( PDF ) Caracterização bioquímica das proteínas RecA e RecX de Herbaspirillum seropedicae

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CAROLINA WEIGERT GALVÃO

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS

RecA E RecX DE Herbaspirillum seropedicae

Tese apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências, Área

Bioquímica, do Setor de Ciências

Biológicas da Universidade Federal do

Paraná, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutora em

Ciências, área de Bioquímica.

Orientadora: Prof

. Dr

. Maria Berenice

Reynaud Steffens

Co-orientadora : Prof

. Dr

. Leda Satie

Chubatsu

CURITIBA

2005

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Milhares de livros grátis para download.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Maria Berenice Reynaud Steffens, pela coragem de ter

aceito o desafio de iniciar o estudo do gene recA, há quase 15 anos, num grupo com

experiência e conhecimento no metabolismo de nitrogênio. Obrigada por ter me

adotado como sua filha primogênita e confiar a mim a sua herança científica. Sua

disponibilidade irrestrita, apoio, orientação e cumplicidade sempre me deram e me dão

força para consertar os erros cometidos no meio do caminho e seguir em frente.

Ao professor Emanuel Maltempi de Souza, por ser o meu exemplo.

Profissional dedicado; orientador exigente, crítico e criativo; ser humano humilde,

honesto e com um carácter fora de série; professor inteligente e atencioso; pesquisador

ambicioso e completamente apaixonado pelo que faz. Obrigada por toda a sua

paciência, credibilidade, apoio e estímulo durante todos estes anos de aprendizado ao

seu lado.

Ao professor Fábio de Oliveira Pedrosa, por ter permitido que um grupo de

estudantes de biologia, do qual eu fazia parte, viesse a compor o Núcleo de Fixação de

Nitrogênio. Obrigada pela oportunidade de desenvolver pesquisa num laboratório com

tamanha infra-estrutura e com uma equipe excepcional.

À professora Leda Satie Chubatsu, pelas idéias, críticas e sugestões recebidas

durante a execução e redação desta tese. Obrigada pelo seu exemplo de dedicação ao

trabalho e à família.

Ao professor Geoff Yates pelas idéias, segurança, conhecimento e confiança.

Obrigada por ter me dado a oportunidade de admirá-lo não só pela sua capacidade

profissional.

À professora Glaci Zancan, por sua dedicação à pesquisa e à formação de

novos profissionais. Obrigada por compartilhar um pouco da sua experiência de vida e

do seu conhecimento científico.

Ao professor Martin Buck, pela oportunidade de fazer parte de seu grupo de

pesquisa por seis meses. Obrigada pelas conversas, idéias e principalmente pela lição

de simplicidade e humildade. Gostaria de agradecer também a todos os componentes

de seu grupo - Patricia Bordes, Patricia Burrows, Goran Jovanovic, Sivaramesh

Wigneshweraraj, Antony Mayhew, e principalmente ao Jorg Schumacher, pelo seu

interesse e sua sempre pronta disponibilidade para discussões.

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AGRADECIMENTOS

Ao Hajime Niwa, por ter dividido um pouco do seu conhecimento de

cristalografia comigo, por sua imensa paciência, estímulo e idéias. Sua doação

incondicional ao trabalho de colegas contribuiu tanto para o meu desenvolvimento

profissional quanto pessoal.

Aos professores do curso de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia

Molecular, pelo conhecimento compartilhado. Deixo um agradecimento especial à Liu

Un Rigo e à Elaine Benelli, pela leitura do projeto e dos relatórios e pelas sugestões, e

ao David Mitchell, pela colaboração na discussão dos gráficos e pelas idéias de

projetos futuros.

À Roseli Wassem e à Rose Adele Monteiro, pelas sugestões e pelo apoio. Vê-

las como professoras da UFPR hoje, depois de termos compartilhado o papel de

estudantes nessa Universidade, me mostra que dedicação e esforço são

recompensados.

Aos coordenadores que estiveram à frente do Curso de Pós Graduação em

Bioquímica e Biologia Molecular durante o período da minha titulação e à Dona

Marilza pela colaboração dispensada.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

Programa de Apoio ao Núcleo de Excelência (PRONEX - MCT, FINEP, CNPq) e à

Secretaria de Estado de Ciência, Tecnologia e Ensino Superior

(SETI), pelo suporte

financeiro.

À Dona Jú, à Rose Prado e ao Valter, pela generosidade, competência e

carinho. Agradeço especialmente ao Valtinho, pelos ensinamentos, segurança e ajuda

incondicional nas purificações de proteína.

Às bibliotecárias do Setor de Ciências Biológicas e a todo pessoal do biotério

pela colaboração e gentileza.

Ao Geraldo Picheth, à Cyntia Picheth e ao Salah Aljanabi, pela simpatia,

carinho, estímulo e irrestrito apoio.

Às colegas de trabalho, que se tornaram amigas de coração Andréa, Fabi e

Lauren, e aos meus amigos de longa data Caro(e), Karen e Rodrigo por todo o carinho,

atenção e as conversas gostosas.

Ao Stefan, por todo o seu carinho, apoio e respeito às minhas decisões.

Obrigada por me fazer sentir parte da sua família e promover a conexão entre mim e

AGRADECIMENTOS

III

pessoas super especiais como o seu pai, sua irmã e, é claro, a sua sobrinha, a

picurrucha Gabriela, que me encanta e me inspira cada dia mais.

Ao Luciano, por toda a segurança recebida desde os tempos da graduação,

pelo seu companheirismo e idéias.

Aos meus colegas de mestrado, que se tornaram meus colegas de doutorado,

Adriano, Lilian, Andréa, Alan, Carol, Rose, Ana Paula, Paulinha, e, aos colegas de

laboratório, Ana Cláudia, Jú Inaba, Marcelo (fumaça), Marceleza, Helisson, Lys,

Giovana, Léo, Gus, Patilene, Rose Adele, Michelle Tadra, Eliel e Adrianas, pela troca

de conhecimento e pelos momentos de descontração e bagunça. Agradeço

especialmente a Fabi, a Luíza e a Dani, pelas sugestões e todas as ajudas DNAsísticas

e protéicas.

Aos meus companheiros da sala 279, André, Rafa, Humberto e Michelle

Hudson, pelas conversas científicas e descontraídas do dia a dia.

Ao Angel, pelo companherismo e segurança durante o nosso estágio

sanduíche. Obrigada por dividir comigo o seu conhecimento, sua humildade e

principalmente sua história de vida. É muito bom saber que agora tenho um

irmãozinho no México e também que há alguém mais bravo do que eu!!!!

Aos amigos Vicente, Alex, Cláudia e em especial ao Carsten e aos colegas do

Departamento de Ciências Biológicas (Imperial College), Costas, Kas e Yanis, pela

companhia, pelos cuidados e pela atenção. Obrigada pelos momentos de diversão e

pelas conversas intelectuais que, ao mesmo tempo que me mostraram o quão aquém eu

estou em termos de cultura, domínio de línguas e experiência de vida, me fizeram

sentir especial por fazer parte do cotidiano de vocês. O negócio é correr em busca do

tempo perdido!!!

AGRADECIMENTOS

À Sue, minha companheira de apartamento em Londres, por me fazer

valorizar ainda mais a minha família. Obrigada por ter tornado o Imperial College um

local menos estressante do que a minha casa em Londres. As horas de laboratório se

tornaram mais longas e mais prazerosas.

À minha professora de natação, a Fer, por ter lutado bravamente contra os

quilos a mais que foram se acumulando, como conseqüência das delícias da minha

segunda mãe e super cozinheira, a Marizinha, e da gulodice de mais de três meses

enfurnada em casa.

A minha Vó Odette, pelas orações e pelo seu amor cego, surdo e mudo.

Obrigada por toda a sua confiança, mesmo que essa desperte em mim o medo de a

decepcionar. Obrigada por me permitir estar sempre muito próxima a você.

Ao meu Vô Derblay, por todo o seu carinho, sua preocupação e sua

participação na realização dos meus sonhos. Obrigada pelo seu apoio incondicional.

À família Galvão Veiga Barros, o Fer, o Pepezinho, a Julinha e especialmente

a Tatazinha, pelo exemplo de alegria, união e cumplicidade. Obrigada por todo o

carinho, apoio, puxões de orelha e, é claro, super conselhos.

À família Weigert, especialmente a vó Inês, a tia Bea, o Guta, a Quel e a tia

Taim, pelo carinho e amor. Mais uma vez as minhas tias Taim e Bea me salvaram das

dificuldades dessa língua portuguesa. Muito muito obrigada.

Ao Markus, pela persistência, paciência e total doação. Obrigada por abrir

meus horizontes e me prover de tanta segurança, atenção e amor. Agradeço também

por todo o seu suporte no quesito computador, desde o download de programas úteis

para esse trabalho, até as muitas horas de ensinamentos quanto à forma de executá-los.

À família Weigert Galvão, por suportar minhas tristezas doando-me todo o

carinho e atenção; por suportar meu mau-humor, respeitando o meu espaço; por

alimentar os meus sonhos, fazendo-me acreditar que eu poderia realizá-los. É muito

bom se sentir bem vinda e receber o carinho de vocês ao chegar em casa. Amo

vocês!!! Pai, agradeço por ter-me imposto sempre tantos desafios e principalmente por

ter-me servido de inspiração e estímulo para vencê-los. Muito obrigada pela sua

preocupação e participação em todos os momentos da minha vida. Mami, agradeço

muito por sua paciência, seu conforto e todo o seu amor. Minha ouvinte, minha

conselheira, minha protetora, minha paz, minha luz, minha mãe, graças à Deus, minha

AGRADECIMENTOS

mãe... Obrigada por ser o nosso equilíbrio e por manter a nossa família tão unida.

Ferzinha, agradeço pelo seu companheirismo, sua cumplicidade e toda essa sua

alegria. Toda essa sua generosidade e afeto me incentivam a melhorar a cada dia, para

me tornar, quem sabe um dia, merecedora de uma irmã como você. Rafa, agradeço

pela sua paciência, por toda a sua atenção no período em que eu estive longe, e

principalmente por ter tomado o meu posto de alvo número um das críticas paternais.

Ao meu Anjinho da Guarda, por colocar pessoas tão maravilhosas na minha

vida e me proporcionar tantos momentos de felicidade e realização profissional e

pessoal.

“Mesmo que nossos projetos não tenham se

realizado inteiramente, temos que ser generosos

com nossos avanços e saber que o sonho sempre

será maior que nossas conquistas”.

Gikovate

SUMÁRIO

VII

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................X

LISTA DE TABELAS ..............................................................................................XII

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS........................................................................XIIIII

RESUMO ................................................................................................................ XIV

ABSTRACT ..............................................................................................................XV

1 INTRODUÇÃO..........................................................................................1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................3

2.1 Envolvimento da proteína RecA nos processos de Recombinação

Homóloga, Resposta SOS e Mutagênese SOS ............................................5

2.1.1 Recombinação Homóloga............................................................................5

2.1.1.1 Vias de Reparo por Recombinação..............................................................6

2.1.2 Resposta SOS.............................................................................................12

2.1.3 Mutagênese SOS........................................................................................13

2.2 Atividades da proteína RecA......................................................................16

2.2.1 Ligação ao DNA ........................................................................................16

2.2.2 Troca de fitas homólogas de DNA.............................................................19

2.2.3 Atividade ATPásica ...................................................................................21

2.2.3.1 Troca de fitas x Hidrólise de ATP .............................................................26

2.3 Estrutura da proteína RecA........................................................................27

2.3.1 Sítios de ligação do DNA...........................................................................31

2.3.2 Sítios de ligação e hidrólise de ATP..........................................................32

2.3.2.1 Motivo Walker A .......................................................................................32

2.3.2.2 Motivo Walker B .......................................................................................33

2.3.3 Motivo MAW (Make ATP Work) ..............................................................33

2.3.4 Região de interface dos oligômeros...........................................................34

2.3.5 Domínio C-terminal ...................................................................................35

2.3.6 Regulação alostérica da atividade da proteína RecA (Integração

funcional dos domínios de RecA)..............................................................36

2.4 Proteínas Homólogas à RecA bacteriana...................................................37

2.5 Envolvimento de outras proteínas na modulação da atividade da

proteína RecA ............................................................................................40

2.5.1 Proteína ligadora de DNA simples-fita (SSB)...........................................40

2.5.2 Proteínas RecF, RecO e RecR ...................................................................41

2.5.3 Complexo RecBCD....................................................................................41

2.5.4 LexA...........................................................................................................43

2.5.5 DNA polimerase V.....................................................................................44

2.5.6 DinI ............................................................................................................44

2.5.7 RecX...........................................................................................................45

2.5.7.1 Análises funcional do gene recX................................................................46

2.5.7.2 Análises in vitro da proteína RecX ............................................................47

2.5.7.3 Análises in silico da proteína RecX...........................................................49

SUMÁRIO

VIII

2.6

Caracterização do operon recArecX e identificação de outros genes

envolvidos nos processos de recombinação e reparo SOS em H.

seropedicae ................................................................................................52

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................54

3.1 Materiais Gerais .........................................................................................54

3.1.1 Composição dos Meios de Cultura ............................................................54

3.1.2 Soluções e Reagentes.................................................................................55

3.1.3 Estirpes de bactérias e plasmídeos.............................................................57

3.1.4 DNA...........................................................................................................59

3.1.5 Reagentes e proteínas.................................................................................60

3.2 Métodos Gerais para DNA.........................................................................60

3.2.1 Manipulação do DNA ................................................................................61

3.2.2 Eletroforese de DNA em gel de agarose ou ágar.......................................61

3.2.3 Transformação bacteriana por Eletroporação ............................................62

3.2.4 Amplificação do DNA ...............................................................................63

3.2.5 Mutagênese sítio-dirigida...........................................................................64

3.2.6 Seqüenciamento de DNA...........................................................................66

3.2.6.1 Reação de seqüenciamento de DNA..........................................................66

3.2.6.2 Purificação do produto da reação de seqüenciamento ...............................66

3.2.6.3 Edição e Análise das seqüências................................................................66

3.2.7 Purificação de DNA simples-fita ...............................................................67

3.2.8 Clonagem ...................................................................................................68

3.2.8.1 Clonagem do gene recA de H. seropedicae...............................................68

3.2.8.2 Clonagem do gene recX de Herbaspirillum seropedicae...........................70

3.3 Métodos Gerais para proteína ....................................................................71

3.3.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante.............71

3.3.2 Superexpressão das proteínas RecA e RecX de H. seropedicae ...............72

3.3.3 Purificação das proteínas ...........................................................................73

3.3.3.1 Purificação de proteína contendo cauda His..............................................73

3.3.3.1.1 Cromatografia de afinidade utilizando metal imobilizado ........................73

3.3.3.2 Purificação de proteína nativa....................................................................74

3.3.3.2.1 Precipitação da proteína RecA com Polietilenoimina e Sulfato de

Amônio.......................................................................................................74

3.3.3.2.2 Cromatografia em DEAE-Sepharose.........................................................75

3.3.3.3 Cromatografia em SP-sepharose................................................................76

3.3.4 Clivagem da proteína RecXHis com trombina ..........................................76

3.3.5 Estocagem das proteínas ............................................................................78

3.3.6 Dosagem da concentração de proteína.......................................................78

3.3.7 Eletroforese de proteína em gel de agarose ...............................................78

3.3.8 Cristalização da proteína RecX..................................................................78

3.4 Ensaios in vitro...........................................................................................80

3.4.1 Ensaio de ligação das proteínas RecA e RecX ao DNA............................80

3.4.1.1 Ensaio de ligação das proteínas RecA e RecX ao DNA marcado com

[

P] ............................................................................................................80

3.4.1.2 Ensaio de ligação da proteína RecA e RecX ao DNA não marcado .........81

3.4.2 Ligação covalente das proteínas RecA e RecX com o DNA induzida

por luz UV..................................................................................................82

SUMÁRIO

3.4.3

Ensaios de interação proteína-proteína ......................................................83

3.4.3.1 Determinação da interação RecA-RecX utilizando resina de

sepharose chelating FF...............................................................................83

3.4.3.2 Determinação da interação RecA-RecX por eletroforese em duas

dimensões (2D) ..........................................................................................84

3.4.4 Ensaio de troca de fita de DNA .................................................................87

3.4.5 Ensaio de ligação do ATP..........................................................................88

3.4.6 Ensaio de atividade ATPásica....................................................................89

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................92

4.1 Clonagem, Expressão e Purificação da proteína RecA..............................92

4.1.1 Clonagem e Expressão da proteína RecA..................................................92

4.1.2 Purificação da proteína RecA ....................................................................93

4.1.2.1 Purificação da proteína RecA ligada à cauda de histidina.........................93

4.1.2.2 Purificação da proteína RecA nativa..........................................................95

4.2 Clonagem, Expressão, Purificação e Cristalização da proteína RecX

de Herbaspirillum seropedicae..................................................................96

4.2.1 Clonagem e Expressão da proteína RecX..................................................96

4.2.2 Purificação e Cristalização da proteína RecX............................................96

4.2.2.1 Purificação da RecX ligada à cauda de histidina.......................................97

4.2.2.2 RecX nativa................................................................................................98

4.2.2.2.1 Purificação da proteína RecX nativa em coluna SP Sepharose.................98

4.2.2.2.2 Clivagem do peptídeo N-terminal contendo a cauda His da proteína

RecXHis.....................................................................................................98

4.2.2.3 Cristalização da proteína RecX..................................................................99

4.3 Ensaios in vitro.........................................................................................100

4.3.1 Determinação da interação entre as proteínas RecA e RecX de H.

seropedicae ..............................................................................................101

4.3.2 Atividade de ligação das proteínas RecX e RecA ao DNA.....................108

4.3.2.1 Atividade de ligação ao DNA da proteína RecA.....................................108

4.3.2.2 Atividade de ligação ao DNA da proteína RecX.....................................111

4.3.2.3 Efeito de RecX sobre a atividade de ligação ao DNA da proteína

RecA.........................................................................................................115

4.3.3 Troca de fitas de DNA mediada pela proteína RecA...............................119

4.3.3.1 Efeito da proteína RecX sobre a troca de fitas de DNA mediada pela

proteína RecA ..........................................................................................121

4.3.4 Atividade de ligação ao ATP da proteína RecA ......................................123

4.3.4.1 Efeito da proteína RecX na atividade de ligação ao ATP da proteína

RecA.........................................................................................................125

4.3.5 Atividade de hidrólise de ATP (ATPásica) .............................................125

4.3.5.1 Atividade ATPásica da proteína RecA ....................................................125

4.3.5.2 Efeito de RecX sobre a Atividade ATPásica da proteína RecA..............128

5 CONCLUSÕES......................................................................................139

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................140

APÊNDICES .............................................................................................................161

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 - Vias de reparo por recombinação envolvidas na restauração da forquilha

de replicação diante de dupla quebra da forquilha de replicação (DSB) ou dupla quebra

do DNA genômico...........................................................................................................8

Figura 2.2 - Vias de reparo por recombinação envolvidas na restauração da forquilha

de replicação diante de lesões ou outras barreiras...........................................................9

Figura 2.3 - Estrutura do filamento de RecA. ...............................................................10

Figura 2.4 - Modelo do mini-mutassomo......................................................................16

Figura 2.5 - Associação e dissociação do filamento de RecA no ssDNA.....................18

Figura 2.6 - Reação de troca de fitas promovida pela proteína RecA in vitro. .............20

Figura 2.7 - Ondas de hidrólise de ATP no filamento de RecA....................................24

Figura 2.8 - Coordenação das ondas de hidrólise de ATP no filamento de RecA........25

Figura 2.9 - Modelo de troca de fitas entre ssDNA e dsDNA no qual a rotação do DNA

está acoplada à hidrólise de ATP...................................................................................27

Figura 2.10 - Modelo estrutural da proteína RecA........................................................29

Figura 2.11 - Alinhamento da seqüência de aminoácidos da proteína RecA de diversos

microrganismos. ............................................................................................................30

Figura 2.12 - Comparação entrutural dos domínios das proteínas RecA, UvsX, Rad51

e Dmc1...........................................................................................................................38

Figura 2.13 - Mecanismo molecular da formação de ssDNA mediado por RecBCD e

chi. .................................................................................................................................43

Figura 2.14 - Alinhamento da seqüência de aminoácidos da proteína RecX de diversos

microrganismos. ............................................................................................................50

Figura 2.15 - Modelo estrutural da proteína RecX........................................................51

Figura 3.1 - Esquema da mutagênese sítio dirigida Quickchange. ...............................65

Figura 3.2 - Etapas do ensaio de interação proteína-proteína utilizando resina de

sepharose ligada a íons Ni

. .........................................................................................84

Figura 3.3 - Esquema do ensaio de interação proteína-proteína utilizando eletroforese

bidimensional.................................................................................................................87

Figura 4.1 - Purificação das proteínas RecA e RecX de Herbaspirillum seropedicae.94

Figura 4.2 - Interação RecA-RecX de H. seropedicae demonstrada através de

imobilização em resina de sepharose-Ni

..................................................................103

Figura 4.3 - Demonstração da interação RecA-RecX de H. seropedicae através de

eletroforese bidimensional - I......................................................................................105

Figura 4.4 - Demonstração da interação RecA-RecX de H. seropedicae através de

eletroforese bidimensional - II.....................................................................................106

LISTA DE TABELAS

Figura 4.5 - Ensaio de retardamento de migração de DNA de baixa massa molecular

na presença da proteína RecA de H. seropedicae. ......................................................110

Figura 4.6 - Ensaio de retardamento de migração de DNA de alta massa molecular

pela presença da proteína RecX de H. seropedicae. ...................................................112

Figura 4.7 - Ensaio de retardamento de migração de DNA de baixa massa molecular

pela presença da proteína RecX de H. seropedicae. ...................................................114

Figura 4.8 - Efeito da proteína RecX sobre a atividade de ligação ao DNA da proteína

reca...............................................................................................................................116

Figura 4.9 - Ligação covalente da proteína RecA e/ou RecX de H. seropedicae ao

dsDNA derivatizado. ...................................................................................................118

Figura 4.10 - Troca de fitas de DNA mediada pelas proteínas RecA de H. seropedicae

e E. coli ........................................................................................................................120

Figura 4.11 - Efeito da proteína RecX na troca de fitas mediada pela proteína RecA.

.....................................................................................................................................122

Figura 4.12 - Ligação ao ATP da proteína RecA de H. seropedicae..........................124

Figura 4.13 - Atividade ATPásica da proteína RecA de H. seropedicae....................127

Figura 4.14 - Efeito da proteína RecX sobre a atividade ATPásica dependente de

ssDNA da proteína RecA de H. seropedicae. .............................................................129

Figura 4.15 - Efeito da ordem de adição da proteína RecX na inibição da atividade

ATPásica dependente de ssDNA da proteína RecA....................................................133

Figura 4.16 - Efeito da adição de ssdna na inibição da atividade atpásica dependente de

ssDNA da proteína RecA pela proteína RecX. ...........................................................135

Figura 4.17 - Modelo de inibição de RecA pela proteína RecX. ................................136

LISTA DE TABELAS

XII

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - Proteínas envolvidas na recombinação homóloga. ...................................39

Tabela 3.1 - Composição dos meios de cultivo bacterianos..........................................54

Tabela 3.2 - Antibióticos usados neste trabalho............................................................55

Tabela 3.3 - Composição das soluções utilizadas neste trabalho..................................55

Tabela 3.4 - Composição dos tampões utilizados neste trabalho..................................56

Tabela 3.5 - Estirpes de bactérias hospedeiras e do bacteriófago usados neste trabalho.

.......................................................................................................................................57

Tabela 3.6 - Plasmídeos usados neste trabalho. ............................................................58

Tabela 3.7 - Composição dos géis de separação e de empilhamento utilizados nas

análises por SDS-PAGE................................................................................................71

Tabela 3.8 - Composição dos géis utilizados para separação das proteínas em condição

nativa. ............................................................................................................................81

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

XIII

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

APAB - brometo de 4-azidofenacil

ATP - 5´ trifosfato de adenosina

Bq - Bequerel

BSA - albumina de soro bovino

CCD - cromatografia em camada delgada

D. O. - densidade óptica

ddNTP - 5´trifosfato de 2´, 3´- didesoxinucleosídeo

dNTP - 5´-trifosfato de 2´desoxinucleosídeos

dsDNA - DNA dupla-fita (double-strand DNA)

DTT - ditiotreitol

EcRecA e EcRecX - proteínas RecA e RecX de E. coli

EDTA - ácido etileno diamino-tetra-acético

EM - Microscopia eletrônica

FPLC - cromatografia líquida de performance rápida (Fast Performance Liquid

Chromatography)

His - cauda N-terminal contendo 6 resíduos de histidinas

HMK - seqüência de aminoácidos reconhecida e fosforilada pela quinase de músculo

cardíaco de boi (bovine heart muscle kinase)

HsRecA e HsRecX - proteínas RecA e RecX de H. seropedicae

IPTG - β-D-isopropil-tiogalactopiranosídeo

kb - kilo base

kDa - kilo Dalton

kpb - kilo pares de bases

MAW - motivo da proteína RecA (Make ATP Work)

MtRecA e MtRecX - proteínas RecA e RecX de M. tuberculosis

nt - nucleotídeos

pb - pares de bases

PCR - reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)

PEG - polietileno glicol

PEI - placa de celulose microcristalina ligada a polietilenamina modificada

(polyethilenimine-modified microcrystaline cellulose)

RBS - sítio de ligação de ribossomo (ribosome-binding site)

RNA - ácido ribonucléico

RNAse - ribonuclease

rpm - rotações por minuto

SDS - dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE - eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS

polyacrylamide gel electrophoresis)

SSB - proteína ligadora de ssDNA (single-stranded binding protein)

ssDNA - DNA simples-fita (single-strand DNA)

UV - Ultra Violeta

RESUMO

XIV

RESUMO

O reparo do DNA é um mecanismo essencial para a sobrevivência de todos os

organismos, desde as formas de vida unicelulares até humanos. A proteína RecA

bacteriana é um componente central no reparo de DNA pois induz indiretamente a

expressão de proteínas envolvidas no reparo não mutagênico e mutagênico do DNA,

reparo SOS e reparo por recombinação. RecX é uma proteína moduladora da atividade

de RecA, mas o mecanismo ainda não é conhecido. Os genes recA e recX de

Herbaspirillum seropedicae formam um único operon e as evidências indicam que

RecX participa no reparo SOS, possivelmente modulando as atividades de RecA. Para

determinar o envolvimento da proteína RecX na regulação das atividades de RecA, as

proteínas RecA, RecA mutante L54Q ou L54Q G73A e RecX de H. seropedicae

foram superexpressas em E. coli, purificadas nas suas formas nativas e/ou com cauda

de resíduos de histina (His) e caracterizadas in vitro. A interação entre as proteínas

RecA e RecX de H. seropedicae (HsRecA e HsRecX) foi demonstrada através de

ensaios de imobilização em resina de sepharose e eletroforese em duas dimensões.

Ensaios de retardamento de migração eletroforética do DNA revelaram que as

proteínas HsRecA e HsRecX são capazes de se ligar ao DNA de fita dupla e simples

na ausência de ATP. HsRecX liga-se ao DNA fita dupla mesmo na presença de

HsRecA. HsRecA também apresentou as atividades de ligação ao ATP, hidrólise de

ATP e troca de fitas de DNA. A proteína HsRecX inibiu 90% da atividade de troca de

fitas de HsRecA quando presente numa concentração molar 50 vezes menor do que

HsRecA. A ligação do ATP à HsRecA não foi afetada pela presença de HsRecX

porém a atividade ATPásica foi reduzida. Quando a proteína HsRecX estava presente

antes da formação do filamento de RecA (HsRecA-ssDNA), a inibição dessa atividade

ATPásica foi substancialmente reduzida, enquanto excesso de ssDNA suprimiu

parcialmente essa inibição. A substituição do resíduo L54 por Q provocou uma

redução na atividade de ligação ao DNA. Além disso, embora esta proteína mutada

ainda ligue ATP, não foi capaz de hidrolisá-lo ou realizar troca de fitas de DNA,

sugerindo que o resíduo L54 está envolvido nesses processos. Estes resultados

sugerem que a proteína HsRecX modula a atividade de HsRecA através de interações

HsRecA-HsRecX e possivelmente controla a disponibilidade de DNA substrato de

RecA.

ABSTRACT

DNA repair is crucial to the survival of all organisms from unicellular life

forms to humans. The bacterial RecA protein is a central component in DNA repair as

it induces indirectly the expression of proteins involved in non-mutagenic and

mutagenic DNA repair, SOS repair and recombination repair. RecX is a modulator

protein of RecA activity, but the mechanism of control remains unknown. The recA

and recX genes of Herbaspirillum seropedicae constitute a single operon, and

evidences suggest that RecX participates in SOS repair, probably modulating RecA

activities. To determine the involvement of RecX in the regulation of RecA activities,

RecA wild-type, RecA mutant L54Q or L54Q G73A and RecX proteins of H.

seropedicae were overexpressed and purified either in native or His-tagged (His) form

and characterized in vitro. The interaction between the RecA and RecX proteins of H.

seropedicae (HsRecA and HsRecX) was demonstrated by sepharose bead

immobilization and two dimensional electrophoresis. DNA band-shift assays revealed

that both HsRecX and HsRecA proteins bound to single-stranded DNA (ssDNA) and

also double-stranded DNA (dsDNA) in the absence of ATP. The HsRecX bound to

DNA even in the presence of HsRecA. HsRecA also possessed ATP binding, ATP

hydrolysis and DNA strand exchange activities. The HsRecX inhibited 90% of the

HsRecA DNA strand exchange activity even when present in a 50 times less molar

concentration than HsRecA. ATP binding to HsRecA was not affected by the addition

of RecX, but the ATPase activity was reduced. Under conditions where HsRecX was

present prior to the formation of RecA filaments (RecA-ssDNA), the inhibition was

substantially reduced, and excess of ssDNA partially suppressed this inhibition. The

substitution of the L54 residue by Q decreased HsRecA DNA binding activity. In

addition, although the mutant protein still binds ATP, it was not able to hydrolyze it

nor to exchange DNA strands, suggesting that the L54 residue is involved in these

processes. The results suggest that the HsRecX protein modulates HsRecA activities

by HsRecA-HsRecX interactions and probably controls the availability of the DNA

substrate of RecA.

1 INTRODUÇÃO

O DNA genômico bacteriano, como qualquer macromolécula, está

constantemente sujeito a lesões químicas e físicas. O reparo destas lesões é essencial já

que o DNA é o molde para a sua própria duplicação e para a produção dos diversos

tipos de RNAs e proteínas (Kuzminov, 1999).

Replicação incompleta implica em instabilidade genômica ou até mesmo

letalidade para a célula. A interrupção da replicação decorrente de modificações

químicas ou quebras no DNA pode produzir pelo menos três fatores: (1) indução de

deleções ou rearranjos genômicos, quando a síntese de DNA reinicia em pontos

errados; (2) indução de mutações, quando um nucleotídeo incorreto for adicionado ou

(3) indução de letalidade, quando o bloqueio não for restaurado. Na tentativa de

impedir alterações genéticas, ou, pelo menos, reduzir sua freqüência, uma maquinaria

enzimática complexa tem se desenvolvido (Friedberg et al., 1995).

A proteína RecA é uma peça chave no processo de reparo do DNA em

bactérias, pois ao induzir a autoclivagem do repressor LexA promove a expressão de

proteínas envolvidas no reparo não mutagênico e mutagênico do DNA (para revisão

Goodman, 2002) e ao catalisar a troca de fitas de DNA promove o reparo por

recombinação (para revisão Lusetti & Cox, 2002). Mutações no gene recA são

pleiotrópicas: os processos de recombinação homóloga, reparo, mutagênese e a divisão

celular são afetados (Bianco et al., 1998).

A proteína RecA está presente em todas as bactérias e proteínas homólogas à

RecA têm sido identificadas em uma variedade de organismos, desde bacteriófagos até

humanos (Roca & Cox, 1997). No bacteriófago T4, a proteína homóloga à RecA foi

denominada UvsX, em eucariotos Rad51 e Dmc1 e em arqueobactéria RadA. RecA,

UvsX, Rad51, Dmc1 e RadA compreendem uma família de proteínas com função e

seqüência universalmente conservadas (Bianco et al., 1998; Lusetti & Cox, 2002).

Essa alta similaridade indica que as funções da proteína RecA são essenciais em todas

as formas de vida. Dentre as proteínas constituintes da família RecA, a proteína RecA

bacteriana tem sido principalmente estudada, uma vez que as bactérias constituem o

grupo de organismos mais simples e a alta conservação de RecA permite a extensão

2 INTRODUÇÃO

das funções de RecA para as proteínas homólogas identificadas nos organismos

superiores.

Para desempenhar suas funções, foi mostrado que a proteína RecA de

Escherichia coli requer a participação de outras proteínas cuja síntese e/ou atividade

são reguladas pela própria RecA (Bianco & Kowalczykowski, 1998). Em particular, a

identificação de um grande número de proteínas moduladoras da atividade da proteína

RecA (proteínas RecFOR, RecBCD, SSB, LexA, UmuD, DinI e RecX) enfatiza a

importância biológica da regulação da função de RecA. Aparentemente a regulação de

RecA se dá através de uma complicada rede de interações protéicas (Stohl et al.,

2003).

A proteína RecX despertou o interesse de diversos grupos de pesquisa porque

o gene recX apresenta uma localização altamente conservada no genoma bacteriano: a

jusante de recA, formando um único operon, e também porque uma grande variedade

de fenótipos tem sido associada a mutantes recX (Zaitsec et al., 1994; Guiliani et al.,

1997; Papavinasasundaram et al., 1997; Vierling et al., 2000; Yang & Chou, 2001;

Yang et al., 2002; Sukchawalit et al., 2001; Galvão, 2001). Estudos in vivo e in vitro

em diversos microrganismos indicaram a participação da proteína RecX na modulação

das atividades de RecA, porém o mecanismo e a função desse processo permanecem

alvo de estudo (Stohl et al., 2002, 2003; Venkatesh, 2002; Drees et al., 2004a, 2004b;

Lusetti et al., 2004b).

Os genes recA e recX da bactéria diazotrófica Herbaspirillum seropedicae

estão organizados em um único operon (Galvão, 2001). Análises fisiológicas do

mutante recX de H. seropedicae sugeriram a participação da proteína RecX nos

processos onde a proteína RecA é essencial como a resposta SOS e a recombinação

homóloga (Galvão, 2001; Galvão et al., 2003), indicando fortemente o envolvimento

da proteína RecX na modulação da atividade de RecA. Com o intuito de elucidar esse

processo, neste trabalho, as proteínas RecA e RecX de H. seropedicae foram

superexpressas, purificadas e caracterizadas in vitro.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A interrupção da síntese de DNA ocorre quando a forquilha de replicação

encontra barreiras no DNA de natureza espontânea ou causadas por agentes ambientais

(Kuzminov, 1999; Lusetti & Cox, 2002; Courcelle & Hanawalt, 2003). As barreiras de

natureza espontânea são formadas devido ao pareamento incorreto, a tautomerização, a

metilação, a desaminação (converte citosina em uracila, por ex.), a depurinização e a

depirimidinização (promovem a formação de sítios abásicos) e a oxidação de bases

(espécies reativas de oxigênio resultantes desse processo promovem a fragmentação de

riboses, perda ou modificação de bases) (Friedberg et al., 1995). As barreiras causadas

por agentes ambientais compreendem os fotoprodutos da exposição a luz UV (dímeros

de pirimidina, por ex.); a ligação covalente entre as fitas da dupla-hélice do DNA

causada pela exposição do DNA a psoralenos e luz UV ou mitomicina C, simples e

duplas quebras no DNA resultantes da radiação ionizante (raios X ou raios gama)

(Kuzminov, 1999). A recuperação destes sítios de lesão com características

particulares requer enzimas e mecanismos de reparo particulares.

O reparo do DNA consiste de um conjunto de reações que promove a

restauração da síntese do DNA. No reparo não mutagênico, a restauração da replicação

ocorre sem comprometer a integridade do genoma, já no reparo mutagênico,

modificações na seqüência de bases são inseridas.

O reparo não mutagênico inclui o reparo por reversão direta, reparo por excisão

de bases, nucleotídeos e pareamentos incorretos (mismatches) e, finalmente, o reparo

por recombinação homóloga. O reparo por reversão direta e o reparo por simples

excisão e reinserção do nucleotídeo correto ocorrem diante de lesões que afetam

apenas uma das fitas do DNA. Já o reparo por recombinação homóloga ocorre na

presença de lesões e quebras em uma única fita de DNA ou em ambas as fitas de DNA

(Cox, 2001; Lusetti & Cox, 2002; Courcelle & Hanawalt, 2003).

O reparo mutagênico, acionado apenas em situações de alta concentração de

lesões e/ou quebras nas fitas de DNA na estirpe de E. coli selvagem, inclui a

mutagênese SOS (Goodman, 2002) e a mutagênese modulada por UV (Pajewala et al.,

1994).

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O mecanismo de reparo por reversão direta é catalisado pelas fotoliases no

reparo de dímeros de pirimidina (Sancar, 1994a) e pela proteína suicida Ada no reparo

de bases O

-metilguanina (Shevell et al., 1990).

Em todos os tipos de reparo por excisão, é feita a remoção do segmento de

DNA que contém a lesão e a outra fita intacta é usada como molde. No reparo por

excisão de bases, DNA glicosidases removem a base modificada produzindo um sítio

abásico e endonucleases AP clivam a fita que contém o sítio abásico e removem

alguns nucleotídeos formando uma lacuna no segmento de DNA. A DNA polimerase I

(polI) catalisa a adição dos nucleotídeos requeridos, preenchendo esta lacuna, e a DNA

ligase une os nucleotídeos (de Vries & Wackernagel, 1992). Esse mecanismo é

adotado para o reparo de lesões oxidativas e metilações.

O reparo por excisão de nucleotídeos está envolvido no reparo de lesões que

causam distorções no DNA. A excinuclease remove um segmento de 12 a 13

nucleotídeos contendo a lesão, resultando em uma lacuna. Após a síntese da seqüência

de nucleotídeos correta pela polI, a DNA ligase une a fita de DNA originalmente

lesada (Sancar, 1994b). Em E. coli, a detecção e o reparo por excisão de nucleotídeos

do DNA contendo lesões causadas por UV, mitomicina, mostarda nitrogenada,

psoralenos fotoativados, N-metil- N´-nitro-N-nitrosoguanidina, são feitos pelo

complexo UvrABC em presença de ATP (Orren & Sancar, 1989).

O reparo de pareamentos incorretos pode levar à excisão de mais de 1000

nucleotídeos de uma das fitas do dsDNA na tentativa de reparar um pareamento

incorreto criado durante a replicação (Modrich, 1994).

O reparo por recombinação homóloga promove a restauração da síntese de

DNA através da troca de fitas homólogas de DNA. Quando apenas uma das fitas de

DNA encontra-se lesada ou quebrada, a troca de fitas de DNA ocorre com o par

homólogo. Por outro lado, para reparar lesões que envolvem as duas fitas de DNA

(ligações entre fitas de DNA, por exemplo) e reparar duplas quebras no DNA sem

perder a informação da seqüência, é necessária a presença de uma molécula de DNA

homóloga extra. Esse fragmento de DNA extra pode ser proveniente da conjugação,

5 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

transformação ou transdução (Roca & Cox, 1997; Kuzminov, 1999), ou da própria

replicação.

Para o reparo propenso a erro do DNA através da mutagênese SOS não é

necessária a presença de uma fita de DNA complementar intacta ou de qualquer DNA

extra, contrastando com o mecanismo de reparo não-mutagênico (Goodman, 2002).

2.1 Envolvimento da Proteína RecA nos processos de Recombinação Homóloga,

Resposta SOS e Mutagênese SOS

A proteína RecA de E. coli é uma proteína multifuncional essencial em três

processos biológicos distintos porém relacionados: (1) recombinação homóloga; (2)

resposta SOS, regulando a expressão coordenada dos genes presentes no regulon SOS;

(3) mutagênese SOS, mediando a síntese translesão (Bianco & Kowalczykowski,

2001). Essa multifuncionalidade de RecA torna mutações no gene recA pleiotrópicas

(Bianco et al., 1998).

2.1.1 Recombinação Homóloga

A recombinação homóloga foi descrita em E. coli nos anos 40 (Lederberg,

1947) e por muitos anos pensou-se ser o resultado de um processo sexual, análogo ao

que é encontrado em eucariotos. Posteriormente, foi constatada uma maior

sensibilidade a lesões no DNA do mutante deficiente em recombinação indicando que

a recombinação em bactérias é também um mecanismo de reparo (Clark et al.,1966;

Clark & Marguilies, 1965; Howard-Flanders, 1973; Howard-Flanders & Theriot,

1966). Recentemente, foi estabelecido que o reparo da forquilha de replicação

interrompida é a primeira função do sistema de recombinação bacteriano (Cox et al.,

2001). As vias de reparo por recombinação são variadas e numerosas, dada à

multiplicidade de graus e tipos de lesões que podem estar causando a interrupção da

replicação e dada à importância do reparo não mutagênico. O reparo por recombinação

6 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

é dependente de proteínas envolvidas em diferentes processos do metabolismo de

DNA e apresentam funções enzimáticas especializadas e complexas.

2.1.1.1 Vias de Reparo por Recombinação

As vias de reparo de quebras em ambas as fitas do DNA (duplas quebras) e as

vias de reparo de lesões nas fitas líder e atrasada do DNA estão agrupadas e ilustradas

nas figuras 2.1 e 2.2, respectivamente.

O mecanismo de reparo de duplas quebras na forquilha de replicação (double-

strand break, DSB) mostra claramente a integração entre os processos de replicação e

recombinação (Lovett, 2003), já que há a participação da RecA e do complexo

RecBCD, proteínas envolvidas na recombinação, e a participação da PriA, PriB, PriC,

DnaC, DnaT, DnaB e DnaG, proteínas envolvidas na replicação do DNA genômico

bacteriano (Kuzminov, 1999).

A dupla quebra da forquilha de replicação (DSB) é resultante da colisão da

DNA polimerase III (polIII) com uma das fitas de DNA quebrada ou resultante da

ação de nucleases que quebram ativamente a forquilha estacionada (Figura 2.1A). Em

E. coli, este tipo de quebra é processada pelo complexo nuclease/helicase RecBCD

(detalhes na seção 2.5.3), o qual promove a formação de extensões de DNA simples-

fita (ssDNA) 3´. A proteína RecA adquire a sua forma ativa ao ligar-se ao ssDNA

gerado na presença de ATP, formando uma estrutura denominada de filamento de

RecA (Figura 2.3). O filamento de RecA, ao identificar o DNA dupla-fita (dsDNA)

homólogo, invade-o a partir do seu terminal 3´, criando intermediários de

recombinação denominados de alça-D (detalhes na seção 2.2.2).

Xu & Marians (2003) mostraram que, na ausência da proteína PriA, a síntese do

DNA a partir do terminal 3´ invasor é estendida sem haver a formação de uma

forquilha de replicação, produzindo ssDNA extensos (Figura 2.1A). Por outro lado, a

ligação da proteína PriA ao terminal 3´ invasor inibe a síntese do DNA pela polIII e

promove juntamente com PriBC DnaCT o direcionamento da helicase DnaB para a fita

deslocada da alça-D. DnaB, por sua vez, recruta a primase DnaG e induz a síntese de

7 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

ambas as fitas de DNA pela polIII. A partir desse modelo é possível verificar que a

proteína PriA assegura que a recombinação em alça-D seja resolvida numa completa

forquilha de replicação, com capacidade de replicar todo o genoma. A estrutura

ramificada (em forma de cruz) gerada como produto desse processo, denominada

junção de Holliday, é processada pelo complexo RuvABC. O papel da proteínas RecF,

RecOR no reparo de dupla quebra da forquilha permanece obscuro (Lovett, 2003).

No reparo de duplas quebras no DNA formadas de forma independente da

replicação, os dois terminais simples-fita 3´ disponíveis formam duas alças-D (Figura

2.1B). Essa estrutura aparentemente impede a ligação da proteína DnaB e

conseqüentemente a sua ausência inibe a formação da forquilha de replicação mediada

por PriA. Dessa forma, o reparo é efetuado apenas com a síntese de uma curta

seqüência de DNA, sem a restauração da forquilha de replicação. Neste tipo de reparo,

há a necessidade da presença de DNA extra (Lovett, 2003).

A colisão da DNA polimerase III com lesões no DNA pode levar à formação de

uma lacuna em uma das fitas de DNA, como ilustrado no esquema da figura 2.2.

Sugere-se que o reparo desse tipo de lesão ocorra a partir da regressão da forquilha de

replicação. Essa regressão pode ocorrer espontaneamente (Cordeiro-Stone et al., 1999)

e também pode ser promovida enzimaticamente pelas proteínas RecG (McGlynn &

Lloyd, 2000; 2001), RuvAB (Michel et al., 2001) ou RecA (Robu et al., 2001). A

atividade de RecA neste processo parece ser inteiramente dependente da hidrólise de

ATP (Robu et al., 2001, 2004) e representa uma possível aplicação da função motora

de RecA (descrita em detalhes na seção 2.2.3.1; Lusetti & Cox, 2002; Cox et al.,

2005). Estudos in vivo reportados recentemente mostraram que a regressão da

forquilha de replicação promovida por RecG e RuvAB não é essencial para o reinício

da replicação (Donaldson et al., 2004).

8 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.1 - VIAS DE REPARO POR RECOMBINAÇÃO ENVOLVIDAS NA

RESTAURAÇÃO DA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DIANTE DE DUPLA QUEBRA DA

FORQUILHA DE REPLICAÇÃO (DSB) OU DUPLA QUEBRA DO DNA GENÔMICO.

Forquilha de replicação quebrada

RecA mediando alça-D

Extensão da alça-D

Ligação de PriA

Recrutamento de DnaB e DnaG

Restabelecimento da forquilha

replicação

Liberação de PriA

3´

5` 3`

5´

3´

5`3´

5´

3´

Dupla quebra no DNA

Invasão dos dois terminais

Bloqueio da ação de DnaB

Reparo sem restabelecimento da

forquilha de replicação

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

Forquilha de replicação quebrada

RecA mediando alça-D

Extensão da alça-D

Ligação de PriA

Recrutamento de DnaB e DnaG

Restabelecimento da forquilha

replicação

Liberação de PriA

3´

5` 3`

5´

3´

5`3´

5´

3´

Dupla quebra no DNA

Invasão dos dois terminais

Bloqueio da ação de DnaB

Reparo sem restabelecimento da

forquilha de replicação

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

Dupla quebra no DNA

Invasão dos dois terminais

Bloqueio da ação de DnaB

Reparo sem restabelecimento da

forquilha de replicação

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

Etapas do reparo de dupla-quebra na forquilha de replicação (A) e de dupla quebra do DNA genômico

(B). Legenda: RecA - Círculo rosa, PriA - hexágono azul, DnaB helicase - anel amarelo, Dna G -

círculo verde e DNA polimerase III - triângulo rosa. A descrição detalhada de cada via de reparo

encontra-se no texto (seção 2.1.1.1).

FONTE: Adaptado de Lovett (2003).

9 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.2 - VIAS DE REPARO POR RECOMBINAÇÃO ENVOLVIDAS NA

RESTAURAÇÃO DA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DIANTE DE LESÕES OU OUTRAS

BARREIRAS.

REINÍCIO DA REPLICAÇÃO DE

FORMA INDEPENDENTE DE oriC

Replicação dependente da oriC

Regressão da forquilha de

replicação e formação da

estrutura em “pé de galinha”

Desligamento gradual da

fita de DNA sintetizada

Pareamento das fitas de

DNA parentais

Proteína RecA mediando a

regressão da forquilha de

replicação

Replicação e formação da

estrutura denominada “pé de

galinha”

Dissociação da RecA do

DNA

Topologia direcionando a

progressão da forquilha de

replicação

RecA +

Topoisomerase

RecA +

Topoisomerase

Lesão na fita líder Lesão na fita atrasada

RecA RecA

Formação do

filamento de RecA

Progressão da forquilha de

replicação

Formação do

filamento de RecA

3´

5´

3´

5´

A via de reparo varia de acordo com a localização da lesão. A lesão pode ser encontrada na fita líder

(A) ou na fita atrasada (B). A descrição detalhada de cada via de reparo encontra-se no texto.Legenda:

Lesão ou barreira no DNA - quadrado preto e RecA - círculos abertos.

FONTE: Adaptado de Lusetti & Cox, 2002.

10 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.3 - ESTRUTURA DO FILAMENTO DE RecA.

(A) Um filamento de RecA contendo 24 monômeros, baseado na estrutura de RecA descrita por Story

& Steitz, 1992, com dois monômeros destacados. (B) Secção transversal do filamento de RecA

mostrando os 6 monômeros envolvidos na formação de uma volta do polímero. Cada monômero está

representado alternadamente em amarelo e verde. Em vermelho está sendo mostrado o sítio de ligação

para o ATP no filamento ativo.

FONTE: Adaptado de Cox (2003) e VanLook et al. (2003a).

11 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Diante de uma região lacuna na fita líder, RecA se liga à região de ssDNA na

direção 5´→3´, levando a regressão da forquilha até o ponto da lesão. Como

conseqüência deste processo é formada uma junção de Holliday com braços curtos

denominada “pé de galinha” (chicken foot) (Figura 2.2A). A formação desta estrutura

permite que a DNA polimerase II (polII) copie a seqüência de DNA correta a partir da

fita molde sintetizada (Goodman, 2002). Após o reanelamento das fitas moldes, RecA

se desprende do DNA deixando as fitas moldes parcialmente desenroladas. Este

desenrolamento pode prover à molécula de DNA o stress torcional necessário para

impulsionar a forquilha numa direção progressiva e restaurar a estrutura da forquilha

(Lusetti & Cox, 2002).

Diante de uma lacuna na fita atrasada, o mecanismo de reparo apresenta

características particulares uma vez que a ligação dos monômeros de RecA ao DNA e

o pareamento das fitas homólogas de DNA sempre ocorre na direção 5´→ 3´. O

modelo proposto na figura 2.2B foi testado in vitro e se mostrou dependente da

presença de RecA e topoisomerase (Cunningham et al., 1981). A troca de fitas cria

uma bolha a jusante da forquilha, e tanto a bolha quanto a forquilha migram

progressivamente até a região além da lesão, induzindo o desprendimento gradual da

fita sintetizada. Quando essa é totalmente separada, as fitas sintetizadas formam a

ramificação curta do “pé de galinha” e a bolha é desfeita como conseqüência do

reanelamento das fitas originais. Sugere-se que o produto final desse processo de

reparo seja o mesmo daquele já descrito para o reparo da lacuna na fita atrasada.

Alternativamente, foi proposto que após sua formação a estrutura em “pé de galinha”

poderia ser clivada, direcionando o reparo para o mecanismo de reparo de duplas

quebras na forquilha de replicação, descrito anteriormente (Figura 2.1A; Cox, 2001;

Lusetti & Cox, 2002). Tanto no reparo por recombinação das lacunas presentes na fita

líder como na fita atrasada, a substituição da proteína ligadora de ssDNA (SSB) por

RecA na região de DNA simples-fita é mediada pelo complexo RecFOR (Umezu &

Kolodner, 1994; Webb et al., 1997; Shan et al., 1997).

Courcelle & Hanawalt (2003) também descrevem a participação de RecA na

recuperação da forquilha de replicação quando a replicação é reiniciada a jusante do

sítio lesado. O modelo proposto por estes autores é classificado como processo de

tolerância à lesão, uma vez que a maquinaria de reparo por recombinação apenas

12 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

preenche as lacunas formadas e a lesão, então, é reparada através de outros

mecanismos de reparo, como, por exemplo, o reparo por excisão de nucleotídeo,

mediado por UvrABC. Esses mesmos autores propõem que a proteína RecA não é

requerida para a troca de fitas de DNA numa situação de parada da replicação, mas

sim para a manutenção da integridade da estrutura até que a lesão seja removida

através de outros mecanismos de reparo.

2.1.2 Resposta SOS

A Resposta SOS é um complexo mecanismo celular induzido devido à

interrupção da replicação diante de barreiras no DNA (Radman, 1975). A indução da

resposta SOS promove a expressão de mais de 40 genes presentes no regulon SOS

(Courcelle et al., 2001). Esses genes operam na manutenção da integridade da

forquilha de replicação, no reparo de lesões, na síntese translesão, e no bloqueio da

divisão celular prematura até que as barreiras no DNA tenham sido eliminadas

(Crowley & Courcelle, 2002; Friedberg et al., 1995).

Assim como no reparo por recombinação, a proteína RecA também tem um

papel central na resposta SOS. Ao ligar-se ao ssDNA formado devido à interrupção da

replicação, RecA na presença de ATP torna-se capaz de induzir a expressão dos genes

presentes no regulon SOS (Courcelle et al., 2001).

Em condições normais de crescimento, a expressão dos genes SOS é reprimida

pelo repressor LexA, que, na sua forma dimérica, liga-se a uma seqüência

palindrômica presente na região operadora dos genes SOS impedindo sua transcrição

(Brent & Ptashne, 1981; Little et al., 1981; Walker, 1984). A seqüência consenso do

operador SOS é 5´ TACTGTATATATATACAGTA3´, e os nucleotídeos em negrito

são absolutamente conservados (Lewis et al., 1994). A expressão basal de genes SOS

em condição de não indução é mantida pela seqüência imperfeita do sítio operador ou

devido a promotores alternativos (Kuzminov, 1999). A desrepressão dos genes

constituintes do regulon SOS ocorre quando a proteína RecA ligada ao ssDNA e em

presença de ATP ativa a autoclivagem (coproteólise) do repressor LexA tornando-o

13 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

inativo (Brent & Ptashne, 1980; Little et al., 1981; Little & Mount, 1982). A

recuperação da capacidade de síntese de DNA em resposta ao reparo das lesões se

reflete na redução da quantidade de ssDNA disponível. RecA na ausência de ssDNA

não é capaz de induzir a co-proteólise de LexA, que se acumula na forma ativa,

reprimindo novamente a expressão dos genes SOS (revisado por Kuzminov, 1999).

Muitos dos genes regulados positivamente na resposta SOS tem como função o

reparo das lesões no DNA e a restauração do processo de replicação. Incluem-se neste

grupo os produtos dos genes uvrA, uvrB (Kenyon & Walker, 1980) e ydjQ

(denominado agora cho) (Fernandez de Henestrosa et al., 2000; Moolenaar et al.,

2002), os quais participam do reparo por excisão de nucleotídeos. Outros genes

regulados positivamente são polB, dinB, umuCD que codificam para as DNA

polimerases: polII, polIV e polV, respectivamente.

As proteínas envolvidas no reparo mutagênico (Mutagênese SOS, detalhada na

seção 2.1.3) são expressas a partir do regulon SOS (Kuzminov, 1999). Nos primeiros 5

minutos após a irradiação com luz UV, os genes recA e recN (envolvidos no reparo do

DNA por recombinação) e o gene sulA (envolvido na inibição da divisão celular) são

induzidos. O repressor LexA também é induzido nesse período. O grau de expressão

destes genes após a indução é 2 - 30 vezes maior do que a expressão constitutiva

(Courcelle et al., 2001). Os genes umuD e umuC são fortemente expressos 20 minutos

após a exposição à luz UV, indicando que numa situação de graves lesões no DNA, ou

seja, numa situação em que a síntese normal do DNA não tenha sido restaurada através

do reparo não mutagênico, as proteínas envolvidas no reparo mutagênico, UmuD e

UmuC, são necessárias (Courcelle et al., 2001).

2.1.3 Mutagênese SOS

A mutagênese SOS, também conhecida como Reparo Propenso a Erro ou como

Síntese Translesão, é um processo de reparo que induz a inserção de mutações na

seqüência do DNA (Radman, 1975; Witkin, 1976). A proteína RecA, mais uma vez,

está diretamente envolvida neste processo induzindo a co-proteólise da proteína UmuD

14 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

(Burckhardt et al., 1988; Nohmi et al., 1988; Shinagawa et al., 1988) e participando da

síntese translesão (Schlancher et al., 2005).

Uma vez formada a proteína UmuD´, a partir da indução da co-proteólise da

proteína UmuD, UmuD´ interage com UmuC formando o complexo estável UmuD´

UmuC (UmuD´

C) também chamado de DNA polimerase V (polV; Shen et al., 2003).

Além da polV, E. coli apresenta outras 2 DNA polimerases: polII (Bonner et al., 1988,

1990; Iwasaki et al., 1990) e polIV (Wagner et al., 1999), as quais realizam a

replicação propensa a erro do DNA e apresentam a expressão controlada pela resposta

SOS (Goodman, 2002). As duas principais DNA polimerases de E. coli, polI e polIII,

não apresentam sua expressão controlada pela resposta SOS. A principal função de

polI é remover os oligonucleotídeos de RNA enquanto processa os fragmentos de

Okazaki e preencher as pequenas lacunas formadas durante o reparo de DNA por

excisão de bases ou nucleotídeos (Kornberg & Baker, 1992). A polIII é responsável

pela replicação genômica (Kornberg & Baker, 1992).

Diferentemente de polIII, polV catalisa a síntese de DNA introduzindo

nucleotídeos em oposição à lesão (Fujii et al., 2004; Tang et al., 2000). Esse processo

induz o aparecimento de mutações no DNA sintetizado numa alta freqüência de 10

-3

-4

(Tang et al., 2000). A polV é capaz de catalisar a síntese translesão tanto in vivo

(Becherel et al., 2002; Echols & Goodman, 1990; Goodman, 2000; Lenne-Samuel et

al., 2002) quanto in vitro (Reuven et al., 1998; Tang et al., 1998, 2000) em um

processo que requer RecA, a subunidade β da DNA polimerase III e a proteína SSB.

Apesar de aumentarem a eficiência da síntese translesão, a subunidade β (Pham et al.,

2002) e SSB (Fujii et al., 2004; Pham et al., 2002) não são essenciais, mas polV é

totalmente dependente de RecA e ATP (Fujii et al., 2004).

Em analogia ao termo replissomo, usado em referência às proteínas associadas à

forquilha de replicação, o termo mutassomo passou a ser usado em referência às

proteínas presentes próximas à região de lesão do DNA. Em situações de indução da

mutagênese SOS in vivo, polV (UmuD´

C), RecA, SSB e a subunidade β da polIII,

foram definidas por Goodman (2000) como as proteínas integrantes do mutassomo

(Echols, 1982). Recentemente, Schlancher et al. (2005) definiram a composição do

15 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

mais simples complexo capaz de realizar a síntese translesão, denominado de mini-

mutassomo, o qual é constituído pela polV e dois monômeros de RecA (Figura 2.4).

Os componentes desse complexo foram determinados a partir de ensaios de interação

proteína-proteína. Como a proteína UmuD´

C interage diretamente com RecA, sem o

envolvimento do filamento de RecA (estrutura essencial no reparo por recombinação e

na resposta SOS), a hipótese levantada pelos autores é a de que a proteína RecA, na

mutagênese SOS, não só direciona a polV para a forquilha de replicação interrompida,

mas também participa como uma subunidade integrante da holoenzima ativa polV

(Schlancher et al., 2005). Essas evidências introduziram novas discussões envolvendo

a atividade e o mecanismo de ativação de RecA, e também modificaram o modelo da

síntese translesão (Schlancher et al., 2005; Sweasy, 2005).

O modelo atual proposto por Sweasy (2005) para explicar o processo de síntese

translesão em E. coli está descrito a seguir. Na presença de uma lesão no DNA, a

forquilha de replicação é interrompida gerando uma região de ssDNA na qual a

proteína RecA se liga. A proteína RecA, na forma de filamento de RecA e na presença

de ATP induz a autoclivagem de UmuD, formando UmuD´. A interação prolongada do

filamento de RecA com UmuD´ parece induzir a deformação desse filamento e

estimular a substituição de RecA por SSB na ligação ao ssDNA. A destruição do

filamento de RecA pela ligação de SSB restringe a mutagênese SOS como o único

processo de reparo da mutação, uma vez que a recombinação homóloga só ocorre na

presença de RecA na forma de filamento de RecA. O monômero de RecA que

permaneceu ligado ao ssDNA após a destruição do filamento, na presença do ATP e

das 2 subunidades de UmuD´, recruta a proteína UmuC (ligada a outro monômero de

RecA) formando o mini-mutassomo, complexo catalisador da síntese translesão.

16 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.4 - MODELO DO MINI-MUTASSOMO.

RecA interage com UmuC e RecA-ATP com UmuD´, sugerindo que duas moléculas de RecA façam

parte da polV. Essas duas interações são necessárias para a síntese de DNA translesão, um processo

que não requer a presença do filamento de RecA, nem a subunidade β da DNA polimerase ou a

proteína SSB.

FONTE: Schlacher et al., 2005.

2.2 Atividades da proteína RecA

Para mediar este amplo espectro de eventos biológicos (recombinação

homóloga, resposta SOS e mutagênese SOS) a proteína RecA apresenta as seguintes

atividades bioquímicas: (1) ligação ao DNA, (2) troca de fitas homólogas de DNA, (3)

hidrólise de ATP e (4) indução da autoclivagem (processamento coproteolítico) de

proteínas efetoras.

2.2.1 Ligação ao DNA

A capacidade de ligar-se ao DNA é fundamental para o envolvimento da

proteína RecA no metabolismo de DNA. Esse evento envolve duas etapas: nucleação e

extensão. A nucleação é o processo mais lento, apesar de ocorrer de forma mais

eficiente na presença de ssDNA do que na presença de dsDNA (Pugh & Cox, 1987;

1988) . Esse processo inicia-se com a ligação do protômero da proteína RecA ao DNA.

A unidade de ligação da proteína RecA de E. coli ao DNA ainda não foi definida, mas

em Thermus thermophilus essa foi definida como monomérica (Masui et al., 1998). A

nucleação é um evento dependente de pH que ocorre mais rapidamente se o pH for

reduzido de 7,0 para 6,0 (Pugh & Cox, 1987; Weinstock et al., 1981; Arenson et al.,

1999). Em qualquer pH, a partir do terminal de associação, protômeros adicionais

17 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

ligam-se ao ssDNA de forma rápida, unidirecional (5´→ 3´) (Pugh & Cox, 1988; Shan

et al., 1997) e cooperativa (Figura 2.5), gerando o filamento de RecA

(Kowalczykowski & Eggleston, 1994; Menetski & Kowalczykowski, 1985). Esse

filamento é formado por moléculas de RecA ligadas ao redor do DNA numa estrutura

helicoidal regular (Figura 2.3; Egelman & Stasiak, 1988, 1993). A associação de RecA

ao dsDNA também é efetuada na direção 5´→ 3´, mas pode ser direcionada por

qualquer uma das fitas de DNA (Pugh & Cox, 1987; 1988). A introdução de um

terminal simples-fita 5´ no dsDNA restringe a direção desses processos e a introdução

de um terminal 3´ simples-fita impede a sua ocorrência (Lindsley & Cox, 1989).

O processo de dissociação ocorre a partir da extremidade oposta ao terminal de

associação e na direção 5´→ 3´ em filamentos formados tanto no ssDNA (Shan et al.,

1997) quanto no dsDNA (Lindsney & Cox, 1990). A dissociação é um evento

altamente dependente de pH, que ocorre lentamente em pH6,0 e atinge níveis máximos

em pH7,5 (Lindsley & Cox, 1989; Arenson et al., 1999).

A proteína SSB substitui RecA após a sua dissociação. Como conseqüência, na

presença de SSB, a nucleação da proteína RecA no ssDNA é reduzida

consideravelmente (Madiraju et al., 1992; Shan et al., 1997). Esta inibição é suprimida

in vivo por outras proteínas. As proteínas RecO e RecR formam um complexo que

facilita a nucleação de RecA no ssDNA ligado a SSB (Umezu & Kolodner, 1994).

Além disso, o complexo RecBCD prepara o DNA duplex para a ligação de RecA,

gerando um terminal simples-fita 3´, alvo de nucleação. RecBCD também direciona a

RecA ao substrato previamente preparado (Anderson & Kowalczykowski, 1997b;

Churchill et al., 1999). In vitro, a inibição de SSB é suprimida ao adicioná-la ao

sistema de recombinação após a incubação prévia de RecA com ssDNA.

A hidrólise de ATP não é necessária para a associação dos monômeros de RecA

no ssDNA, mas o é para sua dissociação (Shan et al., 1997; Arenson et al., 1999; Bork

et al., 2001; Lindsley & Cox, 1989, 1990; Weinstock et al., 1981; Shivashankar et al.,

1999).

18 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.5 - ASSOCIAÇÃO E DISSOCIAÇÃO DO FILAMENTO DE RecA NO ssDNA.

Terminal

associação

Terminal

dissociação

Terminal

associação

Terminal

dissociação

A etapa limitante da formação do filamento de RecA, a nucleação, ocorre seguida de extensão rápida

na direção 5´→3´. A dissociação ocorre também unicamente nessa direção, procedendo a partir do

terminal oposto ao terminal onde está ocorrendo a extensão. A dissociação dos monômeros de RecA

do terminal de dissociação requer hidrólise de ATP.

FONTE: Drees et al., 2004a.

A velocidade de dissociação máxima do ssDNA linear é de 60-70 monômeros

por minuto (Arenson et al., 1999) e no dsDNA essa o é aproximadamente 2 vezes

maior (120 monômeros por minuto; Cox et al., 2005).

No início da formação dos filamentos de RecA em moléculas de dsDNA e

ssDNA lineares, a proteína RecA apresenta velocidades máximas de hidrólise de ATP:

20 e 30 μmol/L por minuto, respectivamente. Entretanto, a velocidade vai sendo

reduzida gradualmente atingindo no estado estacionário valores de 4,2 μmol/L por

minuto e 1,23 μmol/L por minuto no filamento de ssDNA linear (Shan et al., 1997) e

dsDNA linear (Cox et al., 2005), respectivamente. O estado estacionário reflete o

balanço final entre a dissociação e a associação de monômeros de RecA ao DNA. A

redução da velocidade de hidrólise de ATP (30 para 4,2 μmol/L por minuto no ssDNA

linear e 20 para 1,23 μmol/L por minuto no dsDNA linear) indica que houve uma

redução do número de moléculas de RecA ligadas no DNA de 6 a 15%, devido à

ocupação parcial do DNA pela proteína RecA (Shan et al., 1997; Cox et al., 2005).

Nos filamentos de RecA formados no ssDNA circular o balanço entre a

dissociação e a associação de RecA mantém o ssDNA totalmente preenchido e

19 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

conseqüentemente a velocidade de hidrólise de ATP mantém-se sempre constante e

máxima, 30 μmol/L por minuto (Shan & Cox, 1996; Shan et al., 1997). Mesmo

quando há regiões do DNA não ocupadas por RecA, essas regiões são rapidamente

preenchidas pela extensão do filamento de RecA, não afetando a velocidade de

hidrólise. A manutenção da velocidade de hidrólise de ATP, característica exclusiva

do filamento de RecA formado no ssDNA circular, permite verificar a influência de

outras proteínas sobre a atividade de hidrólise de ATP de RecA (Drees et al., 2004a).

2.2.2 Troca de fitas homólogas de DNA

A recombinação homóloga pode ser estudada in vitro através de três reações de

troca de fitas de DNA catalisadas por RecA (Figura 2.6). Na primeira reação, a qual

envolve 3 fitas de DNA, o filamento de RecA está ligado ao ssDNA circular e a troca

de fitas ocorre com o dsDNA linear homólogo. Os substratos e os produtos dessa

reação são facilmente distinguidos em gel de agarose ou através de microscopia

eletrônica. Na segunda reação, a qual envolve 4 fitas de DNA, o filamento de RecA é

formado a partir de uma lacuna no dsDNA circular e a troca de fitas ocorre com um

dsDNA linear homólogo (Cox, 2003). Na terceira reação de pareamento, denominada

de alça-D, RecA se liga ao ssDNA linear e promove o pareamento de parte do

segmento de ssDNA com o dsDNA circular através da invasão do terminal 3´ do

ssDNA. Essa reação é essencial no reparo de dupla quebra no DNA, já que o terminal

3´ simples-fita invasor pode ser subseqüentemente usado como oligonucleotídeo

iniciador na replicação (Figura 2.1; Churchill et al., 1999; Xu & Marians, 2002;

Lovett, 2003).

Nas três reações, a proteína RecA liga-se aos substratos de forma ordenada,

primeiro ao ssDNA, (ou ao substrato que apresenta a região simples-fita, na reação que

envolve 4 fitas de DNA) e em seguida ao dsDNA. Como ilustrado na figura 2.6, na

fase I, o filamento de RecA é formado através da nucleação e posterior extensão do

filamento de RecA. Na fase II ocorre o alinhamento das regiões homólogas. O dsDNA

homólogo é alinhado com o filamento de RecA previamente formado, gerando um

20 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

segmento pareado de aproximadamente 1 kpb (Roca & Cox, 1997; Lusetti & Cox,

2002). Na reação envolvendo 4 fitas o pareamento é feito na região da lacuna do DNA.

Na fase III ocorre a formação e a extensão do DNA heteroduplex. Apenas a ligação do

ATP, e não a sua hidrólise, é necessária para a realização das fases I, II e III, na reação

de troca envolvendo 3 fitas de DNA (Shan et al., 1996; Kowalczykowski & Krupp,

1995; Menetski et al., 1990; Rehrauer & Kowalczykowski, 1993). Já a reação de troca

envolvendo 4 fitas de DNA só ocorre com a hidrólise de ATP (Kim et al., 1992). A

extensão do DNA heteroduplex procede na direção 5´→ 3´ relativo ao ssDNA circular

ou à região da lacuna até a formação dos produtos. Para a efetivação da fase IV, a

hidrólise de ATP é necessária (Jain et al., 1994).

FIGURA 2.6 - REAÇÃO DE TROCA DE FITAS PROMOVIDA PELA PROTEÍNA RecA in

vitro.

3 fitas

4 fitas

Alça-D

I II III IV

I II

3 fitas

4 fitas

Alça-D

3 fitas

4 fitas

Alça-D

3 fitas

4 fitas

Alça-D

I II III IV

I II

(A) Reação de troca de 3 fitas entre ssDNA circular e dsDNA linear. O filamento de RecA é formado

sobre o ssDNA. O complexo RecA-ssDNA permanece normalmente intacto durante toda a reação. (B)

Reação de troca de 4 fitas entre duas moléculas de dsDNA. Tanto a formação do filamento de RecA

quanto a reação de troca de fitas são iniciadas a partir da região de lacuna do dsDNA (a reação

envolvendo 4 fitas sempre se inicia como uma reação de 3 fitas). (C) Formação da alça-D. Após a

formação do filamento de RecA sobre o ssDNA, RecA promove o pareamento de um segmento do

DNA simples-fita com o dsDNA homólogo através da invasão do terminal 3´ do ssDNA.

FONTE: Cox, 2003.

21 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Na reação de troca de fitas de DNA, a região C-terminal da proteína RecA

presente no filamento de RecA modula a introdução do dsDNA homólogo (Lusetti &

Cox, 2002). O processo fundamental de pareamento e de troca de fitas do DNA ocorre

no sulco do filamento de RecA (Howard-Flanders et al., 1984).

2.2.3 Atividade ATPásica

Além da família da proteína RecA e proteínas homólogas, a família das

tubulinas e a família das actinas também são capazes de formar filamentos e hidrolisar

nucleotídeo trifosfatos, processos que apresentam características particulares em cada

uma das famílias (Cox, 2003; Roca & Cox, 1997; Lusetti & Cox, 2002).

A hidrólise de ATP mediada por RecA é quase inteiramente DNA-dependente.

A hidrólise de ATP independente de DNA é observada apenas em presença de alta

concentração molar de sal (1,5-2 mol/L; Pugh & Cox, 1988) e pH 6,0 (Weinstock et

al., 1981). O valor de k

cat

do monômero ligado ao ssDNA a 37

C é de 30 min

-1

, e

quando ligado ao dsDNA decresce para 16-20 min

-1

. Quando RecA está ligada ao

ssDNA, a hidrólise de ATP ocorre de maneira independente do pH entre 5,5 e 9, já

quando ligada ao dsDNA, a hidrólise de ATP ocorre somente em pH entre 5,5 e 6,5

(Weinstock et al., 1981). O S

0,5

é aproximadamente 50 μmol/L (Menge & Bryant,

1992). A proteína RecA hidrolisa uma variedade de NTPs e dNTPs, mas apenas dATP,

dUTP, UTP, ATP e GTP servem de cofatores para algumas reações mediadas por

RecA (Menetski & Kowalczykowski, 1989; Weinstock et al., 1981; Menge & Bryant,

1992). A hidrólise de ATP ocorre uniformemente através do filamento de RecA

(Brenner et al., 1987), não há evidências de aumento dessa taxa nas suas extremidades.

Na ausência de qualquer agente que altere a atividade ATPásica intrínseca de RecA, a

taxa de hidrólise de ATP é diretamente proporcional à quantidade de monômeros de

RecA ligados ao DNA (Shan et al., 1997; Drees et al., 2004a, 2004b).

De acordo com a disponibilidade de ATP ou análogos de ATP e íons Mg

filamento de RecA pode apresentar quatro estados funcionais, denominados O, A

, A

e P (Lusetti & Cox, 2002; Cox, 2003; Cox et al., 2005). O estado O, inativo, é

encontrado na ausência de ATP ou análogos de ATP, ou na presença de ADP. A

ligação ao DNA em presença de ATP, ATPγS ou dATP modifica a estrutura para a

22 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

forma ativa, denominada A. Existem pelo menos duas formas ativas do filamento de

RecA, as quais podem ser interconvertidas entre si dependendo da disponibilidade de

íons Mg

. Quando a concentração de Mg

é comparável com a concentração de ATP,

há pouco Mg

livre presente, o filamento de RecA assume a conformação denominada

fechada (A

). Nessa forma, a troca de fitas só ocorre se o dsDNA linear homólogo

apresenta um terminal 3´ simples-fita (Lusetti et al., 2003). Este é o estado em que

RecA apresenta uma capacidade de pareamento restrita. Em condições de excesso de

em relação à concentração de ATP, a troca de fitas ocorre de forma bastante

eficiente e independente da presença do terminal 3´ do dsDNA, (Cox & Lehman,

1981a; Lusetti et al., 2003; Shan et al., 1996). Nesse estado, o filamento assume a

conformação dita aberta (A

). A mudança da conformação A

para A

é mediada pela

interação direta entre os íons Mg

e a proteína RecA e envolve 17 resíduos da região

C-terminal (Lusetti et al., 2003). Quando estes resíduos são deletados da proteína, o

requerimento do excesso de Mg

é eliminado, pelo menos para a reação de troca de

fitas (Lusetti et al., 2003).

Perante a introdução de uma outra fita de DNA no filamento de RecA, a

conformação do filamento de RecA é convertida ao estado P. Nesse estado, a

velocidade de hidrólise de ATP é reduzida em 30% (Bedale & Cox, 1996; Schutte &

Cox, 1987), há um maior grau de cooperatividade intermonômeros na hidrólise de

ATP (Arenson et al., 1999; Haruta et al., 2003; Shan & Cox, 1996) e a velocidade de

dissociação dos monômeros é duplicada em relação à observada no estado A,

indicando que a introdução da segunda fita de DNA no filamento de RecA modifica o

seu estado funcional (Shan & Cox, 1996, 1997; Cox, 2003; Lusetti et al., 2003; Haruta

et al., 2003). Uma vez que a conformação P reflete o estado do filamento de RecA

capaz de promover a troca de fitas de DNA, as particularidades dessa conformação

passaram a ser foco extensas investigações (Cox et al., 2005) realizadas utilizando

informações relativas à conformação A (Arenson et al., 1999).

Baseando-se nos valores de k

cat

para a hidrólise de ATP (30 min

-1

) e na taxa de

dissociação dos monômeros de RecA presentes no filamento de RecA formado no

ssDNA (60-70 monômeros/min), Arenson et al. (1999) sugeriram que os ciclos de

hidrólise de ATP no ssDNA ocorrem de forma desacoplada. O k

cat

para a hidrólise de

ATP dos monômeros de RecA presentes no filamento de RecA formado no dsDNA é

23 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

de 20 min

-1

e a taxa de dissociação do dsDNA é três vezes maior do que a taxa predita

para uma situação de não acoplamento entre os ciclos de hidrólise de ATP entre os

monômeros adjacentes (120 monômeros/min), indicando uma elaborada coordenação

entre os ciclos de hidrólise de ATP entre os monômeros adjacentes (Cox et al., 2005).

A razão k

off

cat

no dsDNA, considerando k

off

o número de monômeros de

RecA dissociados a partir do respectivo terminal por minuto (120 monômeros/min) e

cat

a quantidade de ATP hidrolisado por monômero por minuto (20 min

-1

), indicou

que o ciclo de hidrólise de ATP no dsDNA ocorre em um intervalo (i) de 6

monômeros (k

off

cat

= i, 120/20 = 6; Figura 2.7). Uma vez que há seis monômeros de

RecA em cada volta helicoidal do filamento de RecA (Figura 2.3), este padrão de

hidrólise de ATP pela RecA revela que a hidrólise de ATP ocorre nos monômeros

alinhados na face longitudinal do filamento (Figura 2.8; Lusetti & Cox, 2002; Cox et

al., 2005). Essas linhas de hidrólise de ATP procedem ao redor da circunferência do

filamento em seis etapas, realizadas num intervalo de 0,5s (Cox et al., 2005; Figura

2.7). Apenas a hidrólise de ATP pelo monômero presente no terminal de dissociação

do filamento de RecA resulta na sua dissociação (Figura 2.6; Shan et al., 1997; Shan &

Cox, 1996; Cox et al., 2005).

A estrutura tridimensional de RecA não revelou nenhum contato entre uma

subunidade de RecA de um hexâmero com outra subunidade localizada 6 monômeros

de distância (Story et al., 1992, Story & Steitz, 1992). Isto sugere que a coordenação

da hidrólise de ATP no filamento seja efetuada apenas pelo contato entre os

monômeros adjacentes. Como a hidrólise de ATP ocorre a cada 6 monômeros, pode-se

esperar em uma hélice de RecA 6 diferentes conformações. Em concordância com essa

sugestão, VanLook et al. (2003a) mostraram a presença de diferentes conformações da

proteína presente no filamento de RecA formado no dsDNA.

24 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.7 - ONDAS DE HIDRÓLISE DE ATP NO FILAMENTO DE RecA.

Terminal

dissociação

Monômeros localizados no interior

do filamento de RecA

Terminal

dissociação

Monômeros localizados no interior

do filamento de RecA

Terminal

dissociação

Monômeros localizados no interior

do filamento de RecA

O intervalo (i) entre os monômeros que estão realizando hidrólise de ATP é 6. Os monômeros

representados em preto são aqueles que estão na etapa de hidrólise de ATP do ciclo. Cada monômero

do filamento (exemplo: o que está destacado por “x”) está hidrolisando o ATP a cada 3 seg. A

hidrólise de ATP do último monômero está associada à dissociação.

Fonte: Cox et al., 2005

25 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.8 - COORDENAÇÃO DAS ONDAS DE HIDRÓLISE DE ATP NO FILAMENTO

DE RecA.

Os monômeros em preto são aqueles que estão na etapa de hidrólise de ATP do ciclo. As etapas

sucessivas são separadas por um período de 0,5 seg. O modelo mostrado assume exatamente os seis

monômeros por volta da hélice e i = 6.

FONTE: Cox et al., 2005.

A atividade de hidrólise de ATP mediada por RecA tem sido objeto de

discussão por mais de duas décadas (Cox & Lehman, 1981a, 1981b, 1987; Cox, 1994;

Roca & Cox, 1997; Bianco et al., 1998; Courcelle et al., 2001; Cox, 2003; Cox et al.,

2005). Como apenas a hidrólise de ATP do monômero presente próximo ao terminal

5´ resulta em dissociação, foi sugerido que a hidrólise de ATP realizada pelos demais

monômeros no interior do filamento de RecA capacita a proteína RecA a agir como

proteína motora (RecA motor). Essa capacidade adicional tem sido associada ao

processo de troca de fitas pois várias evidências sugerem que a hidrólise de ATP: (1)

induz a unidirecionalidade do movimento do DNA heterólogo, na reação de troca de

fitas (Shan et al., 1996; Jain et al., 1994), (2) torna o processo de troca de fitas mais

eficiente (Shan et al., 1996; Jain et al., 1994), (3) capacita a proteína RecA a catalisar

a troca de fitas de DNA contendo regiões não homólogas (bypass) (Kim et al., 1992;

Shan et al., 1996) e a catalisar a troca de quatro fitas de DNA (Kim et al., 1992; Shan

et al., 1996; Shan & Cox, 1998). O acoplamento entre a taxa de hidrólise de ATP e a

migração do DNA heterólogo na reação de troca de fitas de DNA foi verificada

(Bedale & Cox, 1996). A função motora de RecA também promove a regressão da

forquilha de replicação, etapa essencial para a efetivação do reparo por recombinação

26 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

(seção 2.1.1.1; Cox et al., 2000; Cox, 2003; Lusetti & Cox, 2002; Michel et al., 2001;

McGlyn & Lloyd, 2002).

2.2.3.1 Troca de fitas x Hidrólise de ATP

Segundo Cox (2003), muitas idéias abordando o acoplamento da hidrólise de

ATP com a troca de fitas mediada por RecA foram testadas e descartadas ao longo das

duas últimas décadas. Atualmente, dois modelos são aceitos: o que associa a hidrólise

de ATP à redistribuição dos monômeros de RecA no filamento de RecA e o que

acopla a rotação do ssDNA e do dsDNA homólogo, um sobre o outro, à hidrólise de

ATP (Cox, 2003). Como o modelo de redistribuição conflita com alguns resultados

experimentais, apenas o modelo rotacional do DNA será descrito.

O modelo que acopla a hidrólise de ATP à rotação do DNA propõe que a troca

de fitas de DNA ocorre de forma menos eficiente na ausência de hidrólise de ATP em

decorrência da formação de pareamentos improdutivos ou outras interações entre o

complexo ssDNA-RecA e o dsDNA homólogo (Figura 2.9, II). Esses pareamentos

secundários bloqueiam a troca de fitas (Shan et al., 1996, Rice et al., 2001; Sigurdsson

et al., 2001) e geram múltiplas alças externas. Na presença da proteína RecA, numa

reação acoplada à hidrólise de ATP, essas alças podem ser resolvidas através da sua

rotação ao redor do eixo do filamento de RecA (Figura 2.9, III). Acredita-se que essa

rotação seja mediada pela ligação do dsDNA a sítios externos de ligação ao DNA

localizados provavelmente na região C-terminal da RecA (posicionada externamente

ao filamento de RecA; Yu et al., 2001). Sabendo-se que cada volta do filamento

helicoidal de RecA é formada por 6 monômeros, há 6 sítios de ligação para o DNA

disponíveis por volta. O DNA desloca-se unidirecionalmente de um sítio para outro

após a hidrólise de ATP. Esse deslocamento gera o movimento de rotação necessário

para a efetivação da troca de fitas de DNA. Seis moléculas de ATP são hidrolisadas

para fornecer energia para uma rotação de 360º nas moléculas de ssDNA e dsDNA ao

redor dos seus próprios eixos. A reação de troca de fitas através de inserções

heterólogas (bypass) e a reação de troca de 4 fitas são explicadas através desse modelo

(Cox, 2003).

27 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.9 - MODELO DE TROCA DE FITAS ENTRE ssDNA e dsDNA NO QUAL A

ROTAÇÃO DO DNA ESTÁ ACOPLADA À HIDRÓLISE DE ATP.

III

alça

III

alça

Modelo que acopla o requerimento da hidrólise de ATP à necessidade de promover a rotação do

dsDNA homólogo ao redor o filamento de RecA para a efetivação da reação de troca de fitas de DNA

mediada pela proteína RecA. Nesse modelo, pareamentos secundários bloqueiam a troca de fitas e

geram múltiplas alças externas (II). Na presença da proteína RecA, numa reação acoplada à hidrólise

de ATP, essas alças podem ser resolvidas através da sua rotação ao redor do eixo do filamento de

RecA (III). As setas brancas indicam o sentido de rotação das alças e as setas pretas a direção da troca

de fitas.

FONTE: Cox, 2003.

2.3 Estrutura da proteína RecA

A estrutura do filamento RecA-DNA tem sido amplamente caracterizada por

microscopia eletrônica (EM). A proteína RecA liga-se ao DNA numa estequiometria

de 3 nucleotídeos (ssDNA) ou 3 pb (dsDNA) por monômero de RecA formando um

filamento helicoidal voltado para a direita denominado filamento de RecA (Figura 2.3;

Di Capua et al., 1982). Uma volta completa da hélice de RecA contém 6 monômeros e

os hexâmeros não interagem entre si (Story et al., 1992, Story & Steitz, 1992).

A estrutura do filamento de RecA pode assumir duas formas gerais, a

comprimida (inativa) ou estendida (ativa). O filamento inativo é formado pela proteína

sozinha, pela proteína ligada ao DNA na presença de ADP ou ausência de ATP ou

análogos de ATP. O filamento comprimido apresenta 6,2 subunidades/volta e a

distância entre os hexâmeros adjacentes de RecA (pitch) é de 65 Å (Stasiak &

28 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Egelman, 1988; Heuser & Griffith, 1989). O filamento estendido é formado por RecA,

ssDNA (ou dsDNA) e ATP ou (análogos de ATP). Este filamento apresenta também

6,2 subunidades/volta, mas a distância entre os hexâmeros é de aproximadamente 95 Å

(Di Capua et al., 1982; Egelman & Stasiak, 1986; Yu & Egelman, 1992). No filamento

ativo, o DNA apresenta-se aproximadamente 50% desenrolado em relação à forma B

do DNA (Stasiak & DiCapua, 1982).

A estrutura da proteína RecA ou RecA complexada ao ADP de E. coli foi

determinada através de análises cristalográficas de raios-X há mais de uma década

(Story & Seifert, 1992; Story et al., 1992). No cristal, foi verificada a mesma

organização helicoidal visualizada anteriormente por microscopia eletrônica (DiCapua

et al., 1982) e uma distância entre os hexâmeros adjacentes de 83 Å.

Cada monômero apresenta três domínios (Figura 2.10; Story et al., 1992). O

domínio N-terminal (aa 1-33) é formado por α-hélice (αA) e folha β (β0) (Figura 2.10

e 2.11). O domínio Central (aa 34-268) consiste de 8 folhas β (β1→β8) e por 6 α-

hélices (αB→αG). Este domínio contém o sítio de ligação para o ATP, os motivos

Walker A (aa 66-73) e B (aa 195-209), e as regiões de ligação do DNA, designadas L1

(aa 157-164) e L2 (aa 195-209). Os resíduos 269-352 formam o domínio menos

conservado, o domínio C-terminal, que consiste de 3 α-hélices e 2 folhas β. Esse se

projeta para fora do filamento de RecA, estabilizando interações entre polímeros do

cristal. Os resíduos 329-352 formam uma cauda altamente negativa e desordenada na

estrutura do cristal (revisado por McGrew & Knight, 2003). No filamento de RecA, a

região N-terminal de um monômero interage com a região C-terminal do monômero

adjacente através de uma ampla interface.

Mais recentemente foram obtidos cristais da proteína RecA e RecA

complexada com ADP, ATPγS, dATP, Mg- ATPγS ou ADP-AlF

de M. tuberculosis

(Datta et al., 2000, 2003a) e da RecA de M. smegmatis complexada com ADP, ATPγS

ou dATP (Datta et al., 2003b). Em geral, as características estruturais da proteína

RecA de micobactéria se mostraram bastante similares àquelas apresentadas pela

RecA de E. coli. A análise de cristais da proteína RecA de E. coli na presença de íons

cálcio, sulfato e fosfato ressaltam a alta variabilidade conformacional da proteína no

29 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

estado cristalino e o envolvimento do domínio C-terminal nas interações entre os

filamentos de RecA presentes nos feixes (bundles; Xing & Bell, 2004).

FIGURA 2.10 - MODELO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA RecA.

Monômero de RecA ligado ao ADP. As folhas-β estão sendo representadas com números e as α-

hélices, com letras. Os domínios N- e C-terminal estão circulados. A molécula de ADP se encontra

ligada ao domínio Central.

FONTE: Cox, 2003.

30 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.11 - ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA PROTEÍNA

RecA DE DIVERSOS MICRORGANISMOS.

___ M-M __ _ MAW

10 20 30 40 50

ECOLI -----MAIDENKQKALAAALGQIEKQFGKGSIMRLGEDR-SMDVETISTGSLSLDIALGA

HSEROP MDDKKAANNSEKSKALAAALAQIEKQFGKGSVMRMEDGVIAEEIQAVSTGSLGLDIALGI

PAERUG -------MDENKKRALAAALGQIERQFGKGAVMRMGDHE-RQAIPAISTGSLGLDIALGI

SLIV ------MAGTDREKALDAALAQIERQFGKGAVMRMGDRT-NEPIEVIPTGSTALDVALGV

. ::.:** ***.***:*****::**: : : .:.*** .**:***

⏐ αA ⏐ ⏐β0 ⏐ αB ⏐

⏐Walker A _ _

60 70 80 90 100 110

ECOLI GGLPMGRIVEIYGPESSGKTTLTLQVIAAAQREGKTCAFIDAEHALDPIYARKLGVDIDN

HSEROP GGLPRGRVIEIYGPESSGKTTLTLQSIAEMQKLGGTCAFIDAEHALDVTYAQKLGVNLND

PAERUG GGLPKGRIVEIYGPESSGKTTLTLSVIAEAQKQGATCAFVDAEHALDPDYAGKLGVNVDD

SLIV GGIPRGRVVEVYGPESSGKTTLTLHAVANAQKAGGQVAFVDAEHALDPEYAKKLGVDIDN

**:* **::*:************* :* *: * **:******* ** ****::::

⏐ β1 ⏐ ⏐ αC ⏐ ⏐ β2 ⏐ ⏐ αD ⏐ ⏐⏐

M-M ⏐Walke

r B L1_ _

120 130 140 150 160 170

ECOLI LLCSQPDTGEQALEICDALARSGAVDVIVVDSVAALTPKAEIEGEIGDSHMGLAARMMSQ

HSEROP LLISQPDTGEQALEICDALVRSGAVDLIVVDSVAALTPKAEIEGDMGDSLPGLQARLMSQ

PAERUG LLVSQPDTGEQALEITDMLVRSNAVDVIIVDSVAALVPKAEIEGEMGDAHVGLQARLMSQ

SLIV LILSQPDNGEQALEIVDMLVRSGALDLIVIDSVAALVPRAEIEGEMGDSHVGLQARLMSQ

*:.****.******* * *.**.*:*:*::******.*:*****::**: ** **:***

β3 ⏐ ⏐ αE ⏐ ⏐β4⏐ ⏐ L1 αF

L2 _ ___M-

M___

180 190 200 210 220 230

ECOLI AMRKLAGNLKQSNTLLIFINQIRMKIGVMFGNPETTTGGNALKFYASVRLDIRRIGAVKE

HSEROP ALRKLTGSINRTNTTVIFINQIRMKIGVMFGNPETTTGGNALKFYASVRLDIRRTGSIKS

PAERUG ALRKITGNIKNANCLVIFINQIRMKIGVMFGNPETTTGGNALKFYASVRLDIRRTGAVKE

SLIV ALRKITSALNQSKTTAIFINQLREKIGVMFGSPETTTGGRALKFYASVRLDIRRIETLKD

*:**::. ::.:: *****:* *******.*******.************** ::*.

⏐ β5 L2 ⏐ ⏐ αG ⏐ ⏐ β6 ⏐

240 250 260 270 280 290

ECOLI GENVVGSETRVKVVKNKIAAPFKQAEFQILYGEGINFYGELVDLGVKEKLIEKAGAWYSY

HSEROP GDEVIGSETKVKVVKNKVAPPFREAHFDILYGEGTSREGEILDLGSEHKVVEKSGAWYSY

PAERUG GDEVVGSETRVKVVKNKVSPPFRQAEFQILYGKGIYRTGEIIDLGVQLGLVEKSGAWYSY

SLIV GTDAVGNRTRVKVVKNKVAPPFKQAEFDILYGQGISREGGLIDMGVENGFVRKAGAWYTY

* :.:*..*:*******::.**::*.*:****:* * ::*:* : ..:.*:****:*

⏐ β7 ⏐ ⏐ β8 ⏐ ⏐ αH ⏐ ⏐β9⏐ ⏐β10

300 310 320 330 340 350

ECOLI KGEKIGQGKANATAWLKDNPETAKEIEKKVRELLL--SNPNSTPDFSVDDSEGVAETNED

HSEROP NGERIGQGKDNARNYLKEHPELAREIENKVRVAL---GVPELAGGEAEAEAKAS------

PAERUG QGSKIGQGKANAAKYLEDNPEIGSVLEKTIRDQLLAKSGPVKADAEEVADAEAD------

SLIV EGDQLGQGKENARNFLKDNPDLANEIEKKIKQKLGVGVHPEESATEPGADAASA--APAD

:*.::**** ** :*:::*: . :*:.:: * * : :: .

⏐ αI ⏐ ⏐ αJ ⏐

ECOLI F----------------------

HSEROP -----------------------

PAERUG -----------------------

SLIV AAPAVPAPTTAKATKSKAAAAKS

O alinhamento foi feito utilizando o programa Clustal W (Thompson et al., 1994). A numeração dos

resíduos se refere à seqüência da proteína RecA de E. coli. As regiões de α-hélice e folha β estão

destacadas em cinza e as regiões de alça, em azul. A localização dos motivos MAW, Walker A e

Walker B, das regiões de interface entre os oligômeros (M-M) e dos sítios de ligação do DNA (L1 e

L2) estão indicados. Aminoácidos idênticos estão indicados por asterisco (*), substituições

conservadas, por dois pontos (:) e substituições semi-conservadas por um ponto (.). ECOLI -

Escherichia coli, HSEROP - Herbaspirillum seropedicae, PAERUG - Pseudomonas aeruginosa,

SLIV - Streptomyces lividans.

31 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Como não foram obtidos cristais da proteína RecA na sua forma ativa (RecA-

ssDNA-ATP), reconstituições deste filamento continuam sendo feitas e analisadas por

EM. Estudos utilizando dicroísmo linear revelaram que no filamento ativo a região

central da proteína RecA sofre uma rotação de 40º em relação a sua posição no

filamento inativo (Morimatsu et al., 2002). Em concordância com essa observação,

análises por EM de filamentos ativos de RecA mostraram que a região de interface

entre as subunidades de RecA apresenta-se reorientada (VanLook et al., 2003a), em

relação àquela caracterizada na estrutura cristalina do filamento (Story et al., 1992).

Com essa reorientação, o sítio de ligação para o ATP passa a ocupar a região de

interface intermonômeros (VanLook et al., 2003a), sugerindo uma função adicional ao

nucleotídeo ligada à estabilização da forma oligomérica de RecA. Além disso, foi

observado que o domínio C-terminal da proteína RecA presente no filamento sofre

uma reorientação de ∼10º (Yu et al., 2001; VanLook et al., 2003a). Lusetti e

colaboradores (2003) especulam que na forma inativa os domínios Central e C-

terminal adquirem uma conformação fechada impedindo a ligação do dsDNA e

conseqüentemente o processo de recombinação. A rotação da região C-terminal

poderia induzir a formação de uma estrutura aberta, capaz de realizar esse processo

(Lusetti et al., 2003).

2.3.1 Sítios de ligação do DNA

Análises de uma série de estruturas da proteína RecA de M. tuberculosis

(MtRecA) formando complexo com diversos nucleotídeos (Datta et al., 2003a)

confirmaram a proposta de Story e colaboradores (1992) quanto às regiões da proteína

RecA envolvidas na ligação do DNA. A alça 2 (L2; resíduos 195-209) e alça 1 (L1;

resíduos 157-164) são os sítios de ligação do ssDNA e dsDNA, respectivamente

(Figura 2.10 e 2.11; Story et al., 1992).

A caracterização bioquímica de um duplo mutante na alça L1 (E156L e

G157V) levou Mirshad & Kowalczykowski (2003) a sugerirem que L1 pode participar

da ligação tanto do dsDNA quanto do ssDNA. Além disso, a extremidade da região C-

terminal de RecA (aa 329-352), região não resolvida nas estruturas de RecA

32 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

publicadas, apresenta uma importante função na regulação da ligação do dsDNA ao

sítio L1 (Eggler et al., 2003; Lusetti et al., 2003). As evidências sugerem que na

ausência de íons Mg

uma rede de pontes salinas são formadas entre os resíduos

negativamente carregados da região C-terminal (resíduos de aspartato nas posições

336, 340, 341 e 351 e glutamato nas posições 343, 347 e 350) e os resíduos positivos

do restante da estrutura. Na ausência de íons Mg

, a região C-terminal da proteína

RecA está numa conformação fechada. Por outro lado, na presença de 6-10 mmol/L de

, as pontes salinas são quebradas, permitindo que a região C-terminal adquira

uma conformação aberta, permitindo o acesso do dsDNA ao filamento de RecA e

aumentando a atividade de troca de fitas de DNA (Lusetti et al., 2003).

2.3.2 Sítios de ligação e hidrólise de ATP

2.3.2.1 Motivo Walker A

O motivo Walker A, definido como GpESsGKT (Walker et al., 1982),

compreende os resíduos 66-73 da proteína RecA de E. coli e está presente entre a

região β1 e αC. Essa seqüência é altamente conservada e se mostrou idêntica em 61 de

64 proteínas RecA bacterianas comparadas (Karlin & Brocchieri, 1996; Roca & Cox,

1997). Este motivo é freqüentemente observado em proteínas que ligam ATP ou GTP

e está tipicamente envolvido na ligação estável ao NTP (Saraste et al., 1990). O sítio

de ligação do ATP encontra-se na superfície interna do filamento de RecA inativo

(Story & Steitz, 1992) e na região de interface entre os monômeros no filamento ativo

de RecA (VanLook et al., 2003a).

Estudos de mutagênese mostraram que para a manutenção das funções de

RecA, os resíduos G66 e E68 são essenciais, já que nenhuma substituição é permitida.

Algumas substituições são permitidas nos resíduos S69-T73 (Konola et al., 1994). A

proteína mutante RecA K72R é capaz de ligar NTP, mas não é capaz de hidrolisá-lo

(Rehrauer & Kowalczykowski, 1993). In vitro, esse mutante forma o filamento de

RecA no DNA, realiza de forma limitada a reação de troca de fitas (Rehrauer &

Kowalczykowski, 1993; Shan et al., 1996) e induz a autoclivagem (co-proteólise) do

repressor LexA, mas numa taxa reduzida (Shan et al., 1996). In vivo, esta estirpe

33 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

mutante apresenta um fenótipo rec

equivalente ao apresentado quando o gene recA é

deletado (Konola et al., 1994). A substituição do resíduo P67 por triptofano cria uma

proteína RecA com atividade coproteásica constitutiva, porém afeta pouco a função de

recombinação. Substituições do resíduo P67 por E, D, K ou R produzem fenótipos

diferentes (Konola et al., 1994). As propriedades destes mutantes in vivo e in vitro têm

se mostrado importantes para a caracterização das funções de RecA dependentes da

hidrólise de ATP.

2.3.2.2 Motivo Walker B

O motivo Walker B consiste da região 140-vivvD-144; β4, e os 4 resíduos

centrais são em geral hidrofóbicos (Karlin & Brocchieri, 1996). Uma vez que os

resíduos 145-149 estão imediatamente C-terminal ao motivo Walker B e são altamente

conservados, sugere-se que essa região apresenta importância funcional ou estrutural

no processo de hidrólise de ATP (Karlin & Brocchieri, 1996). A estrutura do

complexo MtRecA-NTP revelou que os resíduos V146 e A147 formam pontes de

hidrogênio com resíduos próximos a L2 sugerindo que este segmento 145-149 está

envolvido na transmissão da mudança estrutural induzida pela ligação do NTP às

regiões L2 e L1, coordenando a ligação do ssDNA e dsDNA, respectivamente (Datta

et al., 2003a).

2.3.3 Motivo MAW (M

ake ATP Work)

O motivo estrutural MAW (tgxxxldxalxxGGlxxgxivEiy), que compreende os

resíduos 42-65 (αB e β1), é conservado entre as proteínas RecA bacterianas e

proteínas homólogas à RecA (Roca & Cox, 1997). Oito dos 24 resíduos são idênticos

nas 64 seqüências comparadas da proteína RecA bacteriana (A50, G52, G54, G55,

P57, G59, R60 e E63), quatro fazem parte da porção hidrofóbica da proteína (L47,

L51, I61, I64; Story et al., 1992) e vários resíduos são conservados. Interações entre os

resíduos desse motivo com regiões da proteína RecA envolvidas na ligação de ATP

sugerem que este motivo está envolvido na comunicação das mudanças

34 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

conformacionais induzidas pela ligação do ATP (Roca & Cox, 1997). O contato do

tipo Van der Walls dos resíduos L47 e I64 com L75 e I225 apóia a sugestão de que os

resíduos presentes no motivo MAW interagem com as regiões próximas ao motivo

Walker A (sítio de ligação do ATP; Logan & Knight, 1993). Foi notado que o resíduo

E63 forma uma ligação iônica com R222, resíduo presente na interface da ligação

monômero-monômero, importante no contato entre as subunidades (Skiba & Knight,

1994).

Apenas três mutantes nesta região foram caracterizados até o momento: os

mutantes recA13 (L51F) e recA56 (R60C) apresentaram um fenótipo rec

enquanto o

mutante recA (S44L) apresentou a mesma eficiência de recombinação da proteína

selvagem (Sommer et al., 1998). A estirpe de E. coli contendo a mutação recA13

mostrou-se sensível à luz UV, apresentou uma recombinação deficiente e não foi

capaz de induzir a clivagem do repressor do fago lambda (Willetts & Clark, 1969) ou

do repressor LexA (Sassanfar & Roberts, 1990). A estirpe de E. coli contendo a

mutação recA56 em adição aos fenótipos citados acima (Lloyd & Low, 1976; Clark,

1967; Horii & Clark, 1973) ainda foi incapaz de induzir a resposta SOS (Bagg et al.,

1981; Weisemann et al., 1984) ou promover a mutagênese SOS (Ennis et al., 1989).

Ambas as proteínas mutantes RecA L51F e RecA S44L ligam-se ao ssDNA na

ausência ou presença de ADP in vitro. Entretanto nenhuma das proteínas mutantes foi

capaz de ligar ssDNA na presença de ATP ou hidrolisar ATP (Lauder &

Kowalczykowski, 1993).

2.3.4 Região de interface dos oligômeros

Na presença de ssDNA (ou dsDNA) e na presença (ou ausência) de ATP,

análogos de ATP ou ADP, monômeros de RecA são agrupados entre si de forma

cauda-cabeça (C-terminal/N-terminal) e organizados em forma de hélice ao redor do

DNA formando o filamento de RecA (Figura 2.3) (revisado por Egelman & Stasiak,

1993; Egelman, 1993). A proteína RecA, na ausência de DNA, também adquire a

forma de hexâmero, filamento e feixe (Brenner et al., 1988).

35 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Os resíduos 213-222 (αG) estão envolvidos no contato monômero-monômero.

Esses resíduos são bastante conservados nas 64 seqüências de proteínas RecA

bacterianas analisadas (Karlin & Brocchieri, 1996; Roca & Cox, 1997) e estão

presentes na região que apresenta maior diminuição da acessibilidade do solvente após

o processo de transição monômero → oligômero (Story et al., 1992). Os resíduos

N213, K216, F217, Y218 e R222 fazem contatos específicos com 3 regiões da

subunidade vizinha: resíduos 94-98 (entre β2 e αD), 118-123 (entre β3 e αE) e 148-

156 (entre β4 e l1). O resíduo F217 é importante na transmissão da modificação

conformacional mediada pela ligação do ATP (Skiba et al., 1999).

Contatos entre subunidades foram observados em duas outras regiões da

RecA: entre os resíduos 3-30 (αA; presentes no domínio N-terminal) em uma

subunidade e os resíduos 111-140 (β3 e αE; presentes no domínio Central) da

subunidade vizinha. Estas duas regiões são formadas por resíduos altamente

hidrofóbicos: 6 resíduos de um monômero (L10, A13, L14, I17, F21 e L29) formam

uma superfície apolar localizada a uma distância de van der Walls de ≤ 4Å de 7

resíduos apolares (I111, L115, I128, A131, L132, A137 e V138) da subunidade

vizinha. Apesar de várias interações iônicas e polares ocorrerem também perto desta

região hidrofóbica, foi mostrado através da análise de diversos mutantes que a

interação entre as subunidades de RecA é determinada prioritariamente por interações

hidrofóbicas (Zaitsev & Kowalczykowski, 1999).

2.3.5 Domínio C-terminal

O domínio C-terminal da proteína RecA (resíduos 270-352, αH-J e β9, 10) é o

menos conservado dentre as proteínas RecA bacterianas (Roca & Cox, 1997). Yu et al.

(2001) sugeriram que esse domínio, ao se movimentar em relação ao domínio Central,

pode alternar o estado do filamento de RecA entre as formas ativa e inativa (Yu et al.,

2001). Além disso, esse domínio parece mudar de posição dependendo do tipo de

nucleotídeo ligado (ATP ou ADP) ao sítio de ligação do ATP, indicando que ele se

move durante a hidrólise (VanLook et al., 2003a).

36 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Embora o domínio C-terminal apresente baixa identidade entre as proteínas

RecA, a presença de alta concentração de resíduos negativos é quase invariável (Roca

& Cox, 1997). Foi proposto que essas cargas negativas regulam a ligação ao dsDNA,

repelindo os grupos fosfatos do DNA (Tateishi et al., 1992; Benedict &

Kowalczykowski, 1988). O domínio C-terminal está envolvido na interação entre os

filamentos de RecA para a formação dos feixes (Story et al., 1992; Xing & Bell,

2004).

2.3.6 Regulação alostérica da atividade da proteína RecA (Integração funcional

dos domínios de RecA)

A ligação do ATP ao filamento de RecA promove a sua ativação e a sua

conseqüente capacitação para catalisar a troca de fitas de DNA (na recombinação

homóloga), induzir a co-proteólise das proteínas LexA e UmuD (na resposta SOS e

mutagênese SOS, respectivamente) e efetuar a síntese translesão (na mutagênese

SOS). O mecanismo da mudança induzida pela ligação do ATP e a coordenação das

atividades de troca de fitas e coproteásica ainda não foram totalmente esclarecidos.

A interação do fosfato γ do ATP com o resíduo Q194 (Story et al., 1992),

denominado interruptor alostérico (allosteric switch), inicia uma cascata de mudanças

conformacionais no filamento de RecA. A ligação do ATP modifica a estrutura da alça

2 (permitindo a ligação do ssDNA à mesma), a superfície intermonômeros e a alça 1

(provavelmente através da região próxima ao motivo Walker B). O motivo MAW é

aparentemente o responsável pela transdução do sinal da ligação do ATP

intermolecularmente através de múltiplas interações (McGrew & Knight, 2003),

estimulando a ligação de ATP nos monômeros adjacentes (Lee & Cox, 1990; Menge

& Bryant, 1988). Essas interações tendem a manter todo o filamento no estado ativo.

Entretanto os ciclos de hidrólise de ATP entre os monômeros adjacentes no filamento

formado no ssDNA ocorrem de forma não coordenada (Shan & Cox, 1996; Arenson et

al., 1999). Com a adição da segunda fita de DNA, complementar, os ciclos de

hidrólise de ATP tornam-se coordenados (Seção 2.2.3; Shan & Cox, 1996; Cox et al.,

2005).

37 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.4 Proteínas Homólogas à RecA bacteriana

A proteína RecA bacteriana foi o primeiro membro identificado da família das

proteínas que catalisam a reação de troca de fitas. Nessa família, incluem-se as

proteínas homólogas UvsX do bacteriófago T4 (Kodadek et al., 1988; Beernik &

Morrical, 1999), RadA de arqueobactéria (Seitz et al., 1998), Dmc1 (Gupta et al.,

2001) e Rad51 (Ogawa et al., 1993; Sung, 1994) de eucariotos. Embora considerados

ortólogas estruturais e funcionais, RecA, Rad51 e as demais proteínas exibem algumas

diferenças.

O domínio Central das proteínas é o que apresenta maior homologia: há uma

identidade próxima de 30% em relação à RecA. A proteína RecA apresenta o domínio

C-terminal não encontrado nas proteínas homólogas enquanto as proteínas RadA,

Rad51 e Dmc1 apresentam um domínio N-terminal não encontrado em RecA (Figura

2.12; Roca & Cox, 1997; Brendel et al., 1997). Quanto à estrutura do filamento, Dmc1

forma anéis contendo 8 monômeros ao redor do DNA, enquanto as demais proteínas

formam uma estrutura hexamérica, como a proteína RecA bacteriana (Seitz et al.,

1998; Ogawa et al., 1993; Griffith & Formosa, 1985; Yu et al., 2001).

A diferença mais significativa entre RecA , Rad51 e UvsX ocorre quanto ao

uso do ATP. A proteína Rad51 hidrolisa ATP numa taxa 30-40 vezes menor que RecA

(Sung & Stratton, 1996) e UvsX, numa taxa 8-10 vezes maior (Formosa & Alberts,

1986). A proteína RecA geralmente requer a hidrólise de ATP para efetuar a reação de

troca de fitas de forma extensiva (Cox, 1994; Jain et al., 1994), enquanto a Rad51 é

capaz de realizar a reação completa de troca de fitas na presença de ATPγS ou AMP-

PNP, dois análogos não hidrolisáveis do ATP (Sung & Stratton, 1996) e UvsX é capaz

de formar intermediários de reação na presença de ATPγS (Yonesaki, 1995). Para a

realização da reação de troca de fitas, as proteínas homólogas a RecA também

requerem a presença de outras proteínas (Tabela 2.1).

38 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.12 - COMPARAÇÃO ENTRUTURAL DOS DOMÍNIOS DAS PROTEÍNAS RecA,

UvsX, Rad51 e Dmc1.

RecA

UvsX

Dmc1

RadA

Rad51

Domínio N-terminal Domínio Central Domínio C-terminal

RecA

UvsX

Dmc1

RadA

Rad51

Domínio N-terminal Domínio Central Domínio C-terminal

Comparação estrutural das proteínas RecA de E. coli, UvsX do bacteriófago T4, Rad51 e Dmc1 de

Saccharomyces cerevisiae e RadA de Sulfolobus solfataricus. O domínio conservado entre todos os

organismos (Domínio Central) está destacado por linhas diagonais. O domínio N-terminal conservado

entre Rad51, Dmc1 e RadA está destacado por uma região pontilhada. Regiões sem homologia

incluem a região em cinza claro e todas as regiões C-terminais ao domínio Central, incluindo o

domínio C-terminal das proteínas RecA e UvsX.

FONTE: Lusetti & Cox, 2002.

39 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

TABELA 2.1 - PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA.

BACTÉRIA

BACTERIÓFAGO

ARQUEOBACTÉRIA

EUCARIOTO

Formação do ssDNA

RecBCD gp46, gp47, gp41,

gp59

- Mre11, Rad50, Xrs2,

Spo11

Promoção da troca

de fitas de DNA

RecA UvsX RadA Rad51, Dmc1

Ligação ao ssDNA

SSB gp32 RPA RPA

Proteínas acessórias

RecF, RecO, RecR UvsY RadB Rad52, Rad55, Rad57,

Rad59

Proteínas envolvidas

na migração do DNA

heteroduplex

RuvA, RuvB

RecG

gp41, gp59

UvsW

Dda

- Rad54

Clivagem da

estrutura de Holliday

RuvC gp49 Hjc -

Outras proteínas

DNA topoisomerase I

e II

DNA ligase

DNA polimerase I

DNA topoisomerases

DNA ligase

DNA polimerase

DNA ligase

PolD

DNA topoisomerases

DNA ligases

DNA polimerases

E. coli

bacteriófago T4

Pyrococcus furiosus

Saccharomyces cerevisiae

FONTE: Bianco et al., 1998 ; Komori et al., 1999, 2000.

40 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.5 Envolvimento de outras proteínas na modulação da atividade da proteína

RecA

A modulação das atividades da proteína RecA durante os processos de

recombinação homóloga, resposta SOS e/ou mutagênese SOS é efetuada pelas

proteínas SSB, LexA, PolV, DinI e RecX e pelos complexos protéicos RecBCD e

RecFOR. O envolvimento dessas proteínas na regulação de RecA será descrito a

seguir.

2.5.1 Proteína ligadora de DNA simples-fita (SSB)

O produto do gene ssb, a proteína SSB (∼19 kDa), liga-se ao DNA simples-

fita de forma cooperativa e com alta afinidade na sua forma tetramérica. A presença de

SSB é necessária na recombinação, na resposta SOS, aparentemente na mutagênese

SOS (Sweasy, 2005) e em vários estágios da replicação (Meyer & Laine, 1990).

SSB apresenta múltiplas formas de ligação ao ssDNA e a interconversão entre

elas é mediada pela concentração de sal (Lohman et al., 1988; Bujalowski et al., 1988;

Lohman & Ferrari, 1994). Testes realizados na presença de NaBr, NaCl, NaF, MgCl

ou BaCl

permitiram generalizar que em concentrações baixas de sal (10-100 μmol/L),

cada tetrâmero de SSB liga-se a uma seqüência de ∼35 nucleotídeos (nt) e em

concentrações de 1-10 mmol/L e 0,1-1 mol/L, esse valor aumenta para ∼56 e ∼65

nucleotídeos, respectivamente (Bujalowski et al., 1988).

A proteína SSB modula a atividade de RecA nos processos de recombinação,

resposta SOS e mutagênese SOS: (1) rompendo a estrutura secundária do ssDNA e

conseqüentemente promovendo a polimerização de RecA e (2) otimizando a troca de

fitas, ligando-se ao ssDNA liberado nos estágios finais dessa reação (Lavery &

Kowalczykowski, 1992). SSB inibe a troca de fitas de DNA se for incubada com o

ssDNA antes da adição de RecA em reações in vitro (Cox & Lehman, 1982), uma vez

que SSB pode competir com RecA na ligação ao ssDNA (Tsang et al., 1985;

Kowalczykowski & Krupp, 1987; Kowalczykowski et al., 1987). A formação do

41 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

complexo RecA-SSB foi verificada em M. smegmatis (Reddy et al., 2001), apesar de

não haver nenhuma evidência de interação direta entre RecA e SSB em E. coli.

2.5.2 Proteínas RecF, RecO e RecR

Os produtos dos genes recF, recO e recR, as proteínas RecF (41 kDa), RecO

(27 kDa) e RecR (22 kDa), respectivamente, participam do reparo por recombinação

de lacunas no DNA geradas devido à interrupção da forquilha de replicação diante de

lesões no DNA mediado por RecA. O complexo RecFOR age no estágio inicial do

processo interrompendo a inibição de SSB sobre RecA através da direta interação

RecO e SSB e conseqüentemente facilitando a associação cooperativa de RecA ao

ssDNA e conseqüente formação do filamento de RecA (Umezu et al., 1993; Umezu &

Kolodner, 1994). Além disso, sugere-se que as proteínas RecF, RecO e RecR

estabilizam o filamento de RecA na região da lacuna no DNA e limitam a degradação

do DNA nascente pela nuclease RecJ e pela helicase RecQ (Courcelle et al., 1997,

1999; Courcelle & Hanawalt, 2003).

Webb et al. (1997) propuseram que as proteínas RecF, RecO e RecR agem na

forma alternativa de complexos RecFR e RecOR, os quais apresentam funções

complementares. RecOR e RecFR direcionam a associação ou a dissociação do

filamento de RecA, respectivamente (Webb et al., 1997). Courcelle et al. (1997)

também mostraram a importância das proteínas RecF e RecR para o reinício da

replicação. Apesar da aparente estabilidade da interação entre RecR e os filamentos de

RecA, a interação direta não foi ainda demonstrada (Bork et al., 2001).

2.5.3 Complexo RecBCD

A enzima RecBCD é um complexo multifuncional (330kDa) composto por 3

subunidades, os produtos dos genes recB, recC e recD (Amundsen et al., 1986;

Emmerson, 1968; Glickman, 1979). Essa enzima apresenta atividades de nuclease,

helicase e ATPase, essenciais para o início do reparo de duplas-quebras no DNA

mediado por RecA.

42 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A proteína RecB apresenta atividade de helicase e 3´→5´ e RecD, de helicase

5´→3´, respectivamente (Dillingham et al., 2003; Taylor & Smith, 2003) e a proteína

RecC reconhece uma seqüência específica 5´-GCTGGTGG-3´, chamada sítio chi

(crossover hotspot instigators; Arnold et al., 2000). O complexo RecBCD apresenta

atividade nucleásica 3´→5´ mais vigorosa que 5´→3´ até encontrar o sítio chi,

momento em que essa atividade é reduzida (Dixon & Kowalczykowski, 1991, 1993) e

modificada (a degradação do terminal 5´ ssDNA torna-se a mais vigorosa; Anderson &

Kowalczykowski, 1997a).

O modelo atualmente aceito para o mecanismo de RecBCD está ilustrado na

figura 2.13 (Handa et al., 2005). Nesse modelo, a proteína RecB transloca-se pela fita

atrasada na direção 3´→5´ e a RecD transloca-se pela fita líder na direção 5´→3´

(Dillingham et al., 2003; Taylor & Smith, 2003). A ligação de RecC ao sítio chi induz

a modificação estrutural do complexo induzindo a uma pausa e a posterior redução da

velocidade de translocação do complexo (Spies et al., 2003). Como resultado da

atividade de RecBCD, é produzida uma extremidade 3´ de DNA simples-fita que serve

de alvo para a ligação de RecA. Além de formar o ssDNA, RecBCD, através da

interação entre a proteína RecA e a região C-terminal da RecB, apresenta como função

direcionar a ligação de RecA ao ssDNA, etapa inicial do processo de recombinação

homóloga (Anderson & Kowalczykowski, 1997b; Churchill & Kowalczykowski,

2000; Spies et al., 2003).

43 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.13 - MECANISMO MOLECULAR DA FORMAÇÃO DE ssDNA MEDIADO POR

RecBCD E chi.

rápido

pausa

mudança

conformacional

lento

rápido

pausa

mudança

conformacional

lento

Antes de encontrar o sítio chi, RecBCD degrada terminais 3´ ssDNA. RecBCD, quando reconhece o

sítio chi, pára e tem a sua conformação modificada, provavelmente devido à ligação RecC-chi. Os

terminais ssDNA 5´ passam a ser alvo de degradação ao invés daqueles 3´ e o complexo tem a sua

velocidade de translocação reduzida. A modificação da conformação do complexo também expõe o

sítio de interação de RecB com a proteína RecA. Essa interação permite que RecB direcione RecA ao

ssDNA 3´ produzido. A formação do filamento RecA-ssDNA é a etapa inicial do processo de

recombinação homóloga.

FONTE: Handa et al., 2005.

2.5.4 LexA

A proteína LexA (23 kDa) atua como repressor dos genes presentes no regulon

SOS ligando-se à seqüência operadora desses genes (Courcelle et al., 2001). O

repressor LexA, assim como os repressores do fago λ cI e do fago φ80 (Little &

Mount, 1982) são inativados pela proteína RecA (ligada ao ssDNA e ao ATP) através

de interações proteína-proteína (Little, 1993; Luo et al., 2001). A interação

RecA:LexA ocorre numa estequiometria 2:1 (Yu & Egelman, 1993). Um dos pontos

de contato de LexA com o filamento de RecA encontra-se na região interna do

filamento de RecA, região esta que se estende do motivo Walker A até a região onde

estão acomodados os resíduos G229 e R243 e o segundo ponto encontra-se na região

L1 (Yu & Egelman, 1993). A superfície formada entre os dois pontos de contato

acomoda proteínas do tamanho de LexA, dos outros repressores e de UmuD.

Evidências bioquímicas apóiam a idéia de que L1 não serve apenas como sítio de

44 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

ligação do DNA, mas também faz parte do sítio de ligação do substrato coproteásico.

Tais evidências indicam que os processos de recombinação, resposta SOS e

mutagênese SOS são mutuamente exclusivos (Harmon et al., 1996). A proteína RecA

ao se ligar ao complexo UmuD´

C torna-se incapaz de mediar a clivagem de LexA ou

promover o alinhamento entre seqüências homólogas (Rehrauer et al., 1998; Rehrauer

& Kowalczykowski, 1996). Essa competição é observada também quando há excesso

de ssDNA ou dsDNA, condição em que a atividade coproteásica é inibida (Rehrauer et

al., 1996). Quando RecA é incubada com uma forma não hidrolisável de LexA, a troca

de fitas é inibida (Harmon et al., 1996). Esses resultados indicam que o complexo

UmuD´

C, a proteína LexA e o dsDNA apresentam sítios de interação sobrepostos no

sulco profundo da hélice do filamento de RecA (Yu & Egelman, 1993; Story et al.,

1992).

2.5.5 DNA polimerase V

A DNA polimerase V (polV; 70 kDa) é formada por duas subunidades de

UmuD´ e uma subunidade de UmuC. PolV é uma das polimerases indutoras de erro

envolvidas na restauração da integridade genômica na presença de DNA lesado

(revisado por Goodman, 2002). Foi verificado por Schlacher et al. (2005) que a polV

interage com a proteína RecA de 2 maneiras: (1) RecA interage com a proteína UmuC,

mesmo na ausência de DNA e (2) RecA é capaz de interagir com UmuD´, na presença

de DNA e de ATP. Baseando-se nestas duas maneiras de interação, foi proposto um

modelo de interação envolvendo dois monômeros de RecA e o complexo UmuD´

(seção 2.1.3).

2.5.6 DinI

A proteína DinI (∼9 kDa), produto do gene dinI (damage induced gene),

estabiliza o filamento de RecA, reduzindo ou prevenindo a dissociação do mesmo

quando está presente em excesso (15 vezes a concentração molar de RecA; Lusetti et

al., 2004a). A maior estabilidade do filamento de RecA não altera a atividade de

45 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

hidrólise de ATP intrínseca de RecA (Yasuda et al., 2001), a atividade coproteásica

quando LexA é o substrato, nem a atividade de troca de fitas, diante de dsDNAs

contendo terminal 3´simples-fita (Lusetti et al., 2004a). Assim, DinI parece modular

positivamente RecA, com apenas uma exceção: DinI inibe a indução da autoclivagem

de UmuD (Yasuda et al., 2001). Em altas concentrações (20 a 100 vezes maior que

RecA), DinI induz a desestabilização do filamento de RecA, inibindo todas as

atividades de RecA (Voloshin et al., 2001; Lusetti et al., 2004a).

A proteína DinI liga-se ao filamento de RecA ativo e inativo numa relação de

1:1 (Voloshin et al., 2001; Yasuda et al., 2001), mas não ao ssDNA diretamente

(Yasuda et al., 2001). Análises comparativas quanto à afinidade de ligação pelo

filamento de RecA mostraram que LexA liga-se mais fortemente, seguido de DinI e

UmuD. Voloshin et al. (2001) mostraram que DinI se liga no domínio Central de

RecA, mais precisamente na região L2, bloqueando possivelmente a ligação da

proteína UmuD e do ssDNA (Yoshimasu et al., 2003).

2.5.7 RecX

O gene recX foi descrito pela primeira vez em 1993 por Sano em Pseudomonas

aeruginosa como uma região codificadora de proteína localizada a jusante de recA.

Desde este estudo, genes homólogos a recX foram identificados a jusante de recA em

muitos organismos. Dentre as bactérias e as arqueobactérias que tiveram seu genoma

totalmente seqüenciado e depositado no banco de dados GenBank, o gene recA foi

identificado em respectivamente 43 espécies. Genes homólogos a recX foram

identificados a jusante de recA em 8 das 33 espécies bacterianas cujo genoma foi

totalmente seqüenciado: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae,

Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Mycobacterium leprae e

Mycobacterium tuberculosis e Thermotoga maritima. Entretanto em arqueobactérias o

gene recX não foi identificado.

Foi mostrado que o gene recX é co-transcrito com recA em Thiobacillus

ferroxidans

(Guiliani et al., 1997), Mycobacterium smegmatis (Papavinasasundaram et

al., 1997), Streptomyces lividans (Vierling et al., 2000) e E. coli (Pagès et al., 2003) e

46 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

em P. aeruginosa (Horn & Ohman, 1988). Em Xanthomonas campestris pv. citri,

embora recX esteja localizado a jusante de recA numa organização genética lexA-recA-

recX, os três genes são transcritos a partir de promotores próprios. Em Neisseria

gonorrhoeae e Bacillus subtilis o gene recX não está localizado a jusante de recA

(Stohl & Seifert, 2001; Kunst et al., 1997).

2.5.7.1 Análises funcional do gene recX

Sendo recX um gene constituinte do regulon SOS, sua expressão também está

sob controle do repressor LexA. Em E. coli, a expressão constitutiva do gene recX é

300 vezes menor do que a de recA (Stohl et al., 2003). Nessa condição, são

encontradas em média, por célula, 50 moléculas de RecX e 15.000 moléculas de

RecA. Com a indução da resposta SOS, a razão RecX:RecA é alterada para 1:125

(Stohl et al., 2003). Nessa condição cada célula possui aproximadamente 800

moléculas de RecX e 100.000 moléculas de RecA por célula (Stohl et al., 2003). A

diferença de concentração de RecA e RecX ocorre porque a eficiência da RNA

polimerase em superar o sítio atenuador presente na região intergênica recAX é de

apenas 5 a 10% (Pagès et al., 2003).

A superexpressão da proteína RecA, no mutante recX de P. aeruginosa (Sano,

1993), M. smegmatis (Papavinasasundaram et al., 1998), Xanthomonas oryzae

(Sukchawalit et al., 2001) e S. lividans (Vierling et al., 2000) é letal, sugerindo que a

função da proteína RecX está relacionada com o controle da atividade de RecA na

célula. Mutantes recX de E. coli, entretanto, não apresentaram esse fenótipo de

letalidade em condições de superexpressão de RecA (Pagès

et al., 2003).

A mutação do gene recX de P. aeruginosa (Sano, 1993) e S. lividans (Vierling

et al., 2000) não alterou os fenótipos relacionados às atividades de RecA. Em E. coli,

por outro lado, enquanto Pagès et al. (2003) verificaram o mesmo que Sano (1993) e

Vierling et al. (2000), Stohl et al. (2003) mostraram que o mutante recX de E. coli

tinha uma resistência menor à luz UV.

47 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A superexpressão do gene recX em E. coli com expressão normal de recA

provocou o aumento da sensibilidade à luz UV, inibição tanto da clivagem das

proteínas LexA e UmuD e indução da resposta SOS (Stohl et al., 2003). Quando

analisados em conjunto, esses resultados indicam o envolvimento da proteína RecX

como moduladora negativa das atividades de RecA.

Mutantes recX de outros microrganismos apresentaram novos fenótipos: (1)

redução do tamanho da colônia em S. lividans (Vierling et al., 2000); (2) redução na

variação da fase da colônia, na capacidade de transformação de DNA e na capacidade

de reparo em N. gonorrhoeae (Stohl & Seifert, 2001) e (3) redução de 50% no nível de

expressão da proteína RecA em X. oryzae pv. oryzae (Sukchawalit et al., 2001). Esse

último fenótipo sugere uma função alternativa para a proteína RecX que estaria

atuando como moduladora positiva da atividade de RecA.

Os genes recA e recX de E. coli quando ensaiados no sistema heterólogo de N.

gonorrhoeae indicaram que a proteína RecX de E. coli estabiliza o transcrito de recA,

estabiliza a proteína RecA ou de alguma forma aumenta a atividade de RecA quando

presente numa concentração inferior a de RecA (Stohl et al., 2002). Por outro lado,

altos níveis da proteína RecX inibem ou regulam negativamente a proteína RecA

(Stohl et al., 2002).

Diante de uma variedade de fenótipos associados à proteína RecX e várias

vezes contrastantes, Stohl et al. (2003) sugerem que RecX é uma proteína com

múltiplas atividades ou com atividades espécie-específicas. A confirmação dessa

sugestão depende da caracterização dessa proteína em outros microrganismos

2.5.7.2 Análises in vitro da proteína RecX

Uma característica distintiva apresentada pela proteína RecX é o seu alto pI,

cujos valores variam entre 8,5 e 11. Esses valores indicam que a proteína encontra-se

positivamente carregada na célula, o que permitiria a sua interação com as cargas

negativas do DNA (Venkatesh et al., 2002). Entretanto RecX de M. tuberculosis não

apresentou atividade de ligação ao DNA (Venkatesh et al., 2002) e RecX de E. coli

48 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

(Stohl et al., 2003; Drees et al., 2004a) foi capaz de ligar-se ao DNA somente em

concentrações acima de 1 μmol/L. Por outro lado, RecX foi capaz de modular as

atividades de recombinase e ATPase da proteína RecA através de interação física

direta nas mesmas bactérias (Stohl et al., 2003; Venkatesh, et al., 2002).

O mecanismo pelo qual RecX modula as atividades de RecA ainda não é

totalmente entendido apesar de muitos grupos de pesquisa estarem estudando esse

processo. In vitro, a proteína RecX de E. coli parece bloquear a extensão do filamento

de RecA, provavelmente ligando-se ao monômero de RecA presente no terminal de

associação do filamento de RecA (Drees et al., 2004a). Ao impedir a associação dos

monômeros ao DNA, RecX aumenta a dissociação líquida dos monômeros do

filamento de RecA, e esse aumento se reflete na redução da taxa de hidrólise de ATP

(Drees et al., 2004a). O bloqueio da extensão do filamento de RecA é mais efetivo na

presença da região C-terminal de RecA e na presença de Mg

numa concentração

superior a de ATP (Drees et al., 2004b).

Dados de microscopia eletrônica e de estrutura cristalográfica de RecA (Story

& Steitz, 1992; Story et al., 1992) foram utilizados por VanLook et al. (2003b) na

modelagem da estrutura dos filamentos de RecA (estabilizados pela ligação de

AMPPNP) ligados à proteína RecX de E. coli. VanLook et al. (2003b) sugerem que a

proteína RecX se liga ao filamento de RecA entre o domínio C-terminal de uma

subunidade e o domínio central da subunidade vizinha, interferindo na interação

monômero-monômero. Além disso, foi mostrado que a proteína RecX liga-se à forma

inativa do filamento de RecA (VanLoock et al. 2003b), resultado consistente com os

apresentados por Stohl et al. (2003) e Venkatesh et al. (2002), os quais mostraram que

RecX inibe a atividade de RecA .

Recentemente, Lusetti et al. (2004b) apresentaram um modelo envolvendo as

proteínas RecX e DinI na regulação dos eventos de associação e dissociação de

monômeros no filamento de RecA. Esse modelo baseia-se nos efeitos opostos destas

proteínas: RecX induzindo a dissociação dos monômeros do filamento de RecA e DinI

aumentando a estabilidade do filamento. A ligação de RecX e DinI ao filamento de

RecA foi considerada mutuamente exclusiva. Considerando a concentração requerida

de cada proteína para exercer o efeito sobre RecA, sugeriu-se que a ligação RecA-DinI

49 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

é mais fraca que RecA-RecX (Lusetti et al., 2004b). Os autores propõem que a adição

de DinI induz a dissociação lenta de RecX do filamento de RecA até a sua substituição

completa por DinI. Quando DinI encontra-se ligada ao filamento de RecA

previamente, RecX induz a sua lenta dissociação também. Como a concentração de

RecX necessária para dissociar DinI mostrou-se superior àquela necessária para

induzir a dissociação dos monômeros do filamento de RecA na ausência de DinI,

Lusetti et al. (2004b) sugerem que para a dissociação de DinI, RecX se liga ao longo

do filamento, como foi mostrado por VanLook et al. (2003b), e não apenas no terminal

de extensão, como sugerido por Drees et al. (2004 a, b).

2.5.7.3 Análises in silico da proteína RecX

O alinhamento da seqüência da proteína RecX de diversos organismos mostrou

que essa proteína não apresenta alta similaridade entre as espécies, sugerindo que a

interação RecA-RecX é variável e espécie-específica (Figura 2.14; Mishra et al.,

2003). A proteína RecX de E. coli também não apresentou similaridade substancial

com nenhuma das proteínas depositadas no banco de dados de proteínas (PDB). Sendo

assim, Mishra et al. (2003) utilizaram técnicas de previsão da estrutura tridimensional

para identificar proteínas que poderiam ter uma estrutura tridimensional similar a de

RecX. Todos os métodos de predição revelaram o fator σ

entre as 10 proteínas mais

similares. Uma vez escolhido o fator σ

como molde, foi possível delimitar a posição

das α-hélices após o alinhamento da seqüência de aminoácidos das proteínas alvo e

molde.

O modelo de RecX de E. coli, gerado a partir do uso do programa MODELLER

(Sali & Blundell, 1993) e estudos de dicroísmo circular, está mostrado na Figura 2.15

(Mishra et al., 2003). Essa proteína apresenta um conjunto de nove hélices e é dividida

em dois domínios (Mishra et al., 2003). O domínio C-terminal é formado por duas

hélices anfipáticas estabilizadas por interações hidrofóbicas entre os resíduos F165,

W162 e F138 e o resíduo básico K141 (Mishra et al., 2003). Nesse domínio foi

identificado o motivo hélice volta hélice (HTH) (Mishra et al., 2003). A estrutura de

50 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

RecX é estabilizada por interações hidrofílicas entre os dois domínios (Mishra et al.,

2003).

A previsão da configuração da proteína RecX no hexâmero de RecA mostrou

que RecX liga-se em três moléculas consecutivas de RecA no sítio de ligação de ATP

e nos sítios de ligação de DNA. Os autores sugerem que RecX, ao interagir com o

filamento de RecA, impede a entrada do ATP e da molécula de DNA inibindo as

atividades de ATPase, de troca de fita de DNA e de co-protease de RecA (Mishra et

al., 2003). A veracidade desse modelo ainda deverá ser demonstrada.

FIGURA 2.14 - ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA PROTEÍNA

RecX DE DIVERSOS MICRORGANISMOS.

10 20 30 40 50

ECOLI MTESTSRRPAYARL---LDRAVRILAVRDHSEQELRRKLAAPIMGKNGPEEIDATAEDYE

HSEROP ----MPRPPISLK-----ARALKYLSSREHSRLELARKLAP----------YAQEGDDIE

PAERUG MAIVLDTPVAVRR------AAMDLLARREHGRAELSRKLRQ-----RG-----ASAELID

PFLUOR MTVVLDTLVAVRR------TAMDLLARREHGRVELTRKLRQ-----RG-----AEPEMIE

MTUB MTVSCPPPSTSEREEQARALCLRLLTARSRTRAELAGQLAKR----------GYPEDIGN

: .: *: *.: . ** :* : :

. αA . . αB . . .

60 70 80 90 100 110

ECOLI RVIAWCHEHGYLDDSRFVARFIASR-SRKGYGPARIRQELNQKGISREATEKAMR--ECD

HSEROP ALLQWLEQSRFLSQERFSESLVHRR-AAR-YGNQRILSELHGHGIEGEAIADLKA--DLA

PAERUG PALDRLAEEGLLDESRYLESFIASR-ARSGHGPLRIREELAQRGLPRADIERALG--ACE

PFLUOR TALDRLTEEGLLSEARYLESFVSYR-ARSGYGPARIREELSQRGLQRADIDLALR--ECG

MTUB RVLDRLAAVGLVDDTDFAEQWVQSRRANAAKSKRALAAELHAKGVDDDVITTVLGGIDAG

: :.: : : * : . : ** :*:

. αC . . αD . . αE . . αF .

120 130 140 150 160

ECOLI IDWCALARDQATRKYGEPLPTVFSEKVKIQR----FLLYRGYLMEDIQEIWRNF-AD---

HSEROP AGEAERAAQVLRRKFT-APPADAETRAKQMR----FLQQRGFSHRSIREAFQTAWLDEDD

PAERUG VDWSAQLREVWRRKFA-RLPQDAREKAQQGR----FLAYRGYSMESISRLLNGR-SDD--

PFLUOR ISWQSQLEDTWRRKFAGHLPIDARERAKQGR----FLSYRGFSMDMISRLLSGRDMDD--

MTUB AERGRAEKLVRARLRREVLIDDGTDEARVSRRLVAMLARRGYGQTLACEVVIAELAAERE

* ..: * :* **: .

. αG . . αH . . αI .

ECOLI ----

HSEROP PS--

PAERUG ----

PFLUOR ----

MTUB RRRV

O alinhamento foi feito utilizando o programa Clustal W (Thompson et al., 1994). A numeração dos

resíduos se refere a seqüência da proteína RecX de E. coli. As regiões de α-hélice estão destacadas em

cinza. Aminoácidos idênticos estão indicados por asterisco (*), substituições conservadas, por dois

pontos (:) e substituições semi-conservadas por um ponto (.). ECOLI - Escherichia coli, HSEROP -

Herbaspirillum seropedicae, PAERUG - Pseudomonas aeruginosa,PFLUOR - Pseudomonas

fluorescence e MTUB - Mycobacterium tuberculosis.

51 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

FIGURA 2.15 - MODELO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA RecX.

A estrutura tridimensional da proteína RecX de E. coli foi gerada por modelamento. RecX é formada

por um conjunto de nove hélices e é dividida em dois domínios. Um domínio C-terminal formado por

duas hélices estabilizadas por interações hidrofóbicas.

FONTE: Mishra et al., 2003.

52 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.6 Caracterização do operon recArecX e identificação de outros genes

envolvidos nos processos de recombinação e reparo SOS em H. seropedicae

Herbaspirillum seropedicae é uma β-proteobacteria endofitica encontrada

associada a várias poáceas de interesse econômico (Baldani et al., 1986; Pimentel et

al., 1991; Boddey et al., 1995). Este microrganismo é capaz de fixar nitrogênio em

condições de microaerofilia e produz fito-hormônios que beneficiam a planta

associada, sendo, portanto, considerado um biofertilizante em potencial (Baldani et al.,

1991).

Os estudos do sistema de recombinação e reparo de DNA em H. seropedicae

foram iniciados com a clonagem e a caracterização parcial do gene recA (Steffens et

al., 1993). O gene recA de H. seropedicae foi identificado por complementação

genética da estirpe mutante recA de E. coli HB101 (Steffens et al., 1993).

Posteriormente, o seqüenciamento completo de um fragmento de DNA de H.

seropedicae que continha o gene recA revelou a presença contígua do gene recX. A

caracterização da região regulatória indicou que os genes recAX compõem um único

operon em H. seropedicae (Galvão, 2001).

Com o desenvolvimento do projeto de seqüenciamento completo do genoma de

H. seropedicae (Genopar) foram identificados outros genes constituintes do regulon

SOS e/ou envolvidos nos processos de recombinação e reparo SOS, além dos genes

recA e recX. Os genes uvrB e uvrC que participam da formação do complexo UvrABC

e os genes recR e recO que participam da formação do complexo RecFOR foram

identificados. O gene recG, que codifica para a proteína RecG envolvida no

processamento da junção de Holliday (Lloyd & Sharples, 1993; West, 1997), além dos

genes recN, recJ, recQ, dinP, dinG, polB, dnaN, sbcB e uvrD, foram também

identificados em H. seropedicae.

A análise comparativa da organização dos genes relacionados com as funções

de RecA no genoma de H. seropedicae e no genoma dos microrganismos, cuja

seqüência completa está depositada no banco de dados Genbank, revelou que os genes

ruvABC, que codificam para o complexo protéico RuvABC, estão organizados de

forma contígua no genoma de H. seropedicae assim como no genoma de E. coli,

53 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Mycobacterium sp., P. aeruginosa e outras bactérias. Os genes umuD e umuC também

estão organizados de forma contígua, como em E. coli. Os genes ssb e uvrA, os quais

codificam para a proteína ligadora de ssDNA e uma subunidade do complexo

UvrABC, respectivamente, estão localizados adjacentes, porém são transcritos em

direções opostas. Nesse caso, a organização se mostra coincidente com a de E. coli,

Haemophilus influenza, P. aeruginosa, Pasteurella multocida, entre outros

microrganismos. Finalmente, o gene lexA foi também identificado no genoma de H.

seropedicae, o que permite sugerir que a expressão do regulon SOS também é

regulada pela proteína LexA.

A função das proteínas RecA e RecX de H. seropedicae no reparo SOS foi

investigada através da caracterização de mutantes obtidos por inativação insercional

(Galvão, 2001). Análises fisiológicas do mutante CWG2a (recA::Tn5) confirmaram

que o produto do gene recA em H. seropedicae é essencial para o reparo SOS (Galvão,

2001; Galvão et al., 2003). O mutante CWG1 (recX::lacZ-Km) apresentou

sensibilidade à luz UV e ao agente mutagênico metanosulfonato de metila, indicando a

participação também da proteína RecX nesse processo, possivelmente modulando a

atividade da proteína RecA (Galvão, 2001; Galvão et al., 2003). Para determinar o

mecanismo de regulação de RecA pela proteína RecX e contribuir para o avanço da

compreensão dos processos de recombinação homóloga e reparo SOS, o objetivo geral

desta tese foi a caracterização bioquímica das proteínas RecA e RecX de H.

seropedicae. Para isso, foram realizadas as seguintes etapas experimentais:

• Clonagem dos genes recA e recX em vetores de expressão;

• Expressão e purificação das proteínas RecA e RecX nas suas formas

nativa e ligada à cauda His;

• Determinação da interação entre as proteínas RecA e RecX in vitro;

•

Determinação da ligação das proteínas RecA e RecX ao DNA in vitro;

• Determinação do efeito da proteína RecX sobre as atividades de RecA in

vitro.

54 MATERIAIS E MÉTODOS

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais Gerais

3.1.1 Composição dos Meios de Cultura

A composição dos meios de cultura está mostrada na Tabela 3.1. Todos os

meios de cultivo bacterianos foram preparados e autoclavados por 20 minutos a 120˚C

para esterilização como descrito por Sambrook et al. (1989).

TABELA 3.1 - COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTIVO BACTERIANOS.

TIPO DE MEIO COMPOSIÇÃO (por litro de meio)

Luria-Bertani (LB) 10 g triptona, 5 g extrato de levedura e 10 g NaCl.

Luria-Bertani Agar (LA) 10 g triptona, 5 g extrato de levedura, 10 g NaCl e 15 g ágar.

Terrific Broth (TB) 12 g triptona, 24 g extrato de levedura e 4 mL glicerol.

SOB 20 g triptona, 5 g extrato de levedura, 0,5 g NaCl, 0,19 g/L KCl e 0,2 g/L

MgCl

SOC 20 g triptona, 5 g extrato de levedura, 0,5 g NaCl, 0,19 g/L KCl, 0,2 g/L

MgCl

1,2 g/L MgSO

3,6 g/L de glucose.

Os meios esterilizados foram suplementados com antibióticos em

concentração apropriada para selecionar a estirpe bacteriana e/ou o plasmídeo de

interesse. Os antibióticos usados estão listados na Tabela 3.2. Os estoques de

ampicilina e canamicina foram esterilizados por filtração (membrana ME25, 0,45 μm,

Schleicher & Schuell MicroScience GmbH, Dassel, Germany).

55 MATERIAIS E MÉTODOS

TABELA 3.2 - ANTIBIÓTICOS USADOS NESTE TRABALHO.

ANTIBIÓTICO

CONCENTRAÇÃO

ESTOQUE (mg/mL)

CONCENTRAÇÃO DE

USO (μg/μL)

Ampicilina (Amp) 100 em água 100

Canamicina (Km) 50 em água 50

Tetraciclina (Tc) 10 em etanol 70% 10

Cloranfenicol (Cm) 30 em etanol 80

3.1.2 Soluções e Reagentes

A composição das soluções e dos tampões utilizados neste trabalho está

descrita na Tabela 3.3 e Tabela 3.4, respectivamente.

TABELA 3.3 - COMPOSIÇÃO DAS SOLUÇÕES UTILIZADAS NESTE TRABALHO.

SOLUÇÕES COMPOSIÇÃO

Acrilamida (30% T

, 2,67% C

) 29,2% (p/v) acrilamida e 0,8% (p/v) bisacrilamida.

Corante F. E. FSUDS (5x) 65 mmol/L de Tris-HCl pH8,0; 0,08% (p/v) de azul de

bromofenol; 1% (p/v) de SDS; 10% (p/v) de Ficoll; 1,8

mmol/L de EDTA pH 8,0 e 4 mg/mL de xileno cianol.

Solução de Azul de Coomassie para

coloração proteína

0,5% (p/v) azul de Coomassie R250; 50% (v/v) metanol e

7,5% (v/v) ácido acético.

Fenol equilibrado fenol cristalino (fundido a 65

C), 0,1% 8-

hidroxiquinoleína e um volume de Tris base 0,5 mmol/L.

Após lenta agitação, a fase aquosa foi removida e a fase

fenólica foi extraída com 0,1 mol/L Tris-HCl pH 8,0

contendo 0,2% (v/v) β-mercaptoetanol, até que a fase

aquosa apresentasse pH≥ 7,5.

Solução descorante para gel de proteína 45% (v/v) metanol e 10% (v/v) ácido acético.

Solução II (SDS-PAGE) 1,5 mol/L Tris-HCl pH 8,8 e 0,3% (p/v) SDS.

Solução III (SDS-PAGE) 0,5 mol/L Tris-HCl pH 6,8 e 0,4% (p/v) SDS.

- percentagem de acrilamida + bisacrilamida.

- percentagem de bisacrilamida.

56 MATERIAIS E MÉTODOS

TABELA 3.4 - COMPOSIÇÃO DOS TAMPÕES UTILIZADOS NESTE TRABALHO.

Continua

TAMPÕES COMPOSIÇÃO

A 10 mmol/L Tris-HCl pH 8,0; 50 mmol/L NaCl e 1 mmol/L

DTT.

Amostra - nativo (5x) 312,5 mmol/L Tris-HCl pH 6,8; 50% (v/v) glicerol e 0,05%

(p/v) azul de bromofenol.

Amostra - ligação DNA-proteína

(5x)

40 mmol/L Tris-acetato pH 7,5; 50% (v/v) glicerol e 0,01%

(p/v) azul de bromofenol.

Amostra - ligação proteína-

proteína (5x)

40 mmol/L Tris-acetato pH 7,5 e 50% (v/v) glicerol.

Amostra - SDS-PAGE (4x) 12 mmol/L Tris HCl pH6,8; 5% (v/v) glicerol; 0,4% (p/v) SDS;

2 mmol/L β-mercaptoetanol e 0,02% (p/v) azul de bromofenol.

25 mmol/L NaH

pH 7,0; 5% (v/v) glicerol e 500 mmol/L

NaCl.

ATPase (10x) 250 mmol/L Tris-acetato pH 7,5; 10 mmol/L DTT; 30 mmol/L

glutamato de potássio; 0,1 mol/L acetato de magnésio e 50%

(v/v) glicerol.

Cromatografia ascendente 0,75 mol/L Tris-HCl (pH 8) e 450 mmol/L NaCl.

250 mmol/L Tris HCl pH8,0; 25% (p/v) sacarose e 1 mmol/L de

EDTA.

Laemmli (10x) 30 g Tris base; 140 g glicina e 10 g SDS (1 L).

Ligação ATP- proteína (4x) 80 mmol/L Tris-HCl (pH 7,5); 80 mmol/L cloreto de potássio e

40 mmol/L cloreto de magnésio.

Ligação DNA/proteína-proteína

(10x)

400 mmol/L Tris-acetato pH7,5 e 10 mmol/L EDTA pH 8,0.

PCR (10x) 200 mmol/L Tris HCl pH8,4 e 500 mmol/L KCl.

PEG/NaCl 20% (v/v) PEG-8000 e 2,5 mol/L NaCl.

R 10 mmol/L Tris-HCl pH 8,0; 1 mmol/L DTT e 10% (v/v)

glicerol.

Recombinação 25 mmol/L Tris-acetato pH 7,5; 1 mmol/L DTT; 5% (v/v)

glicerol; 3 mmol/L glutamato de potássio e 10 mmol/L acetato

de magnésio.

STA (10x) 250 mmol/L Tris-acetato pH 8,0; 100 mmol/L KCl; 80 mmol/L

acetato de magnésio; 10 mmol/L DTT e 35% (v/v) PEG-8000.

TAE (50x) 2 mol/L Tris base; 57,1 mL ácido acético glacial e 50 mmol/L

EDTA pH 8,0 (1 L), pH8,0.

57 MATERIAIS E MÉTODOS

Conclusão

TAMPÕES COMPOSIÇÃO

TBE (10x) 0,89 mol/L Tris base; 0,89 mol/L ácido bórico e 20 mmol/L

EDTA pH 8,0, pH8,0.

TE 10 mmol/L de Tris HCl pH8,0 e 0,1 mmol/L de EDTA.

TM (10x) 0,1 mol/L Tris-HCl, pH 8,0 e 0,1 mol/L MgCl

Tris-Glicina (10x) 30,3 g/L Tris base e 150 g/L glicina, pH 8,6.

Tris-HCl (1 mol/L) 121 g/L Tris base em água. O pH foi ajustado com HCl.

3.1.3 Estirpes de bactérias e plasmídeos

As estirpes de E. coli e o bacteriófago utilizados neste trabalho estão listados

na Tabela 3.5. Os plasmídeos estão listados na Tabela 3.6.

TABELA 3.5 - ESTIRPES DE BACTÉRIAS HOSPEDEIRAS E DO BACTERIÓFAGO USADOS

NESTE TRABALHO.

ESTIRPES DE

E. coli

GENÓTIPO RESISTÊNCIA REFERÊNCIA

BL21(DE3) pLysS F¯ ompT hsdS

¯ m

¯] gal dcm (DE3)

pLysS

- Novagen

B834(DE3) F¯ ompT hsdS

[r¯

m¯

] gal dcm met

(DE3)

- Novagen

XL1Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17

supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZ∆M15

Tn10]

Tc Bullock et al.,

1987.

DH10B

ϕ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1

araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK

deoR λ

rpsL mupG

Sm Grant et al.,

1990.

7118

supE thi Δ(lac-proAB) F' [proAB

lacI

lacZ ΔM15 ]

- Messing et al.,

1977.

BACTERIÓFAGO GENÓTIPO RESISTÊNCIA REFERÊNCIA

M13K07 Derivado do M13, carrega o gene II com

a substituição M40I, e a ori de p15A e o

gene de resistência a canamicina

inseridos na ori M13.

Km Vieira &

Messing, 1987.

58 MATERIAIS E MÉTODOS

TABELA 3.6 - PLASMÍDEOS USADOS NESTE TRABALHO.

Continua

PLASMÍDEOS GENÓTIPO / FENÓTIPO RELEVANTES REFERÊNCIA/FONTE

pAET fragmento NdeI/BamHI de 1,1 kpb do pALHBT

clonado no vetor pET28a, contém o gene recA de H.

seropedicae (HsrecA) L54Q, Km

Este trabalho

pAET-G73A pAET mutagenizado, contém o gene HsrecA L54Q

G73A clonado no vetor pET28a, Km

Este trabalho

pAET-HMK fragmento NdeI/BamHI de 1,1 kpb do pAET clonado

no vetor pET28b+HMK, contém o gene HsrecA

L54Q, Km

Este trabalho

pAET-WT pAET mutagenizado, contém o gene HsrecA clonado

no vetor pET28a, Km

Este trabalho

pAETWT-

HMK

pAETWT::seqüência HMK, contém o gene

HsrecA,Km

Este trabalho

pALHBT Fragmento NdeI/BamHI de 1,1 kpb do pATOPO

clonado no vetor pLHBT, contém o gene HsrecA,

Este trabalho

pATOPO pCR4Blunt-TOPO::HsrecA, Amp

Este trabalho

pAX fragmento NdeI de 2,2 kpb do pBMR507 clonado no

vetor pET28a, Km

Este trabalho

pBMR503 fragmento HindIII de 3,65 kpb do pBMR5 clonado

no vetor pTZ18R, contém o gene HsrecA, Amp

Steffens et al., 1993

pBMR507 fragmento EcoRI de 4,5 kpb clonado no vetor

pTZ19R, contém os genes recA e recX de H.

seropedicae, Amp

Galvão et al., 2003

pBT Vetor de expressão, promotor lac, gera proteína de

fusão com o repressor do fago λcI, Cm

Bacteriomatch

pCR4-TOPO vetor de clonagem, lacZ, Amp

e Km

Invitrogen

pCWG3 fragmento NdeI/EcoRI de 0,8 kpb do pBMR507

clonado no vetor pET28a, contém o gene recX de H.

seropedicae (HsrecX), Km

Este trabalho

pCWG5 fragmento KpnI/BamHI de 1,1 kpb do pBMR507

clonado no vetor pTZ18R, contém o gene HsrecA,

Amp

Este trabalho

pCWG7 fragmento EcoRI/BamHI de 1,1 kpb do pCWG5

clonado no vetor pT7-7, contém o gene HsrecA,

Amp

Este trabalho

pCWG8 fragmento NdeI/BamHI de 1,1 kpb do pCWG7

clonado no vetor pET28a, contém o gene HsrecA,

Este trabalho

59 MATERIAIS E MÉTODOS

Conclusão

PLASMÍDEOS GENÓTIPO / FENÓTIPO RELEVANTES REFERÊNCIA/FONTE

pCWG9 pCWG8 contendo o fragmento NdeI/XbaI deletado,

contém o gene HsrecA, Km

Este trabalho

pET28a vetor de expressão (promotor T7), gera proteína de

fusão com His, Km

Novagen

pET28b+HMK vetor de expressão (promotor T7), gera proteína de

fusão com His

e sítio de fosforilação para a proteína

HMK (bovine heart muscle kinase), Km

Bordes, P.

pLHBT fragmento NotI/EcoRI contendo (Gly

Ser)

e um sítio

para NdeI clonado no vetor pBT, Cm

Huergo, L. F.

pT7-7 vetor de expressão (promotor T7), Amp

N. E. Biolabs

pTRG vetor de expressão, promotor lac, gera proteína de

fusão com a subunidade alfa da RNA polimerase,

Bacteriomatch

pTZ18R/19R vetor de clonagem, lacZ f1 IG, Amp

Mead et al., 1986

pXT7 fragmento BamHI/XhoI de 0,8 kpb do pXTRG2

clonado no vetor pT7-7, contém o gene HsrecX,

Amp

Este trabalho

pXTRG2 fragmento BamHI/EcoRI de 0,8 kpb do pCWG3

clonado no vetor pTRG, contém o gene HsrecX, Tc

Este trabalho

3.1.4 DNA

O DNA simples-fita (ssDNA) circular do bacteriófago ϕX174 e o DNA dupla-

fita (dsDNA) circular super-helicoidal ϕX174 foram adquiridos da New England

Biolabs. O dsDNA linear foi gerado pela digestão com a endonuclease de restrição

XhoI, seguindo instruções do fabricante. A concentração do DNA foi determinada pela

absorbância em 260 nm empregando a seguinte relação: D.O.

260

= 1,0 corresponde a

uma concentração de 50 μg/mL de dsDNA ou 37 μg/mL de ssDNA (Sambrook et al.,

1989). A concentração de DNA foi expressa em μmol/L de nucleotídeos ou pares de

nucleotídeos para ssDNA ou dsDNA, respectivamente.

60 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1.5 Reagentes e proteínas

Enzimas de restrição e modificadoras de DNA, RNAse, tampões e sais

utilizados para preparar as soluções utilizadas na manipulação do DNA foram todas de

alto grau de pureza (grau biologia molecular) obtidos de diferentes fornecedores

(Sigma Chemical Company, Merck, GE Healthcare, Invitrogen, New England

Biolabs). A proteína ligadora de ssDNA (single-stranded binding protein - SSB) foi

adquirida da USB (Cleveland, Ohio, USA). A proteína RecA de E. coli e os

nucleotídeos radioativos foram adquiridos da GE Healthcare. A proteína DraG com

cauda N-terminal contendo 6 resíduos de histidinas (His) purificada foi gentilmente

cedida na concentração de 28 μmol/L (considerando monômero) por Luciano F.

Huergo. β-D-isopropil tiogalactosídeo (IPTG) e dNTPs foram adquiridos da

Eppendorf. Etanol, clorofórmio, metanol, isopropanol, ácido acético glacial, álcool

isoamílico foram adquiridos da Merck. Os antibióticos foram adquiridos da Sigma,

exceto a ampicilina a qual foi adquirida da União Química. Como padrão de massa

molecular para DNA foi utilizado o “1 kb ladder” adquirido da Invitrogen. Como

padrões de massa molecular para proteína foram utilizados

BenchMarker, BenchMarker

pré-corado (Invitrogen) ou LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare). Reagentes para preparo

de meios de cultura foram adquiridos da USB. Terrific broth, glucose, glicerol,

agarose e glicina foram adquiridos da Invitrogen. Poliacrilamida e bis-acrilamida

foram adquiridos da Sigma. O gás nitrogênio foi adquirido da White Martins S.A.

3.2 Métodos Gerais para DNA

A velocidade de centrifugação, quando não mencionada, foi de 13.400xg.

Neste trabalho foi denominada água Milli-Q a água que foi destilada e filtrada através

de uma matriz de carvão ativo e de resinas de troca iônica no aparelho Milli-Q Plus

(Millipore) e posteriormente esterilizada.

61 MATERIAIS E MÉTODOS

3.2.1 Manipulação do DNA

As reações de ligação e restrição foram realizadas como sugerido pelo

fabricante ou como descrito por Sambrook et al. (1989).

O isolamento de plasmídeos de E. coli em grande ou pequena escala foi feito

após cultivo da bactéria contendo o plasmídeo de interesse em meio LB ou TB a 37

e 130 rpm por um período de até 16 horas. Visando garantir uma aeração ideal, foi

empregada a relação de 1:5 entre o volume do meio e o volume total do frasco

empregado. O isolamento dos plasmídeos foi feito utilizando kit QIAprep miniprep

system (Qiagen Inc.), kit Flexprep (GE Healthcare), seguindo instruções do fabricante,

ou através do método de lise alcalina (Sambrook et al., 1989).

3.2.2 Eletroforese de DNA em gel de agarose ou ágar

As eletroforeses em gel de agarose ou ágar foram realizadas como descrito por

Sambrook et al. (1989). As soluções tampão utilizadas foram TBE 1x ou TAE 1x. A

concentração dos géis variou de 0,5 - 1,5 % (p/v). As amostras de DNA foram

misturadas com corante F. E. FSUDS (5x).

As corridas eletroforéticas foram feitas a 12-50 V por 2-15 horas. Após

eletroferese, para a visualização das bandas de DNA, o gel foi corado em solução de

brometo de etídio (0,5 μg/mL) durante 20-40 minutos e o excesso de corante foi

retirado com água destilada. O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (312 nm) em

transiluminador EC

System - UVP BioImaging Systems (UVP, Inc. Upland, CA

USA). O registro das imagens foi feito em papel térmico Sony (Video printer Grafic

UP860CE).

62 MATERIAIS E MÉTODOS

3.2.3 Transformação bacteriana por Eletroporação

Preparo de células eletrocompetentes: O pré-inóculo foi preparado a partir da

inoculação de uma colônia de células de E. coli em 5 mL de meio SOB. O cultivo foi

realizado a 37

C e 130 rpm até a saturação da cultura. Quinhentos microlitros desta

cultura foram utilizados como inóculo em 100 mL de meio SOB. As células foram

cultivadas a 37

C e 130 rpm até atingir a D.O.

600

entre 0,6-0,8. Em seguida, a cultura

foi transferida para tubos plásticos de 40mL e centrifugada a 5.000xg a 4

C por 5

minutos. As células foram lavadas duas vezes, com 40 mL de água Milli-Q estéril

gelada (4

C). Após as lavagens, o sedimento foi ressuspenso em 30 mL de glicerol

15% e centrifugado (5.000xg a 4ºC por 10 minutos). Após o descarte do sobrenadante,

o sedimento de células foi ressuspenso na solução de glicerol remanescente nas

paredes do tubo (cerca de 1 mL), a suspensão de células foi aliquotada (30 μL) e

armazenada a -80ºC.

Eletroporação: Alíquotas de 30 μL de células eletrocompetentes foram

descongeladas em banho de gelo e utilizadas para eletroporação. Em cada tubo foi

adicionado 0,8 - 2 μL de DNA plasmidial ou reação de ligação. Após a leve

homogenização da mistura, essa foi transferida para uma câmara de eletroporação e

submetida a um pulso elétrico de 4 kV, 200Ω, 330 μF no aparelho Cell Porator (Life

Technologies). A seguir, as células foram transferidas para frascos de 25 mL contendo

1 mL de meio SOC e incubadas a 37

C a 130 rpm, por 1 hora. Alíquotas de 100-

400 μL de células foram plaqueadas em meio LA contendo os antibióticos apropriados

para a seleção das células transformantes. As placas foram incubadas a 37

C durante

16-24 horas. As colônias de E. coli foram coletadas, os plasmídeos isolados (seção

3.2.1) e analisados.

63 MATERIAIS E MÉTODOS

3.2.4 Amplificação do DNA

O sistema de reação da polimerase em cadeia (PCR) utilizado consistiu de 5 μL

de tampão da polimerase Taq (10x), cerca de 20 ng de DNA molde, 200 pmol dNTPs,

20 pmol de cada oligonucleotídeo iniciador, 1,5 mmol/L MgCl

, 1,5 μL de DMSO, 5U

Taq DNA polimerase (purificada no Laboratório de Fixação de Nitrogênio) e água

Milli-Q para um volume final de 50 μL. Os programas utilizados para amplificação

consistiram de: 30 ciclos de desnaturação (95

C), anelamento (temperatura definida

por cada par de oligonucleotídeos) e extensão (72

C). A temperatura de anelamento foi

calculada considerando que cada par AT contribui em 2ºC para a temperatura de fusão

do DNA dupla-fita e o par GC, em 4ºC. Para cada pareamento incorreto entre o

oligonucleotídeo e a fita molde foi diminuído 5ºC da temperatura calculada. Para

garantir a desnaturação do DNA molde, antes da execução do programa, o sistema de

PCR foi submetido a uma etapa a 95

C por 5 minutos e para garantir a completa

extensão do DNA sintetizado foi acrescentada uma etapa a 72

C por 10 minutos ao

final do programa.

Os produtos de PCR foram purificados por extração com 1 volume de fenol

equilibrado:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Após centrifugação, a fase aquosa

contendo o material amplificado foi coletada e transferida para um novo tubo. A

precipitação do DNA foi feita pela adição de 2 volumes de etanol 95% seguida de

incubação à temperatura ambiente por no mínimo 30 minutos e centrifugação por 15

minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de DNA foi lavado com 1 mL

de etanol 80%. Em seguida o material foi centrifugado por 7 minutos. O etanol foi

retirado por sucção e o material foi seco em bomba de vácuo. O precipitado foi

dissolvido em 10 - 50 μL de água Milli-Q.

64 MATERIAIS E MÉTODOS

3.2.5 Mutagênese sítio-dirigida

A mutagênese sitio-dirigida foi feita utilizando o Kit QuikChange

Site

Directed Mutagenesis (Stratagene). Esta metodologia emprega duas enzimas, (1) a

DNA polimerase PfuI de Pyrococcus furiosus, enzima de alta fidelidade e

processividade e (2) a enzima de restrição DpnI, a qual digere essencialmente DNA

semi-metilado e metilado que contém a seqüência alvo 5’-GmGATC-3’. Usando DNA

plasmidial como molde e dois oligonucleotídeos sintéticos complementares contendo a

mutação desejada, a DNA polimerase PfuI replica integralmente ambas as fitas do

plasmídeo numa reação de PCR. A enzima DpnI, adicionada à mistura de reação após

a amplificação, digere o DNA molde, mas não o DNA sintetizado que contém a

mutação (Figura 3.1).

Os plasmídeos utilizados como molde (parentais) foram preparados como

descrito na seção 3.2.1. Num sistema de reação de 50 μL foram adicionados 50 ng do

DNA molde, 10 pmol de cada oligonucleotídeo, 200 pmol dNTPs, 5μL de tampão da

polimerase PfuI (10x) e 2,5U de PfuI. A reação de amplificação consistiu dos

seguintes passos: 1 ciclo : 95

C - 1 min e 16 ciclos 95

C - 30 s, 55

C - 1 min e 68

C -

12 min. O produto de PCR foi purificado utilizando-se o kit Qiaquick PCR purification

(Qiagen Inc.) para remover a DNA polimerase, e posteriormente foi tratado com 10U

da enzima de restrição DpnI. Após a incubação a 37

C por 1 hora, 2 μL da mistura de

reação foram usados para transformar células de E. coli. Plasmídeos purificados a

partir de colônias isoladas foram seqüenciados para confirmação da presença da

mutação desejada e confirmar a integridade do restante do gene.

65 MATERIAIS E MÉTODOS

FIGURA 3.1 - ESQUEMA DA MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA QUICKCHANGE.

Plasmídeo contendo a

seqüência alvo para mutação.

Desnaturação do plasmídeo para permitir o anelamento

dos oligonucleotídeos contendo a mutação desejada.

Digestão com a enzima de restrição DpnI

Transformação do DNA dupla-fita aberto

Ligase bacteriana liga as pontas do DNA

PCR

Plasmídeo contendo a

seqüência alvo para mutação.

Desnaturação do plasmídeo para permitir o anelamento

dos oligonucleotídeos contendo a mutação desejada.

Digestão com a enzima de restrição DpnI

Transformação do DNA dupla-fita aberto

Ligase bacteriana liga as pontas do DNA

χχ

PCR

O círculo em azul representa o sítio a ser mutado. Os oligonucleotídeos mutagênicos (setas vermelhas)

apresentam um ou mais sítios da mutação (χ). O apêndice A contém a seqüência dos oligonucleotídeos

utilizados.

66 MATERIAIS E MÉTODOS

3.2.6 Seqüenciamento de DNA

Para o seqüenciamento foi utilizado o método de terminador marcado (dye

terminator) utilizando ddNTPs marcados com fluoróforos e a DNA polimerase

termoestável (Sanger et al., 1977; Reeve & Fuller, 1995).

3.2.6.1 Reação de seqüenciamento de DNA

O sistema de reação (10 μL) continha 0,1 - 0,2 μg do DNA plasmidial

purificado (seção 3.2.1), 10 pmol do oligonucleotídeo iniciador (Apêndice A) e 4,0 μL

de reagente de seqüenciamento DYEnamic ET (GE Healthcare). A reação foi

submetida ao seguinte programa no termociclador: 1 ciclo de 5 min a 95

C e 30 ciclos

de 20 s a 96

C, seguido de 90 s a 60

3.2.6.2 Purificação do produto da reação de seqüenciamento

Após a realização da reação de seqüenciamento, o sistema de reação foi

transferido para um tubo de 500 μL no qual foram adicionados também 20 μL de água

Milli-Q e 60 μL de isopropanol. O sistema foi incubado à temperatura ambiente por 10

minutos e posteriormente centrifugado durante 25 minutos. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado foi lavado com 250 μL de etanol 80%. Após a centrifugação

por 8 minutos e descarte do sobrenadante, o precipitado foi seco em bomba de vácuo.

O DNA foi dissolvido em formamida deionizada-blue dextran:EDTA, aquecido a 94

por 2 minutos e aplicado no seqüenciador Automático ABI377 (Applied Biosystems).

3.2.6.3 Edição e Análise das seqüências

As seqüências de DNA obtidas foram alinhadas e editadas utilizando o

programa Bioedit (Hall, 1999). O programa Clustal W (Thompson et al., 1994) foi

utilizado para o alinhamento da seqüência de aminoácidos das proteínas RecA

selvagem com RecA mutantes e para o alinhamento das proteínas RecA e RecX de H.

67 MATERIAIS E MÉTODOS

seropedicae com aquelas de outros organismos. Todas as seqüências obtidas foram

submetidas ao programa Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov

) (Altschul et al., 1997) e

comparadas com as seqüências depositadas no banco de dados GenBank.

3.2.7 Purificação de DNA simples-fita

Células de E. coli 7118 ao serem transformadas com o plasmídeo vetor pTZ19R

e infectadas pelo bacteriófago M13K07 replicam o plasmídeo na forma de ssDNA a

partir da origem de replicação f1 do fago M13 presente no vetor. O DNA é

posteriormente empacotado em capsídeos virais que vão para o meio de cultura sem

induzir a lise da célula hospedeira.

Infecção bacteriana: O ssDNA foi obtido como descrito por Sambrook et al.

(1989). Uma colônia da estirpe de E. coli 7118 contendo o vetor pTZ19R foi cultivada

em 2 mL de meio TB contendo ampicilina em frasco de 10 mL durante 12 horas. Dez

microlitros dessa cultura foram inoculados em 2,5 mL de meio TB contendo

ampicilina em frasco de 25 mL e cultivadas até atingirem a D.O.

600

de 0,2-0,4. Neste

momento, o fago M13K07 (10

- 10

pfu/mL) foi adicionado à cultura numa

concentração 10 vezes maior do que a das células bacterianas (10

células/mL). Após 2

horas de incubação, 100 μL da cultura infectada foram inoculados em 2,5 mL de meio

TB contendo ampicilina e canamicina (20 μg/mL) em frasco de 25 mL e incubados

sob agitação durante a noite.

Isolamento do ssDNA: Uma alíquota de 1,5 mL da cultura foi centrifugada

em tubo plástico de 1,5 mL durante 5 minutos. Cerca de 1,2-1,3 mL do sobrenadante

foram transferidos para outro tubo contendo 200 μL de tampão PEG/NaCl (Tabela

3.4), misturados por inversão e incubados por 30 minutos à temperatura ambiente. A

mistura foi centrifugada por 6 minutos, o sobrenadante foi descartado e novamente

centrifugada por 6 minutos para remoção de sobrenadante residual. O precipitado

contendo os bacteriófagos foi ressuspenso em 100 μL de tampão TE e a lise dos

capsídeos virais foi obtida por extração com 0,5 volumes de fenol equilibrado, com

agitação no vórtex por cerca de 30 s intercalada com 1 minuto sem agitação (3 vezes).

A mistura foi centrifugada por 5 minutos e 80μL da fase aquosa foi transferida para

68 MATERIAIS E MÉTODOS

um novo tubo de 1,5 mL. O sobrenadante foi precipitado com 225 μL de etanol

absoluto e 9 μL de acetato de sódio 3 mol/L após incubação de 5 a 10 minutos a -70

O DNA foi coletado após centrifugação por 10-15 minutos, lavado com etanol 80%,

seco em bomba de vácuo e dissolvido em 20-40 μL de água Milli-Q.

3.2.8 Clonagem

3.2.8.1 Clonagem do gene recA de H. seropedicae

A estratégia inicial adotada para a sub-clonagem do gene recA de H.

seropedicae foi a amplificação do gene a partir do plasmídeo pBMR503 utilizando o

oligonucleotídeo recA2 (contém a seqüência complementar ao final do gene recA e

ainda o sítio de reconhecimento da enzima de restrição BamHI - Apêndice A), e o

oligonucleotídeo reverso (complementar ao vetor - Apêndice A). O fragmento de DNA

amplificado foi digerido com KpnI/BamHI e clonado no vetor pTZ18R digerido com

as mesmas enzimas, originando o plasmídeo pCWG5. KpnI foi utilizada uma vez que

a montante do códon de início de tradução do gene recA há um sítio de

reconhecimento para essa enzima de restrição. Após a clivagem do plasmídeo pCWG5

com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, o gene recA foi clonado no vetor pT7-7,

gerando o plasmídeo pCWG7. Esse plasmídeo, por sua vez, foi digerido com as

enzimas NdeI e BamHI, para a clonagem do gene recA no vetor pET28a, gerando o

plasmídeo pCWG8.

A superexpressão da proteína RecA nativa e RecAHis a partir dos plasmídeos

pCWG7 e pCWG8 indicou que a proteína RecA estava sendo traduzida tanto

utilizando a seqüência de ligação do ribossomo (RBS) do vetor quanto o RBS do gene

recA. Para a retirada de um dos sítios RBS, o plasmídeo pCWG8 foi clivado com as

enzimas de restrição NdeI e XbaI, tratado com a enzima Klenow e dNTPs e então com

a enzima T4 DNA ligase para recircularizar o plasmídeo. O produto de reação foi

transformado em E. coli, obtendo-se o plasmídeo recombinante pCWG9, que codifica

a proteína RecA nativa.

69 MATERIAIS E MÉTODOS

Para a obtenção de uma construção que expressasse a proteína RecAHis, o

oligonucleotídeo recA1 (contém a seqüência complementar ao início do gene recA e

ainda o sítio de reconhecimento da enzima de restrição NdeI - Apêndice A) foi

sintetizado e juntamente com o oligonucleotídeo recA2 foram utilizados numa reação

de PCR empregando o plasmídeo pBMR503 como DNA molde. O produto de

amplificação de aproximadamente 1,1 kpb foi clonado no vetor pCR4-TOPO,

originando o plasmídeo pATOPO. Posteriormente, pATOPO foi digerido com as

enzimas NdeI e BamHI e ligado ao vetor pET28a, originando o plasmídeo pAET. O

seqüenciamento deste plasmídeo utilizando os oligonucleotídeos T7 e T7 terminador

(oligonucleotídeos complementares às regiões que flanqueiam o sítio de policlonagem

do vetor pET28a - Apêndice A) revelou a troca do resíduo de timina 161 por adenina

causando a mudança do resíduo 54 de leucina para glutamina. (Apêndice B). Assim, o

plasmídeo pAET codifica para uma proteína RecAHis mutante contendo a substituição

L54Q.

Para obter um plasmídeo com a seqüência codificando para a proteína RecA na

sua forma selvagem, oligonucleotídeos Q54L e Q54L* (Apêndice A) foram utilizados

na troca do nucleotídeo mutagenizado como descrito na seção 3.2.5. O plasmídeo

contendo o gene recA selvagem foi denominado pAETWT e codifica a proteína

RecAHis selvagem.

Para a inserção da seqüência de aminoácidos reconhecida e fosforilada pela

quinase de músculo cardíaco de boi (bovine heart muscle kinase ou HMK) a montante

da seqüência que codifica para RecA L54Q, o fragmento NdeI/BamHI do plasmídeo

pAET foi clonado no vetor pET28b+HMK (Apêndice C) gerando o plasmídeo

denominado pAET-HMK. Esse plasmídeo também codifica para uma proteína

RecAHis mutante contendo a substituição L54Q. Para a inserção da seqüência que

codifica HMK a jusante da proteína RecA selvagem, foi adotada outra estratégia. Os

oligonucleotídeos HMK e HMK* (Apêndice A e C) foram utilizados numa PCR

mutagênica sítio-dirigida tendo como DNA molde o plasmídeo pAETWT, gerando o

plasmídeo pAETWT-HMK. Esse plasmídeo também codifica a proteína RecAHis.

70 MATERIAIS E MÉTODOS

Ambas as proteínas que apresentam a seqüência HMK e podem ser marcadas com

[

P] utilizando quinase HMK e [γ-

P]ATP.

O códon que codifica para o resíduo de glicina 73 da proteína RecA de H.

seropedicae, essencial para a ligação de ATP (Konola et al., 1994) foi substituído pelo

códon que codifica para alanina (GGC para GCC) por PCR mutagênica. Para obtenção

deste mutante, o plasmídeo pAET foi usado como DNA molde numa PCR mutagênica

sítio-dirigida utilizando os oligonucleotídeos G73A e G73A* (Apêndice A). O

plasmídeo que codifica para a proteína RecA mutante L54Q G73A foi denominado

pAET-G73A.

3.2.8.2 Clonagem do gene recX de Herbaspirillum seropedicae

Para a amplificação do gene recX de H. seropedicae, foram utilizados os

oligonucleotídeos recX1 (complementar ao início do gene recX e contém o sítio de

reconhecimento da enzima de restrição NdeI) e universal (complementar ao vetor

pTZ19R - Apêndice A) e, como molde, o plasmídeo pBMR507. O produto

amplificado de 0,8 kpb foi clonado como fragmento NdeI/EcoRI no vetor pET28a,

originando o plasmídeo pCWG3. Esse plasmídeo codifica a proteína RecXHis. A

identificação de mais um sítio NdeI a jusante do códon de parada da tradução

dificultou a clonagem direta do gene recX do plasmídeo pCWG3 no vetor pT7-7, para

obter a proteína RecX nativa. Dessa forma, o gene recX foi amplificado utilizando os

oligonucleotídeos recX2 (complementar ao início do gene recX e contém o sítio de

reconhecimento da enzima de restrição BamHI) e T7 terminador (complementar ao

vetor pET28a - Apêndice A) e, como molde, o plasmídeo pCWG3. O produto

amplificado de 0,8 kpb foi clonado como fragmento BamHI/EcoRI num vetor

intermediário o pTRG, originando o plasmídeo pXTRG2. Este plasmídeo foi clivado

com as enzimas BamHI/XhoI e o fragmento clonado no vetor pT7-7 BamHI/SalI,

originando o plasmídeo pXT7. Esse plasmídeo codifica para a proteína RecX nativa.

71 MATERIAIS E MÉTODOS

3.3 Métodos Gerais para proteína

3.3.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante

A eletroforese em gel de poliacrilamida que utiliza o SDS como agente

desnaturante de proteína é denominada SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel

electrophoresis). A desnaturação é promovida pela ligação do SDS à proteína

formando um complexo proteína-SDS de carga negativa. O número de moléculas de

SDS ligado à proteína é proporcional ao seu tamanho.

As análises eletroforéticas de proteínas em gel de poliacrilamida em condição

desnaturante foram feitas como descrito por Laemmli (1970) usando sistema de

minigéis Höefer ou BioRad. A percentagem de acrilamida no gel de separação

dependeu da massa molecular das proteínas que estavam sendo analisadas. A Tabela

3.7 contém a composição dos géis utilizados nas análises por SDS-PAGE realizadas

neste trabalho.

TABELA 3.7 - COMPOSIÇÃO DOS GÉIS DE SEPARAÇÃO E DE EMPILHAMENTO

UTILIZADOS NAS ANÁLISES POR SDS-PAGE.

GEL DE SEPARAÇÃO

COMPONENTES

12,5% 15%

GEL DE

EMPILHAMENTO

Solução II (SDS-PAGE) 2,5 mL 2,5 mL -

Solução III (SDS-PAGE) - - 1 mL

Água 3,4 mL 2,5 mL 2,4 mL

Acrilamida (30% T, 2,67% C) 4,1 mL 5,0 mL 0,6 mL

10% (p/v) APS 100 μL 100 μL 40 μL

TEMED 10 μL 10 μL 4 μL

Volume final 10 mL 10 mL 4 mL

As amostras, antes de serem analisadas por SDS-PAGE, foram misturadas com

tampão de amostra - SDS-PAGE (Tabela 3.4) e aquecidas a 95˚C por 3 minutos. As

eletroforeses foram realizadas a 150-200V em tampão Laemmli (1x) durante 40-50 minutos,

72 MATERIAIS E MÉTODOS

ou até o azul do bromofenol atingir 1 cm da borda inferior do gel. O gel foi corado com

solução de azul de Coomassie e descorado com solução descorante para gel de proteína.

3.3.2 Superexpressão das proteínas RecA e RecX de H. seropedicae

Aproximadamente 50 colônias de E. coli B834 (DE3) ou BL21 (DE3) pLysS,

contendo o plasmídeo de interesse, crescidas no dia anterior em meio LA, foram

inoculadas em 1 L de meio TB suplementado com antibiótico adequado. As células

foram cultivadas a 37˚C e 130 rpm, durante 2-3 horas ou até atingirem a D.O.

600

0,3. Posteriormente, o frasco foi transferido para a temperatura de 25

C, seguido de 30

minutos de incubação antes da adição de 1 mmol/L de IPTG. A cultura foi incubada

por mais 3-4 horas na mesma temperatura. As células foram coletadas por

centrifugação (5.000xg, 4˚C por 10 minutos), o sobrenadante foi descartado e o

precipitado de células foi estocado a -20

C até o momento da purificação. Um mililitro

da amostra foi coletado separadamente para análise por SDS-PAGE (seção 3.3.1), para

confirmar a superexpressão da proteína de interesse.

O precipitado de células transformadas com o plasmídeo pCWG3, pAET-

HMK, pAETWT-HMK ou pAET-G73A foi ressuspenso em aproximadamente 50 mL

de tampão A

contendo um tablete de inibidores de protease (Complete Protease

Inhibitor Cocktail Tablets – Roche Applied Science). O rompimento das células foi

induzido pela mudança brusca de pressão: de 1,7 atm para 1 atm, em disruptor de

células (Constant Systems Ltd, UK). O sedimento de células transformadas com o

plasmídeo pCWG9 e pXT7 foi ressuspenso em aproximadamente 20 mL de tampão D

contendo fenil-metil-sulfonil fluoreto (PMSF) 1 mmol/L

ou 25 mL de tampão A

contendo glicerol 10% e PMSF 1 mmol/L, respectivamente. As células foram

rompidas por sonicação (6 vezes de 20 segundos em gelo) em um sonicador Heat

System equipado com microponta. Os lisados de células foram então centrifugados a

18.000xg por 30 minutos a 4˚C.

73 MATERIAIS E MÉTODOS

3.3.3 Purificação das proteínas

Todas as proteínas utilizadas nos ensaios in vitro foram purificadas usando o

equipamento FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography - cromatografia líquida

de performance rápida; GE Healthcare). O grau de pureza das proteínas foi

determinado densitometricamente a partir de géis SDS-PAGE corados com solução de

azul de Coomassie.

3.3.3.1

Purificação de proteína contendo cauda His

3.3.3.1.1 Cromatografia de afinidade utilizando metal imobilizado

A resina utilizada nessa cromatografia de afinidade é formada por uma matriz

de agarose ligada covalentemente a um quelante de cátions divalentes, como o ácido

iminodiacético. O aminoácido histidina tem a capacidade de complexar muitos íons

metálicos de transição. A coluna carregada com íons metálicos adequados, níquel por

exemplo, retém seletivamente as proteínas que apresentem pelo menos duas histidinas

adjacentes e expostas à superfície da molécula. Estas proteínas ligadas à resina podem

ser eluídas através de um gradiente de imidazol. O imidazol complexa o metal de

transição ligado à resina, deslocando a proteína.

A coluna Hi-Trap Chelating Ni

- 5 mL (GE Healthcare) foi preparada como

descrito a seguir. A coluna foi lavada e carregada com íons Ni

seguindo-se a ordem.

a) 10 volumes de coluna (10VC) de água Milli-Q, b) 2VC de acetato de amônio pH 4,0

(100 mmol/L), c) 2VC de NiCl

(100 mmol/L) diluído em acetato de amônio pH 4,0

(100 mmol/L) e finalmente d) 2VC de acetato de amônio pH 4,0 (100 mmol/L) para

remover o níquel não ligado. A coluna foi então conectada ao FPLC e equilibrada com

tampão A

(10 VC), tampão B

(5VC) e novamente com tampão A

(10VC). A

fração sobrenadante do extrato celular (200-800 mg de proteína total diluída em 25-50

mL) foi aplicado à coluna e posteriormente foi feita a lavagem da coluna com 0,04

mol/L de imidazol em tampão A

(10VC). As proteínas foram eluídas com 40 mL

(8VC) de gradiente de imidazol (0,04 a 0,72 mol/L) em tampão A

. A velocidade de

fluxo foi mantida em 2 mL/minutos até o início do gradiente de imidazol, quando o

74 MATERIAIS E MÉTODOS

fluxo foi reduzido para 1 mL/minutos. As frações coletadas, de 4 mL, foram analisadas

por SDS-PAGE (seção 3.3.1). As frações mais puras foram dialisadas por 15 h contra

tampão A contendo glicerol 50% (2x 500 mL), com a troca sendo feita após 4 horas do

início da diálise.

3.3.3.2 Purificação de proteína nativa

3.3.3.2.1 Precipitação da proteína RecA com Polietilenoimina e Sulfato de

Amônio

Tanto a polietilenoimina quanto o sulfato de amônio induzem a precipitação

seletiva das proteínas. A polietilenoimina é um polímero positivamente carregado

((NHCH

[-N(CH

)CH

) que ao interagir com proteínas ácidas

ou com DNA induz a precipitação de ambos. A polietilenoimina ao interagir com o

DNA também induz a precipitação de proteínas ligadas ao DNA. O sulfato de amônio

induz a precipitação das proteínas por salting out. Uma vez que a concentração de

sulfato de amônio requerida para induzir a precipitação das proteínas é variável, esse

sal é comumente usado na primeira etapa da purificação para retirar as proteínas que

precipitam em concentrações diferentes da proteína de interesse e ainda para

concentrá-la (Scopes, 1987).

À fração solúvel do extrato celular foi adicionado polietilenoimina 0,5% (v/v),

a partir de uma solução estoque aquosa 50%. Após a agitação por 30 minutos-1 hora a

C, a amostra foi centrifugada a 12.000xg por 15 minutos e o precipitado ressuspenso

em tampão R contendo 50 mmol/L sulfato de amônio (1,2% de saturação, S = 1,2%).

Após a agitação por 10 minutos-1 hora à 4

C, a amostra foi centrifugada a 12.000xg

por 15 minutos e o precipitado ressuspenso em tampão R contendo sulfato de amônio

200 mmol/L (S = 5%). A amostra foi centrifugada a 27.000xg por 30 minutos, o

precipitado foi descartado e ao sobrenadante foram adicionados 0,2 g/mL de sulfato de

amônio (S = 34%). Após centrifugação a 27.000xg por 30 minutos, o precipitado foi

descartado e ao sobrenadante foram adicionados 0,145 g/mL de sulfato de amônio,

aumentando a saturação para 54%. Após centrifugação a 27.000xg por 30 minutos, o

precipitado foi lavado com tampão R contendo 0,377 g/mL de sulfato de amônio (S =

75 MATERIAIS E MÉTODOS

58%) e novamente centrifugado a 27.000xg por 30 minutos. O precipitado obtido

nessa etapa foi dissolvido em tampão R contendo 200 mmol/L de sulfato de amônio (S

= 5%) e dialisado contra tampão A contendo glicerol 10% (2 x 300mL), sendo que a

troca foi feita após 4 horas do início da diálise, num total de 15 h.

3.3.3.2.2 Cromatografia em DEAE-Sepharose

A coluna DEAE-Sepharose apresenta uma matriz de agarose ligada a grupos

dietilaminoetil (–O–CH

–N+(C

)

H). Esses grupos agem como trocadores

fracos de ânions, uma vez que a ligação das proteínas negativamente carregadas a essa

matriz é fraca. A eluição foi feita em presença de sal. O íon Cl

retira a molécula alvo

do grupo amino imobilizado e, simultaneamente, o íon Na

se liga à molécula alvo,

favorecendo a eluição da mesma.

Após a primeira etapa de purificação, realizada a partir da precipitação seletiva

na presença de polietilenoimina e sulfato de amônio, a proteína de interesse foi

aplicada em coluna DEAE Sepharose (28 mL, 1,6 x 21 cm, GE Healthcare)

empacotada e acoplada ao sistema FPLC (GE Healthcare), num fluxo de 1

mL/minutos. A coluna havia sido previamente equilibrada com tampão A contendo

glicerol 10% (2VC). Após a aplicação da amostra, a coluna foi lavada com tampão A

contendo glicerol 10% (3VC), num fluxo de 2 mL/minutos. A eluição da proteína

RecA nativa foi feita em 3VC, num gradiente crescente de NaCl (0,05 – 1 mol/L) em

tampão A contendo glicerol 10%, num fluxo de 2 mL/minutos. As frações de 2 mL

eluídas durante o gradiente de sal foram coletadas e analisadas por eletroforese SDS-

PAGE (seção 3.3.1). As frações eluídas que apresentavam composição protéica

semelhante entre si e continham a proteína de interesse foram agrupadas e dialisadas

contra tampão A contendo glicerol 50% (2x 500 mL), sendo que a troca foi feita após

4 horas do início da diálise, num total de 15 h.

76 MATERIAIS E MÉTODOS

3.3.3.3 Cromatografia em SP-sepharose

A coluna SP-sepharose apresenta uma matriz de agarose ligada a grupos

sulfopropil (-O-CH

CHOHCH

OCH

-3

). Esses grupos agem como

trocadores fortes de cátion, uma vez que a ligação das proteínas positivamente

carregadas a essa matriz é bastante forte. A eluição foi feita pela variação na

concentração de sal. O íon Na

retira a molécula alvo do grupo sulfopropil imobilizado

e, simultaneamente, o íon Cl

se liga à molécula alvo, favorecendo a eluição da mesma.

A fração solúvel do extrato celular foi aplicada, num fluxo de 1 mL/minutos,

em uma coluna SP-sepharose (50 mL 1,6x 25,5 cm, GE Healthcare) empacotada e

acoplada ao sistema FPLC (GE Healthcare). A coluna havia sido previamente

equilibrada com tampão A contendo glicerol 10%, num fluxo de 2 mL/minutos. Após

a aplicação da amostra, a coluna foi lavada com 3,5VC de tampão A contendo glicerol

10%, num fluxo de 2 mL/minutos. A eluição da proteína RecX nativa foi feita com

4VC de gradiente contínuo de NaCl (0,05 – 1 mol/L) em tampão A contendo glicerol

10%, num fluxo de 2 mL/minutos. As frações de 5 mL eluídas durante o gradiente de

sal foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE (seção 3.3.1). As frações eluídas que

apresentavam composição protéica semelhante entre si e continham a proteína de

interesse foram agrupadas e dialisadas contra tampão A contendo glicerol 50% (2x 500

mL), sendo que a troca foi feita após 4 horas do início da diálise, num total de 15 h.

3.3.4 Clivagem da proteína RecXHis com trombina

A trombina é uma protease específica que reconhece a seqüência de

aminoácidos LVPRGS e cliva a ligação peptídica entre os resíduos R e G. As proteínas

expressas a partir do vetor pET28a contêm entre a cauda His e a primeira metionina a

seqüência reconhecida pela trombina. O tratamento da proteína His purificada com

trombina gera uma proteína nativa (contém apenas os aminoácidos GSH além dos

aminoácidos que constituem parte da proteína). A trombina utilizada nesse tratamento

estava covalentemente ligada à biotina (trombina biotinilada), sendo assim, após a

clivagem da cauda His, a enzima foi removida pela adição da resina de agarose

77 MATERIAIS E MÉTODOS

contendo a proteína streptavidina imobilizada. A cauda His clivada foi removida pela

adição da resina de agarose contendo Ni

imobilizado.

Para clivagem da cauda de histidinas da proteína RecXHis foi usado o Kit

Thrombin Cleavage Capture (Novagen). Para determinar a condição ideal de clivagem

da proteína RecXHis, foram feitos testes variando-se o tempo de incubação e a

concentração de trombina biotinilada no sistema. Baseando-se nos resultados, foram

estabelecidos os parâmetros de clivagem: temperatura de 4

C, já que RecX perde

atividade em temperaturas mais elevadas; tempo de incubação de 12 horas, após testar

os tempos de 2 até 16h, já que não foram detectados produtos de clivagem

inespecíficos adicionais com a extensão do tempo e, além disso, a clivagem foi

otimizada (cerca de 100%); 0,5U de trombina biotinilada / mg de RecXHis, apesar de

o fabricante recomendar o uso de 40U/mg. Essa redução foi efetuada a fim de diminuir

a probabilidade de ocorrer uma proteólise inespecífica e de haver uma contaminação

da amostra protéica de RecX com trombina e além disso foi efetuada para reduzir a

quantidade de resina agarose-estreptavidina utilizada na etapa de remoção da trombina

biotinilada. O sistema de proteólise variou de acordo com a quantidade de proteína

tratada. Basicamente, o sistema continha 10mg da proteína RecXHis recém purificada

na coluna Hi-Trap Chelating Ni

, tampão da trombina e 5U de trombina biotinilada,

num volume de reação de aproximadamente 4 mL. Após a incubação, 10 μg da

amostra foram analisados em gel de poliacrilamida desnaturante 12,5 ou 15%.

Confirmada hidrólise da cauda His, a amostra foi dialisada contra tampão A contendo

glicerol 5% (2x - 500 mL), e a troca foi feita após 4 horas do início da diálise, num

total de 15 h. Posteriormente, à amostra foi adicionada a resina Ni

Sepharose™ High

Performance (GE Healthcare) (100 μL resina / mg RecXHis) e estreptavidina-agarose

(Kit Thrombin Cleavage Capture) (15 μL resina / U de trombina biotinilada). Antes do

uso da resina Ni

Sepharose, esta foi equilibrada 2 vezes com 2 volumes de tampão A

contendo glicerol 5%. Após adicionar a proteína de interesse ao tubo contendo as

resinas, este foi incubado a 4

C durante 30 minutos, efetuando homogeneizações cada

10 minutos. Após incubação, a amostra foi centrifugada, o sobrenadante coletado e

quantificado utilizando método de Bradford (seção 3.3.6).

78 MATERIAIS E MÉTODOS

3.3.5 Estocagem das proteínas

Após a purificação e diálise das proteína de interesse, essas foram divididas

em alíquotas de 20-100 μL, congeladas em nitrogênio líquido e mantidas em freezer a

-80˚C.

3.3.6 Dosagem da concentração de proteína

A quantificação de proteínas (mg/mL) foi feita utilizando o método de

Bradford (1976). A ligação do corante azul de Coomassie G250 (molécula

negativamente carregada) à proteína gera um produto colorido cuja absorbância é

proporcional à concentração de proteína. A concentração das amostras protéicas foi

feita após a determinação da absorbância das mesmas em 595 nm utilizando uma

curva padrão de albumina de soro bovino (BSA).

3.3.7 Eletroforese de proteína em gel de agarose

As eletroforeses em gel de agarose foram realizadas como descrito por

Sambrook et al. (1989) em tampão TAE 1x. As concentrações dos géis usados foram

0,5 e 3% (p/v). As amostras foram misturadas com tampão de amostra - ligação

proteína-proteína, antes da sua aplicação no gel. As corridas eletroforéticas foram

realizadas a 20-30V por aproximadamente 4 horas. Para a visualização das proteínas, o

gel foi incubado por 5 minutos com solução de azul de Coomassie e com solução

descorante para proteína por no mínimo 1 hora. A proteína foi visualizada sob luz

branca no EC

System - UVP BioImaging Systems (UVP, Inc. Upland, CA USA).

3.3.8 Cristalização da proteína RecX

Para a determinação da condição ideal para a formação e o crescimento dos

cristais de proteína foram feitas triagens usando os kits Crystal Screen 1 e 2 (Hampton

Research). Como foram obtidos cristais tanto na presença da solução 16, 17 (kit

79 MATERIAIS E MÉTODOS

Crystal Screen 1) ou 41 (kit Crystal Screen 2), foi possível deduzir que a presença de

LiSO

era importante para a formação dos cristais. Condições próximas daquelas

presentes nessas soluções foram posteriormente testadas. Os valores de pH do tampão

foram: 7,5; 8,0; 8,5 e 9 e concentrações de LiSO

: 0,5; 0,75; 1; 1,25 e 1,5 mol/L, na

ausência ou na presença de NiCl

(0,01 mol/L). Após inspeção visual, a condição em

que se obteve os melhores cristais: pH 8,5 e concentrações de LiSO

igual

ou superior

a 1 mol/L. Cristais da proteína RecX nativa (RecXHis após tratamento com trombina

biotinilada) foram obtidos tanto pelo método da gota sentada quanto pelo método da

gota suspensa, após 2-6 dias a 20

C, misturando 1 μL da solução de proteína (3

mg/mL) e 1 μL da solução do reservatório (0,1 mol/L de Tris HCl pH 8,5 e 1, 1,25 ou

1,5 mol/L de LiSO

, na presença ou ausência de 0,01 mol/L de NiCl

). Para evitar a

agregação dos cristais, foram adicionados à solução reservatório 10% (v/v) glicerol,

10% (v/v) PEG-4000 ou 10% (v/v) dioxano. O tempo necessário para formação dos

cristais variou de acordo com a condição aplicada.

Os dados de difração de raios-X foram coletados de um agregado de cristais

ou de um único cristal usando o detector de imagens MAR345 posicionado a 30 cm do

cristal em gerador RU-H3RHB (Rigaku-MSC) equipado com um ânodo rotatório de

cobre e espelhos Osmic. O sistema de resfriamento usado foi X-stream (Rigaku-MSC).

Os dados foram coletados após tempos de exposição de 20 minutos a 12 horas. A

solução crioprotetora foi a própria solução do reservatório contendo 10, 20 ou 30%

(v/v) glicerol. O cristal foi mergulhado nas diferentes soluções de forma sucessiva,

finalizando com 30% glicerol.

80 MATERIAIS E MÉTODOS

3.4 Ensaios in vitro

Na descrição dos sistemas de reação, quando não mencionado, a concentração

dos componentes foi dada como concentração final e a concentração das proteínas

considerando-as na forma monomérica.

3.4.1 Ensaio de ligação das proteínas RecA e RecX ao DNA

3.4.1.1 Ensaio de ligação das proteínas RecA e RecX ao DNA marcado com [

Os oligonucleotídeos foram marcados com [γ-

P]ATP como descrito: numa

reação com volume final de 20 μL foram misturados 2 μL de tampão de reação da T4

polinucleotídeo quinase (10x), 20 pmoles do oligonucleotídeo (solução estoque 10

pmol/ μL), 10 U de T4 polinucleotídeo quinase (GE Healthcare) e 1,3 MBq de [γ-

P]ATP (185 TBq/mmol). A reação foi incubada a 37

C por 30 minutos e foi parada

com a desnaturação da enzima a 70°C por 10 minutos. O dsDNA foi preparado

misturando quantidades equimolares dos oligonucleotídeos complementares em

tampão TM, num volume final de reação de 20 μL. Posteriormente, o sistema de

reação foi aquecido durante 5 minutos a 95°C e esfriado em gelo por 10 minutos e

estocado a -20°C.

Os ensaios de retardamento de migração eletroforética foram realizados em

tampão de ligação DNA-proteína incubando a proteína RecAHis ou RecXHis (em

concentrações crescentes) com 1,8 μmol/L ssDNA (88 mers) WVC3 ou 1,1 μmol/L

dsDNA (88 bp) WVC3/WVC8 marcados com [

P], num volume final de 10 μL por

15 minutos à 37

C. Nos ensaios onde as proteínas RecA e RecX foram incubadas

conjuntamente, RecA foi adicionada em concentrações de 0 a 10 μmol/L e RecX na

concentração de 250 nmol/L no mesmo sistema de reação descrito. A reação foi parada

com a adição de 2 μL de tampão de amostra – nativo (5x).

Os complexos proteína-DNA foram utilizados por eletroforese em gel de

poliacrilamida (4 ou 4,5%) em condição nativa (ausência de SDS) (Tabela 3.8). Os

géis foram submetidos à pré-corrida a 50V por 30 minutos em tampão Tris-glicina

(1x) antes da aplicação da amostra. A eletroforese foi desenvolvida a 60 V por 80 ou

81 MATERIAIS E MÉTODOS

100 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, o gel foi seco utilizando o

sistema de secagem de gel da BioRad, visualizado no phosphorimager FLA-5000 (Fuji

Photo Film Company, Tokyo, Japan) e a imagem analisada utilizando o programa de

densitometria AIDA (Raytest GmbH, Straubenhardt, Germany).

TABELA 3.8 - COMPOSIÇÃO DOS GÉIS UTILIZADOS PARA SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS

EM CONDIÇÃO NATIVA.

GEL

COMPONENTES

4% 4,5%

Tampão Tris-glicina (10x) 1 mL 1 mL

Água 7,66 mL 7,5 mL

Acrilamida (30% T, 2,67% C) 1,33 mL 1,5 mL

10% (p/v) APS 100 μL 100 μL

TEMED 10 μL 10 μL

Volume final 10 mL 10 mL

3.4.1.2 Ensaio de ligação da proteína RecA e RecX ao DNA não marcado

Os ensaios de ligação proteína-DNA de alta massa molecular foram realizados

como descrito por Kurumizaka et al. (2000), porém utilizando como DNA alvo de

ligação o vetor pTZ19R (2.871 pb) em diferentes conformações. O sistema de reação

(20μL) tinha 20 μmol/L de dsDNA circular, 8 μmol/L de dsDNA linear ou 450

μmol/L de ssDNA circular, 2 μL de tampão de ligação DNA-proteína (10x) e a

proteína RecXHis (0 - 10 μmol/L). Após incubação por 15 minutos a 37

C, foi

adicionado ao sistema tampão de amostra -ligação DNA-proteína, e a amostra foi

eletroforisada em gel de agarose 0,5% e tampão TAE 1x por 5 h a 3,6 V/cm. O gel foi

corado com brometo de etídeo e exposto à luz UV. As imagens foram capturadas

usando transiluminador EC

System - UVP BioImaging Systems (UVP, Inc. Upland,

CA USA).

82 MATERIAIS E MÉTODOS

3.4.2 Ligação covalente das proteínas RecA e RecX com o DNA induzida por luz

A substituição de um oxigênio do grupo fosfato do oligonucleotídeo por um

enxofre permitiu a sua posterior derivatização com brometo de azidofenacil. A

irradiação deste oligonucleotídeo derivatizado com luz UV no comprimento de onda

acima de 300 nm gera intermediários reativos que induzem a formação de ligações

covalentes entre os oligonucleotídeos e as moléculas de proteína próximas em um

tempo bastante curto (30s). A utilização de comprimentos de onda superiores a 254 nm

evita a formação de foto-lesões como a clivagem do DNA e oxidação, as quais

poderiam afetar a integridade e a funcionalidade dos componentes presentes na

mistura (Meisenheimer & Koch, 1997). Isto ocorre, pois a luz UV, no comprimento de

254 nm, não apenas é absorvida pelas bases do DNA, mas é também absorvida por

outros grupos funcionais do oligonucleotídeo ou da proteína.

A ligação do grupo azidofenacil ao oligonucleotídeo fosforotiolado (Apêndice

A) foi feita como descrito a seguir. O oligonucleotídeo fosforotiolado SRW3 (-7/-6)

foi

ressuspenso em 100 mmol/L de bicarbonato de trietilamônio pH 8,0 (concentração

final de 100 μmol/L). A modificação foi obtida pela adição de 100 mmol/L de brometo

de p-azidofenacil, APAB (Sigma) dissolvido em 99% acetonitrila e incubação a 25°C

por 4 h. Uma vez que o grupamento reativo incorporado pode ser destruído por

fotólise quando exposto à luz direta, foi necessário manter todo o sistema em tubos

plásticos negros. O oligonucleotídeo conjugado gerado foi purificado por gel filtração

usando coluna Microspin G-50 (GE Healthcare) e posteriormente marcado com [

através da sua incubação com T4 polinucleotídeo quinase e [γ-

P]ATP, como descrito

na seção 3.4.1.1.

Para o experimento de formação de ligação covalente, 0,8 μmol/L do

oligonucleotídeo conjugado e marcado com [

P] foi incubado com 5 μmol/L RecA, 5

μmol/L RecX ou 5 μmol/L RecA + 5 μmol/L RecX a 37°C em tampão STA, num

volume total de 10 μL. As reações foram incubadas por 15 minutos e então irradiadas

com luz UV a 365 nm por 30 s usando UV Stratalinker 1800 (Stratagene). A uma parte

da reação (2 μL) foi adicionado tampão de amostra - nativo e aos outros 8 μL

restantes, tampão de amostra - SDS-PAGE. As amostras foram então aplicadas no gel

83 MATERIAIS E MÉTODOS

nativo e eletroforisadas por 100 minutos a 60V ou foram aquecidas a 95°C por 3

minutos, aplicadas em SDS-PAGE (12,5%) e eletroforisadas por 40 minutos a 200V,

respectivamente. A migração da proteína em SDS-PAGE foi acompanhada devido à

presença de um marcador pré-corado (Invitrogen) na corrida eletroforética. Os géis

foram secos utilizando o sistema de secagem de gel da BioRad, visualizados no

phosphorimager FLA-5000 (Fuji Photo Film Company, Tokyo, Japan) e as imagens

analisadas utilizando o programa de densitometria AIDA (Raytest GmbH,

Straubenhardt, Germany).

3.4.3 Ensaios de interação proteína-proteína

Os ensaios de interação proteína-proteína foram realizados utilizando-se resina

de Sepharose Chelating FF (GE Healthcare) e eletroforese em duas dimensões,

segundo Schägger & Von Jagow (1991) com algumas modificações.

3.4.3.1 Determinação da interação RecA-RecX utilizando resina de sepharose

chelating FF

A resina sepharose chelating pode ser carregada com íons metálicos e

posteriormente ser utilizada para imobilizar proteínas que apresentam cauda His. Para

determinar se as proteínas RecA e RecX interagem entre si, através do método de

imobilização em resina de sepharose ligada a íons níquel (sepharose-Ni

), foi

necessária a purificação de uma das proteínas na sua forma nativa e a outra contendo a

cauda His.

A proteína RecAHis ou RecXHis num volume de 50μL (4 e 8 μmol/L,

respectivamente) foi incubada por 30 minutos com 15 μL da suspensão de resina

sepharose chelating FF previamente carregada com Ni

como recomendado pelo

fabricante (GE Healthcare) e equilibrada com tampão A contendo 5% de glicerol.

Após este período, a amostra foi centrifugada (500xg, 5 minutos), o sobrenadante

coletado para análise, e o precipitado ressuspenso por inversão em 75 μL de tampão A

contendo glicerol 5% e incubado durante 5 minutos. Após este período, a amostra foi

84 MATERIAIS E MÉTODOS

centrifugada (500xg, 5 minutos) e a proteína RecX ou RecA nativa na concentração de

8 ou 4 μmol/L, respectivamente, foi adicionada na presença ou ausência de ATP

1mmol/L ou ssDNA LHBT-r 80 nmol/L (Apêndice A), num volume final de 50 μL, e

incubada à temperatura ambiente por mais 30 minutos. Após incubação, a amostra foi

centrifugada (500xg, 5 minutos), o sobrenadante coletado para análise, e o sedimento

ressuspenso por inversão em 75 μL de tampão A contendo 5% de glicerol durante 5

minutos. Após a centrifugação (500xg, 5 minutos), o precipitado de resina foi

ressuspenso por inversão em tampão A contendo 5% de glicerol e 0,5 mol/L de

imidazol incubado por 5 minutos e centrifugado novamente a 500xg por 5 minutos. O

sobrenadante foi coletado para análise por SDS-PAGE.

FIGURA 3.2 - ETAPAS DO ENSAIO DE INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA

UTILIZANDO RESINA DE SEPHAROSE ligada a íons NI

Proteína com

cauda His

Proteína nativa

IMIDAZOL 0,5 mol/L

As setas em azul claro presas a uma superfície representam a resina Sepharose Chelating FF

carregadas com Ni

, os círculos em azul e vermelho representam as proteínas com cauda His e nativa,

respectivamente.

FONTE: Adaptado do manual de instruções da GE Healthcare.

3.4.3.2 Determinação da interação RecA-RecX por eletroforese em duas

dimensões (2D)

Neste método foram utilizadas a eletroforese em gel de agarose (condição

nativa) e a eletroforese em gel SDS-PAGE (condição desnaturante). As proteínas que

formam complexos migram juntas na primeira dimensão e normalmente apresentam

85 MATERIAIS E MÉTODOS

um perfil de migração diferenciado daquele apresentado pelas proteínas isoladas.

Desta forma, a análise do perfil de migração na primeira dimensão permite sugerir a

interação das proteínas, que pode ser confirmada na eletroforese de segunda dimensão.

Como a segunda dimensão é realizada em condição desnaturante, o complexo protéico

é desfeito, e as proteínas constituintes do mesmo são resolvidas de acordo com a

massa molecular de cada uma, numa mesma linha do gel. Caso as proteínas ensaiadas

não interajam entre si, as proteínas serão resolvidas também de acordo com a massa

molecular, mas não estarão presentes numa mesma linha do gel da segunda dimensão.

A mistura de reação (25 μL) contendo 23 μmol/L da proteína RecXHis, 7

μmol/L da proteína RecAHis, ou 8 μmol/L da RecXHis juntamente com 4 μmol/L da

RecAHis foram incubadas por 15 minutos a 37

C em tampão de ligação proteína-

proteína. Após este período, foi adicionado tampão de amostra - ligação proteína-

proteína, e a reação foi submetida à eletroforese de primeira dimensão.

Na primeira dimensão, as corridas eletroforéticas foram realizadas em gel de

agarose (0,5 ou 3%) a 4 V/cm em tampão TAE 1x. Para determinar o efeito do azul de

Coomassie G250 no perfil de migração e interação das proteínas, este corante foi

adicionado às amostras na concentração de 0,26% (p/v). O tempo das corridas

eletroforéticas foi de 4 horas ou até o azul de bromofenol atingir 4/5 do comprimento

do gel. Após a eletroforese, as proteínas foram coradas em solução de azul de

Coomassie por 5 minutos e solução descorante para proteína por no mínimo 1 hora.

A estratégia adotada na segunda dimensão para analisar as amostras quando

estas foram aplicadas em gel de agarose 3% apresentou etapas distintas da adotada

quando o gel de agarose 0,5% foi usado.

Após o término da primeira dimensão em gel de agarose 0,5%, o gel foi

cortado (sentido do seu comprimento) com o auxílio de um estilete, para separar as

linhas do mesmo (Figura 3.3, etapa 1). Em seguida, cada linha foi cortada

transversalmente no sentido da largura do gel, formando cubos de agarose (etapa 2a),

que foram transferidos para tubos plásticos de 1,5 mL devidamente identificados

(etapa 3a). Após a fusão do cubo de agarose a 60

C, foi adicionado tampão de amostra

- SDS-PAGE, e os tubos foram incubados por 3 minutos a 95

C. Posteriormente, as

amostras foram aplicadas, ainda quentes, no gel da segunda dimensão (etapa 4a). A

eletroforese de segunda dimensão foi realizada em gel SDS-PAGE 12,5% utilizando o

86 MATERIAIS E MÉTODOS

sistema de minigéis da Höefer. A composição do gel assim como os tampões de

corrida utilizados e tempo de corrida estão descritos na seção 3.3.1.

Após o término da primeira dimensão em gel de agarose 3%, as linhas também

foram isoladas, como descrito anteriormente (Figura 3.3, etapa 1). Em seguida, as

linhas de gel foram cortadas longitudinalmente em lâminas com espessura de

aproximadamente 1mm, compatível com o Sistema de Minigéis da Höefer (etapa 2b).

Quanto mais próximos da base do poço foram feitos os cortes, maior foi a quantidade

de proteína presente. As lâminas de gel foram incubadas durante 15 minutos em uma

solução contendo 1% de SDS (p/v) e 15 mmol/L de β-mercaptoetanol (etapa 3b). O

SDS desnatura as proteínas e forma complexos proteína-SDS negativamente

carregados e o β-mercaptoetanol preserva o estado reduzido das proteínas

desnaturadas, permitindo que a separação das proteínas, no gel de segunda dimensão,

ocorra de acordo com a massa molecular das mesmas. A eletroforese de segunda

dimensão foi realizada em gel SDS-PAGE 12,5% utilizando o sistema de minigéis da

Höefer (seção 3.3.1).

Para realizar a 2

dimensão das amostras presentes na lâmina do gel, apenas o

gel separador foi preparado sem utilizar pente formadores de poços, deixando um

espaço de 2 cm no topo do gel. Uma vez preparado o gel SDS-PAGE (seção 3.3.1), a

placa de vidro do sistema foi separada do gel e a lâmina de gel da 1

dimensão foi

posicionada próxima à parte superior do gel SDS-PAGE. O vidro foi novamente

reposto na posição original, evitando a permanência de bolhas entre os géis. A

permanência das bolhas impede a transferência completa das proteínas para o gel de

poliacrilamida ou ainda faz com que o tampão passe tanto através do gel (como é

desejado) quanto entre o vidro e o gel, comprometendo a análise dos resultados. O gel

foi submetido à corrida eletroforética como descrito no item 3.3.1. Os géis SDS-PAGE

foram corados com solução de azul de Coomassie por no mínimo 20 minutos e

descorados em solução descorante para proteína. As imagens foram capturadas usando

transiluminador EC

System - UVP BioImaging Systems (UVP, Inc. Upland, CA

USA).

87 MATERIAIS E MÉTODOS

FIGURA 3.3 - ESQUEMA DO ENSAIO DE INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA

UTILIZANDO ELETROFORESE BIDIMENSIONAL.

1ª DIMENSÃO

2ª DIMENSÃO

+SDS e β-

mercaptoetanol

5 mm

1 mm

60 mm

5-10 mm

Após corrida eletroforética em gel de agarose 0,5%, cada linha foi isolada (1) e cortada em forma de

cubos (2a), os quais foram transferidos para tubos plásticos de (1,5 mL) devidamente identificados

(3a). Após a fusão do cubo de agarose a 60

C, foi adicionado tampão de amostra - SDS-PAGE, e os

tubos foram incubados por 3 minutos a 95

C. Posteriormente, as amostras foram aplicadas no gel da

segunda dimensão (4a). Após corrida eletroforética dos sistemas de reação em gel de agarose 3%, cada

linha foi isolada (1) e cortada longitudinalmente (2b). As lâminas de gel foram incubadas durante 15

minutos em uma solução contendo 1% de SDS (p/v) e 15 mmol/L de β-mercaptoetanol (3b). A placa

de vidro do sistema foi separada do gel e a lâmina de gel da 1a dimensão foi posicionada na parte

superior do gel SDS-PAGE. O vidro foi reposto na posição original e o gel submetido à corrida

eletroforética (4b).

3.4.4 Ensaio de troca de fita de DNA

Na reação de troca de fitas, o ssDNA ϕX174 circular (S

) e o dsDNA ϕX174

linear homólogo (S

) são recombinados para formar uma molécula de dsDNA circular

aberta (P) e uma molécula de ssDNA linear (Figura 2.6A). A proteína SSB facilita a

efetivação deste processo (Lavery & Kowalczykowski, 1992).

Os ensaios de troca de fitas de DNA foram realizados num sistema de 20μL

pré-incubando a proteína RecA (6,7 μmol/L) e ssDNA φX174 circular (22,6 μmol/L)

88 MATERIAIS E MÉTODOS

por 10 minutos a 37

C, na presença do tampão de recombinação e do sistema de

regeneração de ATP (5 mmol/L fosfocreatina e 10 U/mL fosfocreatina quinase). A

proteína SSB (2 μmol/L) e o ATP (3 mmol/L) foram então adicionados e o sistema

incubado por mais 6 minutos. Quando indicado, a proteína RecX foi adicionada às

reações nas concentrações indicadas e incubada por 6 minutos. A reação foi iniciada

com a adição de dsDNA φX174 linear (15,6 μmol/L). As reações foram incubadas por

30 ou 90 minutos. Para parar a reação, 5 μL de fenol equilibrado e 3 μL de SDS 10%

foram adicionados. As amostras foram submetidas à eletroforese por 5 horas a 3,6

V/cm em gel de agarose 0,8% em tampão TAE (1x). O gel foi corado com brometo de

etídeo e exposto à luz UV. As imagens foram registradas usando transiluminador EC

System - UVP BioImaging Systems (UVP, Inc. Upland, CA USA).

3.4.5 Ensaio de ligação do ATP

Como a ligação do ATP à RecA é temporária, pois sua hidrólise pode ocorrer

rapidamente, para a detecção da ligação do ATP no seu sítio, foi necessário utilizar um

método que induzisse a formação de uma ligação covalente entre o ATP e a proteína

(crosslinking). A irradiação do ATP com a luz UV gera intermediários reativos que

induzem a formação de ligações covalentes entre o ATP e a proteína se ambos

estiverem em contato. O ADP foi utilizado como competidor frio para confirmar a

especificidade da interação. Se a ligação proteína-ATP for específica, ADP frio em

excesso ocupará o sítio antes ocupado pelo ATP marcado, inibindo a formação da

ligação covalente proteína-ATP.

O sistema de reação (20 μL) contendo 5μL de tampão de ligação de ATP-

proteína, ssDNA ϕX174 circular (6,5 μmol/L), proteína RecAHis mutantes (L54Q ou

L54Q G73A) ou RecAHis (2,5 μmol/L), e/ou RecXHis (2,5 ou 10 μmol/L) e 37 kBq

de [α

P]ATP (111 TBq /mmol) foi depositado numa placa de vidro coberta por filme

plástico (Parafilm

) a qual foi mantida no gelo. Posteriormente as amostras foram

irradiadas durante 20 minutos com lâmpada UV (254 nm, 240 V, UVG-54, UVP, San

Gabriel, CA, USA) posicionada a uma distância de 3 cm das amostras. A reação foi

parada com a adição de tampão de amostra - SDS-PAGE e posterior aquecimento a

89 MATERIAIS E MÉTODOS

C por 3 minutos, e analisada por SDS-PAGE (12,5%). O gel foi corado com

solução azul de Coomassie, descorado, e deixado durante 12-24 horas em um

recipiente contendo grande volume de água (aproximadamente 1L), para remover todo

o [α

P]ATP não ligado à proteína. O gel então foi seco utilizando o sistema de

secagem de gel da BioRad, visualizado no phosphorimager FLA-5000 (Fuji Photo

Film Company, Tokyo, Japan) e a imagem foi analisada utilizando o programa de

densitometria AIDA (Raytest GmbH, Straubenhardt, Germany). Um cuidado

importante tomado foi o de expor as amostras à luz UV assim que o ATP marcado foi

adicionado. Antes da exposição à luz UV, todo o sistema foi mantido em banho de

gelo. Todos os ensaios foram realizados em duplicata, e em uma das amostras foi

adicionado ADP (4 mmol/L) ao sistema.

3.4.6 Ensaio de atividade ATPásica

O ensaio de atividade ATPásica dependente de DNA foi utilizado para

monitorar de forma indireta a ligação da proteína RecA ao DNA (Kowalczykowski,

1991). A reação de hidrólise de ATP foi realizada na presença de tampão ATPase, 44

μmol/L ou como mencionado de ssDNA ϕX174 circular (ou 10 μmol/L dsDNA

φX174 linear), 1,2 μmol/L ou como mencionado de RecAHis (ou RecAHis mutante

L54Q) e/ou 5 μmol/L ou como mencionado de RecXHis, 0,2 μmol/L de SSB e 0,4

mmol/L de ATP. O sistema de reação (20 μL) contendo 2 μL de tampão ATPase (10x)

e dois componentes (RecA e ssDNA, RecA e RecX, ou RecX e DNA) foi pré-

incubado por 10 minutos a 37

C antes da adição do terceiro componente juntamente

com SSB e ATP. Alternativamente, os três componentes (RecA, RecX e ssDNA)

foram pré-incubados conjuntamente por 10 minutos a 37

C, antes da adição de SSB e

ATP.

A quantificação das taxas de hidrólise de ATP foi iniciada após a adição do

ATP marcado, o qual foi preparado através da mistura de 1,1 MBq de [α

P] ATP (111

TBq/mmol), 50 μL de ATP frio (4 mmol/L) e 97 μL de água Milli-Q. As reações

foram paradas após diferentes tempos de incubação pela adição de 5 volumes de ácido

90 MATERIAIS E MÉTODOS

fórmico frio (2 mol/L) a cada amostra de reação, que foram mantidas em banho de

gelo. Alíquotas (1 ou 2 μL) de cada amostra foram aplicadas na placa de celulose

microcristalina ligada à polietilenoimina modificada (polyethilenimine-modified

microcrystaline cellulose, PEI) (J. T. Baker) preparada para cromatografia em camada

delgada (CCD), a aproximadamente 2 cm da base da placa. Após a secagem das

amostras à temperatura ambiente, a placa de CCD foi enrolada na forma de um tubo,

através da união de suas pontas com uma fita adesiva, e colocada num recipiente

contendo 200 mL de tampão de cromatografia coberto com filme plástico. Como a

cromatografia era ascendente, apenas 1,5 cm da placa de CCD foi coberto com o

tampão. Após duas horas de cromatografia, a placa foi seca à temperatura ambiente. A

quantificação do ATP e ADP presentes nas preparações foi feita normalmente após 12

horas de sensibilização utilizando o programa de densitometria AIDA (Raytest GmbH,

Straubenhardt, Germany) após captação da imagem no phosphorimager FLA-5000

(Fuji Photo Film Company, Tokyo, Japan). Os valores obtidos foram usados para

calcular a quantidade de ATP hidrolisado e a quantidade de ATP hidrolisado por mol

de RecA por unidade de tempo (turnover ou k

cat

91 MATERIAIS E MÉTODOS

A quantidade de ATP hidrolisado e turnover foram calculados utilizando as

fórmulas abaixo:

ATP hidrolisado (μmol/L)

Turnover (min

-1

)

Sendo:

ADP e ATP - percentagem de ADP e ATP detectada, respectivamente,

[ATP] - concentração de ATP adicionado a reação,

índice 0 - valores referentes ao controle negativo (sem proteína),

índice X - valores referentes à amostra testada,

[Prot.] - concentração da proteína testada quanto à atividade ATPásica na reação (em

μmol/L),

T - tempo de incubação (em minutos).

92 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fenótipo de sensibilidade a agentes mutagênicos apresentado pelo mutante

recX de H. seropedicae sugere que o produto do gene recX participa dos processos em

que a proteína RecA tem função primordial como o Reparo SOS (Galvão, 2001;

Galvão et al., 2003). Essa observação sugere que a proteína RecX de H. seropedicae

pode atuar em outros processos envolvendo a proteína RecA como, por exemplo, a

recombinação homóloga. Considerando que essas funções de RecA são críticas para a

sobrevivência da célula bacteriana, o entendimento de seus mecanismos e a

determinação do envolvimento das proteínas auxiliares e moduladoras destes

processos é um dos problemas mais interessantes da bioquímica e fisiologia de

microrganismos. Para contribuir para esse entendimento, neste trabalho as proteínas

RecA e RecX de H. seropedicae foram superexpressas em E. coli, purificadas e

caracterizadas bioquimicamente.

4.1 Clonagem, Expressão e Purificação da proteína RecA

4.1.1 Clonagem e Expressão da proteína RecA

Como detalhado nos materiais e métodos seção 3.2.8 foram obtidos diversos

plasmídeos codificando para a proteína RecAHis e RecA nativa de H. seropedicae. Os

plasmídeos (1) pAETWT-HMK, (2) pAET-HMK e (3) pAET-G73A foram utilizados

para a expressão da proteína (1) RecAHis selvagem, (2) RecAHis contendo a

substituição de um resíduo de leucina por glutamina na posição 54 (L54Q) e (3)

RecAHis contendo uma dupla substituição L54Q e G73A. O plasmídeo pCWG9 foi

utilizado para a expressão da proteína RecA nativa. Os plasmídeos pAETWT-HMK,

pAET-HMK, pAET-G73A ou pCWG9 foram introduzidos nas linhagens de E. coli

BL21(λDE3) pLysS ou B834(DE3) para a expressão das proteínas de interesse

(Tabela 3.6). Os mesmos plasmídeos foram também introduzidos na linhagem recA

BLR (λDE3), porém não foi observada a expressão das proteínas de interesse nas

diversas condições testadas (variados tempos de indução e concentrações de IPTG ou

lactose). Após a superexpressão de RecA a partir de qualquer uma das construções,

93 RESULTADOS E DISCUSSÃO

cerca de 75% da proteína de interesse apresentou-se na fração solúvel do extrato

celular.

4.1.2 Purificação da proteína RecA

4.1.2.1 Purificação da proteína RecA ligada à cauda de histidina

As proteínas RecAHis selvagem, RecAHis mutante L54Q e RecAHis mutante

L54Q G73A foram superexpressas em E. coli B834(DE3) contendo o plasmídeo

pAETWT-HMK, pAET-HMK ou pAET-G73A, respectivamente, após indução com

IPTG. Tanto a proteína RecA selvagem quanto as mutantes foram purificadas usando

coluna Hi-Trap-Chelating-Ni

(seção 3.3.3). Os rendimentos obtidos foram: 88 mg de

RecAHis por litro de cultura (pureza de 96-98%), 100 mg de RecAHis L54Q por litro

de cultura (pureza de 96-97%) e 180 mg de RecAHis L54Q G73A por litro de cultura

(pureza de 94-96%). As três frações com maior grau de pureza foram dialisadas

separadamente contra tampão A (Tabela 3.4) contendo glicerol 50%. Esse processo

permitiu o aumento da concentração das amostras (cerca de 10 mg/mL) sem a

formação de agregados. Após a diálise, a fração contendo as proteínas RecAHis,

RecAHis L54Q e RecAHis L54Q G73A nas purezas de 98%, 97% e 96%,

respectivamente (determinadas densitometricamente a partir de géis SDS-PAGE

corados com azul de Coomassie; Figura 4.1 A, B, C), foram utilizadas nos ensaios in

vitro.

94 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.1 - PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RecA E RecX DE Herbaspirillum

seropedicae.

As proteínas RecA e RecX foram purificadas como descrito na seção 3.3.3. O grau de pureza das

proteínas RecAHis (A), RecAHis L54Q (B), RecAHis L54Q G73A (C), RecA nativa (D), RecX nativa

(E) e RecXHis após (linha 1) e antes (linha 2) da clivagem do peptídeo N-terminal (F), foi

determinado após eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5% e coloração das proteínas com azul de

Coomassie. O marcador de massa molecular está indicado.

kDa

1 M

RecAHis

L54Q

kDa

1 M

RecAHis

L54Q

RecAHis

kDa

1 M

RecAHis

L54Q G73A

kDa

1 M

RecAHis

L54Q G73A

RecA

nativa

RecA

nativa

M 1

kDa

RecX nativa

M 1

kDa

RecX nativa

kDa

M 1 2

RecXHis

RecX nativa

kDa

M 1 2

RecXHis

RecX nativa

95 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1.2.2 Purificação da proteína RecA nativa

A proteína RecA nativa (39 kDa) foi expressa em E. coli BL21(λDE3)pLysS

contendo o plasmídeo pCWG9 após indução com IPTG. Para a purificação da proteína

RecA nativa, a fração sobrenadante obtida após o cultivo e lise das células foi

precipitada com polietilenoimina e com sulfato de amônio, como descrito na seção

3.3.3.2.1. A polietilenoimina é um polímero carregado positivamente que interage com

proteínas ácidas, como é o caso da RecA de H. seropedicae, e que interage com o

DNA, molécula na qual a RecA também se liga. Sendo assim, a adição de

polietilenoimina ao extrato celular levou à precipitação de RecA. A proteína RecA foi

solubilizada em 5% de saturação de sulfato de amônio em tampão R. O procedimento

de lavagem e dissolução em diferentes concentrações de sulfato de amônio promoveu

a eliminação de outras proteínas contaminantes. A adição de sulfato de amônio acima

de 50% de saturação precipitou a proteína RecA.

A proteína RecA de H. seropedicae apresenta um pI calculado de 4,97 e por

isto optou-se por utilizar a coluna trocadora de ânions fraca, a DEAE-Sepharose. A

análise das frações protéicas coletadas permitiu verificar que a proteína RecA eluiu

mais concentrada em aproximadamente 0,2 mol/L de NaCl. As frações eluídas com

tampão contendo concentrações superiores de NaCl apresentavam a proteína RecA já

diluída e ainda proteínas contaminantes. As frações eluídas próximas a 0,2 mol/L de

NaCl foram dialisadas e a de maior grau de pureza (94%) foi utilizada nos ensaios in

vitro (Figura 4.1D). A proteína RecA nativa presente nessa fração apresentou uma

concentração da 2,3 mg/mL. As colunas de Heparina-Sepharose CL-6 empacotada

(1,6x10cm, GE Helthcare) e gel filtração (Superose 6, GE Healthcare) foram utilizadas

como segunda etapa cromatográfica, mas não foi detectada melhoria da pureza da

RecA. A substituição da coluna DEAE-Sepharose pela coluna Q-Sepharose

empacotada (1,6x21 cm, GE Helthcare), Resource Q (1 mL, GE Healthcare) ou gel

filtração (Superose 6, GE Healthcare) produziram preparações de RecA mais diluídas

e de menor grau de pureza. Dessa forma, foi adotado como procedimento padrão de

purificação da proteína RecA nativa, a precipitação com polietilenoimina e sulfato de

amônio, seguida de cromatografia em coluna DEAE- Sepharose.

96 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.2 Clonagem, Expressão, Purificação e Cristalização da proteína RecX de

Herbaspirillum seropedicae

4.2.1 Clonagem e Expressão da proteína RecX

Os plasmídeos pCWG3 e pXT7 foram utilizados para a expressão da proteína

RecXHis e RecX nativa, respectivamente (Tabela 3.6). Cerca de 75% das proteínas

RecXHis e RecX nativa estavam presentes na fração solúvel do extrato celular.

4.2.2 Purificação e Cristalização da proteína RecX

Para determinar as condições ideais de purificação da proteína RecX foram

testadas diversas condições de purificação variando-se tampões, pHs e a concentração

de sal. Os tampões que permitiram a obtenção da proteína RecX solúvel em maior

concentração (concentração 2 vezes maior do que nas demais condições testadas)

foram o A

para a purificação, o tampão A contendo glicerol 50% para a diálise e

posterior armazenamento da proteína a -80

C e o tampão A contendo glicerol 5%, para

os ensaios de cristalização.

Ao dialisar a fração eluída da coluna Hi-Trap chelating Ni

em tampão A

contra o tampão A contendo glicerol 50%, a concentração da proteína dobrou e a

concentração de sal diminuiu cerca de 1 décimo da original. Tais mudanças resultaram

na agregação da proteína RecXHis. Quando as preparações dialisadas continham cerca

de 20 mg/mL da proteína RecXHis em tampão A

ocorreu a precipitação de mais de

90% da proteína. Concentrações de aproximadamente 3 mg/mL resultaram numa

perda menor (30%). Para evitar a precipitação, NaCl (500 mmol/L) foi adicionado ao

tampão de diálise. Entretanto essa medida foi empregada com cautela uma vez que

poderia interferir nos ensaios de atividade dessa proteína, já que a proteína RecA é

sensível a íons monovalentes (Weinstock et al., 1981; McEntee et al., 1981; Zaitsev &

Kowalczykowski, 1998). Weinstock et al. (1981) mostraram que a formação de

complexos entre a RecA de E. coli (EcRecA) e o DNA dupla-fita (dsDNA) na

presença de ATPγS é extremamente sensível à concentração de íons monovalentes.

McEntee et al. (1981) também mostraram que KCl na concentração de 120 mmol/L

inibe a atividade de ligação ao dsDNA e a atividade ATPásica da proteína EcRecA na

97 RESULTADOS E DISCUSSÃO

presença de dsDNA. Para inibição da ligação ao DNA simples-fita (ssDNA) e da

atividade ATPásica da EcRecA na presença de ssDNA, a concentração de KCl

necessária foi de 300 e 450 mmol/L, respectivamente (McEntee et al., 1981). Além

disso, Zaitsev & Kowalczykowski (1998) mostraram que a atividade ATPásica de

EcRecA diminui com o aumento da concentração de NaCl: na concentração de 500

mmol/L a proteína apresentou apenas 20% de sua atividade.

Paralelamente aos testes para determinação das condições de purificação e

diálise, o operon nativo recArecX foi clonado no vetor pET28a, produzindo o

plasmídeo pAX (Tabela 3.6). Esperava-se que a superexpressão de ambas as proteínas

coordenadamente favorecesse a solubilidade de RecX, como já foi verificado para

outras proteínas (Martin Buck, comunicação pessoal). Células B834(DE3) contendo o

plasmídeo pAX superexpressaram apenas a proteína RecA, indicando que a seqüência

atenuadora presente entre os gene recA e recX reduz substancialmente a expressão da

proteína RecX. Diante dessa limitação, essa estratégia foi abandonada.

4.2.2.1 Purificação da RecX ligada à cauda de histidina

A purificação em larga escala da proteína RecXHis (21 kDa) utilizando coluna

Hi-Trap-Chelating-Ni

(seção 3.3.3.1.1) resultou em 20-130 mg de proteína por litro

de cultura (pureza de 95-97%). As três frações mais puras foram dialisadas

separadamente contra tampão A contendo glicerol 50%. Ao longo das purificações,

foram obtidas frações contendo a proteína RecXHis solúvel na concentração de até 30

mg/mL, que foram diluídas antes da diálise para evitar precipitação. A fração que

apresentou maior grau de pureza (97%) foi usada nos ensaios in vitro (Figura 4.1F,

linha 2). A identidade da proteína RecXHis expressa e purificada foi confirmada por

análises de MALDI-TOF de produtos de digestão tríptica. Essa análise foi realizada

pela GE Healthcare do Brasil.

98 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.2.2.2 RecX nativa

A proteína RecX nativa foi purificada por cromatografia em coluna SP-

sepharose. Alternativamente, a proteína RecXHis foi tratada com trombina para

hidrólise do peptídeo N-terminal contendo a cauda His da proteína.

4.2.2.2.1 Purificação da proteína RecX nativa em coluna SP Sepharose

Células de E. coli BL21(λDE3)pLysS contendo o plasmídeo pXT7-7 foram

induzidas com IPTG e expressaram uma proteína de aproximadamente 17,8 kDa,

correspondente à proteína RecX nativa. Uma vez que o pI calculado da proteína RecX

de H. seropedicae foi de 10,1, a coluna SP-Sepharose foi utilizada para a sua

purificação. A análise das frações protéicas coletadas permitiu verificar que a proteína

RecX começou a ser eluída em 0,4 mol/L de NaCl, juntamente com proteínas

contaminantes e eluiu de forma mais concentrada e com menor grau de contaminação

a partir de 0,5 mol/L até 0,6 mol/L de NaCl. Foram obtidos 80 mg de proteína num

grau de pureza acima de 90% por litro de cultura. Para evitar a precipitação da proteína

RecX durante a diálise foi necessário diluir as amostras até a concentração próxima de

1 mg/mL. Mesmo após a diálise contra glicerol 50% a concentração máxima obtida de

RecX foi de 1 mg/mL. A preparação que apresentou maior grau de pureza (94%;

Figura 4.1E) foi utilizada nos ensaios in vitro descritos a seguir. Cromatografia em

Heparina-Sepharose foi utilizada como segunda etapa cromatográfica, mas não houve

melhoria da pureza.

4.2.2.2.2 Clivagem do peptídeo N-terminal contendo a cauda His da proteína

RecXHis

Dez miligramas da proteína RecXHis com grau de pureza de 97% foram

utilizados no tratamento com trombina biotinilada. A trombina foi utilizada para clivar

o peptídeo N-terminal da RecXHis, e conseqüentemente obter a proteína na sua forma

nativa para ensaios de cristalização posteriores. As condições de clivagem utilizadas

estão descritas na seção 3.3.4. A proteína RecXHis foi adicionada ao sistema de reação

99 RESULTADOS E DISCUSSÃO

na concentração de 20 mg/mL. Durante a clivagem foram detectados agregados

protéicos; a formação do agregado protéico aumentou durante a diálise contra tampão

A contendo glicerol 5%. Ao se aumentar a concentração de NaCl para 0,5 mol/L

houve a resolubilização da proteína, porém a proteína RecX não cristalizou. Desta

forma, nos ensaios de cristalização, foi utilizada a fração da proteína RecX que se

manteve solúvel após a diálise do sistema de reação RecXHis (20mg/mL)+trombina

contra o tampão A contendo glicerol 5%, ou ainda, a fração obtida após a diluição da

amostra (até a RecX atingir a concentração de aproximadamente 3 mg/mL) e sua

posterior diálise contra o mesmo tampão. Essa última estratégia permitiu a obtenção da

proteína RecX nativa apenas na forma solúvel. Ambas as estratégias geraram amostras

protéicas na concentração máxima de 3 mg/mL. As colunas Microcon YM10

(Centrifugal Filter Units - Millipore) foram utilizadas, então, para concentrar a

proteína. Durante o processo de centrifugação não houve a formação de nenhum

floculado, indicando que não estava ocorrendo agregação protéica. Entretanto, ao

determinar a concentração de proteína, verificou-se que esta não não havia aumentado

provavelmente devido à adsorção da RecX na membrana. Outras proteínas apresentam

o mesmo comportamento (Siva R. Wigneshweraraj, comunicação pessoal). Os ensaios

de cristalização foram conduzidos com preparações contendo 3 mg/mL de RecX, valor

máximo obtido sem a formação de precipitados (Figura 4.1F, linha 1).

4.2.2.3 Cristalização da proteína RecX

A proteína RecX nativa foi submetida a diversas condições de cristalização

utilizando a metodologia da gota sentada e da gota suspensa (seção 3.3.8). Os cristais

obtidos variaram em forma e tamanho, além disso foram obtidos como cristais simples

ou agrupados. Como controle negativo, as soluções do reservatório foram misturadas

somente com o tampão de diluição da proteína (tampão A contendo glicerol 5%).

Nessa condição, nenhum cristal foi visualizado após 2 meses de incubação. Para

determinar a resolução, cinco cristais, do tipo agrupado ou simples, foram analisados

quanto à capacidade de difratar raios X. Os espectros de raios X revelaram sinais

fortes, distantes entre si e presentes apenas na área de alta resolução. Tais

características são indicativas de um cristal de um composto iônico pequeno, já que o

100 RESULTADOS E DISCUSSÃO

mesmo apresenta uma unidade celular pequena e ordenada. A extensão do tempo de

exposição do cristal não alterou o padrão de difração. Os cristais foram também

analisados quanto à dureza e resistência à quebra, utilizando MicroTools (Hampton

Research) e também quanto à capacidade de englobar azul de metileno (Izit dye –

Hampton Research). Alguns dos cristais apresentaram características de cristais de

proteína.

A alta tendência à precipitação apresentada pela proteína RecX limitou a

concentração de proteína utilizada nos ensaios de cristalização, mas ao mesmo tempo

sugere a tendência à agregação protéica. O desafio é identificar a condição em que a

agregação protéica ocorra de maneira ordenada. Até o momento não foi descrita a

obtenção de nenhum cristal da proteína RecX. O único modelo estrutural de RecX

reportado foi produzido in silico utilizando o programa MODELLER e resultados de

dicroísmo circular (Mishra et al., 2003)

4.3 Ensaios in vitro

As proteínas RecA nativa, RecAHis, RecAHis L54Q, RecAHis L54Q G73A

RecXHis e RecX nativa foram purificadas com grau de pureza de 94-98% e em

concentração adequada para a determinação das suas atividades in vitro. As proteínas

RecAHis, RecXHis, RecAHis L54Q e RecAHis L54Q G73A foram ensaiadas quanto

às atividades de ligação ao DNA, ligação ao ATP, troca de fitas de DNA e hidrólise de

ATP. Além disso, as proteínas RecAHis, RecA nativa, RecXHis e RecX nativa foram

utilizadas nos ensaios de interação RecA-RecX. A concentração molar das proteínas

foi calculada considerando-as na forma monomérica.

101 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.1 Determinação da interação entre as proteínas RecA e RecX de H.

seropedicae

Como o gene recX de H. seropedicae encontra-se no mesmo operon do gene

recA (Galvão, 2001; Galvão et al., 2003), as proteínas RecX e RecA recém

sintetizadas devem estar próximas favorecendo uma possível interação entre RecA e

RecX. A interação das proteínas RecA e RecX foi determinada através de ensaios de

imobilização em resina de sepharose ligada a íons Ni

e eletroforese bidimensional.

Para a determinação da interação RecA-RecX pelo método de imobilização de

proteína em resina de sepharose ligada a íons Ni

(sepharose-Ni

) foram utilizadas as

proteínas RecA e RecX com a cauda His e nas suas formas nativas. No ensaio

apresentado na Figura 4.2 utilizou-se a proteína RecXHis purificada adsorvida a resina

sepharose-Ni

e a proteína RecA na sua forma nativa. Após a imobilização da

proteína RecXHis na resina sepharose-Ni

, a proteína RecA nativa foi adicionada

(3.4.3.1). Em seguida, foi feita a lavagem da resina com tampão A contendo glicerol

5%, e a eluição da proteína RecXHis adsorvida à resina através da adição do mesmo

tampão contendo 0,5 mol/L de imidazol. Se existisse interação entre RecX e RecA, as

duas proteínas seriam eluídas nas mesmas frações. A eluição de RecXHis e RecA

nativa após adição de imidazol 0,5 mol/L indicou a associação entre as duas proteínas

(Figura 4.2A, linha 3). Um ensaio controle utilizando somente a resina sepharose-Ni

mostrou que a proteína RecA nativa não é adsorvida (Figura 4.2B, linhas 5 e 6). A

presença de ATP no sistema de reação contendo as duas proteínas não modificou a

resposta, indicando que ATP não é importante para a interação entre as duas proteínas

(Figura 4.2A, linha 4). Quando ssDNA 40 mers (80 nmol/L) foi adicionado juntamente

com a proteína RecA nativa ao sistema contendo a proteína RecXHis imobilizada, não

houve a formação do complexo RecA-RecX (Figura 4.2A, linha 5). Esse resultado

sugere que a presença de ssDNA interfere na interação entre RecA e RecX, talvez

porque a proteína RecA ao interagir com o ssDNA seja incapaz de interagir com RecX

ou porque RecX ao interagir com o ssDNA torne-se incapaz de interagir com a RecA

apesar da baixa concentração de DNA presente: a razão RecX:DNA nesse ensaio foi

de 100:1 e RecA:DNA, 50:1. Em ambas as hipóteses a interação proteína-DNA deve

ser mais forte que a interação proteína-proteína.

102 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Experimentos semelhantes foram realizados adsorvendo a proteína RecAHis

na resina sepharose ligada a íons Ni

e adicionando a proteína RecX nativa, obtendo-

se os mesmos resultados (dados não mostrados). Como controles negativos, a proteína

RecA nativa foi testada quanto à capacidade de ligar-se a outra proteína com a cauda

His, mas não relacionada com a resposta SOS. A proteína utilizada foi a DraGHis de

Azospirillum brasilense, envolvida no controle pós-traducional da nitrogenase (Ludden

& Roberts, 1989). Não houve interação entre as duas proteínas (Figura 4.2B, linhas 1-

4).

A interação das proteínas RecA e RecX também foi observada por eletroforese

em duas dimensões. A primeira dimensão, desenvolvida em condições nativas, foi

realizada em (1) gel de poliacrilamida 4% como descrito por Laemmli (1970) mas sem

a adição de SDS, (2) gel de poliacrilamida 4,5% Tris-glicina, (3) gel de agarose 3%,

ou (4) gel de agarose 0,5%.

Quando o gel de poliacrilamida em condições nativas foi utilizado e as

proteínas reveladas com corante azul de Coomassie, não foi visualizada nenhuma

banda correspondente à proteína RecX. Possivelmente devido ao seu alto pI

(aproximadamente 10,1), a proteína RecX seja incapaz de migrar para o pólo positivo

do gel. Nem a adição do análogo de ATP, o ADP-AlF

, e/ou ssDNA modificaram esse

perfil. A proteína RecA, nessas condições, não migrou, possivelmente devido à

formação de um agregado macromolecular, o filamento de RecA. Diante dessa

limitação, a eletroforese em gel de agarose foi adotada na primeira dimensão .

Utilizando gel de agarose 3% em tampão TAE 1x (pH 8,0) para a primeira

dimensão, observou-se que a proteína RecX permanece próxima ao poço de aplicação

(Figura 4.3A, linha 1), enquanto a proteína RecA purificada apresenta migração: forma

uma banda mais difusa se comparada a de RecX (Figura 4.3A linha 2). Quando as

duas proteínas foram incubadas juntas e então submetidas à eletroforese em gel de

agarose 3%, a banda correspondente a RecX diminuiu de intensidade, indicando uma

possível interação entre as duas proteínas.

103 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.2 - INTERAÇÃO RecA-RecX DE H. seropedicae DEMONSTRADA ATRAVÉS DE

IMOBILIZAÇÃO EM RESINA DE SEPHAROSE-Ni

RecXHis

KDa

RecA

1 2 3 4 5

RecA

DraGHis

1 2 3 4 5 6

RecXHis

KDa

RecA

1 2 3 4 5

RecA

DraGHis

1 2 3 4 5 6

(A) A proteína RecXHis (8 μmol/L) foi em primeiro lugar adsorvida em resina sepharose-Ni

posteriormente a resina foi incubada na presença de RecA nativa (4 μmol/L). (B) Como controles, a

proteína DraGHis (4 μmol/L) foi em primeiro lugar adsorvida em resina sepharose-Ni

posteriormente a resina foi incubada na presença de RecA nativa (4 μmol/L) ou a proteína RecA

nativa (4 μmol/L) foi incubada diretamente com a resina. As amostras coletadas durante o ensaio

foram analisadas por SDS-PAGE 12,5% após coloração com azul de Coomassie. (A) Linha 1:

marcador de massa molecular; linha 2: RecA nativa (4,2 μg) e RecXHis (4,2 μg); linha 3: fração

eluída do sistema RecXHis-sepharose-Ni

após incubação com RecA nativa e adição de imidazol ;

linha 4: como na linha 3, mas na presença de 1 mmol/L de ATP; linha 5: como na linha 3, mas na

presença de 88 nmol/L de ssDNA (40 mers). (B) Linha 1: DraGHis (4,2 μg) e RecA nativa (4,2 μg);

linha 2: fração eluída após a incubação de DraGHis com a resina sepharose-Ni

; linha 3: fração eluída

após a adição de RecA nativa ao sistema DraGHis-sepharose-Ni

; linha 4: fração eluída do sistema

DraGHis-sepharose-Ni

após incubação com RecA nativa e adição de imidazol; linha 5: RecA nativa

(4,2 μg); linha 6: fração eluída do sistema contendo resina sepharose-Ni

e RecA nativa, após a adição

de imidazol.

104 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para confirmar a presença de um complexo co-migrando na altura da banda

de RecA, a linha do gel foi recortada e a faixa central com 1 mm de espessura e com

maior concentração das proteínas foi incubada com SDS e β-mercaptoetanol durante

15 minutos, posicionada sobre um gel SDS-PAGE 12,5% preparado sem o gel de

empilhamento ou pente com poços e submetida à eletroforese na segunda dimensão

(seção 3.4.3.2). Após a revelação do gel com azul de Coomassie foi observado que as

proteínas RecA e RecX encontravam-se alinhadas verticalmente (Figura 4.3B),

indicando que as proteínas migraram juntas na eletroforese realizada em condições

nativas. As amostras contendo apenas a proteína RecA ou RecX foram submetidas ao

mesmo procedimento para confirmar a posição das proteínas na 2ª dimensão.

Uma vez confirmada a interação RecA-RecX por eletroforese bidimensional

em gel de agarose 3% e SDS-PAGE 12,5%, uma variante metodológica dessa técnica

foi testada para aprimorar e facilitar o ensaio. O gel de agarose 3% da primeira

dimensão foi substituído pelo gel de agarose 0,5%, já que nessa concentração seria

possível fundir as amostras (regiões de interesse do gel seccionadas após a

eletroforese) e posteriormente analisar o conteúdo protéico por eletroforese

desnaturante.

Após a realização da primeira dimensão em gel de agarose 0,5%, as linhas do

gel foram isoladas e fatiadas transversalmente. As frações do gel foram identificadas

por um número (1-4) e uma letra (a-c), de acordo com a sua posição vertical e

horizontal, respectivamente, como esquematizado na figura 4.4A. A utilização de

solução de azul de Coomassie (Tabela 3.3) para corar o gel de agarose após a corrida

eletroforética, além de permitir a visualização das proteínas no gel ainda delimitou a

área de corte dos cubos de agarose submetidos posteriormente à segunda dimensão.

105 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.3 - DEMONSTRAÇÃO DA INTERAÇÃO RecA-RecX DE H. seropedicae

ATRAVÉS DE ELETROFORESE BIDIMENSIONAL - I

1 2 3

RecX

RecA

RecX + - +

RecA - + +

As proteínas RecAHis e RecXHis foram incubadas conforme descrito na seção 3.4.3.2 e analisadas

por eletroforese bidimensional. (A) Primeira dimensão: eletroforese em gel de agarose 3% em tampão

TAE pH8,0. A linha 1 contém apenas a proteína RecX (23 μmol/L); a linha 2, a proteína RecA (7

μmol/L) e a linha 3, as proteínas RecA (4 μmol/L) e RecX (8 μmol/L). (+) indica presença e (-)

ausência das proteínas indicadas. Após eletroforese, a linha 3 foi recortada (1 mm de espessura) e

submetida à eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5% (segunda dimensão) (B). As posições das

proteínas RecA e RecX estão indicadas. As proteínas foram coradas com azul de Coomassie.

106 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.4 - DEMONSTRAÇÃO DA INTERAÇÃO RecA-RecX DE H. seropedicae

ATRAVÉS DE ELETROFORESE BIDIMENSIONAL - II

1 2 3 4 5 6 7 8 9

RecX

RecA

C 1c 1a 1b 2b 2c 2a 3b 4c

1 2 3 4

RecX

RecA

++-+

+++-

-+++

++-+

+++-

-+++

Azul de Coomassie

As proteínas RecAHis e RecXHis conforme descrito na seção 3.4.3.2 e analisadas por eletroforese

bidimensional. (A) Ilustração da primeira dimensão: eletroforese em gel de agarose 0,5% em tampão

TAE pH8,0. A linha 1 contém as proteínas RecA (4 μmol/L) e RecX (8 μmol/L); a linha 2, como na

linha 1, mas na presença de azul de Coomassie G250 0,26% e as linhas 3 e 4 contém a proteína RecA

(7 μmol/L) e RecX (23 μmol/L), respectivamente, ambas na presença de azul de Coomassie G250

0,26%. (+) indica presença e (-) ausência das proteínas indicadas. Após eletroforese, o gel foi fatiado

como ilustrado em A e as regiões indicadas foram analisadas quanto ao seu conteúdo protéico por

eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5% (segunda dimensão) (B). A linha 1 contém a proteína RecAHis

(4,2 μg) e RecXHis (4,2 μg) purificadas e nas linhas 2-9, as amostras indicadas (numeração feita de

acordo com a ilustração no painel A). As posições das proteínas RecA e RecX estão indicadas. As

proteínas foram coradas com azul de Coomassie.

107 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após a corrida eletroforética em gel SDS-PAGE, foi possível visualizar a

presença das proteínas RecA e RecX num mesmo cubo de agarose (Figura 4.4B, linha

4), indicando a co-migração das proteínas. A posição de migração do complexo RecA-

RecX não foi coincidente com a posição de migração das proteínas RecA e RecX

quando estas foram submetidas à eletroforese isoladamente, indicando que a co-

migração das proteínas foi devido à interação entre elas e não devido à coincidência

dos perfis de migração.

Schägger & Von Jagow (1991) descreveram uma metodologia de eletroforese

nativa onde foi adicionado à amostra protéica azul de Coomassie G250. Esta molécula

se liga à proteína, conferindo a ela carga negativa. Assim, foi adicionado 0,26% (p/v)

de azul Coomassie G250 ao sistema de reação contendo as proteínas antes da

eletroforese em gel de agarose 0,5%. A presença do corante nos sistemas de reação

permitiu o monitoramento da migração das proteínas durante a eletroforese em gel de

agarose 0,5%. Entretanto, após a excisão das regiões de interesse do gel da primeira

dimensão e a análise por SDS-PAGE, não foi observada a co-migração das proteínas

RecA e RecX quando o azul de Coomassie G250 foi adicionado ao sistema (Figura

4.4B, linha 5). Esses resultados contrastam com os resultados obtidos na ausência de

azul de Coomassie G250, onde foi verificada a co-migração das proteínas RecA e

RecX (Figura 4.4B, linha 4).

A inibição da formação do complexo RecA-RecX na presença de azul de

Coomassie sugere que a interação entre as proteínas RecA e RecX é mediada por

interações iônicas. A ligação do azul de Coomassie G250 às proteínas aparentemente

induziu uma mudança das suas cargas inibindo a interação entre elas. Não se pode

descartar a interferência física da molécula de azul de Coomassie no sistema, além da

gerada devido a sua carga.

Todas as proteínas RecX identificadas apresentam alta proporção de resíduos

básicos (Sano, 1993; Pàges et al., 2003) enquanto as proteínas RecA apresentam alta

proporção de resíduos ácidos no domínio C-terminal (Roca & Cox, 1997), que se

encontra voltado para fora do filamento de RecA (Story et al., 1992). Essas

observações sugerem que a interação entre as proteínas RecA e RecX envolve

interações iônicas.

108 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A deleção de 17 aminoácidos da região C-terminal da proteína RecA de E. coli

ou a substituição do resíduo de glutamato (-) na posição 343 por lisina (+) (resíduo

presente na região C-terminal) reduz a capacidade de interação entre as proteínas

RecA e RecX, indicando o envolvimento de interações iônicas na formação do

complexo (Drees et al., 2004b). O azul de Coomassie G250 parece competir com

RecA pelas cargas positivas de RecX.

Os resultados mostrados confirmam que as proteínas RecA e RecX de H.

seropedicae interagem formando um complexo protéico. Este resultado é semelhante

ao reportado para as proteínas RecA e RecX de E. coli e M. tuberculosis (Stohl et al.,

2003; Venkatesh et al., 2002).

4.3.2 Atividade de ligação das proteínas RecX e RecA ao DNA

Para determinar a capacidade de ligação das proteínas RecX e RecA de H.

seropedicae ao DNA, foram realizados ensaios de retardamento de migração de banda

de DNA. As proteínas RecAHis e RecXHis foram ensaiadas em presença de ssDNA

de 88 mers ou dsDNA de 88 pb marcados com [

P]. Nesses ensaios, a interação

proteína-DNA foi determinada através de eletroforese em gel de poliacrilamida e

revelação em PhosphorImager e foi quantificada através da densitometria das bandas

de DNA (seção 3.4.1.1). Além disso, a capacidade da proteína RecXHis de ligar-se ao

DNA foi determinada utilizando o plasmídeo pTZ19R circular ou linear (2.871 pb) ou

ainda na forma de ssDNA circular (2.871 mers). Nesse ensaio, a interação proteína-

DNA foi determinada através de eletroforese em gel de agarose corado com brometo

de etídio (seção 3.4.1.2).

4.3.2.1 Atividade de ligação ao DNA da proteína RecA

A proteína RecA de H, seropedicae (HsRecA) foi capaz de ligar tanto ssDNA

quanto dsDNA, embora tenha apresentado maior afinidade de ligação ao ssDNA

(Figura 4.5). O complexo proteína-ssDNA começou a ser visualizado com 0,25

μmol/L de proteína, enquanto na presença de dsDNA o complexo começa a ser

109 RESULTADOS E DISCUSSÃO

observado em 5 μmol/L de RecA (Figura 4.5A e B). Na presença de 10 μmol/L de

RecA, cerca de 80% do dsDNA permaneceu livre, enquanto que cerca de 70% do

ssDNA foi complexado (Figura 4.5C). A proteína RecA foi requerida na concentração

de 2 μmol/L para retardar 50% do ssDNA.

A proteína RecA de E. coli (EcRecA) foi capaz de ligar-se ao ssDNA, mas não

ao dsDNA, na ausência de ATP ou análogos de ATP (McEntee et al., 1981). O

complexo EcRecA-dsDNA foi visualizado na ausência de ATP ou análogos somente

em condições de pH abaixo de 6,0 (McEntee et al., 1981). A proteína RecA de H.

seropedicae, por outro lado, foi capaz de ligar-se ao dsDNA na ausência de ATP ou

análogos de ATP em pH7,5.

A proteína HsRecA formou um complexo macromolecular com o ssDNA ou

dsDNA que se manteve no poço do gel. Mesmo com a diminuição da concentração do

gel de poliacrilamida para 4%, esse complexo não migrou. Os complexos de alta

massa molecular provavelmente são resultado da formação do filamento de RecA no

ssDNA ou dsDNA em pH 7,5. Nessa condição ocorre nucleação lenta e extensão

rápida do monômero da RecA de E. coli no ssDNA (Cox, 2003). Os filamentos

formados apresentam alta massa molecular já que a cada três nucleotídeos ou pares de

bases, há a ligação de uma molécula de RecA (Figura 2.3). Um complexo EcRecA-

ssDNA estável que permanece no poço do gel de poliacrilamida foi observado

previamente (Lusetti et al., 2004a).

110 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.5 - ENSAIO DE RETARDAMENTO DE MIGRAÇÃO DE DNA DE BAIXA

MASSA MOLECULAR NA PRESENÇA DA PROTEÍNA RecA DE H. seropedicae

RecA (μmol/L)

0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 10

dsDNA livre

Complexo dsDNA-RecA

ssDNA livre

Complexo ssDNA-RecA

012345 91011

100

Complexo DNA-proteína (%)

[RecA] (μmol/L)

RecA + [

P]ssDNA

RecA + [

P]dsDNA

RecA (μmol/L)

0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 10

RecA (μmol/L)

0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 10

dsDNA livre

Complexo dsDNA-RecA

ssDNA livre

Complexo ssDNA-RecA

012345 91011

100

Complexo DNA-proteína (%)

[RecA] (μmol/L)

RecA + [

P]ssDNA

RecA + [

P]dsDNA

Retardamento de migração de DNA determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida em

condição nativa (4,5%, a 60V por 80 min) conforme descrito na seção 3.4.1.1. A proteína RecAHis de

H. seropedicae (nas concentrações indicadas) foi incubada na presença de 1,1 μmol/L de [

P]-dsDNA

88 pb (A) ou 1,8 μmol/L de [

P]-ssDNA 88 mers (B). Os géis foram secos e o material radioativo

detectado em PhosphorImager. (C) Análise densitométrica de A e B. A figura mostra um resultado

representativo.

111 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.2.2 Atividade de ligação ao DNA da proteína RecX

A mutação no gene recX de H. seropedicae causou uma maior sensibilidade

desse microrganismo à luz UV e ao metanosulfonato de metila, sugerindo que a função

de RecA foi afetada (Galvão, 2001; Galvão et al., 2003). Em outros microrganismos,

tanto a mutação quanto a superexpressão de recX aparentemente modificaram a

atividade de RecA (Sano, 1993; Papavinasasundaram et al., 1998; Vierling et al.,

2000; Sukchawalit et al., 2001; Stohl & Seifert, 2001; Stohl et al., 2002; 2003). A

ligação da proteína RecA de E. coli ao ssDNA formando o filamento de RecA é

essencial para a função de RecA na recombinação homóloga, na resposta SOS e na

mutagênese SOS (Schlancher et al., 2005). Assim, um possível mecanismo de atuação

de RecX poderia envolver ligação ao DNA, alterando a estrutura do filamento de

RecA. A alta proporção de resíduos básicos (principalmente arginina), sugestiva de

uma possível interação de RecX com DNA, suporta essa idéia. Além disso,

recentemente, a modelagem in silico de RecX de E. coli (EcRecX) sugere a presença

de um motivo de ligação ao DNA do tipo hélice-volta-hélice (Mishra et al., 2003).

A capacidade da proteína RecX de H. seropedicae (HsRecX) de se ligar a

diferentes tipos de DNA foi investigada inicialmente utilizando DNA não marcado e

de alta massa molecular (seção 3.4.1.2). Os resultados utilizando o plasmídeo pTZ19R

(2.871 pb) são apresentados na Figura 4.6, e mostram RecX formando um complexo

de baixa mobilidade com dsDNA ou ssDNA. Aparentemente existe uma diferença de

afinidade de ligação dependendo do tipo da molécula de DNA. No caso de moléculas

de DNA dupla fita (circular ou linear), a formação do complexo foi observada em

concentrações de RecX a partir de 0,5 μmol/L (Figura 4.6A e B). Entretanto, quando

DNA simples-fita foi utilizado, o retardamento da migração só foi observado em

concentrações superiores a 1 μmol/L (Figura 4.6C). Como controle, o ensaio foi

repetido substituindo a proteína RecX por BSA, e nenhuma alteração na mobilidade do

DNA foi observada (Figura 4.6E) indicando que o efeito observado foi devido à

ligação de RecX às diversas formas de DNA.

112 RESULTADOS E DISCUSSÃO

0 0,2 0,5 1 2 5 7

RecX (μmol/L)

1 2 3 4 5 6 7

0 0,2 0,5 1 2 5 7

RecX (μmol/L)

1 2 3 4 5 6 7

0 0,5 1 2 5 7

BSA (μmol/L)

1 2 3 4 5 6 7

0 0,5 1 2 5 7

BSA (μmol/L)

1 2 3 4 5 6 7

FIGURA 4.6 - ENSAIO DE RETARDAMENTO DE MIGRAÇÃO DE DNA DE ALTA MASSA

MOLECULAR PELA PRESENÇA DA PROTEÍNA RecX DE H. seropedicae

Retardamento de migração de DNA determinado por eletroforese em gel de agarose 0,5%, em tampão

TAE pH8,0, corado com brometo de etídio (seção 3.4.1.2). A proteína RecXHis de H. seropedicae

(nas concentrações indicadas) foi incubada na presença de 20 μmol/L de pTZ19R dsDNA circular (A),

8 μmol/L de pTZ19R dsDNA linear (B), 450 μmol/L de pTZ19R ssDNA circular (C) ou 20 μmol/L de

pTZ19R dsDNA circular e 12 mmol/L de MgCl

(D). RecX foi substituído por BSA nas mesmas

condições do ensaio na presença de 8 μmol/L de pTZ19R dsDNA linear (E). Em (A) e (D), linha 1, as

bandas presentes correspondem aos concatâmeros do vetor pTZ19R e em (C), linha 1, as bandas

correspondem ao ssDNA circular do fago M13K07 (∼8,7 kb) e ao ssDNA circular do vetor pTZ19R

(∼2,9 kb) .

113 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A atividade de ligação ao DNA parece ser controlada negativamente por

cátions divalentes uma vez que a substituição de EDTA por MgCl

(12 mmol/L) na

mistura de reação diminuiu a afinidade aparente de RecX pelo DNA (Figura 4.6D). É

possível que a ligação de íons magnésio pelos grupos fosfatos do DNA interfira

negativamente na ligação de RecX ao DNA. Estes resultados são consistentes com o

fato de que a proteína RecX apresenta um alto pI (aproximadamente 10,1), o que

sugere que a interação entre RecX e o DNA seja mediada pelos fosfatos do DNA e os

resíduos positivamente carregados da proteína RecX. Drees et al. (2004b) mostraram

que altas concentrações de Mg

favorecem a interação RecA-RecX de E. coli. Estas

evidências sugerem que os íons Mg

favorecem a interação de RecX com RecA

desfavorecendo a ligação RecX com o DNA.

Para uma análise mais detalhada, ensaios de retardamento de migração

eletroforética foram realizados utilizando como DNA alvo os polinucleotídeos ssDNA

(88 mers) ou dsDNA (88 bp) marcados com [

P] (3.4.1.1). Semelhante ao resultado

anterior, a proteína RecX foi capaz de ligar tanto ssDNA como dsDNA (Figura 4.7). A

quantidade mínima de RecX necessária para a visualização da formação do complexo

de migração retardada RecX-dsDNA foi de 0,25 μmol/L, e para a visualização do

complexo RecX-ssDNA, 2 μmol/L (Figura 4.7A e B, respectivamente). A diferença de

afinidade entre dsDNA e ssDNA ficou ainda mais evidente em concentrações

superiores de RecX: na concentração de 10 μmol/L de RecX, 40% do ssDNA e apenas

8% do dsDNA foram encontrados na forma livre (Figura 4.7C).

Estes resultados mostram que independentemente da massa molecular do

DNA alvo, a proteína RecX é capaz de se ligar mais eficientemente ao dsDNA do que

ao ssDNA (Figuras 4.6 e 4.7). A proteína RecA, por outro lado, apresentou maior

afinidade pelo ssDNA (Figura 4.5C). As concentrações de RecX necessárias para

retardar 50% do dsDNA e ssDNA foram 1,5 μmol/L e 4,2 μmol/L, respectivamente.

114 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.7 - ENSAIO DE RETARDAMENTO DE MIGRAÇÃO DE DNA DE BAIXA

MASSA MOLECULAR PELA PRESENÇA DA PROTEÍNA RecX DE H. seropedicae

RecX (μmol/L)

0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 10

dsDNA livre

Complexos dsDNA-RecX

ssDNA livre

Complexos ssDNA-RecX

012345 91011

100

Complexo DNA-proteína (%)

[RecX] (μmol/L)

RecX + [

P]ssDNA

RecX + [

P]dsDNA

RecX (μmol/L)

0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 10

RecX (μmol/L)

0 0,1 0,25 0,5 1 2 5 10

dsDNA livre

Complexos dsDNA-RecX

ssDNA livre

Complexos ssDNA-RecX

012345 91011

100

Complexo DNA-proteína (%)

[RecX] (μmol/L)

RecX + [

P]ssDNA

RecX + [

P]dsDNA

012345 91011

100

Complexo DNA-proteína (%)

[RecX] (μmol/L)

RecX + [

P]ssDNA

RecX + [

P]dsDNA

Retardamento de migração de DNA determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida em

condição nativa (4,5%, a 60V por 80 min) conforme descrito na seção 3.4.1.1. A proteína RecXHis de

H. seropedicae (nas concentrações indicadas) foi incubada na presença de 1,1 μmol/L de [

P]-dsDNA

88 pb (A) ou 1,8 μmol/L de [

P]-ssDNA 88 mers (B). A seta indica a banda corresponde ao DNA

livre. Os géis foram secos e o material radioativo detectado em PhosphorImager. (C) Análise

densitométrica de A e B. A figura mostra um resultado representativo.

115 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise dos géis permitiu ainda observar que com o aumento da

concentração de RecX ocorreu a formação de múltiplas bandas de retardamento. É

possível que essas bandas representem complexos RecX:DNA de diferentes

estequiometrias (Figura 4.7A). A adição de 5 ou 10 μmol/L de RecX causou a

formação de uma banda difusa e mais próxima do poço do gel. O complexo RecX-

ssDNA (Figura 4.7B) apresentou características distintas das apresentadas pelo

complexo RecX-dsDNA. Na presença de ssDNA, não há a formação de bandas

definidas mas ocorre a formação de uma banda difusa que se estende da banda de

DNA livre até o topo do gel. Essas diferenças sugerem que os complexos RecX-

dsDNA e RecX-ssDNA têm estruturas distintas.

Os resultados indicam que a proteína RecX de H. seropedicae foi capaz de se

ligar a DNA em concentrações mais baixas do que aquelas reportadas para a RecX de

outros organismos. Enquanto a proteína de H. seropedicae foi capaz de ligar ao DNA

em concentrações de 0,25 μmol/L, a proteína RecX de E. coli foi capaz de ligar-se ao

ssDNA ou dsDNA somente em concentrações acima de 1 μmol/L (Stohl et al., 2003;

Drees et al., 2004a). A proteína RecX de M. tuberculosis não apresentou atividade de

ligação ao ssDNA ou dsDNA linear (Venkatesh et al., 2002).

4.3.2.3 Efeito de RecX sobre a atividade de ligação ao DNA da proteína RecA

Para determinar a influência da presença de RecX na ligação de RecA ao

DNA, foram conduzidos experimentos na presença das duas proteínas e de dsDNA 88

pb ou ssDNA 88 mers marcados com [

P]. Nesses experimentos, a concentração da

proteína RecX foi mantida constante (0,25 μmol/L) e a concentração de RecA

variável. Os resultados são apresentados na Figura 4.8. As percentagens de DNA livre

foram determinadas em relação à quantidade observada na ausência de RecA.

A presença da proteína RecX não modificou o padrão de retardamento de

migração eletroforética dos complexos dsDNA- ou ssDNA-RecA quando presente em

uma relação molar RecA:RecX de 1:1 até 40:1 (Figura 4.8).

116 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.8 - EFEITO DA PROTEÍNA RecX SOBRE A ATIVIDADE DE LIGAÇÃO AO

DNA DA PROTEÍNA RecA.

Retardamento de migração eletroforética de DNA em gel de poliacrilamida em condição nativa (4,5%,

a 60V por 88 min) conforme descrito na seção 3.4.1.1. Foram utilizados nos ensaios 1,1 μmol/L de

[

P]-dsDNA (88 bp) e 1,8 μmol/L de [

P]-ssDNA (88 mers). A proteína RecAHis foi incubada na

ausência ou presença de 250 nmol/L de RecXHis. Os géis foram secos e o material radioativo

detectado em PhosphorImager. A percentagem de DNA livre foi determinada por densitometria dos

géis. Nos ensaios realizados na ausência de RecX, o valor de 100% de DNA livre foi obtido a partir da

reação realizada na ausência de proteína e naqueles ensaios realizados na presença de RecX, o valor de

100% de DNA livre foi obtido a partir da reação realizada na presença de RecX e ausência de RecA.

012345 91011

100

Complexo DNA-proteína (%)

[RecA] (μmol /L)

RecA + [

P]ssDNA

RecA + [

P]ssDNA + RecX

RecA + [

P]dsDNA

RecA + [

P]dsDNA + RecX

117 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para determinar se ambas as proteínas fazem contato com o dsDNA no

complexo ternário RecA-RecX-dsDNA ou se a associação de RecX ocorre

exclusivamente por interação com RecA, como sugerido por Drees et al. (2004a, b) e

Lusetti et al. (2004b), foram realizados experimentos de formação de ligação

covalente induzida pela luz UV (photo-crosslinking).

As proteínas RecX e RecA foram incubadas com o dsDNA (63 pb)

derivatizado com brometo de azidofenacil e marcado com [

P] (Apêndice A) em pH

8,0, na ausência de ATP ou análogos de ATP (3.4.2). Os experimentos foram

realizados em duplicata e submetidos ou não à luz UV (365 nm). O produto das

reações foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida em condição nativa ou

desnaturante (SDS-PAGE).

Após a corrida eletroforética das amostras em gel de poliacrilamida sob

condição nativa foi possível visualizar o aparecimento de bandas com migração

eletroforética reduzida daquela apresentada pelo DNA livre nas reações submetidas ou

não à luz UV, indicando a formação de complexos proteína-DNA (Figura 4.9A).

Quando somente a proteína RecA estava presente foi possível visualizar a formação do

complexo DNA-RecA que se mantém no poço do gel (Figura 4.9A, linhas 4 e 10). Na

presença de RecX, várias bandas foram observadas (Figura 4.9B, linhas 5 e 11).

Quando ambas as proteínas estavam presentes, bandas de migração idêntica àquelas

observadas na condição em que apenas a proteína RecX encontrava-se presente foram

observadas (Figura 4.9B, linha 7 e 13). Esses resultados indicam que mesmo na

presença de RecA, RecX ainda liga-se ao dsDNA nas condições utilizadas (5 μmol/L

de RecX em pH 8,0).

A eletroforese em condição desnaturante dos produtos de reação revelou

bandas de migração retardada correspondentes aos produtos de ligação DNA-proteína

somente após a exposição à luz UV (Figura 4.9B, linhas 11, 12 e 14), confirmando a

efetivação da ligação covalente entre as moléculas de DNA e proteína.

118 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.9 - LIGAÇÃO COVALENTE DA PROTEÍNA RecA E/OU RecX DE H. seropedicae

AO dsDNA DERIVATIZADO.

As amostras foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida em condição nativa (4,5%, a

60V por 100 min) (A) ou em condição desnaturante (12,5% SDS-PAGE a 200V por 40 min) (B).

Ambos os géis foram secos e o material radioativo detectado em PhosphorImager. As proteínas

RecAHis e RecXHis de H. seropedicae foram incubadas na concentração de 5 μmol/L com 0,8

μmol/L de dsDNA (63 pb) conjugado com brometo de azidofenacil e marcado com [

P]. As linhas 1 a

7 não foram expostas à luz UV e as linhas 8 a 14 foram expostas por 30 segundos à luz UV (365 nm)

para a formação da ligação covalente (crosslinking).

-UV

+ UV

dsDNA

RecA

RecX

+ - - + + - + + - - + + - +

- + - + - + + - + - + - + +

- - + - + + + - - + - + + +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

-UV

+ UV

dsDNA

RecA

RecX

+ - - + + - + + - + + - + -

- + - + - + + - + + - + + -

- - + - + + + - - - + + + +

119 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.3 Troca de fitas de DNA mediada pela proteína RecA

A capacidade de promoção de troca de fitas de DNA da proteína RecA de H.

seropedicae (HsRecA) foi determinada em pH 7,5 a 37

C (seção 3.4.4). Na reação de

troca de fitas de DNA, o ssDNA ϕX174 circular (S

) e o dsDNA ϕX174 linear

homólogo (S

) são recombinados para formar uma molécula de dsDNA circular aberta

(P) e uma molécula de ssDNA linear. As condições do ensaio foram padronizadas

utilizando a proteína RecA de E. coli (EcRecA; GE Healthcare) já que essa proteína

foi previamente caracterizada em diversas condições e por diversos grupos de pesquisa

(Drees et al., 2004a, b; Lusetti et al., 2004a, b).

A proteína HsRecA foi capaz de promover a troca de fitas entre duas

seqüências homólogas de DNA (Figura 4.10). Após 30 minutos de reação foi possível

visualizar a formação da banda do produto de reação, que se tornou mais intensa com a

extensão do tempo de incubação (Figura 4.10A, linhas 2 e 3). Mesmo após ser

estocada por 10 dias a -20

C, a proteína HsRecA manteve sua atividade de troca de

fitas (resultado não mostrado). A atividade da proteína EcRecA foi ensaiada como

controle positivo (Figura 4.10A, linhas 4 e 5). Baseando-se na intensidade da banda do

produto, foi possível verificar que a proteína EcRecA foi mais eficiente do que a

proteína HsRecA no processo de troca de fitas de DNA. Como controle negativo, o

sistema de reação sem proteína foi submetido às mesmas condições de incubação.

Como resultado, nenhum produto de recombinação foi formado (Figura 4.10A, linhas

6 e 7). A proteína RecA de M. tuberculosis também não foi capaz de atingir os

mesmos níveis de formação do DNA heteroduplex comparativamente com a proteína

RecA de E. coli nas mesmas condições de ensaio (Venkatesh et al., 2002).

A proteína RecAHis L54Q (Figura 4.10B, linha 2) não foi capaz de catalisar a

troca de fitas entre moléculas de ssDNA circular e dsDNA linear e formar dsDNA

circular, indicando que o resíduo de leucina 54 é importante para a atividade de troca

de fitas de DNA.

120 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.10 - TROCA DE FITAS DE DNA MEDIADA PELAS PROTEÍNAS RecA DE H.

seropedicae E E. coli.

HsRecAL54Q

EcRecA

1 2

1 2 3 4 5 6 7

30´ 90´ 30´ 90´ 30´ 90´

HsRecA

EcRecA

HsRecAL54Q

EcRecA

1 2

1 2 3 4 5 6 7

30´ 90´ 30´ 90´ 30´ 90´

HsRecA

EcRecA

Ensaio de troca de fitas entre DNAs homólogos realizado utilizando 6,7 μmol/L da proteína RecAHis

ou RecAHis mutante L54Q de H. seropedicae, ou RecA de E. coli (conforme indicado); 22,6 μmol/L

ssDNA φX174 circular e 15,6 μmol/L dsDNA φX174 linear, nas condições descritas na seção 3.4.4.

As reações foram incubadas por 30 ou 90 minutos a 37

C (A) ou por 90 minutos (B). Após incubação

as amostras foram extraídas com fenol equilibrado e SDS e submetidas à eletroforese em gel de

agarose 0,8% em tampão TAE 1x, desenvolvida a 3,6 V/cm por 5 horas. O DNA foi visualizado por

coloração com brometo de etídeo e exposição à luz UV. S

indica dsDNA φX174 linear; P, φX174

dsDNA circular, (-) ausência de proteína; HsRecA, RecA de H. seropedicae; HsRecA L54Q, RecA

mutante L54Q de H. seropedicae; EcRecA, RecA de E. coli (GE Healthcare).

121 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O resíduo mutagenizado L54 (corresponde ao resíduo L47 em E. coli,

Apêndice C), encontra-se conservado em 61 de 64 proteínas RecA bacterianas

comparadas (Roca & Cox, 1997), entretanto nenhum estudo de substituição deste

resíduo foi reportado. Esse resíduo faz parte do grupo dos resíduos não polares

presentes no motivo MAW (Figura 2.11), o qual juntamente com os resíduos L51, I61

e I64 fazem parte do núcleo hidrofóbico da proteína RecA (Story et al., 1992). No

mutante HsRecA L54Q, o resíduo hidrofóbico de leucina foi substituído por um

resíduo hidrofílico de glutamina. As proteínas RecA das 3 espécies de bactérias

(Mycoplasma pulmonis, Myxococcus xanthus e Thermotoga maritima) que não

possuem o resíduo de leucina conservado na posição 47, apresentam uma substituição

por um aminoácido também hidrofóbico: isoleucina ou valina (Roca & Cox, 1997).

A substituição R60C, outro resíduo presente no motivo MAW, na proteína

EcRecA, tornou a proteína também incapaz de realizar a troca de fitas de DNA

(Lauder & Kowalczykowski, 1993). Uma vez que esse motivo está envolvido na

comunicação entre monômeros (Roca & Cox, 1997), estes resultados sugerem a

substituição L54Q poderia estar interferindo no processo de transdução de sinal entre

monômeros.

4.3.3.1 Efeito da proteína RecX sobre a troca de fitas de DNA mediada pela

proteína RecA

A reação de troca de fitas de DNA realizada por RecA foi examinada na

presença de concentrações crescentes de RecX (Figura 4.11). Uma redução de cerca de

90% na quantidade de produto de recombinação foi observada ao adicionar 50 nmol/L

de RecX (Figura 4.11A, linha 2). O aumento da concentração de RecX para 2 μmol/L,

eliminou completamente a reação de troca de fitas (Figura 4.11A, linha 4). A proteína

RecX de H. seropedicae também foi capaz de inibir a atividade de troca de fitas

catalisada pela proteína RecA de E. coli (Figura 4.11B). Esses resultados mostraram

que a proteína RecX de H. seropedicae, em concentrações sub-estequiométricas, foi

capaz de inibir a atividade de troca de fitas de DNA mediada por RecA em

concentrações limitantes de DNA. Além disso, foi possível concluir que a proteína

122 RESULTADOS E DISCUSSÃO

RecX não precisa interagir com cada monômero do filamento de RecA para inibir a

troca de fitas na recombinação homóloga.

A proteína RecA de M. tuberculosis num sistema homólogo foi inibida

completamente na presença de 250 nmol/L de RecX (Venkatesh et al., 2002) e a

proteína RecX de E. coli foi necessária em concentrações estequiométricas em relação

a RecA para inibir a sua atividade de troca de fitas (Drees et al., 2004a).

FIGURA 4.11 - EFEITO DA PROTEÍNA RecX NA TROCA DE FITAS MEDIADA PELA

PROTEÍNA RecA.

EcRecA

HsRecX

(μmol/L)

- 0,05

+ +

HsRecA

HsRecX

(μmol/L)

- 0,05 0,1 0,5 2 2 -

+ + + + + - -

1 2 3 4 5 6 7

EcRecA

HsRecX

(μmol/L)

- 0,05

+ +

HsRecA

HsRecX

(μmol/L)

- 0,05 0,1 0,5 2 2 -

+ + + + + - -

1 2 3 4 5 6 7

O efeito da proteína RecX na troca de fitas de DNA mediada pela proteína RecA de H. seropedicae

(A) ou RecA de E. coli (B) foi determinado conforme descrito na seção 3.4.4. O sistema continha 6,7

μmol/L de RecAHis de H. seropedicae (HsRecA) ou de E. coli (EcRecA) e as concentrações indicadas

de RecXHis (HsRecX, em μmol/L) na presença de 22,6 μmol/L ssDNA φX174 circular e 15,6 μmol/L

dsDNA φX174 linear, e foi incubado por 90 min a 37

C. Após extração com fenol equilibrado e SDS,

as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TAE 1x,

desenvolvida a 3,6 V/cm por 5 horas. O DNA foi visualizado por coloração com brometo de etídeo e

exposição à luz UV. S

indica dsDNA φX174 linear; S

indica ssDNA φX174 circular; P, φX174

dsDNA circular; (+); presença de proteína; (-) ausência de proteína.

123 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.4 Atividade de ligação ao ATP da proteína RecA

A capacidade de ligação ao ATP das proteínas RecA, RecA mutante L54Q ou

RecA mutante L54Q G73A foi avaliada em presença de

ssDNA φX174 circular e

[α

P]ATP após exposição à luz UV (254 nm) e eletroforese em gel de poliacrilamida

em condição desnaturante (seção 3.4.5). A proteína EcRecA (GE Healthcare) mais

uma vez serviu de controle positivo. Ao fazer a correspondência entre sinais obtidos

após a revelação no PhosphorImager (Figura 4.12A) e a posição das proteínas no gel

desnaturante (Figura 4.12B) foi possível verificar a formação da ligação proteína-ATP.

Na linha 1A foi visualizado um sinal correspondente a EcRecA ligada covalentemente

ao ATP. Esse sinal desapareceu com a adição de ADP não marcado antes da exposição

à luz UV (Figura 4.12A, linha 2), indicando que a ligação entre RecA e ATP foi

específica. Um resultado semelhante foi obtido com a proteína RecA de H.

seropedicae (Figura 4.12A, linhas 5 e 6). Além disso, a proteína RecA mutante L54Q

foi capaz de ligar ATP, conforme indicado pela formação da ligação covalente com

ATP após a exposição à luz UV (Figura 4.12 A, linha 3). A formação do produto de

ligação ATP-RecA L54Q em intensidade similar ao da proteína HsRecA (Figura

4.12A, linhas 5 e 6) só ocorreu na ausência de ADP, indicando a especificidade dessa

interação. Esta observação mostra que a ligação de ATP não foi afetada pela mutação

no resíduo de leucina 54, indicando que esse resíduo não está envolvido na ligação do

ATP. Por outro lado, a proteína HsRecA G73A L54Q foi incapaz de ligar ATP (Figura

4.12C, linhas 5 e 6). O resíduo G73 da proteína HsRecA corresponde ao resíduo G66

da EcRecA (Apêndice C) presente no motivo Walker A e é conservado em todas as

proteínas RecA de seqüência conhecida (Roca & Cox, 1997). Esse resíduo é essencial

para a atividade de RecA, já que qualquer substituição nessa posição produz proteínas

RecAs incapazes de ligar ATP (Konola et al., 1994; Roca & Cox, 1997). A ausência

de ligação da proteína RecA mutante L54Q G73A confirmou que a formação do

produto de adição entre ATP e RecA ou RecA L54Q não foi resultado de uma

associação inespecífica.

124 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.12 - LIGAÇÃO AO ATP DA PROTEÍNA RecA DE H. seropedicae

HsRecA

- + - + - +

HsRecA L54Q

G73A

RecX

RecA

1 2 3 4 5 6

RecX

(μmol/L)

- - 2,5 2,5 - -

ADP

HsRecAL54Q

EcRecA

HsRecA -

RecA

RecX

- + - + - + - + - + - +

RecX

(μmol/L)

- - - - - - 2,5 2,5 10 10 10 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ADP

EcRecA

HsRecAL54Q

HsRecA -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- + - + - + - + - + - +

- - - - - - 2,5 2,5 10 10 10 10

HsRecA

- + - + - +

HsRecA L54Q

G73A

RecX

RecA

1 2 3 4 5 6

RecX

(μmol/L)

- - 2,5 2,5 - -

ADP

HsRecA

- + - + - +

HsRecA L54Q

G73A

RecX

RecA

1 2 3 4 5 6

RecX

(μmol/L)

- - 2,5 2,5 - -

ADP

HsRecAL54Q

EcRecA

HsRecA -

RecA

RecX

- + - + - + - + - + - +

RecX

(μmol/L)

- - - - - - 2,5 2,5 10 10 10 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ADP

- + - + - + - + - + - +

RecX

(μmol/L)

- - - - - - 2,5 2,5 10 10 10 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ADP

EcRecA

HsRecAL54Q

HsRecA -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- + - + - + - + - + - +

- - - - - - 2,5 2,5 10 10 10 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

- + - + - + - + - + - +

- - - - - - 2,5 2,5 10 10 10 10

A capacidade da proteína RecA em ligar ATP foi determinada conforme descrito na seção 3.4.5. As

proteínas RecA de E. coli, RecAHis ou RecA mutante L54Q ou L54Q G73A de H. seropedicae na

concentração de 2,5 μmol/L e a proteína RecXHis na concentração de 2,5 ou 10 μmol/L (conforme

indicado) foram expostas à luz UV por 20 minutos na presença de 6,5 μmol/L ssDNA ϕX174 circular

e 37 kBq [α

P]ATP. (+) indica presença e (-) ausência de 4 mmol/L ADP no sistema. (A) e (C)

correspondem à imagem obtida pelo PhosphorImager do material marcado radioativamente e separado

em gel SDS-PAGE 12,5%. (B) corresponde ao gel de A corado com azul de Coomassie. EcRecA,

RecA de E. coli; HsRecA, RecAHis de H. seropedicae; HsRecAL54Q, RecAHis mutante L54Q de H.

seropedicae; HsRecA L54Q G73A, RecAHis mutante L54Q G73A de H. seropedicae.

125 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.4.1 Efeito da proteína RecX na atividade de ligação ao ATP da proteína

RecA

Para verificar uma possível influência da proteína RecX na atividade de

ligação ao ATP por RecA, a proteína HsRecA foi incubada com ATP marcado com

[

P] na presença de RecX. A quantidade de produto de adição de ATP com proteína

HsRecA não foi alterada na presença de 2,5 e 10μmol/L de RecX (Figura 4.12A,

linhas 5, 7, 9), indicando que RecX não interfere na capacidade de ligação ao ATP da

proteína HsRecA. Em alta concentração de RecX (10 μmol/L), foi observada uma

banda radioativa fraca na altura de RecX sugerindo a marcação dessa proteína por

[

P]ATP (Figura 4.12A, linha 11). Entretanto, quando a concentração de RecX usada

foi a mesma utilizada que a da proteína RecA (2,5 μmol/L), nenhum sinal de ligação

ao ATP foi observado (Figura 4.12C, linha 4). Aparentemente, a alta concentração

protéica induziu a ligação inespecífica do ATP à proteína RecX. A banda presente

apenas nas linhas do gel onde a proteína RecX foi ensaiada na concentração de 10

μmol/L na presença (Figura 4.12B, linha 9) ou ausência da proteína RecA (Figura

4.12B, linha 11) apresenta massa molecular correspondente à proteína RecX na sua

forma dimérica.

Estes resultados permitem sugerir que a proteína RecA de H. seropedicae liga-

se especificamente ao ATP e que a presença da proteína RecX não afeta essa ligação.

Esses resultados concordam com o que foi reportado para as proteínas de M.

tuberculosis: a proteína RecX desse microrganismo mostrou-se incapaz de ligar ATP

ou de inibir a ligação do ATP à proteína RecA (Venkatesh et al., 2002).

4.3.5 Atividade de hidrólise de ATP (ATPásica)

4.3.5.1 Atividade ATPásica da proteína RecA

A proteína RecA de E. coli apresenta atividade de hidrólise de ATP

dependente de DNA (Roca & Cox, 1997). Essa atividade de RecA tem sido utilizada

como um indicador do nível de RecA ligada ao DNA, uma vez que a taxa de hidrólise

de ATP é diretamente proporcional à quantidade de monômeros de RecA ligados ao

126 RESULTADOS E DISCUSSÃO

DNA na ausência de qualquer agente que altere a atividade ATPásica intrínseca de

RecA (Drees et al., 2004a, b; Cox, 2003; Roca & Cox, 1997; Shan et al., 1997;

Lindsley & Cox, 1989, 1990; Arenson et al., 1999).

O ssDNA ϕX174 circular (44 μmol/L) foi usado para a formação do filamento

de RecA, uma vez que a proteína HsRecA não apresentou atividade ATPásica na

ausência de DNA ou na presença de dsDNA ϕX174 linear (10 μmol/L) em pH7,5

(Figura 4.13). Esses resultados concordam com os reportados para a proteína RecA de

E. coli. A EcRecA apresenta uma atividade ATPásica independente de ssDNA muito

baixa e não apresenta atividade ATPásica dependente de dsDNA em pH 7,5

(Weinstock et al., 1981). Além disso, foi mostrado que a atividade ATPásica

dependente de ssDNA da EcRecA se mantém alta e estável numa faixa ampla de pH

entre 6 e 9 (Weinstock et al., 1981).

A concentração padrão de RecA usada nos ensaios de atividade ATPásica foi

estabelecida após a realização de uma curva de concentração da proteína HsRecA, na

qual foram utilizadas as concentrações de 1,2, 2,4 ou 4,8 μmol/L (seção 3.4.6). No

tempo zero de todos os experimentos foram adicionados o [

P]ATP e a proteína SSB

ao sistema. Como controle positivo, foi utilizada a proteína RecA de E. coli (GE

Healthcare).

127 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.13 - ATIVIDADE ATPÁSICA DA PROTEÍNA RecA DE H. seropedicae

EcRecA(1,2 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (4,8 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (2,4 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (1,2 μmol/L) + ssDNA

HsRecA L54Q (4,8 μmol/L) + ssDNA

HsRecA L54Q (1,2 μmol/L) + ssDNA

HsRecA L54Q (2,4 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (3 μmol/L) + dsDNA

HsRecA (1,2 μmol/L)

ATP hidrolisado (μmol/L)

Tempo (minutos)

100

150

200

250

300

0 102030405060

EcRecA(1,2 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (4,8 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (2,4 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (1,2 μmol/L) + ssDNA

HsRecA L54Q (4,8 μmol/L) + ssDNA

HsRecA L54Q (1,2 μmol/L) + ssDNA

HsRecA L54Q (2,4 μmol/L) + ssDNA

HsRecA (3 μmol/L) + dsDNA

HsRecA (1,2 μmol/L)

ATP hidrolisado (μmol/L)

Tempo (minutos)

100

150

200

250

300

0 102030405060

100

150

200

250

300

0 102030405060

ATP

ADP

ATP

ADP

(A) A atividade de ATPase da proteína RecA foi ensaiada conforme descrito na seção 3.5.6. Foram

utilizadas as proteínas RecA de E. coli (EcRecA) na concentração de 1,2 μmol/L e a RecAHis

(HsRecA) e a RecAHis mutante L54Q (HsRecAL54Q) de H. seropedicae nas concentrações de 1,2,

2,4 ou 4,8 μmol/L. Os ensaios foram realizados na presença de 44 μmol/L ssDNA ϕX174 circular ou

10 μmol/L de dsDNA ϕX174 linear, onde indicado, e 0,4 mmol/L de ATP e 0,2 µmol/L de SSB. As

amostras foram retiradas e analisadas nos tempos indicados. (B) Cromatograma representativo dos

produtos de reação de hidrólise de ATP obtido após a cromatografia em camada delgada das amostras

e visualização da imagem em PhosphorImager. Em vermelho está destacado o sinal correspondente ao

[α

P] ATP e em azul, ao [α

P] ADP.

128 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Como a quantidade de ATP hidrolisado foi aproximadamente linear até 60

minutos na presença de 1,2 μmol/L de HsRecA (Figura 4.13), essa concentração foi

utilizada nos experimentos seguintes.

A atividade ATPásica da proteína mutante RecA L54Q também foi

determinada nas concentrações de 1,2, 2,4 ou 4,8 μmol/L. Os valores de hidrólise

registrados foram próximos a zero indicando que o resíduo de leucina na posição 54 é

importante para a atividade ATPásica de RecA (Figura 4.13). Esse resultado indica

que o resíduo leucina 54, embora não interfira na ligação de ATP (ver Figura 4.12),

impede que haja hidrólise do nucleotídeo. A proteína RecA mutante L51F ou R60C

(resíduos do motivo MAW) de E. coli, foram igualmente incapazes de hidrolisar ATP

(Lauder & Kowalczykowski, 1993). A proteína HsRecA mutante L54Q foi também

incapaz de realizar a troca de fitas de DNA (Figura 4.10B) possivelmente porque para

completar o processo, a hidrólise de ATP é essencial (revisado por Cox, 2003).

4.3.5.2 Efeito de RecX sobre a Atividade ATPásica da proteína RecA

A proteína RecX não apresentou atividade ATPásica na ausência ou presença

de ssDNA (Figura 4.14). Entretanto a atividade ATPásica da proteína RecA (1,2

μmol/L) na presença de 44 μmol/L de ssDNA foi fortemente inibida por RecX de

forma concentração-dependente (Figura 4.14). Na concentração de 10 μmol/L, RecX

inibe 90% da atividade ATPásica de RecA, reduzindo o turnover de 2,5 para 0,3 min

-1

(Figura 4.14). A adição de RecX levou à redução da velocidade de hidrólise de ATP

da proteína HsRecA, porém essa se manteve constante durante os tempos de

incubação. Em contraste, a adição de EcRecX levou ao decréscimo gradativo da

velocidade de hidrólise de ATP da proteína EcRecA (Drees et al., 2004a).

129 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Figura 4.14 - EFEITO DA PROTEÍNA RecX SOBRE A ATIVIDADE ATPásica

DEPENDENTE de ssDNA DA PROTEÍNA RecA DE H. seropedicae

ATP hidrolisado (μmol/L)

Tempo (minutos)

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30 35 40

O ensaio de atividade de hidrólise de ATP da proteína RecA foi realizado conforme descrito na seção

3.5.6, na presença de 1,2 μmol/L da proteína RecAHis de H. seropedicae, 44 μmol/L de ssDNA

ϕX174 circular e concentrações crescentes de RecXHis (em μmol/L): () 0; () 0,1; () 0,5; (¬) 2;

(Δ) 5; (z) 10. A proteína RecX foi adicionada ao sistema de reação juntamente com RecA e o ssDNA.

A proteína RecXHis (5 μmol/L) também foi incubada nas mesmas condições na ausência de RecA

(). A figura mostra um resultado representativo.

130 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A concentração de HsRecX necessária para inibir a atividade ATPásica de

HsRecA foi 10 vezes mais alta que a necessária para a inibição da atividade ATPásica

da RecA pela RecX de E. coli (Drees et al., 2004a) ou de M. tuberculosis (Venkatesh

et al., 2002). É possível que essa diferença se deva à presença de diferentes

concentrações de ssDNA e SSB usadas nos ensaios apresentados neste trabalho. As

proteínas RecA de E. coli e M. tuberculosis foram ensaiadas em uma condição onde o

fator limitante foi o DNA e a HsRecA, numa condição de limitação dessa proteína.

A função de SSB é facilitar a formação dos filamentos de RecA e reduzir a re-

nucleação de filamentos que estiverem em processo de dissociação (Tsang et al., 1985;

Kowalczykowski et al., 1987; Drees et al., 2004a). Nas condições dos ensaios de

atividade ATPásica, cada tetrâmero da proteína SSB, ao se ligar ao DNA, ocupa uma

região correspondente a 35 nucleotídeos (Lohman & Ferrari, 1994), de forma que

ocorre um sítio para SSB (forma tetramérica) a cada 35 nucleotídeos. A proteína

EcRecA foi ensaiada na presença de 0,75 mol de SSB por sítio de ligação (Drees et al.,

2004a) enquanto HsRecA foi ensaiada em uma condição onde havia 0,04 mol de SSB

por sítio. Essa reduzida relação SSB/sítio de ligação no ensaio da HsRecA foi

decorrente da alta concentração de ssDNA presente no sistema de reação. Nas

condições ensaiadas neste trabalho, a concentração de ssDNA foi 20 vezes maior, de

forma que a proteína RecA ocupou 8%, no máximo, das moléculas de ssDNA. A

ligação de RecA ao DNA não ocorre de forma homogênea, ou seja, na mesma

proporção em todas as moléculas de DNA disponíveis, já que uma vez efetuada a

nucleação de RecA no DNA, etapa limitante do processo, o filamento de RecA deve

ser totalmente estendido (seção 2.2.1 e revisado por Cox, 2003).

Nestas condições, a adição de HsRecX no sistema reduz a velocidade de

hidrólise de ATP em relação à registrada na sua ausência sugerindo que o número de

moléculas de HsRecA ligadas ao DNA tenha diminuído. Este valor não sofre redução

progressiva ao longo do tempo, como verificado em E. coli. Drees et al. (2004a),

utilizando EcRecA e EcRecX, também notaram a redução da velocidade de hidrólise

de ATP após a adição de EcRecX, porém esse efeito ocorreu de forma gradativa. Os

autores sugerem que EcRecX bloqueia a associação de EcRecA, sem afetar a

dissociação. Segundo esse modelo, como o terminal de extensão está bloqueado pela

ligação de RecX e como SSB se liga ao longo do ssDNA formado em conseqüência da

131 RESULTADOS E DISCUSSÃO

dissociação de RecA do filamento, RecA torna-se incapaz de efetuar a extensão ou a

renucleação, respectivamente.

Os resultados obtidos com a proteína RecA H seropedicae foram aplicados no

modelo sugerido por Drees et al. (2004a) com as devidas adaptações, já que a

composição do sistema de reação não foi a mesma. Isto foi feito para determinar se o

mecanismo de regulação sugerido por aqueles autores para a EcRecA poderia ser

empregado para a HsRecA.

Neste modelo, na presença de ssDNA em excesso e HsRecX, a extensão do

filamento de RecA seria inibida pela interação RecA-RecX no terminal de extensão e

os monômeros de RecA dissociados poderão iniciar a nucleação em outras moléculas

de DNA disponíveis ou renuclear em outra região da molécula de DNA do qual se

dissociaram, já que a concentração de SSB não é suficientemente alta para impedir

novos eventos de nucleação em todas as moléculas de DNA disponíveis. Quanto maior

a concentração de RecX presente, maior será a probabilidade de ocorrer o bloqueio do

processo de extensão e a conseqüente redução do número de moléculas de RecA

ligadas ao DNA. Nos ensaios utilizando a EcRecA e a proteína RecA de M.

tuberculosis, devido à baixa concentração de DNA, o bloqueio da extensão do

filamento de RecA por RecX induziu a dissociação líquida, uma vez que os eventos de

nucleação foram inibidos pela ligação de SSB ao ssDNA. Assim, concentrações

menores de RecX foram capazes de induzir a inibição quase total da atividade

ATPásica (Venkatesh, 2002; Drees et al., 2004a).

A concentração de HsRecX que induziu aproximadamente metade da inibição

da atividade ATPásica de HsRecA (5 μmol/L; Figura 4.14) foi a utilizada nos demais

experimentos. Inicialmente, foi verificado se a ordem de adição dos componentes do

sistema modificava a atividade ATPásica de HsRecA. Neste ensaio, dois componentes

(RecA e ssDNA, RecA e RecX, ou RecX e DNA) foram pré-incubados por 10 minutos

antes da adição do terceiro componente juntamente com SSB e [α

P]ATP.

Alternativamente, os três componentes (RecA, RecX e ssDNA) foram pré-incubados

conjuntamente por 10 minutos, antes da adição de SSB e [α

P]ATP. Quando RecX

foi adicionada ao sistema após a pré-incubação de RecA com o ssDNA

(RecA+ssDNA→RecX), a taxa de hidrólise de ATP reduziu em 35%, mas quando

RecX foi incubada com RecA antes da adição do ssDNA (RecA+RecX→ssDNA), a

132 RESULTADOS E DISCUSSÃO

redução foi de 50%. A redução foi ainda maior (60%) quando RecX foi incubada

juntamente com o RecA e o DNA (RecA+RecX+ssDNA) (Figura 4.15). Quando RecX

foi adicionada ao sistema antes da formação do filamento de RecA

(RecX+DNA→RecA) o efeito inibitório foi mais evidente, uma vez que a redução da

atividade ATPásica foi de 88% (Figura 4.15). Esses resultados sugerem que a proteína

RecX inibe de forma mais efetiva a atividade ATPásica de RecA quando presente

antes da formação do filamento de RecA. Aparentemente essa inibição não ocorreu

somente devido à interação RecA-RecX, uma vez que a pré-incubação da proteína

HsRecX com HsRecA na ausência de ssDNA ou a incubação de RecA+ RecX+ssDNA

conjuntamente não reduziu a atividade ATPásica de RecA tão efetivamente. Isso

indica que a ligação RecX-DNA pode ser importante para a inibição da formação do

filamento de RecA. Estes resultados são coerentes com os apresentados pelas proteínas

RecA e RecX de E. coli (Drees et al., 2004a). Drees et al. (2004a) sugerem que a

inibição de RecX sobre RecA foi mais efetiva quando EcRecX foi pré-incubada com o

ssDNA porque nessa condição a proteína EcRecX já está disponível para suprimir a

extensão do filamento de RecA após cada evento de nucleação.

O modelo proposto por Drees et al. (2004a) pode ser utilizado para explicar os

resultados obtidos com as proteínas RecA e RecX de H. seropedicae, exceto quando

RecX foi pré-incubada com o ssDNA antes da adição da RecA. Esse modelo prevê

uma inibição semelhante à verificada nas condições RecA+RecX→ssDNA e

RecA+RecX+ssDNA, já que RecX estava previamente disponível nos três sistemas.

Há indícios de que a interação prévia entre ssDNA e RecX é necessária para a

completa inibição de RecA. A capacidade de ligação ao DNA apresentada pela

proteína RecX de H. seropedicae (detalhes na seção 4.3.1.2), suporta essa sugestão. É

possível sugerir ainda que a interação de RecX com ssDNA induz mudanças na

proteína tornando-a competente para inibir RecA.

133 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.15 - EFEITO DA ORDEM DE ADIÇÃO DA PROTEÍNA RecX NA INIBIÇÃO DA

ATIVIDADE ATPásica DEPENDENTE DE ssDNA DA PROTEÍNA RecA

RecA + RecX

RecX + ssDNA → RecA

RecA + ssDNA

RecA + ssDNA → RecX

RecA + RecX → ssDNA

RecA + RecX + ssDNA

100

120

140

160

180

0 5 10 15 20 25 30 35 40

ATP hidrolisado (μmol/L)

Tempo (minutos)

A influência da ordem de adição de componentes na atividade de ATPase da proteína RecA foi

determinada conforme descrito na seção 3.5.6. () reação contendo RecA e ssDNA; () RecX foi

adicionada após a pré-incubação de RecA com ssDNA; () RecA e RecX foram pré-incubadas antes

da adição de ssDNA; (¬) RecA e ssDNA foram incubados na presença de RecX; () RecX foi pré-

incubada com ssDNA antes da adição de RecA; () RecA e RecX foram incubadas na ausência de

ssDNA. As concentrações de RecAHis e RecXHis de H.seropedicae utilizadas no ensaio foram 1,2 e 5

μmol/L, respectivamente e a concentração de ssDNA foi 44 μmol/L.

134 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com o objetivo de determinar o envolvimento do DNA na inibição de RecX

sobre RecA foram feitos ensaios variando-se a concentração de RecX e ssDNA

adicionados e também o momento da adição dos mesmos (Figura 4.16). Quando RecX

foi adicionada numa concentração 10 vezes menor (0,5 μmol/L) do que a usada no

experimento mostrado na Figura 4.15, a taxa de hidrólise de ATP reduziu apenas em

20%. Um valor semelhante foi obtido quando 5 μmol/L da proteína RecX foi pré-

incubada com 44 μmol/L ssDNA por 10 minutos e RecA foi adicionada juntamente

com 132 μmol/L de ssDNA (RecX + ssDNA → RecA + ssDNA) (Figura 4.16).

Finalmente, a participação do ssDNA na inibição da atividade de RecA por RecX foi

claramente observada ao adicionar ao sistema 132 μmol/L de ssDNA, 20 minutos após

o início da reação de hidrólise. Nesse caso, a velocidade de hidrólise de ATP quase

triplicou com a adição de ssDNA ao sistema (Figura 4.16).

Em todos os ensaios de ATPase realizados, o ssDNA foi adicionado em

excesso (44 μmol/L), logo se RecX apresentasse como mecanismo de inibição apenas

o bloqueio da extensão do filamento de RecA, não seria esperada uma modificação do

perfil de inibição com um incremento de 3 vezes na concentração de DNA no sistema.

Essa observação sugere que a inibição de RecX sobre RecA envolve também a

participação da molécula de DNA. Os resultados obtidos sugerem que a ligação da

proteína RecX ao ssDNA torna essa molécula indisponível para a ligação de RecA ou

limita essa ligação. Apesar da concentração de ssDNA, em termos de nucleotídeos no

sistema, ser superior à concentração de RecX (44 μmol/L de ssDNA e 5 μmol/L de

RecX), quando esta é dada em termos de moléculas de DNA, a concentração passa a

ser de apenas 8,2 nmol/L. Isto significa que para cada molécula de ssDNA, 625

moléculas de RecX estariam disponíveis, quando sua concentração foi de 5 μmol/L. O

uso de ssDNA em uma concentração 3 vezes maior de DNA (132 μmol/L) ou de uma

concentração de RecX 10 vezes menor (0,5 μmol/L) reduziu estas proporções: para

cada molécula de ssDNA, 200 ou 60 moléculas de RecX estavam disponíveis,

respectivamente. Baseando-se nestes resultados e em dados reportados na literatura foi

proposto um modelo de inibição das atividades de RecA pela proteína RecX (Figura

4.17).

135 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.16 - EFEITO DA ADIÇÃO DE ssDNA NA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ATPásica

DEPENDENTE DE ssDNA DA PROTEÍNA RecA PELA PROTEÍNA RecX.

RecX (5 μmol/L) + ssDNA (44 μmol/L) → RecA

RecA + ssDNA (44 μmol/L)

RecX (0,5 μmol/L) + ssDNA (44 μmol/L) → RecA

RecX (5 μmol/L) + ssDNA (44 μmol/L) →

RecA + ssDNA (132 μmol/L)

RecX (5 μmol/L) + ssDNA (44 μmol/L) → RecA

ATP hidrolisado (μmol/L)

Tempo (minutos)

100

120

140

160

0 5 10 15 20 25 30 35 40

ssDNA

(132 μmol/L)

Ensaio de atividade de ATPase da proteína RecA foi realizado conforme descrito na seção 3.5.6. A

proteína RecX (0,5 μmol/L) foi pré-incubada com ssDNA (44 μmol/L) antes da adição da proteína

RecA (Δ); RecX (5 μmol/L) foi pré-incubada com ssDNA (44 μmol/L), antes da adição de RecA e

ssDNA (132 μmol/L) () RecX (5 μmol/L) foi pré-incubada com ssDNA (44 μmol/L) antes da adição

de RecA, e 132 μmol/L de ssDNA após 20 minutos de incubação com RecA (seta cinza; ). Como

controles, a proteína RecA foi ensaiada com 44 μmol/L de ssDNA (¡) e a proteína RecX (5 μmol/L)

foi pré-incubada com ssDNA (44 μmol/L) antes da adição de RecA (). A proteína RecAHis de H.

seropedicae foi adicionada às reações na concentração de 1,2 μmol/L.

136 RESULTADOS E DISCUSSÃO

FIGURA 4.17 - MODELO DE INIBIÇÃO DE RecA PELA PROTEÍNA RecX.

(1) Nucleação de

RecA

(2) Extensão e

Formação do

filamento de

RecA

BLOQUEIO DA ASSOCIAÇÃO

DE RecA DEVIDO A LIGAÇÃO

DE RecX AO FILAMENTO DE

RecA

(A) (B)

Presença da proteína RecX

5´

3´

RecA

Velocidade de

hidrólise de ATP

máxima e constante

↓Velocidade de hidrólise

de ATP

BLOQUEIO DA EXTENSÃO

DO FILAMENTO DE RecA

DEVIDO A PRESENÇA DE

RecX LIGADA AO DNA

BLOQUEIO DA

NUCLEAÇÃO DE RecA

DEVIDO A PRESENÇA DE

RecX LIGADA AO DNA

(D)

↓Velocidade de hidrólise

de ATP

(C)

(1) Nucleação de

RecA

(2) Extensão e

Formação do

filamento de

RecA

BLOQUEIO DA ASSOCIAÇÃO

DE RecA DEVIDO A LIGAÇÃO

DE RecX AO FILAMENTO DE

RecA

(A) (B)

Presença da proteína RecX

5´

3´

RecA

Velocidade de

hidrólise de ATP

máxima e constante

↓Velocidade de hidrólise

de ATP

BLOQUEIO DA EXTENSÃO

DO FILAMENTO DE RecA

DEVIDO A PRESENÇA DE

RecX LIGADA AO DNA

BLOQUEIO DA

NUCLEAÇÃO DE RecA

DEVIDO A PRESENÇA DE

RecX LIGADA AO DNA

(D)

↓Velocidade de hidrólise

de ATP

(C)

A formação do filamento de RecA no ssDNA ocorre em duas etapas: nucleação lenta seguida de uma

extensão rápida 5´→3´, levando à formação do filamento de RecA. A dissociação também ocorre

nessa direção 5´→ 3´. (A) Na ausência da proteína RecX, o balanço entre a dissociação e a associação

de RecA, mantém o ssDNA circular totalmente preenchido por moléculas de RecA e

conseqüentemente conserva constante e máxima a velocidade de hidrólise de ATP. (B) A ligação de

RecX ao terminal de associação bloqueia a extensão do filamento de RecA porém não afeta a

dissociação, que continua ocorrendo. Além do bloqueio da associação de RecA ao filamento, RecX

pode bloquear a extensão do filamento de RecA, porém não afeta a dissociação (C). Nesses dois

mecanismos de inibição (B e C), RecA dissocia-se e a velocidade de hidrólise de ATP é reduzida. A

ligação de RecX ao ssDNA também pode de alguma forma bloquear a nucleação de RecA ao ssDNA

(D).

137 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A inibição de RecA através da ligação da proteína RecX ao DNA

provavelmente não é o único mecanismo de controle de RecA por RecX, uma vez que

proteínas ortólogas de diferentes microrganismos apresentam diferentes afinidades ao

DNA. Neste trabalho a formação do complexo HsRecX-dsDNA ou HsRecX-ssDNA

foi visualizada a partir da concentração de 0,25 μmol/L e 1μmol/L de RecX,

respectivamente, enquanto a proteína RecX de M. tuberculosis não foi capaz de ligar

ssDNA ou dsDNA linear (Venkatesh et al., 2002). A proteína RecX de E. coli, por sua

vez, foi capaz de ligar-se ao ssDNA e dsDNA 100 mers somente em concentrações

acima de 1 μmol/L (Stohl et al., 2003; Drees et al., 2004a).

A proteína RecX de H. seropedicae foi necessária em uma concentração mais

elevada para inibir a atividade ATPásica de RecA do que a atividade de troca de fitas

homólogas de DNA. A atividade de troca de fitas da HsRecA foi inibida

completamente quando RecX encontrava-se presente na concentração de 2 μmol/L

(Figura 4.11). RecX, na concentração de 5 μmol/L, quando adicionada após a pré-

incubação de RecA com o DNA, foi capaz de reduzir em 35% a atividade ATPásica de

HsRecA (Figura 4.15). Essa inibição chegou a cerca de 90% quando RecX, na mesma

concentração, foi pré-incubada com o DNA antes da adição de RecA (Figura 4.15). A

maior concentração de RecX para a inibição da atividade ATPásica de HsRecA

aparentemente foi decorrente do excesso de DNA presente nesse experimento.

Entretanto é possível que a presença do dsDNA apenas no ensaio de troca de fitas,

substrato pelo qual RecX apresenta maior afinidade (Figura 4.3 e 4.4), tenha tornado a

inibição de RecX mais efetiva. A concentração de RecX necessária para inibir as

atividades de RecA de M. tuberculosis (MtRecA) também foi variável. Foi necessária

uma menor concentração de MtRecX para inibir a atividade de troca de fitas de DNA

da MtRecA, em relação à necessária para inibir a sua atividade de hidrólise de ATP,

ambos experimentos desenvolvidos em condições limitantes de DNA (Venkatesh et

al., 2002). A proteína EcRecA apresentou um perfil de inibição por EcRecX oposto:

em concentrações subestequiométricas, RecX inibiu a atividade ATPásica de EcRecA

enquanto apenas em concentrações estequiométricas inibiu a atividade de troca de fitas

de DNA (Stohl et al., 2003; Drees et al.,

2004a).

A proteína RecX de H. seropedicae mostrou ser um potente inibidor da

atividade de RecA in vitro. Diante dessa evidência surge a pergunta: Por que a célula

138 RESULTADOS E DISCUSSÃO

possui um mecanismo de inibição de processos essenciais como a recombinação

homóloga e reparo SOS? A ocorrência desses processos diante de substratos

inapropriados como regiões de ssDNA presentes na forquilha de replicação, DNAs

contendo seqüências repetitivas e/ou moléculas de DNA exógenas, introduzidas por

transdução, por exemplo, poderiam induzir a introdução de mutações, deleções e/ou

seqüências de DNA exógenas, gerando mudanças indesejáveis no genoma.

O requerimento do sistema de reparo de pareamento incorreto para a

manutenção da fidelidade do processo de recombinação homóloga indica claramente

que além das propriedades intrínsecas das proteínas envolvidas na replicação, outros

sistemas de regulação são necessários (Modrich & Lahue, 1996). Story et al. (1992)

sugeriram que a formação de agregados de filamentos de RecA, denominados feixes,

seja uma forma de supressão da formação de filamentos de RecA ativos, sugerindo que

a inibição de RecA seja um mecanismo necessário e essencial em algumas situações

particulares. Essas estruturas são formadas na presença (Egelman & Stasiak, 1988) ou

na ausência de DNA e sua formação é inibida pela presença de ADP ou ATP (Brenner

et al., 1988).

As proteínas RecX e DinI de E. coli controlam a atividade de RecA de forma

antagônica (Lusetti et al., 2004b), e fazem parte do grupo de proteínas moduladoras de

RecA, que conta também com as proteínas RecFOR, RecBCD, SSB, LexA e UmuD.

Esta rede regulatória de RecA é bastante complexa em E. coli. Entre as proteínas

regulatórias de RecA, pelo menos duas agem diretamente na disponibilização do DNA

para a proteína RecA. A proteína SSB, que ao interagir com o ssDNA alvo de RecA,

tanto pode agir como moduladora negativa quanto positiva da proteína RecA e o

complexo RecBCD, que catalisa a formação de terminais 3´ que servem de alvo para a

ligação de RecA e a formação do filamento de RecA. Os resultados apresentados neste

trabalho sugerem que além de SSB e RecBCD, a proteína RecX também modula a

atividade de RecA controlando a disponibilidade da molécula alvo dessa proteína.

139 CONCLUSÕES

5 CONCLUSÕES

• As proteínas RecA nativa, RecAHis, RecA mutante L54Q, RecA mutante L54Q

G73A, RecX nativa e RecXHis de Herbaspirillum seropedicae foram

purificadas e caracterizadas bioquimicamente;

• As proteínas RecA e RecX de H. seropedicae (HsRecA e HsRecX) formaram

um complexo de migração eletroforética modificada em relação às proteínas

isoladas;

• As proteínas HsRecA e HsRecX possuem atividade de ligação ao DNA de fita

simples ou dupla na ausência de ATP;

• A proteína HsRecA apresenta uma afinidade aparente maior pelo DNA de fita

simples, enquanto HsRecX, ao DNA de fita dupla;

• A proteína HsRecX liga-se ao DNA fita dupla mesmo na presença de HsRecA;

• O resíduo de leucina na posição 54 da proteína HsRecA está envolvido na

hidrólise de ATP e na troca de fitas de DNA, mas não na ligação do ATP;

• A proteína HsRecX inibe as atividades de hidrólise de ATP e troca de fitas de

DNA da proteína HsRecA, porém não afeta a ligação do ATP;

• A proteína HsRecX aparentemente modula as atividades de HsRecA através da

interação direta RecX-RecA e do controle da disponibilidade do DNA substrato

para a nucleação de RecA ou a extensão do filamento de RecA.

140 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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161 APÊNDICE 1

APÊNDICE 1 OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZADOS NESTE TRABALHO.

OLIGONUCLEOTÍDEOS

SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS

Amplificação dos genes

recA e recX

Universal (23 mers)

GACGTTGTAAAACGACGGCCAGT

Reverso (24 mers)

TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC

recA1 (19 mers)

GAGAGAGACATATG

GACGA

recA2 (27 mers)

AGGGAGCGGATCC

TCAGGAGGCTTTCG

recX1 (27 mers)

TAATCGAACCATATG

CCCAGACCGCCG

recX2 (20 mers)

CGGCGGATCC

ATGCCCAGAC

Seqüenciamento

T7 (19 mers)

TAATACGACTCACTATAGG

T7 terminador

(19 mers)

GCTAGTTATTGCTCAGCGG

Mutagênese sítio-dirigida

Q54L (26 mers)

GCTCACTGGGCCTGGACATCGCCCTG

Q54L* (26 mers)

CAGGGCGATGTCCAGGCCCAGTGAGC

G73A (33 mers)

GTCATCGAGATCTACGCCCCGGAATCCTCGGGC

G73A* (33 mers)

GCCCGAGGATTCCGGGGCGTAGATCTCGATGAC

HMK (36 mers)

CATCATCATCACCGCCGCGCCTCGGTGCCGCGCGGC

HMK* (36 mers)

GCCGCGCGGCACCGAGGCGCGGCGGTGATGATGATG

Ensaios de Retardamento

de migração eletroforética

WVC8 (88 mers)

GAAAGAAAGCCGAGTAGTTTTATTTCAGACGGCTGGCACGACTT

TTGCACGATCAGCCCTGGGCGCGCATGCTGTTGCGCATTCATGT

WVC3

(88 mers)

ACATGAATGCGCAACAGCATGCGCGCCCAGGGCTGATCGTGCAA

AAGTCGTGCCAGCCGTCTGAAATAAAACTACTCGGCTTTCTTTC

Ensaios de Interação

proteína-proteína

LHBT-r (40 mers)

AATTCATATGAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACC

Ensaios de Ligação

covalente proteína-DNA

induzida por luz UV

SRW8 (63 mers)

CAGACGGCTGGCACGACTTTTGCACGATCAGCCCTGGGCGCGCA

TGCTGTTGCGCATTCATGT

SRW3(-7/-6) (63 mers)

ACATGAATGCGCAACAGCATGCGCGCCCAGGGCT#GATCGTGCA

AAAGTCGTGCCAGCCGTCTG

Todas as seqüências estão sendo apresentadas na direção 5'→3'.

Oligonucleotídeo também utilizado na amplificação do gene recX.

Os nucleotídeos sublinhados com um

ou dois traços correspondem aos sítios de

reconhecimento para as enzimas de restrição NdeI e BamHI, respectivamente.

# indica a posição do enxofre no oligonucleotídeo, grupo alvo da derivatização pelo brometo

de azidofenacil

Em negrito estão indicados os nucleotídeos modificados em relação à seqüência original do

DNA molde.

Os oligonucleotídeos foram sintetizados e purificados pela Qiagen, Invitrogen ou Sigma.

162 APÊNDICE 2

APÊNDICE 2 ALINHAMENTO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIOS DAS

PROTEÍNAS RecA DE E. coli e H. seropedicae.

10 20 30 40 50

Ecoli M-----AIDENKQKALAAALGQIEKQFGKGSIMRLGE-DRSMDVETISTGSLSLDIALGA

* :.:*.*******.**********:**: : : :::::*****.******

Hserop MDDKKAANNSEKSKALAAALAQIEKQFGKGSVMRMEDGVIAEEIQAVSTGSLGLDIALGI

10 20 30 40 50 60

60 70 80 90 100 110

Ecoli GGLPMGRIVEIYGPESSGKTTLTLQVIAAAQREGKTCAFIDAEHALDPIYARKLGVDIDN

**** **::**************** ** *: * ************ **:****::::

Hserop GGLPRGRVIEIYGPESSGKTTLTLQSIAEMQKLGGTCAFIDAEHALDVTYAQKLGVNLND

70 80 90 100 110 120

120 130 140 150 160 170

Ecoli LLCSQPDTGEQALEICDALARSGAVDVIVVDSVAALTPKAEIEGEIGDSHMGLAARMMSQ

** ****************.******:*****************::*** ** **:***

Hserop LLISQPDTGEQALEICDALVRSGAVDLIVVDSVAALTPKAEIEGDMGDSLPGLQARLMSQ

130 140 150 160 170 180

180 190 200 210 220 230

Ecoli AMRKLAGNLKQSNTLLIFINQIRMKIGVMFGNPETTTGGNALKFYASVRLDIRRIGAVKE

*:***:*.::::** :************************************** *::*.

Hserop ALRKLTGSINRTNTTVIFINQIRMKIGVMFGNPETTTGGNALKFYASVRLDIRRTGSIKS

190 200 210 220 230 240

240 250 260 270 280 290

Ecoli GENVVGSETRVKVVKNKIAAPFKQAEFQILYGEGINFYGELVDLGVKEKLIEKAGAWYSY

*::*:****:*******:*.**::*.*:****** . **::*** :.*::**:******

Hserop GDEVIGSETKVKVVKNKVAPPFREAHFDILYGEGTSREGEILDLGSEHKVVEKSGAWYSY

250 260 270 280 290 300

300 310 320 330 340 350

Ecoli KGEKIGQGKANATAWLKDNPETAKEIEKKVRELLLSNPNSTPDFSVDDSEGVAETNEDF

:**:***** ** :**::** *:***:*** * .*::: .::*. *::.

Hserop NGERIGQGKDNARNYLKEHPELAREIENKVRVALG-----VPELAGGEAEAEAKAS---

310 320 330 340 350

O alinhamento da seqüência de aminoácidos das proteínas RecA de E. coli (EcRecA) e RecA H.

seropedicae (HsRecA) no programa Clustal W (Thompson et al., 1994) permitiu observar que cada

resíduo n na seqüência de EcRecA, corresponde ao resíduo n+7 na seqüência de HsRecA. A

numeração dos aminoácidos da EcRecA está sendo mostrada acima da sua seqüência e a da HsRecA,

abaixo da sua seqüência. A proteína HsRecA mutante L54Q apresenta o resíduo de leucina (em

amarelo) substituído por glutamina enquanto que a proteína HsRecA mutante L54Q G73A apresenta a

substituição L54Q e a substituição do resíduo de glicina (em azul) por alanina. Aminoácidos idênticos

estão indicados por asterisco (*), substituições conservadas, por dois pontos (:) e substituições semi-

conservadas por um ponto (.), considerando os seguintes grupos:AVFPMILW (resíduos pequenos e

hidrofóbicos, incluindo os aromáticos), DE (resíduos ácidos), RHK (resíduos básicos), STYHCNGQ

(resíduos hidroxil + Amino + básico).

163 APÊNDICE 3

APÊNDICE 3 COMPARAÇÃO ENTRE A SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS E

AMINOÁCIDOS DO VETOR pET28a, pET28b+HMK e, pET28a APÓS

MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA.

pET28a

pET28a após PCR

Mutagênica

trombina

pET28b+HMK

CGCCGCGCCTCG

ArgArgAlaSer

...

CGTCGTGCATCT

ArgArgAlaSer

O retângulo vermelho destaca a seqüência de nucleotídeos e aminoácidos constituintes do sítio de

reconhecimento da quinase HMK (bovine heart muscle kinase) presente nos vetores pET28b+HMK e,

pET28a após mutagênese sítio-dirigida, e ainda destaca os nucleotídeos e aminoácidos presentes no

vetor pET28a em substituição ao sítio HMK.

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