( PDF ) Estudos dos óleos essenciais extraídos de resinas de espécies Protium spp

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Érica Aparecida Souza Silva

Estudos dos óleos essenciais extraídos de resinas

de espécies Protium spp.

Dissertação apresentada ao Instituto de Química

de São Carlos, da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Mestre em Ciências

(Química Analítica).

Orientador: Prof. Dr. Gilberto Orivaldo Chierice.

São Carlos

2006

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Dedicatória

A Deus

Que me permitiu trilhar este caminho

Protegendo-me dos males

Confortando-me no desalento

Dando-me forças para continuar

Sempre.

À minha mãe Joelita,

Mulher guerreira e determinada,

Minha maior fonte de inspiração na vida

Sempre com as palavras certas,

Gestos de bondade e compreensão suprema comigo,

Ensinou-me os valores

Mais importantes de minha vida,

A própria expressão do Amor.

À minha avó Francisca (in memorian),

Por seu pulso forte, imprescindível,

Pelos ensinamentos infinitos,

Pelas histórias contadas sob a mangueira,

Momentos inesquecíveis,

Meu eterno Amor e Gratidão.

À Aia,

Por ser o anjo de nossas vidas,

Nossa pedra mais preciosa.

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Ao Prof. Dr. Gilberto Orivaldo Chierice,

Pela orientação neste trabalho,

Pela paciência e confiança,

E especialmente,

Pela amizade.

À amiga Sandra,

Pelo companheirismo,

Não mediu esforços ajudando-me neste trabalho e,

Pela amizade verdadeira que nasceu.

Aos meus amigos,

Luccy, Júnior, Fabiana e Rachel,

Um agradecimento especial,

Pela lealdade, incentivo e

Infinita compreensão.

Agradecimentos

Aos amigos do Alojamento C-1, pela hospitalidade, amizade e momentos de

descontração.

Aos amigos do Alojamento B-4 (Olimpo), pela amizade, momentos de diversão e

discussões surreais.

Aos amigos Rafa, Daniel (Salame), Allan (Calcinha) pelo convívio e amizade durante

todos estes anos.

Ao Prof. Dr. Mário Sergio Galhiane do Laboratório de Química Analítica e

Cromatografia Gasosa da UNESP de Bauru, pela ajuda imensurável neste trabalho,

discussões, sugestões e, palavras de ensinamentos.

Ao Marcos Vinicius do Laboratório de Química Analítica e Cromatografia Gasosa da

UNESP de Bauru, pela extrema solicitude durante as analises cromatográficas.

Ao Miguel Frasson pela super ajuda na editoração deste trabalho.

Aos colegas (alunos, técnicos e professores) dos grupos LATEQS e GQATP pela

convivência no laboratório e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

Aos técnicos do CAQI (Central de Análises Químicas Instrumentais do IQSC) pela

simpatia e disposição em ajudar-me.

Ao Prof. Dr. Jamal Chaar da Universidade do Amazonas pelo envio das amostras.

Ao Dr. Paulo de Tarso Sampaio do Departamento de Silvicultura do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), pela coleta e identificação das

amostras.

Ao Dr. Antonio Carlos Siani da FioCruz, pela concessão dos artigos.

Às bibliotecárias do IQSC, por toda ajuda no transcorrer deste trabalho.

À Profa. Dra. Eny Maria Vieira, pelas conversas no corredor do IQSC, serenidade e

palavras de incentivo, sempre.

Ao Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças, e ao Guilherme Miola do Grupo CROMA, por

conceder o uso do CG/EM e por toda ajuda durante a análise das amostras.

À Silvia e Andréia do serviço de pós-graduação, pela paciência, simpatia e solicitude

no atendimento.

Aos amigos do Centro Acadêmico (CAASO).

Aos meus familiares por acreditaram em mim.

A todas as outras pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização

deste trabalho.

Ao CNPq pelo suporte financeiro.

Sumário

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de Abreviaturas e Siglas

Resumo

Abstract

1 – Introdução...................................................................................................................... 15

1.1 – O Brasil e a Fitoquímica........................................................................................... 15

1.2 – Óleos Essenciais ..................................................................................................... 17

1.2.1 – Composição ..................................................................................................... 18

1.2.2 – Características ................................................................................................. 21

1.2.3 – Toxicidade........................................................................................................ 21

1.2.4 – Localização ...................................................................................................... 22

1.2.5 – Função biológica .............................................................................................. 22

1.2.6 – Aplicações........................................................................................................ 23

1.2.7 – Aspectos Econômicos...................................................................................... 25

1.3 – Métodos de Extração de Óleos Essenciais.............................................................. 26

1.3.1 – Enfloração ........................................................................................................ 26

1.3.2 – Prensagem....................................................................................................... 27

1.3.3 – Extração com Solvente Orgânico..................................................................... 27

1.3.4 – Extração por Fluido Supercrítico...................................................................... 27

1.3.5 – Arraste por Vapor d’Água................................................................................. 28

1.4 – Protium spp.............................................................................................................. 29

1.5 – Técnicas Espectrométricas...................................................................................... 33

1.5.1 – Espectroscopia de Absorção na Região do Ultravioleta-Vísivel....................... 33

1.5.2 – Espectrometria Vibracional na região do Infravermelho (IV) [42]..................... 35

1.5.3 – Espectrometria de Massas (EM)...................................................................... 35

1.6 – Técnicas Cromatográficas ....................................................................................... 37

1.6.1 – Cromatografia em Camada Delgada (CCD)..................................................... 37

1.6.2 – Cromatografia em Fase Gasosa (CG).............................................................. 38

1.6.2.1 – Detectores ................................................................................................ 39

1.6.2.1.1 – Detector de Massas (EM) ................................................................. 40

1.7 – Métodos de Quantificação ....................................................................................... 41

1.7.1 – Método do Padrão Externo .............................................................................. 41

1.7.2 – Método de Adição de Padrão........................................................................... 41

1.7.3 – Método de Padrão Interno................................................................................ 42

Sumário

1.7.4 – Método de Normalização ................................................................................. 42

1.8 – Objetivos do Trabalho.............................................................................................. 43

2 – Parte Experimental........................................................................................................ 44

2.1 – Identificação, Coleta e Armazenamento das Amostras........................................... 44

2.1.1 – Coleta e Identificação das Espécies Protium spp. ........................................... 44

2.1.2 – Armazenamento das Amostras........................................................................ 44

2.2 – Extração dos Óleos Essenciais................................................................................ 44

2.2.1 – Determinação do Tempo de Extração.............................................................. 45

2.3 – Características Físicas dos Óleos Essenciais ......................................................... 45

2.3.1 – Densidade ........................................................................................................ 45

2.3.2 – Índice de Refração ........................................................................................... 46

2.3.3 – Ponto de Ebulição ............................................................................................ 46

2.4 – Técnicas Espectroscópicas e Cromatográficas Utilizadas para Análise dos Óleos

Essenciais................................................................................................................ 47

2.4.1 – Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho (IV)........................ 47

2.4.2 – Espectroscopia de Absorção na Região do Ultravioleta (UV).......................... 47

2.4.3 – Cromatografia em Camada Delgada (CCD)..................................................... 48

2.4.3.1 – Aplicação da Amostra............................................................................... 48

2.4.3.2 – Escolha da Fase Móvel ............................................................................ 49

2.4.3.3 – Separação e Revelação ........................................................................... 51

2.4.4 – Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas........ 52

2.4.4.1 – Quantificação............................................................................................ 53

3 – Resultados e Discussão ............................................................................................... 54

3.1 – Extração dos Óleos Essenciais por Hidrodestilação................................................ 54

3.2 – Tempo de Extração dos Óleos Essenciais .............................................................. 55

3.3 – Propriedades Físico-Químicas dos Óleos Essenciais ............................................. 57

3.4 – Análises Espectroscópicas dos Óleos Essenciais................................................... 60

3.4.1 – Análises por Infravermelho............................................................................... 60

3.4.2 – Análises por Ultravioleta................................................................................... 64

3.5 – Análises Cromatográficas dos Óleos Essenciais..................................................... 65

3.5.1 – Análises por CG/EM......................................................................................... 66

3.5.2 – Separação por CCD....................................................................................... 112

3.5.3 – Quantificação dos Constituintes por Normalização Simples de Área ............ 127

4 – Conclusões .................................................................................................................. 131

4.1 – Perspectiva de Trabalhos Futuros......................................................................... 132

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos..................................................................... 133

6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais................................................................................ 146

7 – Bibliografia................................................................................................................... 151

Lista de Figuras

Figura 1 – Biossíntese dos terpenos via ácido mevalônico [7]............................................. 20

Figura 2 – Sistema de clevenger modificado........................................................................ 28

Figura 3 – Resina recém exsudada do tronco de P. pallidum (A); Resina envelhecida no

tronco (B)....................................................................................................................... 31

Figura 4 – Suporte de vidro com saída capilar pra DSC. ..................................................... 47

Figura 5 – Fluxograma genérico da metodologia experimental utilizada na CCD................ 52

Figura 6 – Rendimento na extração do óleo essencial em função do tempo....................... 56

Figura 7 – Curvas termoanalíticas de DSC para os óleos essências das resinas Protium

spp................................................................................................................................. 58

Figura 8 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P. hebetatum.

....................................................................................................................................... 61

Figura 9 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P. nitidifolium.

....................................................................................................................................... 61

Figura 10 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P.

amazonicum. ................................................................................................................. 62

Figura 11 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P.

divarictium...................................................................................................................... 62

Figura 12 – Espectros de absorção no UV dos óleos essenciais extraídos das espécies

Protium ssp.................................................................................................................... 65

Figura 13 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

hebetatum...................................................................................................................... 66

Figura 14 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

nitidifolium...................................................................................................................... 67

Figura 15 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

divarictium...................................................................................................................... 67

Figura 16 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

amazonicum. ................................................................................................................. 68

Figura 17 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Tricicleno

(pico 1) na amostra P. hebetatum. ................................................................................ 71

Figura 18 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-Pineno

(pico 2): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum......... 73

Lista de Figuras

Figura 19 – Fragmentograma experimental do componente identificado como α-Fencheno

(pico 3) na amostra P. hebetatum. ............................................................................... 74

Figura 20 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Canfeno

(pico 4): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum ....... 76

Figura 21 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Sabineno

(pico 5) na amostra P. nitidifolium. ................................................................................ 76

Figura 22 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como β-Pineno

(pico 6): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum. ....... 78

Figura 23 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como cis-Pinano

(pico 7): a) P. nitidifolium; b) P. divarictium;................................................................... 79

Figura 24 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como 3-p-

Menteno (pico 8): a) P. hebetatum; b) P.divarictium; c) P. amazonicum...................... 81

Figura 25 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-

Felandreno (pico 9): a) P. hebetatum; b) P. divarictium. ............................................... 82

Figura 26 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como δ-2-Careno

(pico 10): a) P. hebetaum; b) P. divarictium. ................................................................. 83

Figura 27 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como o-Cimeno

(pico 11): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P.divarictium; d) P. amazonicum. ....... 85

Figura 28 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Limoneno

(pico 12): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum........ 87

Figura 29 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como γ-Terpineno

(pico 13): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium................................................................... 88

Figura 30 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Terpinoleno

(pico 14) na amostra P. nitidifolium. .............................................................................. 88

Figura 31 – Fragmentograma experimental do componente identificado como p-Cimeneno

(pico 15) na amostra P. divarictium. .............................................................................. 89

Figura 32 – Fragmentograma experimental do componente identificado como trans-Sabinol

(pico 16) na amostra P. nitidifolium. .............................................................................. 89

Figura 33 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Terpin-4-ol

(pico 17): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium. ...................................... 91

Figura 34 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-Terpineol

(pico 18): a) P.hebetatum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium. ...................................... 92

Figura 35 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Tuj-3-em-10-

al (pico 19) na amostra P. nitidifolium............................................................................ 93

Figura 36 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Verbenona

(pico 20) na amostra P. nitidifolium. .............................................................................. 93

Lista de Figuras

Figura 37 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como δ-Elemeno

(pico 21): a) P. nitidifolium; b) P.a amazonicum. ........................................................... 94

Figura 38 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-

Cubebeno (pico 22): a) P. hebetatum; b) P. divarictium; c) P. amazonicum................. 96

Figura 39 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como

Ciclosativeno (pico 23): a) P. divarictium; b) P. amazonicum........................................ 97

Figura 40 – Fragmentograma experimental do componente identificado como β-Elemeno

(pico 24) na amostra P. amazonicum........................................................................... 97

Figura 41 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Z-cariofileno

(pico 25) na amostra P. amazonicum............................................................................ 98

Figura 42 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como E-

Cariofileno (pico 26): a) P. hebetatum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P.

amazonicum. ............................................................................................................... 100

Figura 43 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Cedrano

(pico 27): a) P. divarictium; b) P. amazonicum;........................................................... 101

Figura 44 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-

Humuleno (pico 28): a) P. nitidifolium; b) P. divarictium; c) P. amazonicum. .............. 102

Figura 45 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Seicheleno

(pico 29): a) P. hebetatum; b) P. divarictium. .............................................................. 103

Figura 46 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como γ-Muuroleno

(pico 30): a) P. nitidifolium; b) P. amazonicum. ........................................................... 104

Figura 47 – Fragmentograma experimental do componente identificado como α-Selineno

(pico 31) na amostra P. nitidifolium. ........................................................................... 105

Figura 48 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como δ-Cadideno

(pico 32): a) P. hebetatum; b) P. divarictium; c) P. amazonicum................................. 106

Figura 49 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Elemol (pico

33) na amostra P. nitidifolium. .................................................................................... 107

Figura 50 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Óxido de

Cariofileno (pico 34) na amostra P. divarictium. ......................................................... 107

Figura 51 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como cis-diidro-

Acetato de Ocidentalol (pico 35): a) P. nitidifolium; b) P. amazonicum. ...................... 108

Figura 52 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Drimenol (pico

36) na amostra P.divarictium....................................................................................... 109

Figura 53 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como trans-diidro-

Acetato de Ocidentalol (pico 37): a) P.divarictium; b) P. amazonicum........................ 110

Lista de Figuras

Figura 54 – Fragmentograma experimental do componente identificado como 2-Acetato de

Fenil-Etil-Fenila (pico 38) na amostra P.divarictium. ................................................... 110

Figura 55 – Metodologia empregada na análise por CCD.................................................. 113

Figura 56 – Visualização sob luz UV

254 nm

da separação dos constituintes dos óleos

essenciais de Protium spp. por CCD (fase móvel 1)................................................... 114

Figura 57 – Visualização sob luz UV

254 nm

da separação dos constituintes dos óleos

essenciais de Protium spp. por CCD (fase móvel 2)................................................... 114

Figura 58 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F1 (P. hebetatum)..................... 115

Figura 59 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F5 (P. hebetatum)..................... 116

Figura 60 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F6 (P. nitidifolium)..................... 117

Figura 61 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F7 (P. divarictium)..................... 118

Figura 62 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F8 (P. amazonicum).................. 118

Figura 63 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F9 (P. hebetatum)..................... 119

Figura 64 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F10 (P.nitidifolium).................... 120

Figura 65 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F10 (P.divarictium).................... 120

Figura 66 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F12 (P.hebetatum).................... 121

Figura 67 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F14 (P.amazonicum)................. 122

Figura 68 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F15 (P.hebetatum).................... 123

Figura 69 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F16 (P.nitidifolium).................... 124

Figura 70 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F17 (P.divarictium).................... 124

Figura 71 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F18 (P.amazonicum)................. 125

Figura 72 – Fragmentograma teórico do composto Tricicleno (1)...................................... 133

Figura 73 – Fragmentograma teórico do composto α-Pineno (2)....................................... 133

Figura 74 – Fragmentograma teórico do composto α-Fencheno (3).................................. 133

Figura 75 – Fragmentograma teórico do composto Canfeno (4)........................................ 134

Figura 76 – Fragmentograma teórico do composto Sabineno (5). ..................................... 134

Figura 77 – Fragmentograma teórico do composto β-Pineno (6)....................................... 134

Figura 78 – Fragmentograma teórico do composto cis-Pinano (7)..................................... 135

Figura 79 – Fragmentograma teórico do composto 3-p-Menteno (8)................................. 135

Figura 80 – Fragmentograma teórico do composto α-Felandreno (9)................................ 135

Figura 81 – Fragmentograma teórico do composto 2-δ-Careno (10). ................................ 136

Figura 82 – Fragmentograma teórico do composto o-Cimeno (11).................................... 136

Figura 83 – Fragmentograma teórico do composto Limoneno (12).................................... 136

Figura 84 – Fragmentograma teórico do composto γ-Terpineno (13)................................. 137

Figura 85 – Fragmentograma teórico do composto γ-Terpinoleno (14).............................. 137

Figura 86 – Fragmentograma teórico do composto p-Cimeneno (15)................................ 137

Lista de Figuras

Figura 87 – Fragmentograma teórico do composto trans-Sabinol(16). .............................. 138

Figura 88 – Fragmentograma teórico do composto Terpin-4-ol (17).................................. 138

Figura 89 – Fragmentograma teórico do composto α-Terpineol (18)................................. 138

Figura 90 – Fragmentograma teórico do composto Tuj-3-en-10-al (19)............................. 139

Figura 91 – Fragmentograma teórico do composto Verbenona (20).................................. 139

Figura 92 – Fragmentograma teórico do composto δ-Elemeno (21). ................................. 139

Figura 93 – Fragmentograma teórico do composto α-Cubebeno (22). .............................. 140

Figura 94 – Fragmentograma teórico do composto Ciclosativeno (23).............................. 140

Figura 95 – Fragmentograma teórico do composto β-Elemeno (24).................................. 140

Figura 96 – Fragmentograma teórico do composto Z-Cariofileono (25)............................. 141

Figura 97 – Fragmentograma teórico do composto E-Cariofileono (26)............................. 141

Figura 98 – Fragmentograma teórico do composto Cedrano (27)...................................... 141

Figura 99 – Fragmentograma teórico do composto α-Humuleno (28)................................ 142

Figura 100 – Fragmentograma teórico do composto Seicheleno (29)................................ 142

Figura 101 – Fragmentograma teórico do composto γ-Muuroleno (30).............................. 142

Figura 102 – Fragmentograma teórico do composto α-Selineno (31)................................ 143

Figura 103 – Fragmentograma teórico do composto δ-Cadideno (32)............................... 143

Figura 104 – Fragmentograma teórico do composto Elemol (33). ..................................... 143

Figura 105 – Fragmentograma teórico do composto Óxido de Cariofileno (34)................. 144

Figura 106 – Fragmentograma teórico do composto cis-Diidro Acetato de Ocidentalol (35).

..................................................................................................................................... 144

Figura 107 – Fragmentograma teórico do composto Drimenol (36)................................... 144

Figura 108 – Fragmentograma teórico do composto trans-Diidro Acetato de Ocidentalol (37).

..................................................................................................................................... 145

Figura 109 – Fragmentograma teórico do composto 2-Acetato de di-Fenil Etila (38). ....... 145

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Dados encontrados na literatura sobre a composição dos óleos essenciais

extraídos de espécies Protium. ..................................................................................... 32

Tabela 2 – Mistura de solventes utilizados para o desenvolvimento das cromatoplacas..... 50

Tabela 3 – Rendimento dos óleos essenciais extraídos por hidrodestilação........................ 54

Tabela 4 – Propriedades físico-químicas dos óleos essenciais extraídos das resinas das

espécies Protium spp. ................................................................................................... 59

Tabela 5 – Possível identificação dos constituintes nos óleos essenciais de Protium spp... 69

Tabela 6 – Concentração relativa dos componentes possivelmente identificados nos óleos

essenciais de Protium spp........................................................................................... 128

Lista de Abreviaturas e Siglas

Lista de Abreviaturas ou Siglas

α Alfa

β Beta

λ Comprimento de Onda

δ Delta

γ Gama

Constante Dielétrica

°C Graus Celsius

°C min

-1

Graus Celsius por Minuto

µL Microlitro

máx

Absortividade Molar

A Absorbância

Acetil CoA Acetil Coenzima A

AcOEt Acetato de Etila

AM Amazonas

AMV Ácido Mevalônico

b Caminho Ótico

c Concentração

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CG/EM Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas

CGC Cromatografia Gás-Sólido

Diclorometano

CHCl

Clorofórmio

CLC Cromatografia Gás-Líquido

-1

Número de Ondas

DMAPP Pirofosfato de 3,3-Dimetilalila

DSC Differential Scanning Calorimetry

eV Elétron Volt

FPP Pirofosfato de Farnesila

g Grama

Lista de Abreviaturas e Siglas

GGPP Pirofosfato de Geranil Geraniol

GPP Pirofosfato de Geranila

h Horas

Hex Hexano

I.E. Impacto de elétrons

INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia

IPP Pirofosfato de Isopentila

ISO Organização Internacional de Padrão

IV Infravermelho

KBr Brometo de Potássio

LM Lanças & Mário

•+

Cátion Radical

m/z Massa/Carga

Metros Quadrados

min. Minuto

mL Mililitro

Mm Milímetro

mmHg Milimetros de Mercúrio

mol. L

-1

Mol por Litro

Sulfato de Sódio

Nm Nanômetro

P. Protium (gênero)

P.I. Padrão Interno

Fator de Retenção

s Segundos

T Transmitância

Tempo de Retenção

UNESP Universidade Estadual Paulista

UV Ultravioleta

v Volume

v/v Volume/Volume

W g

-1

Watt por Grama

Resumo

Protium é o principal gênero pertencente à família Burseraceae e um dos

gêneros mais comum na América do Sul, sendo representativo na flora da Região

Amazônica. Na medicina popular, as oleorresinas das espécies Protium são

amplamente utilizadas para diversos propósitos pelas tribos nativas das regiões

onde estas espécies ocorrem. No presente estudo, os óleos essenciais de quatro

espécies Protium foram extraídos, quantitativamente por hidrodestilação. Estas

resinas foram coletadas de árvores catalogadas no Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia (INPA), na Reserva Ducke, Manaus/AM, em novembro de 2004. Foram

determinadas as características físico-químicas destes óleos. Técnicas

espectroscópicas, como espectrometria de absorção no infravermelho (IV),

espectrometria de absorção no ultravioleta (UV) e espectrometria de massas (EM),

foram utilizadas como ferramentas qualitativas nas análises destes óleos. Foi

utilizada cromatografia em camada delgada (CCD) para a separação dos

constituintes destes óleos em frações. Para identificação e quantificação dos

componentes destes óleos foi utilizada cromatografia gasosa acoplada a

espectrometria de massas (CG/EM). Os espectros de massas obtidos para os

componentes individuais dos óleos foram analisados por comparação com os

espectros da literatura [52]. Os rendimentos nas extrações foram: 3,1% (P.

hebetatum), 3,33% (P. nitidifolium), 2,6% (P.divarictium) e 2,77% (P.amazonicum).

No óleo extraído da espécie P. hebetatum foram identificados 17 compostos, sendo

os monoterpenos constituintes predominantes na composição deste óleo. No óleo

extraído das espécies P. nitidifolium e P. divarictium foram identificados 21 e 23

componentes, respectivamente. No óleo extraído da espécie P. amazonicum foram

identificados 18 compostos. Uma característica notável nesta amostra é a

predominância de sesquiterpenos em sua composição. A literatura relata a

predominância de sesquiterpenos exclusivamente em óleos essenciais extraídos de

folhas de espécies Protium spp. É importante salientar ainda, que não há relatos na

literatura acerca de óleos essências das espécies P. amazonicum e P. divarictium.

Abstract

Protium is the main genus in the Burseracea family and is one of the most

widespread genera in South America, being very representative in the flora of the

Amazon region. In the folk medicine, the oleoresins from species of Protium are

widely used for several purposes by the native tribes in the regions where they occur.

In the present study the essential oils of four species of Protium were extracted

quantitatively by hidrodestillation from aged resins. These samples were collected

from trees catalogued by the National Institute of Resesarch of Amazonia (INPA), in

the National Forest Ducke, Manaus – Amazonas, in November 2004. The oils

extracted were analyzed in order to determine its physical-chemical characteristics.

Spectroscopic techniques such as infrared absorption spectroscopy, ultraviolet

absorption spectroscopy and mass spectrometry were used to analyze these oils.

Thin layer chromatography was used to separate the fractions of the components

from these samples. For the identification and quantification of the components, the

coupled gas chromatography-mass spectrometry technique was employed. The

registered mass spectra of these oils compounds were compared with those of the

literature [52]. The extractions yields were 3.1% (P. hebetatum), 3.33% (P.

nitidifolium), 2.6% (P.divarictium) and 2.77% (P.amazonicum). In the P. hebetatum oil

17 compounds were identified, being the monoterpenes predominate in this oil

composition. In the P. nitidifolium oil 21 compounds were identified and, in the P.

divarictium oil 23 compounds. In the P. amazonicum oil 18 compounds were

identified, and the major constituent identified was the sesquiterpene cedrane. A

noticeable feature is the predominance of sesquiterpenes in the composition of the P.

amazonicum oil. These compounds are reported to be majoritary in essential oils

extracted of Protium species leaves. It is important to notice that, in the present

moment, no data was reported about P. amazonicum and P.divarictium essential oils.

The results show a high potential of these species as a relevant research area,

mainly in Brazil that owns the major flora of the world, the Amazon Forest.

1 – Introdução 15

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1 – Introdução

Essa introdução dará uma visão sobre os principais tópicos abordados nesta

dissertação, desde a importância de estudos fitoquímicos no contexto brasileiro,

aspectos econômicos, e menções sobre as espécies em estudo Protium spp,

passando pelos meios de extração e técnicas de caracterização do óleo essencial,

bem como a finalização do trabalho com a quantificação dos componentes

majoritários destes óleos essenciais.

1.1 – O Brasil e a Fitoquímica

A fitoquímica é a ciência destinada ao estudo dos componentes químicos das

plantas. A aplicação dos estudos fitoquímicos pode se ramificar para a área médica,

assim como para a taxonomia e química, entre outras aplicações.

Os vegetais produzem uma diversidade de substâncias, produtos do

metabolismo secundário, alguns responsáveis pela coloração e aroma de flores e

frutos, outras vinculadas com a interação ecológica. O conhecimento dos

constituintes químicos de diversas partes da planta favorece o seu uso sustentável e

contribui para sua conservação.

As fontes de metabólitos secundários parecem ser inesgotáveis em relação

as possibilidades de se encontrar novas e diferentes estruturas com atividades de

extrema importância medicinal ou comercial [1].

1 – Introdução 16

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

A diversidade de estruturas moleculares foi indicada como razão fundamental

do atual interesse das grandes industrias pelos produtos naturais [1].

Por volta de 1970, a Organização Mundial da Saúde (OMS) reconheceu o

valor das plantas medicinais, considerando os promissores e consagrados

resultados da medicina tradicional chinesa [1].

Como conseqüência do retorno aos produtos naturais como fonte de

medicamentos, muitos fármacos importantes foram desenvolvidos de 1980 até o

presente [1].

O panorama atual para a fitoquímica é muito mais importante, decisivo e

perigoso para o Brasil, ao considerarmos sua grande riqueza vegetal ainda sem

estudo, as possibilidades, e a falta de estimulo e legislação visando o

desenvolvimento cientifico nesta área [2].

Em solo brasileiro estão seis ecossitemas, entre eles a maior floresta tropical

do mundo, a Amazônia. Em, aproximadamente, cada 100 m

da mata encontra-se

de 100 a 300 espécies de plantas. Um gigantesco laboratório da natureza que

garante ao Brasil o título de país de maior biodiversidade da terra [3]

A biodiversidade da flora existente no Brasil e, em particular na floresta

amazônica, representa um grande potencial para o estudo fitoquímico, porém tal

estudo deve ser realizado com responsabilidade, de modo a não acarretar o

desaparecimento de suas espécies [2].

Tomando como exemplo as espécies produtoras de óleos essenciais, de

acordo com a família que pertencem, estas espécies acumulam esse óleo em

órgãos anatômicos específicos. Do ponto de vista da exploração da biodiversidade

vegetal, quando este órgão representa um substrato renovável (resina, folha,flor,

1 – Introdução 17

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

fruto ou semente), é possível extrair-se o óleo essencial sem eliminar a planta. Isso a

torna uma fonte de óleo ecologicamente correta [4].

Caso, não seja possível a preservação desta planta, um reflorestamento

compensador deve ser feito. Trata-se de um problema de grande proporção, pois

dentro de algumas décadas as reservas naturais poderão estar chegando ao seu

fim, devido à pratica extrativa indiscriminada.

Uma empresa suíça, a Novartis, fez um acordo, no inicío desta década, com a

organização social brasileira BioAmazônia para a exploração de matéria-prima na

Amazônia. Este acordo previa o envio em larga escala, para o exterior, de derivados

da biodiversidade amazônica, permitindo que a Novartis patenteasse e controlasse,

com exclusividade, os produtos desenvolvidos por ela a partir de microorganismos,

fungos e plantas coletadas pela BioAmazônia [5].

Caso o Brasil não revise sua atual política extrativista, diante desta nova

busca mundial pelos produtos naturais, corre o risco de perder seu patrimônio

vegetal, por não ter uma rígida legislação que cuide do controle sustentável da

biodiversidade do país.

1.2 – Óleos Essenciais

A ISO (International Standardatization Organization) define óleos essenciais

ou, óleos voláteis, como produtos obtidos de partes de plantas através de destilação

por arraste com vapor d’água [6].

Os óleos essenciais são misturas complexas e muito variáveis de

constituintes voláteis que pertencem de forma quase exclusiva a duas séries,

1 – Introdução 18

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

caracterizadas por suas origens biossintéticas distintas: a série terpênica e a série,

muita menos freqüente, dos fenilpropanóides [7].

Também podem ser chamados de óleos essenciais, óleos etéreos, ou

essências. Essas denominações derivam de algumas de suas características físicas,

como por exemplo, a de terem aparência oleosa à temperatura ambiente, advindo,

daí, a designação de óleo.

1.2.1 – Composição

A composição dos óleos essenciais das plantas é determinada geneticamente,

podendo variar com os seguintes fatores: a) origem botânica (a composição de um

óleo essencial está em função da espécie produtora); b) quimiotipo (os constituintes

químicos do óleo essencial variam com a geografia); c) ciclo vegetativo (dependendo

da época do ano pode varia a porcentagem dos constituintes); d) fatores da

natureza, climáticos e tipo de solo influenciam na produção do óleo essencial; e)

procedimento de obtenção (o modo de extração pode influenciar na composição

química do óleo, extraindo ou não determinados constituintes) [7].

Os produtos químicos produzidos pelos vegetais podem ser divididos em dois

grandes grupos. O primeiro, essencial a todos o seres vivos, são os metabólitos

primários, ou macromoléculas, como os lipídios, protídeos e glicídios que, às custas

de energia originam o segundo grupo de compostos químicos,os metabólitos

secundários, que são micromoléculas com estruturas complexas, possuindo

atividades biológicas com funções variadas [8].

Destaca-se como a principal função das substancias produzidas pelo

metabolismo secundário a de proteger os organismos que as produzem.

1 – Introdução 19

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Os óleos essenciais, no entanto, são formados por constituintes variados,

desde hidrocarbonetos terpênicos, alcalóides, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres,

óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e até compostos

sulforados, constituintes do metabolismo secundário. Entretanto, a grande maioria

dos óleos essenciais é formada por terpenos voláteis.

Os terpenos são substâncias que possuem como unidade básica a molécula

de isopreno CH

=C(CH

)-CH=CH

. Seu precursor na natureza, no entanto, é o ácido

mevalônico, produzido a partir do acetil CoA (acetato ativo), que dá origem ao

pirofosfato de isopentila (IPP) e ao pirofosfato de 3,3-dimetilalila (DMAPP) [5,9].

O próprio isopreno não intervem na biossíntese e esta “regra isoprênica”

utilizada na classificação dos terpenos é meramente teórica, mas tem a vantagem de

mostrar perfeitamente a unidade biossintética deste grupo, e de dar conta da

subdivisão dos terpenos segundo o número de unidades que intervem:

monoterpenos (10 unidades de carbono); sesquiterpenos (15 unidades de carbono);

diterpenos (20 unidades de carbono); sesteterpenos (25 unidades de carbono);

triterpenos e esteróides (30 unidades de carbonos); tetraterpenos ou carotenóides

(40 unidades de carbono).

Na síntese dos terpenos é fundamental a ocorrência de três seqüências

reacionais:

1. Formação do “isopreno ativo” a apartir do acetato via ácido mevalônico;

2. Acoplamento “cabeça-cauda” das unidades de C5 que justifica a

existência de mono, sesqui, di e sesteterpenos;

3. Acoplamento “cauda-cauda” da unidades de C15 ou C20 que justifica a

existência de triterpenos, esteróides e carotenóides [7].

1 – Introdução 20

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

A Figura 1 ilustra a rota de biossíntese dos terpenos via ácido mevalônico.

Figura 1 – Biossíntese dos terpenos via ácido mevalônico [7].

Acetil CoA AMV IPP DMAPP

GPP

FPP

GGPP

Monoterpenos C

Sesquiterpenos C

Diterpenos C

Sesterterpenos C

Politerpenos

+ C

Triterpenos C

Carotenos C

1 – Introdução 21

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Os terpenos e seus derivados oxigenados podem ser de cadeias abertas ou

cíclicos, suas diversidades estruturais resultam nas diferentes atividades biológicas

observadas nos óleos essenciais.

Rearranjos, degradação oxidativa ou introdução de novos átomos de carbono

podem transformar um esqueleto terpênico em outro que não apresenta a seqüência

normal de átomos de carbono que caracteriza a classe. Substâncias assim formadas

são também consideradas como terpenos, uma vez que a rota de biossíntese inicial

é a mesma [10].

1.2.2 – Características

A principal característica dos óleos essenciais é a volatilidade, diferindo-se

assim, dos óleos fixos que são misturas de substâncias lipídicas, obtidos geralmente

das sementes.

Os óleos essenciais são líquidos à temperatura ambiente, tem coloração clara

e, em geral, sua densidade é menor que a da água. Quase sempre dotados de

poder de rotação, têm índice de refração elevado. Solúvel em álcoois, e em

solventes orgânicos habituais, são lipossolúveis e muito pouco solúveis em água,

são arrastáveis por vapor d’água [7].

1.2.3 – Toxicidade

A conotação “produto natural” colocada ao publico pode levar a uma

interpretação errada, levando, algumas vezes, a um emprego abusivo destas

substâncias, ou, a uma automedicação perigosa.

1 – Introdução 22

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.2.4 – Localização

Os óleos essenciais são raramente encontrados no grupo das Gimnospermas

(com exceção das coníferas). Ao contrário, as Angiospermas são plantas ricas em

óleos essenciais tais como as encontradas nas famílias Lauraceae, Piperaceae,

Rutaceae, Burseraceae, entre outras [8].

Dependendo da família a síntese e o acumulo dos óleos essenciais vem

associados a presença de estruturas histológicas especializadas, localizadas em

determinados pontos do tecido vegetal, como em pêlos glandulares, células

parenquimáticas diferenciadas, canais oleíferos e bolsas que podem estar presentes

em alguns dos seguintes órgãos das plantas: flores, frutos, lenhos, cascas, raízes e

sementes [7-8].

1.2.5 – Função biológica

A formação dos óleos essenciais ainda é muito discutida, assim como sua

função na planta. Para alguns citologistas os óleos essenciais seriam matérias-

primas residuais resultantes de fenômenos metabólicos, que a planta excretaria de

suas células afim de eliminá-los.

Sabe-se, porém, que a formação destes óleos essenciais tem intima ligação

coma qualidade de vida ou, por assim dizer, sobrevivência da planta.

Estão associados a varias funções necessárias à sobrevivência do vegetal em

seu ecossitema, exercendo papel fundamental na defesa contra microorganismos e

predadores, e também, na atração de insetos e outros agentes fecundadores [4].

Exalados como bálsamos ou resinas, agem nas árvores como selos protetores

contra doenças ou parasitas. Os componentes dos óleos essenciais são

1 – Introdução 23

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

quimicamente ativos podendo participar de reações metabólicas, assim como a

complexidade de sua composição permite uma interação química complexa e

seletiva da planta frente ao meio ambiente [8].

Os óleos essenciais são quase sempre bacteriostáticos e, freqüentemente

bactericida. Tem função na polinização, como meio de defesa frente à predadores,

microorganismos, parasitas, insetos e herbívoros. Possuem ação tóxico-protetora

sobre a germinação, ação esta facilitada pela localização periférica dos órgãos

secretores [7,11].

1.2.6 – Aplicações

O uso de óleos essenciais como agentes medicinais é conhecido desde a

remota antiguidade. Há registros pictóricos de seis mil anos atrás, entre os egípcios,

de práticas religiosas associadas à cura de males, às unções de realeza, e a busca

de bem estar físico através de aromas obtidos de partes específicas de certos

vegetais, como resinas, flores, folhas e sementes.

As substâncias aromáticas também já eram populares nas antigas China e

Índia. No entanto, foi apenas a partir da Idade Média, através do processo de

destilação introduzido pelos cientistas mulçumanos, que se iniciou a real

comercialização de materiais aromáticos [4].

Sem dúvida, os óleos essenciais encontram sua maior aplicação biológica

como agentes antimicrobianos. Esta capacidade, presente na maioria destes

compostos, de certa maneira, representa uma extensão do próprio papel que

exercem nas plantas, defendendo-as de bactérias e fungos patogênicos.

1 – Introdução 24

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

A maior parte dos trabalhos sobre atividades biológicas atribuídas aos óleos

essenciais na literatura especializada versa sobre o aspecto antimicrobiano destes

(bactericida e fungicida) [12-17].

Muitos autores associam a atividade bactericida dos óleos aos seus

constituintes hidrocarbonetos, sugerindo que maior será a atividade bactericida

deste óleo quanto maior for sua composição de monoterpenos hidrocarbonetos.

Algum trabalho também já foi feito com o intuito de comprovar que estes

monoterpenos também são responsáveis pela atividade antifúngica dos óleos

essências [13].

Há ainda na literatura relatos sobre atividades antiinflamatória, antioxidante e

inseticida de óleos essenciais [12,15,16,18,20].

Seguindo um paradigma análogo ao papel dos terpenóides nas plantas, a

pesquisa dos óleos essenciais como agentes repelentes de insetos vem revelando o

potencial destes compostos nesta área. Foram realizados com sucesso alguns

testes biológicos de repelência aos insetos vetores de doenças, como os mosquitos

do gênero Aedes, transmissores da dengue, e o transmissor da doença de chagas

[21-23].

Alguns óleos essenciais mostraram-se ativos em testes in vitro contra o

agente infectante da malária, outros demonstraram atividade inibidora em alguns

vírus, incluindo herpes simplex 1, influenza e HIV [24-26].

Esta série de resultados confirma o potencial uso dos óleos essências de

plantas em industrias farmacêuticas, e alimentícias na preservação de produtos

alimentícios contra fungos e bactérias, e no combate a doenças de origem

1 – Introdução 25

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

microbiológica. Podendo ainda, alguns destes óleos serem sugeridos como

alternativa ecologicamente correta de inseticida.

1.2.7 – Aspectos Econômicos

Pela utilização crescente nas indústrias de alimentos, cosméticos, e

farmacêuticas, o cultivo de espécies aromáticas e a obtenção de óleos essenciais

constituem importantes atividades econômicas. Assim sendo, há na economia

mundial um movimento enorme de capital pelas indústrias de essências.

Algumas indústrias consomem quantidades importantes de essências

especificas, utilizando-as na flotação de minérios, preparação de agentes molhantes,

inseticidas, bem como na medicina, onde ainda fornecem compostos de partida para

a síntese de outras substâncias úteis na indústria farmacêutica [5].

O Brasil ocupa atualmente um lugar de destaque neste vasto campo. O maior

incentivo foi a escassez de vários óleos essências durante a Segunda Guerra

Mundial. O Brasil chegou a conquistar o primeiro lugar na produção de alguns óleos,

tanto de plantas de sua flora, quanto de culturas organizada, uma vez que, grande

parte dos óleos essenciais mundialmente comercializados são oriundos de culturas

racionalizadas, visando a maior reprodutibilidade do perfil químico do produto.

O maior problema para o desenvolvimento das industrias produtoras de óleos

essenciais é a grande concorrência com os similares sintéticos. Estes óleos

sintéticos podem ser imitações dos naturais, porém de constituição limitada em

relação à diversidade de compostos presentes nos naturais. Por isso, em alguns

setores, como, por exemplo, nas industrias cosmética e alimentícia, há uma

1 – Introdução 26

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

preferência pelo produto natural, pois o sintético não confere as mesmas

propriedades do natural, principalmente no que se refere ao aroma [27].

São os casos da empresa de cosméticos Natura, que utiliza plantas

originalmente brasileiras, mas cultivadas em culturas organizadas e certificadas, na

fabricação de alguns produtos e, da empresa alimentícia Nestlé, que vem utilizando

flavorizantes naturais, os quais correspondem a 75% do total utilizado por esta

industria.

1.3 – Métodos de Extração de Óleos Essenciais

Os processos de extração variam conforme a localização do óleo essencial na

planta e com a finalidade de utilização do mesmo. A seguir, encontram-se alguns

exemplos dos métodos de extração mais utilizados.

1.3.1 – Enfloração

Esse método já foi muito utilizado, mas atualmente é empregado apenas por

indústrias de perfumes, no caso de algumas plantas com baixo teor de óleo de alto

valor comercial, como na extração do óleo essencial de pétalas de flores. O método

consiste no depósito das pétalas, à temperatura ambiente, sobre uma camada de

gordura, durante um certo tempo. Em seguida, essas pétalas esgotadas são

substituídas por novas até a saturação total, quando a gordura é tratada com álcool.

Para se obter o óleo essencial, o álcool é destilado a baixa temperatura, baixa

pressão e o produto assim obtido possui alto valor comercial [7].

1 – Introdução 27

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.3.2 – Prensagem

Esse método é empregado para a extração dos óleos essenciais de frutos

cítricos. Os pericarpos desses frutos são prensados e a camada que contém o óleo

essencial é então separada. Posteriormente o óleo essencial é separado da emulsão

formada com a água por decantação, centrifugação ou destilação fracionada [7].

1.3.3 – Extração com Solvente Orgânico

Os óleos essenciais são extraídos, preferencialmente, com solventes

orgânicos (éter, éter de petróleo ou diclorometano) que, entretanto, extraem outros

compostos lipofílicos, além do óleo essencial. Por isso, os produtos assim obtidos

raramente possuem valor comercial

[7].

1.3.4 – Extração por Fluido Supercrítico

Esse método permite recuperar de modo bastante eficiente não somente os

aromas de óleos essenciais, como vários outros tipos, sendo atualmente um dos

principais métodos de escolha para extração industrial de óleos essenciais. Nenhum

traço de solvente permanece no produto obtido, tornando-o mais puro do que

aqueles obtidos por outros métodos. Para tal extração, o CO

é primeiramente

liquefeito por compressão e, em seguida, aquecido a uma temperatura superior a

31°C. Nessa temperatura, o CO

atinge um quarto estado, no qual sua viscosidade é

análoga a de um gás, mas sua capacidade de dissolução é elevada como a de um

líquido. Uma vez efetuada a extração, faz-se o CO

retornar ao estado gasoso,

resultando na sua total eliminação [6,27].

1 – Introdução 28

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.3.5 – Arraste por Vapor d’Água

Os óleos voláteis possuem tensão de vapor mais elevada que a da água,

sendo por isso, arrastados pelo vapor d’água. Em pequena escala, emprega-se o

Sistema de Clevenger [28]. Com uma variação deste método, inclusive no sistema

de Clevenger, faz-se a extração do óleo volátil pela mistura do material vegetal à

água. Chamada de hidrodestilação obtém-se também o hidrolato, que é a parte

aquosa coma presença de uma porcentagem do óleo essencial que é solúvel nesta.

O óleo coletado deve ser seco com Sulfato de Sódio (Na

) Anidro [2,6,11].

Figura 2 – Sistema de clevenger modificado.

1 – Introdução 29

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.4 – Protium spp.

A família Burseraceae compreende aproximadamente 600 espécies e 21

gêneros distribuídos em três tribos: Protieae (4 gêneros) , Bowellieae (8 gêneros) e

Canarieae (9 gêneros) [29].

Espécies desta família são caracterizadas por exsudar resinas, que se

encontram armazenadas em dutos ou cavidades. As Burseraceaes quase sempre

têm traços de látex branco resinoso tanto em seus ramos, como dispersos em

formas de gotículas em talhos feitos na casca. Ferimentos nos troncos são

caracterizados pelo esbranquiçamento, devido à rápida secagem da resina

aromática [29].

O fluxo natural da resina é obtido também pela ação de insetos e, uma escala

de produção comercial pode ser eventualmente induzida por meios químicos [29].

A presença desta resina exsudada é, em muito, responsável pela

proeminência destas espécies Burseraceaes na etnobotânica das regiões onde

estas ocorrem, e mostra-se como uma fonte botânica muito atrativa,

comercialmente, de compostos aromáticos [29-30].

O gênero Protium, que têm cerca de 135 espécies, é o maior e mais

heterogêneo gênero na tribo Protieae, predominante nos Neotrópicos. Mais de 80%

das espécies Burseraceaes na região amazônica, por exemplo, pertencem a este

gênero [29].

O gênero Protium é amplamente encontrado na região amazônica, onde suas

óleo-resinas são popularmente conhecidas como “breus” [31-34].

1 – Introdução 30

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Estas resinas são colhidas na floresta sob as arvores e então vendidas nos

mercados da região amazônica para vários propósitos [30].

Na medicina popular é considerada um importante agente terapêutico, sendo

utilizada como antiinflamatório, analgésico, expectorante e cicatrizante [31-32].

Baseado nas experiências das populações nativas em utilizar este gênero

como antiinflamatório, Otuki et al (2005) obteve excelentes resultados utilizando o

extrato etéreo de Protium kleinii, como antiinflamatório de uso tópico [35].

A resina é utilizada também na industria de verniz e calefetagem de

embarcações e outros objetos de madeira [31-32,36], e também é popularmente

queimada pela sua ação repelente de insetos [30].

O mercado internacional é muito receptivo a este tipo de resina, por exemplo,

como fonte de fixadores para tintas artísticas, uma propriedade devido a riqueza de

triterpenos nas resinas de Protium spp [30].

Um exemplo disto é o trabalho apresentado por Cruz-Canizares et al (2005)

onde se estudou as resinas Burseraceaes utilizadas em selantes e vernizes para

obras-de-arte, e foi ainda proposto neste trabalho o uso de alguns triterpenos

derivados destas resinas como marcadores, devido à estabilidade destes compostos

durante longos períodos de tempo [37]. Este resultado mostra-se interessante, por

exemplo, na avalição da veracidade de heranças culturais em geral.

Desta forma, atualmente os estudos envolvendo os óleos essenciais extraídos

deste gênero têm merecido especial atenção.

Estes óleos essenciais podem ser obtidos de diferentes partes da planta,

como resina, caule, folhas e frutos. É preciso salientar ainda, que diferenças

quantitativas e qualitativas, na composição química destes óleos, são encontradas

1 – Introdução 31

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

quando se trabalha com óleos extraídos de partes diferentes de uma mesma planta

[18,31,33].

Siani et al (2004) pesquisando os constituintes voláteis da resina, frutos e

folhas da espécie Protium icicariba, encontrou predominantemente monoterpenos no

óleo extraído da resina, enquanto que na amostra de óleo extraída da folhas houve a

prevalência de sesquiterpenos [29].

Quanto a atividade biológica destes óleos essenciais, resultados importantes

foram relatados por Siani et al (1999), onde foi demonstrada a atividade

antiinflamatória, antinociceptiva e antineoplásica de óleos essenciais extraídos de

resina e folhas de algumas espécies Protium [18].

O óleo essencial extraído da resina de Protium heptaphyllum March foi testado

por Citó et al (2003) frente a Artemia Salina Leach, e o teste de toxicidade sugeriu

uma significativa atividade citotóxica deste óleo[17].

Os dados acima apresentados torna, sobremodo, importante o conhecimento

da constituição química destas espécies para contribuir com o aproveitamento e o

controle na medicina e na industria.

A) B)

Figura 3 – Resina recém exsudada do tronco de P. pallidum (A); Resina envelhecida no

tronco (B).

1 – Introdução 32

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Os trabalhos com óleos essenciais deste gênero ainda são muito recentes, e

apenas algumas espécies já foram estudadas.

A Tabela 1 mostra alguns dados encontrados na literatura sobre a

composição dos óleos essenciais extraídos de espécies Protium.

Tabela 1 – Dados encontrados na literatura sobre a composição dos óleos essenciais

extraídos de espécies Protium.

Espécie Constituintes majoritários no óleo essencial Referência

P. icicariba

Resina: p-cimeno, α-pineno, α-terpinoleno e limoneno.

Folhas: germacreno, α-copaeno, γ-elemeno e δ-cadineno.

P.strumosum

Resina: p-cimeno, terpinoleno, α-terpineol e p-cimen-8-ol.

P. spruceanum

Resina: β-felandreno, α-pineno, α-felandreno, p-

cimeno, e

p-ment-3-eno.

P. nitidifolium

Resina: p-cimeno, α-pineno, β-felandreno, e sabineno.

P. panicullatum

Resina: p-cimeno, α-terpineno, p-ment-3-eno e β-felandreno

P. hebetatum

Resina: α-pineno, β-felandreno, p-cimeno,α-

terpineno e

α-felandreno.

P. altsonii

Resina: α-pineno, α-felandreno, p-cimeno, β-

felandreno e

1,8-cineol

P. spruceanum

Folhas: sabineno, terpinen-4-ol, β-cariofileno e limoneno.

Resina: epi-α-cadinol, cânfor, terpinen-4-ol e limoneno.

P. heptaphyllum

Resina: α-terpinoleno, p-cimeno, p-cimen-8-ol e limoneno.

P. lewellyni

Folhas: limoneno, α-copaeno, β-cariofileno, α-

humuleno e

δ-cadineno.

P. hebetatum

Folhas: p-cimeneno, β-cariofileno, α-humuleno, α-copaeno,

viridifloreno, δ-cadineno, e epi-α-cadinol.

1 – Introdução 33

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

P. unifoliolatum

Folhas: trans-cariofileno, limoneno e α-humuleno.

P. heptaphyllum

Resina: terpinoleno, limoneno, felandreno e α-pineno.

P. hebetatum

Resina: p-cimeno, cis-β-dihidro-terpineol, limoneno, α-

pineno,

β-pineno e α-felandreno.

P. alsonii

Folhas: α-pineno, limoneno, germacreno e trans-cariofileno.

P. hebetatum

Folhas: trans-cariofileno, α-humuleno e óxido de cariofileno.

1.5 – Técnicas Espectrométricas

1.5.1 – Espectroscopia de Absorção na Região do Ultravioleta-Vísivel

Muitas moléculas orgânicas e grupos funcionais são transparentes em

porções do espectro eletromagnético que chamamos de ultravioleta (UV) e visível

(VIS), que é a região compreendida entre 190 nm a 800 nm. Quando uma radiação

contínua passa através de um material transparente, que esteja em uma cela de

amostra de quartzo, uma parte da radiação pode ser absorvida. Se isto ocorre, a

radiação residual, quando é passada através de um prisma, produz um espectro

com fendas chamado de espectro de absorção. Como resultado da absorção de

energia, átomos ou moléculas passam de um estado de baixa energia (estado

fundamental) para um estado de maior energia (estado excitado). A radiação

eletromagnética que é absorvida tem energia exatamente igual à diferença entre os

estados excitado e fundamental. Como a energia absorvida é quantizada, o espectro

que se origina de uma única transição eletrônica deveria corresponder a uma linha

única e discreta. Isto não se confirma, já que a à absorção eletrônica superpõem-se

1 – Introdução 34

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

os subníveis rotacionais e vibracionais, originando, então, as bandas de absorção

que possuem posição correspondente ao comprimento de onda cuja energia é igual

À energia necessária para que ocorra a transição eletrônica.

A intensidade de uma absorção pode ser expressa em transmitância (T),

definida como T= I/I

, onde I

é a intensidade da energia radiante que incide na

amostra e I é a intensidade de radiação que emerge da amostra. Uma expressão

mais convincente é obtida da Lei de Lambert-Beer que relaciona a transmitância

com a espessura da cela de amostra e a concentração das espécies que absorvem:

bck

A ..)(log

onde k é igual à constante característica do soluto, c é a concentração do soluto, b é

o comprimento do caminho ótico através da amostra e A é a absorbância. Quando c

é expresso em moles.L

-1

e o comprimento do caminho ótico em centímetros, a

expressão acima torna-se,

cbA ..

A intensidade de uma banda de absorção em um espectro no UV-VIS é

usualmente expressa como absortividade molar no máximo de absorção, ε

máximo

log

(ε

máximo

). Quando não se conhece o material que absorve, pode-se exprimir a

intensidade de absorção como,

onde c é igual à concentração em g/100 mL e b é o caminho ótico através da

amostra em cm.

1 – Introdução 35

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.5.2 – Espectrometria Vibracional na região do Infravermelho (IV) [42]

A radiação infravermelha (IV) corresponde, aproximadamente, a parte do

espectro situada entre as regiões do visível e das microondas. A porção de maior

utilidade está situada entre 4.000 e 400 cm

-1

A radiação no infravermelho em freqüência menor que aproximadamente 100

-1

converte-se, quando absorvida por uma molécula orgânica, em energia de

rotação molecular.

A radiação na faixa de aproximadamente 10.000 à 100 cm

-1

converte-se,

quando absorvida, em energia de vibração molecular. Estas vibrações moleculares

podem ser classificadas em deformações axiais ou deformações angulares.

As intensidades das bandas podem ser expressas como transmitância (T) ou

Absorbância (A). A transmitância é a razão entre a energia radiante transmitida por

uma amostra e a energia radiante que nela incide (T= I/I

). A Absorbância é o

logaritmo decimal do inverso da Transmitância, isto é, A= log(1/T).

Uma resposta positiva a um grupo funcional através da analise de espectro IV

deve ser somada a outras técnicas espectrométricas como espectrometria de

massas (EM) e, ou Ressonância Magnética Nuclear (RMN), para uma determinação

mais exata.

1.5.3 – Espectrometria de Massas (EM)

A espectrometria de massas é uma técnica usada para o estudo das massas

de átomos, moléculas ou fragmentos de moléculas.

Na técnica de impacto de elétrons (I.E), um espectrômetro de massas

bombardeia as moléculas na fase vapor com um feixe de elétrons de alta energia,

1 – Introdução 36

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

usualmente de 70 eV. O evento mais simples que ocorre é a remoção de um elétron

da molécula isolada, com formação de um íon molecular, um cátion radical (M•

). Os

íons obtidos são acelerados por um campo elétrico, e separados. O resultado é

então registrado como um espectro de íons separados de acordo com a razão entre

sua massa e sua carga elétrica, m/z [42].

Um espectro de massas é um gráfico que contem as massas dos fragmentos

positivos, em suas concentrações relativas. O pico mais intenso do espectro é

chamado de pico base, tem arbitrariamente a intensidade de 100%. As intensidades

dos demais picos, incluindo o pico do íon molecular aparecem como frações do pico

base [42].

As principais aplicações da espectrometria de massas (EM) são [43]:

a) determinar a massa molecular, a qual permite deduzir a fórmula molecular;

b) identificação dos compostos eluídos por um sistema cromatográfico;

c) detecção de compostos conhecidos em baixos níveis de concentração;

d) ajudar na determinação estrutural, pela análise do pico base (100%) e do

íon molecular (M

Para identificação dos compostos, utilizam-se geralmente espectros de

massas contidos na “biblioteca” (ex: NBS library, com 40.000 registros) do

computador do espectrômetro, na qual consta diversos terpenóides. Uma listagem

dos dez compostos mais prováveis é fornecida por comparação dos 6 a 8 picos mais

intensos da amostra com os dados da biblioteca [43].

1 – Introdução 37

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.6 – Técnicas Cromatográficas

A cromatografia é um método de separação no qual os componentes de uma

amostra dividem-se entre duas fases: uma permanece imóvel (fase estacionária) e a

outra percola através dela (fase móvel). Durante a passagem da fase móvel sobre a

fase estacionária, os componentes da amostra são distribuídos entre as duas fases,

de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase

estacionária, resultando em migrações diferenciais de cada um destes componentes

[44-47].

A classificação dos diferentes tipos de cromatografia se dá de acordo com: o

estado físico da fase móvel (gasosa, líquida ou fluido supercrítico); a disposição da

fase estacionária (coluna ou planar); e o mecanismo de separação (adsorção,

partição, troca iônica, exclusão por tamanho, etc.) [44-47].

A separação e a purificação dos constituintes químicos das plantas são

freqüentemente efetuadas utilizando-se uma ou mais técnicas cromatográficas.

Entre os métodos modernos de análise a cromatografia ocupa um lugar de destaque

devido a sua facilidade de efetuar a separação, a identificação e a quantificação das

espécies químicas, por si mesma, ou em conjunto com outras técnicas instrumentais

de análise

1.6.1 – Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

A cromatografia em camada delgada é uma técnica amplamente utilizada

para fins de analise, tanto em extratos vegetais brutos quanto para avaliar o

resultado de um processo de separação [1, 7-8].

1 – Introdução 38

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

A cromatografia em camada delgada consiste na separação dos

componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada de

adsorvente retido sobre uma superfície plana [48].

O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno

da adsorção. Neste caso, a sílica é seguramente um dos adsorventes mais

utilizados. Em geral, a sílica é empregada na separação de compostos lipofílicos

[48].

Na escolha da fase móvel deve-se levar em conta a natureza química das

substancias a serem separadas e a polaridade da fase móvel, uma vez que existe

uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra pela superfície do

adsorvente [48].

Após o desenvolvimento dos cromatogramas as placas são secas e

reveladas. A etapa de revelação consiste em tornar visíveis as substancias incolores

presentes na amostra. A visualização das manchas pode ser feita através de

métodos físicos (luz ultravioleta), químicos (reagentes) ou biológicos (enzimas) [48].

1.6.2 – Cromatografia em Fase Gasosa (CG)

As substancias voláteis ou semivoláteis (termo estáveis) são

preferencialmente analisadas por cromatografia gasosa, devido ao grande poder de

separação desta técnica, sendo capaz de separar compostos orgânicos com

isomeria plana similar, isomeria óptica e homólogos com grande pureza [49].

A cromatografia gasosa é um procedimento físico utilizado para separar-se

uma amostra em seus componentes individuais. A base para esta separação é a

distribuição da amostra entre duas fases: uma estacionária e uma fase gasosa

1 – Introdução 39

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

móvel. A amostra é vaporizada e carreada pela fase móvel (ou gás de arraste, uma

vez que se trata de um gás inerte cuja finalidade é transportar as moléculas

separadas) através da coluna onde se encontra a fase estacionária [44-47].

No caso da cromatografia gás-sólido (CGS), a fase estacionária é um sólido

de grande área superficial, usualmente um adsorvente como carvão vegetal, sílica

gel ou peneira molecular. A adsorção diferencial dos componentes da mistura a ser

separada sobre a superfície sólida é a base para a separação cromatográfica na

CGS [44].

Na cromatografia gás-liquído (CGL), a fase estacionária é uma película

delgada liquida, a qual recobre um sólido inerte denominado suporte, que se

encontra acondicionado dentro de uma coluna, através da qual o gás de arraste flui

continuamente. As moléculas da amostra irão distribuir-se entre o gás de arraste e a

fase liquida. As espécies mais solúveis na fase estacionária liquida permanecerão

menos tempo na fase gasosa em movimento, e como conseqüência irão deslocar-se

mais lentamente através da coluna [44].

1.6.2.1 – Detectores

Em um sistema de cromatografia em fase gasosa o detector é, sem dúvida, o

principal responsável pela quantidade mínima de substancia a ser detectada,

enquanto que cabe, em principio, à coluna a responsabilidade de estabelecer a

quantidade máxima [47].

A função do detector em um sistema cromatográfico é acusar a presença e

medir a quantidade de componentes no efluente da coluna [47]. Um sinal elétrico é

gerado, de acordo com a variação na composição do gás de arraste que sai da

1 – Introdução 40

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

coluna cromatográfica, ou seja, é dada uma resposta proporcional à concentração

ou a massa de analito eluído [46].

Neste trabalho foi utilizado um sistema de cromatógrafo a gás acoplado a um

detector de massas (CG/EM), descrito a seguir.

1.6.2.1.1 – Detector de Massas (EM)

Um sistema muito utilizado para análise de amostras é o uso de um

espectrômetro de massas, que funciona como detector, acoplado a um cromatográfo

à gás. Nesta técnica conhecida como CG/EM, o gás de arraste emergente do

cromatógrafo é transferido através de uma válvula dentro de um tubo, onde ele

passa por uma fenda molecular. Uma parte do fluxo de gás é então transferido para

dentro da câmara de ionização do espectrômetro de massas. Cada pico eluído da

coluna cromatográfica é bombardeado com uma fonte ionizante, conseguindo

fragmentar o composto em uma grande diversidade de íons, que são separados e

registrados de acordo com suas razões m/z [44-45,47].

No sistema (CG/EM) é necessário o uso de uma rápida varredura pelo

espectrômetro de massas. O instrumento deve determinar o espectro de massa de

cada componente na mistura, separado pela coluna cromatográfica, antes mesmo

do próximo componente entrar na câmara de ionização, de maneira que uma

substância não seja contaminada pela próxima fração antes que seu espectro tenha

sido obtido [2]

Com um sistema CG/EM é possível também analisar uma mistura e conduzir

uma busca em uma biblioteca de dados existente no sistema, podendo desta

maneira procurar cada componente da mistura por tentativas e comparações [2].

1 – Introdução 41

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.7 – Métodos de Quantificação

Na análise quantitativa são necessárias precauções em todas as etapas para

minimizar ou evitar erros. A alíquota a ser analisada deve ser representativa da

amostra. Em cromatografia, a etapa de separação dos componentes da amostra no

cromatógrafo pode acarretar erros como a adsorção irreversível de parte da amostra

na fase estacionária ou suporte, resposta do detector afetada por alterações de

temperatura e vazão de gás e quantidade de amostra injetada fora da faixa linear do

detector [50].

A concentração de uma substância na amostra pode ser determinada por um

dos métodos determinados a seguir.

1.7.1 – Método do Padrão Externo

No método do padrão externo é primeiramente construída uma curva analítica

do padrão puro, onde se verifica a linearidade de resposta para o componente de

interesse na faixa de concentração esperada. Assim, a percentagem em massa de

uma amostra de concentração desconhecida é determinada a partir da equação da

reta gerada na curva analítica. Alguns parâmetros estatísticos são calculados a partir

dessa curva, tais como o desvio padrão e o limite de detecção do método. O método

é muito funcional quando a concentração do analito é relativamente alta, porém para

concentrações relativamente muito baixas é limitado [51].

1.7.2 – Método de Adição de Padrão

Neste método, um analito de interesse, dentro de uma mistura, pode ser

analisado pela adição de quantidades conhecidas crescentes de seu padrão. Uma

1 – Introdução 42

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

curva analítica é obtida e a partir da equação da reta é determinada a concentração

do analito. A adição de padrão é usada em muitas técnicas analíticas,

principalmente quando a concentração do analito é muito baixa e existem efeitos de

diluição em matrizes [50-51].

1.7.3 – Método de Padrão Interno

O padrão interno (P.I.) é uma substância de concentração conhecida

adicionada à amostra, contendo o componente cuja concentração deve ser

determinada, de forma que não interfira na análise. O P.I. não deve ser encontrado

na amostra, deve ter elevado grau de pureza, ser adicionado em concentrações

similares ao composto analisado e ter boa resolução em relação às outras

substâncias. Uma curva analítica deve ser construída tal como no método do padrão

externo, de forma que, pela relação entre as áreas e massas da amostra e do P.I., a

concentração do analito seja determinada. O P.I. é usado, especialmente, na

ausência do padrão do analito [50-51].

1.7.4 – Método de Normalização

Neste método, a área de cada pico é obtida de uma série de injeções de

réplicas de uma mistura contendo quantidades iguais ou conhecidas de todos os

componentes. Um componente deve ser escolhido como referência e as respostas

relativas dos outros componentes são determinadas pela razão entre as suas áreas

e a do componente de referência. Este método é muito usado, especialmente,

quando não há padrão do analito [51].

1 – Introdução 43

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

1.8 – Objetivos do Trabalho

 Extrair qualitativamente e quantitativamente os óleos essenciais das

resinas de espécies Protium spp;

 Estudar a eficiência na obtenção dos óleos com a variação no tempo de

extração;

 Identificar qualitativamente os óleos obtidos por espectroscopia de

ultravioleta, espectrometria no infravermelho (IV) e espectrometria de

massas acoplada à cromatografia em fase gasosa (CG/EM).

 Isolar os componentes dos óleos por cromatografia em camada delgada

(CCD), e identificá-los por cromatografia em fase gasosa acoplada à

espectrometria de massas (CG/EM);

 Quantificar os componentes majoritários presentes nos óleos essenciais

utilizando o método de normalização simples de área.

2 – Parte Experimental 44

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

2 – Parte Experimental

2.1 – Identificação, Coleta e Armazenamento das Amostras

2.1.1 – Coleta e Identificação das Espécies Protium spp.

As amostras analisadas foram coletadas em árvores catalogadas no Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), na Reserva Ducke (Manaus/AM) em

novembro de 2004.

A identificação das espécies foi feita pelo Departamento de Silvicultura do

INPA.

2.1.2 – Armazenamento das Amostras

As amostras recebidas já secas foram armazenadas em embalagens

plásticas, vedadas, acondicionadas em caixas de papel devidamente identificadas,

em local isento de umidade e luz, à temperatura ambiente.

2.2 – Extração dos Óleos Essenciais

Os óleos essenciais foram extraídos pesando-se 25 g de resina seca

triturada, que foram introduzidas em balão de destilação de fundo redondo com

capacidade de 500 mL, no qual foram adicionados 250 mL de água destilada, e

posteriormente o mesmo foi acoplado ao sistema de extração de Clevenger

2 – Parte Experimental 45

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

modificado (Figura 2). O tempo utilizado para as extrações foi de 3 horas, mantendo

a temperatura constante à 98 °C durante a hidrodestilação.

Após a extração mediu-se o volume dos óleos obtidos na escala graduada do

sistema de extração. Em seguida, aos óleos recolhidos foram adicionados 10mg de

anidro, para eliminação da água residual, e posterior filtração em lã de vidro.

Os óleos obtidos foram armazenados em frascos de vidro fechados e sob

refrigeração (-10 °C) para evitar perdas por evaporação dos constituintes voláteis.

2.2.1 – Determinação do Tempo de Extração

O tempo de extração foi estudado, buscando-se obter rendimento máximo em

tempo mínimo. O estudo foi realizado nos seguintes tempos de extração: 1; 2; 3; 4; 5

e 6 horas. Exceto o tempo de extração, todas as outras condições experimentais

foram mantidas constantes como descritas anteriormente.

2.3 – Características Físicas dos Óleos Essenciais

2.3.1 – Densidade

Não foi utilizado balão volumétrico de 1mL para a medida da densidade dos

óleos essenciais por não haver volume suficiente de óleo todas as espécies para

esta medida. Optou-se por uma micropipeta volumétrica para se medir 500 µL de

cada óleo essencial.

Uma ponteira para 500 µL foi pesada com e sem os óleos essenciais. A

diferença de massa correspondeu a massa de óleo medida. Utilizou-se, então a

seguinte relação:

2 – Parte Experimental 46

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

d = m / v

onde, d é a densidade procurada, m é a massa de óleo essencial e v é o volume

correspondente.

Instrumentos utilizados:

- Balança analítica digital Sartorius – modelo BP121S, com precisão de 10

-4

unidades.

- Micro-pipeta Eppendorf ReferenceOxford.

2.3.2 – Índice de Refração

O índice de refração foi medido à T= 27 °C e P= 692 mmHg em Refratômetro

Abbe modelo 2WAJ.

2.3.3 – Ponto de Ebulição

O ponto de ebulição dos óleos essenciais foram medidos utilizando-se

aparelho Eletrothermal em tubo capilar a uma pressão de 696 mmHg, e por Análise

Térmica (DSC), de onde obtém-se uma curva de Calorimetria Exploratória

Diferencial, indicando a faixa de ebulição destes óleos.

A curva DSC foi obtida no Termoanalisador Dupont 9900 acoplado ao módulo

Calorimétrico DSC 910. A vazão de gás N

foi fixada em 50 mL min

-1

sob uma razão

de aquecimento da amostra de 10 °C min

-1

, iniciando em 0 °C até 300 °C. A massa

de óleo essencial utilizada de 12 mg, colocada no suporte com saída capilar,

desenvolvimento especialmente para este fim, que está apresentado na Figura 4.

2 – Parte Experimental 47

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 4 – Suporte de vidro com saída capilar pra DSC.

2.4 – Técnicas Espectroscópicas e Cromatográficas Utilizadas para

Análise dos Óleos Essenciais

2.4.1 – Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho (IV)

Analisou-se os óleos essenciais por IV no espectrofotômetro Nicolet – 5SXC

FTIR, utilizando-se janelas de KBr, com 32 varreduras e 16 cm

-1

de resolução, na

faixa de 4000 a 400 cm

-1

2.4.2 – Espectroscopia de Absorção na Região do Ultravioleta (UV)

Nas analises dos óleos essências por UV, utilizou-se um espectrofotômetro

MultiSpec-1501, com varreduras entre 190 e 400 nm. Foram utilizadas cubetas de

quartzo com caminho ótico de 10 mm, e etanol como solvente.

2 – Parte Experimental 48

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

2.4.3 – Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Utilizaram-se placas de vidro de 8 x 20 cm recobertas com uma camada de

0,5 mm de espessura, utilizando-se como fase estacionária sílica G-60 e GF

254

Merck



, na proporção 1:10 (m/m).

As placas foram limpas com água e detergente, e em seguida mergulhadas

em solução sulfrocrômica por uma noite. Após este período, as placas de vidro

foram retiradas da solução e enxaguadas em água corrente e, em água destilada e

seca em estufa para uso posterior.

Depois de secas, as placas foram acomodadas uma ao lado da outra numa

prancheta horizontal, feita de alumínio, tendo um bordo retangular longitudinal e

outro transversal, que as mantêm em ordem, lado a lado, para a aplicação da

camada adsorvente.

A aplicação da camada adsorvente (0,25 mm) foi efetuada com ajuda de um

aparelho espalhador especial, que tem um dispositivo que permite a variação de sua

espessura. Colocou-se a suspensão de adsorvente sobre a primeira placa a ser

recoberta, deslocando-se então o aparelho sobre as placas em cima da prancheta,

fazendo-se a deposição da suspensão. Após esta deposição, as placas foram secas

à temperatura ambiente e então ativada em estufa a 140 °C por quatro horas.

2.4.3.1 – Aplicação da Amostra

As amostras de óleos essenciais foram diluídas em clorofórmio (ε

= 4,8)

padrão analítico, na relação 1:10 (v/v).

A aplicação da amostra sobre a cromatoplaca foi feita utilizando-se um tubo

capilar a uma distância de dois centímetros do extremo inferior da cromatoplaca.

2 – Parte Experimental 49

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Efetuou-se a aplicação da amostra em frações consecutivas, com intervalos

suficientes para a evaporação do solvente.

2.4.3.2 – Escolha da Fase Móvel

Para a escolha dos solventes apropriados, os valores das constantes

dielétricas foram obtidos das escalas eluotrópicas, nas quais os solventes estão

relacionados em ordem crescente de seu poder de eluição.

Os solventes estudados como fase móvel durante o desenvolvimento do

método são apresentados na Tabela 2.

2 – Parte Experimental 50

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Tabela 2 – Mistura de solventes utilizados para o desenvolvimento das cromatoplacas.

Solventes (v/v)

εε

(constante dielétrica)

Acetato de Etila : Hexano (1:60) 1,96

Acetato de Etila : Hexano (1:30) 2,02

Acetato de Etila : Hexano (1:10) 2,27

Acetato de Etila : Hexano (1:5) 2,59

Acetato de Etila : Hexano (1:2) 3,29

Acetato de Etila : Hexano (1:1) 3,98

Acetato de Etila : Hexano (2:1) 4,68

Acetona : Hexano (1:60) 2,20

Acetona : Hexano (1:30) 2,50

Acetona : Hexano (1:10) 3,60

Acetona : Hexano (1:7,5) 4,10

Acetona : Hexano (1:5) 5,02

Diclorometano : Hexano (1:10) 2,54

Diclorometano : Hexano (1:5) 3,09

Diclorometano : Hexano (1:2) 4,29

Diclorometano : Hexano (1:1) 5,48

Diclorometano : Hexano (1,5:1) 6,20

Diclorometano : Hexano (2:1) 6,69

2 – Parte Experimental 51

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

2.4.3.3 – Separação e Revelação

Após a aplicação da amostra, as cromatoplacas foram inseridas na cuba

cromatográfica, em contato com a fase móvel.

A altura da fase móvel na cuba cromatográfica foi de aproximadamente 1,0 cm

abaixo do ponto de aplicação da amostra. Para a saturação da cuba utilizou-se uma

tira de papel de filtro, previamente embebida com a mistura de solventes, que foi

aderida à parede da cuba cromatográfica.

Após a fase móvel ter atingido a delimitação superior nas cromatoplacas,

estas foram retiradas da cuba e secas ao ar. A revelação, isto é, a visualização das

manchas foi realizada por meio da irradiação com luz ultravioleta (λ 254 e 354 nm)

sobre as cromatoplacas.

As substâncias cromatografadas foram recuperadas por meio de sucessivas

extrações da sílica gel com 100 µL de solventes (fase móvel).

Estas frações recuperadas foram armazenadas em frascos de vidro fechados

e sob refrigeração, para posterior análise.

A metodologia utilizada na separação dos constituintes dos óleos essenciais

por cromatografia em camada delgada (CCD) encontra-se resumida na Figura 5.

2 – Parte Experimental 52

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 5 – Fluxograma genérico da metodologia experimental utilizada na CCD.

2.4.4 – Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de

Massas

Os óleos essenciais e as frações separadas por CCD foram analisados por

CG/EM em um cromatógrafo em fase gasosa Hewlett-Packard modelo HP-5890,

acoplado a um detector seletivo de massas HP-5970 de modo impacto eletrônico,

com uma energia de 70 eV, temperatura da interfase de transferência de 300 °C e

banco de dados NBS-Reve (40.000 registros).

Condições cromatográficas:

- Coluna LM-5 (50 m x 0,25 mm i.d. x 0,42 µm)

- Temperatura inicial = 60 °C

Óleo Essencial em CHCl

(10%)

Frações (R

0,9; 0,2) Frações (R

0,9; 0,5; 0,3)

CG/EM

AcOEt:Hex (1:60)

CG/EM

Diclo:Hex (1,5:1)

2 – Parte Experimental 53

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

- Tempo inicial = 11 minutos

- Tempo final = 20 minutos

- Temperatura final = 250 °C

- Temperatura do injetor = 250 °C

- Temperatura do detector = 280 °C

- Gás de arraste = He

- Rampa : 60 °C até 100 °C na razão de 7 °C/min, depois 100 °C até 250 °C

na razão de 12 °C/min.

- Split = 1:50

- µ = 36 cm/seg.

- Modo Scan: 30 a 300 Da

2.4.4.1 – Quantificação

Para a quantificação dos componentes por normalização simples de área,

utilizou-se as condições descritas no item 1.7.4. A quantificação nos constituintes

nos óleos foi realizada a partir de soluções 10 % (óleo em clorofórmio) pela

normalização simples da área do pico de cada composto, sendo a área total a

somatória de todas as áreas do cromatograma (100 %).

3 – Resultados e Discussão 54

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

3 – Resultados e Discussão

3.1 – Extração dos Óleos Essenciais por Hidrodestilação

As extrações dos óleos essenciais foram realizadas de acordo com as

condições descritas no item 2.2.

A Tabela 3 indica o rendimento dos óleos essenciais das resinas das espécies

Protium spp, para o tempo de extração de 3 horas.

Tabela 3 – Rendimento dos óleos essenciais extraídos por hidrodestilação.

Espécie Rendimento (%)

P. hebetatum

3,10

P. nitidifolium

3,33

P. amazonicum

2,60

P. divarictium

2,77

Encontra-se na literatura resultados bastante discrepantes a respeito dos

rendimentos dos óleos obtidos de espécies Protium. Isto se deve ao fato de que a

quantidade de óleo essencial extraído de matrizes vegetais está muito relacionado à

estrutura de armazenamento destes óleos nas plantas, assim, como também á

época do ano, uma vez que a produção destes óleos varia durante o ciclo vegetativo.

3 – Resultados e Discussão 55

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Não há documentação acerca da idade das plantas de onde foram coletadas

estas resinas, no entanto, todas as resinas utilizadas neste trabalho foram coletadas

na mesma época do ano, e apresentavam aspecto âmbar ou rochoso, típico de

resinas envelhecidas.

3.2 – Tempo de Extração dos Óleos Essenciais

No material vegetal, os óleos essenciais estão armazenados em estruturas

especializadas. Desta forma, torna-se evidente que o tempo necessário para

remover o óleo essencial do material vegetal é altamente dependente da estrutura

onde este está armazenado. De forma geral, o tempo para a remoção dos óleos

presentes em matrizes como cascas, raízes, sementes, depende da razão de difusão

dos vários constituintes do óleo, que devem permear através do tecido vegetal para

serem extraídos.

O tempo de extração é um dos principais parâmetros no estudo dos óleos

essenciais, está diretamente relacionado com a qualidade e, com a viabilidade

econômica deste processo de extração.

O rendimento na extração e a composição do óleo podem variar em função

do tempo de extração. Uma destilação rápida pode conduzir a um produto contendo

predominantemente constituintes mais voláteis. A destilação mais lenta permite,

portanto uma maior recuperação dos componentes mais pesados.

O óleo deve ser extraído qualitativa e quantitativamente, ou seja, quantidades

significativas dos compostos de interesse no menor tempo de extração possível.

3 – Resultados e Discussão 56

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Para estudar-se o efeito do tempo de extração no rendimento dos óleos

essenciais, inicialmente todas as amostras foram extraídas por 4 horas, obteve-se

um rendimento similar para as quatro espécies. Com base neste experimento

efetuaram-se as extrações em diferentes tempos somente com a espécie P.

hebetatum, uma vez que esta foi a única amostra em quantidade suficiente para a

realização deste estudo.

A Figura 6 apresenta o estudo relacionado ao tempo de extração do óleo

essencial por hidrodestilação da resina da espécie P. hebetatum.

A massa de resina foi fixada em 25,0 g para um volume de 250 mL de água.

Os tempos de extrações estudados foram de 1h; 2h; 3h; 4h; 5h e 6h.

0 1 2 3 4 5 6

Rendimento (%)

Tempo de Extração (horas)

Figura 6 – Rendimento na extração do óleo essencial em função do tempo.

Como pode ser observado no gráfico (Figura 6), há um grande aumento no

rendimento entre os intervalos de tempo de 1 à 3 horas de extração, porém, após 3

3 – Resultados e Discussão 57

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

horas de extração o aumento no rendimento é significativo, mas não o suficiente

para impor este aumento de tempo na extração. Baseando-se no melhor custo x

benefício do processo, o tempo de extração de 3 horas foi escolhido como sendo o

mais viável.

3.3 – Propriedades Físico-Químicas dos Óleos Essenciais

Os óleos essenciais podem sofrer alterações pela ação das condições

naturais, dependendo da natureza química de seus constituintes. O ar, a luz, o calor,

a água e impurezas diversas de origem natural ou oriundas de falsificações estão

entre os principais parâmetros que os modificam. As alterações podem ser

reconhecidas tanto por mudanças de suas características organolépticas (aroma,

cor, sabor, transparências, fluidez), como também dos valores de suas pripriedades

químicas e físicas. Assim, diminuindo as suas qualidades, reduz-se de igual modo

sua utilização nas industrias de perfumaria, cosmético, alimentos, químicas, etc.

Foram determinados alguns valores referentes às propriedades físico-

quimicas dos óleos essenciais obtidos das quatro espécies Protium spp.

Para a determinação do ponto de ebulição destes óleos utilizou-se

primeiramente um aparelho Electrothermal, medindo-se os pontos de ebulição destes

óleos em capilar. Sendo os óleos essenciais misturas complexas de componentes,

houve certa dificuldade na medição exata dos pontos de ebulição destes óleos.

Dessa forma, utilizou-se a técnica DSC (Diferencial Scanning Calorimetry)

para uma determinação mais precisa destes pontos de ebulição.

3 – Resultados e Discussão 58

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

As curvas DSC obtidas com razão de aquecimento de 10 °C min

-1

e 12 mg de

amostra para os óleos essenciais das resinas apresentaram um pico largo

endotérmico. As temperaturas médias de ebulição, para cada óleo, foram

determinadas no mínimo destes picos.

As curvas de DSC foram realizadas ao final deste trabalho e, não foi possível

a obtenção deste dado para amostra de P. nitidifolium, pois a quantidade de amostra

disponível foi insuficiente para esta medida.

As curvas DSC para as determinações dos pontos de ebulição dos óleos

essenciais extraídos das resinas de Protium spp. são mostrados na Figura 7.

0 50 100 150 200 250 300 350

-0,15

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Fluxo de calor (W/g)

Temperatura (

P. hebetatum

P. divarictium

P. amazonicum

Figura 7 – Curvas termoanalíticas de DSC para os óleos essências das resinas Protium

spp.

3 – Resultados e Discussão 59

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Os valores das determinações físico-químicas dos óleos essenciais estão

contidos na Tabela 4.

Não foram encontradas na literatura informações acerca das propriedades

físico-químicas dos óleos estudados neste trabalho, para que uma comparação

fosse feita.

Tabela 4 – Propriedades físico-químicas dos óleos essenciais extraídos das resinas das

espécies Protium spp.

Espécies

Propriedades

P. hebetatum P. nitidifolium P. amazonicum P. divarictium

Cor Incolor Amarelo claro Amarelo Incolor

Aparência Límpido Límpido Límpido Límpido

Densidade (g/cm

) 0,8418 0,8805 0,8314 0,8498

Índice de refração 1,478 1,491 1,493 1,476

Ponto de ebulição (°C)

(Electrothermal)

185,8 168,2 244,8 239,4

Ponto de ebulição (°C)

(DSC)

172,35 – 260,90 250,07

3 – Resultados e Discussão 60

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3.4 – Análises Espectroscópicas dos Óleos Essenciais

Com a finalidade de se obter informações qualitativas a respeito dos óleos

essências extraídos foram efetuadas medidas em Infravermelho e Ultravioleta destes

óleos.

Os resultados obtidos estão apresentados a seguir.

3.4.1 – Análises por Infravermelho

A espectroscopia no Infravermelho é uma técnica amplamente empregada

para a determinação dos grupos funcionais presentes em um determinado

composto. Tratando-se, desta forma, de uma técnica qualitativa. Do ponto de vista

quantitativo o IV não é uma boa escolha, sendo uma técnica pouco sensível para

fins de quantificação.

Escolheu-se analisar os óleos essências neste trabalho por IV a fim de se

verificar as bandas características dos grupos funcionais, que pudessem sugerir

diferenças referentes aos constituintes destes óleos.

As Figuras 8 à 11 apresentam os espectros de Infravermelho obtidos para os

óleos essenciais.

3 – Resultados e Discussão 61

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4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Transmitância (%)

Número de onda (cm

-1

)

Figura 8 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P. hebetatum.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Transmitância (%)

Número de onda (cm

-1

)

Figura 9 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P. nitidifolium.

3 – Resultados e Discussão 62

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4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Transmitância (%)

Número de onda (cm

-1

)

Figura 10 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P.

amazonicum.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Transmitância (%)

Número de onda (cm

-1

)

Figura 11 – Espectro de Infravermelho do óleo essencial extraído da resina de P.

divarictium.

3 – Resultados e Discussão 63

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Observa-se em todos os espectros IV a banda triplete entre aproximadamente

2850 – 2950 cm

-1

referente a deformação axial =C–H , característica de aromáticos

e alcenos conjugados.

As bandas entre 1500 e 1300 cm

-1

devem-se as deformações do esqueleto

hidrocarboneto e, no caso desta amostra complexa não é possível identificar cada

uma das deformações ocorrentes.

No espectro IV do óleo da espécie P. amazonicum nota-se uma banda de

forte intensidade em 1685 cm

-1

, que não aparece nos demais espectros e, que pode

ser atribuída à carbonila em conjugação com insaturação (C=C).

A banda em aproximadamente 3400 cm

-1

referente à deformação axial de

O-H é observada em todos os espectros, porém, mostrando-se de fraca intensidade

nos espectros das espécies P. divarictium e P. hebetatum, enquanto que nos

espectros das espécies P. amazonicum e P.nitidifolium esta banda tem maior

intensidade.

Estes fatos associados podem levar a predição de compostos oxigenados,

como álcoois e ácidos carboxílicos, como constituintes majoritários do óleo essencial

extraído da resina de P. amazonicum. No entanto, por hora, trata-se de mera

suposição, uma vez que, como já dito, a espectroscopia no infravermelho não é uma

técnica indicada para fins quantitativos, principalmente em se tratando de uma

mistura complexa de constituintes.

3 – Resultados e Discussão 64

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

3.4.2 – Análises por Ultravioleta

Na região do ultravioleta as absorções ocorrem por meio de transições

eletrônicas, características para cada tipo de grupo cromóforo. Assim como o

infravermelho, o UV foi utilizado neste trabalho como uma ferramenta qualitativa na

tentativa de se encontrar, através das absorções de cromóforos, a indicação da

presença de insaturações ou carbonila, por exemplo.

A Figura 12 apresenta os espectros de absorção no UV para os óleos

essenciais em etanol.

Nota-se somente no espectro UV do óleo da espécie P. amazonicum a

presença de uma banda de absorção em aproximadamente 230 nm, uma transição

do tipo n → π

, que pode estar associada a uma carbonila (C–O), deslocada pela

conjugação com insaturação. Isto está em concordância com os espectros IV obtidos

para este óleo.

Nos demais espectros nota-se discreta absorção em aproximadamente 217

nm, uma transição do tipo π → π

, associada às insaturações (C=C).

3 – Resultados e Discussão 65

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200 250 300 350 400 450

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Absorbância

Comprimento de onda (nm)

Branco

P. amazonicum

P. divarictium

P. hebetatum

P. nitidifolium

Figura 12 – Espectros de absorção no UV dos óleos essenciais extraídos das espécies

Protium ssp.

3.5 – Análises Cromatográficas dos Óleos Essenciais

No presente estudo analítico dos óleos essenciais extraídos das resinas das

espécies Protium spp., Os óleos essências extraídos foram analisados por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM). Estes óleos

foram ainda submetidos à cromatografia em camada delgada (CCD) para o

isolamento de frações contendo os componentes a serem identificados.

Os resultados das análises de CG/EM dos óleos serão apresentados a seguir.

A fim de se comparar os resultados obtidos, os fragmentogramas dos compostos

3 – Resultados e Discussão 66

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

identificados serão apresentados de forma conjunta para as quatro espécies

estudadas.

Para melhor compreensão, na análise por CCD, os resultados serão

apresentados separadamente para cada fase móvel utilizada. Na etapa de

quantificação serão apresentados os resultados comparativos das quatro espécies

Protium spp.

3.5.1 – Análises por CG/EM

As Figuras 12 a 15 apresentam os cromatogramas de CG/EM dos óleos

essenciais das resinas de Protium spp. nas condições experimentais apresentadas

no item 2.4.3.

Figura 13 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

hebetatum.

3 – Resultados e Discussão 67

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 14 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

nitidifolium.

Figura 15 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

divarictium.

3 – Resultados e Discussão 68

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 16 – Cromatograma CG/EM do óleo essencial extraído da resina de Protium

amazonicum.

A identificação de alguns constituintes do óleo foi possível pela comparação

de espectros de massas encontrados na literatura [52]. É importante salientar, ainda,

que esta identificação por comparação só foi possível porque as condições

experimentais utilizadas foram similares às dos espectros da literatura.

A Tabela 5 mostra os compostos identificados nas amostras de óleos

essenciais extraídos das quatro espécies Protium, com seus respectivos tempos de

retenção e números de identificação utilizados nos cromatogramas.

3 – Resultados e Discussão 69

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Tabela 5 – Possível identificação dos constituintes nos óleos essenciais de Protium spp.

Identificação Tempo de retenção (min.)

(número)

Composto

hebetatum nitidifolium divarictium amazonicum

1 Tricicleno 15,22 - - -

α-Pineno

15,96 15,93 16,00 15,91

α-Fencheno

16,44 - - -

4 Canfeno 16,53 16,51 16,54 16,47

5 Sabineno - 17,58 - -

β-Pineno

17,73 17,75 17,75 17,78

7 cis-Pinano - 18,52 17,97 -

8 3-p-Menteno 17,98 - 18,57 18,48

α-Felandreno

18,69 - 18,73 -

δ-2-Careno

19,09 - 19,09 -

11 o-Cimeno 19,30 19,28 19,30 19,27

12 Limoneno 19,47 19,46 19,48 19,45

γ-Terpineno

20,30 20,27 - -

14 Terpinoleno - 21,82 - -

15 p-Cimeneno - - 21,06 -

16 trans-Sabinol - 22,36 - -

17 Terpin-4-ol 23,02 23,05 23,02 -

α-Terpineol

23,29 23,24 23,29 -

19 Tuj-3-en-10-al - 23,37 - -

20 Verbenona - 23,61 - -

δ-Elemeno

- 25,67 - 25,67

3 – Resultados e Discussão 70

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

α-Cubebeno

25,87 - 25,90 25,86

23 Ciclosativeno - - 26,38 26,30

β-Elemeno

- - - 26,48

25 Z-Cariofileno - - - 26,83

26 E-Cariofileno 26,98 26,98 27,02 26,98

27 Cedrano - - 27,26 27,30

α-Humuleno

- 27,41 27,44 27,43

29 Seicheleno 27,77 - 27,79 -

γ-Muuroleno

- 27,73 - 27,79

αSelileno

- 27,92 - -

δ-Cadideno

28,12 - 28,14 28,11

33 Elemol - 28,43 - -

34 Óxido de Cariofileno - - 29,05 -

34 cis-diidro-Acetato de

Ocidentalol

- 29,64 - 29,62

36 Drimenol - - 29,49 -

37 trans-diidro-Acetato de

Ocidentalol

- - 29,91 29,93

38 Acetato de 2-Difenil Etil - - 32,78 -

3 – Resultados e Discussão 71

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As Figuras 17 à 54 apresentam os fragmentogramas obtidos para cada

componente experimentalmente possivelmente identificado nos óleos.

Encontram-se no Apêndice: Fragmentogramas Teóricos (Capítulo 5) os

respectivos fragmentogramas destes compostos publicados na literatura [52], e

utilizados para identificação dos mesmos por comparação com os resultados

obtidos.

As estruturas propostas pela literatura para os compostos identificados neste

trabalho encontram-se no Apêndice: Fórmulas Estruturais (Capitulo 6)

Figura 17 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Tricicleno

(pico 1) na amostra P. hebetatum.

3 – Resultados e Discussão 72

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3 – Resultados e Discussão 73

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Figura 18 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado

como α-Pineno (pico 2): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium;

d) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 74

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Figura 19 – Fragmentograma experimental do componente identificado como α-Fencheno

(pico 3) na amostra P. hebetatum.

3 – Resultados e Discussão 75

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3 – Resultados e Discussão 76

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Figura 20 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Canfeno

(pico 4): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum

Figura 21 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Sabineno

(pico 5) na amostra P. nitidifolium.

3 – Resultados e Discussão 77

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3 – Resultados e Discussão 78

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Figura 22 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como β-Pineno

(pico 6): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 79

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Figura 23 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como cis-Pinano

(pico 7): a) P. nitidifolium; b) P. divarictium;

3 – Resultados e Discussão 80

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3 – Resultados e Discussão 81

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Figura 24 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como 3-p-

Menteno (pico 8): a) P. hebetatum; b) P.divarictium; c) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 82

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Figura 25 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-

Felandreno (pico 9): a) P. hebetatum; b) P. divarictium.

3 – Resultados e Discussão 83

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 26 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como δ-2-Careno

(pico 10): a) P. hebetaum; b) P. divarictium.

3 – Resultados e Discussão 84

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3 – Resultados e Discussão 85

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Figura 27 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como o-Cimeno

(pico 11): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P.divarictium; d) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 86

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3 – Resultados e Discussão 87

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Figura 28 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Limoneno

(pico 12): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 88

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Figura 29 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como γ-Terpineno

(pico 13): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium.

Figura 30 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Terpinoleno

(pico 14) na amostra P. nitidifolium.

3 – Resultados e Discussão 89

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Figura 31 – Fragmentograma experimental do componente identificado como p-Cimeneno

(pico 15) na amostra P. divarictium.

Figura 32 – Fragmentograma experimental do componente identificado como trans-Sabinol

(pico 16) na amostra P. nitidifolium.

3 – Resultados e Discussão 90

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3 – Resultados e Discussão 91

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Figura 33 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Terpin-4-ol

(pico 17): a) P. hebetaum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium.

3 – Resultados e Discussão 92

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Figura 34 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-Terpineol

(pico 18): a) P.hebetatum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium.

3 – Resultados e Discussão 93

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Figura 35 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Tuj-3-em-10-

al (pico 19) na amostra P. nitidifolium.

Figura 36 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Verbenona

(pico 20) na amostra P. nitidifolium.

3 – Resultados e Discussão 94

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Figura 37 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como δ-Elemeno

(pico 21): a) P. nitidifolium; b) P.a amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 95

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3 – Resultados e Discussão 96

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Figura 38 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-

Cubebeno (pico 22): a) P. hebetatum; b) P. divarictium; c) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 97

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 39 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como

Ciclosativeno (pico 23): a) P. divarictium; b) P. amazonicum.

Figura 40 – Fragmentograma experimental do componente identificado como β-Elemeno

(pico 24) na amostra P. amazonicum

3 – Resultados e Discussão 98

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Figura 41 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Z-cariofileno

(pico 25) na amostra P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 99

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3 – Resultados e Discussão 100

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Figura 42 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como E-

Cariofileno (pico 26): a) P. hebetatum; b) P. nitidifolium; c) P. divarictium; d) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 101

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Figura 43 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Cedrano

(pico 27): a) P. divarictium; b) P. amazonicum;

3 – Resultados e Discussão 102

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Figura 44 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como α-

Humuleno (pico 28): a) P. nitidifolium; b) P. divarictium; c) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 103

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Figura 45 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como Seicheleno

(pico 29): a) P. hebetatum; b) P. divarictium.

3 – Resultados e Discussão 104

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Figura 46 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como γ-Muuroleno

(pico 30): a) P. nitidifolium; b) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 105

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Figura 47 – Fragmentograma experimental do componente identificado como α-Selineno

(pico 31) na amostra P. nitidifolium.

3 – Resultados e Discussão 106

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Figura 48 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como δ-Cadideno

(pico 32): a) P. hebetatum; b) P. divarictium; c) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 107

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 49 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Elemol (pico

33) na amostra P. nitidifolium.

Figura 50 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Óxido de

Cariofileno (pico 34) na amostra P. divarictium.

3 – Resultados e Discussão 108

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Figura 51 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como cis-diidro-

Acetato de Ocidentalol (pico 35): a) P. nitidifolium; b) P. amazonicum.

3 – Resultados e Discussão 109

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 52 – Fragmentograma experimental do componente identificado como Drimenol (pico

36) na amostra P.divarictium.

3 – Resultados e Discussão 110

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Figura 53 – Fragmentogramas experimentais do componente identificado como trans-diidro-

Acetato de Ocidentalol (pico 37): a) P.divarictium; b) P. amazonicum.

Figura 54 – Fragmentograma experimental do componente identificado como 2-Acetato de

Fenil-Etil-Fenila (pico 38) na amostra P.divarictium.

3 – Resultados e Discussão 111

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Os óleos essenciais extraídos das amostras P. hebetaum e P. nitidifolium

mostraram um perfil composto predominantemente por monoterpenos, mostrando-se

de acordo com os relatos publicados na literatura acerca dos óleos extraídos destas

resinas [30,40]. Entretanto estes mesmos relatam o monoterpeno p-cimeno como

constituinte majoritário nestas amostras, sendo, que este composto não foi

identificado no presente trabalho.

Contrario ao que normalmente ocorre com os constituintes não voláteis, há

uma considerável inconsistência nos dados reportados na literatura sobre a

composição de óleos essenciais. Este fato deve-se principalmente a variedade na

composição dos óleos essenciais, que diz respeito a diferentes quimiotipos de

espécies, uma vez que os fatores genéticos e ambientais influenciam sobre os

metabólitos terpenóides. Esta inconsistência de dados é especialmente notada

quando estes óleos são constituídos majoritariamente por compostos voláteis, como

ocorrem em com amostras onde há a predominância de monoterpenos e compostos

mais leves [18].

No óleo extraído de P. divarictium houve um contrabalanço entre os

conteúdos de mono e sesquiterpenos e, no óleo extraído de P. amazonicum houve

um prevalecimento do conteúdo sesquiterpênico. Não há relatos na literatura sobre

óleos essenciais destas duas ultimas espécies.

A predominância de sesquiterpenos no óleo essencial extraído da resina de

P. amazonicum é, sem dúvida, uma característica muito interessante a ser explorada

desta espécie. Esta classe de compostos é característica de óleos extraídos de

3 – Resultados e Discussão 112

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folhas de espécies Protium, sendo o perfil monoterpênico associado aos óleos

extraídos de resinas [18, 30, 33, 38, 40].

3.5.2 – Separação por CCD

Nas separações das frações dos óleos essenciais por CCD, foram escolhidas

como fases móvel as misturas de solventes Acetato de Etila : Hexano, 1:60 (fase

móvel 1, ε

= 1,96), e Diclorometano : Hexano, 1,5:1 (fase móvel 2, ε

= 6,20).

A fase móvel 1 (AcOEt : Hexano) resultou em duas, e a fase móvel 2

(CH

: Hexano) em três manchas bem distintas.

As separações utilizando como fase móvel Acetona : Hexano (1:30), também

resultaram em três manchas bem definidas, porém os resultados de CG/EM destas

frações não foi satisfatório, sendo esta, então, descartada deste trabalho.

A Figura 55 representa a metodologia geral empregada na separação dos

constituintes dos óleos essências por CCD.

3 – Resultados e Discussão 113

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 55 – Metodologia empregada na análise por CCD.

As Figuras 56 e 57 mostram as visualizações obtidas sob luz UV, em

comprimento de onda de 254 nm, nas separações dos constituintes dos óleos

essências das quatro espécies Protium por CCD.

3 – Resultados e Discussão 114

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 56 – Visualização sob luz UV

254 nm

da separação dos constituintes dos óleos

essenciais de Protium spp. por CCD (fase móvel 1).

Figura 57 – Visualização sob luz UV

254 nm

da separação dos constituintes dos óleos

essenciais de Protium spp. por CCD (fase móvel 2).

Acetato de Etila : Hexano (1 : 60)

P. hebetatum

P. nitidifolium

P. divarictium

P. amazonicum

Diclorometano : Hexano (1,5 : 1)

F10

F16

F11

F17

F14

F18

P. nitidifolium

P. divarictium

F13

P. hebetatum

P. amazonicum

F15

F12

3 – Resultados e Discussão 115

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São apresentados a seguir os resultados obtidos na análise CG/EM das

frações separadas por CCD.

Nas separações por CCD utilizando a fase móvel 1, apenas a fração F1 (P.

hebetatum), dentre as frações de Rf = 0,2, resultou na identificação dos constituintes

separados.

Na fração F1 foram identificados os monoterpenos o-cimeno, terpin-4-ol e α-

terpineol. A Figura 58 apresenta o cromatograma referente a esta fração F1.

Figura 58 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F1 (P. hebetatum).

3 – Resultados e Discussão 116

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As fração F2 (P. nitidifolium) e F4 (P. amazonicum) apresentaram manchas

bem definidas, porém, na análise por CG/EM não foi possível a identificação, por

comparação de fragmentogramas com a literatura, de nenhum destes constituintes

separados.

A fração F3 (P. divarictium), onde se obteve uma mancha de pouca

resolução, não apresentou nenhum constituinte na análise por CG/EM.

A identificação por CG/EM nas frações F5 a F8 (fase móvel 1; Rf = 0,9) foi

satisfatória, resultando na identificação dos seguintes terpenóides :

Na fração F5 (P. hebetatum) identificou-se o monoterpeno o-cimeno (11) e o

sesquiterpeno ciclosativeno (23).

Figura 59 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F5 (P. hebetatum).

3 – Resultados e Discussão 117

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Na fração F6 (P. nitidifolium) foram identificados os sesquiterpenos e-

cariofileno (26), α-humuleno (28), γ-muuroleno (30) e α-selineno (31).

Na fração F7 (P. divarictium) foram identificados os monoterpenos o-cimeno

(11) e limoneno (12), e os sesquiterpenos α-cubebeno (22), ciclosativeno (23) e e-

cariofileno (26).

Na fração F8 (P. amazonicum) foram identificados o-cimeno (11), e os

sesquisterpenos β-elemeno (24), z-cariofileno (25), cedrano (27) e γ-muuroleno (30).

Estes resultados são apresentados a seguir, nas Figuras 60 a 62.

Figura 60 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F6 (P. nitidifolium).

3 – Resultados e Discussão 118

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Figura 61 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F7 (P. divarictium).

Figura 62 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F8 (P. amazonicum).

3 – Resultados e Discussão 119

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Para as frações separadas utilizando a fase móvel 2, não foi possível a

identificação na amostra de P. amazonicum, onde não houve visualização de

mancha definida na cromatoplaca.

Na fração F9 (P. hebetatum) (Figura 63) identificou-se os monoterpenos

o-cimeno (11) e terpin-4-ol(17).

Na fração F10 (P. nitidifolium) (Figura 64) foi possível a identificação do

monoterpeno terpin-4-ol (11).

Na fração F11 (P.divarictium) (Figura 65) também foram identificados os

monoterpenos o-cimeno (11) e terpin-4-ol(17).

Os respectivos cromatogramas referentes as frações de Rf = 0,3

(fase móvel 2) encontram-se a seguir.

Figura 63 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F9 (P. hebetatum).

3 – Resultados e Discussão 120

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Figura 64 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F10 (P.nitidifolium).

Figura 65 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F10 (P.divarictium).

3 – Resultados e Discussão 121

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Obteve-se ainda, para este mesmo sistema de solvente (fase móvel 2)

manchas de Rf = 0,5 para as cromatoplacas das amostras de P.hebetatum (F12), P.

nitidifolium (F13) e P. amazonicum (F14). No entanto, na fração F13 não foi possível

a identificação dos constituintes separados.

Na fração F12 observa-se a presença de dois picos majoritários referentes a

monoterpenos não identificados, nesta fração foi identificado somente o

monoterpeno o-cimeno (11).

Na fração F14 foram identificados os monoterpeno o-cimeno (11) e o

sesquiterpeno γ-Muuroleno (30), também foi observado nesta fração a presença de

um pico majoritário, possivelmente referente a um sesquiterpeno não identificado.

Os respectivos cromatogramas são apresentados a seguir.

Figura 66 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F12 (P.hebetatum).

3 – Resultados e Discussão 122

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Figura 67 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F14 (P.amazonicum).

Na etapa subseqüente, foram analisadas as frações de Rf = 0,9 resultantes

das separações com este sistema de solventes (fase móvel 2).

Na fração F15 (P. hebetatum) (Figura 68

) foram identificados o monoterpeno

o-cimeno (11) e os sesquiterpenos α-cubebeno, ciclosativeno, e-cariofileno,

seicheleno e δ-cadideno. Ainda, outros dois picos majoritários não puderam ser

identificados nesta fração.

Na fração F16 (P. nitidifolium) (Figura 69) apesar da presença de picos

menores, que podem ser atribuidos a monoterpenos não identificados, houve uma

separação satisfatória de sesquiterpenos. Observa-se a presença de um pico

majoritário identificado como sendo o sesquiterpeno e-cariofileno (26). Foram

identificados ainda α-humuleno (28), γ-muuroleno (30) e selineno (31).

3 – Resultados e Discussão 123

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Na fração F17 ( P. divarictium) (Figura 70) foram identificados os

monoterpenos o-cimeno (11) e limoneno(12) e, os sesquiterpenos α-cubebeno (22),

ciclosativeno (23), e-cariofileno (26), α-humuleno (28), γ-muuroleno (30) e

δ-cadideno (32).

Na fração F18 (P. amazonicum) (Figura 71) observa-se somente a presença

de sesquiterpenos. Demonstrando a eficiência desta metodologia de CCD na

separação entre mono e sesquiterpenos nesta amostra. Foram identificados nesta

amostra δ-elemeno (21), α-cubebeno (22), ciclosativeno (23), z-cariofileno (25),

e-cariofileno (26), α-humuleno (28), γ-muuroleno (30), δ-cadideno (32), cedrano (27)

e β-elemeno (24), sendo estes dois últimos picos majoritários.

As Figuras 68 a 71 apresentam estes resultados.

Figura 68 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F15 (P.hebetatum).

3 – Resultados e Discussão 124

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Figura 69 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F16 (P.nitidifolium).

Figura 70 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F17 (P.divarictium).

3 – Resultados e Discussão 125

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Figura 71 – Cromatograma CG/EM obtido para a fração F18 (P.amazonicum).

Com a utilização da fase móvel 1 (frações F1 a F8), foram obtidos os

constituintes pertencentes a faixa intermediária, ou seja, monoterpenos de maior, e

sesquiterpenos de menor t

em CG (relativo a suas respectivas classes). Desta

forma, não foi observado um efetivo isolamento de determinados grupos de

constituintes destes óleos. Nas frações F1 e F6 foram identificados mono e

sesquiterpenos, respectivamente. Nas demais frações obtidas neste sistema de fase

móvel observaram-se a coexistência de sesqui e monoterpenos. Apesar desta

coexistência, o perfil obtido na fração F6, mono e sesquiterpenos bem resolvidos no

cromatograma, sugere que, talvez a realização de uma nova cromatografia (CCD)

desta fração resulte em melhor separação, ou isolamento de algum(ns)

constituinte(s) desta amostra.

3 – Resultados e Discussão 126

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Nas frações separadas utilizando-se a fase móvel 2 observou-se na fração

F10 o isolamento do monoterpeno terpin-4-ol e, nas demais frações de mesmo R

foi

identificado além deste o monoterpeno o-cimeno. Nas frações de R

intermediário

observou-se o isolamento de alguns compostos que não puderam ser identificados

e, nota-se nestas frações um comportamento similar ao citado anteriormente para o

sistema de fase móvel 1, a coexistência de monos e sesquiterpenos na mesma

fração. Dentre as frações de maior R

(frações 15 a 18), a fração F18 apresentou um

satisfatório isolamento de somente sesquiterpenos. As frações F15 e F17

apresentaram sesqui e monoterpenos bem separados, o que sugere, como já foi dito

anteriormente, a recromatografia destas frações a fim de se isolar estes

constituintes.

De acordo com os resultados apresentados anteriormente, observa-se que o

sistema cromatográfico onde foi empregada a fase móvel 2 (CH

:Hex, 1,5:1)

mostrou-se mais eficiente para prover a separaçãos dos constituitntes destes óleos

essenciais.

Neste sistema onde a fase móvel tem uma maior constante dielétrica, os

compostos mais leves e, portanto de maior afinidade pelo adsorvente do que pela

fase móvel, deslocam-se mais lentamente, desta forma é feita a separação entre os

monoterpenos e os sesquitepenos. São necessários ainda, alguns estudos mais

detalhados sobre estes sistemas de solventes a serem utilizados, para que seja

possível uma satisfatória separação dos compostos da faixa intermediária. Também

deve ser testada a recromatografia destas frações em outros sistemas de solventes,

3 – Resultados e Discussão 127

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

para que assim, sejam isolados os constituintes previamente separados nestas

frações.

3.5.3 – Quantificação dos Constituintes por Normalização Simples de

Área

O principal objetivo da análise quantitativa é determinar a quantidade de uma

espécies presente na amostra analisada. Neste trabalho, utilizou-se o método de

normalização simples a área a fim de obter-se informações sobre os constituintes

majoritários nestes óleos essenciais extraídos.

Utilizaram-se os cromatogramas já apresentados nas Figuras 13 a 16, para a

quantificação destes constituintes.

A Tabela apresenta os resultados obtidos no estudo de quantificação dos

constituintes identificados nas quatro espécies. Encontram-se destacados os

constituintes majoritários na composição destes óleos essenciais.

3 – Resultados e Discussão 128

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Tabela 6 – Concentração relativa dos componentes possivelmente identificados nos óleos

essenciais de Protium spp.

Identificação Quantificação (%)

(número)

Composto

hebetatum nitidifolium divarictium amazonicum

Tricicleno 0,12 - - -

α-Pineno

15,74 10,96 11,22 4,02

α-Fencheno

0,68 - - -

Canfeno 1,32 0,95 0,41 0,32

Sabineno - 3,37 - -

β-Pineno

2,52 3,62 1,40 0,79

cis-Pinano - 1,53 9,42 -

3-p-Menteno 2,24 - 2,58 0,27

α-Felandreno

1,90 - 2,35 -

δ-2-Careno

1,32 - 0,29 -

o-Cimeno 19,60 4,75 8,21 1,25

Limoneno 10,20 1,05 8,66 2,49

γ-Terpineno

0,36 0,43 - -

Terpinoleno - 0,23 - -

p-Cimeneno - - 0,31 -

trans-Sabinol - 1,66 - -

Terpin-4-ol 1,76 6,89 0,97 -

α-Terpineol

7,64 1,30 5,38 -

Tuj-3-en-10-al - 0,64 - -

Verbenona - 0,80 - -

3 – Resultados e Discussão 129

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δ-Elemeno

- 0,25 - 0,89

α-Cubebeno

0,19 - 4,48 1,38

Ciclosativeno - - 7,52 1,27

β-Elemeno

- - - 10,08

Z-Cariofileno - - - 4,15

E-Cariofileno 0,92 3,01 6,02 1,82

Cedrano - - 1,29 14,09

α-Humuleno

- 0,99 1,89 2,84

Seicheleno 0,91 - 1,67 -

γ-Muuroleno

- 3,01 - 4,90

αSelileno

- 3,07 - -

δ-Cadideno

1,33 - 3,14 1,80

Elemol - 1,64 - -

Óxido de Cariofileno - - 3,22 -

cis- Diidro Acetato de

Ocidentalol

- 6,60 - 3,84

Drimenol - - 3,35 -

trans-Diidro Acetato de

Ocidentalol

- - 1,90 1,67

Acetato de 2-Difenil Etil - - 0,20 -

3 – Resultados e Discussão 130

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Os constituintes majoritários identificados nos óleos essenciais das espécies

Protium spp. foram:

P. hebetatum: os monoterpenos o-cimeno (19,60%), α-pineno (15,74%),

limoneno (10,20%), e α-terpineol (7,64%);

P. nitidifolium: os monoterpenos α-pineno (10,96%), o-cimeno (4,75%),

terpin-4-ol (6,89%), e o sesquiterpeno cis – diidro acetato de ocidentalol (6,60%);

P. divarictium: os monoterpenos α-pineno (11,22%), o-cimeno (8,21%),

limoneno (8,66%) e, cis – pinano (9,42%);

P. amazonicum: os sesquiterpenos cedrano (14,09%) e β-elemeno (10,08%).

Observa-se, que as três primeiras amostras apresentam resultados

compatíveis com os relatos da literatura. Ou seja, a predominância de monoterpenos

entre os consituintes majoritários, sendo ainda, o α-pineno e monoterpenos de tipo

mentano (o-cimeno, limoneno, terpin-4-ol e α-terpineol) representativos nestas

espécies [18,30].

Os resultados acima provêm ainda, uma explicação a respeito dos diferentes

pontos de ebulição encontrados nas análises por DSC (Figura 7). O óleo de P.

hebetatum resultou no ponto de ebulição mais baixo (172,35 °C) em razão de serem

seus constituintes monoterpênicos são mais voláteis, por exemplo, que os

sesquiterpenos presentes majoritariamente no óleo de P. amazonicum, conferindo a

este ponto de ebulição 260,90 °C. Apesar da identificação dos constituintes

majoritários na amostra de P. divaricrtium como sendo monoterpenos, observa-se no

perfil geral deste óleo um contrabalanço na quantidade de constituintes mono e

sesquiterpênicos, respondendo ao ponto de ebulição 250,07 °C.

4 – Conclusões e Perspectivas Futuras 131

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

4 – Conclusões

As técnicas empregadas neste trabalho aliadas às informações populares e à

química analítica formam um conjunto de ferramentas imprescindíveis para o estudo

analítico destes óleos essenciais. Os resultados obtidos demonstram a eficiência das

técnicas e metodologia utilizadas.

O estudo do tempo de extração possibilitou uma extração quantitativa destes

óleos, evitando perdas (de massa e constituintes) e, otimizando esta etapa do

trabalho.

Concluiu-se que a análise por CCD é uma técnica muito útil na análise dos

constituintes dos óleos essências. As separações por CCD mostraram-se eficientes,

desenhando novos caminhos para o isolamento destes compostos. Por exemplo, o

composto terpin-4-ol, separado por CCD é um monoterpeno cujas atividades

antialérgica e vasodilatadora foram descritas, sendo também um dos mais

importantes compostos usados na industria de cosméticos e perfumaria.

Nas análises por CG/EM os dados qualitativos e quantitativos obtidos

apresentaram dados inéditos para este gênero. A espectrometria de massas se

mostrou de extrema importância na possível identificação destes constituintes.

Estas informações associadas à caracterização físico-química deste óleo

representam um novo perfil para os óleos essenciais extraídos de resinas do gênero

Protium, como por exemplo, os resultados obtidos para as espécies P. divarictium e

P. amazonicum.

4 – Conclusões e Perspectivas Futuras 132

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Foram identificados um total de 38 constituintes, entre monos e

sesquiterpenos. Sendo 17 constituintes para a espécie P. hebetatum; 21 para a

espécie P. nitidifolium; 23 para a espécie P. divarictium; e 18 para a espécie P.

amazonicum.

Dentre os constituintes majoritários encontram-se os monoterpenos α-pineno,

limoneno, o-cimeno, terpin-4-ol, α-terpineol, cis-pinano e, os sesquiterpenos

β-elemeno, z- e e-cariofileno, cedrano, γ-muuroleno e cis-diidro acetato de

ocidentalol.

Há muitos relatos na literatura sobre as propriedades anti-sépticas,

antibactericida e antifúngica de óleos essenciais contendo grande porcentagem de

constituintes monoterpênicos, dentro deste contexto este trabalho apresenta um

grande potencial para utilização biológica destes óleos essenciais, entre outras

aplicações.

4.1 – Perspectiva de Trabalhos Futuros

– Extração do óleo essencial por outras técnicas como fluido supercrítico e/ou

SPME-HS;

– Estudo dos parâmetros como força iônica e adição de solvente no meio de

extração;

– Estudo detalhado da metodologia de separação e isolamento por CCD e

CLC dos constituintes que possam vir a apresentar atividade biológica;

– Testes biológicos em cobaia;

– Identificação dos constituintes utilizando índice de Kováts.

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 133

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5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos

Figura 72 – Fragmentograma teórico do composto Tricicleno (1).

Figura 73 – Fragmentograma teórico do composto α-Pineno (2).

Figura 74 – Fragmentograma teórico do composto α-Fencheno (3).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 134

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Figura 75 – Fragmentograma teórico do composto Canfeno (4).

Figura 76 – Fragmentograma teórico do composto Sabineno (5).

Figura 77 – Fragmentograma teórico do composto β-Pineno (6).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 135

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Figura 78 – Fragmentograma teórico do composto cis-Pinano (7).

Figura 79 – Fragmentograma teórico do composto 3-p-Menteno (8).

Figura 80 – Fragmentograma teórico do composto α-Felandreno (9).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 136

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Figura 81 – Fragmentograma teórico do composto 2-δ-Careno (10).

Figura 82 – Fragmentograma teórico do composto o-Cimeno (11).

Figura 83 – Fragmentograma teórico do composto Limoneno (12).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 137

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Figura 84 – Fragmentograma teórico do composto γ-Terpineno (13).

Figura 85 – Fragmentograma teórico do composto γ-Terpinoleno (14).

Figura 86 – Fragmentograma teórico do composto p-Cimeneno (15).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 138

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Figura 87 – Fragmentograma teórico do composto trans-Sabinol(16).

Figura 88 – Fragmentograma teórico do composto Terpin-4-ol (17).

Figura 89 – Fragmentograma teórico do composto α-Terpineol (18).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 139

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Figura 90 – Fragmentograma teórico do composto Tuj-3-en-10-al (19).

Figura 91 – Fragmentograma teórico do composto Verbenona (20).

Figura 92 – Fragmentograma teórico do composto δ-Elemeno (21).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 140

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Figura 93 – Fragmentograma teórico do composto α-Cubebeno (22).

Figura 94 – Fragmentograma teórico do composto Ciclosativeno (23).

Figura 95 – Fragmentograma teórico do composto β-Elemeno (24).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 141

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Figura 96 – Fragmentograma teórico do composto Z-Cariofileono (25).

Figura 97 – Fragmentograma teórico do composto E-Cariofileono (26).

Figura 98 – Fragmentograma teórico do composto Cedrano (27).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 142

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Figura 99 – Fragmentograma teórico do composto α-Humuleno (28).

Figura 100 – Fragmentograma teórico do composto Seicheleno (29).

Figura 101 – Fragmentograma teórico do composto γ-Muuroleno (30).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 143

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Figura 102 – Fragmentograma teórico do composto α-Selineno (31).

Figura 103 – Fragmentograma teórico do composto δ-Cadideno (32).

Figura 104 – Fragmentograma teórico do composto Elemol (33).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 144

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Figura 105 – Fragmentograma teórico do composto Óxido de Cariofileno (34).

Figura 106 – Fragmentograma teórico do composto cis-Diidro Acetato de Ocidentalol (35).

Figura 107 – Fragmentograma teórico do composto Drimenol (36).

5 – Apêndice: Fragmentogramas Teóricos 145

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Figura 108 – Fragmentograma teórico do composto trans-Diidro Acetato de Ocidentalol (37).

Figura 109 – Fragmentograma teórico do composto 2-Acetato de di-Fenil Etila (38).

6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais 146

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6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais

Tricicleno

α-Pineno

-Fencheno

Canfeno Sabineno

β-Pineno

cis-Pinano 3-p-Menteno

α-Felandreno

6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais 147

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

H OH

2-δ-Careno

o-Cimeno Limoneno

γ-Terpineno

Terpinoleno p-Cimeneno

Trans-Sabinol Terpin-4-ol

α-Terpineol

6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais 148

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

Tuj-3-en-10-al Verbenona

δ-Elemeno

α-Cubebeno

Ciclosativeno

β-Elemeno

z-Cariofileno

6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais 149

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

e-Cariofileno Cedrano

α-Humuleno

Seicheleno

γ-Muuroleno

α-Selineno

6 – Apêndice: Fórmulas Estruturais 150

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

H OH

O Ac

δ-Cadideno

Elemol

Óxido de Cariofileno cis – Diidro Acetato de Ocidentalol

Drimenol trans – Diidro Acetato de Ocidentalol

2-Acetato de di-Fenil Etila

7 – Bibliografia 151

Dissertação - Érica Ap. Souza Silva USP/IQSC – GQATP

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