( PDF ) Caracterização farmacoquímica de Drimys angustifolia Miers

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Aline Witaicenis

Caracterização Farmacoquímica de

Drimys angustifolia Miers.

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biociências da Universidade Estadual

Paulista, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas, Área de Concentração:

Farmacologia

Orientador: Prof. Dr. Luiz Claudio Di Stasi

Botucatu

2006

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Aline Witaicenis

Caracterização Farmacoquímica de

Drimys angustifolia Miers.

Dissertação para obtenção do grau de mestre

Comissão julgadora

Presidente e orientador: Prof. Dr. Luiz Claudio Di Stasi

2º Examinador: Prof(a). Dr(a). Clélia Akiko Hiruma-Lima

3º Examinador: Dr(a). Fabiana Gaspar Gonzalez

4º Examinador: Prof(a). Dr(a) Cláudia Pellizon

5º Examinador: Prof(a). Dr(a) Elfriede M. Bacchi

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Auxílio Financeiro: CAPES

(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)

Dados Curriculares

Aline Witaicenis

Nascimento: 27/03/1980- São Manuel/SP

Filiação: Sebastião Borges Witaicenis

Liliana Tomazini Witaicenis

1999/2003- Curso de Graduação em Licenciatura Plena em Ciências Biológicas

Universidade Estadual Paulista – UNESP- Bauru/SP

“Talvez não tenhamos conseguido fazer o

melhor,

mas lutamos para que o melhor fosse

feito...”.

Não somos o que deveríamos ser, não somos

o que iremos ser, mas graças a Deus não

somos mais o que éramos.”

(Martin Luther King)

Dedicatória

DedicatóriaDedicatória

Dedicatória

Dedico esta conquista as pessoas mais importantes da minha vida:

Sebastião, Liliana, Danilo e Luciano

Sebastião, Liliana, Danilo e LucianoSebastião, Liliana, Danilo e Luciano

Sebastião, Liliana, Danilo e Luciano.

"A possibilidade de realizarmos um sonho é o

que torna nossa vida interessante"

(Paulo Coelho)

Agradecimentos

Deus

DeusDeus

Deus

, por ser minha força interior, meu conselheiro e meu guia, obrigada por fazer de mim

o que sou.

“...seja feita a Vossa vontade...”

A meus pais,

Liliana e Sebastião

Liliana e SebastiãoLiliana e Sebastião

Liliana e Sebastião

, por tudo que me ensinaram durante toda a minha vida,

pelo amor, carinho, paciência, confiança em mim depositada, pelo sacrifício que fizeram para

que eu pudesse chegar até aqui, pois sem eles, nada disso seria possível.

A meu irmão

Danilo

DaniloDanilo

Danilo

, peço desculpas, pelas vezes que não pude estar presente em sua vida,

pelos conselhos não dados, pelas conversar que deixamos de ter, pelos momentos que

deixamos de estar juntos. Obrigada pelo carinho, compreensão e amizade.

"O amor é a força mais abstrata, e também a mais

potente, que há no mundo"

Mahatma Gandhi

Mahatma GandhiMahatma Gandhi

Mahatma Gandhi

Luciano

LucianoLuciano

Luciano

, meu porto seguro, meu motivo de seguir em frente. Obrigada por tudo o que

você representa em minha vida, obrigada pela paciência, compreensão, carinho, amor e

amizade.

“Ser profundamente amado por alguém nos dá força;

Amar alguém profundamente nos dá coragem.”

Lao-Tseu

A meus tios

Fábio

Fábio Fábio

Fábio

Elaine

ElaineElaine

Elaine

por estarem sempre presentes em minha vida, obrigada pelo

carinho e amizade.

Ana

AnaAna

Ana

que com seu jeitinho discreto, sempre tem uma palavra amiga e está sempre torcendo

por mim. Obrigada por tudo.

Erika

ErikaErika

Erika

, pela amizade que construímos, por toda ajuda nos experimentos e por me

“contagiar” com seu amor pelo cerrado.

Leonardo

LeonardoLeonardo

Leonardo

por tudo que me ensinou, por toda ajuda que me deu, e pela amizade que se

segue.

Carol, Déborah, Patrícia, Silvia, e Thays

Carol, Déborah, Patrícia, Silvia, e ThaysCarol, Déborah, Patrícia, Silvia, e Thays

Carol, Déborah, Patrícia, Silvia, e Thays

pela ajuda quando precisei, Obrigada pelo

apoio, pelo carinho e pela amizade que espero que dure para sempre.

"Cada amigo novo que ganhamos na vida, nos

aperfeiçoa e enriquece, não pelo que nos dá, mas pelo

quanto descobrimos de nós mesmos. Ser amigo não é

coisa de um dia.... são gestos, palavras, sentimentos

que se solidificam no tempo e não apagam jamais."

Professora Noeli

Professora NoeliProfessora Noeli

Professora Noeli

por me auxiliar nos experimentos, por discutir os resultados comigo e

pelos valiosos ensinamentos.

Professora Clélia

Professora CléliaProfessora Clélia

Professora Clélia

que sempre esteve pronta para ajudar, obrigada pelas dicas, pelos

livros e pela amizade.

Aos

funcionários do departamento de farmacologia,

Aninha, Paulão, Cris, Luiz e

Aninha, Paulão, Cris, Luiz e Aninha, Paulão, Cris, Luiz e

Aninha, Paulão, Cris, Luiz e

Janete

Janete Janete

Janete

obrigada pelos serviços prestados e pela amizade.

Glória

GlóriaGlória

Glória

por passar a fazer parte da minha vida no momento em que eu mais precisava,

obrigada pelos valiosos conselhos.

Regina

ReginaRegina

Regina

Ingrid

IngridIngrid

Ingrid

, obrigada pelas caronas e pelas palavras de apoio.

Enfim, a todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para que esse trabalho

pudesse ser realizado e eu pudesse concluir mais essa etapa da minha vida.

"Se eu pudesse deixar algum presente à

vocês, deixaria aceso o sentimento de amor à vida

dos seres humanos. A consciência de aprender

tudo o que nos foi ensinado pelo tempo afora.

Lembraria os erros que foram cometidos, como

sinais para que não mais se repetissem. A

capacidade de escolher novos rumos. Deixaria

para vocês, se pudesse, o respeito àquilo que é

indispensável: além do pão, o trabalho e a ação.

E, quando tudo mais faltasse, para vocês eu

deixaria, se pudesse, um segredo. O de buscar no

interior de si mesmo, a resposta para encontrar a

saída."

Mahatma Ghandi

Luiz Claudio Di Stasi

Luiz Claudio Di StasiLuiz Claudio Di Stasi

Luiz Claudio Di Stasi

Por tudo que me ensinou durante este período de convivência, obrigada pela confiança em

mim depositada, pela paciência, e pela amizade. À você meu eterno agradecimento.

“Se não der frutos, valeu a beleza das flores;

Se não der flores, valeu a sombra das folhas;

Se não der folhas, valeu a intenção da semente.”

Henfil

Sumário

Lista de Figuras.................................................................................................13

Lista de tabelas..................................................................................................15

1. Introdução....................................................................................................17

2. Materiais e Métodos....................................................................................24

2.1 Material Vegetal.......................................................................................................24

1.Descrição botânica.......................................................................................24

2. Fotos do material vegetal............................................................................25

3. Preparação dos extratos..............................................................................26

4. Extração da clorofila..................................................................................26

2.2. Perfil fitoquímico dos Extratos...........................................................................27

1. Análise fitoquímica qualitativa...............................................................27

A) Prospecção de constituintes do extrato hidroalcoólico..................27

a) Teste para Fenóis e Taninos.........................................................28

b) Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonóides..............28

c) Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas.........28

d)Teste para Flavonóis, Flavononas, Flavananóis e Xantonas..........29

e)Teste para confirmação de catequinas............................................29

f) Teste para esteróides e triterpenóides (Liberman-Burchard).........29

g) Teste para Saponinas.....................................................................30

h) Teste para confirmação de Saponina.............................................30

i) Ácidos Fixos Fortes........................................................................30

j) Teste para Alcalóide.......................................................................31

k) Teste para Bases Quaternárias.......................................................31

B) Prospecção dos constituintes ácidos e neutros após hidrólise.....32

a) Teste para Ácidos Fixos Fortes....................................................32

b) Separação dos Ácidos Fracos e Fenóis........................................32

c) Teste para Quinonas........................................................................33

d) Teste para cumarinas.......................................................................33

2. Determinação do Perfil Cromatográfico dos extratos.............................34

2.3. Avaliação das atividades farmacológicas dos extratos.....................................35

1. Animais.........................................................................................................35

2. Atividade antiulcerogênica.........................................................................35

2.1. Lesão gástrica induzida por etanol absoluto e etanol/HCl 0.3M...36

2.2. Lesão gástrica induzida por etanol absoluto em animais pré-

tratados com L-NAME...............................................................37

2.3. Lesão gástrica induzida por piroxicam.........................................37

3. Atividade Analgésica.................................................................................38

3.1. Teste das Contorções Abdominais................................................38

3.2. Teste de Imersão da Cauda...........................................................39

3.3. Modelo da placa quente................................................................39

4. Atividade antiinflamatória.......................................................................40

5. Atividade Antioxidante.............................................................................40

6. Estudo da toxicidade aguda......................................................................42

7. Análise Estatística......................................................................................42

Resultados......................................................................................................44

1. Rendimento dos extratos.......................................................................................44

2. Perfil Fitoquímico..................................................................................................44

3. Resultados das Atividades Farmacológicas.........................................................45

1. Atividade antiulcerogênica..........................................................................45

2. Atividade analgésica e antiinflamatória......................................................46

3. Atividade Antioxidante...............................................................................47

4. Estudo da toxicidade aguda.........................................................................47

4. Discussão.......................................................................................................65

5. Conclusão......................................................................................................74

6. Referências....................................................................................................75

7. Anexos............................................................................................................87

Lista de Figuras

Figura 1: Fotos do material vegetal........................................................................................25

Figura 2: Análise Cromatográfica de Caule de Drimys angustifolia......................................49

Figura 3: Análise Cromatográfica de Folhas de Drimys angustifolia....................................50

Figura 4: Análise cromatográfica de caules e folhas de Drimys angustifolia em comparação

com padrões de sesquiterpenos................................................................................................51

Figura 5: Avaliação do extrato etanólico de caules de Drimys angustifolia, no modelo de

lesão gástrica induzida por Etanol absoluto..............................................................................52

Figura 6: Avaliação do extrato etanólico das folhas de Drimys angustifolia, no modelo de

lesão gástrica induzida por Etanol absoluto..............................................................................53

Figura 7: Avaliação do extrato etanólico de caules de Drimys angustifolia, no modelo de

lesão gástrica induzida por Etanol/HCl 0,3M...........................................................................54

Figura 8: Avaliação do extrato etanólico de folhas de Drimys angustifolia, no modelo de

lesão gástrica induzida por Etanol/HCl 0,3M...........................................................................55

Figura 9: Avaliação dos extratos etanólicos de caules e folhas de Drimys angustifolia, no

modelo de úlcera induzida por etanol absoluto em camundongos pré-tratados com L-

NAME.......................................................................................................................................56

Figura 10: Avaliação do efeito do extrato etanólico do caule de Drimys angustifolia, no

modelo de lesão gástrica induzida por piroxicam.....................................................................57

Figura 11: Avaliação do efeito do extrato etanólico de folhas de Drimys angustifolia, no

modelo de lesão gástrica induzida por piroxicam.....................................................................58

Figura 12: Avaliação dos extratos etanólicos de caules e folhas de Drimys angustifolia no

modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético....................................................59

Figura 13: Efeito do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, no teste de

imersão da cauda.......................................................................................................................60

Figura 14: Efeito do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, no modelo

da placa quente.........................................................................................................................60

Figura 15: Efeito do tratamento com o extrato etanólico de caules e folhas de Drimys

angustifolia, no modelo de edema de pata de rato induzido por carragenina..........................61

Figura 16: Avaliação da atividade antioxidante dos extratos de caules e folhas de Drimys

angustifolia no modelo de peroxidação lipídica.......................................................................62

Lista de Tabelas

Tabela 1: Identificação dos constituintes químicos ...............................................................28

Tabela 2: Identificação dos constituintes químicos ...............................................................29

Tabela 3: Rendimentos dos extratos.......................................................................................44

Tabela 4: Análise fitoquímica dos extratos...................................... .....................................48

Tabela 5: Avaliação do peso dos órgãos no estudo da toxicidade aguda do extrato de caule de

Drimys angustifolia.................................................................................................................63

Tabela 6: Avaliação do peso dos órgãos no estudo da toxicidade aguda do extrato de caule de

Drimys angustifolia.................................................................................................................64

Tabela 7: Parâmetros observados no screening hipocrático e escores atribuídos ao grupo

controle....................................................................................................................................87

Resumo

A espécie Drimys angustifolia Miers. (Winteraceae) foi selecionada com base em dados

etnofarmacológicos e quimiotaxonômicos, visto que espécies deste gênero são usadas no

tratamento de problemas estomacais, diarréia, febre, úlcera e dor e possuem comprovada

atividade antiinflamatória, analgésica e antialérgica determinada em diferentes modelos

experimentais. Considerando-se a ausência de estudos que garantam o uso seguro desta

espécie, o presente trabalho visa determinar a eficácia, segurança e a qualidade da matéria-

prima vegetal de Drimys angustifolia. Para tal, foram realizados estudos fitoquímicos e

cromatográficos, estudos farmacológicos de atividade analgésica, antiulcerogênica,

antiinflamatória e antioxidante e de toxicidade aguda de extratos etanólicos de caules e folhas,

livres de clorofila. Na análise fitoquímica, ambos os extratos apresentaram reação positiva

para flavonóides, heterosídeo saponínico, triterpenóides glicosilados, ácidos fixos fortes,

glicosídeo cianogênico, quinonas, taninos, agliconas esteróides, enquanto fenóis, catequinas,

triterpenos e leucoantocianidinas foram somente detectados no extrato de caule, e esteróides e

triterpenóides livres foram detectados apenas no extrato de folhas. Quanto as atividades

farmacológicas, ambos extratos promoveram redução significativa na área total de lesão

ulcerativa induzida por etanol absoluto, a partir da menor dose testada (125mg/Kg), com

proteção de 73,56% para o extrato de folhas e de 58,04% para o extrato de caule. No modelo

de úlcera induzida por etanol/HCl 0.3M, a redução da área total de lesão ulcerativa em relação

ao grupo controle, foi observada a partir da dose de 250mg/kg, onde a porcentagem de

inibição foi de 81,42% para o extrato de folhas e de 76,50% para o extrato de caule. Doses

maiores testadas (250, 500 e 1000 mg/Kg) de ambos os extratos, reduziram de forma dose-

dependente a área de lesão, em ambos os modelos, porém, os extratos foram inativos no

modelo de lesão gástrica induzida por piroxicam. Os extratos apresentaram importante

atividade antioxidante no modelo de inibição da lipoperoxidação induzida por ácido ascórbico

e ferro em membranas isoladas de hepatócitos. Ambos extratos não apresentaram atividade

analgésica na dose de 500mg/Kg, nos modelos de contorção abdominal e placa quente, sendo

que no teste de imersão da cauda, somente o extrato de folhas apresentou atividade após 240

minutos da administração. Nenhum dos extratos, na dose de 500mg/Kg, apresentou atividade

antiinflamatória no modelo de edema de pata induzido por carragenina. A atividade

antiulcerogênica dos extratos pode ser devida aos flavonóides presentes em caules e folhas

bem como na atividade antioxidante deste composto, além do envolvimento dos extratos com

o óxido nítrico, observado no modelo de lesão gástrica induzida por etanol absoluto em

camundongos pré-tratados com L-NAME. No estudo da toxicidade foram observadas mortes

de poucos animais, insuficientes para se calcular a DL

e leves alterações comportamentais e

clínicas como perda do equilíbrio e exoftalmia apenas com o tratamento com altas doses,

3500 e 5250mg/Kg. Este estudo demonstra que caules e folhas de Drimys angustifolia

representam uma fonte de produtos com atividade antiulcerogênica e antioxidante, os quais

podem ser úteis na padronização de fitoterápicos seguros ou como base para a prospecção de

novos compostos ativos.

Palavras chaves: Drimys, Winteraceae, úlcera, antioxidante, antiinflamatória, analgésica,

toxicidade aguda, fitoquímica.

Abstract

AbstractAbstract

Abstract

The species Drimys angustifolia Miers, (Winteraceae) was selected on the basis of

etnopharmacological and chemotaxonomical criteria, since the species of this gender is used

in the treatment of gastric disturbs, diarrhoea, fever, ulcer and pain and the fact that the

Drimys winteri species has antiinflammatory, antiallergic and analgesic activities determined

in different experimental models. Considering that the species is used popularly without

studies to assure its effectiveness and safety of use, the objective of the present study was to

evaluate the activity of Drimys angustifolia in experimental models of ulcer, pain and

inflammation, antioxidant activity as well as to verify its acute toxicity and its qualitative

phytochemical profile. The ethanolic extracts of stems and leaves of Drimys angustifolia were

used for the phytochemical and pharmacological tests. In the phytochemical studies both

extracts presented positive reactions for flavonoids, saponins, triterpenoids, fixed acids,

cyanogenic glycosides, quinones, tannins and steroidal aglycones, and showed negative

reaction for anthocyanins, glycosilated steroids, quaternary bases, alkaloids and coumarins.

Phenols, catequins, triterpenoids and leucoanthocyanidines only had been detected in extract

of stem, while free triterpenoids and steroids were detected only in extract of leaves. In the

pharmacological activities, both extracts reduced the area of gastric lesions in the absolute

ethanol-induced damage in the minor tested dose (125mg/Kg), with protection of 73,56% for

the extract of leaves and 58,04% for the extract of stems. In the model of ethanol/HCl-induced

gastric lesions, the reduction of the total area of lesion in comparison to the control group

were observed since the dose of 250mg/Kg, to whom the percentages of inhibition were

81,42% and 76,50% for the leaves extract and stems extract respectively. Both extracts

reduced in a dose-dependent manner the total gastric lesion areas with doses of 250, 500 and

1000mg/Kg in both models. The involvement of nitric oxide on gastric protection was

determined in the model of absolute ethanol induced gastric lesions in animals pre-treated

with the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME. The extracts did not show any activity in

piroxican-induced gastric lesions. The in vitro tests performed for antioxidant activity

evaluation showed that both extracts of D. angustifolia present a concentration-dependent

inhibition on hepatocytes membrane lipid peroxidation. The ethanolic extract of leaves from

D. angustifolia in a dose of 500mg/Kg increased the time of reaction of animals only in the

tail-flick test after 240 minutes of treatment, with no significant activity in the “hot plate” and

“writhing” tests. The extract of stems did not show any analgesic activity in either pain

models used. Both extracts, in tested doses, did not present activity in carrageenan-induced

paw edema. Toxic effects were observed in oral administration of tested extracts at doses up

to 1750mg/Kg and some deaths were observed at doses up to 3500mg/Kg with stems extract.

These data could be related to the presence of cianogenic glycosides particularly higher in the

stems of the plant. This study showed the antiulcerogenic activity of the extracts of stems and

leaves of Drimys angustifolia, with involvement of nitric oxide. This activity might be related

to the presence of flavonoids in the extracts and their antioxidant activity. This data suggests a

higher safety for the leaves than the stems extract. Furthermore, our data indicate the need for

new studies for elucidation of the antiulcerogenic mechanism of action, as well as the

isolation and purification of the active compounds present in the extracts.

Key words: Drimys, Winteraceae, ulcer, antioxidant, antiinflamatory, analgesic, Acute

toxicity, phytochemistry.

Introdução

1. Introdução

A utilização de plantas para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das

formas mais antigas de prática medicinal da humanidade. De acordo com a Organização

Mundial de Saúde (OMS) aproximadamente 80% da população mundial faz uso

principalmente das plantas medicinais como forma de acesso aos cuidados básicos de saúde

(Farnsworth, et al., 1985).

As espécies vegetais apresentam um importante papel na cultura dos povos, sendo

empregadas com diferentes finalidades tais como fonte de alimentos, materiais para

vestuários, habitação, utilidades domésticas, utensílios para manifestações artísticas, culturais

e religiosas e como meio restaurador da saúde. Sua importância pode ser medida não apenas

pela variedade de usos, mas também pela intensidade de sua utilização. Atualmente, as

espécies vegetais representam uma das alternativas entre as diversas fontes de insumos

necessários à existência da sociedade (Schenkel, et al., 2004).

As informações sobre o uso de plantas medicinais e suas virtudes terapêuticas

foram sendo acumuladas durante séculos, e muito desse conhecimento empírico se encontra

disponível atualmente. De domínio público, o conhecimento sobre as plantas medicinais

representou e representa o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos

(Di Stasi, 1996).

As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais

contribuem para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais, pelos efeitos medicinais

que produzem, sendo que esta cultura desperta o interesse dos pesquisadores na realização de

estudos para ampliar os conhecimentos sobre as plantas medicinais (Maciel, et al., 2002).

Tendo em vista a obtenção de melhores resultados, com maior rapidez e

credibilidade, a pesquisa com plantas medicinais necessita de um caráter multi e

Introdução

interdisciplinar, que requer mais que a simples associação de dados, mas também a elaboração

e conseqüente desenvolvimento conjunto das pesquisas, conduzidas por um grande

envolvimento entre os diversos profissionais que compõem esse universo. Essa interação

exige além das críticas e sugestões, uma intermitente participação conjunta dos pesquisadores

das mais variadas áreas, tendo em vista, a padronização de uma via mais promissora para a

execução da pesquisa (Di Stasi, 1996).

É característica fundamental da pesquisa com plantas medicinais a realização de

estudos que incluam os conhecimentos da medicina tradicional e popular (etnofarmacologia e

etnobotânica); a seleção de plantas principalmente por etnofarmacolgia e quimiotaxonomia, a

avaliação farmacológica preliminar de extratos vegetais, a bioprospecção de compostos

ativos, investigação farmacológica e toxicológica, estudos de mecanismos de ação, as

transformações químicas de princípios ativos, estudos de relação estrutura/atividade e a

operação de formulações para a produção de fitoterápicos. A integração destas áreas na

pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho promissor e eficaz para descoberta de

novos medicamentos (Maciel, et al., 2002).

Devido aos custos da pesquisa envolvendo plantas medicinais, tanto considerando

a obtenção de novas moléculas ativas como de fitoterápicos padronizados, a seleção da

espécie a ser investigada é um dos pontos críticos já que uma seleção inadequada de espécies

pode levar ao desperdício de tempo e de recursos (Brito, 1996).

Quando se procura obter substâncias ativas de plantas, um dos principais aspectos

que deve ser observado consiste nas informações da medicina popular. Dados da literatura

revelam que é muito mais provável encontrar atividade biológica em plantas orientadas pelo

uso popular do que em plantas escolhidas ao acaso, sendo que outros aspectos importantes são

as informações químico-taxonômicas (Cechinel Filho & Yunes, 1998a). Apesar das

limitações, vale salientar a importância da quimiotaxonomia na área farmacêutica. Esse

Introdução

conhecimento, aliado à etnofarmacologia, tem permitido a descoberta de novos fármacos de

origem natural, que têm sido utilizados sem alterações estruturais ou como modelo para a

síntese de novas substâncias (von Poser & Mentz, 2004).

Das diversas formas disponíveis para obtenção de novos fármacos tais como

síntese, semi-síntese, planejamento racional de fármacos e bioprospecção de produtos

naturais, é evidente que espécies vegetais de valor medicinal representam uma inquestionável

fonte de novos produtos ativos, especialmente quando se considera a potencialidade e alta

diversidade da flora brasileira, tais como: a Mata Atlântica, o Cerrado e Amazônia, onde um

grande número de espécies vegetais são usadas como medicinais e poucas são estudadas

quanto suas potencialidades farmacológicas. Deve-se salientar que as espécies vegetais podem

ser usadas no desenvolvimento tanto de novos medicamentos farmacoterápicos (constituintes

vegetais quimicamente definidos, isolados e purificados) como de fitoterápicos padronizados

(extratos vegetais e/ou frações com eficácia, segurança e controle de qualidade definidos).

A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que vem crescendo

notavelmente nestes últimos anos, tanto que o mercado mundial de fitoterápicos gira em torno

de aproximadamente 22 bilhões de dólares (Yunes, et al., 2001). Este crescimento está

também associado aos avanços científicos envolvendo os estudos químicos e farmacológicos

de plantas medicinais voltados à obtenção de novos compostos com propriedades terapêuticas

(Cechinel Filho & Yunes, 1998a).

A incorporação de fitoterápicos nos sistemas básicos de saúde requer a

padronização local de produção e uso, determinação precisa da eficácia e toxicidade, além do

desenvolvimento de métodos de controle de qualidade (Jaroszewski, 1984). A eficácia é dada

pela comprovação, através de ensaios farmacológicos pré-clínicos e clínicos, enquanto que a

segurança é determinada pela ausência de efeitos tóxicos. Ambas características do

fitoterápico devem ser definidas para cada produto, pois dependem de diversos fatores, como

Introdução

a metodologia de obtenção dos extratos, a formulação e a forma farmacêutica do produto final

(Farias, 2004), sobre os quais métodos fitoquímicos e cromatográficos devem ser usados para

a análise e o controle da qualidade da matéria-prima vegetal.

A transformação de uma planta em medicamento deve visar a preservação da

integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica

e a segurança de utilização, de forma que a produção de fitoterápicos requer necessariamente

estudos prévios relativos a aspectos botânicos, agronômicos, químicos, farmacológicos e

toxicológicos (Petrovick et al., 1997).

Os novos paradigmas de desenvolvimento social e econômico, baseados nos

recursos renováveis, endossam a afirmação de que as necessidades de uso de plantas

medicinais encontram-se longe de estarem esgotadas, sendo claro que novos conhecimentos e

novas necessidades certamente encontrarão soluções no reino vegetal, através de descobertas

e desenvolvimento de novas moléculas com atividade terapêutica, ou com aplicações na

tecnologia farmacêutica ou no desenvolvimento de fitoterápicos com maior eficiência de ação

(Schenkel, et al., 2004).

Com base no exposto, é clara a necessidade de estudos voltados para obtenção de

novos produtos de interesse terapêutico, seja de novos fármacos ou de fitoterápicos

padronizados, para o tratamento de diversas doenças, dentre as quais podemos destacar as

doenças que afetam o trato gastrintestinal. Os distúrbios do trato gastrintestinal são

considerados doenças dos tempos modernos, onde a vida atribulada e estressante juntamente

com os vícios cada vez mais comuns, tais como fumo, álcool, má alimentação e sedentarismo

são responsáveis pelo desenvolvimento de inúmeras patologias, dentre as quais se destaca por

sua morbidade, as úlceras gástricas e ou duodenais (Lam, et al., 1995).

As úlceras são lesões da mucosa gástrica e ou duodenal provocadas por um

desequilíbrio entre fatores protetores (muco, bicarbonato, fluxo sanguíneo adequado) e lesivos

Introdução

(pepsina, ácido clorídrico), que podem ser agravados pelo estresse, consumo de álcool,

tabagismo, uso de drogas antiinflamatórias não-esteroidais (DAINs), a presença da

Helicobacter pylori no trato gastrintestinal, além de carcinomas que propiciam um aumento

da massa celular parietal e conseqüentemente aumento da secreção ácida (Taylor & Blaser,

1991). Estudos epidemiológicos indicam que a prevalência de úlceras pépticas na população

geral é de aproximadamente 5 a 10%, com variações regionais, sendo que o pico de incidência

das lesões gástricas ocorre em pacientes entre 40-60 anos (Schlesinger, et.al., 1992; Way,

1994). No Brasil, não existem números oficiais, mas segundo dados do Departamento de

Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, calcula-se que

10% da população tem, tiveram ou terão ulcera péptica (Eisig & Laudanna, 2001). Esta

doença traz tremendos custos à sociedade (Jensen, 1984) e torna a vida do paciente

extremamente difícil, podendo ser letal em alguns casos (Mcintosh et al., 1991; Petersen et al.,

1995).

Para o tratamento das úlceras são utilizadas drogas com diferentes mecanismos de

ação, como por exemplo, antagonistas dos receptores histamínicos H

(cimetidina), inibidores

da bomba de prótons (omeprazol), antiácidos (hidróxido de magnésio, ou de alumínio),

antibióticos no caso da presença de H. pylori, sendo que o tratamento eficaz para esta doença

é de alto custo e inacessível para grande parte da população brasileira. Apesar das drogas

disponíveis para o tratamento de distúrbios gastrintestinais serem eficazes, diversas delas

apresentam efeitos indesejáveis, especialmente quando há necessidade de uso constante.

A idéia primordial na pesquisa de fitoterápicos para uso na medicina humana, não

é substituir medicamentos registrados e já comercializados, mas sim aumentar a opção

terapêutica dos profissionais de saúde ofertando medicamentos equivalentes, também

registrados, talvez de menor custo, com espectros de ação mais adequados e com indicações

terapêuticas complementares às medicações existentes (Lapa, et al., 2004).

Introdução

A realização de pesquisas com espécies medicinais nativas do Brasil,

especialmente com o objetivo de investigar a potencialidade de apresentar atividade

preventiva ou curativa em patologias do trato gastrintestinal, as quais estão entre as mais

prevalentes em nosso país, é de grande importância, visto que pode apontar para novas

estratégias terapêuticas complementares e contribuir com o estudo e reconhecimento das

potencialidades de nossa flora, tão abundante e pouco estudada.

Considerando-se estes aspectos e tendo como base dados etnofarmacológicos e

farmacológicos de espécies vegetais úteis para o tratamento de doenças do trato

gastrintestinal, verificou-se que o gênero Drimys, representa uma alternativa potencial de

estudo, visto que espécies deste gênero são usadas no tratamento de problemas estomacais, da

diarréia (Vieira, et al., 2000; Grandi, et al., 1989; Corrêa, 1978), como estimulante,

antiescorbútica, tônica e em certas afecções do trato digestivo (Trinta, et al., 1997), no

tratamento da febre, úlcera, dor, afecções do trato respiratório e câncer (Houghton & Manby,

1985).

Em adição aos dados etnofarmacológicos, estudos mostram que a espécie Drimys

winteri possui comprovada atividade antiinflamatória e antialérgica determinada em

diferentes modelos experimentais, agindo como potente inibidor do edema de pata de rato

induzido por carragenina, prostaglandina E

, bradicinina e substância P (Tratsks et al., 1997),

reduzindo edema de orelha induzido por ácido aracdônico, capsaicina e o óleo de cróton

(Cunha et al., 2001) e como antagonista da contração causada por prostaglandina E

capsaicina e bradicinina em traquéia de cobaia (El Sayah et al.,1997). Além de possuir

atividade analgésica, nos modelos de dor induzida por formalina, e no modelo de contorção

abdominal induzida por diversos agentes irritantes, em camundongos (Mendes, et al., 1998).

Portanto, levando-se em consideração os dados etnofarmacológicos do gênero

Drimys, assim como os aspectos quimiotaxonômicos que sugerem que plantas do mesmo

Introdução

gênero ou família botânica, provavelmente possuem as mesmas rotas biossintéticas de

compostos secundários; bem como, a ausência de estudos farmacológicos e fitoquímicos para

a espécie Drimys angustifolia Miers, (Winteraceae), a mesma foi selecionada visando a

caracterização de suas propriedades farmacoquímicas.

Neste contexto, os objetivos do presente estudo foram:

Avaliar a atividade de Drimys angustifolia Miers. em modelos experimentais de

úlcera, dor e inflamação, bem como verificar sua toxicidade aguda e determinar

qualitativamente através da fitoquímica as principais classes de compostos presentes na

espécie;

Avaliar se caules e folhas possuem as mesmas classes de compostos secundários e as

mesmas atividades farmacológicas;

Verificar se Drimys angustifolia possui as propriedades farmacológicas descritas para

a espécie Drimys winteri e se representa uma nova fonte de produtos de interesse terapêutico.

Materiais e Métodos

2. Materiais e Métodos

2.1 Material Vegetal

1. Descrição Botânica

Drimys angustifolia Miers, (Winteraceae), sinônimo de Drimys winteri fo. angustifolia

(Miers) Eichler e Drimys brasiliensis var. angustifolia (Miers) A.C.Sm. (Smith, 1943) é uma das

espécies medicinais conhecida popularmente como casca d’anta, casca de anta ou cataia.

Drimys é o único gênero da família Winteraceae encontrado na América do Sul, ocorrendo

no Brasil desde a Bahia até o Rio Grande do Sul, tanto na Floresta Ombrófila Mista como nas

Florestas Estacional Semidecidual e Ombrófila Densa (Abreu, et al.; 2005).

A espécie Drimys angustifolia possui hábito arbóreo (3-5m), com folhas pecioladas, com

as lâminas estreitamente elípticas, levemente discolores, com face inferior acinzentada (opaca),

inflorescência curto-pedunculada com 5 flores brancas; na região de Botucatu-SP, floresce de

julho à novembro (Trinta, et al., 1997).

Materiais e Métodos

2. Fotos do Material Vegetal

Figura 1: Fotos do material vegetal.

Árvore de Drimys angustifolia

(www.habitats.org.uk/gardenflora/drimys.htm)

, B. Escanerata do ramo florido (tamanho original), C.

Disposição dos botões florais (aumento 2X), D. Flor (aumento de 3X), E.

Folhas (tamanho

original), (Banco de imagens, Lafit-Botu-2004).

Materiais e Métodos

3. Preparação dos extratos

O material vegetal utilizado na preparação dos extratos foi coletado no início do mês de

agosto de 2004, no Instituto Florestal de Botucatu (Floresta de Botucatu) – SP, e identificado pelo

Dr. Jasper José Zanco (especialista em Winteraceae), Herbário Laélia Purpurata no município de

Tubarão-SC, da Universidade do Sul de Santa Catarina, onde a espécie foi depositada sob o

número 356.

As folhas frescas e a parte mais externa do caule foram separados e desidratados à

temperatura de 50ºC/72h em estufa com circulação e renovação forçada de ar. Após secagem, o

material vegetal foi triturado em moinho de facas Marconi

, modelo 580.

Folhas e caules secos pulverizados, cujo rendimento foi de 39,7% e 36% em relação ao

material vegetal fresco, respectivamente; foram submetidos à extração por maceração a frio em

etanol absoluto (500g de planta para 1,5L de etanol), com filtrações a cada 48h, sendo esse

procedimento repetido durante quatro vezes. Após o final da filtração em pano e em papel de

filtro sob vácuo, o produto resultante foi concentrado em rotavapor (40ºC, pressão reduzida) até

10% do volume para a extração da clorofila, resultando em 300ml de extrato de folhas e 220ml de

extrato de caule.

4. Extração da clorofila

Ao extrato concentrado até 10% do volume total de filtrado, em constante agitação, foi

adicionado água destilada (40% do volume final concentrado), por gotejamento (razão de

4.0ml/min), para facilitar a precipitação das clorofilas. Após esta etapa, o extrato foi mantido em

agitação por 1 hora, seguido de resfriamento a 4

C/2 horas e filtração em celite para retirar os

resíduos de clorofila, segundo metodologia descrita por Ferri (1996). Os extratos restantes, livres

Materiais e Métodos

de clorofila, concentrados até remoção de todo o solvente, foram usados nos ensaios biológicos,

resultando em 250ml de extrato de folhas e 62ml de extrato de caule.

Para que a dose a ser administrada aos animais pudesse ser calculada, foi realizada a

determinação da concentração de sólidos dos extratos, que foi de 420mg/ml para o extrato de

folhas e de 450mg/ml para o extrato de caules.

2.2. Perfil Fitoquímico dos extratos

1. Análise fitoquímica qualitativa

O perfil fitoquímico de caules e folhas de Drimys angustifolia foi realizado conforme

metodologia descrita por Matos (1988) e adaptada por Gonzalez & Di Stasi (2002), visando à

detecção de fenóis, taninos, antocianinas, flavonóides, leucoantocianinas, xantonas, esteróides

triterpenóides, heterosídeo saponínico, ácidos fixos fortes, bases quaternárias, alcalóides,

glicosídeo cianogênico, quinonas, cumarinas e agliconas flavonóides.

Os extratos analisados foram preparados com etanol 70%, por maceração a frio, com três

filtrações, e foram concentrados até 50% do volume (±300ml cada). Metade desse volume foi

separado para realização da hidrólise ácida e a outra metade foi utilizada para realização dos testes

descritos a seguir.

A) Prospecção de constituintes dos extratos hidroalcoólicos

Foram separados e numerados 7 tubos de ensaio com 3ml de extrato cada para realização

dos seguintes testes:

Materiais e Métodos

a) Teste para Fenóis e Taninos

Ao tubo 1 foram adicionadas 3 gotas de FeCl

(cloreto férrico), e após agitação o resultado

foi analisado, seguindo os seguintes parâmetros: coloração variável entre azul e o vermelho indica

presença de fenóis; precipitado escuro de tonalidade azul indica a presença de taninos pirrogálicos

(tanino hidrolisáveis); e precipitado verde indica a presença de taninos flobatênicos.

b) Teste para Antocianinas, Antocianidinas e Flavonóides

Ao tubo 2 foi adicionado HCl 3N, até obtenção de pH 3; o tubo 3 foi alcalinizado com

NaOH 0,2%, até pH 8,5 e o tubo 4 alcalinizado com NaOH 1N até pH 11. A análise dos

resultados foi feita seguindo a tabela a seguir:

Cor do meio

Constituintes

pH ácido (3) pH alcalino (8,5) pH Alcalino (11)

Antocianinas e Antocianidinas

Vermelha Lilás Azul-púrpura

Flavonas, Flavonóis e Xantonas

--- --- Amarela

Chalconas e Auronas

Vermelha --- Vermelha púrpura

Flavananóis

--- --- Vermelha laranja

Tabela 1: Identificação dos constituintes químicos.

c) Teste para Leucoantocianidinas, Catequinas e Flavononas

O extrato do tubo 5 foi acidificado com HCl até pH 3 e o do tubo 6 alcalinizado com

NaOH até pH 11. Os tubos foram aquecidos com auxílio de uma lâmpada de álcool, durante 3

minutos e a mudança de cor foi analisada seguindo a tabela a seguir:

Materiais e Métodos

Cor do meio

Constituintes

pH ácido pH alcalino

Leucoantocianidinas

Vermelha ---

Catequinas

Pardo-amarelada ---

Flavanonas

--- Vermelha laranja

Tabela 2: Identificação dos constituintes químicos

d) Teste para Flavonóis, Flavononas, Flavananóis e Xantonas

Ao tubo 7 foi adicionado 0,5ml de HCl concentrado e uma fita de magnésio granulado.

Após o término da reação, indicada pelo fim da efervescência, a mudança de cor foi comparada

com o extrato do tubo 5 do teste anterior.

O aparecimento ou intensificação de cor vermelha no palito é indicativo da presença de

flavonóides e xantonas.

e) Teste para confirmação de catequinas

Um palito de madeira foi umedecido com o extrato em teste e aquecido para evaporação

do solvente, depois o palito foi umedecido com HCl concentrado e aquecido novamente.

A presença de cor vermelha ou parda-avermelhada neste teste indica a presença de

catequinas.

f) Teste para esteróides e triterpenóides (Liberman-Burchard)

Foram adicionados 10ml do extrato hidroalcoólico em um béquer que foi seco em banho-

maria, até a exaustão. O conteúdo resultante foi raspado, dissolvido em 3ml de clorofórmio e

Materiais e Métodos

filtrado. À solução filtrada foram adicionados 1ml de anidrido acético e 3 gotas de ácido sulfúrico,

após agitação, o resultado foi analisado.

Neste teste a coloração azul evanescente seguida de verde permanente indica a presença de

esteróides livres; e a coloração entre o pardo e o vermelho indica a presença de triterpenóides

pentacíclicos livres.

g) Teste para Saponinas

O resíduo do béquer que não dissolveu no clorofórmio no teste anterior (f), foi dissolvido

em água destilada. Após agitação vigorosa verificou-se a presença de espuma persistente e

abundante, o que caracteriza a presença de saponina.

h) Teste para confirmação de Saponina

Ao tubo do teste anterior acrescentou-se 2ml de HCl concentrado. Esse tubo foi deixado

durante 1h em banho-maria. Depois de esfriar, o conteúdo foi neutralizado e agitado novamente.

A presença de precipitado confirma a presença de saponinas.

i) Ácidos Fixos Fortes

10ml do extrato em teste foram secos em banho-maria, até completa secagem. A

substância restante no fundo do béquer foi dissolvida com 0,5ml de etanol. À esta solução foi

adicionado 1ml de NH

OH concentrado, e o conteúdo foi aquecido e filtrado. O béquer foi então

levado ao banho-maria para evaporação da amônia, após isso o conteúdo seco no fundo do béquer

foi levado para estufa à 100ºC por 10 minutos, e então foi redissolvido em água e filtrado para

Materiais e Métodos

eliminação dos resíduos. O líquido foi dividido em 2 vidros de penicilina, e uma fitinha de papel

de filtro umedecido com reagente de Nesler foi presa na tampa, para evitando contato direto com

a solução, em um dos vidros foi adicionado NaOH N.

A coloração marrom no papel de filtro do frasco que contém NaOH indica presença de

ácidos fixos fortes.

j) Teste para Alcalóide

O extrato hidroalcoólico foi acidificado com HCl concentrado até pH 1, aquecido por 5

minutos; depois foi alcalinizado com NH

OH concentrado, até pH 11. Essa solução alcalina foi

colocada em funil de separação, onde foram adicionados 20ml de solução éter:clorofórmio (3:1).

A fase etérea foi levada para o ar comprimido para que o éter fosse retirado, esta solução foi

filtrada e separada em 3 tubos, aos quais foram adicionados os seguintes reagentes: Dragendorff

(tubo1), reagente de Mayer (tubo2) e reagente de Hanger (tubo3). A presença de precipitado em

pelo menos 2 tubos indica a presença de alcalóides.

k) Teste para Bases Quaternárias

A fase aquosa do teste acima (j), foi utilizada para detecção de bases quaternárias. A

solução foi acidificada, filtrada e separada em 3 tubos aos quais acrescentou-se Dragendorff

(tubo1), reagente de Mayer (tubo2) e reagente de Hanger (tubo3). A presença de precipitado

floculoso indica a presença de bases quaternárias.

Materiais e Métodos

B) Prospecção dos constituintes ácidos e neutros após hidrólise

Hidrólise do extrato hidroalcoólico

À metade do extrato separada no início do processo foi adicionado HCl concentrado, até

obtenção de uma solução, aproximadamente, 6M. Essa solução foi aquecida sob refluxo durante

3h, e adquiriu coloração vinho. Após esfriar, foram adicionados 40ml de éter, o qual permaneceu

em contato com a solução durante 24h, e depois mais duas porções sucessivas de 30 e 20ml de

éter foram adicionados, sob forte e cuidadosa agitação em funil de separação. A solução aquosa

ácida foi desprezada e à solução etérea foi adicionado Na

anidro para retirar o excesso de

água; nessa solução contendo os compostos ácidos e neutros foram realizados os seguintes testes:

a) Teste para Ácidos Fixos Fortes

Para extrair os ácidos fixos fortes da solução etérea foram adicionadas 3 porções

sucessivas (30, 20,10ml) de NaHCO

2,5%. A solução etérea foi reservada e a solução alcalina foi

utilizada neste teste. Essa solução foi acidificada até um pH entre 2 e 3 e os ácidos foram

reextraídos com três porções sucessivas de 10, 6 e 3ml de éter, onde cada fase estava visivelmente

separada. A solução aquosa ácida foi desprezada e na solução etérea foram realizados os mesmos

procedimentos para detecção de ácidos fixos fortes do extrato não hidrolisado.

b) Separação dos Ácidos Fracos e Fenóis

A solução etérea reservada no teste acima foi utilizada para separação dos ácidos fracos e

fenóis, à esta solução foram adicionadas 3 porções sucessivas (30, 20, 10ml) de NaOH 2%. A

Materiais e Métodos

solução etérea foi reservada, pois é a solução que contém os constituintes neutros. A solução

aquosa alcalina foi então acidulada com HCl concentrado até pH entre 3 e 4 e os ácidos fracos e

fenóis foram extraídos em 3 porções sucessivas de 15, 10 e 5ml de éter. A fase aquosa ácida foi

desprezada e na porção etérea foi adicionado Na

anidro, para retirar o excesso de água da

fase orgânica, que contém os ácidos fracos e fenóis, essa solução foi filtrada e nela foram

realizados os testes para quinonas e cumarinas.

Uma parte da solução etérea obtida na separação dos ácidos fracos e fenóis foi separada e

concentrada até a secura, o resido seco foi redissolvido com 12 ml de etanol, a solução foi filtrada

e utilizada para o teste das cumarinas e os testes para fenóis e taninos; antocianinas,

antocianidinas, e flavonóides; leucoantocianidinas, catequinas e flavonas e teste para flavonóis,

flavononas, flavononóis e xantonas, testes estes procedidos da mesma maneira do que para o

extrato não hidrolisado.

c) Teste para Quinonas

Foram separados 5ml da solução etérea, e a esta porção foram adicionados 2ml de NH

(6N), o tubo foi agitado para separação da solução em duas fases. A cor vermelha na camada

aquosa indica a presença de quinonas.

d) Teste para cumarinas

A solução alcoólica, obtida na separação dos ácidos fracos e fenóis, foi colocada em papel

de filtro não fluorescente, com o auxilio de um capilar, formando duas manchas de 1,5cm de

diâmetro cada, sobre uma das manchas foi adicionada uma gota de solução alcoólica de KOH N.

Com o auxílio de um cartão opaco, metade de cada mancha foi coberta e o papel de filtro foi

Materiais e Métodos

exposto a luz U.V. por cerca de 3 minutos. Ainda sob luz U.V., o cartão foi retirado e foi

verificada a ocorrência de diferença de coloração entre a parte coberta e não coberta.

O desenvolvimento de fluorescência azulada, forte, bem visível na metade não encoberta

da mancha alcalinizada, indica a presença de cumarina.

2. Determinação do Perfil Cromatográfico dos extratos

O perfil cromatográfico dos extratos vegetais foi determinado de acordo com a técnica

clássica de cromatografia de camada delgada (Lopes, 1990; Wagner & Bladt, 1995; Ferri, 1996).

Placas cromatográficas, 5X20cm e 0,25mm de espessura foram preparadas utilizando-se o

espalhamento de sílica gel (SiO

) 60FG como fase estacionária. Após a preparação, as

cromatoplacas foram ativadas em estufa a 100ºC/1hora. A fase móvel foi selecionada utilizando-

se alguns solventes com base na série eluotrópica de solventes ordenados por polaridade (Lopes,

1990), sendo selecionadas as misturas de hexano/ acetato de etila (7:3) e de tolueno/ acetato de

etila (97:3).

As amostras dos extratos foram aplicadas nas placas com auxílio de tubos capilares, 2cm

acima da borda inferior da placa, com 1,5cm de distância entre os pontos de aplicação. As

cromatoplacas foram desenvolvidas de forma unidimensional ascendentes, no interior de cubas de

desenvolvimento. Após a secagem das cromatoplacas, a visualização dos cromatogramas foi

executada utilizando-se como reveladores anisaldeído sulfúrico ou vanilina sulfúrica, ambos

indicados para detecção de sesquiterpenos (compostos descritos como os responsáveis pela

atividade analgésica e antiinflamatória de Drimys winteri, (Cechinel filho, et al., 1997; El Sayah,

et al., 1997; Malheiros, et al., 2001). Foram utilizados três padrões de sesquiterpeno, a crotonina,

a transdesidrocrotonina e o transcariofileno. Foram preparados para análise comparativa, um

extrato metanólico, a partir do qual foi realizada partição com diclorometano, seguindo

Materiais e Métodos

metodologia de isolamento do sesquiterpeno de D. winteri descrita por Cequinel Filho, et al.,

(1998b).

Os extratos utilizados nos ensaios biológicos foram comparados com extratos etanólicos

de folhas ou de caules frescos, com os extratos antes da extração da clorofila e com os resíduos de

clorofila, para verificar a ocorrência de perdas durante os processos de secagem, extração e

extração da clorofila.

2.3.

Avaliação das atividades farmacológicas dos extratos

1. Animais

Camundongos albinos Swiss, machos (25-40g) foram utilizados nos ensaios de avaliação

das atividades antiulcerogênica, analgésica e no estudo da toxicidade aguda, sendo que neste

último, foram utilizadas também fêmeas. Ratos Wistar machos (180-230g) foram utilizados no

modelo de edema de pata, para avaliação da atividade antiinflamatória.

Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura de 22ºC ± 2ºC, 60-70%

umidade, com ciclos de 12h de claro e 12h de escuro. Os animais foram provenientes do biotério

central da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu - São Paulo.

Todos os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação

Animal (CEEA) do Instituto de Biociências da UNESP – Botucatu.

2. Atividade antiulcerogênica

A atividade antiulcerogênica dos extratos de folhas e caules foi avaliada em três modelos

diferentes: modelo de lesão gástrica induzida por etanol absoluto (Hayden et al., 1978; Soldato et

Materiais e Métodos

al., 1985), modelo de lesão gástrica induzida por etanol/HCl 0.3M (Mizui e Doteuchi, 1983) e

modelo de lesão gástrica induzida por antiinflamatório não-esteroidal (piroxicam) (Puscas et al.,

1997), seguindo algumas modificações, conforme descrito abaixo. Como drogas de referência

foram utilizadas carbenoxolona (250mg/Kg, v.o.), nos modelos de lesão gástrica induzida por

etanol absoluto e etanol/HCl e cimetidina (100mg/Kg, v.o.) no modelo de lesão gástrica induzida

por piroxicam, água destilada, substância usada para solubilizar os extratos, foi utilizada como

controle negativo em todos os modelos utilizados. Foram testadas as doses de 125, 250, 500 e

1000mg/Kg de ambos os extratos. Após cada experimento os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical, os estômagos foram retirados e abertos pela grande curvatura, prensados

em placas de vidro, escaneados em Scanner Jet HP, as lesões foram coloridas no programa adobe

photoshop e mensuradas no Programa Assess (Image analysis software for Plant disease

quantification). Os resultados foram expressos em área total de lesão ulcerativa (mm

) e área

relativa de lesão em relação à área total do estômago, expressa em arcosseno da porcentagem de

lesão.

2.1. Lesão gástrica induzida por etanol absoluto e etanol/HCl 0.3M.

Foram utilizados nestes experimentos, animais em jejum prévio de 24h com água ad

libitum, armazenados em caixa com fundo de tela de arame, sem maravalha, para evitar

coprofagia. Depois de 1h da administração dos extratos os animais receberam etanol absoluto

(4ml/Kg, v.o.) ou etanol/HCl 0.3M (7ml/Kg) e 1h após administração do agente indutor, os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical.

Materiais e Métodos

2.2. Lesão gástrica induzida por etanol absoluto em animais pré-tratados com

L- NAME

Este modelo foi realizado de acordo metodologia descrita por Arrieta et al. (2003),

seguindo algumas modificações. Os animais em jejum prévio de 24h, foram pré-tratados com um

inibidor da enzima NO sintetase, N

- nitro-L-arginina metilester (L-NAME, 70mg/Kg) ou salina

i.p., 30 minutos antes de receberem água destilada, carbenoxolona (250mg/kg) ou os extratos de

caules ou folhas de D. angustifolia (500mg/Kg), essa dose foi determinada com base nos

resultados da curva dose-resposta realizada nos modelos de etanol absoluto e etanol/HCl, sendo

esta, a dose intermediária entre as doses efetivas testadas. Após 1h, todos os animais receberam

etanol absoluto (4ml/Kg, v.o.) para indução da lesão da mucosa gástrica. Os animais foram

sacrificados 1h após a administração do agente indutor, por deslocamento cervical, os estômagos

foram removidos e a área de lesão ulcerativa foi determinada seguindo a metodologia descrita

anteriormente.

2.3. Lesão gástrica induzida por piroxicam

este modelo de lesão gástrica induzida por analgésico antiinflamatório não-esteroidal,

foram utilizados, animais em jejum prévio de 24h e água ad libitum, armazenados em caixa com

fundo de tela de arame, sem maravalha, para evitar coprofagia. Depois de 1h da administração dos

extratos os animais receberam piroxicam (30mg/Kg, s.c.) e 6h após administração do agente

indutor, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, conforme descrito por Puscas et

al., 1997, seguindo algumas modificações.

Materiais e Métodos

3. Atividade Analgésica

Os estudos da atividade analgésica dos extratos etanólicos de folhas e caules de Drimys

angustifolia foram realizados com a dose de 500mg/kg, administrada por via oral (gavagem). Esta

dose foi selecionada com base nos estudos de Drimys winteri, cuja atividade analgésica foi

detectada, entre as doses de 400 e 600mg/Kg do extrato hidroalcoólico das cascas do caule

(Mendes, et al., 1998).

Para determinação desta atividade foram utilizados os modelos experimentais de contorção

abdominal, teste de imersão da cauda (Tail-flick) e modelo da placa quente, descritos abaixo.

3.1. Teste das Contorções Abdominais

Este modelo analisa a capacidade de uma droga, extrato ou fração em inibir a dor induzida

pela administração intraperitoneal de um agente irritante. Neste modelo experimental, o processo

doloroso se caracteriza por síndrome que inclui contorções abdominais seguida de torções do

corpo e estiramento dos membros, principalmente posteriores (Vacher et al., 1964).

A contorção abdominal foi induzida pela administração de ácido acético 0,6%, 10ml/Kg,

i.p. (Koster et al., 1959) aos 30, 60, 90, 120 e 240 minutos após administração do extrato. Os

animais foram mantidos em gaiolas individuais, e o número de contorções abdominais foi contado

durante 20 minutos. Aspirina foi utilizada como droga de referência e água destilada como

controle negativo. Um animal de cada grupo experimental foi observado simultaneamente.

Materiais e Métodos

3.2. Teste de Imersão da Cauda

Esse teste baseia-se na análise da reação ao estímulo doloroso de origem térmica causado

pela imersão de 1/3 da cauda do animal em água aquecida a 51±1º C, onde a reação ao estímulo

térmico nocivo é caracterizada pelo comportamento de retirada da cauda (Jansen et al., 1963). O

tempo de reação de cada animal foi determinado antes dos tratamentos. Foram selecionados os

animais com tempo de reação entre 5 e 15 segundos. A reação dos animais ao estímulo térmico

nocivo foi avaliada aos 30, 60, 90, 120 e 240 minutos após administração, por v.o, dos extratos na

dose de 500mg/kg; foram utilizados água destilada como controle negativo e ácido acetilsalicílico

(300mg/Kg, v.o.) como controle positivo. A latência máxima permitida foi de 180 segundos.

3.3. Modelo da placa quente

Esse teste é usado para avaliar a resposta de latência do animal em placa metálica aquecida

a 56±1ºC e o tempo de reação é registrado, até o momento que o animal apresente o

comportamento de lamber a pata ou pular

(

Eddy & Leimback, 1953). Um cilindro de alumínio

com 24cm de diâmetro, imerso em banho-maria foi utilizado neste teste. Os animais foram

selecionados antes do tratamento, sendo utilizados no experimento, somente os animais que

reagiram entre 5 e 12 segundos. Morfina (10mg/Kg, s.c.) foi usada como droga de referência, e

água destilada como grupo controle. A reação dos animais ao estimulo térmico nocivo foi

analisada aos 30, 60, 90, 120 e 240 minutos após o tratamento com um dos extratos, morfina ou

água destilada. A latência máxima permitida foi de 30 segundos.

Materiais e Métodos

4. Atividade antiinflamatória

A atividade antiinflamatória foi avaliada de acordo com método de inflamação induzida

por carragenina, descrito por Winter, et al., (1962). Neste experimento foram utilizados ratos

Wistar machos, sem jejum prévio, submetidos a processo anestésico com éter, para administração

intraplantar de 0,1ml de carragenina (300µg/pata) na pata direita posterior do animal, e o mesmo

volume de solução salina 0,9%, foi administrado na pata esquerda posterior para uso como padrão

de comparação (controle). Os animais foram pré-tratados por via oral, com os extratos, 1h antes

da administração da carragenina. Aos 60, 120 e 240 minutos, após administração da carragenina

foram analisados, o edema promovido pelo agente inflamatório e a intensidade de hiperalgesia

mecânica.

O edema foi medido utilizando-se um paquímetro, segundo metodologia descrita por

Fracasso et al. (1996). O valor do aumento da pata foi expresso em volume (ml) de edema da pata

direita. A intensidade de hiperalgesia mecânica foi quantificada utilizando-se o aparelho Basile

Analgesymeter

, o qual exerce uma força mecânica que aumenta linearmente, de acordo com o

método descrito por Randall & Sellito (1957). O limiar nociceptivo foi definido como a força em

gramas aplicada à pata do animal até o momento em que este exibisse o reflexo de retirada. O

limiar de hiperalgesia mecânica foi determinado pelo valor registrado no aparelho, multiplicado

por dez, onde os dados foram expressos em grama/força do limiar nociceptivo da pata direita do

animal.

5. Atividade Antioxidante

A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelo modelo de inibição da

lipoperoxidação induzida por ácido ascórbico e ferro em membranas isoladas de hepatócitos, de

acordo com metodologia descrita por Galvez, et al. (1995). As amostras prontas foram diluídas na

Materiais e Métodos

proporção de 1ml da solução de membrana para 9 ml de tampão glicina 50mM, pH de 10,5 com

MgCl

a 0,5mM. O experimento foi realizado utilizando-se 2 tubos brancos, 2 tubos controles, 1

tubo controle máximo e 8 diferentes concentrações de cada extrato, sendo essas de 2.0, 1.0, 0.5,

0.25, 0.125, 0.625, 0.3125 e 0.15625µg/ml. Quercetina foi utilizada como droga de referência nas

concentrações de 100, 50, 25 e 125µM, porém para o cálculo da IC

(concentração inibitória de

50% da lipoperoxidação) foram consideradas as concentrações finais nos tubos de reação em

µg/ml. Em cada tubo foram adicionados 1ml da solução de membranas, 50 µl de cada substância

teste e 50 µl da solução de ferro (SO

FeH

O)/ ácido ascórbico 28mM, exceto nos tubos brancos e

um dos controles. Após agitação manual, os tubos foram colocados em banho-maria a 37ºC por

45 minutos sob agitação constante. Os tubos foram retirados do banho-maria e 0.5 µl de reativo

Tiobarbitúrico foram adicionados em todas as amostras. Os tubos foram novamente agitados

manualmente e colocados em banho-maria a 100ºC durante 15 minutos, sem agitação. 1ml de

cada amostra foi retirado e transferido para eppendorffs, os quais foram centrifugados a 2500rpm

por 15 minutos a 4ºC. Das amostras retiradas da centrífuga, retirou-se 200 µl do sobrenadante que

foram aplicados poços da placa microtiter, sendo cada amostra, feita em duplicata. A placa foi

lida no espectrofotômetro a 532nm, além da IC

(concentração inibitória de 50% da

lipoperoxidação), a porcentagem de inibição da liberação de malonildialdeído (MDA) de cada

amostra, foi calculada, em relação ao valor do controle máximo utilizado no teste, valor o qual foi

considerado 100%.

Os reativos utilizados neste modelo foram preparados da seguinte forma:

Solução de Ferro e Ácido ascórbico a 28nM:

Foram utilizados 77,8mg de sulfato de ferro (Peso molecular: 278,02) em 10 ml de água;

48,3mg de ácido ascórbico dissolvidos em 10 ml de água; as soluções foram misturadas, agitadas

e abrigadas da luz. A partir dessas soluções foram preparadas as demais concentrações para fazer

a curva-padrão de lipoperoxidação do tecido usado no teste, e para garantir a validade do método.

Materiais e Métodos

A partir dessa solução mãe de concentração 140 µM, foram realizadas as diluições para as

concentrações de 120, 100, 80, 60, 40, 20 e 10 µM.

Reativo Tiobarbitúrico 0,5% (Sigma T-5500) em Ácido tricloroacético 20%

Para cada 5g de tiobarbitúrico foram adicionados 1000ml de ácido tricloroacético 20%

(água destilada), esse reativo foi armazenado ao abrigo da luz e mantido sob agitação até o

momento de sua utilização.

6. Estudo da toxicidade aguda

Foram realizados testes de toxicidade aguda e screening hipocrático em camundongos

albinos swiss, machos e fêmeas, para verificação de morte e sintomas provocados pela

administração oral dos extratos brutos de folhas e caules de Drimys angustifolia nas doses de

1750, 3500 e 5250mg/Kg. Foram utilizados 5 animais por grupo experimental, sendo água

destilada administrada ao grupo controle. Vários parâmetros comportamentais foram avaliados de

acordo com metodologia descrita por Malone e Robichaud (1962) e Irwin (1968). Os animais

foram avaliados aos 0.5, 1, 2, 4, 24 e 48 horas após administração dos extratos. Após a última

avaliação, os animais foram sacrificados e os órgãos como fígado, baço, rins, pulmão e coração

foram retirados, pesados e analisados macroscopicamente.

7. Análise Estatística

Os valores foram expressos em média e erro padrão da média (E.P.M.). Os modelos de

analgesia, úlcera e o peso dos órgãos no estudo da toxicidade aguda foram analisados

estatisticamente por ANOVA com teste posterior de Dunnett. Os resultados dos experimentos da

atividade antiinflamatória e lesão gástrica induzida por etanol absoluto nos animais pré-tratados

Materiais e Métodos

com L-NAME, foram analisados estatisticamente pelo teste “t” de Student. Foram consideradas

significantes diferenças para p<0,05.

Resultados

3. Resultados

1. Rendimento dos Extratos

Os rendimentos dos extratos etanólicos de caules e folhas de Drimys angustifolia seguem

na tabela abaixo:

Material vegetal

Material Fresco

Material Seco

[ ] total Extrato

Rendimento Material

Fresco Seco

Folha

1259,4g 500g 105,0g 8,33% 21%

Caule

1388,8g 500g 27,9g 2,00% 5,58%

Tabela 3: Rendimentos dos extratos

2. Perfil Fitoquímico

2.1. Análise fitoquímica quantitativa

Ambos os extratos apresentaram reação positiva para flavonóides, heterosídeo saponínico,

triterpenóides glicosilados, ácidos fixos fortes, glicosídeo cianogênico, quinonas, taninos,

agliconas esteróides, e apresentaram reação negativa para antocianinas, esteróides glicosilados,

bases quaternárias, alcalóides e cumarinas.

Fenóis, catequinas, triterpenos e leucoantocianidinas foram somente detectados no extrato

de caule, enquanto esteróides e triterpenóides livres foram detectados apenas no extrato de folhas.

2.2. Perfil Cromatográfico

Os cromatogramas (Figuras 2 e 3) dos extratos de caules e folhas demonstram que os

processos de secagem e extração não alteraram a composição qualitativa do material vegetal

Resultados

fresco, e indicam também, que em ambos os extratos, a marcha de extração de clorofila foi pouco

eficaz, visto que outros constituintes vegetais foram retirados por este processo.

Na comparação dos extratos utilizados nos ensaios biológicos com os padrões de

sesquiterpenos (Figura 4), não foram detectadas manchas com coloração, forma ou intensidade

que fossem semelhantes, aos padrões e as amostras dos extratos testados nos ensaios biológicos.

3. Resultados das Atividades Farmacológicas

1. Atividade antiulcerogênica

A redução significativa na área total de lesão ulcerativa induzida por etanol absoluto foi

observada a partir da menor dose testada (125mg/Kg), com proteção de 73,56% para o extrato de

folhas e de 58,04% para o extrato de caule. Doses de 250, 500 e 1000 mg/Kg de ambos os

extratos, reduziram de forma dose-dependente a área de lesão (Figuras 5 e 6).

No modelo de úlcera induzida por etanol/HCl 0.3M, a redução da área total de lesão

ulcerativa em relação ao grupo controle, foi observada a partir da dose de 250mg/kg, onde a

porcentagem de inibição foi de 81,42% para o extrato de folhas e de 76,50% para o extrato de

caule. A partir desta dose, ambos os extratos inibiram de forma dose-dependente as lesões

induzidas por etanol/HCl (Figuras 7 e 8).

1.2. Lesão gástrica induzida por etanol absoluto em animais pré-tratados com L-

NAME

O pré-tratamento dos animais com L-NAME no modelo de lesão gástrica induzida por

etanol absoluto, promoveu uma significante redução na proteção promovida pelos extratos de

caules e folhas.

Resultados

A porcentagem de inibição da área relativa de lesão ulcerativa diminuiu de 73,90% para

41,95% (extrato de caule) e de 67,08% para 34,51% (extrato de folhas) nos animais pré-tratados

com inibidor da enzima NO sintetase (Figura 9).

1.3. Lesão gástrica induzida por piroxicam

Os resultados obtidos no modelo de lesão gástrica induzida por piroxicam demonstraram

um aumento na área de lesão ulcerativa na dose de 1000mg/Kg de ambos os extratos testados.

Esse aumento foi de 256,96% para o extrato de folhas e de 190,74% para o extrato de caule, na

área total de lesão ulcerativa, porém, nas demais doses testadas os extratos foram inativos

(Figuras 10 e 11).

2. Atividade analgésica e antiinflamatória

O extrato etanólico de folhas de D. angustifolia na dose de 500mg/kg aumentou o tempo

de reação dos animais no teste de imersão da cauda, apenas após 240 minutos da administração,

sendo inativo nos intervalos de 30, 60, 90 e 120 minutos (Figura 13). O mesmo extrato não

apresentou nenhum efeito significativo nos outros modelos de analgesia. O tratamento com 500

mg/kg de extrato etanólico de caule foi inativo em todos os modelos de analgesia estudados, não

sendo capaz de reduzir o número de contorções abdominais (Figura 12) ou aumentar o limiar de

dor ao estímulo térmico nocivo na cauda e pata (Figuras 13 e 14).

No modelo de edema de pata induzido por carragenina (Figura 15), ambos extratos, na

dose testada (500mg/Kg), não promoveram diferenças estatisticamente significativas entre o

grupo controle e os grupos tratados com os extratos.

Resultados

3. Atividade Antioxidante

Os extratos de D. angustifolia apresentaram atividade antioxidante no modelo de inibição

da lipoperoxidação induzida por ferro e ácido ascórbico em membranas isoladas de hepatócitos,

onde a IC

foi de 11,61±0,97µg/ml para o extrato etanólico de caule, e de 19,06±0,30µg/ml para

o extrato etanólico de folhas. No mesmo teste, a quercetina, flavonóide antioxidante usado como

referência, apresentou uma IC

de 4,57±0,51µg/ml. Na figura 16, os resultados estão

representados em porcentagem de inibição de MDA.

4. Estudo da toxicidade aguda

A DL

de ambos os extratos não foi determinada devido a insuficiência de mortes

promovidas pelos extratos nas diferentes doses testadas. Mesmo assim, foi detectada morte de

uma fêmea na dose de 3500mg/Kg e três fêmeas e um macho na dose de 5250mg/Kg, nos animais

tratados com o extrato de caules de D. angustifolia. Com este extrato, também ocorreu diminuição

estatisticamente significativa no peso de fígado e baço das fêmeas tratadas com essas mesmas

doses (Tabela 6).

A administração oral do extrato de folhas não promoveu a morte de nenhum animal

(Tabela 5), porém ocorreu redução significante, no peso do baço nas doses de 3500mg/Kg

(fêmeas) e 5250mg/Kg (machos).

Quanto aos sintomas produzidos pelos extratos foi possível observar perda do equilíbrio na

dose de 5250mg/Kg nas quatro primeiras horas de observação, com os dois extratos, em ambos os

sexos. Os animais tratados com o extrato de folhas apresentaram exoftalmia, nas três doses, após

quatro horas da administração.

Todos os resultados podem ser observados nas figuras e tabelas a seguir.

Resultados

Análise Fitoquímica

Tabela 4: Análise fitoquímica dos extratos etanólicos brutos sem clorofila de caules e folhas de

Drimys angustifolia:

Extrato vegetal Teste para: COMPOSTOS CAULE FOLHA

Fenóis Detectado Não detectado

1. Fenóis e Taninos

Taninos Não detectado Não detectado

Antocianinas Não detectado Não detectado

2. Antocianinas e

Flavonóides

Flavonóides Detectado Detectado

Leucoantocianidinas Detectado Não detectado

Catequinas Detectado Não detectado

3. Catequinas,

Leucoantocianidinas

e Flavonóides

Flavonóides Não detectado Não detectado

Flavonóides Detectado Detectado

Xantonas Detectado Detectado

4. Flavonóides e

Xantonas

Triterpenos Detectado Não detectado

5. Catequinas

Catequinas Detectado Detectado

Triterpenóides Detectado Não detectado

6. Esteróides

triterpenóides

Esteróides livres Não detectado Detectado

7. Saponinas

Heterosídeo saponínico Detectado Detectado

Esteróides glicosilados Não detectado Não detectado

Triterpenóides

glicosilados

Detectado Detectado

8. Confirmação

saponinas

Triterpenóides forma

livre

Não detectado Detectado

9. Ácidos fixos fortes

Ácidos fixos fortes Detectado Detectado

10. Bases

quaternárias

Bases quaternárias Não detectado Não detectado

11. Alcalóides

Alcalóides Não detectado Não detectado

NÃO-

HIDROLISADO

12. Glicosídeo

cianogênico

Glicosídeo cianogênico Detectado Detectado

13 Quinonas

Quinonas Detectado Detectado

14. Cumarinas

Cumarinas Não detectado Não detectado

Fenóis Não detectado Não detectado

Taninos Detectado Detectado

Antocianinas Não detectado Não detectado

Flavonóides Detectado Detectado

Catequinas Não detectado Não detectado

Flavonóides Detectado Detectado

Leucoantocianidinas Não detectado Não detectado

Flavonóides Detectado Detectado

15 Agliconas

flavonóides

Xantonas Não detectado Não detectado

Esteróides Detectado Detectado

HIDROLISADO

16. Agliconas

esteróides e

triterpenóides

Triterpenos Detectado Não detectado

Resultados

Análise Cromatográfica dos extratos de Caules de

Drimys angustifolia

Eluente

: Hexano:acetato de Etila (7:3)

Revelador: Anisaldeído Sulfúrico

Eluente

: Tolueno:acetato de Etila (93:7)

Revelador: Anisaldeído sulfúrico

Figura 2

: Comparação por cromatografia de camada delgada, dos diferentes extratos de

caules de D. angustifolia, em dois sistema

s de eluentes, revelados com anisaldeído

sulfúrico.

Extrato etanólico de caules frescos

2- Extrato etanólico de caules com clorofila

3- Extrato etanólico de caules livres de clorofila

4- Resíduo de clorofila

Resultados

Análise Cromatográfica dos extratos de Folhas de

Drimys angustifolia

2 3

Eluente

: Hexano:acetato de Etila (7:3)

Revelador: Anisaldeído Sulfúrico

Eluente

: Tolueno:acetato de Etila (93:7)

Revelador: Anisaldeído sulfúrico

Figura 3

: Comparação por cromatografia de camada delgada, dos diferentes extratos de

folhas de D. angustifolia, em dois sistemas de eluentes, revelados com anisaldeído sulfúrico.

Extrato etanólico de Folhas Frescas

2- Extrato etanólico de Folhas, com clorofila

3- Extrato etanólico de Folhas livre de clorofila

4- Resíduo de clorofila

Resultados

Análise cromatográfica dos extratos de caules e folhas

de Drimys angustifolia em comparação com padrões de

sesquiterpenos

CAULE

FOLHA

Crotonina

2- Transdesidrocrotonina

3- Transcariofileno

4- Extrato Diclorometânico

5- Extrato Metanólico

6- Extrato Etanólico sem clorofila

Eluente

: Tolueno:Acetato de Etila (93:7)

Revelador: Vanilina Sulfúrica

Figura 4: Comparação por cromatografia de camada delgada, do

s diferentes extratos de caules

e de folhas de D. angustifolia, com diferentes padrões de sesquiterpenos.

Resultados

Indução de lesão gástrica por etanol absoluto

Extrato etanólico de caule de Drimys angustifolia

Área total de lesão ulcerativa (mm2)

Área relativa de lesão ulcerativa

Figura 5: Avaliação do extrato etanólico de caules de Drimys angustifolia, no modelo de

lesão gástrica induzida por Etanol absoluto. No gráfico estão representadas as médias da área

total e área relativa de lesão ulcerativa e seus respectivos erros padrão, analisados

estatisticamente por ANOVA com teste posterior de Dunnett, onde **p<0.01, os números

entre parênteses representam o número de animais por grupo experimental.

(19)

(10)

(15)

(19)

(10)

(15)

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

Resultados

Indução de lesão gástrica por etanol absoluto

Extrato etanólico de Folhas de Drimys angustifolia

Área de lesão ulcerativa mm

Área relativa de lesão ulcerativa

Figura 6: Avaliação do extrato etanólico das folhas de Drimys angustifolia, no modelo de

lesão gástrica induzida por Etanol absoluto. No gráfico estão representadas as médias da área

total e área relativa de lesão ulcerativa e seus respectivos erros padrão, analisados

estatisticamente por ANOVA, com teste posterior de Dunnett, onde **p<0,01, os números

entre parênteses representam o número de animais por grupo experimental.

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

(18)

(10)

(14)

(18)

(10)

(14)

Resultados

Indução de lesão gástrica por Etanol/HCl 0.3M

Extrato de caule de Drimys angustifolia

Área de lesão ulcerativa em mm2

Área relativa de lesão

Figura 7: Avaliação do extrato etanólico de caules de Drimys angustifolia, no modelo de lesão

gástrica induzida por Etanol/HCl 0,3M. No gráfico estão representadas as médias da área total e

área relativa de lesão ulcerativa e seus respectivos erros padrão, analisados estatisticamente por

ANOVA, com teste posterior de Dunnett, onde *p<0,05 **p<0,01, os números entre parênteses

representam o número de animais por grupo experimental.

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

(20)

(10)

(15)

(20)

(10)

(15)

Resultados

Indução de lesão gástrica por Etanol/HCl 0.3M

Extrato etanólico de folhas de Drimys angustifolia

Área total de lesão ulcerativa mm

Área relativa de lesão ulcerativa

(

Figura 8: Avaliação do extrato etanólico de folhas de Drimys angustifolia, no modelo de lesão

gástrica induzida por Etanol/HCl 0,3M. No gráfico estão representadas as médias da área total e

área relativa de lesão ulcerativa e seus respectivos erros padrão, analisados estatisticamente por

ANOVA com teste posterior de Dunnett, onde *p<0,05 **p<0,01, os números entre parênteses

representam o número de animais por grupo experimental.

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

(18)

(09)

(10)

(15)

(18)

(09)

(10)

(15)

Resultados

Lesão gástrica induzida por etanol absoluto em camundongos pré-

tratados com L-NAME

Área de lesao ulcerativa em mm

(8)

(9)

(8)

(7)

(8)

(9)

Área relativa de lesão ulcerativa

(8)

(9)

(8)

(7)

(8)

(9)

Figura 9: Avaliação dos extratos etanólicos de caules e folhas de Drimys angustifolia, no

modelo de úlcera induzida por etanol absoluto em camundongos pré-tratados com L-NAME,

os resultados estão apresentados em média e E.P.M, da área total e relativa de lesão

ulcerativa, *p<0,05 e **p<0,01 em relação ao controle interno de cada grupo (ANOVA),

+p<0,05 em relação ao grupo correspondente sem L-NAME (t-Student), o número entre

parênteses indica o número de animais por grupo experimental.

Salina

NAME

Salina

NAME

Água destilada

Extrato Caule

Extrato Folhas

Carbenoxolona

Água destilada

Extrato Caule

Extrato Folhas

Carbenoxolona

Resultados

Indução de lesão gástrica por Piroxicam

Extrato etanólico de caule de Drimys angustifolia

Área total de lesão ulcerativa mm

(8) (8)

(8)

(7)

(8)

Área relativa de lesão ulcerativa

(8)

(8) (8)

(8)

(7)

Figura 10: Avaliação do extrato etanólico do caule de Drimys angustifolia, no modelo de lesão

gástrica induzida por piroxicam. No gráfico estão representadas as médias da área total e área

relativa de lesão ulcerativa e seus respectivos erros padrão, analisados estatisticamente pelo

teste ANOVA, seguido do teste de Dunnett, onde *p<0,05 e **p<0.01, os números entre

parênteses representam o número de animais por grupo experimental.

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

Cimetidina

Resultados

Indução de lesão gástrica por Piroxicam

Extrato etanólico de folhas de Drimys angustifolia

Área total de lesão ulcerativa mm

(8)

(7)

(8)

Área relativa de lesão ulcerativa

(8)

(7)

Figura 11: Avaliação do extrato etanólico de folhas de Drimys angustifolia, no modelo de lesão

gástrica induzida por piroxicam. No gráfico estão representadas as médias da área total e área

relativa de lesão ulcerativa e seus respectivos erros padrão, analisados estatisticamente pelo

teste ANOVA, seguido do teste de Dunnett, onde *p<0,05, os números entre parênteses

representam o número de animais por grupo experimental.

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

1000mg/Kg extrato

500mg/Kg extrato

250mg/kg extrato

Água destilada

Carbenoxolona

125mg/Kg extrato

Cimetidina

Resultados

Modelo de Contorção Abdominal

Nº de contorções abdominais

90 120 240

Tempo min.

(7)

(6)

(7)

(8)

(6)

(7)

(8)

(6)

(7)

(8)

(3)

(6)

(5)

Figura 12: Avaliação dos extratos etanólicos de (A) caules e (B) folhas de Drimys

angustifolia no modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético. No gráfico estão

representadas as médias do número de contorções abdominais e os respectivos erros padrão,

analisados estatisticamente por ANOVA com teste posterior de Dunnett, onde *p<0,05 e

**p<0,01, o número entre parênteses indica o número de animais utilizado em cada grupo

experimental.

Nº contorções abdominais

30 60 90 120 240

Tempo

(5)

(4)

(6)

(4)

(5)

(6)

(5)

(6)

Controle

Extrato 500mg/Kg

Aspirina

(A)

(B)

Resultados

Teste de imersão da cauda

-10

-5

Média do tempo reação (seg.)

Controle

Caule

Folhas

Aspirina

30 60 90 120

240

Figura 13: Avaliação do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, no teste

de imersão da cauda. No gráfico estão representados os tempos médios de reação e a linha

vertical representa o E.P.M., analisados estatisticamente por ANOVA com teste posterior de

Dunnett, onde *p<0,05.

Modelo da Placa Quente

-5

Média do tempo de permanência

Controle

Caule

Folha

Morfina

30 60

120 240 Tempo minutos

Figura 14: Avaliação do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, no

modelo da placa quente. Cada ponto representa a média e a linha vertical o E.P.M., analisados

estatisticamente por ANOVA com teste posterior de Dunnett.

n=7

n=6

n=8

n=12

n=10

n= 12

n=11

Resultados

Avaliação da atividade antiinflamatória e de hiperalgesia mecânica

no Modelo de Edema de pata de Rato

Edema Pata Direita (ml)

Controle

Caule

Folha

120

Minutos

100

150

200

250

Limiar de hiperalgesia da pata direita (g/f)

60 120 240

Minutos

Figura 15: Avaliação dos extratos etanólicos de caules e folhas de Drimys angustifolia, no

modelo de edema de pata de rato induzido por carragenina. Os dados estão expressos em

média e E.P.M. (n=6), analisados estatisticamente pelo teste t-Student.

Resultados

Avaliação da atividade antioxidante de Drimys angustifolia

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

15,63 31,25 62,5 125 250 500 1000 2000

Concentração

% Inibição

Drimys - Folha

Drimys - Caule

Figura 16: Avaliação da atividade antioxidante dos extratos de caules e folhas de Drimys

angustifolia no modelo de peroxidação lipídica em membranas de fígado de rato. Os

resultados representam a porcentagem de inibição da MDA promovida pelos extratos nas

diferentes concentrações.

Extrato de Folhas

Extrato de Caules

µg/ml

Resultados

mg/Kg Peso corpo Peso Rins R/C Peso Fígado F/C Peso Pulmão P/C Peso Baço B/C Peso Coração

C/C Mortes

Àgua

destilada

34,6±1,96 0,411±0,010

0,011

2,120±0,102

0,061

0,200±0,006

0,005

0,174±0,011

0,005

0,162±0,005

0,004

1750

29±1,0 0,353±0,012

0,012

1,863±0,050

0,064

0,206±0,019

0,007

0,157±0,018

0,005

0,155±0,011

0,005

3500

27,6±1,56 0,317±0,026

0,011

1,636±0,135

0,059

0,181±0,007

0,006

0,090±0,016**

0,003

0,124±0,001

0,004

5250

29±1,34 0,353±0,005

0,012

2,046±0,146

0,070

0,183±0,020

0,006

0,126±0,020

0,004

0,139±0,002

0,004

mg/Kg Peso corpo

Peso Rins R/C Peso Fígado F/C Peso Pulmão

P/C Peso Baço B/C Peso Coração C/C Mortes

Àgua

destilada

40±0,92 0,580±0,020

0,014

2,927±0,15

0,073

0,257±0,009

0,006

0,207±0,0296

0,005

0,217±0,0139

0,005 00

1750

40,4±2,50 0,608±0,045

0,015

2,798±0,11

0,069

0,226±0,023

0,005

0,167±0,0185

0,004

0,224±0,0156

0,005 00

3500

38,2±3,05 0,569±0,069

0,014

2,583±0,47

0,067

0,251±0,023

0,006

0,151±0,0223

0,003

0,217±0,0199

0,005 00

5250

37±0,894 0,531±0,017

0,014

1,993±0,29**

0,053

0,218±0,008

0,005

0,107±0,0189*

0,002

0,185±0,015

0,005 01

FÊMEAS

Teste da Toxicidade Aguda de Drimys angustifolia

Extrato de Caule

MACHOS

Tabela 5: Avaliação do extrato de caules de D. angustifolia

, no estudo da toxicidade aguda, os resultados estão expressos em média e E.P.M., do peso

dos animais e dos referidos órgãos em gramas, (n=5), analisados estatisticamente por ANOVA com teste posterior de Dunnett, (**p>0,01 e *p>0,05).

Resultados

Teste da Toxicidade Aguda de Drimys angustifolia

Extrato das Folhas

FÊMEAS

mg/Kg Peso corpo

Peso Rins R/C Peso Fígado F/C Peso Pulmão P/C Peso Baço B/C Peso Coração

C/C

Mortes

Àgua

destilada

31,8±1,497

0,367±0,012

0,011

1,781±0,055

0,056

0,193±0,0105

0,006

0,148±0,015

0,004

0,144±0,002

0,004

1750

28,4±2,482

0,368±0,047

0,012

1,898±0,229

0,066

0,251±0,0572

0,008

0,126±0,023

0,004

0,146±0,009

0,005

3500

35±1,924 0,429±0,0473

0,012

2,218±0,132

0,063

0,195±0,008

0,005

0,138±0,004

0,003

0,174±0,009

0,004

5250

32,2±2,396

0,392±0,062

0,012

2,176±0,184

0,067

0,201±0,043

0,006

0,119±0,009

0,003

0,150±0,008

0,004

MACHOS

mg/Kg Peso corpo

Peso Rins R/C Peso Fígado F/C Peso Pulmão

P/C Peso Baço B/C

Peso Coração C/C Mortes

Àgua

destilada

37,6±1,50

0,367±0,012

0,009

1,781±0,055

0,047

0,193±0,010

0,005

0,180±0,010

0,004

0,144±0,002

0,003

1750

35,8±2,47

0,368±0,021

0,010

1,898±0,229

0,053

0,251±0,057

0,007

0,139±0,011

0,003

0,146±0,009

0,004

3500

37,0±2,00

0,429±0,026

0,011

2,218±0,132

0,059

0,195±0,008

0,005

0,155±0,032

0,004

0,174±0,009

0,004

5250

38,8±1,98

0,392±0,027

0,010

2,176±0,184

0,056

0,201±0,019

0,005

0,107±0,009*

0,002

0,15±0,008

0,003

Tabela 6: Avaliação do extrato de folhas de D. angustifolia

, no estudo da toxicidade aguda, os resultados estão expressos em média e E.P.M., do

peso dos animais e dos referidos órgãos em gramas, (n=5), analisados estatisticamente por ANOVA com tes

te posterior de Dunnett, (**p>0,01 e

*p>0,05).

Discussão

4. Discussão

Os resultados obtidos nos modelos de analgesia (contorção abdominal, teste de

imersão da cauda e modelo da placa quente) e de inflamação (modelo de edema de pata

induzido por carragenina) demonstram que os extratos etanólicos brutos sem clorofila de

caules e folhas de D. angustifolia não possuem atividades analgésica e antiinflamatória.

Apesar do aumento significativo do tempo de reação dos animais aos 240 minutos após a

administração do extrato de folhas no teste de imersão da cauda, este efeito foi muito discreto

para se atribuir ao extrato a atividade analgésica de interesse para uso.

Estudos realizados com o extrato hidroalcoólico de cascas de D. winteri, espécie

do mesmo gênero, que possui comprovada atividade analgésica e antiinflamatória (Mendes, et

al., 1998; Tratsk, et al., 1997, Cequinel Filho, et al., 1997), sugerem que dois sesquiterpenos,

o poligodial e o drimanial são os responsáveis por estas atividades farmacológicas, (Mendes,

et al., 2000; Mendes, et al., 1998; El Sayah, et al., 1997, Malheiros, et al., 2001; Scheidt, et

al., 2002).

Devido a discrepância entre os dados obtidos neste estudo com aqueles descritos

na literatura, realizamos um estudo fitoquímico específico de ambos extratos testados, tendo-

se em vista avaliar a presença de sesquiterpenos. Nestes estudos, os extratos etanólicos livres

de clorofila de folhas e caules usados nos estudos de atividade biológica não possuem estes

compostos. Essa diferença nos constituintes químicos pode explicar a ausência de tais

atividades para a espécie D. angustifolia, quando se compara estes resultados com os obtidos

com a espécie D. winteri.

A atividade antiulcerogênica dos extratos de caules e folhas de D. angustifolia foi

detectada nos modelos de úlcera induzida por etanol e etanol/HCl. Estes modelos avaliam a

capacidade da droga de proteger a mucosa gástrica (Mizui & Doteuchi, 1983), se

Discussão

diferenciando apenas quanto ao grau de lesão que estes agentes lesivos induzem nos

estômagos.

O etanol reduz o fluxo sanguíneo na mucosa gástrica seguida de estase sanguínea,

contribuindo para o desenvolvimento de hemorragias e necroses no tecido (Guth et al., 1984).

Em adição, o etanol também induz a solubilização dos constituintes do muco estomacal,

diminui a diferença de potencial na mucosa, aumentando o fluxo de Na

e K

para o lúmen, a

secreção de pepsina e promovendo a perda de íons H

e de histamina neste local (Guth et al.

1984; Szabo & Vattay, 1990). A presença da solução de HCl acelera (Sun, et al., 1991) e

intensifica a lesão, dificultando a proteção da mucosa por agentes químicos, os quais

necessitam de grande potência para reduzirem a lesão causada por estes agentes.

Diferente do observado nos estudos de atividade analgésica, os extratos testados

possuem importante atividade protetora da mucosa gástrica. Todas as doses testadas

promoveram uma redução significativa da área de lesão ulcerativa, apresentando uma resposta

dose dependente nos modelos de úlcera induzida por etanol e etanol/HCl.

No modelo de úlcera induzida por etanol/HCl, efeitos significativos foram

detectados a partir da dose de 250mg/Kg de ambos os extratos. A inibição da lesão gástrica

promovida pelos extratos de folhas e caules da espécie foi maior que a inibição promovida

pela administração de 250 mg/Kg de carbenoxolona, droga de referência utilizada. No modelo

de lesão gástrica induzida por etanol absoluto, ambos os extratos inibiram a lesão gástrica a

partir da menor dose testada (125mg/Kg).

No modelo de úlcera induzida por drogas antiinflamatórias não esteroidais

(DAINEs), no caso o piroxicam, a lesão do epitélio estomacal ocorre devido à ação inibitória

desta classe de compostos sobre as enzimas ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) que são

responsáveis pela síntese de prostaglandina (Burke et al, 2006). No estômago, a

prostaglandina modula o fluxo sanguíneo, promove a proliferação das células do epitélio,

Discussão

regula a função das células imunológicas da mucosa, aumenta a secreção de muco e

bicarbonato e controla a secreção ácida basal (Chan & Leung, 2002). Esta inibição da síntese

de prostaglandinas está diretamente relacionada à potência de atividade analgésica e

antiinflamatória dos DAINEs.

Os resultados obtidos, com ambos os extratos da espécie vegetal, no modelo de

indução gástrica por piroxicam, demonstraram que na dose mais alta (1000mg/Kg), ocorreu

um aumento na área de lesão ulcerativa, enquanto nas doses menores ambos os extratos foram

inativos. O aumento da área de lesão poderia estar associado a um efeito sinérgico dos

extratos com o piroxicam na inibição da síntese de prostaglandinas, porém os efeitos desta

inibição deveriam promover efeito analgésico e antiinflamatório, o que não foi observado nos

modelos de analgesia e avaliação da atividade antiinflamatória de D. angustifolia, indicando

que outros mecanismos podem estar associados a este aumento de área de lesão gástrica.

Dentre os compostos secundários, descritos na literatura e detectados em ambos os

extratos, os flavonóides são aqueles que apresentam atividade antiulcerogênica em diferentes

modelos experimentais (Lewis & Hanson, 1991). Os flavonóides são metabólitos secundários

presentes na maioria das espécies vegetais e têm atraído atenção, devido suas atividades

farmacológicas (Harborne & Williams, 2000), inclusive descrevendo sua atividade

antiulcerogênica (Gracioso et al., 2002; Gonzalez & Di Stasi, 2002; Alvarez et al., 1999;

Sannomiya, et al., 2005). Os flavonóides são capazes de proteger a mucosa gástrica de vários

agentes ulcerogênicos (Gracioso et al., 2002).

Flavonóides também são conhecidos por sua significante propriedade de seqüestrar

radicais livres in vivo e in vitro (La Casa, et al, 2000). Galati, et al., (2003) descreveram que

existe correlação entre a atividade antioxidante e a atividade antiulcerogênica dos flavonóides.

Di Carlo et al., (1999), investigando a atividade gastrintestinal da quercetina (flavonóide) em

animais pré–tratados com N

-nitro-L-arginina metilester e N

-monometil-L-arginina (L-

Discussão

NAME e L-NMMA), dois inibidores da enzima NO sintetase, sugeriu que o óxido nítrico está

envolvido na atividade gastrintestinal da quercetina, como regulação da secreção e do trânsito

intestinal.

Nossos dados demonstram ainda que a proteção da mucosa gástrica promovida

pelos extratos de D. angustifolia está intimamente relacionada com a participação do óxido

nítrico, já que ocorreu diminuição significativa na proteção promovida pelos extratos, nos

animais pré-tratados com L-NAME.

O óxido nítrico age como um mediador endógeno modulando e reparando a

integridade dos tecidos e possui propriedade gastroprotetora contra diferentes tipos de agentes

agressores (Samini, et al., 2002), está envolvido na regulação do fluxo sanguíneo, na

manutenção do tônus vascular e muscular do trato gastrintestinal, controle da agregação de

plaquetas e modulação da atividade de mastócitos (Martin, et al., 2001).

Considerando que os flavonóides estão presentes em ambos extratos testados de D.

angustifolia, é possível que tais compostos sejam os responsáveis pela atividade

gastroprotetora observada nos modelos de etanol absoluto e etanol/HCl. Esta atividade pode

estar relacionada à ação antioxidante dos extratos, visto que no modelo de peroxidação

lipídica e no modelo de lesão gástrica induzida por etanol absoluto nos animais pré-tratados

com L-NAME, ambos extratos de D. angustifolia atuaram como potente agente antioxidante.

No modelo de peroxidação lipídica utilizado, o ácido tricloroacético precipita as

proteínas das amostras do fígado, enquanto que o reativo tiobarbitúrico reage com o

malonildialdeído (MDA), liberado pela lipoperoxidação causada pelo ferro e ácido ascórbico,

gerando uma cor cuja intensidade é determinada no espectrofotômetro. Quanto maior a

intensidade de cor maior a concentração de MDA. Um composto é considerado antioxidante

se inibir a lipoperoxidação causada pelo ferro e pelo ácido ascórbico, reduzindo os valores de

MDA. Os extratos etanólicos livres de clorofilas de caules e folhas de D. angustifolia,

Discussão

apresentaram importante atividade antioxidante, onde a IC

do extrato de caule foi apenas

duas vezes maior que a IC

da quercetina, que é um flavonóide puro e referência como

agente antioxidante. O extrato de folhas também apresentou atividade antioxidante em

concentração quatro vezes maior que a da quercetina.

Estudos demonstram que a atividade antioxidante é um importante fator na

proteção da mucosa gástrica contra os radicais livres (Ito, et al., 1998; Konturek, et al., 1997).

Essa proteção pode ser devida a inativação dos radicais livres, envolvendo enzimas como a

catalase, superóxido dismutase, peroxidase ou NO sintase (Konturek, et al., 1997).

Os radicais livres formados na lesão induzida por etanol podem estar envolvidos

no processo de lesão necrótica, o mecanismo provavelmente envolve o comprometimento da

microcirculação pela injúria endotelial causada pelos radicais livres (Pihan, et al., 1987).

Além disso, vale ressaltar que os radicais livres, como os ânions superóxido, destroem o NO

(Gryglewski et al., 1986; Rubanyi & Vanhoutte, 1986), um importante fator na proteção das

lesões gástricas (Kato et al., 1999).

Com base no exposto, é provável que a atividade gastroprotetora dos extratos,

esteja relacionada a sua atividade antioxidante, e esta pode ser devida aos flavonóides

presentes em ambos os extratos de D. angustifolia.

Por outro lado, os flavonóides podem inibir a via da ciclooxigenase e/ou da

lipooxigenase no metabolismo do ácido araquidônico (Harbone & Williams, 2000) inibindo

assim os fatores de proteção da mucosa gástrica. Alguns estudos realizados in vitro e in vivo

mostram que muitos flavonóides têm a capacidade de modificar a via do ácido araquidônico;

Alguns tipos de flavonóides como a quercetina e a miricetina, bloqueiam as vias da

ciclooxigenase e da lipooxigenase em altas concentrações, enquanto que em baixas

concentrações bloqueiam apenas a via das lipooxigenases (Landolfi, et al., 1984). Isto poderia

Discussão

explicar os efeitos de aumento da lesão gástrica induzida por piroxicam nos animais tratados

com as maiores doses dos extratos.

Além disso, Kato et.al., (1999), demonstraram que os mecanismos envolvidos nas

lesões induzidas por antiinflamatório não-estoroidal e por etanol/HCl são distintos, assim

como deve ser distinta a participação do NO em cada modelo de indução de lesão gástrica. O

estômago é um órgão que necessita de um equilíbrio constante para se manter íntegro, e para

isso dispõem de mecanismos complexos envolvendo diversos mediadores na regulação dos

processos fisiológicos e diante das diferentes condições adversas.

Os resultados apresentados no estudo da toxicidade aguda e screening hipocrático,

demonstram que as folhas podem possuir menor atividade tóxica do que o caule, pois não

ocorreu morte dos animais até a dose de 5250mg/Kg, porém alguns efeitos colaterais foram

observados em ambos extratos. Apesar destes resultados, os extratos mostram-se seguros para

uso em casos de úlceras, visto que para o consumo da dose de 5000 mg/Kg em um indivíduo

de 70 Kg seria necessário, com base nos cálculos de rendimento dos extratos, o consumo de

1,6Kg de folhas secas e de 6,2Kg de caules secos em uma única administração, o que é

absolutamente impossível.

Na análise fitoquímica foi detectada a presença de glicosídeos cianogênicos, sendo

que ocorreu uma reação mais intensa para o extrato etanólico de caule do que para o extrato

etanólico de folhas. Os glicosídeos cianogênicos possuem um potencial perigoso devido à

produção de HCN por hidrólise. A toxicidade do glicosídeo cianogênico contido nas plantas,

varia de acordo com a sensibilidade de diferentes espécies animais, sendo tóxico ou até

mesmo letal, dependendo da dose, da concentração, da produção de HCN, entre outros fatores

(Vetter, 2000). A presença do glicosídeo cianogênico nos extratos de caules e folhas de D.

angustifolia pode sugerir a causa da ocorrência de mortes e de alguns dos efeitos tóxico

descritos. Porém nenhum efeito tóxico ou letal foi observado nas doses com atividade

Discussão

protetora da lesão gástrica induzida por etanol e etanol/HCl, o que garante, portanto,

segurança de uso, tanto para as folhas como para o caule.

Este estudo sugere também que as folhas possuem as mesmas atividades

farmacológicas que o caule podendo ser utilizada, nesta espécie, no lugar das cascas do caule,

indicadas popularmente, o que permite o uso de uma parte da planta cuja extração causa

menores danos à espécie e ao ambiente onde a mesma está inserida, do que aqueles causados

com a extração do caule. Este aspecto é muito importante, visto que a disseminação do uso de

determinadas partes de plantas consideradas medicinais, promovem um intenso extrativismo

dos recursos vegetais, colocando em risco de extinção inúmeras espécies nativas. Desta

forma, o uso de partes da planta de fácil regeneração, como é o caso das folhas, permite a

exploração da espécie sem risco de extinção.

Este estudo demonstrou ainda que as espécies de Drimys, levando em

consideração as condições de estudo, local de coleta, partes utilizadas e tipo de preparação

dos extratos, não possuem as mesmas atividades farmacológicas da espécie Drimys winteri.

Diferentes fatores ambientais, como por exemplo, a intensidade de luz, fotoperíodo, altitude,

localização geográfica, clima no momento da coleta, forma de coleta, época de floração e/ou

frutificação, estágio de desenvolvimento da planta e outros, podem alterar a ocorrência e a

composição química de algumas plantas, sem afetar a composição química de outras. No caso

do gênero Drimys, um estudo realizado com a espécie Drimys winteri, coletada em cinco

regiões diferentes do Chile, demonstrou diferença quantitativa nos compostos secundários,

como flavonóides, terpenos e óleos essenciais (Munoz-Concha, et al., 2004).

As diferenças nas atividades farmacológicas observadas entre as espécies de

Drimys coletadas em diferentes locais do Brasil, sugerem que as espécies não podem ser

utilizadas como adulterantes, já que até mesmo a identificação botânica das espécies do

gênero, não é consenso entre os próprios taxonomistas. A taxonomia a respeito dos diferentes

Discussão

gêneros e espécies da família Winteraceae, é controvérsia e tem sido discutida por mais de 50

anos (Doust & Drinnan, 2004). Smith (1943), propôs que o gênero Drimys se divide em duas

seções, uma na América do Sul, denominada de Drimys e outra na Austrália, Nova Guiné,

Malásia e Filipinas a qual denominou de gênero Tasmannia (Doust & Drinnan, 2004). A

distinção das espécies de Drimys no Brasil ou o conhecimento de uma única espécie

polimórfica não é consenso entre os taxonomistas (Souza, 2005). Existe uma grande

divergência a respeito da classificação das espécies de Drimys. Alguns autores, relatam a

existência de uma única espécie de Drimys no Brasil, a Drimys brasiliensis (Barroso,1978;

Souza, 2005; Souza & Bianchini, 2002), porém vários taxonomistas descrevem a ocorrência

de várias espécies, com subespécies, formas e variedades, (Smith,1943; Trinta, 1997; PPP-

Index-Europa, 2005; New York Botanical Garden, 2005 e Missouri Botanical Garden, 2005).

Considerando a ausência de uma delimitação coerente e estudos mais aprofundados quanto à

classificação, optou-se neste trabalho, pelo reconhecimento de D. angustifolia como uma

espécie distinta, sinônimo de Drimys winteri fo. angustifolia (Miers) Eichler e Drimys

brasiliensis var. angustifolia (Miers) A.C.Sm., segundo Smith (1943) e Trinta (1997), bem

como na identificação realizada por um especialista em Winteraceae.

Como ocorre com as espécies do gênero Drimys, outras espécies medicinais

indicadas popularmente devem ser utilizadas com cautela e submetidas a um rigoroso controle

de qualidade, desde sua identificação, determinação de eficácia e segurança de uso, cultivo,

colheita, beneficiamento, armazenamento até a forma de utilização final.

Os resultados apresentados sugerem que a espécie Drimys angustifolia, possui

atividade antiulcerogênica, corroborando com os dados de indicação popular do gênero

Drimys, mostrando ser uma importante fonte de produtos de interesse terapêutico para

atividade antiulcerogênica. Nossos resultados permitiram a determinação das doses pré-

clínicas eficazes contra úlceras, a segurança de uso dos extratos, assim como a determinação

Discussão

de parâmetros para o controle de qualidade da matéria-prima vegetal. No entanto, há

necessidade de novos estudos para avaliar os mecanismos da atividade antiulcerogênica de D.

angustifolia, bem como esclarecer se os flavonóides são os responsáveis por tal atividade.

Conclusão

5. Conclusão

Com base nos objetivos propostos, nos resultados e discussões apresentadas, com a

realização do presente estudo foi possível concluir que:

 Os extratos etanólicos de caules e de folhas de Drimys angustifolia possuem

importante atividade antiulcerogênica nos modelos de etanol e etanol/HCl;

 A espécie mostrou-se segura para uso, apesar dos efeitos tóxicos apresentados,

pois estes só foram observados em doses muito superiores a dose efetiva para

úlcera;

 A atividade gastroprotetora provavelmente está relacionada com a atividade

antioxidante dos extratos;

 As folhas podem ser preferencialmente utilizadas como produto ativo

minimizando os efeitos prejudiciais da exploração de caules;

 Ambos extratos não possuem atividades analgésica e antiinflamatória, detectável

pelos modelos e pela dose testada;

 Os resultados obtidos nos modelos de analgesia mostram que a espécie D.

angustifolia não possui as propriedades farmacológicas descritas para a espécie

Drimys winteri provavelmente pela ausência dos sesquiterpenos poligodial e

drimanial nos extratos testados;

 A espécie estudada representa uma nova fonte de produtos de interesse terapêutico

para atividade antiulcerogênica, podendo representar o início para outros estudos,

na elucidação dos compostos ativos ou mesmo na padronização de fitoterápicos

para esta atividade.

Referências

6. Referências

ABREU, D.C.; NOGUEIRA, A.C.; MEDEIROS, A.C.S. Efeito do substrato e da temperatura

na germinação de sementes de cataia (Drimys brasiliensis MIERS. Winteraceae). Rev. Bras.

Sementes, v.27, p.149-157, 2005.

ALVAREZ, A.; POMAR, F.; SEVILLA, M.A.; MONTERO, M.J. Gastric antisecretory and

antiulcer activies of an ethanolic extract of Bildens pilosa L. var. radiata Schult. Bip. J.

Ethnopharmacol., v.67, p.333-340, 1999.

ARRIETA, J.; BENITEZ, J.; FLORES, E.; CASTILLO, C.; NAVARRETE, A. Purification

of gastroprotective triterpenoids from stem bark of Amphipterygium adstringens; roles of

prostaglandins, sulphidryls, nitric oxide and capsaicin neurons. Planta Med., v.69, p.905–

909, 2003.

BARROSO, G.M. Sistemática de angiospermas do Brasil. v.1. São Paulo: Editora USP,

1978.

BRITO, A.R.M.S. Farmacologia de plantas medicinais. In: Di STASI, L.C. (Org.). Plantas

medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: Editora Unesp,

1996.

BURKE, A.; SMYTH, E.; FITZGERALD, G.A. Analgesic- antipyretic agents:

Pharmacotherapy of gout. In: BRUNTON, L.L.; LAZO, J.S.; PARKER, K.L. Godman &

Gilman’s. The pharmacological basis of therapeutics. 11. ed. United State of America:

McGraw- Hill, 2006. p. 671-736.

CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R.A. Estratégias para a obtenção de compostos

farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação

estrutural para otimização da atividade. Quím. Nova, v.21, n.1, p.99-105, 1998a.

CECHINEL FILHO, V.; SCHLEMPER, V.; SANTOS, A.R.S.; PINHEIRO, T.R.; YUNES,

R.A.; MENDES, G.L.; CALIXTO, J.B.; MONACHE, F.D. Isolation and identification of

active compounds from Drimys winteri barks. J. Ethnopharmacol., v.62, p.223-227, 1998b.

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação –

Referencias – Elaboração. Rio de Janeiro, 2002. 22p.

BIOSIS. Serial sources for the BIOSIS preview database. Philadelphia, 1996.468p.

Referências

CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Action of the extract of Drymis

winteri on contraction induced by inflammatory mediqators, compound 48/80 and ovalbumin

of the guinea-pig trachea in vitro. Gen. Pharmacol., v.28, n.5, p.699-704, 1997.

CHAN, F.K.L.; LEUNG, W.K. Peptic-ulcer disease. The lancet., v.360, p.933-41, 2002.

CORRÊA, M.P. Diccionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de

Janeiro: Imprensa Nacional, 1926-1978.v.2.

CUNHA, F.M.; FRODE, T.S.; MENDES, G.L.; MALHEIROS, A.; CECHINEL FILHO, V.;

YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Additional evidence for the anti-inflammatory and anti-

allergic properties of the sesquiterpene polygodial. Life Sci., v.70, n.2, p.159-169, 2001.

Di CARLO, G.; MASCOLO,N.; IZZO,A.A. Flavonoids: old and new aspects of a class of

natural therapeutic drugs. Life Sci., v.65,4, p.337-353, 1999.

DI STASI, L.C. Química de produtos naturais: principias constituintes ativos. In: DI STASI,

L.C. (Org.). Plantas medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São

Paulo: Editora Unesp, 1996. p. 109-127.

DOUST, A.N.; DRINNAN, A.N. Floral development and molecular phylogeny support the

generic status of Tasmannia (Winteraceae). Am. J. Bot., v.91, n.3, p.321-331, 2004.

EDDY, N.B.; LEIMBACK, D. Synthetic analgesics, II. Dithienylbutenyl and

dithienylbutylamines. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.107, p.385-393, 1953.

EISIG, J.N.; LAUDANNA, A.A; Ulcera péptica. Programa de saúde da família, 2001.

Disponível em: < http://ids-saude.uol.com.br/psf/medicina/ tema5/texto81_definicao.asp.>.

Acesso em: 01 jul. 2004.

EL SAYAH, M.; CEQUINEL FILHO, V.; YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Action of the

extract of Drymis winteri on contraction induced by inflammatory mediators, compound

48/80 and ovalbumin of the guinea-pig trachea in vitro. Gen. Pharmacol., v.28, n.5, p. 699-

704, 1997.

FARIAS, M.R. Avaliação da qualidade de matérias-primas vegetais. In: SIMÕES, C.M.O.;

SCHENKEL, E.P.; GOSMANN,G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETRIVICK, P.R.

Referências

(Orgs.) Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. Porto Alegre/ Florianópolis:

Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 263-288.

FARNSWORTH, N.R.; AKERELE, O.; BINGEL, A.S.; SOEJARTO, D.D.; GUO,Z.

Medicinal plants in therapy. Bull. World. Health Organ, v.63, n.6, p.965-981, 1985.

FERRI, P. H. Química de produtos naturais: métodos gerais. In: DI STASI, L.C. (Org).

Plantas medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: Editora da

UNESP, 1996. p.129-156.

FRACASSO, J.F.; NUNES-DE-SOUZA, R.L.; TEIXEIRA, C.E.; CASTRO, R.C.; LEPERA,

E.Z.; SILVA, R.F. Effects of dipyrone, L-NAME and L- arginine on endotoxin-induced rat

paw edema. Braz. J. Med. Biol. Res., v.29, n.11, p.1543-1548, 1996.

GALATI, E.M.; MONDELLO, M.R.; GIUFFRIDA, D.; DUGO, G.; MICELI, N.;

PERGOLIZZI, S.; TAVIANO, M.F. Chemical characterization and biological effects of

Sicilian Opuntia fícus indica (L.) mill, fruit juice: antioxidant and antiulcerogenic activity. J.

Agric. Food Chem., v.51, p.4903-4908, 2003.

GALVEZ, J.; DE LA CRUZ, J.P.; ZARZUELO, A.; SANCHEZ DE LA CUESTA, F.

Flavonoid inhibition of enzymic and nonenzymic lipid peroxidation in rat liver differ from its

influence on the glutathione-related enzimes. Pharmacology, v.51, p.127-33, 1995.

GONZALEZ, F.G.; DI STASI, L. C. Anti-ulcerogenic and analgesic activities of the leaves of

Wilbrandia ebracteata in mice. Phytomedicine, v. 9, p.125-134, 2002.

GRACIOSO, J.S.; VILEGAS,W.; HIRUMA-LIMA, C.A.; BRITO, A.R.M.S. Effects of tea

from Turnera ulmifolia L. on mouse gastric mucosa support the Turneraceae as a new source

of antiulcerogênica drugs. Biol. Pharmac. Bull., v.25, p.487-491, 2002.

GRANDI, T.S.M.; CRINDADI, A.; PINTO, M.J.F.; FERREIRA, L.L.; CATELLA, A.C.

Plantas medicinais de Minas Gerais, Brasil. Acta Bot. Bras., v.3, n.2, p.185-224, 1989.

GRYGLEWSKI, R.J.; PALMER, R.M.; MONCADA, S. Superoxide anion is envolved in the

breakdown of endothelium-derived vascular relaxing factor. Nature, v.320, p.454-456, 1986.

Referências

GUTH, P.H.; PAULSEN,G.; NAGATA,H. Histologic and microcirculatory changes in

alcohol – induced gastric lesions in the rat: effect of prostaglandin cytoprotetion.

Gastroenterology, v.87, p.1083-1090,1984.

HARBORNE, J.B.; WILLIAMS, C.A. Advances in flavonoid research since 1992.

Phytochemistry, v.55, p.481-504, 2000.

HAYDEN, L.J.; THOMAS, G.; WEST, G.B. Inhibitors of gastric lesions in the rat. J. Pharm.

Pharmacol., v.30, p.244-246, 1978.

HOUGHTON, P.J.; MANBY, J. Medicinal plants of the Mapuche. J. Etnopharmacol., v.13,

p.89-103, 1985.

IRWIN, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure

for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychol. Pharmacol.

(Berlin), v.13, p.222-257, 1968.

ITO, M.; SUZUKI, Y.; ISHIBARA, M. Anti-ulcer effects of antioxidants: effect of probucol.

Eur. J. Pharmacol., v.354, p.189-196, 1998.

JANSEN, P.A.J.; NIEMERGEERS, C.J.E.; DONY, J.G.H. The inhibitory effect of fentanyl

and other morphine- like analgesics on the worm induced tail withdraw reflex in rats. Arztl.

Forsch., v.13, p.502-507, 1963.

JAROSZEWSKI, J.W. Natural products and drug development. Pharm. Int., v.5, p.27-28,

1984.

JENSEN, D.M. Heath and economic aspects of peptic disease. Am. J. Medic., v.77, n.5B,

p.8-14, 1984.

KATO, S.; TANAKA, A.; KUNIKATA, T.; NISHIJIMA, M.; TAKEUCHI, K. Changes in

gastric mucosal ulcerogenic responses in rats with adjuvant arthritis: role of nitric oxide.

Aliment. Pharmacol. Ther., v.13, p.833-840, 1999.

KONTUREK, P.C.; KONTUREK, S.J.; MAJKA, J.; ZEMBALA, M.; HAHN, E.G.

Melatonin affords protection against gastric lesions induced by ischemia-reperfusion possibly

due to its antioxidant and mucosal microcirculatory effects. Eur. J. Pharmacol., v.322, p. 73-

77, 1997.

Referências

KOSTER, R.; ANDERSON, M.; DE BEER, E.J. Acetic acid for analgesic screening. Fed.

Proc., v.18, p.412, 1959.

LA CASA, C.; VILLEGAS, C.; ALARCÓN DE LA LASTRA, C.; MOTILVA, V.;

MARTÍN-CALERO, M.J. Evidence for protective and antioxidant properties of rutin, a

natural flavone, against ethanol induced gastric lesions. J. Ethnopharmacol., v.71, p.45-53,

2000.

LAM, S.K.; HUI, W.M.; CHING, C.K. Peptic ulcer disease. Epidemiology, Pathogenesis

and Etiology. In: HAUBRICH, W.S.; SCHAFFNER, F.B. Gastroenterology. Philadelphia:

Saunders, 1995. p.700-748.

LANDOLFI, R.; MOVER, R.L.; STEINER, M. Modification of platelet function and

arachidonic acid metabolism by bioflavonoids. Structure-activity relations. Biochem.

Pharmacol., v.33, n.9, p.1525-1530, 1984.

LAPA, A.J.; SOUCCAR, C.; LIMA-LADMAN, M.T.R.; GODINHO, R.O.; NOGUEIRA,

T.C.M. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL,

E.P.; GOSMANN,G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETRIVICK, P.R. (Orgs.)

Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da

UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 247-262.

LEWIS, D.A.; HANSON, P.J. Anti-ulcer drugs of plant origin. In: ELLIS, G.P.; WEST, G.B.

(Eds.). Progress medicinal chemistry. London: Elsevier Science Publishers, 1991.v.28,

p.2001-2031.

LOPES, J.L.C. Cromatografia de camada delgada. In: COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.;

BONATO, P.S. (Coords.). Introdução a métodos cromatográficos. Campinas: Editora

Unicamp, 1990. p.45-48.

MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA JR., V.F. Plantas medicinais: a necessidade de

estudos multidisciplinares. Quím. Nova, v.25, n.3, p.429-438, 2002.

MALHEIROS, A.; CECHINEL FILHO, V.; SCHIMITT, C.B.; SANTOS, A.R.S.; SCHEIDT,

C.; CALIXTO, J.B.; MONACHE, F.D.; YUNES, R.A. A sesquiterpene drimane with

antinoceptive activity from Drimys winteri bark. Phytochemistry, v.57, p.103-107, 2001.

Referências

MALONE, M.H.; ROBICHAUD, R.C. A hippocratic screen for pure or crude drug materials.

Lloydia, v.25, p.320-332, 1962.

MARTIN, M.J.; JIMÉNEZ, M.D.; MOTILVA, V. New issues about Nitric oxide and its

effects on the gastrointestinal tract. Curr. Pharm. Des., v.7, p.10,881-908, 2001.

MATOS, F.J.A. Introdução à fitoquímica experimental. Ceará: Ed. Universidade do Ceará,

1988. p.37-65.

MCINTOSH, J.H.; BYTH, K.; PIPER, D.W. Causes of death amongst a population of gastric

ulcer patients in New South Wales, Australia. Scand J. Gastroenterol., v.26, p.806-811,

1991.

MENDES, G.L.; SANTOS, A.R.S.; CAMPOS, M.M.; TRATSK, K.S.; YUNES, R.A.;

CECHINEL FILHO, V.; CALIXTO, J.B. Anti-hyperalgesic properties of the extract and of

the main sesquiterpene polygodial isolated from the barks of Drymis winteri (Winteraceae).

Life Sci., v.63, n.5, p.369-381, 1998.

MENDES, G.L.; SANTOS, A.R.S.; MALHEIROS, A.; CECHINEL FILHO, V.; YUNES,

R.A.; CALIXTO, J.B. Assessment of mechanisms involved in antinoception caused by

sesquiterpene polygodial. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.292, p.164-172, 2000.

MISSOURI BOTANICAL GARDEN. St. Louis, 1859. Disponível em : <http://

www.mobot.mobot.org/W3T/search/vast.html>. Acesso em: Dez. 2005.

MIZUI, T.; DOTEUCHI, M. Effect of polyamines on acidified ethanol-induced gastric lesions

in rats. Jpn. J. Pharmacol., v.33, p.939-945, 1983.

MUÑOZ-CONCHA, D.; VOGEL, H.; RAZMILIC, I. Variation of chemical compounds in

leaves of Drimys spp. (Magnoliophyta: Winteraceae) populations in Chile. Rev. Chil. Hist.

Nat., v.77, p.43-50, 2004.

NEW YORK BOTANICAL GARDEN. New York. Disponível em: <http://www.nybg.org>.

Acesso em: Dez. 2005.

PETERSEN, H.; KRISTENSEN, P.; JOHANNESSEN, T.; KLEVELAND, P.M.;

DYBDAHL, J.H.; MYRVOLD, H

. The natural course of peptic ulcer disease and its

predictors. Scand J. Gastroenterol., v.30, p.17-24, 1995.

Referências

PETROVICK, P.R.; GONZÁLEZ ORTEGA, G.; BASAN, V.L. From a medicinal plant to a

pharmaceutical dosage form. A (still) long way for brazilian medicinal plants. Ciên. Cult.,

v.49, n.5, p.364-369, 1997.

PIHAN, G.; REGILLO, C.; SZABO, S. Free radical and lipid peroxidation in etanol- or

aspirin-induced gastric mucosal injury. Dig. Dis. Scien., v. 32, p.1395-1401, 1987.

PPP-INDEX-EUROPEU. Disponível em:

<http://www.ppp-index.de/J9p-MdoQxF5dPLZn7Yp7F1omBnMI.HTML>. Acesso em: Dez.

2005.

PUSCAS, I.; PUSCAS, C.; COLTAU, M.; PASCA, R.; TORRES, J.; MARQUEZ. M.;

HERRERO, E.; FILLAT, O.; ORTIZ ,J.A. Comparative study of the safety and efficacy of

ebrotidine versus ranitidine and placebo in the prevention of piroxicam-induced

gastroduodenal lesions. Arzneimittelforschung. v.47, n.4A, p.568-72, 1997.

RANDALL, L.O.; SELLITO, J.J. A method for measurement of analgesic activity on

inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., v.111, n.4, p.409,419, 1957.

RUBANYI, G.M.; VANHOUTTE, P.M. Superoxide anions and hyperoxia inactivate

endothelium-derived relaxing factor. Am. Physiol. Soc., v.250, p.H822-H827, 1986.

SAMINI, M.; MOEZI, L.; JABARIZADEH, N.; TAVAKOLIFAR, B.; SHAFAROODI, H.;

DEHPOUR, A. Evidences for involvement of nitric oxide in the gastroprotective effect of

bromocriptine and cyclosporin a on water immersion stress-induced gastric lesions.

Pharmacol. Res., v.46, p.519-523, 2002.

SANNOMIYA, M.; FONSECA, V.B.; SILVA, M.A.; ROCHA, L.R.M.; SANTOS, L.C.;

HIRUMA-LIMA, C.A.; SOUZA BRITO, A.R.M.; VILEGAS, W. Flavonoids and

antiulcerogenic activity from Byrsonima crassa leaves extracts. J. Ethnopharmacol., v.97,

p.1-6, 2005.

SCHEIDT, C.; SANTOS, A.R.S.; FERREIRA, J.; MALHEIROS,A.; CECHINEL-FILHO,

V.; YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Evidence for involviment of glutamatergic receptors in

the antinoception caused in mice by the sesquiterpene drimanial. Neuropharmacology, v.43,

p.340-347, 2002.

Referências

SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; PETROVICK, P.R. Produtos de origem vegetal e o

desenvolvimento de medicamentos. In: SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.;

GOSMANN,G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETRIVICK, P.R. (Orgs.) Farmacognosia:

da planta ao medicamento. 5.ed. Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da

UFSC, 2004. p. 371-400.

SCHLESINGER, P.K.; ROBINSON, B.; LAYDEN, T.J. Epimiology consideration in peptic

ulcer disease. J. Assoc. Acad. Minor. Phys., v.3,n.3, p.70-77, 1992.

SMITH, A.C. The American species of Drimys. J. Arnold Arbor., v.24, p.1-33, 1943.

SOLDATO, P.D.; FOSCHI, D.; VARIN, L.; DANIOTTI, S. Comparison of the gastric

cytoprotective properties of atropine, ranitidine and PGE

in rats. Eur. J. Pharmacol., v.106,

p.53-58, 1985.

SONAGLIO, D.; ORTEGA, G.G.; PETROVICK, P.R.; BASSANI, V.L. Desenvolvimento

tecnológico e produção de fitoterápicos. SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.;

GOSMANN,G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETRIVICK, P.R. (Orgs.)

Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. Porto Alegre/ Florianópolis: Editora da

UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 289-326.

SOUZA, F.O.; BIANCHINI, R.S. Winteraceae. In: Flora Fanerogâmica da Ilha do

Cardoso. São Paulo: Instituto de Botânica, 2002. v.9, p.25-28.

SOUZA, V.C. Botânica Sistemática: Guia ilustrado para identificação das famílias de

angiospermas da Flora brasileira, baseado em APGII. Nova Odessa: Instituto Plantarum,

2005.

SUN, S.B.; MATSUMOTO, T.; YAMADA, H. Effects of polysaccharide fraction from the

roots of Bupleurum falcatum L. on experimental gastric ulcer models in rats and mice. J.

Pharm. Pharmacol., v.43, p.699-704, 1991.

SZABO, S.; VATTAY, P. Experimental gastric and duodenal ulcers: advances in

pathogenesis. Gastroenterology. Clin. North. Am., v.19, p.65-85, 1990.

TAYLOR, D.N.; BLASER, M.J. The epidemiology of Helicobacter pylori infection.

Epidemiol Rev. v.13, p.42-59, 1991.

Referências

TRATSK, K.S.; CAMPOS, M.M.; VAZ, Z.R.; CECHINEL FILHO, V.; SCHLEMPER, V.;

YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B. Anti-allergic effects and oedema inhibition caused by the

extract of Drymis winteri. Inflamm. Res., v.46, n.12, p.509-14, 1997.

TRINTA, E.F.; SANTOS, E. Flora ilustrada catarinense: Winteraceas. Itajaí: Herbário

Barbosa Rodrigues, 1997.

VACHER, J.; DUCHÊME-MARULLAZ, P.; BARBOT, P.A. A propos de quelques produits

usuels. Comparasion de Deux méthods d´ etude des analgésiques. Med. Exp., v.11, p.51-58,

1964.

VETTER, J. Plant cyanogenic glycosides. Toxicon, v.38, p.11-36, 2000.

VIEIRA, R.F.; MARTINS, M.V.M. Recursos genéticos de plantas medicinais do cerrado,

uma compilação de dados. Rev. Bras. Plantas Med., v.3, n.1, p.13-26, 2000.

VON POSER, G.L.; MENTZ, L.A. Diversidade biológica e sistemas de classificação.

SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN,G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.;

PETRIVICK, P.R. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. Porto Alegre/

Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, 2004. p. 75-90.

WAGNER, H.; BLADT, S. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas. Berlin:

Springer- Verlag, 1995. 384p.

WAY, L.W. Stomach & Duodenum. In: Corrent surgical diagnosis and treatment. 5.ed.

Appleton & Lange, 1994, 1426p.

WINTER, C.A.; RISLEY, E.A.; NUSS, G.W. Carrageenin-induced edema in hind paw of the

rat as an assay for anti-inflammatory drugs. Proc. Soc. Exp. Biol. Méd., v.111, p.544-

547,1962.

YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; CEQUINEL FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a

necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Quím.

Nova, v.24, n.1, p.147-152, 2001.

Anexos

Tabela 7- Parâmetros observados no Screening Hipocrático e escores atribuídos ao

grupo controle.

Parâmetros Avaliados

Procedimentos Escores

Frêmito vocal Sinais sonoros emitidos pelos animais 0

Estado de

consciência

e disposição

Irritabilidade Comportamento anormal quanto à agressividade 0

Atividade Geral Locomoção, auto-limpeza e ato de levantar 4

Sistema

locomotor

Resposta ao toque

Resposta a toques suaves e inesperados em

diferentes locais do corpo, aplicados com um

bastão de vidro

Tônus muscular e

força de agarrar

Força aplicada pelo animal para agarrar-se a uma

grade e capacidade de manter-se sobre a grade

em plano de 30º

Equilíbrio

Capacidade de manter-se sobre uma haste de

metal suspensa a 20cm da superfície da mesa

Musculatura

Esquelética

Ataxia e trem

posterior

Movimentação espontânea, qualidade de marcha

e postura

Reação de posição

Resposta à alteração de posição de uma pata

traseira quando puxada delicadamente para baixo,

em relação à quina da mesa

Reflexo Postural

Resposta de retornar à posição normal após ter

sido colocado em decúbito dorsal

Reflexos

Reflexo auricular

Resposta a toques suaves e inesperados feitos

com um bastão de vidro nas orelhas

Tremores e

convulsão

Verificação da presença destes eventos 4

Strub

Apresentação da cauda ereta e curvada sobre o

corpo

Sistema

Nervoso

Central

Analgesia Resposta sensitiva ao pinçar a cauda 0

Ptose palpebral Ocorrência de fechamento palpebral 0

Piloereção

Eriçamento dos pelos sobre toda superfície

corporal

Lacrimejamento e

salivação

Presença de secreções oculares e orais 0

Sistema

Nervoso

Autonomo

Excreção

Diferenças quantitativas e/ou qualitativas de

excretas (fezes e urina)

Anexos

Teste Hipocrático – Toxicidade de drogas por Análise Comportamental

Droga.................................................................Via de administração..........................

Dose ...................mg/kg; Volume da injeção;.................mL;

Concentração da droga..................Hora da injeção.........hs.; Data......../......../.........

Administrador:............................................Investigador..................................................

Assinatura...................................................Animal.....................................Sexo( );

Peso............g; Tempo de jejum.................................

Sintomas Normal Tempo

30’ 60’ 120’

180’

240’

24h

48h

Aparência geral 4

Frênito vocal 0

Irritabilidade 0

Atividade Motora 4

Ataxia 0

Redução do reflexo endireitar 0

Resposta ao aperto da cauda 4

Contorção 0

Tônus muscular 4

Força de agarrar 0

Reflexo auricular 4

Reflexo corneal 4

Tremores 0

Convulsões 0

Reação ao susto 0

Straub 0

Hipnose 0

Anestesia 0

Lacrimação 0

Ptose 0

Micção 4

Piloereção 0

Defecação 4

Hipotermia 0

Respiracão 4

Exoftalmia 0

Morte

Códigos: Testes com anotação normal “0”, a intensidade do efeito varia na escala de 1 a 4

Teste com anotação normal “4”, a intensidade do efeito poderá variar de 0 a 3

quando ocorrer diminuição, 4 quando igual ao controle e de 5 a 8 quando

ocorrer aumento.

Observações gerais/comentários

..................................................................................................................................................

.................................................................................................................................................

Anexos

Tabela 1.

Efeito das diferentes doses do extrato etanólico das folhas

(a)

e caules

(b)

de Drimys angustifolia no

modelo de lesão gástrica induzida por Etanol absoluto

Resultados apresentados em média e erro padrão da média. Os resultados da área relativa de lesão ulcerativa estão representados em

arcosseno. Análise estatística ANOVA seguida de teste de Dunnett, onde ** p>0,01.

Tabela 2.

Efeito das diferentes doses do extrato etanólico de caules

(a)

e folhas

(b)

de Drimys angustifolia no

modelo de lesão gástrica induzida por Etanol/HCl 0,3M

Resultados apresentados em média e erro padrão da média. Os resultados da área relativa de lesão ulcerativa estão representados em

arcosseno. Análise estatística ANOVA seguida de teste de Dunnett, onde ** p>0,01.

Tratamento (v.o.) N Área total lesão Inibição (%) Área relativa lesão Inibição (%)

Água destilada

(a)

23,76±4,34

----

17,66±1,85

Extrato 125mg/Kg

(a)

6,28±1,25**

73,56

6,68±1,10**

62,17

Extrato 250mg/Kg

(a)

5,64±1,34**

76,26

8,04±1,14**

54,47

Extrato 500 mg/Kg

(a)

3,77±1,01**

84,13

6,64±0,79**

62,40

Extrato 1000 mg/Kg

(a)

3,07±1,15**

87,07

5,66±0,84**

67,95

Carbenoxolona

(a)

3,40±0,54**

85,69

5,88±0,70**

66,70

Água destilada

(b)

17,35±3,03

----

14,83±1,43

-----

Extrato 125mg/Kg

(b)

7,28±1,45**

58,04

8,70±0,90**

41,33

Extrato 250mg/Kg

(b)

7,67±1,34**

55,79

9,45±1,01**

36,27

Extrato 500 mg/Kg

(b)

5,50±1,28**

68,29

8,25±1,06**

44,36

Extrato 1000 mg/Kg

(b)

2,97±1,39**

82,88

4,03±0,73**

72,82

Carbenoxolona

(b)

2,70±0,28**

84,43

5,73±0,32**

61,36

Tratamento (v.o.) N Área total lesão Inibição (%) Área relativa lesão Inibição (%)

Água destilada

(a)

57,92±7,67

----

24,80±2,87

-----

Extrato 125mg/Kg

(a)

42,97±6,75

25,81

22,54±2,00

9,11

Extrato 250mg/Kg

(a)

10,76±1,80**

81,42

8,41±0,84**

66,08

Extrato 500 mg/Kg

(a)

10,88±1,88**

81,21

8,84±0,98**

64,35

Extrato 1000 mg/Kg

(a)

5,09±1,55**

91,21

5,66±0,75**

77,17

Carbenoxolona

(a)

15,00±4,18**

74,10

10,38±1,41**

58,14

Água destilada

(b)

49,16±5,73

----

26,57±2,78

-----

Extrato 125mg/Kg

(b)

50,45±13,41

-2,62

26,62±3,31

0,00

Extrato 250mg/Kg

(b)

11,55±7,09**

76,50

8,62±1,04**

67,55

Extrato 500 mg/Kg

(b)

8,08±1,91**

83,56

7,25±0,93**

72,71

Extrato 1000 mg/Kg

(b)

12,34±2,41**

74,89

9,00±0,79**

66,12

Carbenoxolona

(b)

15,00±4,18**

69,48

10,45±1,40**

60,66

RESUMO dos RESULTADOS

Anexos

Tabela 3.

Efeito dos extratos de caules e folhas de Drimys angustifolia (500mg/Kg) no modelo de

úlcera induzida por etanol absoluto em animais pré-tratados com L-NAME.

Resultados apresentados em média e erro padrão da média. Os resultados da área relativa de lesão ulcerativa estão representados em

arcosseno. Análise estatística teste t, comparando o grupo tratado com salina com o seu respectivo grupo tratado com L-name, onde **

p>0,01.

Tabela 4.

Tabela 5.

Efeito do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, na dose de

500mg/Kg em camundongos no modelo da Placa Quente.

n 30min. 60min. 90min. 120min. 240min.

Controle

1,46±0,71 1,19±0,66 2,02±1,22 1,28±0,92 4,19±1,52

Caule

0,003±0,78 -0,19±1,52 2,08±2,58 -0,04±1,44 1,6±2,09

Folha

2,48±1,5 1,23±1,1 1,38±1,32 0,02±0,83 0,1±0,67

Morfina

17,12±2,11** 14,22±2,68** 7,98±2,97 5,48±2,37 4,92±1,24

Resultados expressos em média ± E.P.M , analisados estatisticamente por ANOVA seguida do teste de Dunnett´s

comparados com o respectivo controle.

Salina L-Name

Grupos

Área total

Área relativa n Área total Área relativa

Água destilada

30,11±6,05

13,64±1,82

38,94±15,02 14,11±3,05

Ramos

2,60±0,76 3,56±0,46

15,12±9,08 8,16±2,82

Folhas

3,38±0,93 4,49±0,52

16,54±4,27** 9,24±1,52

Carbenoxolona

10,65±5,39

5,98±1,31

53,66±14,30**

14,91±2,27

Efeito das diferentes doses do extrato etanólico de folhas

(a)

e caules

(b)

de Drimys angustifolia no modelo

de lesão gástrica induzida por Piroxicam

Tratamento (v.o.) N Área total lesão Inibição (%) Área relativa lesão Inibição (%)

Água

(a)

2.37±0.92

----

3.92±0.77

----

Extrato 125mg/Kg

(a)

2.49±0.94

-5.06

4.07±0.88

-3.82

Extrato 250mg/Kg

(a)

1.35±0.29

43.03

3.13±0.50

20.15

Extrato 500 mg/Kg

(a)

1.48±0.35

37.55

3.08±0.48

21.42

Extrato 1000 mg/Kg

(a)

4.52±0.81

-90.71

7.19±1.34**

-83.41

Extrato 125mg/Kg

(b)

0.39±0.08

83.54

1.65±0.23

57.90

Extrato 250mg/Kg

(b)

1.80±0.55

24.05

3.46±0.71

11.73

Extrato 500 mg/Kg

(b)

1.47±0.37

37.97

3.13±0.44

20.15

Extrato 1000 mg/Kg

(b)

6.09±2.44

-156.96

6.33±1.42

-61.47

Cimetidina

(b)

2.24±0.77

5.48

3.67±0.63

6.37

Resultados apresentados em média e erro padrão da média. Os resultados da área relativa de lesão ulcerativa estão representados em arcosseno.

Análise estatística ANOVA seguida de teste de Dunnett, onde ** p>0,01.

Anexos

Tabela 6.

Efeito do Extrato etanólico de caules (A) e folhas (B) de Drimys angustifolia, na dose de

500mg/Kg em camundongos no modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético.

+30 n

+60 n

+90 n

+120 n

+240

Água

(a)

50.0±1.67

46.8±4.30

50.4±6.12

48.2±6.10

49.3±6.66

Caule

(a)

37.6±5.0

44.3±5.09

44.0±6.80

38.2±12.82

48.3±3.06

Aspirina

(a)

15.0±5.21

23.2±3.56**

16.4±2.94**

14.3±3.93*

20.0±6.69**

Água

(b)

27.0±4.71

37.7±4.39

46.0±4.38

38.5±5.53

52.5±7.34

Folhas

(b)

30.2±6.62

29.7±3.81

39.87±2.74

32.1±5.74

46.3±3.44

Aspirina

(b)

15.1±4.34

26.1±4.62

14.1±4.19**

13.0±4.58**

26.4±8.13*

Resultados expressos em média ± EPM do número de contorções abdominais, (n), analisados estatisticamente pelo teste

ANOVA seguido do teste de Dunnett´s, onde *p<0,05 e **p<0,01.

Tabela 7.

Efeito do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, na dose de

500mg/Kg no teste de imersão da cauda.

n Basal +30 +60 +90 +120 +240

Controle

6,93±1,06 -0,58±0,78 0,59±1,23 0,70±1,26 0,84±0,96 -0,82±1,05

Caule

11,55±1,87

-3,96±1,02 -0,25±2,36

-4,43±2,13

-2,20±2,40

-2,85±1,68

Folha

7,43±0,72 -1,09±0,68 9,96±6,45 5,66±4,49 10,12±6,75

9,38±5,00*

Aspirina

8,09±1,38 1,76±2,03 -0,42±1,53

-1,24±1,54

0,20±2,16 2,05±1,60

Resultados expressos em média ± EPM, (n), analisados estatisticamente pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett´s, onde

*p<0,05.

Tabela 8-

Efeito do extrato etanólico de caules e folhas de Drimys angustifolia, no

modelo de edema de pata de rato induzido por carragenina. (a)Intensidade

de hiperalgesia e (b)Edema.

+60 +120 +240

Controle

193±19,66 (a) 168±13,47(a) 138±12,7(a)

Caule

207,5±19,26(a) 169,16±24,37(a)

118,33±22,27(a)

Folha

180,83±19,46(a) 155±11,97(a) 130,83±12,2(a)

Controle

4,5±1,43 (b) 9,33±2,76(b) 12,33±2,64(b)

Caule

6,33±1,64(b) 17±2,60(b) 18,83±2,24(b)

Folha

6,33±0,95(b) 12,66±0,98(b) 11,66±1,47(b)

Resultados expressos em média ± E.P.M., (a) multiplicados por 10 (g/f) e (b) (volume) ml, da pata direita,

analisados estatisticamente por ANOVA seguido do teste de Dunnett´s.

Errata

Página

Onde se lê

Leia

A contorção abdominal foi induzida pela

administração de ácido.....

A contorção abdominal foi induzida em

animais em jejum prévio de 24h, pela

administração de ácido.....

Os animais foram selecionados antes do

tratamento,

Os animais sem jejum prévio foram

selecionados antes do tratamento

39 Foram selecionados os animais com tempo... Foram selecionados os animais, sem jejum

prévio, com tempo de reação...

0.625, 03125 e 0.15625µg/ml 0.0625, 0.03125 e 0.015625µg/ml

47 (Tabela 6) (Tabela 5)

47 (Tabela 5) (Tabela 6)

No peso do baço nas doses de 3500mg/Kg

(Fêmeas) e 5250mg/Kg (machos)

No peso do baço na dose de 5250mg/Kg

(machos)

59 (A) 60 minutos (6) sobre as barras do grupo controle e do

extrato

60 ------- Onde ** p<0,01

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