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DEGRADAÇÃO E REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO
DESREGULADOR ENDÓCRINO 17β-ESTRADIOL PELO PROCESSO DE
OZONIZAÇÃO
Daniele Maia Bila
TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS
PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS
NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS
EM ENGENHARIA QUÍMICA.
Aprovada por:
________________________________________________
Profª Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Antonio Filipe Falcão de Montalvão, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Geraldo Lippel Sant'Anna Junior, Dr.Ing.
________________________________________________
Profª Juacyara Carbonelli Campos, D.Sc.
________________________________________________
Prof. Antonio Carlos Silva Costa Teixeira, D.Sc.
________________________________________________
Profª Leda dos Reis Castilho, Dr.-Ing.
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
JULHO DE 2005
i
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BILA, DANIELE MAIA
Degradação e Remoção da Atividade Estro-
gênica do Desregulador Endócrino 17β-Estradi-
ol pelo Processo de Ozonização [Rio de Janeiro]
2005
XIX, 281 p. 29,7 cm (COPPE/UFRJ, D.Sc.,
Engenharia Química, 2005)
Tese - Universidade Federal do Rio de
Janeiro, COPPE
1. Ozonização
2. Desreguladores Endócrinos
3. Atividade Estrogênica
I. COPPE/UFRJ II. Título ( série )
ii
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Como muito amor dedico este trabalho ao
João Marcello, Maria Clara, meus pais e
sogros.
iii
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora professora Márcia Dezotti por seu empenho,
companheirismo e amizade, principalmente nos momentos em que, algumas vezes,
acreditou mais em meu trabalho do que eu mesma.
Ao orientador e amigo Antonio Filipe Montalvão pelo apoio, principalmente na
planta de ozonização e que sempre esteve disponível em todas as etapas desse estudo.
Ao amigo professor Geraldo Lippel Sant’Anna Jr. pelos conselhos e críticas
construtivas nestes quase 6 anos de aprendizado.
Aos professores Juacyara Carbonelli Campos, Antonio Carlos Silva Costa
Teixeira e Leda dos Reis Castilho por terem aceito fazer parte da banca de tese.
Ao professor John P. Sumpter da Universidade de Brunel, Uxbrige, UK pela
cepa de Saccharomyces cerevisiae para os ensaios de YES.
À professora Elisabetta Agradi e seus alunos Andre, Simone, Sara, Frederica,
Elisa, Daniela e Elisa do Instituto de Ciências Farmacológicas da Universidade de
Milão pela paciência e ajuda nos procedimentos dos ensaios de atividade estrogênica.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de Doutorado que possibilitou o
desenvolvimento deste estudo e apresentações em congressos nacionais e internacionais.
Aos professores Lina Zingali e Robson do CCS/UFRJ pelo auxílio na leitura das
microplacas dos ensaios YES.
Aos professores Francisco Radler e Débora de Azevedo e a técnica Ana Paula do
IQ/UFRJ pelas orientações nas análises de GC/EM.
Aos amigos Herval, Ana Karla, Rossano, Cândida, Ariane, Leandro, Ana
Carolina e Lívia do Laboratório de Bioprocessos do PEQ/COPPE/UFRJ pela ajuda
imprescindível nos ensaios de atividade estrogênica.
Aos grandes amigos Simone, Milena, Alessandra, Jackson, Tatiana, Thaís,
Carolina, Amanda, Eduardo Bessa, Alexandre Torres, Nilson e Antônio do Laboratório
de Poluição de Águas do PEQ/COPPE/UFRJ pelo companheirismo, amizade e
incentivo em todas as horas.
Aos meus pais Cremilto e Regina e aos meus irmãos Alisson e Heriston pelo
constante apoio e incentivo em mais esta etapa da minha vida.
Aos meus sogros Rogério e Glória pelo apoio.
À Maria Clara e João Marcello pela paciência e compreensão pelos meses em
que levei trabalho para casa.
iv
Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)
DEGRADAÇÃO E REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO
DESREGULADOR ENDÓCRINO 17β-ESTRADIOL PELO PROCESSO DE
OZONIZAÇÃO
Daniele Maia Bila
Julho/2005
Orientadores: Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti
Antonio Filipe Falcão de Montalvão
Programa: Engenharia Química
Atualmente, há um crescente interesse de grupos científicos em micropoluentes
presentes no meio ambiente que podem interferir no sistema endócrino, afetando a
saúde e a reprodução de humanos e animais. Essas substâncias são conhecidas como
“Desreguladores Endócrinos (DE)”. Várias são as classes de substâncias classificadas
como DE, tais como, os pesticidas, substâncias usadas e produzidas nas indústrias
químicas e estrogênios naturais e sintéticos. Os DE podem ser encontrados em esgoto
doméstico, efluentes de estações de tratamento de esgoto, águas naturais e potável.
Neste estudo, investigou-se a ozonização do 17β-estradiol. Foram estudadas a influência
do pH e diferentes dosagens de ozônio na degradação do 17β-estradiol, na formação de
seus subprodutos e na remoção da atividade estrogênica. A ozonização mostrou-se um
eficiente processo na remoção do 17β-estradiol, alcançando-se altas remoções (>99,1%)
com baixos consumos de ozônio (1,0 mg.L
-1
). Contudo, em pH 7 e 11, a atividade
estrogênica não foi totalmente removida, mesmo com aumento da dosagem de ozônio,
indicando que provavelmente, subprodutos estrogênicos foram formados.
v
Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the
requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)
DEGRADATION AND THE ESTROGENIC ACTIVITY REMOVAL OF THE
ENDOCRINE DISRUPTER CHEMICAL 17β-ESTRADIOL BY OZONATION
PROCESS
Daniele Maia Bila
July/2005
Orientadores: Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti
Antonio Filipe Falcão de Montalvão
Department: Chemical Engineering
There is an increasing interest in micropollutants in the environment that can
interfere in the endocrine system, affecting health, growth and reproduction of animals
and humans. These substances are known as “Endocrine Disrupters Chemicals” (EDCs).
There are numerous classified to be as ED, such as pesticides, chemicals used and
produced in chemical industries and natural and synthetic estrogens. ED can be found in
domestic sewage, domestic wastewater treatment plant effluent, natural and potable
waters. This work investigates the influence of pH and ozone dosage in the degradation
of 17β-estradiol and the formation of byproducts. Ozonation proved to be a highly
efficient process for the removal of 17β-estradiol (>99.1 % of degradation) with low
levels of ozone consumption (1.0 mg.L
-1
). However, at pH’s 7 and 11, the estrogenic
activity was not completely removed, even for higher ozone dosages, which is an
indication that estrogenic byproducts have probably been formed.
vi
ÍNDICE GERAL
I. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS...................................................................... 1
II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................ 6
II.1. DESREGULADORES ENDÓCRINOS.................................................. 6
II.1.1 Definição - O que é um Desregulador Endócrino?............................... 7
II.1.2. Histórico e Estado Atual do Conhecimento......................................... 9
II.1.3. Estratégias Internacionais para Avaliar o Problema dos DE............... 11
II.1.4. Substâncias Classificadas como Desreguladores Endócrinos............. 13
II.1.5. Meios de Exposição aos Desreguladores Endócrinos......................... 19
II.1.6. Ocorrência de Desreguladores Endócrinos no Meio Ambiente.......... 22
II.1.7. Mecanismos de Ação dos Desreguladores Endócrinos....................... 24
II.1.7.1.
Sistema Endócrino....................................................................... 24
II.1.7.2.
Os diferentes mecanismos de ação dos DE.................................. 27
II.1.7.2.a. Via receptores de hormônios esteróides............................... 27
II.1.7.2.b. Mecanismos independentes dos receptores hormonais........ 34
II.1.7.3.
Atividade estrogênica................................................................... 35
II.1.7.4.
Relação estrutura-atividade biológica.......................................... 35
II.1.7.5.
Efeitos de combinação aditivos................................................... 37
II.1.8. Efeitos Causados pela Exposição aos Desreguladores Endócrinos..... 37
II.1.8.1.
Efeitos relatados em animais silvestres e de laboratório............. 38
II.1.8.2
. Efeitos relatados em humanos……………………………….… 44
II.1.8.3.
Efeitos em fetos ou espécies jovens…………………………… 46
II.1.9. Estrogênios Naturais e Sintéticos………………………………….... 47
II.1.9.1.
Hormônios sexuais……………………………………………... 47
II.1.9.2.
Propriedades físico-químicas dos estrogênios............................. 49
II.1.9.3.
Uso e produção............................................................................ 51
II.1.9.4.
Ocorrência e destino no meio ambiente....................................... 52
II.1.9.4.a. Excreção de estrogênios natural e sintético e seus
metabólitos............................................................................................. 52
II.1.9.4.b. Estrogênios no esgoto doméstico e efluente de ETE:
Destino e remoção dos estrogênios nas ETE......................................... 52
II.1.9.4.c. Estrogênios em águas naturais.............................................. 57
II.1.9.4.d. Estrogênios em detritos de animais....................................... 57
II.1.9.5.
Estudos relevantes da avaliação dos efeitos de potencial do
17β-estradiol..............................................................................
58
II.2. MÉTODOS DE ENSAIOS USADOS PARA AVALIAR OS DE......... 59
II.2.1. Ensaios in vivo..................................................................................... 61
II.2.1.1.
Ensaios em roedores.................................................................... 61
II.2.1.2.
Ensaio da indução da síntese de vitelogenina (VTG).................. 62
II.2.2. Ensaios in vitro.................................................................................... 64
II.2.2.1.
Ensaio de ligação competitiva nos receptores dos hormônios
esteróides.................................................................................... 65
II.2.2.2.
Ensaios de proliferação celular.................................................... 66
II.2.2.3.
Ensaios de gene repórter recombinante........................................ 67
II.2.2.3.a. Ensaios gene repórter baseado em células de mamíferos...... 68
II.2.2.3.b. Ensaios gene repórter baseado em células de levedura......... 69
II.2.3. Sistemas de análises............................................................................ 75
vii
II.3 FÁRMACOS RESIDUAIS........................................................................ 77
II.3.1. Ocorrência de Fármacos no Meio Ambiente....................................... 78
II.3.1.1.
Fármacos monitorados no Brasil................................................. 81
II.3.2. Aplicação e Destino dos Fármacos no Meio Ambiente....................... 83
II.3.2.1.
Degradação de fármacos no meio ambiente................................ 86
II.3.3. Possíveis Efeitos da Presença de Fármacos ao Meio Ambiente.......... 88
II.3.4. Avaliação do Impacto Ambiental de Fármacos em Ambientes
Aquáticos............................................................................................ 91
II.4. MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS NA DETERMINAÇÃO
DE FÁRMACOS E ESTROGÊNIOS EM MATRIZES
AMBIENTAIS............................................................................................. 93
II.5. A OZONIZAÇÃO E OS PROCESSOS OXIDATIVOS
AVANÇADOS............................................................................................. 98
II.5.1. Introdução............................................................................................ 98
II.5.2. Geração do Ozônio e Propriedades Químicas e Físicas....................... 100
II.5.3. Instabilidade do Ozônio na Água......................................................... 101
II.5.4. Aplicações do Ozônio nas Plantas de Tratamento de Água e
Efluentes............................................................................................. 107
II.5.5. Reações de Oxidação Durante a Ozonização....................................... 109
II.5.6. Oxidação de Compostos Orgânicos Durante a Ozonização................. 112
II.5.6.1.
Cinética das reações de oxidação durante a ozonização.............. 113
II.5.7. Formação de Subprodutos Indesejáveis na Ozonização...................... 118
II.5.8. Oxidação de Micropoluentes Orgânicos.............................................. 118
II. 5.8.1.
Oxidação de desreguladores endócrinos e fármacos.................. 119
II.6. TRATAMENTOS APLICADOS NA REMOÇÃO DE FÁRMACOS
E PERTURBADORES ENDÓCRINOS EM SISTEMAS
AQUOSOS................................................................................................... 122
II.6.1. Ozonização de Fármacos...................................................................... 123
II.6.2. Ozonização de Estrogênios.................................................................. 126
II.6.3. Os POA na Remoção de Fármacos e Desreguladores Endócrinos...... 127
II.6.4. Outros Tratamentos Empregados na Remoção de Fármacos e DE...... 129
II.7 SUBPRODUTOS FORMADOS DURANTE A OXIDAÇÃO DE
COMPOSTOS ORGÂNICOS................................................................... 133
II.7.1. Introdução............................................................................................ 133
II.7.2. Subprodutos Formados da Oxidação do 17β-Estradiol.......................
135
II.7.3. Metabolismo do 17β-estradiol no corpo..............................................
142
II.8. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA POR
PROCESSOS OXIDATIVOS.................................................................... 143
III. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 146
III.1. REAGENTES......................................................................................... 146
III.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE 17β-ESTRADIOL........................ 147
III.3. EXPERIMENTO DE OZONIZAÇÃO................................................ 147
III.4. METODOLOGIA ANALÍTICA.......................................................... 150
III.4.1. Extração por Fase Sólida (EFS)......................................................... 151
III.4.2. Derivatização...................................................................................... 152
III.4.3. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa (CG)...................... 153
III.4.4. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa / Espectrometria
de Massa (CG/EM)............................................................................. 153
III.4.5. Preparação da Curva de Calibração.................................................... 156
viii
III.4.6. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração.............................. 156
III.4.7. Avaliação do Limite de Detecção da Metodologia Experimental...... 157
III.4.8. Espectrofotometria no UV................................................ 157
III.4.9. Determinação da Atividade Estrogênica pelo Ensaio YES (YEAST
ESTROGEN SCREEN)............................... 158
III.4.9.1.
Ensaio YES................................................................................ 158
III.4.9.2.
Cepa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) recombinante... 160
III.4.9.3.
Preparação do meio de crescimento........................................... 161
III.4.9.4.
Cultivo da cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae....... 162
III.4.9.5.
Preparação do meio de análise................................................... 162
III.4.9.6.
Preparação das amostras para os ensaios YES.......................... 162
III.4.9.7.
Procedimento de análise do ensaio YES.................................... 163
III.4.9.7.a. Procedimento de análise YES para amostras sem preparo
prévio..................................................................................................... 165
III.4.9.7.b. Procedimento de análise YES para amostras com preparo
prévio..................................................................................................... 165
III.4.9.8.
Análise dos dados............................................................................ 166
III.5. TESTE DE TOXICIDADE COM Ceriodaphia dúbia......................... 168
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 169
IV.1. DETERMINAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL......................................... 169
IV.2. AVALIAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA UTILIZADA.. 170
IV.2.1. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração e Detecção........... 170
IV.2.2. Limite de Detecção............................................................................ 171
IV.3. REMOÇÃO DO 17β-ESTRADIOL NAS MATRIZES
INVESTIGADAS........................................................................................ 171
IV.3.1. Remoção do 17β-Estradiol em Solução Aquosa................................
171
IV.3.2. Remoção do 17β-estradiol em Solução Aquosa e Efluente de ETE..
178
IV.4. IDENTIFICAÇÃO DOS SUBPRODUTOS FORMADOS NA
OZONIZAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL.................................................... 180
IV.5. DESAPARECIMENTO DAS BANDAS DE ABSORBÂNCIAS DO
17β-ESTRADIOL APÓS A OZONIZAÇÃO........................................... 186
IV.6. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO 17β-
ESTRADIOL NA OZONIZAÇÃO........................................................... 190
IV.6.1. Ensaio YES........................................................................................ 190
IV.6.2 Atividade Estrogênica da Água Destilada.......................................... 192
IV.6.3. Atividade Estrogênica das Amostras Aquosas de 17β-Estradiol
Ozonizadas.......................................................................................... 194
IV.6.4. Atividade Estrogênica de Possíveis Subprodutos Formados na
Ozonização do 17β-Estradiol.............................................................
206
IV.7. TOXICIDADE CRÔNICA DO 17β-ESTRADIOL............................. 208
V. CONCLUSÕES................................................................................................. 210
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA............................................................. 213
ANEXO 1: Sumário das Concentrações Médias ou Faixas de Concentrações de
Desreguladores Endócrinos Detectados no Meio Ambiente.................... 239
ANEXO 2: Sumário das Concentrações Médias ou Faixas Concentrações de
Fármacos Detectados no Meio Ambiente............................................... 246
ix
ANEXO 3: Sumário de Condições de Tratamentos e Resultados Descritos na
Literatura.................................................................................................. 253
ANEXO 4: Cromatogramas das Amostras Submetidas à Espectrometria de
Massas....................................................................................................... 264
ANEXO 5: Alguns Subprodutos Formados na Ozonização do 17β-Estradiol
Identificados na Espectrometria de Massa................................................ 270
ANEXO 6: Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
), com diferentes dosagem de
ozônio consumido e valores de pH 3, 7 e 11............................................ 272
ANEXO 7: Atividade estrogênica das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas, usadas sem preparo prévio no ensaio YES........................... 275
ANEXO 8: Cromatogramas obtido por CG das amostras aquosas de 17β-
estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 10µg.L
-1
) ozonizadas, preparadas com
água ultrapura apirogênica
....................................................................... 277
x
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela II.1. Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os DE............... 12
Tabela II.2. Substâncias químicas classificadas como DE.................................... 18
Tabela II.3. Principais funções dos hormônios no corpo humano e as doenças
resultantes da superprodução ou escassez dessas substâncias............... 25
Tabela II.4. Diferentes mecanismos de ação dos DE............................................. 33
Tabela II.5. Efeitos e anomalias atribuídos aos DE............................................... 39
Tabela II.6. Efeitos e anomalias em peixes atribuídos aos DE.............................. 40
Tabela II.7. Potências relativas de algumas substâncias estrogênicas
comparadas com o 17β-estradiol (GAIDO et al., 1997)......................
48
Tabela II.8. Estrutura química e algumas características dos estrogênios
naturais e sintéticos.............................................................................. 50
Tabela II.9. Propriedades físico-químicas dos estrogênios.................................... 51
Tabela II.10. Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humanos
(JOHNSON et al., 2000)....................................................................... 52
Tabela II.11. Remoções estrogênios monitoradas na ETE da Penha/RJ por
TERNES et al. (1999)........................................................................... 54
Tabela II.12. Sumário de ensaios in vivo e in vitro usados para identificar
substâncias com atividade estrogênica.................................................. 73
Tabela II.13. Algumas vantagens e desvantagens dos ensaios in vitro e in vivo... 74
Tabela II.14. Fármacos e metabólitos monitorados no Brasil por Stumpf et al.
(1999).................................................................................................... 82
Tabela II.15. Remoções de fármacos residuais monitoradas na ETE da
Penha/RJ por Stumpf et al. (1999)........................................................ 83
Tabela II.16. Métodos utilizados na determinação de fármacos em matrizes
aquosas.................................................................................................. 95
Tabela II.17. Métodos usados na determinação de estrogênios em amostras
ambientais.............................................................................................. 96
Tabela II.18. Potenciais de oxi-redução de alguns agentes oxidantes................... 98
Tabela II.19. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o
ozônio compiladas HOIGNÉ e BADER (1983a)………....………… 116
Tabela II.20. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o
ozônio compiladas de HOIGNÉ e BADER (1983b)………………… 117
Tabela II.21. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o
radical HO
•
compiladas de GLAZE e KANG (1989)……………… 117
Tabela II.22. Constantes das taxas de reação da oxidação de compostos
orgânicos com radicais HO
•
compiladas de estudos da literatura......... 120
Tabela II.23. Constantes das taxas reação da oxidação de compostos orgânicos
com ozônio compiladas de estudos da literatura................................... 121
Tabela II.24. Intermediários identificados ou propostos para a oxidação do 17β-
estradiol copilados da literatura............................................................ 141
Tabela III.1. Estruturas químicas de algumas substâncias usadas nos ensaios..... 146
Tabela III.2. Características e condições de análise do sistema CG empregado... 155
Tabela III.3. Características e condições de análise do sistema CG/EM
empregado............................................................................................. 155
xi
Tabela IV.1. Porcentagem de recuperação do 17β-estradiol após o processo de
EFS........................................................................................................ 170
Tabela IV.2. Parâmetros da composição do efluente de ETE da Ilha do
Governador............................................................................................ 178
Tabela IV.3. Possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol
de acordo com as análises de CG/EM................................................... 183
Tabela IV.4. Subprodutos propostos na ozonização do 17β-estradiol em água
destilada e em efluente de ETE nos diferentes valores de pH
investigados........................................................................................... 186
Tabela IV.5. Valores de EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosas de 17β-
estradiol ozonizadas.............................................................................. 201
Tabela IV.6. Valores de EC
50
e PR para os possíveis subprodutos formados na
ozonização do 17β-estradiol..................................................................
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura II.1. Mecanismo global de ação dos estrogênios. Estrogênio, tal como o
17β-estradiol, regula os processos celulares pela ligação no RE no
núcleo celular. O receptor ativado dimeriza e se acopla ao ERE no
promotor nos genes alvo iniciando a transcrição genética................. 28
Figura II.2. Representação da estrutura tridimensional do DLH do RE-α com o
17β-estradiol acoplado. (a) monômero com a visualização das α-
hélices em vermelho e do 17β-estradiol em azul. (b) Dímero.
(Figura retirada de BRZOZOWSKI et al. (1997))............................. 29
Figura II.3. Mecanismos de atuação dos DE (imagem copiada e modificada
(
http://acpo94.sites.uol.com.br/interferentes_hormonais.htm,
acessado em 12/09/2003)................................................................... 31
Figura II.4. Estrutura química do 17β-estradiol....................................................
48
Figura II.5. Representação esquemática da biosíntese dos estrogênios naturais... 49
Figura II.6. Possíveis rotas de fármacos e estrogênios no meio ambiente (BILA
e DEZOTTI, 2003)............................................................................. 85
Figura II.7. Geração de Ozônio............................................................................. 100
Figura II.8. Esquema de reações do ozônio em solução aquosa. Onde, M =
composto, M
oxid
= composto oxidado, Si = capturador de radical
livre, P = produtos que não catalisam a decomposição do ozônio,
R
•
= radicais livres que catalisam a decomposição do ozônio
(figura copiada de HOGNÉ e BADER, 1983)................................... 103
Figura II.9. Mecanismo da reação do ozônio e radicais HO
•
com solutos (M)
em meio aquoso.................................................................................. 112
Figura II.10. Sistema de reator biocatalítico de degradação do 17α-
etinilestradiol no qual o MnO
2
opera como uma superfície
catalítica e os microrganismos oxidantes de Mn
2+
, re-oxidam e
redepositam o Mn
2+
no MnO
2
............................................................ 131
Figura II.11. Mecanismos de reação para a ozonização do fenol proposto por
HUANG e SHU (1995)...................................................................... 134
Figura II.12. Mecanismo de degradação do 17β-estradiol pela fotocatálise
proposto por OHKO et al. (2002)...................................................... 136
Figura II.13. Estruturas químicas dos compostos ADO e TS................................ 136
Figura II.14. Estruturas químicas do 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftol (THN) e 1
etinil-1-ciclohexanol (ECH)............................................................... 137
Figura II.15. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a
ozonização do composto modelo THN.............................................. 138
Figura II.16. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a
ozonização do composto modelo ECH.............................................. 139
Figura II.17. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al. (2004) para a
ozonização 17β-estradiol e estrona....................................................
140
Figura II.18. Lugares da oxidação metabólica do 17β-estradiol pelas enzimas
citocromo P450 NADPH-dependente. Os principais caminhos
metabólicos (2-hidroxilação, 16α-hidroxilação e a formação da
estrona) são indicados pelas setas pretas............................................ 142
Figura II.19. Os metabólicos 2-hidroxiestradiol e 16α-hidroxiestradiol (estriol).
142
Figura III.1. Esquema da unidade de ozonização................................................. 148
xiii
Figura III.2. Foto das colunas de contato. (A) coluna de acrílico e (B) coluna de
vidro................................................................................................... 149
Figura III.3. Foto da unidade de ozonização......................................................... 149
Figura III.4. Esquema da metodologia analítica utilizada..................................... 151
Figura III.5. Foto do sistema de EFS.................................................................... 152
Figura III.6. Esquemas das metodologias analíticas usadas para avaliar a
eficiência do processo de extração..................................................... 154
Figura III.7. Esquemas das metodologias analíticas usadas para avaliar a
eficiência do processo de extração.....................................................
156
Figura III.8. Esquema detalhado da metodologia analítica utilizada na
espectrometria de UV......................................................................... 157
Figura III.9. Esquema do sistema de expressão do estrogênio induzível na
levedura Saccharomyces cerevisiae................................................... 159
Figura III.10. Microfotografia da Saccharomyces cerevisiae............................... 160
Figura III.11. Esquema detalhado da metodologia analítica usada no ensaio
YES.................................................................................................... 164
Figura III.12. Foto da microplaca de 96 poços no início dos ensaios de
atividade estrogênica.......................................................................... 166
Figura IV.1. Cromatograma de uma amostra aquosa com 50µg.L
-1
de 17β-
estradiol.............................................................................................. 170
Figura IV.2. Estrutura química do 17β-estradiol...................................................
172
Figura IV.3. Remoções do 17β-estradiol após a ozonização nos valores de pH
3, 7, 11. Concentração inicial de 17β-estradiol de 10 e 50 µg.L
-1
.....
173
Figura IV.4. Dosagem de ozônio com o tempo em todos os pH
investigado.............. 175
Figura IV.5. Quantidade de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
)
removida por dosagem de ozônio consumido.................................... 175
Figura IV.6. Remoção do 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
) em
solução aquosa e efluente de ETE pela ozonização........................... 179
Figura IV.7. Estrutura do produto formado da derivatização com BSTFA do
17β-estradiol.......................................................................................
180
Figura IV.8. (A) Espectro de massa (CG/EM) do 17β-estradiol, e (B) o espectro
de massa do Bis-TMS estradiol obtido da biblioteca da NIST.......... 181
Figura IV.9. Representação da atuação do ozônio molecular sobre o anel
fenólico do 17β-estradiol...................................................................
182
Figura IV.10. Espectro de absorbância do 17β-estradiol em metanol (C
17β-estradiol
= 50µg.L
-1
).........................................................................................
187
Figura IV.11. Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas em diferentes valores de pH............................................ 189
Figura IV.12. Redução das absorbâncias a λ = 203 nm nos diferentes valores de
pH em função das dosagens de ozônio consumido........................... 190
Figura IV.13. Microplacas do ensaio YES com a curva padrão do 17β-estradiol
(Fileiras E e G), branco (Fileiras F e H)............................................ 191
Figura IV.14. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no
ensaio YES realizado por WANG et al. (2003)................................. 191
Figura IV.15. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no
ensaio YES. Curva de calibração do estrogênio foi produzida pela
análise de 17β-estradiol na faixa de 54,4 µg.L
-1
a 26,61 ng.L
-1
........
192
xiv
Figura IV.16. Curvas dose-resposta do 17β-estradiol e do extrato de água
destilada no ensaio YES..................................................................... 193
Figura IV.17. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos
extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente
diluídos. Amostras com 10µg.L
-1
de 17β-estradiol e: 1mg.L
-1
de O
3
e pH 3 (fileiras A e C da placa A); 5mg.L
-1
de O
3
e pH 3 (fileiras E
e G da placa A); 1mg.L
-1
de O
3
e pH 7 (fileiras A e C da placa B);
5mg.L
-1
de O
3
e pH 7 (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D,
F, H são os brancos............................................................................ 195
Figura IV.18. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos
extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente
diluídos. Amostras com 10µg.L
-1
de 17β-estradiol e: 10mg.L
-1
de
O
3
e pH 7 (fileiras A e C da placa A); curva padrão do 17β-
estradiol (fileiras E e G da placa A); 10 mg.L
-1
de O
3
e pH 3
(fileiras A e C da placa B); Amostras com 50µg.L
-1
de 17β-
estradiol 10 mg.L
-1
de O
3
e pH 11 (fileiras E e G da placa B); As
fileiras B, D, F, H são os brancos....................................................... 195
Figura IV.19. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos
extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente
diluídas. Amostras com 50µg.L
-1
de 17β-estradiol e: 5 mg.L
-1
de
O
3
e pH 7 (fileiras A e C da placa A). Amostras com 10µg.L
-1
de
17β-estradiol e: 10 mg.L
-1
de O
3
e pH 11 (fileiras E e G da placa
A); Amostras com 50µg.L
-1
de 17β-estradiol e: 1 mg.L
-1
de O
3
e
pH 7 (fileiras A e C da placa B); curva padrão do 17β-estradiol
(fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos..... 195
Figura IV.20. Curva dose-resposta dos extratos das amostras aquosas de
10µg.L
-1
de 17β-estradiol ozonizadas em diferentes valores de pH..
197
Figura IV.21. Comparação das curvas dose- respostas do 17β-estradiol e dos
extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas..............
198
Figura IV.22. (A) Curva dose-resposta dos extratos das amostras ozonizadas de
50µg.L
-1
de 17β-estradiol e pH 7 e (B) comparação das curvas
dose- respostas do 17β-estradiol e dos extratos das amostras
aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.................................................
199
Figura IV.23. EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosa de 17β-estradiol
ozonizadas com 10 µg.L
-1
e 50 µg.L
-1
...............................................
200
Figura IV.24. EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas.......................................................................................... 201
Figura IV.25. Quantidade de 17β-estradiol presente nas amostras aquosas
ozonizadas em água ultrapura apirogênica......................................... 202
Figura IV.26. Remoção do EQ-E
2
dos extratos das amostras ozonizadas............. 204
Figura IV.27. Curva dose-resposta do 17β-estradiol, 2-hidroxiestradiol e
testosterona......................................................................................... 207
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
A
corrigida
Absorbância Corrigida
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
ACSH American Council on Science and Health
ADO Androsta 4,16–dien–3–ona
AP Surfactantes Alquilfenóis
APEO Etoxilados dos Alquilfenóis
ARCEM Austrian Research Cooperation on Endocrine Modulators
B Bases não-Protonadas
B
-
Ácidos deprotonados
BBP Butilbenzil Ftalato
BDE 47 2,2’,4,4’-tetrabromodifenil éter
BDE 99 2,2’,4,4’,5-pentabromodifenil éter
BDE 100 2,2’,4,4’,6-pentabromodifenil éter
BDE 153 2,2’,4,4’,5,5’-hexabromodifenil éter
BDE 154 2,2’,4,4’,5,6’-hexabromodifenil éter
BDE octa Octabromodifenil éter
BDE 209 Decabromodifenil éter
BFR Retardadores de Chama Bromados
Br
-
Brometo
BSTFA N,O-bistrimetilsililtrifluoroacetamida
C
17β-estradiol
Concentração de 17β-estradiol
C
17β-estradiol
inicial Concentração inicial de 17β-estradiol
CAG Carvão Ativado Granular
CAP Carvão Ativado Em Pó
CBF Bifenilos
CBZ Carbamazepina
CDD Dioxinas Cloradas
CDF Benzofuranos
CENO Concentração de efeito não observado
CEO Concentração de efeito observado
CG Cromatografia Gasosa
CLAE Cromatografia Líquida
CLAE/EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de
massas
CLAE/EM/EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a dois
espectrômetros de massas em série
CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
CG-EM/EM Cromatografia gasosa acoplada a dois espectrômetros de massas em série
CL
2
Cloro
CLO
2
Dióxido de Cloro
COD Carbono Orgânico Dissolvido
COMPREHEND Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and
Environmental Hormones
COT Carbono Orgânico Total
CPRG Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosida
CSTEE Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment
DBO
5
Demanda Bioquímica de Oxigênio
xvi
DBP Di-n-Butil Ftalato
DCHP Diciclohexilo ftalato
DDT 2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-tricloroetano
DDE 2,2 bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno
DE Desregulador Endócrino
DEO 10∈ - 17 β-dihidroxi–1,4–estradieno–3–ona
DEHP Di-2-(etil-exil) ftalato
DEP Dietil ftalato
DES Dietilestilbestrol
DIC Ionização em chama
DIBP Di-iso-butil ftalato
DIDP Di-iso-decil ftalato
DINP Di-iso-nonil ftalato
DIOP Di-isooctil ftalato
DLH Domínio de ligação hormonal
DMP Dimetil ftalato
DQO Demanda Química de oxigênio
DOP Di-n-octil ftalato
E
1
Estrona
E
2
17β-estradiol
EC
50
Concentração que elucida uma atividade igual a 50% do controle positivo
17β-estradiol
ECH 1 etinil-1-ciclohexanol
EDCs Endocrine Disrupting Chemicals
EDTA Endocrine Disrupters Testing and Assessment Task Force
EDSP Environmental Disruptor Screening Program
EDSTAC Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee
EE
2
17α-etinilestradiol
EFS Extração por Fase Sólida
ERE Elementos de respostas de estrogênios
ELISA Ensaios de imunoadsorção enzimática
EPA State Environmental Protection Agency
ENV Resina de copolímero poliestireno
EQ-E
2
Equivalentes de estradiol
ER-CALUX Estrogen Receptor – Chemically Activated LUciferase eXpression
ETE Estações de Tratamento de Esgoto
ETIG Estações de Tratamento de Esgoto da Ilha do Governador
HAP Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos
HBCD Hexabromociclododecano
HOBr Ácido hipobromoso
HO
•
Radical Hidroxila
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
I
-
Iodeto
IEH Institute for Enviroment and Health
IPCS International Programme on Chemical Safety
K
ow
Coeficiente de partição octanol-água
K
O3
Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o ozônio
K
OH
Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o radical HO•
K
oc
Coeficiente de sorção
k
tot
Constante da taxa de reação total
xvii
M Composto orgânico
MnO
2
Óxido de manganês
MON Material orgânico natural
M
oxid
Composto orgânico oxidado
MSTFA/TMSI/DTE N-metil-N-(trimetilsilil)- trifluoacetamida / trimetilsililimidazola/
ditioeritrol
MTBFA N-metil-Ntert-butildimetilsilil-trifluoroacetamida
MTBSTFA N-metil-N-(tert- butildimetil trifluoacetamida)
NP Nonilfenol
NF Nanofiltração
NO
2
-
Nitrato
O
2
Oxigênio
O
3
Ozônio
OBr
-
Íons hipobrometo
OCDE Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
OCl
-
Íon hipoclorito
OECD Organisation for Economic Co-operation and Development
OH Hidroxila
OMS Organização Mundial de Saúde
OP Octilfenol
OR Osmose reversa
P Produtos que não catalisam a decomposição do ozônio
PR Potência Relativa estrogênica
PFBBR-TMS Pentafluorbenzil bromado-trimetilsilil
PBB Polibromobifenila
PBDE Difenil-éteres polibromados
PC Policarbonato
PCB Bifenilas policloradas
PCDD Policlorodibenzo-p-dioxinas
PCDF Policlorodibenzofuranos
POA Processos Oxidativos Avançados
POP Poluentes orgânicos persistentes
PVC Poli (cloreto de vinila)
QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship
R
•
Radicais livres que catalisam a decomposição do ozônio
RA Receptor de Andrógeno
RE Receptor de Estrogênio
REh Receptor de Estrogênio Humano
RIE Radioimunoensaio
RP Receptor de progesterona
RYA Recombinant yeast assay
r
O3
Taxa de decomposição do ozônio
SETAC Society of Environmental Toxicology and Chemistry
S
2-
Íons sulfeto
Si Capturador de radical livre
SO
3
2-
Sulfito
T
3
Triiodotironina
T
4
Tiroxina
TBBA Tetrabromobisfenol A
TBT Tributilestanho
xviii
TCDD 2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina
TCDF 2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano
THM Trihalometanos
THN 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftol
TiO
2
Dióxido de Titânio
TPT Trifenilestanho
TS Testosterona
UE União Européia
US EPA United State Environmental Protection Agency
UV Radiação Ultravioleta
VOC Compostos Orgânicos Voláteis
VTG Vitelogenina
WHO World Health Organisation
YES Yeast estrogen-inducible expression system ou recobinant yeast estrogenic
system
xix
I – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
Atualmente, um dos tópicos mais relevantes na química ambiental é a qualidade
da água. A preocupação com micropoluentes – poluentes que estão presentes no meio
ambiente em concentrações da ordem de µg.L
-1
e ng.L
-1
– tem aumentado
expressivamente nos últimos anos. Fármacos, desreguladores endócrinos e poluentes
orgânicos persistentes (POP) são classes de substâncias muito investigadas devido aos
seus efeitos ao meio ambiente. Os riscos podem estar associados com efeitos específicos
dessas substâncias, como por exemplo, os desreguladores endócrinos que são suspeitos
de causarem efeitos adversos no sistema reprodutivo de humanos e animais. Ou, no caso
dos fármacos o efeito mais discutido é o desenvolvimento da resistência bacteriana aos
antibióticos. Os POP são substâncias químicas tóxicas, cuja resistência à biodegradação
favorece a sua permanência por longos períodos de tempo no meio ambiente, sendo
assim, responsáveis por fenômenos como a biomagnificação na cadeia alimentar.
Aparentemente, essas três classes de substâncias parecem ser distintas, porém
avaliando-se mais de perto os seus efeitos e as estruturas dessas substâncias químicas
observa-se que se entrelaçam. Por exemplo, o 17α-etinilestradiol e o DES
(dietilestilbestrol) são substâncias farmacêuticas, porém são classificadas como
desreguladores endócrinos, pois causam efeitos adversos no sistema endócrino.
Conhecidos desreguladores endócrinos fazem parte das classes de pesticidas, PCB e
HAP, contudo, essas substâncias são persistentes no meio ambiente e, por isso, também
são considerados como POP.
Por essa razão, a problemática dos fármacos, dos desreguladores endócrinos e dos
POP muitas vezes é tratada em conjunto. Uma grande preocupação relacionada a essas
classes de substâncias é que podem produzir efeitos tóxicos aos organismos expostos
em concentrações realmente muito baixas.
Em seres humanos e animais a desregulação endócrina é um mecanismo de efeito
relacionado ao funcionamento do sistema endócrino, o qual influência no
desenvolvimento, crescimento, reprodução e comportamento. Os desreguladores
endócrinos podem (EC(2001)):
1
• Danificar diretamente um órgão endócrino;
• Alterar diretamente a função de um órgão endócrino;
• Interagir com um receptor de hormônios;
• Ou alterar o metabolismo de um hormônio em um órgão endócrino (por
exemplo inibindo a esteroidogénesis) ou de forma periférica (por exemplo
um aumento no metabolismo hepático).
Atualmente, este assunto está gerando controvérsias. Há pesquisadores que
acreditam que a exposição aos desreguladores endócrinos pode estar ligada a efeitos
como: anomalias na reprodução de pássaros, peixes e outros animais, redução na
quantidade de esperma e aumento na incidência de alguns tipos de câncer em humanos.
No entanto, um grupo de pesquisadores tem questionado a significância dos dados que
relacionam a exposição aos desreguladores endócrinos, nos níveis encontrados no meio
ambiente, e o aumento da incidência de algumas doenças, argumentando que, tais
efeitos não passam de hipóteses e que não há dados convincentes que sustentem essa
relação.
Contudo, a respeito dos efeitos observados nos animais, vários pesquisadores
concluíram que existem fortes provas obtidas em estudos laboratoriais, que mostram o
potencial de várias substâncias presentes no meio ambiente em causar desregulação
endócrina nos níveis existentes de exposição ambiental.
A origem da hipótese da ação dos desreguladores endócrinos deve-se a
acontecimentos na história, como o aparecimento de câncer no sistema reprodutivo de
filhas de mulheres que usaram DES na gravidez, entre os anos de 1940 a 1970
(BIRKETT E LESTER, 2003); anomalias reprodutivas observadas em jacarés que
habitavam um lago na Flórida contaminado com o pesticida DDT e seu metabólito DDE
(GUILLETTE et al., 1996) e um estudo na Dinamarca que reporta o declínio da
qualidade do sêmen de homens durante os últimos 50 anos (CARLSEN et al., 1992).
Em relação à exposição de humanos e animais aos desreguladores endócrinos, as
maiores preocupações são: 1) se essas substâncias podem produzir efeitos tóxicos em
baixas concentrações; 2) quais substâncias estão associadas aos efeitos tóxicos a baixas
2
concentrações; 3) se essas substâncias estão presentes em concentrações
ambientalmente relevantes que possam ser uma ameaça à saúde de animais e humanos;
4) se existe uma concentração limiar abaixo da qual as substâncias químicas podem ser
consideradas como seguras; 5) se os novos tipos de ensaios, usados para prever os
efeitos causados em organismos expostos, podem realmente fornecer ferramentas para o
entendimento do mecanismo de ação dos desreguladores endócrinos; e 6) se esses
ensaios podem ser facilmente usados em larga escala para monitorar os efeitos no meio
ambiente.
Várias são as substâncias que possuem a capacidade de afetar o sistema endócrino
dos animais expostos, tais como substâncias sintéticas (alquilfenóis, pesticidas, ftalatos,
policlorados de bifenilas (PCD), o bisfenol A, 17α-etinilestradiol, entre outros) e
substâncias naturais (os estrogênios 17β-estradiol e a estrona, e fitoestrogênios).
Os estrogênios, sejam naturais (17β-estradiol, estrona), ou sintéticos (17α-
etinilestradiol), vêm recebendo atenção especial da comunidade científica. Estudos
demonstram que essas substâncias são as maiores responsáveis pela atividade
estrogênica observada nos efluentes de estações de tratamento de esgoto (ETE)
(JOBLING et al., 1998, DESBROW et al., 1998). Sua presença no meio aquático é
atribuída à sua incompleta remoção nos processos de tratamento de esgoto (TERNES et
al., 1999a). Além disso, essas substâncias estrogênicas têm mostrado induzir uma
resposta estrogênica em peixes, em concentrações na água (0,1-1,0 ng.L
-1
) muitas vezes
mais baixas do que as comumente detectadas no meio ambiente (DESBROW et al.,
1998, ROUTLEDGE et al., 1998), enquanto em humanos suas conseqüências ainda
estão sendo investigadas.
Devido à dificuldade de identificação desses micropoluentes, muitos métodos
analíticos foram desenvolvidos para detectar e quantificar essas substâncias em matrizes
ambientais complexas, tais como águas superficiais e subterrâneas, esgoto doméstico,
efluentes de ETE, sedimentos marinhos, solo e lodo biológico. Adicionalmente, a
necessidade de se conhecer os efeitos potenciais dos desreguladores endócrinos tem
conduzido a uma demanda por métodos de ensaios in vitro e in vivo para identificar os
efeitos biológicos de uma grande faixa de substâncias naturais e sintéticas presentes no
meio ambiente.
3
Uma vantagem significativa dos ensaios in vitro e in vivo sobre as análises
químicas é que a atividade biológica das substâncias, com suas naturezas químicas
desconhecidas, são também determinadas nesses ensaios, o que já não ocorre no caso
das análises químicas. Contudo, as análises químicas são importantes para identificar e
quantificar as substâncias químicas. A combinação de ensaios in vitro, e com menos
extensão in vivo, e técnicas de análises químicas, tem sido usada para analisar amostras
ambientais, tanto para confirmar a atividade biológica como para identificar os
compostos responsáveis.
O comportamento desses micropoluentes nas ETE, solo e sedimentos marinhos
tem sido investigado, bem como seu transporte e destino no meio ambiente. O
conhecimento do destino e dos processos de transporte desses poluentes no meio
ambiente é essencial para avaliar seus impactos potenciais no solo e águas naturais.
Vários consórcios têm sido montados em todo o mundo com o objetivo de avaliar
a complexa situação dos desreguladores endócrinos, e são exemplos da crescente
preocupação mundial com essas substâncias. Vários assuntos são abordados e
investigados, tais como: (1) o monitoramento de substâncias estrogênicas em amostras
de águas naturais (ARCEM - Austrian Research Cooperation on Endocrine
Modulators), (2) a validação dos métodos de ensaios que determinam as substâncias
com potencial de desregulação endócrina (EDSTAC - Endocrine Disruptor Screening
and Testing Advisory Committee, EDTA - Endocrine Disrupter Testing and Assessment
Task Force), (3) a identificação e caracterização de todos os efeitos relatados (EDSP –
Environmental Disruptor Screening Program e programa COMPREHEND –
Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and Environmental
Hormones; CSTEE - Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment), (4)
organização do conhecimento científico disponível sobre os desreguladores endócrinos
(SPEED’98/JEA - Exogenous Endocrine Disrupting Chemical Task Force e COM
(1999 e 2001) - Community Strategy for Endocrine Disrupters), entre outros.
A presença de fármacos e desreguladores endócrinos em estações de tratamento
de esgoto e em fontes de água potável demonstra que é necessária uma avaliação dos
processos de tratamento envolvidos com respeito à eficiência de remoção dessas
substâncias. Os processos oxidativos avançados e a ozonização são tecnologias bastante
4
promissoras para a oxidação de fármacos e estrogênios no tratamento de água e esgoto
doméstico (TERNES et al., 2003, HUBER et al., 2003).
No entanto, na ozonização, doses de ozônio economicamente viáveis nem sempre
alcançam a mineralização completa dos micropoluentes, portanto o conhecimento dos
subprodutos formados na oxidação desses compostos, bem como a avaliação dos seus
efeitos são extremamente importantes. O foco principal da eliminação dos
desreguladores endócrinos do meio ambiente deve levar em conta a remoção de sua
atividade biológica.
Os objetivos deste estudo foram estudar a degradação e a remoção da atividade
estrogênica do 17β-estradiol pelo processo de ozonização. Foi investigando a influência
do pH, da dosagem de ozônio e da matriz na remoção do 17β-estradiol e na formação de
seus subprodutos da ozonização, além de avaliar a atividade estrogênica dos
subprodutos formados.
Para investigar a ação dos oxidantes a ozonização foi conduzida em três
valores de pH (3, 7 e 11). Duas matrizes diferentes, água destilada e efluente de ETE,
foram estudadas, que serviu para avaliar se o ozônio pode efetivamente degradar esse
estrogênio presente em uma matriz ambiental complexa. Diferentes dosagens de ozônio
foram aplicadas para avaliar a remoção do 17β-estradiol e seus subprodutos formados.
Estas condições também serviram para investigar a remoção da atividade estrogênica do
17β-estradiol pelo processo de ozonização.
No presente estudo, a quantificação do 17β-estradiol e a identificação dos
subprodutos formados na ozonização por CG e CG/EM foi combinado com a
determinação da atividade estrogênica pelo ensaio in vitro YES.
5
II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
II.1. DESREGULADORES ENDÓCRINOS
As substâncias denominadas desreguladores endócrinos são uma recente categoria
de contaminantes ambientais que interferem nas funções do sistema endócrino. Essas
substâncias são encontradas no meio ambiente em concentrações da ordem de µg.L
-1
e
ng.L
-1
, e são suspeitas de causarem efeitos negativos à saúde humana e animal.
Os desreguladores endócrinos podem interferir com o funcionamento do sistema
endócrino pelo menos de três formas: (1) mimetizam a ação de um hormônio endógeno,
como o estrogênio ou a testosterona, afetando as funções que esses hormônios
controlam; (2) bloqueiam os receptores hormonais nas células, impedindo assim a ação
dos hormônios naturais; (3) afetam a síntese, o transporte, o metabolismo e a excreção
dos hormônios, alterando dessa forma as concentrações dos hormônios naturais no
corpo. Alterações nas funções do sistema endócrino podem prejudicar a saúde do
organismo, da sua descendência ou de uma (sub) população.
Efeitos tais como diminuição na eclosão de ovos de pássaros, peixes e tartarugas;
feminização de peixes machos; deformidade em peixes; problemas no sistema
reprodutivo em répteis, pássaros e mamíferos; e alteração no sistema imunológico de
mamíferos marinhos têm sido associados à exposição de espécies de animais aos
desreguladores endócrinos. Em alguns casos esses efeitos podem conduzir ao declínio
da população. Em seres humanos esses efeitos incluem a redução da quantidade de
esperma, o aumento da incidência de câncer de mama, de testículo e próstata, e a
endometriose.
Algumas vezes, os desreguladores endócrinos são chamados de estrogênios
ambientais ou xenoestrogênios, que não necessariamente apresentam uma estrutura
similar aos estrogênios naturais. Podem abranger uma grande faixa de classe de
substâncias com estruturas distintas, incluindo hormônios sintéticos e naturais,
substâncias naturais e uma grande quantidade de substâncias sintéticas.
6
II.1.1 Definição - O que é um Desregulador Endócrino?
Algumas definições são propostas para essas substâncias, denominadas em inglês
“Endocrine Disrupting Chemicals” (EDCs). Alguns autores entendem que são
considerados “endocrine disrupting chemicals” somente as substâncias que interagem
com sítios receptores de hormônios, enquanto outros entendem como qualquer
substância que cause um desequilíbrio, interferência ou alteração no sistema endócrino,
independentemente se atua diretamente no sítio receptor ou não.
De acordo com a Environmental Protection Agency (U.S. EPA, 1997), um
desregulador endócrino é definido como um “agente exógeno que interfere com a
síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no
corpo que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e ou
comportamento dos organismos”.
O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS) em conjunto com o
Japão, os EUA, o Canadá, a OECD e a União Européia, adotaram as seguintes
definições: “Um desregulador endócrino é uma substância ou um composto exógeno
que altera uma ou várias funções do sistema endócrino e tem, conseqüentemente,
efeitos adversos sobre a saúde num organismo intacto, sua descendência, ou (sub)
populações” (COM(1999)706).
A tradução do termo “endocrine disrupting chemicals” também não é simples,
sendo que existem cinco possíveis traduções: perturbadores endócrinos, interferentes
endócrinos, desreguladores endócrinos, disruptores endócrinos e interferentes
hormonais. Os termos mais usados são perturbadores endócrinos e desreguladores
endócrinos.
Mesmos os termos em inglês geram dúvidas em relação aos seus efeitos, a
existência de vários termos confirmam isso. Na literatura podem ser encontrados
“endocrine disrupting”, “endocrine modulator”, “environmental estrogen”, sendo o
primeiro termo o mais usado. Segundo o ACSH (1999), o termo “endocrine disrupting”
sugestiona que os efeitos de tais substâncias são negativos, mas é também concebível
que a exposição a essas substâncias hormonalmente ativas pode conduzir a resultados
benéficos. Segundo o ACHS, as substâncias “endocrine modulator” focam nas
substâncias químicas industriais, tais como, policlorados de bifenilas e pesticidas.
7
Existem ainda outras definições para as substâncias estrogênicas presentes no
meio ambiente. Freqüentemente, são referidos como estrogênios ambientais, estrogênios
exógenos ou exoestrogênios. Exoestrogênios são diversos grupos de substâncias que
não necessariamente apresentam alguma semelhança com a estrutura química do 17β-
estradiol, mas causa respostas antagônicas e agônicas possivelmente através de
mecanismos de ação via receptores hormonais. Entende-se por atividade agonista a
capacidade de uma substância acoplar-se ao receptor de hormônios esteróides e elucidar
uma resposta. Em contrapartida, a atividade antagonista é a habilidade de uma
substância acoplar-se ao receptor de esteróide e bloquear a ação do ligante natural
(esteróide) e assim sua resposta não será elucidada. Assim, essas substâncias podem ser
identificadas por sua capacidade de ligar-se ao receptor de estrogênios (RE) e induzir ou
atenuar uma resposta hormonal (ZACHAREWSKI, 1997).
Os estrogênios endógenos são os estrogênios produzidos naturalmente pelo corpo
humano, como por exemplo, o 17β-estradiol e a estrona. Substâncias sintéticas com
atividade estrogênica também são denominadas de xenoestrogênios (estrogênios
estranhos) por alguns autores (DESBROW et al., 1998, NOGUEIRA, 2003, SAFE,
2004, SOTO et al., 1995). Os termos estrogênios ambientais ou eco-estrogênios também
geram controvérsias no meio científico, pois omitem a possibilidade de substâncias que
não sejam estrogênicas, como por exemplo, andrógenos (hormônios masculinos), anti –
andrógenos e anti- estrogênicas, poderem afetar o sistema endócrino. Outros autores
usam o termo substância estrogênica para quaisquer substâncias que interagem com
receptores de hormônios esteróides, sendo ele receptor de estrogênio ou não.
Outras definições também geram confusões, que alguns autores tentam esclarecer
(GRAY et al., 1997). Substância estrogênica refere-se à substância cujo efeito se dá
através do receptor de estrogênio, iniciando uma cascata de efeitos específicos no
tecido/célula similar aos iniciados pelo 17β-estradiol. O termo anti-andrógeno e anti-
estrogênico não são especificamente limitados às interações através RA e RE
respectivamente. Anti-hormônios podem atuar via: 1) receptor de hormônios esteróides,
2) inibição da síntese dos hormônios esteróides, 3) diminuição da biodisponibilidade
pela redução da quantidade de hormônios livres no sangue, 4) aumento do metabolismo
dos hormônios que conduz a uma redução dos níveis de hormônios no sangue, entre
outros mecanismos (GRAY et al., 1997).
8
Os chamados “endocrine disrupting chemicals” originalmente foram relacionados
com substâncias que mimetizam a ação dos estrogênios naturais. Porém, com a
descoberta de outros mecanismos de ação, gerou-se uma confusão na nomenclatura.
Com isso, o que se percebe é que a comunidade científica ainda não entrou em consenso
sobre qual a nomenclatura correta que deve ser empregada para essa classe de
substâncias, no que se referem a todos os seus efeitos causados.
Neste trabalho, será usado o termo “Desregulador Endócrino (DE)”, sendo esta a
nomenclatura usada pela União Européia nos textos em português.
II.1.2. Histórico e Estado Atual do Conhecimento
A hipótese de que substâncias químicas presentes no meio ambiente podem causar
uma resposta biológica aos organismos expostos não é nova. Os efeitos causados ao
sistema endócrino de animais de laboratório por substâncias estrogênicas foram
primeiramente evidenciados nos anos 1900 por alguns pesquisadores (ALLEN e
DOISY, 1923 e DODDS et al., 1938). Porém, recentemente este assunto emergiu com
um maior interesse na comunidade científica, devido ao aumento da detecção de
anomalias na saúde humana e de animais, que podem estar relacionadas à ação dos
desreguladores endócrinos.
O caso mais famoso sobre os desreguladores endócrinos é o DDT e seus
subprodutos, um pesticida muito utilizado em todo mundo durante as décadas de 1950 e
1960, e que ainda hoje é usado em alguns países. Estudos mostram que o DDT é
persistente no meio ambiente, apresenta atividade estrogênica e pode afetar o sistema
reprodutor de mamíferos e pássaros (US. EPA 1997). Exemplo disso são as anomalias
detectadas no sistema reprodutivo de jacarés em vários lagos da Flórida contaminados
com DDT (GUILLETTE et al., 1996). Segundo SAFE (2000), em 1962, Rachel Carson
publicou “Silent Spring” que foi um dos primeiros relatos sobre a ligação da presença
do pesticida DDT no meio ambiente e o declínio na população de algumas espécies de
animais.
Uma fase bastante crítica à exposição de desreguladores endócrinos é o
desenvolvimento fetal, o exemplo mais claro dos efeitos causados no feto foi o uso do
9
potente estrogênio sintético DES em mulheres grávidas entre os anos de 1948 a 1970.
Este fármaco era prescrito por médicos para evitar abortos e promover o crescimento
fetal. Mais tarde descobriu-se que as crianças nascidas de mulheres que fizeram uso de
DES, quando atingiam a puberdade apresentaram disfunção no sistema reprodutivo,
gravidez anormal, redução na fertilidade, desordem no sistema imunológico e muitas
desenvolveram câncer vaginal (BIRKETT e LESTER, 2003, COLBORN, et al., 1993).
Recentes estudos sugerem que substâncias estrogênicas, como o DES, podem apresentar
efeitos duradouros no sistema reprodutor em humanos expostos in utero (US. EPA
1997). Os efeitos relatados a curto, médio e longo prazo do DES têm servido como
exemplo e de padrão comparativo para os efeitos da exposição de seres humanos aos
desreguladores endócrinos. É o primeiro exemplo documentado de uma substância
química que, quando administrada à mãe, pode causar câncer na filha.
Em 1993, COLBORN et al. (1993) publicou uma revisão sobre anomalias em
pássaros e peixes associadas à exposição de subprodutos industriais (dioxinas e bifenilas
policloradas) e pesticidas (DDT) em áreas, tais como, os Grandes Lagos na América do
Norte. Também relatou que a exposição humana ao DES ocorrida no passado serve
como um modelo para a exposição a substâncias estrogênicas durante o estágio
prematuro da vida, incluindo contaminantes no meio ambiente que são estrogênios
agonistas.
Em 1996, Colborn e colaboradores publicaram o livro “Our Stolen” que também
relatou a possibilidade de efeitos no sistema endócrino de humanos e animais serem
causados por algumas substâncias presentes no meio ambiente. Este livro faz um
levantamento detalhado de problemas ambientais causados por substâncias químicas,
que mesmo em baixas concentrações, podem causar efeitos adversos ao sistema
reprodutivo de animais.
Vários estudos têm demonstrado que efluentes de ETE apresentam substâncias
químicas classificadas como desreguladores endócrinos. Feminização de peixes machos,
entre outras alterações no sistema reprodutivo de animais que habitam ambientes
aquáticos que recebem descarte de efluentes de ETE, têm sido associados à presença de
substâncias estrogênicas nesses efluentes, tais como, estrogênios naturais e sintéticos.
Esses estrogênios são excretados diariamente pela população humana (GAGNÉ et al.,
2001, RODGER-GRAY et al., 2001).
10
No Brasil, recentemente foram relatados alguns efeitos relacionados à exposição
de desreguladores endócrinos no meio ambiente. FERNANDEZ et al. (2002) relataram
a exposição de organismos marinhos a compostos orgânicos contendo estanho, o
tributilestanho (TBT) e o trifenilestanho (TPT), no litoral do Brasil (Rio de Janeiro,
Fortaleza) e o desenvolvimento de caracteres sexuais masculinos em fêmeas de
moluscos, fenômeno conhecido como imposex. O estudo de KOIFMAN et al., 2002
apresenta os resultados de um estudo epidemiológico, que relaciona a exposição a
pesticidas durante os anos 80 e distúrbios reprodutivos observados nos anos 90 em
estados brasileiros. TORRES et al., 2002 investigaram a concentração e destino de
pesticidas, PCB e HAP na bacia hidrográfica Paraíba do Sul/Guandu, importantes
reservatórios de água usados no abastecimento da população. Os resultados indicaram
que contaminantes industriais, principalmente os HAP, foram encontrados na água e
sedimentos marinhos.
II.1.3. Estratégias Internacionais para Avaliar o Problema dos DE
Nas últimas duas décadas, houve um aumento da preocupação na comunidade
científica, debate público, e atenção da mídia em relação aos possíveis efeitos danosos
causados nos humanos e animais pela exposição a substâncias químicas, presentes no
meio ambiente que têm o potencial de interferir com o sistema endócrino.
Para esclarecer, desenvolver estratégias e solucionar o problema dos
desreguladores endócrinos, várias organizações governamentais e não governamentais,
tais como, União Européia (UE), Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
(EPA), Organização Mundial de Saúde (OMS), Programa Internacional de Segurança
Química (IPCS) e a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
(OCDE) investigam a questão dos desreguladores endócrinos. Assim, e alguns relatórios
estão disponíveis, tais como, o monitoramento e avaliação de metodologias de ensaios
disponíveis para detectar os DE; estudos de efeitos ao meio ambiente; identificação das
substâncias com potencial estrogênico, entre outros. Alguns estudos são apresentados na
Tabela II.1.
11
II.1.4. Substâncias Classificadas como Desreguladores Endócrinos
Com base em informações disponíveis na literatura foram elaboradas, por várias
organizações mundiais, listas de substâncias químicas suspeitas de causar desregulação
do sistema endócrino (COM(1999)706, COM(2001) 262, BIRKETT e LESTER, 2003,
PETROVÍC et al., 2001). Contudo, mais dados científicos são necessários para realizar
uma investigação mais profunda a fim de identificar os critérios de seleção utilizados
para agrupar as substâncias nestas listas. Para tal, a União Européia lançou um estudo
que é o primeiro passo para o estabelecimento de uma lista de substâncias para a futura
avaliação do seu papel na desregulação endócrina.
Uma ação a curto prazo da Comissão Estratégica Comunitária em Matéria os
Desreguladores Endócrinos estabelecida pela Comissão das Comunidades Européias foi
o estabelecimento de uma lista prioritária de substâncias para uma futura avaliação do
seu papel na desregulação endócrina. Assim, em 2000 foi proposta uma lista com 553
substâncias sintéticas e 9 hormônios naturais e sintéticos (COM(2001) 262). Dessas 553
substâncias, existem evidências de perturbação endócrina ou potencial de perturbação
endócrina para 118 substâncias. Para as outras 435 substâncias dados insuficientes
foram apresentados nesse relatório. Baseados nisso, dois novos estudos foram iniciados,
no primeiro avaliaram 9 substâncias sintéticas e de 3 estrogênios das 118 substâncias,
apresentadas no relatório de 2000, que não tinham seus usos restringidos pela UE
(WRc-NSF, 2002). O segundo estudo abrange as 435 substâncias para as quais os dados
foram insuficientes no relatório de 2000. Esta lista foi dividida em três grupos separados
de substâncias que dependem do volume de produção, da persistência no ambiente, das
provas de desregulação endócrina encontradas em bibliografias científicas e nas
considerações relativas à exposição (Anexo 1 de SEC (2004) 1372). Fora da lista de 435
substâncias, outras 147 substâncias foram avaliadas, desse último grupo de substâncias,
129 substâncias eram restringidas pela UE por motivos distintos da perturbação
endócrina.
As substâncias classificadas como DE, incluindo substâncias naturais e sintéticas,
usadas ou produzidas para uma infinidade de finalidades, podem ser agrupadas em
quatro classes:
13
1. Substâncias sintéticas utilizadas na agricultura e seus subprodutos, como
pesticidas, herbicidas, fungicidas e moluscicidas;
2. Substâncias sintéticas utilizadas nas indústrias e seus subprodutos, dioxinas,
PCB, alquilfenóis e seus subprodutos, HAP, ftalatos, bisfenol A, entre outros;
3. Substâncias naturais, como fitoestrogênios, tais como, genisteína e
metaresinol e os estrogênios naturais 17β-estradiol, estrona e estriol;
4. Compostos farmacêuticos, como o DES e o 17α-etinilestradiol.
Resíduos de vários pesticidas vêm sendo encontrados em alimentos, água potável
e em corpos hídricos. Os pesticidas foram largamente utilizados no mundo por vários
anos, sendo o maior grupo de substâncias classificadas como desreguladores
endócrinos. Na classe dos pesticidas, estão inclusos os inseticidas, herbicidas e
fungicidas, que são utilizados na agricultura, na aqüicultura e no uso domiciliar.
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) são substâncias que
apresentam potencial de bioacumulação e atividade estrogênica (SANTODONATO,
1997). E podem ser encontrados na indústria petroquímica e na queima de gasolina e
óleo diesel.
Alguns subprodutos de processos de combustão são suspeitos de serem
desreguladores endócrinos, como os PCDD (policlorodibenzo-p-dioxinas) e PCDF
(policlorodibenzofuranos), conhecidos como dioxinas. Esses organoclorados podem ser
produzidos durante a incineração de hidrocarbonetos clorados e do papel, na produção
de PVC e na produção de compostos aromáticos clorados, como o 2,4,5-triclorofenol.
Pesquisas demonstram que essas substâncias persistem e bioacumulam no meio
ambiente (LOUIE e SIN, 2003). Já foram identificadas 75 moléculas diferentes na
família das dioxinas cloradas (CDD), 135 na dos benzofuranos (CDF) e 209 na dos
bifenilos (CBF) (REYS, 2001).
Outros organoclorados, como as bifenilas policloradas (PCB) também apresentam
atividade estrogênica. No passado, eram utilizados em várias aplicações, como fluidos
de transferência de calor em transformadores e como fluidos dielétricos em capacitores.
14
Ainda que não estejam mais sendo usados, eles estão presentes em algumas instalações
antigas (BIRKETT e LESTER, 2003).
Desreguladores endócrinos também são encontrados na indústria química, como
detergentes, resinas, alguns aditivos e monômeros utilizados na produção de plásticos.
Os ftalatos são usados como aditivos (plastificantes) em alguns plásticos,
principalmente na produção de PVC. Podem ser encontrados ainda em brinquedos
infantis, embalagens de produtos alimentícios e equipamentos médicos. Devido a sua
persistência no meio ambiente, os ftalatos, tais como, butilbenzil ftalato (BBP), di-n-
butil ftalato (DBP), e di-2-(etil-exil) ftalato (DEHP), são comumente encontrados em
águas superficiais e de subsolo (HUTCHINS e WARD, 1984, FROMME et al., 2002).
Os surfactantes alquilfenóis (AP) e seus etoxilados (APEO), particularmente o
nonilfenol (NP), apresentam uma variedade de aplicações, incluindo detergentes
industriais e domésticos, lubrificantes, emulsificantes e em formulações de pesticidas,
de tintas e de produtos de uso pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos de cabelo
e produtos de banho) (BIRKETT e LESTER, 2003). Assim, as possíveis rotas de
entrada dessas substâncias no meio ambiente são durante sua produção, uso e
disposição. Nas ETE, os alquilfenóis polietoxilatos são inicialmente biodegradados,
derivando em metabólitos persistentes e altamente lipofílicos, incluindo alquilfenóis
etoxilatos, e finalmente nos alquilfenóis, tais como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP)
(ROUTLEDGE e SUMPTER, 1996). Estes metabólitos são largamente detectados nos
efluentes de ETE e águas superficiais (SOLÉ et al., 2000 e KUCH e BALLSCHMITER,
2001), sendo também relatado os efeitos causados em organismos expostos a essas
substâncias estrogênicas (JOBLING e SUMPTER, 1993).
O bisfenol A é extensamente usado na produção de plásticos, em particular os
policarbonatos e resinas epóxi (BILES et al., 1997, FÜRHACKER et al., 2000). Pode
ainda ser encontrado em adesivos, papéis para fax, tubulações, painéis de carros e
produtos eletrônicos, também estão presentes em revestimentos de latas de conservas e
frascos de alimentos para bebês; pode ser liberado destes causando graves problemas
para a saúde humana. Alguns polímeros usados no tratamento dentário também contêm
bisfenol A. A exposição humana a esse composto é considerável (BILES et al., 1997,
FROMME et al., 2002) e sua atividade estrogênica tem sido muito relatada
(BERESFORD et al., 2000, DE BOEVER et al., 2001, GAIDO et al., 1997).
15
Os retardadores de chama bromados (BFR), os chamados Difenil-éteres
polibromados (PBDE), são um grupo de substâncias químicas adicionadas em alguns
produtos, como computadores, TV e tecidos domésticos para atrasar a combustão.
Como por exemplo, o polibromobifenila (PBB), tetrabromobisfenol A (TBBA) e
hexabromociclododecano (HBCD). Essas substâncias são persistentes, lipofílicas e
bioacumulativas (BIRKETT e LESTER, 2003).
Os parabenos são ésteres de alquil de ácido para-hidrobenzóico, são compostos
utilizados como conservantes em cosméticos e em algumas pastas usadas por dentistas.
Vários compostos deste grupo mimetizam hormônios endógenos, apresentando assim
atividade estrogênica (REYS, 2001).
Uma variedade de hormônios naturais é encontrada em plantas e são chamados de
fitoestrogênios. Uma grande quantidade dessas substâncias é absorvida através da dieta
alimentar. Alimentos como grãos integrais, ervilhas, feijão, alguns vegetais e frutas
contêm fitoestrogênios. A soja e alimentos baseados em soja, como tofu, são alguns dos
alimentos que possuem essas substâncias. Os fitoestrogênios mais estudados são da
classe dos lignanos e das isoflavonas. Algumas dessas substâncias podem atuar sobre
hormônios naturais em animais. Os fitoestrogênios são compostos naturais mais fracos
do que os estrogênios endógenos, estudos indicam que essas substâncias podem se
acoplar aos RE e podem funcionar como agonistas ou antagonistas no sistema
endócrinos (BIRKETT e LESTER, 2003).
Pesquisadores têm chegado a conclusões dúbias quanto aos benefícios e/ou
toxicidade desses fitoestrogênios e quanto aos seus efeitos hormonais. Segundo a
comissão das comunidades européias (COM (1999)706), os fitoestrogênios apresentam
alguns efeitos benéficos comprovados para a saúde humana, tais como, na prevenção
das doenças cardiovasculares, da osteoporose e de algumas formas de câncer. Acredita-
se que o corpo humano consiga decompor facilmente e excretar rapidamente essas
substâncias, significando que elas passam pouquíssimo tempo no organismo e não se
acumulam gradualmente nos tecidos, como acontece com algumas substâncias
artificiais. Todavia, podem existir alguns riscos associados às alterações de estilo de
vida e à mudança dos hábitos alimentares e de consumo, que levem a um maior
consumo de alimentos que contenham estas substâncias.
16
Estrogênios naturais também pertencem à classe dos desreguladores endócrinos.
Pesquisas demonstram a presença da estrona, 17β-estradiol como fonte de atividade
estrogênica em muitos efluentes (SOLÉ et al., 2003). Estrogênios naturais são
encontrados em efluentes de ETE e águas superficiais em várias partes do mundo
(TERNES et al., 1999a, BELFROID et al., 1999, LOPÉZ e BARCELO, 2001). Esses
estrogênios são naturalmente e diariamente excretados na urina humana e assim
descartados no esgoto doméstico.
Alguns agentes terapêuticos e farmacêuticos também estão na lista das substâncias
classificadas como desreguladores endócrinos. São hormônios sintéticos usados como
contraceptivos orais, na reposição terapêutica na menopausa ou na prevenção do aborto,
tais como, DES e o 17α-etinilestradiol. A maior aplicação médica do 17α-etinilestradiol
tem sido no desenvolvimento de pílulas contraceptivas, os contraceptivos contém de 30
a 50 µg de 17α-etinilestradiol por pílula (BEAUSSE, 2004). O DES foi muito usado nos
anos 1970 na prevenção do aborto (BIRKETT e LESTER, 2003).
Os compostos orgânicos contendo estanho são substâncias sintéticas que também
causam efeitos no sistema endócrino de animais. Esses compostos apresentam uma
infinidade de aplicações, sendo seu maior uso em tintas usadas no casco de embarcações
para protegê-las da ação de organismos incrustantes (antiincrustantes), além de também
serem usados como estabilizantes em plásticos e pesticidas (LINTELMAN et al., 2003).
Podem ser detectados em águas naturais e sedimentos marinhos, impondo um grande
risco aos organismos aquáticos. Estudos demonstraram o desenvolvimento de anomalias
no sistema reprodutivo relacionado à exposição de animais a essas substâncias
(FERNANDEZ et al., 2002, UBA, 1996).
Algumas dessas substâncias tiveram seus usos proibidos ou não são mais
produzidas, porém ainda podem ser encontradas no meio ambiente. A Tabela II. 2
apresenta algumas substâncias conhecidas ou suspeitas de serem desreguladores
endócrinos.
Para identificar se uma determinada substância possui o potencial de causar algum
efeito aos organismos, testes in vitro (cultura de células) e in vivo (animais de
laboratórios) são usados.
17
Tabela II.2. Substâncias químicas classificadas como DE.
Ftalatos Pesticidas
Dimetil ftalato (DMP)
dietil ftalato (DEP)
di-iso-butil ftalato (DIBP)
di-n-butil ftalato (DBP)
butilbenzil ftalato (BBP)
diciclohexilo ftalato (DCHP)
di-(2-etil-exil) ftalato (DEHP)
di-n-octil ftalato (DOP)
di-isooctil ftalato (DIOP)
di-iso-nonil ftalato (DINP)
di-iso-decil ftalato (DIDP)
Inseticidas:
DDT (2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-
tricloroetano)
DDE (2,2 bis-p-clorofenil-1,1-
dicloroetileno
Deltametrin
Carbofurano
Herbicidas:
Atrazina
Linuron
Fungicidas:
Vinclozolina
Carbendazime
Penconazol
Procloraz
Propiconazol
Epoxiconazol
Procimidona
Tridemorfos
Alquilfenóis
Pesticidas organoclorados:
Lindane (1,2,3,4,5,6-hexaclorohexano)
Compostos orgânicos de estanho
Nonilfenol
Nonilfenol etoxilado
Octilfenol
Octilfenoletoxilado
Tributilestanho (TBT) e trifenilestanho
(TPT)
Organoclorados Policlorados de bifenilas
Dibenzo-p-dioxina 2,4,4’-triclorobifenil
TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-
dioxina)
2,2’,5,5’-tetraclorobifenil
TCDF (2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano) 2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenil
Bisfenol
2,3’,4,4’,5-pentaclorobifenil
Bisfenol A 2,2’,3,4,4’,5’-hexaclorobifenil
Parabenos
2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenil
Benzilparabeno 2,2’,3,4,4’,5,5’-heptaclorobifenil
Isobutilparabeno
Retardante de chama bromado
Butilparabeno Polibromobifenila (PBB)
n-propilparabeno
2,2’,4,4’-tetrabromodifenil éter (BDE 47)
etilparabeno
2,2’,4,4’,5-pentabromodifenil éter (BDE 99)
metilparabeno
2,2’,4,4’,6-pentabromodifenil éter (BDE 100)
Hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos
2,2’,4,4’,5,5’-hexabromodifenil éter (BDE 153)
2,2’,4,4’,5,6’-hexabromodifenil éter (BDE 154)
Naftalina Benzo[a]antraceno
2,2’,3,4,4’,5’,6-heptabromodifenil éter
Acenaftileno Criseno Octabromodifenil éter (BDE octa)
Acenafteno Benzo[b]fluoranteno Decabromodifenil éter (BDE 209)
Fluoreno Benzo[k]fluoranteno Hexabromociclododecano (HBCD)
Fenantreno Benzo[a]pireno Tetrabromobisfenol A (TBBA)
Antraceno Indeno[123-cd]pireno
Fitoestrogênios
Fluoranteno Dibenzo[ah]antraceno Isoflavona: daidzeína e genisteína.
Pireno Benzo[ghi]perileno Liganas: metaresinol, enterodiol,
enterolactona
Agentes terapêuticos e farmacêuticos Estrogênios naturais
Dietilestilbestrol (DES)
17α-etinilestradiol (EE
2
)
Estrona (E
1
)
17β-estradiol (E
2
)
18
II.1.5. Meios de Exposição aos Desreguladores Endócrinos
Toneladas de substâncias sintéticas e naturais são lançadas anualmente no meio
ambiente, das quais, um número considerável é de desreguladores endócrinos. Além de
serem associados a vários efeitos, alguns são também persistentes, lipofílicos,
bioacumulativos e têm baixa pressão de vapor, o que facilita a dispersão e difusão no
meio ambiente.
A exposição aos desreguladores endócrinos pode ocorrer sob diversas formas,
como através do contato direto no local de trabalho ou em casa, ou indireto através da
ingestão de água, ar ou alimentos contaminados e ao contato com o solo.
Uma das maiores exposições da população aos desreguladores endócrinos é
através da ingestão de alimentos contaminados. No caso dos seres humanos estima-se
que mais de 90% dos tóxicos ambientais são absorvidos por via digestiva, através de
alimentos contaminados (REYS, 2001).
Alguns desreguladores endócrinos são solúveis em gordura, assim, altos níveis
podem estar presentes na carne, peixe, ovos e derivados do leite. HARTMANN et al.
(1998) relataram à ocorrência de hormônios sexuais (17β-estradiol, estrona, testosterona
e progesterona) em carnes (gado, porco, aves, peixe), leite e seus derivados, ovos e
plantas (gramíneas, leguminosas). A contaminação de alimentos também pode vir do
fato de que alguns hormônios são aplicados na criação de animais e que são usados na
alimentação humana. Contudo, em alguns países essa prática foram proibidas.
A exposição pode também vir de pesticidas residuais que contaminam frutas,
vegetais e em baixas concentrações a água potável. Junto com alguns pesticidas também
podem estar presentes o nonilfenol e seus etoxilados usados na formulação de alguns
pesticidas. Outras fontes de exposição direta dos alquilfenóis são através do uso de
produtos pessoais como, maquiagem, cremes de pele, produtos de cabelo e produtos de
banho (BIRKETT e LESTER, 2003).
O bisfenol A é usado em revestimento de algumas latas de alimentos, e os ftalatos
são encontrados em outras embalagens de comida e em brinquedos infantis
(WILKINSON e LAMB, 1999). Estudos demonstram que resíduos de bisfenol A
residual podem ser encontrados em alguns alimentos humanos devido a sua migração
19
das embalagens (BILES et al., 1997, KUO e DING, 2004). Por ter uso doméstico e
industrial, o bisfenol A também pode ser encontrado no esgoto, efluente e lodo
biológico de ETE (FÜRHACKER et al., 2000). Ambos, Bisfenol A e ftalatos, podem
ser lançados no meio ambiente durante o processo de produção e pela lixiviação dos
produtos finais.
A variedade de produtos de PVC com aditivos tóxicos, os chamados ftalatos,
presente nas residências podem expor diariamente as famílias a múltiplas fontes de
contaminação. Estudos científicos sobre a exposição humana aos componentes tóxicos
começam a serem apresentados em todo o mundo, alguns investigam a hipótese de que
alguns plásticos como o PVC pode afetar a saúde se colocado na boca por crianças
muito pequenas (EARLS, et al., 2003). Entretanto, para outros autores os riscos tóxicos
associados com a exposição oral de alguns ftalatos em produtos de crianças não foram
confirmados (BABICH et al., 2004). De qualquer forma, organizações de alguns países
determinaram a remoção de ftalatos presentes em produtos para crianças (BABICH et
al., 2004).
Recentemente, ftalatos, HAP, PCD, alquilfenóis e seus metabólitos, pesticidas e
retardadores de queima bromados foram encontrados no ar e poeira de residências
(RUDEL et al., 2003).
Os desreguladores endócrinos também podem ser encontrados nas cinzas dos
produtos incinerados, no lodo biológico de estações de tratamento de efluentes e em
chorumes de aterros sanitários. Uma quantidade considerável de vários produtos
industrializados potencialmente tóxicos é disposta diretamente no solo ou em aterros
sanitários. Alguns desreguladores endócrinos, tais como PCDD, PCDF, bisfenol A,
nonilfenol, octilfenol e 17α-etinilestradiol e alguns ftalatos e pesticidas são encontrados
no chorume de aterros sanitários (BEHNISCH et al., 2001).
A água potável é outra significativa fonte de exposição à desreguladores
endócrinos. As águas superficiais e de subsolo, principais fontes de água potável,
podem ser contaminadas pela infiltração de substâncias químicas através do solo, na
agricultura ou mesmo em áreas urbanas, ou no descarte de efluentes industrial e
doméstico e sendo que, muitas dessas substâncias não são removidas pelos processos
convencionais de tratamento de água. Muitos desses DE são encontrados em ambientes
20
aquáticos, como as dioxinas e os furanos, que podem ser descartados nas águas
superficiais através de alguns efluentes industriais (BIRKETT e LESTER, 2003).
Estudos demonstram que a aplicação de esterco animal afeta a qualidade das
águas superficiais e de subsolo. PETERSON et al. (2000) reportaram a presença de
17β-estradiol em águas subterrâneas próxima a áreas com alta densidade de criação de
animais (6 a 66 ng.L
-1
). Os estrogênios são naturalmente excretados pelos animais, ou
são administrados como promotores de crescimento nas criações de animais
(PETERSON et al., 2000, CASEY et al., 2003).
Os efeitos dos desreguladores endócrinos no meio ambiente não dependem
somente das suas concentrações no meio ambiente, mas também de outros fatores, tais
como, a lipofilicidade, persistência, bioacumulação, tempo de exposição, seus
mecanismos de biotransformação e de excreção, etc. Algumas substâncias presentes no
meio ambiente sofrem biotransformação, resultando em metabólitos ou subprodutos
igualmente ou até mais danosos que os compostos originais. Geralmente, os
desreguladores endócrinos persistem no meio ambiente e podem bioacumular, ou
podem ser degradados, tornando-se, porém “persistentes” porque são continuamente
introduzidos no meio ambiente por serem muito usados (MCGOVERN e
MCDONALD, 2003).
A exposição a baixos níveis de desreguladores endócrinos, que bioacumulam com
o tempo pode levar aos seus altos níveis no corpo de animais. Por isso, em uma cadeia
alimentar, os animais que se encontram no topo da cadeia apresentam concentrações
mais altas dessas substâncias no corpo do que os organismos do início da cadeia
alimentar. Pesquisas demonstram que altas concentrações de substâncias químicas são
encontradas no tecido adiposo ou no leite (HARTMANN et al., 1998).
Outros importantes fatores relacionados à exposição de uma substância são
potência e dose. Potência pode ser entendida como a capacidade da substância em
causar uma resposta, neste caso uma resposta hormonal. A dose é a quantidade da
substância que é recebida. Estes fatores são distintos, contudo estão relacionados. Uma
alta dose de uma substância fraca “A”, por exemplo, pode causar o mesmo nível de
resposta, se danoso ou benigno, do que uma baixa dose de uma substância mais potente
“B”. Recebendo doses iguais, essas duas substâncias podem apresentar níveis de
21
respostas diferentes, assim, a diferença das substâncias “A” e “B” é a potência (ACSH,
1999).
Uma fonte de exposição bastante crítica é a presença dessas substâncias químicas
presentes nos organismos das fêmeas que podem ser transferidas aos seus embriões,
fetos ou filhotes através dos ovos, placenta ou leite materno; e assim, afetar o
desenvolvimento fetal. Os hormônios desempenham um papel muito importante no
desenvolvimento embrionário e fetal. Segundo REYS (2001), nos mamíferos alguns
desreguladores endócrinos atravessam a barreira placentária afetando o
desenvolvimento fetal e podem igualmente ultrapassar a barreira hemato-encefálica e
exercer seus efeitos no sistema nervoso. Nos animais aquáticos, a exposição aos
poluentes é inevitável, pois grande parte do ciclo reprodutivo ocorre fora do corpo das
fêmeas, proporcionando um contato direto durante a fase gestacional.
II. 1.6. Ocorrência de Desreguladores Endócrinos no Meio Ambiente
O monitoramento da presença de desreguladores endócrinos no meio ambiente
tem sido realizado em uma grande variedade de estudos em todo mundo. No ambiente
aquático, essas substâncias são encontradas nas águas superficiais e de subsolo,
sedimentos marinhos, solo, efluentes de ETE, lodo biológico das ETE e água potável.
São continuamente introduzidos no meio ambiente em concentrações detectáveis, os
quais podem afetar a qualidade da água, a saúde dos ecossistemas e potencialmente
impactar o suprimento de água potável.
É intensivamente relatado que efluentes de ETE contêm concentrações
consideráveis de estrogênios naturais e sintéticos devido a sua incompleta remoção nos
processos de tratamento de esgoto (DESBROW et al., 1998, TERNES et al., 1999a).
Estudos mostram que outros desreguladores endócrinos, tais como, nonilfenóis
etoxilados, nonilfenol, octilfenol, HAP e bisfenol A, pesticidas também são
identificados em efluentes de ETE e águas superficiais e subterrâneas (BOYD et al.,
2003, HOHENBLUM et al., 2004, KOLPIN et al., 2002, KÖGER et al., 2000).
O bisfenol A e o nonilfenol são fracamente estrogênicos e freqüentemente com
potenciais três ou mais ordens de magnitude menores do que os estrogênios estrona,
22
17β-estradiol e 17α-etinilestradiol. Várias pesquisas sugerem que essas três últimas
substâncias são os maiores responsáveis pela estrogenicidade dos efluentes de ETE
(DESBROW et al., 1998 e JOBLING et al., 1998).
KÖRNER et al. (2000), investigaram a remoção da atividade estrogênica em uma
planta de tratamento de efluente doméstico na Alemanha, determinaram que 90% da
atividade estrogênica foi removida, e somente 2,8% da atividade estrogênica foi
encontrada no lodo biológico, concluindo que a maior parte das substâncias
responsáveis pela estrogenicidade do esgoto doméstico foi de fato biodegradada e não
ficaram adsorvidas nas partículas sólidas ou lodo biológico. Porém, as taxas de
eliminação individuais das substâncias foram diferentes, algumas foram totalmente
removidas enquanto que outras foram ainda detectadas no efluente da ETE, tais como,
bisfenol A, octilfenol e nonilfenol. Outros estudos demonstram uma variação da taxa de
adsorção dessas substâncias no lodo biológico (JOHNSON e SUMPTER, 2001,
TERNES et al., 2001b). A adsorção dessas substâncias no lodo biológico é um
importante caminho para a sua remoção, o que justifica a quantificação da sua adsorção
no lodo biológico de ETE (CLARA et al., 2004, JOHNSON e SUMPTER, 2001,
YAMAMOTO e LILJESTRAND, 2003).
O 4-nonilfenol e o bisfenol A foram detectados em águas superficiais em Portugal
na faixa de 0,03 a 30µg.L
-1
e 0,07 a 4,0µg.L
-1
, respectivamente (AZEVEDO et al.,
2001). O Bisfenol A e ftalatos foram encontrados águas superficiais, sedimentos
marinhos, efluentes de ETE, lodo biológico (FROMME et al., 2002, FÜRHACKER et
al., 2000).
A qualidade da água é fortemente dependente da qualidade dos sedimentos
marinhos, assim, esses últimos podem se tornar fonte em potencial para contaminação
das águas superficiais. Estudos demonstram que os sedimentos marinhos estão
contaminados com vários desreguladores endócrinos, tais como, alquilfenóis, ftalatos,
estrogênios, organoclorados, componentes polibrominados (LEGLER et al., 2002,
PETROVIC et al., 2001). Porém, mais estudos devem ser realizados para se determinar
quais os fatores influenciam na disponibilidade e lançamento dessas substâncias nas
águas.
23
Compostos orgânicos contendo estanho (TBT e TPT) também foram detectados
em águas superficiais e sedimentos marinhos no litoral do Brasil. O TBT se acumula
nos sedimentos em concentrações em média três mil vezes maiores que as detectadas na
água (FERNANDEZ et al., 2002).
O Anexo 1 apresenta uma compilação das concentrações médias ou faixas de
concentração de alguns desreguladores endócrinos detectados no meio ambiente, em
trabalhos conduzidos por diversos autores.
II.1.7. Mecanismos de Ação dos Desreguladores Endócrinos
II.1.7.1.
Sistema Endócrino
O sistema endócrino é um dos mais complexos sistemas do corpo humano,
consiste de várias glândulas em diferentes áreas do corpo, incluindo o pâncreas, a
tireóide, os órgãos reprodutores (ovários e testículos), o hipotálamo, a pituitária
(hipófise), a paratireóide, a supra-renal, que produzem hormônios com diferentes
funções. Essas glândulas secretam hormônios que são ativos em receptores de tecidos e
órgãos ao longo do corpo. A Tabela II.3 apresenta as principais funções dos hormônios
nos seres humanos e algumas doenças que podem resultar da superprodução ou escassez
dessas substâncias no corpo.
Os humanos e outros animais vertebrados (mamíferos, pássaros, répteis, anfíbios e
peixes) apresentam muitas semelhanças nas suas glândulas endócrinas e na composição
de seus hormônios, em particular dos hormônios esteróides.
24
Tabela II.3. Principais funções dos hormônios no corpo humano e as doenças
resultantes da superprodução ou escassez dessas substâncias.
Principais doenças
Hormônios
Lugar de
produção
Principais
funções que
controlam
superprodução
Escassez de
hormônios /
anormalidades no
receptor
Hormônio do
crescimento
Glândula
pituitária
Aceleração do
crescimento
Acromegalia e
gigantismo
Dwarfismo
Triiodotironina
(T
3
) e tiroxina (T
4
)
Tireóide
Estimulo do
metabolismo
celular,
controle da
inteligência e
crescimento
Hipertireodismo Hipotireoidismo
Insulina Pâncreas
Decréscimo de
açúcar no
sangue
Hipoglicemia Hiperglicemia
Hormônios:
glicocorticóides, os
mineralocorticóides
e os androgênios
Adrenais
ou supra-
renais
Controle do
metabolismo,
imunológico,
etc
Síndrome de
Cushing
Doença de Addison
Estrogênios
(hormônios sexuais
femininos)
Ovários
Feminização
(menstruação,
glândula
mamária),
desenvolvimen
to dos óvulos e
ovulação
Endometriose,
câncer vaginal e
de mama
Desenvolvimento de
anomalias na
genitália feminina e
desordem menstrual
Andrógenos
(hormônios sexuais
masculinos)
Testículos
Virilização,
desenvolvimen
to de
testículos,
espermatogêne
ses
Prematuro
desenvolvimento
de características
sexuais
secundárias
Desenvolvimento de
anomalias na
genitália masculina, e
síndrome da
feminização
testicular
O sistema endócrino usa os hormônios como carreadores de informações.
Hormônios são poderosas moléculas mensageiras que controlam funções essenciais do
corpo e após serem sintetizados, são transportados pela corrente sangüínea, no estado
livre ou ligados a proteínas, e agem em locais específicos regulando ou alterando
determinados órgãos ou funções, estabelecendo um modo de comunicação entre
diferentes partes do corpo. Estrogênios, progesteronas e testosterona são alguns dos
hormônios chave no sistema endócrino humano.
A insulina regula os níveis de glicose no sangue, outros hormônios afetam
processos bioquímicos como a produção de espermas no homem e o ciclo menstrual na
25
mulher. Os hormônios desempenham um papel fundamental no crescimento e
desenvolvimento, na reprodução e na diferenciação sexual e ainda na formação dos
sistemas nervoso e imunológico.
Os hormônios possuem características únicas e interagem com as células alvo por
diversos meios. Algumas características dos hormônios são citadas a seguir
(
http://e.hormone.tulane.edu/learning/targetcells.html, acessado em 22/10/2003):
• Os hormônios naturais são potentes, ou seja, pequenas quantidades são
suficientes para causar uma resposta;
• Um mesmo hormônio pode ser produzido por diferentes glândulas. Por
exemplo, ambos, ovários e glândulas supra-renais, podem liberar os mesmos
estrogênios, ao mesmo tempo.
• Um hormônio pode apresentar diferentes efeitos dependendo da
localização da célula alvo, gênero do indivíduo e a espécie. Por exemplo, o
estrogênio liberado pelo ovário da mulher prepara o útero para o ciclo menstrual,
enquanto o mesmo hormônio se liga a células dos ossos fortalecendo a massa
óssea.
• Os hormônios influenciam a expressão de gene ligando-se ao DNA no
núcleo de uma célula. Ou seja, hormônios ligam-se em certos genes que são pré-
programados para produzir proteínas específicas. Estas proteínas promovem
uma resposta da célula em um novo estímulo (crescer, secretar, metabolizar,
etc.).
• A concentração de hormônios esteróides livres que estão disponíveis
para interagir com seus receptores é regulada por proteínas ligantes
extracelulares (ARNOLD et al., 1996).
Os hormônios não estão presentes somente nos seres humanos, eles também são
encontrados na natureza, como em outros animais e vegetais. O mecanismo pelo qual
eles atuam é semelhante, uma substância pode interferir no mecanismo de ação
hormonal alterando o desenvolvimento, a reprodução e as funções dos seres vivos de
diversas espécies.
26
II.1.7.2.
Os diferentes mecanismos de ação dos DE
O sistema endócrino é complexo e há uma variedade de mecanismos de ações
diferentes pelo quais os desreguladores endócrinos podem interferir com este sistema,
incluindo: (1) mimetização dos efeitos dos hormônios naturais pela ligação nos
receptores hormonais; (2) efeitos antagônicos de hormônios naturais pelo bloqueio do
domínio de ligação hormonal (DLH); (3) pela interferência na síntese de hormônios; (4)
pela alteração dos níveis de receptores e pela interferência com o transporte e
eliminação dos hormônios, (5) outros mecanismos que não são via receptores
hormonais.
A possibilidade de haver ações simultâneas por parte de alguns desreguladores
endócrinos dificulta a investigação dos mecanismos de ação dessas substâncias. Isso
ocorre com as amostras ambientais que apresentam uma complexa mistura de
substâncias, que podem ter o mesmo mecanismo de ação biológica, como diferentes
mecanismos de ações.
Dentre os mecanismos de ação dos desreguladores endócrinos, os mais relatados
são mecanismos de ação via receptores dos hormônios esteróides, outros mecanismos
independentes dos receptores hormonais são pouquíssimos relatados.
II.1.7.2.a. Via receptores de hormônios esteróides.
Um grande número de desreguladores endócrinos interage com os receptores
hormonais e causam uma resposta biológica, e assim, atuam como agonistas ou
antagonistas. Receptores hormonais são moléculas protéicas onde os hormônios se
acoplam formando um complexo ativo hormônio-receptor, que por sua vez, se acoplam
a elementos reguladores do DNA (promotores) iniciando e influenciando a transcrição
genética. Os receptores são suscetíveis à ação das substâncias estrogênicas. Domínio de
ligação hormonal (DLH) é o local da ligação hormonal tanto dos hormônios quanto dos
anti-hormônios.
27
Os efeitos fisiológicos dos hormônios esteróides são relacionados à ativação dos
receptores de estrogênios REα e REβ (um membro da superfamília de receptores
encontrado no núcleo das células) por seus ligantes hormonais, incluindo o 17β-
estradiol. O hormônio acopla-se ao DLH do receptor; por sua vez, o complexo
hormônio-receptor, ativado pela alteração conformacional, acopla-se a regiões controle
(promotores) de genes específicos. Assim, por este meio controlam a transcrição dos
genes alvos e inicia uma série de eventos moleculares que culmina com a ativação ou
repressão do gene alvo (BROSENS e PAKER, 2003, BRZOZOWSKI et al., 1997), um
mecanismo simplificado é apresentado na Figura II.1.
Em outras palavras, a ligação de um esteróide no seu receptor causa uma mudança
conformacional no receptor permitindo ao complexo hormônio-receptor se acoplar a
específicas seqüências de DNA, chamadas de elementos de respostas de estrogênios
(ERE). Uma vez acoplado ao DNA, o complexo hormônio-receptor altera expressões de
genes de respostas. E é através dessa mudança na expressão do gene que os hormônios
esteróides exercem seus efeitos (GAIDO et al., 1997, ZACHAREWSKI, 1997).
17
β
-estradiol
RE
Transcrição
ERE
Proteínas
Efeitos Extracelular
Efeitos Intracelular
Figura II.1. Mecanismo global de ação dos estrogênios. Estrogênio, tal como o 17β-
estradiol, regula os processos celulares pela ligação no RE no núcleo celular. O receptor
ativado dimeriza e se acopla ao ERE no promotor nos genes alvo iniciando a transcrição
genética.
28
Fato bastante interessante é que o receptor de estrogênio possui uma característica
que o diferencia dos receptores dos demais esteróides. O seu DLH é dobrado em sua
forma helicoidal produzindo uma concavidade tipo dobra de sanduíche, para receber a
molécula do estrogênio. Apesar do arranjo em forma de pinça em volta do anel A dos
esteróides (anel fenólico) impor um pré-requisito aos ligantes de conter um anel
fenólico em sua molécula, o restante da cavidade pode aceitar um número variado de
compostos esteróides e não esteróides, contendo diferentes grupos hidrofílicos. Isto
pode ser atribuído ao tamanho da concavidade do receptor (quase o dobro da molécula
do 17β-estradiol), que poderá ser ocupado por outros compostos de tamanhos espaciais
menores ou maiores que a molécula do 17β-estradiol, desde que possuam um anel
fenólico (www.lucasmachado.com.br/docs/fitoestrogenios_na_menopausa.pdf).
Assim, a conformação do DLH no receptor de estrogênios, possibilita que outras
moléculas diferentes se acoplem e interajam com o RE. A estrutura cristalina do DHL
do receptor de estrogênios humano α (REhα) foi determinada por BRZOZOWSKI et
al., 1997, e é apresentada na Figura II.2. Substâncias agonistas e antagonistas acoplam-
se no mesmo DLH no receptor, porém, apresentam modos de ligação diferentes, bem
como, cada ligante induz a conformações distintas (BRZOZOWSKI et al., 1997).
Figura II.2. Representação da estrutura tridimensional do DLH do RE-α com o 17β-
estradiol acoplado. (a) monômero com a visualização das α-hélices em vermelho e do
17β-estradiol em azul. (b) Dímero. (Figura retirada de BRZOZOWSKI et al. (1997)).
29
Além do mecanismo de ação que uma substância pode interagir diretamente com
os receptores hormonais, e então mimetizar ou bloquear a ação de um hormônio
endógeno há outros mecanismos pelos quais uma substância química pode alterar o
processo mediante receptores hormonais, tais como, a alteração do nível de hormônios
endógenos pela alteração em sua síntese, metabolismo, distribuição ou clivagem. Pode
ainda, alterar a resposta dos hormônios pela alteração dos níveis de receptores ou por
outros caminhos secundários que afetam as funções dos receptores (GAIDO et al.,
1997).
Além disso, as substâncias químicas podem apresentar múltiplas atividades
hormonais, ou seja, uma substância que mimetiza estrogênios pode ter outros
mecanismos de ação, como apresentar uma atividade anti-andrógena. Por exemplo, o
DDT o qual foi originalmente determinado como uma substância estrogênica, também
possui atividade anti-andrógeno (SOHONI e SUMPTER, 1998).
Os desreguladores endócrinos quando interferem no mecanismo de ação dos
hormônios esteróides pela interação com seus receptores hormonais, acoplam-se aos
receptores e mimetizam a ação de um hormônio. Ativando uma resposta mais fraca ou
mais forte do que o hormônio natural, exerce uma ação agonista. Podem acoplar-se a
um receptor e ocupar o ERE impedindo que o hormônio acople-se, bloqueando assim
seus sinais normais, e impedindo que exerça sua função, funcionando assim como
antagonistas, que possivelmente não elucidam uma resposta biológica porque são
incapazes de estabilizar a mudança conformacional ou a interação molecular requeridos
para a ativação. Algumas vezes essas substâncias podem amplificar ou reduzir as
respostas dos hormônios endógenos (BIRKETT e LESTER, 2003). Esses mecanismos
de ação são apresentados na Figura II. 3.
30
Hormônio Desregulador
Endócrino
Os hormônios acoplam-se perfeitamente
nos receptores e transmitem sinais
indispensáveis às células
Os desreguladores endócrinos ocupam o
lugar dos hormônios endógenos enviam
sinais diferentes e fora de tempo às células
E por fim, os mesmos desreguladores
hormonais atuam como bloqueadores
dos sinais normais dos hormônios que
seriam enviados às células.
Receptor específico
Figura II.3. Mecanismos de atuação dos DE (imagem copiada e modificada de
http://acpo94.sites.uol.com.br/interferentes_hormonais.htm, acessado em 12/09/2003).
Dentre os mecanismos de ação dos desreguladores endócrinos, tem sido muito
investigado a interação direta com os receptores dos hormônios esteróides que é
suspeito de alterar as funções endócrinas, causando alterações na capacidade
reprodutiva, infertilidade, endometriose e diversos tipos de câncer (GAIDO et al.,
1997). Essa capacidade de acoplar-se ao receptor do hormônio esteróide é denominada,
por alguns autores, de atividade biológica. Dos mecanismos de ação, a atividade
estrogênica, que é a capacidade de uma substância se ligar ao receptor de estrogênios e
elucidar uma resposta, é atualmente o mais largamente estudado.
Uma variedade de produtos sintéticos é capaz de interagir com o receptor de
estrogênio. Os pesticidas, como o DDT e componentes de plásticos como o nonilfenol,
mimetizaram a ação de estrogênios endógenos em testes com animais de laboratório
(COLBORN, et al., 1993).
31
Estudos evidenciam que algumas anomalias no sistema reprodutivo de machos
podem ser relacionadas com mecanismos via receptor de andrógeno (SOHONI e
SUMPTER, 1998). Pelo bloqueio da ação do andrógeno, a exposição aos chamados
anti-andrógenos pode causar mudanças similares às associadas com a exposição a
substâncias estrogênios.
Certos desreguladores endócrinos ligam-se às proteínas, reduzindo a
disponibilidade destas para o transporte de hormônios através do sangue. Outros alteram
os níveis de hormônios endógenos acelerando sua ruptura e eliminação, ou desativando
as enzimas que facilitam sua ruptura; alguns reagem diretamente com os hormônios
alterando suas estruturas, afetando sua síntese ou sua eliminação natural.
Os vários mecanismos de ação que os desreguladores endócrinos podem
apresentar são descritos na Tabela II.4. Como são vários os mecanismos de ação dos
desreguladores endócrinos, algumas vezes, é difícil determinar como essas substâncias
afetam o funcionamento de alguns hormônios endógenos no corpo. Contudo, no meio
ambiente podem ainda apresentar outros efeitos que explicam como essas substâncias
podem atuar e assim apresentar os efeitos biológicos, tais como os efeitos citados abaixo
(
http://archive.greenpeace.org/toxics/reports/ptf/ptf.html, acessado em 30/10/2003):
•
Persistência e bioacumulação: Alguns desreguladores endócrinos
bioacumulam no tecido adiposo dos animais e humanos, alcançando níveis que
podem ser mais altos do que os níveis encontrados no meio ambiente. Alguns são
também persistentes, e levam longos tempos para degradar e assim, permanecem no
corpo por vários anos. Como resultados disso, algumas substâncias com essas
propriedades alcançam níveis no corpo de animais e humanos muitas vezes maiores
do que os níveis dos hormônios naturais no corpo.
•
Misturas de substâncias: No meio ambiente, humanos e animais são expostos,
não a desreguladores endócrinos individuais, mas a misturas complexas de diferentes
desreguladores endócrinos. Conseqüentemente é possível que a ação dessas
substâncias juntas se adicione e cause efeitos cumulativos, ou sinérgicos.
32
•
Associação com proteínas: Cerca de 90% dos estrogênios naturais circulam no
sangue ligados a proteínas. Os estrogênios que permanecem livres são capazes de se
difundir nas células e exercer efeitos biológicos. Alguns desreguladores endócrinos
não se ligam as proteínas, permanecendo 100% dessas substâncias circulando
livremente no sangue para se difundir nas células e exercer efeitos.
•
Múltiplos caminhos de ação: Alguns desreguladores endócrinos podem não
somente exercer seus efeitos por um único mecanismo, tal como, mimetizar, mas
podem causar efeitos através de dois ou mais mecanismos, amplificando seu
potencial.
Quando os efeitos acima são considerados, fica claro que, ainda que essas
substâncias sejam muito menos potentes do que os hormônios endógenos e estejam
presentes em baixas concentrações no meio ambiente, os desreguladores endócrinos
podem apresentar ameaça à saúde de animais e humanos.
Para muitas substâncias, um aumento na concentração acarreta um aumenta dos
efeitos tóxicos. Entretanto, para os desreguladores endócrinos, os maiores efeitos podem
ocorrer em baixas concentrações. Isto porque os hormônios normalmente são efetivos
em baixas concentrações, pois os receptores têm uma afinidade muito grande para um
hormônio específico, de forma que baixas concentrações são necessárias para se obter
uma resposta. Apesar da sua alta afinidade por hormônios, esse receptor pode se ligar a
outras substâncias químicas. Assim, desreguladores endócrinos presentes em baixas
concentrações podem causar um efeito e elucidar uma resposta (BIRKETT e LESTER,
2003).
III.1.7.2.b. Mecanismos independentes dos receptores hormonais
Outros mecanismos de ação independente da interação com os receptores dos
hormônios esteróides são pouquíssimos relatados. FISHER (2004) relata dois
mecanismos de ação associados à exposição aos desreguladores endócrinos, que não são
via receptor de estrogênio, são eles, a supressão de síntese de testosterona fetal em
roedores expostos in utero por ftalatos e a capacidade de várias substâncias químicas
34
interferirem com o metabolismo de esteróides pela inibição da enzima sulfotransferase
(enzima envolvida no metabolismo dos hormônios esteróides).
II.1.7.3.
Atividade estrogênica
Vários são os mecanismos de ação pelo qual um desregulador endócrino pode
causar alterações no sistema endócrino. A capacidade de uma substância acoplar-se ao
RE e em elucidar uma resposta estrogênica é um deles, conhecida como atividade
estrogênica.
Muitas vezes, faz-se uma comparação entre a estrutura química do 17β-estradiol
com as substâncias que também apresentam atividade estrogênica. A posição relativa do
grupo hidroxila fenólico (OH) no anel A é considerada crucial para a alta afinidade da
ligação com o receptor de estrogênio e a estrogenicidade in vivo (BIRKETT e LESTER,
2003).
Nos ensaios de atividade estrogênica, a potência estrogênica relativa de uma
substância é comparada com o estrogênio padrão humano 17β-estradiol, que representa
o padrão pelo qual a atividade estrogênica é medida.
A afinidade de ligação de uma substância no RE tem sido investigada para
inúmeras substâncias suspeitas de causar alguma perturbação no sistema endócrino.
Esta afinidade tem sido avaliada, em ensaios in vitro e in vitro, para substâncias como
fitoestrogênios, estrogênios sintéticos e substâncias sintéticas. Há uma significativa
diferença na afinidade das diferentes substâncias químicas pelo RE, com isso, há
substâncias que apresentam estrogenicidade fraca ou forte. O 17β-estradiol é usado
como controle positivo em ensaio in vitro, para avaliar a atividade estrogênica das
substâncias químicas simples ou amostras complexas.
II.1.7.4.
Relação estrutura-atividade biológica
Resultados de vários ensaios in vitro e in vivo demonstram que diferentes tipos de
estruturas de substâncias naturais e sintéticas agem como desreguladores endócrinos.
35
Essas substâncias atuam por diferentes mecanismos de ação, sendo o mais estudado a
atividade estrogênica.
O RE pode ser acoplado por uma variedade de compostos não-esteróides, os quais
são estruturalmente análogos ao fenol do 17β-estradiol. Assim, a atividade biológica de
uma substância pode estar associada com sua estrutura química. A característica
estrutural mais proeminente identificada para a atividade estrogênica é um grupamento
polar capaz de fazer ponte de hidrogênio (isto é a hidroxila) em um sistema aromático
(HAMBLEN et al., 2003). Estudos de relação estrutura-atividade sugerem que quando o
17β-estradiol é acoplado ao receptor de estrogênio, há somente um encaixe perfeito ao
final do anel fenólico do esteróide.
Devido à estrutura similar com o anel fenólico do 17β-estradiol, algumas
substâncias químicas estão sendo relacionadas com a atividade estrogênica, tais como
PCB, alquilfenóis (nonilfenol e octilfenol), bisfenol A, fitoestrogênios (HU e AIZAWA,
2003, ROUTLEDGE e SUMPTER, 1997, SCHULTZ, 2002) entre outras. O número e a
posição do grupo hidroxila na estrutura molecular são importantes fatores que
contribuem para uma forte ligação no RE e na resultante atividade estrogênica (WANG
e LOU, 2004). Segundo ROUTLEDGE e SUMPTER (1997), a posição e a ramificação
do substituinte dos compostos fenólicos alquil-substituídos afetam a sua
estrogenicidade.
Alguns estudos investigam a estrutura química característica de uma substância
que será responsável por sua atividade estrogênica (ROUTLEDGE e SUMPTER, 1997,
SCHULTZ, 2002). Este tipo de análise correlaciona uma estrutura química
característica com uma atividade biológica e os modelos derivados dessas relações
podem ser usados para predizer a atividade não testada de um contaminante ambiental
(BLAIR et al., 2000). Em inglês é denominada de QSAR. Essa ferramenta investiga a
estrutura característica responsável pela atividade estrogênica de uma substância
química baseada em ensaios in vitro e in vivo.
O QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) tem sido utilizado por
alguns pesquisadores, como uma ferramenta de análise inicial a priori aos ensaios in
vivo e in vitro para estimar a atividade estrogênica de substâncias químicas presentes no
meio ambiente. Esta técnica pode ainda fornecer informações sobre o mecanismo da
36
ação dessas substâncias. O QSAR é o estudo das relações entre estrutura e atividade
biológica dos compostos químicos
II.1.7.5.
Efeitos de combinação aditivos
Provavelmente, o efeito potencial de uma substância em uma mistura é diferente
do efeito de uma substância simples. SUMPTER e JOBLING (1995) concluíram que a
combinação de substâncias estrogênicas é consideravelmente mais potente do que cada
substância estrogênica sozinha.
Alguns autores (RAJAPAKSE et al., 2001, SILVA et al., 2002) tentam
desenvolver metodologias para estimar os efeitos esperados de uma mistura. Essa
avaliação pode depender de alguns fatores, tais como, potência dos componentes da
mistura e a relação resposta-concentração (razão de mistura) de uma substância em uma
mistura, como também de efeitos como sinergismo e antagonismo que podem desviar os
efeitos esperados. Misturas sinérgicas mostram-se maior, e misturas antagônicas menor,
do que os efeitos esperados.
RAJAPAKSE et al (2001) avaliaram se substâncias estrogênicas fracas (bisfenol
A e DDT) quando combinadas com o 17β-estradiol contribuem para o efeito de mistura
global, ou seja, investigaram se essas substâncias estrogênicas fracas podem fazer
alterações na intensidade dos efeitos do 17β-estradiol. Nesse estudo foi demonstrado
que o efeito de combinação da mistura dessas três substâncias é aditivo. Substanciais
alterações na intensidade (aumento) dos efeitos do 17β-estradiol, quando combinado
com o DDT e o bisfenol A, foram observadas. Concluíram ainda que o impacto das
substâncias estrogênicas na ação dos hormônios esteróides depende da razão de mistura
e de sua potência relativa ao 17β-estradiol.
II.1.8. Efeitos Causados pela Exposição aos Desreguladores Endócrinos
Recentemente, muitos efeitos causados pelos desreguladores endócrinos presentes
no meio ambiente têm sido relatados, incluindo: 1) anomalias no sistema reprodutivo de
animais (peixes, répteis e pássaros); 2) indução da síntese de vitelogenina (VTG) no
37
plasma de peixes, que tem sido usado como um biomarcador em águas com
contaminação por efluentes de ETE e 3) efeitos na saúde de humanos, tais como,
redução na produção de esperma e aumento da incidência de câncer.
Os riscos em potencial dos desreguladores endócrinos têm sido o tema de vários
debates internacionais e pesquisas científicas (ACSH, 1999, CSTEE, 1999, COLBORN
et al., 1993, GOLDMAN et al., 2000, UBA, 1996, US EPA, 1997). O ponto principal
desta questão é se há evidências significativas de que essas substâncias possam causar
efeitos danosos em animais e humanos e se há níveis suficientes de desreguladores
endócrinos no meio ambiente para exercer esses efeitos.
II.1.8.1.
Efeitos relatados em animais silvestres e de laboratório
Vários estudos relacionam a contaminação ambiental de rios e lagos com algumas
anomalias no sistema reprodutivo e no desenvolvimento de espécies de animais. A
exposição aos desreguladores endócrinos pode ser responsável por alterações
fisiológicas e histológicas em animais silvestres e de laboratórios, incluindo: (1)
alterações nos níveis de VTG (vitelogenina) no plasma sangüíneo, (2) feminização de
peixes machos, (3) indução ao hermafroditismo, (4) inibição no desenvolvimento das
gônadas e (5) declínio na reprodução. Essas e outras anomalias reportadas em várias
espécies de animais são apresentadas na Tabela II. 5 e II.6.
Vários estudos demonstram que organismos aquáticos respondem com a indução
da síntese de VTG à exposição a determinadas concentrações de estrogênios (FOLMAR
et al. 2000, GAGNÉ et al., 2001, THOMPSON et al. 2000). No estudo de THOMPSON
et al. (2000) três espécies de peixes (Oryzia latipes, Morone saxatalis x Morone
chrysops e Ictalurus punctatus) foram expostas a concentrações de 17β-estradiol de 10 a
100 ng.L
-1
por 21 dias, resultando na indução de VTG no plasma para todas as espécies.
38
Tabela II.5. Efeitos e anomalias atribuídos aos DE.
Espécie Contaminante Efeitos Referência
Bisfenol A
Deformidades no sistema
reprodutivo de ratos
MARKEY et al., 2003
PCB Alta mortalidade de golfinho
AGUILAR e BORREL,
1994
Mamífero
DDT
Anomalias no sistema
reprodutivo de ratos
BITMAN et al., 1968
Réptil
DDE e DDT
Concentrações anormais de
hormônios sexuais no plasma
(baixa concentração de
testosterona), anomalias
morfológicas nas gônadas
(redução no tamanho do pênis)
em jacarés.
GUILLETTE et al.,
1996 e 1999, MILNES
et al., 2002
Mexilhão
Efluente de
ETE
Indução a síntese de VTG no
sangue e anomalias no
crescimento da concha dos
mexilhões
GAGNÉ et al., 2001
Moluscos
TBT e TPT
Surgimento de órgãos sexuais
masculinos em fêmeas -
imposex e esterilização
FERNANDEZ et al.,
2002
Tartaruga
17β-estradiol
Indução a síntese de VTG no
sangue e alterações na produção
de ovos.
IRWIN et al., 2001
Pesticidas Decréscimo da fertilidade FRY, 1995
DDT Feminização gaivotas machos FRY e TOONE, 1981
Pássaro
DDT
Anomalias no sistema
reprodutivo
BITMAN et al., 1968
Herbicida
(atrazina)
Anomalias no sistema
reprodutivo e declínio na
população
DALTON, 2002
Anfíbio
Efluente de
ETE
Indução a síntese de VTG no
sangue e hermafroditismo.
BOGI et al., 2003
39
Tabela II.6. Efeitos e anomalias em peixes atribuídos aos DE.
Espécie Contaminante Efeitos Referência
Feminização de peixes ALLEN et al.,1999
Declínio na reprodução ROBINSON et al.,2002
Efluente de
ETE
Indução a síntese de VTG
LARSSON et al., 1999,
RODGER-GRAY et al., 2000,
SOLE et al., 2000, 2001 e
2003, ALLEN et al.,1999,
PANTER et al., 1998
Feminização de peixes
RODGER-GRAY et al., 2001,
KÖGER et al., 2000, KNÖRR e
BRAUNBECK, 2002
Alteração nas gônadas PANTER et al., 2000
Hermafroditismo
HARTLEY et al., 1998,
KÖGER et al., 2000
Incidência de testículo-
óvulos nas gônadas
KANG et al., 2002
Declínio na reprodução
SHIODA e WAKABAYASHI.,
2000, KÖGER et al., 2000
Inibição do crescimento
testicular
PANTER et al., 1998
Mortalidade elevada dos
descendentes
KNÖRR e BRAUNBECK,
2002
17β-estradiol
Indução a síntese de VTG
PANTER et al., 2000,
MONCAUT et al., 2003,
ROUTLEDGE et al., 1998,
ROSE et al., 2002
Indução a síntese de VTG
PANTER et al., 1998,
ROUTLEDGE et al., 1998
Estrona
Inibição do crescimento
testicular
PANTER et al., 1998
Indução a síntese de VTG
SCHMID et al., 2002, ROSE et
al., 2002, FOLMAR et al.,2000
Mortalidade da espécie SCHMID et al., 2002
17α-
etinilestradiol
Declínio na reprodução ROBINSON et al.,2002
bisfenol A e
DEHP (ftalato)
Declínio na reprodução
SHIODA e WAKABAYASHI.,
2000
Declínio na reprodução
SHIODA e WAKABAYASHI,
2000
Indução a síntese de VTG
JOBLING e SUMPTER, 1993,
ROUTLEDGE et al., 1998
Nonilfenol,
octilfenol e
butilfenol
Mortalidade elevada dos
descendentes e
feminização de peixes
machos
KNÖRR e BRAUNBECK,
2002
DES
Indução a síntese de VTG
no sangue
FOLMAR et al., 2000
Peixe
4-tert-
pentilfenol
Feminização de peixes
machos
GIMENO et al., 1998
40
Segundo SCHMID et al. (2002) altos níveis de VTG no plasma podem causar a
mortalidade de peixes. Em seu estudo, peixes da espécie Pimephales promelas foram
expostos a 50 ng/L de 17α-etinilestradiol por 35 dias, seguidos por igual período de
depuração. Foi observado que a mortalidade de peixes ocorreu entre o 20
o
e o 36
o
dia de
exposição, que coincidiu com o período no qual foram observados os maiores níveis de
VTG no plasma.
No estudo de ROUTLEDGE et al. (1998), duas espécies de peixes, Oncorhynchus
mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a concentrações de 17β-estradiol e
estrona ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L
-1
). De acordo com esses e outros
pesquisadores, os resultados confirmaram que os estrogênios identificados em efluentes
domésticos estão presentes em quantidades suficientes para induzir a síntese de VTG
nas espécies de peixes (DESBROW et al., 1998).
A indução da síntese de VTG não ocorre só em espécies de peixes, mas também
em outras espécies de animais. Concentrações ambientalmente relevantes de 17β-
estradiol são suficientes para induzir a síntese de VTG em tartarugas (IRWIN et al.,
2001). Em outro estudo, GAGNÉ et al. (2001) concluíram que efluentes de ETE contêm
estrogênios em níveis suficientes para elucidar efeitos, dentre estes a indução da síntese
do VTG em mexilhões (Elliptio complanata).
Pesquisas têm demonstrado que essas concentrações presentes no meio ambiente,
embora muito baixas, são suficientes para elucidar uma resposta hormonal em uma
variedade de espécies de animais, tais como peixes machos expostos a baixíssimos
níveis de estrogênios (1,0 ng.L
-1
), seja intermitente ou continuamente, exibem respostas
estrogênicas, tal como a indução à síntese da proteína vitelogenina (VTG) (RODGER-
GRAY et al., 2001, HANSEN et al., 1998).
Anomalias no sistema reprodutivo de jacarés jovens que vivem em lagos da
Flórida contaminados, tais como, concentrações anormais de hormônios sexuais no
plasma (baixa concentração de testosterona) e anomalias morfológicas nas gônadas
(redução no tamanho do pênis), têm sido bastante relatadas (MILNES et al., 2002,
GUILLETTE et al., 1996 e 1999). A causa dessas anomalias pode estar relacionada com
a presença de substâncias estrogênicas e anti-andrógenas. O principal contaminante
41
encontrado nesses jacarés é o DDE, o mais persistente metabólito do DDT
(GUILLETTE et al., 1999).
Outros organismos aquáticos também têm efeitos no sistema endócrino resultante
da exposição de TBT, como por exemplo, os moluscos (caramujos e lesmas) que vivem
no litoral brasileiro. Compostos orgânicos contendo estanho, TBT e TPT, oriundos da
tinta dos cascos das embarcações estão provocando o surgimento de órgãos masculinos
em fêmeas, o fenômeno conhecido como imposex – imposição sexual – é irreversível e
provoca a esterilização da população dos animais, podendo causar declínio considerável
nas populações de espécies mais sensíveis. Esses compostos orgânicos contendo
estanho interferem na síntese da testosterona (hormônio masculino), causando um
aumento na sua produção nas fêmeas. Essa alteração hormonal faz surgir estruturas
sexuais masculinas não funcionais, mantendo-se, porém a anatomia interna do
organismo (FERNANDEZ et al., , 2002).
São relatados também efeitos adversos no sistema reprodutivo de pássaros
expostos aos desreguladores endócrinos como, pesticidas (DDT, dicofol) e PCB,
resultando em anomalias em embriões machos e fêmeas como, por exemplo, a
feminização dos machos (FRY, 1995).
Os peixes têm sido usados como um modelo para detectar os efeitos de
desreguladores endócrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo.
Peixes de espécies Oryzias latipes, são excelentes organismos para estudos de
reprodução, pois apresentam a diferenciação sexual antes da eclosão dos ovos, podem
reproduzir todos os dias sob apropriadas condições e levam poucos meses para atingir a
maturidade (KANG et al.,2002, SHIODA e WAKABAYASHI., 2000). Além disso, a
exposição a substâncias estrogênicas pode causar a feminização de peixes se a
exposição ocorrer durante o período crítico da diferenciação sexual. Isso foi observado
em espécies de peixes, como Cyprinus carpio (GIMENO et al., 1998a) e Rutilus rutilus
(JOBLING et al., 1998).
Efluentes de ETE vêm sendo apontados como a maior causa de efeitos
estrogênicos em peixes. RODGRES-GRAY et al. (2000) observaram um aumento nos
níveis de VTG no plasma de peixes da espécie Rutilus rutilus quando expostos ao
efluente de ETE do Reino Unido. Neste efluente foi detectada a presença dos
42
estrogênios 17·-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol nas concentrações de 4, 50 e 1,7-
3,4 ng.L
-1
respectivamente.
De acordo com estudos de PANTER et al (1998) e PANTER et al. (2000),
concentrações baixas de 17β-estradiol e estrona, similares às concentrações encontradas
em efluentes, causaram efeitos em peixes machos (Pimephales promelas). Os efeitos
relatados foram à indução da síntese de VTG e o desenvolvimento das gônadas
(inibição testicular) quando expostos a concentrações na faixa de ng/L.
HARTLEY et al. (1998) utilizaram o desenvolvimento das gônadas de peixes
Oryzias latipes para avaliar os efeitos das substâncias com atividade estrogênica
baseados na indução do hermafroditismo. Os peixes foram expostos a concentrações de
17β-estradiol de 4,0; 29,4 e 115,6 µg.L
-1
por 48 horas. Os resultados mostraram que em
concentrações de 4,0 e 29,4 µg.L
-1
ocorreu 53% de desenvolvimento de
hermafroditismo, e que com a maior concentração de estradiol houve uma mortalidade
de 90%, sendo que dos três peixes sobreviventes, dois eram fêmeas e um hermafrodita.
Pouco é conhecido sobre a exposição de organismos em ambientes aquáticos a
substâncias com atividade estrogênica presentes em sedimentos marinhos. LEGLER et
al. (2002) demonstraram que as substâncias com atividade estrogênica não só são
importantes na fase aquosa, mas também pode acumular-se em sedimentos marinhos.
No estudo de JANSSEN et al. (1997), peixes da espécie Platichthys flesus foram
expostos a sedimentos contaminados, resultando em um prematuro aumento dos níveis
de VTG no plasma dos peixes fêmeas.
Embora as concentrações dessas substâncias nos efluentes sejam baixas (da ordem
de ng.L
-1
e µg.L
-1
), estas são suficientemente elevadas para induzir a síntese de VTG em
peixes machos e outros tipos de anomalias no sistema reprodutivo de organismos
terrestres e aquáticos. E ainda, os efeitos causados no sistema reprodutivo de espécies
de animais podem conduzir a uma diminuição do tamanho da população a um nível
crítico, o qual pode eventualmente causar a extinção da população.
Como reportado, peixes machos expostos a efluente de ETE ou que vivem em rios
com despejos de efluentes de ETE tiveram um aumento dos níveis de VTG no plasma e
hermafroditismo. Isso confirma que efluentes de ETE são rotas importantes de
43
lançamento de substâncias estrogênicas no meio ambiente (JOBLING et al., 1998,
RODGERS-GRAY et al., 2000 e 2001, DESBROW et al., 1998). Segundo JOBLING et
al. (1998) há indícios fortes de que a incidência do hermafroditismo é devida a
feminização de peixes geneticamente machos e não pela androgenização de fêmeas
genéticas.
Estudos que investigam os efeitos causados no sistema reprodutivo de peixes e em
outras espécies de animais são de grande importância para determinar o potencial de
risco de um desregulador endócrino, avaliando as anomalias na reprodução
propriamente dita dos animais. Já, os ensaios in vitro e alguns in vivo são usados para
determinar somente a resposta estrogênica de uma substâncias ou amostra ambiental,
porém, não indicam adequadamente se a substâncias irá causar efeitos adversos nos
animais expostos. Por exemplo, a relação entre os ensaios que se baseiam na interação
com os RE e na subseqüente ativação de uma resposta estrogênica ou no aumento dos
níveis de VTG no sangue de peixes machos, e as anomalias causadas no sistema
reprodutivo de peixes ainda não está claro.
II.1.8.2.
Efeitos relatados em humanos
Uma variedade de substâncias é suspeita de causar efeitos adversos na saúde
humana, resultando em alterações no sistema endócrino, incluindo efeitos no sistema
reprodutivo feminino (diferenciação sexual, função dos ovários, aumento no risco de
câncer de mama e vagina, ovários policísticos e endometriose) e no sistema reprodutivo
masculino (redução na produção de esperma, aumento do risco de câncer testicular e de
próstata, infertilidade e alterações nos níveis hormonais da tireóide). Esses e outros
efeitos foram revisados em alguns estudos (DASTON et al., 1997, HARRISON et al.,
1997, US. EPA, 1997, WEBER et al., 2002).
O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do
balanço e concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos), assim,
uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais como,
irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade, endometriose e ovários
policísticos (para revisão veja NICOLOPOULOU-STAMATI e PITSOS, 2001).
44
Os esteróides podem, em alguns casos, estar envolvido na iniciação de um tumor,
e induzirem eventos críticos na “progressão” maligna destes cânceres (DICKSON e
LIPPMAN, 1986). Alguns tipos de câncer podem estar ligados à exposição inadequada
e/ou prolongada a hormônios endógenos ou substâncias estrogênicas, pois a proliferação
celular, devido aos estrogênios aumenta o que leva ao aumento da probabilidade de
mutações ocorrerem durante a síntese de DNA.
Sabe-se que os desreguladores endócrinos têm a capacidade de modular, alterar a
intensidade desses hormônios, no entanto resta saber se essas substâncias podem
realmente afetar as funções do sistema reprodutivo feminino. O uso de DES em
mulheres grávidas na década de 1970s, e no então desenvolvimento de várias anomalias
no sistema reprodutivo feminino de meninas nascidas de mães que fizeram uso desse
medicamento (tais como câncer vaginal, gravidez anormal e redução na fertilidade) é
sem dúvida uma evidência dos efeitos à exposição de estrogênios.
Vários grupos de pesquisas sugerem que grande parte da população sofre com o
decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas. Contudo, as evidências desse
declínio ainda não estão bem claras. De 1973 a 1992, AUGER et al. (1995) analisaram a
qualidade do sêmen de um grupo de homens férteis saudáveis, levando em conta o
volume do fluido seminal, a concentração de espermas e a mobilidade e morfologia do
espermatozóide. Os autores observaram um declínio na concentração e mobilidade do
esperma nos homens estudados em um período de 20 anos, e esse decréscimo da
qualidade do sêmen coincide um aumento na incidência de anomalias no sistema
reprodutivo masculino, incluindo câncer testicular. O aumento da incidência de câncer
testicular também tem sido relatado por outros autores (WEBER et al., 2002).
Apesar de alguns pesquisadores sugerirem que não há relação entre a exposição
aos desreguladores endócrinos e alguns efeitos danosos em humanos, tal como a
incidência de câncer de mama (SAFE, 1995 e 2004), revisões indicam que há claras
evidências experimentais e epidemiológicas do papel dessas substâncias na disfunção no
sistema reprodutivo humano (DAVIS et al., 1993, DICKSON e LIPPMAN, 1986,
NICOLOPOULOU-STAMATI e PITSOS, 2001, WEBER et al., 2002).
No que diz respeito aos efeitos sobre a saúde humana, o Comitê Científico da
Toxicidade, Ecotoxicidade e Ambiente (CSTEE, 1999) concluiu que há associações
45
entre algumas substâncias causadoras de desregulação endócrina e alterações na saúde
humana, tais como, o câncer de testículo, de mama e de próstata, o declínio das taxas de
espermatozóides, deformidades dos órgãos reprodutivos, a disfunção da tiróide.
II.1.8.3.
Efeitos em fetos ou espécies jovens
Durante os estágios prematuros da vida, na fase fetal e no desenvolvimento
jovem, os hormônios são os principais responsáveis pelo controle e desenvolvimento de
alguns tecidos e órgãos, incluindo os sistemas reprodutivo, imunológico e nervoso. As
crianças e animais jovens são as espécies que talvez apresentem os maiores riscos
quando expostos aos desreguladores endócrinos, pois, durante este estágio crítico de
desenvolvimento, podem causar desequilíbrios hormonais, acarretando problemas que
podem ser pronunciados mais tarde (SOLOMON e SCHETTLER, 2000, WEBER et al.,
2002).
Como o desenvolvimento dos sistemas reprodutivos feminino e masculino ocorre
na fase fetal, anomalias podem estar relacionadas ao aumento da exposição de
substâncias estrogênicas in utero (WEBER et al., 2002). A exposição a essas
substâncias pode, por exemplo, comprometer a produção dos hormônios responsáveis
pelo sistema reprodutivo.
Durante o seu desenvolvimento, o feto é particularmente vulnerável a flutuações
hormonais. A exposição a baixas concentrações de hormônios endógenos pode resultar
em mudanças fisiológicas permanentes, que não são observadas em adultos quando
expostos aos mesmos níveis (SOLOMON e SCHETTLER, 2000). A exposição a essas
substâncias durante o desenvolvimento embrionário pode induzir, tanto a efeitos
catastróficos (mortalidade e câncer) quanto a efeitos sutis (mudança nas funções das
enzimas), que são capazes de desorganizar a diferenciação das células e órgãos
(GUILLETTE et al., 1996).
Algumas disfunções sexuais são verificadas em recém nascidos cujas mães
tiveram contado com substâncias suspeitas de serem desreguladores endócrinos. Alguns
efeitos relatados dessas substâncias podem afetar não só os indivíduos expostos, como
46
também a população ou sub-população a que pertencem, pelos efeitos propagados na
sua descendência.
Alguns pesquisadores afirmam que as evidências da relação dos desreguladores
endócrinos são ainda pequenas ou não existem. Entretanto, para outros as implicações
potenciais para a saúde humana e para outras numerosas espécies de animais é um fato.
Dentre elas, podemos citar a exposição ao DDT e DDE que fizeram com que jacarés na
Flórida desenvolvessem anomalias no sistema reprodutivo (GUILLETTE et al., 1996); e
o desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo de mulheres que foram
expostas in utero ao DES (BIRKETT e LESTER, 2003).
II.1.9. Estrogênios Naturais e Sintéticos
II.1.9.1.
Hormônios sexuais
Os hormônios esteróides são produzidos nas glândulas endócrinas e são
excretados diretamente na corrente sangüínea, estimulando ou inibindo a atividade
metabólica em outros tecidos ou órgãos. Os hormônios sexuais, que controlam a
maturação e a reprodução, podem ser classificados em três grupos principais: (1) os
hormônios sexuais femininos, tais como, estrogênios e progesteronas, (2) os hormônios
sexuais masculinos, tais como, androgênios e (3) corticosteróides, que são divididos em
glicocorticóides e mineralocorticóides.
Todos os hormônios esteróides exercem sua ação pela passagem através da
membrana plasmática e acoplam-se a receptores intracelulares. (YING et al., 2002). Os
hormônios esteróides são um grupo de substâncias ativas biologicamente que são
sintetizadas a partir do colesterol, e tem em comum uma estrutura de anel básica,
constituída de três anéis hexagonais (A, B, C) e um anel pentagonal (D), como
apresentado na Figura II.4. Os estrogênios são caracterizados por seu anel A fenólico, o
qual tem o grupamento hidroxila no carbono 3 e é o que lhe confere à atividade
biológica, neste caso a atividade estrogênica, e uma cetona ou um grupamento hidroxila
no carbono 17. São também referidos como esteróides C
18
, por apresentar 18 carbonos
em sua estrutura. A biosíntese dos estrogênios naturais é apresentada na Figura II.5.
47
O
H
HO
CH
3
A
B
CD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Figura II.4. Estrutura química do 17β-estradiol
Os estrogênios naturais são secretados pelos ovários e promovem o
desenvolvimento das características femininas secundárias que aparecem no início da
puberdade, também estimulam o desenvolvimento das glândulas mamárias durante a
gravidez e induzem o cio dos animais. Dentre os estrogênios naturais, o 17β-estradiol é
mais ativo do que a estrona e o estriol, sendo que estes dois últimos são derivados do
primeiro. Estriol é o principal estrogênio encontrado na urina de mulheres grávidas e
também na placenta. A estrona está em equilíbrio metabólico com o 17β-estradiol. Os
estrogênios sintéticos são geralmente usados como anticoncepcionais orais.
A grande maioria das substâncias estrogênicas presentes no meio ambiente são
consideravelmente menos potentes do que os estrogênios endógenos e estão presentes
em baixas concentrações no tecido humano (RAJAPAKSE et al., 2001). Por outro lado,
os estrogênios sintéticos geralmente são mais estáveis na água dos que os estrogênios
naturais e são mais potentes (SNYDER et al., 1999).
O 17β-estradiol é o estrogênio humano primário, ele representa o maior potencial
estrogênico e o padrão pelo qual a atividade estrogênica é medida. A potência relativa
de algumas substâncias em relação ao 17β-estradiol é apresentada na Tabela II.7, esses
dados foram copilados do estudo de GAIDO et al. (1997).
Tabela II.7. Potências relativas de algumas substâncias estrogênicas comparadas com o
17β-estradiol (GAIDO et al., 1997).
Substância química
Razão de potência estrogênica
(em relação ao 17β-estradiol)
17
β
-estradiol
1
DES
0,64 (1/1,57)
Nonilfenol
0,0002 (1/5.000)
DDT
0,0000001 (1/8.000.000)
Bisfenol A
0,00007 (1/15.000)
48
Deidroepiandrosterona
Colesterol
HO
O
HO
Pregnenolona
O
O
OH
17-OH Pregnenolona
O
O
Progesterona
HO
OH
17
β
-Estradiol
O
HO
OH
O
Testosterona
O
O
Androstenediona
17-OH Progesterona
O
HO
OH
HO
A
ndrostenediol
O
O
OH
OH
OH
HO
Estrona
Estriol
Figura II.5. Representação esquemática da biosíntese dos estrogênios naturais.
II.1.9.2.
Propriedades físico-químicas dos estrogênios
Os estrogênios naturais estrona, 17β-estradiol e estriol têm solubilidade em água
de aproximadamente 13 mg.L
-1
, o estrogênio sintético 17α-etinilestradiol tem
49
solubilidade mais baixa, 4,8 mg.L
-1
(YING et al., 2002). A Tabela II.8 apresenta as
estruturas químicas desses estrogênios e algumas características. Todos esses
estrogênios têm pressão de vapor na faixa de 2,3 x 10
-10
a 6,7 x 10
-15
mmg Hg indicando
baixa volatilidade, essas e outras propriedades estão apresentadas na Tabela II.9.
Tabela II.8. Estrutura química e algumas características dos estrogênios naturais e
sintéticos.
Estrogênio Estrutura Química Características
Estrona
HO
O
Estriol
OH
HO
OH
17 β-estradiol
HO
OH
Principal e mais potente
estrogênio natural
17 α-
etinilestradiol
OH
HO
C CH
É mais potente do que o
17
β-estradiol
50
Tabela II.9. Propriedades físico-químicas dos estrogênios.
Estrogênios
Propriedades
Estrona Estriol
17
β
-estradiol 17
α
-etinilestradiol
Peso Molecular
270,37 288,40 272,39 296,40
Solubilidade na
água
(m./L
-1
a 20
°
C)
a
13 13 13 4,8
Pressão de
Vapor
(mm Hg)
a
2,3 x 10
-10
6,7 x 10
-15
2,3 x 10
-10
4,5 x 10
-11
Log K
ow
b
3,43 2,81 3,94 4,15
K
oc
c,d
4882 1944 3300 4770
Constante de
Henry
(Pa m
3
mol
-1
)
6,2 x 10
-7
2,0 x 10
-11
6,3 x 10
-7
3,8 x 10
-7
a
LAI et al., 2000
b
coeficiente de partição octanol-água
c
YING et al., 2002
d
coeficiente de sorção
Dessas propriedades físico-químicas, observa-se que esses estrogênios são
compostos orgânicos hidrofóbicos, em baixa volatilidade, moderadamente solúveis em
água e adsorvem em sedimentos/partículas sólidas. É de se esperar que a sorção no solo,
ou sedimento ou lodo biológico seja um significativo fator na redução de concentrações
na fase aquosa (LAI
et al., 2000). Durante o tratamento biológico, provavelmente, parte
desses estrogênios fica retida no lodo biológico (na camada lipolítica das células),
devido à sua hidrofobicidade, e conseqüentemente pode ocorrer bioacumulação.
II.1.9.3.
Uso e produção
Além de serem excretados naturalmente por humanos e animais, os estrogênios
naturais também são usados na medicina humana na terapia de substituição hormonal,
no tratamento de outros distúrbios ginecológicos e no tratamento de câncer de próstata e
mama. Na medicina veterinária são usados como promotor de crescimento.
51
II.1.9.4.
Ocorrência e destino no meio ambiente
II.1.9.4.a. Excreção de estrogênios natural e sintético e seus metabólitos
Os estrogênios naturais (estrona, 17
β-estradiol e estriol) são excretados
diariamente na urina por mulheres, animais fêmeas e em menor quantidade por homens
na forma de conjugados polares inativos, predominantemente como glucuronides e
sulfatos. Porém estudos demonstram que esses estrogênios são encontrados nas ETE na
forma livre, sugerindo que ocorrem reações de transformação dessas substâncias
durante o processo na ETE (JOHNSON e SUMPTER, 2001, TERNES
et al., 1999a).
JOHNSON
et al. (2000) revisaram as quantidades diárias excretadas dos
estrogênios naturais 17
β-estradiol, estrona, estriol e da quantidade de 17α-etinilestradiol
nas pílulas orais contraceptivas e estimaram as excreções diárias de estrogênios por
humanos. Essa estimativa está apresentada na Tabela II. 10
Tabela II.10. Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humanos (JOHNSON
et al., 2000).
Categoria Estrona
17 β-Estradiol
Estriol
17 α-
Etinilestradiol
Homens
3,9 1,6 1,5 -
Mulheres menstruando
8 3,5 4,8 -
Mulheres na menopausa
4 2,3 1 -
Mulheres grávidas
600 259 6.000 -
Mulheres
- - - 35
II.1.9.4.b. Estrogênios no esgoto doméstico e efluente de ETE: Destino e remoção
dos estrogênios nas ETE.
Os estrogênios estrona, 17
β-estradiol e 17α-etinilestradiol recebem uma atenção
especial, pois são continuamente e diariamente excretados no esgoto e não são
completamente removidos nas ETE (TERNES
et al., 1999a,b). Com isso, são lançados
continuamente no sistema aquático e podem ser encontrados na água superficial, muitas
vezes usada como suprimento de água potável. Como os processos convencionais de
tratamento de água não removem totalmente esses micropoluentes (JOBLING
et al.,
1998), um risco constante é imposto aos humanos e espécies de animais.
52
Os efluentes de ETE são importantes fontes de lançamento de substâncias
estrogênicas no ambiente aquático. DESBROW
et al., (1998) e JOBLING et al. (1998)
demonstraram que os estrogênios naturais (17
β-estradiol e estrona) e sintético (17α-
etinilestradiol) são responsáveis pela maior parte da atividade estrogênica detectada em
efluentes de ETE no Reino Unido. A atividade estrogênica também foi detectada em
efluentes de ETE da Alemanha (PAWLOWSKI
et al., 2003, PAWLOWSKI et al.,
2004) Suécia (SVENSON
et al., 2003) e Reino Unido (ROUTLEDGE et al., 1998
RODGERS-GRAY
et al., 2001).
Grande parte dos estrogênios excretados por humanos e lançados no esgoto
doméstico está em uma forma conjugada que é menos ativa biologicamente
(glucuronides). Entretanto, a ocorrência de estrogênios livres em efluentes de ETE e
águas naturais (TERNES
et al., 1999a, BARONTI et al., 2000, BELFROID et al., 1999)
indica que essas formas conjugadas são convertidas em formas ativas em alguma parte
entre a entrada e a saída do esgoto doméstico das ETE. Estudos concluíram que a
desconjugação ocorre durante o processo de tratamento da ETE, por microrganismos
presentes no lodo biológico (ANDERSEN
et al., 2003, TERNES et al., 1999b,
DESBROW
et al., 1998). Escherichia coli, a qual é eliminada em largas quantidades
nas fezes e são capazes de sintetizar grandes quantidades da enzima
β-glucuronidase,
podem ser responsáveis por esta transformação (BELFROID
et al., 1999, JOHNSON e
SUMPTER, 2001).
Os estrogênios foram detectados no esgoto doméstico e efluente de ETE na
Alemanha, Brasil, Canadá, Espanha, Holanda, Itália, Inglaterra, Reino Unido, Suécia,
EUA e França na faixa de 0,2 ng.L
-1
a 0,07 µg. .L
-1
(BARONTI et al., 2000,
BELFROID
et al., 1999, CARGOUËT et al., 2004, DESBROW et al., 1998,
JOHNSON
et al., 2000, KOLPIN et al., 2002, LOPÉZ e BARCELÓ, 2001, SVENSON
et al., 2003, TERNES et al., 1999a, XIAO et al., 2001).
No Brasil em 1997, TERNES
et al. (1999a) realizaram o monitoramento de
estrogênios naturais e contraceptivo sintético na ETE da Penha/RJ. No esgoto
doméstico, os estrogênios 17
β-estradiol e estrona foram detectados em concentrações de
0,021 µg.L
-1
e 0,04 µg.L
-1
, respectivamente. As taxas de remoção de estrona observadas
foram de 67% para o efluente tratado em filtro biológico e 83% para o efluente tratado
pelo processo de lodos ativados. Para o 17
β-estradiol, estas taxas foram de 92% e
53
99,9% para o efluente tratado em filtro biológico e para o efluente tratado pelo processo
de lodos ativados, respectivamente. Para o estrogênio contraceptivo 17
α-etinilestradiol,
as taxas de remoção na ETE foram de 64% e 78% para o efluente do filtro biológico e
para o efluente do tanque de lodos ativados. A Tabela II. 11 apresentam as remoções de
estrogênios monitoradas por TERNES
et al. (1999a) na ETE da Penha/RJ.
Tabela II.11. Remoções de estrogênios monitoradas na ETE da Penha/RJ por TERNES
et al. (1999a).
Remoção (%)
Substância
Carga de estrogênios
no esgoto Doméstico
(g.dia
-1
)
Efluente
tratado/filtro
biológico
Efluente
tratado/processo de
lodos ativados
Estrona 5,0 67 83
17
β
-estradiol
2,5
92 99,9
17
α
-
etinilestradiol
0,6
64 78
Muitos estudos foram realizados para investigar o comportamento dos estrogênios
nas ETE e demonstram que essas substâncias não são completamente removidas nestes
processos de tratamento (ANDERSEN
et al., 2003, BARONTI et al., 2000,
D’ASCENZO
et al., 2003, KÖNER et al., 2000, TERNES et al., 1999ab). BARONTI et
al
., 2000 demonstraram que um processo de lodos ativados de uma ETE na Itália
removeu 95% de estriol, 87% de 17
β-estradiol, 85 % de 17α-etinilestradiol e apenas
61% de estrona. Já segundo JOHNSON e SUMPTER (2001) os processos de lodos
ativados removem em torno de 85% do 17
β-estradiol, estriol e 17α-etinilestradiol e em
menor porcentagem a estrona. No caso da estrona essa baixa remoção pode ser atribuída
a sua formação nos processos de tratamento nas ETE pela oxidação do 17
β-estradiol.
Com respeito à remoção dessas substâncias nas ETE e ambientes aquáticos, ainda não
está claro qual o processo que comanda sua eliminação, se os processos de sorção ou de
biodegradação.
CARBALLA
et al., 2004, investigaram a remoção de algumas substâncias nas
ETE na Espanha, dentre elas o 17
β-estradiol e a estrona. No tratamento primário, o 17β-
estradiol foi parcialmente removido (20%), indicando que a adsorção nas partículas
54
sólidas é o mecanismo envolvido na sua remoção. Por outro lado, no tratamento
biológico (processo de lodos ativados) o 17
β-estradiol foi removido 47%, alcançando
uma remoção global na ETE em torno de 65%. Foi detectado que as concentrações de
estrona aumentaram durante o tratamento, indicando que sob condições oxidativas, o
17
β-estradiol foi convertido em estrona, o qual é mais lentamente degradado.
SVENSON
et al. (2003) demonstraram em seu estudo que a remoção da atividade
estrogênica do esgoto doméstico nas ETE é fortemente dependente do tipo de processo
usado, o tratamento biológico aparentemente é essencial para a remoção da
estrogenicidade dos efluentes municipais. Porém, mesmo entre os processos de
tratamento biológico, diferenças de remoções também foram observadas. O processo de
lodos ativados resultou numa remoção na faixa de 69 a 94%, já os métodos baseados em
biomassa imobilizada, tais como filtros biológicos (
trickling filters), baixas remoções
foram alcançadas (em média de 28%). O uso de somente processos de precipitação
química com sais de ferro e alumínio não reduziu a atividade estrogênica. Outros
estudos também demonstram essas diferenças de remoção de substâncias estrogênicas
pelos processos biológicos (TERNES
et al., 1999a, KÖRNER et al., 2001).
Uma vez no meio aquático, os estrogênios sofrem uma série de processos, tais
como diluição, fotólise, biodegradação e sorção em sedimentos, em partículas orgânicas
e no lodo biológico, os quais podem contribuir para sua remoção da fase aquosa. O
processo de adsorção no lobo biológico é de grande importância, pois é o primeiro
estágio de biodegradação que contribui para sua remoção do meio ambiente (CLARA
et
al
., 2004).
Os processos de tratamentos convencionais em uma ETE consistem em:
tratamento preliminar (gradeamento e caixa de areia), tratamento primário
(sedimentação primária) e tratamento secundário (tratamento biológico). No tratamento
preliminar os sólidos grosseiros são retirados e muito pouca remoção de micropoluentes
é observada. No tratamento primário, há a adsorção dessas substâncias sobre os sólidos
do lodo primário. Substâncias hidrofóbicas, como muitos desreguladores endócrinos,
são removidas da fase líquida junto com o lodo primário. O grau de remoção de
compostos orgânicos é bastante dependente da remoção de sólidos suspensos pelo
processo de sedimentação. A remoção de poluentes orgânicos durante o tratamento
biológico inclui a adsorção nos flocos microbianos e posterior remoção no lodo
55
biológico, degradação química e biológica, e transformação e volatilização durante a
aeração.
A fim de se investigar a degradação de estrogênios no meio ambiente, testes em
laboratório com processo de lodos ativados de ETE (TERNES
et al., 1999b), águas
naturais e sedimentos marinhos (LAI
et al., 2000) foram realizados. TERNES et al.
(1999b) avaliaram o comportamento de estrogênios naturais e contraceptivos em ETE,
para isso, realizaram experimentos em batelada com lodo biológico aeróbio de uma
ETE na Alemanha. Os resultados mostraram que depois de um período de 1-3 h, 95%
do 17
β-estradiol foi oxidado a estrona, esta última foi degradada 50% após 24 h.
Aproximadamente 20% do 17
α-etinilestradiol foi degradado nos experimentos em
batelada após 24h com uma concentração inicial de 1 ng.L-
1
e depois de 48h com uma
concentração inicial de 1
µg.L
-1
, indicando uma relativa persistência deste estrogênio. O
comportamento e remoção dessas substâncias nas ETE dependem de suas propriedades
físico-químicas, bem como, a configuração e operação das ETE.
Segundo JOHNSON e SUMPTER (2001), nas ETE o principal mecanismo de
remoção dos estrogênios naturais é a sorção. Contudo, na literatura poucos dados são
disponíveis sobre o potencial de sorção dessas substâncias no processo de lodos
ativados. Estudos indicam a presença de estrogênios nos lodos biológicos das ETE,
mostrando que essas substâncias podem ser persistentes durante a digestão do lodo. Em
um processo de lodos ativados de uma ETE da Alemanha, estrona e 17
β-estradiol foram
detectados em concentrações de 37 ng.g
-1
e 49 ng.g
-1
, respectivamente, enquanto que o
17
α-etinilestradiol foi detectado a 17 ng.g
-1
(TERNES et al., 2001b).
A natureza hidrofóbica dos estrogênios possibilita sua adsorção em partículas
sólidas. Essa propriedade sugere que técnicas de separação que envolve a adsorção, tais
como a sedimentação, poderão resultar em uma significativa remoção desse poluente da
fase aquosa de lodos primários e secundários (BIRKETT e LESTER, 2003). Algumas
pesquisas têm relatado que a eliminação de estrogênios como o 17
β-estradiol é atribuída
à adsorção ou outros fatores independentes da degradação microbiana. Porém, estudos
demonstram que não há acumulo de 17
β-estradiol nos lodos biológicos, indicando a
remoção desses estrogênios nas ETE é devido principalmente aos processos de
biodegradação (BARONTI
et al., 2000).
56
No estudo de KÖRNER
et al. (2000), uma investigação no balanço de massa de
estrogênios em uma ETE na Alemanha demonstrou que 90% da atividade estrogênica
do esgoto bruto foi removida no tratamento, porém somente 3 % da atividade biológica
foi encontrada no lodo biológico, constatando que a maior parte da atividade
estrogênica foi biodegradada durante o tratamento e menor parte ficou adsorvida nos
sólidos suspensos.
II.1.9.4.c. Estrogênios em águas naturais
Devido ao efeito potencial dos estrogênios em espécies de animais e humanos,
fica claro que a ocorrência dessas substâncias no esgoto doméstico e águas naturais são
muito importantes. Estudos demonstram que esses micropoluentes e seus metabólitos
estão presentes em ambientes aquáticos, em faixas de concentrações de
µg.L
-1
e ng.L
-1
,
em várias partes do mundo, tais como, Alemanha (HARTIG
et al., 1999, HIRSCH et
al
., 1998, PUTSCHEW et al., 2001, SACHER et al., 2001, TERNES et al., 1999a),
Áustria (AHRER
et al., 2001), Brasil (STUMPF et al., 1999, TERNES et al., 1999a),
Canadá (TERNES
et al., 1999a, WINKLER et al., 2001), Espanha (FARRÉ et al.,
2001, RODRÍGUEZ
et al., 2003), Holanda (BELFROID et al., 1999, JOHNSON et al.,
2000), Inglaterra (DESBROW
et al., 1998), Itália (BARONTI et al., 2000, JOHNSON
et al., 2000), Japão (BEHNISCH et al., 2001, NAKAMURA et al., 2001), Suíça
(BUSER
et al., 1998a, BUSER et al., 1998b, BUSER et al., 1999), Estados Unidos
(KOLPIN
et al., 2002, LINDSEY et al., 2001, SNYDER et al., 1999), Reino Unido
(XIAO
et al., 2001) e França (CARGOUËT et al., 2004).
O Anexo 1 apresenta uma compilação das concentrações médias ou faixas de
concentrações de estrogênios naturais e sintéticos detectadas no meio ambiente, em
trabalhos conduzidos por diversos autores.
II.1.9.4.d. Estrogênios em detritos de animais
Outra grande fonte de hormônios esteróides é o esterco proveniente de criações de
animais, tais como, gado, porcos, ovelha e aves. Estrogênios são naturalmente
produzidos e excretados por animais, como também são administrados como
57
promotores de crescimento (CASEY
et al., 2003). Os hormônios e outros fármacos são
intensivamente na criação de animais (REFSDAL, 2000). Detritos de animais algumas
vezes são usados como adubo ou podem contaminar o solo de regiões com grandes
criações de animais (PETERSON
et al., 2000, TASHIRO et al., 2003) e podem
potencialmente contaminar as águas superficiais e subterrâneas e os sedimentos
marinhos. FINLAY-MOORE
et al. (2000) determinaram as concentrações de 17β-
estradiol e testosterona do solo e do percolado dos pastos onde foram usados detritos de
aves como fertilizantes, demonstrando que esses hormônios apresentam potencial de
contaminação.
Outros estudos relatam o impacto dos detritos de criações de animais como uma
fonte de hormônios esteróides em ambientes aquáticos de áreas rurais (PETERSON
et
al
., 2000, TASHIRO et al., 2003). TASHIRO et al. (2003) detectaram atividade
estrogênica, proveniente da presença de estrogênios, em águas superficiais e sedimentos
marinhos de regiões próximas à criação de porcos ao sul da Ilha de Okinawa (Japão).
PETERSON
et al. (2000) detectaram 17β-estradiol, na faixa de 6 a 66 ng.L
-1
, em fontes
de águas próximas a regiões que usam detrito de criação de aves como fertilizantes.
Em vista disso, o uso de detritos de animais na agricultura é uma considerável
fonte de contaminação por estrogênios ao meio ambiente. Outros estudos investigam a
persistência e a degradação dos estrogênios naturais e sintéticos no solo (COLUCCI
et
al
., 2001, COLUCCI e TOPP, 2001). Em um solo agrícola, o 17β-estradiol alcançou
remoções de 90,7% em 3 dias, em condições controladas, a determinação da atividade
estrogênica no extrato de solo indicou que outras substâncias estrogênicas não foram
formadas durante a degradação do 17
β-estradiol (COLUCCI et al., 2001).
II.1.9.5
Estudos relevantes da avaliação dos efeitos de potencial do 17β-estradiol
Uma das ações da Comissão Estratégica Comunitária em Matéria dos
Desreguladores Endócrinos estabelecida pela Comissão das Comunidades Européias foi
o estabelecimento de uma lista prioritária com 553 substâncias sintéticas e 9 hormônios
naturais e sintéticos, para uma futura avaliação do seu papel na desregulação endócrina
(COM(2001) 262). Uma ação prioritária foi o início de uma avaliação detalhada de um
58
grupo de 12 substâncias candidatas a desreguladores endócrinos, dentre elas, o 17
β-
estradiol. (WRc-NSF, 2002).
A conclusão obtida pelo relatório WRc-NSF (2002) em relação ao 17
β-estradiol é
que há evidências de que este estrogênio causa efeitos na reprodução e desenvolvimento
de peixes, e estes efeitos acontecem em concentrações ambientalmente relevantes, ou
seja, concentrações detectadas no meio ambiente. Dados globais indicam que o nível
mínimo sobre o qual são observados efeitos em peixes está na faixa 5 - 25 ng.L
-1
baseado em respostas de diferentes ensaios. Sendo assim, o 17
β-estradiol pode
representar um risco para os animais aquáticos. Esta observação seria consistente com
os resultados de pesquisas realizadas por outros países, como por exemplo o Programa
COMPREHEND.
O dados de toxicidade crônica para peixe indicam que os níveis de 17
β-estradiol
que causar efeitos gerais ocorrem em níveis > 100 ng.L
-1
(WRc-NSF, 2002).
II. 2. MÉTODOS DE ENSAIOS USADOS PARA AVALIAR OS DE
Em muitos casos a relação entre a exposição ambiental a uma substância
específica e os efeitos adversos na saúde de humanos e animais ainda não foi bem
estabelecida. Mais pesquisas são necessárias para a completa caracterização dos efeitos
adversos resultante dessa exposição e para o entendimento dos mecanismos básicos de
ação desses efeitos.
Várias substâncias com potencial de causar efeitos em seres vivos estão presentes
em efluentes de ETE, chorume de aterros sanitários e águas naturais, e são
continuamente lançados no meio ambiente. São de grande importância o
desenvolvimento de metodologias analíticas e técnicas de monitoramento para
quantificar e analisar os efeitos endócrinos dos desreguladores endócrinos causados em
humanos e animais expostos. Análises rápidas e confiáveis de um grande número de
substâncias químicas e amostras ambientais requerem ensaios simples, sensíveis e
algumas vezes específicos. Com isso, muitos ensaios
in vitro e in vivo têm sido
desenvolvidos para este fim.
59
Vários ensaios
in vivo e in vitro são desenvolvidos para analisar os efeitos
causados por substâncias presentes no meio ambiente suspeitas ou confirmadas como
desreguladores endócrinos. Contudo há ainda a necessidade de validar os ensaios
in vivo
e
in vitro para avaliar, com uma melhor precisão, esses efeitos. Organizações mundiais
renomadas, tais como, OECD e US EPA, elaboram diretrizes internacionais de métodos
de ensaios para investigar os efeitos dos desreguladores endócrinos (EDSTAC, 1998 e
OECD, 2002). O OECD produz diretrizes reconhecidas internacionalmente em métodos
de teste por investigar e os efeitos ambientais de substâncias químicas.
Os ensaios
in vivo utilizam vários parâmetros, como peso de órgãos sexuais,
diferenciação celular, expressão de proteínas e atividades enzimáticas (GRAY
et al.,
1997, BAKER, 2001). Os ensaios
in vitro que estão sendo usados para analisar a
atividade estrogênica de substâncias químicas, são baseados em mecanismos de ação
que elucidam respostas e utilizam pontos mais definidos do que os ensaios
in vivo, tais
como a interação com receptores hormonais, proliferação de células, entre outros.
Contudo, ensaios
in vitro em conjunto com ensaios in vivo são requeridos para uma
completa análise dos potenciais de riscos dos desreguladores endócrinos presentes no
meio ambiente.
Pesquisadores relatam a existência de ensaios
in vivo, in vitro e ex-vivo (ensaio in
vivo
medido por funções de análise in vitro) para avaliar os efeitos dos desreguladores
endócrinos. Algumas medições finais, chamadas de “
endopoint” dos ensaios in vivo
incluem pesagem e histologia de órgãos reprodutivos, níveis de hormônios no sangue,
ativação de gene
in vivo, síntese de proteínas, comportamento, crescimento,
desenvolvimento, manutenção da gravidez e anatomia/morfologia. Os métodos dos
ensaios
in vitro incluem proliferação de células animais, ligação nos RE e RA, síntese
de hormônios/enzima esteróides, ensaio de gene repórter recombinante usando células
transfectadas estáveis ou transientes (expressão de um gene transferido nas células) e
análises bioquímicas. Os métodos
ex vivo podem ser medidos pela síntese de esteróides
do ovário/testículos (GRAY
et al., 1997).
Como o mecanismo de ação mais investigado é o de mimetizar a ação de
estrogênio endógeno pela ligação no RE, vários bioensaios exploram esse mecanismo
de ação para identificar e analisar substâncias estrogênicas.
60
Os ensaios
in vivo e in vitro apresentam vantagens e desvantagens (GRAY et al.,
1997, ZACHAREWSKI, 1997). Os ensaios
in vitro têm algumas vantagens tais como
sensibilidade a baixas concentrações, respostas específicas, custo baixo, requer pouca
quantidade de amostra, pode ser usado para misturas complexas (águas naturais, lodos
biológicos, etc). Porém, resultados inconsistentes entre diferentes ensaios
in vitro
também têm sido relatados, que podem ser devidos à capacidade metabólica diferente
dos diversos testes usados (BERESFORD
et al., 2000).
Em contrapartida, os ensaios
in vivo apresentam vantagens como explicações para
os mecanismos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção. São ensaios bem
definidos usados por décadas para testes toxicológicos e análise de riscos, incorpora
uma larga faixa de mecanismos, fornece a compreensão e avaliação do sistema
endócrino como uma unidade (GRAY
et al., 1997, ZACHAREWSKI, 1997). Porém, a
falta de especificidade é outra limitação dos ensaios
in vivo, quando o objetivo do
estudo é analisar mecanismos de ação específicos, tais como via RE, RA ou síntese de
um hormônio esteróide, além do problema da utilização de animais nos ensaios (GRAY
et al., 1997). Estudos demonstram que, normalmente, a potência relativa de substâncias
estrogênicas em ensaios
in vitro não refletem a potência em ensaios in vivo, ou seja, as
substâncias estrogênicas são mais potentes
in vivo do que in vitro (FOLMAR et al.,
2002).
Assim, os dois tipos de ensaios se deparam com algumas limitações devido a
custos, sensibilidade, respostas, utilização em largas escalas, entre outros
(ZACHAREWSKI, 1997).
Alguns dos ensaios
in vitro e in vivo desenvolvidos e mais utilizados, de acordo
com a literatura, são apresentados a seguir.
II.2.1. Ensaios in vivo
II.2.1.1. Ensaio em roedores
Dois ensaios clássicos para a identificação de substâncias estrogênicas são ensaio
uterotrófico (alteração do peso uterino) e ensaio de cornificação da mucosa vaginal
61
(ensaio para detectar mudanças histológicas nas células epiteliais da mucosa vaginal)
em roedores (BAKER, 2001).
Em 1923, ALLEN e DOISY (1923) desenvolveram um ensaio com ratos e
camundongos para determinar a atividade estrogênica de substâncias químicas através
da avaliação da alteração do peso uterino, cornificação vaginal, receptividade sexual
feminina e idade da puberdade/abertura vaginal após a exposição às substâncias
testadas. Este é um dos primeiros ensaios desenvolvidos para detectar atividade
estrogênica, e se apresentou como um ensaio útil e sensível na determinação de
substâncias estrogênicas.
Há uma variedade de protocolos descritos para esses ensaios, incluindo o uso de
ratos ou camundongos em vários estágios da vida e o uso de rotas orais ou subcutâneas
de administração das substâncias químicas (ODUM
et al., 1997).
As vantagens desse ensaio é que há a incorporação de todos os aspectos do
sistema endócrino, permitindo um estudo da absorção, metabolismo, distribuição e
excreção da substância, como também de caminhos alternativos para avaliar os efeitos
dos desreguladores endócrinos. Entretanto, já foram relatados resultados inconsistentes,
além de ser um ensaio com custo e tempo alto e sendo ainda necessário ser usado em
conjunto com outros ensaios
in vitro, somado ao problema de utilização de animais nos
ensaios (BERESFORD,
et al., 2000).
Além disso, bioensaios com roedores não são adequados para analisar substâncias
em larga escala lançadas no meio ambiente, devido ao custo, complexidade e problemas
éticos com animais (SOTO
et al., 1995).
II.2.1.2.
Ensaio da indução da síntese de vitelogenina (VTG)
Numerosos testes com biomarcadores têm sido desenvolvidos para detectar a
atividade estrogênica de substâncias (HANSEN
et al., 1998, ZACHAREWSKI, 1997).
Um marcador bastante usado com este fim é a determinação de níveis de Vitelogenina
(VTG) no plasma sangüíneo de um organismo (PANTER
et al., 1998, SCHMID et al.,
2002). VTG é uma proteína que desempenha um importante papel no sistema
reprodutivo de vertebrados ovíparos fêmeas. É sintetizada no fígado, regulada por
62
estrogênio e transportada através do sangue para os ovários, onde será incorporada no
desenvolvimento dos óvulos (IRWIN
et al., 2001, PANTER et al., 1998).
De um modo geral, o gene do VTG também está presente em organismos machos,
mas sob condições normais não é expresso, ou seja, a síntese de VTG nos machos é
muito baixa ou não detectada, possivelmente, pela baixa concentração de estrogênio no
sangue (SCHMID
et al., 2002). Entretanto, quando peixes machos são expostos a
substâncias estrogênicas são capazes de produzir uma grande quantidade de VTG,
similar às fêmeas. O aumento de VTG no plasma de um organismo é considerado uma
evidência da exposição a substâncias com atividade estrogênica (HANSEN
et al., 1998,
JOHNSON
et al., 2000).
O ensaio de indução da síntese de VTG é um ensaio
in vivo muito usado para
avaliar a exposição estrogênica em ambientes aquáticos, e se apresenta como uma
ferramenta apropriada para determinar os efeitos endócrinos em peixes. Este bioensaio é
realizado em curto prazo, relativamente de baixo custo, mostra uma resposta direta e
pode ser facilmente medido. Os níveis de VTG no plasma dos animais são medidos
através dos ensaios de imunoadsorção enzimática (ELISA) ou radioimunoensaio (RIE).
A indução da síntese de VTG no plasma de peixes machos tem sido usada como
um biomarcador específico para detectar substâncias estrogênicas em ambientes
aquáticos, em efluente de ETE, esgoto doméstico e sedimentos marinhos (DESBROW
et al., 1998, GAGNÉ et al., 2001, JOBLING et al., 1998, SOLÉ et al., 2003).
Outros organismos também são usados para avaliar a atividade estrogênica através
da indução da síntese da proteína VTG, tais como, pássaros, anfíbios e répteis (OEDC,
2002).
Outros ensaios
in vivo usados para avaliar o efeito estrogênico de uma substância
podem ser encontrados na revisão realizada por GRAY
et al. (1997). Estes ensaios
levam em consideração os efeitos das substâncias estrogênicas no sistema reprodutivo,
alterações no desenvolvimento da puberdade, alteração da diferenciação sexual e
desenvolvimento de animais machos e fêmeas.
63
II. 2.2. Ensaios in vitro
Os ensaios in vitro se baseiam em mecanismos de ação específicos dos
desreguladores endócrinos e se apresentam como ferramentas úteis para a determinação
do efeito potencial de substâncias individuais, bem como, misturas de substâncias e
amostras ambientais.
Os ensaios
in vitro mais usados para avaliar o potencial de substâncias em afetar o
sistema endócrino incluem: (1) ensaios de interação com receptores hormonais
(determinam a capacidade de uma substância acoplar-se aos receptores hormonais), (2)
ensaios de proliferação de células (análise da capacidade de uma substância estimular o
crescimento de células sensíveis a estrogênios), (3) ensaios de gene repórter em células
de mamíferos ou leveduras (analises da capacidade de uma substância estimular a
transcrição do gene repórter inseridos nas células) (BAKER, 2001).
Muitos outros ensaios
in vitro são usados na determinação da atividade
estrogênica de substâncias químicas ou amostras complexas. Uma grande variedade de
linhagens de células humanas e animais (ratos, camundongos, boi), como também
outros
endpoint são empregados. Uma revisão detalhada desses ensaios pode ser
encontrada em OECD (2002).
Os ensaios
in vitro medem a atividade estrogênica total de uma amostra
negligenciando quais compostos são responsáveis por essa atividade. A atividade
estrogênica total na amostra é então comparada com a atividade do estrogênio endógeno
17
β-estradiol, e pode ser expressa como equivalentes de estradiol (EQ-E
2
).
Os ensaios de ligação nos receptores hormonais sozinhos são suficientes para
determinar a atividade estrogênica de uma substância química, uma vez que a
estrogenicidade é dependente da afinidade do ligante pelo RE e de sua capacidade de
manter ocupado o RE que irá iniciar eventos em cascata que culminem em respostas
adversas. Estudos sugerem que respostas complexas tais como, a modulação do sistema
endócrino e/ou o comprometimento da saúde reprodutiva podem requerer não somente
eventos que envolvam ligação com receptores, mas também a ação acumulativa
continuada da ocupação do complexo ligante-RE (ZACHAREWSKI, 1997).
64
Numerosos estudos empregaram ensaios
in vitro para avaliar a atividade
estrogênica de efluentes de ETE, esgoto doméstico e águas naturais em vários países.
II.2.2.1.
Ensaio de ligação competitiva nos receptores dos hormônios esteróides
Muitos ensaios que determinam à atividade estrogênica de substâncias químicas
são baseados no modo de ação das substâncias estrogênicas de acoplar-se ao RE e
resultar em um subseqüente efeito na atividade biológica. Os ensaios de ligação
competitiva nos receptores dos hormônios esteróides são métodos que
investigam a
capacidade de uma substância de competir com estrogênios pela ligação no RE, para
isso utilizam estrogênios radiomarcados, no caso do RE o hormônio usado é o [
3
H]17β-
estradiol (BIRKETT e LESTER, 2003, GRAY
et al., 1997).
Nos ensaios de ligação competitiva o RE é extraído de uma cultura de células, tal
como as MCF-7 (células cancerígenas mamarias humanas) e incubado com [
3
H]17β-
estradiol e a substância testada, podendo também ser usado o estrogênio sintético DES
como controle. Os [
3
H]17β-estradiol acoplados aos RE são extraídos e quantificados em
um cintilador líquido. Quanto menos [
3
H]17β-estradiol estiver ligado aos RE indica que
as substâncias testadas têm a capacidade de competir pela ligação no domínio de ligação
hormonal (DLH) nos RE (BIRKETT e LESTER, 2003).
Os ensaios que investigam a interação direta do RE com um ligante têm sido
extensivamente utilizados para analisar a atividade estrogênica de substâncias químicas.
Porém, só podem ser usados para substâncias estrogênicas que possuem a capacidade de
se ligar ao RE e elucidar uma resposta. No caso dos ensaios de ligação competitiva, as
substâncias testadas competem com o estrogênio natural pelo RE. A maior limitação
deste ensaio é que não podem distinguir entre efeitos agonista e antagônico (BIRKETT
and LESTER, 2003, ZACHAREWSKI, 1997).
Os ensaios de ligação competitiva nos receptores dos hormônios esteróides são
relativamente rápidos. Entretanto, são significativamente menos sensíveis do que outros
ensaios
in vitro, além de não serem facilmente disponíveis para a automatização e sendo
necessário à utilização de substâncias radiomarcadas, limitando seu uso para sua
utilização como uma ferramenta de análise (
screening).
65
Embora os ensaios de ligação de receptor tenham sido desenvolvidos e utilizem
receptores de estrogênios humanos (RE
α), receptores de estrogênio de outras espécies
também têm sido utilizados, tais como, de répteis e peixes , para substâncias que exibem
maior afinidade por estes receptores (BIRKETT e LESTER, 2003). Além disso, também
tem sido desenvolvido ensaio de ligação com receptor de andrógeno (RA) e receptor de
progesterona (RP) (GRAY
et al., 1997).
II.2.2.2.
Ensaios de proliferação celular
Estes ensaios se baseiam na proliferação de culturas de células cancerígenas
mamarias humanas induzidas pela exposição à substância estrogênica. Comumente, são
usadas culturas de células cancerígenas mamárias humanas MCF-7 ou T47-D receptor-
positivo de estrogênio.
O bioensaio com cultura de células, o qual avalia a proliferação de células
cancerígenas mamárias humanas MCF-7 em resposta a exposição a substâncias
estrogênicas, é conhecido como ensaio de E-screen. A cultura de células MCF-7 foi
derivada de uma efusão pleural de uma paciente com câncer de mama nos anos 70s
(DICKSON e LIPPMAN, 1986). Neste bioensaio, as células MCF-7 são incubadas (seis
dias) com e sem controle de 17
β-estradiol e na presença e ausência de substância ou
amostra ambiental a ser testada. A proliferação das células é determinada através da
contagem do número de células ou núcleos (SOTO
et al., 1995), contudo algumas
modificações e simplificações têm sido realizadas que permite a determinação da
proliferação das células por um método colorimétrico (KÖNER
et al., 1999 e 1998),
além de outras técnicas de medidas também têm sido utilizadas (GRAY
et al., 1997).
O ensaio E-screen é baseado em três premissas: (1) fatores presentes no soro
adicionado no meio inibem a proliferação das MCF-7, (2) os estrogênios induzem a
proliferação das células pela anulação deste efeito inibitório, e (3) substâncias não
estrogênicas não neutralizam o sinal inibitório presente no soro (WORKING REPORT
No. 43, 2003).
O potencial estrogênico de muitas substâncias químicas simples e misturas de
substâncias têm sido avaliados usando o ensaio E-screen, que também tem sido eficiente
66
para avaliar a atividade estrogênica em efluentes de ETE (KÖNER
et al., 1999 e 2000),
esgoto sanitário (KÖRNER
et al., 1999 e 2000), águas naturais (OH et al., 2000),
sedimentos aquáticos (OH
et al., 2000) e chorume de aterros sanitários (BEHNICSH et
al
., 2001). KÖRNER et al. (1999) investigaram a importância do lançamento de
substâncias estrogênicas, via esgoto sanitário, nos rios da Alemanha, aplicando o ensaio
E-screen. Este estudo determinou que em todas as nove amostras de efluente de cinco
diferentes ETE da Alemanha, significativos níveis de atividade estrogênica entre 2,5 e
25 ng de equivalente estradiol (EQ-E
2
)/L, constatando que os efluentes de ETE são as
maiores fontes de lançamento de substâncias estrogênicas nos rios e lagos.
O ensaio E-screen é considerado um ensaio muito sensível, confiável e
relativamente simples, com o qual podem ser analisadas substâncias simples ou
múltiplas substâncias químicas ao mesmo tempo (KÖRNER
et al., 1999, OH et al.,
2000). Porém, alguns fatores afetam a determinação do potencial estrogênico de uma
substância, tais como, diferenças entre células da cultura, condições da cultura,
diferentes níveis dos receptores, densidade das células, que podem complicar a
padronização do ensaio que asseguram sua reprodutividade (BIRKETT e LESTER,
2003, ZACHAREWSKI, 1997).
Além da medida da indução de proliferação das células MCF-7, outros
endpoint
também tem sido usados para avaliar a resposta dessas células a substâncias
estrogênicas, tais como, níveis do receptor de progesterona ou seu mRNA, exo-
proteinas específicas (por exemplo pS2) ou atividade da enzima luciferase (OECD,
2002).
II.2.2.3.
Ensaios de gene repórter recombinante
Ensaios de gene repórter são baseados na capacidade de um componente de
estimular uma atividade transcricional dependente RE (
ER-dependent transcriptional
activity
). Assim, a expressão do gene repórter é um resultado de uma cascata molecular
de eventos implicada pela ativação do receptor, e como tal promove uma integral
indicação da atividade estrogênica de um componente. Esses ensaios
in vitro são
conduzidos com culturas de células mamíferas (câncer humano) ou culturas de
leveduras geneticamente modificadas. São disponíveis para uso nesse ensaio culturas de
67
células com um RE endógeno (células T47D ou MCF-7) ou culturas de células sem um
RE endógeno (células de leveduras ou Hela).
Nos ensaios de gene repórter baseado em células de mamíferos (ER-Calux e
ensaio com células MVLN) o gene repórter codifica para luciferase. No ensaio de gene
repórter baseado em levedura (YES), o gene repórter codifica para
β-galactosidase.
Nos ensaios de gene repórter, a amostra é adicionada às células transfectadas, as
substâncias estrogênicas entram nas células e ligam-se aos RE, o quais se tornam
ativados pela mudança na conformação e se ligam aos ERE. Esta ligação inicia a
expressão do gene repórter e assim ocorre a síntese de uma enzima. Um substrato
presente no meio é metabolizado pela enzima sintetizada, o subproduto formado pode
ser então detectado.
A escolha de qual ensaio de gene repórter empregar, baseado em levedura ou
baseado em células de mamíferos, depende de alguns fatores como baixos custos, fácil
uso e baixo limite de detecção. Diferenças entre ensaio YES e baseado em células de
mamíferos existem, como por exemplo, na sensibilidade da resposta do ensaio com
células de mamíferos que podem detectar baixas concentrações quando comparado com
o ensaio com levedura e na presença de substâncias tóxicas que podem inibir o
crescimento das células animais, mas não as células de levedura.
II.2.2.3.a. Ensaios gene repórter baseado em células de mamíferos
Os ensaios gene repórter baseados em células de mamíferos incluem: (a) ensaio de
expressão do gene da luciferase quimicamente ativada mediante RE (
ER-mediated
chemical activated luciferase gene expression
) denominado de ER-CALUX (Estrogen
Receptor – Chemically Activated LUciferase eXpression
), (b) ensaio com células
MVLN, entre outros (OECD, 2002, WORKING REPORT No. 43, 2003)
O ensaio ER-CALUX utiliza células T47D de adenocarcinoma de mama humano
com RE endógeno, o qual são estavelmente transfectadas com um gene repórter de
luciferase (
Luc) estrogênio-responsivo que contém três EREs. No ensaio, no interior das
células, a substâncias estrogênicas se ligam aos RE endógenos ativando-os. Com isso, o
complexo ligante-receptor se liga aos EREs presentes na região do promotor do gene da
68
luciferase, conduzindo a expressão do gene da luciferase. A enzima luciferase é liberada
através do lise das células, que metaboliza o substrato luciferina e a luz produzida pode
ser medida em um luminômetro (LEGLER
et al., 2002, WORKING REPORT No. 43,
2003).
Os princípios do ensaio de células MVLN são semelhantes aos do ensaio de ER-
CALUX. Entretanto, o ensaio com células MVLN utiliza uma linhagem de células
derivadas das células MCF-7 que expressam o RE endógeno e estavelmente
transfectadas com um gene repórter da luciferase estrogênio-responsivo (o plasmídeo de
vitellogenin-A2-promotor / repórter de luciferase - p-Vit-tk-Luc). Como no ensaio ER-
CALUX, a atividade estrogênica da substância química testada é diretamente
relacionada à atividade da luciferase medida após o lise das células MVLN (WORKING
REPORT No. 43, 2003).
II.2.2.3.b. Ensaios gene repórter baseado em células de levedura
As células de leveduras são transformadas pela introdução de vetores contendo
seqüências de DNA para receptores humanos ou de animais, junto com o gene repórter
contendo elementos de respostas (BIRKETT e LESTER, 2003, GRAY
et al., 1997). A
ativação do receptor pela substância testada resulta na estimulação da expressão do gene
repórter seguida pela ativação de um elemento resposta. Estes ensaios são bastante
usados para avaliar substâncias químicas suspeitas de causar atividade estrogênica
através da interação com receptores de estrogênio.
Os ensaios baseados no uso de levedura geneticamente modificada são
promissores devido a sua simplicidade molecular e biológica, fácil manipulação e baixo
custo (WU
et al., 2002). As culturas recombinantes de levedura é uma ferramenta muito
útil para investigar a função do receptor hormonal de mamíferos isoladamente (GAIDO,
et al., 1997). Esses ensaios com leveduras podem ser utilizados para analisar a interação
de substâncias químicas com múltiplos receptores de hormônios esteróides, como o
receptor de estrogênio (ROUTLEDGE e SUMPTER, 1996), receptor de andrógino
(GAIDO,
et al., 1997, SOHONI e SUMPTER, 1998) e receptor de progesterona
(GAIDO,
et al., 1997).
69
Um grande número de pesquisadores tem usado os ensaios com leveduras gene
repórter para analisar a atividade estrogênica de uma variedade de substâncias químicas.
ROUTLEDGE e SUMPTER (1996) desenvolveram um ensaio com a levedura
Saccharomyces cerevisiae na qual foi inseridos um gene receptor de estrogênio humano
(REh) e a expressão do plasmídeo com um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e
um gene repórter lacZ, o qual codifica a enzima galactosidase. Um ligante ativo (o qual
tenha a capacidade de acoplar-se ao RE) induz a expressão da
β-galactosidase. A
medida é determinada pela produção da enzima galactosidase que metaboliza o
substrato cromogênico clorofenol vermelho-
β-D-galactopiranosida (CPRG) presente no
meio, que é um produto amarelo para vermelho o qual é medido pela absorbância a
540nm. A produção de
β-galactosidase no meio depende da quantidade de substância
estrogênica. A medida da absorbância pela espectrofotometria pode estimar a
quantidade de substância estrogênica no meio de análise.
Outros ensaios com leveduras recombinantes, com culturas de células e
metodologia diferentes do ensaio desenvolvido por ROUTLEDGE e SUMPTER (1996)
também têm sido usados para avaliar a atividade estrogênica de substâncias químicas
(ARNOLD,
et al., 1996, GAIDO et al., 1997, REHMANN et al., 1999).
Os ensaios in vitro que utilizam gene repórter também têm sido adaptados para
outros receptores tais como receptores RA e RP, possibilitando assim a avaliação de
substâncias que interagem com esses outros receptores hormonais esteróides (GAIDO
et
al
., 1997, GRAY et al., 1997, SOHONI e SUMPTER, 1998).
Os ensaios que utilizam a levedura contendo REh para identificar substâncias
estrogênicas pela interação com o receptor de estrogênio humano, é comumente referido
como ensaio YES (
yeast estrogen-inducible expression system ou recobinant yeast
estrogenic system
) ou RYA (recombinant yeast assay).
Com algumas modificações em sua metodologia, os ensaios YES podem ser
usados para investigar, tanto a atividade hormonal agonista como antagonista de
substâncias químicas. No ensaio YES, para determinar se uma substância possui
atividade antagônica, um ligante natural (17
β-estradiol) deve ser adicionado ao meio de
análise numa concentração que produza uma resposta sub-máxima (65%); a capacidade
70
da substância testada em inibir a mudança de cor pelo ligante natural será determinada
(SOHONI e SUMPTER, 1998).
A atividade estrogênica tem sido o mecanismo de ação dos desreguladores
endócrinos mais investigado. Porém, os desreguladores endócrinos possuem outros
mecanismos de ação, como a capacidade de se ligar a outros receptores ou múltiplos
receptores resultando também na deterioração do sistema endócrino. Por isso, os ensaios
YES também são usados para avaliar atividades anti-estrogênicas, androgênicas e anti-
androgênicas de várias substâncias químicas (SOHONI e SUMPTER, 1998, COLLINS
et al., 1997, MOFFAT et al., 2001). SOHONI e SUMPTER (1998) mostraram que
algumas substâncias conhecidas como estrogênicas também possuem atividade anti-
androgêna, tais como o DDT e seu metabólito DDE, o bisfenol A e ftalatos. Esses
resultados demonstram que substâncias químicas que mimetizam estrogênios podem ter
atividades hormonais múltiplas, isso pode fazer com que a interpretação dos
mecanismos de ação in vitro de uma substância seja dificultada.
O ensaio de YES também tem sido usado com sucesso na identificação de
substâncias estrogênicas em efluentes de ETE, esgoto sanitário, águas naturais e extrato
de solo (COLUCCI et al., 2001, COLUCCI e TOPP, 2001, PAWLOWSKI et al., 2003,
PAWLOWSKI et al., 2004, SVENSON et al., 2003, TANAKA et al., 2001). E além de
ser um ensaio muito utilizado para se avaliar a atividade estrogênica de uma substância,
mistura de substâncias e amostras em geral, também tem sido usado para estabelecer a
relação atividade - estrutura estrogênica (ROUTLEDGE e SUMPTER, 1997,
SCHULTZ e SEWARD, 2000, SCHULTZ, 2002), no entanto, essa relação ainda não
esta completamente entendida.
Os ensaios com leveduras recombinantes também têm sido usados para avaliar os
efeitos sinérgicos de uma mistura de substâncias estrogênicas (ARNOLD et al., 1997,
RAJAPAKSE et al., 2001). O ensaio YES é ideal para ser usado para avaliar efeitos
combinados, pois é rápido e mostra-se ser altamente reprodutivo e sensível
(BERESFORD
et al., 200). Estudos demonstram que o REh contém múltiplos DLH e a
interação com duas diferentes substâncias pode produzir atividade estrogênica
sinergística (ARNOLD
et al., 1997). ARNOLD et al. (1997) demonstraram que a
combinação de duas substâncias estrogênicas, o 17
β-estradiol e a estrona, produziram
um aumento sinérgico na atividade estrogênica esperada, outras combinações de
71
estrogênios também provocaram efeitos sinérgicos. O autor constatou ainda, que a
atividade sinérgica na levedura e a combinação de substâncias estrogênicas foram
correlacionados com a ligação das duas substâncias no REh simultaneamente.
Os ensaios gene repórter
in vitro é uma importante ferramenta, pois é capaz de
indicar um mecanismo potencial de ação de uma substância, bem como também
considera os efeitos sinergisticos, antagonisticos e interações aditivas que podem
ocorrer com misturas complexas (WU
et al., 2002).
As vantagens dos ensaios YES são suas especificidade, sensibilidade, capacidade
de realizar análise de grande quantidade de amostras com processo de fácil manuseio
(por que as células não precisam ser continuamente transformadas) e econômico, não
necessita o uso de substâncias radiomarcadas. Porém, algumas amostras ambientais
podem conter interferentes tóxicos as células de leveduras e podem apresentar cor o
qual pode interferir na medida do ensaio com leveduras. Entretanto, as amostras podem
ser fracionadas e os interferentes removidos (
clean-up) antes desses ensaios.
Segundo a União Européia (COMPREHEND, 2002), os ensaios baseados em
leveduras geneticamente modificadas (ensaio de YES) são suficientemente robustos e
seguros para analisar a atividade estrogênica de amostras simples e efluentes
complexos. Os ensaios YES têm o potencial de padronização para testes rotineiros em
efluentes, mas duas fontes de interferência foram identificadas: a toxicidade de alguns
efluentes para as células de levedura que pode ser superada pela diluição e os acetatos
de alquilfenóis que suprimem a atividade estrogênica de esteróides e de alquilfenóis.
Alguns ensaios
in vivo e in vitro usados para identificar e classificar substâncias
naturais e sintéticas com efeitos endócrinos são apresentados na Tabela II.12. Algumas
vantagens e desvantagens dos ensaios
in vitro e in vivo são apresentadas na Tabela II.13.
72
Tabela II.12. Sumário de ensaios in vivo e in vitro usados para identificar substâncias
com atividade estrogênica.
Ensaios
Substâncias testadas
Referências
Ensaio in vivo
Ensaio de
síntese de
VTG
17β-estradiol, estrona, 17α-etinilestradiol,
nonilfenol, dietilestilbestrol.
VAN DEN BELT
et
al
., 2004, FOLMAR
et al., 2000,
PANTER
et al.,
2000, ROSE
et al.,
2002
Ensaio in vitro
YES
Fitoestrogênios, Fitoestrogênios (coumestrol e
genisteína), DDT, 17
β-estradiol, estrona, 17α-
etinilestradiol, bisfenol A, testosterona,
dietilestilbestrol, nonilfenol, metoxicloro, DDE,
dihidrotestosterona e progesterona.
COLLINS
et al.,
1997, ARNOLD
et
al
., 1996, GAIDO et
al
., 1997
YES
(Metodologia
ROUTLEGDE
e SUMPTER,
1996)
Octilfenol e nonilfenol, Fitoestrogênios
(genisteína e coumestrol), 17
β-estradiol, estrona,
cetotestosterona, dihidrotestosterona,
testosterona, 17
α-etinilestradiol, 2-
hidroxiestradiol, mestranol, bisfenol A,
metoxicloro (pesticida), nonilfenol, Bisfenol A,
dietilestilbestrol, butilbenzilftalato DDE, DDT,
estradiol 3-sulfato, 4-tert-octilfenol e 4-tert-
butilfenol
MOFFAT
et al.,
2001,
MATSUMOTO
et
al
., 2004, ELSBY et
al
., 2001, DE
BOEVER
et al.,
2001, VAN DEN
BELT
et al., 2004,
LI
et al., 2004,
SCHULTIS e
METZGER, 2004,
SOHONI E
SUMPTER, 1998 e
BERESFORD
et
al
., 2000
E-screen
Bisfenol A, PCD, dioxinas, octilfenol,
butilbenzilfatalato (BBP)
17
β-estradiol, estrona, 17α-etinilestradiol,
dietilestilbestrol, octilfenol e nonilfenol
BEHNICSH
et al.,
2001, SCHULTIS e
METZGER, 2004,
KÖNER
et al., 1999
73
Tabela II.13. Algumas vantagens e desvantagens dos ensaios in vitro e in vivo.
Ensaio Vantagens Desvantagens
Ensaio in vitro
Ensaio de
Ligação
Competitiva
nos RE
•
Ensaios rápidos.
•
São significativamente menos
sensíveis do que outros ensaios
in
vitro
•
Não é um ensaio de fácil
automatização, limitando assim sua
utilização como ferramenta
screening
•
Requer uso de aparatos especiais de
laboratórios por causa das
substâncias radioativas.
Ensaio E-
screen
•
Ensaio bastante sensível.
•
Algumas substâncias não-
estrogênicas têm influenciado a
proliferação em algumas linhagens
das células MCF-7;
•
Variabilidade inter-laboratórios têm
sido observada nestes ensaios
•
Consumo maior de tempo;
•
Cultivo mais difícil dos que as
células de leveduras;
•
Mais vulneráveis a riscos de
contaminação.
Ensaio YES
•
Simplicidade;
•
Produto do gene reporter é
excretado no meio não sendo
necessário o lise celular;
•
Células de leveduras são mais
resistentes em condições
adversas;
•
Cultivo e manutenção fáceis;
•
Rápido crescimento celular.
•
É menos sensível do que os ensaios
com células de mamíferos e o E-
screen;
•
Endpoint colorimétricos (β-
galactosidase) tendem a ser menos
sensíveis do que para os baseados
na luciferase (luminômetro).
Ensaio in vivo
Ensaio com
Roedores
•
Incorpora todos os aspectos
do sistema endócrino,
permitindo um estudo da
absorção, metabolismo,
distribuição e excreção da
substância, como também de
caminhos alternativos.
•
Não são adequados para analisar
substâncias em larga escala;
•
Custo e complexidade altos;
•
Alto tempo de ensaio;
•
Problemas éticos com o uso de
animais.
Ensaio com
biomarcadores
(VTG)
•
Realizado em curto prazo e
baixo custo;
•
Resposta direta e facilmente
medida.
74
II.2.3. Sistemas de análises
Os ensaios in vitro nem sempre predizem com confiança os resultados in vivo
devido a diferenças no metabolismo dos sistemas usados e os diversos mecanismos pelo
qual um desregulador endócrino pode atuar (BAKER, 2001). A escolha de um sistema
de ensaios apropriado para caracterizar quais substâncias podem afetar o sistema
endócrino é complexa por vários fatores, entre eles o fato de que os desreguladores
endócrinos podem atuar por diversos mecanismos de ação diferentes que podem
produzir uma grande faixa de repostas, e sabemos que muitas substâncias o fazem em
concentrações muito baixas.
Um conjunto de ensaios
in vivo e in vitro é essencial para detectar, caracterizar e
avaliar o efeito potencial de uma substância ou uma mistura de substâncias. Uma gama
de ensaios o quais compreendam vários mecanismos de ação dos desreguladores
endócrinos pode ser usada. Um exemplo dado por BAKER, 2001 inclui: 1) ensaio de
ligação nos receptores hormonais; 2) ensaio gene repórter e 3) ensaio
in vivo (ex. ensaio
uterotrófico).
Enfim, a caracterização de uma substância como um desregulador endócrino vai
depender de um sistema de ensaios com a confirmação positiva utilizando outros
ensaios. Métodos de ensaios confiáveis e adequados existem, são necessárias a
validação e padronização dos sistemas de ensaios
in vivo e in vitro desenvolvidos para
identificar e classificar substâncias com efeitos endócrinos.
Organizações mundiais estão se empenhando no desenvolvimento e
implementação de estratégias de ensaios para avaliar os riscos associados com
substâncias caracterizadas como desreguladores endócrinos, que devem abranger
substâncias estrogênicas, andrógenas e substâncias ativas–tiróide e ainda que
substâncias ativas nestes ensaios devam ser testadas em estudos em animais (BLAIR
et
al
., 2000). Com isso, comitês têm sido criados para desenvolver um programa de
ensaios e testes para avaliar o potencial dos desreguladores endócrinos em humanos e
animais, incluindo o EDSTAC formado pela EPA.
Recentemente, um conjunto de ensaio
in vivo e in vitro está sendo desenvolvido e
aplicado para a avaliação dos potenciais efeitos dos desreguladores endócrinos de
75
substâncias simples ou amostras ambientais (PAWLOWSKI
et al., 2003, VAN DEN
BELT
et al., 2004).
A maior preocupação com relação aos ensaios que caracterizam os efeitos
potenciais dos desreguladores endócrinos é se as novas tecnologias podem realmente
servir como ferramentas para o entendimento do mecanismo de ação dos desreguladores
endócrino e se essas tecnologias podem ser usadas para o monitoramento dos efeitos
provocados em animais e humanos por essas substâncias.
76
II.3. FÁRMACOS RESIDUAIS
Outra classe de micropoluentes orgânicos, presentes em ambientes aquáticos,
bastante investigada atualmente na química ambiental, são os fármacos. Toneladas de
medicamentos são produzidas anualmente e aplicadas na medicina humana e
veterinária, sendo que a quantidade exata produzida não é publicada na literatura. Após
a administração, uma parte significativa dos fármacos é excretada e seu maior destino é
o esgoto doméstico. Estudos demonstram que vários fármacos podem ser persistentes no
meio ambiente e não são completamente removidas nas ETE (STUMPF
et al., 1999,
TERNES, 1998, TERNES
et al., 1999a). Além disso, muitos fármacos resistem aos
processos convencionais de tratamento de água (TERNES, 1998).
Como veremos nesta seção, fármacos, tais como, antibióticos, estrogênio
sintético, anestésicos, agentes reguladores de lipídeos, meio de contraste de Raios-X,
antiinflamatórios, droga antiepilética, entre outros, foram detectados no esgoto
doméstico, em águas superficiais e de subsolo em vários países (BILA e DEZOTTI,
2003).
Na Alemanha, 18 antibióticos foram identificados em efluentes de ETE e águas
superficiais por HIRSCH
et al. (1999); TERNES et al. (1999a) detectaram estrogênios
em concentrações da ordem de
µg.L
-1
em efluentes de ETE. O ácido clofíbrico, um
metabólito de três agentes reguladores de lipídeos, foi identificado em rios, águas de
subsolo e água potável em concentrações na faixa de
µg.L
-1
por TERNES (1998) e
SACHER
et al. (2001).
Dois problemas ambientais relacionados à presença de fármacos no meio
ambiente são amplamente discutidos O primeiro é devido ao uso desenfreado de
antibióticos; as bactérias podem fazer, e freqüentemente o fazem, mudanças no seu
material genético, adquirindo resistência aos antibióticos. Assim, uma bactéria presente
em um corpo hídrico que contenha traços de antibióticos, pode adquirir resistência a
essas substâncias (BOWER e DAESCHEL, 1999). O segundo é o 17
α-etinilestradiol,
um fármaco muito usado como contraceptivo oral que causa efeitos danosos ao sistema
endócrino dos animais, sendo classificado como desregulador endócrino.
77
Os fármacos são desenvolvidos para estimular uma resposta em animais e
humanos, muitas vezes em baixas doses e com um objetivo específico, sendo assim, as
implicações para a saúde humana devido a sua presença no meio ambiente devem ser
avaliadas. O contraceptivo oral 17
α-etinilestradiol tem elevada potência e causa efeitos
biológicos mesmo em baixas concentrações. Antibióticos presentes na água, solo e
sedimentos podem causar alterações na comunidade microbiana e afetar organismos de
uma cadeia alimentar.
Métodos para avaliar os riscos ambientais para os fármacos têm sido investigados
e desenvolvidos, bem como programas de monitoramento de fármacos no meio
ambiente em vários países do mundo têm sido criados. Porém, o levantamento de um
maior número de dados ainda é necessário.
II.3.1. Ocorrência de Fármacos no Meio Ambiente
A ocorrência de fármacos no esgoto doméstico e águas naturais é um importante
tópico internacional. Estudos demonstram que esses micropoluentes e seus metabólitos
estão presentes em ambientes aquáticos em várias partes do mundo, como Alemanha,
Áustria, Brasil, Canadá, Espanha, Holanda, Inglaterra, Itália, Japão, Suíça, Estados
Unidos e Reino Unido, (AHRER,
et al., 2001, BARONTI et al., 2000, BEHNISCH et
al
., 2001, BELFROID et al., 1999, BUSER et al., 1998a, BUSER et al., 1998b, BUSER
et al., 1999, DESBROW et al., 1998, FARRÉ et al., 2001, HARTIG et al., 1999,
HIRSCH
et al., 1998, JOHNSON, et al., 2000, KOLPIN et al., 2002, LINDSEY et al.,
2001, NAKAMURA
et al., 2001, RODRÍGUEZ et al., 2003, SACHER et al., 2001,
STUMPF
, et al., 1999, TERNES et al., 1999a, TERNES e HIRSCH, 2000, WINKLER
et al., 2001, XIAO et al., 2001).
Na investigação de WINKLER
et al. (2001), em rios do Canadá foram detectadas
concentrações de 0,087
µg.L
-1
para o ibuprofeno e 0,049 µg.L
-1
para o ácido clofíbrico.
O ácido clofíbrico e o ibuprofeno também foram detectados em águas superficiais na
Alemanha (TERNES, 1998, WEIGEL
et al., 2002), Áustria (AHRER, et al., 2001),
Brasil (STUMPF
et al., 1999) e Espanha (FARRÉ et al., 2001) na faixa de 0,01 a 3,0
µg.L
-1
.
78
Na Alemanha, TERNES e HIRSCH (2000) investigaram a presença de meios de
contraste de Raios-X em efluentes de ETE. As concentrações máximas foram detectadas
para o iopamidol e iopromida que foram de 15
µg.L
-1
e 11 µg.L
-1
, respectivamente,
indicando que esses fármacos estão em grandes concentrações nos efluentes de ETE.
A ocorrência de meios de contraste de Raios-X tais como, iopamidol, ioprimida e
iomeprol foram investigadas em águas superficiais na Alemanha por PUTSCHEW
et al.
(2001) e TERNES e HIRSCH (2000). As concentrações médias detectadas foram 0,49
µg.L
-1
para iopramidol e 1,6 µg.L
-1
para iopromida. Os meios de contraste de Raios-X
são aplicados em altas doses quando utilizados na radiologia e, segundo STEGER-
HARTMANN
et al. (2002), são excretados quase completamente sem metabolização e
assim lançados em concentrações consideráveis no meio ambiente.
TERNES e HIRSCH (2000) investigaram a ocorrência de meios de contrastes de
Raios-X em águas de subsolo da Alemanha e detectaram uma concentração máxima de
2,4
µg.L
-1
. O iopamidol e diatrizoato foram detectados com valores médios de
0,16
µg.L
-1
e 0,03 µg.L
-1
, respectivamente. A contaminação de fármacos em águas de
subsolo é uma prova de que muitos desses compostos infiltram no aqüífero e podem
persistir por vários anos.
A ocorrência de 32 fármacos residuais de diferentes classes medicinais como
agentes reguladores de lipídeos, drogas psiquiátricas, droga antiepilética,
β-
bloqueadores e 5 metabólitos foram detectados em águas superficiais na Alemanha por
TERNES (1998). Entre os fármacos detectados pode-se citar a carbamazepina um
antiepiléptico e o ácido acetilsalicílico com concentrações médias de 2,1
µg.L
-1
e 0,22
µg.L
-1
, respectivamente.
Uma investigação no Brasil (STUMPF
et al., 1999) detectou diferentes tipos de
fármacos na faixa de
µg.L
-1
, no esgoto doméstico do estado do Rio de Janeiro. As
concentrações máximas foram determinadas para o agente regulador de lipídeo
bezafibrato (1,2
µg.L
-1
), para o antiinflamatório indometacina (0,95 µg.L
-1
) e para o
metabólito ácido clofíbrico (1,0
µg.L
-1
). Outros fármacos foram detectados em
concentrações de 0,1 a 1,0
µg.L
-1
, devido à incompleta eliminação de fármacos durante
sua passagem nas ETE. Outros antiinflamatórios como diclofenaco e ibuprofeno foram
79
detectados no esgoto doméstico e efluentes de ETE na Suíça (BUSER
et al., 1998b,
BUSER
et al., 1999) na faixa de 2 ng.L
-1
a 3,3 µg.L
-1
.
Os rios que recebem os efluentes de ETE são assim contaminados devido às altas
concentrações de fármacos presentes nestes efluentes. Em rios do estado do Rio de
Janeiro, o ácido clofíbrico (metabólito de três agentes reguladores de lipídeos) e os
antiinflamatórios diclofenaco e naproxeno foram freqüentemente detectado no
monitoramento realizado por STUMPF
et al. (1999). As concentrações máximas foram
encontradas em águas superficiais em áreas urbanas da cidade do Rio de Janeiro e
Niterói, e freqüentemente excederam a concentração de 0,1
µg.L
-1
.
TERNES (1998) investigou a ocorrência de fármacos de diferentes classes
medicinais no esgoto doméstico e efluente de ETE na Alemanha, concluindo que
aproximadamente 80% dos fármacos estudados foram encontrados em efluentes de ETE
devido à incompleta remoção de fármacos durante sua passagem na ETE, como a
carbamazepina que foi detectada com uma concentração máxima de 6,3
µg.L
-1
,
resultando na contaminação de rios e lagos.
Os antibióticos são fármacos freqüentemente investigados no meio ambiente
devido ao seu potencial de desenvolver bactérias multi-resistentes. Penicilinas,
fluoroquinolonas, tetraciclinas, sulfonamidas e macrolídeos têm sido amplamente
detectados em vários ambientes aquáticos. Ciprofloxacina e norfloxacina foram
detectados no esgoto doméstico e efluente de ETE na Suíça (GOLET
et al., 2002) na
faixa de 45 a 568 ng/L e 36 a 367 ng/L, respectivamente. A eficiência de remoção
desses fármacos nas ETE esteve na faixa de 79 a 87% (GOLET
et al., 2001 e GOLET et
al
., 2002). De acordo com GOLET et al. (2002) e KÜMERER et al. (2000), as
propriedades de forte adsorção e a resistência à biodegradabilidade observadas nas
fluoroquinolonas, sugerem que a sua adsorção no processo de lodos ativados é o
principal caminho da remoção desses antibióticos durante o tratamento nas ETE.
Os antibióticos foram freqüentemente detectados em águas superficiais em todo o
mundo. No monitoramento realizado por LINDSEY
et al (2001) nos EUA foram
detectados vários antibióticos, entre eles, a tetraciclina, o sulfametoxazol, a
oxitetraciclina e a clorotetraciclina na faixa de 0,07 a 15
µg.L
-1
, esses dois últimos
antibióticos são muito usados na aqüicultura. HIRSCH
et al. (1999) investigaram a
80
ocorrência de 18 antibióticos em águas superficiais na Alemanha, a eritromicina e o
sulfametoxazol foram freqüentemente detectados na faixa de 0,03 a 1,70
µg.L
-1
, outros
antibióticos foram esporadicamente detectados. Outros autores também reportaram a
ocorrência de antibióticos em ambientes aquáticos em outros países (SACHER
et al.,
2001, HIRSCH
et al., 1999, HARTIG et al., 1999).
As águas de subsolo podem ser contaminadas com fármacos através da infiltração
de águas superficiais contendo fármacos, bem como pelo chorume proveniente de
aterros sanitários. Pelo fato de alguns fármacos serem solúveis em água e terem uma
baixa afinidade como o solo, muitas dessas substâncias migram rapidamente para águas
de subsolo.
Analgésicos foram freqüentemente detectados em amostras de água de subsolo em
Berlim (REDDERSEN
et al., 2002). Fenazona, propifenazona e dimetilaminofenazona
foram detectados em concentrações médias de 3
µg.L
-1
, 1 µg.L
-1
e 0,4 µg.L
-1
,
respectivamente. Nesta região, a contaminação das águas de subsolo está sob a
influência das águas superficiais de rios. Fenazona também foi detectada com máxima
concentração de 25 ng/L, no monitoramento das águas de subsolo na Alemanha,
realizado por SANCHER
et al. (2001), no qual ainda foram detectados fármacos como
diclofenaco (analgésico), carbamazepina (antiepiléptico), iopamidol (meio de contraste
de Raios-X) e sulfametoxazol (antibiótico) em concentrações máximas na faixa de 300 a
900 ng/L.
Investigações sobre a contaminação de diferentes ambientes aquáticos por
fármacos residuais revelam que esses contaminantes estão presentes em faixas de
concentrações de
µg.L
-1
e ng.L
-1
. O Anexo 2 apresenta uma compilação das
concentrações médias de fármacos detectados no meio ambiente, em trabalhos
conduzidos por diversos autores.
II.3.1.1.
Fármacos monitorados no Brasil
Em 1996 e 1997, agentes reguladores de lipídeos, antiinflamatórios, e alguns
metabólitos foram detectados em esgoto, em efluente de ETE e em águas de rios no
estado do Rio de Janeiro por STUMPF
et al. (1999). Estes resultados são apresentados
81
na Tabela II. 14. Neste estudo, foram investigados os efluentes de 10 ETE na cidade do
Rio de Janeiro e 17 águas superficiais no estado do Rio de Janeiro, dentre estes, o rio
Paraíba do Sul, Lagoa de Jurtunaíba na Região dos Lagos, a Baía de Guanabara e
amostras de águas potáveis de algumas das maiores cidades do estado do Rio de Janeiro
(Rio de Janeiro, Niterói, Três Rios, Campos e Resende).
Tabela II.14. Fármacos e metabólitos monitorados no Brasil por STUMPF et al.
(1999).
Substância Classe das Substâncias
Concentração
no meio
ambiente
Condições
1,0 µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Ácido
Clofíbrico
Maior metabólito de três
agentes reguladores de
lipídeos
0,2-0,3
µg.L
-1
Correntes do rio
Paraíba do Sul/RJ
Ácido
Fenofíbrico
Maior metabólito do
fenofibrato
0,4
µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Bezafibrato
Agente regulador de
lipídeos
1,2
µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Genfibrozila
Agente regulador de
lipídeos
≈ 0,3 µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Ibuprofeno
Antiinflamatório
≈ 0,35 µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
≈ 0,8 µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Diclofenaco
Antiinflamatório
0,02–0,06
µg.L
-1
Correntes do rio
Paraíba do Sul/RJ
Cetoprofeno
Antiinflamatório
≈ 0,55 µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Indometacina
Antiinflamatório
0,95
µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
≈ 0,55 µg.L
-1
Esgoto doméstico/RJ
Naproxeno
Antiinflamatório
0,02 – 0,05
µg.L
-1
Correntes do rio
Paraíba do Sul/RJ
Segundo STUMPF
et al. (1999), a concentração média nos efluentes de ETE, da
maioria dos fármacos investigados foi faixa de 0,1 a 1,0
µg.L
-1
. Nos rios, as
concentrações médias ficaram entre 0,02 e 0,04
µg.L
-1
, como conseqüência da
incompleta remoção dos fármacos durante sua passagem pela ETE e pelo descarte de
esgoto
in natura. A taxa de remoção de fármacos individuais durante a passagem pela
ETE variou de 12 a 90%, como apresentado na Tabela II. 15. Os fármacos mais
freqüentemente detectados foram o ácido clofíbrico, ibuprofeno, diclofenaco,
bezafibrato e naproxeno. Nas ETE a maior concentração média determinada foi para o
bezafibrato (1,0
µg.L
-1
). O ácido clofíbrico, o diclofenaco e o naproxeno foram
82
detectados na faixa de 0,06 a 0,1
µg.L
-1
no Paraíba do Sul, rio mais importante para a
produção de água potável do estado do Rio de Janeiro. Na Baía de Guanabara o ácido
clofíbrico, o diclofenaco e o naproxeno foram novamente os fármacos mais
freqüentemente detectados, contudo, na faixa de 10 a 100 ng.L
-1
.
Tabela II.15. Remoções de fármacos na ETE da Penha/RJ por STUMPF et al. (1999).
Remoção (%)
Fármaco
Efluente tratado pelo filtro
biológico
Efluente tratado pelo
processo de lodos ativados
Ácido Clofíbrico
15 34
Ácido Fenofíbrico
6 45
Bezafibrato
27 50
Genfibrozila
16 46
Ibuprofeno
22 75
Diclofenaco
9 75
Cetoprofeno
48 69
Indometacina
71 83
Naproxeno
15 78
Em outro estudo na Brasil, TERNES et al. (1999a) detectaram o contraceptivo
oral 17
α-etinilestradiol na ETE da Penha/RJ. O 17α-etinilestradiol foi detectado em
uma concentração de 0,005 µg.L
-1
, as taxas de remoção na ETE foram de 64% e 78%
para o efluente do filtro biológico e para o efluente do processo de lodos ativados.
II.3.2. Aplicação e Destino dos Fármacos no Meio Ambiente
Os Fármacos são largamente utilizados na medicina humana e veterinária, e em
geral, são desenvolvidos para serem persistentes para servir a um propósito terapêutico.
Os fármacos são absorvidos pelo organismo e estão sujeitos a reações metabólicas, tais
como, hidroxilação, clivagem ou glucuronação. Entretanto, segundo MULROY (2001)
cerca de 50 a 90 % dessas substâncias originais e seus metabólitos são excretados na
urina, fezes ou esterco animal. Os fármacos freqüentemente são excretados não
metabolizados ou como moléculas polares conjugadas, tal como glucuronides. Durante
os processos de tratamento das ETE, essa forma conjugada é facilmente transformada
nos fármacos original e assim são lançadas em ambiente aquático (REDDERSEN
et al.,
2002).
83
A excreção é o maior e principal meio pelo qual os fármacos de uso humano e
veterinário são introduzidos no meio ambiente. Uma vez no esgoto doméstico, os
fármacos entram nas ETE, onde não são completamente removidos (STUMPF
et al.,
1999) e são descartados no meio ambiente com os efluentes das ETE. Uma grande
quantidade de fármacos também é encontrada nos efluentes hospitalares (KÜMERER
et
al
., 1997).
Pouco se conhece sobre o comportamento e o destino dos fármacos no meio
ambiente, que dependem de suas propriedades físico-químicas e concentrações médias
presentes no meio ambiente. A Figura II. 6 apresenta um esquema que sugere possíveis
caminhos para os fármacos e estrogênios, quando descartados no meio ambiente (BILA
e DEZOTTI, 2003).
Alguns fármacos também são identificados no lodo biológico das ETE
(BEAUSSE, 2004). Fármacos de uso veterinário e humano podem ser lançados no meio
ambiente através do lodo produzidos nas ETE e do esterco que, algumas vezes, são
aplicados no solo, contaminando um solo que poderá ser usado na agricultura
(JJEMBA, 2002), esse processo pode causar um impacto ambiental, bem como
prejudicar a saúde humana (JORGENSEN e HALLING-SORENSEN, 2000). Outras
pesquisas mostram a ocorrência de fármacos no solo e lodo biológico (BEAUSSE,
2004, RABOLLE e SPLIID, 2000).
Medicamentos que não foram totalmente utilizados ou com a data de validade
vencida, são dispostos nos aterros sanitários ou no esgoto doméstico. Uma prática
comum antigamente em alguns países era o de dispor os resíduos de indústrias
farmacêuticas em aterros sanitários. Assim, uma outra forma de contaminação das águas
superficiais e de subsolo é através do chorume proveniente dos aterros sanitários
(HOLM
et al., 1995).
84
Aplicação Produção
Excreção
Medicina
Veterinária
Medicina
Humana
Aquicultura
Esterco
Esgoto
Sedimento
Águas Superficiais
Estação de Tratamento de Água
Água Potável
Aterro
Sanitário
Água de Subsolo
ETE
Indústria
Solo
Estação de
tratamento
de efluentes
industriais
Figura II.6. Possíveis rotas de fármacos e estrogênios no meio ambiente (BILA e
DEZOTTI, 2003).
Na medicina veterinária, os antibióticos são usados como promotores de
crescimento, na prevenção e controle de doenças na criação de gado, aves, ovelhas e
cavalos, como também, são intensivamente usados como aditivos de alimento de peixe
na aqüicultura e criação de porcos (INGERSLEV
et al., 2001, LOKE et al., 2000,
RABOLLE e SPLIID, 2000). Na produção animal, restos de alimentos que contêm
aditivos podem ser dispostos como lixo ou permanecem nas pastagens. Sendo assim,
podem contaminar o solo, águas de subsolo e superficiais. Devido ao uso na cultura de
peixes, alguns antibióticos como o cloranfenicol e o oxitetraciclina são detectados em
sedimentos de origem marinha (CHIEN
et al., 1999, SMITH e SAMUELSEN, 1996).
Os sedimentos marinhos pode ser o último estágio para muitas dessas substâncias
lançadas no sistema aquático, como o agente farmacêutico 17
α-etinilestradiol
identificados LAI
et al. (2000). Os sedimentos marinhos atuam como uma fonte
secundária de fármacos como o 17
α-etinilestradiol e o DES impactando o sistema
aquático (PETROVIC
et al., 2001).
85
No solo, a sorção e mobilidade dos fármacos dependem de algumas características
do solo e da estrutura química do fármaco. RABOLLE e SPLIID (2000) investigaram a
sorção e a mobilidade de antibióticos, usados na medicina veterinária, em diferentes
solos agrícolas, concluindo que o metronidazol e olaquindox apresentam uma alta
mobilidade, enquanto que a oxitetraciclina e tilosina são fortemente adsorvidos
independentemente do tipo de solo, e apresentam uma fraca mobilidade.
II.3.2.1
Degradação de fármacos no meio ambiente
De acordo com RICHARDSON and BROWRON (1985), há três destinos
possíveis para qualquer fármaco individual nas ETE:
1.
Pode ser biodegradável, ou seja, mineralizado a gás carbônico e água,
como por exemplo, o ácido acetilsalicílico;
2.
Pode passar por algum processo metabólico ou ser degradado
parcialmente, como as penicilinas;
3.
Pode ser persistente, como o clofibrato, um agente regulador de lipídeos.
Fármacos normalmente são lipofílicos, freqüentemente apresentam baixas
biodegradabilidades (CHRISTENSEN, 1998), conseqüentemente, possuem um
potencial para bioacumulação e persistência no meio ambiente. A persistência de
fármacos em águas superficiais e de subsolo, em ETE, em solos e em sedimentos
marinhos tem sido relatada em alguns estudos (TERNES, 1998, RICHARDSON e
BROWRON, 1985). Transformações naturais bióticas e abióticas dessas substâncias
nesses ambientes, tal como a fotodegradação solar influenciam sua degradação no meio
ambiente e necessitam ser mais bem estudada. A persistência à fotodegradação solar de
alguns fármacos em ambientes aquáticos tem sido investigada (ANDREOZZI
et al.,
2002, ANDREOZZI
et al., 2003b, ANDREOZZI et al., 2003c).
TIXIER
et al. (2003) investigaram os processos responsáveis pela remoção de
fármacos em rios de Suíça. A fotodegradação foi identificada como o principal processo
de eliminação do diclofenaco em águas naturais. Com um relativamente alto coeficiente
de sorção em partículas, o ibuprofeno pode ser eliminado pela sedimentação. No caso
86
do cetoprofeno e do naproxeno, a biodegradação e a fotodegradação podem ser
mecanismos de remoção de ambientes aquáticos.
ANDREOZZI
et al. (2002) observaram somente uma leve remoção da
carbamazepina de ambientes aquáticos através dos mecanismos de fotodegradação
solar. Para o diclofenaco, ensaios em laboratórios com águas naturais resultaram em
uma rápida eliminação desse fármaco pela fotodegradação (BUSER
et al., 1998b).
A fim de se investigar a degradação de fármacos no meio ambiente, testes em
laboratórios com lodo biológico de ETE (KALSCH, 1999, STEGER-HARTMANN
et
al
., 1997, TERNES et al., 1999b), águas naturais e sedimentos marinhos (INGERSLEV
et al., 2001, KALSCH, 1999) vêm sendo executados. TERNES et al. (1999b)
analisaram o comportamento do fármaco contraceptivo 17
α-etinilestradiol em ETE.
Para isso, experimentos em batelada foram realizados com lodo biológico aeróbio de
uma ETE na Alemanha. Os resultados mostraram aproximadamente 20% do 17
α-
etinilestradiol foi degradado nos experimentos em batelada após 24h com uma
concentração inicial de 1 ng.L
-1
e depois de 48h com uma concentração inicial de
1
µg.L
-1
, indicando uma relativa persistência deste estrogênio.
Geralmente, os fármacos persistem no meio ambiente e podem bioacumular, ou
podem ser degradados, tornando-se, porém “persistentes” porque são continuamente
introduzidos no meio ambiente por serem muito utilizados (MCGOVERN e
MCDONALD, 2003).
CARBALLA
et al. (2004), investigaram a eficiência de remoção de fármacos
(carbamazepina, diazepan, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, roxitromicina,
sulfametoxazol e iopromida) em uma ETE na Espanha. De acordo com este estudo, as
remoções alcançadas foram de 40-70% para os antiinflamatórios (ibuprofeno e
naproxeno), 67% para o sulfametoxazol, a iopromida não foi significativamente
removida.
STEGER-HARTMMAN
et al. (2002) investigaram a degradação do meio de
contraste de Raios-X, iopromida, através de testes que simulam condições nas ETE.
Concluíram que esse fármaco é lentamente degradado, pois cerca de 80% da iopromida
foi removida após 31 dias. Estes estudos mostram que alguns fármacos não são
removidos no tratamento convencional de esgoto ou não podem ser adsorvidos no lodo
87
biológico. RICHARDSON e BROWRON (1985) investigaram a biodegradação de
fármacos durante o tratamento de esgoto doméstico e concluíram que alguns
analgésicos, antibióticos e antiinflamatórios não são biodegradáveis.
Segundo KÜMMERER
et al. (1997), a ifosfamida, um fármaco usado no
tratamento de tumores, não foi biodegradada nos testes com processo de lodos ativados
de uma ETE, sendo considerado persistente ao meio ambiente. Em outro estudo,
KÜMMERER
et al. (2000) investigaram a biodegradação de alguns antibióticos de uso
veterinário (ciprofloxacina, ofloxacina e metronidazol). Os resultados indicaram que
estes antibióticos não foram biodegradados nos testes, sugerindo que esses fármacos
podem não ser removidos nas ETE e assim serem lançados no ambiente aquático.
INGRERLEV
et al. (2001) estudaram a biodegradação de antibióticos de uso
veterinário em águas superficiais e sedimentos marinhos. Os antibióticos metronidazol,
tilosina, e oxitetraciclina foram considerados moderadamente persistentes no meio
ambiente, já o olaquinox foi biodegradável nos experimentos realizados. HENSCHEL
et
al
. (1997) observaram que o ácido salicílico pode ser facilmente biodegradado, ao
contrário do ácido clofíbrico e do metotrexato que foram considerados persistentes.
A remoção dos analgésicos fenazona e propifenazona (remoções de 90% foram
alcançadas para os dois fármacos) durante o tratamento de água potável foi investigada
por REDDERSEN
et al.(2002). O lodo dos filtros foi analisado para se avaliar se a
redução da concentração desse as substâncias foi causada pela adsorção nas partículas
ou pelos processos microbiológicos, como resíduos desses analgésicos não foram
detectados no lodo biológico, assumiu-se que a fenazona e a propifenazona foram
biodegradas durante o tratamento por processos microbiológicos.
II.3.3. Possíveis Efeitos da Presença de Fármacos ao Meio Ambiente
A ocorrência de fármacos e estrogênios no meio ambiente pode apresentar efeitos
adversos em organismos aquáticos e terrestres. O efeito pode ser em qualquer nível da
hierarquia biológica: célula - órgãos - organismo - população - ecossistema. De acordo
com JORGENSEN e HALLING-SORENSEN (2000) alguns desses efeitos podem ser
observados em concentrações da ordem de ng/L. Pouco é conhecido sobre o destino e o
88
comportamento dessas substâncias no ambiente aquático, assim como não está claro
quais organismos são afetados e em que grau.
Atualmente, os tópicos mais discutidos sobre o efeito de fármacos no meio
ambiente são o desenvolvimento de resistência bacteriana aos antibióticos
(GUARDABASSI
et al., 2002, MIRANDA e CASTILLO, 1998) e os efeitos no sistema
endócrino causados por fármacos como o DES e 17
α-etinilestradiol, conhecidos
desreguladores endócrinos já discutido no capítulo II.2. Até agora, outros efeitos
adversos específicos na saúde humana não foram apresentados e discutidos.
Um inevitável efeito do uso indiscriminado de antibióticos é a contribuição no
desenvolvimento de bactérias resistentes, assunto que tem sido largamente discutido
(GUARDABASSI
et al., 2002, MIRANDA e CASTILLO, 1998, GUILLEMOT, 1999,
MCKEON
et al., 1995). A resistência bacteriana aos antibióticos tem aumentado
substancialmente nos últimos anos, e vem se tornando um problema de saúde pública.
Segundo JORGENSEN e HALLING-SORENSEN (2000), há indícios de que o
desenvolvimento de resistência a antibióticos é favorecido por baixas concentrações. As
bactérias podem adquirir resistência através da mutação ou processos de transferência
genética, tal como, transformação, transducção e conjugação. Esses mecanismos têm
sido discutidos por alguns pesquisadores (ANDERSEN
et al., 2001, BOWER e
DAESCHEL, 1999).
MIRANDA e CASTILLO (1998) investigaram a incidência de resistência
microbiana em uma espécie de
Aeromonas isolada de fontes de águas naturais do Chile,
constatando que a resistência ocorreu com vários antibióticos testados, dentre esses, o
cloranfenicol, trimetropim, sulfametoxazol e tetraciclina.
Os hospitais são poderosos focos de desenvolvimento de bactérias resistentes
(KÜMMERER, 2001). Alguns autores relatam um aumento na incidência de infecções
em hospitais devido à resistência de bactérias aos antibióticos, como é o caso de
bactérias Gram-positivas em um hospital nos EUA relatada por GINZBURG
et al.
(2001). KOLÁR
et al. (2001) avaliaram o desenvolvimento da resistência em bactéria
Gram-negativa a antibióticos usados em um hospital na República Tcheca. Os
resultados mostraram que a resistência bacteriana depende do tipo de antibiótico e que
89
em muitos casos, um aumento nas bactérias resistentes é induzido pelo aumento no uso
de um determinado antibiótico.
Os antibióticos são amplamente aplicados na medicina veterinária, portanto o uso
de esterco como fertilizante na agricultura pode acarretar outros efeitos tóxicos ao meio
ambiente. MIGLIORE
et al. (1995) avaliaram o efeito tóxico da sulfonamida em três
tipos de plantas e observaram alterações no desenvolvimento das plantas e em seus
mecanismos naturais, bem como a bioacumulação, acarretando risco de contaminação
na cadeia alimentar, além de causarem modificações da comunidade microbiana no
solo, incluindo o desenvolvimento de bactérias resistentes.
Estudos sobre os efeitos causados ao meio ambiente com o uso de antibióticos na
aqüicultura foram desenvolvidos por vários pesquisadores (CHIEN
et al., 1999, SMITH
e SAMUELSEN, 1996, WU, 1995). Um desses efeitos, descrito por WU (1995), foi o
desenvolvimento de uma população de bactérias resistentes em sedimentos marinhos.
Esse estudo mostrou que o maior impacto é no sedimento marinho, e em menor
extensão na qualidade da água.
Algumas possíveis rotas de transmissão de resistência ao antibiótico têm sido
estudadas. WITTE (2000) descreveu os possíveis meios de transferência de resistência
aos antibióticos entre diferentes ecossistemas, dentre estes, ambientes aquáticos, tais
como, ETE, águas naturais e ambientes terrestre. CHEE-SANFORD
et al. (2001)
demonstraram que genes de resistência aos antibióticos estão presentes em bactérias de
águas de subsolo e superficiais, como um resultado direto do uso de esterco na
agricultura, assim as águas de subsolo podem ser uma fonte em potencial de bactérias
com resistência aos antibióticos. A transferência de bactérias resistentes de animais para
humanos também tem sido relatada. Humanos podem ser infectados com a bactéria
Salmonella spp. pelo contato direto com animais infectados ou suas fezes, porém a mais
importante fonte de infecções humana é o consumo de produtos de origem animal
infectado (carne, ovos e etc.) (VAN DEN BOGAARD e STOBBERINGH, 2000).
Outros estudos também têm relatado a presença de bactérias resistentes no meio
ambiente, tal como, solo (SENGELOV
et al., 2003), sedimentos marinhos (WU, 1995),
ETE (GRABOW
et al., 1976, GUARDABASSI et al., 2002), águas superficiais
(MIRANDA e CASTILLO, 1998), águas de subsolo (MCKEON
et al., 1995).
90
II.3.4. Avaliação do Impacto Ambiental de Fármacos em Ambientes
Aquáticos
No momento, um ponto crítico neste tema é saber se existem níveis elevados
desses fármacos no meio ambiente, que sejam suficientes para exercer efeitos adversos
em organismos aquáticos e terrestres. Esta questão estimula o desenvolvimento de
estudos de impacto ambiental, causado por diferentes fármacos presentes no meio
ambiente. Dados ecotoxicológicos têm sido levantados por alguns pesquisadores,
identificando assim, fármacos que são potencialmente perigosos ao meio ambiente,
porém, os dados disponíveis na literatura são insuficientes. A ocorrência desses
fármacos residuais em águas superficiais e de subsolo demonstra a necessidade de mais
estudos que determinem os efeitos tóxicos dessas substâncias ao meio ambiente.
Neste contexto, alguns pesquisadores (HENSCHEL
et al., 1997, HALLING-
SORENSEN, 2000, LANZKY e HALLING-SORENSEN, 1997, MIGLIORE
et al.,
1997, STEGER-HARTMANN
et al., 1999, WOLLENBERGER et al., 2000) vêm
avaliando os possíveis riscos ambientais causados por diferentes fármacos. HENSCHEL
et al. (1997) analisaram dois fármacos, o paracetamol (analgésico) e o metotrexato
(fármaco usado na quimioterapia), e dois metabólitos, o ácido salicílico e o ácido
clofíbrico, com relação às suas biodegradabilidades e testes de toxicidade (valores de
EC
50
com algas, microcrustáceo (Daphnia magna), embriões de peixe e bactérias
luminescentes). Os autores concluíram que os fármacos investigados se mostraram
potencialmente perigosos ao meio ambiente.
LANZKY e HALLING-SORENSEN (1997) utilizaram os organismos marinhos
Selenastrum capricormutum e Acatia tonsa para estudar os efeitos tóxicos agudos do
metronidazol (antibiótico). MIGLIORE
et al. (1997) avaliaram a toxicidade de
antibióticos usados na medicina veterinária, determinando dados ecotoxicológicos como
CE
50
utilizando Artemia cysts. HALLING-SORENSE (2000) usaram duas espécies de
micro algas (
Microcystis aeruginosa e Selenastrum capricornutum) para estudar os
efeitos tóxicos agudos de oito antibióticos, dentre eles, a penicilina, a clorotetraciclina, o
olaquindox, a tetraciclina e o tilosina, usados na terapia e como promotores de
crescimento na medicina veterinária. WOLLENBERGER
et al. (2000) avaliaram a
91
toxicidade crônica e aguda com o microcrustáceo
Daphnia magna para 9 antibióticos de
uso veterinário, dentre esses, oxitetraciclina, sulfadiazina, tetraciclina e tilosina. Estes
estudos demonstraram que os fármacos estudados apresentam um potencial de causar
efeitos adversos no ambiente aquático.
STUER-LAURIDSEN
et al. (2000), realizaram estudo de análise de risco
ambiental dos 20 fármacos mais usados na Dinamarca, dentre esses, analgésicos,
estrogênios e antiinflamatórios. No estudo de JONES
et al. (2002) foi apresentada a
análise de risco ambiental para os 25 fármacos mais usados na Inglaterra (analgésicos,
antibióticos, antiinflamatórios, drogas antiepiléticas e
β-bloqueadores).
Os efeitos tóxicos de fármacos residuais têm sido avaliados utilizando biota
aquática, no entanto, poucos dados experimentais têm sido obtidos para comunidades
terrestres. O estudo desenvolvido por MIGLIORE
et al. (1995) avaliou os efeitos do
antibiótico sulfonamida na contaminação de um sistema terrestre com três espécies de
plantas. Observaram bioacumulação deste antibiótico, apresentando um significativo
impacto ambiental na comunidade microbiana e risco de contaminação da cadeia
alimentar.
Atualmente, uma avaliação de risco ambiental devido à contaminação por
fármacos tem sido requerida em vários países. Com isso, vários pesquisadores vêm
desenvolvendo metodologias de testes ecotoxicológicos e modelos para avaliação de
risco ambiental (HENSCHEL
et al., 1997, JORGENSEN et al., 1998,
KOSCHORRECK
et al., 2002).
92
II.4. MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS NA DETERMINAÇÃO DE
FÁRMACOS E ESTROGÊNIOS EM MATRIZES AMBIENTAIS
O uso de técnicas analíticas no monitoramento e identificação de micropoluentes
no meio ambiente é importante tópico da química analítica. Métodos que determinam
com acurácia essas substâncias em concentrações na faixa de
µg.L
-1
e ng.L
-1
em
matrizes ambientais complexas, tais como, águas naturais, solo, sedimento marinho,
lodo biológico e efluente de ETE, são um desafio para muitos pesquisadores.
Para a determinação de fármacos e estrogênios, diferentes métodos analíticos são
reportados na literatura, os quais primeiramente foram válidos para matrizes biológicas
como sangue, tecido e urina (HEDENMO e ERIKSSON, 1995, VREE
et al., 1994,
WHITLAM e VINE, 1980,), sendo que algumas modificações nestes métodos podem
ser suficientes para amostras ambientais. No entanto, as análises de fármacos e
estrogênios em efluentes de ETE, em águas superficiais, de subsolos, água potável,
sedimento marinho, solo e lodo biológico requerem ainda o desenvolvimento de
metodologias analíticas mais sensíveis para a detecção de concentrações na faixa de
µg.L
-1
e ng.L
-1
em matrizes ambientais muitas vezes complexas.
Nos últimos anos, muitos métodos para a análise desses micropoluentes em
amostras ambientais foram publicados, tais como para agentes reguladores de lipídeos,
β-bloqueadores e antiinflamatórios e alguns para a determinação de antibióticos,
estrogênios e drogas psiquiátricas. TERNES (2001) em seu estudo fez uma revisão de
todos os métodos analíticos utilizados na determinação de vários fármacos e
estrogênios, a níveis de ng.L
-1
, em diferentes matrizes ambientais aquosas. No estudo de
PETROVIC
et al. (2002) foi apresentada uma revisão de métodos analíticos usados na
detecção de desreguladores endócrinos (alquilfenóis, PCDD, PCDF, bisfenol A, ftalatos,
PBDE e estrogênios) em amostras ambientais, tais como, águas superficiais e
subterrâneas, sedimento marinhos, solo e lodo biológico.
Para detecção de fármacos e estrogênios em ambiente aquático na faixa de
µg.L
-1
e
ng.L
-1
, os métodos descritos na literatura, na maioria das vezes, são baseados na
extração e preparo das amostras que podem incluir a purificação da amostra,
concentração e/ou derivatização e finalmente a quantificação das substâncias. Os
93
métodos predominantes de quantificação são a cromatografias gasosa (CG) e a líquida
(CLAE), dependendo das substâncias a ser detectada. Em conjunto com a
cromatografia, a espectrometria de massa é bastante usada, freqüentemente conferem à
técnica uma maior sensibilidade e especificidade. A Tabela II.16 apresenta os diferentes
métodos utilizados na detecção de fármacos e estrogênios em amostras de ambientes
aquáticos.
Na determinação de estrogênios, em amostras aquosas, os métodos analíticos
publicados são freqüentemente baseados na extração por fase sólida (EFS),
derivatização e detecção por CG/EM, CG/EM/EM ou CLAE/EM. A EFS é uma técnica
de extração simples, rápida e que requer poucas quantidades de solventes.
Freqüentemente são usados cartuchos ou discos de extração, comercialmente
disponíveis, com uma variedade de adsorventes tais como, C
18
, resina de copolímero
poliestireno (ENV), sílica, alumina B, CN. A EFS não é só uma técnica de extração,
mas também de concentração dos componentes.
Para facilitar a determinação dos estrogênios pela CG, técnicas de derivatização
são usadas. Para isso, diferentes agentes são empregados, predominantemente derivados
sililanizados, tais como, MTBFA (N-metil-Ntert-butildimetilsilil-trifluoroacetamida),
MSTFA/TMSI/DTE(N-metil-N-(trimetilsilil)- trifluoacetamida / trimetilsililimidazola/
ditioeritrol), BSTFA (N, O – bistrimetilsililtrifluoracetamida), PFB-TMS
(pentafluorobenzil-trimetilsilil), MTBSTFA (N-metil-N-(tert- butildimetil
trifluoacetamida), PFPA (ácido pentafluorpropionico), PFBBR-TMS(pentafluorbenzil
bromado-trimetilsilil)). Na determinação de estrogênios pela cromatografia líquida não
há a necessidade de derivatização dos componentes das amostras. A Tabela II. 17
apresenta os métodos usados na determinação de estrogênios em amostras ambientais.
94
Tabela II.16. Métodos utilizados na determinação de fármacos em matrizes aquosas.
Método Substâncias Referência
Estrogênios
JOHNSON
et al. 2000,
LÓPEZ de ALDA e
BARCELÓ, 2001
Meios de contraste de Raios-X TERNES e HIRSCH, 2000
Ácido Clofíbrico, antibióticos, agentes
reguladores de lipídeos, antiinflamatórios,
drogas epiléticas
AHRER
et al., 2001
Ácido salicílico, antiinflamatórios e
agentes reguladores de lipídeos
FARRÉ
et al., 2001
CLAE/
EM
a
Antibióticos LINDSEY et al., 2001
Antibióticos
GOLET,
et al., 2001,
HARTIG
et al., 1999,
HIRSCH
et al., 1998
Antiinflamatórios, antiepiléptico e
antidiabéticos.
TERNES
et al., 2001a
Estrogênios BARONTI et al., 2000
Analgésicos, β-bloqueadores, agentes
reguladores de lipídeos, antibióticos
SACHER
et al, 2001
CLAE/EM
/EM
b
β-bloqueadores, antibióticos
TERNES, 2001
Analgésicos, agentes reguladores de
lipídeos e metabólitos, antiinflamatórios
STUMPF
et al., 1999
Analgésicos, antipiréticos,
antiinflamatórios, agentes reguladores de
lipídeos, drogas epiléticas, drogas
psiquiátricas
SACHER
et al, 2001
Estrogênios
CARGOUËT
et al., 2004,
DESBROW
et al., 1998,
MOL,
et al., 2000,
NAKAMURA,
et al., 2001,
TERNES
et al., 2001b,
XIAO
et al., 2001
CG/EM
c
Ácido Clofíbrico, antiinflamatórios, drogas
epiléticas
ÖLLERS
et al., 2001
Estrogênios
BELFROID
et al., 1999,
FINE
et al., 2003, KELLY,
2000, TERNES
et al.,
1999a,b
CG/EM/
EM
d
Antiinflamatórios, drogas antiepilépticas,
agentes reguladores de lipídeos,
β-
bloqueadores, drogas psiquiátricas,
estrogênios
TERNES, 2001
a
CLAE/EM – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas
b
CLAE/EM/EM – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a dois espectrômetros de massas
em série
c
CG/EM -cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
d
CG-EM/EM - cromatografia gasosa acoplada a dois espectrômetros de massas em série
95
Tabela II.17. Métodos usados na determinação de estrogênios em amostras ambientais.
Amostra
Extração
(EFS)
Derivatizaçã
o
Método
Limite
de
detecção
(ng.L
-1
)
Rec.
a
(%)
Ref.
b
Águas
naturais e
efluentes
de ETE
C
18
Derivados de
tert-butil-
dimetilsilil
CG-
EM/EM
1 90 KELLY, 2000
Águas
superficiais
ENV/124 PFB-TMS CG-EM 0,10-0,28
86-
127
NAKAMURA,
et al., 2001
Água
subterrânea
HLB –
balanço
hidrofílico
lipofílico
PFBBR-
TMSI
CG-
EM/EM
0,2-0,6 103
FINE
et al.,
2003
Afluente e
efluente de
ETE, águas
superficiais
divinilbenz
eno e C
18
PFPA CG-EM - -
CARGOUËT
et al., 2004
Águas
naturais e
potável e
efluentes
de ETE
C18, sílica,
alumina B,
CN
-
CLAE-
EM
0,2-5
96-
112
LÓPEZ DE
ALDA e
BARCELÒ,
2001
Águas
superficiais
e efluentes
de ETE
C
18
, NH
2
Reagente
SIL-A
CG-
EM/EM
0,1-2,4 88-98
BELFROID
et
al
., 1999
Rec.
a
: Recuperação
Ref.
b
: Referências
A presença desses micropoluentes em outros tipos de amostras ambientais, tais
como, lodo biológico e sedimentos marinhos, ditam a necessidade do desenvolvimento
de tecnologias que também façam a detecção nessas amostras, que muitas vezes
necessitam de etapas de extração com solvente, purificação (normalmente com sílica
gel), cromatografia de permeação em gel e/ou EFS dos componentes antes de serem
analisados em técnicas cromatográficas como a CG/EM, CG/EM-EM ou CLAE/EM
(KUSTER
et al., 2004, PETROVIC et al., 2001, TERNES et al., 2001b).
A literatura também reporta o uso de técnicas biológicas na identificação e
quantificação de estrogênios naturais e ambientais tais como, ensaios de imunoadsorção
enzimática (ELISA) e radioimunoensaio (RIE) (BIRKETT e LESTER, 2003, IRWIN
et
al
., 2001, LI et al., 2004). O ensaio ELISA, que é baseado no uso de antígenos, tem sido
descrito como um método altamente sensível e seletivo para analisa de estrogênio e
96
outros desreguladores endócrinos em ambientes aquáticos. O ensaio ELISA é usado em
conjunto com técnicas de extração, tal como EPS para aumentar seu limite de detecção.
Recentemente, estão sendo desenvolvidos outros métodos analíticos baseados em
imunoensaios para monitorar fármacos, estrogênios, e pesticidas em amostras de água,
tal como um biosensor óptico (TSCHAMELAK
et al., 2005).
97
II.5. A OZONIZAÇÃO E OS PROCESSOS OXIDATIVOS AVANÇADOS
II.5.1. Introdução
Segundo GLAZE (1987) o ozônio vem sendo usado no tratamento de água desde
1906, onde foi primeiramente empregado para desinfecção em uma planta de tratamento
de água potável na cidade de Nice na França. Na Europa, a ozonização é largamente
usada em plantas de tratamento de água para a oxidação de micropoluentes orgânicos,
para a desinfecção, no controle da flora, odor e cor. Atualmente, devido ao seu alto
poder de oxidação, o ozônio vem sendo utilizado em plantas de tratamento de água e
efluentes em várias partes do mundo (CAMEL e BERMOND, 1998, VON GUNTEN,
2003a, RICE, 1997, TERNES
et al., 2002). No tratamento de efluentes é aplicado na
indústria têxtil, refinarias de petróleo, indústria de papel, entre outros.
O ozônio é um oxidante muito poderoso, somente os radicais HO
•
e o flúor
apresentam o poder de oxidação maior do que ozônio, como demonstrado pelos
potenciais de oxi-redução apresentados na Tabela II. 18.
Tabela II.18. Potenciais de oxi-redução de alguns agentes oxidantes.
Reação
Potenciais de oxi-redução
(Volts)
F
2
+ 2e
-
↔ 2F
-
2,870
HO
•
+ H
+
+ e
-
↔ H
2
O
2,760
O
3
+ 2H
+
+ 2e
-
↔ O
2
+ H
2
O
2,076
OH
•
+ e
-
↔ HO
-
2,020
H
2
O
2
+ 2H
+
+ 2e
-
↔ 2H
2
O
1,776
MnO
4
-
+ 4H
+
+ 3e
-
↔ MnO
2
+ 2H
2
O
1,679
HOCl + H
+
+ 2e
-
↔ Cl
-
+ H
2
O
1,482
HOBr + H
+
+ 2e
-
↔ Br
-
+ H
2
O
1,331
O
2
+ 4H
+
+ 4e
-
↔ 2H
2
O
1,229
HOI + H
+
+ 2e
-
↔ I
-
+ H
2
O
0,987
Cl
2(aq)
+ 2e
-
↔ ClO
2
-
+ H
2
O
0,954
OCl
-
+ H
2
O + 2e
-
↔ Cl
-
+ 2OH
-
0,810
OBr
-
+ H
2
O + 2e
-
↔ Br
-
+ 2OH
-
0,761
OI
-
+ H
2
O + 2e
-
↔ I
-
+ 2OH
-
0,485
98
A ozonização pode ser combinada com outros processos, tais como, radiação UV
e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), resultando em processos de tratamentos que podem
ser mais poderosos que apenas o ozônio. Com isso, o ozônio pode se decompor por
mecanismos que envolvem a geração de radicais HO•, os quais são espécies mais
reativas. Os processos caracterizados pela geração de radicais HO• são conhecidos
como Processos Oxidativos Avançados (POA) (ANDREOZZI
et al., 1999, GLAZE,
1987, GLAZE e KANG, 1989). Os POA que incluem o ozônio são: O
3
/H
2
O
2
, O
3
/UV e
ozônio em altos valores de pH.
Os POA geralmente usam uma combinação de agentes oxidantes (H
2
O
2
ou O
3
),
irradiação (UV ou ultrasom) e catalisadores (íons metálicos ou fotocatalisadores) com o
objetivo de gerar radicais HO•.Esses processos são de grande interesse devido ao seu
alto poder de oxidação. Os POA são relatados por vários autores para a degradação de
uma variedade de poluentes orgânicos (GLAZE e KANG, 1987). Os radicais HO
•
são
espécies muito reativas e com baixa seletividade, que reagem com a maior parte das
moléculas orgânicas com constantes de reação na ordem de 10
6
-10
9
M
-1
s
-1
(GLAZE,
1987, ANDREOZZI
et al., 1999).
Os POA apresentam grande potencial na remoção de poluentes com altas ou
baixas concentrações em diversas aplicações, entre elas, tratamento de águas
subterrâneas, redução do excesso de lodo biológico de ETE e compostos orgânicos
voláteis (VOC) (PARSONS, 2004)
Segundo PARSONS (2004), o número de publicações com os POA no tratamento
de água tem aumentado nos últimos anos, e apresenta três principais áreas de
oportunidade dessas aplicações, que são:
(1) remoção dos precursores dos subprodutos
da desinfecção (DBP);
(2) remoção de micropoluentes, incluindo, fármacos,
desreguladores endócrinos e biotoxinas e
(3) inativação de microrganismos patogênicos
resistentes (ex.
Crytosporidium).
Apesar do radical HO
•
ser o agente oxidante mais forte, o ozônio, por ser um
oxidante muito seletivo, é bastante usado no tratamento de água e efluentes. Sua
seletividade pode proporcionar que o tratamento seja realizado com baixas dosagens de
ozônio, ao passo que os oxidantes mais reativos (radicais HO
•
) podem ser largamente
consumidos nos processos oxidativos.
99
Os tratamentos baseados na destruição química, como o caso dos POA e a
ozonização, quando bem desenvolvidos, podem ser a solução para o tratamento de
efluentes com características particulares. Os processos de oxidação química permitem
a mineralização de poluentes em dióxido de carbono, água e inorgânicos ou sua
transformação em produtos menos complexos. Em geral, esses processos são acoplados
a outros, sejam biológicos ou físico-químicos, de forma a obter o melhor desempenho
possível no processo global de tratamento. Os processos oxidativos são particularmente
interessantes pelo fato de que levam a uma redução na produção de resíduos. Essas
tecnologias podem destruir efetivamente os poluentes orgânicos e não simplesmente
transferi-los de fase.
II.5.2. Geração do Ozônio e Propriedades Químicas e Físicas
O ozônio é um gás instável, sob as condições normais de tratamento de água e
efluentes, o qual deve ser gerado “
in sito” para imediato uso, podendo ser produzido
comercialmente pelas técnicas: (1) exposição do oxigênio à radiação UV e (2) descarga
elétrica no gás oxigênio, que é a técnica mais usada na geração de ozônio e a qual
produz ozônio de acordo com a reação apresentada na Equação II.1 (GLAZE, 1987,
BALAKRISHNAN
et al., 2002, HARRISON, 2000). O sistema de geração de ozônio
por descarga corona está apresentado na Figura II.7.
3O
2
Descarga
elétrica
2O
3
II.1
O
2
O
2
+ O
3
Descarga de corona
Alta
Voltagem
AC
Remoção de calor
Eletrodo
Eletrodo
Dielétrico
Figura II.7. Geração de Ozônio.
100
O ozônio é gerado pela passagem de um gás contendo oxigênio (ar sintético,
oxigênio puro, ou outras misturas com oxigênio) através da alta energia na descarga
elétrica (descarga corona) ou através da fonte de radiação UV. O ozônio quando gerado
do ar, têm uma cor azulada na célula do gerador, mas misturas de ar/ozônio são
invisíveis até mesmo nas altas concentrações que saem do gerador de ozônio.
Para grandes instalações, os geradores de descarga corona são requeridos, pois são
capazes de gerar altas concentrações de ozônio, necessárias para a suficiente
solubilização do ozônio para satisfazer as demandas de ozônio no tratamento.
O ozônio é parcialmente solúvel em água, de 10-20 vezes mais solúvel do que o
oxigênio. Como outros gases parcialmente solúveis, ozônio segue a lei de Henry que
formula que no equilíbrio, a concentração de um gás na água é diretamente proporcional
as suas pressões parciais na fase vapor sobre o líquido. A constante de
proporcionalidade de Henry varia com a temperatura, e ainda a solubilidade do ozônio
diminui com o aumento da temperatura.
Além de ser muito instável e por isso dever ser imediatamente usado após sua
produção, o ozônio tem uma adicional complicação que é a sua parcial solubilidade em
água. Como resultado disso, a efetividade do processo de ozonização depende da
introdução do ozônio na água ou efluente, ou seja, do contato líquido/gás e da
transferência de massa do ozônio da fase gás para a fase aquosa, que está relacionada
com a concentração de ozônio na fase gás produzido pelo gerador.
Os fatores que afetam a solubilidade do ozônio na água são: a concentração de
ozônio que entra no difusor; temperatura da água, pressão absoluta da água em contato
com o gás de ozônio; a demanda de ozônio na água e a eficiência do difusor de ozônio
empregado.
II 5.3. Instabilidade do Ozônio na Água
O ozônio é uma molécula instável, que se decompõe novamente em oxigênio. O
tempo de meia-vida para a decomposição do ozônio no ar é de 4 a 12 horas dependendo
da temperatura e umidade do ar. O tempo de meia-vida do ozônio na água depende da
temperatura, pH e da qualidade da água que afeta a demanda de ozônio, este valor está
101
na faixa de segundos a horas. O máximo valor de tempo de meia-vida em água muito
limpa é da ordem de poucas horas. No tratamento de água potável, o tempo de meia-
vida do ozônio pode variar de 1 a 30 minutos.
A decomposição do ozônio na água aumenta com o aumento do pH. Em pH 6, o
tempo de meia-vida do ozônio residual é de 20 minutos, nos pH 7 e 8 esse valor cai para
15 e 5 minutos respectivamente. O ozônio é mais estável em águas altamente puras
quando o pH é menor do que 6. Com o aumento do pH, maior do que 7, oxidantes
secundários são formados, tais como os radicais HO
•
, como apresentado na Equação
II.2. A taxa de decomposição do ozônio em radicais HO
•
aumenta com o aumento do
pH e é instantânea em pH acima de 10 (HARRISON, 2000). Os radicais HO
•
são
agentes oxidantes mais fortes do que o ozônio, entretanto, esses radicais que são
também instáveis e reativos, são rapidamente consumidos (milésimos de segundos) por
muitos compostos oxidáveis, tais como, íons bicarbonato/carbonato e compostos
orgânicos presentes na água. Outros radicais livres menos importantes, também são
formados na decomposição do ozônio, como por exemplo, os radicais HO
•
2
. O aumento
da temperatura também irá promover a formação de radicais HO
•
pela decomposição do
ozônio molecular.
O
3
+ H
2
O → O
2
+ HO
•
+ HO
-
II.2
Os radicais HO
•
podem também são formados pela combinação da ozonização
com a radiação UV e/ou H
2
O
2
. Alguns compostos orgânicos refratários, os quais não
são oxidados ou são lentamente oxidados pelo ozônio, podem ser oxidados pelos
radicais HO
•
.
Na ozonização em água, somente parte do ozônio reage diretamente com solutos
dissolvidos, outra parte é decomposta antes da reação. Tal decomposição é catalisada
pelos íons hidróxidos e outras espécies presentes no meio, promovendo a formação dos
radicais HO
•
(HOIGNÉ e BADER, 1983a, STAEHELIN e HOIGNÉ, 1985). Esses
radicais e seus produtos de reação podem adicionalmente acelerar a decomposição do
ozônio, através de reações radicalares em cadeia. A Figura II.8 apresenta um esquema
simplificado de reações do ozônio em solução aquosa. Em alguns sistemas aquosos,
102
águas naturais e potáveis, dependendo do pH e de outros fatores (temperatura e
constituintes presentes na água) esses dois caminhos de reação podem ser significativos.
Figura II.8. Esquema de reações do ozônio em solução aquosa. Onde, M = composto,
M
oxid
= composto oxidado, Si = capturador de radical livre, P = produtos que não
catalisam a decomposição do ozônio, R
•
= radicais livres que catalisam a decomposição
do ozônio (figura copiada de HOGNÉ e BADER, 1983a).
De acordo com a Figura II.8, os efeitos do ozônio em sistemas aquosos são
resultado de: (1) reação direta do ozônio com compostos dissolvidos; (2) sua
decomposição em radicais secundários (radicais livres HO
•
e HO
•
2
) e (3) as
subseqüentes reações dos oxidantes secundários com os compostos dissolvidos na água.
Todas as reações podem ocorrer simultaneamente, as reações predominantes dependem
das condições reacionais (temperatura e pH) e da composição química do meio
(alcalinidade natural – carbonato e bicarbonato que são capturadores e consomem
rapidamente os radicais HO
•
). O aumento da alcalinidade diminui a concentração dos
radicais HO
•
, pelo consumo dessas espécies e assim, o mecanismo via ozônio molecular
predomina no sistema (RICE, 1997).
A presença de espécies capturadoras, tais como carbonato e em menor extensão o
bicarbonato, diminui as taxas de reações dos radicais OH
•
com os solutos. No caso dos
íons carbonatos, este efeito é devido à reação de transferência do elétron do íon CO
3
2-
para os radicais OH
•
, como apresentado na Equação II.3 (HOIGNÉ e BADER, 1976).
103
HO•
+
+
CO
3
•
-
+ HO
-
k = 20 x 10
-
7
L. mol
-
1
.s
-
1
Produtos
II.3
Como na ozonização o ozônio se decompõe em oxidantes secundários, a avaliação
do processo de ozonização sempre envolve, principalmente, duas espécies de oxidantes,
o ozônio e os radicais HO
•
. Enquanto que o processo de desinfecção ocorre
predominantemente através do ozônio molecular.
Os caminhos de reação que ocorrem durante a ozonização são regulados por
diferentes parâmetros que geralmente conduzem a diferentes produtos de oxidação, por
isso, a importância do conhecimento dos mecanismos de oxidação desde a reação direta
com o ozônio até as reações com outros oxidantes secundários formados pela
decomposição do ozônio, essas reações podem e são estudas separadamente.
O conhecimento da cinética de decomposição do ozônio em meio aquoso é de
suma importância devido à larga aplicação da ozonização no tratamento de água e em
outros sistemas aquosos. Na literatura vários mecanismos de decomposição de ozônio
na água são relatados. As cinéticas de decomposição do ozônio em solução aquosa têm
sido bastante investigadas (FORNI
et al., 1982, PELEG, 1976, STAEHELIN e
HOIGNÉ, 1982, STAEHELIN e HOIGNÉ, 1985, SOTELO
et al., 1987), uma vez que
envolve um grande número de reações químicas.
Com base em observações experimentais, WEISS (1935) propôs como uma
primeira etapa da reação de decomposição do ozônio em água a Equação II.4.
O
3
+ HO
-
→ O
2
- •
+ HO
2
•
II.4
Seguida pelas reações em cadeia representadas pelas Equações II.5 a II.8.
O
3
+ HO
2
•
→ 2O
2
•
+ HO
•
II.5
O
3
+ HO
•
→ O
2
•
+ HO
2
•
II.6
104
HO
2
•
+ HO
2
•
→ O
3
+ H
2
O
II.7
HO
2
•
+ HO
•
→ O
2
+ H
2
O
II.8
ADLER e HILL (1950) através de seus estudos cinéticos propuseram o seguinte
mecanismo de reações apresentado pelas Equações II.9 a II.12:
O
3
+ H
2
O → HO
3
+
+ HO
-
II.9
HO
3
+
+ HO
-
→ 2HO
•
2
II.10
O
3
+ HO
2
•
→ HO
•
+ 2O
2
II.11
HO
2
•
+ HO
•
→ H
2
O + O
2
II.12
Segundo FORNI
et al. (1982), a decomposição do ozônio em solução aquosa
alcalina não é um processo de etapa simples, mas, envolve reações em cadeia, que
podem ser iniciadas pela Equação II.13:
O
3
+ HO
-
→ O
3
- •
+ HO
•
II.13
Entretanto, os radicais HO
•
podem ser produzidos de acordo com as reações
apresentadas nas Equações II.14 a II.17. Porém, os radicais O
3
- •
podem ser formados
pela Equação II.18.
O
3
+ HO
-
→ HO
2
•
+ O
2
II.14
HO
2
- •
+ O
3
→ HO
2
•
+ O
3
- •
II.15
O
3
- •
↔ O
- •
+ O
2
II.16
O
- •
+ H
2
O ↔ HO
•
+ HO
-
II.17
105
O
2
- •
+ O
3
→ O
3
- •
+ O
2
II.18
Segundo uma revisão de VON GUNTEN (2003a), a decomposição do ozônio em
água envolve as seguintes reações apresentadas pelas Equações II.19 a II.26:
O
3
+ HO
-
→ HO
2
-
+ O
2
k = 70 M
-1
.s
-1
II.19
O
3
+ HO
2
-
→ HO
•
+ O
2
-•
+ O
2
k = 2,8 x 10
6
M
-1
.s
-1
II.20
O
3
+ O
2
-•
→ O
3
-•
+ O
2
k = 1,6 x 10
9
M
-1
.s
-1
II.21
Em pH<
≈ 8: O
3
-•
+ H
+
↔ HO
3
•
k
+
= 5 x 10
10
M
-1
.s
-1
k
-
= 3,3 x 10
2
s
-1
II.22
HO
3
•
→ HO
•
+ O
2
k = 1,4 x 10
5
s
-1
II.23
Em pH>
≈ 8: O
3
-•
↔ O
-•
+ O
2
k
+
= 2,1 x 10
3
M
-1
.s
-1
k
-
= 3,3 x 10
9
s
-1
II.24
O
-•
→ HO
•
+ HO
-
k = 1 x 10
8
s
-1
II.25
HO
•
+ O
3
→ HO
2
•
+ O
2
k = 1 x 10
8
– 2 x 10
9
M
-1
.s
-1
II.26
De acordo com as Equações II.19 e II.20 o início da decomposição do ozônio pode
ser artificialmente acelerada pelo aumento do pH ou adição de H
2
O
2
. A reação
apresentada pela Equação II.26 é um processo rápido e é importante nas águas com
baixa concentração de espécies capturadores, podendo conduzir ao consumo de radicais
HO
•
e ozônio, e a baixa capacidade de oxidação no sistema.
Como se pode observar, a decomposição do ozônio na água é um tópico bastante
complexo, dependente de vários parâmetros. Além disso, todas as espécies
intermediárias formadas são muito reativas e possuem tempo de meia-vida muito curto
que dificultam sua identificação.
106
A eficiência do processo de ozonização é significativamente afetada pela
eficiência da transferência de massa gás-líquido, pela reação do ozônio e cinética de
decomposição das substâncias químicas. Altos custos associados com a aplicação do
ozônio podem ser reduzidos pelo aumento na taxa de transferência de massa, na
dissolução do ozônio gás, e pela reação do ozônio, assim que é produzido, com os
poluentes em solução pelo uso do gerador de ozônio
in situ. Um aumento na taxa de
transferência de massa está relacionado com a entrada do ozônio no sistema aquoso, ou
seja, no uso de difusores capazes de desenvolverem microbolhas de ozônio que
aumentem a área interfacial para a transferência de massa (PANDA
et al., 2004).
II.5.4. Aplicações do Ozônio nas Plantas de Tratamento de Água e Efluentes
O aumento do uso do ozônio nas estações de tratamento de água potável e esgoto
municipal tem sido estimulado pela necessidade de alcançar um efluente com alta
qualidade que atenda aos padrões de descarte ou potabilidade cada vez mais exigentes.
Nas plantas de tratamento de água ou efluentes, o ozônio pode ser adicionado em
vários pontos ao longo do tratamento: pré-ozonização, ozonização intermediária,
desinfecção final ou como polimento para oxidação de poluentes remanescentes. No
tratamento de água, por exemplo, o ozônio pode ser usado na remoção de inorgânicos,
como auxiliar no processo de coagulação/floculação, na remoção de manganês, na
degradação de material orgânico, na remoção de odor e gosto, na remoção de
micropoluentes e na desinfecção (GLAZE, 1987).
O ozônio é um excelente desinfectante, é capaz de inativar uma grande variedade
de microrganismos patogênicos, como protozoários que são muito resistentes aos
desinfectantes convencionais (Cl
2
e ClO
2
). O ozônio conduz a uma adequada inativação
aplicando baixas doses de ozônio e pequenos tempos de contatos (VON GUNTEN,
2003a).
No tratamento de água potável, a desinfecção e a oxidação podem ocorrer
simultaneamente quando o ozônio é o responsável pelas reações de oxidação.
Entretanto, se compostos resistentes à oxidação pelo ozônio devem ser oxidados, e a
107
oxidação pelos radicais HO
•
sendo a opção, neste caso há um decréscimo na eficiência
de desinfecção.
Uma aplicação importante da ozonização no processo de tratamento de água
potável é a remoção de material orgânico, podendo conter substâncias húmicas,
compostos orgânicos e micropoluentes como os pesticidas. Podem remover compostos
que conferem cor e odor, subprodutos da desinfecção com compostos de cloro, tais
como os trihalometanos (THM), e inibir o crescimento microbiano no sistema de
distribuição de água.
O ozônio começou a ser largamente aplicado no tratamento de água potável nos
anos 1990, hoje está se expandindo no tratamento de uma variedade de efluentes.
Segundo RICE (1997), a ozonização tem sido usada em plantas de tratamento da água
reciclada de aquários marinhos (para a remoção de DBO
5
e NH
3
e desinfecção); na
remoção de cianetos em efluentes de indústrias de acabamento de metais (ex. pinturas
de carros e aviões); no reuso da água de lavagem na produção de circuitos eletrônicos
que necessitam de águas com alta pureza (para remoção de microrganismos, de traços
de compostos orgânicos e amônia); na redução da cor e de concentração de surfactantes
em efluentes de plantas de tratamento da indústria de têxtil; na eliminação de fenóis ou
hidrocarbonetos de efluentes de refinarias de petróleo; na remoção de DQO e COD de
chorume proveniente de aterros sanitários e efluentes da indústria química; no
tratamento de efluentes de indústrias de polpa e papel.
Assim, o ozônio no tratamento de efluentes é aplicado na remoção de DQO, COD
e DBO
5
, compostos orgânicos recalcitrantes (fenóis, compostos organoclorados,
compostos aromáticos, detergentes, pesticidas), compostos inorgânicos (amônia, cianeto
e outros metais), cor, turbidez, no aumento da biodegradabilidade e na redução da
toxicidade (PARASKEVA e GRAHAM, 2002).
Várias substâncias químicas podem ser oxidadas pelo ozônio nas plantas de
tratamento de efluentes. O processo de tratamento com ozônio pode ter custos
altíssimos quando desenvolvidos para alcançar altas eficiências de mineralização
completa de poluentes orgânicos. Entretanto, baixas doses de ozônio podem ser
suficientes para transformar compostos biorefratários e melhorar sua
biodegradabilidade, permitindo um apropriado seqüênciamento do processo de
108
ozonização seguido por um processo de tratamento biológico, diminuindo
consideravelmente os custos do processo (BAIG e LIECHTI, 2001). A ozonização
também pode ser combinada com outros tratamentos, como por exemplo, a adsorção em
carvão ativado pode aumentar a eficiência na remoção de cor e compostos orgânicos se
este processo for usado após a ozonização (CAMEL e BERMOND, 1998, RICE, 1997).
BAIG e LIECHTI (2001) demonstraram que a combinação de processos
oxidativos químicos e biológicos no tratamento de efluentes pode alcançar uma alta
eficiência de remoção de DQO junto com uma redução na dosagem necessária de
ozônio, quando aplicados no tratamento de chorume de aterros sanitários e efluentes de
indústrias de papel.
II.5.5. Reações de Oxidação Durante a Ozonização
Devido à instabilidade do ozônio, uma reação de oxidação ocorre com a colisão
entre uma molécula de ozônio e a molécula dos compostos oxidáveis. Em uma reação
de oxidação a energia usualmente é transferida da molécula de ozônio que deixa uma
molécula de oxigênio estável (O
2
) e um altamente instável átomo de oxigênio (O), a
reação de dissociação do ozônio está apresentada na Equação II.27. A molécula que é
oxidada liga-se então ao átomo de oxigênio (O) livre criando um produto oxidado ou
derivado da substância (HARRISON, 2000). Assim, o ozônio pode oxidar compostos
inorgânicos, orgânicos e inativar microrganismos.
O
3
→ O
2
+ O
II.27
Na ozonização, a estrutura da molécula orgânica é modificada pela oxidação o que
freqüentemente causa a quebra da molécula original. Quando os metais oxidados são
dissolvidos na água, eles são freqüentemente hidrolisados e se tornam insolúveis. Além
de ter um alto potencial de oxidação, o ozônio possui a capacidade de difundir através
das membranas biológicas, assim, as células das bactérias e vírus são rompidas ou
inativadas através da oxidação das cadeias de DNA e RNA (HARRISON, 2000).
O ozônio reage melhor quando atua como um aceptor de transferência de elétrons
(para a oxidação de íons metálicos), como uma espécie eletrofílica (para oxidação de
109
aromáticos ativados, como o fenol) e como um reagente de adição dipolo (pela adição
em ligações carbono-carbono) (GLAZE, 1987).
O ozônio molecular é um oxidante muito seletivo, usualmente reage com as
ligações C=C, C=C−O−R ou C=C−X, e com átomos tais como, N, P, O, S. O ozônio
reage mais rapidamente com compostos orgânicos, os quais tenham substituintes orto e
para dirigidos, ex.: -OH, -CH
3
, -OCH
3
(LEDAKOWICZ et al., 2001). Entretanto,
grupos retiradores de elétrons sempre conduzem a uma diminuição das taxas de reação
(VON GUNTEN, 2003a). O ozônio molecular ataca o anel aromático por reações
eletrofílicas diretas, ocasionando a abertura do anel e gerando compostos oxidados
menores. Um sumário das reações de oxidação pelo ozônio é apresentado a seguir
(HARRISSON, 2000):
1)
Hidrocarbonetos alifáticos saturados (ex. propano) não reagem rapidamente
com o ozônio;
2)
Compostos olefínicos (ex. etileno) reagem com o ozônio rapidamente, em
segundos. Porém, alguns compostos clorados (tais como etilenos clorados),
podem reagir mais lentamente com o ozônio;
3)
Benzeno reage lentamente com o ozônio (dias). Porém, alguns
hidrocarbonetos poliaromáticos reagem rapidamente (segundos), mas a taxa
de reação pode ser dependente do pH;
4)
Fenóis reagem rapidamente com o ozônio (segundos), mas a taxa de reação
é dependente do pH;
5)
As espécies inorgânicas, os íons sulfeto (S
2-
), sulfito (SO
3
2-
), nitrato (NO
2
-
),
brometo (Br
-
) e iodeto (I
-
) reagem imediatamente com o ozônio;
6)
Em pH menor do que 9, amônia livre reage lentamente com o ozônio
(horas);
7)
O íon hipoclorito (OCl
-
) reage moderadamente com o ozônio para produzir
77% de íon cloreto e 23% de íon clorato.
8)
Ácidos hipocloroso e hipobromoso não reagem com o ozônio;
110
9)
A monocloroamina é degradada pelo ozônio mais lentamente do que o íon
hipocloreto;
10)
O ozônio reage rapidamente com os íons brometo para produzir íons
hipobrometo (OBr
-
) o qual equilibra rapidamente com a água para produzir
ácido hipobromoso (HOBr);
11)
Íon hipobrometo (OBr
-
) reage moderadamente com o ozônio para produzir
77% de íon brometo e 23% de íon bromato.
As reações de ozonização em baixo pH são predominantemente via ozônio
molecular, o aumento de pH favorece a decomposição do ozônio em radicais livres,
principalmente os radicais HO
•
, que irão oxidar os compostos. A oxidação pelos
radicais HO
•
é menos seletiva e geralmente mais rápida. Os radicais HO
•
reagem
rapidamente com hidrocarbonetos aromáticos, compostos insaturados, álcoois alifáticos
e ácido fórmico.
Os radicais HO
•
atacam os compostos orgânicos pela adição da hidroxila,
abstração de um átomo de hidrogênio ou pela transferência de elétrons (HUANG
et al.,
1993). Compostos orgânicos contendo sistemas aromáticos ou ligações múltiplas
carbono-carbono sofrem reação de adição de hidroxila devido à nuvem de elétrons
π
dos anéis aromáticos, como apresentado na Equação II.28:
HO
•
+ C
6
H
6
→
•
C
6
H
6
OH
II.28
As reações com compostos orgânicos insaturados são via abstração de hidrogênio
(Equação II.29):
HO
•
+ CH
3
COH
3
→ CH
2
COCH
3
+ H
2
O
II.29
A transferência de elétrons ocorre em reações do radical HO
•
com íons
inorgânicos, como apresentado pela Equação II.30.
Fe
2+
+ HO
•
→ HO
-
+ H
2
O
II.30
111
II.5.6. Oxidação de Compostos Orgânicos Durante a Ozonização
A oxidação de compostos orgânicos e inorgânicos durante a ozonização pode
ocorrer via ozônio molecular (O
3
), ou radicais HO
•
ou ainda uma combinação desses
dois oxidantes. O caminho da oxidação é determinado pela razão das concentrações de
ozônio e radicais HO
•
e as correspondentes cinéticas de reação. O ozônio é um oxidante
muito seletivo e de natureza eletrofílica. Os radicais HO
•
são espécies muito reativas e
com baixa seletividade.
A Figura II.9 apresenta os prováveis mecanismos da reação do ozônio e o radical
HO
•
com solutos. Esses diferentes caminhos de reação conduzem a diferentes produtos
de oxidação, que são controlados por diferentes cinéticas de reação.
Figura II.9. Mecanismo da reação do ozônio e radicais HO
•
com solutos (M) em meio
aquoso.
Na ozonização, tanto as reações de oxidação direta dos poluentes pelo ozônio,
quanto à decomposição do ozônio em sistemas aquosos são afetadas pela temperatura e
pelo pH. Estudos com o tempo de meia-vida do ozônio em solução aquosa indicam que
a decomposição do ozônio é acelerada pelo aumento do pH, que favorece a formação de
radicais HO
•
(GLAZE et al., 1987, STAEHELIN e HOIGNÉ, 1982, STAEHELIN e
HOIGNÉ, 1985). A decomposição do ozônio em um dado pH é também freqüentemente
Oxidação direta do O
3
alta seletividade
Decomposição do O
3
O
3
+ M
+ OH
–
ou + R
•
OH
•
+
•
O
2
–
HO
2
•
Baixa
seletividade
+ M
R
•
ou M’
oxid
O
2
+
•
O
3
–
O
3
+ O
2
ROO
•
M’’
oxi
d
M
oxi
d
112
acelerada por reações radicalares em cadeia, as quais podem ser iniciadas, promovidas
ou inibidas por vários solutos (STAEHELIN e HOIGNÉ, 1985).
A eficiência da degradação de compostos orgânicos em meio aquoso pelo
processo de oxidação depende da natureza dos compostos, bem como da qualidade da
água, isto é, na presença de material orgânico natural (MON) ou carbonatos que atuam
como espécies capturadoras e consomem os oxidantes (CAMEL e BERMOND, 1998).
Na ozonização de compostos orgânicos vários subprodutos são formados,
geralmente, são compostos orgânicos parcialmente oxidados que são mais
biodegradáveis do que seus compostos de origem. Por isso, em alguns casos, um
tratamento biológico pode ser usado com sucesso na mineralização dos subprodutos da
ozonização. A ozonização conduz a compostos de baixa massa molar, aldeídos e ácidos
carboxílicos, os quais podem ser melhor adsorvidos em processos com carvão ativado,
quando esse acoplamento for interessante (CAMEL e BERMOND, 1998).
II.5.6.1.
Cinética das reações de oxidação durante a ozonização
Dados cinéticos são importantes para avaliar quais substâncias químicas serão
oxidadas, em quais velocidades e em alguns casos, podem predizer os subprodutos
formados durante a ozonização. O conhecimento da cinética de reação de ozonização é
necessário ainda para predizer o comportamento dos oxidantes responsáveis pela
ozonização quando aplicados em sistemas complexos, tais como águas naturais e
efluentes. Para as reações com ozônio as constantes das taxas de reação para vários
compostos orgânicos e inorgânicos foram medidas e estão descritas na literatura
(HOIGNÉ e BADER, 1983a,b, HOIGNÉ
et al., 1985).
Segundo HOIGNÉ e BADER (1983a), a cinética de reação do ozônio com
compostos inorgânicos e orgânicos é tipicamente de segunda ordem, isto é, primeira
ordem em relação ao ozônio e primeira ordem aos compostos. A taxa de reação pode ser
formulada como a Equação II.31. Como no processo de ozonização, a oxidação de um
composto é caracterizada pela ação de dois oxidantes (ozônio e radicais HO
•
), essa
oxidação pode ser descrita pela cinética apresentada na Equação II.32.
113
M + O
3
→ produtos
[]
[][
3
OMk
dt
Md
=−
]
II.31
[]
[][] []
[]
.
3
3
HOMkOMk
dt
Md
OHO
+=−
II.32
Para se determinar as constantes das taxas de reações independentes (ozônio ou
radical HO
•
) para uma variedade de compostos, pesquisadores realizam experimentos
com o processo de ozonização em condições controladas. Diferentes métodos
experimentais (HOIGNÉ e BADER, 1983a, GLAZE e KANG, 1989) foram
desenvolvidos para este fim. Nestes estudos, interferente entre a reação direta do ozônio
e reações devido a sua decomposição em oxidantes secundários (radicais HO
•
) podem
ser eliminadas pela ação de espécies capturadoras de radicais HO
•
(HOIGNÉ e BADER,
1983a,b, HOIGNÉ
et al., 1985).
Os compostos orgânicos podem ser divididos entre não dissociáveis, tais como
álcoois alifáticos, olefinas, etilenos cloro substituídos, carboidratos e benzenos
substituídos; e compostos orgânicos os quais podem dissociar e formar espécies iônicas,
tais como, aminas, ácidos aminos, ácidos carboxílicos e fenóis (HOIGNÉ e BADER,
1983a,b). As constantes de taxas de reação com os radicais HO
•
também foram
determinadas por alguns autores (GLAZE e KANG, 1989).
HOIGNÉ e BADER (1983b) formularam um esquema cinético para solutos
orgânicos que se dissociam, que será apresentado a seguir:
Caso I (Caso Geral):
No caso dos solutos que consistem de ácidos (HB) ou bases (B), a taxa de reação
do ozônio também depende do grau de dissociação ou protonação dessas espécies, como
apresentado pelas Equações II.33 e II.34:
HB + H
2
O ' H
3
O
+
+ B
–
II.33
ou
114
B + H
3
O
+
' HB
+
+ H
2
O II.34
Para a Equação II.34, a dependência da taxa de desaparecimento de ozônio,
,
pode ser formulada como mostra a Equação II.35:
3
O
r
][
][
][
tottot
3
3
O
B
O
O
3
k
dt
d
r =
⋅
−=
][[
+
+
+= HBB]
HB
B
kk
(
)
][][
tot
HB
totB
B1B
+
α
−
+
α= kk
II.35
Onde k
tot
é a constante da taxa de reação aparente baseada na concentração total de
base presente, [B
tot
]; k
B
e são as constantes de taxa de reação individuais para a
espécies não-protonada B e a protonada HB
+
HB
k
+
, respectivamente. A quantidade relativa de
B ou HB
+
presentes em solução pode ser calculada a partir de α, o grau de ionização, de
acordo com a Equação II.36. O grau de ionização pode ser determinado a partir do pH
da solução e da constante de ionização da base protonada como mostra a Equação II.37:
][
[
+
+
=α
HB[B]
B]
II.36
+
+
+
=α
HB
H
1
1
K
][
II.37
Formulações correspondentes podem ser usadas para as equações de taxa para
ácidos.
Caso II:
As bases não-protonadas (B) ou ácidos deprotonados (B
–
) freqüentemente reagem
numa ampla faixa de valores de pH, muitas ordens de magnitude mais rápida do que os
115
compostos protonados HB
+
ou HB. Nesta região de pH a taxa de reação é determinada
somente pela taxa na qual B (ou B
–
) reage, conforme a Equação II.38:
B
kα >>
(
)
+
α
−
HB
1 k
II.38
A Equação II.35 se reduz a:
ktot = αkB.
II.39
Quando α é expresso pela Equação II.37 e se [H
+
] >> , a Equação II.38 pode
ser reescrita pelas Equações II.40 e II.41:
+
HB
K
][
+
+
⋅
=
H
HB
B
tot
Kk
k
II.40
ou
+
−
+
=
HB
Btot
ppHlog)log( Kkk
II.41
A Equação II.41 demonstra que nesse caso, o logaritmo da constante da taxa de
reação total,
k
tot
, aumenta linearmente com o pH, com um coeficiente angular igual a
1,0.
As Tabelas II.19 a II.21 apresentam as constantes de taxa de reação para a
oxidação de alguns compostos orgânicos com o ozônio e o radical HO
•
.
Tabela II.19. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o ozônio
compiladas HOIGNÉ e BADER (1983a).
Composto
3
O
k (M
-1
s
-1
)
Benzeno
2±0,4
Tolueno
14±3
Cloro benzeno
0,75±0,2
Tricloroetileno
17±4
Tetracloroetileno <0,1
n-Butanol
0,58±0,06
Acetona
0,032±0,006
tert- Butanol
≈0,003
Etanol
0,37±0,04
Metanol
≈0,024
116
Tabela II.20. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o ozônio
compiladas de HOIGNÉ e BADER (1983b).
Compostos orgânicos dissociáveis
Composto
HB
k (M
-1
s
-1
)
−
B
k (M
-1
s
-1
)
Fenol
(1,3±0,2)x10
3
(1,4±0,4)x10
9
2-Clorofenol
(1,1±0,3)x10
3
(0,2±0,1)x10
9
Ácido fórmico
5±5 100±20
Ácido glioxílico
0,17±0,4 1,9±0,2
Ácido malônico <4
7±2
Ácido oxálico - <0,04
Ácido acético <3x10
-5
-
Tabela II.21. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o radical
HO
•
compiladas de GLAZE e KANG (1989).
Composto
OH
k (M
-1
s
-1
)
Benzeno 7,8x10
9
Tolueno 6,8x10
9
Clorobenzeno 4,5x10
9
Tricloroetileno 4,0x10
9
Tetracloroetileno 2,3x10
9
Ácido fórmico 0,2x10
9
As constantes de taxa de reação nas quais compostos orgânicos dissociáveis
reagem com o ozônio aumentam consideravelmente com o aumento do pH, o que é
diretamente correspondente ao aumento do grau de dissociação de suas espécies
protonadas. Para os compostos fenólicos, as constantes de taxas de reação aumentam
largamente com os valores de pH pelo fator de 10 por unidade de pH (HOGNÉ e
BADER, 1983b). No caso dos compostos fenólicos essas constantes de taxas são de 10
3
a 10
9
M
-1
s
-1
, para o ácido fórmico de 1 para 100 M
-1
s
-1
.
Os dados apresentados nas Tabelas II.19 a II.21 explicam porque os ácidos
fórmico, glioxílico e malônico (formato, glioxilato e malonato) são freqüentemente
observados como intermediários da ozonização de compostos orgânicos. As baixas
constantes das taxas de reação indicam que esses compostos são lentamente oxidados
pelo ozônio quando o tempo de ozonização é estendido e porque as oxidações são mais
rápidas quando o pH é maior do que 3 (HOGNÉ e BADER, 1983b). Como é também o
117
caso dos ácidos acético e oxálico e seus ânions que sempre se acumulam como produtos
finais quando alguns compostos orgânicos são ozonizados em solução aquosa. Porém,
os compostos com baixas constantes das taxas de reação com o ozônio podem ser
oxidados por oxidantes secundários, tais como os radicais HO
•
durante a ozonização.
II.5.7. Formação de Subprodutos Indesejáveis na Ozonização
Durante a ozonização, principalmente em águas naturais, uma variedade de
subprodutos orgânicos são formados da oxidação da MON. Compostos como aldeídos,
cetonas, ceto-aldeídos, ácidos carboxílicos, ácidos acéticos, álcoois e ésteres podem ser
formados. Muitos desses subprodutos orgânicos são biodegradáveis. Devido às
características biodegradáveis desses produtos formados, filtros biológicos são muito
usados depois da ozonização em plantas de tratamento de água potável através do
mundo.
Contudo, até o momento, o único subproduto regulado na ozonização de águas
natural é o bromato, formado através dos íons brometo presentes em águas naturais
(VON GUNTEN, 2003b). Recentemente, devido ao conhecimento da formação desses
subprodutos formados durante a ozonização de águas naturais, o seu monitoramento
durante a ozonização é desejável. O NaCl normalmente contém pequenas quantidades
de íon brometo. Essas espécies de bromo oxidadas são substâncias tóxicas e
cancerígenas. A União européia e a US.EPA estabeleceram um máximo nível de
contaminação de 10 µg.L
-1
para o bromato na água potável (VON GUNTEN, 2003b).
II.5. 8. Oxidação de Micropoluentes Orgânicos
Os compostos orgânicos são oxidados com o ozônio seletivamente em certos
grupamentos funcionais. O ozônio reage principalmente com ligações duplas, sistemas
aromáticos e aminas não protonadas. Em geral, grupos doadores de elétrons melhoram a
oxidação pelo ozônio, enquanto que grupos retiradores de elétrons reduzem as taxas de
reação (VON GUNTEN, 2003a).
118
Recentemente, a ozonização tem sido um processo muito eficiente na oxidação de
vários micropoluentes presente em águas naturais e efluentes de ETE. Outro grupo de
processos oxidativos que também estão sendo avaliados na remoção desses
micropoluentes orgânicos em ambientes aquáticos são os POA.
II.5.8.1.
Oxidação de desreguladores endócrinos e fármacos
Para avaliar a eficiência de remoção de fármacos e desreguladores endócrinos em
águas naturais ou efluentes de ETE, podem-se determinar as constantes das taxas de
reação para a oxidação desses compostos com o ozônio e radicais HO
•
.
As constantes das taxas de reação para a oxidação de alguns pesticidas pelo ozônio
foram determinadas (YAO e HAAG, 1991). Com base nas estruturas e na Tabela II.22,
observa-se que as maiores constantes das taxas de reação são para os compostos que
apresentam grupamentos amino ou fenólicos como o carbofurano e o metoxicloro
respectivamente.
Recentemente, estudos investigam a oxidação de fármacos presentes em fontes de
água usadas no tratamento de água potável. As constantes das taxas de reação para a
oxidação dessas substâncias são apresentadas na literatura (HUBER
et al., 2003). A
cinética de oxidação de fármacos apresentadas nas Tabelas II.22 e II.23 mostram que
compostos com grupamento amino e fenólico e duplas ligações mostraram ser altamente
reativos com o ozônio, como é o caso do diclofenaco, a carbamazepina, o
sulfametoxazol e o 17α-etinilestradiol. A oxidação de todos os fármacos da Tabela II.22
com radicais HO
•
é muito rápida com as constantes de taxa de reação maiores. As
Tabelas II.22 e II.23 apresentam as constantes de taxas de reação de segunda ordem
para a oxidação de alguns compostos orgânicos com ozônio e radicais HO
•
.
As bifenilas policloradas (PCB) exibem uma baixa constantes de taxa de reação
com o ozônio (
< 0,9M
3
O
k
k
-1
s
-1
), segundo YAO e HAANG (1991), essa baixa
reatividade é devido à ozonização do anel aromático com substituintes clorados. Porém,
esses compostos são mais reativos com os radicais HO
•
( = 4,3 – 8x10
OH
9
M
-1
s
-1
).
119
A oxidação de alguns hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) também foi
investigada, esses compostos foram degradados eficientemente pelo ozônio com as
constantes de taxas de reação na faixa de 4,2x10
3
a 5,3x10
4
M
-1
s
-1
(TRAPIDO et al.,
1995).
HUBER
et al. (2003) investigaram as cinéticas de reação de alguns fármacos com
o ozônio e radicais HO
•
, apresentadas nas Tabelas II.22 e II.23. Segundo este estudo,
espécies desprotonadas reagem mais rapidamente com o ozônio eletrofílico, porque eles
são nucleofílicos fortes. As constantes das taxas de reação para o 17α-etinilestradiol e a
roxitromicina são fortemente dependentes do pH devido aos seus valores de pk
a
serem
maiores do que 8 e o grupo fenólico desprotonado do 17α-etinilestradiol e a amina não
protonada da roxitromicina reagirem com algumas ordens de magnitude mais rápidas do
que suas formas protonadas. Para outros fármacos (ibuprofeno, iopromida e diazepan)
as baixas constantes das taxas de reação podem ser explicadas pela ausência de grupos
reativos. Assim, durante a ozonização desses compostos, as reações diretas com ozônio
são menos importantes do que a oxidação pelos radicais HO
•
.
Tabela II.22. Constantes das taxas de reação da oxidação de compostos orgânicos com
radicais HO
•
compiladas de estudos da literatura.
Composto
OH
k (M
-1
s
-1
)
Referência
Pesticidas
(2,6±0,4)x10
9
HAAG e YAO, 1992
Atrazina
2,4 x10
9
HUBER et al., 2003
Carbofurano 7x10
9
HAAG e YAO, 1992
Endrin 4x10
9
HAAG e YAO, 1992
Metoxicloro 2x10
10
HAAG e YAO, 1992
Fármacos
Carbamazepina
(8,8±1,2)x10
9
HUBER et al., 2003
Diclofenaco
(7,5±1,5)x10
9
HUBER et al., 2003
Sulfametoxazol
(5,5±0,7) x10
9
HUBER et al., 2003
17α-etinilestradiol (9,8±1,2) x10
9
HUBER et al., 2003
Diazepan
(7,2±1,0) x10
9
HUBER et al., 2003
Ibuprofeno
(7,4±1,5) x10
9
HUBER et al., 2003
Iopromida
(3,3±0,6) x10
9
HUBER et al., 2003
Benzafibrato
(7,4±1,2)x10
9
HUBER et al., 2003
Dioxina
2,3,7,8 – tetraclorobenzo-
dioxina
4 x 10
9
HAAG E YAO, 1992
120
Tabela II.23. Constantes das taxas de reação da oxidação de compostos orgânicos com
ozônio compiladas de estudos da literatura.
Composto
3
O
k
(M
-1
s
-1
)
Referência
Pesticidas
Atrazina 6 YAO e HAAG, 1991
Carbofurano
620±60
YAO e HAAG, 1991
Endrin <0,02 YAO e HAAG, 1991
Metoxicloro
270±80
YAO e HAAG, 1991
Fármacos
Carbamazepina
≈ 3 x10
5
HUBER et al., 2003
Diclofenaco
≈ 1 x10
6
HUBER et al., 2003
Roxitromicina
(4,5±0,5)x10
6
HUBER et al., 2003
Sulfametoxazol
≈ 2,5 x10
6
HUBER et al., 2003
17α-etinilestradiol ≈ 7 x10
9
HUBER et al., 2003
Diazepan
0,75±0,15
HUBER et al., 2003
Ibuprofeno
≈9,6±1
HUBER et al., 2003
Iopromida <0,8 HUBER et al., 2003
Benzafibrato
590±50
HUBER et al., 2003
PCB
2,2’,4,4’,5,5’-
hexaclorobifenil
<0,9 YAO e HAAG,1991
HAP
Benzo[a]pireno 5,3x10
4
TRAPIDO et al.,1995
pireno 3,6x10
4
TRAPIDO et al., 1995
antraceno 2,7x10
4
TRAPIDO et al., 1995
fenantreno 1,0x10
4
TRAPIDO et al., 1995
fluoranteno 9,5x10
3
TRAPIDO et al., 1995
Benzo[ghi]perileno 8,4x10
3
TRAPIDO et al., 1995
fluoreno 4,2x10
3
TRAPIDO et al., 1995
Ftalatos
dimetil ftalato (DMP)
0,20±0,10
YAO e HAAG, 1991
dietil ftalato (DEP)
0,14±0,05
YAO e HAAG, 1991
Metabólito do clofibrato, um agente regulador de lipídeos.
Ácido clofíbrico 842,1 ANDREOZZI et al., 2003c
121
Dos dados apresentados nas Tabelas II.22 e II.23 conclui-se que a oxidação desses
micropoluentes orgânicos pelo ozônio é somente um processo eficiente para
componentes que contém grupamentos amino, sistemas aromáticos ativados (ex.
fenólicos) ou duplas ligações. As altas constantes das taxas de reação para a oxidação
com radicais HO
•
mostram que a remoção desses compostos orgânicos com radicais
HO
•
é muito mais rápida e mostram a natureza não seletiva dos radicais HO
•
nas reações
em solução aquosa.
A Tabela II.23 mostra que o ozônio pode oxidar todas as substâncias orgânicas
apresentadas, porém é mais eficiente com alguns compostos, ou seja, que apresentam
grupos funcionais específicos. Contudo, na ozonização, os compostos orgânicos que não
reagem diretamente com o ozônio, podem ser removidos através das reações com os
radicais HO
•
.
HUBER
et al. (2003) determinaram as constantes das taxas de reação de segunda
ordem para vários fármacos em água pura e investigaram a cinética de oxidação desses
compostos em um sistema de ozonização em águas naturais. Os autores concluíram que
as constantes das taxas de reação determinadas em água pura podem ser aplicadas para
predizer o comportamento dos fármacos em água natural.
II.6. TRATAMENTOS APLICADOS NA REMOÇÃO DE
MICROPOLUENTES (FÁRMACOS E DESREGULADORES ENDÓCRINOS)
EM SISTEMAS AQUOSOS
Atualmente, a presença de micropoluentes que podem causar danos à saúde
humana e de animais é uma preocupação mundial. Tecnologias de tratamentos que
podem eficientemente remover esses poluentes de ambientes aquáticos têm sido
bastante investigadas. No entanto, não só a eliminação desses micropoluentes, mas
também a destruição do seu efeito potencial deve ser alcançada.
Devido à presença de fármacos e desreguladores endócrinos em ambientes
aquáticos torna-se necessária uma avaliação da eficiência de remoção dos processos de
tratamento empregados nas plantas de tratamento de água potável e de esgoto
122
doméstico. Estudos demonstram que esses micropoluentes não são completamente
removidos pelos processos convencionais de tratamento empregados nas estações de
tratamento de água potável e de esgoto doméstico. Com isso, diferentes outros
processos de tratamento estão sendo investigados para a remoção desses compostos de
sistemas aquosos.
Estes estudos claramente demonstram que os processos oxidativos, tais como,
ozonização e os POA são tecnologias promissoras na remoção de micropoluentes (ex.
fármacos, estrogênios, pesticidas, PCB entre outros) no tratamento de água potável ou
outros sistemas aquosos.
II.6.1. Ozonização de Fármacos
Vários estudos têm demonstrado que a ozonização e os POA são tecnologias
muito eficientes na oxidação de vários fármacos e estrogênios em ambientes aquáticos
(ZWIENER e FRINMEL, 2000, ANDREOZZI
et al., 2002, HUBER et al., 2003,
TERNES
et al., 2002, TERNES et al., 2003). Particularmente, a ozonização tem-se
mostrado ser um processo eficiente na remoção de fármacos em ambientes aquáticos
nas condições usualmente utilizadas no tratamento de água potável (ANDREOZZI
et
al
., 2002, TERNES et al., 2002).
ZWIENER e FRINMEL (2000) investigaram a ozonização do ácido clofíbrico, do
ibuprofeno e do diclofenaco (em concentrações iniciais 2,0 µg.L
-1
). A ozonização, em
condições de ozônio aplicadas em plantas de tratamento de água (1,0 mg.L
-1
de ozônio e
10 min), degradou facilmente o diclofenaco, alcançando 97% de remoção, enquanto que
o ácido clofíbrico e o ibuprofeno foram removidos em 8 e 12 % respectivamente. Com a
aplicação de O
3
/H
2
O
2
a eficiência de remoção aumentou significativamente, alcançando
degradações superiores a 90% dos fármacos investigados.
ANDREOZZI
et al. (2002) estudaram a remoção de carbamazepina em sistemas
aquosos pela ozonização e identificaram os intermediários formados durante a sua
oxidação. Os resultados mostraram que a completa remoção deste fármaco em água
potável, em concentrações encontradas no meio ambiente, pode ser facilmente
alcançada com a ozonização em condições adotadas em plantas de tratamento de água
123
(dosagem de ozônio de 1,0 mg.L
-1
por 10 a 60 min), porém, um baixo grau de
mineralização foi alcançado com 60 minutos de ozonização. Os intermediários
identificados na ozonização da carbamazepina foram: os ácidos oxálico, glioxílico,
cetomalônico.
ADAMS
et al. (2002) avaliaram a eficiência de remoção de antibióticos em vários
processos de tratamentos convencionais utilizados em plantas de tratamento de água
potável, dentre esses processos, a ozonização. Dosagens de ozônio tipicamente
utilizadas em plantas de tratamento de água foram altamente eficientes na remoção de
antibióticos como: carbadox, sulfaclorpiridazina, suladimetoxina, sulfamerazina,
sulfametazina, sulfatiazol e trimetropina, degradações maiores de 95% foram
alcançadas para cada antibiótico investigado, com 0,3 mg.L
-1
de ozônio e 1,3 min de
tratamento.
Outro estudo sobre a ozonização de fármacos em sistemas aquosos foi realizado
por TERNES
et al. (2002). Com uma pequena dosagem de 0,5 mg.L
-1
de O
3
, mais de
97% da concentração de carbamazepina e do diclofenaco foram removidos, enquanto
que somente 50% da concentração de bezafibrato foi removida com uma dosagem de
1,0-1,5 mg.L
-1
de O
3
, para remoções de 90% desse composto, uma concentração de 3,0
mg.L
-1
de ozônio foi necessário. O ácido clofíbrico foi considerado muito estável frente
à ozonização, com uma dosagem de 3,0 mg.L
-1
de O
3
somente 40% desse fármaco foi
degradado.
A ozonização do paracetamol em solução aquosa foi estudada por ANDREOZZI
et al. (2003a). Os resultados mostraram que o ozônio foi capaz de remover totalmente o
paracetamol (concentração inicial = 5,0 x 10
-3
mol.dm
-3
), alcançando um grau de
mineralização de 30% com altos tempos de reação. Em pH 2,0 e 7,0, cerca de 70% dos
subprodutos foram identificados como sendo, ácidos oxálico, glioxálico e fórmico, após
105 minutos de ozonização.
A ozonização do metabólito ácido clofíbrico também foi investigada por
ANDREOZZI
et al. (2003c). A completa remoção do ácido clofíbrico (concentração
inicial = 1,5 x 10
-3
a 2,0 x 10
-3
M) foi alcançada com 20 min de ozonização com um
grau de mineralização de 34%. Uma mineralização de 49% só foi alcançada com 60 min
de um prolongado processo de ozonização (1,0 x 10
-5
M de ozônio). Demonstrando
124
novamente a difícil degradação desses metabólito frente à ozonização. Os autores
também observaram que o conteúdo de cloreto no metabólito foi transformado em íons
cloreto, indicando que não foram formados intermediários clorados perigosos.
TERNES
et al. (2003) investigaram a ozonização na remoção de fármacos (meios
de contraste de Raio-X, antibióticos, β-bloqueadores, metabólito de um regulador de
lipídio e um antiepiléptico) presentes em efluente de ETE. Para uma dosagem de 5 a
15mg.L
-1
de ozônio (tempo de contato de 18 min), a estrona e quase todos os fármacos
foram totalmente removidos, somente os meios de contraste de Raio-X foram ainda
detectados no efluente. Esses fármacos, foram removidos numa faixa de 13 a 89% com
dosagens de ozônio de 10 e 15 mg.L
-1
.
No estudo de HUBER
et al. (2003), a ozonização foi um processo muito eficiente
na remoção de fármacos (bezafibrato, carbamazepina, diazepan, diclofenaco, 17α-
etinilestradiol, ibuprofeno, iopromida, sulfametoxazol e roxitromicina) em
concentrações na faixa de ng.L
-1
em águas naturais. Dosagens de 0,2 a 0,5mg.L
-1
de O
3
foram suficientes para remover mais de 97% de quase todos os fármacos estudados,
com exceção do bezafibrato, em diferentes amostras de águas naturais. A constante de
taxa de reação do benzafibato com o ozônio é no mínimo 100 vezes menor do que as
taxas de reação dos outros compostos investigados com o ozônio. As constantes das
taxas de reação estimadas desses compostos neste estudo estão apresentada
anteriormente nas Tabelas II.22 e II.23. Os autores concluíram que baixas doses de
ozônio são suficientes para alcançar uma completa remoção de fármacos com
constantes das taxas de reação > 10
5
M
-1
.s
-1
.
A ozonização também foi investigada no tratamento de efluentes de indústrias
farmacêuticas. BALCIOGLU e ÖTKER (2003) concluíram que a ozonização pode ser
usada com sucesso como um pré-tratamento, melhorando a biodegradabilidade de
efluentes de indústrias farmacêuticas contendo antibióticos (penicilina e quinolona).
VOGNA
et al. (2004b) mostraram que a ozonização foi efetiva na degradação do
diclofenaco. Após 90 min de tratamento, uma completa conversão do cloro em íons
cloreto com um grau de mineralização de 32% foi alcançada. Os autores ainda
identificaram vários intermediários resultantes da oxidação desse fármaco (acridina,
ácido salicílico, catecol e ácido antranílico).
125
As condições e os resultados desses tratamentos são apresentados no Anexo 3.
II.6.2. Ozonização de Estrogênios
A ozonização tem sido considerada como uma tecnologia promissora na remoção
de estrogênios naturais e sintéticos de água potável e efluentes de ETE. Recentemente,
alguns estudos têm investigado a oxidação dessas substâncias durante a ozonização
(ALUM
et al., 2004, HUBER et al., 2003, KIM et al., 2004, TERNES et al., 2003).
Esses estudos demonstram que os estrogênicos são rapidamente oxidados na
ozonização. Os compostos podem ser oxidados pelo ozônio ou pelos radicais HO
•
. As
duas espécies são oxidantes fortes e as constantes das taxas de reação dos estrogênios
com os dois oxidantes são extremamente altas.
HUBER
et al. (2003) investigaram a oxidação do 17α-etinilestradiol
(concentração inicial = 0,5 µM) durante a ozonização aplicada no tratamento de água
potável. Doses na faixa de 0,1 – 0,2 ng.L
-1
de ozônio foram capazes de alcançar uma
remoção >97% desse estrogênio em águas naturais.
TERNES
et al., (2003) investigaram a remoção de estrona concentração inicial no
efluente de ETE de 0,015µg.L
-1
. Como uma dosagem de 5 mg.L
-1
de ozônio, esse
estrogênio foi reduzido abaixo do limite de detecção.
No estudo de ALUM
et al. (2004), o ozônio (dosagem de 1,5 mg de O
3
.L
-1
) oxidou
rapidamente o bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol, todos com concentração
inicial de 100 nM, em condições usadas no tratamento de água potável. Sendo que o
17β-estradiol e o 17α-etinilestradiol foram mais rapidamente oxidados do que o
bisfenol A. Segundo os autores, a atividade estrogênica dos três desreguladores
endócrinos diminuiu, porém uma estrogenicidade residual permaneceu devido aos
subprodutos de oxidação. A oxidação resultou em uma rápida transformação dos
compostos investigados.
Os resultados do estudo de KIM
et al. (2004) mostraram que a ozonização removeu
99% do 17β-estradiol (concentração inicial de 5,2 µm). Com uma concentração de
ozônio de 5 mg de O
3
.L
-1
após 15 min de tratamento. A mesma remoção de 17β-
126
estradiol foi alcançada com uma concentração de ozônio de 15,0 mg.L
-1
por 4 min. Os
autores observaram que a concentração de ozônio dissolvido aumentou quando muito
do 17β-estradiol já havia sido degradado, concluindo que o 17β-estradiol é altamente
reativo com o ozônio.
II.6.3. Os POA na Remoção de Fármacos e Desreguladores Endócrinos
Sob condições de tratamento reais, atrazina e outros herbicidas foram oxidados
com O
3
/H
2
O
2
. Cerca de 80% da atrazina e >99% dos herbicidas fenil - substituídos
foram degradados em pH 7,8 e razão H
2
O
2
/O
3
de 3,7 g.g
-1
. Outra possibilidade de
tratamento empregada na decomposição de pesticidas na água é o Reativo de Fenton
(Fe
2+
/H
2
O
2
). Porém só foi alcançada uma remoção de 75% de atrazina e 94% de
herbicidas fenil - substituídos em pH 5,5 e 10 mg.L
-1
de H
2
O
2
(IJPELAAR et al., 2000).
Com a fotocatálise com TiO
2
imobilizado, COLEMAN et al. (2000) alcançaram
uma degradação de 50% do 17β-estradiol em 40 minutos. Uma remoção de 98% só foi
alcançada em 3,5 horas de tratamento. Enquanto que OHKO
et al. (2002) alcançaram
mais de 99% de degradação do 17β-estradiol com a fotocatálise com o TiO
2
em
suspensão em 30 minutos de tratamento.
Segundo OHKO
et al. (2002) a degradação de mais de 99% do 17β-estradiol com
a fotocatálise ocorre após 30 minutos de radiação UV, enquanto que a mineralização
completa foi alcançada em 3 horas de tratamento. Neste estudo foram identificados,
alguns intermediários e proposto um mecanismo para a oxidação fotocatalítica do 17β-
estradiol, e concluiu-se que os intermediários produzidos durante a oxidação
fotocatalítica do 17β-estradiol não exibem atividade estrogênica.
A fotocatálise também têm sido avaliada como um processo de remoção para
outros desreguladores endócrinos. A degradação fotocatalítica do bisfenol A foi
investigada por OHKO
et al. (2001). Neste estudo, o bisfenol A foi totalmente
mineralizado com 20h de tratamento. A atividade estrogênica do bisfenol A também foi
drasticamente removida com 6h de tratamento.
127
NAKASHIMA
et al. (2002) utilizaram partículas de TiO
2
imobilizado em tela de
politetrafluoroetileno (PTFE) e luz negra (15 W) na remoção de 17β-estradiol em
solução aquosa. Os resultados mostraram que 98% de remoção do estrogênio foi
alcançada com 1 hora de tratamento. Os autores investigaram também a degradação
fotocatalítica do bisfenol A em água. O bisfenol A mostrou comportamento similar ao
observado com o 17β-estradiol.
ANDREOZZI
et al. (2003a) estudaram a oxidação do paracetamol com H
2
O
2
/UV.
Observaram que com uma concentração de 5,0 x 10
-3
mol.dm
-3
de H
2
O
2
, 21% do
paracetamol foi mineralizado em 4 min de tratamento. Com uma concentração maior de
H
2
O
2
(2,0 x 10
-2
mol.dm
-3
) há um incremento na mineralização de 40%. O processo de
H
2
O
2
/UV foi capaz de remover completamente o paracetamol. Entre os intermediários
identificados têm-se a hidroquinona, o 2 hidroxi-4-(N-acetil)-aminofenol e ácidos
dicarboxílicos.
O processo de H
2
O
2
/UV também foi investigado na remoção do metabólito ácido
clofíbrico em água (ANDREOZZI
et al., 2003c). A quase completa remoção desse
metabólito foi alcançada com 60 min de tratamento, porém com uma baixa
mineralização neste tempo de reação.
Para aumentar a eficiência de degradação dos estrogênios pela fotocatálise,
NAKASHIMA
et al. (2003) desenvolveram uma modificação no processo usado por
NAKASHIMA
et al. (2002), que melhorou a transferência de massa do sistema.
Segundo os autores, 17β-estradiol e estrona em solução aquosa foram rapidamente
degradados. Em efluente de ETE, a estrona foi aproximadamente 90% degradada. Com
esta modificação no processo fotocatalítico, os autores esperam tratar efluentes de ETE
eficientemente com um relativo baixo custo de energia e custo espaço de tempo.
A degradação da carbamazepina pelo processo de H
2
O
2
/UV foi investigada por
VOGNA
et al. (2004a). Uma alta remoção desse fármaco foi alcançada, com a completa
degradação em 4 min de tratamento e 35% de remoção de COT. Foram determinados
também alguns intermediários formados na oxidação do carbamazepina, indicando a
formação de substâncias mais tóxicas e perigosas do que o fármaco investigado.
Em outro estudo, VOGNA
et al. (2004b) estudaram o processo de H
2
O
2
/UV na
degradação do antiinflamatório diclofenaco. Foi concluído que em 90 min de
128
tratamento, 39% do diclofenaco foi degradado e somente 52% de conversão de cloro em
íons cloretos foi alcançada. Alguns intermediários da oxidação do diclofenaco também
foram identificados.
Segundo COLEMAN
et al. (2004), a fotocatálise e a fotólise são eficientes na
degradação de estrogênios (17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol) em água.
Porém, a degradação fotocatalítica dos estrogênios em meio aquoso é muito mais
eficiente do que somente pela luz UV. O 17β-estradiol foi degradado pela fotocatálise
cerca de duas vezes a sua taxa na fotólise.
Com a fotocatálise, diferentes taxas de reações e remoções de estrogênios foram
obtidas em vários estudos, isso é devido ao uso de diferentes lâmpadas, tipo de reatores
e formas de uso dos catalisadores de TiO
2
(suspensão e imobilizados). Com base em
todos os estudos da literatura com a fotocatálise de estrogênios resta ainda determinar se
esse processo pode ser eficiente na degradação de estrogênios em concentrações
ambientais relevantes e em amostras ambientais reais (águas naturais e efluentes de
ETE).
II.6.4. Outros Tratamentos Empregados na Remoção de Fármacos e DE
Outros tratamentos também foram investigados na remoção de fármacos e
desreguladores endócrinos em sistemas aquosos, tais como, filtração,
coagulação/floculação, a adsorção em carvão ativado, osmose reversa, cloração, entre
outros.
MULROY (2001) investigou a eficiência de alguns meios de filtração na remoção
de antibióticos como: tetraciclina, penicilina e vancomicina em sistemas aquosos.
Foram estudadas três colunas: Coluna A recheada com areia; Coluna B com mistura de
areia e a levedura
Saccharomycer cerevisiae; e a Coluna C com mistura de areia e
carvão ativado. Os resultados mostraram que a Coluna C alcançou as melhores
remoções dos antibióticos investigados, para a penicilina uma remoção de 77,1% foi
alcançada, para a tetraciclina 96% e para a vancomicina 93,3%.
129
A eliminação de alguns fármacos durante os processos de tratamento de água
potável foi investigada em escala de laboratório, em planta piloto e em estações de
tratamento de água por alguns pesquisadores. ADAMS
et al. (2002) avaliaram os
processos empregados no tratamento convencional de água potável, comumente
utilizado na Europa e EUA, e determinaram as eficiências de remoções de antibióticos
usados na medicina humana (carbadox, sulfaclorpiridazina, suladimetoxina,
sulfamerazina, sulfametazina, sulfatiazol e trimetropina). Os processos, tais como,
adsorção em carvão ativado, osmose reversa, oxidação com cloro e ozônio, sob
condições tipicamente utilizadas em plantas de tratamento de água, foram efetivos na
remoção dos antibióticos investigados, alcançando remoções de 81-98%, 90,2-99,9%,
90%, 95%, respectivamente. Por outro lado, o processo de coagulação/floculação com
sais de alumínio e ferro não alcançou significativas remoções. Os processos de UV em
dosagens de desinfecção e troca iônica foram pouco eficientes na remoção desses
antibióticos, alcançando remoções de 50-80% e 21 a 58% respectivamente.
TERNES
et al. (2002) investigaram a remoção de carbamazepina, bezafibrato,
ácido clofíbrico e diclofenaco em diferentes processos de tratamento, como floculação,
adsorção em carvão ativado e ozonização em planta piloto e estação de tratamento de
água real. O processo de floculação com FeCl
3
não apresentou boa eficiência na
remoção dos fármacos investigados. Por outro lado, os quatro fármacos investigados
podem ser removidos eficientemente sob condições reais pela filtração em carvão
ativado. Já a ozonização se mostrou muito eficiente na remoção da carbamazepina,
bezafibrato e diclofenaco e moderadamente eficiente na degradação do ácido clofíbrico.
Foi observado ainda, que a capacidade de adsorção para os fármacos diminui no
processo de carvão ativado granular (CAG) se outros compostos, tais como, MON
competem pelos sítios de adsorção.
O poder de oxidação do cloro frente à desreguladores endócrinos (bisfenol A, 17β-
estradiol e 17α-etinilestradiol) foi avaliado por ALUM
et al. (2004). Com exceção o
bisfenol A, o cloro (1 mg.L
-1
) foi capaz de oxidar em pouco tempo de tratamento os
compostos estudados. A oxidação do bisfenol A, abaixo do limite de detecção, só foi
atingida após 4h de cloração. A cloração também resultou em um aumento da atividade
estrogênica do bisfenol A e 17α-etinilestradiol em até 4h de tratamento. No caso do
130
17β-estradiol, baixos níveis de atividade estrogênica foram encontrados já durante a
primeira hora de tratamento.
Um novo processo foi investigado na remoção de micropoluentes em efluentes. O
sistema de filtro biológico em conjunto com o óxido de manganês (MnO
2
) foi
empregado na oxidação de desreguladores endócrinos. O MnO
2
é um conhecido
oxidante em fase sólida e suas reações redox na superfície com compostos orgânicos
estão sendo estudadas (RUDDER
et al., 2004). Neste sistema biocatalítico, o MnO
2
e as
bactérias que oxidam o manganês são integrados. O MnO
2
oxida os micropoluentes em
moléculas menores, que junto com o Mn
2+
são degradados biologicamente e o
manganês reoxidado é redepositado no MnO
2
, este ciclo é apresentado na Figura II.10.
Com esse sistema de tratamento, RUDDER
et al. (2004) alcançou a remoção de 81,7%
de atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol em solução aquosa. A adsorção e a
destruição do 17α-etinilestradiol ocorrem no reator de MnO
2
. Neste estudo, foram
avaliados ainda a remoção da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol com areia e
carvão ativado granular (CAG), que foram de 17,3% e > 99,8% respectivamente.
Figura II.10. Sistema de reator biocatalítico de degradação do 17α-etinilestradiol no
qual o MnO
2
opera como uma superfície catalítica e os microrganismos oxidantes de
Mn
2+
, re-oxidam e redepositam o Mn
2+
no MnO
2.
17α-etinilestradiol
Mn
2+
e moléculas
oxidadas menores
Biofilme na superfície
do MnO
2
Redisposição
CO
2
+ H
2
O
O
2
MnO
2
comercial
131
O carvão ativado é comumente usado no tratamento de água potável para a
remoção de micropoluentes. FÜERHACHER
et al. (2001) investigaram a capacidade do
carvão ativado em remover estrogênios da água. Os resultados mostraram que o 17β-
estradiol (concentração de 0,5-100 ng.L
-1
) foi rapidamente adsorvido e o equilíbrio é
alcançado em 50-180 min de tratamento. Porém, mais estudos devem ser conduzidos
para reduzir a concentração de 17β-estradiol a níveis abaixo dos quais não causem
efeitos deletérios aos organismos expostos. Segundo YOON
et al. (2003), o processo de
adsorção com carvão ativado em pó (CAP) pode ser uma tecnologia útil para a remoção
de três desreguladores endócrinos (bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol) de
águas naturais com remoções > 99% em baixíssimas concentrações iniciais (500 ng.L
-1
).
A US.EPA (2001) realizou um estudo para avaliar os processos usados no
tratamento de água que podem ser usados para a remoção de alguns desreguladores
endócrinos. Concluíram que a melhor tecnologia disponível no tratamento de água para
a remoção de pesticidas (ex. metoxicloro, endosulfano e DDT), ftalatos (ex. DEHP e
DEP), alquilfenóis e alquilfenóis etoxilados (Ex. nonilfenol) e PCB é o processo de
filtração em CAG.
Os pesticidas são tradicionalmente removidos no tratamento de água potável pelo
processo de filtração em carvão ativado. Porém, os custos desse processo aumentam
pela competição do MON com os pesticidas pelos sítios de adsorção no carvão ativado.
Segundo VAN DER BRUGGEN
et al. (1998), a nanofiltração pode ser usada como
uma alternativa para a remoção de pesticidas de águas naturais, ou ainda pode ser usada
combinada com uma filtração em carvão ativado.
A aplicação de processos com membranas de nanofiltração (NF) e osmose reversa
(OR) em plantas de tratamento de água aumentou significativamente (VAN DER
BRUGGEN e VANDECASTEELE, 2003). Processos de NF e OR são particularmente
efetivos na remoção de micropoluentes inorgânicos (tais como, nitrato, arsênico e flúor)
e orgânicos (tais como, pesticidas entre outros) (NGHIEM
et al., 2004, VAN Der
BRUGGEN
et al., 1998, VAN DER BRUGGEN e VANDECASTEELE, 2003).
No estudo de VAN DER BRUGGEN
et al. (1998), a nanofiltração alcançou
remoções de 95% de pesticidas em águas subterrâneas em concentrações na faixa de
100 a 500 µg.L
-1
. Recentemente, os processos de separação, usando membranas
132
comerciais de NF e OR, estão sendo investigados na remoção de estrogênios (NGHIEM
et al., 2004). NGHIEM et al. (2004) avaliaram os fatores que governam a retenção de
estrogênios naturais (17β-estradiol e estrona) em processos de tratamento com
membranas. Porém, mais estudos devem ser realizados.
Os resultados e as condições dos processos de tratamentos apresentados e
utilizados na remoção de fármacos e desreguladores endócrinos em ambientes aquáticos
são apresentados no Anexo 3.
II.7 SUBPRODUTOS FORMADOS DURANTE A OXIDAÇÃO DE
COMPOSTOS ORGÂNICOS
II.7.1. Introdução
A remoção de micropoluentes orgânicos de ambientes aquáticos, seja em efluentes
de ETE ou plantas de tratamento de água potável, visando o menor impacto na saúde
humana e de animais é de suma importância. Entretanto, como é o caso da ozonização, a
mineralização completa do poluente geralmente não é alcançada em condições
economicamente viáveis. Conseqüentemente, os subprodutos formados da oxidação
desses micropoluentes devem ser identificados e investigados se o seu efeito potencial
ainda permanece.
No caso da ozonização, dependendo do ataque do ozônio nos grupos funcionais da
estrutura molecular do poluente, os efeitos potenciais das substâncias podem ser
destruídos. Entretanto, há casos que os produtos de oxidação ainda produzam os
mesmos efeitos, ou são mais tóxicos do que os compostos originais.
Os subprodutos identificados na ozonização de MON são principalmente aldeídos
(formaldeído, acetaldeído, glioxal e metilglioxal) e ácidos carboxílicos (ácidos fórmico,
acético, glioxílico, pirúvico e cetomalônico) (CAMEL e BERMOND, 1998).
Os subprodutos formados da ozonização de compostos orgânicos em sistemas
aquosos foram somente estabelecidos para poucos compostos, tais como, olefinas,
133
compostos aminos e aromáticos simples, como por exemplo, o fenol. O mecanismo de
decomposição do fenol durante a ozonização foi descrito por alguns autores. Um
exemplo é o mecanismo proposto por HUANG e SHU (1995) apresentado na Figura
II.11. As reações do ozônio com compostos fenólicos resultam na abertura do anel
aromático.
OH
OH
OH
+
O
3
+
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
3
+
Ácidos orgânic
o
Caminho de reação proposto para a decomposição do fenol pelo ozônio
OH
+
HO
.
O
.
HO
.
+
OH
OH
OH
+
OH
OH
Ácidos orgânicos
+
OH
OH
OH
OH
HO
.
OH
+
O
.
O
OH
+
Dímero
s
Caminhos de reação proposta para a decomposição do fenol pelos radicais HO
•
Figura II.11. Mecanismos de reação para a ozonização do fenol proposto por HUANG
e SHU (1995).
134
A maior parte das reações dos radicais HO
•
com fármacos acontecem no anel
benzeno, resultando na formação de compostos fenólicos ou a abertura do anel
(ANDREOZZI
et al., 2003a).
Na ozonização do fenol em solução aquosa, catecol e hidroquinona são os maiores
subprodutos (MVULA
et al., 2001). A formação desses intermediários é devida à
reação com os radicais HO
•
. Segundo MVULA et al. (2001), a formação dessas
substâncias pode ser suprimida quando álcool
tert-butil é adicionado como espécies
capturadoras de radicais HO
•
em pH 2. O ozônio ataca as duplas ligações e conduzem à
clivagem das ligações e a formação de compostos carboxílicos.
A investigação e identificação dos subprodutos formados na ozonização de
compostos complexos como é o caso de fármacos e estrogênios tem sido um tópico à
parte na química analítica. Poucos são os estudos que conseguem identificar os vários
subprodutos formados na ozonização desses compostos (ANDREOZZI
et al., 2002,
ANDREOZZI
et al., 2003a).
II.7.2. Subprodutos Formados da Oxidação do 17β-Estradiol
OHKO et al. (2002) investigaram a oxidação do 17β-estradiol através da
fotocatálise e concluíram que essa reação é iniciada com a oxidação do anel fenólico da
molécula de 17β-estradiol, gerando uma molécula de 10∈ - 17 β-dihidroxi–1,4–
estradieno–3–ona (DEO), assim o anel aromático do estradiol pode ser reduzido
parcialmente gerando os intermediários androsta 4,16–dien–3–ona (ADO) e a
testosterona (TS) que também foram identificados no processo, porém, não estão no
mecanismo apresentado na Figura II.12, em que está apresentado o mecanismo de
oxidação fotocatalítica do 17β-estradiol proposto por OHKO
et al. (2002). As estruturas
dos compostos ADO e TS estão apresentadas na Figura II.13. Contudo, nem todos os
intermediários citados no mecanismo proposto foram identificados em suas análises.
135
HO
Figura II.12. Mecanismo de degradação do 17β-estradiol pela fotocatálise proposto por
OHKO
et al. (2002).
OH
E
2
-e
-
+
.
OH
.
O
HO
1
-H
+
OH
2
+O
2
.
-
+H
+
+ OH
.
H
HO
H
HO
.
OH
- H
2
O
.
O
OH
4
7
+O
2
OH
H
HO
HO
OO
.
5
-HO
2
.
HO
HO
OH
6
+ OH
.
O
OH
HOO
3
+H
2
O
-H
2
O
2
DEO
OH
HO
O
Oxidação a CO
2
O
O
OH
ADO TS
Figura II.13. Estruturas químicas dos compostos ADO e TS.
No mecanismo apresentado na Figura II.12, duas rotas foram propostas para a
fotocatálise do 17β-estradiol. Primeiro, os carbonos C
10
e C
3
do 17β-estradiol devem ser
os lugares no quais o 1º elétron é extraído, e conseqüentemente, as reações subseqüentes
irão formar o compostos DEO (E
2
→ 1 → 2 → 3 → 4). Em uma segunda rota, a reação
pode ser iniciada pela adição dos radicais HO
•
no 17β-estradiol (E
2
→ 4) especialmente
nos carbonos C
2
e C
5
. Se a 1ª adição do radical HO
•
ocorrer no átomo C
2
, a
correspondente o-hidroquinona (
6) pode ser formada pela subseqüente reação com O
2
,
(E
2
→ 4 → 5 → 6). Entretanto, tal intermediário não foi identificado neste estudo. Por
136
outro lado, o DEO pode ser produzido através das seguintes etapas: E
2
→ 4 → 2 → 3 →
DEO.
No estudo de HUBER
et al. (2004), foram identificados alguns subprodutos
formados na ozonização do 17α-etinilestradiol. Duas porções da molécula podem ser
primeiramente oxidadas pelo ozônio, o anel fenólico do 17α-etinilestradiol é altamente
reativo com o ozônio (k
O3
= 3 x 10
6
M
-1
s
-1
em pH 7) e o grupamento etinil tem uma
significativa menor reatividade (k
O3
= 200 M
-1
s
-1
). Para facilitar a identificação dos
subprodutos de oxidação, dois compostos modelos foram usados para representar a
oxidação dessas duas porções da molécula de 17α-etinilestradiol, esses compostos estão
apresentados na Figura II.14.
HO
HO
THN ECH
Figura II.14. Estruturas químicas do 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftol (THN) e 1 etinil-1-
ciclohexanol (ECH).
A Figura II.14 apresenta um mecanismo de reação proposto para a ozonização do
composto modelo THN e a identificação dos intermediários. O primeiro subproduto
identificado foi o ácido adípico (
6) usando um padrão na análise de CL-EM/EM. Outro
subproduto identificado foi o ácido 1-hidroxi-ciclopentanocarboxicílico (
7) através da
fragmentação desse produto derivatizado no espectro da CG/EM. Um terceiro
subproduto foi identificado por seu espectro na CG/EM como sendo o ácido 2-
hidroxiheptanodióico, porém, este último não é apresentado na Figura II.14. Esse
mecanismo proposto sugere que o ozônio ataca na posição 3 do anel fenólico. Com base
em estudos da ozonização do fenol, os autores concluem que este primeiro passo da
oxidação conduz ao ácido mucônico (
1), o 5,6,7,8-tetrahidro-2,3-naftoalenodiol (2) e a
2,3-naftalenodiona (
3), como maiores intermediários. Esses subprodutos são reativos
com o ozônio, o que pode resultar na formação do hidroperoxido (
4) e/ou 1,2 –
ciclohexanodiona (
5a).
137
O
3
O
HO
O
HO
4
O
O
5a
HO
O
5b
H
2
O
OH
O
O
HO
O
HO
HO
6
5c
OH
HO
O
7
O
O
HO
HO
1
THM
O
3
O
3
O
3
HO
HO
O
3
HO
O
O
2
3
O
3
Figura II.15. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a
ozonização do composto modelo THN.
Para a ozonização do composto modelo ECH, HUBER et al. (2004), propuseram o
mecanismo de reação apresentado na Figura II.16. O ataque do ozônio no grupamento
etinil do composto ECH resulta na formação do ozonideo primário (
8), o qual
simplesmente se decompõe em hidroxihidroperoxido (
9a) e/ou (9b). Em menos de 2
min de reação, esses compostos não são mais detectados, demonstrando que os
subprodutos (
9a) e (9b) são intermediários de curta vida. Segundo o autor, o maior
subproduto formado nesta reação foi o ceto aldeído (
10), porém, este composto não foi
detectado na análise de CL-EM/EM. Dois outros subprodutos foram identificados pelo
seu espectro de massa na CG/EM, o ácido hidroxiciclohexanocarboxilíco (
11) e o
composto (
12). O terceiro subproduto foi identificado como sendo a ciclohexanona (13),
usando um padrão na análise de CL-EM/EM.
138
HO
O
3
ECH
OO
O
8
H
2
O
HO
HOH
ou
HO
OO
H
OH
OH
9a
9b
O
O
OH
H
2
O
2
+
OO
HO
H
10
H
2
O
2
HO
OH
O
OH
11
12
13
O
H
O
+
O
O
OH
H
+
OH
O
Figura II.16. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a
ozonização do composto modelo ECH.
HUBER
et al. (2004), também investigaram os subprodutos formados na
ozonização do 17β-estradiol e estrona. A Figura II.17 apresenta o mecanismo proposto
neste estudo. Onde os subprodutos (
14) e (17) foram identificado pela CL-EM/EM.
Segundo os autores, inexplicavelmente o grupo álcool do 17β-estradiol foi oxidado a
um grupo carboxílico sob as condições aplicadas de ozônio (10-15 mg.L
-1
) e rendeu os
mesmos produtos da oxidação da estrona (
14 e 17). Os grupos carboxílicos e álcool, da
estrona e 17β-estradiol respectivamente, são muito menos reativos com o ozônio do que
o grupo etinil do 17α-etinilestradiol, assim, esperava-se que no caso da estrona e 17β-
estradiol as reações de oxidação ocorram principalmente no grupamento fenólico. Com
base no estudo de ozonização do composto modelo THN (Figura II.15), o subproduto
(
17) pode ser decompostos no intermediário (22) e a porção ciclohexanedieno pode ser
hidratada e é em parte apresenta-se na forma enol (
23).
139
OH
HO
E
2
O
3
O
O
HO
O
HO
O
3
O
HO
E
1
14
O
3
O
3
O
O
HO
HO
O
O
23 22
O
O
HO
HO
17
Figura II.17. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al. (2004) para a
ozonização 17β-estradiol estrona.
A Tabela II.24 apresenta os intermediários identificados ou propostos para a
oxidação do 17β-estradiol compilados da literatura.
140
Tabela II.24. Intermediários identificados ou propostos para a oxidação do 17β-
estradiol copilados da literatura.
Intermediário
Estrutura
química
Situação
Processo de
oxidação
Referência
10ε-17β-
dihidroxi-1, 4-
estradieno-3-one
(DEO)
OH
O
OH
Identificados pela
CG-EM/EM, sem
padrão.
Fotocatálise
OHKO
et
al
., 2002
2-
hidroxiestradiol
OH
H O
H O
Proposto
mecanisticamente
*
Fotocatálise
OHKO
et
al
., 2002
Androsta-4, 16 –
dieno-3-one
(ADO)
O
Identificados pela
CG-EM/EM, sem
padrão.
Fotocatálise
OHKO
et
al
., 2002
Testosterona
(TS)
O
OH
Identificados pela
CG-EM/EM, sem
padrão
Fotocatálise
OHKO
et
al
., 2002
-
O
O
HO
O
HO
Identificados pela
CL-EM/EM, sem
padrão
Ozonização
HUBER
et
al
., 2004
-
O
O
HO
HO
Identificados pela
CL-EM/EM, sem
padrão
Ozonização
HUBER
et
al., 2004
-
O
O
HO
Proposto
mecanisticamente
*
Ozonização
HUBER
et
al
., 2004
-
O
HO
O
Proposto
mecanisticamente
*
Ozonização
HUBER
et
al
., 2004
*
Proposto devido à identificação de outros subprodutos
141
II.7.3. Metabolismo do 17β-estradiol no corpo
No corpo, o metabolismo dos estrogênios endógenos inclui: (1) metabolismo
oxidativo, em grande parte hidroxilações e
(2) metabolismo conjugativo pela
glucuronação, sulfonação e/ou O-metilação (ZHU e CONNEY, 1998). Os estrogênios
(17β-estradiol e estrona) podem ser hidroxilados em múltiplas posições por enzimas
presentes nos órgãos (Enzimas citocromo P450 NADPH-dependente). Os principais
caminhos metabólicos do 17β-estradiol, por essas enzimas, são apresentados na Figura
II.18. A 2-hidroxilação e 16α-hidroxilação do 17β-estradiol para um catecol e a
formação da estrona são os maiores caminhos metabólicos no fígado, um caminho
secundário neste órgão seria a 4-hidroxilação. Os metabólicos do estradiol 2-
hidroxiestradiol e 16α-hidroxiestradiol (estriol) são apresentados na Figura II.19. Outros
metabólicos ceto e hidroxilados do estradiol e da estrona são encontrados na revisão de
ZHU e CONNEY (1998).
OH
HO
CH
3
A
B
CD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Figura II.18. Lugares da oxidação metabólica do 17β-estradiol pelas enzimas
citocromo P450 NADPH-dependente. Os principais caminhos metabólicos (2-
hidroxilação, 16α-hidroxilação e a formação da estrona) são indicados pelas setas pretas
OH
O
H
HO
O
H
HO
HO
16α-hidroxiestradiol (estriol)
2-hidroxiestradiol
Figura II.19
. Os metabólitos 2-hidroxiestradiol e 16α-hidroxiestradiol (estriol).
142
II.8. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA POR PROCESSOS
OXIDATIVOS
É de suma importância avaliar se os tratamentos que removem efetivamente esses
micropoluentes da água potável ou efluente de ETE são capazes de eliminar totalmente
os efeitos deletérios que esses poluentes possam ter. Atualmente, alguns pesquisadores
começaram a avaliar esse outro parâmetro tão importante quanto à remoção dos
poluentes.
A atividade estrogênica do 17β-estradiol está relacionada com a porção fenólica
de sua estrutura. Assim, é de se esperar que processos que alterem o anel fenólico sejam
efetivos na remoção do potencial estrogênico do 17β-estradiol. O ozônio é muito reativo
com grupamentos fenólicos, bem como outros processos, tais como, os POA também
podem oxidar efetivamente esse grupamento.
O efeito potencial específico dos estrogênios é a atividade estrogênica, que está
intimamente ligada com a porção fenólica da estrutura química dos estrogênios. Como o
ozônio é altamente reativo com alguns grupos funcionais, como o caso do anel fenólico,
alguns pesquisadores acreditam que normalmente o processo predominante na
ozonização dessas substâncias é a oxidação via ozônio. Assim, alguns pesquisadores
investigam a atuação do ozônio molecular na ozonização, suprimindo as reações com os
radicais HO
•
pelo uso de compostos capturadores (HUBER et al., 2004). Contudo, as
reações com os radicais HO
•
não podem ser descartadas.
No estudo de OHKO
et al. (2001), a fotocatálise reduziu consideravelmente a
atividade estrogênica do bisfenol A em água. Após 6h de tratamento, a atividade
estrogênica foi reduzida para menos de 10% da atividade estrogênica inicial do bisfenol
A, e 35% da concentração inicial do bisfenol A permaneceu em solução com alguns
subprodutos.
Em outro estudo de OHKO
et al. (2002), concluíram que os intermediários
formados durante a fotocatálise do 17β-estradiol não exibiram atividade estrogênica.
Em 20 min de tratamento, onde foi observada a maior quantidade de intermediários
formados, a atividade estrogênica foi extremamente pequena, podendo assim, ser
negligenciada. Porém, esta conclusão não está totalmente clara em seus resultados.
143
A remoção da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol durante a ozonização
foi investigada por HUNBER
et al. (2004). O efeito do ozônio na atividade estrogênica
desses compostos em solução aquosa foi avaliado usando o ensaio YES, que
demonstrou que doses de ozônio tipicamente usadas para desinfecção de água potável
foram suficientes para reduzir substancialmente a atividade estrogênica desse
estrogênio. Os autores concluíram que a redução da atividade estrogênica foi
proporcional ao decréscimo da concentração de 17α-etinilestradiol, indicando que a
estrogenicidade dos subprodutos são menores do que a desse estrogênio, a soma da
atividade estrogênica dos intermediários é pelo menos 200 vezes menor do à
estrogenicidade do 17α-etinilestradiol.
COLEMAN
et al. (2005) investigaram a remoção da atividade estrogênica de três
estrogênios separadamente (17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol) com a
fotocatálise e a fotólise. Cerca de 50% da atividade estrogênica dos estrogênios foram
removidas com 10 min de fotocatálise. A total atividade estrogênica foi removida com
1h de tratamento, demonstrando que este é um processo eficiente na diminuição da
atividade estrogênica dos estrogênios investigados. A fotólise removeu mais lentamente
a atividade estrogênicas desses estrogênios do que a fotocatálise.
O ensaio E-Screen foi usado por ALUM
et al. (2004) para avaliar a remoção da
atividade estrogênica dos desreguladores endócrinos (bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-
etinilestradiol em concentrações iniciais = 10 nM), pela ozonização e cloração em
condições utilizadas em plantas de tratamento de água. Os resultados indicaram que a
oxidação pelo cloro do bisfenol A e do 17α-etinilestradiol aumentaram nas primeiras
horas de tratamento e o declínio foi observado após 12h de cloração. A cloração do 17β-
estradiol resultou em um relativo baixo nível de estrogenicidade. Com a ozonização, as
atividades estrogênica dos três compostos diminuíram. Contudo, em ambos os
tratamentos, observaram-se uma atividade estrogênica residual.
KIM
et al. (2004), utilizaram um ensaio de Ligação Competitiva nos RE para
avaliar a atividade estrogênica do 17β-estradiol pela ozonização, na ausência e presença
de ácidos fúlvicos (MON). Os resultados mostraram que quando o 17β-estradiol foi
ozonizado sozinho, a atividade estrogênica não diminuiu consideravelmente com o
aumento da dosagem de ozônio, sugerindo que há a formação de subprodutos que
144
podem ter estrogenicidade similar ao 17β-estradiol, já que este foi rapidamente
removido no início da ozonização. Na presença de ácidos fúlvicos, não foi observada a
formação de subprodutos com estrogenicidade, pois a atividade estrogênica decresceu
com o aumento da dosagem de ozônio. Os autores concluíram que a decomposição do
ácido fúlvico tem um efeito positivo na decomposição dos subprodutos do 17β-
estradiol.
Processos de tratamento alternativos foram investigados na remoção da atividade
estrogênica de estrogênios. SUZUKI
et al., 2003, avaliaram a remoção da atividade
estrogênica do 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol após um tratamento com enzimas
ligninolíticas. Os resultados mostraram que a atividade estrogênica de uma mistura
desses estrogênios foi reduzida em 80% depois de 1 hora de tratamento, porém, a
completa remoção só foi alcançada após 8 h de tratamento. Os autores concluíram que o
fato de 20% da atividade estrogênica permanecer após 1 h de tratamento pode ser
devido a traços residuais de 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol. Embora, detecções das
concentrações residuais dos estrogênios durante o tratamento enzimático mostraram que
essas substâncias foram quase completamente degradadas depois de 1 h de tratamento,
provavelmente próximo do limite de detecção do método analítico empregado.
145
III. MATERIAIS E MÉTODOS
III.1. REAGENTES
O 17β-estradiol (pureza 99%), BSTFA, 19-Nortestosterol, 2-hidroxiestradiol,
testosterona, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
, MgSO
4
, Fe
2
(SO
4
)
3
, L-leucina, L-histidina, adenina,
L-arginina-HCl, L-metionina, L-tirosina, L-isoleucina, L-lisina-HCl, L-fenilalanina, L-
ácido glutâmico, L-valina, L-serina, tiamina, piridoxina, pantetonato de cálcio, inositol,
D-glucose, ácido aspártico, L-treonina, sulfato de cobre (II) e KOH peletes foram
obtidos da Sigma-Aldrich. A biotina e o etanol absoluto foram adquiridos da Merck. Os
solventes hexano, metanol e a acetona da Tedia Brasil. O CPRG (clorofenol vermelho-
β-D-galactopiranosida) foi adquirido da Roche Diagnostics GmbH. As estruturas
químicas de algumas substâncias usadas nos ensaios são apresentadas na Tabela III.1.
Tabela III.1. Estruturas químicas de algumas substâncias usadas nos ensaios
Nome da Substância CAS number Estrutura Química
17β-estradiol
50-28-2
OH
HO
19-nortestosterona 434-22-0
OH
O
2-hidroxiestradiol 362-05-0
OH
HO
HO
testosterona 58-22-0
O
OH
146
III.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE 17β-ESTRADIOL
A solução estoque de 17β-estradiol utilizada nos experimentos de ozonização foi
preparada a uma concentração de 20 mg.L
-1
em acetona e estocada a 4°C. As soluções
nas concentrações iniciais desejadas para cada experimento foram preparadas a partir da
solução estoque.
Nos experimentos de ozonização foram utilizadas duas matrizes: água destilada e
efluente de estação de tratamento de esgoto doméstico da Ilha do Governador/RJ
(ETIG), coletado e utilizado no mesmo dia. Porém, para os ensaios YES, as amostras
aquosas de 17β-estradiol, utilizadas na ozonização, foram preparadas com água
ultrapura apirogênica (< 0,001 endotoxicina / mL) obtida pelo sistema Mili-Q Biocell.
De acordo com os experimentos foram preparadas soluções aquosas com
concentrações iniciais de 1,0 mg.L
-1
, 10 e 50 µg.L
-1
de 17β-estradiol, a partir da solução
estoque de 17β-estradiol. Nos experimentos com o efluente de ETE, o 17β-estradiol foi
adicionado nesta matriz alcançando uma concentração inicial de 50 µg.L
-1
.
III.3. EXPERIMENTOS DE OZONIZAÇÃO
Os experimentos de oxidação com ozônio foram realizados em uma unidade de
ozonização que consiste de três partes principais: o gerador de ozônio, o analisador de
ozônio e a coluna de contato. A Figura III.1 apresenta o esquema da unidade de
ozonização.
O gerador de ozônio, Unitek – modelo UTK-O-5B, que emprega a tecnologia de
descarga corona e gera até 5g de O
3
.L
-1
, foi alimentado com uma mistura de oxigênio e
nitrogênio de acordo com a faixa de dosagem de ozônio que se desejava obter.
Para medir concentração de ozônio (%p/p) na fase gás nas correntes de entrada e
de saída da coluna de contato utilizou-se um analisador de ozônio modelo IN USA,
ASX-Mod H1 sendo, a medida feita por absorção na região do ultravioleta.
147
O
2
O
2
+ O
3
ANALISADOR DE OZÔNIO
2
O
2
+ O
3
GERADOR DE OZÔNIO
0, 50
Ozone Analizer Model H1
DE
Entrada
de O
2
Regulador
de O
3
COLUNA
DE
CONTATO
O
2
O
2
+ O
3
ANALISADOR DE OZÔNIO
2
O
2
+ O
3
GERADOR DE OZÔNIO
0, 50
Ozone Analizer Model H1
DE
Entrada
de O
2
Regulador
de O
3
COLUNA
DE
CONTATO
Figura III.1. Esquema da unidade de ozonização.
Foram usadas duas colunas de contato diferentes, a primeira fabricada em acrílico
com 130 cm de altura, 16,5 cm de diâmetro e volume de trabalho de 1,5 L e outra em
vidro com 50 cm de altura, 7,0 cm de diâmetro e volume de trabalho de 1,0 L. As
colunas de contato são apresentadas na Figura III.2.
A corrente de ozônio foi continuamente introduzida na coluna de contato através
de um difusor de aço inox ou vidro sinterizado, que gera microbolhas, localizado na
parte inferior das colunas. A Figura III.3 apresenta uma foto da unidade de ozonização.
148
Figura III.2. Foto das colunas de contato. (A) coluna de acrílico e (B) coluna de vidro.
Gerador
de ozônio
Analisador
de ozônio
Coluna de
contato
Medidores
de vazão
A
B
Figura III.3. Foto da unidade de ozonização.
Nos experimentos de ozonização, uma corrente contendo ozônio na faixa de 0,40
a 0,55 % (p/p) em uma vazão de 1,46 L.min
-1
era continuamente introduzida na coluna.
149
Pela variação do tempo de ozonização, dosagens diferentes de ozônio foram
introduzidas nas amostras.
A ozonização foi conduzida com diferentes dosagens de ozônio e pH de solução.
Ácido sulfúrico ou hidróxido de sódio foram utilizados para o ajuste do pH das
amostras. A faixa de concentração de ozônio consumido usado no experimento foi de
0,5 – 30 mg.L
-1
de ozônio e foram investigados nos valores de pH 3, 7 e 11. A dosagem
de ozônio utilizada nos experimentos significa a quantidade de ozônio consumida pela
amostra, ou seja, a diferença de ozônio nas correntes gasosas de entrada e de saída da
coluna de contato no tempo de ozonização.
Após a ozonização, todas as amostras foram tratadas de acordo com uma
metodologia analítica desenvolvida para avaliar, tanto a degradação do 17β-estradiol,
quanto à formação e identificação dos intermediários formados na ozonização, além de
avaliar a atividade estrogênica dos intermediários formados.
III.4. METODOLOGIA ANALÍTICA
A metodologia analítica empregada para avaliar a remoção do 17β-estradiol
pela ozonização, consistiu de: extração por fase sólida (C
18
), derivatização e detecção
por CG ou CG/EM para a determinação da concentração de 17β-estradiol, e
identificação dos subprodutos formados na ozonização. A transformação do anel
fenólico do 17β-estradiol foi investigada através do desaparecimento das bandas de
absorbância na espectrometria de UV das amostras ozonizadas. A remoção da atividade
estrogênica foi avaliada pelo ensaio
in vitro YES. Um esquema dos procedimentos
analíticos é apresentado na Figura III.4.
150
Amostra aquosa
(pH 3,0 ajustado)
EFS
Condicionamento do
cartucho
Descarte do
Eluato
Eluição
4 mL de acetona
Secagem
em N
2
Derivatização
com BSTFA
CG e CG/EM
Eluição
4 mL de metanol
Espectrofotometria de UV
Eluição
4 mL de acetona
Secagem
em N
2
Reconstituição com 2 mL
de etanol absoluto
Atividade
Estrogênica
Amostra aquosa
(pH 3,0 ajustado)
EFS
Condicionamento do
cartucho
Descarte do
Eluato
Eluição
4 mL de acetona
Secagem
em N
2
Derivatização
com BSTFA
CG e CG/EM
Eluição
4 mL de metanol
Espectrofotometria de UV
Eluição
4 mL de acetona
Secagem
em N
2
Reconstituição com 2 mL
de etanol absoluto
Atividade
Estrogênica
Figura III.4. Esquema da metodologia analítica utilizada.
III.4.1. Extração Por Fase Sólida (EFS)
A EFS é uma ferramenta útil para extração e concentração de micropoluentes em
amostras aquosas. Na EFS foram utilizados cartuchos de extração em fase C
18
de 500mg
e 3 mL obtidos da Varian. Antes de receber a amostra, os cartuchos foram
condicionados pela lavagem com 3 X 2 mL de hexano, seguido por 1 X 2 mL de
acetona e 3 X 2 mL de metanol, por último 5 X 2 mL de água (pH 3). Os baixos valores
de pH das amostras contribuem consideravelmente para a extração eficiente desses
estrogênios polares (FOTSIS
et al., 1980). Em seguida, passou-se através dos cartuchos,
numa taxa de 20 mL.min
-1
, um litro de amostra com pH 3 previamente ajustado.
Subseqüentemente, os analitos foram eluídos com 4 X 1 mL de acetona. A acetona foi
151
totalmente evaporada por uma corrente de nitrogênio. O sistema de extração é
apresentado na Figura III.5.
Amostras
Manifold
Cartucho
de C
18
Bomba
de vácuo
Figura III.5
. Foto do sistema de EFS.
No caso dos ensaios realizados com efluente de ETE, antes de realizarem-se as
EFS, as amostras ozonizadas primeiramente foram filtradas em membrana de acetato de
celulose de 0,45 µm para a remoção do material particulado, como descrita na
metodologia analítica. Estudos demonstram que a adsorção dos componentes
estrogênicos no filtro pode ser negligenciada, ou seja, os componentes estrogênicos não
ficam retidos nos filtros ou no material particulado suspenso, mas permanecem em
solução (XIAO
et al., 2001, DESBROW et al., 1998).
III.4.2. Derivatização
Após a acetona ser totalmente evaporada, as amostras foram deixadas no
dessecador por 30 min, em seguida, os componentes foram derivatizados pela adição de
50 µL de BSTFA por 30 min a 60°C. Depois da derivatização as amostras foram
152
novamente deixadas no dessecador por, pelo menos, 30 min antes de serem analisadas
por CG ou CG/EM
III.4.3. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa (CG)
As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo gasoso GC –
17A – Shimadzu com um detector por ionização em chama (DIC) nas condições de
operação descritas na Tabela III.2. O esquema da metodologia analítica utilizada para a
determinação do 17β-estradiol e seus subprodutos de ozonização estão apresentados na
Figura III.6.
III.4.4. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa / Espectrometria de
Massa (CG/EM)
As análises por espectrometria de massas foram realizadas em um cromatógrafo
HP 5890 series II acoplado a Espectrômetro de Massas HP 5972, no modo de varredura,
entre 45 e 600 m/z, utilizando-se a mesma coluna DB–5 descrita no item anterior. A
Tabela III.3 apresenta as características e condições operacionais do sistema empregado.
As análises de espectrometria de massa nessas condições foram realizadas para as
amostras de 17β-estradiol em água e efluente de ETE ozonizadas e para amostras de
17β-estradiol, 19-nortestosterona, 2-hidroxiestradiol e testosterona.
153
Amostra aquosa
( pH 3,0 ajustado)
Extração em
C
18
Condicionamento:
- 3x2mL de hexano
- 1x2mL de acetona
- 3x2mL de metanol
- 5x2mL de água (pH3)
Descarte do
eluato
50µ L de BSTFA
Eluição- 4mL de
acetona
Derivatização
60°C / 30min
Secagem
em N
2
Analisado em CG ou CG / EM
Amostra -
Efluente de
ETE
Filtração em
membrana de
0,45 µm
Dessecador por
30 min
Dessecador por
30 min
(pH 3,0 ajustado)
Amostra aquosa
( pH 3,0 ajustado)
Extração em
C
18
Condicionamento:
- 3x2mL de hexano
- 1x2mL de acetona
- 3x2mL de metanol
- 5x2mL de água (pH3)
Descarte do
eluato
50µ L de BSTFA
Eluição- 4mL de
acetona
Derivatização
60°C / 30min
Secagem
em N
2
Analisado em CG ou CG / EM
Amostra -
Efluente de
ETE
Filtração em
membrana de
0,45 µm
Dessecador por
30 min
Dessecador por
30 min
(pH 3,0 ajustado)
Figura III.6. Esquema detalhado da metodologia analítica utilizada na determinação do
17β-estradiol e seus subprodutos formados na ozonização.
154
Tabela III.2. Características e condições de análise do sistema de CG empregado.
Cromatógrafo Gasoso
Modelo GC – 17A – Shimadzu
Gás de arraste Hidrogênio
Coluna
DB-5 (Agilent Technologies) com diâmetro interno de 0,25
mm, comprimento de 30 m e espessura de fase de 0,25 mm
Parâmetros
Taxa
(°C⋅min
–1
)
Temperatura
(°C)
Tempo
(min)
T
injetor
— 280 —
T
detector
— 320 —
— 180 —
Programação de
Temperatura
T
coluna
10 300 1
Parâmetro
Taxa
(kPa⋅min
–1
)
Pressão
(kPa)
Tempo
(min)
— 118 —
Programação de Pressão
P
coluna
3 155 1
Vazão do Gás de Arraste
2,0 mL⋅min
–1
Velocidade Linear do gás
de arraste
61 cm⋅s
–1
Volume de Injeção
1,0 µL
Modo de injeção split (1:150)
Tabela III.3. Características e condições de análise do sistema de CG/EM empregado.
Espectrômetro de massa
Modelo
HP 5890 series II acoplado a Espectrômetro de Massas HP
5972 no modo de varredura entre 45 e 600 m/z
Gás de arraste Hélio
Coluna
DB-5 (Agilent Technologies) com diâmetro interno de 0,25
mm, comprimento de 30 m e espessura de fase de 0,25 mm
Parâmetros
Taxa
(°C⋅min
–1
)
Temperatura
(°C)
Tempo
(min)
T
injetor
— 290 —
T
detector
— 300 —
— 50 —
30 150 —
Programação de
Temperatura
T
coluna
10 300 5
Pressão na Coluna 65 kPa
Vazão do Gás de Arraste
1,22 mL⋅min
–1
Velocidade Linear do gás
de arraste
40 cm⋅s
–1
Volume de Injeção
1,0 µL
Modo de injeção Splitless
155
III.4.5. Preparação da Curva de Calibração
A curva de calibração do 17β-estradiol, usada na CG, foi preparada com
concentrações na faixa de 0,2 a 10,0, µg.L
-1
e foi obtida a partir da solução estoque, pela
diluição em água destilada, seguida pela mesma metodologia analítica utilizada para
todas as amostra ozonizadas, descrita no item III.4.3.
III.4.6. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração
A avaliação da eficiência do processo de extração foi realizada através da análise
da recuperação do 17β-estradiol, que foi determinado pela comparação das áreas dos
picos das amostras da curva de calibração do 17β-estradiol (Caminho 1 da Figura III.7)
com amostras preparadas a partir da solução estoque de 17β-estradiol com diluições em
acetona (Caminho 2 da Figura III. 7), ambas em várias concentrações de 17β-estradiol e
posteriormente analisadas por CG. Todas as determinações foram realizadas em cinco
réplicas.
Caminho 1
17β-estradiol
em acetona
Secagem
em N
2
Derivatização
com
BSTFA
Análise em
CG
17β-estradiol
em água
destilada
EFS
Secagem
em N
2
Derivatização
com
BSTFA
Análise em
CG
Caminho 2
Figura III.7.
Esquemas das metodologias analíticas usadas para avaliar a eficiência do
processo de extração.
156
III.4.7. Avaliação do Limite de Detecção da Metodologia Experimental
Os limites de detecção do 17β-estradiol são definidos como a quantidade mínima
de substância observada como uma razão sinal/ruído acima de 3.
III.4.8. Espectrofotometria de UV
As varreduras no UV foram realizadas em um espectrofotômetro UV Visível,
Shimadzu, modelo UV Mini-1240. Foram analisadas amostras ozonizadas de 17β-
estradiol em água destilada nas concentrações iniciais de 10 e 50µg.L
-1
.
Para a análise da espectrofotometria de UV das amostras ozonizadas, a
metodologia analítica foi modificada. Para isso, na EFS, os cartuchos foram
condicionados pela lavagem com 4 X 2 mL de metanol, seguido por 5 X 2 mL de água
(pH 3). Em seguida, passou-se através dos cartuchos, 1 L de amostra com pH 3
previamente ajustado, numa taxa de 20 mL.min
-1
. Subseqüentemente, os analitos foram
eluídos com 4 X 1 mL de metanol. Essa solução final foi analisada no
espectrofotômetro UV-Visível, como apresentado na Figura III.8.
Amostra aquosa
(pH 3,0 ajustado)
Extração em
C
18
Condicionamento:
-4x2mL de metanol
- 5x2mL de água (pH3)
Descarte do
eluato
Eluição- 4mL de
metanol
Espectrofotometria de UV
Figura III.8. Esquema detalhado da metodologia analítica utilizada na espectrometria
de UV.
157
III.4.9. Determinação da Atividade Estrogênica pelo Ensaio YES (YEAST
ESTROGEN SCREEN)
III.4.9.1. Ensaio YES
A atividade estrogênica das amostras foi determinada pelo ensaio in vitro YES,
realizado segundo metodologia desenvolvida por ROUTLEDGE E SUMPTER (1996).
Este ensaio permite a identificação de substâncias químicas que são capazes de
mimetizar a atividade do estrogênio pela interação com o REh. Em resumo, a levedura
Saccharomyces cerevisiae, na qual foi inserido um gene receptor de estrogênio humano
(REh), a expressão do plasmídeo com um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e
um gene repórter lac-Z, o qual codifica a enzima β-galactosidase, é incubada com um
ligante ativo (substância capaz de acoplar-se ao RE) que induz a expressão da β-
galactosidase. A medida é determinada pela produção da enzima galactosidase que
metaboliza o substrato cromogênico clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosida
(CPRG) presente no meio, que é um produto amarelo e muda para vermelho, e pode ser
medido por absorbância a 540nm. A produção de β-galactosidase no meio depende da
quantidade de substância estrogênica. A medida da absorbância pela espectrofotometria
permite estimar a quantidade de substância estrogênica no meio de análise. No ensaio
YES a levedura fica permanentemente transformada se o crescimento ocorrer sob
condições apropriadas. Um esquema do sistema de expressão do estrogênio induzível na
levedura
Saccharomyces cerevisiae desenvolvida por ROUTLEDGE E SUMPTER
(1996) é apresentado na Figura III.9.
O ensaio de YES é prático e altamente sensível, pode detectar concentrações
baixas de 17β-estradiol na ordem de 2 ng.L
-1
(ROUTLEDE E SUMPTER, 1996). Este
ensaio é realizado em microplacas de 96 poços, o que permite a análise de múltiplas
amostras em uma larga faixa de concentrações e o resultado pode ser obtido após três
dias. Os resultados podem ser visualizados a olho nu com uma mudança de coloração
do meio. Segundo os resultados obtidos por ROUTLEDGE E SUMPTER (1996), o
ensaio de YES mostrou-se ser altamente específico, reprodutivo e rápido, permitindo
seu uso como análise rotineira para avaliar a atividade estrogênica de substâncias
químicas e amostras ambientais.
158
Figura III.9. Esquema do sistema de expressão do estrogênio induzível na levedura
Saccharomyces cerevisiae. O gene receptor de estrogênio humano é integrado no
genoma principal e é expresso (
1) na forma capaz de acoplar-se aos elementos de
respostas de estrogênios (ERE) dentro de um promotor híbrido na expressão do
plasmídeo (
2). Ativação do receptor (3), pela ligação do ligante, causa expressão do
gene receptor da lac–Z (
4) o qual produz a enzima β-galactosidase. Esta enzima é
excretada no meio (
5) e metaboliza o substrato cromogênico CPRG (amarelo) em um
produto vermelho (
6), que pode ser medido pela absorbância a 540 nm (Retirado de
ROUTLEDGE E SUMPTER (1996)).
Símbolos
Estrogênio
Receptor de estrogênio
Receptor ativado
β-Galactosidade
Citoplasma
REh
Núcleo
Meio
6
CPRG
amarelo
CPRG
vermelho
ERE
Lac
-
Z
PGK
1
2
3
4
5
159
III.4.9.2.
Cepa de Levedura (Saccharomyces cerevisiae) Recombinante
Uma cepa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) modificada geneticamente foi
desenvolvida pelo Departamento de Genética da Glaxo para ser usada no teste para
identificar as substâncias que podem interagir com o REh. Essa levedura é apresentada
na Figura III.10.
Figura III.10. Microfotografia de células de Saccharomyces cerevisiae recombinante.
A cepa de
Saccharomyces cerevisiae utilizada no ensaio YES foi doada pelo Prof.
J. P. Sumpter da Universidade de Brunel, Uxbrige, UK. No nosso laboratório uma
amostra dessa cepa foi obtida da Prof. Elisabetta Agradi do Instituto de Ciências
Farmacológicas, Universidade de Milão. A cepa de levedura foi acondicionada e trazida
no meio de crescimento fresco, foi mantida no laboratório em temperatura ambiente e
replicada para ser utilizada nos ensaios, além de amostras conservadas em glicerol a -
4°C por até quatro meses.
O cultivo da cepa de
Saccharomyces cerevisiae foi realizado segundo a
metodologia desenvolvida por ROUTLEDE e SUMPTER (1996) descrita a seguir.
160
III.4.9.3.
Preparação das Soluções do Meio de Cultivo
O problema de impurezas ou contaminação causa falsos positivos no ensaio YES.
Assim, os reagentes, a água e os recipientes usados no preparo das soluções que
compõem o meio de cultivo e análise devem apresentar alto grau de pureza. Os
reagentes foram comprados da Sigma-Aldrich, os recipientes de vidro foram rinsados
com etanol absoluto da Merck e foi utilizada água apirogênica (< 0.001 Endotoxicina /
mL) obtida pelo sistema Mili-Q Biocell.
O meio mínimo (pH 7,1) foi preparado pela adição de 13,61 g de KH
2
PO
4
, 1,98g
(NH
4
)
2
SO
4
, 4,2g de KOH peletes, 0,2g de MgSO
4
, 1 mL de solução de Fe
2
(SO
4
)
3
(40
mg/50 mL H
2
O), 50 mg de L-leucina, 50 mg de L-histidina, 50 mg de adenina, 20 mg
de L-arginina-HCl, 20 mg de L-metionina, 30 mg de L-tirosina, 30 mg de L-isoleucina,
30 mg de L-lisina-HCl, 25 mg de L-fenilalanina, 100 mg de L-ácido glutâmico, 150 mg
de L-valina, e 375 mg L-serina para 1 L de água. A solução foi armazenada em frascos
de vidro, esterilizadas a 121°C por 10 min e estocadas em temperatura ambiente.
A solução de vitamina foi preparada pela adição de 8 mg de tiamina, 8 mg de
piridoxina, 8 mg de pantetonato de cálcio, 40 mg de inositol e 20 mL de solução de
biotina (2mg/100 mL H
2
O) em 180 mL de água. Essa solução foi filtrada e esterilizada
em membrana de 0,2 µm estéril, e estocada em alíquotas de 10 mL a 4°C em frascos de
vidro esterilizados.
Uma solução de 20% p/v de glucose foi esterilizada em alíquotas de 20 mL a
121°C por 10 min e estocada em temperatura ambiente.
Uma solução estoque de 4 mg.mL
-1
de ácido aspártico foi esterilizada em
alíquotas de 20 mL a 121°C por 10 min e estocada a temperatura ambiente.
Foi preparada uma solução estoque de 24 mg.mL
-1
de L-treonina e esterilizada em
alíquotas de 5 mL a 121°C por 10 min e estocada a 4°C.
Uma solução de 20 mM de sulfato de cobre (II) foi preparada, filtrada e
esterilizada em membrana de 0,2 µm esterilizada. A solução foi estocada a temperatura
ambiente em frascos de vidro esterilizados.
161
A solução estoque de 10 mg.mL
-1
de CPRG foi preparada em água estéril e
estocada a 4°C em frascos de vidro esterilizados.
III.4.9.4.
Cultivo da Cepa de Levedura de Saccharomyces cerevisiae
O meio de cultivo foi preparado pela adição de 5 mL de solução de glucose, 1,25
mL de solução de ácido L-aspartico, 0,5 mL de solução de vitamina, 0,4 mL de solução
de L-treonina, e 125µL de solução de sulfato de cobre (II) em 45 mL de meio mínimo.
O cultivo era realizado inoculando-se, com 100µL da solução estoque da
levedura, 10 mL de meio de cultivo e incubado a 28°C por aproximadamente 24 h a 100
rpm em um agitador orbital (Modelo N
o
G 24, New Brunswick Scientific).
III.4.9.5.
Preparação do Meio de Análise
O meio de análise foi preparado pela adição de 250 µL do substrato cromogênico
CPRG a 25 mL de meio de cultivo. O meio foi inoculado com 4 x 10
7
células de
levedura de uma cultura.
III.4.9.6.
Preparação das Amostras para os Ensaios YES
Nos ensaios YES foram analisadas amostras ozonizadas em água ultrapura obtida
do sistema MiliQ Biocel com a concentração inicial de 17β-estradiol de 10 µg/L, com
dosagens de 1,0; 5,0 e 10 mg.L
-1
de ozônio e nos três pHs investigados (pH 3, 7 e 11). E
para a concentração inicial de 17β-estradiol de 50 µg/L, com dosagens de 1,0; 5,0 e 10
mg.L
-1
e pH 7. Os testes foram realizados utilizando-se diretamente essas amostras
segundo COLEMAN
et al. (2004), e com as mesmas amostras preparadas segundo um
método descrito por PAWLOWSKI
et al. (2003) modificado.
Para as amostras obtidas com preparo prévio, utilizou-se a extração por fase
sólida, onde 1 L da amostra acidificada com H
2
SO
4
até pH 3,0 foi passada por um
162
cartucho de C
18
(500 mg da Varian) previamente condicionado pela lavagem com 3 X 2
mL de hexano, seguido por 1 X 2 mL de acetona e 3 X 2 mL de metanol, por último 5 X
2 mL de água (pH 3). Subseqüentemente, os analitos foram eluidos com 4 X 1 mL de
acetona. A acetona foi totalmente evaporada por uma corrente de nitrogênio e os
analitos foram reconstituídos com 2,0 mL de etanol absoluto e essas amostras foram
estocadas a 4°C até serem usadas no ensaio YES. A Figura III.11 apresenta a
metodologia analítica utilizada para a extração e preparo das amostras para o teste de
atividade estrogênica.
Água ultrapura também foi preparada de acordo com o mesmo procedimento
realizado para as amostras (Figura III.11) e usada como controle no ensaio com preparo
prévio das amostras. Nos ensaios sem preparo das amostras, utilizou-se água, sem
preparo, como controle.
III.4.9.7.
Procedimento de Análise do Ensaio YES
O procedimento de análise foi desenvolvido de acordo com a metodologia de
ROUTLEDGE e SUMPTER (1996), com algumas modificações. As análises foram
realizadas em microplacas de 96 poços (marca TPP) e preparadas em uma capela de
fluxo laminar. As amostras ozonizadas foram avaliadas em duplicata com um mínimo
de duas réplicas.
Como descrito no item III.4.9.5, foram usadas amostras sem e com preparo
prévio, assim, foram realizados dois procedimento de análise descritos a seguir:
163
Amostra aquosa
(pH 3,0 ajustado)
Extração em
C
18
Condicionamento:
- 3x2mL de hexano
- 1x2mL de acetona
-3x2mL de metanol
- 5x2mL de água (pH3)
Descarte do
eluato
2,0 mL de etanol
Eluição- 4mL de
acetona
Reconstituição da
amostra
Secagem
em N
2
Teste de atividade estrogênica
Dessecador por
30 min
Amostra aquosa
(pH 3,0 ajustado)
Extração em
C
18
Condicionamento:
- 3x2mL de hexano
- 1x2mL de acetona
-3x2mL de metanol
- 5x2mL de água (pH3)
Descarte do
eluato
2,0 mL de etanol
Eluição- 4mL de
acetona
Reconstituição da
amostra
Secagem
em N
2
Teste de atividade estrogênica
Dessecador por
30 min
Figura III.11. Esquema detalhado da metodologia analítica usada no ensaio YES.
164
III.4.9.7.a. Procedimento de análise do ensaio YES para amostras sem preparo
prévio
Uma alíquota de 10µL de cada amostra aquosa foi transferida para os poços da
microplaca de 96 poços. Um volume de 190µL de meio de análise (composto de meio
de crescimento fresco, levedura e CPRG) foi adicionado em cada poço. Após este
procedimento, as microplacas foram seladas com fita crepe, agitadas vigorosamente por
5 min em um agitador (modelo CERTOMAT II, B. Braun Biotech International), e
incubadas por 3 dias a 30°C em uma estufa (modelo 410, Nova Ética).
As microplacas para cada ensaio YES continham fileiras em duplicata das
amostras, fileira com água - controle negativo, e fileiras em duplicata com uma diluição
serial de 17β-estradiol em etanol absoluto (controle positivo), na faixa de 54,48 µg.L
-1
a
26,61 ng.L
-1
, preparada a partir de uma solução de 54,48 µg.L
-1
de 17β-estradiol em
etanol absoluto.
Após a incubação, as microplacas foram agitadas e permaneceram em repouso por
um período de 1 hora, depois do qual a absorbância foi lida a 540 nm, para a cor, e 650
nm, para a turbidez, (comprimento de onda mais próximo de 620 nm) usando um
Leitora de microplacas de 96 poços (THERMO Max, Molecular Devices).
III.4.9.7.b. Procedimento de análise YES para amostras com preparo prévio
Uma curva padrão de 17β-estradiol foi preparada através de uma diluição em série
de uma solução estoque de 17β-estradiol (54,48 µg.L
-1
) em etanol absoluto (faixa de
54,48 µg.L
-1
a 26,61 ng.L
-1
). Alíquotas de 10 µL das amostras reconstituídas em etanol,
da curva padrão de 17β-estradiol e etanol absoluto foram adicionadas em cada poço da
microplaca de 96 poços, por fim, o etanol absoluto dos poços foi totalmente evaporado.
Um volume de 200 µL de meio de análise (composto de meio de crescimento fresco,
levedura e CPRG) foi adicionado em cada poço da microplaca de 96 poços. As
microplacas foram seladas com fita crepe, agitadas vigorosamente por 5 min em um
agitador (modelo CERTOMAT II, B. Braun Biotech International), e incubadas por 3
dias a 30°C em uma estufa (modelo 410, Nova Ética).
165
As microplacas continham fileiras em duplicata das amostras, duas fileiras
contendo etanol absoluto para cada amostra e duas fileiras com água preparada pela
mesma metodologia analítica das amostras ozonizadas, como controles negativos –
solventes, e fileiras em duplicata da curva padrão de 17β-estradiol em etanol absoluto
(controle positivo).
Após a incubação, as microplacas foram agitadas e permaneceram em repouso por
um período de 1 hora, depois do qual a absorbância foi medida a 540 nm (para a cor) e
650 nm (para a turbidez) usando uma Leitora microplacas de 96 poços (THERMO Max,
Molecular Devices).
III.4.9.8. Análise dos Dados
O crescimento da levedura é acompanhado por uma turbidez aparente, medida a
620 nm. A mudança da cor amarela (não apresenta atividade) para rosa (máxima
atividade), medida por absorbância a 540 nm, indica a atividade estrogênica da amostra.
A Figura III.12 apresenta uma foto da microplaca de 96 poços no início do ensaio YES.
Figura III.12. Foto da microplaca de 96 poços no início dos testes de atividade
estrogênica.
Nestes ensaios, para corrigir a reposta estrogênica de cada amostra analisada para
turbidez (Acorr), a seguinte correção foi aplicada para os dados de cada poço da
microplaca.
166
A
corrAmostra
= A
540Amostra
– (A
620 Amostra
– A
620 Branco
)
Para cada amostra construiu-se uma curva dose-resposta com os resultados dos
valores experimentais das absorbâncias corrigidas. O 17β-estradiol representa o padrão
da atividade estrogênica (controle positivo) para o ensaio YES.
A concentração de equivalente de 17β-estradiol (EQ-E
2
) nas amostras foi
calculado a partir da curva dose-resposta do 17β-estradiol, usando os valores de
absorbância corrigidos de cada amostra em duplicata. O EQ-E
2
é definido como a
concentração de 17β-estradiol requerida para elucidar a mesma resposta na amostra no
ensaio YES.
Os valores de EC
50
(a concentração que elucida uma atividade igual a 50% do
controle positivo 17β-estradiol) foi determinada a partir da curva dose-resposta obtida
pelo ajuste dos dados experimentais na Equação III.1, que usa o método dos mínimos
quadrados.
2
0
21
1
A
x
x
AA
y
p
+
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
+
−
=
III.1
Onde: y é o valor de A
corrAmostra
, x é a concentração da substância estrogênica
no ensaio, A
1
a máxima indução da atividade estrogênica, A
2
é o limite de detecção, x
0
é
o valor de EC
50
, p é a inclinação da região mediana da curva como estimado de um
regressão linear/log da parte linear da curva dose-resposta.
Para fazer uma comparação direta entre cada ensaio foi determinada a potência
relativa estrogênica (PR), calculada a partir da Equação III.2, para cada substância com
referência ao 17β-estradiol.
amostra
EC
EC
PR
estradiol
50
50
17 −
=
β
III.2
167
III.5. TESTE DE TOXICIDADE COM Ceriodaphia dubia
A avaliação da toxicidade crônica do 17β-estradiol foi realizada nas
concentrações de 100, 10, 1, 0,5, 0,1, 0,02 µg.L
-1
. Os testes de toxicidade crônica a
Ceriodaphia dubia, um microcrustáceo de água doce, foram realizados segundo a
norma ABNT (1995) no BIOAGRI – Laboratório de Ecotoxicologia.
Este ensaio consiste na exposição de indivíduos jovens do gênero
Ceriodaphnia
dubia
, a várias concentrações da substância-ensaio, por um período de
aproximadamente sete dias, nas condições prescritas na Norma. No final do período de
exposição, determina-se o número médio de jovens produzidos por fêmea e o número de
fêmeas adultas sobreviventes. Com estes dados, calculam-se a CENO e a CEO do
agente tóxico em estudo.
CENO é a concentração de efeito não observado, ou seja, maior concentração
nominal da substância-ensaio, que não causa efeito deletério, estatisticamente
significativo, na sobrevivência e reprodução dos organismos, nas condições de ensaio.
CEO é a concentração de efeito observado, definida por: menor concentração
nominal da substância-ensaio, que causa efeito deletério, estatisticamente significativo,
na sobrevivência e reprodução dos organismos, nas condições de ensaio.
168
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A identificação dos subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol e a
investigação de sua atividade estrogênica são tópicos importantes para se avaliar se
além da remoção do 17β-estradiol, a ozonização também é eficiente para a remoção do
efeito potencial desse desregulador endócrino. Esses tópicos serão abordados a seguir.
IV.1. DETERMINAÇÃO DO 17
β-ESTRADIOL
Para a detecção de estrogênios em amostras aquosas várias metodologias
experimentais são aplicadas. Para a extração e concentração desses micropoluentes a
extração por fase sólida (EFS) é bastante usada, devido a ser uma extração simples,
rápida e que requer o uso de pequenas quantidades de solventes. No caso do 17β-
estradiol, cartuchos com fase sólida apolar de C
18
são bastante empregados.
Atualmente, o uso da cromatografia, líquida ou gasosa, confere aos métodos
de determinação de micropoluentes em amostras ambientais, normalmente complexas,
uma maior sensibilidade e confiabilidade. Para a quantificação de estrogênios a CG é
uma técnica que alcança excelentes resultados e o uso em conjunto da CG/EM na
identificação dos subprodutos formados na oxidação do 17β-estradiol confere à
metodologia experimental uma excelente confiabilidade.
A metodologia analítica desenvolvida para a determinação do 17β-estradiol
em amostras aquosas mostrou-se bastante adequada para a extração, concentração e
detecção desse estrogênio nas amostras investigadas (água destilada e efluente de ETE).
O cromatograma representativo do 17β-estradiol em água obtido a partir da
metodologia analítica empregada e análise em CG é apresentado na Figura IV.1.
169
Figura IV.1. Cromatograma de uma amostra aquosa de 17β-estradiol
(C
17β-estradiol
= 50µg.L
-1
) obtido por CG.
IV.2. AVALIAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA UTILIZADA
IV.2.1. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração e Detecção
A avaliação da eficiência do processo de extração e detecção foi realizada
através de um estudo de recuperação do 17β-estradiol segundo a metodologia
empregada. A Tabela IV.1 apresenta as porcentagens de recuperação do 17β-estradiol
em diferentes concentrações. Todas as determinações foram realizadas em cinco
réplicas.
Tabela IV.1. Porcentagem de recuperação do 17β-estradiol após o processo EFS e
detecção por CG.
C
17β-estradiol
(µg.L
-1
)
Recuperação (%)
1
96 ± 8,7
10
92 ± 8,2
20
101 ± 5,4
40
96 ± 8,7
17
β
-estradiol
170
Os resultados mostraram que tanto a adsorção do 17β-estradiol pelo cartucho
como sua posterior eluição foram eficientes. Portanto, a metodologia analítica
desenvolvida está adequada para a quantificação do 17β-estradiol em baixíssimas
concentrações em solução aquosa.
Esta verificação é de grande importância, pois é necessário determinar se a
substância química em questão, neste caso o 17β-estradiol, é retida na resina C
18
e
principalmente se é extraída em sua totalidade, ou quase, do cartucho pelo solvente
orgânico empregado, neste caso a acetona.
Os valores obtidos de porcentagem de recuperação (%) do 17β-estradiol
podem ser considerados muito bons e validam, portanto, a metodologia.
IV.2.2. Limite de Detecção
A determinação do limite de detecção do 17β-estradiol em solução aquosa foi
baseada na razão sinal/ruído pelo menos três vezes maior que qualquer interferência no
branco do tempo de retenção do analito. O limite de detecção foi de 5,0 ±0,1ng.L
-1
.
IV.3. REMOÇÃO DO 17β-ESTRADIOL NAS MATRIZES INVESTIGADAS
IV.3.1. Remoção do 17
β-Estradiol em Solução Aquosa
Na ozonização, dois oxidantes principais (O
3
molecular e radicais HO
•
) podem
estar atuando de acordo com o pH de reação. O aumento do pH favorece a formação dos
radicais HO
•
, que atuam como oxidantes menos seletivos no ataque aos compostos
orgânicos, porém reagem rapidamente com uma variedade de compostos. Já em baixos
valores de pH, a oxidação ocorre com maior freqüência via O
3
molecular, que é mais
seletivo e reage rapidamente com grupamentos específicos.
Segundo a literatura, a oxidação de micropoluentes orgânicos pelo O
3
é
somente um processo eficiente para componentes que contém grupamentos amino,
171
sistemas aromáticos ativados (ex. fenólicos) ou duplas ligações (HARRISON, 2000,
VON GUNTEN, 2003). As altas constantes das taxas de reação para a oxidação com
radicais HO
•
mostram que as remoções de compostos orgânicos por esses oxidantes são
muito mais rápidas, porém, mostram a natureza não seletiva dos radicais HO
•
. Esses
mecanismos serão abordados a seguir.
Na ozonização, o O
3
molecular é muito seletivo e reage principalmente com
certos grupamentos, dentre eles o fenólico, que é um grupo doador de elétrons e pelo
qual ataque pelo ozônio ocorre. Isto pode ser bastante interessante no caso do 17β-
estradiol já que seu anel fenólico é o que confere atividade estrogênica a esse
desregulador endócrino (BIRKETT e LESTER, 2003), como apresentado na Figura
IV.2.
OH
HO
Figura IV.2. Estrutura química do 17β-estradiol.
Para se avaliar a influência do pH na degradação do 17β-estradiol pelo
processo de ozonização, três diferentes valores de pH, 3,0; 7,0 e 11 foram investigados.
A Figura IV.3 apresenta a remoção do 17β-estradiol na ozonização nas concentrações
iniciais desse estrogênio de 10µg.L
-1
e 50µg.L
-1
nos três valores de pH estudados.
Diferentes valores de pH foram investigados para avaliar se a atuação dos radicais HO
•
seria mais efetiva do que a do O
3
molecular na oxidação do 17β-estradiol, além de se
investigar os principais subprodutos formados em todos os valores de pH de reação.
172
012345678910
0
2
4
6
8
10
C
17
β
-estradiol
inicial = 10µg.L
-1
C
17
β
-estradiol
( µg.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 3
pH 7
pH 11
012345678910
0
10
20
30
40
50
C
17
β
-estradiol
inicial = 50
µ
g.L
-1
C
17
β
-estradiol
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 3
pH 7
pH 11
012345678910
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
C
17
β
-estradiol
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
0
0,00
0,02
12345678910
0,04
0,06
0,08
0,10
C
17
β
-estradiol
(µg.L
-1
)
gem de ozônio consumido (mg.L
-1
)Dosa
Figura IV.3. Remoções do 17β-estradiol após a ozonização nos valores de pH 3, 7, 11.
Concentração inicial de 17β-estradiol de 10 e 50 µg.L
-1
.
173
Em pH 3 estudou-se a ação do O
3
molecular, em pH 7 os dois oxidantes
podem estar atuando. Em pH 11 a oxidação ocorre via radical HO
•
, pois em altos
valores de pH a decomposição do O
3
em radicais secundários, principalmente os
radicais HO
•
, ocorre instantaneamente (HARRISON, 2000).
Outro aspecto importante da variação do pH de reação é que diferentes
espécies do composto podem estar presentes e assim, serem suscetíveis à oxidação. O
grupo reativo do 17β-estradiol é o grupamento fenólico (HUBER
et al., 2003). No caso
do fenol (HB), em pH muito ácido (pH < 4) a concentração de fenolato (B
-
) é
desprezível, com isso, a espécie atacada pelos oxidantes seriam os fenóis. Em pH muito
básico (pH>10), todo o fenol estaria na forma de fenolato, que é a espécie mais reativa.
Segundo HOIGNÉ e BADER (1983a) a constante de taxa de reação do ozônio com o
fenolato (1,4±0,4x10
9
M
-1
s
-1
) é muito maior do que a constante de taxa de reação do
ozônio com o fenol (1,3±0,2x10
3
M
-1
s
-1
). Assim, é de se esperar que a reação de
oxidação do 17β-estradiol em pH 3 seja mais lenta do que em pH básico.
Segundo HUBER
et al. (2003), a constante de taxa de reação dos estrogênios é
fortemente dependente do pH e o grupamento fenólico desprotonado dos estrogênios
reage mais rapidamente do que sua forma protonada. Esses autores determinaram as
constantes de taxas de reação do 17α-etinilestradiol com o O
3
(k
O3
= ∼ 7 x 10
9
M
-1
s
-1
) e
com o radical HO
•
(k
OH
= 9,8 x 10
9
M
-1
s
-1
) em pH entre 6 e 7, demonstrando que em pH
neutro, as constantes de taxa de reação desses estrogênios com o O
3
e o radical HO
•
são
iguais.
Os experimentos de investigação da remoção do 17β-estradiol em solução
aquosa pela ozonização foram repetidos 7 vezes. A repetibilidade dos resultados foi
excelente, no entanto, para concentrações abaixo de 0,1 µg.L
-1
a variabilidade foi maior.
É interessante notar que nas menores concentrações de 17β-estradiol (< 0,1 µg.L
-1
) a
oxidação nos três valores de pH é mais lenta, ou seja quanto menor a concentração do
17β-estradiol mais lenta é a sua oxidação. Isso ocorre porque até a remoção < 99% de
17β-estradiol os resultados foram idênticos nos três valores de pH, e o consumo de
ozônio para concentrações menores do que 0,1 µg.L
-1
foi muito pequeno.
Na ozonização do 17β-estradiol, o consumo de ozônio com o tempo
praticamente não se alterou nos valores de pH investigados, como mostra a Figura IV.4.
174
A quantidade de 17β-estradiol removida por dosagem de ozônio consumido é
apresentada na Figura IV.5.
0 5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Tempo ( s )
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 3
pH 7
pH 11
Figura IV.4. Dosagem de ozônio com o tempo nos valores de pH investigados.
012345678910
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Quantidade de 17
β
-estradiol removido (
µ
g)
Ozônio comsumido (mg)
pH 3
pH 7
pH 11
Figura IV.5. Quantidade de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
) removida por
dosagem de ozônio consumido.
175
012345678910
49,88
49,90
49,92
49,94
49,96
49,98
50,00
50,02
Quantidade de 17
β
-estradiol removido (
µ
g)
Ozônio consumido (mg)
Da Figura IV.5 observa-se claramente que a quantidade de 17β-estradiol
removida em função da dosagem de ozônio consumido é a mesma até se obter uma
concentração residual < 0,1 µg.L
-1
, portanto, até essa concentração residual a oxidação
do 17β-estradiol ocorre rapidamente.
Provavelmente, o motivo pelo qual só se observa essa mudança de
comportamento em baixíssimas concentrações é devido à reatividade do anel fenólico,
sendo este muito reativo tanto com ozônio como com os radicais HO
•
(HUBER et al.,
2003). No entanto, para baixíssimas concentrações observa-se uma diferença de
reatividade. Observa-se ainda que em pH 3 a reação ocorre mais lentamente do que em
pH 7 e 11, indicando que a oxidação pelo O
3
é mais lenta que a oxidação pelo radical
HO
•
(oxidante predominante em pH 11).
O 17β-estradiol foi rápido e quase completamente oxidado nos diferentes
valores de pH investigado. Uma vez que, baixas dosagens de ozônio consumido (1,0
mg.L
-1
) foram suficientes para a quase completa remoção do 17β-estradiol, ou seja, foi
removido pelo menos 99,1 % do 17β-estradiol no pH 3 e 99,8 % no pH 11.
Na remoção de maiores concentrações de 17β-estradiol, não foram observados
alterações significativas no comportamento oxidativo do 17β-estradiol frente à
ozonização com a mudança do pH de reação. No entanto, para pequenas concentrações
de 17β-estradiol (< 0,1 µg.L
-1
) esse padrão oxidativo modificou-se. Uma concentração
residual de 17β-estradiol na faixa de ng.L
-1
permaneceu, algumas vezes, mesmo com
excesso de ozônio. Contudo, essa concentração residual foi menor em pH básico, ou
seja, em pH 11 a oxidação foi mais rápida e mais eficiente para baixas concentrações.
Em todos os valores de pH investigados e dosagens de ozônio consumido,
algumas vezes foram detectadas pequenas concentrações residuais do 17β-estradiol,
como se pode observar na Figura IV.3. Foram realizados experimentos com
concentrações iniciais de 17β-estradiol de 10 e 50µg.L
-1
, e independentemente dessa
concentração inicial, as concentrações de 17β-estradiol residuais estiveram na faixa de
0,0 a 90 ng.L
-1
para pH 3, isso equivale a remoções de 17β-estradiol > 99,1 %. No pH
11 concentrações residuais mais baixas foram observadas, na faixa de 0,0 a 30 ng.L
-1
.
Deve-se ressaltar que embora as remoções sejam na faixa de 99,1 a 99,8 %, a
176
concentração residual na faixa de ng.L
-1
ainda é suficiente para elucidar uma resposta
estrogênica nos ensaios
in vivo de atividade estrogênica (ROUTLEDGE et al., 1998,
THOMPSON
et al., 2000). Essa concentração residual pode ser explicada pelo fato de
que, para que a oxidação pela ozonização ocorra, uma molécula de oxidante (O
3
ou
radicais HO
•
) deve encontrar-se com a molécula de 17β-estradiol. Porém, as chances
desse choque são bem reduzidas no caso de baixíssimas concentrações.
Os processos convencionais empregados nas plantas de tratamento de água
potável não são eficientes na remoção de micropoluentes, como é o caso do 17β-
estradiol, isso impõe um risco constante aos humanos (JOBLING
et al., 1998,
TERNES, 1998). Alguns estudos mostram que outros processos de tratamento podem
ser eficientes na remoção dessas substâncias da água potável, como é o caso da
ozonização (ALUM
et al., 2004, HUBER et al., 2003).
Alguns estudos na literatura mostram a rápida oxidação de estrogênios, tais
como 17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol, pela ozonização. As altas constantes
das taxas de remoções, maiores que 99%, alcançadas com esse processo oxidativo
também são relatadas por outros pesquisadores (ALUM,
et al., 2004, HUBER et al.,
2003, TERNES
et al., 2003).
As dosagens de ozônio comumente usadas nas plantas de tratamento de água
são na faixa de 1,0 mg.L
-1
de ozônio que como apresentado neste estudo, são suficientes
para remoção acima de 99,3 % de 17β-estradiol, quando a concentração inicial desse é
de 10 µg.L
-1
em pH 7,0.
Deve-se ressaltar que as concentrações de 17β-estradiol na água de
abastecimento são menores que a estudada nesse trabalho, no entanto, as remoções na
faixa de ng L
-1
só ocorreram com dosagens maiores de ozônio. Um outro fator
importante é que a água de abastecimento possui outros contaminantes orgânicos que
certamente vão consumir parte do ozônio introduzido na água. Portanto, pode-se
concluir que muito provavelmente as dosagens de ozônio aplicadas atualmente nas
plantas de tratamento de água de abastecimento não são suficientes para remover o 17β-
estradiol na sua totalidade.
177
Além disso, ainda é importante investigar se os efeitos em potencial dos DE
podem também ser efetivamente removidos nessas condições, fato este que será
discutido no item IV.6.
Como se observou, a ozonização alcançou remoções de 17β-estradiol maiores
que 99,1 % nos valores de pH investigados. O 17β-estradiol foi rapidamente oxidado
neste processo. A investigação dos subprodutos formados e se ainda apresentam
atividade estrogênica, como é o caso do 17β-estradiol, é de suma importância para se
avaliar se a ozonização também é capaz de remover o efeito deletério do 17β-estradiol e
de seus subprodutos.
IV.3.2. Remoção do 17β-Estradiol em Solução Aquosa e Efluente de ETE
Para investigar se a ozonização pode efetivamente degradar esse estrogênio em
uma matriz ambiental complexa, na qual as substâncias em questão não são os alvos
sozinhos, a ozonização do 17β-estradiol foi realizada em efluente de ETE. O efluente de
ETE, utilizado nos ensaios de ozonização, apresentou os parâmetros descritos na Tabela
IV.2. Nestes estes ensaios, foi mantido o pH original da amostra e o 17β-estradiol foi
introduzido na amostra na concentração de 50µg.L
-1
.
Tabela IV.2. Parâmetros da composição do efluente de ETE da Ilha do Governador.
Parâmetro Valor Médio
COD (mg.L
-1
)
1,6
Turbidez (NTU)
4,5
pH
6,7
SST (mg.L
-1
)
15
A remoção do 17β-estradiol em água destilada (pH 7) e em efluente de ETE
(pH original 6,7) estão apresentados na Figura IV.6. A remoção do 17β-estradiol no
efluente de ETE ocorreu mais lentamente do que em água destilada. Com uma dosagem
de 1,0 mg.L
-1
de ozônio aproximadamente 80% do 17β-estradiol foi degradado, uma
remoção de 17β-estradiol de 99,6% foi alcançada com uma dosagem de 10 mg.L
-1
de
ozônio. Assim, observou-se que na ozonização, os oxidantes atacam outras substâncias
178
presentes no efluente de ETE além do 17β-estradiol e com isso, uma maior
concentração de ozônio seria necessária para remover o 17β-estradiol dessa matriz
ambiental complexa, como efluente de ETE.
A quantidade de 17β-estradiol adicionada na amostra de efluente de ETE foi
bastante alta, com o objetivo de se determinar analiticamente o seu desaparecimento. No
entanto, observa-se que para concentrações inferiores a 0,5 µg.L
-1
a sua oxidação pela
ozonização nessa matriz é muito difícil. Com uma dosagem de ozônio de 10 mg.L
-1
uma
concentração residual de 17β-estradiol de 0,2 µg.L
-1
permaneceu no efluente de ETE.
012345678910
0
10
20
30
40
50
C
17
β
-estradiol
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
Efluente de ETE - pH 6,7
Solução aquosa - pH 7
012345678910
0
2
4
6
8
10
12
C
17
β
-estradiol
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
Figura IV.6. Remoção do 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
) em solução
aquosa e efluente de ETE pela ozonização.
Esses resultados são de extrema importância, pois os efluentes de ETE
apresentam o 17β-estradiol em concentrações na faixa de 0,5 a 12 ng.L
-1
(Anexo 1). E
sendo esse efluente descartado nos corpos receptores, provavelmente, causará
problemas ambientais como feminização de peixes e outras anomalias no sistema
reprodutivo dos organismos expostos (ALLEN
et al.,1999, RODGER-GRAY et al.,
179
2000). Deve-se ressaltar que os ensaios realizados
in vivo com desreguladores
endócrinos relatam várias dessas anomalias e é de consenso mundial que esses efeitos
ocorram em concentrações ambientalmente relevantes (COM, 1999 (706),
COMPREHEND, 2002, UBA, 1996). Além do mais, o 17β-estradiol está sendo lançado
no meio ambiente continuamente e o seu destino pode ser a água de captação para
abastecimento humano ou irrigação.
IV.4. IDENTIFICAÇÃO DOS SUBPRODUTOS FORMADOS NA
OZONIZAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL
Além de investigar os subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol,
foi também avaliada a influência do pH na formação desses subprodutos de oxidação.
Nesta etapa do estudo, duas concentrações iniciais de 17β-estradiol foram estudadas
(50µg.L
-1
e 1,0mg.L
-1
), pois na concentração de 50µg.L
-1
, concentrações muito baixas
de subprodutos foram tão rapidamente formadas e degradadas que dificultaram a
identificação. Na ozonização com concentração inicial de 1,0 mg.L
-1
foram formados
subprodutos em maior concentração que possibilitaram uma melhor identificação.
A Figura IV.7 apresenta a estrutura do 17β-estradiol formada após a
derivatização com BSTFA. O espectro de massa do 17β-estradiol obtido da CG/EM e os
espectros de massa do Bis-TMS estradiol obtidos da biblioteca do programa de
identificação NIST são apresentados na Figura IV.8. O espectro de massa do Bis-TMS
estradiol é caracterizado pelo íon
m/z 416, e pelos íons 73, 129 e 285. Estes resultados
mostraram que a derivatização dos dois grupos –OH da molécula de 17β-estradiol foi
alcançada, formado o Bis-TMS estradiol.
O
Si
H
3
CCH
3
CH
3
CH
3
H
3
C
CH
3
Si
O
Figura IV.7. Estrutura do produto formado da derivatização com BSTFA do 17β-
estradiol.
180
40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 430
0
50
100
45
59
73
115
129
141
177
231
285
298
326
401
416
40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 430
0
50
100
45
59
73
115
129
141
177
231
285
298
326
401
416
40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 430
0
50
100
45
59
73
81
93
115
129
147
163
232
285
298
326
401
416
m/z
Abundance
40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 430
0
50
100
45
59
73
81
93
115
129
147
163
232
285
298
326
401
416
40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 430
0
50
100
45
59
73
81
93
115
129
147
163
232
285
298
326
401
416
m/z
Abundance
O
Si
O
Si
(A)
(B)
Figura IV.8. (A) Espectro de massa (CG/EM) do 17β-estradiol, e (B) o espectro de
massa do Bis-TMS estradiol obtido da biblioteca da NIST.
Os cromatogramas das amostras submetidas à espectrometria de massa da
CG/EM provenientes da ozonização do 17β-estradiol em solução aquosa (concentrações
iniciais de 50µg.L
-1
e 1,0mg.L
-1
) nos diferentes valores de pH e dosagens de ozônio
consumido investigados, estão apresentados no Anexo 4. Esses cromatogramas
demonstram que vários subprodutos foram formados na ozonização do 17β-estradiol,
porém, as identificações foram dificultadas pela presença de contaminantes nas
amostras ozonizadas.
Neste estudo, observou-se claramente que a qualidade da água utilizada nos
ensaios de oxidação é de grande importância. Em se tratando de investigações com
substâncias em concentrações da ordem de µg.L
-1
e ng.L
-1
, qualquer contaminante que
já esteja na água, antes dos testes, ou seja, no preparo das soluções utilizadas nos
ensaios, pode dificultar e muito todas as avaliações de oxidação, identificação de
subprodutos e como será apresentada no item a seguir, a avaliação da atividade
estrogênica.
181
Apesar de vários intermediários serem formados na ozonização do 17β-
estradiol, até o momento, somente alguns possíveis intermediários puderam ser
propostos. Para a identificação dos subprodutos foram utilizadas duas bibliotecas de
programas de identificação: NIST e WILEY 275, além de padrões de alguns possíveis
intermediários. As bibliotecas estudadas indicaram uma variedade de substâncias
químicas, porém com base na estrutura do 17β-estradiol e nos seus possíveis produtos
de oxidação, alguns compostos identificados nas bibliotecas foram descartados.
Algumas substâncias e seus espectros de massa estão apresentados no Anexo 5. O que
provavelmente está ocorrendo é que os subprodutos formados na ozonização do 17β-
estradiol apresentam estruturas químicas similares aos identificados pelas bibliotecas,
com algumas modificações em sua estrutura química, isso pode ser devido ao fato de
que não existem, nas bibliotecas, espectros de massa dos subprodutos formados na
oxidação do 17β-estradiol.
A Figura IV.9 apresenta onde preferencialmente pode começar o ataque do O
3
à molécula de 17β-estradiol. Como os radicais HO
•
são agentes oxidantes não seletivos,
podem atacar tanto o anel fenólico como outra parte da molécula. Contudo, estudos
demonstram que o grupamento reativo dos estrogênios frente ao O
3
ou radical HO
•
é o
grupamento fenólico (HUBER
et al., 2003).
OH
HO
O
3
O
3
Figura IV.9.
Representação da atuação do ozônio molecular sobre o anel fenólico do
17β-estradiol.
A seguir, será apresentada uma discussão sobre alguns intermediários
identificados pelas bibliotecas e os possíveis subprodutos de ozonização do 17β-
estradiol. Como esses compostos estão derivatizados, apresentam em sua estrutura
química o grupamento - Si (CH
3
)
3
.
182
O Anexo 5 apresenta alguns subprodutos identificados na espectrometria de
massa como sendo oriundos da ozonização do 17β-estradiol com seus respectivos
espectros de massa, estruturas químicas e similaridades; esses dados foram obtidos nas
bibliotecas empregadas (NIST e WILEY-275). Porém muitos foram descartados, pois
não poderiam ser subprodutos da ozonização do 17β-estradiol.
A Tabela IV.3 apresenta alguns subprodutos propostos resultante da
ozonização do 17β-estradiol identificados na espectrometria de massa das amostras de
17β-estradiol ozonizadas.
Tabela IV.3. Possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol de acordo
com as análises de CG/EM.
Composto Nome do Composto Estrutura Química
1
Estr-5(10)-en-3-one, 17-
hidroxi-, (17β)-
O
OH
2
19-nortestosterona
O
H
O
3
10ε-17β-dihidroxi-1, 4-
estradieno-3-one (DEO)
OH
O
OH
4
2-hidroxiestradiol
HO
OH
HO
5
Testosterona
O
H
O
Para um composto ser confirmado pela cromatografia estar presente em uma
amostra são necessárias várias etapas de verificação, algumas delas como, injetar
183
padrões desses compostos numa mesma programação e mesma coluna que as amostras,
injetar em colunas e programações diferentes, para assim, confirmar a presença ou não
de um determinado composto. Neste estudo, além dos espectros de massa obtidos das
amostras de 17β-estradiol ozonizadas, padrões de alguns possíveis subprodutos da
oxidação do 17β-estradiol foram injetados na CG e CG/EM na mesma coluna e na
mesma programação das amostras de 17β-estradiol ozonizadas.
O primeiro composto a ser identificado na espectrometria de massa foi a 19-
nortestosterona, com uma baixa similaridade, de 49%, porém uma das maiores
similaridades obtidas neste estudo. Um padrão desse composto foi injetado na CG e
CG/EM e não apresentou o mesmo tempo de retenção de um intermediário presente nas
amostras de 17β-estradiol ozonizadas. Com isso, conclui-se que a 19-nortestosterona
não é um subproduto da ozonização do 17β-estradiol nas condições empregadas neste
estudo. Contudo, não está descartada a hipótese de outro isômero da 19-nortestosterona,
como por exemplo de número 1, apresentado na Tabela IV.4, porém, não foi possível
obter padrão deste composto.
O segundo composto a ser identificado pelo espectro de massa foi 10ε-17β-
dihidroxi-1, 4-estradieno-3-one (DEO), porém com uma baixa similaridade. O padrão
deste composto não foi encontrado para sua confirmação como subproduto da
ozonização do 17β-estradiol. Contudo, o DEO foi citado por OHKO
et al. (2002) como
sendo um possível subproduto formado na oxidação do 17β-estradiol na fotocatálise,
sua identificação foi realizada através da espectrometria de massa, sem a confirmação
com um padrão, porém confirmado mecanisticamente. Com isso, pode-se propor que o
DEO seja um subproduto formado na ozonização do 17β-estradiol. Observa-se que um
isômero de posição deste composto também pode ser um dos subprodutos formados na
oxidação do 17β-estradiol.
Em várias amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, o 2-hidroxiestradiol
foi identificado pela espectrometria de massa com uma similaridade alta (93 %).
Segundo ZHU e CONNEY (1998) um dos maiores caminhos metabólicos do 17β-
estradiol no corpo é a 2-hidroxilação, em segundo uma 16α-hidroxilação do 17β-
estradiol para um catecol e a formação da estrona. Com isso, é de se esperar que a
oxidação do 17β-estradiol possa conduzir ao 2-hidroxiestradiol. Na espectrometria de
184
massa, pelo menos três isômeros de posição deste catecol foram identificados, porém
sem confirmação com padrões. Um padrão do 2-hidroxiestradiol foi analisado na CG e
CG/EM na mesma programação das amostras aquosas do 17β-estradiol, sendo,
confirmada a presença desse composto. Com isso, podemos propor que o 2-
hidroxiestradiol seja um dos subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol.
Outros estudos de oxidação do 17β-estradiol também relataram o 2-hidroxiestradiol
como subproduto de reação (OHKO
et al., 2002).
A testosterona foi um dos subprodutos identificados na oxidação do 17β-
estradiol pela fotocatálise no estudo de OHKO
et al. (2002). No nosso estudo, um
padrão da testosterona foi analisado e identificado como um dos subprodutos formados
na ozonização do 17β-estradiol.
Apesar de ser observado que vários subprodutos foram formados da
ozonização do 17β-estradiol, poucos puderam ser identificados ou propostos. Como, por
exemplo, não foi possível identificar subprodutos da ozonização do 17β-estradiol que
mostrassem a abertura do anel fenólico. Contudo, a identificação dos subprodutos
formados na oxidação do 17β-estradiol não é um tópico fácil de estudo, pois
pouquíssimos são os trabalhos na literatura onde são propostos esses subprodutos
(HUBER
et al., 2004, OHKO et al., 2002).
Observou-se que nem todos os valores de pH apresentaram os mesmos
subprodutos formados na oxidação do 17β-estradiol. A Tabela IV.4 apresenta alguns
intermediários propostos para a oxidação do 17β-estradiol em solução aquosa em todos
os pH investigado e no efluente de ETE.
Observou-se que o pH influencia na formação dos subprodutos formados na
ozonização do 17β-estradiol. Alguns subprodutos propostos nos valores de pH 7 e 11
não foram detectados quando a ozonização foi conduzida em pH 3. Isto indica que
diferentes caminhos de reação estão ocorrendo em diferentes valores de pH de
ozonização e pode ser explicado devido ao pH 11 favorecer a formação dos radicais
HO
•
, que agem como oxidantes; o que já não acontece no pH 3 onde há a maior atuação
do O
3
molecular na oxidação dos compostos. Além disso, em pH 11 os compostos
fenólicos se encontram na forma de íons fenolatos, espécie que não está presente em pH
ácido.
185
Tabela IV.4. Subprodutos propostos na ozonização do 17β-estradiol em água destilada
e em efluente de ETE nos diferentes valores de pH investigados.
Água destilada
Efluente
de ETE
Nome do
composto
Estrutura Química
pH 3 pH 7 pH 11 pH 6,7
10ε-17β-
dihidroxi-1, 4-
estradieno-3-
one (DEO)
OH
O
OH
ND
√ √ √
2-
hidroxiestradiol
HO
OH
HO
ND
√ √ √
Testosterona
OH
O
√ √
ND
√
ND: não detectado
IV.5. DESAPARECIMENTO DAS BANDAS DE ABSORBÂNCIAS DO 17β-
ESTRADIOL APÓS A OZONIZAÇÃO
A atividade estrogênica do 17β-estradiol está relacionada com a sua estrutura
química. A posição relativa do grupo hidroxila fenólico (OH) no anel A é considerada
crucial para a alta afinidade da ligação com o RE e assim seu potencial estrogênico.
A Figura IV.10 apresenta o espectro de absorbância do 17β-estradiol em
metanol. De acordo com a literatura, as bandas de absorbância de uma substância na
faixa de comprimento de onda de 190 a 300 nm representam as ligações duplas e triplas
conjugadas da molécula, e a banda de absorbância no comprimento de onda de 288 nm
representa o anel fenólico (LIU e LIU, 2004). O espectro de absorbância do 17β-
estradiol indica que essa molécula apresenta um máximo de absorção característico em
λ = 203 nm e uma pequena banda de absorbância em λ = 280 nm.
186
Segundo LIU e LIU (2004), a estrutura conjugada principal do 17β-estradiol é
o grupo hidroxila substituinte do anel benzênico, o qual tem uma fraca absorbância na
região UV com a banda de absorbância em 288 nm. Essa banda de absorbância em um
comprimento de onda aproximado (λ = 280 nm) pode ser observada na Figura IV.13.
Este deslocamento nas bandas de absorbâncias se deve ao fato de que essas análises
foram realizadas em diferentes solventes, no caso desse estudo, o metanol e no artigo de
LIU e LIU (2004) a água.
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
HO
OH
Figura IV.10. Espectro de absorbância do 17β-estradiol em metanol
(C
17β-estradiol
= 50µg.L
-1
).
Deve-se ressaltar que esses espectros no UV foram feitos em metanol
(metodologia analítica apresentada no item III.4.8) e que esse foi o melhor solvente
encontrado para identificar os máximos de absorbância. Isso só foi possível porque as
amostras foram extraídas e concentradas em C
18
e eluídas com solvente orgânico. Em
geral seria impossível obter tais espectros em concentrações tão baixas.
A resolução do espectro em metanol foi excelente e houve um pequeno
deslocamento nos máximos de absorbância, o que é esperado uma vez que o solvente
não foi a água, este mesmo deslocamento foi observado no espectro de absorção do
187
composto fenol em metanol. Observa-se que é idêntico ao da literatura apenas com o
deslocamento do máximo de absorbância.
Esse espectro valida o método aqui empregado para essas varreduras no UV. A
Figura IV.11 e o Anexo 6 apresentam os espectros de UV em metanol das amostras de
17β-estradiol ozonizadas.
A Figura IV.11 demonstra o desaparecimento das bandas de absorbâncias do
17β-estradiol pela ozonização, nos três valores de pH investigados. Observa-se a
degradação do 17β-estradiol com o aumento da dosagem de ozônio. Todas as bandas de
absorbância (203 e 280 nm) diminuíram consideravelmente depois da ozonização,
indicando que o anel fenólico parece ser rompido e conseqüentemente a remoção da
estrogenicidade do 17β-estradiol.
Este comportamento é melhor avaliado na Figura IV.12. Observa-se que há
uma redução significativa na banda de absorbância máxima em 203 nm com o aumento
da dosagem de ozônio. Contudo, em pH 3 essa redução foi menor, provavelmente nesse
pH a absorbância é devido à concentração residual de 17β-estradiol, que é maior do que
em outros valores de pH, como demonstrado na CG. Nos valores de pH 7 e 11 essa
redução foi maior indicando uma maior remoção dessa estrutura. Essas informações são
muito interessantes, pois revelam o rompimento do anel fenólico, que é a parte da
molécula a qual é atribuída a atividade estrogênica. Portanto, o rompimento do anel
fenólico leva à remoção da atividade estrogênica, não sendo necessária a mineralização
total da substância. Esses resultados concordam parcialmente com os resultados obtidos
nos testes de atividade estrogênica que serão discutidos posteriormente.
188
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 3
50 µg.L
-1
de E
2
0,5 mg.L
-1
de O
3
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 7
50 µg.L
-1
de E
2
0,5 mg.L
-1
de O
3
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 11
50
µ
g.L
-1
de E
2
0,5 mg.L
-1
de O
3
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
Figura IV.11. Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas em diferentes valores de pH.
189
012345678910
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Abosrbância normalizada
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 3
pH 7
pH 11
Figura IV.12. Redução das absorbâncias a λ = 203 nm nos diferentes valores de pH em
função das dosagens de ozônio consumido.
IV.6. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO 17β-ESTRADIOL NA
OZONIZAÇÃO
IV.6.1. Ensaio YES
No ensaio YES, o potencial estrogênico das substâncias ou amostras testadas
pode ser medido colorimetricamente pela mudança de cor do substrato cromogênico
(CPRG) presente no meio reacional. O substrato é metabolizado pela enzima β-
galactosidase produzida como resposta à ligação da substância estrogênica no RE da
levedura. Assim, quando uma substância estrogênica está presente no ensaio YES, a
coloração do meio de análise muda de amarelo para rosa, como pode ser observado na
Figura IV.13, que apresenta a resposta estrogênica do 17β-estradiol no ensaio YES.
O 17β-estradiol é considerado um padrão dos ensaios de atividade estrogênica,
sendo assim, é usado como controle positivo no ensaio YES para demonstrar a resposta
190
estrogênica. A Figura IV.14 apresenta uma curva dose-resposta padrão do 17β-estradiol
característica do ensaio YES.
Tempo = 0 dias Tempo = 3 dias
Figura IV.13. Microplacas do ensaio YES com a curva padrão do 17β-
estradiol (Fileiras E e G), branco (Fileiras F e H).
Figura IV.14. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no ensaio
YES realizado por WANG
et al. (2003).
A Figura IV.15 apresenta a curva dose-resposta do 17β-estradiol para o ensaio
YES obtida neste estudo. A curva padrão do 17β-estradiol mostra-se uma função
sigmoidal, que foi determinada pelo método de regressão não linear.
191
1E-7 1E-6 1E-5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17
β
-estradiol
Figura IV.15. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no ensaio
YES. Curva de calibração do estrogênio foi produzida pela análise de 17β-estradiol na
faixa de 54,4 µg.L
-1
a 26,61 ng.L
-1
.
Para cada ensaio, uma curva dose-resposta do 17β-estradiol foi determinada,
produzida na faixa de 54,4 µg.L
-1
a 26,61 ng.L
-1
. O limite de detecção foi de
0,4±0,1µg.L
-1
, a máxima indução da β-galactosidase foi de 2,980 ± 0,1 e o EC
50
foi de
2,13 ± 0,3 µg.L
-1
. Observa-se que a curva dose-resposta obtida está de acordo com a
literatura validando os testes aqui realizados.
IV.6.2 Atividade Estrogênica da Água Destilada
Neste estudo, observou-se que impurezas ou contaminações causam falsos
positivos nos ensaios YES. Assim, os reagentes, a água e os recipientes usados no
preparo das soluções que compõem o meio de cultivo e análise devem apresentar um
alto grau de pureza. Para isso, no ensaio YES utilizou-se água ultrapura apirogênica (<
0,001 endotoxicina / mL) obtida pelo sistema Mili-Q Biocell.
192
Primeiramente foram usadas no ensaio YES as amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas preparadas com água destilada, contudo, os experimentos não puderam ser
realizados dessa forma. A Figura IV. 16 apresenta o resultado do potencial estrogênico
da água destilada no ensaio YES.
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17
β
-estradiol
0,01 0,1 1
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
A
corrigido
Fator de diluição
Água Destilada
Figura IV.16. Curvas dose-resposta do 17β-estradiol e do extrato de água destilada no
ensaio YES.
193
A água destilada usada em todos os experimentos de ozonização não pôde ser
utilizada no ensaio YES devido à sua atividade estrogênica antes do preparo das
soluções aquosas de 17β-estradiol, como mostrado na Figura IV.16(B). Assim, conclui-
se que a água destilada possui contaminantes que apresentam atividade estrogênica no
ensaio YES e, portanto, não pode ser usada para avaliação da estrogenicidade das
amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas. Deve-se deixar claro que essa
estrogenicidade é observada para o extrato da água destilada e que as suas
concentrações na água destilada estão abaixo de ng.L
-1
.
Com isso, a mesma água ultrapura usada no preparo das soluções do ensaio YES
foi utilizada para preparar todas as soluções aquosas de 17β-estradiol usadas na
ozonização.
IV.6.3. Atividade Estrogênica das Amostras Aquosas de 17
β-Estradiol
Ozonizadas
Como apresentada na seção III (Materiais e Métodos), a atividade estrogênica
do 17β-estradiol após a ozonização foi avaliada em amostras com e sem preparo prévio,
ou seja, sem e com extração e concentração em EFS. Para medir a atividade estrogênica
no ensaio YES, as amostras aquosas passaram por um processo de extração, para a
concentração das amostras. A curva dose-resposta do controle positivo (17β-estradiol)
para o ensaio YES pode ser medida em uma concentração maior do que a apresentada
na amostra aquosa. Como apresentado no Anexo 7 as amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas sem o processo de extração (EFS em C
18
) não apresentaram atividade
estrogênica no ensaio YES ao contrário dos extratos das amostras ozonizadas como será
apresentado a seguir.
A atividade estrogênica dos extratos das amostras ozonizadas em água foi
determinada pelo ensaio YES. As microplacas de 96 poços mostrando a resposta
estrogênica ao ensaio YES das amostras são apresentadas nas Figuras IV.17 a IV.19.
194
Figura IV.17. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das
amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídos. Amostras com 10µg.L
-1
de
17β-estradiol e: 1mg.L
-1
de O
3
e pH 3 (fileiras A e C da placa A); 5mg.L
-1
de O
3
e pH 3
(fileiras E e G da placa A); 1mg.L
-1
de O
3
e pH 7 (fileiras A e C da placa B); 5mg.L
-1
de
O
3
e pH 7 (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos.
Figura IV.18. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das
amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídos. Amostras com 10µg.L
-1
de
17β-estradiol e: 10mg.L
-1
de O
3
e pH 7 (fileiras A e C da placa A); curva padrão do
17β-estradiol (fileiras E e G da placa A); 10 mg.L
-1
de O
3
e pH 3 (fileiras A e C da
placa B); Amostras com 50µg.L
-1
de 17β-estradiol 10 mg.L
-1
de O
3
e pH 11 (fileiras E e
G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos.
Figura IV.19. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das
amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídas. Amostras com 50µg.L
-1
de
17β-estradiol e: 5 mg.L
-1
de O
3
e pH 7 (fileiras A e C da placa A). Amostras com
10µg.L
-1
de 17β-estradiol e: 10 mg.L
-1
de O
3
e pH 11 (fileiras E e G da placa A);
Amostras com 50µg.L
-1
de 17β-estradiol e: 1 mg.L
-1
de O
3
e pH 7 (fileiras A e C da
placa B); curva padrão do 17β-estradiol (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F,
H são os brancos.
(A) (B)
(A)
(B)
(A) (B)
195
As Figuras IV.17 a IV.19 apresentam as respostas estrogênicas dos extratos
das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas com uma concentração inicial de
10µg.L
-1
. Pode-se observar visualmente a mudança de cor, demonstrando a presença de
substâncias estrogênicas nas amostras.
Para as diluições seriais dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas, a atividade estrogênica foi representada pela curva dose-resposta medida no
ensaio YES, construída pelos valores de A
corrigidos
versus fator de diluição. Essas curvas
dose-resposta estão apresentadas na Figura IV.20.
Pelas curvas dose-resposta apresentadas na Figura IV.20 observa-se que os
extratos das amostras ozonizadas em pH 3 são fracamente estrogênicas, e que a remoção
dessa pequena atividade estrogênica residual ocorre com o aumento da dosagem de
ozônio consumido. Já os extratos das amostras ozonizadas em pH 7 e pH 11 foram
fortemente estrogênicos no ensaio YES. Em pH 7, a atividade estrogênica só é
consideravelmente reduzida com a maior dosagem de ozônio consumido (10 mg.L
-1
). O
que já não ocorre com as amostras ozonizadas em pH 11, onde a atividade estrogênica
não é reduzida com o aumento da dosagem de ozônio consumido. Assim, observou-se
que o potencial estrogênico diminuiu com a redução do pH de reação.
Uma comparação qualitativa da curva dose-resposta do controle positivo do
ensaio YES (17β-estradiol) e dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas estão apresentadas na Figura IV.21. Cabe ressaltar que as abscissas da curva
dose-resposta do 17β-estradiol e dos extratos das amostras são diferentes, a primeira
apresenta a concentração do composto e o segundo o fator de diluição dos extratos das
amostras diluídas serialmente.
Da Figura IV.21 observa-se que os extratos das amostras ozonizadas em pH 7
e pH 11 quase atingem o máximo da absorbância alcançada pelo 17β-estradiol no
controle positivo do ensaio YES, demonstrando, que são fortemente estrogênicas.
A Figura IV.22 apresenta a curva dose-resposta e a comparação com o
controle positivo dos extratos das amostras ozonizadas com a concentração inicial de
50µg.L
-1
de 17β-estradiol em pH 7.
196
1E-3 0,01 0,1 1
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
C
17
β
-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
e pH 3
A
corrigido
Fator de Diluição
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
1E-3 0,01 0,1 1
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
C
17β-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
e pH 7
A
corrigido
Fator de Diluição
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
1E-3 0,01 0,1 1 10
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
C
17
β
-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
e pH 11
A
corrigido
Fator de Diluição
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
Figura IV.20. Curva dose-resposta dos extratos das amostras aquosas de 10µg.L
-1
de
17β-estradiol ozonizadas em diferentes valores de pH.
197
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
C
17
β
-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
e pH 3
Fator de diluição
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17
β
-estradiol
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
C
17
β
-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
e pH 7
Fator de diluição
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17β-estradiol
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
C
17
β
-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
e pH 11
Fator de diluição
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17
β
-estradiol
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
Figura IV.21. Comparação das curvas dose- respostas do 17β-estradiol e dos extratos
das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.
198
1E-3 0,01 0,1 1
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
C
17
β
-estradiol
inicial= 50
µ
g.L
-1
e pH 7
A
corrigida
Fator de diluição
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
C
17
β
-estradiol
inicial= 50
µ
g.L
-1
e pH 7
Fator de diluição
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17
β
-estradiol
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
(A)
(B)
Figura IV.22. (A) Curva dose-resposta dos extratos das amostras ozonizadas de
50µg.L
-1
de 17β-estradiol e pH 7 e (B) comparação das curvas dose- respostas do 17β-
estradiol e dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.
Observa-se que com o aumento da concentração inicial de 17β-estradiol na
solução aquosa, ocorre um aumento na atividade estrogênica dos extratos das amostras
ozonizadas. Além disso, não houve uma redução da atividade estrogênica com o
aumento da dosagem de ozônio, como ocorreu nas amostras com concentração inicial
de 10 µg.L
-1
em pH 7.
A atividade estrogênica dos extratos das amostras após a ozonização pode ser
expressa como equivalentes de 17β-estradiol em µg.L
-1
(EQ-E2). O EQ-E
2
faz uma
comparação da potência estrogênica da amostra com a causada pelo 17β-estradiol. Estes
199
resultados estão apresentados na Figura IV.23 e Tabela IV.5. A Figura IV.24 apresenta
uma comparação dos EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas.
0246810
0
2
4
6
8
4900
4920
4940
4960
4980
5000
C
17
β
-estradiol
inicial= 10
µ
g.L
-1
EQ-E
2
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 3
pH 7
pH 11
0246810
0
2
4
6
8
25000
C
17
β
-estradiol
inicial = 50
µ
g.L
-1
EQ-E
2
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 7
Figura IV.23. EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosa de 17β-estradiol ozonizadas
com 10 µg.L
-1
e 50 µg.L
-1
.
200
1510
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
EQ-E
2
(
µ
g.L
-1
)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
C
E
2
= 10
µ
g.L
-1
, pH 3
C
E
2
= 10
µ
g.L
-1
,pH 7
C
E
2
= 10
µ
g.L
-1
,pH 11
C
E
2
= 50
µ
g.L
-1
,pH 7
Figura IV.24. EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.
Tabela IV.5. Valores de EQ-E
2
dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol
ozonizadas.
EQ-E
2
(µg.L
-1
)
C
17β-estradiol
inicial= 10µg.L
-1
EQ-E
2
(µg.L
-1
)
C
17β-estradiol
inicial = 50µg.L
-1
Dosagem de ozônio
consumido
(mg.L
-1
)
pH 3 pH 7 pH 11 pH 7
1,0 0,46 3,33 5,75 9,70
5,0 0,00 3,00 5,50 8,47
10 0,00 0,40 4,49 8,04
Na Figura IV.23 observa-se uma grande remoção do EQ-E
2
dos extratos das
amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas. Contudo, um residual ainda permaneceu
na amostra, além disso, este residual aumenta com o aumento do pH de reação.
A Figura IV.24 mostra que as atividades estrogênicas apresentadas pelos
extratos das amostras de 17β-estradiol aumentam com o aumento do pH de reação. Esse
aumento também é notado quando a concentração inicial de 17β-estradiol é maior.
201
Da Tabela IV.5 observou-se que após a ozonização, ainda permaneceu um
resíduo de EQ-E
2
no extrato. Das análises químicas (CG) da solução aquosa de 17β-
estradiol após a ozonização concluiu-se que uma alta remoção do 17β-estradiol foi
alcançada, maior do que 99,1%, porém observou-se algumas vezes um residual de 17β-
estradiol de até 90 ng.L
-1
nas amostras ozonizadas em pH 3. Contudo, em pH 11 a
concentração residual de 17β-estradiol foi menor do que 30 ng.L
-1
e, mesmo assim, a
atividade estrogênica foi maior. A Figura IV.25 apresenta a quantidade de 17β-estradiol
presente nas mesmas amostras aquosas ozonizadas que foram utilizadas nos ensaios
YES. Como não houve tempo hábil para a construção de uma nova curva de calibração
do 17β-estradiol, os resultados estão apresentados em área do pico e os cromatogramas
do CG, apresentados no Anexo 8.
012345678910
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
Área do pico
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
pH 3
pH 7
pH 11
012345678910
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Área do Pico
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
Figura IV.25. Quantidade de 17β-estradiol presente nas amostras aquosas
ozonizadas em água ultrapura apirogênica.
Os resultados indicam que em pH 7 e 11 a atividade estrogênica não foi
completamente removida com a significativa diminuição da concentração de 17β-
estradiol, mesmo com um aumento da dosagem de ozônio, provavelmente, há a
formação de subprodutos que podem ter estrogenicidade similar à do 17β-estradiol,
nestes valores de pH, já que este foi rapidamente removido no início da ozonização.
202
É interessante notar que em pH 3 houve maior remoção da estrogenicidade da
amostra. No entanto, em pH 3 a remoção do 17β-estradiol foi mais lenta (Figura IV.25).
No pH 11 houve maior remoção do 17β-estradiol (>99,8%) e no entanto, as amostras
ozonizadas apresentaram maior estrogenicidade. Portanto, provavelmente, os
intermediários formados em pH 7 e 11 apresentam estrogenicidade e os formados em
pH 3 não.
Uma explicação para esse fato pode estar na natureza do oxidante, pois em pH
11 tem-se o radical HO
•
como oxidante, que é inespecífico. Nesse pH também foi
observado um maior número de subprodutos.
Outra conclusão bastante importante é que as análises químicas sozinhas não
devem ser usadas sozinhas para se avaliar a remoção de micropoluentes de amostras
aquosas ambientais, como os desreguladores endócrinos. Pois, mesmo que esses
tratamentos alcancem altíssimas remoções, podem não ser totalmente eficiente na
remoção dessas substâncias. Assim, ensaios que avaliam os efeitos deletérios dos DE
devem ser usados em conjunto com as análises químicas clássicas na avaliação da
remoção de DE do meio ambiente.
O extrato da amostra original de 17β-estradiol com concentração inicial de
10µg.L
-1
em solução aquosa apresentaria uma concentração de 5.000 µg.L
-1
de 17β-
estradiol no extrato. Pela curva dose-resposta do 17β-estradiol do ensaio YES sabe-se
que a máxima resposta estrogênica se dá com uma concentração de 54,5 µg.L
-1
. A
amostra inicial de 17β-estradiol ozonizada tem concentração muito maior do que a da
máxima resposta da curva dose resposta do controle do ensaio YES, sendo assim,
conclui-se que esta amostra original é fortemente estrogênica e que, teria que ser diluída
para poder ser medida neste ensaio.
Outra observação importante nestes ensaios está apresentada na Figura IV.26
que mostra as remoções dos EQ-E
2
dos extratos das amostras de 17β-estradiol
ozonizadas.
203
12345678910
99,89
99,90
99,91
99,92
99,93
99,94
99,95
99,96
99,97
99,98
99,99
100,00
99,89
99,90
99,91
99,92
99,93
99,94
99,95
99,96
99,97
99,98
99,99
100,00
Remoção do EQ-E
2
(%)
Dosagem de ozônio consumido (mg.L
-1
)
C
17
β
-estradiol
= 10
µ
g.L
-1
e pH 3
C
17
β
-estradiol
= 10
µ
g.L
-1
e pH 7
C
17
β
-estradiol
= 10
µ
g.L
-1
e pH 11
C
17
β
-estradiol
= 50
µ
g.L
-1
e pH 7
Figura IV.26. Remoção do EQ-E
2
dos extratos das amostras ozonizadas.
Alguns dos extratos das amostras ozonizadas ainda continuam sendo
fortemente estrogênicos, apresentando máxima resposta estrogênica para o ensaio YES,
porém muito menor do que o extrato da amostra inicial de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 10 µg.L
-1
em solução aquosa) apresentaria. Da Figura IV.26 observa-se que
uma alta remoção da atividade estrogênica da amostra de 17β-estradiol foi alcançada
com a ozonização, acima de 99,89%. Contudo, algumas amostras ozonizadas ainda
apresentam potencial estrogênico.
Assim, apesar de ser observada alta remoção da atividade estrogênica, maiores
do que 99,89 %, os resíduos de potencial estrogênico presentes no extrato das amostras
aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, indica que as amostras ainda continuam sendo
fortemente estrogênicas. O potencial estrogênico das substâncias é observado em
baixíssimas concentrações, sendo assim, um resíduo de substâncias estrogênicas, na
ordem de ng.L
-1
, faz com que a amostra aquosa ainda continue sendo estrogênica.
As respostas estrogênicas do ensaio YES são produzidas na faixa de µg.L
-1
. Na
literatura, outros ensaios
in vivo demonstram atividade estrogênica em amostras em
concentrações na ordem de ng.L
-1
, como por exemplo, o ensaio de determinação de
204
VTG em peixes expostos a substâncias estrogênicas, onde os efeitos estrogênicos são
observados na faixa de 1 a 100 ng.L
-1
(ROUTLEDGE et al., 1998, THOMPSON et al.,
2000).
Deve-se ressaltar que embora a ozonização tenha sido muito eficiente na
remoção do 17β-estradiol, alcançando remoções maiores do que 99,8%, não foi
totalmente suficiente para concentrações na faixa de ng.L
-1
em pH 7 e 11, mesmo
considerando as altas dosagens de ozônio consumido. As concentrações em ng.L
-1
são
suficientes para causar efeitos em peixes e em outros organismos, portanto, a remoção
deve ser maior que a obtida nesse trabalho.
Estudos na literatura (ALUM
et al., 2004, HUBER et al., 2004, KIM, et al.,
2004) demonstram a redução da atividade estrogênica de estrogênios, tais como o 17β-
estradiol e o 17α-etinilestradiol, com alguns processos oxidativos. HUBER et al. (2004)
observaram uma redução da atividade estrogênica de uma amostra aquosa de 17α-
etinilestradiol em pH 8 pela ozonização. Contudo, neste estudo os autores usaram
espécies capturadoras de radicais HO
•
, sendo assim, os autores estudaram somente a
oxidação dessa substância via ozônio molecular. No presente estudo, também foi
observada a perda da atividade estrogênica do 17β-estradiol quando a ozonização foi
conduzida em pH 3, no qual a oxidação ocorre mais efetivamente via ozônio molecular.
Porém, em plantas de tratamento de água ou efluentes, provavelmente, a ozonização
será conduzida em pH acima de 3, no qual a ação dos radicais HO
•
deverá ser
considerada.
ALUM et al. (2004) investigaram a ozonização de três DE, o bisfenol A, o
17β-estradiol e o 17α-etinilestradiol. Os autores observaram que houve rápida
transformação dos compostos após a ozonização, com remoções maiores que 99%.
Contudo, atividade estrogênica residual foi observada no final da ozonização, e
concluíu-se que, provavelmente, os subprodutos formados da oxidação exercem
atividade estrogênica.
Os resultados dos estudos de KIM
et al. (2004) demonstraram que na
ozonização do 17β-estradiol a atividade estrogênica não diminuiu consideravelmente
com o aumento da dosagem de ozônio, sugerindo que há a formação de subprodutos que
205
podem ter estrogenicidade similar à do 17β-estradiol, já que este foi rapidamente
removido no início da ozonização.
IV.6.4. Atividade Estrogênica de Possíveis Subprodutos Formados na
Ozonização do 17
β-Estradiol
A atividade estrogênica de dois possíveis subprodutos formados na ozonização
do 17β-estradiol foi avaliada. A Figura IV.27 apresenta as curvas dose-resposta do 2-
hidroxiestradiol e da testosterona.
O EC
50
para o 17β-estradiol, que corresponde à concentração de 17β-estradiol
que elucida 50% da resposta estrogênica, foi determinada a partir da curva dose-
resposta (que foi calculada usando os métodos de regressão não-linear). O EC
50
e a
potência estrogênica relativa (PR) do 17β-estradiol e das substâncias químicas estudas
estão apresentadas na Tabela IV.6.
Tabela IV.6. Valores de EC
50
e PR para os possíveis subprodutos formados na
ozonização do 17β-estradiol
Substância Química EC
50
(g.L
-1
) PR
17
β
-estradiol
2,13 x 10
-6
1
Testosterona
- -
2-hidroxiestradiol
2,33 x 10
-5
0,1
206
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17
β
-estradiol
2-Hidroxiestradiol
1E-6 1E-5 1E-4
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17β-estradiol
Testosterona
Figura IV.27. Curva dose-resposta do 17β-estradiol, 2-hidroxiestradiol e testosterona.
Os resultados da Tabela IV.6 indicam que o 2-hidroxiestradiol é 10 vezes
menos potente do que o 17β-estradiol, enquanto que a testosterona não apresentou
estrogenicidade nas condições do ensaio YES.
207
Como observado na identificação dos subprodutos formados na ozonização do
17β-estradiol, diferentes subprodutos foram formados de acordo com o pH de reação.
Provavelmente, esse fato pode explicar a diferença de remoção de atividade estrogênica
das soluções aquosas de 17β-estradiol ozonizadas nos diferentes valores de pH de
reação.
Observou-se que em pH 11, no qual ocorreram as maiores degradações de
17β-estradiol, uma atividade estrogênica residual permaneceu, mesmo com o aumento
da dosagem de ozônio consumido. Já em pH 3 foram observadas as maiores
concentrações residuais de 17β-estradiol, uma baixíssima atividade estrogênica estava
presente na amostra, sendo totalmente reduzida com o aumento da dosagem de ozônio
consumido.
Um dos possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol em
pH 11 foi o 2-hidroxiestradiol, que também foi observado em pH 7 e como visto nesta
seção, é fortemente estrogênico, sendo somente 10 vezes menos potente do que o 17β-
estradiol. Contudo, este subproduto não foi observado em pH 3.
A testosterona foi observada como possível subproduto formado na
ozonização do 17β-estradiol nos valores de pH 3 e 7, porém, não foram detectados no
pH 11. Além disso, a testosterona não apresentou estrogenicidade nas condições do
ensaio YES, contudo, esta substância pode apresenta outro efeito biológico diferente da
atividade estrogênica.
IV.7. TOXICIDADE CRÔNICA DO 17β-ESTRADIOL
Para avaliar a toxicidade do 17β-estradiol utilizou-se um teste de toxicidade
crônica a
Ceriodaphia dubia. Este teste foi escolhido por ter a possibilidade de
investigar os efeitos potenciais do 17β-estradiol tanto nos indivíduos adultos, como em
sua reprodução.
208
A literatura comenta que há poucas informações sobre a toxicidade dessas
substâncias e que essas informações são importantes para se determinar o potencial
tóxico dessas substâncias no meio ambiente (FERNANDEZ
et al., 2002).
A avaliação da toxicidade crônica do 17β-estradiol foi realizada nas
concentrações de 20 ng.L
-1
a 100 µg.L
-1
. Os resultados deste ensaio demonstraram que
não foram observados efeitos tóxicos nas condições dos testes.
Com isso, pode-se concluir que os testes de toxicidade, que junto com as
análises químicas clássicas, estão sendo bastante usados para se avaliar os efeitos de um
determinado efluente ou substância química no meio ambiente, são ineficientes para
predizer os efeitos causados no meio ambiente por essa nova classe de micropoluentes,
os desreguladores endócrinos. Assim, os ensaios de atividade estrogênica, são os mais
indicados para avaliar os efeitos em potencial do DE. Por isso, suas metodologias
deverão ser completamente dominadas e implantadas como testes necessários para
avaliar os efeitos de efluentes descartados.
209
V. CONCLUSÕES
A ozonização foi muito eficiente para a remoção do 17β-estradiol em solução
aquosa. Com baixas dosagens de ozônio (1,0 mg.L
-1
- dosagens normalmente utilizadas
em plantas de tratamento de água) foi alcançada remoção maior que 99%. O 17β-
estradiol foi rápido e quase completamente oxidado nos diferentes valores de pH
investigado (3, 7 e 11).
Contudo, o comportamento oxidativo do 17β-estradiol frente à oxidação
modificou-se em relação à concentração desse estrogênio na água e ao pH de reação.
Para remoções de maiores concentrações de 17β-estradiol, não foram observadas
alterações significativas com a mudança do pH de reação. Porém, para pequenas
concentrações de 17β-estradiol (< 0,1 µg.L
-1
) a oxidação tornou-se mais lenta. E
observou-se que a concentração residual diminuiu com o aumento do pH, ou seja, em
pH 11 a oxidação foi mais rápida e mais eficiente para baixas concentrações.
A ozonização do 17β-estradiol em pH 3 foi mais lenta e menos eficiente,
alcançando menores remoções (99,1%), do que nos outros dois valores de pH
investigados. Em pH 11 a oxidação foi mais rápida atingindo-se menores concentrações
residuais de 17β-estradiol.
Os experimentos realizados no efluente de ETE indicaram que o 17β-estradiol
é mais lentamente oxidado em uma matriz mais complexa, onde estão presentes outras
substâncias orgânicas oxidáveis pelo ozônio. Pois, uma concentração residual (cerca de
0,2 µg.L
-1
) maior do que em solução aquosa, permaneceu mesmo com uma maior
dosagem de ozônio. Assim, maiores doses de ozônio devem ser aplicadas em matrizes
aquáticas complexas, como é o caso do efluente de ETE. É de extrema importância que
os efluentes de ETE descartem mínimas concentrações desse e de outros DE, para que
seus efeitos potenciais não causem impacto nos animais que vivem nos corpos
receptores e que por outro lado, não influenciem negativamente qualidade das águas
captadas para abastecimento humano.
Apesar de ser observado que vários subprodutos foram formados na
ozonização do 17β-estradiol, poucos puderam ser identificados ou confirmados.
Contudo, o que se observou é que este ainda é um tópico difícil de ser elucidado.
210
Observou-se que diferentes subprodutos são formados em diferentes valores de pH de
reação, o que provavelmente se deve ao fato de que diferentes caminhos de reação
ocorrem em função do pH de ozonização, que conduz a atuação de diferentes oxidantes.
Os subprodutos propostos de serem formados na ozonização do 17β-estradiol em pH 11
foram o DEO e o 2-hidroxiestradiol, que não foram observados em pH 3. Somente a
testosterona foi formada em pH 3, já em pH 7 foram observados os três subprodutos de
oxidação.
Nos três valores de pH investigados, a ozonização alcançou altas remoções,
maiores do que 99,1%. Contudo, nos pH 7 e 11 as dosagens de ozônio aplicadas não
foram suficientes para remover o potencial estrogênico do 17β-estradiol, embora nesses
dois valores de pH a concentração residual de 17β-estradiol tenha sido menor do que em
pH 3. Provavelmente, os subprodutos formados nos pH 7 e 11 apresentam atividade
estrogênica, visto que diferentes subprodutos foram formados nos diferentes valores de
pH de ozonização. A ozonização em pH 11 resultou em maior estrogenicidade do que
em pH 7, possivelmente, a oxidação via radical HO
•
gere mais subprodutos com
atividade estrogênica, já que acima do pH 10, o ozônio é instantaneamente decomposto
em radicais HO
•
. Uma análise qualitativa dos cromatogramas também sugere a
formação de um maior número de subprodutos em pH 11. Provavelmente, a formação
do subproduto 2-hidroxiestradiol em pH 7 e 11 está associada a estrogenicidade residual
das amostras ozonizadas nesses pH.
Assim, conclui-se que embora a ozonização tenha sido muito eficiente na
remoção do 17β-estradiol, alcançando remoções maiores do que 99,8%, não foi
suficiente para remover a atividade estrogênica do 17β-estradiol nos valores de pH 7 e
11, mesmo considerando as altas doses de ozônio aplicadas. Sabe-se que em
concentrações de ng.L
-1
desse DE são suficientes para causar efeitos em peixes e em
outros organismos, portanto, a remoção deve ser maior que a obtida nesse trabalho. A
ozonização do 17β-estradiol só foi eficiente na remoção de sua atividade estrogênica
para a ozonização em pH 3.
Por fim, este estudo confirma que para avaliar as remoções dos DE nos
tratamentos empregados, as análises químicas devem ser usadas em conjunto com
ensaios
in vitro ou/e in vivo que determinem os efeitos potencias dessas substâncias.
Pois, mesmo que esses tratamentos alcancem altíssimas remoções, podem não ser
211
totalmente eficiente na remoção desses micropoluentes nas baixíssimas concentrações
que são encontradas no meio ambiente e nos quais seus efeitos são observados.
212
VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACSH, 1999 “Endocrine Disrupters: A Scientific Perspective” American Council on
Science and Health,
pp. 1-36.
ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas). 1995. Água – Avaliação de
toxicidade crônica utilizando
Ceriodaphia dúbia Richard, 1984 (Cladocera,
Crustácea
). ABNT NBR 13373. Rio de Janeiro. 14p
ADAMS, C., ASCE, M., WANG, Y., et al., 2002 “Removal of Antibiotics from Surface
and Distilled Water in Conventional Water Treatment Processes”
Journal
Environmental Engineering
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ANEXO 4
Cromatogramas das Amostras Submetidas à Espectrometria de Massas
1. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
) ozonizadas
com uma dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L
-1
e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C)
pH 11.
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7759.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7762.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7765.D
(A)
(B)
(C)
264
2. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
) ozonizadas
com uma dosagem de ozônio consumido de 5,0 mg.L
-1
e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C)
pH 11.
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7760.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
5500000
6000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7763.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
5500000
Time-->
Abundance
TIC: AN7766.D
(B)
(C)
(A)
265
3. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
) ozonizadas
com uma dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L
-1
e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C) pH
11.
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7761.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7764.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
Time-->
Abundance
TIC: AN7767.D
(B)
(C)
(A)
266
4. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 1,0 mg.L
-1
) ozonizadas
com uma dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L
-1
e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C)
pH 11.
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8110.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8114.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
1e+07
Time-->
Abundance
TIC: AN8118.D
(A)
(B)
(C)
267
5. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 1,0 mg.L
-1
) ozonizadas
com uma dosagem de ozônio consumido de 5,0 mg.L
-1
e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C)
pH 11.
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8111.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8115.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8119.D
(A)
(B)
(C)
268
6. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 1,0 mg.L
-1
) ozonizadas
com uma dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L
-1
e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C) pH
11.
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
Time-->
Abundance
TIC: AN8112.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8116.D
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Time-->
Abundance
TIC: AN8120.D
(A)
(B)
(C)
269
ANEXO 6
Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas (C
17β-
estradiol
inicial = 50 µg.L
-1
), com diferentes dosagem de ozônio consumido e valores
de pH 3, 7 e 11.
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 7
50
µ
g.L
-1
de E
2
0,5 mg.L
-1
de O
3
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 11
50 µg.L
-1
de E
2
0,5 mg.L
-1
de O
3
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
272
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 3
50
µ
g.L
-1
de E
2
1,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
15 mg.L
-1
de O
3
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 11
50
µ
g.L
-1
de E
2
1,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
15 mg.L
-1
de O
3
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 7
50
µ
g.L
-1
de E
2
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
20 mg.L
-1
de O
3
35 mg.L
-1
de O
3
273
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 7
50
µ
g.L
-1
de E
2
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
20 mg.L
-1
de O
3
35 mg.L
-1
de O
3
200 220 240 260 280 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorbância
λ
(nm)
pH 7
50
µ
g.L
-1
de E
2
20 mg.L
-1
de O
3
60 mg.L
-1
de O
3
274
ANEXO 7
Atividade estrogênica das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, usadas sem
preparo prévio no ensaio YES
1. Curva dose-resposta do 17β-estradiol para esse ensaio YES
1E-7 1E-6 1E-5 1E-4
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
A
corrigido
Concentração (g.L
-1
)
17β-estradiol
2. Curva dose-resposta para as amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas no
pH 3
0,01 0,1 1
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
C
17
β
-estradiol
inicial = 10 µg.L
-1
e pH 3
A
corrigida
Fator de diluição
1,0 mg.L
-1
de O
3
5,0 mg.L
-1
de O
3
10 mg.L
-1
de O
3
275
3. Absorbância corrigida das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas nos
valores de pH 7 e 11
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
C
17
β
-estradiol
inicial = 10
µ
g.L
-1
, pH 7 e 11
A
corrigido
Fator de Diluição
Amostras com pH 7
Amostras com pH 11
276
Anexo 8
Cromatogramas obtido por CG das amostras aquosas de 17β-estradiol (C
17β-estradiol
inicial = 10µg.L
-1
) ozonizadas, preparadas com água ultrapura apirogênica.
1) Condições: pH 3 e dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L
-1
2) Condições: pH 3 e dosagem de ozônio consumido de 5,0 mg.L
-1
277
3) Condições: pH 3 e dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L
-1
4) Condições: pH 7e dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L
-1
278
5) Condições: pH 7e dosagem de ozônio consumido de 5,0 mg.L
-1
6) Condições: pH 7e dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L
-1
279
7) Condições: pH 11e dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L
-1
8) Condições: pH 11 e dosagem de ozônio consumido de 5,0 mg.L
-1
280
9) Condições: pH 11 e dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L
-1
281
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