelo indica que a indução em Abs
600nm
em torno de 0,2 e temperatura de 37°C, por
6h, deve provocar um aumento de aproximadamente 340% na expressão desta
proteína, quando comparado com as condições padrão (Abs
600nm
=0,6,
64
Temperatura=35°C e Tempo=3 h). Este nível de expressão seria semelhante ao valor
encontrado nas condições de Abs
600nm
=0,3, Temperatura=35°C e Tempo=3 h
(303,4%), contudo, como em 6 h a quantidade de células obtidas no final do processo,
considerando um tempo de geração de 40 min, seria de aproximadamente 22 vezes
maior, se aumentaria o rendimento do processo. Deve-se ressaltar que esta análise
apenas mostra uma direção para a execução de outros planos na tentativa de
otimização do processo.
4.4 Caracterização
A partir da determinação das melhores condições de expressão, entre as
estudadas, partiu-se então para a caracterização da enzima recombinante expressa
nestas condições.
A figura 4.15a permite observar a atividade de éster hidrolase da enzima de P.
furiosus utilizando-se três substratos derivados da 4-metilumbeliferona (MUF): 4-
metilumbeliferil acetato (MUF-Ace), heptanoato (MUF-Hep) e palmitato (MUF-Pal), os
quais possuem comprimentos de cadeia da porção ácida diferentes, sendo que MUF-
Ace, MUF-Hep e MUF-Pal possuem, respectivamente, 2, 7 e 16 átomos de carbono. A
maior atividade da enzima recombinante foi para o MUF-Hep, mostrando a preferência
desta enzima por substratos de cadeia média. Levando-se em conta que esterases,
por definição (JAEGER et al., 1999), são enzimas que possuem a habilidade para a
hidrólise de acilgliceróis com ácidos graxos de cadeia curta (≤C10) e que lipases, por
outro lado, são caracterizadas como enzimas com habilidade de catalisarem a
hidrólise de acilgliceróis com ácidos graxos de cadeia longa (≥C10), a enzima
recombinante produzida a partir do gene PF2001∆60 trata-se de uma esterase com
especificidade para substratos com cadeia média.
Este resultado, embora condizente com os encontrados para outras esterases,
quando se observa a especificidade de algumas enzimas classificadas como lipases,
mostradas na tabela 4.3, pode-se notar que não existe muita diferença nas
especificidades de esterases e lipases, quando se leva em consideração apenas o
tamanho das cadeias. Contudo, deve-se observar que, mesmo com a preferência por
substratos com comprimento de cadeia similares ao de algumas esterases, todas as
lipases mostraram habilidade para catalisar a hidrólise de triacil gliceróis.
65
(a)
12,7
10,6
100,0
0 102030405060708090100110
Muf-Ace
Muf-Hep
Muf-Pal
atividade relativa (%)
(b)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0246810
tempo (min)
fluorescência (u.a.)
1mM PMSF
35
µ
g de proteína
Figura 4.15. Ensaios de especificidade e inibição da enzima recombinante. (a)
Atividade relativa da enzima recombinante em substratos com diferentes
comprimentos de cadeia da porção ácida: MUF-Ace (2 carbonos), MUF-Hep (7
carbonos) e MUF-Pal (16 carbonos); (b) Inibição da atividade esterásica da enzima
recombinante frente ao substrato MUF-Hep, pela adição de 1mM de PMSF.
Tabela 4.3. Especificidade de algumas esterases e lipases de alguns organismos.
Classificação da enzima e
Fonte
Substratos com ação
preferencial
(número de carbonos)
Referência
Esterase de Pyrococcus furiosus 4-metilumbeliferil acetato
(C2)
IKEDA e CLARK (1998)
Esterase de Pyrococcus abyssi p-nitrofenil pentanoato
(C5)
CORNEC et al. (1998)
Esterase de Archaeoglobus
fulgidus
p-nitrofenil hexanoato
(C6)
MANCO et al., (2000)
Esterases de Sulfolobus
solfataricus MT4 e P2
p-nitrofenil pentanoato
(C5)
MORANA et al. (2002);
KIM e LEE (2004)
Esterase de Thermoanaerobacter
tengcongensis
p-nitrofenil propionato
(C3)
ZHANG et al. (2003)
Esterase de Bacillus sp 4 p-nitrofenil butirato (C4) ATESLIER et al. (2005)
Lipase de Streptococcus sp N1 óleo de oliva (rico em
trioleína) (C18:1)
TRIPATHI et al. (2004)
Lipase de Bacillus
thermoleovorans ID-1
p-nitrofenil hexanoato
(C6) e tricaprilina (C8)
LEE et al. (1999)
Lipase de Bacillus
stearothermophilus P1
p-nitrofenil decanoato
(C10) e tricaprilina (C8)
SINCHAIKUL et al.
(2001)
Lipase de Bacillus
thermocatenulatus
p-nitrofenil decanoato
(C10) e tributirina (C4)
SCHIMIDT-DANNERT,
et al. (1996)
Lipase de Bacillus sp THL027 tricaprilina (C8) DHARMISTHITI e
LUCHAI (1999)
Como dito anteriormente na seção 4.1, a enzima de P. furiosus deste trabalho
é codificada por um gene diferente daquele identificado por IKEDA e CLARK (1998) e,
portanto, se trata de uma nova esterase, o que fica mais evidente pelo fato das duas
enzimas possuírem especificidades diferentes, pois uma hidrolisa mais
66
especificamente MUF-Hep e a outra MUF-Ace, como pode ser observado na tabela
4.3.
Ainda é importante ressaltar que, através do teste de atividade proteásica
utilizando-se caseína como substrato, não foi possível se detectar a hidrólise de
ligações peptídicas, sugerindo que a enzima recombinante, codificada pelo gene
PF2001∆60, não possui esta habilidade.
A figura 4.15b mostra um experimento cinético típico realizado com a esterase
de P. furiosus contra o substrato MUF-Hep a 37°C, onde se pode visualizar a inibição
da enzima por PMSF, sugerindo fortemente que uma serina participe de seu sítio
catalítico. Este comportamento é típico para inúmeras esterases e lipases (LEE, et al.
1999; SINCHAIKUL, et al. 2001; MORANA et al., 2002; KIM e LEE, 2004; ATESLIER
et al., 2005), as quais possuem, como já comentado, sítios catalíticos formados por
uma tríade composta pelos resíduos Ser-Asp-His. Contudo, nem todas esterases e
lipases são inibidas por PMSF, como, por exemplo, a esterase de
Thermoanaerobacter tengcongensis (ZHANG et al., 2003) e a lipase de Acinetobacter
calcoaceticus LP009 (DHARMSTHITI et al., 1998). DAS et al. (2000) sugere que estas
enzimas possuam uma estrutura específica em torno da serina catalítica que a proteja
da ação deste inibidor.
A análise da temperatura ótima de atuação e termoestabilidade da esterase
recombinante de P. furiosus, cujos resultados são apresentados na figura 4.16,
revelou que a enzima possui maior atividade a 60°C e mantém 92% de sua atividade
após incubação a 75°C por 120 min, sendo que a 100°C perde quase toda sua
atividade nos primeiros minutos de incubação. Estes resultados são diferentes,
quando comparados com outras enzimas de Pyrococcus furiosus, como pode ser
verificado na tabela 4.4. Isto pode sugerir que a enzima recombinante necessite de
fatores externos para sua estabilização, como as conhecidas aspartil-tRNA sintetase
de Pyrococcus sp. KOD1 (FUJIWARA et al., 1996) e a aspartato transcarbamilase de
Pyrococcus abyssi (PURCAREA et al., 1997). A aspartil-tRNA sintetase recombinante
de Pyrococcus sp. KOD1, embora possua uma grande termoestabilidade, com um
tempo de meia vida de 17 h a 90°C, apresenta uma temperatura ótima de 65°C, que é
20°C inferior à temperatura ótima de crescimento deste microrganismo. A temperatura
ótima desta enzima foi aumentada para 75°C com a adição de poliaminas, indicando a
necessidade destes componentes para aumentar a eficiência catalítica da enzima em
altas temperaturas (FUJIWARA et al., 1996). Já a aspartato transcarbamilase
recombinante de Pyrococcus abyssi apresenta somente 60% de sua atividade depois
de tratada a 90°C por 20min, o que é bem inferior quando comparada com a enzima
nativa. Além disso, os autores sugerem, por terem observado efeitos similares durante
67
a purificação da enzima nativa, que a mesma necessite de outros componentes
celulares para sua estabilização (PURCAREA et al., 1997).
Contudo, a esterase de P. furiosus identificada neste trabalho pode ser, uma
proteína extracelular, o que sugeriria que a enzima não necessite de fatores
extrínsecos para sua atividade e estabilidade. A hipótese de que se trataria de uma
enzima extracelular se deve aos fatos de que foi identificado um possível peptídeo
sinal em sua região aminoterminal e que CORNEC et al. (1998) não detectaram
atividade esterásica no extrato celular de Pyrococcus furiosus. Portanto, a explicação
para a baixa temperatura ótima deve recair sobre outros aspectos, como, por exemplo,
o fato de que ela não esteja sendo enovelada corretamente ou mesmo que não esteja
sofrendo as modificações pós-traducionais necessárias, perdendo assim, suas
características intrínsecas naturais.
(a)
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
30 40 50 60 70 80 90
temperatura (°C)
atividade relativa (%)
(b)
0
20
40
60
80
100
120
0 20406080100120
tempo (min)
atividade relativa (%)
75°C
100°C
Figura 4.16. Efeito da temperatura (a) e análise de termoestabilidade (b) da enzima
recombinante.
Outro aspecto importante na análise destes resultados é que a esterase
recombinante de P. furiosus está fusionada a um tag de tiorredoxina (TrxA) de E. coli.
Esta proteína possui 11,7 kDa, conferindo 24% da massa molecular total da enzima
recombinante, o que pode estar modificando seu comportamento frente à temperatura.
É sabido, no entanto, que a TrxA possui uma termoestabilidade intrínseca, a qual é
mantida em alguns casos quando de sua fusão a outras proteínas (LAVALLIE et al.,
1993), facilitando a purificação da proteína em estudo. Contudo, PEDONI et al. (2001)
demonstraram que a 90°C, aproximadamente 90% da TrxA encontra-se desnaturada,
o que então pode realmente explicar os resultados obtidos para a esterase
recombinante fusionada com TrxA.
Ainda que os resultados da caracterização da enzima obtida possam ser
considerados inferiores a outras enzimas de P. furiosus, quando extende-se esta
comparação a outras esterases e lipases de organismos termofílicos, cujas
68
propriedades estão descritas na tabela 4.5, pode-se observar que as características
obtidas para a esterase recombinante de P. furiosus conferem um grande potencial a
esta enzima. Além disso, quando estes resultados são comparados com as lipases de
Rhizomucor miehei e de Thermomices lanuginosus, enzimas amplamente
comercializadas para a indústria alimentícia e de detergentes (JAEGER e REETZ,
1998), as quais apresentam temperaturas ótimas de atuação de 40 e 60°C,
respectivamente (SAXENA et al., 1999), há a indicação de que não seja necessário,
para aplicações tecnológicas, que se retire o tag de TrxA da esterase recombinante de
P. furiosus.
Tabela 4.4. Algumas enzimas de Pyrococcus furiosus, temperaturas ótimas de
atuação e termoestabilidade.
Enzima Temperatura ótima Estabilidade Referência
β glicosidase
105
o
C 80 a 90% a 100°C
por 30 h
VOORHORST et al.
(1995)
α amilase
100
o
C 50% a 120°C por 2h
KOCH et al. (1990)
α amilase
a
100
o
C 85% a 100°C por 3 h LADERMAN et al.
(1993)
α amilase
b
100
o
C ~80% a 100°C por
2 h
JØRGENSEN et al.
(1997)
Hidrogenase ~100
o
C N.D. PEDRONI et al.
(1996)
Pirrolidona
carboxil peptidase
95
o
C N.D. TSUNASAWA et al.
(1998)
Esterase 100
o
C 100% a 100
o
C por
120 min
IKEDA e CLARK,
(1998)
a
enzima intracelular;
b
enzima extracelular; N.D. = Não Determinado
Tabela 4.5. Temperatura ótima de atuação e termoestabilidade de algumas esterases
e lipases.
Enzima Temperatura
ótima
Estabilidade Referência
Esterase de
Thermoanaerobacter
tengcongensis
70°C ~40% a 70°C por 2 h ZHANG et al. (2003)
Esterase de Bacillus
acidocaldarius
70°C ~90% a 75°C por 2 h MANCO et al. (1998)
Esterase de Bacillus
stearothermophilus
N. D. 50% a 70°C por 5 h
WOOD et al. (1995)
Esterase de Bacillus
sp 4
65°C ~20% a 75°C por 1 h
ATESLIER et al. (2005)
Lipase de Bacillus
coagulans BTS-3
55°C 50% a 55°C por 2 h KUMAR et al. (2005)
Lipase de Bacillus
stearothermophilus
P1
55°C 60% a 55°C por 6 h SINCHAIKUL et al.
(2001)
Lipase de Bacillus
thermoleovorans ID-1
75°C 60% a 70°C por 0,5 h LEE et al. (1999)
69
4.5 Purificação
Uma vez que a proteína apresentou atividade, o próximo passo foi purificá-la,
utilizando a cromatografia de afinidade, como descrito na seção 3.5. Para a
purificação, a expressão foi conduzida em 1 L de meio, em frasco agitado, nas
melhores condições determinadas pelo planejamento experimental (Abs
600nm
=0,3,
Temp=35°C e Tempo=3 h). Ao término da expressão, as células foram lisadas e a
atividade da fração solúvel foi determinada a 60°C com MUF-Hep. 8 mL da fração
solúvel foi aplicada na coluna e a proteína recombinante foi eluída na primeira fase da
purificação, com 150 mM de imidazol. A atividade da fração purificada também foi
dosada nas mesmas condições. A figura 4.17 e a tabela 4.6 ilustram os resultados da
purificação.
Figura 4.17. Análise do processo de purificação da esterase recombinante de
Pyrococcus furiosus. Eletroforese desnaturante não redutora em gel de poliacrilamida
15% corada por prata (a) e revelada pela atividade em MUF-Hep (b). 1) Fração solúvel
aplicada na coluna; 2) Fração não adsorvida; 3) Proteína recombinante eluída com
150mM de imidazol. PM é o padrão de massa molecular.
Tabela 4.6. Avaliação do processo de purificação da esterase de Pyrococcus furiosus.
Proteína Total
(mg)
Atividade Total
(U)
Atividade
Específica
(U/mg)
Rendimento
(%)
Fração solúvel
bruta
8,32 29,6 3,9 100
Coluna de Ni-
NTA
0,84
3,8
4,5 12,8
70
Como pode ser observada na figura 4.17, a esterase foi levada a um nível de
pureza acima de 99% (determinado por densitometria do gel corado por prata). Além
disso, a tabela 4.6 mostra que aproximadamente 10% das proteínas solúveis da célula
recombinante correspondem à enzima expressa, o que demonstra um bom rendimento
em termos de proteína expressa. Contudo, quando se analisa o rendimento da
purificação em termos de atividade, o mesmo foi de aproximadamente 13%, o que é
baixo quando comparado, por exemplo, ao processo de purificação por cromatografia
de afinidade da lipase de B. thermocatenulatus, o qual reucuperou 60% da atividade
(SCHLIEBEN et al., 2004). Neste caso, como a expressão, a purificação e as
dosagens de atividade das frações foram feitas em intervalos de tempo muito grandes
(superiores a 30 dias), acredita-se que esteja ocorrendo a desativação da esterase no
processo de armazenamento.
4.6 Modelagem estrutural comparativa da lipase de Pyrococcus furiosus
ALMEIDA (2001), através do alinhamento com outras seqüências de lipases,
identificou o pentapetídeo Gly147-Phe148-Ser149-Met150-Gly151 como pertencente
ao sítio catalítico da esterase, faltando caracterizar o Asp e a His participantes da
tríade, além dos resíduos do buraco do oxiânion. Desta forma, na tentativa de melhor
identificar os resíduos do sítio ativo e de se explorar as razões estruturais pelas quais
a esterase de P. furiosus possui características de termoestabilidade e termoatividade,
buscou-se construir um modelo estrutural para esta enzima, o qual foi obtido seguindo-
se os procedimentos descritos na seção 3.7.
4.6.1 Escolha do molde
Após serem obtidos os alinhamentos no CLUSTAL W e no T-COFFEE, pode-
se observar de forma qualitativa que os alinhamentos com o T-COFFEE foram
melhores que os do CLUSTAL W, pois se observou uma maior freqüência de
pareamentos corretos entre as tríades catalíticas das seqüências envolvidas. Estes
resultados, embora obtidos de uma avaliação qualitativa, estão de acordo com os
resultados de NOTREDAME et al. (2000), sobre a eficiência de vários programas de
alinhamento, apontando que o T-COFFEE, por unir dois tipos de algoritmos de
alinhamento, global e local, apresenta uma melhor eficiência.
Após esta primeira investigação, foram analisados os alinhamentos, no T-
COFFEE, de todas seqüências que resultaram um Score maior ou igual a 55, quando
alinhadas com a esterase de P. furiosus. Estas enzimas estão relacionadas na tabela
4.7 e seus respectivos alinhamentos com a lipase de P. furiosus podem ser
visualizados no anexo II.
71
Os alinhamentos contidos no anexo II permitem concluir que a maioria das
tríades (Ser – Asp – His) catalíticas das enzimas não se encontram alinhadas e,
mesmo quando isso ocorre, um grande número de gaps demonstra a sua baixa
qualidade, o que, em princípio, impossibilitaria a obtenção de um modelo estrutural.
O fato de não ter sido encontrado, no Lipase Engineering Database, nenhum
molde que proporcionasse a construção de um bom modelo para a esterase de P.
furiosus, pode ser explicado pelos seguintes fatos: esterases e lipases, como já
comentado, não possuem grande similaridade entre seqüências primárias, sendo
possível somente encontrar maiores similaridades entre famílias relacionadas; a
esterase de P. furiosus, por não se enquadrar em nenhuma das famílias já
relacionadas, e também por se constituir de uma proteína de Archaea (domínio da vida
onde até agora poucas estruturas de esterases e lipases foram descritas) pode possuir
um dobramento diferente das enzimas até aqui descritas.
Este exercício inicial da busca de uma estrutura de referência para se modelar
a estrutura da esterase de P. furiosus, embora não tenha dado bons resultados,
permitiu identificar o Asp233 e a His264, como os outros participantes da tríade
catalítica desta enzima.
Tabela 4.7. Relação das enzimas com estruturas no Lipase Engineering Database que
possuem um Score de alinhamento com a lipase de P. furiosus maior ou igual a 55.
Este Score foi obtido pelo alinhamento no T-COFFEE.
Enzima Código no PDB Organismo fonte
Lipase (E.C. 3.1.1.3) 1LBS
Candida antarctica
Cloroperoxidase T (E.C. 1.11.1.10) 1A7U_A
Streptomyces aureofaciens
Bromoperoxidase A1 (E.C. 1.11.1.10) 1A8Q
Streptomyces aureofaciens
Cloroperoxidase F (E.C. 1.11.1.10) 1A8S
Pseudomonas fluorescens
Bromoperoxidase A2 (E.C. 1.11.1.10) 1BRO_A
Streptomyces aureofaciens
Lipase (E.C. 3.1.1.3) 1ETH_A
Sus scrofa
Lipase (E.C. 3.1.1.3) 1GPL
Cavia porcellus
Lipase (E.C. 3.1.1.3) 1RP1
Canis familiaris
Acetilcolina esterase (E.C. 3.1.1.7) 1C2O_
A
Electrophorus electricus
Acetilcolina esterase (E.C. 3.1.1.7) 1MAA_A
Mus musculus
Desta forma, tentou-se buscar no Protein Data Bank (PDB), o banco de dados
de estrutura de proteínas, uma estrutura que pudesse servir como molde para se
modelar a enzima em estudo. Com este objetivo, utilizou-se o THREADER, visto que
este programa utiliza a metodologia de threading que tem como vantagem, ao simples
alinhamento, o fato de que muitas proteínas, mesmo não tendo uma estrutura primária
muito conservada, mantêm o mesmo dobramento tridimensional, e, como o
THREADER procura ajustar estruturalmente a seqüência que se quer modelar a um
possível molde, isto poderia ser mais eficiente, no caso estudado.
72
Analisando-se o resultado do THREADER, verificou-se que o melhor molde
seria a prolil oligo peptidase muscular de Sus scrofa (FÜLÖP et al., 1998), cuja
estrutura pode ser visualizada na figura 4.18a cujo código no PDB é 1QFM. Esta prolil
oligo peptidase é uma proteína com 710 resíduos de aminoácidos, divididos em dois
domínios bem característicos, o domínio propulsor β, que se estende do resíduo 73 ao
427 e o domínio catalítico, que vai do resíduo 1 até o 72 e do 428 ao 710. Esta enzima
está envolvida na hidrólise de pequenos peptídeos, com não mais de 30 resíduos, na
região carbóxi terminal de prolinas. Dentre os seus substratos, pode-se citar as
angiotensinas I e II, bradiquinina, oxitocina e vasopressina (FÜLÖP et al., 1998).
Figura 4.18. Diferentes representações da estrutura da prolil oligo peptidase muscular
de Sus scrofa empregada como molde para a construção do modelo estrutural neste
trabalho. (a) Visão global da enzima mostrando seus dois domínios, o propulsor β na
parte inferior, e o catalítico na superior. Colorida em degradée da porção amino
terminal, em azul, até a carbóxi terminal, em vermelho. (b) Visão do domínio propulsor
β, enfatizando sua semelhança com uma pá propulsora, e a cavidade central onde o
substrato entra para encontrar o sítio ativo. Colorida por estrutura, magenta (α
hélices), amarelo (folhas β) e azul e cinza (alças). (c) Visão do domínio catalítico
enfatizando seu dobramento αβ com as folhas β envoltas pelas α hélices. Além disso,
é ressaltado na representação spacefill a tríade catalítica Ser554 (vermelho) – Asp641
(azul) – His680 (verde). As cores restantes representam as mesmas estruturas da
figura b. Estas figuras foram construídas no RasMol v2.7.1 para Windows.
73
O domínio propulsor β é chamado desta forma, pois ele é composto quase que
exclusivamente de folhas β, arranjadas espacialmente em uma forma que lembra uma
hélice propulsora (figura 4.18b). Este domínio tem como função principal evitar a
entrada de proteínas maiores no sítio ativo da enzima, regulando assim, a sua
atividade.
O domínio catalítico, apresentado na figura 4.18c, possui o dobramento de αβ
hidrolase, com a tríade catalítica, Ser554 – Asp641 – His680, ocupando uma grande
cavidade entre os dois domínios da enzima.
Embora, em uma primeira análise, as prolil oligo peptidases e lipases possam
parecer enzimas distantes, deve-se lembrar que lipases e prolil oligo peptidases
possuem uma relação estrutural e estão envolvidas evolutivamente (POLGÁR, 1992).
Além disso, deve-se ressaltar que a análise do THREADER recai apenas sobre o
domínio catalítico da 1QFM, que apresenta muitas semelhanças estruturais com
esterases e lipases, pois pertence à família das αβ hidrolases e possui a mesma tríade
catalítica. Já o domínio propulsor β não apresenta semelhança alguma de sua
seqüência primária com a esterase de P. furiosus. Todos estes dados dão suporte à
adoção do domínio catalítico da 1QFM como estrutura molde para a modelagem.
4.6.2 Alinhamento e Modelagem
Alinhou-se apenas parte do domínio catalítico compreendido entre os resíduos
428 e 710 da prolil oligo peptidase muscular de Sus scrofa com a esterase de P.
furiosus sem os 20 primeiros resíduos pertencentes ao peptídeo sinal. Este
alinhamento foi gerado pelo T-COFFEE e validado, comparando-se as estruturas
secundárias da 1QFM e da esterase de P. furiosus, que foi calculada utilizando-se os
programas GOR4, HNN, SOPM e SOPMA. Como pode ser visualizado na figura 4.19,
o resíduo Asp233 da esterase de P. furiosus não está alinhado com o Asp641 da
1QFM, o que gerou um modelo com o resíduo Asp233 em uma orientação contrária,
que não convergia para a tríade catalítica, impossibilitando a formação de pontes de
hidrogênio entre os resíduos Ser149, His264 e Asp233 da esterase. Como o Asp233
está localizado em uma alça, ou seja, uma região variável na estrutura protéica, fez-se
novos alinhamentos onde foi variada principalmente a posição deste resíduo em
relação ao Asp641 da prolil oligo peptidase. Para que se avaliasse estes novos
alinhamentos, os quais podem ser acessados no anexo III, mediu-se as distâncias
entre os átomos Oγ-Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-Asp233, que participam de
pontes de hidrogênio no sítio catalítico. As distâncias para cada alinhamento estão
74
relacionados na tabela 4.8. Embora a variação da posição do Asp233 tenha causado
mudanças nas distâncias entre os átomos medidos, quando estas distâncias são
comparadas com as do molde, ou mesmo com as de outras lipases e esterases, pode-
se observar que os átomos Oγ-Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-Asp233 do
modelo ainda estão relativamente afastados.
Figura 4.19. Alinhamento inicial da seqüência compreendida entre os resíduos 428 a
710 da prolil oligo peptidase de Sus scrofa (1qfm-domcat) e a seqüência da esterase
de P. furiosus (pfuqfmt6). Em laranja são mostrados os pentapeptídeos das duas
enzimas e em vermelho os Asp e His das tríades catalíticas. A estrutura secundária da
1qfm-domcat é mostrada, sendo que setas verdes, retângulos amarelos e linhas,
representam folhas β, α hélices e alças, respectivamente.
As pequenas alterações na posição do Asp233 não permitiram atingir uma
distância entre os átomos Oγ-Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-Asp233 que fosse
condizente com a formação de pontes de hidrogênio, de forma que um último
alinhamento (figura 4.20) foi utilizado para se construir o modelo da esterase de P.
furiosus.
Contudo, as distâncias entre os átomos Oγ-Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e
Oδ-Asp233 com este alinhamento ainda ficaram superiores àquelas mostradas na
tabela 4.8, para as enzimas com estrutura determinada. Isto ocorre principalmente
pelo fato de que os resíduos Asp233 e His264, estão situados em uma região de baixa
homologia e com muitos gaps, o que dificulta a ação do MODELLER em definir a
posição correta destes resíduos nas alças em que se situam.
75
Tabela 4.8. Distâncias entre os átomos Oγ-Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-
Asp233, que participam de pontes de hidrogênio no sítio catalítico, dos modelos
obtidos com os alinhamentos do anexo III, prolil oligo peptidase muscular de Sus
scrofa (1QFM) utilizada como molde e de algumas esterases e lipases.
distâncias entre os átomos em Å
Descrição estrutura
Nδ-His e Oδ-Asp Oγ-Ser e Nε-His
Modelo 1 (pfuqfmt1) pfuqfmt1 5,57 5,00
Modelo 2 (pfuqfmt2) pfuqfmt2 3,38 4,72
Modelo 3 (pfuqfmt3) pfuqfmt3 9,95 5,03
Modelo 4 (pfuqfmt4) pfuqfmt4 12,31 4,77
Modelo 5 (pfuqfmt5) pfuqfmt5 3,73 4,03
Modelo 6 (pfuqfmt6) pfuqfmt6 2,60* 3,42*
Prolil oligopeptidase 1QFM 2,77 2,96
Lipase de B. cepacia 3LIP 2,89 2,78
Lipase de P. camembertii 1TIA 2,84 2,82
Lipase de R. miehei 3TGL 2,77 2,87
Lipase de C. familiaris 1RP1 2,91 2,66
cloroperoxidase F de P.
fluorescens
1A8S 2,69 2,81
Lipase de C. rugosa 1CRL 2,71 2,81
Lipase de S. exfoliatus 1JFR 3,12 2,69
Lipase de B. subtilis 1I6W 2,68 2,77
Lipase de C. viscosum 1CVL 1,79 2,70
Lipase de C. antarctica 1TCA 1,90 3,12
Cutinase de F. solani pisi 1AGY 1,84 2,7
A
cetil colina esterase de
E. electricus
1C2B 2,86 2,80
Acil esterase de A.
acidocaldarius
1EVQ 3,20 2,70
*após procedimentos de otimização
Visando melhorar estas distâncias e, conseqüentemente, a qualidade do
modelo, utilizou-se o SpdbViewer para otimizar a posição da alça onde a His264 está
localizada. Assim, foram fixados os resíduos Asn254 e Pro272, e empregando-se o
SpdbViewer, foram calculadas novas possíveis orientações espaciais para os resíduos
pertencentes a esta alça. Após este procedimento, também modificou-se o rotâmero
da cadeia lateral do Asp233 e, com isto, foram obtidas as distâncias de 2,89 e 3,60Å
para os átomos Nδ-His264 e Oδ-Asp233, Oγ-Ser149 e Nε-His264, respectivamente.
Após o processo de otimização destas distâncias (com 100 passos de Steepest
Descent e 200 passos de Gradientes Conjugados), conseguiu-se diminuí-las para 2,60
e 3,42 Å, encontrando-se dentro de uma faixa aceitável quando comparadas àquelas
da tabela 4.8. As comparações entre o domínio catalítico da prolil oligo peptidase e o
modelo da esterase podem ser observados na figura 4.21.
76
Figura 4.20. Alinhamento da seqüência compreendida entre os resíduos 428 a 710 da
prolil oligo peptidase de Sus scrofa (1qfm-domcat) e a seqüência da esterase de P.
furiosus (pfuqfmt6). Em laranja são mostrados os pentapeptídeos das duas enzimas e
em vermelho os Asp e His das tríades catalíticas. A estrutura secundária da 1qfm-
domcat é mostrada, sendo que setas verdes, retângulos amarelos e linhas,
representam folhas β, α hélices e alças respectivamente.
Como pode ser observado, e já seria de se esperar, em se tratando de
modelagem comparativa, o modelo se assemelha muito ao molde, contudo a
disposição do sítio ativo difere um pouco, principalmente na posição do Asp233. Estas
diferenças foram causadas pela baixa homologia entre as seqüências nesta região,
como já comentado antes. Porém, deve ser ressaltado que uma pequena variação
nesta disposição também é observada entre outras esterases e lipases.
Estes resultados corroboram os obtidos pelos outros alinhamentos, feitos na
tentativa de se encontrar um molde para a esterase de P. furiosus (anexo II), com
relação à identificação dos resíduos Ser149, Asp233 e His264 como pertencentes à
tríade catalítica. Além disso, como colocado por PLEISS et al. (2000), um dos
resíduos do buraco do oxiânion é o que sucede a serina catalítica no pentapeptídeo
conservado, portanto a Met150. Contudo, o outro resíduo do buraco do oxiânion,
segundo estes pesquisadores, não se situa em uma região conservada e sim em uma
alça no topo da folha β central 3. Analisando esta região no modelo, é possível sugerir
que a Tyr75 seja o outro resíduo formador do buraco do oxiânion.
77
Figura 4.21. Representações das estruturas e dos sítios catalíticos da prolil oligo
peptidase muscular de Sus scrofa e do modelo da esterase de P. furiosus. (a)
sobreposição entre o domínio catalítico da prolil oligo peptidase (amarelo) e o modelo
da esterase de P. furiosus (verde); (b) sítio catalítico da prolil oligo peptidase; c) sítio
catalítico da esterase de P. furiosus. Em cinza claro estão representados os átomos de
carbono, em azul os de nitrogênio e em vermelho os de oxigênio. Os números indicam
as distâncias em angstrons entre os átomos ligados por barras. Esta figura foi
construída utilizando-se o programa SpdbViewer v3.7b2
4.6.3 Validação
A validação do modelo foi feita, avaliando-se o gráfico de Ramachandran
gerado pelo PROCHECK, cuja análise revelou que 98,6% dos resíduos estão dentro
das regiões mais favoráveis e que somente três resíduos (Tyr136, Trp194 e Arg232)
estão em regiões desfavoráveis, demonstrando a relativa qualidade do modelo. Deve
ser ressaltado que a serina catalítica está em uma região pouco favorável, contudo, a
serina da prolil oligo peptidase também ocupa a mesma região. Este fato também já foi
verificado para outras enzimas da classe das αβ hidrolases, visto que o pentapeptídeo
forma uma alça rígida em um motivo folha β – alça – α hélice, o que acaba por forçar a
serina a adotar uma conformação desfavorável dos ângulos φ e ψ da cadeia principal
(SCHRAG e CYGLER, 1997). Além disso, análises com o WHAT-CHECK, PROVE e
ERRAT também indicaram uma qualidade satisfatória para o modelo.
78
4.7 Razões estruturais para a termoestabilidade da esterase de P. furiosus
O processo de desnaturação térmica de uma proteína, o qual pode ser descrito
pela equação abaixo, ainda é um processo onde muitas dúvidas permanecem,
principalmente com relação às razões estruturais que governam este fenômeno, como
por exemplo: O que faz uma enzima mesofílica atuar em temperaturas elevadas?
Quais são as razões que fazem algumas enzimas de organismos termofílicos e
hipertermofílicos apresentarem temperaturas ótimas de atuação menores que àquelas
de seus habitats naturais? Existe uma regra geral que seja capaz de responder estas
e outras perguntas? Até o presente momento não existe uma regra geral que possa
ser aplicada a todos os casos, pois, mesmo com evidências que englobem uma boa
parte das proteínas descritas, sempre são encontradas exceções (VIELLE e ZEIKUS,
2001). Contudo, embora as evidências estruturais não possam ser aplicadas de forma
generalizada, elas dão uma boa direção para os estudos e explicações das razões
estruturais que governam a termoatividade e termoestabilidade de uma determinada
enzima.
Proteína Nativa → Proteína Desnaturada
∆G
desn
= ∆H
desn
-T∆S
desn
Onde:
∆G
desn
, ∆H
desn
e ∆S
desn
são, respectivamente, as variações de energia livre, de
entalpia e de entropia do processo de desnaturação na temperatura T.
Desta forma, entre os principais fatores estruturais intrínsecos que podem
estabilizar uma proteína pode-se citar: a composição em aminoácidos, que de certa
forma está relacionada às interações hidrofóbicas e aromáticas, bem como com pares
iônicos; a presença de pontes de enxofre e de hidrogênio; as interações entre
subunidades; empacotamento e redução da acessibilidade ao solvente da superfície
hidrofóbica; as interações entre os terminais amino e carbóxi; entre outros (VIELLE e
ZEIKUS, 2001).
Com a intenção de se fazer uma inferência sobre as razões da
termoestabilidade da esterase de Pyrococcus furiosus, alguns destes fatores foram
analisados em sua seqüência de aminoácidos e no modelo estrutural.
Uma das primeiras observações que pode ser feita com relação à
termoestabilidade é quando se analisa o alinhamento entre a esterase de P. furiosus e
o domínio catalítico da 1QFM na figura 4.20. Pode-se notar que as alças da primeira
são menores quando comparadas com as da segunda, sugerindo uma estrutura mais
79
compacta e rígida, o que poderia estar contribuindo para a sua maior
termoestabilidade.
Abaixo, na tabela 4.9, é apresentada a composição de aminoácidos da
esterase de Pyrococcus furiosus comparada com a do domínio catalítico da 1QFM e
também com uma composição média de aminoácidos de proteínas de organismos
mesofílicos e hipertermofílicos. Nesta tabela, pode-se observar um aumento na
presença de aminoácidos carregados, quando comparado com a 1QFM e a média de
proteínas mesofílicas, respectivamente. Além disso, a composição de aminoácidos
carregados, entre a esterase de P. furiosus e a média encontrada em proteínas
hipertermofílicas, é considerada igual. Contudo, a maior parte destes aminoácidos
carregados, segundo o modelo estrutural, estão situados longe da superfície da
proteína, onde não são tidos como agentes estabilizadores. Mesmo assim, é possível
citar as interações atrativas entre os aminoácidos: Lys37 (superfície da enzima) -
Glu51 (inacessível ao solvente); Glu240 (superfície não tão exposta) – Lys237
(inacessível ao solvente); Arg266 (superfície não tão exposta) – Glu273 (inacessível
ao solvente) e uma rede de interações atrativas entre a Lys163 (superfície da enzima)
- Glu161 (superfície não tão exposta) – Lys126 (superfície não tão exposta) – Glu164
(inacessível ao solvente) – Lys133 (inacessível ao solvente). Estas interações têm um
caráter interessante, pois se estendem da superfície até o interior da enzima,
sugerindo um processo de ancoramento das partes mais externas e um possível
mecanismo de proteção à ação da temperatura.
Outro aspecto que pode ser observado é a redução da quantidade de Asn+Gln,
os quais são aminoácidos termolábeis e também de cisteína, que embora seja
termolábil, pode provocar, através da formação de pontes dissulfeto, um efeito
termoestabilizador pela redução da entropia do estado desnaturado (VIELLE e
ZEIKUS, 2001). Desta forma, as cisteína presentes não parecem ter uma contribuição
para a termoestabilidade. A esterase de P. furiosus apresentou um conteúdo de
aminoácidos apolares maior do que o molde e a média encontrada nos organismos
mesofílicos e hipertermofílicos, o que pode indicar algum efeito adicional desta família
de aminoácidos na termoestabilização desta enzima.
80
Tabela 4.9. Composição em aminoácidos de proteínas de organismos mesofílicos,
hipertermofílicos, do domínio catalítico da 1QFM e da esterase de P. furiosus.
Aminoácidos Mesofílicos
(%)*
Hipertermofílicos
(%)*
Domínio
Catalítico
1QFM (%)
Esterase de
P. furiosus
(%)
Ala 8,1 6,8 6,7 3,7
Gly 6,7 7,2 9,9 8,6
Met 2,4 2,3 2,1 1,9
Ser 6,1 5,5 5,3 5,6
Cys 1,1 0,9 2,1 0,7
His 2 1,6 4,2 1,9
Asn 4,9 3,5 4,2 4,5
Thr 5,1 4,3 4,9 4,5
Asp 5 4,6 6,4 4,9
Ile 7,4 7,8 8,1 5,6
Pro 3,8 4,3 4,6 5,6
Val 6,4 8,1 6 9,3
Glu 6,5 8,6 2,8 7,5
Lys 6,8 7,6 7,1 9,3
Gln 4 1,8 3,5 0,7
Trp 1 1,1 1,4 3,4
Phe 4,6 4,4 4,6 4,9
Leu 10,4 10,2 8,1 7,8
Arg 4,3 5,6 3,2 5,2
Tyr 3,3 3,8 4,6 4,5
Ala+Gly 14,8 14 16,6 12,3
Asp+Glu 11,5 13,2 9,2 12,4
Lys+Arg+His 13,1 14,8 14,5 16,4
Ser+Thr 11,2 9,8 10,2 10,1
Asn+Gln 8,9 5,3 7,7 5,2
Ile+Leu+Met+Val 26,6 28,4 24,3 24,6
Phe+Trp 8,9 9,3 10,6 12,8
*Dados retirados de VIELLE e ZEIKUS (2001) que foram calculados a partir dos
genomas de B. subtillis, Campylobacter jejuni, E. coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter
pylori, Neisseria meningitidis, Rickettsia prowazekii e Synechocystis para os mesofílicos e A.
fulgidus, A. pernix, M. jannaschii, P. abyssi, P. horikoshii e T. maritima para os
hipertermofílicos
.
O conteúdo de Trp+Phe, que são aminoácidos apolares que possivelmente
podem estar envolvidos em interações aromáticas e cátions π, apresentou um
aumento principalmente pela maior presença de Trp. Estas interações são tidas como
estabilizadoras em proteínas termofílicas. O número de prolinas na esterase de P.
furiosus também foi maior. As prolinas são tidas como aminoácidos que diminuem a
energia livre do estado desnaturado, portanto promovendo uma maior
termoestabilização das proteínas (VIELLE e ZEIKUS, 2001). Além disso, é importante
salientar que, dentre as nove prolinas da esterase, seis estão situadas em alças,
podendo estar contribuindo para uma menor flexibilidade e, conseqüentemente, para
uma maior proteção contra a ação da temperatura.
81
Outro aspecto que pode estar contribuindo para a termoestabilização da
esterase de P. furiosus é a interação entre os terminais amino e carbóxi desta
proteína, pois, como se pode observar na figura 4.22, o modelo sugere a existência de
uma rede de interações através de pontes de hidrogênio (figura 4.22a), hidrofóbicas e
atrativas (figura 4.22b). Como, em geral, estas regiões são tidas como flexíveis,
portanto mais suscetíveis ao processo de desnaturação térmica, estas interações que,
em princípio, sugerem um ancoramento dos dois terminais da proteína com a hélice
α1, podem estar contribuindo para a estabilização desta enzima em altas
temperaturas.
Figura 4.22. Interações entre as regiões amino e carbóxi terminais da esterase de P.
furiosus. Pontes de hidrogênio (a); interações hidrofóbicas e atrativas (b). Os terminais
amino e carbóxi, assim como as hélices α1 e α8, estão representados em ribon
(verde), as pontes de hidrogênio com linhas tracejadas em rosa, e os aminoácidos na
figura b foram coloridos conforme suas características químicas: carregados
positivamente (azul); carregandos negativamente (vermelho); hidrofóbicos (cinza);
polares não carregados (amarelo).
82
5 CONCLUSÕES
Neste trabalho, isolou-se o gene PF2001 de Pyrococcus furiosus, o qual,
depois de clonado e expresso, mostrou codificar uma nova esterase termoestável. Foi
construído um modelo estrutural, através do qual foi possível confirmar os resíduos do
sítio ativo e sugerir as razões para a termoestabilidade da enzima. Abaixo são
descritas as principais conclusões obtidas durante este trabalho.
5.1 Clonagem e expressão do gene PF2001
Após inúmeras abordagens para se clonar e expressar o gene PF2001 em
nível que proporcionasse a caracterização futura da enzima, verificou-se a influência
de um peptídeo sinal nesta proteína, composto pelos primeiros 20 aminoácidos
aminoterminais. Este peptídeo sinal, que provavelmente serve como sinalização para
excreção da proteína, possui um alto grau de hidrofobicidade, como observado para a
lipase de Candida rugosa (ALBERGHINA e LOTTI, 1997), o que poderia estar
dificultando sua expressão. Quando se clonou o gene PF2001 sem os primeiros 60
nucleotídeos responsáveis pela codificação desta seqüência sinalizadora
(PF2001∆60), fusionado à tioredoxina, foi possível detectar o produto do gene
clonado.
Para melhorar a expressão deste gene, foi executado um planejamento
experimental variando-se a concentração celular na indução, a temperatura e o tempo
de cultivo após a indução, através do qual foi possível observar que as melhores
condições empregadas foram Abs
600nm
=0,3, Temperatura=35°C e Tempo=3 h. Além
disso, verificou-se o alto grau de correlação entre as variáveis estudadas. Os efeitos
das variáveis concentração celular e tempo foram negativos, ou seja, que uma maior
expressão é obtida quanto menores forem os valores destas variáveis, evidenciando
que possivelmente esteja ocorrendo a ação de enzimas proteolíticas, degradando a
proteína expressa. O efeito isolado da temperatura foi positivo.
A partir da análise da influência da concentração celular, temperatura e tempo
sobre a expressão da enzima recombinante de P. furiosus e do modelo obtido, pode-
se prever experimentos que busquem a otimização da expressão desta proteína. O
modelo indica que a indução em Abs
600nm
em torno de 0,2 e temperatura de 37°C, por
6h, deve provocar um aumento de aproximadamente 340% na expressão, quando
comparado com as condições padrão (Abs
600nm
=0,6, Temperatura=35°C e Tempo=3
h), o que é equivalente ao valor encontrado nas condições de Abs
600nm
=0,3,
Temperatura=35°C e Tempo=3 h, contudo como em 6 h a quantidade de células
83
obtidas no final do processo, considerando um tempo de geração de 40 min, seria
aproximadamente 22 vezes maior, se aumentaria o rendimento do processo. Esta
análise não deve ser considerada com muito rigor, pois os valores propostos estão
fora da faixa estudada. Ela apenas mostra uma direção para a execução de outros
planos na tentativa de otimização do processo.
5.2 Caracterização da enzima
Os testes enzimáticos, utilizando-se substratos com diferentes comprimentos
da porção ácida, assim como a análise da atividade proteásica contra a caseína,
indicaram que o produto do gene PF2001∆60 constitui uma nova esterase com maior
especificidade para ácidos graxos de cadeia intermediária. Além disso, a enzima
demonstrou em pH7 ter temperatura ótima de atuação de 60°C e ser termoestável a
75°C. Estas características são inferiores às encontradas para outras enzimas de P.
furiosus, mas, como a enzima encontra-se fusionada a um tag de tiorredoxina de E.
coli, acredita-se que este esteja influenciando as propriedades da enzima
recombinante. Contudo, estas características são consideradas interessantes quando
comparadas às de outros organismos termofílicos e demonstram a grande
potencialidade desta enzima para aplicações tecnológicas.
A enzima foi inibida pela adição de 1 mM de PMSF, o que indica, como
esperado para esterases e lipases, a presença de uma serina em seu sítio catalílico.
Como algumas lipases não são inibidas por PMSF em virtude da proteção de seu sítio
ativo, acredita-se que a esterase de Pyrococcus furiosus apresente a sua serina
catalítica disponível à ação deste inibidor.
5.3 Modelagem estrutural e razões para a termoestabilidade
A esterase de Pyrococcus furiosus possui os domínios conservados de
dipeptidil aminopeptidases, α/β hidrolases e de esterases/lipases, que são domínios
evolutiva e estruturalmente relacionados. Por isso, foi construído um modelo estrutural
para a esta enzima utilizando-se o domínio catalítico da prolil oligo peptidase de Sus
scrofa (1QFM) como molde. Este modelo mostrou-se capaz de indicar com maior
exatidão os possíveis resíduos do sítio catalítico (Ser149, Asp233 e His264) e do
buraco do oxiânion (Tyr75 e Met150), além de apontar possíveis razões estruturais
para a sua termoestabilidade.
Dentre as possíveis razões para termoestabilidade foram observados que a
enzima possui alças menores que o domínio catalítico da 1QFM, um maior conteúdo
de prolinas, de aminoácidos carregados e apolares e além disso, foi verificada uma
84
diminuição do conteúdo de Asn e Gln e a complementariedade dos terminais amino e
carbóxi.
As alças menores, assim como o maior conteúdo de prolinas, as quais em sua
maioria estão situados em alças, provocam uma maior rigidez na estrutura protéica,
podendo estar contribuindo para a termoestabilidade da enzima.
O maior conteúdo de aminoácidos carregados pode provocar uma maior
estabilidade pela formação de interações iônicas intra-estrutura, e neste sentido foram
encontradas interações atrativas entre os resíduos Lys37 - Glu51; Glu240 – Lys237;
Arg266 – Glu273 e também de uma rede de interações atrativas entre a Lys163 -
Glu161 – Lys126 – Glu164 – Lys133. Estas interações, por estenderem-se da
superfície até o interior da enzima, podem estar provocando um ancoramento das
partes mais externas da enzima e um possível mecanismo de proteção à ação da
temperatura.
As interações entre os terminais amino e carbóxi se deram principalmente por
pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas envolvendo, além das extremidades
terminais a hélices α1.
85
PERSPECTIVAS
A nova esterase de Pyrococcus furiosus codificada pelo gene PF001, descrita
neste trabalho, constitui uma enzima com grande potencial de aplicação tecnológica e
também como modelo no entendimento das relações estruturais envolvidas no
mecanismo da termoestabilidade. Desta forma, duas principais linhas de perspectivas
são apontadas para a continuidade deste trabalho, uma mais relacionada às
características da enzima, visando o conhecimento detalhado das características
bioquímicas e também estruturais; e outra buscando uma aplicação tecnológica para
este biocatalisador.
5.4 Caracterização da enzima
Inicialmente, pretende-se proceder a retirada do tag de TrxA e caracterizá-la
novamente frente à temperatura ótima de atuação e termoestabilidade. Além disso,
será feita a caracterização do pH ótimo da enzima com e sem a TrxA, pois a mesma
causa uma mudança no pI da proteína recombinante. Se pretende verificar a influência
de íons e outros inibidores, de detergentes e resistência contra a ação de proteases.
Adicionalmente, pretende-se testar a atividade porteásica contra peptídeos,
para se verificar que a mesma não possui atividade de oligopeptidase.
Uma outra perpectiva que se abre é a caracterização estrutural, a qual
inicialmente será feita por dicroísmo circular, até para proporcionar uma melhor
avaliação do modelo estrutural, e posteriormente pela tentativa de elucidação da
estrutura da enzima.
5.5 Aplicação tecnológica
Para aplicações tecnológicas futuras, será de fundamental importância uma
melhora da expressão da enzima. Neste sentido, alguns aspectos ainda não
abordados, como a tentativa de expressão em outros hospedeiros, como E. coli com
tRNAs raros e em Pichia pastoris, buscando principalmente a secreção da enzima
para o meio de cultivo, diminuindo etapas do processo de purificação, são sugeridos.
Paralelamente a este processo de melhoria da expressão, pretende-se testar a
esterase de P. furiosus na síntese de fármacos, principalmente na resolução de
misturas racêmicas, visando desenvolver um processo de aplicação desta enzima,
assim como um biocatalisador adequado para esta aplicação, o que inclusive deverá
passar pela escolha do melhor suporte e condições de imobilização da enzima.
86
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99
ANEXOS
Anexo I
Visualização do Lipase Engineering Data base (www.led.uni-stuttgart.de) em 11
de novembro de 2003. Classe de lipases GlyX.
100
Visualização do Lipase Engineering Data base (www.led.uni-stuttgart.de) em 11
de novembro de 2003. Classe de lipases GlyGlyGlyX.
101
Anexo II
Alinhamentos com a lipase de Pyrococcus furiosus cujos Scores no T-COFFEE
foram maiores que 55.
1LBS_ LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG
Pyrococcusfuriosus ----------VIIEILVAALVLFLVFTAFV--------GYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFE
consensus .......... .* *.* *........* * ** *
1........10........20........30........40........50.........
1LBS_ YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNK--LPVLTWSQGGLVAQWGLTFF
Pyrococcusfuriosus Y------------KDVEITTEDNVK-LSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVI
consensus *............ * . ** * .... . * *...*. .. .
61.......70........80........90........100.......110........
1LBS_ PSIRSKVDRLMAFAPDYKGT-----VLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGL
Pyrococcusfuriosus EFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVGDKEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFS
consensus . ..** * ..... * . * . * * . . *
121......130.......140.......150.......160.......170........
1LBS_ TQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLD---------------SSYLFNGKNVQAQAVCG-
Pyrococcusfuriosus MGALVAIRGLSEVKEICCGVADSPPIYLDKTGARGMKYFAKLPEWLYSFVKPFSELFSGG
consensus . * ** *. ............... .*. *.
181......190.......200.......210.......220.......230........
1LBS_ -PLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAA
Pyrococcusfuriosus RPINVLNYTNSIKKPLFLIIGR----------RDTLVKVEEVQEFYERNKHVNPNVELWV
consensus .*. *. *. ..**..........* . . . *
241......250.......260.......270.......280.......290........
1LBS_ LLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP
Pyrococcusfuriosus TDAPHVRTIQVFPEE-------WKSRVGEFLKRWMG-----
consensus ** * * ....... * ** .....
301......310.......320.......330.........
1A7U_A -------------------------------------------PFITVGQENSTSIDLYY
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWW
consensus ........................................... . . * . ..
1........10........20........30........40........50.........
1A7U_A EDHGAGQPVVLIHGFPLS--GHSWERQSAA-LLDAGYRVITYDRRGFGQSSQPTTGYDYD
Pyrococcusfuriosus IDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG-D
consensus * * *. .**. *... . * .** ** *. .* *. * * * .*
61.......70........80........90........100.......110........
1A7U_A TFAADLNTVLETLD------LQDAVLVGFSMGTGEVARYVSSYGTARIAKVAFLASLEPF
Pyrococcusfuriosus KEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLS--------------EVKEI
consensus ** . * ...... ..***** * .*.............. .
121......130.......140.......150.......160.......170........
1A7U_A LLKTDDNPDGAAPKEFFDGIVAAVKADRYAFYTGFFNDFYNLDENLGTRISEEAVRNSWN
Pyrococcusfuriosus CCGVADSPPIYLDKTGARGMKYFAKLPEWLY--SFVKPFSEL------------------
consensus * * * *. * . ... * * *..................
181......190.......200.......210.......220.......230........
102
1A7U_A TAASGGFFAAAAAPTTWYTDFRADIPRIDVPALILHGTGDRTLPIENTARVFHKALPSAE
Pyrococcusfuriosus ------FSGGRPINVLNYTN------SIKKPLFLIIGRRDTLVKVEEVQEFYERNKHVNP
consensus ......* .. ** ...... * * .. * * . .* . .
241......250.......260.......270.......280.......290........
1A7U_A YVE--VEGAPH-GLLWTHAEEVNTALLAFLAK---
Pyrococcusfuriosus NVELWVTDAPHVRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG
consensus **..* ***. . ** . . ** ....
301......310.......320.......330...
1A8Q_ ---------------------------------------------PICTTRDGVEI--FY
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWW
consensus ............................................. ** * * .....
1........10........20........30........40........50.........
1A8Q_ KDWGQGRPVVFIHGWPLNGDAWQDQ-LKAVVD----AGYRGIAHDRRGHGHSTPVWDGYD
Pyrococcusfuriosus IDNGSDKTVIPLHGY--TSSRWAEHYMRPVIEFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG
consensus * * . *. .**... * . ... *...... ** .* * *.** * .
61.......70........80........90........100.......110........
1A8Q_ FDTFADDLNDLLTDLDLRDVTLVAHSMGGGELARYVGRHGTGRLRSAVLLSAIPPVMIKS
Pyrococcusfuriosus DKEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEICCGVADSPPIYLD
consensus * . * . * .. *. * .. * * .
121......130.......140.......150.......160.......170........
1A8Q_ DKNPDGVPDEVFDALKNGVLTERSQ-----------FWKDTAEGFFSANRPGNKVTQGNK
Pyrococcusfuriosus KTGARGM-----------------KYFAKLPEWLYSFVKPFSE-LFSGGRPINVL-----
consensus *.................. ...........* * *. **. ** * ......
181......190.......200.......210.......220.......230........
1A8Q_ DAFWYMAMAQTIEGGVRCVDAFGYTDFTEDLKKFDIPTLVVHGDDDQVVPIDATGR---K
Pyrococcusfuriosus -------------------------NYTNSIKK---PLFLIIGRRDTLVKVEEVQEFYER
consensus ......................... .* .**...* .. * * .* .. ....
241......250.......260.......270.......280.......290........
1A8Q_ SAQIIPNAELKVYEGSSHGIAMVPGDKEKFNRDLLEFLNK---
Pyrococcusfuriosus NKHVNPNVELWVTDAPH--VRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG
consensus . ** ** * .. ... . * . . *** ....
301......310.......320.......330.......340.
1A8S_ ---------------------------------------------TTFTTRDGTQI--YY
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWW
consensus ............................................. ** * .....
1........10........20........30........40........50.........
1A8S_ KDWGSGQPIVFSHGWPLN--ADSWESQMI-FLAAQGYRVIAHDRRGHGRSSQPWSGNDMD
Pyrococcusfuriosus IDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYT-----
consensus * ** .. **. ..*. . .*.** ** *.* * *.**.* .......
61.......70........80........90........100.......110........
1A8S_ TYADDLAQLIEHLDLRDAVLFGFSTGGGEVARYIGRHGTARVAKAGLISAVPPLMLKTEA
Pyrococcusfuriosus TVGDK-----EILDLKAGV------------KWLKDNYPEKSKRIGVI------------
consensus * .* .....* ***. .*............... . . *.*............
121......130.......140.......150.......160.......170........
1A8S_ NPGGLPMEVFDGIRQASLADRSQLYKDLASGPFFGFNQPGAKSSAGMVDW-FWLQGMAAG
Pyrococcusfuriosus ---GFSMGALVAIR--GLSEVKEICCGVADSPPIYLDKTGARGMKYFAKLPEWLYSFVKP
consensus ...* * .**.. * . . .* * **. . **
181......190.......200.......210.......220.......230........
103
1A8S_ HKNAYDCIKAFSETDFTEDLKKIDVPTLVVHGDADQVVPIEA--SGIASAALVKGSTLKI
Pyrococcusfuriosus FSELFSGGRPINVLNYTNSIKK---PLFLIIGRRDTLVKVEEVQEFYERNKHVNPNVELW
consensus . . .* .**...* .. * * .* .* .. *
241......250.......260.......270.......280.......290........
1A8S_ YSGAPHGLT-DTHKDQLNADLLAFIKG---
Pyrococcusfuriosus VTDAPHVRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG
consensus . *** *. . . *.* ...
301......310.......320........
1BRO_A -------------------------------------------PFITVGQENSTSIDLYY
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWW
consensus ........................................... . . * . ..
1........10........20........30........40........50.........
1BRO_A EDHGTGQPVVLIHGFPLS--GHSWERQSAA-LLDAGYRVITYDRRGFGQSSQPTTGYDYD
Pyrococcusfuriosus IDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG-D
consensus * *. *. .**. *... . * .** ** *. .* *. * * * .*
61.......70........80........90........100.......110........
1BRO_A TFAADLNTVLETLD------LQDAVLVGFSMGTGEVARYVSSYGTARIAKVAF-LASLEP
Pyrococcusfuriosus KEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLS-----EVKEICCGVADSPP
consensus ** . * ...... ..***** * .*..... . . ..* *
121......130.......140.......150.......160.......170........
1BRO_A FLLKTDDNPDGAAPQEFFDGIVAAVKADRYAFYTGFFNDFYNLDENLGTRISEEAVRNSW
Pyrococcusfuriosus IYL----DKTGARGMKYF----AKLPEWLYSFVKPFSELFSG-----GRPINVLNYTNS-
consensus *.... ** .*....* . * * * * .....* * **.
181......190.......200.......210.......220.......230........
1BRO_A NTAASGGFFAAAAAPTTWYTDFRADIPRIDVPALILHGTGDRTLPIENTARVFHKALPSA
Pyrococcusfuriosus ----------------------------IKKPLFLIIGRRDTLVKVEEVQEFYERNKHVN
consensus ............................* * .. * * . .* . .
241......250.......260.......270.......280.......290........
1BRO_A EYVE--VEGAPH-GLLWTHAEEVNTALLAFLAK---
Pyrococcusfuriosus PNVELWVTDAPHVRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG
consensus **..* ***. . ** . . ** ....
301......310.......320.......330....
1ETH_A --SEVCFPRLGCFSDDAPWAG--IVQRPLKILPWSPKDVDTRFLLYTNQNQNNYQELVAD
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDN-------
consensus .. *. * * . *...*. * . *.***. . *.......
1........10........20........30........40........50.........
1ETH_A PSTITNSNFRMDR---KTRFIIHGFID-KGEEDWLSNICKNLFKVESVNCICVDWKGGSR
Pyrococcusfuriosus ---VKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLK-EGYNVLAFDFRAHGK
consensus .... * . .* ...** .**. .. * .. . * *.* * . *... .
61.......70........80........90........100.......110........
1ETH_A TGYTQASQNIRIVGAEVAYFVEVLKSSLGYSPSNVHVIGHSLGSHAAGEAGRRTNGTIER
Pyrococcusfuriosus SGGKYTTVGDKEI-LDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMG---ALVAIRGLSEVKEI
consensus .* . . .. .. * ** . *** *.*...* * * *
121......130.......140.......150.......160.......170........
1ETH_A ITGLDPAEPCFQGTPELVRLDPSDAKFVDVIHTDAAPIIPNLGFGMSQTVGHLDFFPNGG
Pyrococcusfuriosus CCGVADSPPIY--------LDKTGAR--------------------------------GM
consensus *. * .........** . *.................................*
181......190.......200.......210.......220.......230........
104
1ETH_A KQMPGCQKNILSQIVDIDGIWEGTRDFVACNHLRSYKYYADSILNPDGFAGFPCDSYNVF
Pyrococcusfuriosus KYFAKLPEWLYSFVKPFSELFSGGRPINVLNY----------------------------
consensus * . * . .. * * * ............................
241......250.......260.......270.......280.......290........
1ETH_A TANKCFPCPSEGCPQMGHYADRFPGKTNGVSQVFYLNTGDASNFARWRYKVSVTLSGKKV
Pyrococcusfuriosus --------------------------TNSIKKPLFLIIGRRDTLVKVEEVQEFYERNKHV
consensus ..........................** . .* * . * *
301......310.......320.......330.......340.......350........
1ETH_A TGHILVSLFGNEGNSRQYEIYKGTLQPDNTHSDEFDSDVEVGDLQKVKFIWYNVINPTLP
Pyrococcusfuriosus NPNVELWV------------------TDAPH---------VRTIQVFPEEWKSRVGEFLK
consensus . . ................... * *.........* .* * . *
361......370.......380.......390.......400.......410........
1ETH_A RVGASKITVERNDGKVYDFCSQETVREEVLLTLNPC
Pyrococcusfuriosus RWMG--------------------------------
consensus * .................................
421......430.......440.......450....
1GPL_ --------AEVCYSHLGCFSDEKPWAGTSQRPIKSLPSDPKKINTRFLLYTNENQNSYQL
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYK------------MVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEI
consensus ........* * . * *............. *. . .
1........10........20........30........40........50.........
1GPL_ ITATDIATIKASNFNLNRKTRFIIHGFTDSGENSWLSDMCKNMFQVEKVNCICVDWKGGS
Pyrococcusfuriosus TTEDNVKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKEGYNVLAFDFRAHG
consensus * . * ** .**.* * * * . *...
61.......70........80........90........100.......110........
1GPL_ KAQYSQASQNIRVVGAEVAYLVQVLSTSLNYAPENVHIIGHSLGAHTAGEAGKRLNGLVG
Pyrococcusfuriosus KSGGKYTTVGDKEI-LDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVA---IRGLSEVKE
consensus * . . .. .. * * . .** *.** *... . * .
121......130.......140.......150.......160.......170........
1GPL_ RITGLDPAEPYFQDTPEEVRLDPSDAKFVDVIHTDISPILPSLGFGMSQKVGHMDFFPNG
Pyrococcusfuriosus ICCGVADSPPIYLD-KTGARGMKYFAKLPEWLYSFVKPFSELFSGG--------------
consensus *. * . *. * ** . . . . * *..............
181......190.......200.......210.......220.......230........
1GPL_ GKDMPGCKTGISCNHHRSIEYYHSSILNPEGFLGYPCASYDEFQESGCFPCPAKGCPKMG
Pyrococcusfuriosus ---------------------------RPINVLNY-------------------------
consensus ........................... * * *.........................
241......250.......260.......270.......280.......290........
1GPL_ HFADQYPGKTNAVEQTFFLNTGASDNFTRWRYKVSVTLSGKKVTGHILVSLFGNKGNSKQ
Pyrococcusfuriosus ---------TNSIKKPLFLIIGRRDTLVKVEEVQEFYERNKHVNPNVELWV---------
consensus .........** . ** * * . * * . . ..........
301......310.......320.......330.......340.......350........
1GPL_ YEIFKGTLKPDSTHSNEFDSDVDVGDLQMVKFIWYNNVINPTLPRVGASKIIVETNVGKQ
Pyrococcusfuriosus ---------TDAPH---------VRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG-------------
consensus ......... * *.........* .*. * * .*.............
361......370.......380.......390.......400.......410........
1GPL_ FNFCSPETVREEVLLTLTPC
Pyrococcusfuriosus --------------------
consensus ....................
421......430........
105
1RP1_ --KEVCYEQIGCFSDAEPWAGTAI--RPLKVLPWSPERIGTRFLLYTNKNPNNFQTLLPS
Pyrococcusfuriosus VIIEILVAALVLFLVFTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEY--------KDVEITTED
consensus .. *. . * . * ... * * *.* . .........
1........10........20........30........40........50.........
1RP1_ DPSTIGASNFQTDKKTRFIIHGFIDKGEENWLLDMCKNMFKVEEVNCICVDWKKGSQTSY
Pyrococcusfuriosus NVKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGG
consensus * . ** .**. . * * . *.. .
61.......70........80........90........100.......110........
1RP1_ TQAANNVRVVGAQVAQMLSMLSANYSYSPSQVQLIGHSLGAHVAGEAGSRTPGLGRITGL
Pyrococcusfuriosus KYTTVGDKEI-LDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVA------------IRGL
consensus . .. . . * ** . .** *.** **............* **
121......130.......140.......150.......160.......170........
1RP1_ DPVEASFQGTPEE--VRLDPTDADFVDVIHTDAAPLIPFLGFGTSQQMGHLDFFPNGGEE
Pyrococcusfuriosus SEVKEICCGVADSPPIYLDKTGA-------------------------------------
consensus * * . ... ** * *.....................................
181......190.......200.......210.......220.......230........
1RP1_ MPGCKKNALSQIVDLDGIWEGTRDFVACNHLRSYKYYSESILNPDGFASYPCASYRAFES
Pyrococcusfuriosus -------------------------------RGMKYFAK---------------------
consensus ...............................* **. .....................
241......250.......260.......270.......280.......290........
1RP1_ NKCFPCPDQGCPQMGHYADKFAQKYFLNTGDSSNFARWRYGVSITLSGKRATGQAKVALF
Pyrococcusfuriosus ----------------------------------LPEWLYSFVKPFS----------ELF
consensus .................................. * * *.......... **
301......310.......320.......330.......340.......350........
1RP1_ GSKGNTHQFNIFKGILKPGSTHSNEFDAKLDVGTIEKVKFLWNNNNPTFPKVGAAKITVQ
Pyrococcusfuriosus SGGRPINVLNYTNSIKKPLFLIIGRRDTLVKV---EEVQEFYERNKHVNPNV--ELWVTD
consensus * * ** * . *...* * . * * *..
361......370.......380.......390.......400.......410........
1RP1_ KGEEKTVHSFCSESTVREDVLLTLTPC
Pyrococcusfuriosus APHVRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG
consensus .*. * * * *
421......430.......440.....
1C2O_A DPQLLVRVRGGQLRGIRLKAPGGPVSAFLGIPFAEPPVGSRRFMPPEPKRPWSGVLDATT
Pyrococcusfuriosus ---VIIEILVAALVLFLV------FTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDV-EITT
consensus ...... . . * ....... .**.* ** . * . . *.. **
1........10........20........30........40........50.........
1C2O_A FQNVCYQYVDTLYPGFEGTEMWNPNRELSEDCLYLNVWTPYPRPASPTPVLIWIYGGGFY
Pyrococcusfuriosus EDNV------------KLSGWWIDN--------------------GSDKTVIPLHG---Y
consensus **............ . * *.................... .* . *...*
61.......70........80........90........100.......110........
1C2O_A SGAASLDVYDGRFLAQVEGAVLVSMNYRVGTFGFLALP---GSREAPGNVGLLDQRLALQ
Pyrococcusfuriosus TSSRWAEHYMRPVI-----EFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVGDKEILDLKAGVK
consensus . . * ...... *. * * * * * ...* * .** . ..
121......130.......140.......150.......160.......170........
1C2O_A WVQENIAAFGGDPMSVTLFGESAGAASVGMHILSLPSRSLFHRAVLQSGTPNGPWATVSA
Pyrococcusfuriosus WLKDNYP-----------------------------------------------------
consensus *. .* .....................................................
181......190.......200.......210.......220.......230........
106
1C2O_A GEARRRATLLARLVGCPPGGAGGNDTELIACLRTRPAQDLVDHEWHVLPQESIFRFSFVP
Pyrococcusfuriosus -EKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEICC-----------------------------
consensus .* .* ... .* . * . * *.............................
241......250.......260.......270.......280.......290........
1C2O_A VVDGDFLSDTPEALINTGDFQDLQVLVGVVKDEGSYFLVYGVPGFSKDNESLISRAQFLA
Pyrococcusfuriosus ----GVADSPPIYLDKTG--------------------ARGMKYFAKLPEWLYSFVKPFS
consensus .... * * **.................... *. * * * * *
301......310.......320.......330.......340.......350........
1C2O_A GVRIGVPQASDLAAEAVVLHYTDWLHPEDPTHLRDAMSAVVGDHNVVCPVAQLAGRLAAQ
Pyrococcusfuriosus ELFSG-------GRPINVLNYTN--------SIKKPLFLIIGRRDTLVKVEE--------
consensus . *........ ** ** ........ .. . ..* . * ........
361......370.......380.......390.......400.......410........
1C2O_A GARVYAYIFEHRASTLTWPLWM-GVPHGYEIEFIFGLPLDPSLNYTTEERIFAQRLMKYW
Pyrococcusfuriosus ---VQEFYERNKHVNPNVELWVTDAPHVRTIQV-----------FPEEWKSRVGEFLKRW
consensus ...* . . **.. ** * ............ * . .* *
421......430.......440.......450.......460.......470........
1C2O_A TNFARTGDPNDPRDSKSPQWPPYTTAAQQYVSLNLKPLEVRRGLRAQTCAFWNRFLPKLL
Pyrococcusfuriosus MG----------------------------------------------------------
consensus ..........................................................
481......490.......500.......510.......520.......530........
1C2O_A SAT
Pyrococcusfuriosus ---
consensus ...
541
1MAA_A EGREDPQLLVRVRGGQLRGIRLKAPGGPVSAFLGIPFAEPPVGSRRFMPPEPKRPWSGVL
Pyrococcusfuriosus -------VIIEILVAALVLFLV------FTAFVGYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDV-
consensus .......... . . * ....... .**.* ** . * . . *.
1........10........20........30........40........50.........
1MAA_A DATTFQNVCYQYVDTLYPGFEGTEMWNPNRELSEDCLYLNVWTPYPRPASPTPVLIWIYG
Pyrococcusfuriosus EITTEDNV------------KLSGWWIDN--------------------GSDKTVIPLHG
consensus . ** **............ . * *.................... .* . *
61.......70........80........90........100.......110........
1MAA_A GGFYSGAASLDVYDGRFLAQVEGAVLVSMNYRVGTFGFLALP---GSREAPGNVGLLDQR
Pyrococcusfuriosus ---YTSSRWAEHYMRPVI-----EFLLKEGYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVGDKEILDLK
consensus ...*. . * ...... *. * * * * * ...* * .** .
121......130.......140.......150.......160.......170........
1MAA_A LALQWVQENIAAFGGDPMSVTLFGESAGAASVGMHILSLPSRSLFHRAVLQSGTPNGPWA
Pyrococcusfuriosus AGVKWLKDNYP-------------------------------------------------
consensus .. *. .* .................................................
181......190.......200.......210.......220.......230........
1MAA_A TVSAGEARRRATLLARLVGCPPGGAGGNDTELIACLRTRPAQDLVDHEWHVLPQESIFRF
Pyrococcusfuriosus -----EKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEICC-------------------------
consensus .....* .* ... .* . * . * *.........................
241......250.......260.......270.......280.......290........
1MAA_A SFVPVVDGDFLSDTPEALINTGDFQDLQVLVGVVKDEGSYFLVYGVPGFSKDNESLISRA
Pyrococcusfuriosus --------GVADSPPIYLDKTG--------------------ARGMKYFAKLPEWLYSFV
consensus ........ * * **.................... *. * * * * *
301......310.......320.......330.......340.......350........
107
1MAA_A QFLAGVRIGVPQASDLAAEAVVLHYTDWLHPEDPTHLRDAMSAVVGDHNVVCPVAQLAGR
Pyrococcusfuriosus KPFSELFSG-------GRPINVLNYT---------------------NSIKKPLFLIIGR
consensus . *........ ** **..................... . *. . **
361......370.......380.......390.......400.......410........
1MAA_A LAAQGARVYAYIFEHRASTLTWPLWMGVPHGYEIEFIFGLPLDPSLNYTTEERIFAQRLM
Pyrococcusfuriosus -------------------------------------------------RDTLVKVEEVQ
consensus ................................................. . . .
421......430.......440.......450.......460.......470........
1MAA_A KYWTNFARTGDPNDPRDRKSPQWPPYTTAAQQYVSLNLKPLEVRRGLRAQTCAFWNRFLP
Pyrococcusfuriosus EFY----------ERNKHVNPNVELWVTDAPHVRTIQVFPEE----WKSRVGEFLKRWMG
consensus ............. *. . * * .... * *.... . * *..
481......490.......500.......510.......520.......530........
1MAA_A KLLSATDTLD
Pyrococcusfuriosus ----------
consensus ..........
541.......
108
Anexo III
Alinhamentos utilizados para tentar diminuir as distâncias entre os átomos Oγ-
Ser149 e Nε-His264, Nδ-His264 e Oδ-Asp233 do modelo. Grifados em verde, magenta
e amarelo, são identificados as Ser, os Asp e as His pertencentes à tríade catalítica de
cada enzima.
-pfuqfmt1
>1QFM
--KGID----ASDYQTVQIFYPSKDGTKIPMFIVHKKGIKLD-GSHPAFLYGYGGFNISITPNYSVSRLIFVRHM
GGVLAVANIRGGGEYGETWHKGGILANKQNCFDDFQCAAEYLIKEGYTSPKRLTINGGSNGGLLVATCANQRPDL
FGCVIAQVGVMDMLKFHKYTIGHAWTTDYGCSDSKQHFEWLIKYSPLHNVKLPEADDIQYPSMLLLTADHDDRVV
PLHSLKFIATLQYIVGRSRKQNNPLLIHVDTKAGHGAGKPTAKVIEEVSDMFAFIARCLNIDWIP*
>pfuqfmt1
GYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKE
GYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG-----DKEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEI
C-CGVADSPPIYLDKTGARGMKYFAKLPEWLYSFVKPFSELFSGGRPINV-LNYTNSIKKPLFLII-G-R-RD-T
LVKVEEVQEFY-----ERNKHVNPNVELWVTDAPH------VRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG*
-pfuqfmt2
>1QFM
--KGID----ASDYQTVQIFYPSKDGTKIPMFIVHKKGIKLD-GSHPAFLYGYGGFNISITPNYSVSRLIFVRHM
GGVLAVANIRGGGEYGETWHKGGILANKQNCFDDFQCAAEYLIKEGYTSPKRLTINGGSNGGLLVATCANQRPDL
FGCVIAQVGVMDMLKFHKYTIGHAWTTDYGCSDSKQHFEWLIKYSPLHNVKLPEADDIQYPSMLLLTADHDDRVV
PLHSLKFIATLQYIVGRSRKQNNPLLIHVDTKAGHGAGKPTAKVIEEVSDMFAFIARCLNIDWIP*
>pfuqfmt2
GYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKE
GYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG-----DKEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEI
C-CGVADSPPIYLDKTGARGMKYFAKLPEWLYSFVKPFSELFSGGRPINV-LNYTNSIKKPLFLII-GRR--D-T
LVKVEEVQEFY-----ERNKHVNPNVELWVTDAPH------VRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG*
-pfuqfmt3
>1QFM
--KGID----ASDYQTVQIFYPSKDGTKIPMFIVHKKGIKLD-GSHPAFLYGYGGFNISITPNYSVSRLIFVRHM
GGVLAVANIRGGGEYGETWHKGGILANKQNCFDDFQCAAEYLIKEGYTSPKRLTINGGSNGGLLVATCANQRPDL
FGCVIAQVGVMDMLKFHKYTIGHAWTTDYGCSDSKQHFEWLIKYSPLHNVKLPEADDIQYPSMLLLTADHDDRVV
PLHSLKFIATLQYIVGRSRKQNNPLLIHVDTKAGHGAGKPTAKVIEEVSDMFAFIARCLNIDWIP*
>pfuqfmt3
GYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKE
GYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG-----DKEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEI
C-CGVADSPPIYLDKTGARGMKYFAKLPEWLYSFVKPFSELFSGGRPINV-LNYTNSIKKPLFLII-GR-R-D-T
LVKVEEVQEFY-----ERNKHVNPNVELWVTDAPH------VRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG*
-pfuqfmt4
>1QFM
--KGID----ASDYQTVQIFYPSKDGTKIPMFIVHKKGIKLD-GSHPAFLYGYGGFNISITPNYSVSRLIFVRHM
GGVLAVANIRGGGEYGETWHKGGILANKQNCFDDFQCAAEYLIKEGYTSPKRLTINGGSNGGLLVATCANQRPDL
FGCVIAQVGVMDMLKFHKYTIGHAWTTDYGCSDSKQHFEWLIKYSPLHNVKLPEADDIQYPSMLLLTADHDDRVV
PLHSLKFIATLQYIVGRSRKQNNPLLIHVDTKAGHGAGKPTAKVIEEVSDMFAFIARCLNIDWIP*
>pfuqfmt4
GYKMVNPPRVVGNWTPKDLSFEYKDVEITTEDNVKLSGWWIDNGSDKTVIPLHGYTSSRWAEHYMRPVIEFLLKE
GYNVLAFDFRAHGKSGGKYTTVG-----DKEILDLKAGVKWLKDNYPEKSKRIGVIGFSMGALVAIRGLSEVKEI
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TLVKVEEVQEFY----ERNKHVNPNVELWVTDAPH------VRTIQVFPEEWKSRVGEFLKRWMG*
109
-pfuqfmt5
>1QFM
--KGID----ASDYQTVQIFYPSKDGTKIPMFIVHKKGIKLD-GSHPAFLYGYGGFNISITPNYSVSRLIFVRHM
GGVLAVANIRGGGEYGETWHKGGILANKQNCFDDFQCAAEYLIKEGYTSPKRLTINGGSNGGLLVATCANQRPDL
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