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Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Caracterização genotípica de cepas da família
Enterobacteriaceae produtoras de β-lactamases de
espectro estendido, isoladas de pacientes de um
hospital da rede pública da cidade de São Paulo
Milena Dropa
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde Pública para obtenção do
título de Mestre em Saúde Pública.
Área de concentração: Serviços de Saúde
Pública.
Orientadora: Profª Associada Maria Helena Matté
São Paulo
2006
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Caracterização genotípica de cepas da família
Enterobacteriaceae produtoras de β-lactamases de
espectro estendido, isoladas de pacientes de um
hospital da rede pública da cidade de São Paulo
Milena Dropa
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde Pública da Faculdade de
Saúde Pública da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Saúde Pública.
Área de concentração: Serviços de Saúde
Pública.
Orientadora: Profª Associada Maria Helena Matté
São Paulo
2006
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É expressamente proibida a comercialização deste documento tanto na sua forma
impressa como eletrônica. Sua reprodução total ou parcial é permitida
exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, desde que na reprodução figure a
identificação do autor, título, instituição e ano da dissertação.
Dedicatória
À minha família, Paizinho, Mãezinha, Mô, Nina e Frê, sem vocês não
teria chegado até aqui.
Agradecimentos
A Deus, por toda a proteção e luz em meu caminho.
Aos meus pais, pelo amor, pela proteção, e por sempre
acreditarem que não perdemos o que investimos em conhecimento.
Às minhas irmãs, Mônica e Marina... “One who has a sister will
never be left alone in life”, e ao Fred, meu irmão de coração, obrigada
por tudo, amo vocês!
À toda minha família, por sempre acreditar que eu posso e
consigo;
À Tia Rose, por me acolher no início dessa jornada no “planeta
São Paulo”, por todo o amor, dedicação e arroz com feijão!
À Professora Maria Helena Matté, por apostar neste trabalho, pela
confiança, amizade e carinho, obrigada, “Mamuska”!
Ao Professor Glavur Rogério Matté, pelo incentivo e pela aposta
em minha carreira.
À equipe da CCIH do HU-USP, em especial ao Dr. Fábio Franco,
pelo convite, e à Dra. Valéria Cassettari Chiaratto, por todo o suporte e
sugestões durante a realização deste trabalho.
À Professora Elsa Masae Mamizuka e ao Dr. Nilton Lincopan, da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, pelos ensinamentos, dicas
e material que enriqueceram esta pesquisa.
À equipe do Laboratório de Microbiologia Clínica do HU-USP,
especialmente à Stella, Angélica, Fátima, Neide e Henriqueta, obrigada
pela paciência, pelos ensinamentos e pela amizade.
Às alunas de aprimoramento do Laboratório de Prática de Saúde
Pública da FSP-USP, Martha, Lívia e Lícia, que acompanharam e
contribuíram para que o trabalho fosse realizado.
Ao Centro Colaborador em Vigilância Sanitária (CECOVISA),
pelo patrocínio deste projeto.
Aos meus amigos...
...Rosinha, pelo “empurrãozinho” na hora de decidir entrar nesta
batalha;
...Tiago, pela amizade, carinho e “conversas farmacêuticas”;
...Fernanda, pelo “empurrãozinho”, pelas conversas, pelas
gargalhadas, pelas lágrimas, enfim, por tudo que aprendemos juntas nos
últimos anos;
...Shamyr, pelo apoio e amizade nestes quase três anos de
coleguismo;
...Vandréa, por sempre fazer de todos os momentos uma alegria,
uma festa, e por todos os papos nas madrugadas e no café da manhã;
...Martha (Marthuxa), por sempre saber ouvir, entender e respeitar,
pela confiança e dedicação, pelo carinho, e por todos os momentos
alegres e tristes que compartilhamos e nos fizeram fortes;
...Solange, pela amizade e confiança nestes anos todos de FSP;
...Viraneide, especialmente por estar sempre perto, mesmo que tão
longe;
...Regina e Celita, pelo orgulho que sentem por eu ter chegado até
aqui;
...Ronalda, por ser companheira e amiga, e pelas divertidas
“conversas de copa”;
...Lívia (Pixunguinha), pela ajuda essencial no laboratório durante
este trabalho, e pela amizade tão sincera e divertida;
...José Eduardo (Maestro), que já tendo passado por tudo isso, me
entende e incentiva muito. Obrigada por ter se tornado este amigo
especial.
...Ao King, pelo companheirismo e fidelidade, e por toda a alegria
que trouxe à minha vida;
...Ao Sérgio e à Luna, pelas caminhadas, conversas, apoio e
carinho durante esta jornada;
...e a todos os amigos que de alguma forma, em algum momento,
me trouxeram momentos felizes.
Muito Obrigada!
2000 A.C. – Agora, coma esta raiz
· 1000 D.C. – Aquela raiz é pagã. Agora, diga esta oração.
· 1850 D.C. – Aquela oração é superstição. Agora, beba esta poção.
· 1920 D.C. – Aquela poção é óleo de serpente. Agora, tome esta pílula.
· 1945 D.C. – Aquela pílula é ineficaz. Agora, leve esta penicilina.
· 1955 D.C. – "Oops"... os micróbios mudaram. Agora, leve este tetraciclina.
· 1960-1999 – 39 mais "oops" ... Agora, leve este antibiótico mais poderoso.
· 2000 D.C. – Os bichos ganharam! Agora, coma esta raiz...
Anônimo
"A resistência antibiótica é um fenômeno, em si
mesmo, não surpreendente. Nem é novo. Porém, está
preocupando porque recentemente está se acumulando
em grande velocidade, enquanto as ferramentas do
mundo para o seu controle diminuem em poder e
número."
Joshua Lederberg, vencedor do Prêmio Nobel
RESUMO
Dropa M. Caracterização genotípica de cepas da família Enterobacteriaceae
produtoras de β-lactamases de espectro estendido, isoladas de pacientes de um
hospital da rede pública da cidade de São Paulo [dissertação de mestrado]. São
Paulo: Faculdade de Saúde Pública da USP; 2006.
Introdução - A crescente resistência antimicrobiana em bactérias responsáveis por
infecções hospitalares é um grande desafio à Saúde Pública. As β-lactamases de
espectro estendido (ESBL), que hidrolisam a maioria dos compostos β-lactâmicos,
são reconhecidas mundialmente como um grande problema para pacientes
hospitalizados, devido à localização de seus genes em elementos transferíveis,
facilitando sua disseminação. Objetivo - Caracterizar geneticamente cepas de
Enterobactérias produtoras de ESBL isoladas de pacientes de um hospital público da
cidade de São Paulo. Material e Métodos - Todas as cepas de enterobactérias
produtoras de ESBL isoladas em um ano foram submetidas a análises moleculares
pela PCR, com iniciadores específicos para oito genes bla, e as cepas de Klebsiella
pneumoniae ESBL positivas (ESBL-Kp) identificadas nesse período foram
comparadas pela técnica de PFGE. Resultados - Os genes, bla
TEM
, bla
SHV
, bla
CTX-M
,
bla
PER-2
bla
VEB
and bla
GES
foram identificados em 9 espécies: Klebsiella pneumoniae
(71,5%), Escherichia coli (13,5%), Morganella morganii (6%), Proteus mirabilis
(3%), Klebsiella oxytoca (1,5%), Providencia rettgeri (1,5%), Providencia stuartii
(1,5%), Enterobacter aerogenes (0,75%) and Enterobacter cloacae (0,75%). Os
genes bla
PER-1
e bla
OXA
não foram detectados. O PFGE revelou 8 perfis moleculares
principais em 68,4% das ESBL-Kp, e 31,6% das cepas não estavam relacionadas.
Conclusões – Os resultados de PCR revelaram uma grande variedade de grupos de
ESBL, e aparentemente este é o primeiro relato de grupos GES e VEB em
enterobactérias no Brasil. Os resultados sugerem a disseminação de genes de
resistência em cepas diferentes de ESBL-Kp em alguns setores do hospital, e que
alguns clones fortemente relacionados colonizaram pacientes do Berçário por 3
meses.
Descritores: Saúde Pública; Vigilância Sanitária; Infecção Hospitalar; Resistência a
antimicrobianos; β-lactamases de espectro estendido (ESBL); Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR); Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE).
ABSTRACT
Dropa M. Genotypic characterization of Extended-Spectrum β-lactamase-producing
Enterobacteriaceae strains, isolated from patients of a public hospital in the city of
São Paulo [dissertation]. São Paulo (BR): Faculdade de Saúde Pública da
Universidade de São Paulo; 2006.
Introduction - The increasing antimicrobial resistance in pathogenic bacteria
causing nosocomial infections is a major public health challenge. The extended-
spectrum β-lactamases (ESBL), which hydrolyze most of β-lactams, are recognized
worldwide as a great problem to hospitalized patients, due to the transferable location
of their genes, which facilitates their spreading. Objective - Genetically characterize
ESBL-producing Enterobacteriaceae strains isolated from patients of a Public
Hospital in the city of São Paulo. Material and Methods - All Enterobacteriaceae
ESBL-producing strains isolated in an 1-year period were submitted to molecular
analysis by PCR with specific primers for eight bla genes, and all ESBL Klebsiella
pneumoniae (ESBL-Kp) identified in this period were compared by the PFGE
technique. Results - Genes bla
TEM
, bla
SHV
, bla
CTX-M
, bla
PER-2
, bla
VEB
and bla
GES
were
identified in 9 species: Klebsiella pneumoniae (71,5%), Escherichia coli (13,5%),
Morganella morganii (6%), Proteus mirabilis (3%), Klebsiella oxytoca (1,5%),
Providencia rettgeri (1,5%), Providencia stuartii (1,5%), Enterobacter aerogenes
(0,75%) and Enterobacter cloacae (0,75%). Genes bla
PER-1
and bla
OXA
were not
detected in any strain. PFGE revealed 8 distinct main molecular patterns in 68,4% of
ESBL-Kp, and 31,6% of the strains were totally unrelated. Conclusions - PCR
results showed a great variety of ESBL groups in the institution, and apparently this
is the first report of GES- and VEB-ESBL groups in enterobacteria in Brazil. The
results suggest the spread of resistance genes in different strains of ESBL-Kp in some
hospital wards, and also that some strongly related clones of these bacteria colonized
patients from a neonatal ward in a 3-month period.
Descriptors: Public Health; Sanitary Surveillance; Nosocomial Infection;
Antimicrobial Infection; Extended-Spectrum β-lactamases (ESBL); Polimerase
Chain Reaction (PCR); Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE).
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... 1
1.1. Considerações Gerais............................................................................................ 1
1.1.1. Infecção Hospitalar.......................................................................................... 1
1.1.2. Resistência a Antimicrobianos.......................................................................... 5
1.1.3. Antimicrobianos β-Lactâmicos.......................................................................... 11
1.1.4. Enzimas β-Lactamases....................................................................................... 15
2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 21
2.1. Beta-Lactamases de Espectro Estendido (ESBL)................................................. 21
2.1.1. Definição e Histórico......................................................................................... 21
2.1.2. Principais espécies produtoras de ESBL........................................................... 22
2.1.3. Classificação...................................................................................................... 24
2.1.4. Hidrólise de Antimicrobianos............................................................................ 33
2.1.5. Detecção e Identificação................................................................................... 35
2.2. ESBL e Infecção Hospitalar................................................................................. 36
2.3. Colonizações, Surtos e Infecções......................................................................... 37
3. OBJETIVOS.......................................................................................................... 42
3.1. Objetivo Geral...................................................................................................... 42
3.2. Objetivos Específicos........................................................................................... 42
4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 43
4.1. Cepas Bacterianas................................................................................................. 43
4.2. Determinação da Produção de ESBL................................................................... 44
4.3. Extração de DNA total.......................................................................................... 45
4.4. Identifcação dos grupos de ESBL pela Reação em Cadeia de Polimerase........... 46
4.5. Comparação genética entre as cepas de Klebsiella pneumoniae por
Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE).................................................................... 49
4.5.1. Preparo do Plug................................................................................................ 49
4.5.2. Extração de DNA Genômico............................................................................. 50
4.5.3. Digestão Enzimática.......................................................................................... 50
4.5.4. Eletroforese em Campo Pulsado....................................................................... 51
4.5.5. Visualização....................................................................................................... 51
4.6. Análise dos Resultados......................................................................................... 52
4.6.1. PCR.................................................................................................................... 52
4.6.2. PFGE................................................................................................................. 52
5. RESULTADOS...................................................................................................... 53
5.1. Cepas Bacterianas................................................................................................. 53
5.2. Identificação dos Grupos de ESBL pela PCR...................................................... 55
5.3. Comparação Genética entre as cepas de Klebsiella pneumoniae por PFGE........ 59
6. DISCUSSÃO.......................................................................................................... 71
6.1. Espécies produtoras de ESBL............................................................................... 71
6.2. Determinação dos Grupos de ESBL pela PCR..................................................... 72
6.3. Análise dos Perfis Moleculares de Klebsiella pneumoniae.................................. 76
7. CONCLUSÕES...................................................................................................... 84
8. BIBLIOGRAFIA................................................................................................... 85
Lista de Quadros
Quadro 1 - Principais Grupos de Antimicrobianos.......................................................
10
Quadro 2 - Principais grupos de β-lactâmicos.............................................................. 12
Quadro 3 - Esquema de Classificação para β-lactamases............................................. 19
Quadro 4 – Seqüência de iniciadores para a detecção dos genes bla........................... 48
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Número e porcentagem de espécies da família Enterobacteraceae
produtoras de ESBL nos setores do hospital, Julho/2004 a Junho/2005........................ 54
Tabela 2 - Distribuição em número e porcentagem de cepas contendo genes bla para
grupos de ESBL, Julho/2004 a Junho/2005................................................................... 58
Tabela 3 - Distribuição em número e porcentagem de cepas de K. pneumoniae e
respectivos perfis moleculares por setor do hospital, de Julho/2004 a Junho/2005....... 62
Lista de Figuras
Figura 1 – Anel β-lactâmico....................................................................................... 11
Figura 2 – Estrutura molecular das β-lactamases....................................................... 15
Figura 3 - Método da combinação de discos ............................................................. 45
Figura 4 - Exemplos da detecção de genes bla em algumas espécies da família
Enterobacteriaceae...................................................................................................... 57
Figura 5 – Representação gráfica da matriz de similaridade de Dice, dos perfis
obtidos por meio de PFGE em cepas de K. pneumoniae produtoras de ESBL
isoladas na instituição, no período de Julho de 2004 a Junho de 2005....................... 60
Figura 6 – PFGE – exemplos de cepas de K. pneumoniae apresentando perfis
distintos........................................................................................................................
60
Figura 7 - Representação gráfica da matriz de similaridade de Dice, dos perfis
obtidos por meio de PFGE em cepas de K. pneumoniae produtoras de ESBL
isoladas no Berçário do hospital, no período de Agosto de 2004 a Fevereiro de
2005..............................................................................................................................
61
Figura 8a – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares
observados no hospital, de 20-26 de Junho (semana 1) a 25-31 de dezembro
(semana 28) de 2004..................................................................................................... 64
Figura 8b – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares
observados no hospital, de 1-7 de janeiro (semana 29) a 24-30 de junho (semana
54) de 2005................................................................................................................... 64
Figura 9 – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares observados
no Berçário do hospital, de 31/7-6/8 de 2004 (semana 7) a 5-11/2 de 2005 (semana
35)................................................................................................................................. 65
Figura 10a - Representação gráfica da distribuição de cepas de ESBL-Kp isoladas
em pacientes do Berçário no período do surto, provenientes de infecções, de 31/7-
6/8 (semana 7) a 20-26/9 de 2004 (semana 23)............................................................ 66
Figura 10b - Representação gráfica da distribuição de cepas de ESBL-Kp
colonizadoras, isoladas em pacientes do Berçário no período do surto, provenientes
de culturas de vigilância, de 20-26/11 (semana 20) a 12-18/12 (semana 35) de 2004. 67
Figura 11 – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares PF 1, PF
4 e PF 1-4 no hospital, de 20-26 de junho de 2004 (semana 1) a 5-11 de fevereiro
de 2005 (semana 33).....................................................................................................
69
Figura 12 – Representação gráfica da distribuição dos Perfis PF 3, PF 5 e PF 3-5
de cepas de K. pneumoniae no hospital, de 25-31 de dezembro (semana 28) a 12-18
de Fevereiro de 2005 (semana 34)................................................................................ 70
Figura 13 - Representação gráfica da distribuição dos Perfis PF 7, PF 8 e PF 7-8 de
cepas de K. pneumoniae no hospital, 20-26 de junho (semana 1) a 18-24 de
dezembro (semana 25) de 2004.................................................................................... 70
Introdução
_________________________________________________________________
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
1.1.1 Infecção Hospitalar
Infecção hospitalar é, por definição, uma reação adversa, local ou sistêmica,
que pode se expressar no curso da internação ou no pós-alta, desencadeada pela
presença de um agente infeccioso e/ou sua toxina. Deve ser adquirida após a
internação e relacionada a procedimentos diagnósticos ou terapêuticos, sem
evidências de que esteja presente, ou em incubação, no momento da admissão
hospitalar (BRASIL 1998).
As infecções hospitalares contribuem para maiores índices de morbidade e
mortalidade, tempos de internação prolongados, custos altos, e principalmente
trazem a ameaça constante de disseminação de bactérias multi-resistentes (FAR et al.
2001).
Não há dados consistentes sobre a incidência de infecção hospitalar no Brasil.
Em 1994, segundo estudo realizado pelo Ministério da Saúde, este índice era de
15,5% entre os pacientes internados. Esta porcentagem de acordo com a média aceita
pela Organização Mundial da Saúde, que varia entre 9% e 20%, porém muito acima
da média mundial de índice de infecção hospitalar em países desenvolvidos, que é de
5 a 10%. Em países em desenvolvimento, esta média pode ser de até 25% (OPAS
2000; OMS 2004).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) promove campanhas
e programas para que o Brasil conheça e mude a realidade atual de seus hospitais.
Introdução
_________________________________________________________________
2
Comissões de Controle de Infecções Hospitalares (CCIH) estão atualmente
interligadas às vigilâncias sanitárias municipais e estaduais, por meio do Sistema
Nacional de Informação para o Controle de Infecções em Serviços de Saúde
(SINAIS), para que forneçam dados que gerem indicadores sobre infecção hospitalar,
porém, segundo a própria ANVISA, apenas 38% dos hospitais do país possuem
CCIH atuantes, o que constitui mais um desafio para a agência (ANVISA 2001;
ANVISA 2002).
A criação e estruturação das CCIH no Brasil tornou-se obrigatória pela
portaria 196/83 do Ministério da Saúde, a qual foi substituída pela Portaria 930, de
agosto de 1992 e, posteriormente, pela Portaria 2616 em maio de 1998. Após a
passagem da competência das atividades para a ANVISA em 1999, iniciou-se o
Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar (PNCIH), em 2000. Os
serviços foram estruturados para que os profissionais da CCIH formada realizassem
vigilância epidemiológica das infecções relacionadas à assistência à saúde (ANVISA
2000; Brasil 1997; BRASIL 1998).
Baseada em informações clínicas, microbiológicas e epidemiológicas, como
microrganismos prevalentes, mecanismos de resistência, distribuição pelos setores do
hospital, principais antibióticos prescritos, e dados de epidemiologia molecular, a
CCIH de cada instituição pode adotar medidas que podem trazer o sucesso do
controle das infecções e da disseminação de cepas resistentes. A literatura cita
algumas destas medidas, como restrição do uso de antimicrobianos de amplo
espectro, monitoramento de pacientes colonizados, uso alternado das classes de
antimicrobianos (para limitar a pressão seletiva na flora hospitalar bacteriana),
cuidados especiais com barreiras de proteção utilizadas pelos profissionais a serviço
Introdução
_________________________________________________________________
3
do hospital, cuidados na manipulação de equipamentos invasivos, higienização de
fômites, lavagem correta das mãos, e vigilância clínica e epidemiológica de pacientes
admitidos nas UTI (PEÑA et al. 1998; BRADFORD 2001; LAUTENBACH et al.
2001; PEÑA et al. 2001; PESSOA-SILVA et al. 2003; SAMAHA-KFOURY e
ARAJ 2003; STÜRENBURG e MACK 2003).
O Núcleo de Apoio ao Controle de Infecção Hospitalar (NACIH), que reúne
membros da CCIH de hospitais vinculados ao Programa de Qualidade Hospitalar da
Associação Paulista de Medicina e do Conselho Regional de Medicina de São Paulo,
reúne-se desde 1998 para discutir e solucionar falhas relacionadas ao controle de
infecções hospitalares e à resistência antimicrobiana. Em 2000, por exemplo, o
NACIH constatou que no Brasil a utilização dos procedimentos invasivos é
semelhante à dos hospitais americanos, porém com risco dobrado de infecção destes
procedimentos (NACIH 1998 e 2003).
Há atualmente uma preocupação mundial em se controlar as infecções de
origem hospitalar, e a disseminação da resistência bacteriana aos antimicrobianos
disponíveis (TOSIN et al. 2003).
Muitos programas de controle, nacionais e internacionais, foram lançados
desde o fim da década de 1990, todos visando a conscientização sobre o uso racional
de antimicrobianos, o controle da disseminação de cepas resistentes e/ou de seus
genes, além da pesquisa sobre os mecanismos de transmissão da resistência e novos
métodos de detecção da mesma.
Alguns exemplos desses programas são: Projeto Intensive Care Antimicrobial
Resistance Epidemiology (ICARE), da Escola Rollins de Saúde Pública da
Universidade de Emory (Atlanta, Geórgia), desde 1995; SENTRY Antimicrobial
Introdução
_________________________________________________________________
4
Surveillance Program, desde 1997; Meropenem Yearly Susceptibility Test
Information (MYSTIC), desde de 1997; European Antimicrobial Resistance
Surveillance System (EARSS), desde 1998; Preventing Emerging Infectious
Diseases: a Strategy for de 21
st
Century, do Center for Diseases Control (CDC), em
1998; Paul-Ehrlich-Gesellschaft (PEG), desde 1998 (Alemanha); Task Force on
Antimicrobial Resistance (TFAR), da Food and Drug Administration (FDA), desde
1999; e Pan-European Antimicrobial Resistance using Local Surveillance
(PEARLS), desde 2001 (Rollins SPH 1995; CDC 1998; FDA 2000; OTEO et al.
2002; SADER et al. 2003; STÜRENBURG e MACK 2003; TENOVER et al. 2003;
BOUCHILLON et al. 2004).
Segundo dados de todos os programas citados, as bactérias produtoras de β-
lactamases de espectro estendido (ESBL) são, entre as Gram negativas, as maiores
responsáveis pela ocorrência e disseminação mundial de resistência em ambientes
hospitalares. Desde seu surgimento, estas enzimas tiveram evolução rápida e foram
isoladas em muitos países (CDC 1998; ANVISA 2001; BRADFORD 2001; Rollins
SPH 1995; STÜRENBURG e MACK 2003).
As cepas produtoras podem fazer parte da flora bacteriana normal de
indivíduos, além de terem capacidade de adesão a equipamentos invasivos utilizados
em pacientes hospitalizados (PEÑA et al. 1998; LAUTENBACH et al. 2001; PEÑA
et al. 2001; PESSOA-SILVA et al. 2003; STÜRENBURG e MACK 2003).
Os principais fatores de risco para o aparecimento de infecções hospitalares,
especialmente por microrganismos resistentes, são o uso indiscriminado de
antimicrobianos de amplo espectro, internações prolongadas (principalmente em
UTI), aumento do número de transferências entre unidades e hospitais, severidade da
Introdução
_________________________________________________________________
5
doença, entubação e ventilação mecânica, uso de cateteres em geral, e exposição
prévia a antimicrobianos de qualquer classe. No caso de UTI neonatais, fatores como
sexo e peso ao nascer também são inclusos (KLIEBE et al. 1985; PEÑA et al. 1998;
BRADFORD, 2001 LAUTENBACH et al. 2001; BERMEJO et al. 2003; DAOUD e
HAKIME 2003; PESSOA-SILVA et al. 2003; STÜRENBURG e MACK 2003).
1.1.2 Resistência a Antimicrobianos
Na década de 1940, a grande disponibilidade de penicilina e o posterior
descobrimento da estreptomicina levaram a uma acentuada redução das doenças e
mortes causadas por doenças infecciosas. Infelizmente, o surgimento da resistência
bacteriana reverteu este progresso trazido pelas drogas miraculosas desenvolvidas
nos últimos 50 anos. Neste início de século há muitas opções importantes de drogas
para o tratamento de infecções comuns tornando-se cada vez mais limitadas,
dispendiosas e, em alguns casos, inexistentes (CDC 1998).
O aumento da resistência antimicrobiana de bactérias patogênicas observado
nos últimos 20 anos é considerado um dos maiores problemas da medicina humana.
Diversos aspectos desta situação são especialmente preocupantes. Há mecanismos de
resistência que eliminam o uso da última opção terapêutica para o tratamento de
vários tipos de infecção. Muitos destes mecanismos que surgem e são disseminados
nas populações bacterianas possuem amplo espectro de ação, o que compromete
todas ou a maioria das drogas pertencentes a um dado grupo terapêutico. Dados de
pacientes de unidades de terapia intensiva dos Estados Unidos mostram que 28% das
bactérias que causam infecções hospitalares com mais freqüência são resistentes ao
Introdução
_________________________________________________________________
6
antimicrobiano de escolha para o tratamento (CDC 1998; GNIADKOWSKI 2001;
DZIDIC e BEDKOVIC 2003).
Os mecanismos de resistência são parte da evolução natural das bactérias, que
os utilizam com o objetivo de sobrevivência. Quando as células bacterianas são
expostas a antimicrobianos inadequados, em doses inadequadas, as cepas suscetíveis
são destruídas e somente sobrevivem as resistentes, ao que se chama pressão seletiva.
Para que cada célula se defenda, cresça e se divida o mais rápido possível para
aumentar o número de indivíduos, ela pode utilizar mecanismos naturais de defesa,
sofrer mutações que originam sua resistência ou adquirir genes de resistência de
outras células, por conjugação plasmidial (FORBES et al. 1998; KONEMAN et al.
2001).
A resistência a antimicrobianos mediada pelas bactérias ocorre devido a
características codificadas geneticamente, podendo ser intrínseca ou adquirida.
Resistência intrínseca é aquela resultante da genética, estrutura e fisiologia natural do
microrganismo. Sendo assim, ocorre em grupos específicos, e é útil na escolha dos
antimicrobianos a serem incluídos no teste de sensibilidade para determinados
microrganismos. A resistência adquirida resulta da alteração da estrutura e fisiologia
celular, causada por mudanças na genética normal do microrganismo. Pode ser
adquirida por mutação genética, aquisição de genes de outros organismos, ou uma
associação de ambas. Ao contrário da resistência intrínseca, ocorre em apenas
algumas cepas de um grupo ou espécie de organismos (FORBES et al. 1998;
DZIDIC & BEDEKOVIC, 2003).
Toda estratégia de resistência bacteriana é codificada por um ou mais genes,
os quais podem ser compartilhados entre cepas até mesmo de gêneros diferentes, por
Introdução
_________________________________________________________________
7
mecanismos moleculares específicos. Então, a resistência pode se expandir para um
grande número de bactérias clinicamente significativas, e/ou uma única cepa pode
adquirir resistência múltipla (FORBES et al. 1998; GNIADKOWSKI 2001).
Os genes de resistência bacteriana variam de acordo com sua localização, tipo
de transferência e expressão (KONEMAN et al. 2001).
A localização desses genes pode ser cromossômica, o que confere uma certa
estabilidade genética ao microrganismo, ou extra-cromossômica, em elementos
móveis como plasmídios, que são moléculas circulares de DNA atuando
independentemente do cromossomo, sendo facilmente mobilizados para transferência
horizontal de uma célula bacteriana a outra. Há também elementos chamados
transposons, que são segmentos de DNA que se movem pelo genoma, sendo capazes
de se auto-replicarem e aumentar o tamanho do DNA. Dentro destes, pode haver
integrons, elementos que capturam e mobilizam genes contidos em cassetes (LEWIN
1995a,c; DZIDIC & BEDEKOVIC, 2003; FLUIT & SCHMITZ 2004).
O mecanismo mais comum pelo qual os genes de resistência são transferidos
é a conjugação. Esta requer contato célula a célula, através de um pilus sexual
especializado, codificado por um plasmídio denominado F. Assim que o contato se
estabelece, o plasmídio circular F começa a ser replicado, e uma das cadeias simples
de DNA plasmidial passa para a célula receptora através do pilus. A cadeia simples
começa a ser replicada à medida que entra na célula, formando-se ao final duas
células contendo plasmídios conjugativos completos. Outros mecanismos de
transferência genética são a transdução, que é uma permuta de informação genética
através de bacteriófagos (vírus que infectam as células bacterianas), e a
transformação, que é a transferência direta de DNA entre espécies compatíveis,
Introdução
_________________________________________________________________
8
através da incorporação de DNA livre no meio circundante por células
fisiologicamente competentes para isso, normalmente no final da fase de crescimento
exponencial ou fase log (LEWIN 1995b; SNYDER & CHAMPNESS 1997a,b;
DZIDIC & BEDEKOVIC, 2003).
A expressão dos genes de resistência pode ou não ser dependente da
exposição a algum estímulo. A expressão indutiva só ocorre na presença de estímulo
(ex.: produção de β-lactamase na presença do antimicrobiano β-lactâmico), a
constitutiva independe deste estímulo e a constitutiva-indutiva aumenta quando
exposta a algum estímulo (KONEMAN et al. 2001).
As células bacterianas podem impedir a ação dos agentes antimicrobianos por
inativação enzimática, alteração de receptores e/ou de permeabilidade, ou por
transporte alterado da droga. Algumas espécies são capazes de expressar diversos
tipos de mecanismos de resistência, dependendo do antimicrobiano com o qual
entram em contato (KONEMAN et al. 2001; DZIDIC & BEDEKOVIC, 2003).
Alguns tipos de resistência podem ser adquiridos por uma única mutação
genética, como a alteração de alvo da enzima DNA-girase que resulta em resistência
às fluoroquinolonas. Outros mecanismos de resistência são muito mais complexos e
consistem em genes que codificam a produção de enzimas altamente específicas que
inativam diversos antimicrobianos, como β-lactâmicos e aminoglicosídeos (SHLAES
et al. 1997).
As principais classes de antimicrobianos, seu mecanismo de ação, espectro de
atividade e mecanismos de resistência, estão resumidos no Quadro 1.
Quadro 1 - Principais Grupos de Antimicrobianos
CLASSE MECANISMO DE AÇÃO ESPECTRO DE ATIVIDADE MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
Aminoglicosídeos
Inibem a síntese protéica, fixando-se à Bactérias aeróbias, Alterações enzimáticas;
Amicacina Subunidade ribosomal 30S. Gram positivas e negativas. Diminuição da captação da droga pela
Canamicina célula devido à perda de proteínas porinas;
Estreptomicina Alvos da célula bacteriana alterados
Gentamicina por mutação.
N
etilmicina
Tobramicina
Beta-lactâmicos
Inibem a síntese da parede celular, Bactérias Gram positivas e negativas, Destruição enzimática por β-lactamases;
Cefalotina fixando-se às proteínas fixadoras de com espectro variado para cada Alvos da célula bacteriana alterados
Cefotetan penicilina (PBPs - penicillin-binding proteins), droga. por mutação;
Ceftazidima impedindo a produção de peptideoglicanos. Diminuição da captação da droga
Cefepime pela célula devido à perda de
proteínas porinas.
Cloranfenicol
Inibe a síntese protéica, fixando-se à Bactérias Gram positivas e negativas. Alterações enzimáticas;
Subunidade ribosomal 50S. Diminuição da captação da droga pela
célula devido à perda de proteínas porinas.
Fluoroquinolonas
Inibem a síntese de DNA, fixando-se às Bactérias Gram positivas e negativas, Diminuição da captação da droga pela
Ciprofloxacin DNA-girases. com espectro variado para cada célula devido à perda de proteínas porinas;
N
orfloxacin droga. Alvos da célula bacteriana alterados
Ofloxacin por mutação.
Glicopeptídeos
Inibem a síntese da parede celular. Interagem Bactérias Gram positivas. Alvos da célula bacteriana alterados
Vancomicina com precursores e impedem sua incorporação por mutação.
À nova parede celular.
Macrolídeos,
Inibem a síntese protéica, fixando-se à Maioria das bactérias Gram positivas Alterações enzimáticas;
Lincosamidas e
Subunidade ribosomal 50S. e algumas Gram negativas. Alvo ribossomal alterado;
Streptogramina
Sistema de efluxo da droga pela célula,
(grupo MLS)
diminuindo sua concentração intracelular.
Azitromicina
Claritromicina
Clindamicina
Eritromicina
(continua)
Quadro 1 (cont.) - Principais Grupos de Antimicrobianos
CLASSE MECANISMO DE AÇÃO ESPECTRO DE ATIVIDADE MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
Metronidazol
Rompe o DNA. Mecanismo exato incerto. Bactérias Gram negativas, e algumas Bactérias aeróbias não são capazes de
Gram positivas e anaeróbias. reduzir anaerobicamente a droga à sua
forma ativa.
Nitrofurantoína
Prejudica o DNA. Mecanismo exato incerto. Bactérias Gram positivas e negativas.
Polimixinas
Rompem a membrana celular. Bactérias Gram negativas, com pouca
Polimixina B atividade contra Gram positivas.
Colistina
Rifampicina
Inibe a síntese de RNA, fixando-se à Bactérias Gram positivas, e algumas Alteração de alvo enzimático
RNA-polimerase DNA-dependente. Gram negativas. (RNA-polimerase DNA-dependente).
Sulfonamidas
Interferem na via do ácido fólico, fixando-se Bactérias Gram positivas e muitas Alteração de alvos enzimáticos.
à enzima diidropteroato-sintetase. Gram negativas.
Tetraciclina
Inibem a síntese protéica, fixando-se à Bactérias Gram positivas e negativas, Sistema de efluxo da droga pela célula,
subunidade ribossomal 30S. e muitos patógenos intracelulares. diminuindo sua concentração intracelular;
Inativação enzimática;
Alvo ribosomal alterado.
Trimetoprim
Interferem na via do ácido fólico, fixando-se Bactérias Gram positivas e muitas Alteração de alvos enzimáticos.
à enzima diidrofolato-redutase. Gram negativas.
Fontes: FORBES et al 1998; KONEMAN et al. 2001.
Introdução
_________________________________________________________________
11
1.1.3 Antimicrobianos β-Lactâmicos
Os compostos β-lactâmicos são o maior grupo de antimicrobianos, com ação
geralmente bactericida e baixa toxicidade em humanos. Agem como inibidores da
síntese da parede celular bacteriana, estrutura vital para as bactérias e inexistente nas
células humanas, o que a torna o foco de atenção para o desenvolvimento de novas
drogas.
A base da estrutura molecular dos compostos β-lactâmicos é um anel β-
lactâmico central (Figura 1), o qual é a chave para o mecanismo de ação dessas
drogas na parede celular através da ligação às enzimas envolvidas na síntese. A
estrutura destes compostos pode ser manipulada para se obter maior atividade e mais
aplicações terapêuticas.
Figura 1 - Anel β-lactâmico.
Os principais grupos de β-lactâmicos são as penicilinas, as cefalosporinas,
os monobactâmicos e os carbapenens. A estrutura molecular de cada grupo e os
exemplos de antimicrobianos pertencentes a eles estão representados no Quadro 2.
Introdução
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12
Quadro 2 – Principais grupos de β-lactâmicos.
Fontes: FORBES et al. 1998; SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003; STÜRENBURG
& MACK, 2003.
Introdução
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13
Mecanismo de Ação
¾ Síntese da Parede Celular Bacteriana
A síntese da parede celular das bactérias ocorre em três estágios.
O
primeiro estágio ocorre no citoplasma, onde são sintetizados os precursores
de baixo peso molecular. No segundo estágio, as porções não-nucleotídicas dessas
moléculas precursoras são transferidas seqüencialmente para uma camada na
membrana citoplasmática, e este processo é catalisado por enzimas de ligação à
membrana. A camada lipídica funciona como ponto de ligação à membrana para os
precursores e permite o transporte das subunidades através do interior hidrofóbico da
membrana citoplasmática para a superfície externa (BARON et al. 1996).
O
terceiro estágio da síntese envolve a polimerização das subunidades e a
ligação do novo peptideoglicano à parede celular. A polimerização ocorre através da
transferência da nova cadeia de peptideoglicanos de sua camada na membrana para a
N-acetilglucosamina do novo peptideoglicano que já está ligado à membrana. O
novo peptideoglicano é ligado ao peptideoglicano de parede celular pré-existente,
através de uma reação de transpeptidase que envolve cadeias peptídicas de ambos os
polímeros, sendo que um deles deve possuir um terminal D-alanil-D-alanina. Esta
última reação é inibida pelos compostos β-lactâmicos (BARON et al. 1996).
¾ Entrada dos Compostos β-lactâmicos nas Células Bacterianas
Tanto bactérias Gram positivas como Gram negativas possuem uma mistura
de elementos celulares no citoplasma. As primeiras têm uma membrana celular com
uma espessa camada externa de peptideoglicanos, enquanto as últimas possuem uma
Introdução
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14
membrana plasmática interna e uma membrana celular lipoprotéica externa, entre as
quais há uma camada fina de peptideoglicanos (KONEMAN et al. 2001).
Os compostos β-lactâmicos não necessitam atravessar a membrana plasmática
para exercer sua atividade sobre microrganismos Gram positivos. Passam facilmente
pela camada de peptideoglicanos e agem junto às transpeptidases na formação da
parede celular (KONEMAN et al. 2001).
Já nas bactérias Gram negativas, as duas membranas existentes servem de
barreira para os antimicrobianos β-lactâmicos, porque seu alvo de ação fica no
interior da célula, após a membrana externa e o espaço periplasmático. Mesmo
substâncias altamente lipofílicas têm dificuldade de se difundirem diretamente para o
interior da célula devido à natureza polarizada e assimétrica da membrana celular
externa (KONEMAN et al. 2001).
Os compostos β-lactâmicos são transportados para o interior das células Gram
negativas principalmente através de proteínas chamadas porinas. Normalmente há
uma porina de canal amplo (OmpF) e uma de canal pequeno (OmpC) na membrana
celular externa. O tamanho, a carga e a hidrofobicidade das moléculas que tentam
entrar na célula influenciam na velocidade e efetividade desse transporte. O
imipenem, por exemplo, tem excelente desempenho por ser um composto pequeno,
hidrofílico, e com cargas positivas e negativas equilibradas (KONEMAN et al.
2001).
¾ Ação dos Compostos β-lactâmicos
O anel β-lactâmico desencadeia uma reação de acilação com as
transpeptidases, promovendo uma ligação cruzada dos polímeros citados
Introdução
_________________________________________________________________
15
anteriormente. As enzimas envolvidas no processo final de formação da parede
celular são as proteínas fixadoras de penicilina (PBPs – penicillin-binding proteins),
às quais se ligam, então, os compostos β-lactâmicos. As PBPs normalmente
impedem a ação das enzimas hidrolases, que ficam livres para lisar a parede celular.
As PBPs são diferentes em microrganismos Gram positivos e Gram negativos e em
espécies anaeróbias, o que pode explicar os diferentes espectros de atividade
antimicrobiana dos β-lactâmicos em diferentes tipos bacterianos (BARON et al.
1996; SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003).
1.1.4 Enzimas β-lactamases
A resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos pode ocorrer pelas 3 vias
citadas anteriormente (inativação enzimática, alteração de receptores ou por
transporte alterado da droga), sendo a destruição enzimática da droga a via mais
comum, através da produção de β-lactamases (Figura 2).
Figura 2 – Estrutura molecular das β-lactamases.
A primeira β-lactamase mediada por plasmídio em microrganismos Gram
negativos, TEM-1, foi descrita no início da década de 1960. Foi encontrada em uma
Introdução
_________________________________________________________________
16
cepa de Escherichia coli isolada do sangue de uma paciente chamada Temoniera, na
Grécia. A localização plasmidial e/ou em transposons facilitou a disseminação da
TEM-1 para outras espécies bacterianas (BRADFORD, 2001; SAMAHA-KFOURY
& ARAJ, 2003; STÜRENBURG & MACK, 2003)
Outro tipo de β-lactamase é a SHV-1 (de “sulfidrila variável”), codificada
cromossomicamente na maioria das cepas de Klebsiella pneumoniae, o que confere
resistência intrínsica à ampicilina nesta espécie, e normalmente mediada por
plasmídios em E. coli (BRADFORD, 2001).
Origem e Função
Beta-lactamases e PBPs possuem origem evolutiva comum, e ambas
necessitam interagir com os compostos β-lactâmicos para exercerem sua função.
Foram originadas provavelmente devido à pressão seletiva exercida por organismos
existentes no solo, produtores de compostos β-lactâmicos (BRADFORD 2001;
KONEMAN et al. 2001).
As PBPs de alto e de baixo peso molecular possuem seqüências de
aminoácidos similares às das β-lactamases, além de possuírem semelhanças nas suas
conformações e estruturas tridimensionais. O mecanismo de ação de ambas baseia-se
na ruptura de uma ligação amida por acilação enzimática. A especificidade das PBPs
para os antimicrobianos β-lactâmicos determina a sensibilidade da bactéria à droga,
assim como a especificidade das β-lactamases aos β-lactâmicos determina a eficácia
da hidrólise dos mesmos através da enzima. Uma mutação pontual em um ou mais
aminoácidos, em uma área estruturalmente crítica da enzima, pode causar a
Introdução
_________________________________________________________________
17
inutilização do antimicrobiano β-lactâmico através da alteração da especificidade da
molécula enzimática (KONEMAN et al. 2001).
A síntese das β-lactamases pode ser cromossômica (constitutiva) ou mediada
por plasmídios (indutiva). A produção destas enzimas pode ser induzida tanto pela
presença de β-lactâmicos como de precursores da parede celular no meio extracelular
(KONEMAN et al. 2001; SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003).
A provável função fisiológica dessas enzimas é de reestruturar o
peptideoglicano durante o crescimento da célula bacteriana (KONEMAN et al.
2001).
Localização e Transferência Genética
Tanto microrganismos Gram positivos como Gram negativos podem produzir
β-lactamases. Dos Gram positivos os mais comuns são os estafilococos, em que 90%
ou mais das cepas são resistentes à penicilina como resultado da produção da enzima.
Raras cepas de enterococos também podem produzir β-lactamases (FORBES et al.
1998).
As β-lactamases produzidas pelos microrganismos Gram positivos são em sua
maioria indutivas de Classe A, localizadas em plasmídios e excretadas no meio
extracelular, onde ocorre a hidrólise do composto β-lactâmico antes que este se ligue
às PBPs na membrana celular. Os plasmídios dessas bactérias são transferidos por
transdução, através de bacteriófagos. As β-lactamases estafilocócicas são capazes de
hidrolisar a penicilina e a maioria de seus derivados, porém não conseguem
hidrolisar efetivamente muitas cefalosporinas e carbapenens (FORBES et al. 1998;
KONEMAN et al. 2001; SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003).
Introdução
_________________________________________________________________
18
As bactérias Gram negativas produzem muitos tipos diferentes da enzima,
que pode ser codificada por genes cromossômicos ou plasmidiais, e podem hidrolisar
a maioria dos β-lactâmicos. Nesse grupo está inclusa a família Enterobacteriaceae e
outras bactérias como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,
Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae (FORBES et al. 1998; SAMAHA-
KFOURY & ARAJ, 2003).
Nos microrganismos Gram negativos, a enzima permanece no espaço
periplasmático intracelular, estrategicamente posicionada para hidrolisar o composto
β-lactâmico após este transpor a membrana externa através de porinas (FORBES et
al. 1998).
Classificação
As enzimas β-lactamases já foram classificadas de três formas diferentes.
O primeiro esquema sugerido foi o de Richmond e Sykes, 1973,
baseado no perfil do substrato das enzimas e na localização do gene
codificador das mesmas. Em 1980, foi desenvolvida a classificação
molecular de Ambler, baseada nas seqüências de nucleotídeos e
aminoácidos das enzimas, denominando-as A, B, C ou D. Em 1995, Bush,
Jacoby e Medeiros propuseram um esquema baseado nas propriedades
bioquímicas, estrutura molecular e seqüência nucleotídica das enzimas,
separando-as em grupos funcionais. Os três esquemas de classificação
estão representados no Quadro 3 (RICHMOND & SYKES 1973; BUSH et al.
1995; BRADFORD 2001; KONEMAN et al. 2001; SAMAHA-KFOURY &
ARAJ, 2003).
19
Quadro 3 - Esquema de Classificação para β-lactamases.
Richmond e Classificação Bush, Características
Número
Sykes Molecular Jacoby e
Inibidas por: Enzimas estimado
de Ambler Medeiros Substratos Representativas de
1973 1980 1995 Preferenciais Clavulanato EDTA
Enzimas
Ia, Ib, Id C 1 Cromossômicas ou Plasmidiais não não AmpC de bactérias Gram 51
β-lactâmicos, exceto Carbapenens negativas; MIR-1
não inclusa A 2ª Penicilinases sim não Penicilinases de bactérias 23
Penicilinas Gram positivas
III A 2b β-lactamases de amplo espectro sim não TEM-1, TEM-2, SHV-1 16
Penicilinas e Cefalosporinas
não inclusa, 2be ESBL não TEM-3 a TEM-26,
exceto a K1 A
(β-lactamases de espectro estendido) sim
SHV-2 a SHV-6, e 119
na classe IV Penicilinas, Oximino-Cefalosporinas e monobactâmicos grupo OXY ou K1 da K. oxytoca
não inclusa A 2br β-lactamases resistentes a inibidores modestamente não TEM-30 a TEM-36; TRC-1 24
Penicilinas
II, V A 2c Carbenicilinases sim não PSE-1, PSE-3, PSE-4 19
Penicilinas e Carbenicilinas
V D 2d Oxacilinases modestamente não OXA-1 a OXA-11, PSE-2 31
Penicilinas e Cloxacilina; Carbapenens (parcialmente). (OXA-10)
Ic A 2e Cefalosporinases sim não Cefalosporinases induzíveis 20
Cefalosporinas de Proteus vulgaris
NMC-A de Enterobacter cloacae;
não inclusa A 2f Penicilinases
sim não
Sme-1 de Serratia marcescens; 4
Penicilinas, Cefalosporinas e Carbapenens KPC-1 e -2 de K. pneumoniae;
GES-2 de P. aeruginosa.
3 MBL L1 de Stenotrophomonas maltophilia;
não inclusa B
(metalo-β-lactamases) Não
sim
CcrA de Bacteroides fragilis; 24
Todos os β-lactâmicos, exceto monobactâmicos Grupos IMP e VIM.
não inclusa Não 4 enzimas não seqüenciadas 9
Determinada
e não classificadas
Fontes: Bush et al. 1995; Shah et al. 2004.
Introdução
_________________________________________________________________
20
Mecanismo de Ação
As β-lactamases clivam o anel β-lactâmico, alterando assim a estrutura do
antimicrobiano, que não consegue se ligar efetivamente às PBPs, o que permite que a
síntese da parede celular bacteriana continue normalmente (FORBES et al. 1998).
O mecanismo de ação das β-lactamases é baseado no seu resíduo do
aminoácido serina. As enzimas possuem um sítio de ação que consiste em uma
cavidade longitudinal estreita, com um bolso oxiânion em sua base, construído para
conferir flexibilidade conformacional em termos de fixação do substrato. Próximo a
esta cavidade está o resíduo de serina, que reage irreversivelmente com o radical
carbonila do anel β-lactâmico, o qual se abre (SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003).
Revisão da Literatura
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21
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Beta-Lactamases de Espectro Estendido (ESBL)
2.1.1 Definição e Histórico
Beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) são, por definição, enzimas da
classe molecular A ou D (classificação de Ambler), ou das classes 2be ou 2d
(classificação de Bush, Jacoby e Medeiros), capazes de hidrolisar cefalosporinas de
terceira geração (oximino-cefalosporinas) 10% a mais do que hidrolisam as
benzilpenicilinas, possuem sítio de ação contendo o aminoácido serina como resíduo
catalítico principal, e geralmente são inibidas por compostos como ácido clavulânico
(clavulanato), sulbactam e/ou tazobactam (BUSH et al. 1995; BRADFORD 2001;
STÜRENBURG e MACK 2003; PFALLER & SEGRETI 2006).
A primeira ESBL foi observada na Europa, em 1983, em uma única cepa de
Klebsiella ozaenae, e denominada SHV-2 devido à grande homologia observada com
os genes bla da β-lactamase SHV-1, sua precursora. Desde então, cepas produtoras
de ESBL têm sido descritas em muitos países, inclusive no Brasil. Sua prevalência é
hoje provavelmente subestimada devido à sua dificuldade de detecção e à
inconsistência dos relatos existentes (KLIEBE et al. 1985; CDC 1998; BRADFORD
2001; LAUTENBACH et al. 2001; DAOUD & HAKIME 2003; PESSOA-SILVA et
al. 2003; SADER et al. 2003; STÜRENBURG & MACK 2003).
As enzimas ESBL e seus precursores têm localização plasmidial, porém
podem ter sido originadas nos cromossomos, uma vez que a maioria das
enterobactérias contém enzimas cromossômicas constitutivas (Classe C) produzidas
Revisão da Literatura
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22
em baixos níveis, variando conforme a espécie. Os plasmídios que carregam os genes
codificadores das ESBL podem levar também determinantes de resistência a
aminoglicosídeos, tetraciclinas, cloranfenicol, trimetoprim e sulfonamidas
(BRADFORD 2001; GNIADKOWSKI 2001; COQUE et al. 2002; HERNÁNDEZ et
al. 2003; SAMAHA-KFOURY e ARAJ 2003).
2.1.2 Principais espécies produtoras de ESBL
De maneira geral, as ESBL podem ser encontradas na família
Enterobacteriaceae e em Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii
(BRADFORD 2001; DZIDIC e BEDEKOVIC 2003; COLODNER 2005).
Klebsiella pneumoniae é a espécie em que se descreve produção de ESBL
com maior freqüência, sendo que 2 a 5% das infecções hospitalares, principalmente
respiratórias e urinárias, estão associadas a esta espécie. Segundo dados de
programas internacionais de vigilância no Brasil (SENTRY e MYSTIC), a
prevalência de isolamento de K. pneumoniae produtoras de ESBL é de
aproximadamente 50%. É um importante patógeno hospitalar, com potencial para
causar morbidade severa e mortalidade em pacientes pediátricos. É parte da flora
intestinal normal, e sua virulência está associada à presença de uma cápsula
polissacarídica, sistema de captação de ferro, fenótipo mucóide e lipopolissacarídeo
tóxico. Podem sobreviver por muito tempo na pele e em ambientes secos, como
superfícies hospitalares, além de adquirir plasmídios conjugativos com certa
facilidade, os quais podem carregar também genes para outros tipos de resistência,
como para aminoglicosídeos. É intrinsicamente resistente à ampicilina, devido à
presença da β-lactamase cromossômica SHV-1, pode produzir enzimas plasmidiais
Revisão da Literatura
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23
como a AmpC (normalmente constitutiva em diversas espécies), metalo-β-
lactamases (MBL) e carbapenemases (KPC), além de poder expressar resistência
devido à perda de porinas (GOUBY et al. 1994; PEÑA et al. 1998 e 2001; YUAN et
al. 1998; BABINI & LIVERMORE 2000; MENDES et al. 2000; SADER 2000;
MARTINS-LOUREIRO et al. 2001; SADER et al. 2001; NORDMANN e POIREL
2002; YONG et al. 2002; HERNÁNDEZ et al. 2003; PESSOA-SILVA et al. 2003;
CARTELLE et al. 2004; JACOBY et al. 2004; PFALLER & SEGRETI 2006).
No Brasil, há relatos de isolamento de cepas de K. pneumoniae multi-
resistentes em pacientes internados. Mendes et al. (2004) relatam o caso de uma cepa
de K. pneumoniae pertencente ao programa MYSTIC no Brasil. A cepa foi isolada da
urina de um paciente que também desenvolveu pneumonia por Acinetobacter spp e
Staphylococcus aureus resistente à oxacilina durante sua internação, que foi de 34
dias, tendo recebido grande carga de antimicrobianos durante este período. A
investigação detalhada da cepa de K. pneumoniae concluiu que a mesma era
produtora da ESBL SHV-4 e não possuía uma proteína de membrana externa, ou
seja, não apresentava uma porina, o que provavelmente foi responsável pela baixa
sensibilidade da cepa aos carbapenens (meropenem e imipenem).
Lincopan et al. (2005) relatam o primeiro caso de isolamento de K.
pneumoniae produtora de metalo-β-lactamase (MBL) na América Latina (KPBr1). A
cepa foi isolada do sangue de um paciente cuja internação durou 53 dias após um
acidente vascular cerebral, com diagnóstico posterior de pneumonia por
Acinetobacter baumannii e outras infecções secundárias e colonizações. A cepa
KPBr1, produtora de ESBL do grupo CTX-M e resistente à maioria dos
antimicrobianos β-lactâmicos e aztreonam, também expressava resistência ao
Revisão da Literatura
_________________________________________________________________
24
imipenem e a inibidores de β-lactamases (ácido clavulânico e tazobactam) devido à
produção da MBL IMP-1. A presença destas duas enzimas contribuíram para a falha
terapêutica e morte do paciente.
Escherichia coli e Klebsiella oxytoca ESBL positivas também são
comumente notificadas como responsáveis por infecções hospitalares. Porém, outras
enterobactérias como Enterobacter spp, Morganella morganii, Proteus mirabilis,
Providencia spp, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Shigella spp e
Salmonella spp também têm sido descritas freqüentemente como produtoras de
diversos tipos de ESBL, isoladas em diversas amostras biológicas, como sangue,
abscessos, pontas de cateteres, pulmões, fluido peritonial, lavado bronco-alveolar e
orofaringe (BRADFORD 2001; CHANAWONG et al. 2001; AITMHAND et al.
2002; CANTÓN et al. 2002; CAO et al. 2002; PAGANI et al. 2002; QUALE et al.
2002; AIBINU et al. 2003; DHAWAN et al. 2003; DZIDIC e BEDEKOVIC 2003;
MOTTA et al. 2003; MULVEY et al. 2003; QUINTEROS et al. 2003; YU et al.
2003; KIM et al. 2004a; KIM et al. 2004b; NAUMIUK et al. 2004; TUMBARELLO
et al. 2004; WU et al. 2004; HO et al. 2005; CELENZA et al. 2006).
2.1.3 Classificação
Todas as ESBL são derivadas de outras β-lactamases, após a ocorrência de
uma ou mais mutações genéticas pontuais que são clonadas em certas áreas da
enzima adjacentes aos 4 elementos estruturais evolutivos conservados que limitam o
sítio de ação. As ESBL diferem de suas enzimas de origem por 1 a 7 substituições e
algumas deleções de aminoácidos que alteram a configuração e as propriedades do
seu sítio de ação. As substituições de aminoácidos ocorridas estendem esta região,
Revisão da Literatura
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25
permitindo novas interações enzima-substrato com as oximino-cefalosporinas
(BRADFORD 2001; STÜRENBURG e MACK 2003).
Atualmente há mais de 400 β-lactamases descritas, das quais mais de 300 são
ESBL, com distribuição mundial (BRADFORD 2001; LAUTENBACH et al. 2001;
DAOUD & HAKIME 2003; SAMAHA-KFOURY & ARAJ 2003; BUSH &
JACOBY 2003).
A maioria das ESBL pertence à classe molecular A de Ambler, e pelo
esquema de classificação de Bush, Jacoby e Medeiros, são classificadas como 2be ou
2d, podendo ou não ser inibidas pelo ácido clavulânico (BUSH et al. 1995;
BRADFORD 2001).
As enzimas ESBL são agrupadas e denominadas de acordo com sua
similaridade com enzimas precursoras e/ou com grupos já conhecidos.
A maioria das ESBL são derivadas das β-lactamases dos tipos TEM e SHV,
das quais derivam 150 e 88 ESBL, respectivamente (BRADFORD 2001).
Outros tipos de ESBL, não menos importantes clinicamente, são: CTX-M,
OXA, PER, VEB, CME, TLA, SFO, GES e BES, sendo que a última foi encontrada
no Brasil (Brazil extended-spectrum-
β
-lactamase) em cepas de Serratia marcescens,
em um estudo realizado entre 1996 e 1997. Outras ESBL identificada no Brasil são a
SHV-27, em cepas de K. pneumoniae isoladas em hemoculturas de neonatos, por
Corkill et al. (2001), e a CTX-M-8, em cepas clínicas de Enterobacter cloacae, E.
aerogenes e Citobacter amalonaticus, em hospitais do Rio de Janeiro, por Bonnet et
al. (2000b) (BONNET et al. 2000a; BRADFORD 2001; GNIADKOWSKI 2001;
BUSH & JACOBY 2003; SAMAHA-KFOURY & ARAJ 2003; STÜRENBURG &
MACK 2003).
Revisão da Literatura
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2.1.3.1 Grupo TEM
A β-lactamase TEM-1 é a enzima mais comumente encontrada em
microrganismos Gram negativos, localizada normalmente no transposon Tn3, que é
muito pouco seletivo, o que permite que haja uma série de transposições e rearranjos
envolvendo seu gene codificador bla
TEM-1
. As enzimas deste grupo são comuns em
diversas espécies de enterobactérias, principalmente Proteus mirabilis, Escherichia
coli e Klebsiella pneumoniae (CAO et al. 2002; PAGANI et al. 2002; ARPIN et al.
2003; SANGUINETTI et al. 2003; STÜRENBURG & MACK, 2003; KIM et al.
2004; BIENDO et al. 2005; ENDIMIANI 2005).
Mais de 50-60% da resistência de E. coli à ampicilina se deve à presença de
enzimas TEM-4, também responsáveis pela resistência de Haemophilus influenzae e
Neisseria gonorrhoeae à ampicilina e penicilina. É capaz de hidrolisar a penicilina e
algumas cefalosporinas de primeira geração como cefalotina e cefaloridina
(BRADFORD, 2001; SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003; STÜRENBURG &
MACK, 2003).
Seu primeiro derivado, TEM-2, apesar de ter sofrido substituição de um
aminoácido, não teve seu perfil de substrato modificado, mesmo com a alteração em
seu ponto isoelétrico de 5,4 para 5,6 (BRADFORD, 2001).
A primeira β-lactamase do tipo TEM a expressar o fenótipo ESBL foi a TEM-
3, relatada em 1987. Após isso, mais de 100 derivados TEM foram descritos, sendo
alguns resistentes a inibidores de β-lactamases e a grande maioria com fenótipo
ESBL (BRADFORD, 2001; STÜRENBURG & MACK, 2003; BUSH & JACOBY,
2003).
Revisão da Literatura
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27
As combinações das substituições de aminoácido que ocorrem em posições
limitadas na enzima TEM resultam em diversas alterações nos fenótipos ESBL,
como a habilidade de hidrolisar oximino-cefalosporinas específicas como
ceftazidima e cefotaxima, ou alterar seus pontos isoelétricos de 5,2 para 6,5. Alguns
resíduos de aminoácido são muito importantes para a produção do fenótipo ESBL
quando as substituições ocorrem nessas posições (BRADFORD, 2001;
STÜRENBURG & MACK, 2003; PFALLER & SEGRETI 2006).
Alguns exemplos são:
- glutamato por lisina na posição 104 ou 240;
- arginina por serina ou histiolina na posição 164; e
- glicina por serina na posição 238.
Outra enzima TEM descrita é a TEM-AQ, que contém, além de algumas
substituições, a deleção de um aminoácido, que ainda não havia sido observada neste
grupo de enzimas (BRADFORD, 2001).
As TEM-β-lactamases resistentes a inibidores (ácido clavulânico, sulbactam e
tazobactam), em sua maioria, surgem independentemente da ação de ESBL, sendo
relativamente inativas contra as oximino-cefalosporinas. Porém, algumas variantes
como TEM-50 e TEM-68 retêm ambas as atividades em níveis significativos
(STÜRENBURG & MACK, 2003).
2.1.3.2 Grupo SHV
As enzimas deste grupo são mais comumente encontradas em cepas de K.
pneumoniae, em que bla
SHV-1
ou outro gene relacionado está integrado no
Revisão da Literatura
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cromossomo bacteriano. São responsáveis por até 20% da resistência à ampicilina
mediada por plasmídios nesta espécie. São também resistentes à ticarcilina e
piperacilina. Podem ser encontradas também em outras espécies de
Enterobacteriaceae e em Pseudomonas aeruginosa. Atualmente há mais de 50
variantes ESBL da SHV-1 (COUDRON et al. 1997; PITOUT et al. 1998; BABINI &
LIVERMORE 2000; BRADFORD, 2001; CHANAWONG et al. 2001; CAO et al.
2002; HOWARD et al. 2002; AIBINU et al. 2003; QUINTEROS et al. 2003;
SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003; SANGUINETTI et al. 2003; STÜRENBURG
& MACK, 2003; KIM et al. 2004; HO et al. 2005; WU et al. 2006; PFALLER &
SEGRETI 2006).
A alteração que ocorre no gene blaSHV que origina fenótipos de ESBL é
basicamente a substituição de uma glicina por serina na posição 238 (Gli238Ser).
Pode ocorrer também lisina por glutamato na posição 240, porém o mais interessante
é que ambas as substituições se espelham às das ESBL do tipo TEM. O resíduo de
serina na posição 238 é crítico para a hidrólise eficiente da ceftazidima, e o resíduo
de lisina na posição 240 é crítico para a hidrólise da cefotaxima. O aumento da
Concentração Inibitória Mínima (CIM) para a cefotaxima é maior que o da
ceftazidima (BRADFORD, 2001; STÜRENBURG & MACK, 2003).
A maioria das β-lactamases SHV têm fenótipo ESBL, com exceção da SHV-
4, SHV-11, e SHV-10, que possui fenótipo de resistência a inibidores das β-
lactamases. Esta enzima mantém parcialmente sua habilidade para hidrolisar as
penicilinas, porém sua atividade contra as cefalosporinas é significativamente
reduzida (BRADFORD, 2001; HOWARD et al. 2002; STÜRENBURG & MACK,
2003).
Revisão da Literatura
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2.1.3.3 Grupo CTX-M
A primeira CTX-M-β-lactamase (CTX-M-1) foi isolada na Alemanha em
1989, e após isso foi rapidamente disseminada entre diferentes espécies clínicas de
enterobactérias, principalmente na América do Sul e, posteriormente, em diversas
partes do mundo. Atualmente há mais de 50 enzimas descritas neste grupo
(ALOBWEDE et al. 2003; QUINTEROS et al. 2003; STÜRENBURG & MACK,
2003; BUSH & JACOBY 2003; PITOUT et al. 2005; RODRIGUEZ et al. 2005;
RYOO et al. 2005; CELENZA et al. 2006; SOGE et al. 2006)
Esta família de ESBL mediadas por plasmídios hidrolisa preferencialmente a
cefotaxima e é encontrada principalmente em cepas de Salmonella enterica serovar
Typhimurium e E. coli, além de outras Enterobacteriaceae, em diversas partes do
mundo. Apresentam apenas 40% de identidade com as β-lactamases TEM e SHV.
Foram originadas provavelmente a partir da enzima cromossômica AmpC de
Kluyvera ascorbata, uma vez que possuem alto grau de homologia entre si
(BRADFORD, 2001; BONNET 2004).
As CTX-M-β-lactamases hidrolisam mais efetivamente a cefalotina e a
cefaloridina que a benzilpenicilina. A capacidade dessas enzimas hidrolisarem a
ceftazidima não é suficiente para promover a resistência clínica do microrganismo
em que se encontram. Outra característica importante é que essas enzimas são
inibidas mais efetivamente pelo tazobactam que pelo sulbactam e clavulanato
(BRADFORD, 2001).
O resíduo do aminoácido serina na posição 237 está presente em todas as
CTX-M- β-lactamases e tem papel fundamental em sua atividade de amplo espectro.
Revisão da Literatura
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O resíduo de arginina na posição 276 (Arg-276), em uma posição equivalente à Arg-
244 nas ESBL do tipo TEM e SHV, também deve ter papel importante na hidrólise
das oximino-cefalosporinas (BRADFORD, 2001; BONNET 2004).
2.1.3.4 Grupo OXA
As OXA-ESBL diferem das enzimas TEM e SHV por pertencerem à classe
molecular D (oxacilinases), grupo funcional 2d, e por serem mais comumente
encontradas em cepas de P. aeruginosa que nas enterobactérias (DANEL et al. 2005;
BRADFORD, 2001; CHANAWONG et al. 2001; STÜRENBURG & MACK, 2003;
PFALLER & SEGRETI 2006).
As OXA-ESBL conferem resistência à ampicilina e cefalotina, têm alta
atividade hidrolítica contra a oxacilina, cloxacilina e meticilina, e são fracamente
inibidas pelo ácido clavulânico (BRADFORD, 2001; STÜRENBURG & MACK,
2003).
Muitas OXA-ESBL são derivadas da OXA-10 (OXA-11,-13,-14,-16,-17,-19,
-28 e -35), tendo sempre uma das seguintes substituições de aminoácido: asparagina
por serina na posição 73 ou aspartato por glicina na posição 157, sendo esta última
necessária para o alto nível de resistência à ceftazidima (BRADFORD, 2001;
STÜRENBURG & MACK, 2003).
Ao contrário das demais OXA-ESBL, o tipo OXA-17 confere resistência à
cefotaxima e ceftriaxona, e apenas uma fraca proteção contra a ceftazidima
(BRADFORD, 2001).
Apesar dos poucos relatos sobre o isolamento de OXA-ESBL, não se deve
esquecer que os genes codificadores destas enzimas têm localização plasmidial e/ou
Revisão da Literatura
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em transposons, o que permite sua ampla distribuição (STÜRENBURG & MACK,
2003).
2.1.3.5 Grupo PER
O grupo PER de enzimas compreende as enzimas PER-1, PER-2 e PER-3.
As enzimas PER-1 foram identificadas na Turquia, em 1991, em cepas de
Pseudomonas aeruginosa, e alguns relatos da presença das mesmas em
enterobactérias já foram publicados. Poirel et al. (2000) sugerem que a localização
dos genes bla
PER-1
pode ser plasmidial ou em integrons, e nestes podem estar
contidos genes para os grupos OXA, VEB,e GES de ESBL, fornecendo a estes genes
um meio adicional de disseminação e expressão. Pagani et al. (2002) descreve um
surto causado por cepas de P. mirabilis produtoras das ESBL PER-1 na Itália, as
quais foram isoladas inicialmente apenas na UTI da instituição, e após um certo
período já foram identificadas em outros 15 setores, o que sugere uma alta
capacidade de disseminação dos genes bla
PER-1
(DANEL et al. 1995; BAUERFEIND
et al. 1996; WELDHAGEN et al. 2003).
As enzimas PER-2 foram identificadas em Salmonella enterica serovar
Typhimurium, na Argentina, em 1996. Já foram detectadas também em
Acinetobacter baumanii e nas enterobactérias K. pneumoniae e E. coli. Atualmente
só há relatos da presença dos genes bla
PER-2
em países da América do Sul
(BAUERFEIND et al. 1996; BRADFORD, 2001; QUINTEROS et al. 2003;
CELENZA et al. 2006).
A ESBL PER-3 foi identificada em Aeromonas caviae, por Neuwirth e
Siebor (2004) (BUSH e JACOBY 2003).
Revisão da Literatura
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2.1.3.6 Grupo VEB
Este grupo de ESBL foi identificado na França, em 1999, em uma cepa de E.
coli isolada de uma criança vietnamita, e portanto recebeu o nome de Vietnamese
Extended-Spectrum β-Lactamase (VEB) (POIREL et al. 1999).
Os genes bla
VEB
possuem uma significativa semelhança com bla
PER-1
e bla
PER-
2
, porém as proteínas entre si possuem apenas 38% de homologia. É a primeira
ESBL da classe A que é parte de um cassete de genes, localizado em um integron de
classe A. Além disso, bla
VEB-1
foi identificado em um grande plasmídio de K.
pneumoniae, do mesmo paciente vietnamita, que o adquiriu por transferência
horizontal (conjugação) (POIREL et al. 1999; CHANAWONG et al. 2001).
As ESBL PER-1, PER-2 e VEB-1 são todas relacionadas entre si, porém com
apenas 40 a 50% de homologia. São originadas provavelmente a partir das
cefalosporinases cromossômicas de Bacteroides spp. Todas conferem resistência às
oximino-cefalosporinas (principalmente ceftazidima) e ao aztreonam. VEB-1, GES-1
e PER-1 possuem perfil de resistência e inibição por clavulanato semelhantes, e
devido à sua localização em integrons, podem estar associadas a um cassete de genes
(BRADFORD, 2001; WELDHAGEN et al. 2003; KIM et al. 2004).
2.1.3.7 Grupo GES
As ESBL do tipo GES-1 foram identificadas em uma cepa de K. pneumoniae,
na Guiana Francesa, sendo denominada Guiana Extended-Spectrum β-Lactamase
(GES-1). Estas enzimas se mostraram ativas contra a cefamicina cefoxitina, que em
geral é ativa contra enzimas ESBL. Os genes bla
GES-1
, assim como no grupo VEB,
Revisão da Literatura
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podem estar localizados tanto em plasmídios como em integrons, constituindo uma
forma a mais de disseminação e expressão. É um grupo incomum de enzimas, não
relacionadas a nenhuma β-lactamase mediada por plasmídio, tendo porém 36% de
homologia com a carbecilinase do Proteus mirabilis (POIREL et al. 2000;
BRADFORD 2001; KIM et al. 2004; KYOO et al. 2005; PFALLER & SEGRETI
2006).
Neste grupo de ESBL também estão as enzimas GES-2, isolada em P.
aeruginosa na África dom Sul e resistente ao imipenem, e GES-3, isolada na Grécia
em E. coli. Na América do Sul, há relatos da detecção de genes bla
GES
apenas em P.
aeruginosa (CASTANHEIRA et al. 2004; KYOO et al. 2005; PASTERÁN et al.
2005).
A variedade de enzimas β-lactamases com amplo espectro de especificidade
para os substratos explica muito bem o fato de que, juntas, constituem o mecanismo
de resistência mais importante de bacilos Gram negativos. São capazes de hidrolisar
a maioria dos compostos β-lactâmicos utilizados atualmente (Quadro 2), sendo
portanto um grande problema clínico. Sua especificidade para substratos é muito
ampla, incluindo quase todas as penicilinas, cefalosporinas (exceto cefamicinas) e
monobactâmicos. As cepas produtoras de ESBL podem parecer sensíveis, in vitro, a
alguns destes substratos, mas resultam, em falha terapêutica quando os mesmos são
utilizados in vivo (GNIADKOWSKI 2001; HERNÁNDEZ et al. 2005; RAMPHAL
& AMBROSE 2006).
2.1.4 Hidrólise de Antimicrobianos
As enzimas ESBL contêm um número de mutações que as permitem
hidrolisar antimicrobianos de amplo espectro. Ligam-se covalentemente com o sítio
Revisão da Literatura
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carbonila do anel β-lactâmico e inativam a molécula por hidrólise de sua ligação
amida (FORBES et al. 1998; KONEMAN et al. 2001).
Enquanto que as ESBL TEM e SHV possuem habilidade para hidrolisar as
penicilinas, não são tão eficientes cataliticamente quanto as suas enzimas de origem,
TEM-1 e SHV-1. Além disso, a expansão do sítio ativo que permite a atividade
aumentada contra as cefalosporinas de amplo espectro pode resultar em sensibilidade
aumentada aos inibidores das β-lactamases (BRADFORD 2001; GNIADKOWSKI
2001).
As enzimas mais freqüentes em isolados clínicos de K. pneumoniae, K.
oxytoca e E. coli conferem alto grau de resistência à ampicilina, ticarcilina e
cefalotina, e sensibilidade reduzida ao aztreonam e às oximino-cefalosporinas, como
cefotaxima, ceftriaxona e ceftazidima (KONEMAN et al. 2001).
A maioria das enzimas ESBL são derivadas dos tipos clássicos de β-
lactamases TEM e SHV, com maior atividade contra ceftazidima que contra
cefotaxima. Já o tipo CTX-M de ESBL (cefotaximase) tem alto nível de resistência à
cefotaxima e baixa atividade contra ceftazidima (COQUE et al. 2002; SABATÉ et al
2002; DAOUD & HAKIME 2003).
As ESBL não são ativas contra as cefamicinas (cefotetan e cefoxitina),
porém, já há relatos de cepas ESBL positivas resistentes a estas drogas devido à
perda de uma proteína porina da membrana celular externa. As enzimas do grupo
GES-1 foram descritas como ativas contra a cefoxitina (BRADFORD 2001; KYOO
et al. 2005; PFALLER & SEGRETI 2006).
Revisão da Literatura
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2.1.5 Detecção e Identificação
A detecção das ESBL se dá através de métodos fenotípicos de triagem e
confirmação da presença ou ausência das enzimas. A identificação dos grupos de
ESBL é feita através de métodos moleculares como PCR (Reação em Cadeia de
Polimerase) e seus derivados, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),
SSCP (Single-strand Conformational Polymorphism); Oligotipagem; LCR (Reação
em Cadeia de Ligase); Hibridização e Sequenciamento (JARLIER et al. 1988;
BRADFORD 2001; KONEMAN et al. 2001; COQUE et al. 2002; SABATÉ et al.
2002; DAOUD & HAKIME 2003; NCCLS 2003a,b; SAMAHA-KFOURY e ARAJ
2003; STÜRENBURG e MACK 2003; TENOVER et al. 2003; SHAH et al. 2004).
A PCR possibilita a amplificação de seqüências de DNA através da utilização
de iniciadores específicos (primers). Permite a replicação, in vitro, de uma seqüência
definida do DNA, sendo esta amplificada de forma exponencial e possível de ser
visualizada após uma eletroforese (MATTÉ 1996; MATTÉ 2003).
A técnica de PFGE, segundo Matté (2003) e Martins-Loureiro et al. (2001) é
uma das mais utilizadas em estudos epidemiológicos. Em surtos hospitalares é
necessário a descoberta da fonte de infecção e da relação genética entre as cepas
isoladas, a qual pode ser feita através da eletroforese em campo pulsado, capaz de
revelar padrões de bandas específicos para cada cepa bacteriana após a utilização de
enzimas que fragmentam determinadas regiões do DNA (MATTÉ 2003).
Tosin et al. (2003) em um estudo epidemiológico em hospitais brasileiros
(integrado ao programa internacional de vigilância SENTRY), avaliaram a técnica de
PFGE para a caracterização genotípica de bacilos Gram negativos. O método,
segundo os autores, fornece informações únicas sobre o perfil molecular das cepas,
Revisão da Literatura
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podendo ser muito útil na determinação da disseminação clonal e da fonte de
infecção em caso de ocorrência de surtos.
Tenover et al. (1995) descreve uma metodologia simplificada de
agrupamento de perfis moleculares gerados por PFGE, para facilitar a investigação
de pequenos surtos hospitalares.
2.2. ESBL e Infecção Hospitalar
As ESBL são mundialmente reconhecidas como um problema para pacientes
hospitalizados. Nos últimos anos, a freqüência de ESBL aumentou muito em todo o
mundo, sendo hoje um dos maiores problemas terapêuticos em muitas instituições.
Os surtos normalmente se iniciam na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) e se
disseminam pelo hospital por vias tradicionais, como contato com profissionais da
instituição e/ou fômites contaminadas (BRADFORD 2001; DAOUD & HAKIME
2003; SAMAHA-KFOURY e ARAJ 2003; STÜRENBURG e MACK 2003).
As cepas produtoras de ESBL e/ou seus genes codificadores das enzimas são
capazes de se estabelecer permanentemente nos hospitais, produzindo surtos de
infecção e de colonização, principalmente em setores onde os pacientes possuem um
alto nível de comprometimento imunológico, debilidade e manipulação, além do uso
excessivo de antimicrobianos de amplo espectro. Isto ocorre devido à localização dos
genes para ESBL em plasmídios ou em transposons, que são facilmente transferíveis
entre cepas por conjugação (BRADFORD 2001; GNIADKOWSKI 2001; COQUE et
al. 2002; SABATÉ et al. 2002; DAOUD & HAKIME 2003; STÜRENBURG e
MACK 2003).
Revisão da Literatura
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A disseminação das ESBL é facilitada por diversos aspectos, como a
diversidade de β-lactamases relacionadas diretamente entre si na sua evolução, a
prevalência mundial de seus tipos específicos, a facilidade relativa do surgimento de
uma ESBL, a mobilidade de seus genes e a forte pressão seletiva do uso
indiscriminado dos antimicrobianos (KLIEBE et al. 1985; GNIADKOWSKI 2001;
PEÑA et al. 2001; DAOUD & HAKIME 2003; LI et al. 2003).
Cavassin (2003), após um levantamento bibliográfico entre 1990 e 2003,
conclui que 17% dos pacientes atingidos por infecções hospitalares são de UTI,
número que se eleva para 30% em neonatos. Em seu estudo, descreve um surto por
Klebsiella pneumoniae em uma UTI neonatal, que se estende por sete meses, até sua
erradicação após medidas de prevenção de contato.
Mesmo havendo atualmente uma grande “corrente” de conscientização
quanto ao uso racional dos antimicrobianos e às boas práticas de higiene no ambiente
hospitalar entre profissionais da saúde, o grande número de publicações descrevendo
surtos, colonizações prolongadas em pacientes internados e casos de infecções na
comunidade por bactérias multi-resistentes, mostra que estas situações ocorrem com
muita freqüência e podem evoluir para situações endêmicas complexas, com uma
grande variedade de cepas expressando combinações múltiplas de mecanismos de
resistência.
2.3. Colonizações, Surtos e Infecções
As infecções invasivas por cepas produtoras de ESBL estão relacionadas
provavelmente à colonização prévia e formação de biofilme. A colonização por
cepas multi-resistentes é considerada um pré-requisito para a infecção, e na vigência
Revisão da Literatura
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de surtos ou para fins de pesquisa deve ser investigada inclusive em pessoas
saudáveis. O aumento da proporção de portadores destas cepas aumenta o risco de
outros indivíduos se tornarem portadores como conseqüência da transmissão
ambiental ou de pessoa para pessoa. Bagattini et al. (2006), em um estudo da
epidemiologia molecular de K. pneumoniae em uma UTI Neonatal na Itália,
identificaram o clone de um surto em amostras ambientais e em um dos servidores da
instituição (VALVERDE et al. 2004).
Mesmo em UTI neonatais, apesar dos pacientes não possuírem microflora
intestinal ao nascerem e a desenvolverem mais lentamente, espécies de Klebsiella
têm sido altamente prevalentes como colonizadoras, produtoras de ESBL e
causadoras de infecções (BRADFORD 2001; MARTINS-LOUREIRO et al. 2001;
STÜRENBURG & MACK 2003; DAOUD & HAKIME 2003).
No estudo de Pessoa-Silva et al. (2003), dos 13 neonatos infectados por K.
pneumoniae ESBL positivas, 12 sofreram colonização prévia por este
microrganismo, e em um total de 383 neonatos, 206 foram colonizados. Segundo os
autores, a probabilidade de colonização com patógenos hospitalares em UTI
neonatais aumenta com o tempo: até o décimo dia de internação, 40% das crianças
são colonizadas, porcentagem que sobe para 90% após um mês.
Em situações de surto ou endemias graves, uma das medidas de controle da
colonização do trato digestivo por cepas ESBL-positivas é a análise periódica de
amostras de swab retal dos pacientes internados, principalmente em UTI neonatais e
pediátricas, e em pacientes recém admitidos no hospital.
Decré et al. (2004) relatam um surto por cepas de Klebsiella oxytoca isoladas
tanto de amostras clínicas como de swab retal, produtoras de ESBL e expressando
Revisão da Literatura
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uma superprodução de β-lactamases constitutivas do grupo OXY. Estas cepas
também eram resistentes a aminoglicosídeos, fluoroquinolonas e sulfametoxazol.
Técnicas moleculares (PFGE e ERIC-PCR) identificaram dois clones relacionados ao
surto, sendo que um deles era responsável apenas pela produção das enzimas OXY-
2, e o outro pela produção tanto da enzima cromossômica como de ESBL.
Valverde et al. (2004) realizaram um estudo comparando a prevalência da
produção de ESBL por cepas isoladas de amostras fecais nos anos de 1991 e 2003. A
instituição estudada já realizava a triagem para produção de ESBL em todas as
enterobactérias isoladas desde 1987. As amostras eram de pacientes hospitalizados e
ambulatoriais, coletadas em períodos em que certamente não havia surtos. Nenhum
dos pacientes ambulatoriais freqüentava serviços de saúde ou eram moradores de
casas de repouso. Em 1991, a prevalência de portadores de cepas ESBL era duas
vezes maior na comunidade que entre pacientes internados, situação que se inverteu
em 2003, em que a prevalência de portadores hospitalizados foi duas vezes maior
que nos ambulatoriais. Os autores atribuem este aumento significativo no número de
portadores de cepas ESBL no ambiente hospitalar à pressão seletiva do uso
inadequado de drogas antibacterianas.
Há uma forte associação entre o alto consumo de antimicrobianos em uma
população e a freqüência do isolamento de bactérias resistentes. Os resultados da
participação do Brasil no programa SENTRY de vigilância de infecções hospitalares
(1997-1999), apresentados por Sader et al. (2001) mostram o contraste entre as
proporções de cepas de K. pneumoniae e E. coli produtoras de ESBL no Brasil (50%
e 9%, respectivamente) e nos Estados Unidos (5% e 2%, respectivamente), e Europa
(15-20% para K. pneumoniae). Os autores ressaltam que, apesar de haver
Revisão da Literatura
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disseminação dos genes para ESBL através de plasmídios, a grande variabilidade
genética encontrada entre as cepas no Brasil sugere a seleção contínua de mutantes
resistentes, devido principalmente ao uso de cefalosporinas de terceira geração.
Motta et al. (2003) relatam que, na América Latina, bactérias resistentes são
uma ameaça a pacientes com infecções comuns na comunidade e nos hospitais. Em
seu trabalho, os autores verificaram a presença de ESBL em cepas de enterobactérias
isoladas de úlceras em pés de pacientes diabéticos, enfatizando que a resistência
entre bactérias Gram negativas está se tornando cada vez mais comum, mesmo fora
do ambiente hospitalar.
As infecções no trato urinário por enterobactérias ESBL positivas também
são muito freqüentes, tanto no ambiente hospitalar como na comunidade. Segundo
resultados da América Latina do programa SENTRY de 1997 a 2000, K. pneumoniae
e E. coli são as espécies produtoras de ESBL mais isoladas nestas infecções, sendo
ambas muito resistentes a várias classes antimicrobianas, inclusive fluoroquinolonas.
Embora o programa SENTRY seja voltado para a vigilância de infecções
hospitalares, neste estudo foram inclusas cepas de pacientes que haviam adquirido a
infecção na comunidade e necessitaram de internação devido à gravidade da mesma
(GALES et al. 2002).
O uso indiscriminado de antimicrobianos está entre os principais fatores de
risco para a ocorrência de infecções graves e surtos hospitalares (GNIADKOWSKI
2001; LAUTENBACH et al. 2001; LIN et al. 2003).
No controle do surto descrito por Peña et al. (1998), causado por K.
pneumoniae ESBL positiva, uma das medidas eficientes adotadas foi a restrição do
uso de oximino-cefalosporinas, que reduziu a tendência à infecção em pacientes da
Revisão da Literatura
_________________________________________________________________
41
UTI. Pessoa-Silva et al. (2003) analisando fatores de risco para colonização e
infecção por K. pneumoniae ESBL positiva em uma UTI neonatal, relacionaram a
associação cefalosporinas/aminoglicosídeos com o aumento do risco de colonização,
enquanto que a substituição destes por imipenem nos neonatos diminuiu este risco.
Em um estudo epidemiológico realizado em 15 hospitais do Brooklyn, NY,
cepas de K. pneumoniae ESBL positivas foram analisadas através de técnicas
moleculares (PCR, sequenciamento e ribotipagem automatizada). Dois grandes
grupos de cepas relacionadas geneticamente pertenciam a mais de 10 hospitais, e as
análises estatísticas dos dados obtidos no estudo revelaram que apenas o uso de
cefalosporinas e aztreonam estava direta e estatisticamente correlacionado com a
prevalência das cepas em cada hospital. Os autores consideram esta questão um
problema de saúde pública, e não apenas institucional, devido à falta de prioridade
das políticas de uso restrito de antimicrobianos no local (QUALE et al. 2002).
A importância do uso racional dos antimicrobianos se reafirma no estudo de
Rodríguez-Baño et al. (2004) na Espanha. Os autores analisam a epidemiologia de
cepas de Escherichia coli ESBL positivas causadoras de infecções urinárias em
pacientes ambulatoriais. Uma análise multivariada dos dados obtidos revela que os
fatores de risco estatisticamente significativos para a ocorrência destas infecções são,
entre outros, o uso prévio de fluoroquinolonas e as internações anteriores dos
pacientes. Paterson et al. (2000) e Bradford (2001) também observaram que
freqüentemente cepas produtoras de ESBL são mais resistentes às fluoroquinolonas
que as ESBL negativas, e esta relação é bastante pesquisada por outros autores
(MARTÍNEZ-MARTÍNEZ et al. 1998, 2002; PATERSON et al. 2000; SIROT et al.
2002; YU et al. 2002; TOLUN et al. 2004).
Objetivos
_________________________________________________________________
42
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar geneticamente cepas da família Enterobacteriaceae produtoras
de ESBL isoladas de pacientes de um hospital da rede pública da cidade de São
Paulo.
3.2 Objetivos Específicos
• Pesquisar a presença de genes codificadores da produção de
diferentes grupos de ESBL nas cepas estudadas;
• Relacionar os grupos de ESBL encontrados com as espécies onde
foram detectados;
• Verificar a similaridade genética entre as cepas de Klebsiella
pneumoniae do estudo;
• Analisar os possíveis meios de disseminação de cepas de K.
pneumoniae de acordo com seus perfis moleculares e com os
genes bla que nelas forem detectados.
Material e Métodos
_________________________________________________________________
43
4. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Prática de Saúde Pública
da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo (FSP-USP), em
conjunto com o Comitê de Ensino e Pesquisa (COMEP), a Comissão de Controle de
Infecção Hospitalar (CCIH) e o Laboratório de Microbiologia Clínica de um hospital
da rede pública da cidade de São Paulo. O hospital caracteriza-se como instituição de
ensino e pesquisa na área de saúde e assistência hospitalar de média complexidade,
possuindo 258 leitos, distribuídos entre os setores: Centro Cirúrgico, Centro
Obstétrico, Unidades de Terapia Intensiva Adulta, Pediátrica e Neonatal, Unidade de
Terapia Semi-Intensiva, Berçário, Ambulatório, Pronto Socorro, Clínica Médica e
Pediátrica.
Os critérios utilizados para classificação de casos de infecções e colonizações
pela CCIH foram segundo o Manual para Prevenção das Infecções Hospitalares do
hospital, baseado em padronizações internacionais (CASSETARI et al. 2005).
4.1 Cepas Bacterianas
As cepas utilizadas no estudo foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de
Microbiologia Clínica do hospital, no período de Julho/2004 a Junho/2005.
Foram estudadas 135 cepas de enterobactérias caracterizadas como
produtoras de β-lactamases de espectro estendido (ESBL) após os testes laboratoriais
específicos, independentemente do tipo de amostra clínica e/ou do setor hospitalar
onde foram isoladas.
Material e Métodos
_________________________________________________________________
44
O laboratório clínico forneceu também os resultados dos testes de
identificação e de sensibilidade antimicrobiana realizados para cada cepa estudada. A
CCIH do hospital forneceu dados referentes à internação, estada em UTI e topografia
de cada caso de infecção hospitalar pelas cepas envolvidas neste estudo.
4.2 Determinação da Produção de ESBL
A triagem e a confirmação das cepas produtoras de ESBL foram realizadas
através do sistema automatizado Vitek System (BioMerieux, Hazlewood, MO), que
utiliza ceftazidima e cefotaxima, isoladas e associadas ao ácido clavulânico (4
µg/mL). A redução do crescimento nas lacunas contendo clavulanato comparado
àquelas contendo as drogas isoladas indica a presença de ESBL (SHAH et al. 2004).
A confirmação também foi feita manualmente, pelo método da combinação
de discos, ilustrada na Figura 3, que utiliza discos contendo: ceftazidima (30µg),
ceftazidima (30µg) associada ao ácido clavulânico (10µg), cefotaxima (30µg),
cefotaxima (30µg) associada ao ácido clavulânico (10µg), cefpodoxima (10µg) e
cefpodoxima (10µg) associada ao ácido clavulânico (1µg). Um aumento maior ou
igual a 5mm na zona de inibição do disco associado ao inibidor de β-lactamase
indica produção de ESBL.
Material e Métodos
_________________________________________________________________
45
Figura 3 – método da combinação de discos em cepas de K. oxytoca (produtora de
CTX-M-1 - ESBL), E. coli (produtora de TEM-52 – ESBL) e K. pneumoniae
(produtora de SHV-18 – ESBL), respectivamente.
4.3 Extração de DNA total
A extração do DNA total foi realizada para todas as cepas de enterobactérias,
segundo Chapman et al. (2001).
Cada cepa foi reisolada em Ágar MacConkey e incubada a 35°C por 18-24h.
De cada placa, inoculou-se uma colônia em 10mL de caldo Luria 0,5% de NaCl, em
tubos tipo Falcow
®
, incubando-os a 35°C por 18-24h.
Os tubos foram então centrifugados a 5000rpm, a 24°C por 10 minutos.
Descartou-se o sobrenadante e as células do sedimento (pellet) foram ressuspensas
em 1mL de água mQ
®
estéril e transferidas para um microtubo tipo eppendorf
®
.
Os microtubos foram centrifugados a 12000rpm, a 24°C por 3min. Cada
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 200µL de água mQ
®
estéril.
A suspensão foi então submetida ao banho de água a 95°C, por 10 minutos, e
em seguida colocada em freezer a -20°C, por 30 minutos. Os microtubos foram então
retirados do freezer e colocados em repouso em temperatura ambiente até o
descongelamento.
Material e Métodos
_________________________________________________________________
46
Os microtubos foram centrifugados a 12000rpm, a 24°C por 10min e o
sobrenadante contendo o material genético transferido para um novo tubo de
eppendorf
®
. Os tubos contendo o DNA foram armazenados em freezer a -20°C.
4.4 Identificação dos grupos de ESBL pela Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR)
Foram pesquisados os grupos de ESBL TEM, SHV, CTX-M, OXA, PER,
VEB e GES. Toda a técnica realizada, bem como os pares de iniciadores (primers)
utilizados (Quadro 4), foram baseados na metodologia descrita por Cao et al. (2002),
com modificações. Apenas o par de iniciadores para pesquisa do gene bla
PER-2
foi
utilizado segundo Bauerfeind et al. 1996.
Foram utilizados controles positivos gentilmente cedidos pela Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da USP (FCF-USP) e pela Universidade Federal de São
Paulo (UNIFESP), além de cepas da Americam Type Culture Colection (ATCC).
Cada microtubo de reação continha um volume total de 25µL, nos quais havia
os seguintes reagentes nas respectivas concentrações: DNA total 25ng, tampão 1X
sem Mg, MgCl
2
1,5mM, dntp 200µM, iniciadores 50pmol cada, e Taq-DNA-
polimerase 2U.
Em um termociclador (Mastercycler gradient, Eppendorf), a reação ocorreu
com uma denaturação inicial a 94°C por 2 min., seguida de 30 ciclos consistindo de:
denaturação a 94°C por 45s, anelamento a 52°C por 1 min., e extensão a 72°C por
1minuto. Após a finalização dos ciclos, houve uma extensão final a 72°C por 10
minutos.
Material e Métodos
_________________________________________________________________
47
Os produtos de PCR, juntamente com um marcador de peso molecular (100bp
MassRuler™ DNA Ladder, Fermentas), foram submetidos a uma eletroforese a
6V/cm em gel de agarose a 1,8%, corado com brometo de etídio e visualizado em luz
ultravioleta (Epi Chemi II Darkroom, UVP Bioimaging Systems).
Quadro 4 – Seqüência de iniciadores para a detecção dos genes bla.
GENES SEQUÊNCIA 5’-3’ POSIÇÃO Fonte Controle Positivo
Bla
TEM
TCGGGGAAATGTGCGCG
TGCTTAATCAGTGAGGCACC
90-105
1042-1062
Cao et al. 2002
K. pneumoniae; TEM-3
FCF-USP
bla
SHV
TTATCTCCCTGTTAGCCACC
GATTTGCTGATTTCGCTCGG
23-42
799-818
Cao et al. 2002
K. pneumoniae; SHV-18
FCF-USP
bla
CTX-M
SCSATGTGCAGYACCAGTAA
CCGCRATATGRTTGGTGGTG
270-289
794-813
Cao et al. 2002
E. coli
FCF-USP
bla
OXA-10
TTAGGCCTCGCCGAAGCG
CTTTGTTTTAGCCACCAATGATG
7331-7348
8297-8319
Cao et al. 2002
Não
bla
PER-1
ATGAATGTCATTATAAAAGC
AATTTGGGCTTAGGGCAGAA
309-328
1233-1214
Cao et al. 2002
Não
bla
PER-2
CGCTTCTGCTCTGCTGAT
GGCAGCTTCTTTAACGCC
307-324
758-775
Bauerfeind et al., 1996
E. aerogenes
(FCF-USP)
bla
VEB-1
CGACTTCCATTTCCCGATGC
GGACTCTGCAACAAATACGC
128-151
1198-1180
Cao et al. 2002
Não
bla
GES-1
ATGCGCTTCATTCACGCAC
CTATTTGTCCGTGCTCAGG
1322-1340
2095-2077
Cao et al. 2002
P. aeruginosa 2663
(UNIFESP)
Material e Métodos
_________________________________________________________________
49
4.5 Comparação genética entre as cepas de Klebsiella pneumoniae por
Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE)
A técnica de PFGE foi realizada para as 95 cepas identificadas como
Klebsiella pneumoniae produtoras de enzimas ESBL, uma vez que foi a espécie
isolada em maior quantidade no hospital no período estudado.
O procedimento foi baseado na metodologia descrita pelo Center for Diseases
Control (CDC) (2004). Esta técnica foi descrita para cepas de outras enterobactérias
(Escherichia coli, Salmonella e Shigella sonnei), e algumas modificações foram
necessárias para adaptá-la às cepas de K. pneumoniae.
A cepa ATCC 13883 de K. pneumoniae, fornecida pela Coleção de Cultura
do Instituto Adolfo Lutz (IAL 1920), foi utilizada como controle positivo para esta
técnica.
4.5.1. Preparo do plug
As cepas foram reisoladas em ágar MacConkey (MC) e incubadas a 35°C por
18-24h. Uma única colônia de cada cepa foi então semeada em 30mL de caldo Luria
a 0,5% de NaCl, e incubada novamente a 35°C por 18-24h.
As culturas foram então centrifugadas a 5000RPM por 15 minutos, em
temperatura ambiente. Descartou-se o sobrenadante e as células foram ressuspensas
em 1mL de solução tampão TE I (Tris-HCl 10mM, pH 7,5; EDTA 1mM, pH 8,0) e
transferidas para microtubos tipo eppendorf
®
, os quais foram centrifugados a
12000RPM por 5 minutos a 24°C.
Adicionou-se então às células 400µL de TE I, e desta suspensão, 80µL foram
adicionados a 320µL de agarose para Pulsed Field a 1%, a 55-60°C. Em seguida, os
Material e Métodos
_________________________________________________________________
50
moldes (3 por amostra) para confecção dos plugs foram preenchidos e incubados por
15 minutos a 4°C, para solidificação.
4.5.2. Extração de DNA Genômico
Os plugs foram então retirados dos moldes e colocados em 5mL de uma
solução de lise (EDTA 50mM, pH8,0; Tris-HCl 50mM, pH 7,5; SDS 20%, Sarkosyl
1%, proteinase K 20mg/mL), em tubos tipo Falcow
®
, e incubados a 55°C por 2h.
Após a incubação, foram realizadas 2 lavagens dos plugs em 10mL de água
mQ
®
e 4 lavagens em 10mL de TE I (Tris-HCl 10mM, pH 7,5; EDTA 1mM, pH8,0),
com intervalos de 15min, a 55°C.
Os plugs foram então transferidos para um microtubo tipo Eppendorf
®
e
estocados em 1mL de TE I a 4°C, até o momento do uso.
4.5.3. Digestão Enzimática
A enzima de restrição utilizada foi a XbaI, que fornece fragmentos de
restrição com peso molecular adequado para a corrida eletroforética e para a
visualização dos perfis moleculares das cepas estudadas (MARTINS-LOUREIRO et
al. 2001; XIONG et al. 2002, GRUTEKE et al. 2003; PESSOA-SILVA et al. 2003;
CARTELLE et al. 2004).
Para este procedimento foi utilizado apenas um plug por amostra. Cada plug
foi transferido para um novo microtubo e neste adicionou-se 300µL do tampão
específico da enzima XbaI, diluído de 10X para 1X, segundo instruções do
fabricante. Os tubos foram então incubados em banho-maria a 37°C por 30 minutos.
Após este período, retirou-se o tampão da enzima e adicionou-se 300µL de uma
Material e Métodos
_________________________________________________________________
51
solução contendo novo tampão da enzima 1X, albumina bovina acetilada (BSA)
0,01% e 10U de XbaI, e as amostras foram incubadas a 37°C por 18h.
4.5.4. Eletroforese em Campo Pulsado
Após a digestão pela enzima XbaI, os fragmentos de restrição foram
submetidos à eletroforese em campo pulsado (Chef Mapper (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA).
Em um gel de agarose para Pulsed Field a 1% em solução tampão TBE 0,5X
(Tris-borato 45mM, EDTA dissódico 1mM, pH 8,0), foram colocados os plugs das
amostras e de 1 marcador de peso molecular (multimeric phase lambda DNA ladder
48, 5Kb, Bio-Rad).
As condições utilizadas na eletroforese foram: voltagem de 6V/cm, a 14°C,
por 20h, com intervalo de pulsos de 3,51s a 30,82s.
4.5.5. Visualização
O gel de PFGE foi corado em brometo de etídio 1µg/mL, durante 1h, e
visualizado em luz ultravioleta (Epi Chemi II Darkroom, UVP Bioimaging Systems).
Material e Métodos
_________________________________________________________________
52
4.6 ANÁLISE DOS RESULTADOS
4.6.1 PCR
As imagens dos géis, capturadas em sistema para aquisição de imagem
(Epi Chemi II Darkroom e LabWorks Software, UVP Bioimaging Systems,
Upland, CA), foram analisadas visualmente. Os grupos de ESBL foram
identificados pelo peso molecular dos produtos da reação de PCR, o qual será
estimado após a comparação com a imagem do marcador de peso molecular
utilizado (MATTÉ 2003).
4.6.2 PFGE
Após a captação das imagens dos géis de PFGE (Epi Chemi II Darkroom,
UVP Bioimaging Systems), o polimorfismo das bandas geradas pela eletroforese
foi analisado primeiramente segundo Tenover et al. 1995, para o agrupamento de
perfis similares. Após este agrupamento, os perfis de fragmentos de DNA
observados foram analisados no programa GelWorks 1D Advanced – UVP,
versão 4.01 e GelWorks 1D Database versão 1.12 – UVP Bioimaging Systems,
Upland, CA.
Os perfis foram agrupados segundo o coeficiente de similaridade de Dice
e demonstrados graficamente em dendrogramas (MATTÉ 2003).
Resultados
_________________________________________________________________
53
5. RESULTADOS
5.1 Cepas Bacterianas
No período estudado (Julho/2004 a Junho/2005), foram isoladas, de amostras
clínicas de 92 pacientes, 135 cepas de enterobactérias produtoras de ESBL, sendo 97
(71,9%) Klebsiella pneumoniae, 18 (13,3%) Escherichia coli, 8 (5,9%) Morganella
morganii, 4 (3,0%) Proteus mirabilis, 2 (1,5%) Klebsiella oxytoca, 2 (1,5%)
Providencia rettgeri, 2 (1,5%) Providencia stuartti, 1 (0,7%) Enterobacter
aerogenes e 1 (0,7%) Enterobacter cloacae. Segundo avaliação da CCIH do hospital,
82 (61,6%) casos foram de colonização pela cepa isolada, 19 (14,3%) foram
infecções comunitárias ou não relacionadas à instituição, e 32 (24,1%) foram
consideradas infecções hospitalares. Dos casos de colonização, 55 (40,7%) eram
provenientes de amostras de rotina e 27 (20%) de culturas de vigilância.
Os setores do hospital onde as cepas foram obtidas são: Ambulatório, Pronto
Socorro (PS), Clínica Cirúrgica, Clínica Médica, Clínica Pediátrica, Unidades de
Terapia Intensiva (UTI) Adulta, Neonatal e Pediátrica, Unidade de Terapia Semi-
Intensiva (SEMI) e Berçário. O número e a porcentagem de cepas isoladas em cada
setor estão relacionados na Tabela 1.
Tabela 1 – Número e porcentagem de espécies da família Enterobacteriaceae produtoras de ESBL nos setores do hospital, Julho/2004 a
Junho/2005.
SETOR
Clínica Clínica Clinica UTI UTI UTI
ESPÉCIE
Ambulatório
PS
Cirúrgica Médica Pediátrica Adulta Neonatal Pediátrica
SEMI Berçário Total
nº (%) nº (%) nº (%) nº (%) nº (%) nº (%) nº (%) nº (%)
nº
(%)
nº (%) nº (%)
K. pneumoniae
5 (3,7) 3 (2,2) 1 (0,7) 8 (6,0) 4 (3,0) 7 (5,2) 13 (9,6) 7 (5,2)
3
(2,2)
46 (34,1)
97 (71,8)
E. coli
2 (1,5) 1 (0,7) 5 (3,7) 4 (3,0) 1 (0,7) 3 (2,2) 0 (0) 2 (1,5) 0 (0) 0 (0)
18 (13,3)
M. morganii
3 (2,2) 3 (2,2) 0 (0) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7)
8 (6,0)
P.mirabilis
0 (0) 2 (1,5) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0)
1
(0,7)
0 (0)
4 (3,0)
K. oxytoca
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
2 (1,5)
P. rettgeri
1 (0,7) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
2 (1,5)
P. stuartti
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (1,5) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
2 (1,5)
E. aerogenes
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
1 (0,7)
E. cloacae
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (0,7) 0 (0) 0 (0)
1 (0,7)
Total 11 (8,1) 10 (7,4) 6 (4,4) 13 (9,6) 6 (4,4) 15 (11,1) 13 (9,6) 10 (7,4) 4 (3) 47 (34,8) 135 (100)
Resultados
_________________________________________________________________
55
5.2 Identificação dos Grupos de ESBL pela PCR
A identificação dos grupos de ESBL produzidas pelas cepas deste estudo foi
realizada pela PCR, com iniciadores específicos. Todas as 135 cepas tiveram seu
DNA total extraído para a pesquisa da presença dos genes bla
SHV
, bla
TEM
, bla
CTX-M
,
bla
GES
, bla
VEB
, bla
OXA
, bla
PER-1
e bla
PER-2
.
A presença do gene bla
SHV
foi detectada em 81 (60,0%) cepas, sendo 71
(87,7%) Klebsiella pneumoniae, 4 (4,9%) Escherichia coli, 2 (2,5%) Morganella
morganii, 2 (2,5%) Proteus mirabilis, 1 (1,2%) Providencia rettgeri, e 1 (1,2%)
Enterobacter cloacae.
O gene bla
TEM
foi detectado em 23 (17,0%) cepas, sendo 16 (69,6%) K.
pneumoniae, 3 (13,0%) E. coli, 2 (8,7%) P. mirabilis, 1 (4,35%) M. morganii, e 1
(4,35%) Klebsiella oxytoca.
O gene bla
CTX-M
estava presente em 44 (32,6%) cepas: 24 (54,5%) K.
pneumoniae, 8 (18,2%) E. coli, 5 (11,4%) M. morganii, 3 (6,8%) P. mirabilis, 2
(4,5%) Providencia stuartti, 1 (2,3%) K. oxytoca, e 1 (2,3%) Enterobacter
aerogenes.
Detectou-se a presença do gene bla
GES
em 4 (3,0%) cepas: 3 (75%) P.
mirabilis e 1 (25%) K. pneumoniae. O gene bla
VEB
foi encontrado em 6 (4,4%) cepas
destas mesmas espécies: 5 (83,3%) K. pneumoniae e 1 (16,7%) P. mirabilis. 11
(8,1%) cepas apresentavam o gene bla
PER-2,
sendo 8 (72,7%) K. pneumoniae, 2
(18,2%) P. stuartti, e 1 (9,1%) E. coli.
Os genes bla
OXA
e bla
PER-1
não foram detectados nas cepas estudadas. Em 25
(18,5%) cepas nenhum dos genes pesquisados foi identificado.
Resultados
_________________________________________________________________
56
Os genes presentes em cepas de pacientes do Ambulatório foram: bla
SHV
em
K. pneumoniae, E. coli, M. morganii e P. rettgeri; bla
TEM
em K. pneumoniae; e
bla
CTX-M
em K. pneumoniae, M. morganii e E. coli. No Pronto Socorro os isolados
continham os genes bla
SHV
e bla
TEM
em K. pneumoniae e P. mirabilis; bla
CTX-M
em
K. pneumoniae, E. coli, P. mirabilis e M. morganii; e bla
GES
e bla
VEB
em P.
mirabilis.
Nas cepas da Clínica Cirúrgica detectou-se os genes bla
SHV
em E. coli e K.
pneumoniae, e bla
TEM
e bla
CTX-M
apenas em E. coli. No setor de Clínica Médica,
bla
TEM
e bla
CTX-M
foram detectados em K. pneumoniae, E. coli e M. morganii; bla
SHV
foi encontrado em K. pneumoniae e E. coli; e bla
VEB
em K. pneumoniae. Na Clínica
Pediátrica, os genes encontrados foram bla
SHV
em K. pneumoniae, bla
TEM
em K.
oxytoca e bla
CTX-M
em K. pneumoniae e E. coli.
Nos isolados de pacientes da UTI Adulta, foram detectados os genes bla
SHV
e
bla
TEM
em K. pneumoniae; bla
CTX-M
em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli, P.
mirabilis, E. aerogenes e P. stuartii; bla
GES
em K. pneumoniae; e bla
PER-2
em P.
stuartii. Na UTI Neonatal, onde só foram isoladas cepas de K. pneumoniae,
detectou-se a presença dos genes bla
SHV
, bla
TEM
, bla
CTX-M
, bla
VEB
e bla
PER-2
. Na UTI
Pediátrica os genes observados foram: bla
SHV
em K. pneumoniae, E. coli e E.
cloacae; bla
TEM
em K. pneumoniae e E. coli; bla
CTX-M
em K. pneumoniae e E.
cloacae; e bla
PER-2
em K. pneumoniae e E. coli.
No Berçário, foram isoladas 46 cepas de K. pneumoniae e 1 de M. morganii.
Nas cepas de K. pneumoniae, os genes detectados foram: bla
SHV
, bla
TEM
, bla
CTX-M
,
bla
VEB
e bla
PER-2
. Cada cepa apresentou até 4 destes genes em seu DNA total. Na
cepa de M. morganii detectou-se a presença do gene bla
CTX-M
.
Resultados
_________________________________________________________________
57
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
795 pb
972 pb
543 pb
860 pb
468 pb
642 pb
1031 pb
Figura 4 – Exemplos da detecção de genes bla em algumas espécies da família
Enterobacteriaceae. Linhas 1 e 10, 100bp MassRuler™ DNA Ladder, Fermentas;
Linha 2, bla
SHV
em K. pneumoniae; Linha 3, bla
TEM
em K. pneumoniae; Linha 4,
bla
TEM
em P. mirabilis; Linha 5, bla
CTX-M
em P. mirabilis; Linha 6, bla
CTX-M
em K.
pneumoniae; Linha 7, bla
GES
em P. mirabilis; Linha 8, bla
GES
em K. pneumoniae;
Linha 9, bla
PER-2
em P. stuartii; Linha 11, bla
VEB
em K. pneumoniae.
Na Figura 4 são observados exemplos de cepas positivas para os genes bla
nas espécies de Enterobacteriaceae. A tabela 2 apresenta a distribuição em número e
porcentagem de cepas em que se detectou cada um dos genes bla, nos diferentes
setores do hospital.
Tabela 2 – Distribuição em número e porcentagem de cepas contendo genes bla para grupos de ESBL, Julho/2004 a Junho/2005.
SETOR
Clínica Clínica Clinica UTI UTI UTI
Ambulatório PS
Cirúrgica Médica Pediátrica Adulta Neonatal Pediátrica
SEMI Berçário
Grupo de
ESBL
n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%)
N°
(%)
n° (%)
SHV
9 (82) 4 (40) 2 (33) 7 (54) 3 (50) 6 (40) 11 (85) 8 (80) 1 (25) 30 (64)
TEM
1 (9) 3 (30) 1 (17) 5 (38) 1 (17) 2 (13) 4 (31) 2 (20) 1 (25) 2 (4)
CTX-M
3 (27) 6 (60) 2 (33) 7 (54) 3 (50) 12 (80) 1 (8) 3 (30) 2 (50) 6 (12)
GES
0 (0) 2 (20) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1(7) 0 (0) 0 (0) 1 (25) 0 (0)
VEB
0 (0) 1 (10) 0 (0) 2 (15) 0 (0) 0 (0) 2 (15) 0 (0) 0 (0) 1 (2)
PER-2
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (13) 4 (31) 2 (20) 0 (0) 3 (6)
Não
Identificado
3 (27) 2 (20) 2 (33) 2 (15) 1 (17) 2 (13) 1 (8) 1 (10) 1 (25) 10 (22)
Resultados
_________________________________________________________________
59
5.3 Comparação genética entre as cepas de Klebsiella pneumoniae
por PFGE
No presente estudo, das 135 cepas produtoras de ESBL estudadas, 97 (71,9%)
eram de Klebsiella pneumoniae, e estas tiveram seus perfis moleculares analisados e
comparados após a realização da técnica de PFGE.
Foram identificados 8 perfis genéticos principais, PF 1 a PF 8, em 68 (70,1%)
cepas, os quais apresentaram similaridade mínima de 78%. O dendrograma
apresentado na Figura 5 apresenta a relação entre estes perfis, com o respectivo
número de cepas apresentando cada padrão molecular.
As outras 29 (29,8%) cepas apresentaram perfis diversos, como pode ser
observado nos exemplos da Figura 6.
As cepas do Berçário do hospital apresentaram 11 perfis distintos, PF 1 a PF
8, e três perfis isolados. A análise em separado de todos estes padrões foi realizada,
resultando no dendrograma da Figura 7.
Resultados
_________________________________________________________________
60
Figura 5 – Representação gráfica da matriz de similaridade de Dice, dos perfis
obtidos por meio de PFGE em cepas de K. pneumoniae produtoras de ESBL isoladas
na instituição, no período de Julho de 2004 a Junho de 2005. *n = número de cepas
apresentando cada padrão molecular.
M 8 32 53 59 64 69 110 2 37
Figura 6 – PFGE - exemplos de cepas de K. pneumoniae apresentando perfis
distintos. Cepas 8, 32, 53, 59, 64, 69 e 110 provenientes da Unidade de Terapia
Intensiva; cepas 2 e 37 provenientes da Unidade de Terapia Semi-Intensiva. São
Paulo, Julho de 2004 a Junho de 2005.
Resultados
_________________________________________________________________
61
Os diferentes setores da instituição apresentaram de 0 a 8 dos perfis
analisados e denominados PF 1 a PF 8. Na UTI Adulta, Clínica Médica, Clínica
Cirúrgica e Unidade de Terapia Semi-Intensiva, apenas perfis isolados foram
identificados.
Cada perfil molecular foi observado em até 5 setores do hospital, como se
pode observar na Tabela 3. As Figuras 8a e 8b apresentam os períodos em que estas
cepas foram isoladas.
Ocorrência dos perfis moleculares nos setores do hospital
Figura 7 – Representação gráfica da matriz de similaridade de Dice, dos perfis
obtidos por meio de PFGE cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBL,
isoladas no Berçário do hospital, no período de Agosto de 2004 a Fevereiro de 2005.
As cepas 47, 78 e 86 pertencem a perfis moleculares isolados. *n = número de cepas
apresentando cada padrão molecular.
Tabela 3 - Distribuição em número e porcentagem de cepas de K. pneumoniae e respectivos perfis moleculares por setor do hospital, de
Julho/2004 a Junho/2005.
Perfis
Setores
PF 1 PF 2 PF 3 PF 4 PF 5 PF 6 PF 7 PF 8
Isolados
TOTAL
n° (%) N° (%) N° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%) n° (%)
Berçário
9 (9,3) 3 (3,1) 5 (5,1) 10 (10,3) 7 (7,2) 6 (6,2) 2 (2,1) 1 (1) 3 (3,1)
46 (47,4)
Ambulatório
1 (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 0 (0) 4 (4,1)
6 (6,2)
PS
0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (3,1)
4 (4,1)
UTI Neonatal
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (2,1) 3 (3,1) 5 (5,1) 1 (1) 1 (1)
12 (12,4)
UTI Adulta
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 7 (7,2)
7 (7,2)
UTI Pediátrica
2 (2,1) 0 (0) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 3 (3,1) 1 (1) 0 (0) 0 (0)
7 (7,2)
Clínica Médica
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 7 (7,2)
7 (7,2)
Clínica Cirúrgica
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (1)
1 (1)
Clínica Pediátrica
0 (0) 2 (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (2,1) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
4 (4,1)
SEMI
0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (3,1)
3 (3,1)
TOTAL
12 (12,4) 5 (5,1) 5 (5,1) 12 (12,4) 9 (9,3) 15 (15,5) 8 (8,2) 2 (2,1) 29 (29,9) 97 (100)
n° de Pacientes
10 4 4 10 8 5 5 2 21 69
Resultados
_________________________________________________________________
63
Berçário
O aparecimento de isolados de K. pneumoniae produtoras de ESBL em
pacientes do Berçário a partir de agosto de 2004 levou a CCIH da instituição a
suspeitar da ocorrência de um surto. Iniciou-se então em novembro do mesmo ano a
coleta periódica de amostras de swab anal de todos os pacientes do setor, para cultura
de vigilância.
Os padrões moleculares analisados (PF 1 a PF 8) foram observados em 43
cepas do Berçário, além de três isolados com perfis diferentes destes. Na Figura 9
está a distribuição de todos os isolados e seus respectivos perfis durante o período do
surto. As Figuras 10a e 10b apresentam a distribuição das cepas causadoras de
infecções e colonizações, respectivamente, isoladas antes e após o início das culturas
de vigilância.
Figura 8a - Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares observados no hospital, de 20-26 de Junho (semana 1) a 25-31 de dezembro (semana 28) de 2004.
Figura 8b – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares observados no hospital, de 1-7 de janeiro (semana 29) a 24-30 de junho (semana 54) de 2005.
Figura 9 – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares observados no Berçário do hospital, de 31/7-6/8 de 2004 (semana
7) a 5-11/2 de 2005 (semana 35).
Figura 10a – Representação gráfica da distribuição de cepas de ESBL-Kp isoladas em pacientes do Berçário no período do surto,
provenientes de infecções, de 31/7-6/8 (semana 7) a 20-26/9 de 2004 (semana 23).
Figura 10b – Representação gráfica da distribuição de cepas de ESBL-Kp colonizadoras, isoladas em pacientes do Berçário no período do
surto, provenientes de culturas de vigilância, de 20-26/11 (semana 20) a 12-18/12 (semana 35) de 2004.
Resultados
_________________________________________________________________
68
Segundo Tenover et al., 1995, perfis que diferem do perfil principal de um
surto por 2 ou 3 fragmentos são considerados subtipos deste padrão, ou seja,
fortemente relacionados ao surto.
Sendo assim, os perfis PF 1 (16 bandas) e PF 4 (17 bandas), PF 3 (19) e PF 5
(17), e PF 7 (19) e PF 8 (19), poderiam ser unidos e considerados como clones
epidemiológicos. As Figuras 11, 12 e 13 apresentam a distribuição desses perfis
somados e em separado no período estudado.
Figura 11 – Representação gráfica da distribuição dos perfis moleculares PF 1, PF 4 e PF 1-4 no hospital, de 20-26 de junho de 2004
(semana 1) a 5-11 de fevereiro de 2005 (semana 33).
Resultados
_________________________________________________________________
70
Figura 12 – Representação gráfica da distribuição dos Perfis PF 3, PF 5 e PF 3-5 de
cepas de K. pneumoniae no hospital, de 25-31 de dezembro (semana 28) a 12-18 de
Fevereiro de 2005 (semana 34).
Figura 13– Representação gráfica da distribuição dos Perfis PF 7, PF 8 e PF 7-8 de
cepas de K. pneumoniae no hospital, 20-26 de junho (semana 1) a 18-24 de
dezembro (semana 25) de 2004.
Discussão
_________________________________________________________________
71
6. DISCUSSÃO
O controle da resistência a antimicrobianos tem se tornado prioridade para
hospitais e serviços relacionados à saúde no mundo todo. No Brasil, apesar dos dados
escassos sobre o índice de infecção hospitalar e resistência de microrganismos,
muitos projetos e pesquisas têm sido realizados numa tentativa de se conhecer o
problema com base em dados consistentes para que as medidas mais adequadas de
prevenção sejam adotadas (MENDES et al. 2000; ANVISA 2001; SADER et al.
2001; TOSIN et al. 2003).
A produção de β-lactamases é o mecanismo de resistência mais importante
contra antimicrobianos β-lactâmicos em microrganismos Gram negativos. Entre estas
enzimas, estão as β-lactamases de espectro estendido (ESBL), presentes
principalmente em espécies da família Enterobacteriaceae, limitando as opções de
tratamento para infecções hospitalares graves (HERNÁNDEZ et al. 2005;
RAMPHAL & AMBROSE 2006).
De acordo com dados fornecidos pela CCIH do hospital deste estudo, as
cepas de enterobactérias produtoras de ESBL representam um grande desafio ao
controle das infecções e colonizações ocorridas na instituição, especialmente nas
Unidades de Terapia Intensiva.
6.1 Espécies produtoras de ESBL
Na América Latina a prevalência de cepas do gênero Klebsiella produtoras de
ESBL passou de 30% a 45% de 1997 a 2000. Klebsiella pneumoniae é a espécie em
que mais se observa a produção de ESBL, e a localização plasmidial dos genes
codificadores destas enzimas (genes bla) facilita sua transferência por conjugação
Discussão
_________________________________________________________________
72
para muitas outras espécies de enterobactérias. No presente estudo, no período de um
ano foi detectada a presença de 1 a 4 genes bla em cepas de 9 espécies: Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Klebsiella
oxytoca, Providencia rettgeri, Providencia stuartti, Enterobacter aerogenes e
Enterobacter cloacae (LI et al. 2003; PFALLER & SEGRETI 2006).
6.2 Determinação dos Grupos de ESBL pela PCR
A maioria das ESBL pertencem aos grupos TEM e SHV, porém o surgimento
de enzimas com baixa homologia com estes grupos e com perfis de resistência
diversos tem sido objeto de estudo e um desafio para o tratamento de infecções
causadas por cepas produtoras destas enzimas. A presença de vários genes em
plasmídios de uma mesma cepa aumenta seu espectro de resistência e sua
probabilidade de disseminação (CAO et al. 2002; PFALLER & SEGRETI 2006).
O presente trabalho pesquisou 8 grupos de ESBL em todas (135) as cepas de
enterobactérias que apresentaram este fenótipo no período de um ano no hospital.
Os genes do grupo SHV foram detectados em 60% das cepas, em 6 espécies,
sendo 87,7% K. pneumoniae. A maioria das enzimas deste grupo são ESBL, exceto
SHV-1 e SHV-11, e segundo a literatura, a grande maioria das cepas de K.
pneumoniae possuem o gene bla
SHV-1
cromossômico. Sendo assim, a identificação de
genes bla
SHV
na maioria das cepas de K. pneumoniae neste estudo estaria de acordo
com a literatura, porém apenas o seqüenciamento destes genes nos permitiria saber se
são codificadores ou não de ESBL, principalmente em cepas que apresentaram mais
de um dos genes bla (BABINI & LIVERMORE 2000; HOWARD et al. 2002).
Discussão
_________________________________________________________________
73
As espécies E. coli, E. cloacae, M. morganii, P. mirabilis e o gênero
Providencia já foram descritos como produtores do grupo SHV em outros estudos.
(COUDRON et al. 1997; PITOUT et al. 1998; CHANAWONG et al. 2001; CAO et
al. 2002; AIBINU et al. 2003; QUINTEROS et al. 2003; SANGUINETTI et al.
2003; KIM et al. 2004; HO et al. 2005; WU et al. 2005).
O grupo TEM foi identificado em 17% das cepas do estudo, em 5 espécies
diferentes: K. pneumoniae, E. coli, P. mirabilis, K. oxytoca e M. morganii. No estudo
de Cao et al. (2002), que também pesquisou diversos grupos de ESBL, este grupo foi
identificado em K. pneumoniae (38%), E. coli (84%) e P. mirabilis (100%). No
presente estudo apenas 4 cepas de P. mirabilis foram isoladas, e destas 2 possuíam os
genes bla
TEM
, muito comum nesta espécie. As espécies M. morganii e K. oxytoca já
foram descritas como produtoras deste grupo de enzimas anteriormente (CAO et al.
2002; PAGANI et al. 2002; ARPIN et al. 2003; SANGUINETTI et al. 2003; KIM et
al. 2004; BIENDO et al. 2005; ENDIMIANI 2005).
Assim como o grupo SHV, as enzimas TEM podem não ser de espectro
estendido, como TEM-1 e TEM-2, e o seqüenciamento dos genes bla
TEM
detectados
neste estudo seria necessário para a identificação exata dos mesmos (BRADFORD
2001).
Genes do grupo CTX-M foram detectados em 32,6% dos isolados, em 7
espécies: K. pneumoniae, E.coli, M. morganii, P. mirabilis, P, stuartti, K. oxytoca e
E. aerogenes, todas já descritas como produtoras de enzimas CTX-M. Este grupo é o
mais comum entre as ESBL que não pertencem aos grupos TEM e SHV, sendo muito
freqüente na América do Sul. Nos últimos 10 anos 50 enzimas diferentes foram
descritas no mundo todo. No Brasil já foi caracterizada a ESBL CTX-M-8. Celenza
Discussão
_________________________________________________________________
74
et al. (2006) detectou em seu estudo na Bolívia genes bla
CTX-M
em 92% das cepas
estudadas, em 6 espécies diferentes de enterobactérias. Quinteros et al. (2003)
pesquisou na Argentina diversos grupos de ESBL em diferentes espécies de
enterobactérias, e o grupo CTX-M foi detectado em maior quantidade de cepas
(67%), e em maior variedade de espécies (7 de 8), assemelhando-se aos resultados
deste trabalho (BONNET et al. 2000a; ALOBWEDE et al. 2003; BONNET 2004;
RODRIGUEZ et al. 2005; RYOO et al. 2005; CELENZA et al. 2006; SOGE et al.
2006).
O grupo GES foi detectado em cepas de P. mirabilis e K. pneumoniae, em 4
pacientes de 3 setores e datas distintos (dados não apresentados). Os genes deste
grupo de enzimas localizam-se em plasmídios e em integrons, nos quais podem estar
presentes também genes bla
VEB-1,
possuindo portanto um meio adicional de
disseminação e resistência. Alguns estudos realizados na Ásia e na Europa têm sido
divulgados com a pesquisa dos genes bla
GES
, e na América do Sul há relatos da
identificação dos mesmos apenas em P. aeruginosa, sendo este aparentemente o
primeiro relato de cepas de enterobactérias produtoras do grupo GES de ESBL na
América do Sul, a serem confrmadas pelo seqüenciamento dos genes detectados
(POIREL et al. 2000; CAO et al. 2002; CASTANHEIRA et al. 2004; KIM et al.
2004; KYOO et al. 2005; PASTERAN et al. 2005).
O grupo VEB foi identificado em 6 cepas, sendo 5 K. pneumoniae e 1 P.
mirabilis. Este grupo de ESBL foi descoberto em cepas de E. coli na França, e já foi
descrito em outras espécies de enterobactérias na Ásia e Europa. No estudo de Cao et
al. (2002) no Vietnam (onde o gene foi descoberto) o gene bla
VEB-1
foi detectado em
6 de 10 cepas de P. mirabilis e em K. pneumoniae, localizado em um integron onde
Discussão
_________________________________________________________________
75
também foi identificado o gene bla
OXA-10
. Na América Latina não há relatos sobre a
produção deste grupo de β-lactamases, sendo o presente estudo aparentemente o
primeiro relato de cepas de enterobactérias produtoras do grupo VEB de ESBL na
América do Sul, a serem confrmadas pelo seqüenciamento dos genes detectados
(POIREL et al. 1999; CHANAWONG et al. 2001; WELDHAGEN et al. 2003; KIM
et al. 2004; KYOO et al. 2005).
O gene bla
PER-2
foi descoberto em cepas de Salmonella enterica serovar
Typhimurium na Argentina, e permanece localizado exclusivamente na América do
Sul. Neste estudo foi detectado em 8,1% das cepas, em 3 espécies distintas: K.
pneumoniae, P. stuartti e E coli. A presença deste grupo de ESBL nestas espécies e
em outras enterobactérias, com exceção de P. stuartii, já foi descrita em outros
estudos na Argentina e na Bolívia Não foram observados relatos do gênero
Providencia apresentando o gene bla
PER-2
(BAUERFEIND et al. 1996; QUINTEROS
et al. 2003; CELENZA et al. 2006).
O fato dos genes dos grupos OXA e PER-1 não terem sido detectados em
nenhuma das cepas do estudo reafirma os relatos da literatura.
Os genes do grupo OXA, apesar de poder fazer parte do mesmo integron
onde estão presentes genes para os grupos GES, VEB e PER-1, são descritos com
mais freqüência em cepas de Pseudomonas aeruginosa que em espécies da família
Enterobacteriaceae (DANEL et al. 1995; CHANAWONG et al. 2001; PFALLER e
SEGRETI 2006).
Já o gene bla
PER-1
foi descoberto na Turquia em cepas de P. aeruginosa, e já
foi descrito nesta espécie na França, Itália e Bélgica. Não há relatos da presença de
enzimas ESBL PER-1 na América do Sul. Pagani et al. (2002) descreve um surto
Discussão
_________________________________________________________________
76
causado por cepas de P. mirabilis produtoras da ESBL PER-1, na Itália, destacando
sua provável capacidade de disseminação (DANEL et al. 1995; BAUERFEIND et al.
1996; PAGANI et al. 2002; WELDHAGEN et al. 2003).
As cepas em que nenhum dos genes pesquisados foi encontrado mesmo tendo
o fenótipo ESBL podem conter genes de outros grupos não investigados neste
trabalho, como em outros relatos, e serão avaliadas em estudos posteriores (CAO et
al. 2002; HO et al. 2005).
O presente trabalho realizou a técnica de PCR e posterior visualização em gel
de agarose para determinação de grupos de ESBL, uma vez que o objetivo era
pesquisar a diversidade dos mesmos dentro do ambiente hospitalar. A identificação
precisa dos genes poderá ser determinada por meio do seqüenciamento dos genes
detectados em estudos posteriores.
6.3 Análise dos Perfis Moleculares de Klebsiella pneumoniae
A tipagem molecular contribui para a avaliação de surtos de infecção
hospitalar, infecções recorrentes e disseminação clonal de patógenos específicos. A
escolha da técnica de PFGE para a determinação dos perfis moleculares foi devido à
sua alta capacidade discriminatória, boa reprodutibilidade e fácil interpretação. É
considerada padrão-ouro para estudos de epidemiologia molecular, apesar de
controvérsias quanto ao tempo e trabalho que exige. Tem sido adotada por programas
de vigilância epidemiológica de patógenos multi-resistentes, inclusive o Programa
Sentinela de Vigilância de Resistência Antimicrobiana no Brasil (TENOVER et al.
1995; MARTINS-LOUREIRO et al. 2001; TOSIN et al. 2003; CARTELLE et al.
2004).
Discussão
_________________________________________________________________
77
A espécie produtora de ESBL com maior número de isolados no hospital no
período estudado foi K. pneumoniae (71,9%), e por este motivo seu perfil molecular
foi analisado.
Ao todo, foram identificados 8 perfis em 70,1% dos isolados, com
similaridade mínima de 78%, além de 29 padrões não relacionados entre si (Figuras
5 e 6).
As infecções e colonizações por cepas dos perfis PF 1-4, PF 3-5 e PF 7-8
ocorreram, na maioria dos casos, no Berçário e Unidades de Terapia Intensiva
Neonatal (PF 5) e Pediátrica (PF1), e poucos perfis isolados foram identificados
nestes setores. O sistema imunológico deficiente de pacientes nestas unidades e a
excessiva manipulação e pressão de antimicrobianos que estes sofrem, podem ser
fatores predisponentes para a ocorrência de infecções, bem como para a
disseminação de genes de resistência (BRADFORD 2001; MARTINS-LOUREIRO
et al. 2001; STÜRENBURG & MACK 2003; DAOUD & HAKIME 2003).
O perfil PF 6, apesar de ter sido isolado em 15 cepas, 8 destas eram
provenientes de amostras de um único paciente, o qual esteve internado na UTI
Neonatal, Berçário, UTI Pediátrica e Clínica Pediátrica durante todo o período deste
trabalho (dados não apresentados), coincidindo com as datas de isolamento das cepas
deste padrão molecular.
O perfil PF 2 foi identificado em três cepas isoladas de pacientes do Berçário
e duas de pacientes da UTI Pediátrica, entre os meses de novembro e dezembro de
2004. Após este período, cepas pertencentes a este perfil molecular não foram mais
isoladas em pacientes do hospital.
Discussão
_________________________________________________________________
78
K. pneumoniae isoladas de pacientes da UTI Adulta, SEMI, Clínica Médica e
Clínica Cirúrgica apresentaram apenas perfis não relacionados entre si. Segundo
Tosin et al. (2003), quando os isolados são geneticamente distintos, o grupo de
microrganismos resistentes pode ser formado devido à excessiva pressão seletiva de
antimicrobianos, que favorece fenótipos resistentes dentro de um grupo de cepas não
relacionadas, sendo um problema de resistência endêmica por diferentes grupos de
organismos.
Li et al. (2003), após a tipagem molecular de 20 cepas de K. pneumoniae,
detectaram 18 perfis distintos, sugerindo a transferência horizontal de genes de
resistência como modo de disseminação. Estas cepas apresentavam genes do grupo
CTX-M de ESBL, que é exclusivamente plasmidial.
No presente trabalho, as enzimas CTX-M foram identificadas em um grande
número de cepas com perfis não relacionados (73,3%), e em poucos isolados dos
demais perfis (dados não apresentados), o que pode sugerir que no ambiente deste
estudo também houve disseminação de genes de resistência por conjugação. Outras
observações nos resultados do presente estudo podem reafirmar este tipo de
disseminação. Os grupos TEM e VEB de ESBL foram detectados em K. pneumoniae
pertencentes ao perfil PF 4, porém não estavam presentes nas cepas PF 1, que foi
agrupado ao PF 4 devido à sua alta similaridade. O mesmo ocorreu nos perfis PF 7 e
PF 8, em que os grupos TEM e CTX-M estão presentes apenas no último, enquanto
que o grupo VEB foi detectado apenas no primeiro.
Segundo Li et al. (2003), quando o mesmo clone apresenta diferentes genes
bla, isto é devido à presença de diferentes plasmídios entre estes isolados. Tosin et
Discussão
_________________________________________________________________
79
al. (2003) discute que o problema da transferência horizontal de genes de resistência
poderia ser controlado pela restrição do uso de antimicrobianos.
Berçário
No estudo de Cartelle et al. (2004), a elevação do número de isolamentos de
K. pneumoniae com baixa sensibilidade às cefalosporinas na Unidade de Terapia
Intensiva Neonatal os levou a suspeitar da ocorrência de um surto, que se confirmou
após a tipagem molecular das cepas de 21 neonatos, provenientes de infecções e/ou
colonizações. O surto foi controlado após a adoção de algumas medidas como
isolamento dos pacientes infectados, uso de luvas e aventais descartáveis, e um maior
cuidado na lavagem das mãos.
Esta situação se assemelha à do Berçário do hospital deste estudo, em que
houve a suspeita da ocorrência de um surto pela CCIH, devido ao aparecimento de
isolados de K. pneumoniae produtoras de ESBL em agosto de 2004. Cassetari et al.
(2006) descrevem clinicamente este surto, e o presente trabalho procura esclarecer a
forma de disseminação das cepas por meio da tipagem molecular das mesmas.
Considerou-se que o surto ocorreu em duas fases epidemiologicamente
distintas. A primeira fase foi de agosto ao início de novembro de 2004, em que os
casos ocorridos foram todos de infecções. Neste período, medidas de intervenção
como precauções de contato e restrição do uso de cefalosporinas de terceira geração
foram adotadas. Analisando o perfil molecular das cepas envolvidas neste período do
surto, percebemos que em agosto observou-se os perfis PF 6 e PF 7-8, e a partir de
setembro o perfil PF 1-4 começou a predominar entre os isolados (Figuras 10a, b).
As medidas adotadas pela CCIH não foram suficientes para que cessassem os
Discussão
_________________________________________________________________
80
casos de isolamento de K. pneumoniae ESBL positiva no setor. Iniciou-se, então, a
segunda fase do surto, em que culturas de vigilância semanais de swab retal de todos
os pacientes foram realizadas. A partir de então, todos os casos ocorridos no setor até
fevereiro de 2005 foram de colonização. A tipagem molecular das cepas por PFGE
neste período (semanas 23 a 34) mostra que o perfil PF 1-4 foi predominante até a
semana 27 (dezembro/2004), quando o perfil PF 3-5 passou a ser isolado com igual
ou maior freqüência que o PF 1-4 (Figura 10b). A seleção das cepas de um perfil que
até então não havia sido isolado no hospital, e que só foi observado no berçário, pode
ter ocorrido devido a alguma intervenção que estava em curso no período do surto,
como mudanças nos esquemas de tratamento com antimicrobianos.
No início de 2005, foram realizadas culturas de swabs das mãos de todos os
profissionais a serviço do berçário que apresentassem lesões dermatológicas de
qualquer natureza. Em uma destas culturas foi identificada uma cepa de K.
pneumoniae produtora de ESBL, a qual apresentou perfil molecular PF 1,
identificado anteriormente no hospital em junho de 2004 (UTI Pediátrica), como
colonizadora, e no berçário em setembro e outubro, em infecções. Em novembro, foi
isolada em maior quantidade, durante as coletas de culturas de vigilância. Portanto,
clones desta cepa (PF 1-4) já poderiam estar colonizando os pacientes do berçário
antes mesmo de causar a primeira infecção, em setembro de 2004. O surto foi
contido após a descolonização das mãos do servidor com ciprofloxacina oral e
tópica, e o tratamento de uma onicomicose com fluconazol.
Uma vez que o paciente da UTI pediátrica portador do primeiro isolado da
cepa em questão não esteve internado no berçário (dados não apresentados), é
provável que a transmissão da mesma para outro setor tenha ocorrido pelo contato
Discussão
_________________________________________________________________
81
com o ambiente hospitalar. O isolamento de cepas de outros perfis (PF 2, PF 6, PF 7
e perfis isolados) durante as culturas de vigilância no setor também podem indicar o
mesmo tipo de transmissão. Percebe-se que, além da contenção do surto após o
tratamento do servidor colonizado, as medidas de prevenção de contato e higiene
foram também muito eficazes e contribuíram para que outros clones de K.
pneumoniae produtoras de ESBL fossem eliminados do ambiente.
O estudo realizado por Martins-Loureiro et al. (2001) relata resultados de
tipagem molecular semelhantes em cepas de K. pneumoniae isoladas de pacientes da
UTI Neonatal de um hospital no Rio de Janeiro durante 2 anos. Os 42 isolados
apresentaram 6 perfis distintos, sendo 4 identificados no primeiro ano do estudo e 2
no segundo. A intervenção com medidas de prevenção de contato controlou dois
surtos que ocorreram em paralelo no primeiro ano, porém dois meses depois um
novo clone passou a ser isolado no setor, provavelmente devido à pressão seletiva
devido ao uso de cefalosporinas de terceira geração em um esquema de tratamento.
Segundo os autores, a manipulação é a principal rota de transmissão de K.
pneumoniae produtoras de ESBL em UTI Neonatais, uma vez que o trato digestivo
de recém nascidos é o principal reservatório destas bactérias. Pessoa-Silva et al.
(2003) afirmam que apesar destes pacientes nascerem sem microflora gastrintestinal
e a colonização ocorrer mais lentamente, K. pneumoniae ESBL positiva tem sido
muito prevalente e a colonização por estas bactérias tem sido associada a infecções
pelas mesmas. Cavassin (2003) também descreve um surto causado por cepas de K.
pneumoniae em uma UTI Neonatal, o qual é controlado após medidas de prevenção
de contato.
Discussão
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82
Um surto descrito por Pessoa-Silva et al. (2003) teve duração de 2 anos em
uma UTI Neonatal. Após a realização do PFGE, 14 das 17 cepas isoladas de
infecções tinham o mesmo perfil molecular, e as cepas isoladas de colonizações
apresentaram 4 perfis distintos. Cepas isoladas de fômites e amostras de leite também
foram avaliadas, porém a fonte de contaminação não foi identificada. Os autores
concluem que a probabilidade era muito maior de que os procedimentos de rotina
(manipulação) nos bebês tivessem transmitido o microrganismo, e que o longo
período deste surto sugere que o ambiente tenha papel importante na persistência de
Klebsiella spp no setor hospitalar.
Bagattini et al. (2006) investigaram a epidemiologia molecular de K.
pneumoniae produtoras de ESBL em uma UTI Neonatal. A investigação de focos e
reservatórios ambientais de infecções foi incluída no estudo, e um único clone foi
identificado em 3 pias, 2 superfícies em 3 quartos diferentes, 2 incubadoras, e da mão
de um enfermeiro, sugerindo a transmissão horizontal deste clone de um paciente
para outro por meio de um profissional do hospital.
Os resultados do presente trabalho sugerem que o problema da disseminação
de clones e genes de resistência no ambiente hospitalar pode ocorrer devido ao
contato com profissionais da saúde ou devido à transferência de pacientes entre
setores, uma vez que cepas de perfis moleculares idênticos foram observadas em
diferentes unidades, e isolados de pacientes apresentaram perfis idênticos à cepa
proveniente das mãos de um servidor da instituição.
Os dados apresentados mostram a importância da conscientização quanto ao
uso restrito de antimicrobianos β-lactâmicos, e das medidas de prevenção de contato,
como lavagem correta e eficiente das mãos, utilização de luvas e aventais
Discussão
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83
descartáveis, isolamento de pacientes colonizados e/ou infectados por bactérias
multi-resistentes, e monitoramento da transferência entre setores do hospital, e
culturas de vigilância, as quais levaram a instituição em estudo a detectar a causa da
disseminação de K. pneumoniae produtoras de ESBL no Berçário.
Conclusões
_________________________________________________________________
84
7. CONCLUSÕES
• Há diversos genes bla disseminados no hospital estudado, inclusive alguns
codificadores de grupos que ainda não haviam sido identificados no Brasil;
• Cepas com perfis moleculares distintos possuíam genes bla exclusivamente
plasmidiais, sugerindo a transferência horizontal (conjugação) destes genes;
• Cepas com perfis similares foram disseminadas em algumas unidades, sugerindo
contaminação no ambiente hospitalar.
Bibliografia
_________________________________________________________________
85
8. BIBLIOGRAFIA
1. Alobwede I, M’Zali FH, Livermore DM, Heritage J, Todd N, Hawkey PM.
CTX-M extended-spectrum β-lactamase arrives in the UK. J Antimicrob
Chemother 2003; 51: 470-471.
2. Agência Nacional de Vigilância Sanitária [homepage na Internet]. [acesso em
2003 Out 9]. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/
3. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC-48, de 2 de junho
de 2000. Aprova o Roteiro de Inspeção do Programa de Controle de Infecção
Hospitalar [lei na Internet]. [acesso em 23 Out 2003]. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/legis/
4. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Projeto Hospitais-Sentinela
[documento na Internet]. Brasil; c2001. [acesso em 9 Out 2003]. Disponível
em:
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/hsentinela/
5. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Sistema Nacional de Informação
para o Controle de Infecções em Serviços de Saúde (SINAIS) [homepage na
Internet]. Brasil; c2001. [acesso em 10 Mar 2006]. Disponível em:
www.anvisa.gov.br/servicosaude/
6. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Sistema Nacional de Informação
para o Controle de Infecções em Serviços de Saúde (SINAIS) [homepage na
Internet]. Brasil; c2002. [acesso em 10 Mar 2006]. Disponível em:
www.anvisa.gov.br/divulga/
7. Aibinu IE, Ohaegbulam VC, Adenipekun EA, Ogunsola FT, Odugbemi TO,
Mee BJ. Extended-spectrum β-lactamase enzymes in clinical isolates of
Enterobacter species from Lagos, Nigeria. J Clin Microbiol 2003, 41:2197-
2200.
8. Aitmhand R, Soukri A, Moustaoui N, Amarouch H, Eimdaghri N, Srot D,
Benbachir M. Plasmid-mediated TEM-3 extended-spectrum β-lactamase
production in Salmonella typhimurium in Casablanca. J Antimicrob
Chemother 2002, 49:169-72.
Bibliografia
_________________________________________________________________
86
9. Arpin C, Dubois V, Coulange L, André C, Fischer I, Noury P et al. Extended-
spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae in community and
private health care centers. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3506-
3514.
10. Babini GS, Livermore DM. Are SHV β-lactamases Universal in Klebsiella
pneumoniae?. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 2230. Letter.
11. Bagattini M, Crivaro V, Popolo A, Gentile F, Scarcella A, Triassi M et al.
Molecular epidemiology of extended-spectrum β-lactamase-producing
Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit. J Antimicrob
Chemother 2006; 57: 979-982.
12. Bauerfeind A, Stemplinger I, Jungwirth R, Mangold P, Amann S, Akalin E
et al. Characterization of β-lactamase gene bla
PER-2
, which encodes an
extended-spectrum class A β-lactamase. J Antimicrob Chemother 1996; 40:
616-620.
13. Bermejo J, Lesnaberes P, Arnesi N, Gianello M, Notario R, Borda N et al.
Factores de riesgo asociados a infecciones por Klebsiella pneumoniae
resistentes a ceftacidima. Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clínica
2003; 21:72-76.
14. Biendo M, Thomas D, Laurans G, Hamdad-Daoudi F, Canarelli B, Rousseau
F et al. Molecular diversity of Proteus mirabilis isolates producing extended-
spectrum β-lactamases in a French university hospital. Clin Microbiol Infect
2005; 11: 395-401.
15. Bonnet R. Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the CTX-M
enzymes. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1-14.
16. Bonnet R, Sampaio JLM, Chanal C, Sirot D, Champs C de, Viallard JL et al.
A novel class A extended-spectrum β-lactamase (BES-1) in Serratia
marcescens isolated in Brazil. Antimicrob Agents Chemother 2000a;
44:3061-68.
17. Bonnet R, Sampaio JLM, Labia R, de Champs C, Sirot D, Chanal C, Sirot J.
A novel CTX-M β-lactamase (CTX-M-8) in cefotaxime-resistant
Enterobacteriaceae isolated in Brazil. Antimicrob Agents Chemother 2000b;
44: 1936-1942.
Bibliografia
_________________________________________________________________
87
18. Bouchillon SK, Johnson BM, Hoban DJ, Johnson JL, Dowzicky MJ, Wu DH
et al. Determining incidence of extended-spectrum β-lactamase-producing
Enterobacteriaceae, vancomycin-resistant Enterococcus faecium and
methicillin-resistant Staphylococcus aureus in 38 centres from 17 countries:
the PEARLS study 2001-2002. Int J Antimicrob Agents 2004, 24:119-24.
19. Bradford PA. Extended-spectrum β-lactamases in the 21
st
century:
characterization, epidemiology, and detection of this important resistance
threat. Clin Microbiol Rev 2001; 14:933-51. Review.
20. Brasil. Decreto Lei n.9431, de 6 de janeiro de 1997. Dispõe sobre a
obrigatoriedade da manutenção de programa de controle de infecções
hospitalares pelos hospitais do país [lei da Internet]. [acesso em 23 Out
2003]. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/legis/leis/
21. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for β-
lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents
Chemother 1995; 39:1211-33.
22. Bush K, Jacoby GA. Amino Acid Sequences for TEM, SHV and OXA
Extended-spectrum and Inhibitor Resistant β-lactamases. Lahey Clinic
[homepage na internet] c2003. [acesso em 3 Jul 2006]. Disponível em:
http://www.lahey.org/
23. Cantón R, Oliver A, Coque TM, Varela MC, Pérez-Díaz JC, Baquero F.
Epidemiology of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacter
isolates in a spanish hospital during a 12-year period. J Clin Microbiol 2002,
40:1237-43.
24. Cao V, Lambert T, Nhu DQ, Loan HK, Hoang NK, Arlet G, Courvalin P.
Distribution of extended-spectrum β-lactamases in clinical isolates of
Enterobacteriacea in Vietnam. Antimicrob Agents Chemother 2002;
46:3739-43.
25. Cartelle M, Tomas MM, Pertega S, Beceiro A, Dominguez MA, Velasco D
et al. Risk Factors for colonization and infection in a hospital outbreak caused
by a strain of Klebsiella pneumoniae with reduced susceptibility to expanded-
spectrum cephalosporins. J Clin Microbiol 2004; 42: 4242-4249.
Bibliografia
_________________________________________________________________
88
26. Cassetari VC, Silveira IR, Balsamo AC, Franco F. Outbreak of extended-
spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in an intermediate-
risk neonatal unit linked to onychomycosis in a healthcare worker. J Pediatr
(Rio J) 2006; 82.
27. Castanheira M, Mendes RE, Walsh TR, Gales AC, Jones RN. Emergence of
the extended-spectrum β-lactamase GES-4 in a Pseudomonas aeruginosa
strain from Brazil: report from the SENTRY antimicrobial surveillance
program. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 2344-45.
28. Cavassin ED. Surto de infecção hospitalar causado por Klebsiella
pneumoniae produtora de ESBL em uma UTI-neonatal: análise e impacto das
medidas de controle [dissertação de mestrado]. São Paulo: Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da USP; 2003.
29. Celenza G, Pellegrini C, Caccamo M, Segatore B, Amicosante G, Perilli M.
Spread of bla
CTX-M
-type and bla
PER-2
β-lactamase genes in clinical isolates
from Bolivian hospitals. J Antimicrob Chemother 2006; 57: (975-978).
30. Centers for Disease Control and Prevention. Preventing Emerging Infectious
Diseases: a Strategy for the 21
st
Century [documento na internet]. Atlanta
(GA); c1998. [acesso em 9 Out 2003]. Disponível em:
http://www.cdc.gov/ncidod/emergplan/
31. Chanawong A, M’zali FH, Heritage J, Lulitanond A, Hawkey PM. J
Antimicrob Chemother 2001; 48: 839-852.
32. Chapman PA, Ellin M, Ashton R, Shafique W. Comparison of culture, PCR
and immunoassays for detecting Escherichia coli O157 following enrichment
culture and immunomagnetic separation performed on naturally contaminated
raw meat products. Int J Food Microbiol 2001; 68:11-20.
33. Coque TM, Oliver A, Pérez-Díaz JC, Baquero F, Cantón R. Genes encoding
TEM-4, SHV-2, and CTX-M-10 extended-spectrum β-lactamases are carried
by multiple Klebsiella pneumoniae clones in a single hospital (Madrid, 1989
to 2000). Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:500-10.
34. Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do Hospital Universitário da
Universidade de São Paulo (CCIH-HU/USP). Manual para Prevenção das
Bibliografia
_________________________________________________________________
89
Infecções Hospitalares [manual na Internet]. São Paulo; c2003. [acesso em 22
Nov 2005]. Disponível em:
http://www.hu.usp.br/
35. Corkill JE, Cuevas LE, Gurgel RQ, Greensill J, Hart CA. SHV-27, a novel
cefotaxime hydrolyzing β-lactamase, identified in Klebsiella pneumoniae
isolates from a Brazilian hospital. J Antimicrob Chemother 2001, 47:463-65.
36. Coudron PE, Moland ES, Sanders CC. Occurrence and detection of
extended-spectrum β-lactamases in members of the family
Enterobacteriaceae at a veterans medical center: seek and you may find. J
Clin Microbiol 1997; 35: 2593-2597.
37. Danel F, Hall LM, Gur D, Akalin HE, Livermore DM. Transferable
production of PER-1 beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. J
Antimicrob Chemother 1995; 35: 281-94.
38. Daoud Z, Hakime N. Prevalence and susceptibility patterns of extended-
spectrum betalactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella
pneumoniae in a general university hospital in Beirut, Lebanon. Rev Esp
Quimioterap 2003; 16:233-38.
39. Decré D, Burghoffer B, Gautier V, Petit JC, Arlet G. Outbreak of multi-
resistant Klebsiella oxytoca involving strains with extended-spectrum β-
lactamases and strains with extended-spectrum activity of the chromosomal
β-lactamase. J Antimicrob Chemother 2004, 54:881-88.
40. Dhawan B, Bonnet R, Shukla NK, Mathur P, Das BK, Kapil A. Infection
with an extended-spectrum β-lactamase-producing strain of Serratia
marcescens following tongue reconstruction. J Clin Microbiol 2003, 41:2233-
34.
41. Dzidic S, Bedekovic V. Horizontal gene transfer-emerging multidrug
resistance in hospital bacteria. Acta Pharmacol Sin 2003; 24:519-26.
42. Endimiani A, Luzzaro F, Brigante G, Perilli M, Lombardi G, Amicosante G
et al. Proteus mirabilis bloodstream infections: risk factors and treatment
outcome related to the expression of extended-spectrum β-lactamases.
Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 2598-2605.
43. Fluit AC, Schmitz FJ. Resistance integrons and super-integrons. Clin
Microbiol infect 2004; 10: 272-288.
Bibliografia
_________________________________________________________________
90
44. Food and Drug Administration. Department of Health and Human Services.
Task Force on Antimicrobial Resistance: Key Recommendations and Report
[documento na internet]. Washington (DC); c2000. [acesso em 9 Out 2003].
Disponível em:
http://www.fda.gov/
45. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott’s Diagnostic
Microbiology. 10
a
ed. St. Louis: Mosby; 1998. Cap. 17, p.234-49.
46. Gales AC, Sader HS, Jones RN. Urinary tract infection trends in Latin
American hospitals: report from the SENTRY antimicrobial surveillance
program (1997-2000). Diagn Microbiol Infect Dis 2002, 44:289-99.
47. Gniadkowski M. Evolution and epidemiology of extended-spectrum β-
lactamases (ESBL) and ESBL-producing microorganisms. Clin Microbiol
Infect 2001; 7:597-608.
48. Gouby A, Neuwirth C, Bourg G, Bouziges N, Carles-Nurit MJ, Despaux E,
Ramuz M. Epidemiological study by pulsed-field gel eletrophoresis of an
outbreak of extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella
pneumoniae in a Geriatric hospital. J Clin Microbiol 1994; 32:301-05.
49. Gruteke P, Goessens W, Van Gils J, Peerbooms P, Lemmens-Den TN, Van
Santen-Verheuvel M et al. Patterns of resistance associated with integrons,
the extended-spectrum beta-lactamase SHV-5 gene, and a multidrug efflux
pump of Klebsiella pneumoniae causing a nosocomial outbreak. J Clin
Microbiol 2003; 41: 1161-1166.
50. Hernández JR, Pascual A, Cantón R, Martínez-Martínez L. Escherichia coli
y Klebsiella pneumoniae productores de betalactamasas de espectro
extendido em hospitales españoles (Proyecto GEIH-BLEE 2000).
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2003; 21:77-82.
51. Hernández JR, Martínez-Martínez L, Cantón R, Coque TM, Pascual A.
Nationwide study of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing
extended-spectrum β-lactamases in Spain. Antimicrob Agents Chemother
2005; 49: 2122-2125.
52. Ho PL, Ho AYM, Chow KH, Wong RCW, Duan RS, Ho WL et al.
Occurrence and molecular analysis of extended-spectrum β-lactamase-
Bibliografia
_________________________________________________________________
91
producing Proteus mirabilis in Hong Kong, 1999-2002. J Antimicrob
Chemother 2005; 55: 840-845.
53. Ho PL, Shek RH, Chow KH, Duan RS, Mak GC, Lai EL et al. Detection and
characterization of extended-spectrum β-lactamases among bloodstream
isolates of Enterobacter spp in Hong Kong, 2000-2002. J Antimicrob
Chemother 2005; 55: 326-332.
54. Howard C, Daal A, Kelly G, Schooneveldt J, Nimmo G, Giffard PM.
Identification and minisequencing-based discrimination of SHV β-lactamases
in nosocomial infection-associated Klebsiella pneumoniae in Brisbane,
Australia. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 659-664.
55. Infecção Hospitalar e suas Interfaces na Área da Saúde [homepage na
Internet]. [acesso em 6 Out 2003]. Disponível em:
http://www.ccih.med.br/
56. Infecção Hospitalar e suas Interfaces na Área da Saúde, Núcleo de Apoio ao
Controle de Infecção Hospitalar. Programa de Qualidade Hospitalar
[documento na Internet]. São Paulo; c1998. [acesso em 23 Out 2003].
Disponível em:
http://www.ccih.med.br/nacih.html/
57. Jacoby GA, Mills DM, Chow N. Role of β-lactamases and porins in
resistance to ertapenem and other β-lactams in Klebsiella pneumoniae.
Antimicrob Agents Chemother 2004, 48:3203-06.
58. Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum
beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam
agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns.
Rev Infect Dis 1988; 10:867-78.
59. Kim JY, Park YJ, Kim SI, Kang MW, Lee SO, Lee KY. Nosocomial
outbreak by Proteus mirabilis producing extended-spectrum β-lactamase
VEB-1 in a Korean university hospital. J Antimicrob Chemother 2004a,
54:1144-47.
60. Kim S, Kim J, Kang Y, Park Y, Lee B. Occurrence of extended-spectrum β-
lactamases in members of the genus Shigella in the republic of Korea. J Clin
Microbiol 2004b, 42:5264-69.
Bibliografia
_________________________________________________________________
92
61. Kliebe C, Nies BA, Meyer JF, Tolxdorff-Neutzling RM, Wiedemann B.
Evolution of plasmid-coded resistance to broad-spectrum cephalosporins.
Antimicrob Agents Chemother 1985; 28:302-07.
62. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC.
Diagnóstico Microbiológico – Texto e Atlas Colorido. 5
a
ed. Rio de Janeiro:
Medsi; 2001. Provas de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos; p.795-865.
63. Lautenbach E, Patel JB, Bilker WB, Edelstein PH, Fishman N. Extended-
spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella
pneumoniae: risk factors for infection and impact of resistance on outcomes.
Clin Infect Dis 2001; 32:1162-71.
64. Lewin B. Genes V. 4
a
ed. Nova Iorque (NY): Oxford University Press;
1995a. Phage Strategies: lytic cascades and lysogenic repression; p.493.
65. Lewin B. Genes V. 4
a
ed. Nova Iorque (NY): Oxford University Press;
1995b. The replicon: unit of replication; p.549-553.
66. Lewin B. Genes V. 4
a
ed. Nova Iorque (NY): Oxford University Press;
1995c. Transposons that mobilize via DNA; p.999-1031.
67. Li CR, Li Y, Zhang PA. Dissemination and spread of CTX-M extended-
spectrum β-lactamases among clinical isolates of Klebsiella pneumoniae in
central China. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 521-525.
68. Lin MF, Huang ML, Lai SH. Risk factors in the acquisition of extended-
spectrum β-lactamase Klebsiella pneumoniae: a case-control study in a
district teaching hospital in Taiwan. J Hosp Infect 2003, 53:39-45.
69. Lincopan N, McCulloch JÁ, Reinert C, Cassetari VC, Gales AC, Mamizuka
EM. First Isolation of metallo-β-lactamase-producing multiresistant
Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil. J Clin Microbiol 2005; 43:
516-519.
70. Martínez-Martínez L, Pascual A, Jacoby GA. Quinolone resistance from a
transferable plasmid. Lancet 1998, 351:797-99.
71. Martínez-Martínez L, Pascual A, Conejo MC, García I, Joyanes P,
Doménech-Sanchez A, Benedí VJ. Energy-dependent accumulation of
norfloxacin and porin expression in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae
Bibliografia
_________________________________________________________________
93
and relationship to extended-spectrum β-lactamase production. Antimicrob
Agents Chemother 2002, 3926-32.
72. Martins-Loureiro M, Moraes BA, Mendonça VL, Rocha-Quadra MR,
Santos-Pinheiro G, Dutra-Asensi M. Molecular epidemiology of extended-
spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolated from
neonatal intensive care unit patients involved in hospital infection cases in
Rio de Janeiro, Brazil. Rev Latinoam Microbiol 2001; 43(2): 88-95.
73. Matté GR. Estudo de Vibrio spp potencialmente patogênicos através de
métodos moleculares [tese de livre-docência]. São Paulo: Faculdade de Saúde
Pública da USP; 2003.
74. Matté MH. Ribotipagem de Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae,
Aeromonas sobria e Aeromonas jandaei, potencialmente patogênicas,
isoladas de amostras de água do reservatório de Guarapiranga, São Paulo
[tese de doutorado]. São Paulo: Faculdade de Saúde Pública da USP; 1996.
75. Mendes C, Hsiung A, Kiffer C, Oplustil C, Sinto S, Mimica I, Zoccoli C,
Mystic Study Group. Evaluation of the in vitro activity of 9 antimicrobials
against bacterial strains isolated from patients in intensive care units in
Brazil: MYSTIC Antimicrobial Surveillance Program. Braz J Infect Dis
2000; 4(5): 236-244.
76. Mendes C, Kiffer C, Segura A, Ribeiro J, Turner P. Klebsiella pneumoniae
with multiple antimicrobial resistance. Braz J Infect Dis 2004, 8:109-11.
77. Ministério da Saúde [homepage na Internet]. [acesso em 23 Out 2003].
Disponível em:
http://www.saude.gov.br/
78. Ministério da Saúde. Portaria MS 2616, de 12.5.1998: expede diretrizes e
normas para a prevenção e o controle das infecções hospitalares [lei na
Internet]. [acesso em 30 Out 2003]. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/index98/
79. Motta RN, Oliveira MM, Magalhães PSF, Dias AM, Aragão LP, Forti AC,
Carvalho CBM. Plasmid-mediated extended-spectrum β-lactamase-producing
strains of Enterobacteriaceae isolated from diabetes foot infections in a
Brazilian diabetic center. Braz J Infect Dis 2003, 7:129-34.
Bibliografia
_________________________________________________________________
94
80. Mulvey MR, Soule G, Boyd D, Demczuk W, Ahmed R et al.
Characterization of the first extended-spectrum beta-lactamase-producing
Salmonella isolate identified in Canada. J Clin Microbiol 2003, 41:460-62.
81. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003a. Disk Difusion
Supplemental Tables. Informational Supplement M100-S13 (M2). National
Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne (Pa).
82. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003b. MIC Testing
Supplemental Tables. Informational Supplement M100-S13 (M7). National
Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne (Pa).
83. Naumiuk L, Baraniak A, Gnisdkowski M, Krawczyk B, Rybak B, Sadowy E
et al. Molecular epidemiology of Serratia marcescens in two hospitals in
Danzig, Poland, over a 5-year period. J Clin Microbiol 2004, 42:3108-16.
84. Nordmann P, Poirel L. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes.
Clin Microbiol Infect 2002, 8:321-31.
85. Organização Mundial da Saúde [homepage na Internet]. [acesso em 9 Maio
2006]. Disponível em:
www.who.int/
86. Organização Panamericana da Saúde [homepage na Internet]. [acesso em 9
maio 2006]. Disponível em:
www.opas.org.br/.
87. Oteo J, Campos J, Baquero F. Antibiotic resistance in 1962 invasive isolates
of Escherichia coli in 27 Spanish hospitals participating in the European
antimicrobial resistance surveillance system (2001). J Antimicrob Chemother
2002, 50:945-52.
88. Pagani L, Migliavacca R, Pallecchi L, Matti C, Giacobone E, Amicosante G
et al. Emerging extended-spectrum β-lactamases in Proteus mirabilis. J Clin
Microbiol 2002, 40:1549-52.
89. Pasteran F, Faccone D, Petroni A, Rapoport M, Galas M, Vazquez M,
Procopio A. Novel variant bla
VIM-11
of the metallo-beta-lactamase bla
VIM
family in a GES-1 extended-spectrum-beta-lactamase-producing
Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in Argentina. Antimicrob Agents
Chemother 2005; 49: 474-475.
90. Paterson DL, Mulazimoglu L, Casellas JM, Ko W, Goossens H, Gottberg
AV et al. Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to
Bibliografia
_________________________________________________________________
95
extended-spectrum β-lactamase production in Klebsiella pneumoniae isolates
causing bacteremia. Clin Infect Dis 2000; 30:473-78.
91. Peña C, Pujol M, Ardanuy C, Ricart A, Pallares R, Liñares J et al.
Epidemiology and successful control of a large outbreak due to Klebsiella
pneumoniae producing extended-spectrum β-lactamases. Antimicrob Agents
Chemother 1998; 42:53-58.
92. Peña C, Pujol M, Ardanuy C, Ricart A, Pallares R, Liñares J et al. An
outbreak of hospital-acquired Klebsiella pneumoniae bacteraemia, including
strains producing extended-spectrum β-lactamase. J Hosp Infect 2001; 47:53-
59.
93. Pessoa-Silva CL, Moreira BM, Almeida VC, Flannery B, Lins MCA,
Sampaio JLM et al. Extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella
pneumoniae in a neonatal intensive care unit: risk factors for infection and
colonization. J Hosp Infect 2003; 53:198-206.
94. Pfaller MA, Segreti J. Overview of the epidemiological profile and
laboratory detection of extended-spectrum β-lactamases. Clin Infect Dis
2006; 42:S153-63.
95. Pitout JD, Thomson KS, Hanson ND, Ehrhardt AF, Moland ES, Sanders CC.
Beta-lactamases responsible for resistance to extended-spectrum
cephalosporins in Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, and Proteus
mirabilis isolates recovered in South Africa. Antimicrob Agents Chemother
1998; 42: 1350-1354.
96. Pitout JD, Nordmann P, Laupland KB, Poirel L. Emergence of
Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) in
the community. J Antimicrob Chemother 2005; 56: 52-59.
97. Poirel L, Naas T, Guibert M, Chaibi EB, Labia R, Nordmann P. Molecular
and biochemical characterization of VEB-1, a novel class A extended-
spectrum β-lactamase encoded by an Escherichia coli integron gene.
Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 573-581.
98. Poirel L, Thomas I, Naas T, Karim A, Nordmann P. Biochemical sequence
analyses of GES-1, a novel class A extended-spectrum β-lactamase, and the
Bibliografia
_________________________________________________________________
96
class 1 integron IN52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents
Chemother 2000; 44: 622-632.
99. Quale JM, Landman D, Bradford P, Visalli M, Ravishankar J, Flores C et al.
Molecular epidemiology of a citywide outbreak of extended-spectrum β-
lactamase-producing Klebsiella pneumoniae infection. Clin Infect Dis 2002,
35:834-41.
100. Quinteros M, Radice M, Gardella N, Rodriguez MM, Costa N, Korbenfeld
D et al. Extended-spectrum β-lactamases in Enterobacteriaceae in Buenos
Aires, Argentina, Public Hospitals. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:
2864-2867.
101. Rodriguez C, Radice M, Perazzi B, Castro S, Juárez J, Santini P et al.
Resistencia enzimática a betalactámicos en el género Proteus y evaluación de
los fenotipos y genotipos de resistencia a cefalosporinas de tercera y cuarta
generación en Proteus mirabilis. Enferm Infecc Microbiol Clin 2005; 23:
122-126.
102. Rodríguez-Baño J, Navarro MD, Romero L, Martínez-Martínez L, Muniain
MA, Perea EJ et al. Epidemiology and clinical features of infections caused
by extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli in
nonhospitalized patients. J Clin Microbiol 2004, 42:1089-94.
103. Rollins School of Public Health of Emory University. Project ICARE
(Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology) Phase 1, 2, 3 and 4
[documento na internet]. Atlanta (GA); c1995. [acesso em 9 Out 2003].
Disponível em:
http://www.sph.emory.edu/ICARE/
104. Ryoo NH, Kim EC, Hong SG, Park YJ, Lee K, Bae IK et al. Dissemination
of SHV-12 and CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases among clinical
isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and emergence of
GES-3 in Korea. J Antimicrob Chemother 2005; 56:698-702.
105. Sabaté M, Miró E, Navarro F, Vergés C, Aliaga R, Mirelis B, Prats G. β-
Lactamases involved in resistance to broad-spectrum cephalosporins in
Escherichia coli and Klebsiella spp clinical isolates collected between 1994
and 1996, in Barcelona (Spain). J Antimicrob Chemother 2002; 49:989-97.
Bibliografia
_________________________________________________________________
97
106. Sader HS. Antimicrobial Resistance in Brazil: comparison of results from
two multicenter studies. Braz J Infect Dis 2000; 4(2): 91-99.
107. Sader HS, Gales AC, Pfaller MA, Mendes RE, Zoccoli C, Barth A, Jones
RN. Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals:
summary of results from three years of the SENTRY antimicrobial
surveillance program. Braz J Infect Dis 2001, 5:200-214.
108. Sader HS, Jones RN, Andrade-Baiocchi S, Biedenbach DJ et al. Four-year
evaluation of frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility
patterns of bacteria from bloodstream infections in Latin American medical
centers. Diagn Microbiol Infect Dis 2003; 44:273-80.
109. Samaha-Kfoury JN, Araj GF. Recent developments in β-lactamases and
extended-spectrum β-lactamases. BMJ 2003; 327:1209-13. Review.
110. Sanguinetti M, Posteraro B, Spanu T, Ciccaglione D, Romano L, Fiori B et
al. Characterization of clinical isolates of Enterobacteriaceae from Italy by
the BD Phoenix Extended-Spectrum β-Lactamase detection method. J Clin
Microbiol 2003; 41: 1463-1468.
111. Shah AA, Hasan F, Ahmed S, Hameed A. Characteristics, epidemiology
and clinical importance of emerging strains of Gram-negative bacilli
producing extended-spectrum β-lactamases. Res Microbiol 2004, 155:409-21.
112. Shlaes DM, Gerding DN, John JF, Craig Jr WA, Bornstein DL, Duncan RA
et al. Society for Healthcare Epidemiology of America and Infectious
Diseases Society of America Joint Committee on the Prevention of
Antimicrobial Resistance: Guidelines for the prevention of antimicrobial
resistance in hospitals. Clin Infect Dis 1997; 25:584-99.
113. Sirot J, Nicolas-Chanoine MH, Chardon H, Avril JL, Cattoen C, Croix JC
et al. Susceptibility of Enterobacteriaceae to β-lactam agents and
fluoroquinolones: a 3-year survey in France. Clin Microbiol Infect 2002,
8:207-13.
114. Snyder L, Champness W. Molecular Genetics of Bacteria. 2
a
ed.
Washington (DC): ASM Press; 1997a. Transformation; p. 149-159.
115. Snyder L, Champness W. Molecular Genetics of Bacteria. 2
a
ed.
Washington (DC): ASM Press; 1997b. Bacteriophages; p. 178-180.
Bibliografia
_________________________________________________________________
98
116. Soge OO, Queenan AM, Ojo KK, Adeniyi BA, Roberts MC. CTX-M-15
extended-spectrum β-lactamase from Nigerian Klebsiella pneumoniae. J
Antimicrob Chemother 2006; 57: (24-30).
117. Stürenburg E, Mack D. Extended-spectrum β-lactamases: implications for
the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect
2003; 47:273-95. Review.
118. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing
DH, Swaminathan B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns
produced by pulsed-field gel eletrophoresis: criteria for bacterial strain
typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233-2239. Guest Comentary.
119. Tenover FC, Raney PM, Williams PP, Rasheed JK, Biddle JW, Oliver A et
al. Evaluation of the NCCLS extended-spectrum β-actamase confirmation
methods for Escherichia coli with isolates collected during project ICARE. J
Clin Microbiol 2003; 41:3142-46.
120. Tolun V, Küçükbasmac Ö, Törümküney-Akbulut D, Çatal Ç, Ang-Küçüker
M, Ang Ö. Relationship between ciprofloxacin resistance and extended-
spectrum β-lactamase production in Escherichia coli and Klebsiella
pneumoniae strains. Clin Microbiol Infect 2004, 10:72-75.
121. Tosin I, Silbert S, Sader HS. The use of molecular typing to evaluate the
dissemination of antimicrobial resistance among Gram-negative rods in
Brazilian Hospitals. Braz J Infect Dis 2003, 7:360-69.
122. Tumbarello M, Citton R, Spanu T, Sanguinetti M, Romano L, Fadda G,
Cauda R. ESBL-producing multidrug-resistant Providencia stuartii infections
in a university hospital. J Antimicrob Chemother 2004, 53:277-82.
123. Valverde A, Coque TM, Sánchez-Moreno MP, Rollán A, Baquero F,
Cantón R. Dramatic increase in prevalence of fecal carriage of extended-
spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae during nonoutbreak
situations in Spain. J Clin Microbiol 2004, 4769-75.
124. Weldhagen GF, Poirel L, Nordmann P. Ambler class A extended-spectrum
β-lactamases in Pseudomonas aeruginosa: novel developments and clinical
impact. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 2385-2392.
Bibliografia
_________________________________________________________________
99
125. Wu LT, Tsou MF, Wu HJ, Chen HE, Chuang YC, Yu WL. Survey of CTX-
M-3 extended-spectrum β-lactamase (ESBL) among cefotaxime-resistant
Serratia marcescens at a medical center in middle Taiwan. Diagn Microbiol
Infect Dis 2004, 49:125-29.
126. Wu LT, Wu HJ, Chung JG, Chuang YC, Cheng KC, Yu WL.
Dissemination of Proteus mirabilis isolates harboring CTX-M-14 and CTX-
M-3 β-lactamase at 2 hospitals in Taiwan. Diagn Microbiol Infect Dis 2006;
59: 89-94.
127. Xiong Z, Zhu D, Wang F, Zhang Y, Okamoto R, Inoue M. Investigation of
extended-spectrum β-lactamase in Klebsiella pneumoniae and Escherichia
coli from China. Diagn Microbiol Infect Dis 2002; 44:195-200.
128. Yong D, Park R, Yum JH, Lee K, Choi EC, Chong Y. Further modification
of the Hodge test to screen AmpC β-lactamase (CMY-1)-producing strains of
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. J Microbiol Methods 2002,
51:407-10.
129. Yu WL, Jones RN, Hollis RJ, Messer SA, Biedenbach DJ, Deshpande LM,
Pfaller MA. Molecular Epidemiology of extended-spectrum β-lactamase-
producing, fluoroquinolone-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae in
Taiwan. J Clin Microbiol 2002, 40:4666-69.
130. Yu WL, Wu LT, Pfaller MA, Winokur PL, Jones RN. Confirmation of
extended-spectrum β-lactamase-producing Serratia marcescens: preliminary
report from Taiwan. Diagn Microbiol Infect Dis 2003, 45:221-24.
131. Yuan M, Aucken H, Hall LMC, Pitt TL, Livermore DM. Epidemiological
typing of klebsiellae with extended-spectrum β-lactamases from European
intensive care units. J Antimicrob Chemother 1998; 41:527-39.
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