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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação das variáveis analíticas dos métodos de determinação do teor de
taninos totais baseados na formação de complexos com substâncias protéicas
e derivados da polivinilpirrolidona
SIMONE GASPARIN VERZA
PORTO ALEGRE, 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação das variáveis analíticas dos métodos de determinação do teor de
taninos totais baseados na formação de complexos com substâncias protéicas
e derivados da polivinilpirrolidona
Dissertação apresentada por Simone
Gasparin Verza para obtenção do GRAU DE
MESTRE em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Prof. Dr. George González Ortega
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, em nível de Mestrado da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 12 de abril de 2006 pela
Comissão/Banca Examinadora constituída por:
Profa. Dr. Gilsane Lino von Poser
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dr. Osvaldo de Freitas
Universidade São Paulo
Profa. Dr. Valquiria Linck Bassani
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
V574a Verza, Simone Gasparin
Avaliação das variáveis analíticas dos métodos de determinação do
teor de taninos totais baseados na formação de complexos com
substâncias protéicas e derivados da polivinilpirrolidona / Simone Gasparin
Verza – Porto Alegre : UFRGS, 2006. - xxviii, 134 p.: il., gráf., tab.
Dissertação(mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa de
Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Taninos. 2. Métodos analíticos. 3. Complexação. 4. Caseína. 5. Pó-
de-pele. 6. CLAE. 7. PVPP. I. González Ortega, George. II. Título.
CDU:615.4
Bibliotecária responsável:
Margarida Maria C. F. Ferreira, CRB10/480
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Desenvolvimento Galênico, empregando também
equipamentos da Central Analítica e do Laboratório
de Química Farmacêutica, com suporte financeiro
concedido pelo CNPq a quem expresso nossos
agradecimentos.
“Descobri como é bom chegar quando se tem paciência, e para chegar onde
quer que seja, aprendi que não é preciso dominar a força, mas a razão. É
preciso antes de mais nada, querer.”
Amyr Klink
Agradecimentos
Ao meu orientador, Professor Dr. George González Ortega, pela acolhida,
pela confiança, orientação, incentivo e exemplo profissional.
Aos professores Dr. Pedro Ros Petrovick, Dra. Valquíria Linck Bassani e Dr.
Paulo Mayorga, pelo apoio e contribuição para meu crescimento profissional e pela
ética profissional.
Aos amigos de laboratório o meu muito obrigada, pelo aprendizado e pela
amizade, em especial, Ana Paula, Angélica, Bárbara, Camila, Daniel, Elias,
Francilene, Gizele, Greice, Gustavo Petrovick, Iguatinã, Janine, Juliana, Liége,
Luana, Maria Kreinecker, Mariana Meurer, Maribete, Olívia, Paula, Rafael, Renata,
Roberta, Samuel e Tiago Sausen. Em particular, ao Cabral, pelo aprendizado e
ajuda técnica. Aos bolsistas de iniciação científica: Gustavo Borré, Lísias, Luana,
Maria, Mariana Petry, Paula, Thiago e em particular Vinícius, pela ajuda no trabalho
experimental. Contem sempre comigo!
À todos os colegas e professores deste programa de Pós-Graduação pela
convivência e disponibilidade sempre que necessário.
À colega e amiga Maria Luisa que me auxiliou e incentivou para que eu
ingressasse na Pós-Graduação e aos amigos que trago comigo pelo carinho,
amizade e compreensão.
À minha família que me apoiou incondicionalmente e com amor me
acompanhou, durante esse percurso, em especial, minha mãe, Lourdes, meu pai,
Severino e minha irmã Daniela.
E finalmente, ao meu querido Daniel, pelo amor, carinho, apoio e
companheirismo em todos os momentos difíceis, sem o quais essa trajetória não
seria a mesma.
Sumário
Lista de Tabelas.. .......................................................................................................xv
Lista de Figuras ......................................................................................................xvii
Lista de Anexos........................................................................................................ xxi
Lista de Abreviaturas...................................................................................................xx
Resumo ................................................................................................................... xxv
Abstract ..................................................................................................................xxvii
1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA DO TEMA ........................................................... 1
2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 5
2.1 Objetivo Geral....................................................................................................... 7
2.2 Objetivos específicos............................................................................................ 7
3. REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 9
3.1 Taninos: estrutura e classificação ...................................................................... 11
3.2 Atividades farmacológicas.................................................................................. 13
3.3 Métodos de doseamento de taninos................................................................... 14
3.3.1 Métodos de oxi-redução com formação de complexo ..................................... 15
3.3.2 Métodos baseados na precipitação de proteínas ............................................ 16
3.3.2.1 Complexação de polifenóis com pó-de-pele e caseína ................................ 22
3.3.3 Complexação com derivados da povidona...................................................... 24
3.3.4 Aspectos analíticos por CLAE ......................................................................... 27
3.4 Validação de métodos analíticos........................................................................ 29
4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 31
x
4.1 Materiais............................................................................................................. 33
4.1.1 Matéria-prima vegetal...................................................................................... 33
4.1.2 Reagentes, solventes e substâncias de referência. ........................................ 33
4.1.3 Agentes precipitantes ...................................................................................... 33
4.1.4 Aparelhos equipamentos e materiais diversos ................................................ 33
4.2 Métodos.............................................................................................................. 34
4.2.1 Caracterização da matéria-prima vegetal........................................................ 34
4.2.1.1 Identificação botânica................................................................................... 34
4.2.1.2 Secagem e moagem do material vegetal ..................................................... 34
4.2.1.3 Determinação da perda por dessecação...................................................... 34
4.2.2 Preparo da solução extrativa para análise do teor de taninos......................... 35
4.2.3 Caracterização da solução extrativa para análise do teor de taninos.............. 35
4.2.3.1 Análise cromatográfica qualitativa de taninos condensados e
hidrolisáveis.............................................................................................. 35
4.2.3.2 Determinação do pH..................................................................................... 36
4.2.3.3 Determinação do resíduo seco..................................................................... 36
4.2.4 Preparação do produto seco liofilizado............................................................ 36
4.2.5 Caracterização do produto seco liofilizado ...................................................... 37
4.2.5.1 Determinação da perda por dessecação...................................................... 37
4.2.5.2 Análise cromatográfica qualitativa de taninos condensados e
hidrolisáveis.............................................................................................. 37
4.2.6 Caracterização das substâncias de referência ................................................ 37
xi
4.2.6.1 Espectroscopia no ultravioleta...................................................................... 37
4.2.6.2 Espectroscopia no infravermelho ................................................................. 37
4.2.6.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) .................................................. 38
4.2.7 Caracterização dos agentes complexantes..................................................... 38
4.2.7.1 Caseína grau técnico e caseína purificada................................................... 38
4.2.7.2 Derivados de PVPP...................................................................................... 38
4.2.8 Avaliação das variáveis analíticas de métodos para determinação do teor
de taninos totais utilizando agentes precipitantes protéicos .......................... 39
4.2.8.1 Preparo dos reagentes ................................................................................. 39
4.2.8.2 Determinação dos polifenóis totais............................................................... 40
4.2.8.2.1 Estabelecimento da região de comportamento linear................................ 40
4.2.8.3 Quantificação da fração não-tanante............................................................ 40
4.2.8.4 Seleção da substância de referência............................................................ 41
4.2.8.5 Curva de calibração do pirogalol (substância de referência) ........................ 41
4.2.8.6 Curva de calibração para polifenóis totais e fração não-tanante da
solução extrativa ......................................................................................... 41
4.2.8.7 Cálculo do teor de taninos ............................................................................ 42
4.2.8.8 Reprodutibilidade para o método de doseamento do teor de taninos
totais ........................................................................................................... 42
4.2.8.9 Repetibilidade para o método de doseamento do teor de taninos totais ...... 43
4.2.8.10 Comparação entre o reagente de Folin-Ciocalteu e o reagente de
Folin-Denis ............................................................................................... 43
4.2.8.11 Quantificação de taninos mediante uso de pó-de-pele............................... 43
xii
4.2.8.12 Avaliação da especificidade da formação de complexos entre derivados
protéicos e taninos através de método espectrofotométrico e por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)........................................ 44
4.2.9 Caracterização físico-química dos complexos PVPP-substância de
referência .................................................................................................... 45
4.2.9.1 Preparo das soluções de referência ............................................................. 45
4.2.9.2 Seleção do comprimento de onda para leitura ............................................. 45
4.2.9.3 Preparo das dispersões de PVPP ................................................................ 45
4.2.9.4 Avaliação do perfil de complexação das diferentes PVPP ........................... 45
4.2.9.5 Avaliação da complexação entre substâncias de referência e PVPP-
P6755 mediante calorimetria exploratória diferencial (DSC)....................... 46
4.2.9.6 Efeito da purificação ácida da PVPP-P6755 sobre a capacidade
complexante ............................................................................................. 46
4.2.9.7 Avaliação da influência do pH na estabilidade dos complexos PVPP-
catequina..................................................................................................... 47
4.2.9.8 Avaliação da especificidade da formação de complexos entre PVPP-
P6755 e substâncias de referência por método espectrofotométrico e
por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .................................... 48
4.2.10 Complexação de taninos de Psidium guajava com PVPP-P6755 ................. 48
4.2.10.1 Seleção da substância de referência.......................................................... 48
4.2.10.2 Curva de calibração da catequina (substância de referência) .................... 48
4.2.10.3 Determinação dos polifenóis totais............................................................. 49
4.2.10.4 Quantificação da fração não-tanante com PVPP-P6755............................ 49
4.2.10.5 Cálculo do teor de taninos .......................................................................... 49
xiii
4.2.10.6 Avaliação da formação de complexos entre taninos da droga vegetal e
PVPP-P6755 por CLAE............................................................................ 49
4.2.11 Análise comparativa dos teores de taninos totais, calculados mediante
utilização de caseína, pó-de-pele e PVPP-6755......................................... 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 51
5.1 Caracterização da matéria-prima vegetal........................................................... 53
5.2 Preparo e caracterização da solução extrativa para análise do teor de
taninos.............................................................................................................. 53
5.2.1 Análise cromatográfica qualitativa de taninos condensados e hidrolisáveis.... 54
5.3 Preparação e caracterização do produto seco liofilizado ................................... 55
5.4 Caracterização das substâncias de referência................................................... 56
5.4.1 Espectroscopia no ultravioleta......................................................................... 56
5.4.1 Espectroscopia no ultravioleta......................................................................... 56
5.4.2 Espectroscopia no infravermelho..............................................................................57
5.4.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ..................................................... 57
5.5 Caracterização dos agentes complexantes........................................................ 58
5.6 Avaliação das variáveis analíticas de métodos para determinação do teor de
taninos totais utilizando agentes complexantes protéicos................................ 59
5.6.1 Comprimento de onda de leitura e tempo de leitura........................................ 59
5.6.2 Quantidade e tipo de reagente de oxi-redução................................................ 60
5.6.3 Seleção do tipo e da quantidade de caseína a ser utilizada............................ 64
5.6.4 Estudos da especificidade da caseína e do pó-de-pele ao reagir com
taninos ........................................................................................................... 68
xiv
5.7 Caracterização físico-química dos complexos PVPP-substância de
referência....................................................................................................... 76
5.7.1 Avaliação do perfil de complexação das diferentes PVPP .............................. 76
5.7.2 Avaliação da complexação entre substâncias de referência e PVPP-P6755
através de calorimetria exploratória diferencial (DSC)................................... 79
5.7.3 Efeito da purificação ácida da PVPP-P6755 sobre a capacidade
complexante .................................................................................................. 86
5.7.4 Efeito do pH sobre a capacidade complexante ............................................... 86
5.7.5 Avaliação da especificidade da formação de complexos entre diferentes
PVPP e substâncias de referência ................................................................ 88
5.8 Complexação de taninos de Psidium guajava com PVPP-P6755 ...................... 92
5.8.1 Curva de calibração......................................................................................... 92
5.8.2 Complexação de taninos de Psidium guajava com PVPP-P6755 ................... 94
5.9 Análise comparativa dos teores de taninos totais, calculados mediante
utilização de caseína, pó-de-pele e PVPP-P6755............................................ 97
5.9.1 Efeito da substância de referência no cálculo do teor de taninos totais .......... 97
5.9.2 Efeito do agente complexante ......................................................................... 98
6. CONCLUSÕES: ..................................................................................................101
7. REFERÊNCIAS ...................................................................................................105
8. ANEXOS..............................................................................................................117
Lista de Tabelas
Tabela 1. Resumo dos métodos por CLAE de determinação de taninos e
monômeros de taninos hidrolisáveis e condensados............................. 28
Tabela 2. Soluções e condições utilizadas para avaliação da influência do pH
sobre a formação de complexos entre derivado da povidona cruzada
e catequina ............................................................................................ 47
Tabela 3. Valores de pH obtidos para os derivados da PVPP............................... 59
Tabela 4. Resultados da análise de regressão linear das curvas analíticas do
pirogalol, com 2,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu........................... 61
Tabela 5. Resultado da análise de regressão linear da curva analítica obtida
para o pirogalol, a partir da comparação das curvas ............................. 62
Tabela 6. Resultados da análise de regressão linear da curva analítica do
pirogalol, com 1,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu........................... 62
Tabela 7. Resultados obtidos com a utilização do reagente de Folin-Denis
após 2 e 30 minutos da adição de solução de carbonato de sódio,
para polifenóis totais e fração não-tanante ............................................ 64
Tabela 8. Resultados obtidos para os parâmetros de validação do método de
determinação do teor de taninos totais de Psidium guajava.................. 66
Tabela 9. Resultados da análise de regressão linear das curvas analíticas
obtidas para polifenóis totais e fração não-tanante com o reagente
de Folin-Ciocalteu .................................................................................. 67
Tabela 10. Percentual de ácido gálico, catequina e flavonóides de Psidium
guajava complexados com diferentes quantidades de caseína e pó-
de-pele................................................................................................... 75
Tabela 11. Comparação entre os parâmetros térmicos observados para o ácido
gálico e a PVPP-P6755 e da mistura na proporção ponderal 1:1, 1:5,
1:10........................................................................................................ 81
xvi
Tabela 12. Comparação entre os parâmetros térmicos observados para o
pirogalol e PVPP-P6755 e suas misturas nas proporções ponderais
1:1, 1:5, 1:10.......................................................................................... 82
Tabela 13. Comparação entre os parâmetros térmicos observados para a
catequina e PVPP-P6755 e suas misturas nas proporções ponderais
1:1, 1:5, 1:10.......................................................................................... 85
Tabela 14. Percentuais de ácido gálico + pirogalol, catequina e rutina
complexados à diferentes quantidades de PVPP-P6755....................... 92
Tabela 15. Resultados da análise de regressão linear das curvas analíticas da
catequina ............................................................................................... 93
Tabela 16. Resultados da análise de regressão linear da curva analítica obtida
para catequina, a partir da comparação das curvas .............................. 94
Tabela 17. Percentual de ácido gálico, catequina e flavonóides de Psidium
guajava complexados com diferentes quantidades de PVPP-P6755. ... 96
Tabela 18. Teor de taninos obtido com a utilização de diferentes concentrações
de caseína, pó-de-pele e PVPP-P6755 ................................................. 98
Lista de Figuras
Figura 1. Estrutura dos taninos hidrolisáveis. ....................................................... 11
Figura 2. Monômeros de taninos condensados .................................................... 12
Figura 3. Estrutura molecular do aminoácido prolina e da PVPP. ........................ 27
Figura 4. Representação esquemática do cromatograma obtido mediante
análise de taninos nas amostras de Psidium guajava. .......................... 55
Figura 5. Espectros de absorção no UV das substâncias de referência, ácido
gálico, ácido tânico, catequina e pirogalol. ............................................ 56
Figura 6. Espectros de absorção na região do visível para a solução extrativa
de Psidium guajava e solução aquosa de pirogalol, após adição de
2,0 e 1,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu......................................... 63
Figura 7. Valores de absorvância da fração residual da solução extrativa de
Psidium guajava em função da quantidade de caseína purificada. ....... 65
Figura 8. Valores de absorvância da fração residual da solução extrativa de
Psidium guajava em função da quantidade de caseína GT................... 65
Figura 9. Cromatogramas obtidos para ácido gálico, pirogalol, catequina e
rutina...................................................................................................... 69
Figura 10. Espectros no UV do ácido gálico, pirogalol, catequina e rutina,
obtidos a partir do cromatograma da figura 9. ....................................... 69
Figura 11. Cromatograma obtido para a solução extrativa de Psidium guajava
L. Detecção em 280 nm......................................................................... 70
Figura 12. Espectros no UV obtidos do cromatograma da figura 11....................... 70
Figura 13. Cromatograma obtido para a solução extrativa de Psidium guajava.
Detecção em 352 nm............................................................................. 71
Figura 14. Espectros no UV obtidos para os picos 1,2,3,4,5 e 6 da figura 13. ....... 71
xviii
Figura 15. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos após tratamento com
400,0 mg de caseína. ............................................................................ 72
Figura 16. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos após tratamento com
1600 mg de caseína.. ............................................................................ 73
Figura 17. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos após tratamento com
100,0 mg de pó-de-pele......................................................................... 74
Figura 18. Complexação de ácido gálico, ácido tânico, catequina, pirogalol e
solução extrativa com as diferentes PVP............................................... 77
Figura 19. Termogramas obtidos por DSC para o ácido gálico e PVPP-P6755,
assim como para suas misturas nas proporções ponderais 1:1, 1:5 e
1:10........................................................................................................ 80
Figura 20. Termogramas obtidos por DSC para o pirogalol e PVPP-P6755,
assim como para suas misturas nas proporções ponderais 1:1, 1:5 e
1:10........................................................................................................ 82
Figura 21. Termogramas obtidos por DSC para a catequina e PVPP-P6755
assim como para suas misturas nas proporções ponderais 1:1, 1:5 e
1:10........................................................................................................ 84
Figura 22. Influência da purificação ácida da PVPP-P6755 sobre a fração de
catequina ligada..................................................................................... 86
Figura 23. Influência do pH sobre a fração de catequina ligada à PVPP-P6755 .... 87
Figura 24. Complexação de rutina com as diferentes PVPP. ................................. 89
Figura 25. Complexação de solução contendo catequina e rutina com PVPP-
P6755. ................................................................................................... 89
Figura 26. Estrutura molecular da catequina e da rutina. ....................................... 90
Figura 27. Complexação de solução contendo pirogalol e rutina com PVPP-
P6755. ................................................................................................... 91
xix
Figura 28. Perfil de complexação para a solução extrativa de Psidium guajava
em função da concentração PVPP-P6755, expresso como taninos
totais, com determinação em 760 nm.................................................... 95
Figura 29. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos sem tratamento e após
tratamento com 150,0 mg de PVPP-P6755........................................... 96
Lista de Anexos
Tabela 1A. Preparação da Amostra........................................................................118
Tabela 1B. Polifenóis Totais ...................................................................................119
Tabela 1C. Fração não-tanante – polifenóis não adsorvidos pelo pó-de-pele ........120
Tabela 1D. Solução de Referência..........................................................................121
Tabela 1E. Cálculos................................................................................................122
Tabela 1F. Soluções Reagentes .............................................................................123
Figura 1A. Espectro na região do infravermelho do ácido gálico. ..........................125
Figura 1B. Espectro na região do infravermelho do ácido tânico ...........................125
Figura 1C. Espectro na região do infravermelho da catequina...............................126
Figura 1D. Espectro na região do infravermelho do pirogalol.................................126
Figura 1E. Espectro na região do infravermelho das PVPP...................................127
Tabela 2A. Valores médios da absorvância e CV % obtidos para a fração não-
tanante com caseína purificada durante três dias de análise, em
triplicata. ...............................................................................................127
Tabela 3A. Valores médios da absorvância e CV % obtidos para a fração não-
tanante com caseína grau técnico durante três dias de análise, em
triplicata. ...............................................................................................128
Tabela 4A. Absorvâncias obtidas para a solução extrativa e fração não-tanante
de Psidium guajava antes e após a adição de rutina............................128
Tabela 5A. Áreas dos picos de ácido gálico, catequina e flavonóides
complexados com diferentes quantidades de caseína e pó-de-pele ....129
Tabela 6A.
Absorvâncias obtidas na complexação de diferentes PVPP com
ácido gálico, ácido tânico, catequina, pirogalol e solução extrativa. .....130
xxii
Tabela 7A. Valores de absorvância obtidos para a utilização de PVPP-P6755
purificada e não purificada quando complexada com catequina.. ........131
Tabela 8A. Valores de absorvância obtidos para a complexação de catequina
com suspensão de PVPP-P6755 em diferentes valores de pH............131
Tabela 9A. Valores de absorvância obtidos pela adição de dispersões de PVPP-
P6755 à rutina em diferentes concentrações........................................131
Tabela 10A. Valores de absorvância obtidos para uma solução de catequina e
rutina quando complexada com dispersões de diferentes
concentrações de PVPP-P6755.........................................................132
Tabela 11A. Valores de absorvância obtidos para uma solução de pirogalol e
rutina quando complexada com dispersões de diferentes
concentrações de PVPP-P6755.........................................................132
Tabela 12A. Áreas dos picos de ácido gálico + pirogalol, catequina e rutina
complexados com diferentes quantidades de PVPP-P6755.. ............132
Tabela 13A. Valores de absorvância obtidos para a solução extrativa de
Psidium guajava sem o tratamento com PVPP-P6755 e após o
tratamento com diferentes quantidades de PVPP-P6755.. ................133
Tabela 14A. Áreas dos picos de ácido gálico, catequina e flavonóides de
Psidium guajava complexados com diferentes quantidades de
PVPP-P6755. ....................................................................................134
Introdução
Lista de Abreviaturas
AG: ácido gálico
AT: ácido tânico
CAT: catequina
FCL: fração de catequina ligada
FNT: fração não-tanante
GT: grau técnico
Piro: pirogalol
PT: polifenóis totais
PVPP: polivinilpirrolidona
PVPP-P6755: polivinilpirrolidona Sigma
Rut: rutina
SE: solução extrativa
SP: solução dos padrões
T
máx.
: temperatura máxima
T
onset
: temperatura de onset
TT: taninos totais
Resumo
O presente trabalho objetivou estudar as principais variáveis analíticas associadas
aos métodos espectrofotométricos de quantificação do teor de taninos utilizando
caseína e pó-de-pele, os reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu, bem como a
avaliação de diferentes tipos de PVPP (Divergan® F, Divergan® RS, Kollidon® CL e
PVPP-P6755) na substituição dos substratos protéicos. Para tanto, dois métodos de
análise, um espectrofotométrico e outro por CLAE foram desenvolvidos, utilizando os
polifenóis catequina, ácido tânico, ácido gálico e pirogalol como substâncias de
referência e rutina como flavonóide modelo. Para maiores inferências uma solução
extrativa de folhas secas de Psidium guajava L também foi quantificada. A análise
comparativa assinalou o uso vantajoso do reagente de Folin-Ciocalteu, em relação
ao reagente de Folin-Denis. Em termos de reprodutibilidade, a caseína grau técnico
(GT) mostrou-se superior à caseína purificada, embora essa última possua maior
afinidade pelos polifenóis testados. Contudo, as análises por UV-VIS e por CLAE em
comprimentos de onda de 280m e 352 nm, demonstraram que tanto a caseína GT
quanto o pó-de-pele não são seletivos para complexar taninos, de acordo com as
normas do ICH. Tanto o pó-de-pele quanto a caseína GT foram capazes de
complexar polifenóis e rutina de maneira inespecífica. Isso foi evidenciado quando
misturas de um único polifenol e rutina ou a fração flavonoídica de P. guajava foram
testadas. A capacidade de complexação de polifenóis e rutina por parte da PVPP foi
avaliada por UV-VIS, DSC e CLAE. Os melhores resultados foram observados para
PVPP-P6755, no entanto com restrições. De maneira similar a caseína GT e pó-de-
pele a PVPP-P6755 foram capazes de complexar de maneira inespecífica rutina e
outros flavonóides do extrato de P. guajava. Uma validação plena para o caso
específico de folhas de P. guajava é questionável. No entanto, o método baseado na
utilização de PVPP mostrou-se passível de padronização utilizando 500,0 mg de pó
de droga, 2,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, tempo de leitura 30 min após
adição desse reagente e quantificação em 760 nm. Sob essas condições, a análise
comparativa demonstrou que 50,0 mg de PVPP foram, em termos analíticos,
equivalentes a 100,0 mg de pó-de-pele ou a 750 mg de caseína GT.
Palavras-chave: taninos, métodos analíticos, complexação, caseína, pó-de-pele,
PVPP, CLAE.
Abstract
Evaluation of analytical variables of methods for total tannins determination based
on complexation with proteins and polyvinylpyrrolidone
This work aims the study of the main analytical variables related to spectrophotometric
assay of the tannin content using casein and hide powder, Folin-Denis and Folin-
Ciocalteu reagents, as well as the evaluation of different PVPP types (Divergan® F,
Divergan® RS, Kollidon® CL and PVPP-P6755®) as substitutes of these protein
substrates. For comparison purposes, a HPLC method and a spectrophotometric method
were developed using the polyphenols catechin, tanic acid, galic acid and pyrogallic acid
as reference substances and rutin as a flavonoid model. In order to obtain more
extensive inferences, a Psidium guajava L leaves aqueous extract was also assayed.
The analytical comparisons showed that the Folin-Ciocalteu reagent was better than
Folin-Denis ones. The use of technical grade casein (TG) led to more reproducible
results in comparison to the purified casein, although the last one had more affinity for
the tested polyphenols. The UV-VIS and HPLC analysis carried out at 280nm and 352nm
did not fulfill the specificity criterium, according to the ICH validation guidelines. Both hide
powder and casein-TG were able to bind polyphenols and rutin in an unspecific way,
either when single polyphenol and rutin mixtures or the P. guajava flavonoid fraction
were assayed. The PVPP binding capability for polyphenols and rutin was compared by
means of UV-VIS, DSC and HPLC. The better result was assigned to the PVPP-P6755,
but with some restrictions. Similarly to casein-TG and hide powder, PVPP-P6755 was
also able to bind in an unspecific way rutin and other flavonoids from a P. guajava
aqueous extract. Strictly speaking, the full validation of a method for the tannin content
assay becomes questionable. However, the method standardization based on the use of
PVPP-P6755 appears to be possible by using of 500,0 mg of drug powder, 2.0 mL of
Folin-Ciocalteu reagent, an scan time of 30 min after addition of this reagent and
detection at 760 nm. Under these experimental conditions, a comparative analysis
showed that 50.0 mg PVPP-P6755 was analytically equivalent to100.0 mg of hide
powder or 750.0 mg of casein-TG.
Keywords: tannin, analytical methods, complexation, casein, hide powder, PVPP,
HPLC.
1. INTRODUÇÃO
Introdução
3
Como metabólitos secundários, os taninos são compostos fenólicos de
grande interesse econômico e ecológico. A sensação adstringente provocada por
vinhos, sucos de frutas, chás e outras bebidas está relacionada, em grande parte,
aos taninos. Ao precipitar as proteínas ricas em prolina presentes na saliva, ocorre a
perda do poder lubrificante (BRUNETON, 2001; CHARLTON et al., 2002; SANTOS;
MELLO, 2003; SIMON et al., 2003). A maior parte das propriedades biológicas dos
taninos, dentre elas, cicatrizante de feridas e queimaduras, em casos de úlcera
gástrica e a ação bactericida e fungicida, se deve ao poder que possuem de formar
complexos com íons metálicos e macromoléculas, especialmente protéicas
(MARTINS, 1998; BRUNETON, 2001; SANTOS; MELLO, 2003; MONTEIRO et al.,
2005). Neste contexto, os taninos têm sido amplamente empregados como
substâncias marcadoras para a avaliação da qualidade de diversas matérias-primas
vegetais (SOARES, 2002; SANTOS; MELLO, 2003).
O fundamento original dos métodos de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu,
preconizados para a determinação do teor de taninos é basicamente o mesmo. No
entanto, a análise comparativa de diversos métodos oficiais (Ph. Eur., 2002; BP,
2001; DAB, 1998; F. Bras. 1988), realizada em fase prévia ao presente trabalho,
revela que existem diferenças em termos de técnica, em parâmetros tais como,
composição de reagentes, tempo ótimo de leitura e comprimento de onda (ANEXO-
tabela 1A até 1F). A suscetibilidade do complexo tanino-proteína a fatores tais como:
temperatura, pH, proporção tanino:agente complexante, massa molecular,
solubilidade do complexo e a própria variabilidade do teor de taninos na amostra
estão amplamente documentados na literatura.
Estas constatações respaldam a necessidade de uma abordagem analítica
diferenciada, baseada na revisão sistemática das diferentes variáveis de interesse, e
tendo como finalidade última a padronização e validação do método de quantificação
de taninos. Uma segunda abordagem plausível é a de explorar as possibilidades
analíticas de um método diferente, baseado na formação de complexos insolúveis,
não-protéicos, com derivados insolúveis da PVPP. Sobre este tema há relativamente
poucos trabalhos relatados.
SOARES (2002), ao avaliar a capacidade de complexação de derivados
insolúveis da povidona (Kollidon® CL e Kollidon® CL-M), observou que esses são
capazes de remover os taninos de forma eficaz, porém, sem chegar a conclusões
Introdução
4
definitivas. No presente trabalho, realizou-se uma avaliação mais aprofundada das
potencialidades analíticas relativas ao uso de novos derivados da PVPP como
agentes complexantes de taninos. Fez-se ainda uma análise comparativa com o
objetivo de avaliar a especificidade do pó-de-pele, caseína e PVPP frente a
substâncias de referência comumente utilizadas para expressar o teor de taninos e
frente a flavonóides. Além das substâncias de referência, a análise comparativa
inclui uma solução extrativa de folhas de Psidium guajava, espécie rica em
elagitaninos e taninos complexos (elagitaninos associados a uma unidade de tanino
condensado) (LANS et al., 2000; SANTOS; MELLO, 2003). Psidium guajava é
amplamente distribuída e empregada na medicina popular (WHO, 1998; LOZOYA et
al., 2002; GONÇALVES et al., 2005) sendo utilizada nesse trabalho como modelo de
extrato vegetal.
2. OBJETIVOS
Objetivos
7
2.1 Objetivo Geral
Analisar comparativamente o uso dos agentes complexantes caseína e pó-
de-pele na determinação do teor de taninos, com ênfase nos estudos de
especificidade frente às substâncias de referência e presença de flavonóides, assim
como analisar as possibilidades de introdução da povidona reticulada (PVPP), com a
mesma finalidade analítica.
2.2 Objetivos específicos
i) Analisar dois métodos espectrofotométricos oficiais de quantificação de
taninos comparando os reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu, selecionando um
deles.
ii) Analisar comparativamente as caseínas purificada e grau técnico como
agentes complexantes, estabelecendo parâmetros analíticos de padronização e de
validação.
iii) Aplicar o método validado, baseado na utilização de caseína, na
determinação do teor de taninos totais de um extrato padronizado de Psidium
guajava, comparando-o com o método oficial descrito na Ph. Eur. (2002).
iv) Avaliar propriedades físico-químicas da reação de complexação de
substâncias de referência com vários polímeros reticulados da povidona (PVPP) e
estabelecer condições experimentais que permitam selecionar o derivado da PVPP
com o melhor perfil na formação de complexos.
v) Desenvolver um método por cromatografia líquida de alta eficiência que
permita separar os taninos dos demais compostos polifenólicos presentes no extrato
vegetal de Psidium guajava.
vi) Avaliar por CLAE-PDA a especificidade do derivado de PVPP selecionado,
bem como a dos agentes precipitantes protéicos, pó-de-pele e caseína.
Objetivos
8
vii) Propor as linhas gerais de um método de doseamento de taninos para a
matéria-prima vegetal de P. guajava L., baseado na complexação com o derivado
selecionando da PVPP, comparando os resultados com os obtidos a partir do
método oficial descrito na Ph. Eur. (2002).
3. REFERENCIAL TEÓRICO
Referencial Teórico
11
3.1 Taninos: estrutura e classificação
Taninos são substâncias polifenólicas complexas, e de acordo com suas
estruturas químicas, são divididos em dois grupos nas plantas terrestres: taninos
hidrolisáveis e taninos condensados (BRUNETON, 2001; SANTOS; MELLO, 2003).
Existem ainda os florotaninos, presentes em algas pardas (SWANSON; DRUEHL,
2002; NAGAYAMA et al., 2003; JORMALAINEN et al., 2005).
Os taninos hidrolisáveis são ésteres de um açúcar (central) e de ácidos
fenólicos, principalmente ácidos gálico e elágico e seus derivados. Os galotaninos
resultam da união entre unidades de ácido gálico e um poliol. Os elagitaninos
possuem um ou dois resíduos de hexa-hidroxidifenoila-D-glicose (HHDP) unidos a
um açúcar central (Figura 1). Pode ocorrer a oxidação de HHDP a desidro-
hexaidroxidifenoila (DHHDP) que é característico dos desidroelagitaninos (COSTA,
1994; BRUNETON, 2001; HARVEY, 2001; SANTOS; MELLO, 2003).
Figura 1. Estrutura dos taninos hidrolisáveis.
O
O
OH
O
O
HO
OH
OH
O
O
O
OH
OHOH
OH
OH
O
O
O
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
O
HO
HO
Tanino
g
álico
Ácido
g
álico
Ácido elágico
Tanino elágico
COO H
OH
HO OH
OH
HO
OH
OH
HO
O
OH
O
O
O
O
OH
O
O
HO
O
O
O
OH
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
HO
HO
O
O
O
OH
OH
OH
Referencial Teórico
12
Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela
policondensação de duas ou mais unidades flavan-3-ol, tais como catequina ou
epicatequina, respectivamente unidas por pares de ligações C
4
→C
8
ou C
4
→C
6
.
(Figura 2). Essas unidades podem ser esterificadas com ácido gálico originando 3-
O-galatos. Esses taninos também são denominados proantocianidinas, devido à
propriedade de produzirem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas,
após degradação à quente com ácido mineral diluído (MARTINS, 1998;
BRUNETON, 2001; SANTOS; MELLO, 2003; SHOJI et al., 2006).
Figura 2. Monômeros de taninos condensados
Taninos hidrolisáveis e condensados se distribuem no reino vegetal seguindo
padrões significativamente diferentes. Os condensados ocorrem amplamente em
gimnospermas e angiospermas, enquanto que os hidrolisáveis estão quase restritos
a angiospermas dicotiledôneas (SANTOS; MELLO, 2003). Podem ocorrer na casca,
folhas, frutos e galhos. Algumas espécies produzem somente galotaninos ou
elagitaninos, enquanto outras apresentam misturas complexas contendo
galotaninos, elagitaninos e taninos condensados (HARVEY, 2001).
Os florotaninos são polímeros de floroglucinol e terpenos, presentes em algas
pardas que apresentam função de evitar a herbivoria. Outras propriedades têm sido
atribuídas aos florotaninos, tais como a proteção das algas frente à radiação UV, já
que ocorrem em tecidos por indução da radiação (GRAHAM; WILCOX, 2000;
SWANSON; DRUEHL, 2002). Também têm sido sugerido que os florotaninos
participam da ligação e da acumulação de metais pesados (GRAHAM; WILCOX,
2000), no entano essa classe de taninos não é objeto de estudo nesse trabalho.
(
+
)
-Cate
q
uina
O
OH
OH
OH
HO
OH
(
-
)
-E
p
icate
q
uina
O
HO
OH
OH
OH
OH
Referencial Teórico
13
3.2 Atividades farmacológicas
As aplicações de medicamentos com taninos estão relacionadas,
principalmente, com suas propriedades adstringentes (MONTEIRO et al., 2005). As
propriedades antidiarréica e hemostática, por exemplo, foram atribuídas à
capacidade de complexação com polissacarídeos, proteínas e íons metálicos
(BRUNETON, 2001; SANTOS; MELLO, 2003; MONTEIRO et al., 2005). Por
precipitar proteínas proporcionam também efeito antimicrobiano e antifúngico. Como
precipitam alcalóides os taninos podem servir de antídoto em casos de intoxicações
(MONTEIRO et al., 2005).
Outras atividades atribuídas aos taninos, como ação bactericida e fungicida,
antiviral, moluscicida (BRUYNE, et al., 1999; BRUNETON, 2001; SANTOS; MELLO,
2003), antitumoral, no tratamento da arteriosclerose e da artrite reumatóide têm sido
atribuídas, em parte, à capacidade de complexação ou à captação de radicais livres
por parte dos taninos. Dessa forma originam radicais estáveis, inibindo a
peroxidação de lipídios e outras substâncias (OKUDA et al.,1989; BRUYNE et al.,
1999; GAULEJAC et al., 1999; RIGO et al., 2000; BRUNETON, 2001; SANTOS;
MELLO, 2003; GUENDEZ et al., 2005; MONTEIRO et al., 2005). A eficácia como
cicatrizante de feridas, queimaduras e inflamações da pele, assim como a proteção
da mucosa em casos de úlcera gástrica, parece estar relacionada à formação de um
complexo tanino-proteína ou tanino-polissacarídeo (MARTINS, 1998; BRUNETON,
2001; SANTOS; MELLO, 2003; MONTEIRO et al., 2005).
De forma geral, os taninos são inibidores enzimáticos, devido à capacidade
de se ligarem às proteínas. Os taninos inibem a 5-lipoxigenase, a enzima conversora
de angiotensina, e as glicosiltransferases de microorganismos implicados na
formação das cáries e inflamação da gengiva (BRUNETON, 2001; SANTOS;
MELLO, 2003). Os taninos elágicos e os taninos condensados inibem a quinase C
(WANG et al.,1996; BRUNETON, 2001).
Taninos têm demonstrado ainda atividade contra HIV. Os galotaninos
demonstraram atividade inibitória somente em concentrações tóxicas. Elagitaninos e
taninos condensados inibiram fracamente a replicação viral e os taninos complexos
mostraram potente atividade contra a replicação do HIV. Verificou-se que a atividade
Referencial Teórico
14
anti-HIV exibida por taninos é devida à inibição da transcriptase reversa, dificultando
assim a replicação viral (KILKUSKIE et al., 1992).
Devido à capacidade de formar complexos com proteínas, outras
macromoléculas e íons metálicos, os taninos também apresentam efeitos tóxicos.
Estudos têm demonstrado efeitos nocivos em animais e humanos (LIAO et al., 2003;
MONTEIRO et al., 2005). Em herbívoros, os taninos promovem efeitos negativos no
apetite e na utilização de nutrientes, devido à sua capacidade de precipitar
proteínas, inibir enzimas digestivas e afetar a utilização de vitaminas e de sais
minerais (SILANIKOVE et al., 2001; LIAO et al., 2003; MAKKAR, 2003; MONTEIRO
et al., 2005). Existem estudos indicando a maior toxicidade dos taninos hidrolisáveis,
em relação aos taninos condensados. Isso porque os taninos hidrolisáveis, como o
ácido tânico, podem ser facilmente degradados nos sistemas biológicos e os
produtos da hidrólise podem chegar a órgãos como fígado e rins. Os taninos
condensados não são hidrolisados nos sistemas biológicos e, portanto, não chegam
à corrente sangüínea (LIAO et al., 2003).
3.3 Métodos de doseamento de taninos
Vários são os métodos de determinação do teor de taninos que têm sido
empregados, tanto quantitativa quanto qualitativamente. Dentre os colorimétricos
destacam-se os métodos de determinação de fenóis totais, que utilizam os
reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu, bem como o doseamento butanol/ácido
empregado para taninos condensados e o método da vanilina, que é específico para
meta-difenóis (SCALBERT, 1992; SCHOFIELD et al., 2001; MONTEIRO et al.,
2005). Para a quantificação colorimétrica de taninos hidrolisáveis se destacam os
métodos que empregam o iodato de potássio e rodanina (SCALBERT, 1992;
HARVEY, 2001; MONTEIRO et al., 2005).
Dentre os métodos gravimétricos de quantificação do teor de fenóis em
extratos vegetais, destaca-se a utilização de Itérbio, para a precipitação de taninos
condensados (MONTEIRO et al., 2005), e de PVPP para a quantificação de ácido
tânico (SCHOFIELD et al., 2001).
Os métodos por CLAE podem ser empregados para taninos hidrolisáveis e
para taninos condensados. Para taninos hidrolisáveis há relatos de uso na
Referencial Teórico
15
determinação da massa molecular, bem como para a determinação de ácido gálico e
ácido elágico após a hidrólise das estruturas poliméricas (HARVEY, 2001). No caso
de taninos condensados podem ser utilizados na determinação de polímeros com
até 7 ou 8 unidades (SCHOFIELD et al., 2001).
Para a determinação da massa molecular tem sido utilizada a espectrometria
de massas e para o estudo dos complexos solúveis entre proteínas e taninos tem-se
empregado a ressonância magnética nuclear (CHIEN; HAGERMAN, 2004).
Existem ainda os métodos nefelométricos que medem a dispersão da luz
resultante da formação gradual de precipitados dos agregados tanino-proteína.
Esses métodos geralmente são utilizados pelas indústrias vinícolas, cervejarias e de
sucos de frutas (CARVALHO et al., 2004).
3.3.1 Métodos de oxi-redução com formação de complexo
Os métodos de doseamento de polifenóis baseados em reações de oxi-
redução iniciaram-se com a utilização do reagente fosfotúngstico por FOLIN e
MACALLUM (1912), como forma de quantificar o ácido úrico na urina. O reagente foi
modificado posteriormente e denominado reagente de Folin-Denis (FOLIN; DENIS,
1912)
Uma outra variante do método de quantificação de fenóis implica no uso do
reagente de Folin-Ciocalteu, inicialmente denominado de reagente fenol modificado,
que difere do reagente de Folin-Denis pela presença de sulfato de lítio, adicionado
para evitar a formação de precipitados (FOLIN; CIOCALTEU, 1927; SCALBERT,
1992).
Em todas as suas variantes, os métodos por oxi-redução mencionados
envolvem o doseamento de polifenóis totais (quantificados por espectrofotometria),
mediante a formação de um complexo de coloração azul, derivado da redução do
reagente pelas hidroxilas fenólicas. A coloração azul ocorre em meio alcalino, porém
é pouco estável em excesso de base fraca, fato que se acentua quando uma base
forte é utilizada, observando-se uma perda rápida da coloração (FOLIN; DENIS,
1912; SCALBERT, 1992).
Referencial Teórico
16
Cabe destacar que os métodos de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu encontram
aplicação na determinação, tanto de substâncias polifenólicas em geral quanto de
taninos. O cálculo do teor de taninos é realizado indiretamente, subtraindo do teor de
polifenóis totais o teor da fração não-tanante, isto é, o teor de polifenóis não reativos
ao tratamento prévio com material protéico ou polimérico (SCALBERT, 1992;
COSTA, 1994; BRUNETON, 2001; SANTOS; MELLO, 2003).
Algumas limitações têm sido atribuídas aos métodos de quantificação que se
utilizam dos reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu. Entre elas, encontra-se o
fato de os reagentes serem inapropriados para a comparação do conteúdo fenólico
de amostras de diferentes extratos vegetais. Embora o reagente seja reduzido pelas
hidroxilas aromáticas, características de todos os fenóis, a redução depende da
estrutura fenólica, além do fato de o reagente poder ser reduzido por outros
constituintes do extrato, como alcalóides e proteínas, por exemplo. Dessa forma, a
composição e a quantidade de fenóis pode ser diferente, mesmo quando a
absorvância é semelhante. Por essa razão, os reagentes de Folin-Denis e Folin-
Ciocalteu não fornecem uma idéia exata da quantidade de fenóis, mas sim da
capacidade de redução da amostra analisada (APPEL et al., 2001).
As limitações do método também se estendem à escolha de uma substância
de referência para expressar o teor de fenóis. Se a capacidade de redução da
substância selecionada como padrão não é precisamente a mesma do extrato
analisado, a concentração calculada a partir da curva padrão não refletirá,
obviamente, o teor de fenóis da amostra (APPEL et al., 2001).
3.3.2 Métodos baseados na precipitação de proteínas
Os estudos sobre a complexação de polifenóis com proteínas datam de 200
anos atrás, sendo um dos primeiros relatos atribuído a Davy, em 1803 (HASLAM et
al., 1989). Os complexos formados entre taninos e proteínas podem ser reversíveis
ou irreversíveis. Os reversíveis são estabelecidos via ligações de hidrogênio e
interações hidrofóbicas, enquanto que os irreversíveis implicam em reações de
oxidação, via formação de ligações covalentes (LUCK et al., 1994; KAWAMOTO et
al, 1997a; SANTOS; MELLO, 2003).
Referencial Teórico
17
Os processos de complexação e precipitação de taninos e proteínas são tidos
como específicos e estão relacionados com a estrutura de ambos. Algumas
características importantes das proteínas para sua complexação e precipitação com
taninos são:
• Estrutura molecular: proteínas com estruturas mais abertas e flexíveis
têm maior afinidade pelos taninos, como as proteínas salivares, ricas
em prolina. Por outro lado, proteínas globulares, mais compactas,
como a albumina sérica bovina, possuem menor afinidade aos
compostos fenólicos (HAGERMAN; BUTLER, 1981; HASLAM et al.,
1989; LUCK et al., 1994; FREITAS; MATEUS, 2001; CARVALHO et al.,
2004);
• Ponto isoelétrico: a afinidade das proteínas por taninos é maior no
ponto isoelétrico da proteína (HAGERMAN; BUTLER, 1981; HASLAM
et al., 1989; KAWAMOTO; NAKATSUBO, 1997a);
• Conteúdo de prolina: proteínas ricas em prolina têm uma grande
afinidade por polifenóis (HAGERMAN; BUTLER, 1981; HASLAM et al.,
1989; LUCK et al., 1994, SIEBERT et al., 1996a; HAGERMAN et al.,
1998). A ligação tanino-proteína é favorecida quando o nitrogênio da
amida é substituído por um grupamento alquila. Os peptídeos que
contém prolina apresentam o nitrogênio adjacente à carbonila
substituído, explicando essa maior afinidade (HAGERMAN; BUTLER,
1981).
• Glicosilação da proteína: proteínas não-glicosiladas apresentam menor
afinidade por taninos do que as proteínas glicosiladas (FICKEL et al.,
1999).
Em contrapartida, a estrutura e propriedades dos taninos também são
determinantes na formação de complexos entre taninos e proteínas e na
precipitação desses. Nesse sentido, quatro características devem ser consideradas:
• Tamanho da molécula: é importante no estágio de complexação inicial.
Moléculas maiores, porém não tão grandes que não possam se
Referencial Teórico
18
intercalar entre os espaços interfibrilares das proteínas, são mais
eficazes na formação de complexos (FREITAS; MATEUS, 2001;
MONTEIRO et al., 2005). Para taninos hidrolisáveis as estruturas que
apresentam maior capacidade de precipitação obedecem a seqüência:
penta-galoil-D-glicose > tetra-galoil-D-glicose > tri-galoil-D-glicose)
(HAGERMAN; BUTLER, 1981; SPENCER et al., 1988; HASLAM et al.,
1989; LUCK et al., 1994; KAWAMOTO; NAKATSUBO, 1997b). A
disposição dos grupos galoila também influencia na capacidade de
precipitação. Polifenóis com grupamentos galoila distantes entre si são
mais eficientes como agentes precipitantes. Essa característica está
relacionada com o impedimento estérico exercido por grupamentos
galoila próximos (KAWAMOTO et al., 1996). Para taninos condensados
também é importante a associação com moléculas de ácido gálico.
Monômeros como a (-)-epicatequina, quando esterificados com ácido
gálico, aumentam sua capacidade de formar complexos insolúveis com
proteínas ricas em prolina. No entanto, para dímeros a associação a
um grupamento galoila não é importante, já que ocorre diminuição da
liberdade conformacional (FREITAS; MATEUS, 2001).
• Flexibilidade conformacional: quando existe um impedimento
conformacional no polifenol, a capacidade de complexação é
drasticamente reduzida (SPENCER et al., 1988; HASLAM et al., 1989;
SIEBERT et al., 1996a)
• Solubilidade em água do polifenol: existe uma relação inversa entre o
grau de complexação e a solubilidade do polifenol em água.
Normalmente, baixas solubilidades favorecem uma complexação mais
forte (SPENCER et al.; 1988 HASLAM et al., 1989; LUCK et al., 1994).
No entanto, HAGERMAN e colaboradores (1998), ao investigarem os
mecanismos de precipitação dos taninos pentagaloilglicose (PGG) e
epicatequina-(4→8)-catequina observaram o oposto: a epicatequina-
(4→8)-catequina, que é muito solúvel, foi mais eficiente na precipitação
da ASB do que PGG, que é virtualmente solúvel. Para a precipitação
Referencial Teórico
19
dos taninos condensados são importantes as hidroxilas existentes nos
anéis A e B (KAWAMOTO et al., 1996).
• Posição dos grupos periféricos: (+)-catequina apresenta maior
afinidade por proteínas ricas em prolina quando comparada a (-)-
epicatequina. Este fato foi associado à estereoquímica do anel pirano
(FREITAS; MATEUS, 2001).
A combinação dessas peculiaridades, referentes tanto às proteínas quanto
aos taninos, explica a falta de especificidade no comportamento de taninos
diferentes, ou de diferentes extratos vegetais, frente a um mesmo substrato protéico.
Atualmente três mecanismos têm sido propostos para elucidar a precipitação
de proteínas por parte dos taninos. No primeiro, a precipitação de proteínas por
polifenóis seria principalmente um fenômeno de superfície. A eficácia da ligação
decorreria do fato de os polifenóis serem ligantes multidentados, capazes de se ligar
mediante diferentes grupos fenólicos e de modo simultâneo a mais de um ponto na
superfície da proteína (SPENCER et al., 1988; HASLAM et al., 1989; LUCK et al.,
1994).
Recentemente, alguns autores modificaram esse mecanismo por acreditar
que, na realidade, a precipitação de proteínas por parte dos taninos ocorre em três
estágios. Inicialmente várias moléculas de polifenol se ligam a um mesmo peptídeo.
Esse processo continua até que ocorra a associação entre duas moléculas de
peptídeo, formando um dímero, que começa a precipitar. Inicia-se então o terceiro
estágio, onde a espontânea agregação desses leva à formação de grandes
complexos precipitados (CHARLTON et al., 2002; JÖBSTL et al., 2004).
Uma terceira alternativa proposta para elucidar a precipitação tanino-proteína,
ocorreria também em dois estágios: uma complexação inicial entre taninos e
proteínas, e a subseqüente precipitação dos complexos (KAWAMOTO et al., 1996).
Essa proposta difere do primeiro e segundo mecanismos por não considerar a
associação entre diferentes moléculas de proteínas.
A natureza da ligação entre taninos e proteínas também tem sido objeto de
discussões. SIEBERT e colaboradores (1996a) afirmam que os complexos formados
Referencial Teórico
20
entre taninos e proteínas mantêm-se unidos através da combinação de ligações de
hidrogênio e interações hidrofóbicas. Alguns autores descreveram a complexação
como um exemplo específico de reconhecimento molecular, onde a associação seria
dirigida por efeitos hidrofóbicos (SPENCER et al., 1988; HASLAM et al., 1989;
SIEBERT et al., 1996a). No entanto, HAGERMAN e BUTLER (1981), ao descrever
as interações entre proantocianidinas e proteínas em meio aquoso, observaram que
essas eram governadas por ligações de hidrogênio.
Mais recentemente HAGERMAN e colaboradores (1998), propuseram que a
polaridade do polifenol pode ser utilizada para predizer se a precipitação vai ocorrer
via ligações de hidrogênio ou interações hidrofóbicas. Os resultados indicaram que,
para heptagaloilglicose, que é mais polar do que a pentagaloilglicose, o fator
determinante na complexação com albumina sérica bovina reside nas ligações de
hidrogênio. Para polifenóis não-polares, como o galato de epicatequina, as
interações hidrofóbicas seriam dominantes na reação.
SIMON e colaboradores (2003), em um estudo da estrutura tridimensional dos
complexos formados entre os taninos do vinho e proteínas salivares, observaram
que as moléculas dos taninos se associam somente a um lado da superfície do
peptídeo. Esse lado foi identificado como a porção hidrofílica, o local onde ocorrem
numerosas ligações de hidrogênio entre os grupamentos carbonila de alguns
resíduos de prolina e os grupamentos OH dos anéis das proantocianidinas. Os
autores atribuem a discordância de seus resultados com os anteriormente relatados
ao fato de que, tanto SPENCER e colaboradores (1988) quanto HASLAM e
colaboradores (1989), teriam conduzido seus experimentos na presença de DMSO,
visando elevar a solubilidade das preparações. Segundo SIMON e colaboradores
(2003), esse fato pode modificar as propriedades hidrofóbicas/hidrofílicas de taninos
e proteínas no meio.
FREITAS e colaboradores (2003) estudando a influência da força iônica nas
interações entre taninos e proteínas observaram que com o aumento da força iônica
ocorria uma diminuição da precipitação. Esses resultados contradizem os relatados
por LUCK e colaboradores (1994) e os observados por KAWAMOTO e
NAKATSUBO (1997a) na análise da precipitação de proteínas por galotaninos.
FREITAS e colaboradores (2003) atribuem as discordâncias de resultados às
Referencial Teórico
21
diferentes condições e ao tipo de tanino em análise. LUCK e colaboradores (1994) e
KAWAMOTO e NAKATSUBO (1997a) utilizaram taninos hidrolisáveis, para os quais
as interações hidrofóbicas parecem dirigir o processo de precipitação. No entanto,
FREITAS e colaboradores (2003) fizeram uso de proantocianidinas em suas
análises e afirmam, que seus resultados são indícios de que para os taninos
condensados as interações hidrofílicas são dominantes em relação às interações
hidrofóbicas para a precipitação de proteínas. Dessa forma, a importância das
interações de hidrogênio bem como das interações hidrofóbicas não está claramente
definida.
Além das propriedades estruturais, a precipitação de proteínas por compostos
polifenólicos depende também de fatores externos. HAGERMAN e BUTLER (1978)
compararam a precipitação dos taninos presentes no sorgo com cinco diferentes
proteínas, pepsina, ovoalbumina, albumina sérica bovina, tripsina e lizosima, em
meios com pH diferentes. Os autores observaram que a máxima precipitação
ocorreu em valores de pH próximos ao ponto isoelétrico (P.I.) de cada proteína,
especificamente, pH 3,0 para pepsina (P.I. 1,0); 3,5 para a albumina sérica bovina
(P.I. 4,9) e ovoalbumina (P.I. 4,6), e valores de pH superiores a 8,0 para as
proteínas tripsina (P.I. 10,1) e lisozima (P.I. 11,0).
KAWAMOTO e NAKATSUBO (1997a), estudando os fatores que afetam a
precipitação tanino-proteína, observaram que a concentração de proteína interfere
principalmente no estágio inicial da complexação (referente ao terceiro mecanismo
relatado neste trabalho), enquanto, pH, temperatura e aumento da força iônica
determinam a precipitação do complexo (segundo estágio).
Outros autores também têm levantado a importância de fatores como pH,
força iônica do meio, temperatura, presença de sais e as concentrações iniciais de
proteínas e taninos no processo de complexação (LUCK et al., 1994; KAWAMOTO;
NAKATSUBO, 1997a; FREITAS; MATEUS, 2001; SOARES, 2002; SANTOS;
MELLO, 2003; CARVALHO et al., 2004).
De modo global, a importância de tais fatores resulta em limitações, do ponto
de vista analítico, para a quantificação de taninos. Tais limitações foram levantadas
recentemente por SOARES (2002).
Referencial Teórico
22
A presença de substratos como os polissacarídeos também influenciam no
processo de precipitação de proteínas por taninos (HASLAM et al., 1989; LUCK et
al., 1994; SIEBERT et al., 1996b; RIOU et al., 2002; FREITAS et al., 2003; MATEUS
et al., 2004). Estudos têm demonstrado a capacidade de alguns polissacarídeos,
como pectina, carragenina e gomas arábica e xantana, de inibir a precipitação de
proteínas, enquanto que as gomas guar, tara e caroba não a inibem (LUCK et al.,
1994). Esse fenômeno pode ser explicado de diversas formas. O polissacarídeo
pode formar um complexo ternário proteína/tanino/carboidrato, aumentando a
solubilidade em meio aquoso; o polissacarídeo pode competir com as proteínas pela
associação com o tanino; ou os polissacarídeos podem desenvolver uma estrutura
secundária em solução, capaz de encapsular e se complexar com taninos (LUCK et
al., 1994; SIEBERT et al., 1996b; FREITAS et al., 2003; RIOU et al., 2002).
A complexação entre taninos e carboidratos pode ser explicada devido às
ligações de hidrogênio entre o átomo de oxigênio do carboidrato e as hidroxilas
fenólicas dos taninos, bem como por interações hidrofóbicas (FREITAS et al., 2003).
FREITAS e colaboradores (2003), ao estudar a influência dos carboidratos na
precipitação de proteínas por taninos, verificaram que carboidratos neutros como
glicose e β-ciclodextrina possuem menor afinidade por taninos do que os aniônicos
como pectina, goma xantana, ácido poligalacturônico e goma arábica. A baixa
afinidade de carboidratos neutros por taninos foi também observada por LUCK e
colaboradores (1994).
3.3.2.1 Complexação de polifenóis com pó-de-pele e caseína
Considerando os níveis estruturais, as proteínas podem ser classificadas em
dois grandes grupos: as proteínas fibrosas, que se encontram dispostas em forma
de fibra, com superfícies largas e planas, e as proteínas globulares que se
apresentam na forma esférica. Os dois grupos são estruturalmente distintos, pois as
proteínas fibrosas apresentam um único tipo de estrutura secundária, já às
globulares possuem vários tipos de estruturas secundárias (NELSON; COX, 2000).
O colágeno é uma proteína fibrosa e o principal constituinte da pele e dos
ossos (BERG et al., 2004). Apresenta-se na forma helicoidal com uma estrutura
secundária que se repete: glicina-AA-prolina ou glicina-AA-hidroxiprolina, onde AA
Referencial Teórico
23
pode ser qualquer resíduo de aminoácido. O colágeno é constituído por 35% de
glicina, 11% de alanina e 21% de prolina e hidroxiprolina. Somente os resíduos de
glicina podem ser acomodados nas junções entre as cadeias α individuais. Os
resíduos de prolina permitem o entrelaçamento da hélice do colágeno. As cadeias α
das moléculas de colágeno e as moléculas de colágeno das fibras são ligadas por
ligações covalentes, envolvendo lisina, hidroxilisina ou resíduos de histidina.
Sob o termo caseína entende-se um grupo de proteínas denominadas α
S1-
,
α
S2-
, β- e k-caseínas, secretadas na forma de complexos micelares, esféricos,
estáveis, que contêm fosfato de cálcio. Todas as α
S1
-, α
S2
-, β- e κ-caseínas são
moléculas anfipáticas, relativamente pequenas, contendo grande número de
resíduos de prolina distribuídos de maneira uniforme nas seqüências de
aminoácidos. Essa característica estrutural confere à caseína bruta (in natura)
conformações moleculares relativamente abertas. Todas as caseínas possuem uma
carga negativa próxima da neutralidade e a neutralização da carga facilita a
complexação e a precipitação com taninos (LUCK et al., 1994).
Acredita-se que cada micela é composta por unidades submicelares porosas,
de 10 a 15 nm de diâmetro aproximadamente, as quais são mantidas unidas por
pontes de íons cálcio, ligações de hidrogênio, forças eletrostáticas e forças
hidrofóbicas. Esta proposta, porém, não é completamente aceita por vários
pesquisadores (LUCK et al., 1994; WALSTRA, 1999). Considerando a proposta de
que as micelas de caseína seriam constituídas por submicelas, acredita-se que as
primeiras apresentariam superfície rugosa e esférica. As submicelas apresentariam
composição variável, algumas constituídas de α
s
e β
s
-caseínas enquanto outras por
α
s
e κ-caseínas. As submicelas seriam unidas por fosfato de cálcio. Nesse sentido,
as mesmas se agregariam até a formação das micelas onde as que apresentassem
κ-caseínas permaneceriam na parte externa com a cadeia C-terminal formando a
superfície da micela. Dessa forma, a cadeia C-terminal impediria, por repulsão
eletrostática, a agregação de outras submicelas, também garantindo estabilidade
contra floculação (WALSTRA, 1999).
Observações têm sido feitas de que as micelas de caseína não são estruturas
fixas. Mudanças de temperatura, pH e força iônica ocasionam mudanças na
Referencial Teórico
24
distribuição do tamanho e na proporção de submicelas livres (KRUIF, 1999;
WALSTRA, 1999).
No que tange à complexação de polifenóis em solução, esses são removidos
pela caseína mediante a participação das estruturas micelares, poros hidrofóbicos,
regiões submicelares hidrofóbicas e, possivelmente, também devido a um
deslocamento favorável da β-caseína nas estruturas micelares (LUCK et al., 1994).
3.3.3 Complexação com derivados da povidona
Face às limitações observadas para o uso de agentes complexantes
protéicos, a avaliação de novos agentes, de natureza não-protéica, representa uma
alternativa analítica já anteriormente relatada na literatura, com destaque para a
polivinilpirrolidona (PVPP) e à sua elevada capacidade de complexação com
polifenóis (HORN; DITTER, 1982; MAKKAR, et al., 1995; SOARES, 2002).
Atualmente, polivinilpirrolidonas solúveis (PVP) são utilizadas como
adjuvantes farmacêuticos devido às suas propriedades adesivas, de formação de
filme, sua excelente solubilidade em água e outros solventes de uso farmacêutico
além da afinidade por superfícies hidrofílicas e hidrofóbicas. A capacidade de formar
complexos (solúveis) com um grande número de substâncias pode ser utilizada para
incrementar a solubilidade de fármacos, em meio líquido, ou aumentar a
biodisponibilidade, de formas sólidas. Outra aplicação para a propriedade de
complexação é a estabilização de proteínas e enzimas em diagnósticos (KOLLIDON,
2001).
Os derivados insolúveis da povidona reticulada (ou cruzada), incorretamente
denominados de polivinilpolipirrolidona pela indústria alimentícia e abreviados como
PVPP pela indústria de bebidas, encontram aplicação na indústria farmacêutica
como desintegrantes, adsorventes e formadores de complexos (KOLLIDON, 2001).
Nesse trabalho, será utilizada a abreviatura PVPP para designar os derivados
insolúveis da polivinilpirrolidona.
Os polímeros da PVPP apresentam ainda outros empregos na indústria e em
pesquisas. Exemplo disso são as investigações que têm sido feitas utilizando esses
polímeros para extração e purificação de DNA de microorganismos, entre eles,
Escherichia coli (TROCHIMCHUNK et al., 2003) e Ralstonia solanacearum
Referencial Teórico
25
(POUSSIER et al., 2002). Também tem sido investigada a aplicação na extração de
enzimas (ASEGA; CARVALHO, 2004), bem como nos processos de remoção de
resíduos de fungicidas em vinhos tintos. Neste caso, a complexação ocorre através
de ligações de hidrogênio entre os grupos carbonila da poliamida e as hidroxilas
fenólicas (FERNÁNDEZ et al., 2005).
Outra aplicação dos polímeros insolúveis da PVPP, como Divergan® RS e
Divergan® F, é na clarificação de cervejas e vinhos. Depois de um curto período de
tempo os polifenóis presentes no vinho podem se oxidar, alterando assim a
coloração e as qualidades sensoriais da bebida. No caso de cervejas os compostos
polifenólicos formam complexos causadores de turbidez. A fim de evitar esses
problemas, a indústria de bebidas tem se utilizado de polímeros como Divergan® RS
(regenerável) e Divergan® F (não-regenerável), que apresentam capacidade de
complexar os polifenóis (BASF, 2003).
Nesse sentido, derivados de PVPP também têm sido utilizados em
membranas de ultrafiltração, para evitar a formação de precipitados de polifenóis e
proteínas em sucos de frutas. A PVPP associada às membranas promove a
complexação das substâncias polifenólicas maiores, permitindo a passagem de
pigmentos e pequenas substâncias fenólicas através dos poros (BORNEMAN et al.,
2001).
Derivados da PVPP, assim como bentonita e misturas de pectinase e amilase,
também têm sido avaliados para utilização no tratamento prévio de sucos de frutas,
em processo anterior a ultrafiltração. A bentonita em concentração de 0,5% foi
superior quanto à redução da turbidez, no entanto, a PVPP foi mais efetiva para a
remoção de taninos (YOUN et al., 2004).
Em contrapartida, alguns autores afirmam que o processo de clarificação
afeta a qualidade do vinho, já que agentes clarificantes como a bentonita, a PVPP e
a gelatina reduzem os níveis de compostos fenólicos, alteram a cor e as
características sensoriais da bebida. Segundo os autores, a gelatina apresenta
pouca influência sobre vinhos tintos jovens já que afeta somente compostos
coloidais, enquanto a PVPP removeria também compostos fenólicos de baixa massa
molecular (GÓMEZ-PLAZA et al., 2000).
Referencial Teórico
26
De modo geral, os polifenóis apresentam uma maior afinidade por PVPP do
que pelas proteínas, o que justifica sua inserção em vários campos da pesquisa
(GARRIDO et al., 1991; MAKKAR, 2003).
A PVPP contém grupos hidrofílicos (anel pirrolidina) e grupos hidrofóbicos
(cadeia vinílica). Devido a isso, dois tipos de ligação parecem ser importantes para a
complexação de moléculas com o polímero: a formação de ligações de hidrogênio
através das funções carbonila (ANDERSEN; SOWERS, 1968; DONNER et al., 1993
MAKKAR et al., 1995) e as interações hidrofóbicas (PLAIZIER-VERCAMEN; DE
NÈVE, 1982).
FRÖMMING e colaboradores (1981), ao investigar as possíveis interações
entre diversos fármacos e a polivinilpirrolidona, observaram diferentes afinidades
dos fármacos pelo polímero, onde o aumento da força de interação se dá devido a
uma elevação no número de grupos funcionais polares e a um aumento na extensão
da porção hidrofóbica, justificativas estas aplicadas para explicar as elevadas
constantes de associação observadas para o ácido tânico, por exemplo.
Respaldando a importância das ligações de hidrogênio no processo de
complexação PLAIZIER-VERCAMEN e De NÉVE (1982) observaram que um
aumento no número de grupamentos hidroxila substituídos no anel benzênico
promove aumento na constante de associação PVPP/polifenóis.
HORN e DITTER (1982) verificaram a existência de uma correspondência
entre a força de interação com o número e a posição dos grupos doadores de
hidrogênio. Observaram ainda que em todos os compostos bifuncionais os
complexos mais fracos eram formados por isômeros orto. Uma maior tendência de
interação observada para bifenóis com isômeros meta e para indicam a influência da
posição dos grupos hidroxila na molécula e, possivelmente, de um efeito estérico.
MAKKAR e colaboradores (1995) observaram que taninos se ligam à PVPP
em diferentes graus. Isso pode ser devido à diferença no número de grupos
fenólicos e suas posições no núcleo ou às conformações desses taninos.
Propuseram ainda que a ligação de taninos com PVPP seja análoga à ligação de
taninos com proteínas, ou seja, a associação é maior para taninos que apresentam
uma conformação aberta.
Referencial Teórico
27
SIEBERT (1999), compara a PVPP aos resíduos do aminoácido prolina.
Ambos apresentam anéis de cinco membros saturados, contém nitrogênio no anel,
ligações amida e não possuem outros grupamentos funcionais. Dessa forma, o autor
sugere que os polifenóis se complexam com a PVPP de maneira similar ao que
acontece às proteínas ricas em prolina.
Figura 3. Estrutura molecular do aminoácido prolina e da PVPP.
SIEBERT e LYNN (1997) estudando os mecanismos de adsorção na
estabilização de bebidas verificaram que a eficiência da utilização de PVPP como
agente clarificante varia de acordo com o tipo de bebida. Em cervejas, a PVPP
mostrou-se menos efetiva na remoção de polifenóis quando comparada ao suco de
maçã. De acordo com os autores esse fato está relacionado com a menor
quantidade de polifenóis presente na cerveja. Nessa condição, os polifenóis
parecem se associar preferentemente às proteínas ficando indisponíveis para a
PVPP. Em contrapartida, em bebidas com elevada concentração de polifenóis a
maior parte dos sítios ligantes das proteínas se encontraria “ocupada” por polifenóis,
que por sua vez apresentariam sítios disponíveis para a complexação com a PVPP,
originando complexos proteína-polifenol-PVPP.
Os processos de quantificação de taninos que envolvem pó-de-pele, caseína
e PVPP como agentes complexantes, que já se encontram na forma insolúvel, não
envolvem a precipitação protéica. Dessa forma, nesses processos, são importantes
somente os fatores que influenciam na complexação entre polifenóis e proteínas.
3.3.4 Aspectos analíticos por CLAE
A cromatografia líquida de alta eficiência trouxe avanços significativos na
análise de produtos naturais. A utilização de colunas com superfície apolar (fase
H
2
NC
CH
2
CH
2
H
2
C
H
COO
prolina
CH
2
H
2
C
H
2
C
N
C
CH
O
CH
2
n
PVPP
Referencial Teórico
28
reversa) permitiu a identificação e quantificação de substâncias polares, pouco
voláteis e termolábeis (SADEK, 2000).
As técnicas analíticas por CLAE encontram emprego na identificação e
quantificação de estruturas monoméricas dos taninos, como ácido gálico, ácido
elágico, catequina e pirogalol; ou estruturas com até 7-8 unidades flavônicas dos
taninos condensados (HARVEY, 2001).
Nesse sentido diversos trabalhos têm sido realizados e condições
cromatográficas distintas têm sido utilizadas. A tabela 1 descreve de forma
resumida, as principais condições cromatográficas relatadas para análise de taninos
e estruturas monoméricas.
Tabela 1. Resumo dos métodos por CLAE de determinação de taninos e
monômeros de taninos hidrolisáveis e condensados.
Coluna Fase móvel Eluição
Fluxo
(mL/min)
λ (nm)
Referência
Cosmosil C
18
TFA 0,1%/,01% TFA em
MeOH (4:1)
I 1,0 220 Kawamoto et al.,
1995
Nucleosil C
18
A – H
2
O: MeOH :
H
3
PO
4
(975,5:19,5:1)
B – MeOH: H
2
O (70:30)
G 1,2 280 FAO, 2000.
TSK-gel ODS
A – 0,025% H
3
PO
4
(água)
B - 0,025% H
3
PO
4
G 1,0 Detector
eletroquímico
Nakai et al., 2000
Exsil C
18
A – H
3
PO
4
0,2%
B – 82% ACN:0,04
G 1,0 280 Peng et al., 2001
Alltech C
18
A – H
2
O: CH
3
COOH
(97:3)
B
-
MeO
H
G 1,0 280 e 360 Zuo et al., 2002
LiChrospher
RP-18
A - H
3
PO
4
(pH 2,5)
B – MeCN: H
2
O (4:6)
G 1,0 280 Makris et al., 2003
Shim-Pack VP-
ODS
A – H
3
PO
4
0,1%
B - MeOH
G 0,6 280 Shui; Leong, 2004.
-
A – HClO4 0,6%
B - MeOH
G 1,0 280 Guendez et al.,
2005
ODS
Spherisorb RP
A – ACN: H
2
o (1:9)
B – ACN: H
2
O (1:1)
G 0,7 280 Ramma et al., 2005
Alltima C
18
ACN: CH
3
COOH (90:20) I 1,0 Fluorescência
: λ
EX
280; λ
EM
315.
Savova et al., 2005
Hypersil C
18
A – CH
3
COOH 0,6%
B - MeOH
G 0,7 280 Pinelo et al., 2006
Hypersil C
18
A – CH
3
COOH 2%
B - CH
3
COOH: ACN
(1 1)
G 1,0 280 Stampar et al., 2006
Spherisorb
ODS 2
A - CH
3
COOH 6%
B – ACN:H
2
O (65:30)
G 0,5 280 Proestos et al.,
2006
Waters C
18
0,1% de CH
3
COOH em
H
2
O: ACN: CH
3
C
2
H
5
(87:10:3)
I 1,0 280 Row; Jin, 2006
Referencial Teórico
29
Como se pode observar na tabela 1, existem diversos métodos aplicados na
quantificação de taninos por CLAE. No entanto, a maior parte desses utiliza fase
móvel com presença de ácido, coluna C
18
eluição em gradiente e comprimento de
onda em 280 nm.
3.4 Validação de métodos analíticos
Validação de um método analítico é o processo de demonstrar que o método
é adequado ao uso pretendido, é um aspecto vital da garantia da qualidade analítica
(BARROS, 2002; BRASIL, 2003). Também pode ser entendida como um processo
de obtenção, documentação e análise de dados, permitindo descrever o método de
forma detalhada e permitindo a identificação e o controle dos fatores de variação. A
validação é, portanto, um processo sistemático, o que permite que as operações de
trabalho (sistema de execução do processo analítico) sigam critérios estabelecidos e
aceitos, e sejam reprodutíveis em diferentes laboratórios, com precisão e exatidão,
através do estabelecimento de limites de confiança (MARTINS, 1998).
Os testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos
farmacêuticos são considerados validados, desde que sejam avaliados parâmetros
como, exatidão, precisão (repetibilidade e reprodutibilidade), especificidade,
linearidade, intervalo e robustez (EMEA, 1998; BRASIL, 2003).
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
33
4.1 Materiais
4.1.1 Matéria-prima vegetal
Constituída por folhas secas de Psidium guajava, coletadas no Município de
Porto Alegre, em março de 2004.
4.1.2 Reagentes, solventes e substâncias de referência.
Acetato de etila, acetonitrila grau CLAE (Merck); ácido clorídrico, ácido
fórmico, ácido fosfórico a 85% (Merck); ácido fosfomolíbdico (Sigma), ácido gálico
(Merck), ácido tânico (Merck), catequina (Sigma), molibdato de sódio (Sigma),
pirogalol (Merck), rutina (Sigma), solução metanólica de cloreto férico a 5%, solução
saturada de bromo, sulfato de lítio monoidratado (Merck), tungstato de sódio
(Sigma).
4.1.3 Agentes precipitantes
Caseína grau técnico (GT) (Sigma, C7870, lote: 35H0822); Caseína purificada
(Sigma, C5890; lote: 042K0112); Divergan® F (BASF, lote: 98566236WO);
Divergan® RS (BASF, lote: 333050); Kollidon® CL (BASF, lote: 26897); pó-de-pele
(Freiberg-Forschungsinstitut); PVPP-P6755 (Sigma);
4.1.4 Aparelhos equipamentos e materiais diversos
Agitador magnético (IKA, RO15), balança analítica (Mettler, AB204), balança
de infravermelho (Bel Mark, Top Ray), banho-de-água (BUCHI, B-480), banho de
ultra-som (Elma Transonic 460), calorímetro diferencial exploratório (Shimadzu, DSC
60): controlador de fluxo para gás de purga (N
2
) (Shimadzu, FC-60A), integrador
(Shimadzu, TA-60WS) e software de controle e avaliação (Shimadzu, TA-60 versão
2.0), centríguga (FANEM, 206 BL), cromatógrafo líquido de alta eficiência
(Shimadzu, LC-10A): bomba (LC10AD), sistema de válvulas para eluição gradiente
(Shimadzu, FVC-10AL), detector UV/VIS (Shimadzu, SPD10A), injetor automático
(Shimadzu, SIL-10A), desgaseificador DGU-2A, programa para aquisição de dados
(Shimadzu, CLASS-LC10), coluna cromatográfica Gemini C18, 5μm, 110A, 250 x
4,60 mm (Phenomenex), pré-coluna Bondapack C
18
, 10mm x 4 mm, com 125 μm
(Shimadzu), espectrofotômetro (Hewlett Packard, HP8452A), espectrômetro de
Materiais e Métodos
34
infravermelho (Shimadzu, DR-8001), estufa de ar circulante (Memmert, TV 60 UL),
estufa (Biomatic, 1305), liofilizador (Edwards, Modulyo, 4K), membrana hidrofíica:
0,45 µm de poro, 7 mm de diâmetro (HVLP04700, Millipore), membrana hidrofílica:
0,45 µm de poro, 13 mm de diâmetro (HVLP01300, Millipore), moinho de facas (SK1,
Retsch); placas de sílica gel GF
254
, porta-amostras de alumínio (Shimadzu, ref. C
201-52943), seladora para porta-amostras (Shimadzu, SSC-30).
4.2 Métodos
4.2.1 Caracterização da matéria-prima vegetal
4.2.1.1 Identificação botânica
A droga vegetal foi identificada por Daniel Martins Ayub, botânico da
Universidade Luterana do Brasil. Uma exsicata das partes aéreas foi depositada no
Herbário da UFRGS e identificada pelo número de depósito ICN 135288.
4.2.1.2 Secagem e moagem do material vegetal
O material vegetal foi dessecado em estufa de ar circulante a 40 °C, durante
cinco dias. As folhas foram selecionadas manualmente e submetidas à moagem em
um moinho de facas, provido de malha de 180 μm. O produto foi acondicionado em
frascos de vidro e armazenado em local fresco, protegido da umidade e da luz.
4.2.1.3 Determinação da perda por dessecação
i) Método de secagem em estufa
Três amostras de 2,0 g de droga moída, exatamente pesadas, foram
colocadas em pesa-filtros previamente tarados e mantidas em estufa a 105 °C, por 2
horas. Após resfriamento por 30 minutos em dessecador provido de sílica, os pesa-
filtros foram pesados e novamente colocados na estufa por mais 1 hora, repetindo-
se o procedimento até obter uma diferença igual ou inferior a 5 mg entre duas
pesagens sucessivas. Os resultados foram expressos como perda de massa
percentual, relativos à média de três determinações (DEUTSCHES, 1986).
Materiais e Métodos
35
ii) Método de secagem em balança de infravermelho
Três amostras de 1,0 g da droga seca moída, exatamente pesadas, foram
analisadas em balança de infravermelho, conforme descrito por MARTINS (1998). A
temperatura de aquecimento foi programada para 105 °C, com ciclos de
resfriamento de 15 segundos.
4.2.2 Preparo da solução extrativa para análise do teor de taninos
Para obtenção da solução extrativa, 0,5 g de matéria-prima vegetal seca e
moída foram submetidas à decocção a 100 °C com 150,0 mL de água, durante 30
minutos. Após resfriamento à temperatura ambiente, a solução extrativa foi
transferida para balão de 250,0 mL e o volume completado com água. Em seguida,
a solução extrativa foi filtrada, sendo desprezados os primeiros 50,0 mL (Ph. Eur.,
2002).
4.2.3 Caracterização da solução extrativa para análise do teor de taninos
4.2.3.1 Análise cromatográfica qualitativa de taninos condensados e hidrolisáveis
i) Preparação das amostras:
A uma amostra de 5,0 g de droga vegetal moída foram adicionados 50 mL de
água destilada. A mistura resultante foi extraída por digestão sobre banho-maria a
95 °C, por 15 minutos. Após resfriamento à temperatura ambiente, a solução
extrativa foi filtrada e o seu volume ajustado para 50,0 mL com água destilada.
Desta, um volume de 3 μL foi aplicado sobre placa de gel de sílica (F. Bras. IV,
1988).
ii) Preparo das soluções de referência para análise por CCD
Quatro soluções de substâncias de referência foram preparadas por
dissolução utilizando as seguintes quantidades e volumes:
a) Solução 1: 5 mg de ácido gálico em 5,0 mL de álcool a 60 % (V/V).
b) Solução 2: 30 mg de ácido tânico em 5,0 mL de álcool a 60% (V/V).
c) Solução 3: 5,0 mg de (+)-catequina em 5,0 mL de álcool a 60% (V/V).
Materiais e Métodos
36
d) Solução 4: 5,0 mg de pirogalol em 5,0 mL de álcool a 60 % (V/V).
iii) Procedimento analítico
O sistema cromatográfico foi preparado a partir de uma mistura de acetato de
etila: ácido fórmico: água (80:1:1), utilizando placas de gel de sílica, não ativadas,
com indicador de fluorescência. O processo foi desenvolvido a temperatura
ambiente, observando um percurso de 10,0 cm em cuba cromatográfica saturada. A
revelação foi realizada utilizando-se solução metanólica de cloreto férrico a 5%.
4.2.3.2 Determinação do pH
O pH da solução extrativa foi determinado a 25 °C em potenciômetro
calibrado com soluções de tampão fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0 respectivamente.
O resultado foi expresso pela média de três determinações (F. Bras. IV, 1988).
4.2.3.3 Determinação do resíduo seco
Um volume equivalente a 20,0 g da solução extrativa foi pesado, de forma
exata em pesa-filtro previamente tarado, e evaporado sobre banho-de-água fervente
até à secura, com agitação ocasional. O resíduo foi colocado em estufa a 105 ºC por
duas horas, resfriado em dessecador provido de sílica e pesado. A amostra foi
recolocada em estufa por 30 minutos, repetindo-se o procedimento até peso
constante. O resultado, expresso em relação a 100,0 g da solução extrativa,
corresponde à média de três determinações.
4.2.4 Preparação do produto seco liofilizado
A solução extrativa aquosa foi dividida em frascos para liofilização cobertos
com papel filtro. Após congelamento desses, procedeu-se à liofilização nas
seguintes condições: pressão de 10
-1
mbar e temperatura de -60 °C. Os frascos de
liofilização ficaram ao abrigo da luz durante todo o processo de secagem. O produto
seco liofilizado foi acondicionado em frascos âmbar, hermeticamente fechado e
armazenado em dessecador até o momento do seu uso.
Materiais e Métodos
37
4.2.5 Caracterização do produto seco liofilizado
4.2.5.1 Determinação da perda por dessecação
Exatamente, cerca de 100,0 mg do produto seco liofilizado foram pesados em
pesa-filtro previamente tarado, colocados em estufa a 105 °C por duas horas e, a
seguir, resfriados a temperatura ambiente sobre sílica e pesados. Este procedimento
foi repetido em intervalos de 30 minutos até peso constante. Os resultados foram
expressos em percentual ponderal pela média de três determinações (DEUTSCHES,
1986).
4.2.5.2 Análise cromatográfica qualitativa de taninos condensados e hidrolisáveis
A amostra foi ensaiada e comparada conforme descrito no item 4.2.3.1.
4.2.6 Caracterização das substâncias de referência
4.2.6.1 Espectroscopia no ultravioleta
Os espectros de absorção foram obtidos por varredura no intervalo de
comprimento de onda de 200 a 500 nm, utilizando soluções aquosas nas
concentrações de 0,4, 0,4, 1,4 e 3,0 mg mL
-1
de ácido gálico, ácido tânico, catequina
e pirogalol, respectivamente. Os critérios de comparação foram a coincidência dos
máximos de absorção e sobreposição geral dos espectros.
4.2.6.2 Espectroscopia no infravermelho
Amostras de 1,5 mg de ácido gálico, ácido tânico, catequina e pirogalol foram
exatamente pesadas e misturadas com 150,0 mg de brometo de potássio
previamente dessecado por uma hora, a 105 ºC. As pastilhas foram obtidas por
compressão em prensa hidráulica, com uma pressão aplicada de 8 Ncm
-2
,
aproximadamente Os espectros foram obtidos no modo transmitância, utilizando os
seguintes parâmetros: resolução de 4 cm
-1
; acumulações de 40 e faixa de leitura de
4000 a 400 cm
-1
. Para fins de identificação, os espectros obtidos foram comparados
com análogos relatados na literatura.
Materiais e Métodos
38
4.2.6.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
Amostras de aproximadamente 1 a 2 mg de ácido gálico, ácido tânico,
catequina e pirogalol foram pesadas em porta-amostra de alumínio, o qual foi
posteriormente fechado. O equipamento foi previamente calibrado com índio
(99,999%) e zinco (99,999%), em termos de temperatura e valores de entalpia. Os
parâmetros utilizados para os experimentos foram: velocidade de aquecimento de 10
ºC min
-1
; faixa de temperatura de 25 a 300 ºC, utilizando nitrogênio (pureza de
99,999%), com fluxo de 50 mL min
-1
, como gás de purga.
As temperaturas de fusão obtidas foram comparadas com as relatadas na
literatura para as referidas substâncias.
4.2.7 Caracterização dos agentes complexantes
4.2.7.1 Caseína grau técnico e caseína purificada
As diferentes amostras de caseína foram caracterizadas pela perda por
dessecação. Para tanto, amostras de 2,0 g, exatamente pesadas, foram colocadas
em pesa-filtros previamente tarados e mantidas em estufa a 105 °C, por 2 horas.
Após resfriamento por 30 minutos em dessecador provido de sílica, os pesa-filtros
foram pesados e novamente colocados na estufa por mais 1 hora, repetindo-se o
procedimento até obter uma diferença igual ou inferior a 5 mg entre duas pesagens
sucessivas. Os resultados foram expressos como perda de massa percentual,
relativos à média de três determinações (DEUTSCHES, 1986).
4.2.7.2 Derivados de PVPP
i) Espectroscopia no infravermelho
A análise foi realizada para o Divergan® F; Divergan® RS; Kollidon® CL;
PVPP-P6755. Para a realização das análises empregou-se a mesma metodologia
descrita no item 4.2.6.2.
ii) Determinação do pH
Foram utilizadas suspensões aquosas a 1% (m/m) dos diferentes tipos de
PVPP. As leituras foram realizadas a 25 ºC, em potenciômetro calibrado com
Materiais e Métodos
39
soluções de tampão fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0 respectivamente. O resultado
expresso corresponde à média de três determinações (USP 29, 2006).
4.2.8 Avaliação das variáveis analíticas de métodos para determinação do teor
de taninos totais utilizando agentes precipitantes protéicos
4.2.8.1 Preparo dos reagentes
i) Folin-Ciocalteu
Pesou-se 100,0 g de tungstato de sódio R e 25,0 g de molibdato de sódio R,
que foram dissolvidos em 700 mL de água. À solução resultante foram adicionados
100,0 mL de ácido clorídrico R e 50,0 mL de ácido fosfórico R. A mistura foi
aquecida durante 12 horas sob refluxo em aparelho de vidro. Após resfriamento,
foram adicionados 150,0 g de sulfato de lítio monoidratado, 50,0 mL de água e
algumas gotas de bromo R. A solução foi aquecida, sem refluxo, por 15 minutos, a
fim de promover a evaporação do bromo residual. Após resfriamento, a mistura foi
transferida para balão volumétrico de 1000,0 mL e o volume completado com água.
O reagente foi filtrado e armazenado em geladeira (4 °C), em frasco de vidro âmbar
(Ph. Eur., 2002). Quando necessário, o procedimento de adição e aquecimento com
bromo R foi repetido, a fim de assegurar a atividade plena do reagente.
ii) Folin-Denis
Foram pesados 10,0 g de tungstato de sódio e 2,0 g de ácido fosfomolíbdico,
que foram dissolvidos em 75,0 mL de água. À solução foram adicionados 5,0 mL de
ácido fosfórico R e essa submetida a aquecimento sob refluxo durante 2 horas. Após
resfriamento, a solução foi transferida para balão de 100,0 mL e o volume
completado com água (F. Bras. IV, 1988).
iii) Solução de carbonato de sódio a 20%
Para preparação do reagente, 20,0 g de carbonato de sódio anidro foram
dissolvidos com aproximadamente 80,0 mL de água. A solução foi transferida para
balão volumétrico de 100,0 mL e o volume foi completado com água.
Materiais e Métodos
40
4.2.8.2 Determinação dos polifenóis totais
Foi realizada, com modificações, conforme descrito no Método Geral para a
quantificação de taninos da Ph. Eur. (2002). Para a determinação dos polifenóis
totais, 5,0 mL da solução extrativa, preparada conforme descrito no item 4.2.2, foram
diluídos a 25,0 mL com água (concentração de 0,4 mg mL
-1
). Em balão de 25,0 mL,
volumes de 1,0 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, conforme o
caso, foram adicionados de 10,0 mL de água e 2,0 mL da solução extrativa diluída e
o volume foi completado com solução de carbonato de sódio a 20%. A leitura da
absorvância foi realizada em 760 nm, 30 min após adição do reagente de oxi-
redução à solução extrativa diluída, de modo a obter leituras de absorvância entre
0,4 e 0,8 U.A. O tempo de leitura foi estabelecido mediante acompanhamento da
cinética de reação nos tempos de 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 15; 20; 30 e 60 min após adição
do reagente de oxi-redução à solução extrativa diluída, com leitura em 760 nm.
4.2.8.2.1 Estabelecimento da região de comportamento linear
A quantidade ótima de agente de oxi-redução, capaz de assegurar a
linearidade na faixa de trabalho pretendida, foi determinada mediante análise de
regressão das curvas de calibração obtidas para pirogalol (0,8, 1,6, 2,4, 3,2 e 4,0 μg
mL
-1
). Soluções de compensação foram obtidas substituindo o volume de amostra
por água, mantendo mesmas quantidades de reagente de Folin-Ciocalteu e solução
saturada de carbonato de sódio.
4.2.8.3 Quantificação da fração não-tanante
Foi realizada segundo descrito no Método Geral para a quantificação de
taninos da Ph. Eur. (2002), porém, utilizando caseína purificada e caseína grau
técnico como agentes complexantes. Para estabelecer o tipo e a quantidade de
caseína a serem utilizados, alíquotas de 10,0 mL da solução extrativa filtrada
(preparada conforme item 4.2.2) foram misturadas, separadamente, com
quantidades de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 e 800 mg de caseína, submetidas
a agitação magnética durante uma hora e, finalmente, filtradas. Dos filtrados,
alíquotas de 5,0 mL de cada foram diluídas a 25,0 mL com água. Em balão de 25,0
mL, 2,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu e 10,0 mL de água foram adicionados a
2,0 mL da solução extrativa diluída e o volume completado com solução de
Materiais e Métodos
41
carbonato de sódio a 20%. As condições experimentais, tempo de leitura,
quantidade de reagente e comprimento de onda foram as mesmas estabelecidas a
partir do item 4.2.8.2.
4.2.8.4 Seleção da substância de referência
A seleção foi baseada na comparação entre os espectros de absorção das
substâncias de referência e da solução extrativa (32 μg mL
-1
), na região 400 a 800
nm. As condições experimentais, tempo de leitura e quantidade de reagente para a
preparação das soluções de leitura foram as mesmas estabelecidas em 4.2.8.2.
4.2.8.5 Curva de calibração do pirogalol (substância de referência)
As curvas de calibração utilizando 1,0 e 2,0 mL de reagente foram obtidas
para as concentrações de pirogalol de 0,8, 1,6; 2,4, 3,2, 4,0 μg mL
-1
. A absorção
específica (
%1
cm1
A
) do pirogalol foi calculada a partir dos dados gerados. As demais
condições experimentais foram as estabelecidas a partir do item 4.2.8.2. A absorção
específica do pirogalol foi calculada a partir da equação:
C
10 A
A
%1
cm1
⋅
=
Onde:
%1
1cm
A
= absorção específica do produto reacional reagente-pirogalol; A
= absorvância do produto reacional (U.A.); C = concentração de pirogalol (g L
-1
).
4.2.8.6 Curva de calibração para polifenóis totais e fração não-tanante da solução
extrativa
A linearidade na faixa de concentração estudada e a proporcionalidade entre
os resultados para polifenóis totais e a fração não-tanante foram avaliadas mediante
análise de duas curvas de calibração, uma para polifenóis totais e a outra para a
fração não-tanante, obtidas segundo a metodologia abaixo descrita.
A solução extrativa foi diluída de modo a obter uma concentração de 20 mg
mL
-1
. Para a quantificação dos polifenóis totais alíquotas dessa solução foram
tomadas, obtendo-se soluções com concentrações de 0,24, 0,32, 0,40, 0,48, 0,56 e
Materiais e Métodos
42
0,64 mg mL
-1
. Em balão de 25,0 mL, o reagente de Folin-Ciocalteu e 10,0 mL de
água foram adicionados a 2,0 mL de cada uma das soluções previamente diluídas e
o volume completado com solução de carbonato de sódio a 20%. As condições
experimentais tempo de leitura, quantidade de reagente e comprimento de onda
foram as mesmas estabelecidas no item 4.2.8.2.
Para a quantificação da fração não-tanante foram utilizadas 400,0 mg de
caseína GT e as demais condições experimentais definidas em 4.2.8.3.
4.2.8.7 Cálculo do teor de taninos
Para o cálculo do teor de taninos totais foi utilizado o conjunto de equações:
()
%1
1
1
cm
Apm
FDA
PT
⋅−
⋅
=
()
%1
1
2
cm
Apm
FDA
FNT
⋅−
⋅
=
FNTPTTT
−
=
Onde, m = massa da amostra (g); p = perda por dessecação (g); A
1
, A
2
=
absorções das soluções (U.A.); FD = fator de diluição; PT = teor de polifenóis totais
(g%); FNT = teor de substâncias não-tanantes (g%); TT = teor de taninos totais (g%);
1%
cm 1
A = absorção específica do pirogalol (2099 UA).
4.2.8.8 Reprodutibilidade para o método de doseamento do teor de taninos totais
Foi realizado utilizando três soluções extrativas, preparadas segundo item
4.2.2, em dias diferentes e em triplicata. A determinação dos polifenóis totais foi
realizada com as condições experimentais tempo de leitura, quantidade de reagente
e comprimento de onda estabelecidas no item 4.2.8.2. O teste de reprodutibilidade
para a fração não-tanante foi realizado segundo o descrito no item 4.2.8.3 com 400,0
mg de caseína GT.
Materiais e Métodos
43
4.2.8.9 Repetibilidade para o método de doseamento do teor de taninos totais
Foi realizado utilizando uma mesma solução extrativa, preparada segundo
item 4.2.2, a qual foi diluída de modo a obter uma concentração de 0,4 μg mL
-1
. Para
avaliar a repetibilidade dos polifenóis totais, nove alíquotas da solução extrativa
foram tratadas com 2,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, 10,0 mL de água e o
volume completado a 25,0 mL com solução de carbonato de sódio a 20%.
Para a fração não-tanante, especificamente, uma mesma solução extrativa
com concentração de 2,0 mg mL
-1
foi tratada com 400,0 mg de caseína GT,
mantendo-se as demais condições experimentais definidas no item 4.2.8.3.
Posteriormente, a amostra foi filtrada e 5,0 mL do filtrado foram diluídos a 25,0 mL
com água, rendendo uma concentração de 0,4 mg mL
-1
. A seguir, nove alíquotas de
2,0 ml dessa solução foram submetidas ao mesmo tratamento adotado no teste de
repetibilidade para os polifenóis totais descrito nesse mesmo item.
4.2.8.10 Comparação entre o reagente de Folin-Ciocalteu e o reagente de Folin-
Denis
Para a determinação dos polifenóis totais, 5,0 mL da solução extrativa filtrada
foram diluídos a 25,0 mL com água. Em balão de 25,0 mL, 2,0 mL do reagente de
Folin-Denis foram adicionados a 2,0 mL de solução extrativa e 10,0 mL de água e o
volume completado com solução de carbonato de sódio a 20%. O comprimento de
onda e a concentração de reagente foram aqueles definidos no item 4.2.8.2.
Para a determinação da fração não-tanante utilizou-se 400,0 mg de caseína
GT e foram adotadas as demais condições experimentais definidas no item 4.2.8.3.
4.2.8.11 Quantificação de taninos mediante uso de pó-de-pele
A quantificação dos polifenóis totais foi realizada segundo o descrito no item
4.2.8.2. Para a determinação da fração não-tanante utilizou-se 100,0 mg de pó-de-
pele e as demais condições experimentais definidas no item 4.2.8.3. O teor de
taninos foi calculado utilizando o mesmo conjunto de equações descrito no item
4.2.8.7.
Materiais e Métodos
44
4.2.8.12 Avaliação da especificidade da formação de complexos entre derivados
protéicos e taninos através de método espectrofotométrico e por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE)
A) Avaliação a especificidade utilizando método espectrofotométrico
Adicionou-se 20,0 mg de rutina em 100,0 mL de solução extrativa preparada
segundo item 4.2.2 e procedeu-se a quantificação dos polifenóis totais, de acordo
com o especificado no item 4.2.8.2. Para a determinação da fração não-tanante
foram utilizados 400 e 600 mg de caseína GT e as demais condições experimentais
estabelecidas no item 4.2.8.3. Os resultados obtidos foram comparados com os
encontrados através de realização do ensaio sem a adição de rutina.
B) Avaliação da especificidade utilizando CLAE
i) Preparação de amostras
Soluções das substâncias de referência: foram preparadas utilizando como
solvente uma mistura de acetonitrila:água 1:3 e uma quantidade apropriada de cada
uma das substâncias de referência, de modo a obter soluções individuais com
concentração de 80 μg mL
-1
de ácido gálico, catequina, pirogalol e rutina.
Posteriormente foi preparada uma solução contendo essas quatro substâncias,
mantendo-se a mesma concentração.
Solução extrativa
: 100,0 mg do produto liofilizado foram diluídos em 50,0 mL
de água. A solução resultante foi filtrada e injetada no aparelho. Para avaliar a
complexação com caseína, alíquotas de 10,0 mL da solução reconstituída foram
tratadas com 100, 200, 400, 600, 800 e 1600 mg de caseína. Realizou-se o mesmo
procedimento para avaliar a complexação com pó-de-pele utilizando 50,0 e 100,0
mg do mesmo. As demais condições experimentais como tempo de complexação e
filtração foram as mesmas descritas no item 4.2.8.3.
ii) Sistema cromatográfico
Foi adotada uma separação em gradiente de nove fases, utilizando misturas
de ácido fosfórico a 5% (solução A) e acetonitrila:ácido fosfórico a 5% (60:40 m/m)
(solução B), em diferentes proporções. Fase 1: de 13% a 25% de B, em 25 min;
Materiais e Métodos
45
fase 2: isocrática, com 25% de B, por 5 min; fase 3: de 25% a 33% de B, em 7 min;
fase 4: isocrática, 33% de B por 3 min; fase 5: de 33% a 40% de B, em 7 min; fase
6: isocrática, mantendo 40% de B, por 3 min; fase 7: de 40 a 43% de B, em 3 min;
fase 8: isocrática, mantendo 43% de B, por 2 min; fase 9 (recondicionamento da
coluna): de 43% a 13% de B, em 15 min. Em todas as fases o fluxo foi de 0,8 mL
min
-1
e a pressão mantida constante. Detecção em 280 e 352 nm, com sensibilidade
de 0,5 U.A.
4.2.9 Caracterização físico-química dos complexos PVPP-substância de
referência
4.2.9.1 Preparo das soluções de referência
As soluções aquosas de ácido gálico e ácido tânico foram preparadas na
concentração de 0,4 mg mL
-1
; a catequina e o pirogalol nas concentrações de 1,4 e
3,0 mg mL
-1
respectivamente. Foi utilizado banho de ultra-som para assegurar a total
dissolução. Quando não utilizadas de imediato, as soluções foram armazenadas ao
abrigo da luz.
4.2.9.2 Seleção do comprimento de onda para leitura
Foram preparadas soluções aquosas de 0,40 μg mL
-1
de cada uma das
substâncias de referência e a absorvância registrada por varredura da região de 200
a 500 nm. Água foi utilizada como líquido de compensação.
4.2.9.3 Preparo das dispersões de PVPP
As dispersões aquosas de Kollidon® CL, Divergan® RS, Divergan® F e P
6755 – Sigma, nas concentrações de 0,5, 2,5, 7,5 e 15 mg mL
-1
, foram mantidas sob
agitação constante durante 24 h, e utilizadas imediatamente após esse período de
hidratação.
4.2.9.4 Avaliação do perfil de complexação das diferentes PVPP
Por separado, alíquotas de 5,0 mL de cada substância de referência e de
rutina (0,4 mg mL
-1
) foram adicionadas a balões volumétricos de 25,0 mL contendo
cada uma das dispersões obtidas no item 4.2.9.3. Após 30 minutos, as preparações
Materiais e Métodos
46
foram centrifugadas a 3000 rpm, durante 30 minutos. Do sobrenadante foi retirada
uma alíquota de 5,0 mL e essa diluída com água destilada em balão de 25,0 mL. As
concentrações de ácido gálico, ácido tânico, catequina, pirogalol e rutina foram
determinadas em espectrofotômetro nos comprimentos de onda definidos no item
4.2.9.1, utilizando água como líquido de compensação.
Para avaliação da formação de complexos entre a solução extrativa e os
diferentes tipos de PVPP, 10,0 mL da solução extrativa (preparada conforme item
4.2.2) foram tratados com as diferentes dispersões de PVPP. O procedimento a
seguir foi o mesmo, acima descrito, para as substâncias de referência.
4.2.9.5 Avaliação da complexação entre substâncias de referência e PVPP-P6755
mediante calorimetria exploratória diferencial (DSC)
Misturas das substâncias de referência e PVPP-P6755 nas proporções 1:1,
1:5 e 1:10, foram submetidas à análise por calorimetria exploratória diferencial. Uma
massa entre 1,0 e 2,0 mg foi pesada em porta-amostra de alumínio, posteriormente
tampado e selado com selador apropriado. Os parâmetros utilizados para os
experimentos foram os mesmos relatados no item 4.2.6.3.
4.2.9.6 Efeito da purificação ácida da PVPP-P6755 sobre a capacidade complexante
Uma amostra exatamente pesada de 50 g de PVPP foi submetida à agitação
com 250 mL de HCl 0,1 M por 30 minutos. O material foi filtrado por funil de vidro
sinterizado G3, sob pressão reduzida. O resíduo de filtração foi lavado com um litro
da mesma solução ácida e, em seguida, repetidas vezes com água destilada, até
obtenção de um filtrado totalmente límpido. O resíduo foi seco em estufa a 40 °C,
durante 72 horas, e mantido em recipiente hermeticamente fechado até o momento
de uso (DONNER et al., 1993; SOARES, 2002).
Dispersões de PVPP-P6755 purificada e não purificada nas concentrações
0,25, 0,5, 1,25, 2,5, 5,0, 7,5 e 15 mg mL
-1
foram submetidas à complexação com 5,0
mL de solução de catequina na concentração de 1,4 μg mL
-1
em balões de 25,0 mL.
O procedimento a seguir foi o mesmo descrito no item 4.2.9.4.
Materiais e Métodos
47
4.2.9.7 Avaliação da influência do pH na estabilidade dos complexos PVPP-
catequina
Uma solução de catequina a 700 μg mL
-1
foi tratada com dispersão de PVPP-
P 6755 a 15 mg mL
-1
. O pH foi ajustado utilizando soluções HCl 0,1 M e soluções-
tampão de fosfatos e boratos (tabela 2). O procedimento a seguir foi o mesmo
descrito no item 4.2.9.4. A absorvância foi determinada nos comprimentos de onda
especificados na Tabela 2, utilizando água como líquido de compensação. Os
resultados foram expressos como fração ponderal de catequina ligada (FCL) em
função do pH.
Tabela 2. Soluções e condições utilizadas para avaliação da influência do pH sobre
a formação de complexos entre derivados da povidona cruzada e
catequina.
Solução Volume
adicionado
pH obtido
λ
nm
HCl 0,1N 1,0 mL 2,94 280
HCl 0,1N 0,5 mL 3,36 280
Água destilada - 6,0 280
Tampão fosfato 15,0 mL 6,99 280
Tampão fosfato
15,0 mL 7,98 280
Tampão borato
15,0 mL 8,43 290*
Tampão borato
15,0 mL 8,99 290*
Tampão borato 15,0 mL 9,39 290*
* Devido ao deslocamento batocrômico sofrido em pH alcalino, as leituras foram realizadas em 290 nm.
Materiais e Métodos
48
4.2.9.8 Avaliação da especificidade da formação de complexos entre PVPP-P6755 e
substâncias de referência por método espectrofotométrico e por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE)
A) Avaliação do perfil de complexação de substâncias de referência adicionadas de
rutina com PVPP-P6755
Foram preparados 100,0 mL de soluções das substâncias de referência
catequina e pirogalol. A essas soluções se adicionou 20,0 mg de rutina. As soluções
contaminadas foram complexadas com as diferentes dispersões de PVPP-P6755
conforme descrito no item 4.2.9.4.
B) Avaliação da formação de complexos entre substâncias de referência e PVP-
P6755 por CLAE
i) Preparação de amostras para análise por CLAE
Substâncias de referência: uma solução contendo 80 μg mL
-1
de ácido gálico,
catequina, pirogalol e rutina foi preparada mediante dissolução em uma mistura de
acetonitrila:água 1:3 (V/V). Dessa solução, 10,0 mL foram tratados com 10,0; 50,0;
150,0 e 300,0 mg de PVPP-P6755 durante 30 minutos, centrifugadas a 3000 rpm,
por 30 minutos, e finalmente, filtradas e injetadas no cromatógrafo.
4.2.10 Complexação de taninos de Psidium guajava com PVPP-P6755
4.2.10.1 Seleção da substância de referência
Catequina foi selecionada como substância de referência considerando os
resultados obtidos previamente neste trabalho, além dos observados por SOARES
(2002).
4.2.10.2 Curva de calibração da catequina (substância de referência)
As curvas de calibração utilizando o reagente de Folin-Ciocalteu foram
obtidas com concentrações de 1,28, 2,56; 3,84, 5,12, 6,4 μg mL
-1
. As demais
condições experimentais, entre outras, tempo de leitura, comprimento de onda e
concentração de reagente foram aquelas definidas em 4.2.8.2. A absorção
específica da catequina foi calculada a partir da equação descrita no item 4.2.8.5.
Materiais e Métodos
49
4.2.10.3 Determinação dos polifenóis totais
Foi realizada conforme descrito no item 4.2.8.2.
4.2.10.4 Quantificação da fração não-tanante com PVPP-P6755
Foi realizado segundo descrito no Método Geral para a quantificação de
taninos da Ph. Eur. (2002), utilizando a PVPP-P6755 como agente complexante.
Diferentes concentrações desse agente complexante foram testadas: 10,0; 25,0;
50,0; 100,0; 150,0 e 300 mg. Para tanto, 10,0 mL da solução extrativa filtrada (ver
item 4.2.2) foram tratados, durante 30 minutos, com as concentrações de PVPP-
P6755 acima pré-estabelecidas. Após a complexação, as amostras foram filtradas e
5,0 mL do filtrado, diluídos a 25,0 mL com água. Em balão de 25,0 mL, 2,0 mL de
reagente de Folin-Ciocalteu e 10,0 mL de água foram adicionados a 2,0 mL da
solução extrativa diluída e o volume foi completado com solução de carbonato de
sódio a 20%. As condições experimentais tempo de leitura, quantidade de reagente
e comprimento de onda foram às mesmas estabelecidas no item 4.2.8.2.
4.2.10.5 Cálculo do teor de taninos
Para o cálculo do teor de taninos totais foi utilizado o conjunto de equações
descrito no item 4.2.8.7. Para fins de cálculo adotou-se o
1%
cm 1
A da catequina
(1359,65).
4.2.10.6 Avaliação da formação de complexos entre taninos da droga vegetal e
PVPP-P6755 por CLAE
i) Preparação de amostras para análise por CLAE
Solução extrativa: 100 mg do produto liofilizado foram diluídos em 50,0 mL de
água, filtrados e injetados no cromatógrafo. Dessa solução, alíquotas de 10,0 mL
foram adicionadas de PVPP-P6755 nas concentrações de 10,0; 50,0; 150,0 e 300,0
mg. A seguir as amostras foram agitadas durante 30 minutos e centrifugadas a 3000
rpm, por 30 minutos. Após, as mesmas foram filtradas e injetadas no cromatógrafo.
Materiais e Métodos
50
4.2.11 Análise comparativa dos teores de taninos totais, calculados mediante
utilização de caseína, pó-de-pele e PVPP-6755
Foi realizada uma análise comparativa dos resultados obtidos para os teores
de taninos totais com os diferentes agentes complexantes utilizados, bem como das
diferenças no perfil de complexação por CLAE da solução extrativa de Psidium
guajava com os agentes complexantes avaliados. Também foi realizada uma
avaliação da influência das substâncias de referência selecionadas para a
quantificação de taninos utilizando o método espectrofotométrico que emprega o
reagente de Folin-Ciocalteu.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados e Discussão
53
5.1 Caracterização da matéria-prima vegetal
O elevado teor de água que caracteriza órgãos vegetais verdes, favorece a
ação de enzimas, podendo acarretar a degradação dos constituintes ativos além de
possibilitar o desenvolvimento de microorganismos (FARIAS, 2003). Para taninos,
em geral, é inconveniente a análise de tecidos frescos, tornando-se indispensável a
operação de secagem. No entanto, a secagem através de métodos que empregam
calor (sol, ou em estufas acima de 70 ° C) diminui consideravelmente a
concentração de taninos (SANTOS; MELLO, 2003).
Por esse motivo, para folhas de Psidium guajava, se adotou neste trabalho a
secagem em estufa a 40 °C, por um período de tempo de cinco dias. O teor de
umidade, determinado pelos métodos em estufa e balança de infravermelho para a
droga vegetal seca, foi de 8,82 ± 0,12 (CV% = 1,32, n = 3) para o primeiro e de 9,49
± 0,37 (CV% = 3,88, n=3) para o segundo método. Uma vez que o teor de umidade
estabelecido em diferentes farmacopéias varia entre 8 e 14%, com algumas
exceções especificadas nas monografias (FARIAS, 2003), os valores obtidos por
ambos os métodos foram tidos como satisfatórios. Não obstante a maior dispersão
dos resultados no método por balança de infravermelho, carece de um real
significado tecnológico, além de já ter sido constatada por outros pesquisadores
deste PPGCF, que precederam o presente trabalho.
5.2 Preparo e caracterização da solução extrativa para análise do teor de
taninos
A relação de solventes e misturas desses relatada na literatura para a
extração de taninos é relativamente ampla (HARVEY, 2001). Vários autores
recomendam por exemplo metanol:água ou acetona:água. O uso de água parece
consensual, uma vez que essa ou sua mistura com alguns solventes orgânicos têm
demonstrado rendimentos favoráveis na extração. Contudo, há algumas
constatações interessantes, dependendo do tipo de solvente orgânico utilizado. A
acetona bloqueia a associação tanino-proteína, o que não ocorre com o metanol
(SANTOS e MELLO, 2003). No entanto, o metanol é capaz de romper ligações em
galotaninos dando origem a monômeros de ácido gálico ocorrendo o mesmo com
água, quando essa é utilizada como líquido extrator a temperaturas acima de 60 °C.
Resultados e Discussão
54
Em temperaturas próximas a 100 °C, a água também pode romper as ligações éter
de elagitaninos, o que resulta na liberação de ácido elágico (HARVEY, 2001).
Por entender que a acetona não poderia ser utilizada no processo de extração
(devido ao método de doseamento proposto) e que misturas de água:metanol
podem provocar a despolimerização dos taninos, optou-se pelo método de extração
por decocção com água, como preconizado pela Farmacopéia Brasileira e outros
Códigos Oficiais (F. Bras. 1988; DAB, 1998; BP, 2001; Ph. Eur., 2002).
Para a caracterização da solução extrativa foram realizados ensaios de
determinação do perfil cromatográfico por CCD, pH e resíduo seco. O valor médio de
pH foi de 6,04 ± 0,13 (CV% 2,23; n =3), o que é condizente com a presença de
compostos polifenólicos no extrato. O teor médio de resíduo seco foi de 0,0515 ±
0,0017 (CV% 3,36), o que equivale a 8,5% em relação à massa seca de droga
vegetal seca (0,5 g), extraída com 250,0 mL de água.
5.2.1 Análise cromatográfica qualitativa de taninos condensados e hidrolisáveis
A partir do cromatograma obtido para taninos da solução extrativa de Psidium
guajava (figura 4) não se pode concluir pela presença de catequina e ácido gálico, já
que ambas as substâncias apresentam bandas de coloração e Rf semelhantes. A
presença de pirogalol e ácido tânico não foi confirmada a partir do cromatograma
obtido. O ácido tânico apresentou uma banda semelhante à do ácido gálico,
indicando a presença deste no padrão de ácido tânico, que é constituído por uma
mistura de taninos hidrolisáveis. O mesmo foi observado por DE SOUZA (2004), que
utilizou ácido tânico e ácido gálico para avaliação do perfil cromatográfico de
Phyllanthus niruri.
Resultados e Discussão
55
Figura 4. Representação esquemática do cromatograma obtido mediante análise de
taninos nas amostras de Psidium guajava. SE: solução extrativa, AG:
ácido gálico, AT: ácido tânico, CAT: catequina, Piro: pirogalol. Sistema
cromatográfico: acetato de etila: ácido fórmico: água (80:1:1), gel de sílica
GF
254
, revelação: cloreto férrico.
Sistemas cromatográficos semelhantes ao aqui aplicado, diferindo apenas na
proporção da fase móvel, foram utilizados para a detecção de taninos em Maytenus
ilicifolia (MARTINS, 1998) e Phyllanthus niruri (DE SOUZA, 2004), no entanto ambos
mostraram-se inconclusivos enquanto à presença de ácido gálico e de catequina. O
sistema aqui adotado representa uma tentativa de obter melhor resolução para as
bandas dessas substâncias alterando-se a fase móvel. Com isso, valores de Rf
diferentes foram obtidos para ácido gálico e catequina. No entanto, as alterações
não foram suficientes para garantir a identificação dessas substâncias em Psidium
guajava.
5.3 Preparação e caracterização do produto seco liofilizado
Para a caracterização do produto seco liofilizado foram realizados os testes
de perda por dessecação e perfil cromatográfico por CCD. O teor de umidade
resultante foi de 4,85 ± 0,11 (CV% 2,4).
Amostra Rf/ coloração
Solução extrativa 0,51 – azul escuro
Ácido gálico 0,49 – azul escuro
Ácido tânico 0,49 – azul escuro
Catequina 0,51 – verde azulado
Pirogalol 0,62 – azul escuro
0
0,5
1,0
SE AG AT CAT Piro
Resultados e Discussão
56
O cromatograma obtido para o produto seco liofilizado foi semelhante ao
observado para a solução extrativa (figura 4).
Posteriormente a comparação do perfil cromatográfico da solução extrativa e
produto seco liofilizado foi também avaliada através de método por CLAE. Os
cromatogramas obtidos para a solução extrativa e produto seco liofilizado foram
idênticos, indicando que o processo de liofilização não alterou a constituição fenólica
do extrato de Psidium guajava (figura 11).
5.4 Caracterização das substâncias de referência
5.4.1 Espectroscopia no ultravioleta
O ácido gálico apresentou pico de absorção máximo em torno de 271 nm, o
pirogalol por sua vez teve seu máximo de absorção detectado em 267 nm, já a
catequina apresentou pico máximo próximo a 280 nm e o ácido tânico com pico de
absorção em torno de 270 (figura 5). De modo geral, esses valores coincidem com
aqueles relatados na literatura (JURD, 1962; FRÖMMING et al., 1981; RAMOS-
TEJADA et al., 2002).
Figura 5. Espectros de absorção no UV das substâncias de referência, ácido
gálico (A), ácido tânico (B), catequina (C) e pirogalol (D).
200 250 300 350 400
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Absorvância (UA)
Comprimento de Onda (nm)
B
200 250 300 350 400
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Absorvância (UA)
Comprimento de Onda (nm)
200 250 300 350 400
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Absorvância (UA)
Comprimento de Onda (nm)
200 250 300 350 400
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Absorvância (UA)
Comprimento de Onda (nm)
A
D
C
Resultados e Discussão
57
5.4.2 Espectroscopia no infravermelho
Os espectros obtidos para o ácido gálico, ácido tânico, catequina e pirogalol
mostraram-se sobreponíveis àqueles relatados na literatura (POUCHERT,1991). As
substâncias de referência apresentaram as seguintes bandas características
(NAKANISHI; SOLOMON, 1977; SILVERSTEIN et al., 1998; PAVIA et al., 2001).
Ácido gálico: ν
máx
(KBr/cm
-1
): 3200: deformação axial O-H, por formação de
ligações de hidrogênio intramoleculares; 3100: deformação axial C-H aromático;
1700: deformação axial C=O; 1600 e 1500: deformação axial C=C de núcleo
aromático; 1350: deformação angular no plano de O-H; 1250: deformação axial C-O;
650: deformação axial de C-H de núcleo aromático (ANEXO-figura 1A).
Ácido tânico (polímero constituído por moléculas de ácido gálico e ácido
elágico): ν
máx
(KBr/cm
-1
): 3150; deformação axial O-H; 1720: deformação axial C=O;
1610 e 1540: deformação axial C=C de anel aromático; 1200: deformação angular
de O-H e deformação axial de C-O; 750: deformação angular fora do plano de C-H
aromático; 650: deformação angular fora do plano de O-H (ANEXO-figura 1B).
Catequina: ν
máx
(KBr/cm
-1
): 3370 e 3200: deformação axial O-H; 1600 e 1510:
deformação axial C=C do anel aromático; 1250: deformação axial assimétrica de C-
O-C; 1240 e 1100: deformação angular de O-H e deformação axial de C-O; 900 e
650: deformação angular fora do plano de C-H aromático (ANEXO-figura 1C).
Pirogalol: ν
máx
(KBr/cm
-1
): 3400: deformação axial O-H; 1900 e 1700: bandas
harmônicas de anel aromático trissubstituido; 1620 e 1520: deformação axial C=C do
anel aromático; 1390-1180: deformação angular de O-H e deformação axial de C-O;
815: banda forte do C-H fora do plano relativa à substituição do anel aromático
(ANEXO-figura 1D).
5.4.3 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
Para o ácido gálico, a catequina e o pirogalol os valores teóricos das
temperaturas de fusão relatados na literatura são, respectivamente, 265 ºC, 175-
177ºC e 131-133 ºC (BUDAVARI, 1996). Os valores determinados
experimentalmente foram bastante semelhantes (264 ºC, 171 ºC, 132 ºC). Cabe
Resultados e Discussão
58
salientar que pequenas diferenças entre as temperaturas medidas pelo aparelho de
Köffler, e aquelas determinadas através de DSC, podem existir. Isso ocorre porque a
sensibilidade do segundo é superior, além de haver diferenças de parâmetros tais
como atmosfera em que os experimentos são realizados, bem como as velocidades
de aquecimento utilizadas (FORD; TIMMINS, 1989; HAINES, 1995; HATAKEYAMA;
QUINN, 1999; COSTA, 2005).
A temperatura de fusão de 251 ºC determinada para o ácido tânico (mistura
polimérica) diferiu da faixa de fusão de 210-215 ºC relatada na literatura. Esse fato
pode encontrar resposta nas observações feitas por MAKKAR; BECKER (1993), no
sentido que, amostras de diferentes marcas comerciais (Merck, Sigma, Fluka, dentre
outras) tiveram diferentes capacidades de precipitação protéica e de composições
em termos de ácido tânico. Foi realizada para o ácido tânico também a
determinação através de Köffler e verificou-se que a partir de 200 ºC inicia-se o
processo de carbonização da amostra. Ao atingir temperatura de 220 ºC a amostra
encontra-se totalmente carbonizada. Dessa forma, é possível afirmar que a fusão é
acompanhada de carbonização, sendo esses resultados, obtidos no aparelho de
Köffler, semelhantes aos relatados na literatura (BUDAVARI, 1996).
5.5 Caracterização dos agentes complexantes
O teor médio de umidade obtido para a caseína purificada foi de 8,74 ± 0,06
com CV % 0,67. O teor de umidade obtido para a caseína grau técnico foi de 9,25
±
0,10 com CV% 1,09.
Os derivados da PVPP foram caracterizados mediante a determinação do pH
e a obtenção dos espectros no infravermelho. Os resultados da determinação do pH
estão representados na tabela 3.
Resultados e Discussão
59
Tabela 3. Valores de pH obtidos para os derivados da PVPP.
Substância
pH
±
S
CV (%)
PVPP (P 6755 – Sigma)
7,32
±
0,04
0,56
Divergan® F
5,58
±
0,06
1,07
Divergan® RS
5,02
±
0,04
0,87
Kollidon-CL®
4,47
±
0,03
0,74
Nota: S: desvio padrão; n = 4.
De acordo com os resultados obtidos verificou-se que os derivados da PVPP
apresentam um pH ácido, com exceção da PVPP-P6755, que apresentou pH
próximo da neutralidade. Através da comparação dos resultados com as
especificações estabelecidas pelos fornecedores e também pela USP 29 (2006),
verificou-se que os valores de pH estão dentro da faixa estabelecida que
compreende os limites 3,0 e 7,0.
Os diferentes derivados da PVPP apresentaram espectros no infravermelho
idêntidos entre si e completamente sobreponíveis aos relatados na literatura
(POUCHERT, 1991; KOLLIDON, 2001). Os espectros apresentaram as seguintes
bandas características: ν
máx
(KBr/cm
-1
): ∼ 2900: deformação axial da ligação C-N;
1670: deformação axial C=O, característica de lactamas de 5 membros; 1450:
deformação angular de C-H (NAKANISHI e SOLOMON, 1977; SILVERSTEIN et al.,
1998; PAVIA et al., 2001) (ANEXO-figura 1E).
5.6 Avaliação das variáveis analíticas de métodos para determinação do teor
de taninos totais utilizando agentes complexantes protéicos
5.6.1 Comprimento de onda de leitura e tempo de leitura
A revisão comparativa dos métodos gerais de determinação do teor de
taninos totais, especificamente daqueles baseados na complexação com proteínas e
seguidos de uma reação de oxi-redução, revelou uma certa diversidade nas
especificações analíticas entre algumas das principais Farmacopéias e Códigos
Oficiais (ANEXO-tabela 1A até 1F). Assim, os comprimentos de onda de leitura
variaram entre 730 e 760 nm, dependendo do material vegetal analisado e do
Resultados e Discussão
60
reagente de oxi-redução empregado. De modo similar, os tempos de leitura variaram
de dois para 25 e 30 min.
No caso particular da solução extrativa de folhas de Psidium guajava, essa
apresentou absorção máxima em 760 nm, quando tratada segundo o método de
Folin-Ciocalteu. Por sua vez, pirogalol também apresentou um máximo de absorção
muito próximo (765 nm), quando tratado nas mesmas condições experimentais. Isso
se deve ao fato dos produtos de reação entre o reagente de Folin-Ciocalteu e
diversas substâncias polifenólicas terem comprimentos de onda máximos quase
sempre próximos a 760 nm, sendo essa uma desvantagem do método (SCALBERT,
1992).
As cinéticas de reação do reagente de Folin-Ciocalteu com pirogalol e com a
solução extrativa mostraram comportamentos semelhantes. Em ambos os casos,
logo após uma pequena fase de estabilidade, se observou uma segunda de
aumento acentuado, quase exponencial, que atingiu valores máximos de
absorvância 30 min após adição do reagente. Este resultado coincide com o
preconizado por alguns Códigos Oficiais (F. Bras. 1988; DAB, 1998; BP, 2001; Ph.
Eur., 2002). Este fato e o precedente uso de pirogalol como substância de referência
(DAB, 1998; MARTINS, 1998), levou a selecioná-lo com esta finalidade no presente
trabalho.
5.6.2 Quantidade e tipo de reagente de oxi-redução
A possibilidade de esgotamento do reagente de oxi-redução em análises de
taninos fora anteriormente assinalada por MARTINS (1998), que constatou a perda
da linearidade nas curvas de calibração do pirogalol e de uma solução extrativa de
Maytenus ilicifolia. Este fato foi notório para a solução extrativa de folhas de Psidium
guajava, quando utilizado 1,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, sobretudo nas
faixas de maior concentração. A adição de 2,0 mL restabeleceu contudo a
linearidade, que se mantém quando a quantidade de reagente foi aumentada para
3,0 mL. O mesmo fato foi observado neste trabalho para o pirogalol, nas faixas de
concentração referentes às respectivas curvas de calibração. Isso fica evidente na
comparação estatística das equações de regressão e dos respectivos limites de
Resultados e Discussão
61
confiança (LC) calculados para as curvas de calibração do pirogalol com 2,0 mL e
1,0 mL de reagente.
Inicialmente realizou-se uma comparação entre as três curvas de calibração
obtidas para o pirogalol utilizando 2,0 mL de reagente, a fim de verificar a igualdade
estatísitica entre elas e determinar uma única curva para fins de cálculo. Para tanto,
as três curvas de calibração foram submetidas à análise de regressão linear (tabela
4) e os parâmetros foram comparados a fim de verificar diferenças entre as
inclinações e elevações obtidas nas retas.
Tabela 4. Resultados da análise de regressão linear das curvas analíticas do
pirogalol em 760 nm, com 2,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu
Curva 1
Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) -0,02027 0,00666 -0,03465 -0,00588 0,00940
Inclinação (b) 0,21655 0,00251 0,21113 0,22197 2,54 x10
-19
R
2
0,9982 = ; F
tabelado
=4,67 ; F
calculado
= 7446,76 ; Equação 1: y = 0,21655 x – 0,02027
Curva 2
Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) -0,01633 0,00822 -0,03410 0,00144 0,06862
Inclinação (b) 0,21206 0,00310 0,20536 0,21876 5,18 x 10
-18
R
2
= 0,9972 ; F
tabelado
= 4,67; F
calculado
= 4678,38; Equação 2: y = 0,21206x – 0,01633
Curva 3
Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) -0,02190 0,01100 -0,04568 0,00188 0,06810
Inclinação (b) 0,22148 0,00415 0,21251 0,23044 1,28 x 10
-16
R
2
= 0,9954; F
tabelado
= 4,67; F
calculado
= 2849,51; Equação 3: y = 0,22148x – 0,02190
Através de teste F,. constatou-se que as curvas apresentam inclinações
idênticas (F
calculado
= 2,01; F
0,05(2),39
= 3,24), no entanto observou-se diferença entre
as elevações das curvas 2 e 3 (F
calculado
= 4,95; F
0,05(2),41
= 3,22). A diferença
encontrada não é altamente significativa já que F
0,01(2),41
= 5,16, no entanto, para
fins de cálculo foram levadas em consideração as curvas de 2,0 mL idênticas,
originando uma única equação (tabela 5).
Resultados e Discussão
62
Tabela 5. Resultado da análise de regressão linear da curva analítica obtida para o
pirogalol, em 760 nm, a partir da comparação das curvas.
Parâmetros Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) -0,02108 0,00671 -0,03483 -0,00734 0,00395
Inclinação (b) 0,21902 0,00253 0,21383 0,2242 1,47 x 10
-35
R
2
= 0,9963 ; F
tabelado
= 4,19; F
calculado
= 7494,88 ; Equação 1: y = 0,21902x – 0,02108
A equação representada na tabela 5 foi então comparada com a equação
obtida quando da utilização de 1,0 mL de reagente (tabela 6).
Tabela 6. Resultados da análise de regressão linear da curva analítica do pirogalol
em 760 nm, com 1,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu
Parâmetros Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) -0,009911 0,003673 -0,017847 -0,001975 0,018261
Inclinação (b) 0,17915 0,001384 0,176162 0,18214 1,32 x 10
-21
R
2
= 0,9992 ; F
tabelado
=4,67 ; F
calculado
= 16745,13 ; Equação 1: y = 0,17915x – 0,00991
A comparação das curvas obtidas com 2,0 e 1,0 mL, tabelas 5 e 6
respectivamente, evidenciou que a quantidade de reagente influencia
significativamente no valor de absorvância obtido. Testando a igualdade dos
coeficientes (inclinações) das curvas obteve-se um valor de t
calculado
= 2,98 maior do
que t
0,05(2), 41
= 2,02 e maior também do que t
0,01(2), 41
= 2,70 permitindo afirmar que
a diferença entre as inclinações é altamente significativa. Da mesma forma, a
análise revelou diferença altamente significativa entre as elevações (plano ocupado
em relação ao eixo dos Y) das curvas obtidas: valor de t
calculado
= 10,76 e t
0,05(2); 45
=
2,01 e t
0,01(2); 45
= 2,69.
A análise dos resíduos de regressão, realizada pelo teste de Durbin-Watson
não detectou auto-correlação, ou seja há independência de cada ponto em relação à
resposta, tanto para as equações obtidas com 1,0 e 2,0 mL de reagente: dw
calculado
=
2,3047 e 2,5975 respectivamente > dw
inferior
1,08 e dw
superior
1,36 (n = 15; α = 0,05).
A adição de 2,0 mL de reagente provocou ainda um efeito hipercrômico
(figura 6) e um pequeno deslocamento batocrômico do λ
máx
obtidos com 1,0 mL
Resultados e Discussão
63
desse reagente, os quais se mantiveram constantes quando o volume de reagente
foi aumentado para 3,0 mL. Dessa forma, o conjunto de resultados justifica a
escolha do volume de 2,0 mL de reagente de Folin-Ciocalteu. Cabe aqui salientar
que o volume de 1,0 mL é preconizado no Método Geral de determinação de taninos
Ph. Eur., 2002) e em monografias específicas de Farmacopéias (DAB, 1998; BP,
2001).
Figura 6. Espectros de absorção na região do visível para a solução extrativa
de Psidium guajava (A) e solução aquosa de pirogalol a 3,2 µg mL
-1
(B), após adição de 2,0 (___) e 1,0 mL (.....) de reagente de Folin-
Ciocalteu.
Dessa forma, o coeficiente de absorção específica (
1%
cm 1
A ) do pirogalol,
calculado a partir da curva de calibração utilizando 2,0 mL de reagente, foi de
2098,8.
Com o intuito de comparar dois reagentes bastante utilizados na quantificação
de polifenóis totais, realizaram-se medidas utilizando também o reagente de Folin-
Denis. Para tanto, foram efetuadas leituras em 2 minutos, tempo preconizado em
DAB (1986) quando se utiliza o reagente de Folin-Denis, e 30 minutos, tempo
preconizado quando da utilização do reagente de Folin-Ciocalteu. Os resultados
mostraram que para o Folin-Denis, após um breve período de estabilidade, até o
segundo minuto, ocorre um aumento da absorvância. Nesse, a coloração azul
translúcida passa paulatinamente para uma azul-opaco, acompanhada de turvação,
revelando que o produto de reação formado é instável, o que compromete a
veracidade da leitura após o período de 2 minutos (tabela 7).
B
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Absorvância (UA)
Comprimento de Onda (nm)
A
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Absorvância (UA)
Comprimento de Onda (nm)
Resultados e Discussão
64
Tabela 7. Resultados obtidos com a utilização do reagente de Folin-Denis após 2 e
30 minutos da adição de solução de carbonato de sódio (20%), para
polifenóis totais (PT) e fração não-tanante (FNT)
2 min.
±
S
CV %
30 min.
±
S
CV %
PT (UA)
0,4552
±
0,0071
1,68
0,5450
±
0,029
5,38
FNT (UA)
0,2936
±
0,0010
0,36
0,3738
±
0,0044
1,18
Nos métodos de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu existem dois fatores que
limitam a proporcionalidade da reação. A reação entre fenóis e reagentes não é
absolutamente completa. Por esse motivo, costuma-se utilizar um excesso de
reagente o que implica na segunda limitação, uma certa absorvância na região
espectral do azul acompanhada de turbidez. A origem dos precipitados é atribuída à
formação de sais insolúveis de sódio, sobretudo no caso do reagente de Folin-Denis.
Devido a isso, a inclusão de sais de lítio no reagente de Folin-Ciocalteu tem a
finalidade de deslocar o sódio, minimizando assim essa turbidez (FOLIN;
CIOCALTEU, 1927; SCALBERT, 1992). Se aceita geralmente que o reagente de
Folin-Ciocalteu possui uma maior sensibilidade, quando comparado ao reagente de
Folin-Denis (SCALBERT, 1992).
5.6.3 Seleção do tipo e da quantidade de caseína a ser utilizada
Para a determinação do tipo e da quantidade de agente complexante o tempo
de complexação foi determinado em 60 minutos, tempo preconizado por Códigos
Oficiais como sendo ideal (F. Bras. 1988; DAB, 1998; BP, 2001; Ph. Eur., 2002).
Os resultados de testes preliminares com diferentes tipos de caseína
demonstraram a existência de diferenças significativas na capacidade de
complexação dessas. De modo geral, pode-se afirmar que a variabilidade
experimental está associada ao tipo e quantidade de caseína utilizada,
principalmente para a caseína purificada. Para essa caseína, a falta de precisão
intermediária foi observada em quantidades próximas a 100,0 mg, inviabilizando a
utilização dessa, no prosseguimento do trabalho (figura 7; ANEXO-tabela 2A).
Resultados e Discussão
65
Figura 7. Valores de absorvância da fração residual da solução extrativa de Psidium
guajava em função da quantidade de caseína purificada.
Em termos de precisão intermediária, os melhores resultados foram obtidos
para uma quantidade de, no máximo, 600,0 mg de caseína grau técnico (GT). Para
quantidades acima desse valor, foram observados desvios grandes e um
decaimento linear da absorvância (figura 8; ANEXO-tabela 3A).
Figura 8. Valores de absorvância da fração residual da solução extrativa de
Psidium guajava em função da quantidade de caseína GT.
No que concerne à maior capacidade de complexação e aos resultados
erráticos decorrentes da dispersão da caseína purificada, alguns trabalhos
anteriores permitem explicar tanto um quanto o outro. A defosforilação da caseína,
implícita no processo de purificação dessa, afeta negativamente a coesão estrutural
e a capacidade de formação de estruturas micelares, originalmente observadas na
caseína bruta. Como conseqüência disso, tanto a superfície reacional quanto a
capacidade de complexar taninos aumentam, porém, à custa de um aumento da
hidrofobia da superfície (LUCK et al., 1994; JÖBSTL et al., 2004). Em caseínas
brutas, as propriedades de superfície são influenciadas pelas κ e α
S
-caseínas
presentes na superfície das micelas (LUCK et al., 1994; WALSTRA, 1999). Esta
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
100 200 300 400 500
Concentração caseína (mg)
Absorvância (U.A.)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
100 200 300 400 500 600 700 800
Concentração caseína (mg)
Absorvância (UA)
Resultados e Discussão
66
característica se perde na caseína purificada e, conseqüentemente, ocorre um
aumento na hidrofobia superficial que compromete a obtenção de dispersões
homogeneamente ativas. Face à essas constatações, foi dada a preferência ao uso
da caseína GT para a realização dos ensaios posteriores descritos neste trabalho.
Tomando como ponto de partida uma quantidade de 400,0 mg de caseína GT
(SOARES, 2002), uma tomada de amostra de 0,5 g de material vegetal, 2,0 mL do
reagente de Folin-Ciocalteu e leitura em 760 nm, 30 min após adição do reagente, o
teor de taninos calculado corresponde a 3,620 g por 100 g de droga vegetal seca
(CV = 4,4 %), expressos como pirogalol.
Os experimentos a seguir tiveram como objetivo a validação desse resultado.
Os resultados para os testes de repetibilidade e precisão intermediaria estão
contidos na tabela 8 e encontram-se dentro do limite de 5%, preconizado para
matrizes complexas, como drogas vegetais
(HEFENDEHL, 1985).
Tabela 8. Resultados obtidos para os parâmetros de validação do método de
determinação do teor de taninos totais de Psidium guajava
REPRODUTIBILIDADE
PT (UA) FNT (UA) TT (g %)
Primeiro dia 0,583 0,351 3,481
Segundo dia 0,574 0,334 3,585
Terceiro dia 0,580 0,326 3,793
Média 0,579 0,337 3,620
Desvio padrão 0,005 0,012 0,15901
CV (%) 0,82 3,71 4,39
REPETIBILIDADE
Média 0,617 0,359 3,84
Desvio padrão 0,004 0,005 0,096
CV (%) 0,65 1,40 2,51
Nota: PT: Polifenóis totais; FNT: Fração não-tanante; TT: Taninos totais; CV %: coeficiente de variação
percentual (n=9).
A linearidade na faixa de concentração estudada e a proporcionalidade entre
os resultados para polifenóis totais e a fração não-tanante foram avaliadas mediante
análise de duas curvas de calibração, uma para polifenóis totais e a outra para a
fração não-tanante. Os resultados obtidos através de análise de regressão linear são
mostrados na tabela 9.
Resultados e Discussão
67
Tabela 9. Resultados da análise de regressão linear das curvas analíticas obtidas
para polifenóis totais (PT) e fração não-tanante (FNT) com o reagente de
Folin-Ciocalteu
Polifenóis totais (PT)
Parâmetros Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) 0,02072 0,00972 0,00658 0,04781 0,01291
Inclinação (b) 0,01552 0,00026 0,01496 0,01607 3,96 X 10
-20
R
2
= 0,9954; F
tabelado
= 4,49; F
calculado
= 3460,78; Equação 1: y = 0,01552x + 0,02072
Fração não-tanante (FNT)
Parâmetros Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) -0,14030 0,01339 -0,16869 -0,11191 1,43 x 10
-8
Inclinação (b) 0,01294 0,00036 0,01217 0,01371 1,14 x 10
-16
R
2
= 0,9875; F
tabelado
= 4,49; F
calculado
= 1268,70; Equação 2: y = 0,01294x – 0,14030
A curva de calibração obtida para PT apresentou pequeno desvio de
linearidade (R
2
= 0,9954) enquanto para FNT, obteve-se um desvio maior: R
2
=
0,9875. Avaliou-se ainda a correlação existente entre as absorvâncias obtidas na
curva dos polifenóis totais em relação às da fração não-tanante. Obteve-se um r =
0,9862, indicando correlação entre os valores de absorvância dos PT e FNT. Valores
satisfatórios de correlação entre PT e FNT, e o desvio da linearidade foram
observados também por MARTINS (1998) para Maytenus ilicifolia. Nesse caso, o
esgotamento prematuro do reagente de Folin-Ciocalteu para as concentrações mais
elevadas da solução extrativa pode estar relacionado com o comprometimento da
linearidade.
Cabe aqui destacar que o teor de taninos, calculado utilizando 400,0 mg de
caseína, diferiu sensivelmente do teor de 7,641 g/100 g (CV % 1,18), calculado
quando a mesma amostra foi analisada conforme a metodologia da Farmacopéia
Européia (Ph. Eur., 2002), que preconiza o uso de 100,0 mg de pó-de-pele. Mais
ainda, foi possível demonstrar que a utilização de 100,0 mg de pó-de-pele levou a
um esgotamento quase total dos polifenóis do meio reacional, resultando em uma
fração não-tanante próxima de zero (0,094 ± 0,003 U.A.). Isso sugere fortemente
Resultados e Discussão
68
que existe uma falta de especificidade no método oficial, pelo menos no caso
específico de Psidium guajava.
Uma vez que o método baseado na complexação com caseína parte de
princípios químicos e físico-químicos semelhantes aos encontrados na complexação
com pó-de-pele, nesta segunda parte do trabalho se deu ênfase ao estudo da
especificidade de ambos os métodos.
5.6.4 Estudos da especificidade da caseína e do pó-de-pele ao reagir com taninos
A análise por UV da fração não-tanante mostrou que o grau de retirada dos
polifenóis do meio com 100,0 mg de pó-de-pele foi comparável àquele obtido com
800,0 mg de caseína GT ou 500,0 mg caseína purificada (figuras 7 e 8).
Para a caseína GT, observou-se também uma zona de relativa estabilização
da absorvância na faixa de 400,0 a 600,0 mg de caseína (figura 8). Acima desses
valores, a absorvância começa a diminuir e a variabilidade experimental a aumentar.
Inicialmente, esse comportamento foi interpretado como sendo o resultado de
reações diferentes, sendo a primeira etapa de abaixamento da absorvância atribuída
a uma reação (complexação) preferencial dos taninos, frente à presença de outros
polifenóis. Seguindo esse mesmo pressuposto, o abaixamento posterior da
absorvância, observado com quantidades maiores de caseína GT (700,0 e 800,0
mg) seria resultado da complexação de outros polifenóis presentes na solução
extrativa.
Para comprovação dessa hipótese adicionou-se rutina à solução extrativa e
procederam-se análises com 400,0 e 600,0 mg de caseína. Cabe aqui acrescentar
que a rutina foi selecionada como flavonóide modelo por ser de ampla distribuição
no reino vegetal. Por si só, a adição de rutina resultou num aumento de 0,139 U.A.
na absorvância. Esse aumento foi reduzido para 0,100 U.A., quando utilizados 400,0
mg de caseína GT. Com 600,0 mg de caseína esse aumento na absorvância
desapareceu completamente, permitindo inferir que, com a utilização de 600,0 mg
de caseína GT, já teria ocorrido uma retirada do meio reacional da rutina (ANEXO-
tabela 4A).
Resultados e Discussão
69
Uma segunda forma de verificar a complexação concomitante dos flavonóides
por parte da caseína foi utilizar a técnica de CLAE-PDA. Como ponto referencial
foram obtidos os cromatogramas do ácido gálico, pirogalol, catequina e rutina e os
respectivos espectros no ultravioleta por PDA (figuras 9 e 10).
Figura 9. Cromatogramas obtidos para (1) ácido gálico, (2) pirogalol, (3)
catequina e (4) rutina. Detecção em 280 nm.
Figura 10. Espectros no UV do (1) ácido gálico, (2) pirogalol, (3) catequina e (4)
rutina, obtidos a partir do cromatograma da figura 9.
A presença dessas substâncias no cromatograma por CLAE da solução
extrativa foi analisada e os espectros no UV, relativos a picos de igual tempo de
retenção, são mostrados nas figuras 11 e 12.
0 10203040506070
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
4
3
2
1
mABS (UA)
Tempo (min.)
(1) (2) (3) (4)
Resultados e Discussão
70
Figura 11. Cromatograma obtido para a solução extrativa de Psidium guajava.
Detecção em 280 nm. 1 - ácido gálico; 3 – catequina.
Figura 12. Espectros no UV obtidos do cromatograma da figura 11: 1 - ácido
gálico; 3 - catequina. Detecção em 280 nm.
A comparação dos cromatogramas e espectros no UV, contidos nas figuras 9
a12, permite concluir que o ácido gálico e catequina estão presentes na solução
extrativa de Psidium guajava. A presença de pirogalol (substância 2 – figura 9) e
rutina (substância 4 – figura 9) não pôde ser confirmada de forma unívoca.
A presença de ácido gálico e catequina em Psidium guajava é relatada na
literatura (WHO, 1998; KONDO et al., 2005), além de epicatequina (KONDO et al.,
2005), ácido elágico (WHO, 1998; LANS et al., 2000) e outros taninos (WHO, 1998;
GONÇALVES et al., 2005; OH et al., 2005).
3 1
λ (nm) λ (nm)
0 10203040506070
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
3
1
Absorvância
Tempo (min.)
Resultados e Discussão
71
Alterando o comprimento de onda de detecção para 352 nm foi possível uma
melhor detecção da fração flavonoídica presente na solução extrativa (Figuras 13 e
14).
Figura 13. Cromatograma obtido para a solução extrativa de Psidium guajava.
Detecção em 352 nm.
Figura 14. Espectros no UV obtidos para os picos 1,2,3,4,5 e 6 da figura 13.
A julgar pelos tempos de retenção e pelas duas bandas de absorção máximas
em torno de 257 e 357 nm, com um submáximo próximo de 300 nm nos picos 1 a 5
(figuras 13 e 14), os espectros de UV identificam estruturas com dois cromóforos
aromáticos conjugados típicos de flavonóis e sobreponíveis aos observados para
derivados da quercetina, como a rutina (figura 10 sub-item 4). Diferentemente, o pico
6 apresenta máximos e submáximos de absorção diferentes (262,5, 357,7 nm e
aprox. 295 nm), contudo, mantendo um perfil de absorção próprio de flavonóide
(HARBORNE et al., 1975).
0 10203040506070
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
1
2
3
4
5
6
mAbsorvância
Tempo (min.)
1 2 3 4 5 6
Resultados e Discussão
72
A presença de flavonóides como a quercetina e seus derivados glicosilados
como 3-L-4-arabinofuranosídeo (avicularina) e 3-L-4-piranosídeo têm sido
amplamente relatada na literatura para Psidium guajava (JAIARJ et al., 1999; LANS
et al., 2000; LOZOYA et al., 2002; GONÇALVES et al., 2005; KONDO et al., 2005;
LAPCÍK et al., 2005; OH et al., 2005). Alguns autores mencionam a predominância
do derivado da quercetina 3-O-beta glicosídeo (LOZOYA et al., 2002). No entanto,
existem relatos da predominância de miricetina e apigenina em Psidium guajava
(MANOSROI et al., 2005)
1
. Também é mencionada a presença de ácido clorogênico
(KONDO et al., 2005).
Isoflavonas também têm sido detectadas em Psidium guajava por CLAE e
espectrometria de massa, tais como daidzeína, glicitina, genisteína, prunetina e
formononetina (LAPCIK et al., 2005).
A análise dos cromatogramas obtidos por CLAE-PDA mostra claramente que
há alterações na composição da solução extrativa, quando da utilização de 400,0 mg
de caseína, independente se a detecção é feita em 280 ou 352 nm (Figura 15, A e
B). Contudo, cabe aqui observar que, por uma necessidade analítica, as
concentrações das amostras analisadas por CLAE foram quatro vezes maiores do
que as analisadas por UV.
Figura 15. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos após tratamento com 400,0
mg de caseína. A: detecção em 280 nm; B: detecção em 352 nm.
0 10203040506070
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
3
1
mAbsorvância
Tempo (min.)
0 10203040506070
0
2000
4000
6000
8000
10000
1
2
3
4
5
6
mAbsorvância
Tempo (min.)
A B
1 MANOSROI, J.; DHUMTANOM, P.; MANOSROI, A. Anti-proliferative activity of essential oil
extracted from Thai medicinal plants on KB and P388 cell lines. Cancer Letters, in press, 2005.
Resultados e Discussão
73
Para restabelecer a mesma proporção droga vegetal: caseína utilizada no
método espectrofotométrico, a quantidade de caseína foi aumentada em quatro
vezes, para 1600,0 mg (Figura 16, A e B).
Figura 16. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos após tratamento com
1600 mg de caseína. A: detecção em 280 nm; B: detecção em 352
nm.
Face a essa consideração, após a adição de 1600,0 mg de caseína ficaram
claramente evidentes as alterações ocorridas na composição da solução extrativa,
quando essa foi analisada em 280 nm, comprimento de onda em que catequina e
ácido gálico são detectáveis. Mais ainda, a composição da solução extrativa
mostrou-se nitidamente alterada em 352 nm, um comprimento de onda no qual
rutina e flavonóides afins absorvem, mas não ácido gálico e catequina.
Para fins de comparação, foi realizada uma análise semelhante com 100,0
mg de pó-de-pele, nas mesmas condições experimentais que a caseína (Figura 17 A
e B).
A
0 10203040506070
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
2
3
4
5
6
1
mAbsorvância
Tempo (min.)
B
0 10203040506070
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
3
1
mAbsorvância
Tempo (min.)
Resultados e Discussão
74
Figura 17. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos após tratamento com
100,0 mg de pó-de-pele. A: detecção em 280 nm; B: detecção em 352 nm.
Pode-se verificar que as análises por CLAE-PDA confirmam os resultados
obtidos por ultravioleta para a solução extrativa de Psidium guajava, ou seja, tanto o
pó-de-pele quanto a caseína são capazes de complexar os flavonóides do meio, fato
que compromete a especificidade de ambos os métodos (Tabela 10; ANEXO-tabela
5A). Contudo, merece especial atenção o fato da eficiência de retirada dos
flavonóides ser mais acentuada com caseína do que com 100,0 mg de pó-de-pele, o
que não condiz plenamente com o observado no método espectrofotométrico.
Aparentemente esses resultados contradizem o observado por LIAO e
colaboradores (2003) que afirmam que as fibras de colágeno (pó-de-pele) são
seletivas para a remoção de taninos. Os autores realizaram experimentos utilizando
as isoflavonas daidzeína, genisteína e o flavonóide baicaleína e demonstraram que
a afinidade do pó-de-pele por essas substâncias é muito menor do que a observada
para o ácido tânico. Considerando que a complexação de polifenóis utilizando pó-de-
pele e PVPP é semelhante (MAKKAR et al., 1995; SIEBERT, 1999) a baixa
afinidade da PVPP por isoflavonas foi relatada anteriormente por DONNER e
colaboradores (1993), que demonstraram que a afinidade está relacionada com a
estrutura dos flavonóides.
Os resultados por CLAE-PDA permitem também estabelecer diferenças
quanto à afinidade para complexação. Especificamente, o ácido gálico não foi
complexado na mesma intensidade pela caseína e pelo pó-de-pele, se comparado
com as outras substâncias de referência estudadas neste trabalho. A análise dos
dados indicou que tanto caseína, quanto pó-de-pele, têm uma afinidade maior por
0 10203040506070
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
1
mAbsorvância
Tempo (min.)
0 10203040506070
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
1
2
3
4
5
6
mAbsorvância
Tempo (min.)
A B
Resultados e Discussão
75
catequina e flavonóides do que por ácido gálico (Figuras 11-17). Isso, de certa
forma, levanta questionamentos sobre o uso do ácido gálico como substância de
referência na quantificação de taninos.
Tabela 10. Percentual de ácido gálico, catequina e flavonóides de Psidium guajava
complexados com diferentes quantidades de caseína e pó-de-pele.
Detecção em 280 nm (ácido gálico e catequina) e 352 nm (flavonóides).
280 nm 352 nm Detecção
Amostras
AG
CV %
CAT
CV%
Pico 1
CV%
Pico 2
CV%
Pico 3
CV%
Pico 4
CV%
Pico 5
CV%
Pico 6
CV%
SE + 100 mg de
caseína
16,08
6,29
32,75
7,49
31,13
0,86
58,62
1,26
57,73
0,34
51,79
0,90
55,02
0,32
67,06
0,46
SE + 400 mg de
caseína
30,66
0,47
63,16
1,69
54,87
1,56
85,66
3,86
84,65
0,55
79,54
1,34
88,69
0,38
95,80
5,10
SE + 800 mg de
caseína
34,55
2,07
82,47
9,16
94,84
5,36
93,05
6,23
93,17
2,63
91,41
2,16
96,06
3,18
90,45
2,64
SE + 1600 mg de
caseína
48,38
3,84
75,66
2,63
92,62
4,30
96,92
4,48
96,31
3,70
95,61
4,67
98,56
6,26
100
SE + 50 mg de pó-
de-pele
50,60
2,09
61,11
1,04
72,41
1,74
58,97
1,16
55,16
0,61
50,64
2,71
81,01
0,95
79,67
1,70
SE + 100 mg de
pó-de-pele
60,41
3,26
60,01
5,05
81,64
1,40
63,96
1,85
60,98
0,42
55,66
2,50
89,25
0,81
89,37
5,64
Nota: AG: ácido gálico; CAT: catequina; SE: solução extrativa; CV %: coeficiente de variação percentual (n = 3).
O tema certamente merece ainda estudos complementares, uma vez que os
resultados relatados por SOARES (2002) contradizem em parte aqueles observados
para a rutina e outros flavonóides presentes na solução extrativa de folhas de
Psidium guajava. Segundo esse autor, a presença expressiva de caseína parece
não afetar algum tipo de flavonóide, o que obriga certamente a restringir qualquer
conclusão de caráter geral sobre a capacidade irrestrita da caseína e do pó-de-pele
de complexarem, de forma inespecífica, qualquer flavonóide na presença de taninos.
Resultados e Discussão
76
5.7 Caracterização físico-química dos complexos PVPP-substância de
referência
5.7.1 Avaliação do perfil de complexação das diferentes PVPP
Os derivados de PVPP, avaliados como agentes complexantes nesse
trabalho, são amplamente utilizados pela indústria. O Kollidon® CL é utilizado para
favorecer o processo de dissolução de fármacos, influenciando assim a
biodisponibilidade destes (KOLLIDON, 2001). Derivados como Divergan® F e
Divergan® RS encontram aplicação na indústria de bebidas, para a retirada de
polifenóis no processo de clarificação (BASF, 2001). A PVPP-P6755 (Sigma) por sua
vez é preconizada pela FAO (2000) como agente complexante para a remoção de
taninos de extratos vegetais. Com o intuito de identificar o polímero com as melhores
características de complexação frente ao extrato de Psidium guajava e frente à
substâncias de referência amplamente utilizadas na quantificação de taninos, foram
realizadas as análises subseqüentes.
A capacidade de formação de complexos das diferentes PVPP foi avaliada
mediante o tratamento das substâncias ácido gálico, ácido tânico, pirogalol e
catequina com os polímeros: Divergan® F; Divergan® RS; Kollidon® CL; PVPP-P
6755 – Sigma. Os resultados obtidos estão representados na figura 18 e ANEXO-
tabela 6A.
Resultados e Discussão
77
Figura 18. Complexação de ácido gálico (A), ácido tânico (B), catequina (C),
pirogalol (D) e solução extrativa (E) com as diferentes PVPP. PVPP-
P6755 Sigma (); Kollidon® CL (S); Divergan® F(); Divergan®RS
( ).
A julgar pelas curvas de complexação, fica evidente a maior afinidade do
ácido tânico e da catequina pelas PVPP testadas. Essas substâncias se
complexaram com os diferentes PVPP com maior intensidade, quando comparados
ao ácido gálico e pirogalol (figura 18).
Este fato parece estar relacionado com algumas peculiaridades nas estruturas
químicas das substâncias de referência. A complexação de polifenóis, em geral, com
derivados da PVPP, por exemplo, estaria relacionada com o aumento no número de
grupamentos hidroxila, uma vez que isso favorece a formação mais intensa de
associação por ligações de hidrogênio (DONNER et al., 1993). Isso explica a maior
afinidade dos polímeros pelo ácido tânico, uma estrutura polimérica constituída por
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração de PVPP (mg/mL)
Ácido gálico livre (%)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Fenóis SE livres (%)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Ácido tânico livre (%)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Catequina livre (%)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Pirogalol livre (%)
A
B
C
D
E
Resultados e Discussão
78
unidades de ácido gálico, com numerosos grupamentos hidroxila disponíveis para a
formação de ligações de hidrogênio (FRÖMMING et al., 1981; HORN; DITTER,
1982). Por sua vez, ácido gálico apresentou uma menor afinidade por derivados da
PVPP quando comparado ao ácido tânico. Porém apresentou afinidade maior, se
comparada à do pirogalol. O elemento diferencial neste caso parece ser a presença
do grupamento carboxílico. HORN e DITTER (1982), ao estudar as interações entre
PVPP e vários fármacos, verificaram que os grupos carboxila foram mais efetivos do
que os hidroxila na complexação com PVPP. A catequina apresenta maior número
de grupamentos hidroxila (nas posições, 3,5,7,3’ e 4’) quando comparada ao ácido
gálico e pirogalol (cada molécula apresenta três grupamentos hidroxila)
proporcionando maior capacidade de complexação. No entanto, a maior capacidade
de complexação da catequina com PVPP, em relação ao ácido gálico e pirogalol,
não pode ser atribuída somente ao maior número de grupamentos hidroxila,
certamente a massa molecular da catequina, bem como sua conformação estrutural
proporcionam uma maior afinidade por PVPP.
SIEBERT e colaboradores (1996a) investigando a afinidade da gelatina por
ácido tânico e catequina evidenciaram uma maior formação de precipitados com o
ácido tânico e atribuíram o fato à diferenças como o tamanho do polifenol e a
densidade dos grupamentos hidroxila do ácido tânico, quando comparado com a
catequina.
FICKEL e colaboradores (1999) estudando a complexação de ácido tânico,
ácido gálico e catequina à tripsina (proteína rica em prolina) observaram que
somente o ácido tânico foi capaz de precipitar a proteína, reforçando a importância
das diferenças estruturais dos polifenóis para a complexação e precipitação.
Analisando o comportamento dos diferentes derivados de PVPP, verificou-se
uma semelhança de comportamento dos mesmos frente ao ácido tânico, catequina e
pirogalol. Em contrapartida, o ácido gálico, apresentou uma menor afinidade por
PVPP-P6755 (Sigma), quando comparada às demais PVPP. Por outro lado, ao
analisar o comportamento da solução extrativa de Psidium guajava frente ao
tratamento com as diferentes PVPP, evidenciou-se uma retirada maior de fenóis por
parte da PVPP-P6755 (Sigma). Esse fato e o precedente uso desse polímero pela
FAO (2000), levaram a selecioná-lo como agente complexante para as análises
Resultados e Discussão
79
subseqüentes. Sempre que referindo-se a esse polímero em especial será utilizada
a demominação PVPP-P6755.
5.7.2 Avaliação da complexação entre substâncias de referência e PVPP-P6755
através de calorimetria exploratória diferencial (DSC)
As complexações do ácido gálico, ácido tânico, pirogalol e catequina com a
PVPP-P6755 selecionada também foram investigadas na forma de misturas físicas
em proporções 1:1, 1:5 e 1:10, respectivamente. A proporção 1:1 é geralmente
utilizada, a fim de maximizar as interações (WELLS, 1988; ANDO; RADEBAUGH,
2000), já a proporção 1:5 correspondeu àquela utilizada nos ensaios de
complexação com as substâncias de referência. A partir dos resultados obtidos
optou-se também pela realização de análises em proporção 1:10 (substância de
referência: PVPP-P6755). Não foram realizados outros ensaios com proporções
além do limite 1:10, dado o total desaparecimento dos picos característicos das
substâncias de referência.
Para possibilitar um melhor entendimento dos dados obtidos por DSC, cabe a
explicação de que a temperatura de onset (T
onset
) corresponde à temperatura na qual
a transição começa a acontecer, quando ocorre a primeira variação da linha de
base. A temperatura máxima (T
máx.
) é a que corresponde a temperatura medida no
ápice do evento endotérmico ou exotérmico e o valor de ΔH corresponde à entalpia
envolvida no evento térmico, sendo proporcional à área do pico obtido (COSTA,
2005).
Para a análise dos termogramas, inicialmente foram considerados os
comportamentos isolados. Para o ácido gálico, foram observados dois picos
endotérmicos: em 68,13 e 263,99 °C. O primeiro está relacionado com a perda da
água de cristalização; o segundo com a fusão do ácido gálico, cuja temperatura de
onset (tabela 11) coincide com o valor citado na literatura (BUDAVARI, 1996), antes
já comentando no item 5.4.3. Em relação à PVPP-P6755, observam-se dois
fenômenos, a perda da água de adsorção e o fenômeno de transição vítrea,
característico de algumas substâncias poliméricas (tabela 11). Os resultados estão
de acordo com os valores relatados na literatura para a PVPP, que admitem como
Resultados e Discussão
80
faixa de transição vítrea temperaturas entre 90 e 185 °C, variando de acordo com a
massa molecular (KOLLIDON, 2001).
Analisando-se os termogramas realizados para as misturas de ácido gálico e
PVPP-P6755 (figura 19), notam-se alterações importantes em relação aos
termogramas das substâncias isoladas, indicando algum tipo de interação ou
complexação. Na mistura 1:1 de ambas substâncias, verifica-se uma leve inflexão,
originada pela água de adsorção do polímero, e um pico endotérmico característico
da água de cristalização do ácido gálico, indicando que esta é mantida. Observa-se
ainda que o pico endotérmico da fusão do ácido gálico, encontra-se deslocado e não
apresenta mais o formato característico (figura 19). Os termogramas das misturas
1:5 e 1:10 de ácido gálico e PVPP-P6755 foram semelhantes e observou-se o
completo desaparecimento da endoterma de fusão do ácido gálico. No entanto, os
fenômenos referentes à água de cristalização (do ácido gálico) e água de adsorção
(da PVPP-P6755) ainda se fizeram presentes. Os parâmetros térmicos estão
listados na tabela 5.
Figura 19. Termogramas obtidos por DSC para o ácido gálico (AG) e PVPP-
P6755, assim como para suas misturas nas proporções ponderais 1:1,
1:5 e 1:10.
100.00 200.00 300.00
Temp [C]
-20.00
-10.00
0.00
mW
DSC
A
G:PVPP 1:1
A
G
A
G:PVPP 1:10
A
G:PVPP 1:5
PVPP
Resultados e Discussão
81
Tabela 11. Comparação entre os parâmetros térmicos observados para o ácido
gálico (AG) e a PVPP-P6755 e da mistura na proporção ponderal 1:1, 1:5,
1:10.
O termograma obtido para o pirogalol apresentou dois eventos endotérmicos,
o primeiro com um baixo valor de ΔH, em 75,20 °C, e o segundo referente à fusão
do pirogalol, que ocorre em 131,82 °C. Para verificação do fenômeno representado
pelo primeiro pico endotérmico foram realizados dois aquecimentos. Primeiramente,
realizou-se aquecimento até temperatura de 90 °C, resfriou-se para atingir
temperatura ambiente e novamente procedeu-se aquecimento até temperatura de
200 °C. Observou-se que o pico referente ao primeiro efeito endotérmico não se fez
presente no segundo aquecimento, indicando que pode estar relacionado à
presença de algum tipo de impureza, que se volatiliza ou decompõe durante o
primeiro aquecimento. No segundo efeito endotérmico relativo à fusão do pirogalol, a
temperatura de onset encontra-se de acordo com o relatado na literatura
(BUDAVARI, 1996). A comparação das curvas de aquecimento do pirogalol e da
PVPP-P6755 em diferentes proporções, está demonstrada na figura 20 e seus
parâmetros térmicos contidos na tabela 12.
Eventos
Endotérmico Endotérmico Endotérmico Transição vítrea
Amostra
(massa;
mg)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
med.
Trans.
(°C) (°C) (J g
1
)
AG (1,3)
68,13 87,68 310,95 263,99 266,06 557,96
PVPP (1,3)
22,31..53,61..215,12 198,79 206,56 0,08
1:1 (1,6)
80,19 90,54 57,88 230,56 244,91 111,99 28,50 58,83 41,98
1:5 (1,7)
26,04 74,94 382,99 197,70 202,67 0,06
1:10 (1,1)
29,17 69,15 374,54 196,78 204,36 0,09
Resultados e Discussão
82
Figura 20. Termogramas obtidos por DSC para o pirogalol (Piro) e PVPP-P6755
(PVPP), assim como para suas misturas nas proporções ponderais
1:1, 1:5 e 1:10.
Tabela 12. Comparação entre os parâmetros térmicos observados para o pirogalol
(Piro) e PVPP-P6755 (PVPP) e suas misturas nas proporções ponderais
1:1, 1:5, 1:10
Nota: * representam o primeiro fenômeno endotérmico do pirogalol e a perda de água da PVPP-P6755.
Eventos
Endotérmico Endotérmico Endotérmico Transição vítrea
Amostra
(massa;
mg)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
med.
Trans.
(°C) (°C) (J g
-1
)
Piro (1,3)
75,20 77,26 7,98 132,28 133,72 273,78
PVPP (1,3)
22,31 53,61 215,12 198,79 206,56 0,08
1:1 (1,2)
74,37 76,06 5,55 131,82 132,86 9,64 206,81 236,29 0,13
1:5 (1,5)
27,64 75,77 225,66* 131,80 132,91 9,73 190,67 212,26 0,11
1:10 (1,4)
63,74 75,98 256,86* - 195,44 196,34 0,06
100.0
0
200.0
0
300.0
0
Tem
p
[C]
-20.0
0
-10.0
0
0.0
0
m
W
DS
C
Piro
PVPP
Piro:PVPP (1:1)
Piro:PVPP (1:5)
Piro:PVPP (1:10)
Resultados e Discussão
83
A análise dos termogramas evidencia uma diminuição do pico de fusão do
pirogalol e uma leve redução na temperatura de onset na mistura 1:1, o que sugere
a ocorrência de interação ou complexação entre esse e a PVPP-P6755. Também foi
observada uma leve inflexão associada à perda de água de adsorção do polímero. O
termograma para a mistura de pirogalol e PVPP-P6755 na proporção 1:5 foi
bastante semelhante ao observado para a proporção 1:1 desses. Porém, deve-se
levar em consideração a diminuição do sinal endotérmico relativo à água de
cristalização do pirogalol que é observada na análise da mistura com proporção 1:5,
podendo indicar uma maior interação nessa proporção.
A julgar pelos termogramas obtidos para as proporções de pirogalol:PVPP 1:1
e 1:5, poder-se-ia, equivocadamente, considerar uma maior interação na proporção
1:1 devido à maior redução na intensidade do pico. No entanto, deve-se levar em
consideração a massa de amostra utilizada nas análises. Na mistura com proporção
1:5 utilizou-se 1,5 mg, massa maior, quando comparada à utilizada na proporção 1:1
(1,3 mg). Os valores semelhantes de ΔH (em J g
-1
) obtidos para a fusão do pirogalol
nas proporções citadas confirmam o fato de a interação entre pirogalol e PVPP-
P6755 ser semelhante nas proporções 1:1 e 1:5 (tabela 12). Analisando a mistura de
pirogalol: PVPP-P6755 na proporção 1:10 verifica-se o total desaparecimento do
pico relativo à fusão do pirogalol e o quase desaparecimento do pico relativo à água
de cristalização.
Comparando os resultados obtidos para as misturas em diferentes
proporções de ácido gálico e pirogalol com PVPP-P6755 verifica-se a existência de
uma interação mais forte entre ácido gálico e PVPP-P6755 quando comparada à
que se observa para o pirogalol e o polímero. Isso fica evidente quando se
comparam as curvas obtidas para as misturas nas proporções 1:1 e 1:5. Na mistura
de proporção 1:1 (ácido gálico: PVPP-P6755), o pico de fusão característico do
ácido gálico já sofreu modificações de forma e alteração na temperatura de onset.
Quando se analisa o pirogalol, verifica-se a presença do pico de fusão dessa
substância mesmo para mistura em proporção 1:5, indicando interação menos
acentuada. Esses resultados assemelham-se aos obtidos por ultravioleta (figura 18)
quando se realizaram as complexações de pirogalol e ácido gálico com PVPP-
P6755 em meio líquido.
Resultados e Discussão
84
Para a catequina foram observados três efeitos endotérmicos (figura 21). O
primeiro associado à perda de água de cristalização, fato esse comprovado pela
realização de dois aquecimentos subseqüentes. No mesmo termograma,
imediatamente antes do segundo efeito endotérmico, observou-se uma alteração na
linha de base, que pode estar relacionada a uma transição sólido-sólido da
catequina. O terceiro pico endotérmico, está relacionado com a fusão da catequina,
onde a temperatura de onset corresponde à faixa de 175 a 177 °C relatada na
literatura (BUDAVARI, 1996). Os termogramas por DSC para as misturas de
catequina e PVPP-P6755, assim como os obtidos para as substâncias isoladas,
encontram-se na figura 21. Os parâmetros térmicos encontram-se na tabela 13.
Figura 21. Termogramas obtidos por DSC para a catequina (CAT) e PVPP-
P6755 (PVPP) assim como para suas misturas nas proporções
ponderais 1:1, 1:5 e 1:10.
Analisando-se os termogramas obtidos para as misturas em diferentes
proporções, verificou-se que os eventos característicos da catequina e da PVPP-
P6755 foram mantidos ainda na proporção 1:1, indicando a existência de interação,
ainda que em pequena intensidade. Assim, pode-se constatar que o processo
endotérmico referente à perda da água de cristalização, por exemplo, foi deslocado
para temperaturas um pouco mais elevadas. Para as proporções 1:5 e 1:10 os sinais
100.00 200.00 300.00
Temp [C]
-10.00
-5.00
0.00
mW
DSC
CAT
CAT:PVPP (1:1)
CAT:PVPP (1:10)
CAT:PVPP (1:5)
PVPP
Resultados e Discussão
85
referentes a todos os eventos endotérmicos ainda permanecem reconhecíveis, no
entanto, em intensidades menores quando comparados à mistura em proporção 1:1.
De modo abrangente, ao comparar os resultados obtidos para a catequina,
pirogalol e ácido gálico, a interação da PVPP-P6755 com ácido gálico foi a maior de
todas, o que não condiz com o observado na análise por ultravioleta, onde a
catequina apresentou uma maior complexação com PVPP-P6755, em detrimento do
pirogalol e ácido gálico. Isso reforça a negação de uma equivalência nos
comportamentos entre misturas líquidas e sólidas de substâncias, prevalecendo a
cautela na transposição de resultados obtidos por métodos calorimétricos em meio
sólido e métodos espectrofotométricos em meio líquido.
Tabela 13. Comparação entre os parâmetros térmicos observados para a catequina
(CAT) e PVPP-P6755 (PVPP) e suas misturas nas proporções ponderais
1:1, 1:5, 1:10.
Nota: * representam o primeiro fenômeno endotérmico da catequina e a perda de água da PVPP-P6755.
O ácido tânico apresenta um perfil térmico por DSC sem eventos marcantes,
da mesma forma que a própria PVPP-P6755. Isso impossibilitou a realização de
análises comparativas entre substâncias isoladas e as respectivas misturas.
Eventos
Endotérmico
Endotérmico
Endotérmico Endotérmico Transição vítrea
Amostra
(massa;
mg)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) . (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
máx.
ΔH
(°C) (°C) (J g
-1
)
T
onset
T
med.
Trans.
(°C) (°C) (J g
-1
)
CAT (1,7)
61,63 84,01 73,03 140,48 149,26 37,71 171,28 176,59 13,62
PVPP (1,3)
22,31 53,61 215,12 198,79 206,56 0,08
1:1 (1,2)
92,61 98,60 4,57 140,21 147,60 16,68 171,63 176,50 6,65 24,31 85,61 201,48
1:5 (1,4)
27,00 73,76 432,89* 139,56 147,60 8,18 171,91 176,69 4,55
1:10 (1,4)
29,94 74,91 318,11* 140,76 147,44 4,19 171,85 176,00 2,40
Resultados e Discussão
86
5.7.3 Efeito da purificação ácida da PVPP-P6755 sobre a capacidade complexante
O estudo da influência do processo de purificação objetivou a eventual
constatação de efeitos adversos por parte de resíduos de síntese solúveis, como
H
2
O
2
, e de frações de oligômeros de baixa massa molecular na formação de
complexos entre a PVPP-P6755 e substâncias polifenólicas. Para isso, a capacidade
de complexação foi testada utilizando catequina, antes e após o processo de
purificação da PVPP-P6755 (figura 22; ANEXO-tabela 7A).
Figura 22. Influência da purificação ácida da PVPP-P6755 sobre a fração de
catequina ligada. () PVPP-P6755 não purificada, ({) PVPP-P6755
purificada.
Os resultados obtidos demonstraram que não existe diferença significativa na
capacidade de complexação entre a PVPP-P6755 tal e como recebida do fornecedor
e a mesma após o processo de purificação. No entanto, por já ter sido relatada a
utilização do polímero purificado (DONNER et al.,1993, SOARES, 2002) optou-se
pela utilização deste nas análises seguintes.
5.7.4 Efeito do pH sobre a capacidade complexante
ANDERSEN e SOWERS (1968) investigando a ligação de PVPP a diversos
compostos fenólicos observaram que a complexação é máxima quando o pH é
suficientemente baixo, suprimindo a ionização de hidroxilas fenólicas e favorecendo
a formação de ligações de hidrogênio. SOARES (2002), ao estudar a formação de
complexos entre catequina e derivados da PVPP em diferentes condições de pH,
observou que a razão molecular do complexo polifenol-PVPP permanece inalterada
na faixa de pH de 3,1 a 7,0. No entanto, quando o pH foi elevado a 8,0, houve
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
02468101214161820
Concentração de PVPP (mg/mL)
FCL
Resultados e Discussão
87
pequena redução no teor de catequina ligada à PVPP e, em valores de pH
superiores a 8,0, observou reversão significativa da fração de catequina ligada à
PVPP.
Com a finalidade de otimizar os parâmetros de complexação, realizou-se
ensaio avaliando a influência do pH sobre a estabilidade dos complexos. Nos
experimentos realizados com PVPP-P6755 e catequina (figura 23; ANEXO-tabela
8A), se observou maior complexação entre o polímero e a substância de referência
quando o pH foi inferior ou igual a 8,0. Nesses casos, devido a total complexação da
catequina, os valores de absorvância obtidos foram baixos (em torno de 0,09 e
0,10), originando desvios padrões grandes, em função de se estar trabalhando na
faixa de erro do equipamento. Quando o pH foi elevado para 8,5 ocorreu queda
brusca na fração de catequina ligada (FCL) e acima desse valor de pH verificou-se
uma FCL praticamente nula.
Figura 23. Influência do pH sobre a fração de catequina ligada (FCL) à PVPP-
P6755
Esses resultados corroboram com estudos anteriores que afirmam que as
ligações de hidrogênio são importantes na ligação de PVPP a compostos fenólicos
(ANDERSEN; SOWERS, 1968, PLAIZIER VERCAMEN; DE NEVE, 1982, HORN;
DITTER, 1982, SOARES, 2002). Ao mesmo tempo, esses confirmam a possibilidade
de realização dos experimentos empregando água destilada como solvente, desde
que o pH do meio se mantenha neutro ou levemente ácido.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
2345678910
pH
FCL
Resultados e Discussão
88
FICKEL e colaboradores (1999), ao investigar a associação de taninos a
PVPP, gelatina, albumina sérica bovina e proteínas da saliva a um pH 8,2,
evidenciaram que todos os agentes complexantes testados formaram complexos
solúveis com taninos, não sendo observada a precipitação dos complexos e
indicando que a precipitação é dependente do pH. No entanto, a PVPP apresentou
maior capacidade de complexação, quando comparada aos demais agentes
testados.
5.7.5 Avaliação da especificidade da formação de complexos entre diferentes PVPP
e substâncias de referência
Os métodos utilizados para avaliação da especificidade foram o
espectrofotométrico e por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As
limitações de especificidade observadas quando da utilização de derivados protéicos
para a quantificação de taninos, assim como as restrições levantadas por SOARES
(2002) à utilização de PVPP, segundo as quais o polímero também poderia reagir de
forma inespecífica com flavonóides, levaram a realização de estudos mais
aprofundados nesse sentido.
Com a finalidade de verificar a capacidade de complexação das PVPP com
flavonóides, optou-se pela análise das características de complexação da rutina com
diferentes tipos de PVPP (figura 24; ANEXO-tabela 9A). Ao mesmo tempo, foi
também explorada a fração de polifenóis, presentes na solução extrativa, com a
mesma finalidade.
Os resultados demonstram que, de fato, ocorre complexação entre rutina e
diferentes tipos de PVPP. No entanto, percebe-se que a afinidade dos polímeros
pela catequina e ácido tânico é maior (figura 18B e 18D), o que sugere uma maior
afinidade pelos taninos.
Resultados e Discussão
89
Figura 24. Complexação de rutina com as diferentes PVPP PVPP-P6755 ();
Kollidon CL® (S); Divergan® F(); Divergan® RS ( ).
Para comprovação desta hipótese, realizou-se a complexação de uma
solução contendo catequina (monômero de tanino condensado) e rutina com a
PVPP-P6755, sendo os complexos analisados em 280 nm e 352 nm, comprimentos
de onda de absorção máxima da catequina e rutina, respectivamente (figura 25;
ANEXO-tabela 10A). Cabe salientar que, no comprimento de onda de 352 nm, a
rutina e outros derivados flavonoídicos derivados da quercetina apresentam uma
forte absorção, não assim a catequina, que nesse comprimento de onda não é
detectada.
Figura 25. Complexação de solução contendo catequina e rutina com PVPP-
P6755 (Sigma); () 280 nm, ({) 352 nm.
De acordo com os resultados obtidos, pode-se verificar uma maior afinidade
da PVPP-P6755 pela catequina, a julgar pela diminuição mais acentuada da
absorvância em 280 nm, quando comparada à observada em 352 nm. Pela análise
comparativa em nível molecular, esse fato resulta coerente. A rutina, quando
comparada a catequina (figura 26) apresenta a hidroxila da posição C3 ligada a uma
molécula de rutosídeo, o que impediria a formação de ligações de hidrogênio entre a
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Rutina livre (%)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Catequina + Rutina livre (%)
Resultados e Discussão
90
PVPP-P6755 e uma das posições mais ativas da molécula de rutina, dificultando
assim o acesso do polímero a outros grupamentos hidroxila da rutina (DONNER et
al., 1993).
O
O
Orutinosídeo
OH
OH
OH
HO
6'
2'
2
9
8
6
10
5'
Figura 26. Estruturas moleculares da catequina e da rutina.
DONNER e colaboradores (1993), estudando a afinidade de flavonóides a
PVPP, observaram que a complexação dos flavonóides por parte do polímero varia
de acordo com o padrão de substituição. De uma maneira geral, para flavonóides
com grande número de grupamentos hidroxila, a afinidade por PVPP mostra-se
aumentada. Por outro lado, a metilação e a glicosilação, como explicitado para a
rutina, diminuem a complexação de favonóides por parte da PVPP. A falta de
afinidade das isoflavonas por PVPP, já mencionada neste trabalho, pode ser
atribuída à falta de planaridade do anel C. Dessa forma, poderia-se especular, por
exemplo, que espécies vegetais mais evoluídas, com níveis de oxidação maiores
nos seus flavonóides, apresentem afinidade diferenciada por PVPP, já que os graus
de oxidação e substituição estão associados à evolução das mesmas. Por esse
motivo, a complexação de flavonóides por parte de polímeros reticulados da
povidona deve ser vista com cautela, não se pode generalizar que a PVPP tenha a
mesma afinidade por flavonóides de outras espécies vegetais que não Psidium
guajava.
Realizou-se ainda a complexação entre PVPP-P6755 e uma solução
contendo pirogalol e rutina, ambas substâncias com baixa afinidade pelo polímero
(figura 27; ANEXO-tabela 11A).
O
HO
OH
OH
OH
OH
(
+
)
-Cate
q
uina
Rutina
Resultados e Discussão
91
Figura 27. Complexação de solução contendo pirogalol e rutina com PVPP-
P6755; () 267 nm, ({) 352 nm.
A semelhança entre os efeitos nas absorvâncias, observados em 280 nm e
352 nm, indica uma afinidade semelhante do polímero pelas duas substâncias. Esse
resultado difere do observado para a catequina e rutina. A menor afinidade do
pirogalol pela PVPP-P6755, quando comparada à catequina, está relacionada, como
já dito anteriormente, com o número de grupamentos hidroxila presentes na
molécula e com a baixa massa molecular do mesmo, dificultando a sua
complexação com o polímero.
Para rutina e pirogalol, cabe destacar o aumento da absorvância quando da
utilização da dispersão a 0,5 mg mL
-1
, origina teores percentuais maiores do que 100
% (figura 27). O mesmo fenômeno foi observado nas figuras 18 D e 24 e não pôde
ser explicado em função da turbidez, pelo fato de o líquido de compensação ser
água ou por dissolução de frações de baixa massa molecular de PVPP, uma vez
que a mesma foi previamente purificada. Provavelmente, esse fenômeno está
relacionado a adição de pequenas quantidades de PVPP a soluções de substâncias
com baixa afinidade pelo polímero, provocando um leve efeito hipercrômico.
Os resultados espectrofotométricos foram comparados com os obtidos
mediante CLAE-PDA, técnica que permitiu a identificação e separação do ácido
gálico, catequina, pirogalol e rutina (figuras 9 e 10).
Os resultados obtidos com uma solução das substâncias de referência em
mistura, submetida à complexação com diferentes concentrações de PVPP-P6755,
demonstraram que pequenas concentrações do polímero, de até 10 mg, foram
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Concentração PVPP (mg/mL)
Pirogalol + rutina livre (%)
Resultados e Discussão
92
capazes de complexar de modo indiferente a rutina e as substâncias de referência
(tabela 14; ANEXO-tabela 12A).
Tabela 14. Percentuais de ácido gálico + pirogalol, catequina e rutina complexados à
diferentes quantidades de PVPP-P6755. Detecção em 280 nm e 352 nm.
AG + Piro CAT RUT
SP + 10 mg PVPP 20,13% 73,98% 15,78%
SP + 50 mg PVPP 56,19% 96,56% 49,70%
SP + 150 mg PVPP 57,67% 98,95% 75,18%
SP + 300 mg PVPP 51,76% 99,71% 86,43%
Nota: SP: solução-mãe dos padrões
5.8 Complexação de taninos de Psidium guajava com PVPP-P6755
5.8.1 Curva de calibração
A curva de calibração foi construída utilizando catequina como substância de
referência, em detrimento do pirogalol, que apresenta um perfil de complexação
diferenciado dos taninos e caracterizado pela escassa sensibilidade frente à PVPP-
P6755. Para isso utilizaram-se 2,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu, garantindo a
linearidade na faixa de trabalho, conforme já antes discutido para o pirogalol (item
5.6.2).
Três curvas de calibração obtidas foram submetidas à análise de regressão
linear e os parâmetros comparados a fim de verificar diferenças entre as inclinações
e elevações obtidas nas retas (tabela 15).
Resultados e Discussão
93
Tabela 15. Resultados da análise de regressão linear das curvas analíticas da
catequina em 760 nm
Curva 1 Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) 0,06561 0,00623 0,05215 0,07907 9,86 x10
-8
Inclinação (b) 0,11859 0,00146 0,11541 0,12176 5,79 x 10
-19
R
2
= 0,9980; F
tabelado
= 4,67; F
calculado
= 6227,23; Equação 1: y = 0,11859x + 0,06561
Curva 2 Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) 0,05051 0,00565 0,03828 0,06274 6,61 x 10
-7
Inclinação (b) 0,12089 0,00133 0,11801 0,12377 1,33 x 10
-19
R
2
= 0,9984; F
tabelado
= 4,67; F
calculado
= 8223,71; Equação 2: y = 0,12089x + 0,05051
Curva 3 Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) 0,07983 0,00432 0,07048 0,08918 1,05 x 10
-10
Inclinação (b) 0,11280 0,00101 0,11061 0,11499 9,23 x 10
-21
R
2
= 0,9989; F
tabelado
= 4,67; F
calculado
= 12390; Equação 3: y = 0,11280x + 0,07983
Realizando a comparação entre as três curvas analíticas, verificou-se que a
diferença entre os coeficientes angulares (inclinações) é significativa (F
calc
= 8,626 >
F
0,05 (2) 2,39
= 3,238 e maior que F
0,01 (2) 2,39
= 5,194). Quando comparadas as
equações um e dois e dois e três, pelo teste de Tuckey, não foi constatada diferença
entre as inclinações. No entanto, verificou-se que existe diferença significativa entre
as inclinações das equações dois e três (q
calc
= 3,620 > q
0,05, 39, 3
= 3,442), indicando
que essas retas diferem estatisticamente (ZAR, 1999).
As elevações das três retas demonstraram ser idênticas (F
calc
= 1,571 < F
0,05
(1) 2, 41
= 3,22) indicando que as retas ocupam o mesmo plano em relação ao eixo
dos Y (ZAR, 1999).
A análise dos resíduos de regressão, realizada pelo teste de Durbin-Watson,
não detectou autocorrelação para a equação três (dw
calculado
2,203 > dw
inferior
1,08 >
dw
superior
1,36; para n = 15; α = 0,05). Por sua vez, esse teste não foi conclusivo para
a equação um (dw
superior
1,36 > dw
calc
= 1,278 > dw
inferior
= 1,08). Para a equação
dois, o teste de Durbin-Watson detectou autocorrelação entre os resíduos (dw
calc
Resultados e Discussão
94
1,059 < dw
inferior
1,08). Com base nos resultados obtidos entre a comparação das
retas e a análise de resíduos optou-se por retirar a equação dois do conjunto de
curvas analíticas e obter uma única curva a partir do conjunto de dados que gerou
as equações um e três, sendo essa utilizada para fins de cálculo. Os resultados
determinados pela análise de regressão estão ilustrados na tabela 16.
Tabela 16. Resultados da análise de regressão linear da curva analítica obtida para
catequina, em 760 nm, a partir da comparação das curvas.
Parâmetros Coeficiente Erro padrão LC
inferior
LC
superior
Valor-p
Interseção (a) 0,07261 0,00435 0,05215 0,06368 4,6x10
-16
Inclinação (b) 0,11605 0,00102 0,11541 0,11394 8,55 x 10
-39
R
2
= 0,9978; F
tabelado
= 4,19; F
calculado
= 12777,22; Equação : y = 0,11605x + 0,07261
Dessa forma, o coeficiente de absorção específica (
1%
cm 1
A ) da catequina,
calculado a partir da curva de calibração utilizando 2,0 mL de reagente foi de
1359,65.
5.8.2 Complexação de taninos de Psidium guajava com PVPP-P6755
Com a finalidade de verificar o perfil de complexação da solução extrativa de
Psidium guajava frente ao derivado PVPP-P6755 realizaram-se complexações
utilizando diferentes concentrações desse agente precipitante.
Foi detectado para a solução extrativa de Psidium guajava (figura 28;
ANEXO-tabela 13A) o mesmo comportamento observado para o ácido tânico e
catequina sem o uso do reagente de Folin-Ciocalteu, através de leitura
espectrofotométrica direta (figura 18 B e C).
Resultados e Discussão
95
Figura 28. Perfil de complexação para a solução extrativa de Psidium guajava
em função da concentração PVPP-P6755 (PVPP), expresso como
taninos totais (TT), com determinação em 760 nm.
Pela análise do perfil de complexação, verifica-se que, a partir da utilização
de 50,0 mg de PVPP-P6755, o teor de taninos totais calculado permaneceu
praticamente inalterado. Mais ainda, os valores de absorvância nesse platô foram
bastante baixos, em torno de 0,09 e 0,10. Isso indica um esgotamento quase total da
fração não-tanante, no qual, não somente os taninos foram complexados, mas
também todos os outros polifenóis presentes na solução extrativa. Esse fenômeno é
semelhante ao observado quando da utilização de 800,0 mg de caseína GT e 100,0
mg de pó-de-pele
A especificidade da complexação também foi avaliada através da técnica de
CLAE-PDA. Os cromatogramas obtidos para a solução extrativa sem PVPP-P6755
estão ilustrados nas figuras 11 e 13. Os resultados indicam que uma concentração
de 50,0 mg de PVPP-P6755 é, de fato, capaz de complexar a catequina em sua
totalidade e a maior parte dos flavonóides presentes na solução extrativa (tabela 17;
ANEXO-tabela 14A), demonstrando falta de especificidade do método. O emprego
de 150,0 e 300,0 mg de PVPP-P6755 promovem a retirada de praticamente todos os
outros polifenóis do meio, com exceção do ácido gálico (figura 29), confirmando a
baixa capacidade de complexação para este polifenol, já antes observada com pó-
de-pele e caseína.
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
0 50 100 150 200 250 300 350
Concentração de PVPP (mg)
Teor de taninos (g/%)
Resultados e Discussão
96
Tabela 17. Percentual de ácido gálico, catequina e flavonóides de Psidium guajava
complexados com diferentes quantidades de PVPP-P6755. Detecção em
280 (ácido gálico e catequina) e 352 nm (flavonóides).
280 nm 352 nm Detecção
Amostras
AG
CV %
CAT
CV%
Pico 1
CV%
Pico 2
CV%
Pico 3
CV%
Pico 4
CV%
Pico 5
CV%
Pico 6
CV%
SE + 10 mg PVPP
28,64%
2,26%
76,53%
1,94%
36,24%
3,16%
71,68%
1,43%
79,40%
1,00%
65,00%
0,25%
55,19%
0,14%
84,00%
1,17%
SE + 20 mg PVPP
30,89%
0,25%
100% 37,80%
2,84%
84,30%
1,19%
90,67%
1,36%
77,62%
1,41%
69,73%
0,36%
85,35%
6,64%
SE + 30 mg PVPP
42,69%
4,76%
100% 46,79%
1,53%
91,21%
3,82%
94,94%
2,04%
86,03%
0,67%
82,41%
2,84%
86,34%
4,96%
SE + 40 mg PVPP
47,38%
4,40%
100% 53,90%
1,33%
93,83%
1,72%
96,47%
3,49%
89,78%
2,54%
87,68%
0,99%
89,13%
8,83%
SE + 50 mg PVPP
57,59%
1,62%
100% 68,09%
0,64%
95,96%
3,18%
97,72%
5,09%
92,97%
2,20%
92,87%
1,57%
91,35%
4,34%
SE +150 mg PVPP
63,34%
0,97%
100% 88,76%
2,56%
100% 100% 97,81%
5,20%
98,24%
1,76%
91,95%
4,01%
SE + 300 mg PVPP
69,79%
0,32%
100% 95,38%
8,81%
100% 100% 100% 99,44%
21,98%
91,77%
9,94%
Nota: AG: ácido gálico; CAT: catequina; SE: solução extrativa; CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Figura 29. Cromatogramas da solução extrativa, obtidos sem tratamento (A) e
após tratamento com 150,0 mg de PVPP-P6755 (B). Detecção em
280 nm.
0 10203040506070
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
3
1
Absorvância
Tempo (min.)
0 10203040506070
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
1
mAbsorvância
Tempo (min.)
A B
Resultados e Discussão
97
5.9 Análise comparativa dos teores de taninos totais, calculados mediante
utilização de caseína, pó-de-pele e PVPP-P6755
5.9.1 Efeito da substância de referência no cálculo do teor de taninos totais
As substâncias de referência utilizadas no presente trabalho (ácido tânico,
ácido gálico, catequina e pirogalol) são relatadas na literatura para o cálculo de
taninos totais. Devido aos resultados divergentes assinalados para o ácido tânico
proveniente de fornecedores diferentes (MAKKAR; BECKER, 1993), logo de início
descartou-se a utilização desse como substância de referência.
Apesar da semelhança entre os espectros obtidos para o pirogalol e a solução
extrativa de Psidium guajava, a falta de afinidade desse, por derivados da PVPP
(figura 18 C), restringe sua utilização como substância de referência na
quantificação de taninos. De modo semelhante, o ácido gálico apresenta baixa
afinidade em relação à PVPP-P6755 (tabela 17 e figura 28) e em relação aos
derivados protéicos caseína e pó-de-pele, (tabela 10), sendo também questionável
sua utilização como substância de referência.
Nesta etapa final do trabalho, a escolha da catequina mostrou-se mais
adequada em função da sua maior afinidade pelos agentes complexantes, tanto
pelos de natureza protéica, como pelos derivados da PVPP (tabela 10, figura 18,
tabela 17). Esse fato nos permite especular que a catequina apresenta capacidade
de redução do reagente de Folin-Cioclateu semelhante ao que se verifica para as
estruturas poliméricas dos taninos, sendo portanto mais indicada para referenciar
essa classe de substâncias. O reagente de Folin-Ciocalteu mede a capacidade de
redução da amostra, que depende da estrutura fenólica, sendo necessário uma
substância de referência com capacidade de redução do reagente semelhante à do
extrato analisado, para que a representação dê origem a resultados precisos.
Uma comparação do teor de taninos obtidos pela utilização de diferentes
agentes precipitantes e de duas substâncias de referência encontra-se na tabela 18.
Resultados e Discussão
98
Tabela 18. Teor de taninos obtido com a utilização de diferentes concentrações de
caseína, pó-de-pele e PVPP-P6755.
Teor de taninos totais (g%)
Pirogalol (g%); CV% Catequina (g%); CV%
SE + 400 mg de caseína 3,62; 4,39 5,58; 4,39
SE + 800 mg de caseína 8,25; 2,94 12,34; 2,94
SE + 100 mg de pó-de-pele 7,64; 1,18 11,79; 1,18
SE + 10 mg de PVPP 3,67; 9,02 5,26; 9,02
SE + 25 mg de PVPP 7,07; 0,77 10,90; 0,77
SE + 50 mg de PVPP 7,44; 1,48 11,49; 1,48
Pelos valores obtidos de
1%
cm 1
A para pirogalol e catequina e considerando que
a razão entre eles é 1:1,54, verifica-se que as diferenças observadas nos
respectivos teores de taninos totais, são basicamente, devidas à variação no valor
de
1%
cm 1
A . A equivalência na proporção 1:1,54, assinalada para as razões das
absorvâncias específicas (do pirogalol e da catequina) e os teores calculados (com
50,0 mg de PVPP-P6755 e 100,0 mg de pó-de-pele), reflete diretamente, uma
capacidade diferenciada do reagente de Folin-Ciocalteu em reduzir ambas
substâncias de referência.
5.9.2 Efeito do agente complexante
Os três agentes complexantes avaliados nesse trabalho diferem
quimicamente em relação à estrutura. Contudo, apresentam comportamentos
semelhantes em relação à falta de especificidade na determinação do teor de
taninos da Psidium guajava.
De maneira geral, a caseína apresenta uma menor capacidade de
complexação em relação tanto ao pó-de-pele quanto à PVPP-P6755. A diferença
pode ser constatada através de comparação entre os teores de taninos obtidos pelo
método espectrofotométrico (tabela 18), além da comparação dos percentuais de
ácido gálico e catequina, bem como dos flavonóides complexados (tabelas 10, 17).
Resultados e Discussão
99
Por extrapolação dos resultados aqui obtidos e os mostrados na figura 7,
onde se observa uma tendência quase linear para as quantidades de 600,0 a 800,0
mg de caseína, é possível estimar que 750,0 mg de caseína GT provocam o mesmo
efeito que 100,0 mg de pó-de-pele para a solução extrativa de Psidium guajava.
Contudo, cabe enfatizar o fato de os teores de taninos calculados
espectrofotometricamente com 800,0 mg de caseína e 100 mg de pó-de-pele terem
sido semelhantes, o que não reflete no perfil dos flavonóides em ambos casos, o
qual difere claramente. Observou-se uma maior afinidade pela catequina e por
flavonóides, bem como uma menor afinidade por ácido gálico quando da utilização
de caseína, e, diferentemente, uma maior afinidade pelo ácido gálico quando
utilizado o pó-de-pele. Essas diferenças não puderam ser detectadas pelo método
espectrofotométrico, mas foram comprováveis estatisticamente, através de
realização de teste t de Student considerando variâncias diferentes. O resultado do
teste indica que existem diferenças entre os teores de flavonóides obtidos pela
utilização de 800,0 mg de caseína e 100,0 mg de pó-de-pele (t
calculado
= 3,1744 >
t
0,05 (2)
= 2,571).
Observa-se ainda, que o teor calculado quando da utilização de 50,0 mg de
PVPP-P6755 foi semelhante àquele obtido com 100,0 mg de pó-de-pele (tabela 18).
Nessa oportunidade, houve diferenças na complexação dos flavonóides presentes
na solução extrativa, quando utilizados pó-de-pele ou PVPP-P6755, as quais
ocorreram de maneira diferenciada segundo o flavonóide analisado. No entanto,
considerando a fração flavonoídica como um todo, não foram constatadas diferenças
estatísticas significativas quando aplicado o teste t de Student para variâncias
diferentes (t
calculado
= 2,1555 < t
0,05 (2) 9
= 2,26). Em relação ao ácido gálico, tanto o
pó-de-pele quanto a PVPP-P6755 comportaram-se de maneira semelhante. No
entanto, quando analisa-se especificamente o caso da catequina, percebe-se uma
maior afinidade dessa pela PVPP-P6755, o que foi tido como uma vantagem desse
polímero (tabelas 10 e 17).
Aparentemente, esses resultados diferem parcialmente daqueles relatados
por LIAO e colaboradores (2003). Segundo esses, o pó-de-pele apresentou uma
maior afinidade pelo galato de (-)-epigalocatequina, galato (-)-galocatequina e (-)-
epigalocatequina, quando comparado ao Divergan® RS. No entanto, a julgar pelos
Resultados e Discussão
100
dados informados no artigo, verifica-se que os autores adicionaram ácido tânico
somente à solução submetida a complexação com PVPP, em detrimento da solução
submetida à complexação com pó-de-pele. Esse fato pode influenciar a
complexação do Divergan® RS com as substâncias supracitadas, tendo em vista a
grande afinidade da PVPP pelo ácido tânico (FRÖMMING et al., 1981; HORN;
DITTER, 1982). Além disso, não foi possível verificar se as soluções comparadas
apresentavam concentrações idênticas, já que os métodos utilizados para as
análises por CLAE foram, nesse trabalho citado, distintos.
Observou-se ainda que um teor de taninos comparável ao obtido com 400,0
mg de caseína GT foi encontrado com a utilização de 10,0 mg de PVPP-P6755
(tabela 18).
Visto como um todo, o método proposto é, no mínimo, equivalente aos que
utilizam caseína e pó-de-pele. Especificamente, pode-se afirmar que uma solução
extrativa de Psidium guajava, quando analisada com 2,0 mL do reagente de Folin-
Ciocalteu e tratada com 50,0 mg de PVPP-P6755, leva a um teor de taninos
equivalente ao obtido a partir do método oficial da Ph. Eur (2002), que preconiza o
uso de 100,0 mg de pó-de-pele. Teor semelhante também é obtido quando se utiliza
750,0 mg de caseína. Levando em consideração, preço, facilidade de aquisição e
pequena variabilidade de lote, o uso de PVPP, ainda que com as mesmas limitações
de especificidade observadas no caso específico de solução extrativa de Psidium
guajava, surge como uma alternativa analiticamente viável, se comparado ao pó-de-
pele.
Considerando finalmente as especificidades da estrutura molecular que muito
provavelmente estão envolvidas na interação PVPP-flavonóides, fica negada a
transposição dos dados obtidos para Psidium guajava para outras drogas vegetais.
Com isso, abre-se a possibilidade de estudos subseqüentes da aplicação dessa
metodologia para espécies, oficiais ou não, onde não se observe a falta de
especificidade assinalada para o método com PVPP, deficiência esta também
sentida com pó-de-pele e caseína.
6. CONCLUSÕES:
Conclusões
103
• A análise comparativa de diversos métodos oficiais preconizados para o
doseamento do teor de taninos revelou uma falta de uniformidade, em termos de
reagente, comprimento de onda de leitura e tempo de leitura.
• A análise comparativa das características de complexação da caseína purificada e
caseína grau técnico (GT) assinalou falta de precisão intermediária para o uso da
caseína purificada, provavelmente, em função da defosforilação implícita no
processo de purificação.
• Para os métodos espectrofotométrico e por CLAE, evidenciou-se falta de
especificidade para os agentes complexantes caseína GT e pó-de-pele, frente ao
flavonóide rutina e à fração flavonoídica da solução extrativa de Psidium guajava.
• A comparação da capacidade de complexação dos diferentes tipos de PVPP
evidenciou diferenças entre eles, sendo selecionada a PVPP-P6755 para a
realização das análises subseqüentes.
• A formação de complexos entre PVPP-P6755 e catequina mostrou ser pH
dependente. Quando o pH assumiu valores iguais ou superiores a 8,5 ocorreu uma
queda brusca da fração de catequina ligada, comprometendo a complexação.
• Evidenciou-se falta de afinidade do ácido gálico e pirogalol, em relação à caseína
GT e pó-de-pele, assim como para a PVPP-P6755, comprometendo, de certa forma,
sua utilização como substâncias de referência na quantificação de taninos.
Conclusões
104
• PVPP-P6755 demonstrou a mesma falta de especificidade relatada para o pó-de-
pele e caseína frente à solução extrativa de Psidium guajava e, também, frente às
substâncias de referência, ácido gálico, catequina, pirogalol e rutina, tanto para o
método espectrofotométrico quanto por CLAE.
• Avaliando e estudando as peculiaridades de cada método e confrontando os
resultados obtidos verificou-se que a utilização de 100,0 mg de pó-de-pele, método
preconizado por Ph. Eur (2002), origina teores de taninos semelhantes aos obtidos
quando se utiliza 50,0 mg de PVPP-P6755 para a quantificação de taninos em
Psidium guajava. Dessa forma, pode-se sugerir um método de quantificação com a
utilização de 2,0 mL do reagente de Folin-Ciocalteu, leitura em 760 nm e 50,0 mg de
PVPP-P6755 para Psidium guajava.
• Abre-se a possibilidade de estudos subseqüentes da aplicação dessa metodologia
para outras espécies vegetais, já que especificidades da estrutura molecular estão
envolvidas na interação PVPP-flavonóides, o que veda a transposição de resultados
para outras drogas vegetais.
7. REFERÊNCIAS
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8. ANEXOS
Anexos
118
Tabela 1A. Preparação da Amostra
Observações
Para extratos ou tinturas
utilizar a quantidade
especificada em cada
monografia e diluir a 250,0
mL com água. Filtrar a
mistura através de um papel
filtro de 12,5 cm de
diâmetro. E proceder como
descrito no item 5.
6
Desprezar os
primeiros 50,0 mL de
filtrado e utilizar o
restante para o
doseamento.
Desprezar os
primeiros 50,0 mL do
filtrado.
Desprezar os
primeiros 50,0mL do
filtrado. O restante é
utilizado para a
determinação do teor.
5
Deixar decantar,
filtrar o líquido
através de papel
filtro de 12 cm de
diâmetro.
Deixar decantar o
sedimento e filtrar
através de papel
filtro.
Deixar sedimentar,
filtrar o líquido
remanescente
através de papel
filtro de 12,5 cm de
diâmetro.
4
Transferir para
um balão
volumétrico de
250 mL e
completar com
água a 250,0 mL.
Transferir a
mistura para
balão
volumétrico e
diluir a 250,0 mL
com água .
Transferir para
balão
volumétrico e
completar com
água a 250,0 mL
3
Resfriar a
mistura em
água corrente.
Resfriar em
água corrente.
Resfriar a
mistura até
20º C.
2
Adicionar 150 mL de
água. Aquecer até
fervura e manter em
banho-maria durante
30 min.
Transferir para
erlenmeyer e
adicionar 150 mL de
água. Aquecer até
fervura e manter em
banho-maria à
temperatura de 80-
90°C por 30 min.
Transferir para
erlenmeyer e
adicionar 150 mL de
água. Aquecer até a
fervura e manter em
banho-maria durante
30 minutos.
Etapas de Preparação
1
Pesar exatamente
cerca de 0,750g da
droga pulverizada
(180).
Pesar 0,75g da droga
pulverizada.
Pesar a quantidade
especificada em cada
monografia (para
droga ).
Monografia
Ratanhiae racine
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Rhatany root
Hamamelis leaf
Hamamelidis folium
Eugeniae folium
Método geral para
determinação de taninos
Farmacopéia
Francesa - 1974
Européia - 1976
Alemã -1987
Européia - 1997
Britânica- 1999
Brasileira IV ed –
1988 (1996)
Brasileira IV ed –
1988 (2003)
Alemã - 1998
Britânica - 2000
e 2001
Européia - 2002
Espanhola -
2002
Portuguesa -
2002
Anexos
119
Tabela 1B. Polifenóis Totais
3
Medir a absorvância da solução (E1) de 354 a
750 nm, exatamente 2 minutos após a adição
do último reagente, utilizando água como
branco.
Medir a absorvância da solução (A1) em 715
nm exatamente 2 minutos após a adição do
último reagente, utilizando água como branco.
Medir a absorvância da solução (A1) em 715
nm, exatamente 3 minutos após a adição do
último reagente, utilizando água como branco.
Determinar a absorvância da solução (A1) em
760 nm após 30 minutos utilizando água
como branco.
Determinar a absorvância (A1) em 715 nm,
exatamente 3 minutos após a adição do último
reagente. Utilizar água como branco.
2
Adicionar a 2,0 mL desta solução, 1,0 mL de
ácido fosfotúngstico R e 17,0 mL de uma
solução 38% (m/V) de carbonato de sódio R.
Adicionar a 5,0 mL desta solução 1,0 mL da
solução de ácido fosfotúngstico R e diluir a
50,0 mL, em balão volumétrico, com uma
solução de carbonato de sódio R 15% (m/v).
Adicionar a 5,0 mL desta solução, 2,0 mL da
solução de ácido fosfotúngstico SR e diluir a
50,0 mL , em balão volumétrico, com
solução de carbonato de sódio SR.
Adicionar a 2,0 mL desta solução, 1,0 mL do
reagente molibdato-tugstato R, bem como
10,0 mL de água e diluir a 25,0 mL, em um
frasco volumétrico de 25,0 mL, com uma
solução de carbonato de sódio R 29,0 %
(m/v).
Adicionar a 5,0 mL desta solução, 2,0 mL do
reagente de Folin-Denis. Diluir a 50,0 mL
com uma solução de carbonato de sódio SR.
1
Diluir 5,0 mL do filtrado a
25,0 mL com água.
Diluir 5,0 mL do filtrado a
25,0 mL com água.
Diluir 5,0 mL do filtrado a
25,0 mL com água.
Diluir 5,0 mL do filtrado a
25,0 mL com água.
Diluir 5,0 mL do filtrado a
25,0 mL com água.
Monografia
Ratanhia racine
Rhataniae radix
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Rhatany root
Hamamelidis folium
Hamamelis leaf
Método geral para
determinação de
taninos
Eugeniae folium
Farmacopéia
Francesa – 1974
Européia - 1976
Alemã -1987
Européia - 1997
Britânica – 1999
Brasileira IV ed – 1988 (1996)
Britânica - 1999
Alemã -1998
Britânica – 2000 e 2001
Européia 2002
Espanhola - 2002
Portuguesa 2002
Brasileira IV ed – 1988 (2003)
Anexos
120
Tabela 1C. Fração não-tanante – polifenóis não adsorvidos pelo pó-de-pele
3
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
2
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Diluir 5,0 mL do filtrado a 25,0
mL com água R.
Etapas de Preparação
1
Adicionar a 10,0 mL de filtrado, 0,10 g de pó de pele CRS e
agitar vigorosamente durante 60 minutos. Filtrar.
Adicionar a 10,0 mL de filtrado, 0,10 g de pó de pele CRS e
agitar vigorosamente durante 60 minutos. Filtrar.
Adicionar a 10,0 mL de filtrado, 0,10 g de pó de pele CRS e
agitar vigorosamente durante 60 minutos. Filtrar.
Adicionar a 20,0 mL do filtrado 0,2 g de pó-de-pele e agitar
vigorosamente por 60 min. Filtrar.
Adicionar a 10,0 mL do filtrado 0,10 g de pó de pele CRS e
agitar durante 60 minutos. Filtrar a mistura.
A 20,0 mL do filtrado adicionar 0,20 g de pó de pele CRS e
agitar vigorosamente por 60 minutos. Filtrar.
A 10,0 mL do filtrado adicionar 0,10 g do pó de pele CRS e
agitar vigorosamente por 60 minutos. Filtrar.
A 10,0 mL do filtrado adicionar 0,10 g do pó de pele CRS e
agitar vigorosamente por 60 minutos. Filtrar.
A 10,0 mL do filtrado adicionar 0,10 g do pó de pele CRS e
agitar vigorosamente por 60 minutos. Filtrar.
A 10,0 mL do filtrado adicionar 0,10 g do pó de pele CRS e
agitar vigorosamente por 60 minutos. Filtrar.
A 10,0 mL do filtrado adicionar 0,10 g do pó de pele CRS e
agitar vigorosamente por 60 minutos. Filtrar.
A 20,0 mL do filtrado adicionar 0,20 g de pó de pele e agitar ,
mecanicamente, por 60 minutos. Filtrar.
Monografia
Ratanhia racine
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Hamamelidis folium
Método geral para
determinação de taninos
Hamamelis leaf
Rhatany rot
Método geral para
determinação de taninos
Eugeniae folium
Farmacopéia
Francesa - 1974
Européia - 1976
Alemã –1987
Européia - 1997
Brasileira IV ed – 1988 (1996)
Alemã – 1998
Britânica- 1999
Britânica- 1999
Britânica – 2000 e 2001
Espanhola - 2002
Européia - 2002
Portuguesa - 2002
Brasileira IV ed – 1988 (2003)
Anexos
121
Tabela 1D. Solução de Referência
Obs
Conservar esta solução ao abrigo
da luz e do ar e medir a
absorvância dentro de 30 min a
partir da dissolução do pirogalol.
Medir a absorvância dentro de 15
minutos após a dissolução do
pirogalol.
3
*
*
*
2
Colocar 5,0 mL desta
solução em outro balão
volumétrico e completar
à 100,0 mL com água.
Diluir 5,0 mL desta
solução com água a
100,0 mL.
Diluir 5,0 mL desta
solução a 100,0 mL com
água.*
Etapas de Preparação
1
Colocar 50,0 mg de pirogalol (R)
exatamente pesados em um
balão volumétrico e completar a
100,0 mL com água.
Dissolver 50,0 mg de pirogalol
com água a 100,0 mL.
Dissolver 50,0 mg de pirogalol R
com água a 100,0 mL .
Monografia
Ratanhiae racine
Ratanhiae radix
Hammamelidis folium
Ratanhiae radix
Hamamelis leaf
Rhatany root
Eugeniae folium
Método geral para
determinação de
taninos
Farmacopéia
Francesa - 1974
Européia – 1976
Alemã –1987
Brasileira IV ed – 1988 (1996)
Européia - 1997
Britânica – 1999
Britânica- 1999
Brasileira - 2003
Alemã –1998
Britânica- 2000 e 2001
Espanhola – 2002
Européia 2002
Portuguesa - 2002
* As etapas subseqüentes são idênticas às adotadas para determinação de polifenóis totais, a partir do item 2. O valor de absorvância obtido designa-se por A
2
ou E
2
dependendo da Farmacopéia
Anexos
122
Tabela 1E. Cálculos
Cálculo do teor de taninos totais (%)
4,2 x 3,125 (E
1
-E
2
)
p x E3
13,12 (A
1
- A
2
)
A
3
x m
m= massa da amostra em g
Obs.: somente a F. Brasileira considera a determinação de água na droga seca.
62,5 (A
1
-A
2
) m2
A
3 x
m1
m1= massa da amostra em g
m2 = massa de pirogalol em g
Monografia
Ratanhia racine
Rhataniae radix
Ratanhiae radix
Hamamelidis folium
Ratanhiae radix
Hamamelis leaf
Rhatany root
Eugeniae folium
Método geral para determinação de taninos
Farmacopéia
Francesa - 1974
Européia - 1976
Alemã -1987
Brasileira IV ed – 1988 (1996)
Européia - 1997
Britânica - 1999
Britânica- 1999
Brasileira IV ed – 1988 (2003)
Alemã -1998
Britânica- 2000 e 2001
Espanhola - 2002
Européia - 2002
Portuguesa - 2002
Anexos
123
Tabela 1F. Soluções Reagentes
5
Resfriar. Diluir com água a 100,0 mL
Resfriar. Diluir com água a 100,0 mL
Resfriar. Diluir com água a 100,0 mL
Resfriar, filtrar e adicionar água
suficiente para obter 100 mL
4
Aquecer durante 3
horas sob refluxo
Aquecer durante 3
horas sob refluxo
Aquecer sob refluxo
por 3 horas
Aquecer sob refluxo
por 3 horas
3
+ 75,0 mL
de água
+ 75,0 mL
de água
+ 75,0 mL
de água
2
+ 8,0 mL ácido fosfórico
+ 8,0 mL ácido fosfórico
R
+ 8,0 mL de ácido
fosfórico 85% SR
adicionar 8,0 mL de
ácido ortofosfórico
Solução de ácido fosfotúngstico - Etapas da preparação
1
Misturar 10 g de
tungstato de sódio
Misturar 10 g de ácido
túngstico R
Misturar 10 g de
tungstato de sódio
Dissolver 10 g de
tungstato de sódio em
75mL de água
Monografia
Ratanhia racine
Rhataniae radix
Hamamelidis folium
Rhataniae radix
Rhataniae radix
Hamamelis leaf
Rhatany root
Farmacopéia
Francesa - 1974
Européia – 1976
Brasileira IV ed – 1988 (1996)
Alemã –1987
Européia - 1997
Britânica – 1999
Britânica – 1999
10
O reagente deve
apresentar coloração
amarela. Caso
apresente coloração
esverdeada, é
insatisfatório para
utilização; pode ser
regnerado pela
fervura com algumas
gotas de bromo R e
deve ser novamente
fervido para retirar o
excesso de bromo
Armazenamento 2
a 8 graus
9
Ferver a
mistura
para
remover o
excesso de
bromo
durante 15
minutos.;re
sfriar; diluir
a 1000,0
mL com
água R e
filtrar.
8
+ 50 mL
de água.
Adicionar
algumas
gotas
bromo.
7
Adicionar
150 g de
sulfato de
lítio R
6
Aquecer a
mistura
durante 10
horas sob
refluxo em
aparato de
vidro.
5
+ 50,0 mL de
ác. fosfórico
85% R
Diluir a 100,0
mL com água.
A solução
apresenta
coloração
esverdeada.
4
Adicionar
100,0 mL
HCl 36% R
Manter em
refluxo por
2 horas.
Resfriar.
3
Solubiliz
ar em
700,0 mL
de água
R.
+ 5,0 mL
de ácido
fosfórico.
2
+ 25 g de
molibdato
de sódio R
+ 2,0 g de
ácido
fosofomolí
bdico
Reagente fosfomolibdotúngstico – Etapas da preparação
1
Pesar 100 g
de tungstato
de sódio R
A 75,0 mL
de água
adicionar
10,0 g de
tungstato de
sódio
Designação
Reagente
molibdato-
tungstato R
(Folin-
Ciocalteau)
Reagente
Folin-Denis
Monografia
Método
Geral
para
determinação
de taninos
Eugeniae
folium
Farmacopéia
Alemã –1998
Britânica-
2000 e 2001
Espanhola -
2002
Européia
2002
Portuguesa -
2002
Brasileira IV
ed – 1988
(2003)
Anexos
124
Tabela 1F. Soluções Reagentes - continuação
Solução de carbonato de sódio R
Carbonato de sódio 38% (m/v)
Carbonato de sódio anidro 15,0 % m/V
Carbonato de sódio anidro a 10,6% m/V
Carbonato de sódio anidro 29,0% m/V
Monografia
Ratanhia racine
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Ratanhiae radix
Rhatany root
Hamamelidis folium
Rhatany root
Hamamelis leaf
Método geral para determinação de
taninos
Farmacopéia
Francesa - 1974
Européia – 1976
Alemã –1987
Européia - 1997
Britânica – 1999
Brasileira IV ed – 1988 (1996)
Britânica – 1999
Alemã –1998
Britânica- 2000 e 2001
Espanhola - 2002
Européia 2002
Portuguesa - 2002
A elaboração das tabelas 1A até a 1F contou com a colaboração do Prof. Dr. George G. Ortega, Profa. Dra. Amélia T. Henriques, Simone G.
Verza e Maria T. Kreinecker. Dados não publicados
Anexos
125
Figura 1A. Espectro na região do infravermelho do ácido gálico em pastilhas de KBr.
Figura 1B. Espectro na região do infravermelho do ácido tânico em pastilhas de KBr.
Anexos
126
Figura 1C. Espectro na região do infravermelho da catequina em pastilhas de KBr.
Figura 1D. Espectro na região do infravermelho do pirogalol em pastilhas de KBr.
Anexos
127
Figura 1E. Espectro na região do infravermelho das PVPP em pastilhas de KBr.
Tabela 2A. Valores médios da absorvância (UA) e CV % obtidos para a fração não-
tanante com caseína purificada durante três dias de análise, em triplicata.
Quantidade caseína Dia 1;.CV% Dia 2; CV% Dia 3; CV% Média; CV%
100,0 mg 0,357; 3,32 0,3167; 1,12 0,3704; 1,65 0,3480; 8,03*
200,0 mg 0,2183; 2,19 0,2573; 1,84 0,3363; 1,22 0,2706; 22,24*
300,0 mg 0,1783; 2,60 0,3065; 1,05 0,2617; 1,49 0,2488; 26,14*
400,0 mg 0,1684; 2,01 0,1567; 1,19 0,1086; 3,51 0,1456; 21,90*
500,0 mg 0,0496; 20,50 0,2498; 4,81 0,0369; 13,19 0,1122; 106,48*
Nota: CV %: coeficiente de variação percentual (n = 3); * n = 9
Anexos
128
Tabela 3A. Valores médios da absorvância (UA) e CV % obtidos para a fração não-
tanante com caseína grau técnico durante três dias de análise, em
triplicata.
Quantidade caseína Dia 1;.CV% Dia 2; CV% Dia 3; CV% Média; CV%
100,0 mg 0,4440; 0,13 0,4465; 1,32 0,4421; 1,31 0,4442; 0,50*
200,0 mg 0,4250; 0,88 0,4286; 0,43 0,4082; 1,74 0,4172; 2,49*
300,0 mg 0,3749; 2,48 0,3625; 2,018 0,3774; 1,08 0,3716; 2,15*
400,0 mg 0,3342; 1,41 0,3509; 1,04 0,3264; 1,12 0,3372; 3,71*
500,0 mg 0,3169; 1,45 0,3034; 1,57 0,2929; 1,24 0,3044; 3,96*
600,0 mg 0,3088; 0,76 0,3005; 1,07 0,2796; 1,98 0,2947; 4,46*
700,0 mg 0,1963; 2,14 0,1418; 2,87 0,1885; 2,69 0,1755; 16,78*
800,0 mg 0,0746; 6,51 0,0577; 1,34 0,0550; 4,71 0,0624; 17,02*
Nota: CV %: coeficiente de variação percentual (n = 3); * n = 9
Tabela 4A. Absorvâncias obtidas (UA) para a solução extrativa e fração não-tanante
(FNT) de Psidium guajava antes e após a adição de rutina.
Sem adição rutina Contaminado com rutina
Polifenóis totais
0,5947 0,7262
0,5913 0,7405
0,5906 0,7279
Média; CV % 0,5922; 0,36 0,7315; 1,06
FNT (400 mg de caseína)
0,3448 0,4428
0,3415 0,4444
0,3452 0,4427
Média; CV% 0,3438; 0,59 0,4433; 0,21
FNT (600 mg de caseína)
0,3656 0,3525
0,3617 0,3597
0,3612 0,3739
Média; CV% 0,3628; 0,67 0,3620; 3,01
Nota: CV %: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Anexos
129
Tabela 5A. Áreas dos picos de ácido gálico, catequina e flavonóides complexados
com diferentes quantidades de caseína e pó-de-pele. Detecção em 280
nm (ácido gálico e catequina) e 352 nm (flavonóides).
280 nm 352 nm Detecção
Amostras
AG
CV %
CAT
CV%
Pico 1
CV%
Pico 2
CV%
Pico 3
CV%
Pico 4
CV%
Pico 5
CV%
Pico 6
CV%
SE
756308,33
3,87
355988,67
5,44
211259,67
4,64
484263
2,87
498337
2,84
304879
4,95
1829781
2,19
104888
3,19
SE + 100 mg de
caseína
634707,67
6,29
239379,33
7,49
145489,33
0,86
200359,33
1,26
210617,67
0,34
146976,67
0,90
822999
0,32
34539,67
0,46
SE + 400 mg de
caseína
524379,33
0,47
131133,33
1,69
95326,67
1,56
69407
3,86
76458
0,55
62348,33
1,34
206837
0,38
4395,33
5,10
SE + 800 mg de
caseína
494989,33
2,07
62391,67
9,16
10883,67
5,36
33634,67
6,23
34012,33
2,63
26174
2,16
72131,33
3,18
10017
2,64
SE + 1600 mg de
caseína
390362,67
3,84
86639
2,63
15600
4,30
14914,67
4,48
18363,33
3,70
13389,33
4,67
26297,67
6,26
-
SE + 50 mg de pó-
de-pele
373557,67
2,09
138427,33
1,04
58271
1,74
198685,33
1,16
223450,33
0,61
150488
2,71
347445,3
0,95
21319,33
1,70
SE + 100 mg de
pó-de-pele
299407
3,26
142331,67
5,05
38769,67
1,40
174514,33
1,85
194412,67
0,42
135160,7
2,50
196593,3
0,81
11144,67
5,64
Nota: AG: ácido gálico; CAT: catequina; SE: solução extrativa; CV %: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Anexos
130
Tabela 6A. Absorvâncias obtidas na complexação de diferentes PVPP com ácido
gálico (AG), ácido tânico (AT), catequina, (CAT), pirogalol (Piro) e solução
extrativa (SE).
Concentração
PVPP
AG; CV% AT; CV% CAT; CV% Piro; CV% SE; CV%
0 0,5895; 1,50 0,6906; 0,63 0,6959; 2,04 0,7045; 0,70 0,5808; 0,88
0,5 mg mL
-
1
PVPP
0,4050; 0,63 0,3054; 0,67 0,4672; 0,77 0,7125; 1,04 0,2678; 0,95
2,5 mg mL
-
1
PVPP
0,3072; 2,43 0,0956; 0,43 0,1033; 2,56 0,6812; 0,71 0,1072; 1,23
7,5 mg mL
-
1
PVPP
0,1863; 2,01 0,0560; 6,23 0,0264; 2,14 0,6146; 0,65 0,0952; 2,36
15 mg mL
-
1
PVPP
0,1653; 0,89 0,0273; 15,25 0,0179; 8,37 0,5045; 0,40 0,0956; 0,82
0,5 mg mL
-
1
K-
CL
0,4918; 1,14 0,3087; 2,77 0,4803; 2,04 0,7207; 0,76 0,4007; 0,85
2,5 mg mL
-
1
K-
CL
0,2531; 0,41 0,1358; 0,20 0,1230; 2,00 0,6578; 1,06 0,1990; 0,41
7,5 mg mL
-
1
K-
CL
0,1166; 10,9 0,0395; 19,29 0,0339; 7,18 0,5631; 0,75 0,1402; 2,00
15 mg mL
-
1
K-
CL
0,060; 11,44 0,0809; 1,29 0,0223; 8,04 0,4676; 1,81 0,1032; 0,24
0,5 mg mL
-
1
DIV
F
0,4579; 1,50 0,2971; 1,92 0,4653; 2,66 0,7146; 0,66 0,3650; 0,57
2,5 mg mL
-
1
DIV.F
0,2405; 1,72 0,1446; 8,23 0,0496; 5,30 0,7046; 0,76 0,1529; 0,24
7,5 mg mL
-
1
DIV
F
0,1053; 3,15 0,0472; 14,91 0,0115; 16,06 0,5585; 0,67 0,0809; 14,49
15 mg mL
-
1
DIV
F
0,0756; 10,74 0,0651; 10,34 0,0086; 16,01 0,4703; 0,52 0,0671; 14,49
0,5 mg mL
-
1
DIV
RS
0,5895; 1,50 0,3022; 4,88 0,4099; 1,11 0,7040; 0,60 0,3956; 0,43
2,5 mg mL
-
1
DIV
RS
0,2919; 2,34 0,1065; 3,39 0,1084; 8,26 0,6730; 1,86 0,1604; 0,61
7,5 mg mL
-
1
DIV
RS
0,1069; 1,73 0,1031; 0,95 0,0367; 4,53 0,5558; 1,20 0,1149; 5,70
15 mg mL
-
1
DIV
RS
0,0812; 13,61 0,0632; 11,28 0,0383; 7,66 0,4833; 2,60 0,0859; 8,81
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Anexos
131
Tabela 7A. Valores de absorvância (UA) obtidos para a utilização de PVPP-P6755
purificada e não purificada quando complexada com catequina. Detecção
280 nm.
Quantidade de PVPP-P6755 PVPP-P6755 não purificada; CV% PVPP-P6755 purificada; CV%
0 0,6769; 0,35 0,6769; 0,35
0,25 mg mL
-1
0,5745; 0,08 0,5780; 0,51
0,5 mg mL
-1
0,4968; 1,19 0,4810; 1,08
1,25 mg mL
-1
0,2874; 3,05 0,3272; 0,97
2,5 mg mL
-1
0,1576; 4,52 0,1861; 4,27
5,0 mg mL
-1
0,0747; 11,60 0,0576; 2,80
7,5 mg mL
-1
0,0879; 1,10 0,0469; 2,79
15 mg mL
-1
0,0831; 9,26 0,0887; 6,38
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Tabela 8A. Valores de absorvância obtidos (UA) para a complexação de catequina
com suspensão de PVPP-P6755 (15 mg mL
-1
) em diferentes valores de
pH. Detecção em 280 nm e 290 nm.
Quantidade de PVPP adicionada Absorvância (UA); CV%
0 0,3287; 1,15
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
; pH = 2,94 0,1015; 5,28
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 3,36 0,0951; 2,78
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 5,2 0,1199; 1,90
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 6,99 0,0955; 5,54
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 7,98 0,0966; 3,82
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 8,43 0,2499; 0,901
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 8,99 0,3277; 0,76
PVPP-P6755 15 mg mL
-1
pH = 9,39 0,3659; 1,08
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Tabela 9A. Valores de absorvância (UA) obtidos pela adição de dispersões de
PVPP-P6755 à rutina em diferentes concentrações. Detecção em 352 nm.
Quantidade de
PVPP adicionada
PVPP-P6755; CV% K-CL; CV% DIV. F CV% DIV. RS; CV%
0 0,7173; 1,21 0,7173; 1,21 0,7173; 1,21 0,7173; 1,21
0,5 mg mL
1
0,7536; 1,41 0,7760; 0,96 0,7374; 2,56 0,7831; 2,04
7,5 mg mL
1
0,5902; 1,79 0,5407; 1,49 0,5499; 3,76 0,5992; 0,74
15 mg mL
1
0,4699; 1,84 0,438; 1,39 0,4316; 1,64 0,4427; 1,83
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Anexos
132
Tabela 10A. Valores de absorvância (UA) obtidos para uma solução de catequina e
rutina quando complexada com dispersões de diferentes concentrações
de PVPP-P6755. Detecção em 280 e 352 nm.
Quantidade de PVPP adicionada 280 nm; CV% 352 nm; CV%
0 0,9982; 1,03 0,3481; 1,00
0,5 mg mL
1
0,8002; 1,03 0,3216; 1,15
2,5 mg mL
1
0,3480; 0,57 0,2409; 0,48
7,5 mg mL
1
0,1630; 0,48 0,1419; 0,51
15 mg mL
1
0,0946; 2,80 0,0891; 2,92
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Tabela 11A. Valores de absorvância (UA) obtidos para uma solução de pirogalol e
rutina quando complexada com dispersões de diferentes concentrações
de PVPP-P6755. Detecção em 267 e 352 nm.
Quantidade de PVPP adicionada 267 nm; CV% 352 nm; CV%
0 1,06; 0,23 0,3331; 0,72
0,5 mg mL
1
1,15; 0,79 0,3509; 0,75
2,5 mg mL
1
1,02; 0,66 0,2980; 0,71
5,0 mg mL
1
0,91; 0,48 0,2597; 0,74
7,5 mg mL
1
0,83; 0,30 0,2336; 0,76
15 mg mL
1
0,69; 2,93 0,1986; 3,82
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).
Tabela 12A. Áreas dos picos de ácido gálico + pirogalol, catequina e rutina
complexados com diferentes quantidades de PVPP-P6755. Detecção em
280 nm e 352 nm.
AG + Piro; CV% CAT; CV% RUT; CV%
SP 5467300; 0,34 1164392; 0,60 2504255; 0,30
SP + 10 mg PVPP 4366836; 0,04 302975,7; 0,27 2109140; 0,04
SP + 50 mg PVPP 2395323; 0,27 40067,67; 0,25 1259656; 0,41
SP + 150 mg PVPP 2314442; 0,01 12162; 6,41 621578,7; 0,32
SP + 300 mg PVPP 2637174; 0,30 3319; 10,59 339835,3; 0,68
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3).; SP: solução dos padrões;AG: ácido gálico; Piro: pirogalol;
CAT: catequina; RUT: rutina.
Anexos
133
Tabela 13A. Valores de absorvância obtidos para a solução extrativa de Psidium
guajava sem o tratamento com PVPP-P6755 e após o tratamento com
diferentes quantidades de PVPP-P6755. Detecção em 760 nm.
Quantidade PVPP-P6755 Dia 1;.CV% Dia 2; CV% Dia 3; CV% Média; CV%
0 (PT) 0,6023; 2,24 0,6363; 1,66 0,6125; 1,26 0,6170; 2,83*
10,0 mg 0,3744; 2,09 0,3582; 4,04 0,3796; 2,70 0,3707; 3,01*
250,0 mg 0,1294; 3,67 0,1572; 6,85 0,1433; 9,75 0,1433; 9,69*
50,0 mg 0,1099; 8,47 0,1259; 11,59 0,1183; 8,82 0,1180; 6,75*
75,0 mg 0,1160; 14,37 0,1270; 14,47 0,1075; 3,36 0,1168; 8,37*
100,0 mg 0,0618; 3,80 0,1205; 6,19 0,0910; 15,07 0,0911; 32,16*
150,0 mg 0,1215; 8,82 0,0690; 26,34 0,1169; 15,94 0,1025; 28,36*
300,0 mg 0,0632; 10,33 0,0833; 10,22 0,0714; 10,37 0,0727; 13,89*
Nota: CV%: coeficiente de variação percentual (n = 3);* n = 9; PT: polifenóis totais.
Anexos
134
Tabela 14A. Áreas dos picos de ácido gálico, catequina e flavonóides de Psidium
guajava complexados com diferentes quantidades de PVPP-P6755.
Detecção em 280 (ácido gálico e catequina) e 352 nm (flavonóides).
280 nm 352 nm Detecção
Amostras
AG
CV %
CAT
CV%
Pico 1
CV%
Pico 2
CV%
Pico 3
CV%
Pico 4
CV%
Pico 5
CV%
Pico 6
CV%
SE
756308,33
3,87
355988,67
5,44
211259,67
4,64
484263
2,87
498337
2,84
304879
4,95
1829781
2,19
104888
3,19
SE + 10 mg PVPP
539641,67
2,26
83540,67
1,94
134695
3,16
137108,67
1,43
102632,67
1,00
106681
0,25
819915
0,14
16776,33
1,17
SE + 20 mg PVPP
522618
0,25
- 131393,33
2,84
76005,33
1,19
46467,67
1,36
68226
1,41
553717,7
0,36
15365,33
6,64
SE + 30 mg PVPP
433453
4,76
- 112411,67
1,53
42531,67
3,82
25176,33
2,04
42568,33
0,67
321737
2,84
14318,67
4,96
SE + 40 mg PVPP
397960,33
4,40
- 97371
1,33
29874,67
1,72
17549,33
3,49
31153,67
2,54
225277,7
0,99
11395,33
8,83
SE + 50 mg PVPP
320726,33
1,62
- 67409
0,64
19554,67
3,18
11345,67
5,09
21424,67
2,20
130437,7
1,57
9062,5
4,34
SE +150 mg PVPP
277204,67
0,97
- 23732,67
2,56
- - 6647
5,20
32049
1,76
8442
4,01
SE + 300 mg PVPP
228465,33
0,32
- 9743,33
8,81
- - - 10218,67
21,98
8626
9,94
Nota: AG: ácido gálico; CAT: catequina; SE: solução extrativa; CV%: coeficiente de variação percentual; n = 3.
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