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Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista - UNESP, para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas, Área de
Concentração: Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Gomes
Botucatu
2006
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SUMÁRIO
R
ESUMO
A
BSTRACT
L
ISTA DE
F
IGURAS
14
L
ISTA DE TABELAS
15
1.I
NTRODUÇÃO
17
2.O
BJETIVOS
25
3.M
ATERIAL E MÉTODOS
26
3.1 Material vegetal
26
3.1.1 Espécie utilizada
26
3.1.2 Coleta
26
3.1.3 Identificação
26
3.2 Obtenção e preparo dos extratos
28
3.2.1 Extrato etanólico bruto
28
3.2.2 Eliminação de clorofila
28
3.3 Perfil cromatográfico
29
3.4 Animais
30
3.5 Obtenção das suspensões celulares contendo mastócitos
30
3.5.1 Suspensão celular contendo mastócitos peritoneais de rato
30
3.5.2 Suspensão celular contendo mastócitos de pulmão de cobaia
31
3.5.3 Suspensão celular contendo mastócitos de bolsa jugal de hamster
31
3.6 Incubações das suspensões das suspensões celulares
32
3.6.1 Influência da concentração externa de cálcio
32
3.7 Pré-tratamento por via oral com extrato etanólico de Cordia verbenacea
33
3.8 Extração e dosagem automática de histamina
33
3.9 Apresentação dos resultados
34
3.9.1 Porcentagem de liberação de histamina
34
3.9.2 Inibição da liberação de histamina
34
3.10 Análise estatística
35
3.11 Drogas, reagentes e soluções utilizadas
35
3.11.1 Drogas
35
3.11.2 Reagentes
35
3.11.3 Soluções
36
3.11.4 Preparo das drogas utilizadas e do extrato de Cordia verbenacea
37
4.R
ESULTADOS
40
4.1 Curva concentração-efeito do extrato de Cordia verbenacea sobre a
liberação espontânea de histamina de mastócitos peritoneais de rato
40
4.2 Efeito do etanol (3,15 mg/mL) sobre a liberação espontânea de histamina
de mastócitos peritoneais de rato
41
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4.3 Conteúdo total de histamina de mastócitos peritoneais de rato nas
amostras contendo Cordia verbenacea (0,3 – 30 µ
µµ
µg/mL)
42
4.4 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (0,3- 30 µ
µµ
µg/mL) sobre a liberação de
histamina, induzida por ionóforo A23187, composto 48/80 ou concanavalina A
em mastócitos peritoneais de rato
43
4.5 Efeito do extrato de Cordia verbenacea 30 µ
µµ
µg/mL sobre a liberação
espontânea de histamina de mastócitos de pulmão de cobaia e de bolsa jugal
de hamster
44
4.6 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (0,3- 30 µ
µµ
µg/mL) sobre a liberação de
histamina, induzida por ionóforo A23187 (3 µ
µµ
µM) em mastócitos de pulmão de
cobaia
45
4.7 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (0,3-30 µ
µµ
µg/mL) sobre a liberação de
histamina, induzida por ionóforo A23187 ou concanavalina A em mastócitos
de bolsa jugal de hamster.
46
4.8 Influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação espontânea
de histamina de mastócitos peritoneais de rato na presença de Cordia
verbenacea (30 µ
µµ
µg/mL)
47
4.9 Influência da concentração externa de cálcio na liberação de histamina
induzida por composto 48/80, concanavalina A e ionóforo A23187 em
mastócitos peritoneais de rato
48
4.10 Influência da concentração externa de cálcio sobre o efeito inibitório de
Cordia verbenacea na secreção de mastócitos peritoneais de rato induzida por
ionóforo A23187, composto 48/80 ou concanavalina A
49
4.11 Comparação de efeito inibitório de cromoglicato de sódio (0,3-100 µ
µµ
µM),
quercetina (1-30 µ
µµ
µM), teofilina (0,3-100 µ
µµ
µM) e extrato de Cordia verbenacea
(0,3-30 µ
µµ
µg/mL) sobre a secreção de histamina induzida por ionóforo A23187
em mastócitos peritoneais de rato
50
4.12 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (30 µ
µµ
µg/mL) sobre a inibição
causada por cromoglicato de sódio (100 µ
µµ
µM), quercetina (3, 10 e 30 µ
µµ
µM) e
teofilina (3 e 10 µ
µµ
µM) na secreção de histamina induzida por 0,3 µ
µµ
µM de
ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais de rato
53
4.13 Efeito do pré-tratamento (gavagem) com extrato de Cordia verbenacea
(300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
de histamina, induzida in vitro por ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais
de rato
55
4.14. Efeito do pré-tratamento (gavagem) com extrato de Cordia verbenacea
(300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
de histamina, induzida in vitro por composto 48/80 em mastócitos peritoneais
de rato
56
4.15. Efeito do pré-tratamento (gavagem) com extrato de Cordia verbenacea
(300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
de histamina, induzida in vitro por concanavalina A em mastócitos peritoneais
de rato
57
5.
D
ISCUSSÃO
58
6.
C
ONCLUSÃO
64
7.
R
EFERÊNCIAS
65
1. Introdução
A
S PLANTAS MEDICINAIS TEM SIDO TRADICIONALMENTE USADAS PELA
POPULAÇÃO COMO TRATAMENTO ALTERNATIVO DE PROBLEMAS DE SAÚDE EM
PAÍSES EM DESENVOLVIMENTO
,
PRINCIPALMENTE OS QUE POSSUEM RICA
BIODIVERSIDADE
,
COMO É O CASO DO
B
RASIL
.
A
DIVERSIDADE DA FLORA BRASILEIRA ABRANGE PRINCIPALMENTE ÁREAS
COMO CERRADO
,
MATA ATLÂNTICA E FLORESTA AMAZÔNICA
,
E FAZ COM QUE O
PAÍS OCUPE UMA POSIÇÃO DE DESTAQUE NA EXPLORAÇÃO E
DESENVOLVIMENTO DE NOVAS SUBSTÂNCIAS PROVENIENTES DE FONTES
NATURAIS QUE POSSUAM POTENCIAL TERAPÊUTICO
,
VISTO QUE
,
OS PRODUTOS
NATURAIS E DERIVADOS SÃO A FONTE MAIS COMUM DE OBTENÇÃO DE DROGAS
NO MUNDO
,
REPRESENTANDO MAIS DE
30%
DO MERCADO FARMACÊUTICO
MUNDIAL
.
A
LÉM DISSO
,
SEGUNDO A
O
RGANIZAÇÃO
M
UNDIAL DA
S
AÚDE
(OMS),
APROXIMADAMENTE
25%
DAS DROGAS PRESCRITAS NO MUNDO FORAM
EXTRAÍDAS DE PLANTAS
(RATES
ET AL
.,
2001;
BASSO
ET AL
.,
2005).
Tem sido amplamente demonstrado que compostos derivados de plantas possuem
significante efeito anti-inflamatório, por esta razão estes compostos representam potencial
molecular para o desenvolvimento de novas drogas, especialmente designadas para o
tratamento e ou controle de estados inflamatórios crônicos tais como, doenças
inflamatórias intestinais, reumatismo, asma, entre outras (CALIXTO et al.,2004).
Muitos extratos e óleos essenciais obtidos de plantas medicinais
brasileiras utilizadas pela população no tratamento de diversas enfermidades
possuem atividade biológica comprovada tanto in vitro como in vivo, contra
doenças infecciosas, câncer, doenças inflamatórias, doenças imunológicas,
incluindo doenças alérgicas (BASSO et al., 2005; DUARTE et al., 2005).
A ocorrência de desordens alérgicas como rinite, asma, conjuntivite,
dermatite atópica, alergias alimentares e os gravíssimos choques anafiláticos,
vem crescendo mundialmente nos últimos anos. Estima-se que 30% da
população mundial seja acometida por alergias, e 35 % da população brasileira,
cerca de 66 milhões de pessoas, têm doenças alérgicas, sendo a asma a quinta
principal causa de internação no Sistema Único de Saúde (SUS), consumindo
parcela importante dos recursos financeiros destinados à saúde. (Ministério da
Saúde, 2006).
Princípios ativos contra os sintomas das doenças alérgicas como a asma,
já foram identificados em algumas plantas da flora brasileira, como a Mikania
glomerata Sprengel (Compositae), conhecida como “guaco”, que possue ação
brocodilatadora e é eficaz em inibir a inflamação de origem imunológica
(FIERRO et al., 1999; SOARES DE MOURA et al., 2002). O extrato hidro-
alcoólico de Drymes winteri (casca de anta) demostrou claro efeito anti-
inflamatório e anti-alérgico, confirmando o uso medicinal da planta para o
tratamento de doenças inflamatórioas das vias áreas (TRATSK et al.,1997).
A Cordia verbenacea D.C. (Boraginaceae), conhecida popularmente
como “erva baleeira”, é uma espécie perene, nativa da América do Sul,
amplamente distribuída por toda região tropical do Novo Mundo, ocorrendo em
toda costa litorânea brasileira desde a Amazônia ao Rio Grande do Sul, bem
como em diversas áreas tropicais e subtropicais da Ásia, África, Austrália,
Guiana e América Central (RANGA & DA SILVA, 2002, BAYEUX et al.,
2002). No Brasil tem sido identificada como Cordia verbenacea D.C., mas de
acordo com SMITH (1970) e TARODA & GIBBS (1986), este binômio é
sinônimo de Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult.
O extrato das partes aéreas da planta possui indicação etnofarmacológica
para diversas enfermidades, como no tratamento da gripe e pneumonia, doenças
parasitárias, doenças articulares e como analgésico e cicatrizante, mas
principalmente é utilizado no tratamento de processos inflamatórios (AKISUE et
al., 1983; BARRET et al., 1998; FICARRA et al., 1995).
Pesquisas vêm sendo realizadas para investigar as atividades
farmacológicas e toxicidade de Cordia verbenacea, através da utilização de
diversas partes da planta, sendo mais comumente relatado na literatura estudos
utilizando o extrato bruto ou frações e o óleo essencial provenientes das folhas,
bem como a utilização de componentes químicos já isolados da planta (SERTIÉ
et al., 1988; SERTIÉ et al., 1990; OLIVEIRA et al., 1998; DE CARVALHO
JÚNIOR. et al., 2004).
Estudos relatam atividade antimicrobiana do óleo essencial extraído de
folhas de Cordia verbenacea contra bactérias gram-positivas (DE CARVALHO
JÚNIOR. et al., 2004). Cordiaquinonas isoladas a partir de raízes de Cordia
verbenacea demostraram atividade anti-fúngica contra Cladosporium
cucumerium, Candida albicans e toxicidade contra larvas do mosquito Aedes
aegypte (IOSET et al., 2000).
O extrato metanolíco de folhas de C. verbenacea apresentou atividade
anti-ofídica, contra o veneno de Bothrops jararacussu inibindo a miotoxicidade
e o edema de pata em camundongos. A atividade anti-ofídica foi atribuída ao
ácido rosmarínico, composto posteriormente isolado e testado no mesmo modelo
(TICLI et al., 2005).
Foram comprovadas as atividades anti-ulcerogênica, anti-inflamatória e
cicatrizante do extrato etanólico das folhas de C. verbenacea, administrado tanto
por via oral como por via tópica, em modelos in vivo; assim como a baixa
toxicidade em ratos (SERTIÉ et al., 1988; BASILE et al., 1989; SERTIÉ et al.,
1990; SÉRTIE et al., 1991; SERTIÉ et al., 2005).
O extrato diclorometano bruto apresentou alta atividade anti-inflamatória
em diversos modelos de indução de edema de pata em camundongos
(BAYEUX, et al., 2002). No modelo experimental de inflamação aguda de
edema induzido por carragenina, bem como nos modelos de granuloma de
pellets de algodão e permeabilidade vascular em resposta a histamina em ratos,
o extrato bruto de folhas de C. verbenacea apresentou marcado efeito anti-
inflamatório, sendo consistente com o uso popular da planta (SERTIÉ et al.,
1988). Além disso, foi desenvolvido um fitoterápico com ação anti-inflamatória
e de uso tópico a partir de princípios ativos isolados do óleo essencial da planta
(PIANOWSKY, 2005).
Em virtude da importância das doenças alérgicas no contexto mundial, cada vez mais vêm se estudando alternativas no tratamento destas
afecções. Desta forma, plantas medicinais com indicação na medicina popular para tratamento problemas alérgicos ou com atividade
anti-inflamatória, vêm sendo investigadas de modo a comprovar cientificamente seus efeitos e abrir caminho para o desenvolvimento de
novos compostos terapêuticos (BIERLORY, 2004).
Entretanto a dificuldade no diagnóstico etiológico e a complexidade dos
mecanismos fisiopatológicos envolvidos acabam sendo problemas no combate a alergia,
restando na maioria das vezes o tratamento sintomático através da utilização de fármacos,
principalmente glicocorticóides, anti-histamínicos, inibidores de leucotrienos, xantinas,
agonistas beta-adrenérgicos, anticolinérgicos e agentes estabilizadores de mastócitos
(NAGAI et al., 2006).
Os mastócitos são células efetoras chaves em alergias e têm sido observada a presença destes em todos os vertebrados, como anfíbios,
répteis, algumas famílias de peixes, pássaros e mamíferos (ROCHA et al., 2006). Estas células são derivadas de precursores
pluriponteciais na medula óssea e ganham a circulação como células imaturas, migrando a partir daí para os tecidos onde amadurecem,
residem e desenvolvem suas funções (METCALFE et al., 1997).
Os mastócitos estão amplamente distribuídos no organismo, sendo encontrados
principalmente em tecido conjuntivo e mucosas, mais freqüentemente dispostos em regiões
que são expostas ao ambiente externo, particularmente no tecido subepitelial da pele, nos
tratos gastrointestinal, respiratório e genito-urinário, são encontrados também no espaço
perivascular e em associação a fibras nervosas periféricas (METCALFE et al., 2006).
Algumas espécies contém grande quantidade de mastócitos em cápsulas fibrosas de órgãos
e fluído peritoneal, como por exemplo o rato (GALLI et al., 1990). Desta forma, os
mastócitos estão estrategicamente dispostos como células primordiais nas defesas contra
parasitas, microorganismos e agentes causadores de alergias. Em determinadas condições
orgânicas como em estados patológicos, podem estar em número aumentado no tecido
envolvido (CHANG & SHIUNG, 2006).
Além disso, apesar de possuírem muitas características em comum, os mastócitos não
representam uma população celular homogênea (METCALFE et al., 1997). Estas células
diferem quanto à localização anatômica, quanto às características morfológicas, como
tamanho e ultraestrutura dos grânulos citoplasmáticos, propriedades imunohistoquímicas e
exibem diferenças funcionais em relação à sensibilidade a estímulos secretores e
susceptibilidade à drogas (MARONE et al., 1997). Baseado em diferenças fenotípicas
estão historicamente classificados em subtipos, de acordo com o tipo de proteases neutras
presentes em seus grânulos, como por exemplo mastócitos que contém apenas triptase,
encontrados em tecido conjuntivo, como os da pele e cavidade peritoneal, e mastócitos que
contém tanto triptase quanto quimase, presentes em mucosas como mucosa intestinal e
bronquial (CHURCH & LEVI-SCHAFFER, 1997).
A participação dos mastócitos nos processos alérgicos se dá através da secreção uma série de mediadores pró-inflamatórios liberados
após a ativação destas células, e incluem mediadores pré-formados em grânulos citoplasmáticos, mediadores neo-sintetizados a partir de
lipídios da membrana celular e citocinas (CHURCH & LEVI-SCHAFFER, 1997). Dentre os mediadores pré-formados está a histamina,
amina vasoativa e espasmogênica, grande responsável por algumas alterações observadas nas reações de hipersensibilidade tipo I,
proteases neutras, proteoglicanos, fatores quimiotáxicos e diversas citocinas. Como mediadores neo-sintetizados encontram-se
prostaglandinas, como PGD2 e leucotrienos, sustâncias com capacidade brococonstritora, recrutadora celular e vasoativas (KIM et al.,
2005; WILLIAMS & GALLI, 2000).
Os mastócitos podem ser ativados tanto por estímulos imunológicos como não
imunológicos. A estimulação imunológica, considerada não citotóxica, ocorre através da
interação de um antígeno multivalente, denominado alérgeno, com a imunoglobulina E
(IgE) ligada a superfície da membrana celular de mastócitos através de receptores de alta
afinidade (FcεRI), levando a ativação dos mastócitos através de uma típica reação
antígeno-anticorpo. Ocasionalmente estas células podem ser ativadas também pela IgG
através de expressão de receptores com afinidade para tal imunoglobulina (FcγRII) ou
ainda por anafilotoxinas (METCALFE et al., 1997).
Embora a sinalização molecular envolvendo o receptor FcεRI seja o mecanismo melhor
compreendido na ativação de mastócitos, há uma variedade de mecanismos adicionais
envolvidos no evento, como a participação de receptores acoplados a família G, o
envolvimento de proteínas kinases ativadoras de mitose (MAPKs) e ativação de genes
codificadores de citocinas e quimoquinas (BANSAL et al., 2004; VINES & PROSSNITZ,
2004; RIVERA et al., 2006).
Fatores não imunológicos tais como estímulos químicos, físicos ou extremos de temperatura e pH, envolvem diferentes interações com a
membrana celular de mastócitos, podendo atuar na ativação celular tanto por mecanismos citotóxicos como por não citotóxicos (GALLI,
1993). Os agentes citotóxicos agem através da lise da membrana plasmática, liberando todo o conteúdo intracelular, neste grupo
incluem-se: os detergentes, estímulos físicos - energia térmica, mecânica ou radiante (GALLI, 1990).
Venenos de insetos, neuropeptídeos, relaxantes musculares, opioídes e algumas substâncias
químicas como o composto 48/80 e o ionóforo de cálcio A23187 são agentes secretores
não citotóxicos comumente utilizados no estudo da secreção de mastócitos. Algumas
lectinas de plantas (concanavalina A) também são capazes de promover estimulação dessas
células em várias espécies animais por mecanismos não citotóxicos (GALLI et al., 1990;
FERREIRA et al., 1996; WANG et al., 2005).
Morfologicamente, a ativação não citotóxica produzida por estímulos imunológicos e não
imunológicos parecem similares, entretanto, os processos bioquímicos que culminam na
liberação dos mediadores podem ser diferentes (METCALFE et al., 1997).
Embora possa ocorrer exocitose de mediadores independente de cálcio
(Ca
2+
), em geral, o processo requer aumento de sua concentração intracelular, a
qual após o estímulo secretor, ocorre através da mobilização do íon a partir de
organelas celulares como retículo endoplasmático e mitocôndria, além da
mobilização de Ca
2+
do meio extracelular (CHANG & SHIUNG, 2006). O
aumento da concentração interna de cálcio está relacionado com a ação de
fosfolipases, proteina kinase C, calmodulina e adenilato ciclase que controla os
níveis de AMPcíclico (TASAKA, 1991; KIM et al., 2005).
As alterações mais comuns observadas nas alergias perante as ações de mediadores
liberados são características de processo inflamatório. Na dependência do agente causador,
da via de exposição e da espécie animal, ocorre: prurido, aumento da permeabilidade
vascular, edema tecidual, vasodilatação, broncoconstrição, secreção de muco e variados
graus de inflamação. Freqüentemente os mediadores agem de maneira sobreposta, de modo
que, o bloqueio de apenas um ou outro mediador não previne ou extermina todas as
alterações observadas (METCALFE et al., 2006).
O amplo envolvimento de mastócitos nas desordens alérgicas levou
naturalmente ao desenvolvimento de drogas anti-alérgicas que suprissem a
secreção dos mesmos, porém o extenso envolvimento de diversos mediadores
bioquímicos no processo fisiopatológico da alergia e a heterogeneidade destas
células dificultam o desenvolvimento de novos agentes capazes de inibir sua
secreção de forma ampla (PEARCE et al., 1986). Além do que, as drogas
inibidoras da secreção de mastócitos apresentam diferenças quanto à eficácia
(MANCEL et al., 1999).
Em virtude destes fatores, cada vez mais vem se buscando substâncias
alternativas com ação mais ampla e eficaz sobre a exocitose de mediadores
mastocitários, sendo que um grande número de substâncias naturais como
extrato de plantas medicinais e compostos isolados destes, tem sido
identificados como possíveis candidatos a agentes inibidores da secreção de
mastócitos (CHANG & SHIUNG, 2006).
O extrato de Anchietia salutaris (St. Hil.) (Violacea), planta brasileira
com indicação popular contra alergias, conhecida popularmente como “cipó-
suma”, apresentou atividade inibidora da secreção de mastócitos peritoneais de
rato, de pulmão e coração de cobaia (in vitro e in vivo) (GOMES et al., 1994),
tendo sido observado da mesma forma que, os princípios ativos de Caesalpinia
ferrea (Mart.) (Leguminosae) conhecida como “pau-ferro”, são capazes de inibir
a secreção de mastócitos peritoneais de rato, pulmão de cobaia e bolsa jugal de
hamster (FERREIRA et al., 1996).
Apesar dos variados relatos sobre os efeitos de Cordia verbenacea,
principalmente em relação ao efeito anti-inflamatório e do fato de que princípios
ativos isolados desta já estão sendo utilizados como agentes terapêuticos, nada
foi encontrado na literatura a respeito de alguma atividade de C. verbenacea
sobre a secreção de mastócitos, despertando assim o interesse em verificar se o
extrato desta planta apresenta efeito inibitório sobre secreção e, por conseguinte,
qual a pontencialidade deste efeito, utilizando para este estudo suspensões
celulares contendo mastócitos de diferentes espécies animais e tecidos.
2. O
BJETIVOS
O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do extrato etanólico
de folhas de Cordia verbenacea sobre a secreção de mastócitos in vitro em
diferentes espécies animais, considerando:
O efeito direto sobre a secreção espontânea;
A heterogeneidade funcional de mastócitos;
O efeito sobre a secreção induzida por diferentes agentes secretores;
A influência da concentração externa de cálcio;
Comparação com drogas inibidoras da secreção de mastócitos;
O efeito do pré-tratamento por administração do extrato por via oral.
3. M
ATERIAL E
M
ÉTODOS
3.1 Material Vegetal
3.1.1 Espécie utilizada
Utilizou-se o extrato etanólico bruto de folhas da espécie Cordia
verbenacea D.C. (Boraginaceae) (figura 1). Planta aromática, de crescimento
arbustivo e ereto, medindo cerca de 1,5-2,5m de altura, ramificada, apresentando
ramos pendentes e puberulentos; folhas simples com formas variadas de
lanceoladas, ovado-lanceoladas a oblongo-elípticas, apresentando margens
serruladas, superfície superior geralmente glabra, tuberculada; inflorescência em
espiga densa, internodal ou terminal com flores amarelo-esbranquiçadas; frutos
cônicos, vermelhos quando maduros, com cerca de 5 mm de diâmetro. Propaga-
se por sementes (Adaptado de RANGA & DA SILVA, 2002).
3.1.2 Coleta
O material vegetal foi obtido por meio de duas coletas, uma realizada no
mês de junho de 2004 no município de Ubatuba (Coletor
:
Cássio Pontes
Octaviani) e outra no mês de janeiro de 2006 no município de Registro (Coletor:
Wagner Portilho), ambos localizados em região de Mata Atlântica, no Estado de
São Paulo.
Posteriormente, o material foi armazenado em sacos plásticos para evitar
desidratação durante o transporte. Amostras representativas da espécie (parte
vegetativa + reprodutiva), foram selecionadas para preparação de exsicatas.
3.1.3 Identificação
O material vegetal fértil foi autenticado pela especialista Drª.Neusa
Taroda Ranga, professora. do Departamento de Zoologia e Botânica do Instituto
de Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP, São José do Rio Preto, São
Paulo, onde o material foi depositado sob o número: SJRP 28117.
3.2 Obtenção e preparo dos extratos
3.2.1 Extrato etanólico bruto
As folhas foram separadas das demais partes da planta e secas em estufa
com circulação e renovação de ar forçado à 100
0
C durante 24 horas e em
seguida à 50
0
C durante 72 horas. Uma amostra contendo 10 gramas das folhas
foi desidratada em separado, para cálculo de rendimento (peso seco/peso úmido
= 23,2 %). Após secagem, as folhas foram pulverizadas em moinho de facas e
pesadas rendendo 640g de material, o qual
acondicionado em frascos de vidro e
submetido à extração etanólica por maceração a frio, utilizando etanol absoluto.
Os frascos foram abrigados da luz e mantidos em câmara fria à 4
0
C por 72
horas.
O material foi filtrado em tecido e o resíduo da planta foi submetido a 3
extrações até obter esgotamento do material vegetal. O filtrado total de todas as
extrações (3,1850 mL) foi submetido à concentração com auxílio de evaporador
rotativo à 50
0
C até 20% do volume total.
Sobre este extrato concentrado foi
realizada a retirada de clorofila do extrato.
3.2.2 Eliminação de clorofila
O extrato etanólico concentrado de folhas de Cordia verbenacea foi
submetido ao procedimento sistemático de eliminação de clorofilas proposta por
QUEIROZ PAULO (1983) e adaptado por FERRI (1996). Esse procedimento
baseia-se no gotejamento de água, com auxílio de uma bureta, sobre o extrato
etanólico em constante agitação (agitador magnético), até a obtenção de uma
solução etanol-água 7:3. Ao término do gotejamento, essa solução foi mantida à
baixa temperatura (câmara fria) por um período de 24 horas. Após esse período,
a solução foi filtrada sobre Celite e em sistema de vácuo, obtendo-se um resíduo
precipitado rico em clorofila e um extrato etanólico livre de clorofila.
O extrato
livre de clorofila foi novamente levado ao evaporador rotativo à temperatura de
40ºC, para a retirada completa do solvente e a posterior utilização do mesmo nos
experimentos.
Ao retirar todo o etanol do extrato, este se dividiu em duas
porções, parte aquosa e parte sólida (rendimento: 3,6 %), sendo a parte sólida
utilizada no presente estudo.
3.3 Perfil cromatográfico
O perfil cromatográfico dos extratos obtidos a partir do material
proveniente das coletas de junho de 2004 e janeiro de 2006, foi determinado de
acordo com a técnica clássica de cromatografia em camada delgada (CCD)
(LOPES, 1990; WAGNER & BLADT, 1995; FERRI, 1996).
As cromatoplacas (20 cm comprimento x 10 cm largura e 0,3 mm de
espessura) foram preparadas por espalhamento, utilizando sílica gel (SiO
2
) 60FG
como fase estacionária. Posteriormente, foram ativadas em estufa à 100º C
durante uma hora. Amostras dos dois extratos foram aplicadas na cromatoplaca
com auxílio de capilares. Os cromatogramas foram obtidos utilizando-se
hexano/acetato de etila (fase móvel) na proporção de 7:3 e o reagente
anisaldeído sulfúrico, como revelador. Ambos os extratos demostraram perfil
cromatográfico semelhante o que permitiu a utilização dos dois extratos nos
testes realizados.
3.4 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 180 e 200g e cobaias
Dunkin-Hartley machos pesando entre 280 e 350g, ambas as espécies foram
fornecidas pelo Biotério Central da UNESP-Botucatu e hamsters sírio machos
pesando entre 80 e 120g, comprados do Centro de Bioterismo da Faculdade de
Medicina da USP. Os animais foram transferidos para o Biotério do
Departamento de Farmacologia, do Instituto de Biociências da UNESP -
Botucatu, onde foram mantidos sob condições controladas de temperatura,
luminosidade e umidade, com livre acesso à água e alimentação até o momento
da realização do procedimento experimental.
Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal (CEEA), do Instituto de Biociências da UNESP de
Botucatu, protocolo n
o
048/05-CEAA.
3.5 Obtenção das suspensões celulares contendo mastócitos
Para obtenção das suspensões celulares contendo mastócitos, os animais
foram mortos por secção dos grandes vasos cervicais e coluna vertebral, após
terem sido previamente anestesiados por inalação de éter etílico em capela de
exaustão. A técnica de obtenção de suspensão celular foi realizada conforme a
origem dos mastócitos.
3.5.1 Suspensão celular contendo mastócitos peritoneais de rato
Após a morte dos animais, a suspensão celular contendo mastócitos
peritoneais foi obtida por lavagem direta da cavidade peritoneal utilizando-se
solução de Tyrode contendo heparina (5 unidades/mL). Em seguida, foi filtrada
em gaze dupla umedecida com Tyrode. As células foram recuperadas por
centrifugação (22
0
C, 1000 rpm, 5 minutos) e lavadas duas vezes em 12 mL de
Tyrode (22
0
C, 1000 rpm, 5 minutos). Posteriormente, as células foram
ressuspensas em volume necessário para a realização do protocolo experimental.
3.5.2 Suspensão celular contendo mastócitos de pulmão de cobaia.
Após a morte dos animais, os pulmões foram removidos rapidamente e
lavados externamente com solução de Tyrode, o excesso de tampão foi retirado
com papel de filtro e o órgão foi picado em pedaços de aproximadamente 1mm
3
.
Em seguida foi incubado a 37
0
C por 90 minutos sob agitação constante em 12,5
mL de solução de Tyrode-Hepes contendo colagenase tipo IA (160
unidades/mL), suplementado com soro albumina bovina. Durante este período, o
meio foi mantido sob aeração constante com uma mistura carbogênica (95% de
oxigênio e 5% de dióxido de carbono).
Ao final da incubação, o tecido foi passado sob pressão em seringa por
aproximadamente 10 vezes consecutivas, para ruptura das fibras. A suspensão
resultante foi filtrada em gaze dupla umedecida com Tyrode. As células foram
recuperadas por centrifugação (4
0
C, 1000rpm, 5 minutos) e lavadas uma vez em
12 mL de Tyrode a 4
0
C contendo soro albumina bovina a 0,05% e uma vez em
Tyrode a 4
0
C. Posteriormente, as células foram ressuspensas em volume
necessário para a realização do protocolo experimental.
3.5.3 Suspensão celular contendo mastócitos de bolsa jugal de hamster.
Após a morte dos animais, as bolsas jugais (direita e esquerda) foram
rapidamente seccionadas em suas bases, retiradas com auxílio de pinça, lavadas
várias vezes com solução de Tyrode e após a retirada do excesso de tampão com
papel filtro, os órgãos foram picados em pedaços de aproximadamente 1mm
3
e
submetidos ao mesmo procedimento descrito no item 3.5.2.
3.6 Incubações das suspensões das suspensões celulares
O volume final de suspensão celular obtido foi pré-incubado à 37ºC por 5
minutos, para a uniformização da temperatura, e dividido em tubos de ensaio em
alíquotas de 0,5 mL para cada amostra experimental. Em cada amostra, foi
adicionado o extrato e/ou outras soluções, com exceção de duas amostras
reservadas para a dosagem da liberação espontânea de histamina, utilizadas
como controle e uma amostra utilizada para dosagem de histamina total.
Amostras foram incubadas por 10 minutos, para verificação do efeito
direto do extrato sobre a liberação de histamina e as demais amostras, após a
pré-incubação por 10 minutos, receberam os agentes estimuladores da secreção
de mastócitos e em seguida procedida incubação por 10 minutos. Após este
período a reação foi bloqueada pela adição de 1mL de Tyrode a 4°C. Em
seguida, foram centrifugadas (4°C, 1000 rpm, 10 min) e o sobrenadante
separado do precipitado por decantação. A este último, foi adicionado 1,5mL de
Tyrode. Finalmente, todas as amostras, precipitado e sobrenadante, receberam
50 µL de ácido perclórico 11,6N (concentração final 0,4N) para precipitação de
proteínas.
3.6.1 Influência da concentração externa de cálcio
Alíquotas de 0,5 mL da suspensão celular contendo mastócitos peritoneais
de rato foram pré-incubadas à 37°C por 5 minutos, para uniformização da
temperatura na presença de 1, 3 e 10 mM
de cálcio
.
Posteriormente, realizou-se
o mesmo procedimento experimental descrito anteriormente.
3.7 Pré-tratamento por via oral com extrato etanólico de Cordia verbenacea.
Foram utilizados ratos Wistar os quais foram submetidos à 12 horas de
jejum e posteriormente foram tratados com extrato de Cordia verbenacea na
dose de 300mg/Kg, por gavagem, uma vez ao dia durante dois dias, e mortos
seis horas após a última administração. Em seguida, foi realizada a técnica para
obtenção de suspensão celular contendo mastócitos peritoneais, como descrito
no item 3.5.1. e a suspensão celular obtida foi desafiada com os agentes
estimuladores da secreção de mastócitos durante a incubação celular procedida
conforme descrito nos item 3.6 e 3.6.1.
3.8 Extração e dosagem automática de histamina
Para dosagem e extração automática de histamina foi utilizado o
método fluorométrico de SHORE et al. (1959), realizado através de um
sistema de fluxo contínuo modular automático (SIRAGANIAN, 1974).
Brevemente, as amostras contendo histamina, são submetidas à extração
butanólica após adição de NaOH 2N saturado com NaCl, formando duas fases:
aquosa e orgânica. A fase aquosa é desprezada e à fase orgânica, é adicionado
NaOH 0,1N saturado com NaCl para remover resíduos orgânicos, formando
novamente uma fase orgânica e outra aquosa; após a extração, esta última é
desprezada. É adicionado então HCl 0,1N na fase orgânica. Após a extração a
fase orgânica é desprezada, ficando a histamina extraída na fase aquosa ácida.
Em seguida, a histamina é condensada com ortoftaldialdeído (OPT) em solução
fortemente alcalina. O resultado é um produto fluorescente, estabilizado por
acidificação com HCl 3N. A intensidade de fluorescência é registrada em papel
na forma de picos, medidos para o cálculo de porcentagens de histamina
liberada.
3.9 Apresentação dos resultados
3.9.1 Porcentagem de liberação de histamina
Os resultados são expressos em porcentagem média de liberação de
histamina (% LH) em relação ao total de histamina liberada, com seus
respectivos erros-padrão (EPM). Todos os resultados são apresentados
descontando-se a histamina liberada espontaneamente.
Cálculo:
% LH= S.100/T
S= comprimento do pico sobrenadante
P= comprimento do pico precipitado
T= soma dos comprimentos dos picos (S+P)
3.9.2 Inibição da liberação de histamina
Os resultados sobre o efeito inibitório da liberação de histamina são apresentados em porcentagem média de inibição da
liberação de histamina (% Inibição) com seus respectivos erros-padrão (EPM).
Cálculo:
% Inibição = 100- (L/A). 100
L= % liberação histamina do extrato + agente secretor
A= % liberação histamina do agente secretor
3.10 Análise estatística
Para comparação dos resultados obtidos, foi realizado o teste paramétrico de análise de variância (ANOVA) seguido do teste
de comparações múltiplas de Tukey-Kramer, para detectar médias estatisticamente diferentes. As diferenças entre as médias foram
consideradas significantes quando a probabilidade de erro foi menor do que 5%. Para a avaliação estatística foi utilizado o programa
INSTAT 3.0 (GraphPad Software).
Para os dados cujas comparações foram feitas apenas entre duas amostras, foi utilizado o Teste t de Student, sendo da mesma
forma consideradas significantes, as diferenças entre médias cuja probabilidade de erro foi menor do que 5%.
3.11 Drogas, reagentes e soluções utilizadas
3.11.1 Drogas
colagenase tipo IA (Sigma)
concanavalina A (Sigma)
composto 48/80 (Sigma)
cromoglicato de sódio (Fisons)
ionóforo A23187 (Sigma)
quercetina (Sigma)
soro albumina bovina (Sigma)
teofilina (Sigma)
3.11.2 Reagentes
álcool butílico (Vetec)
ácido clorídrico (Vetec)
ácido perclórico (Merck)
cloreto de cálcio diidratado (Merck)
cloreto de potássio (Merck)
cloreto de sódio (Synth)
dimetilsufóxido –DMSO (Merck)
glicose (Inlab)
heparina (Liquemine)
HEPES (Sigma)
heptano (Synth)
hidróxido de sódio (Synth)
metanol (Merck)
ortoftaldialdeído- OPT (Sigma)
triton X-450 (Sigma)
3.11.3 Soluções
Tyrode
SAIS CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl 137,0
CLORETOS
KCl 2,7
CaCl
2
1,0
TAMPÃO
NaH
2
PO
4
0,4
NaHCO
3
11,9
Glicose 5,6
Soluções de cloretos e tampão foram preparadas 20 vezes mais concentradas, armazenadas em geladeira. No início do
experimento, as soluções foram diluídas em água destilada e adicionou-se glicose. O pH foi ajustado para 7,3 – 7,4 através de aeração
com mistura de oxigênio (95%) e dióxido de carbono (5%) por 7 a 10 minutos.
Tyrode – HEPES
SAIS CONCENTRAÇÃO (mM)
NaCl 137,0
KCl 2,7
CaCl
2
1,0
NaH
2
PO
4
H
2
O
0,4
HEPES 10,0
Glicose 5,6
Soro albumina bovina (0,1%) e colagenase tipo IA (160 unidades/mL) foram adicionadas à solução após o pH da
mesma ser ajustado para 7,3 – 7,4 pela adição de NaOH 4N.
3.11.4 Preparo das drogas utilizadas e do extrato de Cordia verbenacea
Extrato de Cordia verbenacea
O extrato foi dissolvido para a concentração de 300µg/mL, no momento do uso, em uma solução contendo etanol e água
destilada na proporção 1:3 e posteriormente, foi diluído em água destilada nas demais concentrações utilizadas para realização da curva
concentração-efeito in vitro.
Para utilização in vivo, o extrato foi diluído no momento do uso em uma
solução hidro-alcoólica conteno16% de etanol.
Cloreto de cálcio
O cloreto de cálcio foi dissolvido em água destilada para as concentrações
de 3 e 10mM. Estas soluções foram armazenadas em geladeira.
Composto 48/80
O composto 48/80 foi dissolvido em água destilada para a concentração
desejada. Estas soluções foram aliquotadas e armazenadas (-18°C).
Concanavalina A
A concanavalina A foi dissolvida em solução salina (NaCl 0,9%) na
concentração de 100µg/mL, aliquotadas e armazenadas (-18
o
C).
Ionóforo A23187
Foi inicialmente preparada uma solução-mãe de ionóforo A23187 (1000 µM) dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) a qual
posteriormente foi diluída em água destilada para as concentrações desejadas (0,3 e 3µM). Estas soluções foram aliquotadas e armazenadas (-
18°C).
Cromoglicato de sódio
O cromoglicato de sódio foi dissolvido, no momento do uso, em água destilada na
concentração de 100 µM e, posteriormente diluído para as demais concentrações desejadas.
Quercetina
A quercetina foi dissolvida no momento do uso, em uma solução
contendo etanol e água destilada na proporção de 1:3, para a concentração de 30
µM e posteriormente, diluída para as demais concentrações desejadas.
Teofilina
A Teofilina foi dissolvida no momento do uso em água destilada na
concentração de 100 µM e posteriormente, diluída para as demais concentrações
desejadas.
4. Resultados
4.1 Curva concentração-efeito do extrato de Cordia verbenacea sobre a
liberação espontânea de histamina de mastócitos peritoneais de rato.
A curva concentração-efeito foi realizada com o objetivo de selecionar as
maiores concentrações de Cordia verbenacea que não interferissem com a
liberação espontânea de histamina, para serem utilizadas em testes posteriores.
As concentrações de 100 e 300 µg/mL promoveram liberação de histamina, já as
demais concentrações não; sendo assim, foram selecionadas as concentrações de
0,3 a 30µg/mL (tabela 1).
Tabela 1: Efeito de Cordia verbenacea nas concentrações 0,3; 1; 3; 10; 30; 100; 300
µ
µµ
µg/mL sobre a liberação de histamina espontânea (Esp) de mastócitos peritoneais de
rato.
C. verbenacea
( µg/mL)
% de liberação de
histamina
( Média ± EPM)
Esp
11,3 ± 0,6
0,3
11,6 ± 0,5
1
13,5 ± 0,9
3
10,9 ± 1,2
10
13,8 ± 2,5
30
16,1 ± 1,9
100
41,2 ± 3,6*
300
87,2 ± 0,9*
Os dados representam as médias e os respectivos erros-padrão
(EPM)
de 7 experimentos
* indica médias estatisticamente diferentes quando comparadas
com a
liberação espontânea de histamina. (ANOVA-Tukey-Kramer
p<0,05).
4.2 Efeito do etanol (3,15 mg/mL) sobre a liberação espontânea de
histamina de mastócitos peritoneais de rato.
Para diluição do extrato à 30 µg/mL, foi utilizado como solvente uma
solução de etanol e água destilada, na proporção de 1:3, o que corresponde a
concentração de 3,15 mg/mL de etanol na amostra de suspensão celular
contendo mastócitos. O etanol nesta concentração, não alterou a liberação
espontânea de histamina (tabela 2).
Tabela 2: Efeito do etanol (3,15mg/mL) sobre a liberação espontânea (Esp) de
histamina em mastócitos peritoneais de rato.
Os dados representam as médias e os respectivos erros-padrão (EPM)
de 7 a 8 experimentos. Teste t de Student p>0,05.
% de liberação de histamina
( Média ± EPM)
Esp Etanol
11,6 ± 0,6 13,3 ± 1,2
4.3 Conteúdo total de histamina de mastócitos peritoneais de rato nas
amostras contendo Cordia verbenacea (0,3 – 30 µ
µµ
µg/mL).
A análise do conteúdo total de histamina das amostras de células na
presença do extrato de Cordia verbenacea foi realizada com o intuito de
verificar se o extrato poderia exercer alguma influência no conteúdo
(fluorescência) total de histamina de mastócitos peritoneais de rato. Na presença
das concentrações de Cordia verbenacea utilizadas, não se observou alterações
do conteúdo total de histamina (tabela 3).
Tabela 3: Conteúdo total de histamina de mastócitos peritoneais de rato de cada
amostra de Cordia verbenacea nas concentrações 0,3; 1; 3; 10; 30 µg/mL.
C .verbenacea
(µg/mL)
Conteúdo total de
histamina
(Média ± EPM)
0
153, 8 ± 13,7
0,3
147,4 ± 12,0
1
150,7 ± 12,5
3
148,7 ± 13,3
10
149,2 ± 13,3
30
150,3 ± 12,8
Os dados representam médias e respectivos erros-padrão
(EPM) de
7 experimentos (ANOVA-Tukey-Kramer p>0,05).
4.4 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (0,3-30 µ
µµ
µg/mL) sobre a
liberação de histamina, induzida por ionóforo A23187, composto 48/80
ou concanavalina A em mastócitos peritoneais de rato.
A Cordia verbenacea na concentração de 30 µg/mL inibiu a
secreção de mastócitos peritoneais de rato induzida por 0,3 µM de ionóforo
A23187, por 0,5 µg/mL de composto 48/80 e por 100 µg/mL de concanavalina
A. As demais concentrações não alteraram a secreção (tabela 4).
Tabela 4: Efeito do extrato de Cordia verbenacea sobre a liberação de
histamina induzida por 0,3 µM de ionóforo A23187 (Ion), 0,5 µg/mL de
composto 48/80 ou 100 µg/mL de concanavalina A (Con A) em mastócitos
peritoneais de rato.
% de liberação de histamina
(Média ± EPM)
Cordia verbenacea (µg/mL)
0 0,3 1 3 10 30
Ion
66,0±3,2
59,9±5,2
60,1±4,9
62,5±3,9
55,3±4,5
22,1±2,2
*
Con A
44,6±2,0
44,9±3,6
46,6±4,6
40,6±4,0
40,0±3,6
24,3±2,5
*
48/80
35,1±0,9
28,6±2,6
41,9±2,6
33,0±3,1
31,6±3,1
21,4±2,1
*
Os dados representam as médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 8 a
10 experimentos.
* indica médias estatisticamente diferentes quando comparadas com resultados obtidos
na ausência do extrato (ANOVA-Tukey-Kramer p<0,05).
4.5 Efeito do extrato de Cordia verbenacea 30 µ
µµ
µg/mL sobre a liberação
espontânea de histamina de mastócitos de pulmão de cobaia e de bolsa
jugal de hamster.
A Cordia verbenacea (30 µg/mL) não alterou a liberação
espontânea de histamina em mastócitos de pulmão de cobaia e mastócitos de
bolsa jugal de hamster (tabela 5).
Tabela 5: Efeito do extrato de Cordia verbenacea (30 µg/mL) sobre a liberação
espontânea de histamina em mastócitos de pulmão de cobaia e de bolsa jugal de
hamster.
% de liberação de histamina
(Média ± EPM)
Esp
Pulmão de cobaia
6,3 ± 0,7 8,8 ± 1,3
Bolsa jugal de hamster
11,3 ± 1,1 13,8 ± 1,0
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 7 a 8
experimentos. Teste t de Student p>0,05.
4.6 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (0,3-30 µ
µµ
µg/mL) sobre a
liberação de histamina, induzida por ionóforo A23187 (3 µ
µµ
µM) em
mastócitos de pulmão de cobaia.
Na concentração de 30 µg/mL o extrato de Cordia verbenacea inibiu a
secreção de mastócitos induzida por 3 µM de ionóforo A23187 em mastócitos
de pulmão de cobaia (tabela 6).
Tabela 6: Efeito do extrato de Cordia verbenacea sobre a liberação de
histamina, induzida por 3 µM de ionóforo A23187 em mastócitos de pulmão de
cobaia.
% de liberação de histamina
(Média ± EPM)
Cordia verbenacea (µg/mL)
0 0,3 1 3 10 30
48,2±2,0
44,0±3,4 45,1±3,7
43,3±3,0
42,2±2,9
33,7±2,2
*
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão
(EPM)
de 7 experimentos.
* indica média estatisticamente diferente quando comparada
com resultado
obtido na ausência do extrato (ANOVA-Tukey-Kramer
p<0,05).
4.7 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (0,3-30 µ
µµ
µg/mL) sobre a
liberação de histamina, induzida por ionóforo A23187 ou concanavalina
A em mastócitos de bolsa jugal de hamster.
Na concentração de 30 µg/mL o extrato de Cordia verbenacea inibiu a
secreção de mastócitos de bolsa jugal de hamster induzida por 0,3 µM de
ionóforo A23187 e nas concentrações de 10 e 30 µg/mL inibiu também a
secreção induzida por 100 µg/mL de concanavalina A (tabela 7).
Tabela 7: Efeito do extrato de Cordia verbenacea sobre a liberação de
histamina, induzida por 0,3 µM de ionóforo A23187 (Ion) e 100 µg/mL de
concanavalina A (Con A) em mastócitos de bolsa jugal de hamster.
% de liberação de histamina
(Média ± EPM )
Cordia verbenacea (µg/mL)
0 0,3 1 3 10 30
Ion
31,0±3,1 32,9±3,4 31,0±2,9 30,6±3,2 27,6±3,0 15,8±2,5
*
Con A
27,9±0,8 20,7±3,3 21,3±3,3 19,4±2,9 16,3±2,3
*
10,8±2,6
*
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 6
a 8
experimentos.
*indica médias estatisticamente diferentes quando comparadas com resultados obtidos na
ausência do extrato (ANOVA-Tukey-Kramer p<0,05).
4.8 Influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
espontânea de histamina de mastócitos peritoneais de rato na presença
de Cordia verbenacea (30 µ
µµ
µg/mL).
O aumento da concentração de cálcio de 1 mM para 3 mM, não alterou a
liberação espontânea de histamina na presença do extrato de Cordia verbenacea
na concentração de 30 µg/mL (tabela 8).
Tabela 8: Influência da concentração externa de cálcio no efeito de Cordia
verbenacea (30 µg/mL) sobre a liberação espontânea de histamina (Esp) de
mastócitos peritoneais de rato.
% de liberação de histamina
(Média± EPM )
Cálcio
(mM)
Esp C.verbenacea
1
6,3 ± 1,1 7,9 ± 0,8
3
-
10,5 ± 1,2
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de
7 a 8 experimentos (ANOVA-Tukey-Kramer p>0,05).
4.9 Influência da concentração externa de cálcio na liberação de
histamina induzida por composto 48/80, concanavalina A e ionóforo
A23187 em mastócitos peritoneais de rato.
O aumento da concentração externa de cálcio (3 mM) não
influenciou no efeito secretor dos agentes indutores da liberação de histamina
em mastócitos peritoneais de rato (tabela 9). O aumento da concentração externa
de cálcio para 10 mM inibiu diretamente a secreção induzida por 0,5 µg/mL de
composto 48/80, embora não tenha influenciado os efeitos secretores dos outros
agentes. Por esta razão, a concentração de 10 mM de cálcio não foi utilizada nos
demais experimentos.
Tabela 9: Influência da concentração externa de cálcio na liberação de
histamina induzida por composto 0,5 µg/mL de composto 48/80, 100 µg/mL de
concanavalina A (Conc A) e 0,3 µM de ionóforo A23187 (Ion) em mastócitos
peritoneais de rato.
% de liberação de histamina
(Média ± EPM)
Cálcio 1 3
48/80
43,8 ± 4,0 42,0 ± 1,7
Conc A
39,7 ± 3,6 41,2 ± 2,9
Ion
70,1 ± 1,4 69,7 ± 4,4
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 6 a 7
experimentos (ANOVA-Tukey-Kramer p > 0,05).
4.10 Influência da concentração externa de cálcio sobre o efeito
inibitório de Cordia verbenacea na secreção de mastócitos peritoneais de
rato induzida por ionóforo A23187, composto 48/80 ou concanavalina A.
O efeito inibitório do extrato de Cordia verbenacea (30µg/mL)
sobre a liberação de histamina induzida por 0,5 µg/mL de composto 48/80 e 100
µg/mL de concanavalina A continuou acontecendo mesmo com o aumento das
concentrações de cálcio (tabela 10).
Tabela 10: Influência da concentração externa de cálcio no efeito inibitório de
Cordia verbenacea (30 µg/mL) sobre a secreção de mastócitos peritoneais de
rato induzida por 0,3 µM de ionóforo A23187 (Ion), 0,5 µg/mL de composto
48/80 ou 100 µg/mL de concanavalina A (Con A).
% de liberação de histamina
(Média ± EPM )
Cálcio (mM)
1
1 3
C. verbenacea
- + +
Ion
44,0 ± 4,0 26,5 ±2,2
*
27,3 ± 2,8
*
48/80
33,7 ± 2,4
19,5 ± 1,7
*
25,5 ± 2,5
*
Con A
40,7 ± 2,7
23,2 ± 2,3
*
22,8 ± 2,2
*
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 6
experimentos.
* indica médias estatisticamente diferentes quando comparadas com resultados
obtidos na ausência do extrato (ANOVA-Tukey-Kramer p<0,05).
4.11 Comparação de efeito inibitório de cromoglicato de sódio (0,3-100
µ
µµ
µM), quercetina (1-30 µ
µµ
µM), teofilina (0,3-100 µ
µµ
µM) e extrato de Cordia
verbenacea (0,3-30 µ
µµ
µg/mL) sobre a secreção de histamina induzida por
ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais de rato.
O Cromoglicato de sódio (100 µM), quercetina (3, 10 e 30 µM), teofilina
(3 e 10 µM) e extrato de Cordia verbenacea (30 µg/mL) inibiram a liberação de
histamina induzida por 0,3 µM de ionóforo A23187 (figura 2).
A porcentagem de inibição provocada pelo extrato de Cordia verbenacea
foi maior do que as das demais substâncias observadas (tabela 11).
Figura 2:
Comparação de efeito inibitório de cromoglicato de sódio (0,3-100
µM), quercetina (1-30 µM), teofilina (0,3-100 µM) e extrato de Cordia
verbenacea (0,3-30 µg/mL) sobre a secreção de induzida por 0,3 µM de
ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais de rato induzida.
0 0,3 1 3 10 30
0
10
20
30
40
50
60
Cordia verbenacea (µg/mL)
0 0,3 1 3 10 30 100
0
10
20
30
40
50
60
Cromoglicato de sódio (µM)
0 0,3 1 3 10 30 100
0
10
20
30
40
50
60
Teofilina (µM)
% liberação de histamina
*
*
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 7 a 9 experimentos.
* indica médias estatisticamente diferentes quando comparadas com o ionóforo A23187,
representado por 0 µM. (ANOVA-Tukey-Kramer p < 0,05).
Tabela 11: Porcentagem de inibição de cromoglicato de sódio (100 µM),
quercetina (3, 10 e 30 µM), teofilina (3 e 10 µM) e extrato de Cordia
verbenacea (30 µg/mL) sobre a secreção de histamina induzida por 0,3 µM de
ionóforo A21387 em mastócitos peritoneais de rato.
% de inibição de histamina
(Média ± EPM)
C. verbenacea (30 µg/mL)
Cromoglicato (100 µM)
Quercetina (3 µM)
Quercetina (10 µM)
74,0 ± 3,2*
58,6 ± 3,2
42,0 ± 2,0
55,6 ± 2,5
0 1 3 10 30
0
10
20
30
40
50
60
Quercetina (µM)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Quercetina (30µM)
Teofilina (3 µM)
Teofilina (10 µM)
46,6 ± 3,6
35,4 ± 1,0
38,8 ± 1,0
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 7 a 9 experimentos
* indica média estatisticamente diferentes quando comparadas com as drogas inibidoras da
secreção (ANOVA-Tukey-Kramer p < 0,05).
4.12 Efeito do extrato de Cordia verbenacea (30 µ
µµ
µg/mL) sobre a inibição
causada por cromoglicato de sódio (100 µ
µµ
µM), quercetina (3, 10 e 30 µ
µµ
µM)
e teofilina (3 e 10 µ
µµ
µM) na secreção de histamina induzida por 0,3 µ
µµ
µM de
ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais de rato.
O extrato de Cordia verbenacea (30µg/mL) aumentou o efeito
inibitório do cromoglicato de sódio (100 µM), quercetina (3,10 e 30 µM) e
teofilina (3 e 10 µM) sobre a liberação de histamina induzida por 0,3µM de
ionóforo A23187. Entretanto, mesmo com este aumento da inibição, o efeito
final não é maior do que se verifica apenas com a presença do extrato de Cordia
verbenacea (tabela 12).
Tabela 12: Influência do extrato de Cordia verbenacea (30 µg/mL) no efeito
inibitório causado pelo cromoglicato de sódio, quercetina e teofilina na liberação
de histamina induzida por 0,3 µM de ionóforo A23187.
% de liberação de histamina
(média± EPM)
Cordia verbenacea
- +
-
13,2 ± 1,1
Cromoglicato
100 µM
30,8 ± 2,3* 11,3 ± 0,9
Quercetina
30,4 ± 3,0* 12,0 ± 1,2
3 µM
Quercetina
10 µM
23,3± 0,7* 14,9 ± 0,7
Quercetina
30 µM
28,0 ± 2,0* 8,4 ± 0,5
Teofilina
3 µM
33,9 ± 2,2* 11,3 ± 1,3
Teofilina
10µM
32,1 ± 3,1* 10,2 ± 1,1
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 7 a 9 experimentos.
Não existe diferença entre as médias das amostras contendo extrato de Cordia verbenacea
(ANOVA-Tukey-Kramer p>0,05).
* indica médias estatisticamente diferentes quando comparadas com resultados na presença do
extrato de Cordia verbenacea (Test t de Student p<0,05).
4.13 Efeito do pré-tratamento (gavagem) com extrato de Cordia
verbenacea (300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio
sobre a liberação de histamina, induzida in vitro por ionóforo A23187 em
mastócitos peritoneais de rato.
O pré-tratamento com o extrato de Cordia verbenacea inibiu em 56,6% ±
0,9 (Média ± EPM) a secreção de histamina induzida por 0,3 µM de ionóforo
A23187 em mastócitos peritoneais de rato.
O efeito inibitório sobre a secreção induzida por ionofóro A23187 não foi
revertido com o aumento da concentração externa de cálcio de 1mM para 3mM
(tabela 13).
Tabela 13: Efeito do pré-tratamento com extrato de Cordia verbenacea
(300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
de histamina de mastócitos peritoneais de rato, induzida in vitro por 0,3 µM de
ionóforo A23187.
% de liberação de histamina ( ionóforo A23187 )
(Média± EPM)
Cálcio (mM) 1 3
Veículo
(Etanol)
61,0 ± 3,8
57,8 ± 5,6
Tratado
36,3 ± 3,2
*
30,2 ± 2,8
*
Não tratado
70,1 ± 1,4
69,7 ± 4,4
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM)
de 7 experimentos.
* indica média estatisticamente diferentes quando comparada com o grupo não
tratado. (ANOVA-Tukey-Kramer p<0,05).
4.14 Efeito do pré-tratamento (gavagem) com extrato de Cordia
verbenacea (300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio
sobre a liberação de histamina, induzida in vitro por composto 48/80 em
mastócitos peritoneais de rato.
O pré-tratamento com extrato de Cordia verbenacea não inibiu a secreção
de histamina induzida por composto 48/80 em mastócitos peritoneais de rato
(tabela 14). O aumento da concentração externa de cálcio não interferiu nestes
experimentos.
Tabela 14: Efeito do pré-tratamento com extrato de Cordia verbenacea
(300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
de histamina de mastócitos peritoneais de rato, induzida in vitro por 0,5 µg/mL
composto 48/80.
% de liberação de histamina (composto 48/80)
(Média ± EPM)
Cálcio (mM) 1 3
Veículo
(Etanol)
44,5 ± 2,0 47,8 ± 2,0
Tratado
41,4 ± 3,2
37,9 ± 3,2
Não tratado
43,8 ± 4,0 42,0 ± 1,7
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM)
de 7 experimentos. (ANOVA-Tukey-Kramer p >0,05).
4.15. Efeito do pré-tratamento (gavagem) com extrato de Cordia
verbenacea (300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio
sobre a liberação de histamina, induzida in vitro por concanavalina A em
mastócitos peritoneais de rato.
O pré-tratamento com extrato de Cordia verbenacea não inibiu a secreção
de histamina induzida por concanavalina A em mastócitos peritoneais de rato
(tabela 15). O aumento da concentração externa de cálcio não interferiu nestes
experimentos.
Tabela 15: Efeito do pré-tratamento com extrato de Cordia verbenacea
(300mg/Kg) e a influência da concentração externa de cálcio sobre a liberação
de histamina de mastócitos peritoneais de rato, induzida in vitro por 100 µg/mL
de concanavalina A.
% de liberação de histamina (concanavalina A)
(Média ± EPM)
Cálcio (mM) 1 3
Veículo (Etanol)
29,1 ± 1,9
31,1 ± 1,4
Tratado
29,4 ± 0,7 30,5 ± 3,2
Não tratado
39,7 ± 3,6
41,2 ± 2,9
Os dados representam médias e os respectivos erros-padrão (EPM) de 7
experimentos. (ANOVA-Tukey-Kramer p >0,05).
7
5.
D
ISCUSSÃO
O extrato de C. verbenacea não alterou a liberação espontânea de histamina de mastócitos
peritoneais de rato nas concentrações de 0,3 a 30 µg/mL entretanto, em concentrações
maiores (100 e 300µg/mL) houve aumento da liberação espontânea de histamina, o que
sugere a presença de substâncias estimulantes da secreção ou efeito citotóxico, desta
forma, tais concentrações foram descartadas do estudo.
O efeito do solvente (solução de etanol/água destilada) sobre a liberação de histamina foi
testado em virtude do etanol ser capaz de produzir efeito direto sobre a secreção de
mastócitos de modo concentração-dependente, ou seja, iniciando com concentrações
baixas (10mg/mL) pode ocorrer inibição da liberação de histamina induzida por ionóforo
A23187e em concentrações altas (100mg/mL) pode haver estimulação da liberação
espontânea de histamina (RUIZ & GOMES, 2000). A concentração de etanol utilizada no
presente estudo (3,15 mg/mL) não influenciou na liberação de histamina de mastócitos.
Por se tratar de um extrato bruto, diversas substâncias contidas no extrato de C. verbenacea
poderiam influenciar na intensidade da fluorescência da histamina porém, não foi
observada interferência do extrato no conteúdo (fluorescência) total de histamina de
mastócitos peritoneais de rato.
Os agentes secretores utilizados neste estudo para estimulação da secreção de mastócitos
agem por mecanismos distintos, embora todos de maneira não citotóxica e sob influência
da concentração externa de cálcio (Ca
2+
) (GOMES et al., 1994).
O composto 48/80 age diretamente na membrana de mastócitos ligando-se à proteínas
G, sendo recentemente identificados como alvo de ligação as subfamílias G
1
e G
0
(MOUSLI
et al. 1990; CHAHDI et al., 2000; PALOMAKI & LAITINEN, 2006). A interação leva, via
fosfolipase C e D (PLC e PLD), ao aumento da atividade da proteína quinase C (PKC) e do
fluxo de cálcio intracelular, ocorrendo a ativação dos mastócitos (WANG et al., 2005). A
concanavalina A induz a liberação de histamina interagindo com resíduos de açúcar e metais
ligados a superfície de mastócitos; porém, embora contendo açúcar em sua molécula, a
presença de IgE conjugada com mastócitos não é fundamental para que o estímulo secretor
ocorra (FERREIRA et al., 1996; LOPES et al., 2005). Já o ionóforo A23187 funciona como
um carreador de Ca
2+
do meio extra para o meio intracelular, além de promover a liberação
de cálcio de organelas intracelulares (GOMES et al., 1994). Este aumento de cálcio ativa
PKC e induz a fosforilação de cadeias de miosina presentes no citoesqueleto de mastócitos
facilitando o processo de exocitose (LUDOWYKE, 1996), sendo que o efeito máximo do
ionóforo é essencialmente maior que o da reação anafilática (PEARCE & TRUNEH, 1981).
A concanavalina A e composto 48/80 não foram utilizados na indução da liberação de
histamina de mastócitos de pulmão de cobaia, assim como o composto 48/80 em
mastócitos de bolsa jugal de hamster, em virtude destes órgãos não terem sido responsivos
a estes agentes nas concentrações utilizadas, sugerindo que diferenças entre as espécies e
tecido influenciam no efeito secretor, corroborando com LOPES et al. (2005) que relatam
que a eficácia da concanavalina A em induzir a secreção de mastócitos varia de acordo
com a sensibilidade da espécie animal e tecido e UNDEM et al. (1986) que demostraram
que mastócitos de pulmão de cobaia não respondem bem ao composto 48/80 e
concanavalina A LEUNG et al. (1984) ao compararem a secreção induzida por composto
48/80 em mastócitos de rato com mastócitos de hamsters, notaram que estes últimos foram
menos responsivos ao composto.
A atividade inibitória in vitro do extrato de C. verbenacea sobre a liberação de histamina
induzida por ionóforo A23187 e concanavalina A em mastócitos de bolsa jugal de hamster,
por ionóforo A23187 em mastócitos de pulmão de cobaia e por composto 48/80,
concanavalina A e ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais de rato, revela que o extrato
contém princípios ativos eficazes em inibir amplamente a secreção de mastócitos. Devido
ao fato deste efeito ocorrer sob a estimulação de mastócitos por diferentes agentes
secretores, os quais apresentam em comum a dependência de cálcio para serem eficazes,
isto poderia indicar que o mecanismo de ação dos princípios ativos contidos no extrato se
dê por alteração na disponibilidade de cálcio intracelular.
Por esta razão, foi estudado o efeito do aumento da concentração externa de cálcio para 3
mM; este aumento, não interferiu na inibição causada pelo extrato de Cordia verbenacea
na liberação de histamina de mastócitos peritoneais de rato induzida por composto 48/80,
concanavalina A e ionóforo A23187, o que sugere que o mecanismo de inibição do extrato
apresenta pouca ou nenhuma dependência da concentração externa de cálcio. Embora o
aumento da concentração externa de cálcio para 10 mM não tenha influenciado na
liberação espontânea de histamina e no efeito secretor do ionóforo e de concanavalina A,
esta concentração não foi utilizada nos demais testes farmacológicos deste trabalho, em
virtude de ter influenciado na ação do composto 48/80.
Comparando-se o efeito inibitório do extrato de C. verbenacea com os fármacos com ação
inibitória sobre a secreção de mastócitos peritoneais de rato (cromoglicato de sódio,
teofilina e quercetina), observou-se o que o efeito do extrato foi mais eficaz do que o
apresentado pelos três fármacos.
Os estabilizadores de mastócitos do tipo cromoglicato de sódio ou
cromonas, são drogas que vem sendo utilizadas no tratamento de alergias como
rinite e asma, há cerca de três décadas. Apesar disso, seu mecanismo de ação do
ponto de vista molecular não está ainda claramente elucidado (SHAPIRO &
KONIG,1985; MITCHELL, 2006). As drogas desta classe possuem potências
variadas sobre mastócitos de diferentes espécies, apresentam maior eficácia
sobre a secreção de mastócitos de rato do que de hamster e, nenhum efeito sobre
mastócitos de camundongo (LEUNG et al., 1984). São eficazes em inibir a
secreção de mastócitos peritoneais de rato induzida por estímulos imunológicos
e não-imunológicos (SHIN et al., 2004). Sugere-se que o cromoglicato age
indiretamente através da inibição da mobilização de cálcio, bloqueando os
canais de cálcio e inibindo portanto o influxo do íon, além de prejudicar o
transporte de íons cloreto, resultando na inibição da descarga de mediadores
(CHANG & SHIUNG, 2006; MITCHELL, 2006). Devido a produção de ácido
araquidônico estar acoplada ao influxo de Ca
2+
, o cromoglicato também inibe a
síntese de mediadores derivados de lipídeos da membrana (NABE et al., 2004).
A teofilina pertence à classe de compostos inibidores não seletivos das
fosfodilesterases (PDE) e tem sido empregada no tratamento da asma por mais
de 50 anos (WESTON et al., 1997) devido seu marcado efeito brocondilatador e
por exibir pontecial terapêutico como imunomodulador e anti-inflamatório,
sendo capaz de inibir a secreção de mastócitos (PAGE, 1999). Os mecanismos
de ação propostos para este fármaco incluem: indução de acúmulo de
AMPcíclico em virtude da inibição da PDE, inibição do influxo de cálcio e
bloqueio de receptores de adenosina (A
1
e A
2
) (COWARD et al., 1998;
WESTON et al., 1997). Ocorrendo variação do efeito inibitório conforme a
espécie animal e dose/concentração utilizada (LEUNG et. al., 1984).
Alguns flavonóides de ocorrência natural em plantas, como a quercetina, kempferol e
miricetin, apresentam efeito inibitório sobre a liberação de histamina, leucotrienos e
algumas citocinas de mastócitos de roedores e de humanos (DURAISAMY et al., 2005). A
quercetina é estruturalmente relacionada ao cromoglicato e possui eficácia semelhante em
mastócitos da cavidade peritoneal de rato e de hamster, intestino de rato, pulmão de cobaia
e pulmão humano (PEARCE et al ; 1986). A inibição da secreção se faz de maneira
dose/concentração-dependente, sendo associada à marcada diminuição do influxo de
cálcio, inibição da translocação e da atividade de PKC e de algumas kinases reguladas por
sinais extracelulares (ERKs), sendo estas últimas envolvidas na liberação de leucotrienos e
prostaglandinas (DI CARLO et al., 1999; KIMATA et al., 2000; DURAISAMY et al.,
2005).
Tanto o cromoglicato de sódio, como a teofilina e quercetina foram
eficazes em inibir a secreção de mastócitos peritoneais de rato induzida por
ionóforo A23187; entretanto, a inibição causada pelo extrato de Cordia
verbenacea é significativamente maior, o que acentua as potencialidades de seus
princípios ativos como substâncias anti-alérgicas. A eficácia inibitória do extrato
é tão intensa que não é alterada pela presença concomitante de cromoglicato de
sódio, teofilina ou quercetina.
O extrato de C. verbenacea foi também eficaz em experimentos in vivo
onde apresentou efeito inibidor sobre a liberação de histamina induzida por
ionóforo A23187 em mastócitos peritoneais de rato. Esta inibição foi detectada
seis horas após a administração do extrato por via oral e foi observada apenas a
inibição da liberação de histamina induzida por ionóforo mas não pelos demais
agentes secretores. Considerando que o extrato de Cordia verbenacea inibe in
vitro a liberação de histamina induzida por três estímulos com mecanismos
diferentes e em mastócitos de espécies e tecidos também diferentes, sugere-se
que existam mais de um princípio ativo envolvidos nesta atividade inibitória,
desta forma, seria também possível que alguns deles possam ter sofrido
alterações de natureza farmacocinética ou enzimática através de
biotransformação, perdendo assim, suas atividades inibitórias sobre a liberação
de histamina por composto 48/80 e concanavalina A.
Estudos de caracterização fitoquímica da Cordia verbenacea
identificaram a presença de taninos, mono e sesquiterpenos (trans-cariofileno,
alfa-pireno e alfa-humuleno), naftoquinonas, cordiaquiononas, flavonóides
como quercetina, artemetina e hidroxartemetina (DE CARVALHO JÚNIOR et
al., 2004; SERTIÉ et al., 2005).
Inicialmente o efeito anti-inflamatório do extrato foi atribuído ao
flavonóide artemetina, visto que alguns flavonóides exibem propriedades anti-
histamínicas, antibradicinina e inibem enzimas como 12-lipoxigenase e 5-
lipoxigenase. (SERTIÉ et al., 1990). Posteriormente foi verificado que o extrato
bruto diclorometano mas não a artemetina, exercia atividade anti-inflamatória
em modelos de inflamação aguda (BAYEUX et al., 2002). Outros estudos
revelaram que os compostos trans-cariofileno e alfa-humuleno obtidos de óleo
essencial de C. verbenacea são potentes agentes anti-inflamatórios e em
decorrência de experimentações anteriores, estas substâncias acabaram sendo a
base para o desenvolvimento do primeiro fitoterápico produzido a partir de uma
planta brasileira denominado Acheflan , o qual já é comercializado no Brasil
em forma de creme para uso tópico além disso, estudos estão sendo realizados
para o desenvolvimento também de um fármaco para administração por via oral
(PIANOWSKY, 2005).
É possível que o efeito inibidor da liberação de histamina seja devido a
ação de flavonóides, visto que esse grupo de substâncias é capaz de inibir a
secreção de mastócitos peritoneais de rato, a semelhança do que ocorre com a
quercetina bem como outros flavonóides de ocorrência natural em plantas
(DURAISAMY et al., 2005). Porém, certamente tal efeito não deveria ser
atribuído a quercetina ou pelo menos não somente a esta, em virtude do efeito
do extrato sozinho ter sido muito mais intenso.
Os resultados deste trabalho demostram a existência de compostos com
atividade anti-alérgica (inibidora da secreção de mastócitos) no extrato etanólico
de folhas de Cordia verbenacea, o que confere importância adicional a sua
atividade anti-inflamatória.
6.
C
ONCLUSÕES
- O extrato etanólico bruto de folhas de C. verbenacea inibe a liberação de
histamina induzida por composto 48/80, concanavalina A e ionóforo A23187
em mastócitos de diferentes espécies, demostrando ampla ação in vitro, a
qual independe de concentrações de cálcio extracelular.
- O efeito inibitório do extrato etanólico bruto de folhas de C. verbenacea
sobre a secreção de mastócitos peritoneais de rato induzida por ionóforo
A23187 também ocorre in vivo. O mesmo não acontece quando o agente
estimulador de secreção é composto 48/80 ou concanavalina A. Sugere-se a
existência de mais de um princípio ativo com esta atividade inibitória.
- O extrato etanólico bruto de folhas de C. verbenacea possui alta eficácia na
inibição da liberação de histamina de mastócitos, sendo mais eficaz que
cromoglicato de sódio, teofilina e quercetina.
- A ampla ação e alta eficácia do(s) princípio(s ) ativo(s) de C. verbenacea,
sugerem que possam ser potencialmente úteis no tratamento de desordens
alérgicas ou outras doenças relacionadas a secreção de mastócitos.
7
.
R
EFERÊNCIAS
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