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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DA NUTRIÇÃO ADEQUADA E INSUFICIENTE EM
COBRE OU ZINCO SOBRE A RESPOSTA IMUNE HUMORAL À
VACINAÇÃO CONTRA
Clostridium chauvoei E PARÂMETROS
HEMATOLÓGICOS EM BEZERROS NELORE
HORRYS FRIAÇA SILVA
BOTUCATU – SP
AGOSTO 2006
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1
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DA NUTRIÇÃO ADEQUADA E INSUFICIENTE EM
COBRE OU ZINCO SOBRE A RESPOSTA IMUNE HUMORAL À
VACINAÇÃO CONTRA
Clostridium chauvoei E PARÂMETROS
HEMATOLÓGICOS EM BEZERROS NELORE
HORRYS FRIAÇA SILVA
Tese apresentada junto ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária
para obtenção do título de Doutor
Orientador: Prof.Dr. João Pessoa Araújo Júnior
Co-Orientador: Prof.Dr. Márcio R. G. Kuchembuck
BOTUCATU – SP
Agosto 2006
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2
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Silva, Horrys Friaça.
Avaliação da nutrição adequada e insuficiente em cobre ou zinco sobre a
resposta imune humoral à vacinação contra Clostridium chauvoei e
parâmetros hematológicos em bezerros Nelore / Horrys Friaça Silva. – 2006.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2006.
Orientador: João Pessoa Araújo Junior
Assunto CAPES: 50501062
1. Bovino - Doenças 2. Bezerro - Doenças - Aspectos imunológicos
CDD 636.20896
Palavras-chave: Anticorpos; Bovinos; Clostridium chauvoei; Cobre; Zinco
ii
Composicão da banca examinadora:
Autor: Horrys Friaça Silva
Botucatu, 24 de agosto de 2006.
__________________________________________
Orientador:Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior
_________________________________________
Prof. Adjunto Dr. Julio Naylor Lisboa
____________________________________________
Prof. Adjunta Dra. Maria Clorinda Soares Fioravanti
_________________________________
Prof. Dr. Alexandre Secorum Borges
__________________________________
Prof. Dr. Roberto Calderon Gonçalves
iii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1. Composição das misturas minerais formuladas com base na análise de
pastagem
17
QUADRO 2. Momentos de avaliação efetuados antes dos animais
completarem seis meses de idade e receberem a primeira vacinação (M1 A
M6)
19
QUADRO 3. Datas dos momentos de avaliação referentes à primeira
vacinação: material coletado e análises correspondentes
20
QUADRO 4. Datas dos momentos de avaliação referentes à segunda
vacinação: material coletado e análises correspondentes
20
QUADRO 5. Condições de operação do espectrômetro com configuração
axial para as determinações dos minerais Cu e Zn
22
iv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Médias e desvios padrões dos níveis hepáticos de cobre (ppm)
das matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
29
TABELA 2. Cobre hepático materno, hipóteses testadas, estatística
calculada e comentários (análise de perfil)
29
TABELA 3. Médias e desvios padrões dos níveis hepáticos de zinco (ppm)
das matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
31
TABELA 4. Zinco hepático materno, hipóteses testadas, estatística calculada
e comentários (análise de perfil)
31
TABELA 5. Médias e desvios padrões dos níveis hepáticos de cobre e zinco
(ppm) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e aos 150 dias de idade
(M6)
34
TABELA 6. Cobre e zinco hepático dos bezerros aos 150 dias de idade (M6),
hipóteses testadas, estatísticas calculadas e comentários
34
TABELA 7. Médias e desvios padrões dos níveis séricos de cobre (ppm) dos
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7, M15 e
M21)
36
TABELA 8. Cobre sérico dos bezerros, hipóteses testadas, estatística
calculada e comentários (análise de perfil)
36
TABELA 9. Médias e desvios padrões dos níveis séricos de zinco (ppm) dos
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7, M15 e
M21)
38
TABELA 10. Zinco sérico bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada
e comentários (análise de perfil)
38
TABELA 11. Médias e desvios padrões da concentração de superóxido
dismutase (SOD U/g Hb) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M1 a M6)
40
TABELA 12. Concentração de superóxido dismutase (SOD U/g Hb) dos
bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e comentários (análise de
perfil)
40
TABELA 13. Médias e desvios padrões do índice ELISA para os anticorpos
anti-Clostridium chauvoei (passivos) de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M1 a M6)
42
v
TABELA 14. Índice ELISA para os Ac. anti-Clostridium chauvoei (passivos)
dos bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e comentários
(análise de perfil)
42
TABELA 15. Médias e desvios padrões do índice ELISA para anticorpos anti-
Clostridium chauvoei em resposta à vacinação dos bezerros sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação
48
TABELA 16. Índice ELISA para os anticorpos anti-Clostridium chauvoei
(vacina) dos bezerros, hipóteses, estatística e comentários (análise de perfil)
48
TABELA 17. Médias e desvios padrões do volume globular (%) de bezerros
Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M0 a M7)
52
TABELA 18. Volume globular (%) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
52
TABELA 19. Médias e desvios padrões do volume globular (%) ao reforço
vacinal dos bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
(M15 a M21)
53
TABELA 20. Volume globular (%) ao reforço vacinal dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
53
TABELA 21. Médias e desvios padrões da concentração plasmática de
proteína total (g/dL) de bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
54
TABELA 22. Concentração plasmática de proteína total (g/dL) dos bezerros,
hipóteses testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
54
TABELA 23. Médias e desvios padrões da concentração plasmática de
proteína total (g/dL) ao reforço vacinal, de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
55
TABELA 24. Concentração plasmática de proteína total (g/dL) ao reforço
vacinal dos bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e
comentários (análise de perfil)
55
TABELA 25. Médias e desvios padrões da concentração de fibrinogênio
(mg/dL) dos bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
56
TABELA 26. Concentração sérica de fibrinogênio (mg/dL) dos bezerros,
hipóteses testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
56
TABELA 27. Médias e desvios padrões da concentração sérica de
fibrinogênio (mg/dL) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
57
vi
TABELA 28. Concentração sérica de fibrinogênio (mg/dL) ao reforço vacinal
dos bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e comentários
(análise de perfil)
57
TABELA 29. Médias e desvios padrões da concentração de leucócitos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
58
TABELA 30. Concentração de leucócitos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
58
TABELA 31. Médias e desvios padrões da concentração de leucócitos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal, de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
59
TABELA 32. Concentração de leucócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
59
TABELA 33. Médias e desvios padrões da concentração de neutrófilos
(x10
3
/L) de bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
(M7 a M14)
60
TABELA 34. Concentração de neutrófilos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
60
TABELA 35. Médias e desvios padrões de neutrófilos (x10
3
/L) ao reforço
vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação
61
TABELA 36. Concentração de neutrófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
61
TABELA 37. Médias e desvios padrões da concentração de linfócitos
(x10
3
/L) dos bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
62
TABELA 38. Concentração de linfócitos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
62
TABELA 39. Médias e desvios padrões da concentração de linfócitos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal, de bezerros Nelores sob diferentes tratamentos
e momentos de avaliação (M15 a M21)
63
TABELA 40. Concentração de linfócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
63
TABELA 41. Médias e desvios padrões da concentração de monócitos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
64
vii
TABELA 42. Concentração de monócitos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
64
TABELA 43. Médias e desvios padrões da concentração de monócitos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M8 a M14)
65
TABELA 44. Concentração de monócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
65
TABELA 45. Médias e desvios padrões da concentração de eosinófilos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
66
TABELA 46. Concentração de eosinófilos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
66
TABELA 47. Médias e desvios padrões da concentração de eosinófilos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
67
TABELA 48. Concentração de eosinófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
67
TABELA 49. Médias e desvios padrões da concentração de basófilos
(x10
3
/L) dos bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
68
TABELA 50. Concentração de basófilos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
68
TABELA 51. Médias e desvios padrões de basófilos (x10
3
/L) ao reforço
vacinal dos bezerros em diferentes tratamentos e momentos de avaliação
69
TABELA 52. Concentração de basófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
69
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Gráfico das médias dos níveis hepáticos de cobre (ppm) das
matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
29
FIGURA 2. Representação gráfica das médias dos níveis hepáticos de zinco
(ppm) das matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1
a C3)
31
FIGURA 3 e 4. Representações gráficas das médias dos níveis hepáticos de
cobre ou zinco (ppm) sob diferentes tratamentos aos 150 dias de idade (M6)
34
FIGURA 5. Representação gráfica das médias dos níveis séricos de cobre
(ppm) dos bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7, M15 e M21)
36
FIGURA 6. Representação gráfica das médias dos níveis séricos de zinco
(ppm) dos bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7, M15 a M21)
38
FIGURA 7. Representação gráfica da concentração de superóxido dismutase
(SOD U/g Hb) de bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M1 a M6)
40
FIGURA 8. Representação gráfica das médias do índice ELISA para os
anticorpos anti-Clostridium chauvoei (colostrais) de bezerros Nelore sob
diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M0, M6, M7, M8 e M14)
42
FIGURA 9. Representação gráfica das médias do índice ELISA para os
anticorpos anti-Clostridium chauvoei (vacina) de bezerros sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação
48
FIGURA 10. Representação gráfica das médias do volume globular (%) de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7 a
M14)
52
FIGURA 11. Representação gráfica das médias do volume globular (%) ao
reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos
de avaliação (M15 a M21)
53
FIGURA 12. Representação gráfica das médias da concentração sérica de
proteína total (g/dL) de bezerros Nelores sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M7 a M14)
54
FIGURA 13. Representação gráfica das médias da concentração sérica de
proteína plasmática total (g/dL) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob
diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
55
ix
FIGURA 14. Representação gráfica das médias da concentração sérica de
fibrinogênio (mg/dL) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M7 a M14)
56
FIGURA 15. Representação gráfica das médias da concentração sérica de
fibrinogênio (mg/dL) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
57
FIGURA 16. Representação gráfica das médias da concentração de
leucócitos (x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M7 a M14)
58
FIGURA 17. Representação gráfica das médias da concentração de
leucócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
59
FIGURA 18. Representação gráfica das médias da concentração de
neutrófilos (x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M7 a M14)
60
FIGURA 19. Representação gráfica das médias de neutrófilos (x10
3
/L) ao
reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos
de avaliação (M15 a M21)
61
FIGURA 20. Representação gráfica das médias da concentração de linfócitos
(x10
3
/L) dos bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
62
FIGURA 21. Representação gráfica das médias da concentração de linfócitos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M8 a M14)
63
FIGURA 22. Representação gráfica das médias da concentração de
monócitos (x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M7 a M14)
64
FIGURA 23. Representação gráfica das médias da concentração de
monócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
65
FIGURA 24. Representação gráfica das médias da concentração de
eosinófilos (x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M7 a M14)
66
FIGURA 25. Representação gráfica das médias da concentração de
eosinófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
67
x
FIGURA 26. Representação gráfica das médias de basófilos (x10
3
/L) de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7 a
M14)
68
FIGURA 27. Representação gráfica das médias da concentração de basófilos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
69
xi
SUMÁRIO
1) INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA................................................ 1
1.1) Cobre e zinco............................................................................................ 1
1.2) Cobre e zinco e resposta imune.............................................................. 6
1.3) Clostridium chauvoei............................................................................... 12
2) OBJETIVOS....................................................................................................... 15
3) MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 16
3.1) Animais e características dos grupos experimentais........................... 16
3.2) Suplementação mineral........................................................................... 16
3.3) Controle sanitário do rebanho................................................................ 17
3.4) Colheita de amostras de fêmeas adultas............................................... 17
3.5) Vacinação dos bezerros........................................................................... 18
3.6) Acompanhamento dos bezerros e colheita de material....................... 18
3.7) Processamento do material obtido......................................................... 20
3.8) Análise dos resultados............................................................................ 26
4) RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 27
4.1) Níveis hepáticos de cobre nas matrizes................................................. 27
4.2) Níveis hepáticos de zinco nas matrizes................................................. 30
4.3) Níveis hepáticos de cobre e zinco nos bezerros................................... 32
4.4) Níveis séricos de cobre nos bezerros.................................................... 35
4.5) Níveis séricos de zinco nos bezerros..................................................... 37
4.6) Superóxido-dismutase............................................................................. 39
4.7) Índice ELISA de anticorpos anti-C.chauvoei (passivos/colostrais)..... 41
4.8) Índice ELISA de anticorpos anti-C.chauvoei (vacina)........................... 43
4.9) Hemograma............................................................................................... 49
5) CONCLUSÕES.................................................................................................. 70
6) BIBLIOGRAFIA................................................................................................. 71
8) TRABALHO CIENTÍFICO.................................................................................. 79
RESUMO
Autor: Horrys Friaça Silva. Título: Avaliação da nutrição adequada e
insuficiente em cobre ou zinco sobre a resposta imune humoral à vacinação
contra Clostridium chauvoei e parâmetros hematológicos em bezerros
Nelore. Botucatu-SP, 2006, 108p., Doutorado, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia – FMVZ-UNESP/Botucatu: Avaliou-se o efeito de níveis
nutricionais adequados ou insuficientes em cobre (Cu) ou zinco (Zn) sobre a
resposta imune humoral e hemograma de bezerros Nelore, submetidos à
vacinação contra Clostridium chauvoei. O grupo Controle (n=10) foi composto por
bezerros cujas mães receberam nutrição mineral adequada. O grupo -Zn (n=10),
e o -Cu (n=10) foram formados por bezerros nascidos de vacas mantidas em dieta
insuficiente em Zn e Cu respectivamente. Estes bezerros foram acompanhados
até os seis meses de idade, recebendo a mesma suplementação mineral de suas
mães. Nestes primeiros seis meses de vida foram medidos os títulos de
anticorpos anti-Clostridium chauvoei recebidos via colostro e os níveis de
superóxido dismutase eritrocitária. Aos 150 dias de vida estes bezerros tiveram
fragmentos de tecido hepático colhidos para análise de Cu e Zn. Aos 180 dias de
vida os bezerros receberam vacina contra Clostridium chauvoei, e 36 dias após,
receberam reforço vacinal. Foram então medidos os níveis séricos de Cu e Zn
(três momentos), titulos de anticorpos em resposta à vacinação (cinco momentos)
e hemograma (14 momentos). Apesar de não terem sido obtidos níveis hepáticos
de Cu indicativos de deficiência, foram observadas diferenças significativas
destes níveis de Cu entre os três grupos (-Zn>Controle>-Cu). Tais diferenças se
refletiram em diferenças significativas entre os títulos de anticorpos (Controle>-
Zn>-Cu aos 21 dias após a vacinação e 15 dias após o reforço) e algumas
variáveis do hemograma dos diferentes grupos, durante os momentos
relacionados ao reforço vacinal (volume globular, leucócitos, neutrófilos,
monócitos e eosinófilos).
ABSTRACT:
Author: Horrys Friaça Silva. Title: Evaluation of copper or zinc adequate or
insufficient nutrition on the humoral immune response to Clostridium
chauvoei and haematological parameters of Nelore calves. Botucatu-SP,
2006, 108p., Doctorate, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –
FMVZ-UNESP/Botucatu: This research aims to assess the effects of copper and
zinc insufficient nutritional levels on the humoral immune response of Nelore
calves, submitted to Clostridium chauvoei vaccination. The Control Group (n=10)
was composed of calves whose mothers received adequate mineral nutrition.The
calves of Group -Zn (n=10) and Group -Cu (n=10) were born, respectivelly, from
cows under insufficient Zn or Cu nutrition. These calves were accompanied until
six months of life, having access to the same mineral supplementation of their
mothers. In these calves’ first six months of life the titers of anti-Clostridium
chauvoei antibodies, received via colostrums, were measured by ELISA assay. At
150 days old, these calves had fragments of their hepatic tissue collected for Cu
and Zn levels analysis. At 180 days old, the calves received the first dose of
Clostridium chauvoei vaccine. A second dose of this vaccine was given 36 days
later. Then, the antibodies titers in response to both vaccination (five sampling
times), the serum Cu and Zn levels (three sampling times) and hemogram were
also measured (14 sampling times). Although Cu hepatic levels compatible with
deficiency were not obtained, significant differences among these Cu levels of the
three groups of calves were observed (-Zn>Control>-Cu), as well as significant
differences among the antibodies titers (Control>-Zn and -Cu at 21 days after the
first vaccine dose and Control>-Zn>-Cu at 15 days after the booster vaccination)
and hemogram of the different groups at the sampling times related to the booster
vaccination (corpuscular volume, leucocytes, neutrophils, monocytes and
eosynophils).
1
1) INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
1.1) Cobre e Zinco
Desequilíbrios minerais nos solos e pastagens têm sido responsáveis por
baixa produtividade em ruminantes criados sob pastejo em extensas áreas do
planeta. Muitas vezes tal efeito acaba ocorrendo a despeito da presença de
suprimentos forrageiros abundantes. O fornecimento adequado de minerais é
fundamental para aumentar os índices de produtividade dos rebanhos e dentre as
deficiências nutricionais, a mais fácil de ser corrigida, a um custo relativamente
baixo, é a de minerais (McDOWELL, 1999).
O cobre (Cu) e o zinco (Zn), são microelementos minerais considerados
essenciais para as espécies domésticas. O Cu funciona como componente
essencial de inúmeras enzimas, incluindo lisil-oxidase (tecido conjuntivo), Cu-Zn-
superóxido-dismutase (antioxidante), citocromo-oxidase (metabolismo
energético), ceruloplasmina (transporte de ferro, antioxidante) e tirosinase
(melanina) e por isto, está envolvido em diversos processos metabólicos,
podendo a hipocuprose afetar todos os estágios de crescimento e produção
(NRC, 1996; SUTTLE, 1986).
A função primária do Zn no organismo está relacionada ao seu
envolvimento com os processos enzimáticos, ora como componente molecular,
ora como ativador. Está envolvido no metabolismo de carboidratos, proteínas e
ácidos nucléicos. O Zn interage biologicamente com a produção, armazenamento
e secreção de hormônios individuais (insulina, testosterona e adrenocorticóides),
bem como na integridade da resposta de orgãos efetores (McDOWELL, 1999). O
zinco é um cofator de pelo menos 90 metaloenzimas, incluindo aquelas
envolvidas na estabilização de DNA e transcrição de RNA. Dessa maneira a
deficiência marginal de zinco pode afetar os sinais reguladores e a expressão de
genes. A deficiência deste elemento afeta predominantemente células que estão
em constante proliferação e diferenciação, como as células do sistema imune e
reprodutor (MYRVIK, 1994; KEUSCH, 1994).
O Cu e o Zn são componentes da metaloenzima Cu-Zn-superóxido-
dismutase (Cu-Zn-SOD), que exerce atividade antioxidante no metabolismo
celular e são elementos considerados essenciais para o bom funcionamento do
sistema imunológico e das funções reprodutivas dos bovinos (GRAHAM, 1991).
2
A deficiência de cobre foi apontada como a mais comum entre as
deficiências de microminerais encontradas em bovinos por todo o planeta
(McDOWELL, 1999).
Tokarnia et al. (1999), em artigo de revisão sobre os estudos realizados no
período de 1987 até 1998 a respeito de deficiências e desequilíbrios minerais em
bovinos e ovinos no Brasil, apontaram as deficiências de cobre e de cobalto como
as mais freqüentes. A deficiência de zinco também foi verificada com freqüência
elevada no período abrangido pela revisão. Destacaram-se por outro lado, os
valores acentuados de ferro encontrados em diversas regiões. Em algumas delas,
foi demonstrado que os altos níveis de ferro estavam associados aos baixos
valores de cobre. Moraes et al. (1994) observaram a existência de níveis de zinco
abaixo dos requerimentos mínimos dos bovinos em 42% das pastagens avaliadas
no Brasil.
Os requerimentos diários de Cu para bovinos de corte, em suas diversas
faixas etárias, foram estimados em 10 mg/kg, em bases de matéria seca (ppm),
pelo National Research Council norte-americano (NRC, 1996). Segundo Marston
(1999), estes requisitos devem apresentar certa variabilidade, relativa ao
metabolismo das diversas raças bovinas e sistemas de exploração. Outro fator a
ser considerado é a interação com outros elementos, afetando a
biodisponibilidade do cobre. Os elementos que freqüentemente interagem com o
Cu são: molibdênio (Mo), ferro (Fe), enxofre (S) e zinco (Zn). Outros como cálcio
(Ca), cobalto (Co), manganês (Mn), fósforo (P) e selênio (Se), também
demonstram interação, porém em menor grau.
Os requerimentos de Cu, geralmente se elevam quando da presença de
níveis relativamente elevados de Mo e S. O efeito antagonista do Mo sobre o
metabolismo do Cu é exacerbado pela presença de S. Estes elementos interagem
nas condições próprias do rúmen e formam “tiomolibdatos”. Quando formados,
estes complexos são pouco absorvidos. Porém, a pequena quantidade que atinge
a circulação sangüínea afeta sistematicamente o metabolismo do Cu, fazendo
com que ele se ligue à albumina plasmática e torne-se indisponível para as
reações bioquímicas. Assim, inibe diretamente a produção de metaloenzimas
dependentes de Cu. Por esta razão, observa-se em bovinos com deficiência de
Cu secundária ao excesso de Mo e S, um comprometimento mais acentuado das
funções do sistema imune (COUSINS, 1985; SUTTLE, 1986). No Brasil o
3
problema está mais ligado ao excesso de Fe nos solos e pastagens do que ao Mo
e S (TOKARNIA et al., 1999).
Marston (1999) propõe que para cada ppm de Mo na dieta, ocorre uma
diminuição da biodisponibilidade do Cu avaliada em 8 ppm. Assim se uma ração
contiver 1ppm de Mo e 20 ppm de Cu, o gado só poderá contar efetivamente com
12 ppm.
Para McDowell (1999) uma dieta total contendo seis ppm de Cu e 1,5
ppm de Mo, seria apropriada, na maioria dos casos para bovinos de corte. Para
valores inferiores a 1,5 ppm de Mo, níveis de até quatro ppm de Cu poderiam ser
suficientes.
O NRC (1996), estabelece 30 mg/kg de Zn, em bases de matéria seca
(ppm), como nível nutricional diário adequado para gado de corte em todas as
categorias. McDowell (1999) sugere valores entre 20 e 40 ppm de Zn em bases
de matéria seca na dieta total diária.
Outros fatores além da ingestão do mineral interferem na manifestação da
deficiência de Zn. Menard e Cousins (1983) demonstraram em ratos o aumento
da absorção de Zn em períodos de restrição da ingestão deste mineral. Houve
aumento da expressão da proteína transportadora do elemento, em preparado de
células intestinais dos animais deficientes, em relação ao grupo controle.
Segundo os autores, tal efeito pode ocorrer durante períodos de maior demanda
como a gestação e a lactação.
O desenvolvimento do feto requer alta demanda de nutrientes oriundos de
fontes maternas (XIN et al., 1993). O feto acumula Cu no fígado às expensas de
sua mãe, via transferência placentária. A concentração de Cu se eleva no fígado
fetal com o tempo de gestação, sendo que no gado deficiente em Cu ocorrerá um
declínio nos níveis hepáticos fetais após seis meses de gestação. No gado
alimentado adequadamente, o feto acumulará Cu crescentemente, até o final da
gestação, para alcançar as necessidades do período pós-natal. A magnitude da
deficiência de Cu em certas áreas ressalta a importância da adequada
suplementação deste elemento em fêmeas prenhes, visto que a nutrição materna
adequada é essencial para o desenvolvimento do feto e também para saúde e
crescimento pós-natal (SMART et al., 1983).
Gengelbach et al. (1997) avaliaram a concentração tecidual de cobre, em
bezerros nascidos de mães submetidas a diferentes níveis nutricionais de Cu, Fe
4
e Mo durante a gestação. Nas novilhas não suplementadas com Cu, a gestação
contribuiu para a redução dos teores plasmáticos de Cu e da atividade da
ceruloplasmina. Eles afirmam que a baixa concentração plasmática de Cu nos
grupos não suplementados pode ter diminuído a transferência deste elemento
para o feto, resultando em menores níveis de cobre hepático fetal.
O suprimento de Cu dos bezerros até o desmame depende em primeiro
lugar da transferência placentária materna durante a gestação. Este Cu, oriundo
de fonte materna e acumulado no fígado fetal, deverá suprir a demanda dos
meses seguintes até o desmame. Desde o nascimento, até o desmame, o bezerro
ingere quantidades insuficientes de Cu no leite e ainda não pasta em quantidade
suficiente para satisfazer suas necessidades por esta via. A ingestão de colostro
nos primeiros dias de vida consegue elevar as concentrações plasmáticas de Cu
e Zn, porém a quantidade de minerais no colostro reduz-se rapidamente nas
primeiras 72 horas de vida. Nas primeiras 24 horas de vida o colostro contém 0,12
ppm de Cu e 17,2 ppm de Zn, proporcionando uma ingestão de 1,2 mg de Cu e
20,4 mg de Zn. Após 72 horas, o colostro conterá apenas 0,03 ppm de Cu e 2,5
ppm de Zn (KUME e TANABE, 1993).
Hansard et al. (1968), demonstraram grande elevação das concentrações
fetais de Zn durante a gestação, concluindo que 13,5% do total de Zn absorvido
pela mãe durante este período é transferido para o feto.
O diagnóstico das deficiências minerais pode ser difícil quando não são
observados sintomas característicos que direcionem a investigação para os níveis
teciduais ou alimentares de um determinado elemento. Os resultados das
análises de solo e de pastagens são difíceis de serem interpretados. Inúmeros
fatores atuam no solo e nas forrageiras, alterando a assimilação dos minerais pela
planta e pelo animal. Dados sobre a concentração de elementos minerais no solo,
na água e nas pastagens apenas complementam a avaliação das deficiências em
bovinos. Além disso, a concentração dos elementos minerais na pastagem varia
de acordo com fatores climáticos e com o estádio de maturação da planta. Assim,
deve-se priorizar a avaliação do conteúdo mineral nos tecidos animais
(TOKARNIA et al., 2000).
O tecido que propicia melhor interpretação do estado nutricional de Cu
nos bovinos é o hepático. Muitas vezes, a aferição combinada dos níveis séricos
deste elemento poderá enriquecer a interpretação. Porém, a grande variação dos
5
níveis séricos de Cu muitas vezes não reflete o estado nutricional em relação ao
elemento (McDOWELL, 1999; SUTTLE 1986; TOKARNIA et al., 2000). Diversos
autores, dentre eles, Cousins (1981), Suttle (1986) e Borges (2001) não
encontraram correlação entre os teores hepáticos e séricos de cobre em bovinos.
O acesso à deficiência de Zn através da medição dos níveis deste mineral
nos tecidos é extremamente complicado, devido à falta de um órgão responsável
pelo armazenamento do elemento. Recomenda-se a aferição dos níveis hepáticos
de Zn e se possível, a confrontação com os dados de outro tecido (plasma ou
soro) (MARSTON, 1999; TOKARNIA et al., 2000). Outra dificuldade é a constante
alteração na distribuição de zinco através dos compartimentos orgânicos,
principalmente em resposta à fase aguda das infecções. Este efeito é mediado
pela interleucina -1, que regula a transcrição da metalotioneína (proteína
transportadora de Zn). Ocorre a mobilização de Zn para o espaço intracelular no
fígado, timo e medula óssea (KEUSCH, 1994).
Pott et al. (1989a), observaram diferenças sazonais nos níveis hepáticos
de cobre de bovinos de corte criados na região central do Pantanal Mato-
grossense (Nhecolândia). Os valores nos meses de fevereiro (278 ppm) e agosto
(261 ppm) foram significativamente mais elevados que os obtidos em novembro
(129 ppm) e maio (239 ppm). Em todos os momentos avaliados, os valores
médios obtidos estavam dentro da faixa de normalidade admitida por Underwood
(1977) (100 a 400 ppm) mesmo com teores insuficientes de cobre nas gramíneas
(entre 2,4 e 4 ppm). Segundo os autores, tal fato explica-se pela possibilidade do
cobre ter sido fornecido por outras espécies não gramíneas (com teores de cobre
entre 16 e 27 ppm), também ingeridas junto com as pastagens.
Em Roraima, Souza et al. (1989) observaram níveis hepáticos de cobre
entre 157 e 271 ppm e 120 e 262 ppm, respectivamente em vacas em lactação e
novilhos. Apesar dos baixos teores de Cu das forrageiras (1,5 a 3,6 ppm), os
valores observados foram considerados normais (100 a 400 ppm conforme critério
de Underwood, 1977). Segundo os autores, o ocorrido pode ser explicado pelos
níveis reduzidos de Mo das pastagens. Nos animais jovens foram encontrados
valores de 167 ppm na estação das chuvas. Estes teores foram estatisticamente
diferentes dos 208 ppm da estação seca. Menores concentrações hepáticas de
Cu na época de chuva explicam-se pela maior demanda por este mineral em
6
períodos de maior crescimento corporal. Níveis adequados de proteína e energia,
durante a estação chuvosa, favorecem o crescimento dos animais.
Souza e Darsie, (1985), encontraram deficiência de zinco nas forrageiras
de todos os locais estudados em um levantamento das deficiências minerais dos
bovinos da região nordeste de Roraima. Os níveis hepáticos do mineral também
foram baixos e estas deficiências foram mais pronunciadas na época de chuvas
(79 ppm em animais adultos e 76 ppm em jovens).
Em todas as épocas do ano avaliadas por Brum et al. (1987), os níveis de
zinco de forrageiras do Mato Grosso foram deficientes, variando de 7,1 a 5,6 ppm.
Os teores de zinco no tecido hepático dos bovinos avaliados no mês de novembro
foram significativamente superiores (233,8 ppm) em relação aos níveis em agosto
(44,5 ppm), fevereiro (106,1 ppm) e maio (107,3 ppm).
Morais et al. (2000), observaram níveis séricos normais de Cu (0,79 e
0,81 mg/L) e Zn (1,43 e 1,33 mg/L) em novilhas mestiças Nelore, respectivamente
em solos arenosos e argilosos As novilhas do experimento foram mantidas em
pastagens com níveis insuficientes destes minerais, recebendo suplemento
mineral comercial.
1.2) Cu e Zn e resposta imune
Examinando a relação entre a gravidade das deficiências de
microelementos e seus efeitos em rebanhos bovinos, observa-se que, em
deficiências marginais, o sistema imunológico é o primeiro a ter suas funções
comprometidas. Conforme o grau da deficiência se agrava, ocorrerá então o
comprometimento do crescimento e da fertilidade dos animais. Deficiências
graves poderão ocasionar disfunções metabólicas mais evidentes (MARSTON,
1999 apud WIKSE 1992). Desta maneira, deficiências menos severas também
poderão causar prejuízos financeiros elevados pelo comprometimento do estado
sanitário e da produtividade dos rebanhos. Assim, quando dietas são formuladas
para rebanhos, deve-se considerar a qualidade das forragens e ingestão de
conteúdo mineral. Adicionalmente, composição racial e níveis de produção no
rebanho podem influenciar as necessidades de suplementação mineral,
justificando a necessidade de referências regionais sobre a matéria (MARSTON
,1999).
7
A função do Cu e do Zn no sistema imunológico dos animais está
diretamente relacionada à produção de enzimas do “metabolismo oxidativo”.
Estas serão responsáveis pela produção de substâncias microbicidas na
“explosão respiratória” dos fagócitos, ao mesmo tempo reduzindo o efeito nocivo
de tais substâncias sobre os componentes celulares do sistema.
Durante a fagocitose, grandes quantidades de radicais superóxido,
gerados pelos próprios fagócitos, são liberados no interior dos fagossomos para
destruição das partículas fagocitadas. A enzima Cu-Zn-SOD é responsável pela
dismutação de radicais superóxido em peróxido de hidrogênio. O peróxido de
hidrogênio é o principal substrato para a produção de substâncias microbicidas,
tais como o íon hipoclorito e radical hidroxila pelo sistema mieloperoxidase-halide
(XIN et al. 1991). Então, é possível que baixas concentrações de SOD nos
fagócitos levem à redução do potencial microbicida pelo decréscimo do
suprimento de peróxido de hidrogênio para o sistema mieloperoxidase-halide e
produção de radicais hidroxilas nas reações de Harber-Weiss ou Fenton (JONES
e SUTTLE, 1981; MINATEL e CARFAGNINI, 2000). O resultante decréscimo na
capacidade microbicida dos fagócitos se reflete em redução da apresentação de
antígenos às células T e cooperação entre células T e B, necessária para a
produção de anticorpos (CERONE et al. 1995).
Em adição, a grande quantidade de radicais superóxido, gerados pelos
fagócitos durante a explosão respiratória, pode alcançar outras partes destas
células e até mesmo os espaços extracelulares, ocasionando dano às estruturas
celulares. Assim, a dismutação dos radicais superóxido para peróxido de
hidrogênio, catalizada pela Cu-Zn-SOD, possibilitará a posterior inativação em
água por outras enzimas como a glutationa-peroxidase e a catalase, prevenindo
danos ao funcionamento celular (JONES e SUTTLE, 1981).
A importância clínica desta relação é o aumento da susceptibilidade às
doenças infecciosas, com elevadas taxas de enterites virais, septicemia e
pneumonias bacterianas nos bezerros de rebanhos deficientes em Cu (WIKSE et
al., 1992).
Jones e Suttle (1981) não encontraram diminuição da capacidade dos
neutrófilos em fagocitar Candida albicans em bovinos e ovinos deficientes em
cobre, entretanto, ocorreu redução do potencial microbicida. Foi demonstrada a
restauração da função dos neutrófilos quando da posterior suplementação com
8
cobre. Houve redução dos níveis de Cu-Zn-SOD dos eritrócitos e leucócitos,
relativa aos níveis de deficiência de cobre.
Xin et al. (1991) observaram em novilhas a redução da atividade de Cu-
Zn-SOD nos eritrócitos e neutrófilos, em paralelo à redução da atividade
bactericida dos neutrófilos e níveis hepáticos de cobre. Estes autores
consideraram a importância da aferição da atividade de Cu-Zn-SOD como critério
adicional para a interpretação do estado nutricional de cobre dos bovinos. A
redução da atividade de Cu-Zn-SOD está associada aos estados de deficiência
de cobre prolongados sendo importante na interpretação destes casos (SUTTLE,
1986).
Diferentes razões foram enunciadas para explicar o decréscimo no
potencial microbicida dos neutrófilos. Arthur e Boyne (1985) observaram redução
do potencial microbicida antes que ocorresse decréscimo nos níveis de SOD,
indicando que tal efeito pudesse estar relacionado à produção de radicais
superóxido pelos neutrófilos. Boyne e Arthur (1981) sugeriram que tal ocorrência
poderia estar relacionada à produção celular de nicotinamida-adenosina-difosfato
(NADPH) ou NADPH oxidase, importantes para a produção de radicais
superóxido pelos neutrófilos. Além disto, a deficiência de Cu altera a expressão
de vários genes dos mamíferos, incluindo Cu-Zn-SOD (LAI et al., 1994), Mn-SOD
(LAI et al., 1996), catalase (LAI et al., 1996), glutationa-peroxidase (PROHASKA
et al., 1992). Verificou-se que as mudanças observadas na atividade de células do
sistema imunológico, em resposta à deficiência de Cu, são mediadas por
alterações na capacidade de alguns fatores de transcrição específicos, em se
ligar ao ácido nucléico (FAILLA e HOPKINS, 1998).
Os neutrófilos são os componentes mais estudados da resposta imune
inata dos ruminantes com deficiência de Cu. A redução da função dos neutrófilos
é um dos primeiros sinais observados em bovinos sob depleção de Cu, ocorrendo
antes do aparecimento de outros sinais clínicos. Potencial microbicida, produção
de superóxido e níveis de atividade de SOD estarão reduzidos em bovinos e
ovinos deficientes em Cu. Além disto, a capacidade de fagocitose dos neutrófilos
também pode estar comprometida em bovinos acometidos por severa deficiência
de Cu, induzida pela administração de antagonistas. Entretanto, a função dos
macrófagos demonstra-se menos susceptível aos efeitos da deficiência de Cu
(MINATEL e CARFAGNINI, 2000).
9
O potencial fagocitário e microbicida dos macrófagos alveolares de
bezerros deficientes em Cu não foi significativamente afetado pelo estado de Cu
dos animais. Houve porém, uma tendência ao decréscimo da atividade de SOD e
produção de radical superóxido e peróxido de hidrogênio (MINATEL e
CARFAGNINI, 2000). Entretanto, sob deficiência de Cu induzida, Saker et al.
(1998) observaram redução da capacidade fagocitária e da expressão de
complexo maior de histocompatibilidade de classe II (MHC II) dos monócitos
periféricos de bezerros com baixos níveis de Cu.
Segundo Minatel e Carfagnini (2000), os macrófagos são importantes não
apenas para a imunidade inata, mas também para a imunidade específica
atuando,nesse nível, como células apresentadoras de antígenos. Portanto, deve-
se estudar com maior profundidade os efeitos da deficiência de Cu sobre estas
células, assim como o reflexo sobre a resposta imune específica. Para estes
autores os resultados indicando efeito da deficiência de Cu sobre a resposta
imune humoral dos bovinos são ainda inconsistentes.
Diferentes autores investigaram o efeito da deficiência de Cu sobre a
resposta imune humoral de bovinos e obtiveram resultados variados. Stabel et al.
(1993), imunizaram bezerros contra o vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina
(IBRV) e observaram títulos de anticorpos mais elevados em bezerros que
receberam nutrição insuficiente em Cu do que naqueles que receberam
suplementação do referido elemento. Neste mesmo experimento, os autores não
encontraram diferenças significativas entre os títulos de anticorpos contra-
Pasteurella haemolytica em bezerros sob nutrição insuficiente ou suplementada
em Cu. Entretanto, os bezerros suplementados com Cu apresentaram tendência
aos maiores títulos de anticorpos anti-Pasteurella haemolytica, quando
comparados aos obtidos pelos animais sem suplementação.
Ward et al. (1997) conduziram experimentação para determinar o efeito
da deficiência de Cu, com ou sem a presença de altos níveis nutricionais de Mo
ou Fe, sobre a imunidade específica de bezerros. Estes autores utilizaram 38
bezerros, nascidos de vacas mantidas sob dietas experimentais controladas,
desde o último terço da gestação até o desmame de suas crias. Dietas não
suplementadas com Cu resultaram em níveis plasmáticos indicativos de
deficiência, de acordo com os padrões de Underwood (1981) (<0,5 mg/L).
Bezerros que não receberam suplementação de Cu (0,30 mg/L de Cu plasmático)
10
obtiveram títulos de anticorpos em resposta à segunda inoculação de eritrócitos
suínos (PRBC), significativamente mais elevados do que os grupos
suplementados com Cu, Mo e Fe aos 14 e 21 dias após a inoculação. Não houve
diferença significativa entre os títulos de anticorpos dos diferentes grupos na
primeira inoculação.
Cerone et al. (1995) alimentaram novilhas da raça Aberdeen Angus com
uma dieta contendo excesso de Mo e S por nove meses com objetivo de induzir
deficiência de Cu. Estas novilhas foram então vacinadas com a cepa viva S1119
de Brucella abortus. Em resposta, estes autores observaram redução dos níveis
séricos de cobre (aproximadamente 0,4 mg/L de Cu sérico, quatro meses após o
início das dietas do experimento) e da atividade da ceruloplasmina. Níveis séricos
totais de imunoglobulina G e complemento também foram reduzidos pelos baixos
níveis orgânicos de Cu, quando comparados aos do grupo controle. Títulos de
anticorpos contra Brucella abortus e proliferação de células mononucleares
periféricas em resposta à Concanavalina A foram significativamente menores nas
bezerras deficientes em cobre do que no grupo controle. Seguindo a mesma
linha, Cerone et al. (1998) observaram redução da capacidade dos neutrófilos em
reduzir nitroblue tetrazólium (NBT) e fagocitar eritrócitos ovinos em bovinos com
deficiência de cobre secundária, induzida por molibdênio e enxofre. Também foi
encontrada redução significativa do número de linfócitos B, sem redução da
contagem total de linfócitos e 50% de decréscimo nos níveis de ceruroplasmina
dos animais deficientes, quando comparados aos do grupo controle.
Dorton et al. (2003) utilizaram 48 novilhas da raça Aberdeen Angus, com
aproximadamente sete meses de idade, para determinar os efeitos das fontes de
Cu e suas concentrações sobre a resposta imune de bovinos. As novilhas
receberam dieta contendo 7.1 ppm de Cu por 56 dias e depois, por mais 144 dias,
receberam dieta com 6.1 ppm de Cu. Os grupos que receberam dieta
suplementada com 10 ppm de Cu obtiveram, aos 14 dias após a inoculação de
PRBC, títulos mais elevados de anticorpos do que os grupos que receberam
suplementação com 20 ppm de Cu. Aos 14 dias após a segunda inoculação de
PRBC os grupos suplementados com 20 ppm de Cu obtiveram títulos mais
elevados do que os obtidos pelos grupos suplementados com 10 ppm deste
mineral e animais não suplementados. Entretanto, 21 dias após a segunda
inoculação de PRBC os títulos de anticorpos obtidos pelos animais não
11
suplementados foram superiores aos observados nos grupos suplementados. Por
outro lado, resultados diferentes foram observados com a inoculação de
ovalbumina (OVA) nos animais. Aos 14 e 21 dias após a inoculação de OVA, as
novilhas que receberam 20 ppm de Cu obtiveram títulos mais elevados de
anticorpos do que os animais que receberam 10 ppm deste mineral. Novilhas que
receberam 20 ppm de Cu, de fontes orgânicas, obtiveram maiores títulos de
anticorpo do que as que receberam o mesmo teor deste mineral, oriundo de
fontes inorgânicas (sulfato de cobre). As novilhas que não receberam
suplementação obtiveram os títulos de anticorpos mais baixos.
Cerone et al. (1998) adicionaram 30 ppm de Mo e 225 ppm de S à
alimentação de seis bezerras da raça Aberdeen Angus (cinco meses), com o
intuito de estudar o efeito da deficiência induzida de Cu sobre as células do
sangue periférico. A deficiência secundária de Cu foi constatada por níveis séricos
abaixo de 5,9 Umol/L. O número total de leucócitos não foi afetado pela
deficiência de Cu. Entretanto, a contagem diferencial revelou o significativo
aumento do número de monócitos e redução, também significativa do número de
linfócitos B. Não houve alteração significativa do número de neutrófilos,
entretanto, ocorreu redução da atividade destes polimorfonucleares, caracterizada
pelo decréscimo na capacidade de redução do corante NBT e fagocitose de
eritrócitos ovinos.
Randhawa et al. (2002) induziram deficiência de Cu em oito bezerros
bubalinos adicionando 30 ppm de Mo às suas dietas. Os autores avaliaram os
níveis de hemoglobina, hematócrito e contagem total e diferencial do número de
leucócitos. A função dos neutrófilos periféricos também foi acessada in vitro,
avaliando o potencial fagocitário e microbicida sobre Staphylococcus aureus. A
contagem total dos leucócitos não foi afetada pela deficiência secundária de Cu,
apesar de ter ocorrido uma redução significativa do número de neutrófilos. Tal
redução coincidiu com o decréscimo dos níveis hepáticos de Cu para 23.9±2.69
ppm. A redução do número de neutrófilos não foi acompanhada por variações na
proporção das suas diferentes células precursoras na medula óssea. Os autores
concluíram que a neutropenia ocasionada pela deficiência de Cu, induzida por
excesso de Mo, não estaria relacionada ao efeito sobre a síntese ou maturação
medular de tais células. Em pacientes humanos com deficiência de Cu a
neutropenia é um achado comum (WILLIAMS, 1983; PERCIVAL, 1995).
12
O efeito da quantidade e das fontes de suplementação de zinco na
resposta imune de novilhas foi investigado por Spears (1991). Nesse estudo, os
grupos que receberam dieta suplementada com fontes de zinco apresentaram
títulos de anticorpos em resposta à vacinação contra herpes vírus bovino tipo 1,
significativamente maiores que o grupo de animais sem suplementação.
Engle et al. (1997) observaram em bezerras com deficiência marginal de
Zn um decréscimo na conversão alimentar e diminuição da resposta imune celular
em resposta à injeção intradérmica com o mitógeno fitohemaglutinina - PHA.
Morais et al. (2000) submeteram 128 novilhas Nelore à diferentes níveis
de suplementação de Zn. Num dos tratamentos, as novilhas não receberam
suplementação de Zn. Em outros, as novilhas receberam 30 ppm de fontes
orgânicas, 30 ppm de fontes inorgânicas e ainda 60 ppm de fontes inorgânicas.
Segundo os autores, os bezerros nascidos das vacas que receberam
suplementação com 30 ppm de Zn orgânico e 60 ppm de Zn inorgânico
demonstraram menor incidência de doenças. Os autores ainda quantificaram os
níveis séricos de IgG e IgM correlacionando as diferenças entre grupos, sob
distintos tratamentos, às diferentes taxas de morbidade.
1.3) Clostridium chauvoei
Testes de função imunológica podem ser utilizados como indicadores do
impacto da intervenção nutricional sobre os mecanismos intrínsecos de defesa do
hospedeiro. A utilização de análises convenientemente inter-relacionadas torna tal
avaliação efetiva. Para tanto, é importante a mensuração de diversos níveis de
atividades do sistema. A inclusão de testes in vivo, como o acesso à resposta
imune humoral através da detecção de anticorpos específicos, produzidos em
resposta à imunização enriquece tal avaliação (CUNNINGHAM-RUNDLES, 1998).
O Clostridium chauvoei é o agente bacteriano causador do carbúnculo
sintomático (manqueira) em bovinos, ovinos e outras espécies domésticas e
selvagens. É responsável por grandes perdas econômicas, especialmente em
regiões onde medidas profiláticas não são tomadas apropriadamente. O controle
de tal enfermidade é feito através da administração de vacinas comerciais
contendo culturas inativadas em formalina. Protocolos de vacinação com duas
doses intercaladas são amplamente recomendados para a indução de resposta
13
imune de memória, com intuito de assegurar a prevenção da doença (MATTAR et
al., 1999; DI GENARO et al., 1999).
Schipper et al. (1978) estudaram a resposta de bezerros à imunização
com vacina anti-Clostridium chauvoei e observaram que nos filhos de vacas
imunizadas, a maior produção de anticorpos ocorreu em bezerros vacinados com
quatro a 12 meses de idade, comparada à produção por aqueles vacinados com
seis semanas de vida. Tal fato é explicável pela presença dos anticorpos
maternos, que, apesar de conferirem proteção durante os primeiros meses de
vida, interferem negativamente na síntese de imunoglobulinas pelos bezerros e
impedem o sucesso da vacinação em animais muito jovens (TIZARD, 2000).
Silva (2003) avaliou os níveis de gama globulina, dos mesmos bezerros
utilizados nesta pesquisa, até os seis meses de idade e observou os menores
níveis, durante o segundo e terceiro meses de vida (respectivamente 0,44 e 0,57
g/dL e que foram estatisticamente semelhantes). Posteriormente, os níveis
começaram a se elevar. Entretanto, somente no quinto mês de vida, estes valores
se elevaram significativamente em relação aos observados no segundo e terceiro
meses de idade (quarto mês: 0,68 g/dL; quinto mês: 0,82 g/dL).
O reforço da vacinação é prática recomendável, pois estimula maior
produção de anticorpos e melhor imunização do gado que a recebe. As
características da resposta imunológica frente ao desafio do reforço vacinal são
diferentes da resposta à primeira vacinação. Na idade da primeira vacinação, os
bezerros que já ultrapassaram a fase de catabolismo das imunoglobulinas
recebidas pelo colostro, iniciam a produção endógena de anticorpos. No caso da
resposta imune ao reforço da vacina existe uma forte resposta de memória,
devido à atuação de células T de memória e proximidade da imunização anterior.
Isto induz uma maior produção de anticorpos num período de tempo mais curto
(TIZARD, 2000).
Tamura et al. (1985) desenvolveram uma prova de hemaglutinação
indireta para a detecção de anticorpos contra Clostridium chauvoei. Utilizaram
como antígeno, extratos celulares da bactéria obtidos por tratamento ultrassônico.
Esta técnica demonstrou praticidade e especificidade na detecção de anticorpos
contra este organismo. Posteriormente, estes mesmos autores relataram
correlação positiva entre a detecção de anticorpos pela técnica de
hemaglutinação indireta anteriormente proposta e a proteção conferida por
14
imunógenos de Clostridium chauvoei em camundongos. Estes autores indicaram
a metodologia para a avaliação de vacinas anti-carbúnculo e como prova
adicional em testes de proteção de camundongos (TAMURA et al., 1986).
Os títulos de anticorpos anti-Clostridium chauvoei também podem ser
quantificados através de ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), conforme
a metodologia descrita por Crichton et al. (1990). Estes autores desenvolveram
uma técnica simples para ser utilizada em coelhos e servir como alternativa para
os testes de susceptibilidade em cobaios. Foi encontrada correlação entre os
títulos de anticorpos medidos pela da metodologia de ELISA e a proteção
observada nos testes de desafio, permitindo a utilização da técnica para conferir a
eficiência de vacinas, evitando o sacrifício de animais e gastos na sua
manutenção.
Considerando a importância do efeito das deficiências de Cu e Zn sobre o
sistema imunológico dos bovinos e a carência de informações sobre o efeito
destes minerais na resposta imune humoral e variáveis do hemograma de
bovinos, delineou-se esta pesquisa. Os resultados obtidos acrescentarão
subsídios ao estudo do efeito do Cu e Zn, sobre os aspectos clínicos e resposta
imunológica de bezerros Nelore criados extensivamente. Permitirão também,
recomendações mais consistentes sobre formulação de misturas minerais,
contribuindo para a redução das perdas econômicas provocadas pela inadequada
utilização destes nutrientes.
15
2) OBJETIVOS
A) Avaliar o efeito da nutrição adequada e da insuficiente em cobre ou
zinco, sobre os teores hepáticos e séricos destes elementos minerais,
nos bovinos Nelore deste experimento.
B) Estudar o efeito de dietas com teores adequados e insuficientes em
cobre e zinco sobre a produção de anticorpos dos bezerros, em
resposta à vacinação contra Clostridium chauvoei.
C) Avaliar o efeito das dietas com diferentes teores de cobre e zinco sobre
as variáveis do hemograma, em resposta à vacinação dos bezerros
contra Clostridium chauvoei.
16
3) MATERIAL E MÉTODOS
3.1) Animais e características dos grupos experimentais
Foram utilizados 30 bezerros da raça Nelore, de ambos os sexos,
nascidos de vacas mantidas por 18 meses sob nutrição mineral adequada ou
insuficiente em Cu ou Zn. O grupo Controle foi estabelecido com 10 bezerros que
nasceram das vacas submetidas a uma nutrição mineral adequada (Cu = 10 ppm
e Zn = 30 ppm, conforme o NRC, 1996). O grupo -Zn foi constituído por 10
bezerros que nasceram das vacas com fornecimento mineral insuficiente em
zinco (23 ppm de Zn) e o grupo -Cu foi constituído por 10 animais que nasceram
das vacas com fornecimento mineral insuficiente em cobre (seis ppm de Cu).
3.2) Suplementação mineral
O pasto formado por B. decumbens, disponível para a realização deste
experimento, foi submetido à análise da sua composição (UNESP - Faculdade de
Ciências Agronômicas - Departamento de Ciência do Solo - Laboratório de
Nutrição Mineral de Plantas), obtendo-se os seguintes teores de minerais: N = 5
g/kg, P = 0,8 g/kg, K = 8 g/kg, Ca = 3 g/kg, Mg = 2,6 g/kg, S = 0,6 g/kg, B = 6 ppm,
Cu = 6 ppm, Fe = 153 ppm, Mn = 278 ppm, Zn = 23 ppm, Mo = 2 ppm. Um sal
mineral foi formulado com base nestes dados, de forma a suprir os requerimentos
diários de bovinos da raça Nelore, em todas as suas fases, conforme
recomendações do NRC (1996) e de McDowell (1999) (Tabela 1). Este sal
mineral foi oferecido ad libitum em cocho coberto para as novilhas do grupo
Controle. O grupo -Zn recebeu a mesma mistura, porém sem adição de fontes de
zinco e o grupo -Cu recebeu a mesma mistura que o grupo Controle sem a adição
de fontes de cobre, ambos em cocho coberto.
Antes de parirem os bezerros utilizados nesta pesquisa, as matrizes
receberam os diferentes suplementos minerais do experimento por 18 meses (de
abril/2000 a setembro/2001) compreendendo um período de adaptação (de
abril/2000 a novembro/2000), estação reprodutiva (30 dias entre dezembro/2000 e
janeiro/2001) e passaram toda a gestação recebendo as diferentes misturas
minerais propostas.
Os bezerros foram acompanhados clinicamente, do nascimento até os
seis meses de vida. Neste período permaneceram com suas respectivas mães e
17
tiveram à sua disposição o mesmo fornecimento mineral correspondente ao grupo
original materno.
QUADRO 1: Composição das misturas minerais formuladas com base na análise de
pastagem
Suplemento
mineral
P
(%)
Cu
(%)
Zn
(%)
Co
(%)
Na Cl
(%)
Se
(%)
Grupo
Controle
68 0,625 0,765 0,007 30,6 0,003
Grupo –Zn
68 0,625 0 0,007 31,365 0,003
Grupo -Cu
68 0 0,765 0,007 31,225 0,003
Fontes
Fosfato
Bicálcico
CuSO
4
ZnSO
4
CoSO
4
NaCl
Selenito de
Sódio
3.3) Controle sanitário do rebanho
As matrizes do experimento receberam diagnótico negativo para
leptospirose, brucelose e leucose bovina à vírus, mediante a realização de provas
sorológicas específicas. Estas fêmeas receberam vacina contra febre aftosa
anualmente (conforme recomendação do Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento). Foi administrada uma dose de vacina polivalente contra
clostridioses, incluindo imunógenos anti-Clostridium chauvoei em março/2000
(aproximadamente 18 meses antes das matrizes parirem). Também receberam
uma dose de vermífugo (ivermectina) antes do início do experimento e três vezes
ao ano (Janeiro, Junho e Agosto). O controle do berne (Dermatobia hominis) e da
mosca do chifre (Haematobia irritans) foi realizado sempre que necessário.
3.4) Colheita de amostras das fêmeas adultas
Foram colhidos fragmentos de fígado, de todas as matrizes de cada
grupo. Estas colheitas foram realizadas no momento anterior à colocação das
novilhas nas diferentes dietas (C1 - março/2000), 15 dias antes da colocação dos
animais em estação reprodutiva (C2 - setembro/2000) e uma última colheita foi
efetuada uma semana após o parto (C3 - setembro de 2001). Foram efetuadas
dosagens de cobre e zinco hepático neste material, para posterior comparação
com os níveis destes elementos nos bezerros. Os fragmentos de tecido hepático
foram colhidos com os animais em estação, no tronco de contenção, conforme a
técnica adaptada de Smart e Northcole (1985). Esta consiste em anestesia local
18
com lidocaína a 2%, anti-sepsia com iodopovidona, incisão da pele com bisturi e
penetração da cavidade abdominal com a agulha. Esta deverá estar posicionada na
interseção da linha imaginária, traçada paralelamente ao eixo dorsal, partindo do ponto
médio da fossa paralombar direita até o 11
0
espaço intercostal. Após a penetração da
cavidade abdominal na inserção do diafragma com a parede torácica, o mandril da
agulha foi retirado e a cânula deslocada no sentido crânio-ventral, na direção da
articulação úmero-rádio-ulnar do membro esquerdo. Com movimentos de rosca, a
cânula foi introduzida no parênquima hepático. Pressão negativa foi produzida
obstruindo-se o orifício externo da cânula com o polegar, durante a retirada do
conjunto. As amostras foram secas em papel de filtro, pesadas e armazenadas sob
temperatura de -20C em tubos plásticos de 1,5mL para posterior análise dos
elementos minerais. A agulha utilizada foi confeccionada com as seguintes dimensões:
comprimento do mandril 25 cm, comprimento da cânula 23 cm, diâmetro interno da
cânula 0,7cm e externo 0,8cm.
3.5) Vacinação dos bezerros
Os bezerros do experimento foram vacinados aos 180 dias de vida (M7)
com vacina comercial contra carbúnculo sintomático
1
, obtida por inativação de
cultivos de Clostridium chauvoei em formalina e adsorção em hidróxido de
alumínio. A vacina, conservada sob condições indicadas pelo fabricante foi
administrada com seringa plástica descartável e agulha hipodérmica 30 x 1,0 mm
por via subcutânea, na dose recomendada (2,0 mL). A idade em que foi feita a
vacinação está de acordo com dados relatados por Schipper et al. (1978), que
estudaram a resposta de bezerros à imunização com vacina anti-Clostridium
chauvoei. Trinta e seis dias após terem recebido a vacina os bezerros do
experimento receberam uma segunda dose da mesma como reforço (M15).
3.6) Acompanhamento dos bezerros e colheita do material
Os bezerros foram acompanhados clinicamente até o final do
experimento. Inicialmente foram colhidas amostras em seis momentos antes dos
animais completarem seis meses e receberem a primeira vacinação (M1 a M6).
Estas amostras foram colhidas durante a primeira semana de vida (M1) e depois
1
Monovacina Vallée S.A. Montes Claros MG.
19
mensalmente, até os animais completarem cinco meses de idade (M2 A M6). Este
material se destinaria à titulação de anticorpos anti-Clostridium chauvoei
recebidos via colostro e mensuração dos níveis de superóxido-dismutase
eritrocitária. Aos 150 dias de vida (M6), para medir os teores de cobre e zinco,
foram colhidos fragmentos de tecido hepático, novamente pela técnica de Smart &
Northcole(1985)(Tabela3).
QUADRO 2. Momentos de avaliação efetuados antes dos animais completarem seis
meses de idade e receberem a primeira vacinação (M1 A M6)
Momento/Data Material obtido Análises correspondentes
M1 – 1 semana p.p.
1- Soro
2- Hemácias (sangue c/ heparina)
1- Anticorpos
2- superóxido-dismutase - SOD
M2 – 1 mês
1- Soro
2- Hemácias (sangue c/ heparina)
1- Anticorpos
2- SOD
M3 – 2 meses
1- Soro
2- Hemácias (sangue c/ heparina)
1- Anticorpos
2- SOD
M4 – 3 meses
1- Soro
2- Hemácias (sangue c/ heparina)
1- Anticorpos
2- SOD
M5 – 4 meses
1- Soro
2- Hemácias (sangue c/ heparina)
1- Anticorpos
2- SOD
M6 – 5 meses
(150 dias)
1- Soro
2- Hemácias (sangue c/ heparina)
3- Fígado
1- Anticorpos
2- SOD
3- Cu e Zn hepáticos
Aos 180 dias de vida os bezerros receberam a primeira dose de vacina
contra Clostridium chauvoei. Para a avaliação do hemograma, amostras de
sangue foram então colhidas no momento imediatamente anterior à aplicação da
vacina (M7) e depois com oito horas (M8), um (M9), dois (M10), três (M11), sete
(M12), 15 (M13) e 21 dias após (M14). Uma outra dose da vacina foi aplicada 36
dias após a primeira e novos momentos de colheita foram instituídos, seguindo o
esquema efetuado após a primeira dose da vacina. A saber: uma primeira colheita
foi efetuada imediatamente antes da aplicação do reforço vacinal (M15) e
posteriormente outras seis colheitas foram feitas, sendo a primeira delas com oito
horas (M16), um (M17), dois (M18), três (M19), sete (M20) e 15 dias após a
administração do reforço vacinal (M21). Os títulos de anticorpos em resposta à
vacinação foram medidos em amostras de soro obtidas imediatamente antes da
vacinação (M7), 15 dias após a vacina (M13), 21 dias após a vacina (M14),
imediatamente antes do reforço vacinal (M15) e 15 dias após o mesmo (M21). A
dosagem dos níveis séricos de cobre e zinco foi efetuada em amostras colhidas
durante o M7, M15 e M21 (Tabelas 4 e 5).
20
QUADRO 3. Datas dos momentos de avaliação referentes à primeira vacinação:
material coletado e análises correspondentes
Momento/Data Material obtido Análises correspondentes
M7 – 180 dias
(imediatamente antes da
vacina)
1- Sangue c/ EDTA
2- Soro
3- Soro (
Tubo s/ contaminantes
minerais
)
1- Hemograma
2- Anticorpos
3- Cu e Zn sérico
M8 – 8 horas após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M9 – 1 dia após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M10 – 2 dias após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M11 – 3 dias após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M12 – 7 dias após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M13 – 15 dias após
1- Sangue c/ EDTA
2- Soro
1- Hemograma
2- Anticorpos
M14 – 21 dias após
1- Sangue c/ EDTA
2- Sangue / Soro
1- Hemograma
2- Anticorpos
QUADRO 4. Datas dos momentos de avaliação referentes à segunda vacinação:
material coletado e análises correspondentes
Momento/Data Material obtido Análises correspondentes
M15 – imediatamente antes
do reforço da vacina)
1- Sangue c/ EDTA
2- Soro
3- Soro (
Tubo s/ contaminantes
minerais
)
1- Hemograma
2- Anticorpos
3- Cu e Zn sérico
M16 – 8 horas após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M17 – 1 dia após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M18 – 2 dias após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M19 – 3 dias após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M20 – 7 dias após 1- Sangue c/ EDTA 1- Hemograma
M21 – 15 dias após
1- Sangue c/ EDTA
2- Soro
3- Soro (
Tubo s/ contaminantes
minerais
)
1- Hemograma
2- Anticorpos
3- Cu e Zn sérico
3.7) Processamento do material obtido
3.7.1) Dosagem do cobre e zinco hepático
A quantificação dos minerais presentes nas amostras de fígado foi obtida
empregando-se a técnica de espectrometria de emissão óptica com fonte de
plasma de argônio, indutivamente acoplada, pelo espectrômetro simultâneo
BAIRD
2
. Uma amostra de fígado bovino certificada
3
foi seca em estufa, a 110°C,
por 12 horas, sendo em seguida utilizada para a validação da metodologia.
Foram realizados testes preliminares para escolha do método de
preparação das amostras de fígado bovino. Foi então empregada a metodologia
da digestão ácida de Asp & Lund (1992). Foram pesados 0,2000 + 0,0011 g de
2
Modelo ICP 2000 Massachusetts, USA
21
cada amostra de fígado bovino em tubos de vidro, acrescentando-se 15 mL de
ácido nítrico concentrado. Iniciou-se o aquecimento do bloco digestor a 50°C, cuja
temperatura se elevou de 10 em 10°C, a intervalos de 30 minutos até 160°C.
Aqueceu-se até o volume atingir aproximadamente cinco mL. As amostras foram,
então transferidas para balões volumétricos de 25 mL, completando-se o volume
com ácido clorídrico 5% v:v. As amostras de fígado colhidas dos animais do
experimento foram então processadas como anteriormente descrito para a
amostra certificada.
3.7.2) Dosagem de cobre e zinco sérico dos bezerros
A metodologia de preparo das amostras de soro foi adaptada de
Subramaniam (1996) para a determinação dos minerais Cu e Zn: pesaram-se
0,500g da amostra em um frasco de Becker e adicionaram-se 10 mL de ácido
nítrico concentrado. Em seguida, a amostra foi digerida em chapa elétrica
aquecida, por 3 horas. Após esfriar, transferiu-se quantitativamente a amostra
para balão volumétrico de 25 mL e que foi preenchido com solução de ácido
clorídrico a 5% (v/v).
A curva analítica para a quantificação dos elementos minerais Cu e Zn foi
preparada com diluições seriadas da solução padrão
4
(concentração aferida de
1,000mg L
-1
) em solução de ácido clorídrico 5% (v/v) nas seguintes
concentrações: 0,005; 0,010; 0,025; 0,050; 0,100 e 0,250 mg L
-1
.
Para a quantificação dos elementos minerais Cu e Zn, foi utilizado um
espectrômetro de emissão óptica com plasma de argônio induzido (ICP-OES)
5
.
As condições ótimas para determinação multielementar foram estabelecidas para
o elemento manganês, conforme recomendações do fabricante. Os comprimentos
de onda (nm) usados foram: cobre 324,754 e zinco 206,200. Os parâmetros
instrumentais utilizados estão descritos na Tabela 6.
3
1577b – Bovine Liver do National Institute of Standards and Technology (NIST-USA)
4
Merck ©
5
VARIAN, VISTA-MPX, Mulgrave, Austrália.
22
QUADRO 5. Condições de operação do espectrômetro com configuração axial para
as determinações dos minerais Cu e Zn
Potência do plasma(Kw) 1,0
Gás refrigerante(Ar) (L min
-1
) 15
Gás auxiliar (Ar) (L min
-1
) 1,5
Pressão do nebulizador (kPa) 200
Gerador de rádio freqüência (MHz) 40
Tempo de estabilização (segundos - s) 10
Tempo de leitura (segundos - s) 10
3.7.3) Quantificação de SOD eritrocitária
Optou-se pela determinação da atividade de SOD em eritrócitos lisados,
obtidos de amostras de sangue colhidas dos bezerros durante os seis primeiros
meses de vida. As determinações foram efetuadas em aparelho analisador
bioquímico
6
utilizando-se Kit RANSOD
7
. Considerando o potencial da SOD em
acelerar a dismutação do radical superóxido para peróxido de hidrogênio e água,
o kit empregado baseia-se na utilização de xantina oxidase para a formação de
radicais superóxido. Os radicais superóxido reagem com 2(4-iodofenil) 3(4-
nitrofenol) 5-feniltetrazolium (I.N.T) presente no kit, formando o corante formazan
vermelho. A atividade de SOD pode então ser mensurada indiretamente pelo do
grau de inibição desta reação avaliado ao espectrofotômetro.
Foram utilizadas amostras de sangue colhidas em frascos contendo
heparina como anticoagulante. Tais amostras foram processadas imediatamente
depois de coletadas produzindo-se a hemólise das hemácias. A saber:
- depois de coletadas, as amostras de sangue total (alíquotas de 0,5 ml) foram
centrifugadas por 10 minutos e tiveram a porção de plasma retirada por
aspiração. A porção de células resultante foi então lavada três vezes, com 3,0
mL de solução fisiológica, sob centrifugação por 10 minutos em cada lavagem.
A cada lavagem retirava-se a capa de leucócitos resultante para que apenas as
hemácias fossem aproveitadas. Após as três lavagens, as hemácias receberam
dois mL de água destilada e foram então mantidas por 15 minutos a 4
o
C para
que ocorresse a hemólise do material.
- a porção de hemácias hemolizadas de cada amostra foi então estocada a –
6
Aparelho Analisador Bioquímico RaxT Cobas Mias
7
RANSOD Randox Laboratories LTDA. Antrim, Reino Unido.
23
70
o
C até o momento da análise, para conservação de suas características
originais.
- para efetuar o processamento das amostras, utilizou-se o aparelho analisador
bioquímico automático RAxT, regulado conforme as condições de análise
prescritas nas instruções do kit. Os resultados foram apresentados como
Unidade de SOD por grama de hemoglobina (U/g Hb), sendo que a
concentração de hemoglobina nas amostras foi medida na ocasião da colheita,
utilizando-se o contador automático de células
8
.
3.7.4) Titulação de anticorpos em resposta à vacinação.
Optou-se pela metodologia de ELISA para titulação de anticorpos anti-
Clostridium chauvoei proposta por Crichton et al. (1990). A saber:
► Cultivo de Clostridium chauvoei (Antígeno) – Foi utilizado cultivo de Clostridium
chauvoei inativado em formalina e adsorvido ao meio de cultura. A cepa
bacteriana presente no cultivo inativado foi a mesma utilizada para a fabricação
da vacina.
► Soro controle positivo – Utilizou-se um pool de soros colhidos dos animais do
grupo Controle aos 15 dias após o reforço da vacinação (M21).
► Soro controle negativo - Pool de soros colhidos dos bezerros antes que estes
tivessem mamado colostro.
► Anticorpos - Anticorpo produzido por coelho anti-IgG de bovino e marcado com
peroxidase
9
.
► Placas de microtitulação - Alta capacidade de adsorção
10
, 96 poços com fundo
chato.
3.7.4.1) Produção do antígeno
O cultivo de Clostridium chauvoei inativado em formalina e adsorvido ao
meio de cultura foi descongelado em temperatura ambiente. Duas alíquotas de 25
mL do cultivo foram separadas em tubos de fundo cônico. Uma das alíquotas foi
então centrifugada a 3000 G por 20 minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi então
descartado e ao cultivo aderido ao fundo, foi adicionado tampão PBS até atingir
8
Cell-Dyn 3500R Abott
9
DakoCytomation Glostrup, Dinamrca.
10
Nunc Maxisorp Nalg Nunc International
24
25 mL de solução total. Este procedimento foi repetido mais duas vezes com
intuito de lavar as células de Clostridium chauvoei para retirar os resíduos de
cultivo, sem alterar suas propriedades antigênicas. Ao final da última
centrifugação e retirada do líquido sobrenadante, foi adicionado 2,5 mL de tampão
PBS ao pellet resultante.
Foi efetuado o tratamento ultra-sônico das bactérias lavadas. O tubo com
as células foi mantido em gelo e submetido a 15 ciclos de 30 segundos cada
utilizando freqüência de 20 KHz. Após o tratamento ultra-sônico, uma gotícula do
material foi corada pelo método de Gram para confirmação da ruptura das células
bacterianas.
Os 2,5 mL de material tratado por ultra-som foram submetidos à
centrifugação por 10 minutos a 10.000 G sob 4
o
C. O sobrenadante foi descartado
e adicionou-se tampão PBS até atingir volume total de 15 mL. O material foi então
centrifugado novamente e após a retirada do sobrenadante, foi adicionado
tampão PBS até atingir novamente um volume final de solução de 2,5 mL. Os 2,5
mL de solução foram então centrifugados outra vez a 10.000 G por mais 10
minutos sob 4
o
C e o sobrenadante foi separado para ser utilizado como antígeno.
Foi feita a determinação da concentração protéica do sobrenadante da
solução a ser utilizado como antígeno. O teor de proteínas, determinado pelo
método de Bradford, foi de 3,42 mg/mL. A concentração protéica do antígeno
utilizado por Crichton et al. (1990) foi de 1,5 a 3,0 mg/mL.
3.7.4.2) Sensibilização das placas de microtitulação com o antígeno
Crichton et al. (1990) utilizaram solução de antígeno com 20 a 30 g/mL
para sensibilização das placas de microtitulação. Para adequação ao sistema
experimental, os valores citados foram utilizados como referência, porém testou-
se o antígeno nas concentrações de cinco, 10, 20 e 40 g/mL, partindo da
solução original com 3,42 mg/mL. Assim, 100 uL das soluções diluídas do
antígeno foram colocadas nos poços de uma placa de microtitulação. As placas
foram mantidas a 4
o
C overnight para adsorção do antígeno às mesmas. Após
este período, a placa foi lavada três vezes com tampão PBS com 0,05% de
“Tween 20” (PBST) por 60 segundos em cada lavagem. Após os testes, concluiu-
se que a melhor concentração do antígeno era a de 10 g/mL.
25
3.7.4.3) Bloqueio das placas
Utilizou-se tampão carbonato/bicarbonato com 10% de leite em pó
desnatado. A placa recebeu em cada poço 200 L do referido tampão e foi
mantida por 60 minutos a 37
o
C. Após este período a placa foi lavada três vezes
com tampão PBST por 60 segundos em cada lavagem.
3.7.4.4) Adição das amostras de soro dos bezerros
Foram testadas as diluições 1:100, 1:200 e 1:400 (v:v) para as amostras de
soro. As amostras foram diluídas em tampão PBST com 10% de leite em pó
desnatado e em cada poço foram adicionados 100 L de solução diluída de soro.
A placa foi mantida por 60 minutos a 37
o
C para que ocorresse a ligação dos
anticorpos anti-Clostridium chauvoei, presentes no soro dos bezerros, aos
antígenos adsorvidos à placa. Após este período, a placa foi lavada três vezes
com tampão PBST por 60 segundos em cada lavagem. Os testes efetuados
permitiram concluir de que a amostra de soro diluída 400 vezes (v:v) se adequava
melhor ao sistema.
3.7.4.5) Adição do anticorpo anti-IgG de bovino e marcado com peroxidase
A diluição recomendada pelo fabricante do anticorpo foi de 1:1000 (v:v) em
tampão PBST com 10% de leite em pó desnatado. Feita a diluição, 100 L de
solução do anticorpo foram adicionados a cada poço e mantidos por 60 minutos a
37
o
C para que este anticorpo conjugado pudesse se ligar aos anticorpos anti-
Clostridium chauvoei, dos bezerros, que já estavam aderidos indiretamente à
placa. Após este período a placa foi lavada três vezes com tampão PBST por 60
segundos em cada lavagem.
3.7.4.6) Adição do cromógeno ortofenilamina diamina (OPD)
Foi preparada uma solução com 10 mg de OPD em 25 mL de tampão
heparina-fosfato (0,05 M, pH 5). Uma vez preparada esta solução, 10L de
peróxido de hidrogênio foram adicionados. Após rápida homogeneização da
solução resultante, 100 L dela foram adicionados a cada poço da placa e
manteve-se a mesma por 15 minutos sob agitação. Ao final deste tempo, foram
26
adicionados 50 L de solução de ácido clorídrico a 2N em cada poço, para
finalizar a reação. Procedeu-se então a leitura a 492 nm em aparelho leitor
apropriado
11
.
3.7.5) Hemograma
As contagens de hemácias, leucócitos e as determinações dos teores de
hemoglobina foram realizadas em contador automático de células
12
.
O volume globular foi determinado pelo método do microhematócrito
(COLES, 1984), no mesmo dia da colheita. O fibrinogênio foi determinado pela
técnica de precipitação no tubo de microhematócrito a 56
o
C. A proteína total
plasmática foi determinada por refratometria (JAIN, 1986).
3.8) Análise dos resultados
Para as variáveis avaliadas em um só momento (Cu e Zn hepático
materno) foi utilizada a análise de variância para experimento inteiramente
aleatorizado, com cálculo das estatísticas F e P e contrastes entre pares de
médias pelo método de Tukey. Para as variáveis avaliadas em mais de um
momento foi utilizada a análise de perfil (MORRISON, 1967), com os testes das
hipóteses descritas a seguir:
1- Interação entre grupos e momentos: verifica a similaridade (ausência
de interação) ou a não similaridade (presença de interação) entre os
perfis dos três grupos experimentais;
2- Diferença entre grupos no conjunto dos momentos: só será
considerada no caso de ausência de interação (perfis similares) e
verifica se os perfis são iguais ou em níveis diferentes;
3- Diferença entre momentos no conjunto dos três grupos: esta hipótese,
também só será considerada nos casos em que houver similaridade
dos perfis (ausência de interação) e verifica o efeito de momento no
conjunto dos três grupos;
4- Diferença entre grupos em cada momento;
5- Diferença entre momentos, dentro de cada grupo.
11
Multskan EX® Biosystems©
12
Cell-Dyn 3500R Abott
27
Em todas as hipóteses testadas, as estatísticas F calculadas foram
consideradas significativas quando p < 0,05
28
4. Resultados e Discussão
4.1 Níveis hepáticos de cobre das matrizes
Houve diferença entre os níveis de Cu observados nos diferentes grupos
de matrizes (Tabelas 1 e 2). Na ocasião da primeira colheita (março, 2000),
quando as matrizes ainda não haviam sido submetidas às dietas do experimento,
o grupo -Zn, que seria submetido à mineralização insuficiente em Zn já
apresentava os maiores valores de Cu (366,10 ppm) significativamente superiores
aos níveis observados nos animais do grupo -Cu, que seriam submetido à dieta
insuficiente em Cu (254,42 ppm) (Tabela 1). Os valores observados nos animais
do grupo Controle foram intermediários, ou seja, não diferiram significativamente
do grupo -Zn ou -Cu, naquele momento de avaliação (Tabela 2). Cabe salientar
que a distribuição dos animais pelos grupos experimentais foi aleatória, sem
qualquer tipo de direcionamento baseado em análises de minerais. No segundo
momento de avaliação, após seis meses de adaptação às dietas do experimento
(setembro de 2000), observou-se que os níveis de Cu dos grupos Controle e -Zn
foram semelhantes entre si (252,65 e 277,41 ppm) e estatisticamente superiores
aos teores do grupo –Cu (184,01 ppm) (Tabelas 1). Além disto, na terceira
colheita, 12 meses após a segunda, observou-se que o grupo em dieta
insuficiente em Cu também apresentava níveis de Cu inferiores (249,25 ppm) aos
encontrados no grupo -Zn (348,62 ppm), apesar de estatísticamente não diferirem
dos teores do grupo Controle (234,23 ppm) (Tabela 1). Nota-se também que nos
grupos -Zn e -Cu, houve significativa redução dos níveis hepáticos de Cu entre a
primeira (março/chuvas) e a segunda colheita (setembro/seca). Porém, o intervalo
de tempo até a terceira colheita (setembro 2001) foi suficiente para estes níveis
se elevaram significativamente, até alcançarem os valores observados no material
obtido na primeira colheita (Tabela 2). A proximidade entre a terceira colheita e o
parto torna mais difícil a interpretação destes achados. Sabe-se que as vacas
aumentam os estoques hepáticos de micronutrientes durante o terço final da
gestação. Estas reservas formadas servem para suprir as necessidades do
período puerperal, geradas pelo grande aporte de nutrientes para a produção do
colostro e manutenção da lactação (SMART et al., 1983; XIN et al., 1991). Não
foram encontrados níveis hepáticos de Cu inferiores aos considerados normais
por Underwood (1977) (100 a 400 ppm), Fick et al. (1979) (100 a 300 ppm),
29
Graham (1991) (30 a 120 ppm), Marston (1999) (25 a 100 ppm) ou McDowell
(1999) (100 a 300 ppm) em nenhum dos grupos sob diferentes tratamentos.
Pott et al. (1989) também verificaram redução sazonal dos níveis de Cu
hepático dos bovinos, tendo os autores encontrado em novembro (seca), valores
mais baixos deste elemento do que nos meses de fevereiro (chuvas) e maio (fim
das chuvas). Estes achados são semelhantes aos observados nesta pesquisa nas
duas primeiras colheitas. Estes autores embora não tenham encontrado variação
sazonal de Cu nas pastagens, observaram oscilações nos níveis hepáticos.
Segundo Suttle (1986), a estabilidade dos teores de Cu nas pastagens com
variação da concentração hepática é possível devido à diferença na
biodisponibilidade do elemento, causada por fatores climáticos característicos de
cada época do ano.
Moraes et al. (2000), também não observaram deficiência nos níveis
séricos de Cu de 20 vacas aneloradas mantidas em pastos de Brachiaria
decumbens com alta lotação e níveis de Cu considerados abaixo das
necessidades dos bovinos. Essas vacas também estavam em período gestacional
e apresentaram diferenças sazonais dos valores de Cu, atribuídas pelos autores à
estação do ano. Os níveis mais elevados foram observados nos meses com maior
precipitação pluviométrica (março com 1,7 e 0,97mg/dL respectivamente para
novilhas em solo arenoso e argiloso) e os menores foram obtidos durante o
inverno (agosto 0,63 mg/dL nos dois grupos) e início da primavera (outubro 0,51 e
0,61 mg/dL), coincidindo com os resultados desta pesquisa.
.
30
TABELA 1. Médias e desvios padrões dos níveis hepáticos de cobre (ppm) das
matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
Grupos
C1 Mar/2000 C2 Set/2000 C3 Set/2001 Média grupos
Controle
(n=10)
Média
s
290,51
ABa
99,69
252,65
Ab
67,13
234,23
Bb
101,56
259,13
-Zn
(n=10)
Média
s
366,10
Aa
73,70
277,41
Ab
59,92
348,62
Aa
80,79
330,71
-Cu
(n=10)
Média
s
254,42
Ba
64,96
184,01
Bb
51,82
249,25
Ba
61,03
229,23
Média
momentos
303,69 238,02 277,37
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 2. Cobre hepático materno, hipóteses testadas, estatística calculada e
comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 4,64; p<0,05
Interação significativa. Perfis não
similares.
4- Diferença entre grupos em
cada momento
C1: F= 4,97; p<0,05
C2: F= 6,51; p<0,05
C3: F= 5,64; p<0,05
C1: -Zn>-Cu (Contr intermediário)
C2: (Contr =-Zn)>-Cu
C3: -Zn>(Cont=-Cu)
5- Diferenças entre momentos
em cada grupo
Contr: F= 10,67; p<0,05
-Zn: F= 27,83; p<0,05
-Cu: F= 17,54; p<0,05
Contr: C1>(C2=C3)
-Zn: (C1=C3)>C2
-Cu: (C1=C3)>C2
Obs: hipóteses 2 e 3, sem efeito diante do resultado da primeira
0
50
100
150
200
250
300
350
400
C1 Mar/2000 C2 Set/2000 C3 Set/2001
Momentos
Cu hepático materno (ppm)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 1. Gráfico das médias dos níveis hepáticos de cobre (ppm) das matrizes sob
diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
..
31
4.2. Níveis hepáticos de zinco nas matrizes
Não houve diferença significativa entre os níveis medios de Zn observados
nos três grupos, em nenhum dos momentos de avaliação (Controle=85,72; -
Zn=81,86; -Cu=82,94 ppm) (Tabelas 3 e 4). Nota-se também, que a despeito das
dietas, os níveis de Zn mais elevados foram obtidos na última colheita, em todos
os grupos (-Cu=90,12 e Controle=79,71=-Zn=80,68 ppm) (Tabelas 3 e 4). Além
disto, os valores médios observados nos diferentes grupos estão dentro do
intervalo de valores considerados normais por Graham (1999). Entretanto, todas
as médias das amostras obtidas durante a primeira e segunda colheita estiveram
abaixo dos valores citados como adequados por Fick et al. (1979) (84 a 132 ppm).
Até mesmo os animais do grupo -Cu apresentaram valores considerados
inferiores ao adequado por este critério. A média geral dos resultados das duas
primeiras colheitas esteve abaixo do intervalo de valores considerado normal por
Fick et al. (1979). Todas as médias obtidas estão abaixo dos níveis considerados
adequados por Underwood (1977) (> 125 ppm). Apesar disto, segundo Marston
(1999), apenas valores entre 25 e 40 ppm podem ser considerados indicativos de
deficiência marginal e níveis indicativos de deficiência, somente abaixo dos 25
ppm.
As diferenças significativas entre as médias obtidas durante a primeira
(março de 2000) e a segunda colheita (setembro de 2000) em relação aos valores
observados na terceira (setembro 2001) podem não estar refletindo
adequadamente o estado nutricional de zinco no momento avaliado (Tabela 4).
Pela proximidade do parto os níveis hepáticos de zinco podem ter sido afetados.
O acesso à deficiência de Zn através da medição dos níveis deste mineral
nos tecidos é extremamente complicado devido à falta de um órgão responsável
pelo armazenamento deste elemento (McDOWELL, 1999; TOKARNIA, 2000).
Outra dificuldade é a constante alteração na distribuição de zinco através dos
compartimentos orgânicos, principalmente em resposta à fase aguda das
infecções. Este efeito é mediado pela interleucina-1, que regula a transcrição da
metalotioneína (proteína transportadora de Zn). Ocorre a rápida mobilização de
Zn da circulação para o espaço intracelular no fígado, timo e medula óssea
(KEUSCH, 1994).
32
TABELA 3. Médias e desvios padrões dos níveis hepáticos de zinco (ppm) das
matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
Grupos
C1 Mar/2000 C2 Set/2000 C3 fev/2001 Média grupos
Controle
(n=10)
Média
s
82,42
Ab
11,64
82,60
Ab
6,22
92,13
Aa
11,60
85,72
-Zn
(n=10)
Média
s
73,58
Ab
22,26
79,11
Ab
3,41
92,88
Aa
9,55
81,86
-Cu
(n=10)
Média
s
83,13
Ab
16,42
80,32
Ab
5,43
95,35
Aa
9,76
82,94
Média
momentos
79,71 80,68 90,12
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 4. Zinco hepático materno, hipóteses testadas, estatística calculada e
comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 1,33; p>0,10
Não houve interação
significativa. Perfis similares.
2- Diferença entre grupos no
conjunto dos momentos
F= 0,75; p>0,10
Não houve diferença
significativa. Perfis iguais (Contr
= -Zn = -Cu)
3- Diferenças entre momentos
no conjunto dos grupos
F= 7,21; p<0,05
Existe efeito dos momentos.
(C1=C2)<C3.
Obs: hipóteses 4 e 5 sem efeito diante do resultado das demais.
0
20
40
60
80
100
C1 Mar/2000 C2 Set/2000 C3 Fev/2001
Momentos
Zn hepático materno (ppm)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 2. Representação gráfica das médias dos níveis hepáticos de zinco (ppm) das
matrizes sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (C1 a C3)
33
4.3. Níveis hepáticos de cobre e zinco nos bezerros
Cobre: avaliados aos 150 dias de vida, o animais do grupo -Zn apresentaram
níveis de Cu significativamente superiores (434,93 ppm) aos do grupo controle,
(323,61 ppm) que, por sua vez, foram maiores do que os observados no grupo -
Cu (173,30 ppm) (Tabelas 5 e 6). Cabe salientar que o elemento Zn exerce efeito
antagônico à biodisponibilidade de Cu (MARSTON, 1999; McDOWELL, 1999;
TOKARNIA, 2000). Assim, a menor oferta de Zn na dieta do grupo -Zn pode ter
sido responsável pelos elevados níveis de Cu, observados neste grupo,
explicando a ocorrência de valores superiores aos obtidos pelo grupo controle.
Nos bezerros também não foram evidenciados níveis hepáticos compatíveis com
deficiência pelos padrões de Underwood (1977), Graham (1991) (10 a 25 ppm),
Marston (1999) (5 a 25 ppm) ou McDowell (1999) (25 a 75 ppm) em nenhum dos
grupos sob diferentes tratamentos. É importante destacar que, apesar da falta de
suplementação de Cu no grupo -Cu não ter ocasionado deficiência, houve
diferenças significativas entre os níveis hepáticos de Cu dos grupos sob
diferentes tratamentos (Tabela 6). Tal ocorrência merecia ser avaliada por um
período de tempo mais prolongado, que permitisse maiores conclusões sobre os
mecanismos compensatórios dos animais e sobre a eficácia dos tratamentos
propostos para ocasionar deficiência marginal de Cu ou Zn.
Este dado indica que os bezerros acompanharam a tendência materna e
demonstra a importância do estado nutricional materno durante a gestação para a
formação das reservas hepáticas fetais, conforme já demonstrado por Kume e
Tanabe (1983), Smart et al. (1983) e Xin et al. (1993) (Tabelas 4 e 6).
Suttle (1986) relata que a proporção dietética segura de Cu:Mo é variável
dependendo da pastagem, sendo que McDowell (1999) considera segura a
manutenção de bovinos em pastagens com 6 ppm de cobre quando os níveis de
molibdênio não ultrapassam 1,5 ppm, condições estas, próximas às deste
experimento (Cu: 6,0 ppm ; Mo: 2,0 ppm). Por outro lado, os elevados níveis de
ferro da pastagem (153 ppm), associados à taxa de crescimento acelerada dos
animais durante o período avaliado, poderiam ter contribuído de forma mais
significativa para o estabelecimento de deficiência no grupo sem suplementação.
A ingestão de outras espécies de plantas, que não a Brachiaria
decumbens, pode ter contribuído para manutenção dos teores hepáticos de
34
cobre. Esta possibilidade foi discutida nos experimentos de Brum et al. (1987) e
Pott et al.(1989a), que não observaram níveis hepáticos de cobre compatíveis
com deficiência, apesar das pastagens não suprirem as necessidades dos
bovinos.
Zinco: Não houve diferenças significativas entre valores de Zn observados nas
amostras colhidas dos animais dos três grupos (Controle= 79,78; -Zn= 79,20 e -
Cu=80,53 ppm) (Tabelas 5 e 6).
Os valores hepáticos de zinco obtidos neste experimento apresentam-se
normais quando comparados com os descritos por Graham (1991) (40 a 100
ppm). Todas as médias ficaram abaixo dos padrões de normalidade de acordo
com Fick et al. (1979) (84 a 134 ppm). Segundo o critério de Underwood (1977)
todas as médias, de todos os grupos, podem ser consideradas deficientes (< 125
ppm).
A comparação das médias dos três grupos não indicou diferenças
significativas (Tabela 6). A discrepância dos valores hepáticos quando
comparados com os níveis dietéticos, também foi observada nos estudos de Pott
et al. (1989a, 1989b), Brum et al. (1987) e Borges (2001).
Os bezerros seguiram a tendência materna não apresentando diferenças
significativas entre os grupos.
35
TABELA 5. Médias e desvios padrões dos níveis hepáticos de cobre e zinco (ppm) de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e aos 150 dias de idade (M6)
Grupos
Cu hepático (ppm) Zn hepático (ppm)
Controle
(n=10)
Média
s
323,61
B
26,73
79,78
A
7,08
-Zn
(n=10)
Média
s
434,93
A
211,56
79,20
A
4,90
-Cu
(n=10)
Média
s
173,30
C
51,54
80,53
A
11,11
Médias
310,62
163,78
79,84
7,90
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
TABELA 6. Cobre e zinco hepático dos bezerros aos 150 dias de idade (M6), hipóteses
testadas, estatísticas calculadas e comentários
Hipótese (Cu hepático) Estatística (Cu hepático) Comentário (Cu hepático)
Diferença entre grupos no M6
F= 10,75 ; p<0,05 -Zn>Contr>-Cu
Hipótese (Zn hepático) Estatística (Zn hepático) Comentário (Zn hepático)
Diferença entre grupos no M6
F= 0,19; p>0,50 Contr=-Zn=-Cu
0
100
200
300
400
500
M6 (150 d.)
Cu hepático bezerros (ppm)
Controle - Zn - Cu
0
20
40
60
80
100
M6 (150 d.)
Zn hepático bezerros (ppm)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 3 e 4. Representações gráficas das médias dos níveis hepáticos de cobre ou
zinco (ppm) sob diferentes tratamentos aos 150 dias de idade (M6)
36
4.4 Níveis séricos de cobre nos bezerros
Não houve diferença significativa entre os valores observados nos animais
dos três grupos em nenhum dos momentos de avaliação (M7, M15 e M21)
(Tabelas 7 e 8).
A única ocorrência, digna de nota, foi a acentuada média obtida no material
do grupo -Zn, imediatamente antes do reforço (M15) (Tabela 7).
Todas as médias das concentrações séricas de cobre, dos três grupos,
com exceção da citada no parágrafo anterior, podem ser consideradas indicativas
de deficiência marginal segundo Fick et al. (1979) (0,6 mg/L ou < 0,7 mg/L) e
deficientes segundo McDowell (1999) (< 0,65 mg/L).
Comparando os teores de cobre hepático e sérico com os valores
adequados citados por Fick et al. (1979) (hepático 100 a 300 ppm e sérico 0,7 a
1,4 mg/L) e McDowell (1999) (hepático > 75 ppm e sérico > 0,65 mg/L) observa-
se que, apesar dos níveis hepáticos observados nos bezerros serem
considerados adequados, os valores séricos, quando confrontados com os dados
dos mesmos autores, se enquadram no intervalo de valores que caracteriza a
deficiência. Este dado ilustra a baixa correlação entre os níveis hepáticos e
séricos de cobre, como já citada anteriormente por Suttle (1986). Este autor
apontou a ausência de correlação entre os níveis hepáticos e séricos e
preconizaram a priorização dos níveis hepáticos para o diagnóstico das
deficiências de cobre. Também observou teores hepáticos de cobre considerados
normais em animais que apresentavam valores séricos considerados deficientes.
Borges (2001) também não observou correlação positiva entre os níveis séricos e
hepáticos de cobre nas novilhas Nelore, mães dos bezerros desta pesquisa.
37
TABELA 7. Médias e desvios padrões dos níveis séricos de cobre (ppm) dos bezerros
sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7, M15 e M21)
Grupos
M7
Antes da vacina
M15
antes do reforço
M21
15 d. após reforço
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
0,621
Aa
0,112
0,642
Aa
0,121
0,660
Aa
0,181
0,641
-Zn
(n=10)
Média
s
0,604
Ab
0,110
0,809
Aa
0,353
0,593
Ab
0,161
0,669
-Cu
(n=10)
Média
s
0,581
Aa
0,085
0,600
Aa
0,052
0,629
Aa
0,104
0,603
Média
momentos
0,602 0,684 0,627
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 8. Cobre sérico dos bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e
comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 2,58; p<0,05
Interação significativa. Perfis não
similares.
4- Diferença entre grupos em
cada momento
M7: F= 0,39; p>0,5
M15: F= 2,58; p>0,05
M21: F= 0,50; p>0,5
M7: Contr=-Zn=-Cu
M15: Contr=-Zn=-Cu
M21: Contr=-Zn=-Cu
5- Diferenças entre momentos
em cada grupo
Contr: F= 0,82; p>0,10
-Zn: F= 8,44; p<0,05
-Cu: F= 1,24; p>0,10
Contr: M7=M15=M21
-Zn: (M7=M21)<M15
-Cu: M7=M15=M21
Obs: hipóteses 2 e 3, sem efeito diante do resultado da primeira.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
M7 vacina M15 antes reforço M21 15 d. pós
reforço
Momentos
Cu sérico bezerros (ppm)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 5. Representação gráfica das médias dos níveis séricos de cobre (ppm) dos
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7,
M15 e M21)
38
4.5. Níveis séricos de zinco nos bezerros
Não houve diferenças significativas entre valores médios de Zn observados
nas amostras colhidas dos animais dos três grupos em nenhum dos momentos
(Médias dos grupos: Controle= 1,906; -Zn= 1,822; -Cu=1,606 mg/L) (Tabelas 9 e
10). Entretanto, observou-se acentuada redução entre as médias dos animais dos
três grupos na última colheita (0,578 mg/L em M21, 15 dias após o reforço
vacinal) em relação às duas anteriores (antes da vacina M7=2,224 e antes do
reforço M15=2,532 mg/L) (tabela 10). Os níveis observados na última colheita
podem ser considerados indicativos de deficiência marginal segundo o critério de
Graham (1991) (0,4 a 0,8 mg/L) e Marston (1999) (0,5 a 0,6 mg/L). Tal redução
pode ter ocorrido por estresse dos animais, devido ao intenso manejo durante o
período final de colheitas. Este efeito do estresse sobre os níveis séricos de zinco
já foi descrito por outros autores (Keusch, 1994).
Os teores séricos de zinco encontrados neste estudo estavam dentro da faixa de
normalidade proposta por Fick (1979) (0,5 a 1,2 mg/L); Graham (1991) (0,8 a 1,4
mg/L); Marston (1999) (> 0,6 mg/L) e McDowell (1999) (> 0,8 mg/L).
39
TABELA 9. Médias e desvios padrões dos níveis séricos de zinco (ppm) dos bezerros
sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7, M15 e M21)
Grupos
M7
Antes da vacina
M15
antes do reforço
M21
15 d. após reforço
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
2,142
Aa
1,791
2,706
Aa
0,960
0,871
Ab
0,856
1,906
A
-Zn
(n=10)
Média
s
2,281
Aa
2,265
2,784
Aa
0,939
0,401
Ab
0,508
1,822
A
-Cu
(n=10)
Média
s
2,249
Aa
1,366
2,106
Aa
0,383
0,463
Ab
0,594
1,606
A
Média
momentos
2,224
a
2,532
a
0,578
b
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 10. Zinco sérico bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e
comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 0,46; p>0,50
Não houve Interação
significativa. Perfis similares.
2- Diferença entre grupos no
conjunto dos momentos
F= 0,57; p>0,50
Controle=-Zn=-Cu
3- Diferenças entre momentos
no conjunto dos grupos
F= 21,83; p<0,05 (M7=M15)>M21
Obs: hipóteses 4 e 5 sem efeito diante do resultado das demais.
0
1
2
3
M7 antes vacina M15 antes reforço M21 15 d. pós
reforço
Momentos
Zn sérico bezerros (ppm)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 6. Representação gráfica das médias dos níveis séricos de zinco (ppm) dos
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
(M7, M15 a M21)
40
4.6. Superóxido dismutase (SOD)
Avaliada como indicador indireto do metabolismo oxidativo dos bezerros e
como um dos parâmetros para averiguar a eficiência da transmissão de
micronutrientes maternos para os bezerros. Não houve diferença significativa
entre as médias observadas nos diferentes grupos, na maioria dos momentos
(tabelas 11 e 12). Apenas durante a primeira colheita se evidenciou média mais
elevada de SOD no grupo controle (Tabela 11). Entretanto, esta média elevada
deveu-se à presença de valores individuais discrepantes, que elevaram a média
durante este momento (Tabela 11). Cabe salientar que os níveis de SOD
observados foram compatíveis com valores considerados adequados por Xin et
al. (1985). A SOD eritrocitária quantificada neste trabalho não se compõe apenas
pela fração Cu/Zn-SOD, mas também pela Mn-SOD. Assim, outros
micronutrientes além do Cu e do Zn estão relacionados direta ou indiretamente
aos níveis desta enzima.
A não ocorrência de decréscimo nos níveis de SOD também ocorreu nos
experimentos de Ward et al. (1993); Niederman et al. (1994); Torre et al. (1995) e
ainda no experimento conduzido por Dorton et al. (2003). Assim como no
presente experimento, os pesquisadores anteriormente mencionados também
atribuíram este achado à inexistência de níveis hepáticos de Cu, compatíveis com
deficiência.
Segundo Minatel e Carfagnini (2000) a SOD eritrócitária é uma das últimas
enzimas a sofrer algum decréscimo de atividade em função dos níveis de Cu.
Xin et al. (1993) correlacionaram a redução dos níveis de SOD eritrocitária
apenas à períodos prolongados de deficiência de Cu. Entretanto, quando dietas
semipurificadas, com baixos níveis de Cu, foram utilizadas em outros estudos,
ocorreu a significativa redução da atividade da SOD eritrocitária em relação aos
animais suplementados com Cu (ANDREWARTHA E CAPLE, 1980; JONES E
SUTTLE, 1981; XIN ET AL., 1991).
41
TABELA 11. Médias e desvios padrões da concentração de superóxido dismutase
(SOD U/g Hb) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M1 a M6)
Grupos
M1
Até 1 sem
M2
1 mês
M3
2 meses
M4
3 meses.
M5
4 meses
M6
5 meses
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
6888,5
Aa
1819,1
3541,7
Ac
1009,5
3248,8
Ac
944,0
3173,9
Ac
545,4
3927,1
Ab
950,8
3342,7
Ac
748,1
4020,5
-Zn
(n=10)
Média
s
4475,7
Ba
933,8
3322,2
Ac
847,7
2814,4
Ac
342,9
3454,5
Ac
577,5
3865,9
Ab
1662,8
3619,6
Ac
993,8
3592,1
-Cu
(n=10)
Média
s
4314,7
Ba
1468,2
3079,2
Ac
466,5
2743,8
Ac
342,8
3071,7
Ac
304,7
3406,2
Ab
665,3
3309,0
Ac
588,4
3320,8
Média
momentos
4458,3 3005,6 2645,4
3279,5 3582,6 3363,1
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 12. Concentração de superóxido dismutase (SOD U/g Hb) dos bezerros,
hipóteses testadas, estatística calculada e comentários (análise de
perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre
grupos e
momentos
F= 3,33; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças entre
grupos em cada
momento
M1: F= 12,28; p<0,05 M2: F= 1,20; p>0,10
M3: F= 2,80; p>0,05 M4: F= 1,62; p>0,10
M5: F= 0,66; p>0,50 M6: F= 0,43; p>0,50
M1: Controle>(-Zn=-Cu)
M2 a M6: Contr=-Zn=-Cu
5- Diferenças entre
momentos dentro
de cada grupo
M1: F= 44,64; p<0,05
M2: F= 11,37; p<0,05
M3: F= 7,70; p<0,05
Contr: B1>(B2=B5)>(B3=B4=B6)
-Zn: (M1=M2=M4=M5=M6)>B3
-Cu: B1>B3 (M2=M4=M5=M6)
Obs: hipóteses 2 e 3 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
2000
4000
6000
8000
10000
M1
1s.
M2
1m.
M3
2m.
M4
3m.
M5
4m.
M6
5m.
Momentos
Superóxido dismutase
(SOD U/g Hb)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 7. Representação gráfica da concentração de superóxido dismutase (SOD U/g
Hb) de bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M1
a M6)
42
4.7. Índice ELISA Anticorpos anti-Clostridium chauvoei (passivos/colostral)
Não houve diferença significativa entre os níveis de anticorpos anti-C
chauvoei dos distintos grupos nos diferentes momentos de avaliação (Tabelas 13
e 14). Nota-se a redução seqüencial e significativa dos títulos de anticorpos até o
quarto mês de idade dos bezerros, sendo bastante acentuada nos primeiros dois
meses de vida (Tabela 14). O objetivo destas avaliações foi verificar se os
bezerros receberam ou absorveram quantidades diferentes de anticorpos
maternos. Também se objetivou checar a ocorrência eventual de contato com
antígenos de C chauvoei que pudessem ter ocasionado resposta humoral nestes
animais, antes deles receberem a primeira dose da vacina. Nota-se, pelo
decréscimo constante dos títulos de anticorpos, que não houve estimulação
antigênica que levasse à produção de anticorpos pelos bezerros.
Deve-se correlacionar a ausência de diferenças significativas entre os
níveis de anticorpos colostrais dos três grupos com os níveis de Cu e Zn das
matrizes (Tabelas 1, 2, 3, 4, 13 e 14). Apesar das diferenças significativas
observadas entre os teores de Cu nos diferentes grupos de matrizes, todas as
médias hepáticas de Cu estiveram muito acima dos níveis indicativos de
deficiência (5 a 25 ppm, conforme Marston (1999) e 10 a 25 ppm por Graham
(1999)) (Tabelas 1 e 2). Além disto, os níveis hepáticos de zinco, apesar de
estarem um pouco abaixo dos valores considerados adequados por Fick et al.
(1979), estão dentro do padrão de normalidade proposto por Graham (1991), bem
acima dos níveis indicativos de deficiência marginal (25 a 40 ppm) (Tabela 3).
Assim, pode-se considerar que as matrizes utilizadas neste experimento, mesmo
as submetidas a dietas insuficientes em Cu e Zn, mantiveram estoques hepáticos
destes nutrientes, que permitiram a produção adequada de imunoglobulinas.
43
TABELA 13. Médias e desvios padrões do índice ELISA para os anticorpos anti-
Clostridium chauvoei (passivos) de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M1 a M6)
Grupos
M1
Até 1 sem
M2
1 mês
M3
2 meses
M4
3 meses.
M5
4 meses
M6
5 meses
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
1,018
Aa
0,360
0,452
Ab
0,351
0,116
Ac
0,115
0,080
Ad
0,073
0,016
Ae
0,020
0,012
Ae
0,038
0,282
A
-Zn
(n=10)
Média
s
0,962
Aa
0,418
0,358
Ab
0,139
0,065
Ac
0,048
0,031
Ad
0,029
0,015
Ae
0,025
0,014
Ae
0,030
0,240
A
-Cu
(n=10)
Média
s
1,019
Aa
0,413
0,332
Ab
0,238
0,111
Ac
0,187
0,089
Ad
0,105
0,022
Ae
0,050
0,019
Ae
0,046
0,265
A
Média
momentos
0,999
a
0,380
b
0,097
c
0,066
d
0,018
e
0,015
e
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 14. Índice ELISA para os Ac. anti-Clostridium chauvoei (passivos) dos
bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e comentários
(análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos
e momentos
F= 1,33; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Diferença entre grupos
no conjunto dos
momentos
F= 0,75; p>0,10
Não houve diferença significativa.
Perfis iguais (Controle=-Zn=-Cu)
3- Diferenças entre
momentos no conjunto
dos grupos
F= 7,21; p<0,05
Existe efeito dos momentos. M1>M2>
M3>M4>(M5=M6).
Obs: hipóteses 2 e 3 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
0,25
0,5
0,75
1
M1
1s.
M2
1m.
M3
2m.
M4
3m.
M5
4m.
M6
5m.
Momentos
Índice Elisa Ac
Clostridium chaouvei
(colostro)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 8. Representação gráfica das médias do índice ELISA para os anticorpos anti-
Clostridium chauvoei (colostrais) de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M0, M6, M7, M8 e M14)
44
4.8. Índice ELISA Anticorpos anti-Clostridium chauvoei (vacina)
Nota-se que o grupo -Cu, que detinha os menores níveis hepáticos de Cu
apresentou os menores títulos de anticorpos 15 dias após a vacinação (M13), não
havendo diferenças entre o grupo Controle e o grupo -Zn, detentor dos maiores
níveis hepáticos de Cu aos 150 dias de vida (M6) (Tabelas 15 e 16). Além disto,
aos 21 dias após a vacinação (M14) os títulos do grupo Controle estavam
significativamente mais elevados do que os observados nos grupos -Zn e -Cu,
mostrando a maior competência dos animais em dieta adequada para a produção
de anticorpos (Tabelas 15 e 16). Aos trinta e seis dias após a primeira vacinação
e imediatamente antes da segunda dose (M15), os títulos de anticorpos dos
animais de todos os grupos estavam estatisticamente semelhantes. Entretanto, 15
dias após o reforço vacinal (M21) pôde-se constatar, mais uma vez, a diferença
entre os títulos de anticorpos dos três grupos de animais. O grupo controle
apresentou os maiores títulos, seguido pelo grupo -Zn, composto por animais
alimentados com níveis insuficientes de Zn (Tabela 16). Os animais do grupo -Cu,
cuja dieta continha níveis insuficientes de Cu, e por conseqüência, apresentaram
os menores níveis hepáticos do mineral, apresentaram também os menores
títulos de anticorpos anti-C chauvoei neste momento de avaliação (Tabela 5 e 6).
Considerando a ausência de diferenças significativas entre os níveis
séricos de Zn, dos animais dos três grupos experimentais em todos os momentos
avaliados (Tabelas 5 e 6), tais observações devem ser analisadas considerando-
se as diferenças nos níveis de Cu. Cabe salientar que, apesar das diferenças
significativas entre os teores hepáticos de Cu dos bezerros, nenhuma das médias
esteve próxima de valores indicativos de deficiência (Tabela 5 e 6).
Nota-se que a última colheita após o reforço da vacina (M21) foi efetuada
15 dias após sua administração e não aos 21 dias como na primeira aplicação de
vacina. Esta decisão baseou-se no fato de que as respostas imunológicas ao
reforço de vacinal desenvolvem-se de maneira distinta, produzindo uma grande
quantidade de anticorpos num espaço de tempo mais curto.
Diferentes autores investigaram o efeito da deficiência de Cu sobre a
resposta imune humoral de bovinos e obtiveram resultados variados. Stabel et al.
(1993) observaram títulos de anticorpos contra o vírus da rinotraqueíte infecciosa
bovina (IBRV), mais elevados em bezerros que receberam nutrição insuficiente
45
em Cu do que naqueles que receberam suplementação do referido elemento.
Nesse mesmo experimento, os autores não encontraram diferenças significativas
entre os títulos de anticorpos contra-Pasteurella haemolytica em bezerros sob
nutrição insuficiente ou suplementada em Cu. Entretanto, os bezerros
suplementados com Cu apresentaram tendência aos maiores títulos de anticorpos
anti-Pasteurella haemolytica, quando comparados aos obtidos pelos animais sem
suplementação. Esse estudo, de cinco meses de duração, foi conduzido com 14
novilhas da raça Holandesa com aproximadamente 30 dias de idade, submetidas
à uma dieta insuficiente em Cu (1. 5 ppm), ou suplementada com 10 ppm deste
mineral. Os níveis hepáticos de Cu dos animais que receberam suplementação
deste elemento (61 ± 23 ppm) foram significativamente superiores aos dos
animais sob nutrição insuficiente (7,4 ± 2,5 ppm). Esses níveis hepáticos de Cu
são muito menores que os obtidos nesta presente pesquisa, tornando difícil a
comparação direta entre os resultados. Nota-se a presença de níveis hepáticos de
Cu indicativos de deficiência, conforme as referências de Graham (1991) (< 10
ppm) e Marston (1999) (0.5-10 ppm). Segundo Mc Dowell (1999) (25-75 ppm), até
mesmo os grupos que receberam suplementação de Cu apresentaram níveis
hepáticos indicativos de deficiência.
Ward et al. (1997) conduziram experimentação para determinar o efeito
da deficiência de Cu, com ou sem a presença de altos níveis nutricionais de Mo
ou Fe, sobre a imunidade específica de bezerros. Estes autores utilizaram 38
bezerros, nascidos de vacas mantidas sob dietas experimentais controladas,
desde o último terço da gestação até o desmame de suas crias. Dietas não
suplementadas com Cu resultaram em níveis plasmáticos indicativos de
deficiência, de acordo com os padrões de Underwood (1981) (<0,5 mg/L).
Bezerros que não receberam suplementação de Cu (0,30 mg/L de Cu plasmático)
obtiveram títulos de anticorpos, em resposta à segunda inoculação de PRBC,
significativamente mais elevados do que os grupos suplementados com Cu, Mo e
Fe aos 14 e 21 dias após a inoculação (respectivamente 0.68 mg/L, 0.35 mg/L
and 0.22 mg/L de Cu plasmático). Não houve diferença significativa entre os
títulos de anticorpos dos diferentes grupos na primeira inoculação. A dieta basal
continha 1.5 ppm de Cu e os grupos foram suplementados com 10 ppm de Cu; 5
ppm de Zn e 600 ppm de Fe.
46
Cerone et al. (1995) alimentaram novilhas da raça Aberdeen Angus com
uma dieta contendo excesso de Mo e S por nove meses com o objetivo de induzir
deficiência de Cu. Estas novilhas foram então vacinadas com a cepa viva S1119
de Brucella abortus. Em resposta, estes autores observaram redução dos níveis
séricos de cobre (aproximadamente 0,4 mg/L de Cu sérico, quatro meses após o
início das dietas do experimento) e da atividade da ceruloplasmina. Níveis séricos
totais de imunoglobulina G e complemento também foram reduzidos pelos baixos
níveis orgânicos de Cu, quando comparados aos do grupo controle. Títulos de
anticorpos contra Brucella abortus e proliferação de células mononucleares
periféricas em resposta à Concanavalina A foram significativamente menores nas
bezerras deficientes em cobre do que no grupo controle. Seguindo a mesma
linha, Cerone et al. (1998) observaram redução da capacidade dos neutrófilos em
reduzir nitroblue tetrazólium - NBT e fagocitar eritrócitos ovinos em bovinos com
deficiência de cobre secundária, induzida por molibdênio e enxofre. Também foi
encontrada redução significativa do número de linfócitos B, sem redução da
contagem total de linfócitos e 50% de decréscimo nos níveis de ceruroplasmina
dos animais deficientes, quando comparados aos do grupo controle.
Estes dois autores previamente mencionados utilizaram apenas níveis
plasmáticos ou séricos como indicadores do estado nutricional de Cu. Além disto,
utilizaram antagonistas de Cu para induzir deficiência. Sabe-se que a deficiência
secundária de Cu, induzida pelo excesso de antagonistas, costuma ocasionar
sintomas mais graves. Estes pontos são diferentes da metodologia adotada nesta
presente pesquisa e podem ter influenciado adversamente a interpretação dos
resultados daqueles trabalhos.
Dorton et al. (2003) utilizaram 48 novilhas da raça Aberdeen Angus, com
aproximadamente 7 meses de idade, para determinar os efeitos das fontes de Cu
e suas concentrações sobre a resposta imune. As novilhas receberam dieta
contendo 7.1 ppm de Cu por 56 dias e depois, por mais 144 dias, receberam dieta
com 6.1 ppm de Cu. Os grupos que receberam dieta suplementada com 10 ppm
de Cu obtiveram, aos 14 dias após a inoculação de PRBC, títulos mais elevados
de anticorpos do que os grupos que receberam suplementação com 20 ppm de
Cu. Aos 14 dias após a segunda inoculação de PRBC os grupos suplementados
com 20 ppm de Cu obtiveram títulos mais elevados do que os obtidos pelos
grupos suplementados com 10 ppm deste mineral e animais não suplementados.
47
Entretanto, 21 dias após a segunda inoculação de PRBC os títulos de anticorpos
obtidos pelos animais não suplementados foram superiores aos observados nos
grupos suplementados. Por outro lado, resultados diferentes foram observados
com a inoculação de ovalbumina (OVA) nos animais. Aos 14 e 21 dias após a
inoculação de OVA, as novilhas que receberam 20 ppm de Cu obtiveram títulos
mais elevados de anticorpo do que os animais que receberam 10 ppm deste
mineral. Novilhas que receberam 20 ppm de Cu, de fontes orgânicas, obtiveram
maiores títulos de anticorpo do que as que receberam o mesmo teor deste
mineral, oriundo de fontes inorgânicas (sulfato de cobre). As novilhas que não
receberam suplementação obtiveram os títulos de anticorpos mais baixos. Aos
112 dias do expermento, quando os animais receberam a segunda dose de PRBC
e a única de OVA, os grupos estavam com os seguintes níveis hepático de Cu:
grupo sem suplementação - 37,4 ppm (deficiência marginal conforme Mc Dowell
(1999) (25-75 ppm); grupo 10 ppm de Cu - 113,9 ppm; grupo 20 ppm de Cu -
116,9; grupo 10 ppm de Cu (fontes orgânicas) – 94,8 ppm e grupo 20 ppm de Cu
(fontes orgânicas): 194,6 9 (adequado conforme Underwood (19991); Marston
(1999); Mc Dowell (1999)). Para estes autores, os efeitos da suplementação de
Cu sobre a resposta imune dos animais são variados e dependem da classe de
célula imune que está sob estudo, assiim como da fonte e concentração de Cu
suplementar. Células B tendem à aumentar à resposta imune primária ou
secundária em resposta à suplementação. Quando um antígeno com grande
capacidade antigênica é administrado, a maior suplementação de Cu, resulta em
títulos mais elevados. Os autores também mencionaram que as diferenças entre
os resultados obtidos por vários pesquisadores se deve à influência do tipo de
estimulação antigênica. Nesse caso, os autores atribuíram importância ao uso do
“adjuvante completo de Freund” para aumentar o estímulo antigêncio da OVA,
induzindo formação de granuloma, melhor processamento do antígeno e
apresentação para células T.
Nesta presente pesquisa, não houve níveis de Cu indicativos de
deficiência. Entretanto, o grupo –Cu, com níveis de hepáticos de Cu
significativamente menores, também apresentou títulos de anticorpos
significativamente inferiores aos dos outros grupos. Embora os níveis hepáticos
de Cu do grupo –Zn tenham sido os mais elevados, os títulos de anticorpos deste
grupo foram significativamente inferiores aos obtidos pelo grupo Controle, em
48
nutrição adequada (Tabelas 5 e 6). Estes resultados indicam a vantagem da
nutrição mineral adequada e bem balanceada em todos os nutrientes, para
prevenir disfunções imunológicas. É importante mencionar que os níveis de Cu
hepático, observados neste presente estudo, até mesmo nos animais sob nutrição
insuficiente foram superiores (173.30 51.54 ppm) às referências de Mc Dowell
(1999) (27 – 75 ppm), Marston (1999) (5 – 25 ppm) e Graham (1991) (10 – 25
ppm) para deficiência marginal. Neste sentido, os altos níveis de hepáticos de Cu
alcançados pelos animais do grupo –Zn, possivelmente pela falta do elemento
antagonista Zn, podem ter ocasionado algum efeito negativo à produção de
anticorpos (Tabelas 5 e 6). Os altos níveis de Cu podem ter reduzido a
biodisponibilidade de outros minerais, tais como Se e Mn, também importantes
para a resposta imune dos bovinos (Tabelas 5 e 6). Cabe salientar que outros
pesquisadores observaram menores títulos de anticorpos em grupos de bovinos
suplementados com Cu, em comparação com outros sob nutrição insuficiente em
Cu e até mesmo em animais deficientes. Além disto, é importante ressaltar que os
os teores teciduais de Cu e Zn obtidos nesta pesquisa não foram induzidos por
suplementação com elevados nívieis de elementos antagonistas. Estas
condições, somadas às diferenças raciais, tornam difícil a comparação direta
entre os resultados obtidos por outros pesquisadores.
49
TABELA 15. Médias e desvios padrões do índice ELISA para anticorpos anti-
Clostridium chauvoei em resposta à vacinação dos bezerros sob
diferentes tratamentos e momentos de avaliação
Grupos
M7
antes
M13
15 dias
M14
21 dias
M15
Reforço
M21
15 dias pós
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
0,028
Ad
0,044
0,949
Aa
0,248
0,858
Ab
0,234
0,580
Ac
0,194
0,827
Ab
0,200
0,648
-Zn
(n=10)
Média
s
0,047
Ad
0,054
0,924
Aa
0,300
0,696
Bb
0,279
0,538
Ac
0,270
0,733
Bb
0,242
0,587
-Cu
(n=10)
Média
s
0,020
Ad
0,027
0,829
Ba
0,350
0,726
Bb
0,333
0,578
Ac
0,264
0,679
Cb
0,201
0,566
Média momentos
0,030 0,901 0,760 0,565 0,746 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 16. Índice ELISA para os anticorpos anti-Clostridium chauvoei (vacina)
dos bezerros, hipóteses, estatística e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos e
momentos
F= 1,96; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos em
cada momento
M7: F= 1,72; p>0,10 M13: F= 0,56; p>0,50
M14: F= 0,90; p>0,10 M15: F= 1,00; p>0,10
M21: F= 1,08; p>0,10
M7: Contr=-Zn=-Cu M15: Contr=-Zn=-Cu
M13: (Contr=-Zn)>-Cu M21: Contr>-Zn>-
Cu
M14: Contr>(-Zn=-Cu)
5- Diferenças entre
momentos dentro
de cada grupo
G1: F= 7,28; p<0,05
G2: F= 19,92; p<0,05
G3: F= 14,07; p<0,05
Contr: M13>(M14=M21)>M15>M7
-Zn: M13>(M14=M21)>M15>M7
-Cu: M13>(M14=M21)>M15>M7
Obs: hipóteses 2 e 3 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
0,25
0,5
0,75
1
M7
antes
vacina
M13
15 d.
M14
21d.
M15
antes
reforço
M21
15d. Pós
reforço
Momentos
Índice Elisa Ac
Clostridium chaouvei
(vacina)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 9. Representação gráfica das médias do índice ELISA para os anticorpos
anti-Clostridium chauvoei (vacina) de bezerros sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação
50
4.9. Hemograma
Serão comentadas as diferenças significativas entre as médias dos
diferentes grupos para as variáveis do hemograma em que tal efeito foi
observado. Todos os resultados, bem como a respectiva análise estatística estão
dispostos nas tabelas dispostas em seguimento.
Volume globular: foram observadas diferenças significativas entre as médias do
VG dos diferentes grupos, imediatamente antes do reforço vacinal e também aos
dois e três dias após o reforço vacinal (M15, M18 e M19) (Tabelas 19 e 20).
Nestes momentos os valores obtidos pelos animais do grupo -Cu foram os mais
elevados. Apesar das médias de VG do grupo -Cu já estarem mais elevadas
durante o momento imediatamente anterior ao reforço vacinal (M15), tal
ocorrência, relacionada à hemoconcentração, pode significar certo efeito dos
níveis de Cu sobre a resposta à fase aguda das infecções e/ou estresse (manejo
excessivo dos animais durante as colheitas) (COLES, 1986; JAIN, 1991). A
hemoconcentração por estresse pode ser correlacionada à liberação de
hormônios adrenocorticóides. Sendo assim, poderia haver ligação mais evidente
com os níveis orgânicos de Zn. Por outro lado, não houve diferença significativa
entre os níveis hepáticos ou séricos dos diferentes grupos em nenhum dos
momentos de avaliação.
Fibrinogênio: possivelmente as diferenças entre as médias dos grupos
observadas em M1 e M2 não detêm relevância biológica. Imediatamente antes da
vacina (M7), as médias do grupo -Cu estiveram mais elevadas do que as dos
outros grupos (devido a 4 animais que apresentaram valores acentuados), porém,
apenas oito horas após (M8), as médias do grupo -Cu foram as menores (Tabelas
25 e 26).
Leucócitos, neutrófilos e monócitos: verificou-se que as médias do número de
leucócitos do grupo -Cu foram menores do que as do grupo -Zn durante todos os
momentos relacionados ao reforço vacinal (M15 a M21). Nota-se também que as
maiores contagens de leucócitos foram obtidas um dia após o reforço vacinal
(M17) em todos os grupos (tabelas 31 e 32).
Para os neutrófilos, verificou-se que das oito até as 48 hs após o reforço
vacinal (M16, M17 e M18) o grupo -Cu obteve menores médias do que o grupo -
51
Zn. Tal tendência repetiu-se na contagem dos monócitos. As médias do grupo -Cu
foram inferiores às do grupo –Zn, dois dias após o reforço vacinal (M18) e
novamente, aos 15 dias depois do reforço vacinal (M21). Nota-se que dois dias
após o reforço vacinal foram obtidas as maiores médias desta variável em todos
os grupos (Tabelas 35 e 36).
Cerone et al. (1998) estudaram os efeitos da deficiencia induzuda de Cu
sobre as células do sangue periférico de seis bezerras da raça Aberdeen Angus
(5 meses) suplementadas com 30 ppm de Mo e 225 ppm de S. A deficiência
secundária de Cu foi constatada por níveis séricos abaixo de 5,9 Umol/L. Ao
contrário deste presente trabalho, o número total de leucócitos, das bezerras
estudadas por Cerone et al. (1998) não foi afetado pela deficiência de Cu.
Entretanto, a contagem diferencial revelou o significativo aumento do número de
monócitos e redução, também significativa, do número de linfócitos B. Não houve
alteração significativa do número de neutrófilos, entretanto, ocorreu redução da
atividade destes polimorfonucleares, caracterizada pelo decréscimo na
capacidade de redução do corante nitroblue tetrazolium – NBT e fagocitose de
eritrócitos ovinos. Os achados de Cerone et al. (1998) em relação aos monócitos
e neutrófilos diferiram desta presente pesquisa, em que os animais com menores
níveis de Cu, do grupo –Cu, apresentaram em alguns momentos, as menores
contagens de neutrófilos e monócitos. A deficiência de Cu induzida por excesso
de Mo e S, assim como a falta de mensuração dos teores hepáticos de Cu,
dificultam a comparação entre os resultados das duas pesquisas.
Randhawa et al. (2002) avaliaram os níveis de hemoglobina, hematócrito
e contagem total e diferencial do número de leucócitos de oito bezerros bubalinos
com deficiência de Cu induzida pela adição de 30 ppm de Mo às suas dietas.
Diferente desta presente pesquisa, a contagem total dos leucócitos não foi
afetada pela deficiência secundária de Cu nos bezerros estudados por Randhawa
et al. (2002). Porém, ocorreu redução significativa do número de neutrófilos. Tal
redução coincidiu com o decréscimo dos níveis hepáticos de Cu para 23.9±2.69
ppm. A redução do número de neutrófilos não foi acompanhada por variações na
proporção das suas diferentes células precursoras na medula óssea. Os autores
concluíram que a neutropenia ocasionada pela deficiência de Cu, induzida por
excesso de Mo, não estaria relacionada à efeito sobre a síntese ou maturação
52
medular de tais células. Em pacientes humanos com deficiência de Cu a
neutropenia é um achado comum (WILLIAMS, 1983; PERCIVAL, 1995).
Cabe salientar que as altas médias do númer de lincócitos obtidas neste
presente trabalho (Tabelas 29 e 30) podem ser consideradas dentro dos valores
normais para animais entre 6 a 12 meses da raça Nelore ( 16,99 ± 4,10 x 10
3
/L),
conforme Costa (2000). Este pesquisador, estudou a influência de fatore etários
em bovinos Nelore e concluiu que animais mais jovens detêm maiores contagens
de leucócitos e que o avanço da idade contribui significativamente para a redução
do número de leucócitos.
Eosinófilos e Basófilos: As médias dos números de eosinófilos do grupo -Cu
foram mais elevadas que as dos outros grupos as oito e 48 horas após o reforço
vacinal (M16 e 18) (Tabelas 46 e 47).
No que se refere aos basófilos, as médias mais elevadas do grupo –Zn,
registradas aos 15 dias após a vacina (M13) e também às 72 horas após o reforço
vacinal, se devem a valores individuais e não detêm relevância biológica (Tabelas
50 e 51).
Apesar de não terem sido observadas concentrações hepáticas de Cu
compatíveis com deficiência, as diferenças entre as médias dos diferentes grupos
refletiram-se nas contagens de algumas variáveis do hemograma. Tal achado não
pode ser interpretado apenas estatisticamente. O fato das diferenças entre os
grupos se manifestarem apenas em alguns momentos isolados pode significar a
menor relevância biológica do efeito. Entretanto, como os níveis de Cu dos
animais deste experimento não foram compatíveis com deficiência e apesar disto,
provocaram algum efeito sobre as variáveis do hemograma, os achados indicam a
necessidade de estudar mais os efeitos de níveis de Cu sobre as variáveis do
hemograma dos bovinos. A falta de informações na literatura a respeito do efeito
dos níveis de Cu sobre as variáveis do hemograma dificulta a interpretação dos
achados.
53
4.9.1. Volume Globular
TABELA 17. Médias e desvios padrões do volume globular (%) de bezerros Nelore sob
diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M0 a M7)
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Control
(n=10)
Média
s
38,40
Aab
2,84
38,50
Aab
2,88
38,50
Aa
2,88
36,50
Ab
2,17
36,00
Ab
3,23
37,30
Ab
2,95
36,20
Ab
3,99
38,80
Aab
4,89
37,53
A
-Zn
(n=10)
Média
s
36,60
Aab
2,17
36,10
Aab
2,18
37,90
Aa
2,38
36,00
Ab
2,11
35,20
Ab
2,30
35,70
Ab
2,16
35,90
Ab
2,69
35,70
Aab
2,21
36,14
A
-Cu
(n=10)
Média
s
38,50
Aab
3,75
37,60
Aab
2,76
39,20
Aa
3,16
37,40
Ab
3,78
36,20
Ab
3,05
36,00
Ab
1,76
36,00
Ab
3,33
38,90
Aab
2,85
37,48
A
Média
momentos
37,83
ab
37,40
cb
38,53
a
36,63
b
35,80
b
36,33
b
36,33
b
37,8
ab
-
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 18. Volume globular (%) dos bezerros, hipóteses testadas, estatística
calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 1,58; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 0,98; p>0,10
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 11,00; p<0,05
Houve efeito significativo
M9>(M10=M11= M12=M13)
(M7=M8=M14 intermediários)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
10
20
30
40
50
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Volume globular (%)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 10. Representação gráfica das médias do volume globular (%) de bezerros
Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7 a M14)
54
4.9.2. Volume Globular (reforço vacinal)
TABELA 19. Médias e desvios padrões do volume globular (%) ao reforço vacinal dos
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M15 a
M21)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=11)
Média
s
37,7
ABa
2,31
39,7
Aa
3,06
38,7
Aa
2,41
33,9
Bb
1,91
35,2
Bb
1,69
35,8
Ab
2,66
37,3
Aa
1,83
36,90
-Zn
(n=11)
Média
s
35,4
Ba
5,87
38,5
Aa
1,58
37,6
Aa
1,71
35,2
ABb
3,19
34,5
Bb
2,01
34,8
Ab
2,53
36,8
Aa
3,12
36,11
-Cu
(n=11)
Média
s
40,5
Ab
2,46
39,1
Aa
2,18
38,5
Aab
2,32
37,3
Ab
2,31
37,2
Ab
1,81
37,1
Ab
2,73
38,5
Aab
3,79
38,31
Média
momentos
37,87 39,1 38,27 35,47 35,63 35,90 37,53 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 20. Volume globular (%) ao reforço vacinal dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos e
momentos
F= 2,41; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos em
cada momento
M15: F= 4,26; p<0,05 M16: F= 0,65; p>0,10
M17: F= 0,73; p>0,10 M18: F= 4,60; p<0,05
M19: F= 5,78; p<0,05 M20: F= 1,91; p>0,10
M21: F= 0,84; p>0,10
M15: -Zn<-Cu (Contr intermediário)
M16, M17, M20 e M21: Contr=-Zn=-Cu
M18: Contr<-Cu (-Zn intermediário)
M19: (Contr=-Zn)<-Cu
5- Diferenças
entre momentos
dentro de cada
grupo
Contr: F= 32,95; p<0,05
-Zn: F= 24,75; p<0,05
-Cu: F= 9,95; p<0,05
Contr: (M15=M16=M17=M18)>(M19=M20=M21)
-Zn: (M15=M16=M17=M21)>(M18=M19=M20)
-Cu: M16>(M15=M18=M19=M20)
(M17=M21 intermediários)
Obs: hipóteses 2 e 3 perderam o efeito diante do resultado das demais.
30
32
34
36
38
40
42
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Volume globular (%)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 11. Representação gráfica das médias do volume globular (%) ao
reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
55
4.9.3 Proteína Total
TABELA 21. M
sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
o
grupos
édias e desvios padrões da concentração plasmática de proteína total
(g/dL) de bezerros
Grup s
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
Control
(
Média
6,84
n=10) s
6,62
Aa
0,33
6,88
Aa
0,42
6,69
Aa
0,41
7,09
Aa
0,42
6,75
Aa
0,34
6,98
Aa
0,24
6,65
Aa
0,32
7,06
Aa
0,33
-Zn
(
Média
6,81
n=10) s
6,58
Aa
0,33
6,82
Aa
0,32
6,53
Aa
1,00
7,13
Aa
0,31
6,73
Aa
0,33
6,86
Aa
0,28
6,79
Aa
0,29
7,03
Aa
0,38
-Cu
(n=10) s
Média
6,89
6,70
Aa
0,37
6,84
Aa
0,28
6,92
Aa
0,29
7,19
Aa
0,40
6,80
Aa
0,23
6,92
Aa
0,19
6,67
Aa
0,45
7,04
Aa
0,34
Média momentos
6,63 6,85 6,71 6,14 6,76 6,92 6,70 7,04
-
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 22. C póteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
oncentração plasmática de proteína total (g/dL) dos bezerros, hi
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
F= 0,94; p>0,10
ção significativa.
momentos
Não houve intera
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
F= 0,16; p>0,50
ção, perfis iguais.
conjunto dos momentos
Não houve intera
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
0=M11=M12=M13=M14
conjunto dos grupos
F= 13,86; p>0,10
M7=M8=M9=M1
Não houve efeito significativo
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
2
4
6
8
10
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Proteína Sérica Total
(g/dL)
Controle - Zn - Cu
Representação gráfica das médias da concentração sérica de proteína
total (g/dL) de bezerros N
FIGURA 12.
elores sob diferentes tratamentos e momentos
de avaliação (M7 a M14)
56
4.9.4. Proteína plasmática Total (reforço vacinal)
TABELA 23. Médias e desvios padrões da concentração plasmática de proteína total
(g/dL) ao reforço vacinal, de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos
e momentos de avaliação (M15 a M21)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=11)
Média
s
9,69
Aa
0,51
7,12
Aa
0,29
7,12
Aa
0,36
7,01
Aa
0,38
7,06
Aa
0,44
6,82
Aa
0,42
6,96
Aa
0,34
5,81
-Zn
(n=11)
Média
s
6,90
Aa
0,41
6,98
Aa
0,24
7,48
Aa
0,32
7,33
Aa
0,27
7,29
Aa
0,37
6,92
Aa
0,38
7,2
Aa
0,33
7,53
-Cu
(n=11)
Média
s
6,92
Aa
0,38
7,28
Aa
0,33
7,22
Aa
0,33
7,15
Aa
0,40
7,14
Aa
0,42
6,76
Aa
0,31
7,04
Aa
0,40
7,05
Média
momentos
6,79 6,68 6,68 6,37 6,59 7,59 6,89 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 24. Concentração plasmática de proteína total (g/dL) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e comentários
(análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 0,79; p<0,05
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 2,86; p>0,10
Perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 1,13; p>0,10
Não houve efeito dos momentos
(M15=M16=M17=M18= M19=M20=M21)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais
0
5
10
15
20
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Proteína Total reforço
vacinal (g/dL)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 13. Representação gráfica das médias da concentração sérica de proteína
plasmática total (g/dL) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob
diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
57
4.9.5. Fibrinogênio Sérico
TABELA 25. Médias e desvios padrões da concentração de fibrinogênio (mg/dL) dos
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
290
Bb
119,72
390
Aa
119,72
190
Ac
144,91
430
Aa
188,86
360
Aa
227,06
370
Aa
216,28
250
Ab
184,09
220
Ab
139,84
312,5
-Zn
(n=11)
Média
S
230
Bb
125,17
320
ABab
103,28
250
Ab
135,40
380
Aa
193,22
200
Aa
124,72
350
Aa
135,40
290
Aab
233,10
210
Ab
137,03
278,75
-Cu
(n=11)
Média
S
420
Aa
193,22
220
Bb
131,66
210
Ab
87,56
410
Aa
213,18
240
Ab
117,38
390
Aa
196,92
320
Aab
147,57
190
Ab
128,67
300
Média momentos
313,33 310,00 216,67 406,67 266,67 370,00 286,67 206,67 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 26. Concentração sérica de fibrinogênio (mg/dL) dos bezerros, hipóteses
testadas, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre
grupos e momentos
F= 3,33; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos
em cada
momento
M7: F= 4,20; p<0,05 M8: F= 5,17; p<0,05
M9: F= 0,60; p<0,50 M10: F= 0,16; p<0,50
M11: F= 2,57; p>0,10 M12: F= 0,12; p>0,50
M13: F= 0,34; p> 0,50 M14: F= 0,13; p>0,50
M0: (G1=G2)<G3
M1: G1>G3 (G2 intermediário)
M2, M3, M4, M5, M6 e M7: G1=G2=G3
5- Diferenças
entre
momentos
dentro de cada
grupo
Contr: F= 14,90; p<0,05
-Zn: F= 5,62; p<0,05
-Cu: F= 14,22; p<0,05
Contr: M9<(M14=M13=M14)<(M8=M10=M11=M12)
-Zn: (M14=M9=M11=M14)<(M10=M12)
(M8=M13 intermediários)
-Cu: (M8=M9=M11=M14)<(M14=M10=M12)
(M13 intermediário)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
100
200
300
400
500
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Fibrinogênio (mg/dL)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 14. Representação gráfica das médias da concentração sérica de fibrinogênio
(mg/dL) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
58
4.9.6. Fibrinogênio sérico (reforço vacinal)
TABELA 27. Médias e desvios padrões da concentração sérica de fibrinogênio (mg/dL)
ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
300
Ab
226,08
330
Ab
216,28
340
Ab
134,99
370
Ab
133,75
420
Aa
147,57
510
Aa
191,20
380
Ab
147,57
378,57
-Zn
(n=10)
Média
S
400
Ab
223,61
340
Ab
134,99
580
Ab
198,89
500
Ab
176,38
580
Aa
348,97
460
Aa
189,74
380
Ab
113,52
458,57
-Cu
(n=10)
Média
S
370
Ab
211,08
420
Ab
198,89
400
Ab
230,94
380
Ab
198,89
420
Aa
147,57
440
Aa
157,76
400
Ab
188,56
404,29
Média
momentos
346,67 363,33 440,00 416,67 473,33 470,00 386,66 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 28. Concentração sérica de fibrinogênio (mg/dL) ao reforço vacinal dos
bezerros, hipóteses testadas, estatística calculada e comentários
(análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 1,16; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 2,29; p>0,10
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 2,15; p=0,05
Houve efeito significativo dos momentos
(M15=M16=M17=M18=M21)<(M19=M20)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
200
400
600
800
1000
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Fibrinogênio sérico
reforço vacinal (mg/dL)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 15. Representação gráfica das médias da concentração sérica de fibrinogênio
(mg/dL) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos
e momentos de avaliação (M15 a M21)
59
4.9.7 Leucócitos
TABELA 29. Médias e desvios padrões da concentração de leucócitos (x10
3
/L) de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
(M7 a M14)
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=11)
Média
S
17,17
Aa
4,49
19,40
Aa
4,18
17,55
Aa
4,20
16,93
Aa
4,94
16,42
Aa
4,40
16,53
Aa
4,38
17,53
Aa
3,14
17,34
Aa
3,84
17,36
-Zn
(n=11)
Média
S
17,54
Aa
1,79
18,61
Aa
2,20
18,33
Aa
2,09
17,29
Aa
3,44
17,62
Aa
2,13
16,41
Aa
2,80
18,00
Aa
3,22
16,83
Aa
3,15
17,58
-Cu
(n=11)
Média
S
15,42
Aa
3,64
15,02
Aa
3,56
16,50
Aa
3,24
15,17
Aa
2,99
14,70
Aa
3,21
14,52
Aa
2,75
14,94
Aa
3,96
15,44
Aa
2,00
15,21
Média
momentos
16,71 17,68 17,46 16,46 16,25 15,82 16,82 16,54 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 30. Concentração de leucócitos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 1,44; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 1,85; p>0,10
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 0,87; p>0,10
Não houve efeito significativo
M7=M8=M9=M10=M11=M12=M13=M14
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
10
20
30
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Leucócitos
(x 10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 16. Representação gráfica das médias da concentração de leucócitos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
60
4.9.8. Leucócitos (reforço vacinal)
TABELA 31. Médias e desvios padrões da concentração de leucócitos (x10
3
/L) ao
reforço vacinal, de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
17,45
ABab
3,38
17,57
ABab
3,23
18,51
ABb
4,00
17,61
ABab
3,17
16,66
ABab
2,39
16,07
ABa
2,45
16,12
ABa
2,06
17,14
-Zn
(n=11)
Média
s
17,64
Aab
3,44
19,13
Aab
4,63
19,60
Ab
6,05
18,43
Aab
3,99
17,09
Aab
3,35
16,34
Aa
3,32
17,42
Aa
4,08
17,95
-Cu
(n=11)
Média
s
14,83
Bab
2,24
14,62
Bab
2,05
14,52
Bb
1,72
14,85
Bab
2,15
14,37
Bab
1,64
14,94
Ba
1,48
13,56
Ba
2,41
14,52
Média
momentos
16,64 17,11 17,54 16,96 16,04 15,78 15,70 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 32. Concentração de leucócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos bezerros,
hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 1,38; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 4,18; p<0,05
Perfis em níveis diferentes.
-Zn>-Cu (Contr intermediário)
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 4,98; p<0,05
Houve efeito significativo dos momentos
M17>(M20=M21)
(M15=M16=M18= M19 intermediários)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
10
20
30
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Leucócitos reforço
vacinal (x 10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 17. Representação gráfica das médias da concentração de leucócitos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
61
4.9.10. Neutrófilos
TABELA 33. Médias e desvios padrões da concentração de neutrófilos (x10
3
/L) de
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7 a M14)
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
3,62
Aab
0,83
4,25
Aa
0,53
4,44
Aab
1,21
4,12
Aab
1,22
3,94
Aab
1,99
3,72
Ab
0,93
3,46
Ab
0,72
3,43
Ab
0,83
3,87
-Zn
(n=10)
Média
S
3,98
Aab
0,90
4,98
Aa
1,07
4,59
Aab
1,49
3,94
Aab
1,18
3,91
Aab
0,96
3,47
Ab
0,81
3,73
Ab
1,06
3,63
Ab
0,74
4,03
-Cu
(n=10)
Média
S
4,95
Aab
4,63
4,67
Aa
0,93
4,12
Aab
1,06
3,59
Aab
1,24
3,16
Aab
1,05
3,05
Ab
0,84
3,29
Ab
0,89
3,17
Ab
0,63
3,75
Média
momentos
4,18 4,63 4,38 3,88 3,67 3,41 3,49 3,41 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 34. Concentração de neutrófilos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 0,97; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 0,30; p>0,50
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 4,53; p<0,05
Houve efeito significativo
M8>(M12=M13=M14)
(M7=M9=M10=M11 intermediários)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
1
2
3
4
5
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Neutrófilos
(x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 18. Representação gráfica das médias da concentração de neutrófilos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
62
4.9.11. Neutrófilos (reforço vacinal)
TABELA 35. Médias e desvios padrões de neutrófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
3,66
Ab
0,93
4,21
Bab
0,88
5,40
Aa
1,29
4,13
ABab
0,98
4,00
Aab
1,23
3,43
Ab
1,47
3,86
Ab
1,27
4,10
-Zn
(n=10)
Média
s
4,55
Ab
1,87
6,69
Aa
3,72
7,07
Aa
4,26
5,11
Aab
2,56
4,56
Ab
1,99
5,17
Aab
4,03
4,14
Ab
1,64
5,33
-Cu
(n=10)
Média
s
3,33
Aab
0,48
3,76
Bab
0,60
4,58
Aa
0,57
3,21
Bb
0,51
3,11
Ab
0,61
3,26
Aab
0,86
3,25
Aab
0,70
3,50
Média
Momentos
3,85 4,88 5,70 4,15 3,89 3,95 3,75 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 36. Concentração de neutrófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos bezerros,
hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos e
momentos
F= 2,80; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos em
cada momento
M15: F= 2,63; p>0,10 M16: F= 5,00; p<0,05
M17: F= 2,41; p>0,10 M18: F= 3,50; p<0,05
M19: F= 2,73; p>0,10 M20: F= 1,75; p>0,10
M21: F= 1,32; p>0,10
M15: Contr=-Zn=-Cu
M16: -Zn>(Contr=-Cu)
M17: (-Zn>-Cu) (Contr intermediário)
M18, M19, M20 e M21: Contr=-Zn=-Cu
5- Diferenças entre
momentos dentro
de cada grupo
Contr: F= 8,89; p<0,05
-Zn: F= 21,37; p<0,05
-Cu: F= 10,52; p<0,05
Contr: M17>(M15=M20=M21)
(M16=M18=M19 intermediários)
-Zn: (M16=M17)> (M15=M19=M21)
(M18=M20 intermediários)
-Cu: M17>(M18=M19) (demais intermed.)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
1
2
3
4
5
6
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Neutrófilos reforço
vacinal (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 19. Representação gráfica das médias de neutrófilos (x10
3
/L) ao reforço
vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M15 a M21)
63
4.9.10. Linfócitos
TABELA 37. Médias e desvios padrões da concentração de linfócitos (x10
3
/L) dos
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
11,79
Ab
3,98
13,66
Aa
3,50
11,37
Ab
3,50
11,16
Ab
4,86
10,65
Ac
3,75
11,30
Ab
4,28
12,71
Aab
2,73
12,19
Aab
3,91
11,85
-Zn
(n=10)
Média
s
11,82
Aa
2,00
12,16
Aa
2,80
12,02
Aa
2,29
11,77
Aa
3,60
11,81
Aa
2,08
11,32
Aa
2,55
12,66
Aa
2,61
11,39
Aa
3,28
11,87
-Cu
(n=10)
Média
s
10,34
Aa
3,21
9,16
Ba
3,07
10,92
Aa
2,14
10,12
Aa
2,28
10,01
Aa
2,55
10,18
Aa
2,22
10,11
Aa
3,38
10,89
Aa
1,58
10,22
Média
momentos
11,31 11,66 11,44 11,02 10,80 10,93 11,83 11,49 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 38. Concentração de linfócitos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos
e momentos
F= 1,84; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos
em cada
momento
M7: F= 0,72; p>0,10 M8: F= 5,35; p<0,05
M9: F= 0,42; p>0,50 M10: F= 0,50; p>0,50
M11: F= 1,00; p>0,10 M12: F= 0,43; p>0,50
M13: F= 2,58; p> 0,10 M14: F= 0,45; p>0,50
M7: Contr=-Zn=-Cu
M8: (Contr=-Zn)>-Cu
M9, M10, M11, M12, M13 e M14: Contr=-Zn=-
Cu
5- Diferenças
entre
momentos
dentro de
cada grupo
Contr: F= 12,41; p<0,05
-Zn: F= 4,47; p>0,05
-Cu: F= 3,86; p>0,10
Contr: M8>(M14=M9=M10=M12)>M11
(M13 e M14 intermediários)
-Zn: M7=M8=M9=M10=M11=M12=M13=M14
-Cu: M7=M8=M9=M10=M11=M12=M13=M14
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
5
10
15
20
25
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Linfócitos (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 20. Representação gráfica das médias da concentração de linfócitos (x10
3
/L)
dos bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
64
4.9.11. Linfócitos (reforço vacinal)
TABELA 39. Médias e desvios padrões da concentração de linfócitos (x10
3
/L) ao
reforço vacinal, de bezerros Nelores sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
12,25
Aa
2,70
11,92
Aa
2,40
11,46
Aa
3,33
11,93
Aa
2,47
10,98
Aa
1,48
11,19
Aa
1,51
10,65
Aa
1,06
11,48
-Zn
(n=10)
Média
S
11,55
Aa
2,79
11,06
Aa
2,85
10,89
Aa
2,47
11,41
Aa
2,47
10,77
Aa
2,517
11,11
Aa
3,03
11,41
Aa
2,59
11,17
-Cu
(n=10)
Média
S
10,05
Aa
2,19
9,25
Aa
2,31
8,36
Aa
1,81
9,96
Aa
2,39
9,63
Aa
2,22
10,37
Aa
1,77
8,99
Aa
2,22
9,52
Média
momentos
11,28 10,74 10,24 11,10 10,46 10,89 10,35 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 40. Concentração de linfócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos bezerros,
hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 0,94; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 3,08; p>0,05
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 1,98; p>0,10
Não houve efeito significativo dos momentos
M15=M16=M17=M18= M19=M20=M21
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
5
10
15
20
25
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Linfócitos reforço
vacinal (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 21. Representação gráfica das médias da concentração de linfócitos (x10
3
/L)
ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M8 a M14)
65
4.9.12. Monócitos
TABELA 41. Médias e desvios padrões da concentração de monócitos (x10
3
/L) de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
(M7 a M14)
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
1,17
Aa
0,49
1,09
Aa
0,51
1,16
Aa
0,28
1,12
Aa
0,37
1,32
Aa
0,46
1,02
Aa
0,35
0,93
Aa
0,22
1,03
Aa
0,26
1,11
-Zn
(n=10)
Média
S
1,08
Aa
0,29
1,00
Aa
0,39
1,13
Aa
0,36
1,03
Aa
0,34
1,26
Aa
0,26
0,99
Aa
0,35
1,05
Aa
0,28
1,08
Aa
0,29
1,08
-Cu
(n=10)
Média
S
1,08
Aa
0,22
0,92
Aa
0,21
1,12
Aa
0,31
1,06
Aa
0,42
1,14
Aa
0,26
0,93
Aa
0,18
0,99
Aa
0,24
0,96
Aa
0,23
1,02
Média
momentos
1,11 1,00 1,14 1,07 1,24 0,98 0,99 1,02 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 42. Concentração de monócitos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 0,41; p>0,50
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 0,29; p>0,50
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 1,20; p>0,10
Não houve efeito significativo
M7=M8=M9=M10=M11=M12=M13=M14
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
1
2
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Monócitos
(x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 22. Representação gráfica das médias da concentração de monócitos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
66
4.9.13. Monócitos (reforço vacinal)
TABELA 43. Médias e desvios padrões da concentração de monócitos (x10
3
/L) ao
reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M8 a M14)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
1,05
Aab
0,39
0,96
Ab
0,38
1,24
Aab
0,34
1,31
ABa
0,32
1,09
Aab
0,33
0,91
Ab
0,31
1,01
ABab
0,25
1,08
-Zn
(n=10)
Média
S
1,04
Ab
0,24
1,10
Ab
0,29
1,29
Aab
0,64
1,52
Aa
0,39
1,24
Aab
0,46
1,07
Ab
0,24
1,30
Aab
0,59
1,22
-Cu
(n=10)
Média
S
0,79
Aa
0,20
0,91
Aab
0,19
1,00
Ab
0,23
1,00
Bb
0,19
0,95
Aab
0,20
0,90
Aab
0,14
0,86
Bab
0,18
0,91
Média
momentos
0,96 0,99 1,18 1,27 1,09 0,96 1,06 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 44. Concentração de monócitos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos bezerros,
hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre
grupos e momentos
F= 3,07; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos
em cada
momento
M15: F= 2,67; p>0,10 M16: F= 1,08; p>0,10
M17: F= 1,28; p>0,10 M18: F= 7,03; p<0,05
M19: F= 1,72; p>0,10 M20: F= 1,56; p>0,10
M21: F= 3,34; p=0,05
M15. M16, M17: Contr=-Zn=-Cu
M18: (-Zn>-Cu) (Contr intermediário)
M19 e M20: Contr=-Zn=-Cu
M21: (-Zn>-Cu) (Contr intermediário)
5- Diferenças
entre
momentos
dentro de cada
grupo
Contr: F= 14,92; p<0,05
-Zn: F= 34,74; p<0,05
-Cu: F= 6,81; p<0,05
Contr: (M16=M20)<M18 (demais intermed.)
-Zn: M18>(M15=M16=M20)
(M17=M19=M21 intermediários)
-Cu: M15>(M17=M18)
(M16=M19=M20=M21 intermediários)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
1
2
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Monócitos reforço
vacinal (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 23. Representação gráfica das médias da concentração de monócitos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
67
4.9.14. Eosinófilos
TABELA 45. Médias e desvios padrões da concentração de eosinófilos (x10
3
/L) de
bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
(M7 a M14)
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
0,39
Aa
0,21
0,26
Aa
0,28
0,50
Aa
0,29
0,43
Aa
0,35
0,41
Aa
0,25
0,41
Aa
0,55
0,35
Aa
0,27
0,32
Aa
0,21
0,38
-Zn
(n=10)
Média
S
0,47
Aa
0,35
0,37
Aa
0,45
0,41
Aa
0,29
0,40
Aa
0,39
0,53
Aa
0,49
0,5
Aa
0,62
0,43
Aa
0,54
0,32
Aa
0,34
0,43
-Cu
(n=10)
Média
S
0,39
Aa
0,27
0,18
Aa
0,23
0,29
Aa
0,21
0,35
Aa
0,40
0,33
Aa
0,32
0,25
Aa
0,21
0,46
Aa
0,39
0,33
Aa
0,38
0,32
Média
momentos
0,41 0,27 0,40 0,39 0,42 0,39 0,41 0,33 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 46. Concentração de eosinófilos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação entre grupos e
momentos
F= 0,79; p>0,10
Não houve interação significativa.
Perfis similares.
2- Efeito dos grupos para o
conjunto dos momentos
F= 0,35; p>0,50
Não houve interação, perfis iguais.
Contr=-Zn=-Cu
3- Efeito dos momentos para o
conjunto dos grupos
F= 1,52; p>0,10
Não houve efeito significativo
M7=M8=M9=M10=M11=M12=M13=M14
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
0,5
1
1,5
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Eosinófilos
(x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 24. Representação gráfica das médias da concentração de eosinófilos
(x10
3
/L) de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de
avaliação (M7 a M14)
68
4.9.15. Eosinófilos (reforço vacinal)
TABELA 47. Médias e desvios padrões da concentração de eosinófilos (x10
3
/L) ao
reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes tratamentos e
momentos de avaliação (M15 a M21)
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
0,33
Aab
0,17
0,34
ABab
0,44
0,33
Aab
0,36
0,17
Bb
0,07
0,43
Aa
0,43
0,43
Aa
0,41
0,49
Aab
0,49
0,36
-Zn
(n=10)
Média
s
0,28
Aab
0,33
0,12
Bb
0,12
0,23
Aab
0,17
0,28
Bab
0,23
0,32
Aab
0,23
0,32
Aab
0,25
0,41
Aa
0,40
0,28
-Cu
(n=10)
Média
s
0,56
Aab
0,46
0,57
Aab
0,48
0,49
Aab
0,39
0,60
Aab
0,56
0,64
Aa
0,62
0,34
Ab
0,18
0,34
Ab
0,30
0,51
Média
momentos
0,39 0,34 0,35 0,35 0,46 0,36 0,41 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 48. Concentração de eosinófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos bezerros,
hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos e
momentos
F= 2,47; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos em
cada momento
M15: F= 1,98; p>0,10 M16: F= 3,52; p<0,05
M17: F= 1,61; p>0,10 M18: F= 4,10; p<0,05
M19: F= 1,29; p>0,10 M20: F= 0,45; p>0,50
M21: F= 0,35; p>0,50
M15 e M17: Contr=-Zn=-Cu
M16: (-Zn<-Cu) (Contr intermediário)
M18: (Contr=-Zn)<-Cu
M19, M20 e M21: Contr=-Zn=-Cu
5- Diferenças
entre momentos
dentro de cada
grupo
Contr: F= 8,85; p<0,05
-Zn: F= 6,37; p<0,05
-Cu: F= 6,10; p<0,05
Contr: (M19=M20)>M18
(M15=M16=M17=M21 intermediários)
-Zn: M16<M21
(M15=M17=M18=M19=M20 intermed.)
-Cu: M19>(M20=M21) (demais intermed.)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
0,5
1
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Eosinófilos reforço
vacinal (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 25. Representação gráfica das médias da concentração de eosinófilos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
69
4.9.16. Basófilos
TABELA 49. Médias e desvios padrões da concentração de basófilos (x10
3
/L) dos
bezerros sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação
Grupos
M7
antes
M8
8 h.
M9
24 h.
M10
48 h.
M11
72 h.
M12
7 dias
M13
15 dias
M14
21 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
s
0,12
Aa
0,06
0,12
Aa
0,05
0,08
Ab
0,04
0,08
Ab
0,03
0,08
Aab
0,02
0,10
Aab
0,03
0,10
ABb
0,02
0,09
Aab
0,03
0,096
-Zn
(n=10)
Média
s
0,17
Aa
0,07
0,11
Ab
0,05
0,08
Ab
0,03
0,11
Ab
0,07
0,09
Ab
0,05
0,13
Aab
0,06
0,21
Aa
0,28
0,12
Aab
0,06
0,126
-Cu
(n=10)
Média
s
0,14
Aa
0,07
0,09
Aab
0,05
0,06
Ab
0,03
0,08
Aab
0,04
0,07
Ab
0,03
0,07
Aab
0,03
0,09
Bab
0,03
0,09
Aab
0,04
0,09
Média momentos
0,14 0,11 0,074 0,089 0,080 0,10 0,13 0,10 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 50. Concentração de basófilos (x10
3
/L) dos bezerros, hipóteses testadas,
estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos
e momentos
F= 1,96; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos
em cada
momento
M7: F= 1,72; p>0,10 M8: F= 0,56; p>0,50
M9: F= 0,90; p>0,10 M10: F= 1,00; p>0,10
M11: F= 1,08; p>0,10 M12: F= 3,51; p<0,05
M13: F= 1,82; p>0,10 M14: F= 1,32; p>0,10
M7, M8, M9, M10, M11, M12: Contr=-Zn=-Cu
M13: -Zn>-Cu (Contr intermediário)
M14: Contr=-Zn=-Cu
5- Diferenças
entre
momentos
dentro de
cada grupo
Contr: F= 7,28; p<0,05
-Zn: F= 19,92; p<0,05
-Cu: F= 14,07; p<0,05
Contr: (M7=M8)>(M9=M10)
(M11=M12=M13=M14 intermediários)
-Zn: (M7=M13)>( M8=M9=M10=M11)
(M12=M14 intermediários)
-Cu: M7>(M9=M11)
(M8=M10=M12=M13=M14 intermed.)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14
Momentos
Basófilos (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 26. Representação gráfica das médias de basófilos (x10
3
/L) de bezerros
Nelore sob diferentes tratamentos e momentos de avaliação (M7 a M14)
70
4.9.17. Basófilos (reforço vacinal)
TABELA 51. Médias e desvios padrões de basófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos
bezerros em diferentes tratamentos e momentos de avaliação
Grupos
M15
antes
M16
8 h.
M17
24 h.
M18
48 h.
M19
72 h.
M20
7 dias
M21
15 dias
Média
grupos
Controle
(n=10)
Média
S
0,18
Aa
0,08
0,14
Aab
0,04
0,15
Aab
0,08
0,09
Ab
0,02
0,13
ABb
0,06
0,10
Ab
0,02
0,10
Ab
0,03
0,12
-Zn
(n=10)
Média
S
0,21
Aa
0,14
0,18
Aab
0,08
0,13
Ab
0,07
0,12
Ab
0,06
0,21
Aa
0,12
0,11
Ab
0,08
0,15
Aab
0,06
0,16
-Cu
(n=10)
Média
S
0,18
Aa
0,04
0,14
Aab
0,05
0,10
Ab
0,04
0,08
Ab
0,02
0,11
Bb
0,04
0,07
Ab
0,03
0,12
Aab
0,04
0,11
Média
momentos
0,19 0,15 0,12 0,10 0,14 0,09 0,12 -
Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre grupos.
Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre momentos.
TABELA 52. Concentração de basófilos (x10
3
/L) ao reforço vacinal dos bezerros,
hipóteses, estatística calculada e comentários (análise de perfil)
Hipótese Estatística Comentário
1- Interação
entre grupos e
momentos
F= 2,09; p <0,05
Houve interação significativa.
Perfis não similares.
4- Diferenças
entre grupos em
cada momento
M15: F= 0,39; p>0,50 M16: F= 2,04; p>0,10
M17: F= 1,27; p>0,10 M18: F= 2,42; p>0,10
M19: F= 4,11; p<0,05 M20: F= 1,44; p>0,10
M21: F= 3,05; p>0,50
M15, M16, M17, M18: Contr=-Zn=-Cu
M19: -Zn>-Cu (Contr intermediário)
M20 e M21: Contr=-Zn=-Cu
5- Diferenças
entre momentos
dentro de cada
grupo
Contr: F= 18,22; p<0,05
-Zn: F= 27,38; p<0,05
-Cu: F= 29,24; p<0,05
Contr: M15>(M18=M19=M20=M21)
(M16=M17 intermediários)
-Zn: (M15=M19)>( M17=M18=M20)
(M16=M21 intermediários)
-Cu: M15>(M17=M18=M19=M20)
(M16=M21 intermediários)
Obs: hipóteses 4 e 5 perderam o efeito diante do resultado das demais.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21
Momentos
Basófilos reforço
vacinal (x10
3
/micro L)
Controle - Zn - Cu
FIGURA 27. Representação gráfica das médias da concentração de basófilos
(x10
3
/L) ao reforço vacinal de bezerros Nelore sob diferentes
tratamentos e momentos de avaliação (M15 a M21)
71
5) Conclusões:
- As dietas utilizadas no experimento não provocaram níveis hepáticos de Cu
indicativos de deficiência. Apesar disto, os níveis séricos de Cu estiveram
abaixo dos considerados adequados pela literatura consultada;
- As dietas utilizadas no experimento provocaram níveis hepáticos de Zn
indicativos de deficiência. Apesar disto, os níveis séricos deste elemento nos
bezerros mantiveram-se dentro dos parâmetros considerados adequados,
exceto durante o último momento;
- Apesar de não terem sido observados níveis de Cu compatíveis com
deficiência, foi observado o efeito dos diferentes teores deste mineral sobre a
produção de anticorpos em resposta à vacina anti-C. chauvoei.
- Houve diferenças significativas na contagem das variáveis do hemograma,
volume globular, leucócitos, neutrófilos, monócitos e eosinófilos, em
momentos relacionados ao reforço vacinal, entre os grupos com distintos
teores de Cu hepático.
72
6) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARTHUR, J.R.; BOYNE, R. Superoxide dismutase and glutathione peroxidase
activities in neutrophils from selenium deficient and copper deficient cattle. Life
Sci., Elmsford, v.36, p.1569-1575, 1985.
ASP, T.N.; LUND, W. Elemental analysis of bovine liver by inductively coupled
plasma atomic emission-spectrometry by using a simple dissolution procedure,
Talanta, London, v.39, n.5, p.563-566, 1992.
BOYNE, R.; ARTHUR, J.R. Effects of selenium and copper deficiency on
neutrophil function in cattle. J. Comp. Pathol., Liverpol, v.91, p.271-276, 1981.
BORGES, A.S. Valores séricos e hepáticos de elementos minerais,
determinação da ceruloplasmina sérica, hemograma e metabolismo
oxidativo de neutrófilos em novilhas nelore suplementadas com diferentes
níveis nutricionais de cobre e zinco. 2001. 141f. Tese (Doutorado) - Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
BRUM, P.A.R.; SOUZA, J.C.; FILHO, J.A.; ALMEIDA, I.L. Deficiências minerais de
bovinos na sub-região dos Paiaguas, no Pantanal Mato-Grossense. II. Cobre,
zinco, manganês e ferro. Pesqui. Agropec. Bras., Brasília, v.22, n.9/10, p.1049-
1060, 1987.
CERONE, S.I.; SANSINANEA, A.S.; AUZA, N.J. Copper deficiency alters the
immune response of bovine. Nutr. Res., Elmsford, v.15, p.1333-1341, 1995.
CERONE, S.I.; SANSINANEA, A.S.; STREITENBERGER, S.A.; GARCIA, M.C.;
AUZA, N.J. The effect of copper deficiency on the peripheral blood cells of cattle.
Vet. Res. Commun., Dordrecht, v.22, p.47-57, 1998.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação -
Referências - Elaboração. Rio de Janeiro, 2002. 24p.
BIOSIS. Serial sources for the BIOSIS preview database. Philadelphia, 1996. 468p.
73
COLES, E.H. Veterinary clinical pathology. Philadelphia: Saunders, 1986.
p.139.
COSTA, J. N.; BENESI, F. J.; BIRGEL, E. H.; D’ANGELINO, J. L.; AYRES, M. C.
C. BARROS FILHO, I. R. Fatores etários no leucograma de fêmeas zebuínas
sadias da raça Nelore (Bos indicus). Ciência Rural, v. 30, p. 399-403, 2000.
COUSINS, R.J. Absorption, transport, and hepatic metabolism of copper and zinc:
special reference to metallothionein and ceruloplasmin. Physiol. Rev., Baltimore,
v.65, p.238-309, 1985.
CRICHTON, R.; SOLOMON, J.; BARTON, A.M. The development of na Enzyme-
linked Immunosorbent Assay for Measuring the Poteny of Vaccines Containing
Clostridium chauvoei antigens. Biologicals, London, v.18, p.49-54, 1990.
CUNNINGHAM-RUNDLES, S. Analytical methods for evaluation of immune
response in nutrient intervention. Nutr. Rev., Washington, v.56, n.1, p.27-37,
1998.
Di GENARO, M.S.; MICALIZZI, B.; GUZMAN, A.M.S. Clostridium chauvoei:
immunological characterization of antigenic preparations. Anaerobe, England, v.5,
p.301-303, 1999.
DORTON, K.L., ENGLE, T.; HAMAR, D.; SICILIANO, P.; YEMM, R. Effects of
copper source and concentration on copper status and immune function in
growing and finishing steer. Anim. Feed Sci. Tech., Amsterdam, v.110, p.31-44,
2003.
ENGLE, T.E.; NOCKELS, C.F.; KIMBERLING, W.; WEABER, D.L.; JOHNSON,
A.B. Zinc repletion with organic or inorganic forms of zinc and protein turnover in
marginaly zinc-deficient calves. J. Anim. Sci., Champaign, v.75, p.3074-3081,
1997.
74
FAILLA, M.L.; HOPKINS, R.G. Is low copper status immunosuppresive? Nutr.
Rev., Washington, v.56, p.S59-64, 1998.
FICK, K.R.; McDOWELL, L.R.; MILES, P.H.; WILKINSON, N.S.; FUNK, J.D.;
CONRAD, J.H. Methods of mineral analysis for plant and animal tissues.
2.ed. Gainesville: Animal Science Department, University of Florida, 1979. 90p.
GENGELBACH, G.P.; WARD, J.D.; SPEARS, J.W.; BROWN, T.T. Effects of
cooper deficincy and copper deficiency couple with high dietery iron or
molybdenum on phagocytic cell function and response of calves to a respirotory
disease challange. J. Anim. Sci., Champaign, v.75, p.1112-1118, 1997.
GRAHAM, T.H. Trace element deficiencies in cattle. Vet. Clin. North Am. Food
Anim. Pract., Philadelphia, v.7, p.153-215, 1991.
HANSARD, S.L.; MOHAMMED, A.S.; TURNER, J.W. Gestation age effects upon
maternal-fetal zinc utilization in the bovine. J. Anim. Sci., Champaign, v.27,
p.1097-1102, 1968.
JAIN, N.C. Schalm’s Veterinary hematology. 4. ed. Philadelphia: Lea & Febiger,
1986. 1221p.
JONES, D.G.; SUTTLE, N.F. Some effects of copper deficiency on leucocyte
function in sheep and cattle. Res. Vet. Sci., London, v.31, p.151-156, 1981.
KEUSCH, G.T. Nutrition and infection. In: _______. Modern nutrition in health
and disease. 8. ed. Baltimore: Williams & Wilkins,1994. v.1, p.1241-1258.
KUME, S.; TANABE, S. Effect of parity on colostral mineral concentrations of
holstein cows and value of colostrum as a mineral source for newborn calves. J.
Anim. Sci., Champaign, v.76, p.1654-1660, 1993.
75
LAI, C.C.; HUANG, W.H.; ASKARI, A.; WANG, Y.; SARWAZYAN, N.; KLEVAY,
L.M.; CHIU, T.H. Differential regulation of superoxide dismutase in copper-
deficient rat organs. Free Radic. Biol. Med., Elmsford, v.16, p.613-620, 1994.
LAI, C.C.; HUANG, W.H.; KLEAVY, L.M.; CUNNING, W.T.; CHIU, T.H.
Antioxidant enzyme gene transcription in copper-deficient rat liver. Free Radic.
Biol. Med., Elmsford, v.21, p.233-240, 1996.
LEI, K.Y.; WU, J.Y.J.; ZHANG, J.J. Regulation of apolipoprotein A-I gene
expression in HepG2 cells depleted of copper by cupruretic tetramine. Fed. Am.
Soc. Exp. Biol. J., Bethesda, v.11, p.A362, 1997.
MARSTON, T. Trace mineral supplementation in beef cattle. Part I. Compend.
Contin. Educ. Pract. Vet., Princeton Junction, v.21, p.21-27, 1999
MATTAR, M.A.; CORTIÑAS, T.; DI GENARO, M. Immunogenic power of cellular
and extracellular antigens of Clostridium chauvoei strain isolated in San Luis,
Argentina. Anaerobe, England, v.5, p.295-296, 1999.
McDOWELL, L.R. Minerais para ruminantes sob pastejo em regiões tropicais,
enfatizando o Brasil. 3.ed. Florida: University of Florida Institute of Food and
Agricultural Sciences, 1999. 92p.
MENARD, M.P.; COUSINS, R.J. Zinc transport by brush border membrane
vesicles from rat intestine. J. Nutr., Philadelphia, v.113, p.1434-1442, 1983.
MINATEL, L.; CARFAGNINI, J.C. Copper deficiency and immune response in
ruminants. Nutr. Res., Elmsford, v.20, p.1519-1529, 2000.
MORAES, S.S.; SILVA, G.N.; DÖBEREINER, J. Microelementos minerais e a
“Cara Inchada” dos bovinos. Pesqui. Vet. Bras., Rio de Janeiro, v.14, p.25-33,
1994.
76
MORAIS, M.G.; RANGEL, J.M.; MADUREIRA, J.S.; SILVEIRA, A.C. Variação
sazonal da bioquímica clínica de vacas aneloradas sob pastejo contínuo de
Brachiaria decumbens. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v.52, p.98-
104, 2000.
MORRISON, D.F. Multivariate statistical methods. 2.ed. New York: Mc Graw
Hill, 1967. 325p.
MYRVIK, Q.N. Immunology and nutrition. In: SHILS, M.E.; OLSON, J.A. Modern
nutrition in health and disease. 8. ed. Baltimore: Williams & Wilkins,1994. v.1,
p.623-662.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Nutrient requeriment of beef cattle. 7.ed.
Washington: National Academy Press, 1996. 242p.
PERCIVAL, S.S. Neutropenia caused by copper deficiency: possible mechanism
of action. Nutr. Rev., Washington, v.53, p.59-66, 1995.
POTT, E.B.; ALMEIDA, I.L.; BRUM, P.A.R.; FILHO, J.A.C.; POTT, A.; DYNIA, J.F.
Nutrição mineral de bovinos de corte no pantanal Mato-Grossense: 2.
Micronutrientes na Nhecolândia (Parte Central). Pesqui. Agropec. Bras., Brasília,
v.24, p.109-126, 1989a.
POTT, E.B.; BRUM, P.A.R.; POTT, A.; ALMEIDA, I.L.; FILHO, J.A.C.; TULLIO,
R.R. Nutrição mineral de bovinos de corte no Pantanal Mato-Grossense. IV.
Levantamento de micronutrientes no Baixo Piquiri. Pesqui. Agropec. Bras.,
Brasília, v.24, p.1369-1380, 1989b.
PROHASKA, J.R.; SUNDE, R.A.; ZINN, K.R. Livers from copper-deficient rats
have lower glutatione peroxidase activity and m RNA levels but normal liver
selenium levels. J. Nutr. Biochem., Stoneham, v.3, p.429-436, 1992.
77
RANDHAWA, C.S.; RANDHAWA, S.S.; SOOD, N.K. Effect of molybdenum
induced copper deficiency on peripheral blood cells and bone marrow in buffalo
calves. Asian-Australas. J. Anim. Sci., Suwon, v.15, n.4, p.509-515, 2002.
SAKER, K.E.; ALLEN, V.G.; KALNITSKY, J.; THATCHER, C.D.; SWECKER JR.,
W.S.; FONTENOT, J.P. Monocyte immune cell esponse and copper status in beef
steers that grazed endophyte-infected tall fescue. J. Anim. Sci., Champaign, v.76,
p.2694-700, 1998.
SCHIPPER. I.A.; KELLING, C.L.; MAYER, J.; PFEIFFER, N.W. Effects of passive
immunity on immune response in calves vaccinated against Clostridium chauvoei
infection. Vet. Med. Small Anim. Clin., Bonner Springs, v.78, p.1564-1566, 1978.
SMART, M.E.; NORTHCOLE, M.J. Liver biopses in cattle. Compend. Cont. Educ.
Pract. Vet., Princeton, v.7, p.327-332, 1985.
SMART, M.E.; CHRISTENSEN, D.A.; SHORGOOL, M. The liver copper (Cu) and
Zinc (Zn) concentrations of the bovine fetus and its dam during pregnancy. Can. J.
Anim. Sci., Ottawa, v.63, p.1021-1028, 1983.
SILVA, H.F. Avaliação da bioquímica clínica de bezerros Nelore, nascidos de
vacas em dieta adequada ou insuficiente em cobre ou zinco e mantidos sob
a mesma nutrição mineral de suas mães até os seis meses de idade. 2003.
149f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
SOUZA, J.C.; DARSIE, G. Deficiências minerais em bovinos de Roraima, Brasil. I.
Zinco e cobalto. Pesqui. Agropecu. Bras., Brasília, v.20, p.1309-1316, 1985.
SOUZA, J.C.; GOMES, R.F.C.; REZENDE, A.M.; ROSA, I.V.; CARDOSO, E.G.;
GOMES, A.; COSTA, F.P.; OLIVEIRA, A.R.; COELHO NETO, L.; CURVO, J.B.E.
Resposta de novilhos nelorados à suplementação mineral em pastagens de capim
colonião. Pesqui. Agropecu. Bras., Brasília, v.18, p.311-318, 1983.
78
SOUZA, J.C.; NICODEMO, M.L.F.; DARSIE, G. Deficiencias minerais em bovinos
de Roraima, Brasil. V. Cobre e Molibdenio. Pesqui. Agropecu. Bras., Brasília,
v.24, p.1547-1554, 1989.
SPEARS, J.W.; HARVEY, R.W.; BROWN, T.T. Effects of zinc methionine and zinc
oxide on performance, blood characteristics, and antibody titers response to viral
vaccination in stressed feeder calves. J. Am. Vet. Med. Assoc., Schaumburg,
v.199, p.1731-1733, 1991.
STABEL, J.R.; SPEARS, J.; BROWN, T. Effect of copper deficiencyon tissue
blood characristics, and immune function calves challenged with infectious bovine
rhinoracheitis virus Pasteurella haemolytica. J. Anim. Sci., Champaign, v.71,
p.1247-1255, 1993.
SUTTLE, N.F. Copper deficiency in ruminants; recent developments. Vet. Rec.,
London, v.119, p.519-522, 1986.
TAMURA, Y.; MAKIE, H.; TANAKA, M. An indirect hemagglutination test for the
detection of antibodies to Clostridium chauvoei. Vet. Microbiol., Amsterdam, v.10,
p.315-324, 1985.
TAMURA, Y.; MAKIE, H.; TANAKA, M. Correlation between the indirect
hemagglutination antibody and protection of mice against Clostridium chauvoei.
Jpn. J. Vet. Sci., Tokyo, v.48, p.1249-1251, 1986.
TIZARD, I. Veterinary immunology: an introduction. 6.ed. Phyladelphia: W.B.
Saunders Company, 2000. 482p.
TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J.; MORAES, S.S.; PEIXOTO, P. Deficiências e
desequilíbrios minerais em bovinos e ovinos - revisão de estudos realizados no
Brasil de 1987 a 1998. Pesqui. Vet. Bras., Rio de Janeiro, v.19, p.47-62, 1999.
79
TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J.; PEIXOTO, P.V. Deficiências minerais em
animais de fazenda, principalmente bovinos em regime de campo. Pesqui. Vet.
Bras., Brasília, v.20, p.127-138, 2000.
TORRE, P.M.; HARMON, R.L.; SORDILLO, L.M.; BOISSONNEAULT, G.A.;
HEMKEN, R.W.; TRAMMELL, D.S.; CLARK, T.W. Modulation of bovine
mononuclear cell proliferation and cytokine production by dietary copper
insufficiency. J. Nutr. Immunol., Haworth, v.3, p.3-20, 1995.
UNDERWOOD, E.J. Trace elements in human and animal nutrition. 4.ed. New
York: Academic Press, 1977.
WARD, J.D.; GENGELBACH, G.; SPEARS, J. The ects copper deficiency wi or
without high dietary iron or molybdenum on immune function of cattle. J. Anim.
Sci., v.75, p.1400-1408, 1997.
WIKSE, S.E. The relationship of trace minerals deficiences and infectious
diseases of beef cattle. In: TEXAS BEEF CATTLE SHORT COURSE, 1992,
Texas. Proceedings... Texas, 1992.
WIKSE, S.E.; HERD, D.; FIELD, R.; HOLLAND, P. Diagnosis of copper deficience
in cattle. J. Am. Vet. Med. Assoc., Schaumburg, v.200, p.1625-1629, 1992.
WILLIAMS, D. Copper deficiency in humans. Semin. Hematol., Duluth, v.20,
p.118-128, 1983.
WILSON, J.J.; IWAKIRI, Y.; CLARKE, S.D. Hepatic glutathione redox influences 3-
hidroxy-3-methyl glutaryl Co-A reductase (HMG-CoAR) activity and message
abundance. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. J., Bethesda, v.11, p.A361, 1997.
XIN, Z.; WATERMAN, D.F.; HEMKEM, R.W.; HARMON, R.J. Effects of copper
status on neutrophil function, superoxide dismutase and copper distribution in
steers. J. Dairy Sci., Champaign, v.74, p.3078- 3085, 1991.
1
Tabalho enviado para publicação na revista Journal of Veterinary Medicine A”
Response to Clostridium chauvoei vaccination in Nelore calves under copper or zinc insufficient
nutrition.
A
Authors: Horrys Friaça Silva
1
; João Pessoa Araújo Júnior
2
; Alexandre Secorun Borges
1
; Rogério
Martins AmoriST1; Márcio Rubens Graf Kuchembuck
1
.
Corresponding author’s e-mail adress: horrys@agricultura.gov.br
Summary: Considering the importance of mineral deficiency upon the cattle immunological system, this
research aims to assess the effects of Cu (copper) and Zn (zinc) insufficient nutritional levels on the
humoral immune response of Nelore calves, submitted to Clostridium chauvoei (Blackleg) vaccination.
30 calves, born from cows that had spent 18 months under different experimental diets were utilized. The
Control Group (n=10) was composed of animals whose mothers received adequate mineral nutrition (10
ppm of Cu and 30 ppm of Zn, dry matter basis). The calves of Zn Insufficient Group (-Zn, n=10) and Cu
Insufficient Group (-Cu, n=10) were born from cows under insufficient Zn (23 ppm) or Cu (6 ppm)
nutrition. These calves were clinically accompanied until six months of life, having access to the same
mineral supplementation of their mothers. In these calves first six months of life the titers of anti-
Clostridium chauvoei antibodies, received via colostrums, was measured by ELISA assay. At 150 days
old, these calves had fragments of their hepatic tissue collected for Cu and Zn levels analysis. At 180 days
old, the calves received the first dose of Clostridium chauvoei vaccine. A second dose of this vaccine was
given 36 days later. Then, the antibodies titers in response to both vaccination (five sampling times) and
the serum Cu and Zn levels were also measured (three sampling times). Although Cu hepatic levels
compatible with deficiency were not obtained, significant differences for these Cu levels among the three
groups of calves were observed, as well as significant differences among the antibodies titers of the
different groups.
Number of tables and graphs: 06 tables.
A
This present work was carried out in the UniversidadeEstadual Paulista - UNESP, Campus of
Botucatu, São Paulo State, Brazil. This work has been conducted as part of the doctorate requistes
of the correpondent author.
1
Dept. of Veterinary Clinic – Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia – UniversidadeEstadual
Paulista – FMVZ-UNESP / Botucatu – SP. Rubião Júnior District, ZIP code 18618-000.
2
Departament of Microbiology and Immunology – Instituto de Biociências de Botucatu – Universidade
Estadual Paulista – IBB-UNESP / Botucatu – SP. Rubião Júnior District, ZIP code 18618-000.
1
2
Introduction:
Mineral unbalances in soils and pastures have been responsible for low productivity amongst ruminants
raised on pasture in wide areas worldwide. Very ofen, such effect happens despite abundant pasture
resources. Copper deficiency was pointed as the most common micro minerals deficiency of cattle
worldwide (McDOWELL, 1999).
As the relation between the severity of trace elements deficiency and its effects in cattle is examined, it is
observed that, under marginal deficiency, the immune system is the first to suffer negative effects
(MARSTON, 1999).
Cu and Zn function in the animals’ immune system is directly related to the production of enzymes in the
oxidative metabolism. These are responsible for the production of microbicide substances in the
phagocytes “respiratory explosion”, as well as reducing the harmful effect of such substances on the
cellular components. This way, Cu deficiency may cause a decrease in the phagocytes functions,
reduction in the interacting between T and B lymphocytes, which can also be reflected on the antibodies
production (GRAHAM, 1991; CERONE et al., 1995).
According to Minatel & Carfagnini (2000), impaired neutrophil function is one of the earliest functional
defects in cattle undergoing Cu depletion. Microbicidal activity, superoxide-radicals production, and SOD
activity are decreased. Phagocytic neutrophils’ function might be affected in ruminants with severe
induced-Cu deficiency. However, macrophages appear to be less susceptible to Cu deficiency related
functional decrease. Since macrophages are important not only in innate immunity but also in specific
immunity as antigen-presenting cells, much work has to be done in this area. For these authors, the results
indicating some effect of Cu deficiency on the humoral immune response of ruminants are inconsistent.
Clostridium chauvoei is the bacterial agent that causes Blackleg in cattle, sheep and other livestock and
wild species. It is responsible for huge economic losses, mainly in regions where prophylactic measures
are not adequately taken. This disease may be controlled by vaccination with inactivated bacterial
cultures. The use of two-dose vaccination protocol is widely recommended for induction of anamnestic
immune response in order to assure the prevention of this disease (MATTAR et al., 1999).
Considering the importance of microminerals deficiency on the cattle immune system and the need for
more information about this issue, this study was outlined to assess the effects of insufficient Cu or Zn
nutritional levels on the antibody response of Nelore calves to Clostridium chauvoei vaccination.
2
3
Materials and Methods:
Animals and characteristics of the experimental groups
30 Nelore calves, from both genders, were utilized. These calves were born from cows that had spent 18
months under adequate or Zn or Cu insufficient nutrition. The Control Group was composed of 10
animals born from cows submitted to adequate mineral nutrition. Respectively, 10 ppm/DM of Cu (parts
per million = mg/kg on dry matter basis) and 30 ppm of Zn according to NRC (1996). The Zn Insufficient
Group (-Zn) was composed with 10 animals born from cows with insufficient Zn supply (23 ppm) and the
Cu Insufficient Group (-Cu) was composed of 10 animals born from cows with insufficient Cu supply (6
ppm). The calves were clinically accompanied from birth until six months of age. During this time, they
remained with their respective mothers and had access to the same mineral supply of each group.
Mineral Supplementation
The Brachiaria decumbens pasture was submitted to composition analysis. The following mean values
were obtained: N = 5 g/kg, P = 0.8 g/kg, K = 8 g/kg, Ca = 3 g/kg, Mg = 2.6 g/kg, S = 0.6 g/kg, B = 6
ppm, Cu = 6 ppm, Fe = 153 ppm, Mn = 278 ppm, Zn = 23 ppm, Mo = 2 ppm. It must be noted that the Cu
and Zn pasture levels were below the NRC (1996) recommendations.
Based on these data and according to NRC (1996) and McDowell (1999), a mineral suplement was
formulated, in order to satisfy the nutritional needs of beef cattle in the reproductive phase (TABLE 1).
The mineral mixtures of each group were available to the mothers and their calves during the whole
period of this experiment. The mentioned mineral supplement was offered ad libitum in a sheltered feeder
to the animals of the Control Group. The –Zn Group received the same mixture, however, without Zn
sources and the –Cu Group received the same mixture, without Cu sources.
Vaccination
The calves’ mothers received, approximately 18 months before breeding, a dose of polyvalent
Clostridiosis vaccine, including anti-Clostridium chauvoei antigens.
According to Schipper et al. (1978), in order to prevent the negative interference of residual passive
antibodies, the calves were vaccinated at 180 days of age (ST6). A commercial vaccine against
Blackleg
13
, obtained by the inactivation of the Clostridium chauvoei cultures with formalin and adsorbed
on aluminum hydroxide was utilized. 36 days after vaccination (ST10), the calves received a second
vaccine dose (booster).
13
Monovacina Vallée S.A. Montes Claros, Minas Gerais, Brazil.
3
4
Performed analyses and sampling times:
Cu and Zn quantification:
Fragments of hepatic tissue were collected from calves at 150 days old (ST6) according to the adapted
biopsy technique of McDowell (1999). 30 days of interval between biopsy and vaccination were obeyed.
Calves’ serum samples were collected at three different sampling times. The first immediately before the
vaccination (ST7), then immediately prior to the booster dose (ST10), and later on, 15 days after the
booster dose, at the end of the sampling times (ST11).
For Cu and Zn quantification in both tissues samples, the technique of optical emission spectrometry with
inductively coupled argon plasma generator was utilized by means of the simultaneous spectrometer
14
.
The Asp & Lund (1992) acid digestion method was then applied for preparing the liver samples.
Anti-Clostridium chauvoei antibodies titration: Initially, samples collected in six different sampling
times, prior to the age of six months, and prior to their first vaccination were analyzed (ST1 to ST6). This
material was collected during the first week of the calves’ life and, after that, on a monthly basis until five
months old (ST1 a ST6). After these aforementioned sampling times, five new smples were taken, after
the animals were 180 days old, mileposted by the vaccine administration. These collections were done
immediately prior to the vaccine (ST7), at 15 (ST8) and 21 days after the vaccination (ST9), and then,
immediately prior to the booster dose (ST10) and 15 days later (ST11).
The ELISA method for the anti-Clostridium chauvoei antibodies titration, proposed by Crichton et al.
(1990), was chosen. The results were expressed by means of “ELISA’s index”.
► Antigen – A Clostridium chauvoei strain, formalin inactivated, collected from the vaccine culture
medium. This bacterial strain was the same utilized for the production of the used vaccine.
► Positive Control Serum – a pool of serums collected from the Control Group calves (control / adequate
diet), 15 days after the booster vaccination (ST11).
► Negative Control Serum – a pool of serum collected from calves before the colostrums nursing.
► Antibodies – Peroxidase-labeled
15
, rabbit anti-bovine Immunoglobulin G antibody.
► Microtitration plates – High adsorption capacity
16
, 96-well flat bottom.
14
BAIRD Model ICP 2000 Massachusetts, USA
15
DakoCytomation Glostrup, Denmark.
16
Nunc Maxisorp Nalg Nunc International
4
5
Statistical analysis
The “Analysis of Variance”, for a complete random experiment, was utilized for the variables assessed in
one single sampling time (calves’ hepatic Zn and Cu). The F and P statistical calculus and comparisons
between pairs of means were assessed by the Tukey’s method. For the variables assessed in more than
one sampling time the “Profile Analysis” was utilized (MORRISON, 1967). This analysis was conducted
to verify the differences among results of groups in each sampling time as well as the difference among
results obtained in the sampling times of each group. For all the tested hypothesis the calculated F
statistics were considered significant when p < 0.05.
Results and discussion:
Calves’ hepatic Cu levels (Table 2): At 150 days old, the calves of – Zn Group presented significant
higher Cu levels (434.93 ppm) than the Control Group (323.61 ppm), which have significant higher levels
than the ones observed in -Cu Group (173.30 ppm).
Calves’ serum Cu levels (Table 3): There were no significant differences among the values of the three
calves’ groups in any of the sampling times. Mean values of groups were 0.602 mg/L immediately before
vaccine first dose (ST7); 0.684 mg/dL immediately before booster dose and 0.627 mg/dL (ST10) and 15
days after the booster vaccination (ST11). The only noteworthy occurrence was the stressed mean value
obtained in the -Zn Group at the time immediately before the booster vaccination (0.809 ± 0.353mg/dL at
ST10).
Calves’ Zn hepatic level (Table 2): There were no significant differences among the Zn values of the
three calves groups at 150 days old (Control group 79.78 ± 7.08 ppm;-Zn Group 79.20 ± 4.90 and –Cu
Group 80.53 ± 11.11 at ST6).
Calves’ Zn serum level (Table 4): There were no significant differences among the Zn mean values of
the different groups in any of the sampling times (G1= 1,906; G2= 1,822; G3=1,606 ppm). However, it
was noted an accentuated reduction on the serum Zn mean values of the three groups at the last collection
(0,578 ppm at ST11), compared to the prior sampling times (immediately before vaccine 2,224 ppm
(ST7) and booster 2,532 ppm (ST10)).
ELISA index for anti-Clostridium chauvoei antibodies obtained via colostrums (Table 5): There were
no significant differences among the anti-C chauvoei antibodies titers of any groups in any of the
sampling times. A sequential and significant reduction of the antibody titers is observed until the calves
were four months old. Such reduction was very accentuated in the first two months of life.
5
6
ELISA index for anti-Clostridium chauvoei antibodies in response to the vaccination
(Table 6):
The statistically lowest antibodies titers were presented by the -Cu Group at 15 days after the vaccination
(0.829 ± 0.350 at ST8). There were no significant differences in the antibody titers among the Control
Group and the -Zn Group at this sampling time (respectively 0.949 ± 0.248 and 0.924 ± 0.300 at ST8).
Furthermore, at 21 days after the vaccine (ST9) the titers of Control Group were significantly more
elevated (0.858 ± 0.234 at ST9) than the ones in -Zn Group and –Cu Group (respectively 0.696 ± 0.279
and 0.726 ± 0.333 at ST9). At 36 days after the first vaccination and immediately prior to the second
dose, the antibodies titers of all the groups were statistically similar (0.565 for all groups mean at ST10).
Nevertheless, 15 days after the booster vaccination we could notice the significant difference among the
antibodies titers among the three groups of animals. The Control Group presented higher titers (0.827 ±
0.200 at ST11), followed by -Zn Group (0.733 ± 0.242 at ST11). The animals from -Cu Group, which had
the lowest hepatic levels of such mineral, presented lower titers of anti-C chauvoei antibodies at this
sampling time (0.679 ± 0.201 at ST11).
Discussion:
Calves’ hepatic and serum Cu levels: At 150 days old, the calves of – Zn Group presented significant
higher hepatic Cu levels than the Control Group, which have significant higher levels than the ones
observed in the -Cu Group. The element Zn causes an antagonistic effect in the Cu bio-availability
(SUTTLE, 1986; MARSTON, 1999). Therefore, the smaller offer of Zn for the -Zn Group may have been
responsible for the higher hepatic Cu levels observed in this Group, thus explaining the occurrence of
superior values than the Control Group. In accordance to Graham (1991) (10 a 25 ppm), Marston (1999)
(5 – 25 ppm) or McDowell (1999) (25 –75 ppm) reference values, there were not hepatic levels indicative
of marginal deficiency in any of the groups at any sampling time. It is important to mention that, despite
the absence of deficiency, there were significant differences in the hepatic Cu levels among the different
treatment groups.
Suttle (1986) reports that the safe Cu:Mo (copper : molybdenum) dietetic rate varies in accordance to the
pasture, and McDowell (1999) considers safe to maintain cattle in pastures with 6 ppm of copper when
the levels of molybdenum are not higher than 1.5 ppm. Such conditions neared this experiment (Cu: 6.0
ppm; Mo: 2.0 ppm).
6
7
On the other hand, the high Fe (iron) pasture levels (153 ppm), associated to the additional Zn supply,
could have contributed for the lower Cu levels of the –Cu Group. The accelerated growth rate of the
animals during the assessed period was not capable of producing deficiency.
There were no significant differences among the serum Cu levels of the three calves’ groups in any of the
sampling times. All the serum Cu mean values of the three groups, except those ones, observed
immediately before booster vaccination (ST10), may be considered as indicative of marginal deficiency,
according to McDowell (1999) (<0,65 mg/L). If we compare the hepatic and serum copper levels with the
normal values mentioned by McDowell (1999), we would notice that, despite the hepatic levels being
considered adequate, the serum values fit the deficiency values. Wikse et al. (1992) indicated that serum
Cu levels are more susceptible to metabolic variation and, many times, it doesn’t correspond to liver
copper or even to the organic Cu status.
Calves’ hepatic and serum Zn levels: There were no significant differences among the Zn hepatic levels
of the three calves groups. The Zn hepatic values obtained in this experiment may be considered as
normal if compared with the ones described by Graham (1991) (40 – 100 ppm). According to the
Underwood (1977) criteria, all the mean hepatic values, for all groups, may be considered as indicative of
deficiency (<125 ppm).
There were no significant differences among the serum Zn mean values of the different groups in any of
the sampling times. However, it was noted an accentuated reduction on the serum Zn mean values of the
three groups at the last collection, compared to both prior sampling times. The levels observed in the last
collection may be considered indicative of a marginal deficiency according to Graham (1991) (0,4 to 0,8
ppm) and Marston (1999) (0,5 to 0,6 ppm) criteria. Such reduction may have occurred due to the animals’
stress, caused by the intense handling, during the last collection stage. The stress effects on the zinc serum
levels had already been described by other authors (SPEARS et al. 1991; KINCAID et al., 1997).
The serum Zn levels found in the first two sampling times ranged within the normality rates as proposed
by Graham (1991) (0,8 to 1,4 ppm); Marston (1999) (> 0,6 ppm) and McDowell (1999) (> 0,8 ppm).
ELISA index for anti-Clostridium chauvoei antibodies obtained via colostrums: There were no
significant differences among the anti-C chauvoei antibody titers of any groups in any of the sampling
times. A sequential and significant reduction in the titers of antibodies is observed until the calves are
four months old, due to the physiological catabolism of immunoglobulins. Such reduction was more
accentuated in the first two months of life.
7
8
Silva (2003) has analyzed the gamma globulins levels of the same calves utilized in this present research.
An accentuated decrease of these levels until the third month of life was observed (3,02 ± 0,98 g/dL
during the first week, significantly higher than 0,85 ± 0,35 g/dL at the first month, statistically higher than
0,44 ± 0,11 g/dL at the second month , which was statistically equivalent to 0,57 ± 0,12 g/dL at the third
month of calves’ life).
Despite the experimental diets, we can consider that, the matrixes, even the ones submitted to the Cu and
Zn insufficient diets, have maintained hepatic stocks of these nutrients, which have enabled the adequate
production of immunoglobins. Ward et al. (1997) haven’t found significant differences among colostrums
collected from heifers at parturition or on serum IgG levels of 7 day old calves that were born from
heifers under insufficient or adequate Cu levels.
ELISA index for anti-Clostridium chauvoei antibodies in response to the vaccination:
Considering the absence of significant differences among the hepatic Zn levels or the serum Cu and Zn
levels in any of the three experimental groups, in all sampling times, such observations shall be evaluated
taking into account the different Cu hepatic levels. We must also take into account the fact that, despite
the significant differences among the calves’ hepatic Cu levels, none of the mean levels was near the
indicative values for deficiency.
Several studies have investigated the effect of Cu deficiency on the humoral immune response of
ruminants with different results.
Stabel et al. (1993) found in calves that received insufficient Cu diet the higher serum antibody titers to
IBRV than did calves that received Cu supplement. In the same study, the authors did not find significant
differences among the anti-Pasteurella haemolytica antibody titters of calves under insufficient or
supplement Cu diets. However, calves with supplemented Cu diet tended to have higher Pasteurella
hemolytica titers than did calves without Cu supplement. This 5 months study was conducted with 14
Holstein steers, averaging 30 days of age, submitted to an insufficient diet (1. 5 ppm of Cu) or
supplemented with 10 ppm of Cu. The hepatic Cu levels were significantly higher for the Cu
supplemented animals (61 ± 23 ppm), compared to the group submitted to insufficient Cu nutrition (7,4 ±
2,5 ppm). These hepatic Cu levels are much lower than the ones found in this present research, making
difficult some direct correlation among the results. It must be noted the presence of hepatic Cu levels
indicative of deficiency, according to Graham (1991) (< 10 ppm) and Marston (1999) (0.5-10 ppm).
According to Mc Dowell (1999) (25-75 ppm), even the group receiving Cu supplemented diet presented
hepatic Cu levels indicative of marginal deficiency.
8
9
Ward et al. (1997) conducted an experiment to determine the effects of Cu deficiency, with or without
high dietary Mo or Fe on the specific immunity of calves. These authors used 38 calves from bred heifers,
fed experimental diets from the last third of gestation until the calves were weaned. Feeding diets not
supplemented with Cu resulted in Cu deficiency according to Underwood (1981) plasma Cu parameters
(<0.5 mg/L). Unsupplemented calves (0.30 mg/L serum Cu levels) had significant higher secondary
antibody response to the second inoculation of porcine red blood cells than the Cu, Mo, or Fe
supplemented groups at 14 and 21 days after vaccination (respectively 0.68 mg/L, 0.35 mg/L and 0.22
mg/L of serum Cu levels). There were no significant differences among groups at the time of the first
inoculation of PRBC. The basal diet of the experiment was adjusted for 1.5 ppm of Cu and the groups
were supplemented with 10 ppm of Cu; 5 ppm of Zn and 600 ppm of Fe.
Cerone et al. (1995) fed female Aberdeen Angus heifers with a diet containing Mo and sulfate for 9
months to develop a low Cu status. The animals were immunized with live S1119 Brucella abortus.
Serum Cu concentration and activity of ceruloplasmin were decreased by the induced Cu deficiency
(about 0.4 mg/L of serum copper at four months from the beginning of the treatment). Total level of
immunoglobulin G and total complement concentration in serum were impaired by low Cu status.
Antibody titers to B. abortus and proliferation of Concanavalin A were significantly lower in Cu deficient
heifers than in controls. Results show that specific immune response to a intracellular pathogen may be
impaired by Cu deficiency.
These previously mentioned two authors used only plasma or serum Cu values as indicator of Cu organic
status and utilized supplementation with Cu antagonists in order to induce deficiency. These points are
different from the methodology adopted in this present research and may have adversely influenced the
results interpretation of these works.
Dorton et al. (2003) used 48 purebred Angus steers, about 7 months of age, to determine the effects of Cu
source and concentration on immune function. Steers were fed a diet containing 7.1 ppm of Cu for 56
days, then switched to a diet containing 6.1 ppm of Cu for 144 days. 14 days after the first inoculation of
porcine red blood cells (PRBC) the groups supplemented with 10 ppm of Cu had the highest antibody
titers, even higher than the groups supplemented with 20 ppm of Cu. 14 days after the second dose of
PRBC the groups supplemented with 20 ppm of Cu had higher antibody titers than the groups
supplemented with 10 ppm and the unsupplemented group. However, 21 days after the second PRBC
inoculation, the antibody titers of the unsupplemented group were higher than the supplemented ones.
9
10
On the other hand, steers receiving 20 ppm of Cu had higher specific antibody titers to OVA (ovalbumin)
than steers receiving 10 ppm of Cu at 14 or 21 days after OVA inoculation. Steers receiving 20 ppm of
Cu from organic sources had higher anti-OVA specific antibody titers than steers supplemented with the
same amount of Cu, derived from CuSO4. The unsupplemented steers had the lower anti-OVA antibody
titers. The liver Cu levels of the groups at 112 days of the experiment, when received the second dose of
PRBC and the unique inoculation of OVA were: Unsupplemented group - 37,4 ppm (marginal deficiency
according to Mc Dowell (1999) (25-75 ppm); Group 10 ppm of Cu - 113,9 ppm; Group 20 ppm of Cu -
116,9; Group 10 ppm of Cu from organic sources – 94,8 and Group 20 ppm of Cu from organic sources:
194,6 9 (adequate according to Underwood (19991); Marston (1999); Mc Dowell (1999)). For the
authors, the results suggested that the effect of Cu supplementation on the immune response are variable
and depend on the class of immune cell being studied as well as the source and concentration of Cu
supplementation. B cell stimulated primary and secondary immune responses tended to be enhanced by
Cu supplementation. When a more antigenic antigen was administered the higher Cu supplementation
induced higher antibody titers. They also mentioned that the differences among results of other
researchers have influences of the type of antigenic stimulation. These authors attributed importance to
the use of “Freund’s Incomplete Adjuvant” to improve the antigenic effect of OVA by inducing the
granuloma formation and a better antigen processing and presentation to T-cells.
In this present work there were not Cu levels indicative of deficiency. However, the -Cu Group, with
significant lower hepatic Cu levels, had the significant lower antibody titers among the three groups.
Although the Cu hepatic levels of the -Zn Group were the highest, the antibody titers of this Group were
significant lower than the observed on the Control Group, under adequate diet. These results indicate the
advantage of an adequate and well-balanced mineral nutrition in order to prevent immune dysfunctions. It
is important to mention that hepatic Cu levels observed in this present study, even in the animals under
Cu insufficient diet, are much higher (173.30 51.54 ppm) than the marginal deficiency references of Mc
Dowell (1999) (27 – 75 ppm) or Marston (1999) (5 – 25 ppm) and Graham (1991) (10 – 25 ppm). In the
same way, the high hepatic Cu levels, reached by the -Zn Group, possibly because of the absence of Zn
antagonism, may cause some negative effect on the antibody production. The extremely high Cu levels of
the -Zn Group animals could reduce the bioavailability of other minerals, such as Se and Mn that also
have an important rol in immune response. It must be noted that other researchers have found lower
antibody titers in Cu supplemented groups when compared to cattle under insufficient Cu supply and even
to deficient ones. In addition, it is possible that the measured Zn values of this present work did not
10
11
indicate accurately the calves’ Zn status or reflected the metabolic functions of this mineral. It must be
noted that that these aforementioned mineral values weren’t induced by heavily supplementation with Cu
absorption antagonists. Those conditions made difficult the direct comparison among other researchers’
results.
Conclusions:
- The diets utilized during the experiment did not cause Cu hepatic levels that indicated deficiency.
Despite this, the serum levels of Cu were compatible with Cu deficiency.
- There were no significant differences between the titles of anti-Clostridium chauvoei passive
antibodies between the three calves’ groups, thus demonstrating the absence of treatments effect on
the matrixes’ colostrums immunoglobins production.
- Despite not having noticed Cu levels compatible with deficiency, the different Cu hepatic levels were
reflected on the production of antibodies in response to the anti-Clostridium chauvoei vaccine.
References
Asp, T.N., and W. Lund, 1992: Elemental analysis of bovine liver by inductively coupled plasma atomic
emission-spectrometry by using a simple dissolution procedure. Talanta. 39, 563-566.
Cerone, S.I., S.A. Sansinanea, and N.J. Auza, 1995: Copper deficiency alters the immune response of
bovine. Nutr. Res. 15, 1333-41.
Crichton, R., J. Solomon, and A. M. Barton, 1990: The development of na Enzyme-linked
Immunosorbent Assay for Measuring the Poteny of Vaccines Containing Clostridium chauvoei antigens.
Biologicals. 18, 49-54.
Dorton, K.L., T. Engle, D. Hamar, P. Siciliano, R. Yemm, 2003: Effects of copper source and
concentration on copper status and immune function in growing and finishing steer. Anim. Feed Sci.
Tech. 110, 31-44.
Graham, T. H., 1991: Trace element deficiencies in cattle. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 7,
153-215.
11
12
Kincaid, R.L., B. Chew, J. Cronrath, 1997: Zinc oxide and amino acids as sources of dietary zinc for
calves: effects on uptake and immunity. J. Dairy Sci. 80, 1381-8.
Mattar, M.A., T. Cortiñas, M. Di GENARO, et al., 1999: Immunogenic power of cellular and
extracellular antigens of Clostridium chauvoei strain isolated in San Luis, Argentina. Anaerobe. England,
5, 295-6.
Marston, T., 1999: Trace mineral supplementation in beef cattle. Part I. Compend. Contin. Educ. Pract.
Vet. 21, 21-7.
Mcdowell, L.R., 1999: Minerais para ruminantes sob pastejo em regiões tropicais, enfatizando o Brasil.
3.ed. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, Florida.
Minatel, L., J. Carfagnini 2000: Copper deficiency and immune response in ruminants. Nut. Res., 20,
1519-29.
Morrison, D.F., 1967: Multivariate statistical methods. 2. ed. Mc Graw Hill, New York .
National Research Council, 1996: Nutrient requeriment of beef cattle. 7.ed. National Academy Press,
Washington.
Schipper, I.A.; L.C. Kelling, and J. Mayer, 1978: Effects of passive immunity on immune response in
calves vaccinated against Clostridium chauvoei infection. Vet. Med. Small Anim. Clin. 78, 1564-6.
Silva, H.F. Avaliação da bioquímica clínica de bezerros Nelore, nascidos de vacas em dieta adequada ou
insuficiente em cobre ou zinco e mantidos sob a mesma nutrição mineral de suas mães até os seis meses
de idade. 2003: 149p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
12
13
Spears, J.W., R. Harvey, T. Brown, 1991: Effects of zinc methionine and zinc oxide on performance,
blood characteristics, and antibody titers response to viral vaccination in stressed feeder calves. J. Am.
Vet. Medical Assoc. 199, 1731-3.
Stabel, J.R, J. Spears, T. Brown. 1993: Effect of copper deficiencyon tissue blood characristics, and
immune function calves challenged with infectious bovine rhinoracheitis virus Pasteurella haemolytica.J.
Anim. Sci. 71, 1247-55.
Suttle, N. F., 1986: Copper deficiency in ruminants; recent developments. Vet. Rec., 119, 519-522.
Underwood, E. J., 1997: Trace elements in human and animal nutrition. 4.ed. New York: Academic Press,
1977.
Ward, J. D., G. Gengelbach, J. Spears. 1997: The ects copper deficiency wi or without high dietary iron
or molybdenum on immune function of cattle. J. Anim. Sci., 75, 1400-08.
Wikse, S.E.; D. Herd; R. Field; et al. 1992. Diagnosis of copper deficience in cattle. J. Amer. Vet Med
Assoc. , 200, p. 1625-9.
Table 01. Mineral suplement composition. based on pasture mineral analysis.
Mineral
Suplement
P
(%)
Cu
(%)
Zn
(%)
Co
(%)
Na Cl
(%)
Se
(%)
Control Group
68 0.625 0.765 0.007 30.6 0.003
-Zn Group
68 0.625 0 0.007 31.365 0.003
-Cu Group
68 0 0.765 0.007 31.225 0.003
Source
Bicálcium
Fosfate
CuSO
4
ZnSO
4
CoSO
4
NaCl
Sodium
Selenite
Mean values followed by equal capital letters do not differ significantly between the groups.
Mean values followed by equal small letters do not differ significantly between the sampling times.
Table 02. Mean values and standard deviations of hepatic Copper and Zinc levels (ppm) of Nelore
calves under different treatments at 150 days old (ST6).
Groups
Hepatic Cu (ppm) Hepatic Zn (ppm)
Control Group
(n=10)
Means
s
323.61
B
26.73
79.78
A
7.08
-Zn Group
(n=10)
Means
s
434.93
A
211.56
79.20
A
4.90
-Cu Group
(n=10)
Means
s
173.30
C
51.54
80.53
A
11.11
Groups’ Mean values
310.62
163.78
79.84
7.90
Mean values followed by equal capital letters do not differ significantly between the groups.
13
14
Mean values followed by equal small letters do not differ significantly between the sampling times.
Table 03. Mean values and standard deviations of the serum Copper levels (ppm) in Nelore calves
under different treatments and sampling times (ST7. ST10 e ST11).
Groups
ST7
Vaccine
ST10
Booster
ST11
15 days after booster
Groups’
Means
Control Group
(n=10)
Means
s
0.621
Aa
0.112
0.642
Aa
0.121
0.660
Aa
0.181
0.641
-Zn Group
(n=10)
Means
s
0.604
Ab
0.110
0.809
Aa
0.353
0.593
Ab
0.161
0.669
-Cu Group
(n=10)
Means
s
0.581
Aa
0.085
0.600
Aa
0.052
0.629
Aa
0.104
0.603
Groups’ Mean values
Means
s
0.684 0.627
Mean values followed by equal capital letters do not differ significantly among the groups.
Mean values followed by equal small letters do not differ significantly among the sampling times.
Table 04. Mean values and standard deviations of the serum Zinc levels (ppm) in Nelore calves
under different treatments and sampling times (ST7. ST10 e ST11).
Groups
ST7
Vaccine
ST10
Booster
ST11
15 days after
booster
Groups’ Means
Control
Group (n=10)
Means
s
2.142
Aa
1.791
2.706
Aa
0.960
0.871
Ab
0.856
1.906
-Zn Group
(n=10)
Means
s
2.281
Aa
2.265
2.784
Aa
0.939
0.401
Ab
0.508
1.822
-Cu Group
(n=10)
Means
s
2.249
Aa
1.366
2.106
Aa
0.383
0.463
Ab
0.594
1.606
Groups’ Mean values
2.224 2.532 0.578
Mean values followed by equal capital letters do not differ significantly between the groups.
Mean values followed by equal small letters do not differ significantly between the sampling times.
Table 05. Mean values and standard deviations of the ELISA index for anti-Clostridium chauvoei
antibodies (passive) of Nelore calves under different treatments and sampling times (ST1.
ST2. ST3. ST4. ST5 and ST6).
Groups
ST1
1 week
ST2
1 month
ST3
2 month
ST4
3 month
ST5
4 month
ST6
5 month
Groups’
Means
Control
Group (n=10)
Means
s
1.018
Aa
0.360
0.452
Ab
0.351
0.116
Ac
0.115
0.080
Ad
0.073
0.016
Ae
0.020
0.012
Ae
0.038
0.282
-Zn Group
(n=10)
Means
s
0.962
Aa
0.418
0.358
Ab
0.139
0.065
Ac
0.048
0.031
Ad
0.029
0.015
Ae
0.025
0.014
Ae
0.030
0.240
-Cu Group
(n=10)
Means
s
1.019
Aa
0.413
0.332
Ab
0.238
0.111
Ac
0.187
0.089
Ad
0.105
0.022
Ae
0.050
0.019
Ae
0.046
0.265
Groups’ Mean values
0.999 0.380 0.097 0.066 0.018 0.015
Mean values followed by equal capital letters do not differ significantly between the groups.
Mean values followed by equal small letters do not differ significantly between the sampling times.
14
15
Table 06. Mean values and standard deviations of the ELISA index for anti-Clostridium chauvoei
antibodies (vaccine) of Nelore calves under different treatments and sampling times (ST7.
ST8. ST9. ST10 and ST11).
Groups
ST7
Vaccine
ST8
15 days after
ST9
21 days after
ST10
Booster
ST11
15 days after
booster
Groups’
Mean
Control Group
(n=10)
Means
s
0.028
Ad
0.044
0.949
Aa
0.248
0.858
Ab
0.234
0.580
Ac
0.194
0.827
Ab
0.200
0.648
-Zn Group
(n=10)
Means
s
0.047
Ad
0.054
0.924
Aa
0.300
0.696
Bb
0.279
0.538
Ac
0.270
0.733
Bb
0.242
0.587
-Cu Group
(n=10)
Means
s
0.020
Ad
0.027
0.829
Ba
0.350
0.726
Bb
0.333
0.578
Ac
0.264
0.679
Cb
0.201
0.566
Groups’ Means values
0.030 0.901 0.760 0.565 0.746 -
Means values followed by equal capital letters do not differ significantly between the groups.
Means values followed by equal small letters do not differ significantly between the sampling times.
15
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