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ESTUDO DA CATÁLISE ENZIMÁTICA EM MEIO ORGÂNICO PARA A
PRODUÇÃO DE PROTÓTIPO DE FÁRMACO ANTIASMÁTICO
Juliana Vaz Bevilaqua
TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS
PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS
NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS
EM ENGENHARIA QUÍMICA.
Aprovada por:
______________________________________________
Prof. Denise Maria Guimarães Freire, D.Sc.
______________________________________________
Prof. Tito Lívio Moitinho Alves, D.Sc.
______________________________________________
Prof. José Carlos Costa da Silva Pinto, D.Sc.
______________________________________________
Prof. Octávio Augusto Ceva Antunes, D.Sc.
______________________________________________
Prof. Lucia Moreira Campos Paiva, D.Sc.
______________________________________________
Prof. Raquel de Lima Camargo Giordano, D.Sc.
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
MARÇO DE 2005
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BEVILAQUA, JULIANA VAZ
Estudo da catálise enzimática em meio
orgânico para a produção de protótipo de
fármaco antiasmático [Rio de Janeiro]
2005
IX, 156 p. 29,7 cm (COPPE/UFRJ,
D.Sc., Engenharia Química, 2005)
Tese – Universidade Federal do Rio de
Janeiro, COPPE
1 Lipase
2 Hidrólise enzimática em meio orgânico
I. COPPE/UFRJ II. Título (série)
ii
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Dedico esta Tese aos meus filhotes
Felipe e Bernardo.
iii
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora Prof
a
. Denise Freire (Dedé), que durante todos esses
anos sempre vibrou com o trabalho, contagiando todos com seu entusiasmo e nos
incentivando a persistir.
Ao Sérgio, meu marido, que durante muitos finais-de-semana cuidou de nossos
filhos; sem o seu apoio teria sido impossível escrever esta Tese!
Aos meus pais que sempre estimularam seus filhos a estudarem e nos mostraram o
valor da educação.
Aos alunos de Iniciação Científica: Absai, Tatiane, Aline e Luciana, e também à
Aline Cunha, que além de ajudarem a realizar o trabalho experimental, me fizeram
refletir mais sobre o trabalho com suas infinitas dúvidas e sobre a importância desse
programa para a formação científica na graduação. Agradeço especialmente ao Absai
que trabalhou neste projeto com extrema dedicação durante cerca de 2 anos e com quem
voltei a trabalhar recentemente. É com satisfação que vejo sua maturidade profissional
atual e me sinto orgulhosa por ter colaborado para seu desenvolvimento profissional.
Aos meus amigos Bioc@talíticos Lucia, Aline Cunha, Rodrigo, pelas conversas
alegres nas terça-feiras sem as quais nossas reuniões talvez não nos motivassem tanto.
Ao meu irmão Diego que me ajudou com o desenvolvimento matemático de
equações.
Ao Prof. Eliezer Batista e Prof
a
. Lídia pelo apoio ao trabalho.
Aos companheiros do PEQ Claudia, Tânia, Maria de Fátima e Márcia pela
companhia no laboratório e apoio na produção de lipases.
Aos Profs. Helio Matos e Rogério Margis que viabilizaram a utilização de HPLC.
Ao Prof. José Carlos, excelente professor, pela colaboração no planejamento
experimental e na modelagem.
A todos os membros da banca: Prof
a
. Raquel Giordano, Prof. Octávio Antunes,
Prof
a
. Lúcia e Prof. José Carlos que aceitaram fazer parte da banca examinadora
trazendo importantes contribuições para o trabalho.
A todos esses e a muitos outros que tive o prazer de compartilhar da companhia
durante esses anos, muito obrigada. Sem vocês teria sido impossível chegar ao fim desta
jornada e descobrir os novos caminhos que agora se descortinam para que outros os
trilhem.
iv
Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)
ESTUDO DA CATÁLISE ENZIMÁTICA EM MEIO ORGÂNICO PARA A
PRODUÇÃO DE PROTÓTIPO DE FÁRMACO ANTIASMÁTICO
Juliana Vaz Bevilaqua
Março / 2005
Orientadores: Denise Maria Guimarães Freire
Tito Lívio Moitinho Alves
Programa: Engenharia Química
Este trabalho investigou a utilização de lipases imobilizadas em reação de
hidrólise em meio orgânico para a produção do ácido 4-etil-(2-(1,3–dioxo-1,3–dihidro–
2-isoindolil))-fenoxiacético. Este produto é um protótipo de fármaco planejado pelo
Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) para atuar
como antiasmático. A reação de hidrólise de ésteres precursores foi realizada em meio
orgânico simples para seleção do solvente e do biocatalisador mais adequados e para
avaliação da cinética da reação. A hidrólise também foi efetuada em sistema trifásico no
qual foi empregada a técnica do planejamento de experimentos para a otimização das
condições reacionais. Os resultados do planejamento experimental foram analisados
estatisticamente e utilizados para a estimação de parâmetros de modelo semi-empírico.
Foram realizados experimentos dinâmicos cujos resultados serviram para teste de
validação do modelo e para a estimação de parâmetros de novo modelo dinâmico. A
hidrólise enzimática mostrou-se efetiva para a produção desse protótipo de fármaco, no
entanto, parte significativa do custo do processo deveu-se ao biocatalisador importado e
de elevado custo. Com o intuito de otimizar os custos de produção deste protótipo,
foram realizados experimentos preliminares visando à obtenção de biocatalisador
próprio.
v
Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as partial fulfillment of the requirements
for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)
STUDY OF ENZYMATIC CATALYSIS IN ORGANIC MEDIA FOR THE
PRODUCTION OF ANTIASTHMA PROTOTYPE DRUG
Juliana Vaz Bevilaqua
March / 2005
Advisors: Denise Maria Guimarães Freire
Tito Lívio Moitinho Alves
Department: Chemical Engineering
This work investigated the use of immobilized lipase in hydrolysis reactions in
organic media for producing the 4-ethyl-(2-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-2-isoindolyl))-
phenoxyacetic acid. This product is a prototype drug planned by Laboratório de
Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) to drift as antiasthma drug.
Hydrolysis reaction was performed in simple organic media for selection of suitable
solvent and biocatalyst and for reaction kinetics evaluation. Hydrolysis was also
performed in three-phase reaction system to which experimental design was used to
optimize reaction conditions. Experimental design results were statistically analyzed
and used for parameter estimation of semi-empirical model. Time course experiments
were performed and these results were used to test validation of the semi-empirical
model and to estimate the parameters of the new dynamic model. Enzymatic hydrolysis
was effective technique for production of that prototype drug; nevertheless, the
imported and expensive biocatalyst was responsible for significant part of the process
costs. In this sense, it was performed preliminary experiments to produce home-made
catalyst that could optimize production costs of the prototype drug.
vi
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO 1
II. OBJETIVOS 4
III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5
III.1 Características das Lipases 5
III.1.1 Características gerais 5
III.1.2 Estrutura protéica 8
III.1.3 Mecanismo cinético 11
III.2 Biocatálise em solventes orgânicos 14
III.2.1 Influência do solvente 19
III.2.2 O papel da água 21
III.3 Imobilização de enzimas 25
III.3.1 Aspectos gerais 25
III.3.2 Imobilização de lipases 31
III.3.3 Imobilização de lipases por adsorção 36
III.4 Aplicações de lipases na síntese de fármacos 46
III.5 Asma 52
III.5.1 Características da asma 52
III.5.2 Terapias antiasmáticas 53
III.5.3 Protótipo de fármaco antiasmático 54
IV. MATERIAIS E MÉTODOS 57
IV.1 Materiais 57
IV.1.1 Ésteres precursores do antiasmático 57
IV.1.2 Enzimas 57
vii
IV.1.3 Suportes de imobilização 59
IV.1.4 Outros materiais 60
IV.2 Metodologias 61
IV.2.1 Experimentos preliminares de hidrólise 61
IV.2.2 Cinética enzimática 62
IV.2.3 Hidrólise em sistema trifásico 62
IV.2.4 Planejamento experimental para sistema trifásico 64
IV.2.5 Determinação de perfil cinético em sistema trifásico 65
IV.2.6 Produção de lipase de Penicillium restrictum 66
IV.2.7 Imobilização 66
IV.2.8 Metodologias analíticas 69
V. RESULTADOS 74
V.1. Atividade enzimática 74
V.1.1 Atividade Lipozyme
®
IM 74
V.1.2 Atividade Novozym
®
435 74
V.1.3 Atividade Lipozyme
®
RM IM 75
V.2 Experimentos preliminares 76
V.2.1 Hidrólise de ésteres 76
V.2.2 Recuperação de atividade enzimática 80
V.3 Cinética de hidrólise 81
V.4 Hidrólise em sistema trifásico 84
V.4.1 Planejamento experimental da hidrólise do FIT-MET em sistema trifásico 86
V.4.2. Planejamento experimental da hidrólise do FIT-ET em sistema trifásico 92
V.4.3 Otimização através de modelo semi-empírico 95
V.4.4 Hidrólise de FIT-MET em sistema trifásico - Progresso da reação 98
V.4.5 Re-estimação de modelo empírico 100
V.5 Otimização da hidrólise de FIT-MET 103
viii
V.6 Imobilização 107
V.6.1 Imobilização Lipozyme
®
10,000 107
V.6.2 Imobilização da lipase de Penicillium restrictum 110
VI. CONCLUSÕES 113
VII – SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 115
BIBLIOGRAFIA 117
APÊNDICE 132
Maximização da Equação V.5 através do Mathematica
®
133
Artigo Publicado Biochemical Engineering Journal 137
Artigo Publicado no Applied Biochemistry and Biocatalysis 145
ix
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo I – Introdução
_________________________________________________________________________________________
1
I. INTRODUÇÃO
Nas últimas três décadas, houve enorme evolução nas pesquisas relacionadas à
catálise enzimática em diversos campos, desde os conhecimentos mais fundamentais
como a elucidação estrutural e dos mecanismos de catálise das enzimas, passando pelo
desenvolvimento dos biocatalisadores até o desenvolvimento de novas aplicações. Entre
as áreas de pesquisa aplicada que mais têm se aproveitado e impulsionado esta
evolução, estão as áreas farmacêutica e de química fina. Nestas áreas, a rigorosa
especificação de pureza dos produtos requer o emprego nos processos produtivos de
catalisadores que apresentem excelência em sua performance. Ainda que o custo dos
catalisadores empregados seja elevado, sua utilização se justifica devido ao alto valor
agregado dos produtos. As enzimas, por apresentarem propriedades de especificidade e
seletividade química, posicional e estérica, são candidatas naturais ao emprego como
catalisadores em reações para a produção de fármacos.
O desenvolvimento de reações enzimáticas em meio orgânico possibilitou a
melhor integração entre a catálise enzimática e a química orgânica convencional,
ampliando as possibilidades de síntese de novas substâncias de interesse farmacológico.
Assim, a catálise enzimática vem sendo empregada como ferramenta complementar das
rotas de síntese eliminando algumas das etapas que seriam necessárias para a obtenção
do produto através da química orgânica tradicional.
As lipases, em particular, constituem uma classe de enzimas de grande
importância na biocatálise em meio orgânico. Sua boa estabilidade na presença de
solventes orgânicos propicia a utilização na catálise de reações químicas envolvendo
substratos insolúveis em meio aquoso e em etapas intermediárias de processos químicos
convencionais.
O ponto de partida para esta pesquisa foi uma consulta do Laboratório de Síntese
e Avaliação de Substâncias Bioativas (LASSBio - Faculdade de Farmácia/UFRJ) ao
Núcleo de Biocatálise da UFRJ sobre a possibilidade de empregarem-se enzimas como
biocatalisadores em algumas reações necessárias para a produção de protótipos de
fármacos. O LASSBio tem como uma de suas linhas de pesquisa o desenvolvimento de
novas substâncias com potencial atividade antiasmática e antinflamatória e vinha tendo
dificuldade para sintetisar algumas dessas moléculas. A síntese química dos protótipos
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo I – Introdução
_________________________________________________________________________________________
2
propostos requeria reações hidrolíticas quimiosseletivas em etapas intermediárias, o que
nem sempre pode ser alcançado diretamente através da química orgânica convencional.
Por isso foi proposto o estudo do uso de lipases como catalisadores dessa reação.
Vislumbrava-se que o emprego de lipases permitiria a realização de reações de hidrólise
quimiosseletivas necessárias à síntese do protótipo de fármaco, pois as lipases atuariam
seletivamente sobre a ligação éster, preservando o anel ativo da molécula. Após a
execução de alguns testes preliminares cujos resultados foram positivos, decidiu-se
explorar o tema de forma mais intensiva, o que culminou na realização desta Tese.
O estudo de novas moléculas com potencial para atuar como antiasmáticos
constitui, por si só, inegável avanço do conhecimento científico nacional. Além disso,
poderia proporcionar melhoria na qualidade de vida de cerca de 19 milhões de
brasileiros que sofrem com a asma (OLIVEIRA, 2004) e se traduzir em vantagens
econômicas para o país. A asma é a terceira maior causa de internações hospitalares no
Brasil. São 370 mil internações anuais no Sistema Único de Saúde (SUS), e os recursos
consumidos apenas com essas internações alcançam R$ 100 milhões, sem computar os
custos com serviço médico, medicamentos e perdas indiretas (TEIXEIRA, 2005).
As pesquisas realizadas para a elaboração desta tese foram realizadas no Núcleo
de Biotecnologia da UFRJ (IQ, COPPE e EQ), que vem estudando lipases há mais de
uma década. Nestes laboratórios já foram produzidos trabalhos de isolamento de
microrganismos produtores de lipases (FREIRE, 1996; FREIRE et al., 1997a),
otimização de meio de cultivo em fermentação submersa (FREIRE et al., 1997b;
COELHO, 2001) e em estado sólido (GOMBERT et al., 1999; PALMA et al., 2000;
PINTO, 2003; GUTARRA, 2003; DI LUCCIO et al., 2004), purificação de lipases
(JESUS et al., 1999), produção e aplicação de lipases no tratamento de efluentes ricos
em gorduras (LEAL, 2000; TEIXERA, 2001; CAMAROTTA et al., 2001; JUNG, 2002;
JUNG et al., 2002; RIBEIRO et al., 2002; LEAL, 2004; ROSA, 2004), aplicação de
lipases comerciais na hidrólise de óleos vegetais (QUEIROZ JUNIOR, 1996) e síntese
de triglicerídeos estruturados (LANGONE, 1998), entre outros.
A extensa experiência do grupo relacionada aos processos produtivos e de
aplicação de lipases tornou natural a realização de estudo preliminar para a produção de
biocatalisador próprio. O principal intuito desse estudo foi produzir um biocatalisador
que pudesse ser empregado na reação proposta, sem que seu custo impactasse a
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo I – Introdução
_________________________________________________________________________________________
3
viabilidade do processo. Isso por que os biocatalisadores comerciais que foram
empregados nas reações desta Tese, como será apresentado mais adiante, embora sejam
amplamente utilizados em projetos de pesquisa envolvendo reações em meio orgânico,
apresentam custo bastante elevado.
Dessa forma, este trabalho abre caminho para novas e promissoras linhas de
pesquisa nestes laboratórios: a aplicação da catálise enzimática para a produção de
fármacos e a imobilização de lipases para a produção de biocatalisadores próprios, que
possam ser utilizados neste e em outros processos biotecnológicos.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo II – Objetivos
_________________________________________________________________________________________
4
II. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo geral o estudo da biocatálise por lipase
imobilizada realizada em solventes orgânicos. Este estudo foi conduzido como uma
pesquisa aplicada sobre o emprego de lipases como catalisadores em uma reação
química chave para a síntese de novas substâncias de interesse farmacológico.
Os objetivos específicos foram:
• Realizar a hidrólise enzimática de éster intermediário para a obtenção de
protótipo de antiasmático planejado e sintetizado pelo LASSBio.
• Otimizar as condições reacionais da hidrólise desse éster catalisada por
lipase imobilizada comercial.
• Produzir um biocatalisador próprio (“home-made”), obtido pela
imobilização, em resina polimérica, de lipase produzida por
microrganismos da coleção de culturas do Núcleo de Biotecnologia da
UFRJ
• Avaliar o biocatalisador obtido e testar na reação modelo deste trabalho.
Estes objetivos específicos foram traçados com o intuito de fechar o ciclo de
produção do protótipo de antiasmático planejado pelo LASSBio através de rota
biocatalítica. Não somente empregando lipases como catalisadores da hidrólise
quimiosseletiva, mas também produzindo estes biocatalisadores.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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5
III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
III.1 Características das Lipases
III.1.1 Características gerais
Lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster hidrolases E.C.
3.1.1.3), sendo capazes de catalisar reações de hidrólise e síntese em grupamentos
ésteres de diversos compostos. As lipases são amplamente encontradas na natureza,
podendo ser obtidas a partir de microrganismos naturais ou geneticamente modificados
e também a partir de fontes animais e vegetais. A principal forma de produção de
lipases tem sido através de processos fermentativos, pois estes processos apresentam
maior facilidade de controle, maior capacidade produtiva e custo de obtenção reduzido
Os principais microrganismos utilizados para produção de lipases são fungos dos
gêneros Rhizopus, Aspergillus e Mucor, bactérias do gênero Pseudomonas e leveduras
do gênero Candida (BALCÃO et al., 1996; PANDEY et al., 1999).
As áreas nas quais a aplicação das lipases vem tendo maior destaque são (LEAL
et al., 2002; BARON, 2003; WAKABAYASHI, 2003):
• Farmacêutica – síntese de intermediários de fármacos (ex. ibuprofeno e
naproxeno, fármacos com atividade anti-inflamatória); resolução de
misturas racêmicas (ex. síntese de atenolol, fármaco anti-hipertensivo)
• Alimentos – síntese de aromas (ex. maturação de queijos); síntese de
edulcorantes, (ex. aspartame).
• Detergentes – remoção de manchas de gorduras dos tecidos
• Agroquímica – síntese de inseticidas e pesticidas
• Tratamento de efluentes – redução do teor de gorduras em efluentes da
indústria de laticíneos.
• Oleoquímica – hidrólise e interesterificação regiosseletiva de óleos e
gorduras
Entre as possibilidades de utilização de lipases, provavelmente, a aplicação mais
interessante seja o uso como catalisador em sínteses enantiosseletivas. Compostos
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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6
oticamente puros são dificilmente obtidos por rotas de química orgânica tradicional.
Esses compostos podem apresentar grande valor tanto para aplicações diretas como
produto final ou ainda como intermediário em reações de síntese (WAKABAYASHI,
2003)
As lipases constituem ferramentas potentes na catálise não apenas de reações de
hidrólise mas também de diversas reações ditas "reversas" (ex. esterificação,
transesterificação e aminólise), pois se mantém ativas em meios contendo solventes
orgânicos. A Figura III.1 ilustra as principais reações catalisadas por lipases.
Figura III.1 – Reações químicas catalisadas por lipases
Assim como lipases podem catalisar o rompimento hidrolítico da ligação C-O em
ésteres, resultando na liberação de álcoois, compostos tióis podem ser gerados pela ação
de enzimas hidrolíticas sobre tioésteres (Figura III.2). Esta reação é particularmente
interessante pelo seu potencial de aplicação na produção e modificação de aromas
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
7
Figura III.2 – Reação de geração de tióis catalisada por lipases
Apesar de os principais substratos das lipases serem triglicerídeos de cadeia longa
(com mais de 10 átomos de carbono), essas enzimas atuam sobre uma gama de
substratos não-naturais (ésteres não-lipídicos) e de diversos tamanhos. A versatilidade
das lipases sugere que sua estrutura polipeptídica seja flexível e possa adotar diferentes
conformações dependendo das características físico-químicas do meio, o que dificulta a
modelagem e previsão de interações estereoquímicas enzima-substrato (COSTA e
AMORIM, 1999).
Em geral, a maior atividade catalítica de lipases ocorre na interface água/lipídeo,
através do fenômeno chamado de ativação interfacial e tanto a qualidade quanto a área
interfacial têm papel importante na atividade catalítica dessas enzimas (SARDA e
DESNUELE, 1958; BALCÃO et al., 1996; PAIVA et al., 2000). A ocorrência da
ativação interfacial juntamente com a existência de uma tampa polipeptídica (parte da
proteína que recobre o sítio ativo) já foi utilizada como parâmetro de distinção entre
lipases “verdadeiras” e esterases.
O fenômeno da ativação interfacial foi proposto por Sarda e Desnuelle (1958)
após verificar diferença no comportamento das cinéticas entre enzimas. Os autores
verificaram que a atividade de esterases era função da concentração do substrato de
acordo com o modelo clássico de Michaelis e Menten, no qual a velocidade máxima
ocorria antes do limite de solubilidade do substrato ser atingido e da formação de
agregados e/ou interfaces. Já a atividade das lipases, se caracterizou por manter-se
constante até que a concentração micelar crítica (CMC) do substrato no sistema fosse
alcançado, e aumentando a partir desse ponto. A este fenômeno de aumento de atividade
enzimática quando há formação de interfaces, denominou-se “ativação interfacial”.
A existência de diversas enzimas que possuem tampa porém não são ativadas
interfacialmente (como por exemplo cutinase de Fusarium solani ssp pisi) ou não
possuem a tampa (lipases de Pseudomonas glumae e P. aeruginosa) fez com que a
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
8
ativação interfacial e a presença de tampa recobrindo o sítio ativo fossem reavaliadas
como critério para a distinção de lipases e esterases (JAEGGER et al., 1999; PAIVA et
al, 2000). Atualmente, consideram-se lipases as carboxilesterases que catalisam a
hidrólise e síntese de acil-gliceróis de cadeia longa (mais de 10 átomos de carbono)
(JAEGGER et al., 1999).
A maioria das lipases apresenta atividade ótima na faixa entre 30 e 40
o
C, e
embora sua termoestabilidade varie consideravelmente em função da origem, as
enzimas de origem microbiana são, em geral, as mais estáveis. Usualmente, lipases
são
ativas em uma ampla faixa de pH, apresentando uma alta atividade na faixa de pH entre
5 e 9, com um máximo situado entre 6 e 8, e massa molecular entre 12 e 69 kDa (apud
LANGONE, 1998; apud BARON, 2003).
Uma cepa do fungo Penicillium restrictum isolada de um rejeito agroindustrial
(torta de babaçu) foi selecionada por FREIRE (1996) como sendo um microrganismo
que apresenta excelente produção de lipases tanto em meio de cultivo submerso quanto
sólido (FREIRE et al.,1997b; GOMBERT et al., 1999; CASTILHO et al., 2000). A
preparação bruta desta lipase de Penicillium restrictum produzida por fermentação
submersa foi caracterizada por FREIRE et al. (1997a). A atuação dessa preparação
enzimática em diversos pHs e temperaturas foi investigada e determinou-se o pH e
temperatura ótimos como sendo 7,0 e 37
o
C, respectivamente. O tempo de meia-vida
dessa preparação enzimática em pH alcalino (8,0 e 9,0) foi 20 a 1000 vezes inferior ao
obtido em pH 7,0 a 30
o
C, que foi de 4.800 h. A afinidade entre a lipase de Penicillium
restrictum parcialmente purificada e substratos de diversos tamanhos foi estudada por
JESUS et al. (1999). Essa preparação enzimática apresentou baixa atividade catalítica
frente a triacilgliceróis de cadeia pequena (tributirina) e altos níveis frente a
triacilgliceróis de cadeia média (óleo de babaçu) e de cadeia grande (óleo de oliva)
indicando que a enzima estuda era de fato uma lipase.
III.1.2 Estrutura protéica
Onze lipases de diferentes fontes foram amplamente investigadas através de
técnicas de purificação, expressão genética, clonagem, cristalização e cristalografia de
raios-X pelo projeto “BRIDGE t-project” (BALCÃO et al, 1996; PAIVA et al., 2000).
Verificou-se que lipases possuem baixa homologia na seqüência de aminoácidos
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
9
(estrutura primária), no entanto, estas enzimas têm alta similaridade em sua arquitetura
tridimensional (estruturas secundária e terciária). Assim como outras hidrolases, as
lipases possuem uma tríade catalítica em seu centro ativo que é formada por um resíduo
nucleofílico (serina), um resíduo ácido (aspartato ou glutamato) e histidina (JAEGER et
al., 1999). A localização topológica da tampa das lipases varia entre as diversas lipases
e seu tamanho e complexidade geralmente aumentam com o aumento da molécula
protéica (JAEGER et al., 1999). A diversidade estrutural entre lipases de diferentes
origens foi representada esquematicamente na Figura III.3.
O centro ativo fica oculto pela tampa polipeptídica na forma nativa da enzima, o
que o torna inacessível às moléculas do substrato que estejam isoladas em meio aquoso.
A ativação da enzima, como mencionado na seção anterior, ocorre quando há contato
com uma interface, e então, há a abertura dessa tampa polipeptídica. Essa abertura
consiste na restruturação conformacional da lipase que cria uma região eletrofílica
(“buraco do oxiânion”) em torno do resíduo serina: a tampa helicoidal vira-se para trás
encobrindo seu lado hidrofílico em uma cavidade polar, antes preenchida por moléculas
de água, e expondo totalmente o lado hidrofóbico da tampa. Essa exposição faz com que
a superfície apolar em torno do sítio catalítico seja expandida. O buraco do oxiânion é
responsável pela estabilização de cargas negativas geradas durante o ataque nucleofílico
na ligação carbonila do substrato, portanto estabiliza o estado de transição durante a
catálise. (BALCÃO et al, 1996; PAIVA et al., 2000).
CAJAL et al. (2000) estudaram o mecanismo de ativação interfacial da lipase de
Thermomyces lanuginosa e verificaram que a ativação interfacial não é alcançada na
presença de vesículas zwitteriônicas ou quando há grandes vesículas aniônicas
(diâmetro de 100 nm) apesar de a enzima ligar-se a estas interfaces. De acordo com os
autores, a conformação com a tampa aberta é alcançada e estabilizada por uma
combinação de interações eletrostáticas e hidrofóbicas entre a face da enzima de ligação
com lipídeos e a interface do meio.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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Figura III.3 – Representação esquemática do sítio de ligação em diferentes lipases. Nos
exemplos (b) a (f) apenas um modelo do ácido graxo é mostrado, a espécie álcool foi
omitida para maior clareza da representação (reproduzido de PLEISS et al., 1998)
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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11
III.1.3 Mecanismo cinético
A ação das lipases é, geralmente, descrita pelo mecanismo cinético ping-pong bi
bi. Este mecanismo consiste de duas etapas principais: 1) ataque nucleofílico na ligação
éster do substrato pelo átomo de oxigênio do grupo hidroxil do resíduo serina do sítio
ativo após a abertura da tampa (resultando na formação de complexo enzimático acilado
e desprendimento de espécie álcool do substrato original) e 2) hidrólise do complexo
enzimático acilado, resultando na regeneração da enzima (JAEGER et al., 1999; PAIVA
et al., 2000). A Figura III.4, a seguir, apresenta de forma esquemática as duas etapas
principais da hidrólise catalisada por lipases e os estados transientes formados.
Figura III.4 – Mecanismo de reação de lipases. [1] Ligação do lipídio, ativação do resíduo
serina pelo vizinho histidina e ataque nucleofílico do átomo C do grupo carbonil do substrato
pelo O
-
da serina. [2] Intermediário transiente tetraédrico com O
-
estabilizado pela interação
com dois grupos NH de peptídeos. A histidina doa um próton para o componente álcool que
deixa o substrato. [3] Intermediário covalente enzima “acilada”, no qual o componente ácido do
substrato encontra-se esterificado com o resíduo serina da enzima. A molécula de água que se
aproxima é ativada pelo resíduo histidina vizinho, e o íon hidroxil resultante promove o ataque
nucleofílico no átomo de carbono carbonil do intermediário covalente. [4] O resíduo histidina
doa um próton para o átomo de oxigênio do resíduo serina ativo, a ligação éster entre a serina e
o componente acil é quebrada e o produto acil é liberado. Reproduzido de JAEGER et al.
(1999).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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12
A Figura III.5 apresenta de forma esquemática o mecanismo ping pong bi bi
envolvendo substratos e produtos múltiplos usando a notação de Cleland.
Es Al W Ac
F
Figura III.5 – Mecanismo cinético (ping pong bi bi) de reações com múltiplos produtos
e substratos catalisadas por lipases (E: enzima; Es: éster; Al: álcool; Ac: ácido; W: água;
i = 1,2,...,I; j=1,2,...,J) (PAIVA et al., 2000).
Segundo o mecanismo ping pong bi bi, a taxa de hidrólise (r) de um éster gerando
um ácido e um álcool, considerando a inibição pelo substrato e pelo produto, pode ser
genericamente descrita através da Equação III.1 (PAIVA et al., 2000)
[][]
[
]
[
]
[] [] [] []
[][] [][] [][ ] [][]
++++
++++
−
=
AcAl
K
v
AcW
K
vK
AlEs
KK
vK
WEsv
Ac
K
vK
Al
K
vK
WKvEsKv
K
AcAl
WEsvv
r
eq
f
Aci
rEsm
Esieq
fAcm
r
eq
fAlm
eq
fAcm
EsmrWmr
eq
rf
max,
,
max,,
,
max,,
max,
max,,max,,
,max,,max,
max,max,
(Eq.III.1)
Onde: Ac : ácido; Al: álcool; Es: éster; W: água; os subescritos
f
e
r
denotam o sentido
direto (hidrólise) e reverso (síntese) das reações, respectivamente; e ν
max,f
; ν
max,r
; K
eq
;
K
m,Ac
; K
m,Es
; K
i,Es
; K
m,W
; K
m,Al
e K
i,Ac
são parâmetros globais relativos às taxas
máximas, constante de equilíbrio, constantes de Michaelis-Menten e constantes de
inibição, respectivamente, que podem ser ajustados independentemente a partir de dados
de concentração de produtos e reagentes.
Quando água está presente em grande excesso no meio reacional (concentração de
água permanece constante) a equação genérica que descreve o mecanismo ping pong bi
bi pode ser simplificada em uma expressão bem mais simples, semelhante a expressão
E
E.Es F.Al E.Ac F.W
E
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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13
de taxa de reação de Michaelis-Menten, representada pela Equação III.2 (PAIVA et al.,
2000):
[]
[]
EsK
Esv
r
aparentem
aparente
+
=
,
max,
(Eq. III.2)
Onde: ν
max,aparente
definida como ν
max,f
[W]/(K
m,W
+ [W]) denota a taxa máxima aparente
da reação no sentido direto (hidrólise) e K
m,aparente
definido como K
m,Es
[W]/(K
m,W
+ [W])
denota uma constante de Michaelis-Menten aparente.
Embora o modelo de mecanismo ping pong bi bi seja o mais empregado para
descrever a ação catalítica das lipases, ele não é o único. GARCÍA et al. (2000)
modelaram a cinética da esterificação entre o ácido 2-clorobutírico e 1,2 epoxi-5-hexeno
catalisada pela lipase de Rhizomucor miehei imobilizada (Lipozyme
®
IM) através de
mecanismo reversível bi uni sequencial ordenado. Apesar de a última etapa da reação
não ser reversível, o mecanismo proposto pelos autores foi descrito como sendo:
Ou de acordo com a notação de Cleland (Figura III.6):
Ac
E
p
Es
E.Es E
E.Ac.Ep
E E.Ac
Figura III.6 - representação da reação de esterificação entre ácido 2-clorobutírico (Ac) e
1,2-epoxy-5-hexeno e éster 2-hidroxi-5-hexenil (Ep), onde: E, e Es representam a
enzima, e éster 2-cloro-butírico, respectivamente.
Segundo os autores ocorre inibição em duas etapas:
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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Considerando que os complexos com a enzima estão em estado estacionário, a
seguinte equação cinética pode ser escrita (Equação III.3):
]][[)/]][[
))´/]([1]([))´/]([1]([
))´/][1)(/][())´/]([1(
))/]([]][([
maxmax
maxmax
max
AcEpKKVEpEsV
KAcAcKKEpEpK
KAcKVEsVKEpKK
KEsEpAcV
v
eqip
iAcmEpiEpmAc
iAceqiEpmEpiAc
eq
ff
ff
f
++
++++
+++
−
=
(Eq III.3)
Onde: [Ac]: concentração do ácido 2-clorobutírico; [Ep]: concentração de 1,2-epoxi-5-
hexeno; [Es]: éster 2-hidroxi-5-hexenil 2-clorobutirato; K
eq
: constante de equilíbrio
(L/mol); K
i
: constante de inibição (mol/L); K
m
: constantes de Michaelis-Menten
(mol/L) .
Os dados levantados pelos autores foram bem ajustados por este modelo de
mecanismo cinético bi uni ordenado com o ácido e epóxido como inibidores
competitivos da lipase.
III.2 Biocatálise em solventes orgânicos
Tradicionalmente, a catálise enzimática limitava-se ao estudo de reações em meio
aquoso, o que restringia em muito as possibilidades de aplicações industriais. A partir
da observação de que muitas enzimas, tais como lipases, desidrogenases, esterases e
outras, atuam in vivo em ambientes ricos em lipídeos, constatou-se que os ambientes
aquo-restritos também poderiam ser meios adequados à catálise enzimática (apud
BARON, 2003). Assim, foram iniciadas pesquisas dedicadas a explorar a catálise
enzimática nos chamados meios reacionais não-convencionais, nos quais incluem-se os
solventes orgânicos, fluidos supercríticos, fluidos iônicos, fases gasosas e sólidas
(ADLERCREUTZ, 1994; CERNIA e PALOCCI, 1997; LANGONE 1998; OLIVEIRA,
1999).
O primeiro trabalho que observou a presença de atividade enzimática em
solventes orgânicos data da década de 60 (DASTOLI et al, 1966; ZAKS, 1996). No
entanto, apenas a partir dos anos 80 se vislumbrou o potencial das aplicações
biocatalíticas em meio orgânico, principalmente a partir de trabalhos desenvolvidos por
KLIBANOV (1986 e 1989).
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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Entre os meios não-convencionais, as aplicações em solventes orgânicos são as
que mais vêm sendo estudadas, principalmente devido ao interesse na síntese de
compostos enantioméricos puros e resolução de misturas racêmicas, de grande
importância para a indústria farmacêutica.
Existem diversas conformações de sistemas reacionais com meios orgânicos nos
quais se pode empregar a biocatálise. A seguir encontra-se classificação desses sistemas
em termos de homogeneidade (ILLANES, 1994; ADLERCREUTZ, 1996):
• Sistema homogêneo: solventes miscíveis em água (ex. glicerol,
etanol, metanol)
• Sistemas macro-heterogêneos: líquido-líquido (solvente imiscível e
enzima diluída na fase aquosa); sólido-líquido (biocatalisador sólido
em solvente miscível); sólido-líquido-líquido (biocatalisador sólido
em solvente imiscível)
• Sistema micro-heterogêneo: miscelas reversas
BARON (2003) comparou os rendimentos obtidos pela utilização de lipase de
Penicillium coryliphilum para a síntese de oleato de n-butila em diferentes sistemas
aquo-restritos (a
w
=0,11): micelas reversas, macro-heterogêneo com lipase liofilizada e
macro-heterogêneo com enzima imobilizada em gel de octil sepharose. Os rendimentos
obtidos na síntese foram de 80% no sistema empregando micelas reversas, 57% no meio
contendo a enzima livre, 20% no meio com enzima liofilizada na presença de β-
ciclodextrina, e de apenas 9% no sistema com enzima imobilizada.
A biocatálise em meio orgânico amplia as possibilidades de aplicação das
enzimas. As principais vantagens em se utilizá-la estão listadas a seguir (GUPTA, 1992;
ILLANES, 1994):
• Conversão de substratos insolúveis em meio aquoso;
• Variação na especificidade e seletividade enzimática;
• Alteração no equilíbrio da reação como efeito da partição de
substratos e produtos;
• Facilidade de recuperação de produtos e do biocatalisador;
• Aumento da termoestabilidade do biocatalisador;
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• Menor risco de contaminação microbiana;
• Maior facilidade de integração com etapas de síntese química
convencional.
O aumento da termoestabilidade das enzimas em meio orgânico resulta da
diminuição da dinâmica molecular protéica. Os exemplos listados na Tabela III.1
ilustram a enorme diferença entre os tempos de meia-vida de enzimas em meio aquoso e
orgânico. Como pode ser verificado nesta tabela, o tempo de meia vida (t
1/2
) de uma
preparação de lipase de pâncreas de porco em meio orgânico (t
1/2
= 26 horas) aumentou
em cerca de 800 vezes quando comparado com o meio aquoso (t
1/2
= 2 minutos) (ZAKS,
1996). Neste caso, deve-se ressaltar que, além da maior estabilidade térmica
proporcionada pelo meio orgânico, há concomitantemente o efeito de estabilização por
substrato (tributirina).
Tabela III.1 – Estabilidade de enzimas em meio aquoso versus não-aquoso (ZAKS,
1996)
Enzima Condição Tempo de meia-vida*
Tributirina t
1/2
< 26 h Lipase de pâncreas de porco
Aquoso; pH 7,0 t
1/2
<2 min
Tributirina/heptanol t
1/2
1,5 h Lipase de Candida sp.
Aquoso; pH 7,0 t
1/2
< 2 min
Octano; 100
o
C t
1/2
80 min Quimiotripsina
Aquoso; pH 8,0; 55
o
C t
1/2
15 min
Clorofórmio; 50
o
C t
1/2
90 min Tirosinase
Solução aquosa; 50
o
C t
1/2
10 min
*Tempo de meia-vida é o tempo decorrido até que haja o decaimento da atividade enzimática até metade
da atividade original.
Apesar da biocatálise em meio orgânico oferecer numerosas características
favoráveis, o uso destes sistemas apresenta alguns problemas que devem ser avaliados
antes de se decidir por sua utilização (ILLANES, 1994):
• Possibilidade de desnaturação e/ou inibição do biocatalisador pelo
solvente;
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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17
• Aumento da complexidade do sistema reacional;
• Custos adicionais com solventes, co-solventes e surfactantes.
Diferentes formulações enzimáticas podem ser empregadas como biocatalisadores
de reações em meio orgânico. A utilização de preparações sólidas (enzimas liofilizadas
ou imobilizadas) é mais freqüente, no entanto também é possível fazer modificações
químicas na proteína que possibilitem o emprego da enzima na forma solúvel em
solventes orgânicos. As principais formas de emprego das enzimas em meio orgânico
são (ADLERCREUTZ, 1996):
• Preparações sólidas: liofilização e imobilização
• Preparações solúveis: modificação covalente (ex. polietilenoglicol – PEG,
poliestireno e poliacrilatos), complexos não-covalentes (ex. surfactantes,
ácidos graxos, polímeros), e micro-emulsões.
Os sistemas em meio orgânico nos quais são utilizadas preparações de enzimas
solubilizadas encontram maiores limitações quanto às suas aplicações que aqueles com
preparações enzimáticas sólidas. Há restrições maiores inclusive quanto aos solventes
que poderão ser empregados. Hidrocarbonetos aromáticos ou clorados são os solventes
mais comuns quando se empregam enzimas modificadas covalentemente com
polietilenoglicol (PEG). Estes sistemas, no entanto, podem ser úteis na catálise de
substratos sólidos como por exemplo no método de síntese enzimática de peptídeos
catalisada por proteases modificadas com PEG, no qual a cadeia peptídica cresce ligada
a uma resina sólida (ADLERCREUTZ, 1996). Embora recuperar essas enzimas
solubilizadas no meio orgânico através de modificações covalentes seja mais difícil que
a recuperação das preparações sólidas, é possivel fazê-lo através de técnicas de
precipitação por solventes apolares ou por retenção com membranas (ADLERCREUTZ,
1996).
Além da imobilização, outros procedimentos de modificação de enzimas vêm
sendo estudados para aumentar a atividade das lipases como, por exemplo, o
revestimento da enzima com surfactantes e, mais recentemente, a “bio-impressão”.
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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18
O conceito de impressão molecular em polímeros orgânicos foi introduzido nos
anos 70 e consiste da formação de polímeros com ligação cruzada ao redor de molécula
que funciona como molde (FISHMAN e COGAN, 2003). Após a remoção do molde,
uma impressão contendo grupos funcionais capazes de interação química permanece no
polímero. A impressão em biopolímeros (“bio-imprinting”) é baseada na mesma idéia e
foi primeiramente descrita por Russel e Klibanov em 1988 em seu trabalho sobre
subtilisina, no qual obtiveram aumento de 100 vezes na atividade da enzima pela
liofilização na presença de inibidor competitivo.
A bio-impressão de enzimas ocorre quando, ainda em solução aquosa, o sítio ativo
destas proteínas é preenchido com um análogo do substrato formando um complexo
similar ao complexo enzima-substrato. Esse processo possivelmente é acompanhado por
pequenas modificações conformacionais, o chamado encaixe induzido (“induced fit”).
Quando o complexo é transferido para meio essencialmente anidro, o ligante é
removido, mas a enzima está inapta a retornar para sua conformação original devido à
rigidez de sua estrutura, resultante de fortes interações eletrostáticas em meios contendo
baixas constantes dielétricas. Como consequência, a estrutura tridimensional da enzima
permanece “congelada” na forma modificada, com a mesma configuração de quando o
ligante estava presente. A bio-impressão é restrita a solventes orgânicos anidros ou
microaquosos, pois a chamada “memória” é perdida em meio aquoso a menos sejam
tomadas outras medidas para estabilização. A ativação causada pela impressão com o
análogo foi drasticamente reduzida pela presença de água, mesmo quando quantidades
de água de apenas 0,04% foram adicionadas ao solvente (FISHMAN e COGAN, 2003).
Outra técnica utilizada para aumentar a atividade e estabilidade de enzimas é a
formação de um complexo entre a enzima e surfactantes solúveis em meio oleoso ou
com ácidos graxos (MARUYAMA et al., 2001). Denomina-se esse complexo de enzima
revestida com surfactante ou modificada com lipídeos.
Como durante o processo de revestimento é possível que parte do surfactante se
ligue ao sítio ativo e saia quando em contato com o meio orgânico, então é provavel que
ocorra bio-impressão concomitante ao processo de revestimento, principalmente quando
o revestimento é feito com análogos dos substratos. FISHMAN et al (1998)
descreveram o uso de ácidos graxos no revestimento de enzimas para aumentar sua
atividade em solventes orgânicos por torná-las mais hidrofóbicas.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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A combinação da bio-impressão e do revestimento com surfactante foi descrito
por OKAHATA et al. (1995). Lipase de Candida rugosa (CRL) foi impressa com várias
moléculas e revestidas moléculas amfifílicas. O revestimento com lipídios foi
importante tanto para manter a estrutura impressa como para solubilizar a enzima.
FISHMAN e COUGAN (2003) estudaram o uso de ácidos graxos para a bio-
impressão de lipases e ainda o efeito sinérgico da bio-impressão com o revestimento
pelos ácidos graxos e a imobilização. A bio-impressão foi realizada pela adição de ácido
caprílico dissolvido em etanol à solução tamponada da enzima, na presença de Tween
20 (laurato de sorbitan etoxilado), para aumentar a solubilidade do ácido, ou na ausência
deste surfactante. A solução da enzima adicionada do ácido caprílico foi posteriormente
congelada e liofilizada. O pó da enzima foi lavado com hexano para remoção da
molécula impressa e foi seco a vácuo para remoção do solvente. O efeito da bio-
impressão mostrou-se mais pronunciado em meios reacionais contendo solventes com
hidrofobicidade moderada (log P 1,0 a 2,5) que em meios mais hidrofóbicos. No
primeiro caso, a ativação foi de 200 a 300% em relação à enzima nativa e no segundo
caso de apenas 5 a 15%, possivelmente por que em solventes altamente hidrofóbicos a
enzima nativa já se encontra em estágio mais ativo.
De forma semelhante ao que ocorre na bio-impressão, quando enzimas são
precipitadas, tendem a manter a mesma conformação e distribuição de cargas
características da solução aquosa original. Quando essas enzimas são utilizadas em
reações em meio orgânico, essas características são mantidas em decorrência da
dificuldade de protonação e desprotonação. Denominou-se esse fenômeno de “memória
de pH” (ADLERCREUTZ, 1996). Portanto, no caso de utilização de enzimas
liofilizadas, a liofilização dessas enzimas deve ser realizada no estado de ionização
apropriado à catálise.
III.2.1 Influência do solvente
Em solventes orgânicos anidros, as enzimas permanecem cineticamente
aprisionadas a sua conformação nativa (YANG E RUSSEL, 1996; ZACKS, 1996). A
baixa constante dielétrica dos solventes faz com que haja aumento nas interações
eletrostáticas dos resíduos carregados das proteínas o que causa diminuição da
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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flexibilidade interna tornando as enzimas menos ativas, embora preserve a integridade
estrutural da proteína (ZACKS, 1996).
As propriedades dos solventes como polaridade (1/ε), hidrofobicidade (geralmente
determinada como log P
1
), geometria molecular e habilidade de solvatação são
essenciais à biocatálise em meio orgânico. No entanto, não existem correlações de
caráter geral entre essas propriedades e a atividade e estabilidade enzimática. O efeito
dos solventes é distinto para cada enzima. Enquanto lipases são mais estáveis em
solventes hidrofóbicos (log P>2), a quimotripsina é mais estável em solventes
relativamente hidrofílicos e não foi notada nenhuma correlação entre a atividade da
polifenol oxidase e a hidrofobicidade de solventes desde que a atividade de água no
meio fosse controlada (YANG e RUSSEL, 1996).
A performance catalítica da lipase de Mucor javanicus na síntese de n-pentil
laurato foi avaliada em relação a diferentes solventes orgânicos. A enzima não
apresentou atividade catalítica nas reações realizadas com solvente relativamente
hidrofílico (log P < 2), apresentou eficiência catalítica moderada em solvente com log P
entre 2 e 4; e alta eficiência em solventes fortemente apolares (log P > 4). Os
rendimentos em n-pentil laurato foram 82% em hexano (log P = 3,5), 70% em
ciclohexano (log P = 3,2), 68% em tolueno (log P = 2,5) e em diclorometano (log P =
0,93), acetona ( log P = –0,23) e acetonitrila (log P = –0,33) não foi observada a
formação do éster (SILVA e JESUS, 2003).
Apesar das numerosas exceções, o parâmetro Log P é o que apresenta melhor
correlação com a atividade de enzimas e, geralmente, as enzimas são mais estáveis em
solventes com caráter hidrofóbico. A Tabela III.2, a seguir, lista alguns solventes de uso
comum e os valores de Log P relativos a eles.
A forma como os solventes afetam a atividade enzimática e a enantiosseletividade
ainda não é bem compreendida e as hipóteses apresentadas para explicar esse fenômeno
apresentam discrepâncias entre si (COSTA e AMORIM, 1999). Pode-se observar nos
trabalhos que exploram esse tema a preocupação em salientar que os resultados
alcançados são restritos aos sistemas estudados, evitando-se generalizações.
1
Log P é definido como o logaritmo do coeficiente de partição de uma substância em um sistema padrão
de duas fases água/1-octanol [ADLERCREUTZ, 1994]
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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21
Tabela III.2 - Valor de Log P de solventes orgânicos (ADLERCREUTZ, 2000)
Solvente Log P Solvente Log P
Dimetilsulfóxido -1,3 Éter dietílico 0,85
Metanol -0,76 Clorofórmio 2,0
Acetonitrila -0,33 Benzeno 2,0
Etanol -0,24 Hexano 3,5
Acetona -0,23 Dodecanol 5,0
Acetato de etila 0,68 Dodecano 6,6
III.2.2 O papel da água
A existência de água nos sistemas de biocatálise em meio orgânico é essencial
para a atividade enzimática embora freqüentemente não seja necessária a presença de
uma fase aquosa macroscópica.
A água presente no meio orgânico pode estar dissolvida no solvente, ligada à
enzima ou ao suporte. A quantidade total de água presente no meio reacional não reflete
o grau de hidratação da enzima. Por isso, freqüentemente, prefere-se utilizar o conceito
termodinâmico da atividade de água (a
w
) para referir-se à quantidade de água em
sistemas orgânicos, já que, no equilíbrio, a atividade dos componentes é a mesma em
todas as fases (HALLING, 1989; ADLERCREUTZ, 1996). Este conceito
termodinâmico, atividade de água (a
w
), é definido como a razão entre a pressão parcial
da água no sistema (p
w
) e a pressão parcial da água pura (p
0
w
), como mostra a Equação
III.4.
0
w
w
w
p
p
a =
(Eq. III.4)
A atividade de água representa a umidade relativa do sistema considerado,
situando-se entre 0 e 1, sendo que quando a atividade de água iguala-se a 1, já há
formação de uma fase aquosa distinta (
apud BARON, 2003)
A atividade de água das soluções salinas saturadas é uma propriedade da
substância. Na Tabela III.3, a seguir, são listados alguns sais empregados para fazer o
controle da atividade de água e as atividades de suas respectivas soluções saturadas.
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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22
Tabela III.3 – Soluções salinas saturadas adequadas ao controle da atividade de água
(ADLERCREUTZ, 2000).
Sal Atividade de água (25
o
C)
LiCl 0,113
Acetato de potássio 0,225
MgCl
2
0,328
K
2
CO
3
0,432
Mg(NO
3
)
2
0,529
SrCl
2
0,708
KCl 0,843
KNO
3
0,936
K
2
SO
4
0,973
A técnica mais empregada, em escala de laboratório, para utilizar sistemas
reacionais com atividades de água fixas consiste no pré-equilíbrio desses sistemas com
o vapor de soluções salinas saturadas de atividade de água conhecida (HUTCHEON
et
al
., 1997). Também é possível promover o pré-equilíbrio por contato indireto entre a
solução salina saturada e o meio reacional através de tubo de silicone
(ADLERCREUTZ, 2000) (Figura III.9).
Figura III.9 – Controle de atividade de água via fase gasosa ou através de tubo de
silicone. [1] fase gasosa; [2] enzima imobilizada; [3] meio reacional (substrato em meio
orgânico); [4] agitador; [5] solução salina saturada; [6] cristais do sal; [7] tubo de
silicone; [8] solvente orgânico. Reproduzido de ADLERCREUTZ (2000)
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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23
As moléculas de água que circundam a proteína contribuem nas principais forças
que a estabilizam (interações van der Waals, pontes salinas e ligações de hidrogênio),
ativam a enzima ao permitir sua flexibilidade e estão envolvidas nas interações enzima-
substrato (ADLERCREUTZ, 1996). A quantidade de água presente no meio reacional,
assim como qualquer outro substrato ou produto, afeta também o equilíbrio
termodinâmico entre as reações catalisadas pelas enzimas, alterando a conversão de
equilíbrio, embora não modifique a constante de equilíbrio (PAIVA
et al., 2000). Há
evidências de que a atividade enzimática em meio orgânico seja predominantemente
dominada pela interação entre o solvente e a água ligada à proteína (YANG e RUSSEL,
1996).
Geralmente, o aumento na polaridade do solvente causa o aumento da quantidade
ótima de água necessária à reação, pois solventes com maior afinidade pela água tendem
a removê-la em maior quantidade da superfície da proteína. Metanol (log P = – 0,76) foi
capaz de promover a dessorção de até 60% da água ligada a enzimas (quimiotripsina,
subtilisina e peroxidase) enquanto hexano (log P = 3,5) promoveu a dessorção de
apenas 0,5% da água ligada às mesmas enzimas (YANG e RUSSEL, 1996). A remoção
de água da camada de hidratação da enzima também pode ser minimizada pela
hidrofilização da superfície da proteína. A modificação covalente de
α-quimiotripsina
com dianidrido piromelítico resultou no aumento de sua estabilidade em solventes
orgânicos (YANG e RUSSEL, 1996).
Embora a quantidade ótima de água necessária à atividade enzimática dependa da
enzima utilizada, um perfil típico de sistemas enzimáticos em meio orgânico é
apresentado na Figura III.10. Em geral, o aumento da quantidade de água disponível
provoca o aumento da atividade enzimática até que a quantidade ótima de água seja
alcançada, a partir desse ponto ótimo ocorre decréscimo da atividade enzimática. Na
Figura III.10 pode-se observar que a adição de uma pequena quantidade de água (até
5%) a um sistema reacional em meio de acetato de etila e empregando
α-quimiotripsina
como biocatalisador aumentou consideravelmente sua atividade enzimática.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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24
0,00
0,01
0,01
0,02
0,02
0,03
0,03
0246810
Água adicionada (%)
Atividade (
µ
mol/min/mg)
Figura III.10 – Atividade catalítica de
α-quimiotripsina em função da quantidade de
água adicionada em meio contendo acetato de etila (reproduzido de ADLERCREUTZ,
1996).
Apesar de as lipases, particularmente, serem reconhecidas como enzimas capazes
de manterem-se ativas em meios com baixa atividade de água, essa generalização deve
ser vista com cautela, pois lipases de origens distintas apresentam perfis de atividade,
em função da atividade de água, diferentes entre si. A Figura III.11 mostra a variação no
perfil de atividade de lipases de
Rhizopus arrhizus, Candida rugosa e Pseudomonas sp.
em um sistema empregando como reação modelo a esterificação entre ácido decanóico e
dodecanol (WEHTE e ADLERCREUTZ, 1997)
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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25
0
50
100
150
200
250
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Atividade de água
Atividade enzimática
(
µ
mol / min*g)
Figura III.11 – Efeito da atividade de água na atividade enzimática de lipases de
origens diversas: - Rhizopus arrhizus ; { - Candida rugosa; - Pseudomonas sp.
(WEHTJE e ADLERCREUTZ, 1997)
WEHTJE
et al. (1997) verificaram através de reações de esterificação entre 2-
octanol (e outros álcoois) e ácido n-decanóico que a atividade de água, e portanto o grau
de hidratação da lipase, não afetou significativamente a enantiosseletividade,
independentemente da fonte de lipase testada ou do solvente ou substrato (álcool)
empregados. No entanto, o aumento da flexibilidade molecular mostrou ser
determinante para a atividade enzimática.
III.3 Imobilização de enzimas
III.3.1 Aspectos gerais
A tecnologia de imobilização de enzimas teve início nos anos 50, quando foram
pela primeira vez produzidas preparações enzimáticas imobilizadas por inclusão em
matrizes poliméricas e por ligação em suportes (TISCHER e KASCHE, 1999). Desde
então numerosos métodos de imobilização em diferentes materiais foram desenvolvidos.
Os métodos de imobilização são frequentemente classificados segundo o tipo de
ligação empregada e o suporte (LIMA
et al., 2001):
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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• Separação por membrana
• Encapsulamento
• Membranas fibrosas semi-permeáveis
• Microencapsulamento
• Entrelaçamento com polímeros
• Formação de ligações covalentes
• Adsorção
O uso de enzimas imobilizadas oferece importantes vantagens em processos
industriais e tem sido utilizado extensivamente por facilitar o desenvolvimento de
processos em escala comercial (TISCHER e KASCHE, 1999). São numerosas as
vantagens do uso de enzimas imobilizadas em relação ao uso de preparações de enzimas
livres. As principais vantagens apontadas por diversos autores são (FREIRE, 1988,
ILLANES, 1994; BENJAMIN e PANDEY, 1998; VILLENEUVE
et al., 2000;
GUISÁN
et al., 2001):
a) Facilidade de recuperação do biocatalisador. O uso de enzimas
imobilizadas facilita a aplicação da biocatálise pois as operações unitárias
empregadas na separação do biocatalisador são simples (filtração ou
centrifugação). Não é necessário realizar procedimentos de inativação
enzimática como a desnaturação térmica ou por pH, que podem levar a
alterações indesejáveis do produto final. Além disso, os efluentes são
gerados livres do biocatalisador.
b) Facilidade de separação dos produtos. O emprego de enzimas
imobilizadas é especialmente indicado para processos cujos produtos
finais requeiram elevado grau de pureza, pois o biocatalisador é facilmente
removido do meio.
c) Processo pode ser operado continuamente. A facilidade em se reter o
biocatalisador permite que processos contínuos sejam implementados
utilizando reatores variados, como os reatores tubulares (PFR) ou tanques
de agitação (CSTR), e o controle do processo é facilitado.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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d) Previne a formação de agregados em meio orgânico. Enzimas livres,
quando suspensas em um solvente orgânico, tendem a se agregar e a
prender nas paredes do reator, principalmente se for adicionada água a esse
sistema. A imobilização de enzimas em suportes sólidos pode contornar
esse problema.
e) Minimização de efeitos desnaturantes e maior proteção contra
desativação por produtos químicos. A diminuição da dinâmica
molecular minimiza a ocorrência de desnaturação por efeitos térmicos ou
por pH. Certas técnicas de imobilização, como a adsorção seguida por
recobrimento da enzima com polímeros hidrofílicos, diminuem a interação
entre a enzima e o meio reacional prevenindo a desnaturação por efeito de
produtos químicos.
f) Manutenção de micro-ambiente com alta atividade de água. A
imobilização permite a manutenção de uma camada de solvatação no
micro-ambiente em torno da enzima capaz de manter uma dinâmica
molecular mínima, essencial à atividade enzimática em ambientes
orgânicos.
g) Propriedades enzimáticas (como atividade e termoestabilidade)
podem ser alteradas favoravelmente. A interação entre a enzima e o
suporte além de reduzir a dinâmica molecular da enzima pode ocasionar
mudanças conformacionais. A escolha de suportes e técnicas de
imobilização adequados podem ser empregados para provocar alterações
desejadas nas propriedades das enzimas.
h) Custos com manejo de materiais são minimizados. A melhor
estabilidade da enzima imobilizada facilita a sua estocagem e diminui as
exigências para sua manipulação.
A imobilização pode tornar economicamente viável o emprego da catálise
enzimática em processos que necessitem do uso de biocatalisadores de custo elevado
pois estes poderão ser re-utilizados.
Apesar das vantagens do emprego das enzimas imobilizadas em relação ao uso de
enzimas livres, as técnicas de imobilização apresentam alguns problemas. O principal
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Capítulo III – Revisão bibliográfica
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28
obstáculo ao uso mais amplo da imobilização de enzimas reside no aumento do custo do
biocatalisador. Vários dos suportes normalmente empregados em imobilizações são de
custo elevado e diversas técnicas são muito trabalhosas. Além disso, freqüentemente,
ocorre redução da atividade enzimática, o que constitui um custo a mais, pois uma
maior quantidade do biocatalisador precisará ser empregada no processo. A decisão
entre o uso de enzimas livres ou imobilizadas deve avaliar as características do processo
e as exigências técnicas para a sua execução bem como e o balanço econômico
considerando as vantagens e desvantagens proporcionadas pelo uso de cada
biocatalisador.
O processo de imobilização normalmente ocasiona modificações nas propriedades
físico-químicas da enzima com conseqüente alteração na estabilidade e nas propriedades
cinéticas da enzima imobilizada. Os principais aspectos a respeito desses efeitos serão
apresentados a seguir (
apud FREIRE, 1988):
• Efeitos conformacionais – São os efeitos associados às modificações na
conformação da proteína em conseqüencia da alteração dos aminoácidos
residuais do sítio ativo. As interações covalentes entre a enzima e o suporte
podem causar o estiramento da molécula, alterando a estrutura
tridimensional do sítio ativo.
• Efeitos estereoquímicos – A imobilização pode tornar certas regiões da
enzima pouco acessíveis ao substrato causando um efeito de exclusão. As
propriedades do suporte sólido, tais como: natureza hidrofóbica ou
hidrofílica, constante dielétrica e a presença de cargas fixas no suporte;
podem interferir na performance do biocatalisador. A minimização desses
efeitos pode ser realizada pela utilização de espaçadores capazes de manter
os sítios ativos da enzima mais distantes dos efeitos de exclusão do suporte.
• Efeitos de partição - São os efeitos causados pela desigualdade na
distribuição das espécies químicas entre o micro-ambiente e o seio do meio
reacional. Esses efeitos resultam de interações hidrofóbicas, hidrofílicas e
eletrostáticas entre o suporte e o substrato.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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• Limitações difusionais – Assim como ocorre com a catálise heterogênea, a
ação catalítica de enzimas imobilizadas pode ser dividida em pelo menos 5
etapas. Essas etapas são:
- Difusão externa de substratos
Î difusão do substrato do seio da fase
líquida até a superfície do suporte.
- Difusão interna de substratos
Î Transporte do substrato da superfície do
suporte para o domínio da enzima.
-Catálise
Î Atuação da enzima reduzindo a energia de ativação para a
reação química.
- Difusão interna de produtos
Î Transporte do produto do domínio da
enzima para a superfície do suporte.
- Difusão externa de produtos Î Difusão do produto da superfície do
suporte para o seio do meio reacional.
As alterações nas propriedades enzimáticas são decorrentes da interação entre os
vários efeitos citados anteriormente (conformacionais, estereoquímicos, de partição e
limitações difusionais). Dependendo do efeito que controla a reação, os parâmetros
cinéticos podem ser diferenciados. Esses parâmetros podem ser classificados em três
categorias principais (
apud FREIRE, 1988).
• Parâmetros cinéticos intrínsecos – São os parâmetros que refletem o
comportamento cinético verdadeiro da enzima imobilizada. Esses
parâmetros só podem ser determinados no macroambiente caso a
concentração de substratos e produtos sejam a mesma do micro-
ambiente. Devido à existência de efeitos conformacionais e estereo-
químicos, os parâmetros cinéticos intrínsecos da enzima imobilizada
podem ser distintos desses parâmetros para a enzima solúvel.
• Parâmetros cinéticos inerentes – Esses parâmetros refletem o
comportamento cinético da enzima na ausência de limitações
difusionais e só podem ser determinados quando o transporte de
substratos e produtos ocorrer de forma infinitamente rápida. Essa
condição pode ser alcançada na prática pelo uso de membranas finas,
enzimas com baixa atividade e agitação suficiente do meio reacional.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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30
Os parâmetros cinéticos inerentes e intrínsecos diferem entre si quando
o efeito de partição é importante, ou seja quando a matriz sólida
interage com as espécies solúveis.
• Parâmetros cinéticos efetivos – São os parâmetros globais que
refletem o comportamento da enzima imobilizada na presença de
efeitos difusionais, de partição, conformacionais e estereoquímicos.
Esses parâmetros são determinados a partir da velocidade global da
reação nas condições experimentais normalmente empregadas.
A existência de efeitos de partição na matriz sólida pode ocasionar alterações no
perfil de pH em enzimas imobilizadas. Suportes que apresentem cargas positivas em sua
superfície tendem a deslocar o pH ótimo de atividade da enzima para valores mais
ácidos. Isso ocorre pela atração de cargas negativas pelo suporte que forma um “filme”
de ânions, gerando microambiente com pH mais alcalino que o macro-ambiente onde o
pH é medido. Da mesma forma, suportes contendo cargas negativas tendem a deslocar o
pH ótimo de atividade da enzima para faixas mais alcalinas (FREIRE e SANT’ANNA,
1990).
Restrições difusionais externas e internas (no caso de suportes porosos) e a
existência de gradientes de concentração podem reduzir a taxa reacional global. As
limitações difusionais podem ser diminuídas se forem utilizados suportes com partículas
de menor tamanho. Contudo, o uso desses suportes de tamanho reduzido pode resultar
em maiores quedas de pressão. TISCHER e KASCHE (1999) mencionam as técnicas
mais apropriadas para que se consiga uma melhor performance do biocatalisador
imobilizado:
a) Diminuição do tamanho de partícula; em aplicações técnicas o limite
são partículas esféricas com 100
µm, pois assim é possível retê-las
em pratos de peneiras comuns mesmo em grandes biorreatores.
b) Redução da carga de enzima quando estas possuirem alta atividade
específica.
c) Ligação preferencial sobre a camada externa do suporte.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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31
O suporte empregado deve ser avaliado quanto à morfologia, às características
químicas, às propriedades mecânicas e ao preço. Os suportes mais utilizados na
imobilização de enzimas pertencem às seguintes categorias de materiais
(ADLERCREUTZ, 1996):
• inorgânicos (vidro, terra diatomácea, sílica-gel, alumina);
• polímeros sintéticos (polietileno, polipropileno, poliestireno,
poliéster acrílico, monômeros de acrílicos, poliuretanos, álcool
polivinílico, resinas trocadoras de íons);
• polissacarídeos (agarose, alginato de cálcio, quitina);
• agregados enzima-lipídeos.
III.3.2 Imobilização de lipases
Diversas técnicas de imobilização e numerosos suportes podem ser utilizados para
imobilizar lipases. A seleção da técnica e suporte empregados depende da aplicação que
o biocatalisador se destina. Apesar de ser objeto de estudo de pesquisas científicas há
bastante tempo, a imobilização de lipases ainda demanda investigações adicionais sobre
os efeitos exercidos pelas diferentes técnicas de imobilização sobre a estrutura destas
enzimas, e sobre o emprego de novos materiais como suportes.
A imobilização de lipase de pâncreas de porco foi realizada por Kilinç
et al (2002)
através da ligação covalente com álcool poli-vinílico com ligação cruzada com
adipoildicloreto. O rendimento de atividade foi de 63% e quando foram comparadas as
propriedades da enzima livre e imobilizada verificou-se a mudança do pH ótimo de 8,5
para 9,0 e da temperatura de 30
o
C para 37
o
C.
Anteriormente a imobilização de lipases era realizada principalmente sobre
suportes inorgânicos. Mais recentemente, tem-se dado preferência à imobilização em
materiais como resinas de troca iônica e biopolímeros (VILLENEUVE
et al., 2000). A
Tabela III.4 apresenta uma compilação feita por Benjamin e Pandey (1998) de trabalhos
relacionados à imobilização de lipases de
Candida rugosa. Os exemplos de suportes e
técnicas de imobilização de lipases listados nesta tabela são apenas uma parcela do
montante de estudos já realizados explorando esse tema.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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Tabela III.4 – Imobilização de lipase de
Candida rugosa (BENJAMIN e PANDEY,
1998)
Agente Reação Produto Referência
Esterificação
estereosseletiva
Ácido 2-(4-
clorofenoxi)
propanóico
Fukui
et al., (1990)
Appl. Microbiol.
Biotechnol
. 34, 330-
334
Celite
Esterificação Éster de álcool
isoamílico com
ácido butírico
Kawakami
et al.
(1996)
Biotechnol.
Tech
. 10, 206-210
Fibra de nylon Hidrólise
estereoespecífica
Metil
metoxifenil
glicidato
Braun
et al., (1996)
Biotechnol. Bioeng,
51, 327-341..
Co-polímero de
metil acrilato e
metil metacrilato
Hidrólise Ácidos graxos
livres
Yunus
et al. (1996)
Biotechnol. Appl.
Biochem.
24, 19-23
Polimetil
metacrilato
Esterificação Ésteres graxos Basri et al (1996) J.
Chem Technol.
Biotechnol
. 66, 169-
173
Cristal líquido
liotrópico
Esterificação Butirato de
butila
Frense et al. (1996)
Biotechnol. Lett. 18,
293-298
Pérolas de vidro Esterificação Éster citronelol
com ácido
valérico
Ikushima
et al. (1996)
J. Chem. Eng. Jpn.
29, 551-553
Sílica-gel Hidrólise Glicerol Sanchez et al. (1996)
Enzyme Microb.
Technol
. 18, 468-476
Cristais com
ligações cruzadas
com enzimas
Hidrólise / síntese Ésteres Persichetti
et al.
(1996)
Abstr. Pap.
Am. Chem. Soc. 211
meet Pt. 2, ORGN006
Vertex Pharm (1992)
PN: WO; 9202617
Quitina Hidrólise Ácidos graxos
livres
Williams, T.R. (1996)
Abstr. Pap. Am.
Chem. Soc.
211 meet
Pt. 1, CHED, 319
As propriedades catalíticas de lipases podem ser modificadas através das diversas
técnicas de imobilização por envolverem diferentes áreas das enzimas. A Figura III.12
representa de maneira esquemática as diferentes conformações que são assumidas por
lipases em função da técnica de imobilização.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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33
Figura III.12 – Comparação entre as formas de lipases após diferentes processos de
imobilização (PALOMO
et al, 2002 c).
No trabalho de PALOMO et al., (2002b), lipase de Mucor miehei foi imobilizada
covalentemente em diferentes resinas epoxi (resinas epoxi hidrofóbicas padrão, epoxi-
etilenodiamina, ácido epoxi-iminodiacético, quelatos cobre-epoxi) e adsorvida via
adsorção interfacial em suportes octadecil-sepabeads. A Figura III.13 apresenta uma
representação das diferentes conformações de lipases em função da imobilização em
diversos suportes. Assim como o verificado pela imobilização de lipase de
Candida
rugosa
(PALOMO et al. 2002a), verificou-se que a enantiosseletividade de lipase de
Mucor miehei foi fortemente modificada pelas características da imobilização e das
condições experimentais.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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34
Figura III.13 – Esquema da conformação de lipase de
Mucor miehei imobilizada
covalentemente em diferentes resinas epoxi (resinas epoxi hidrofóbicas padrão, epoxi-
etilenodiamina, ácido epoxi-iminodiacético, quelatos cobre-epoxi) e adsorvida via
adsorção interfacial em suportes octadecil-sepabeads. em diferentes suportes
A utilização de protocolos de imobilização diversos, envolvendo diferentes áreas
da proteína ou promovendo diferentes graus de rigidez na enzima podem alterar o
equilíbrio entre as estruturas abertas (ativas) e fechadas (inativas) assim como a
conformação do sítio da enzima imobilizada (SABUQUILLO et al., 1999;
FERNÁNDEZ-LORENTE et al., 2001; PALOMO et al., 2002 a).
Lipase de
Candida rugosa (CRL) foi imobilizada através de diversos protocolos
por PALOMO
et al. (2002 a): adsorção interfacial em suportes hidrofóbicos, adsorção
iônica em suportes revestidos com PEI (polietilenoimina) e imobilização covalente (em
suportes com gluteraldeído). Os derivados formados apresentaram alterações
importantes em suas propriedades catalíticas (atividade, especificidade e
enantioseletividade): o derivado por adsorção interfacial mostrou-se mais ativo na
hidrólise de substratos mais simples como etil butirato, enquanto o derivado PEI
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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mostrou-se mais ativo na hidrólise de substratos iônicos (ácido 2-fenil-2-butiroilacético
em pH 7) ou de metil mandelato. A enantiosseletividade dos derivados também variou
bastante em relação aos substratos testados (Tabela III.5)
Tabela III.5 – Hidrólise de diferentes substratos por derivados de lipase de
Candida
rugosa
em pH 7 e 25
o
C (PALOMO et al., 2002 a)
Derivado
Butil
butirato
Metil mandelato
ácido 2-fenil-2-butiroilacético
Ativ.
a
Ativ.
a
ee
b
Sp
c
E
d
Ativ.
a
ee
b
Sp
c
E
d
Adsorção interfacial
211 0,006 66 S 10 0,009 19 S 1,6
Adsorção iônica (PEI)
51 0,0015 60 S 8 0,0057 100 R >400
Ligação covalente
(gluteraldeído)
40 0,01 78 S 20 0,01 18 S 1,4
a
Atividade específica: mol/h mg lipase.
b
Excesso Enantiomérico
c
Preferência estereoquímica
d
Razão enantiomérica
+⋅−
−⋅−
=
)1()1(
)1()1(
ln
eeX
eeX
E
, onde X é conversão e ee é o excesso enantiomérico ee=[%R-%S]
Os resultados de PALOMO et al. (2002 a, b, c) e FERNANDEZ-LORENTE et al.
(2001b) indicam que as propriedades de lipases podem ser moduladas através da
“engenharia conformacional”, ou seja, que o emprego de diferentes técnicas de
imobilização e variações das condições experimentais podem alterar as propriedades
catalíticas de determinada lipase.
A imobilização de lipase de
Candida rugosa por encapsulamento em
biopolímeros (agarose, alginato e quitosana) foi realizada por BETIGERI e NEAU
(2002). Neste trabalho, verificou-se que agarose não constituiu um bom suporte pois
houve inchamento dos grânulos formados e lixiviamento da enzima para o meio
reacional. Já a imobilização em alginato e em quitosana apresentou eficiências de
imobilização equivalentes (cerca de 50%), no entanto a atividade da lipase imobilizada
em quitosana foi muito superior à imobilizada em alginato, 1110 e 240 U/mL,
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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36
respectivamente. A diferença no efeito dos suportes na atividade dos biocatalisadores
foi atribuída à forte interação entre a enzima e alginato, impedindo a livre
movimentação da proteína.
Excelentes revisões abordando esse tema podem ser encontradas nos trabalhos de
PAIVA
et al. (2000); VILLENEUVE et al. (2000); PANDEY et al. (1999);
BENJAMIN e PANDEY (1998); BALCÃO
et al. (1996).
O estudo mais aprofundado sobre a imobilização de lipases se restringirá, neste
trabalho, à imobilização de lipases por adsorção (seção III.3.3) por essa ser a técnica
mais utilizada em reações biocatalíticas em meio orgânico.
III.3.3 Imobilização de lipases por adsorção
Entre todos os métodos de imobilização de lipases , a adsorção ainda é o mais
comum. Os métodos de imobilização por adsorção apresentam baixo custo, poucos
efeitos deletérios para a atividade e seletividade da enzima. Métodos de imobilização
que envolvem formas de ligação fraca entre a enzima e o suporte, como a adsorção,
podem ser utilizados para aplicações de catálise enzimática em meio não-aquoso, pois
como as enzimas são insolúveis em praticamente todos os solventes orgânicos, sua
dessorção do suporte é negligenciável.
Normalmente, a quantidade máxima de proteína adsorvida corresponde a uma
mono-camada sobre a superfície do suporte. A adsorção depende do pH da solução
enzimática, obtendo-se valores máximos de adsorção no ponto isoelétrico da proteína
(
apud BARON, 2003). Isto ocorre pois, no pH correspondente ao ponto isoelétrico da
proteína, a repulsão eletrostática entre as moléculas é minimizada.
Suportes hidrofóbicos conseguem adsorver maiores quantidades de enzimas e a
densidade da camada de adsorção também pode ser maior, em relação aos suportes
hidrofílicos (
apud BARON, 2003). Outra razão pela qual o emprego de suportes
hidrofóbicos é preferível aos hidrofílicos para a imobilização de lipases decorre da
tendência dos suportes hidrofílicos em competir pela água disponível no meio reacional
(VILLENEUVE
et al., 2000).
A imobilização de enzimas por adsorção, por envolver apenas forças fracas de
ligação, geralmente, permite a dessorção de enzimas já sem atividade e a regeneração
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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do suporte através de procedimentos simples como a alteração do pH ou força iônica do
meio (VILLENEUVE
et al., 2000). A facilidade com que ocorre a dessorção das
proteínas pode ser vista tanto como uma vantagem (regeneração de suportes caros)
como um dos principais pontos fracos dessa técnica pois pode haver dessorção das
proteínas ao longo da reação quando o biocatalisador constituído é empregado em
reações em meio aquoso. Porém, como já foi mencionado anteriormente, a baixa
afinidade entre enzimas e solventes orgânicos, principalmente os mais apolares,
restringe a ocorrência de dessorção em reações em meio orgânico.
Os parâmetros mais importantes ao processo de adsorção são (VILLENEUVE
et
al
., 2000):
• Tamanho da proteína
• Características morfológicas do suporte (área específica, porosidade,
tamanho de poros) e natureza da superfície (constituição química)
• Concentração de enzima
• pH
• Possibilidade de regeneração do suporte
As imobilizações por adsorção são usualmente realizadas pela incubação do
suporte junto à solução com a enzima em tampão ou pela precipitação da lipase com
solventes como acetona sobre a superfície do suporte. As soluções de lipases que serão
imobilizadas devem ser preparadas preferencialmente com tampões de molaridade
reduzida, pois ao contrário do que ocorre com outras proteínas, a adsorção de lipases é
favorecida em meio com baixa força iônica (BATISDA
et al., 1998; SABUQUILLO et
al
., 1998).
A inclusão de aditivos durante o processo de imobilização de lipases é uma
técnica bastante utilizada, embora não haja unanimidade quanto ao seu efeito. Diversos
trabalhos descrevem um melhoramento significativo na atividade e estabilidade de
enzimas imobilizadas, quando é realizada a co-imobilização de aditivo em processo de
adsorção. Alguns efeitos atribuídos a esta técnica (
apud SOARES et al., 2003):
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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38
1. Proteção da inativação da enzima durante a etapa de imobilização;
2. Retenção da camada de água ao redor do biocatalisador
3. Efeitos dispersantes das moléculas da enzima e facilitadores de transporte
de massa quando aditivos são usados como matrizes de imobilização.
No caso específico das lipases, que exigem uma interface para sua total atividade
catalítica, aditivos macromoleculares, como caseína, gelatina, albumina de ovo ou de
soro bovino, polietilenoglicol e álcool polivinílico, mostraram-se eficientes como
aditivos de imobilização dessas enzimas em vários suportes (
apud SOARES et al.,
2003). Esses aditivos apresentam efeitos estabilizantes significativos por meio do
revestimento da interface, impedindo, desta forma, uma mudança de sua estrutura
protéica. SOARES
et al. (2003) testaram a imobilização de lipase de Candida rugosa
em sílica de porosidade controlada (SPC) na presença de polietilenoglicol (PEG, MM
1500 e 10.000) e albumina de soro bovino. A albumina apresentou efeitos benéficos
para todas as concentrações de lipase testadas, sendo obtido um valor máximo de
atividade lipolitíca de 153 U/g de suporte para uma concentração de lipase da ordem de
450 U/g de suporte. Rendimentos mais elevados (59,6%) foram obtidos quando PEG-
1.500 foi utilizado como agente estabilizante, produzindo uma preparação catalítica
altamente ativa (109 U/g), com uma redução considerável de lipase utilizada na etapa de
imobilização (150 U/g de suporte). O tempo de meia-vida da lipase imobilizada em SPC
foi aumentado em 2,7 vezes, quando comparado com o tempo de meia-vida da lipase
imobilizada em SPC sem aditivo. Entre os aditivos testados, apenas o PEG- 10.000 não
foi efetivo, reduzindo o rendimento de imobilização da lipase em SPC em comparação
ao controle.
Em preparações enzimáticas não-purificadas, a adsorção preferencial de lipases
pelos suportes hidrofóbicos pode levar à purificação parcial desta enzima durante o
processo de imobilização (SABUQUILLO
et al., 1998). Lipases parecem ser fortemente
adsorvidas em interfaces hidrofóbicas através de vários bolsos da grande superfície
hidrofóbica que rodeia o sítio catalítico. Esta grande superfície hidrofóbica envolve os
resíduos da face interna da tampa assim como outras cadeias protéicas (BRZOZOWSKI
et al., 1991, BASTIDA et al., 1998). A existência do mecanismo de ativação interfacial
das lipases, apesar de dificultar o entendimento e controle dessa enzima, pode ser
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
39
explorada no desenvolvimento métodos novos e mais simples de imobilização. Pode-se
esperar que lipases com pequenas diferenças estruturais reconheçam interfaces
hidrofóbicas de maneiras diferentes, modificando a taxa de adsorção. Esta diferença na
afinidade por superfícies com graus de hidrofobicidade distintos pode ser explorada
para separar isoformas. Fibras de agarose recobertas por grupos hidrofóbicos (butil,
fenil ou octil) constituem uma interface hidrofóbica mimética na qual lipases estão aptas
a sofrer adsorção interfacial seletiva similar à experimentada pelas lipases na presença
de gotas de substratos líquidos insolúveis (SABUQUILLO
et al., 1998).
A imobilização de lipases de
Candida antarctica, Mucor miehei e Candida rugosa
em octadecil-sepabeads (matriz acrílica epoxi com superfície coberta por grupos
octadecil) por adsorção interfacial, permitiu a estabilização da “forma aberta”
(PALOMO
et al., 2002c). A comparação destes biocatalisadores com a enzima solúvel e
outros biocatalisadores obtidos pela imobilização covalente multipontual, na qual
predominam as “formas fechadas”, evidenciou a ocorrência de hiperativação nas lipases
imobilizadas em suportes hidrofóbicos. Houve aumento da atividade específica da
lipase em até 20 vezes quando comparou-se a lipase imobilizada em suporte hidrofóbico
com a solúvel, além de aumento na estabilidade ao calor e aos solventes orgânicos
(mesmo quando comparada com imobilização covalente multipontual).
Assim como a maioria das proteínas, as lipases são solúveis em água e, portanto,
pode-se considerar que possuam caráter hidrofílico. No entanto, quando em contato com
interfaces hidrofóbicas, há ativação interfacial e estas moléculas adquirem alto grau de
hidrofobicidade, o que é uma característica incomum entre as enzimas. Segundo
BATISDA
et al. (1998), suportes porosos, com grande superfície interna inerte ativada
por espessas camadas bem definidas e altamente hidrofóbicas, são reconhecidos como
interfaces sólidas. A imobilização de lipases nestes suportes, ocorreria via adsorção
interfacial, um mecanismo distinto da adsorção convencional de proteínas em
superfícies hidrofóbicas. Ou seja, lipases seriam adsorvidas nestes suportes através dos
grandes bolsos hidrofóbicos (formados pela face interna da tampa que recobre o sítio
ativo e outras áreas hidrofóbicas da proteína próximas ao sítio) que a forma aberta da
enzima expõe ao meio. Desta forma, a adsorção de lipases por suportes como octil-
agarose faria com que estas enzimas estivessem na forma de estruturas abertas
imobilizadas. Como a ativação interfacial já ocorreu, as lipases podem atuar em
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
40
substratos solúveis que penetrem no interior dos poros (FERNÁNDEZ-LORENTE
et
al
., 2001).
Lipase de
Penicillium coryliphilum foi imobilizada por adsorção interfacial
utilizando como suporte gel de octil Sepharose 4 Fast Flow (Amersham-Pharmacia
Biotech), um gel constituído por esferas de 200
µm de diâmetro contendo 40 µmol de
grupos octil por mL do suporte (BARON, 2003). A atividade teórica (inferida a partir da
da determinação da atividade enzimática do sobrenadante antes e após a imobilização)
do biocatalisador obtido foi de 166 U.mg
-1
, e a atividade específica foi de 251 U.mg
-1
. O
biocatalisador imobilizado foi empregado na síntese de oleato de n-butila porém o
desempenho alcançado foi muito inferior ao esperado (conversões de 57% no meio
contendo a enzima livre, 20% no meio com enzima liofilizada na presença de
β-
ciclodextrina, e de apenas 9% no sistema com enzima imobilizada). BARON atribui o
fraco desempenho do biocatalisador imobilizado à desidratação da camada superficial
do material imobilizado devido à hidrofilicidade do substrato (n-butanol). Segundo a
autora, nas enzimas livres essa desnaturação ocorreria apenas na superfície dos
agregados formados protegendo a enzima no interior das partículas.
A imobilização de lipases na resina polimérica (polipropileno) Accurel
®
EP 100
foi estudada por BOSLEY (1997). Neste trabalho o máximo de atividade enzimática foi
alcançado pela colocação de 100.000 U/g , o que correspondia a 10% da atividade de
saturação do suporte. Esse resultado, no qual o máximo de atividade enzimática
imobilizada não coincide com a saturação do suporte, foi interpretado pelo autor como
resultado de concorrência entre dois fênomenos distintos, um predominante quando a
concentração de enzima no meio era baixa e, o outro, quando em alta concentração de
enzima. Segundo Bosley, quando há pouca enzima no meio, a interação com o suporte é
muito intensa, causando deformação das moléculas. Já a utilização de concentrações
altas de lipase causa limitações difusionais. Verificou-se ainda que a introdução de
proteínas inertes em meios com baixa concentração de lipases favoreceu a atividade
imobilizada por diminuir a interação entre as lipases e o suporte. Isotermas de Langmuir
descreveram bem o equilíbrio de adsorção de 5 diferentes tipos de proteínas (lipase de
Candida rugosa, albumina, α-quimotripsina, lipase pura de Humicola lanuginosa,
lipase bruta de
Pseudomonas fluorescens) nesse suporte (Accurel
®
EP 100). Os níveis
de saturação do suporte, 220 mg
proteína
/ g
suporte
, foram semelhantes para todas proteínas
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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41
(GITLESEN
et al.1997). Segundo os estudos de GITLESEN et al. (1997), a adsorção
não foi significativamente afetada por alterações no pH, indicando que as forças de
adsorção predominantes são forças hidrofóbicas e não interações eletrostáticas. Os
autores verificaram ainda que a dessorção em meio aquoso, na ausência de detergentes,
foi desprezível.
Este mesmo suporte (Accurel
®
EP 100) foi empregado por AL-DURI et al. (2001)
para a imobilização de lipase de
Rhizomucor miehei. O biocatalisador foi empregado em
sistema utilizando CO
2
supercrítico como solvente e foi caracterizado quanto à
estabilidade e à atividade. As variações de pressão (pressão máxima 18 MPa) não
causaram efeito significativo em nenhum desses dois parâmetros, comprovando a boa
resistência mecânica do suporte e a qualidade da imobilização; já o aumento de
temperatura (até 60
o
C) favoreceu a atividade enzimática porém não a estabilidade do
biocatalisador. Também foram avaliados os efeitos de difusão interna e externa e que
foram considerados desprezíveis
O equilíbrio da adsorção de lipases por suportes hidrofóbicos (ex. Accurel
®
EP
100) pode ser descrita por modelos de equilíbrio clássicos: Langmuir, Freundlich ou
ainda Redlich-Kwong
(AL-DURI e YONG, 2000). A origem da lipase é determinante
em sua estrutura assim como em sua afinidade pela superfície hidrofóbica.
Consequentemente, o modelo que melhor descreverá o equilíbrio de adsorção dependerá
da interação enzima-suporte. Já o equilíbrio de adsorção em suportes cuja superfície
apresenta característica mista hidrofílica/hidrofóbica se caracterizou, no trabalho de AL-
DURI e YONG (2000), pela formação de um duplo platô. AL-DURI e YONG (2000),
justificam a adsorção bi-modal pela ocorrência de duas formas distintas de adsorção,
uma que prevalece em baixa concentração de proteínas e outro que só ocorre em alta
concentração de proteínas. Os autores sugerem que, similarmente ao que BOSLEY
(1997) propôs e foi discutido anteriormente, este fenômeno seja resultado de dois
efeitos distintos: um deles ocorrendo quando há baixa concentração de proteínas e então
haveria o espalhamento das proteínas em uma forma mais “achatada” ; enquanto que o
outro efeito verificado em concentrações elevadas de proteína resultaria na ocorrência
de adsorsão das moléculas de lipase em uma forma mais compacta. Os autores ainda
acrescentam que o componente hidrofílico do suporte favoreceria a formação de
aglomerados (“clusters”) de lipases que, no entanto, seriam inativos.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo III – Revisão bibliográfica
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42
O efeito de solventes apolares pode ser prejudicial mesmo sobre lipases
imobilizadas, podendo causar a perda de atividade por desnaturação. Para evitar o
contato direto entre a enzima e os solventes, um novo protocolo de imobilização lipases
foi desenvolvido por GUISÁN
et al. (2001) para aplicações de biocatálise em meio
orgânico. A técnica proposta consistiu da adsorção seletiva de lipase de
Candida rugosa
em resina poliacrílica macroporosa (Sepabeads) recoberta por grupamentos hidrofóbicos
C18. Após a imobilização propriamente dita, foi feito o recobrimento da enzima por
polietilenoimina, um polímero hidrofílico que foi capaz de protegê-la dos efeitos
deletérios de solventes orgânicos.
A imobilização de lipase de
Candida rugosa por adsorção em resina polimérica
revelou que a carga de proteínas afeta o perfil da atividade enzimática em relação a
atividade de água do meio reacional (reação de esterificação entre dodecanol e ácido
dodecanóico catalisada por lipase imobilizada e utilizando hexano como solvente)
(PERSSON
et al., 2000). O aumento na carga de proteínas resultou em redução da
atividade de água ótima, o que foi interpretado pelos autores como sendo resultado do
aumento das interações proteína-proteína.
Lipases de diferentes fontes (
Mucor javanicus, Pseudomonas cepacia, Rhizopus
oryzae
, Aspergillus niger e Candida rugosa) foram imobilizadas em crisotila, um
silicato magnesiano de baixo custo, e utilizadas na esterificação de diversos ácidos
(ácido hexanóico, ácido octanóico e ácido láurico) com diferententes álcoois (metanol,
etanol, 1-butanol, 1-pentanol e 1-octanol) em hexano como solvente (SILVA e JESUS,
2003). Os melhores resultados foram obtidos com a lipase de
Mucor javanicus e o ácido
láurico, obtendo-se ésteres com rendimentos entre 62 e 97%.
Diversos trabalhos encontrados na literatura tratam da imobilização de lipases por
adsorção em diferentes suportes. A Tabela III.6 apresenta os resultados alcançados em
alguns destes trabalhos.
Tabela III.6 - Imobilização de lipases por adsorção
Origem Suporte Características do
suporte
Atividade colocada Atividade
imobilizada
Aplicação Referência
Rhizopus delemar Celite Terra diatomácea 6764 u/g interesterificação
Urata
et al. (1986) - Patente
GB 2 168 983 A
PH 5,0 37 BIU/g
[2]
PH 5,9 34 BIU/
[2]
g
Humicola sp.
Duolite
ES 562
Resina macroporosa
fenólica aniônica
21.500 LU/g
[1]
(hidrólise tributirina)
PH 6,8 30 BIU/
[2]
g
esterificação Eigtved (1989) patente WO
89/06278
Pseudomonas cepacea Lewatit E 1999/85 Resina de troca
aniônica básica fraca
23.500 LU/g
[1]
120 BIU/g
[2]
hidrólises e sínteses de
ésteres e reações de
interesterificação
inclusive de álcools
secundários
Nielsen e et al. (1989) Patente
WO 89/01032
Rhizomucor miehei Grace material
macroporosos de
sílica Dp 0,5-1mm;
D
poro
700 Å
200.000 LU/g
[1]
26 BIU/g
[2]
interesterificação,
hidrólise de óleo de
soja ou síntese de
gorduras
Pedersen e Tomas (1990)
patente WO 90/05778
C. cilindracea, A. niger
e P. fluorescens
Celite No 535;
Duolite A 562 -
16.600 nkat/mL esterificação e
transesterificação
Mustranta
et al. (1993)
Rhizopus sp.; Mucor
sp.
Lewatit R259K
modificado com
grupos epóxi;
Co-polímero
estireno/divinil
benzeno; Dp=500µm
D
poro
17nm
42.000 U
H
/g
[3]
108.000 U
H
/g
[3]
Transesterificação de
óleos e gorduras em
sistema com pouca
água
Yuzo et al. (1994) Patente EP
0 579 928
Candida rugosa,
Pseudomonas sp;
Rhizopus arrhizus
EP 100 Pó de polipropileno 20-2,5 mmol/min.g
[4]
(ativ. enz. depende da
atividade de água)
Resolução
enantiomérica de
Ibuprofeno
Wehte et al. (1997)
Tabela III.6 - Imobilização de lipases por adsorsão (continuação)
Origem Suporte Características do
suporte
Atividade colocada Atividade
imobilizada
Aplicação Referência
Mucor javanicus 0,046 U/mL
suporte
[8]
0,56 U/mL
suporte
[8]
Rhizopus niveus 0,2 U/mL
suporte
[8]
2 U/mL
suporte
[8]
Pseudomonas
fluorescens
Octil-agarose
Suporte poroso
ativado por densas
camadas de grupos
altamente
hidrofóbicos.
10 U/mL
suporte
[8]
60 U/mL
suporte
[8]
Hidrólise
enantiosseletiva de
ésteres quirais solúveis
em meio aquoso.
Batisda
et al. (1998)
Candida rugosa Octil-sepharose 0,01 mg PTN / mL;
2962 U / mgPTN
[5]
850 U/mg
[5]
Hidrólise
enantioespecífica de
(R,S)-HPBE;
Esterificação de ácido
(s)-2-fenilpropiônico
com 1-propanol
Sanchez et al. (1999)
Pseudomonas sp,
Humicola sp,
Rhizomucor miehei,
Alcaligenes sp.
Accurel
®
EP 100
Pó microporoso de
Polipropileno
Lipase de
Pseudomonas sp. 50
kLU/g
[1]
Lipase de
Pseudomonas sp:
4 µmol/min.g
[6]
esterificação Al-Duri e Yong (2000)
Candida rugosa EP 100 Pó microporoso de
Polipropileno
Procedimento de acordo com Gitlesen et al
(1997) Bioch.Biopys. Acta 1345,188-196.
Resolução de trans-2-
fenil ciclohexanol
Sanchez
et al. (2000)
oxido de nióbio
cristalino
Área superficial
BET
= 18 m
2
/g
208 U/g
354 µmol/min.g
[7]
oxido de nióbio
amorfo
Área superficial
BET
= 110 m
2
/g
208 U/g
157 µmol/min.g
[7]
Candida rugosa
Fosfato de zircônio
amorfo
Área superficial
BET
= 234 m
2
/g
208 U/g
388 µmol/min.g
[7]
Hidrólise de óleos,
esterificação n-butanol
com ácido butírico
Castro
et al. (2000)
Nigella sativa Celite 535 20 U/g
[3]
3,54 U/g
[3]
Hidrólise de óleos Akova e Ustun (2000)
Tabela III.6 - Imobilização de lipases por adsorsão (continuação)
Origem Suporte Características do
suporte
Atividade colocada Atividade
imobilizada
Aplicação Referência
Accurel
®
EP-100
Pó microporoso de
Polipropileno
40 mgPTN/g
92 µmol/min.mg
[9]
Candida rugosa
Celite 2 mgPTN/g
2,9 µmol/min.mg
[9]
Esterificação em meio
orgânico
Persson
et al. (2000)
Pseudomonas cepacea Toyonite 200-M Preparação
hidrotérmica de
minerais de caolinita
Dp 155 µm,
7400 U/mL
[3]
Teórica = 99%
[3]
1303 U/mL suporte
(álcool + acetato de
vinila em éter
dietílico)
Acilação
estereoespecífica
Kamori et al., 2000
octil-agarose 1 mg/mL
suporte
3,5 U/mg
[8]
;ee = 99% Pseudomonas
fluorencens.
decaoctil Sepabeads 1 mg/mL
suporte
3,4 U/mg
[8]
; ee = 99%
Hidrólise
estereoespecífica
Fernández-Lorente
et al.,
2001
[1]
Hidrólise de tributirina
[2]
Reação de acidólise ác.palmítico e trioleína.
[3]
Hidrólise de óleo de oliva
[4]
Reação ácido decanóico com 2-(-) octanol
[5]
Hidrólise de pNPP (para-nitrofenil propionato)
[6]
Formação de octil-oleato
[7]
Esterificação n-butanol com ácido butírico
[8]
Hidrólise de (R,S)-HPBE (2-hidroxi 4-fenil butanoato de etila)
[9]
Esterificação do ác. decanóico com dodecanol
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Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
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46
Verifica-se na Tabela III.6 a variedade de suportes que podem ser empregados na
imobilização de lipases por adsorção ou por ligação iônica. As resinas poliméricas,
como a Accurel
®
EP 100 (atualmente denominada Accurel
®
MP 1000), constituída por
polipropileno, e materiais contendo grupos hidrófobos de ligação, como octil-agarose,
são exemplos de suportes que vem se destacando como sendo apropriados à
imobilização das lipases. Entretanto não é possível fazer uma comparação direta e
precisa entre os diversos métodos devido à ausência de uma reação padrão para
determinação de atividade enzimática.
III.4 Aplicações de lipases na síntese de fármacos
A versatilidade das lipases as torna importantes biocatalisadores utilizados na área
biomédica. Essas enzimas vêm sendo utilizadas em numerosas pesquisas e em algumas
aplicações industriais como biocatalisadores de reações diversas como hidrólise de
ésteres racêmicos, transesterificação, racemização
in situ para produção de
enantiômeros oticamente puros e em reações sintéticas para produção de fármacos
(PANDEY
et al., 1999).
A pureza enantiomérica é de extrema importância para a industria farmacêutica. A
maioria das substâncias biologicamente ativas (fármacos, herbicidas, fungicidas,
inceticidas, aromatizantes e fragrâncias) são moléculas quirais. Em geral, apenas um dos
enantiômeros possui a atividade biológica desejada. O antípoda ótico pode não
apresentar atividade alguma ou mesmo produzir efeitos indesejáveis. O caso de maior
repercussão foi o da talidomida, droga amplamente receitada nos anos 60 contra os
enjôos em gestantes e que causou o nascimento de milhares de bebês com deformações
congênitas. Posteriormente, descobriu-se que o efeito teratogênico da talidomida era
proveniente do emprego do enantiômero de configuração absoluta (S), enquanto que seu
antípoda era desprovido de ação teratogênica em humanos (WNENDT e
ZWINGENBERGER, 1997; LIMA, 2001).
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Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
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O principal exemplo de importância econômica do emprego de lipases no
processo de produção de fármacos é a produção do Diltiazen
3
(JAEGER et al., 1999). A
etapa-chave dessa síntese reside na resolução cinética da mistura racêmica de éster
epoxi quiral, baseada na hidrólise preferencial de um dos enantiômeros pela lipase de
Serracia marcescens (Figura III.14). Desde 1993, a Tanabe Seiaku S.A. produz 50
toneladas por ano dessa molécula quiral, a qual é posteriormente convertida em
Diltiazen (JAEGER
et al., 1999).
Figura III.14 – Resolução cinética de metil-p-metoxifenilglicidato catalisada por lipase
de Serratia marcescens como etapa chave da síntese do Ditiazen (JAEGER et al., 1999)
3
Fármaco bastante prescrito no tratamento da hipertensão arterial cuja atividade farmacológica ocorre
como antagonista de cálcio.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
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Diversos trabalhos vem sendo desenvolvidos relacionados às propriedades
enantiosseletivas de lipases tendo como substrato alvo diversos ácidos aril propiônicos
utilizados como anti-inflamatórios não-esteroidais, como por exemplo: (R,S)-
ibuprofeno, cetoprofeno, fluorbiprofeno e naproxeno. SÁNCHEZ
et al. (2000)
compilaram as principais conclusões alcançadas por trabalhos que estudaram a
resolução enantiosseletiva desses ácidos:
1) Os solventes devem ser preferencialmente apolares, pois exercem efeito
importante sobre a conversão de reações de esterificação, embora
solventes hidrofílicos favoreçam a enantiosseletividade. Os solventes
mais comumente usados são n-hexano, ciclohexano e isooctano.
2) A atividade de água do sistema é considerada um dos fatores
primordiais para a enantiosseletividade e, sistemas empregando lipases
de
Candida rugosa e C. antartica tiveram sua enantiosseletividade
melhorada quando houve aumento da quantidade de água presente.
Diferentes formas de preparações enzimáticas podem ser empregadas na catálise
da esterificação enantiosseletiva do (R,S)-ibuprofeno. O trabalho desenvolvido por
PERSICHETTI
et al. (1996) utiliza CLECs
5
de lipase de Candida rugosa em reações
em solvente apolar. Já o trabalho desenvolvido por SANCHEZ et al. (2000) empregou a
lipase de
Rhizomucor miehei imobilizada em resina de troca iônica (Lipozyme
®
).
A lipase de
Candida rugosa, devido à suas características enantiosseletivas, vem
sendo uma das principais lipases empregadas na catálise de reações de química fina. A
Tabela III.7, a seguir, relaciona alguns trabalhos já publicados em que a lipase de
Candida rugosa foi utilizada em reações de síntese de fármacos.
5
Cristais de enzimas com ligações cruzadas (Cross Linked Enzyme Crystals)
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
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Tabela III.7 – Síntese de fármacos catalisada por lipase de Candida rugosa
(BENJAMIN e PANDEY, 1998)
Produto Precursor Reação
Ibuprofeno álcool graxo esterificação
Trifluorfenantril etanol éster cloroacetato alcoólise
pró-drogas semelhantes ao
ácido salicílico
acetoxi e fenetil benzoatos hidrólise
derivados de ácido acético
acetato de metila α−substituídos
hidrólise
Androstane androstane acilado hidrólise
Prostaglandin óleos contendo ácidos graxos poli-
insaturados
hidrólise
Cetoprofeno (R,S) cloroetil cetoprofeno hidrólise
Naproxeno trimetil siltl metanol esterificação
Propanolaminas epoxido e 2-propilamina esterificação
Solketal butirato de trifluoretila esterificação
Alcalóide aconitium acetato de vinila e mesodiols esterificação
Carbovir anti-HIV azabiciclo heptenonas Esterificação
Na resolução de substâncias quirais considera-se viável o uso de enzimas com
enantiosseletividade na faixa de 10 a 20 (MARGOLIN, 1993). A resolução de
propranolol
6
(apenas o enantiômero (S)- apresenta atividade desejada) foi realizada
empregando-se lipase de Pseudomonas cepacia (Lipase PS, Amano), a
enantiosseletividade alcançada foi superior a 100 (MARGOLIN, 1993).
HUGHES
et al. (1993) empregaram lipases de diversas origens na hidrólise quiral
de diéster proquiral intermediário de Verlukast
7
(Figura III.15). Apesar de haver uma
distância de 4 ligações entre o grupamento éster da molécula hidrolisada e seu centro
proquiral, as lipases de
Pseudomonas sp. e Chromobacterium viscosum proporcionaram
alta enantiosseletividade (ee > 98%). A abordagem adotada pelos autores de
assimetrização de centro proquiral permitiu que o enantiômero desejado pudesse ser
6
Bloqueador β-adrenérgico empregado no tratamento de hipertensão e angina.
7
Fármaco desenvolvido nos laboratórios da Merck Frost Canada como bloqueador de receptores de
leucotrienos D4 (LTD4) comprovado clinicamente como efetivo no controle da asma.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
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50
obtido com rendimento teórico de 100% enquanto que a resolução convencional do
racemato teria rendimento teórico de no máximo 50% em cada enantiômero.
Verlukast (MK-0679) (R-enantiômero) MK-0571 (racemato)
Figura III.15 – Estruturas químicas do MK-0571 e Verlukast e esquema da
assimetrização de centro proquiral de produto intermediário na síntese do Verlukast
através de reações de hidrólise catalisadas por lipases (HUGHES
et al., 1993).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
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51
Figura III.16 – Síntese de lamivudine através de rota enantiosseletiva empregando lipase
de
Pseudomonas fluorescens. Reagentes e condições: i) LiBH
4
, PrOH (cat.), THF
rendimento 96%; ii) BzCl, piridina, CH
2
Cl
2
, rendimento 88%; iii) n-acetil citosina
sililada (11), TMSOTf, CH
3
CN, rendimento 43%; iv) NH
3
, MeOH, rendimento 98%
Lipases de
Pseudomonas fluorescens foram empregadas na resolução de α-
acetoxisulfeto para a síntese enantiosseletiva de Lamivudine
8
(3TC
TM
) (MILTON et al.,
1995). A síntese enantiosseletiva representava um desafio à química sintética por
envolver 2 centros acetal quirais compartilhando o mesmo átomo de oxigênio (Figura
III.16). Verificou-se importante influência dos solventes utilizados, pois o uso de CHCl
3
como co-solvente forneceu baixa enantiosseletividade, no entanto a troca deste solvente
por t-BuOMe aumentou a enantiosseletividade da reação.
A esterificação de ácido 2-clorobutírico com 1,2-epoxi-5-hexeno catalisada por
lipase de
Rhizomucor miehei imobilizada (Lipozyme
®
IM) para produção de um éster
8
Droga candidata para o combate à infecções por HIV e HBV.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
52
intermediário da síntese do Taxol (droga anticancer) alcançou conversões de até 85%,
dependendo da condição experimental utilizada (GARCÍA
et al., 2000).
III.5 Asma
III.5.1 Características da asma
A asma é uma fisiopatologia constituída por estado inflamatório crônico e
geralmente acompanhada de sinais clínicos familiares, como dispnéia, tosse, espirro
intermitente, opressão torácica e broncoconstrição, decorrentes de processos fisiológicos
como edema, recrutamento e ativação de células inflamatórias, aumento na secreção de
muco e contração da musculatura lisa brônquica, seguida de hipertrofia e hiperplasia
muscular. Além desses sinais, ocorre o broncoespasmo, uma das caracterísicas
principais do processo de obstrução reversível das vias aéreas
(SHELHAMER et. al.,
1982; HAY
et al., 1995; LIMA, 2001) (Figura III.17).
Figura III.17 – Representação esquemática do processo asmático, exemplificando os
principais sintomas da asma brônquica (reproduzido de LIMA, 2001).
A asma era uma fisiopatologia rara no ínicio do século, entretanto, sua
prevalência em países industrializados tem crescido, assumindo proporções epidêmicas,
atualmente acometendo cerca de 155 milhões de pessoas por todo mundo (LIMA,
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
53
2001). O custo do tratamento de pacientes asmáticos é substancial, estimando-se gastos
da ordem de US$ 6 bilhões nos EUA, US$ 3 bilhões na Alemanha e US$ 1,6 bilhões
anuais na Inglatera e rendendo à indústria farmacêutica de antiasmáticos um lucro da
ordem de US$ 5,5 bilhões/ano (COOKSON, 1999; LIMA, 2001)
O crescimento no número de mortes associadas à asma caracteriza sua letalidade e
justifica o investimento dedicado à busca de novos agentes antiasmáticos mais eficazes
que permitam reverter o significativo impacto sócio-econômico da asma (BARNES,
2000; LIMA, 2001).
III.5.2 Terapias antiasmáticas
O reconhecimento da asma brônquica como uma resposta inflamatória que
envolve diversas células e mediadores químicos é fruto do avanço de conhecimento
científico integrado de diversas áreas: farmaco-imunologia, biologia molecular e
engenharia genética. Foi possível a partir de então a identificação de novos alvos
terapêuticos úteis para o tratamento eficaz da asma, revolucionando as abordagens para
a terapia antiasmática que vinham sendo empregadas até a década de 90.
Os fármacos disponíveis para o tratamento clínico da asma podem ser divididos
em duas classes terapêuticas distintas:
broncodilatadores e antinflamatórios. Em cada
uma dessas classes existem vários fármacos com alvos terapêuticos diversos.
Como exemplos de agentes terapêuticos broncodilatadores podem ser citados os
agonistas
β
2
adrenérgicos, anticolinérgicos, metilxantinas e moduladores de canais de
potássio. Os agonistas de
β
2
-adrenoceptores inaláveis são os broncodilatadores mais
eficientes prescritos para o alívio dos sintomas da asma. No entanto, essas drogas não
apresentam impacto na inflamação crônica das vias aéreas em pacientes asmáticos,
possivelmente em decorrência da dessenssibilização que faz com que a droga perca seu
efeito terapêutico no endotélio vascular e epitélio das vias aéreas (ROGER e
GIEMBYCZ, 1999). Poucos avanços vêm sendo alcançados no desenvolvimento dessa
classe de drogas e o uso excessivo desses medicamentos tem sido associado ao aumento
da mortalidade da doença (ROGER e GIEMBYCZ, 1999).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
54
A terapia antiasmática moderna envolve o uso de fármacos que atuam sobre
etapas do processo inflamatório desta patologia, tais como inibidores da eosinofilia,
bloqueadores da adesão celular, moduladores de citocinas, inibidores de
fosfodiesterases, inibidores duplos de TNF/PDEs
9
e antileucotrienos. As três últimas
estratégias surgem como as mais promissoras, visto a possibilidade de sua utilização no
tratamento crônico da asma, com menores efeitos adversos (HART
et al., 1998 citado
por LIMA, 2001). Entre essas classes de drogas, destacam-se os antagonistas de
receptores de leucotrienos, sendo o zafirlukast (Accolate
®
) e Pranlukast os primeiros
tratamentos realmente novos desenvolvidos para essa doença nos últimos 25 anos
(ROGERS e GIEMBYCZ, 1999).
III.5.3 Protótipo de fármaco antiasmático
MULLER
et al. (1998) descreveram a síntese e avaliação farmacológica de novos
agentes simbióticos, inibidores duplos de PDE-4 e dos efeitos do TNFα, desenhados
como híbridos da talidomida (primeiro fármaco descrito com propriedades moduladoras
da biossíntese desta citocina) e do rolipram (primeiro inibidor seletivo de PDE-4 de
origem sintética), consagrando, de forma definitiva, a diversidade molecular de
inibidores de PDE-4 e marcando uma nova abordagem convergente para o tratamento
de fisiopatologias de origem inflamatória (MULLER
et al., 1998 citado por LIMA,
2001; ROGERS e GIEMBYCZ, 1999).
Com o objetivo de se aprimorar as propriedades farmacocinéticas insuficientes da
talidomida e reduzir seus efeitos teratogênicos, inúmeros esforços de pesquisa têm sido
feitos na busca de análogos otimizados, com melhor perfil farmacoterapêutico, através
da identificação e exclusão de grupamentos toxicofóricos presentes na estrutura da
9
TNF – Fator de Necrose Tumoral. O TNFα possui atividade pró-inflamatória e imunorreguladora, em
baixa concentração exerce seu potencial farmacológico regulando as células endoteliais e diferentes
leucócitos. Já a produção elevada da TNFα está associada a condições patológicas de natureza auto-
imune e inflamatória.
PDE – Fosfodiesterases.Onze isoformas de PDEs já foram identificadas, essas enzimas são responsáveis
pela inativação de AMPc (monofosfato de3,5-adenisina cíclico) e GMPc (monofosfato de 3,5-guanosina
cíclico), mensageiros citoplasmáticos.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
55
talidomida (Figura III.18), resguardando-se os grupamentos farmacofóricos (MARRIOT
et al., 1998; SHIBATA et al., 1995; LIMA, 2001).
Figura III.18 – Demonstração esquemática dos enantiômeros da talidomida
(reproduzido de LIMA, 2001).
No âmbito de uma linha de pesquisa do LASSBio (Faculdade de Farmácia/UFRJ)
que visa o planejamento, a síntese e avaliação farmacológica de novos candidatos a
protótipos de agentes anti-inflamatórios e antiasmáticos foram realizados na tese de
doutoramento de LIMA (2001) o planejamento, síntese e avaliação farmacológica de
quatro novas famílias de compostos ftalimídicos (113-117), (118-122), (123-128) e
(129-133), racionalmente desenhados como candidatos de novos protótipos simbióticos,
ou seja, inibidores de PDEs e anti-TNF
α; e ainda a utilização do anel isoindolinodiona
(anel ftalimídico) na construção de uma série de derivados (134-141) planejados como
antagonistas de receptores de leucotrieno D
4
(CysLT
1
), explorando-se uma nova
possível relação bioisostérica entre o anel ftalimídico e quinolínico, presente nas
estruturas dos protótipos eleitos (Figura III.19).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo IIII – Revisão Bibliográfica
_________________________________________________________________________________________
56
N
O
O
CysLTant
W= (CH
2
)nCO
2
H
(CH
2
)
2
-tetrazol
Ph-4-(CH
2
)nCO
2
H
Inibidor PDEs
& Anti-TNFα
R=
NH
N
O
N
S
N
N
N
CH
3
N
N
Ph
Inibidor PDEs
& Anti-TNFα
Espaçador
CH
2
CH
2
ou
s/ espaçador
O-CHR-W
O-CH
2
-COR
SO
2
--R
CO--R
O-CH
2
-W
(134-141)
(113-117)
(118-122)
(123-128)
(129-133)
R=H,W=CO
2
Et
R=CH
3
, W=CO
2
Me
R=H, W=(CH
2
)
2
CN
R=H, W=(CH
2
)
3
CN
R=H, W=Ph-4-CO
2
Me
R=H, W=CO-
SN
Figura III.19 –- Gênese das séries de derivados propostos como inibidores duplos de
PDEs e TNF e antagonistas de receptores
CysLT
1
(reproduzido de LIMA, 2001).
Entre os derivados propostos por LIMA (2001) encontra-se o ácido 4-etil - (2-
(1,3-dioxo - 1,3 - di-hidro - 2-isoindolil))-fenoxiacético (denominado LASSBio 482 e
representado pela estrutura 134 na Figura III.19), que em sua síntese necessita que haja
a hidrólise quimiosseletiva de ésteres precursores. A dificuldade em se realizar essa
hidrólise quimiosseletiva com rendimentos elevados através da química orgânica
convencional estimulou a escolha desses ésteres precursores do protótipo de
antiasmático planejado por LIMA (2001) como substratos modelos para a hidrólise
catalisada por lipases realizada neste trabalho.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
57
IV. MATERIAIS E MÉTODOS
IV.1 Materiais
IV.1.1 Ésteres precursores do antiasmático
Os ésteres 4 – etil - (2 - (1,3 – dioxo - 1,3 - di-hidro – 2 - isoindolil)) –
fenoxiacetato de etila (denominado FIT-ET) e 4 – etil - (2 - (1,3 – dioxo - 1,3 - di-hidro
– 2 - isoindolil)) - fenoxiacetato de metila (denominado FIT-MET) foram sintetisados
pelo LASSBio / UFRJ (Figura IV.1).
N
O
O
O
O
O
CH
3
ou C
2
H
5
Figura IV.1- Estrutura química dos ésteres FIT-MET e FIT-ET.
IV.1.2 Enzimas
As lipases imobilizadas comerciais Novozym
435, Lipozyme
IM e Lipozyme
RM IM foram cedidas por Novozymes (antiga Novo Nordisk, Dinamarca).
Nos experimentos preliminares foi empregada uma preparação enzimática de
Lipozyme
IM fabricada em 1998. Essa preparação é produzida a partir de lipase de
Mucor miehei, cujo gene responsável por sua produção é expresso em Aspergillus
oryzae.
Nos experimentos posteriores, de cinética enzimática, hidrólise em sistema
trifásico e otimização das condições reacionais, foi empregada uma preparação mais
recente, fabricada em 2000 cuja denominação foi modificada pelo fabricante para
Lipozyme
RM IM e o microrganismo produtor foi reclassificado como Rhizomucor
miehei
.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
58
O suporte empregado na imobilização de Lipozyme
IM e Lipozyme
RM IM é
uma resina macroporosa de troca aniônica, do tipo fenólica, no qual a enzima é
fortemente ligada por adsorção, sem a utilização de agentes de ligação cruzada. O
aspecto do produto é granular com tamanho de partícula entre 0,2 e 0,6 mm e densidade
entre 350 e 450 kg/m
3
(NOVO NORDISK, 1992a e 1999). A atividade típica dessas
preparações enzimáticas é de 5 a 6 BAUN/g
10
, e no caso específico A Lipozyme
IM
possuia atividade nominal de 7,1 enquanto que a Lipozyme
RM IM possuia atividade
nominal de 5 BAUN/g. Essas preparações enzimáticas são fornecidas com baixo teor de
água, geralmente, entre 2 e 3 %. A perda de atividade prevista pelo fabricante é inferior
a 5% em um ano desde que esses produtos sejam armazenados em local seco e com
temperatura de 5
o
C (NOVO NORDISK, 1992a e 1999).
A preparação enzimática Novozym 435, utilizada nos experimentos preliminares é
produzida a partir da lipase de Candida antarctica cujo gene responsável por sua
produção é expresso em
Aspergillus oryzae. A lipase produzida pelo microrganismo
hospedeiro é imobilizada em resina macroporosa de troca iônica do tipo acrílica. O
produto é constituído por partículas de formato esferoidal, com diâmetro de partícula
entre 0,3 e 0,9 mm, e densidade de aproximadamente 430 kg/m
3
. A atividade é de cerca
de 7000 PLU/g
11
. Esse produto é fornecido com quantidade de água entre 1 e 2 %
(NOVO NORDISK, 1992b)
Nos experimentos de imobilização foi empregada a preparação enzimática
comercial líquida, Lipozyme
10,000 (Novo Nordisk), uma lipase de Mucor miehei 1,3
específica.
Foi empregada também lipase de Penicilium restrictum produzida por
fermentação submersa em Laboratórios do Núcleo de Biotecnologia da UFRJ. A cepa
utilizada foi isolada de resíduos de processamento de babaçu por FREIRE em seu
doutoramento (1996). Este microrganismo é excelente produtor de lipases e vem sendo
10
BAUN (Batch Acidolysis Units Novo) é uma unidade de atividade baseada em reações de acidólise em
batelada óleo de girassol altamente oléico e ácido decanóico, a 70
o
C por 60 min. A taxa de reação é
determinada pela quantidade de ácido decanóico incorporado nas posições 1 e 3 do triglicerídeo.
11
PLU (Propyl Laurate Units) é uma unidade de atividade baseada em ensaio de síntese de ésteres
utilizando como substrato 1-propanol e ácido láurico, a 60
o
C por 15 minutos. A taxa de formação de éster
é calculada com base no valor de acidez determinada por titulação antes e após a reação.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
59
amplamente investigado no Núcleo de Biotecnologia da UFRJ (IQ, COPPE, EQ), como
foi comentado anteriormente na seção III.1.1.
IV.1.3 Suportes de imobilização
A imobilização das lipases foi efetuada em resinas poliméricas microporosas. Os
suportes empregados foram Amberlite
®
XAD-2 (Rohm & Haas), Accurel
®
MP 1000 e
Accurel
®
MP 100 (anteriormente denominados EP 1000 e EP 100), os dois últimos
cedidos pelo fabricante, Membrana GmbH (Alemanha).
A resina Amberlite
®
XAD-2 possui tamanho de partículas entre 0,2 e 0,5 mm
composta por copolímero estireno-divinilbenzeno (HIRADE e UCHITOMI, 1999).
As características das resinas Accurel
®
encontram-se listadas na Tabela IV.1:
Tabela IV.1- Características físico-químicas e morfológicas dos suportes
(MEMBRANA GmbH, 2001).
Produto MP 100 MP 1000
Aspecto
Pellets brancos (2-4 mm)
Pó branco < 1500
µm
Composição
Polipropileno Polipropileno
Área Superficial
Específica (BET)
13 m
2
/g 51 m
2
/g
Volume de poros
78% 75%
Densidade real
900 Kg/m
3
900 Kg/m
3
Densidade “bulk”
120-140 100-120
Ponto de fusão
156
o
C 156
o
C
Capacidade de carga
75% 65%
A Figura IV.2 apresenta micrografias do suporte Accurel MP 1000, em duas
magnitudes, mostrando a alta porosidade desse suporte.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
60
Figura IV.2 – Micrografias do suporte Accurel MP 1000 (AL-DURI et al., 2001)
IV.1.4 Outros materiais
Os outros reagentes e materiais empregados neste trabalho de pesquisa estão
listados na Tabela IV.2
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
61
Tabela IV.2 – Materiais empregados
Produto Fabricante
acetato de etila
Vetec
acetona
Vetec
acetonitrila (grau HPLC)
Tedia
ácido acético
Reagen
ácido clorídrico
Reagen
ácido láurico
Merk
albumina de soro bovino
Vetec
carbonato de sódio
CRQ
clorofórmio
Quimex
dimetil sulfóxido - DMSO
Vetec
etanol
Vetec
fosfato de sódio di-básico
Vetec
fosfato de sódio mono-básico
Reagen
glicerol
Vetec
goma arábica
Vetec
hidróxido de sódio
Vetec ou Isofar
n-hexano
Vetec
óleo de oliva (comercial)
Malagueña
sulfato de cobre
Reagen
reativo de Folin
QEEL
tartarato duplo de sódio e potássio
Reagen
Os reagentes possuíam grau analítico (exceto quando explicitado na Tabela IV.2)
e foram utilizados como fornecidos.
IV.2 Metodologias
IV.2.1 Experimentos preliminares de hidrólise
Devido aos substratos serem moléculas novas, havia poucas informações
disponíveis a respeito de suas propriedades. Esses experimentos preliminares visaram,
inicialmente, a identificação de solventes capazes de solubilizar os substratos e que
propiciassem a hidrólise enzimática. Os experimentos de hidrólise foram realizados em
frascos fechados, termostatizados e agitados magneticamente. Nesses experimentos
preliminares, o meio reacional era composto por 0,5 mg/mL do substrato, 20 mg/mL de
enzima imobilizada (Lipozyme
®
IM ou Novozym
®
435), 10 mL de solvente (acetona,
acetato de etila, clorofórmio, n-hexano, DMSO) e a temperatura empregada foi de 40
o
C.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
62
IV.2.2 Cinética enzimática
Os experimentos para a determinação da cinética enzimática de hidrólise do éster
FIT-MET foram realizados em frascos selados, termostatizados e agitados
magneticamente. Em cada frasco foi adicionado 1 mL de acetato de etila, quantidades
variáveis do substrato (4,0; 27,0; 50,0 mg/mL), 0,10 mL de água destilada e 0,9 U
H
/mL
de Lipozyme
RM IM (12 mg pois à época do ensaio a atividade do biocatalisador foi
de 80 U
H
/g). Empregou-se na realização desses experimentos o biocatalisador
Lipozyme
®
RM IM, e não o Lipozyme
®
IM como nos experimentos preliminares, pois
esse biocatalisador foi adquirido especificamente para os experimentos da tese, sendo de
fabricação mais recente. A concentração máxima de substrato testada foi limitada pela
sua solubilidade e o intuito ao adicionar-se água ao sistema reacional foi de garantir
excesso desse reagente, de forma que a cinética da reação se aproximasse do modelo
Michaelis-Menten. As amostras foram retiradas inicialmente em 30, 60, 90 e 120
minutos, posteriormente, ao verificar-se progresso significativo da reação na primeira
hora, as amostras passaram a ser retiradas em 15, 30, 45 e 60 minutos.
Os dados foram ajustados ao modelo proposto por Michaelis-Menten e os
parâmetros cinéticos da reação foram calculados. A Equação IV.1 apresenta o modelo
de Michaelis-Menten:
][
][
max
SK
SV
v
m
+
⋅
=
(Eq. IV.1)
Onde:
v é a velocidade da reação [mmol/min]; V
max
corresponde à velocidade máxima
da reação [mmol/min];
[S] é a concentração de substrato [mmol/L]; K
m
é a constante de
Michaelis-Menten [mmol/L] e equivale à concentração de substrato necessária para se
alcançar metade da velocidade máxima.
IV.2.3 Hidrólise em sistema trifásico
Os experimentos de hidrólise em sistema trifásico foram realizados em frascos
fechados, termostatizados e agitados magneticamente (Figura IV.3). Utilizou-se 2,5 mL
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
63
de acetato de etila e quantidades variáveis de uma solução de Na
2
CO
3
saturada, 4
mg/mL
solvente
do substrato (FIT-MET ou FIT-ET) e Lipozyme
RM IM como
biocatalisador, com tempo reacional de 4 horas. A atividade enzimática (hidrólise e
esterificação) do biocatalisador foi determinada freqüentemente para assegurar
manutenção dos níveis enzimáticos da Lipozyme
RM IM empregada de acordo com as
metodologias analíticas descritas na seção VI.2.8.
Figura IV.3 – Foto da aparelhagem real e esquema do sistema experimental empregado
na hidrólise.
As reações foram paralisadas pela remoção do biocatalisador do meio reacional.
Em seguida, as fases orgânica (contendo substrato não-reagido) e aquosa (contendo o
produto) foram separadas e procedeu-se a recuperação do produto. A fase aquosa foi
acidificada pela adição de HCl (1:2) até pH 3, e o produto foi, então, extraído com
acetato de etila. Nos experimentos em que não foi utilizada a fase aquosa, a solução de
Na
2
CO
3
saturada foi adicionada após o final da reação para separar o produto de
substratos não-convertidos.
Foi realizada reação em branco usando 4 mg/mL
solvente
de FIT-MET, 2,5 mL de
acetato de etila, 2,5 mL Na
2
CO
3
saturada (relação fase orgânica:fase aquosa 1:1),
temperatura de 40
o
C. Após 4 horas de tempo reacional, as fases foram separadas de
acordo com o procedimento descrito acima.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
64
IV.2.4 Planejamento experimental para sistema trifásico
As três variáveis consideradas mais importantes ao processo foram estudados em
experimentos da hidrólise do FIT-MET: temperatura (T), enzima (E) e volume da
solução de Na
2
CO
3
saturada (V
A
). Os experimentos foram planejados de acordo com
plano fatorial fracionário de Taguchi (
apud PINTO, 1998) em dois níveis com réplica
do ponto central, perfazendo o total de 7 experimentos. Os experimentos foram
realizados em ordem aleatória (Tabela IV.3).
Tabela IV.3 – Plano experimental fatorial fracionário reduzido
para 3 variáveis em 2 níveis.
Ordem T E V
A
4 -1 -1 +1
7 -1 +1 -1
1 +1 -1 -1
5 +1 +1 +1
3 0 0 0
2 0 0 0
6 0 0 0
A transformação das variáveis reais em variáveis codificadas no intervalo -1 a +1
foi efetuada de acordo com a Equação IV.2:
)(
)(2
.
menormaior
menormaiorreal
codif
VV
VVV
V
−
+−×
=
(Eq. IV.2)
Onde:
V
codif.
, V
real
, V
maior
e V
menor
representam a variável codificada, a variável em seu
valor real, o limite superior e o limite inferior da faixa das variáveis, respectivamente.
As faixas iniciais das variáveis estudadas foram:
Temperatura: 40 a 50
o
C
Enzima/substrato: 20,0 a 50,0 mg
Relação Fase orgânica:aquosa: 1:1 a 1:2 (Na
2
CO
3
(sat)
: 2,50 a 5,00 mL)
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
65
Como dentro das faixas propostas inicialmente não foi verificada nenhuma
variação significativa na conversão do éster, foram propostas novas faixas. As novas
faixas das variáveis foram inferiores aos valores mínimos testados anteriormente por
representarem uma região de menor custo material e energético do processo.
Temperatura: 30 a 40
o
C
Enzima: 5,0 a 15,0 mg
Relação fase orgânica : fase aquosa: 1:0 a 1:1 (volume Na
2
CO
3sat
: 0 a 2,50 mL)
O planejamento dos experimentos de hidrólise do éster FIT-ET seguiu o mesmo
plano utilizado para a hidrólise do FIT-MET, no entanto as faixas das variáveis foram
alteradas:
Temperatura: 30 a 50
o
C
Enzima: 10 a 30 mg
Relação fase orgânica : fase aquosa: 1:0 a 1:1 (volume Na
2
CO
3sat
: 0 a 2,50 mL)
IV.2.5 Determinação de perfil cinético em sistema trifásico
A determinação do perfil cinético da reação de hidrólise do FIT-MET em sistema
trifásico catalisada por Lipozyme
®
RM IM foi realizada em frascos fechados, contendo
2,5 mL de acetato de etila, 2,5 mL de solução saturada de Na
2
CO
3
, 4 mg/mL de
substrato e 0,5; 0,9 ou 1,4 U
H
/mL do biocatalisador (10, 20 ou 30 mg, a atividade à
época do experimento foi 120 U
H
/g). As amostras foram retiradas em 0,5; 1,0; 2,0; 3,0;
4,0; 6,0; 8,0 e 15 horas e a reação foi paralisada e as amostras preparadas para análise
como o descrito na seção IV.2.3.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
66
IV.2.6 Produção de lipase de
Penicillium restrictum
A lipase de Penicillium restrictum (PRL) foi produzida em fermentação submersa
de acordo com a metodologia desenvolvida por FREIRE
et al., (1997). Após cerca de
72 horas de fermentação, o meio foi filtrado em papel de filtro Whatman n
o
1 para
remoção da biomassa. Posteriormente, o meio livre de biomassa fúngica foi
microfiltrado (0,45
µm) e foi concentrado por ultrafiltração através de membrana com
diâmetro de corte de 10.000 Dalton (JESUS, 2001).
IV.2.7 Imobilização
Os suportes (1,0 g) foram embebidos em etanol (10 mL) por 30 minutos,
posteriormente com 10 mL de uma solução etanol:água (1:1) e após 10 minutos essa
solução foi substituída por água destilada, que foi removida em seguida, logo após a
sedimentação do material. O objetivo deste procedimento foi o deslocamento do ar
existente nos interstícios dos suportes para permitir o acesso de soluções aquosas.
A imobilização da Lipozyme
®
10,000 foi realizada pela adição de 5,0 mL da
enzima (cerca de 965 U) a 1,0 g das resinas, com agitação magnética em temperatura de
5
o
C (exceto quando mencionada outra temperatura). A imobilização da PRL foi
realizada pela adição de 50 mL da solução enzimática (atividade variável) a 1,0 g das
resinas nas mesmas condições em que a Lipozyme 10,000 havia sido imobilizada.
Após o tempo estabelecido para a imobilização, procederam-se a filtração e
lavagem dos sólidos com água destilada para remoção da enzima não-aderida. Em
seguida, o biocatalisador foi seco em dessecador, sob vácuo, por uma noite.
Foram retiradas alíquotas do sobrenadante (0,1 mL da Lipozyme
®
10,000 e 0,5
mL da PRL) em intervalos de tempo pré-determinados para a avaliação da adsorção de
proteínas (seção IV.2.8.4). Ao final da imobilização foi retirada uma alíquota do
sobrenadante para a dosagem da atividade hidrolítica (atividade imobilizada teórica).
Amostras do biocatalisador pronto foram utilizadas para a dosagem de atividade
hidrolítica (atividade imobilizada real) e de esterificação
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
67
IV.2.7.1 Parâmetros de imobilização:
Os parâmetros carga de proteínas adsorvidas, atividade imobilizada teórica,
atividade imobilizada real, retenção de atividade e eficiência de imobilização foram
empregados para avaliar a imobilização de lipase comercial (Lipozyme® 10,000) e
lipase produzida em laboratório do Núcleo de Biotecnologia da UFRJ (PRL). A
definição destes parâmetros, encontra-se a seguir (FREIRE e SANT’ANNA JR.,
1990b):
Carga de Proteínas adsorvidas
Definida com sendo a diferença entre a quantidade de proteínas colocadas e a
quantidade de proteínas ao final da imobilização dividida pela massa de suporte
(Equação IV.3).
orte
soluçãotsoluçãot
m
VPTNVPTN
adsaC
to
sup
][][
_arg
⋅
−⋅
=
(Eq. IV.3)
Onde:
é a carga de proteínas adsorvida (mg/g); [ e [
correspondem à concentração de proteínas no início e ao fim do proceso de
imobilização, respectivamente (mg/mL);
V é o volume da solução de enzimas
(mL);
m é a massa de suporte (g).
adsaC _arg
ortesup
o
t
PTN]
t
t
PTN]
solução
Atividade imobilizada teórica
A atividade hidrolítica imobilizada teórica foi definida como sendo a diferença
entre a atividade da solução enzimática em contato com o suporte no início e ao término
do processo de adsorção dividida pela quantidade de suporte empregada (Equação
IV.4).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
68
orte
tHtH
teórica
m
AA
A
f
sup
0
−
=
(Eq. IV.4)
Onde :
é a atividade imobilizada teórica (U
teórica
A
H
/g);
0
tH
A e
f
tH
A correspondem à
atividade hidrolítica no início e ao fim do proceso de imobilização, respectivamente
(mg/mL);
é a massa de suporte (g)
orte
m
sup
Atividade imobilizada real
A atividade imobilizada real (A
real
) foi determinada utilizando o biocatalisador
imobilizado e óleo de oliva emulsionado como substrato (ver seção IV.2.8.5).
Retenção de atividade:
A retenção de atividade foi definida como a relação percentual entre as atividades
hidrolíticas imobilizadas real e teórica (Equação IV.5).
100⋅=
teórica
real
ativ
A
A
R
(Eq. IV.5)
Onde:
é a retenção de atividade (%); e correspondem à atividade
hidrolítica teórica e real, respectivamente (U
ativ
R
teórica
A
real
A
H
/g).
Eficiência de imobilização
A Eficiência de imobilização é definida como sendo a relação pecentual entre a
concentração de proteínas do sobrenadante no início e ao final do processo de
imobilização (Equação IV.6).
100
][
][][
0
0
⋅
−
=
t
tt
imob
PTN
PTNPTN
E
f
(Eq. IV.6)
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
69
Onde:
é a Eficiência de imobilização (%); [ e [ correspondem à
concentração de proteínas no início e ao fim do proceso de imobilização,
respectivamente (mg/mL)
imob
E
o
t
PTN ]
t
t
PTN ]
IV.2.8 Metodologias analíticas
IV.2.8.1 Análise RMN
Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN
1
H) foram
registrados em aparelhos Varian XI-200, Brucker DPX-200 ou em Brucker DRX 300
operando, respectivamente, a 200 MHz, 200 MHz e 300 MHz. As amostras foram
dissolvidas em solvente deuterado (DMSO d
6
) ou em acetona, e utilizando o
tetrametilsilano (TMS) como referência interna. Ácido LASSBio 482 (200 MHz;
DMSO-d
6
) δ: 2,86 (t; J= 7,28 Hz; R(CO)
2
NCH
2
CH
2
R); 3,78 (t; J= 7,28 Hz;
R(CO)
2
NCH
2
CH
2
R); 4,62 (s; ArOCH
2
CO
2
H); 6,82 (d; J= 8,52 Hz; H3’ and H5’); 7,12
(d; J=8,52 Hz; H2’and H6’); 7,83 (s; H5-H6 and H4-H7) ppm. RMN
1
H de FIT-MET
(200 MHz; CDCl
3
) δ: 2,92 (t; J= 7,64 Hz; R(CO)
2
NCH
2
CH
2
R); 3,79 (s,
ArOCH
2
CO
2
CH
3
); 3.88 (t; J= 7,64 Hz; R(CO)
2
NCH
2
CH
2
R); 4,60 (s;
ArOCH
2
CO
2
CH
3
); 6,82 (d; J= 8,47 Hz; H3’and H5’); 7,12 (d; J=8,42 Hz; H2’and H6’);
7,69 (m; H5 and H6); 7,81 (m; H4 and H7) ppm. RMN
1
H de FIT-ET (200 MHz;
CDCl
3
) δ: 1,29 (t; J=7,14 Hz; RCO
2
CH
2
CH
3
); 2,93 (t; J= 7,51 Hz; R(CO)
2
NCH
2
CH
2
R);
3,88 (t; J= 7,51 Hz; R(CO)
2
NCH
2
CH
2
R); 4,28 (q; J= 7,14 Hz; RCO
2
CH
2
CH
3
); 6,84 (d;
J= 8,70 Hz; H3’and H5’); 7,18 (d; J=8,61 Hz; H2’and H6’); 7,72 (m; H5 and H6); 7,83
(m; H4 and H7) ppm.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
70
IV.2.8.2 – Análise por TLC
Previamente à análise quantitativa por HPLC, foram realizadas análises
qualitativas por cromatografia em camada delgada (TLC – T
hin Layer Chromatograph).
A cromatografia em camada delgada foi realizada aplicando, com auxílio de tubo
capilar, uma pequena amostra do meio reacional ou das fases orgânica e aquosa (após a
etapa de separação do produto e extração por solvente do produto da fase aquosa
acidificada). Foi utilizada uma solução de CH
3
OH 2% (v/v) em CH
2
Cl
2
como fase
móvel e luz u.v. como revelador. O fator de retenção (R
f
) foi utilizado como critério de
distinção entre o ácido (Rf = 0) e o substrato éster (Rf = 0,66). e foi definido como
(Equação IV.7):
eluentedotodeslocamen
substânciadatodeslocamen
R
f
__
__
= (Eq. IV.7)
A análise qualitativa do grau de conversão da reação através de TLC foi avaliada
por um critério subjetivo baseado na visualização das marcas dos ésteres e ácido assim
como a intensidade dessas marcas quando a placa era exposta à luz u.v., como ilustra a
Figura IV.6:
Figura IV.6 – Esquema de análise por TLC de reação realizada em sistema trifásico com
alto grau de hidrólise.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
71
IV.2.8.3 Análise HPLC
A quantificação do éster de partida e do ácido formado foi realizada por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC – H
igh Performance Liquid
Ch
romatograph), em coluna de fase reversa Nova-pak C18, utilizando como fase móvel
acetonitrila:H
2
O: ácido acético (50:50:1) com fluxo de 0,4 mL.min
-1
e temperatura
ambiente (25
o
C).
Após reação de hidrólise e sucessiva separação entre biocatalisador e os produtos,
procedeu-se à secagem do solvente. O precipitado foi ressuspenso em acetonitrila e
filtrado através de cartuchos Sep-pak C18. Alíquotas de 20
µL dessa solução foram
injetadas no HPLC para análise dos ésteres e ácido presentes. A concentração dos
substratos e do produto foi calculada comparando-se os valores das áreas com o das
curvas de calibração dos ésteres e do ácido.
A conversão (
X) foi calculada de acordo com a seguinte equação (Equação IV.8):
aqforgfaqforgf
aqforgf
SSPP
PP
X
....
..
][][][][
][][
+++
+
=
(Eq. IV.8)
Onde: [
P]
f.org
produto na fase orgânica (mM); [P]
f.aq
produto na fase aquosa (mM);
[
S]
f.org
substrato na fase orgânica (mM); [S]
f.aq
substrato na fase orgânica (mM).
IV.2.8.4 Dosagem de proteínas
A adsorção de proteínas durante o processo de imobilização foi acompanhada pela
determinação do teor de proteínas através do método de Lowry em alíquotas do
sobrenadante (LOWRY
et al, 1951).
O método consiste da adição em tubos de ensaio de 0,4 mL da amostra (ou da
solução padrão) adequadamente diluída, mais 2,0 mL da solução A (1,0 mL de solução
de tartarato duplo de sódio e potássio 2% p/v; 1,0 mL de solução de CuSO
4
1% p/v ,
98,0 mL de solução de N
2
CO
3
2% p/v em NaOH 0,1 N). Em seguida a solução é
homogeneizada e, após 10 minutos, adiciona-se 0,2 mL da solução de Folin-Ciocalteu
(diluída 1:2 em água destilada) e homogeneíza-se. Trinta minutos depois, é feita a
leitura da absorvância em espectrofotômetro em 660 nm.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
72
A concentração de proteínas é calculada a partir da curva de calibração construída
empregando solução padrão de albumina de soro bovino (BSA, 0,1 mg/mL) diluída para
atingir concentrações entre (0,01 e 0,1 mg PTN/mL).
Todas as amostras foram analisadas em duplicata.
IV.2.8.5 Atividade hidrolítica
A dosagem de atividade hidrolítica se baseou na reação de hidrólise do óleo de
oliva catalisada pela lipase. Uma unidade de atividade hidrolítica (U
H
) foi definida
como a quantidade de enzima que produz 1
µmol de ácidos graxos livres por minuto nas
condições de ensaio (FREIRE, 1996).
O substrato empregado foi o óleo de oliva (5% p/v) emulsionado com uma
solução de goma arábica 5% (p/v) em tampão fosfato de sódio 0,10 M pH 7,0. Para
preparar a emulsão, a goma arábica foi adicionada ao tampão e a mistura foi
homogeneizada empregando mixer. Em seguida, adicionou-se o óleo (pesado
diretamente no becher contendo a solução de goma arábica em tampão) e a emulsão foi
formada pela agitação vigorosa (empregando mixer) durante 3 minutos.
Em condições típicas dos ensaios, foram empregados 19 mL da emulsão e 1,0
mL de solução enzimática convenientemente diluída ou 0,1 g do biocatalisador
imobilisado em cada frasco de reação. As reações foram realizadas em agitador
rotatório a 200 rpm em temperatura constante de 37ºC.
Após o tempo estabelecido (20 minutos para determinação de atividade de 0,1g de
Lipozyme RM IM), ou em intervalos pré-determinados, a reação foi paralisada pela
adição de 20 mL de solução acetona/etanol 1:1 e procedeu-se à titulação em titulador
automático (Mettler DL 50 ou DL 21), utilizando uma solução de NaOH 0,05N para
titular os ácidos produzidos até pH 11,0.
O cálculo da atividade foi efetuado de acordo com a Equação IV.9:
tE
NVV
A
NaOH
t
NaOH
t
NaOH
H
⋅
⋅⋅−
=
1000)(
0
(Eq. IV.9)
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo fármaco de antiasmático
Capítulo IV – Materiais e métodos
_________________________________________________________________________________________
73
Onde :
A
H
é a atividade hidrolítica (µmol/min.g ou µmol/min.mL); e V
correspondem ao volume de solução de NaOH (mL) gasto na titulação do branco e da
amostra, respectivamente;
é a normalidade da solução de NaOH (mEq/mL); E é
a quantidade de enzima (mL ou g); e
t é o tempo de reação (min).
0
t
NaOH
V
t
NaOH
NaOH
N
IV.2.8.6 Atividade de esterificação
A dosagem de atividade de esterificação se baseia na reação de esterificação do
ácido láurico promovida pela lipase. Uma unidade de atividade de esterificação (U
E
)
foi definida como a quantidade de enzima que esterifica 1
µmol de ácidos graxos livres
por minuto nas condições de ensaio (LANGONE, 1998).
O meio reacional foi constituído de 0,4604 g de glicerol (0,005 mol), 3,0045 g de
ácido láurico (0,015 mol) e 0,10 a 0,20 g de enzima imobilizada (PEI). As reações
foram realizadas em reatores termostatizados à temperatura de 60ºC, com agitação
magnética. Em intervalos de tempo de pré-determinados, foram retiradas alíquotas de
150
µL em duplicata. Estas amostras foram dissolvidas com 30 mL de uma solução de
acetona/etanol 1:1 e analisadas em titulador automático (Mettler DL 50), utilizando uma
solução de NaOH 0,04N para titular os ácidos residuais até pH 11,0.
O cálculo da atividade foi efetuado de acordo com a Equação IV.10:
amostra
meioNaOH
t
NaOH
t
NaOH
E
V
V
tE
NVV
A
⋅
⋅
⋅⋅−
=
1000)(
0
(Eq. IV.10)
Onde:
A
E
é a atividade de esterificação (µmol/min.g);
V
e
V
correspondem ao
volume de solução de NaOH (mL) gasto na titulação da amostra no tempo t e no tempo
inicial, respectivamente;
é a normalidade da solução de NaOH (mEq/mL); E é a
quantidade de enzima (g); e
t é o tempo de reação (min); V e V correspondem
ao volume total do meio reacional (3,0 mL) e da amostra (0,15 mL), respectivamente.
t
NaOH
0
t
NaOH
amostra
NaOH
N
meio
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
74
V. RESULTADOS
V.1. Atividade enzimática
V.1.1 Atividade Lipozyme
®
IM
A atividade hidrolítica da preparação enzimática comercial Lipozyme
®
IM foi
verificada freqüentemente e ao longo do período em que foram realizados os
experimentos preliminares (cerca de 4 meses) não foi notada tendência de queda da
atividade. A atividade média, determinada empregando óleo de oliva como substrato,
foi de 45 ± 10 U
H
/g. O perfil cinético da reação de hidrólise do óleo de oliva catalisada
pela Lipozyme
®
IM (Figura V.1) revelou que até cerca de 30 minutos a reação ainda
estava em condição de velocidade inicial e que portanto a titulação da reação em 20
minutos era representativa da atividade enzimática.
y = 1,3458x
R
2
= 0,9998
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
02040608010
Tempo (min)
Ácidos Graxos
livres (
µ
Mol)
0
Figura V.1 – Atividade hidrolítica da Lipozyme
®
IM (5,0 mL de emulsão de óleo de
oliva 5% com goma arábica 5% em tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0; 0,25 mg
Lipozyme
®
IM; atividade calculada neste teste: 54 U
H
/g).
V.1.2 Atividade Novozym
®
435
A atividade hidrolítica de óleo de oliva da preparação enzimática Novozym
®
435
foi determinada (Figura V.2). Verificou-se que a atividade hidrolítica desta preparação
frente ao óleo de oliva foi bastante baixa (4,8 U
H
/g), o que indica haver pouca afinidade
entre este biocatalisador e o óleo de oliva, ou ainda que as condições de determinação
de atividade não foram adequadas a esse biocatalisador.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
75
y = 0,1472x
R
2
= 0,9923
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
0 2040608010
Tempo (min)
Ácidos graxos
livres (
µ
Mol)
0
Figura V.2 – Atividade hidrolítica da Novozym
®
435 (5,0 mL de emulsão de óleo de
oliva 5% com goma arábica 5% em tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0; 0,25 mg
Novozym
®
435; atividade calculada neste teste: 5,9 U
H
/g).
V.1.3 Atividade Lipozyme
®
RM IM
A atividade da Lipozyme
®
RM IM foi determinada periodicamente para verificar
sua estabilidade e garantir a manutenção dos níveis enzimáticos empregados nos
experimentos. O perfil cinético da reação de hidrólise do óleo de oliva catalisada pela
Lipozyme
®
RM IM (Figura V.3) revelou que até cerca de 20 minutos a reação ainda
estava em condição de velocidade inicial e que portanto a titulação do meio reacional
neste intervalo de tempo era representativa da atividade enzimática.
y = 3,4875x
R
2
= 0,9912
0
20
40
60
80
100
120
020406
Tempo (min)
Ácidos graxos livres
(
µ
Mol)
0
Figura V.3 – Atividade hidrolítica de Lipozyme
®
RM IM (10,0 mL de emulsão de óleo
de oliva 5% com goma arábica 5% em tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0; 0,25 mg
Lipozyme
®
RM IM; atividade calculada neste teste: 140 U
H
/g).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
76
A atividade hidrolítica da preparação enzimática Lipozyme
®
RM IM foi de 120 ±
22U
H
/g. Notou-se grande dispersão dos resultados das análises de atividade,
possivelmente em decorrências de erros experimentais aleatórios causados por
heterogeneidades nas amostras de Lipozyme
®
RM IM utilizadas, pois a quantidade do
biocatalisador empregada era bastante reduzida. O monitoramento da atividade
hidrolítica dessa preparação enzimática por um período de cerca de 4 anos (Agosto de
2000 a Dezembro de 2004) verificou a boa estabilidade do biocatalisador estocado à
5
o
C e apenas após cerca de 2 anos houve queda significativa da atividade, e mesmo após
cerca de 4 anos a atividade foi reduzida em apenas 35% (Figura V.4).
0
50
100
150
02040
Tempo (mês)
Atividade (U/g)
60
Figura V.4 – Perda gradativa de atividade da preparação enzimática Lipozyme RM IM.
Atividade hidrolítica determinada utilizando óleo de oliva emulsificado, pH 7,0 (os
pontos representam a média de testes realizados em duplicata).
V.2 Experimentos preliminares
V.2.1 Hidrólise de ésteres
Foram realizados experimentos preliminares de hidrólise enzimática dos ésteres 4-
etil - (2 - (1,3 – dioxo - 1,3 - di-hidro – 2 – isoindolil)) - fenoxiacetato de etila
(denominado FIT-ET) e 4-etil (2 - (1,3 – dioxo - 1,3 - di-hidro – 2 – isoindolil)) -
fenoxiacetato de metila (denominado FIT-MET) para investigar a viabilidade do
emprego de lipases na reação proposta (Figura V.5).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
77
N
O
O
O
O
O
CH
3
N
O
O
O
OH
O
Lipase
ou C
2
H
5
Figura V.5 – Esquema de hidrólise dos ésteres FIT-MET e FIT-ET para produção do
candidato a antiasmático LASSBio 482.
Os experimentos preliminares visaram, inicialmente, a identificação de solventes
capazes de solubilizar os substratos e nos quais ocorria reação enzimática. Os produtos
reacionais desses experimentos preliminares foram analisados qualitativamente por TLC
para verificar a ocorrência da hidrólise e por RMN para avaliar a integridade do restante
da molécula. A Tabela V.1, a seguir, apresenta de forma qualitativa os resultados
obtidos nesses experimentos preliminares.
Tabela V.1 – Resultados qualitativos dos experimentos preliminares com as lipases
comerciais Lipozyme
®
IM e Novozym
®
435 (0,5 mg/mL do substrato, 20,0 mg/mL de
enzima imobilizada, 40
o
C).
FIT-ET FIT-MET
Solvente solubilidade Hidrólise
Lipozyme
Hidrólise
Novozym
solubilidade Hidrólise
Lipozyme
Hidrólise
Novozym
Acetato de
etila
Alta + + Alta + +
Acetona
Alta + + Alta + +
Clorofórmio
Alta - + Alta - +
DMSO
Alta - - Alta - -
n-hexano
Baixa - - Baixa - -
n-hexano +
acetona (1:1)
Alta - Alta
A técnica de TLC empregada para análise desses primeiros experimentos é pouco
precisa mas foi útil para indicar os sistemas viáveis possíveis para a hidrólise.
Aparentemente, apenas o experimento utilizando acetona como solvente apresentou
hidrólise completa dos ésteres e o uso de acetato de etila também proporcionou
conversões elevadas.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
78
A inabilidade das preparações enzimáticas testadas em catalisar a hidrólise
proposta em meio contendo hexano, provavelmente, ocorreu pela baixa solubilidade dos
substratos nesse solvente, pois a atividade da Lipozyme
®
IM em meios contendo hexano
já foi reportada como excelente em diversos trabalhos (OLIVEIRA, 1999; MONTEIRO
et al., 2000). A utilização de quantidades equivolumétrica de acetona e hexano como
solventes foi testada e proporcionou a solubilização do substrato porém, ainda assim,
não foi alcançado êxito na hidrólise do FIT-ET. Também não foi possível realizar a
hidrólise dos ésteres quando dimetilsulfóxido (DMSO) foi utilizado como solvente e o
mesmo foi verificado pelo uso de clorofórmio em sistemas com a Lipozyme
®
IM como
biocatalisador. Clorofórmio pode ser empregado como solvente apenas quando a
preparação enzimática Novozym
®
435 foi utilizada como biocatalisador, no entanto,
ocorreu hidrólise apenas parcial.
Os experimentos preliminares foram realizados com os solventes em forma quase
anidra, a água disponível para a hidrólise apenas era apenas a água em equilíbrio com a
fase orgânica. No entanto, como o substrato foi empregado em baixas concentrações
(0,2 mg/mL) a ocorrência de hidrólise do éster nas condições empregadas era factível.
Ainda assim, foram realizados experimentos adicionando pequenas quantidades de água
aos solventes acetona, acetato de etila e clorofórmio (cerca de 0,1 mg/mL), porém não
foi verificado incremento na conversão dos ésteres. Possivelmente, os solventes já
estavam saturados pela própria umidade do ar.
Os espectros obtidos por RMN revelaram que em nenhum desses experimentos
houve o rompimento do anel ativo do protótipo de antiasmático LASSBio 482 (Figura
V.6).
Embora a lipase comercial Novozym
®
435 tenha sido capaz de catalisar a
hidrólise dos ésteres eficazmente nas condições testadas (inclusive quando clorofórmio
foi utilizado como solvente, ao contrário do verificado com a Lipozyme
®
IM), este
biocatalisador não foi utilizado nos experimentos seguintes por causa da baixa
resistência mecânica do suporte. A fricção causada pela agitação magnética moderada
triturou o biocatalisador até um pó fino, dificultando etapas subsequentes de separação e
recuperação do produto e biocatalisador.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
79
B
A
Figura V.6 - Espectro de RMN1H do substrato FIT-MET (A) e do produto LASSBio
482 (B) da hidrólise enzimática, mostrando a atuação seletiva da enzima na ligação
éster.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
80
V.2.2 Recuperação de atividade enzimática
As preparações enzimáticas empregadas na hidrólise do FIT-ET foram
recuperadas do meio reacional por decantação, lavadas com o solvente empregado na
reação e após secar por uma noite em dessecador, tiveram sua atividade determinada
(Tabela V.2).
Tabela V.2 – atividade da Lipozyme
®
IM recuperada (substrato óleo de oliva 5%, tempo
de reação 20 minutos).
Solvente Log P Atividade (U
H
/g) Atividade recuperada
Acetona -0,23 39 ± 7 87 %
Acetona:hexano 1:1(v/v)
1
- 36 ± 6 80 %
Acetato de etila 0,68 54 120 %
Clorofórmio 2,0 35 77 %
1
Não foi encontrado dado de literatura de Log P de solução acetona:hexano. Pode-se estimar que o valor
de log P seja intermediário ao das substâncias puras, o que seria em torno de 1,3.
Diversos trabalhos relatam a melhor atividade e estabilidade de enzimas quando o
solvente utilizado para as reações em meio orgânico possui razoável hidrofobicidade
(Log P>2) (DE CRESCENZO
et al., 2000; WEHTJE e ADLERCREUTZ, 1997;
WEHTJE
et al., 1997). Porém, os resultados da recuperação de atividade enzimática,
mostraram não haver relação aparente entre a hidrofobicidade dos solventes e seu efeito
na preparação enzimática Lipozyme
IM. O melhor resultado em termos de recuperação
de atividade enzimática (120%) foi obtido quando acetato de etila (Log P = 0,68) foi
utilizado como solvente, seguido da utilização de acetona (Log P = - 0,23), da mistura
equivolumétrica de acetona com hexano e por último da utilização de clorofórmio (Log
P = 2,0), quando foi possível recuperar 87%, 80% e 77%, respectivamente, da atividade
original.
A baixa atividade recuperada após a utilização da preparação enzimática em
meios com clorofórmio e o aumento da atividade após utilização em meio com acetato
de etila contrariam as expectativas baseadas nos dados da literatura. Pois, geralmente,
considera-se que solventes com Log P superior a 2 ofereçam maior proteção à atividade
de lipases [ZACKS, 1996; YANG e RUSSEL, 1996; ADLERCREUTZ, 2000].
Devido aos resultados positivos de hidrólise dos ésteres e à ausência de efeito
deletério para a atividade da preparação enzimática Lipozyme
IM, o solvente acetato
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
81
de etila foi selecionado para uso nos experimentos subseqüentes. Este solvente já havia
sido inclusive empregado em trabalho anterior, realizado em laboratório do Núcleo de
Biotecnologia da UFRJ, para a lavagem e recuperação da preparação enzimática
Lipozyme
IM sem que houvesse perda de atividade enzimática (LANGONE, 1998).
V.3 Cinética de hidrólise
Foram realizados experimentos de hidrólise enzimática do éster FIT-MET.
Diferentemente do esquema reacional utilizado nos testes preliminares, na realização
dos testes cinético foi adicionado 10% de água ao solvente. A presença da água em
abundância permite que o modelo cinético se aproxime mais do modelo de Michaelis-
menten. Foi ainda empregado Lipozyme
®
RM IM como biocatalisador e acetato de etila
como solvente. A lipase imobilizada Lipozyme
®
RM IM é similar à Lipozyme
IM
utilizada nos experimentos anteriores, porém tratava-se de biocatalisador adquirido mais
recentemente e por isso empregado em todos os testes subseqüentes desta Tese. O
solvente empregado foi acetato de etila, pois, nos experimentos preliminares, a
utilização desse solvente possibilitou a reação de hidrólise com conversões elevadas e
alta recuperação da atividade enzimática após o final da reação. Esses experimentos
visaram ao levantamento de parâmetros cinéticos aparentes do modelo de Michaelis-
Menten e para isso foram realizadas reações empregando diversas concentrações iniciais
de substrato. A Figura V.7, a seguir, apresenta a formação do produto ao longo do
tempo para a reação de hidrólise do FIT-MET em diferentes concentrações iniciais de
substrato.
A partir dos dados de progresso da hidrólise que foram obtidos, foi gerado o
gráfico Velocidade Inicial versus Concentração do Substrato FIT-MET (Figura V.8).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
82
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 10203040
Tempo (min)
[P] (mM)
S = 4 mg/mL
S = 27 mg/mL
S = 50 mg/mL
Figura V.7 –Formação de produto x tempo da reação de hidrólise de FIT-MET
empregando diferentes concentrações inicias do substrato (solvente acetato de etila,
biocatalisador Lipozyme
®
RM IM - 0,9 U
H
/mL)
y = 0,0092x
R
2
= 0,9852
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0 50 100 150
Substrato (mM)
Velocidade inicial (mM/min)
Figura V.8 – Velocidade inicial de formação do ácido LASSBio 482 (mM/min) versus
concentração inicial do substrato FIT-MET (mM).
Assim como foi verificado por CUNHA (2004) em sua monografia que investigou
a hidrólise do éster [4-(1,3-dioxo-1,3-di-hidro-2-isoindolil) fenóxi] acetato de etila
(denominado p-FITSE-ET) em sistema semelhante ao empregado neste trabalho, a
relação entre a velocidade inicial de formação do produto versus concentração inicial do
substrato mostrou-se linear. Este fato indica que a reação de hidrólise enzimática ainda
se encontrava na região de cinética de primeira ordem e que portanto a condição
reacional testada estava longe da condição de saturação da enzima. O modelo de
cinética enzimática de Michaelis-Mentem é hiperbólico, e a obtenção de
V
max
e K
m
para
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
83
uma reação só é possível quando a cinética da reação encontra-se em região de ordem
mista. No entanto, não foi possível empregar concentrações iniciais de substrato
superiores a 50 mg/mL pois esse valor já se encontrava próximo ao limite de
solubilidade do éster FIT-MET em acetato de etila que foi determinado como sendo 52
mg/mL.
Para os casos em que a reação se encontra em cinética de primeira ordem, onde
[S] <<
K
m
, a expressão de taxa de reação de Michaelis-Menten se reduz a Equação V.1:
[]
m
K
SV
v
max
=
(Eq. V.1)
Onde: [S] é a concentração de substrato (mM), e V
max
(mM/min) e K
m
(mM) são
parâmetros cinéticos.
Esta equação estabelece uma relação linear entre
ν e a concentração de substrato
e permite definir-se outro parâmetro cinético a partir do coeficiente angular da curva de
saturação (
K
1
= V
max
/ K
m
).
A regressão linear dos pontos experimentais da Figura V.7 permite o cálculo de
K1, cujo valor para a reação de hidrólise do éster FIT-MET foi 0,0092 (mM
substrato
. mM
-
1
produto
.min
-1
). Este valor supera em cerca de dez vezes o valor de K1 obtido por
CUNHA (2004), que foi 0,0008 (mM
substrato
. mM
-1
produto
.min
-1
). Provavelmente, o
principal motivo pelo qual houve uma diferença tão grande entre os valores de
K1 da
hidrólise de
p-FITSE-ET e FIT-MET foi por que, ao contrário deste trabalho, na
determinação da cinética de hidrólise do
p-FITSE-ET não houve adição alguma de água
ao sistema, e possivelmente o solvente empregado não havia ainda absorvido água em
quantidade excedente ao substrato. Como a concentração de água não foi determinada
no trabalho de CUNHA (2004), não é possível comprovar se a diferença entre o
parâmetro
K1 para a hidrólise desses dois substratos foi realmente ocasionada pela
diferença na quantidade de água disponível para a reação.
Um outro fator que pode ter influenciado na diferença entre o
K1 calculado para
os dois sistemas, consiste da diferença estrutural entre os dois substratos. O substrato
p-
FITSE-ET não possui o espaçador etila após o grupamento ftalimida, o que pode
dificultar o encaixe do substrato no sítio ativo da enzima (BEVILAQUA
et al., 2005).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
84
Além do espaçador, outro aspecto da estrutura dos substratos que pode ocasionar
diferenças nas taxas de hidrólise é o grupamento éster, que no caso do FIT-MET é um
grupo metila e no
p-FITSE-ET é um grupo etila. Ao se analisar os resultados
preliminares deste trabalho, verificou-se, ainda que através de resultados qualitativos
por TLC, que a conversão alcançada pela hidrólise de FIT-ET foi inferior à conversão
de FIT-MET após 4 horas de reação. Assim, é possível que uma das influências para
que as taxas de hidrólise de
p-FITSE-ET sejam inferiores às taxas do FIT-MET seja por
causa do grupamento éster.
Embora não tenha sido possível calcular os parâmetros cinéticos
K
m
e V
max
, o fato
de a reação ainda estar em região de cinética de 1ª ordem mesmo quando a concentração
de substrato já estava próxima ao seu limite de solubilidade, evidencia o alto valor de
K
m
. Por sua vez, o valor do parâmetro cinético K1 calculado foi 0,0092 mM
substrato
. mM
-
1
produto
.min
-1
, indicando que o valor de V
max
, caso pudesse ser calculado, seria muito
inferior ao valor de
K
m
.
A cinética de hidrólise do éster FIT-MET em acetato de etila tornou evidente a
baixa taxa de conversão deste substrato na condição reacional testada. Mesmo quando a
concentração inicial de substrato esteve em 143 mM, a velocidade inicial da reação foi
de apenas 1,3 mM/min. Esse fato tem implicações na aplicação prática na hidrólise
enzimática desses ésteres precursores de antiasmático, pois as taxas de reação serão
sempre reduzidas, ainda que se trabalhe no limite de solubilidade. A fim de incrementar
as taxas de reação e as conversões obtidas, uma outra estratégia, a hidrólise em sistema
trifásico foi abordada.
V.4 Hidrólise em sistema trifásico
Conforme foi visto anteriormente, na seção III.2.2, a presença de água é essencial
para a atividade enzimática (ADLERCREUTZ, 1996; WEHTJE e ADLERCREUTZ,
1997; WEHTJE
et al., 1997). Em reações de hidrólise, o papel da água no meio
reacional torna-se ainda mais importante pois além de ser necessária para estabilizar a
proteína e permitir sua flexibilidade, a água atua também como um reagente.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
85
A partir dos resultados de cinética da reação (seção V.3), verificou-se a baixa
velocidade da reação em meio orgânico simples. A fim de incrementar as taxas da
hidrólise de FIT-MET, um novo sistema reacional foi testado: um sistema trifásico.
A idéia de empregar sistema reacional trifásico baseou-se na metodologia
utilizada no LASSBio para purificação do produto final em conjunto com a constatação
de que a presença de água em excesso poderia favorecer significativamente a conversão
dos ésteres. Os substratos empregados (FIT-MET e FIT-ET) e o produto de hidrólise
LASSBio 482 são insolúveis em água pura. Porém, em meio alcalino, o ácido é
convertido em sua forma salina, o que faz com que tenha maior afinidade pela fase
aquosa que pela fase orgânica. O sistema trifásico foi composto por três fases
macroscópicas: uma fase orgânica, na qual o substrato estava dissolvido em solvente
orgânico adequado, uma fase aquosa formada por uma solução saturada de Na
2
CO
3
e
uma fase sólida composta pelo biocatalisador imobilizado. O intuito da introdução dessa
fase aquosa foi introduzir mais água no sistema e deslocar o equilíbrio da reação, ao
realizar a extração do produto simultaneamente com sua síntese, pois uma vez que o
ácido fosse formado pela hidrólise do éster, esse produto migraria para a fase aquosa.
Este é um sistema inovador para reações enzimáticas por incluir uma fase aquosa
altamente alcalina (pH ~ 11) para extração do produto formado, e na pesquisa
bibliográfica realizada não foi encontrado nenhum sistema similar.
Os experimentos preliminares já haviam mostrado que o acetato de etila era capaz
de dissolver os ésteres e favorecer a sua hidrólise. Esse solvente foi, portanto,
selecionado para experimentos subseqüentes em que se desejava testar a hidrólise
enzimática em um sistema trifásico e, por ser pouco miscível com a água, permitiu a
constituição uma fase orgânica macroscópica adequada à reação.
A despeito do fenômeno da memória de pH de enzimas imobilizadas e da catálise
ocorrer na fase orgânica, o elevado pH da fase aquosa (pH em torno de 11) poderia ser
prejudicial à reação de hidrólise dos ésteres FIT-MET e FIT-ET. Para verificar se o pH
elevado prejudicaria a catálise enzimática, foram realizados experimentos preliminares
de hidrólise do FIT-MET e do FIT-ET empregando o sistema trifásico proposto. Os
resultados obtidos foram excelentes, houve hidrólise completa dos ésteres ao serem
empregadas as seguintes condições reacionais: acetato de etila 2,5 mL ; FIT-MET 4
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
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86
mg/mL
solvente
; 50 mg de Lipozyme
®
RM IM; relação entre as fases orgânica e aquosa
1:1; temperatura 40
o
C.
Foi realizado branco de reação nas mesmas condições deste experimento, porém
na ausência do biocatalisador não foi detectada hidrólise alguma dos ésteres.
Os resultados alcançados pelo emprego do sistema trifásico na hidrólise desses
ésteres foram promissores e portanto um estudo mais aprofundado para a otimização
desse sistema foi desenvolvido.
V.4.1 Planejamento experimental da hidrólise do FIT-MET em sistema trifásico
Para obter uma resposta rápida sobre quais as condições reacionais ótimas
(máxima conversão com o mínimo de gasto material e energético), os experimentos
foram realizados segundo o planejamento experimental fatorial fracionário proposto por
Taguchi (PINTO, 1998). Foi realizada a quantidade mínima de experimentos que
permitiam a avaliação dos efeitos das variáveis estudadas. Os seguintes parâmetros de
processo foram eleitos como variáveis de estudo: quantidade de enzima (
E);
temperatura (
T) e volume da solução de Na
2
CO
3
saturada adicionada (V
A
). A
concentração de substrato no meio, embora constitua um parâmetro de processo
importante em sistemas enzimáticos, não foi otimizada e foi mantida em um valor baixo
(4 mg/mL) para garantir a total dissolução do substrato. Os experimentos foram, então,
planejados para avaliar 3 variáveis em dois níveis diferentes perfazendo um conjunto
com sete experimentos incluindo a réplica do ponto central. O uso do plano
experimental de Taguchi foi bastante útil no sentido de minimizar os esforços para a
avaliação dos efeitos das variáveis, entretanto, os dados levantados com este plano
fracionário mínimo não permitem a avaliação de efeitos combinados entre variáveis,
apenas dos efeitos principais.
O primeiro conjunto de experimentos realizados visava avaliar as variáveis dentro
das seguintes faixas: 20 a 50 mg de Lipozyme
RM IM (1,12 a 2,80 U
H
/mL
solvente
);
temperatura de 40 a 50
o
C; e 2,5 a 5,0 mL da solução de Na
2
CO
3
saturada (relação entre
fase orgânica e fase aquosa de 1:1 a 1:2). Os resultados desse conjunto de experimentos
foram apresentados na Tabela V.3.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
87
Tabela V.3 – Hidrólise enzimática de FIT-MET catalisada pela Lipozyme
RM IM após
4 horas de reação.
Enzima
(mg)
Temperatura
(K)
Na
2
CO
3(sat)
(mL)
Conversão
(%)
20,0 323 2,50 86
20,0 313 5,00 88
35,0 318 3,75 97
35,0 318 3,75 83
35,0 318 3,75 90
50,0 323 5,00 92
50,0 313 2,50 Não realizado
A conversão alcançada nos 6 primeiros experimentos (realizados em ordem
aleatória) desse primeiro conjunto foi praticamente total, independentemente das
condições reacionais utilizadas (Tabela V.3). Optou-se por não realizar o sétimo
experimento desse conjunto pois se percebeu que provavelmente sua execução não
forneceria informações adicionais sobre o processo.
Ainda que a partir de análise preliminar, tenha sido possível antecipar que o
conjunto de experimentos realizados não constituía em uma base de dados adequados
para verificação dos efeitos principais relacionados à hidrólise de FIT-MET em sistema
trifásico, procedeu-se à análise estatística. Para isso, foi empregado um modelo linear
simples que utiliza as variáveis em formato normalizado (Equação V.2).
X = b
0
+ b
E
E + b
T
T + b
VA
V
A
(Eq. V.2)
Onde:
X representa a conversão alcançada; b
0
, b
E
, b
T
e b
VA
são coeficientes estimados;
E, T e V
A
são variáveis independentes que representam a quantidade de enzima
empregada, temperatura e volume de fase aquosa, respectivamente.
A estimação dos coeficientes
b
0
, b
E
, b
T
e b
VA
foi realizada através de regressão
linear pelo programa Statistica
5.0 com base nos parâmetros independentes (E, T e
V
A
) com valores normalizados. Os resultados desta estimação estão apresentados na
Tabela V.4.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
88
Tabela V.4 – Resumo da regressão linear para estimativa dos coeficientes da Equação
V.2 (R=0,40; R²= 0,16).
Coeficientes Valor
estimado
Erro padrão Nível de
confiança
b
0
0,903 0,042 1,00
b
E
0,032 0,066 0,33
b
T
-0,014 0,066 0,15
b
VA
-0,005 0,066 0,06
Os parâmetros estimados apresentaram baixo nível de confiança exceto pelo
parâmetro independente
b
0
, que foi o único parâmetro significativo da regressão linear.
Conforme já havia sido possível perceber em análise preliminar, através desse conjunto
de experimentos não era possível distinguir o efeito das variáveis. Os experimentos
realizados concentraram-se em faixa de alto nível de conversão e não em toda a faixa
experimental como seria desejável. A relação entre os resultados de conversão do FIT-
MET observados experimentalmente e a conversão calculada através do modelo linear
descrito pela Equação V.2 cujos coeficientes foram estimados com base nos dados do
primeiro conjunto de experimentos planejados, pode ser visualizada no gráfico da
Figura V.9.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
89
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Valores Preditos
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Valores Observados
Figura V.9 – Conversão observada e prevista por modelo linear baseado em dados do
primeiro conjunto de experimentos de hidrólise de FIT-MET em sistema trifásico.
A partir desta indicação de que as faixas de variação dos parâmetros de processo
haviam sido superestimadas, novas faixas de valores foram propostas para um segundo
conjunto de experimentos que foi planejado.
O segundo conjunto de experimentos foi planejado para avaliar o efeito das
variáveis em faixas de valores inferiores aos utilizados no primeiro conjunto. Esse
segundo conjunto de experimentos foi realizado utilizando 5 a 15 mg de Lipozyme
RM IM (0,28 a 0,84 U
H
/mL
solvente
); temperatura de 30 a 40
o
C; e 0 a 2,5 mL da solução
de Na
2
CO
3
saturada (relação entre fase orgânica e fase aquosa de 1:0 a 1:1) (Tabela
V.5).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
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90
Tabela V.5 – Hidrólise enzimática de FIT-MET catalisada pela Lipozyme
RM IM após
4 horas de reação – segundo plano experimental
Enzima
(mg)
Temperatura
(K)
Na
2
CO
3(sat)
(mL)
Conversão
(%)
5,0 313 0,00 18
5,0 303 2,50 1,7
10,0 308 1,25 1,8*
10,0 308 1,25 31
10.0 308 1,25 12
15,0 313 2,50 84
15,0 303 0,00 12
*Este ponto foi desprezado nos cálculos subsequentes para estimativa
dos parâmetros do modelo por ser considerado um “outlier”, ou seja
resultado de erro experimental fora do padrão.
O erro associado aos experimentos foi calculado baseado nas réplicas do ponto
central realizadas. Para os experimentos realizados no primeiro plano o valor médio da
conversão foi de 90% e o desvio padrão foi 7%, já para o segundo plano, o valor médio
de conversão alcançado foi de 23 % com desvio padrão de 13% (eliminando o resultado
de 1,8% , considerado resultado de erro experimental fora do padrão). Os erros
experimentais calculados foram bastante elevados, principalmente para os experimentos
realizados no segundo plano experimental. A discrepância entre os valores pode ser
resultado das incertezas associadas às reações enzimáticas e aos procedimentos de
extração empregados na separação produto / substrato. Como foi visto anteriormente,
variações superiores a 15% da média foram observadas na própria atividade da
preparação enzimática utilizada.
Assim como o primeiro cunjunto experimental, esse segundo bloco de
experimentos também foi analisado estatisticamente para verificação das variáveis
responsáveis pelos principais efeitos na conversão da reação. Com esta finalidade, mais
uma vez o modelo linear da Equação V.2 teve seus coeficientes estimados e os
resultados obtidos foram apresentados na Tabela V.6.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
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91
Tabela V.6 – Resumo da regressão linear dos resultados do segundo bloco experimental
planejado para a hidrólise em sistema trifásico do FIT-MET para estimativa dos
coeficientes da Equação V.2 (R= 0,97; R²= 0,94).
Coeficientes Valor
estimado
Erro padrão Nível de
confiança
b
0
0,263 0,046 0,97
b
E
0,192 0,057 0,92
b
T
0,219 0,057 0,94
b
VA
0,140 0,057 0,87
Pode-se observar, pelos coeficientes da Tabela V.6, que as variáveis que
ocasionaram efeitos mais relevantes na conversão do FIT-MET foram a quantidade de
enzima (
b
E
= 0,19) e temperatura (b
T
= 0,21). Os coeficientes (b
E
e b
T
) apresentaram
níveis de confiança significativos na regressão linear (0,92 e 0,94, respectivamente). A
variável
V
A
(volume de solução de Na
2
CO
3
saturada), apresentou efeito benéfico ao
processo, porém foi menos importante (
b
VA
= 0,14) e significativo (nível de confiança
de
b
VA
= 0,13) que o efeito das demais variáveis estudadas.
A qualidade da análise dos efeitos das variáveis foi superior ao verificado no
primeiro bloco experimental. Ainda que tenham ficado mais concentrados em valores de
baixa conversão, este conjunto de experimentos apresentou resultados de conversão
melhor distribuídos quando comparados ao primeiro bloco de experimentos planejados.
A relação entre os valores de conversão observados experimentalmente no
segundo bloco de experimentos de hidrólise do FIT-MET e a conversão prevista através
do modelo linear da Equação V.2, cujos coeficientes foram estimados com base nestes
resultados, pode ser visualizada através do gráfico apresentado na Figura V.10.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
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92
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Valores Preditos
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Valores Observados
Figura V.9 – Conversão observada e prevista por modelo linear baseado em dados do
segundo conjunto de experimentos de hidrólise de FIT-MET em sistema trifásico.
V.4.2. Planejamento experimental da hidrólise do FIT-ET em sistema trifásico
O sistema trifásico utilizado anteriormente nos experimentos de hidrólise do FIT-
MET foi também empregado na hidrólise do FIT-ET, outra espécie precursora do
protótipo de antiasmático LASSBio 482. As faixas das varáveis foram estipuladas com
base nos resultados obtidos anteriormente para a hidrólise de FIT-MET e tiveram como
intuito evitar a concentração de experimentos em condições que proporcionassem
conversão em faixas estreitas dessa variável. Os resultados obtidos (conversão após 4
horas de reação) estão apresentados na Tabela V.7.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
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93
Tabela V.7 – Experimentos de hidrólise do FIT-ET em sistema trifásico após 4 horas de
reação.
Enzima
(mg)
Temperatura
(K)
Na
2
CO
3(sat)
(mL)
Conversão
(%)
10 303 2,50 2,2
10 323 0,00 70,3
20 313 1,25 27,6
20 313 1,25 18,7
20 313 1,25 49,6
30 303 0,00 75,0
30 323 2,50 52,0
Assim como foi feito na análise da hidrólise do éster FIT-MET, neste novo
conjunto de experimentos, o erro experimental foi calculado baseado nos resultados das
réplicas do ponto central. Houve grande discrepância entre os valores obtidos, pois para
uma conversão média de 32%, o desvio padrão calculado foi de 16% .
Um modelo linear (Equação V.2) foi mais uma vez utilizado para verificação de
efeitos principais. Os coeficientes obtidos por este ajuste estão listados a seguir na
Tabela V.8.
Tabela V.8 – Resumo da regressão linear para estimativa dos coeficientes do modelo
linear (Eq. V.2) para hidrólise de FIT-ET (R= 0,87; R²= 0,75).
Coeficiente Valor
estimado
Erro padrão Nível de
confiança
b
0
0,422 0,071 0,99
b
E
0,136 0,094 0,76
b
T
0,113 0,094 0,69
b
VA
-0,228 0,094 0,91
Verifica-se que o ajuste dos dados obtidos a um modelo linear não foi satisfatório,
pois o coeficiente de correlação foi baixo (R
2
=0,75) e o coeficiente b
0
apresentou valor
muito superior aos demais coeficientes do modelo (b
0
= 0,423) além de ter sido o termo
de maior significância (0,99). Apesar da baixa qualidade do ajuste não permitir que se
obtenha respostas confiáveis sobre o processo, o efeito da presença da fase aquosa
saturada com Na
2
CO
3
foi inesperado e deve ser assinalado. Ao contrário do que havia
sido observado nos experimentos de hidrólise do FIT-MET, este parâmetro causou
efeito prejudicial à conversão do éster FIT-ET, sendo este o efeito mais relevante e
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
94
significativo dentre as variáveis investigadas (
b
VA
= -0,228; nível de confiança = 0,91).
Entre os motivos do efeito prejudicial da presença da fase aquosa alcalina e do efeito
pouco relevante da quantidade de enzima no meio reacional, podem ser citados: a
redução da solubilidade do FIT-ET em acetato de etila na presença da solução de
Na
2
CO
3 sat
; e a maior dificuldade de hidrólise do FIT-ET quando comparado ao FIT-
MET. A influência da solução de Na
CO
3 sat
na solubilidade do FIT-ET é uma hipótese
que ainda carece de comprovação experimental. Já a maior facilidade de hidrólise do
FIT-MET, havia sido verificada qualitativamente nos experimentos preliminares em
meio orgânico isento de fase aquosa livre.
2
A relação entre os valores de conversão observados experimentalmente pelos
experimentos de hidrólise do FIT-ET e a conversão prevista através do modelo linear,
cujos coeficientes foram estimados com base nestes resultados, pode ser visualizada
através do gráfico apresentado na Figura V.10.
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Valores Preditos
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Valores Observados
Figura V.10 – Conversão observada e prevista por modelo linear baseado em resultados
de hidrólise de FIT-ET em sistema trifásico.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
95
V.4.3 Otimização através de modelo semi-empírico
O éster FIT-MET foi selecionado como substrato padrão para os estudos
subseqüentes já que a base de dados experimentais para hidrólise deste composto em
sistema trifásico era maior que a base de dados disponível para a hidrólise do éster FIT-
ET e os resultados obtidos apresentavam-se mais coerente. Um modelo semi-empírico
baseado nas características fenomenológicas do processo foi proposto com o objetivo de
prever as condições ótimas de hidrólise do FIT-MET. Experimentos pertencentes aos
dois planos experimentais realizados foram utilizados para estimar os parâmetros.
Devido à utilização de dois conjuntos distintos de experimentos, a matriz experimental
utilizada na estimação dos parâmetros deixou de ser ortogonal. Por isso, na estimação
deste modelo utilizou-se as variáveis com seus valores reais e não mais com os valores
normalizados.
A Equação V.3 representa o modelo semi-empírico proposto para descrever a
hidrólise de FIT-MET no sistema trifásico:
)4/**)*1(*)(exp(1
2
tEVbTKX
A
+−=
(Eq. V.3)
Onde: X = conversão
)/1313/1(*exp()(
11
TbaTK
−
+−=
T = temperatura (K)
V
A
= Volume da fase aquosa presente (mL)
E = massa do biocatalisador (mg)
t = tempo de reação (h)
Algumas hipóteses foram consideradas ao se propor o modelo representado pela
Equação V.3:
1.
A variação do substrato durante a reação ocorre segundo equação de 1
a
ordem:
STK
dt
dS
⋅−= )(
2. O efeito da temperatura na constante da taxa de reação é exponencial como o
descrito na forma de Arrhenius (HILL, 1977).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
96
3.
A presença da fase aquosa contendo Na
2
CO
3
saturado influencia a constante
de equilíbrio.
Os coeficientes desse modelo semi-empírico foram estimados através de regressão
não-linear utilizando o programa Statistica
®
5.0. Os resultados dessa estimativa foram
apresentados na Tabela V.9.
Tabela V.9 – Resumo da regressão não-linear para estimação dos parâmetros da
Equação V.3 (R= 0,97; R²= 0,94)
Coeficiente Valor
estimado
Erro padrão Nível de
confiança
a
1
-3,08 0,54 1,00
b
1
21191 7650 0,98
b
2
0,50 0,52 0,63
A relação entre os valores de conversão observados experimentalmente pelos
experimentos de hidrólise do FIT-MET e a conversão prevista através do modelo semi-
empírico (Equação V.3), pode ser visualizada através do gráfico apresentado na Figura
V.11
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Valores Preditos
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Valores Observados
Figura V.11 – Conversão observada e prevista por modelo semi-empírico baseado em
resultados de hidrólise de FIT-MET em sistema trifásico.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
97
A partir do modelo semi-empírico proposto, foi realizada uma simulação para
visualizar a relação entre a quantidade de enzima empregada e a conversão alcançada
(Figura V.12). Através de simulação, verificou-se que utilizando cerca de 20 mg de
Lipozyme
®
RM IM (1,1 U
H
/mL
solvente
) a conversão estimada era cerca de 96%, o
aumento da quantidade do biocatalisador empregada para 30 mg (1,7 U
H
/mL
solvente
)
resultou no aumento de conversão para 99% e que o uso de quantidades maiores de
Lipozyme
®
R MIM constitui um gasto desnecessário. Quantidades maiores que 30 mg
de Lipozyme
®
RM IM só se justificariam caso houvesse ganho cinético significativo, o
que só poderá ser verificado quando experimentos para avaliar a cinética da reação já
houverem sido realizados.
Enzima (mg)
Conversão
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0
Figura V.12 – Relação entre a quantidade de enzima empregada e a conversão de
substrato segundo o modelo exponencial semi-empírico. As condições utilizadas na
simulação foram: V
A
= 5,0 mL; T = 313 K; t = 4 horas.
A Figura V.13 ilustra uma simulação da curva de progresso da reação de hidrólise
baseada nos resultados do modelo semi-empírico representado pela Equação V.3.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
98
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Tempo (h)
Conversão
30 mg
20 mg
10 mg
Figura V.13 – Simulação do progresso da reação empregando diferentes quantidades do
biocatalisador Lipozyme RM IM; as outras condições reacionais simuladas foram: V
A
=
5,0 mL e T = 313 K.
V.4.4 Hidrólise de FIT-MET em sistema trifásico - Progresso da reação
A fim de verificar o comportamento cinético da reação de hidrólise de FIT-MET
em sistema trifásico e verificar se a simulação do progresso da reação utilizando o
modelo proposto pela Equação V.3 (seção V.4.3) representava adequadamente a
realidade, foram realizados novos experimentos. Estes experimentos foram realizados
empregando as mesmas condições simuladas na na seção anterior. A Figura V.14
apresenta a conversão alcançada ao longo da reação empregando-se diferentes
quantidades do biocatalisador
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
99
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 5 10 15
Tempo (hora)
Conversão
Figura V.14 – Curva experimental de progresso da reação com diferentes quantidades
do biocatalisador Lipozyme RM IM, 10 mg (
), 20 mg (▲) e 30 mg (¦). As outras
condições reacionais foram: 10 mg do éster, 2,5 mL de acetato de etila, 5,0 mL de
Na
2
CO
3
(sat)
, temperatura de 40
o
C.
A comparação entre os resultados experimentais e os obtidos através de simulação
empregando o modelo semi-empírico da Equação V.3 mostrou que havia discrepâncias
entre os valores experimentais e o modelo (Figura V.15). Esta discrepância não foi
inesperada, pois embora o modelo da Equação V.3 incluisse a variável tempo, ainda não
haviam sido realizado nenhum experimento em sistema trifásico que pudesse subsidiar a
estimação do modelo.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
100
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 5 10 15
Tempo (hora)
Conversão
Figura V.15 – Comparação entre a curva experimental de progresso da reação com
diferentes quantidades do biocatalisador Lipozyme RM IM, 10 mg (
), 20 mg (▲) e
30 mg (
¦) e a simulação através da Equação V.3 (linhas contínuas). As outras
condições reacionais foram: 10 mg do éster, 2,5 mL de acetato de etila, 5,0 mL de
Na
2
CO
3
(sat)
, temperatura de 40
o
C.
V.4.5 Re-estimação de modelo empírico
Os dados obtidos nos experimentos para acompanhamento do perfil cinético
de hidrólise do éster FIT-MET em sistema trifásico, juntamente com os resultados
obtidos nos experimentos do planejamento experimental, foram utilizados para refazer a
modelagem do processo. Para isso, novos modelos empíricos foram propostos e tiveram
seus parâmetros estimados através da utilização do programa Statistica
5.0. Entre os
modelos que foram testados, o que melhor previu a conversão experimental foi o
representado pela Equação V.4.
(
[
{
tKEKX
)
]
}
∗
−∗∗−=
21
exp1exp1
(Eq. V.4)
−∗+−=
T
baK
1
313
1
exp
111
−∗+−=
T
baK
1
313
1
exp
222
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
101
Onde: X representa a conversão; E, T e t são as condições de processo independentes
quantidade de enzima (mg), temperatura (K) e tempo (hora), respectivamente.
Os coeficientes
a
1
, b
1
, a
2
e b
2
do modelo descrito pela Equação V.4 foram
estimados usando o procedimento dos mínimos quadrados. Os valores dos coeficientes
estimados encontram-se na Tabela V.10.
Tabela V.10 – Estimação dos parâmetros do modelo semi-empírico (R=0,96).
Valor
estimado
Erro padrão Nível de
confiança
a
1
-1,885 0,232 1,00
b
1
-5639 4218 0,81
a
2
-1,905 0,312 1,00
b
2
28873 7685 1,00
Como pode ser verificado através da tabelaV.10, foi possível estimar os
parâmetros do modelo representado pela Equação V.4 com elevado grau de
significância (nível de confiança entre 0,81 e 1,00) e boa aderência aos dados
experimentais (R=0,96). A Equação V.4 tem como base um esquema cinético
simplificado no qual presumiu-se que um certo nível de decaimento da atividade
enzimática ocorre durante a reação:
D
K
EE →
2
EPES
K
+→+
1
Neste caso K
2
pode ser considerado uma medida da estabilidade enzimática
enquanto K
1
é uma medida da atividade enzimática.
O modelo inicialmente proposto (Equação V.3) incluiu V
A
como sendo
importante para o bom ajuste do modelo. No entanto, a ampliação da base experimental
e a remodelagem do processo resultaram em equação (Equação V.4), onde V
A
não foi
incluído no modelo pois não contribuia de forma efetiva para o ajuste do modelo. A
exclusão de V
A
como parâmetro de processo, possivelmente se deveu mais a base de
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
102
dados experimentais, que se concentrou em um único valor de V
A
(V
A
=5 mL), que a
verdadeira influência deste fator na hidrólise de FIT-MET.
O modelo representado pela Equação V.4 foi capaz de prever satisfatoriamente
a conversão da reação de hidrólise do FIT-MET em sistema trifásico, ficando o ajuste
dos dados experimentais bem melhor que o obtido quando modelo anterior (Equação
V.3) foi empregado. A Figura V.16 compara os resultados dos experimentos de
progresso da reação de hidrólise do FIT-MET em sistema trifásico com os valores
obtidos por simulação empregando o modelo semi-empírico descrito pela Equação V.4.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 5 10 15
Tempo (hora)
Conversão
Figura V.16 – Comparação entre a curva experimental de progresso da reação com
diferentes quantidades do biocatalisador Lipozyme RM IM, 10 mg (), 20 mg (▲) e
30 mg (
¦) e a simulação através da Equação V.4.(linhas contínuas). As outras
condições reacionais foram: 10 mg do éster, 2,5 mL de acetato de etila, 5,0 mL de
Na
2
CO
3
(sat)
, temperatura de 40
o
C.
Este modelo previu com alto grau de aderência aos resultados experimentais a
conversão do FIT-MET no protótipo de antiasmático LASSBio 482 para diferentes
concentrações do biocatalisador. Por essa razão o modelo semi-empírico pôde ser usado
com alto grau de confiança na otimização do processo
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
103
V.5 Otimização da hidrólise de FIT-MET
Foi feita a otimização das condições reacionais considerando aspectos econômicos
do processo envolvendo o custo dos reagentes e da enzima Lipozyme RM IM, o preço
do produto e o custo do equipamento. A otimização teve como intuito principal a
realização de exercício acadêmico a partir dos modelos propostos e não um estudo de
viabilidade econômica do processo. Diversos parâmetros necessários para a otimização
precisaram ser estimados nos cálculos efetuados.
O preço do produto foi estimado tendo como base o preço de um medicamento
(Accolate) contendo princípio ativo com atuação similar a do protótipo de fármaco
proposto. O preço de venda nas farmácias de uma caixa contendo 28 comprimidos com
20 mg do fármaco é de cerca de R$65,00. Estimando que o preço do fármaco
corresponda a 10% do preço do medicamento, tem-se um preço estimado do fármaco de
4360 US$/kg (1 US$ = 2,65 R$). A estimativa do preço do possível novo fármaco a
partir de um outro produto com atividade semelhante não é a ideal. Como as duas
moléculas possuem pesos moleculares e atividade farmacológica distintas a comparação
direta não é possível, serve apenas para que se tenha uma noção da ordem de grandeza
dos valores.
O preço do éster FIT-MET foi calculado com base nos preços de catálogo da
Sigma para os principais reagentes empregados em sua síntese, considerando os
rendimentos obtidos em cada etapa. O preço final do FIT-MET foi estimado em 2.100
US$/kg.
Por se tratar de uma lipase imobilizada, a recuperação e posterior reutilização em
várias bateladas da Lipozyme RM IM é possível, e neste caso foi considerada a
reutilização da enzima por 5 bateladas. O preço desta preparação enzimática é de
800US$/kg.
O investimento em equipamentos foi estimado incluindo apenas o custo de
aquisição de um reator. O custo desse reator depende do volume, que neste execício de
otimização considera uma relação fixa entre o volume de solvente e a massa de reagente
(250 L/kg) e um volume variável da fase aquosa por massa do reagente (V
A
). Foi
considerada como base de cálculo o processamento anual de 100 kg do reagente, reator
operando 300 dias por ano, e o preço do vaso foi estimado em 3.000 US$/L, podendo
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
104
ser amortizado em 5 anos. O número de bateladas diárias depende do tempo da reação e
o intervalo entre bateladas foi estipulado em 1 hora.
Definindo,
X
Conversão
(
)
[
]
{
}
tKEKX
∗
−
∗
∗
−=
21
exp1exp1
K
1
−∗−−−=
T
K
1
313
1
5639885,1exp
1
K
2
−∗+−−=
T
K
1
313
1
28873905,1exp
2
F
Fator de ajuste f = 325/339 = 0,96 (kg/kg)
R
Quantidade de reagente R = P/(X*f) (kg)
P
Quantidade de produto base P = 100 kg/ano
E
Quantidade de enzima (mg)
E’
Quantidade total de enzima (kg) E’ = E*f’
f’
Fator de ajuste f’ = 10
7
/(5*10
6
) = 2
V
A
Volume da fase aquosa (L)
R’
Quantidade de reagente em uma batelada R’ = R/n
o
_bat (kg)
n
o
_bat
Número de bateladas anuais n
o
_bat = {300*(t + 1)}/24
$
R
Custo do reagente 2.100 US$/kg
$
P
Preço do produto 4360 US$/kg
$
E
Custo da enzima 800 US$/kg
$
eq
Custo equipamento 600US$/L
V
solv
Volume de solvente V
solv
= 250*R’ (L)
$
I
Custo de investimento $
I
= 600*(V
solv
+R’*V
A
) (US$)
A função que deve ser otimizada é dada pela Equação V.5:
IERP
ERPF $'$$$ −⋅
−
⋅−⋅=
(Eq. V.5)
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
105
Fazendo as substituições pertinentes:
)
92,0
100
92,0
100250
(600'800
96,0
1002100
1004360
A
oo
V
BatnXBatnX
Ef
X
F ⋅
⋅⋅
+
⋅⋅
⋅
⋅−⋅⋅−
⋅
⋅
−⋅=
)
24
)1(300
92,0
100
24
)1(300
92,0
25000
(1600
218750
436000
A
V
t
X
t
X
E
X
F ⋅
+⋅
⋅⋅
+
+⋅
⋅⋅
−⋅−−=
)
)1(
69,8
)1(
91,2173
(1600
218750
436000
A
V
tXtX
E
X
F ⋅
+⋅
+
+⋅
−⋅−−=
E assim chega-se a Equação V.6:
}{ }{
⋅
+⋅−
+
+⋅−
−⋅−
−
−=
⋅⋅
⋅
−⋅⋅−⋅⋅
−⋅⋅
A
eEKeEK
eEK
V
tete
E
e
F
tKtK
tK
)1(1
69,8
)1(1
91,2173
1600
1
218750
436000
]}1[{]}1[{
]}1[{
)
2
(
1
)
2
(
1
)
2
(
1
(Eq. V.6)
Onde:
−∗−−−=
T
K
1
313
1
5639885,1exp
1
−∗+−−=
T
K
1
313
1
28873905,1exp
2
A validade das variáveis foi limitada nos seguintes intervalos:
0 ≤ E ≤ 50
0 ≤ V
A
≤ 5
0 ≤ t ≤ 8
303 ≤ T ≤ 323
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
106
Como as variáveis t e V
A
são monotônicas na função representada pela Equação
V.5, o máximo da função em relação a essas variáveis encontra-se nos limites de
validade. Para proceder à otimização da Equação V.5 em relação às demais variáveis,
foi empregada a função maximize do programa Mathematica
®
(ver Apêndice). O ponto
ótimo da Equação V.5 ocorreu nos seguintes valores das variáveis:
E = 24,5 mg
T = 316 K
V
A
= 0 mL
t = 8 h
Os valores ótimos das variáveis, considerando estimativas econômicas do
processo, situaram-se próximos aos valores estabelecidos anteriormente, com base
apenas na conversão máxima. Substituindo o valor ótimo das variáveis na Equação V.5,
chega-se aos seguintes valores econômicos para o processo (Tabela V.9).
Tabela V.9 – Economia do processo de produção do protótipo de antiasmático
LASSBio 482 através de hidrólise enzimática.
US$
Custo (%)
Faturamento 436.000,00
Custo Total 267.759,74
Biocatalisador 39.152,00
14,6
Investimento 252,15
0,1
Reagentes 228.355,58
85,3
Lucro Bruto 168.240,26
De acordo com os cálculos, processo apresentou viabilidade econômica
considerando as suposições feitas. O item de maior influência no custo total foram os
reagentes (85,3 %), seguidos do custo com da enzima (14,6%). A estimativa do valor
gasto com reagente baseou-se em dados de catálogo da Sigma, muito acima dos valores
de mercado para venda de quantidades industriais. Já o custo com enzima baseou-se no
preço informado pelo fabricante para venda de quantidades grandes e portanto mais
próximo da realidade.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
107
V.6 Imobilização
Conforme foi verificado na otimização do processo (seção V.5), o custo com a
aquisição do biocatalisado tem impacto significativo no custo total estimado para o
processo (14,6%). A fim de reduzir os custos, foram realizados experimentos
preliminares visando à constituição de um biocatalisador próprio.
Para padronizar a metodologia empregada e selecionar suportes para a
imobilização, empregou-se uma solução comercial de lipases Lipozyme
®
10,000. Essa
preparação enzimática foi utilizada para que, ao menos nos experimentos preliminares,
se pudessem evitar outras fontes de erro que não fossem as já implícitas na própria
metodologia de imobilização e em sua avaliação. Posteriormente, a produção do
biocatalisador foi testada empregando a lipase de Penicillium restrictum (PRL)
imobilização
V.6.1 Imobilização Lipozyme
®
10,000
A enzima Lipozyme
®
10,000 foi imobilizada por adsorção nas resinas Amberlite
®
XAD-2, Accurel
®
MP1000 e Accurel
®
MP100. A seguir estão apresentados os
resultados mais significativos.
Em todos os experimentos realizados a cinética de adsorção foi rápida, ocorrendo
a saturação do suporte em cerca de 20 minutos (Figura V.17).
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (min)
PTN adsorvida (mg/g
suporte
)
Amberlite XAD-2
Accurel MP 1000
Accurel MP 100
Figura V.17 – Adsorção de proteínas da lipase comercial Lipozyme
®
10,000 durante o
processo de imobilização em diferentes suportes.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
108
A Tabela V.12, apresentada a seguir, sintetiza os resultados obtidos na
imobilização da lipase comercial Lipozyme
®
10,000 nos suportes Amberlite
®
XAD-2,
Accurel
®
MP 100 e Accurel
®
MP 1000.
Tabela V.12 – Resumo dos resultados obtidos pela imobilização da solução enzimática
Lipozyme
®
10,000
Suporte Carga
de PTN
ads.
(mg/g)
Eficiência
de imob.
PTN (%)
Ativ.
esterif.
(U
E
/g )
Ativ.
imob.
teórica
(U
H
/g)
Eficiência
de imob.
ativ. (%)
Ativ. imob.
real (U
H
/g)
Retenção de
ativ. (%)
Amberlite
®
XAD-2
46 23 4440 249 25 26 10
Accurel
®
MP100
46 26 21560 990 83 43 4
Accurel
®
MP1000
77 52 15700 940 87 182 22
Amberlite
®
XAD-2 foi o suporte que apresentou o pior desempenho na
imobilização de Lipozyme
®
10,000. A imobilização neste suporte apresentou eficiência
mediana em termos de adsorção de proteínas (a carga adsorvida foi semelhante à obtida
pelo uso da resina Accurel
®
MP100). Porém os parâmetros relacionados à atividade
efetivamente imobilizada (atividade hidrolítica imobilizada real e de esterificação)
foram muito inferiores aos valores alcançados quando os suportes de polipropileno
microporoso foram empregados (Accurel
®
MP100 e MP 1000).
A resina Accurel
®
MP 100 é constituída por partículas de maior tamanho (2 a 4
mm), o que facilita os processos de separação e recuperação do biocatalisador. Embora
a imobilização neste suporte tenha apresentado os melhores resultados de atividade de
esterificação e atividade imobilizada teórica (atividade hidrolítica), demostrou baixa
atividade imobilizada real e conseqüentemente baixa retenção de atividade (apenas 4%).
Essa aparente incoerência dos resultados pode ser resultado de maior impedimento à
difusão do substrato empregado na determinação da atividade hidrolítica (óleo de oliva
emulsionado) devido à hidrofobicidade do suporte associada ao tamanho da partícula.
O suporte com maior capacidade de adsorção de proteínas foi a resina Accurel
®
MP 1000 (77 mg/g). Provavelmente, isto se deveu à menor granulometria deste suporte
(o que diminui os efeitos de difusão) e à sua maior área superficial, que possibilitam a
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
109
maior adsorção de proteínas. A quantidade de proteínas adsorvida foi cerca de 35% da
saturação do suporte determinada por GITLESEN et al. (1997), e portanto
possivelmente a imobilização poderia ainda ser alvo de otimização. Também foi este o
suporte que propiciou maior atividade imobilizada real e retenção de atividade. A
avaliação dos parâmetros relativos a atividade imobilizada (hidrolítica real e de
esterificação) foi decisiva para a seleção deste suporte para experimentos subseqüentes.
Além dos testes de imobilização da solução enzimática Lipozyme
®
10,000 em
diversas resinas em temperatura de 4
o
C, foi realizado um experimento de imobilização
em Accurel
®
MP 1000 (a resina que proporcionou melhor atividade nos experimentos
anteriores) em temperatura mais elevada (35
o
C). Apesar do fenômeno de adsorção
clássico ser favorecido por temperaturas baixas, decidiu-se testar o uso de temperatura
mais próxima à temperatura ótima de reação da lipase, pois diversos trabalhos da
literatura realizaram a imobilização nessa condição. Segundo o verificado na literatura,
o fenômeno da adsorção de lipases é diferente da adsorção de proteínas mais
convencionais, por envolver a interação hidrofóbica entre a superfície do suporte e a
face interna da “tampa” da enzima e áreas próximas ao seu sítio ativo (BATISDA et al.,
1998). Ou seja, a adsorção de lipases por superfícies hidrofóbicas necessitaria que a
enzima estivesse em sua forma ativa.
A Figura V.18 apresenta a evolução do processo de imobilização da enzima
Lipozyme
®
10,000 no suporte Accurel
®
MP 1000 a temperatura de 35
o
C. A carga de
proteína imobilizada foi de 38 mg/g de suporte, e portanto inferior ao verificado nos
experimentos realizados com esse suporte à 5
o
C. A lipase imobilizada à 35
o
C não exibiu
nenhuma atividade em reações de esterificação. A análise da atividade hidrolítica de
amostras da solução enzimática ao início e término do processo de imobilização revelou
que a atividade imobilizada teórica foi de 365 U
H
/g. Já a atividade imobilizada foi de
5,8 U
H
/g o que implica em retenção de atividade inferior a 2 %.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
110
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2040608010
Tempo (min)
PTN adsorvida (mg/g
suporte
)
0
Figura V.18 - Imobilização da Lipozyme
®
10,000 em Accurel
®
MP 1000 a 35
o
C.
A imobilização de lipase por adsorção em temperaturas elevadas mostrou-se
insatisfatória por reduzir a carga de proteínas adsorvida pelo suporte e ser deletéria à
atividade enzimática.
V.6.2 Imobilização da lipase de Penicillium restrictum
A adição de 1250 U
H
da PRL a 1,0g (peso seco) do suporte Accurel
®
MP1000
proporcionou a produção de 1,7 g de um biocatalisador cuja atividade hidrolítica era de
80 U
H
.g
-1
. Esse valor representa uma retenção de atividade de 13%, já que a atividade
imobilizada teórica foi de 628 U
H
.g
-1
. A adsorção de proteínas (Figura V.19) ocorreu
um pouco mais lentamente que o verificado na imobilização da Lipozyme
®
10,000, e
após cerca de 60 minutos, o limite de adsorção do suporte foi alcançado. A carga de
proteínas adsorvidas foi de 106 mg PTN/g
suporte
, portanto superior à alcançada na
imobilização de Lipozyme
®
10,000. Esse resultado não era esperado pois a
concentração de proteínas no meio para a imobilização de PRL era inferior ao utilizado
para Lipozyme
®
10,000 (ainda que as atividades totais colocadas fossem as mesmas) e a
adsorção segundo o modelo de Langmuir é função da concentração do meio. Esse fato
pode indicar maior afinidade entre a PRL e a superfície hidrofóbica do suporte. Mesmo
empregando uma solução de lipase cerca de dez vezes menos concentrada (25 U
H
/mL)
que a Lipozyme
®
10,000 (230 U
H
/mL), apresentou boa atividade hidrolítica frente ao
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
111
óleo de oliva, cerca de metade da obtida pela imobilização de Lipozyme
®
10,000 (80
U
H
/g e 182 U
H
/g, respectivamente).
0
20
40
60
80
100
120
0 20406080100120
Tempo (min)
PTN adsorvida (mg/g
suporte
)
Figura V.19 – Adsorção da PRL em Accurel
®
MP 1000 (concentração inicial de
proteínas 6 mg/mL, volume da solução 50 mL, T = 4
o
C).
O biocatalisador próprio produzido pela imobilização de PRL em polipropileno
microporoso foi testado na catálise da reação de hidrólise do FIT-MET. Este
biocatalisador foi utilizado tanto em sistema trifásico, como o descrito na seção IV.2.2,
quanto em meio orgânico simples empregando acetato de etila como solvente. Mesmo
quando este biocatalisador foi empregado em altíssimas concentrações (80 mg/mL
solvente
o que equivale a 6,4 U
H
/mL
solvente
), análises por TLC revelaram não haver nenhuma
formação do protótipo de antiasmático LASSBio 482 em ambos os sistemas. O mau
desempenho deste biocatalisador frente ao substrato modelo desta Tese não foi
totalmente inesperado uma vez que a PRL é uma enzima com especificidade por
triglicerídeos com ácidos graxos de cadeia média e longa (JESUS et al., 1999).
O êxito na produção do biocatalisador suplanta o resultado negativo para a
hidrólise do éster precursor do antiasmático. A produção de um biocatalisador próprio,
com alta atividade e produzido por uma metodologia simples mostrou o alto potencial
para o desenvolvimento para pesquisas nessa área. Apesar da produção do
biocatalisador próprio de PRL ainda requerer otimização, comparando-se os resultados
de atividade frente ao óleo de oliva com a atividade do biocatalisador comercial
Lipozyme
®
RM IM pode-se visualizar a excelente performance. A atividade do
biocatalisador próprio foi cerca de dois terços da atividade do biocatalisador comercial
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo V – Resultados
_________________________________________________________________________________________
112
(80 U
H
/g e 120 U
H
/g).O biocatalisador produzido apresenta excelente potencial para
outras aplicações como produção de biodiesel e hidrólise de óleos vegetais.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo VI – Conclusões e etapas futuras
_________________________________________________________________________________________
113
VI. CONCLUSÕES
Os experimentos preliminares revelaram que a hidrólise enzimática dos ésteres
FIT-ET e FIT-MET catalisada por lipase pode ser realizada em diversos solventes
(acetona, clorofórmio e acetato de etila) ou em sistema trifásico constituído do
biocatalisador, solvente (acetato de etila) e fase aquosa (solução saturada de Na
2
CO
3
).
A hidrólise do éster FIT-MET em sistema trifásico partiu da necessidade de
incrementar as taxas de reação obtidas. A execução desse estudo segundo um
planejamento experimental mínimo revelou que a quantidade ótima de Lipozyme
®
RM
IM empregada era de até 1,8 U
H
/mL
solvente
. Também foi verificado que embora o
aumento da temperatura contribuísse para o aumento da conversão, temperaturas na
faixa de 50
o
C deveriam ser evitadas pois, além de representarem gasto energético maior,
causam a volatilização dos solventes. A presença da fase aquosa foi considerada
benéfica ao processo de hidrólise do FIT-MET ainda que na análise estatística dos
resultados tenha apresentado significância relativamente baixa. Já os resultados dos
experimentos de hidrólise do éster FIT-ET apresentaram discrepâncias grandes entre si,
não sendo possível um bom ajuste dos dados obtidos.
A realização de experimentos para acompanhamento da reação ao longo do tempo
em 3 diferentes concentrações enzimáticas, ampliou a base de dados experimentais.
Estes resultados foram aproveitados para a re-estimação de modelo semi-empírico para
previsão de performance da reação. Este novo modelo proporcionou excelente ajuste
dos dados experimentais. No entanto, o modelo semi-empírico estimado com base de
dados ampliada (resultados dos dois blocos de experimentos planejados e resultados de
experimentos cinéticos em sistema trifásico) não incluiu V
A
(volume da fase aquosa
saturada com Na
2
CO
3
) como um parâmetro significativo. Provavelmente, isso ocorreu
devido à base de dados considerada que continha muitos experimentos realizados na
mesma condição reacional em relação a V
A
. A comprovação da real influência desta
variável na conversão da reação no sistema testado requereria a realização de
experimentos adicionais.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo VI – Conclusões e etapas futuras
_________________________________________________________________________________________
114
A otimização da hidrólise de FIT-MET em sistema trifásico foi calculada tendo
como base o modelo semi-empírico proposto e parâmetros de economia, alguns deles
estimados. Concluiu-se que o processo apresentava viabilidade econômica e que os itens
de maior influência no custo eram os reagentes e a enzima. A concentração de substrato
não foi alvo de otimização, provavelmente poderia ser aumentada, se traduzindo em
menor custo para o processo.
Os testes de imobilização realizados com a solução enzimática Lipozyme
®
10,000
mostraram que o suporte mais adequado para a imobilização de lipases foi a resina
Accurel
®
MP 1000. Foi este o suporte que proporcionou maior carga de proteína
imobilizada (77 mg
PTN
/g
suporte
) e apresentou máxima atividade em reações hidrolíticas.
Foi produzido um biocatalisador próprio, através de metodologia simples porém
efetiva. A lipase de Penicillium restrictum (PRL) imobilização no suporte em Accurel
®
MP 1000 apresentou boa atividade hidrolítica empregando óleo de oliva emulsionado
como substrato. Os resultados de atividade obtidos foram superior a 65% da atividade
dosada na lipase comercial Lipozyme
RM IM (120 U
H
.g
-1
). Entretanto, a aplicação da
PRL imobilizada em reações de hidrólise dos ésteres estudados não foi eficaz para esse
fim. Ainda assim, deve-se ressaltar que este biocatalisador apresenta excelente potencial
para outras aplicações como produção de biodiesel e hidrólise de óleos vegetais.
A partir dos resultados gerados nesta pesquisa foram publicados dois artigos
científicos em periódicos internacionais, um no Biochemical Engineering Journal
(BEVILAQUA et al., 2004) e outro no Applied Biochemistry and Bioengineering
(BEVILAQUA et al., 2005). Neste último artigo conjugou-se os resultados parciais
desta pesquisa com os resultados obtidos por CUNHA (2004). Os resultados parciais
desta Tese também foram divulgados em congressos nacionais: IV Enzitec
(BEVILAQUA et al., 2004b), XXXI Reunião Anual da SBBq (CUNHA et al., 2004a);
e em congressos internacionais: Biocat (BEVILAQUA et al., 2002), 26
th
Symposium of
Biotechnology for Fuels and Chemicals (BEVILAQUA et al., 2004c) e 12
th
International Biotechnology Symposium and Exhibition (CUNHA et al., 2004b).
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo VI – Conclusões e etapas futuras
_________________________________________________________________________________________
115
VII – SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
O trabalho desenvolvido nesta Tese não encerra as possibilidades de investigações
adicionais sobre o tema estudado. Foi originada uma nova linha de pesquisa nos
Laboratórios do Núcleo de Biotecnologia da UFRJ que visa investigar a biocatálise por
lipases (comerciais e próprias) em processos para a produção de fármacos e outros
produtos de interesse biotecnológico.
Sugestões para trabalhos futuros:
1.
Empreender estudos de modelagem molecular e docking para que se
possa ter uma melhor compreensão teórica da especificidade dos
biocatalisadores e a previsão de sua performance frente a diversos
fármacos e protótipos de fármacos.
2.
Realizar experimentos adicionais de hidrólise do éster FIT-MET em
sistema trifásico para a comprovação da influência da fase aquosa
(Na
2
CO
3
sat
) na taxa da reação.
3.
Empregar a catálise enzimática proporcionada por lipases em reações
para a resolução racêmica de novas moléculas com potencial bioativo.
4.
Aprofundar os estudos de imobilização da lipase de Penicillium
restrictum em suportes hidrofóbicos (polipropileno microporoso) e testar
o emprego de aditivos como BSA e gelatina.
5.
Testar a imobilização de PRL por adsorção em suportes como octadecil
sepabeads e através de outras técnicas como imobilização multipontual.
6.
Desenvolver aplicações para a PRL imobilizada como por exemplo
produção de biodiesel, lubrificantes biodegradáveis, hidrólise de óleos
vegetais para obtenção de ácidos graxos.
7.
Desenvolver novos biocatalisadores baseados na produção de lipases por
diferentes fungos e bactérias do banco de cepas do Núcleo de
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Capítulo VI – Conclusões e etapas futuras
_________________________________________________________________________________________
116
Biotecnologia da UFRJ e imobilizar essas enzimas em diferentes
suportes (comerciais ou não).
8.
Testar a bio-impressão com ácidos graxos de lipases produzidas por
microrganismos do banco de cepas do Núcleo de Biotecnologia da
UFRJ.
Estudo da catálise enzimática em meio orgânico para a produção de protótipo de fármaco antiasmático
Bibliografia
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APÊNDICE
Maximização da Equação V.5 através do Mathematica
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