( PDF ) Clonagem e expressão do gene da B[beta]-glicosidase da bactéria endofítica Bacillus pumilus

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Andréa Cristina Bogas

Clonagem e expressão do gene da β-glicosidase da

bactéria endofítica Bacillus pumilus

Londrina

2005

Universidade Estadual de Londrina

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Andréa Cristina Bogas

Clonagem e expressão do gene da β-glicosidase da

bactéria endofítica Bacillus pumilus

Londrina

2005

Universidade Estadual de Londrina

Instituto Agronômico do Paraná

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

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Andréa Cristina Bogas

Clonagem e expressão do gene da β - glicosidase da

bactéria endofítica Bacillus pumilus

Londrina

2005

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Genética e Biologia Molecular, da Universidade

Estadual de Londrina, como requisito parcial à obtenção do

título de Mestre.

Orientadora: Dra. Maria Helena Pelegrinelli Fungaro

Co-orientador: Dr. Laurival Antônio Vilas Bôas

Andréa Cristina Bogas

Clonagem e expressão do gene da β - glicosidase da

bactéria endofítica Bacillus pumilus

Londrina, 24 de fevereiro de 2005.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Genética e Biologia Molecular,

da Universidade Estadual de Londrina, como

requisito parcial à obtenção do título de Mestre.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Maria Helena Pelegrinelli Fungaro

Universidade Estadual de Londrina

Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo

ESALQ/USP

Profa. Dra. Aneli de Melo Barbosa

Universidade Estadual de Londrina

Aos meus queridos pais que

sempre me incentivaram, pelo

exemplo, amor e por tudo que

representam na minha vida

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a

realização deste trabalho e, em especial,

À Profa. Dra. Maria Helena P. Fungaro que com sua competência, apoio e amizade

contribuiu para a minha formação acadêmica e crescimento pessoal;

Ao Prof. Dr. Laurival Antônio Vilas Boas pela co-orientação, presteza e amizade;

Ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/UFPR e em especial ao Prof.

Dr. Emanuel de Souza pela atenção, ensinamentos e contribuições para a

realização dos estudos de expressão gênica;

Ao Departamento de Biologia Geral/UEL e à Prof. Dra. Rosângela Maria Pinto

Moreira, coordenadora do programa de pós-graduação em Genética e Biologia

Molecular;

Ao corpo docente do Departamento de Biologia Geral/UEL pelos ensinamentos que

contribuíram para a minha formação acadêmica;

À Profa. Dra. Aneli de Melo Barbosa pela colaboração na realização dos ensaios

enzimáticos e contribuições no trabalho;

Ao Dr. Welington Luiz de Araújo pelas sugestões dadas ao trabalho;

À Profa. Dra. Olívia Márcia Nagy Arantes pelas críticas e sugestões na ocasião do

exame de qualificação;

À Profa. Dra. Márcia Cristina Furlaneto que com sua experiência profissional

colaborou para o desenvolvimento deste trabalho.

À Profa. Dra. Maria Angélica Ehara Watanabe pela colaboração durante a realização

dos experimentos.

À Profa. Dra. Marilda Carlos Vidotto por disponibilizar seu laboratório para a

realização de alguns experimentos.

Aos funcionários do Setor de Radiologia do Hospital das Clínicas da UEL que

gentilmente sempre colaboraram na revelação dos filmes de RAIO X.

À amiga Daniele Sartori pelo companheirismo desde a graduação e que também

vence mais esta etapa.

Aos amigos do laboratório Márcia, Patrícia, Renan, Lígia e Luís pela amizade e

inesquecível convivência e à Rosana pelos serviços técnicos prestados.

Às doutorandas Ana Cláudia Bonatto (UFPR) e Flora Kano (UEL) pela atenção e

ajuda durante o trabalho.

Aos amigos do programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular pelo

companheirismo durante o curso.

Aos amigos queridos Rogério e Rogéria pelo incentivo e preciosa amizade.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de estudos.

BOGAS, Andréa Cristina. Clonagem e expressão do gene da β-glicosidase da

bactéria endofítica Bacillus pumilus. 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e

Biologia Molecular) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.

RESUMO

Endófitos são microrganismos que habitam, em alguma fase do seu ciclo de vida, o

interior dos tecidos vegetais sem causar danos ao hospedeiro. O estudo destes

organismos, iniciado na década de 80, tem possibilitado a descoberta de novos

genes com funções importantes para processos industriais, abrindo novos caminhos

para exploração biotecnológica. Dentre as bactérias endofíticas, as do gênero

Bacillus têm sido identificadas como as mais freqüentes nas espécies vegetais

estudadas. Este gênero contém espécies economicamente importantes. O gene

eglA, que codifica para uma β-1,4-endoglucanase termoestável, foi clonado a partir

de uma biblioteca genômica de uma linhagem endofítica (CL16) de B. pumilus. Isto

despertou nosso especial interesse em estudar outras enzimas do complexo

celulolítico, como a β-glicosidase. No presente trabalho, o gene que codifica para a

β-glicosidase de B. pumilus foi clonado a partir de uma biblioteca shotgun. O gene

(1419 pb), aqui denominado bglH, está organizado em um operon de maneira similar

àquele descrito para outras espécies de Bacillus. A seqüência de aminoácidos,

predita a partir da seqüência de nucleotideos, apresenta um domínio e sítios ativos

característicos da família 1 das glicosil hidrolases (GH1). A expressão heteróloga do

gene bglH resultou numa proteína de 54 kDa que teve sua identidade confirmada

por espectrometria de massa (MALDI-TOF). O alinhamento da estrutura primária da

BglH de B. pumilus com a BglH de B. subtilis subsp. subtilis 168 mostrou alta

similaridade entre elas (80% de identidade e 89% de positividade). Estudos

preliminares de atividade enzimática indicaram que a BglH de B. pumilus é mais

ativa sobre o substrato para-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo do que sobre celobiose.

Palavras-chave: endofíticos, Bacillus pumilus, bglH, β-glicosidase, glicosil hidrolase

família 1

BOGAS, Andréa Cristina. 2005. Cloning and expression of the β-glucosidase

gene from the endophyte bacterium Bacillus pumilus Dissertação (Mestrado em

Genética e Biologia Molecular) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.

ABSTRACT

Endophytes are microorganisms that reside in plant tissues at some stage in their life

cycles, without causing harm to the host. The study of these organisms, begun in the

80’s, has facilitated the discovery of new genes with functions important to industrial

processes, opening up new areas for biotechnological exploitation. Amongst the

endophytic bacteria, those of Bacillus genus have been identified as the most

frequent. This genus contains economically important species. The eglA gene, which

codes for a thermostable β-1,4-endoglucanase, was cloned from an endophyte strain

(CL16) of the B. pumilus genomic library. This encouraged us to study other

cellulolitic complex enzymes such as the β-glucosidase. In this study, the gene that

encodes for a β-glucosidase of B. pumilus was cloned from a shotgun library. The

gene (1419 bp), here named bglH, is organized as an operon similarly to that

described for other Bacillus species. The amino acid sequence, predicted from the

nucleotide sequence, displays a domain and active sites typical of glycosil hydrolase

(GH1) family 1. The heterologous expression of bglH resulted in a 54 kDa protein,

whose identity was confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF). Alignment of the

BglH primary structure from B. pumilus with one from B. subtilis subsp. subtilis strain

168 revealed a high degree of similarity (80% identity and 89% positivity). Preliminary

studies of enzyme activity indicated that the BglH from B. pulimus is more active on

the para-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside substrate than on cellobiose.

Palavras-chave: endophytes, Bacillus pumilus, bglH, β-glucosidase, glycosil

hydrolase família 1

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.7 SUBCONAGEM DO GENE bgl DE B. pumilus VIA SISTEMA GATEWAY

Figura 1 - Etapas de clonagem de um produto de PCR no vetor de entrada.............52

Figura 2 - Etapas de transferência do produto de PCR do vetor de entrada para o

vetor de destino via reação LR.........................................................................53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CLONAGEM DO GENE bglH DE B. pumilus

Figura 3- Autoradiografia resultante da hibridação da sonda contra a biblioteca

genômica do B. pumilus. A seta indica o clone positivo contendo o

plasmídeo denominado pMH2 .........................................................................65

Figura 4- Caracterização da seqüência de nucleotídeos da ORF bglH no fragmento

clonado a partir da biblioteca genômica de B. pumilus. Os códons iniciador

e terminador e o sítio de ligação do ribossomo (RBS) estão sublinhados....

...............................................................................................................................67

Figura 5 - Organização da região bglP-bglH no fragmento clonado.............................69

Figura 6- Representação esquemática do domínio conservado de glicosil hidrolase

na BglH de B. pumilus........................................................................................70

Figura 7- Alinhamento de seqüências de aminoácidos preditas a partir do gene bglH

(depositadas no NCBI GenBank, de espécies de Bacillus e da BglH de B.

pumilus predita neste trabalho, utilizando-se do programa BioEdit v. 5.0.9.

As regiões destacadas em preto correspondem aos aminoácidos

conservados entre as proteínas; as regiões cinzas correspondem aos

aminoácidos com propriedades químicas similares; os aminoácidos

destacados dentro do retângulo correspondem aos sítios catalíticos das

enzimas..................................................................................................................72

5.2 SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DO GENE bglH DE B. pumilus EM E.

coli

Figura 8- SDS-PAGE da proteína expressa em E. coli BL21CodonPlus(DE3). As

proteínas estão coradas com Coomassie Blue R-250. Linha 1, marcador

de massa molecular (Pharmacia); linha 2, extrato celular de E. coli BL21

CodonPlus(DE3) não transformadas com pAB1 e não induzidas com

IPTG; linha 3, extrato celular de E. coli BL21 CodonPlus(DE3) não

transformadas com pAB1 e induzidas com IPTG; linha 4, extrato celular de

E. coli BL21 CodonPlus(DE3) transformadas com pAB1 e não induzidas

com IPTG; linha 5, extrato celular de E. coli BL21 CodonPlus(DE3)

transformadas com pAB1 e induzidas com IPTG...........................................74

Figura 9 - Ensaio preliminar de atividade da ß-glucosidase de B. pumilus. Tubos 1 e

3 : atividade da enzima sobre o substrato ρ-nitrofenil-ß-D-glicopiranosídeo.

Tubo 2 –Controle negativo (substrato e tampão)...............................................76

LISTA DE TABELAS

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.2 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS UTILIZADOS NA CLONAGEM E EXPRESSÃO

Tabela 1 - Linhagens de bactérias .....................................................................................37

Tabela 2 - Plasmídeos...........................................................................................................37

4.3 OLIGONUCLEOTÍDEOS

Tabela 3 - Oligonucleotídeos...............................................................................................38

4.4.8 QUANTIFICAÇÃO DA SONDA

Tabela 4 - Diluições da sonda e DNA controle (1 ng/µl)..................................................46

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.2 SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DO GENE bglH DE B. pumilus EM E.

coli

Tabela 5 - Resultados da análise de espectrometria de massa que comprovam a

identidade da ß-glicosidase de B. pumilus expressa em E. coli...............75

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................15

2 REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................17

2.1CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS E GÊNERO BACILLUS .

................................................................................................................................................. 17

2.2 CLASSIFICAÇÃO DAS GLICOSIL HIDROLASES ....................................................................21

2.3 CLASSIFICAÇÃO E IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL DAS β-GLICOSIDASES ...............................23

2.4 CLONAGEM DE β-GLICOSIDASES BACTERIANAS...............................................................29

3 OBJETIVOS........................................................................................................................35

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................36

4.1 MATERIAL BIOLÓGICO........................................................................................................36

4.2 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS UTILIZADOS NA CLONAGEM E EXPRESSÃO...........................36

4.3 OLIGONUCLEOTÍDEOS........................................................................................................38

4.4 CLONAGEM DO GENE DA β-GLICOSIDASE DE B. pumilus ...............................................38

4.4.1 Biblioteca de B. pumilus .............................................................................................38

4.4.2 Transferência dos Clones Bacterianos para Membranas de Náilon...................40

4.4.3 Obtenção de Parte do Gene que Codifica para β-glicosidase ............................41

4.4.4 Extração de DNA Plasmidial para Obtenção da Sonda........................................42

4.4.5 Hidrólise do DNA Plasmidial para Purificar a Sonda..............................................43

4.4.6 Eluição dos Fragmentos de DNA ..............................................................................44

4.4.7 Marcação da Sonda.....................................................................................................44

4.4.8 Quantificação da Sonda..............................................................................................45

4.4.9 Preparo de Membranas Controles para Hibridação...............................................47

4.4.10 Hibridação com Membranas Controles..................................................................48

4.5 SEQÜENCIAMENTO DO GENE bgl DE B. pumilus..............................................................49

4.6 ANÁLISE DO FRAGMENTO SEQÜENCIADO .........................................................................50

4.7 SUBCLONAGEM DO GENE bgl DE B. pumilus VIA SISTEMA GATEWAY ...........................51

4.7.1 Obtenção do Gene bgl por PCR................................................................................54

4.7.2 Clonagem do Gene bgl no Vetor de Entrada..........................................................54

4.7.3 Análise dos Transformantes.......................................................................................55

4.7.3.1 Extração de DNA plasmidial...................................................................................55

4.7.3.2 Reação de PCR para confirmar a ligação do gene bgl no vetor de entrada..56

4.7.4 Transferência do Produto de PCR do Vetor de Entrada para o Vetor de Destino

Via Reação LR............................................................................................................57

4.7.5 Preparo de Células de E. coli Eletrocompetentes..................................................58

4.7.6 Transformação de E. coli Eletrocompetentes..........................................................58

4.8 ANÁLISE DOS TRANSFORMANTES......................................................................................59

4.9 SUPEREXPRESSÃO DO GENE bgl EM E. coli....................................................................59

4.10 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS SOB CONDIÇÕES DESNATURANTES (SDS-PAGE)....61

4.11 ANÁLISE DA PROTEÍNA SUPEREXPRESSA EM ESPECTROMETRIA DE MASSA................62

4.12 ATIVIDADE DE β-GLICOSIDASE........................................................................................63

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................64

5.1 CLONAGEM DO GENE bglH DE B. pumilus.......................................................................64

5.2 SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DO GENE bglH DE B. pumilus EM E. coli...

..................................................................................................................................................73

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................77

REFERÊNCIAS......................................................................................................................78

ANEXO....................................................................................................................................87

ANEXO A – ARTIGO ..............................................................................................................88

1 INTRODUÇÃO

Microrganismos endofíticos são organismos que pelo menos em

uma fase do seu ciclo de vida habitam o interior de tecidos vegetais, freqüentemente

vivendo em simbiose com o hospedeiro. Estes microrganismos têm sido apontados

como uma nova fonte de genes, cuja clonagem e expressão tem aberto caminhos

para exploração biotecnológica. Na década de 80 iniciou-se o estudo de bactérias

endofíticas e dentre as espécies mais freqüentemente encontradas nas espécies

vegetais estudadas estão aquelas pertencentes ao gênero Bacillus. Este gênero

possui espécies economicamente importantes, e no que se refere à produção de

enzimas, têm se destacado pela capacidade de produção em grandes quantidades.

Este fato caracteriza o gênero Bacillus como um dos mais importantes na produção

de enzimas com aplicações industriais. O gênero Bacillus destaca-se ainda como

uma fonte de genes de interesse biotecnológico, tais como aqueles que codificam

para enzimas com potencial para degradar lipídeos, proteínas e carboidratos. B.

pumilus é uma das espécies deste gênero que apresenta potencial biotecnológico e

tem sido empregada na indústria para a produção de xilanases, xilosidades e

proteases alcalinas. Recentemente um isolado endofítico de B. pumilus obtido a

partir de plantas de Citrus, teve o gene que codifica para uma endoglucanase (eglA)

clonado e expresso em E. coli. O estudo das características enzimáticas mostrou

que esta enzima apresenta potencial para aplicações biotecnológicas. O fato deste

isolado ter sido obtido de material vegetal desperta o interesse para o estudo de

outras enzimas do complexo celulolítico, as quais são aplicáveis a processos

industriais. Dentre as enzimas que apresentam grande potencial biotecnológico

estão as glicosil hidrolases. Estas são uma das maiores classes de enzimas com

função na degradação de carboidratos e realizam a hidrólise terminal de resíduos de

ß – D - glicose não reduzida com conseqüente liberação de ß – D - glicose. Nas

famílias 1 e 3 de glicosil hidrolases estão classificadas as ß- glicosidases (EC

3.2.1.21), um grupo enzimas que têm sido empregado em vários processos

industriais. A participação na hidrólise de celulose é um dos motivos que tem

despertado o interesse por ß- glicosidases. A celulose é um carboidrato que

representa a maior fonte de energia renovável na Terra que pode ser convertido a

produtos tais como açúcares solúveis, álcool e outros químicos via degradação

enzimática. Para uma eficiente hidrólise da celulose, microrganismos celulolíticos

produzem um complexo celulolítico com diferentes especificidades e modos de ação

para a hidrólise da estrutura microcristalina da celulose. Entre estas enzimas, as ß-

glicosidases, participam da última etapa do processo de hidrólise da celulose

reduzindo celobiose à glicose. Devido às suas inúmeras aplicações, várias ß-

glicosidases têm sido caracterizadas e seus respectivos genes clonados a partir da

construção de bibliotecas genômicas. Várias espécies bacterianas, dentre elas

aquelas pertencentes ao gênero Bacillus, tiveram o gene que codifica para a ß-

glicosidase clonado e a enzima caracterizada. No entanto, até o momento nenhuma

ß-glicosidase de B. pumilus foi relatada. Dentro deste contexto, o presente trabalho

teve por objetivo clonar, caracterizar e expressar em E. coli o gene da ß-glicosidase

da bactéria endofítica de citros B. pumilus.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS E GÊNERO Bacillus

Endófitos são microrganismos que colonizam o interior de tecidos

vegetais, vivendo de maneira simbiótica com seus hospedeiros (AZEVEDO et al.,

2000). A versatilidade bioquímica e diversidade dos endofíticos representam uma

enorme variedade de genes, cuja clonagem e expressão tem aberto caminhos de

exploração biotecnológica. Bactérias endofíticas estão presentes em todas as

espécies vegetais estudadas até o momento, permanecendo em estado de latência

ou colonizando ativamente os tecidos de forma local ou sistêmica.

O estudo de bactérias endofíticas teve início na década de 80.

Utilizando-se de técnicas imunológicas e de microscopia eletrônica de varredura,

Jacobs et al (1985) enumeraram, localizaram e caracterizaram bactérias endofíticas

de raízes de beterraba açucareira. Estes autores observaram uma grande

diversidade de espécies bacterianas, dentre elas Bacillus subtilis, Pseudomonas

aeruginosa, Corynebacterium sp, e Erwinia herbicola. Em 1991, McInroy e Kloepper,

ao estudarem bactérias endofíticas de milho e algodão, observaram que os gêneros

mais frequentemente encontrados eram Pseudomonas e Bacillus. Fages e Lux

(1991) ao estudarem a microbiota de raízes de girassol (Helianthus annus L.)

cultivado em solo do sudeste da França observaram que a maioria dos isolados

Gram-positivos pertencia à espécie B. cereus, embora as espécies de Bacillus mais

comumente encontradas em associação com raízes de plantas sejam B. polymyxa,

B. circulans e B. macerans. Araújo (1996) ao isolar, identificar e caracterizar

geneticamente bactérias endofíticas de porta-enxertos de citros verificou a presença

de dois grupos bacterianos principais. Um destes grupos era constituído por Erwinia

herbicola e o outro, mais freqüente, constituído por isolados de Bacillus, incluindo B.

pumilus, B. megaterium, B. cereus e B. lentus.

O gênero Bacillus foi proposto por Cohn em 1872 e faz parte da

família Bacillaceae, formulada por Fisher em 1895. As bactérias pertencentes ao

gênero Bacillus são bastonetes, Gram-positivos, aeróbicos e formadores de

endósporos (CLAUS e BERKELEY, 1986, APUD ASH et al., 1991).

A classificação das espécies de Bacillus foi inicialmente baseada na

morfologia, no metabolismo aeróbico e na formação de endósporos. Estes

parâmetros freqüentemente permitem agrupar organismos heterogêneos quanto às

suas propriedades fisiológicas, ecológicas e genéticas, dificultando, portanto, a

sistemática do gênero. Desde o estabelecimento do gênero até o momento a

sistemática de Bacillus passou por várias mudanças. Gordon et al (1981 APUD

BERKLEY, 2002) contribuíram significativamente para a organização das espécies

deste gênero. Estes autores revisaram a classificação das espécies designadas ao

gênero Bacillus listadas no Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.

Baseados em estudos morfológicos e bioquímicos eles foram capazes de eliminar

espécies antes erroneamente classificadas como pertencentes ao gênero Bacillus.

Isto resultou num rearranjo taxonômico do gênero no Bergey’s Manual of Systematic

Bacteriology. Algumas espécies que tinham sido inadequadamente descritas ou

tiveram seus isolados originais perdidos permaneceram na categoria “Species

Incertae Sedis” (BERKELEY, 2002).

Com o advento de ferramentas moleculares, alguns métodos de

análises genômica foram adotados para a reclassificação de bactérias do gênero

Bacillus.

Estudos sobre a variação no conteúdo de GC (32 – 69 mol%) entre

espécies de Bacillus, bem como experimentos de hibridação de DNA revelaram a

heterogeneidade do gênero (PRIEST, 1981; FAHMY et al., 1985), que veio a ser

confirmada mais tarde através de análises de seqüências de nucleotídeos do rRNA

16S (ASH et al., 1991). As análises de seqüências de rRNA 16S de 51 espécies de

Bacillus permitiram a Ash e seus colaboradores mostrarem a existência de 5 cinco

grupos taxonômicos, então denominados Bacillus RNA 1 – 5. Alguns anos após

Nielsen et al (1994) sugeriram a inclusão de um sexto grupo de RNA, composto por

espécies alcalitolerantes e alcalifílicas.

Os métodos moleculares continuam auxiliando na organização do

gênero Bacillus. No entanto, não têm sido suficientes para solucionar os problemas

de taxonomia deste gênero, sendo necessário o estabelecimento de critérios mais

definidos. Apesar disso, atualmente além da divisão em grupos de Bacillus RNA

(STACKEBRANDT e SWIDERSKI, 2002), as espécies de Bacillus também têm sido

divididas em cinco grupos de bactérias aeróbicas produtoras de endósporos,

denominados grupos “cereus”, “megaterium”, “subtilis”, “circulans” e “brevis”

(FRITZE, 2002).

B. pumilus pertence ao grupo “subtilis” no qual estão classificadas

espécies menores que 1 µm de diâmetro, produtoras de esporos elipsoidais,

mesófilas e neutrófilas. Além de B. pumilus, fazem parte deste grupo B.

amylolinquefaciens, B. atrophaeus, B. licheniformis, B. mojavensis, B. subtilis spp.

subtilis, B. subtilis spp. spizizenii e B. vallismortis, todas inclusas no grupo Bacillus

RNA 1 (FRITZE, 2002).

O gênero Bacillus contém espécies economicamente importantes

para diversos processos industriais. A título de exemplo, espécies deste gênero vêm

sendo utilizadas em controle biológico de insetos, em processos de fermentação, na

produção de antibióticos e enzimas, vitaminas, entre outros (SCHALLMEY et al.,

2004).

No que se refere à produção de enzimas algumas espécies deste

gênero tem se destacado devido à capacidade de produção em grandes

quantidades (20-25 g/L). Este fato caracteriza o gênero Bacillus como um dos mais

importantes na produção de enzimas com aplicação industrial. Destaca-se ainda a

contribuição deste gênero como fonte de genes de interesse biotecnológico, tais

como aqueles que codificam para enzimas com potencial para degradar

carboidratos, lipídios e proteínas (SCHALLMEY et al., 2004).

Dentre as espécies de Bacillus com potencial para emprego

industrial está B. pumilus. Esta espécie tem sido usada na indústria para a produção

de xilanases (PANBANGRED et al., 1983; NUYES et al., 2001), xilosidases

(PANBANGREB et al., 1984) e proteases alcalinas (FENG et al., 2001; KUMAR,

2002). Recentemente um isolado endofítico de B. pumilus foi descrito como

altamente eficiente na hidrólise de CMC celulose. Uma endoglucanase (eglA) deste

isolado foi clonada e expressa em E. coli. O estudo das propriedades enzimáticas

mostrou que esta enzima tem alto potencial para aplicações biotecnológicas (LIMA

et al., 2004). O fato de que este isolado foi obtido a partir de material vegetal,

desperta o interesse para o estudo de outras enzimas envolvidas no complexo

celulolítico, as quais são aplicáveis a diversos setores industriais.

2.2 CLASSIFICAÇÃO DAS GLICOSIL HIDROLASES

Carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na natureza.

Eles são constituídos por unidades básicas denominadas monossacarídeos que se

combinam através de ligações glicosídicas resultando na formação de oligo e

polissacarídeos com notável diversidade estrutural e funcional. Os oligos e

polissacarídeos podem ser eficientemente hidrolisados por enzimas produzidas por

microrganismos.

Glicosil hidrolases constituem uma das maiores classes de enzimas

com função na degradação de carboidratos (HENRISSAT e DAVIES, 2000). A

classificação das glicosil hidrolases segue critérios baseados na especificidade do

substrato, na similaridade de seqüência de aminoácidos, e no modo de ação

(HENRISSAT e DAVIES, 1997).

Quando a classificação deste grupo de enzimas é feita com base na

especificidade do substrato critérios estabelecidos pela União Internacional de

Bioquímica e Biologia molecular (IUBMB) devem ser seguidos. Conforme determina

a IUBMB cada enzima recebe um código denominado “EC number” (Enzyme

Commission number). Glicosil hidrolases são desta forma representadas através do

código EC 3.2.1.x, onde x representa o substrato específico, e em alguns casos,

também o mecanismo molecular ou o tipo de ligação entre as moléculas

(HENRISSAT e DAVIES, 1997).

O sistema de classificação baseado na especificidade do substrato é

um dos mais simples na categorização das glicosil hidrolases. Este sistema, no

entanto, não é muito adequado às enzimas que agem sobre vários substratos,

sendo isto particularmente relevante para aquelas glicosil hidrolases que atuam

sobre polissacarídeos complexos presentes na natureza e que freqüentemente

exibem ampla especificidade de substratos. Além disso, este sistema não leva em

conta as características estruturais da enzima. Conseqüentemente, enzimas que

agem sobre substratos similares podem ser incluídas numa mesma classe, sem que

suas características estruturais, modo de ação e relações evolutivas sejam

consideradas (DAVIES e HENRISSAT, 1995; HENRISSAT e DAVIES, 1997).

Um segundo critério de classificação de glicosil hidrolases, que veio

a complementar a classificação baseada na especificidade do substrato, foi sugerido

por Henrissat em 1991. A proposta deste autor foi de classificar glicosil hidrolases

dentro de famílias de acordo com a similaridade de seqüências de aminoácidos.

Glicosil hidrolases com domínios conservados são classificadas dentro de uma

mesma família. Ou seja, quando as seqüências de aminoácidos de duas ou mais

glicosil hidrolases são alinhadas sobre um domínio, estas são incluídas numa

mesma categoria (HENRISSAT et al., 1995).

Inicialmente a classificação com base na similaridade de seqüências

de aminoácidos agrupou as glicosil hidrolases em 35 famílias então designadas

famílias 1 a 35 (HENRISSAT, 1991). No decorrer dos anos, houve um aumento

significativo de seqüências de glicosil hidrolases depositadas em bancos de dados

(EMBL/GenBank e SWISS-PROT), e atualmente há o reconhecimento de 99 famílias

de glicosil hidrolases. A descrição destas famílias está disponível no site

http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/, o qual tem sido regularmente atualizado.

A classificação de glicosil hidrolases em famílias, baseando-se em

seqüências de aminoácidos, permite agrupar enzimas com diferentes

especificidades de substratos. Por outro lado, algumas enzimas que hidrolisam o

mesmo substrato podem ser encontradas em diferentes famílias (DAVIES e

HENRISSAT, 1995; HENRISSAT e DAVIES, 1997).

As estruturas tri-dimensionais (3D) das proteínas são mais

conservadas do que suas seqüências de aminoácidos (DAVIES e HENRISSAT,

1995; HENRISSAT e DAVIES, 1997). Em função disso, a estrutura 3D das glicosil

hidrolases vem sendo utilizada para agrupar as famílias em “clans”. Atualmente

existem 14 clans de famílias de glicosil hidrolases sendo o maior destes o clan GH-

A, que inclui as famílias 1, 2, 5, 10, 17, 26, 30, 35, 39, 42, 50, 51, 53, 59, 72, 79 e 86

(http://amfb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).

Ainda é importante ressaltar que a denominação exo ou endo

enzimas também tem sido utilizada para caracterizar as glicosil hidrolases

(HENRISSAT e DAVIES, 1997). As exo-enzimas removem unidades de um ou mais

açúcares a partir do terminal não redutor do polissacarídeo, enquanto que as endo-

enzimas realizam a hidrólise aleatória de ligações interiores à cadeia do polímero

(WARREN, 1996). Embora as terminologias exo e endo forneçam informações

adicionais quanto à classificação das glicosil hidrolases, existem dificuldades para

determiná-las, pois podem ser confundidas se aplicadas para enzimas que

apresentam comportamento intermediário ou se determinadas utilizando-se

substratos inadequados (HENRISSAT e DAVIES, 1997).

2.3 CLASSIFICAÇÃO E IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL DAS β-GLICOSIDASES

β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações

glicosídicas, uma função essencial a muitos processos biológicos, o que faz destas

enzimas alvo de grande interesse para a bioquímica, medicina e biotecnologia.

β-glicosidases (β-D-glicosideo glicohidrolase, EC 3.2.1.21),

constituem o maior grupo de enzimas dentre as glicosil hidrolases (BHATIA et al.,

2002), ocorrendo de forma ubíqua em fungos, plantas, bactérias e mamíferos

(WOODWARD e WISEMAN, 1982). β-glicosidases são distribuídas entre as famílias

1 (GH1) e 3 (GH3) de glicosil hidrolases. Tanto glicosil hidrolases da família 1 quanto

da família 3 compreendem enzimas que hidrolisam seus substratos por um

mecanismo de retenção da configuração anomérica via duplo mecanismo de

substituição (CARL e WITHERS, 2000).

Embora β-glicosidases sejam biologicamente importantes e bem

caracterizadas, não há um método bem definido de classificação para estas

enzimas. Em geral, β-glicosidases são classificadas com base na especificidade do

substrato e na similaridade das seqüências de aminoácidos (BHATIA et al., 2002).

Em relação à classificação com base na similaridade das seqüências

de aminoácidos, inicialmente as β-glicosidases foram classificadas em dois tipos. As

β-glicosidases tipo I incluíam enzimas com cadeia polipeptídica com cerca de 480

aminoácidos e estavam presentes em bactérias, enquanto que as β-glicosidases tipo

II, incluíam enzimas com cadeia polipeptídica com cerca de 800 aminoácidos e

estavam presentes tanto em bactérias quanto em fungos (BEGUIN, 1990).

Henrissat e Bairoch (1996) propuseram a classificação das β-

glicosidases levado-se em consideração a similaridade de seqüência de

aminoácidos e estrutura terciária da proteína. Tal classificação permite a dedução de

características estruturais, relações evolucionárias e os mecanismos catalíticos para

β-glicosidases.

As β-glicosidases possuem inúmeras aplicações e têm sido alvo de

interesse de vários setores industriais.

Uma das aplicações de β-glicosidases se faz presente na indústria

de alimentos. Juntamente com outras enzimas, o uso de β-glicosidases tem sido

sugerido, por exemplo, no processamento de frutas para melhorar a qualidade do

sabor, aroma, coloração, clarificação e viscosidade de sucos (TRAON-MASSON e

PELLERIN, 1998).

A indústria vinícola também tem feito uso de β-glicosidases em

preparações comerciais para aumentar a qualidade de vinhos. Terpenos, um dos

maiores componentes de uvas que contribuem para o aroma em vinhos, estão

presentes em uvas numa forma livre volátil e numa forma não volátil conjugada a

açúcares (GUNATA et al., 1985). Durante o processamento de uvas para a produção

de vinhos pequenas quantidades de terpenos voláteis são liberadas para a produção

de aroma. A atividade de β-glicosidases produzidas por algumas espécies de

Aspergillus (DECKER et al., 2000), Saccharomyces cerevisiae (HÉRNANDEZ et al.,

2003), Oenococcus oeni (BARBAGALLO et al., 2004), entre outros, levam à hidrólise

de compostos não voláteis a terpenos voláteis contribuindo, assim, para aumentar a

produção de aroma durante a fabricação de vinhos.

Outra aplicação biotecnológica de β-glicosidases na indústria inclui a

redução da viscosidade de certos polissacarídeos empregados em preparações

comerciais de alimentos. A alta viscosidade e baixa solubilidade de gelana, por

exemplo, produzido por Sphingomonas paucimobilis, tem limitado seu uso na

indústria alimentícia. A hidrólise inicial de gelana a tetrassacarídeos pela ação de

liase e glicosidase extracelulares, com subseqüente redução destes

tetrassacarídeos a monossacarídeos por β-glicosidases intracelulares produzidas

por Bacillus sp. GL1, tem resultado na produção de gelana de menor viscosidade

(HASHIMOTO et al., 1998).

β-glicosidase produzida por Lactobacillus casei subsp. rhamnosus,

por exemplo, tem sido usada na hidrólise das formas β-glicosídicas das isoflavonas

(daidizna e genistina) às formas agliconas (daidzeína e genisteína) e à glicose,

levando à redução do sabor amargo e da adstringência de isoflavonóides

glicosídicos presentes na soja (MATSUDA et al., 1994).

Um segundo motivo pelo grande interesse por β-glicosidases está

focado na sua aplicação para a hidrólise de celulose (BHATIA et al., 2002). A

celulose é a biomolécula mais abundante e a maior fonte de energia renovável na

terra (BHAT e BHAT, 1997), e sua conversão a açúcares solúveis é de grande

interesse biotecnológico. A celulose é um homopolímero de cadeia linear formada

por unidades repetitivas de glicose unidas por ligações glicosídicas β-1,4. Suas

moléculas podem estar orientadas paralelamente e associadas através de pontes de

hidrogênio formando unidades cristalinas, ou em áreas menos ordenadas,

apresentando estrutura amorfa (BROWN e SAXENA, 2000). As unidades cristalinas

estão arranjadas de maneira compactada de modo a evitar não apenas a

penetração de enzimas, mas também a penetração de pequenas moléculas como a

água, conferindo, assim, à molécula de celulose resistência à rápida hidrólise. Além

disso, sua associação com lignina e hemicelulose também dificulta a hidrólise da

celulose em açucares mais simples. Em função disso, a hidrólise de materiais

celulolíticos é considerada complexa, e necessita da participação de um complexo

celulolítico (LYND et al., 2002).

Vários microrganismos têm sido descritos como produtores de

celulases. Dentre eles podem ser citados Ruminococcus albus (HOWARD e WHITE,

1988), Microbispora bispora (WRIGHT et al., 1992), Clostridium thermocellum

(ROMANIEC et al., 1993), Phanerochaete chrysosporium (LYMAR et al., 1995),

Bacillus sp. (SÁNCHES-TORRES et al., 1996), Humicola grisea e Trichoderma

reesei (TAKASHIMA et al., 1999), entre muitos outros.

Para eficiente degradação da celulose os microrganismos podem

produzir múltiplas celulases com diferentes especificidades e modos de ação para

hidrolisar ligações glicosídicas (WARREN, 1996; HOWARD et al., 2003).

As três maiores classes de celulases envolvidas no processo de

degradação de celulose são endoglucanases (3.2.1.4), celobiohidrolases (3.2.1.91) e

β-glicosidases (3.2.1.21). Estas enzimas atuam de forma sinérgica de modo que a

atividade de um componente enzimático é favorecida pela ação hidrolítica de outro.

As endoglucanases atuam aleatoriamente sobre sítios internos presentes na região

amorfa da cadeia polissacarídica da celulose, gerando oligossacarídeos de

comprimentos variados e conseqüentemente novas cadeias terminais.

Subseqüentemente, celobiohidrolases agem sobre as cadeias terminais não

redutores de celulose liberando celobiose. A última etapa do processo é realizada

por β-glicosidases, que agem sobre celobiose e celodextrinas solúveis hidrolisando-

as a glicose (LYND et al., 2002).

A contribuição de β-glicosidases e outras celulases nos processos

que requerem a hidrólise de materiais celulolíticos têm sido de significante

importância para alguns setores da economia como, por exemplo, para a indústria

de suplementos animal. O interesse pela suplementação enzimática de alimentos

está relacionado com o fato de que animais monográstricos não possuem

capacidade enzimática para digerir celulose. A adição aos alimentos de enzimas

fibrolíticas exógenas, tal como β-glicosidase, produzidas em sua maioria por Bacillus

spp., e também por algumas espécies de fungos tais como Trichoderma

longibrachiatum, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae, tem auxiliado na degradação

da celulose melhorando a digestão e a eficiência na utilização dos alimentos pelos

animais (BEAUCHEMIN et al., 2003).

β-glicosidases também têm sido aplicadas na indústria de

combustíveis para a produção de etanol a partir da bioconversão da celulose. Este

processo permite a produção de combustíveis renováveis. Como combustível, o

etanol já é utilizado no Brasil e adicionado à gasolina no Brasil e também nos

Estados Unidos (HOWARD et al., 2003).

Celulases podem ainda ser usadas como aditivos em detergentes,

na indústria têxtil para o processamento de brim e na indústria de papel para

reciclagem (OUTTRUP e JORGENSEN, 2002).

Em adição à suas aplicações industriais e funções na sacarificação

de materiais celulolíticos, β-glicosidases apresentam importantes funções biológicas

em tecidos de plantas, tais como, ativação de fitormônios (ESTRUCH et al., 1991),

formação de aromas em frutas (GUNATA et al, 1985), e resistência a fitopatógenos

(WOODWARD e WISEMAN, 1982). O interior de plantas é, portanto, um sítio

potencial para a localização de β-glicosidases funcionalmente interessantes.

O interior de plantas pode ser habitado por microrganismos

fitopatogênicos e endofíticos. Conforme já comentado, os endófitos são definidos

como microrganismos que pelo menos em uma fase do seu ciclo de vida habitam o

interior de plantas, sem causar efeitos aparentes em seus hospedeiros. Ao

competirem por espaço e nutrientes na planta, bactérias endofíticas e epífitas

produzem enzimas e toxinas.

Considerando este fato, algumas hidrolases de microrganismos

endofíticos têm sido estudadas. Um exemplo é a endoglucanase produzida por B.

pumilus CL16, um endofítico isolado de Citrus por Araújo et al (2001). B. pumilus

CL16 apresentou capacidade de hidrolisar celulose sob condições in vitro quando

investigado quanto à atividade de endoglucanase (LIMA et al., 2004). Portanto, B.

pumilus CL16 também poderia ser uma fonte de outras celulases, tal como β-

glicosidase, com importantes aplicações biotecnológicas e, por isso, é objeto do

presente estudo.

2.4 CLONAGEM DE β-GLICOSIDASES BACTERIANAS

A clonagem e expressão heteróloga de genes que codificam para

enzimas possibilitam obter uma enzima livre de outras enzimas do sistema da qual

faz parte e, assim, caracterizá-la (WARREN et al., 1996).

A clonagem de genes que codificam para enzimas como a β-

glicosidases tem sido obtida a partir da construção de bibliotecas genômicas. Uma

das maneiras que tem sido utilizada para selecionar clones recombinantes contendo

o gene da β-glicosidase tem sido a análise de expressão utilizando-se de substratos

cromogênicos, tais como X-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucopiranosídeo),

MUG (4-metil umbeliferil β-D-glucopiranosídeo) e pNPG (p-nitrofenil β-D-

glucopiranosídeo) (BHATIA et al., 2002). Uma segunda alternativa que vem sendo

utilizada para selecionar clones recombinantes contendo o gene da β-glicosidase é

através do uso de sondas específicas (BHATIA et al., 2002). Dessa forma, vários

microrganismos já tiveram genes que codificam para β-glicosidases clonados,

expressos e suas enzimas caracterizadas. As propriedades enzimáticas, tais como a

especificidade pelo substrato, temperatura e pH ótimos, propriedades cinéticas,

localização, massa molecular e classificação dentro de famílias de glicosil hidrolases

tem sido consideravelmente variáveis (BHATIA et al., 2002).

Dentre as espécies de bactérias cujos genes que codificam para β-

glicosidases tem sido estudados estão aquelas pertencentes ao gênero Bacillus.

O gene que codifica para a β-glicosidase em Bacillus polymyxa foi

clonado a partir de uma biblioteca genômica construída em E. coli. Os clones

recombinantes da biblioteca expressando β-glicosidase em E. coli foram

selecionados em placas contendo o substrato cromogênico pNPG. Restrições com

endonucleases e análises de Southern blotting dos fragmentos clonados mostraram

a existência de dois genes diferentes codificando para duas β-glicosidases, então

designadas BglA e BglB. As enzimas purificadas apresentaram cerca de 51 KDa.

BglA foi localizada no citoplasma e apresentou maior atividade sobre celobiose como

substrato. BglB, presente no espaço periplasmático, embora tenha apresentado

atividade sobre celobiose, mostrou-se mais ativa sobre pNPG. Baseando-se na

similaridade das seqüências de aminoácidos, ambas foram classificadas na família 1

de glicosil hidrolases (GONZÁLEZ-CANDELAS et al., 1989).

Painbeni et al (1992) também purificaram e caracterizaram uma β-

glicosidase de B. polymyxa expressa em E. coli. BglA apresentou localização

intracelular, 50 KDa e ponto isoelétrico 4.6. A enzima foi localizada intracelularmente

e apresentou especificidade por pNPG e celobiose, com valores de K

de 0,6 mM e

13 mM, respectivamente para estes substratos. O efeito de íons metálicos também

foi estudado, sendo Hg

um forte inibidor da atividade da enzima. Esta β-glicosidase

de B. polymyxa faz parte da família 1 de glicosil hidrolases.

Bacillus circulans subsp. alkalophilus é outra espécie que teve o

gene que codifica para β-glicosidase clonado e expresso em E. coli. Um fragmento

do DNA cromossômico da bactéria foi amplificado por PCR para obtenção de uma

sonda que reconhecesse o gene que codifica para uma β-glicosidase. O DNA total

de B. circulans foi digerido com enzimas de restrição, os fragmentos foram

separados em gel de eletroforese, e posteriormente transferidos para uma

membrana através da técnica de Southern blotting. A sonda marcada radiativamente

com P

foi usada para hibridação como os fragmentos cromossomais presentes na

membrana. Os fragmentos que hibridaram com a sonda foram ligados a um vetor,

que posteriormente foram usados para transformar E. coli. Para a seleção dos

clones recombinantes analisou-se a expressão da β-glicosidase através do uso do

substrato cromogênico X-glu. A enzima (BglA) purificada apresentou 51 KDa e

localização intracelular. A atividade enzimática ótima foi detectada a 55

C sobre o

substrato pNPG e a 50

C sobre celobiose, e pH variando numa faixa de 6 a 9. A

BglA de B. circulans subsp. alkalophilus foi classificada na família 1 de glicosil

hidrolase (PAAVILAINEN et al., 1993).

Bacillus sp. GL1 também teve dois genes que codificam para β-

glicosidases clonados a partir de uma biblioteca genômica da bactéria construída em

E. coli. A seleção dos clones recombinantes foi realizada através da análise de

expressão utilizando-se de substrato cromogênico X-glu. As enzimas expressas em

E. coli foram purificadas e caracterizadas. BglA e BglB, assim denominadas,

apresentaram massa molecular de 51 e 82 KDa, respectivamente, sendo ambas

consideradas, pelos autores, como intracelular. BglA foi mais ativa em pH 6,0 e a

C, enquanto BglB mostrou maior atividade em pH 8,0 e a 40

C. Quanto à

especificidade pelo substrato, BglA foi ativa sobre pNPG, celobiose, gelana, e

trissacarídeos, e BglB sobre ρNPG. BglA e BglB foram classificadas nas famílias 1 e

3 de glicosil hidrolases, respectivamente (HASHIMOTO et al., 1998).

Além de espécies de Bacillus, outras espécies bacterianas

portadoras de genes que codificam para β-glicosidases têm sido estudadas. Dois

genes que codificam para a β-glicosidase em Agrobacterium tumefaciens foram

clonados a partir de uma biblioteca genômica construída em E. coli. Os clones foram

transferidos para filtros de nitrocelulose e rastreados para a atividade de β-

glicosidase através da exposição das colônias em placas contendo substrato

cromogênico X-glu. A enzima expressa em E. coli apresentou massa molecular de

88 KDa, localização intracelular e atividade sobre coniferina. A β-glicosidase de A.

tumefaciens apresentou similaridade com enzimas da família 3 de glicosil hidrolase

(CASTLE et al., 1992).

Erwinia herbicola teve o gene que codifica para β-glicosidase

clonado a partir de biblioteca genômica. A massa molecular da proteína foi estimada

em 58 KDa. A enzima foi localizada no espaço periplasmático e apresentou atividade

sobre salicina, arbutina, e celobiose. A β-glicosidase de E. herbicola foi classificada

na família 1 de glicosil hidrolase (MARRI et al., 1995).

O gene da β-glicosidase de Flavobacterium meningosepticum

também foi clonado a partir de uma biblioteca genômica construída em E. coli.

Clones portando os plasmídeos recombinantes com o gene desejado foram

selecionados em placas contendo o substrato MUG. A proteína expressa em E. coli

foi estimada em 79 KDa e apresentou atividade ótima em pH 4,2-5,0 e 50

C, com

estabilidade numa faixa de pH 5,0-8,1 e 25

C. A enzima mostrou alta especificidade

por aril-glicosídeos, com valor de K

de 0,68 mM para pNPG. Através da

similaridade de seqüências de aminoácidos, a β-glicosidase de F. meningosepticum

foi classificada na família 3 de glicosil hidrolases (LI e LEE, 1999).

Dois genes de Azospirillum irakense KBC1 denominados salA e

salB, que conferem atividade de β-glicosidases foram clonados a partir de uma

biblioteca genômica construída em cosmídios. Para detecção de clones contendo

atividade de β-glicosidases foi empregado o substrato cromogênico MUG. SalA

apresentou 78.5 KDa de massa molecular e SalB 64.6 KDa, ambas localizadas no

espaço periplasmático. Tanto SalA quanto SalB hidrolizaram preferencialmente

pNPG, salicina e arbutina. Os K

também foram medidos. Para pNPG os valores de

foram 0,11 mM para SalA e 0,05 para SalB; para o substrato salicina os valores

foram 0,4 mM para SalA e 0,06 mM para SalB; e para arbutina obteve-se valores de

de 0,25 mM para SalA e 0,06 mM para SalB. As condições ótimas de atuação de

SalA e SalB foram 45

C e pH 6,5 e 7,0, respectivamente. Tanto SalA quanto SalB

pertencem à família 3 de glicosil hidrolases (FAURE et al., 1999).

Tajima et al (2001) clonaram o gene da β-glicosidase de Acetobacter

xylinum ATCC 23769 a partir do DNA genômico da bactéria. Para tanto, o DNA

genômico foi submetido à hidrólise total com enzimas de restrição. Primers

degenerados foram selecionados a partir de seqüências consensos de genes

bacterianos para β-glicosidase. Um fragmento de DNA foi obtido por PCR a partir do

DNA genômico de A. xylinum usado como molde. Usando este fragmento como

sonda, o DNA genômico da bactéria digerido foi analisado por Southern blotting. Os

fragmentos de DNA isolados do gel foram ligados a um vetor e transformados em E.

coli. Os clones obtidos foram divididos em vários grupos (96 colônias x 20 grupos).

Cada clone foi transferido para duas novas placas (master plate), e plasmídeos

foram preparados a partir destes grupos. Um clone foi selecionado através de

amplificação utilizando-se os primers degenerados desenhados para reconhecer o

gene da β-glicosidase. A seqüência de aminoácidos deduzida a partir da seqüência

de nucleotídeos do gene clonado permitiu estimar a massa molecular da proteína em

79 KDa. A atividade de β-glicosidase testada em culturas sobrenadantes mostrou

que maior atividade desta enzima foi detectada sobre celooligossacarídeos.

Baseado na similaridade de seqüências de aminoácidos, a β-glicosidase de A.

xylinum foi classificada na família 3 de glicosil hidrolases.

Além destas espécies citadas, outras espécies bacterianas

(Sphingomonas paucimobilis, Thermus thermophilus, Clostridium thermocellum,

Cellvibrio gilvus) também tiveram o gene que codifica para β-glicosidase clonado e a

enzima caracterizada (MARQUES et al., 2003; PARK et al., 2002; DION et al., 1999;

ROMANIEC et al., 1993; KASHIWAGI et al., 1993). No entanto, até o momento,

nenhuma β-glicosidase de B. pumilus tinha sido relatada.

3 OBJETIVOS

Este trabalho teve por objetivo clonar, caracterizar e expressar em E.

coli o gene da β-glicosidase da bactéria B. pumilus CL16, endofítica de Citrus,

isolada por Araújo et al (2001).

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL BIOLÓGICO

A linhagem CL16 de B. pumilus utilizada neste trabalho foi isolada e

caracterizada por Araújo et al (2001). Trata-se de uma linhagem isolada de Citrus

que se destacou pela capacidade de hidrolisar celulose e goma xantana em meio de

cultura.

4.2 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS UTILIZADOS NA CLONAGEM E EXPRESSÃO

As bactérias e os plasmídeos usados na clonagem e expressão do

gene da β-glicosidase estão listados nas Tabelas I e II, respectivamente.

Tabela 1 – Linhagens de Bactérias

Linhagens Características Fonte

E. coli DH10B

E. coli BL21CodonPlus (DE3)

E. coli TOP10

E. coli DH5α-E

mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ?M15

?lacX74 deoR recA1 endA1 ara?139 ?(ara,

leu)7697 galK λ

rpsL (Str

) nupG

dcm ompT hsdS(r

) galλ (DE3)

mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ?M15

?lacX74 recA1 deoR araD139 ?(ara-leu)7697

galU galK rpsL (Str

) endA1 nupG

φ80dlacZ?M15 ?(lacZYA-argF) U169 deoR

recA1 endA1 hsdR17(r

) gal

–

phoA

supE44

thi

–

1 gyuA96 relA1

Invitrogen

Stratagene

Invitrogen

Tabela 2 - Plasmídeos

Plasmídeos Características Relevantes Fonte

Vetor de clonagem. Amp

pUC18

pENTR/SD/D-TOPO

Vetor de clonagem. Km

Invitrogen

pET-DEST42 Vetor de expressão/promotor T7. Amp

Invitrogen

4.3 OLIGONUCLEOTÍDEOS

O desenho dos oligonucleotídeos necessários ao desenvolvimento

deste trabalho foi feito utilizando-se do programa GeneRunner v. 3.05. Suas

respectivas sequências e aplicações estão apresentadas na Tabela 3.

Tabela 3 – Oligonucleotídeos

Oligonucleotídeo

Seqüência 5’→3’

Aplicação

DEG1F

DGE1R

M13F

M13R

GLICO1

GLICO2

MHF

MHR

GLm

T7F

T7R

ATRACCTACgNAARTTRgg

gCRAANCCYAgHTARACggT

gTAAAACgACggCCAg

CAggAAACAgCTATgAC

TCCAgAgATTCTTggACAAgT

CACTTggAACAAATTggTgATg

CACCATgAACAAgTTAgAAAAAACAT

TTAGTAATCCAAATgTTCCCCATTTg

gCATAAgCACggAATTgAgTC

TAATACgACTCACTATAggg

TAgTTATTgCTCAgCggTgg

Clonagem sonda

Sequenciamento pMH2

Sequenciamento pMH2, pAB1

Clonar bglH, sequenciamento pAB1

Sequenciamento pMH2, pAB1

Sequenciamento pAB1

4.4 CLONAGEM DO GENE DA β - GLICOSIDASE DE B. pumilus

4.4.1 Biblioteca de B. pumilus

Uma biblioteca genômica de B. pumilus construída conforme

descrito por Lima et al (2004) foi utilizada para seleção de um fragmento contendo o

gene da β-glicosidase. Segundo estes autores, o DNA genômico de B. pumilus foi

extraído com o Kit Wizard Genomic DNA (Promega). Ao final o DNA foi diluído a 100

ng/µL em água ultrapura (Milli-Q - Millipore). A uma amostra de 10 µL de DNA foram

acrescentados 10 µL de água. Este material foi submetido a sonicação (Ultrasonic

Homogenizer CV26, Cole Parmer, Model CV 26) a 20KHz por 5 segundos. A fim de

gerar fragmentos com terminais abruptos, após a sonicação o DNA foi tratado com

as enzimas T4 DNA Polimerase (Gibco) por 45 minutos (37°C) e Klenow (Gibco) por

15 minutos (temperatura ambiente). Em seguida o DNA foi separado em gel de

agarose (1% low melting temperature agarose – Gibco) e os fragmentos entre 2 e 3

Kb foram purificados, utilizando-se de fenol e éter saturado. Os fragmentos de DNA

foram submetidos a uma reação de ligação (16 horas a 15°C) com plasmídeo

pUC18 (SmaI/BAP - Pharmacia), utilizando-se de T4 DNA ligase (T4 DNA ligase –

Gibco). Após a ligação, o material foi desalinizado em membrana (Millipore 0,025

µm). Um total de 40 µL de células de E. coli (EletroctroMAX DH10B, Gibco) foi

transformado com 3 µL da ligação através de eletroporação (Gene Pulser, BioRad -

1,8 Kv, 25 µF, 200 Ω, cubetas de 0,2 cm). Após 45 minutos de crescimento em meio

LB, as células foram diluídas 10 vezes, e 100 µL foram semeados em placas

contendo LB suplementado com ampicilina, isopropil-tio-galactosídeo (IPTG) (USB)

e 5-bromo 4-cloro 3-indolil β-galactosídeo (X-Gal - Sigma). Dentre os clones

recombinantes obtidos (colônias brancas), 7000 foram isolados, cultivados em

microplacas de 96 poços (LB adicionado de ampicilina e 10% de glicerol) e

armazenados a – 80°C. A fim de avaliar o tamanho dos fragmentos de DNA

clonados na biblioteca genômica de B. pumilus, foram coletados aleatoriamente 20

clones e estes submetidos à reação de PCR de colônia. Foram utilizados os primers

M13 (F- GTAAAACGACGGCCAG e R - CAGGAAACAGCTATGAC) que se ligam ao

plasmídeo pUC18 de forma a flanquear o inserto. As condições de PCR utilizadas

foram: 5 minutos a 94°C; 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C e 3

minutos a 72°C; extensão final de 6 minutos a 72°C. As reações de 25 µL eram

compostas por: 2,5 µL de tampão para PCR (Gibco); 2,5 µL de cada primer (5 µM);

1,4 µL MgCl

(50 mM); 2,5 µL dNTP (2,5 mM de cada); 1 unidade de Taq Polimerase

(Gibco), 1 µL da colônia do clone a ser testado. O produto da amplificação foi então

separado em gel de agarose (1%).

4.4.2. Transferência dos Clones Bacterianos para Membranas de Náilon

Os clones da biblioteca genômica foram transferidos para

membranas de náilon para que pudessem posteriormente ser submetidos à

hibridação. Com este objetivo, 7000 colônias foram crescidas em LBA por 12 h a

C. Foram usadas placas (15 x 15 cm), nas quais eram inoculados 96 clones

recombinantes, além de um controle positivo e um controle negativo. Uma

membrana de náilon (Hybond

-N, 0.45 micrômetros, Amersham) foi colocada

sobre cada uma das placas contendo as colônias crescidas. O tempo de contato

entre a membrana e as colônias foi de um minuto. Após este período as membranas

foram colocadas sobre um papel de filtro embebido em solução desnaturante (1,5 M

NaCl, 0,5 NaOH), onde permaneceram por 7 minutos. Em seguida, as membranas

foram colocadas sobre papel de filtro embebido com solução neutralizadora (1,5 M

NaCl, 0,5 Tris-HCl pH 7,2, 0,001 M EDTA), onde permaneceram por 3 minutos. Este

passo foi repetido mais uma vez, com novo papel de filtro embebido na mesma

solução. Em seguida a membrana foi transferida para papel de filtro embebido em

SSC 2X. Após apenas alguns segundos em SSC, a membrana foi retirada e mantida

à temperatura ambiente por 30 minutos para completa secagem. Por fim, as

membranas foram colocadas em forno a 80

C onde foram mantidas por 2 horas. As

membranas foram acondicionadas em papel alumínio e estocadas a – 20

C, até o

momento do uso.

4.4.3 Obtenção de Parte do Gene que Codifica para β-Glicosidase

Devido à inexistência da seqüência de aminoácidos da β-glicosidase

de B. pumilus nos bancos de dados, seqüências de outras espécies de Bacillus

disponíveis no banco do NCBI foram analisadas para o reconhecimento de regiões

conservadas. As seqüências de aminoácidos das β-glicosidases foram alinhadas

(CLUSTAL W 1.8 software) e a partir das regiões conservadas um par de primers

degenerados foi desenhado (DEG1F 5’ATRACCTACTgNAARTTRgg3’ e

DEG1R5’gCRAANCCYAgHTARACggT3’) visando sua utilização na PCR para

amplificação de parte do gene da β-glicosidase de B. pumilus. Este fragmento seria

posteriormente utilizado como sonda para rastrear a biblioteca genômica de B.

pumilus. A temperatura de anelamento utilizada na reação de PCR foi de 48

C. Um

fragmento de aproximadamente 560 pb foi obtido. Este fragmento foi eluído do gel

utilizando-se o Kit Concert

Rapid Gel Extraction System (Invitrogen), conforme

descrito no item 4.4.6. Após eluição, o fragmento foi ligado em um vetor pUC18

utilizando-se do Kit Sure Clone Ligation (Armersham Pharmacia Biotech). A reação

de ligação foi utilizada para transformar células de E. coli DH5α por eletroporação

(1,8 Kv, 25 µF, 200 Ω, cubetas de 0,2 cm), conforme descrito no item 4.7.6. Os

clones recombinantes foram selecionados através do sistema IPTG X-Gal. Os

plasmídeos dos clones recombinantes foram extraídos conforme descrito no item

4.7.3.1 e seqüenciados de acordo com o item 4.5. A análise de BLAST mostrou que

a seqüência obtida era homóloga ao gene da β-glicosidase de Bacillus subtilis. Isso

permitiu que o fragmento de DNA obtido através da PCR fosse usado como sonda

para a seleção do gene da β-glicosidase na biblioteca genômica de B. pumilus. O

plasmídeo contendo a sonda foi denominado pMH1.

4.4.4 Extração de DNA Plasmidial para Obtenção da Sonda

A extração do DNA plasmidial foi realizada segundo o protocolo do

Kit Concert

Rapid Plasmid Miniprep Systems (Invitrogen).

Células de E. coli DH5α contendo o plasmídeo pMH1 foram

cultivadas em 3 mL de meio Luria Bertani (LB - triptona 10 g, extrato de levedura 5 g,

NaCl 5 g, água ultrapura qsp 1000 mL), suplementado com 100 µg/mL de ampicilina,

à 37

C, sob 180 rpm de agitação, por 16 horas. Posteriormente, a cultura foi

centrifugada por 5 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e às

células foram adicionados 210 µl de tampão de suspensão celular G1 (50 mM Tris-

HCl pH 8,0, 10 mM EDTA) contendo RNAse (0,16 mg/mL). A lise celular foi efetuada

pela adição de 210 µl de solução G2 (200 mM NaOH, 1% SDS v/v). A mistura foi

homogeneizada e mantida em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente.

Decorrido o tempo de lise, 280 µl de tampão de neutralização G3

(acetato, hidrocloreto de guanidina) foram adicionados à mistura, a qual então foi

homogeneizada e centrifugada por 10 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante foi

transferido para uma coluna (fornecida pelo Kit) e centrifugado por um minuto a

12.000 rpm.

Após centrifugação, 700 µl de tampão G4 (NaCl, EDTA, Tris-HCl pH

8.0) contendo etanol, foram adicionados ao centro da coluna. Em seguida, a mistura

foi novamente centrifugada por um minuto a 12.000 rpm.

Para ressuspender o DNA, 75 µl de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1

mM EDTA) foram acrescentados ao centro da coluna e incubados por um minuto à

temperatura ambiente. O DNA foi retirado da coluna por centrifugação por dois

minutos a 12.000 rpm e posteriormente conservada à 4

4.4.5 Hidrólise do DNA Plasmidial para Purificar a Sonda

O fragmento de DNA correspondente à parte do gene da β-

glicosidase a ser usado como sonda foi obtido hidrolisando-se o vetor pMH1 com a

enzimas de restrição EcoRI e BamHI, ambas localizadas justapostas aos sítios de

clonagem. O sistema de reação continha 4,5 µg de DNA, 1 U de enzima, 1 µl

tampão de reação 10 X, água ultrapura qsp 10 µl. Após 12 horas de incubação o

DNA digerido foi submetido à eletroforese em gel de agarose 0,8%. Para recuperar o

fragmento que seria utilizado como sonda, a banda correspondente foi eluída do gel

segundo o protocolo do Kit Concert

Rapid Gel Extraction System (Invitrogen)

como segue no item 4.4.6.

4.4.6 Eluição dos Fragmentos de DNA

Os fragmentos de DNA foram eluídos do gel conforme descrito no

protocolo do Kit Concert

Rapid Gel Extraction System (Invitrogen).

A área do gel contendo o fragmento desejado foi cortada com o

auxílio de uma lâmina e distribuída em tubos de microcentrífuga previamente

pesados. Para cada 10 mg de gel foram adicionados 30 µl do tampão de

solubilização L1 (acetato de sódio, TBE), e os tubos foram incubados à 50

C por 15

minutos, agitando-os brandamente a cada três minutos para facilitar a dissolução do

gel. A mistura foi transferida para colunas de filtração, e centrifugada a 12.000 rpm

por um minuto. O DNA foi lavado com 700 µl do tampão de lavagem L2 (NaCl,

EDTA, Tris-HCl), que foram colocados diretamente no centro das colunas. A mistura

foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente, e então centrifugada por mais

duas vezes a 12.000 rpm. O DNA obtido foi ressuspendido em 50 µl de TE (0,1 mM

EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8.0) depositados no centro da coluna, e após um minuto

de incubação à temperatura ambiente, a mistura foi centrifugada a 12.000 rpm por

dois minutos.

Uma vez recuperado, o DNA foi quantificado em equipamento Dyna

Quant 200 e marcado com objetivo de utilizá-lo como sonda para isolar o gene bgl

da biblioteca genômica de B. pumilus.

4.4.7 Marcação da Sonda

A marcação da sonda foi realizada conforme recomendado no

protocolo do Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche).

Sessenta nanogramas de DNA molde foram desnaturados à 95

em banho-Maria por 10 minutos, seguido de resfriamento rápido em gelo. Após

desnaturação, foram adicionados ao DNA 4 µl do Mix DIG-High Prime (fornecido

pelo kit). A solução foi homogeneizada e incubada à 37

C por 18 horas. A reação foi

interrompida pela adição de 2 µl de EDTA (0,2 M, pH 8,0) e aquecimento em banho-

Maria à 65

C por 10 minutos.

4.4.8 Quantificação da Sonda

A sonda foi quantificada conforme os procedimentos sugeridos no

protocolo do Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche).

A sonda e um DNA controle (fornecido pelo kit) foram previamente

diluídos para 1 ng/µl e, em seguida foi preparada uma série de diluições como se

segue abaixo (Tabela 4).

Tabela 4 – Diluições da sonda e DNA controle (1 ng/µl)

Tubos

DNA (µl)

Do tubo Tampão de diluição

de DNA (µl)

Diluição Concentração final

1 Diluição original

1 ng/µl

2 5 1 495 1:100 10 pg/µl

3 15 2 35 1:3.3 3 pg/µl

4 5 2 45 1:10 1 pg/µl

5 5 3 45 1:10 0,3 pg/µl

6 5 4 45 1:10 0,1 pg/µl

7 5 5 45 1:10 0,03 pg/µl

8 5 6 45 1:10 0,01 pg/µl

9 0 - 50 - 0

Um microlitro de sonda e de DNA controle do tubo 2 ao tubo 9 foi

depositado sobre uma membrana de nailon (Hybond

-N, 0.45 micrômetros,

Amersham). Para a fixação do DNA na membrana, esta foi exposta à luz ultravioleta

(UV) por 3 minutos, sendo cada 1 minuto de exposição seguido de 2 minutos de

intervalo.

A membrana foi submetida a tratamentos com diferentes soluções.

Inicialmente a membrana foi incubada à 25

C sob agitação por 2 minutos em 20 mL

de tampão de ácido maléico (NaCl 0,15 M; ácido maléico 0,1 M, pH 7,5), seguidos

de incubação por 30 minutos em 10 mL de solução de bloqueio (fornecida pelo kit), e

30 minutos em 10 mL de uma solução de anticorpo antidigoxigenina (fornecida pelo

Kit). Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes por 15 minutos em 10 mL de

tampão de lavagem (ácido maléico 0,1 M; NaCl 0,15 M; Tween 20 0,3%, pH 7,5) e

incubada por 5 minutos em 10 mL de tampão de detecção (NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,1

M pH 9,5) à 25

A membrana foi colocada sobre uma folha de transparência e à sua

face contendo o DNA foram aplicados 0,1 mL de CSPD (substrato para a fosfatase

alcalina conjugada a antidigoxigenina). Em seguida, a membrana foi coberta com

uma segunda folha de transparência e incubada por 5 minutos à 25

C. O excesso de

líquido da membrana foi retirado rolando-se um bastão de vidro sobre as folhas de

transparências entre as quais estava a membrana.

A membrana foi posta dentro de um cassete e sobre ela foi colocada

uma folha de filme de raios-X (IBF-Medix - AGFA). Após 3 horas de exposição, o

filme foi revelado no aparelho GLUNZ & JENSEN modelo MULTI – X 36.

4.4.9 Preparo de Membranas Controles para Hibridação

Os microrganismos utilizados como controles negativo (E. coli e E.

coli + pUC18) e positivo (B. pumilus CL16 e E. coli + pUC18 + inserto) foram

cultivados em meio LB, suplementado com 100 µg/mL de ampicilina quando

necessário, à 37

C, sob 180 rpm de agitação durante 16 horas. Posteriormente, 2 µl

de cada cultura foram inoculados em placas contendo LB, e antibiótico quando

necessário, e então incubadas à 37

C por 16 horas.

Membranas de náilon foram colocadas em contato com as culturas

das placas, e removidas após um minuto. Em seguida, com a face contendo as

colônias voltadas para cima, as membranas foram colocadas sobre papéis de filtro

absorventes esterilizados, previamente umedecidos em solução desnaturante (NaCl

1,5 M; NaOH 0,5 M) e incubadas à temperatura ambiente por 7 minutos.

Após desnaturação, as membranas foram colocadas sobre novos

papéis de filtro umedecidos em solução neutralizante (NaCl 1,5 M; Tris-HCl pH 7,2;

EDTA 0,001 M pH 8,0) e incubadas por 3 minutos também à temperatura ambiente,

repetindo-se o mesmo procedimento por mais uma vez em novos papéis de filtro

umedecidos na mesma solução. Finalmente, as membranas foram colocadas sobre

papéis de filtro umedecidos em solução SSC 2x e incubadas por 5 minutos.

As membranas foram deixadas à temperatura ambiente por 30

minutos, e em seguida foram secas à 80

C por 2 horas para a fixação do DNA.

4.4.10 Hibridação com Membranas Controles

A hidridação foi realizada conforme recomendado pelo protocolo do

Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche).

As membranas contendo o DNA dos controles positivo e negativo

foram colocadas em saco plástico contendo 5 mL de solução de pré-hibridação (Kit)

e incubadas à 42

C, sob 80 rpm de agitação, por 30 minutos. Decorrido este tempo,

a solução de pré-hibridação foi retirada do saco plástico. 125 ng de sonda

previamente desnaturados à 100

C por 5 minutos, seguidos de resfriamento em

gelo, foram suspensos em 5 mL de solução de hibridação, e então colocados no

saco plástico. As membranas foram incubadas por 18 horas nas mesmas condições

de pré-hibridação.

Após hibridação, as membranas foram inicialmente lavadas duas

vezes com SSC 2x, SDS 0,1% por 5 minutos à 25

C, e mais duas vezes com SSC

0,5x, SDS 0,1% por 15 minutos à 68

C, sob 80 rpm de agitação. Em seguida, foram

lavadas em tampão de lavagem (ácido maléico 0,1 M; NaCl 0,15 M; Tween 20 0,3

%, pH 7,5) por 5 minutos à 30

C sob agitação, e incubadas em 144 mL de solução

de bloqueio (Kit) por 30 minutos nas mesmas condições. As membranas ainda foram

incubadas por 30 minutos à 30

C em 30 mL de solução de anticorpo (Kit),

anteriormente diluída 1:10.000 em solução de bloqueio, também sob agitação, e

novamente lavadas em tampão de lavagem duas vezes por 15 minutos à 30

C sob

agitação. Por último, foram colocadas em 30 mL de tampão de detecção (NaCl 0,1

M; Tris-HCl 0,1 M pH 9,5) por 5 minutos em iguais condições.

As membranas foram colocadas sobre uma folha de transparência e

à suas faces contendo o DNA foram aplicados 1,44 mL de CSPD (Kit). Em seguida

as membranas foram cobertas com outra folha de transparência e incubadas por

mais 5 minutos à 30

C. O excesso de líquido entre as folhas de transparência entre

as quais estavam as membranas foi retirado rolando-se um bastão de vidro sobre

elas. As membranas foram incubadas por 10 minutos à 37

C e expostas a filme de

raios-X por 3 horas.

Este mesmo procedimento de hibridação foi realizado para a seleção

do clone contendo o gene bgl na biblioteca genômica de B. pumilus.

4.5 SEQÜENCIAMENTO DO GENE bgl DE B. pumilus

O inserto do clone selecionado após hibridação (denominado pMH2)

foi seqüenciado utilizando-se dos primers M13 foward e reverse. Baseando-se na

seqüências obtidas, novos primers foram desenhados (GLICO1, GLICO2, GLm) para

seqüenciar a porção interna do gene. A reação de seqüenciamento foi constituída de

2,0 µl do DNA plasmidial, 2,0 µl de primers (2,5 pM/µl), 4,0 µl de DYEnamic ET DYE

Terminator e água qsp 10 µl. Esta foi submetida ao termociclador Mastercycler

Gradient (Eppendorf) programado para 1 minuto de desnaturação inicial a 95

seguido de 35 ciclos, sendo cada ciclo constituído das etapas de desnaturação

(95

C, 20 seg), pareamento (55

C, 15 seg), e extensão (60

C, 1 min).

O produto amplificado foi precipitado pela adição de 2 µl de acetato

de amônio (7,5 M), e 65 µl de etanol 96% (MERCK) ao produto. A reação de

precipitação foi incubada à temperatura ambiente por 15 minutos e, em seguida,

centrifugada a 12.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado, o

precipitado obtido foi lavado com 140 µl de etanol 70% e centrifugado a 12.000 rpm

por 5 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado mantido

em estufa até a secagem completa.

Após secagem, o produto da reação de seqüenciamento foi

ressuspendido em 10 µl de H2O ultrapura, e então, submetido ao seqüenciador

automático MegaBACE 1000 (Pharmacia Biotech) para determinação das

seqüências de bases. As seqüências de DNA obtidas foram agrupadas em contigs e

analisadas quanto à qualidade através do programa PhrePhrapConsed versão

0,990722. A seqüência consenso gerada pelo programa PhrePhrapConsed foi

utilizada para as análises posteriores.

4.6 ANÁLISE DO FRAGMENTO SEQÜENCIADO

A seqüência de nucleotídeos, bem como a seqüência de

aminoácidos deduzida, foram analisadas através de programas computacionais.

A busca de ORFS foi realizada utilizando-se o programa OrfFinder,

disponível no Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov). O programa GeneRunner foi utilizado para a medida do

conteúdo de G/C e para a tradução da seqüência de nucleotídeos da ORF predita

em seqüência de aminoácidos. O perfil de hidrofobicidade e provável localização

celular da proteína foram analisados com o programa TMPred -

http://www.ch.embnet.org/software (HOFMANN & STOFFEL, 1993). A presença de

sinais de exportação da proteína foi verificada através do programa SignalP 3.0

(BENDTSEN et al., 2004). A massa molecular, bem como o pI da proteína foram

preditos através do programa ProtParam (Expasy home page –

http://br.expasy.org/tools/protparam.html). Os programas Blast(n), Blast(p)

(ALTSCHUL et al., 1997) e CD-Search, todos disponíveis no servidor NCBI, foram

utilizados para pesquisas de similaridade com sequências de nucleotídeos,

seqüências de proteínas e busca de domínios conservados, respectivamente. O

programa BioEdit v. 5.0.9. (HALL, 1999) foi usado para alinhamento global das

seqüências de β-glicosidases.

4.7 SUBCLONAGEM DO GENE bgl DE B. pumilus VIA SISTEMA GATEWAY

A Tecnologia Gateway (Invitrogen) é um sistema que permite a

transferência de segmentos de DNA entre diferentes vetores através de

recombinações sítio específicas, mantendo a orientação e a fase de leitura,

facilitando dessa forma maior eficiência na expressão de proteínas.

Este sistema de clonagem e expressão consiste das etapas de

obtenção do produto de PCR, seguida da clonagem deste produto em um vetor de

entrada/clonagem, e sua transferência do vetor de entrada para um vetor de

destino/expressão via reação LR (Figuras 1 e 2).

Produto de PCR

Gene

topoisomerase

CCC TT AAG GGT

GGG AAG TGG TTC CCA

topoisomerase

attL1 attL2

Vetor de entrada

pENTR/SD/D-TOPO

Clone de entrada

Gene

att

Figura 1- Etapas de clonagem de um produto de PCR no vetor de entrada

Clone de entrada

Gene

att

ccd

Amp

att

Vetor de destino

pET-DEST42

clonase

gene

Amp

att

Clone de expressão

coli

transformadas

Figura 2 – Etapas de transferência do produto de PCR do vetor

de entrada para o vetor de destino via reação LR

4.7.1 Obtenção do Gene bgl por PCR

Com base nas regiões N-terminal e C-terminal da seqüência de

nucleotídeos do gene bgl de B. pumilus, foram desenhados primers então

designados MHF e MHR (Tabela 3). Visando posteriormente a clonagem direcional

do produto de PCR no vetor de entrada, quatro nucleotídeos (CACC), antecedentes

ao códon iniciador (ATG) foram acrescentados à região N-terminal do primer

forward.

Para a reação de amplificação foram utilizados 1,5 µl dos primers

MHF e MHR (10 pmol/µl), 1U de AccuPrime Pfx DNA polimerase (Invitrogen), 0,5 µl

de DNA (60 ng/µl) e água qsp 25 µl. Os parâmetros utilizados para a amplificação

foram 30 ciclos de 2 minutos a 95

C, 15 segundos a 95

C, 30 segundos a 56

C e 1,5

minutos a 68

C. O produto de PCR obtido foi checado através de eletroforese em gel

de agarose 1%.

4.7.2 Clonagem do Gene bgl no Vetor de Entrada

O produto de PCR correspondente ao gene bgl foi direcionalmente

clonado no vetor de entrada pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) pelo pareamento das

bases (CACC) adicionadas ao seu terminal 5’ com uma sequência overhang (GTGG)

presente no vetor, gerando assim um clone de entrada.

Para a clonagem foi montado um sistema contendo 1 µl do vetor de

entrada pENTR/SD/D-TOPO, 1 µl do produto de PCR, 1 µl de solução de sal (200

mM NaCl, 10 mM MgCl

), e água qsp 6 µl. Este sistema foi incubado por 5 minutos à

temperatura ambiente, e em seguida mantido em gelo para posterior transformação

do produto da reação, clone de entrada, em E. coli TOP10 quimicamente

competente (Invitrogen).

Para a transformação 2 µl do clone de entrada foram adicionados a

50 µl de E. coli TOP10. A mistura foi mantida em gelo por 20 minutos, e após este

período foi incubada em banho-Maria a 42

C por 30 segundos, seguidos de

resfriamento em gelo. Após a transformação as células foram mantidas em 250 mL

de meio SOC (bacto triptona 20 g, extrato de levedura 5 g, NaCl 0,5 g, KCl 1M 2,5

mL, glicose 1M 20 mL, MgCl2 1M 10 mL, água ultrapura qsp 1000 mL) e incubadas

à 37

C, sob 180 rpm de agitação, por 1 hora. Decorrido o tempo de incubação, 100

µl da cultura foram plaqueados em meio LB contendo canamicina (100 µg/mL) e

mantidas à 37

C por 18 horas para seleção dos transformantes.

4.7.3 Análise dos Transformantes

4.7.3.1 Extração de DNA plasmidial

A extração do DNA plasmidial foi realizada pelo método de lise

alcalina (SAMBROOK et al., 1989). Os transformantes de E. coli selecionados após

a clonagem foram cultivados em 3 mL de meio LB contendo canamicina (100 µg/mL)

sob agitação de 180 rpm, à 37

C por 16 horas. A cultura foi centrifugada por 5

minutos a 12000 rpm e o sobrenadante descartado. As células foram

ressuspendidas em 100 µl de GET (glicose 50 mmol/L; Tris-HCl 25 mmol/L pH 8,0;

EDTA 10 mmol/L pH 8,0) juntamente com a adição de 2,5 µl de RNAse (20 mg/mL).

Em seguida, as células foram lisadas pela adição de 100 µl de solução de lise

(NaOH 10 N; SDS 10%), permanecendo em banho de gelo por 5 minutos.

Para a precipitação do DNA cromossomal e proteínas foram

adicionados 200 µl de solução de neutralização (KOAc 3 M; ácido acético glacial), a

mistura foi incubada em gelo por 5 minutos e, após centrifugação por 10 minutos a

12.000 rpm, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga.

O DNA plasmidial foi precipitado pela adição de 2,5 volumes de

álcool absoluto e incubação a -20

C por 15 minutos. A mistura foi novamente

centrifugada por 10 minutos a 12.000 rpm, o sobrenadante foi descartado e o

precipitado lavado com 500 µl de álcool 70%. O DNA plasmidial foi ressuspendido

em 20 µl de água ultrapura e quantificado em gel de agarose 0,8%.

4.7.3.2 Reação de PCR para confirmar a ligação do gene bgl no vetor de

entrada

Para confirmar a construção do clone de entrada foi realizada uma

reação de PCR utilizando-se dos primers MHF e MHR. A reação foi constituída de 1

µl do DNA plasmidial (80 ng), 1,5 µl dos primers MHF e MHR (10 pmol/µl), 5 µl de

MgCl

(10 mM), 2,5 µl de dNTPs (2,5 mM), 2,5 µl de tampão (10 X), 0,2 µl de DNA

Taq Polimerase (1 U), e água qsp 25 µl. Os parâmetros utilizados para a

amplificação foram 2 minutos de desnaturação inicial a 95

C, seguidos de 35 ciclos,

sendo cada ciclo constituído das etapas de desnaturação (94

C, 1 minuto),

pareamento (60

C, 1 minuto), e extensão (72

C, 7 minutos). O produto de PCR foi

analisado em gel de agarose 1%. A presença de uma banda amplificada indicou

sucesso na construção do clone de entrada.

4.7.4 Transferência do Produto de PCR do Vetor de Entrada para o Vetor de

Destino Via Reação LR

Após a construção do clone de entrada, o gene bgl foi transferido

para o vetor de destino pET-DEST 42 via reação LR, gerando um clone de

expressão.

A reação LR consiste em uma recombinação sítio-específica em que

os sítios attL presentes no vetor de entrada pENTR/SD/D-TOPO, e que estão,

portanto, flanqueando o produto de PCR, são com este transferidos para o vetor de

destino pET-DEST 42, que contém os sítios attR.

O sistema de reação LR para a construção do clone de expressão

consistiu de 4 µl LR Clonase Mix, 4 µl de tampão de reação LR (5 x), 300 ng do vetor

de destino pET-DEST 42, 300 ng do clone de entrada num volume final de 20 µl. O

sistema foi incubado à 25

C por 1 hora. Após este período a reação foi interrompida

pela adição de 2 µl de proteinase K (2 µg/µl) e incubação à 37

C por 10 minutos. A

transferência do fragmento de DNA correspondente ao gene bgl do clone de entrada

para o vetor de expressão pET-DEST 42 gerou um plasmídeo recombinante

denominado pAB1. A reação LR foi então usada para transformar células de E. coli

DH10B eletrocompetentes.

4.7.5 Preparo de Células de E. coli Eletrocompetentes

Três colônias de E. coli DH10B foram inoculadas em 10 mL de meio

LB, adicionado de 20 µg/mL de estreptomicina, e incubadas à 37

C, sob agitação de

180 rpm, por 16 horas. As pré-culturas de E. coli foram reinoculadas em meio SOB

(triptona 20,0 g, extrato de levedura 5,0 g, NaCl 0,5 g, KCl 0,186 g, água ultrapura

qsp 1000 mL) numa proporção 1/100 e incubadas à 37

C sob agitação de 180 rpm,

até alcançarem uma D.O.

600

entre 0,5 e 1,0. Após este período, as culturas foram

mantidas no gelo durante 15 minutos, e então centrifugadas a 0

C, 5.000 x g por 5

minutos. As células foram lavadas uma vez com água ultrapura esterilizada, e após

centrifugação a 7.000 x g por 7 minutos as células foram ressuspendidas em 1 mL

de glicerol 15% e armazenadas em alícotas de 30 µl a – 70

Células de E. coli BL21 CodonPlus(DE3) foram igualmente

preparadas, exceto pela não adição de estreptomicina ao meio de cultura.

4.7.6 Transformação de E. coli Eletrocompetentes

Para a transformação, 30 µl de E. coli DH10B eletrocompetentes

foram misturadas a 1 µl da reação LR, mantendo-se as células no gelo por no

mínimo 1 minuto. Em seguida, as células foram transferidas para uma cubeta de

eletroporação (BRL), também anteriormente mantida no gelo, e então submetidas a

um choque elétrico (1,8 Kv, 25 µF, 200 Ω) a fim de promover a entrada do plasmídeo

pAB1 nas células. Após a eletroporação, as células foram ressuspendidas em 800 µl

de meio SOC e incubadas à 37

C por 1 hora. Em seguida, 100 µl da suspensão

celular foram plaqueados em meio LB contendo ampicilina (250 µg/mL) e

estreptomicina (20 µg/mL) e incubados à 37

C por 16 horas para a seleção dos

transformantes.

A linhagem de E. coli DH10B foi usada para manter o plasmídeo

pAB1 por ser uma bactéria recA

4.8 ANÁLISE DOS TRANSFORMANTES

Para confirmar a subclonagem do gene bgl no vetor de expressão

pET-DEST 42 e verificar a ausência de possíveis mutações gênicas, o plasmídeo

pAB1, extraído da E. coli DH10B conforme descrito no item 4.7.3.1 foi submetido à

reação de seqüenciamento (item 4.5). Porém, os primers T7 forward e reverse foram

utilizados no lugar do par M13.

4.9 SUPEREXPRESSÃO DO GENE bgl EM E. coli

O plasmídeo pAB1 foi extraído da linhagem de E. coli DH10B pelo

método de lise alcalina (SAMBROOK et al., 1989) conforme descrito no item 4.7.3.1.

Uma vez extraído, este plasmídeo foi usado para transformar a linhagem de E. coli

BL21 CodonPlus(DE3) eletrocompetente (item 4.7.6) para indução da expressão do

gene bgl.

Três colônias transformadas com o pAB1 foram inoculadas em 10

mL de meio LB contendo ampicilina (250 µg/mL) e incubadas à 37

C, sob agitação a

180 rpm, por 16 horas. Células de E. coli BL21 CodonPlus(DE3) não transformadas

com o pAB1 também foram cultivadas nas mesmas condições. Em seguida, as

culturas foram reinoculadas em 1200 mL de meio LB na proporção 1/100 e

incubadas à 37

C, sob agitação a 180 rpm até atingir uma D.O.

600

igual a 0,2. Neste

ponto, uma alíquota das culturas foi coletada para posterior análise das proteínas

em gel. Estas amostras foram utilizadas como controles não induzidos.

A indução foi feita com a adição de IPTG para concentração final de

0,5 mmol/L à 37

C, sob agitação a 180 rpm durante 3 horas. Após a indução, as

células foram coletadas por centrifugação a 12,000 x g por 15 minutos a 4

C. Uma

alíquota dos extratos celulares foi utilizada para análise em gel e o restante foi

ressuspendido em tampão de sonicação (NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0,

glicerol 10%). Em seguida, 1 mmol/L de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) foi

adicionado à mistura e as células foram lisadas em ciclos de 30 segundos com

intervalos de 30 segundos por 6 vezes, utilizando-se um sonicador (Heat System)

equipado com microponta. O material lisado foi centrifugado a 12,000 x g por 15

minutos a 4

C e o sobrenadante coletado foi usado para ensaios de atividade

enzimática.

4.10 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS SOB CONDIÇÕES DESNATURANTES (SDS-PAGE)

A concentração das proteínas presentes nos extratos celulares foi

determinada pelo método descrito por Bradford (1976), utilizando-se albumina de

soro bovino (1 µg/mL) como padrão.

A análise das proteínas foi realizada em gel SDS-PAGE como

descrito por Laemmli (1970).

O gel separador foi preparado a 12% a partir de uma mistura de 4

mL de solução estoque de acrilamida (30% acrilamida, 0,8% bisacrilamida), 2,5 mL

de Tris-HCl (1,5 mol/L, pH 8,8), 3,5 mL de água destilada, 300 µl de SDS (10%), 150

µl de persulfato de amônio (10%), e 10 µl de TEMED (N, N, N’, N’-

tetrametiletilenodiamina).

Para o preparo do gel empilhador foram utilizados 600 µl de solução

estoque de acrilamida, 1 mL de Tris-HCl (0,5 mol/L, pH 6,8), 2,4 mL de água

destilada, 300 µl de SDS (10%), 75 µl de persulfato de amônio e 4µl de TEMED.

O tampão de amostra contendo Tris-HCl (12 mmol/L, pH 6,8),

glicerol (5%), SDS (0,4%), 2-mercaptoetanol (2 mmol/L) e azul de bromofenol (0,02

%) foi preparado 5 vezes concentrado. As proteínas a serem analisadas foram

misturadas ao tampão de amostra, aquecidas à 95

C por 10 minutos e, em seguida,

foram submetidas à eletroforese. As corridas foram realizadas a 180 volts por 1 hora

e 30 minutos em tampão Laemmli (25 mmol/L Tris, 192 mmol/L glicina, 0,1% SDS,

pH 8,3) preparado a 10 x e diluído para 1 x no momento do uso.

Concluída a eletroforese o gel foi corado com Coomassie Blue R-

250 0,1% (10% de ácido acético, 40% de metanol).

4.11 ANÁLISE DA PROTEÍNA SUPEREXPRESSA EM ESPECTROMETRIA DE MASSA

A análise em espectrometria de massa (MALDI-TOF) foi utilizada

para confirmar a expressão da β-glicosidase. A confirmação foi feita comparado-se

valores de massas de polipeptídeos preditos através da seqüência de aminoácidos

com valores de massas obtidas no MALDI-TOF após tratamento da proteína

expressa com tripsina. Esta análise foi feita no Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Paraná, sob a supervisão do Dr. Emanuel de Souza.

O fragmento do gel contendo a proteína de interesse foi incubado

por 10 minutos em acetonitrila 100% por duas vezes. O resíduo de acetonitrila foi

evaporado utilizando um evaporador rotativo Speed Vac Plus. Em seguida o

fragmento do gel foi imerso em uma solução contendo 250 µg/mL de tripsina

(dissolvida em 50 mM de bicarbonato de amônio) e incubado por 40 minutos em

gelo. A seguir o tubo foi transferido para banho-Maria por 12 horas. A ação da

tripsina foi bloqueada com adição da solução de acetonitrila 50% e ácido fórmico

5%. Os peptídeos foram retirados da matriz de acrilamida com 3 lavagens

sucessivas de 10 minutos cada com a solução contendo 50% de acetonitrila e 5% de

ácido fórmico. Os peptídeos extraídos foram sonicados por 10 minutos. O excesso

de acetonitrila foi evaporado no Speed Vac Plus. Um décimo do volume da amostra

foi purificada usando Zip Tip C18 (Millipore) e misturado com 60% de acetonitrila e

0,1% de ácido trifluoroacético (TFA).

A amostra preparada conforme descrito acima foi misturada com a

matriz a-ciana (CHCA), e alíquotas de 1 µl foram aplicadas na placa de leitura do

espectrômetro de massa.

4.12 ATIVIDADE DE β-GLICOSIDASE

Alguns ensaios preliminares foram realizados quanto à atividade da

β-glicosidase.

A atividade da enzima foi testada usando p-nitrofenil -β - D –

glicopiranosíde ou celobiose como substratos. Os ensaios consistiram de 0,1 mL de

substratos (100 mg/mL de p -nitrofenil -β - D – glicopiranosíde ou 0,2 % de

celobiose), 1 mL de tampão fosfato (50 mM Na

HPO

-NaH

pH 6,0) e 0,03 mL

de enzima. A mistura foi incubada à 37

C por 1 hora e as reações foram

interrompidas pela adição de 1 mL de Na

1 M. A atividade de β-glicosidase

sobre p -nitrofenil -β - D – glicopiranosíde foi estimada pela medida de ρ-nitrofenol

liberado à 400 nm. A atividade de β-glicosidase sobre celobiose foi estimada pela

medida de glicose liberada utilizando-se o método de glucose oxidase (Kit Glucose

Enzyme Color – Bio Diagnostica).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CLONAGEM DO GENE bglH DE B. pumilus

O procedimento de shotgun utilizado para a construção da biblioteca

genômica de B. pumilus permitiu a obtenção de 7000 clones recombinantes, com

insertos variando de 2 e 3 Kb. Esta biblioteca já se mostrou apropriada para a

seleção de genes de importância industrial. Lima et al (2004) isolaram um clone que

continha o gene que codifica para a β-1,4 D – endoglucanase, enzima envolvida no

complexo celulolítico. Estudos das propriedades enzimáticas mostraram que esta

enzima apresenta alto potencial para aplicações biotecnológicas.

No presente estudo, estratégias foram utilizadas visando clonar e

expressar um segundo gene de B. pumilus CL16, um gene que codifica uma β-

glicosidase.

Considerando-se a inexistência de informações sobre seqüências de

nucleotídeos e/ou aminoácidos de β-glicosidase de B. pumilus em banco de dados,

procedeu-se inicialmente um estudo do grau de conservação desta proteína em

diferentes espécies de bactérias. O alinhamento gerado permitiu detectar regiões

conservadas na proteína e o desenho dos primers degenerados DEG1F

ATRACCTACTgNAARTTRgg e DG1R gCRAANCCYAgHTARACggT para

amplificação de parte do gene. O uso destes primers permitiu detectar um fragmento

de 560 pb com alta homologia às β-glicosidases já depositadas em banco de dados.

Este fragmento após sofrer marcação com digoxigenina mostrou-se apropriado para

rastrear a biblioteca genômica, visando selecionar clones contendo genes que

codificam para β-glicosidases.

Após análise de 2400 clones recombinantes a sonda detectou um

forte sinal de hibridação com um dos clones (Figura 3). O plasmídeo recombinante

continha um fragmento de aproximadamente 2484 pb, portanto bem superior ao

tamanho do gene que codifica para a maioria das β-glicosidases de Bacillus. Este

plasmídeo foi denominado pMH2.

A Figura 4 mostra a seqüência de nucleotídeos do inserto presente

no pMH2. A análise deste fragmento evidenciou a presença de duas ORFs. Uma

ORF incompleta, com alta similaridade ao gene bglP descrito para B. subtilis subsp.

subtilis 168 (KUNST et al., 1997) localizada entre os nucleotídeos 1 e 534 do

fragmento, apresentando um códon terminador (TAG) e um conteúdo de G/C

calculado em 42,6%. Por similaridade esta ORF de B. pumilus foi denominada bglP.

Downstream da ORF bglP foi localizada uma ORF completa denominada com 1419

nucleotídeos. Esta ORF apresenta um códon iniciador (ATG) na posição 561 e um

códon terminador (TAA) na posição 1977 do fragmento. Esta ORF mostrou alta

Figura 3-

Autoradiografia resultante da hibridação da sonda contra

a biblioteca genômica do B. pumilus. A seta indica o

clone positivo contendo o plasmídeo denominado pMH2.

similaridade ao gene bglH de B. subtilis subsp. subtilis 168 (KUNST et al., 1997). Por

similaridade esta ORF de B. pumilus foi denominada bglH. O conteúdo de G/C da

ORF bglH foi estimado em 41,6%.

A Figura 5 ilustra a organização das ORFs bglP e bglH de B. pumilus

no fragmento clonado. As ORFs estão separadas por uma região de 24 pares de

bases onde a 9 nucleotídeos localizados upstream do códon iniciador da ORF bglH

está um provável sítio de ligação de ribossomo (AGGAGG) com consenso

semelhante àqueles encontrados para bglH de B. subtilis subsp. subtilis 168 (KUNST

et al., 1997) e bglB de E. coli (SCHNETZ et al., 1987). Nenhuma seqüência

promotora foi localizada upstream da ORF bglH caracterizando, portanto, um

operon. Seqüências que caracterizam o término da transcrição, tais como aquelas

rho independentes (seqüência repetida e invertida) não foram detectadas

downstream da ORF bglH. Um sub-banco do NCBI, denominado (Entrez Gene –

NCBI server) foi consultado para localizar o gene bglH no contexto do genoma de B.

subtilis. Esta análise demonstrou que o operon estudado no presente trabalho é

estruturalmente semelhante àquele descrito para B. subtilis subsp. subtilis 168

(KUNST et al., 1997). Este dado também está de acordo com Le Coq et al (1995)

que demonstraram a conservação desta estrutura em operon para Bacillus.

O gene bglP codifica para uma permease do sistema de

fosfotransferase tipo II (PTS) com função na recepção, transporte e fosforilação de

moléculas glicosídicas para o interior da célula bacteriana (LE COQ et al., 1995;

GONZY-TRÉBOUL e STEINMETZ, 1987). A análise da seqüência de nucleotídeos

do gene bglP mostrou alta similaridade com espécies do gênero Bacillus (B. subtilis,

gi730418 e B. licheniformis, gi52787892), bem como com espécies bacterianas

endofíticas, tal como Erwinia carotovora (gi50120800).

1 TTCTCGGATTCAAAGATGTACCAGTGAAAGATGATACAAAAGCAGACAAACCAGAAGAAA

61 AGAAAGACACAGCAGCACTTCAAAATGAAGTGGTACAAAGCCCACTTGAAGGTCAACTAA

121 AGCCGCTCAATCAAGTAAATGATGCAACGTTCTCTAATGAAATCATGGGCAAAGGTGCAG

181 CCATTGTACCAACAGCTGGGCGTGTTGTAGCACCGTTCAACGGCAAGGTTGAAACCATTT

241 TCCACACAAAACATGCCATTGGCTTGAAGAGTGAACAAGGTACAGAACTTCTCATTCATG

301 TCGGGATTGACACGGTAAAACTTGGCGGAAAGTATTTCACAAGTCATGTGCAATCAGGTG

361 ATCTGATTCAAGCAGGAGATGTACTCATTGATTTTGATATCGAGGGCATTCAGCAAGAAG

421 GCTATGATGTCACCACACCTGTTATTGTCACCAACACGAATGATTATGCACAAGTTGATG

481 CGAAAACAGATGGAACGATTACAGTAAAAGAGACACTGCTTACAGTCAGTGTAGAAGAAA

541 AAGAGGAGGGTATTCAACATGAACAAGTTAGAAAAAACATTTCCTAAAGGTTTCTTATGG

RBS M N K L E K T F P K G F L W

601 GGCGGCGCTGTTGCAGCCAACCAAGTTGAAGGCGCATATAATCAAGATGGAAAAGGCTTA

G G A V A A N Q V E G A Y N Q D G K G L

661 TCGACAGCTGATGTATCACCAAATGGTATTATGCACCCATTCGATGAATCAATGAAAGAC

S T A D V S P N G I M H P F D E S M K D

721 CTTAACTTATATCATGATGCAATCGATTTCTACCATCGCTATAAAGAAGATATTGCACTC

L N L Y H D A I D F Y H R Y K E D I A L

781 TTTGCAGAAATGGGATTCAAGTGCTTCAGACTATCCATTTCTTGGCCGCGTATTTTCCCA

F A E M G F K C F R L S I S W P R I F P

841 AATGGCGACGATGCGGAACCGAATGAAGCAGGCCTCGCTTTTTATGAAAAAGTATTTGAT

N G D D A E P N E A G L A F Y E K V F D

901 GAACTGCATAAGCACGGAATTGAGTCAGTTGTCACCATCTCTCACTATGAAATGCCGCTC

E L H K H G I E S V V T I S H Y E M P L

961 GCACTTGTGAAAAACTACGGCGGATGGAGAAACCGCAAGCTTGTCGATCTTTATGAAACA

A L V K N Y G G W R N R K L V D L Y E T

1021 TACGCGAAAACATTGTTCACTCGCTTTAAAGACAAAGTGAAATATTGGATGACATTCAAT

Y A K T L F T R F K D K V K Y W M T F N

1081 GAAATCAATGTCGTGTTACATGCGCCTTTCACTGGCGGCGGACTTGTATTTGAAGAGGGT

E I N V V L H A P F T G G G L V F E E G

1141 GATGACGAGAAAAGCATTCAATATCAAGCAGCGCATCACCAATTTGTTGCAAGTGCTTTG

D D E K S I Q Y Q A A H H Q F V A S A L

1201 GCTGTCAAAGCAGGACACGAAATCATTCCTGATGCGAAAATCGGCTGTATGATTGCAGCG

A V K A G H E I I P D A K I G C M I A A

1261 ATGACAACTTATCCGTACAGCTCAAGACCAGAAGATATGTTTGCTGCAATTGAGCAAGAC

M T T Y P Y S S R P E D M F A A I E Q D

1321 CGTAAAACATTATTCTTCTCAGATGTACAGGCAAGAGGTTATTACCCAGGTTACATGAAA

R K T L F F S D V Q A R G Y Y P G Y M K

1381 CGTTATTTCCTTGAAAATGACATCAACATCGAGTTCCAAGAAGGGGACGAAGACATTTTA

R Y F L E N D I N I E F Q E G D E D I L

1441 AGAAACCATACAGTGGACTATATTGGCTTCAGTTATTATATGAGCTTTGTGACAAGTACA

R N H T V D Y I G F S Y Y M S F V T S T

1501 GATCCAGAGATTCTTGGACAAGTGACTGGCGGTAACTTATTTGAAGGTGTGAAAAACCCT

D P E I L G Q V T G G N L F E G V K N P

1561 TATCTAGAAGCAAGTGATTGGGGCTGGCAAATTGATCCGAAAGGACTTCGTACAACACTG

Y L E A S D W G W Q I D P K G L R T T L

1621 AATCAGCTGTATGACCGCTACCAAAAGCCATTGTTTATCGTAGAAAATGGATTGGGTGCT

N Q L Y D R Y Q K P L F I V E N G L G A

1681 GTCGATCAAGTAGAAGAAGACGGATCAATTCAAGACGATTACCGAATTGATTACCTCAGA

V D Q V E E D G S I Q D D Y R I D Y L R

1741 AGCCATTTGCTAGAGGCGAGAGAAGCGATCGCAGACGGAGTTGACCTGATCGGTTATACA

S H L L E A R E A I A D G V D L I G Y T

1801 AGCTGGGGCCCAATTGACCTTGTCAGCGCATCAACGGCTGAAATGAAAAAACGCTACGGC

S W G P I D L V S A S T A E M K K R Y G

1861 TTCATTTATGTTGACCGTGATAATGAAGGAAACGGTACATTAGATAGAAAGAAAAAGAAA

F I Y V D R D N E G N G T L D R K K K K

1921 AGCTTCGATTGGTATAAACAAGTGATTGCGACAAATGGGGAACATTTGGATTACTAA ACA

S F D W Y K Q V I A T N G E H L D Y

1981 GAGAAAATATTGTTTCGATCCTTTAAGAACATATAGTGTCTTGAAACGGTGATAACAATT

2041 TGAATCAGGCATTATCATTCATTGGGTCTCCTCTAGGGGCATGATGGGTGATAATGCCTT

2101 TTTTATGAAAAAGACAAAATCGAACAAAAAATAAACCACACTTCAAATGGTTGCGTGGTT

2161 CAAATAAATCATATGATCGGAGTTTTGAGCTTCATACATTGGTTTTAATTCGGTAATACC

2221 TATTCTTCAAGTATTTCTTTTATATCTTCAATGATTAGGGTATTTAAAATTAAATTCTAG

2281 TAGACTTAACCCTTTCCCAATTGTGGTCTAAGAAAAGAATCCTATTCTCTAATGGTTATC

2341 AGCAGCAATTCTGTCTTCAATTCAGTAATTATACATCTGAATCTTTCTCCACTGTATGAA

2401 TTCATAATCAATGTTATAAAATTTAACTAGCTCAGGATAGACTATTAATAACTTGGTAGT

2461 ACTACTGGAACTAGTCAGTCAGCT

Figura 4 – Caracterização da seqüência de nucleotídeos da ORF

bgl

no fragmento clonado a partir da biblioteca genômica de

B. pumilus. Os códons iniciador e terminador e o sítio de

ligação do ribossomo (RBS) estão sublinhados.

O gene bglH de B. subtilis codifica para uma β-glicosidase cuja

especificidade varia para diferentes substratos de acordo com a literatura. As

análises comparativas da seqüência de nucleotídeos da ORF bglH obtida no

presente trabalho com aquelas de bancos de dados mostraram maior similaridade

com B. subtilis subsp. subtilis 168 (gi505577), B. licheniformis DSM 13 (gi52001702),

B. cereus ZK (gi51973633), B. halodurans C-125 (gi10173176), e Listeria

monocytogenes str. 4b F2365 (gi46879488), respectivamente.

Análises realizadas com o programa ProtParam indicaram que a

ORF bglH codifica para uma proteína de 472 aminoácidos com massa molecular

estimada em cerca de 53.9 kDa e um ponto isoelétrico de 4.97. Conforme verificado

através do programa TMPred a seqüência de aminoácidos da proteína BglH indica

uma característica essencialmente hidrofílica com provável localização

citoplasmática. Este fato foi confirmado pela ausência de uma seqüência sinal

conforme demonstrado pela análise realizada com o programa SignalP 3.0. Na

literatura tem sido descrito que as β-glicosidases do gênero Bacillus têm localização

periplasmática e citoplasmática (BHATIA et al., 2002). A β-glicosidase clonada no

presente trabalho se caracteriza, portanto, como citoplasmática.

Figura 5: Organização da região bglP-bglH no fragmento clonado

bglP bglH

0,2 Kb

Eco

Hind

III

Hind

III

Hae

Eco

A submissão da seqüência de aminoácidos à análise pelo programa

CDSearch (NCBI server) permitiu localizar um único domínio conservado

característico da família 1 de glicosil hidrolases entre os aminoácidos 4 e 468 da

proteína (Figura 6).

A comparação da seqüência de aminoácidos predita no presente

estudo com aquelas depositadas no GenBank (NCBI), mostrou que a BglH de B.

pumilus tem alta similaridade com β-glicosidases de diferentes organismos. Grande

similaridade foi encontrada com β-glicosidases da família 1 de glicosil hidrolases de

diferentes espécies de Bacillus, sendo as maiores delas com 6-phospho-beta-

glucosidase de B. subtilis subsp. subtilis 168 (gi7435440, score 791, valor de E=00),

e beta-glicosidase/Gentiobiase/Celobiase de B. subtilis subsp. subtilis 168

(gi50812306, score 791, valor de E=00). Valores de identidade de 80% e

positividade de 89% foram observados entre a BglH de B. pumilus e as outras 2

BglH de B. subtilis mencionadas acima. Os sítios ativos Glu

175

(ácido catalítico) e

Glu

369

(nucleofilo catalítico) observados na BglH de B. pumilus são conservados

entre as glicosil hidrolases da família 1 (PROSITE motif PS00572 –

http://enterprise.bio.tamu.edu/prosite/prosite_new.html) (Figura 7) e estão envolvidos

Figura 6 – Representação esquemática do domínio conservado

de glicosil hidrolase na BglH de B. pumilus

na hidrólise de ligações glicosídicas via mecanismo de catálise ácida/básica

(WITHERS e AEBERSOLD, 1995).

A presença de um domínio e resíduos catalíticos típicos da família 1

de glicosil hidrolases, preditos a partir da seqüência de nucleotídeos do gene

clonado (bglH), demonstram o sucesso obtido na clonagem de um gene que codifica

uma enzima pertencente a esta família.

As diferentes seqüências de aminoácidos correspondentes às β-

glicosidases codificadas pelo gene bgl depositadas nos bancos GeneBank e

GenePept disponíveis no banco CAZY (http://afmb.cnrs.cnrs-mrs.fr/CAZY/) foram

alinhadas entre si juntamente com a seqüência deduzida da ORF bglH (Figura 7).

Observa-se nesta Figura a alta conservação entre a proteína predita para o gene

bglH de B. pumilus e aquelas depositadas em bancos de dados preditas para o gene

bglH das espécies B. halodurans (gi 10173210), B. subtilis subsp. subtilis 168 (gi

7435440), B. cereus (gi 52144364), B. thuringiensis (gi 49477027), B. licheniformis

(gi 52082495), B. clausii (gi56965550).

B cereus 1 --MSKVIFPKGFLWGGAIAANQVEGAYVEDGKGLTTVDLLPTGENRWDIMKGNIHSFTPV

B.thuringiensis 1 --MSKVIFPKGFLWGGAIAANQVEGAYVEDGKGLTTVDLLPTGENRWDIMKGNIHSFTPV

B.halodurans 1 --MSKHSFPEGFLWGGAIAANQAEGAYLEDGKGLTLVDLLPTGQKRWDVMLGKLDSFTPL

B.clausii 1 --MSNYKFPDGFLWGGAIAANQAEGAYLEGGKGLTIVDLLPTGEQRRAIMEGYVQSLIPE

B.subtilis 1 MSSNEKRFPEGFLWGGAVAANQVEGAYNEGGKGLSTADVSPNG---------IMSPFDES

B.licheniformis 1 MTEQTKKFPEGFLWGGAVAANQVEGAYNVGGKGLSTADVSPNG---------VMYPFDES

B.pumilus 1 MNKLEKTFPKGFLWGGAVAANQVEGAYNQDGKGLSTADVSPNG---------IMHPFDES

consensus 1 .. . **.*******.****.****...****...*..*.* . .. . . .. .

B.cereus 59 EGEFYPSHEAIDFYHRYKEDIALFAEMGFKALRVSIAWTRIFPNGDDEKPNEAGLQFYED

B.thuringiensis 59 EGEFYPSHEAIDFYHRYKEDIALFAEMGFKALRVSIAWTRIFPNGDDEKPNEAGLQFYDN

B.halodurans 59 EGEFYPSHEAIDFYHRYQEDVALLAEMGFKAFRLSISWARIFPNGDDPEPNEKGLQFYDD

B.clausii 59 EGVYYPSHEAIDFYHRYKEDIKLFAEMGFKALRVSIAWARIFPTGEDEEPNEDGLLFYDR

B.subtilis 52 MTSLNLYHNGIDFYHRYKEDIALFAEMGFKAFRTSIAWTRIFPNGDEEEPNEEGLRFYDD

B.licheniformis 52 MESLNLYHEGIDFYHRYKEDIALFAEMGFKAFRTSIAWTRIFPNGDETEPNEEGLEFYDR

B.pumilus 52 MKDLNLYHDAIDFYHRYKEDIALFAEMGFKCFRLSISWPRIFPNGDDAEPNEAGLAFYEK

consensus 61 .......*..*******.**..*.******..*.**.*.****.*....*** ** **.

B.cereus 119 LFDELLKHDIEPVVTMAHFDVPVHLVEKYGSWRSRKLVNFFETYAKTIFNRYKDKVKYWM

B.thuringiensis 119 LFDELLKHDIEPVVTMAHFDVPIHLVEKYGSWRSRKLVDFFETYAKTIFNRYKDKVKYWM

B.halodurans 119 LFDELLKYNIQPVVTMAHFDVPVHLIESYGGWRSRKLVGLFETYAKTILSRYKDKVKYWM

B.clausii 119 LFNELLAHNIEPVVTLAHFDVPVHLIEKYGSWRSRKLVGLFEMYAKTVFTRYKNKVKYWM

B.subtilis 112 LFDELLKHHIEPVVTISHYEMPLGLVKNYGGWKNRKVIEFYERYAKTVFKRYQHKVKYWM

B.licheniformis 112 LFDELLKYNIEPVVTISHYEMPLGLIKKYGGWKNRKVIDCYEHYAKTVFTRYKEKVKYWM

B.pumilus 112 VFDELHKHGIESVVTISHYEMPLALVKNYGGWRNRKLVDLYETYAKTLFTRFKDKVKYWM

consensus 121 .*.**... *..***..*...*..*...**.*..**... .*.****...*...******

B.cereus 179 TFNEINMLLHLPFMGAGLAFKEGDNKKQIQYQAAHHQLVASALAVKACHEIIPDAKIGCM

B.thuringiensis 179 TFNEINMLLHLPFMGAGLAFKEGDNKKQIQYQAAHHQLVASALAVKACHEIIPDAKIGCM

B.halodurans 179 TFNEINMLLHLPFVGAGLVFKEGENKKQIQYQAAHHQLVASSLAVKACHELIPDAKIGCM

B.clausii 179 TFNEINMLLHLPFLGAGLVFKEGDNKQQIQYQAAHHQLVASALAVKACHEIIPDAKIGCM

B.subtilis 172 TFNEINVVLHAPFTGGGLVFEEGENKLNAMYQAAHHQFVASALAVKAGHDIIPDSKIGCM

B.licheniformis 172 TFNEINMVLHAPFTGGGLVFEEGENKLNAMYQAAHHLFVASALAVKAGHDIIPDAKIGCM

B.pumilus 172 TFNEINVVLHAPFTGGGLVFEEGDDEKSIQYQAAHHQFVASALAVKAGHEIIPDAKIGCM

consensus 181 ******..**.**.*.**.*.**.......******..***.*****.*..***.*****

B.cereus 239 LAAGATYPYTCNPDDVLRAMEQDRESFFFIDVQARGAYPGYAKRFFKDNNVTIEMEKEDE

B.thuringiensis 239 LAAGATYPYTCNPDDIQRAMEQDRESFFFIDVQARGAYPGYAKRFFTDNNVTIEMEKEDE

B.halodurans 239 LAAGATYPYTCHPNDVFEAMTKDRESFFFIDVQSRGEYPGYAKRFFRDHNIVIDMEEGDE

B.clausii 239 LAAGSFYPYTCNPKDIFKGMEKDRESYFFIDVQSRGEYPPYAMRFFKDNQLDIAMEPGDT

B.subtilis 232 IAATTTYPMTSKPEDVFAAMENERKTLFFSDVQARGAYPGYMKRYLAENNIEIEMAEGDE

B.licheniformis 232 IAATTTYPMTPKPEDVLAAMENERRTLFFSDVQARGAYPGYMKRFFKENGITIEMAEGDE

B.pumilus 232 IAAMTTYPYSSRPEDMFAAIEQDRKTLFFSDVQARGYYPGYMKRYFLENDINIEFQEGDE

consensus 241 .**...**....*.*.. .....*...**.***.**.**.*..*....... *.....*.

B.cereus 299 EILKEHTVDYIGFSYYASRATSTDPEVLKSITSGNVFGSVENPYLEKSEWGWTIDPKGFR

B.thuringiensis 299 AILKEHTVDYIGFSYYASRATSTDPEVLKSITSGNVFGSVENPYLEKSEWGWTIDPKGFR

B.halodurans 299 ALLKNHTVDYIGFSYYASRVTSTDPEVLKNITSGNVFGSVENPYLEKSEWGWTIDPKGFR

B.clausii 299 ELLKAHTVDYIGFSYYSSRTTSTDPEVNKNQTTGNVFGSIVNPYLEKSEWGWTIDPLGFR

B.subtilis 292 ELLKEHTVDYIGFSYYMSMAASTDPEELAKSGG-NLLGGVKNPYLKSSEWGWQIDPKGLR

B.licheniformis 292 DILKENTVDYIGFSYYMSMVASTSPEDLAKTEG-NLLGGVKNPYLESSEWGWQIDPKGIR

B.pumilus 292 DILRNHTVDYIGFSYYMSFVTSTDPEILGQVTGGNLFEGVKNPYLEASDWGWQIDPKGLR

consensus 301 ..*...********** *. .**.**... ....*..... ****..*.***.***.*.*

B.cereus 359 ITANQLYDRYQKPLFVVENGLGAIDELNDADAVNDAYRIDYLEKHIIEMSEAIQDGVDII

B.thuringiensis 359 ITANQLYDRYQKPLFVVENGLGAIDQLNDEDEVNDAYRIDYLEKHMIEMSEAIQDGVDII

B.halodurans 359 TTANQLYDRYQKPLFVVENGLGAVDDVTLEGEINDEYRIDYLRKHIAEMAEAIADGVDII

B.clausii 359 ITANQLYDRYQKPLFVVENGLGAVDEWNEEGQIDDSYRIDYLGSHLAALGEAIKDGVEII

B.subtilis 351 ITLNTLYDRYQKPLFIVENGLGAVDKVEEDGTIQDDYRINYLRDHLIEAREAIADGVELI

B.licheniformis 351 ITLNTLYDRYQKPLFIVENGLGAVDVVEEDGSIQDDYRINYLRDHLKEVREAIADGVDLI

B.pumilus 352 TTLNQLYDRYQKPLFIVENGLGAVDQVEEDGSIQDDYRIDYLRSHLLEAREAIADGVDLI

consensus 361 .*.*.**********.*******.* . ... ..*.***.**. *.... ***.***..*

B.cereus 419 GYTSWGPIDLVSASTGEMKKRYGYIYVDKDNEGKGSLKRSKKKSFDWYKEVIKTNGESLE

B.thuringiensis 419 GYTSWGPIDLVSASTGEMKKRYGYIYVDKDNEGKGSLKRSKKDSFNWYKEVIATNGGSLE

B.halodurans 419 GYTSWGPIDVVSASTGEMKKRYGYIYVDRDNEGKGSLKRMKKKSFHWYKKVIETNGEKR-

B.clausii 419 GYTSWGPIDIVSASSGEMKKRYGYIYVDRDNEGNGTLNRAKKASFDWYKQVIATNGESL-

B.subtilis 411 GYTSWGPIDLVSASTAEMKKRYGFIYVDRDNEGNGTFNRIKKKSFNWYQQVIATNGESL-

B.licheniformis 411 GYTSWGPIDLVSASTAEMKKRYGYIYVDRDNEGKGTLSRTRKKSFYWYKKVIETNGESL-

B.pumilus 412 GYTSWGPIDLVSASTAEMKKRYGFIYVDRDNEGNGTLDRKKKKSFDWYKQVIATNGEHLD

consensus 421 *********.****..*******.****.****.*.. * .*.** **. **.***...

Figura 7 – Alinhamento de

sequências de aminoácidos preditas a partir do gene

bgl

H (depositadas no NCBI GenBank),

de espécies de Bacillus e da BglH de B. pumilus predita neste trabalho, utilizando-se do programa

BioEdit

v.5.0.9. As regiões destacadas em preto correspondem aos aminoácidos conservados entre as proteínas;

as regiões cinzas correspondem aos aminoácidos com propriedades químicas similares; os aminoácidos

destacados dentro do retângulo correspondem aos sítios catalíticos das enzimas.

5.2 SUBCLONAGEM E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DO GENE bglH DE B. pumilus EM E.

coli.

A partir de uma reação de PCR utilizando-se dos primers MHF e

MHR (Tabela 3) que reconhecem os terminais da ORF bglH, foi obtido um produto

de amplificação de 1419 bases. A utilização do Sistema Gateway de Clonagem

(Invitrogen) permitiu ligar este fragmento correspondente ao gene bglH a um vetor

denominado vetor de entrada pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen), gerando clones de

entrada, usados para transformar células de E. coli. A presença do gene bglH nestes

clones foi confirmada por PCR, utilizando-se os mesmos primers. Através de

recombinação sítio específica, o gene bglH foi transferido do vetor de entrada para

um vetor de expressão fornecido pelo Kit do Sistema Gateway de Clonagem, o pET-

DEST 42, resultando assim em um plasmídeo recombinante denominado pAB1. Os

resultados do seqüenciamento do pAB1 mostraram que o gene bglH foi inserido

integralmente e em fase de leitura para permitir a correta expressão.

O vetor de expressão pAB1 foi transferido para células de E. coli

BL21 CodonPlus(DE3), visando obter a proteína BglH. A expressão do gene bglH foi

realizada sob controle induzível do promotor T7 presente no pAB1. Este promotor é

reconhecido pela RNA polimerase da linhagem de E. coli BL21 CodonPlus(DE3). O

perfil eletroforético dos extratos celulares da linhagem de E. coli BL21

CodonPlus(DE3) transformada com o vetor de expressão pAB1 mostrou que a

proteína BglH foi superexpressa após indução com IPTG (Figura 8). Uma banda de

massa molecular estimada em 54 kDa foi observada exclusivamente na situação em

que E. coli BL21 CodonPlus(DE3) portadoras do vetor pAB1 foram tratadas com o

indutor de expressão IPTG. Esta massa molecular observada corresponde à massa

molecular predita no Protparam e também está próxima daquelas descritas para as

β-glicosidases de algumas espécies de Bacillus, tais como, Bacillus sp. GL1

(HASHIMOTO et al., 1998), B. subtilis subsp. subtilis 168 (KUNST et al., 1997), B.

circulans subsp. alkalophilus (PAAVILAINEN et al., 1993) e B. polymyxa (PAINBENI

et al., 1992; GONZÁLEZ-CANDELAS et al., 1989).

A análise de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foi utilizada

para identificar a proteína revelada na banda de 54 KDa. A Tabela 5 mostra que as

massas dos polipeptídeos gerados, após tratamento com tripsina, estão muito

próximas das massas de peptídeos preditos para a BglH de B. pumilus, confirmando

a super expressão da β-glicosidase de B. pumilus em células de E. coli.

kDa 1 2 3 4 5

BglH

Figura 8 - SDS-PAGE da proteína BglH expressa em E. coli BL21 CodonPlus(DE3). As

proteínas estão coradas com Coomassie Blue R-250. Linha 1, marcador de

massa molecular (Pharmacia); linha 2, extrato celular de E. coli BL21

CodonPlus(DE3) não transformadas com pAB1 e não induzidas com IPTG;

linha 3, extrato celular de E. coli BL21 CodonPlus(DE3) não transformadas

com pAB1 e induzidas com IPTG; linha 4, extrato celular de E. coli BL21

CodonPlus(DE3) transformadas com pAB1 e não induzidas com IPTG; linha

5, extrato celular de E. coli BL21 CodonPlus(DE3) transformadas com pAB1

e induzidas com IPTG.

Tabela 5. Resultados da análise de espectrometria de massa que comprovam a

identidade da ß-glicosidase de B. pumilus expressa em E. coli.

Massa de

polipeptídeos

preditos

Posição de

corte

Seqüência do peptídeo Massa dos

polipeptídeos

gerados

1032.5149 433-440 YGFIYVDR 1032.550

1183.6106 257-266 TLFFSDVQAR 1183.229

1791.8449 54-67 DLNLYHDAIDFYHR 1791.8449

2472.1565 276-295 YFLENDINIEFQEGDEDILR 2470.895

3297.5909 361-389 YQKPLFIVENGLGAVDQVEEDGSIQDDYR 3297.737

O gene bglH de B. subtilis codifica para uma β-glicosidase cuja

especificidade varia para diferentes substratos. Le Coq et al (1995) descreveram que

o gene bglH de B. subtilis codifica para uma fosfo- ß-glucosidase. Setlow et al (2004)

sugeriram que o gene bglH de B. subtilis codifica para uma aril-fosfo-ß-D-

glucosidase e na anotação do genoma de B. subtilis linhagem 168 sugere-se que

este gene codifica para uma ß-glucosidase com atividade sobre celobiose (KUNST

et al., 1997). O potencial biotecnológico desta nova enzima somente poderá ser

sinalizado após estudos de suas propriedades cinéticas, tais como pH, temperatura

e K

para diferentes substratos. Estudos preliminares de atividade sobre celobiose e

ρ-nitrofenil-ß-D-glicopiranosídeo permitiram apenas detectar atividade neste último

substrato (Figura 9).

Concluindo, este trabalho descreve a clonagem e a expressão da

primeira ß-glucosidase de B. pumilus e sugere a continuidade dos estudos para a

caracterização da atividade enzimática.

1 2 3

Figura 9 – Ensaio preliminar de atividade da ß-glucosidase de B. pumilus.

Tubos 1 e 3: atividade da enzima sobre o substrato ρ-nitrofenil-

ß-D-glicopiranosídeo. Tubo 2 – Controle negativo (substrato e

tampão).

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente trabalho permite concluir que B. pumilus, uma bactéria

endofítica de Citrus, possui um gene de 1419 pb altamente similar ao gene

denominado bglH de outras espécies de Bacillus. Este gene codifica para uma β-

glicosidase pertencente à família 1 das glicosil hidrolases e está organizado em um

operon de maneira muito similar àquele descrito para B. subtilis. Embora uma alta

similaridade na seqüência de aminoácidos tenha sido encontrada entre a BglH de B.

pumilus e BglH B. subtilis, diferenças na estrutura primária da proteína (20% dos

aminoácidos) permitem classificá-la como uma nova β-glicosidases da família 1 de

glicosil hidrolases.

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ANEXO

ANEXO A – ARTIGO

STRUCTURAL CHARACTERIZATION OF THE bgl OPERON ENCODING 6-PHOSPHO -β-D-

GLUCOSIDASE IN AN ENDOPHYTIC Bacillus pumilus STRAIN

∗ Este artigo será enviado para publicação na revista GENETICS and Molecular Biology

Structural characterization of the bgl operon encoding 6-phospho-β-D-

glucosidase in an endophytic Bacillus pumilus strain.

Andréa Cristina Bogas

Laboratório Genoma. CCB.Universidade Estadual de Londrina. Caixa Postal 6001.

CEP 86100-990. Londrina-Paraná.

Abstract

An aryl-phospho-β-D-glucosidase-encoding gene (bglH) of an endophytic Bacillus

pumilus strain (CL16) was cloned from a shotgun genomic library constructed in

Escherichia coli. The nucleotide sequence of the entire cloned fragment (2,484 bp)

was determined and characterized. An incomplete ORF of 534 bp (ORF1) designed

bglP and a complete ORF of 1,419 bp (ORF2) designed bglH, located into the

fragment, are organized in an operon. The protein deduced from 1,419 bp (ORF2)

has 472 amino acids residues without a characteristic signal peptide sequence,

suggesting that the enzyme is localized into the cytoplasm. The amino acids

sequence deduced from bglH gene was high similar with β-glucosidases from

glycosyl hydrolase family 1. The over-expression of the B. pumilus bglH gene in E.

coli showed a protein of 54 KDa which identity was confirmed by mass spectrometry

(MALDI-TOF).

Keywords: Bacillus pumilus, bglH, aryl-phospho-β-D-glucosidase, PTS, glycosil

hydrolase 1

Introduction

Cellulose comprises the major polymer of plant cell wall. It is an unbrached

glucose polymer composed of anhydro- ß-1,4-glucose units linked by a ß-1,4-

glycosidic bound. Enzymatic degradation of cellulose within the polisaccharide matrix

of the cell wall requires multiple related enzymes such as endoglucanases and ß-

glucosidases (Knauf and Moniruzzaman, 2004). ß-glucosidases are widespread in

microorganisms where they metabolize various carbohydrate substrates, including

aromatic glycosides like arbutin and salicin that are produced by a variety of plants

(Tajima et al., 2001, Spiridonov and Wilson, 2001, Park et al., 2002; Marques et al.,

2003, An et al., 2005). Considerable polymorphism in ß-glucosidases forms,

functions, and degradative kinetics has been found (Ogunseitan, 2003). Although

several cellulolytic enzymes released by phytopathogens are already well

characterized the knowledge about uptake and hydrolysis of carbohydrates by

endophytic microorganisms is limited. Endophyte microorganisms colonize inner

plant tissues, living in a symbiotic manner with the host species (Azevedo et al.,

2000). These microorganisms have been investigated as a source of new genes and

proteins to be used in industrial processes (Stamford et al., 2001, 2002; Pleban et al.,

1997; Reddy et al., 1996; Moy et al., 2002; Lima et al., 2004). Recently, our group

evaluated 15 endophytic strains of Bacillus spp. isolated from Citrus (Lima et al.,

2004) for cellulolytic activity. The strain CL 16 of B. pumilus showed high cellulase

activity and then it was selected for further studies. We have cloned the gene eglA

(ß-1, 4-endoglucanase) from B. pumilus and expressed it in E. coli. The

endoglucanase denoted EglA showed high termostability, which is an important

feature for biotech processes that require high temperatures (Lima et al., 2004).

In this study, we described the isolated and characterized a new locus of ß-

glucoside sugar utilization genes from the endophytic CL16 strain of B. pumilus.

Material and Methods

Bacterial strains

The endophytic B. pumilus strain (CL16) used in this work was isolated from

Citrus (Araújo et al., 2001). The E. coli strains DH10B (Invitrogen - USA), DH5a-E

(Invitrogen - USA), TOP10 (Invitrogen - USA), and BL21 CodonPlus(DE3)

(Stratagene - Germany) were used for constructing the genomic library of B. pumilus,

direct cloning of the amplified DNA, and expression analyses, respectively. E coli

strains were grown in Luria Bertani (LB) medium otherwise stated.

Genomic library

A genomic shotgun library of B. pumilus CL16 constructed by our group (Lima

et al., 2004) was used. Briefly, total bacterial DNA was extracted using the Wizard

Genomic Purification Kit (Promega - USA) and fragmented by sonication (15 sec,

Ultrasonic Homogenizer CV26, Cole Parmer - USA). Fragments of 2-3 Kb were

cloned in pUC18. Recombinant plasmids were introduced by electroporation (Gene

Pulser II, Bio-Rad - USA) into competent E. coli DH10B cells (Eletromax, Invitrogen -

USA). Standard DNA manipulation techniques were performed according to

Sambrook et al (2001).

Nucleotide probe

Degenerated PCR primers (5’ATRACCTACTgNAARTTRgg3’ and

5’gCRAANCCYAgHTARACggT3’) used for amplifying a ß-glucosidase (bgl) gene

fragment were designed based on conserved amino acid regions amongst ß-

glucosidases reported for Bacillus spp. PCR reaction was prepared as usual, and the

annealing temperature of the amplification cycles was 48ºC. A fragment of 560 bp

was recovered and cloned into pUC18. Nucleotide sequence was determined using

the DYEnamic

ET DYE Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences

- Germany) on MegaBACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech - Germany). The

identity of the insert (a bgl gene fragment) was confirmed using the BLAST tools

(Altschul et al., 1997) by accessing the National Center for Biotechnological

Information (NCBI–http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

Colonies blotting and hybridization

The genomic shotgun library of B. pumilus was screened by hybridization. A

total of 7,000 recombinant clones were blotted onto nylon membranes (Hybond

–N,

0.45 µm Amersham Biosciences - Germany). The membranes were further processed

and hybridized using DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II,

according to manufacturer instructions (Roche - Germany). Pre-hybridization (30 min)

and hybridization (overnight) steps were carried out at 42ºC.

Sequencing the cloned fragment

The sequence of the entire cloned fragment was determined in two steps.

Firstly, using the M13 primers (Amersham Biosciences - Germany) and then with a

set of new primers (F–5´TCCAgAgATTCTTggACAAgT3´, R-

5´CACTTggAACAAATTggTgATg3´and F-5’gCATAAgCACggAATTgAgTC3’)

designed specifically for a bgl internal segment. Nucleotide sequence was

determined using the DYEnamic

ET DYE Terminator Cycle Sequencing Kit

(Amersham Biosciences - Germany) on MegaBACE 1000. The plasmid isolated from

the positive clone was named pMH2.

Computer analysis

Nucleotide and amino acid sequences were analyzed by a variety of computer

programs. GeneRunner v. 3.05 (Hasting Software) was applied for primer design.

ORFFinder (NCBI) was used for find open reading frames. The CD-Search program

(NCBI) was used to reveal the protein domain. Prediction of transmembrane regions

was done by using the TMPred program (Hofmann and Stoffel, 1993). The BLAST

tools (Altschul et al., 1997), used for sequence comparisons were accessed by the

National Center for Biotechnological Information (NCBI). SignalP 3.0 (Bendtsen et al.,

2004) e Protparam (Expasy server – http://br.expasy.org/tools/protparam.html) were

used for some protein analyses. BioEdit v. 5.0.9 (Hall, 1999) was used for global

alignment among amino acid sequences.

Cloning of bgl in expression vector

To construct an expression vector for ß-glucosidase (Bgl) hyper production,

the open reading frame (ORF) of bgl, was amplified by PCR. It was used a pair of

primers denoted MHF (5’CACCATgAACAAgTTAgAAAAAACAT3’ and MHR

(5’TTAgTAATCCAAATgTTCCCCATTTg3’). The PCR condition was 30 cycles of

95°C for 2 min, 95°C for 15 sec, 56°C for 30 sec, and 68°C for 1.5 min. For DNA

polymerization the AccuPrime Pfx enzyme (Invitrogen - USA) was used. The

amplified product was cloned into the pENTR/SD/D-TOPO plasmid producing the

entry vector of the Gateway Cloning System (Invitrogen - USA). From entry vector

the bgl gene was transferred, by in vitro site-specific recombination, to the expression

vector pET-DEST42. The recombinant expression plasmid containing the bgl gene

was named pAB1. The cloned fragment was completely sequenced to confirm that

no mutations were introduced during amplification procedures.

Over-expression of bgl

Transformed E. coli BL21 CodonPlus(DE3) cells harboring the pAB1

expression vector were grown on LB medium supplemented with ampicillin (250 µg

-1

) at 37°C until the log phase (OD

600nm

= 0.2). Then, IPTG (0.5 mmol/l) was added

in order to induce the pAB1 promoter to transcribe the bgl gene, and culture duration

was expanded (3 h at 37°C). After incubation, the bacterial cells were collected by

centrifugation (12,000g, 15 min, 4°C), and the proteins were analyzed by SDS-

PAGE.

SDS-PAGE

Protein concentrations were determined according to Bradford (1976) using

bovine serum albumin (1 µg/mL) as a standard. Proteins were analyzed by sodium

dodecyl sulphate/ polyacrylamide gel (12%) electrophoresis (SDS-PAGE), essentially

as described by Laemmli (1970) and stained with Coomassie blue R-250.

MALDI-TOF mass spectrometry

In order to confirm the protein identity a MALDI-TOF mass spectrometry was

carried out. The 54 kDa band was recovered from the SDS-PAGE gel and twice

incubated for 10 min in 100% acetonitrile (ACN). After complete acetonitrile

evaporation (Speed Vac Plus), the gel piece was immersed in a 250 µg/mL tripsin

solution and incubated (12 h, 32°C). To block tripsin activity and extract the peptides,

the gel piece was rinsed (three times) with ACN (50%) and formic acid (5%). After

peptide sonication (10 min), the sample (one tenth) was cleanup with C-18 Zip Tips

(Millipore) and mixed with 60% ACN and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA). Purified

sample was mixed to a-ciana (CHCA) matrix, and 1 µl aliquot was injected in the

mass spectrometer plate.

Results and discussion

Using degenerated primers for the conserved regions of the bgl genes, a 560

bp fragment of B. pumilus was obtained and successfully cloned in pUC18. The

nucleotide sequence showed high similarity with the bglH gene from B. subtilis

subsp. subtilis strain 168 (E value=1e

-17

). The fragment was successfully used as

probe for screening the bglH gene in a shotgun genomic library constructed from the

CL16 strain of B. pumilus. Only one positive transformant was recovered from 2,400

colonies. The recombinant plasmid isolated from this clone was denoted pMH2. The

presence of the bglH gene was confirmed by sequencing. Two open reading frames

were found to compose the insert: an incomplete ORF of 534 bp (ORF1) and a

complete one with 1,419 bp (ORF2), which present high similarity with the bglP and

bglH genes, respectively, both from B. subtilis subsp. subtilis strain 168 (Kunst et al.,

1997).

The bglP gene from B. subtilis encodes an aryl-beta-glucoside-specific

enzyme II of the phosphoenolpyruvate

sugar: phosphotransferase system (PTS),

whereas the bglH gene product functions as

an aryl-phospho-beta-D-glucosidase (Le

Coq et al., 1995, Setlow et al., 2004). The β-glucoside utilization pathways that rely

upon the PTS for

carbohydrate uptake have been characterized in several bacteria

(Krüger and

Hecker, 1995, Lai et al., 1997, Brown and Thomson, 1998, Brehm et al.,

1999, Marasco

et al., 1998, An et al., 2005), but not in B. pumilus. According to An et

al (2005) the discovery of new PTS-related sequences in bacterial genomes

continues, and suggests that PTSs might have additional unknown functions.

The nucleotide sequence of the entire insert (2,484 bp) and the deduced

protein sequence of the bglH gene from B. pumilus are shown in Figure 1. The ORF1

was upstream from the ORF2, and there is a 24 bp sequence between them.

The absence of a promoter sequence between the ORFs here identified and

their similarity with the operon described for B. subtilis strain 168 (Entrez Gene–NCBI

server) support that they are organized into an operon.

The 1,419-nucleotide-long ORF2 has a GC content of 41.6%. It is preceded by

a potential ribosome binding site (AGGAGG) that is 9 bp upstream from the putative

ATG start codon but, as expected, with no adjacent promoter sequence. Downstream

the TAA stop codon, no sequence resembling a rho-independent transcriptional

terminator could be identified. The protein deduced from the ORF-complete

sequence has 472 amino acid residues with a deduced molecular mass of 53.9 kDa

and a pI of 4,97. The CDSearch program (NCBI server) revealed that the BglH has a

single domain that is constituted by the glycosyl hydrolase family 1 (GH1) sequence,

covering 464 residues from the amino acid 4 up to 468.

The deduced amino acid sequence of B. pumilus BglH was compared to other

BglH sequences deposited at NCBI GenBank (Figure 2). Based on the comparison

the enzyme here studied is similar to that described from several Bacillus species: B.

halodurans (gi 10173219), B. subtilis strain 168 (gi 7435440), B. cereus (gi

52144364), B. thuringiensis (gi 49477027), B. licheniformis (gi 52082495), B. clausii

(gi 56965550). The regions of catalytic acid Glu

175

e the catalityc nucleophile Glu

369

found in the B. pumilus BglH are active sites of the family 1 proteins that hydrolyze

glucosidic bonds by acid/base catalysis (Withers and Aebersold, 1995).

The amino acid sequence of the BglH protein is essentially hydrophilic

(TMPred program). The absence of a signal peptide sequence (SignalP 3.0 program)

suggests that the enzyme is localized intracellularey as mostly of the bacterial ß-

glucosidase (Bhatia et al., 2002 and references therein).

The bglH was sub-cloned into an expression vector using the Gateway

Cloning System (Invitrogen - USA). According to Twerdochlib et al (2003)

explanation, this system allows direct cloning of amplified DNA fragments using site-

specific recombination (att), thus replacing the restriction endonuclease and ligase

steps of regular cloning. The att recombination sites were presents in the

pENTR/SD/D-TOPO allowing the recombination of amplified DNA fragment with the

pET-DEST42 plasmid. The sub-cloned fragment was successfully transferred into the

expression vector pET-DEST42 by site-specific recombination. The plasmid obtained

with the appropriate orientation was denoted pAB1.

After using IPTG to induce the pAB1 promoter, a strong band of 54 kDa was

detected by SDS-PAGE analysis (Figure 3) suggesting the over-expression of the B.

pumilus bglH gene in E. coli. This molecular mass is consistent with the one

predicted from the nucleotide sequence data. The over-expressed protein was

subjected to digestion with trypsin followed by peptide fingerprint analysis by matrix

assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-

TOF/MS). The provided peptide masses were equivalent to the ones predicted,

confirming that the over-expressed 54 KDa-band was in fact the BglH protein of B.

pumilus. The enzyme activity against aryl-phospho-β-D-glucosides was not

measured because unfortunately there is not a commercial supplier for this substrate.

Concluding, this study presents a new gene cloned from the endophyte B.

pumilus. The gene and its amino acid sequence were fully characterized, but further

studies are necessary to evaluate the enzyme properties.

Acknowledgments

We would like to thank Dr. Fábio de Oliveira Pedrosa (GENOPAR Consortium

Coordinator) for provinding us laboratory facilities. This work was partially supported

by CNPq. A. C. Bogas is grateful to CAPES.

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Figure 1. Nucleotide sequence characterization of the ORF bglH found into the

selected fragment from the genomic library of B. pumilus. Start and stop codons and

the ribosome-bounding site (RBS) are underlined.

Figure 2. Multiple alignment of amino acids sequence predicted from bglH gene from

some Bacillus species: B. halodurans (gi 10173210), B. subtilis strain 168 (gi

7435440), B. cereus (gi 52144364), B. thuringiensis (gi 49477027), B. licheniformis

(gi52082495), B. clausii (gi 56965550) and B. pumilus obtained in the present study.

Asterisks shows amino acids conserved in all sequences analyzed. The regions of

catalytic acid Glu

175

and the catalytic nucleophile Glu

369

are boxed.

Figure 3. The BglH protein over-expression in E. coli BL21 CodonPlus(DE3) were

analysed by 12% SDS-PAGE. Proteins were Coomassie blue R-250 stained. Lane 1,

lysate from untransformed cells not induced with IPTG ; Lane 2, lysate from

untransformed cells induced with IPTG; Lane 3, lysate from transformed cells with

pAB1 not induced with IPTG; Lane 4, lysated from transformed cells with pAB1

induced with IPTG. Molecular weight markers (MW) are indicated in KDa. Arrows

indicate the BglH protein.