( PDF ) Papel do fator de transcrição NFAT1 na regulação da resposta alérgica asmática

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Dissertação de Mestrado

BRUNA DE PAULA FONSECA E FONSECA

PAPEL DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO NFAT1

NA REGULAÇÃO DA RESPOSTA ALÉRGICA

ASMÁTICA

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2006

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PAPEL DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO NFAT1 NA

REGULAÇÃO DA RESPOSTA ALÉRGICA ASMÁTICA

BRUNA DE PAULA FONSECA E FONSECA

Dissertação de mestrado

apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Ciências

Biológicas (Biofísica), Instituto

de Biofísica Carlos Chagas

Filho da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre

em Ciências Biológicas

(Biofísica).

Orientador: Dr. João Paulo de Biaso Viola

Rio de Janeiro

Agosto

2006

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III

FONSECA, Bruna de Paula Fonseca e

Papel do fator de transcrição NFAT1 na

regulação da resposta alérgica asmática / Bruna

de Paula Fonseca e Fonseca. - Rio de Janeiro:

UFRJ/ IBCCF, 2006.

xiv, 116f.: il.; 1,5cm.

Orientador: João Paulo de Biaso Viola.

Dissertação (mestrado) – UFRJ/ IBCCF/

Programa de Pós-graduação em Ciências

Biológicas, 2006.

Referências Bibliográficas: f. 70-86.

1. Alergia 2. Asma 3. Resposta Imune 4.

Broncoconstrição 5. NFAT. I. Viola, João Paulo de

Biaso. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III.

Papel do fator de transcrição NFAT1 na regulação

da resposta alérgica asmática.

Este trabalho foi realizado na Divisão de Biologia

Celular da Coordenação de Pesquisa (CPQ) no

Instituto Nacional de Câncer (INCA), sob

orientação do Dr. João Paulo de Biaso Viola. Este

projeto foi financiado pelo CNPq, INCA/FAF e

Furnas Centrais Elétricas S.A.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Dr. João Viola, por ter acreditado no meu trabalho, por ter

me ensinado o que realmente é ciência e por passar pra mim um pouco da

paixão que você tem por ela. Obrigada pela paciência e placidez de sempre

que eu um dia ainda aprendo a ter!

Ao Dr. Marco Aurélio Martins, pelas grandes idéias tão importantes nas

discussões sobre o trabalho, pelo apoio e estímulo durante o tempo em que

estive em seu laboratório.

Aos meus pais, Kátia e Marcus, por simplesmente serem quem vocês são:

meus exemplos de vida. Obrigada por ajudarem nos meus caminhos, nas

minhas escolhas, pelos risos e choros juntos, pelo amor e apoio incondicional.

Ao meu irmão Diego, pelo grande amigo que você é, pelo amor e carinho de

sempre. Eu não poderia querer alguém melhor pra dividir meus pensamentos,

minhas aflições, minha vida. Essa tese é também um pouco sua, pra variar os

créditos das figuras são todos seus!!!

Às minhas irmãs Monique e Michele, por serem as melhores amigas que uma

irmã pode querer! Que bom que a vida nos trouxe mais pra perto uma da outra,

obrigada por estarem sempre torcendo por mim!

Aos meus avós, Affonso e Geisa, por serem mais que avós, por serem meus

amigos! Obrigada pelos conselhos, pela ajuda de sempre, pelo carinho e pelo

colo de Vô e Vó que eu tanto amo!

Ao André, meu gordinho, pelo amor, carinho, incentivo, paciência e por me

mostrar um jeito diferente de viver a vida. Você é mesmo tudo que eu sempre

quis...

Aos meus amigos de bancada que fazem o trabalho e a vida ficar no mínimo

mais divertida! Bianca, que nos últimos tempos acabou virando minha

conselheira oficial, obrigada por estar sempre pronta pra me ajudar em

qualquer circunstância! Margot, obrigada pela ajuda nos tempos difíceis e pela

ótima companhia nas nossas noitadas!! Bruno, que se tornou um grande

amigo, obrigada pelas conversas profundas sobre ciência ou sobre a vida e

pela encheção de saco, claro!! Giu, figurinha rara, obrigada pelos papos e por

essa alegria que você me passa a cada dia! Queridos, vocês moram no meu

coração!!

A todo o pessoal do laboratório: Lílian, Nina, André, Natália, Maria Theresa e

Cristiane. Obrigada pela ajuda na bancada e na vida!

À Erika, Priscilla e todo pessoal do laboratório de Inflamação, na Fiocruz.

Meninas, obrigada pela grande ajuda nos experimentos finais da tese!!

À Amanda, Teresa e Michele, minhas grandes amigas. Longe ou perto, sempre

arranjamos um jeito de estarmos juntas! Obrigada pela ajuda e pelos

conselhos, essa tese, assim como eu, não seria a mesma sem vocês!

Às amigas de sempre, Verônica, Maria Clara e Elisa, nossa amizade é o maior

presente que eu tenho! Obrigada pelo apoio, pela cumplicidade, vocês são

minhas eternas amiguetes!

Aos amigos da geração de ouro da Biologia, Bruno, Patrícia, Maurício Mala,

Paulinha e Layla. Obrigada por dividir as alegrias, tristezas, pela torcida pelo

sucesso de cada um de nós, pelo que eu aprendi e aprendo com vocês, a

Biologia me deu muitos mais que simples amigos...

À minha Dinda, Cintia, que é mesmo uma fada-madrinha! Obrigada pelo apoio,

pela ajuda (mesmo quando eu reluto em aceitar) pelo amor e incentivo que

você me dá, de perto ou de longe.

Aos meus tios dindos Alexandre e Gláucia, pelo carinho de sempre, por

tornarem nossa família tão especial. Obrigada por estarem sempre por perto,

torcendo por mim.

VII

A minha prima Michele, que é a minha melhor amiga por telepatia. Obrigada

por ser minha irmãzinha, pelos papos e conselhos mesmo a alguns quilômetros

de distância, minhas saudades são eternas.

Aos meus priminhos (sempre pequenos!!!), Natasha, Lara, Pedro e Júlia pela

amizade e amor que vocês me transmitem de perto ou de longe.

VIII

RESUMO

PAPEL DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO NFAT1 NA REGULAÇÃO DA

RESPOSTA ALÉRGICA ASMÁTICA

Bruna de Paula Fonseca e Fonseca

Orientador: João Paulo de Biaso Viola

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de pós

graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas (Biofísica).

Apesar da hiper-reatividade brônquica ser uma característica marcante da

asma, os mecanismos moleculares que a determinam ainda não estão

completamente estabelecidos. Os principais receptores envolvidos no processo

de broncoconstrição são os receptores muscarínicos. Esses receptores são

ativados por acetilcolina e geram um influxo de Ca

intracelular que ativa os

fatores de transcrição da família NFAT. Animais deficientes para NFAT1

(NFAT1-/-) diferenciam-se preferencialmente para um fenótipo Th2 e

apresentam uma resposta alérgica pleural exacerbada quando comparados

aos animais NFAT1+/+. Para estudar o papel do NFAT1 na patologia da asma

alérgica e sua influência na hiper-reatividade brônquica, submetemos

camundongos NFAT1+/+ e NFAT1-/- a um modelo experimental de asma.

Nestas condições, os camundongos NFAT1-/- apresentaram resposta

inflamatória eosinofílica exacerbada, altos níveis de IgE sérica, níveis

aumentados de eotaxina, intenso infiltrado inflamatório e maior deposição de

fibras colágenas no tecido pulmonar quando comparados com os animais

NFAT1+/+. Apesar disso, a provocação alergênica nos camundongos NFAT1-/-

, ao contrário do observado nos camundongos selvagens, não produziu hiper-

reatividade, já que os camundongos NFAT1-/- foram claramente refratários ao

broncoespasmo induzido pelo aerosol de metacolina. Experimentos com

camundongos “naive” demonstraram que essa inibição ocorre de maneira

intrínseca e independente do processo de sensibilização. Além disso, essa

inibição é específica para a via colinérgica, já que camundongos NFAT1-/-

expostos a serotonina apresentaram taxas de hiper-reatividade claramente

maiores comparadas às dos camundongos NFAT1+/+. Esses resultados, em

conjunto, mostram que o NFAT1 é extremamente importante na regulação da

resposta alérgica asmática e essencial para a broncoconstrição induzida

especificamente pela via colinérgica.

Palavras-chave: 1. Alergia 2. Asma 3. Resposta Imune 4. Broncoconstrição 5.

NFAT

Rio de Janeiro

Agosto, 2006

ABSTRACT

ROLE OF NFAT1 TRANSCRIPTION FACTOR IN THE REGULATION OF

ASTHMATIC ALLERGIC RESPONSES.

Bruna de Paula Fonseca e Fonseca

Orientador: João Paulo de Biaso Viola

Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de pós

graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas (Biofísica).

Despite being a marked feature of asthma, the molecular mechanisms that

determine bronchial hyperreactivity are not completely established. The main

receptors involved in the bronchoconstriction process are the muscarinic

receptors. These receptors are activated by acetylcholine and generate a

calcium influx that activates the NFAT family of transcription factors. NFAT1-

deficient mice (NFAT1-/-) preferentially differentiate towards a Th2 phenotype

and present an increased pleural allergic response when compared with

NFAT1+/+ mice. In order to study the role of NFAT1 in the pathology of allergic

asthma and its influence in bronchial hyperrreactivity, we took advantage of an

experimental model of asthma. Under these conditions, NFAT1-/- mice

presented an exacerbated inflammatory eosinophilic response, high levels of

serum IgE, high levels of eotaxin, intense inflammatory infiltrate and increased

deposition of collagen fibers in the lung tissue when compared to NFAT1+/+

mice. Despite all that, allergenic provocation in NFAT1-/- mice, in opposition to

that observed in wild-type mice, did not produce hyperreactivity, once NFAT1-/-

mice were clearly refractory to the bronchospasm induced by methacholine

aerosol. Experiments with naïve mice demonstrated that this inhibition occurs in

an intrinsic way that is independent of the sensitization process. Besides, this

inhibition seems to be specific for the cholinergic pathway, once NFAT1-/- mice

exposed to serotonin presented markedly increased hyperreactivity rates when

compared to NFAT1+/+ mice. These results altogether show that NFAT1 is

extremely important to the regulation of the asthmatic response and essential to

the bronchoconstriction specifically induced by the cholinergic pathway.

Key-words: 1. Allergy 2. Asthma 3. Immune Response 4. Bronchoconstriction 5.

NFAT

Rio de Janeiro

August, 2006

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................

XIII

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................

1.1 Alergia.................................................................................................... 1

1.2 Asma...................................................................................................... 3

1.2.1 Bases genéticas e ambientais da asma.............................................. 3

1.2.2 Bases imunológicas da asma.............................................................. 5

1.2.3 Fase imediata e fase tardia da resposta alérgica asmática................ 8

1.3 Fisiopatologia da asma.......................................................................... 10

1.4 Mediadores da resposta asmática......................................................... 13

1.4.1 Citocinas.............................................................................................. 13

1.4.2 Quimiocinas......................................................................................... 15

1.4.3 Acetilcolina.......................................................................................... 16

1.4.3.1 Sinalização pelos mAChRs.............................................................. 18

1.4.3.2 Receptores muscarínicos no pulmão............................................... 19

1.4.3.3 Acetilcolina na asma........................................................................ 21

1.4.4 Serotonina........................................................................................... 21

1.4.4.1 Serotonina na asma......................................................................... 22

1.5 Família NFAT......................................................................................... 23

1.5.1 Fenótipo dos camundongos deficientes para NFAT........................... 26

1.5.2 NFAT1 na resposta alérgica/asmática................................................ 27

1.6 Objetivos...................................................................................................

1.6.1 Geral.................................................................................................... 29

1.6.2 Específicos.......................................................................................... 29

2. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................

2.1 Animais utilizados................................................................................... 30

2.2 Pleurisia.................................................................................................. 30

2.3 Cultura de células................................................................................... 30

2.4 Modelo experimental de asma............................................................... 31

2.5 Lavado Broncoalveolar (BAL)................................................................ 31

2.6 Contagem diferencial de células............................................................ 31

2.7 Análise de imunoglobulinas.................................................................... 32

2.8 Estimulação in vitro................................................................................ 32

2.9 Análise de citocinas e quimiocinas......................................................... 32

2.10 Histopatologia....................................................................................... 33

2.11 Análise da (hiper-) reatividade brônquica............................................. 33

2.12 RT-PCR................................................................................................ 33

2.13 Análise estatística................................................................................ 34

2.14 Soluções e reagentes utilizados........................................................... 35

2.14.1 PBS 1X…………………………………………………………………… 35

2.14.2 Ovalbumina....................................................................................... 35

2.14.3 Solução de Turk................................................................................ 35

2.14.4 DMEM suplementado........................................................................ 35

2.14.5 Hidróxido de alumínio........................................................................ 36

2.14.6 Tampão de homogeneização............................................................ 36

3. RESULTADOS.............................................................................................

4. DISCUSSÃO................................................................................................

5. CONCLUSÕES............................................................................................

XII

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................

7. ANEXOS.......................................................................................................

7.1 Anexo I…................................................................................................

TEIXEIRA, L.K., FONSECA, B.P.F., VIEIRA DE ABREU, A., BARBOZA,

B.A., ROBBS, B.K., BOZZA, P.T., VIOLA, J.P.B. IFN-γ production by CD8

T cells depends on NFAT1 transcription factor and regulates Th

differentiation. J Immunol. 175:5931-5939. 2005.

7.2 Anexo II..................................................................................................

TEIXEIRA L.K., FONSECA, B.P.F., BARBOZA B.A., VIOLA, J.P.B. The

role of interferon-γ on immune and allergic responses. Mem Inst Oswaldo

Cruz 100: 137-144. 2005.

7.3 Anexo III.................................................................................................

VIOLA J.P.B., CARVALHO L.D.S., FONSECA, B.P.F., TEIXEIRA L.K.

NFAT transcription factors: from cell cycle to tumor development. Braz J

Med Biol Research 38: 335-344. 2005.

106

XIII

LISTA DE ABREVIATURAS

ACh - Acetilcolina

ADAM - Domínio de Disintegrina A e Metaloproteinase (A Disintegrin And

Metalloproteinase Domain)

APC - Células Apresentadoras de Antígeno (Antigen Presenting Cells)

BCG - Bacilo de Calmette-Guérin

BCR - Receptor de Células B (B Cell Receptor)

C5 - Fator 5 do sistema Complemento (Complement factor 5)

CD - Complexo de Diferenciação (Cluster of Differentiation)

CFA - Adjuvante Completo de Freund (Complete Freund´s Adjuvant)

CRAC - Canais Ativados por Liberação de Cálcio (Calcium Release Activated

Channels)

CsA - Ciclosporina A

DAG - sn-1,2-diacilglicerol

DPP - Dipeptidil Peptidase (Dipeptidyl Peptidase)

EPO - Peroxidase de Eosinófilos (Eosinophil Peroxidase)

FcR - Receptor de Fc

GM-CSF - Fator de Estimulação de Colônias de Granulócitos e Macrófagos

(Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor)

IFN - Interferon

IgE - Imunoglobulina E

IL - Interleucina

IL-4R - Receptor de IL-4

InsP

- inositol 1,4,5-trisfosfato

LT - Leucotrieno

mAChR - Receptor Muscarínico de Acetilcolina

MAP - Proteína Ativada por Mitógenos (Mitogen-Activated Protein)

MAPK - Quinase da Proteína Ativada por Mitógenos (Mitogen-Activated Protein

Kinase)

MBP - Proteína Básica Principal (Major Basic Protein)

MCP - Proteína Quimioatrativa de Macrófagos (Macrophage Chemoattractant

Protein)

XIV

MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major Histocompatibility

Complex)

MIP - Proteína Inflamatória de Macrófagos (Macrophage Inflammatory Protein)

MUC - Mucina

nAChR - Receptor Nicotínico de Acetilcolina

NFAT - Fator Nuclear de Células T Ativadas (Nuclear Factor of Activated T

cells)

NK - Natural Killer

OVA - Ovalbumina

PAF - Fator Ativador de Plaquetas (Platelet-Activating Factor)

PKA - Proteína Quinase A

PKC - Proteína Quinase C

PLC - Fosfolipase C

PtdIns(4,5)P

- Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

RANTES - proteína Regulada durante a Ativação, Normalmente Expressa e

Secretada por células T (Regulated on Activation, Normal T cell-Expressed,

and

Secreted protein).

RE - Retículo Endoplasmático

TCR - Receptor de Células T (T Cell Receptor)

TIM1 - Homólogo de Timeless, Drosophila

Th - Células T helper

TGF - Fator de Crescimento Tumoral (Tumor Growth Factor)

TNF - Fator de Necrose Tumoral (Tumor Necrosis Factor)

VLA - Proteína de ativação tardia (Very Late Activation Protein)

VCAM - Molécula de Adesão de Células Vasculares (Vascular Cell Adhesion

Molecule)

1. INTRODUÇÃO

1.1 Alergia

A palavra “alergia” foi originalmente utilizada por Von Pirquet (1906) para

descrever “a habilidade de animais e humanos de desenvolverem respostas alteradas à

substâncias estranhas após repetidas exposições”. Von Pirquet era pediatra e

acreditava que essa reação alterada se manifestava através de mudanças do sistema

imune do próprio paciente, potencializadas por influências externas tais como:

alimentação, o ar respirado ou contato direto com a pele. Nascia aí o termo “alergeno”

(substância responsável pela reação alterada). Alguns anos mais tarde, Prausnitz e

Küstner (1921) demonstraram que a reatividade cutânea poderia ser passivamente

transmitida para a pele de indivíduos saudáveis, através de injeções subcutâneas do

soro de indivíduos alérgicos. A natureza do fator responsável por essa sensibilização

passiva era desconhecida e esse fator foi posteriormente chamado “reagina” por Coca

e Cooke (revisto em Johansson, 2002). Em 1967, a “reagina” foi identificada como uma

imunoglobulina (Ig) por Ishizaka e colaboradores (1967a). Uma nova classe de

imunoglobulinas foi então reconhecida, a IgE (Bennich

et al.

, 1968). A descoberta e

isolamento da estrutura antigênica da IgE, introduziu uma nova dimensão à

metodologia de estudo da alergia (Ishizaka

et al.

, 1967b). A partir deste momento

passou a ser possível procurar por respostas imunes específicas – anticorpos do tipo

IgE específicos para determinados alergenos. Além disso, uma série de estudos

confirmou o envolvimento de células do sistema imune no desenvolvimento de reações

alérgicas, como os mastócitos e os eosinófilos (revisto em Johansson, 2002), colocando

o sistema imune como peça-chave nas respostas alérgicas.

Enquanto a alergia era uma desordem rara na época de sua descoberta,

atualmente quase metade da população dos países ditos “ocidentalizados” apresenta

sensibilização a um ou mais alergenos ambientais. Em países como a Inglaterra ou

Austrália, isso se reflete em uma em cada quatro crianças menores de 14 anos

sofrendo de asma e uma em cada cinco sofrendo de eczema (Beasley, 1998). Essa

condição vem aumentando cada vez mais nos últimos 40 anos. Só nos Estados Unidos,

de 1980 a 1994 a prevalência de asma aumentou 75% (Castro

et al.

, 2005).

Atualmente a alergia é considerada uma disfunção imunológica, que pode causar

em indivíduos pré-dispostos (ou atópicos), uma resposta inflamatória local ou efeitos

sistêmicos severos. As doenças alérgicas ou atópicas são fenômenos complexos, que

induzem diversas manifestações patofisiológicas como aumento de permeabilidade

vascular, vasodilatação, hiper-reatividade brônquica e inflamação local. O processo de

sensibilização geralmente resulta do contato primário com o alergeno, gerando uma

resposta imune específica caracterizada pelo predomínio de citocinas produzidas por

um subtipo de linfócitos CD4

denominado T helper (Th)2 (Interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-

13) e produção de anticorpos do tipo IgE. Após reexposição, o alergeno interage com a

IgE, agora fixada na superfície de células-alvo, e dispara a liberação de uma série de

mediadores responsáveis pelo desenvolvimento do quadro alérgico (revisto em Wills-

Karp, 1999) (Figura 1).

Figura 1: Eventos iniciadores da resposta alérgica. Os alergenos são endocitados pelas

células dendríticas e apresentados aos linfócitos T CD4

. As citocinas produzidas nesse

microambiente induzem a diferenciação dos linfócitos CD4

para um fenótipo Th2, gerando uma

expansão dessa subpopulação. As células Th2 induzem então a mudança de classe de

imunoglobulina para IgE pelos linfócitos B. Essa IgE alergeno-específica se liga a receptores na

superfície de mastócitos, e uma subseqüente reexposição ao alergeno leva à degranulação e

liberação de moléculas pro-inflamatórias por essas células. Essas moléculas recrutam outras

células inflamatórias, como os eosinófilos, os quais quando ativados também liberam

mediadores inflamatórios. O conjunto desses mediadores presentes no microambiente

pulmonar irá então culminar no fenômeno de hiper-reatividade das vias aéreas. Adaptado de

Cookson, 2004.

1.2 Asma

A asma é uma manifestação alérgica caracterizada principalmente pela

inflamação crônica da mucosa brônquica, níveis aumentados de IgE sérica e por uma

hiper-reatividade das vias aéreas, culminando num fenômeno de obstrução intermitente

destas vias (revisto em Corrigan & Kay, 1992). Estruturalmente, as vias aéreas de um

indivíduo asmático são caracterizadas pela presença de inflamação crônica com

infiltração intensa da mucosa brônquica por mastócitos, linfócitos e eosinófilos,

juntamente com descamação do epitélio, hiperplasia das células caliciformes resultando

na produção de grandes quantidades de muco e espessamento da submucosa pela

deposição de colágeno (Cohn

et al.

, 1997; revisto em Wills-Karp, 1999).

Por muito tempo, a asma foi considerada uma doença totalmente reversível.

Como conseqüência, a abordagem terapêutica para essa doença era focalizada no

controle dos sintomas, através do alívio do broncoespasmo e redução da inflamação

das vias aéreas. Além disso, diversos estudos têm demonstrado que indivíduos

asmáticos apresentam uma alta taxa de deterioração das funções respiratórias (Lange

et al.

, 1998). Hoje, a asma é considerada uma doença para a qual raramente existe

cura, só controle.

1.2.1 Bases genéticas e ambientais da asma

A asma é uma doença multifatorial, uma vez que suas causas incluem tanto

fatores ambientais quanto fatores genéticos. Essa predisposição genética para o

desenvolvimento de uma resposta aumentada a aeroalergenos comuns tem sido alvo

de diversos estudos. Até o momento 18 genes de susceptibilidade à asma foram

identificados, revelando a complexidade e heterogeneidade dessa doença (Hoffjan &

Obber, 2002). A região cromossômica mais estudada é o “cluster” de citocinas

localizado no cromossomo 5q (genes da IL-4, 13, 9 e 15). Apesar de numerosos

estudos, nem todos conseguiram comprovar e reproduzir a efetiva herdabilidade dos

loci-candidatos identificados nessa região (revisto em Wills-Karp & Ewart, 2004). Nos

últimos quatro anos, alguns grupos se dedicaram à identificação de novos genes de

susceptibilidade à asma. Esses estudos resultaram na descoberta de 2 genes

associados à asma em humanos:

ADAM33

, uma metaloproteinase envolvida no

remodelamento dos tecidos das vias aéreas; e

DPP10

, uma dipeptidase que especula-

se ser moduladora da atividade de várias citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias ao

clivar a porção N-terminal dessas proteínas (revisto em Wills-Karp & Ewart, 2004). Em

camundongos, outros 2 genes foram considerados cruciais para a patogênese da

asma:

Tim1

, uma proteína transmembrana expressa em linfócitos CD4

;

, o fator 5

do sistema complemento (revisto em Wills-Karp & Ewart, 2004).

Apesar dos fatores genéticos contribuírem para a susceptibilidade de um

indivíduo à asma, em muitos casos para se manifestarem, eles precisam interagir com

estímulos ambientais. Além disso, os fatores genéticos explicam parcialmente as

grandes diferenças de incidência da asma entre países, mas não a crescente tendência

de aumento da doença nas últimas décadas, especialmente nos países

“ocidentalizados”. Os aspectos da vida “ocidental” responsáveis por esse aumento

ainda não foram claramente definidos: poluição do ar, exposição doméstica a alergenos

derivados de ácaros, animais domésticos ou fungos, etc. No final dos anos 80, uma

hipótese tornou-se bastante popular no intuito de explicar a alta prevalência de doenças

atópicas em países desenvolvidos. Essa hipótese, chamada de hipótese da higiene,

correlaciona doenças atópicas à falta de infecções na infância. A hipótese da higiene é

derivada da observação da relação inversa entre a ocorrência de febre do feno e o

tamanho familiar feita por David Strachan, em 1989. A febre do feno é um tipo de rinite

alérgica sazonal que ocorre numa determinada época do ano, na primavera, quando

ocorre a polinização. Os grãos de pólen estão intimamente relacionados aos sintomas

dessa doença, enquanto o feno representa apenas uma pequena porcentagem

responsável pela causa da doença. Essas substâncias entram em contato com a

membrana mucosa dos olhos e nariz de indivíduos alérgicos, causando inflamação.

Strachan pesquisou os arquivos médicos de 17.000 crianças inglesas e verificou que

quanto maior o número de irmãos mais velhos que essas crianças tinham, menor era a

susceptibilidade delas à febre do feno. Strachan sugeriu que os irmãos mais velhos

estariam trazendo mais infecções virais para seus irmãos menores, tornando o sistema

imune dessas crianças mais tolerante ao pólen (Strachan, 1989). A hipótese da higiene

argumenta então que infecções desenvolvidas durante os primeiros anos da infância

inibem a tendência de desenvolvimento de doenças alérgicas (Strachan, 1989). Como

conseqüência, crianças com estilo de vida “ocidentalizado”, protegidas das infecções

que afetam as crianças nascidas em países em desenvolvimento, sofrem de um risco

aumentado de desenvolverem doenças alérgicas. Isso aconteceria porque muitas das

infecções comuns induzem uma forte resposta imune do hospedeiro caracterizada pela

produção de IFN-

, uma resposta típica mediada por linfócitos CD4

do subtipo Th1. As

respostas Th1 tendem a antagonizar o desenvolvimento de respostas Th2, mediadoras

da resposta alérgica. Prescott e colaboradores (1998a) demonstraram que o sistema

imune de crianças recém-nascidas possui um forte componente Th2 e que,

posteriormente, esse viés Th2 diminui gradualmente durante os dois primeiros anos de

vida em indivíduos não-alérgicos (Prescott

et al.

, 1998b). Em crianças alérgicas ocorre

o contrário, há um aumento na intensidade das respostas do tipo Th2 ao longo do

tempo (Prescott

et al.

, 1998b). Por essa razão especula-se que o sistema imune em

desenvolvimento necessite de um estímulo Th1 do meio ambiente para evitar o

desenvolvimento das doenças alérgicas (Wills-Karp

et al.

, 2001). Muitas infecções

bacterianas e virais podem fornecer esse estímulo. De fato, a infecção com BCG

(

Mycobacterium bovis

) atenua a asma experimental induzida em camundongos (Erb

al.

, 1999). Esses dados sugerem que o fator etiológico chave nas doenças alérgicas

pode não ser somente a aquisição inicial de uma resposta imune baseada no fenótipo

Th2, mas também a eficiência dos mecanismos de equilíbrio da resposta imune

(Prescott

et al.

, 1998a).

1.2.2 Bases imunológicas da asma

O processo inflamatório asmático se inicia como resultado de uma resposta

imune exacerbada a alergenos comumente inalados. Os principais iniciadores dessa

resposta são os linfócitos T CD4

, essenciais na fase de sensibilização do indivíduo.

Os linfócitos T (CD4

e CD8

) apresentam em sua superfície o receptor de

células T (TCR), que os torna células altamente específicas. Através do TCR, os

linfócitos T CD4

reconhecem peptídeos de antígenos protéicos apresentados em

moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II. Estas

moléculas do MHC de classe II estão presentes na superfície de células

apresentadoras de antígeno (APC) como células dendríticas, macrófagos e linfócitos B.

A apresentação do alergeno para os linfócitos T CD4

ocorre exatamente através da

interação MHC-TCR. As APCs têm a capacidade de endocitar o alergeno que penetrou

no organismo pelo trato respiratório ou pele por exemplo, e degradá-lo em pequenos

peptídeos no compartimento lisossomal. Posteriormente, esses peptídeos se ligam a

moléculas de MHC de classe II, vindas do retículo endoplasmático (RE). Ao ser

direcionado para a superfície da APC, o complexo MHC de classe II-peptídeo liga-se ao

TCR da célula CD4

, fazendo com que ela seja ativada.

Os linfócitos T CD4

, após ativação, têm a capacidade de se diferenciar

principalmente em duas classes de células Th com habilidades funcionais distintas, os

linfócitos CD4

do tipo Th1 e Th2 (Mosmann

et al.

, 1989). Essas duas classes de

linfócitos CD4

diferenciados produzem citocinas específicas e mutuamente exclusivas,

influenciando a ativação e diferenciação de outros tipos celulares (Mosmann

et al.

1986; revisto em Abbas

et al.

1996). Células do tipo Th1 caracterizam-se pela produção

de IFN-

, IL-2, e TNF

, enquanto células do tipo Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e

IL-13 (revisto em Seder & Paul, 1994; Coffman

et al.

,1988). As citocinas produzidas

pelas células Th1 e Th2 funcionam de maneira autócrina, promovendo o

desenvolvimento de seu próprio fenótipo, a IL-4 estimulando o fenótipo Th2 e o IFN-

promovendo o fenótipo Th1. Além desse papel regulador positivo, as citocinas Th1 e

Th2 também regulam negativamente o fenótipo oposto.

As células CD4

diferenciadas para Th1 e Th2 exibem fatores de transcrição

específicos e mutuamente exclusivos de seu fenótipo. O fator de transcrição GATA-3 é

expresso durante o processo de diferenciação de células CD4

para um fenótipo Th2 e

tem a capacidade de transativar o promotor do gene de IL-4

in vitro

(Zheng & Flavell,

1997; Ranganath

et al.

, 1998). O fator de transcrição GATA-3, além de extremamente

importante na consolidação do fenótipo Th2, também controla a expressão de diversas

citocinas típicas do fenótipo Th2, as quais são essenciais para a indução de inflamação

alérgica

in vivo

. Outros fatores de transcrição também são importantes para o

desenvolvimento do fenótipo Th2, como NFAT, AP-1 e a subunidade p50 do NF-

Especificamente, células CD4

de camundongos deficientes para p50 não induzem a

expressão de GATA-3 em condições Th2 de diferenciação (Das

et al.

, 2001). Células

Th deficientes para NFAT2 produzem níveis diminuídos de citocinas do tipo Th2,

enquanto células CD4

deficientes para NFAT1 têm produção aumentada de citocinas

do tipo Th2, sugerindo que esses fatores são especialmente importantes no

desenvolvimento do fenótipo Th2 (Hodge

et al.

, 1996; Kiani

et al.

, 1997). Em oposição,

o fator de transcrição T-bet é especificamente expresso em células CD4

diferenciadas

para Th1, mostrando-se um potente ativador do gene de IFN-γ (Szabo

et al.

, 2000).

Apesar disso, os mecanismos moleculares de regulação da diferenciação Th1/Th2 por

fatores de transcrição ainda não estão completamente elucidados.

A inflamação alérgica está fortemente associada aos linfócitos T CD4

do tipo

Th2, uma vez que um padrão de citocinas do tipo Th2 foi associado à patogênese

dessa doença (Renauld, 2001). De fato, números elevados de células Th2 foram

identificados em fluidos de lavados broncoalveolares (BAL) e biópsias de vias aéreas

de pacientes asmáticos. Além disso, nas vias aéreas de indivíduos asmáticos foram

identificados níveis aumentados de expressão do mRNA para GATA-3 quando

comparados com seus respectivos controles, que foram correlacionados com

expressão aumentada de IL-5 (Nakamura

et al.

, 1999a). Quando uma proteína GATA-3

mutante, que atua como dominante negativo, é expressa especificamente em linfócitos

T ocorre uma redução dos níveis das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13, típicas do fenótipo

Th2, além de diminuição da produção de muco, síntese de IgE e eosinofilia nesses

animais transgênicos (Zhang

et al.

, 1999). Similarmente, a administração intranasal de

DNA anti-senso para GATA-3 reduz a inflamação das vias aéreas, hiper-reatividade e

produção de muco num modelo experimental de asma em camundongos (Finotto

et al.

2001). Camundongos deficientes para T-bet apresentam diminuição da produção de

IFN-

e desenvolvem hiper-reatividade das vias aéreas espontaneamente (Finotto

et al.

2002). De forma similar, a expressão de T-bet em células CD4

está diminuída no

pulmão de indivíduos asmáticos, quando comparados com indivíduos saudáveis

(Finotto

et al.

, 2002).

As principais citocinas produzidas pelas células Th2: IL-4, IL-5 e IL-13, são

extremamente importantes no recrutamento e ativação de células efetoras relacionadas

às respostas alérgicas, como eosinófilos e mastócitos. A IL-13 é responsável pela

hipersecreção de muco das glândulas da submucosa e/ou células caliciformes. A IL-4 e

IL-5 aumentam a adesão de eosinófilos às células endoteliais vasculares, promovendo

sua infiltração nos sítios inflamatórios ao regular moléculas de adesão na superfície dos

eosinófilos (VLA-4) e do próprio endotélio (VCAM-1). A IL-4 também é essencial para a

diferenciação de linfócitos CD4

para um fenótipo Th2 e para a diferenciação de

mastócitos, além de ser caracterizada como um indutor da mudança de classe de

imunoglobulinas para IgE em linfócitos B (revisto em Gould

et al.

, 2003).

Essa IgE secretada por linfócitos B ativados é direcionada para a corrente

sanguínea e liga-se a receptores de Fc específicos (FcεR) na superfície de mastócitos

teciduais ou basófilos sangüíneos. A partir desse momento, essas células estão

preparadas para serem ativadas por antígenos/alergenos, tornando o indivíduo

sensibilizado para aquele determinado antígeno específico.

1.2.3 Fase imediata e fase tardia da resposta alérgica asmática

A resposta alérgica asmática pode ser dividida em duas fases distintas: uma

imediata, caracterizada pela degranulação de mastócitos, aumento da permeabilidade

vascular e edema; e uma tardia, que começa a se desenvolver 5-6h após contato com o

alergeno, sendo caracterizada por infiltrado de células inflamatórias, principalmente

linfócitos, eosinófilos e neutrófilos (Figura 2).

Figura 2

Fases da resposta asmática.

A asma pode ser dividida em duas fases distintas. A

fase imediata ocorre rapidamente após a exposição ao alergeno, induzindo degranulação de

mastócitos, causando liberação de mediadores inflamatórios e, conseqüentemente, mudanças

nas funções das vias aéreas. Os mediadores liberados durante a fase imediata causam

progressão para a fase tardia da resposta imune contra esse determinado alergeno. A fase

tardia é geralmente mais severa e caracterizada pelo acúmulo de células mononucleares

(monócitos e linfócitos), bem como de eosinófilos. Os tipos celulares que se acumulam durante

a fase tardia estão associados com disfunção e dano prolongado das vias aéreas. Adaptado de

Lukacs, 2001.

A fase imediata inicia-se após a sensibilização, quando ocorre uma reexposição

ao alergeno. Ele interage com duas moléculas de IgE adjacentes, levando à formação

de um “cross-linking” de receptores, culminando na ativação/degranulação dos

mastócitos (revisto em Gould

et al.

, 2003). Uma vez ativadas essas células liberam

mediadores lipídicos e vasoativos (como histamina, prostaglandinas e leucotrienos),

proteases, fatores quimiotáticos (como

eotaxina, MCP-1 e RANTES) e citocinas (IL-4, IL-

5, IL-13, TNF-α, TGF-β), que irão contribuir para o recrutamento de outros tipos

celulares e desenvolvimento da inflamação alérgica aguda (revisto em Wills-Karp,

1999).

Durante a fase tardia ocorre então a migração de diversos tipos celulares para o

sítio inflamatório, atraídos pelo microambiente de citocinas e quimiocinas já

estabelecido. Um dos tipos celulares extremamente importante nessa fase da resposta

alérgica é o eosinófilo. Após a migração para o sítio inflamatório e durante a reação

alérgica, os eosinófilos estão sujeitos à ativação, que resulta na degranulação e

produção de mediadores por estas células. Após ativação, essas células secretam

mediadores inflamatórios, como leucotrieno C

(LTC

) e fator ativador de plaquetas

(PAF), induzindo broncoconstrição, e proteínas com alto nível de toxicidade para o

epitélio, como MBP (Major Basic Protein) e EPO (Eosinophil Peroxidase), gerando

descamação da camada epitelial das vias aéreas (revisto em Corrigan & Kay, 1992). Os

eosinófilos também são capazes de apresentar antígenos e secretar citocinas do tipo

Th2, podendo funcionar como amplificadores ou perpetuadores do processo

inflamatório em seus sítios de infiltração (Shi

et al.

, 2000). De fato, animais deficientes

para eosinófilos são completamente protegidos contra hiper-reatividade das vias aéreas

e demonstram proteção parcial contra metaplasia das células caliciformes (Lee

et al.

2004). Além disso, os eosinófilos secretam citocinas envolvidas em seu próprio

processo de ativação, incluindo IL-3, IL-4, IL-5 e GM-CSF, podendo participar de uma

alça de retroalimentação positiva (Kita

et al.

, 1991).

1.3 Fisiopatologia da asma

Na asma, a parede das vias aéreas é infiltrada por células mononucleares, em

sua maioria linfócitos CD4

, e eosinófilos. Mastócitos, macrófagos, plasmócitos e

neutrófilos estão variavelmente aumentados nas vias aéreas de indivíduos asmáticos

comparados com seus respectivos controles. No lúmen das vias aéreas, o muco está

junto a macrófagos ativados, linfócitos, eosinófilos e células epiteliais danificadas. Em

alguns casos, especialmente os mais severos, neutrófilos também estão presentes

(revisto em Cohn

et al.

, 2004).

Mudanças estruturais da parede das vias aéreas, conjuntamente chamadas de

remodelamento das vias aéreas, podem ser resultantes tanto da interação de

mediadores inflamatórios com as células epiteliais quanto da injúria tecidual (

Figura 3

Fatores locais, incluindo as células estruturais das vias aéreas e matriz, respondem à

inflamação de maneira coordenada, a fim de reparar o dano causado pela inflamação

local, num esforço para manter as vias aéreas intactas (revisto em Cohn

et al.

, 2004). O

espessamento das vias aéreas varia de 10 a 300 % do normal, o que leva a uma

redução do diâmetro luminal das vias aéreas (Elias

et al.

, 1999). Além das células

inflamatórias, a maioria dos elementos das vias aéreas contribui para o aumento desse

espessamento. As células epiteliais, no intuito de reparar a injúria ao epitélio, começam

a proliferar e com a exposição aos mediadores inflamatórios do microambiente, passam

de um fenótipo absortivo, para um fenótipo secretório. Há então um aumento da

produção e secreção de muco por essas células em conjunto com uma hipertrofia das

células caliciformes, produtoras de muco. A camada subepitelial, que varia de 4 a 5

microns em indivíduos normais, vai de 7 a 23 microns em indivíduos asmáticos como

resultado da deposição de colágeno (tipos I, III e IV), fibronectina e tenascina logo

abaixo da membrana basal (Roche

et al.

, 1989). A massa da musculatura lisa aumenta

e pode ocupar até três vezes a área normal, predominantemente por causa da

hiperplasia dessas células. Também ocorre dilatação vascular e angiogênese, aumento

de permeabilidade vascular e edema da parede das vias aéreas (revisto em Cohn

et al.

2004).

Figura 3: Vias aéreas antes e após exposição ao alergeno. Na ausência do alergeno as vias

aéreas têm estruturação tecidual e funções normais (painel superior). Quando o alergeno é

inalado, o sistema imune do indivíduo asmático gera uma resposta inflamatória contra ele

(painel inferior). Durante esse processo há estimulação da diferenciação e proliferação de

linfócitos T CD4

Th2, ativação e recrutamento de células inflamatórias e liberação de

mediadores inflamatórios. Todos esses fatores contribuem para o aumento da produção e

camada de muco no lúmen do brônquio, espessamento da membrana basal do epitélio e dano

epitelial, gerando um quadro de inflamação persistente e remodelamento das vias aéreas que

resulta na hiper-reatividade das vias aéreas. Adaptado de Cohn

et al.

, 2004.

O remodelamento das vias aéreas e a inflamação resultam na hiper-reatividade e

obstrução das vias aéreas, causando dispnéia. A hiper-reatividade brônquica é definida

como uma broncoconstrição aumentada em resposta a um estímulo não específico

(revisto em Cohn

et al.

, 2004). A magnitude da hiper-reatividade está correlacionada

com o grau de inflamação das vias aéreas (Jeffery

et al.

, 1989). Outros fatores como o

diâmetro reduzido das vias aéreas, aumento na contratibilidade da musculatura lisa, o

grau de dano no epitélio, desregulação das funções neuronais, aumento da

permeabilidade vascular, e muitos mediadores inflamatórios também foram associados

à hiper-reatividade (revisto em Cohn

et al.

, 2004). Quando as vias aéreas tornam-se

estreitadas por essas mudanças estruturais, com muco e células inflamatórias no

espaço luminal, é fácil imaginar como qualquer estímulo que aumente a contração da

musculatura lisa resulta em obstrução das vias aéreas.

A inflamação e as mudanças estruturais descritas anteriormente foram

observadas em biópsias de crianças anos antes dos sintomas da asma se

manifestarem, sugerindo a hipótese de que a obstrução sintomática das vias aéreas

ocorra apenas quando um grau crítico de remodelamento ocorre (Pohunek

et al.

, 2005).

Ao longo do tempo, a função pulmonar dos indivíduos asmáticos cai mais rapidamente

se comparada à de indivíduos normais, indicando progressão da doença (Lange

et al.

1998).

1.4 Mediadores da resposta asmática

1.4.1 Citocinas

As citocinas são glicoproteínas solúveis multifuncionais, que atuam local ou

sistemicamente na regulação de funções celulares através de sua interação com

receptores específicos, presentes na membrana citoplasmática da maioria das células.

Apesar da cadeia de eventos que leva ao desenvolvimento da patologia asmática ser

bastante complexa, as citocinas típicas de uma resposta Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) se

destacam como importantes participantes tanto no desenvolvimento quanto no

estabelecimento da asma. Os mecanismos exatos pelos quais estas citocinas regulam

a inflamação pulmonar e a conseqüente hiper-reatividade das vias aéreas ainda não

estão completamente elucidados, mas sabe-se que elas atuam em diferentes tipos

celulares envolvidos no desenvolvimento da resposta asmática.

Além do papel fundamental da IL-4 na diferenciação de células CD4

“naive” em

células Th2, essa citocina também influencia diversos outros processos. Como dito

anteriormente, a IL-4 induz a mudança de classe de imunoglobulina para IgE em

linfócitos B; é um fator de crescimento para mastócitos, juntamente com a IL-3 e induz a

expressão de moléculas de adesão (VCAM-1) que levam à migração preferencial de

eosinófilos aos tecidos (revisto em Wills-Karp, 1999). Animais geneticamente

deficientes para o gene da IL-4 não são capazes de gerar hiper-reatividade brônquica

ou eosinofilia pulmonar quando submetidos a um modelo de asma experimental

(Brusselle

et al.

, 1994). Segundo os autores, esta incapacidade está relacionada à

ausência de produção de anticorpos sensibilizantes, devido à falhas na geração de

linfócitos Th2 (Brusselle

et al.

, 1994). Além disso, Gavett e colaboradores (1997)

demonstraram que a administração de anticorpos contra o receptor de IL-4 (IL-4R) em

camundongos já sensibilizados inibe a inflamação alérgica pulmonar e hiper-reatividade

brônquica. Estudos com camundongos transgênicos para a expressão IL-4 demonstram

seu envolvimento na produção de muco, uma vez que esses animais apresentam

aumento considerável das células produtoras de muco no epitélio das vias aéreas

(Temann

et al.

, 1997). Neste mesmo estudo, os autores também demonstraram que a

IL-4 também regula um gene responsável pela expressão de uma mucina (

MUC5

) nas

vias aéreas desses animais (Temann

et al.

, 1997).

A IL-5 parece ser um elemento essencial na indução da inflamação alérgica

mediada por eosinófilos. Na medula óssea a IL-5 é importante na estimulação da

eosinofilopoiese e indução da diferenciação terminal de precursores mielóides em

eosinófilos. A IL-5 também aumenta a adesão de eosinófilos às células endoteliais

vasculares, promove a migração de eosinófilos da corrente sanguínea para os tecidos,

prolonga a sobrevivência dos eosinófilos nos tecidos e aumenta a atividade citotóxica

dessas células (revisto em Wills-Karp, 1999). De fato, animais deficientes para o gene

da IL-5 não desenvolvem eosinofilia pulmonar induzida por aeroalergenos (Foster

et al.

1996). A IL-5 é também a citocina predominantemente encontrada em fluidos nasais de

indivíduos alérgicos (Sim

et al.

, 1994). Além disso, parece haver uma correlação entre o

aumento da concentração de IL-5 e o aumento de eosinófilos no sangue e lavado

broncoalveolar de pacientes asmáticos (Walker

et al.

, 1991).

A IL-13 ficou primeiramente reconhecida por seus efeitos em linfócitos B e

monócitos, induzindo a expressão de MHC de classe II, promovendo mudança de

classe de imunoglobulina para IgE e inibindo a produção de citocinas inflamatórias

(revisto em Wynn, 2003). Atualmente a IL-13 é considerada uma citocina fundamental

na resposta alérgica, estando envolvida na patologia da asma e anafilaxia (revisto em

Wynn, 2003). Algumas das propriedades funcionais da IL-13 se sobrepõem às da IL-4.

Isso ocorre porque o receptor para IL-13 (IL-13R) compartilha uma de suas

subunidades com o receptor para IL-4 (IL-4R), a IL-4R

, fazendo com que as vias de

sinalização desses receptores também sejam similares (revisto em De Vries, 1998).

Entretanto, estudos feitos com camundongos transgênicos que expressam IL-13

especificamente no pulmão puderam elucidar as funções específicas da IL-13 na

patologia asmática. Esses camundongos desenvolvem espontaneamente diversas

características da asma incluindo eosinofilia pulmonar, hiperplasia das células epiteliais

das vias aéreas, metaplasia das células caliciformes, fibrose subepitelial, obstrução das

vias aéreas e hiper-reatividade (Zhu

et al.

, 1999). O bloqueio da IL-13 também inibiu

muitas dessas características em camundongos normais submetidos a um modelo de

asma experimental, demonstrando um papel crítico e não-redundante para a hiper-

reatividade mediada por IL-13 (Grunig

et al.

, 1998).

1.4.2 Quimiocinas

As quimiocinas são um grupo de citocinas quimiotáticas estruturalmente

relacionadas, envolvidas principalmente na ativação e recrutamento de diversos tipos

celulares. Elas são classificadas em 4 grupos distintos, denominados CXC, CC, C e

CX3C, dependendo do espaçamento entre as cisteínas conservadas (onde X

representa um aminoácido qualquer). Os grupos CXC e CC, ao contrário dos grupos C

e CX3C, possuem vários membros e têm sido estudados mais detalhadamente. As

quimiocinas da família CXC atuam principalmente em neutrófilos e linfócitos, enquanto

as da família CC agem em uma diversidade de tipos celulares, incluindo macrófagos,

eosinófilos, basófilos e células dendríticas (revisto em Zimmermann

et al.

, 2003).

Diversos estudos demonstraram que uma variedade de quimiocinas é fortemente

induzida em modelos de inflamação alérgica e em doenças alérgicas em humanos.

Na família das CC quimiocinas, destacam-se as eotaxinas I e II, RANTES, MIP-

1α, MIP-1β, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 e MCP-5. Essas quimiocinas são

importantes não só na regulação do recrutamento de leucócitos, mas também por

outras atividades, como ativação celular, indução da liberação de mediadores

inflamatórios, participação no desenvolvimento de respostas Th2 e regulação da

síntese de IgE (revisto em Gangur & Oppenheim, 2000). Camundongos geneticamente

deficientes para eotaxina apresentam uma redução considerável do recrutamento de

eosinófilos quando submetidos a um modelo de inflamação alérgica (Rothenberg

et al.

1997). Além disso, a eotaxina também tem um papel na indução da degranulação de

eosinófilos (Fujisawa

et al.

, 2000). De forma similar o uso de um antagonista do

receptor de RANTES inibiu completamente a eosinofilia pulmonar em camundongos

submetidos a um modelo experimental de asma (Gonzalo

et al.

, 1998).

Estudos clínicos também demonstram um papel importante das quimiocinas na

patofisiologia da asma. Pacientes asmáticos apresentam concentrações aumentadas

de eotaxina em fluidos de lavagem broncoalveolar e maior expressão do mRNA e

proteína dessa quimiocina no epitélio e submucosa de suas vias aéreas, quando

comparados com seus respectivos controles (Lamkhioued

et al.

, 1997). Além disso, foi

demonstrada uma associação direta entre níveis aumentados de eotaxina, diagnóstico

de asma e diminuição da função pulmonar (Nakamura

et al.

, 1999b). Da mesma forma,

as concentrações de MCP-1, MIP-1

e RANTES também estão aumentadas em fluidos

de lavagem broncoalveolar de indivíduos asmáticos (Alam

et al.

, 1996).

1.4.3 Acetilcolina

Os nervos parassimpáticos são responsáveis pelo principal mecanismo neural de

broncoconstrição das vias aéreas de humanos e animais. As fibras nervosas

colinérgicas partem do cérebro através do nervo vago, terminando em fibras nervosas

pré e pós-ganglionares situadas nas vias aéreas. Essas fibras nervosas recebem o

impulso nervoso e o conduzem até a musculatura lisa das vias aéreas e glândulas da

submucosa. A estimulação do nervo vago gera a liberação de acetilcolina (ACh) que irá

ativar receptores específicos no músculo liso, resultando em broncoconstrição (revisto

em Barnes, 1993).

A ACh é o principal neurotransmissor do sistema nervoso periférico. As ações

fisiológicas mais importantes da ACh são iniciadas pela sua ligação à duas classes

distintas de receptores de membrana: os receptores nicotínicos (nAChRs) e

muscarínicos (mAChRs). Esses receptores foram nomeados de acordo com sua

afinidade por duas substâncias, a nicotina e a muscarina, um alcalóide derivado do

cogumelo venenoso

Amanita muscaria

. Enquanto os nAChRs funcionam como canais

de Na

e K

controlados por ligante, os mAChRs são membros de uma superfamília de

receptores acoplados à proteína G. As ações muscarínicas da ACh são mediadas por

cinco subtipos de mAChRs molecularmente distintos (M

-M

) (Caulfield & Birdsall,

1998).

Baseado em sua habilidade de ativar diferentes classes de proteínas G

heterotriméricas, os cinco subtipos de mAChRs podem ser subdivididos em duas

classes distintas de acordo com suas atividades funcionais: os mobilizadores

intracelulares de cálcio (receptores M

, M

e M

), que são acoplados seletivamente às

proteínas G da família G

e os inibidores da adenilato ciclase (M

e M

), que

demonstram seletividade por proteínas G da família G

(revisto em Felder, 1995).

Diferentes abordagens experimentais demonstram que os mAChRs estão

presentes em praticamente todos os órgãos, tecidos e tipos celulares. Os mAChRs

periféricos são responsáveis pelas ações clássicas da ACh em órgãos ou tecidos

inervados por fibras nervosas parassimpáticas. As principais ações mediadas por esses

mAChRs periféricos incluem a redução do ritmo cardíaco e estimulação de secreção

glandular e contração da musculatura lisa (revisto em Wess, 2004). Os mAChRs

centrais estão envolvidos na regulação de um número extraordinário de funções

cognitivas, comportamentais, sensitivas, motoras e autônomas. Sinalização reduzida ou

aumentada dos diferentes subtipos de mAChRs implicam na patofisiologia de diversas

doenças do sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer e Parkinson,

depressão, esquizofrenia e epilepsia (revisto em Wess, 2004).

1.4.3.1 Sinalização pelos mAChRs

A sinalização da via dos mAChRs é determinada por elementos estruturais

desses receptores que os permitem ligar seletivamente à acetilcolina e à proteína G

apropriada. Todos os membros da família dos receptores acoplados à proteína G são

caracterizados por uma única proteína que transpassa a membrana plasmática sete

vezes, resultando em sete domínios hidrofóbicos transmembrana conectados por três

“loops” hidrofílicos extracelulares e três intracelulares. A porção N-terminal reside no

meio extracelular e a porção C-terminal no citoplasma.

As proteínas G existem como um heterotrímero contendo três subunidades:

β e γ. Na sua forma inativa, a protéina G está complexada em α, β e γ, com GDP fixado

à subunidade α. Uma vez estimulada por um receptor ativado por seu ligante, a

subunidade α troca seu GDP por GTP. Isso causa a dissociação de α que se separa

das subunidades β e γ, interagindo com uma proteína efetora ou canal iônico afim de

estimular ou inibir mensageiros intracelulares secundários. A conseqüência fisiológica

da ligação da ACh é determinada pelo subtipo de mAChR recebendo o estímulo bem

como pela proteína G e mensageiros celulares secundários (revisto em Felder, 1995).

Os receptores M

e M

acoplados à proteína G

, uma vez ativados, ativam a

fosfolipase C (PLC), causando a hidrólise do fosfolipídeo de membrana fosfatidilinositol

4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P

) em inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP

) e

-1,2-diacilglicerol

(DAG). O InsP

está envolvido na mobilização de cálcio dos estoques intracelulares,

gerando um aumento rápido e transiente das concentrações intracelulares de cálcio. O

DAG, por sua vez, ativa a proteína quinase C (PKC), que pode ativar a cascata de

sinalização das MAP quinases (MAPK) (Figura 4).

Já os receptores M

acoplados à proteína G

, uma vez ativados, inibem a adenilil

ciclase através da ligação da subunidade

com essa enzima. Isso faz com que haja

uma diminuição dos níveis de AMP cíclico intracelulares e conseqüente inibição da via

de ativação celular induzida pela proteína quinase A (PKA) (Figura 4).

Figura 4: Vias de sinalização mediadas por proteínas G.

Agonistas estimulam

especificamente seus receptores acoplados a proteínas G, os quais estão inseridos na

membrana plasmática. O mAChR2 ativa as proteínas G do subtipo G

, que inibem a geração de

cAMP e a conseqüente ativação da via de sinalização induzida por PKA. O mAChR3 ativa as

proteínas G do subtipo G

que induzem um influxo de Ca

e ativação de PKC através da

ativação da PLC e subseqüente conversão de PtdIns(4,5)P

em InsP

e DAG. Adaptado de

Malbon, 2005.

1.4.3.2 Receptores muscarínicos no pulmão

Nos pulmões, as fibras nervosas parassimpáticas inervam a musculatura lisa, as

glândulas produtoras de muco da submucosa e os vasos sanguíneos. Elas mantêm o

tônus muscular das vias aéreas, estimulam a secreção de muco pelas glândulas da

submucosa e dilatam os vasos sanguíneos (revisto em Coulson & Fryer, 2003).

A distribuição dos mAChRs no tecido pulmonar de animais e humanos revelou

que esses receptores estão localizados na musculatura lisa das vias aéreas, tanto nas

vias superiores quanto nas inferiores. Os mAChRs também estão localizados no epitélio

das vias aéreas e nas glândulas da submucosa (revisto em Barnes, 2004).

Dos cinco subtipos de mAChRs, três deles, os receptores M

, M

e M

exercem

efeitos fisiológicos nas vias aéreas. A musculatura lisa das vias aéreas apresenta

mAChRs dos subtipos M

e M

. Apesar de corresponderem a 50-80% dos mAChRs

pulmonares, os receptores M

não parecem desempenhar um papel direto na contração

da musculatura lisa das vias aéreas (revisto em Fryer & Jacoby, 1998). Ao invés disso,

os mAChRs do subtipo M

inibem qualquer tipo de broncodilatação mediada pela

ativação da adenilato ciclase, como a broncodilatação induzida por β-agonistas

(Fernandes

et al.

, 1992). Esses receptores também estão presentes nas fibras

nervosas pré-ganglionares que chegam ao pulmão. Neste sítio os receptores M

funcionam diretamente como inibidores da liberação de ACh. De fato, a função alterada

desses receptores aumenta a concentração de ACh liberada na musculatura lisa,

resultando numa broncoconstrição aumentada em resposta a estimulação pelo nervo

vago (revisto em Coulson & Fryer, 2003).

Os receptores M

são considerados os responsáveis pela contração da

musculatura lisa das vias aéreas. A estimulação dos receptores M

pela ACh ativa a

fosfolipase C, aumentando as concentrações intracelulares de Ca

e causando a

contração da musculatura lisa (revisto em Coulson & Fryer, 2003). De fato,

camundongos geneticamente modificados para não expressarem o receptor M

(mAChR3-/-) apresentam uma inibição de 60% da broncoconstrição induzida por

muscarina (Struckmann

et al.

, 2003). Surpreendentemente, neste mesmo estudo,

camundongos geneticamente modificados para não expressarem os dois receptores M

e M

(mAChR2-/- x mAChR3-/-) demonstram uma completa inibição da

broncoconstrição induzida por muscarina (Struckmann

et al.

, 2003). Esses dados

sugerem que a dicotomia M

não é tão rígida, indicando um papel importante para o

receptor M

na contração da musculatura lisa.

As glândulas da submucosa expressam mAChRs dos subtipos M

e M

. Os

receptores M

são predominantes e regulam a secreção de eletrólitos, muco e água. Os

receptores M

parecem contribuir apenas para a regulação da secreção de água e

eletrólitos (revisto em Coulson & Fryer, 2003).

1.4.3.3 Acetilcolina na asma

Até o momento não se tem registro de nenhuma alteração de expressão dos

mAChRs na asma. Estudos funcionais em vias aéreas de camundongos demonstraram

que a resposta dos mAChRs permanece inalterada após desafio antigênico (Fryer &

Wills-Karp, 1991).

In vitro

, agonistas colinérgicos exógenos não produziram diferenças

na contração da musculatura retirada de indivíduos asmáticos versus indivíduos

normais (Whicker

et al.

, 1988). Portanto, não há evidências de que o número ou função

dos receptores M

ou M

presentes na musculatura lisa das vias aéreas esteja alterado.

Entretanto, estudos demonstram que a função dos receptores M

nas fibras

nervosas parassimpáticas estaria diminuída, fazendo com que sua atividade inibitória

seja perdida em indivíduos asmáticos. Isso contribuiria para o reflexo colinérgico

exagerado característico da asma. De fato, agonistas muscarínicos inibem a

broncoconstrição em indivíduos normais, mas não em indivíduos asmáticos,

demonstrando uma possível perda de função do receptor M

(Minette

et al.

, 1989; Ayala

& Ahmed, 1989). O mecanismo exato pelo qual essa perda de função ocorre ainda não

está completamente estabelecido, mas acredita-se que a liberação de MBP por

eosinófilos pode estar envolvida nesse processo (revisto em Coulson & Fryer, 2003).

1.4.4 Serotonina

A serotonina (ou 5-hidroxitriptamina; 5-HT) foi inicialmente descrita como um

importante fator vasotônico. Ela é uma amina formada pela descarboxilação do

aminoácido triptofano, proveniente da dieta que se encontra armazenada nos grânulos

secretórios de mastócitos de roedores, mas não de humanos. A principal fonte de

serotonina em humanos são as plaquetas, apesar de também ser encontrada em

células neuroendócrinas do trato respiratório e nervos periféricos (revisto em Barnes,

2001).

Seus efeitos são mediados pela interação com uma família de receptores

dividida em 7 subtipos (5-HT

1-7

). Os receptores 5-HT

, 5-HT

e 5-

são acoplados à proteína G, enquanto os receptores 5-HT

são canais iônicos

ativados por ligantes (revisto em Raymond

et al.

, 2001). Quatro desses subtipos 5-HT

5-HT

, 5-HT

e 5-HT

são importantes no controle funcional das vias aéreas humanas.

Entretanto, aparentemente, existem diferenças entre espécies quanto ao subtipo de

receptor e sua capacidade de induzir broncoconstrição direta ou indiretamente. Em

ratos a serotonina induz broncoconstrição diretamente via receptores 5-HT

localizados na musculatura lisa das vias aéreas, mas em cobaias a broncoconstrição

pode ser causada pela ativação dos receptores 5-HT

, 5-HT

-like e 5-HT

. Em

humanos a serotonina tem tanto uma função constritora quanto relaxante da

musculatura lisa das vias aéreas mediada pelos receptores 5-HT

e 5-HT

respectivamente (revisto em Raymond

et al.

, 2001).

Além do papel direto da serotonina na musculatura lisa induzindo

broncoconstrição, também já foi comprovada uma influência indireta da serotonina

nesse processo. Dupont e colaboradores (1999) demonstraram que a serotonina atua

como facilitadora da contração colinérgica, induzindo a liberação de ACh pelas fibras

nervosas pós-ganglionares humanas, via receptores 5-HT

e 5-HT

. Em camundongos

a influência da serotonina na broncoconstrição mediada por ACh também já foi

demonstrada. Estudos com traquéias isoladas de camundongos utilizando antagonistas

e agonistas seletivos dos diferentes receptores de serotonina demonstraram um papel

importante de receptores 5-HT

-like nesse processo (Van Oosterhout

et al.

, 1991).

1.4.4.1 Serotonina na asma

O papel da serotonina na patologia da asma ainda não está completamente

elucidado. Lechin e colaboradores (1996) demonstraram que os níveis plasmáticos de

serotonina estão aumentados em indivíduos asmáticos e que esses níveis estavam

relacionados à severidade da doença. De fato, antagonistas do receptor 5-HT

foram

capazes de inibir parcialmente a hiper-reatividade brônquica e eosinofilia induzidas em

camundongos submetidos a um modelo experimental de asma (De Bie

et al.

, 1998).

Além disso, a tianeptina, um antidepressivo que estimula a recaptação de serotonina

pelas plaquetas, diminui os níveis de serotonina no plasma em pacientes asmáticos e

foi associado à redução dos sintomas da asma (Lechin

et al.

, 1998).

1.5 Família NFAT

Muitos dos processos que fazem parte do desenvolvimento da patologia

asmática têm a participação de fatores de transcrição da família NFAT (Nuclear Factor

of Activated T cells) (revisto em Rao

et al.

, 1997). A família NFAT é composta por

quatro membros distintos regulados por calcineurina: NFAT1 (NFATp, NFATc2), NFAT2

(NFATc, NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx, NFATc3) e uma proteína

regulada por estresse hiperosmótico (NFAT5/TonE-BP) (nomenclatura alternativa entre

parênteses) (Lopez-Rodriguez

et al.

, 1999; revisto em Rao

et al.

, 1997). Todas as

proteínas da família NFAT têm um domínio de ligação ao DNA (DBD) extremamente

conservado, que confere a essas proteínas uma especificidade comum de ligação ao

DNA (revisto em Rao

et al.

, 1997).

As proteínas NFAT1-4 são ativadas pela estimulação de receptores acoplados à

mobilização de cálcio, como os receptores de antígeno presentes em linfócitos T e B,

os receptores de Fcε presentes em mastócitos e basófilos e os receptores de Fcγ em

macrófagos e células NK (revisto em Rao

et al.

, 1997). Além disso, o NFAT também é

ativado por receptores acoplados a proteínas G

, mais especificamente o receptor

muscarínico M

(Boss

et al.

, 1996). A ativação das proteínas da família NFAT é inibida

por agentes imunossupressores, como ciclosporina A (CsA) e FK506 (revisto em Rao

al.

, 1997).

A família NFAT foi inicialmente identificada como um fator nuclear capaz de se

ligar ao promotor da IL-2 em linfócitos T ativados. Atualmente, os diversos membros da

família NFAT já foram identificados em diversos tipos celulares, incluindo outras células

do sistema imune e células “não-imunes”. O NFAT1 e o NFAT2 são expressos em

linfócitos T periféricos enquanto o NFAT4 é predominantemente expresso no timo

(Masuda

et al.

, 1995; revisto em Rao

et al

., 1997). Já o NFAT3 é preferencialmente

expresso em células que não fazem parte do sistema imune (revisto em Rao

et al.

1997). O NFAT1 também é expresso em linfócitos B (Peng

et al.

, 2001), mastócitos

(Prieschl

et al.

, 1995), eosinófilos (Seminario

et al.

, 2001), células NK e alguns

monócitos e macrófagos (Wang

et al.

1995).

As proteínas da família NFAT são expressas constitutivamente em sua forma

fosforilada, estando em sua forma inativa. Estímulos que induzem mobilização de cálcio

para o citoplasma das células levam a ativação da PLC, que hidrolisa o fosfolipídeo de

membrana PtdIns(4,5)P

em InsP

e DAG, como já descrito anteriormente. O InsP

induz a liberação de cálcio dos estoques intracelulares, que promove a abertura dos

canais ativados por liberação de cálcio (CRAC) presentes na membrana plasmática

gerando um aumento rápido e transiente das concentrações intracelulares de cálcio. O

cálcio então se liga à calmodulina que por sua vez ativa a calcineurina, uma serina-

treonina fosfatase dependente de cálcio/calmodulina. O NFAT é então rapidamente

defosforilado pela calcineurina (revisto em Macian, 2005). Uma vez defosforilado, o

NFAT transloca para o núcleo, ligando-se a regiões promotoras e reguladoras de vários

genes, incluindo genes que codificam para citocinas como IL-4, IFN-

, IL-2, IL-5, IL-13 e

GM-CSF, e para moléculas de superfície, como CTLA-4 e CD40L (revisto em Rao

et al.

1997) (

Figura 5

Figura 5: Vias de sinalização que levam a ativação das proteínas da família NFAT através

da geração de influxo de cálcio intracelular. A ativação de receptores que induzem

mobilização de cálcio ativam a PLC, que hidrolisa PtdIns(4,5)P

em InsP

e DAG. O InsP

induz

a liberação de cálcio dos estoques intracelulares. O cálcio se liga à calmodulina, que ativa a

calcineurina, levando a uma rápida defosforilação do NFAT. Uma vez defosforilado, o NFAT

transloca para o núcleo, ligando-se a regiões promotoras e reguladoras de vários genes.

Adaptado de Macian, 2005.

1.5.1 Fenótipo dos camundongos deficientes para NFAT

Camundongos geneticamente modificados com uma deleção dos diferentes

genes que codificam as proteínas NFAT1/2/4 apresentam algumas alterações nas

funções do sistema imune, como descrito na

Tabela 1

. Quando mais de um membro da

família é eliminado, alterações severas em diversas células e funções do sistema imune

tornam-se aparentes, sugerindo que há certo grau de redundância nas funções dessas

proteínas e indicando também que algumas dessas funções podem ser controladas

pela regulação de proteínas NFAT específicas que podem ocupar um determinado

promotor de um determinado gene em momentos diferentes de ativação celular.

Tabela 1: Fenótipo dos animais deficientes para as diferentes proteínas da família

NFAT*.

*Adaptado de Macian, 2005.

No sistema de quimeras de fígado fetal, células T apresentam um

comprometimento de funções efetoras com uma importante diminuição da

produção de citocinas Th1 e Th2. Hiperreatividade de células B.

NFAT1+NFAT2

Função de células T diminuída em condições hiperosmóticas. Celularidade

diminuída no timo e baço.

NFAT5

Desordem linfoproliferativa devido a uma hiperreatividade da resposta dependente

da ativação via TCR e defeito de apoptose de células T. Aumento da resposta Th2

com blefarite alérgica e pneumonite intersticial.

NFAT1+NFAT4

Moderado comprometimento no desenvolvimento de células CD4 e CD8 devido a

um aumento da apoptose de timócitos duplo positivos. Moderada hiperativação de

células T periféricas.

NFAT4

Ainda não mostrado.NFAT3

Fenótipo letal (defeito em desenvolvimento de válvulas cardíacas). No sistema de

complementação de blastocisto de animais RAG-/-, células T e B apresentam uma

redução de proliferação e uma moderada redução da resposta Th2 com uma

diminuição da produção de IL-4.

NFAT2

Hiperproliferação de linfócitos. Aumento moderado da resposta de células T e B

com uma superprodução de IL-4 e outras citocinas Th2, e diminuição de expressão

de IFN-γ. Hipereosinofília e alergia.

NFAT1

Fenótipo dos animais NFAT “knockouts”Proteínas NFAT

Os camundongos NFAT1-deficientes (NFAT1-/-) apresentam desenvolvimento

normal, não exibem deficiências comportamentais óbvias e são, surpreendentemente,

imunocompetentes (Xanthoudakis

et al.

, 1996; Hodge

et al.

, 1996). Além disso, esses

animais apresentam esplenomegalia e uma resposta imune exacerbada, caracterizada

por uma hiperproliferação linfocitária em resposta a diferentes estímulos (Xanthoudakis

et al.

, 1996; Caetano

et al.

, 2002). Quando submetidos a um modelo de pleurisia

alérgica, os animais NFAT1-/- apresentam uma resposta alérgica exacerbada

caracterizada por hipereosinofilia na cavidade pleural e medula óssea, além de um

aumento nos níveis séricos de IgE (Xanthoudakis

et al.

, 1996; Viola

et al.

1998).

Corroborando os resultados da pleurisia alérgica, foi demonstrado que células CD4

NFAT1-/- diferenciam-se preferencialmente para um fenótipo Th2

in vitro

, caracterizado

por alta produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, confirmado pela maior susceptibilidade

dos animais NFAT1-/- a infecção por

L. major

(Kiani

et al.

, 1997).

Estes resultados sugerem que o NFAT1 pode ter um papel regulador negativo da

expressão gênica durante a resposta imune. Entretanto, quando camundongos cujos

linfócitos T não expressam NFAT1 e NFAT2 foram gerados através da transferência do

fígado fetal de doadores NFAT1-/- e NFAT2-/- para receptores letalmente irradiados,

verificou-se que os linfócitos T apresentavam produção de citocinas nula ou

extremamente diminuída, incluindo tanto IFN-γ quanto IL-4 (Peng

et al.

, 2001).

Analisados em conjunto, estes resultados sugerem que o NFAT1 tem papel tanto

positivo quanto negativo na regulação da expressão gênica de linfócitos T. Apesar

disso, as bases moleculares destes efeitos ainda estão por ser identificadas.

1.5.2 NFAT1 na resposta alérgica/asmática

Os resultados descritos na seção acima sugerem fortemente o envolvimento do

NFAT1 na resposta alérgica. A predominância de um fenótipo Th2 e a exacerbação da

resposta alérgica e hipereosinofilia no modelo de pleurisia em camundongos NFAT1-/-

indicam um possível papel desse fator de transcrição nas patologias alérgicas.

Corroborando essa hipótese, camundongos NFAT1-/- x NFAT4-/- desenvolvem

uma síndrome predominantemente Th2, caracterizada por blefarite e pneumonite

alérgicas associadas com aumentos dos níveis séricos de IgG1 e IgE (Ranger

et al

1998). Esses animais apresentam uma diferenciação preferencial para um fenótipo Th2,

com uma produção de IL-4 que pode chegar a ser 600 vezes maior que a de seus

respectivos controles (Ranger

et al

., 1998). A produção de outras citocinas típicas do

fenótipo Th2, como IL-5, IL-6 e IL-10 também está significativamente aumentada,

enquanto a produção de IFN-

e TNF-

apresenta-se diminuída (Ranger

et al

., 1998).

Apesar disso, um estudo recente mostrou que a inibição de todos os membros

da família NFAT em linfócitos T previne inflamação pulmonar alérgica, recrutamento

inicial de eosinófilos para o pulmão e desenvolvimento de uma resposta Th2 em

camundongos submetidos a um modelo de asma experimental (Diehl

et al.

, 2004).

Esses resultados suportam a idéia de que diferentes membros da família NFAT podem

ter papéis específicos durante a resposta imune

in vivo

, já que essa família de fatores

de transcrição é composta de 5 proteínas distintas com propriedades de regulação

gênica também distintas.

1.6 OBJETIVOS

1.6.1 Geral

Com base nas informações apresentadas anteriormente, temos como objetivo

principal estudar o papel do NFAT1 na patologia da asma alérgica, e sua

influência na hiper-reatividade brônquica.

1.6.2 Específicos

•

Confirmar os dados relativos aos ensaios de pleurisia em animais

selvagens e deficientes para NFAT1;

• Avaliar e caracterizar a resposta inflamatória alérgica de animais selvagens

e deficientes para NFAT1 submetidos a um modelo de asma;

• Avaliar a hiper-reatividade brônquica de animais selvagens e deficientes

para NFAT1;

•

Avaliar o papel do NFAT1 na broncoconstricção mediada por receptores

muscarínicos.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Animais utilizados

Foram utilizados camundongos geneticamente deficientes para o fator de

transcrição NFAT1 (NFAT1-/-) (Xanthoudakis

et al.

, 1996) e seus respectivos

controles selvagens: linhagem mista de 129/Sv x C57BL/6 (NFAT1+/+). Os

animais foram mantidos no biotério do Instituto Nacional de Câncer (INCA). Os

animais foram tratados de acordo com as normas de tratamento de animais do

Council for International Organizations of Medical Sciences. Foram utilizados em

todos os experimentos, camundongos de 8 a 12 semanas de idade, criados e

mantidos independentemente.

2.2 Pleurisia

Os animais (5 animais/grupo) foram sensibilizados subcutaneamente em uma das

patas traseiras com 0,1 ml (200

g) de ovalbulmina (OVA) emulsificada em

adjuvante completo de Freund (CFA), na proporção de 1:1. Quinze dias após a

sensibilização a pleurisia alérgica foi induzida por injeção intratorácica de 0,1 ml

de solução de ovalbumina (12 µg/cavidade). Os animais foram sacrificados (asfixia

por CO

) 24 horas depois e sua cavidade torácica foi lavada com 1 ml de PBS 0,1

% BSA (albumina bovina sérica) (Sigma). A suspensão celular recuperada foi

centrifugada e as células resultantes da centrifugação foram ressuspendidas em 1

ml de PBS 0,1 % BSA, diluídas em solução de Turk e contadas em uma câmara

de Newbauer.

2.3 Cultura de células

As culturas de células foram feitas em meio DME (Dulbecco’s modified eagle’s

medium) e mantidas em estufas úmidas a 37ºC, com 5 % de CO

2.4 Modelo experimental de asma

Os animais (6 animais/grupo) foram sensibilizados subcutaneamente em uma das

patas traseiras com 0,1 ml (50 µg) de ovalbulmina (OVA) (Sigma) emulsificada em

adjuvante completo de Freund (CFA) ou em hidróxido de alumínio (20 mg/ml) na

proporção de 1:1. Sete dias após a sensibilização os animais foram novamente

sensibilizados com OVA (50 µg) intraperitonialmente, na ausência de adjuvante.

Sete dias depois os animais foram desafiados através da exposição a um aerosol

de PBS ou OVA 2,5 % em PBS por 30 min durante 3 dias consecutivos.

2.5 Lavado Broncoalveolar (BAL)

Os animais foram submetidos ao modelo experimental de asma descrito na seção

2.4. Vinte e quatro horas após a última aerolização os animais foram sacrificados,

tendo sua traquéia exposta por dissecção. Um tubo plástico de 0,70 mm de

diâmetro foi então inserido e fixado no interior da traquéia. Um volume de 1 ml de

PBS 0,1 % BSA foi instilado e gentilmente aspirado com o auxílio de uma seringa.

Cada amostra de BAL recuperada foi centrifugada e as células resultantes da

centrifugação foram ressuspendidas em 500

l de PBS 0,1 % BSA (Sigma). Uma

alíquota dessa suspensão celular foi então diluída em solução de Turk e contada

em uma câmara de Newbauer.

2.6 Contagem diferencial de células

Alíquotas das suspensões celulares contendo as células totais recuperadas no

lavado pleural ou lavado broncoalveolar foram citocentrifugadas em lâminas de

vidro por 5 minutos a 450 rpm e coradas com May-Grünwald-Giemsa (Merck). A

análise diferencial de leucócitos foi feita com o auxílio de uma objetiva de imersão,

baseada nas características morfológicas e de coloração das células.

2.7 Análise de imunoglobulinas

Para medir a concentração de imunoglobulina E (IgE) no soro dos animais

submetidos à pleurisia alérgica e modelo experimental de asma, o sangue de

animais individuais foi recolhido através de punção cardíaca e deixado coagular

por 30 minutos a 37ºC. As amostras foram então centrifugadas por 5 min a 13000

rpm e o sobrenadante (soro) foi avaliado para os níveis protéicos de IgE através

da metodologia de ELISA, como descrito pelo fabricante (BD Pharmingen).

2.8 Estimulação

in vitro

Os animais (5 animais/grupo) foram sensibilizados como descrito na seção 2.4.

Quinze dias após a sensibilização os linfonodos drenantes (inguinais e poplíteos)

da pata sensibilizada foram recolhidos e estimulados

in vitro

com anti-CD3 (1

µg/ml) (2C11) fixado à placa. Quarenta e oito horas após a estimulação, os

sobrenadantes das culturas foram recolhidos e avaliados para IL-4 e IFN-γ através

da metodologia de ELISA (BD Pharmingen).

2.9 Análise de citocinas e quimiocinas

Os animais (3 animais/grupo) foram submetidos ao modelo experimental de asma

descrito na seção 2.4. Vinte e quatro horas após a última aerolização os animais

foram sacrificados e tiveram seus pulmões isolados. O tecido retirado (0,1 g) foi

colocado em 1 ml de tampão de homogeneização e homogeneizado com o auxílio

de um homogeneizador de tecidos. Os homogenatos foram imediatamente

congelados em nitrogênio líquido. Posteriormente ao uso das amostras, essas

foram descongeladas e centrifugadas a 6000 g por 20 min a 4ºC. Os

sobrenadantes foram então coletados para quantificação de proteínas totais e

análise de citocinas e quimiocinas através da metodologia de ELISA (BD

Pharmingen).

2.10 Histopatologia

Os animais (3 animais/grupo) foram submetidos ao modelo experimental de asma

descrito na seção 2.4. Vinte e quatro horas após a última aerolização os animais

foram sacrificados e tiveram seus pulmões isolados, fixados, embebidos em

parafina e seccionados na espessura de 5

m com o auxílio de um micrótomo. As

secções foram montadas em lâminas de vidro e coradas com Hematoxilina e

Eosina (HE), tricrômico de Gomori e PAS (Periodic Acid-Schiff). As secções foram

então avaliadas por microscopia óptica.

2.11 Análise da (hiper-) reatividade brônquica

As análises de (hiper-) reatividade brônquica foram feitas em animais não-

anestesiados e não-imobilizados utilizando-se o sistema conhecido como

pletismografia barométrica de corpo inteiro (Buxco

Electronics, Sharon, CT, USA),

como descrito por Hamelmann e colaboradores (1997). A reatividade brônquica foi

avaliada utilizando estímulos de metacolina ou serotonina (5-hidroxitriptamina). Os

animais foram colocados numa câmara de acrílico (Buxco) e os parâmetros

respiratórios foram medidos após exposição por 2 min a aerosol de 0, 6, 12 e 24

mg/ml de metacolina ou 0, 5, 10 e 20 mg/ml de serotonina. A impedância expressa

em Penh (enhanced pause), foi calculada de acordo com os parâmetros

recomendados pelo fabricante: Penh = [(tempo de expiração/tempo de

relaxamento) - 1] × (pico do fluxo expiratório/pico do fluxo inspiratório). Antes de

medirem-se as variações de Penh provocadas pela exposição dos animais aos

agonistas aerolizados, valores basais de Penh foram obtidos em resposta à

aerolização do veículo (PBS).

2.12 RT-PCR

Para os ensaios de RT-PCR, secções de tecido do pulmão de camundongos

selvagens e deficientes para NFAT1 (3 animais/grupo) foram retiradas e

congeladas imediatamente em nitrogênio líquido. Posteriormente as amostras

congeladas foram colocadas separadamente na presença de 1ml de Trizol (Gibco)

e homogeneizadas com o auxílio de um homogenizador de tecidos. O RNA total

das amostras foi extraído de acordo com as recomendações do fabricante. Cinco

microgramas de RNA total foram incubados por 5 min a 65ºC na presença de 2,5

M oligo(dT) e 0,5 mM dNTP. As amostras foram então colocadas a 4ºC por 1 min

e posteriormente incubadas a 50ºC por 1 h na presença de 0,5 mM DTT e 200 U

Superscript III RNase Transcriptase Reversa (Invitrogen). Para a reação de PCR

as amostras foram incubadas na presença de 2 mM MgCl

(Invitrogen), 20 pmoles

de cada primer (Dialab Diagnósticos), 0,25 mM dNTP e 2 U Taq DNA polimerase

(Invitrogen). Condições de amplificação: 10 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 seg a

94ºC, 20 seg a 62ºC e 30 seg a 73ºC, seguidos de 7 min a 73ºC.

A seqüência dos primers utilizados está demonstrada na tabela a seguir:

Gene Primer Seqüência

Tamanho do

produto (pb)

mAChR1

Fwd

Rev

cag tcc caa cat cac cgt ctt

gag aac gaa gga aac caa cca c

441

mAChR2

Fwd

Rev

tgt ctc cca gtc tag tgc aag g

cat tct gac ctg acg atc caa c

369

mAChR3

Fwd

Rev

gta caa cct cgc ctt tgt ttc c

gac aag gat gtt gcc gat gat g

245

GAPDH

Fwd

Rev

gtg atg ggt gtg aac cac gag

cca cta tgc caa agt tgt ca

120

2.13 Análise estatística

Os resultados foram expressos em média +

SEM.

A análise estatística dos valores

correspondentes aos camundongos selvagens e deficientes para NFAT1 foi

determinada utilizando um teste

de Student para comparações simples, ou uma

análise de variância seguida da Student-Newman-Keuls para comparações

múltiplas.

<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

2.14 Soluções e reagentes utilizados

2.14.1 PBS 1x

8,0g NaCl

1,44g NaH

0,24g KH

0,2g KCl

Água milli-Q q.s.p

2.14.2 Ovalbumina

Foi feita uma solução estoque de 4 mg de OVA (Sigma) em 1 ml de PBS 1x. Para

a sensibilização dos animais utilizamos uma parte dessa solução para uma parte

de CFA (Sigma) ou Hidróxido de Alumínio (Pepsamar – Sanofi-Synthelabo). Para

a aerolização dos animais foi feita uma solução de 2,5 % de OVA em PBS 1x.

2.14.3 Solução de Turk

2 % de ácido acético

0,01 % de cristal violeta

Água milli-Q q.s.p

2.14.4 DMEM suplementado

O meio DME (Dulbecco’s modified eagle’s medium - high glucose - A13233)

(Gibco) foi suplementado com 10 % SFB (Gibco), 40 mM de Bicarbonato de Sódio

(Sigma), 1 mM de Fosfato de Sódio Monobásico (Reagen), 1 mM de Piruvato de

Sódio (Gibco), aminoácidos essenciais (Gibco), aminoácidos não-essenciais

(Gibco), vitaminas (Gibco), 10 mM de HEPES (Gibco), 100.000 U/L de penicilina e

100 mg/ml de estreptomicina (Gibco), 2 mM de L-glutamina (Gibco) e 55 µM de β-

mercaptoetanol (Gibco).

2.14.5 Hidróxido de alumínio

Para obtenção da solução de hidróxido de alumínio, diluímos 24 ml de Pepsamar

(Sanofi-Synthelabo) em 320 ml de água milli-Q e centrifugamos a 3000 rpm por 6

min. O sedimento resultante da centrifugação foi lavado 3 vezes em água milli-Q e

centrifugado a 2500 rpm por 6 min. Após a última lavagem o sedimento foi

transferido para um becher e adicionado dos seguintes reagentes: 25 ml de Tris

0,01 M pH 7, 1,8 ml de HCl 1 N, 2,9 g de NaCl e 223 ml de água milli-Q. A solução

resultante foi homogeneizada por 30 min. A solução foi então dividida em 5 partes

de 1 ml e cada uma foi transferida para um becher independente. A solução foi

aquecida a 100ºC por 24 h e, ao final desse processo de secagem, determinamos

o peso seco da solução, obtendo a concentração exata do hidróxido de alumínio

por ml. Para a sensibilização dos animais foi feita uma solução estoque de 20

mg/ml de hidróxido de alumínio e utilizamos uma parte dessa solução para uma

parte de ovalbumina, como descrito no item 2.14.2 desta seção.

2.14.6 Tampão de homogeneização

500 mM NaCl

50 mM Hepes, pH 7.4

0,1 % Triton X-100

0,5 mg/ml de leupeptina

1 mM PMSF

0.02 % NaN

PBS 1x q.s.p

3. RESULTADOS

Como demonstrado por Viola e colaboradores (1998), os animais deficientes

para NFAT1 (NFAT1-/-) ao serem submetidos a um modelo de pleurisia, apresentam

hipereosinofilia e altos níveis séricos de IgE quando comparados aos seus

respectivos controles selvagens (NFAT1+/+). A fim de confirmar esses resultados e

caracterizar o padrão da resposta alérgica desses animais, submetemos animais

NFAT1+/+ e NFAT1-/- ao mesmo modelo de pleurisia alérgica, como descrito na

Figura 6.

Figura 6: Esquema do modelo in vivo de pleurisia: Os animais foram sensibilizados

subcutaneamente com OVA emulsificada em CFA em uma das patas traseiras. Quinze dias

depois, os animais foram desafiados com uma injeção intratorácica de PBS ou OVA,

conforme indicado. As análises seguintes foram feitas 24 h após o desafio.

Como o aumento dos níveis séricos de IgE é uma das características

marcantes das patologias alérgicas, o sangue dos animais submetidos à inflamação

alérgica foi coletado, processado e analisado para os níveis de IgE. Também foi

avaliado o influxo de leucócitos na cavidade pleural de animais selvagens e

deficientes para NFAT1, submetidos ao modelo de alergia descrito anteriormente

(Figura 6).

Os animais desafiados com OVA desenvolveram um processo inflamatório

alérgico aumentado quando comparados aos controles desafiados com PBS, uma

vez que foi observado um maior influxo de eosinófilos na cavidade pleural tanto de

animais NFAT1+/+, quanto de animais NFAT1-/- desafiados com OVA (Figura 7).

Apesar de ambos animais apresentarem eosinofilia característica de uma resposta

inflamatória alérgica, os animais NFAT1-/- apresentam uma hipereosinofilia quando

Sensibilização

(s.c.)

OVA + CFA

Desafio

(i.t.)

(PBS ou OVA)

Análises

Dias

comparados com seus respectivos controles selvagens (Figura 7). Da mesma

forma, os animais NFAT1-/- também apresentam uma alta concentração de IgE no

soro (Figura 8). Esses resultados corroboram dados anteriores demonstrando que

os animais NFAT1-/- realmente apresentam uma resposta alérgica exacerbada

quando comparados com seus respectivos controles.

Figura 7: Caracterização do fenótipo alérgico de animais selvagens e deficientes para

NFAT1 submetidos ao modelo de pleurisia. Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes

(NFAT1-/-) para NFAT1 foram sensibilizados como descrito na Figura 6. Vinte e quatro

horas após o desafio, a cavidade torácica foi lavada e a suspensão celular foi

citocentrifugada e corada com May-Grünwald/Giemsa para análise diferencial de leucócitos.

Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo de 3 experimentos

independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando comparados com

animais NFAT1+/+ desafiados com OVA (

<0,05).

Leucócitos

totais

Céls

mononucleares

Neutrófilos

Eosinófilos

PBS OVA PBS OVA PBS OVA PBS OVA

NFAT1+/+

NFAT1-/-

Leucócitos

(x10

-6

células/cavidade)

Figura 8: Caracterização dos níveis séricos de IgE de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/-

submetidos ao modelo de pleurisia. Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-

/-) para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como descrito na Figura 6. Vinte e quatro

horas após o desafio, o sangue dos animais foi coletado através de punção cardíaca,

coagulado e centrifugado. O sobrenadante (soro) foi coletado e acessado para IgE através

da metodologia de ELISA. Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo de 3

experimentos independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando

comparados com animais NFAT1+/+ desafiados com OVA (

<0,05).

Com base nesses dados, estabelecemos um modelo de inflamação alérgica

pulmonar que mimetiza a resposta asmática induzida por alergenos a fim de avaliar

o envolvimento do NFAT1 na patologia da asma. Os animais foram então

submetidos a um modelo experimental de asma, conforme descrito na Figura 9.

Figura 9: Esquema do modelo experimental de asma. Os animais foram sensibilizados

subcutaneamente com OVA emulsificada em CFA ou hidróxido de alumínio em uma das patas

traseiras. Sete dias após a sensibilização os animais foram novamente sensibilizados com OVA

intraperitonialmente, na ausência de adjuvante. Sete dias depois os animais foram desafiados

através da exposição a um aerosol de PBS ou OVA durante 3 dias consecutivos. As análises

seguintes foram feitas 24 h após o desafio.

10000

20000

30000

40000

NFAT1-/-

NFAT1+/+

IgE (ng/ml)

0151614717

Dias

50µg Ova

(s.c.)

CFA ou Al

(OH)

50µg Ova

(i.p.)

Desafio (aerosol)

Ova 2,5%

30 min

Análises

OVA OVA

O lavado broncoalveolar (BAL) desses animais mostrou que os animais

desafiados com OVA apresentam aumento do influxo de leucócitos totais,

particularmente de eosinófilos, quando comparados aos seus respectivos controles

desafiados com PBS (Figura 10). Esse fato demonstra a eficácia do modelo

experimental escolhido uma vez que a eosinofilia é característica marcante das

patologias asmáticas. Tal como no modelo de pleurisia, os animais NFAT1-/-

desafiados com OVA apresentaram hipereosinofilia quando comparados com os

animais selvagens (Figura 10). De forma similar, os animais NFAT1-/- também

apresentam uma alta concentração de IgE sérica, quando comparados com os

animais NFAT1+/+ (Figura 11).

Figura 10: Caracterização do lavado broncoalveolar (BAL) de animais NFAT1+/+ e

NFAT1-/- submetidos ao modelo de asma.

Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes

(NFAT1-/-) para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte

e quatro horas após a última aerolização foi feito um lavado broncoalveolar dos animais. A

suspensão celular recolhida foi citocentrifugada e corada com May-Grünwald/Giemsa para

análise diferencial de leucócitos. Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo

de 4 experimentos independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando

comparados com animais NFAT1+/+ desafiados com OVA (

<0,05).

PBS OVA PBS OVA PBS OVA PBS OVA

NFAT1+/+

NFAT1-/-

Leucócitos

totais

Céls

mononucleares

Neutrófilos

Eosinófilos

Leucócitos (x10

-4

células/BAL)

Figura 11: Caracterização dos níveis séricos de IgE de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/-

submetidos ao modelo de asma.

Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-)

para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro

horas após o desafio, o sangue dos animais foi coletado através de punção cardíaca,

coagulado e centrifugado. O sobrenadante (soro) foi coletado e acessado para IgE através

da metodologia de ELISA. Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo de 3

experimentos independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando

comparados com animais NFAT1+/+ desafiados com OVA (

<0,05).

Como demonstrado por Kiani e colaboradores (1997), os linfócitos T CD4

animais deficientes em NFAT1, quando submetidos a um protocolo de diferenciação

in vitro na ausência de citocinas exógenas, diferenciam-se preferencialmente para

um fenótipo Th2. Para caracterizar o padrão de resposta predominante e a produção

de IFN-γ e IL-4 in vivo pelos linfócitos destes animais, estes foram sensibilizados

subcutaneamente com OVA em uma das patas traseiras. Quinze dias após a

sensibilização, os linfonodos drenantes das patas sensibilizadas foram então

recolhidos e estimulados in vitro. Na Figura 12 podemos observar que, de fato, os

linfócitos NFAT1-/- apresentam alta produção de IL-4 e baixa produção de IFN-γ,

caracterizando a resposta Th2 predominante observada anteriormente. Já os

linfócitos dos animais NFAT1+/+ apresentam alta produção de IFN-γ e baixa

produção de IL-4, característica de uma resposta Th1 (Figura 12). Esses dados

demonstram que os animais NFAT1-/- apresentam um padrão de resposta

característico de um fenótipo Th2 in vivo. Além disso, observamos que os animais

25000

50000

75000

NFAT1-/-

NFAT1+/+

IgE (ng/ml)

OVA OVA

NFAT1-/- apresentam inflamação alérgica exacerbada em relação aos animais

NFAT1+/+, caracterizada por hipereosinofilia e altos níveis de IgE sérica. Em

conjunto, esses resultados sugerem um papel importante do NFAT1 na patologia de

doenças alérgicas pulmonares.

Figura 12: Padrão de produção de IFN-γ e IL-4 por linfócitos de animais NFAT1+/+ e

NFAT1-/- sensibilizados

in vivo. Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-)

para NFAT1 foram sensibilizados como descrito na

Figura 9. Quinze dias depois, os

linfonodos drenantes (inguinais e poplíteos) das patas traseiras foram recolhidos e as

células foram estimuladas

in vitro

por 48 h com anti-CD3 fixado à placa. Os sobrenadantes

foram então recolhidos e acessados para IFN-γ e IL-4 através da metodologia de ELISA.

Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo de 2 experimentos

independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando comparados com

animais NFAT1+/+ (

<0,05).

A fim de caracterizarmos o perfil de citocinas e quimiocinas estabelecido no

microambiente pulmonar desses animais, os níveis de IL-13 e eotaxina foram

medidos no tecido pulmonar de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- submetidos ao

modelo descrito na Figura 9 e desafiados com OVA.

Como demonstrado na Figura 13, os animais NFAT1-/- apresentam níveis de

IL-13 no pulmão ligeiramente aumentados se comparados aos níveis apresentados

pelos animais NFAT1+/+, apesar desse resultado não ter atingido diferença

estatisticamente significativa (p=0,1793). Além disso, os animais NFAT1-/- possuem

níveis aumentados de eotaxina quando comparados aos animais NFAT1+/+,

corroborando o maior influxo de eosinófilos no pulmão demonstrado nas análises de

BAL dos animais NFAT1-/- (Figura 14).

PBS

-CD3

100

200

NFAT1+/+

NFAT1-/-

IFN-

(ng/mL)

PBS

-CD3

0.0

0.1

0.2

0.3

NFAT1+/+

NFAT1-/-

IL-4 (ng/mL)

Figura 13: Níveis de IL-13 nos pulmões de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- desafiados

com OVA.

Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1 foram

sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após o desafio,

o pulmão dos animais foi isolado, homogeneizado e centrifugado. O sobrenadante foi

coletado e acessado para IL-13 através da metodologia de ELISA. Resultado expresso em

média +

EPM (n=4), representativo de 1 experimento.

Figura 14: Níveis de eotaxina nos pulmões de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/-

desafiados com OVA.

Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1

foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após o

desafio, o pulmão dos animais foi isolado, homogeneizado e centrifugado. O sobrenadante

foi coletado e acessado para eotaxina através da metodologia de ELISA. Resultado

expresso em média +

EPM (n=4), representativo de 1 experimento. (*) Resultados

significativamente diferentes quando comparados com animais NFAT1+/+ (

<0,05).

100

200

300

400

500

NFAT1+/+

NFAT1-/-

IL-13

(pg/mg de proteína)

100

NFAT1+/+

NFAT1-/-

Eotaxina

(pmoles/mg de proteína)

OVA OVA

Com base nesses resultados decidimos avaliar as características histológicas

do pulmão de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/-, a fim de verificar quaisquer alterações

na estruturação do tecido pulmonar desses animais. Para isso, os animais foram

submetidos ao modelo de asma descrito na Figura 9 e 24 h após a última

aerolização seus pulmões foram isolados, fixados, embebidos em parafina e

seccionados. As secções foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE), para

avaliarmos a estruturação tecidual geral do pulmão, bem como a ausência ou

presença de influxo leucocitário; tricrômico de Gomori, para avaliarmos a deposição

de colágeno no tecido; e PAS (Periodic Acid-Schiff), a fim de verificarmos a

produção de mucopolissacarídeos pelas células caliciformes.

Na Figura 15 (A e C) podemos observar que os animais desafiados com

PBS, tanto NFAT1+/+ quanto NFAT1-/-, apresentam parênquima pulmonar limpo,

sem qualquer infiltrado celular. Já os animais desafiados com OVA apresentam

intenso infiltrado inflamatório, caracterizado pela presença de leucócitos tanto no

parênquima pulmonar quanto na região peribronquiolar (Figura 15B e D). Como

demonstrado na Figura 15D os animais NFAT1-/- apresentam infiltrado leucocitário

aumentado em relação aos animais NFAT1+/+, corroborando os dados obtidos nas

análises de BAL.

Em comparação aos seus respectivos controles, os animais NFAT1+/+ e

NFAT1-/- desafiados com OVA também apresentam deposição de colágeno na

região peribronquiolar (Figura 16A e C). Podemos observar também que os animais

NFAT1-/- demonstram maior acúmulo de colágeno nessa região, evidenciado por

um espessamento maior da área logo abaixo da membrana basal em comparação

aos animais NFAT1+/+ (Figura 16C e D).

Como demonstrado na Figura 17, comparados com os animais controle

desafiados com PBS, há um grande aumento na produção de muco pelas células do

epitélio dos animais NFAT1+/+ desafiados com OVA (Figura 17A e B). Por outro

lado, esse aumento foi mais discreto quando comparamos a produção de muco

pelas células dos animais NFAT1-/- com seus respectivos controles desafiados com

PBS (Figura 17C e D). Da mesma forma, a produção de muco pelos animais

NFAT1-/- também se apresenta diminuída em relação aos animais NFAT1+/+

(Figura 17B e D).

NFAT1+/+ NFAT1-/-

PBS

OVA

Figura 15:

Histopatologia dos pulmões de animais NAFT1+/+ e NFAT1-/- submetidos ao modelo de asma. Animais selvagens

(NFAT1+/+) (A e B) e deficientes (NFAT1-/-) (C e D) para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro

horas após o desafio, os animais foram sacrificados e tiveram seus pulmões isolados, fixados, embebidos em parafina e seccionados com o

auxílio de um criostato. As lâminas foram coradas com Hematoxilina e Eosina e foram avaliadas por microscopia óptica com aumento de 40X.

Figura 16: Histopatologia dos pulmões de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- submetidos ao modelo de asma. Animais selvagens

(NFAT1+/+) (A e B) e deficientes (NFAT1-/-) (C e D) para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro

horas após o desafio, os animais foram sacrificados e tiveram seus pulmões isolados, fixados, embebidos em parafina e seccionados com o

auxílio de um criostato. As lâminas foram coradas com tricrômico de Gomori e avaliadas por microscopia óptica com aumento de 40X.

NFAT1+/+ NFAT1-/-

PBS

OVA

Figura 17: Histopatolgia dos pulmões de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- submetidos ao modelo de asma.

Animais selvagens (NFAT1+/+)

(A e B) e deficientes (NFAT1-/-) (C e D) para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após o

desafio, os animais foram sacrificados e tiveram seus pulmões isolados, fixados, embebidos em parafina e seccionados com o auxílio de um

criostato. As lâminas foram coradas com PAS (Periodic Acid-Schiff) e avaliadas por microscopia óptica com aumento de 60X.

NFAT1+/+ NFAT1-/-

PBS

OVA

A asma é uma manifestação alérgica caracterizada principalmente pela

inflamação crônica da mucosa brônquica, níveis aumentados de IgE sérica e por

uma hiper-reatividade das vias aéreas. Os resultados anteriores mostram que os

animais NFAT1-/- submetidos ao modelo experimental de asma apresentam

inflamação pulmonar, caracterizada por uma hipereosinofilia, e altos níveis de IgE

sérica, além de apresentarem alterações características da patologia asmática na

estrutura do pulmão, sugerindo que esses animais desenvolvem asma exacerbada

em relação a seus respectivos controles. Dessa forma, decidimos avaliar a hiper-

reatividade brônquica dos animais selvagens e deficientes para NFAT1 através do

método não-invasivo de “enhanced pause” (Penh). Os animais foram então

submetidos ao modelo experimental de asma descrito na Figura 9 e a hiper-

reatividade a um broncoconstrictor análogo à acetilcolina, a metacolina, foi avaliada

24 h após a última aerolização.

Na Figura 18, podemos observar que comparados com os animais

desafiados com PBS, os animais NFAT1+/+ desafiados com OVA apresentam

broncoconstrição aumentada em resposta à metacolina, corroborando os dados de

eosinofilia e IgE sérica observados anteriormente (Figuras 10 e 11). Já os animais

NFAT1-/- desafiados com OVA, os quais possuem inflamação e níveis de IgE

aumentados em relação aos animais NFAT1+/+, surpreendentemente não

apresentam hiper-reatividade em relação aos controles desafiados com PBS,

mesmo quando submetidos às maiores concentrações de metacolina (Figura 18).

Similarmente, os animais NFAT1-/- desafiados com PBS também não apresentam a

broncoconstrição basal observada nos animais NFAT1+/+ desafiados da mesma

maneira (Figura 18).

Figura 18: Hiper-reatividade à metacolina de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- submetidos

ao modelo de asma.

Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1

foram sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após a

última aerolização a hiper-reatividade brônquica dos animais foi analisada por pletismografia

barométrica. Os parâmetros respiratórios foram medidos após exposição a aerosol de

metacolina, conforme indicado. A resistência é expressa em Penh (enhanced pause), de

acordo com os parâmetros recomendados pelo fabricante. Resultado expresso em média

EPM (n=5), representativo de 3 experimentos independentes. (*) Resultados

significativamente diferentes quando comparados com animais NFAT1-/- desafiados com

OVA (

<0,05).

A fim de adequarmos nosso modelo aos modelos experimentais de asma

mais utilizados na literatura e dessa forma corroborar os resultados de hiper-

reatividade observados, utilizamos como adjuvante na sensibilização o hidróxido de

alumínio ao invés do adjuvante completo de Freund (CFA). Os animais foram então

submetidos ao mesmo modelo experimental de asma descrito na Figura 9 e um

lavado broncoalveolar foi feito para avaliar o influxo de leucócitos no pulmão dos

animais. Como demonstrado na Figura 19, tanto os animais NFAT1+/+, quanto os

animais NFAT1-/- desafiados com OVA apresentam níveis similares de eosinofilia

pulmonar, ao contrário do que ocorre quando os animais são sensibilizados na

presença de CFA (Figura 10).

Apesar de não observarmos diferenças no influxo de eosinófilos entre os

animais selvagens e deficientes para NFAT1, ambos apresentam influxo inflamatório

característico da resposta asmática (Figura 19). Por esse motivo, decidimos avaliar

a hiper-reatividade brônquica desses animais sensibilizados com hidróxido de

0 6 12 24

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NFAT1+/+ PBS

NFAT1+/+ OVA

NFAT1-/- PBS

NFAT1-/- OVA

Metacolina (mg/ml)

Penh

alumínio. Os animais foram então submetidos ao modelo experimental de asma

descrito na Figura 9 e a hiper-reatividade brônquica à metacolina foi avaliada 24 h

após a última aerolização. Na Figura 20 podemos observar que enquanto os

animais NFAT1+/+ desafiados com OVA apresentam hiper-reatividade brônquica em

relação aos controles desafiados com PBS, os animais NFAT1-/- não induzem a

broncoconstrição característica dessa hiper-reatividade. Portanto, independente do

adjuvante utilizado na sensibilização dos animais, os animais NFAT1-/- não induzem

broncoconstrição em resposta à metacolina, mesmo quando submetidos às maiores

concentrações desse mediador.

Figura 19: Caracterização do lavado broncoalveolar (BAL) de animais NFAT1+/+ e

NFAT1-/- submetidos ao modelo de asma na presença de hidróxido de alumínio.

Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1 foram sensibilizados e

desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após a última aerolização o

pulmão dos animais foi lavado com PBS 0.1% BSA. A suspensão celular recolhida foi

citocentrifugada e corada com May-Grünwald/Giemsa para análise diferencial de leucócitos.

Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo de 3 experimentos

independentes. (*) Resultados significativamente diferentes

quando comparados com

animais NFAT1+/+ desafiados com OVA (

<0,05).

Céls

mononucleares

PBS OVA PBS OVA PBS OVA PBS OVA

NFAT1+/+

NFAT1-/-

Leucócitos

totais

Neutrófilos Eosinófilos

Leucócitos (x10

-4

células/BAL)

Figura 20: Hiper-reatividade à metacolina de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- submetidos

ao modelo de asma na presença de hidróxido de alumínio.

Animais selvagens

(NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1 foram sensibilizados e desafiados como

descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após a última aerolização a hiper-reatividade

brônquica dos animais foi analisada por pletismografia barométrica. Os parâmetros

respiratórios foram medidos após exposição a aerosol de metacolina, conforme indicado. A

resistência é expressa em Penh (enhanced pause), de acordo com os parâmetros

recomendados pelo fabricante. Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo

de 3 experimentos independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando

comparados com NFAT1-/- desafiados com OVA (

<0,05).

Com base nesses dados, decidimos investigar a capacidade de

broncoconstrição natural de animais “naive”, não sensibilizados ou submetidos a

qualquer manipulação. Para isso animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- “naive” foram

submetidos a aerosol de diferentes concentrações de metacolina. Verificamos então

que os animais NFAT1-/- apresentam broncoconstrição diminuída em relação aos

seus respectivos controles selvagens (Figura 21). Ou seja, os animais NFAT1-/-

apresentam naturalmente uma capacidade de broncoconstrição diminuída em

resposta à metacolina.

0 6 12 24

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NFAT1+/+ PBS

NFAT1+/+ OVA

NFAT1-/- PBS

NFAT1-/- OVA

Metacolina (mg/ml)

Penh

Figura 21: Reatividade à metacolina de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- “naive”.

reatividade brônquica dos animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para

NFAT1 foi analisada por pletismografia barométrica. Os parâmetros respiratórios foram

medidos após exposição a aerosol de metacolina, conforme indicado. A resistência é

expressa em Penh (enhanced pause), de acordo com os parâmetros recomendados pelo

fabricante. Resultado expresso em média +

EPM (n=5), representativo de 3 experimentos

independentes. (*) Resultados significativamente diferentes quando comparados com

animais NFAT1-/- desafiados com OVA (

<0,05).

A fim de confirmar o envolvimento do NFAT1 no fenômeno de

broncoconstrição induzida por metacolina, animais NFAT1+/+ “naive” receberam

diferentes concentrações de ciclosporina A (CsA), um bloqueador da ativação do

NFAT. Três horas após o tratamento, os animais NFAT1+/+ tratados com CsA,

juntamente com animais “naive” NFAT1+/+ não-tratados e animais “naive” NFAT1-/-,

foram submetidos a aerosol de diferentes concentrações de metacolina. Os animais

NFAT1+/+ tratados com a menor concentração de CsA (20 mg/kg) já apresentam

redução na broncoconstrição induzida por metacolina quando comparados aos

animais NFAT1+/+ (Figura 22A). Essa redução torna-se mais pronunciada nos

animais tratados com 50 mg/kg de CsA, os quais já apresentam broncoconstrição

diminuída quando submetidos a concentração de 12 mg/ml de metacolina,

aproximando-se dos níveis de Penh apresentados pelos animais NFAT1-/- (Figura

22B

). Esses resultados demonstram que ao bloquear a ativação do NFAT1, ocorre

inibição da broncoconstrição induzida por metacolina de forma similar ao que ocorre

0 6 12 24

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NFAT1+/+

NFAT1-/-

Metacolina (mg/ml)

Penh

com os animais NFAT1-/-, sugerindo fortemente o envolvimento do NFAT1 nesse

processo.

Figura 22: Reatividade à metacolina de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- “naive” tratados

com CsA.

A reatividade brônquica dos animais selvagens (NFAT1+/+), tratados ou não com

diferentes concentrações de Cisclosporina A (CsA), e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1 foi

analisada por pletismografia barométrica. Os animais foram tratados com

A) 20 mg/kg ou B)

50 mg/kg de CsA e foram analisados 3 horas após o tratamento. Os parâmetros

respiratórios foram medidos após exposição a aerosol de metacolina, conforme indicado. A

resistência é expressa em Penh (enhanced pause), de acordo com os parâmetros

recomendados pelo fabricante. Resultados expressos em média +

EPM (n=5),

representativos de 2 experimentos independentes. (*) Resultados significativamente

diferentes quando comparados com os animais NFAT1-/- (

<0,05). (+) Resultados

significativamente diferentes quando comparados com os animais NFAT1+/+ (

<0,05).

0 6 12 24

NFAT1+/+

NFAT1-/-

NFAT1+/+ CsA 20 mg/kg

Metacolina (mg/ml)

Penh

0 6 12 24

NFAT1+/+

NFAT1-/-

NFAT1+/+ CsA 50 mg/kg

Metacolina (mg/ml)

Penh

Para avaliar a especificidade da participação do NFAT1 na broncoconstrição

induzida pela via colinérgica utilizamos um mediador que induz broncoconstrição por

outra via. Para isso animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- “naive” foram submetidos a

aerosol de diferentes concentrações de serotonina. Verificamos então que os

animais NFAT1-/- apresentam níveis de broncoconstrição similares aos níveis dos

animais NFAT1+/+ (Figura 23A). Portanto, os animais NFAT1-/- têm capacidade

normal de broncoconstrição em resposta à serotonina, mostrando que as células da

musculatura lisa do pulmão desses animais têm capacidade de contração. Dessa

forma, os dados sugerem que a falha na indução da resposta bronconstrictora está

envolvida exclusivamente com a via dos receptores muscarínicos.

Baseados nesses resultados decidimos investigar os níveis de hiper-

reatividade à serotonina dos animais NFAT1-/- e NFAT1+/+ quando os submetemos

ao modelo experimental de asma utilizado inicialmente. Na Figura 23B podemos

observar que os animais NFAT1-/- desafiados com OVA apresentam hiper-

reatividade brônquica aumentada em relação aos animais NFAT1+/+ desafiados da

mesma maneira. Esses resultados demonstram que os animais NFAT1-/- são hiper-

reativos e têm real capacidade de broncoconstrição, perdendo essa capacidade

quando esta é especificamente induzida por um estímulo colinérgico, como a

metacolina.

Figura 23: (Hiper-) reatividade à serotonina de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- “naive” e

submetidos ao modelo de asma. A)

A reatividade brônquica dos animais selvagens

(NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1 foi analisada por pletismografia

barométrica.

B) Animais selvagens (NFAT1+/+) e deficientes (NFAT1-/-) para NFAT1 foram

sensibilizados e desafiados como descrito na

Figura 9. Vinte e quatro horas após a última

aerolização a hiper-reatividade brônquica dos animais foi analisada por pletismografia

barométrica.

A e B) Os parâmetros respiratórios foram medidos após exposição a aerosol

de serotonina, conforme indicado. A resistência é expressa em Penh (enhanced pause), de

acordo com os parâmetros recomendados pelo fabricante. Resultados expressos em média

EPM (n=5), representativos de 3 experimentos independentes. (*) Resultados

significativamente diferentes quando comparados com os animais NFAT1+/+ desafiados

com OVA (

B) ou não (A) (

<0,05).

0 5 10 20

NFAT1+/+ PBS

NFAT1+/+ OVA

NFAT1-/- PBS

NFAT1-/- OVA

Serotonina (mg/ml)

Penh

0 5 10 20

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

NFAT1+/+

NFAT1-/-

Serotonina (mg/ml)

Penh

Uma das hipóteses que poderia explicar a ausência de broncoconstrição

induzida pela via colinérgica seria a ausência dos receptores muscarínicos nas

células do pulmão de animais NFAT1-/-. Para avaliarmos essa hipótese fizemos uma

reação de RT-PCR utilizando como amostras o RNA total do pulmão de três animais

“naive” individuais NFAT1+/+ e NFAT1-/-.

Na Figura 24 podemos verificar que ambas linhagens de camundongos

NFAT1+/+ e NFAT1-/- expressam mRNAs para esses receptores em seu tecido

pulmonar, em quantidades relativamente similares. Dessa forma a ausência de

hiper-reatividade dos animais NFAT1-/- em relação aos controles selvagens não

pode ser explicada por uma ausência ou diminuição da expressão do mRNA para os

receptores da via colinérgica nos pulmões desses animais.

Figura 24: Análise por RT-PCR da expressão dos receptores muscarínicos 1-3 em

extratos de tecido pulmonar de animais NFAT1+/+ e NFAT1-/-.

Primers específicos para

os receptores mAChR1, 2 e 3 foram utilizados para amplificar o cDNA derivado de extratos

de tecido pulmonar de animais NFAT1+/+ (três primeiras colunas) e NFAT1-/- (três últimas

colunas). Os detalhes da seqüência dos primers ou condições da reação de RT-PCR estão

descritos na

seção 2.12 do Material e Métodos.

mAChR1

mAChR2

mAChR3

GAPDH

NFAT1

+/+ -/-+/+ +/+ -/- -/-

4. DISCUSSÃO

A incidência, morbidade e mortalidade da asma cresceram mundialmente

nas últimas décadas. A asma é uma doença inflamatória do pulmão,

extremamente complexa, caracterizada pela obstrução do fluxo de ar para as vias

aéreas, hiper-reatividade brônquica e inflamação das vias aéreas.

A hiper-reatividade brônquica é uma característica marcante da asma,

definida como uma broncoconstrição excessiva das vias aéreas em resposta a

uma variedade de estímulos contráteis. Elucidar os mecanismos moleculares que

induzem ou mantêm essa hiper-reatividade é extremamente importante para o

desenvolvimento de novos tratamentos para doenças pulmonares. Diversas

evidências sugerem que a contração da musculatura lisa das vias aéreas em

resposta à estimulação por receptores acoplados a proteínas G regula o tônus

broncomotor (revisto em Amrani & Panettieri, 2002). A contração da musculatura

lisa é iniciada por aumento nas concentrações intracelulares de Ca

subseqüente ativação da maquinaria contrátil. Os níveis intracelulares de Ca

são

o principal determinante na contratibilidade das células da musculatura lisa. O

NFAT1 é um fator de transcrição, constitutivamente expresso no citoplasma,

ativado por Ca

(revisto em Rao

et al.

, 1997). Animais geneticamente deficientes

para NFAT1, ao serem submetidos a um modelo de inflamação pulmonar alérgica,

apresentam uma resposta exacerbada quando comparados a seus respectivos

controles (Viola

et al.

, 1998). Apesar disso, nenhum estudo sobre a fisiologia

pulmonar desses animais em resposta a estímulos alérgicos havia sido feito até o

momento.

A fim de confirmar os resultados de Viola e colaboradores e caracterizar o

padrão de resposta alérgica dos animais NFAT1-/-, esses animais foram

submetidos ao modelo de pleurisia alérgica utilizado anteriormente por esses

autores (Viola

et al.

, 1998) (Figura 6). De fato, observamos que os animais

NFAT1-/- desenvolvem uma resposta alérgica exacerbada em relação aos animais

NFAT1+/+, caracterizada por hipereosinofilia e altos níveis séricos de IgE (Figuras

7 e 8).

Com base nesses resultados decidimos avaliar o papel do NFAT1 na

patofisiologia de uma importante doença alérgica, a asma. Para isso, os animais

NFAT1+/+ e NFAT1-/- foram submetidos a um modelo experimental de asma

(Figura 9). A partir daí foram avaliados os principais fatores característicos dessa

doença: influxo de eosinófilos, níveis de IgE, produção de citocinas, níveis de

quimiocinas e citocinas no pulmão, estrutura do tecido pulmonar e, por fim, hiper-

reatividade brônquica.

O lavado broncoalveolar dos animais submetidos ao modelo de asma

demonstrou novamente uma hipereosinofilia dos animais NFAT1-/- em relação aos

animais NFAT1+/+ (Figura 10). A intensa infiltração da mucosa brônquica por

eosinófilos é uma característica importante da asma (Azzawi

et al.

, 1990). Essa

infiltração de eosinófilos foi correlacionada com a presença de linfócitos T ativados

em fluidos de lavagem broncoalveolar de pacientes asmáticos, da mesma forma

que a severidade da reação asmática foi associada ao número de linfócitos T

ativados e eosinófilos (Walker

et al.

, 1991). Além disso, a análise da freqüência de

eosinófilos presentes no escarro de 205 pacientes asmáticos demonstrou uma

correlação significativa entre eosinofilia e hiper-reatividade das vias aéreas

(Woodruff et al., 2001). De fato, as proteínas liberadas por eosinófilos ativados,

tais como ECP e MBP, são tóxicas para o epitélio das vias aéreas. O dano ao

epitélio pode levar à hiper-reatividade ao alterar a função de enzimas importantes

para a degradação de neuropeptídeos (revisto em Wills-Karp, 1999). Estudos em

cobaias também demonstraram que a MBP pode induzir hiper-reatividade ao inibir

competitivamente a ligação da ACh ao receptor muscarínico M

nos nervos

parassimpáticos, resultando num aumento ao invés de inibição da liberação de

ACh (Jacoby

et al.

, 1993).

A dosagem dos níveis de IgE também confirmou os dados do modelo de

pleurisia alérgica: os animais NFAT1-/- apresentam maiores níveis de IgE no soro

que seus respectivos controles (Figura 11). A IgE secretada liga-se a receptores

de Fc específicos (FcεR) na superfície de mastócitos teciduais ou basófilos

sangüíneos, preparando essas células para serem ativadas por antígenos. Uma

vez ativadas essas células liberam mediadores lipídicos e vasoativos, proteases,

fatores quimiotáticos e citocinas, que irão contribuir para o desenvolvimento da

resposta alérgica.

O fenótipo alérgico apresentado por esses animais foi correlacionado

anteriormente com uma alta produção de IL-4 e IL-5, decorrentes de uma resposta

Th2 predominante (Viola

et al.

, 1998). De fato, linfócitos CD4

Th2 e suas citocinas

têm um papel importante tanto no recrutamento de eosinófilos quanto na indução

da produção de IgE. A depleção de células Th2 antígeno-específicas ou das

citocinas (IL-4 e IL-5) produzidas por elas reduz significativamente a eosinofilia

pulmonar (Garlisi

et al.

, 1995; Foster

et al.

, 1996; Lukacs

et al.

, 1994). Neste

estudo, verificamos que enquanto os animais NFAT1+/+ produzem altos níveis de

IFN-γ e baixos níveis de IL-4, ocorre o inverso nos animais NFAT1-/- (Figura 12).

Esses resultados confirmam dados apresentados por Kiani e colaboradores

(1997), os quais mostram que os linfócitos NFAT1-/- produzem maiores

quantidades de IL-4 que os linfócitos NFAT1+/+. A expressão aumentada de IL-4

pelos linfócitos NFAT1-/- foi atribuída a uma manutenção prolongada dos mRNAs

para IL-4 por essas células (Kiani

et al.

, 1997). Resultados anteriores também

mostram que os linfócitos T NFAT1-/- já diferenciados apresentam níveis menores

de expressão de mRNA para IFN-γ (Kiani

et al.

, 1997). Além disso, dados

propostos por Kiani e colaboradores (2001) mostram que células CD4

deficientes

para NFAT1 apresentam um defeito intrínseco na expressão do gene de IFN-

manifestado por uma expressão diminuída dos níveis de mRNA e proteína.

Adicionalmente, esses efeitos foram observados independentemente dos efeitos

inibitórios da IL-4, uma vez que os animais utilizados nesse estudo são

duplamente deficientes para NFAT1 e IL-4 (Kiani

et al.

, 2001).

Ao contrário do padrão de produção de IL-4 apresentado pelos animais

NFAT1-/-, os níveis de IL-13 no pulmão desses animais não diferiram

significativamente dos níveis apresentados pelos animais NFAT1+/+ (Figura 13).

Apesar disso, podemos observar uma tendência de aumento dessa citocina no

pulmão dos animais NFAT1-/- quando comparamos com os respectivos controles

(

Figura 13

). Uma vez que Kiani e colaboradores (1997) demonstraram

anteriormente que células CD4

NFAT1-/- apresentam alta produção de IL-13 e

Viola e colaboradores (1998) detectaram níveis aumentados dessa citocina na

cavidade pleural de animais NFAT1-/- submetidos ao modelo de pleurisia alérgica,

acreditamos que esse resultado, por ser preliminar, ainda necessite de

confirmação posterior.

A dosagem dos níveis de eotaxina nos mesmos extratos de pulmão de

animais NFAT1-/- desafiados com OVA demonstrou uma maior produção dessa

quimiocina no tecido pulmonar desses animais (

Figura 14

). Esses dados

corroboram os resultados de hipereosinofilia apresentados pelos animais NFAT1-/-

, uma vez que a eotaxina tem alto grau de seletividade para recrutamento de

eosinófilos. Muitos tipos celulares são capazes de produzir eotaxina no pulmão,

incluindo fibroblastos, células da musculatura lisa, células endoteliais, macrófagos

alveolares, eosinófilos e linfócitos (revisto em Pease & Williams, 2001). A geração

dessa quimiocina no pulmão é dependente da presença de linfócitos T uma vez

que a depleção dessas células inibe a expressão de eotaxina, reduzindo a

infiltração de eosinófilos no pulmão (MacLean

et al.

, 1996). Além disso, já foi

demonstrado que a IL-4 estimula a transcrição do gene da eotaxina em

fibroblastos pulmonares e células epiteliais das vias aéreas de humanos (Teran

al.

, 1999; Stellato

et al.

, 1999). Em conjunto, esses dados sugerem que o infiltrado

inflamatório aumentado associado aos altos níveis de IL-4 apresentados pelos

animais NFAT1-/- podem estar correlacionados com o aumento dos níveis de

eotaxina no pulmão desses animais.

As alterações estruturais na arquitetura do tecido pulmonar são

extremamente importantes na patofisiologia da asma. O interesse pelas alterações

estruturais evidenciadas em vias aéreas asmáticas surgiu pela observação de que

em alguns pacientes asmáticos havia queda da função pulmonar de caráter

irreversível ao longo do tempo (Lange

et al.

, 1998). Além disso, alguns estudos

mostraram que certos pacientes têm alteração persistente da função pulmonar,

apesar de não manifestarem a doença clinicamente (revisto em Cohn

et al.

, 2004).

Esse processo de remodelamento das vias aéreas é um processo crônico,

resultante da persistência da inflamação que age em cada um dos

compartimentos das vias aéreas e leva a um dano tecidual progressivo. Com base

nessas informações, avaliamos neste estudo as alterações mais imediatas que

são características das vias aéreas asmáticas: infiltrado inflamatório, deposição de

colágeno e produção de muco.

Na Figura 15 podemos observar que os animais NFAT1-/- apresentam

infiltrado leucocitário peribronquiolar aumentado em relação aos animais

NFAT1+/+. Esses resultados confirmam os dados anteriores que mostram um

aumento do influxo de leucócitos totais nos fluidos de lavagem broncoalveolar

desses animais (Figura 10). A infiltração de células inflamatórias no pulmão é um

dos achados histopatológicos mais comuns na asma. A presença e ativação

dessas células, principalmente de eosinófilos, linfócitos e mastócitos gera a

liberação de diversos mediadores inflamatórios, como histamina, leucotrienos,

PAF, etc. Os efeitos contráteis desses mediadores são mediados através da

estimulação direta de receptores na musculatura lisa e através de mecanismos

que incluem a indução da liberação de outros agonistas contráteis (revisto em

Wills-Karp, 1999).

As paredes das vias aéreas são compostas por um epitélio associado a

uma membrana basal e uma camada de tecido submucoso contendo glândulas,

todas circundadas por musculatura lisa. A membrana basal consiste de três

camadas: a lamina lúcida, adjacente à membrana plasmática basal das células

que repousam na lamina, tipicamente células epiteliais; a lamina densa e a lamina

reticularis, contendo fibrilas de colágeno, que liga a membrana basal ao tecido

conjuntivo subjacente. Na asma ocorre o espessamento da lamina reticularis da

membrana basal que se torna uma densa camada de colágeno fibrilar, decorrente

de uma deposição anormal de componentes da matriz intersticial extracelular,

como as fibras colágenas tipos I, III e V (Roche

et al.

, 1989). Os animais NFAT1-/-

desenvolvem maior acúmulo dessas fibras quando comparados aos animais

NFAT1+/+ (Figura 16). Em humanos, esse espessamento, avaliado através de

fragmentos de biópsias brônquicas feitas através da broncoscopia de 34 pacientes

asmáticos, demonstrou uma correlação estreita entre espessura da membrana

basal e gravidade da doença (Chetta

et al.

, 1997). As principais células

associadas a esse acúmulo de colágeno e à fibrose subepitelial em pacientes

asmáticos são os miofibroblastos (Brewster

et al.

, 1990). Os fibroblastos, fontes

bem conhecidas de colágeno intersticial, não expressam NFAT1 (revisto em Rao

et al.

, 1997). Portanto esse aumento da deposição de colágeno não pode ser

explicado por uma superprodução dessa substância pelos miofibroblastos

pulmonares. Entretanto, o grau de deposição subepitelial de colágeno está

intimamente relacionado à expressão de TGF

por eosinófilos presentes nas vias

aéreas de pacientes asmáticos (Minshall

et al.

, 1997). Os níveis de TGFβ

nos

pulmões dos animais NFAT1+/+ e NFAT1-/- não foram analisados nesse estudo,

mas a hipereosinofilia dos animais NFAT1-/- sugere níveis aumentados dessa

citocina que poderiam explicar o aumento da espessura da camada subepitelial

observado nesses animais.

A produção excessiva de muco e a obstrução das vias aéreas devido ao

acúmulo dessa substância são achados muito comuns em pacientes asmáticos.

Essa hipersecreção de muco está associada a uma hipertrofia das glândulas

mucosas e hiperplasia e metaplasia das células caliciformes na superfície do

epitélio, culminando num aumento da secreção intraluminal com conseqüente

obstrução das vias aéreas. O acúmulo de muco nas vias aéreas reduz a tensão

superficial e aumenta a probabilidade de colapso das vias aéreas (revisto em

Maddox & Schwartz, 2002). A capacidade secretória relativa das glândulas da

submucosa e das células caliciformes ainda não é bem definida, mas estudos

recentes demonstram que as células caliciformes presentes no epitélio são tão

importantes, se não mais, para a secreção de muco quanto as glândulas (revisto

em Jackson, 2001). Essa resposta secretória aumentada está relacionada a

efeitos de mediadores inflamatórios e citocinas produzidas nas vias aéreas,

principalmente IL-13, além de efeitos de mecanismos neuronais, especialmente os

ligados à via colinérgica (revisto em Rogers, 2004). Neste estudo, pudemos

verificar que os animais NFAT1-/- desafiados com OVA apresentam menor

marcação para muco nas células caliciformes do epitélio das vias aéreas quando

comparados aos animais NFAT1+/+ (Figura 17). Mesmo apresentando níveis

similares de produção de IL-13 no pulmão, os animais NFAT1-/- apresentam uma

secreção de muco diminuída, ao contrário do que ocorre nos animais NFAT1+/+. A

via colinérgica é o principal mecanismo neural responsável pelo controle da

secreção de muco das vias aéreas. Agonistas de receptores colinérgicos induzem

a secreção de mucinas pelas células caliciformes em modelos de asma em

roedores e cobaias. Nessas espécies, onde o componente glandular na

submucosa é relativamente pequeno, a regulação neuronal da secreção de muco

pelas células caliciformes é extremamente importante (revisto em Jackson, 2001).

Uma vez que o NFAT é ativado pela via dos receptores muscarínicos, os

principais receptores da via colinérgica no pulmão, a ausência desse fator de

transcrição poderia comprometer a indução da secreção de muco por essa via.

Os animais NFAT1-/- quando comparados com seus controles selvagens

apresentam hipereosinofilia, altos níveis de IgE no soro, fenótipo Th2

predominante, presença de IL-13 e altos níveis de eotaxina no pulmão, intenso

infiltrado inflamatório e maior deposição de fibras colágenas no pulmão. Todos

esses fatores caracterizariam os animais NFAT1-/- como potenciais asmáticos

exacerbados em relação aos animais NFAT1+/+, uma vez que essas

características estão presentes na patologia asmática como discutido nos

parágrafos anteriores. A hiper-reatividade brônquica é um fenômeno marcante da

asma que é determinado e influenciado por todos esses fatores.

Conseqüentemente, as características apresentadas pelos animais NFAT1-/-

contribuiriam para que esses animais apresentassem maiores níveis de hiper-

reatividade brônquica em relação aos controles selvagens. Apesar disso, quando

os animais NFAT1-/- desafiados com OVA são aerolizados com metacolina como

broncoconstrictor, esses animais além de não serem hiper-reativos quando

comparados com os controles desafiados com PBS, têm broncoconstrição

diminuída em relação aos animais NFAT1+/+, desafiados ou não com OVA

(Figura 18).

O hidróxido de alumínio é, de fato, o adjuvante mais comumente utilizado

na literatura para sensibilização de animais nos modelos experimentais de asma.

Por causa disso decidimos reproduzir esses resultados utilizando o hidróxido de

alumínio como adjuvante na sensibilização. Esses experimentos corroboraram os

dados da hiper-reatividade observados nos animais NFAT1-/- sensibilizados com

CFA, demonstrando que independente do adjuvante utilizado no processo de

sensibilização os animais NFAT1-/- realmente apresentam um defeito na

broncoconstrição induzida por metacolina (

Figura 20

Nestes ensaios também verificamos que os animais NFAT1-/- apresentam

níveis de eosinofilia similares aos apresentados pelos animais NFAT1+/+, ao

contrário do que ocorre quando os animais são sensibilizados utilizando o CFA

como adjuvante (

Figura 19

). Como descrito anteriormente, a eosinofilia pulmonar

característica da asma está fortemente associada ao desenvolvimento de um

fenótipo Th2 pelos linfócitos T CD4

(revisto em Wills-Karp, 1999). Estudos

anteriores demonstraram que enquanto o hidróxido de alumínio estimula a

diferenciação de linfócitos CD4

para o fenótipo Th2, o CFA faz o oposto,

promovendo a diferenciação Th1 (Grun & Maurer, 1989). Posteriormente esses

resultados foram confirmados por Chuang e colaboradores (1997) que

demonstraram um aumento da relação IFN-

/IL-4 produzida por esplenócitos de

animais sensibilizados com CFA. Como mencionado anteriormente, os animais

NFAT1-/- têm uma produção de IL-4 aumentada concomitante com uma produção

de IFN-

diminuída de maneira independente dos efeitos mediados pela IL-4. De

fato, durante um estímulo primário os linfócitos T CD4

de animais NFAT1-/-

“naive” produzem níveis de IL-4 bastante similares aos produzidos pelas mesmas

células NFAT1+/+, que tornam-se aumentados em 72 h de estimulação (dados

não mostrados). Por outro lado, ao passo que os linfócitos T CD4

NFAT1+/+ já

produzem IFN-

em momentos iniciais da cultura, essa produção não é

acompanhada por linfócitos T CD4

NFAT1-/-, mesmo em momentos tardios de

estimulação primária (dados não mostrados). Essa diferença inicial de produção

de IFN-γ é refletida no padrão de diferenciação dessas células, como demonstrado

Figura 12

. Uma vez que o CFA induz a produção de IFN-γ e que os animais

NFAT1-/- têm um defeito nessa produção, o equilíbrio Th1/Th2 desses animais é

afetado. Ou seja, a ausência da produção de IFN-

faz com que não ocorra o

contrabalanço ou “freio” natural da produção de IL-4, fazendo com que os animais

NFAT1-/- desenvolvam um fenótipo Th2 aumentado em relação aos animais

NFAT1+/+. Como o hidróxido de alumínio favorece a produção de IL-4 e ambos

animais são capazes de produzir essa citocina, o IFN-γ por não ser

preferencialmente induzido nesse tipo de sensibilização, não teria um papel tão

ativo no contrabalanço ou “freio” da diferenciação Th2. Ou seja, os níveis basais

de IFN-γ produzidos tanto pelos animais NFAT1+/+ quanto NFAT1-/- não seriam

suficientes para afetar a produção de IL-4 e acentuar a diferença de produção

dessa citocina entre as duas linhagens de animais. É claro que para confirmarmos

essa hipótese, o padrão de produção de citocinas dos linfócitos de animais

NFAT1+/+ e NFAT1-/- sensibilizados na presença de hidróxido de alumínio ainda

precisa ser analisado. Com esses dados poderemos verificar se os animais

NFAT1+/+ e NFAT1-/- de fato apresentam níveis similares de produção de IL-4

quando sensibilizados com hidróxido de alumínio, o que poderia explicar a

similaridade no influxo de eosinófilos apresentado por esses animais.

Os ensaios anteriores com animais sensibilizados sugerem que os animais

NFAT1-/- têm um defeito na broncoconstrição induzida por metacolina de maneira

independente do processo de sensibilização. Para confirmar essa hipótese,

animais “naive” NFAT1+/+ e NFAT1-/-, os quais não foram submetidos a qualquer

protocolo de sensibilização ou desafio, foram aerolizados com metacolina.

Corroborando os dados anteriores, os animais NFAT1-/- “naive” também

apresentam broncoconstrição diminuída em relação aos animais selvagens

(Figura 21), sugerindo que este é um fenômeno intrínseco causado pela ausência

do NFAT1 e não por quaisquer efeitos do processo de sensibilização ou desafio. O

tratamento com CsA, um inibidor da ativação do NFAT, confirmou o envolvimento

do NFAT1 no processo de broncoconstrição uma vez que os animais NFAT1+/+

tratados com CsA apresentaram níveis de broncoconstrição diminuídos, similares

aos apresentados pelos animais NFAT1-/- (

Figura 22

Como descrito anteriormente, a liberação de acetilcolina (ACh) pelos nervos

parassimpáticos é responsável pelo principal mecanismo neural de

broncoconstrição das vias aéreas. Os receptores muscarínicos do subtipo M

e M

ao se ligarem a ACh, geram um influxo de cálcio intracelular ao ativarem a cascata

de sinalização da PLC (revisto em Felder, 1995). Experimentos anteriores

demonstraram que células T Jurkat que expressam ectopicamente o receptor M

(J-HM1-2.2) quando ativadas com carbachol, um agonista de receptores

muscarínicos, produzem IL-2 e induzem a atividade do NFAT (Desai

et al.

, 1990;

et al.

, 1995). Posteriormente foram feitos experimentos similares tanto com

linhagens de células linfóides (Jurkat) quanto com linhagens de células não-

linfóides (feocromocitoma PC12) (Boss

et al.

, 1996). Ambas linhagens foram

transfectadas com vetor de expressão para o receptor M

e vetor que continha

seqüências consenso de ligação para NFAT conjugadas a um gene repórter, a

luciferase. O tratamento com carbacol induz expressão de luciferase pelas células

transfectadas demonstrando que a ativação do receptor M

leva à indução da

ativação do NFAT (Boss

et al.

, 1996). Isso ocorre de maneira específica para o

receptor M

, uma vez que células PC12 transfectadas com um vetor de expressão

para o receptor M

, quando tratadas com carbacol, não apresentam indução do

gene da luciferase (Boss

et al.

, 1996). Além disso, o tratamento com CsA inibe a

expressão de luciferase induzida por carbacol nas células PC12 que expressam o

receptor M

, demonstrando que de fato o NFAT é ativado por esses receptores em

células não-imunes (Boss

et al.

, 1996).

Os receptores muscarínicos do subtipo M

estão presentes na musculatura

lisa do pulmão e são os principais mediadores da broncoconstrição (revisto em

Coulson & Fryer, 2003). Camundongos deficientes para esse receptor têm

broncoconstrição induzida por metacolina completamente abolida (Fisher

et al.

2004). Outros experimentos mostram uma inibição de 60% da broncoconstrição

induzida por metacolina em camundongos geneticamente deficientes para M

(Struckmann

et al.

, 2003). Até o momento, não há qualquer registro na literatura

que indique especificamente quais membros da família NFAT estão expressos na

musculatura lisa do pulmão. No entanto, ensaios com uma linhagem de células de

musculatura lisa das vias aéreas de humanos (HASM) demonstraram que essas

células não só expressam NFAT, mas apresentam atividade funcional desses

fatores de transcrição (Ediger

et al.

, 2003). Quando essas células HASM são

transduzidas com vetor retroviral contendo regiões consenso de ligação para

NFAT fusionadas a luciferase e são posteriormente estimuladas, ocorre expressão

do gene repórter (Ediger

et al.

, 2003). Além disso, já foi demonstrado que os

membros da família NFAT são expressos principalmente na musculatura lisa

vascular de diversos tecidos, incluindo cérebro e coração (Boss

et al.

, 1998;

revisto em Hill-Eubanks

et al.

, 2003). Em uma linhagem de células de musculatura

lisa vascular aórtica, a estimulação com diversos agonistas de receptores

acoplados a proteínas G da família G

foi capaz de ativar o NFAT (Boss

et al.

1998).

Todas essas informações juntas sugerem um papel importante do NFAT na

musculatura lisa e na sinalização via receptores muscarínicos acoplados a

proteína G da família G

. A fim de comprovar a especificidade da resposta

broncoconstritora à metacolina observada nos animais NFAT1-/-, utilizamos outro

broncoconstritor, a serotonina. Como demonstrado na Figura 23, os animais

“naive” NFAT1+/+ e NFAT1-/- apresentam respostas broncoconstritoras similares

quando expostos à serotonina, ao contrário do que ocorre durante a exposição à

metacolina. Já os animais NFAT1-/- submetidos ao modelo de asma e desafiados

com OVA além de apresentarem hiper-reatividade em relação aos controles

desafiados com PBS, têm resposta broncoconstritora exacerbada em relação aos

animais NFAT1+/+ (Figura 23). Por causa da grande diversidade de receptores

para serotonina há bastante controvérsia sobre qual receptor é capaz de induzir

broncoconstrição em diferentes espécies. Acredita-se que a ativação do receptor

5HT

presente na musculatura lisa das vias aéreas seja a principal via de

broncoconstrição induzida por serotonina em ratos, mas não há qualquer estudo

que demonstre os mesmos dados para camundongos (Saxena, 1995). A via de

sinalização do receptor 5HT

também envolve influxo de Ca

através da ativação

da PLC, mas até o momento não há qualquer evidência de

que o NFAT seja

ativado por esse receptor (Raymond

et al.

, 2001). Além disso, a natureza do

estímulo indutor do influxo de Ca

também é importante para a ativação de

diferencial de alguns fatores de transcrição, como o NFAT (Dolmetsch

et al.

1997).

A ausência dos receptores muscarínicos do subtipo M

no pulmão dos

animais NFAT1-/- poderia explicar o defeito na broncoconstrição apresentado por

esses animais. De fato, o promotor do gene que codifica para o receptor M

humanos possui diversos sítios de ligação para NFAT (Forsythe

et al.

2002).

Apesar disso a análise da expressão desses receptores no pulmão de animais

NFAT1+/+ e NFAT1-/- revelou que todos os três subtipos de receptores

muscarínicos têm mRNAs igualmente expressos (Figura 24). Esses resultados

sugerem que o NFAT1 está atuando abaixo da via dos receptores muscarínicos do

subtipo M

e não como regulador direto de sua expressão. Para confirmar essa

hipótese ainda precisam ser feitos experimentos que confirmem a expressão

protéica desses receptores, assim como sua funcionalidade.

Os resultados anteriores, em conjunto, mostram que o NFAT1 é essencial

para a broncoconstrição induzida especificamente pela via colinérgica. O processo

de contração da musculatura lisa é extremamente complexo e pode ser regulado

por uma variedade de fatores. O exato papel no NFAT1 nesse processo ainda

permanece obscuro. Sabe-se que o NFAT2 é importante para a transcrição do

gene que codifica para a cadeia pesada da miosina específica de músculo liso em

células da musculatura lisa aórtica, o que poderia influenciar na contração

muscular (Wada

et al.

, 2002). Além disso, a modulação da homeostase do Ca

também é extremamente importante para a resposta da musculatura lisa a

estímulos contráteis (Amrani & Panettieri, 2002). Análises de sítios putativos de

ligação NFAT/AP1 em células T identificaram sítios de ligação para NFAT nas

regiões promotoras de genes que codificam para proteínas que se ligam à Ca

incluindo a calmodulina 2 (Kel

et al.

, 1999). Para dar continuidade ao trabalho,

pretendemos investigar mais detalhadamente a via do receptor muscarínico M

, a

fim de fundamentar uma hipótese mais completa de como ocorre exatamente a

participação do NFAT1 no processo de broncoconstrição.

5. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que o NFAT1 tem papel

extremamente importante na resposta alérgica, sendo fundamental na

broncoconstrição induzida pela via colinérgica.

• Os animais NFAT1-/- quando comparados com seus controles selvagens

apresentam hipereosinofilia, altos níveis de IgE no soro, fenótipo Th2

predominante, presença de IL-13 e altos níveis de eotaxina no pulmão,

intenso infiltrado inflamatório e maior deposição de fibras colágenas no

pulmão, sugerindo um papel regulador negativo da proteína NFAT1 na

resposta alérgica asmática;

• Os animais NFAT1-/-, quando expostos a metacolina, não apresentam

hiper-reatividade em relação a seus respectivos controles, além de

apresentarem broncoconstrição diminuída quando comparados com os

animais NFAT1+/+, sugerindo um papel essencial para o NFAT1 no

processo de broncoconstrição induzido pela via colinérgica;

• Quando expostos a serotonina, os animais NFAT1-/- são hiper-reativos em

relação a seus respectivos controles e apresentam resposta

broncoconstritora aumentada quando comparados aos animais NFAT1+/+.

Além disso, animais NFAT1-/- “naive” apresentam broncoconstrição similar

aos controles selvagens, excluindo um papel do NFAT1 no processo de

broncoconstrição mediado pela serotonina.

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7. ANEXOS

7.1 Anexo I

TEIXEIRA, L.K.,

FONSECA, B.P.F.

, VIEIRA DE ABREU, A., BARBOZA, B.A.,

ROBBS, B.K., BOZZA, P.T., VIOLA, J.P.B. IFN-

production by CD8 T cells

depends on NFAT1 transcription factor and regulates Th differentiation.

J Immunol

175:5931-5939. 2005.

IFN-

␥

Production by CD8

T Cells Depends on NFAT1

Transcription Factor and Regulates Th Differentiation

Leonardo K. Teixeira,* Bruna P. F. Fonseca,* Adriana Vieira-de-Abreu,

†

Bianca A. Barboza,*

Bruno K. Robbs,* Patrı´cia T. Bozza,

†

and Joa˜o P. B. Viola

CD8

T lymphocytes are excellent sources of IFN-

␥

; however, the molecular mechanisms that dictate IFN-

␥

expression upon TCR

stimulation in these cells are not completely understood. In this study, we evaluated the involvement of NFAT1 in the regulation

of IFN-

␥

gene expression in murine CD8

T cells and its relevance during Th differentiation. We show that CD8

, but not CD4

T cells, represent the very ﬁrst source of IFN-

␥

upon primary T cell activation, and also that the IFN-

␥

produced by naive CD8

T cells may enhance CD4

Th1 differentiation in vitro. TCR stimulation rapidly induced IFN-

␥

expression in CD8

T lympho-

cytes in a cyclosporin A-sensitive manner. Evaluation of CD8

T cells showed that calcium inﬂux alone was sufﬁcient to activate

NFAT1 protein, transactivate IFN-

␥

gene promoter, and induce IFN-

␥

production. In fact, NFAT1-deﬁcient mice demonstrated

highly impaired IFN-

␥

production by naive CD8

T lymphocytes, which were totally rescued after retroviral transduction with

NFAT1-encoding vectors. Moreover, NFAT1-dependent IFN-

␥

production by the CD8

T cell compartment was crucial to control

a Th2-related response in vivo, such as allergic inﬂammation. Consistently, CD8

␣

- as well as IFN-

␥

-deﬁcient mice did not mount

a Th1 immune response and also developed in vivo allergic inﬂammation. Our results clearly indicate that IFN-

␥

production by

CD8

T cells is dependent of NFAT1 transcription factor and may be an essential regulator of Th immune responses in vivo. The

Journal of Immunology, 2005, 175: 5931–5939.

pon T cell stimulation, CD4

T lymphocytes may un-

dergo a Th1/Th2 differentiation that is mostly character-

ized by the distinct pattern of cytokines they secrete.

Th1 cells produce IFN-

␥

, which is essential for the eradication of

intracellular pathogens, whereas Th2 cells secrete IL-4, IL-5, and

IL-13, which are crucial to the elimination of extracellular organ-

isms and to sustain allergic reactions. Several factors can inﬂuence

the differentiation pathway of CD4

Th cells, especially the cy-

tokines prevailing within the microenvironment where these cells

encounter Ags (1, 2). IL-12 and IFN-

␥

are known to be the major

Th1-inducing cytokines (3). IFN-

␥

is a pleiotropic cytokine that is

essential for both innate and adaptive immunities (4), and its role

in CD4

Th1 differentiation has been intensely addressed. In vitro

studies have shown that IFN-

␥

exerts both indirect and direct ef-

fects during Th1 development (5, 6). It induces APCs to produce

IL-12, which is of great importance during Th1 cell commitment

(7, 8). In addition, IFN-

␥

is responsible for inducing/maintaining

the expression of the

␤

-chain of the IL-12R (IL-12R

␤

2) on CD4

T cells, indicating an important role for IFN-

␥

in the Th1 effects

mediated by IL-12 (9, 10). Furthermore, IFN-

␥

and Th1 responses

are considered to be protective against Th2-related disorders such

as asthma and allergy (11–13). In animal models, the adoptive

transfer of IFN-

␥

-producing cells into allergen-sensitized recipi-

ents has protected from airway eosinophilia after Ag challenge (14,

15). Defective IFN-

␥

production also predisposes toward the de-

velopment of allergic diseases, and patients with severe asthma

present signiﬁcantly reduced IFN-

␥

production in response to al-

lergen compared with control individuals (16, 17).

Different transcription factors have been shown to regulate IFN-

␥

gene expression in T lymphocytes (3, 18). In CD4

T cells, T-bet, the

master switch of the Th1 response, is a key regulator of IFN-

␥

pro-

duction in developing Th1 lymphocytes (19). However, T-bet expres-

sion is induced by IFN-

␥

signaling pathway through STAT1, and thus

is dependent on an initial source of IFN-

␥

(10, 20). Several cellular

compartments of the immune system have been characterized as po-

tential sources of IFN-

␥

in vivo, including NK cells and CD8

T cells

(21, 22). It has been suggested that CD8

T cells may represent an

early source of IFN-

␥

, which acts directly on CD4

Th1 differenti-

ation (22). Nevertheless, there are no available data concerning the

involvement of TCR-induced transcription factors in the regulation of

IFN-

␥

expression in CD8

T cells.

NFAT proteins are pre-existing cytoplasmic transcription fac-

tors that are rapidly activated in T lymphocytes upon TCR stim-

ulation (23). The activation of NFAT proteins requires sustained

intracellular calcium levels that are induced shortly after TCR trig-

gering (23, 24). Calcium inﬂux then activates the Ca

2ϩ

-dependent

phosphatase calcineurin, which dephosphorylates NFAT (25, 26).

Once activated, NFAT translocates to the nucleus, where it binds

to regulatory sequences and regulates the expression of several

cytokine genes, including IFN-

␥

(27, 28). The process of NFAT

activation is blocked by immunosuppressive drugs, such as cy-

closporin A (CsA)

and FK506, which inhibit the phosphatase

activity of calcineurin (29, 30). In fact, NFAT1-deﬁcient mice

*Division of Cellular Biology, Brazilian National Cancer Institute, Rio de Janeiro,

Brazil; and

†

Laboratory of Immunopharmacology, Department of Physiology and

Pharmacodynamics, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil

Received for publication February 4, 2005. Accepted for publication August 24, 2005.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page

charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance

with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

This work was supported by grants from Instituto Nacional de Ca៮ ncer/Fundac¸a˜o Ary

Frauzino, Furnas Centrais Ele´tricas S.A. and Conselho Nacional de Pesquisas (to

J.P.B.V.); and Howard Hughes Medical Institute and Conselho Nacional de Pesquisas

(to P.T.B.). L.K.T. and B.A.B. were supported by an Instituto Nacional de Ca៮ ncer/

Fundac¸a˜o Ary Frauzino fellowship; B.P.F.F., A.V-A. and B.K.R. were supported by

a Conselho Nacional de Pesquisas fellowship.

Address correspondence and reprint requests to Dr. Joa˜o P. B. Viola, Divisa˜o de

Biologia Celular, Instituto Nacional de Ca៮ ncer, Rua Andre´ Cavalcanti 37, Rio de

Janeiro, Brasil 20231-050. E-mail address: [email protected]

Abbreviations used in this paper: CsA, cyclosporin A; EGFP, enhanced GFP;

Eomes, eomesodermin; IRES, internal ribosomal entry sequence.

The Journal of Immunology

(NFAT1

Ϫ/Ϫ

) present a preferential differentiation toward a Th2

phenotype, including low levels of IFN-

␥

and high levels of

IL-4 (31, 32). Consistently, CD4

T cells from NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice present an impaired IFN-

␥

production (33), but no reports

regarding the participation of NFAT1 in the regulation of IFN-

␥

in CD8

T lymphocytes have been described.

Thus, we addressed the involvement of NFAT1 transcription factor

in the regulation of IFN-

␥

production in CD8

T cells and its inﬂu

ence on Th1/Th2 immune responses using in vitro and in vivo models

of Th differentiation. In this study we show that naive CD8

T cells

do produce high levels of IFN-

␥

upon TCR triggering during the

primary response, which is dependent on NFAT1 transcription factor.

Also, we demonstrate that IFN-

␥

production by the CD8

T cell

compartment enhances CD4

Th1 differentiation in vitro and is cru

cial to control allergic inﬂammation, which has been related to a Th1/

Th2 immune response deregulation. Our results thus suggest that

NFAT1 protein plays a positive regulatory role in IFN-

␥

production in

CD8

T cells, which may modulate Th immune response in vivo.

Materials and Methods

Animals, cells, and reagents

C57BL/6, NFAT1

Ϫ/Ϫ

, CD8

␣

Ϫ/Ϫ

, and IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

8- to 12-wk-old female

mice were used in all experiments. Animals were bred and maintained in

the Brazilian National Cancer Institute animal facility. Animals were

treated according to the animal care guidelines of the Council for Interna-

tional Organizations of Medical Sciences. All primary cells (lymph nodes,

CD3

, CD4

, and CD8

T lymphocytes) and the mouse CD8

CTLL-

cell line were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS, L-

glutamine, streptomycin-penicillin, essential and nonessential amino acids,

sodium pyruvate, vitamins, and 2-ME (all from Invitrogen Life Technol-

ogies). Hybridomas 2C11 (anti-CD3) and 53-6.7 (anti-CD8) were cultured

in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS. All Abs were puriﬁed from

hybridoma supernatants by chromatography over protein G (Amersham

Biosciences), and their activities were functionally tested by cellular pro-

liferation, complement-dependent depletion, and ELISA. The cytokines

IFN-

␥

, IL-2, IL-12, and IL-18 were purchased from PeproTech. The poly-

clonal Ab 67.1 (Dr. A. Rao, Harvard University, Boston, MA) was used to

detect the NFAT1 protein. PMA and ionomycin were obtained from Cal-

biochem, and the immunosuppressive drug CsA was obtained from LC

Laboratories. CFA and OVA were purchased from Sigma-Aldrich. The

solutions of May-Gru¨nwald and Giemsa were obtained from Merck.

Polybrene (hexadimethrin bromide) was obtained from Fluka Chemie, and

chondroitin 6-sulfate sodium salt was purchased from Sigma-Aldrich.

Cell isolation and ﬂow cytometry

In all experiments, different cell populations (CD3

, CD4

, and CD8

cells) were obtained from lymph nodes (inguinal, brachial, axillary, and su-

perﬁcial cervical). Puriﬁed single-cell suspensions were isolated by negative

selection with magnetic beads (Micro Beads, MACS technology) according to

the manufacturer’s instructions (Miltenyi Biotec). Streptavidin magnetic beads

were conjugated to speciﬁc-biotinylated Abs (anti-CD4, anti-CD8, and anti-

B220/CD45R) to sort out undesired cell populations. For cytometric analysis,

cells were stained with speciﬁc ﬂuorochrome-labeled Abs as previously de-

scribed (32). Labeled mAbs were all obtained from BD Pharmingen, and cells

were analyzed by ﬂow cytometry on a FACScan (BD Biosciences). Cell pop-

ulations were isolated to Ͼ95% purity.

CD4

Th differentiation

CD4

and CD8

T cells were puriﬁed from C57BL/6 (IFN-

␥

ϩ/ϩ

) or IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

as described. For cocultivation assays, CD4

T cells from IFN-

␥

ϩ/ϩ

mice were cultured together with CD8

T cells from either IFN-

␥

ϩ/ϩ

IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

mice (CD4:CD8 ratio, 2:1) and primarily stimulated in vitro for

72 h with plate-bound anti-CD3 (1

␮

g/ml) in the presence of IL-12 (10

ng/ml). On the third day, cells were harvested, washed, and rested for 48 h.

After resting, CD4

T cells were isolated again as described and were left

unstimulated or were in vitro stimulated for 48 h with plate-bound anti-

CD3 (1

␮

g/ml). After stimulation, cell-free supernatants were assessed for

IFN-

␥

or IL-4 by ELISA.

ELISA and intracellular cytokine staining

Cells were left unstimulated or were in vitro stimulated for 24, 48, or 72 h

at 37°C with different stimuli as indicated. Cell-free supernatant was as-

sessed for IFN-

␥

and IL-4 protein levels by ELISA according to the man-

ufacturer’s instructions (BD Pharmingen). For intracellular cytokine stain-

ing, indicated cell populations (1 ϫ 10

cells) from naive C57BL/6,

NFAT1

ϩ/ϩ

, and NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice were stimulated in vitro for 72 h with

plate-bound anti-CD3 (1

␮

g/ml). Brefeldin A (1/1000; Cytoﬁx/Cytoperm;

BD Pharmingen) was added to the culture 5 h before the staining proce-

dure. Brieﬂy, cells were harvested, and surface markers were stained with

anti-CD8-FITC or anti-CD4-FITC Ab. Cells were next ﬁxed and perme-

abilized for intracellular cytokine staining with anti-IFN-

␥

-PE Ab, then

analyzed by ﬂow cytometry.

RNase protection assays, Western blot, and immunoﬂuorescence

staining

For RNase protection assay analysis, puriﬁed CD8

T cells (2 ϫ 10

cells)

from C57BL/6 mice were left unstimulated or were in vitro stimulated for

6 h at 37°C with plate-bound anti-CD3 (1

␮

g/ml) as indicated. CsA (5

␮

was added to cells 15 min before anti-CD3 stimulation. Total RNA was

immediately extracted with TRIzol reagent according to the manufacturer’s

protocol (Invitrogen Life Technologies). mRNA expression was analyzed

with a multiprobe RNase protection assay kit (Ribo-Quant; BD Pharmin-

gen). For IFN-

␥

expression analysis, mCK-1 and mCK-2 multiprobe sets

were used, and RNA loading was estimated by measuring GAPDH and

L32 housekeeping genes.

To detect the presence of the NFAT1 protein, puriﬁed CD8

T cells

from C57BL/6 mice or the CTLL-R8

cell line (2 ϫ 10

cells) were left

unstimulated or were in vitro stimulated for 15 min at 37°C with ionomycin

␮

M). CsA (5

␮

M) was added to cells 15 min before stimulation. Total

protein lysates were obtained as previously described (26). Brieﬂy, cells

were lysed in buffer containing 40 mM Tris (pH 7.5), 60 mM sodium

pyrophosphate, 10 mM EDTA, and 5% SDS, followed by incubation at

100°C for 20 min. Small-scale nuclear extracts were made as previously

described (34). Brieﬂy, cells were resuspended in buffer containing 0.5%

Nonidet P-40, 10 mM Tris (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

, 0.5 mM

DTT, 0.1 mM EGTA, 2 mM leupeptin, 1 mg/ml aprotinin, and 1 mM

PMSF. The supernatant was removed to a separate tube, and the nuclear

pellet was lysed in the same buffer as described above. Cell extracts were

analyzed by electrophoresis on 6% SDS-PAGE. The separated proteins

were transferred to nitrocellulose membrane, and NFAT1 protein was de-

tected by the polyclonal Ab 67.1 as previously described (26).

Intracellular localization of NFAT1 protein was addressed in puriﬁed

CD8

T cells (2 ϫ 10

cells) from C57BL/6 mice by immunoﬂuorescence

staining, also as previously described (26). Brieﬂy, cells were attached to

coverslips previously coated for 1 h with 2% gelatin and were left un-

stimulated or were stimulated for 16 h at 37°C with ionomycin (5

␮

M).

CsA (5

␮

M) was added to cells 15 min before ionomycin. Then cells were

ﬁxed in 3% paraformaldehyde, permeabilized with 0.1% Nonidet P-40, and

stained with anti-NFAT1 67.1 Ab. The cells were photographed under

ϫ100 magniﬁcation with a Zeiss Axiovert S100 microscope.

Retroviral construction and lymphocyte transduction

The pLIRES-EGFP bicistronic vector was constructed by inserting a 1.4-kb

BglII-NotI fragment from the pIRES2-EGFP vector (BD Clontech), compris-

ing the encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry sequence (IRES)

and the enhanced GFP (EGFP) coding region, into the pLEGFP-N1 retroviral

vector (BD Clontech; pLIRES-EGFP-empty). To generate the retroviral vector

encoding for NFAT1, the full-length cDNA from NFAT1 isoform C was

cloned into the pLIRES-EGFP (pLIRES-EGFP-NFAT1). Then, the BD Eco-

Pack2 ecotropic packing cell line (BD Biosciences) was transiently transfected

with retroviral vectors by calcium phosphate precipitation for 16 h. Cell-free

virus-containing supernatant was collected 48 h after transfection, and con-

centrated as previously described (35). The supernatant was supplemented

with IL-2 (20 U/ml), and immediately used for spin infection (twice, 45 min

each time, 1800 rpm, room temperature) of puriﬁed CD8

T cells from naive

NFAT1

ϩ/ϩ

and NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice previously stimulated with anti-CD3 (1

␮

ml) for 24 h. Infected cells were incubated at 37°C for an additional 48 h,

supplemented with fresh medium, and stimulated with anti-CD3 (1

␮

g/ml) for

another 48 h. Cells were then stained for intracellular cytokine as described

above, and EGFP

CD8

lymphocytes were analyzed by ﬂow cytometry for

IFN-

␥

production as described.

Transactivation assays

CTLL-R8

cell line (2 ϫ 10

cells) was eletroporated (950

␮

F, 250 V) in

a 0.4-cm GenePulser Cuvette (Bio-Rad) with 5

␮

g of the indicated IFN-

␥

-promoter constructs fused to a luciferase reporter gene (Luc; donated by

Dr. C. Wilson, University of Washington, Seattle, WA) (28) in serum-free

5932 REGULATION OF IFN-

␥

EXPRESSION IN CD8

T CELLS

medium. After 24 h, cells were washed and left unstimulated or were stim-

ulated in vitro for 16 h at 37°C with PMA (10 nM) or ionomycin (5

␮

as indicated. CsA (5

␮

M) was added to cells 15 min before any other

treatment when indicated. The next day, cells were harvested, and lysis was

performed for 20 min at room temperature with 50

␮

lof1ϫ cell culture

lysis reagent (Promega). Crude extract (10

␮

l) was added to 100

␮

lof

luciferase assay substrate (Promega). Luciferase activity was promptly

measured in a Monolight 3010 Luminometer (Analytical Luminescence

Laboratory) and was expressed as relative light units.

Eomesodermin (Eomes) RT-PCR

Puriﬁed CD8

T cells (2 ϫ 10

cells) from naive NFAT1

ϩ/ϩ

and

NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice were left unstimulated (0 h) or were in vitro stimulated

for the indicated time periods at 37°C with plate-bound anti-CD3 (1

␮

ml). Total RNA was extracted with TRIzol reagent (Invitrogen Life Tech-

nologies), and semiquantitative RT-PCR for murine Eomes expression was

performed using the Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads, accord-

ing to the manufacturer’s instructions (Amersham Biosciences). The prim-

ers used were as follows: Eomes, 5Ј-GCC CAC GTC TAC CTG TGC

AAC CG-3Ј and 5Ј-TGT TAT TGG TGA GTT TTA ACT TCC C-3Ј

(334-bp product); and GAPDH, 5Ј-TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT

TTG-3Ј and 5Ј-ACG ACA TAC TCA GCA CCA GCA TCA-3Ј (276-bp

product). PCR conditions were as follows: 95°C for 3 min; 35 cycles at

95°C for 30 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 45 s; and ﬁnal elongation at

72°C for 10 min. PCR products were resolved on 1.5% agarose gels and

visualized with ethidium bromide.

Pleurisy model

Naive animals were s.c. sensitized with 200

␮

g (0.1 ml) of OVA emulsiﬁed

in CFA in a hind footpad, as previously described (36). Fifteen days later,

animals were intrathoracically challenged with PBS or OVA (12

␮

g) as

indicated. After 24 h, thoracic cavity was rinsed with 1 ml of PBS/0.1%

BSA. Cells were then cytocentrifuged and stained with May-Gru¨nwald/

Giemsa for differential leukocyte analysis. Draining lymph nodes (popliteal

and inguinal) were harvested, and cells (2 ϫ 10

cells) were stimulated in

vitro for 48 h with plate-bound anti-CD3 (1

␮

g/ml). Cell-free supernatants

were then assessed for IFN-

␥

and IL-4 by ELISA. For in vivo CD8

T cell

depletion, NFAT1

ϩ/ϩ

mice were i.v. treated with anti-CD8 Ab (100

␮

animal) every 2 days in a total of ﬁve injections before sensitization

(NFAT1

ϩ/ϩ

and anti-CD8). Thereafter, mice continued to be treated with

anti-CD8 Ab (100

␮

g/animal) every 2 days until challenge. CD8

T cell

depletion was evaluated by ﬂow cytometry of lymph nodes, which always

showed Ͻ3% CD8

T cells.

Statistical analysis

Statistical analysis of values from wild type (ϩ/ϩ) and knockout (Ϫ/Ϫ)

mice and between control and treated groups was performed using un-

paired Student’s t test for single comparison. A value of p Ͻ 0.05 was

considered statistically signiﬁcant.

Results

Inﬂuence of IFN-

␥

produced by CD8

T cells on CD4

Th1

differentiation

The cytokine IL-12 was initially characterized as the dominant

cytokine inﬂuencing the Th1 phenotype (3, 7, 8). However, addi-

tional studies have shown that other cytokines, such as IFN-

␥

, may

also play a role during Th1 development (5, 6). In an in vitro

model of Th differentiation, disruption of IFN-

␥

R signaling path-

way drastically reduced IFN-

␥

production by CD4

T cells even

when stimulated in the presence of IL-12, indicating that IFN-

␥

directly enhances CD4

Th1 differentiation (data not shown). Sev

eral cellular sources of IFN-

␥

may enhance CD4

Th1 differen

tiation, such as NK, dendritic cells and CD8

T cells (3, 21, 22).

As shown in Fig. 1A, upon TCR stimulation of primary lymph

node cells, CD8

T lymphocytes represent the very ﬁrst source of

IFN-

␥

production. To speciﬁcally address the inﬂuence of the

IFN-

␥

produced by CD8

T cells on CD4

Th1 differentiation,

naive CD4

T lymphocytes cultivated together with CD8

T cells

from IFN-

␥

ϩ/ϩ

or IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

mice were stimulated in vitro for 72 h

with anti-CD3. After this primary stimulation, CD4

T lympho

cytes were puriﬁed, stimulated in vitro, and assessed for their abil-

ity to produce IFN-

␥

and IL-4. We observed in this study that

CD4

T cells, which were cocultivated with IFN-

␥

-competent

CD8

T cells, clearly produce more IFN-

␥

and less IL-4 than

those cocultivated with IFN-

␥

-deﬁcient CD8

T lymphocytes

(Fig. 1B). Thus, our results demonstrate that the IFN-

␥

produced

by CD8

T cells enhances Th1 phenotype development of CD4

T lymphocytes during primary stimulation in vitro.

IFN-

␥

production by CD8

T lymphocytes

The molecular mechanisms that control IFN-

␥

gene expression in

CD4

Th cells are widely known; however, the mechanisms that

dictate its expression in CD8

T lymphocytes are not completely

elucidated. Thus, we decided to address the molecular pathways by

which CD8

T cells produce IFN-

␥

. We show in this study that pu

riﬁed naive CD8

T cells produce IFN-

␥

upon TCR stimulation, but

not in response to IL-12/IL-18 treatment alone (Fig. 2A). We also

observed that the IFN-

␥

production level was not altered when anti-

CD28 costimulation was administered together with anti-CD3 (data

not shown). However, IL-12/IL-18 administration highly increased

IFN-

␥

levels when associated with TCR triggering, suggesting that

both cytokines may play a secondary role on TCR-induced IFN-

␥

production by CD8

T lymphocytes (Fig. 2B). To evaluate the inﬂu

ence of other pathways in IFN-

␥

production, we stimulated naive

CD8

T cells with different stimuli. Surprisingly, ionomycin-driven

2ϩ

inﬂux was sufﬁcient to induce IFN-

␥

production in CD8

cells, which was slightly potentiated by PMA administration (Fig.

2C). However, PMA stimulation alone was not sufﬁcient to induce

IFN-

␥

production in these cells (Fig. 2C). In addition, we found

that IFN-

␥

expression is totally dependent on TCR stimulation, be-

cause IFN-

␥

transcript levels could be detected as early as 6 h after

TCR triggering, but not in unstimulated CD8

T cells (Fig. 2D). In

this study, we also show that IFN-

␥

expression/production by CD8

T lymphocytes is totally inhibited when CsA is administered together

FIGURE 1. IFN-

␥

produced by CD8

T lymphocytes enhances CD4

Th1 differentiation. A, Total lymph node cells from naive C57BL/6 mice

were stimulated in vitro with anti-CD3 (1

␮

g/ml). After stimulation, cells

were analyzed for intracellular IFN-

␥

production at 72 h as described. Data

are representative of three independent animals. B, Puriﬁed CD4

T lym

phocytes from IFN-

␥

ϩ/ϩ

mice were cultivated together with CD8

T cells

from IFN-

␥

ϩ/ϩ

or IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

mice, and then stimulated in vitro for 72 h

with anti-CD3 (1

␮

g/ml) in the presence of IL-12 (10 ng/ml). On the third

day, cells were rested for 48 h. After resting, CD4

T cells were puriﬁed

again and were left unstimulated (Unst) or were stimulated in vitro for 48 h

with anti-CD3 (1

␮

g/ml). Cell-free supernatants were assessed for IFN-

␥

and IL-4 by ELISA. All results are from a pool of three mice and are

representative of two independent experiments.

5933The Journal of Immunology

with any other stimulus (Fig. 2). These results clearly demonstrate that

CD8

T lymphocytes are competent for IFN-

␥

production upon TCR

engagement, and IFN-

␥

expression was totally inhibited by CsA at the

transcriptional level.

CD8

T lymphocytes present functional NFAT1 protein

The activation of NFAT transcription factors requires sustained intra-

cellular Ca

2ϩ

levels induced by TCR engagement (23). Calcium in

ﬂux then activates the Ca

2ϩ

-dependent phosphatase calcineurin,

which is blocked by the immunosuppressive drug CsA (23). Taking

into account that IFN-

␥

expression is Ca

2ϩ

dependent and blocked in

a CsA-sensitive manner, we decided to investigate whether CD8

lymphocytes presented NFAT transcription factor. We demonstrate

for the ﬁrst time, to our knowledge, that naive CD8

T cells do

present inactive endogenous NFAT1 transcription factor (phosphor-

ylated form), which is activated by ionomycin-induced Ca

2ϩ

inﬂux

(dephosphorylated form), and blocked by CsA (Fig. 3). In fact, iono-

mycin treatment not only led to NFAT1 dephosphorylation, but also

resulted in NFAT1 nuclear translocation, which was again blocked by

CsA as observed by Western blot of nuclear lysate and immunoﬂu-

orescence staining of CD8

T lymphocytes (Fig. 3).

Effect of NFAT transcription factor on IFN-

␥

promoter

We then examined the ability of NFAT transcription factor to reg-

ulate the IFN-

␥

promoter in a CD8

T cell line. The CTLL-R8

cell line presents endogenous NFAT1 whose activation is induced

by ionomycin and blocked by CsA (Fig. 4A). Moreover, the

CTLL-R8

cell line did not produce IFN-

␥

when maintained in

culture without stimulation, but ionomycin treatment was sufﬁcient

to induce its production, as assessed by ELISA (data not shown).

We then transiently transfected these cells with different IFN-

␥

promoter constructs containing NFAT-binding sites and driving

the luciferase reporter gene (Fig. 4B). Three NFAT-binding sites

were approximately identiﬁed at positions Ϫ100, Ϫ160, and Ϫ280

bp through the proximal 538 bp of the IFN-

␥

promoter (pIFN-

␥

Ϫ538; Fig. 4B) (28). Interestingly, ionomycin stimulation was suf-

ﬁcient to highly transactivate the IFN-

␥

proximal promoter con-

struct pIFN-

␥

Ϫ538 (Fig. 4C). In accordance with primary CD8

T cells results, PMA administration alone did not induce luciferase

activity or enhance reporter expression when associated with iono-

mycin, indicating that ionomycin-driven Ca

2ϩ

inﬂux alone was

sufﬁcient to induce optimal response (Fig. 4C). The partial pro-

moter construct pIFN-

␥

Ϫ108, which contained a single NFAT-

binding site, still showed 50% luciferase activity compared with

the full-length promoter construct (Fig. 4D). Again, IFN-

␥

pro-

moter activity remained sensitive to CsA (Fig. 4, C and D). How-

ever, promoter construct pIFN-

␥

Ϫ39 showed no luciferase ex-

pression at all (Fig. 4D). To evaluate the direct role of NFAT on

IFN-

␥

promoter transactivation, we analyzed the effects of point

mutations in different NFAT binding sites (Fig. 4B) (28). As

shown in Fig. 4E, point mutations at the NFAT Ϫ160 site (N160),

Ϫ280 site (N280), or both sites (N160/N280) decreased luciferase

activity compared with the wild-type pIFN Ϫ538 construct. Point

mutation at both sites (N160/N280) decreased luciferase expres-

sion by an average of 50% compared with the pIFN Ϫ538 con-

struct, which is similar to the reduction observed in the pIFN-

␥

Ϫ108 construct (Fig. 4, D and E). It is still important to note in this

study the presence of a third intact NFAT binding site at position

Ϫ100, which could explain at least some of the luciferase activity

observed in the double mutant (N160/N280) and pIFN Ϫ108 con-

structs (Fig. 4, D and E). This site might play an important unrec-

ognized role in IFN-

␥

promoter regulation in CD8

T cells. More

over, luciferase expression always remained sensitive to CsA in all

constructs (Fig. 4, D and E). Based on these results, we conclude

that NFAT transcription factor plays a positive role in regulation of

the IFN-

␥

promoter in the CD8

T cell compartment.

Involvement of NFAT1 in IFN-

␥

production by CD8

T cells

To unequivocally test the hypothesis that NFAT1 is required for

IFN-

␥

production in CD8

T lymphocytes, we evaluated intracel

lular IFN-

␥

production by these cells in NFAT1-deﬁcient mice

(NFAT1

Ϫ/Ϫ

). Strikingly, upon stimulation of puriﬁed naive CD3

T lymphocytes from NFAT1

ϩ/ϩ

mice, CD8

, but not CD4

FIGURE 2. TCR triggering induces IFN-

␥

production in CD8

T lym

phocytes in a CsA-sensitive manner. CD8

T lymphocytes were puriﬁed

from naive C57BL/6 mice as described, and then left unstimulated or stim-

ulated in vitro as indicated: anti-CD3 (1

␮

g/ml), IL-12 (10 ng/ml), IL-18

(50 ng/ml), PMA (10 nM), ionomycin (Iono; 5

␮

M), or CsA (5

␮

M). CsA

was added 15 min before the other treatments. A–C, Analysis of IFN-

␥

production by CD8

T cells after 72 h of stimulation as indicated. Cell-free

supernatant was assessed for IFN-

␥

by ELISA. D, Analysis of IFN-

␥

ex-

pression in CD8

T cells by RNase protection assay after6hofstimula

tion. RNA loading was estimated by measuring the intensity of L32 house-

keeping ribosomal protein gene. All results are from a pool of three mice

and are representative of three independent experiments.

FIGURE 3. NFAT1 is dephosphorylated and translocated to the nucleus

in CD8

T lymphocytes after Ca

2ϩ

inﬂux. CD8

T lymphocytes were

puriﬁed from naive C57BL/6 mice as described, and then left unstimulated

(Unst) or stimulated in vitro as indicated: ionomycin (Iono; 5

␮

M) or CsA

␮

M). CsA was added 15 min before ionomycin. A, Detection of NFAT1

transcription factor in CD8

T cells in total lysates (Total; upper panel)or

nuclear lysates (Nuclear; lower panel) by Western blot analysis after 15

min of stimulation. NFAT1, dephosphorylated NFAT1; NFAT1-P, phos-

phorylated NFAT1. B, Cellular localization of NFAT1 protein in CD8

cells by immunoﬂuorescence staining after 15 min of stimulation. All re-

sults are representative of at least two independent experiments.

5934 REGULATION OF IFN-

␥

EXPRESSION IN CD8

T CELLS

cells represented the main source of IFN-

␥

during the primary

response (Fig. 5A). Furthermore, NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice showed a 3-fold

decrease in the frequency of IFN-

␥

-producing CD8

T cells com

pared with NFAT1

ϩ/ϩ

mice after 72 h of in vitro stimulation (Fig.

5A). Also, NFAT1

Ϫ/Ϫ

CD8

T cells showed a drastic impairment

of IFN-

␥

production compared with NFAT1

ϩ/ϩ

CD8

T cells, as

assessed by ELISA (Fig. 5B). To investigate the essential role of

NFAT1 transcription factor during IFN-

␥

expression in CD8

cells, NFAT1

Ϫ/Ϫ

CD8

T lymphocytes were retrovirally trans

duced with an NFAT1-enconding vector. As shown in Fig. 5C,

CD8

T cells from NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice infected with pLIRES-EGFP-

empty construct showed drastically decreased IFN-

␥

-producing

cells compared with NFAT1

ϩ/ϩ

CD8

T cells infected with the

same construct. However, the frequency of IFN-

␥

-producing cells

was rescued in NFAT1

Ϫ/Ϫ

CD8

T cells retrovirally transduced

with NFAT1-encoding vector (pLIRES-EGFP-NFAT1) to the

same levels as the NFAT1

ϩ/ϩ

CD8

T cells (Fig. 5C). Although

these results clearly demonstrate that IFN-

␥

expression in CD8

lymphocytes is extremely dependent on NFAT1, we also decided

to investigate the expression levels of the transcription factor

Eomes, which has been shown to be responsible for IFN-

␥

pro-

duction in CD8

T lymphocytes (37). As shown in Fig. 5D,no

differences were observed on Eomes gene expression levels in

CD8

T lymphocytes from NFAT1

ϩ/ϩ

compared with

NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice. Thus, our results clearly demonstrate that the

IFN-

␥

produced by T lymphocytes upon TCR stimulation primar-

ily originates from CD8

T cells and depends mostly on NFAT1

transcription factor.

In vivo consequences of NFAT1-dependent IFN-

␥

production

To further characterize the relevance of the IFN-

␥

produced by

CD8

T cells during in vivo Th immune responses, we took ad

vantage of a well-deﬁned pleurisy model. Allergic diseases are

usually characterized by eosinophil tissue inﬁltration, increase in

the level of serum IgE, and a Th2 pattern of cytokine production,

including IL-4, IL-5, and IL-13, which is totally dependent on

CD4

T lymphocytes (38). It has been clearly shown that Th1

cytokines, such as IFN-

␥

and IL-12, may suppress and counteract

the Th2 response of some allergic diseases (11, 12). Thus, we

asked whether NFAT1-dependent IFN-

␥

production by CD8

cells could modulate the Th1/Th2 immune response and control

allergic inﬂammation in vivo. We performed a pleurisy model of

allergic inﬂammation to evaluate the inﬂuence of IFN-

␥

on eosin-

ophil inﬁltration and cytokine production proﬁle. As previously

demonstrated, we show in this study that NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice present

more eosinophils in the pleural cavity than wild-type mice after Ag

challenge (Fig. 6) (36, 39). Reinforcing our proposal, in vivo de-

pletion of CD8

T cells from wild-type mice (NFAT1

ϩ/ϩ

plus

anti-CD8) led to eosinophilia in the pleural cavity similar to levels

in NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice (Fig. 6). Consistently, CD8

␣

Ϫ/Ϫ

and IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

mice also presented more pleural eosinophils compared with

respective wild-type mice (Fig. 6). To better understand the im-

mune response generated in vivo in this model, we analyzed the

cytokine production proﬁle after restimulation ex vivo. As shown

in Fig. 7, NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice presented an enhanced Th2 phenotype,

including higher levels of IL-4 production and lower levels of

IFN-

␥

compared with wild-type mice. Surprisingly, CD8

T cell-

depleted NFAT1

ϩ/ϩ

mice, which presented eosinophilia similar to

NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice, did not show high levels of IL-4 production (Fig.

7). However, IFN-

␥

production was strikingly decreased to levels

similar to those in NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice (Fig. 7). Consistently, the

frequency of IFN-

␥

-competent CD4

T cells in CD8

T cell-

depleted mice was also decreased to the level in NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice

as analyzed by intracellular cytokine staining (data not shown).

Interestingly, CD8

␣

Ϫ/Ϫ

mice also presented a highly decreased

IFN-

␥

response compared with respective wild-type mice, but

showed a mild increase in IL-4, which was observed in IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

mice (Fig. 7). These results suggest that NFAT1 transcription fac-

tor-dependent IFN-

␥

production by CD8

T cells plays a crucial

role in eosinophil migration in this model of allergic inﬂammation

FIGURE 4. NFAT is able to transactivate IFN-

␥

promoter in the CD8

T cell line. CTLL-R8

cells

were left unstimulated (Unst) or were stimulated in

vitro as indicated: ionomycin (Iono; 5

␮

M), PMA (10

nM), or CsA (5

␮

M). CsA was added 15 min before

the other treatments. A, Detection of NFAT1 transcrip-

tion factor in CTLL-R8

cells by Western blot anal

ysis 15 min after stimulation. NFAT1, dephosphory-

lated NFAT1; NFAT1-P, phosphorylated NFAT1. B,

Schematic view of the plasmid constructs used in the

transactivation assay. Different IFN-

␥

-promoter con-

structs containing NFAT-binding sites were used:

pIFN-

␥

Ϫ538 (proximal 538 bp of IFN-

␥

promoter),

pIFN-

␥

Ϫ108, pIFN-

␥

Ϫ39, pIFN-

␥

Ϫ538N160

(point mutation in the NFAT Ϫ160 site), pIFN-

␥

Ϫ538N280 (point mutation in the NFAT1 Ϫ280 site),

and pIFN-

␥

Ϫ538N160/N280 (double mutation). El-

ement binding sites for the transcription factors

NFAT, AP-1, AP-2, and YY-1 are indicated. C–E,

CTLL-R8

cells were transfected with the indicated

IFN-

␥

-promoter constructs and left unstimulated

(Unst) or stimulated in vitro for 16 h as indicated.

Then luciferase activity (Luc) was measured, and gene

reporter activity was expressed as relative light units

(RLUs). All results are representative of at least two

independent experiments.

5935The Journal of Immunology

and may be important to control Th immune responses and allergic

diseases in vivo.

Discussion

In this study, we have demonstrated that IFN-

␥

production by CD8

T cells during the primary response is dependent on NFAT1 tran-

scription factor. Little is known about the molecular mechanisms that

regulate IFN-

␥

production in CD8

T cells. T-bet, the master switch

of the Th1 response, is a key regulator of IFN-

␥

expression in CD4

T cells (19). Nonetheless, it is noteworthy that T-bet expression is

induced through the IFN-

␥

signaling pathway, and thus its effects are

dependent on an initial source of this cytokine (10, 20). Pearce et al.

(37) have shown that the transcription factor Eomes, a T-bet paral-

ogue, controls effector functions of CD8

T cells, including IFN-

␥

production. However, this transcription factor is highly induced in

activated CD8

T lymphocytes, but moderately detectable in naive

CD8

T cells (37). Also, the regulatory mechanisms that dictate

Eomes gene expression in CD8

T lymphocytes are not completely

elucidated. In fact, Eomes expression was induced in CD8

T cells

early after TCR triggering (Fig. 5D), but this does not seem to explain

the striking differences observed in IFN-

␥

production by NFAT1

ϩ/ϩ

and NFAT1

Ϫ/Ϫ

CD8

T lymphocytes.

By contrast, the NFAT family of transcription factors is largely

known to be activated soon after TCR stimulation. Within minutes

after Ca

2ϩ

inﬂux, NFAT translocates to the nucleus and binds to

regulatory sequences of the IFN-

␥

promoter region, regulating its

expression (23, 27, 28). In this study we have shown that iono-

mycin-induced calcium inﬂux was sufﬁcient for IFN-

␥

production

FIGURE 5. NFAT1 is crucial for IFN-

␥

production

in CD8

T lymphocytes. A, CD3

T lymphocytes were

puriﬁed from naive NFAT1

ϩ/ϩ

and NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice as

described and were stimulated in vitro with anti-CD3 (1

␮

g/ml). After stimulation, CD4

and CD8

T cells

were analyzed for intracellular IFN-

␥

production at 72 h

as described. B–D, CD8

T lymphocytes were puriﬁed

as described from naive NFAT1

ϩ/ϩ

and NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice and were stimulated in vitro with anti-CD3 (1

␮

ml). B, Cell-free supernatants of stimulated cells were

assessed for IFN-

␥

by ELISA at the indicated time

points. C, Cells were transduced with either pLIRES-

EGFP-empty or -NFAT1 vector after 24 h of stimula-

tion. Then, EGFP

cells were analyzed by ﬂow cytom

etry for intracellular IFN-

␥

production at 96 h as

described. D, Eomes gene expression was analyzed by

semiquantitative RT-PCR at the indicated time points.

RNA loading was estimated by measuring the intensity

of the GAPDH housekeeping gene. All results are from

a pool of three mice and are representative of at least

two independent experiments.

FIGURE 6. NFAT1-dependent IFN-

␥

production by CD8

T lymphocytes controls eosinophilia in vivo. Naive animals (NFAT1

ϩ/ϩ

, NFAT1

Ϫ/Ϫ

, CD8

␣

ϩ/ϩ

CD8

␣

Ϫ/Ϫ

, IFN-

␥

ϩ/ϩ

, and IFN-

␥

Ϫ/Ϫ

)orCD8

T cell-depleted mice (NFAT1

ϩ/ϩ

plus anti-CD8) were s.c. sensitized with OVA (200

␮

g) emulsiﬁed in CFA in

a hind footpad as described. Fifteen days later, animals were intrathoracically challenged with PBS or OVA (12

␮

g) as indicated. After 24 h, the thoracic cavity

was assessed for differential leukocyte analysis. The total number of pleural eosinophils is shown in control (PBS) and treated (OVA) groups. Data are expressed

as the mean Ϯ SEM of values from ﬁve mice and are representative of two independent experiments. ء, Signiﬁcantly different from wild-type, OVA-challenged

mice (p Ͻ 0.05); ϩ, signiﬁcantly different from non-CD8

T cell-depleted, wild-type, OVA-challenged mice (p Ͻ 0.05).

5936 REGULATION OF IFN-

␥

EXPRESSION IN CD8

T CELLS

in naive CD8

T lymphocytes. In fact, the three NFAT-binding

sites identiﬁed in the proximal regulatory region of the IFN-

␥

pro-

moter are required for maximum inducibility of this gene in Jurkat

T cells and primary murine splenocytes (27, 28). Consistently,

CD4

T lymphocytes lacking NFAT1 display a substantial defect

in IFN-

␥

gene expression, independent of the down-regulatory ef-

fects of IL-4 and GATA-3 (33). It has also been proposed that

NFAT transcription factors may act as candidates to drive early

transcription of cytokine genes in T cells, because they can recruit

histone acetyltransferases and thus initiate localized histone mod-

iﬁcation in the IFN-

␥

promoter region (40 – 42). Thus, TCR-in-

ducible transcription factors, such as NFAT1, may represent the

very ﬁrst switch on IFN-

␥

production in CD8

T cells.

The local cytokine microenvironment is fundamental to deﬁne the

Th1/Th2 balance that CD4

T cells may undergo during Ag recog

nition (1, 2). The cytokine IFN-

␥

induces IL-12 production by APCs

and also up-regulates the expression of IL-12R

␤

2onCD4

T cells

through the activation of T-bet (7–10). Both mechanisms are widely

known to promote/enhance CD4

Th1 differentiation (3). Myeloid

cells, such as dendritic cells and macrophages, represent an early

source of IFN-

␥

and IL-12 in the innate arm of the immune system (3,

4). In fact, CD8a

dendritic cells are able to prime CD4

T lympho

cytes toward the Th1 phenotype (43, 44). Furthermore, it has been

recently demonstrated that NK cells may also represent an initial

source of IFN-

␥

during Th1 polarization of naive CD4

T cells (21).

Our data indicate that upon TCR stimulation of primary T cells,

CD8

, but not CD4

, T lymphocytes, are excellent producers of

IFN-

␥

, which is crucial to enhance CD4

Th1 differentiation (Fig. 1).

We thus suggest that CD8

T cells also function as another source of

IFN-

␥

that may reinforce and amplify an adaptive Th1-speciﬁc re-

sponse. In accordance, it has been argued that the IFN-

␥

secreted by

CD8

T cells acts directly on CD4

Th1 priming and also stimulates

APCs to secrete IL-12 (22). In that work, in vivo injections of anti-

CD3 in various MHC gene knockout mice have clearly demonstrated

that IFN-

␥

is rapidly produced by a distinct population of CD8

cells and polarizes CD4

T cells toward the Th1 phenotype (22). It

has also been shown that the presence of IFN-

␥

during the early phase

of CD4

Th priming is essential for Th1 phenotype stabilization,

because CD4

T cells lacking the IFN-

␥

gene or its receptor do not

mount an efﬁcient Th1 response and retain the capacity to produce

IL-4 (6). We thus suggest that CD8

T lymphocytes represent an

early source of NFAT1-dependent IFN-

␥

production during the initial

adaptive response, which may account for the consolidation of Th1

immunity.

Altering the cytokine-producing proﬁle of Th cells by inducing Th1

responses has been proposed to be protective against Th2-related dis-

orders, such as allergy (11–13). Our ﬁndings show that IFN-

␥

and

also CD8

T cells are regulators of eosinophil recruitment and Th

immune responses in vivo. Because the IFN-

␥

produced by CD8

lymphocytes was highly dependent on NFAT1, we suggest that mice

lacking this transcription factor could not counteract a Th2 response

and presented overexpression of Th2 cytokines and eosinophilia in

vivo. Thus, the impaired NFAT1-dependent IFN-

␥

production by

CD8

T cells could be an alternative explanation for the allergic

phenotype described in the NFAT1-deﬁcient mice (36, 39). However,

we cannot rule out the hypothesis that NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice present a

Th2-biased phenotype in consequence of an intrinsic defect of CD4

T cells to silence IL-4. This hypothesis could explain the low levels of

IL-4 production observed in CD8

T cell-depleted mice and the only

moderate increase in CD8

␣

- and IFN-

␥

-deﬁcient mice, rather than the

profound increase in IL-4 levels observed in NFAT1

Ϫ/Ϫ

mice

(Fig. 7).

In vivo studies of airway allergic inﬂammation have demon-

strated that IFN-

␥

, CD8

T cells, and also CD4

Th1 cells are

able to regulate Ag-induced eosinophil inﬁltration by inhibiting

Th2 responses (11–15). Interestingly, T-bet-deﬁcient mice had im-

paired IFN-

␥

production and also developed spontaneous airway

hyper-responsiveness similar to asthma patients, who revealed de-

ﬁcient T-bet expression of the lungs and signiﬁcantly lower IFN-

␥

secretion by PBMC compared with healthy individuals (45, 46). In

accordance, it has been recently shown in a model of Leishmania

major infection that the IFN-

␥

produced by CD8

T cells directly

promotes Th1 differentiation and down-regulates initial Th2 im-

mune responses (47). Although depletion of CD8

T lymphocytes

in NFAT1

ϩ/ϩ

mice induced eosinophil inﬁltration in our model of

allergic inﬂammation (Fig. 6), we cannot exclude the involvement

of other cell types in this phenomenon. In addition to CD8

cells, in vivo treatment with anti-CD8 Ab could deplete CD8a

dendritic cells, which have been implicated in Th1 differentiation

as well (43, 44). Thus, it is still possible that the absence of both

CD8

T cells and CD8a

dendritic cells might explain the en

hanced allergic inﬂammation observed in CD8-depleted

NFAT1

ϩ/ϩ

mice. Nevertheless, conﬂicting results have been doc

umented regarding the protective action of CD8

T and CD4

Th1 cells against allergic diseases (48 –50).

The suppressive effects of IFN-

␥

on allergic inﬂammation may

be explained by several mechanisms. It is most likely that IFN-

␥

directly induces the differentiation of naive T cells toward the Th1

phenotype and/or represses Th2 cell recruitment/differentiation

rather than acting on eosinophils itself (4– 6). It is also possible

that IFN-

␥

suppresses the release of Th2 cytokines from activated

T cells (51, 52) and thus inhibits the following Th2-dependent

FIGURE 7. IFN-

␥

production by CD8

T cells reg

ulates the cytokine proﬁle in vivo. Naive animals were

treated as described in Fig. 6. One day after challenge,

the draining lymph nodes (popliteal and inguinal) of the

indicated animals were stimulated in vitro for 48 h with

anti-CD3 (1

␮

g/ml). Then cell-free supernatants were

assessed for IFN-

␥

and IL-4 by ELISA. Data are ex-

pressed as the mean Ϯ SEM values from ﬁve mice and

are representative of two independent experiments. ء,

Signiﬁcantly different from wild-type, OVA-challenged

mice (p Ͻ 0.05); ϩ, signiﬁcantly different from non-

CD8

T cell-depleted, wild-type, OVA-challenged mice

(p Ͻ 0.05).

5937The Journal of Immunology

eosinophil recruitment (11, 38). However, other reports have

shown inhibitory properties of IFN-

␥

directly on eosinophil inﬁl-

tration into inﬂammatory tissues (53, 54). Our results support the

idea that NFAT1 plays a positive regulatory role in IFN-

␥

produc-

tion by CD8

T cells and may control allergic inﬂammation in

vivo. In contrast, a recent report have shown that inhibition of all

NFAT family members in T cells prevents allergic pulmonary in-

ﬂammation, early eosinophil recruitment to the lungs, and Th2

response development (55). These results support the idea that

different NFAT members may play speciﬁc roles during immune

responses in vivo, because this family consists of ﬁve proteins with

distinct properties in the regulation of cytokine genes.

In conclusion, we demonstrate in this study that IFN-

␥

produc-

tion by naive CD8

T cells during primary stimulation is highly

dependent on NFAT1 transcription factor. We also indicate that

CD8

T cells and IFN-

␥

are essential to control allergic inﬂam

mation. Finally, we suggest that NFAT1 protein plays a positive

regulatory role on IFN-

␥

production in CD8

T cells, which is

central to the generation of Th1 immune responses in vivo.

Acknowledgments

We are especially grateful to M. A. Barcinski and B. L. Diaz for comments

on the work and manuscript, and to members of our laboratory for helpful

advice and discussions. We are in debt to A. Rao, C. Wilson, and

F. Cunha for kindly providing reagents, and to E. Abrantes for help with

gene reporter experiments.

Disclosures

The authors have no ﬁnancial conﬂict of interest.

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5939The Journal of Immunology

7.2 Anexo II

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137137

137Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 100(Suppl. I): 137-144, 2005

The role of interferon-

γγ

γ on immune and allergic responses

Leonardo K Teixeira

, Bruna PF Fonseca

, Bianca A Barboza

, João PB Viola

Divisão de Biologia Celular, Instituto Nacional de Câncer, Rua André Cavalcanti 37, 20231-050 Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Allergic diseases have been closely related to Th2 immune responses, which are characterized by high levels of

interleukin (IL) IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13. These cytokines orchestrate the recruitment and activation of different

effector cells, such as eosinophils and mast cells. These cells along with Th2 cytokines are key players on the

development of chronic allergic inflammatory disorders, usually characterized by airway hyperresponsiveness,

reversible airway obstruction, and airway inflammation. Accumulating evidences have shown that altering cytokine-

producing profile of Th2 cells by inducing Th1 responses may be protective against Th2-related diseases such as

asthma and allergy. Interferon-

(IFN-

), the principal Th1 effector cytokine, has shown to be crucial for the resolu-

tion of allergic-related immunopathologies. In fact, reduced production of this cytokine has been correlated with

severe asthma. In this review, we will discuss the role of IFN-

during the generation of immune responses and its

influence on allergic inflammation models, emphasizing its biologic properties during the different aspects of

allergic responses.

Key words: interferon-γ - lymphocytes - immune system - allergy - allergic inflammation

Airway allergic diseases are common disorders, which

affect approximately 5% of the Western world popula-

tion, and show reportedly increasing incidence in devel-

oping countries during the last decades. Asthma, rhinitis,

and allergy represent the most common allergic diseases,

which arise as a result of interaction between multiple

genetic and environmental factors. Most patients exhibit

an acute immediate hypersensitivity to inhaled antigens,

known as allergens, as a consequence of a genetic pre-

disposition for the development of deregulated immune

responses (atopy). The inflammatory process may be di-

vided into early- and late-phase reactions. The early (im-

mediate) response is usually mediated by mast cell de-

granulation, whereas late phase is followed by neutro-

phil, eosinophil, and lymphocyte migration to the inflam-

matory site. This chronic inflammatory disorder of the lung

is usually characterized by (i) airway hyperresponsiveness

(AHR), (ii) reversible airway obstruction and mucus hyper-

secretion, and (iii) airway inflammation (Wills-Karp 1999).

Although allergic diseases have been linked to an en-

hanced Th2 immune response associated with high levels

of interleukin (IL) IL-4, IL-5 and IL-13, accumulating evi-

dences demonstrate that a decreased Th1 immune re-

sponse is also important in the pathogenesis of theses

diseases, and that interferon-γ (IFN-γ) could act as a cen-

tral regulator in this phenomenon. Therefore, in this re-

view we have decided to focus on some of the major func-

tions of IFN-γ that may be implicated in the pathogenic

process of allergic inflammation.

Financial support: Inca/FAF, Furnas Centrais Elétricas S.A.,

CNPq

Corresponding author. E-mail: [email protected].br

Inca/FAF fellowship.

Received 8 November 2004

Accepted 30 December 2004

The IFN-

γγ

γ cytokine

The molecule - The cytokine IFN-γ belongs to the

family of interferons, which are closely related by their

ability to protect cells from viral infections. Based on sev-

eral criteria, the IFN molecules have been divided into

two distinct classes. The first class is named type I IFN

and includes the IFN-α and IFN-β molecules, which are

the classical interferons induced in response to viral in-

fections. The second class is solely composed by IFN-γ

(also termed type II or immune IFN), which is not related

to the type I IFN at both the genetic and the protein lev-

els. Although IFN-γ displays most of the biologic activi-

ties that have been described to the other IFN, it has a

lower specific antiviral activity, but presents more

immunomodulatory properties than the type I interferons

(Farrar & Schreiber 1993).

Both human and mouse IFN-γ genes generate a unique

1.2 kb mRNA that encodes an amino acid polypeptide of

166 and 134 residues, respectively (Boehm et al. 1997).

Two polypeptide chains self-associate in an antiparallel

fashion, producing a molecule that exhibits a twofold axis

of symmetry with an apparent molecular weight of 34 kDa

(Farrar & Schreiber 1993, Bach et al. 1997). Only the dimer

displays biologic activity, possibly because it is the only

conformation of the molecule that can induce IFN-γ re-

ceptor (IFN-γR) dimerization (Farrar & Schreiber 1993).

For a long time, the production of IFN-γ has been consid-

ered to be restricted to activated natural killer (NK) cells,

CD4

T helper-1 (Th1) cells, and CD8

T cytotoxic cells

(Farrar & Schreiber 1993, Boehm et al. 1997). However, we

now know that these cells are the most potent, but not the

only sources of IFN-γ. Several studies have identified

additional IFN-γ-secreting cell types, including γδ T cells,

NKT cells, macrophages, dendritic cells, naive CD4

cells, and even B cells (Frucht et al. 2001, Szabo et al.

2003).

Molecular mechanisms of gene expression - Much of

the knowledge regarding the molecular mechanisms for

IFN-γ expression has been described in T lymphocytes,

138138

138 IFN-γ in immune and allergic responses • Leonardo K Teixeira et al.

since these cells are excellent producers of this cytokine.

Its gene expression is dictated by several transcription

factors, which bind to DNA elements located within spe-

cific regulatory regions of the IFN-γ locus (Murphy et al.

2000, Szabo et al. 2003). DNase I-hypersensitive experi-

ments have shown that the IFN-γ regulatory region en-

compasses more than 8.0 Kb of genomic DNA, and con-

sists of promoter cis elements, intronic regions and distal

enhancers. The promoter region contains binding sites

for a sort of IFN-γ-inducers, such as NF-kB, NFAT, STAT-

4, and T-bet (Murphy et al. 2000, Szabo et al. 2003).

The expression of the IFN-γ gene has showed to be

repressed by the immunosuppressive drug cyclosporin.

In fact, three binding sites for the cyclosporin-sensitive

NFAT family of transcription factors have been identified

through the proximal region of the IFN-γ promoter. These

sites are required for maximal IFN-γ expression in T cell

lines and primary T lymphocytes (Sweetser et al. 1998).

The NFAT and NF-kB transcription factors are thought to

bind to similar DNA sequences, and may thus coordi-

nately cooperate for the regulation of IFN-γ gene expres-

sion. Hence, NF-kB induction within T cells is crucial for

substantial IFN-γ production and Th1 response (Sica et

al. 1997). It has also been shown that both IL-12 and IL-18

augments IFN-γ production through the activation of NF-

kB pathway. However, the influence of the IL-12/IL-18

pathway on IFN-γ production in Th1 effector cells de-

pends mainly on STAT4, which is able to directly bind to

the promoter region of the IFN-γ gene. Even so, STAT4

does not seem to be essential for the initial production of

IFN-γ, but to amplify the amount of IFN-γ produced by

individual cells since STAT4-/- T lymphocytes are still

able to produce this cytokine (Murphy et al. 2000, Szabo

et al. 2003).

While some nuclear factors are ubiquitous regulators

of gene expression, others are required for selective gene

expression in specific cellular subsets. In CD4

T lym-

phocytes, T-bet (T-box expressed in T cells) was recently

identified as the master switch of Th1 differentiation and

to be the key regulator of IFN-γ expression in these cells

(Szabo et al. 2000). T-bet is largely expressed in the lym-

phoid system, and also has shown to transactivate the

IFN-γ gene and induce chromatin remodeling of the IFN-

γ locus (Szabo et al. 2003). Three putative T-box binding

sites were identified in the IFN-γ gene locus, two sites

located 2 Kb from the start site and one in the third intron.

Recently, Reiner and collaborators have identified two

transcription factors also related to IFN-γ production: Hlx,

a potential interacting partner for T-bet that has presented

synergistic effects on IFN-γ production (Mullen et al.

2002); and Eomesodermin, a T-bet paralogue that con-

trols effector functions of CD8

T cells, including IFN-γ

production (Pearce et al. 2003). Although some transcrip-

tion factors are conserved regulators of IFN-γ gene ex-

pression among different cell types, it remains to be de-

termined the key effectors of each cell lineage. Further-

more, the regions responsible for tissue-specific expres-

sion of the IFN-γ gene remain to be elucidated.

The signaling pathway - IFN-γ exerts its pleiotropic

effects through a specific interaction with the cell surface

IFN-γR. The receptor complex consists of two chains: IFN-

γR1 (also known as IFN-γ receptor α), which is the major

ligand-binding subunit, and IFN-γR2 (also known as IFN-

γ receptor β), which is obligatory for IFN-γ signal trans-

duction, and also increases the affinity of IFN-γR1 for its

ligand, presumably by enhancing the stability of the com-

plex (Boehm et al. 1997, Tau & Rothman 1999).

Signal transduction starts with an interaction of the

IFN-γ homodimer with two α-chain receptors, thereby in-

ducing α-chain dimerization and the subsequent recruit-

ment of two β-chains to the complex. Each chain is consti-

tutively associated with a specific Janus kinase (JAK)

(the α-chain with JAK1 and the β-chain with JAK2)

(Igarashi et al. 1994). The aggregation of the receptor com-

ponents brings inactive JAKs into close proximity with

one another. Once clustered, JAKs are reciprocally acti-

vated through sequential auto and transphosphorylation

events. After activation, JAKs then phosphorylate a spe-

cific tyrosine residue near the C-terminus of the IFN-γR1,

which serve as a docking site to the binding of STAT1

(Heim et al. 1995). The recruitment of STAT1 is followed

by its phosphorylation on tyrosine residue 701 by the

receptor-associated JAKs. This phosphorylation leads to

a rapid dissociation of the receptor and to the formation

of STAT1 homodimers (also called GAF, for gamma-acti-

vated factor) (Greenlund et al. 1995). At some point dur-

ing the early phase of activation, STAT1 is also phospho-

rylated on serine 727 by a process involving phos-

phatidylinositol 3-kinase (PI3-K) and Akt that is required

for maximal transcriptional activity (Nguyen et al. 2001).

The STAT1 homodimer then translocates into the nucleus,

where it is able to bind to defined DNA sequences (known

as GAS, for gamma-activated site) and initiate or suppress

transcription of IFN-γ-regulated genes (Darnell et al. 1994)

(Fig. 1). In addition to the well known Jak-STAT pathway,

IFN-γ activates several additional signal-transduction

proteins (Ramana et al. 2002). In fact, targeted disruption

of the STAT1 gene in mice has revealed STAT1-indepen-

dent pathways in IFN-γ-dependent signaling (Gil et al.

2001). The role of these pathways in the variety of physi-

ological and pathological conditions remains to be eluci-

dated.

In summary, by activating the latent cytosolic tran-

scription factor STAT1, IFN-γ initiates the transcription

of a number of genes containing STAT1-binding sites in

their promoter regions. Many of these induced genes are

transcription factors (for example, IRF-1) that are able to

further drive the regulation of the next wave of transcrip-

tion. The total number of IFN-γ-regulated genes is esti-

mated to be ~500 (Boehm et al. 1997). It has been demon-

strated that IFN-γ upregulates the transcription of genes

related to antigen presentation (MHC class I and II, β2-

microglobulin, TAP), Th1 phenotype development

(STAT1, T-bet), chemokine-based recruitment of mono-

cytes, T cells, eosinophils and basophils (MCP-1, MCP-

2, MCP-3, RANTES), cellular adhesion (VLA-4, ICAM-1,

VCAM-1 molecules), immunoglobulin heavy chain class

switch (IFN-γ upregulates IgG and downregulates IgE),

cytokines network (IL-12, IFN-γ, CD40), apoptosis (CD95,

caspases), lymphocyte activation (B7-1 and B7-2 mol-

ecules), and others (Boehm et al. 1997). As we shall dis-

139139

139Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 100(Suppl. I), 2005

cuss here, these IFN-γ-regulated genes take part in the

generation of immune responses related to several stages

of some allergic processes.

Immunologic basis of allergic diseases

Allergic inflammation has been closely associated with

CD4

Th lymphocytes, since a classical Th2 pattern of

cytokine production has shown to contribute to the patho-

genesis of this disease (Renauld 2001). Elevated numbers

of Th2 cells have been identified in the bronchoalveolar

lavage (BAL) fluids and airway biopsies from asthmatic

patients. These lymphocytes produce high levels of IL-4,

IL-5, IL-9, and IL-13, which orchestrate the recruitment

and activation of effector cells related to allergic re-

sponses, such as eosinophils and mast cells. The cytokine

IL-4 was originally identified as a B cell growth factor, and

further showed to promote IgE isotype switch in B cells.

In addition, IL-4 is required for optimal Th2 and mast cell

differentiation, whereas IL-5 is a selective factor for eosi-

nophil activation and development. IL-4 and IL-5 also in-

crease eosinophil adhesion to vascular endothelial cells,

and promotes its infiltration to inflammatory sites by regu-

lating surface markers on eosinophils (such as VLA-4)

and endothelium (such as VCAM-1). These cytokines may

be produced not only by CD4

T cells, but also by mast

cells and eosinophils themselves. Still considering Th2

cytokines, IL-13 is responsible for the mucus hyper-se-

cretion of submucosal glands and/or epithelial cells, and

IL-9 has been recently related to mast cell and eosinophil

proliferation/differentiation (Wills-Karp 1999, Renauld

2001).

In line with all these features, allergic inflammation is

correlated with pronounced levels of serum IgE, eosino-

phil migration to the site of inflammation, and activation

of specific cellular compartments. Together with allergen

recognition, IgE antibodies bind to Fc receptors (FcR)

present on the surface of mast cells and basophils, and

thus trigger the release of inflammatory mediators (such

as histamine, prostaglandin and leukotrienes), as well as

chemotactic factors (such as eotaxin/CCL11, MCP-1/CCL2

and RANTES/CCL5) and cytokines that in a fine-tuned

way are responsible for several allergic reactions. In the

mucosa, these mediators of hypersensitivity reactions

rapidly induce vascular changes, edema, mucus produc-

tion, and smooth muscle constriction. Furthermore, it

seems that eosinophils are also involved in the patho-

genesis of allergic diseases because they usually infil-

trate to the target tissues, where they release several in-

flammatory mediators and cytokines that contribute to

airway wall epithelium damage. Finally, chemokines, or

chemoattractants, are also relevant in allergy not only for

their role in regulating leukocyte recruitment (mainly ba-

sophils, eosinophils, and mast cells), but also because

they can regulate cellular activation and inflammatory

mediators release, IgE synthesis, and Th2 cell recruitment

to the site of allergic inflammation. Taken all together, these

findings indicate that Th2 cells and their cytokines can

account for some of the initial hallmarks of airway inflam-

mation, and are crucial for the pathogenesis of allergic

diseases (Wills-Karp 1999, Renauld 2001). During the next

sections, we will focus on how IFN-γ regulates Th im-

mune responses, and may thus control allergic diseases.

IFN-

γγ

γ and Th immune response

A critical aspect of the immune response to allergens

is mediated by the helper function of CD4

T cells. After

engagement of the T cell receptor (TCR) by the appropri-

ate peptide-MHC complex, naive CD4

T cells rapidly

undergo a differentiation process that leads to the devel-

opment of two functionally distinct cell subsets. These

subsets are characterized by a mutually exclusive pattern

of cytokine secretion. Th1 cells secrete IFN-γ and TNF-β

and are efficient in eliminating intracellular pathogens.

Th2 cells produce IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13, which affect

Fig. 1: interferon-γ (IFN-γ) signaling pathway. IFN-γ binds to its receptor (IFN-γR) and leads to the aggregation of α and β-chains, which

are constitutively associated with Janus Kinases (JAKs). Once actived, JAKs phosphorylate the IFN-γRα chain, creating a docking site for

STAT1, which is then phosphorylated and associated in homodimers (named GAF, for gamma-activated factor). The STAT1 homodimer

translocates to the nucleus where it is able to bind to specific DNA sequences (named GAS, for gamma-activated site) and regulate the

expression of IFN-γ-responsive genes.

140140

140 IFN-γ in immune and allergic responses • Leonardo K Teixeira et al.

humoral immunity to helmintic parasites and are respon-

sible for immune responses to persistent allergens (Abbas

et al. 1996). Several factors can influence the differentia-

tion pathway of CD4

Th cells, specially the cytokines

prevailing within the microenvironment where these cells

encounter antigens (Constant & Bottomly 1997). IL-12

and IL-4 are known to be the major Th1- and Th2-induc-

ing cytokines, respectively (Abbas et al. 1996). The Th1/

Th2 balance is extremely important and may determine

whether the immune response is appropriate or leads to

severe immunopathologies. Overproduction of Th1

cytokines has been implicated in delayed-type hypersen-

sitivity reactions and autoimmune diseases. On the other

hand, it is notorious that the basis for allergic disorders

remains on the dysregulation of the Th2 phenotype as

previously stated here (Abbas et al. 1996).

Accumulating evidences have shown that altering

cytokine-producing profile of Th2 cells by inducing Th1

responses is protective against Th2-related disorders

such as asthma and allergy. It has been demonstrated

that Th1 lymphocytes and cytokines such as IFN-γ and

IL-12 may counteract and suppress Th2 responses of al-

lergic diseases (Iwamoto et al. 1993, Cohn et al. 1999, Dow

et al. 1999). In fact, defective IFN-γ production predis-

poses toward the development of allergic diseases, and

patients with severe asthma present significantly reduced

IFN-γ production in response to allergen when compared

to control individuals (Leonard et al. 1997, Renzi et al.

1999). Moreover, resolution of allergy seems not to be

related with a reduction in Th2-cytokine production, but

with normalization of IFN-γ levels (Smart et al. 2002). In-

terestingly, it has also been reported an inverse associa-

tion between dominant IFN-γ immune responses to intra-

cellular pathogens in childhood and the incidence of

asthma (Shirakawa et al. 1997). These results emphasize

the inhibitory character of IFN-γ on the response against

allergens.

IFN-γ is the principal Th1 effector cytokine, and it has

a crucial role in Th1 differentiation. IFN-γ has the ability

to act in a great number of cell types that are involved in

Th differentiation. It induces IL-12 production by antigen

presenting cells (APC), such as dendritic cells and mac-

rophages (Snijders et al. 1998, Szabo et al. 2003). These

APCs provide the first contact of naive CD4

T cells with

the antigen, therefore this IL-12 production is of great

importance on the differentiation pathway towards a Th1

phenotype. In addition to its role on APC, IFN-γ exerts

effects on the CD4

T cells themselves. This cytokine is

capable of enhancing the development of Th1 effector

cells from BALB/c mice by increasing naive CD4

T cells

responses to IL-12 (Wenner et al. 1996). Actually, IFN-γ is

responsible for inducing/maintaining the expression of

the β chain of the IL-12 receptor (IL-12Rβ2) through T-bet

activation, stating an important role of IFN-γ on the Th1

effects mediated by IL-12 (Mullen et al. 2001, Afkarian et

al. 2002). Studies on CD4

T cells from C57BL/6 mice have

also revealed a direct role for IFN-γ as an inducer of Th1

polarization via an autocrine mechanism, independent of

IL-12 (Bradley et al. 1996) (Fig. 2).

IFN-γ also exerts direct inhibitory effects on Th2

cytokines, reducing the levels of IL-4 and IL-5 produc-

tion. The IFN-γ signaling pathway activates T-bet pro-

tein, the Th1-specific and Th2-suppresing transcription

factor (Lighvani et al. 2001, Afkarian et al. 2002). In fact,

ectopically expression of T-bet was able to repress IL-4

and IL-5 in Th2 cells (Szabo et al. 2000). In a model of

atopic dermatitis, Th2 cells retrovirally transfected with a

vector expressing T-bet conferred Th1-like cytokine pro-

duction and migratory capacities to those cells (La-

metschwandtner et al. 2004). Consistently, T-bet-deficient

mice have impaired IFN-γ production and also develop

spontaneous AHR similar to allergic patients (Finotto et

al. 2002). Also, T-bet expression in CD4

T cells is dimin-

ished in the lungs of asthmatic patients, who present sig-

Fig. 2: interferon-γ (IFN-γ) controls Th immune and allergic responses. IFN-γ is produced by different cell sources. It may counteract Th2

immune responses (by suppressing the development of Th2 lymphocytes), induce Th1 differentiation (by enhancing IL-12 production by

APC or skewing naive Th lymphocytes toward the Th1 phenotype), and control several steps of allergic responses (by inducing eosinophil

apoptosis and blocking IgE isotype switch in B cells).

141141

141Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 100(Suppl. I), 2005

nificantly lower IFN-γ secretion by peripheral blood mono-

nuclear cells when compared with healthy individuals

(Nurse et al. 1997, Finotto et al. 2002). On the other hand,

the Th2-induced transcription factor GATA-3 specifically

controls the expression of Th2 cytokines, which are es-

sential to induce allergic inflammation in vivo (Zheng &

Flavell 1997). In fact, increased levels of GATA-3 mRNA

expression have been reported in asthmatic airways when

compared to those of control subjects and correlated with

increased IL-5 expression (Nakamura et al. 1999). The ex-

pression of a dominant-negative mutant of GATA-3 led to

a reduction in the levels of all Th2 cytokines and attenu-

ated mucus production, IgE synthesis, and airway eosi-

nophilia in the transgenic mice (Zhang et al. 1999).

IFN-γ has indeed a crucial role on inhibiting Th2 re-

sponses but not only through T-bet expression. Loss of

IL-4 receptor responsiveness may be another mechanism

that suppresses Th2 development in polarizing Th1 cells

(Huang & Paul 1998). Other studies have shown that IFN-

γ directly suppresses IL-4 gene expression through IRF-1

and 2, which bind to three distinct IL-4 promoter sites and

act as transcriptional repressors (Elser et al. 2002). In vivo,

IFN-γ-mediated Th2 repression can be shown by experi-

ments based on models of pulmonary inflammation or-

chestrated by Th2 cytokines. In IFN-γR-/- mice previously

sensitized with OVA and rechallenged intranasally with

the same antigen, the inflammatory lung disease persisted

long after it was resolved by wild type mice (Coyle et al.

1996). As discussed before, IFN-γ acts not only as a po-

tent activator of the Th1 phenotype, but also as a sup-

pressor of Th2 development.

Besides the counteracting roles of IFN-γ in the Th2

differentiation process, IFN-γ has a role in inhibiting the

proliferation of Th2 cells. In fact, over a decade ago

Gajewski and Fitch (1988) have observed that IFN-γ was

responsible for the inhibition of proliferation and IL-1-

induced responses of some Th2 clones. Further experi-

ments have shown that Th1 cells decreased their expres-

sion of the β chain of the IFN-γR while Th2 cells did not,

suggesting a mechanism by which IFN-γ could inhibit

selectively the proliferation of Th2 clones (Pernis et al.

1995). The role of IFN-γ in promoting Th1- and inhibiting

Th2-type responses has also been subject of some con-

troversy. Recently, Bocek and colleagues (2004) have

shown a quite unexpected function for IFN-γ as an IL-4-

production inducer. The authors suggest that the precise

amount of cytokines may be the key to whether the domi-

nant effect of IFN-γ is to enhance or suppress Th2 prim-

ing (Bocek et al. 2004).

IFN-

γγ

γ and allergic inflammation

The suppressive effects of IFN-γ on allergic diseases

have been shown to be mediated by various mechanisms,

such as the (1) regulation of allergen presentation to T

lymphocytes, (2) differentiation of naive T cells toward

Th1 phenotype and/or inhibition of Th2 cell recruitment/

differentiation, (3) suppression of Th2 cytokine release

from activated T cells, (4) inhibition of effector cell re-

cruitment to the site of inflammation, (5) induction of

apoptosis in T cells and eosinophils, (6) blockage of IgE

isotype switch in B cells, and (7) induction of nitric oxide

(NO) production. Actually, IFN-γ is known to be a pleio-

tropic cytokine that induces and modulates an array of

immune responses. Therefore, in this section we have

decided to focus on some of the major functions of this

cytokine not discussed until here that may be implicated

in allergic diseases in a certain manner.

One of the important physiologic roles of IFN-γ dur-

ing the generation of immune responses is its ability to

upregulate the expression of MHC class I and II proteins

in several cell types. While this upregulation enhances

antigen presentation in macrophages, it has been shown

that IFN-γ almost completely abrogates the capacity to

present antigens by mast cells, central mediators of aller-

gic reactions (Farrar & Schreiber 1993, Frandji et al. 1995).

Since Th cells can be activated in the airway mucosa,

mast cells could act as APCs in the absence of IFN-γ,

inducing Th2-type responses through their ability to pro-

duce substantial amounts of IL-4 (Hamid et al. 1991, Frandji

et al. 1995, Constant & Bottomly 1997).

It has been demonstrated that IFN-γ is responsible for

regulating the activation, differentiation and recruitment

of eosinophils. In fact, IFN-γ induces a decrease in the

expression of the eotaxin receptor (CCR3), which was re-

cently showed to be an important inducer of eosinophil

differentiation from hematopoietic progenitor cells

(Lamkhioued et al. 2003). Lung eosinophil recruitment is

one of the hallmarks of atopic asthma and IFN-γ seems to

play an important inhibitory role on these cells. Through

the induction of the chemokine Mig (CXCL9), IFN-γ in-

hibits the eotaxin-dependent recruitment of eosinophils

to the lung (Fulkerson et al. 2004). In vivo models of aller-

gic inflammation have also proved the properties of IFN-

γ to regulate allergen-induced eosinophilic infiltration.

Recombinant IFN-γ treatment before inhalation of aero-

solized antigen prevented eosinophil infiltration into the

trachea of sensitized mice (Iwamoto et al. 1993). Targeted

disruption of the IFN-γ receptor gene has resulted in a

prolonged airway eosinophilia in response to allergen,

suggesting that IFN-γ signaling pathway is crucial to con-

trol eosinophil recruitment in vivo (Coyle et al. 1996). In

human studies, nebulized IFN-γ has also reduced the num-

ber of eosinophils in the BAL of asthmatic patients

(Boguniewicz et al. 1995). However, it is unlikely that this

cytokine directly acts on the eosinophils during its infil-

tration to inflammatory tissues. In agreement, several re-

ports have concluded that IFN-γ directly prevents aller-

gen-induced CD4

T cell infiltration into the tissue and

thereby inhibits the following IL-5-dependent eosinophil

recruitment.

IFN-γ also plays a role in the nitric oxide pathway,

inducing iNOS, an NO synthase (Boehm et al. 1997).

Through the induction of NO production, IFN-γ inhibits

IgE-mediated degranulation of mast cells (Eastmond et al.

1997). Moreover, NO itself is a bronchodilator, and inhala-

tion of high concentrations of NO has resulted in a small

bronchodilatory response in asthmatic patients (Högman

et al. 1993). NO has also shown a role in inhibiting prolif-

eration and DNA synthesis in airway smooth muscle cells

(Patel et al. 1999). Since hyperplasia and hypertrophy of

airway smooth muscle are thought to contribute to air-

way dysfunctions such as asthma, NO induction could

be an important inhibitor of these diseases (Patel et al.

1999).

142142

142 IFN-γ in immune and allergic responses • Leonardo K Teixeira et al.

Another critical role of IFN-γ in allergic reactions is its

ability to inhibit immunoglobulin class switching to IgE,

which is an important mediator of allergic pathologies in-

duced by Th2 cytokines as discussed before (Boehm et

al. 1997). Besides inhibiting IgE class switch, IFN-γ in-

duces IgG production instead. IgG may neutralize inhaled

allergens, and through interactions with Fcγ receptors

(FcγR), may promote activation of accessory cells and

enable FcγR-mediated endocytosis of allergen-IgG com-

plexes, thereby promoting allergen capture and presenta-

tion by APC, such as alveolar macrophages (Sehra et al.

2003). This results on the activation of specific Th sub-

sets, specially cells from the Th1 lineage, since several

studies have shown that the APC activity of macroph-

ages is associated with Th1 cell priming (Desmedt et al.

1998). In fact, treatment with anti-allergen IgG in the air-

ways of sensitized mice was followed by an increment of

secreted IFN-γ along with a shift from a Th2-skewed re-

sponse to a more balanced Th1/Th2 response. In addi-

tion, a resulting reduction in eosinophils in the

bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of these mice has also

been observed after treatment (Sehra et al. 2003). For these

reasons, it has been suggested that the induction of IFN-

γ may be beneficial in regulating IgE-mediated inflamma-

tion. Thus, the decreased production of IFN-γ in asth-

matic patients may enable an increase in IgE levels by

either permitting IgE isotype switch of B cells or by per-

mitting more CD4

T cell progenitors to differentiate into

Th2 cells.

It has also been reported the involvement of IFN-γ in

apoptotic events. Inflammatory responses induced by al-

lergen exposure cause mucus cell metaplasia by differen-

tiation of existing and proliferating epithelial cells into

mucus-storing cells. IFN-γ has a role in inducing apoptosis

of these cells through the induction of caspases and Bax,

two proapoptotic proteins, thereby recovering the origi-

nal proportions of cell types in the airway epithelium (Shi

et al. 2002, Tesfaigzi et al. 2002). Accordingly, IFN-γ has

shown to induce apoptosis in T cells and eosinophils

through caspase and CD95/Fas-mediated mechanisms,

respectively (Luttman et al. 2000, Refaeli et al. 2002). Also,

it has been indicated a correlation between increased IFN-

γ production and enhanced apoptosis of eosinophils and

CD4

T cells in allergic airway infiltrates (Kodama et al.

2003). Thus, IFN-γ-mediated apoptosis induction of CD4

T cells and eosinophils may be an alternative explanation

for the suppressive effects of IFN-γ directly on the local

recruitment of these cells in allergic situations.

The adoptive transfer of IFN-γ-producing cells into

allergen-sensitized recipients has also protected from air-

way eosinophilia after antigen challenge. Indeed, when

transferred into recipient mice, CD4

Th1 cells have inhib-

ited Th2-induced eosinophilia and mucus secretion

through the production of IFN-γ, since IFN-γR-/- mice

had prolonged eosinophilia (Cohn et al. 1999). However,

other studies have suggested that adoptively transferred

Th1 cells might induce an inflammatory response encoun-

tered in asthma due to the proinflammatory properties of

IFN-γ. It really seems that an inflammatory response is

necessary to activate lung macrophages to produce reac-

tive oxygen species, which are important to airway re-

modeling. Lung macrophages are also able to selectively

promote Th1 responses during secondary exposure to

inhaled allergen, thereby suppressing Th2-mediated al-

lergic airway inflammation (Tang et al. 2001). Finally, IFN-

γ secretion by transferred CD8

T cells has also controlled

airway eosinophilia in a model of allergen-challenged rats

(Suzuki et al. 2002). Although increasing evidences sug-

gest a protective role for IFN-γ against allergic diseases,

conflicting results still regard its involvement in these

responses (Hansen et al. 1999). Therefore, strengthening

Th1 responses of allergic patients either by the adoptive

transfer of activated antigen-specific T cells or by the

administration of recombinant IFN-γ may only be consid-

ered as a potential immunotherapy intervention after fur-

ther intensive investigations.

Concluding remarks

Several experimental findings have strongly supported

the idea that the pathogenesis of allergic diseases is re-

lated to a misbalance between Th1/Th2 immune responses.

For the past few years, it has been demonstrated that

allergic inflammation is associated to an enhanced Th2

immune response. However, we now know that the ab-

sence of competent Th1 immune responses, specially the

downregulation of IFN-γ, accounts for the establishment

of these diseases. We reviewed here the recent data that

demonstrate the importance of this cytokine in the modu-

lation of allergic diseases. The development of novel thera-

peutic strategies has been designed to inhibit the devel-

opment of Th2 cells (or the effect of their cytokines) and

shift the immune response into a Th1 phenotype. In fact,

the potent inhibitory property of IFN-γ on Th2 responses

and allergic inflammation has suggested that it might be a

possible treatment approach for such diseases. However,

initial studies have shown unexpectedly high toxicity and

several side effects related to IFN-γ administration to al-

lergic patients. Even so, based on all findings related to

IFN-γ modulation of Th immune response and allergy,

any new possible immunotherapy approach developed

for allergic inflammation will need to take into account the

potent immunoregulatory properties of this cytokine.

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106

7.3 Anexo III

VIOLA J.P.B., CARVALHO L.D.S., FONSECA, B.P.F.

, TEIXEIRA L.K. NFAT

transcription factors: from cell cycle to tumor development.

Braz J Med Biol

Research

38: 335-344. 2005.

335

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

NFAT proteins in cell cycle and tumorigenesis

NFAT transcription factors: from cell

cycle to tumor development

Divisão de Biologia Celular, Instituto Nacional de Câncer,

Rio de Janeiro, RJ, Brasil

J.P.B. Viola,

L.D.S. Carvalho,

B.P.F. Fonseca

and L.K. Teixeira

Abstract

The nuclear factor of activated T cells (NFAT) family of transcription

factors has been primarily identified in immune cells; however, these

proteins have been recently found to be functionally active in several

other non-immune cell types. NFAT proteins are activated upon

different stimuli that lead to increased intracellular calcium levels.

Regardless of their widely known cytokine gene expression proper-

ties, NFATs have been shown to regulate other genes related to cell

cycle progression, cell differentiation and apoptosis, revealing a broader

role for these proteins in normal cell physiology. Several reports have

addressed the participation of NFATs in many aspects of malignant

cell transformation and tumorigenic processes. In this review, we will

discuss the involvement of the different NFAT family members in the

regulation of cell cycling, differentiation and tumor formation, and

also its implications on oncogenesis. Better understanding the mechan-

isms by which NFATs regulate cell cycle and tumor-related events

should be relevant for the development of rational anti-cancer thera-

pies.

Correspondence

J.P.B. Viola

Divisão de Biologia Celular

Instituto Nacional de Câncer (INCA)

Rua André Cavalcanti, 37, 5º andar

20231-050 Rio de Janeiro, RJ

Brasil

Fax: +55-21-3233-1470

E-mail: [email protected]

Presented at the XI Congresso

Brasileiro de Biologia Celular,

Campinas, SP, Brazil, July 15-18,

2004.

Research supported by INCA/FAF,

FURNAS Centrais Elétricas S.A.,

and CNPq. L.K. Teixeira and

B.P.F. Fonseca were supported by

an INCA/FAF fellowship.

Received July 16, 2004

Accepted November 12, 2004

Key words

• NFAT

• Cell cycle

• Cancer

• Cell differentiation

• Gene expression

Introduction

Cell activation is regulated by an interact-

ing network of transcription factors that de-

termine the expression of different genes. It

has been shown that several transcription

factors, including the nuclear factor of acti-

vated T cells (NFAT) family, play an impor-

tant role in the control of gene expression

during cell activation and differentiation.

Most of the work on NFAT proteins has been

related to immune cell activation and its

mediators, such as cytokines (1). However,

accumulating evidence has been demonstrat-

ing that NFAT transcription factors are pres-

ent in a wide range of cell types and tissues

that are not related to the immune system,

and implicated in the regulation of genes that

control cell cycle progression, cell develop-

ment and differentiation, angiogenesis, and

possibly tumorigenesis (2-7). Given the im-

portance of these processes in different stages

of cell physiology, it is of considerable inter-

est to understand the mechanisms by which

NFAT transcription factors affect cell acti-

vation and function. Thus, in this review we

will focus on the involvement of the NFAT

family of transcription factors in cell cycle

Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2005) 38: 335-344

ISSN 0100-879X Review

336

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

J.P.B. Viola et al.

regulation, cell differentiation and oncogen-

esis.

The NFAT family of transcription

factors

NFAT was first identified in T cells as a

rapidly inducible nuclear factor able to bind

to the distal antigen receptor responsive ele-

ment of the human IL-2 promoter (8). Over

the past few years, studies from several labo-

ratories have indicated that NFAT proteins

regulate the expression of different genes,

including signaling proteins, cytokines, cell

surface receptors, and cell cycle and apopto-

sis related proteins. The NFAT family of

transcription factors encodes four distinct

proteins that are regulated by the calcium/

calcineurin signaling pathway, known as

NFAT1 (also called NFATp, NFATc2),

NFAT2 (NFATc, NFATc1), NFAT3

(NFATc4), and NFAT4 (NFATx, NFATc3),

and another protein named NFAT5 (TonE-

BP), which is regulated by hyperosmotic

stress (1,9). NFAT1, the first identified mem-

ber of the family, was cloned from murine

(Ar-5) and human (Jurkat) T cell cDNA

libraries (10,11). A distinct protein, NFAT2,

was also cloned from a Jurkat T cell cDNA

library (12). cDNA clones encoding two other

NFAT proteins, NFAT3 and NFAT4, were

isolated from Jurkat T cell, human peripher-

al blood lymphocyte and human thymus

cDNA libraries (13,14).

Despite their name, NFAT proteins are

expressed not only in T cells, but also in

other classes of immune and non-immune

cells. NFAT1, NFAT2 and NFAT4 are ex-

pressed at the protein level in peripheral T

and B cells; NFAT1 is also expressed in mast

cells, NK cells, and in certain monocytes and

macrophages (1,9,15). NFAT1 and NFAT2

mRNAs are expressed in peripheral lym-

phoid tissues, and NFAT2 mRNA is upregu-

lated in activated T cells and NK cells (12,14).

NFAT4 mRNA is expressed at high levels in

the thymus and at low levels in peripheral

lymphoid tissues (13,14). However, several

data have demonstrated that NFAT proteins

are also present in different non-related im-

mune cell lines and tissues, such as neuronal

cell line and nervous system tissues, endo-

thelial cell line, skeletal and heart muscle,

chondrocytes, keratinocytes, and adipocytes

among others (1,5,16).

Several isoforms have been described for

NFAT1, NFAT2 and NFAT4. Sequence ho-

mology represented in all the isoforms sug-

gests two different domains, comprising the

DNA-binding domain and the NFAT homol-

ogy region (11,17). The DNA-binding do-

main, which is located between amino acid

residues 400 and 700, is highly conserved

within the NFAT family, and shows moder-

ate sequence similarity to the DNA-binding

domains of Rel-family proteins (17). Based

on comparisons of binding site sequences,

the NFAT binding site is determined to be a

9-bp element, possessing the consensus

nucleotide sequence (A/T)GGAAA(A/N)(A/

T/C)N (1,9). In addition, NFAT transcrip-

tion factors cooperate with AP-1 proteins in

DNA binding and transactivation, and this

association results in stabilization of the

NFAT-DNA interaction (1,9). The NFAT

homology region is located in the N-terminal

region, comprising 300 amino acids, and

shows a strong conservation of several se-

quence motifs characteristic of the NFAT

family (11,13,14).

Further on, NFAT transcription factors

have been characterized as cytosolic proteins

constitutively expressed in resting cells (1).

Upon stimulation of receptors coupled to cal-

cium mobilization, NFAT proteins are acti-

vated by calcineurin, the calcium/calmodulin-

activated serine-threonine phosphatase (1,9).

Activation of NFAT by calcineurin is sensitive

to calcineurin inhibitors and immunosuppres-

sive agents, such as cyclosporin A and FK506

(1,15). Three different steps of activation have

been defined for NFAT proteins: dephospho-

rylation, nuclear translocation, and DNA bind-

ing (Figure 1). In resting cells, NFAT proteins

337

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

NFAT proteins in cell cycle and tumorigenesis

are phosphorylated and cytoplasmic, and show

a low affinity for DNA (18). Stimuli that

trigger calcium mobilization result in rapid

dephosphorylation of NFAT proteins and their

translocation to the nucleus, where dephos-

phorylated proteins show increased affinity

for DNA (18,19). Binding sites for NFAT

proteins are present in the promoter/enhancer

regions of several inducible genes, including

the cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ,

and TNF-α; the cell surface proteins CD40L,

CTLA-4 and FasL; the enzyme cyclooxy-

genase-2, and the cell cycle regulator CDK4

(1,4,15,20,21). Thus, a large number of induc-

ible genes that regulate cell proliferation, dif-

ferentiation, survival, and apoptosis are under

the control of NFAT proteins.

NFAT and cell cycle regulation

The cell cycle is controlled by a set of

protein complexes composed by two basic

components: cyclin-dependent kinases

(CDK) and their activation partners, the

cyclins. Cyclin-CDK activity is regulated in

response to appropriate stimuli and plays a

key role in controlling cell cycle progres-

sion. The expression of specific cyclins is

regulated at the transcription level, and dic-

tates the formation of distinct cyclin/CDK

complexes at different points of the cell

cycle. CDK activity is usually influenced by

several mechanisms, such as cyclin degrada-

tion (22) and phosphorylation of CDKs by

inhibitory proteins, known as CDK inhibi-

tors. CDK inhibitors are composed by two

families of proteins: INK4 proteins, which

specifically inhibit the catalytic subunit of

CDK4 and CDK6, and Cip/Kip proteins,

which affect the activity of cyclin D-, E-, and

A-dependent kinases (23).

Different classes of cyclins are defined

by the cell cycle phase at which they bind to

CDKs and exert their function. During G0/

G1 transition phase, cyclin C stimulates

CDK3-mediated phosphorylation of the ret-

inoblastoma protein (pRB), exiting cells from

quiescence (24). In G1 phase, cyclin D-

CDK4/6 complex phosphorylates pRB and

leads to E2F transcription factor release,

which transactivates genes related to S phase

entry (23,25,26). During late G1, cyclin E-

CDK2 phosphorylates additional sites of the

pRB subsequent to cyclin D-CDK4/6 phos-

phorylation sites, regulating G1/S transition.

Cyclin A has been implicated in the control

of S phase entry, as well as in the G2/M

transition by binding to CDK2 and CDK1,

respectively. Mitosis phase events are quite

dependent on specific cyclin B-CDK1 com-

plex activity (23,26).

Increase of intracellular free calcium is

central for cellular activation. Several obser-

vations have demonstrated that calcium sig-

nal stimulates gene transcription associated

with cell cycle progression, and also pro-

motes G1/S phase transition (27-29). Fur-

thermore, accumulating evidence suggests

that the phosphatase calcineurin plays a ma-

jor role in the regulation of cell cycle pro-

gression by acting during the early stages of

G1 phase (20,30,31). Taken together, these

results suggest that NFAT proteins, which

are activated in consequence of calcium

stimulus and calcineurin activity, are central

regulators of the cell cycle machinery.

Figure 1. Schematic view of

NFAT transcription factor signal-

ing pathway in gene expression

regulation. NFAT proteins are

activated upon different stimuli

that lead to increased intracellu-

lar calcium levels. When de-

phosphorylated by calcineurin,

NFAT rapidly translocates to the

nucleus where it regulates the

expression of several target

genes. NFATs may function as

transcriptional activators or re-

pressors and cooperate with

several other transcription fac-

tors. Ca

= calcium; CaM = cal-

modulin; Cn = calcineurin; CsA

= cyclosporin A; NFAT = nuclear

factor of activated T cells; P =

phosphorylation; TFs = trans-

cription factors.

CaM/Cn

CsA

FK506

Other

pathways

Receptors

Stimulation

[Ca

]

Cytoplasm

NFATNFAT

TFs

Nucleus

Target gene

338

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

J.P.B. Viola et al.

Recently, it has been demonstrated that the

promoter of CDK4 presents a consensus-bind-

ing site for NFAT proteins and is negatively

regulated by NFAT1 without AP-1 coopera-

tion (4). This finding demonstrates that NFAT1

directly controls the expression of CDK4 at

the transcription level. Furthermore, NFAT1

has been implicated in the control of some

cyclin genes, acting as a negative regulator of

cyclins A2, E and B1 during lymphocyte acti-

vation (3). These results support the idea that

the hyperproliferative phenotype observed in

NFAT1-/- lymphocytes is related to a deregu-

lated cell cycle progression, suggesting that

NFAT1 transcription factor plays a central

role in controlling cell cycle during T cell

activation (3). Several other data also support

this evidence. It has been shown that cyclo-

sporin A and FK506 inhibit the expression of

cyclins A and E in 3T3 fibroblasts (31). An-

other evidence for the involvement of NFAT

on cell growth has been shown in keratinocyte

cells, where cyclosporin A suppressed the

expression of p21

WAF1/Cip1

and p27

KIP1

, two

CDK inhibitors (32). Moreover, transactiva-

tion of p21 promoter is upregulated by calci-

neurin and is dependent of Sp1/Sp3 in syner-

gism with NFAT1 and NFAT2 (32). In addi-

tion, it has also been demonstrated that over-

expression of NFAT2 in preadipocyte 3T3-L1

cells promoted cell cycle progression even

under low serum concentrations and induced

altered expression of cell cycle-related genes,

such as cyclin D1, cyclin D2, pRB, and c-Myc

(6). Finally, preliminary data from our labora-

tory suggest that NFAT1 directly regulates the

expression of cyclin A2 gene (Carvalho LDS

and Viola JPB, unpublished observations).

This evidence supports the hypothesis that

NFAT transcription factors control the expres-

sion of cell cycle-related genes and are central

regulators of cell cycle progression.

Cell cycle and CD4

T cell

differentiation

Upon primary stimulation, naive CD4

lymphocytes (T helper, Th) differentiate into

two classes of effector cells with distinct

functional abilities (33). During Th differen-

tiation, these cells commit to a specific and

mutually exclusive pattern of cytokine se-

cretion (33). Th1 cells are characterized by

the production of IFN-γ, contributing to cel-

lular immune responses against intracellular

pathogens, while Th2 cells produce IL-4, IL-

5 and IL-13, participating on the response

against extracellular pathogens (33). Several

factors can influence the differentiation path-

way of Th cells, specially the conditions

prevailing within the microenvironment

where T cells encounter antigen (34). How-

ever, the molecular basis for the cell-specific

and mutually exclusive expression of Th1 or

Th2 cytokines is not yet completely defined.

Genetic experiments have implicated sev-

eral transcription factors in Th cell differen-

tiation, including NFAT, STAT4, STAT6,

T-Bet and GATA-3. The proteins T-Bet and

GATA-3 have been implicated as critical

lineage-specific transcription factors which

are sufficient to program Th1 and Th2 cy-

tokine expression profiles, respectively

(35,36). Conversely, gene disruption of

STAT4 and STAT6 indicated that these trans-

cription factors also play major roles in Th

differentiation (37,38). However, in this sec-

tion we will focus on reviewing data regard-

ing the role of NFAT family proteins in Th

differentiation.

NFAT proteins are present in both Th1

and Th2 cells, and can activate cytokine

promoters in both cell types (1,15). Also,

NFAT transcriptional activity appeared to

be similarly regulated during Th1/Th2 de-

velopment, although it was enhanced in dif-

ferentiated Th2 cells compared with differ-

entiated Th1 cells (39). These similarities

suggested that the activity of NFAT trans-

cription factors were likely to overlap sub-

stantially. However, data generated by in

vivo gene disruption of the different NFAT

proteins suggest that they may have distinct

roles in Th differentiation. NFAT1-/- mice

339

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

NFAT proteins in cell cycle and tumorigenesis

developed normally, and did not exhibit any

obvious behavioral deficiencies (40,41).

However, NFAT1-/- mice consistently

showed a marked increase in their immune

response. NFAT1-/- mice showed an en-

hanced Th2 development in both in vivo and

in vitro models of Th differentiation, as evi-

denced by increased levels of IL-4 produc-

tion (40,42,43). Furthermore, cells from

lymph nodes and spleen hyperproliferated in

response to different antigen stimulations

(41). Likewise, CD4

T cells hyperproliferated

in vitro in response to anti-CD3 (40). On the

other hand, targeted disruption of NFAT2

resulted in an embryonic lethal phenotype

(9,15). Complementing RAG-1- or RAG-2-

deficient blastocysts with homozygous

NFAT2-/- mutant ES cell lines demonstrated

that T and B cells from chimeric mice showed

reduced proliferation of peripheral lympho-

cytes when compared to wild-type mice

(44,45). In an in vitro model of Th differen-

tiation, the chimeric mice displayed a de-

creased production of IL-4 but normal pro-

duction of IFN-γ, demonstrating an impaired

Th2 response in NFAT2-/- T cells (44,45).

Taken together, the results observed in

NFAT-deficient mice demonstrated that these

transcription factors play an important role

in Th differentiation, and suggest that NFAT1

and NFAT2 have opposite roles in regulat-

ing gene expression in Th cell activation and

differentiation. However, the molecular ba-

sis of these effects remains to be identified.

Cell cycle entry is one of the first events

that occur during lymphocyte activation.

Upon T cell receptor (TCR) activation, naive

T lymphocytes, which are in a quiescent

stage, proliferate, differentiate and acquire

their effector functions. It has been shown

that T cell differentiation is dependent on the

cell cycle entry (46,47). Although prolifera-

tion and differentiation of CD4

T cells oc-

cur concomitantly during cellular activation,

it is still not clear whether they are effec-

tively interconnected. Reiner and colleagues

(46) have argued that cell cycle is an impor-

tant regulator of Th differentiation. IL-4 and

IFN-γ production by naive CD4

T cells

could only be detected after one and three

rounds of cellular division, respectively, be-

ing blocked by cell cycle-arresting drugs

(46). Furthermore, it has been suggested that

DNA synthesis is essential for the acquisi-

tion of IL-4 production competence in acti-

vated CD4

T cells, since it is blocked by

specific drugs that prevent cell cycle pro-

gression to S phase, but not to G2/M phase

(48). In contrast, it has been proposed that

cell cycling only increases the frequency of

cytokine-secreting cells, showing a correla-

tion rather than dependence between cell

cycle and differentiation (47,49). In fact,

non-cycling cells are capable of IFN-γ secre-

tion, suggesting that acquisition of compe-

tence to produce IFN-γ can be achieved with-

out entering into S phase (49). Other studies

have argued that cell cycle progression is

fundamental to the commitment of a Th cell

with its cytokine-secreting profile, including

the heritable activation/silencing of lineage-

defining players (50). Actually, the reversi-

bility of Th1 and Th2 populations is lost

along the increasing number of cellular divi-

sions and after long-term stimulation (47).

Moreover, it has been shown that T cell

differentiation is associated with a dynamic

process of histone acetylation and chromatin

remodeling at regulatory regions of IL-4 and

IFN-γ genes, suggesting that cell cycle could

provide a window of opportunity to rear-

range genes from an inactive to an active

state (47,51).

As discussed before, NFAT1-/- T cells

show both hyperproliferation and increase

in Th2 cytokine expression (40-42). How-

ever, it is still not clear whether the overex-

pression of Th2 cytokines, such as IL-4, is

dependent on the hyperproliferative response

observed in NFAT1-/- T cells or both phe-

nomena are independent. We have hypoth-

esized that NFAT transcription factors coor-

dinately regulate the expression of early-

inducible genes that are involved in cell

340

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

J.P.B. Viola et al.

cycle control, such as cyclin genes, and in

Th1/Th2 differentiation, such as IFN-γ and

IL-4 cytokines (3). It has been demonstrated

that NFAT1 is able to bind to IFN-γ pro-

moter regions and to the IL-4 enhancer in T

cells stimulated under Th1 or Th2 condi-

tions, respectively (51). Since TCR stimula-

tion activates an immediate and global chro-

matin derepression program in naive T cells,

it has been suggested that TCR-inducible

transcription factors, such as the preexisting

cytoplasmic NFAT1 protein, may bind to

regulatory regions of these cytokine genes,

initiating localized chromatin remodeling

(51). Finally, we indicate here that NFAT

proteins regulate central events during lym-

phocyte activation, such as cell proliferation

and cytokine expression, and may represent

an informative model to elucidate the real

correlation between cell cycle and Th differ-

entiation.

NFAT and malignant cell

transformation

As we discussed until here, NFAT pro-

teins are involved in a variety of cellular

mechanisms, and thus represent broader con-

trollers of cell growth and development of

normal cells. Several studies have already

demonstrated definitive evidence for the in-

volvement of NFAT proteins in the regula-

tion of cell cycle progression, cell differen-

tiation and cell death in different tissues

(3,6,52,53). These findings point to NFAT

activation as an essential pathway in normal

cell physiology, and therefore suggest that

deregulation of NFAT signaling may occur

during cellular aberrations and tumorigenic

processes.

NFAT proteins have been shown to regu-

late cell cycle progression by modulating

cyclin/CDK gene expression profile (3,4). In

mouse models, deficiency of NFAT1 trans-

cription factor caused hyperproliferative cel-

lular responses, altered cell cycle control,

and increased stage-specific cyclin expres-

sion in lymphocytes (3,40,41). NFAT1 pro-

tein also repressed the CDK4 gene in T cells,

dictating cell cycle re-entry from quiescence

(4). Out of the immune system, NFAT1 defi-

ciency also led to uncontrolled cell growth

and differentiation of the connective tissue

and skeletal muscle cells (52,54). These re-

sults clearly implicate NFAT1 as a negative

controller of early-inducible genes that regu-

late cell cycle progression and differentia-

tion, and thus suggest a putative tumor sup-

pressor role for this protein in different or-

gan systems.

Although some members of the NFAT

family are regulated in a similar way, they

seem to play quite different effects during

cellular responses. In contrast to NFAT1

effects, NFAT2 as well as NFAT3 and

NFAT4 appear to function as inductors of

cellular proliferation. NFAT2-deficient lym-

phocytes present a defect in B and T cell

proliferation and an impaired repopulation

of both thymus and peripheral lymphoid or-

gans (44,45). Recently, Neal and Clipstone

(6) have shown that NFAT2 protein controls

cellular proliferation of adipocytes by regu-

lating cell cycle-related genes. In skeletal

muscle and endothelial cells, NFAT2 activa-

tion was also essential for cellular growth

and cardiac morphogenesis, respectively

(9,15,55). In accordance to NFAT2 data,

several mouse models have elucidated the

importance of NFAT3 and NFAT4 activa-

tion in smooth and skeletal muscle cell dif-

ferentiation, indicating their role in blood

vessels formation and angiogenesis (16,29).

These results provide evidence for a positive

regulatory role of NFAT2 transcription fac-

tor in cell cycle machinery and growth signal

autonomy, revealing its oncogenic potential.

Another hallmark of tumorigenesis is the

ability that cancer cells present to evade cell

death. Programmed cell death by apoptosis

occurs in virtually all cell types and is pre-

cisely regulated at the cellular and molecular

levels. Many molecular players have been

characterized to take part in the apoptotic

341

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

NFAT proteins in cell cycle and tumorigenesis

process, such as caspases, kinases and trans-

cription factors. In fact, NFAT proteins have

shown to bind to promoter regions and up-

regulate the expression of some effectors of

apoptosis, such as TNF-α and FasL (1). It

seems that NFAT1 presents a pro-apoptotic

role in T lymphocytes since cells lacking this

protein showed a decreased expression of

FasL and TNF-α and were resistant to apop-

tosis (53). Moreover, overexpression of some

NFAT members in primary T cells led to

increased rates of apoptosis (53). These re-

sults thus suggest that NFAT deregulation

may rescue normal cells from apoptosis and

enable tumor cell survival. Conversely, some

reports have also indicated anti-apoptotic

roles for NFAT members. Overexpression

of the NFAT2 protein in adipocytes pro-

tected cells from undergoing apoptosis in

response to growth factor withdrawal (6).

Mice lacking NFAT4 presented impaired

expression of the anti-apoptotic protein Bcl-

2 and increased thymocyte apoptosis during

T cell development in the thymus (56). Also,

NFAT1 showed to rescue lymphocytes from

activated-induced cell death upon antigen

stimulation in vitro (3). In spite of the con-

troversial data discussed, NFAT proteins are

known regulators of apoptotic mechanisms

and may take part in tumor development by

sustaining cell survival.

Besides indirect evidence, there is plenty

of data demonstrating the effective partici-

pation of NFAT proteins in tumor-related

processes. Several in vitro and also in vivo

reports support NFAT transcription factors

as essential targets for better understanding

tumor progression pathways. In an elegant

work, Neal and Clipstone (6) have investi-

gated the role of NFAT2 in tumorigenesis. A

constitutively active form of the NFAT2 pro-

tein expressed in the murine 3T3-L1 preadi-

pocyte cell line was able to induce cell trans-

formation and inhibit cell differentiation.

Upregulated NFAT2 activity induced the

acquisition of well-defined hallmarks of tu-

morigenesis, including: 1) loss of contact-

mediated growth inhibition, 2) reduced se-

rum growth requirements, 3) protection from

apoptosis, 4) formation of colonies in semi-

solid media, 5) acquisition of growth au-

tonomy, and 6) formation of tumors in

athymic nude mice (6). Moreover, authors

speculate that sustained NFAT2 activity in

vivo could be achieved by the continuous

presence of a soluble promitogenic/prosur-

vival factor, which establishes an autocrine

regulatory growth loop and leads to cell

autonomy. These results provide strong evi-

dence for the oncogenic potential of NFAT2

transcription factor and elicit its participa-

tion during tumor progression in vivo. Still,

the expression of functional NFAT2 has been

also identified in proliferating glioma cells, a

nervous system-derived cell line. In line with

this, cyclosporin A inhibited the prolifera-

tion of these cells and induced apoptotic cell

death in a dose-dependent manner (57). Thus,

the correlation between the presence of NFAT

proteins and the proliferative status of glioma

cells might converge to the participation of

NFAT transcription factors in the transformed

glioma cell phenotype by regulating an auto-

crine growth factor stimulation.

The formation of new blood vessels, a

process called angiogenesis, is also essential

in tumor development, since it supplies oxy-

gen and nutrients during late stages of tum-

origenesis. NFAT proteins have been impli-

cated in the regulation of vascular endotheli-

al growth factor-mediated angiogenesis by

dictating the expression of cyclooxygenase-

2, an enzyme that plays a pivotal role in

neovascularization (2,21). A very recent data

also suggest NFAT1 protein as a convergent

factor during angiogenesis, since it regulates

the balance between stimulatory and inhibi-

tory angiogenic signals (7). Beyond angio-

genic processes, NFAT proteins have also

been related to cellular metastasis. Rao and

colleagues (58) have linked the integrin-

signaling pathway to the activation of NFAT1

and NFAT5 proteins, which induced carci-

noma invasion of cell lines derived from

342

Braz J Med Biol Res 38(3) 2005

J.P.B. Viola et al.

human breast and colon cancer. Integrins are

extracellular matrix ligand receptors widely

described as controllers of tumor invasion

and migration. These results have highlighted

NFAT proteins as relevant players in pro-

moting tumor metastasis.

It is evident the involvement of NFAT

transcription factors during tumorigenic pro-

cesses (Figure 2). In accordance, antagonists

of NFAT proteins inhibit tumor formation,

supporting an oncogenic potential for these

family of transcription factors (59). When

binding to promoter regions and regulating

gene expression, NFATs have shown to co-

operate with several protooncogene prod-

ucts, such as c-Fos, c-Jun (AP-1), and Egr

proteins (1,60). These interactions may re-

sult in transcriptional activators or repres-

sors in different moments (Figure 1). How-

ever, the subset of genes regulated by NFAT

proteins and its importance during the differ-

ent stages of tumor progression remain to be

elucidated. Strong effort must focus on clari-

fying this still puzzling participation of

NFATs during tumorigenesis.

Final remarks

NFAT transcription factors act as ubiqui-

tous regulators of gene expression during

cellular activation. NFAT proteins have di-

verse effects not only on cytokine expres-

sion, but also on cell cycle entry and apopto-

sis. Cumulative evidence has recently dem-

onstrated that NFAT transcription factors

exert important roles in the physiology of

different cell types, and not only in cells

related to the immune system. As such, NFAT

has the potential to participate in malignant

cell transformation related to cancer. As we

discussed here, NFAT proteins regulate genes

involved in cell cycle control, cell death and

angiogenesis. Given the importance of these

phenomena in the development of cell ma-

lignancies, it is of considerable interest to

understand the mechanisms by which NFAT

affects cell growth, differentiation and func-

tion. Finally, understanding more about the

cell cycle regulation by NFAT proteins is

central to precisely indicate the involvement

of these transcription factors in malignant

cell transformation and oncogenic processes.

Figure 2. Tumor-related processes regulated by NFAT transcription factors. NFAT proteins

have shown to directly regulate the expression of genes related to cellular proliferation

(e.g., CDK4) and differentiation (e.g., cytokines and growth factors), apoptosis (e.g., FasL),

angiogenesis (e.g., cyclooxygenase-2) and tissue invasion mechanisms among others.

NFAT = nuclear factor of activated T cells.

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Cell growth andCell growth and

Cell growth and

proliferationproliferation

proliferation

Cell differentiationCell differentiation

Cell differentiation

Growth signalsGrowth signals

Growth signals

Tissue invasion andTissue invasion and

Tissue invasion and

migrationmigration

migration

AngiogenesisAngiogenesis

Angiogenesis

NFATNFAT

NFAT

ApoptosisApoptosis

Apoptosis

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