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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES,
TIMP-1 E DA ESCLEROSE VASCULAR NAS ENDOMETRITES
CRÔNICAS DAS ÉGUAS
LOUISIANE DE CARVALHO NUNES
BOTUCATU, MARÇO DE 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASES,
TIMP-1 E DA ESCLEROSE VASCULAR NAS ENDOMETRITES
CRÔNICAS DAS ÉGUAS
LOUISIANE DE CARVALHO NUNES
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, para obtenção do
título de Doutora em Medicina Veterinária
(Área de Concentração: Patologia Animal).
ORIENTADOR: JULIO LOPES SEQUEIRA
BOTUCATU, MARÇO DE 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Nunes, Louisiane de Carvalho.
Avaliação da expressão de metaloproteinases, TIMP-1 e da esclerose
vascular nas endometrites crônicas das éguas / Louisiane de Carvalho Nunes.
– Botucatu : [s.n.], 2006.
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2006.
Orientador: Prof. Dr. Julio Lopes Sequeira.
Assunto CAPES: 50503006
1. Patologia animal. 2. Eqüino. 3. Endométrio. 4. Colágeno.
CDD 636.1089607
Palavras chave: Colágeno; Endométrio; Eqüino; Metaloproteinase;
Vasculatura.
ii
TESE DE DOUTORADO
LOUISIANE DE CARVALHO NUNES
Composição da Banca Examinadora
________________________________________________
Orientador: Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
________________________________________________
Prof
a
. Dra. Ana Maria Reis Ferreira
________________________________________________
Prof. Ass. Dr. Alessandre Hataka
________________________________________________
Prof
a
. Ass. Dra. Noeme Sousa Rocha
________________________________________________
Prof. Dr. Marco Antônio Alvarenga
Botucatu, 06 de março de 2006.
iii
As coisas que amamos,
as pessoas que amamos
são eternas até certo ponto.
Duram o infinito variável
no limite de nosso poder
de respirar a eternidade...
(Carlos Drummond de Andrade)
À minha filha Alice Nunes Viana por ser a grande razão da minha vida, pelas
descobertas de cada dia e por acreditar que todos os esforços realizados nos
dão a chance de um futuro melhor.
Ao meu pai José de Ribamar Nunes Silva pela incansável busca pelo saber e
por me ensinar que o amor supera todos os momentos ruins da vida.
Aos meus irmãos Emanuel de Carvalho Nunes e Emerson Abraão Nunes da
Silva pelo carinho de sempre e por nunca deixarem de acreditar em mim.
DEDICO
iv
Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam a vida inteira.
Esses são os imprescindíveis.
(Bertolt Brecht)
Ao meu eterno orientador, Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira, pela amizade ao
longo destes anos, pela ajuda nos momentos difíceis, pelo exemplo de vida e
por me ensinar que a ética é a maior qualidade do ser humano.
AGRADEÇO
v
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP,
pelo apoio financeiro concedido para a realização deste trabalho.
À pós-graduanda Camila Dias Porto pela parceria na execução deste
trabalho, pela busca incansável pelo perfeccionismo e pela amizade
dispensada ao longo destes oito anos de convivência.
À professora Dra. Noeme Sousa Rocha, Departamento de Clínica
Veterinária da FMVZ, UNESP, Campus de Botucatu, pelo exemplo de
vida, de pesquisadora e por todos os seus ensinamentos.
À professora Dra. Reneé Laufer Amorim, Departamento de Clínica
Veterinária da FMVZ, UNESP, Campus de Botucatu, pela amizade, pela
confiança e por toda ajuda na área de imunoistoquímica.
Ao professor Dr. Marco Antônio Alvarenga, Departamento de
Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ, UNESP,
Botucatu, pela ajuda na catalogação dos blocos de arquivo para a
realização deste trabalho.
Ao professor Dr. Deilson Elgui de Oliveira do Departamento de Patologia
da Faculdade de Medicina da UNESP - Botucatu, por toda a ajuda com
as metaloproteinases e pela amizade.
Ao funcionário do Laboratório de Imunoistoquímica do Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina da UNESP - Botucatu, Marcos
Roberto Franchi pela ajuda valiosa na padronização das técnicas de
imunoistoquímica e histoquímica.
Ao professor Dr. José Tarcísio da Silva Oliveira, Departamento de
Engenharia Rural do Centro de Ciências Agrárias (CCA) da
Universidade Federal do Espírito Santo pela oportunidade da realização
da análise morfométrica junto ao Laboratório de Ciência da Madeira do
NEDTEC e pela amizade.
Ao professor Dr. Sebastião Martins Filho, Departamento de Engenharia
Rural do CCA da Universidade Federal do Espírito Santo pela realização
da análise estatística deste trabalho.
Aos funcionários e residentes do Serviço de Patologia Veterinária da
UNESP pelo convívio amigo e por toda a ajuda dispensada.
vi
Aos todos os pós-graduandos da Medicina Veterinária, em especial a
Christianne, Adriana Wanderley, Anne, Gaspar, Fábio, Sara e Fabíola
pelo convívio amigo e por transformar nossas tristezas em momentos de
muita alegria.
Ao Departamento de Zootecnia e Economia Rural do CCA da
Universidade Federal do Espírito Santo pela liberação para a conclusão
deste trabalho.
Aos novos amigos, professores e alunos, do CCA da Universidade
Federal do Espírito Santo pelo apoio de sempre.
A todos os meus familiares, piauienses, pelas orações feitas e pelo
carinho demonstrado mesmo à distância.
vii
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1. Classificação dos 82 casos de endometrites crônicas diagnosticados no
Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP de acordo com Kenney e Doig
(1986)..........................................................................................................................
31
FIGURA 2. Classificação dos 82 casos de endometrites crônicas diagnosticados no
Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP de acordo com Ricketts e
Alonso (1991)...............................................................................................................
31
FIGURA 3. Amostra P223/01. Endométrio eqüino normal – epitélio luminal (EL),
estrato compacto (EC), estrato esponjoso (EE) e glândulas endometriais (G) sem
sinais de inflamação e/ou fibrose. Coloração de hematoxilina e
eosina..........................................................................................................................
38
FIGURA 4. Amostra P96/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa
/ categoria III. Infiltrado inflamatório mononuclear (seta) e presença de ninho
fibrótico (NF) na região do estrato esponjoso. Coloração de
HE...............................................................................................................................
38
FIGURA 5. Amostra P100/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
degenerativa / categoria III. Fibrose intersticial difusa (F), presença de ninhos
fibróticos (NF), dilatação glandular (DG) e lacunas linfáticas (L) na região do estrato
esponjoso. Coloração de HE......................................................................................
39
FIGURA 6. Amostra B15/92. Endométrio eqüino com endometrite crônica
degenerativa / categoria III. Fibrose intersticial difusa na região do estrato
esponjoso (seta). Coloração de tricrômico de Masson................................................
39
FIGURA 7. Amostra P207/01. Endométrio eqüino normal. Presença predominante
de colágeno fibrilar (seta) - fibras esverdeadas – colágeno tipo III na região do
estrato esponjoso. Coloração de picrosirius red sob
polarização..................................................................................................................
40
FIGURA 8. FIGURA 8. Amostra B27/92. Endométrio eqüino com endometrite
crônica infiltrativa / IIB. Presença de colágeno fibrilar e áreas esparsas com
colágeno denso (seta) - fibras avermalhadas – tipo I na região do estrato
esponjoso. Coloração de picrosirius red sob polarização...........................................
40
FIGURA 9. Amostra P81/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa
/ III. Presença predominante de colágeno denso - tipo I (seta) ao redor de ninho
fibrótico (NF). Coloração de picrosirius red sob polarização.......................................
41
FIGURA 10. Amostra P203/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Espessamento da parede vascular (seta), fibrose perivascular
acentuada (FPV) e presença de lacunas linfáticas (L) na região do estrato
esponjoso. Coloração de Verhöeff Van Gieson..........................................................
41
FIGURA 11. Amostra P203/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Fibrose privascular (seta) e fibroelastose (FE) tipo 3 na região do
estrato esponjoso. Coloração de Verhöeff Van Gieson...............................................
42
viii
Página
FIGURA 12. Amostra P98/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
categoria infiltrativa / III. Alteração vascular grave caracterizada por fibroelastose
(FE) tipo 4, fibrose perivascular (seta) e lacunas linfáticas (L) na região do estrato
esponjoso. Coloração de Verhöeff Van Gieson...........................................................
42
FIGURA 13. Amostra P90/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
categoria degenerativa / III. Marcação positiva de MMP-1 (1:100) nas células do
epitélio glandular (EG), na fibrose periglandular (FPG) na região do estrato
compacto e nas células do epitélio luminal (EL)..........................................................
57
FIGURA 14. Amostra P90/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
degenerativa / III. Marcação positiva de MMP-1 (1:100) nas células do epitélio
glandular e na fibrose periglandular na região do estrato compacto...........................
57
FIGURA 15. Amostra P92/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / IIB. Marcação positiva de MMP-2 (1:200) nas células do epitélio
glandular (EG) no estrato esponjoso............................................................................
58
FIGURA 16. Amostra P99/04. Endométrio eqüino com endometrite infiltrativa / IIB.
Marcação positiva de MMP-2 (1:200) na parede vascular (PV) e células estromais
(setas) no estrato esponjoso........................................................................................
58
FIGURA 17. Amostra P208/01. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / IIB. Marcação positiva de MMP-7 (1:100) nas células inflamatórias intra-
epiteliais luminais (seta)..............................................................................................
59
FIGURA 18. Amostra P202/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Marcação positiva de MMP-7 (1:100) em células inflamatórias intra-
epiteliais glandulares (setas) na região do estrato esponjoso.....................................
59
FIGURA 19. Amostra P91/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Marcação positiva de MMP-9 (1:100) nas células do epitélio luminal
(EL), epitélioglandular (EG) e nas células endoteliais (seta) na região do estrato
compacto......................................................................................................................
60
FIGURA 20. Amostra P201/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Intensa marcação positiva de MMP-9 (1:100) nas células do epitélio
glandular (EG) e estromais (seta) na região do estrato
compacto......................................................................................................................
60
FIGURA 21. Amostra P03/05. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Intensa marcação positiva de TIMP-1 (1:100) nas células do epitélio
luminal (EL) e nas células inflamatórias na região do estrato compacto
(seta)............................................................................................................................
61
FIGURA 22. Amostra P82/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Intensa marcação positiva de TIMP-1 (1:100) nas células do epitélio
glandular (EG) e na parede vascular (seta) na região do estrato
esponjoso......................................................................................................................
61
ix
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1. Anticorpos primários, concentrações testadas e utilizadas nas
reações imunoistoquímicas das biopsias uterinas de éguas com
endometrite crônica.....................................................................................
.
25
TABELA 2. Classificação das endometrites crônicas de acordo com
Kenney e Doig, (1986)................................................................................
27
TABELA 3. Classificação das endometrites crônicas de acordo com
Ricketts e Alonso (1991).............................................................................
27
TABELA 4. Classificação das alterações vasculares do endométrio
eqüino de acordo com Inoue et al. (2000)..................................................
28
TABELA 5. Tipo de colágeno predominante nas 82 amostras de
endometrites crônicas diagnosticadas no Serviço de Patologia Veterinária
da UNESP, Botucatu, SP...........................................................................
34
TABELA 6. Tipo de colágeno predominante nas diferentes categorias de
endometrites crônicas eqüinas diagnosticadas de acordo com Kenney e
Doig (1986).................................................................................................
34
TABELA 7. Tipo de colágeno predominante nas diferentes categorias de
endometrites crônicas eqüinas diagnosticadas de acordo com Ricketts e
Alonso (1991).............................................................................................
34
TABELA 8. Distribuição do colágeno total no endométrio eqüino nas
diferentes categorias de endometrites crônicas diagnosticadas de acordo
com Kenney e Doig (1986).........................................................................
35
TABELA 9. Distribuição do colágeno total no endométrio eqüino nas
diferentes categorias de endometrites crônicas diagnosticadas de acordo
com Ricketts e Alonso (1991).....................................................................
35
TABELA 10. Graus de fibroelastose (INOUE et al., 2000) nas 82
amostras de endometrites crônicas diagnosticadas no Serviço de
Patologia Veterinária da UNESP, Botucatu, SP..........................................
36
TABELA 11. Graus de fibroelastose vascular (INOUE et al., 2000)
observados nas diferentes categorias de endometrites crônicas eqüinas
diagnosticadas de acordo com Kenney e Doig
(1986)..........................................................................................................
36
TABELA 12. Graus de fibroelastose vascular (INOUE et al., 2000)
observados nas diferentes categorias de endometrites crônicas eqüinas
diagnosticadas de acordo com Ricketts e Alonso
(1991)...........................................................................................................
37
x
Página
TABELA 13. Valores medianos dos graus de fibroelastose da vasculatura
endometrial (INOUE et al., 2000) nas diferentes categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).....
37
TABELA 14. Valores medianos dos graus de fibroelastose da vasculatura
endometrial (INOUE et al., 2000) nas diferentes categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991)..
37
TABELA 15. Valores percentuais da fibrose periglandular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
44
TABELA 16. Valores percentuais da fibrose periglandular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991)...............................................................................................
44
TABELA 17. Valores percentuais da fibrose perivascular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
44
TABELA 18. Valores percentuais da fibrose perivascular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991)...............................................................................................
44
TABELA 19. Valores medianos da expressão de MMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
46
TABELA 20. Valores medianos da expressão de MMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991)...............................................................................................
46
TABELA 21. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-1
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986)......
47
TABELA 22. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-1
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991)..
47
TABELA 23. Valores medianos da expressão de MMP-2 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
49
TABELA 24. Valores medianos da expressão de MMP-2 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991)..............................................................................................
49
xi
Página
TABELA 25. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-2
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986)......
49
TABELA 26. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-2
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991)..
50
TABELA 27. Valores medianos da expressão de MMP-7 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
51
TABELA 28. Valores medianos da expressão de MMP-7 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991)..............................................................................................
51
TABELA 29. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-7
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986)......
51
TABELA 30. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-7
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso
(1991)...........................................................................................................
52
TABELA 31. Valores medianos da expressão de MMP-9 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
53
TABELA 32. Valores medianos da expressão de MMP-9 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991) .............................................................................................
53
TABELA 33. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-9
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986)......
53
TABELA 34. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-9
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991)..
54
TABELA 35. Valores medianos da expressão de TIMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986)..................................................................................................
55
TABELA 36. Valores medianos da expressão de TIMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991)...............................................................................................
55
xii
Página
TABELA 37. Valores medianos da intensidade da marcação de TIMP-1
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986)......
56
TABELA 38. Valores medianos da intensidade da marcação de TIMP-1
nos diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991)..
56
xiii
SUMÁRIO
Página
RESUMO................................................................................................. 01
ABSTRACT....................................................................................... ..... 02
1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 03
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................ 04
3 OBJETIVOS......................................................................................... 19
3.1 Objetivos gerais.............................................................................. 19
3.2 Objetivos específicos...................................................................... 19
4 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 20
4.1 Procedência do material................................................................. 20
4.2 Levantamento dos casos................................................................ 20
4.3 Processamento do material............................................................ 20
4.4 Avaliação histoquímica................................................................... 21
4.4.1 Método de Tricrômico de Masson...........................................
21
4.4.2 Método de Picrosirius Red..................................................... 22
4.4.3 Método de Verhöeff Van Gieson............................................ 22
4.5 Avaliação imunoistoquímica........................................................... 23
4.5.1 Padronização das técnicas de imunofenotipagem ................ 23
4.5.2 Anticorpos utilizados............................................................... 24
4.5.3 Roteiro de aplicação da técnica de imunoistoquímica........... 24
4.5.3.1 Preparação das lâminas.................................................... 24
4.5.3.2 Obtenção dos cortes histológicos...................................... 24
4.5.3.3 Bloqueio da peroxidase endógena.................................... 24
4.5.3.4 Recuperação antigênica................................................... 25
4.5.3.5 Incubação com o anticorpo primário.................................. 25
4.5.3.6 Complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC)..................... 26
4.5.3.7 Revelação.......................................................................... 26
4.6 Análise do material......................................................................... 26
4.6.1 Aplicação da classificação das endometrites crônicas
eqüinas....................................................................................................
26
4.6.2 Análise qualitativa do colágeno endometrial.......................... 27
4.6.3 Análise da esclerose e fibroelastose vascular........................ 28
4.6.4 Análise morfométrica.............................................................. 29
4.6.5 Análise imunoistoquímica....................................................... 29
4.7 Análise estatística........................................................................... 30
5 RESULTADOS......................................................................................
31
5.1 Classificação histológica das endometrites
crônicas...................................................................................................
31
5.2 Avaliação histoquímica................................................................... 32
5.2.1 Tricrômico de Masson............................................................ 32
5.2.2 Picrosirius Red....................................................................... 32
5.2.3 Verhöeff Van Gieson.............................................................. 35
5.3 Análise morfométrica...................................................................... 43
5.4 Avaliação imunoistoquímica........................................................... 45
5.4.1 Metaloproteinase 1 (MMP-1).................................................. 45
5.4.2 Metaloproteinase 2 (MMP-2).................................................. 47
5.4.3 Metaloproteinase 7 (MMP-7).................................................. 50
xiv
Página
5.4.4 Metaloproteinase 9 (MMP-9).................................................. 52
5.4.5 Inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP-1)................. 54
6 DISCUSSÃO........................................................................................ 62
6.1 Considerações finais...................................................................... 73
7 CONCLUSÕES.................................................................................... 75
8 BIBLIOGRAFIA..................................................................................... 77
9 TRABALHO CIENTÍFICO..................................................................... 85
RESUMO
NUNES, L.C. Avaliação da expressão de metaloproteinases, TIMP-1 e da
esclerose vascular nas endometrites crônicas das éguas. 2006. 99p. Tese
(Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, 2006.
A endometrite é a principal causa de subfertilidade em éguas sendo o processo
fibrótico fator limitante no desempenho reprodutivo nesta espécie. Este trabalho
teve por objetivos avaliar o colágeno presente nas endometrites crônicas das
éguas, a expressão das enzimas que degradam o colágeno e de seus
inibidores e as alterações vasculares. 82 biópsias uterinas recebidas na FMVZ,
UNESP, Botucatu, SP foram classificadas histologicamente e a fibrose foi
avaliada pelos métodos de tricrômico de Masson e picrosirius red. A avaliação
vascular foi feita pelo VVG. Verificou-se a expressão das enzimas MMP-1,
MMP-2, MMP-7, MMP-9 e TIMP-1 por método imunoistoquímico. A quantidade
de colágeno na fibrose endometrial foi maior nas regiões periglandulares,
perivasculares e no estrato esponjoso, predominando o colágeno tipo I. Quanto
maior o grau de endometrite mais acentuada era a esclerose vascular e a
fibroelastose. Não houve diferença na expressão das MMP-1, MMP-2, MMP-7,
MMP-9 e TIMP-1 entre éguas normais e com endometrites. Porém houve
diferença em relação à intensidade de marcação notando-se que esta
aumentava em determinadas regiões do endométrio. As MMPs e o TIMP-1
estão envolvidos nos processos fibróticos endometriais das éguas uma vez que
estas enzimas variam em expressão e intensidade de reação conforme o grau
de endometrite.
Palavras-chave: endométrio, eqüino, MMP, TIMP, vasculatura, colágeno
ABSTRACT
NUNES, L.C. Metalloproteinases and TIMP-1 expressions and evaluation
of the vascular sclerosis in chronic endometritis of mares. 2006. 99p.
Thesis (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2006.
Endometritis is the main cause of mare subfertility and the associated uterine
fibrotic process is a limitant factor for the reproductive performance. The aim of
this work was to evaluate the collagen distribution and type, the enzymes that
are responsible for collagen degradation and its inhibitors, and vascular
changes in the endometrium of normal and chronic endometritis carrying mares.
So a prospective and comparative study was conducted at Veterinary Hospital
of Veterinary College UNESP, Botucatu-SP. Eighty-two uterine biopsy were
histologically classified in paraffin sections stained with hematoxylin and eosin,
Masson's Trichrome and Verhoeff van Gieson (VVG) stains examined under the
light microscope. Picrosirius red polarization was also used for collagen
evaluation. The MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, and TIMP-1 expressions was
obtained by immunohistochemichal method. The collagen concentration in
fibrotic endometrium was higher at periglandular, perivascular and stratum
spongiosum regions with collagen type I predominance. In the most severe
endometritis had more advanced grades of vascular sclerosis and
fibroelastosis. No difference was found in MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, and
TIMP-1 expressions between normal and chronic endometritis samples, but the
immunohistochemical reaction was more intense in some regions of fibrotic
endometrium. In conclusion, the MMPs and TIMP-1 showed variation in
expression and reaction intensity in the normal and chronic affected
endometrium and may plays a hole in the endometrial fibrotic process.
Key Words: endometrium, equine, MMP, TIMP, vasculature, collagen
3
1 INTRODUÇÃO
As endometrites crônicas são tidas como a principal causa de
subfertilidade nas éguas. O estudo realizado por Traub-Dargatz, Salman e
Voss (1991) nos Estados Unidos revelou que a endometrite é o terceiro maior
problema que ocorre em eqüinos adultos levando a redução anual do número
de potros e, conseqüentemente, grandes perdas econômicas.
As endometrites crônicas exibem padrões morfológicos caracterizados por
lesões inflamatórias e fibróticas. A fibrose representa um fator limitante na
performance reprodutiva da égua uma vez que é irreversível e contribui de
maneira significativa para a morte embrionária precoce. A patogênese da
fibrose ainda permanece desconhecida, embora a idade, o número de parições
e os processos inflamatórios crônicos do útero sejam indicados como fatores
contributivos.
A deposição de colágeno em torno das estruturas endometriais durante os
processo fibróticos está associada ao remodelamento tecidual que envolve a
síntese e a degradação da matriz extracelular. As metaloproteinases (MMPs)
são enzimas que participam deste processo e são secretadas por vários tipos
celulares e estimuladas por vários fatores dentre estes as citocinas e os fatores
de crescimento. Estas enzimas podem ser inativadas pelos inibidores teciduais
de metaloproteinases (TIMPs) que previnem a ação descontrolada das MMPs.
Por outro lado, as alterações vasculares podem estar relacionadas aos
processos de degeneração do endométrio, mas também podem estar
relacionadas com a idade avançada. Alguns autores sugerem que as
alterações vasculares contribuem para o aparecimento da fibrose endometrial,
mas a relação destas com o ambiente uterino e a idade dos animais e a
influência destes fatores na endometrose ainda não estão esclarecidos.
Com base nestes dados este trabalho foi realizado no intuito de entender
melhor os mecanismos envolvidos nas endometrites crônicas das éguas
avaliando as alterações vasculares, a deposição de colágeno e a participação
das enzimas envolvidas neste processo.
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
O útero eqüino é constituído de três camadas: o endométrio (camada
mucosa interna), o miométrio e o perimétrio mais externamente (BANKS,
1992).
O endométrio por sua vez é composto por duas camadas: o epitélio
luminal e a lâmina própria. Esta última se estende da membrana basal do
epitélio luminal à camada circular interna do miométrio. O epitélio luminal
consiste de células cuboidais a colunares altas, sobre a membrana basal e
variam de tamanho de acordo com o ciclo estral (KENNEY, 1978). Este epitélio
é composto por células ciliadas e não ciliadas ou células secretoras que
apresentam microvilosidades (CHIARINI-GARCIA, 1999).
A lâmina própria, onde se localizam as numerosas glândulas
endometriais, é composta pelos estratos compacto e esponjoso, de acordo com
a densidade das células do estroma. O estrato compacto é caracterizado por
alta densidade celular, numerosos capilares localizados logo baixo da
membrana basal e um delicado emaranhado de fibras reticulares. Já o estrato
esponjoso é caracterizado, principalmente, por baixa densidade celular,
conferindo-lhe uma aparência esponjosa pela presença de capilares, arteríolas,
vênulas, pequenas artérias musculares e numerosos vasos linfáticos
(AMARAL, 2002)
As glândulas endometriais tubulares presentes na lâmina própria são
conectadas ao epitélio luminal por meio de ductos, localizadas principalmente
no estrato compacto. Estes ductos normalmente não apresentam ramificações
como acontece nas porções médias e basal, localizadas no estrato esponjoso,
onde as glândulas endometriais podem apresentar cerca de dez ou mais
ramificações primárias e secundárias (KENNEY, 1978).
Os produtos da secreção dos epitélios luminal e glandular incluem muco,
lipídios, glicogênio e proteínas (BANKS, 1992). Segundo Gray et al (2001) as
glândulas endometriais sintetizam e secretam ou transportam um complexo
grupo de proteínas e substâncias denominadas histotróficas que são
essenciais para o desenvolvimento do concepto (embrião e membranas
placentárias associadas).
5
As secreções uterinas são importantes para a sobrevivência e
desenvolvimento do concepto particularmente em ovelhas, vacas, porcas e
éguas onde um prolongado período de pré-implantação do embrião precede à
adesão e placentação (GRAY et al., 2001).
Em uma égua normal o útero está protegido das contaminações externas
pelas barreiras físicas que consiste da vulva, do vestíbulo, da vagina e da
cérvix e qualquer comprometimento em uma destas barreiras pode levar à
infecção crônica do útero (TROEDSSON, 1999).
Um estudo realizado nos Estados Unidos demonstrou que a endometrite é
o terceiro maior problema que acomete animais adultos, sendo o primeiro a
cólica seguida dos problemas do trato respiratório (TRAUB-DARGATZ;
SALMAN e VOSS, 1991).
Até relativamente recente as éguas eram classificadas como suscetíveis
ou resistentes às endometrites baseadas na sua capacidade de eliminar
infecções uterinas dentro de um determinado período de tempo ou baseado no
escore da biópsia endometrial (WATSON, 2000). Éguas férteis realizam a
limpeza uterina dentro de 24 a 36 horas após a cobertura. Isto ocorre antes do
embrião entrar no útero, cerca de 5,5 dias após a ovulação (LEBLANC, 2003).
Segundo Troedsson (1999), após a fertilização o zigoto permanece no oviduto
de cinco a seis dias sendo, depois deste período, o concepto transportado até
o lúmen uterino. Quando a endometrite persiste por mais de cinco dias, quando
o embrião entra no lúmen uterino, o ambiente citotóxico não permite a
manutenção da gestação (WATSON, 2000).
De acordo com Alghamdi et al. (2001) em éguas normais há um influxo de
polimorfonucleares (PMNs) para o lúmen uterino dentro de uma hora após a
cobertura. Estas células aumentam em número de seis a 12 horas e diminuem
de 24 a 48 horas. Entretanto esta inflamação pode se desenvolver em condição
patológica se a égua não eliminar os fluidos e produtos inflamatórios
adequadamente.
Estudos em camundongo sugerem que a presença de fluido, bactérias e
produtos inflamatórios são incompatíveis com a sobrevivência do embrião, se
isto também se aplicar às éguas, o útero de uma égua normal pode ser capaz
de espontaneamente desenvolver endometrite pós-cobertura e causar a morte
embrionária (TROEDSSON, 1999).
6
Defeitos anatômicos da genitália, defeitos na contratilidade endometrial,
baixa resposta imune, baixa produção de muco, inadequada drenagem linfática
ou uma combinação destes fatores predispõem ao aparecimento da
endometrite (WATSON, 2000).
A deposição de sêmen no ambiente intra-uterino predispõe a uma reação
inflamatória resultando de contaminação bacteriana do ejaculado ou dos
espermatozóides. Em um estudo recente, aproximadamente 15% da população
de éguas normais desenvolveu endometrite persistente pós-cobertura
(TROEDSSON, 1999).
Troedsson (1999) cita que a inflamação persistente do endométrio resulta
em luteólise prematura e perda embrionária precoce devido ao aumento das
concentrações de prostaglandina F
2
α (PGF
2
α). No entanto, Ghinter (1992)
afirma que a relação entre a inflamação uterina com luteólise secundária e
baixos níveis de progesterona induzem à morte embrionária precoce.
Segundo Silva et al. (1987) éguas com afecções severas do endométrio
não são completa e definitivamente estéreis, exceto aquelas com problemas
genéticos graves como aberrações cromossômicas.
A biópsia uterina, quando associada ao histórico reprodutivo e exame
ginecológico, é uma ferramenta valiosa utilizada freqüentemente na avaliação
da fertilidade da égua (RICKETTS, 1975). Esta técnica tem se mostrado de
grande valor no auxílio ao diagnóstico de processos patológicos do endométrio
fornecendo uma base para o prognóstico e tratamento de éguas subférteis
(MANSOUR; FERREIRA e FONSECA, 1999).
A biópsia endometrial pode ser utilizada em éguas vazias após a estação
de monta, com repetição de cio, com histórico de morte embrionária precoce e
com endometrite clínica ou piometra. A biópsia também pode ser de grande
valor para o prognóstico de correções cirúrgicas de anormalidades da genitália
como urovagina, adesões ou lacerações cervicais e neoplasias do trato genital
(KENNEY e DOIG, 1986).
Estudos de microscopia de luz no endométrio eqüino têm revelado:
padrões do desenvolvimento cíclico endometrial, morfologia celular no pós-
parto e alterações patológicas do endométrio (FERREIRA-DIAS; NEQUIN e
KING, 1999).
7
Nielsen (2005) mostrou que a avaliação histológica de biópsias
endometriais representa o melhor método para o diagnóstico de endometrite e
infecção uterina. Segundo este mesmo autor a histologia endometrial permite a
detecção da resposta inflamatória causada por diferentes agentes infecciosos e
de desordens degenerativas crônicas do endométrio na mesma amostra.
As alterações histopatológicas apresentadas pelo endométrio eqüino
foram descritas em detalhes por Kenney (1978) e incluem os processos
inflamatórios agudos ou crônicos e as alterações crônicas degenerativas como
fibrose, dilatação cística e lacunas linfáticas.
Várias têm sido as metodologias propostas para classificação do
endométrio com o objetivo de se avaliar o potencial reprodutivo da égua. A
classificação mais amplamente utilizada foi proposta por Kenney (1978) e
modificada por Kenney e Doig (1986), segundo a qual o endométrio da égua
pode ser classificado em quatro categorias (I, IIA, IIB e III) de acordo com a
presença, distribuição e intensidade das lesões observadas na lâmina própria.
Neste sistema, quanto maior o grau de classificação da biópsia, menor é a
probabilidade do endométrio suportar uma gestação.
Ricketts e Alonso (1991) observaram que as endometrites poderiam estar
ou não acompanhadas por infiltrado mononuclear, denominando de
endometrite crônica infiltrativa as que apresentavam sinais de inflamação e
fibrose e de doença endometrial degenerativa crônica (endometrose) aquelas
em que estavam presentes apenas ninhos ou cistos glandulares associados à
fibrose periglandular ou difusa.
A endometrite crônica infiltrativa e a doença endometrial degenerativa
crônica são as duas alterações histopatológicas mais comumente observadas
nas biópsias endometriais de éguas inférteis e subférteis (RICKETTS e
ALONSO, 1991). Ricketts e Barrelet (1997) realizaram um estudo retrospectivo
em 4241 biópsias uterinas eqüinas e encontraram que 92% das amostras
revelaram endometrite crônica infiltrativa, 56% endometrite degenerativa e 55%
mostraram endometrite aguda com infiltrado inflamatório polimorfonuclear.
A endometrite provavelmente tem origem multifatorial sendo que a falha
do clearance uterino certamente contribui para isto. A endometrose é definida
como uma condição degenerativa que resulta de inflamação aguda. As éguas
8
com endometrose podem falhar para conceber e manter a prenhez e isto pode
resultar em infecções crônicas uterinas (DASCANIO et al., 1998).
Doig, McNight e Miller (1981) citaram que a doença endometrial
degenerativa crônica é uma condição progressiva inevitável e está associada
mais com os efeitos da idade do que com o número de partos. Já Watson
(2000) afirma que a endometrose não é uma condição pós-cobertura, embora
esteja associada à falha do clearance uterino, mas também pode ser resultado
de repetidas inflamações e do avanço da idade.
As alterações degenerativas, embora não necessariamente irreversíveis,
tendem a ser progressivas e contribuem para o declínio do potencial de
fertilidade. Existem hipóteses que a endometrite crônica infiltrativa seja um
sinal de resposta imune local e que a endometrite degenerativa seja a resposta
à inflamação crônica, aumento da idade e/ou possíveis fatores endócrinos
(RICKETTS e ALONSO, 1991).
Um estudo realizado por Papa et al. (1998) revelou que de 17 éguas que
apresentaram morte embrionária precoce, nove mostraram endometrite aguda
e/ou crônica, duas apresentaram fibrose periglandular e seis apresentaram
combinação de ambos, sugerindo que os processos inflamatórios que
envolvem o endométrio representam a maior causa de morte embrionária nesta
espécie.
Ekici et al. (2001) realizaram um estudo em éguas que apresentavam
problemas reprodutivos há mais de dois anos. Neste estudo foram utilizadas 36
éguas entre 7 e 18 anos de idade, classificadas segundo Kenney e Doig (1986)
como categoria IIA, IIB e III. Após a inseminação apenas 3 de 8 éguas da
categoria IIA emprenharam. Nenhuma égua dos outros grupos obteve prenhez
demonstrando que éguas com endometrites crônicas têm reduzida capacidade
de manter a gestação.
Dascanio et al. (1998) relataram que éguas com endometrose podem ter
cistos ou problemas de clearance uterinos. Isto pode ser devido à idade, visto
que éguas velhas apresentam má conformação perineal, baixo tônus
miometrial e fibrose uterina aumentada quando comparadas com éguas jovens.
Ricketts e Alonso observaram que éguas velhas, independente das alterações
relacionadas ao sêmen, infecções, prenhez, partos e/ou involução uterina pós-
parto apresentaram sinais avançados de doença degenerativa endometrial.
9
Os cistos endometriais podem afetar a fertilidade quando numerosos ou
aumentados de tamanho e interferem com a motilidade embrionária, absorção
de nutrientes pelo concepto, reconhecimento materno da gestação e
placentação (DASCANIO et al., 1998). A atrofia do endométrio também
interfere com a fertilidade e tem sido relacionada a um processo de
envelhecimento do útero da égua. Este quadro de atrofia endometrial é
geralmente complicado pela presença de endometrite crônica (TROEDSSON e
LUI, 1991).
Ferreira-Dias, Nequin e King (1999) encontraram uma população
dominante de células claras ricas em estruturas degeneradas e poucas células
ciliadas nas glândulas endometriais de éguas classificadas na categoria III
sugerindo que estes achados sejam sinais de processos patológicos nestas
éguas. Estes mesmos autores afirmaram que se as células claras são células
glandulares lesadas isto pode ser resultado de suprimento sanguíneo
inadequado para as glândulas ou devido à barreira fibrótica depositada em
torno destas.
A detecção da fibrose endometrial pode refletir alterações degenerativas e
inflamatórias do endométrio. Entretanto, a identificação de vários graus de
fibrose difusa ou periglandular em combinação com a infiltração de células
inflamatórias indicam exposição persistente ao agente (TROEDSSON;
MORAES e LIU, 1993).
A fibrose periglandular pode lesar a superfície endometrial, reduzir o
crescimento microcotiledonário, reduzir a taxa de crescimento fetal e alterar a
secreção de substâncias histotróficas (EVANS; MILLER e GANJAM, 1998).
A fibrose é um dos principais elementos da reação tecidual, sendo,
portanto, importante a determinação de seu arranjo, localização e composição
para se avaliar o grau de comprometimento do endométrio (NUNES, 2003).
Entretanto a patogênese da fibrose periglandular ainda permanece
desconhecida, embora a idade, o número de parições e o uso de medicações
cáusticas intra-uterinas possam contribuir para o aparecimento do processo
(EVANS; MILLER e GANJAM, 1998).
A avaliação do grau de fibrose endometrial é importante, pois, ao contrário
das alterações inflamatórias, é permanente. Nestas lesões a deposição de
colágeno ocorre mais comumente ao redor das glândulas ou associada à
10
membrana basal (KENNEY e DOIG, 1986). A fibrose pode estar localizada no
estrato esponjoso, envolvendo a base das glândulas, resultando na formação
dos ninhos fibróticos, ou ainda no estrato compacto envolvendo os ductos das
glândulas, o que pode comprometer o fluxo de secreção, resultando na
dilatação glandular e formação de cistos (AMARAL, 2002).
É comum na prática laboratorial utilizar colorações como o tricrômico de
Masson para avaliação de amostras endometriais. Este método tem sido
utilizado para identificar a fibrose endometrial patológica (BLANCHARD et al.,
1987). O aumento do número de camadas de tecido conjuntivo em volta das
glândulas endometriais correlaciona-se significativamente com baixa fertilidade:
éguas com uma média menor do que três camadas de fibrose periglandular
têm 75% de probabilidade de levar uma gestação a termo, enquanto que éguas
com uma média maior do que 3,5 camadas apresentam um prognóstico pior
(25%) para fertilidade (LEISCHMAN; MILLER e DOIG, 1982)
Embora as fibras colágenas apareçam geralmente bem coradas por este
método, outras estruturas que contém colágeno (como as fibras reticulares e as
membranas basais) não são coradas seletivamente pelos métodos tricrômicos.
Deste modo, os vários tipos de colágeno não podem ser distinguidos (CALDINI,
1992).
Outro método também utilizado é o de Picrosirius Red associado à
microscopia de polarização. Este método histoquímico é específico para
detecção de estruturas compostas de moléculas de colágeno orientadas
(MONTES e JUNQUEIRA, 1991). Este método provou ser útil para o estudo
dos diferentes tipos de colágeno em cortes histológicos obtidos de amostras
normais e em vários modelos patológicos (JUNQUEIRA et al., 1980).
Segundo Andrade et al. (1999) o exame ao microscópio de luz polarizada
de cortes corados pelo método de Picrosirius representa um eficiente meio
para estudar a cronologia das lesões fibróticas. Também é utilizado para
estudar a distribuição dos colágenos Tipo I e Tipo III. O primeiro aparece na
forma de fibras espessas, amareladas ou avermelhadas, birrefringentes e o
segundo com birrefrigência fraca, caracterizado por fibras esverdeadas.
Há evidências de que, em lesões granulomatosas com fibrose persistente,
ocorre formação progressiva de pontes de ligação de colágeno e conseqüente
11
bloqueio de sítios de reação com as enzimas colagenolíticas, o que impede a
degradação das moléculas de colágeno (ANDRADE et al., 1999).
A presença de quantidades crescentes de colágeno ao redor das
glândulas e logo abaixo da membrana basal do epitélio luminal provavelmente
interfere na fisiologia normal das células glandulares e do epitélio luminal, uma
vez que impedem o intercâmbio normal entre estas estruturas e os capilares
adjacentes (KENNEY, 1978).
No que diz respeito ao endométrio eqüino o estudo histoquímico e ultra-
estrutural do colágeno na fibrose periglandular revelou que a base molecular da
fibrose endometrial eqüina reside na substituição do colágeno tipo III, presente
na maior parte da lâmina própria do endométrio, por colágeno do tipo I, o que
demonstra que o colágeno está envolvido nas bases moleculares desta
patologia (CALDINI, 1992).
Walter et al. (2001) avaliaram a presença de colágeno tipo I, III, IV,
laminina e fibronectina em éguas normais e com endometrose e observaram
que a distribuição do colágeno tipo I foi dependente do estágio no ciclo estral.
Estes mesmos autores demonstraram que as éguas com endometrose
apresentaram arranjo das fibras colágenas tipo I e III semelhante ao das éguas
normais.
Nunes (2003) estudando o padrão de distribuição e tipos de colágeno nas
endometrites crônicas observou que havia maior concentração nas regiões
periglandular e perivascular e no estrato esponjoso. Ao correlacionar a
gravidade da endometrite com a distribuição do colágeno, concluiu que quanto
mais grave o grau, mais acentuado o acúmulo de colágeno ao redor das
glândulas. Verificou também que o colágeno do tipo I foi mais freqüente nas
lesões fibróticas periglandulares nas biópsias incluídas nas categorias IIB e III.
Walter et al. (2001) afirmaram que a fibrose periglandular em amostras
com endometrose não é caracterizada pelo aumento da incidência de fibras
colágenas, mas pelo arranjo de fibroblastos periglandulares, em uma ou mais
camadas. Segundo estes mesmos autores os fibroblastos se diferenciam em
miofibroblastos e trazem sérias conseqüências ao epitélio glandular uterino ou
às células estromais, tendo em vista que os miofibroblastos são capazes de
produzir citocinas e que estas interferem com a produção e degradação da
matriz extracelular.
12
Segundo Montenegro e Franco (1999) o que leva as células do tecido
conjuntivo a proliferar e secretar os componentes da matriz extracelular são
mensageiros químicos sob a forma de peptídeos secretados por vários tipos
celulares (citocinas). Entre estas células, os macrófagos e os linfócitos T estão
entre as mais importantes. Segundo Walter et al. (2001) os fibroblastos
representam um papel essencial na síntese e regulação do tecido conjuntivo e
estão envolvidos no processo fibrótico.
Vários estudos têm revelado que a matriz extracelular não apenas fornece
aos tecidos um suporte estrutural, mas também troca informações com as
células, modulando uma série de processos que incluem: desenvolvimento,
migração celular, adesão, diferenciação e reparo (BRANTON e KOPP, 1999;
MARTINEZ-HERNANDEZ, 1999). A síntese e degradação da matriz
acompanham dentre outros fatores os processos fibróticos (COTRAN; KUMAR
e COLLINS, 1999).
Mansour, Henry e Ferreira (2003) verificaram a distribuição de
componentes da matriz extracelular em amostras de endométrio eqüino
durante o ciclo estral. Estes autores encontraram que o colágeno IV estava
presente na membrana basal das glândulas endometriais e do epitélio luminal
e, ainda, nos capilares sangüíneos. Também foi verificada a expressão de
laminina e fibronectina. A laminina foi observada na membrana basal das
glândulas endometriais e dos capilares sangüíneos e a fibronectina no
interstício endometrial e nos vasos sangüíneos.
Segundo Branton e Kopp (1999) em circunstâncias normais, no
remodelamento tecidual, a taxa de síntese das proteínas da matriz são
balanceadas por proteínas de degradação, catalizadas por várias famílias de
enzimas, incluindo plasmina e metaloproteinases (MMPs).
O plasminogênio é produzido no fígado e nos rins e é liberado para outros
tecidos pela circulação. A plasmina é a enzima na forma ativa e degrada
fibrina, fibronectina e laminina e ativa as gelatinases, colagenases e fator
transformador do crescimentoβ (TGF-β) (BRANTON e KOPP, 1999).
As MMPs constituem mais de 20 tipos e são divididas em quatro grupos:
as colagenases intersticiais (MMP-1, MMP-8 e MMP-13) que degradam os
colágenos fibrilares I, II e III; as gelatinases (MMP-2 e MMP-9) que degradam o
colágeno amorfo e fibronectina; as estromalisinas (MMP-3, MMP-7 e MMP-10)
13
que degradam componentes da membrana basal como colágeno IV e V,
laminina e outras proteínas como a fibronectina; as metaloproteinases tipo
membrana (MT-MMP) que degradam colágeno I e III, fibronectina, laminina,
entactina/nidogênio, tenascina e perlecan e ainda ativam outras MMPs
(BRANTON e KOPP, 1999; GOFFIN et al., 2003).
Segundo Contran, Kumar e Collins (1999) as MMPs são secretadas por
macrófagos, neutrófilos, células epiteliais, fibroblastos, células sinoviais, dentre
outras. A secreção é induzida por vários fatores dentre estes as citocinas e os
fatores de crescimento. De acordo com Branton e Kopp (1999) as MMPs
podem ser inativadas pelos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMP-1,
TIMP-2 e TIMP-3) que são produzidos principalmente por células
mesenquimais e previnem a ação descontrolada das MMPs.
González et al. (2002) citam que as MMPs são uma família de enzimas
com características em comum: (1) existem na forma de pró-enzimas, que são
biologicamente inativas, ou como enzimas ativas que tem alto grau de
afinidade pelos substratos dos componentes do tecido conjuntivo como os
colágenos, elastina e proteoglicanas; (2) têm complexos mecanismos de
ativação que podem envolver uma ou mais etapas nas quais ocorre proteólise
parcial ou remodelamento estrutural da pró-enzima resultando na descoberta
do seu local de ação (que contém zinco e requer cálcio para a sua função
catalizadora); e (3) são sujeitas à inativação por complexos inbidores (TIMPs).
As metaloproteinases da família das estromalisinas estão envolvidas em
algumas funções do trato reprodutivo humano incluindo ovulação, placentação,
implantação, partos e involução uterina pós-parto (OSTEEN et al., 1994). Estes
mesmos autores citam que as estromalisinas também participam de outros
processos como a morfogênese dos órgãos durante o desenvolvimento
embrionário e processos patológicos de neoplasias invasivas e metástases.
A avaliação da expressão de MMP-2, MMP-9 e TIMPs foi realizada por
Riley et al (2001) durante o crescimento folicular em ovários eqüinos. Os
resultados desta avaliação mostraram que a MMP-2 e a MMP-9 estavam
localizadas nas células estromais, células da granulosa e da teca. Os TIMP-1,
TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4 estavam presentes nas células da granulosa e da
teca dos folículos e associados ao estroma ovariano. Os autores deste estudo
sugerem que as MMPs e os TIMPs estejam envolvidos na regulação da matriz
14
extracelular durante o desenvolvimento folicular e migração do folículo para a
fossa ovulatória.
Song, Porter e Coomber (1999) acreditam que as células estromais
ovarianas da égua produzem importantes componentes da matriz extracelular e
que estes representam papel fundamental no remodelamento tecidual durante
o crescimento folicular. Estes autores observaram a presença de MMP-2,
MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 e TIMP-3 nas células estromais ovarianas nesta
espécie.
Segundo Noguchi et al. (2003) o endométrio humano produz diferentes
tipos de MMPs. No endométrio normal, as MMP-1 e MMP-3 foram observadas
nas células estromais durante as fases pré-menstrual e menstrual. As MMP-2 e
MMP-9 foram observadas nas células estromais e epitélio glandular durante o
ciclo menstrual ou na fase secretória. A MT1-MMP foi observada no epitélio
endometrial durante o ciclo menstrual.
Liu, He e Peng (2002) verificaram a expressão de MMP-9 no endométrio
eutópico e ectópico de mulheres e mostraram que os tecidos com
endometriose processam níveis de gelatinases mais altos do que o tecido
normal e acreditam que a MMP-9 possa ser importante para o crescimento
invasivo e a implantação do tecido endometriótico.
No útero humano, a MMP-2 é a que se encontra mais amplamente
distribuída. É detectada na maioria das células endometriais, sejam epiteliais,
estromais, vasculares, mas não nos leucócitos, porém observada em maior
intensidade no tecido menstrual em degeneração. Já a MMP-9 é encontrada no
epitélio somente durante a fase secretória precoce e durante a menstruação
está presente predominantemente em leucócitos (ZHANG e SALAMONSEN,
2002).
Po-Yin Chu et al. (2002) avaliando o papel das MMPs no endométrio de
30 cadelas, observaram que a MMP-2 (forma latente e ativa) e a MMP-9 (forma
latente) foram detectadas no endométrio de todos os animais. A forma latente
da MMP-7 e a forma ativa da MMP-9 foram observadas somente em uma
cadela em anestro e nas cadelas com hiperplasia cística endometrial, piometra
e nos animais entre duas e três semanas pós-parto. Os autores concluíram que
o estudo das MMPs no endométrio canino pode representar um importante
15
papel na hiperplasia cística endometrial, piometra e no pós-parto. Porém, não
observaram envolvimento das MMPs com a degeneração do epitélio luminal.
Foi demonstrado por Vagnoni, Ginther e Lunn (1995) que no útero das
éguas a invasão de uma subpopulação de células trofoblásticas (chorionic
girdle cells), durante a formação da cinta coriônica é dependente da ação de
metaloproteinases.
Porto et al (2005) avaliaram a expressão de MMP-2 e MMP-9 no
endométrio eqüino e observaram que o tecido intersticial apresentou marcação
positiva difusa para MMP-2, tanto no estrato compacto quanto no estrato
esponjoso. Além disso, as células do epitélio luminal, do epitélio glandular e a
parede de algumas arteríolas também apresentaram imuno-reatividade para
esta enzima. A expressão da MMP-9 foi detectada principalmente na periferia
dos focos fibróticos periglandulares do estrato esponjoso. A expressão desta
metaloproteinase foi observada, de forma esparsa, em células inflamatórias
presentes nos focos fibróticos intersticiais. Com base nestes dados os autores
sugerem que pode haver envolvimento das metaloproteinases no processo
fibrótico que ocorre na endometrite crônica das éguas. Walter et al. (2005)
avaliaram a expressão de MMP-2 na fibrose periglandular das éguas e
verificaram que a expressão desta enzima estava associada com a dilatação e
fibrose glandular. Quanto à distribuição no endométrio, estes autores
observaram que a MMP-2 estava localizada no estrato compacto no
endométrio de éguas saudáveis e com endometrose. Os autores sugerem que
a MMP-2 tenha um papel importante nas alterações da homeostase da matriz
extracelular em regiões de fibrose endometrial.
Alguns autores citam que as MMPs podem sofrer influências hormonais e
que isto pode levar a alterações na expressão destas enzimas. Osteen et al.
(1994) em humanos e demonstraram através de cultivo celular que a
progesterona é um importante inibidor das estromalisinas.
Um estudo realizado por González et al. (2002) sobre a presença das
MMPs e TIMPs em lesões cardíacas e sarcoidose pulmonar em humanos
revelou que a MMP-1 foi bastante expressa pelas células gigantes
multinucleadas e de forma moderada pelas células endoteliais e pelas células
da musculatura lisa bronquiais nos granulomas pulmonares. Neste mesmo
trabalho, a MMP-2 foi mais expressa pelas células epitelióides e macrófagos
16
enquanto que a MMP-7 e a MMP-9, pelas células gigantes multinucleadas,
células epitelióides e macrófagos. Observou-se, ainda, que a marcação da
MMP-7 foi bem mais fraca que MMP-1 e MMP-2 e que a MMP-3, embora tenha
apresentado marcação positiva, não apresentou padrões distintos de
localização em nenhum tipo celular.
Arthur (2000) observaram em estudos de fibrose hepática que as células
estreladas hepáticas quando ativadas, exibindo fenótipo de miofibroblastos,
secretam pro-MMP-2, induzidas pela presença de colágeno do tipo I, o principal
no fígado fibrótico. A pro-MMP-9, no fígado, tem como principal fonte as células
de Kupffer ativadas. O aumento da atividade colagenolítica está associado à
diminuição rápida e significativa do nível de TIMP .
Tem sido demonstrado que os TIMPs inibem a invasão celular (in vitro),
tumorigênese, metástases (in vivo) e angiogênese. Os TIMP-1 e TIMP-2 têm
atividade mitogênica em variados tipos celulares, entretanto a alta expressão
destes inibidores reduz o crescimento tumoral. O TIMP-2 age como inibidor do
fator de crescimento de fibroblastos (NAGASE e WOESSNER JR, 1999).
Lenhart et al. (2002) demonstraram que no útero suíno a expressão dos
inibidores das metaloproteinases está relacionada ao aumento da expressão
de relaxina durante a fase precoce da prenhez, sugerindo que esta estimula o
crescimento uterino durante a placentação.
Freitas et al. (1999) realizaram um estudo para verificar a expressão das
MMPs e TIMPs nos vasos sangüíneos no endométrio humano e constataram
que tanto as MMPs quanto TIMPs participam dos processos de remodelamento
durante a angiogênese e menstruação e sugerem que as alterações cíclicas
envolvem componentes vasculares.
A degeneração vascular endometrial também contribui para o retardo do
clearance uterino. A esclerose (angiose) das veias, artérias e arteríolas
também conhecidas como esclerose da prenhez em humanos tem sido
observada em biópsias eqüinas (SCHOON; SCHOON e KLUG, 1999). As
alterações degenerativas observadas incluem elastose, fibrose e fibroelastose
dos vasos bem como a fibrose perivascular e a calcificação (LEBLANC, 2003).
A angiose parece reduzir indiretamente a fertilidade pela redução da
perfusão endometrial e pelos distúrbios de drenagem uterina causados pela
redução da função das veias (LEBLANC, 2003). Segundo Inoue et al (2000) as
17
alterações patológicas no útero produzidas pela esclerose vascular podem
contribuir para a endometrose ou a esclerose e a progressão para a
endometrose podem ocorrer simultaneamente como resultado da idade.
A maior evidência clínica de angiose nas éguas é a persistência do edema
endometrial após a ovulação. Durante o estro ocorre uma linfangiectasia
fisiológica que resulta em edema típico. O edema desaparece rapidamente
após a ovulação, demonstrando que os mecanismos de drenagem estão
funcionalmente intactos. Quando isto não ocorre resulta em edema patológico
caracterizado por linfangiectasia persistente que é comum em éguas velhas e
multíparas (LEBLANC, 2003).
Um estudo sobre as alterações vasculares observadas no endométrio
eqüino revelou que os animais que apresentaram os maiores graus de
endometrose com ninhos glandulares difusos e/ou cistos associados a fibrose
periglandular grave ou estromal difusa, apresentaram alterações vasculares
severas (INOUE et al., 2000). Oikawa et al. (1993) relataram que as artérias
uterinas de éguas que tiveram mais de uma gestação exibiam elastose da
íntima ou adventícia.
Através da videoendoscopia, Inoue et al. (2000) observaram que
pequenas artérias localizadas abaixo do endométrio apareciam com a
coloração mais clara. Com base nestes dados estes autores propuseram uma
classificação histológica para as alterações vasculares divididas em quatro
grupos a saber: tipo 1 – lesões arteriais não são significativas; tipo 2 – observa-
se espessamento da camada íntima com multiplicação da lâmina elástica; tipo
3 – moderada elastose caracterizada por espessamento da camada íntima e
aumento das fibras elásticas na camada adventícia; tipo 4 – severa elastose
tanto na camada íntima quanto na adventícia.
Grüninger et al. (1998) realizaram estudo sobre a relação entre as
angiopatias e a idade a número de parições em éguas e observaram que e
perivasculite foi observada em apenas 20,5% das amostras enquanto que a
angiose foi notada em 88,9%. Foi verificado neste mesmo estudo que as éguas
virgens não mostraram alterações vasculares graves, entretanto, nas éguas
velhas (entre 13 e 19 anos) e multíparas, observou-se moderada degeneração
da membrana elástica interna e perifibrose ou perifibroelastose.
18
A relação entre o ambiente uterino, a esclerose vascular e a idade e como
estes fatores interferem com a endometrose ainda não são claros (INOUE et
al., 2000).
O resultados dos estudos morfológicos das endometrites crônicas das
éguas têm adicionado dados importantes para o entendimento da etiologia,
patogênese, diagnóstico, tratamento e prognóstico deste processo. No entanto,
por se tratar de um processo patológico complexo, estudos recentes
demonstram que esta afecção continua sendo um problema sério nas criações
de eqüinos.
A análise histopatológica das lesões crônicas endometriais fornece
informações sobre o estado funcional da mucosa uterina e a evolução do
processo inflamatório. A identificação dos tipos celulares presentes nesta
resposta, através da imunofenotipagem, permite um melhor entendimento dos
mecanismos imunológicos envolvidos no processo. Por outro lado, sendo a
fibrose um dos elementos principais da reação tecidual, a determinação do seu
arranjo, localização e composição poderão ajudar na identificação do grau de
comprometimento do endométrio e das chances de regressão da lesão já
estabelecida. O estudo dos tipos de colágeno que se acumulam na fibrose
endometrial é necessário para que seja realizada a correlação cronológica com
as alterações encontradas na histopatologia. A avaliação da esclerose vascular
poderá trazer dados importantes sobre a habilidade reprodutiva das éguas em
relação à idade. Estudos sobre a expressão das metaloproteinases e seus
inibidores poderão auxiliar no entendimento deste processo, pois tais enzimas
participam ativamente do remodelamento tecidual e ainda não se conhece o
verdadeiro papel das MMPs e dos TIMPs no endométrio eqüino.
19
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Avaliar o tipo de colágeno, a expressão das enzimas que degradam
o colágeno e de seus inibidores e as alterações vasculares
presentes nas endometrites crônicas das éguas.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Categorizar as endometrites crônicas das éguas nos sistemas de
classificação histológica descritos por Kenney e Doig (1986) e
Ricketts e Alonso (1991);
Avaliar a fibrose endometrial caracterizando os tipos e a proporção
de colágeno envolvidos neste processo;
Avaliar a esclerose vascular e o grau de fibroelastose presente nos
processos crônicos endometriais das éguas;
Verificar a expressão e a distribuição das metaloproteinases
(MMPs) e dos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) no
endométrio de éguas normais e portadoras de endometrites
crônicas.
20
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Procedência do material
Foram utilizadas 163 biópsias uterinas provenientes dos Serviços de
Patologia Veterinária e de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia (FMVZ), UNESP, Campus de Botucatu, SP. Este
material incluiu biópsias provenientes da rotina de diagnóstico do Hospital
Veterinário, bem como aquelas enviadas por clínicas particulares e
profissionais autônomos durante o período de 1987 a 2004. Do total de casos
levantados foram selecionados apenas 82 biópsias.
Os dados clínicos referentes aos 82 casos não foram utilizados devido à
dificuldade de acesso às fichas clínicas dos animais. Apenas as biópsias das
quinze éguas normais possuía histórico reprodutivo.
4.2 Levantamento dos casos
Após o levantamento dos casos nos arquivos de fichas, foram
selecionadas as lâminas e os blocos de parafina, correspondentes, no
Laboratório de Histopatologia da FMVZ. De cada bloco foram obtidos novos
cortes histológicos e as lâminas foram reavaliadas para a confirmação do
diagnóstico. As amostras utilizadas neste estudo foram selecionadas de acordo
com a qualidade do material emblocado.
4.3 Processamento do material
Tanto as biopsias correspondentes ao material recuperado do arquivo do
Serviço de Patologia Veterinária e de Reprodução Animal como os casos
encaminhados durante o desenvolvimento deste trabalho foram submetidos ao
mesmo tipo de processamento laboratorial, ou seja, fixação em solução de
Bouin durante 24 horas seguida da imersão em álcool 70% e posterior inclusão
em parafina, de acordo com as técnicas de rotina histopatológica.
Dos blocos selecionados, foram obtidos cortes com espessura variando
de três a cinco micrômetros (µm) para coloração pelos métodos de
Hematoxilina e Eosina - HE (LUNA, 1968), Tricrômico de Masson (LUNA,
1968), Picrosirius Red (JUNQUEIRA, COSSERMELI e BRENTANI, 1978) e
21
Verhöeff Van Gieson (VERHÖEFF, 1908). Do mesmo material foram também
retirados os cortes para o processamento imunoistoquímico.
4.4 Avaliação histoquímica
4.4.1 Método de Tricrômico de Masson
A técnica utilizada foi descrita por Luna (1968) e segue o roteiro da
Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do Laboratório de
Histopatologia do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ. Para a
padronização desta técnica foram utilizados fragmentos de endométrio eqüino
com diagnóstico de endometrite crônica, colhidos durante exame necroscópico.
Os fragmentos de endométrio foram processados da mesma maneira que as
biópsias uterinas, ou seja, fixados em solução de Bouin a 10% por 24 horas e,
em seguida, colocados em solução de álcool a 70%. Após o processamento
histológico e a inclusão em parafina foram feitos cortes com cinco micrômetros
de espessura.
As lâminas foram submetidas ao processamento de rotina de
desparafinização e hidratação e em seguida, colocadas em solução de Bouin à
60ºC, em estufa, por uma hora. Após o resfriamento à temperatura ambiente,
foram lavadas em água corrente por um minuto e passadas rapidamente em
água destilada. Após esta etapa, as lâminas foram colocadas em suporte de
coloração e os corantes foram aplicados na seguinte ordem:
Hematoxilina de Weight por cinco minutos, lavagem em água corrente
por cinco minutos, seguida de lavagem em água destilada;
Fuccina Ácida adicionada de Ponceau por dez minutos, lavagem em
água corrente por um minuto, seguida de lavagem em água destilada;
Ácido fosfomolíbdico a 5% por cinco minutos até o clareamento dos
cortes e lavagem em água corrente e água destilada rapidamente;
Azul de anilina a 2,5% por oito minutos, lavagem em água corrente e
água destilada rapidamente e Ácido acético por um minuto.
Após a passagem pelos corantes, as lâminas foram submetidas aos
processos de desidratação e montagem.
Após a passagem pelos corantes, as lâminas foram submetidas aos
processos de desidratação e montagem.
22
4.4.2 Método de Picrosirius Red
A utilização desta técnica, descrita por Junqueira, Cossermelli e Brentani
(1978), seguiu o roteiro da Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do
Departamento de Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina da UNESP.
Para a padronização do método, foram utilizados fragmentos de endométrio
eqüino que apresentavam alteração fibrótica significativa, colhidos de animais
encaminhados para necropsia no Serviço de Patologia. Os fragmentos, com
cinco micrômetros de espessura foram processados da mesma maneira que as
biopsias uterinas, conforme descrito anteriormente.
As lâminas foram submetidas aos processos de desparafinização e
hidratação e em seguida processadas da seguinte maneira:
Imersão em solução de ácido fosfomolíbdico a 0,2% por dois minutos e
em seguida lavagem em água corrente e água destilada;
Imersão em uma solução a 0,1% de Direct Red (Direct Red 36554-8,
Sigma Chemical C.O., St. Louis M.O., E.U.A) dissolvido em ácido pícrico
a 1,5% (aquoso saturado) durante 110 minutos;
Imersão em solução de ácido clorídrico a 0,1N por dois minutos.
Após estas etapas, o material foi lavado em solução de álcool a 70%,
durante 45 segundos e submetido aos processos de desidratação e montagem
em resina sintética.
Para a verificação do padrão de qualidade da coloração e a confirmação
da refringência das fibras colágenas, as lâminas foram observadas no
microscópio de luz polarizada (campo escuro), modelo Axio Imager A1 (Carl
Zeiss, Alemanha) do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP,
Botucatu, SP.
4.4.3 Método de Verhöeff Van Gieson
A utilização desta técnica, descrita por Verhöeff (1908), seguiu o roteiro da
Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do Laboratório de
Histopatologia do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ. Para a
padronização do método, foram utilizados fragmentos de aorta e endométrio
eqüinos, colhidos de animais encaminhados para necropsia no Serviço de
Patologia.
23
As lâminas foram submetidas aos processos de desparafinização e
hidratação e em seguida processadas da seguinte maneira:
Deposição do corante de Verhöeff sobre as lâminas por 15 minutos e em
seguida lavagem em água corrente e água destilada;
Diferenciação por 20 segundos em cloreto férrico aquoso a 2%,
observando em água ao microscópio, até que as fibras elásticas
aparecessem em preto e os núcleos em cinza;
Quando diferenciadas em excesso, as lâminas eram novamente coradas
com o Verhöeff;
Lavagem em água corrente;
Imersão em solução de tiossulfato de sódio a 5% por um minuto para
retirada do excesso de iodo;
Lavagem em água corrente e água destilada;
Imersão em solução de Van Gieson por cinco minutos;
Lavagem em álcool a 95% rapidamente.
Após a passagem pelos corantes, as lâminas foram submetidas aos
processos de desidratação e montagem.
4.5 Avaliação imunoistoquímica
4.5.1 Padronização das técnicas
A padronização da técnica de imunoistoquímica foi realizada no
Laboratório de Pesquisa do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ,
UNESP, Botucatu, SP e no Laboratório de Patologia Molecular da Faculdade
de Medicina, UNESP, Botucatu, SP.
Para a padronização desta técnica foram utilizados fragmentos de
endométrio eqüino, fixados em Bouin e blocos de parafina contendo amostras
de tecido de granulação em pele de eqüino e de carcinoma mamário de cadela,
provenientes do Serviço de Patologia Veterinária. Também foram utilizadas
amostras de placenta e de carcinoma mamário humano obtidas no
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu. As
amostras de tecido de granulação, placenta e carcinoma mamário (canino e
humano) foram utilizadas como controle positivo para as MMPs e TIMP-1.
24
4.5.2 Anticorpos utilizados
TIMP-1 (C-20 SC 6832) – Anticorpo policlonal humano que reconhece a
glicoproteína TIMP-1 (inibidor tecidual de metaloproteinases – 1) expressa em
vários tipos celulares.
MMP-1 (RDI-MMP1abm-E5) – Anticorpo monoclonal humano que se liga às
formas latente e ativa da enzima MMP-1.
MMP-2 (RDI-MMP2abm-5D) – Anticorpo monoclonal humano que se liga às
formas latente e ativa da enzima MMP-2.
MMP-7 (RDI-MMP7amb-B2) – Anticorpo monoclonal humano que se liga à
forma da pró-enzima MMP7, mas não à sua forma ativa.
MMP-9 (C-20 SC 6840) – Anticorpo policlonal humano que se liga às formas
latente e ativa da enzima MMP-9.
4.5.3 Roteiro de aplicação da técnica de imunoistoquímica
4.5.3.1 Preparação das lâminas
As lâminas foram inicialmente mergulhadas em álcool a 70% e depois de
secas, imergidas em cola líquida a base de organosilano (A3648 – SIGMA, St.
Louis, E.U.A.).
4.5.3.2 Obtenção dos cortes histológicos
Cortes histológicos com três micrômetros de espessura foram feitos em
micrótomo rotativo e as lâminas, em seguida, permaneceram na estufa a 60°C
por 24 horas para fixação do tecido à lâmina.
Após este procedimento, as lâminas foram submetidas aos processos de
desparafinização e hidratação.
4.5.3.3 Bloqueio da peroxidase endógena
O bloqueio da peroxidase endógena foi feito em solução de água
oxigenada a 10 volumes por 10 minutos para os anticorpos MMP-1, MMP-2 e
MMP-7.
Para os anticorpos MMP-9 e TIMP-1 o bloqueio foi realizado em solução
de água oxigenada 30% diluída na concentração de 1:9 em metanol. Após este
25
procedimento foi realizada lavagem com TBS pH 7,5 seguida do bloqueio de
proteínas com leite em pó Molico a 3% em TBS por uma hora.
4.5.3.4 Recuperação antigênica
Para a recuperação antigênica do material foram utilizados dois
protocolos:
Solução tampão de citrato 10 mM, pH 6,0, em forno de microondas, na
potência máxima (700W) por cinco minutos para os anticorpos MMP-9 e
TIMP-1;
Solução tampão de citrato 10 mM, pH 6,0, em forno de microondas, na
potência máxima (700W) por 20 minutos para os anticorpos cinco
minutos para os anticorpos MMP-1, MMP-2 e MMP-7.
Após o procedimento, o material foi resfriado até atingir a temperatura
ambiente.
4.5.3.5 Incubação com o anticorpo primário
Os anticorpos MMP-1, MMP-2 e MMP-7 foram diluídos em solução a 0,1%
de albumina sérica bovina em solução tampão de TRIS (TRIZMA base, D5637
Sigma Chemical C.O., St. Louis, E.U.A.).
Os anticorpos MMP-9 e TIMP-1 foram diluídos em solução a 1% de
albumina sérica bovina em solução de água destilada.
O material foi submetido à incubação com os anticorpos primários, em
câmara úmida por 18 horas a 4ºC.
As concentrações testadas e utilizadas em cada uma das reações são
apresentadas na Tabela 1.
TABELA 1. Anticorpos primários, concentrações testadas e utilizadas nas
reações imunoistoquímicas das biopsias uterinas de éguas com
endometrite crônica.
Anticorpo Concentrações testadas Concentração utilizada
TIMP-1 1:50, 1:100 e 1:200 1:100
MMP-1 1:50, 1:100, 1:200 1:100
MMP-2 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400 1:200
MMP-7 1:50, 1:100, 1:200 1:100
MMP-9 1:50, 1:100, 1:200 1:100
26
4.5.3.6 Complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC)
As lâminas foram lavadas com solução de TRIS e incubadas com o
anticorpo secundário anti-mouse (BA2000-VECTOR) por 30 minutos à
temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram novamente lavadas em
solução de TRIS e incubadas com o KIT ABC (PK6100 – VECTASTAIN ELITE)
por 30 minutos à temperatura ambiente. O KIT ABC foi preparado 30 minutos
antes do uso.
4.5.3.7 Revelação
Para visualização da reação, as lâminas foram tratadas com solução de
3,3´diaminobenzidina (Liquid DAB – K3466 DakoCytomation) durante cinco
minutos à temperatura ambiente.
Os cortes foram contra-corados com hematoxilina de Harris, por 35
segundos e, em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente por 10
minutos e submetidas aos processos de desidratação e montagem em resina
sintética.
4.6 Análise do material
4.6.1 Aplicação da classificação das endometrites
crônicas eqüinas
Para cada caso, o tipo histológico foi categorizado segundo a
classificação proposta por Kenney e Doig (1986) para as endometrites
crônicas, e as definições de endometrite crônica degenerativa (endometrose) e
infiltrativa, descritas por Ricketts e Alonso (1991).
No presente estudo, visando a avaliação dos processos fibróticos
endometriais, foram utilizadas somente as amostras classificadas como
endometrite crônica categoria IIB e III, crônica infiltrativa e crônica
degenerativa. As amostras classificadas como categoria I (éguas normais)
serviram de parâmetro para comparação e as amostras categoria IIA não foram
utilizadas neste estudo.
27
Nas Tabelas 2 e 3 estão apresentadas as características morfológicas das
classificações propostas para as endometrites crônicas utilizadas no presente
trabalho.
TABELA 2. Classificação das endometrites crônicas de acordo com
Kenney e Doig, (1986)
CATEGORIAS DE
ENDOMETRITE
ACHADOS MORFOLÓGICOS
Categoria I O endométrio não é atrófico ou hipoplásico e as alterações
fibróticas e inflamatórias são ausentes ou, quando aparecem,
são discretas e esparsas.
Categoria IIA As alterações inflamatórias são moderadas e difusas. As lesões
fibróticas podem envolver ramos individuais de glândulas em
qualquer grau de severidade (mas geralmente com 1 a 3
camadas de células). Menos que 2 ninhos fibróticos são vistos
por 5,5mm de campo linear
Categoria IIB As alterações inflamatórias são difusas e moderadamente
severas. A fibrose é mais severa e extensa do que na categoria
IIA. Há envolvimento de 4 ou mais camadas de células ao redor
de glândulas individuais. Os ninhos fibróticos são observados,
em média, de 2 a 4, por 5,5mm de campo linear.
Categoria III A inflamação severa e difusa em qualquer grau inclui a égua
nesta categoria. A fibrose é ampla e são observados 5 ou mais
ninhos fibróticos por 5,5mm de campo linear. As lacunas
linfáticas são observadas com freqüência.
TABELA 3. Classificação das endometrites crônicas de acordo com
Ricketts e Alonso (1991)
CATEGORIAS DE
ENDOMETRITE
ACHADOS MORFOLÓGICOS
Égua normal O endométrio não é atrófico ou hipoplásico e as alterações
fibróticas e inflamatórias são ausentes ou, quando aparecem, são
discretas e esparsas.
Endometrite crônica
infiltrativa
Presença de células mononucleares, incluindo histiócitos e
plasmócitos, infiltrando o estroma.
Endometrite crônica
degenerativa
(endometrose)
Presença de alterações degenerativas glandulares (ninhos e/ou
cistos) associadas à fibrose periglandular e/ou fibrose estromal
difusa.
4.6.2 Análise qualitativa do colágeno endometrial
O material corado pelo método de Picrosirius Red foi analisado em
microscópio de luz polarizada (campo escuro), modelo Axio Imager A1 (Carl
Zeiss, Alemanha) do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP,
Botucatu, SP.
28
Inicialmente, foi feita a análise qualitativa do colágeno total em todas as
amostras. Nesta análise foi realizada uma avaliação detalhada da distribuição
do colágeno, determinando-se as regiões de sua maior concentração no
endométrio. As regiões consideradas foram: o espaço subepitelial, os estratos
compacto e esponjoso e as regiões periglandulares e perivasculares. Ainda foi
observado se o padrão de distribuição era difuso ou localizado nestas regiões.
Na análise do tipo de colágeno presente nas amostras foi feita uma
avaliação com base na refringência das fibras sob polarização de luz: as fibras
espessas e de coloração amarelada a avermelhada foram classificadas como
colágeno tipo I e as fibrilas delgadas e de coloração esverdeada, como de
colágeno tipo III. Quando não era possível determinar a predominância de um
dos tipos, considerou-se que havia os dois tipos de colágeno na mesma
amostra.
4.6.3 Análise da esclerose e fibroelastose vascular
O material corado com VVG foi utilizado para a avaliação da esclerose e
do grau de fibroelastose vascular e seguiu a classificação descrita por Inoue et
al. (2000). Em cada amostra eram avaliadas todas as arteríolas para a
observação da fibroelastose e esclerose vascular. Para cada arteríola era dado
um grau de fibroelastose e ao final da análise se obtinha uma média com base
no número de arteríolas observadas, chegando-se a classificação adequada.
Para a análise estatística cada grau de fibroelastose encontrado foi substituído
por um valor numérico variando de um a quatro, conforme a classificação
morfológica. Na Tabela 4 estão apresentadas as características morfológicas
da classificação para fibroelastose proposta por Inoue et al. (2000).
TABELA 4. Classificação das alterações vasculares do endométrio eqüino
de acordo com Inoue et al. (2000)
ALTERAÇÕES
VACULARES
ACHADOS MORFOLÓGICOS
Tipo 1 Quando não são observadas lesões vasculares significativas.
Tipo 2 Presença de discreto espessamento da camada íntima, mas sem
alterações nas camadas média e adventícia.
Tipo 3 Moderada elastose com espessamento da íntima e aumento das
fibras elásticas na adventícia.
Tipo 4 Presença de elastose acentuada observada tanto na camada
íntima quanto na adventícia.
29
4.6.4 Análise morfométrica
Para a análise morfométrica da fibrose periglandular foram utilizados os
cortes histológicos corados pelo método do Picrosirius Red. A morfometria foi
realizada de acordo com Nunes (2003), utilizando-se microscópio de luz
polarizada (campo escuro), modelo Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Alemanha),
contendo câmera digital modelo Axiocam MRc (Zeiss Vision, Alemanha)
equipado com programa de análise de imagem Axio Vision Software Rel.
versão 4.3 (Zeiss Vision, Alemanha) do Serviço de Patologia Veterinária da
FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. Foram avaliadas todas as amostras que
apresentavam fibrose periglandular, em ramos individuais ou em ninhos
fibróticos. A área de fibrose era calculada subtraindo-se a área do lúmen
glandular da área total da fibrose em volta da glândula. Este valor era dividido
pela área total da amostra e multiplicado por 100. O número final correspondia
ao percentual total de fibrose periglandular existente na amostra.
Para a análise morfométrica da esclerose vascular endometrial foi
utilizada a mesma técnica feita para a avaliação da fibrose periglandular
descrita por Nunes (2003). Foram utilizadas nesta análise as lâminas coradas
com VVG. As lâminas coradas pelo Tricrômico de Masson serviram para
avaliação complementar da esclerose.
A morfometria da esclerose vascular foi realizada utilizando-se
microscópio modelo Physis, câmera de captura tipo CCB (Sony) e programa de
análise de imagem Image Pro Plus versão 1.0 do Laboratório de Ciência da
Madeira do Núcleo de Estudos e de Difusão em Tecnologia em Floresta,
Recursos Hídricos e Agricultura Sustentável (NEDTEC) da Universidade
Federal do Espírito Santo, Jerônimo Monteiro, ES.
4.6.5 Análise imunoistoquímica
Para cada anticorpo utilizado, a intensidade da reação era estimada
conforme a marcação positiva. Porém, por tratar-se de anticorpos monoclonais
e policlonais a marcação positiva variava de intensidade sendo necessário
caracterizar cada marcador, visto que alguns apresentavam marcação fraca
enquanto que outros eram fortemente marcados. Para esta avaliação foram
utilizados dois observadores.
30
Para cada região onde a enzima foi observada, adotou-se um valor para a
intensidade da marcação, sendo: 0=negativo, 1=marcação fraca, 2=marcação
moderada e 3=marcação acentuada. Os locais observados foram: epitélio
luminal, epitélio glandular, parede vascular, célula endotelial, célula inflamatória
e célula estromal.
Para a avaliação do grau de expressão de cada enzima foram utilizados
valores numéricos variando de zero a seis. O valor zero correspondia à
ausência da marcação. Para cada local era atribuído o valor um. A expressão
da enzima era calculada com base no somatório dos locais onde esta enzima
estava presente, ou seja, de zero a seis.
4.7 Análise estatística
Para cada variável utilizada no experimento, as três categorias de
endometrites foram comparadas utlizando-se as diferentes classificações
(KENNEY e DOIG, 1986; RICKETTS e ALONSO, 1991). O teste estatístico
utilizado foi o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (ZAR, 1996), adotando-
se o nível de 5% de significância.
31
5 RESULTADOS
5.1 Classificação histológica das endometrites
crônicas
Após a classificação histológica das 82 biópsias de acordo com a
descrição de Kenney e Doig (1986), 15 animais foram incluídos na categoria I
(18,29%), 18 na categoria IIB (21,95%) e 49 na categoria III (59,76%). Os
resultados da classificação histológica das 82 amostras de acordo com a
descrição de Ricketts e Alonso (1991) demonstraram que 15 dos animais
apresentavam endométrio normal (18,29%), 50 apresentaram endometrite
crônica infiltrativa (60,98%) e 17 animais apresentaram endometrite crônica
degenerativa (endometrose) (20,73%). Os percentuais dos 82 casos nas
diferentes classificações para endometrites crônicas estão dispostos nas
Figuras 1 e 2.
FIGURA 1. Classificação dos 82 casos de endometrites crônicas
diagnosticados no Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP de
acordo com Kenney e Doig (1986).
21,95%
59,76%
18,29%
Categoria I
Categoria IIB
Categoria III
FIGURA 2. Classificação dos 82 casos de endometrites crônicas
diagnosticados no Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP de
acordo com Ricketts e Alonso (1991).
18,29%
20,73%
60,98%
Normal
Endometrite crônica
infiltrativa
Endometrose
32
As alterações histopatológicas encontradas nas diferentes categorias de
endometrites crônicas estão ilustradas nas Figuras 3, 4 e 5.
5.2 Avaliação histoquímica
5.2.1 Tricrômico de Masson
A fibrose endometrial, evidenciada pelo método de tricrômico de Masson,
foi caracterizada pelo acúmulo de camadas de células, fibras colágenas e
elásticas coradas em tons de azul que se distribuíam preferencialmente ao
redor das glândulas endometriais, dos vasos sangüíneos e abaixo da
membrana basal do epitélio luminal. Nossos resultados revelaram que este
método contribuiu para a observação dos acúmulos de tecido conjuntivo nas
amostras e permitiu a avaliação da fibrose intersticial difusa, que não é
evidenciada pelo método de HE. Os dados obtidos neste estudo revelaram que
todas as amostras das endometroses apresentaram fibrose intersticial
acentuada. As amostras de endometrite crônica categoria IIB, categoria III e
infiltrativa também revelaram a presença de fibrose intersticial.
A avaliação da esclerose vascular mostrou que em 72 amostras (92,68%)
apresentaram fibrose perivascular, sendo que destas, a esclerose vascular total
foi observada em seis casos.
As lesões fibróticas evidenciadas pelo método de tricrômico de Masson
encontradas nas endometrites crônicas estão ilustradas na Figura 6.
5.2.2 Picrosirius Red
Os resultados obtidos em relação ao tipo de colágeno presente nas
endometrites crônicas das éguas revelaram que o colágeno tipo I, representado
pelas fibras espessas, foi o tipo predominante. Das 82 amostras utilizadas
neste estudo 53 (64,63%) apresentaram predominância do colágeno tipo I, 24
(29,27%) apresentaram predominância do colágeno fibrilar, tipo III, e apenas 5
(6,10%) revelaram a presença dos dois tipos de colágeno na mesma amostra.
Estes dados estão dispostos na Tabela 5.
33
Quando avaliado o tipo de colágeno presente em cada categoria de
endometrite os resultados encontrados revelaram que as amostras
classificadas na categoria I mostraram predominância do colágeno tipo III,
representando 66,67% dos casos. Nas endometrites crônicas mais graves o
colágeno predominante foi o do tipo I, representando 66,67% nas amostras da
categoria IIB, 77,55% da categoria III, 72,00% das endometrites infiltrativas e
82,36% das endometroses. O colágeno tipo I, denso, também foi observado
nas amostras de endométrio normais porém em baixa freqüência (20,00% dos
casos analisados). Os dados referentes ao tipo de colágeno presente em cada
categoria de endometrite estão expostos nas Tabelas 6 e 7.
A avaliação da distribuição do colágeno nas diversas categorias de
endometrites crônicas revelou que nas amostras normais o colágeno era
observado de forma difusa. À medida que o grau de endometrite se agravava
mais acentuado era o acúmulo de colágeno ao redor das estruturas. Os
resultados obtidos revelaram que a maior concentração de colágeno nas
amostras encontrava-se na região periglandular. No endométrio normal
observou-se que a distribuição de colágeno estava mais concentrada na região
periglandular (53,34% das amostras) sendo o colágeno tipo III o predominante
nestas amostras. Nas amostras com endometrite a distribuição do colágeno foi
observada com maior freqüência também na região periglandular, porém o tipo
de colágeno predominante nestes casos foi o tipo I.
A distribuição do colágeno também foi observada de forma acentuada nas
regiões perivasculares e no estrato esponjoso de todas as amostras
analisadas. Em 13,33% das amostras normais, 27,78% das endometrites
categoria IIB, 30,62% categoria III, 28,00% infiltrativa e 23,53% das
endometroses mostraram a distribuição de colágeno predominantemente no
estrato esponjoso. A deposição perivascular foi observada em 20,00% das
amostras normais, 27,78% das endometrites categoria IIB, 12,24% das
endometrites categoria III, 18,00% das infiltrativas e 17,65% das endometroses.
A presença predominante de colágeno na região subepitelial não foi observada
em nenhumas das amostras analisadas.
34
Os dados referentes à distribuição do colágeno nas categorias de
endometrite estão apresentados nas Tabela 8 e 9 e as Figuras 7, 8 e 9 ilustram
os tipos de colágeno presentes nas endometrites crônicas das éguas.
TABELA 5. Tipo de colágeno predominante nas 82 amostras de
endometrites crônicas diagnosticadas no Serviço de Patologia Veterinária
da UNESP, Botucatu, SP.
Tipo de Colágeno Número de amostras
Tipo I 53 (64,63%)*
Tipo III 24 (29,27%)
Tipo I/III 5 (6,10%)
Total 82 (100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses
TABELA 6. Tipo de colágeno predominante nas diferentes categorias de
endometrites crônicas eqüinas diagnosticadas de acordo com Kenney e
Doig (1986).
Tipo de colágeno Categoria I Categoria IIB Categoria III
Tipo I 3 (20,00%)* 12 (66,67%) 38 (77,55%)
Tipo III 10 (66,67%) 5 (27,78%) 9 (18,37%)
Tipo I/III 2 (13,33%) 1 (5,55%) 2 (4,08%)
Total 15 (100,00%) 18 (100,00%) 49 (100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
TABELA 7. Tipo de colágeno predominante nas diferentes categorias de
endometrites crônicas eqüinas diagnosticadas de acordo com Ricketts e
Alonso (1991).
Tipo de Colágeno Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Tipo I 3 (20,00%)* 36 (72,00%) 14 (82,36%)
Tipo III 10 (66,67%) 12 (24,00%) 2 (11,76%)
Tipo I/III 2 (13,33%) 2 (4,00%) 1 (5,88%)
Total 15 (100,00%) 50 (100,00%) 17 (100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
35
TABELA 8. Distribuição do colágeno total no endométrio eqüino nas
diferentes categorias de endometrites crônicas diagnosticadas de acordo
com Kenney e Doig (1986).
Regiões do endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Subepitelial 0 (0,00%)* 0 (0,00%) 0 (0,00%)
Estrato Compacto 0 (0,00%) 1 (5,55%) 2 (4,08%)
Estrato Esponjoso 2 (13,33%) 5 (27,78%) 15 (30,62%)
Periglandular 8 (53,34%) 6 (33,34%) 23 (46,94%)
Perivascular 3 (20,00%) 5 (27,78%) 6 (12,24%)
Difuso 2 (13,33%) 1 (5,55%) 3 (6,12%)
Total 15 (100,00%) 18 (100,00%) 49 (100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
TABELA 9. Distribuição do colágeno total no endométrio eqüino nas
diferentes categorias de endometrites crônicas diagnosticadas de acordo
com Ricketts e Alonso (1991).
Regiões do
endométrio
Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Subepitelial 0 (0,00%)* 0 (0,00%) 0 (0,00%)
Estrato Compacto 0 (0,00%) 1 (2,00%) 4 (23,53%)
Estrato Esponjoso 2 (13,33%) 14 (28,00%) 4 (23,53%)
Periglandular 8 (53,34%) 22 (44,00%) 6 (35,29%)
Perivascular 3 (20,00%) 9 (18,00%) 3 (17,65%)
Difuso 2 13,33%) 4 (8,00%) 0 (0,00%)
Total 15 (100,00%) 50 (100,00%) 17 (100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
5.2.3 Método de Verhöeff Van Gieson
A vasculatura endometrial, evidenciada pelo método de VVG, demonstrou
que todas as amostras de endométrio de éguas normais e portadoras de
endometrites crônicas apresentavam fibroelastose. No entanto, observou-se
que as alterações vasculares se tornavam mais graves à medida que o grau de
endometrite aumentava.
Do total de 82 casos analisados 7 (8,53%) apresentaram fibroelastose tipo
1, 28 (34,15%) tipo 2, 28 (34,15%) tipo 3 e 19 (23,17%) mostraram lesões do
tipo 4. Com relação à esclerose vascular os resultados encontrados foram os
mesmos observados com o Tricrômico de Masson, ou seja, 92,68% das
amostras apresentaram algum grau de fibrose vascular, independentemente da
categoria de endometrite. Os dados referentes à fibroelastose no total de
amostras estão apresentados na Tabela 10.
36
Nas amostras classificadas como categoria I as lesões vasculares mais
freqüentemente observadas foram do tipo 2 (discretas), representando 60%
dos casos analisados. Nas endometrites crônicas categoria III foram mais
observadas alterações vasculares do tipo 3 (moderada) (42,86% dos casos).
As endometrites infiltrativas mostraram alterações vasculares diversas sendo
observada fibroelastose do tipo 2 (discreta) em 22% dos casos, tipo 3
(moderada) em 40% das amostras e tipo 4 (severa) em 28 % dos casos
analisados. Todas as amostras de endometrose apresentaram fibroelastose,
sendo que em 52,94% das amostras foram observadas lesões discretas e em
29,41% lesões moderadas. As alterações vasculares severas, nesta classe de
endometrite, representaram 17,65% das amostras. No entanto, a fibroelastose
não mostrou diferença significativa entre as categorias de endometrites. Estes
dados estão expostos nas Tabelas 11, 12, 13 e 14.
As Figuras 10, 11 e 12 ilustram as alterações vasculares, evidenciadas
pelo método do VVG, observadas nas amostras de endométrio eqüino.
TABELA 10. Graus de fibroelastose (INOUE et al., 2000) nas 82 amostras
de endometrites crônicas diagnosticadas no Serviço de Patologia
Veterinária da UNESP, Botucatu, SP.
Grau de fibroelastose Número de amostras
Tipo 1 7 (8,53%)*
Tipo 2 28 (34,15%)
Tipo 3 28 (34,15%)
Tipo 4 19 (23,17%)
Total 82 (100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
TABELA 11. Graus de fibroelastose vascular (INOUE et al., 2000)
observados nas diferentes categorias de endometrites crônicas eqüinas
diagnosticadas de acordo com Kenney e Doig (1986).
.Grau de fibroelastose Categoria I Categoria IIB Categoria III
Tipo1 2(13,34%)* 3(16,67%) 2(4,08%)
Tipo 2 9(60,00%) 5(27,78%) 14(28,57%)
Tipo 3 2(13,33%) 5(27,78%) 21(42,86%)
Tipo 4 2(13,33%) 5(27,77%) 12(24,49%)
Total 15(100,00%) 18(100,00%) 49(100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
37
TABELA 12. Graus de fibroelastose vascular (INOUE et al., 2000)
observados nas diferentes categorias de endometrites crônicas eqüinas
diagnosticadas de acordo com Ricketts e Alonso (1991).
Grau de
fibroelastose
Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Tipo1 2(13,34%)* 5(10,00%) 0(0,00%)
Tipo 2 9(60,00%) 11(22,00%) 9(52,94%)
Tipo 3 2(13,33%) 20(40,00%) 5(29,41%)
Tipo 4 2(13,33%) 14(28,00%) 3(17,65%)
Total 15(100,00%) 50(100,00%) 17(100,00%)
*Valores percentuais entre parênteses.
TABELA 13. Valores medianos dos graus de fibroelastose da vasculatura
endometrial (INOUE et al., 2000) nas diferentes categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Categoria de Endometrite Grau de fibroelastose vascular
Categoria I 2,0a
1
Categoria IIB 3,0a
Categoria III 3,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 14. Valores medianos dos graus de fibroelastose da vasculatura
endometrial (INOUE et al., 2000) nas diferentes categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991).
Categoria de endometrite Grau de fibroelastose vascular
Égua normal 2,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 3,0a
Endometrose 3,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
38
FIGURA 3. Amostra P223/01. Endométrio eqüino normal – epitélio luminal (EL), estrato
compacto (EC), estrato esponjoso (EE) e glândulas endometriais (G) sem sinais de
inflamação e/ou fibrose. Coloração de hematoxilina e eosina.
FIGURA 4. Amostra P96/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
categoria III. Infiltrado inflamatório mononuclear (seta) e presença de ninho fibrótico (NF)
na região do estrato esponjoso. Coloração de HE.
EL
EC
EE
G
G
NF
39
FIGURA 5. Amostra P100/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica degenerativa /
categoria III. Fibrose intersticial difusa (F), presença de ninhos fibróticos (NF), dilatação
glandular (DG) e lacunas linfáticas (L) na região do estrato esponjoso. Coloração de HE.
FIGURA 6. Amostra B15/92. Endométrio eqüino com endometrite crônica degenerativa /
categoria III. Fibrose intersticial difusa na região do estrato esponjoso (seta). Coloração
de tricrômico de Masson.
F
L
NF
NF
DG
40
FIGURA 7. Amostra P207/01. Endométrio eqüino normal. Presença predominante de
colágeno fibrilar (seta) - fibras esverdeadas – colágeno tipo III na região do estrato
esponjoso. Coloração de picrosirius red sob polarização.
FIGURA 8. Amostra B27/92. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa / IIB.
Presença de colágeno fibrilar e áreas esparsas com colágeno denso (seta) - fibras
avermalhadas – tipo I na região do estrato esponjoso. Coloração de picrosirius red sob
polarização.
41
FIGURA 9. Amostra P81/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa / III.
Presença predominante de colágeno denso - tipo I (seta) ao redor de ninho fibrótico (NF).
Coloração de picrosirius red sob polarização.
FIGURA 10. Amostra P203/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
III. Espessamento da parede vascular (seta), fibrose perivascular acentuada (FPV) e
presença de lacunas linfáticas (L) na região do estrato esponjoso. Coloração de Verhöeff
Van Gieson.
FPV
L
L
L
NF
NF
42
FIGURA 11. Amostra P203/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
III. Fibrose privascular (seta) e fibroelastose (FE) tipo 3 na região do estrato esponjoso.
Coloração de Verhöeff Van Gieson.
FIGURA 12. Amostra P98/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica categoria
infiltrativa / III. Alteração vascular grave caracterizada por fibroelastose (FE) tipo 4,
fibrose perivascular (seta) e lacunas linfáticas (L) na região do estrato esponjoso.
Coloração de Verhöeff Van Gieson.
FE
FE
L
43
5.3 Análise morfométrica
A análise morfométrica da fibrose periglandular revelou que quanto maior
é o grau de endometrite mais acentuada é a lesão fibrótica localizada em torno
das glândulas endometriais. Os resultados deste estudo mostraram que as
éguas com lesões endometriais mais graves, categoria IIB, categoria III,
infiltrativa e endometrose, apresentaram significativamente os maiores
percentuais de fibrose periglandular maiores quando comparadas com as
éguas normais, conforme os dados da Tabelas 15 e 16.
O valor percentual médio para a fibrose periglandular foi de 0,92% nas
éguas normais, 3,67% nas éguas com endometrite crônica categoria IIB, 5,02%
nas éguas com endometrite crônica categoria III, 4,67% nas endometrites
infiltrativas e 4,72% nas endometroses. Os maiores valores percentuais de
fibrose periglandular foram observados nas endometrites crônicas categoria III
e nas endometroses.
A morfometria da fibrose perivascular revelou dados semelhantes aos
encontrados na avaliação da fibrose periglandular. Foi observado que quanto
maior é o grau de endometrite mais graves também se tornam as alterações
vasculares. Nas amostras classificadas como endometrite crônica categoria III
o percentual de esclerose vascular foi significativamente maior que nas éguas
normais. Porém não houve diferença significativa entre as éguas normais e
com endometrites infiltrativas ou endometroses em relação às alterações
vasculares. Estes dados estão apresentados nas Tabelas 17 e 18.
O percentual de fibrose perivascular médio observado nas amostras de
éguas normais e com endometrites crônicas categoria IIB, categoria III,
infiltrativas e endometroses foram 5,39%, 10,75%, 12,06%, 11,70%, 10,99%
respectivamente. Os resultados observados demonstram que as alterações
vasculares mais graves foram observadas nas endometrites crônicas categoria
III e infiltrativas.
44
TABELA 15. Valores percentuais da fibrose periglandular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de Endometrite Percentual de fibrose
periglandular
Categoria I 0,80a
1
Categoria IIB 3,81b
Categoria III 4,35b
1
Medianas seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, ao nível
de 5% de probabilidade, pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 16. Valores percentuais da fibrose periglandular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite Percentual de fibrose
periglandular
Égua normal 0,80a
1
Endometrite crônica infiltrativa 4,42b
Endometrose 3,83b
1
Medianas seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, ao nível
de 5% de probabilidade, pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 17. Valores percentuais da fibrose perivascular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de Endometrite Percentual de fibrose perivascular
Categoria I 5,00a
1
Categoria IIB 6,56ab
Categoria III 8,09b
1
Medianas seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, ao nível
de 5% de probabilidade, pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 18. Valores percentuais da fibrose perivascular nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite Percentual de fibrose perivascular
Égua normal 5,00a
1
Endometrite crônica infiltrativa 7,85a
Endometrose 7,37a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
45
5.4 Avaliação imunoistoquímica
5.4.1 Metaloproteinase 1 (MMP-1)
Na análise qualitativa da expressão da enzima MMP-1 foi verificada
marcação fraca a moderada na maioria das amostras. A MMP-1 foi expressa
por todos os tipos celulares e regiões do endométrio avaliadas. Em apenas
duas amostras, sendo uma classificada como endometrite crônica categoria III
e uma como endometrose, houve ausência da marcação de MMP-1.
Das 15 amostras classificadas como categoria I quatro casos revelaram
escore de expressão 6, indicando que a MMP-1 foi observada em diferentes
tipos celulares no endométrio normal. Nas amostras com endometrites crônicas
foram observados os seguintes resultados: na categoria IIB a maioria das
amostras apresentou escore 2 e 5 (cinco amostras em cada escore); na
categoria III, onze casos revelaram escore 5 e 14 escore 6; na endometrite
infiltrativa, 14 casos obtiveram escore 5 e na endometrose oito apresentaram o
escore 6. Estes resultados revelaram que as éguas com endometrite crônica
apresentaram os maiores escores (5 e 6), na maioria dos casos, indicando que
a enzima é expressa por mais tipos celulares durante o processo crônico.
Embora os dados tenham revelado que nas endometrites a expressão das
enzimas aumenta, a MMP-1 não apresentou diferença significativa, com
relação à expressão, nas diferentes categorias de endometrite ao nível de 5%
de probabilidade, conforme as Tabelas 19 e 20.
Com relação à distribuição da MMP-1 no endométrio eqüino, os dados
revelaram que esta enzima foi expressa em todas as regiões analisadas,
porém não houve diferença significativa na sua intensidade de marcação,
independente do local observado, em cada categoria de endometrite.
Quando observada quanto à intensidade da marcação da MMP-1, em
cada local do endométrio, observou-se que na categoria I, embora esta enzima
fosse expressa por vários tipos celulares, a marcação era fraca ou moderada
na maioria das amostras. A marcação intensa só foi observada em três
amostras. Também foi observado que nas células dos epitélios luminal e
glandular a marcação da MMP-1 foi ausente na maioria das amostras (nove
casos). Nas endometrites crônicas a intensidade da marcação era moderada a
46
intensa e a maioria das células expressavam MMP-1. Estes resultados
demonstraram que a intensidade da marcação de MMP-1 foi maior nas éguas
com endometrites mostrando diferença significativa entre as categorias. Nas
endometrites categoria III a MMP-1 foi observada com maior intensidade nas
células do epitélio glandular em relação às éguas normais. Nas endometroses
também foi observada diferença significativa na intensidade de marcação
sendo a MMP-1 mais observada no epitélio glandular em relação às éguas
normais. Os dados estão expostos na Tabela 21 e 22.
As Figuras 13 e 14 ilustram a expressão da MMP-1 no endométrio eqüino.
TABELA 19. Valores medianos da expressão de MMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-1
Categoria I 3,0a
1
Categoria IIB 3,0a
Categoria III 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 20. Valores medianos da expressão de MMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-1
Normal 3,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 4,0a
Endometrose 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
47
TABELA 21. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-1 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 0aA
1
1aA 1aA
Epitélio glandular 0aA 1aAB 2aB
Célula endotelial 1aA 2aA 1aA
Parede vascular 1aA 0,5aA 1aA
Célula inflamatória 2aA 2aA 2aA
Célula estromal 1aA 1aA 1aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 22. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-1 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991).
Local no endométrio Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Epitélio luminal 0aA
1
1aA 1aA
Epitélio glandular 0aA 1aAB 2aB
Célula endotelial 1aA 1aA 2aA
Parede vascular 1aA 1aA 1aA
Célula inflamatória 2aA 2aA 2aA
Célula estromal 1aA 1aA 1aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
5.4.2 Metaloproteinase 2 (MMP-2)
Na análise da expressão da enzima MMP-2 foi verificada que a marcação
variou de fraca a intensa. Com relação ao escore de expressão observou-se
que independente da categoria de endometrite a maioria das amostras foi
atribuído o escore 3, o que demonstra que somente alguns tipos celulares
expressaram esta enzima. As células endoteliais e inflamatórias não revelaram
marcação de MMP-2 em nenhuma das amostras analisadas.
A ausência de marcação para MMP-2 foi observada em uma amostra
normal, sete amostras categoria III, quatro amostras de endometrite infiltrativa
48
e em três amostras de endometrose. Porém notou-se que não existem
diferenças significativas entre a expressão desta enzima nas diferentes
categorias de endometrite, conforme as Tabelas 23 e 24.
Considerando-se o local do endométrio no qual ocorria a marcação
positiva para MMP-2, notou-se que havia diferença significativa entre as
regiões observadas dentro da mesma categoria de endometrite. Estes dados
mostraram que as éguas da categoria I apresentaram intensidade de marcação
maior para MMP-2 na parede vascular e nas células estromais, sendo a
diferença significativa em relação ao epitélio luminal, a células endoteliais e as
células inflamatórias. Nas éguas das categorias IIB, III e infiltrativa a MMP-2 foi
expressa com maior intensidade pelas células do epitélio glandular, parede
vascular e células estromais em relação aos outros locais avaliados e nas
endometroses a expressão foi maior nas células estromais. Todos estes
resultados mostraram diferença significativa.
Quando a expressão da enzima, por região do endométrio, foi comparada
dentro de cada categoria de endometrite notou-se que a intensidade de
expressão da MMP-2 nas células do epitélio glandular foi significativamente
maior nas amostras classificadas como endometrite crônica categoria III em
relação as éguas normais. As éguas das categorias IIB e III também
expressaram MMP-2 com menor intensidade na parede vascular em relação às
éguas normais havendo diferença significativa.Os dados estão dispostos na
Tabela 25.
Nas endometrites crônicas infiltrativas e nas endometroses observou-se
intensidade significativamente menor de expressão da enzima MMP-2 na
parede vascular em relação às éguas normais. Nas endometrites infiltrativas
também houve expressão significativamente maior desta enzima nas células do
epitélio glandular em relação às éguas normais e às portadoras de
endometrose. Os dados estão dispostos na Tabela 26.
As Figuras 15 e 16 ilustram a expressão da MMP-2 no endométrio eqüino.
49
TABELA 23. Valores medianos da expressão de MMP-2 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-2
Categoria I 3,0a
1
Categoria IIB 2,5a
Categoria III 3,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 24. Valores medianos da expressão de MMP-2 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-2
Normal 3,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 3,0a
Endometrose 3,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 25. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-2 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
Epitélio glandular 1abA 1bAB 2bB
Célula endotelial 0aA 0aA 0aA
Parede vascular 2bA 1bB 1bB
Célula inflamatória 0aA 0aA 0aA
Célula estromal 2bA 1,5bA 2bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
50
TABELA 26. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-2 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991).
Local no endométrio Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
Epitélio glandular 1abA 2bB 1abA
Célula endotelial 0aA 0aA 0aA
Parede vascular 2bA 1bB 1abB
Célula inflamatória 0aA 0aA 0aA
Célula estromal 2bA 2bA 2bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
5.4.3 Metaloproteinase 7 (MMP-7)
Na análise da expressão da enzima MMP-7 foi verificada que a marcação
variou de fraca a moderada. A marcação intensa foi observada em apenas três
amostras. Esta enzima foi expressa por vários tipos celulares, porém a
marcação na parede vascular foi ausente em todas as amostras analisadas.
Com relação ao escore de expressão observou-se que independente da
categoria de endometrite a maioria das amostras apresentou escore 1, sendo
nove amostras da categoria I, sete da categoria IIB, 26 da categoria III, 21 do
tipo infiltrativa e 12 de endometrose.
A ausência de marcação para MMP-7 foi observada em apenas duas
amostras, sendo uma da categoria III e uma endometrite infiltrativa. Os
resultados referentes à MMP-7 revelaram que não existem diferenças
significativas entre a expressão desta enzima nos diferentes tipos de processo,
independentemente da classificação histológica, conforme demonstram as
Tabelas 27 e 28.
No que diz respeito a intensidade de marcação para MMP-7 observou-se
que, independente da classificação utilizada, as células que expressaram
escores de intensidade significativamente maiores para esta enzima foram as
células inflamatórias em relação aos outros elementos avaliados. Não houve
diferença entre a intensidade da expressão nos diferentes locais do endométrio
51
entre as categorias de endometrite. Estes resultados estão apresentados nas
Tabelas 29 e 30.
As Figuras 17 e 18 ilustram a expressão da MMP-7 no endométrio eqüino.
TABELA 27. Valores medianos da expressão de MMP-7 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-7
Categoria I 1,0a
1
Categoria IIB 2,0a
Categoria III 1,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 28. Valores medianos da expressão de MMP-7 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite EXPRESSÃO DE MMP-7
Normal 1,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 2,0a
Endometrose 1,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 29. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-7 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
Epitélio glandular 0aA 0aA 0aA
Célula endotelial 0aA 0aA 0aA
Parede vascular 0aA 0aA 0aA
Célula inflamatória 1bA 2bA 1bA
Célula estromal 0aA 0aA 0aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
52
TABELA 30. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-7 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991).
Local no endométrio Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
Epitélio glandular 0aA 0aA 0aA
Célula endotelial 0aA 0aA 0aA
Parede vascular 0aA 0aA 0aA
Célula inflamatória 1bA 1bA 1bA
Célula estromal 0aA 0aA 0aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
5.4.4 Metaloproteinase 9 (MMP-9)
Na análise da expressão da enzima MMP-9 foi verificada marcação difusa
e intensa na maioria das amostras. A ausência de marcação não foi observada
em nenhum caso analisado.
A enzima MMP-9 foi expressa em todos os locais avaliados neste estudo
e observou-se escore 6 de expressão para a maioria das amostras, sendo nove
da categoria I, oito da categoria IIB, 28 da categoria III, 29 do tipo infiltrativa e 7
com endometrose. Não foram observadas diferenças significativas entre a
expressão desta enzima nas diferentes categorias de endometrite, conforme as
Tabelas 31 e 32.
Quando comparada a intensidade da marcação nos diferentes locais do
endométrio dentro de cada categoria notou-se que as éguas com endometrite
categoria III apresentaram expressão significativamente menor no epitélio
glandular e na parede vascular. Por outro lado, as éguas com endometrite
infiltrativa expressaram a MMP-9 com intensidade significativamente menor na
parede vascular em relação a intensidade de marcação apresentada pelo
epitélio luminal, célula endotelial, célula inflamatória e célula estromal, mas não
em relação ao epitélio glandular desta mesma categoria. Os dados estão
dispostos na Tabelas 33 e 34.
As Figuras 19 e 20 ilustram a expressão da MMP-9 no endométrio eqüino.
53
TABELA 31. Valores medianos da expressão de MMP-9 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-9
Categoria I 6,0a
1
Categoria IIB 5,0a
Categoria III 6,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 32. Valores medianos da expressão de MMP-9 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-9
Normal 6,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 6,0a
Endometrose 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 33. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-9 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 3aA
1
3aA 3aA
Epitélio glandular 2aA 2aA 2bA
Célula endotelial 3aA 3aA 3aA
Parede vascular 2aA 1aA 2bA
Célula inflamatória 3aA 3aA 3aA
Célula estromal 3aA 2aA 3aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
54
TABELA 34. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-9 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991).
Local no endométrio Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Epitélio luminal 3aA
1
3aA 3aA
Epitélio glandular 2aA 2abA 2aA
Célula endotelial 3aA 3aA 3aA
Parede vascular 2aA 1,5bA 2aA
Célula inflamatória 3aA 3aA 2aA
Célula estromal 3aA 3aA 3aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
5.4.5 Inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP-1)
Na análise da expressão do inibidor tecidual de metaloproteinases 1
(TIMP-1) verificou-se marcação moderada a intensa e de padrão difuso na
maioria das amostras. A ausência da marcação deste inibidor não foi
observada em nenhuma das amostras estudadas.
Com relação ao escore de expressão observou-se que independente da
categoria de endometrite a maioria das amostras apresentou escore 6,
revelando que em todas as regiões avaliadas do endométrio o TIMP-1 foi
observado. O TIMP foi observado com escore 6 em seis casos de endometrite
crônica categoria I, seis casos de endometrite crônica categoria IIB, 22 de
endometrite crônica categoria III, 21 do tipo endometrite infiltrativa e em sete
casos de endometrose. Não foram observadas diferenças significativas entre a
expressão deste inibidor nas diferentes categorias de endometrite, conforme as
Tabelas 35 e 36.
Quando foi avaliada a intensidade da marcação do TIMP-1 nas amostras
de endométrio observou-se que na maioria destas a marcação era acentuada,
independentemente da classificação utilizada. Nas éguas categoria I observou-
se que a intensidade de marcação foi maior nas células estromais e endoteliais
em relação aos demais locais avaliados, mostrando diferença significativa. Nas
éguas com endometrite categoria IIB a intensidade de marcação foi
significativamente maior nas células do epitélio luminal, células estromais e
55
células endoteliais em relação à parede vascular. Nas éguas categoria III a
intensidade de marcação foi significativamente maior nas células do epitélio
luminal, células estromais, células inflamatórias e células endoteliais em
relação à parede vascular e o epitélio glandular. As éguas com endometrite
infiltrativa revelaram intensidade de marcação mais intensa nas células do
epitélio luminal, células estromais, células inflamatórias e células endoteliais
em relação à parede vascular e o epitélio glandular. Nas éguas com
endometrose a intensidade de marcação foi significativamente maior nas
células do epitélio luminal, células estromais e células endoteliais em relação à
parede vascular.
Quando a expressão da enzima, por região do endométrio, foi comparada
entre as categorias de endometrite não foi observada diferença significativa na
intensidade de marcação entre éguas normais e portadoras de endometrites
crônicas, independentemente da classificação utilizada.Os dados referentes a
estas análises estão dispostos nas Tabelas 37 e 38.
As Figuras 21 e 22 ilustram a expressão do TIMP-1 no endométrio eqüino.
TABELA 35. Valores medianos da expressão de TIMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e
Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de TIMP-1
Categoria I 4,0a
1
Categoria IIB 5,0a
Categoria III 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 36. Valores medianos da expressão de TIMP-1 nas diferentes
categorias de endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e
Alonso (1991).
Categoria de endometrite Expressão de TIMP-1
Normal 4,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 5,0a
Endometrose 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
56
TABELA 37. Valores medianos da intensidade da marcação de TIMP-1 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 2aA
1
3bA 3bA
Epitélio glandular 2aA 2abA 2aA
Célula endotelial 3bA 3bA 3bA
Parede vascular 1aA 0,5aA 1aA
Célula inflamatória 2aA 2abA 3bA
Célula estromal 3bA 3bA 3bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 38. Valores medianos da intensidade da marcação de TIMP-1 nos
diferentes locais do endométrio de acordo com as categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Ricketts e Alonso (1991).
Local no endométrio Normal Endometrite
Infiltrativa
Endometrose
Epitélio luminal 2aA 3bA 3bA
Epitélio glandular 2aA 2aA 2abA
Célula endotelial 3bA 3bA 3bA
Parede vascular 1aA 1aA 0aA
Célula inflamatória 2aA 3bA 2abA
Célula estromal 3bA 3bA 3bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo
teste de Kruskal-Wallis.
57
FIGURA 13. Amostra P90/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica categoria
degenerativa / III. Marcação positiva de MMP-1 (1:100) nas células do epitélio glandular
(EG), na fibrose periglandular (FPG) na região do estrato compacto e nas células do
epitélio luminal (EL).
FIGURA 14. Amostra P90/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica degenerativa /
III. Marcação positiva de MMP-1 (1:100) nas células do epitélio glandular e na fibrose
periglandular na região do estrato compacto.
FPG
FPG
EG
EG
EL
EG
58
FIGURA 15. Amostra P92/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
IIB. Marcação positiva de MMP-2 (1:200) nas células do epitélio glandular (EG) no estrato
esponjoso.
FIGURA 16. Amostra P99/04. Endométrio eqüino com endometrite infiltrativa / IIB.
Marcação positiva de MMP-2 (1:200) na parede vascular (PV) e células estromais (setas)
no estrato esponjoso.
EG
PV
59
FIGURA 17. Amostra P208/01. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
IIB. Marcação positiva de MMP-7 (1:100) nas células inflamatórias intra-epiteliais luminais
(seta) (Barra = 50µ
µµ
µm).
FIGURA 18. Amostra P202/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
III. Marcação positiva de MMP-7 (1:100) em células inflamatórias intra-epiteliais
glandulares (setas) na região do estrato esponjoso (Barra = 50µ
µµ
µm).
60
FIGURA 19. Amostra P91/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa / III.
Marcação positiva de MMP-9 (1:100) nas células do epitélio luminal (EL),
epitélioglandular (EG) e nas células endoteliais (seta) na região do estrato compacto.
FIGURA 20. Amostra P201/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa /
III. Intensa marcação positiva de MMP-9 (1:100) nas células do epitélio glandular (EG) e
estromais (seta) na região do estrato compacto.
EL
EG
EG
61
FIGURA 21. Amostra P03/05. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa / III.
Intensa marcação positiva de TIMP-1 (1:100) nas células do epitélio luminal (EL) e nas
células inflamatórias na região do estrato compacto (seta).
FIGURA 22. Amostra P82/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica infiltrativa / III.
Intensa marcação positiva de TIMP-1 (1:100) nas células do epitélio glandular (EG) e na
parede vascular (seta) na região do estrato esponjoso.
EL
EG
62
6 DISCUSSÃO
As alterações fibróticas e inflamatórias foram as lesões de maior
relevância nas biópisas endometriais eqüinas. Ricketts (1975) foi o primeiro
autor a avaliar amostras de endométrio eqüino. Kenney e Doig (1986) e
Ricketts e Alonso (1991) classificaram as amostras de biópsias uterinas de
acordo com o grau de fibrose periglandular e inflamação. Segundo Evans,
Miller e Ganjam (1998) vários esquemas de classificação, incluindo o sistema
modificado de Kenney e Doig (1986), têm auxiliado no prognóstico dos
problemas reprodutivos na espécie eqüina. Estes mesmos autores afirmaram
que embora estas classificações descrevam a localização, a freqüência e a
severidade da fibrose periglandular as avaliações são semi-quantitativas e que
a fibrose periglandular necessita de avaliação mais detalhada do tamanho dos
focos fibróticos, número de células envolvidas no foco fibrótico e percentual de
glândulas endometriais individuais circundadas por duas ou mais camadas de
fibroblastos. No sistema de Kenney e Doig (1986) o conjunto destas alterações
poderia ser classificado, em uma mesma amostra, como categoria IIA, IIB ou
III, dependendo da severidade da fibrose.
Nossos resultados mostraram que a intensidade do infiltrado inflamatório
e o grau das alterações fibróticas foram os achados mais importantes. Deve-se
destacar, no entanto, seguindo-se a classificação proposta por Kenney e Doig
(1986), que as lesões fibróticas por si só, quando muito acentuadas, são
suficientes para que a lesão uterina seja classificada como pertencente a
categoria III, mesmo que sejam acompanhadas de infiltrado inflamatório
discreto. Ainda segundo os nossos resultados, quando aplicada a classificação
de Ricketts e Alonso (1991) as amostras de endometrite infiltrativa englobavam
amostras que, pelo método de Kenney e Doig (1986) foram consideradas como
pertencentes a categoria IIB ou categoria III, mostrando o caráter
predominantemente inflamatório da maioria das amostras (60,98%). As
alterações degenerativas foram observadas com baixa freqüência (20,73%). No
entanto, muitas das éguas utilizadas no presente estudo, classificadas como
portadoras de endometrite crônica categoria III, mostraram lesões compatíveis
com àquelas observadas nos casos de endometrose.
63
A avaliação histoquímica de biópsias endometriais representam um
método bastante eficaz para o estabelecimento de diagnósticos mais precisos.
Segundo Blanchard et al (1987) os métodos de colorações tricrômicos auxiliam
nesta avaliação.
No presente trabalho, a utilização do tricrômico de Masson permitiu a
identificação dos focos de fibrose endometrial, facilitando a análise de sua
distribuição e a avaliação da intensidade dessa alteração nas diferentes
categorias de lesão crônica do endométrio. Estas alterações, no entanto podem
ser observadas em colorações de rotina como a hematoxilina e eosina. A
vantagem da utilização deste método reside na observação minuciosa da
fibrose estromal difusa, presente na maioria dos casos de endometrose e
endometrites crônicas categorias IIB e III. Blanchard et al. (1987) já haviam
realizado estudo utilizando o tricrômico de Masson na avaliação da fibrose
endometrial eqüina e concluíram também que não houve diferença entre a
utilização do método tricrômico em relação ao método de HE para a detecção
da incidência e severidade da fibrose periglandular focal. No entanto
observaram que este método foi bastante útil para a detecção da freqüência,
severidade e distribuição do tecido conjuntivo estromal.
Neste estudo observou-se que a fibrose endometrial se localiza
preferencialmente em torno das glândulas, dos vasos sangüíneos e difusa no
estrato esponjoso conforme descrito por Kenney (1978). Estes dados também
foram notados por Leischman, Miller e Doig (1982) que observaram que o
aumento do número de camadas de tecido conjuntivo em volta das glândulas
endometriais correlaciona-se significativamente com baixa fertilidade: éguas
com uma média menor do que três camadas de fibrose periglandular têm 75%
de probabilidade de levar uma gestação a termo, enquanto que éguas com
uma média maior do que 3,5 camadas apresentam um prognóstico pior (25%)
para fertilidade.
Assim também, a avaliação da esclerose vascular utilizando-se o método
de tricrômico de Masson revelou resultados bastante satisfatórios, pois permitiu
a detecção do colágeno depositado em torno dos vasos, mesmo aqueles mais
discretos. As classificações de Kenney e Doig (1986) e Ricketts e Alonso
(1991) não contemplam as alterações vasculares entre os critérios de avaliação
da endometrite. No entanto, deve-se considerar que a angiose pode reduzir
64
indiretamente a fertilidade pela redução da perfusão endometrial, pelos
distúrbios de drenagem uterina causados pela redução da função das veias e
que as alterações patológicas no útero produzidas pela esclerose vascular
podem contribuir para endometrose (INOUE et al., 2000; LEBLANC, 2003).
O método de picrosirius red, também utilizado neste estudo, revelou
resultados bastante vantajosos em relação ao tricrômico de Masson. Estes
dados são semelhantes aos descritos por Caldini (1992) que relatou que
embora as fibras colágenas apareçam geralmente bem coradas pelo método
de Masson, outras estruturas que contém colágeno (como as fibras reticulares
e as membranas basais) não são coradas seletivamente pelos métodos
tricrômicos e, por isto, os vários tipos de colágeno não podem ser distinguidos.
De acordo com Luna (1968) é fato conhecido que o tricrômico de Masson não é
especialmente útil para o estudo das fibras que contém colágeno. Mesmo
assim, Caldini (1992) afirma que existe um efeito significativo desta coloração
sobre o diagnóstico da presença e da severidade do processo fibrótico nos
endométrios eqüinos.
Através da simples coloração com o picrosirius red é possível a detecção
de fibras que contém colágeno no estroma dos endométrios eqüinos,
conferindo a estas fibras um tom vermelho profundo. A associação deste
método à polarização de luz promove um aumento da sensibilidade e resolução
das imagens, permitindo a distinção entre os tipos de colágeno, fibrilar e denso,
destacados pela refringência das fibras, em decorrência do efeito de campo
escuro obtido na polarização (CALDINI, 1992).
Vários trabalhos têm sido realizados utilizando-se o método de picrosirius
red. Este método é empregado não só para evidenciar a presença do colágeno
nos órgãos e estruturas normais (JUNQUEIRA et al, 1980), mas também para
a separação dos seus tipos em lesões fibróticas (ANDRADE et al., 1999).
Assim sendo, o uso rotineiro do método de picrosirius red sob polarização
poderia ser de grande valor na avaliação do tipo de colágeno presente na
fibrose periglandular endometrial eqüina.
A avaliação da distribuição do colágeno nas diversas categorias de
endometrites crônicas revelou que quanto mais grave o grau da endometrite
mais acentuado era o acúmulo de colágeno. Nas éguas com endometrites
65
crônicas verificou-se maior distribuição periglandular, perivascular e no estrato
esponjoso. Nunes (2003) encontrou resultados semelhantes ao estudar o
padrão de distribuição e tipos de colágeno nas endometrites crônicas. Esta
autora observou que havia maior concentração de colágeno nas regiões
periglandular e perivascular e no estrato esponjoso. Ao correlacionar a
gravidade da endometrite com a distribuição do colágeno, concluiu que quanto
mais grave o grau, mais acentuado o acúmulo de colágeno ao redor das
glândulas. Assim sendo, a estrutura glandular afetada tem sua função
comprometida e as conseqüências deste comprometimento são o prejuízo no
desenvolvimento microcotiledonário, a redução da taxa de crescimento fetal e a
alteração das secreções endometriais, que, em última análise, vão influenciar
negativamente a performance reprodutiva da égua (KENNEY e DOIG, 1986;
EVANS; MILLER e GANJAM, 1998).
Nas lesões fibróticas de qualquer natureza são importantes não só a
determinação do grau de intensidade e a distribuição, mas também os tipos de
colágeno que as compõe. A utilização do método de picrosirius red associado à
microscopia de polarização é extremamente útil nesta avaliação. Andrade et al.
(1999), avaliaram as alterações fibróticas em granulomas hepáticos e
constataram que o método de picrosirius red pode auxiliar o estudo da
cronologia destas lesões. Estes autores observaram que, à medida que os
granulomas se organizavam, havia o aumento progressivo da espessura das
fibras de colágeno e, portanto, a substituição das fibras mais delgadas do
colágeno do tipo III pelas fibras mais densas e compactas do colágeno do tipo
I.
Os resultados obtidos neste experimento revelam que o colágeno tipo III
foi o mais freqüentemente observado nas amostras de éguas normais
enquanto que nas éguas portadoras de endometrites crônicas o colágeno
predominante foi o tipo I. Estes dados estão de acordo com Caldini (1992) que
afirmou que a base molecular da fibrose endometrial eqüina reside na
substituição do colágeno tipo III, presente na maior parte da lâmina própria de
endométrio, por colágeno do tipo I, demonstrando que o colágeno está
envolvido nas bases moleculares deste processo patológico. Nunes (2003)
66
verificou que o colágeno do tipo I foi mais freqüente nas lesões fibróticas
periglandulares nas biópsias incluídas nas categorias IIB e III.
Os dados obtidos por meio da análise morfométrica demonstraram que as
lesões fibróticas localizam-se preferencialmente ao redor das estruturas
glandulares e vasculares.
A análise morfométrica da fibrose periglandular revelou que quanto maior
é o grau de endometrite mais acentuada é a lesão fibrótica localizada em torno
das glândulas endometriais. Os resultados deste estudo mostraram que as
éguas com lesões endometriais mais graves, ou seja categoria IIB, categoria
III, endometrites infiltrativa e endometrose, apresentaram percentuais de
fibrose periglandular significativamente maiores do que as éguas normais. O
valor percentual médio para a fibrose periglandular foi de 0,92% nas éguas
normais, 3,67% nas éguas com endometrite crônica categoria IIB, 5,02% nas
éguas com endometrite categoria III, 4,67% nas endometrites infiltrativas e
4,72% nas endometroses. Estes dados concordam com os descritos por
Evans, Miller e Ganjam (1998) que encontraram fibrose ausente ou mínima nos
endométrios classificados como categoria I e que relataram que a fração do
volume do colágeno periglandular endometrial tem correlação positiva com a
categoria da endometrite crônica, encontrando como valores médios de
percentual de fibrose 0,05% nas éguas categoria I e 13,47% nas éguas
categoria III. Isto se deve a presença de grandes ninhos fibróticos e a fibrose
em torno de ramos glandulares individuais, que são mais freqüentes e mais
graves nas endometrites crônicas categoria III. Estes autores encontraram
diferença significativa entre cada uma das categorias.
A técnica de VVG permitiu avaliar a quantidade de fibras elásticas
presentes na vasculatura endometrial e correlacioná-las com a quantidade de
fibrose existente, caracterizando assim, os processos de esclerose vascular no
endométrio eqüino. Observou-se, no entanto, que poucas fibras elásticas eram
marcadas pelo corante. Segundo Caldini (1992), apenas as fibras elásticas
maduras são coradas pela Hematoxilina Férrica de Verhöeff. Isto pode ser
explicado pelo fato de que nem toda a elastina detectável bioquimicamente é
Verhöeff-positiva e, assim, apenas as fibras maduras (que contém grande
quantidade de elastina) são coradas por esta técnica. Um outro fator observado
67
é a instabilidade deste corante, sendo necessária a sua utilização a fresco para
obtenção de resultados confiáveis. Além disto, o processo de diferenciação da
coloração com a utilização do cloreto férrico a 2% requer bastante atenção,
sendo o tempo de 20 segundos de imersão nesta solução o mais adequado
para amostras de endométrio eqüino.
A fibroelastose da vasculatura endometrial, evidenciada pelo método de
VVG demonstrou que nas endometrites crônicas eqüinas as alterações
vasculares se tornavam mais graves à medida que o grau de endometrite
aumentava. No entanto, todas as amostras mostraram algum grau de
fibroelastose. Estes dados reforçam os descritos por Inoue et al. (2000) que
relataram que há relação entre as endometroses e a esclerose da íntima e da
adventícia de pequenas artérias observadas no endométrio.
A avaliação morfométrica da fibrose perivascular revelou que quanto
maior é o grau de endometrite as alterações vasculares também se agravavam.
Nas amostras classificadas como endometrite categoria III e infiltrativa o
percentual de esclerose vascular foi significativamente maior que nas éguas
normais. Porém não houve diferença significativa com relação às alterações
vasculares entre as éguas normais e com endometrites infiltrativas ou
endometroses. Estes dados estão de acordo com Walter et al (2001) que
revelaram que as alterações escleróticas não necessariamente estão ligadas
às endometroses. Sabe-se, no entanto, que alterações no ambiente uterino
produzidas pela esclerose das artérias podem contribuir para a progressão da
endometrose ou esta pode ocorrer como resultado da idade. No entanto, a
patogênese deste processo ainda permanece desconhecida.
Segundo Schoon, Schonn e Klug (1999) a degeneração vascular
endometrial também contribui para o retardo do clearance uterino. Desta forma,
a falha da limpeza uterina favorece o aparecimento das endometrites. Por outro
lado, a endometrose é definida como uma condição degenerativa que resulta
de inflamação aguda e as éguas com endometrose podem ser incapazes de
conceber ou manter a prenhez e isto pode resultar em infecções crônicas
uterinas (DOIG; MCNIGHT e MILLER, 1981; DASCANIO et al., 1998). Inoue et
al (2000) citaram que o grau de comprometimento dos vasos acompanha a
gravidade da lesão uterina e que esta afecção pode ser conseqüência da
idade, de inflamação crônica e possivelmente de fatores endócrinos.
68
Grüninger et al. (1998) realizaram estudo sobre a incidência de
angiopatias em relação à idade e ao número de partos em éguas e observaram
que a perivasculite foi observada em apenas 20,5% das amostras enquanto
que a angiose foi notada em 88,9%. Nossos resultados revelaram que 92,68%
das amostras apresentaram comprometimento vascular caracterizado pela
deposição de colágeno em torno das arteríolas, não havendo, nesses casos,
sinais de processo inflamatório vascular.
Com relação à fibroelastose nossos resultados revelaram que 8,53% das
amostras apresentaram fibroelastose tipo 1, 34,15% tipo 2, 34,15% tipo 3 e
23,17% tipo 4. Nas éguas normais verificou-se que 60,00% das amostras
revelaram alterações vasculares discretas (tipo 2) enquanto que, nas éguas
com endometrite, as alterações observadas foram do tipo moderada (tipo 3) na
maioria das amostras. Estes dados concordam com Grüninger et al (1998) que
constataram que éguas virgens não mostram alterações vasculares severas,
entretanto, nas éguas mais idosas (entre 13 e 19 anos) e multíparas, observa-
se moderada degeneração da membrana elástica interna e perifibrose ou
perifibroelastose. Assim também, Oikawa et al. (1993) observaram que as
artérias uterinas de éguas que tiveram mais de uma gestação mostravam graus
variáveis de elastose das camadas íntima e adventícia.
A utilização dos métodos imunoistoquímicos em biopsias endometriais
eqüinas introduz um elemento importante de avaliação no diagnóstico e
prognóstico da fertilidade em éguas (MANSOUR, 2000). Estudos
imunoistoquímicos têm sido realizados em diferentes espécies no sentido de
detectar a expressão destas enzimas no endométrio (ZHANG e
SALAMONSEN, 2002).
Neste estudo foram utilizados anticorpos monoclonais e policlonais anti-
humanos para metaloproteinases e um de seus inibidores. A ausência de
marcação dos anticorpos monoclonais MMP-1, MMP-2 e MMP-7 em algumas
amostras provavelmente se deve a falhas no processamento histológico do
material de arquivo. Este problema não ocorreu com os anticorpos policlonais.
As MMP-1, MMP-9 e TIMP-1 foram expressas por células epiteliais luminais e
glandulares, pelas células endoteliais, estromais e inflamatórias e pela parede
vascular. A MMP-2 não foi expressa pelas células endoteliais e inflamatórias e
a MMP-7 não foi observada na parede vascular. Estes locais de expressão de
69
cada enzima variaram em intensidade em éguas normais e portadoras de
endometrite. Na maioria dos casos, observou-se aumento na intensidade da
expressão das enzimas nas endometrites crônicas mais graves. As MMP-1 e
MMP-7 revelaram marcação imunoistoquímica fraca quando comparada com
as outras enzimas estudadas. González et al. (2002) também observaram que
a marcação da MMP-7 foi bem mais fraca que MMP-1 e MMP-2.
A MMP-1 foi expressa por diferentes tipos celulares em éguas normais e
com endometrites crônicas, porém, nos quadros crônicos observou-se aumento
da intensidade da marcação o que sugere o envolvimento desta enzima nestes
processos. Os resultados revelaram também que a intensidade de marcação
da MMP-1 nas células do epitélio glandular foi significativamente maior nas
endometrites crônicas III e nas endometroses do que nas éguas normais. Os
estudos no endométrio humano revelaram que na fase pré-menstrual e
menstrual, do endométrio normal, são encontradas as MMP-1 e MMP-3, nas
células estromais (NOGUCHI et al., 2003). No presente estudo a MMP-1 foi
expressa pelas células estromais com baixa intensidade e não revelou
diferença significativa entre as amostras normais e com endometrites crônicas.
A MMP-1 representa uma enzima do grupo das colagenases intersticiais
(MMP-1, MMP-8 e MMP-13) que degradam os colágenos fibrilares I, II e III
(BRANTON e KOPP, 1999; GOFFIN et al., 2003). Nas amostras analisadas
neste estudo observou-se a deposição dos colágenos I e III. As amostras
normais mostraram predominância do colágeno tipo III enquanto que nas
amostras de endometrite prevaleceu o colágeno tipo I. Nas endometrites
crônicas categoria III e nas endometrites degenerativas, onde a intensidade da
MMP-1 foi maior, o colágeno tipo I era predominante.
As enzimas do grupo das gelatinases (MMP-2 e MMP-9) que degradam o
colágeno amorfo e fibronectina também foram avaliadas e revelaram que a
MMP-2 foi expressa por vários tipos celulares, mas não foi observada nas
células endoteliais e inflamatórias. Os resultados obtidos por Zhang e
Salamonsen (2002) no útero humano demonstraram que esta enzima se
encontra mais amplamente distribuída, sendo detectada na maioria das células
endometriais, sejam epiteliais, estromais, vasculares, mas não nos leucócitos,
porém observada em maior intensidade no tecido menstrual em degeneração.
70
Nossos resultados também revelaram que a maioria das amostras apresentou
escore 3 para expressão da MMP-2. Isto indica que, em média, apenas três
locais do endométrio, por amostra, expressavam esta enzima.
Nas amostras de éguas normais a MMP-2 foi expressa com maior
intensidade pela parede vascular e pelas células estromais. Nas endometrites
categoria IIB, III e infiltrativa a expressão desta enzima se deu nas células do
epitélio glandular, parede vascular e células estromais e nas endometroses nas
células estromais.
Os dados revelaram que quanto maior o grau de endometrite maior é a
intensidade da expressão desta enzima nas células epiteliais glandulares,
parede vascular e células estromais. Estes dados concordam com os achados
de Noguchi et al. (2003) que demonstraram que as MMP-2 e MMP-9 são
expressas no estroma e epitélio glandular em todo o ciclo menstrual ou na fase
secretória das mulheres. Walter et al. (2005) observaram que a MMP-2 estava
localizada no estrato compacto no endométrio de éguas saudáveis e com
endometrose. Os autores sugerem que a MMP-2 tenha um papel importante
nas alterações da homeostase da matriz extracelular em regiões de fibrose
endometrial.
A presença de colágeno do tipo I em lesões fibróticas pode estar
relacionada a produção de MMP-2. De acordo com Arthur (2000) as células
estreladas hepáticas quando ativadas e exibindo fenótipo de miofibroblastos,
secretam pro-MMP-2, induzidas pela presença de colágeno do tipo I, o mais
abundante no fígado fibrótico. Nas amostras endometriais deste estudo
também foi observado o colágeno do tipo I como o tipo predominante,
indicando que a MMP-2 pode ter a sua expressão aumentada devido a
presença do colágeno mais espesso. Porto et al (2005) afirmaram que existem
evidências de que a MMP-2 e a MMP-9 participem do processo fibrótico que
ocorre na endometrite crônica das éguas. Walter et al. (2005) avaliaram a
expressão de MMP-2 na fibrose periglandular das éguas e verificaram que a
expressão desta enzima estava associada com a dilatação e a fibrose
glandular.
A MMP-9, outra enzima do grupo das gelatinases, foi expressa por células
epiteliais luminais e glandulares, pelas células endoteliais, estromais e
71
inflamatórias e pela parede vascular. A marcação da MMP-9 em todas
amostras foi difusa e acentuada. Nas éguas com endometrite crônica categoria
III notou-se expressão significativamente maior no epitélio glandular e na
parede vascular, em relação às outras categorias. As éguas com endometrite
infiltrativa expressaram a MMP-9 com intensidade significativamente menor na
parede vascular em relação a intensidade de marcação apresentada pelo
epitélio luminal, célula endotelial, célula inflamatória e célula estromal, mas não
em relação ao epitélio glandular desta mesma categoria. De acordo com Zhang
e Salamonsen (2002) a MMP-9 é encontrada no epitélio somente durante a
fase secretória precoce e durante a menstruação nas mulheres. De acordo com
estes mesmos autores a MMP-9 está presente predominantemente em
leucócitos. González et al. (2002) também encontraram expressão de MMP-9
pelas células gigantes multinucleadas, células epitelióides e macrófagos.
Nas éguas, também foi verificada presença das MMP-2 e MMP–9, no
fluido folicular, em todos os estágios de desenvolvimento dos folículos
ovarianos, indicando sua necessidade durante o remodelamento tecidual no
crescimento e desenvolvimento folicular (RILEY et al., 2001). Song, Porter e
Coomber (1999) acreditam que as células estromais ovarianas da égua
produzem importantes componentes da matriz extracelular e que estes
representam papel fundamental no remodelamento tecidual durante o
crescimento folicular.
Dentre as estromalisinas (MMP-3, MMP-7 e MMP-10) que degradam
componentes da membrana basal como colágeno IV e V, laminina e outras
proteínas como a fibronectina, a MMP-7 foi a única avaliada no presente
estudo.
A MMP-7 neste estudo foi expressa pelas células epiteliais luminais e
glandulares, pelas células estromais, endoteliais e inflamatórias. Porém
independentemente do grau de endometrite as células inflamatórias foram o
tipo celular que mais expressou esta enzima. Po-Yin Chu et al. (2002)
observaram a presença de MMP-7 e MMP-9 no endométrio de cadelas com
anestro, hiperplasia cística endometrial, piometra e durante o pós-parto. Todos
estes fatores induzem a uma resposta inflamatória do endométrio o que
72
permite supor que quanto maior a quantidade de células inflamatórias, de
acordo com os resultados deste estudo, maior seria a expressão da MMP-7.
De acordo com Branton e Kopp (1999) as MMPs podem ser inativadas
pelos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMP-1, TIMP-2 e TIMP-3) que
são produzidos principalmente por células mesenquimais e previnem a ação
descontrolada das MMPs. Os TIMP-1 e TIMP-2 têm atividade mitogênica em
variados tipos celulares, entretanto a alta expressão destes inibidores reduz o
crescimento tumoral (NAGASE e WOESSNER JR, 1999). O TIMP-1 foi
expresso pelas células estromais em diferentes estudos. No presente trabalho,
a marcação imunoistoquímica do TIMP-1 no endométrio eqüino, revelou-se
intensa e difusa em todas as amostras. Nas éguas normais o TIMP-1 foi
expresso com maior intensidade pelas células estromais e endoteliais. Nos
animais com endometrite os resultados foram variados, no entanto a expressão
foi maior nas células do epitélio luminal, células estromais, células endoteliais e
células inflamatórias. A expressão deste tipo de inibidor de metaloproteinase já
foi identificada em outros órgãos do sistema genital. Song, Porter e Coomber
(1999) e Riley et al. (2001) também observaram expressão de TIMP-1 pelas
células estromais durante o crescimento ovariano.
Lenhart et al. (2002) demonstraram que no útero suíno a expressão dos
inibidores das metaloproteinases está relacionada ao aumento da expressão
de relaxina durante a fase precoce da prenhez, sugerindo que esta estimula o
crescimento uterino durante a placentação. Um estudo realizado por Freitas et
al. (1999) verificando a expressão das MMPs e TIMPs nos vasos sangüíneos
do endométrio humano constatou que ambas participam dos processos de
remodelamento durante a angiogênese e menstruação e sugerem que as
alterações cíclicas envolvem componentes vasculares.
73
6.1 Considerações finais
Os resultados dos estudos morfológicos das endometrites crônicas das
éguas têm adicionado dados importantes para o entendimento da etiologia,
patogênese, diagnóstico, tratamento e prognóstico deste processo. No entanto,
por se tratar de uma alteração morfológica complexa, as dificuldades
enfrentadas são inúmeras.
As endometrites apresentam etiologias diversas e que muitas vezes nos
casos naturais não são identificadas pelos meios de diagnóstico rotineiros. O
próprio sêmen quando introduzido no útero de éguas sadias altera a população
de células de defesa do endométrio, gerando uma resposta inflamatória
transitória. A resposta a esta grande variedade de agentes deve mostrar
variações mesmo que sutis.
A avaliação do histórico reprodutivo da égua torna-se bastante importante
para adicionar dados aos achados morfológicos. Dados como a idade das
éguas e o número de partos seriam fundamentais, pois permitiriam
correlacionar os achados referentes às endometroses e às alterações
vasculares.
A análise histopatológica das lesões crônicas do endométrio fornece
informações sobre o estado funcional da mucosa uterina e a evolução do
processo inflamatório. Nestas lesões predominam o infiltrado leucocitário e as
alterações fibróticas. Nossos resultados, aqui apresentados, assim como os de
outros trabalhos na mesma linha, mostram que a utilização de métodos
histoquímicos, aliados a análise morfométrica, podem permitir a obtenção de
dados que esclareçam pontos importantes relacionados aos estudos
morfológicos das endometrites crônicas das éguas. Sendo a fibrose um dos
elementos principais da reação tecidual, a determinação do seu arranjo,
localização e composição podem auxiliar na determinação do grau de
comprometimento do endométrio e das chances de regressão da lesão já
estabelecida.
A avaliação da expressão das metaloproteinases, através da
imunoistoquímica, sugere que as MMPs e os TIMPs desempenham papel
importante no remodelamento tecidual do endométrio eqüino. O estudo destas
74
enzimas no endométrio normal deve ser continuado no que diz respeito às
alterações cíclicas endometriais e fases de placentação e implantação
embrionária, além das pesquisas referentes às endometrites crônicas. O
estudo das MMPs e TIMPs no endométrio eqüino pode vir a esclarecer pontos
importantes como a patogênese e a evolução das endometrites nas éguas,
bem como, poderá auxiliar na descoberta de novos métodos de tratamento
para esta enfermidade.
75
7. CONCLUSÕES
Os resultados deste estudo permitiram concluir que:
As endometrites crônicas foram na sua maioria classificadas como
categoria III no sistema de Kenney e Doig (1986) e crônicas
infiltrativas pelo sistema de Ricketts e Alonso (1991), mostrando
que prevaleceram as alterações do tipo inflamatórias e fibróticas;
A distribuição do colágeno presente na fibrose endometrial das
éguas foi preferencialmente nas regiões periglandulares e
perivasculares e no estrato esponjoso;
O tipo de colágeno predominante na fibrose periglandular nas
amostras endometriais de éguas normais e portadoras de
endometrite foi o do tipo I;
A esclerose vascular e o grau de fibroelastose aumentam no
endométrio eqüino conforme aumenta o grau de endometrite
crônica;
A MMP-1, MMP-9 e TIMP-1 foram expressas pelas células
epiteliais luminais e glandulares, estromais, endoteliais e
inflamatórias e pela parede vascular de éguas normais e com
endometrites crônicas;
A MMP-2 foi expressa pelas células epiteliais luminais e
glandulares, estromais e pela parede vascular de éguas normais e
com endometrites crônicas;
A MMP-7 foi expressa pelas células epiteliais luminais e
glandulares, estromais, endoteliais e pelas células inflamatórias em
amostras de éguas normais e com endometrites crônicas;
A MMP-1 foi expressa com maior intensidade pelas células do
epitélio glandular nas endometrites crônicas categoria III e nas
endometroses do que nas éguas normais;
A MMP-2 revelou maior intensidade nas células do epitélio
glandular, parede vascular e células estromais nas endometrites
categoria IIB, III e infiltrativa e nas células estromais nas
endometroses;
76
A MMP-2 mostrou reação menor na parede vascular das éguas
com endometrite e mais intensa no epitélio glandular das éguas
com endometrites III e infiltrativas;
A MMP-7 foi expressa com maior intensidade pelas células
inflamatórias em amostras normais e com endometrites crônicas;
A MMP-9 foi expressa com maior intensidade pelo epitélio luminal,
e pelas células endoteliais, inflamatórias e estromais nas
endometrites crônicas categoria III e infiltrativas;
O TIMP-1 foi expresso com maior intensidade pelas células
estromais e endoteliais nas éguas normais e pelas células do
epitélio luminal, células estromais, endoteliais e inflamatórias nas
éguas com endometrite;
As MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 e o TIMP-1 estão envolvidos
nos processos fibróticos endometriais das éguas uma vez que há
variação na expressão destas enzimas nas diferentes regiões do
endométrio conforme o grau de endometrite.
77
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85
9. TRABALHO A SER ENVIADO PARA A REVISTA “ ARQUIVO
BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA – Brazilian
Journal of Veterinary and Animal Sciences”
EXPRESSÃO DE MMP-1 E MMP-7 NO ENDOMÉTRIO DE ÉGUAS NORMAIS
E PORTADORAS DE ENDOMETRITES
Louisiane de Carvalho NUNES
1
, Camila Dias PORTO
2
, Julio Lopes SEQUEIRA
3
,
Marco Antônio ALVARENGA
4
, Deilson Elgui de OLIVERA
5
, Sebastião Martins
FILHO
6
1
Professora Assistente do Departamento de Zootecnia e Economia Rural, Centro de
Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo, Alegre, ES, Brasil
2
Pós-graduanda do curso de Mestrado da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil.
3
Professor Assistente Doutor do Departamento de Clínica Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo,
Brasil.
4
Professor Doutor do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista,
Botucatu, São Paulo, Brasil.
5
Professor Assistente Doutor do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil.
6
Professor Adjunto do Departamento de Economia Rural, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Espírito Santo, Alegre, ES, Brasil
Endereço:
Julio Lopes Sequeira
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Departamento de Clínica Veterinária, Caixa Postal 560, Distrito de Rubião Júnior,
Botucatu, SP, CEP 18618-970.
86
RESUMO
Este estudo teve por objetivo avaliar a expressão das enzimas MMP-1 e MMP-7
no endométrio de éguas normais e portadoras de endometrites. Foram utilizadas 82
biópsias uterinas recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária e de Reprodução
Animal da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. As biópsias uterinas foram fixadas em bouin
por até 24 horas e transferidas solução de álcool a 70%. O material foi incluído em
parafina e corado pelo método de HE para a classificação histológica (Kenney e Doig,
1986) e submetido à técnica de imunoistoquímica. Os anticorpos utilizados foram
MMP-1 (RDI-MMP1abm-E5) e MMP-7 (RDI-MMP7amb-B2). A análise histológica
revelou que prevaleceram as alterações dos tipos inflamatórias e fibróticas. A MMP-1 e
MMP-7 foram expressas por diversos tipos celulares no endométrio normal e com
endometrite crônica. A intensidade de marcação da MMP-7 foi maior nas células
inflamatórias tanto nas éguas normais quanto com endometrites.A intensidade de
marcação da MMP-1 foi significativamente maior nas células do epitélio glandular nas
endometrites crônicas categoria III em relação às amostras normais.
Palavras-chave: endométrio, eqüino, MMP-1, MMP-7.
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the expression of the enzymes MMP-1 and MMP-
7 in normal and chronic endometritis samples. eighty two uterine biopsies received at
Veterinary Pathology Service and Animal Reproduction Service of the FMVZ, UNESP,
Botucatu, SP were classified according to endometrial histopathological alterations. The
uterine biopsies were fixed in bouin’s fixative for up to 24 hours and transferred to 70%
alcohol solution, embedded in paraffin wax and staining with hematoxilyn-eosin. The
samples was classified according to Kenney and Doig (1986). The evaluation of matrix
metalloproteinaes was made by the immunohistochemical technique using as primary
antibodies MMP-1 (RDI-MMP1abm-E5) and MMP-7 (RDI-MMP7amb-B2).
Inflammatory and fibrotics were the predominant changes in endometrial samples. The
the MMP-1 and MMP-7 expressions did not showed significant difference between
normal endometrium and endometritis. The intensity of the MMP-1 expression was
higher in the glandular epithelium cells of category III chronic endometritis when
87
compared to normal endometrium. The MMP-7 labeled intensity was more intense in
inflammatory cells in both normal and endometritis samples.
Key-words: endometrium, equine, MMP-1 e MMP-7.
INTRODUÇÃO
Desde a década de 70, o exame histopatológico de biópsias endometriais tem sido
incluído na avaliação reprodutiva de éguas subférteis (Evans; Miller e Ganjam, 1998).
Esta técnica permite evidenciar a situação morfológica do endométrio e fornece dados
sobre a situação funcional, representando, portanto, uma ajuda valiosa no diagnóstico e
prognóstico da infertilidade na égua (Doig; Mcknight e Miller, 1981; Mansour et al.,
1997).
As alterações mais freqüentemente observadas nas análises de biópsias
endometriais de éguas são a endometrite crônica e a doença endometrial degenerativa
crônica (endometroses) (Evans; Miller e Ganjam, 1998).
Várias têm sido as metodologias propostas para classificação do endométrio com o
objetivo de se avaliar o potencial reprodutivo da égua. A classificação mais amplamente
utilizada foi proposta por Kenney (1978) e modificada por Kenney e Doig (1986),
segundo a qual o endométrio da égua pode ser classificado em quatro categorias (I, IIA,
IIB e III) de acordo com a presença, distribuição e intensidade das lesões observadas na
lâmina própria. Neste sistema, quanto maior o grau de classificação da biopsia, menor é
a probabilidade do endométrio suportar uma gestação.
A fibrose é um dos principais elementos da reação tecidual, sendo, portanto,
importante a determinação de seu arranjo, localização e composição para se avaliar o
grau de comprometimento do endométrio e as chances de regressão da lesão já
estabelecida (Nunes, 2003). Este processo não apenas interfere com a habilidade da
égua de levar uma gestação a termo, como também mostra pouco ou nenhuma resposta
ao tratamento (Amaral, 2002).
Durante os processos de reparo e nos processos de fibrose em geral os fibroblastos
proliferam em larga escala em resposta à injúria, constituindo a resposta do tecido
conjuntivo à inflamação (Cotran; Kumar e Collins, 1999). Segundo Montenegro e
Franco (1999) o que leva as células do tecido conjuntivo a proliferar e secretar os
componentes da matriz extracelular são mensageiros químicos sob a forma de peptídeos
88
secretados por vários tipos celulares (citocinas). Entre estas células, os macrófagos e os
linfócitos T estão entre as mais importantes. Segundo Walter et al. (2001) os
fibroblastos representam um papel essencial na síntese e regulação do tecido conjuntivo
e estão envolvidos no processo fibrótico.
Vários estudos têm revelado que a matriz extracelular não apenas fornece aos
tecidos um suporte estrutural, mas também troca informações com as células,
modulando uma série de processos que incluem: desenvolvimento, migração celular,
adesão, diferenciação e reparo (Branton e Kopp, 1999; Martinez-Hernandez, 1999). A
síntese e degradação da matriz acompanham dentre outros fatores os processos
fibróticos (Cotran; Kumar e Collins, 1999).
Segundo Branton e Kopp (1999) em circunstâncias normais, no remodelamento
tecidual, a taxa de síntese das proteínas da matriz são balanceadas por proteínas de
degradação, catalizadas por várias famílias de enzimas, incluindo plasmina e
metaloproteinases (MMPs).
A degradação da matriz extracelular envolve muitas enzimas, mas as
metaloproteinases (MMP) são as mais importantes nesse processo, e a interação das
MMP ativas e seus inibidores (inibidor tecidual de metaloproteinase - TIMP) é regulada
de tal forma que evita o dano tecidual desnecessário (Arthur, 2000; Lenhart et al.,
2002). As metaloproteinases são uma família de enzimas que degradam alguns
componentes da matriz extracelular como proteoglicanos, glicoproteínas e colágenos da
membrana basal. Acredita-se que esse grupo de enzimas desempenha papel fundamental
no remodelamento e reparo em vários processos (Osteen et al, 1994; Yokota et al.,
2002). Elas são divididas em vários subgrupos distintos, baseados na especificidade ao
substrato ou semelhanças estruturais: as colagenases intersticiais (MMP-1, MMP-8 e
MMP-13) que degradam os colagenos fibrilares I, II e III; as gelatinases (MMP-2 e
MMP-9) que degradam o colágeno amorfo e fibronectina; as estromalisinas (MMP-3,
MMP-7 e MMP-10) que degradam componentes da membrana basal como colágeno IV
e V, laminina e outras proteínas como a fibronectina; as metaloproteinases tipo
membrana (MT-MMP-1 a 6) que degradam colágeno I e III, fibronectina, laminina,
entactina/nidogênio, tenascina e perlecan e ainda ativam outras MMPs; e, ainda, existe
um grupo formado por enzimas de características estruturais e ações variadas, que inclui
MMP-12, MMP-18 a 26 (Branton e Kopp, 1999; Goffin et al., 2003.
89
Estudos imunoistoquímicos têm sido realizados em diferentes espécies no sentido
de detectar a expressão destas enzimas no endométrio. Goffin et al. (2003) relatam que
em humanos as MMP são responsáveis pelo remodelamento do colágeno uterino nas
fases pré-menstruais. Especificamente no trato reprodutivo feminino, estão relacionadas
ao remodelamento e reparo tecidual em eventos como ovulação, implantação
embrionária, útero pós-parto e involução da glândula mamária (Bruner et al., 1995).
Segundo Noguchi et al. (2003), o endométrio humano produz diferentes classes de
MMPs. Na fase pré-menstrual e menstrual, do endométrio normal, são encontradas as
MMP-1 e MMP-3, nas células estromais. As MMP-2 e MMP-9 são expressas no
estroma e epitélio glandular em todo o ciclo menstrual ou na fase secretória. A MMP-
TM1 é expressa no epitélio endometrial em todas as fases do ciclo menstrual.
Po-Yin Chu et al. (2002) avaliaram a relação entre a atividade das
metaloproteinases e a ocorrência de degeneração do epitélio luminal, hiperplasia cística
endometrial, piometra e remodelamento uterino pós-parto em cadelas. A MMP-2 e a
MMP-9 foram detectadas no útero de todas as cadelas. A MMP-7 e a MMP-9 foram
observadas somente em uma cadela em anestro e nas cadelas com hiperplasia cística
endometrial, piometra e nos animais entre duas e três semanas pós-parto. Os autores
concluíram que o estudo das MMPs no endométrio canino pode representar um
importante papel na hiperplasia cística endometrial, piometra e no pós-parto. Porém,
não observaram envolvimento das MMPs com a degeneração do epitélio luminal. Em
eqüinos ainda não existem estudos sobre o papel destas enzimas no endométrio.
O presente trabalho teve por objetivos avaliar a expressão das metaloproteinases 1
e 7 no endométrio de éguas normais e portadoras de endometrites.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados neste estudo 82 amostras de biópsias uterinas eqüinas recebidas
no Serviço de Patologia Veterinária e Reprodução Animal da FMVZ, UNESP, no
período de 1987 a 2004. Este material incluiu biópsias provenientes da rotina de
diagnóstico do Hospital Veterinário, bem como aquelas enviadas por clínicas
particulares e profissionais autônomos. Todas as amostras foram submetidas ao mesmo
processamento, ou seja, fixação em solução de Bouin durante 24 horas seguida da
imersão em álcool 70% e posterior inclusão em parafina, de acordo com as técnicas de
90
rotina histopatológica. Dos blocos, foram obtidos cortes com cinco micrômetros (µm)
de espessura para coloração pelo método de Hematoxilina e Eosina e para a
imunoistoquímica.
A técnica de imunoistoquímica foi realizada no Laboratório de Pesquisa do
Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
UNESP, Botucatu, SP. Os anticorpos utilizados foram MMP-1 (RDI-MMP1abm-E5) e
MMP-7 (RDI-MMP7amb-B2).
As lâminas permaneceram na estufa a 60°C por 24 horas para fixação do tecido e,
em seguida, foram submetidas aos processos de desparafinização e hidratação. O
bloqueio da peroxidase endógena foi feito em solução de água oxigenada a 10 volumes
por 15 minutos. Para a recuperação antigênica dos anticorpos foi utilizada a solução
tampão de citrato 10 mM, pH 6,0, em forno de microondas, na potência máxima por 20
minutos. Após o procedimento, o material foi resfriado até atingir a temperatura
ambiente.
Cada anticorpo foi diluído em solução a 0,1% de albumina sérica bovina em
solução tampão de TRIS (TRIZMA base, D5637 Sigma Chemical C.O., St. Louis,
E.U.A.). Foi empregado o anticorpo secundário anti-mouse (BA2000-VECTOR) e o kit
ABC (PK6100 – VECTASTAIN ELITE). As lâminas foram incubadas com os
anticorpos primários por 18 horas a 4°C, lavadas em solução TRIS pH 7,4 (Trizma Base
Reagent Grade – T1503 SIGMA) e incubadas com o anticorpo secundário anti-mouse à
temperatura ambiente por 30 minutos. Após a reação com o anticorpo secundário o
material foi lavado com TRIS e as lâminas incubadas com o kit ABC, preparado 30
minutos antes do uso, à temperatura ambiente por 30 minutos.
Para visualização da reação, as lâminas foram tratadas com solução de
3,3´diaminobenzidina (Liquid DAB – K3466 DakoCytomation) durante cinco minutos à
temperatura ambiente. Os cortes foram contra-corados com Hematoxilina de Harris, por
35 segundos.
Para cada caso, o tipo histológico foi caracterizado segundo a classificação
proposta por Kenney e Doig (1986) para as endometrites crônicas, porém só foram
utilizadas as amostras categorizadas como normais (categoria I) e as endometrites
crônicas mais graves (IIB e III).
91
Para cada anticorpo utilizado, a reação imunoistoquímica foi estimada conforme a
marcação positiva. Em cada região onde a enzima foi observada foi adotado um valor
para a intensidade da marcação, sendo: 0=negativo, 1=marcação fraca, 2=marcação
moderada e 3=marcação acentuada. Após esta análise estes valores eram transformados
em mediana e então se obtinha a intensidade da enzima em cada elemento avaliado. Os
locais avaliados foram: epitélio luminal, epitélio glandular, parede vascular, célula
endotelial, célula inflamatória e célula estromal.
Para a avaliação do grau de expressão de cada enzima foram utilizados valores
numéricos variando de zero a seis. O valor zero correspondia à ausência de marcação.
Para cada local era atribuído o valor um. A expressão da enzima era calculada com base
no somatório dos locais onde ocorria a expressão da enzima, ou seja, de zero a seis.
Para cada variável utilizada no experimento, as três categorias de endometrites
foram comparadas utilizando-se a classificação de Kenney e Doig (1986). O teste
estatístico utilizado foi o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (Zar, 1996),
adotando-se o nível de 5% de significância.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a classificação histológica das 82 biópsias de acordo com a descrição de
Kenney e Doig (1986), 15 animais foram incluídos na categoria I (18,29%), 18 na
categoria IIB (21,95%) e 49 na categoria III (59,76%). Nossos resultados mostraram
que a intensidade do infiltrado inflamatório e o grau das alterações fibróticas foram os
achados mais importantes. Deve-se destacar, no entanto, seguindo-se a classificação
proposta por Kenney e Doig (1986), que as lesões fibróticas por si só, quando muito
acentuadas, são suficientes para que a lesão uterina seja classificada como pertencente a
categoria III, mesmo que sejam acompanhadas de infiltrado inflamatório discreto.
Segundo Evans, Miller e Ganjam (1998) vários esquemas de classificação,
incluindo o sistema modificado de Kenney e Doig (1986), têm auxiliado no prognóstico
dos problemas reprodutivos na espécie eqüina. Estes mesmos autores afirmaram que
embora estas classificações descrevam a localização, a freqüência e a severidade da
fibrose periglandular as avaliações são semi-quantitativas e que a fibrose periglandular
necessita de avaliação mais detalhada do tamanho dos focos fibróticos, número de
células envolvidas no foco fibrótico e percentual de glândulas endometriais individuais
92
circundadas por duas ou mais camadas de fibroblastos. No sistema de Kenney e Doig
(1986) o conjunto destas alterações poderia ser classificado, em uma mesma amostra,
como categoria IIA, IIB ou III, dependendo da severidade da fibrose.
Na análise qualitativa da expressão da enzima MMP-1 foi verificada marcação
fraca a moderada na maioria das amostras. A MMP-1 foi expressa por todos os tipos
celulares e regiões do endométrio avaliadas. Em apenas uma amostra classificada como
endometrite crônica categoria III houve ausência da marcação de MMP-1.
Das 15 amostras classificadas como categoria I a maioria (quatro casos) revelou
escore de expressão 6, indicando que a MMP-1 foi observada em diferentes tipos
celulares no endométrio normal. Nas amostras com endometrites crônicas foram
observados os seguintes resultados: na categoria IIB a maioria das amostras apresentou
escore 2 e 5 (cinco amostras em cada escore) e na categoria III, onze casos revelaram
escore 5 e 14 escore 6. Estes resultados revelaram que as éguas com endometrite
crônica apresentaram os maiores escores (5 e 6), na maioria dos casos, indicando que a
enzima é expressa por mais tipos celulares durante o processo crônico.
Embora os dados tenham revelado que nas endometrites a expressão das enzimas
aumenta, a MMP-1 não apresentou diferença significativa, com relação à expressão, nas
diferentes categorias de endometrite, conforme a Tab. 1.
Com relação à distribuição da MMP-1 no endométrio eqüino, os dados revelaram
que esta enzima foi expressa em todas as regiões analisadas, porém não houve diferença
significativa na sua intensidade de marcação, independente do local observado, em cada
categoria de endometrite.
Quando observada quanto à intensidade da marcação da MMP-1, em cada local do
endométrio, observou-se que na categoria I, embora esta enzima fosse expressa por
vários tipos celulares, a marcação era fraca ou moderada na maioria das amostras. A
marcação intensa só foi observada em três amostras. Também foi observado que nas
células dos epitélios luminal e glandular a marcação da MMP-1 foi ausente na maioria
das amostras (nove casos). Nas endometrites crônicas a intensidade da marcação era
moderada a intensa e a maioria das células expressavam MMP-1. Estes resultados
demonstraram que a intensidade da marcação de MMP-1 foi maior nas éguas com
endometrites mostrando diferença significativa entre as categorias. Nas endometrites
93
categoria III a MMP-1 foi observada com maior intensidade nas células do epitélio
glandular em relação às éguas normais, conforme mostra a Fig. 1 e a Tab. 2.
Segundo Cotran, Kumar e Collins (1999) as MMP-1 representam as colagenases e
são responsáveis pela degradação dos colágenos fibrilares enquanto que a MMP-7, as
estromalisinas, agem em uma variedade de componentes da matriz incluindo
proteoglicanos, laminina, fibronectina e colágeno amorfo.
A MMP-1 foi expressa por diferentes tipos celulares em éguas normais e com
endometrites crônicas, porém, nos quadros crônicos observou-se aumento da
intensidade da marcação o que sugere o envolvimento desta enzima nestes processos.
Os resultados revelaram também que a intensidade de marcação da MMP-1 nas células
do epitélio glandular foi significativamente maior nas endometrites crônicas III do que
nas éguas normais. Os estudos no endométrio humano revelaram que na fase pré-
menstrual e menstrual, do endométrio normal, são encontradas as MMP-1 e MMP-3,
nas células estromais (Noguchi et al., 2003). No presente estudo a MMP-1 foi expressa
pelas células estromais com baixa intensidade e não revelou diferença significativa entre
as amostras normais e com endometrites crônicas.
Na análise da expressão da enzima MMP-7 foi verificada que a marcação variou
de fraca a moderada. A marcação intensa foi observada em apenas três amostras. Esta
enzima foi expressa por vários tipos celulares, porém a marcação na parede vascular foi
ausente em todas as amostras analisadas.
Com relação ao escore de expressão observou-se que independente da categoria de
endometrite a maioria das amostras apresentou escore 1, sendo nove amostras da
categoria I, sete da categoria IIB e 26 da categoria III. A ausência de marcação para
MMP-7 foi observada em apenas uma amostra da categoria III. Os resultados referentes
à MMP-7 revelaram que não existem diferenças significativas entre a expressão desta
enzima nos diferentes tipos de processo, independentemente da classificação
histológica, conforme demonstra a Tab.3.
No que diz respeito a intensidade de marcação para MMP-7 observou-se que,
independente da classificação utilizada, as células que expressaram escores de
intensidade significativamente maiores para esta enzima foram as células inflamatórias
em relação aos outros elementos avaliados, conforme mostra a Fig. 2. Não houve
94
diferença entre a intensidade da expressão nos diferentes locais do endométrio entre as
categorias de endometrite. Estes resultados estão apresentados na Tab. 4.
Dentre as estromalisinas (MMP-3, MMP-7 e MMP-10) que degradam
componentes da membrana basal como colágeno IV e V, laminina e outras proteínas
como a fibronectina, a MMP-7 foi a única avaliada no presente estudo.
A MMP-7 neste estudo foi expressa pelas células epiteliais luminais e glandulares,
pelas células estromais, endoteliais e inflamatórias. Porém independentemente do grau
de endometrite as células inflamatórias foram o tipo celular que mais expressou esta
enzima. Po-Yin Chu et al. (2002) observaram a presença de MMP-7 e MMP-9 no
endométrio de cadelas com anestro, hiperplasia cística endometrial, piometra e durante
o pós-parto. Todos estes fatores induzem a uma resposta inflamatória do endométrio o
que permite supor que quanto maior a quantidade de células inflamatórias, de acordo
com os resultados deste estudo, maior seria a expressão da MMP-7.
Nossos resultados, assim como os de outros trabalhos na mesma linha, mostraram
que por meio da utilização da imunoistoquímica podem ser obtidos dados morfológicos
importantes sobre o endométrio eqüino. As metaloproteinases parecem ter influência no
processo de reparo endometrial, visto que em algumas situações alguns tipos celulares
mostraram maior intensidade de expressão de determinada enzima. No entanto os dados
deste estudo não permitem concluir se MMP-1 e MMP-7 interferem ou não nos
processos crônicos endometriais.
95
Tabela 1. Valores medianos da expressão de MMP-1 nas diferentes categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-1
Categoria I 3,0a
1
Categoria IIB 3,0a
Categoria III 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis
Tabela 2. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-1 nos diferentes
locais do endométrio de acordo com as categorias de endometrites crônicas
diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 0aA
1
1aA 1aA
Epitélio glandular 0aA 1aAB 2aB
Célula endotelial 1aA 2aA 1aA
Parede vascular 1aA 0,5aA 1aA
Célula inflamatória 2aA 2aA 2aA
Célula estromal 1aA 1aA 1aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não
diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Kruskal-
Wallis
Tabela 3. Valores medianos da expressão de MMP-7 nas diferentes categorias de
endometrites crônicas diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Categoria de endometrite Expressão de MMP-7
Categoria I 1,0a
1
Categoria IIB 2,0a
Categoria III 1,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis
96
Tabela 4. Valores medianos da intensidade da marcação de MMP-7 nos diferentes
locais do endométrio de acordo com as categorias de endometrites crônicas
diagnosticadas segundo Kenney e Doig (1986).
Local no endométrio Categoria I Categoria IIB Categoria III
Epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
Epitélio glandular 0aA 0aA 0aA
Célula endotelial 0aA 0aA 0aA
Parede vascular 0aA 0aA 0aA
Célula inflamatória 1bA 2bA 1bA
Célula estromal 0aA 0aA 0aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não
diferem significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Kruskal-
Wallis
97
Figura 1. Amostra P90/04. Endométrio eqüino com endometrite crônica categoria
degenerativa / III. Marcação positiva de MMP-1 (1:100) nas células do epitélio
glandular (EG), na fibrose periglandular (FPG) na região do estrato compacto e nas
células do epitélio luminal (EL).
Figura 2. FIGURA 18. Amostra P202/02. Endométrio eqüino com endometrite crônica
infiltrativa / III. Marcação positiva de MMP-7 (1:100) em células inflamatórias intra-
epiteliais glandulares (setas) na região do estrato esponjoso (Barra = 50µm).
FPG
EG
EG
EL
98
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