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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Análise Botânica, Química e Biológica Comparativa entre Flores das Espécies
Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl. e Avaliação Preliminar da
Estabilidade
MARINA SCOPEL
PORTO ALEGRE, 2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Análise Botânica, Química e Biológica Comparativa entre Flores das Espécies
Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl. e Avaliação Preliminar da
Estabilidade
Orientador: Profa. Dra. Amélia T. Henriques
Co-orientador: Profa. Dra. Lílian A. Mentz
Dissertação apresentada por Marina
Scopel para obtenção do GRAU DE
MESTRE em Ciências Farmacêuticas.
4
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, em nível de Mestrado da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 29 de agosto de 2005, pela Banca
Examinadora constituída por:
Prof
a
. Dr
a
. Edna Sayuri Suyenaga
Universidade Luterana do Brasil
Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
Universidade Federal Fluminense
Prof
a
. Dr
a
. Mara Ritter
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dr. Martin Steppe
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Bibliotecárias responsáveis:
Heloisa do Canto Canabarro, CRB 10/1036
Cláudia da Silva Gonçalves, CRB 10/1012
S422a Scopel, Marina
Análise Botânica, Química e Biológica Comparativa entre Flores das
Espécies Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl. e
Avaliação Preliminar de sua Estabilidade / Marina Scopel – Porto Alegre:
UFRGS, 2005. – 263p.: il., gráf., tab.
Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Sambucus nigra. 2. Sambucus australis. 3. Cromatografia líquida de
alta eficiência. 4. Sabugueiro. 5. Caprifoliaceae. I. Henriques, Amélia T. II.
Mentz, Lílian A. III. Título.
CDU: 547.9:582.973
5
Este trabalho foi subvencionado pela CAPES e desenvolvido nos Laboratórios
de Farmacognosia e Fitoquímica, de Controle de Qualidade e de Botânica da
Faculdade de Farmácia desta Faculdade, bem como no Departamento de Produtos
Naturais e Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
6
7
“O maior prazer que a vida proporciona
é a superação das dificuldades,
passar de uma etapa do sucesso para a outra,
criar novos desejos e satisfazê-los”.
SAMUEL JOHNSON
8
9
Aos alicerces Assis e Beatriz,
a irmã Cláudia, a tia Cuca
e especialmente à nossa luz,
meu afilhado, João Victor
Dedico.
10
11
AGRADECIMENTOS
A Deus por olhar por mim.
À professora Dr
a
. Amélia T. Henriques por ter acreditado no meu potencial e por sua
orientação.
À professora Dr
a
. Lílian A. Mentz pela co-orientação e a professora Dr
a
. Eliane
Nunes, Msc. Márcia Vignoli, Msc. Giovana Vendruscolo pelo exaustivo e paciente
trabalho botânico realizado.
Ao professor Dr. André A. Souto pelos ensinamentos na iniciação científica (PUCRS)
e às professoras Dras. Clarice M. Azevedo e Renata P. Limberger pelo incentivo ao
ingresso no programa de pós-graduação desta universidade.
Às companheiras de luta Ana Lúcia Arigony e Camila Sebben, aos amigos do
laboratório Carolina Passos, Eduardo Konrath, Fabiane Farias, Jean Andrade,
Rafaela Marin, Raquel Giordani, Roger Dresh, Rogério Petersen, Valquiria Reis, aos
novos integrantes Dimas Jr., Graziele Ramos, Letícia Pagliosa, Tiago Souza e Maria
T. Kreinecker e especialmente às pacientes Ana Aboy, Melissa Schwanz e Miriam
Apel. Além das amigas e vizinhas Msc. Ana Cristina Stein, Ana Paula Bernardi,
Carolina Nör, Daniela Albring, Daniela Fritz, Juliana Haas, Kenia Correa, Simone
Cargnin e aos Profs. Elfrides Schapoval, Gilsane von Poser e José Ângelo Zuanazzi.
Aos mestres Cláudia A. S. Pires, Nael Hamid, Paulo Artur Coelho, Tatiana Castilhos,
pelo alegre acolhimento e momentos felizes vividos no laboratório.
As amigas, parceiras em momentos de descontração, ouvidoras e apoiadoras
constantes Cassiana Viau, Clarissa Xavier, Fernanda Ponticelli, Kátia Verenzuck,
Lisiane Fanton e ao amigo Paulo Mendes.
E àquelas pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste
trabalho ou estiveram presentes ao meu lado nesta jornada.
12
13
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ xvii
LISTA DE TABELAS ....................................................................................... xxi
LISTA DE EQUAÇÕES ................................................................................... xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................ xxv
RESUMO ......................................................................................................... xxvii
ABSTRACT ..................................................................................................... xxix
INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................... 1
OBJETIVOS GERAIS ...................................................................................... 5
CAPÍTULO 1 DESCRIÇÃO E ANALISE BOTÂNICA ...................................... 9
1.1 Introdução .................................................................................................. 11
1.2 Objetivos .................................................................................................... 13
1.3 Revisão da Literatura ................................................................................ 14
1.3.1 Sambucus nigra L. x Sambucus australis Cham. & Schltdl. ................... 14
1.4 Materiais e Métodos .................................................................................. 17
1.4.1 Material vegetal ...................................................................................... 17
1.4.2 Análise macroscópica ............................................................................. 19
1.4.3 Análise microscópica .............................................................................. 19
1.4.4 Testes histoquímicos .............................................................................. 20
1.5 Resultados ................................................................................................. 22
1.5.1 Análise macroscópica ............................................................................. 22
1.5.2 Análise microscópica .............................................................................. 31
CAPÍTULO 2 AVALIAÇÃO QUÍMICA QUALI E QUANTITATIVA ................... 69
2.1 Introdução .................................................................................................. 71
2.2 Objetivos .................................................................................................... 78
2.3 Revisão da Literatura ................................................................................ 79
2.3.1 Estudos químicos em Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham
& Schltdl...........................................................................................................
79
2.3.2 Análises cromatográficas e espectrofotométricas................................... 82
2.3.3 Estudo de estabilidade............................................................................ 83
2.4 Materiais e Métodos................................................................................... 85
14
2.4.1 Material vegetal....................................................................................... 85
2.4.2 Determinação de perda por dessecação................................................. 85
2.4.3 Determinação de materiais estranhos (contaminantes).......................... 86
2.4.4 Determinação de cinzas totais................................................................ 86
2.4.5 Análise qualitativa.................................................................................... 86
2.4.5.1 Avaliação do perfil cromatográfico utilizando cromatografia em
camada delgada...............................................................................................
86
2.4.5.2 Avaliação do perfil cromatográfico utilizando cromatografia líquida de
alta eficiência....................................................................................................
87
2.4.6 Análise quantitativa................................................................................. 90
2.4.6.1 Validação do método por cromatografia líquida de alta eficiência....... 91
2.4.7 Determinação do teor de flavonóides totais............................................ 95
2.4.8 Estudo preliminar da estabilidade acelerada........................................... 97
2.4.9 Análises das amostras coletadas, adquiridas no comércio ou
fornecidas pelo Laboratório de Farmacognosia (UFRGS)...............................
98
2.5 Resultados e Discussão............................................................................. 100
2.5.1 Determinação da perda por dessecação................................................. 100
2.5.2 Determinação de materiais estranhos (contaminantes).......................... 101
2.5.3 Determinação de cinzas totais................................................................ 102
2.5.4 Análise qualitativa.................................................................................... 103
2.5.5 Análise quantitativa................................................................................. 112
2.5.5.1 Validação do método por cromatografia líquida de alta eficiência....... 115
2.5.6 Determinação do teor de flavonóides totais............................................ 124
2.5.7 Estudo preliminar da estabilidade acelerada........................................... 128
2.5.8 Análise das amostras coletadas, comerciais ou fornecidas pelo
Laboratório de Farmacognosia (UFRGS).........................................................
137
CAPÍTULO 3 AVALIAÇÕES BIOLÓGICAS...................................................... 145
3.1 Introdução................................................................................................... 147
3.2 Objetivos..................................................................................................... 149
3.3 Revisão da Literatura................................................................................. 150
3.3.1 Gênero Sambucus sp.............................................................................. 150
3.3.2 Sambucus nigra L. x Sambucus australis Cham. & Schltdl..................... 152
3.4 Materiais e Métodos................................................................................... 157
3.4.1 Determinação da atividade antiinflamatória in vivo................................ 157
xiv
15
3.4.2 Determinação da atividade antioxidante in vitro...................................... 159
3.5 Resultados e Discussão............................................................................. 162
3.5.1 Atividade antiinflamatória in vivo............................................................. 162
3.5.2 Atividade antioxidante in vitro.................................................................. 165
DISCUSSÃO GERAL....................................................................................... 169
CONCLUSÕES................................................................................................ 181
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 185
ANEXOS........................................................................................................... 199
xv
16
17
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Fotografia ilustrativa de fores da espécie Sambucus nigra L........... 12
Figura 1.2 Fotografias ilustrativas de inflorescências da espécie Sambucus
australis Cham. & Schltdl...................................................................................
13
Figura 1.3 Sambucus nigra L. - estruturas macroscópicas observadas nas
flores..................................................................................................................
21
Figura 1.4 Sambucus australis Cham. & Schltdl. - estruturas macroscópicas
observadas nas flores........................................................................................
25
Figura 1.5 Sambucus nigra L. - estruturas microscópicas observadas nas
brácteas.............................................................................................................
35
Figura 1.6 Sambucus nigra L. - estruturas microscópicas observadas nas
sépalas...............................................................................................................
37
Figura 1.7 Sambucus nigra L. - estruturas microscópicas observadas nas
pétalas e nos filetes...........................................................................................
39
Figura 1.8 Sambucus nigra L. - estruturas microscópicas observadas nas
anteras, no receptáculo e nos pedicelos............................................................
41
Figura 1.9 Sambucus nigra L. - estruturas microscópicas observadas nos
pedicelos e no pó...............................................................................................
43
Figura 1.10 Sambucus australis Cham. & Schltdl. - estruturas microscópicas
observadas nas brácteas e nas sépalas...........................................................
51
Figura 1.11 Sambucus australis Cham. & Schltdl. - estruturas microscópicas
observadas nas sépalas e nas pétalas..............................................................
53
Figura 1.12 Sambucus australis Cham. & Schltdl. - estruturas microscópicas
observadas nos estames e no receptáculo........................................................
55
Figura 1.13 Sambucus australis Cham. & Schltdl. - estruturas microscópicas
observadas no pedicelo e no pó........................................................................
57
Figura 2.1 Cromatograma de Sambucus nigra L. observado no comprimento
de onda de 357 nm............................................................................................
99
Figura 2.2 Cromatograma de Sambucus australis Cham. & Schltdl.
observado no comprimento de onda de 357 nm................................................
100
Figura 2.3 Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE que mostram
os perfis de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl...........
101
Figura 2.4 Sobreposição dos cromatogramas de substâncias de referência....
103
Figura 2.5 e 2.6 Sobreposições dos cromatogramas obtidos com soluções
extrativas de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl. com
o cromatograma da substância referência rutina...............................................
104
18
Figura 2.7 Representação gráfica da curva de calibração de rutina por CLAE,
equação da reta e coeficiente de regressão......................................................
106
Figura 2.8 Cromatograma relativo a pureza do marcador químico da amostra
de Sambucus nigra L.........................................................................................
110
Figura 2.9 Cromatograma relativo a pureza do marcador químico da
Sambucus australis Cham. & Schltdl.................................................................
111
Figura 2.10 Curva de linearidade apresentando as equações da reta e os
coeficientes de regressão para as amostras de Sambucus nigra L. e
Sambucus australis Cham. & Schltdl.................................................................
112
Figura 2.11 Sobreposição de cromatogramas obtidos com amostra de
Sambucus não hidrolisada e hidrolisada...........................................................
120
Figura 2.12 Cromatograma de amostra de Sambucus hidrolisada....................
120
Figura 2.13 Sobreposição dos cromatogramas das substâncias referência
quercetina e canferol e cromatograma da amostra de Sambucus hidrolisada..
121
Figura 2.14 Cromatogramas dos extratos das amostras de Sambucus nigra
L. submetidas à análise da estabilidade acelerada (50°C ± 90%
U.R.)...................................................................................................................
123
Figura 2.15 Cromatogramas dos extratos das amostras de Sambucus
australis Cham. & Schltdl. submetidas à análise da estabilidade acelerada
(50°C ± 90% U.R.).............................................................................................
123
Figura 2.16 Perfil da redução do teor percentual de rutina obtido a partir das
análises cromatográficas dos extratos obtidos de Sambucus nigra L. e
Sambucus australis Cham & Schltdl.................................................................
124
Figura 2.17 Representação gráfica da curva de degradação, com reação de
primeira ordem, para a amostra Sambucus nigra L...........................................
126
Figura 2.18 Representação gráfica da curva de degradação, com reação de
segunda ordem, para a amostra Sambucus australis Cham. & Schltdl.............
126
Figura 2.19 Representação gráfica da curva de degradação, com reação de
segunda ordem, para a amostra Sambucus nigra L..........................................
128
Figura 2.20 Análise da área dos principais picos encontrados nos
cromatogramas de Sambucus nigra L. obtidos com a análise das amostras
provenientes do estudo de estabilidade............................................................
130
Figura 2.21 Análise da área dos principais picos encontrados nos
cromatogramas de Sambucus australis Cham. & Schltdl. obtidos com a
análise das amostras provenientes do estudo de estabilidade..........................
130
Figura 2.22 Cromatogramas das soluções extrativas das amostras de
Sambucus nigra L. adquiridas nos anos de 2001 até 2004...............................
133
Figura 2.23 Cromatogramas das soluções extrativas das amostras de
Sambucus australis Cham. & Schltdl. adquiridas nos anos de 2003 e 2004. ...
134
xviii
19
Figura 2.24 Cromatogramas referentes à amostras de Sambucus australis
Cham. & Schltdl. coletadas nas localidades de Veranópolis, Porto Alegre,
Caxias do Sul, Santa Maria e Praia da Guarda do Embaú (SC).......................
135
Figura 2.25 Sobreposição de cromatogramas referentes à diferença relativa
ao comprimento dos estames encontrados em Sambucus australis Cham. &
Schltdl................................................................................................................
137
Figura 3.1 Efeito da administração v.o. do extrato de Sambucus nigra L.
sobre o edema em patas de ratos induzido por carragenina.............................
155
Figura 3.2 Efeito da administração v.o. do extrato de Sambucus australis
Cham & Schltdl. sobre o edema em pata de rato induzido por carragenina......
156
Figura 3.3 “Seqüestro” do hidrato de 2,2-difenill-1-picrilhidrazila (DPPH
.
-
radical livre) por um flavonóide (agente seqüestrante)......................................
158
Figura 3.4 Representação gráfica comparativa de atividade antioxidante dos
extratos aquosos e etanólicos de Sambucus nigra L. e Sambucus australis
Cham. & Schltdl.................................................................................................
159
Figura 3.5 Demonstração da atividade antioxidante de extratos de Sambucus
nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl................................................
160
xix
20
21
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 Listagem das amostras de Sambucus australis Cham. & Schltdl.
e Sambucus nigra L. utilizadas na avaliação botânica e química....................
15
Tabela 1.2 Principais diferenças macro e microscópicas detectadas na
análise das flores de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. &
Schltdl...............................................................................................................
58
Tabela 2.1 Apresentação da definição das zonas climáticas definidas pela
Organização Mundial da Saúde.......................................................................
69
Tabela 2.2 Flavonóides encontrados na constituição química das flores de
Sambucus nigra L.............................................................................................
73
Tabela 2.3 Parâmetros cromatográficos para a análise das soluções
extrativas das espécies Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. &
Schltdl...............................................................................................................
81
Tabela 2.4 Sistema gradiente linear utilizado para desenvolvimento do
método de CLAE..............................................................................................
82
Tabela 2.5 Parâmetros analíticos modificados para a realização do teste de
robustez............................................................................................................
88
Tabela 2.6 Teor de umidade de amostras de Sambucus nigra L. para
diferenciação das análises por gravimetria e utilizando balança com
radiação infravermelho.....................................................................................
93
Tabela 2.7 Teor de cinzas totais para amostras de Sambucus nigra L. e
Sambucus australis Cham. & Schltdl...............................................................
96
Tabela 2.8 Valores de Rf obtidos com observação em CCD das amostras
de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham & Schltdl. analisadas, e
dados da literatura encontrados para Sambucus nigra L.................................
97
Tabela 2.9 Tempos de retenção e absorvâncias obtidas com CLAE/DAD
dos picos observados nos cromatogramas de Sambucus nigra L. e
Sambucus australis Cham & Schltdl................................................................
102
Tabela 2.10 Valores de tempo de retenção e absorvância para substâncias
de referência após análises utilizando CLAE/DAD..........................................
103
Tabela 2.11 Análise de variância (ANOVA) para a média das curvas de
calibração de rutina..........................................................................................
106
Tabela 2.12 Ensaios para determinação das condições ideais de extração
para Sambucus nigra L. utilizando os parâmetros: proporção
planta:solvente, teor de orgânico no solvente extrator e método extrativo......
107
Tabela 2.13 Ensaios para determinação das condições ideais de extração
para Sambucus australis Cham. & Schltdl. utilizando os parâmetros:
proporção planta:solvente, teor de orgânico no solvente extrator e método
extrativo............................................................................................................
107
Tabela 2.14 Análise de variância (ANOVA) para os dados de linearidade de
Sambucus nigra L.............................................................................................
113
22
Tabela 2.15 Análise de variância (ANOVA) para dados obtidos com o
parâmetro de linearidade de Sambucus australis Cham. &
Schltdl...............................................................................................................
113
Tabela 2.16 Resultados para o parâmetro de exatidão para as amostras de
Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl.............................
114
Tabela 2.17 Valores experimentais obtidos para o parâmetro de precisão da
metodologia de CLAE aplicada à soluções extrativas das amostras de
Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl.............................
115
Tabela 2.18 Análise de amostras de Sambucus nigra L. e Sambucus
australis Cham. & Schltdl. para verificação de precisão e repetibilidade entre
as soluções extrativas......................................................................................
115
Tabela 2.19 Avaliação do parâmetro de robustez para soluções extrativas
de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl........................
116
Tabela 2.20 Análise do teor de flavonóides totais, expressos em teor de
quercetina para amostras de flores de Sambucus nigra L. e Sambucus
australis Cham. & Schltdl.................................................................................
118
Tabela 2.21 Análise da estabilidade acelerada para as amostras de flores
das espécies Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham &
Schltdl...............................................................................................................
123
Tabela 2.22 Valores experimentais obtidos no estudo da estabilidade
acelerada com as amostras de Sambucus nigra L. através do método
proposto de cromatografia liquida de alta eficiência, considerando-se as
diferentes ordens de reação.............................................................................
125
Tabela 2.23 Valores experimentais obtidos no estudo da estabilidade
acelerada com as amostras de Sambucus australis Cham & Schltdl.,
através do método proposto de cromatografia líquida de alta eficiência,
considerando-se as diferentes ordens de reação............................................
125
Tabela 2.24 Teores médios de rutina encontrados nas amostras comerciais
e/ou fornecidas pelo laboratório, de Sambucus nigra L. e nas amostras
coletadas de Sambucus australis Cham. & Schltdl..........................................
132
Tabela 3.1 Descrição dos relatos etnobotânicos e etnofarmacológicos
encontrados para Sambucus nigra L................................................................
147
Tabela 3.2 Efeito da administração v.o. dos extratos de Sambucus nigra L.... 155
Tabela 3.3 Efeito da Administração v.o. dos extratos de Sambucus australis
Cham & Schltdl.................................................................................................
156
Tabela 3.4 Percentual de atividade antioxidante demonstrado pelos extratos
aquosos e etanólicos de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham &
Schltdl...............................................................................................................
159
xxii
23
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 2.1 Cálculo utilizado para determinação do percentual de
recuperação do marcador químico....................................................................
86
Equação 2.2 Cálculo para determinação dos limites de detecção (LD) e
quantificação (LQ)..............................................................................................
88
Equação 2.3 Cálculo para determinação do teor percentual de quercetina...... 90
Equação 2.4 Equações de ordem zero e de segunda ordem utilizadas para o
cálculo da velocidade de degradação (k) e t
90%
.................................................
126
Equação 3.1 Equação para determinação do percentual antioxidante para as
amostras de Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl..........
154
24
25
LISTA DE ABREVIATURAS
AA: atividade antioxidante.
ACN: acetonitrila.
CCD: cromatografia em camada delgada.
CE
50
: concentração suficiente para obter 50% de um efeito máximo estimado em
100%.
CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência.
CLAE/DAD: Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de
diodos.
DP: desvio padrão.
DPPH: hidrato de 2,2-difenil-1-picrilhidrazila.
DPR: desvio padrão relativo.
k: constante de velocidade de reação.
PVDF: membrana filtrante em fluoreto de polivilideno.
SA: solução extrativa de Sambucus australis com concentração teórica final de 25
mg/ml.
SAA: diluição da solução extrativa SA, com concentração teórica final de 2,5 mg/ml.
SAA1: diluição da solução SAA, com concentração teórica final de 1,25 mg/ml.
SAE: solução final de acetato de etila.
SC: solução comparativa.
SL: solução metanólica de ácido acético a 5%.
SN: solução extrativa de Sambucus nigra com concentração teórica final de 25
mg/ml.
26
SNN: diluição da solução extrativa SN, com concentração teórica final de 2,5 mg/ml.
SNN 1: diluição da solução SNN, com concentração teórica final de 1,25 mg/ml
SQR: substância química de referência.
T
90%
: valor em que a concentração da substância avaliada é 90% da concentração
inicial.
TFA: ácido trifluoroacético.
UV/VIS: ultravioleta na região do visível.
Rf: razão entre a distância percorrida pela mancha relativa a componentes presentes
numa mesma amostra e a distância percorrida pelo eluente na CCD.
xxvi
27
RESUMO
Flores das espécies Sambucus nigra, de origem européia, e Sambucus australis,
nativa da América do Sul (Caprifoliaceae), denominadas sabugueiro e sabugueiro-
do-brasil, respectivamente, são utilizadas popularmente sob forma de infusão, como
antiinflamatórias, laxativas e para condições febris resultantes de afecções do trato
respiratório. Estudos prévios para S. nigra indicam compostos fenólicos como
principais constituintes químicos, sendo estes relacionados às principais atividades
biológicas avaliadas. Objetivando comparar esta espécie com Sambucus australis,
foram realizadas análises botânicas macro e microscópicas das flores, identificando
as principais diferenças entre as espécies, tais como o número de lóculos no ovário
e presença de idioblastos cristalíferos em algumas estruturas, e observando os
possíveis contaminantes (pedicelos). Também foram determinados os parâmetros
farmacopéicos: cinzas totais e perda por dessecação. Após a análise química, foi
escolhido o flavonóide rutina como marcador das espécies, para realizar análises
quantitativas nas 31 amostras adquiridas e / ou coletadas, utilizando método de
CLAE previamente validado. Soluções hidroetanólicas apresentaram maior
capacidade de extração do produto alvo. Os limites mínimos de rutina observados
para ambas as espécies foram de aproximadamente 0,65%. Também foram
quantificados, por método espectrofotométrico, os flavonóides totais expressos em
quercetina, sendo 0,93% e 1,46% os teores mínimos determinados para S.nigra e S.
australis, respectivamente. O estudo da estabilidade acelerada (50°C ± 90% U.R.),
avaliando a degradação dos constituintes químicos presentes permitiu sugerir a
cinética de degradação de segunda ordem para da rutina nas duas espécies.
Comparações de atividades biológicas das espécies foram realizadas pelos ensaios
das atividades antiinflamatória (inibição do edema em pata de rato induzido por
carragenina) e antioxidante (DPPH). Os resultados para o primeiro ensaio
demonstraram ação equivalente em ambas as espécies para extratos
hidroetanólicos a 80% (86% de inibição) e aquosos (81%), com atividade
semelhante ao padrão indometacina (~83%); para a atividade antioxidante os
extratos hidroetanólicos a 80% foram mais ativos (CE
50
= 16 μg/ml) que os
aquosos (CE
50
= 27 μg/ml) em S. australis, e ambos extratos, superiores ao
28
extrato padronizado Gingko biloba (CE
50
= 40 μg/ml) e aos extratos de S. nigra
(CE
50
= 50 μg/ml – hidroetanólico e CE
50
= 32 μg/ml – aquoso).
Palavras-chave: Sambucus australis, Sambucus nigra, cromatografia líquida de alta
eficiência, estudo de estabilidade.
xxviii
29
ABSTRACT
“Botanical, Chemical, Biological comparative analysis among flowers of
Sambucus nigra L. and Sambucus australis Cham. & Schltdl. species and preliminar
stability evaluation”.
Sambucus nigra (from Europe) and Sambucus australis (from South America)
flowers (Caprifoliaceae), called sabugueiro and sabugueiro-do-brazil, respectively,
are used in the folk medicine as anti-inflammatory, laxative and for respiratory
diseases. Previous studies for S. nigra indicate phenolic compounds as the main
chemical constituents, being related for these ones the biological activities reported.
In order to compare this species with S. australis macro and microscopical analysis
of the flowers were carried out to identify the major differences between the species,
such as the number of ovary locules and idioblasts in some structures, verifying the
possible contaminants (pedicels). The following Pharmacopoeia parameters were
also determined: total ash and loss on drying. After the chemical analysis, it was
chosen the rutin flavonol as the mark constituent for both species, to carry through
quantitative analysis of the 31 acquired and/or collected samples, by previously
validated HPLC method. Hydroethanolic solutions had shown greater capacity of
extraction of the target product. The minimum limits of rutin observed for both species
had been of approximately 0.65%. The total flavonoid content was also quantified by
spectrophotometer method, being expressed as quercetin, finding 0.93% and 1.46%
the minimum values for S. nigra and S. australis, respectively. The accelerated
stability test (50 ºC ± 90% UR) that evaluate the degradation of the constituents,
allowed to verify a kinetic degradation of second order for rutin in both species.
Comparison of biological activities of these species was carried out using the
antiedematogenic (rat paw edema) and antioxidant (DPPH) activities. The results for
the first test showed an equivalent action for the hydroethanolic (86% of edema
inibition) and aqueous (81%) extracts, exhibiting a similar activity to indometacin
(~83%). For the antioxidant activity, the ethanolic extracts (CE
50
= 16 μg/ml) were
more active than the aqueous (CE
50
= 27 μg/ml ) for S. australis, and, both extracts
were superiors to the Ginko biloba (CE
50
= 40 μg/ml) and to the S. nigra extracts
(CE
50
= 50 μg/ml – hydroethanolic and CE
50
= 32 μg/ml - aqueous).
Palavras-chave: Sambucus australis, Sambucus nigra, HPLC, stability study.
INTRODUÇÃO GERAL
2
3
Os produtos naturais são largamente reconhecidos pela grande diversidade
estrutural bem como sua ampla faixa de atividade farmacológica. Aproximadamente
30 % dos medicamentos mais vendidos no mundo são produzidos a partir de
produtos obtidos de matérias-primas vegetais (STROHL, 2000).
Um fator limitante para uma maior utilização de plantas como matéria-prima
pelas indústrias é que sua maioria não possui descrição em códigos oficiais
(formulários e farmacopéias), não havendo inclusive estudos científicos adequados
sobre muitas delas. Dentro deste restrito número pode-se citar que 324 estão
descritas na Farmacopéia Alemã, 60 na Cooperativa Européia Científica de
Fitoterapia, 13 na Farmacopéia Americana, 60 na Organização Mundial da Saúde e
apenas 24 na Farmacopéia Brasileira (TOLEDO et al., 2003).
Segundo a Organização Mundial da Saúde, entre as especificações
necessárias para controle efetivo e garantia de produtos fitoterápicos, encontram-se
aquelas relativas à qualidade e integridade do material de partida, em sentido
restrito: da matéria-prima vegetal, com relevância para a correta identificação da
espécie de interesse, suas características quanto ao cultivo, condições da coleta,
fatores edafoclimáticos e região de origem (WHO, 1993).
A qualidade exigida e a disponibilidade de matérias-primas para a fabricação
de fitoterápicos são fatores de estrangulamento para a indústria farmacêutica, fato
que não é observado em relação aos produtos sintéticos. Enquanto milhares de
estudos clínicos são realizados (fase II e III) com estes últimos, poucos fitoterápicos
foram objeto de estudos clínicos duplo-cegos, aleatórios e bem controlados, de
acordo com padrões aceitos internacionalmente (CALIXTO, 2001a).
Neste contexto, onde os estudos sobre composição química e avaliação de
atividades biológicas que validem a utilização de uma variedade de insumos
industriais são relativamente escassos, o estudo de parâmetros de qualidade e
estabilidade de matérias-primas vegetais para que seja assegurada a produção de
fitoterápicos com qualidade, são ainda mais raros. Assim, um conjunto de aspectos
são relevantes e devem ser avaliados. Entre estes estão a análise botânica para
4
verificação de possíveis contaminantes, o desenvolvimento de metodologias
confiáveis que permitem a quantificação de marcadores químicos, para a provável
utilização destes no desenvolvimento de medicamentos, alguns ensaios biológicos
que auxiliem na escolha de doses preliminares e estudos da estabilidade visando a
determinação do prazo de utilização dos produtos desenvolvidos.
Por estes motivos, foram selecionadas as espécies Sambucus nigra, de
origem européia, estudada e mundialmente comercializada na forma de pó ou
cápsulas em associação com os frutos e in natura para o preparo de infusões e
Sambucus australis, nativa de nosso País, pouco investigada. Sabe-se que,
popularmente, as flores de ambas as espécies são indicadas principalmente para
condições febris resultantes de afecções do trato respiratório, como antiinflamatórias
e laxativas; e são muitas vezes confundidas ou substituídas uma pela outra, devido
a ausência de aprofundados estudos comparativos. Sendo assim, este trabalho visa
a realização um estudo comparativo no âmbito botânico, químico e farmacológico
para as espécies supramencionadas.
5
OBJETIVOS GERAIS
6
7
O objetivo geral deste trabalho é avaliar comparativamente as espécies
Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl. quanto aos seguintes
aspectos:
• Botânicos:
• descrição macro e microscópica das flores das espécies;
• descrição microscópica dos elementos constituintes dos pós obtidos e dos
elementos contaminantes das espécies;
• Químicos:
• Avaliação qualitativa e determinação do marcador químico;
• escolha do método extrativo;
• determinação de métodos para análise quantitativa;
• análise de amostras adquiridas e/ou coletadas em diversas localidades;
• estudo preliminar da estabilidade das flores;
• Biológicos:
• avaliação da atividade antiinflamatória e antioxidante.
8
9
CAPÍTULO 1
DESCRIÇÃO E ANÁLISE BOTÂNICA
10
11
1.1 INTRODUÇÃO
Na primeira etapa da investigação fitoquímica, a coleta do material vegetal,
bem como a correta preparação de exsicatas são essenciais para a identificação
botânica. Estas exsicatas servirão de contraprova para a identificação de uma
determinada espécie no momento que existam dúvidas quanto à sua classificação
botânica. Assim, a seleção do material coletado deve ser cuidadosa, evitando partes
do vegetal afetadas por doenças, parasitas e também materiais estranhos, tais como
outras plantas ou mesmo partes da própria planta que não sejam de interesse para a
investigação (FALKENBERG et al., 2002).
O principal objetivo da realização de estudos botânicos é a identificação
inequívoca de uma espécie vegetal, através da análise de características
anatômicas e morfológicas, procurando destacar aquelas consideradas peculiares
de uma determinada espécie e que, em ultima instância, estejam presentes na
matéria-prima vegetal. Da mesma forma, é importante o estabelecimento de
características botânicas comparativas que permitam detectar a presença de uma ou
mais espécies adulterantes (SONAGLIO et al., 2002; TOLEDO et al., 2003),
garantindo a originalidade do material que está sendo trabalhado.
Ensaios macro e microscópicos são ferramentas importantes para a
certificação de autenticidade da matéria-prima vegetal manipulada, aliados também
às características organolépticas. No que tange às análises microscópicas, percebe-
se sua importância quando o material vegetal encontra-se na forma de pó, podendo
assim certificar-se da pureza e garantir a qualidade da amostra analisada.
Posteriormente a estes ensaios, a realização de análises fitoquímicas auxiliará na
identificação de grupos de substâncias químicas presentes na espécie vegetal e de
possíveis contaminantes, quando estes não são detectados a olho nu ou através de
microscopia.
Uma espécie identificada erroneamente pode resultar em medicamento
fitoterápico inócuo ou até em intoxicação quando a mesma for tóxica. Igualmente, o
cultivo em solo ou clima inadequado, bem como o uso de pesticidas podem gerar
12
uma planta com modificações quanto ao teor dos princípios ativos responsáveis
pelas atividades biológicas. Coleta do material vegetal realizada na época e de
forma adequada e o armazenamento incorreto podem comprometer a constituição
química ou causar contaminação por microorganismos, causando intoxicações na
população. Por fim, a utilização errônea das plantas ou o emprego de técnicas
inadequadas de conservação e preparo pode prejudicar a constituição química final
ou causar efeitos adversos, indicando a necessidade de estudos morfo-anatômicos
aprofundados.
13
1.2 OBJETIVOS
Análise botânica das flores das espécies Sambucus nigra L. e Sambucus
australis Cham. & Schltdl. com objetivos:
• descrição macroscópica ;
• descrição microscópica;
• descrição microscópica dos elementos constituintes dos pós obtidos das
espécies;
• avaliação dos caracteres botânicos dos elementos contaminantes.
14
1.3 REVISÃO DA LITERATURA
1.3.1 Sambucus nigra L. x Sambucus australis Cham. & Schltdl.
A família Caprifoliaceae (sensu lato) compreende 18 gêneros e 450 espécies,
distribuídas principalmente nas regiões temperadas do Hemisfério Norte (Europa,
América do Norte, oeste e centro da Ásia, e norte da África), com uma menor
distribuição no Hemisfério Sul (HEYWOOD, 1993). O único gênero com espécies
nativas na América do Sul é Sambucus, com duas espécies (DIMITRI, 1980),
Sambucus peruviana Kunth, que ocorre no nordeste da Argentina e na Região
Andina da América do Sul, na América Central até o México e Sambucus australis
Cham. & Schltdl., ocorrendo da Região Sudeste até o Rio Grande do Sul, no Brasil,
e no Paraguai, Argentina e Uruguai (BACIGALUPO, 1974; REITZ, 1985). Os demais
gêneros encontrados no país foram introduzidos e são atualmente cultivados
(Abelia, Lonicera e Viburnum), ou esporadicamente assilvestrados (BARROSO,
1986; REITZ, 1985). Autores recentes sugerem que o gênero Sambucus seja
realocado para a família Sambucaceae (TAKHTAJAN, 1997), ou para Adoxaceae
(JUDD et al., 1999), enquanto outros ampliam a circunscrição de Caprifoliaceae
(APG II, 2003).
O gênero Sambucus possui cerca de 25 espécies (REITZ, 1985). Entre estas,
destacam-se Sambucus canadensis L. (American Elder), Sambucus ebulus L. (Dwarf
Elder), Sambucus nigra L. (Black Elder, European Elder) e Sambucus australis
Cham. & Schltdl. (sabugueiro-do-rio-grande, sabugueiro-do-brasil). As duas últimas
espécies são referidas como medicinais e possuem origens distintas, Sambucus
nigra é uma espécie européia e Sambucus australis é nativa. Ambas possuem as
flores como farmacógeno e são comercializadas principalmente na forma de chás,
no Brasil. A espécie mais difundida é Sambucus nigra, encontrada também em
outros países em preparações farmacêuticas e homeopatia. Estas duas espécies
são o objetivo deste trabalho e estão descritas a seguir.
Sambucus nigra L. (sabugueiro) é uma árvore ou arbusto muito ramificado, de
até 7,0 m de altura e copa globosa. As folhas são pecioladas, opostas,
15
imparipinadas, compostas de 3 a 7 (raro até 11) folíolos elípticos, fracamente
assimétricos, membranosos, de 5,0 a 12,0 cm de comprimento, finamente dentados
na margem, agudos no ápice, glabros. As estípulas são sésseis, e geralmente
caducas. As flores são amareladas ou brancas, pequenas, dispostas em amplas
cimeiras corimbosas terminais, monoclinas, diclamídeas, pentâmeras ou tetrâmeras,
actinomorfas. O androceu é formado por quatro ou cinco estames epipétalos. O
gineceu é formado, em regra, por três carpelos soldados entre si, com três lóculos e
três rudimentos seminais, de placentação axial. Em algumas inflorescências ocorre
predominância de flores tetrâmeras. O fruto é negro, elíptico, com cerca de 7,0 mm
de diâmetro (Figura 1.1) (PERROT, 1944; PLANCHON et al., 1946; PARIS &
MOYSE, 1971; DIMITRI, 1980, BRITISH, 1996; CZYGAN et al., 2001; WHO, 2001).
Sambucus australis Cham. & Schltdl. (sabugueiro-do-brasil, sabugueiro-do-
rio-grande), é um arbusto muito ramificado, ou uma arvoreta, de até 4,0 m de altura,
raramente mais e copa irregular. As folhas são pecioladas, opostas, imparipinadas,
compostas de 7 (raro 5) a 13 folíolos ovalado-lanceolados, assimétricos,
membranosos, de 4,0 a 7,5 cm de comprimento, finamente serreados na margem,
acuminados no ápice, glabros. As estípulas são sésseis na base do pecíolo,
obovaladas, dentadas na margem, caducas. As flores são brancas a branco-
amareladas, pequenas, dispostas em amplas cimeiras corimbosas terminais,
morfologicamente monoclinas, diclamídeas, pentâmeras ou tetrâmeras,
actinomorfas. O androceu é formado por quatro ou cinco estames epipétalos, que
podem apresentar filetes curtos (denominadas pistiladas) ou longos (denominadas
estaminadas) (Figura 1.2). O gineceu é formado, em regra, por cinco carpelos
soldados entre si, com cinco lóculos e cinco rudimentos seminais de placentação
axial. Em algumas inflorescências ocorre uma predominância de flores tetrâmeras. O
fruto é negro, ovalado a globoso, com 6,0 a 7,5 mm de diâmetro (MUELLER, 1885;
CABRERA, 1965; BACIGALUPO, 1974; DIMITRI, 1980; REITZ, 1985; ALICE et al.,
1990).
16
As diferenças encontradas entre Sambucus nigra e Sambucus australis são
muito discretas. Ambas são arbustivas a arbóreas. Sambucus nigra se caracteriza
por apresentar, em regra, folhas com 5 a 7 folíolos, de bordo dentado, enquanto que
Sambucus australis tem folhas com 7 a 13 folíolos, ou mais, raramente, cinco
folíolos, de bordo serreado (DIMITRI, 1980; REITZ, 1985). As inflorescências, nas
duas espécies, são cimeiras corimbosas terminais, com flores muito semelhantes
entre si, diferindo principalmente no número de lóculos existentes no ovário. Em
Sambucus nigra os estames têm filetes de tamanho igual em todas as flores da
inflorescência, enquanto que em Sambucus australis ocorrem flores com estames de
filetes curtos (Figura 1.2 – B) e de filetes longos (Figura 1.2 – A). Sambucus nigra
apresenta predominantemente 3 lóculos no ovário, enquanto que em Sambucus
australis ocorrem principalmente 5 lóculos no ovário.
Figura 1.1 Fotografia ilustrativa de flores da espécie Sambucus nigra L.
Figura 1.2 Fotografia ilustrativa de inflorescências da espécie Sambucus australis Cham. &
Schltdl.
A
B
69
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO QUÍMICA QUALI E QUANTITATIVA
70
71
2.1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas ocorreram grandes avanços analíticos no âmbito de
isolamento e identificação de constituintes químicos das espécies vegetais. Porém,
raramente todos os constituintes presentes nos extratos das plantas podem ser
identificados e caracterizados.
Além de existirem dificuldades de análise, o teor dos constituintes presentes
nas plantas pode variar consideravelmente em função de fatores externos, incluindo:
temperatura, umidade, luminosidade, nutrientes do solo, método de coleta,
secagem, transporte, parte da planta usada, entre outros. Cada um desses fatores
pode afetar diretamente a qualidade da matéria-prima vegetal e, conseqüentemente,
o produto final e a eficácia clínica dos medicamentos fitoterápicos (CALIXTO,
2001a).
A determinação dos constituintes químicos, principalmente do marcador
químico das espécies vegetais é de extrema importância na definição dos
parâmetros necessários na padronização de metodologias para a avaliação da
qualidade da matéria-prima vegetal e de medicamentos fitoterápicos. Segundo a
resolução n° 48 (BRASIL, 2004a), marcador é o “componente ou classe de
compostos químicos (ex: alcalóides, flavonóides, ácidos graxos, etc.) presente na
matéria-prima vegetal, idealmente o próprio princípio ativo, e preferencialmente que
tenha correlação com o efeito terapêutico”.
Para a análise das matérias-primas vegetais, muitos parâmetros são
requeridos e devem ser considerados anteriormente à aplicação dos métodos
desenvolvidos para a realização do controle de qualidade e determinação do
marcador químico. Entre os principais fatores estão a proporção de planta : solvente
extrator a ser utilizado, bem como a escolha do solvente ideal, o método de
extração, calibração de material, entre outros. Após estas definições, o método de
análise mais adequado deve ser selecionado de acordo com os constituintes
presentes na planta, elegendo preferencialmente aquele que propicie maior rapidez
72
e simplicidade de análise, e que possibilite quantificação precisa dos compostos,
principalmente do marcador.
Atualmente, muitas indústrias de fitoterápicos estão empregando métodos
analíticos como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para avaliação do
perfil químico e determinação do marcador para as espécies trabalhadas porém,
quando esta técnica não é acessível parte-se para a quantificação de um grupo de
constituintes por metodologias que, na maioria das vezes encontram-se descritas
em compêndios oficiais como, por exemplo, a espectrofotometria na região do
ultravioleta.
A técnica de CLAE vem sendo selecionada por apresentar uma variedade de
parâmetros passíveis de modificação, pelo operador, para otimizar o procedimento
de separação dos constituintes. Entre os principais fatores encontram-se os
solventes que compõem a fase móvel, o tamanho e enchimento das colunas, a
presença de diferentes tipos de detectores, alta rapidez de análise, repetibilidade e
precisão dos resultados, além da facilidade na manipulação do equipamento e a
presença de softwares modernos que possibilitam análises completas dos
cromatogramas.
Aliados ao desenvolvimento de metodologias analíticas quantitativas
utilizando CLAE estão os procedimentos de validação, onde órgãos
regulamentadores como ICH (International Harmonization Conference, 1996),
Farmacopéia Americana (United States Pharmacopoeia Convention; USP, 2005), e
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, BRASIL; 2003) estabelecem
normas para a sua realização, garantindo assim a confiabilidade nos resultados
alcançados.
Podem ser encontrados na literatura um número significativo de trabalhos que
apresentam métodos de quantificação de substâncias químicas em medicamentos
utilizando CLAE que apresentam metodologia de análise validada (GÖREN et al.,
2004; NISHITANI & SAGESAKA, 2004; KOKOLETSI et al., 2005). Por outro lado,
para matérias-primas vegetais ou fitoterápicos, a publicação de trabalhos que
73
relatam o desenvolvimento e a validação de metodologias para a realização do
controle de qualidade está em ascendência. Sendo assim, os parâmetros de
performance analítica utilizados estão fundamentados naqueles utilizados para os
medicamentos, segundo ICH (1996), SWARTZ & KRULL (1997), HONG & SHAH
(2000), ANVISA (BRASIL, 2003), SHABIR (2003), RIBANI e colaboradores (2004),
Farmacopéia Americana 28 (USP, 2005) são eles:
Especificidade / Seletividade – um método instrumental de separação que produza
resposta para uma única substância de interesse, normalmente um dado elemento,
pode ser chamado de específico e um método que produza resposta para vários
compostos químicos com características em comum, seletivo. Apesar do termo mais
adequado para a descrição do parâmetro seja seletividade, o ICH (1996) e a
Farmacopéia Americana (USP, 2005) consideram especificidade como o termo
correto. Então, especificidade traduz-se como a capacidade de medir exata e
especificamente o analito de interesse na presença de outros componentes que
podem ser esperados na amostra (cada um dos ativos, excipientes, impurezas e
produtos de degradação bem como outros compostos de propriedades similares).
Uma das maneiras para avaliação da especificidade para CLAE é utilizando
detectores de arranjo de fotodiodos, que comparam o espectro de absorção de uma
substância referência com a do pico obtido na separação da amostra e utiliza-se isto
como indicação da pureza do composto. Se a especificidade não for assegurada, a
linearidade, exatidão e precisão estarão comprometidas.
Linearidade – corresponde à capacidade de um método fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância em exame dentro de uma
determinada faixa de aplicação que deve possuir, no mínimo, cinco concentrações
no intervalo de 80 – 120%. O comportamento dos resultados obtidos com a análise
deve ser descrito por uma equação linear e avaliado por métodos estatísticos
apropriados como, por exemplo, o cálculo da regressão pelos métodos dos mínimos
quadrados e análise da variância.
74
Exatidão – indica o percentual de recuperação de um composto (substância
referência, marcador) adicionado à uma amostra cuja concentração é conhecida.
Para esta análise, devem-se executar no mínimo três níveis de concentração.
Precisão - é a medida de concordância entre valores experimentais obtidos que
resultam da aplicação repetida do método à amostra homogênea. Usualmente é
avaliada nos resultados o desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV), que
corresponde ao desvio padrão relativo (DPR). O ICH (1996) e a resolução n°. 899
(BRASIL, 2003) concordam que a precisão pode ser medida em três níveis:
• Repetibilidade: medição de precisão entre ensaios com condições analíticas
mantidas. A avaliação do resultado ocorre através de medições sucessivas
em um curto período de tempo de uma mesma amostra, porém em diferentes
preparações, como pela avaliação de seis determinações a 100% da
concentração teórica da amostra, ou nove determinações em três níveis de
concentração.
• Precisão Intermediária: expressa a variabilidade em longo prazo de um
processo de determinação. Indica o efeito das variações dentro de um
laboratório devido a eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou
equipamentos. É a mais representativa variabilidade dos resultados em um
único laboratório e podem ser monitoradas as variáveis individuais dos
analistas (rotina analítica). Expresso em DP ou DPR (DPR).
• Reprodutibilidade: refere-se a estudos colaborativos entre laboratórios, no
sentido de reprodução dos resultados da metodologia de análise aplicada.
Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) – o primeiro pode ser
definido como a menor concentração do analito detectado em uma amostra, mas
não necessariamente quantificada, enquanto que o LQ representa a menor
quantidade do analito em uma amostra que pode ser quantificado com precisão e
exatidão aceitáveis, ambos sob as condições experimentais previamente
estabelecidas. Podem ser calculados com dados obtidos do desvio padrão do
75
intercepto e da inclinação da curva de calibração, previamente construída com o
composto de interesse. Outros meios para determinação do LD e LQ são aqueles
baseados na avaliação visual em métodos não instrumentais e na relação sinal-ruído
para procedimentos analíticos que exibem ruído de base.
Robustez – medida da capacidade do método de análise em resistir a pequenas e
deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Para CLAE os parâmetros
requeridos são variação do pH da fase móvel, variação da composição da fase
móvel, diferentes lotes e temperatura das colunas e fluxo da fase móvel.
Na validação de metodologias analíticas cromatográficas o ICH (1996) e a
Farmacopéia Americana (USP, 2005) reconhecem que não existe a necessidade de
avaliar todos os parâmetros de performance analítica. O tipo de método e seu
respectivo uso determinam quais os parâmetros devem ser investigados (SWARTZ
& KRULL, 1997) então, é de inteira responsabilidade do analista identificá-los para
que os resultados gerados pela aplicação do método sejam de total confiabilidade
quando o seu uso for rotineiro.
Aliado à validação de metodologias analíticas para as matérias-primas
vegetais, um requisito importante para garantir a qualidade, segurança e eficácia da
substância é o estudo da estabilidade química de seus constituintes. Na atualidade,
CLAE é considerado método de escolha para investigar a estabilidade dos
componentes de matérias-primas vegetais e seus possíveis produtos de
degradação.
Estabilidade é definida como o tempo durante o qual um produto de origem
sintética ou vegetal permanece íntegro em termos de identidade química,
efetividade, potência, inocuidade e pureza. Alguns fatores ambientais podem afetar
a integridade da amostra analisada, como a temperatura, luz e umidade, existindo
também outros fatores relacionados ao próprio produto como pH, excipientes
farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e
propriedades dos materiais de embalagem (NUDELMAN, 1976; WHO, 1996;
MERCOSUL, 1996; LACHMAN et al., 2001; MINISTÉRIO, 2003; BRASIL, 2004b;
76
MINISTÉRIO, 2004). Tratando-se de plantas medicinais, se os constituintes com
atividade terapêutica não são conhecidos, um limite de variação de 10 % do valor do
ensaio inicial é aceito (EMEA, 1999; LACHMAN et al., 2001; HEIGL & FRANZ, 2003)
e 5% para condições aceleradas de estabilidade, segundo a resolução n. 398
(BRASIL, 2004b), WHO (1996), Ministério da Saúde da Costa Rica (2003) e
Ministério da Saúde de Cuba (2004).
A Organização Mundial da Saúde (WHO, 1996) e o ICH (2003) descrevem
que o tempo de conservação de um fármaco deve ser estabelecido levando-se em
consideração as zonas climáticas em que um produto encontra-se disponível para a
comercialização. Estes órgãos definem quatro diferentes zonas climáticas (Tabela
2.1) que são, segundo ANVISA (BRASIL, 2004b), espaços ou zonas
geograficamente delimitadas de acordo com os critérios de temperatura e umidade
aplicáveis quando da realização de estudos de estabilidade.
Tabela 2.1 Apresentação de definição das zonas climáticas definidas pela Organização
Mundial da Saúde (WHO, 1996):
Zona Descrição Temperatura Umidade Relativa (U.R.)
Zona I Clima Temperado
21°C ± 2°C 45% ± 5%
Zona II Mediterrâneo
25°C ± 2°C 60% ± 5%
Zona III Quente e Seco
30°C ± 2°C 35% ± 5%
Zona IV Quente e Úmido
30°C ± 2°C 70% ± 5%
Para os produtos encontrados nas zonas III e IV que, se destinados ao
mercado mundial, o estudo da estabilidade deve realizar-se nas condições da zona
IV (MERCOSUL, 1996; WHO, 1996), pois precisa-se levar em conta o efeito nocivo
das condições climáticas adversas existentes em certos países, principalmente nos
casos de exportação. O Brasil está situado na Zona Climática IV (quente/úmida)
(BRASIL, 2004b).
Órgãos regulamentadores responsáveis pelo estabelecimento de diretrizes
para a realização destes estudos da estabilidade, os classificam em (ICH, 1996;
WHO, 1996; BRASIL, 2004b):
77
Estudos da estabilidade a longo prazo - são estudos utilizados para determinar, a
longo prazo, as características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas do
produto, durante e além do prazo de armazenamento. Seus resultados são usados
para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e predizer as condições de
armazenamento.
Estudos da estabilidade acelerada – são realizados para monitorar a aceleração
da velocidade de degradação química ou física de uma substância e / ou alterações
de características da forma farmacêutica, quando são empregadas condições
extremas de armazenamento, com o propósito de prever o prazo de validade nas
condições normais de armazenamento em sua embalagem primária definitiva. Os
resultados nem sempre podem prever mudanças físicas e devem ser sustentados
por estudos de estabilidade a longo prazo.
Os testes para o estudo da estabilidade acelerada devem ser conduzidos,
para a zona IV, nas condições de temperatura de 40°C ± 2°C e 75% ± 5% de
umidade relativa (U.R.) em 6 meses e como alternativa, também podem ser
utilizados 50°C ± 2°C e 90% ± 5% em 3 meses (MERCOSUL, 1996; BRASIL,
2004b).
Em alguns casos, dados sobre estabilidade dos compostos farmacológicos
ativos ou marcadores químicos de materiais vegetais são documentados nas suas
respectivas monografias. Pela escassez destes dados, principalmente para material
de origem vegetal, tornam-se indispensáveis estes estudos para obter informações
extensivas sobre estabilidade destas substâncias (HEIGL & FRANZ, 2003).
78
2.2 OBJETIVOS
No que se refere à avaliação química, os objetivos deste trabalho consistem
em avaliar a matéria-prima vegetal, constituída por flores de Sambucus nigra L. e
Sambucus australis Cham. & Schltdl. quanto aos aspectos:
• perda por dessecação;
• quantidade de materiais estranhos (contaminantes);
• teor de cinzas totais;
• análise qualitativa da droga por cromatografia em camada delgada e
cromatografia líquida de alta eficiência a fim de estabelecer o marcador
químico para a espécie;
• desenvolvimento e validação de metodologia de análise quantitativa do
marcador químico utilizando CLAE;
• análise quantitativa por espectrofotometria na região do ultravioleta
(UV/VIS) com a determinação do teor de flavonóides totais;
• avaliação preliminar da estabilidade;
• análise (UV/VIS e CLAE) de diferentes amostras adquiridas
comercialmente, fornecidas pelo laboratório de Farmacognosia desta
Faculdade e/ou amostras coletadas.
79
2.3 REVISÃO DA LITERATURA
2.3.1 Estudos químicos em Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. &
Schltdl.
As flores de Sambucus nigra são constituídas, especialmente, por flavonóides
(> 3,0%) principalmente glicosilados como rutina (1,5% a 3,5%), considerado
majoritário (CHARAUX, 1924; DAVIDECK, 1961; SHOAIB et al., 1972; NEWALL et
al., 2002), hiperosídeo, isoquercitrina, quercitrina, astralgina, canferol-7-ramnosideo,
isoramnetina-3-glucosídeo e isoramnetina-3-rutinosideo; aparecendo em menor
quantidade as agliconas quercetina e canferol (Tabela 2.2) (ALICE et al., 1990;
LAMAISON et al., 1991; BRITISH, 1992; SEITZ et al., 1992; WAGNER & BLADT,
1996; D’AMÉLIO, 1999; EVANS, 2002; NEWALL et al., 2002). SEITZ e
colaboradores (1992) identificaram flavanonas como naringina e hesperidina.
80
Tabela 2.2 Flavonóides encontrados na constituição química das flores de Sambucus nigra
L.
O
OH
R
1
OOH
R
3
OR
2
Composto R
1
R
2
R
3
Rutina -OH -ramnoglucose -OH
Isoquercitrina -OH -glucose -OH
Hiperosídeo -OH -galactose -OH
Quercitrina -OH -ramnose -OH
Astralgina -H -glucose -OH
Canferol-7-ramnosideo -H -H -ramnose
Isoramnetina-3-glucosídeo -OCH
3
- glucose -OH
Isoramnetina-3-ramnoglucosídeo -OCH
3
-ramnoglucose -OH
Quercetina -OH -H -OH
Canferol -H -H -OH
Para flores desta espécie também é descrita a presença de óleos (0,05% a
0,14%) onde, entre as 80 substâncias identificadas estão, em grande concentração,
os ácidos graxos livres (66%), principalmente os ácidos linoleico, linolênico e
palmítico (38%), seguido de 7,2% de alcanos (C
14
– C
31
) (TOULEMONDE &
RICHARD, 1983; BRITISH, 1992; HERBAL, 2000; PDR, 2000; BRUNETON, 2001;
EVANS, 2002; REVIEW, 2002) entre outros componentes como éteres, óxidos,
cetonas, aldeídos, álcoois e ésteres (TOULEMONDE & RICHARD, 1983; NEWALL
et al., 2002).
Triterpenos como
α
- e
β
- amirina (1%), ocorrendo como ésteres de ácidos
graxos, ácidos ursólico e oleanólico (0,85%) e 20
β
-hidroxiursólico (BRITISH, 1992;
81
ALONSO, 1998; D’AMÉLIO, 1999; HERBAL, 2000; BRUNETON, 2001; CZYGAN et
al., 2001; EVANS, 2002; NEWALL et al., 2002), lupeol, cicloartenol, 24-
metilenocicloartenol e cicloeucalenol (WILLUHN & RICHTER, 1977) também fazem
parte da composição química das flores de Sambucus nigra, bem como os esteróis
sitosterol, estigmasterol e campesterol (WILLUHN & RICHTER, 1977; HERBAL,
2000; CZYGAN et al., 2001; NEWALL et al., 2002). Outros compostos fenólicos
como ácidos clorogênico (3%), caféico, ferúlico e p-cumárico e seus ésteres β-
glucosilados (BRITISH, 1992; ALONSO, 1998; D’AMÉLIO, 1999; HERBAL, 2000;
EVANS, 2002; NEWALL et al., 2002), sambunigrina (ALONSO, 1998; EVANS, 2002)
e taninos também são descritos para a espécie. A presença de mucilagem, pectina,
açúcares, minerais (8 – 9% potássio), plastocinina (proteína) igualmente foi relatada
(ALICE et al., 1990; ROMBI, 1991; BRITISH, 1992; ALONSO, 1998; D’AMÉLIO,
1999; HERBAL, 2000; EVANS, 2002; NEWALL et al., 2002).
Por outro lado, as flores da espécie Sambucus australis apresentam poucos
estudos quanto à constituição química, sendo relatados flavonóides do tipo 3-O-
monoglicosídeo de diidroflavonol, 3,7-O-diglicosídeo de flavonol, isoquercitrina,
rutina e quercetina, ácidos caféico e clorogênico (ALICE et al., 1990). Os dois
primeiros constituintes citados, encontrados em extratos metanólicos, são
considerados pelos autores como um dos pontos de diferenciação entre as espécies
Sambucus nigra e Sambucus australis.
Segundo ALICE e colaboradores (1991), em screening realizado com amostra
de Sambucus australis, foi possível identificar a presença de flavonóides em grande
quantidade, esteróis e triterpenos em menor quantidade e ausência de taninos.
Parâmetros farmacognósticos utilizando tintura-mãe da espécie nativa e da
espécie européia foram estabelecidos por MACIEL & BRANDÃO (1998). Estes
determinaram perda por dessecação, cinzas totais, determinação da presença de
taninos, flavonóides e triterpenos utilizando testes reativos e caracterização das
tinturas-mãe quanto a densidade, teor alcoólico, pH e resíduo seco total. Os valores
obtidos para as duas espécies apresentaram diferenças significativas, observando
82
também a presença de apenas traços de taninos em Sambucus australis, enquanto
que estes estão presentes na outra espécie.
2.3.2 Análises cromatográficas e espectrofotométricas
Relatos científicos de análises cromatográficas e espectroscópicas para os
extratos de flores de Sambucus nigra e Sambucus australis são escassos. Em
farmacopéias, como citado anteriormente, são encontrados somente métodos de
doseamento utilizando espectroscopia na região do ultravioleta, visando a
determinação do teor de flavonóides totais, calculados como isoquercitrina, em
monografia de Sambucus nigra, porém utilizando a espécie Sambucus ebulus para
as análises químicas (DAB 10, 1994; EUROPEAN, 2002; FARMACOPÉIA, 2002).
No ano de 1992, PIETTA e colaboradores analisaram as espécies Calendula
officinalis L e Sambucus nigra utilizando CLAE e cromatografia capilar eletrocinética
micelar (MECC). Para Sambucus nigra foi possível realizar a separação dos
flavonóides glicosilados presentes em extratos hidrometanólicos (rutina,
isoquercitrina, astralgina, entre outros) utilizando 2-propanol:THF:água (12:4:84)
como fase móvel e verificou-se também que a MECC foi uma técnica de análise
complementar à CLAE.
MALEŠ E MEDIĆ-ŠARIĆ (1999) investigaram a constituição de extratos
metanólicos das flores de Sambucus nigra por cromatografia em camada delgada
(CCD). Neste estudo foram testados dez diferentes sistemas eluotrópicos a fim de
estabelecer o melhor para análise dos compostos encontrados. Através da
construção de um dendograma relacionando os sistemas e os tempos de retenção
dos flavonóides e ácidos fenólicos analisados, os autores selecionaram dois
sistemas como sendo os melhores para separação: acetato de etila:metanol:ácido
fórmico:água (100:13,5:2,5:10) e acetato de etila:ácido fórmico:água (8:1:1). A British
Herbal Pharmacopoeia (BRITISH, 1996) e a Farmacopéia Européia (EUROPEAN,
2002) citam análises de CCD para os extratos das flores de Sambucus ebulus em
monografia de Sambucus nigra, utilizando um sistema cromatográfico com acetato
de etila:ácido fórmico:ácido acético glacial:água (100:11:11:27) e a Farmacopéia
83
Portuguesa (2002) utiliza ácido fórmico:água:metiletilcetona:acetato de etila
(10:10:30:50) para tal análise. WAGNER & BLADT (1996) empregam o mesmo
sistema das Farmacopéias Européia e da Herbária Britânica, citadas anteriormente,
porém utilizando a espécie Sambucus nigra.
Outras metodologias analíticas também foram encontradas para análise dos
extratos das flores de Sambucus nigra como cromatografia líquida de alta eficiência
com detector UV e fotodiodos (CLAE/DAD) (LAMAISON et al., 1992) e eletroforese
capilar (SEITZ et al., 1992). No primeiro método citado, os autores realizaram a
identificação de dois glicosídeos de isoramnetina utilizando UV e CLAE/DAD em
extrato das flores; e no segundo os autores desenvolveram um método validado de
eletroforese capilar que foi utilizado para a quantificação dos flavonóides presentes
na solução extrativa das flores.
Para a espécie Sambucus australis existe somente um relato onde os autores
verificaram a presença de compostos polifenólicos em soluções extrativas das flores,
comparativamente com Sambucus nigra. Nesta descrição os autores analisaram
amostras das flores extraídas em Soxhlet, com solventes em polaridade crescente,
empregando técnicas de cromatografia em papel e em camada delgada
bidimensional (ALICE et al., 1990).
2.3.3 Estudo da estabilidade
O único estudo que referenda a avaliação da estabilidade para Sambucus
nigra foi realizado por HEIGL & FRANZ (2003), utilizando diferentes tipos de
embalagens primárias e granulometrias. O teste empregado foi o de estabilidade de
longa duração (~27 meses – 25°C / 60% U.R.) com a planta inteira e pulverizada,
utilizando, para avaliação do estudo, a determinação do teor de flavonóides totais
segundo a Farmacopéia Européia e estudos com CLAE (EUROPEAN, 2002). Foi
constatada uma redução no teor de flavonóides totais e CLAE acima dos limites
permitidos (10%) após o período de 12 meses. Além disso, esta análise demonstrou
um desenvolvimento não-linear no método espectrofotométrico que, segundo os
autores, ocorreu devido à insuficiente reprodutibilidade do método analítico aplicado
84
ou devido a problemas de dissolução dos flavonóides durante o processo de
extração.
Após análise dos dados encontrados na literatura para ambas espécies,
constatou-se a escassez de estudos relativos a análise do conteúdo de flavonóides
totais, bem como para identificação do marcador e constituinte majoritário além do
desenvolvimento de metodologias analíticas validadas. Para a espécie européia,
mesmo com presença de monografias nas Farmacopéias Alemã (DAB 10, 1994),
Portuguesa (FARMACOPEIA, 2002), Européia (EUROPEAN, 2002), Herbária
Britânica (BRITISH, 1996), entre outras, além de citações científicas, não existem
dados referentes ao desenvolvimento de um método de análise validado utilizando
CLAE e testes de estabilidade acelerada analisando possíveis produtos de
degradação.
144
145
CAPÍTULO 3
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA
ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA E ANTIOXIDANTE
146
147
3.1 INTRODUÇÃO
Terapias medicamentosas convencionais estão sendo cada vez mais
substituídas, pela população mundial, por outras que utilizem fitoterápicos ou
preparados vegetais capazes de fornecer os mesmos efeitos benéficos, porém
minimizando assim os indesejáveis efeitos colaterais.
O uso de plantas como medicamento está fundamentado em estudos
etnofarmacológicos que, partindo do uso tradicional e do conhecimento popular
sobre as propriedades farmacológicas (antiinflamatória, analgésica,
antiespasmódica, antitérmica, laxativas, entre outras) de certas drogas vegetais,
indicam o potencial para o desenvolvimento de novos fitoterápicos.
As atividades biológicas sugeridas pela população para espécies vegetais
estão sendo constantemente comprovadas através de estudos científicos.
Pesquisadores apontam alguns grupos de substâncias químicas, presentes nas
plantas examinadas, como responsáveis por tais atribuições. Entre os principais
grupos químicos destacam-se os flavonóides que apresentam grande variedade de
efeitos farmacológicos, incluindo ação anticarcinogênica e antiproliferativa
(HOLLMAN
et al., 1996; PELZER et al., 1998), antibacteriana, antiviral,
vasodilatadora, antialergênica, analgésica (PELZER
et al., 1998; WANG et al, 1998;
HARBORNE & WILLIAMS, 2000; LÓPEZ
et al., 2001), citotóxica, antilhipertensiva e
hipolipidêmica (PELZER
et al., 1998).
Além destas atividades relatadas para os flavonóides, encontram-se também
as propriedades antiinflamatória e antioxidante, que vêm sendo exaustivamente
estudadas na ultima década (TOURNAIRE
et al., 1993; FORMICA & REGELSON,
1995; RICE-EVANS
et al., 1996; YOKOSAWA et al., 1997; PELZER et al., 1998; Di
CARLO
et al., 1999; HARBORNE & WILLIAMS, 2000; NIJVELDT et al., 2001;
SUYENAGA, 2002; AMIĆ
et al., 2003; TSIMOGIANNIS & OREOUPOULOU, 2004).
Em relação ao efeito antiinflamatório produzido por estes compostos,
encontram-se relatos na literatura indicando seu mecanismo de ação, onde os
148
flavonóides podem interferir nas rotas das enzimas ciclo-oxigenase e / ou a 5-
lipoxigenase do metabolismo do ácido araquidônico (HARBORNE & WILLIAMS,
2000), aumentando a permeabilidade capilar, inibindo a exudação protéica e
migração de leucócitos (PELZER
et al., 1998), entre outros.
Por outro lado os flavonóides podem também agir como quelantes do radical
oxigênio (
1
O
2
) e seqüestradores de várias espécies de radicais, como o ânion
superóxido (O
2
.-
), radicais hidroxila e peroxila (TOURNAIRE et al., 1993;
HARBORNE & WILLIAMS, 2000; AMIĆ
et al., 2003) e, efetivamente suprimir a
peroxidação lipídica em tecidos biológicos e frações subcelulares como
mitocôndrias, microssomos, lipossomos, lipoproteínas de baixa densidade e
membrana eritrocitária (YOKOSAWA
et al., 1997; NG et al., 2000; YANG et al.,
2001; GEORGETTI
et al., 2003; TSIMOGIANNIS & OREOUPOULOU, 2004),
demonstrando assim, sua potencial atividade antioxidante.
A atividade antiinflamatória pode ser avaliada por modelos
in vitro (ex:
quimiotaxia) e
in vivo (ex: edema em pata de ratos, pleurisia e microcirculação in
situ). Um dos métodos in vivo mais utilizados é o ensaio de edema em pata de ratos
induzido por carragenina, relatado por WINTER e colaboradores (1962). A obtenção
dos resultados neste experimento é feita com auxílio de pletismômetro, do qual as
patas são imersas em uma solução, e o volume deslocado (ml) corresponde ao
inchaço provocado pelo agente flogístico, quando comparado com um controle. O
edema produzido pelo mesmo agente flogístico também pode ser avaliado pela
determinação do diâmetro (mm) da pata do rato na altura da articulação tíbio-társica.
Para a avaliação da ação antioxidante, diversos são os métodos relatados.
Entre estes encontram-se o ensaio de peroxidação lipídica, método colorimétrico
com β-caroteno e métodos fotocolorimétricos utilizando β-caroteno, ácido 2,2’-azino-
bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonico) (ABTS) e hidrato de 2,2-difenill-1-picrilhidrazila
(DPPH). Este último é considerado um ensaio válido e fácil para avaliar o potencial
dos flavonóides como seqüestradores de radicais livres através da rápida doação de
um átomo de hidrogênio, estabilizando o radical (MENSOR
et al., 2001; LEE et al.,
2003; DAWIDOVICZ
et al., 2005).
149
3.2 OBJETIVOS
Com relação à avaliação das atividades biológicas, os objetivos deste
trabalho consistem em verificar a atividade antiinflamatória
in vivo através do ensaio
de edema em pata de rato e a atividade antioxidante
in vitro através do método de
doseamento colorimétrico do radical hidrato de 2,2-difenill-1-picrilhidrazila (DPPH)
para as soluções extrativas hidroetanólicas e aquosas das flores das espécies
Sambucus nigra e Sambucus australis.
150
3.3 REVISÃO DA LITERATURA
3.3.1 Gênero Sambucus sp.
O gênero Sambucus é composto por diversas espécies que apresentam
importantes atividades biológicas. Entre os principais farmacógenos utilizados para a
realização destes ensaios estão as folhas e rizomas, e alguns estudos estão
descritos a seguir.
Para uma espécie de sabugueiro encontrada na Argentina (
Sambucus
peruviana), HERNÁNDEZ e colaboradores (2000) demonstraram que extratos das
partes aéreas apresentaram atividade antibacteriana frente à cocos gram positivos
como
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis quando
comparados ao padrão cloranfenicol. Outro relato para esta espécie, porém, nativa
do Peru, foi relacionado à significativa atividade encontrada para extratos etanólicos
de folhas e brotos para
Staphylococcus conhii, Streptococcus bovis, Clostridium
histolyticum, Corynebacterium diphteriae, Bacterioides fragilis e Bacillus megaterium
(NETO et al., 2002).
Estudando uma espécie iraniana de
Sambucus ebulus, AHMADIANI e
colaboradores (1998) realizaram testes para a avaliação da atividade antiinflamatória
aguda, atividade antinociceptiva e a toxicidade aguda dos extratos metanólicos
obtidos de folhas, raízes e rizomas. Quanto aos resultados obtidos, o extrato
metanólico dos rizomas apresentou-se efetivo para todos os experimentos citados e
os autores atribuíram à presença de flavonóides e esteróides na planta.
Encontrada também na Turquia, a espécie mencionada anteriormente
apresentou considerável atividade para três cepas de Helicobacter pylori, utilizando
extratos em clorofórmio das folhas (YESILADA
et al., 1999).
Compostos isolados de folhas da espécie
Sambucus formosana, identificados
como palmitato de
α
- e
β
- amirina,
β
- amirina e
β
-sitosterol, e um novo composto
151
como o éster triterpênico sambuculina A, têm sido citados por exibir forte atividade
antihepatotóxica contra danos no fígado produzidos experimentalmente por
tetracloreto de carbono (LIN & TOME, 1988).
Para a espécie
Sambucus mexicana, coletada na Guatemala, algumas
atividades foram relatadas, principalmente, para suas folhas, como a atividade
antimicrobiana contra
Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi,
Shigella dysenteriae e Shigella flexneri (CACERES et al., 1990), antimicótica em
cepas de
Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Microsporum gypseum,
Trichophyton mentagrophytes var. algodonosa, Trichophyton mentagrophytes var.
granulare e Trichophyton rubrum (CACERES et al., 1991) e sua ação frente cepas
da enterobactéria
Vibrio cholerae (ESPAÑA et al., 1994).
O extrato aquoso das raízes de
Sambucus williamsii exibiu atividade
analgésica e antiinflamatória em modelos experimentais de inflamação aguda e
crônica em ratas, pela indução de carragenina (TUNÓN
et al., 1985). Os mesmos
resultados foram descritos para o extrato bruto das folhas de
Sambucus mexicana
(ALONSO, 1998).
O único relato encontrado utilizando flores como material de partida foi
descrito por MECKES-LOZOYA & CAMPOS (1985), onde utilizaram a espécie
Sambucus mexicana para o preparo de infusões a 100 mg/ml e posterior avaliação
in vitro sobre os efeitos de contração ou relaxamento produzidos em músculo liso
(tecidos da aorta, traquéia, intestino e útero) de algumas espécies de animais
(porcos da guiné, ratos, coelhos e cachorros). Os extratos produziram alteração da
atividade muscular em quase todos os tecidos, exceto para os traqueais. Também
foram estudados os parâmetros respiratórios, cardiovasculares e os efeitos sobre a
glicemia em cachorros anestesiados (realizados simultaneamente), e ainda a
atividade eletroencefalográfica em coelhos. Estes últimos testes não apresentaram
atividade para a infusão das flores desta espécie relatada.
152
Além das espécies anteriormente citadas, cabe enfatizar os relatos populares
e biológicos encontrados para as espécies
Sambucus nigra e Sambucus australis,
objetos deste trabalho.
3.3.2 Sambucus nigra L. x Sambucus australis Cham. & Schltdl.
Usos populares
As aplicações terapêuticas modernas aprovadas no British Herbal
Compendium (BRITISH, 1992) e pela Comissão E (HERBAL, 2000) para as flores de
Sambucus nigra estão baseadas em uma combinação de fatores, incluindo sua
longa história de utilização em sistemas da medicina tradicional bem estabelecidos,
estudos pré-clínicos e investigações fitoquímicas.
Popularmente, infusões e decoctos das flores de
Sambucus nigra em questão
são utilizadas principalmente como diaforéticas em quadros febris (CORREA, 1984;
MARTINS, 1989; ROMBI, 1991; BRITISH, 1992; QUER, 1993; ALONSO, 1998;
MOERMAN, 1998; SIMÕES
et al., 1998; HERBAL, 2000; PDR, 2000; WHO, 2000;
BRUNETON, 2001; CZYGAN
et al., 2001; EVANS, 2002; NEWALL et al., 2002),
também para debelar sarampo e escarlatina (CRUZ, 1979; CORREA, 1984), onde
freqüentemente são combinadas com outras espécies, em bebidas quentes. Este
farmacógeno supostamente aumenta a resposta das glândulas sudoríparas
estimulando a produção de calor corporal, provavelmente tal efeito deva-se aos seus
constituintes (flavonóides e ácidos fenólicos) ou pela simples ingestão de líquidos
(BRITISH, 1992; PEIRCE, 1999; HERBAL, 2000; CZYGAN
et al., 2001).
São relatados também que infusões das flores atuariam como diuréticas
(SIMÕES
et al., 1998; PEIRCE, 1999; REVIEW, 2002; EVANS, 2002; BRITISH,
1992; NEWALL
et al., 2002), laxativas leves (ALONSO, 1998; SIMÕES et al., 1998;
PEIRCE, 1999; WHO, 2000; CZYGAN
et al., 2001; NEWALL et al., 2002; REVIEW,
2002), antiinflamatórias (antireumática) (ALONSO, 1998; MOERMAN, 1998;
SIMÕES
et al., 1998; D’AMÉLIO, 1999; WHO, 2000; NEWALL et al., 2002), afecções
nas vias respiratórias (tosses, bronquites, sinusites) (ALONSO, 1998; SIMÕES
et al.,
153
1998; PEIRCE, 1999; HERBAL, 2000; PDR, 2000; WHO, 2000; CZYGAN
et al.,
2001; NEWALL
et al., 2002), laringite (PDR, 2000), conjuntivite, dor de cabeça
(WHO, 2000) e, ocasionalmente, usado para aumentar lactação (PDR, 2000;
COIMBRA, 1958). Com as flores são preparadas pomadas e banhos utilizados em
queimaduras, tônicos para erupções cutâneas (QUER, 1993; MOERMAN, 1998;
SIMÕES
et al., 1998) e travesseiros herbais para inflamação e inchaço (PDR, 2000).
Quanto à espécie nativa
Sambucus australis, foram encontrados relatos
populares muito semelhantes a espécie anterior, sendo considerada “remédio do
peito” pela eficiência contra problemas respiratórios (uso interno), além de ser
descrita também como diurética, anti-séptica, cicatrizante e antiinflamatória (artrite e
gota) (LORENZI & MATOS, 2002).
Desde o início do século XX o chá das flores desta espécie é indicado como
antiálgico para dores em geral e como estimulante da sudorese (SILVA, 1929;
CRUZ, 1979; CORREA, 1984; REITZ, 1985; SIMÕES
et al., 1998; JORGE et al.,
1999; LORENZI & MATOS, 2002). Possui indicações também para sarampo,
catapora (CRUZ, 1979), como digestivo (ALICE
et al., 1995) e purgativo (SILVA,
1929). O farmacógeno também é utilizado externamente contra irritação dos olhos,
dermatoses (erisipela, erupções cutâneas, pruridos, eczemas e reações alérgicas),
queimaduras leves, úlceras bucais e pequenas injúrias, na forma de gargarejos,
compressas e cataplasmas, aplicadas diretamente sobre as áreas afetadas (REITZ,
1985; LORENZI & MATOS, 2002).
Levantamentos etnobotânicos e etnofarmacológicos relacionados à
Sambucus nigra foram realizados em países do hemisfério Norte, principalmente na
Europa, indicando os principais usos para o seu farmacógeno, flores (Tabela 3.1).
154
Tabela 3.1 Descrição dos relatos etnobotânicos e etnofarmacológicos encontrados para
Sambucus nigra L.
Localidade Atividades relacionadas ao farmacógeno Referência
L’Ált Empordà e Lês
Guilleries (Espanha)
Infusão e decocção – anticatarral, anticefálgico,
anti-séptico ocular e digestivo.
BONET et al., 1999.
Província de Lucca
(Itália)
Infusão – digestiva. PIERONI, 2000.
Território de
Fluminimaggiore
(Sardenha/ Itália)
Decocção - alívio de dores. BALLERO et al., 2001
Leste do Azerbaijão
(Irã)
Infusão – antiinflamatória (reumatismo), utilizado
para resfriados e bronquites e diaforéticas.
MIRALDI et al., 2001
Província de Chieti
(Abruzzo/Itália)
Infusão – para resfriados e asma, antipirético e
promove diurese.
LEPORATTI &
CORRADI, 2001.
Distrito de Sarrabus
(Sardenha/ Itália)
Cataplasma – analgésico em dores de cabeça. PALMESE et al., 2001
Basilicata do Norte
(Itália)
Decocção - dores de garganta. PIERONI et al., 2002
Marche, Abruzzo e
Latium (Itália Central)
Infusão ou decocção – resfriados, asma e
inflamação nos olhos.
GUARRERA, 2005.
Atividades farmacológicas
Foram apenas encontradas atividades farmacológicas cientificamente
comprovadas para as flores da espécie
Sambucus nigra.
Dentre os efeitos observados, está o efeito diurético. REBUELTA e
colaboradores (1983) verificaram que uma infusão preparada com as flores de
sabugueiro (200 ml/kg) causou diurese em ratos, apresentando maior eficácia do
que a teofilina (5 mg/kg). Esta atividade foi atribuída à presença de flavonóides e
sais de potássio presentes nos extratos (REBUELTA
et al., 1983; WHO, 2000).
Segundo
The American Pharmaceutical Association (PEIRCE, 1999), o efeito
diurético pode ser explicado pelo extensivo uso do farmacógeno em pílulas para
emagrecer e em outras fórmulas dietéticas, produzindo uma perda transitória de
fluido corporal.
Outro efeito farmacológico foi apresentado por MASCOLO e colaboradores
(1987) utilizando o ensaio de indução de edema em pata de rato por carragenina
para verificar a atividade antiinflamatória das flores desta espécie. Extratos
hidroetanólicos (80%) apresentaram atividade antiinflamatória moderada (27% de
155
inibição do edema em ratos Wistar machos) em doses de 100 mg/kg via oral quando
comparados com o padrão indometacina (inibição de 45%). Alguns autores
atribuíram a atividade apresentada por esta espécie, provavelmente à presença de
ácido ursólico (LAWRIE
et al, 1964; MASCOLO et al., 1987; WHO, 2000).
Extrato metanólico de flores inibiu a biossíntese das citocinas inflamatórias
interleucina 1- α e 1-β e fator de necrose α (TNF-α) na concentração de 30 μg/ml em
células mononucleares periféricas
in vitro (YESILADA et al., 1997).
SERKEDJIEVA e colaboradores (1990), investigaram a atividade antiviral de
uma infusão composta por flores de
Sambucus nigra L., raiz de Saponaria officinalis
L. e partes aéreas de
Hypericum perforatum L., frente a cepas de vírus influenza
tipos A e B (
in vitro e in vivo) e herpes vírus tipo 1 (in vitro). Esta infusão inibiu a
reprodução viral em diferentes cepas, sendo que tal atividade foi atribuída à
presença de flavonóides, saponinas, ácidos fenólicos e polissacarídeos que
atuariam sinergicamente (BERGHE
et al., 1986; SERKEDJIEVA et al., 1990; WHO,
2000). Outros estudos também relataram a atividade antiviral de extratos aquosos
(liofilizados) e etanólicos contra o vírus HIV frente a diversas plantas. Todos os
extratos etanólicos deste experimento apresentaram-se tóxicos frente às células
humanas linfocíticas MT-2, porém os liofilizados de
Sambucus nigra e Sambucus
ebulus
demonstraram baixa toxicidade (BEDOYA et al., 2001).
GIAMPIERI e colaboradores (2003) observaram que o óleo obtido das flores
de
Sambucus nigra em aparelho de Clevenger possuiu fraca atividade antioxidante
(29%) e quando obtido da extração etanólica (95%), foi paticamente inativo (3,6%),
quando comparados ao controle positivo (timol-70%) e com o padrão BHT (3,5-di-
terc-butil-4-hidroxitolueno) (100%). A ausência, no óleo, de constituintes que
possuíssem atividade antioxidante, principalmente eugenol, foi a conclusão dos
autores para o estudo (GIAMPIERI
et al., 2003).
Outro relato que descreve a atividade antioxidante, porém utilizando flores,
folhas e frutos de
Sambucus nigra, foi realizado por DAWIDOWICZ e colaboradores
(2005). Os extratos hidroetanólicos (80%), obtidos a 20 e 100°C, bem como a
156
temperaturas crescentes de 20 a 200°C foram submetidos aos métodos utiliznado
DPPH (2,2-difenil-1-fenilhidrazila) e β-caroteno. Verificou-se que as flores
apresentaram maior capacidade em neutralizar os radicais livres, ao passo que aos
demais extratos, observou-se potencial atividade aos obtidos na tempratura de
100°C. Segundo os autores esta propriedade antioxidante está ligada à presença de
flavonóides, que estão presentes em maiores quantidades nas flores. Quando
avaliados os resultados obtidos utilizando temperaturas crescentes, foi observado
que o aumento de temperatura na extração foi diretamente proporcional ao aumento
de atividade para os extratos, sendo que isto ocorreu pelo fato de que em
temperaturas elevadas, os flavonóides glicosilados podem sofrer hidrólise originando
suas agliconas, para as quais é relatada sua pronunciada atividade antioxidante.
Constatou-se ausência de estudos farmacológicos para a espécie
Sambucus
australis, em relatos científicos, apesar das indicações populares encontradas.
Frente aos relatos de atividades farmacológicas de
Sambucus nigra e a escassez de
informações referentes à espécie
Sambucus australis, realizou-se estudo
comparativo entre estas plantas, através da avaliação da atividade antiinflamatória
pelo modelo de inibição de edema em pata de rato induzido pela carragenina e
investigação do potencial efeito antioxidante, utilizando hidrato de 2,2-difenill-1-
picrilhidrazila.
169
DISCUSSÃO GERAL
170
171
Devido ao seu crescente uso mundial, as plantas medicinais necessitam cada
vez mais de um estabelecimento de normas que venham a contribuir para a garantia
de sua qualidade, bem como em todas as etapas do desenvolvimento de
fitoterápicos.
O trabalho com plantas medicinais inicia-se na identificação correta da
espécie, coleta e armazenamento adequados, processamento e utilização
terapêutica, produzindo assim resultados clínicos satisfatórios. O controle de
qualidade nas etapas iniciais é fundamental para obter reprodutibilidade no material
de partida a fim de minimizar a dificuldade de padronização do material estudado.
Assim, esta dissertação objetivou avaliar aspectos botânicos, químicos e
biológicos comparativos entre duas espécies utilizadas na medicina popular e como
matéria-prima na produção de fitomedicamentos,
Sambucus nigra e Sambucus
australis.
No Capítulo 1 estão apresentadas descrições botânicas completas macro e
microscópicas das espécies, e de seus pós,
fundamentais na identificação correta
destes vegetais, bem como para sua diferenciação e de relevante interesse para a
padronização destas matérias-primas vegetais para a elaboração de monografias
analíticas.
A dificuldade de distinção morfológica entre duas espécies do mesmo gênero,
idênticas a olho nu, quando não é disponível material de referência para tal, muitas
vezes necessita de um estudo profundo de todas as estruturas presentes no material
a ser analisado. Outro aspecto que dificulta esta distinção é a presença de apenas
material seco pelo fato de que este é mais frágil e freqüentemente as características
a serem observadas não se apresentam íntegras.
O estudo minucioso realizado neste trabalho demonstrou que as diferenças
morfológicas existentes entre as flores de
Sambucus nigra e Sambucus australis são
poucas e foram identificadas principalmente com as análises microscópicas. Entre
elas encontram-se, por exemplo, idioblastos de areia cristalina, de oxalato de cálcio,
172
presentes somente nas flores de
Sambucus nigra e a forma da parede das células
fundamentais da epiderme das sépalas que é sinuosa nas sépalas de
Sambucus
australis e retilíneas na outra espécie. Macroscopicamente as diferenças mais
evidentes foram quanto ao número de lóculos no ovário e o comprimento do filete
nos estames. Somente a identificação destas observações citadas não é suficiente
para distinguir uma espécie da outra, necessitando então a reunião do maior número
de caracteres que o analista puder encontrar.
A análise dos contaminantes presentes nas amostras de flores adquiridas
evidenciou a presença de pedicelos grosseiros, avaliados macro e
microscopicamente e flores escurecidas. Também foi realizada a análise do material
pulverizado, importante quando não é possível o contato com o material íntegro ou
para a análise de cápsulas. Neste pó foi possível distinguir fragmentos de dentes
marginais das sépalas de
Sambucus nigra, bem como os idioblastos cristalíferos em
pedaços de epiderme e uma grande quantidade de pólen. Todas estas
características mencionadas na descrição do pó concordaram com as informações
descritas por ESCHRICH (1988).
A segunda parte do trabalho contemplou o desenvolvimento de parâmetros
para análises químicas quali e quantitativas para as flores das espécies em questão,
visando também contribuir com o estabelecimento de alguns parâmetros
farmacopéicos tais como determinação de perda por dessecação, materiais
estranhos e cinzas totais.
As análises qualitativas iniciaram com a determinação do marcador químico,
essencial para avaliar a qualidade e autenticidade das matérias-primas vegetais
como, por exemplo, na identificação das plantas em preparações fitoterápicas ou
chás compostos por mais de uma espécie vegetal, como é o caso dos produtos
fitoterápicos combinando sene (
Sena Alexandrina Miller), funcho (Foeniculum
vulgare Miller) e erva-doce (Pimpinella anisum L.), com os dois sabugueiros
indistintamente. Entre as formas farmacêuticas encontradas para as flores de
Sambucus nigra estão, principalmente, cápsulas, pó e elixir, mais freqüentes no
mercado europeu, indicadas para auxiliar no aumento de imunidade em estados
173
gripais. No Brasil, flores das duas espécies são comercializadas na forma não
rasurada, isoladas ou em misturas para chás.
Para caracterização do marcador, diversas técnicas cromatográficas são
aplicadas para possibilitar e / ou auxiliar na sua identificação ou reconhecimento.
Atualmente, entre os procedimentos mais empregados estão a CCD, para análises
rápidas e auxiliares também na identificação de impurezas; e CLAE. Em geral, este
último método analítico está se tornando um método de escolha na análise de
plantas medicinais pela acessibilidade e uso que não é limitado pela estabilidade ou
volatilidade de compostos químicos e pela possibilidade de acoplar outros métodos
de análise que permitem pronta identificação do constituinte desejado (LIANG
et al.,
2004).
Auxiliando esta investigação encontram-se os relatos científicos que são
decisivos na identificação desta substância. Para a espécie
Sambucus nigra,
diversos autores citam, em análises cromatográficas, o flavonóide rutina como sendo
majoritário, presente também em
Sambucus australis e outros glicosídeos de
flavonóides e suas agliconas como principais constituintes para ambas.
A partir dessa informação o próximo passo para um efetivo controle de
qualidade das matérias-primas vegetais foi eleger o método mais adequado para
análise quantitativa. Técnicas de CLAE e, quando este equipamento não está ao
alcance dos laboratórios de análise, técnicas espectrofotométricas, determinando o
teor de um conjunto de substâncias são as mais freqüentemente preconizadas.
Optou-se então, pela quantificação por ambos métodos para possibilitar alternativas
de análises para estas espécies.
Na busca de métodos de CLAE que promovam separações adequadas dos
constituintes de interesse, alguns parâmetros podem ser variados para obter-se
sucesso na análise cromatográfica como diversos tipos de colunas, detectores e
solventes. Neste trabalho foi utilizada coluna cromatográfica em fase reversa com
partículas simétricas e de menor tamanho do que as mais utilizadas pelo motivo de
que, em análises preliminares, observou-se grande presença de glicosídeos de
174
flavonóides com comprimentos de onda máximos muito semelhantes quando
observados com o CLAE/DAD, podendo estes ficar sobrepostos, mascarando o
resultado. O uso desta coluna de melhor performance possibilitou uma melhor
separação dos constituintes que, em sua maioria modificava somente o tipo de
açúcar ligado ao C3 da estrutura principal. Acetonitrila, água ultrapura e TFA foram
selecionados para compor a fase móvel, em sistema gradiente linear para facilitar
também a separação dos constituintes durante a eluição.
Após a seleção dos parâmetros mais adequados, o método foi validado
conforme estabelecido por órgãos internacionais como o ICH (1996) e a
Farmacopéia Americana (USP, 2005) responsáveis pela normatização dos
parâmetros analíticos, necessários para registro de medicamentos, produtos de
origem vegetal e biológica. No Brasil a resolução RDC n. 899 (BRASIL, 2003)
regulamenta este procedimento. Cabe salientar que não são definidos legalmente
parâmetros para a validação de fitoterápicos ou matérias-primas vegetais. Então,
muitas vezes são levados em conta os limites estabelecidos para a validação de
amostras de origem biológica, que possuem faixas amplas para variação dos
resultados, já que os vegetais possuem matriz complexa.
Neste trabalho, para a análise cromatográfica dos constituintes químicos
presentes nas flores das duas plantas foi selecionado o mesmo método por elas
apresentarem perfís similares. Porém apesar de ser o mesmo, este foi duplamente
validado para garantir a confiabilidade nas análises quantitativas realizadas para o
marcador químico de cada espécie, identificado como o flavonóide glicosilado rutina.
O outro ensaio analítico proposto de utilidade para laboratórios ou pequenas
indústrias que realizam controle de qualidade destas matérias-primas vegetais, foi o
método de quantificação de flavonóides totais, expressando os resultados em teor
percentual de quercetina. Devido aos extratos serem constituídos por flavonóides,
em sua maioria
O-glicosilados, nesta técnica utilizou-se hidrólise ácida para
promover o rompimento da ligação glicosídica, facilitando a identificação
espectrofotométrica da aglicona formada, a quercetina.
175
Nas análises em CLAE, os resultados obtidos para as amostras analisadas
não demonstraram diferenças estatisticamente significativas, o que não ocorreu
quando utilizado o método espectrofotométrico. Este fato deveu-se provavelmente à
pouca especificidade e sensibilidade da técnica empregada, além de introduzir erros
de manipulação devido às várias etapas necessárias para a obtenção do resultado
final, não esquecendo também a variação intra e interespecífica de cada planta.
Também puderam ser observadas, com estas análises, a dificuldade no
estabelecimento de valores para a diferenciação destas espécies quanto ao seu
conteúdo flavonoídico por ambos os métodos empregados. Os valores mínimos
obtidos para as soluções extrativas elaboradas com flores da espécie nativa cruzam-
se com a faixa de valores obtidos para aquelas preparadas com flores da espécie
européia. Este fato pode estar relacionado com a origem das amostras, onde as
variações edafoclimáticas podem interferir nos resultados mesmo tratando-se de um
mesmo indivíduo.
Estas variações foram avaliadas para as flores de
Sambucus australis, para
as quais foram possíveis realizar comparações do teor do marcador químico, através
de análises cromatográficas, entre coletas de diferentes regiões, dentro de uma
mesma região e ainda, amostras com características botânicas diferenciadas. Em
quase todos os casos foram observadas apenas diferenças quantitativas entre os
constituintes químicos presentes. Em uma das plantas, coletada na região de Porto
Alegre, foi constatada a presença de um composto em maior quantidade que o
marcador rutina.
Aliado à identificação do marcador químico para análises quantitativas ou
apenas para diferenciação de espécies, está o estudo da sua estabilidade ou do
conjunto dos constituintes presentes nas plantas. A identificação dos produtos de
degradação surgidos são importantes pela possibilidade destes artefatos serem
tóxicos à saúde humana.
O estudo da estabilidade acelerada é utilizado por indústrias para o
estabelecimento do prazo de validade provisório para a aquisição do registro dos
176
seus produtos destinados a comercialização. Concomitantemente, devem ser
realizados estudos da estabilidade a longo prazo.
No ano de 2004 foi publicada pela ANVISA a resolução n. 398 (BRASIL,
2004b) referente realização de estudos de estabilidade, que revogou a resolução n.
560 de 2002 (BRASIL, 2002). As condições para a realização de estudos da
estabilidade acelerada nesta resolução revogada incluía como opção de ensaio a
realização dos testes a 50 ± 2 ºC / 90 ± 5% de umidade relativa no período de 3
meses. A nova resolução instituiu a necessidade da apresentação de resultados
referentes a 12 meses de estudo da estabilidade a longo prazo juntamente com os
da estabilidade acelerada e ainda definiu as condições citadas na resolução n. 560
como sendo técnica de estudo alternativa.
A condição utilizada no presente trabalho foi a indicada na resolução
revogada pelo fato dos testes já estarem ocorrendo no momento da publicação da
nova resolução. Os resultados demonstraram que houve a degradação de diversos
picos presentes nos cromatogramas para as duas espécies, sem surgimento de
algum componente na mesma proporção de redução de massa observada para a
rutina ou qualquer outro componente. O mesmo fato foi relatado por HEIGL &
FRANZ (2003) em trabalho utilizando amostras de diversas espécies, incluindo
Sambucus nigra. Em se tratando de matrizes complexas, como extratos vegetais, a
interação entre componentes pode ser um fator importante nos resultados obtidos
com este tipo de ensaio.
Também foi observado no ensaio da estabilidade acelerada, que a velocidade
de degradação para as duas plantas foi diferenciada num primeiro momento, sendo
mais suave para
Sambucus nigra. Esta ocorrência pôde ter sido devido ao método
de secagem do material utilizado, que não é conhecido,
bem como a data exata de
sua coleta e ainda a diversidade de constituintes que podem interagir no momento
da exposição do material às condições estabelecidas de temperatura e umidade.
Sendo assim, é correto afirmar que os estudos realizados para a espécie nativa,
onde todo o processo de manipulação da planta até o momento de disposição das
amostras na câmara climática foi controlado, é o de maior veracidade.
177
Neste estudo de estabilidade, após os 3 meses de exposição das amostras às
condições de temperatura e umidade explicitadas, os valores percentuais médios de
rutina encontrados no ponto 3 (60 dias) foram de 0,87% para
Sambucus nigra e
0,57% para a outra espécie. Estes resultados encontrados foram similares ao teor
de rutina determinados em algumas das amostras adquiridas ou coletadas. Este
dado, juntamente com a análise dos resultados apresentados pelas amostras
fornecidas pelo laboratório que datavam de 2001, armazenadas em condições não
controladas de temperatura e umidade, analisadas em 2003, podem indicar
estabilidade da rutina nas flores desta espécie.
Partindo-se destes resultados do estudo da estabilidade realizou-se a
determinação da cinética de reação de degradação do marcador químico na
tentativa de estabelecer o prazo de validade do material vegetal. Num primeiro
momento, na avaliação dos valores obtidos com a análise de
Sambucus nigra,
obteve-se reação de primeira ordem e, para
Sambucus australis, segunda ordem.
De acordo com NUDELMAN (1976), devem ser considerados nestes estudos,
valores superiores a 20% de degradação do marcador, para a determinação da
ordem da reação ser mais fidedigna. Assim, como os valores encontrados para os
primeiro 30 dias de exposição às condições 50°C e 90% U.R. das amostras de
Sambucus nigra foram inferiores, descartou-se este valor. Com isto, obteve-se uma
reação de degradação de segunda ordem.
Porém, mesmo com a determinação da constante de velocidade de reação e
o valor de t
90%
(valor em que a concentração da substância avaliada é 90% da
concentração inicial), para maior confiabilidade nos resultados visando a
determinação de um correto prazo de validade para uso destas matérias-primas,
maior número de amostras devem ser avaliadas. Igualmente é necessária a
realização de estudos em diferentes condições de temperatura e umidade
juntamente com estudos a longo prazo em condições controladas.
Estudos das atividades antiinflamatória
in vivo e antioxidante in vitro das flores
das espécies também puderam ser realizados.
178
A escolha entre testes farmacológicos
in vitro ou in vivo depende de inúmeros
fatores, sendo o principal critério o domínio do modelo experimental pelo
investigador e, naturalmente, do alvo a ser atingido. No entanto, os efeitos
observados nos testes realizados
in vitro com certa freqüência não são observados
nos estudos realizados
in vivo, devido a problemas de farmacocinética. Os testes in
vivo podem confirmar o uso popular das plantas quando o modelo experimental é
confiável e ainda podem fornecer informações preliminares a respeito dos efeitos
tóxicos das plantas (CALIXTO, 2001b).
Estudos etnofarmacológicos e referentes à constituição química das plantas
são de grande utilidade na seleção dos ensaios a serem realizados. Para os
sabugueiros, devido a constituição majoritária em compostos flavonoídicos, as
atividades antiinflamatória e antioxidante, extensivamente estudadas para estes
compostos, foram escolhidas.
A atividade antiinflamatória observada com o ensaio de inibição do edema em
pata de ratos induzida por carragenina, para extratos aquosos e hidroetanólicos das
flores de
Sambucus nigra e Sambucus australis apresentou potência equivalente ao
padrão indometacina. Este resultado não foi observado pelos autores MASCOLO e
colaboradores (1987), onde a atividade do extrato hidroetanólico das flores de
S.
nigra, utilizando o mesmo método de avaliação, foi aproximadamente metade do
valor obtido para o controle positivo. No entanto, para este relato não foi citada
claramente a forma de preparação do extrato utilizado. A dose selecionada para
avaliação desta atividade utilizando extratos aquosos e hidroetanólicos dos
sabugueiros foi baseada em suposições levantadas após análise minuciosa do
experimento realizado por MASCOLO e colaboradores (1987).
De acordo com a constituição química para as espécies, na sua maioria,
glicosídeos de flavonóides, a atividade antiinflamatória torna-se quase que evidente,
pois estes já foram estudados em outras plantas (HARBORNE & WILLIAMS, 2000)
ou isoladamente (SUYENAGA, 2002) apresentando efeito significativo.
179
Para o ensaio de atividade antioxidante realizado, os resultados encontrados
para as amostras de
Sambucus nigra e Sambucus australis foram bem distintos. Os
extratos hidroetanólicos apresentaram atividade mais pronunciada do que os
extratos aquosos, preparados em temperatura ambiente. Avaliação do teor de rutina
demonstrou maior percentual no extrato hidroetanólico, sendo, portanto, possível de
verificar que esta atividade pode estar diretamente relacionada com a presença de
flavonóides conforme já descrito para
S. nigra (DAWIDOVICZ et al., 2005).
A atividade antioxidante mais pronunciada para a espécie
Sambucus australis
pode ser atribuída ao fato desta possuir maior quantidade de flavonóides
glicosilados do que a outra espécie. Também pode ser salientada a presença de
glicosídeos de canferol nestes extratos onde, segundo AMIC e colaboradores (2005)
sua aglicona demonstrou ser mais efetiva como seqüestrante de radicais livres, que
os derivados quercetínicos estudados.
Assim, este trabalho contribuiu para a confirmação do uso popular das flores
das espécies como antiinflamatórias e antioxidantes. Sua validade também pode ser
verificada comparando com relatos apresentados para a atividade antiinflamatória
por MASCOLO e colaboradores (1987) e mais recentemente, para a ação
antioxidante por DAWIDOWICZ e colaboradores (2005), para
Sambucus nigra.
O conjunto de resultados botânicos e químicos forneceu o aporte necessário
para o estabelecimento de parâmetros farmacopéicos para a garantia da qualidade
de flores de
Sambucus nigra e Sambucus australis, bem como permitiu realizar
avaliação preliminar para a determinação do prazo de validade através do estudo da
estabilidade acelerada.
Estes resultados representam uma contribuição para o conhecimento de
matérias-primas para produção de fitomedicamentos com qualidade, os quais são
escassos na literatura em especial, no que se refere a estudos de estabilidade. Pelo
estudo comparativo foi possível verificar a similitude entre as espécies o que poderia
indicar o uso comercial do vegetal nacional, implicando na redução de custos de
importação.
180
181
CONCLUSÕES
182
183
9 Descrição e análise botânica:
• As principais diferenças macroscópicas encontradas nas 18 amostras
frescas de
Sambucus australis coletadas nas cidades de Caxias do
Sul, Porto Alegre, Santa Maria, Veranópolis e Praia da Guarda do
Embaú / Palhoça / SC e Viamão, e 13 amostras de
Sambucus nigra
adquiridas no comércio e/ou fornecidas pelo laboratório de
Farmacognosia desta Faculdade, foram o número de lóculos no ovário,
três para as flores de
Sambucus nigra e cinco para Sambucus
australis; e o tamanho do filete dos estames, diferenciado em amostras
de flores de
Sambucus australis;
• As principais diferenças microscópicas encontradas foram: presença
de idioblastos cristalíferos em brácteas, sépalas e pétalas, endoderme
do pedicelo, dentes marginais e paredes das células fundamentais
retilíneas na epiderme das sépalas nas flores de
Sambucus nigra;
• Pedicelos grosseiros e flores acastanhadas foram identificados como
contaminantes em ambas espécies.
9 Quanto à avaliação química quali e quantitativa:
• O teor de perda por dessecação utilizando termobalança com
infravermelho foi de 11,68% e 10,90% para
Sambucus nigra e
Sambucus australis, respectivamente;
• O conteúdo de materiais estranhos encontrado respeitou os limites
indicados pela Farmacopéia Européia, bem como o teor de cinzas
totais;
• O flavonóide rutina foi identificado como marcador químico para as
duas espécies de
Sambucus estudadas;
184
• O método desenvolvido utilizando a cromatografia líquida de alta
eficiência foi validado, demonstrando ser linear, sensível, específico,
preciso, exato e robusto para análise quantitativa de rutina em
soluções extrativas hidroetanólicos de flores de
Sambucus nigra e
Sambucus australis;
• A avaliação do teor de rutina verificada por CLAE apresentou médias
de 1,04% e 1,20 % para
Sambucus nigra e Sambucus australis,
respectivamente, e o teor de flavonóides totais, pelo método de
espectrofotometria, com hidrólise ácida, apresentou valores médios de
quercetina de 1,66% e 2,31% para
Sambucus nigra e Sambucus
australis
;
• O estudo preliminar de estabilidade acelerada demonstrou uma
degradação no teor de rutina de 27% e 57% para as flores de
Sambucus nigra e Sambucus australis, respectivamente, após o
período de três meses;
• Sugere-se a segunda ordem para a cinética da reação de degradação
dos teores de rutina para as duas espécies.
9 Quanto à avaliação biológica:
• Os extratos aquosos e hidroetanólicos de
Sambucus nigra e Sambucus
australis
apresentaram significativa atividade antiinflamatória in vivo;
• Os extratos aquosos e hidroetanólicos de
Sambucus australis
apresentaram atividade mais pronunciada que os mesmos extratos de
Sambucus nigra.
9 Sugere-se a elaboração de uma monografia para cada espécie para a
inclusão na Farmacopéia Brasileira
185
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Da UFRGS / Ed. Da UFSC, 2002. 833 p.
199
ANEXOS
200
201
CAPÍTULO 1
Tabela A1 Diferenças macroscópicas detectadas na análise das flores de Sambucus
australis Cham. & Schltdl. e Sambucus nigra L.
Estruturas Caracteres Sambucus australis Sambucus nigra
diâmetro 7,0 a 10,1 mm 3,0 a 5,0 mm
quanto ao sexo
funcionalmente unissexuais
(pistiladas, com estames
curtos ou estaminadas, com
estames longos)
monoclinas
FLORES
botões florais 1,0 a 3,0 mm de diâmetro 1,5 mm a 3,0 mm de diâmetro
distribuição dos
tricomas tectores
e glandulares
porção basal da face adaxial
tectores: distribuídos por toda
a lâmina, mais comumente na
margem e na base da face
adaxial
glandulares: mais abundantes
na base da face adaxial
medida
0,5 a 0,6 mm de largura e 0,9
a 2,8 mm de comprimento
0,5 mm de largura e 0,6 a 1,5
mm de comprimento
forma triangulares ou elípticas
triangulares, oblongas,
ovaladas a elípticas, laminares
BRÁCTEAS
ápice proeminência apical presente proeminência apical ausente
coloração amarelo-esverdeadas
esbranquiçado-amareladas,
esverdeadas ou
amarronzadas
forma triangular-ovaladas triangulares
medidas
1,0 a 1,5 mm de comprimento
e 1,0 mm de largura na porção
basal
0,5 a 1,0 mm de comprimento
e 0,5 a 0,7 mm de largura na
porção basal
dentes marginais ausentes presentes
SÉPALAS
distribuição dos
tricomas tectores
e glandulares
ocorrem na porção basal da
face adaxial
tectores: na margem e na
base da face adaxial
glandulares: na base da face
adaxial
PÉTALAS medidas
2,5 a 5,0 mm de comprimento
e 1,5 a 3,0 mm de largura
2,0 a 3,5 mm de comprimento
e 2,0 a 3,0 mm de largura
comprimento dos
estames
curtos ou longos longos
deiscência das
anteras
deiscentes nas flores
estaminadas e indeiscentes
nas flores pistiladas
deiscentes
ANDROCEU
comprimento dos
filetes
flores pistiladas - 1,0 a 2,0 mm
flores estaminadas - 3,0 a 4,0
mm
1,0 a 1,5 mm
número de lóbulos
no estigma
pentalobado trilobado
GINECEU
número de
carpelos e lóculos
no ovário
pentacarpelar ou tetracarpelar,
raro tricarpelar, pentalocular
ou tetralocular, raro trilocular
tricarpelar, raro tetracarpelar,
trilocular, raro tetralocular
PEDICELOS medida 1,0 a 6,0 mm de comprimento 1,0 a 7,0 mm de comprimento
202
Tabela A2. Diferenças microscópicas detectadas na análise das flores de Sambucus
australis Cham. & Schltdl. e Sambucus nigra L.
Estruturas Caracteres
Sambucus australis Sambucus nigra
forma das
células
fundamentais
da epiderme
(secção
transversal)
poligonal
alongadas, de diferentes
formas
distribuição
dos tricomas
tectores e
glandulares
porção basal da face adaxial
principalmente na base da
face adaxial e na porção basal
marginal
classificação
quanto aos
estômatos
anfiestomáticas hipoestomáticas
vista frontal
dos bordos
células tabulares mais
alongadas com paredes
retilíneas
células mais alongadas com
paredes retilíneas
organização do
sistema
vascular
um a quatro feixes vasculares
ou agrupamentos xilemáticos.
Quando apenas um, localiza-
se na região da nervura
principal, podendo ser
constituído por
subagrupamentos
geralmente composto por um
único agrupamento xilemático
BRÁCTEAS
idioblastos
cristalíferos
ausentes raros
gotas lipídicas grande quantidade quantidade normal
RECEPTÁCULO
tricomas
gandulares ocorrem na região
de inserção da bráctea.
tectores e glandulares
ocorrem na região de inserção
da bráctea.
forma das
células
fundamentais
da epiderme
face abaxial: alongadas e
possuem forma irregular
face adaxial: retangular
tabular
paredes das
células
fundamentais
da epiderme
sinuosas em ambas as faces,
espessas e com visíveis
pontoações
face adaxial: retilíneas
face abaxial: retilíneas a
sinuosas
distribuição
dos tricomas
tectores e
glandulares
ocorrem na porção basal da
face adaxial; os glandulares
são abundantes
ocorrem nas regiões basais de
ambas as faces, com maior
densidade na face adaxial; os
tectores ocorrem também na
região da margem e são
comumente encontrados na
porção basal entre as sépalas
espessura da
cutícula
mais espessa na face abaxial
espessa principalmente na
região dos bordos
SÉPALAS
estômatos hipoestomático anfihipoestomático
203
Continuação...
Estruturas Caracteres
Sambucus australis Sambucus nigra
idioblatos
cristalíferos
ausentes
idioblastos de areia cristalina,
de oxalato de cálcio, de
aspecto enegrecido e sem
forma definida, são visíveis
em ambas as faces
SÉPALAS
mesofilo
duas a sete camadas de
células parenquimáticas.
até cinco camadas de células
parenquimáticas.
número de
nervuras
geralmente cinco, raro quatro
paralelas;
três, raro quatro paralelas;
distribuição
dos tricomas
tectores e principalmente
glandulares na porção basal
da face adaxial;
na porção basal de ambas as
faces ocorrem tricomas
tectores e glandulares de
diferentes formas, sendo que
a maior densidade é verificada
na face adaxial;
estriação
cuticular (vista
frontal)
face adaxial: intensamente
estriada
face abaxial: menos estriada
face adaxial: menos estriada
face abaxial: mais estriada
idioblastos
cristalíferos
ausentes presentes
mesofilo
até doze camadas de
clorênquima
até dez camadas clorênquima
PÉTALAS
sistema
vascular
pode ocorrer um feixe
vascular de maior
desenvolvimento na região da
nervura principal.
feixes vasculares colaterais
igualmente desenvolvidos.
ANDROCEU
diâmetro dos
grãos de pólen
18 μm a 34 μm 15 μm a 25 μm
GINECEU
número de
lóculos
cinco, quatro ou raro três três ou raro quatro
colênquima uma camada uma a seis camadas
endoderme ausente presente
sistema
vascular
até doze feixes vasculares;
não apresenta fibras
calibrosas na porção externa
do floema; câmbio
interfascicular ausente;
estágio de desenvolvimento
secundário ausente;
até dezesseis feixes
vasculares; podem ocorrer
fibras calibrosas na porção
externa do floema; câmbio
interfascicular pode estar
presente; estágio de
desenvolvimento secundário
pode estar presente;
PEDICELOS
gotas lipídicas em todos os tecidos.
na epiderme e no parênquima
cortical.
204
CAPÍTULO 2
Tabela B1 Teor de umidade, flavonóides totais e rutina obtido com o ensaio de perda por
dessecação para as amostras de Sambucus nigra e Sambucus australis.
Espécie Amostras Umidade Relativa (%)
Teor de
Flavonóides Totais
(%)
Teor de Rutina (%)
1
1
13,85 1,67 0,96
2
1
13,79 2,31 0,89
3
1
10,33 1,67 0,81
4
2
10,73 1,91 0,63
5
3
9,95 2,92 1,67
6
3
10,30 2,47 1,52
7
3
10,05 1,46 0,84
8
3
10,25 2,57 2,18
9
3
9,90 2,69 1,42
10
3.1
10,65 2,72 1,33
11
3.1
10,64 2,35 1,70
12
3.1
9,94 - 1,08
13
3.1
9,50 - 0,90
14
4
11,57 3,30 1,58
15
4
11,39 2,32 1,0
16
5
9,74 2,57 0,64
17
5
13,17 1,75 1,48
18
6
10,52 - 0,99
S
a
m
b
u
c
u
s
a
u
s
t
r
a
l
i
s
19
11,43 1,79 1,03
20
12,02 1,74 1,05
21
12,23 1,46 1,02
22
11,65 1,37 0,79
23
12,54 1,63 1,31
24
12,49 1,41 0,93
25
13,38 1,95 1,30
26
10,37 1,72 1,18
27
10,73 1,87 0,78
28
11,34 2,51 1,64
29
10,63 0,99 0,72
30
9,63 1,69 0,68
S
a
m
b
u
c
u
s
n
i
g
r
a
31
12,05 1,52 1,09
1
Amostras coletadas em Viamão.
2
Amostra coletadas em Porto Alegre.
3
Amostras coletadas em Caxias do Sul (Cidade).
3.1
Amostras coletadas em Caxias do Sul (Interior).
4
Amostras coletadas em Veranópolis.
5
Amostras coletadas em Santa Maria.
6
Amostra coletada em Santa Catarina / Praia da Guarda do Embaú.
205
Tabela B2 Áreas absolutas relativas a curva de calibração de rutina realizada no dia 1.
Concentração de rutina (μg/ml)
10 15 20 25 30 35 40 45
ÁREAS
ABSOLUTAS*
245117 374182,3 497678,3 625952,3 753156 872581 998550,3 1117387
DPR (%)
0,27 0,77 0,06 0,15 0,94 0,32 0,93 0,1
*Média de três determinações.
Tabela B3 Áreas absolutas relativas a curva de calibração de rutina realizada no dia 2.
Concentração de rutina (μg/ml)
10 15 20 25 30 35 40 45
ÁREAS
ABSOLUTAS*
235117 378088,7 501676,7 628406,3 753422,7 877187 999633 1144302
DPR (%)
0,67 0,11 0,22 0,09 0,53 0,17 0,11 1,57
*Média de três determinações.
Tabela B4 Áreas absolutas relativas a curva de calibração de rutina realizada no dia 3.
Concentração de rutina (μg/ml)
10 15 20 25 30 35 40 45
ÁREAS
ABSOLUTAS*
246588 372591,3 497941 623880 754828,3 866731 993264,3 1106550
DPR (%)
0,76 0,13 0,31 0,079 0,098 0,086 0,24 0,63
*Média de três determinações.
206
207
Figura B1 Amostra 1 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Viamão,
coletada no ano de 2003.
Figura B2 Amostra 2 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Viamão,
coletada no ano de 2003.
Figura B3 Amostra 3 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Viamão,
coletada no ano de 2003.
208
209
Figura B4 Amostra 4 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Porto Alegre,
coletada no ano de 2003.
Figura B5 Amostra 5 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Caxias do Sul
(Centro), coletada no ano de 2003.
Figura B6 Amostra 6 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Caxias do Sul
(Centro), coletada no ano de 2003.
210
211
Figura B7 Amostra 7 (Sambucus australis Cham. & Schltdl). Procedente de Caxias do Sul
(Centro), coletada no ano de 2003.
Figura B8 Amostra 8 (Sambucus australis Cham. & Schltdl). Procedente de Caxias do Sul
(Centro), coletada no ano de 2003.
Figura B9 Amostra 9 (Sambucus australis Cham. & Schltdl). Procedente de Caxias do Sul
(Centro), coletada no ano de 2003.
212
213
Figura B10 Amostra 10 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Caxias do Sul
(Centro), coletada no ano de 2003.
Figura B11 Amostra 11 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Caxias do Sul
(Interior), coletada no ano de 2003.
Figura B12 Amostra 12 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Caxias do Sul
(Interior), coletada no ano de 2004.
214
215
Figura B13 Amostra 13 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Caxias do Sul
(Interior), coletada no ano de 2004.
Figura B14 Amostra 14 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Veranópolis,
coletada no ano de 2003.
Figura B15 Amostra 15 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Veranópolis,
coletada no ano de 2004.
216
217
Figura B16 Amostra 16 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Santa Maria,
coletada no ano de 2004.
Figura B17 Amostra 17 (Sambucus australis Cham. & Schltdl) Procedente de Santa Maria,
coletada no ano de 2004.
Figura B18 Amostra 18 (Sambucus australis Cham. & Schltdl.) Procedente de Guarda do
Embaú / Santa Catarina, coletada no ano de 2005.
218
219
Figura B19 Amostra 19 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura 20 Amostra 20 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura B21 Amostra 21 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
220
221
Figura B22 Amostra 22 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura B23 Amostra 23 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura B24 Amostra 24 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
222
223
Figura B25 Amostra 25 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura B26 Amostra 26 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura B27 Amostra 27 - Sambucus nigra L., adquirida comercialmente.
224
225
Figura B28 Amostra 28 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
Figura B29 Amostra 29 - Sambucus nigra L., adquirida comercialmente.
Figura B30 Amostra 30 - Sambucus nigra L., adquirida comercialmente.
226
227
Figura B31 Amostra 31 - Sambucus nigra L., fornecida pelo Laboratório de Farmacognosia /
UFRGS.
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