( PDF ) Atividade dos flavonóides rutina e naringina sobre o tumor ascítico de Ehrlich "in vivo"

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HUSSEN MACHADO

ATIVIDADE DOS FLAVONÓIDES RUTINA E NARINGINA SOBRE O

TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH “IN VIVO”.

VIÇOSA

MINAS GERAIS–BRASIL

2006

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das exigências

do Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica Agrícola, para obtenção do titulo

de "Magister Scientiae".

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HUSSEN MACHADO

ATIVIDADE DOS FLAVONÓIDES RUTINA E NARINGINA SOBRE O

TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH “IN VIVO”.

APROVADA: 02 maio de 2006

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das exigências

do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Agrícola, para obtenção do titulo de "Magister

Scientiae".

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Dedico essa tese a meus pais, Milton e Marion, pela educação, dedicação e

principalmente por compreenderem minha ausência. Pois, os filhos crescem e saem para

o mundo, mas sem perder de vista o porto seguro, com o seu farol sempre aceso, atento

a tudo e de portas abertas. É essa segurança, de saber que estou sempre protegido que

me da a força necessária para seguir em frente. A vocês dedico não só está vitória, mas

o fato de existir. Amo e admiro muito vocês não apenas como filho, mas com Homem.

A minha irmã Francely, pela cumplicidade e torcida por minhas realizações.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora e amiga Dra. Tânia Toledo de Oliveira, pela confiança, sinceridade

e orientação tanto científica como de vida. “Pois, Umas são mulheres; algumas

professoras; poucas são mestres. As primeiras escuta-se; as segundas respeita-se; as

últimas segue-se”. Um obrigado de seu eterno amigo.

Ao professor Dr. Marcelo José Vilela, exemplo de sinceridade, amizade e seriedade

profissional. Muito obrigado. Pois, “Os melhores professores são aqueles que se fazem

de ponte e convidam seus alunos a atravessá-la depois, de facilitada a atravessia, eles se

desfazem com prazer, incentivando seus alunos a construírem suas próprias pontes”.

Ao professor Dr. Tanus Jorge Nagem pelo apoio, conselhos e tão calorosa acolhida,

possibilitando meu crescimento profissional.

À professora Dra. Marlene Isabel Vargas Viloria pela colaboração imprescindível

durante a leitura das lâminas.

A Silvana Lages Ribeiro Garcia pelas análises estatísticas realizadas com carinho e

dedicação. Obrigado.

Ao meu primo Salustiano, pela confiança, conselhos e orientação profissional. Muito

obrigado pela ajuda e contribuição para a realização de meus sonhos.

A Cristiane pela amizade e enorme dedicação para a realização de nosso trabalho.

A Santuzza, pela dedicação, paciência e carinho diário. Obrigado por sempre acreditar

em mim e em meu sucesso.

A Maria Aparecida Leão, pela grande amizade e ajuda para a conclusão desse trabalho.

Ao José Geraldo Pinto, pelo apoio indispensável nas análises sangüíneas.

A todos os estagiários do Laboratório de Biofármacos que muito contribuíram para a

realização desta obra, durante o desenvolvimento dos experimentos. A todos muito

obrigado!

Aos estagiários do laboratório do Câncer que não mediram esforços para me ajudar. A

ajuda de vocês foi imprescindível.

Ao meu eterno amigo Dr. Rodrigo Vilela Rodrigues, pela amizade, lealdade ao longo de

nossa carreira estudantil.

Ao futuro Dr. Eduardo Rodrigues de Castro pela amizade e confiança construída em tão

pouco tempo de convivência.

Aos meus amigos de república Toninho, Vinícius, Renato e Felipe e todos que por aqui

passaram.

À Universidade Federal de Viçosa pela oportunidade e à coordenação do Programa de

Pós Graduação em Bioquímica Agrícola que possibilitaram a realização deste curso.

A todos que, direta ou indiretamente, me ajudaram na realização deste trabalho.

BIOGRAFIA

HUSSEN MACHADO, filho de Milton José Machado e Marion Pessoa

Machado, nasceu em Boa Esperança, MG, em 01 de novembro de 1978.

Concluiu o curso de graduação em Farmácia na Universidade Federal de Juiz de

Fora (Juiz de Fora, MG), em janeiro de 2004.

Em agosto de 2004 foi aceito no programa de Pós-Graduação do Departamento

de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa, onde deu

início aos trabalhos do mestrado na área de Bioquímica Agrícola.

CONTEÚDO

LISTA DE FIGURAS ------------------------------------------------------

LISTA DE TABELAS------------------------------------------------------

LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS---------------------------

RESUMO --------------------------------------------------------------------

xvi

ABSTRACT -----------------------------------------------------------------

xvii

1. INTRODUÇÃO ---------------------------------------------------------- 1

2. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------- 3

2.1 Objetivos Geral ------------------------------------------------------ 3

2.2 Objetivos Específicos ----------------------------------------------- 3

3. REVISÃO DE LITERATURA ---------------------------------------- 4

3.1. Câncer ------------------------------------------------------------- -- 4

3.1.1. Invasão e Metástase-----------------------------------------

3.2. Tumor de Ehrlich----------------------------------------------------

3.3. Flavonóides e Câncer-----------------------------------------------

3.3.1. Flavonóides---------------------------------------------------

3.4. Mecanismo de ação dos flavonóides----------------------------- 25

3.4.1 Ação Antioxidante ------------------------------------------- 25

3.4.2 Atividade inibitória da síntese de óxido nítrico ---------- 28

3.4.3 Ação Antiinflamatória --------------------------------------

3.4.4 Interação de flavonóides com outros sistemas

xiv

enzimáticos----------------------------------------------------------

3.3.5 Ação anti-estrogênicas dos flavonóides-------------------

3.3.6 Inibição do proteasoma-------------------------------------- 39

4. MATERAL E MÉTODOS -------------------------------------------- 41

4.1 Animais --------------------------------------------------------------- 41

4.2 Obtenção doTumor Ascítico de Ehrlich -------------------------- 42

4.3 Preparação das células tumorais para inoculação ---------------

4.4 Inoculação dos animais--------------------------------------------- 43

4.5 Grupos e protocolo de tratamento --------------------------------- 43

4.5.1. Primeiro experimento - prevenção do tumor ascítico

de ehrlich com flavonóides----------------------------------------

4.5.2. Segundo experimento - tratamento de camundongos

com TAE com flavonóides ---------------------------------------

4.5.3. Neotaxel-------------------------------------------------------

4.6 Eutanásia dos camundongos, coleta de sangue, coleta de

líquido ascítico e coleta do fígado para histopatologia--------------

4.7 Análise do tempo de vida-------------------------------------------

4.8 Análise estatística ---------------------------------------------------

5. RESULTADOS E DISCUSÃO---------------------------------------- 49

5.1 Prevenção do Tumor Ascítico de Ehrlich em camundongos

tratados com diferentes flavonóides por 18 dias ---------------------

5.2 Tratamento de camundongos com Tumor Ascítico de Ehrlich

com diferentes flavonóides por 18 dias -------------------------------

5.3 Morfologia Hepática------------------------------------------------ 81

5.3 Modificações histopatológicas encontradas---------------------- 82

6. CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------- 86

7. PERSPECTIVAS FUTURAS------------------------------------------

8. BIBLIOGRAFIA -------------------------------------------------------

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Os múltiplos passos da carcinogênese------------------------

Figura 2 Mecanismos pelo qual um oncogene pode promover o

crescimento celular----------------------------------------------

Figura 3 Comparação entre tumor benigno do miotério

(leiomioma) e tumor maligno de origem semelhante

(leiomiuossarcoma)----------------------------------------------

Figura 4 Representação esquemática dos múltiplos eventos

apoptóticos--------------------------------------------------------

Figura 5 Representação esquemática simplificada da biossíntese de

flavonóides--------------------------------------------------------

Figura 6 Representação esquemática dos processos fisiológicos

desempenhados pelo oxido nítrico-----------------------------

Figura 7 Representação simplificada do potencial de indução de

COX em macrófagos ativados na indução da angiogênese

em lesões pré-neoplásicas--------------------------------------

Figura 8 Estrutura do proteasoma----------------------------------------

Figura 9 Administração dos flavonóides por gavage------------------

Figura 10 Inoculação das células tumorais intraperitoneal-------------

Figura 11 Corte de tecido hepático de animal normal que recebeu

ração, onde são observados hepatócitos e espaço

sinusóide ----------------------------------------------------------

Figura 12 Corte de tecido hepático de animal com TAE que recebeu

ração, onde são observados hepatócitos, espaço sinusóide

e adesão de células tumorais -----------------------------------

Figura 13

Corte de tecido hepático de animal com TAE que recebeu

o flavonóide naringina, onde são observados, espaço

sinusóide e adesão de células tumorais------------------------

Figura 14 Corte de tecido hepático de animal com TAE que recebeu

a associação dos flavonóide rutina + naringina, onde são

observadas, hemácias e adesão de células tumorais---------

Figura 15 Corte de tecido hepático de animal com TAE que recebeu

o medicamento Neotaxel

, onde são observados

hepatócitos, espaço sinusóide e adesão de células

tumorais-----------------------------------------------------------

Figura 16 Corte de tecido hepático de animal com TAE que recebeu

o medicamento rutina, onde são observadas hemácias e

adesão de células tumorais--------------------------------------

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Estrutura química de certos flavonóides de ocorrência

natural em plantas -------------------------------------------

Tabela 2

Distribuição de animais por grupo------------------------

Tabela 3

Distribuição dos animais em cada grupo e seus

respectivos tratamentos ------------------------------------

Tabela 4

Valores médios de proteínas totais no soro sangüíneo

de camundongos tratados com flavonóides por 20 dias

com posterior indução do tumor ascítico de Ehrlich ---

Tabela 5

Valores médios de aspartato aminotransferase no soro

sangüíneo de camundongos tratados com flavonóides

por 20 dias com posterior indução do tumor ascítico

de Ehrlich-----------------------------------------------------

Tabela 6

Valores médios de alanina aminotransferase no soro

sangüíneo de camundongos tratados com flavonóides

por 20 dias com posterior indução do tumor ascítico

de Ehrlich-----------------------------------------------------

Tabela 7

Valores médios de albumina no soro sangüíneo de

camundongos tratados com flavonóides por 20 dias

com posterior indução do tumor ascítico de Ehrlich ---

Tabela 8

Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Número

de células tumorais viáveis presentes no líquido

ascítico dos camundongos ---------------------------------

Tabela 9

Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Número

de células tumorais mortas presentes no líquido

ascítico dos camundongos ---------------------------------

Tabela 10

Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Número

de células tumorais totais presentes no líquido ascítico

dos camundongos -------------------------------------------

Tabela 11 Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE.

Viabilidade celular presente no líquido ascítico dos

camundongos ------------------------------------------------

Tabela 12

Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Volume

do líquido ascítico dos camundongos --------------------

Tabela 13

Atividade preventiva de flavonóides sobre o tempo de

vida de camundongos com TAE --------------------------

Tabela 14

Valores médios de proteínas totais (g/dL) no soro

sanguíneo de camundongos com tumor ascítico de

Ehrlich tratados com flavonóides por 18 dias -----------

Tabela 15

Valores médios de Aspartato aminotransferase – AST

- (U/mL) do soro sanguíneo de camundongos com

tumor ascítico de Ehrlich tratados com flavonóides

por 18 dias----------------------------------------------------

Tabela 16

Valores médios de Alanina aminotransferase – ALT -

(U/mL) do soro sanguíneo de camundongos com

tumor ascítico de Ehrlich tratados com flavonóides

por 18 dias ---------------------------------------------------

Tabela 17

Valores médios de albumina (g/dL) do soro sanguíneo

de camundongos com tumor ascítico de Ehrlich

tratados com diferentes flavonóides por 18 dias --------

Tabela 18

Valores médios de proteínas totais (g/dL) do líquido

ascítico de camundongos com tumor ascítico de

Ehrlich tratados com diferentes flavonóides por 18

dias ------------------------------------------------------------

Tabela 19

Valores médios de aspartato aminotransferase (AST)

do líquido ascítico de camundongos com tumor

ascítico de Ehrlich tratados com diferentes

flavonóides por 18 dias ------------------------------------

Tabela 20

Valores médios de Alanina aminotransferase – ALT

do líquido ascítico de camundongos com tumor

ascítico de Ehrlich tratados com diferentes

flavonóides por 18 dias ------------------------------------

Tabela 21

Valores médios de albumina no líquido ascítico de

camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados

com diferentes flavonóides por 18 dias------------------

Tabela 22

Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE.

Número de células tumorais viáveis presentes no

líquido ascítico dos camundongos-------------------------

Tabela 23

Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE.

Número de células tumorais mortas presentes no

líquido ascítico dos camundongos-------------------------

Tabela 24

Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE.

Número de células tumorais totais no líquido ascítico

dos camundongos-------------------------------------------

Tabela 25 Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE.

Viabilidade celular no líquido ascítico dos

camundongos------------------------------------------------

Tabela 26 Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE.

Volume do líquido ascítico dos camundongos ----------

Tabela 27 Atividade dos flavonóides e tempo de vida de

camundongos com TAE -----------------------------------

LISTA DE ABREVIATURAS

%ILS- Percentagem de aumento do tempo de sobrevida

AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida

ALT- Alanina aminotransferase

ANG- Angioprotéinas

AST- Aspartato aminotransferase

ATP- Adenosina trifosfato

CDK 1- Quinase dependente de ciclina 1

CDK 2- Quinase dependente de ciclina 2

CDK 5- Quinase dependente de ciclina 5

CDKs- Quinases dependentes de ciclinas

cNOS- Óxido nítrico sintetase constitutiva

COX 2- Cicloxigenase 2

COX- Ciclogenase

CYPs- Enzimas do citocromo p450

DMBA- 9,10 dimetil -1,2-benzantraceno

DNA- Ácido desoxirribonucléico

ECM- Matriz extracelular

EGCG- Epigalocatequina galato

ERs- Receptores de estrógenos

FAP- Fator ativador plaquetário

FGF- Fator de crescimento de fibroblasto

GADD 45- Growth arrest DNA damage inducible

GST- Glutationa transferase

iNOS- Óxido nítrico sintetase induzida

LDLs- lipoproteínas de baixa densidade

MDM 2- Mouse double minute 2

MDV- Densidade de microvasos

MECB – Extrato metanólico de Cesalpinia bonducella.

MHC- Complexo maior de histocompatibilidade

MMPs- Metaloproteína de matriz

MST- Tempo médio de sobrevida dos animais

NADPH- Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NO- Óxido nítrico

NSAID- Antiinflamatório não esteroidal

PD-ECGF- Fator crescimento endotelial celular derivado de plaqueta

PDGF- Fator de crescimento derivado de plaquetas

PGE 2- Prostaglandina E2

PGs- Prostaglandinas

PI3 K- Fosfoinositol 3 quinase

PIGF- Fator de crescimento derivado da placenta

PKC- Proteína quinase C

RNS- Espécies reativas de nitrogênio

ROS- Espécies reativas de oxigênio

S1P- Esfingosina 1 fosfato

SGLT 1- Transportador de glicose sódio dependente

TAE- Tumor ascítico de Ehrlich

TGF β- Fator de transformação de crescimento beta

TNF α- Fator de necrose tumoral alfa

TXA 2- Tromboxano A2

TXs- Tromboxanos

UPF- Fator de permeabilidade vascular

VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular

VEGFr- Receptor de fator de crescimento endotelial vascular

VEGFRs- - Receptores de fator de crescimento endotelial vascular

RESUMO

MACHADO, Hussen, M.S., Universidade Federal de Viçosa, maio de 2006. Atividade

dos flavonóides rutina e naringina sobre o tumor ascítico de Ehrlich “in vivo”.

Orientadora: Tânia Toledo de Oliveira. Co-Orientadores: Marcelo José Vilela e

Tanus Jorge Nagem.

O presente trabalho avaliou a atividade dos flavonóides rutina e naringina na

prevenção e tratamento do tumor ascítico de Ehrlich, com intuito de esclarecer alguns

aspectos relacionados à viabilidade celular tumoral, parâmetros sanguíneos e tempo de

vida dos animais. Para avaliar o efeito preventivo dos flavonóides sobre o tumor

ascítico de Ehrlich, os animais foram tratados, por via oral, com 10mg/kg dos

flavonóides por 20 dias. No 21

º-

dia os animais foram inoculados com 1,66 x 10

cel/100

µL em PBS pH 7,4 por via intraperitoneal. Neste mesmo dia foi suspenso o tratamento

com o flavonóide. Após 18 dias da inoculação das células tumorais, os animais sofreram

eutanásia e os devidos fluídos corporais foram coletados para análises. Para avaliar o

efeito de tratamento dos flavonóides sobre o tumor ascítico de Ehrlich, no 1

º-

dia do

experimento os animais foram inoculados com 1,66 x 10

cel/100 µL em PBS pH 7,4

por via intraperitoneal. Após 24 horas de inoculação, iniciou-se o tratamento com os

flavonóides na dosagem de 10mg/kg; Após 18 dias de tratamento com os flavonóides,

os animais sofreram eutanásia e os devidos fluídos foram coletados para análises.

Utilizou-se o medicamento Neotaxel

como controle positivo. O tempo médio de vida

dos animais (MST) e a porcentagem de aumento do tempo de vida (%ILS) foram

avaliados durante 40 dias.

ABSTRACT

MACHADO, Hussen, M.S., Universidade Federal de Viçosa, May, 2006. Effect the

flavonoids rutin and naringin on the Ehrlich ascitic tumor “in vivo”. Adviser:

Tânia Toledo de Oliveira. Co-advisers: Marcelo José Vilela and Tanus Jorge

Nagem.

The present research is evalvating the flavonóids rutin and naringin effect in the

prevention and treatment on the Ehrlich ascitic tumor; with the intention of having a

better understernding of the viability of tumor cells, sanguine parameters and animals

life. To evaluate the preventive effect of flavonoid on the the Ehrlich ascitic tumor, the

animals were medicated, through an oral way, with 10mg/kg of flavonoid for 20 days.

In the 21

day the animals were inoculated with 1,66 x 10

cel/100 µL in PBS pH 7,4 in

an intraperitoneal way. The treatment with flavonoids was interrupted in the same day.

After 18 days of the tumor cell inoculation, the animals were submitted to euthanasia

and respectives corporal fluid was collected for analyze. To evaluate the effect of

flavonoid treatment on the the Ehrlich ascitic tumor, in the 1

experimental day the

animals were inoculated with 1,66 x 10

cel/100 µL in PBS pH 7,4, in a intraperitoneal

way. Twenty-four hours after the inoculation the treatment started with the flavonoids in

a proportiur of 10mg/kg; Then, 18 days after the use of flavonóids, the animals were

submitted to euthanasia and respectives corporal fluid was collected for analyze. To

have a positive control, Neotaxel

was used as a medication. The median survival time

of the animals (MST) and the increased percentage of this survival (%ILS) was

evaluated a during 30 day period.

1. INTRODUÇÃO

Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em

comum o crescimento desordenado (maligno) de células que invadem os tecidos e

órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo. Dividindo-se

rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando

a formação de tumores (acúmulo de células cancerosas) ou neoplasias malignas. Por

outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma massa localizada de células

que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido original, raramente

constituindo um risco de vida (INCA, 2004)

O câncer está entre as doenças que mais causam mortes no mundo. Segundo

dados do INCA (2004), as neoplasias constituem a segunda maior causa de morte no

Brasil, precedida somente por doenças cardiovasculares.

Os grandes avanços na área da oncologia experimental e o conhecimento do

comportamento da célula tumoral e seus mecanismos de disseminação foram em grande

parte resultado do uso de modelos tumorais em animais. Nos estudos da biologia do

câncer, questões específicas como viabilidade celular tumoral, volume de líquido

ascítico e tempo médio de vida dos animais, somente podem ser respondidas por um

modelo experimental adequado. Obviamente que os diversos modelos experimentais

não respondem todas as perguntas para os inúmeros sistemas animais e o extenso

número de enfermidades do homem. Mesmo assim, os modelos animais são

inestimáveis para a elucidação de possíveis respostas do hospedeiro frente ao tumor,

além de permitir o estudo das características referentes ao crescimento neoplásico e os

possíveis mecanismos de disseminação favorecendo, dessa forma nosso conhecimento a

respeito da biologia e terapia da enfermidade neoplásica (RIZZO, 2000).

O tumor de Ehrlich tem a capacidade de crescimento em suspensão no líquido

ascítico após sua inoculação na cavidade peritoneal em camundongos. Dos tumores

experimentais utilizados para estudos in vivo o tumor de Ehrlich na forma ascítica tem

sido um recurso útil principalmente por permitir uma padronização do número de

células a serem inoculadas, quantificação do crescimento e regressão da massa tumoral

(DAGLI, 1989).

A literatura indica que muitos produtos naturais são estudados como agentes

quimioprotetores contra cânceres de ocorrência mundial (REDDY, 2003). Estudos

epidemiológicos sugerem a relação inversa entre risco de câncer e consumo de vegetais,

frutas, cereais e grãos de uma maneira geral, fibras dietética, certos micronutrientes,

certos tipos de gordura (ácidos graxos ϕ-3) e também hábitos de vida, como prática de

atividade física (GREENWALD, 2001).

Um grande número de flavonóides e isoflavonóides (BIRT, 2001) têm sido

pesquisados por suprimir a carcinogênese em vários modelos animais (RASHMI, 2003).

Existe um considerável interesse nesses compostos que exercem efeitos benéficos em

mecanismos que envolvem a patogênese do câncer. Em recentes anos, uma considerável

atenção tem sido dada a habilidade desses compostos em inibir o ciclo celular, a

proliferação celular, o estresse oxidativo e na indução da detoxificação de enzimas,

apoptose e no sistema imune (BIRT, 2001).

No presente trabalho avaliou-se o efeito dos flavonóides rutina, naringina e do

quimioterápico Neotaxel® na prevenção e no tratamento do tumor ascítico de Ehrlich in

vivo.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVOS GERAIS

Avaliar o efeito dos flavonóides rutina, naringina na prevenção e no tratamento

de camundongos inoculados com tumor ascítico de Ehrlich.

2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar a atividade preventiva dos flavonóides rutina e naringina no

desenvolvimento do tumor ascítico de Ehrlich em camundongos.

• Avaliar a atividade dos flavonóides rutina e naringina no desenvolvimento

do tumor ascítico de Ehrlich em camundongos.

• Verificar alterações histológicas no fígado dos camundongos com TAE

tratados com os flavonóides rutina e naringina.

• Comparar o efeito do quimioterápico Neotaxel

com os flavonóides rutina e

naringina no tratamento de camundongos com TAE.

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1. CÂNCER

A palavra câncer é derivada do latim e significa caranguejo. Este nome foi dado

a essa doença devido à semelhança com que este crustáceo se adere firmemente a sua

presa, assim como o tumor se adere ao local do corpo onde se desenvolve (BOLD et al.,

1997).

Provavelmente, o mais antigo reconhecimento da ocorrência de câncer em seres

humanos refere-se à descrição encontrada em papiros do antigo Egito, datados de 1500

a.C, referentes a úlceras cutâneas resistentes a tratamentos. Ao longo dos anos, marcos

importantes no estudo do câncer puderam ser registrados, como a classificação de

Galeno, no ano de 150 de nossa era, que incluía os hoje conhecidos tumores benignos e

malignos como fenômenos “contrários à natureza” (DAGLI, 1989).

O câncer pode ser genericamente definido como tumor ou neoplasma.

Neoplasma (do grego neos: novo, e plasma: algo formado) significa "novo

crescimento" (HARNDEN & MCGEE, 1992). Segundo Ruppert Wíllis, citado por

(BAAK, 2003), neoplasia é “uma massa anormal de tecido cujo crescimento excede e

não está coordenada ao crescimento dos tecidos normais e que persiste mesmo cessada a

causa que a provocou”.

As neoplasias são classificadas de acordo com a origem embrionária dos tecidos

dos quais são derivados: os carcinomas são originários de células epiteliais, derivadas

de qualquer uma das três camadas germinativas (ectodérmica, mesodérmica e

endodérmica). Logo, os carcinomas com padrão microscópio de crescimento glandular

são definidos como adenocarcinomas. Os sarcomas são derivados de tecido

mesenquimatoso como osso, cartilagem e gordura. Os linfomas são neoplasias

originárias de tecido linfóide, enquanto que as leucemias são de células hematopoéticas

de origem medular (COTRAN et al., 2000).

A carcinogênese pode ser compreendida como um processo complexo no qual se

encontram envolvidos muitos genes, particularmente os que regulam a estabilidade e o

reparo do DNA, crescimento celular, imunidade e quimio-resistência às drogas

(JÚNIOR, 2002). A vida da célula normalmente necessita da expressão equilibrada dos

genes proliferativos que favorecem o desencadeamento da divisão celular e da

diferenciação celular; e dos genes antiproliferativos (supressores de tumores) os quais,

inibem o ciclo celular ou induzem a morte celular programada (apoptose). Sendo assim,

o câncer é decorrente das transformações celulares que promovem a ruptura do

equilíbrio fisiológico (MADELAINE, 2005). A figura 1 demonstra alguns dos passos da

indução carcinogênica:

Figura 1 – Os múltiplos passos da carcinogênese.

Célula normal

Dano ao DNA

Mutação no genoma

das células somáticas

Alteração de genes

que regulam a

apoptose

Inativação de

genes

supressores do

tumor

Agentes

ambientais

Ativação de

promotores

de crescimento de

oncogêneses

reparo do DNA

Mutações em genes que

afetam o reparo do DNA

falencia no

reparo do DNA

Fonte: Robbins, 2005.

Uma das causas relacionadas ao desenvolvimento neoplásico é o funcionamento

inadequado de genes reguladores da proliferação celular. Em condições normais, o

crescimento celular é controlado por duas classes de genes os proto-oncogenes e os

Expressão de produtos de genes

alterados e perda dos produtos de

genes regulatórios

Expansão clonal, Mutações adicionais

(progressão).

Câncer

genes supressores que codificam proteínas capazes de regular o crescimento celular,

evitando o comportamento maligno das células (ALBERTS et al., 1997).

Os proto-oncogenes são genes celulares que promovem o crescimento e

diferenciação normal da célula. Estes genes quando mutados tomam-se amplificados no

número de cópias e funcionam como promotores da expansão clonal da célula tumoral,

passando a ser denominados de oncogenes. Nestas condições, as onco-proteínas

codificadas por estes genes são responsáveis pela proliferação anormal das células que

uma vez desreguladas, superam a parada do ciclo celular no ponto R, onde seria feita a

checagem do DNA. Assim, se houver dano ao genoma, não haverá tempo suficiente

para sua reparação, tampouco haverá tempo para a célula danificada entrar no processo

de apoptose. Deste modo, as alterações do genoma serão herdadas pelo clone celular

após a divisão, perpetuando os danos no DNA (NERY, 2004). A figura 2 representa

alguns dos mecanismos utilizados pelos oncogenes para promover o crescimento

celular.

Figura 2 - Mecanismos pelo qual um oncogene pode promover o crescimento celular

Maior produção de fator de

crescimento

Gene ativado

do fator de

crescimento

Gene do

receptor do

fator de

crescimento

Maior número de receptores para

fatores de crescimento

Fonte: Robbins,2005

A mais importante contribuição para o aparecimento do câncer é o dano ao

DNA. As mutações ocorrem em proto-oncogênes, que são normalmente expressos

durante o desenvolvimento embrionário e também em células maduras, e em genes

supressores tumorais, geralmente por perda de função e inativação de alelos (ALBERTS

et al., 1997; BROOKS et al, 2000; JORD et al, 2000). Sabe-se que para ocorrer a

transformação maligna de células em cultura requerem-se duas ou mais alterações de

oncogenes e freqüentemente são necessárias quatro a seis diferentes genes alterados

para o crescimento tumoral (ZORNIG et al., 2001).

Células do corpo que se dividem rapidamente são mais susceptíveis a

carcinogênese devido a menor oportunidade do DNA ser reparado antes da

divisão celular (REDDY, 2003). Uma célula anormal que não prolifere mais do

que suas vizinhas normais não provoca danos significativos, mas se sua

proliferação está fora de controle irá originar um tumor ou neoplasma, ou seja,

um crescimento incansável de uma massa de células anormais (ALBERTS,

1997). A resistência à apoptose fisiológica é uma das características

fundamentais da célula cancerosa (MEDELAINE, 2005).

Vários outros fatores favorecem o aparecimento do câncer: influências

ambientais, como agentes físicos (raio ultravioleta, radiação ionizante), químicos

(aflatoxinas) e biológicos (vírus); e também as influências culturais (alimentação,

estresse, tabagismo), raciais (possivelmente genéticos), e principalmente fatores como a

idade e a hereditariedade que podem culminar em sucessivas mutações contribuindo

para o aparecimento de diversas neoplasias (COTRAN et al., 2000; MADELAINE,

2005).

Gene do

receptor

mutante do

fator de

crescimento

Receptor defeituoso do fator

de crescimento é ativado

continuamente

Mutações nos

trantransdutores

Proteína mutante

transdutora de sinal

A dieta possui uma grande contribuição na etiologia e prevenção do câncer

(GREENWALD, 2001). A literatura reconhece que os fatores dietéticos representam

cerca de 30% das causas de câncer (PADILHA, 2004) e no caso de câncer de cólon,

essa porcentagem sobe para 80%. Quando se adiciona consumo de álcool e cigarro à

dieta, ocorre um aumento para 60%. Predisposição genética ao câncer está associada a

20% dos casos. Os carcinógenos ambientais incluem poluição do ar e água, radiação e

medicamentos (REDDY, 2003).

Segundo Kroeff (2004) em 35 anos de trabalho experimental sobre câncer em

animais de laboratório, a humanidade aprendeu muito mais do que em todos os séculos

de empirismo, transcorridos.

3.1.1. INVASÃO E METÁSTASE

Segundo Alberts (1997) a capacidade de invasão geralmente implica na habilidade

das células tumorais em escapar, entrar na corrente sanguínea e/ou vasos linfáticos e

formar tumores secundários ou metástases em outros locais do corpo. Quanto mais

metástases um câncer for capaz de produzir, mais difícil a sua erradicação.

A medida que células neoplásicas permanecem agrupadas numa massa única, o

tumor é dito benigno e a cura completa pode ser obtida pela remoção da massa

cirurgicamente. Um tumor é considerado como câncer somente se for maligno, se as

células tiverem o poder de invadir tecidos vizinhos. Geralmente, o sufixo –oma é

empregado para designar os tumores benignos, assim fibroma é um tumor benigno que

surge de células fibroblásticas, condroma um tumor cartilaginoso e osteoma, um tumor

de osteoblastos (ALBERTS, 1997).

As características que diferenciam neoplasias benignas e malignas podem

convenientemente ser discutidas sob quatro aspectos: (a) diferenciação e anaplasia; (b)

taxa de crescimento; (c) invasão local; (d) metástase.

Diferenciação e anaplasia: Diferenciação refere-se ao grau de

semelhança entre as células neoplásicas e as células normais comparáveis

tanto morfológica quanto funcionalmente. Em geral, os tumores benignos são

bem diferenciados. Os neoplasmas malignos compostos de células

indiferenciadas são ditos anaplásicos, pois, literalmente no sentido da palavra,

“regridem”, indicando uma reversão de um alto nível de diferenciação para um

nível inferior. A falta de diferenciação ou anaplasia é marcada por várias

alterações morfológicas e funcionais como pleomorfismo (variação de tamanho

e forma tanto das células como dos núcleos), os núcleos apresentam uma

abundância de DNA e são normalmente escuros (hipercromáticos). A forma

nuclear é geralmente muito variável, e a cromatina freqüentemente está

aglomerada e distribuída ao longo da membrana nuclear. Grandes nucléolos

geralmente estão presentes nestes núcleos. Os tumores indiferenciados em

geral possuem um grande número de mitoses, refletindo a maior atividade

proliferativa das células parenquimatosas.

Taxa de crescimento: Em geral a maioria dos tumores benignos cresce

lentamente durante um período de anos, enquanto a maioria dos cânceres

cresce rapidamente, às vezes a uma velocidade errática, eventualmente se

espalhando e matando seus hospedeiros.

Invasão local: A maioria dos tumores benignos cresce como massas

coesivas em expansão, permanecendo situadas em seu local de origem, sem a

capacidade de se infiltrarem, invadirem ou metastatizarem para locais

distantes, como ocorre nos tumores malignos, nos quais o crescimento é

acompanhado de infiltração progressiva, invasão e destruição do tecido vizinho

(Figura 3).

Figura 3 – Comparação entre tumor benigno do miotério (leiomioma) e

tumor maligno de origem semelhante (leiomiossarcoma).

Fonte: COTRAN, 2000.

Metástase: O termo "metástase" vem do Grego (meta = além; stasis = parar)

sendo originalmente empregado no contexto da Teoria Fisiológica Humoral vigente

400-500 anos a.C., segundo a qual, o equilíbrio da homeostase corporal era dado pelo

perfeito balanceamento entre os quatro humores orgânicos: sangue, bile amarela, bile

negra e fleuma. Esta teoria fisiopatológica foi criada em analogia à Teoria dos "Quatro

Elementos", sendo documentada por Hipócrates e posteriormente traduzida por Galeno

no século II d.C., passando então à Escola Escolástica de Medicina da Idade Média

(MEOHAS, 2005)

Segundo a “Teoria Fisiológica Humoral”, o organismo cozinhava o excesso ou o

eliminava através dos dejetos orgânicos. Caso o material não fosse completamente

cozido ou eliminado, era depositado ("apostasis") ou mandado para outra parte do corpo

("metástases"). Acreditava-se que o acúmulo de bile negra era responsável pelo

surgimento dos tumores e que as metástases eram depósitos desta bile transportados

para outra parte do organismo. Estes conceitos influenciaram o meio científico até o

século XIX, quando importantes descobertas delinearam um novo panorama no campo

da oncologia (MEOHAS, 2005)

O termo "metástase" foi introduzido por Récamier. Entretanto, coube a Thiersch

(1822-1895) e Waldeyer (1865-1921) a estrutura das bases da Teoria Mecanicista que

ganhou espaço a partir do século XIX através da comprovação morfológica de êmbolos

metastáticos de células epiteliais em vasos linfáticos e linfonodos. De acordo com esta

teoria, plenamente aceita no final do século XIX, as células tumorais seriam distribuídas

via vasos sangüíneos e linfáticos, formando colônias tumorais no local onde fossem

depositadas (BROWN, 2001).

Dentre um dos primeiros estudos experimentais sobre metástases Takahashi

(1915), citado por Dagli (1989), descreveu a existência das vias linfática e hematógena

de disseminação das neoplasias, aceitando a hipótese do transporte de êmbolos

tumorais. O mesmo autor afirmou constituir-se de duas fases o processo metastático,

seja de tumor espontâneo ou transplantável: uma fase inicial, na qual as células tumorais

penetram pelo endotélio vascular, e uma segunda fase, na qual os êmbolos, após

transporte vascular mecânico, estabelecem união com a parede vascular dos órgãos-alvo

e penetram pelo endotélio. E importante ressaltar, que o processo de entrada da célula

tumoral no componente vascular pode ocorrer de forma passiva, pelos vasos

neoformados que irrigam a massa tumoral, ou de forma ativa, atravessando o endotélio

e a membrana basal (BRENTANI et al, 1988).

Sabe-se, atualmente, que as células tumorais passam por várias fases antes de

estabelecerem focos metastáticos. Após o crescimento e a vascularização do tumor

original elas devem, inicialmente, separar-se da massa tumoral, invadirer localmente a

matriz tecidual adjacente, adentrar a parede de vasos sanguíneos ou linfáticos,

sobreviver na circulação sanguínea ou linfática, ligar-se ao endotélio capilar do tecido

em que se estabelecerão, iniciar agregação plaquetária, atravessar a parede capilar,

invadir o tecido local, e então proliferar. A metástase é, portanto, o resultado final de

várias etapas interdependentes, um processo multifacetado que inclui uma complexa

interação entre o tumor e organismo hospedeiro, uma seqüência de eventos que ainda

hoje não está completamente esclarecida (BROWN, 2001).

Em geral, as localizações anatômicas de tumores primários diferem do sitio

inicial de metástase. As células neoplásicas que sobrevivem, multiplicam-se e

extravasam para o parênquima dos órgãos formando novos focos tumorais (RIZZO,

2000). Alterações genéticas influenciam a adesividade celular, favorecendo o

desprendimento das células do tumor primário, além da neovascularização, que não só

serve para manter as necessidades metabólicas inerentes ao desenvolvimento do tumor,

como também para prover uma rota de "fuga" pela qual as células neoplásicas podem

deixar o tumor primário (TANAKA et al., 2002) e adentrar o sistema linfático ou

circulatório, caracterizando a disseminação linfática e hematogênica, respectivamente

(CNAMBERS et aI., 2002).

Aventa-se a possibilidade de que a pressão exercida pelo tumor seja um

mecanismo passivo de que se valem as células tumorais para invadirem tecidos

adjacentes. Isso pode ocorrer devido a mecanismos enzimáticos, alterações no

citoesqueleto celular, diminuição do número de junções intercelulares ou a um

decréscimo na biossíntese de componentes da matriz extra-celular (DAGLI, 1989).

Outro fator importante para a circulação de células neoplásicas dentro do organismo é a

atividade do citoesqueleto, particularmente a formação, desintegração, contração e

relaxamento de feixes de filamentos de actina; associados a eles, existem diferentes

proteínas que na maioria das vezes são reguladas diretamente por concentrações de Ca

ou indiretamente via calmodulina (ROOS, 1984).

Iwasaki (1915) citado por Dagli (1989), considerou que as células tumorais,

apesar de serem originárias do próprio organismo, são tratadas como corpos estranhos

na corrente sanguínea. Este autor realizou estudo histológico de neoplasias em seres

humanos e, experimentalmente, inoculou células tumorais em ratos e camundongos pela

veia femural. Observando histologicamente a presença de êmbolos tumorais em vasos, e

em muitos casos a ausência de formações metastáticas, Iwasaki concluiu haver

destruição de células tumorais na corrente sanguínea.

Sabe-se, por exemplo, que após injeção intravenosa experimental de células

tumorais, apenas 0,01% destas irão conseguir formar um foco tumoral. Essa baixa

percentagem deve-se às várias etapas interdependentes que compõem a complexa

cascata de eventos necessários ao estabelecimento do implante secundário (BROWN,

2001). Tumores histologicamente comparáveis podem ter potencial metastático

extremamente divergente, dependendo do genótipo e influências ambientais locais. O

potencial metastático é influenciado pelo micro-ambiente local, angiogênese, interações

tumor-estroma, elaboração de citocinas pelo tecido local, e mais significativamente por

seu genótipo molecular (LIOTTA & KOHW, 2000).

As metástases são os aspectos mais insidiosos e ameaçadores do câncer, sendo a

principal causa de morbidade, mortalidade e de falhas em tratamento de pacientes com

neoplasias, uma vez que a cada dez mortes pela doença nove são resultados de

metástases (GIBBS, 2003). Cerca de 30% dos pacientes com diagnóstico de tumores

malignos sólidos (com exceção do câncer de pele não-melanoma) desenvolve

metástases, fato que reduz acentuadamente a possibilidade de cura (COTRAN et al.,

2000).

3.2. TUMOR DE EHRLICH

Dos inúmeros tumores experimentais utilizados para estudo in vivo em animais,

o uso de tumores transplantáveis na forma ascítica tem sido um recurso útil pelas

seguintes razões: facilidade na padronização do número de células a serem inoculadas;

quantificação do crescimento e regressão da massa tumoral e também porque permitem

o estudo comparativo com os mesmos métodos desenvolvidos para a pesquisa de

células na corrente sanguínea e demais fluidos corporais (DAGLI et al., 1989; SAAD-

HOSSNE et al., 2004).

Historicamente, os primeiros relatos de transplante de neoplasias datam de 1773

quando PEYRILHE inoculou material extraído de neoplasias mamárias humanas sob a

pele de cães. De modo geral, quer para os estudos básicos de biologia tumoral, quer para

a investigação de novas modalidades terapêuticas (cirúrgica, medicamentosa,

radioterápica) dispõem-se hoje de uma variedade de tumores experimentais, já

catalogados (SAAD-HOSSNE, 2002).

O tumor de Ehrlich foi introduzido por Paul Ehrlich em 1886 e descrito em 1906

como um carcinoma mamário de camundongos fêmeas (DAGLI, 1989; RIZZO, 2000).

Devido a suas características e facilidade de manuseio experimental, o tumor de Ehrlich

tem sido extensamente aplicado para a chamada Oncologia Experimental (DAWE,

1982).

Inicialmente, o tumor de Ehrlich foi desenvolvido experimentalmente sob a

forma sólida, sendo transplantado em animais da mesma espécie. Somente em 1932,

com Loewenthal & Jahn, é que surgiu a forma ascítica, ou seja, aquela desenvolvida no

peritônio de animais inoculados com células tumorais (DAGLI, 1989).

O termo ascite (do grego askites, que significa bexiga, barriga ou bolsa) é

definido como sendo o acúmulo de líquido na cavidade peritoneal. Esta patologia ocorre

devido a um aumento da pressão venosa, a qual se estende aos capilares do peritônio

causando a transudação de líquido para o abdômen ou quando aumenta a pressão nos

sinusóides hepáticos (de 5 a 10 mm de Hg) podendo haver a transudação pela própria

superfície do fígado. Uma terceira causa de ascite pode ser a diminuição da pressão

coloidosmótica do plasma. Muitas vezes as três causas podem estar envolvidas

(HAUSBERGER et al., 2001).

O tumor de Ehrlich tem a capacidade de crescimento em suspensão no líquido

ascítico e em tecido celular subcutâneo e após a sua implantação na cavidade peritoneal

em camundongos sadios tem como resultado a formação de líquido ascítico tumoral

(DAGLI, 1989; SAAD-HOSSNE, 2004). Estima-se que 10% de todos os casos de ascite

em humanos, são de origem neoplásica, sendo a maioria destas provenientes de tumores

gastrointestinais e ovarianos (SAAD-HOSSNE et al., 2004). Várias doenças estão

associadas à ascite, dentre elas a carcinomatose peritoneal que é responsável por causar

uma exsudação de fluído proteináceo das células tumorais, fazendo com que o líquido

extracelular entre na cavidade peritoneal para restabelecer o balanço osmótico. Em

metástases maciças no fígado e no carcinoma hepatocelular, ocorre hipertensão portal

secundária, desencadeando um mecanismo semelhante ao da cirrose, que ocasiona

aumento dos níveis de oxido nítrico, causando uma vasodilatação que simula um

decréscimo no volume arterial efetivo e possivelmente, leva ao aumento do hormônio

retentor de sódio, diminuindo a filtração renal. A ascite quilosa, secundária ao linfoma

maligno, aparece como conseqüência da obstrução dos linfonodos pelo tumor e pela

ruptura dos vasos linfáticos (HAUSBERGER et al., 2001).

Histologicamente, o tumor sólido de Ehrlich apresenta extensas áreas de

necrose, oriundas da morte das células neoplásicas, a qual é bastante intensa já na

primeira semana pós-inoculação. Intensa atipia e células extremamente anaplásicas são

também comumente vistas no tumor. O tumor possui poucas células inflamatórias e

estroma escasso. Alto índice mitótico e de invasividade caracterizam essa neoplasia

(GABAI et al., 1995; DAGLI, 1989). Quando observado em maior aumento ao

microscópio de luz, é evidente a presença de células epiteliais neoplásicas arranjadas

concentricamente a um foco de necrose do tipo coagulativa. Essas células exibem

intenso pleomorfismo, hipercromatismo nuclear e alteração da relação núcleo

citoplasma. Observaram-se também células multinucleadas com núcleos, muitas vezes,

gigantes, evidenciando ainda mais intensa atipia nuclear, com citoplasma bastante

amplo. O estroma é bastante escasso, com pouca vascularização (OLIVEIRA et al.,

2003).

Segundo Dagli (2002), o exame histoquímico de uma gota de líquido ascítico do

tumor de Ehrlich revela células pleomórficas, com diâmetros 2 a 3 vezes superiores as

das hemácias do camundongo, que contêm numerosas gotículas de tamanho variável

com material birrefringente em seu interior. Essas gotículas são lipídeos, os quais estão

presentes devido a um processo degenerativo que leva ao acúmulo lipídico no interior

da célula ou a uma desregulação genômica que provoca a intensificação da produção de

lipídios pelas células.

O tumor ascítico de Ehrlich pode ser transplantado para qualquer linhagem de

camundongo, provavelmente devido à perda da expressão do MHC. Esta característica

exclui o principal papel do linfócito T citotóxico durante o desenvolvimento do tumor,

indicando que talvez a imunidade celular não seja o principal mecanismo de defesa do

hospedeiro contra o tumor ascítico de Ehrlich (BERGAMI-SANTOS et al., 2004).

Segundo Sugiura (1965), citado por Gentile (2001), não há ocorrência de metástases no

coração, rins, adrenais, fígado ou baço. Além disso, é sabido que as células do tumor de

Ehrlich podem ser inoculadas por via intravenosa sendo de grande utilidade nos estudos

sobre migração de células e desenvolvimento de metástases, visto que, na forma sólida,

não há ocorrência de crescimento secundário (RIZZO, 2000). Dentre outros modelos, o

tumor ascítico de Ehrlich é utilizado para auxiliar na investigação de novas modalidades

terapêuticas em biologia tumoral (SAAD-HOSSNE, 2002), e principalmente na

fisiopatologia do câncer e das metástases.

3.3. FLAVONÓIDES E CÂNCER

O câncer é um dos mais antigos males da humanidade Djuric e colaboradores

(2001) estimaram, para o ano de 2000, que o número de novos casos de câncer no

mundo seria mais de 10 milhões, dentre os quais, 53% dos casos ocorreriam nos países

em desenvolvimento. Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (2004), no Brasil,

as estimativas para o ano de 2005 apontavam para a ocorrência de mais de 467.440

novos casos de câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção de pele não melanoma, serão

os de próstata e pulmão no sexo masculino e mama e colo do útero para o sexo

feminino, acompanhando a mesma magnitude observada no mundo.

Das 520 drogas aprovadas entre 1983 e 1994, 39% eram derivadas de produtos

naturais das quais, 60% eram antibióticos e anticarcinogênicos (CRAGG, 1997). Entre

esses produtos naturais encontram-se os “alimentos funcionais”, que nas últimas

décadas tornaram-se apreciados por profissionais da área de saúde e pelo público em

geral devido a seus benefícios à saúde. Segundo Lander (2001) a sociedade não deveria

negligenciar o poder dos compostos naturais no tratamento das doenças humanas.

Segundo Yang et al., (2001) vários flavonóides têm demonstrado suprimir a

carcinogênese em modelos animais. Há relatos interessantes considerando que os

flavonóides exercem um efeito benéfico em vários mecanismos que envolvem a

patogenia do câncer.

Os flavonóides representam um grande grupo de fitoquímicos que são

conhecidos por exercerem uma atividade anti-tumoral. Assim, estudos investigativos

têm demonstrado que os possíveis mecanismos de inibição da carcinogênese por

polifenóis estejam relacionados com o aumento da expressão de superóxido dismutase

(MANSON, 2003), inibição da cicloxigenase e lipoxigenase (HONG, 2001; SAKATA,

2003), indução de apoptose e repressão do ciclo celular, como demonstrado em células

carcinogênicas humanas in vitro (MANSON, 2003).

Os flavonóides vêm sendo extensivamente pesquisados como protetores das

células contra danos de raios-X, bloqueando a progressão do ciclo celular e a síntese de

prostaglandinas e inibindo mutações em experimentos animais (REDDY, 2003).

Quercetina, luteolina e genisteína têm mostrado capacidade de inibir o dano oxidativo

do DNA induzido por irradiação ultravioleta (WEISS, 2003). Reddy (2003) relata que a

propriedade antioxidante dos flavonóides faz com que eles tenham a propriedade de

inibir vários tipos de câncer.

Existem diferentes “mecanismos de ação” desempenhados pelos flavonóides

como agentes anti-mutagênicos. Certos flavonóides podem influenciar diretamente a

atividade enzimática envolvida no reparo do DNA e/ou modular expressão de genes

(FERGUSON, 2001). De acordo com Marchand (2002), os flavonóides afetam a

progressão do ciclo celular. O flavonóide quercetina bloqueou o ciclo celular na fase

G1/S de células cancerosas de cólon e gástrica. Já em linhagens de células de mama e

laringe esse flavonóide mostrou bloquear a fase G2/M do ciclo celular (FORMICA,

1995). O metabolismo rápido da quercetina forma o metabólito metilado isorhamnetina,

que possui efeito no retardamento das fases G0-G1 do ciclo celular em baixas

concentrações em linhagens de células HepG2 (hepatocarcinoma).

A isorhamnetina e o flavonóide miricetina, em diferentes concentrações,

afetaram diferentes enzimas envolvidas na transdução de sinais, dessa forma

interromperam o ciclo celular em estágios específicos (RUSAK, 2005). Alguns

flavonóides como apigenina, luteolina e quercetina induzem a apoptose por mecanismos

dependentes do gene p-53. A proteína p-53 funcional apresenta meia vida curta (10 a 20

minutos) e atua na regulação do ciclo celular, reparo de DNA e, dependendo da

extensão da lesão, indução da apoptose das células geneticamente instáveis, mantendo

desta forma a integridade do genoma (JUNIOR, 2002; SCHUTZ, 2003).

Evidências in vitro mostraram que a quercetina pode inibir a proliferação celular

através do bloqueio da atividade da ornitina carboxilase e da incorporação da timidina

ao DNA além de, modular a apoptose em cultura de células. Resultados mostraram

ainda que a quercetina inibiu tanto a mitose quanto a apoptose em cultura de células

glomerulares. O mecanismo molecular envolvido no efeito anti-mitótico e anti-

apoptótico da quercetina são largamente obscuros, mas investigações sugerem que os

flavonóides inibem a tirosina quinase e MAP quinase podendo ser estes os possíveis

alvos farmacológicos (MARCHAND, 2002).

As proteínas quinases regulam e controlam muitas atividades fisiológicas,

consequentemente interferem nas enzimas que estão associadas ao crescimento tumoral.

Flavonóides podem inibir a promoção do tumor através de efeitos inibitórios na

fosforilase C e proteína quinase. A atividade da proteína tirosina quinase foi inibida

pelo flavonóide quercetina em tumores mamários de ratos induzidos pelo (DMBA) 9,10

dimetil -1,2-benzantraceno (FORMICA, 1995). Segundo Williams (2004), diversos

flavonóides como epicatequina, epicatequina galato, epigalocatequina galato (EGCG) e

quercetina vêm sendo pesquisados como citoprotetores nas rotas de sinalização do ciclo

celular. Uma ação citoprotetora importante desses compostos está envolvida na inibição

da caspase-3 e ativação de proteínas MAP quinases que são pró-apoptóticas.

Os efeitos celulares dos flavonóides são dependentes da associação deles com as

células, pela interação com a membrana ou pela entrada deles no citosol. Flavonóides

possuem a capacidade de se ligar aos sítios de ligação do ATP de um grande número

de proteínas, incluindo ATPase mitocondrial, cálcio plasma membrana ATPase,

proteína quinase A, proteína quinase C e topoisomerase. Os flavonóides hesperidina

e naringenina têm sido pesquisados por possuírem a atividade inibitória de

numerosas proteínas quinases. Essa inibição é mediada via ligação dos flavonóides

ao sítio de ligação do ATP, presumivelmente por causar trocas na estrutura

tridimensional das quinases levando à sua inatividade. Flavonóides também podem

interagir com a mitocôndria, interferindo em passos do metabolismo intermediário

e/ou baixa regulação da expressão de adesão de moléculas. Quercetina, um flavonol,

expressa efeitos antiproliferativos e induz a morte celular de células tumorais

predominantemente por mecanismos apoptóticos em diversas linhagens de células

cancerosas. Os flavonóides induzem a ativação da caspase-3, caspase-9 em linhagens

de células malignas (WILLIAMS, 2004).

Flavonóides possuem atividade anti-tumoral, causando inativação do

carcinógeno, paralisação do ciclo celular, indução da apoptose e inibição da

angiogênese. A figura 4 representa esquematicamente os eventos apoptóticos, onde 1

assinala os múltiplos estímulos da apoptose. Estes incluem ligantes de morte

específicos (fator de necrose tumoral – FNT), subtração de fatores de crescimento ou

hormônios e agentes nocivos (radiação). Alguns estímulos (como células citotóxicas)

ativam diretamente as caspases executoras. O controle e regulação são influenciados

por membros da família Bcl-2 de proteínas, que podem inibir ou promover a morte

celular. As caspases executoras ativam endonucleases citoplasmáticas latentes e

proteases que degradam proteínas do citoesqueleto e núcleo. Isso resulta em uma

cascata de degradação intracelular, incluindo fragmentação da cromatina nuclear e

ruptura do citoesqueleto. Resultado final é a formação de corpúsculos apoptóticos

que contêm várias organelas intracelulares e outros componentes do citosol; esses

corpúsculos também expressam novos ligantes para ligação e captação por células

fagocíticas (CHEVET, 2001).

A naringenina (flavonóide) causa citotoxicidade e apoptose via indução da

atividade de caspase-3/CPP32, mas não da atividade da caspase-1, em linhagens de

células humanas promielo leucêmicas (HL-60). Esses achados sugerem que a

naringenina pode inibir o crescimento tumoral. Agentes com habilidade de induzir

apoptose em tumores têm sido usados na terapia anti-tumoral. Flavonóides produzem

diferentes efeitos biológicos e a atividade deles em induzir apoptose tem sido

identificada em muitos estudos. Estudos in vivo, mostram o efeito da naringenina em

inibir o crescimento do tumor em camundongos induzidos com sarcoma S-180. A

ação sobre as caspases é importante porque a morte celular por apoptose é seguida

pela ativação de proteínas efetivas chamadas caspases, que participam de cascatas

enzimáticas que terminarão na desmontagem celular (SCHULTZ, 2003).

Figura 4 – Representação esquemática dos múltiplos eventos apoptóticos.

Fonte: COTRAN, 2000

Porém, ainda, muitas questões precisam ser esclarecidas, incluindo exatamente

como específicos fatores dietéticos estão relacionados na prevenção do câncer.

Estudos epidemiológicos, embasados em dados in vivo e in vitro têm contribuído

imensamente para ajudar elucidar a ligação existente entre dieta e prevenção de

câncer (GREENWALD, 2001). Razões tiveram Ewing e Greenough em dizer: "O

diagnóstico e o tratamento do câncer já deixou de ser trabalho de um só homem – no

longer one man job". Enunciaram uma verdade (KROEFF, 2004).

3.3.1. FLAVONÓIDES

Em 1930 uma nova substância química foi isolada de laranjas e acreditava-se

tratar de mais um novo membro da família das vitaminas e essa substância foi

designada como vitamina P. Quando estudos demonstraram tratar-se de um flavonóide,

a Rutina, uma agitação na pesquisa formou-se na tentativa do isolamento deste e de

vários outros flavonóides (NIJVELDT et al., 2001). Sendo assim, desde que foi

identificada, a natureza química dos flavonóides vem sendo estudada extensivamente

(WOO, 2005).

Polifenóis, especialmente os flavonóides, são metabólitos secundários de plantas

biossintetizados a partir da via dos fenilpropanóides (SIMÕES et al., 2000) e definidos

quimicamente como substâncias compostas por um núcleo comum de fenilcromanona

-C

) com substituição em uma ou mais hidroxilas, incluindo derivados ligados a

açucares (BIRT, 2001).

A estrutura dos flavonóides está baseada no núcleo flavilium, o qual consiste de

três anéis fenólicos. O benzeno do primeiro anel é condensado com o sexto carbono do

terceiro anel, que na posição 2 carrega um grupo fenila como substituinte. O terceiro

anel pode ser um pirano heterocíclico, gerando as estruturas básicas das

leucoantocianinas (ou pró-antocianinas ou catequinas) e as antocianidinas, denominado

de núcleo flavana. Devido ao fato do terceiro anel apresentar-se como uma pirona,

ocorre a formação das flavonas, flavonóis, flavanonas, isoflavonas, chalconas e auronas,

recebendo a denominação de núcleo 4-oxo-flavonóide (AHERNE & O’BRIEN, 2002).

As atividades bioquímicas dos flavonóides e de seus metabólitos dependem de

sua estrutura química, que podem variar com substituições incluindo hidrogenação,

hidroxilações, metilações, malonilações, sulfatações e glicosilações. Flavonóides e

Isoflavonóides ocorrem comumente como ésteres, éteres ou derivados glicosídicos ou

ainda uma mistura deles (BIRT, 2001). Exceto o grupo das leucoantocianinas, os

demais flavonóides ocorrem em plantas sempre acompanhados por glicídios recebendo

assim, a denominação de glico-flavonóide ou flavonóides glicosilados (DEGÁSPARI,

2004). As substituições glicídicas incluem D-glicose, L-rhamnose, glicorhamnose,

galactose, lignina e arabinose (BIRT, 2001). Quando se apresentam isentos de glicídios,

a estrutura recebe o nome de aglicona (DEGÁSPARI, 2004).

O termo "fenólico" ou "polifenol" pode ser definido como sendo uma substância

que tem um ou mais núcleos aromáticos contendo substituintes hidroxilas e/ou seus

derivados funcionais como ésteres, metoxilas, glicosídeos e outros. Essa definição

também engloba a classe dos flavonóides . Entretanto, uma definição levando em conta

somente a estrutura química não é apropriada, uma vez que existem compostos

contendo hidroxilas fenólicas, fazendo parte de outras classes de metabólitos diferentes

dos flavonóides. Dessa forma, é mais conveniente empregar-se uma definição que leva

em conta também a origem biogenética (SIMÕES et al., 2000). Uma representação

esquemática da biossíntese de flavonóides está representada na figura 5.

Os flavonóides representam um dos grupos mais importantes e diversificados

entre os produtos de origem vegetal e natural. Essa classe de compostos é amplamente

distribuída no reino vegetal. Com poucos relatos em algas, alguns representantes foram

identificados em briófitas, existindo apenas um relato de ocorrência em fungos. Em

pteridófitas também foram encontrados, mas sua variabilidade estrutural é pequena.

Todavia estão presentes em abundância nas angiospermas, apresentando nesse grupo

enorme diversidade estrutural (SIMÕES et al., 2000).

A distribuição dos flavonóides nos vegetais depende de diversos fatores de

acordo com a fila/ordem/família do vegetal, bem como da variação das espécies.

Geralmente, flavonóides encontrados nas folhas podem ser diferentes daqueles

presentes nas flores, nos galhos, raízes e frutos. O mesmo composto ainda pode

apresentar diferentes concentrações dependendo do órgão vegetal em que se encontra

(SIMÕES, 2000). É importante ressaltar que fatores abióticos naturais como a radiação

solar, raios UV, períodos de seca ou chuva, nutrientes e estações do ano influenciam no

metabolismo e na produção destes compostos e ainda, fatores artificiais, como

poluentes, podem interferir também nesse mecanismo (CATHERINE, 2003;

DEGÁSPARI, 2004). Em períodos de chuva os compostos mais polares são eliminados

das plantas por lixiviação. Também em regiões poluídas a planta pode produzir maior

quantidade de metabólitos secundários, incluindo flavonóides, como mecanismo de

defesa contra patógenos como vírus, bactérias, fungos, insetos.

A maioria dos flavonóides presentes nos alimentos ocorre principalmente na

forma glicosilada de 3-O-glicosídeo e polímeros (HEIM, 2002).

Figura 5 - Representação esquemática simplificada da biossíntese de

flavonóides.

Fonte: SIMÕES et al., 2000.

Não surpreendentemente, a

-ligação destes açúcares ao anel fenólico é

resistente a hidrólises por enzimas pancreáticas. Assim sendo, acreditou-se que a

microbiota intestinal era responsável pela

-hidrólise de muitos açúcares dessas

moléculas. Porém, duas

-endoglicosidases foram caracterizadas no intestino delgado

humano como capazes de hidrolisar flavonóides glicosilados incluindo lactase

phlorizina hidrolase e uma enzima citosólica não específica capaz de desglicosilação de

flavonóides, permitindo assim, sua conjugação com outros grupos (HEIM, 2002).

Spencer et al., citado por Heim (2002), demonstraram que os flavonóides 7-glicosil

luteolina, 3-glicosil Kaemferol e 3-glicosil quercetina são hidrolisados e absorvidos

pelo intestino delgado pela ação da enzima glicosidase.

As cinéticas de absorção variem consideravelmente entre alimentos devido à

heterogeneidade de açúcares e outros grupos funcionais ligados ao núcleo de flavonas.

Além do mais, a absorção também é dependente da dosagem, veículo de administração,

antecedentes da dieta, diferenças sexuais, população microbiana do cólon e de

flavonóides que são absorvidos ligados a proteínas (WALLE, 2004).

O preparo dos alimentos para consumo pode, algumas vezes, resultar em perdas

destes compostos, em maior ou menor grau, variando de acordo com o tipo de alimento

e o tipo de preparo empregado. Todavia, os flavonóides são compostos relativamente

estáveis, pois resistem à oxidação, altas temperaturas e moderadas variações de acidez

(PETERSON & DWYER, 1998). Flavonóides e isoflavonóides compreendem uma

classe de fitoquímicos que não podem ser sintetizados por humanos, ocorrendo somente

através da ingestão dietética (PETERSON & DWYER 1998; BIRT, 2001).

Em 1995, Hollman et al., citado por Walle (2004), baseado em evidências

indiretas, propôs que os flavonóides glicosilados poderiam ser absorvidos intactos pelo

intestino delgado usando um transportador de glicose sódio dependente (SGLT 1).

Mais tarde, este postulado foi confirmado através da pesquisa de que os flavonóides são

usualmente absorvidos por difusão passiva pelos enterócitos, após serem glicosilados

e/ou convertidos em agliconas (MARCHAND, 2002) por glicosidases presentes em

alimentos, mucosa gastrointestinal ou na microflora do cólon (YANG, 2001). Segundo

Heim (2002), agliconas apresentam um maior poder antioxidante que seus

correspondentes glicosilados.

Após sua absorção, os flavonóides são conjugados no intestino delgado e no

fígado pela glicuronidação, sulfatação ou metilação ou metabolizados a pequenos

compostos fenólicos (MARCHAND, 2002; YANG, 2001; HEIM, 2002). Ao sofrerem

essas modificações, os flavonóides podem tornar-se metabólitos mais ativos ou serem

eliminados do organismo mais facilmente por tornarem-se mais polares; dessa forma,

muitos desses produtos metabólicos podem ser detectados na urina e fezes humanas

(WALLE, 2004).

O metabolismo bacteriano de flavonóides, principalmente no cólon, tem sido

bem reportado em estudos com animais e pode ser um passo limitante na

biodisponibilidade de muitos flavonóides em humanos e animais. Bactérias da

microflora do cólon são responsáveis pela hidrólise de flavonóides glicosilados e

conjugados, gerando numerosos compostos fenólicos menores, ácido carboxílico assim

como a produção de dióxido de carbono (WALLE, 2004).

Recentes avanços em pesquisas com biologia molecular no genoma e proteoma

definiram o papel dos flavonóides no desenvolvimento de plantas e sua aplicação

potencial na agricultura e farmacoterapia (WOO, 2005). Diversas funções são atribuídas

aos flavonóides nas plantas. Entre elas, pode-se citar a proteção contra a incidência de

raios ultravioleta, proteção contra microrganismos patogênicos, ação antioxidante,

agentes alelopáticos e inibição enzimática (SIMÕES, 2000; HARBORNE, 2000; HEIM,

2002). Segundo Heim (2002) e Degáspari (2004), os pigmentos derivados de

antocianinas em flores atraem insetos polinizadores e são responsáveis pela

característica cor vermelha e azul de bagas, vinhos e certos vegetais que são as maiores

fontes de flavonóides na dieta humana.

Atualmente mais de 6000 diferentes flavonóides têm sido descritos

(MARCHAND, 2002; YANG, 2001), sendo suas maiores classes os flavonóis,

flavonas, flavanonas, catequinas, antocianinas, isoflavonas, diidroflavonóis e chalconas

(COOK & SAMMAN, 1996). Na tabela 1 observa-se as estruturas dos flavonóides das

principais classes já estudadas

O interesse econômico dos flavonóides é decorrente de suas diferentes

propriedades. Ensaios biológicos usando combinações isoladas revelam que os

flavonóides exibem uma grande ação sobre os sistemas biológicos demostrando efeitos

antimicrobiano, antiviral, antiulcerogênico, citotóxico, antineoplásico, antioxidante,

antihepatotóxico, antihipertensivo, hipolipidêmico, antiinflamatório, antiplaquetário.

Também demonstraram aumento na permeabilidade capilar, inibição da exudação

protéica e migração de leucócitos (PELZER, 1998). Estes efeitos podem estar

relacionados às propriedades inibitórias que os flavonóides desempenham nos vários

sistemas enzimáticos incluindo hidrolases, isomerases, oxigenases, oxidoredutases,

polimerases, fosfatases, proteínas fosfoquinases e amino ácido oxidases (FERGUSON,

2001).

Tabela 1- Estrutura química de alguns flavonóides de ocorrência natural em

plantas.

Fonte: BIRT, 2001.

3.4. MECANISMOS DE AÇÃO DOS FLAVONÓIDES.

3.4.1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídios

ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações de oxidação em

cadeia (DEGÁSPARI, 2004). O oxigênio, indispensável para a vida, pode resultar em

danos reversíveis ou até irreversíveis, quando os seres vivos são expostos a ele em

concentrações superiores à encontrada na atmosfera, podendo inclusive, levar à morte

celular (MANSON, 2003).

O oxigênio atua em organismos aeróbicos como aceptor final de elétrons e,

dessa forma, o oxigênio envolvido no processo respiratório é estável, mas em certas

condições pode ser transformado nas seguintes espécies: ânion superóxido (O

), radical

hidroxila (OH

) e peróxido de hidrogênio (H

) que são responsáveis por danos

celulares (CODY at al., 1986).

Os radicais livres então, podem ser definidos como qualquer espécie química

capaz de existência independente, que contenha um ou mais elétrons desemparelhados,

sendo portanto, altamente reativos e capazes de atacar qualquer biomolécula. A

formação desses compostos é determinada pela perda ou ganho de um elétron ficando

com um elétron desemparelhado (MARRONI, 2002). A formação destas espécies

reativas de oxigênio (ROS) ocorre durante os processos oxidativos biológicos, sendo

assim, formados fisiologicamente nos sistemas biológicos a partir de compostos

endógenos (MARRONI, 2002) ou em circunstâncias patológicas incluindo

envelhecimento, reações inflamatórias, câncer, desordens cardiovasculares, doença de

Alzheimer, doença de Parkinson, catarata e diabetes (CODY at al., 1986).

Células corporais e tecidos são constantemente ameaçados por danos causados

por radicais livres e espécies de oxigênio (GRACE, 1994; WALLE, 2004). O

mecanismo e seqüência de eventos pelos quais os radicais livres interferem na função

celular ainda não são completamente entendidos, mas um dos mais importantes eventos

parece ser a peroxidação lipídica que resulta em danos à membrana celular. Esses danos

celulares causam uma troca na carga líquida da membrana provocando mudanças de

pressão osmótica que resultam em lise celular. Radicais livres podem agir sobre vários

mediadores inflamatórios contribuindo para uma inflamação geral responsável por

danos aos tecidos (NIJVELDT, 2001), além de estarem ligados com processos de

envelhecimento corporal (DEGÁSPARI, 2004).

Com a evolução dos seres vivos no planeta, surgiram mecanismos para combater

esses efeitos deletérios causados por espécies reativas de oxigênio. Contra os radicais

livres, os organismos viventes desenvolveram vários mecanismos efetivos. São os

mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos (MANSON, 2003).

Os mecanismos de defesa contra radicais livres no corpo incluem enzimas como

superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase; e cofatores enzimáticos como

glutationa, ácido ascórbico e α-tocoferol (CODY at al., 1986). É difícil fazer uma

medição direta da oxidação nos componentes celulares devido a sua alta reatividade,

porém é possível uma determinação indireta pelos efeitos por eles causados, através da

oxidação dos lipídios, dos grupamentos sulfidrila das proteínas, das bases púricas e

pirimídicas, o que leva a uma alteração no DNA e no balanço tiol/dissulfeto (BASU,

1999). Foi descoberto que uma série de doenças entre as quais câncer, aterosclerose,

diabetes, artrite, malária, AIDS, doenças do coração, podem estar ligadas aos danos

causados por formas de oxigênio extremamente reativas denominadas de ROS ou

“substâncias reativas oxigenadas” (DEGASPARI, 2004).

Diversos estudos têm demonstrado que o consumo de substâncias antioxidantes

na dieta diária pode produzir uma ação protetora efetiva contra estes processos

oxidativos que ocorrem no organismo (DEGASPARI, 2004). A proteção antioxidante

dos flavonóides foi o primeiro mecanismo de ação estudado, em particular, com relação

a seus efeitos protetores em doenças cardiovasculares (BRAVO, 1998). A atividade

antioxidante de compostos fenólicos é principalmente devida às suas propriedades de

óxido-redução, as quais podem desempenhar um importante papel na absorção e

neutralização de radicais livres, quelando o oxigênio tripleto e singleto ou decompondo

peróxidos (DEGÁSPARI, 2004). Dessa forma, eles demonstram grande eficiência no

combate de vários tipos de moléculas oxidantes, incluindo oxigênios reativos e vários

radicais livres (BRAVO, 1998) que estão envolvidos em danos no DNA e promoção de

tumores (MARCHAND, 2002).

A atividade antioxidante dos flavonóides tem sido bem estudada in vitro, mas a

atividade antioxidante na prevenção do câncer in vivo ainda esta sendo pesquisada.

Quimicamente, os flavonóides e isoflavonóides são doadores de elétrons. Eles servem

como derivados de estruturas conjugadas em anel e grupos hidroxila que tem potencial

de ação como antioxidantes em cultura de células ou em sistemas de células livres por

reagirem e inativarem ânions superóxido, oxigênio singleto, radicais peróxido de

lipídios e/ou estabilizando radicais livres envolvidos no processo oxidativo através da

hidrogenação ou complexação com espécies oxidantes (BIRT, 2001).

Das & Pereira, (1990) citado por Harborne (2000), demonstraram que o grupo

carbonila em C-4 e a dupla ligação entre C-2 e C-3 desempenham um importante papel

na ação antioxidante dos flavonóides. Além disso, a configuração das hidroxilas no

anel

é determinante no processo de eliminação de ROS e RNS. Em outras palavras,

os flavonóides estabilizam espécies reativas de oxigênio porque apresentam grupos

hidroxila altamente reativos, os quais estabilizam os radicais (KORKINA, 1997).

A atividade antioxidante e a relação estrutura-atividade dos flavonóides têm sido

intensamente investigadas por Djuric, (2001) e Loo, (2003). Este último relata que a

ação antioxidante deve-se ao número e à posição dos grupos hidroxilas, que são capazes

de doar os átomos de hidrogênio na “varredura” dos ROS. Essa idéia tem sido

desenvolvida principalmente porque H

ou produtos da reação com OH

, são

essenciais para a transdução do sinal e a ativação de genes específicos que promovam a

proliferação de células carcinogênicas. Assim, a varredura desses ROS com substâncias

fenólicas inibiu esse processo celular e consequentemente, a proliferação de células

cancerosas.

A ação antioxidante dos flavonóides é desempenhada de acordo com as

equações abaixo:

Flavonoid(OH) + R• > flavonoid(O•) + RH

Flavonoid(OCH

) + R• > flavonoid(O•) + RCH

As diferenças na atividade antioxidante de flavonóides por polihidroxilação ou

polimetoxilação ocorrem, provavelmente, devido a diferenças em hidrofobicidade e

configurações estruturais dos radicais livres. Após a doação de grupos hidroxila e metila

pelos flavonóides esses radicais livres perdem sua reatividade, dessa forma não são

capazes de atacar biomoléculas do organismo (HEIM, 2002).

3.4.2. ATIVIDADE INIBITÓRIA DA SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO

A inibição de RNS através de flavonóides envolve o mesmo mecanismo básico

de eliminação de ROS. Os flavonóides são conhecidos por sua ação antioxidante por

reagirem diretamente com peroxinitritos e seu progenitor superóxidos (HEIM, 2002).

Quando flavonóides são usados como antioxidantes ocorre uma eliminação na

reatividade dos radicais livres corporais; dessa forma, uma menor quantidade de radicais

livres reagirá com óxido nítrico, causando menores danos à célula (SHUTENKO et al.,

1999). O óxido nítrico pode ser considerado um radical livre e foi demonstrado que é

diretamente eliminado por flavonóides (VAN ACKER et al. 1995).

Vários flavonóides, incluindo a quercetina, provocaram a redução de danos

causados por radicais livres através da interferência na atividade da óxido nítrico sintase

(SHOSKES, 1998). Existem também muitas evidências que os flavonóides podem

modular a produção de óxido nítrico pelo endotélio vascular; sendo assim, os

flavonóides podem agir como agentes antinflamatórios em inflamações agudas

(HUANG et al., 2004).

Na década de 80, a descoberta do óxido nítrico (NO) como um mensageiro

molecular para os vários sistemas do organismo de mamíferos revolucionou as

pesquisas acerca da extensão de sua atividade biológica. Desde então, um crescente

número de pesquisas acerca da molécula NO, na fisiopatologia humana e animal, são

desenvolvidas (COSTA et al., 2003).

O NO é um gás extremamente reativo, que participa de muitos processos

fisiológicos relacionados aos sistemas nervoso central e periférico. Na figura 6 estão

representados alguns desses processos fisiológicos desempenhados pelo oxido nítrico.

Na verdade, os compostos reativos intermediários do nitrogênio incluem o nitrito

(N0

) e nitrato (N0

), e óxidos altamente reativos como o óxido nítrico (NO) e dióxido

de nitrogênio (NO

). Dentre estes compostos, o NO é o composto intermediário de vida

curta, com potente atividade biológica, sendo sintetizado por uma família de enzimas

(óxido nítrico sintases), expressas em uma grande variedade de células de mamíferos

(miócitos cardíacos, células pancreáticas, células renais e neurônios), através da catálise

enzimática do aminoácido essencial L-arginina pela enzima óxido nítrico sintase, cuja

ação é dependente de NADPH (MONCADA et al., 1991; COSTA et al., 2003; DUDA

et al., 2004).

Figura 6 - Representação esquemática dos processos fisiológicos desempenhados pelo

oxido nítrico.

Fonte: LACCHINI, 2004.

A catálise enzimática da reação do aminoácido L-arginina e oxigênio, que

resulta na formação de L-citrulina e óxido nítrico (NO), é feita por enzimas que são

designadas de constitutivas (cNOS) ou induzidas (iNOS). As cNOS são enzimas que

estão presentes em muitas células; sua liberação depende da concentração intracelular

de cálcio/calmodulina e, uma vez liberadas, sintetizam NO por curtos períodos com o

propósito básico de sinalização celular. O NO formado por esta via participa de muitos

processos homeostáticos. Por outro lado, as iNOS independem da concentração

intracelular de cálcio, e são liberadas por macrófagos (incluindo células de Kupffer),

neutrófilos e outros tipos celulares como células endoteliais, hepatócitos, neurônios e

fibroblastos (MONCADA et al., 1991; COSTA et al., 2003; DUDA et al., 2004).

O óxido nítrico desempenha um importante papel no controle de muitas

infecções, apresentando atividade antibacteriana, antiparasitária e antiviral, entretanto

em excesso pode ser tóxico. Sendo assim, o descontrole na síntese de NO está

implicado na patogênese de doenças cardiovasculares, autoimunes, rejeição de

transplantes, sépsis, doenças cerebrais, indução de câncer, genotoxicidade e na

inflamação (COSTA et al., 2003). A ativação de macrófagos durante as respostas

imunes in vivo ou pela exposição a certas citocinas in vitro, mostra uma marcada

elevação dos níveis de (N0

)

e (N0

). Portanto, a citotoxicidade de macrófagos ativados

contra organismos estranhos é também dependente da via L-arginina – óxido nítrico

(RIZZO, 2000).

O óxido nítrico também apresenta ação anti-tumoral. Entretanto, a atividade

anti-tumoral do NO depende de sua quantidade gerada e da interação das células do

hospedeiro com as do tumor. Esta interação pode gerar efeitos ora estimulantes, ora

inibitórios na imunidade anti-tumoral. A diversidade de efeitos do óxido nítrico parece

estar relacionada às concentrações de NO gerados, a sensibilidade individual das células

e à duração do fenômeno (COSTA et al., 2003). Segundo hipótese de Wang et al.,

(2000), citado por Costa et al., (2003), a microvasculatura hepática regula a apreensão e

o destino de células metastáticas de câncer através da liberação de NO. Estes autores

concluíram que existe um mecanismo de defesa natural contra metástases de câncer por

meio do qual a apreensão de células tumorais no fígado induz uma grande liberação de

NO endógeno, levando à morte das células tumorais no sinusóides e reduzindo a

formação de metástase hepática.

Macrófagos ativados têm a capacidade de selecionar e eliminar de forma

eficiente um grande número de células neoplásicas por processos não fagocíticos

(contato-dependente). Durante esta interação, macrófagos ativados induzem alterações

metabólicas características nas células tumorais, incluindo a inibição na síntese de

DNA, respiração mitocondrial (inibição do complexo I e II do sistema de transporte de

elétrons) e da enzima aconitase presente no ciclo dos ácidos cítricos, enquanto que

outras vias metabólicas, como a glicólise, mantém-se funcionais. Além disso, a inibição

das várias atividades enzimáticas são acompanhadas pela liberação intracelular de ferro

das células alvo, causando injúria ou morte celular (RIZZO, 2000).

O papel do NO como agente promotor de câncer possivelmente se deve à

geração de espécies reativas de óxido de nitrogênio (RNOS), geradas a partir das

sintases de NO. As reações seguintes à formação das RNOS dão origem ao estresse

oxidativo e nitrosativo e apresentam efeitos potencialmente genotóxicos (HEIM, 2002).

Experimentos com óxido nítrico demonstraram que ele apresenta um papel

fundamental dentro da regulação da “cadeia transportadora de elétrons” devido à sua

habilidade em inibir reversivelmente o citocromo C oxidase (complexo IV), aceptor

final de elétrons (CLEETER et al., 1994). Porém, uma superprodução de óxido nítrico

está associada a uma inibição prolongada do transporte de elétrons, que resulta em um

extravasamento de elétrons da matriz, aumentando a geração de oxigênio reativo, os

quais conduzem a um rompimento celular. Além do mais, o NO pode afetar a expressão

e a atividade de proteínas críticas no ciclo celular e, por sua vez, também ser alvo das

mutações do DNA celular (GHAFOURIFAR et al., 2001; HEIM, 2002).

Na regulação da apoptose, o NO parece apresentar efeitos contraditórios.

Aparentemente, a morte celular mediada por NO ocorre tanto por necrose como por

apoptose. Os efeitos pré-apoptóticos parecem estar mais relacionados a condições

patofisiológicas, onde grandes quantidades de NO são produzidas por síntese induzida

de NO (COSTA et al., 2003). Nestas circunstâncias, a grande atividade de macrófagos

aumenta simultaneamente, a produção de óxido nítrico e superóxido de amônia. O

óxido nítrico reage com os radicais livres e produz assim, peroxinitritos altamente

prejudiciais, os quais são responsáveis pela oxidação direta de LDL’s resultando em

danos irreversíveis à membrana da célula (HEIM, 2002).

Vale lembrar, que a função do NO na biologia tumoral ainda não é bem

compreendida, porém existem dados recentes demonstrando que o NO produzido por

células tumorais seria responsável pelas características de invasividade e angiogênese.

Sendo a angiogênese um marcador patológico de carcinogênese, doenças inflamatórias

e de várias isquemias (CARMELIET, 2000), o desenvolvimento do tumor, sua

vascularização e seu potencial invasivo estão relacionados à reduzidas concentrações de

NO produzidas pelas células tumorais (COSTA et al., 2003) incluindo os carcinomas

ovarianos, uterinos, tumores do sistema nervoso central, câncer de mama, carcinoma

gástrico, prostático e pulmonar (RIZZO 2000).

Neste mesmo contexto, Maeda & Akaike (1998), sugeriram que o NO gerado

em tumores sólidos experimentais, poderia facilitar a permeabilidade vascular e

conseqüentemente, o suprimento nutricional do tecido e o rápido crescimento do tumor.

3.4.3. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA.

Em 1930 dois ginecologistas americanos, Kurzrok & Lieb, observaram que

fatias do útero humano se relaxavam ou se contraíam quando expostas ao sêmen

humano. Von Euler descreveu a substância ativa como um ácido lipossolúvel, que ele

denominou "prostaglandina". Anos mais tarde, a compreensão de que as prostaglandinas

"conhecidas classicamente" constituíam apenas uma fração dos produtos

fisiologicamente ativos do metabolismo do araquidonato, resultou nas descobertas do

tromboxano A2 (TXA2), da prostaciclina, dos leucotrienos e dos fosfolipídios

modificados, hoje em dia representados pelo fator ativador plaquetário (FAP)

(GOODMAN & GILMAN, 2003).

As famílias das prostaglandinas, leucotrienos e compostos relacionados são

conhecidas como eicosanóides, pois são derivadas dos ácidos graxos essenciais de 20

carbonos, que contêm três, quatro ou cinco ligações duplas: ácido 8,11,l4-

eicosatrienóico (ácido diomo-y-linolênico), ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóico (ácido

araquidônico) e ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenóico. O araquidonato é então

esterificado em fosfolipídios das membranas celulares ou outros lipídios complexos

(SHARMA, 2001). Em outras palavras, os eicosanóides formam uma família

complexa de derivados de ácidos graxos poliinsaturados (principalmente do

araquidônico), sintetizados por quase todas as células dos mamíferos (FONSECA,

2002).

O aumento da biossíntese dos eicosanóides é regulado e ocorre em resposta a

estímulos físicos, químicos e hormonais diversos. Essas alterações levam as células

agredidas a adquirir comportamentos diferentes: movimentos novos, alterações de

forma e liberação de enzimas e substâncias farmacológicas que possuem efeitos

intracelulares importantes nos líquidos teciduais, tanto em condições fisiológicas como

patológicas. Toda essa transformação morfológica e funcional do tecido, característica

dos processos inflamatórios, visa destruir, diluir ou isolar o agente lesivo, sendo,

portanto, uma reação de defesa e de reparação do dano tecidual (NOVELLI, 2000).

Como a concentração do araquidonato livre na célula é muito pequena, a

biossíntese dos eicosanóides depende principalmente da sua disponibilidade para as

enzimas que os sintetizam; essa disponibilidade depende de sua liberação a partir das

reservas adiposas pelas hidrolases acíclicas, principalmente a fosfolipase A2 e a lipase

do diacilglicerol. O primeiro passo na síntese das PGs e dos tromboxano (TXs) é

mediado pela enzima Ciclooxigenase (COX), a qual catalisa a incorporação de oxigênio

ao ácido araquidônico, com subseqüente formação de endoperóxidos cíclicos

(FONSECA, 2002). Esses endoperóxidos contribuem para alguns processos fisiológicos

e patológicos, incluindo inflamação, tônus da musculatura lisa, hemostasia, trombose,

parto e secreções gastrintestinais (FUKUDA, 2003).

A ciclooxigenase-2 (COX-2) catalisa a formação de prostaglandinas e

tramboxanos a partir do ácido araquidônico. A COX-2 e sua isoenzima, COX-1 estão

envolvidas também na indução da angiogênese. A super expressão de COX-2 tem sido

implicada na tumorígenese de cânceres de cólon, reto, estômago, pulmão, mama, cabeça

e pescoço. A redução da atividade de COX está relacionada com o aumento da

apoptose, diminuição da proliferação celular, redução da adesão célula-célula, redução

da aderência de células a matrix extracelular e a indução da angiogênese (figura 7).

Estudos mostram que enzimas como COX-2 e/ou óxido nítrico sintase (iNOS),

em associação com resposta inflamatória podem ter um papel central na carcinogênese

(SURH, 2003). Em alguns tumores humanos, como no esôfago de Barrett, foram

identificados elevados níveis de mRNA para iNOS e para COX-2. Para os

pesquisadores, estes resultados sugerem que tanto a iNOS como a COX-2 estejam

envolvidas na progressão neoplásica associada ao esôfago de Barrett (COSTA et al.,

2003). Além disso, estudo de Etherton (2002) sugere que COX-2, mediada por

sinalização parácrina de macrófagos, pode ser o pivô central na progressão de tumores

do cólon.

Figura 7 – Representação simplificada do potencial de indução de COX em macrófagos

ativados na indução da angiogênese em lesões pré-neoplásicas.

Fonte: SHARMA, 2001.

A formação de prostaglandina E

, catalisada por COX-2, induz a síntese do

principal fator de crescimento angiogênico, o VEGF. Estudos de formação do VEGF

Fator de crescimento EGF

bactérias

Cox 2

induz

PGE

adesão

angiogênese

Fator de crescimento

angiogênico (VEGF)

Apoptose

proliferação

Substâncias químicas

promotoras de tumor

foram obtidos em culturas de linhagens de células normais, sinoviais, de osteoblastos e

de células malignas. COX-2 também modula a atividade de peptídeos regulatórios de

crescimento, como TGF-β (SHARMA, 2001). A promoção do crescimento e os efeitos

pró-angiogênicos do TGF-β têm sido vistos quando células epiteliais são expostas a

outras citoquinas, que induzem a expressão da COX-2, como de fatores de crescimento

epidérmico. Tem-se observado ainda, nos processos inflamatórios, a migração de

macrófagos ativados para a região da inflamação, estando estes associados à indução da

angiogênese.

A inflamação crônica é um passo importante na etiologia do câncer e inibidores

de COX-2 têm sido estudados como agentes quimioprotetores contra câncer coloretal

(MARCHAND, 2002). A quimioprevenção é considerada um dos propósitos mais

promissores na prevenção de cânceres humanos (SAKATA, 2003). Pai et al., (2003)

demonstraram que (PGE

) além de atuar no seu próprio receptor, estimula a produção

de fatores de crescimento epidermal, potencializando o crescimento tumoral. Segundo

Fukuda (2003), prostaglandina (PGE

) pode induzir a angiogênese e aumentar a

resistência das células à apoptose, o que enfatiza a promoção da carcinogênese pela

COX-2.

Estudos de Takahashi (1999), citado em Shan (2004), demonstraram que a

superprodução de COX-2 induz a produção de uma metaloproteína de matriz (MMPs)

envolvida na invasão da matriz extracelular. Dessa forma, COX-2 é uma enzima

essencial na manutenção da migração de células tumorais (DORMOND, 2001). Além

disso, COX-2 estimula diretamente a produção de fatores angiogênicos (VEGF, PDGF,

bFGF e TGF-β); esses mediadores angiogênicos e seus receptores aumentam a

permeabilidade vascular, induzindo a proliferação e migração celular (FOSSLIEN,

2001).

Em 1995, Tsujii e Dubois criaram, através da engenharia genética, uma

linhagem de ratos que expressavam uma superprodução de COX-2 em células do

epitélio intestinal. Essas células demonstraram um aumento na resistência a apoptose

(Butirato induzida), que foi confirmada pelo aumento da expressão de fatores anti-

apoptóticos como BCL

e TGF-β. Segundo Narko (1997) e Sheng (1998), a

superprodução de COX-1 ou a adição de PGE

em culturas celulares poderiam também

aumentar a resistência a apoptose.

Certos flavonóides podem afetar (usualmente inibindo) processos biosintéticos

de eicosanóides. Eles também são responsável pela inibição de processos mitogênicos,

interações célula-célula, incluindo possíveis efeitos na adesão molecular (WILLIAMS,

2004). O mecanismo de inibição exercido pelos flavonóides sobre as enzimas

ciclooxigenase e lipoxigenase está sendo extensivamente pesquisado (NIJVELTD,

2001). Flavonóides como a quercetina e a apigenina têm demonstrado possuir ação

antiinflamatória por causar inibição de COX-2 e de óxido nítrico sintase. (MUTOH et

al., 2000; RASO et al., 2001). Segundo Friesenecker et al., (1995), flavonóides como a

quercetina e a luteolina podem reduzir a ativação do sistema complemento, diminuindo

a adesão de células inflamatórias ao endotélio, resultando em uma redução da resposta

inflamatória.

A hesperidina é um flavonóide de ocorrência natural encontrado em frutas e

vegetais. Quando sozinha ou combinada com diosmina, exerce ação anticarcinogênica

em modelos animais para câncer de língua, intestino, esôfago e bexiga (WILLIAMS,

2004). Etherton (2002) relatou que flavonóides possuem efeito antitrombótico, como

resultado da menor agregação plaquetária, redução da síntese de mediadores pró-

trombóticos e pró-inflamatórios e diminuição da expressão de adesão molecular.

Flavonóides podem ainda, inibir a atividade de ciclooxigenase, reduzindo a agregação

plaquetária e tendência à trombose (ETHERTON, 2002). Ferguson (2001) observou que

quercetina inibe a agregação plaquetária in vitro e reduz síntese de tromboxano in vivo.

Vários grupos de medicamentos, em especial as drogas antiinflamatórias não-

esteróides, têm seus efeitos terapêuticos atribuíveis ao bloqueio da produção dos

eicosanóides. Eles atuam no processo de redução da reação inflamatória por inibirem a

liberação de prostaglandinas, atuando em etapas pré-estabelecidas na via do ácido

araquidônico. Seus maiores efeitos farmacológicos são redução do edema, eritema e

dano tecidual resultante de processos inflamatórios cíclicos (FONSECA, 2002).

Estudos indicam que alguns tipos de flavonóides incluindo a hesperidina e

naringina possuem atividade antiinflamatória (SURH, 2003). Atualmente, o Daflon

500mg, um flavonóide purificado (vendido comercialmente) contém 90% de diosmina e

10% de hesperidina, possuindo uma atividade antiinflamatória e atua na insuficiência

venosa; e existe uma possível correlação entre efeito antiinflamatório e atividade

quimioprotetora de hesperidina (SAKATA, 2003).

Estudos epidemiológicos indicaram que, o uso de antinflamatórios a longo

prazo, está associado a uma redução de 30% a 50% no risco de mortes causadas por

câncer (RODRIGUEZ, 2000). Além disso, pesquisas sugerem que a duração e a

consistência no tratamento com antiinflamatórios são mais importantes que as dosagens

utilizadas. Outros estudos epidemiológicos observaram uma associação entre o uso de

antiinflamatórios e uma menor incidência de mortes causadas por câncer de esôfago,

estômago, mama, pulmão, próstata, bexiga e ovário (MORAN, 2002; THUN et al.,

2002). Tentativas clínicas utilizando NSAID em populações de risco demonstraram uma

redução no número e tamanho de adenomas (CALALUCE, 2000; HULS, 2003).

Seed et al. (1997), citado por Shan (2004), demonstraram que um inibidor de

ciclooxigenase não específico (diclofenaco), suprime o aumento de COX-2 em modelos

animais, bloqueando a angiogênese tumoral. Similarmente, os flavonóides

desempenham um efeito interessante em sistemas enzimáticos, inibindo ambas as

enzimas ciclooxigenase e lipoxigenase (FERRANDIZ, 1991; PELZER, 1998) e

reduzindo, dessa forma, o metabolismo do ácido araquidônico (RASO et al., 2001). Isso

confere aos flavonóides uma característica antiinflamatória, antitrombótica

(ETHERTON, 2002) e antilipoperoxidante (CODY, 1987).

3.4.4. INTERAÇÃO DE FLAVONÓIDES COM OUTROS SISTEMAS

ENZIMÁTICOS.

Outro possível mecanismo de ação dos flavonóides é a interação com vários

outros sistemas enzimáticos. Em analogia com o metabolismo de drogas e outros

compostos exógenos, imaginava-se que flavonóides eram metabolizados por enzimas do

citocromo P-450 (CYPs). Assim, estudos focados em interações entre flavonóides e

(CYPs) demonstraram uma potente inibição da atividade enzimática das CYPs, em

particular CYP1A1 e CYP1A2 pelos flavonóides (HEIM, 2002; WALLE, 2004). Essas

enzimas apresentam um importante papel na ativação de um grande número de

suspeitos carcinógenos humanos, como hidrocarbonetos policíclicos e aminas

heterocíclicas.

Muitos carcinógenos químicos requerem uma transformação metabólica para sua

maior reatividade com o DNA assim, se as mutações não forem reparadas pelo sistema

de triagem celular isso possivelmente, promoverá a carcinogênese (MARCHAND,

2002). As principais enzimas envolvidas nessas transformações metabólicas sofridas

pelo carcinógenos químicos são as enzimas CYPs. Os flavonóis Quercetina e

Kaempferol, Galangina e a flavona Apigenina demonstraram possuir efeitos inibitórios

a nível de Citocromo P-450 e de enzimas da família CYP1A, dessa forma, os

flavonóides impedem as transformações metabólicas desses carcinógenos químicos

impedindo assim a maior reatividade desses compostos com o DNA (LAUTRAITE,

2002). Além disso, alguns efeitos dos flavonóides podem ser resultados da combinação

da eliminação de radicais livres e de interações com enzimas do sistema hepático

responsáveis pela detoxcificação de drogas e medicamentos (NIJVELDT, 2001).

Outros mecanismos de ação de flavonóides são realizados na rota metabólica de

síntese de ácido úrico. Essa síntese é bem conhecida causar danos oxidativos aos tecidos

e as enzimas Xantina oxidase e Xantina desidrogenase estão envolvidas no metabolismo

de Xantina em ácido úrico. A Xantina desidrogenase é uma forma da enzima presente

em baixas concentrações em condições fisiológicas, mas sua configuração é mudada

para Xantina oxidase em condições de isquemia (SANHUEZA, 1992). Sendo assim, a

Xantina oxidase é uma fonte produtora de oxigênio reativo, pois na fase de

reoxigenação a Xantina oxidase reage com moléculas de oxigênio dessa forma,

resultando em radicais superóxidos reativos. Há pelo menos dois flavonóides,

Quercetina e Silibina que inibem a atividade da Xantina oxidase resultando em

decréscimos de danos oxidativos (CHANG, 1993; SHOSKES, 1998). Segundo COS et

al (1998) Luteolina (3, 4, 5, 7 tetrahidroxiflavona) provocou uma inibição mais potente

na Xantina oxidase.

Valerio (2001) descreve em seu trabalho que os flavonóides aumentam a

atividade de vários detoxificantes e enzimas antioxidantes como catalase, quinona

redutase, glutationa peroxidase, redutase, S-redutase. Certos flavonóides podem induzir

enzimas como a glutationa transferase (GST), aumentar a excreção de espécies

oxidantes ou induzir enzimas antioxidantes como as metalotioneínas (metal ligado à

proteína com atividade antioxidante) (FERGUSON, 2001).

A habilidade de certos flavonóides de se ligarem a minerais pode ser benéfica

em muitos casos (WILLIAMS, 2004). Quando oxigênios reativos estão na presença de

, isso resulta em peroxidação lipídica (NELSON, 1992). Flavonóides específicos

são conhecidos por serem quelantes de ferro e cobre prevenindo a participação deles em

reações tipo Fenton e na geração de radicais hidroxila altamente reativos (FERRALI,

1997; YANG 2001). Dessa forma, os flavonóides removem fatores que auxiliam na

peroxidação lipídica. Por exemplo, o ácido tânico (polifenol) inibiu a formação de

radicais hidroxila devido a sua capacidade de complexar com íons ferro. Muitos

polifenóis com função antioxidante eliminaram os radicais livres e também podem

quelar íons metálicos que são capazes de catalisar a peroxidação de lipídios

(WILLIAMS, 2004).

3.4.5. AÇÃO ANTI-ESTROGÊNICA DOS FLAVONÓIDES

Vários flavonóides têm sido pesquisados e seus mecanismos de ação

demonstrados como estrogênicos e anti-estrogênicos. Muitos estudos in vitro indicam

que vários fitoestrógenos agem similarmente aos estrógenos esteroidais. Eles ligam aos

receptores de estrógenos, induzem genes, estimulam o crescimento de células

cancerosas e suas ações podem ser bloqueadas pelos antiestrógenos (SHIRAI, 2002).

Fitoestrógenos são geralmente mais fracos que estrógenos esteroidais

endógenos, e sugere-se que eles ajam como antiestrógenos pela competição com

estrógenos endógenos mais potentes por ligarem aos receptores estrogênicos (ERs). Um

estudo relata que fitoestrógenos como genisteína são bons ligantes aos ERs (FRITZ,

2002). Fitoestrógenos possuem uma afinidade maior de ligação a um subtipo do

receptor - ER

. (SHEIKE, 2003).

Os estrógenos não esteroidais ligam-se preferencialmente aos receptores do tipo

β, principalmente os distribuídos nos tecidos ósseo, cérebro e endotélio vascular. Os

flavonóides (estrógenos esteroidais) exercem atividade antioxidante, antiproliferativa e

anti-angiogênica. Eles reduzem a formação de fatores de crescimento, afetam a

atividade de tirosina quinase e tem potencial anti-carcinogênico. Os flavonóides

possuem diferentes afinidades aos receptores de estrógeno do subtipo α e β. A

genisteína possui uma afinidade 20 vezes maior pelo receptor β do que pelo receptor α

(FRITZ, 2002). Numerosos estudos in vitro, relatam que muitos, mas não todos os

fitoestrógenos, inibem muitas enzimas chave na biossíntese de estrógenos e andrógenos.

Essas incluem 17-β-hidroxiesteróide oxidorredutase tipo 1 e 2, aromatase e 5-α-redutase

(STRAUSS, 1998).

Muitos fitoestrógenos têm sido relatados em exercer várias ações (efeitos) que

não estejam relacionados ao ERs. Esses efeitos incluem atividade antiproliferativa,

inibição da tirosina quinase, proteína quinase C, DNA topoisomerase II, atividade

antioxidante, inibição da angiogênese (STRAUSS, 1998). Segundo Tapiero (2002), os

compostos com ação estrogênica, como os flavonóides, podem produzir:

- resposta hormonal normal;

- resposta anormal bloqueando os sítios dos receptores de estrógenos, impedindo

que esses hormônios liguem-se aos receptores (ação anticarcinogênica);

- ligam-se aos receptores e criam uma nova reação ou interferem indiretamente

na ação hormonal normal;

- alteram a produção e degradam os receptores hormonais como também

modificam a resposta endócrina de hormônios naturais;

- ligam-se a receptores de estrógeno interferindo na síntese de proteínas;

- a atividade estrogênica também está relacionada com a reprodução dos

animais, afetando-a seriamente.

3.4.6. INIBIÇÂO DO PROTEASSOMA

Outra forma de atuação dos flavonóides é a inibição do proteasoma. Os passos do

processo de ubiquitina-proteasoma são importantes na regulação tanto do ciclo

celular quanto apoptose (CHEN, 2005). Para remover danos e proteínas não

necessárias, a proteólise mediada por proteasoma tem sido um mecanismo

importante na regulação protéica dentro da célula. A rapidez e a irreversibilidade do

proteasoma eliminam proteínas, sendo o pivô da modulação da ativação e repressão

de passos da transdução de sinais, incluindo proliferação e morte celular (WÓJCIK,

2003).

O proteasoma 26S é composto por subunidades protéicas múltiplas, um núcleo

proteolítico complexo de 20S e duas subunidades regulatórias de 19S presente no

citoplasma e núcleo de todas as células eucarióticas. O proteasoma 20S consiste em 28

subunidades (14 diferentes), 21-31kDa de massa molecular, organizada em 4 anéis

heptaméricos (Figura 8). Os 2 anéis exteriores contêm subunidades (1-7, verde) e

aminoterminal que está na abertura central do cilindro. Os 2 anéis internos contêm duas

cópias da subunidade (1-7, azul e vermelho) três das quais (1,2,5, vermelhas) ocupam

seis locais ativos. A subunidade 19S inclui e subestruturas. A base que prende aos dois

anéis está composta de seis ATPase (roxo) e duas subunidades não-ATPase (laranja). A

tampa que contém até 10 subunidades não-ATPase (laranja) é responsável pela ligação

ao substrato (Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001).

Proteínas marcadas para degradação pelos proteasomas são covalentemente

modificadas para a cadeia protéica poli-ubiquitina que e reconhecida pela subunidade

19S. Uma vez reconhecida pelo complexo regulatório, as cadeias de ubiquitina são

removidas e a proteína é desnaturada e levada para o centro do complexo 20S. A

proteólise pelo proteasoma 26S é um processo metabólico essencial. Porém, os

mecanismos envolvidos não estão totalmente claros, células cancerosas e células

normas parecem responder diferentemente aos efeitos da inibição do proteasoma.

Quando tratados com inibidor de proteasoma, o ciclo celular usualmente é detido em

células normais, já em células cancerosas é mais provável que sejam submetidos a

apoptose. Taxa de proliferação parece não ser importante na sensibilização de células

com câncer porque células malignas com baixa taxa de proliferação são também

sensíveis à inibição do proteasoma (ADAMS, 2003; WÓJCIK, 2003).

Figura 8 - Composição do proteasoma.

Fonte: Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001

Os flavonóides inibem a atividade proteasômica ligada a quimiotripsina em dose

e tempo dependente em estudos realizados “in vitro” em cultura de células leucêmicas.

A ordem de potência de quatro flavonóides em inibir a atividade de proteasoma e

induzir a apoptose em células tumorais é: apigenina > quercetina> kaempferol >

miricetina (CHEN, 2005).

4. MATERIAL E MÉTODOS

Para o estudo dos efeitos de flavonóides e do medicamento Neotaxel

(controle

positivo) em modelos animais com tumor ascítico de Ehrlich foram realizados dois

experimentos:

- 1

experimento: foram estudados os flavonóides rutina, naringina, rutina +

naringina como possíveis agentes preventivos da multiplicação celular tumoral, in vivo.

- 2

experimento: foram estudados os flavonóides rutina, naringina, rutina +

naringina como possíveis agentes medicamentosos no tratamento do tumor ascítico de

Ehrlich e o quimioterápico Neotaxel

4.1. ANIMAIS

Para a realização do presente estudo, utilizaram-se 202 camundongos albinos

Swiss, não isogênicos, machos, com 6-8 semanas de idade, pesando de 20 a 25 g,

obtidos do Biotério Central da Universidade Federal de Viçosa (UFV). Durante o

período de realização do estudo, os animais permaneceram em sala experimental do

Laboratório de Biofármacos da UFV, alojados em caixas de policarbonato, com período

de 12 horas claro-escuro, temperatura de 22 ± 2

C e umidade de 45-65%. Os animais

permaneceram durante cinco dias, no referido laboratório, em período de adaptação

antes de iniciar os tratamentos. No período de experimentação os animais receberam

água e ração comercial balanceada (Labina

) ad libitum.

4.2. OBTENÇÃO DO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH

As células do tumor ascítico de Ehrlich (TAE) encontravam-se congeladas em

nitrogênio líquido e foram cedidas pelo Laboratório de Biologia do Câncer do

Departamento de Biologia Animal da UFV, coordenado pelo Professor Dr. Marcelo

José Vilela. Para manutenção do TAE em laboratório, descongelou-se a temperatura

ambiente uma alíquota de 500µL de células tumorais que foram inoculadas

intraperitonealmente, com auxílio de seringas de insulina em camundongos receptores.

Para a manutenção do tumor foram colhidos de animais portadores cerca de 0,3 mL do

fluido ascítico contendo aproximadamente 10

células tumorais e inoculados por via

intraperitoneal em camundongos receptores (normais). Esse procedimento foi repetido a

cada 10 dias durante 30 dias.

4.3. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS TUMORAIS PARA INOCULAÇÃO

Para obtenção das células tumorais para serem inoculadas, os camundongos

foram eutanasiados com uma superdosagem de éter etílico por inalação e em seguida

imersos em álcool 70

por 5 minutos. A seguir, sob condições estéreis, em capela de

fluxo laminar, foram retirados 5 mL do líquido ascítico da cavidade abdominal e

misturados com o mesmo volume de PBS (tampão fosfato salino), pH 7,4 e

centrifugados a 7100 x g por 5 minutos para lavagem das células. O sobrenadante foi

descartado, as células foram ressuspendidas em tubos de centrífuga com PBS, sendo

este procedimento repetido por 3 vezes.

Foram feitas contagens das células pelo método de exclusão com azul de tripano

(responsável pela coloração de todas as células mortas presentes na amostra) a 0,4%,

utilizados na proporção 1:1. Para contagem das células utilizou-se Hemocitômetro de

Newbauer, contando as células dos quatro quadrados externos e no quadrado central. As

células que apresentaram coloração azul eram consideradas inviáveis levando em

consideração a viabilidade maior que 90%.

4.4. INOCULAÇÃO DOS ANIMAIS

Após a contagem das células, preparou-se uma suspensão de 1,66 x 10

cel/100

µL em PBS pH 7,4, sendo inoculada por via intraperitoneal nos camundongos.

4.5. GRUPOS E PROTOCOLOS DE TRATAMENTO

O trabalho foi dividido em duas etapas distintas, onde na primeira etapa foi feito

um estudo de prevenção com os flavonóides, na segunda etapa, um estudo de tratamento

com os flavonóides sobre o TAE .

4.5.1. PRIMEIRO EXPERIMENTO - PREVENÇÃO DO TUMOR

ASCÍTICO DE EHRLICH COM FLAVONÓIDES

Nessa primeira etapa, os camundongos foram tratados com uma emulsão (água e

óleo mineral, 1:1) de flavonóides que foram administrados por gavage (figura 9) na

concentração de 10 mg/Kg (para os flavonóides rutina, naringina) e 5 mg/Kg de cada na

associação de, rutina + naringina durante um período de 20 dias como descrito na

tabela 2.

Os flavonóides foram obtidos da SIGMA

Figura 9 - Administração dos

flavonóides através de gavage.

Tabela 2 – Distribuição dos animais por grupo.

Grupos Número de

animais

Tratamentos

Grupo 1 – animais não inoculados

com TAE

12 Ração (R)

Grupo 2 – animais com TAE 14 Ração (R)

Grupo 3 – animais tratados 14 R + Rutina

Grupo 4 - animais tratados 14 R + Naringina

Grupo 5 – animais tratados 14 R + Rutina + Naringina

No 21-° dia após o tratamento diário com os flavonóides, procedeu-se a

inoculação das células tumorais do tumor ascítico de Ehrlich (1,66 x 10

cel/100 µL em

PBS pH 7,4) por via intraperitoneal conforme a figura 10. Nesse mesmo dia foi

suspenso o tratamento com os flavonóides.

Após 18 dias de inoculação (39-º de experimentação) os animais foram

eutanasiados para execução das análises propostas no (item 4.6).

Figura 10 – Inoculação intraperitoneal das células tumorais.

4.5.2. SEGUNDO EXPERIMENTO - TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS

COM TAE COM FLAVONÓIDES

No segundo experimento avaliou-se o efeito dos flavonóides no tratamento de

animais com TAE.

Os camundongos foram inoculados com as células tumorais do TAE por via

intraperitoneal na concentração de 1,66 x 10

cel/100 µL em PBS, pH 7,4. Após 24

horas de inoculação, iniciou-se o tratamento com os flavonóides na dosagem de

10mg/kg durante 18 dias conforme a tabela 3 .

Tabela 3 - Distribuição dos animais em cada grupo e seus respectivos tratamentos.

Grupos Número de

animais

Tratamentos

Grupo 1 – animais não inoculados

com TAE

12 Ração (R)

Grupo 2 – animais com TAE 16 Ração (R)

Grupo 3 – animais com TAE tratados 16 R + Rutina

Grupo 4 - animais com TAE tratados 16 R + Naringina

Grupo 5 – animais com TAE tratados 16 R + Medicamento Neotaxel

Grupo 6- animais com TAE tratados 16 R + Rutina + Naringina

4.5.3. NEOTAXEL

O medicamento Neotaxel

foi cedido pela empresa Quiral Química do Brasil

S.A. A administração do medicamento Neotaxel

ocorreu em dose única por via

endovenosa na veia da cauda do camundongo na dosagem de 100mg/m

(1 quilograma

de peso corporal é equivalente a 6,6 m

) , após 24 horas da inoculação das células

tumorais.

As informações abaixo foram retiradas da bula do medicamento Neotaxel

produzido pela empresa Quiral Química do Brasil S.A.

Docetaxel é um agente antineoplásico pertencente à família dos taxóides. É

preparado por semi-síntese, sendo o seu precursor extraído de uma fonte renovável

de folhas de espécies do gênero Taxus. É um pó quase branco, com fórmula empírica

e massa molecular de 807,9.

O docetaxel, princípio ativo do Neotaxel

é um agente que atua promovendo a

agregação das tubulinas na formação de microtúbulos estáveis, inibindo a sua

despolimerização, causando a diminuição da tubulina livre. A ligação do docetaxel

aos microtúbulos não altera o número de protofilamentos.

O docetaxel tem demonstrado, in vitro, romper a rede de microtúbulos, a qual é

essencial para a interfase vital e função mitótica da célula. Mostrou ser citotóxico, in

vitro, contra várias linhagens de células tumorais humanas e de roedores. Mostrou

também ser ativo em linhagens celulares, destacando-se a p-glicoproteína, a qual é

codificada por um gene multirresistente à drogas. In vitro, docetaxel demonstrou

experimentalmente ter um largo espectro de atividade antitumoral contra enxertos

tumorais avançados em humanos e roedores.

Baseado em estudos in vitro, isoenzimas do citocromo P450 parecem estar

envolvidas no metabolismo do docetaxel. Cerca de 95% desse medicamento se

encontra ligado às proteínas plasmáticas.

É indicado no tratamento de câncer de mama localmente avançado ou metastático,

após falha na quimioterapia prévia. Também em câncer de pulmão e carcinoma

metastático de ovário.

4.6. EUTANÁSIA DOS CAMUNDONGOS, COLETA DE SANGUE,

COLETA DE LÍQUIDO ASCÍTICO E COLETA DO FÍGADO PARA

HISTOPATOLOGIA.

Após 18 dias da inoculação das células tumorais, os animais sofreram eutanásia

e retirou-se o sangue por punção cardíaca com auxílio de uma seringa de 5 mL. As

amostras de sangue dos animais foram centrifugadas a 7100 x g durante 15 minutos para

obtenção do soro. As dosagens sorológicas de proteínas totais, alanina aminotransferase

(ALT ou TGP), aspartato aminotransferase (AST ou TGO) e albumina foram efetuadas

no equipamento de dosagens multiparamétrico de Bioquímica (Alizé) utilizando kits da

marca BioMérieux®.

Com o auxílio de uma seringa de 10 mL foi coletado todo o líquido ascítico da

cavidade abdominal do camundongo, sendo este colocado em proveta graduada para

mensuração do volume. Para a contagem das células presentes nesse líquido, foi retirado

uma alíquota de 100 µL do líquido ascítico e colocado em um ependorf contendo 100

µL de azul de tripano e 800 µL de solução fisiológica (NaCl, 0,9%) . As células foram

contadas em Hemocitômetro de Newbauer usando a técnica de exclusão pelo azul de

tripano.

As amostras do líquido ascítico dos animais foram centrifugadas a 7100 x g

durante 15 minutos para precipitação das células. As dosagens no líquido ascítico de

proteínas totais, alanina aminotransferase (ALT ou TGP), aspartato aminotransferase

(AST ou TGO) e albumina foram efetuadas no equipamento de dosagens

multiparamétrico de Bioquímica (Alizé) utilizando kits da marca BioMérieux®.

Após a retirada do sangue e líquido ascítico, foram coletados fragmentos de

fígado para análise histopatológica verificando a adesão de células tumorais e focos

metastáticos. Os fragmentos coletados foram imediatamente colocados em formol

neutro tamponado a 10%, sendo que após as primeiras 6 horas de fixação foram

recortados em fragmentos menores de aproximadamente 5 mm de espessura e colocados

novamente em formol por 24 horas. Decorrido esse tempo, foram desidratados em

soluções crescentes de álcoois 70

, 80

, 90

e 100%, diafanizados em xilol, incluídos em

parafina e cortados em micrótomo de rotação na espessura de 5 µm e estendidos em

lâmina de vidro com polipep, sendo corados pela hematoxilina/eosina (H&E).

4.7. ANÁLISE DO TEMPO DE VIDA

Para avaliar a mortalidade dos animais foi registrada diariamente a ocorrência de

morte dos mesmos para posterior confecção da curva de mortalidade. O ponto final do

experimento foi determinado pela morte espontânea dos animais.

O tempo médio de sobrevida dos animais (MST) e a porcentagem de aumento do

tempo de sobrevida (%ILS) foram avaliados durante 40 dias. A %ILS e MST foi

calculada usando a equação segundo GUPTA et al (2004):

MST = (1

dia de morte + último dia de morte)

ILS(%) = MST grupo tratado 1 x 100

De acordo com ORSOLIC (2005) e GUPTA et al (2004) se a MTS dos grupos

tratados dividido pela média do tempo de sobrevida do grupo controle exceder 125% e

ILS exceder 25%, é um indicativo que a droga testada possui uma atividade antitumoral

significativa.

4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA

As médias dos tratamentos (ou grupos) foram comparadas por meio do teste t

para amostras independentes, adotando-se %5

como nível de significância.

(Banzatto e Kronka, 1989; Gomes, 1985). A comparação entre os tempos foi feita por

meio do teste

de Snedecor, também adotando-se %5

como nível de significância,

uma vez que a relação

tF = é válida quando se comparam apenas dois tratamentos.

O programa estatístico utilizado para efetuar os testes foi o Sistema de Análises

Estatísticas e Genéticas, desenvolvido pelo Prof. Ricardo Frederico Euclydes, do

Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa-MG.

5. RESULTADOS E DISCUSSÂO

5.1 PREVENÇÃO DO TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH (TAE) EM

CAMUNDONGOS TRATADOS COM DIFERENTES FLAVONÓIDES POR 20

DIAS.

Na tabela 4 são apresentados os níveis médios de proteínas totais de camundongos

tratados com flavonóides com posterior indução do Tumor ascítico de Ehrlich (TAE).

Tabela 4 - Valores médios de proteínas totais (± desvio padrão) no soro sangüíneo de

camundongos tratados com flavonóides por 20 dias com posterior indução do tumor

ascítico de Ehrlich

Tratamentos

Proteínas Totais (

/dl)

21 dias

Proteínas Totais (g/dl)

39 dias

Ração (G1) 55,9 ± 3,67 a ---------------

Ração + câncer induzido (G2) ------------ 48,8 ± 9,08 a

Ração + Rutina (G3) 53,12 ± 7,94 Aab 60,13 ± 36,7 Aa

Ração + Naringina (G4) 49,76 ± 3,03 Bb 66,26 ± 10,2 Aa

Ração + Rutina + Naringina (G5) 54,70 ± 8,37 Aab 66,32 ± 21,99 Aa

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05). Em cada tratamento A difere de B (na horizontal) pelo teste F (P<0,05).

De acordo com os resultados bioquímicos, obtidos na tabela acima, observou-se

que os animais tratados com os flavonóides Rutina (G3), Naringina (G4) e associação

de Rutina + Naringina (G5) apresentaram valores médios de proteínas totais circulantes

próximos ao valor médio do grupo controle normal (G1) grupo esse, não submetido a

nenhuma forma de tratamento durante o experimento.

Esses resultados são importantes considerando que a maioria das proteínas

plasmáticas são sintetizadas pelo fígado. Sendo assim, a variação não significativa nos

níveis desse parâmetro são indícios que os flavonóides testados não causam toxicidade

aos hepatócitos.

As proteínas plasmáticas representam um grupo heterogêneo, de diferentes

pesos moleculares. Consistem basicamente de albumina, que é a menor e a de maior

ocorrência, α-globulinas, β-globulinas, γ-globulinas e fibrinogênio. Quando dosadas no

soro, apresentam um valor menor do que no plasma, já que o fibrinogênio é perdido na

formação do coágulo (AMARAL, 1996). Elas são o principal componente do tecido

muscular, dos hormônios e das enzimas, e correspondem aos anticorpos, elementos de

defesa orgânica do animal contra doenças (MELLO, 1988).

É importante ressaltar, que apenas o grupo (G4), após 20 dias de tratamento,

apresentou um redução nos níveis de proteínas totais circulantes estatisticamente

significativos em relação ao grupo (G1). Valores diminuídos na concentração de

proteínas totais do soro sangüíneo podem estar relacionados com doenças renais,

hepáticas ou em casos de hiperhidratação, desnutrição grave, síndrome de má absorção,

deficiência de cálcio e de vitamina D (MEYER et al, 1992).

Outro fato, importante a ser relatado foi o aumento durante o período

experimental de 34% nos níveis de proteínas totais circulantes ocorrido no grupo (G4) e

essa variação foi estatisticamente significativa. Nota-se, no entanto, que no 21º- dia de

experimentação todos os animais encontravam-se normais (não haviam sido submetidos

a indução carcinogênica por TAE), recebendo apenas os flavonóides, e após 38º- dias

todos os animais encontravam-se doentes apresentado sinais claros de ascite.

Na tabela 5 encontram-se registrados os valores médios de Aspartato Amino

Transferase (também chamada de AST ou GOT ou TGO) do soro sanguíneo de

camundongos, tratados durante 20 dias com flavonóides, com posterior indução do

tumor ascítico de Ehrlich.

De acordo com os resultados bioquímicos obtidos na tabela 5 pode-se observar

que não ocorreram variações estatisticamente significativas nos níveis de atividade de

(AST) após 21º dias de experimentação, entre os grupos submetidos aos diferentes

tratamentos. Resultados semelhantes ocorreram aos 39º dias de experimentação.

Tabela 5 - Valores médios de aspartato aminotransferase (± desvio padrão) no soro

sangüíneo de camundongos tratados com flavonóides por 20 dias com posterior indução

do tumor ascítico de Ehrlich

Tratamentos AST (U/ml)

21 dias

AST (U/ml)

39 dias

Ração (G1) 587,56 ± 75,60 a ----------

Ração + câncer induzido (G2) ----------- 2021,25 ± 492,11 a

Ração + Rutina (G3) 333,36 ± 176,28 Ba 1276,85 ± 1006,78 Aa

Ração + Naringina (G4) 700,96 ± 487,03 Ba 1680,88 ± 282,97 Aa

Ração + Rutina + Naringina (G5) 561,34 ± 371,78 Ba 2076,58 ± 1204,68 Aa

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05). Em cada tratamento A difere de B (na horizontal) pelo teste F (P<0,05).

A transaminase (AST) é uma enzima hepática cujo nível no sangue aumenta

freqüentemente, mas não sempre, quando há lesões das células hepáticas (hepatócitos)

provocadas por qualquer tipo de agressões, como vírus da hepatite (A, B ou C),

consumo excessivo de álcool, processos carcinogênicos ou drogas. Existem no fígado

mais de 60 reações que produzem transaminases, porém as únicas com valor clínico são

a AST (também conhecida pelas siglas GOT, ASAT, TGO ou SGOT) e a ALT (também

conhecida pelas siglas GPT, ALAT, TGP ou SGPT), sendo que, estas não são

produzidas exclusivamente no fígado e se encontram extensamente distribuídas pelo

organismo (VARALDO, 2005).

Comparando-se os valores médios das atividades de (AST) aos 21º- dia e aos

39º- dia de experimentação, entre os grupos submetidos ao mesmo tratamento, notou-se

um aumento abrupto na atividade enzimática da transaminase, valores esses,

estatisticamente significativos nos grupos (G3), (G4) e (G5). Lembrando sempre, que os

animais sofreram indução carcinogênica após o vigésimo dia de tratamento hipótese

essa que pode elucidar o aumento abrupto nos níveis de AST.

Como podemos observar na tabela acima, os flavonóides testados não

desencadearam um aumento na atividade de AST após 21-º dias de tratamento, mas um

aumento estatisticamente significativo foi observado após a inoculação de células do

TAE nos animais.

A AST é uma enzima catalítica encontrada primariamente no coração, fígado e

tecido muscular sendo que, níveis altos de AST na corrente sanguínea nem sempre

indicam danos hepáticos. Por exemplo, até mesmo exercícios vigorosos podem elevar

os níveis de AST no corpo. Essa transaminase catalisa a reação do ácido oxaloacético +

acido glutâmico para produzir ácido α-cetoglutárico + ácido aspártico. As variações na

atividade dessa enzima podem ser encontradas em hepatites infecciosas, hepatopatias

crônicas, carcinomas hepáticos e infarto do miocárdio (LIMA, 2003).

Na tabela 6 encontram-se registrados os valores médios de Alanina amino

transaminase (também chamada de ALT ou GPT ou TGP) do soro sanguíneo de

camundongos, tratados durante 20 dias com flavonóides, com posterior indução do

tumor ascítico de Ehrlich.

Tabela 6 - Valores médios de alanina aminotransferase (± desvio padrão) no soro

sangüíneo de camundongos tratados com flavonóides por 20 dias com posterior indução

do tumor ascítico de Ehrlich

Tratamento ALT (U/ml)

21 dias

ALT (U/ml)

39 dias

Ração (G1) 50,00 ± 17,79 a ------------

Ração + câncer induzido (G2) ------------- 53,40 ± 18,23 a

Ração + Rutina (G3) 29,2 ± 4,55 Abc 43,25 ± 19,41 Aa

Ração + Naringina (G4) 25,20 ± 4,92 Ac 58,99 ± 36,59 Aa

Ração + Rutina + Naringina (G5) 38,60 ± 13,54 Aab 30,20 ± 16,05 Aa

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05). Em cada tratamento A difere de B (na horizontal) pelo teste F (P<0,05).

De acordo com os resultados bioquímicos obtidos na tabela 6, no 21º- dia de

experimentação, os grupos submetidos ao tratamento com os flavonóides rutina (G3) e

naringina (G4) apresentaram atividade enzimática de ALT reduzida em relação ao

grupo ração (G1) e essa variação foi estatisticamente significativa.

A alanina aminotransferase (ALT) também é responsável por reações de

transaminações (LIMA, 2003). A ALT é uma enzima produzida pelo fígado e

encontrada em certos líquidos corporais (bile, líquido cefalorraquidiano, plasma, saliva),

no fígado, na musculatura esquelética, no pâncreas e nos rins. Sua dosagem é

comumente efetuada para avaliar lesões hepáticas, quando seus níveis podem aumentar

e atingir até 50 vezes seu valor normal (MEYER,1992).

Os valores bioquímicos de ALT encontrados no trabalho reforção a premissa de

que os flavonóides testados em nosso experimento, na concentração de 10mg/Kg, não

desencadearam lesões hepáticas nos animais. Segundo Coles (1986b) esta enzima está

presente em grandes quantidades no citoplasma dos hepatócitos. A pequena quantidade

existente no soro é decorrente da substituição fisiológica de algumas células do tecido

hepático, com a subseqüente liberação da enzima. O aumento da atividade sérica reflete

anormalidade das células hepáticas.

A ALT estará aumentada no soro quando houver degeneração ou necrose do

fígado; nestes casos ocorre extravazamento da enzima do citoplasma do hepatócito para

o sangue. Meyer et al. (1992a) acrescentaram que a ALT estará aumentada no soro

também por processos que alterem a permeabilidade de membrana dos hepatócitos,

como agressão por toxinas e hipóxia.

Na tabela 7 encontram-se registrados os valores médios de Albumina (g/dl) do

soro sanguíneo de camundongos, tratados durante 20 dias com flavonóides, com

posterior indução do tumor ascítico de Ehrlich.

Tabela 7 - Valores médios de albumina (± desvio padrão) no soro sangüíneo de

camundongos tratados com flavonóides por 20 dias com posterior indução do tumor

ascítico de Ehrlich.

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05). Em cada tratamento A difere de B (na horizontal) pelo teste F (P<0,05).

De acordo com os resultados bioquímicos obtidos, no 21º dia de

experimentação, observou-se que as concentrações de albumina sofreram uma redução

estatisticamente significativa apenas no grupo dos animais submetidos ao tratamento

com naringina (G4) em relação ao grupo ração (G1). Sendo assim, a redução dos níveis

de albumina no grupo (G4) desencadeou conseqüentemente, uma redução dos níveis de

proteínas totais presentes no soro sangüíneo dos animais do mesmo grupo, pois estes

Tratamentos Albumina (g/dl)

21 dias

Albumina (g/dl)

39 dias

Ração (G1) 3,78 ± 0,25 Aa --------------

Ração + câncer induzido (G2) ------------ 3,48 ± 0,44 ab

Ração + Rutina (G3) 3,37 ± 0,48 Aa 2,90 ± 0,88 Aab

Ração + Naringina (G4) 2,28 ± 1,19 Bb 3,74 ± 0,58 Aa

Ração + Rutina + Naringina (G5) 3,76 ± 0,45 Aa 2,86 ± 0,69 Bb

parâmetros encontram-se correlacionados. Nesse estudo, essa correlação pode ser

observada, pois o tratamento com o flavonóide naringina (G4) apresentou valores

estatisticamente significativos também na redução de proteína totais em comparação

com o grupo ração (G1).

Pode-se observar também, que os níveis de albumina no grupo (G4)

apresentaram um aumento estatisticamente significativo ao longo do tempo de

experimentação como pode ser comprovado em análises bioquímicas realizadas no

mesmo grupo aos 21º e 39º dias. Segundo Meyer, (1992) valores elevados de albumina

podem ocorrer em carcinomatose metastática, colite ulcerativa, nefrose, neoplasias entre

outras.

Outro fato observado foi que a associação entre os flavonóides rutina +

naringina grupo (G5) sofreu um redução estatisticamente significativa nas

concentrações de albumina ao longo do experimento.

Os valores referentes ao número de células tumorais vivas presentes no líquido

ascítico encontram-se registrados na tabela 8.

Tabela 8 - Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Número de células tumorais

viáveis (± desvio padrão) presentes no líquido ascítico dos camundongos

Tratamento Células tumorais viáveis (N x 10

)

Ração + Animal com câncer (G2)

10,84 ± 1,44 a

Ração + Rutina (G3)

4,99 ± 1,54 b

Ração + Naringina (G4)

6,78 ± 1,24 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

5,95 ± 1,97 b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos na tabela 8 observou-se que os grupos

submetidos a diferentes tratamentos com flavonóides, como forma de prevenção,

apresentaram resultados estatisticamente significativos na redução do número de células

tumorais viáveis do líquido ascítico de camundongos em comparação com o grupo

(G2). Os tratamentos (G3), (G4) e (G5) não diferem estatisticamente na redução no

número de células viáveis.

Kennedy, (2002) demonstrou que o extrato de chá verde, galoil polifenol e

epigalocatequinas (ricos em flavonóides) têm demonstrado possuir efeito inibitório nas

células do TAE e muitos mecanismos têm sido elucidados. Muitos deles incluem

redução da atividade da ornitina descarboxilase, glutationa celular e de proteínas que

contêm o grupo SH. Polifenóis e flavonóides causam paralisação do ciclo celular na fase

G0-G1, levando subsequentemente a apoptose.

Os resultados da ação dos flavonóides na redução do número de células vivas

presentes no liquido ascítico de camundongos pode ser melhor visualizado no gráfico 1.

Gráfico 1 - Número de células viáveis doTAE em camundongos tratados

com diferentes flavonóides durante 20 dias com indução posterior do

TAE.

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

1,20E+08

rutina r + n naringina controle

tratamentos

Células viáveis

abbb

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

Os valores referentes ao número de células tumorais mortas presentes no líquido

ascítico encontram-se registrados na tabela 9.

Tabela 9 - Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Número de células tumorais

mortas (± desvio padrão) presentes no líquido ascítico dos camundongos

Tratamento Células tumorais mortas (N x 10

)

Ração + Animal com câncer (G2)

0,046 ± 0,020 b

Ração + Rutina (G3)

0,378 ± 0,090 a

Ração + Naringina (G4)

0,315 ± 0,177ab

Ração + Rutina + Naringina (G5)

0,278± 0,198 ab

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

De acordo com a tabela 9, pode-se observar que o número de células tumorais

mortas do grupo tratado com o flavonóide rutina aumentou de forma estatisticamente

significativa em relação ao grupo (G2).

Os flavonóides podem exercer efeitos modulatórios nas células, independentes

da sua atividade antioxidante clássica, através de ações seletivas em diferentes rotas de

sinalização das proteínas quinases. Ações inibitórias ou estimuladoras dessas rotas

afetam profundamente a função celular por alterar a fosforilação de moléculas alvos

e/ou por modular a expressão gênica. Ações inibitórias seletivas dessas quinases podem

ser benéficas no tratamento do câncer, doenças proliferativas, inflamação e

neurodegeneração que podem ser deteriorantes durante o desenvolvimento

(WILLIAMS, 2004). Quercetina e genisteína inibem a proteína tirosina quinase que

também está envolvida na proliferação celular.

Os resultados das ações dos flavonóides na indução da mortalidade de células

presentes no líquido ascítico de camundongos, pode ser melhor visualizado no gráfico

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

Orsolic (2005) realizou um estudo preventivo com o objetivo de avaliar a

atividade terapêutica da própolis e dos flavonóides naringenina, crisina e quercetina em

camundongos com TAE. Para realização do estudo os camundongos foram tratados com

Gráfico 2 - Número de células mortas do TAE de

camundongos tratados com diferentes flavonóides

durante 20 dias com posterior indução do TAE

0,0E+00

5,0E+05

1,0E+06

1,5E+06

2,0E+06

2,5E+06

3,0E+06

3,5E+06

4,0E+06

Tratamentos

Células morta

rutina naringina R + N controle

50mg/kg desses compostos, por via oral, por 7º dias e no 8

dia ocorreu a indução do

TAE. As análises de viabilidade celular, volume do líquido ascítico e número de células

tumorais totais foram realizadas no 14

dia de experimentação. Esse autor afirma que a

atividade terapêutica da própolis é dependente principalmente da presença de

flavonóides, entre eles, quercetina, naringenina, crisina, galangina, etc. Quando foi

avaliado o número de células tumorais mortas, observou-se um aumento de 4,3% no

número dessas células quando os animais foram tratados com o flavonóide naringenina

comparado ao grupo de animais com TAE não tratados e de 3,79% quando utilizado o

flavonóide quercetina. Esse mesmo pesquisador afirma que a combinação de

flavonóides apresenta melhores resultados na redução do número de células tumorais

mamárias induzidas por DMBA e em cultura de células mamárias humanas da linhagem

MDA-MB-435.

Os resultados encontrados nesse trabalho estão de acordo com os resultados de

Orsolic (2005). Ao avaliar o número de células tumorais mortas contidas no líquido

ascítico dos camundongos com TAE tratados como a associação dos flavonóides rutina

+ naringina encontrou-se um aumento significativo (p<0,05) no número de células

tumorais mortas quando comparado aos animais do grupo com TAE não tratados.

Na tabela 10 encontram-se expostos os valores encontrados na contagem das

células tumorais totais presentes no líquido ascítico dos diferentes grupos.

Tabela 10 - Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Número de células tumorais

totais (± desvio padrão) presentes no líquido ascítico dos camundongos

Tratamento Células tumorais totais (N x 10

)

Ração + Animal com câncer (G2)

10,89 ± 1,46 a

Ração + Rutina (G3)

5,37 ± 1,63 b

Ração + Naringina (G4)

7,10 ± 1,22 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

6,23 ± 2,17 b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

Como pode-se observar na tabela 10 os grupos (G3), (G4) e (G5) apresentaram

menores valores, referentes a totalidade de células, comparado ao grupo (G2) e esses

valores foram estatisticamente significativos. Os resultados encontrados nesse estudo

estão de acordo com os resultados encontrados por Orsolic (2005) que constatou em seu

estudo preventivo uma redução estatisticamente significativa de 79% no número de

células tumorais totais quando os animais foram tratados com própolis; 74% quando

tratados com o flavonóide naringenina e 57% com o flavonóide quercetina.

Quando comparou-se a eficácia na redução do número de células tumorais, entre

os grupos (G3), (G4) e (G5) pode-se observar que não ocorreram variações

estatisticamente significativas entre eles. Através dessa análise matemática, pode-se

afirmar que os diferentes tratamentos apresentaram um mesmo padrão de redução no

número total de células tumorais no líquido ascítico de camundongos.

Esses dados podem ser melhor visualizados no gráfico 3.

Gráfico 3 - Número de células tumorais totais do TAE de

camundongos tratados com diferentes flavonóides por 20 dias com

indução posterior do TAE

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

1,20E+08

Tratamentos

Células totais

rutina R + N narin

ina controle

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

Os resultados referentes a viabilidade celular tumoral de Ehrlich encontram-se

registrados na tabela 11.

De acordo com os resultados obtidos para a viabilidade celular observou-se que

os grupos submetidos a diferentes tratamentos com flavonóides, como forma de

prevenção da multiplicação celular tumoral, apresentaram resultados estatisticamente

significativos apenas, quando os animais foram submetidos ao tratamento com o

flavonóide rutina (G3) comparando ao grupo (G2). Esse resultado pode ser melhor

visualizado no gráfico 4.

b b a

Tabela 11 - Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Viabilidade celular ± desvio

padrão presente no líquido ascítico dos camundongos

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos de uma mesma letra minúscula, não diferem entre si

pelo teste t de Student (P>0,05).

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

Segundo Woo (2005), flavonóides inibem a proliferação celular pela modulação

da atividade de ciclinas dependente de quinase, moléculas chave envolvidas na

regulação do ciclo celular. Os flavonóides causam paralisação do crescimento de células

tumorais por impedirem a progressão da fase G0-G1 do ciclo celular, levando

subseqüentemente a célula a apoptose. A paralisação do ciclo celular é mediada através

da indução de fatores nucleares e da baixa modulação da ciclina D1 e E. Essa

paralisação também pode estar associada com a inibição de CDK2, CDK 4 e CDK5 pela

expressão de inibidores de cdk (p21 e p27).

Orsolic (2005) observou em seu estudo que os animais tratados com o

flavonóide quercetina apresentaram no líquido ascítico uma viabilidade celular de

96,21%, e de 95,7% quando os animais foram tratados com o flavonóide naringenina.

Tratamento Viabilidade celular (%)

Ração + Animal com câncer (G2)

99,5 ± 0,12 a

Ração + Rutina (G3)

92,8 ± 0,61 b

Ração + Naringina (G4)

95,0 ± 2,00 ab

Ração + Rutina + Naringina (G5)

95,8 ± 1,91 ab

Gráfico 4 - Viabilidade celular do tumor ascítico de Ehrlich em

camundongos submetidos a diferentes tratamentos

100

101

Tratamentos

Viabilidade Celular (%

)

Rutina Naringina R + N Controle

b ab

Gráfico 4 - Viabilidade celular do TAE em camundongos tratados

com diferentes flavonóides

or 20 dias com indu

ão

osterior de TAE

Sendo assim, os resultados encontrados nesse trabalho estão em concordância com os

resultados encontrados por Orsolic (2005). Em nosso estudo foi constatado que os

animais tratados, com o flavonóide rutina, apresentaram uma viabilidade celular de

92,8%.

Na tabela 12 encontram-se destacados os valores referentes ao volume do

líquido ascítico, acumulado ao longo do experimento, na cavidade abdominal dos

animais.

Tabela 12 - Efeito dos flavonóides na prevenção do TAE. Volume do líquido ascítico(±

desvio padrão) dos camundongos

Tratamento Volume do liquido ascítico (mL)

Ração + Animal com câncer (G2)

14,9 ± 2,35 b

Ração + Rutina (G3)

27,0 ± 6,36 a

Ração + Naringina (G4)

16,9 ± 2,71 ab

Ração + Rutina + Naringina (G5)

23,7 ± 4,8 a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos observou-se que o grupo (G3), tratado com

o flavonóide rutina, apresentou o maior valor em volume de líquido ascítico presente na

cavidade abdominal dos animais quando comparado aos demais grupos. Valor esse,

estatisticamente significativo em relação ao grupo (G2).

Orsolic (2005), ao realizar seu estudo de prevenção com os flavonóides

quercetina, naringenina administrados de forma oral e intraperitoneal, observou uma

redução estatisticamente significativa no volume do líquido ascítico dos animais

tratados em relação aos animais com TAE (não tratados). Os dados encontrados em

nosso estudo mostraram que os animais tratados com os diferentes flavonóide (rutina,

naringina, rutina + naringina) por 20 dias na prevenção do TAE, tiveram um aumento

significativo no volume do líquido ascítico. Sendo assim, os resultados encontrados por

Orsolic (2005) não estão em concordância com os resultados encontrados nesse

trabalho.

Quando comparou-se os tratamentos (G3), (G4) e (G5) observou-se que não

ocorreram diferenças estatisticamente significativas nos valores referentes ao volume de

líquido acumulado na cavidade abdominal dos animais.

Esses resultados podem ser melhor visualizados no gráfico 5.

Gráfico 5 - Volume do líquido ascítico em camundongos

tratados com diferentes flavonóides durante 20 dias com

indução posterior do TAE

Tratamentos

Volume (mL)

Controle Naringina R + N Rutina

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula, não diferem entre si pelo

teste t de Student (P>0,05).

O gráfico 6 destaca os resultados da freqüência de mortalidade dos

camundongos tratados com diferentes flavonóides por 20 dias com posterior indução do

TAE.

De acordo com os resultados obtidos observou-se que o grupo controle, referente

aos animais não submetidos a nenhuma forma de tratamento, apresentou taxa de

mortalidade acumulada de 80% dos animais aos 21 dias de experimentação.

Percentagem de mortalidade ocorrida aos 22 dias ao grupo tratado com o flavonóide

Rutina.

O grupo tratado com o flavonóide Naringina apresentou taxa de mortalidade

acumulada de 80% da população de camundongos aos 23 dias. Quando os flavonóides

Rutina e Naringina foram associados observou-se um sinergismo de adição no potencial

terapêutico, fato esse observado pela maior longevidade dos animais com taxa de

mortalidade acumulada de 80% da população aos 25 dias de experimentação.

Frequência de mortalidade

-20

100

120

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Dias

porcentagem

Rutina Naringina Controle R + N

Nesse trabalho os camundongos foram tratados diariamente por 20 dias com

10mg/kg dos diferentes flavonóides por via oral e no 21º dia do experimento ocorreu a

indução do TAE. Observou-se um aumento de 8,0 % na expectativa de vida dos

camundongos que receberam o flavonóide rutina quando comparado ao grupo controle.

Quando os animais foram tratados com a naringina esse aumento foi de 13,5%. A

associação dos flavonóides rutina + naringina prolongou a vida dos animais em 29,7%.

De acordo com Orsolic (2005), em um estudo preventivo testando diferentes

flavonóides em camundongos com TAE, foi observado um aumento de 15,83% no

tempo de vida dos animais que foram tratados com o flavonóide naringenina na

concentração de 50mg/kg por 7 dias. Quando o tratamento foi efetuado com a

quercetina, o aumento observado foi de 6,66% . O autor afirma que esses tratamentos

aumentam o tempo de vida dos animais, confirmando assim, a eficácia dos compostos

testados.

Os resultados obtidos nesse experimento estão em concordância com os

resultados publicados por Orsolic dessa forma, podemos afirmar que os flavonóides

testados aumentam o tempo de vida dos animais com TAE.

A análise do tempo de vida dos animais também foi realizada através de cálculos

de MST (Tempo médio de sobrevida dos animais) e de %ILS (percentagem de aumento

do tempo de sobrevida). Esses resultados podem ser visualizados na tabela 13.

Gráfico 6 - Freqüência de mortalidade de camundongos tratados com

diferentes flavonóides durante 20 dias com

osterior indu

ão do TAE

Ao analisar esses resultados observou-se que os flavonóides rutina e naringina

quando administrados previamente por 20 dias nos camundongos não possuíram uma

atividade antitumoral significativa de acordo com o critério de NCI citado por Orsolic

(2005). Pois segundo esse critério, e a MTS dos grupos tratados dividido pela média do

tempo de vida do grupo controle exceder 125% e ILS exceder 25%, é um indicativo que

a droga testada possui uma atividade antitumoral significativa.

Um atividade antitumoral significativa de acordo com a MTS e ILS pode ser

observada apenas na associação das drogas.

Tabela 13 – Atividade preventiva de flavonóides sobre o tempo de vida de

camundongos com TAE

Tratamentos Variação do

tempo de vida

MST (d)

ILS (%)

T/C (%)

Eficácia

Ração 15 -22 18,5 ------ ------

Ração + rutina 17-23 20,0 8,0 108,0 -

Ração + naringina 19-23 21,0 13,5 113,5 -

Ração + rutina +

naringina

22-26 20,0 29,7 129,7 +

a) MST=(1

dia de morte + ultimo dia de morte)/2; b) ILS% = (MST grupo tratado /MST grupo controle)-

1 x 100; c) T/C % = (MST grupo tratado /MST grupo controle) x 100

Um atividade antitumoral significativa de acordo com a MTS e ILS pode ser

observada apenas na associação das drogas.

5.2 - TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS COM TUMOR ASCÍTICO DE

EHRLICH (TAE) COM DIFERENTES FLAVONÓIDES POR 18 DIAS.

Na tabela 14 encontram-se registrados os valores médios de Proteínas Totais do

soro sanguíneos de camundongos com Tumor ascítico de Ehrlich tratados durante 18

dias com diferentes flavonóides.

Tabela 14 - Valores médios de proteínas totais (± desvio padrão) no soro sanguíneo de

camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com flavonóides por 18 dias .

Tratamentos Proteínas Totais (g/dl)

18 dias

Ração (G1) 54,63 ± 2,67 b

Ração + Animal com câncer (G2) 48,80 ± 5,08 c

Ração + Rutina (G3) 74,32 ± 8,42 a

Ração + Naringina (G4) 64,48 ± 16,60 ab

Ração + Rutina + Naringina (G5) 52,73 ± 3,28 bc

Ração + Neotaxel (G6) 60,13 ± 7,49 b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos observou-se que o grupo (G2), animais

doentes com tumor ascítico de Ehrlich não submetidos a tratamento, apresentou a menor

média na concentração de proteínas totais após 18 dias de experimentação. Segundo

Meyer, (1992) hipoproteinemia pode ocorrer quando a um aumento do volume

plasmático como na emodiluição por intoxicação hídrica, na cirrose ou quando a ascite

está presente.

Quando análises foram efetuadas comparando-se os diferentes tratamentos com

o grupo (G2) pode-se observar, com exceção do tratamento utilizando a associação

Rutina + Naringina, que os diferentes tratamentos desencadearam um aumento nas

concentrações de proteínas totais e esses resultados foram estatisticamente

significativos. Esses aumentos, nos níveis de proteínas totais pelos flavonóides são de

grande importância, pois essas proteínas estão envolvidas com transporte de fármacos,

reparo de tecidos lesados e em respostas imunológicas.

De acordo com Meyer, (1992), as proteínas séricas totais sintetizadas no fígado e

no sistema retículo-endotelial constituem mais de 100 substâncias diferentes,

classificadas como albumina e globulinas. As proteínas séricas são essenciais para

regulação da pressão coloidosmótica. Elas incluem fatores de coagulação, enzimas,

hormônios e são responsáveis por crescimento e reparo dos tecidos e tampões de pH,

anticorpos, transportam componentes sanguíneos (bilirrubina, cálcio, esteróides,

hormônios tireóideos, lipídeos, metais, oxigênio e vitaminas) e são preservadoras dos

cromossomos.

É importante observar que os animais com câncer (G2) tiveram menores

concentrações plasmáticas de proteínas totais e isso é coerente, pois no processo de

carcinogênese diversas proteases são liberadas e suas atividades aumentadas dessa

forma, ocorre uma maior degradação protéica, embora formem-se novas proteínas

(oncoproteínas).

Na tabela 15 encontram-se registrados os valores médios da atividade de

Aspartato Amino Transferase (também chamada de AST ou GOT ou TGO) no soro

sanguíneo de camundongos, com tumor ascítico de Ehrlich, tratados durante 18 dias

com diferentes flavonóides.

Tabela 15 - Valores médios de Aspartato aminotransferase – AST - (± desvio padrão)

do soro sanguíneo de camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com

flavonóides por 18 dias

Tratamentos AST (U/ml)

18 dias

Ração (G1) 587,56 ± 75,60 c

Ração + Animal com câncer (G2) 2021,25 ± 492,11 c

Ração + Rutina (G3) 4818,63 ± 698,95 a

Ração + Naringina (G4) 2375,25 ± 709,73 bc

Ração + Rutina + Naringina (G5) 2949,00 ± 553,94 b

Ração + Neotaxel (G6) 2803,80± 558,71b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos, os tratamentos efetuados ao longo do

experimento, com exceção do grupo G4, desencadearam um aumento na atividade de

(AST) de forma estatisticamente significativa em relação ao grupo G1 e G2.

Gupta e colaboradores 2004 realizaram um estudo com uma planta da Índia, a

Cesalpinia bonducella, que possui associação de flavonóides, terpenos, saponinas e

alcalóides. Para avaliar a toxicidade da planta em camundongos normais (sem TAE)

foram testadas dosagens diferentes (50, 100, 200 e 300mg/kg) do extrato metanólico

dessa planta (MECB). Esse extrato foi dissolvido em propileno glicol e administrado

intraperitonealmente em camundongos. Após 14 dias de tratamento, foi observado um

aumento estatisticamente significativo (P<0,05) na atividade sérica das enzimas

(transaminases) quando comparou o grupo controle (animal normal) em relação ao

grupo tratado com 300mg/kg do extrato. As demais concentrações desse extrato

provocaram um aumento da atividade dessas enzimas, porém esses resultados não foram

estatisticamente significativos. Os autores concluíram que uma alta concentração do

extrato da planta (300 mg/kg) provocou um aumento na atividade de transaminases

indicando assim, a ocorrência de disfunções hepato-renais e alterações no metabolismo.

Os resultados encontrados nesse trabalho demonstraram um aumento na

atividade de AST nos grupos (G3), (G5) e (G6) em comparação ao grupo (G2) dessa

forma, estes resultados estão em concordância com os resultados de Gupta et al, mas

alterações hepato-renais não foram observadas em análises histopatológicas de fígado

realizadas em nosso experimento.

Na tabela 16 encontram-se registrados os valores médios da atividade de alanina

amino transaminase (também chamada de ALT ou GPT ou TGP) no soro sanguíneo de

camundongos, com tumor ascítico de Ehrlich, tratados durante 18 dias com diferentes

flavonóides.

Tabela 16 - Valores médios de Alanina aminotransferase – ALT - (± desvio padrão) do

soro sanguíneo de camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com

flavonóides por 18 dias.

Tratamentos ALT (U/ml)

18 dias

Ração (G1) 50,00 ± 17,79 b

Ração + Animal com câncer (G2) 53,40 ± 18,23 b

Ração + Rutina (G3) 120,75 ± 69,96 a

Ração + Naringina (G4) 27,50 ± 2,29 bc

Ração + Rutina + Naringina (G5) 12,00 ± 2,60 cd

Ração + Neotaxel (G6) 12,38 ± 2,56 cd

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados bioquímicos demonstrados na tabela acima, os

animais submetidos ao tratamento com o flavonóide Rutina (G3) apresentaram a maior

atividade enzimática de (ALT), estatisticamente significativa, em relação aos demais

grupos. Outro fato, que merece ser destacado é a redução na atividade de (ALT)

decorrentes dos tratamentos (G5) e (G6) quando comparados ao grupo (G2). Essas

reduções ocorreram de forma estatisticamente significativa como podemos observar na

tabela 16.

Matsuzaki et al (2003) realizaram um estudo com a planta Pfaffia paniculata

(Ginseng brasileiro), que contém flavonóides e é um estimulante tônico e coadjuvante

no tratamento do câncer. Foram testadas doses de 200 e 400mg/kg do extrato dessa

planta administrados por via oral durante 10 dias em camundongos com TAE. Os

resultados demonstraram que não ocorreram alterações histopatológicas em fígado e

rins desses animais. Ao avaliar a atividade sérica da enzima ALT no soro sanguíneo dos

animais que receberam 400mg/kg do extrato de Ginseng, observou-se uma redução na

atividade dessa enzima quando comparado ao grupo de animais com TAE, não tratados.

Nassair et al (2000), analisando a hepatotoxidade de flavonóides em culturas de

hepatócitos de ratos, observaram que esses compostos não apresentaram efeitos tóxicos.

Esses dados foram obtidos através da avaliação da liberação de lactato desidrogenase,

inibição da respiração mitocondrial e do desacoplamento da fosforilação oxidativa.

Os resultados encontrados por Matsuzaki e Nassair estão em concordância com

os resultados encontrados nesse trabalho, onde foram observadas reduções na atividade

de ALT nos grupos G4 e G5 e a não toxicidade dos flavonóides testados. Essa não

toxicidade pode ser comprovada através de análises histopatológicas de fígado

realizadas em nosso trabalho.

Na tabela 17 encontram-se registrados os valores médios da concentração de

albumina no soro sanguíneo de camundongos, com tumor ascítico de Ehrlich, tratados

durante 18 dias com flavonóides.

De acordo com os resultados bioquímicos obtidos os grupos (G4) e (G5)

apresentaram as menores concentrações plasmáticas de albumina e esses resultados

foram estatisticamente significativos quando comparados ao grupo (G2). Segundo

Meyer, (1992) em presença de ascite de qualquer causa a albumina sérica não é um bom

índice da capacidade sintética dos hepatócitos, pois na ascite a síntese de albumina pode

estar normal ou mesmo alterada, no entanto os teores séricos podem estar baixos devido

ao grande volume de distribuição. Mas, o objetivo da análise de albumina nesse trabalho

não foi o de avaliar danos hepáticos e sim, a capacidade de transporte de drogas

(flavonóides) na corrente sangüínea pela albumina.

Tabela 17 - Valores médios de albumina (± desvio padrão) do soro sanguíneo de

camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com diferentes flavonóides por 18

dias

Tratamentos Albumina (g/dl)

18 dias

Ração (G1) 3,78 ± 0,25 a

Ração + Animal com câncer (G2) 3,48 ± 0,44 a

Ração + Rutina (G3) 3,61 ± 0,43 a

Ração + Naringina (G4) 2,94 ± 0,36 b

Ração + Rutina + Naringina (G5) 2,81 ± 0,26 b

Ração + Neotaxel (G6) 3,71 ± 0,83 a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

O grupo tratado com o medicamento Neotaxel

(G6) apresentou valores

semelhantes aos grupos (G1), (G2) e (G3) e esses valores não foram estatisticamente

significativos. É importante ressaltar que além da função de transporte a albumina pode

determinar a proporção de um fármaco livre farmacologicamente ativo disponível no

plasma. Esses resultados demonstraram que o flavonóide rutina e o medicamento

Neotaxel

encontravam-se em maiores proporções livres no plasma conseqüentemente,

eles desempenharam uma maior ação farmacológica que os demais flavonóides

testados.

Além da sua função como molécula fixadora e de transporte, a albumina

desempenha um papel importante na nutrição. Argumenta-se que a proteína está

constituída de tal modo que é facilmente metabolizada, contendo todos os aminoácidos

essenciais (MEYER et al, 1992). Albumina representa de 40% a 60% das proteínas

totais de um animal adulto, sendo produzida exclusivamente no fígado. A principal

função da albumina normal é o transporte e armazenagem de uma ampla variedade de

substâncias de baixo peso molecular, como o cortisol, hormônios sexuais, fármacos,

ácidos graxos, cálcio e várias drogas. A fixação, e consequentemente a detoxificação,

constituem outra das funções primaria da albumina no recém-nascido (AMARAL,

1996).

Na tabela 18 encontram-se registrados os valores médios da concentração de

proteínas totais (g/dl), no líquido ascítico de camundongos, tratados durante 18 dias

com diferentes flavonóides.

Tabela 18 - Valores médios de proteínas totais (± desvio padrão) do líquido ascítico de

camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com diferentes flavonóides por 18

dias

Tratamentos Proteínas Totais (g/dl)

18 dias

Ração + Animal com câncer (G2)

37,72 ± 2,92 a

Ração + Rutina (G3)

40,14 ± 5,32 a

Ração + Naringina (G4)

39,18 ± 2,05 a

Ração + Rutina + Naringina (G5)

36,76 ± 2,13 a

Ração + Neotaxel (G6)

37,22 ± 2,74 a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos na tabela 18, foram observadas pequenas

variações na concentração de proteínas totais, presentes no liquido ascítico. Essas

variações não foram estatisticamente significativas. Dessa forma, os flavonóides

testados não provocaram danos hepáticos aos animais.

Na tabela 19 encontram-se registrados os valores médios da concentração de

aspartato amino transferase (também chamada de AST ou GOT ou TGO), no líquido

ascítico de camundongos, tratados durante 18 dias com diferentes flavonóides.

De acordo com os resultados bioquímicos expostos na tabela 19, os grupos (G3)

e G4) apresentaram menor atividade enzimática de (AST) quando comparados ao grupo

(G2) e esses resultados foram estatisticamente significativos. Sendo assim, os

flavonóides rutina e naringina promoveram uma proteção aos hepatócitos quando

administrados na concentração de 10mg/Kg.

Tabela 19 - Valores médios de aspartato aminotransferase - AST (± desvio padrão) do

líquido ascítico de camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com diferentes

flavonóides por 18 dias.

Tratamentos

AST (U/ml)

18 dias

Ração + Animal com câncer (G2)

236,00 ± 60,52 a

Ração + Rutina (G3)

31,67 ± 32,35 b

Ração + Naringina (G4)

109,00 ± 101,53 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

284,25 ± 68,28 a

Ração + Neotaxel (G6)

265,20 ± 38,05 a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

Na tabela 20 encontram-se registrados os valores médios de alanina amino

transaminase (também chamada de ALT ou GPT ou TGP), no liquido ascítico de

camundongos, tratados durante 18 dias com diferentes flavonóides.

Tabela 20 - Valores médios de Alanina aminotransferase – ALT (± desvio

padrão) do líquido ascítico de camundongos com tumor ascítico de Ehrlich tratados com

diferentes flavonóides por 18 dias

Tratamentos

ALT (U/ml)

18 dias

Ração + Animal com câncer (G2)

21,25 ± 4,43 d

Ração + Rutina (G3)

71,67 ± 22,05 a

Ração + Naringina (G4)

33,75 ± 10,24 bc

Ração + Rutina + Naringina (G5)

66,60 ± 40,07 ab

Ração + Neotaxel (G6)

25,00 ± 4,69 cd

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos observou-se que o grupo de animais tratado

com o flavonóide rutina (G3) obteve o mais alto valor na atividade enzimática de (ALT)

e esse valor foi estatisticamente significativo quando comparado ao grupo de animais

com câncer (G2). Resultado semelhante pode ser observado no grupo (G5).

A atividade da ALT encontra-se elevada na presença de danos hepáticos. Sendo

assim os tratamentos dos grupos G3 e G5 podem ter desencadeado lesões aos

hepatócitos as quais, não foram confirmadas por análises histológicas.

Quando comparamos o grupo (G2), com o grupo tratado com o quimioterápico

Neotaxel

, (G6) observamos que não ocorreram variações estatisticamente

significativas em valores de atividade enzimática de (ALT) entre os grupos.

Na tabela 21 encontram-se registrados os valores médios da concentração de

Albumina (g/dl), no líquido ascítico de camundongos, tratados durante 18 dias com

diferentes flavonóides.

Tabela 21 - Valores médios de albumina (± desvio padrão) no liquido ascítico de

camundongos com tratados com diferentes flavonóides por 18 dias.

Tratamentos

Albumina (g/dl)

18 dias

Ração + Animal com câncer (G2)

2,73 ± 0,25 ab

Ração + Rutina (G3)

2,75 ± 0,33 ab

Ração + Naringina (G4)

2,79 ± 0,14 a

Ração + Rutina + Naringina (G5)

2,64 ± 0,11 b

Ração + Neotaxel (G6)

2,59 ± 0,18 b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados bioquímicos, demonstrados na tabela 21, observou-

se que os grupos (G4), (G5) e (G6) apresentaram valores em concentração de albumina

semelhantes ao grupo de animais com câncer (G2) e esses resultados não foram

estatisticamente significativos. Isso indica que a capacidade de transporte da albumina

não foi alterada na presença dos flavonóides testados.

Na tabela 22 encontram-se registrados os valores referentes a contagem de

células tumorais vivas presentes no líquido ascítico dos grupos submetidos a diferentes

tratamentos.

De acordo com os resultados obtidos, o número de células vivas tumorais

presentes no líquido ascítico dos camundongos apresentou uma redução,

estatisticamente significativa em todos os grupos, quando comparados ao grupo (G2). É

importante ressaltar que, os diferentes tratamentos reduziram o número de células

tumorais vivas em aproximadamente 40.000.000 milhões de células.

Tabela 22 - Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE. Número de células tumorais

viáveis presentes no líquido ascítico dos camundongos

Tratamento Células tumorais viáveis (N x 10

)

Ração + Animal com câncer (G2)

9,23 ± 1,37 a

Ração + Rutina (G3)

4,56 ± 1,60 b

Ração + Naringina (G4)

4,99 ± 0,56 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

4,93 ± 1,41 b

Ração + Neotaxel

(G6)

4,88 ± 0,13 b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

Como podemos observar na tabela acima, os flavonóides e a associação de

flavonóides apresentaram resultados estatisticamente semelhantes ao grupo (G6). Esses

mesmos resultados podem ser melhor visualizados no gráfico 7.

Gráfico 7- Número de células tumorais vivas do tumor ascitico de Ehrlich

em camundongos tratamentos com diferentes flavonóides.

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

rutina medicamento rutina + naringina naringina controle

tratamentos

Células viva

b b b b

Gupta, (2004) avaliaram a atividade anti-tumoral de uma planta da Índia,

Cesalpinia bonducella, que possui associação de flavonóides, terpenos, saponinas e

alcalóides. Camundongos com TAE foram tratados por 14 dias com dosagens diferentes

do extrato metanólico dessa planta. Ao avaliar o número de células viáveis presentes no

líquido ascítico dos camundongos com Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE) e tratados

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

com o extrato da planta, os pesquisadores encontraram reduções significativas (p<0,01)

no número de células tumorais viáveis nos animais dos grupos tratados com 50 e

200mg/kg do extrato quando comparado com os animais do grupo com TAE não

tratados.

Os resultados encontrados por Gupta et al (2004) estão de acordo com resultados

encontrados esse estudo, onde também foram observadas reduções significativas

(p<0,05) no número de células tumorais viáveis quando os camundongos com TAE

foram tratados com 10mg/kg dos flavonóides rutina, naringina e rutina + naringina.

Na tabela 23 encontram-se registrados os valores referentes a contagem de

células tumorais mortas presentes no líquido ascítico dos grupos submetidos a

diferentes tratamentos.

Tabela 23 - Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE. Número de células tumorais

mortas ± desvio padrão presentes no líquido ascítico dos camundongos.

Tratamento Células tumorais mortas (N x 10

)

Ração + Animal com câncer (G2)

0,11 ±0,12 b

Ração + Rutina (G3)

1,18 ±0,46 a

Ração + Naringina (G4)

0,27 ± 0,06 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

0,34 ± 0,16 b

Ração + Neotaxel

(G6)

0,78 ± 0,16 a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos o grupo tratado com o flavonóide Rutina

(G3) apresentou um aumento no número de células tumorais mortas 10 vezes maior do

que o grupo controle (G2). Como podemos observar também, o grupo (G3) apresentou

resultados semelhantes ao grupo (G6) comprovando assim, a eficácia desse tratamento

no aumento do número de células tumorais mortas presentes no líquido ascítico.

Quando Gupta et al, (2004) avaliaram o número de células tumorais mortas

presentes no líquido ascítico dos camundongos com TAE e tratados com diferentes

dosagens do extrato da planta (Cesalpinia bonducella), eles observaram que os animais

do grupo tratados com 50mg/kg tiveram um aumento significativo (p<0,01) de 96% no

número de células mortas. Os animais dos grupos tratados com 100 e 200mg/kg tiveram

um aumento significativo (p<0,01) de 162% e 343% respectivamente, quando

comparados com os animais do grupo com TAE não tratados.

Os resultados de Gupta (2004) estão de acordo com os resultados encontrados

nesse trabalho. Ao avaliar o número de células tumorais mortas contidas no líquido

ascítico dos camundongos com TAE tratados como o flavonóide rutina, encontrou-se

um aumento significativo (p<0,05) no número de células tumorais mortas quando

comparado aos animais do grupo com TAE não tratados.

Esses resultados podem ser melhor visualizados no gráfico 8.

Gráfico 8- Células tumorais mortas do tumor ascítico de Ehrlich

em camundongos submetidos a diferentes tratamentos

0,0E+00

2,0E+06

4,0E+06

6,0E+06

8,0E+06

1,0E+07

1,2E+07

1,4E+07

Tratamentos

Células mortas

rutina medicamento R + N naringina controle

a a b b b

A contagem do número de células tumorais totais, presentes no líquido ascítico

dos animais submetidos a 18 dias de tratamento encontram-se registrados na tabela 24.

Tabela 24 - Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE. Número de células tumorais

totais presentes no líquido ascítico dos camundongos.

Tratamento Células tumorais totais (N x 10

)

Ração + Animal com câncer (G2)

9,33 ±1,24 a

Ração + Rutina (G3)

5,73 ±1,22 b

Ração + Naringina (G4)

5,26 ± 0,60 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

5,28 ± 1,57 b

Ração + Neotaxel

(G6)

5,66 ± 0,28 b

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t

de Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos, os grupos (G3), (G4), (G5) e (G6)

apresentaram valores estatisticamente significativos menores no número de células

tumorais totais, quando comparados ao grupo controle (G2). Lembrando sempre, que

essa redução no número de células tumorais abrange a casa dos milhões.

Matsuzaki et al (2003) realizaram um estudo para avaliar o efeito do Ginseng

brasileiro (planta rica em flavonóides) em camundongos com TAE e observaram que

quando os animais foram tratados com 200mg/kg do extrato por 20 dias, ocorreu uma

redução de 30% no número de células tumorais totais presentes no líquido ascítico dos

animais. Sendo assim, os resultados encontrados por Matsuzaki estão em concordância

com os resultados encontrados nesse trabalho.

É importante observar também, que os grupos (G3), (G4) e (G5) não diferem

estatisticamente do resultado obtido quando os animais foram tratados com o

quimioterápico Neotaxel

(G6). Esses resultados são semelhantes aos encontrados por

Rusak (2005), onde ele afirmou que os flavonóides inibem de forma significativa o

crescimento de linhagens de HL-60 (célula humana leucêmica) e sua eficácia

antiproliferativa foi equivalente ou um pouco maior que os agentes anticarcinogênicos

tradicionais como doxorrubicina, vincristina e metotrexato.

Esses resultados podem ser melhor visualizados no gráfico 9.

Gráfico 9 - Número de células tumorais do tumor ascítico de

Ehrlich em camundon

os tratados com diferentes flavonóides

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

Tratamentos

Células totais

narin

ina R + N medicamento rutina controle

b b b b a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

As porcentagens de viabilidade celular no líquido ascítico de camundongos,

submetidos a diferentes tratamento, encontram-se registradas na tabela 25.

Tabela 25 - Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE. Viabilidade celular ± desvio

padrão no líquido ascítico dos camundongos.

Tratamento Viabilidade celular (%)

Ração + Animal com câncer (G2)

98,67 ±1,62 a

Ração + Rutina (G3)

77,80 ±12,3 c

Ração + Naringina (G4)

94,93 ±0,85 b

Ração + Rutina + Naringina (G5)

93,73 ±1,07 b

Ração + Neotaxel

(G6)

86,37 ±2,03 bc

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos, todos os tratamentos reduziram a

viabilidade celular das células tumorais em valores estatisticamente significativos

quando comparado ao grupo (G2).

Observou-se que o flavonóide rutina (G3) apresentou uma maior eficácia na

redução da viabilidade celular tumoral, efeitos esses similares aos produzidos pelo

quimioterápico Neotaxel

®.

Esses resultados, podem ser melhor visualizados no

gráfico10.

Gráfico 10 - Viabilidade celular do tumor ascítico de Ehrlich em

camundongos submetidos a diferentes tratamentos

100

Tratamentos

Viabilidade Celular (%)

Rutina medicamento R + N naringina Controle

c bc b b a

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

Os flavonóides possuem uma dupla ação quimioprotetora no câncer, eles

suprimem o crescimento tanto das células tumorais quanto das células endoteliais

(O´PREY, 2003). Luteolina, genistéina, apigenina, quercetina e fisitina inibem culturas

de células tumorais e endoteliais em concentrações similares. (GOSSLAU, 2004). Tem

sido sugerido que flavones, 3,4-diidroxiflavone, reservatrol e luteolina são alguns dos

mais potentes polifenóis anti-endoteliais que suprimem a proliferação celular (CAO,

2002).

Os valores referentes ao volume do líquido ascítico encontram-se registrados na

tabela 26.

Tabela 26 - Efeito dos flavonóides no tratamento do TAE. Volume do líquido ascítico

dos camundongos.

Tratamento Volume do liquido ascítico (mL)

Ração + Animal com câncer (G2)

17,00 ± 1,91 c

Ração + Rutina (G3)

19,10 ± 1,15 bc

Ração + Naringina (G4)

26,30 ± 2,69 a

Ração + Rutina + Naringina (G5)

24,00 ± 2,65 a

Ração + Neotaxel

(G6)

22,33 ± 2,89 ab

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com os resultados obtidos na tabela 26 observou-se que os grupos

(G4), (G5) e (G6) apresentaram valores aumentados em volume de líquido ascítico e

esses foram estatisticamente significativos quando comparados aos grupos (G2).

Gupta et al (2004) avaliaram o volume do líquido ascítico presente na cavidade

abdominal dos camundongos com TAE e tratados com diferentes dosagens do extrato

da planta Cesalpinia bonducella. Eles observaram que independente das concentrações

do extrato da planta, houve uma redução significativa (p<0,01) no volume desse líquido

comparado ao grupo de animais com TAE que não receberam tratamento. Os dados

encontrados nesse trabalho não estão de acordo com os resultados obtidos por esses

pesquisadores. Nesse estudo observamos um aumento no volume do líquido ascítico dos

camundongos tratados com os flavonóides naringina e rutina + naringina e estes

resultados foram estatisticamente significativos (p<0,05) quando comparado ao grupo

de animais com TAE não tratados.

Matsuzaki et al (2003) realizaram um estudo para avaliar o efeito do Ginseng

brasileiro em camundongos com TAE e observaram que quando os camundongos com

TAE foram tratados com 200mg/kg do extrato por 20 dias, observou-se uma redução no

volume do líquido ascítico (p<0,05) desses animais, quando comparado ao grupo de

animais com TAE não tratados. Sendo assim, o resultado encontrado por estes

pesquisadores também não estão em concordância com os resultados encontrados nesse

trabalho.

O grupo (G3) quando comparados ao grupo (G2), não apresentou variações

significativas em volume de liquido ascítico. Esses resultados podem ser melhor

visualizados no gráfico11.

Gráfico 11 - Volume do líquido ascítico em camundon

submetidos a diferentes tratamentos

Tratamentos

Volume (mL)

Controle rutina medicamento R + N naringina

cbcabaa

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

Os resultados da mortalidade dos camundongos com câncer induzidos e tratados

com flavonóides durante 18 dias encontram-se registrados no gráfico 12.

Observou que os grupos tratados com os diferentes flavonóide obtiveram

resultados melhores sobre a sobrevida dos animais quando comparado ao grupo

controle. O grupo composto pela associação de flavonóides obteve o melhor resultado

em sobrevida animal quando comparado aos demais tratamentos.

De acordo com os resultados obtidos o grupo controle com câncer não tratado

teve 80% de mortalidade dos animais aos 20 dias de experimentação. O grupo de

animais tratado com medicamento alcançou 80% de mortalidade aos 24 dias. Já o grupo

tratado com rutina foi aos 21 dias e com naringina aos 23 dias.

Frequência de mortalidade

-20

100

120

5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627

Dias

porcent age

Série1 Série2 Série3 Série4 Série5

Em cada coluna, médias seguidas de pelo menos uma letra minúscula, não diferem entre si pelo teste t de

Student (P>0,05).

De acordo com Gupta et al (2004), ao avaliar a percentagem do aumento de vida

de camundongos com TAE tratados por 14 dias com diferentes concentrações do extrato

da planta Cesalpinia bonducella, eles observaram que houve um aumento do tempo de

vida de 24,44%, 58,88% e 87,22% quando os animais foram tratados com 50, 100 e

200mg/kg do extrato, respectivamente.

Nesse trabalho testaram-se os flavonóides rutina e naringina isoladamente na

concentração de 10mg/kg administrados oralmente por 18 dias, como forma de

tratamento, e foi observado um aumento de 8,8% no tempo de vida dos animais tratados

com o flavonóide rutina em comparação com o tempo de vida dos animais com TAE

que não receberam tratamento. Quando os animais foram tratados com a naringina,

houve um aumento do tempo de vida em 11,7%. Os resultados obtidos nesse

experimento estão em concordância com os resultados publicados por Gupta dessa

Controle Medicamento Rutina Naringina R+N

Gráfico 12 – Freqüência de mortalidade de camundongos com TAE

tratados com diferentes flavonóides

forma, podemos afirmar que os flavonóides testados aumentam o tempo de vida dos

animais com TAE.

Quando Gupta et al (2004) injetaram diariamente 20mg/kg, intraperitonealmente

do medicamento 5-fluorouracil (quimioterápico), obtiveram um aumento de 119,49%

no tempo de vida dos camundongos em comparação com o grupo de animais com TAE

não tratados. O fármaco utilizado em nosso trabalho foi o Neotaxel

administrado em

uma única dosagem intravenosa 24 horas após a indução do câncer na concentração de

100mg

. Observou-se que ocorreu uma redução de 9% no tempo de vida dos animais.

A análise do tempo de vida dos animais também foi realizada através de cálculos

de MST (Tempo médio de sobrevida dos animais) e de %ILS (percentagem de aumento

do tempo de sobrevida). Esses resultados podem ser visualizados na tabela 27.

Tabela 27 – Atividade dos flavonóides e tempo de vida de camundongos com

TAE

Tratamentos Variação do

tempo de vida

MST (d)

ILS (%)

T/C (%)

Eficácia

Ração 10 -24 17,0 ------ ------

Ração + Neotaxel® 7-24 15,5 -8,8 91,1 -

Ração + rutina 13-24 18,5 8,8 108,8 -

Ração + naringina 14-24 19,0 11,7 111,7 -

Ração + rutina +

naringina

14-27 20,5 20,5 120,5 -

a) MST=(1

dia de morte + ultimo dia de morte)/2; b) ILS% = (MST grupo tratado /MST grupo controle)-

1 x 100; c) T/C % = (MST grupo tratado /MST grupo controle) x 100

Ao analisar esses resultados observou-se que nenhuma das substâncias testadas

possuiu uma atividade antitumoral significativa de acordo com o critério de NCI citado

por ORSOLIC (2005). Pois segundo esse critério, e a MTS dos grupos tratados dividido

pela média do tempo de sobrevida do grupo controle exceder 125% e ILS exceder 25%,

é um indicativo que a droga testada possui uma atividade antitumoral significativa.

5.3.MORFOLOGIA HEPÁTICA

O fígado é a maior glândula do corpo humano, localizado no quadrante superior

do abdômen, é composto por quatro lóbulos separados de tecido conjuntivo, que

sustentam vasos sangüíneos e condutos biliares com disposição arboriforme e uma

grande massa de células parenquimatosas que se dispõem ao longo dos ramos mais

finos da árvore vascular formando placas contínuas de células (CONTRAN, 2000).

A unidade estrutural clássica do fígado é o lóbulo hepático descrito com um

prisma hexagonal de tecido, com diâmetro aproximado de 0.7 x 2 mm, contendo células

parenquimatosas anastomosadas e um labirinto sistêmico de sinusóides. A massa de

células parenquimatosas corresponde a 60% do peso do fígado. As paredes dos

sinusóides são constituídas de células endoteliais e células integrantes do sistema

retículo-endotelial, chamadas células de Kupffer, dotadas de funções imunológicas,

hematopoiéticas e fagocitárias (WEISS, 1977).

O lóbulo hepático é composto por uma veia central eferente, tributária da veia

hepática para a qual convergem radialmente sinusóides, oriundos das subdivisões de

ramos da veia porta e artéria hepática, presentes nos espaços portais periféricos. Vasos

sanguíneos eferentes e ductos biliares encontram-se distribuídos a longo das

extremidades do poliedro. Todas as funções bioquímicas do fígado são efetuadas pelas

células epiteliais parenquimatosas do fígado, os hepatócitos, e são dependentes de

relações complexas entre sistema vascular e o sistema de drenagem da bile (STEVENS,

2001).

O fígado funciona com uma glândula endócrina e exócrina. O sistema excretor

inicia-se no interior do lóbulo, em espaços tubulares finos que resultam de sulcos

opostos nas faces de contato de hepatócitos contíguos. Esses canalículos biliares não

têm paredes próprias, anastomosam-se ricamente, formando um retículo que envolve as

células hepáticas e drenam em dutos biliares terminais de paredes finas, localizados na

periferia do lóbulo denominados colangíolos ou canais de Hering. Os colangíolos, por

sua vez, são tributários dos dutos biliares mais calibrosos nos espaços portais

interlobulares. A bile secretada pelo fígado é responsável pela emulsificação das

gorduras no duodeno (STEVENS, 2001). O fígado também sintetiza muitas substâncias

em resposta às demandas do corpo como albumina, colesterol e glicogênio, além de

metabolizar drogas participando assim, do mecanismo de detoxificação do organismo

(WEISS,1977).

Essencial para a vida, o fígado junto com outros órgãos participa da homeostase

metabólica normal, isso inclui o processamento dos aminoácidos, carboidratos, lipídios

e vitaminas alimentares; síntese de proteínas séricas, desintoxicação e excreção na bile

de resíduos endógenos e xenobióticos poluentes (COTRAN, 2000). Com grande poder

de regeneração, os hepatócitos do rato apresentam vida média que varia entre 191 a 453

dias.

5.4. MODIFICAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS ENCONTRADAS

Nesse trabalho foram analisados cortes de tecidos hepáticos de três animais de

cada grupo, escolhidos ao acaso, com objetivo de avaliar possíveis alterações no tecido

causado pelo TAE e/ou pelos diferentes flavonóides testados.

A morfologia hepática pertencente aos animais do grupo tratado apenas com

ração e não submetidos à indução do TAE encontra-se representada na figura 11.

Como podemos observar na figura 11 os núcleos dos hepatócitos são grandes,

esféricos e centrais. Muitas células são binucleadas, sendo que os núcleos

frequentemente são poliplóides. Podemos observar também, a presença de espaços

sinusóide ao longo do tecido hepático.

A morfologia hepática pertencente aos animais do grupo tratado apenas com

ração e submetidos à indução do TAE encontra-se representada na figura 12.

Ao analisar o corte de tecido hepático dos animais com TAE que receberam

somente ração observou-se uma grande adesão das células do TAE na cápsula hepática.

Os núcleos hepáticos encontram-se dilatados e um grande número de hemácias pode ser

observado no interior dos espaços sinusóides quando, comparamos o tecido

representado na figura 12 com o tecido da figura 11.

A morfologia hepática pertencente aos animais com TAE tratados com o

flavonóide naringina por 18 dias encontra-se representada na figura 13.

O fígado dos animais com TAE tratados com o flavonóide naringina na

concentração de 10mg/Kg por 18 dias apresentou aparentemente uma redução na

quantidade de células tumorais aderidas (linha branca) quando comparado ao grupo com

TAE não tratado, porém observou-se que essa adesão foi aparentemente maior ao

comparar com o grupo de animais com TAE tratados com o medicamento Neotaxel

Outro fato observado foi a formação de angiogênese (seta azul) pelas células

tumorais, mas não foi observado a presença de hemácias nos espaços sinusóides (setas

pretas) que encontram-se dilatados.

Como podemos observar, o flavonóide naringina não causou alterações

histopatológica aos tecidos hepáticos analisados, consequentemente o flavonóide

testado não demonstrou ser tóxico às células do tecido na concentração de 10mg/Kg por

18 dias.

A morfologia hepática pertencente aos animais com TAE tratados com a

associação dos flavonóides rutina + naringina por 18 dias encontra-se representada na

figura 14.

Os animais com TAE tratados com a associação dos flavonóides rutina +

naringina apresentaram aparentemente em análise histopatológica do fígado uma menor

adesão (linha branca) das células do TAE na cápsula hepática quando comparado aos

animais que não receberam tratamento. Porém, essa adesão foi aparentemente maior que

nos animais dos grupos tratados com medicamento Neotaxel

e com o flavonóide

rutina. Foi possível observar também, a presença de hemácias (seta azul) no interior dos

espaços sinusóides como também, a formação de angiogênese pelas células do tumor

ascítico de Ehrlich.

Como podemos observar, a associação dos flavonóides rutina + naringina não

causou alterações histopatológica aos tecidos hepáticos analisados, consequentemente a

associação testada não demonstrou ser tóxica às células do tecido na concentração de

10mg/Kg por 18 dias

A morfologia hepática pertencente aos animais com TAE tratados com o

medicamento Neotaxel

encontra-se representada na figura 15.

O fígado dos animais com TAE que receberam uma dosagem única do

quimioterápico Neotaxel

, por via intravenosa, apresentou aparentemente em análise

histopatológica uma pequena adesão das células do TAE na cápsula hepática como pode

ser verificado na figura 15. Além disso, pode-se observar a presença de angiogênese

formada pelas células do TAE. Os espaços sinusóides apresentaram pequenas variações

ao comparar com os animais com TAE não tratados.

Como podemos observar o medicamento Neotaxel

não causou alterações

histopatológica aos tecidos hepáticos analisados, consequentemente o medicamento

testado não demonstrou ser tóxico às células do tecido na concentração de 100mg/m

em dosagem única. Informações essas, de não toxicidade hepática relatadas na bula do

medicamento.

A morfologia hepática pertencente aos animais com TAE tratados com o

flavonóide rutina por 18 dias encontra-se representada na figura 16.

Ao analisar o corte de tecido hepático dos animais com TAE tratados com o

flavonóide rutina observou-se que o tratamento apresentou aparentemente uma maior

eficácia na redução da adesão das células do TAE à cápsula hepática. Porém, um grande

número de hemácias pode ser observado no interior dos sinusóides hepáticos.

Como podemos observar, o flavonóide rutina não causou alterações

histopatológica aos tecidos hepáticos analisados, consequentemente o flavonóide

testado não demonstrou ser tóxico às células do tecido na concentração de 10mg/Kg por

18 dias.

Figura 11 - Corte de tecido hepático de

animal normal que recebeu ração, onde

são observados hepatócitos (seta

amarela) e espaço sinusóide (seta preta).

Figura 12 - Corte de tecido hepático de

animal com TAE que recebeu ração,

onde são observados hepatócitos (seta

amarela), espaço sinusóide (seta preta) e

adesão de células tumorais (linha

branca).

Figura 16 - Corte de tecido hepático de

animal com TAE que recebeu o flavonóide

rutina, onde são observadas hemácias (seta

verde) e adesão de células tumorais (linha

ranca

)

Figura 15 - Corte de tecido hepático de

animal com TAE que recebeu o

medicamento Neotaxel

, onde são

observados hepatócitos (seta amarela),

espaço sinusóide (seta preta) e adesão de

células tumorais (linha branca).

Figura 14 - Corte de tecido hepático de

animal com TAE que recebeu a associação

dos flavonóide rutina + naringina, onde são

observadas, hemácias (seta verde) e adesão

de células tumorais (linha branca).

Figura 13 - Corte de tecido hepático de

animal com TAE que recebeu o flavonóide

naringina, onde são observados, espaço

sinusóide (seta preta) e adesão de células

tumorais (linha branca).

6. CONCLUSÕES

6.1. Conclusões do experimento de prevenção

¾ O flavonóide naringina reduziu os valores médios de proteínas totais (g/dl) no

soro sangüíneo dos animais.

¾ Os flavonóides rutina e naringina reduziram a atividade de alanina

aminotransferase (ALT) no soro sangüíneo dos animais

¾ O flavonóide naringina reduziu os valores médios de albumina (g/dl) no soro

sangüíneo dos animais

¾ Com relação a viabilidade celular das células tumorais de Ehrlich observou-se

uma redução significativa no tratamento utilizando o flavonóide rutina.

¾ O tratamento preventivo com a associação de flavonóides (rutina + naringina)

demonstrou atividade anti-tumoral significativa de acordo com os critérios de

NCI.

6.2. Conclusões do experimento de tratamento

¾ Os animais com TAE tratados com o flavonóide rutina e os animais tratados

com o flavonóide naringina apresentaram um aumento nos valores médios de

proteínas totais (g/dl) no soro sangüíneo.

¾ Os animais com TAE tratados com o flavonóide rutina e com a associação

(rutina + naringina) aumentaram a atividade de aspartato amino transferase

(AST) no soro sangüíneo

¾ A associação de flavonóides (rutina + naringina) reduziu a atividade de alanina

aminotransferase (ALT) no soro sangüíneo dos animais

¾ Os tratamentos efetuados com o flavonóide naringina e associação dos

flavonóides (rutina + naringina) reduziram os níveis de albumina no soro

sangüíneo dos animais

¾ Com relação a viabilidade celular das células tumorais todos os tratamentos

efetuados com os flavonóides apresentaram redução em comparação aos animais

controle.

¾ Observou-se que o flavonóide rutina apresentou valores semelhantes na redução

da viabilidade celular ao do medicamento Neotaxel

¾ É importante ressaltar, que os melhores resultados na redução da viabilidade

celular foram obtidos durante os experimentos de tratamento.

7. PERSPECTIVAS FUTURAS

¾ Pela grande facilidade de transplantação, padronização e crescimento rápido do

TAE este modelo favorece o estudo de associações de flavonóides como

quimioterápicos.

¾ Avaliar a presença de marcadores tumorais no soro sangüíneo dos animais

tratados com diferentes flavonóides.

¾ Atuação dos flavonóides sobre a forma sólida do tumor de Ehrlich que

possibilite uma avaliação experimental por um tempo maior.

¾ Estudos in vitro que possibilitem avaliar quais os mecanismos de atuação dos

flavonóides na redução da viabilidade celular.

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