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COLETA CAPES
Alexandre Legora Machado.
Bolsista CAPES (48 meses)/ Doutorado em Química Biológica no Instituto de
Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, ano de ingresso
março/2002.
Dissertação de doutorado intitulada “Busca por novos fármacos
moduladores da inflamação pulmonar aguda”, defendida no dia 28 de
março de 2006, totalizando 100 páginas.
Palavras chaves: Inflamação pulmonar, antiinflamatórios, Plantas medicinais.
Resumo
Embora diversas substâncias apresentem resultados positivos em modelos
experimentais, os ensaios clínicos não mostraram redução significativa da
mortalidade de pacientes com as formas mais graves de inflamação pulmonar
aguda. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do extrato da planta
Eleusine indica (Ei) e dos compostos L-998 e L-541 projetados como inibidores
de p38 MAP cinase e PDE IV, respectivamente, na inflamação pulmonar aguda
induzida por LPS. A análise do lavado broncoalveolar (LBA) em 3 horas
mostrou que o tratamento com Ei, antes do LPS, reduziu o número de
neutrófilos, os níveis de TNF-α, IL-1β e a ativação do fator de transcrição NF-
κB. A análise do LBA em 24 horas mostrou redução do número de neutrófilos e
dos níveis da quimiocina KC com tratamentos antes ou depois do LPS tanto i.p.
quanto v.o. O tratamento com L-998 i.p. ou v.o. reduziu o número de neutrófilos
e os níveis de TNF-α em 3 horas, mas não modificou os níveis de KC. O
composto L-541 reduziu o número de neutrófilos por via i.p. ou v.o. e os níveis
de TNF-α apresentaram redução por via i.p., mas não por v.o. Conclusão: Os
tratamentos com Ei, L-998 ou L-541 reduziram a inflamação pulmonar aguda
por mecanismos diferentes e apresentam potencial para o desenvolvimento de
novos fármacos para uso clínico.
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ALEXANDRE LÉGORA MACHADO
BUSCA POR NOVOS FÁRMACOS
MODULADORES DA INFLAMAÇÃO
PULMONAR AGUDA
Rio de Janeiro
2006
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ALEXANDRE LÉGORA MACHADO
BUSCA POR NOVOS FÁRMACOS
MODULADORES DA INFLAMAÇÃO
PULMONAR AGUDA
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Bioquímica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
para a obtenção do título de Doutor em Química Biológica
Orientadora: Vera Lúcia Gonçalves Koatz
Rio de Janeiro
2006
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
LÉGORA-MACHADO, Alexandre.
Busca por novos fármacos moduladores da inflamação pulmonar
aguda - Rio de Janeiro, 2006
orientação Prof
a
. Vera Lúcia Gonçalves Koatz.
Rio de Janeiro, 2006.
100p.
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Bioquímica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
1. Inflamação pulmonar. 2. Antiinflamatórios. 3. Plantas medicinais
iii
FOLHA DE APROVAÇÃO
BUSCA POR NOVOS FÁRMACOS MODULADORES DA INFLAMAÇÃO
PULMONAR AGUDA.
Alexandre Légora Machado
Banca Examinadora:
________________________________________________
Debora Foguel
Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ
________________________________________________
Hugo Caire Castro Faria Neto
Pesquisador Titular do Departamento de Fisiologia e Farmacodinâmica,
FIOCRUZ
________________________________________________
Thereza Christina Barja Fidalgo
Prof. Adjunto do Departamento de Farmacologia e Psicobiologia, IBRAG,
UERJ
________________________________________________
Paulo Antonio de Souza Mourão
Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ.
________________________________________________
Sônia Soares Costa
Prof. Adjunto do Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Bioquímica Médica
2006
iv
Este trabalho é dedicado à minha filha Júlia,
Que chegou como um presente
Durante a sua elaboração.
v
Agradecimentos
Agradeço à minha mãe e ao meu pai pelo amor com que fui criado e
pelos valores que me foram ensinados com eles não apenas chego até aqui,
mas sigo adiante. Aos meus irmãos Sandro, Andréia e Andressa, porque
sempre estivemos unidos e por isso superamos todas as dificuldades
enfrentadas. Agradeço a todos por tudo.
À minha querida esposa Liliane, que me apoiou e me incentivou todo o
tempo. Muito obrigado Ane!
Ao Professor Franklin e o pessoal do seu laboratório Francisco, Daniel,
Nívea, Isabel, Marcelo, Nelson, Gilson e Andréa, que além de vizinhos
generosos também são grandes amigos.
À Professora Sônia Costa, à Giany, à Michelle e à Fernanda pelos
ensinamentos sobre produtos naturais.
À Professora Lídia e ao Professor Eliézer pelas discussões sobre os
compostos sintéticos.
Ao Professor Paulo Mourão pela revisão da tese e pela árdua luta para
implantação do Programa de Formação em Pesquisa Médica, que me permite
estar aqui hoje.
À Professora Patrícia Martins que, gentilmente, realizou as dosagens de
KC em seu laboratório.
Ao Júlio e à Dilma que agüentam o pessoal do laboratório e toda hora
atendem aos pedidos mais complicados.
Às amigas que passaram pelo laboratório me dando um pouquinho de
trabalho, mas que me ajudaram muito, algumas por mais outras por menos
tempo, mas minha gratidão fica aqui registrada a vocês: Thaís, Renata,
Cláudia, Cynthia, Ana Maria e a Patrícia, que me acompanhou na reta final e
mostrou ser grande companheira, abrindo mão de muitas coisas para poder me
ajudar.
Ao genial Agessandro, às grandes amigas Joyce, Helena e Ingred. À
recém-chegada Aline que mostrou muito desembaraço e me ajudou muito.
À Larissa pela generosidade e por tudo que fizemos juntos no
laboratório, uma sociedade muito produtiva que se desfaz, mas que deixa boas
lembranças.
vi
Paulo, mais que um amigo, você fica como meu irmão, pelos
experimentos que acabavam de madrugada, pelas técnicas que agente
começou do zero errando as coisas mais grotescas e pelos momentos de apoio
prestados mutuamente nas horas mais difíceis. Mais sobre tudo, pela
intrepidez, ousadia e espírito investigativo para esclarecer e não aceitar
explicações que não te convenceram na constante busca da verdade... o que é
a verdade?...
À Chefe (Vera) pela paciência quando estive mais ausente do que
presente, pelo apoio quando estava mais por baixo que por cima e pelo
incentivo quando tinha mais dúvidas do que certeza. Sei que muitos
acreditaram, alguns me apoiaram, mas você foi além, apostou e investiu em
mim. Obrigado Chefe.
Minha gratidão maior para quem me faz ser especial. Obrigado Senhor,
porque em cada acontecimento da minha vida vejo o Teu cuidado. Tua
presença é a minha fonte de vida. Tudo que faço e alcanço são frutos da Tua
misericórdia e do Teu amor. Tua bondade me conduziu até aqui. Continue
orientando meus passos e que meu coração sempre ouça e atenda a Tua voz.
vii
Resumo
Embora diversas substâncias apresentem resultados positivos em
modelos experimentais, os ensaios clínicos não mostraram redução
significativa da mortalidade de pacientes com as formas mais graves de
inflamação pulmonar aguda. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do
extrato da planta Eleusine indica (Ei) e dos compostos L-998 e L-541
projetados como inibidores de p38 MAP cinase e PDE IV, respectivamente, na
inflamação pulmonar aguda induzida por LPS. A análise do lavado
broncoalveolar (LBA) em 3 horas mostrou que o tratamento com Ei, antes do
LPS, reduziu o número de neutrófilos, os níveis de TNF-α, IL-1β e a ativação
do fator de transcrição NF-κB. A análise do LBA em 24 horas mostrou redução
do número de neutrófilos e dos níveis da quimiocina KC com tratamentos antes
ou depois do LPS tanto i.p. quanto v.o. O tratamento com L-998 i.p. ou v.o.
reduziu o número de neutrófilos e os níveis de TNF-α em 3 horas, mas não
modificou os níveis de KC. O composto L-541 reduziu o número de neutrófilos
por via i.p. ou v.o. e os níveis de TNF-α apresentaram redução por via i.p., mas
não por v.o. Conclusão: Os tratamentos com Ei, L-998 ou L-541 reduziram a
inflamação pulmonar aguda por mecanismos diferentes e apresentam potencial
para o desenvolvimento de novos fármacos para uso clínico.
Palavras-chave: Inflamação pulmonar. Antiinflamatórios. Plantas medicinais.
viii
Abstract
Although several substances show positive results in experimental
models, clinical studies have not shown significantly decrease in mortality of
patients with severe forms of acute lung injury. Present study we evaluated the
effect of crude extract of Eleusine indicada (Ei) and the design compounds L-
998 and L-541, inhibitors of p38 MAP kinase and PDE IV, respectively, in LPS-
induced acute lung inflammation. Analysis of bronchoalveolar lavage (BAL) at 3
hours showed treatment with Ei, before LPS, reduced number of neutrophils,
TNF-α and IL-1β levels and transcription factor NF-κB activation. Analysis at 24
hours showed decrease of number of neutrophils and chemokine KC levels with
treatment before or after LPS i.p. or p.o. Treatment with L-998 i.p. or p.o.
reduced number of neutrophils and TNF-α levels at 3 hours, but not modified
KC levels. Treatment with L-541 reduced number of neutrophils i.p. or p.o. and
inhibition in TNF-α levels by i.p., but not p.o. Conclusion: Treatments with Ei, L-
998 or L-541 reduced acute lung inflammation by different mechanisms and
have potential with new drugs for clinical use.
Key words: Lung inflammation. Anti-inflammatories. Medicinal plants
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Exemplos de mediadores liberados pelos neutrófilos e suas
funções..................................................................................13
Tabela 2 -
Critérios clínicos para lesão pulmonar aguda (LPA) e
síndrome da angústia respiratória aguda (SARA). PaO
2
–
Pressão parcial de oxigênio arterial; FiO
2
– Fração de
oxigênio no ar inspirado........................................................16
Tabela 3 -
Causas diretas e indiretas mais freqüentes de inflamação
pulmonar aguda.....................................................................17
Isoformas de fosfodiesterases (PDE), características e
distribuição. Adaptado de Essayan D.M., 1999.....................36
Tabela 4 -
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Papiro de Edwin Smith, cerca de 2500 a.C. (FALTAS, 2004)............2
Aulus Cornelius Celsus 25 a.C. – 50 d.C………………………………4
Figura 2.
Figura 3.
Felix Hoffmann descreveu o processo de síntese do ácido acetil salisílico
em 1897 e a direita, o primeiro frasco de Aspirina comercializado em
1898..............................................................................................................7
Fases de migração dos neutrófilos...................................................12
Figura 4.
Figura 5.
Representação esquemática das via respiratória. 1- O ar ao entrar
pelas narinas sofre a primeira filtração e ao passar por meatos
estreitos há um equilíbrio térmico. 2, 3 e 4 – O epitélio ciliado depura
o muco com impurezas que recobre a superfície da via. 5 e 6 – O ar
chega aos alvéolos livre de partículas..............................................18
Figura 6.
Macrófago alveolar na luz do alvéolo indicado pela seta.................19
Cortes histológicos de pulmão normal (esquerda) e com inflamação
aguda (direita)...................................................................................20
Figura 7.
Figura 8.
Esquema de sinalização celular pela via do NF-κB..........................24
Figura 9.
Esquema de sinalização do receptor de TNF-α...............................26
Eleusine indica .................................................................................33
Figura 10.
Figura 11.
Inibidores de p38 MAP cinase. Piridinilimidazóis (a) e compostos de
interesse (b)......................................................................................39
Figura 12.
Esquema de sinalização da via p38 MAP cinase.............................40
xi
Figura 13. Tratamento com Ei i.p. reduz o número de neutrófilos no LBA
após a inalalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratrados com veículo ou Ei (4, 40, 100 ou 400 mg/kg) i.p. 1 hora
antes e o LBA foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de
uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05, ** p<0,01 e
*** p<0,001 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo...............................................................................................52
Figura 14.
Tratamento com Ei i.p. reduz os níveis de TNF-α no LBA após a
inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratrados com
veículo ou Ei (4, 40, 100 ou 400 mg/kg) i.p., 1 hora antes e o LBA foi
realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão
de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram
aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média ±
erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05 em comparação com
o grupo LPS pré-tratado com veículo...............................................53
Figura 15.. Tratamento com Ei i.p. reduz o número de neutrófilos no LBA 3
e 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c
foram pré-tratrados com veículo ou Ei (100 mg/kg) i.p., 1 hora antes
e o LBA foi realizado 3 ou 24 horas após a inalação de aerossóis de
uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo...............................................................................................54
Figura 16. Tratamento com Ei i.p. reduz o número de neutrófilos no LBA 3
horas após a instilação de TNF-α i.n. Os camundongos BALB/c
foram pré-tratados com Ei (100 mg/kg) i.p. 1 hora antes e o LBA foi
realizado 3 horas após a instilação de TNF-α (0,5 mg/animal). Os
animais controle receberam instilação de salina i.n. Os resultados
foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. * p<0,05 em comparação com o grupo TNF-α pré-tratado
com veículo.......................................................................................55
Figura 17. Tratamentos em diferentes tempos com Ei reduzem o número
de neutrófilos no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os
camundongos BALB/c foram tratados com Ei (100 mg/kg) i.p. nos
tempos indicados, em relação à inalação de LPS. O LBA foi
realizado 24 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão
de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram
aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média ±
erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05 e *** p<0,001 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo...................56
xii
Figura 18. Tratamentos em diferentes tempos com Ei reduzem os níveis
KC no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos
BALB/c foram tratados com Ei (100 mg/kg) i.p. nos tempos
indicados, em relação à inalação de LPS. O LBA foi realizado 24
horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de
LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS pré-
tratado com veículo...........................................................................57
Figura 19. Tratamento com Ei por via oral reduz o número de neutrófilos
no LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
pré-tratrados com veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o. 1 ou 4 horas antes
e o LBA foi realizado 3 horas após da inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo...................60
Figura 20.
Tratamento com Ei v.o. reduz os níveis de TNF-α no LBA após a
inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratados com
veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o., 4 horas antes e o LBA foi realizado 3
horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de
LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS pré-
tratado com veículo...........................................................................61
Figura 21.
Tratamento com Ei v.o. reduz os níveis de IL-1β no LBA após a
inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratrados com
veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o., 4 horas antes e o LBA foi realizado 3
horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de
LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS pré-
tratado com veículo...........................................................................62
Figura 22. Tratamento com Ei reduz os níveis KC no LBA 3 horas após a
inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram tratados com Ei
(500 mg/kg) v.o. 4 horas antes e o LBA foi realizado 3 horas após a
inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5
mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de
5-7 animais. * p<0,05 em comparação com o grupo LPS pré-tratado
com veículo.......................................................................................63
xiii
Figura 23. Tratamento com Ei v.o. não reduz os níveis de MCP-1 no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratados com veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o., 4 horas antes e o LBA
foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais.................................64
Figura 24.
Ativação do NF-κB em animais expostos a aerossóis de LPS e
tratados com E.i. (A) Gel Ensaio da mudança de mobilidade
eletroforética de extratos nucleares de tecido pulmonar. CTR:
animais expostos aos aerossóis de salina; Veic: animais tratados
com veículo e expostos ao LPS; +Ab: grupo Veic + adição de
anticorpo contra a subunidade p65 do NF-κB. Ei: Animais tratados
com Ei (500 mg/kg) v.o. 4 horas antes da inalação de LPS. Em (B),
densitometria do gel apresentado na Figura A. Valores expressos
como média+erro padrão da média. p<0,04 = estatisticamente
significante........................................................................................65
Figura 25. Tratamento com Ei por via oral reduz o número de neutrófilos
no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos
BALB/c foram tratados com Ei (500 mg/kg) v.o. nos tempos
indicados, em relação à inalação de aerossóis de uma suspensão de
2 mL de LPS (0,5 mg/mL). O LBA foi realizado 24 horas após a
inalação. Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de
5-7 animais. * p<0,05, *** p<0,001 em comparação com o grupo LPS
pré-tratado com veículo....................................................................66
Figura 26. Tratamentos em diferentes tempos com Ei v.o. reduzem os
níveis KC no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os
camundongos BALB/c foram tratados com Ei (500 mg/kg) v.o. nos
tempos indicados, em relação à inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). O LBA foi realizado 24
horas após inalação. Os animais controle inalaram aerossóis de
salina. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da
média de 5-7 animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS
pré-tratado com veículo....................................................................67
Figura 27. Tratamento com L-998 i.p. reduz o número de neutrófilos no
LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratados com veículo ou L-998 (1, 10, 100 mg/kg) i.p. 1 hora antes
da inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5
mg/mL) e o LBA realizado 3 horas após a inalação. Os animais
controle inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram
expressos como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. *
p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em comparação com o grupo LPS
pré-tratado com veículo....................................................................69
xiv
Figura 28.
Tratamento com L-998 i.p. reduz os níveis de TNF-α no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratrados com veículo ou L-998 (1, 10, 100 mg/kg) i.p., 1 hora antes
e o LBA foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). As barras cinza
representam os níveis de TNF-α e as barras pretas representam os
níveis de IL-1b. Os animais controle inalaram aerossóis de salina.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. * p<0,05, , ** p<0,01 e *** p<0,001 em comparação
com o grupo LPS pré-tratado com veículo.......................................70
Figura 29. Tratamento com L-998 i.p. reduz o número de neutrófilos no
LBA 3 horas após a instilação de TNF-α i.n. Os camundongos
BALB/c foram pré-tratados com L-998 (100 mg/kg) i.p. 1 hora antes
da instilação de TNF-α (0,5 mg/animal) i.n. e o LBA foi realizado 3
horas depois. Os animais controle receberam instilação de salina i.n.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. * p<0,05 em comparação com o grupo TNF-α pré-
tratado com veículo...........................................................................71
Figura 30. Tratamento com L-998 v.o. reduz o número de neutrófilos no
LBA após inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratados com L-998 (200 mg/kg) v.o. 4 horas antes da inalação de
aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL) e o LBA
foi realizado 3 horas após a inalação. Os animais controle
receberam instilação de salina i.n. Os resultados foram expressos
como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo...................73
Figura 31.
Tratamento com L-998 v.o. reduz os níveis de TNF-α no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratados com veículo ou L-998 200 mg/kg v.o. 4 horas antes e o LBA
foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo...................74
Figura 32. Tratamento com L-998 v.o. não modifica os níveis de KC no LBA
3 horas após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
pré-tratados com veículo ou L-998 200 mg/kg v.o. 4 horas antes e o
LBA foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais.................................75
xv
Figura 33. Tratamento com L-541 i.p. reduz o número de neutrófilos no
LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
tratados com L-541 (10 mg/kg) i.p. 1 hora antes ou 1 hora depois da
inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5
mg/mL) e o LBA foi realizado 3 horas após a inalação. Os animais
controle inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram
expressos como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. *
p<0,05 e ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS pré-tratado
com veículo.......................................................................................77
Figura 34. Tratamento com L-541 i.p. não reduz o número de neutrófilos no
LBA 3 horas após a instilação de TNF-α i.n. Os camundongos
BALB/c foram pré-tratados com L-541 (10 mg/kg) i.p. 1 hora antes
da instilação de TNF-α (0,5 mg/animal) i.n. e o LBA foi realizado 3
horas depois. Os animais controle receberam instilação de salina i.n.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. * p<0,05 em comparação com o grupo TNF-α pré-
tratado com veículo...........................................................................78
Figura 35. Tratamento com L-541 v.o. reduz o número de neutrófilos no
LBA após inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratados com L-541 (10 mg/kg) v.o. 4 horas antes e o LBA realizado
3 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de
LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
de 5-7 animais. * p<0,05 em comparação com o grupo LPS pré-
tratado com veículo...........................................................................79
Figura 36.
Tratamento com L-541 v.o. não modifica os níveis de TNF-α no
LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratrados com veículo ou L-541 (100 mg/kg) v.o. 4 horas antes e o
LBA foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais.................................80
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AMPc: 3’-5’ monofosfato cíclico de adenosina
BSA: albumina sérica bovina
CD14: domínio celualr 14
cIAP1: proteína inibidora celular da apoptose do tipo 1
cIAP2: proteína inibidora celular da apoptose do tipo 2
COX: ciclooxigenase
DNA: Ácido desoxiribonucléico
DTT: 1-4 ditiotreitol
Ei: Eleusine indica
ELISA: ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima
ERK: cinase reguladora da sinalização extracelular
FADD: domínio de morte associado ao Faz
FBS: soro fetal bovino
GM-CSF: fator de estimulação da colônia granulocítica-macrofágica
i.p: via intraperitoneal
IFN-γ: interferon gama
IKKβ: cinase de IκB beta
IL-1β: Interleucina-1beta
IL-6: Interleucina 6
IL-8: Interleucina 8
IκB: proteína inibitória do kappa B
JNK: cinase do N-terminal de c-Jun
xvii
kDa: quiloDalton
kg: quilograma
LBA: lavado broncoalveolar
LBP: proteína ligante de LPS
LPA: lesão pulmonar aguda
LPS: Lipopolissacarídeo bacteriano
MAP: proteína de atividade mitogênica
mg: miligrama
mL: mililitro
NF-κB: Fator nuclear kappa B
NOS: oxido nitrico sintase
PDE: fosfodiesterase
pg: picograma
PHA: fitohemaglutinina
PMSF: fenil-metil-sulfonil-fluoreto
RIP: proteína que interage com receptor
RNA: Ácido ribonucléico
RNAm: RNA mensageiro
SARA: síndrome da angustia respiratória aguda
SEM: erro padrão da média
SODD: proteína silenciadora do domínio de morte
TACE:enzima conversora de TNF-α
TLR: receptor Toll-like
TNFR1: receptor de TNF-α do tipo 1
TNFR2: receptor de TNF-α do tipo 2
xviii
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa.
TRADD: domínio de morte associado ao receptor de TNF-α
TRAF2: fator associado ao TNFR do tipo 2
v.o: via oral
V: volts
μCi: micro Curie
μg: micrograma
μL: microlitro
μm: micrômetro
xix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Processo Inflamatório 1
1.1.1. Histórico 1
1.1.2. Conceitos Básicos 9
1.2. Inflamação Pulmonar Aguda 15
1.2.1. Relevância 15
1.2.2. Fisiopatologia 17
1.2.3. Sinalização 21
1.2.4 Alternativas terapêuticas 27
1.3. DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS 28
1.3.1. Pesquisa com Plantas Medicinais 28
1.3.1.1 Eleusine indica (L.) Gaertn 31
1.3.2. Pesquisa por Compostos Sintéticos Projetados 34
1.3.2.1. Inibidores de Fosfodiesterase IV 35
1.3.2.2. Inibidores da p38 MAP Cinase 37
2. OBJETIVOS 42
2.1 Extrato de planta 42
2.1 Produtos sintéticos 42
3. MATERIAL E MÉTODOS 43
3.1 Reagentes 43
3.2 Animais 43
44
3.3 Inalação de LPS e instilação de TNF-α intranasal
3.4 Lavado broncoalveolar 44
3.5 Contagem de células 45
3.6 Dosagem de mediadores inflamatórios 45
3.7. Extrato nuclear das células do pulmão 46
3.8. Marcação do oligonucleotídeo 47
3.9. Ensaio da mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) 47
3.10. Tratamento com o extrato de planta e os compostos
sintéticos
48
xx
3.11. Análise estatística 49
4. RESULTADOS 50
4.1. Efeito do tratamento com extrato bruto de Eleusine indica
por via intraperitonial na inflamação pulmonar induzida pela
inalação de LPS.
50
4.2. Efeito do tratamento com extrato bruto de Eleusine indica
por via oral na inflamação pulmonar induzida pela inalação de
LPS.
58
4.3. Efeito do tratamento com L-998 por via intraperitonial na
inflamação pulmonar induzida pela inalação de LPS.
68
4.4. Efeito do tratamento com L-998 por via oral na inflamação
pulmonar induzida pela inalação de LPS.
72
4.5. Efeito do tratamento com L-541 por via intraperitonial e
oral na inflamação pulmonar induzida pela inalação de LPS.
76
5.
CONCLUSÃO 81
5.1 Eleusine indica 81
5.2 L-998 82
5.3 L-541 82
6. DISCUSSÃO 83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87
ANEXOS 101
A
B
C
D
E
xxi
1. INTRODUÇÃO
1.1. O Processo Inflamatório
1.1.1. Histórico
O termo inflamação (do latim, inflammatio - incêndio) e o seu sinônimo
flogose (do grego phlogosis - “phlox” = fogo e “osis” = estado de) retratam
como os povos mais primitivos comparavam uma região inflamada com algo
relativo a chamas, quente ou ardido. Essa analogia deve ter surgido nos
tempos do primeiro contato do homem com o fogo, antes mesmo do controle
de sua produção e manipulação.
A civilização egípcia antiga deixou, em hieróglifos, os primeiros
registros (Figura 1) com relatos médicos sobre a identificação e tratamento da
inflamação, através do uso de procedimentos e fórmulas (FALTAS, 2004).
Em escritos antigos encontramos o relato da aplicação de mel sobre
ferimentos com a descrição detalhada dos benefícios observados. Este deve
ter sido o primeiro relato das propriedades antimicrobianas do mel, embora não
houvesse conhecimento da existência de microorganismos nesta época
remota, e que teve comprovação no final do século XX (EFEM, 1988).
O sal e o vinagre também eram aplicados em algumas condições
inflamatórias. Vale ressaltar o emprego da casca de salgueiro (Salix Alba) por
diferentes povos, atravessando séculos e resultando na descoberta de um dos
medicamentos mais utilizados nos dias atuais para combater os sintomas da
inflamação, o ácido acetilsalicílico – Aspirina
®
. Na Grécia antiga, Hipócrates
1
mencionava tratamentos em sua obra, como o uso da casca de salgueiro,
aplicação de sal sobre ferimentos e a inalação de vapor de água salgada para
alívio dos sintomas respiratórios (CIRILLO, 1994).
Figura 1. Papiro de Edwin Smith, cerca de 2500 a.C.
(Faltas, 2004)
Figura 1. Papiro de Edwin Smith, cerca de 2500 a.C.
(Faltas, 2004)
2
Embora os papiros de Edwin Smith (cerca de 2500 a.C.), parcialmente
decifrados apenas em 1930, contenham descrições detalhadas dos sinais
cardinais da inflamação e de estágios de fechamento da ferida – reparo
(FALTAS, 2004), credita-se a Aulus Cornelius Celsus (Figura 2) a descrição
dos 4 sinais cardinais da inflamação ["Signa inflammationis quatror sunt: Rubor
et tumor, cum calor et dolor"]. A sua obra De Medicina está reunida em oito
volumes com destaque para o oitavo “In hoc volvmine haec continentur Aurelii
Cornelii Celsi medicinae libri VIII quam emendatissimi”, produzida na Roma
Antiga, por volta dos anos 30 d.C. Encontramos na obra de Celsus fórmulas,
receitas e um vasto repertório terapêutico para diferentes problemas de saúde,
com destaque para o uso de ópio em extração dentária, correção de fraturas de
mandíbula e nariz.
A descrição do quinto sinal (perda de função) é tradicionalmente
atribuída por muitos estudiosos a Rudolf Virchow, mas cerca de um século
após a produção de Celsus, Galeno havia descrito em sua vasta obra a
impotência funcional associada aos outros quatro sinais.
3
Figura 2. Aulus Cornelius Celsus 25 a.C. – 50 d.C.
Disponível em: < www.countway.med.harvard.edu>. Acesso em: 10 mar. 2006
4
Em 1793, o cirurgião escocês John Hunter concluiu que a inflamação
não era uma doença, e sim uma resposta inespecífica do organismo às
agressões. O final do século XIX ficou marcado por Julius Cohnheim, um pupilo
de Virchow, que observando mesentério e língua de rãs ao microscópio,
descreveu as alterações vasculares e celulares da inflamação e com isso
explicava os quatro sinais de Celsus.
Em 1863, von Recklinghausen encontrou evidências, pela primeira
vez em vertebrados, de englobamento de partículas de corante por leucócitos
de sapo. Schultze, em 1865, dispondo de um microscópio muito rudimentar e
sem usar colorações, conseguiu discriminar quatro tipos de leucócitos
humanos, descrevendo a formação de pseudópodos e englobamento dos
corantes carmina, cinabar, índigo e anilina em gotas de sangue, na
temperatura entre 30° e 40° C (BREWER, 1994).
Entretanto, em 1822, foi o biólogo russo Elie Metchnikoff, trabalhando
no Instituto Pasteur, quem foi reconhecido pela identificação da fagocitose.
Suas observações levaram-no a concluir que o objetivo da inflamação era levar
células para combater o agente agressor no local da lesão. No entanto, havia
um forte conceito na época, baseado nos estudos de Paul Ehrlich, que atribuía
esse papel aos fatores neutralizantes humorais levados pelo sangue. Logo,
ficou claro que ambos os eventos eram importantes para a defesa contra
microorganismos e ambos os pesquisadores receberam o Prêmio Nobel em
1908 (COTRAN, Parte ,1 cap. 3, 2003 VI ed).
O final do século XIX, além das descobertas sobre o processo
inflamatório, também presenciou um fato revolucionário quanto ao tratamento
dos males da inflamação. Em 1897, Felix Hoffmann (Figura 3) estava
5
pesquisando a cura para a artrite que afligia seu pai, uma pessoa sensível aos
efeitos colaterais do salicilato de sódio, quando redescobriu as reações
descritas em 1853 por Charles Frederic Gerhardt para sintetizar o ácido
acetilsalicílico. Este era menos ácido que o ácido salicílico, mas mantinha as
propriedades analgésica e antiinflamatória desejadas. Hoffmann foi contratado
pela Bayer e em poucos anos a aspirina tornou-se o medicamento mais
vendido no mundo.
6
íntese do ácido acetil
salicí
988.
Disponí
http://www.bayer.de/aktionaersbrief2q2002/de/news/images/img_asp irin.jpg.
Acesso em: 10 mar. 2006
Figura 3. Felix Hoffmann descreveu o processo de síntese do ácido acetilsalicílico
em 1897 e a direita, o primeiro frasco de Aspirina comercializado em 1898.
.
Disponível em: <http://www.bayer.de/aktionaersbrief2q2002/de/news/images/img_asp>
Acesso em: 10 mar. 2006
7
Em 1927, Thomas Lewis estabeleceu o conceito de mediador químico
pró-inflamatório ao observar que uma amina liberada pela lesão do tecido –
Substância H (histamina) - desencadeava os eventos vasculares da
inflamação. Este fato começou a abrir novos horizontes para o
desenvolvimento de substâncias moduladoras do processo inflamatório, porque
os mediadores inflamatórios passaram a ser alvo para esta regulação que era
perseguida como uma oportunidade de amenizar os sintomas de muitas
doenças, sabidamente inflamatórias na época.
Entre os brasileiros, tivemos a grande contribuição de Maurício da Rocha e
Silva que teve a histamina como um dos principais objetos de estudo nos seus
trabalhos. Ele observou que a histamina promovia o relaxamento das fibras
musculares lisas, causando vasodilatação, o que reduz a pressão arterial. Mas
sua maior descoberta aconteceu em observações de seus experimentos com
intestino isolado, que mostraram a presença de um agente que causava uma
contração seguida de relaxamento lento, a bradicinina. A descoberta foi
publicada na revista brasileira Ciência e Cultura em 1948 e no periódico
American Journal of Physiology, no ano seguinte.
Sérgio H. Ferreira foi outro grande nome brasileiro na área de inflamação.
Foi um dos discípulos que mais ajudou Rocha e Silva em seus trabalhos. Ele
descobriu um grupo de peptídeos no veneno de Bothrops jararaca que
potencializavam a ação da bradicinina e inibiam a conversão da angiotensina I
em modelos de hipertensão. Esses achados resultaram no desenvolvimento da
classe de anti-hipertensivo conhecida como inibidores da enzima conversora
de angiotensina, amplamente usados desde a década de 70 (
FERREIRA SH,
ROCHA E SILVA M. 1962; FERREIRA SH, ROCHA E SILVA M. 1965).
8
Outro marco de Sérgio H. Ferreira foi sua participação na descoberta da
inibição da síntese de prostaglandinas pelo ácido acetilsalicílico (FERREIRA
SH, VANE JR. 1967; FERREIRA SH, BARTELT DC, GREENE LJ, 1970).
1.1.2. Conceitos Básicos
O conjunto de eventos iniciados por uma perturbação da homeostase
tecidual, denomina-se inflamação. O requisito fundamental para o
estabelecimento da inflamação é que o tecido seja vascularizado ou avascular
próximo da vascularização de tecidos vizinhos. Para designar o processo
inflamatório do local acometido (órgão, tecido ou cavidade) acrescentamos o
sufixo “ite“ (ex.: otite, meningite, hepatite, cistite, peritonite, etc.).
Por definição, a inflamação ocorre em organismos vivos com sistema
circulatório desenvolvido e pode ser desencadeada por diferentes eventos
modificadores da homeostase: agentes físicos (trauma e radiação), químicos
(toxinas, ácidos, álcalis), biológicos (bactérias, fungos, protozoários, helmintos,
vírus), distúrbios auto-imunes, necrose e neoplasias.
A inflamação é classicamente dividida em aguda e crônica (COTRAN,
Parte 1, cap. 3, 2003 VI ed).
A forma aguda tem duração que varia de algumas horas até poucos dias
entre o início, o desenvolvimento e o término. Esta é a forma imediata de
resposta a uma lesão tecidual e tem três componentes principais:
1) Modificações do Calibre Vascular
9
Imediatamente após a lesão ocorre uma vasoconstricção reflexa, de
origem neurogênica, mediada por terminações do sistema nervoso autônomo
que dura poucos segundos. A seguir, tem início a vasodilatação, que primeiro
envolve as arteríolas, levando a abertura de novos leitos capilares e aumento
do fluxo sangüíneo para a região, provocando calor e rubor.
2) Aumento da Permeabilidade Vascular
Nos vasos de pequeno calibre ocorrem modificações que permitem a
passagem de proteínas plasmáticas para o espaço extracelular, provocando
aumento da pressão oncótica e retenção de água no interstício (edema). O
fluído rico em proteínas é chamado de exsudato.
3) Migração de Leucócitos
A abertura de novos leitos capilares causa uma redução na velocidade
do sangue e permite a orientação dos leucócitos para o endotélio (marginação).
Por causa dos mediadores pró-inflamatórios nesta região, o endotélio expõe
moléculas na superfície de sua membrana que se ligam às proteínas presentes
na membrana dos leucócitos, principalmente os neutrófilos que são as células
que caracterizam o processo inflamatório agudo. Os neutrófilos se ligam
fracamente ao endotélio pelas primeiras interações que ocorrem entre P-
selectina e receptor endotelial e são conduzidos pelo fluxo em contato com a
célula endotelial (rolamento). As primeiras interações levam a exposição de
novas moléculas de superfície que realizam interações mais fortes (integrinas e
imunoglobulinas) até o momento em que o leucócito fica retido sobre o
endotélio (adesão). Em seguida, novas modificações de citoesqueleto e de
10
interações intercelulares permitem a migração do leucócito entre duas células
endoteliais - diapedese (Figura 4).
Os leucócitos (predominantemente neutrófilos) chegam ao local e
liberam mediadores inflamatórios de diferentes naturezas químicas e funções
(Tabela 1), criando um ambiente extremamente citotóxico para destruir os
agentes invasores, mas que causa degradação do próprio tecido circunvizinho
e frequentemente, a dano causado pela resposta apresenta uma magnitude
maior que o agente agressor.
11
Disponível em:
<http://torre.fffcmpa.tche.br/Volumes/Prof.+Claudio/inflama%C3%A7%C3%A3o+1.pp
t>. Acesso em: 11 mar. 2006.
Figura 4. Fases de migração dos neutrófilos.
12
Mediadores Inflamatórios Função
Mieloperoxidase Catalisa a formação radicais livres
Lactoferrina Seqüestro de íon Fé
+2
Elastase Hidrólise de fibras elásticas
Derivados de ácido aracdônico Modulação da inflamação
Lisozima Degrada parede bacteriana
Citocinas (TNF e IL-1) Sinalização pró-inflamatória
Tabela 1. Exemplos de mediadores liberados pelos neutrófilos e suas funções.
13
Com o fim dos efeitos do agente desencadeante da resposta, ocorre a
resolução do foco inflamatório e o reparo tecidual. Embora os eventos do
reparo sejam mais facilmente observados no final do processo inflamatório, sua
sinalização tem início concomitante com o disparo da resposta inflamatória. O
reparo objetiva a reposição do tecido lesado e/ou a substituição por tecido
conjuntivo - fibrose ou cicatrização.
A inflamação crônica não tem uma definição precisa. Ela é considerada
um processo prolongado, que pode ter semanas ou até anos de duração.
Nesse processo, simultaneamente, são encontrados inflamação ativa,
destruição de tecido e tentativa de reparo. A forma crônica da inflamação pode
ser observada na fisiopatologia de muitas doenças, como a tuberculose, artrite
reumatóide e a doença pulmonar obstrutiva crônica.
Diferente da forma aguda, a crônica apresenta um infiltrado celular com
predomínio de macrófagos e linfócitos, além de angiogênese.
O processo inflamatório também pode estar relacionado à fisiopatologia
de diversas doenças, que são classificadas como degenerativas.
a. Aterosclerose (LAURILA, 1997; GRAYSTON, 1999);
b. Doença de Parkinson (HIRSCH, 2000; BAL-PRICE, 2001);
c. Esclerose Múltipla (BITSCH, 2000);
d. Doença de Alzheimer (McGEER, 2002).
As doenças neoplásicas, em muitos casos, parecem ter início a partir de
um foco inflamatório persistente local (EKBOM, 1990; VESTERINEN, 1996). A
relação entre a liberação e a produção de mediadores inflamatórios e o
processo canceroso está se estreitando cada vez mais, desde a última década.
14
Esses e outros exemplos de descontrole do processo inflamatório que
resultam em dano tecidual motivam buscas por meios controlar a exacerbação
que traz conseqüências mais deletérias que o agente deflagrador.
1.2. Inflamação Pulmonar Aguda
1.2.1. Relevância
A inflamação pulmonar aguda pode se manifestar sob duas formas
principais de síndrome clinica: lesão pulmonar aguda (LPA) e a síndrome de
angústia respiratória aguda (SARA), que são as causas mais importantes de
insuficiência respiratória em pacientes em estado crítico (WARE AND
MATTHAY, 2000). Os parâmetros destas duas síndromes são mostrados na
Tabela 2 (BERNARD, ARTIGAS, 1994). Apesar dos avanços no suporte à vida
de pacientes em unidades de cuidados intensivos, a morbidade e a mortalidade
por essas síndromes apresentam índices elevados. A mortalidade em centros
de referência em países desenvolvidos é de 35% (MILBERG, 1995; ABEL,
1998) e ainda, dentre os sobreviventes, uma parcela significativa apresenta
seqüelas graves com importante limitação funcional (HERRIDGE, 2003).
Correlações entre sobrevida e modificação dos níveis de mediadores pró-
inflamatórios e antiinflamatórios têm direcionado a busca por alternativas
terapêuticas para melhorar esses índices negativos (DONNELLY , 1996).
15
Dados
Clínicos\Síndromes
LPA SARA
Instalação aguda + +
Infiltrado bilateral na
radiografia de tórax
+ +
Pressão de oclusão da
artéria pulmonar
≤18 mm Hg ≤18 mm Hg
Relação PaO
2
/FiO
2
≤ 300 e > 200 ≤ 200
Tabela 2. Critérios clínicos para lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome da angústia
respiratória aguda (SARA). PaO
2
– Pressão parcial de oxigênio arterial; FiO
2
– Fração
de oxigênio no ar inspirado.
16
1.2.2. Fisiopatologia
A inflamação pulmonar aguda pode ocorrer de forma direta, quando
algum agente alcança o espaço alveolar ou pode ocorrer indiretamente por via
intravascular como mostrado na Tabela 3 (FOWLER, 1983; DOYLE, 1995).
Causas Diretas Causas Indiretas
Pneumonia Sepse
Aspiração de conteúdo gástrico Choque
Contusão pulmonar Pancreatite aguda
Tabela 3. Causas diretas e indiretas mais freqüentes de inflamação pulmonar
aguda.
Devido ao seu permanente contato com meio externo, o sistema
respiratório está exposto aos agentes que causam lesão tecidual, sejam eles
de natureza biológica como bactérias, fungos e vírus, química por aspiração de
ácidos, álcalis e gases tóxicos ou física pelo calor, frio e partículas. Para
impedir que esses agentes entrem no organismo e/ou causem doenças, o
sistema respiratório é dotado de barreiras como sua anatomia, células de
revestimento e secreções. (Figura 5).
Entretanto, a despeito dessas barreiras, partículas com 3 a 5 μm podem
alcançar a luz do alvéolo, onde se encontram os macrófagos alveolares (Figura
6) que funcionam como a última linha de defesa contra patógenos (BERSTEIN,
1989). Apesar desde sofisticado sistema de defesa, as causa diretas,
17
principalmente as infecciosas, são a forma mais freqüente de inflamação
pulmonar aguda, respondendo por cerca de 70% do total dos casos em
unidades de tratamento intensivo.
A inflamação aguda pulmonar tem como característica histológica uma
lesão alveolar difusa com infiltrado de neutrófilos (Figura 7). A discreta barreira
formada pelo endotélio capilar e o epitélio alveolar que separa o ambiente
externo do meio intravascular, é rompida e ocorre preenchimento do espaço
alveolar por exsudato, levando a formação do edema intersticial (PUGIN, 1999;
WEINACKER, VASZAR, 2001).
1
3
2
4
5
6
Figura 5. Representação esquemática das via respiratória. 1- O ar ao entrar
pelas narinas sofre a primeira filtração e ao passar por meatos estreitos há
um equilíbrio térmico. 2, 3 e 4 – O epitélio ciliado depura o muco com
impurezas que recobre a superfície da via. 5 e 6 – O ar chega aos alvéolos
livre de partículas.
18
Figura 6. Macrófago alveolar na luz do alvéolo indicado pela seta.
Disponível em: < www.pathguy.com>. Acesso em: 11 mar. 2006.
19
Figura 7. Cortes histológicos de pulmão normal (esquerda) e com
inflamação aguda (direita).
Disponível em: < www.pathguy.com>. Acessado em: 11 mar. 2006.
20
Na fase inicial da reação inflamatória há uma queda da relação
ventilação-perfusão pulmonar, que poderá evoluir para uma insuficiência
respiratória. Dependendo da extensão e da intensidade do processo, a
evolução para a formação de fibrose poderá comprometer a complacência
pulmonar e a capacidade funcional (FUKUDA , 1987).
1.2.3. Sinalização celular
Muitos modelos de inflamação aguda apontam o macrófago alveolar como
a principal célula iniciadora da inflamação aguda no pulmão. Isto se deve a sua
grande capacidade de liberar espécies reativas de oxigênio, enzimas líticas e
citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), a
interleucina 1 beta (IL-1β), a interleucina 6 (IL-6) e a interleucina 8 (IL-8)
(SIBILLE, 1990).
O macrófago alveolar pode ser ativado por diferentes agentes biológicos,
dentre os mais estudados está o lipopolissacarídio (LPS). O LPS é um
componente da membrana externa de bactérias gram-negativas e um dos mais
potentes ativadores do sistema imune inato humano (BEUTLER, 2003).
O LPS interage com uma proteína solúvel conhecida como LPS-binding
protein - LBP (SCHUMANN, 1990) e o complexo é transportado para à
superfície da célula e transferido para o receptor CD14 (WRIGHT, 1990), uma
proteína ancorada à bicamada lipídica por um grupo glicofosfatidilinositol, que
também é encontrada na forma solúvel. O CD14 não apresenta domínio
citoplasmático, portanto não pode transduzir o sinal de LPS diretamente. Para
21
isto, é necessária uma proteína que pertence à família de receptores do tipo
Toll (TLR – Toll like receptors), identificada recentemente e que atua no
reconhecimento de componentes microbianos e na sinalização da resposta aos
agentes infecciosos. (POLTORAK, 1998 ; POLTORAK, 2000 e LIEN, 2000).
Atualmente são conhecidos 10 representantes da família Toll que podem
ligar-se a diferentes componentes microbianos. Por exemplo, o TLR2
reconhece lipopeptídeos e peptídeoglicanos de bactérias gram-positivas
(UNDERHILL, 1999 e TAKEUCHI, 1999), o TLR3 se liga ao RNA dupla fita
(ALEXOPOULOU, 2001), o TLR5 se liga à flagelina (HAYASHI, 2001) e o TLR9
tem especificidade por DNA não metilado (HEMMI, 2000). O TLR4 é o mais
estudado e foi o primeiro a ser descrito (POLTORAK, 1998), atuando como
receptor de LPS e transmitindo o sinal através de sua porção citoplasmática
com a participação da proteína MyD88, dando início a uma complexa rede de
sinalização intracelular que envolve vias diferentes de ativação
(GEPPERT,1994; KYRIAKIS, 1994; HAN, 1994 e SUZUKI, 2002) .
Uma das vias de ativação mais descritas no macrófago alveolar é a via
do fator de transcrição nuclear - NF-κB (Figura 8), que compreende uma família
de proteínas citoplasmáticas, presente em praticamente todas as células
eucarióticas, que migram na forma de dímero para o núcleo e promovem a
transcrição nuclear. A sua primeira descrição foi em 1986, como fator
necessário à transcrição da cadeia leve κ de imunoglobulina em linfócitos B
(SEN, 1986). Cada membro da família contém uma região N-terminal
conservada de 300 aminoácidos que é responsável pela ligação os sítios κB do
DNA, pela dimerização e pela interação com as proteínas inibitórias da família
IκB. A primeira molécula descrita foi o heterodímero de subunidades p50-p65
22
que é comumente referido como sinônimo de NF-κB, apesar de diversos
membros já serem descritos e conhecidos como proteínas da família Rel – p65,
p105/50, p100/52, Rel-B e c-Rel (KOPP, 1995). Cada combinação dimérica
apresenta uma diferente especificidade pelo sítio de ligação ao DNA, assim
algumas moléculas de NF-κB apresentam atividade transcripcional (p50/p65,
p50/c-Rel e p65/c-Rel) e outras combinações são inativas ou repressoras de
transcrição (p50/p50 e p52/p52). São muitos os indutores de ativação da via do
NF-κB, como LPS, espécies reativas de oxigênio, luz UV e componentes virais
e a subunidade p65 é a mais estudada no contexto inflamatório (SCHWARTZ,
1996). A ativação da via do NF-κB exerce um papel central na regulação do
processo inflamatório porque aumenta a expressão de diversos genes
relacionados à imunidade inata. Dentre estes podemos destacar citocinas pró-
inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e Interferon-γ), moléculas de adesão
(ICAM e VCAM) e enzimas (COX-2 e NOS-2) que participam no processo
inflamatório (LI, 2002).
23
Citoplasma
Meio extracelula
r
Membrana
Nuclea
r
Núcleo
DNA
NF-κB
Cascata de Cinases
(Ativação de IKK)
Receptor
Nuclear
RNA
TLR 4
LPS
—P
AAAA
TACE
LBP
I-κB
TNF-α
CD 14
Membrana
p
lasmática
—P
Figura 8. Esquema de sinalização celular pela via do NF-κB.
Degradação
24
Um dos mais abundantes produtos secretados pelo macrófago é o TNF-
α, descrito há duas décadas como mediador principal da patogênese do
choque séptico (BEUTLER, 1985). Ele podia ser encontrado em curto período
de tempo após a administração de LPS em camundongo e, quando bloqueado
por imunização passiva, produzia uma redução parcial da letalidade do LPS
(BEUTLER,1985
b
).
O TNF-α é sintetizado como um precursor ancorado à membrana
plasmática, onde é processado pela enzima conversora de TNF-α (TACE –
TNF-
α
converting enzyme), uma metaloprotease que libera a forma solúvel de
17 kDa (MOSS, 1997) que pode se ligar aos receptores conhecidos como
TNFR1 ou p55 e TNFR2 ou p75 (BARBARA, 1996). Diversas abordagens
experimentais têm sugerido que o TNFR1 inicia a maior parte das respostas
biológicas (HSU, 1995). A ligação do TNF-α com o TNFR1 resulta na
trimerização deste receptor e na liberação da proteína silenciadora dos
domínios de morte (SODD). A porção intracelular dos receptores TNFR1 é
reconhecida então por uma proteína adaptadora do domínio de morte
associado ao receptor de TNF (TRADD). Esta se liga ao receptor e atrai a
proteína que interage com o receptor RIP (TING, 1996), o fator 2 associado ao
TNFR (TRAF2) e a proteína com domínio de morte associado ao Fas (FADD)
(HSU, 1996). Dependendo do estímulo, o TNFR1 pode ativar 3 vias diferentes
de sinalização intracelular. Uma das vias levaria à apoptose por intermédio do
FADD, que recrutaria a enzima caspase 8 para o complexo de receptores de
TNF, disparando uma seqüência de reações que culminaria com a morte
celular. Por outro lado, a ação do TRAF2 pode recrutar inibidores de apoptose
25
como a proteína inibidora celular de apoptose 1 e 2 (cIAP-1 e cIAP-2) e ativar a
via das MAP cinases e do NF-κB (Figura 9).
TNF-
α
CITOPLASMA
Membrana
plasmática
TNFR1/p55
Trímero
TNFR1/p55
Death
Domain
(DD)
SODD
SODD
TRADD
TRAF2
FADD
RIP
A
tivação de MAP
cinase e NF-κB
A
tivação de caspases
(apoptose)
Figura 9. Esquema de sinalização do receptor de TNF-α.
26
1.2.4. Alternativas Terapêuticas
Os fármacos utilizados como antiinflamatórios podem ser classificados
como esteroidais e não-esteroidais. Os glicocorticóides possuem uma grande
potência antiinflamatória, mas seu uso muitas vezes é restrito pelos vários
efeitos colaterais que são muito comuns. Dentre os não-esteroidais destacam-
se os inibidores da enzima ciclooxigenase (COX) utilizados na clínica e os
inibidores seletivos para a COX-2, isoforma estimulada nos processos
inflamatórios. Entretanto, em todos os casos os efeitos colaterais têm se
tornado uma preocupação com o paciente.
Em relação à inflamação pulmonar aguda, a única intervenção capaz de
melhorar a mortalidade é a ventilação mecânica (DELCLAUX, 2000). Apesar de
bons resultados em modelos experimentais, com diversas classes de
substâncias, os ensaios clínicos não mostraram redução significativa na
mortalidade de pacientes com as formas mais graves de inflamação pulmonar
aguda (JAIN, 2006).
A ausência de uma alternativa terapêutica farmacológica eficaz estimula
a pesquisa sobre os mecanismos envolvidos na resposta aos patógenos, na
busca por novos alvos que contribuam para reduzir a mortalidade e as
seqüelas da inflamação pulmonar aguda.
27
1.3. DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS
1.3.1 Pesquisa com Plantas Medicinais
Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde tempos pré-
históricos. A busca pela cura de doenças através da ingestão de ervas e folhas
talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais.
A história do desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental é rica em
exemplos da utilização de recursos naturais na medicina, no controle de pragas
e em mecanismos de defesa, merecendo destaque a civilização Egípcia,
Greco-romana e Chinesa. A medicina tradicional chinesa desenvolveu-se com
tal grandiosidade e eficiência que até hoje muitas espécies e preparados
vegetais medicinais são estudados na busca pelo entendimento de seu
mecanismo de ação e no isolamento dos princípios ativos (VIEGAS, 2005).
De acordo Farnsworth (1985), cerca de 80% da população de países em
desenvolvimento usa material de plantas como fonte primária de cuidados com
a saúde.
A natureza é a responsável pela produção da maioria das substâncias
orgânicas conhecidas, e o reino vegetal é responsável pela maior parcela da
diversidade química conhecida e registrada na literatura. A variedade e a
complexidade das micromoléculas que constituem os metabólitos secundários
de plantas e organismos marinhos ainda são inalcançáveis por métodos
laboratoriais. Isto seria a conseqüência direta de milhões de anos de evolução,
28
atingindo um refinamento elevado de formas de proteção e resistência às
intempéries do clima, poluição e predadores (VIEGAS, 2005).
Neste sentido, a natureza forneceu muitos modelos moleculares que
fundamentaram estudos de relação estrutura-atividade (SAR) e inspiraram o
desenvolvimento da síntese orgânica clássica. Como exemplo, podemos citar:
O curare - droga obtida de diversas espécies de Strychnos e
Chondodendron americanas e africanas, utilizadas pelos índios para produzir
flechas envenenadas para caça e pesca. Somente no século XIX Boehm isolou
o principal constituinte ativo do curare americano (Chondrodendron
tomentosum), a (+)-tubocurarina (VIEGAS, 2005).
O ópio - preparado dos bulbos de Papaver somniferum é conhecido há
séculos por suas propriedades soporíferas e analgésicas. Esta planta era
utilizada desde a época dos Sumérios (4000 a.C.), havendo relatos na
mitologia grega atribuindo à papoula do ópio o simbolismo de Morfeu, o deus
do sono. Em 1804, na França, Armand Séquin isolou o seu constituinte
majoritário, a morfina (VIEGAS, 2005).
A utilização pelos índios das cascas secas de espécies de Cinchona
para tratamento de alguns tipos de febre e o isolamento da quinina, que
durante quase duzentos anos foi o único princípio ativo eficaz contra a malária
(VIEGAS, 2005).
Entre 1967 e 1971, o taxol (paclitaxel) foi identificado e re-isolado das
cascas de Taxus brevifolia. Durante os primeiros estudos sobre sua
potencialidade como um novo agente antineoplásico, foi questionada a
viabilidade de seu futuro emprego face à complexidade de sua estrutura e à
29
relativa escassez da fonte natural (VIEGAS, 2005). Por exemplo, para se
extrair 1 kg de taxol, era preciso 10 t de cascas de Taxus brevifolia, o que
representava o abate de cerca de 3000 árvores. Entre 1985 e 1995, estes
dados e a forte pressão de militantes ambientalistas, além da restrição imposta
pelo “Forest Service Bureau of Land Management” (EUA) para o acesso à
planta, motivaram intensos esforços no sentido de se encontrar fontes naturais
alternativas para o taxol (TER HAAR, 1996). Atualmente a síntese de taxol é
feita em laboratório.
A investigação de produtos naturais como fonte de novos agentes
terapêuticos atingiu seu pico na indústria farmacêutica ocidental entre as
décadas de 70 e 80. Das 877 pequenas moléculas de novas entidades
químicas introduzidas entre 1981 e 2002 praticamente metade (49%) foram de
produtos naturais, análogos semi-sintéticos ou compostos sintéticos baseados
em produtos naturais. Dentre os 50 antiinflamatórios utilizados na clínica,
atualmente, 13 são derivados de produtos naturais (NEWMAN, 2003).
Entretanto, quer pela dificuldade de se obter grandes quantidades de
material, quer pela dificuldade de se comprovar a ação específica de cada
substância obtida, a pesquisa farmacêutica em produtos naturais passou por
um declínio nas duas últimas décadas (KOEHN, 2005).
O banco de dados mundial que centraliza as informações sobre
pesquisas com plantas medicinais, conhecido como NAPRALERT, possui
14.300 registros de espécies de planta. Estima-se que este valor corresponda a
5,3% do total de espécies existentes em que apenas 40% desta fração tem
sido objeto de estudo biológico ou químico (CORDELL, 2005).
30
1.3.1.1. Eleusine indica (L.) Gaertn
O nome Eleusine é derivado de Eleusis, cidade grega onde se adorava a
deusa Ceres e indica (pronúncia proparoxítona) tem provável origem de
indicum termo em latim para índigo e poderia ser uma referência ao tom
azulado que por vezes aparece nas plantas.
A E. indica (Figura 10) pertence à família Poaceae e apresenta como
sinonímia botânica: Eleusine gracilis Salisb, Cynosurus indicus L., Cynodon
indicus Rasp; tem como nomes vulgares: Capim-pé-de-galinha, Grama-de-
coradouro, Gram-criador, Capim-da-cidade e Pé-de-papagaio (MARTINS,
1995; KISSMANN,1997).
As informações mais antigas sobre essa planta vêm da Ásia, mas não
há consenso sobre sua origem exata. Atualmente, ela pode ser encontrada nas
regiões tropicais, subtropicais e temperadas. Sua presença é mais marcante na
região intertropical e como a maior parte do território brasileiro está incluído
nesta região, a planta é encontrada praticamente em todo país, desde a zona
rural até as cidades, onde cresce entre as pedras de calçamento, podendo
chegar a 70 cm de altura (KISSMANN,1997; SILVA, 2001).
A E. indica é pouco exigente em relação ao solo e pode crescer em
solos com ampla faixa de pH. Tem bom desenvolvimento em solos pobres e
compactados como beira de estradas e terrenos abandonados, justificando seu
predomínio sobre as outras espécies. Apresenta grande resistência à seca e ao
excesso de umidade (KISSMANN,1997).
31
A luminosidade e o fototropismo influem pouco no processo reprodutivo,
mas determinam características diversas no aspecto vegetativo (SIONIT,
1987). A alta luminosidade estimula o crescimento e certa prostração; sob
pouca luz as plantas ficam mais eretas, mas a altura é menor.
Atualmente, na literatura, encontramos diversas publicações
relacionadas ao combate desta espécie que é considerada uma das piores
plantas invasoras, por causar grandes prejuízos na agricultura em várias partes
do mundo. Os danos à agricultura não ocorre apenas pela competição de
nutrientes do solo com as espécies cultivadas, mas também por ser hospedeira
de diversos agentes patogênicos que contaminam a cultura (KISSMANN,1997).
A E. indica não é adequada como pasto, porque as plantas jovens
apresentam elevado teor de ácido cianídrico (43 mg/kg), causando intoxicação
dos animais. No entanto, a espécie é utilizada pela população na forma de
decocto e infuso da planta inteira para tratamento de casos de febre,
inflamação dentária e principalmente, processos inflamatórios das vias
respiratórias como gripe, pneumonia e bronquite (SILVA, 2001). Nos processos
de preparação a planta é fervida, o que reduz em cerca de 20 vezes o teor de
ácido cianídrico, ficando fora da faixa de toxicidade para a quantidade média
consumida pela população (DIAZ, 1978).
32
Figura 10. Eleusine indica. Disponível em:
<http://www.missouriplants.com/Grasses/Eleusine_indica_page.html>. Acesso
em: 25 jan.2006.
Figura 10. Eleusine indica. Disponível em:
<http://www.missouriplants.com/Grasses/Eleusine_indica_page.html>. Acesso
em: 25 jan.2006.
A E. indica apresenta alta resistência contra os herbicidas mais
modernos, como os das classes ciclohexanodionas e ariloxifenoxipropiônicos
que inibem a acetil coenzima A carboxilase. A resistência a esses herbicidas é
conferida por mutações nesta enzima (LEACH, 1995). A resistência aos
antimitóticos como dinitroanilina e fosforotioamidato é conseqüência de
mutação na α-tubulina, e o uso persistente dessa classe de herbicida foi
determinante para a seleção deste mutante (ETSUO, 1998). Também foi
detectado como ponto de resistência aos herbicidas glifosatos, por uma
33
mutação na enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS – enzyme
5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase).
1.3.2. Pesquisa por Compostos Sintéticos Projetados
A pesquisa por novas entidades químicas bioativas (bioNCEs) pelos
laboratórios de pesquisa industriais introduziu novas técnicas, como o uso da
química combinatória, para se obter maior número de substâncias. De modo
geral, por esta nova tecnologia, as reações são feitas em várias etapas,
ocorrendo em paralelo ou em misturas, a partir de poucos reagentes. Os
produtos reacionais resultantes são combinações aleatórias dos reagentes e,
portanto, um número muito grande de compostos novos pode ser gerado.
Paralelamente, ocorreu o desenvolvimento de métodos de “screening”
biológicos automatizados que passaram a permitir a avaliação in vitro de
milhares de substâncias por experimento. Essas técnicas, empregadas
concomitantemente, permitem a identificação de novos compostos capazes de
interagir com os alvos terapêuticos ensaiados inicialmente em escala
micromolar e atualmente nanomolar (KOEHN, 2005).
A maioria dos fármacos são micromoléculas bioativas que exercem seu
efeito terapêutico graças às interações específicas com uma biomacromolécula
ou receptor. Métodos computacionais modernos permitem que se determine
qualitativo e quantitativamente as diferentes contribuições das distintas
subunidades estruturais dos fármacos, tanto aquelas de natureza eletrônica
como estérica, no reconhecimento molecular dos sítios receptores.
34
A combinação dessas tecnologias com o avanço dos campos da
genômica e da síntese química oferece possibilidades promissoras no
desenvolvimento de novos fármacos (KOEHN, 2005).
1.3.2.1. Inibidores de Fosfodiesterase IV
O 3’-5’ monofosfato cíclico de adenosina (AMP cíclico) é um importante
mensageiro intracelular que regula funções celulares. Em muitas células pró-
inflamatórias e do sistema imune o aumento na concentração intracelular deste
nucleotídeo causa uma diminuição da resposta (VERGHESE, 1995;
GONÇALVES DE MORAES, 1996). Por isso, compostos que elevam os níveis
de AMP cíclico intracelular têm potencial como novas drogas antiinflamatórias.
A elevação dos níveis de AMP cíclico intracelular pode acontecer por:
- aumento da produção seja pela ativação direta da adenilato ciclase
(responsável pela síntese) ou indireta, através de receptores de membrana
acoplados;
- diminuição da hidrólise pelo bloqueio da fosfodiesterase de
nucleotídeos cíclicos (PDE – phosphodiesterase).
As PDEs são agrupadas em sete famílias de isoformas (PDE I – PDE
VII) de acordo com a seqüência gênica, especificidade por substrato (Tabela
4), distribuição tecidual e sensibilidade aos inibidores (BEAVO, 1995). A PDE
IV é a isoforma predominante em praticamente todas as células pró-
inflamatórias e do sistema imune. Por isso, muitos inibidores seletivos para
esta isoforma foram desenvolvidos como inibidores do processo inflamatório e
35
com efeito comprovado em modelos in vivo e in vitro. (SEMMLER, 1993;
TORPHY, 1991. GONÇALVES DE MORAES, 1998).
Entretanto, o uso terapêutico mostrou que inibidores da PDE IV, como o
rolipram, causam efeitos colaterais como hipotensão, náuseas e taquicardia,
restringindo seu uso clínico. Contudo, os bons resultados obtidos em diferentes
processos inflamatórios têm estimulado a procura de análogos do rolipram com
ação inibidora seletiva para a PDE IV e reduzido efeito colateral (WRIGHT,
1998).
Nessa perspectiva o Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias
Bioativas (LASSBio) da UFRJ desenvolveu uma família de substâncias
derivadas do sildenafil (inibidor de PDE V) e da talidomida projetados como
inibidores de PDE IV.
Músculo esquelético, rim, pâncreas
e linfócito T
Específica para AMP cíclicoPDE VII
FotoreceptoresEspecífica para GMP cíclicoPDE VI
Pulmão, plaquetas e músculo lisoEspecífica para GMP cíclicoPDE V
Células de Sertoli, rim, cérebro e
leucócitos
Específica para AMP cíclicoPDE IV
Coração, pulmão, fígado e
adipócitos
Inibida por GMP cíclicoPDE III
Supra-renal, coração, pulmão e
plaquetas
Estimulada por GMP cíclicoPDE II
Coração, cérebro, pulmão e
músculo liso
Estimulada por Ca
+2
/ calmodulina
PDE I
Distribuição tecidualCaracterísticasIsoforma
Tabela 4. Isoformas de fosfodiesterase (PDE), características e distribuição. Adaptado de
Essayan, D.M., 1999.
Músculo esquelético, rim, pâncreas
e linfócito T
Específica para AMP cíclicoPDE VII
FotoreceptoresEspecífica para GMP cíclicoPDE VI
Pulmão, plaquetas e músculo lisoEspecífica para GMP cíclicoPDE V
Células de Sertoli, rim, cérebro e
leucócitos
Específica para AMP cíclicoPDE IV
Coração, pulmão, fígado e
adipócitos
Inibida por GMP cíclicoPDE III
Supra-renal, coração, pulmão e
plaquetas
Estimulada por GMP cíclicoPDE II
Coração, cérebro, pulmão e
músculo liso
Estimulada por Ca
+2
/ calmodulina
PDE I
Distribuição tecidualCaracterísticasIsoforma
Músculo esquelético, rim, pâncreas
e linfócito T
Específica para AMP cíclicoPDE VII
FotoreceptoresEspecífica para GMP cíclicoPDE VI
Pulmão, plaquetas e músculo lisoEspecífica para GMP cíclicoPDE V
Células de Sertoli, rim, cérebro e
leucócitos
Específica para AMP cíclicoPDE IV
Coração, pulmão, fígado e
adipócitos
Inibida por GMP cíclicoPDE III
Supra-renal, coração, pulmão e
plaquetas
Estimulada por GMP cíclicoPDE II
Coração, cérebro, pulmão e
músculo liso
Estimulada por Ca
+2
/ calmodulina
PDE I
Distribuição tecidualCaracterísticasIsoforma
Tabela 4. Isoformas de fosfodiesterase (PDE), características e distribuição. Adaptado de
Essayan, D.M., 1999.
36
1.3.2.2. Inibidores da p38 MAP Cinase
As MAP cinases (MAPK – Mitogen Activated Protein Kinase) são
enzimas integrantes de vias de sinalização que controlam diversos
mecanismos de regulação celular envolvendo controle da embriogênese,
diferenciação, proliferação e morte celular (PEARSON, 2001).
Estão descritas três vias distintas de MAP Cinases, que parecem ser
conservadas de leveduras ao homem. A primeira descoberta foi a via das
cinases reguladas por sinal extracelular (ERK1 e 2 – extracellular signal-
regulated kinases) e em seguida foram identificadas a JNK (c-Jun N-terminal
Kinase) a MAP cinase p38. Cada subfamília consiste de várias isoformas e
membros que frequentemente apresentam funções distintas. Uma
característica comum entre eles é a ativação por duas fosforilações que
ocorrem em resíduos de treonina e tirosina e que estão separados por um
resíduo diferencial para cada subfamília (glicina – p38, prolina – JNK e
glutamato – ERK) (PEARSON, 2001).
A MAP cinase p38α é a isoforma melhor caracterizada e talvez a de
maior relevância para o processo inflamatório. Sua descrição como alvo
molecular veio da observação de que compostos da classe piridinil imidazólicos
levavam à inibição da síntese de citocinas inflamatórias como IL-1β e TNF-α
em monócitos humanos estimulados com LPS e outras citocinas (LEE,1994;
ADAMS, 2001).
Vários inibidores de p38 (Figura 11) bloqueiam a produção de IL-1β,
TNF-α e outras citocinas. Essa inibição envolve mecanismos regulatórios da
transcrição e da tradução.
37
A MAPK p38 promove o aumento de expressão gênica pela fosforilação
intranuclear de NF-κB, por uma via independente da ativação da molécula
inibidora IKK-γ, sem degradação de I-κB e sem translocação nuclear de RelA
(JIJON, 2004)
A participação da p38 na estabilidade das moléculas de RNA
mensageiro começou a ser demonstrada por uma produção reduzida de IL-6 e
TNF-α em camundongos com deficiência de MAPKAP K2, substrato da p38
(KOTLYAROV, 1999).
Uma característica dos RNA mensageiros de várias proteínas envolvidas
no processo inflamatório é a presença de uma região rica em adenina e uracila
(AU-rich element – ARE) em uma porção não traduzida próxima à extremidade
3’ dos transcritos (CAPUT, 1986). Algumas proteínas se ligam em regiões ARE,
cuja interação favorece a degradação dos transcritos por exossomos, um
complexo exonucleotídico 3’–5’ (Figura 12). Por isso, os transcritos que
apresentam seqüências ARE possuem uma meia-vida mais curta quando
comparados aos que não possuem essa região. Além disso, a inserção de uma
região ARE em RNA mensageiros mais estáveis provoca uma redução da
meia-vida desses transcritos modificados (SHAW, 1986)
38
Figura 11. Inibidores de p38 MAP cinase.
Piridinilimidazóis (a) e compostos de interesse (b).
39
Figura 12. Esquema de sinalização da via p38 MAP
cinase.
40
A via da p38 tem papel fundamental na estabilização desses RNA
mensageiros de vida curta (WINZEN, 1999). A fosforilação dessas proteínas
desestabilizadoras pela MAPKAP K2 causa a dissociação da região ARE e
permite uma conformação mais estável do RNA mensageiro, aumentando a
meia-vida e a tradução, levando a um aumento da síntese de proteína
(WINZEN, 1999; NEININGER, 2002).
Outro fato que confirma a importância da via p38 para regulação do
processo inflamatório é a resistência ao choque endotóxico induzido por LPS,
observada em camundongos deficientes em MAPKAP K2 (KOTYAROV, 1999).
Na busca por novos fármacos para o tratamento de doenças
inflamatórias, o laboratório LASSBio desenvolveu por planejamento estrutural
uma família de compostos projetados para serem inibidores de p38 MAP
cinase.
41
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivos:
2.1 Extrato de planta
Avaliar os efeitos do extrato da planta Eleusine indica no modelo de
inflamação pulmonar aguda induzida por LPS, em camundongos, investigando
o recrutamento de neutrófilos, mediadores inflamatórios e ativação celular,
comparando via oral com via intraperitonial,
2.2 Produtos sintéticos
Avaliar os efeitos dos compostos sintéticos L-998 e L-541 no modelo de
inflamação pulmonar aguda induzida por LPS, em camundongos, investigando
o recrutamento de neutrófilos e mediadores inflamatórios, comparando via oral
com via intraperitonial.
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
Parte de Material e Métodos encontra-se nos artigos anexos.
3.1. Reagentes
Ácido etilenodiaminotetracético – EDTA (VETEC, Brasil); Fluoreto
fenilmetilsulfonila – PMSF (BIOAGENCY, EUA); RPMI 1640, estreptomicina,
penicilina, brometo (3 - (4,5 - dimetiltiazol – 2il) 2,5 – difeniltetrazolio – MTT,
fenoxinonilpolietoxi etanol - NP-40, ditiotreitol – DTT, (N-(2 hidroxietil)
piperazina N-(ácido 2 etano sulfônico) – HEPES, N,N’-metileno-bis-acrilamida;
lipopolissacarídeo bacteriano extraído de E. coli, serotipo 055:B5 – LPS,
albumina sérica bovina (ASB), acrilamida, bis acrilamida, soro fetal bovino –
SFB (GIBCO BRL Co, EUA); dimetil sulfóxido – DMSO, etanol (Merk-
Schuchardt, Alemanha); T4 polinucleotídeo cinase (BIOLABS, RU); Diff-Quick
(SHANDOM, EUA); ácido clorídrico e hiróxido de sódio (Merk, Alemanha).
3.2. Animais
Nesse trabalho foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem
BALB/c machos, pesando 25 gramas, obtidos do Núcleo de Animais de
Laboratório (NAL) da Universidade Federal Fluminense. Os animais foram
mantidos no biotério do Laboratório de Imunofarmacologia Celular, com ciclo
de luz 12 horas claro e escuro, temperatura e umidade controladas e ração
(Purina, Brasil) e água ad libitum. Todos os procedimentos com os
43
camundongos foram orientados pelas recomendações do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal e os Princípios Éticos e Práticos do Uso de Animais de
Experimentação.
3.3. Inalação de LPS e instilação de TNF-α intranasal
Os camundongos foram colocados em uma câmara para inalar os
aerossóis produzidos por pressão positiva em 2 mL de uma suspensão de LPS
contendo 0,5 mg/mL, preparado em salina. Os animais do grupo controle
inalaram salina fisiológica (NaCl 0,9 %).
No modelo de inflamação pulmonar usando TNF-α murino recombinante
(ENDOGEN, EUA), os camundongos foram levemente anestesiados por
inalação de éter etílico e após atingirem o estado de depressão dos reflexos,
foram instilados 50 μL (0,5 μg de TNF-α) nas narinas de cada camundongo.
Foram instilados 50 μL de salina fisiológica (NaCl 0,9 %) em animais do grupo
controle.
3.4. Lavado broncoalveolar (LBA)
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical três ou vinte e
quatro horas após a inalação, suas traquéias foram expostas, canuladas
através da membrana cricotireoidea e o espaço aéreo foi preenchido com 0,7
mL de solução salina fisiológica (NaCl 0,9%). O LBA foi obtido pela aspiração
do conteúdo (cerca de 80% volume injetado). Três operações repetidas
forneciam um volume final de 1,5 mL de LBA que era mantido a 4 °C. Uma
44
alíquota de 0,3 mL do lavado foi utilizada para a contagem e identificação das
células e o restante foi centrifugado a 1.500 x g por 10 minutos (SORVALL,
EUA) e o sobrenadante foi estocado a -20 ºC para posterior análise das
citocinas.
3.5. Contagem de células
O número total de células foi determinado em um contador de células do
tipo Coulter Counter (Coulter Eletronics Inc. - EUA). A identificação dos
diferentes tipos de células presentes no LBA foi feita após citocentrifugação de
100 ou 400 μL de LBA a 80 x g por 1 minuto Cytospin 3 (Shandon - EUA). As
lâminas preparadas a partir da citocentrifugação foram coradas com o kit Diff-
Quick (SHANDON, EUA). Foram contadas, em média, cerca de 200 células em
cada lâmina. A identificação do tipo celular foi baseada conforme as descrições
morfológicas descritas por Stevens e Lowe (1995).
3.6. Dosagem dos mediadores inflamatórios
A dosagem quantitativa de TNF-α, IL-1β, MCP-1 e KC no LBA foram
feitas através do ensaio da imunoabsorbância ligada à enzima (enzyme
immunoabsorbent assay - ELISA).
O método utilizado para a dosagem de TNF-α consistiu na utilização de
anticorpo monoclonal de rato anti-TNF-α murino e anticorpo policlonal de
coelho anti-TNF-α murino (ENDOGEN, EUA), com limite de detecção de 50
pg/ml, conforme descrito em Gonçalves de Moraes et al. (1996).
45
Para a dosagem de IL-1β, MCP-1 e KC foram utilizados kits R&D
SYSTEMS e ENDOGEN Co. (EUA), respectivamente, com seus limites de
detecção em torno de 4 pg/ml.
3.7. Extrato nuclear das células do pulmão
Após o lavado broncoalveolar alguns animais foram perfundidos com
solução salina fisiológica. Após a perfusão, foi feito o extrato das proteínas
nucleares das células pulmonares conforme descrito em Madjpour e cols.
(1999). Os pulmões de cada animal foram homogenados em tampão fosfato pH
7,6. Depois de centrifugados por 1.500 x g por 10 minutos (EPPENDORF,
Alemanha), os sobrenadantes foram descartados e o precipitado foi
processado para a extração das proteínas nucleares. A esta fração foram
adicionados 200 μL de tampão hipotônico contendo 10 mM de HEPES, 10 mM
de KCl, 2 mM de MgCl
2,
0,1 mM de EDTA com pH 8,0, 10 mM de DTT, 1 mM
de PMSF e 0,5% de detergente não-iônico NP-40 (v/v). As amostras foram
centrifugadas por 14.000 x g (EPPENDORF, Alemanha) a 4 ºC. Os
sobrenadantes foram descartados e os precipitados ressuspensos em 100 μL
da solução hipertônica contendo 50 mM de HEPES, 50 mM de KCl, 300 mM de
NaCl, 0,1 mM de EDTA com pH 8,0, 10% de glicerol (v/v), 1 mM de PMSF e
1,0 mM de DTT para a lise da membrana nuclear e incubados por 1 hora a 4
ºC. Após esse período de tempo, as amostras foram centrifugadas e os
sobrenadantes contendo as proteínas nucleares foram coletados e estocados a
-70ºC.
46
3.8. Marcação do oligonucleotídeo
Os oligonucleotídeos foram marcados radioativamente com o isótopo
32
Pi através do uso da enzima T4 polinucleotídeo cinase. A técnica consistiu na
transferência do radical Pi da posição γ do ATP para a região hidroxil 5’
terminal do oligonucleotídeo. Para a marcação, foram utilizados 5 pM de
oligonucleotídeo, 4 μL de [γ
32
P] ATP (10 μCi) da AMERSHAM (EUA), 4 μL de
tampão de incubação (70 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl
2
, 5 mM de
ditiotreitol, pH 7,6) a 25 ºC, 1,0 μL da enzima T4 polinucleotídeo cinase (20
unidades de Richardson) e 7,5 μL de água deionizada. Após 1h de incubação,
a solução foi centrifugada por 1 minuto a 80 x g numa coluna com resina
sephadex G-50 (BIORAD, EUA). A solução resultante, contendo a sonda
marcada, foi estocada a -20ºC para ser utilizada posteriormente no ensaio da
mudança de mobilidade eletroforética.
3.9. Ensaio da mudança de mobilidade eletroforética (EMSA)
Após a realização do extrato nuclear, foi feita a verificação da ativação
do NF-κB pela técnica EMSA em gel de poliacrilamida não desnaturante a 6%.
Células Hela foram utilizadas como controle positivo para mostrar a ativação do
NF-κB. Para a ativação dessas células, 1,0 μg/mL de PHA (SIGMA, EUA) foi
adicionado à suspensão de células contendo 1,0 mL de RPMI 1640 com 10%
de SFB. As células foram incubadas por 1 h a 37°C, e em seguida foram
processadas para a obtenção do extrato nuclear. Os extratos foram incubados
com uma sonda sintética de DNA dupla fita (Gibco BRL Co, EUA) com a
47
seguinte seqüência (MUNOZ et al., 1998):
5’ AGTTGAGGGGACTTCCCCAGGC 3’
O tempo de incubação foi de 30 minutos à 37ºC. Em cada poço foram
aplicados de 1 a 6 μg de proteína do extrato nuclear e aproximadamente
100.000 com de sonda marcada com
32
Pi, no total de 30 μL de volume final.
Após a adição das amostras no gel, foi aplicada uma diferença de potencial de
150 V por 2 horas. O gel foi então desidratado e analisado pelo sistema Storm
840 (MOLECULAR DYNAMICS, EUA). Para verificar se a subunidade p65 do
NF-κB fazia parte do complexo, foi adicionado 1 μL de anticorpo antip65
(SANTA CRUZ, EUA) na concentração de 200 μg/μL, 1 h antes da adição da
sonda marcada.
O princípio do método é baseado na mudança do deslocamento da
sonda radioativa aplicada no gel, que ocorrerá se o NF-κB estiver presente no
extrato do núcleo após 2 horas sob a diferença de potencial de 150 V. Nos
experimentos em que há adição do anticorpo contra a subunidade p65, é
esperado que haja uma atenuação da banda referente ao NF-κB, caso essa
subunidade esteja presente no complexo. Este ensaio recebe o nome de
supershift.
3.10. Tratamento com o extrato de planta e os compostos sintéticos
Os animais foram tratados com o extrato bruto liofilizado de Eleusine
indica ou com um dos compostos projetados e produzidos pelo Laboratório
LASSBio ( L-998 ou L-541). Em cada experimento estão indicadas as doses e
48
os tempos relativos ao estímulo inflamatório. Para os tratamentos por via
intraperitoneal (i.p.) o extrato foi dissolvido em solução salina e os compostos
dissolvidos em DMSO e diluídos 80 vezes em salina. Em todos os casos de
tratamento por via oral (v.o.) foi utilizada a carboximetilcelulose 0,5% para a
diluição. O volume administrado foi de 0,2 mL em todas as situações e os
grupos controles receberam os veículos correspondentes.
3.11. Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados pelo teste-t não-pareado,
considerando significativo quando p<0,05.
49
4. RESULTADOS
Parte dos Resultados encontra-se nos artigos anexos.
Novos Resultados
4.1. Efeito do tratamento com extrato bruto de Eleusine indica por via
intraperitonial na inflamação pulmonar induzida pela inalação de LPS.
Nós descrevemos, previamente, que o tratamento com extrato bruto de
Eleusine indica (Ei) inibe o recrutamento de neutrófilos de forma dose-
dependente. Os dois flavonóides majoritários isolados (vitexina e schaftosídeo)
apresentaram, individualmente, uma potência 100 vezes maior que a do extrato
bruto (DE MELO, 2005 – artigo anexo).
O LBA dos camundongos BALB/c realizado 3 horas após a inalação de
LPS apresentou um aumento no número de neutrófilos. Os animais tratados
com o Ei apresentaram uma redução dose-dependente do número de
neutrófilos (Figura 13). A dosagem de TNF-α no LBA também mostrou uma
redução dos níveis desta citocina nos grupos tratados com Ei (Figura 14).
Para avaliar se o efeito inibitório permaneceria após 24 horas, quando
há o pico do número de neutrófilos no LBA, foi escolhida a dose de 100 mg/kg
para o pré-tratamento.
O pré-tratamento 1 hora antes da inalação causou uma redução do
número de neutrófilos no LBA avaliado em 3 e 24 horas após a inalação de
LPS (Figura 15). Os sobrenadantes do LBA dos grupos de 24 horas não
apresentaram níveis detectáveis de TNF-α. Para verificar se o efeito de Ei
50
sobre o recrutamento de neutrófilos envolvia uma etapa de sinalização anterior
ou posterior à liberação de TNF-α, pelo macrófago alveolar, foi utilizado o
modelo de inflamação pulmonar aguda induzida pela instilação intranasal (i.n.)
de TNF-α murino recombinante. O grupo pré-tratado com 100 mg/kg de Ei
apresentou uma redução de cerca de 80% em relação ao grupo veículo (Figura
16).
Com o objetivo de avaliar o efeito de Ei como tratamento após a inalação
de LPS, além do grupo tratado 1 hora antes, grupos foram tratados com 100
mg/kg i.p. 1 hora e 5 horas após a inalação de LPS. Houve inibição do número
de neutrófilos em todos os tempos de tratamento (Figura 17). A análise do
sobrenadante mostrou uma redução dos níveis da quimiocina atractante de
neutrófilos, KC, nos tratamentos antes e após a inalação de LPS (Figura 18).
51
Figura 13. Tratamento com Ei i.p. reduz o número de neutrófilos
no LBA após a inalalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
pré-tratrados com veículo ou Ei (4, 40, 100 ou 400 mg/kg) i.p. 1 hora
antes e o LBA foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de
uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05, ** p<0,01 e
*** p<0,001 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo.
Neutrófilos (x 10
3
/mL)
0
50
100
150
200
250
300
Veículo
Inalação
de
LPS
Ei (mg/kg) i.p.
4Veículo 40 100 400
*
**
***
***
Inalação
de
salina
52
0
200
400
600
800
1000
1200
TNF-
α
(pg/mL)
Veículo 4Veículo 40 100 400
*
*
Inalação
de
LPS
Ei (mg/kg) i.p.
Inalação
de
salina
Figura 14. Tratamento com Ei i.p. reduz os níveis de TNF-a no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratrados
com veículo ou Ei (4, 40, 100 ou 400 mg/kg) i.p., 1 hora antes e o LBA foi
realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2
mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. * p<0,05 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo.
53
Veículo
Neutrófilos (X10
3
/mL)
0
100
200
300
400
500
EI
100
Inalação
de
LPS
**
**
Veículo
Inalação
de
Salina
Veículo
EI
100
Veículo
Inalação
de
LPS
Inalação
de
Salina
LBA
3h após
inalação
LBA
24h após
inalação
Figura 15. Tratamento com Ei i.p. reduz o número de neutrófilos
no LBA 3 e 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos
BALB/c foram pré-tratrados com veículo ou Ei (100 mg/kg) i.p., 1 hora
antes e o LBA foi realizado 3 ou 24 horas após a inalação de aerossóis
de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
54
Neutrófilos (X 10
3
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Veículo
Ei
TNF-α i.n.
Veículo
Salina i.n.
*
Figura 16. Tratamento com Ei i.p. reduz o número de neutrófilos
no LBA 3 horas após a instilação de TNF-α i.n. Os camundongos
BALB/c foram pré-tratados com Ei (100 mg/kg) i.p. 1 hora antes e o
LBA foi realizado 3 horas após a instilação de TNF-α (0,5 mg/animal).
Os animais controle receberam instilação de salina i.n. Os resultados
foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. *
p<0,05 em comparação com o grupo TNF-α pré-tratado com veículo.
55
0
200
400
600
800
Inalação
de
Salina
Veículo
-1h
+1h
+5h
EI 100 mg/kg i.p.
Inalação
de
LPS
Neutrófilos (X10
3
/ mL)
*
***
***
Veículo
Figura 17. Tratamentos em diferentes tempos com Ei reduzem o
número de neutrófilos no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os
camundongos BALB/c foram tratados com Ei (100 mg/kg) i.p. nos tempos
indicados, em relação à inalação de LPS. O LBA foi realizado 24 horas
após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5
mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os resultados
foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. *
p<0,05 e *** p<0,001 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo.
56
Veículo
KC (pg/mL)
0
100
200
300
400
500
-1h
+5h
**
Ei 100 mg/kg i.p.
Inalação
de
LPS
Veículo
Inalação
de
salina
Figura 18. Tratamentos em diferentes tempos com Ei reduzem os
níveis KC no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos
BALB/c foram tratados com Ei (100 mg/kg) i.p. nos tempos indicados, em
relação à inalação de LPS. O LBA foi realizado 24 horas após a inalação
de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais
controle inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos
como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
57
4.2. Efeito do tratamento com extrato bruto de Eleusine indica por via oral
na inflamação pulmonar induzida pela inalação de LPS.
A experiência prévia em nosso laboratório mostrou que a injeção
intraperitonial de material contaminado com LPS poderia levar a interpretação
equivocada dos resultados obtidos no modelo de inflamação pulmonar aguda.
Imaginando que outros tipos de irritação peritonial poderiam reduzir o
influxo de neutrófilos para o pulmão, grupos de animais foram tratados com as
doses de 40 e 100 mg/kg i.p. e três horas depois foi coletado o lavado peritonial
para contagem total e diferencial de células. O lavado peritonial dos grupos
tratados com extrato de Ei mostra intenso influxo de neutrófilos em ambas as
doses, com aumentos de 100 e 140 vezes em relação ao controle (dados não
mostrados).
Para eliminar essa possibilidade os animais foram tratados por via oral
(gavagem) com concentrações crescentes de Ei preparada em 0,5 % de
carboximetilcelulose. O número de neutrófilos no LBA 3 horas após a inalação
foi reduzido em cerca de 90% com o tratamento 4 horas antes (Figura 19) e os
níveis de TNF-α (Figura 20), IL-1β (Figura 21) e os de KC (Figura 22) foram
inibidos em cerca de 50%. Os níveis de MCP-1 não apresentaram variação
significativa (Figura 23).
A ativação do fator de transcrição NF-κB, no tecido pulmonar, mostrou
que o tratamento com Ei reduz a sua translocação nuclear (Figura 24).
Com o objetivo de verificar se o tratamento após a inalação de LPS
apresentava efeito semelhante ao tratamento por via intraperitonial, os animais
foram tratados com 500 mg/kg de Ei por via oral 4 horas antes, no momento e
58
4 horas após a inalação de LPS. A avaliação do LBA 24 horas após o LPS
mostrou que o tratamento com extrato de Ei inibe o influxo de neutrófilos,
quando administrado no momento (62%), 4 horas antes (68%) e 4 horas depois
(28%) do estímulo com LPS (Figura 25). Os níveis de KC também
apresentaram redução de 60%, 46% e 33%, respectivamente, sendo que este
último não apresentou significância estatística (Figura 26).
59
0
20
40
60
80
100
120
140
Veículo -1h -4h
EI 500 mg/kg v.o.
Inalação
de
LPS
Neutrófilos (X10
3
/ mL)
**
Veículo
Inalação
de
salina
Figura 19. Tratamento com Ei por via oral reduz o número de
neutrófilos no LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c
foram pré-tratrados com veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o. 1 ou 4 horas antes e
o LBA foi realizado 3 horas após da inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram
aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média ± erro
padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo
LPS pré-tratado com veículo.
60
TNF-
α
(pg/mL)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Veículo
Veículo
Ei 500 mg/kg v.o.
-4h
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
**
Figura 20. Tratamento com Ei v.o. reduz os níveis de TNF-α no LBA após
a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratados com veículo
ou Ei (500 mg/kg) v.o., 4 horas antes e o LBA foi realizado 3 horas após a
inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os
animais controle inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos
como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
61
0
100
200
300
400
500
IL-1
β
(pg/mL)
Veículo
EI 500 mg/kg v.o.
-4h
Veículo
**
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
Figura 21. Tratamento com Ei v.o. reduz os níveis de IL-1β no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratrados
com veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o., 4 horas antes e o LBA foi realizado 3
horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS
(0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo.
62
0
200
400
600
800
1000
1200
SAL
KC (pg/mL)
Veículo
Inalação
de
LPS
Ei 500 mg/kg v.o.
-4h
Inalação
de
salina
*
Figura 22. Tratamento com Ei reduz os níveis KC no LBA 3 horas
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram tratados com Ei
(500 mg/kg) v.o. 4 horas antes e o LBA foi realizado 3 horas após a
inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os
animais controle inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram
expressos como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05
em comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
63
0
5
10
15
20
25
30
35
MCP-1 (pg/mL)
Veículo
EI 500 mg/kg v.o.
-4h
Veículo
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
Figura 23. Tratamento com Ei v.o. não reduz os níveis de MCP-1
no LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
pré-tratados com veículo ou Ei (500 mg/kg) v.o., 4 horas antes e o
LBA foi realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como
média ± erro padrão da média de 5-7 animais.
64
Sal Sal Veic Veic Veic +Ab Ei Ei Ei
Sal
Unidades Arbitrárias
0
50
100
150
200
250
300
350
Veic +Ab Ei
p <0,004 p <0,004
Figura 24. Ativação do NF-kB em animais expostos a aerossóis de LPS e
tratados com E.i.. (A) Gel Ensaio da mudança de mobilidade eletroforética
de extratos nucleares de tecido pulmonar. CTR: animais expostos aos
aerossóis de salina; Veic: animais tratados com veículo e expostos ao LPS;
+Ab: grupo Veic + adição de anticorpo contra a subunidade p65 do NF-kB. Ei:
Animais tratados com Ei (500 mg/kg) v.o. 4 horas antes da inalação de LPS.
Em (B), densitometria do gel apresentado na Figura A. Valores expressos
como média+erro padrão da média. p<0,04 = estatisticamente significante.
A
B
NF-κB
65
0
100
200
300
400
500
Veículo
-4h
0 h
+4 h
Ei 500 mg/kg v.o.
Inalação
de
LPS
Neutrófilos (X10
3
/ mL)
*
***
***
Veículo
Inalação
de
salina
Figura 25. Tratamento com Ei por via oral reduz o número de
neutrófilos no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos
BALB/c foram tratados com Ei (500 mg/kg) v.o. nos tempos indicados, em
relação à inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5
mg/mL). O LBA foi realizado 24 horas após a inalação. Os animais controle
inalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média ±
erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05, *** p<0,001 em comparação
com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
66
Veículo
KC (pg/mL)
0
100
200
300
400
500
0 h
+4 h
*
Ei 500 mg/kg v.o.
Inalação
de
LPS
-4 h
Veículo
Inalação
de
salina
*
Figura 26. Tratamentos em diferentes tempos com Ei v.o. reduzem os
íveis KC no LBA 24 horas após a inalação de LPS. Os camundongos
ALB/c foram tratados com Ei (500 mg/kg) v.o. nos tempos indicados, em
lação à inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5
g/mL). O LBA foi realizado 24 horas após inalação. Os animais controle
nalaram aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média
erro padrão da média de 5-7 animais. ** p<0,01 em comparação com o
po LPS pré-tratado com veículo.
n
B
re
m
i
±
gru
67
4.3. Efeito do tratamento com L-998 por via intraperitonial na inflamação
pulmonar induzida pela inalação de LPS.
Os grupos tratados com o composto L-998 apresentaram uma redução
dose-dependente do número de neutrófilos (Figura 27) e dos níveis de TNF-α
no LBA (Figura 28). Os níveis de IL-1β não apresentaram diferença
estatisticamente significativa.
Para verificar se o efeito do L-998 sobre o recrutamento de neutrófilos
envolvia uma etapa de sinalização anterior ou posterior à liberação de TNF-
α, pelo macrófago alveolar, a inflamação pulmonar aguda foi induzida pela
instilação intranasal (i.n.) de TNF-α murino recombinante (0,5 μg/animal). A
Figura 29 mostra que o grupo pré-tratado com 100 mg/kg de L-998 i.p.
apresentou uma redução de cerca de 90% em relação ao grupo veículo.
68
Figura 27. Tratamento com L-998 i.p. reduz o número de neutrófilos no
LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratados
com veículo ou L-998 (1, 10, 100 mg/kg) i.p. 1 hora antes da inalação de
aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL) e o LBA realizado
3 horas após a inalação. Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em comparação com o grupo LPS
pré-tratado com veículo.
0
50
100
150
200
250
300
Neutrófilos (X 10
3
/mL)
Veículo 110100
L-998 (mg/kg)
Inalação
de
LPS
*
**
**
Inalação
de
salina
Veículo
69
TNF-
α
( pg/mL)
0
500
1000
1500
2000
IL-1
β
(pg/mL)
0
50
100
150
200
250
300
TNF-α
IL-1 β
Veículo
110100
L-998 (mg/kg)
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
Veículo
*
**
***
Figura 28. Tratamento com L-998 i.p. reduz os níveis de TNF-
α
no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratrados
com veículo ou L-998 (1, 10, 100 mg/kg) i.p., 1 hora antes e o LBA foi
realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL
de LPS (0,5 mg/mL). As barras cinza representam os níveis de TNF-
α
e as
barras pretas representam os níveis de IL-1
β
. Os animais controle inalaram
aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média ± erro
padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05, , ** p<0,01 e *** p<0,001 em
comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
70
0
20
40
60
80
14
0
0
0
12
10
Neutrófilos (X 10
3
/mL)
Veículo
L-998
100 mg/kg
TNF i.n.
*
Veículo
Salina i.n.
Figura 29. Tratamento com L-998 i.p. reduz o número de neutrófilos no
LBA 3 horas após a instilação de TNF-
α
i.n. Os camundongos BALB/c
foram pré-tratados com L-998 (100 mg/kg) i.p. 1 hora antes da instilação de
TNF-
α
(0,5 mg/animal) i.n. e o LBA foi realizado 3 horas depois. Os animais
controle receberam instilação de salina i.n. Os resultados foram expressos
como média ± erro padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05 em
comparação com o grupo TNF-
α
pré-tratado com veículo.
71
4.4. Efeito do tratamento com L-998 por via oral na inflamação pulmonar
induzida pela inalação de LPS.
Pelos motivos citados no item tratamento por via oral com extrato bruto
de Eleusine indica, os animais receberam 100 mg/kg de L-998 i.p. O lavado
peritonial 3 horas depois mostrou intenso influxo de neutrófilos com aumento
de150 vezes em relação ao controle (dados não mostrados).
Os animais foram tratados por via oral (gavagem) com L-998 (200
mg/kg) v.o. preparado em 0,5% de carboximetilcelulose. A figura 30 mostra que
o tratamento, 4 horas antes da inalação, reduziu o número de neutrófilos em
cerca de 60% e os níveis de TNF-α em cerca de 25% (Figura 31) no LBA 3
horas após a inalação. Os níveis de KC não mostraram modificação
significativa com o tratamento (Figura 32).
72
0
50
100
150
200
250
300
350
Veículo
Inalação
de
LPS
Neutrófilos (X10
3
/ mL)
Veículo
L-998
200 mg/kg v.o.
-4h
Inalação
de
salina
*
Figura 30. Tratamento com L-998 v.o. reduz o número de neutrófilos no
LBA após inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratados
com L-998 (200 mg/kg) v.o. 4 horas antes da inalação de aerossóis de uma
suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL) e o LBA foi realizado 3 horas após
a inalação. Os animais controle receberam instilação de salina i.n. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. * p<0,05 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
73
Veículo
TNF-
α
(pg/mL)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Veículo
L-998
200 mg/kg v.o.
-4h
**
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
Figura 31. Tratamento com L-998 v.o. reduz os níveis de TNF-
α
no LBA
após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-tratados
com veículo ou L-998 200 mg/kg v.o. 4 horas antes e o LBA foi realizado 3
horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS
(0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. ** p<0,01 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo.
74
0
500
1000
1500
2000
SAL
KC (pg/mL)
Veículo
Inalação
de
LPS
L-998 200 mg/kg v.o.
-4h
Inalação
de
salina
Figura 32. Tratamento com L-998 v.o. não modifica os níveis de KC no
LBA 3 horas após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
pré-tratados com veículo ou L-998 200 mg/kg v.o. 4 horas antes e o LBA foi
realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL
de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais.
75
4.5. Efeito do tratamento com L-541 por via intraperitonial e oral na
inflamação pulmonar induzida pela inalação de LPS.
Nós mostramos em trabalhos anteriores que, compostos desenhados
como híbridos de análogos de talidomida e inibidores de fosfodiesterases,
mostraram uma redução do número de neutrófilos e inibição dos níveis de
TNF-α no LBA (LIMA, 2002 – artigo em anexo). Dentre os integrantes da
família desses compostos, a terceira geração mostrou a maior atividade
antiinflamatória, com destaque para o L-541 e L-542 (LEGORA-MACHADO,
2005 – artigo em anexo) que reduziram o número de neutrófilos em 60% e os
níveis de TNF-α em 50 e 60%, respectivamente.
Para avaliar o efeito do L-541 após o LPS, o tratamento com 10 mg/kg
i.p. foi feito 1 hora antes ou 1 hora depois da inalação de aerossóis de LPS.
Ambos os tratamentos reduziram o número de neutrófilos em cerca de 60%
(Figura 33). Os níveis de TNF-α foram reduzidos em cerca de 20 no pré-
tratamento (dados não mostrados). O tratamento com 10 mg/kg i.p. não
modificou o recrutamento de neutrófilos provocado pela instilação de TNF-α i.n.
(Figura 34).
Para avaliar se administração por via oral apresentava efeito sobre a
inflamação pulmonar aguda, os animais foram tratados com 100 mg/kg v.o. 4
horas antes da inalação de LPS. A análise do LBA mostrou uma redução de
70% no número de neutrófilos (Figura 35) sem modificação dos níveis de TNF-
α (Figura 36).
76
Neutrófilos (X 10
3
/mL)
0
100
200
300
400
500
600
700
Veículo
Veículo -1h
*
**
+1h
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
L-541 10 mg/kg i.p.
Figura 33. Tratamento com L-541 i.p. reduz o número de neutrófilos
no LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram
tratados com L-541 (10 mg/kg) i.p. 1 hora antes ou 1 hora depois da
inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS (0,5 mg/mL) e
o LBA foi realizado 3 horas após a inalação. Os animais controle inalaram
aerossóis de salina. Os resultados foram expressos como média ± erro
padrão da média de 5-7 animais. * p<0,05 e ** p<0,01 em comparação
com o grupo LPS pré-tratado com veículo.
77
Neutrófilos (X 10
3
/mL)
0
20
40
60
80
100
120
140
Veículo
L-541
10 mg/kg i.p.
Instilação
de
TNF-
α i.n.
Veículo
Instilação
de
salina
i.n.
Figura 34. Tratamento com L-541 i.p. não reduz o número de
neutrófilos no LBA 3 horas após a instilação de TNF-
α
i.n. Os
camundongos BALB/c foram pré-tratados com L-541 (10 mg/kg) i.p. 1
hora antes da instilação de TNF-
α
(0,5 mg/animal) i.n. e o LBA foi
realizado 3 horas depois. Os animais controle receberam instilação de
salina i.n. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da
média de 5-7 animais. * p<0,05 em comparação com o grupo TNF-
α
pré-
tratado com veículo.
78
0
100
200
300
400
500
SAL
Neutófilos (X 10
3
/mL)
Veículo
Inalação
de
LPS
L-541 100 mg/kg v.o.
-4h
Inalação
de
salina
*
Figura 35. Tratamento com L-541 v.o. reduz o número de neutrófilos
no LBA após inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratados com L-541 (10 mg/kg) v.o. 4 horas antes e o LBA realizado 3
horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL de LPS
(0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais. * p<0,05 em comparação com o grupo LPS pré-tratado com
veículo.
Neutrófilos (X 10
3
/mL)
79
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Veículo
TNF-
α
(pg/mL)
Veículo
L-541
100 mg/kg v.o.
-4h
Inalação
de
LPS
Inalação
de
salina
Figura 36. Tratamento com L-541 v.o. não reduz os níveis de TNF-
α
no
LBA após a inalação de LPS. Os camundongos BALB/c foram pré-
tratrados com veículo ou L-541 (100 mg/kg) v.o. 4 horas antes e o LBA foi
realizado 3 horas após a inalação de aerossóis de uma suspensão de 2 mL
de LPS (0,5 mg/mL). Os animais controle inalaram aerossóis de salina. Os
resultados foram expressos como média ± erro padrão da média de 5-7
animais.
80
5. CONCLUSÔES
5.1. Eleusine indica
Este estudo mostrou que, no modelo de inalação de LPS, o extrato bruto
da planta Eleusine indica inibe o influxo de neutrófilos no LBA. Análise da fase
precoce (3h) mostrou que a redução do número de neutrófilos é acompanhada
pela queda dos níveis de TNF-α, IL-1β e KC. A inibição do recrutamento de
neutrófilos, no modelo de instilação de TNF-α recombinante, indica que o
extrato interfere em etapas posteriores a sua liberação. A redução da ativação
de NF-κB sugere uma diminuição da resposta do tecido pulmonar e pode ser
uma justificativa para a queda nos níveis de alguns mediadores pró-
inflamatórios.
A análise tardia (24h) mostrou queda nos níveis de KC, que é um
importante quimioatractante de neutrófilos e isso deve contribuir para a redução
do número dessas células. Esses efeitos foram observados tanto no tratamento
anterior quanto no posterior à inalação de LPS por via oral, logo, o uso
profilático ou terapêutico, do extrato da planta mostrou-se capaz de reduzir o
processo inflamatório agudo in vivo e pode aliviar seus sintomas. Isso vai ao
encontro das indicações (pneumonia, bronquite e gripe) preconizadas pelo uso
popular.
A vitexina e o schaftosídeo foram os flavonóides majoritários isolados do
extrato bruto. A vitexina apresentou uma potência cerca de 100 vezes maior e
o schaftosídeo cerca de 50 vezes maior que o extrato bruto na redução do
81
número de neutrófilos (dados do artigo no Anexo I). Esses flavonóides podem
contribuir para o efeito observado no tratamento com o extrato bruto.
5.2. L-998
O uso do L-998 por via i.p., no modelo de inalação de LPS, inibiu o
recrutamento de neutrófilos, reduziu os níveis de TNF-α no LBA. Houve
redução do número de neutrófilos no modelo de instilação de TNF-α
recombinante, indicando que a ação pode ser por inibição da liberação dessa
citocina, mas também em etapas de sinalização posteriores. O tratamento por
via oral mostrou resultados semelhantes e, além disso, foi verificado que os
níveis de KC ficam inalterados. Esses resultados sugerem que o efeito inibitório
do L-998 pode ocorrer em etapas de sinalização posteriores a liberação de KC
como em células alvo da quimiocina ou interferir em etapas da migração como
a expressão de moléculas de adesão.
5.3. L-541
Este estudo mostrou que, no modelo de inalação de LPS, o L-541 inibe o
influxo de neutrófilos no LBA, por via i.p., mas não há inibição no modelo de
instilação de TNF-α recombinante. Isto sugere que o L-541 atua inibindo a
liberação desta citocina pelo macrófago alveolar. Entretanto, o tratamento por
via oral mostrou redução do número de neutrófilos, mas não houve modificação
dos níveis de TNF-α. Neste caso, o mecanismo de ação por via oral pode ser
pelo bloqueio direto da citocina produzida, em etapas de sinalização após a
interação com o receptor ou em etapas da migração.
82
6. DISCUSSÃO
O modelo de inflamação pulmonar aguda por LPS provoca a liberação
de citocinas e um influxo de neutrófilos nos alvéolos, que são características da
LPA e da SARA. A despeito do sucesso em alguns modelos experimentais, os
ensaios clínicos usando corticosteróides, prostaglandinas, óxido nítrico,
cetoconazol, surfactante e N-acetilcisteína não mostraram melhora significativa
na mortalidade de pacientes com essas formas mais graves de inflamação
pulmonar aguda (JAIN; DALNOGARE, 2006). Isto justifica a busca por novos
fármacos que tenham potencial para uso no tratamento clínico de LPA e SARA.
O pré-tratamento com Ei i.p. reduziu de forma dose-dependente o
número de neutrófilos no LBA 3 horas após a inalação de LPS (Figura 1). Os
dois flavonóides majoritários purificados apresentaram, individualmente, uma
potência 100 vezes maior que a do extrato bruto (DE MELO, 2005 – artigo do
Anexo I). Os níveis de TNF-α também apresentaram uma inibição com o pré-
tratamento de Ei (Figura 2). No entanto, análise do LBA 1 hora após a inalação
de LPS, quando estão presentes apenas os macrófagos alveolares, pois não
houve tempo para a chegada de neutrófilos, não mostrou diferença nos níveis
de TNF-α, indicando que não houve interferência na produção e liberação
desta citocina pelos macrófagos alveolares. A diferença observada, na análise
3 horas após a inalação de LPS, pode ser pela produção dessa citocina pelos
neutrófilos que migraram para a luz do alvéolo. Pois, foi demonstrado que os
neutrófilos recrutados contribuem para produção local de TNF-α e KC
(GARCÍA-RAMALLO, 2002). Como o grupo tratado apresenta redução do
número de neutrófilos, a produção de TNF-α também ficaria menor.
83
O TNF-α desempenha um papel importante no recrutamento de
neutrófilos, atuando na liberação de citocinas quimioatractantes e na expressão
de moléculas de adesão. Além disso, sua inibição causa uma redução na
migração de neutrófilos (BEUTLER, 2003).
A análise do LBA 24 horas após a inalação mostrou que a redução do
número de neutrófilos pelo extrato de Ei continua sendo observada com o
tratamento 1 hora antes e também 5 horas após a inalação de LPS. Neste
estágio já existe um intenso influxo de neutrófilos para o alvéolo e os
mediadores que deflagram processo inflamatório, como TNF-α, apresentam
níveis indetectáveis. Logo, a inibição observada deve ser resultado de uma
interferência em mediadores de ação mais prolongada. Um indicativo do
potencial uso terapêutico do extrato de Ei, pois Os níveis da quemocina KC
também apresentaram redução, embora com significância estatística apenas
no pré-tratamento. A KC desempenha um papel central na migração e ativação
de neutrófilos (QUINTON, 2004) e pode ser sintetizada por diferentes células
incluindo os próprios neutrófilos e pneumócitos, mas principal fonte nas fases
iniciais da inflamação são os macrófagos (GARCÍA-RAMALLO, 2002). Sabe-se
que o TNF-α pode induzir a síntese de quimiocinas, mas a participação de
outras citocinas como IL-1β ou IL-6 não pode ser descartada (ROMANO, M.,
1997).
O tratamento com Ei pode estar inibindo a liberação de TNF-α pelos
macrófagos alveolares e os efeitos desencadeados pela sua ação, justificando,
em parte, a redução dos níveis de KC e do número de neutrófilos no LBA.
Como os níveis de TNF-α não são detectáveis no LBA 6 horas
após o LPS, a contribuição de outras citocinas na regulação pode estar sendo
84
alvo de ação do extrato de Ei, como foi observado no tratamento feito 5 horas
após a inalação LPS (Figura 15 e 16).
A experiência prévia em nosso laboratório mostrou que a administração
de algumas substâncias por via intraperitonial, pode induzir a migração de
neutrófilos para esta cavidade e provocar uma redução no influxo para o
alvéolo após a inalação de LPS. Para descartar que os dados obtidos fossem
resultados de um efeito inespecífico, foram feitos tratamentos por via oral.
Considerando que a via oral, geralmente, tem uma período de absorção
mais longo, foram testados diferentes intervalos entre administração e a
inalação de LPS.
Os efeitos do extrato de Ei observados no LBA por v.o. foram
semelhantes aos encontrados por via i.p., tanto na redução de neutrófilos e
TNF-α em 3 horas, quanto na redução de neutrófilos e KC em 24 horas após a
inalação de LPS. Além disso, a ativação de NF-κB mostrou-se reduzida no
tecido pulmonar com o tratamento de neutrófilos no LBA 3 horas após a
inalação foi reduzido em cerca de 90% com o tratamento 4 horas antes (Figura
17) e os níveis de TNF-α foram inibidos aproximadamente em 55% (Figura 18).
A avaliação do LBA 24 horas após o LPS mostrou que o tratamento com
extrato inibe o influxo de neutrófilos quando administrado no momento (62%), 4
horas antes (68%) e 4 horas depois (28%) do estímulo com LPS. Logo, o grupo
tratado 4 horas após o LPS estava sujeito à ação do extrato somente cerca de
8 horas depois da inalação. Portanto, cada grupo estava sujeito à ação do
extrato cerca de 4 horas depois da administração oral.
A p38 MAP cinase surgiu há cerca de uma década como um potencial
alvo para regulação do processo inflamatório e novos inibidores desta enzima
85
estão sendo desenvolvidos e alguns em fase clínica de teste (FIJEN, 2001).
Pela sua importância tanto na regulação da transcrição quanto na estabilização
e meia-vida do transcrito, acredita-se que o efeito clínico final seja superior aos
alvos pesquisados antes.
O composto projetado como inibidor de MAP cinase p38, L-998 na dose
de 200 mg/kg v.o. reduziu o número de neutrófilos em 70% e os níveis de TNF-
α em 20%, indicando que o efeito observado pode ser uma ação combinada de
inibição em diferentes pontos da sinalização. A inibição de 90% no
recrutamento de neutrófilos observada no grupo tratado com 100 mg/kg i.p. no
modelo de inflamação por TNF-α intranasal, corrobora com essa possibilidade.
Além disso, os níveis de KC não foram modificados com o tratamento, portanto
o efeito do L-998 é independente desta quimiocina. Isto sugere uma possível
ação em etapas de interação entre endotélio e neutrófilos, pela modificação de
moléculas de adesão.
Outro alvo também muito estudado em muitos modelos inflamação
pulmonar aguda é a PDE IV (ESSAYAN, 1999). Em um trabalho anterior, nós
utilizamos representante L-596, da família de híbridos de análogos da
talidomida e inibidores de PDE, no modelo de lesão pulmonar aguda por LPS
intratraqueal (ROCCO, 2003 – artigo em anexo). Atualmente a eficácia clínica
dos inibidores de PDE IV permanece incerta.
O composto L-541, projetado como inibidor de PDE e da ação de TNF-α
inibiu o recrutamento de neutrófilos, tanto por via i.p. quanto por v.o., mas os
níveis de TNF-α apresentaram uma redução discreta, no primeiro e nenhuma
redução no segundo caso. Essa diferença pode ser explicada pelo
metabolismo distinto entre as vias de administração. O tratamento por via oral
86
pode originar um metabólito que não apresenta efeito sobre os níveis de TNF-
α, mas com ação em um ponto posterior a sua liberação. O tratamento i.p. com
L-541 não apresentou efeito sobre o número de neutrófilos no modelo de
instilação de TNF-α i.n. Isto reforça a hipótese de que o efeito por via i.p. seja
principalmente devido a uma ação inibitória sobre a liberação de TNF-α.
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100
Design, synthesis and antiinflammatory activity of novel
phthalimide derivatives, structurally related to thalidomide
Alexandre Le
´
gora Machado,
c
Lı
´
dia Moreira Lima,
a,b
Joa˜o Xavier Arau
´
jo-Jr,
a
Carlos Alberto M. Fraga,
a,b
Vera Lu
´
cia Gonc¸alves Koatz
c
and Eliezer J. Barreiro
a,b,
*
a
Laborato
´
rio de Avaliac¸a˜o e Sı
´
ntese de Substa
ˆ
ncias Bioativas (LASSBio), Faculdade de Farma
´
cia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, PO Box 68006, ZIP 21944-971, Rio de Janeiro, ZIP 21940-910, R.J., Brazil
b
Instituto de Quı
´
mica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ZIP 21941-590, Brazil
c
Instituto Bioquı
´
mica Me
´
dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
Received 18 October 2004; revised 26 November 2004; accepted 2 December 2004
Available online 12 January 2005
Abstract—As part of an ongoing effort to develop new thalidomide analogues as antiinflammatory lead-candidates, this paper
describes the synthesis and antiinflammatory activity of novel N-phenyl-phthalimide functionalized derivatives (4a–d, 5a,b, 6a,b).
The target compounds were assayed in an acute lung inflammatory model and all compounds were able to inhibit TNF-a produc-
tion and subsequent neutrophil recruitment in the LPS-acute lung inflammatory model.
Ó 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Thalidomide (1), first synthesized as an antihistaminic
drug in 1954, was introduced as a sedative/hypnotic
drug in 1956 but withdrawn from the market because
of its catastrophic teratogenicity.
1
In the early 1960s, a
new use was found for thalidomide (1) as a sedative in
patients suffering from lepromatous leprosy (erythema
nodosum leprosum, ENL). A rapid and noticeable
improvement of the painful neuritis experienced by these
patients was observed and published by Sheskin in
1965.
2
This activity was a posteriori attributed to a selec-
tive blockade of tumor necrosis factor-a (TNF-a) pro-
duction,
3
suggesting a new use for thalidomide (1)as
antiinflammatory and immunomodulator,
3,4
under re-
stricted conditions.
TNF-a is a cytokine considered to be a primary media-
tor of the inflammatory response.
5
At lung level, it has
been demonstrated that the release of TNF-a favors
the sequestration and migration of neutrophils which
play a critical role in the pathogenesis of lung inflamma-
tion.
6–8
To modulate the over production of TNF-a,
associated to the severity of many pathological pro-
cesses, different strategies has been employed.
9–11
In this
context, new synthetic thalidomide analogues, designed
for keeping its beneficial action and avoiding its side ef-
fects, have been developed. We have described previ-
ously the identification of the prototypes 2 (LASSBio
468) and 3 (LASSBio 595) (Chart 1), designed as hybrid
analogues of thalidomide (1) and aryl-sulfonamide
phosphodiesterase inhibitors, which presented antiin-
flammatory properties acting on TNF-a production.
12
In the present paper, we investigate the antiinflamma-
tory effect of new phthalimide derivatives planned as a
new generation of analogues of the lead-compounds 2
and 3 (Chart 1).
As depicted in Chart 1, compound 4d represents the
interphenylene analogue of 4a–c, which presents a dis-
tinct substituent pattern in the phenyl-phthalimide moi-
ety in comparison with the initial lead compounds 2 and
3, through the introduction of a ortho-phenoxy-ester
motif. In addition, derivative 5b was designed as a hy-
brid of the compounds 4b and 5a, while compound 6b
is also a hybrid analogue planned from the isosteric
leads 2 and 4b.
As outlined in Scheme 1, the key step to prepare our tar-
get molecules (4a–d, 5a and b, 6a and b) involved the
0960-894X/$ - see front matter Ó 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bmcl.2004.12.012
Keywords: Antiinflammatory activity; Phthalimide derivatives; Thali-
domide analogues; Tumor necrosis factor-a; Neutrophils.
*
Corresponding author at present address: Dept. Mediana Legal,
Universidade Federal de Alagoas, ZIP 57072-970, Brazil. Tel./fax:
+55 21 25626644; e-mail: [email protected]
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 1169–1172
easy condensation of phthalic anhydride (7) with the
corresponding functionalized amines at reflux.
13
By
applying this approach, it was possible to obtain the
ortho and meta N-phenyl-phthalimide substituted deriva-
Chart 1.
Scheme 1. Conditions: (a) 2-NH
2
PhOH, AcOH, reflux, 1 h, 91%; (b) EtO
2
CCH
2
Br or MeO
2
CCH(CH
3
)Br or MeO
2
CPhCH
2
Br, K
2
CO
3
, DMF, rt,
72 h, 74–83%; (c) HCl:AcOH (1:1), rt, 1 h, 85%; (d) 2-NH
2
PhCO
2
H, AcOH, reflux, 1 h, 83%; (e) 1-SOCl
2
, DMF (cat.), reflux, 1 h; 2-thiomorpholine,
CH
2
Cl
2
, rt, 1 h, 80% (5a), 85% (6a) and 87% (6b); (f) 6-aminobenzo[d][1,3]dioxole-5-carboxylic acid, AcOH, reflux, 1 h, 80%; (g) ClSO
3
H, 90 °C, 2 h,
89%; (h) thiomorpholine, CH
2
Cl
2
, rt, 2 h, 78%; (i) MeO
2
CCH(CH
3
)Br, K
2
CO
3
, DMF, rt, 72 h, 60%.
1170 A. L. Machado et al. / Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (2005) 1169–1172
tives (8–10) in high yields. With these intermediates in
hands, we accomplished the O-alkylation of compound
8 with the adequately functionalized alkyl bromide,
using K
2
CO
3
in DMF at room temperature, which re-
sulted in the formation of ester derivatives 4a, 4b, and
4d in good yields.
14
Further, the ester 4b was hydrolyzed
by treatment with a mixture of HCl and AcOH (1:1)
15
furnishing compound 4c in 85% yield.
The target amide derivatives 5a,b and 6a were prepared
from functionalized phthalimides 9, 10, and 4c, in excel-
lent yields, using thionyl chloride to convert its carbox-
ylic acid moiety in the corresponding acyl chloride
intermediates, followed by treatment with thiomorpho-
line in dichloromethane at room temperature.
16
Finally,
the synthesis of sulfonamide derivative 6b involved regio-
selective eletrophilic aromatic substitution of phthal-
imide 8, employing chlorosulfonic acid at 60 °C,
obtaining the sulfonylchloride intermediate 11 in 89%
yield, which was next condensed with thiomorpholine
to give 12.
11
O-alkylation of 12 with methyl 2-bromo-
propanoate in the presence of K
2
CO
3
in DMF at room
temperature furnished 6b in 60% yield, as showed in
Scheme 1.
17,18
Groups of seven mice were treated ip with 10 mg/kg of
thalidomide or its analogues (4a and d, 5a and b, 6a
and b) 1 h before inhalation of aerosols of LPS.
12
Treat-
ment with all drugs inhibited both TNF-a and neutro-
phil influx into mouse lungs as showed in Figure 1.
In the series of 2-phenoxy-phthalimide derivatives (4a–
d), the racemate 4b was the most active, inhibiting
60% of TNF-a production and neutrophil influx, similar
to the effect of thalidomide. These results indicate that
the substitution in the ortho position of the phenyl ring
of N-phenyl-phthalimide moiety led to the same inhibi-
tory profile as functionalization in the para position
(e.g., 3).
12
For this reason, in the next step the activity
of the target phthalimide-amides 5a and 5b were evalu-
ated with the purpose of investigating the contribution
of the methylenedioxy subunit in the antiinflammatory
activity. The data obtained showed that these com-
pounds were equipotent to the prototype 3 (LASSBio
595, i.e., 48% inhibition of the neutrophils recruitment
induced by LPS
12
) as inhibitors of the inflammatory re-
sponse. Taken together, these data indicate that the anti-
inflammatory profile is closely dependent of the
substitution pattern in the phenyl ring, considering that
no activity for N-phenyl-phthalimide was found (data
not shown). Furthermore, these data indicate that sub-
stitutions in the positions ortho or para, in the phenyl
ring, for sulfonamide (2), amide, (3,5a,b, ester 4a,b,d),
or either by carboxylic acid (4c) are essential for the
antiinflammatory activity, through the modulation of
the production of TNF-a. To investigate a possible opti-
mization of the antiinflammatory activity of these com-
pounds, a double functionalization in the N-attached
phenyl ring produced the compound 6b (LASSBio
867), designed as an hybrid derivative between 2 (LASS-
Bio 468) and 4b (LASSBio 542). Treatment with 10 mg/
kg of compound 6b 1 h before inhalation of LPS did not
improve the antiinflammatory activity, even considering
the presence of the sulfonamide group in C-3 and the
phenoxy-ester group in C-2 positions.
Our data show, for all the compounds tested, that the
inhibition of TNF-a production was accompanied by a
similar reduction in neutrophil recruitment triggered
by aerosols of LPS into alveolar spaces of mouse lungs.
However, the functionalization in more than one posi-
tion in the phenyl ring of phthalimide system, such as
for 5b and 6b, led to a decrease in the inhibitory effect
on TNF-a levels and neutrophil recruitment.
In conclusion, in an effort to discover new thalidomide
analogues with antiinflammatory activity we were able
to identified novel N-phenyl-phthalimide derivatives
that blocked the inflammatory reaction in mouse lungs
triggered by aerosols of LPS, similar to the prototype
thalidomide.
Acknowledgments
This work was supported by the Brazilian agencies:
CNPq (BR), FAPERJ (BR), PRONEX (E-26/171162/
2003, BR), FUJB (BR), and CAPES (BR).
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Neutrophils (X 10
4
/mL)
TNF-α (pg/mL)
0
5
10
15
20
25
30
0
200
400
600
800
1000
1200
Neutrophils
TNF-
α
5a 5b
4a 4b 4c 4d 6a 6b
V Th
Figure 1. Inhibitory effect of thalidomide and its analogues on TNF-a
production and neutrophil influx into the BALF of mice lungs.
V = vehicle or control; Th = thalidomide.
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17. The analytical results for C, H, N of the compounds 4a–d,
5a,b, and 6a,b were within ±0.4% of calculated
values.
18. Physical and spectroscopic data: Compound 4a: mp: 137–
138 °C;
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) d: 1.15 (t,
J = 7.14 Hz, ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
); 4.15 (q, J = 7.14 Hz,
ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
); 4.62 (s, ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
);
6.97 (dd, J = 8.33 Hz and 1.10 Hz, H3
0
); 7.15 (dt,
J = 7.60 Hz and 7.60 Hz, H5
0
); 7.32 (dd, J = 7.78 Hz and
1.74 Hz, H6
0
); 7.42 (dt, J = 8.30 Hz and 7.51 Hz, H4
0
);
7.78 (m, H5 and H6); 7.95 (m, H4 and H7);
13
C NMR
(50 MHz, CDCl
3
) d: 14.08 (ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
); 61.42
(ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
); 66.50 (ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
);
113.84 (C3
0
); 121.37 (C1
0
); 122.34 (C5
0
); 123.81 (C7
and C4); 130.35 (C4
0
); 130.65 (C6
0
); 132.41 (C7a and
C3a); 134.26 (C6 and C5); 154.08 (C2
0
); 167.33 (C1
and C3); 168.38 (ROCH
2
CO
2
CH
2
CH
3
); Compound
4b: mp: 101–102 °C;
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) d:
1.42 (d, J = 6.80 Hz, ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
); 3.59
(s, ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
); 4.69 (q, J = 6.80 Hz,
ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
); 6.86 (d, J = 8.17 Hz, H3
0
); 7.05
(dt, J = 7.44–7.70 Hz, H5
0
); 7.23 (dd, J = 7.71–1.50 Hz,
H6
0
); 7.32 (dt, J = 8.20–7.48 Hz, H4
0
); 7.72 (m, H5–H6);
7.83 (m; H4–H7);
13
C NMR (50 MHz, CDCl
3
) d: 18.47
(ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
); 52.33 (ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
);
73.99 (ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
); 114.23(C3
0
); 121.42 (C1
0
);
122.08 (C5
0
); 123.59–123.70 (C7–C4); 130.30 (C6
0
); 130.54
(C4
0
); 132.15–132.33 (C3a–C7a); 134.19 (C6–C5); 153.79
(C2
0
); 167.14–167.23 (C1–C3); 171.99 (ROCH(CH
3
)-
CO
2
CH
3
); Compound 4c: mp: 125–126 °C;
1
H NMR
(200 MHz, CDCl
3
) d: 1.56 (d, J = 6.76 Hz, ROCH(CH
3
)-
CO
2
H); 4.94 (q, J = 6.77 Hz, ROCH(CH
3
)CO
2
CH
3
); 5.75
(s, CO
2
H); 7.01 (d, J = 8.20 Hz, H3
0
); 7.16 (dt,
J = 7.53 Hz and 7.58 Hz, H5
0
); 7.35 (d, J = 8.65 Hz,
H6
0
); 7.42 (dt, J = 7.58 Hz and 8.70 Hz, H4
0
); 7.83 (m,
H5 and H6); 7.97 (m, H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d: 18.48 (ROCH(CH
3
)CO
2
H); 73.25
(ROCH(CH
3
)CO
2
H); 113.03 (C3
0
); 120.52 (C1
0
); 122.60
(C5
0
); 124.22 (C7 and C4); 125.92 (C6
0
); 130.83 (C4
0
);
131.98 and 132.03 (C7a and C3a); 134.83 (C6 and C5);
151.92 (C2
0
); 167.11 and 168.24 (C1 and C3); 173.15
(ROCH(CH
3
)CO
2
H); Compound 4d: mp: 165–167 °C;
1
H
NMR (200 MHz, CDCl
3
) d: 3.83 (s; ArCO
2
CH
3
); 5.19 (s,
ROCH
2
Ar); 7.02 (dd, J = 8.30 Hz and 1.18 Hz, H3
0
); 7.12
(dt, J = 7.62 Hz and 7.68 Hz, H5
0
); 7.32 (dd, J = 7.87 Hz
and 1.78 Hz, H6
0
); 7.38 (d, J = 8.13 Hz, H2
00
and H6
00
);
7.39 (m, H4
0
); 7.79 (m, H5 and H6); 7.94 (d, J = 8.00 Hz,
H3
00
and H5
00
); 7.95 (m, H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d: 51.90 (RCO
2
CH
3
); 69.57 (ROCH
2
R); 113.32
(C3
0
); 120.63 (C1
0
); 121.30 (C5
0
); 126.38 (C2
00
and C6
00
);
123.46 (C7 and C4); 129.35 (C4
00
); 129.59 (C3
00
and C5
00
);
129.99 (C4
0
); 130.41 (C6
0
); 131.98 (C7a and C3a); 134.06
(C6 and C5); 141.51 (C1
00
); 153.93 (C2
0
); 166.57
(RCO
2
CH
3
); 167.17 (C1 and C3); Compound 5a: mp:
139–140 °C;
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) d: 2.58 (m,
CH
2
S); 3.73 (m, CH
2
N); 8.13 (d, J = 8.20 Hz, H3
0
); 7.29
(dt, J = 7.78 Hz and 8.70 Hz, H5
0
); 7.45 (d, J = 8.70 Hz,
H6
0
); 7.22 (dt, J = 7.78 Hz and 8.20 Hz, H4
0
); 7.85 (m, H5
and H6); 7.91 (m, H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d: 28.02 (CH
2
S); 28.30 (CH
2
S); 44.99 (CH
2
N);
49.68 (CH
2
N); 129.83 (C3
0
); 141.52 (C1
0
); 131.60 (C5
0
);
123.92 (C7 and C4); 121.89 (C6
0
); 126.88 (C4
0
); 131.98 and
137.03 (C7a and C3a); 134.60 (C6 and C5); 122.83 (C2
0
);
165,61 (ArCONR
2
); 166.85 and 167.94 (C1 and C3);
Compound 5b: mp: 159–160 °C;
1
H NMR (200 MHz,
CDCl
3
) d: 2.53 (m, CH
2
S); 3.70 (m; CH
2
N); 6.01 (s,
OCH
2
O); 6.63 (s, H3
0
); 7.08 (s, H6
0
); 7.86 (m, H5 and H6);
7.89 (m, H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz, CDCl
3
) d: 28.06
(CH
2
S); 29.10 (CH
2
S); 44.50 (CH
2
N); 49.02 (CH
2
N);
100.61 (OCH
2
O); 107.88 (C3
0
); 135.48 (C1
0
); 149.74 (C5
0
);
123.71 (C7 and C4); 104.89 (C6
0
); 148.88 (C4
0
); 131.98 and
137.83 (C7a and C3a); 137.90 (C6 and C5); 119.11 (C2
0
);
164,91 (ArCONR
2
); 166.80 and 166.95 (C1 and C3);
Compound 6a: brownish oil;
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
)
d: 1.51 (d; J = 6.76 Hz, ROCH(CH
3
)CONR); 2.60 (m;
CH
2
S); 3.70 (m; CH
2
N); 4.90 (q, J = 6.77 Hz,
ROCH(CH
3
)CONR); 7.02 (d, J = 8.20 Hz, H3
0
); 7.18
(dt, J = 7.53 Hz and 7.58 Hz, H5
0
); 7.36 (d, J = 8.65 Hz,
H6
0
); 7.44 (dt, J = 7.58 Hz and 8.70 Hz, H4
0
); 7.85 (m; H5
and H6); 7.94 (m; H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d: 18.44 (ROCH(CH
3
)CONR); 27.44 (CH
2
S);
28.31 (CH
2
S); 44.87 (CH
2
N); 48.26 (CH
2
N); 72.85
(ROCH(CH
3
)CONR); 113.01 (C3
0
); 120.55 (C1
0
); 122.70
(C5
0
); 124.45 (C7 and C4); 126.02 (C6
0
); 130.83 (C4
0
);
131.98 and 132.05 (C7a and C3a); 134.61 (C6 and C5);
151.95 (C2
0
); 166,28 (ArOCH(CH
3
)CONR); 167.15 and
168.21 (C1 and C3); Compound 6b: brownish oil;
1
H
NMR (200 MHz, CDCl
3
) d: 1.53 (d, J = 6.70 Hz,
ROCH(CH
3
)CONR); 2.77 (m, CH
2
S); 2.81 (m, CH
2
S);
3.68 (m, CH
2
N); 3.90 (m, CH
2
N); 4.88 (q, J = 6.70 Hz,
ROCH(CH
3
)CONR); 7.09 (d, J = 8.10 Hz, H3
0
); 8.08 (s,
H6
0
); 8.12 (d, J = 8.10 Hz, H4
0
); 7.93 (m, H5 and H6); 7.97
(m, H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz, CDCl
3
) d: 19.40
(ROCH(CH
3
)CONR); 27.40 (CH
2
S); 27.45 (CH
2
S); 27.85
(CH
2
S); 28.05 (CH
2
S); 44.85 (CH
2
N); 48.26 (CH
2
N);
50.81(CH
2
N); 51.05 (CH
2
N); 73.01 (ROCH(CH
3
)CONR);
115.43 (C3
0
); 131.12 (C1
0
); 139.60 (C5
0
); 124.72 (C7 and
C4); 115.95 (C6
0
); 126.77 (C4
0
); 131.98 and 134.53 (C7a
and C3a); 134.60 (C6 and C5); 154.10 (C2
0
);
168.01(ArOCH(CH
3
)CONR); 167.11 and 167.23 (C1 and
C3).
1172 A. L. Machado et al. / Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (2005) 1169–1172
Inhibition of interleukin-1h reduces mouse lung inflammation
induced by exposure to cigarette smoke
Paulo Castro
a
, Alexandre Legora-Machado
a
, Larissa Cardilo-Reis
a
, Samuel Valenc¸a
b
,
Luis Cristo´va˜o Porto
b
, Christoph Walker
c
, Claudia Zuany-Amorim
d
,
Vera Lucia Gonc¸alves Koatz
a,
*
a
Departamento de Bioquı´mica Me´dica, ICB, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil
b
Depto de Embriologia e Histologia, UERJ, Rio de Janeiro, Brazil
c
Novartis Research Centre, Horsham, England, United Kingdom
d
Aventis Pharma, Vitry-sur-Seine, France
Received in revised form 1 July 2004; accepted 6 July 2004
Available online 20 August 2004
Abstract
We examined nuclear factor nB activation, release of inflammatory mediators and cellular infiltration in acute cigarette smoke
inflammation models. One hour after exposure to one puff of cigarette smoke, alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage (BAL)
fluid of C57BL/6J mice showed an increased activity of nuclear factor nB-DNA binding but similar numbers as compared to that of BAL
fluid from mice exposed to ambient air. Exposure to 1 cigarette/day for 1, 4 or 7 days led to an increase in interleukin-1h and monocyte
chemoattractant protein-1 levels and to a progressive influx of nuclear factor nB-activated alveolar macrophages into the BAL fluid and lung
tissue. Exposure to 2 cigarettes/day for 7 days led to a significant increase in interleukin-1h levels accompanied by a massive alveolar
macrophage influx into the BAL fluid. Tumor necrosis factor-a levels and subsequent neutrophil influx were only detected after exposure to
4 or 8 cigarettes/day for 7 days. Treatment of mice with an antibody anti-interleukin-1h during cigarette smoke exposure for 7 days
significantly reduced both interleukin-1h levels and alveolar macrophage influx. These data show that a single exposure to cigarette smoke
rapidly activates alveolar macrophages, inducing the production of interleukin-1h, which may play an important role in triggering chronic
cigarette smoke-mediated lung inflammation.
D 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Cigarette smoke; Lung, mouse; Inflammation
1. Introduction
The reduced capacity of people work during their pro-
ductive life has transformed cigarette smoking into a world-
wide public health problem. Cigarette smoke-related disorders
are close ly associ ated with vascular alterations in coronary
arteries, suppression of gastric wound repair and reduction
of lung resp iratory capacity (Shah and Helfant, 1988;
Sherman, 1991; Shin et al., 2002; Gajalakshmi et al., 2003).
Cigarette smoke is a complex mixture of over 4700
components (Rahman and MacNee, 1996) and contains high
concentrations of active oxygen species in the gas phase and
tar (Pryor et al., 1983; Repine et al., 1997). Free radicals
activate the transcription of nuclear factor nB, which in turn
leads to the expression of many genes encoding mediators
of the inflammatory process, such as interleukins and
chemokines (Baldwin, 1996; Blackwell and Christman,
1997). Analysis of samples from cigarette smokers showed
that peripheral blood monocytes had high nuclear factor nB
activation (Van den Berg et al., 2001) and altered levels of
tumor nec rosis factor-a,interleukins1h,6and8in
bronchoalveolar lavage (BAL) fluids (McCrea et al., 1994;
Ryder et al., 2002). Cigarette smoke has been correlated
with an increased susceptibility to respiratory infections, the
mechanisms of which are not completely understood. The
0014-2999/$ - see front matter D 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.ejphar.2004.07.047
* Corresponding author. Tel.: +55 21 2562 6758; fax: +55 21 2270 8647.
E-mail address: [email protected] (V.L.G. Koatz).
European Journal of Pharmacology 498 (2004) 279 – 286
www.elsevier.com/locate/ejphar
strategic position of alveolar macrophages in the air-tissue
interface indicates that these cells are involved in the control
of the pulmonary responses to injurious processes (Sibille
and Reynolds, 1990; Goncalves-de-Moraes et al., 1998).
Analysis of alveolar macrophages from cigarette smokers
demonstrated a number of morphological and functional
alterations (Harris et al., 1970; Hoidal and Niewoehner,
1982), suggesting that the continual exposure to cigarette
smoke may stimulate these cells to work abnorm ally, con-
tributing to the development of pulmonary chronic diseases.
Once activated, alveolar macrophages can release different
inflammatory mediators into the lung environment, such as
interleukin-1h (Friedlander et al., 1994). This cytokine is a
potent inflammatory mediator, stimulating chemokine pro-
duction, recruiting leukocytes to the site of injury and
inducing the synthesis of tumor necrosis factor-a and
interleukin-6 (Barnes and Page, 1998; Hashimoto et al.,
2000). Interleukin-1h up-regulates metalloproteinases
(Sasaki et al., 2000) and fibroblast proliferation (Dinarello
et al., 1989; Raines et al., 1989 ), features that are closely
associated with the chronic inflammation and structural
changes observed in the lungs of patients (Sa saki et al.,
2000).
Chronic lung inflammation may be triggered by the first
exposure to cigarette smoke. To test this hypothesis, we
examined the effect of a short-term exposure to cigarette
smoke on nuclear factor nB-DNA binding, production of
mediators and cellular infi ltration into the lungs. Further-
more, we investigated the effect of treatment with a
neutralizing antibody anti -interleukin-1h on the cigarette
smoke-induced lung inflammation in mice.
2. Material and methods
2.1. Animals
C57BL/6J or DBA-2 male mice (20–25 g; FIOCRUZ,
Rio de Janei ro, Brazil) were put in the smoking chamber,
consisting of conic tubes attached to a glass chamber of 1 l.
The tubes are opened to allow the muzzles to be in contact
with the interior of the chamber. Through a tube adapte d to
the upper part of the chamber, a volume of 100 ml of
cigarette smoke corresponding to one puff is drawn from a
commercial filtered cigarette with a syringe and injected
into the chamber. Mice were exposed for 60 s to cigarette
smoke and then the chamber was opened to permit
exchange with ambient air, for 60 s. This procedure was
repeated according to the cigarette smoke exposure regimen
used. All the procedures involving animals were done in
accordance with international guidelines.
2.2. Cigarette smoke exposure
In a set of experiments, groups of seven mice were
exposed to one puff of cigarette smoke and BAL fluid was
collected 1 h after the exposure. Control mice were exposed
to ambient air. In another set of experiments, mice were
exposed to the smoke from one, two, four or eight cigarettes
daily, receiving puffs in the morning and in the afternoon for
1, 4 or 7 days. Twenty-four hours after the last cigarette
smoke exposure, BAL fluid was collected.
2.3. BAL fluid
At the indicated time points, animals were terminally
anesthetized with pentobarbital sodium (60 mg/kg i.p.).
Tracheas were cannulated and BAL fluid was obtained by
injecting buffered saline (PBS) three consecutive times to a
final volume of 1.5 ml. The fluid was withdrawn and stored
on ice. Total cell number was determined in a Zi Coulter
(Beckman Coulter, USA). Differential cell counts were
performed on cytospin preparations (Shandon, USA) stained
with Diff-Quik (Baxter Dade, Dudingen, Switzerland). At
least 200 cells/BAL fluid were counted, using standard
morphological criteria. Results are expressed as number of
cell populations per milliliter. The remaining BAL fluid was
centrifuged (400
Â
g for 10 min) and the supernatant was
collected and stored at À20 8C for interleukin-1h, tumor
necrosis factor-a and monocyte chemoattractant protein-1
assays. For the nuclear factor nB assay, alveolar macro-
phages were separated and nuclear extracts were prepared
immediately.
2.4. Quantification of lung tissue macrophages
For histopathological studies of lung tissue, mice were
exposed to 1 cigarette/day or to ambient air for 1, 4 and 7
days. Twenty-four hours after the last exposure, mice were
anesthetized with pentobarbital sodium (60 mg/kg i.p.) and
exsanguinated. Lungs were distented with 10% phosphate-
buffered formalin (pH 7.4) at a constant pressure of 2.45
kPa. Both the main bronchi and the parenchyma of the right
caudal lobe were dissected out and embedded in paraffin for
24 h. Sections (5 Am thick) were cut from each sample.
Histopathological assessment by light microscopy was
performed in a blind fashion using randomized sections.
Macrophages were counted in Giemsa-stained sections, in
30 fields of 26,000 Am
2
(10 random fields in 3 different
sections-30 Am apart) in each lung, under 40
Â
magnifica-
tion, using an Olympus BH-2 microscope equipped with an
eyepiece in a graticule .
2.5. Electrophoretic mobility shift assay
Nuclear extracts from alveolar macropha ges and the
electrophoretic mobility shift assay were performed as
described by Munoz et al. (1994). As exposure to smoke
from one or two cigarettes yielded to 97–100% of alveolar
macrophages in BAL fluid, we prepared nuclear extracts
without any further purification (i.e., separation from
neutrophils). Nuclear extracts from culture cells 70Z/3
P. Castro et al. / European Journal of Pharmacology 498 (2004) 279–286280
stimulated with 15 Ag/ml lipopolysaccharide (E. coli serotype
055:B5—Sigma, Chemical Co. USA) for 1 h were used as a
positive control (Sen and Baltimore, 1986). The binding
reaction between nuclear factor nB consensus sequence 5V
AGTTTGATGAGTCAGCCG 3Vand 3VCGGCTGACTCAT-
CAAACT 5Vwith nuclear protein (4 Ag) was performed in a
final volume of 10 Al in 8 mM HEPES, 10% glycerol, 20 mM
KCl, 4 mM MgCl
2
,1.0Ag polydl-dC (pH 7.0). The
oligonucleotides (DNAgency, NY, USA) were 5V-end labeled
with T4 polynucleotide kinase and [g-
32
P]dATP (N5000 Ci/
mmol; Amersham International Biosciences, England) and
50,000 cpm of relevant double-stranded oligonucleotides
were used per reaction. Bindin g was allowed to proceed for
30 min at room temperature. The complexes were separated
by gel eletrophoresis on a 6% polyacrylamide gel with 0.5
Â
Tris buffer pH 7.0 containing borate and EDTA (TBE) at 180
V for 2 h at room temperature. Specificity was determined by
addition of 50-fold excess unlabeled oligonucleotide. The
gels were then dried and quantification was achieved on
phosphorimager (Molecular Dynamics).
2.6. Cytokines
All of the cytokines in supernatant from BAL fluid were
quantified with a specific enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA), using rat anti-mouse monoclonal and
polyclonal antibodies, with a detection limit of 10 pg/ml,
according to manufacturer’s instructions (R&D Systems,
UK). Mouse recombinant cytokine standards were used in
every assay.
2.7. Anti-interleukin-1b treatment
Mice were exposed to ambient air or to 1 cigarette/day
for 7 days, as described above. On days 0, 4 and 7, animals
received intravenously (i.v.) 5 or 20 Ag IgG goat anti-mouse
interleukin-1h antibody, or its matched isotype control
(R&D Systems, UK) or saline. BAL fluid was collected
24 h after the last exposure and used for cellular analysis
and cytokine determination.
2.8. Statistical analysis
Comparisons were made by analysis of variance
(ANOVA). Post-hoc tests, Dunnett’s T3 and Tukey, were
also used to identify differences between values. Results are
expressed as meansFS.E.M. and values of Pb0.05 were
considered statistically significant.
3. Results
3.1. Cigarette smoke-induced cellular infiltration
In a first set of experiments, the ability of cigarette
smoke to induce lung inflammation was investigated in
C57BI/6J mice, after 1 or 7 days of exposure. As shown in
Fig. 1A, exposure to cigarette smoke from 1 cigarette/day
induced a time-dependent influx of alveolar macrophages
into the BAL fluid of C57BI/6J mice when compared with
that of control animals. The number of alveolar macro-
phages was elevated in BAL fluid already 1 day after
exposure to cigarette smoke. Even higher numbers of
alveolar macrophages were found after 7 days of cigarette
smoke exposure. The number of alveolar macrophages in
control mice was similar after 1 or 7 days of exposure to
ambient air and for this reason the value obtained after 7
days was used as control. Similar to the finding in BAL
fluid, a significant incre ase in the numbe r of alveolar
macrophages was also found in the pulmonary tissue from
C57Bl/6J mice, 7 days after cigarette smoke exposur e (Fig.
1B). The effect of cigarette smoke in another mouse strain
(DBA-2) was also investigated. In this case, however,
exposure to smoke from one cigarette for 7, 30 or 60 days
did not change the number of alveolar macrophages in
BAL fluid compared with those of mice exposed to
ambient air (data not shown). With respect to the neu-
trophil accumulation, our data showed no significant
increase in the number of neutrophils in BAL fluid or
lung following exposure to cigarette smoke over the entire
duration of the experiment. To investigate if the absence of
neutrophils was due to the amount of cigarette smoke
used, C57Bl/6J mice were exposed daily to 1, 2, 4 or 8
cigarettes/day, for 7 days. As shown in Fig. 2, exposure to
2 cigarettes/day led to a massive influx of macrophages
into the lungs, detected in the BAL fluid that was
accompanied by a discrete increase in lymphocyte num-
Fig. 1. Alveolar macrophage recruitment into the BAL fluid and lung tissue
after cigarette smoke exposure-C57BI/6J mice (n=7) were daily exposed to
ambient air (AA) or to smoke from one commercial filtered cigarette for 1 or 7
consecutive days. (A) BAL fluids were collected 24 h after the last exposure;
(B) lungs of C57BI/6J were removed 24 h after the last exposure to ambient
air or cigarette smoke, and alveolar macrophages were counted as described
in Section 2. Control values were taken from the group exposed to ambient
air for 7 days. Data are expressed as meansFS.E.M.
P. Castro et al. / European Journal of Pharmacology 498 (2004) 279–286 281
bers. Neutrophils were largely recruited after exposure to 4
or 8 cigarettes/day.
3.2. Cigarette smoke-induced nuclear factor jB-DNA bind-
ing activity
To investigate if cigarette smoke could activate alveolar
macrophages after the first exposure, mice were exposed to
one puff of cigarette smoke and BAL fluid was analyzed 1 h
after exposure. Similar numbers of alveolar macrophages
were found in cigarette smoke-exposed mice and control
animals; however, the nuclear factor nB mobility shift assay
on nuclear extracts clearly showed that a single exposure to
cigarette smoke was enough to acti vate nuclear factor nB-
DNA binding in alveolar macrophages (Fig. 3). A similar
activation of nuclear factor nB was found in infiltrating
alveolar macrophages obtained 24 h after exposure to 1 and
2 cigarettes/day over 7 days.
3.3. Cigarette smoke-induced production of inflammatory
mediators
The observed c igarette smoke-induced activation of
nuclear factor nB could lead to the release of inflammatory
mediators, which in turn could induce the influx of alveolar
macrophages into pulmonary tissue. The alveolar macro-
phage-derived cytokines, interleukin-1h and tumor necrosis
factor-a, and the chemokine monocyte chemoattra ctant
protein-1 were analyzed in the BAL fluid of mice exposed
to 1 cigar ette/day for 1, 4 or 7 days. As shown in Fig. 4,a
time-dependent and significant increase in the levels of both
interleukin-1h and monocyte chemoattractant protein-1 was
Fig. 3. Electrophoretic mobility shift assay showing the effect of cigarette smoke on nuclear factor nB activation in alveolar macrophages from C57BI/6J
mice-Figure shows: on the left side the negative (nuclear extract-free nuclear factor nB probe without protein extracts and after cold competition) and the
positive control with nuclear factor nB-DNA binding from 70Z/3 cells after incubation with 15 Ag/ml lipopolysaccharide for 1 h (see Section 2); in the
middle, nuclear factor nB DNA-binding in nuclear extracts of alveolar macrophages 1 h after a single exposure to one puff of cigarette smoke and, on the right
side, binding after exposure to 1 or 2 cigarettes/day over 7 days. The results are representative of two independent experiments.
Fig. 4. Increased levels of interleukin-1h and monocyte chemoattractant
protein-1 levels in the protein-1 in the BAL fluid of C57BI/6J after cigarette
smoke exposure-C57BI/6J mice (n=7) were daily exposed to ambient air
(AA) or to smoke from one commercial filtered cigarette. Interleukin-1h
(A) and monocyte chemoattractant protein-1 (B) were measured by specific
ELISA assay as described in Section 2. Control values were taken from
the group exposed to ambient air for 7 days. Data are expressed as
meansFS.E.M.
Fig. 2. Cellular influx into the BAL fluid of C57BI/6J mice after exposure
to increasing amounts of cigarette smoke—groups of seven C57BI/6J mice
were daily exposed to ambient air (AA) or to smoke from one, two, four or
eight cigarettes for 7 consecutive days. BAL fluids were collected 24 h after
the last exposure. At least 200 cells/BAL fluid were counted, using standard
morphological criteria. The number of each cell population per milliliter is
expressed as meansFS.E.M.
P. Castro et al. / European Journal of Pharmacology 498 (2004) 279–286282
found in cigarette smoke-exposed animals compared to mice
exposed to ambient air. Control values were similar after 1,
4 or 7 days of exposure to ambient air and for this reason
values from 7 days were used as control. The observation
that tumor necrosis factor-a was not detectable after
exposure to 1 cigarette/day led us to investigate this
cytokine in the BAL fluid of mice exposed to higher
amounts of cigarette smoke. Fig. 5 shows that levels of
tumor necrosis facto r-a increased when mice were exposed
to smoke from four or eight cigarettes, concomitant with the
influx of neutrophils into the BAL fluid (Fig. 2).
3.4. Inhibition of alveolar macrophage influx and interleu-
kin-1b production by treatment with anti-interleukin-1b
antibody
To further investigate the potential role of interleukin-1h
in regulating the influx of alveolar macrophages, cigarette
smoke-exposed mice were treated with 5 or 20 Ag
immunoglobulin G goat anti-mouse interleukin-1h anti-
bodies on days 0, 4 and 7. Control groups received isotonic
saline or 20 Ag isotype control antibody. As shown in Fig. 6,
the exposure of mice to 1 cigarette/day over 7 days induced
significant increases in alveolar macrophage numbers and
interleukin-1h levels in the BAL fluid that were signifi-
cantly blocked by treatment with anti-interleukin-1h anti-
body. Analysis of lung homogenates also showed a
reduction in interleukin-1h levels from 225.6F22.1 pg/ml
in mice exposed to cigarette smoke (saline- or isotype-
treated) to 146.5F16.7 and 110.4F14 pg/ml after treatment
with 5 and 20 Ag anti-interleukin-1h antibody, respectively.
4. Discussion
In this study, we have shown that murine alveolar
macrophages are rapidly activated following the first contact
with cigarette smoke and that the inflammatory reaction
triggered by cigarette smoke is dependent on interleukin-1h
synthesis.
The data presented in this study show that C57Bl/6J mice
reacted to small amounts of cigarette smoke soon after
exposure. The susceptibility to inflammatory agents is
associated with the cytokine profile produced in different
mouse strains, as well as the sensitivity to oxidants and to
anti-elastase activity (Gardi et al., 1994; Morokata et al.,
1999; Leikauf et al., 2002). This could explain the different
chronic inflammatory responses seen in DBA-2 and C57Bl/
6J mice. Howeve r, DBA-2 and C57Bl/6J mice develop a
similar pattern of lung alterations after 7 months of exposure
to 3 cigarettes/day (Cavarra et al., 2001), suggesting that the
induction of airway inflammation and the development of
emphysema in different mouse strains may be time- and
cigarette smoke-exposure dependent. Different responses to
Fig. 5. Dose-dependent levels of interleukin-1h and tumor necrosis factor-a
in the BAL fluid of C57BI/6J after exposure to increasing amounts of
cigarette smoke—groups of seven C57BI/6J mice were daily exposed to
ambient air (AA) or to smoke from 1, 2, 4 or 8 cigarettes/day for 7
consecutive days. BAL fluids were collected 24 h after the last exposure.
Interleukin-1h (IL-1h—5) and tumor necrosis factor-a (TNF-a—5) were
measured by specific ELISA assay as described in Section 2. Data are
expressed as meansFS.E.M.
Fig. 6. Anti-interleukin-1h treatment reduces alveolar macrophage recruit-
ment and interleukin-1h production induced by cigarette smoke exposure.
C57BI/6J mice (n=7) were daily exposed to ambient air (AA) or to smoke
from one commercial filtered cigarette for 7 consecutive days. On days 0, 4
and 7, animals received i.v. 5 or 20 Ag IgG goat anti-mouse interleukin-1h
antibody, or 20 Ag of its matched isotype control (I) or saline (S). BAL fluid
was collected 24 h after the last exposure and used for cell analysis and
cytokine determination. Alveolar macrophages (A) and interleukin-1h (IL-
1h) levels (B) were determined as described in Section 2. Control values
were taken from the group exposed to ambient air for 7 days. Data are
expressed as meansFS.E.M.
P. Castro et al. / European Journal of Pharmacology 498 (2004) 279–286 283
cigarette smoke are also found among smokers (Gaja-
lakshmi et al., 2003), and there is a clear relationship
between the smoking habit and mortality due to respiratory
diseases. However, why only 18–20% of smok ers develop
emphysema, which leads to chronic obstructive pulmonary
disease (Sherman, 1991; Repine et al., 1997), remains to be
elucidated.
Multiple studies indicate that repeated exposure to
cigarette smoke may induce prolonged airway inflammation
associated with cellular infiltration of macrophages (Harris et
al., 1970; McCrea et al., 1994; Hautamaki et al., 1997; Ofulue
et al., 1998; Ofulue and Ko, 1999), neutrophils (Dahmi et al.,
2000; Churg et al., 2002) or eosinophils (Matsumoto et al.,
1998). However, until now, the effector cell and the
mechanism responsible for the inflammation have not been
completely elucidated.
The dose-d ependent massive influx of alveolar macro-
phages observed in our study could therefore be an essential
trigger to the inflammatory process in smokers, and macro-
phage influx has indeed been correlated to the development
of emphysema in animal model s (Hautamaki et al., 1997;
Ofulue et al., 1998; Ofulue and Ko, 1999). We were thus
very interested to investigate whether a single exposure to
cigarette smoke led to activation of alveolar macrophages
with a subsequent release of pro-inflammatory cytokines. In
this respect, activation of nuclear factor nB, a pivotal
transcription factor in chronic inflammatory diseases (Barnes
and Karin, 1997), is known to be intimately involved in the
expression of different inflammatory mediators (Baldwin,
1996; Blackwell and Chr istman, 1997) associated with the
induction of inflammatory responses in the airways. By
using a specific DNA probe, we could indeed demonstrate a
rapid activation of nuclear factor nB in macrophages 1 h after
a single exposure to cigarette smoke, which was still detected
after 7 days of daily exposure to increasing amounts of
cigarette smoke. Similar results were obtained in studies
showing that cigarette smoke rap idly up-regulates the
expression of genes for mediators important to the pulmo-
nary vascul ature (Wright et al., 2002). Nuclear factor nB
activation was also observed in mice or guinea pigs exposed
to higher doses of cigarette smoke (Nishikawa et al., 1999;
Churg et al., 2003). In the latter study, the effect was
associated with presence of superoxide, the main reactive
oxygen species present in cigarette smoke. Previous studies
have demonstrated that activation of nuclear factor nB can be
stimulated by oxygen radicals found in cigarette smoke
(Pryor et al., 1983; Rahman and MacNee, 1996 ). Moreover,
in peripheral blood mononuclear cells from healthy smokers,
the activation of nuclear factor nB by cigarette smoke was
suggested as a functional marker of oxidative stress (Van den
Berg et al., 2001).
Interestingly, despite the significant activation of nuclear
factor nB, not all cytokines known to be regulated by this
transcription factor were found in measurable amounts in
BAL fluid of mice exposed to cigarette smoke for 1 or 2
cigarettes/day. Our data show that exposure to cigarette
smoke led to interleukin-1h and monocyte chemoattractant
protein-1 production accompanied by alveolar macrophage
influx, but did not lead to an increase in tumor necrosis
factor-a levels, which may also explain the absence of
neutrophils in the lungs of cigarette smoke-exposed animals.
In a murine model using aerosols of lipopolysaccharide, we
previously demonstrated (Goncalves-de-Moraes et al.,
1998) the close interrelationship between production of
tumor necrosis factor-a and neutrophil infiltration, showing
that the blockage of tumor necrosis factor-a expression
impaired neutrophil recruitment induced by lipopolysac-
charide. In accordance with these findings, significant
increases in tumor necrosis factor-a production with a
parallel increase in neutrophil were only found after
exposure to 4 and 8 cigarettes/day for 7 days. The influx
of mononuclear or polymorphonuclear cells driven by cyto-
kines, depending on the number of cigarettes bsmokedQ,
may explain the discrepancy observed in the literature. Our
data also demonstrated that exposure to smoke from four
commercial cigarettes for 1 day did not induce neutrophil
influx observed after 4 days (data not shown), indicating
that differences in cellular influx are also time dependent. A
possible explanation for this may be an increase or
persistence of toxic substances presen t in cigarette smoke,
such as superoxide, in contact with lung parenchyma. The
findings suggest that exposure to cigarette smoke activates
nuclear factor nB, leading to the synthesis and release of
interleukin-1h, which in turn stimulates the synthesis of
tumor necrosis factor-a, as discussed in Barnes and Page
(1998).
The finding of a parallel increase in interleukin-1h levels
and alveolar macrophage infiltration in response to cigarette
smoke was of particular interest as interleukin-1h exerts
multiple functions which might be associated with the
characteristic pathological changes in the airways of patients
with chronic obstructive pulmonary diseases and emphy-
sema. For example, in chroni c lung inflammation, like that
produced by cigarette smoke, there is tissue damage and
subsequent fibrosis that may be associated with the up-
regulation of macrophage metalloelastases known to be
induced by interleukin-1h (Sasaki et al., 2000). Recentl y, it
was suggested that the involvement of metalloelastases in
cigarette smoke-induced lung inflammation (Churg et al.,
2003) is mediated by the release of tumor necrosis factor-a
from macrophages with subsequent neutrophil influx, which
would partly explain why the release of interleukin-1h pre-
cedes that of tumor necrosis factor-a. Moreover, interleukin-
1h mediates leukocyte extravasation through the up-
regulation of adhesion molecules on both endothelial and
respiratory epithelial cells (Bochner et al., 1991), as well as
affecting the proliferation of fibroblasts through the pro-
duction of platelet-derived growth factor (Raines et al.,
1989), and the extracellular matrix components fibronectin
and collagen (Dinarello et al., 1989). These effects are
consistent with the role of interleukin-1h as an early,
proximal mediator of the inflammatory response. Therefore,
P. Castro et al. / European Journal of Pharmacology 498 (2004) 279–286284
inhibition of the synthesis of interleukin-1h or blocking the
bioactivity of this cytokine is expected to have a broad
spectrum of anti-inflammatory effects in the lung and to
have an impact on the remodeling processes associated with
long-term chronic lung injury. None of the currently used
animal models replicates all of the pathological effects of
chronic obstructive pulmonary disease; however, cigarette
smoke exposure in a variety of experimental animals
induces at least some changes in the lung that are similar
in humans and animals species (Rylander, 1972; Cavarra et
al., 2001; Churg et al., 2003). Our results showing that
neutralizing interleukin-1h resulted in reduced macrophage
infiltration in response to exposure of mice to cigarette
smoke are in line with this hypothesis and suggest that
strategies to inhibit interleukin-1h may have therapeutic
benefit in chronic pulmonary diseases.
Acknowledgments
We are in debt with Dr. Ronir R. Luiz and Dr. F.
Rumjanek’s research group for their helpful assistance. This
work was supported by Brazilian agencies: CNPq, CAPES,
FUJB and FAPERJ.
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Therapeutic potential of a new phosphodiesterase inhibitor in
acute lung injury
P.R.M. Rocco
*
, D.P. Momesso
*
, R.C. Figueira
*
, H.C. Ferreira
*
, R.A. Cadete
*
,A.Le´gora-Machado
#
,
V.L.G. Koatz
#
, L.M. Lima
}
, E.J. Barreiro
}
, W.A. Zin
*
Therapeutic potential of a new phosphodiesterase inhibitor in acute lung injury.
P.R.M. Rocco, D.P. Momesso, R.C. Figueira, H.C. Ferreira, R.A. Cadete, A. Le´gora-
Machado, V.L.G. Koatz, L.M. Lima, E.J. Barreiro, W.A. Zin. #ERS Journals Ltd
2003.
ABSTRACT: The effects of LASSBio596, a phosphodiesterase type-4 and -5 inhibitor,
were tested in Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury.
Twenty-four BALB/c mice were randomly divided into four groups. In the control
group, saline (0.05 mL) was injected intratracheally (i.t.). The LPS group received LPS
(10 mg i.t., 0.05 mL). In the LASSBio596 groups, LASSBio596 (10 mg?kg
-1
, 0.2 mL)
was injected intraperitoneally 1 h before or 6 h after LPS administration. After 24 h,
in vivo (lung resistive and viscoelastic pressures, and static and dynamic elastances) and
in vitro (tissue resistance, elastance and hysteresivity) pulmonary mechanics, lung
morphometry and collagenous fibre content were computed. Neutrophils and tumour
necrosis factor (TNF)-a levels were evaluated in the bronchoalveolar lavage fluid.
LASSBio596 prevented the changes in lung mechanics, and inhibited neutrophilic
recruitment, TNF-a release, bronchoconstriction, alveolar collapse and the increment of
collagen fibre content induced by LPS, independently of the moment of injection.
In conclusion, LASSBio596 modulated the lung inflammatory process and had the
potential to block fibroproliferation. Thus, agents that inhibit phosphodiesterase 4 and 5
simultaneously may be a useful adjunct therapy for acute lung injury.
Eur Respir J 2003; 22: 20–27.
*Laboratory of Respiration Physiology,
Carlos Chagas Filho Biophysics Institute,
#
Dept of Medical Biochemistry and
}
Labor-
ato´ rio de Avaliac¸a˜o e Sı´ntese de Substaˆncias
Bioativas (LASSBio), Federal University of
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil.
Correspondence: W.A. Zin, Universidade Fede-
ral do Rio de Janeiro, Instituto de Biofı´sica
Carlos Chagas Filho - C.C.S., Laborato´ rio
de Fisiologia da Respirac¸a˜o Ilha do Funda˜o,
21949-900 - Rio de Janeiro, Brazil.
Fax: 55 2122808193
E-mail: [email protected]
Keywords: Inflammation, lung morphome-
try, phosphodiesterase inhibitor, respiratory
mechanics
Received: November 26 2002
Accepted after revision: March 16 2003
This study was supported by the Centres of
Excellence Programme (PRONEX-MCT),
Brazilian Council for Scientific and Technolo-
gical Development (CNPq), Financing for
Studies and Projects (FINEP) and Rio de
Janeiro State Research Supporting Found-
ation (FAPERJ).
Acute respiratory distress syndrome (ARDS) remains a
common cause of morbidity and mortality. Although pro-
gress has been made in treating ARDS, no suitable thera-
peutic option exists and treatment is largely supportive. Thus,
the development of new drugs with an effective anti-
inflammatory profile would be extremely valuable.
Lately, a strategy that has received much attention relates
to the level of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and
cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in the cells parti-
cipating in the inflammatory process. Cyclic nucleotide second
messengers (cAMP and cGMP) play a central role in signal
transduction and regulation of physiological responses. Their
intracellular levels are controlled by the superfamily of cyclic
phosphodiesterase (PDE) enzymes. Inhibition of PDE family
members increases intracellular cAMP and cGMP levels,
thus exhibiting significant anti-inflammatory and disease-
modifying effects, associated with the suppression of immune
and inflammatory cells [1].
It is well documented that elevated levels of cAMP,
mediated predominantly through inhibition of PDE4, sup-
press tumour necrosis factor (TNF)-a production and modulate
the activity of virtually all cells involved in the inflammatory
process [1–6]. Rolipram, a potent PDE4 inhibitor, effectively
inhibits acute lung injury (ALI) induced by Escherichia coli
lipopolysaccharide (LPS) when administered before or after
LPS [5]. Its protective effect is associated with reduced pro-
inflammatory cytokine production, inhibition of neutrophil
accumulation in the lungs [1–5] and attenuated polymorpho-
nuclear activation after sequestration [5]. Selective PDE5
inhibitors (sildenafil and zaprinast) block the hydrolysis of
cGMP with minimal effects on the metabolism of cAMP
[7–10]. Therefore, these PDE inhibitors not only augment the
effect of combined inhaled nitric oxide [7–10], but produce
selective pulmonary vasodilatation without a systemic coun-
terpart when given alone [8–10]. Thus, pulmonary vascular
resistance and capillary pressure would decrease, promoting
the resolution of pulmonary oedema and improving gas
exchange.
Presently, the clinical efficacy of the available PDE inhi-
bitors on ARDS remains uncertain. Pentoxifylline, a non-
selective PDE inhibitor, may have clinical potential in the
treatment of ARDS [11–13], but there is not enough infor-
mation to allow definite recommendations for clinical use. In
addition, a recent trial by the National Institutes of Health
ARDS Network showed no beneficial effects of lisofylline
therapy in established ALI/ARDS [14]. Lisofylline is a com-
pound chemically related to pentoxifylline, but its mechanism
of action is unrelated to PDE effects [15].
LASSBio596 [16], designed as a hybrid of thalidomide and
sildenafil, is a new agent that exhibits potent inhibitory effects
Eur Respir J 2003; 22: 20–27
DOI: 10.1183/09031936.03.00108603
Printed in UK – all rights reserved
Copyright
#
ERS Journals Ltd 2003
European Respiratory Journal
ISSN 0903-1936
on PDE types 4 and 5, which are the main isozymes dis-
tributed in the lungs [1]. The current study was undertaken to
test the effects of LASSBio596 when administered either prior
to or after the induction of E. coli LPS ALI on in vivo and
in vitro respiratory mechanics, and to correlate these results
with collagen fibre content, bronchoalveolar lavage fluid
(BALF) and lung morphometric analysis.
Materials and methods
Animal preparation
Twenty-four BALB/c mice (20–25 g) were randomly
divided into four groups (n
=
6). In the control group, saline
(0.05 mL) was instilled intratracheally (i.t.). The LPS group
received LPS (E. coli O55:B5, 10 mg in 0.05 mL of saline per
mouse i.t.). For intratracheal instillation, mice were treated
with sevoflurane anaesthesia, a 1-cm midline cervical incision
was made to expose the trachea, and then LPS or saline was
instilled with a bent 27-gauge needle mounted on a tuberculin
syringe. The cervical incision was closed with 5.0 silk suture
and the mice were returned to their cage. The animals
recovered rapidly after surgery. In the LASSBio596 groups,
animals were treated with LASSBio596 (10 mg?kg body
weight
-1
, 0.2 mL) intraperitoneally (i.p.), 1 h before or 6 h
after LPS administration.
LASSBio596 was structurally designed as a hybrid of
thalidomide and the PDE inhibitor sildenafil [16]. Hydrolysis
of the phthalimide framework was performed to remove the
teratogenic effects of thalidomide [16].
Twenty-four hours later, the animals were sedated with
diazepam (1 mg i.p.), anaesthetised (pentobarbital sodium,
20 mg?kg body weight
-1
i.p.) and a snugly fitting cannula
(0.8 mm internal diameter (ID)) was introduced into the
trachea. Mechanical ventilation (model 683; Harvard
Apparatus, Southnatick, MA, USA), with a frequency of
100 breaths?min
-1
, a tidal volume (VT)of7mL?kg
-1
and
positive end-expiratory pressure of 2.0 cmH
2
O, was applied.
The anterior chest wall was surgically removed.
A pneumotachograph (1.5 mm ID, length 4.2 cm, distance
between side ports 2.1 cm) was connected to the tracheal
cannula for the measurements of airflow and changes in lung
volume [17]. The pressure gradient across the pneumotacho-
graph was determined by means of a Validyne MP45-2 dif-
ferential pressure transducer (Engineering Corp., Northridge,
CA, USA). The flow resistance of the equipment, tracheal
cannula included, was constant up to flow rates of 26 mL?s
-1
and amounted to 0.12 cmH
2
O?mL
-1
?s
-1
. Equipment resistive
pressure was subtracted from pulmonary resistive pressure, so
that the present results represent intrinsic values. Tracheal
pressure was measured with a Validyne MP-45 differential
pressure transducer (Engineering Corp.). All signals were
conditioned and amplified in a Beckman type R Dynograph
(Beckman, Schiller Park, IL, USA). Flow and pressure signals
were also passed through eight-pole Bessel filters (902LPF;
Frequency Devices, Haverhill, MA, USA), with the corner
frequency set at 100 Hz, sampled at 200 Hz with a 12-bit
analogue-to-digital converter (DT2801A; Data Translation,
Marlboro, MA, USA), and stored on a microcomputer. All
data were collected using LABDAT software (RHT-Info
Data Inc., Montreal, QU, Canada).
Measurement of pulmonary mechanics
Muscle relaxation was achieved with gallamine triethyliodide
(2 mg?kg body weight
-1
i.v.) and a constant flow ventilator
provided artificial ventilation (Samay VR15; Universidad de
la Republica, Montevideo, Uruguay). Special care was taken
to keep V
T (0.2 mL) and flow (1 mL?s
-1
) constant in all
animals in order to avoid the effects of different flows,
volumes and inspiratory duration on the measured variables.
Pulmonary mechanics were measured by the end-inflation
occlusion method [18, 19]. In an open chest preparation, tra-
cheal pressure reflects transpulmonary pressure [20]. Pulmo-
nary resistive, viscoelastic/inhomogeneous and total pressures,
static elastance and dynamic elastance, and the difference
between dynamic and static elastances were determined.
Pulmonary mechanics measurements were performed 10
times in each animal. Data are presented as mean
¡
SEM for
each group.
Measurement of tissue mechanics
Heparine (1,000 IU) was intravenously injected immedi-
ately after the determination of respiratory mechanics. The
trachea was clamped 10 min later at end-expiration, and
the abdominal aorta and vena cava were sectioned, yielding
a massive haemorrhage that quickly killed the animals.
The lungs were removed en bloc, and placed in a modi-
fied Krebs-Henseleith (K-H) solution containing (mM)
118.4 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 K
3
PO
4
,25NaHCO
3
, 2.5 CaCl
2
?H
2
O,
0.6 MgSO
4
?H
2
O and 11.1 glucose; at pH 7.40 and at 6uC. A
262610-mm strip of subpleural parenchyma was cut from the
periphery of each left lung and suspended vertically in an
organ bath filled with K-H solution maintained at 37uC,
continuously bubbled with a mixture of 95% oxygen and 5%
carbon dioxide.
Lung strips were weighed and their unloaded resting
lengths were determined with a calliper. Lung strip volume
(V) was measured by simple densitometry, as follows:
V~DF=d ð1Þ
where DF is the total change in force before and after strip
immersion in K-H solution and d is the mass density of the K-
H solution [21–23].
One end of the material was attached to a force transducer
(FT03; Grass Instruments Co., Quincy, MA, USA), while the
other end was fastened to a vertical rod. This fibreglass stick
was connected to the cone of a woofer, which was driven by
the amplified sinusoidal signal of a waveform generator
(3312A Function Generator; Hewlett Packard, Beaverton,
OR, USA). A side arm of the rod was linked to a second force
transducer by means of a silver spring of known Young9s
modulus, thus allowing the measurement of displacement.
Length and force output signals were conditioned (Gould
5900 Signal Conditioner Frame; Gould Inc., Valley View,
OH, USA), fed through eight-pole Bessel filters (902LPF;
Frequency Devices), analogue-to-digital converted (DT2801A;
Data Translation Inc.) and stored on a computer. All data
were collected using LABDAT software (RHT-InfoData
Inc.). The frequency response of the system was dynamically
studied by using calibrated silver springs with different elastic
Young9s modulus. Neither amplitude dependence (v0.1%
change in stiffness) nor phase changes with frequency were
detected in the range of 0.01–14 Hz. The hysteresivity of the
system was independent of frequency and had a valuev0.003
[22, 23].
Each parenchymal strip was preconditioned by sinusoidal
oscillation of the tissue during 30 min (frequency 1 Hz;
amplitude large enough to reach a maximal stress of
20 g?cm
-2
). Thereafter, the amplitude was adjusted to 5% of
the unloading resting length and the oscillation was main-
tained for another 30 min or until a stable length/force loop
21PDE INHIBITOR THERAPY FOR ALI
was reached. The isometric stress adaptation period resulted
in a final force of 0.5 g. After preconditioning, the strips were
oscillated at a frequency of 1 Hz [22, 23].
Tissue resistance, elastance and hysteresivity were calcu-
lated from the oscillatory recordings according to F
REDBERG
and STAMENOVIC [24].
Lung morphometric analysis
Morphometric analysis was performed in excised lungs
at functional residual capacity. Immediately after the removal
of the lungs en bloc, the right lung was quick-frozen by
immersion in liquid nitrogen and fixed with Carnoy9s solution
[25]. After fixation, the tissue was embedded in paraffin.
Blocks were cut to a thickness of 4 mm by a microtome. The
slices were stained with haematoxylin-eosin. Two investiga-
tors, who were unaware of the origin of the material, per-
formed the microscopic examination.
Morphometric analysis was performed with an integrating
eyepiece with a coherent system made of a 100-point grid
consisting of 50 lines of known length, coupled to a con-
ventional light microscope (Axioplan; Zeiss, Oberkochen,
Germany). Volume fractions of collapsed and normal pul-
monary areas were determined by the point-counting tech-
nique, made across 10 random noncoincident microscopic
fields at a magnification of 6400 [26]. Lung tissue distortion
was assessed by measuring the mean linear intercept between
alveolar walls at a magnification of 6100 [26]. The mean
linear intercept between alveolar walls was determined by
counting the number of intercepts between the eyepiece lines
and the alveolar septum of each microscopic field, and was
expressed as the relation between the line length (1,250 mm)
and the total number of intercepts. The internal diameter of
the central airways was computed by counting the points
falling on the airway lumen and those falling on airway
smooth muscle and epithelium. The perimeter of the airways
was estimated by counting the intercepts of the lines of the
integrating eyepiece with the epithelial basal membrane. This
procedure was repeated four times for each airway. The areas
of smooth muscle and airway epithelium were corrected in
terms of airway perimeter by dividing their values by the
number of intercepts of the line system with the epithelial
basal membrane of the corresponding airway. Since the
number of intercepts (NI) of the lines with the epithelial basal
membrane is proportional to airway perimeter, and the
number of points (NP) falling on the airway lumen is pro-
portional to airway area, the magnitude of bronchoconstric-
tion (contraction index (CI)) was computed by the following
relationship [27]:
CI~NI=
ffiffiffiffiffiffiffi
NP
p
ð2Þ
Polymorphonuclear and mononuclear cells, and pulmonary
tissue were evaluated at 61,000 magnification. Points falling
on tissue area were counted and divided by the total number
of points in each microscopic field. Thus, data were reported
as the fractional area of pulmonary tissue [26]. The same
method was applied to determine polymorphonuclear and
mononuclear cells. The inflammation index was estimated by
the relationship between the number of polymorphonuclear
cells and the number of intersections of the alveolar septa.
Morphometric analysis of the parenchymal strips
At the end of the experiments, the organ bath was removed
and the parenchymal strips were frozen by rapid immersion in
liquid nitrogen at the force maintained during the experiment.
Frozen strips were fixed as aforementioned. Sections were
examined at 6400 magnification, and the fractional areas of
alveolar wall, blood-vessel wall and bronchial wall were
determined by the point-counting technique [26]. This
analysis was performed in 10 random nonoverlapping fields
in each strip.
The tissue slices also underwent the picrosirius polarisation
method to characterise the collagenous fibre system in the
alveolar septa [28]. Quantification was carried out with the aid
of a digital analysis system and specific software (Bioscan-
Optimas 5:1; Bioscan Inc., Edmond, WA, USA) under 6200
magnification. The images were generated by a microscope
(Axioplan; Zeiss) connected to a camera (Sony Trinitron
CCD; Sony, Tokyo, Japan), fed into a computer through a
frame grabber (Oculus TCX; Coreco Inc., St Laurent, PQ,
Canada) for offline processing. The thresholds for fibres of
the collagenous system were established after enhancing the
contrast up to a point at which the fibres were easily identified
as birefringent (collagen) bands. The area occupied by fibres
was determined by digital densitometric recognition. Bronchi
and blood vessels were carefully avoided during the measure-
ments. The areas occupied by the collagen fibres were divided
by the length of each studied septum, in order to avoid any
bias due to septal oedema or alveolar collapse. The results
were expressed as the amount of collagen fibres per unit of
septal length.
Evaluation of bronchoalveolar lavage fluid
Another eight to 16 animals of each group were submitted
to the aforementioned protocol in order to obtain aliquots
of BALF. For this purpose, 24 h after saline or LPS
instillation, the animals were anaesthetised (pentobarbital
sodium, 12 mg?kg body weight
-1
i.p.), the trachea was
cannulated and the lungs washed eight times with 0.5 mL of
saline to provide 4 mL of BALF. Aliquots of each BALF
were used to evaluate total and differential cell numbers and
TNF-a level.
Total cells present in the BALF were counted with a
Coulter counter ZM (Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA)
and values were expressed as number of cells?mL
-1
. Differ-
ential cell counts were performed after cytocentrifugation
(Shandon, East Grinstead, UK) and staining with Diff-Quick
stain (Baxter Dade AG, Dunding, Germany). At least 250
cells were counted and the results were expressed as number
of cell population?mL
-1
[29, 30].
After centrifugation of the BALF, the supernatant was
collected and stored at -70uC. The supernatant was then
assayed for TNF-a levels. TNF-a levels in the BALF were
determined by a highly specific enzyme-linked immunosor-
bent assay with a detection limit of 50 pg?mL
-1
[29, 30].
Statistical analysis
The mechanical, morphometrical and BALF parameters
gathered from the control, LPS, LASSBio596 before and after
groups were compared using a one-way analysis of variance.
If multiple comparisons were then required, the Student-
Newman-Keuls test was applied. The relationships between
mechanical and morphometrical parameters were evaluated
by Spearman correlation. In all tests the significance level was
set at 5%.
Results
There was no statistically significant difference in flow and
volume among the groups. Dynamic and static elastances,
22 P.R.M. ROCCO ET AL.
total, resistive and viscoelastic/inhomogeneous pressures,
tissue elastance and resistance, and hysteresivity were all
higher in the LPS group compared with the other groups
(table 1).
Histological changes in the LPS group included inters-
titial and alveolar oedema, atelectasis, inflammation with
polymorphonuclear cells, hyaline membrane, airway infiltra-
tion of neutrophils and inflammatory oedema; features that
all contribute to a reduced airway calibre. These changes were
not observed when LASSBio596 was administered 1 h before
or 6 h after LPS-induced ALI (fig. 1).
The mean
¡
SEM percentages of normal and collapsed areas,
Table 1. – In vivo and in vitro mechanical parameters
Control LPS 596-b 596-a
In vivo
V9 mL?s
-1
1.03
¡
0.01 1.01
¡
0.01 1.01
¡
0.01 1.01
¡
0.01
V mL?s
-1
0.21
¡
0.01 0.21
¡
0.01 0.20
¡
0.01 0.20
¡
0.01
E
st cmH
2
O?mL
-1
26.27
¡
1.21 43.25
¡
3.20* 23.96
¡
1.33 24.60
¡
1.33
E
dyn cmH
2
O?mL
-1
29.88
¡
1.23 47.94
¡
3.33* 27.82
¡
1.37 28.31
¡
1.36
DE cmH
2
O?mL
-1
3.61
¡
0.16 4.70
¡
0.18* 3.86
¡
0.17 3.71
¡
0.13
DP
tot cmH
2
O 1.21
¡
0.04 1.60
¡
0.06* 1.21
¡
0.04 1.17
¡
0.03
DP
1 cmH
2
O 0.47
¡
0.02 0.63
¡
0.03* 0.46
¡
0.01 0.41
¡
0.01
DP
2 cmH
2
O 0.74
¡
0.04 0.97
¡
0.04* 0.75
¡
0.03 0.75
¡
0.02
In vitro
E N?m
-2
?10
-4
0.98
¡
0.04 1.46
¡
0.04* 1.17
¡
0.06 1.06
¡
0.07
R N?s
-1
?m
-2
?10
-2
1.05
¡
0.02 1.57
¡
0.07* 1.10
¡
0.09 1.15
¡
0.07
g 0.07
¡
0.01 0.08
¡
0.01* 0.07
¡
0.01 0.07
¡
0.01
Data are presented as means
¡
SEM of six animals (10 determinations per mouse). Data are shown for control, lipopolysaccharide (LPS),
LASSBio596 1 h before LPS (596-b) and LASSBio596 6 h after LPS (596-a) groups. V9: gas flow; V: volume; E
st: pulmonary static elastance; Edyn:
pulmonary dynamic elastance; DE: difference between dynamic and static elastances; DP
tot: total pressure; DP1: resistive pressure; DP2: viscoelastic/
inhomogeneous pressure; E: tissue elastance; R: resistance; g: hysteresivity. *: pv0.05 versus the other groups.
a) b)
d)
c)
Fig. 1. – Photomicrographs of lung parenchyma stained with haematoxylin-eosin: a) control, b) acute lung injury (ALI) induced by Escherichia
coli lipopolysaccharide, c) treatment with LASSBio596 1 h before or d) 6 h after ALI induction. Scale bars
=
100 mm.
23PDE INHIBITOR THERAPY FOR ALI
mean linear intercept between alveolar walls, inflammation
index and contraction index in the control, LPS, LASSBio596
before and after groups are listed in table 2. The fraction of
alveolar collapse was higher in LPS than in the control group;
although LASSBio596 lessened collapse in relation to LPS,
the values were still higher than in control. LASSBio596
administered prior to ALI induction seemed to be more effi-
cient in avoiding alveolar collapse. The LPS group presented
smaller mean linear intercept between alveolar walls and
central airway diameters (larger contraction index) than those
found in the other groups (table 2). Total and polymorpho-
nuclear cell contents were higher in the LPS group than
in control, LASSBio596 before and after groups (table 3).
These data suggest that LASSBio596 presents potent anti-
inflammatory effects on ALI induced by E. coli LPS. Tissue
strip morphometric analysis showed similar anatomic com-
position in all groups (table 4).
Collagen fibre content was greater in LPS (0.041
¡
0.002 mm
2
?
mm
-1
) than in the control group (0.012
¡
0.003 mm
2
?mm
-1
) and
LASSBio596 avoided the increment in the collagen fibre
content independently of the time of injection (after: 0.012
¡
0.002 mm
2
?mm
-1
; before: 0.014
¡
0.002 mm
2
?mm
-1
).
There was an increase in neutrophil numbers and an
increment in TNF-a levels in the BALF 24 h after the E. coli
LPS-induced ALI. LASSBio596, injected 1 h before or 6 h
after LPS administration, prevented increases in the neutro-
phil content and TNF-a levels in the BALF (fig. 2).
Considering the control, LPS, LASSBio596 before and
after groups together, static elastance and viscoelastic/
inhomogeneous pressures were well correlated with the
fraction of area of alveolar collapse, the inflammation index
and the mean linear intercept between alveolar walls, as
shown in table 5. Resistive pressure was correlated with the
contraction index. Tissue elastance and resistance, and
hysteresivity were related to total cell count (p
=
0.004, p
=
0.01 and p
=
0.01, respectively), and with polymorphonuclear
cell count (p
=
0.003, p
=
0.011 and p
=
0.005, respectively).
Hysteresivity was correlated with collagen fibre content
(p
=
0.014).
Discussion
This study demonstrated that treatment with LASSBio596
can avoid increases in in vivo and in vitro pulmonary
impedance caused by LPS administration, when given either
1 h prior to or 6 h after ALI induction. LASSBio596 also
modulated the lung inflammatory process elicited by LPS.
A model of LPS-induced ALI was applied to mimic the
morphological and functional changes observed in clinical
situations resulting from circulating LPS. It is well documen-
ted that LPS administration triggers a network of inflamma-
tory responses mediated by a number of immune cells, which
is followed by the release of a vast array of pro-inflammatory
mediators that orchestrate the acute inflammatory response
[29, 30]. LPS promotes activation of mononuclear phago-
cytes, leading to the release of different cytokines, including
TNF-a, which induces neutrophil adherence to endothelial
cells, and facilitates migration and infiltration of polymorpho-
nuclear cells into pulmonary spaces. Neutrophil activation
Table 2. – Morphometrical parameters
Groups Normal area % Alveolar collapse % Inflammation index Lm mm Contraction index
Control 99.2
¡
0.2 0.8
¡
0.1 0.2
¡
0.01 59.5
¡
1.6 1.73
¡
0.03
LPS 19.3
¡
2.4* 80.7
¡
2.4* 0.6
¡
0.02* 48.2
¡
2.4* 2.06
¡
0.03*
596-b 85.2
¡
1.5*
,#
14.8
¡
1.5*
,#
0.3
¡
0.01*
,#
61.3
¡
0.6 1.85
¡
0.04
596-a 74.9
¡
0.5*
,#,}
25.1
¡
0.5*
,#,}
0.3
¡
0.01*
,#
59.5
¡
1.0 1.84
¡
0.02
Data are presented as mean
¡
SEM of six animals in each group (10 random, noncoincident fields per mouse). Data are shown for control,
lipopolysaccharide (LPS), LASSBio596 1 h before LPS (596-b) and LASSBio596 6 h after LPS (596-a) groups. L
m: mean linear intercept between
alveolar walls. *: pv0.05 versus control group;
#
:pv0.05 versus LPS group;
}
:pv0.05 versus 596-b.
Table 3. – Cellularity in lung parenchyma
Groups Total % PMN % MN %
Control 20.7
¡
0.80 15.5
¡
1.06 5.2
¡
0.36
LPS 31.3
¡
1.87* 27.8
¡
2.46* 3.5
¡
0.98
596-b 23.9
¡
1.44 20.9
¡
1.72 3.0
¡
1.10
596-a 20.4
¡
0.42 16.8
¡
1.73 5.2
¡
0.75
Data are presented as mean
¡
SEM of six lungs in each group (10
microscopic fields were analysed in each lung). Data are shown for
control, lipopolysaccharide (LPS), LASSBio596 1 h before LPS (596-
b), and LASSBio596 6 h after LPS (596-a) groups. Total: total cellular
fractional area; PMN: polymorphonuclear cell fractional area; MN:
mononuclear cell fractional area. *: pv0.05 versus the other groups.
Table 4. – Volume proportions of alveolar (AW), blood vessel
(BVW) and bronchial (BW) walls in parenchymal strips
Groups AW % BVW % BW %
Control 92.2
¡
0.2 4.7
¡
0.2 3.2
¡
0.1
LPS 92.4
¡
0.1 4.3
¡
0.1 3.4
¡
0.2
596-b 92.2
¡
0.3 4.6
¡
0.3 3.2
¡
0.2
596-a 92.3
¡
0.3 4.6
¡
0.2 3.1
¡
0.2
Data are presented as mean
¡
SEM of six strips in each group (10
microscopic fields were analysed in each strip). Data are shown for
control, lipopolysaccharide (LPS), LASSBio596 1 h before LPS (596-b)
and LASSBio596 6 h after LPS (596-a) groups.
600
400
200
0
Neutrophils ×10
4
cells·mL
-1
Control LPS 596-b 596-a
#
#
#
#
*
*
60
40
20
0
TNF-a pg·mL
-1
Fig. 2. – Neutrophil (h) and tumour necrosis factor (TNF)-a (p)
recruitment in bronchoalveolar lavage fluid in control, lipopolysac-
charide (LPS), LASSBio596 1 h before LPS (596-b) and 6 h after
LPS (596-a) groups. Data are presented as mean
¡
SEM.*:pv0.05
versus control group;
#
:pv0.05 versus LPS group.
24 P.R.M. ROCCO ET AL.
produces oxygen radicals and releases granular enzymes that
are associated with the development of ALI [30]. The
intratracheal instillation of LPS induced in vivo and in vitro
respiratory mechanical changes (table 1) associated with lung
morphometrical alterations, an increment in TNF-a levels,
collagen fibre deposition in the alveolar septa and neutrophil
infiltration in the lung tissue and BALF (table 2, figs 1 and 2).
LASSBio596, structurally designed as a hybrid of thalido-
mide and the PDE inhibitor sildenafil, exhibited important
anti-inflammatory and immunomodulatory profiles [16].
The molecule of this new thalidomide analogue lacks the
phthalimide ring (responsible for the teratogenic effects of
thalidomide), thus, possibly avoiding an eventual teratogenic
effect. LASSBio596 modulates the inflammatory process by
inhibiting PDE4 and 5, which regulate the breakdown of the
intracellular second messengers cAMP and cGMP, respec-
tively [16].
The administration of LASSBio596 1 h before or 6 h after
LPS instillation inhibited alterations in in vivo mechanical
parameters (table 1). Interestingly, respiratory mechanics and
histological lung changes observed at 24 h were already
present as early as 6 h after ALI induction, although less
intense. A
STI et al. [31] also observed a massive margination
of polymorphonuclear cells in lung parenchyma and in the
BALF with a similar dose of intratracheal LPS. They
demonstrated a significant increase in lung myeloperoxidase
activity at 4 h (131% increase versus controls, pv0.001) and
6 h (147% increase versus controls, pv0.001). Thus, LASS-
Bio596 was given both when lung dysfunction was present
and after the inflammatory cascade was initiated.
LASSBio596 attenuated the increases in BALF TNF-a
levels (fig. 2) and inhibited pulmonary neutrophilia (table 3).
The precise mechanism whereby LASSBio596 attenuates lung
inflammation is not known. In accordance with the literature,
PDE4 and 5 inhibitors may lead to the suppression of
chemoattractant and pro-inflammatory cytokine release [2–5,
29], the downregulation of cell adhesion molecules [1], the
inhibition of leukocyte migration [2, 5], functional inhibition
of the various types of cells including lung macrophages,
neutrophils, lymphocytes, and monocytes [1, 2, 5, 32], and
increased macrophage anti-inflammatory cytokine produc-
tion [32].
LASSBio596 is a potent anti-inflammatory agent and it
could be expected to increase susceptibility to infection. Of
the animals, 40% died of diffuse lung oedema at day 1 after
intratracheal instillation of LPS alone, whilst the animals that
received LASSBio596 presented a significantly higher survival
rate (100%) at day 1 (pv0.001), which remained unchanged
until 4 weeks after ALI induction. At 4 weeks, the macro-
scopic aspects of the lungs from animals treated with
LASSBio596 were similar to those of the control group.
Immediately after ALI induction, the animals were housed for
4 weeks in conventional open cages and with access to
standard food and water ad libitum. Thus, the environmental
conditions associated with the inhibition of neutrophilia and
the TNF-a production did not induce infection nor the
increased mortality rate
LASSBio596 anti-inflammatory effects in LPS-induced
ALI were similar to those observed with rolipram, the pro-
totypic PDE4 inhibitor [2, 3, 30]. In addition, in a model of
ALI induced by LPS followed by zymozan, rolipram inhibited
lung injury when given before or after LPS through the
attenuation of neutrophil activation even after sequestration,
apparently independently of TNF-a inhibition [5].
LASSBio596 also prevented the reduction of central airway
calibre (table 2). PDE4 inhibition could explain this phenom-
enon by airway smooth muscle relaxation, modulation of the
activity of pulmonary nerves and suppression of the activa-
tion of inflammatory cells, thus modulating the bronchomo-
tor tone [1, 33]. Additionally, LASSBio596 attenuated the
alveolar collapse observed in the LPS group, suggesting that it
might diminish the impairment of the surfactant system
usually observed in injured lungs. H
AFNER and GERMANN
[34] demonstrated that combined treatment with protein-C-
based surfactant, rSP-C, and a PDE4 inhibitor, roflumilast,
led to improved oxygenation and inhibition of hyaline
membrane formation in a lung lavage model of ALI. This
information supports the current histopathological findings
presented in LASSBio596 before and after groups, which did
not demonstrate hyaline membrane formation.
The method used to determine tissue mechanical properties
in this study avoids the effects of surface film, alveolar
flooding and airway inhomogeneity. Thus, a direct analysis of
the role of fibre-to-fibre networking within the connective
tissue matrix on tissue mechanical properties is ensured
[22–24, 35]. The current study is the first analysis of tissue
mechanical properties by oscillation of lung parenchymal
strips in an E. coli LPS model of ALI. Elastance, resistance
and hysteresivity of LPS-treated mice were significantly
increased in comparison with control tissue, suggesting that
parenchymal mechanical dysfunction plays an important role
in the pathophysiology of ALI (table 1). These modifications
happened in an early phase of the lesion, and were
accompanied by cellular polymorphonuclear infiltration in
lung parenchyma and deposition of collagen fibres. The
present results show that the collagen content was already
elevated 24 h after tissue damage with E. coli LPS, indicating
that the biochemical processes implicated in collagen synth-
esis are indeed able to react very quickly. LASSBio596
avoided tissue mechanical changes in LPS-induced ALI
(table 1) by inhibiting collagen fibre deposition in the alveolar
septa and preventing polymorphonuclear infiltration into the
lung parenchyma. The modulating effect of LASSBio596 on
the connective matrix remodelling is in line with previous
reports [36–38], showing that PDE4 inhibitors are able to
suppress fibroblast activity, and, thus, have the potential to
block the development of progressive fibrosis.
Oedema formation was observed in the present model of
ALI. LASSBio596, however, demonstrated a protective effect
against pulmonary oedema formation, possibly by: 1) the
anti-inflammatory effects of PDE4 inhibition, as described
previously [1–6, 30, 32]; and 2) pulmonary vasodilatation via
the inhibition of cGMP inactivation by PDE5 [7–10].
Pentoxifylline, a nonselective PDE inhibitor, has been used
Table 5. – Correlation matrix between physiological and morphometric parameters
Contraction index Collapse % Inflammation index Lm mm
E
st cmH
2
O?mL
-1
0.42 (0.044) 0.44 (0.029) 0.42 (0.041) -0.47 (0.021)
DP
2 cmH
2
O 0.46 (0.023) 0.52 (0.009) 0.64 (0.001) -0.60 (0.002)
DP
1 cmH
2
O 0.42 (0.041) 0.38 (NS) 0.46 (0.024) -0.60 (0.002)
The correlation was performed on data from control, lipopolysaccharide (LPS), LASSBio596 1 h before LPS and 6 h after LPS groups. All p-values
are shown in brackets. L
m: mean linear intercept between alveolar walls; Est: pulmonary static elastance; DP2: viscoelastic/inhomogeneous pressure;
DP
1: resistive pressure; NS: nonsignificant.
25PDE INHIBITOR THERAPY FOR ALI
to treat septic patients, as it improves cardiopulmonary
function and reduces the mortality rate [12, 13]. Additionally,
C
REAMER et al. [39] showed that pentoxifylline, given as a
rescue agent, prevents deterioration of lung compliance and
preserves vascular integrity. Therefore, experimental studies
and limited clinical experience in humans suggest that
pentoxifylline may have a clinical potential in the treatment
of ARDS. Conversely, lisofylline has no beneficial effects in
the treatment of established ALI/ARDS [14]. Lisofylline is a
new compound chemically related to pentoxifylline with
potential biological activity unrelated to PDE effects. It
inhibits the generation of phosphatidic-acid species, which act
as intermediary messengers with selective pro-inflammatory
targets [15]. New PDE inhibitors with more selective targets
are under development for clinical use and may have
significant clinical potential in the treatment of ARDS.
To conclude, LASSBio596 effectively prevented respiratory
and tissue mechanical changes, minimised lung morpho-
metrical alterations and had the potential to block lung
fibroproliferation in a mouse model of Escherichia coli
lipopolysaccharide-induced acute lung injury. Thus, LASS-
Bio596 displayed an important anti-inflammatory profile and
may act on the pulmonary vasculature, suggesting that the use
of agents that inhibit phosphodiesterase 4 and 5 simulta-
neously could be a useful adjunct therapy for acute lung
injury. Mouse and man clearly share many basic physiological
processes; nonetheless each animal model should be viewed as
one component of the process for studying human disease and
not viewed in isolation nor extrapolated directly to humans.
Acknowledgements. The authors would like to
express their gratitude to E.M. Negri for comments
and advice, to F.O. Leal for help in morphometric
analysis and to A. Carlos de Souza Quaresma and
R. da Conceic¸a˜o Pereira Milho for their skilful
technical assistance.
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27PDE INHIBITOR THERAPY FOR ALI
Synthesis and Anti-Inflammatory Activity of Phthalimide
Derivatives, Designed as New Thalidomide Analogues
Lı
´
dia M. Lima,
a,b
Paulo Castro,
c
Alexandre L. Machado,
c
Carlos Alberto M. Fraga,
a,b
Claire Lugnier,
d
Vera Lu´ cia Gonc¸ alves de Moraes
c
and Eliezer J. Barreiro
a,b,
*
a
Laborato
´
rio de Avaliac¸a
˜
oeSı
´
ntese de Substa
ˆ
ncias Bioativas (LASSBio, http://www.farmacia.ufrj.br/lassbio),
Faculdade de Farma
´
cia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
b
Instituto de Quı
´
mica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
c
Departamento de Bioquı
´
mica Me
´
dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
d
CNRS URA 600, IllKirch, France
Received 3 December 2001; accepted 16 January 2002
Abstract—This paper describes the synthesis and anti-inflammatory activity of new N-phenyl-phthalimide sulfonamides (3a–e) and
the isosters N-phenyl-phthalimide amides (4a–e), designed as hybrids of thalidomide (1) and aryl sulfonamide phosphodiesterase
inhibitor (2). In these series, compound 3e (LASSBio 468), having a sulfonyl-thiomorpholine moiety, showed potent inhibitory
activity on LPS-induced neutrophil recruitment with ED
50
=2.5 mg kg
À1
, which was correlated with its inhibitory effect on TNF-a
level. # 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.
Introduction
Tumor necrosis factor-a (TNF-a), is a cytokine con-
sidered to be a primary mediator of the inflammatory
response.
1
At lung level, it has been demonstrated that
the release of TNF-a favours the sequestration and
migration of neutrophils which play a critical role in the
pathogenesis of lung inflammation.
2À4
Using different
models, it has been shown that adenosine cyclic mono-
phosphate (cAMP) elevating-agents can also regulate
the induction of TNF-a synthesis at the transcriptional
levels.
5,6
Over production of TNF-a is associated with a
wide range of pathological conditions, this has led to
much recent effort in finding ways to downregulate its
production or inhibit its effects.
7À9
Cyclic-AMP or GMP are ubiquitous second messengers
involved in a vast array of cellular responses to different
inflammatory stimuli.
10
Inside the cell, cyclic nucleotide
phosphodiesterase (PDE) represents a group of 11
distinct proteins, differentially expressed depending on
the tissue, whose function is to hydrolyse cyclic nucleo-
tides.
10,11
Since the last decade, studies on the control of
cAMP or cGMP levels through the action of PDE
increased and its relevance can be demonstrated by the
number of clinical trials with selective inhibitors of PDE
for different inflammatory disorders such as asthma.
12,13
Trying to reduce side effects, much effort have been
expended to discover new substances that could selec-
tively block members of the PDE family, such as PDE-4,
the isoform found in all pro-inflammatory and immuno-
competent cells.
14,15
It is well documented that elevated levels of cAMP
inhibit TNF-a production in activated monocytes and
peripheral blood mononuclear cells,
22
and inhibition of
PDE-4 has been shown to be a successful method for
modulating TNF-a activity.
Thalidomide (1), a drug used to treat different inflam-
matory diseases is also an inhibitor of TNF-a
expression.
16À21
It has been approved by the Food and
Drug Administration (FDA) in July 1998 for a treat-
ment of erythema nodosum leprosum. After that, the
interest in this drug has been intensified because of its
effective immunomodulatory and anti-inflammatory
properties.
23
However, given the problems in admini-
stering an effective, nontoxic oral dose of thalidomide
(1), there is concern about the design of new compounds
that are based on the thalidomide structure, but which
have greater anti-TNF-a activity, less toxicity and
greater stability than the prototype (1).
0968-0896/02/$ - see front matter # 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.
PII: S0968-0896(02)00152-9
Bioorganic & Medicinal Chemistry 10 (2002) 3067–3073
*Corresponding author. e-mail: [email protected]
As part of a research program aiming at the synthesis
and pharmacological evaluation of novel anti-inflam-
matory lead-candidates, we describe in the present
paper the synthesis and anti-inflammatory profile of
new N-substituted phthalimides derivatives (3a–e) and
(4a–e), structurally designed as hybrids of thalidomide
(1) and aryl sulfonamides, described as selective PDE-4
inhibitors, like active compound (2)
24
(Chart 1). The
rational basis to design the new derivatives 3 was foun-
ded to promote a dual anti-inflammatory profile acting
at TNF-a and phosphodiesterase levels. For instance,
this symbiotic activity
25
was anticipated to be possible
in a compound having the phthalimide ring of 1 (A,
Chart 1) and the phenylsulfonamide moiety of 2 (B,
Chart 1), raising the new derivatives 3a–e.
In order to investigate the contribution of the C frame-
work of 2 (Chart 1) in the anti-inflammatory activity,
the isoindoline group was substituted by a hexahydro-
pyrazine moiety in the derivative 3a. Next, we decide to
vary the N-piperazinyl ring substituent as methyl (3b),
the large phenyl group (3c) and by isosteric morpholine
and thiomorpholine nucleous, providing derivatives 3d
and 3e, respectively (Chart 1).
Chemistry
Among several obvious synthetic routes to the new
thalidomide analogues 3a–e, we decided to explore in
our approach the sulfonylchloride derivative (7)asthe
key intermediate. This compound could be easily
obtained, in high yield, by the synthetic sequence
depicted in Scheme 1. The condensation of phthalic
anhydride (5) with aniline at reflux, furnished the
N-phenylphthalimide (6) in 86% yield.
26
The second step in the synthesis of 7 was based on a
regioselectivy eletrophilic aromatic substitution
employing a mixture of chlorosulfonic acid and phos-
phorous pentachloride,
27
at 50
C, obtaining 7 in 70%
yield. The synthetic route to the new derivatives 3a–e
was accomplished by classical functional group inter-
conversion. Thus, the target compounds 3a–e could be
prepared by condensation of 7 with corresponding
piperazine derivatives,
28
as showed in Scheme 1.
Finally, the bioisosteric series 4a–e, possessing a car-
bonyl group instead of the sulfonyl unit of derivatives
3a–e (Chart 1), was synthesized by the route illustrated
in Scheme 1. The amide derivatives 4a–e were prepared
from functionalized phthalimide 9, in excellent yields,
exploring classical methodology, using thionyl chloride
to the more electrophilic acid chloride, followed by
treatment with functionalized piperazines in the pre-
sence of dichlorometane, at room temperature.
29
Results and Discussion
Thalidomide analogues (3a–e) were screened for their
ability to inhibit the acute inflammatory response, mea-
sured by inhibition of LPS-induced TNF-a and neutro-
phil infiltration into mice lungs, with thalidomide as
standard. The results obtained are shown in Figure 1.
In the series of sulfonamide derivatives (3a–e), the most
active compound (3e), which possesses the thiomorpho-
line ring at the aryl moiety of the 4-sulfonylphenyl-
phthalimide framework, was selected to study the dose-
dependent response for this new bioactive compound.
Compound 3e (LASSBio 468) inhibited the neutrophil
infiltration induced by LPS with ED
50
2.5 mg kg
À1
.
In order to investigate the importance of phthalimide
ring in the anti-inflammatory activity, compound 3e
(LASSBio 468) was hydrolised by treatment with
lithium hydroxide in a mixture of THF/MeOH/H
2
O,
29
to furnish compound 8 in 77% yield (Scheme 1). The
pharmacological evaluation of this compound (8)
revealed a remarkable decrease in anti-inflammatory
activity (Table 1).
Chart 1.
3068 L. M. Lima et al. / Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 3067–3073
In order to study the role of the sulfonyl group present
in the aryl-sulfonamide moiety found in the prototype
(2), we were able to replace this group by an isosteric
carbonyl unit, as in compounds 4a–e. The pharmacolo-
gical evaluation of amide compound 4e (LASSBio 596),
designed upon the bioassays results from 3e, revealed a
significant loss of activity when compared with the ori-
ginal compound 3e (Table 1), suggesting the crucial role
of the phenyl-sulfonyl-piperazine framework in the
investigated bioactivity.
To correlate the anti-inflammatory activity of com-
pound 3e (LASSBio 468) with a possible effect on TNF-a
production, the cytokine levels were also evaluated as
shown in Figure 2. This result revealed the ability of
compound 3e (LASSBio 468) to inhibit TNF-a levels in
BALF of mice lungs treated with LPS.
It is well-known that elevation of intracellular levels of
cAMP in leukocytes is accompanied by significant inhi-
bition of the production of TNF-a and is associated
with inhibition of PDE-4 activity.
6,30,31
Therefore, the
new thalidomide analogues 3e, 4e and 8 were also eval-
uated, in vitro, as PDE-4 and PDE-3 inhibitors. The
results obtained with PDE’s from bovine aorta assay,
32
Figure 1. Effect of compounds 3a–e and thalidomide on neutrophil
influx induced by LPS into BALF of mice lungs.
Table 1. Inhibitory effects of compounds 1, 3e, 4e, and 8 on neutro-
plihs recruitment induced by LPS
a
Compd % Inhibition
DMSO (vehicle) 0.0Æ 0.0
Thalidomide (1) 50.0Æ 7.3
LASSBio 468 (3e) 72.0Æ 8.6
LASSBio 595 (4e) 48.0Æ 11.7
LASSBio 596 (8) 50.0Æ 7.3
a
Neutrophils number was determined by BALF CTR=animals
pretreated with vehicle. Results are expressed as meanÆ SEM of five
animals.
4
Figure 2. Effect of compound 3e (LASSBio 468) on TNF-a levels and
neutrophil influx into the BALF of mice lungs.
Scheme 1. (a) C
6
H
5
NH
2
, reflux, 1 h; 86%; (b) ClSO
3
H, PCl
5
,50
C, 30 min, 70%; (c) functionalized piperazines, CH
2
Cl
2
, rt, 30 min, 60–66%;
(d) LiOH, THF, MeOH, H
2
O, rt, 10 min, 77%; (e) 4-CO
2
HC
6
H
4
NH
2
, AcOH, reflux, 1 h, 91%; (f) (1) SO
2
Cl, DMF (cat), reflux, 1 h; (2) CH
2
Cl
2
,
functionalized piperazines, rt, 30 min, 81–97%.
L. M. Lima et al. / Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 3067–3073 3069
indicated that none of the compounds assayed pre-
sented a significative inhibitory effect on PDE-4 and
PDE-3 activity. For instance, 3e (LASSBio 468) pre-
sented only 40% of PDE-4 inhibition at 300 mM con-
centration and was ineffective on PDE-3. Compound 8
(LASSBio 596) and 4e (LASSBio 595) presented the
same poor profile of bioactivity (data not shown).
In conclusion, in an effort to discover new thalidomide
analogues with anti-inflammatory activity we found a
novel lead-compound candidate 3e (LASSBio 468). The
preliminary SAR with this compound revealed the
importance of the sulfonyl group, the nature of the
N-terminal piperazine ring, and also indicated the role
of the phthalimide ring in the anti-inflammatory activity
of this compound (3e). Further, 3e presented a great
inhibitory activity on neutophil recruitment and on
TNF-a level in BALF of mice lungs treated with LPS.
Moreover, the ability of compound 3e (LASSBio 468)
to inhibit TNF-a production seems to not correlate with
activity awards PDE-4 or PDE-3, major isoforms found
in all pro-inflammatory and immunocompetent cells.
Experimental
Chemistry
Melting points were determined with a Buchi 540 appa-
ratus and are uncorrected. Proton magnetic resonance
(
1
H NMR), unless otherwise stated, was determined in
deuterated dimethylsulfoxide containing ca. 1% tetra-
methylsilane as an internal standard with Bruker AC
200, Bruker DRX 300 spectrometers at 200 and
300 MHz, respectively. Splitting patterns are as follows:
s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; qt, quintet;
dd, double doublet; br, broad; m, multiplet. Carbon
magnetic resonance (
13
C NMR) was determined in the
same spectrometers described above at 50 and 75 MHz,
respectively, using deuterated dimethylsulfoxide as
internal standard. Infrared (IR) spectra were obtained
with Nicolet-550 Magna spectrophotometer using
potassium bromide plates. The mass spectra (MS) were
obtained by electron impact (70 eV) with a GC/VG
Micromass 12 spectrometer.
The progress of all reactions was monitored by tlc per-
formed on 2.0 Â 6.0 cm aluminum sheets precoated with
silica gel 60 (HF-254, Merck) to a thickness of 0.25 mm.
The developed chromatograms were viewed under
ultraviolet light at 254 nm. For column chromatography
Merck silica gel (70–230 mesh) was used.
2-Phenyl-1,3-isoindolinedione (6).
26
A mixture of 0.5 g
(3.38 mmol) of phthalic anhydride in 0.4 mL
(4.06 mmol) of aniline was refluxed for 30 min. The
N-phenyl phthalimide (6) separates out on cooling. A
nearly white powder appeared which was filtered
through a Bu
¨
chner funnel and washed twice with 20 mL
of water, to give the desired 2-phenyl-1,3-iso-
indolinedione (6) in 86% yield, mp 204–205
C.
1
H
NMR (200 MHz, CDCl
3
) d 7.46 (m, H2
0
-H6
0
), 7.80 (m,
H5 and H6), 7.96 (m, H4 and H7).
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d 123.91 (C4 and C7), 126.74 (C2
0
and C6
0
),
128.26 (C4
0
), 129.28 (C3
0
and C5
0
), 131.86 (C1
0
), 131.94
(C3a–C7a), 134.56 (C5–C6), 167.44 (C1 and C3).
4-(1,3-Dioxo-2,3-dihydro-1H-2-isoindolyl)-1-benzene-
sulfonyl chloride (7).
27
To a solution of 0.16 g (0.09 mL,
1,35 mmol) of chlorosulfonic acid and 0.14 g
(0.67 mmol) of phosphorus pentachloride that had been
stirred for 10 min, was added 0.15 g (0.67 mmol) of
N-phenyl-phthalimide (6) in small portion. The result-
ing mixture was stirred and heated at 50
C for 30 min.
The reaction mixture was poured onto ice and extracted
with chloroform. The organic phase was separated,
washed with brine, dried over anhyd Na
2
SO
4
and eva-
porated at reduced pressure to furnish compound (7)in
70% yield, as a white solid mp 180–182
C.
1
H NMR
(200 MHz, DMSO-d
6
) d 7.41 (d, J=8.25 Hz, H2–H6
0
),
7.74 (d, J=8.23 Hz, H3
0
and H5
0
), 7.91 (m, H4–H7);
13
C
NMR (50 MHz, DMSO-d
6
) d 124.05 (C4 and C7),
126.66 (C2
0
and C6
0
), 127.34 (C3
0
and C5
0
), 132.08
(C3a–C7a), 132.67 (C1
0
), 135.37 (C5–C6), 147.97 (C4
0
),
167.50 (C1 and C3).
General procedures for the preparation of sulfonamides
3a–e
28
To a solution of sulfonyl chloride derivative (7) (0.5 g;
1.56 mmol) in 50 mL of methylene chloride, were added
the functionalized piperazine derivatives (3.12 mmol).
The reaction mixture was stirred for about 30 min, at
room temperature, when the end of reaction was
observed by TLC. Next, the phthalimide derivatives 3a–
e were isolated by addition of 50 mL of methylene
chloride and extraction with 10% aq HCl and brine.
The organic layer was dried over anhyd Na
2
SO
4
and
evaporated at reduced pressure to give the sulfonamide
derivatives 3a–e in good yields.
2-(4-Hexahydro-1-pyrazinylsulfonylphenyl)-1,3-isoindo-
linedione (3a). The title compound was obtained as a
white powder, in 60% yield, by condensing 7 with
piperazine, as described above, mp > 250
C.
1
H NMR
(200 MHz, DMSO-d
6
) d 3.21 (sl, H1
00
and H2
00
and H3
00
and H4
00
), 7.82 (d, J=8.58 Hz, H2
0
and H6
0
), 7.97 (d,
J=8.62 Hz, H3
0
and 5
0
), 7.99 (s, H5–H6 and H4–H7).
13
C NMR (50 MHz, DMSO-d
6
) d 42.59 (C3
00
and C4
00
),
43.30 (C1
00
and C2
00
), 124.13 (C7 and C4), 128.18 (C2
0
and C6
0
), 128.89 (C3
0
and C5
0
), 131.93 (C7a and C3a),
133.73 (C6 and C5), 135.45 (C1
0
), 137.04 (C4
0
), 166.96
(C1 and C3). IR (KBr) 3495 and 3363 (n NH), 1787 and
1766 (n C¼O), 1747 and 1720 (n C¼O), 1381 (n C–N–
C), 1343 (n SO
2
)cm
À1
. Anal. calcd for C
18
H
17
N
3
O
4
S: C,
58.21; H, 4.61; N, 11.31; O, 17.23; S, 8.63. Found: C,
58.19; H, 4.60; N, 11.33; O, 17.22; S, 8.62.
2 - [4 - (4 - Methylhexahydro - 1 - pyrazinylsulfonyl)phenyl]-
1,3-isoindolinedione (3b). The title compound was
obtained as a white powder, in 63% yield, by conden-
sing 7 with 1-methylpiperazine, as described above, mp
210–213
C.
1
H NMR (200 MHz, DMSO-d
6
) d 3.21 (sl,
H1
00
and H2
00
and H3
00
and H4
00
), 7.82 (d, J=8.58 Hz,
H2
0
and H6
0
), 7.97 (d, J=8.62 Hz, H3
0
and 5
0
), 7.99 (s,
H5–H6 and H4–H7).
13
C NMR (50 MHz, DMSO-d
6
) d
3070 L. M. Lima et al. / Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 3067–3073
42.59 (C3
00
and C4
00
), 43.30 (C1
00
and C2
00
), 124.13 (C7
and C4), 128.18 (C2
0
and C6
0
), 128.89 (C3
0
and C5
0
),
131.93 (C7a and C3a), 133.73 (C6 and C5), 135.45 (C1
0
),
137.04 (C4
0
), 166.96 (C1 and C3). IR (KBr) 3495 and
3363 (n NH), 1787 and 1766 (n C¼O), 1747 and 1720 (n
C¼O), 1381 (n C–N–C), 1343 (n SO
2
)cm
À1
. Anal. calcd
for C
19
H
19
N
3
O
4
S: C, 59.21; H, 4.97; N, 10.90; O, 16.60; S,
8.32. Found: C, 59.20; H, 4.96; N, 10.88; O, 16.59; S, 8.31.
2-[4-(4-Phenylhexahydro-1-pyrazinylsulfonyl)phenyl]-1,3-
isoindolinedione (3c). The title compound was obtained
as a white powder, in 65% yield, by condensing 7 with
1-phenylpiperazine, as described above, mp 231–233
C.
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) d 3.26 (s, H1
00
and H2
00
and H3
00
and H4
00
), 6.90 (m, H3
000
-H5
000
), 7.27 (dd,
J=7.58 and 8.25 Hz, H2
000
and H6
000
), 7.76 (d,
J=8.74 Hz, H2
0
and H6
0
), 7.86 (m, H5 and H6), 7.94 (d,
J=8.77 Hz, H3
0
and 5
0
), 8.00 (m, H4 and H7).
13
C
NMR (50 MHz, CDCl
3
) d 46.10 (C3
00
and C4
00
), 49.28
(C1
00
and C2
00
), 117.05 (C2
000
and C5
000
), 120.95 (C4
000
),
124.09 (C7 and C4), 126.31 (C2
0
and C6
0
), 128.66 (C3
0
and C5
0
), 129.24 (C3
000
and C5
000
), 131.41 (C7a and C3a),
134.44 (C6 and C5), 134.88 (C1
0
), 136.12 (C4
0
), 150.68
(C1
000
), 166.54 (C1 and C3). IR (KBr) 1789 and 1745 (n
C¼O), 1714 (n C¼O), 1384 (n C–N–C), 1348 (n SO
2
)
cm
À1
. Anal. calcd for C
24
H
21
N
3
O
4
S: C, 64.42; H, 4.73;
N, 9.39; O, 14.30; S, 7.16. Found: C 64.43; H 4.72; N,
9.40; O, 14.29; S, 7.17.
2-[4-(1,4-Oxazinan-4-ylsulfonyl)phenyl]-1,3-isoindoline-
dione (3d). The title compound was obtained as a white
powder, in 66% yield, by condensing 7 with morpho-
line, as described above, mp 218–220
C.
1
HNMR
(300 MHz, CDCl
3
) d 3.05 (t, J=4.70 Hz, H1
00
and H2
00
),
3.77 (t, J=4.71 Hz, H3
00
and H4
00
), 7.76 (d, J=8.76 Hz,
H2
0
and H6
0
), 7.85 (m, H5 and H6), 7.90 (d, J=8.77 Hz,
H3
0
and 5
0
), 8.00 (m, H4 and H7) ppm.
13
CNMR
(75 MHz, CDCl
3
) d: 46.04 (C1
00
and C2
00
), 66.16 (C3
00
and C4
00
), 124.19 (C7 and C4), 126.42 (C2
0
and C6
0
),
128.75 (C3
0
and C5
0
), 131.43 (C7a and C3a), 134.08 (C6
and C5), 135.01 (C1
0
), 136.22 (C4
0
), 166.65 (C1 and C3)
ppm. IR (KBr): 1743 and 1716 (n C¼O), 1595 (n C–O–
C), 1373 (n C–N–C), 1352 (n SO
2
)cm
À1
. Anal. calcd for
C
18
H
16
N
2
O
5
S: C, 58.06; H 4.33; N, 7.52; O, 21.48; S,
8.61. Found: C, 58.05; H 4.31; N, 7.53; O, 21.49; S, 8.60.
2-[4-(1,4-Thiazinan-4-ylsulfonyl)phenyl]-1,3-isoindoline-
dione (3e). The title compound was obtained as a white
powder, in 60% yield, by condensing 7 with thiomor-
pholine, as described above, mp 190–192
C.
1
HNMR
(200 MHz, CDCl
3
) d 2.73 (t, J=5.22 Hz, H3
0
and H4
0
),
3.40 (t, J=5.06 Hz, H1
0
and H2
0
), 7.74 (d, J=8.58 Hz,
H2
0
and H6
0
), 7.85 (m, H5 and H6), 7.88 (d, J=8.65 Hz,
H3
0
and 5
0
), 7.99 (m, H4 and H7).
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d 26.95 (C3
00
and C4
00
), 47.48 (C1
00
and C2
00
),
123.65 (C7 and C4), 126.07 (C2
0
and C6
0
), 127.79 (C3
0
and C5
0
), 130.93 (C7a and C3a), 134.55 (C6 and C5),
135.25 (C1
0
), 135.63 (C4
0
), 166.55 (C1 and C3). IR
(KBr) 1786 and 1766 (n C¼O), 1745 and 1716 (n C¼O),
1379 (n C–N–C), 1337 (n SO
2
)cm
À1
. Anal. calcd for
C
18
H
16
N
2
O
4
S
2
: C, 55.66; H 4.15; N, 7.21; O, 16.47; S,
16.51. Found: C, 55.67; H 4.15; N, 7.22; O, 16.48; S,
16.50.
2-[4-(1,4-Thiazinan-4-ylsulfonyl)phenylcarbamoyl]benzoic
acid (8).
29
To a solution of 0.2 g (0.51 mmol) of the
phthalimide derivative (3e) in a solution of 6 mL of tet-
rahydrofuran/methanol/water (3:1:1) was added 0.1 g
(4.12 mmol) LiOH 98% and the resulting solution was
stirred at room temperature for 2 h. The reaction mix-
ture was diluted with ethyl ether (20 mL) and carefully
acidified with 2 N aq HCl. The organic layer was
washed with brine, dried over anhyd Na
2
SO
4
and eva-
porated at reduced pressure to give the acid derivative
(9) in 77% yield, as a white solid, mp 187–189
C.
1
H
NMR (200 MHz, DMSO-d
6
) d 2.68 (sl, H3
00
and H4
00
),
3.18 (sl, H1
00
and H2
00
), 7.61 (d, J=8.14 Hz, H2
0
and
H6
0
), 7.67 (d, J=8.10 Hz, H3
0
and 5
0
), 7.96 (m, H4 and
H5), 7.95 (m, H3 and H6), 10.80 (s, CON
HAr), 12.41
(sl, ArCO
2
H).
13
C NMR (50 MHz, DMSO-d
6
) d 26.91
(C3
00
and C4
00
), 48.28 (C1
00
and C2
00
), 119.77 (C2
0
and
C6
0
), 124.13 (C3), 128.42 (C6), 128.94 (C3
0
and C5
0
),
130.15 (C5), 130.34 (C1), 130.94 (C2), 132.39 (C4),
138.89 (C4
0
), 144.20 (C1
0
), 167.71 (ArCONHR), 168.55
(ArCO
2
H).
4-(1,3-Dioxo-2,3-dihydro-1H -2-isoindolyl)benzoic acid
(9).
26
Dissolve 1.0 g (7.29 mmol) of 4-aminobenzoic
acid and 1.0 g (6.75 mmol) of phthalic anhydride in
10 mL of glacial acetic acid and reflux for 1 h. The
N-substituted phthalimide (9) separates out on cooling.
A nearly white powder appeared that was filtered
through a Bu
¨
chner funnel and washed twice with 30 mL
of water, to give the desired 4-(1,3-dioxo-2,3-dihydro-
1H-2-isoindolyl)benzoic cid (9) in 91% yield, as white
powder, mp > 250
C.
1
H NMR (200 MHz, DMSO-d
6
/
40
C) d 7.70 (d, J=8.70 Hz, H2
0
–H6
0
), 7.90 (m, H5–
H6), 7.99 (m, H4–H7), 8.08 (d, J=8.70 Hz, H3
0
-H5
0
),
13.02 (sl, RCO
2
H).
13
C NMR (50 MHz, DMSO-d
6
/
40
C) d 123.42 (C4 and C7), 126.78 (C2
0
and C6
0
),
129.75 (C3
0
and C5
0
), 129.98 (C4
0
), 131.36 (C3a and
C7a), 134.71 (C5 and C6), 135.73 (C1
0
), 166.51
(ArCO
2
H), 166.62 (C1 and C3). IR (KBr) 3547 (n OH),
1782 and 1748 (n C¼O), 1746 (n C¼O), 1700 (n C¼O),
1428 (n N–C–O), 1380 (n C–N–C) cm
À1
.
General procedures for the preparation of amides 4a–e
29
A solution of 0.2 g (0.75 mmol) of the acid (9) in 3 mL of
freshly distilled thionyl chloride and catalytic amount of
dimethylformamide was vigorously stirred under reflux
for 1 h. After this time, the solvent was carefully evapo-
rated at reduced pressure and a solution of 0.97 mmol of
the respective amine in 10 mL of methylene chloride was
added. The reaction mixture was stirred for 30 min at
room temperature, then poured in 20 mL of water and
extracted with methylene chloride (3 Â 15 mL). The
organic layer was dried over anhydrous Na
2
SO
4
and
evaporated at reduced pressure to give the amides deri-
vatives (4a–e) in excellent yields.
2-(4-Hexahydro-1-pyrazinylcarbonylphenyl)-1,3-isoindo-
linedione (4a). The title compound was obtained as a
white powder, in 82% yield, by condensing 9 with
piperazine, as described above, mp > 250
C.
1
H NMR
(200 MHz, CDCl
3
) d 1.60 (sl, H1
00
and H2
00
), 3.72 (sl,
H3
00
and H4
00
), 7.59 (m, H2
0
-6
0
and H3
0
-H5
0
), 7.84 (m,
L. M. Lima et al. / Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 3067–3073 3071
H5 and H6), 7.97 (m, H4 and H7). IR (KBr): 3470 (n
NH), 1739 and 1713 (n C¼O), 1621 (n C¼O), 1466 (n
N–C–O), 1389 (n C–N–C) cm
À1
. Anal. calcd for
C
19
H
17
N
3
O
3
: C, 68.05; H 5.11; N, 12.53; O, 14.31;
Found: C, 68.06; H 5.10; N, 2.56; O, 14.32.
2 - [4 - (4- Methylhexahydro - 1 -pyrazinylcarbonyl)phenyl]-
1,3-isoindolinedione (4b). The title compound was
obtained as a white powder, in 96% yield, by condensing 9
with 1-methylpiperazine, as described above, mp 140–
142
C.
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) d 1.26 (R
2
NCH
3
),
3.05 (sl, H1
00
-H2
00
,3.14(sl,H3
00
-H4
00
), 7.55 (s, H2
0
-H6
0
and
H3
0
-H5
0
), 7.82 (m, H5 and H6), 7.98 (m, H4 and H7);
13
C
NMR (50 MHz, CDCl
3
) d 29.87 (R
2
NCH
3
), 35.59 (C1
00
and C2
00
), 39.85 (C3
00
and C4
00
), 124.05 (C4 and C7), 126.37
(C2
0
and C6
0
), 128.14 (C3
0
and C5
0
), 131.80 (C3a and C7a),
133.03 (C1
0
), 134.76 (C5 and C6), 135.82 (C4
0
), 167.15 (C1
and C3), 170.95 (ArCONR
2
). IR (KBr) 2923 (n CH
3
),
1788 and 1712 (n C¼O), 1617 (n C¼O), 1491 (n N–C–O),
1388 (n C–N–C) cm
À1
. Anal. calcd for C
20
H
19
N
3
O
3
:C,
68.75; H 5.48; N, 12.03; O, 13.74. Found: C, 68.76; H 5.49;
N, 12.05; O, 13.75.
2 - [4 - (4 - Phenylhexahydro - 1 - pyrazinylcarbonyl)phenyl]-
1,3-isoindolinedione (4c). The title compound was
obtained as a yellow powder, in 97% yield, by conden-
sing 9 with 1-phenylpiperazine, as described above, mp
242–244
C.
1
H NMR (200 MHz, CDCl
3
) d 3.21 (sl,
H1
00
–H2
00
), 3.80 (m, H3
00
–H4
00
), 6.95 (d, J=8.58 Hz,
H2
000
and H6
000
), 7.44 (m, H3
000
,H4
000
and H5
000
), 7.58 (s,
H2
0
–H6
0
and H3
0
–H5
0
), 7.82 (m, H5 and H6), 7.99 (m,
H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz, CDCl
3
) d 29.83 (C1
00
and C2
00
), 49.93 (C3
00
and C4
00
), 116.92 (C2
000
and C6
000
),
120.82 (C4
000
), 124.04 (C4 and C7), 126.52 (C2
0
and C6
0
),
128.17 (C3
0
and C5
0
), 129.41 (C3
000
and C5
000
), 131.74
(C3a and C7a), 133.26 (C4
0
), 134.77 (C5 and C6), 135.13
(C1
0
), 151. 06 (C1
000
), 167.09 (C1 and C3), 169. 61
(ArCONR
2
). IR (KBr) 1780 and 1760 (n C¼O), 1736
and 1711 (n C¼O), 1633 (n C¼ O), 1461 (n N–C–O),
1379 (n C–N–C) cm
À1
. Anal. calcd for C
25
H
21
N
3
O
3
:C,
72.98; H 5.14; N, 10.21; O, 11.67. Found: C, 72.97; H
5.12; N, 10.22; O, 11.65.
2-[4-(1,4-Oxazinan-4-ylcarbonyl)phenyl]-1,3-isoindoline-
dione (4d). The title compound was obtained as a white
powder, in 87% yield, by condensing 9 with morpho-
line, as described above, mp 158–160
C.
1
HNMR
(200 MHz, DMSO-d
6
) d 3.62 (sl, H1
00
–H2
00
and H3
00
–
H4
00
), 7.56 (s, H2
0
–H6
0
and H3
0
–H5
0
), 7.95 (m, H4–H7
and H5–H6);
13
C NMR (50 MHz, DMSO-d
6
) d 66.38
(C1
00
and C2
00
), 66.56 (C3
00
and C4
00
), 123.98 (C4 and
C7), 127.67 (C2
0
and C6
0
), 128.13 (C3
0
and C5
0
), 132.00
(C3a and C7a), 133.37 (C4
0
), 135.26 (C5 and C6), 135.54
(C1
0
), 167.29 (C1 and C3), 168.90 (ArCONR
2
). IR
(KBr) 1786 and 1764 (n C¼O), 1740 and 1708 (n C¼O),
1625 (n C¼O), 1518 (n C–O–C), 1440 (n N–C–O), 1380
(n C–N–C) cm
À1
. Anal. calcd for C
19
H
16
N
2
O
4
: C, 67.85;
H 4.79; N, 8.33; O, 19.03; Found: C, 67.86; H 4.79; N,
8.31; O, 19.04.
2-[4-(1,4-Thiazinan-4-ylcarbonyl)phenyl]-1,3-isoindoline-
dione (4e). The title compound was obtained as a white
powder, in 81% yield, by condensing 9 with thio-
morpholine, as described above, mp 197–199
C.
1
H
NMR (200 MHz, CDCl
3
) d 2.64 (sl, H3
00
–H4
00
), 3.85 (sl,
H1
00
–H2
00
), 7.54 (s, H2
0
–H6
0
and H3
0
–H5
0
), 7.81 (m, H5
and H6), 7.96 (m, H4 and H7);
13
C NMR (50 MHz,
CDCl
3
) d 27.40 (C3
00
and C4
00
), 44.24 (C1
00
), 49.70 (C2
00
),
123.52 (C4 and C7), 126.10 (C2
0
and C6
0
), 127.33 (C3
0
and C5
0
), 131.20 (C3a and C7a), 132.71 (C4
0
), 134.30
(C5 and C6), 134.80 (C1
0
), 166.55 (C1 and C3), 169.43
(ArCONR
2
). IR (KBr) 1780 and 1761 (n C¼O), 1739
and 1715 (n C¼O), 1635 (n C¼O), 1459 (n N–C–O),
1379 (n C–N–C) cm
À1
. Anal. calcd for C
19
H
16
N
2
O
3
S:
C, 64.76; H 4.58; N, 7.95; O, 13.62; S, 9.10; Found: C,
64.77; H 4.59; N, 7.97; O, 13.61; S, 9.09.
Biological assays
Male BALB/c mice weighing 25–30 g (UFF, RJ, BR.)
were used throughout this study. Animals were main-
tained in a temperature-controlled room and received
water and food ad libitum. During all experiments mice
were care in accordance with published guidelines for
animal use in laboratory.
33
Mice were pretreated with
saline (vehicle) or 10 mg/kg of each compound ip,
45 min before LPS inhalation. The inhalation procedure
has been done as previously described.
4
After different
time intervals, airspaces were washed with saline to
provide 4 mL of bronchoalveolar lavage fluid (BALF).
Aliquots were used for evaluate the neutrophil number
and for TNF-a assay. TNF-a levels were determined
by a highly specific ELISA with a detection limit of
50 pg/mL. Results are expressed as meanÆ SEM of five
animals.
4
Acknowledgements
Thanks are due to CNPq (#52.0033/98–5), FAPERJ
(E-26/151.868/2000) and FUJB-UFRJ (BR.) for the
financial support of this work and to CNPq and CAPES
(BR.) for fellowships (LML, PC, ALM, CAMF, VLGM
and EJB). We are grateful to Analytical Center of NPPN
(UFRJ-BR) and Instituto de Quı
´
mica (UFRJ-BR).
References and Notes
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2. Ulich, T. R.; Watson, L. R.; Yin, S.; Guo, K.; Del Castillo,
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vassos, L. R.; Ferguson, M. A.; Almeida, I. C.; Gazzinelli,
R. T. Br. J. Pharmacol. 1999, 127, 1195.
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Cunha, F. Q.; Teixeira, M. M. Eur. J. Pharmacol. 2000, 399,243.
32. Bourguignon, J. J.; Desaubry, L.; Raboisson, P.; Wer-
muth, C. G.; Lugnier, C. J. Med. Chem. 1997, 40, 1768.
33. Zimmermann, M. Pain 1983, 16, 109.
L. M. Lima et al. / Bioorg. Med. Chem. 10 (2002) 3067–3073 3073
Título da Invenção: USO DE COMPOSTOS UREÍDICOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
CONTENDO OS MESMOS, NO TRATAMENTO DE DOENÇAS DE ORIGEM INFLAMATÓRIA E COMO
INIBIDORES DA PROTEÍNA QUINASE ATIVADA POR MITÓGENO P-38 (MAPK p-38)
Continuação do item Inventor
Inventor (1)
Nome: ELIEZER JESUS DE LACERDA BARREIRO
Qualificação: PROFESSOR UNIVERSITÁRIO
Endereço: RUA HADDOCK LOBO, No. 35 /APT 603, TIJUCA/ RIO DE JANEIRO/RJ/BRASIL
Cep: 20260-130 Telefone: 2273-3890
Nac: BRASILEIRO Dt. Nasc.: 23/05/1947
CPF: 202751707-30
Inventor (2)
Nome: LÍDIA MOREIRA LIMA
Qualificação: PROFESSORA UNIVERSITÁRIA
Endereço: Av. PARANAPUAM 1129/ APT 204, TAUÁ/ILHA GOVERNADOR/ RIO DE JANEIRO/RJ/BRASIL
Cep: 21910-000 Telefone: 2465-1535
Nac: BRASILEIRA Dt. Nasc.: 03/08/1972
CPF: 022122037-21
Inventor (3)
Nome: GILBERTO MARCELO SPERÂNDIO DA SILVA
Qualificação: FARMACÊUTICO
Endereço: RUA FREDERICO DE CASTRO PEREIRA No. 985/CASA 4, JARDIM TROPICAL/NOVA
IGUAÇU/RJ/BRASIL
Cep:26011-370 Telefone: 2768-3625
Nac: BRASILEIRO Dt. Nasc.: 28/06/1972
CPF: 018132307-90
Inventor (4)
Nome: FÁTIMA MEDEIROS DE CARVALHO
Qualificação: ESTUDANTE
Endereço: RUA DA FLORESTA No. 1030, SEPETIBA, RIO DE JANEIRO/RJ/BRASIL
Cep:23540-158 Telefone: 3317-7938
Nac: BRASILEIRA Dt. Nasc.: 10/11/1979
CPF: 05436749755
Página: 1
Título da Invenção: USO DE COMPOSTOS UREÍDICOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
CONTENDO OS MESMOS, NO TRATAMENTO DE DOENÇAS DE ORIGEM INFLAMATÓRIA E COMO
INIBIDORES DA PROTEÍNA QUINASE ATIVADA POR MITÓGENO P-38 (MAPK p-38)
Continuação do item Inventor
Inventor (4)
Nome: LUIS EDUARDO MENEZES QUINTAS
Qualificação: PROFESSOR UNIVERSITÁRIO
Endereço: Av. DOS MANANCIAIS, 470, APT. 104, BLOCO 01, RIO DE JANEIRO/RJ/BRASIL
Cep: 22720-410 Telefone: 2562-6732
Nac: BRASILEIRA Dt. Nasc.: 18/06/1971
CPF: 025400187-42
Inventor (5)
Nome: ALEXANDRE LÉGORA MACHADO
Qualificação: MÉDICO
Endereço: Avenida Teixeira de Castro 64/301, Bonsucesso, Rio de Janeiro.
Cep: 21040-110 Telefone: 3868 9029
Nac: BRASILEIRO Dt. Nasc.: 19/09/1974
CPF: 036691877-07
Inventor (6)
Nome: VERA LÚCIA GONCALVES KOATZ
Qualificação: PROFESSORA UNIVERSITÁRIA
Endereço: RUA NINA RODRIGUES 69/302, JARDIM BOTANICO, RIO DE JANEIRO/RJ/BRASIL
Cep: 22461-100 Telefone: 2539-3681
Nac: BRASILEIRA Dt. Nasc.: 01/10/1948
CPF: 296254167-49
Página: 2
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