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MARCELO MOREIRA FREIRE
COMPOSIÇÃO E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO
ESSENCIAL DE HORTELÃ-PIMENTA (Mentha piperita L.)
Tese apresentada à Universidade Federal
de Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Agroquímica, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
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MARCELO MOREIRA FREIRE
COMPOSIÇÃO E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO
ESSENCIAL DE HORTELÃ-PIMENTA (Mentha piperita L.)
Tese apresentada à Universidade Federal de
Viçosa, como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Agroquímica, para
obtenção do título de Magister Scientiae.
APROVADA: 23 de fevereiro de 2006.
_____________________________ _____________________________________
Elson Santiago de Alvarenga, Ph. D. Mayura Marques Magalhães Rubinger, Ph. D.
(Conselheiro)
_____________________________ _____________________________________
Onkar Dev Dhingra, Ph. D. Sérgio Tinôco Verçosa de Magalhães, D. S.
(Conselheiro)
__________________________
Gulab Newandram Jham, Ph. D.
(Orientador)
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ii
À minha querida esposa Aline, companheira e
amiga de todas as horas e aos meus pais,
Evaristo e Anatália, pelo apoio, incentivo e
amor, especialmente nos momentos difíceis,
DEDICO.
A todos, que de uma forma ou outra,
muito contribuíram para a realização
desse sonho, em especial minhas
queridas irmãs: Rosemeire, Marlene,
Gilmara, Roseli e Rita,
OFEREÇO.
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por essa vitória e aos meus pais, Evaristo e Anatália, pela sólida formação
dada até minha juventude, que me proporcionou a continuidade nos estudos até este
momento, meus eternos agradecimentos.
À Universidade Federal de Viçosa – UFV – MG, por intermédio dos Departamentos
de Química e Fitopatologia, pela oportunidade de realização deste trabalho.
À Capes pela concessão da bolsa de estudo,
Ao Prof. Gulab Newandram Jham e a sua esposa Alice Jham, pela amizade,
orientação, ensinamentos, incentivo e apoio constantes durante todo o curso.
Aos conselheiros, Prof. Onkar Dev Dhingra e Prof. Elson Santiago de Alvarenga
pelos conselhos, ajuda e orientação para a realização deste trabalho.
Ao amigo Sérgio Tinoco, pelos conselhos, ensinamentos e amizade.
Ao técnico Eduardo Rezende, pela paciência, pelo companheirismo em todas as
horas de nosso convívio.
À minha querida esposa Aline, pela dedicação, amor, fidelidade, compreensão e
respeito.
Aos professores e técnicos do Departamento de Química, em especial aos
professores: Paulo Gontijo, Éfraim Lázaro, Elita, Marcelo, Cláudio Lima, Célia Regina,
Mayura Marques e ao técnico José Luiz (LASA-UFV) pelos bons conselhos e
ensinamentos transmitidos.
Aos meus amigos incondicionais, Francisco Frederico, Douglas, Josely, Geraldo
Magela, Roberto (pink), Márcio, Edson (Lontra), Fred (cachaça), Neliberto, Ezequiel
(pinda) pela amizade, fidelidade e companheirismo desde o começo dessa etapa da minha
vida.
Às minhas amigas Carolina e Vânia Moreira, pelas sugestões, apoio, amizade e
colaboração na realização desse trabalho.
Aos meus amigos e colegas da graduação e pós-graduação em especial, Josie,
Fernanda, Júlio César, Ricardo, Cristiane, Kelly, Vanessa,Vânia Carneiro, Rosimeire,
Larisse, Guilherme, Vagner, Luis Gustavo, pela amizade cultivada.
iv
A coordenação da pós-graduação em Agroquímica na pessoa do professor Luís
Cláudio e aos demais professores pelos valiosos ensinamentos que contribuíram para a
minha formação.
À secretária da pós-graduação, Marisa, pelo pronto atendimento, ajuda e
principalmente pelo carinho, dedicação e alegria contagiante em todos os momentos.
Ao amigo Naylor Daniel, pela amizade e colaboração.
Aos funcionários da Clínica de Doenças de Plantas José Orlando, Osvaldo e
Henrique pela atenção e amizade a mim dispensada durante a realização desse trabalho.
Aos estudantes pós-graduandos em fitopatologia Daniel, Davi e Maria Luiza,
Henrique, pelo apoio e colaboração.
Às minhas irmãs, Rosemeire, Marlene, Gilmara, Roseli e Rita, pelo amor, carinho,
apoio e incentivo.
Aos meus primos, em especial, Guilherme, Dárcio, Jaime, pela grande amizade e
companheirismo.
Aos meus sogros, José Geraldo e Lúcia, pelo apoio, respeito e incentivo.
A todos os meus familiares, em especial meus cunhados, Severiano, Clóves,
Marcos, Adário, Weslley, Warlley, minhas avós, Júlia e Rita. pelo amor, carinho, apoio,
respeito e incentivo.
Enfim, a todos que de algum modo contribuíram para a realização deste trabalho.
v
LISTA DE ABREVIATURAS
DCM diclorometano
OE óleo essencial
EM espectrômetro de massas
DIC detector por ionização em chama
CG-EM cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
CG-DIC cromatografia gasosa com detector por ionização em chama
MSI monitoramento seletivo de íons
CCD cromatografia em camada delgada
FA fração ativa
R
f
fator de retenção
W
b
largura da banda
IK índice de retenção de Kováts
AF
Aspergillus flavus
AG
Aspergillus glaucus
AN
Aspergillus niger
AO
Aspergillus ochraceous
CG
Colletotrichum gloeosporioides
CM
Colletotrichum musae
FO
Fusarium oxysporum
FS
Fusarium semitectum
BDA
batata, dextrose, ágar
vi
ESTRUTURAS DOS COMPOSTOS IDENTIFICADOS NESTE ESTUDO
O
O
Acetato de isomentila
O
O
Acetato de mentila Acetato de neomentila
O
O
.
...
Acetato de oct-7-en-1-ol**
O
O
O
trans-Anetola
O
O
N
O
H
O
Acetilglicinato de metila**
Ácido palmítico**
O
OH
OH
Álcool perílico
14
para-Anisaldeido
C
OH
O
C
H
O
Benzaldeido
vii
β-Bourboneno
H
H
δ-Cadineno γ-Cadineno
H
HO
H
α-Cadinol
H
H
trans-Cariofileno
OH
cis-Carveol trans-Carveol
OH
O
Carvona 1,8-Cineol
O
Diidroactinidiolida**
OO
1,3-Dimetiladamantano** Dodecan-2-ona**
O
Eugenol
OH
O
9
Ergosterol
H
H
HO
(E)-β-Farneseno (Z)-β-Farneseno
viii
OH
2-Feniletan-1-ol
C
H
O
2-Feniletanal
OH
trans-Fitol**
O
Furfural Germacreno D
H
O
(E)-Hex-2-nal
α-(E)-Ionona
O
O
β-(E)-Ionona
OH
Isomentol
OH
Linalol
O
O
Linoleato de metila
74
7
O
O
Linolenato de metila**
OH
Mentol
O
Mentona
ix
Metilchavicol
O
O
3-Metilcicloexanona
O
O
4-Metoxiacetofenona
γ-Muuroleno
Neomentol
OH
neo-allo-Ocimeno
OH
Oct-1-en-3-ol
OH
Octan-3-ol
4
4
H
H
O
Óxido de cariofileno
Piperitona
O
O
Pulegona
H
OH
Spatulenol
OH
Terpinen-4-ol
OH
α-Terpineol
OH
Timol
HO
Torreiol
Viridiflorol
H
H
OH
______________________________________________________________________________
** compostos identificados somente por CG-EM
x
CONTEÚDO
RESUMO.......................................................................................................................................
xii
ABSTRACT
..................................................................................................................................
xiv
1- INTRODUÇÃO GERAL
....................................................................................................
1
2- ARTIGO I- Avaliação da atividade antifúngica e identificação dos
compostos no óleo essencial de hortelã-pimenta
(Mentha piperita L.)................ 5
Resumo ……………………………………………………………………………………..
5
Abstract.............................................................................................................
6
1. Introdução
…………………………………………………………...…….....................
7
2. Materiais e Métodos
……………………………….……………………....................
9
2.1. Materiais e reagentes
……………………………………..………………….…….
9
2.2. Extração do óleo essencial
......................................................................................
9
2.3. Aquisição dos fungos
...............................................................................................
9
2.4. Avaliação fitopatológica
.........................................................................................
10
2.4.1- Potencial antifúngico do óleo essencial
………………………......................
10
2.4.2. Fracionamento do óleo essencial por cromatografia em camada delgada
(CCD)
...................................................................................................................................
10
2.4.3 Identificação e recuperação da fração antifúngica do óleo essencial
....
11
2.4.4. Potencial antifúngico das subfrações ativas do óleo essencial
..............
11
2.4.5 Análise estatística
11
2.5. Instrumentação
.........................................................................................................
12
2.6. Identificação e quantificação dos compostos do óleo essencial e
subfrações ativas
.............................................................................................................
12
xi
3. Resultados...................................................................................................................
14
4. Discussão
…………………………………………………………………................
16
Anexos
………………………………………………………………...………..............
19
3-
ARTIGO II- Efeito do óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita
L.) no controle fúngico em ração armazenada..............................................
26
Resumo.............................................................................................................................
26
Abstract........................................................................................................
27
1. Introdução
...................................................................................................................
28
2. Materiais e Métodos
................................................................................................
29
2.1. Materiais e reagentes
...........................................................................................
29
2.2. Extração do óleo essencial
................................................................................
29
2.3. Avaliação da estabilidade do óleo essencial
................................................
29
2.4. Eliminação de ácaros da ração
.........................................................................
31
2.5. Avaliação da umidade inicial da ração...............................................
31
2.6. Avaliação da contaminação fúngica da ração.....................................
31
2.7. Avaliação do controle fúngico pelo óleo essencial
...................................
31
2.8. Extração do ergosterol.........................................................................
32
2.8.1 Identificação e quantificação do ergosterol
...............................................
32
2.9. Instrumentação
.....................................................................................................
33
2.9.1 Análise estatística..............................................................................
33
3. Resultados
.................................................................................................................
34
4. Discussão
..................................................................................................................
37
Anexos
...........................................................................................................................
40
4- CONCLUSÕES GERAIS
..........................................................................................
46
5- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
..................................................................
47
xii
RESUMO
FREIRE, Marcelo Moreira, MS., Universidade Federal de Viçosa, Fevereiro de 2006.
Composição e atividade antifúngica do óleo essencial de hortelã-pimenta (
Mentha
piperita
L.). Orientador: Gulab Newandram Jham. Conselheiros: Onkar Dev Dhingra e
Elson Santiago de Alvarenga.
O óleo essencial (OE) de hortelã-pimenta (
Mentha piperita L.), obtido por
hidrodestilação de folhas secas, foi avaliado,
in vitro, através do ensaio “poison food” (0,1;
0,2 e 0,3%) e apresentou atividade antifúngica contra
Aspergillus flavus, A. ochraceous, A.
niger
, A. glaucus, Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae e C.
gloeosporioides
. O OE, fracionado por cromatografia em camada delgada (CCD)
preparativa (sílica-gel), utilizando como eluente diclorometano:hexano (2:1, v/v),
apresentou 7 frações (cinco visíveis sob luz ultravioleta e duas outras quando reveladas
com vanilina sulfúrica). Sua fração antifúngica (FA) foi identificada por CCD-
bioautografia. A FA, com fator de retenção (R
f
) igual a 0,47 e largura da banda (W
b
) de 8,0
cm, foi fracionada em três subfrações ativas e avaliadas através do ensaio “poison food” a
0,1% e 0,2%. Os componentes do óleo essencial bruto e das subfrações ativas foram
identificados por cromatografia gasosa, usando o índice de Kováts (IK) em conjunto com a
espectrometria de massas, sendo identificados um total de 57 compostos. A subfração ativa
1, cujo composto principal é o mentol, se mostrou como a mais eficaz para a maioria dos
fungos avaliados, seguida da subfração ativa 3, cujo composto principal é a carvona. Diante
da atividade antifúngica obtida pelo OE
in vitro, avaliou-se seu potencial antifúngico, in
vivo
, em ração para suínos à base de milho. Rações, em três umidades diferentes (13, 15 e
18%), foram tratadas com óleo essencial a 0,2% e armazenadas por 30, 60 e 90 dias. O
nível de contaminação fúngica foi avaliado através da quantificação de ergosterol por CG-
EM através do Monitoramento Seletivo de Íons (MSI) As concentrações de ergosterol, nas
amostras quantificadas, ficaram entre 0,01 a 11,44 µg/g de ração. O melhor controle
fúngico (95,8%, à umidade de 13%) foi obtido no primeiro mês de armazenamento seguido
xiii
de 91,0%, à umidade 15%, no segundo mês. O OE, armazenado à 4ºC e à 25ºC, teve sua
estabilidade avaliada através de cromatografia gasosa, por comparação entre as razões de
áreas dos picos dos seus principais componentes (1,8-cineol, mentona, neomentol, mentol,
carvona, acetato de mentila,
trans-cariofileno e viridiflorol) e de um padrão interno
(nonano). `A temperatura ambiente, o componente que apresentou maior variação entre a
sua quantidade inicial e após o tempo de armazenamento foi o
trans-cariofileno. Mentona e
1,8-cineol foram os que mais degradaram quando estocados à 4
o
C. Como esperado, os
principais componentes do óleo essencial, como um todo, mostraram-se bem mais estáveis
à temperatura mais baixa (4ºC).
Palavras-chave: Óleo essencial, Mentha piperita L., composição química, atividade
antifúngica
xiv
ABSTRACT
FREIRE, Marcelo Moreira, MS., Universidade Federal de Viçosa, February 2006.
Composition and antifungal activity of pepper mint (
Mentha piperita L.) essential
oil. Adviser: Gulab Newandram Jham. Committee Members: Onkar Dev Dhingra and
Elson Santiago de Alvarenga.
Pepper mint (
Mentha piperita L.) essential oil (EO), obtained by hydro distillation
of dry leaves, was evaluated
in vitro through a poison food assay (0.1; 0.2 and 0.3%)
presented antifungal activity against
Aspergillus flavus, A. ochraceous, A. niger, A.
glaucus
, Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae and C.
gloeosporioides
. The EO was fractioned by preparative silica gel thin layer chromatography
(TLC), using hexane dichloromethane (2:1, v/v) as solvent, presenting 7 fractions (five
being visible under ultraviolet light and two when revealed with vanillin-sulfuric acid). Its
antifungal fraction (AF) was identified by TLC –bioautography. AF activity, with R
f
value
of 0.47 and band width (W
b
) of 8.0 cm, was fractioned into active three sub-fractions,
evaluated through poison food assay at 0.1% and 0.2%. The components of the crude OE
and of the active sub-fractions were identified by gas chromatography using the Kováts
index (KI), along with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), with a total of 57
compounds being identified. Active sub-fraction 1, whose main compound was menthol,
was found to be more efficient for most of the fungi evaluated, followed by active sub-
fraction 3, whose main compound was carvone. In view of the antifungal activity obtained
by the EO
in vitro, its antifungal potential, in vivo was evaluated in corn-based swine
ration. Rations were treated with essential oil at 0.2% under three humidity conditions (13,
15 and 18%) and stored for 30, 60 and 90 days. The level of fungal contamination was
evaluated through ergosterol quantified by GC-MS and selective ion monitoring (SIM).
The concentrations of ergosterol in the samples quantified ranged from 0.01 to 11.44 µg/g
of ration. The best fungal control (95.8%, at 13% humidity) was obtained in the first month
of storage followed by 91.0%, at 15% humidity in the second month. EO stability was
xv
assessed through gas chromatography, stored at 4ºC and 25ºC, by comparing the ratios of
the peak areas of its main components (1.8-cineole, menthone,
neomenthol, menthol,
carvone, menthyl acetate,
trans-caryophyllene, and viridiflorol) and internal standard
(nonane). At room temperature,
trans-caryophyllene showed the highest variation between
its initial amount and after storage. Menthone and 1,8-cineole degraded the most when
stored at 4
o
C. As expected, the main components of the essential oil, as a whole, were more
stable at lower temperatures (4
o
C).
Keywords: Essential oil, Mentha piperita L., chemical composition, antifungal activity.
1
INTRODUÇÃO GERAL
Os fungos são um dos principais agentes decompositores de matéria orgânica na
natureza. Eles têm a capacidade de se desenvolver em diversos substratos, causando
prejuízos econômicos volumosos. Produtos agrícolas, como grãos, sementes e frutas são
severamente afetados por fungos, que podem começar a deteriorá-los no campo durante a
maturação e continuar nos processos de colheita, de secagem, de transporte e de
armazenamento (1). Alguns fungos são capazes de produzir substâncias tóxicas elaboradas,
as micotoxinas, que podem causar intoxicações severas com efeitos cancerígenos ao
homem e animais quando na ingestão de alimentos e rações contaminados (2).
Os fungos são classificados em fungos do campo e fungos do armazenamento. Os
do campo contaminam os grãos durante a pré-colheita por estes requererem ambientes com
umidade relativa superior a 90%. Os fungos dos gêneros:
Alternaria, Cladosporium,
Fusarium e Helminthosporium
são os mais comuns. Por outro lado, os fungos do
armazenamento demandam menor quantidade de água e proliferam em maior intensidade
na massa de grãos no período pós-colheita. Os fungos de armazenamento mais comuns são:
Aspergillus repens, A. amstetodami, A. ruber, A. restrictus, A. glaucus, A. halophilicus, A.
candidus, A. ochraceous, A. flavus, A. parasiticus e
algumas espécies do gênero
Penicillium (3). Os fungos de armazenamento Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Mucor
são encontrados em grande número em armazéns, moinhos, silos, moegas, elevadores,
equipamentos e lugares onde são armazenados, manuseados e processados produtos
agrícolas (4).
O
Fusarium oxysporum é o agente causal da doença vascular que causa murcha em
plantas (5).
Colletotrichum é um dos gêneros de fungos patogênicos de plantas mais importante
em todo o mundo, especialmente em regiões tropicais e sub tropicais. O fungo causa
2
doenças que levam a perdas econômicas significativas (6). Dentre essas doenças, podemos
destacar a antracnose em mamão causada pelo
Colletotrichum gloeosporioides e a
antracnose e podridão-do-colo em banana causada pelo
C. musae (7). No caso do mamão, o
fungo causa uma lesão circular, deprimida, com margem marrom-clara, produzindo, na
porção central, massas de esporos de cor laranja ou rosada. Com o progresso da doença, as
lesões podem coalescer e causar o apodrecimento do fruto (8), causando perdas
significativas a mercadistas e consumidores (9). Além disso, as lesões provocadas por
C.
gloeosporioides
servem como porta de entrada para patógenos secundários e, com isso,
agravam o quadro sintomatológico da doença (10). No caso da banana há formação de.
Assim como no mamão, antracnose em banana leva a formação de lesões escuras e
deprimidas que, com o progresso da doença, aumentam de tamanho e podem coalescer. Os
sintomas em banana se manifestam sob duas formas distintas, conforme o modo de
infecção: a antracnose da fruta madura tende a formar lesões circulares; a antracnose de
ferimento de fruto verde causada pelo manuseio durante o transporte, forma lesões
alongadas no sentido longitudinal do fruto. Os sintomas oriundos do ataque do patógeno à
fruta imatura no campo (infecção latente), geralmente passam despercebidos neste estado
de desenvolvimento da planta. Geralmente a polpa não é afetada, exceto a altas
temperaturas ou quando o fruto torna-se muito maduro (11).
O uso de fungicidas sintéticos é um dos principais métodos de controle de doenças
de plantas, porém, o uso contínuo pode promover a seleção de fungos fitopatogênicos
resistentes, não controlados pelo fungicida anteriormente eficaz (12).
Devido a crescente pressão de órgãos não governamentais de caráter ecologístico e
de algumas instituições governamentais, especialmente nos países desenvolvidos, para
evitar o uso de fungicidas sintéticos, o conseqüente aumento de espécies de patógenos
resistentes e o efeito cancerígeno potencial de alguns desses produtos (13, 14), tem se
desenvolvido um renovado interesse por compostos antimicrobianos naturais,
particularmente aqueles derivados de plantas (15). A literatura tem registrado a eficiência
de extratos obtidos de uma enorme gama de espécies botânicas em promover a inibição do
desenvolvimento de vários fitopatógenos de natureza fúngica (16, 17, 18). Os óleos
essenciais, por exemplo, são conhecidos por conter um coquetel natural de monoterpenos,
3
diterpenos e hidrocarbonetos, com uma variedade de grupos funcionais que levam a uma
atividade antifúngica e antimicrobiana (19).
estolhos rastejantes, ou rizomas subterrâneos. O fuste é quadrangular, verde ou vermelho
escuro a purpúreo, com altura de 40 a 80 cm, às vezes, mais de um metro, ramificado, com
folhas opostas pecioladas ovais, glabras, de margem serrilhada, de cor verde escura na face
superior, pálida na inferior (21). A hortelã-pimenta, é uma rica fonte de mentol,
apresentando várias aplicações industriais, como em produtos de higiene bucal,
flavorizantes, aromatizantes de alimentos e bebidas, em perfumaria, confeitarias e produtos
farmacêuticos (22, 23).Um hectare de
M. piperita pode render mais de 10 toneladas de
matéria fresca e até o dobro disso, com rendimento de essência de 3 a 5 g/kg de matéria
fresca. “Há cultivos importantes de
M. piperita na França, Itália, Alemanha, Rússia, África
Oriental, Estados Unidos e Argentina. No Brasil não se têm notícias de cultivos comerciais,
mas ele deve com certeza existir em alguma região do sul do país, de clima mais fresco pela
latitude ou altitude, tratando-se de planta tão conhecida e de tão alto valor” (21).
Extratos originários de
M. piperita têm evidenciado propriedades antifúngicas,
demonstrando controle para patógenos de plantas (24, 25). Seu óleo, essencial, considerado
não tóxico a humanos (26), apresenta, além das propriedades antifúngicas (27-29),
propriedade antiviral (30), antibacteriana (31), nematicida (32) larvicida e repelente de
mosquitos (33).
A composição química do óleo essencial dessa planta tem sido relatada por alguns
trabalhos. O mentol, neomentol, acetato de mentila, mentona e linalol são os
monoterpenóides mais abundantes no óleo essencial de
M. piperita (34), sendo o mentol e a
mentona os principais constituintes (35, 36). Segundo Zambonelli (35), o mentol representa
47,18% da constituição do óleo, seguido pela mentona 23,65%.
A hortelã-pimenta (
Mentha piperita L.), um híbrido natural entre
M. aquatica e M. spicata que pertence à família Labiatae, é uma das
espécies produtoras de terpenóides mais exploradas comercialmente(20).
A hortelã-pimenta é planta de clima temperado; originária provavelmente
da Inglaterra. A planta é uma erva vivaz ou perene, de ramos eretos e
4
Estudos mais elaborados da atividade antifúngica do óleo essencial de M. piperita
aliado à identificação de compostos presentes são escassos na literatura. Além disso o
estudo do potencial antifúngico do óleo essencial em ração armazenada não foi investigado.
Sendo assim, a
M. piperita é uma espécie que ainda tem muito a ser explorada.
Diante disso, os objetivos desse trabalho foram:
1.
Avaliar a ação antifúngica, in vitro, do óleo essencial da espécie M. piperita contra
Aspergillus flavus, A. ochraceous, A. niger, A. glaucus, Fusarium oxysporum, F.
semitectum, Colletotrichum musae
e C. gloeosporioides;
2.
Determinar a fração antifúngica do óleo essencial;
3.
Identificar os componentes do óleo essencial e os componentes da fração que
apresentou atividade antifúngica.
4.
Avaliar a atividade, in vivo, do óleo essencial em ração de porco à base de milho.
5.
Avaliar a estabilidade do óleo essencial ao armazenamento em diferentes
temperaturas.
5
ARTIGO I
Composição e atividade antifúngica do óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha
piperita
L.)
Marcelo M. Freire*, Gulab N. Jham,
Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Química, Universidade Federal de
Viçosa, 36570, Viçosa, MG, Brasil
Onkar D. Dhingra
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, 36570, Viçosa, MG,
Brasil
Resumo
O óleo essencial (OE) de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.), obtido por
hidrodestilação de folhas secas, foi avaliado,
in vitro, através do ensaio “poison food” (0,1;
0,2 e 0,3%) e apresentou atividade antifúngica contra
Aspergillus flavus, A. ochraceous, A.
niger
, A. glaucus, Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae e C.
gloeosporioides
. Dependendo do fungo, a atividade inibitória variou de 17,4% a 85,4% na
concentração de 0,1%, apresentando diferença significativa para a maioria dos fungos
quando essa concentração foi aumentada para 0,2%. O OE, fracionado por cromatografia
em camada delgada (CCD) preparativa (sílica-gel), utilizando como eluente
diclorometano:hexano (2:1, v/v), apresentou 7 frações (cinco visíveis sob luz ultravioleta e
duas outras quando reveladas com vanilina sulfúrica). Sua fração antifúngica (FA) foi
identificada por CCD-bioautografia. A FA, com fator de retenção (R
f
) igual a 0,47 e largura
da banda (W
b
) de 8,0 cm, foi fracionada em três subfrações ativas e avaliadas através do
ensaio “poison food” a 0,1% e 0,2%. Os componentes do óleo essencial bruto e das
subfrações ativas foram identificados por cromatografia gasosa usando o índice de Kováts
(IK) em conjunto com a espectrometria de massas, sendo identificados um total de 57
compostos. A subfração ativa 1, cujo composto principal é o mentol, se mostrou como a
mais eficaz para a maioria dos fungos avaliados, seguida da subfração ativa 3, cujo
composto principal é a carvona.
Palavras- chave:
Mentha piperita L., óleo essencial, composição química, fungos.
6
Abstract
Composition and antifungal activity of pepper mint (Mentha piperita L.) essential oil.
Pepper mint (Mentha piperita L.) essential oil (EO), obtained by hydro distillation of
dry leaves, was evaluated
in vitro through a poison food assay (0.1; 0.2 and 0.3%)
presented antifungal activity against
Aspergillus flavus, A. ochraceous, A. niger, A.
glaucus
, Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae and C.
gloeosporioides
. Depending upon the fungi, the activity inhibitory varied from 17.4 to
85.4%, at concentration of 0.1%. The EO was fractioned by preparative silica gel thin layer
chromatography (TLC), using hexane dichloromethane (2:1, v/v) as solvent, presenting 7
fractions (five being visible under ultraviolet light and two when revealed with vanillin-
sulfuric acid). Its antifungal fraction (AF) was identified by TLC –bioautography. AF
activity, with R
f
value of 0.47 and band width (W
b
) of 8.0 cm, was fractioned into active
three sub-fractions, evaluated through poison food assay at 0.1% and 0.2%. The
components of the crude OE and of the active sub-fractions were identified by gas
chromatography using the Kováts index (KI), along with gas chromatography-mass
spectrometry (GC-MS), with a total of 57 compounds being identified. Active sub-fraction
1, whose main compound was menthol, was found to be more efficient for most of the
fungi evaluated, followed by active sub-fraction 3, whose main compound was carvone.
Keywords: Mentha piperita L., essential oil, chemical composition, fungi.
7
1- Introdução
Certos fungos, causadores de danos e deterioração de produtos agrícolas, são
responsáveis por consideráveis perdas para as culturas de importância econômica. Alguns
são capazes de produzir substâncias tóxicas denominadas micotoxinas, que são altamente
nocivas à saúde do Homem (2). As micotoxinas mais largamente encontradas em
alimentos, com possível dano ao consumidor, são: aflatoxinas, esterigmatocistina,
ocratoxina, zearalenona, tricotecenos, fumonisinas, patulina, rubratoxinas, esporodesminas,
ácido ciclopiazônico e micotoxinas tremorgênicas. O principal grupo de fungos, de
conhecida capacidade para produzir micotoxinas, inclui espécies de
Aspergillus,
Penicillium e Fusarium. (1)
Parte significativa da produção de frutíferas é perdida devido a doenças fúngicas
pós-colheita, dentre elas podemos destacar a antracnose em mamão causada pelo
Colletotrichum gloeosporioides e a antracnose e podridão-do-colo em banana causada pelo
C. musae (7).
Para se evitarem os danos causados pela invasão fúngica e o uso intensivo de
fungicidas químicos sintéticos, o uso de produtos naturais se constitui em uma alternativa
viável e desejável em relação ao tratamento químico tradicional, principalmente em função
de não deixarem resíduos tóxicos ao Homem e nos alimentos tratados (37).
Os óleos essenciais são conhecidos por conterem um coquetel natural de
monoterpenos, diterpenos e hidrocarbonetos, com uma variedade de grupos funcionais que
levam a uma atividade antifúngica e antimicrobiana (19).
A
Mentha piperita L., espécie pertencente à família Labiatae, é planta de clima
temperado, originária provavelmente da Inglaterra. É uma erva vivaz ou perene, de folhas
opostas pecioladas ovais, glabras, de margem serrilhada, de cor verde escura na face
superior, pálida na inferior e com altura de 40 a 80 cm, às vezes, mais de um metro (21). O
mentol, principal componente do óleo essencial de
M. piperita, apresenta várias aplicações
industriais, como em produtos de higiene bucal, flavorizantes, aromatizantes de alimentos e
bebidas, em perfumaria, confeitarias e produtos farmacêuticos (22, 23). O óleo essencial de
M. piperita apresenta propriedade antifúngica (27-29), antiviral (30), antibacteriana (31),
8
nematicida (32), larvicida e repelente de mosquitos e é considerado não tóxico a humanos
(26).
Devido à escassez de trabalhos que relatem a atividade antifúngica do óleo essencial
de
M. piperita, aliada à sua caracterização química, um estudo mais elaborado a fim de
caracterizar os componentes com potencial antifúngico no óleo essencial de
M. piperita se
faz necessário.
Esse trabalho tem como objetivos avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial
de
M. piperita contra os fungos: Aspergillus flavus, A. ochraceous, A. niger, A. glaucus,
Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides,
identificar seus componentes e os compostos responsáveis por essa atividade.
9
2- Materiais e métodos
2.1. Materiais e reagentes:
As folhas de M. piperita (16 kg), lote MENI09/02, de origem polonesa, foram
adquiridas da Santos Flora Comércio de Ervas Ltda São Paulo-SP-Brasil em março de
2005. Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico, sendo os solventes
destilados antes de sua utilização. Foram utilizadas placas de Petri descartáveis (60 x 15
cm e 90 x 15 cm) adquiridas da J. Prolab. A sílica-gel utilizada foi adquirida da
MERCK.
2.2 - Extração do óleo essencial:
O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação de 200 g de folhas, secas à
sombra, de M. piperita, sendo que cada 1 L de hidrolato foi extraído por 2 vezes com
100 mL de diclorometano. A fase orgânica, seca com sulfato de magnésio anidro, foi
filtrada e seu solvente evaporado em evaporador rotatório à temperatura de 35ºC. A
amostra obtida foi armazenada em frascos de vidro selados e guardada em geladeira a
7
o
C.
2.3- Aquisição dos fungos:
Utilizaram-se grãos e frutas contaminados por fungos: A. flavus, A. ochraceous,
A. niger, A. glaucus, F. oxysporum, F. semitectum, C. musae e C. gloeosporioides. O
papel de germinação foi embebido em água autoclavada e colocado no fundo de uma
placa gerbox. Grãos e fragmentos de frutas foram suavemente lavados com água e
colocados em uma placa de Petri contendo álcool etílico 50%, por um minuto, sob uma
câmara de fluxo. A seguir, transferiram-se os mesmos para uma segunda placa contendo
água sanitária 2%, por um minuto, sendo finalmente imersos em água destilada por mais
um minuto, transferidos para a placa gerbox e deixadas em incubadora, a 25°C, por 7
dias. Após esse período fez-se a identificação dos fungos e coleta de esporos, sendo
estes transferidos para novas placas contendo meio de cultura BDA (batata, dextrose,
ágar) e antibiótico a fim de se multiplicarem por um período de 7 dias.
10
2.4- Avaliação fitopatológica:
2.4.1- Potencial antifúngico do óleo essencial:
O potencial antifúngico do óleo essencial foi avaliado contra os fungos A. flavus,
A. ochraceous, A. niger, A. glaucus, F. oxysporum, F. semitectum, C. musae e C.
gloeosporioides. O método utilizado baseou-se na técnica “poison food” descrita por
Dhingra e Sinclair (38) e Sridhar et al. (19). Preparou-se o meio de cultura, BDA,
cozendo-se 200 g de batata inglesa em 1 L de água, filtrando-se e recolhendo-se o
filtrado, ao qual foram adicionados 20 g de dextrose e 20 g de ágar. Transferiu-se o
meio assim obtido para Erlenmeyers, definindo-se o volume (100 mL) a fim de obter as
concentrações desejadas, tampando-se com algodão e autoclavando por 20 minutos a
120 ºC. O óleo foi emulsificado com tween 20 (0,1% v/v) e incorporado ao meio de
cultura juntamente com o antibiótico (sulfato de estreptomicina) de modo que ficasse
com concentrações finais de 0,1; 0,2 e 0,3% (v/v). Após a solidificação do meio de
cultura, adicionou-se os esporos dos fungos avaliados, ao centro de cada placa de Petri,
sob a forma de um círculo de 0,5mm de diâmetro. Prepararam-se placas controle
contendo o meio de cultura, tween 20, o antibiótico e esporos do fungo, visando
observar o desenvolvimento deste em condições normais. Todos os testes foram feitos
em três repetições para cada concentração e fungo, sendo as placas vedadas e mantidas
à temperatura de 25ºC por um período de 7 dias. A cada 24h o crescimento micelial dos
fungos, determinado pelo diâmetro da colônia, era medido. A atividade antifúngica foi
expressa em termos da inibição do crescimento micelial e calculada segundo a fórmula:
100x
dc
dtdc
−
Onde, dc = medida do diâmetro da colônia do fungo controle
dt = medida do diâmetro da colônia do fungo com tratamento
2.4.2- Fracionamento do óleo essencial por cromatografia em camada delgada (CCD):
O fracionamento do óleo essencial foi obtido aplicando-se 200 mg do óleo por
placa de cromatografia em camada preparativa (20 x 20 cm, com fase estacionária de 1
mm de sílica-gel 60GF
254
) utilizando-se como fase móvel diclorometano e hexano (2:1
v/v).
11
As frações foram visualizadas sob luz ultravioleta com comprimento de onda de
254 nm ou através de revelação com solução de vanilina sulfúrica.
2.4.3- Identificação e recuperação da fração antifúngica do óleo essencial
A fração ativa do óleo essencial foi determinada baseando-se na técnica de
bioautografia em camada delgada descrita por Sridhar et al (19). Foram aplicadas 75 mg
de óleo essencial em uma placa preparativa (20 x 5 cm). A placa foi desenvolvida com
diclorometano:hexano (2:1 v/v), revelada sob luz UV para identificação de suas frações
e depois coberta por uma fina camada de meio de cultura acrescido de esporos do fungo
(A. flavus) e antibiótico (sulfato de estreptomicina). Esta foi colocada em uma bandeja
esterilizada e umedecida com água autoclavada, coberta com filme de PVC transparente
e incubadas a 25ºC por um período de 7 dias para o crescimento do fungo. A região
onde o fungo não se desenvolveu, foi atribuída à fração ativa do óleo essencial. Essa
fração, identificada em outras placas por comparação entre fator de retenção (R
f
) e
largura da banda (W
b
), foi recuperada sob a forma de três subfrações ativas (somente
duas visíveis sob luz ultravioleta) raspando-se cada uma delas da fase estacionária,
extraindo-se com diclorometano, sob agitação magnética (3h), filtrando-se a vácuo em
funil de vidro sinterizado e eliminando o solvente em evaporador rotatório.
2.4.4- Potencial antifúngico das subfrações ativas do óleo essencial
O potencial antifúngico das subfrações ativas do óleo essencial foi avaliado nas
concentrações de 0,1 e 0,2% utilizando-se a mesma metodologia descrita para óleo
(item 2.4.1).
2.4.5- Análise estatística:
Os dados da inibição do crescimento micelial feito em três repetições foram
submetidos à analise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a
5% de probabilidade, usando-se o programa SAEG - Sistema de Análises Estatísticas
em Genética (39).
12
2.5- Instrumentação
As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo a gás
(Shimadzu, CG-17A) com detector por ionização em chama (DIC), auto-injetor
(Shimadzu, AOC-17); coluna de sílica fundida revestida com fase estacionária DB-5,
(30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, J & W Scientific), temperatura
inicial 60°C, isotérmico por 1 min, aumento de 3°C/min até atingir 240°C,
permanecendo isotérmico por 9 min; nitrogênio foi utilizado como gás de arraste, fluxo
de 1,33 mL/min; temperatura do injetor 220°C; temperatura do detector 240°C; modo
de injeção Split, na razão 1:20. Utilizou-se, também, um cromatógrafo a gás acoplado a
um espectrômetro de massas (CG-EM), (Shimadzu, QP 5000); injetor automático
(Shimadzu, AOC-17); coluna capilar de sílica fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm
de espessura do filme, Supelco) revestida com fase estacionária Equity
TM
-5,
temperatura inicial 60°C, isotérmico por 1 min, aumento de 3°C/min até atingir 240°C,
permanecendo isotérmico por 9 min; hélio ultrapuro foi usado como gás de arraste,
fluxo de 1 mL/min; temperatura do injetor 220ºC; temperatura da interface 280ºC;
modo de injeção Split 1:20; modo de ionização impacto de elétrons (70 eV); faixa de
massa (m/z) 40 – 350.
2.6 - Identificação e quantificação dos compostos do óleo essencial e subfrações ativas
:
As amostras de óleo essencial e das subfrações ativas de M. piperita foram
preparadas à concentração de 10 mg/mL em diclorometano e 1 µL foi injetado tanto no
aparelho de CG-DIC quanto no de CG-EM. Seus componentes foram identificados
através do índice de Kováts (IK), calculados por uma interpolação relativa dos tempos
de retenção de uma série de n-alcanos (de 7 a 26 carbonos) em comparação com dados
da literatura (37) e com a identificação feita através da biblioteca do CG-EM (Wiley 7).
O índice de retenção de Kováts expressa o número de átomos de carbono,
multiplicado por 100, de um alcano hipotético de cadeia normal que teria um tempo de
retenção ajustado idêntico ao do pico de interesse quando analisado sob condições
idênticas.
13
Utilizou-se a equação 1 para o cálculo do índice de retenção de Kováts (IK).
100 [(log t´
R
X) - [(log t´
R
Z)]
IK = 100 Z +
(log t´
R
Z + 1) - (log t´
R
Z)
(equação 1)
Onde:
X, o composto de interesse;
t´
R
X, o tempo de retenção ajustado de X;
Z, o número de átomos de carbono do hidrocarboneto com tempo de retenção
imediatamente anterior ao tempo de retenção de X;
t´
R
Z, o tempo de retenção ajustado de Z;
t´
R
Z + 1, o tempo de retenção ajustado do hidrocarboneto com tempo de retenção
imediatamente posterior ao tempo de retenção de X;
14
3. Resultados
O óleo essencial de M. piperita foi obtido a partir de folhas secas em rendimento de
0,6% e foram identificados e quantificados cerca de 96% do total de compostos nele
presentes (tabela 1). O cromatograma do óleo essencial é mostrado na figura 1. A fração
ativa (figura 2), determinada por CCD-bioautografia, apresentou fator de retenção (R
f
)
igual 0,47 e largura da banda (W
b
) de 8,0 cm. A placa de cromatografia em camada
preparativa apresentava quando revelada sob luz ultravioleta 5 frações e ao ser revelada
com vanilina sulfúrica apresentou mais duas frações. A fração ativa que foi determinada
por CCD-bioautografia era composta por três das sete frações reveladas, sendo essa
isolada sob a forma de três subfrações ativas cujos fatores de retenção e largura da
banda são, subfração ativa 1 (R
f
= 0,43 e W
b
= 6,5), subfração ativa 2 (R
f
= 0,60 e W
b
=
0,5) e subfração ativa 3 (R
f
=0,68 e W
b
= 1). Foram feitas 63 placas cromatográficas,
sendo o rendimento da subfração ativa 1: 31,75%; da subfração ativa 2: 6,15% e da
subfração ativa 3: 5,15%.
Somente as subfrações ativas 2 e 3, do óleo bruto, foram visíveis sob luz
ultravioleta, sendo isoladas antes da subfração ativa 1 que não era visível sob luz
ultravioleta e foi isolada baseando-se no seu fator de retenção e largura da banda. Na
subfração ativa 1, foram identificados 4 compostos: neomentol (1,52%), mentol
(94,27%), α-terpineol (2,15%), menta furanona (2,06%); na subfração ativa 2, 13
compostos: 1,8-cineol (1,57%), neomentol (14,15%), mentol (41,87%), terpinene-4-ol
(5,84%), isomentol (1,76%), acetato de oct-7-en-1-ol (2,32%), pulegona (2,59%),
carvona (2,28%), piperitona (6,11%), menta furanona (1,27%), spatulenol (4,5%),
viridiflorol (14,40%), torreiol (1,34%) e na subfração ativa 3, 10 compostos: 1,8-cineol
(5,62%), mentona (10,62%), neomentol (21,48%), pulegona (5,49%), carvona
(33,93%), benzaldeido (1,64%), timol (3,49%), eugenol (2,23%), 1,3-dimetil
adamantano (3,42%), óxido de cariofileno (12,18%). Os cromatogramas das três
subfrações ativas são apresentados nas figuras 3, 4 e 5 respectivamente.
O óleo essencial de M. piperita apresentou atividade antifúngica sobre os oito
fungos avaliados nas concentrações de 0,1; 0,2 e 0,3% (Figura 6). A concentração de
0,1% o crescimento micelial de todos os fungos foi inibido apenas parcialmente, sendo
a porcentagem de inibição ao quinto dia de avaliação de 78,3% para o A. ochraceous,
70,8% para o A. flavus, 60,6% para o A. glaucus, 44,1% para o A. niger, 82,0% para o
C. musae, 17,4% para o C. gloeosporioides, 77,4% para o F. semitectum, 85,4% para o
F. oxysporum. A análise da variância seguida pelo teste de médias de Tukey a 5% não
15
revelou diferença significativa na inibição do crescimento micelial, nesse ensaio, para
os fungos F. oxysporum e C. musae e nem entre o A. ochraceous e F. semitectum. A
0,2% observou-se que não houve inibição total do crescimento micelial somente do
fungo A. glaucus, visto que, a análise de variância seguida pelo teste de médias de
Tukey a 5% não revelou diferença significativa entre a inibição do crescimento micelial
do C. musae e os que foram totalmente inibidos. A 0,3% todos tiveram inibição total do
crescimento micelial, exceto o A. glaucus que apresentou inibição de 92,4%.
Todos os fungos avaliados mostraram-se sensíveis à presença das subfrações
ativas no meio de cultura (figuras 7 e 8). No sexto dia de avaliação foi observado que a
subfração ativa 1 a 0,1% era mais ativa para os fungos A. flavus, A.glaucus, A.
ochraceous, F. oxysporum, C. musae e C. gloeosporioides, a 2 mais efetiva para o A.
niger e a 3 para F. semitectum. Na concentração de 0,2% a subfração ativa 3 passou a
ser mais efetiva que a 1 para o A. flavus e mais efetiva que a 2 para o A. glaucus e A.
ochraceous e a subfração ativa 2 nessa concentração passou a ser mais efetiva que a 3
para o C. gloeosporioides e C. musae quando comparado à concentração de 0,1%.
16
4- Discussão:
A maioria dos componentes do óleo essencial de M. piperita foram identificados
através do índice de Kováts (IK) e dados da espectrometria de massas, havendo uma
boa concordância com os dados da literatura (40). Alguns compostos, porém, só
puderam ser identificados através do índice de similaridade do espectro de massas do
composto com dados da biblioteca do aparelho, visto que, não havia dados na literatura
disponível. O índice de Kováts calculado para alguns compostos diferiu da literatura,
mas, esta diferença não foi superior a dez unidades e esta variação pode ser justificada
pelas diferentes concentrações de cada composto na amostra, erros cromatográficos etc.
Os componentes do óleo essencial, aqui identificados, em sua maior parte, eram
monoterpenos, sendo que o principal deles é o mentol (44,92%), seguido da mentona
(6,02%), neomentol (5,19%), carvona (4,09%) e acetato de mentila (3,29%) e em
menores quantidades outros monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos. Esse resultado
quando comparado a outros da literatura é semelhante para alguns compostos. Segundo
dados da literatura a concentração de alguns desses compostos em óleo essencial está
entre 30-81,1% para o mentol, 2,9-5,9% para o neomentol, 5,8-33% para a mentona,
0,1- 5,5% para o acetato de mentila (26, 27, 33, 35) e 0,6-23,42% para a carvona (16,
30). Martins et al. (41), identificaram 40 compostos no óleo essencial das partes aéreas
de M. piperita, porém, não detectaram o mentol, sendo o composto principal o acetato
de linalila (72%). Duarte et al. (16), identificaram somente 10 compostos, sendo que
dentre estes não foi detectada a presença de mentol, sendo o composto principal o
linalol (51%). Logo, como visto, há uma grande variação da composição do óleo
essencial dessa espécie.Essas variações podem ser atribuídas às diferentes origens
geográficas e idades das plantas. Em estudos realizados com extratos e óleos de folhas
de M. piperita mostram que a quantidade dos principais terpenos dessa espécie pode
variar com a idade e local de origem da planta (42, 43). Assim, torna-se necessária a
identificação e quantificação dos seus componentes antes de qualquer ensaio biológico.
As propriedades antifúngicas do óleo essencial de M. piperita têm sido
divulgadas em alguns trabalhos (25, 29, 30, 33, 44-48). Neste presente estudo, ele
apresentou atividade antifúngica sobre todos os fungos avaliados, sendo esta inibição
aumentada com o aumento da concentração. Kritzinger et al. (25), relatou que esse óleo
inibiu o crescimento dos fungos de armazenamento A. flavus, A. niger, F. oxysporum, F.
equiseti e
Penicillium chrysogenume, sendo que somente o A. niger, a 0,2%, não teve
inibição total. Belmont e Carvajal (17), verificaram que o óleo essencial da M. piperita
17
mostrou total inibição do A. flavus em milho. Entre os fungos do gênero Aspergillus, o
A. niger foi o que apresentou maior resistência ao óleo essencial na concentração de
0,1%. Dentre os Colletotrichum, o agente causal da podridão de frutos em mamoeiro, C.
gloeosporioides, apresentou a maior resistência ao óleo na concentração de 0,1%,
porém, foi o mais sensível ao aumento da concentração de 0,1 para 0,2%. O C.
gloeosporioides foi avaliado por Ribeiro et al. (37), utilizando extratos aquoso de M.
piperita que promoveu a inibição do crescimento do micélio de 18,3% na concentração
de 0,1% e de 23,94% na concentração de 0,2%. Zambonelli et al (34), realizaram testes
in vitro com óleo essencial da M. piperita contra Rhizoctonia solani Kühn, Pythium
ultimum Trow var. ultimum, F. solani e C. lindemuthianum, esse inibiu completamente
o crescimento de todos os fungos a 0,16%. Segundo Baruah et al. (16) o óleo de M.
piperita exibiu atividade antifúngica contra F. moniliforme e a atividade antifúngica
dele aumenta com a concentração. Neste trabalho as espécies do gênero Fusarium se
mostraram bastantes sensíveis ao óleo na concentração de 0,1%, tendo inibição total do
crescimento micelial acima de 0,2%.
O mentol era o principal componente da fração 1. A atividade da subfração ativa
1 é atribuída ao mentol e essa subfração foi a que teve melhor atividade a 0,1% para
maioria dos fungos avaliados. Segundo Edris e Farrag (27), que avaliaram o efeito do
mentol e mentona contra Sclerotinia sclerotiorum (Lib.), Rhizopus stolonifer (Ehrenb.
exFr.) Vuill e Mucor sp. (Fisher), o mentol se mostrou como componente responsável
pelas propriedades antifúngicas e seu efeito era aumentado na presença de mentona,
sendo que esta sozinha não apresenta essa propriedade. A subfração ativa 3 diferente
das outras duas, não apresenta mentol na sua constituição, porém, apresenta como
composto principal a carvona, esta relatada por Sridhar et al.(19) como composto com
alta atividade antifúngica, além disso, as subfrações ativas 2 e 3 apresentavam o
neomentol, composto com atividade antifúngica descrita por Niridy (33), que avaliou a
atividade do mentol, neomentol, acetato de mentila, mentona e linalol contra o C.
gloeosporioides, todos esses inibiram o do crescimento micelial deste fungo. Além do
composto citado para a subfração ativa 3, ela ainda apresenta o timol e o eugenol que
segundo Belmont e Carvajal (17), apresenta atividade contra o A. flavus, sendo o timol o
mais ativo. Isto também, foi verificado por Luna et al.(18), que comprovou que o timol
era o mais efetivo para inibição do crescimento micelial do F. moniliforme, ainda
segundo ele as concentrações mínimas inibitórias para as espécies de Aspergillus, estão
entre os valores de 0,01-0,04% para o timol, 0,0125-0,03% para o eugenol e de 0,06%
para o mentol sobre o A. parasiticus Assim, as propriedades antifúngicas comprovadas
18
dessas 2 últimas subfrações ativas não podem ser atribuídas a um único composto
presente em cada uma delas, mas sim ao possível efeito aditivo ou sinergético entre
estes compostos.
Nesse presente trabalho, pôde-se confirmar o potencial antifúngico in vitro do
óleo essencial de M. piperita, identificar seus compostos e os da sua fração ativa.
Faz-se necessário ainda, um estudo da eficiência da aplicação do óleo essencial
de M. piperita no campo contra os fungos que foram avaliados, dos efeitos tóxicos ao
homem e ao ambiente, DL
50
, interações negativas, etc. para que se possa recomendar o
seu uso para agricultores em escala comercial. Além disso, a atividade biológica do óleo
essencial bruto e fracionado contra outras pragas como nematóides, insetos, dentre
outras deve ser investigada, visto que, poucos trabalhos relatam essas atividades. Desta
maneira saberemos se a utilização do óleo de M. piperita ou de alguns de seus
componentes é uma alternativa viável no controle de pragas.
19
ANEXOS:
Figura 1: Cromatograma típico obtido ao analisar o óleo essencial bruto de M. piperita
L. por cromatografia gasosa com detector por ionização em chama. Coluna de sílica
fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, J & W Scientific)
revestida com fase estacionária DB-5. Programação de temperatura: inicial 60°C (1
min), aumento de 3°C/min até atingir 240°C (9 min), fluxo do gás de arraste (N
2
) 1,33
mL/min; temperatura do injetor 220°C; temperatura do detector 240°C; modo de injeção
Split 1:20. Amostras a 10 mg/mL em diclorometano. Os picos identificados são
apresentados na tabela 1.
20
Tabela 1: Identificação dos compostos no óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha
piperita L.) por comparação entre os índice de Kováts (IK) e dados dos espectros de
massas dos compostos com dados da biblioteca do CG-EM (Wiley 7).
Percentagem relativa
Neste Literatura
#
N
o
do
pico
Índice de
retenção de
Kováts (IK)*
Composto
estudo 1 2 3 4 5
1
830 Furfural
0,16 - - - - -
2
854 (E)-Hex-2-enal
0,26 - - - - -
3
952 3-Metilciclohexanona
0,12 - - - - -
4
961 Benzaldeido
0,13 - - - - -
5
978 Oct-1-en-3-ol
0,58 <0,05 - - - -
6
993 Octan-3-ol
0,29 - - - - 10,09
7
1033 1,8-Cineol
2,1 0,3 - 6,76 9,23 -
8
1043 2-Feniletanal
0,31 - - - - -
9
1098 Linalol
0,21 12,3 0,3 - - 51,03
10
1110 2-Feniletan-1-ol
0,24 - - - - -
12
1142 neo-allo- Ocimeno
0,19 - - - - -
14
1154 Mentona
6,02 - 11,7 25,36 23,65 -
15
1165 Neomentol
5,19 - 5,9 0,30 - -
16
1173 Mentol
44,42 - 48,7 42,96 47,18 -
17
1177 Terpinen-4-ol
1,39 0,05 - - - 8,0
18
1182 Isomentol
0,70 - - - - -
19
1188 α-Terpineol
1,06 1,0 - 0,38 - 1,31
21
1195 Metilchavicol
0,61 - - - - -
22
- Acetato de oct-7-en-1-ol **
0,90 - - - - -
23
1217 trans-Carveol
0,51 - - - - -
24
1229 cis-Carveol
0,23 - - - - -
25
1237 Pulegona
1,54 - - - 0,06 -
26
1242 Carvona
4,09 - - - - 23,42
27
1252 para-Anisaldeido
0,54 - - - - -
28
1252 Piperitona
1,16 - - 0,72 - -
29
1275 Acetato de neomentila
0,41 - - - - -
30
1283 trans-Anetola
0,21 - - - - -
31
1295 Álcool perílico
0,54 - - - - -
32
1290 Timol
0,46 - - - - -
33
1294 Acetato de mentila
3,29 5,5 - 3,89 0,1 -
36
1306 Acetato de isomentila
0,17 - - - - -
37
1348 4-Metoxiacetofenona
0,16 - - - - -
38
1356 Eugenol
0,31 - - - - -
40
1384 β-Bourboneno
0,65 0,1 - - - 0,18
42
1426 α-(E)-Ionona
0,40 - - - - -
43
1418 trans-Cariofileno
2,01 2,0 - - - 2,31
21
44
1443 (Z)-β-Farneseno
0,16 - - - - -
46
1458 (E)- β -Farneseno
0,42 <0,05 - - - -
48
1477 γ-Muuroleno
0,19 <0,05 - - - -
49
1480 Germacreno D
0,54 1,1 - 1,91 - 0,44
50
1485 β-(E)-Ionona
0,18 - - - - -
51
- 1,3-Dimetiladamantano**
0,64 - - - - -
52
- Menta furanona**
1,56 - - - - -
53
1513 γ-Cadineno
0,21 - - - - -
54
1524
δ-Cadineno
0,37 - - - - -
55
- Diidroactinidiolida**
0,64 - - - - -
57
1576 Spatulenol
1,06 - - - - -
58
1581 Óxido de cariofileno
1,72 0,1 - - - -
59
1590 Viridiflorol
2,38 1,2 - - - -
63
1645 Torreiol
0,24 - - - - -
66
1653 α-Cadinol
0,56 - - - - -
71
- Dodecan-2-ona**
0,25 - - - - -
72
- Acetilglicinato de metila**
0,23 - - - - -
73
- Ácido palmítico**
1,80 - - - - -
74
2092 Linoleato de metila
0,16 - - - - -
75
- Linolenato de metila**
0,56 - - - - -
77
- trans-Fitol**
0,81 - - - - -
outros
3,76 76,2 33,4 17,72 19,78 3,22
* Adams (40).
** compostos identificados somente pela biblioteca do aparelho de CG-EM (Wiley7)
# 1- Martins et al., 2004 (41); 2- Niridy et al., 1998 (33); 3- Maffei and Mucciarelli, 2003 (20);
4- Zambonelli et al., 1996 (34); 5- Duarte et al., 2005 (16).
22
Figura 2: Foto do ensaio CCD-bioautografia, mostrando a fração ativa, obtida 7 dias
após aplicação de meio de cultura contendo grande número de esporos de A. flavus (AF)
sobre uma placa de cromatografia em camada delgada preparativa 20 x 5 cm [60 mg de
óleo essencial, 1 mm de sílica-gel 60G F
254
e diclorometano:hexano (2:1 v/v) como
eluente].
Figura 3: Cromatograma típico da subfração ativa 1 (fração não visível sob luz
ultravioleta) obtido por cromatografia gasosa com detector por ionização em chama.
Coluna de sílica fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, J & W
Scientific) revestida com fase estacionária DB-5. Programação de temperatura: inicial
60°C (1 min), aumento de 3°C/min até atingir 240°C (9 min), fluxo do gás de arraste
(N
2
) 1,33 mL/min; temperatura do injetor 220°C; temperatura do detector 240°C; modo
de injeção Split 1:20. Amostras a 10 mg/mL em diclorometano. Os picos identificados
são: 1. neomentol, 2. mentol, 3. α-terpineol, 4. menta furanona.
FRAÇÃO ATIVA
23
Figura 4 Cromatograma típico da subfração ativa 2 (visível sob luz ultravioleta), obtido
por cromatografia gasosa com detector por ionização em chama. Coluna de sílica
fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, J & W Scientific)
revestida com fase estacionária DB-5. Programação de temperatura: inicial 60°C (1
min), aumento de 3°C/min até atingir 240°C (9 min), fluxo do gás de arraste (N
2
) 1,33
mL/min; temperatura do injetor 220°C; temperatura do detector 240°C; modo de injeção
Split 1:20.Os picos identificados são:1. 1,8-cineol, 2. neomentol, 3. mentol, 4. terpinen-
4-ol, 5. isomentol, 6. acetato de oct-7-en-1-ol, 7. pulegona, 8. carvona, 9. piperitona, 10.
menta furanona, 11. spatulenol, 12. viridiflorol, 13. torreiol.
Figura 5: Cromatograma típico da subfração ativa 3 (visível sob luz ultravioleta), a 10
mg/mL, obtido por cromatografia gasosa com detector por ionização em chama. Coluna
de sílica fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, J & W
Scientific) revestida com fase estacionária DB-5. Programação de temperatura: inicial
60°C (1 min), aumento de 3°C/min até atingir 240°C (9 min), fluxo do gás de arraste
(N
2
) 1,33 mL/min; temperatura do injetor 220°C; temperatura do detector 240°C; modo
de injeção Split 1:20. Os picos identificados são: 1. 1,8-cineol, 2. mentona, 3.
neomentol, 4. pulegona, 5. carvona, 6. para-anisaldeido, 7. timol, 8. eugenol, 9. 1,3-
dimetil adamantano, 10. óxido de cariofileno.
24
Figura 6 - Porcentagem de inibição do crescimento micelial apresentada por A. flavus
(AF), A. glaucus (AG), A. niger (AN) A. ochraceous (AO), F. oxysporum (FO), F.
semitectum (FS), C. gloeosporioides (CG) e C. musae (CM) no quinto dia de avaliação
do ensaio “poison food”, submetidos ao óleo essencial de Mentha piperita L. a 0,1; 0,2
e 0,3% no meio de cultura.
*Os dados apresentados nas colunas, de mesma cor, seguidos por diferentes letras são
significativamente diferentes pelo método de análise de Variância de Tukey a 5%. As
barras (I) representam o desvio padrão.
Figura 7: Inibição do crescimento micelial dos fungos apresentada por A. flavus (AF),
A. glaucus (AG), A. niger (AN) A. ochraceous (AO), F. oxysporum (FO), F. semitectum
(FS), C. gloeosporioides (CG) e C. musae (CM) no sexto dia de avaliação do ensaio
“poison food”, submetidos às subfrações ativas 1, 2 e 3 da fração ativa do óleo essencial
de Mentha piperita L. a 0,1% no meio de cultura.
*Os dados apresentados nas colunas, para o mesmo fungo, seguidos por diferentes letras
são significativamente diferentes pelo método de análise de Variância de Tukey a 5%.
As barras (I) representam o desvio padrão.
Inibição ao crescimento micelial (%)
Fungos
0,1%
0,2%
0,3%
Inibição ao crescimento micelial (%)
Fungos
0,1%
0,2%
0,3%
25
Figura 8: Inibição do crescimento micelial dos fungos apresentada por A. flavus (AF),
A. glaucus (AG), A. niger (AN) A. ochraceous (AO), F. oxysporum (FO), F. semitectum
(FS), C. gloeosporioides (CG) e C. musae (CM) no sexto dia de avaliação do ensaio
“poison food”, submetidos às subfrações ativas1, 2 e 3 da fração ativa do óleo essencial
de Mentha piperita L. a 0,2% no meio de cultura.
*Os dados apresentados nas colunas, para o mesmo fungo, seguidos por diferentes letras
são significativamente diferentes pelo método de análise de Variância de Tukey a 5%.
As barras (I) representam o desvio padrão.
Inibição ao crescimento micelial (%)
Fungos
0,1%
0,2%
0,3%
26
ARTIGO II
Efeito do óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.) no controle fúngico
em ração armazenada
Marcelo M. Freire*, Gulab N. Jham,
Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Química, Universidade Federal de
Viçosa, 36570, Viçosa, MG, Brasil
Onkar D. Dhingra
Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, 36570, Viçosa, MG,
Brasil
Resumo
Testes foram conduzidos para avaliar a estabilidade do óleo essencial (OE) de
hortelã-pimenta (Mentha piperita L.) a diferentes temperaturas (4ºC e 25ºC) e
determinar in vivo a proteção oferecida pelo OE contra os fungos de armazenamento
presentes em ração à base de milho para suínos. A ração, avaliada em três umidades (13,
15 e 18%) e tempos (30, 60 e 90 dias) diferentes, foi tratada com óleo essencial na
concentração de 0,2%. A medida do ergosterol, composto específico das membranas de
fungos, foi utilizada para determinar o nível de controle fúngico obtido pelo óleo
essencial. Nesse trabalho, utilizou-se a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria
de massas (CG-EM), operada no modo de Monitoramento Seletivo de Íons (MSI) para
essa quantificação. O melhor controle fúngico, 95,8%, foi conseguido no primeiro mês
de armazenamento na umidade de 13%. No último mês o melhor controle fúngico foi
75,3% na umidade de 13%. As concentrações de ergosterol, nas amostras quantificadas,
ficaram entre 0,01 e 11,44 µg/g de ração. O OE, teve sua estabilidade avaliada, através
de cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (CG-DIC), por
comparação entre as razões de áreas dos picos dos seus principais componentes (1,8-
cineol, mentona, neomentol, mentol, carvona, acetato de mentila, trans-cariofileno e
viridiflorol) e de um padrão interno (nonano). O trans-cariofileno, à temperatura
ambiente, foi o que revelou a maior diferença entre as quantidades inicial e final nas
amostras de óleo. Os compostos do óleo armazenado em geladeira que mais se
degradaram foram a mentona e o 1,8-cineol. Como esperado, os principais componentes
do óleo essencial, como um todo, mostraram-se bem mais estáveis à temperatura mais
baixa (4ºC).
Palavras-chave: Óleo essencial, Mentha piperita L., ergosterol, fungos, CG-EM
27
Abstract
Effect of (Mentha piperita L.) essential oil on fungal control of stored ration
Tests were performed to evaluate the stability of pepper mint (Mentha piperita
L.) essential oil (EO) at 4ºC and 25ºC and determine in vivo the protection offered by
the EO against storage fungi found in corn-based swine ration. The ration was treated
with 0.2% EO and evaluated at three humidity (13, 15, and 18%) levels and times (30,
60, and 90 days). Rations were treated with essential oil at 0.2% under three humidity
conditions (13, 15 and 18%) and stored for 30, 60 and 90 days. The level of fungal
contamination was evaluated through ergosterol quantified by GC-MS and selective ion
monitoring (SIM). The concentrations of ergosterol in the samples quantified ranged
from 0.01 to 11.44 µg/g of ration. The best fungal control (95.8%, at 13% humidity)
was obtained in the first month of storage followed by 91.0%, at 15% humidity in the
second month. EO stability was assessed through gas chromatography, stored at 4ºC and
25ºC, by comparing the ratios of the peak areas of its main components (1.8-cineole,
menthone, neomenthol, menthol, carvone, menthyl acetate, trans-caryophyllene, and
viridiflorol) and internal pattern (nonane). At room temperature, trans-caryophyllene
showed the highest variation between its initial amount and after storage. Menthone and
1,8-cineole degraded the most when stored at 4
o
C. As expected, the main components of
the essential oil, as a whole, were more stable at lower temperatures (4
o
C).
Keywords:
Essential oil, Mentha piperita L., ergosterol, fungi, GC-MS
28
1- Introdução:
Em climas tropicais e subtropicais, o desenvolvimento fúngico em cereais, é
favorecido por excelentes condições de umidade e temperatura (49)
. Fungos de
armazenamento, como Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Mucor são encontrados em
grande número em armazéns, moinhos, silos, moegas, elevadores, equipamentos e
lugares onde são armazenados, manuseados e processados produtos agrícolas (4).
Devido aos danos causados ao homem e ao meio ambiente pelos defensivos
químicos (8) e as restrições impostas por regulamento a indústrias e agências de
alimentos sobre o uso de alguns aditivos sintéticos em alimentos (15), os produtos
naturais originários de plantas vêm sendo utilizados para a preservação de alimentos em
vários países, sendo que, dentre as plantas com propriedades antifúngicas, as especiarias
são as que apresentam melhor atividade, mas, como óleo essencial, somente algumas
delas foram testadas (17).
A óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.), um híbrido natural
entre M. aquatica e M. spicata que pertence à família de Labitae (50), apresenta
atividade contra o Aspergillus flavus em sementes de milho (17). Estudos in vitro
mostraram uma boa atividade antifúngica contra os fungos A. flavus, A. ochraceous, A.
niger, A. glaucus, Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae e C.
gloeosporioides (51).
A maioria dos trabalhos relacionados com a M. piperita relata a sua atividade
antifúngica in vitro, ensaios biológicos para avaliar a real atividade do óleo essencial in
vivo são escassos. No caso dos ensaios com ração, não há nada disponível na literatura.
Uma das formas de se avaliar a invasão fúngica em alimentos infestados é
através da medida do teor de ergosterol. Esta análise é um dos melhores indicadores da
biomassa fúngica quando comparado aos outros métodos disponíveis (52), apresentando
alta sensibilidade e especificidade (53). A determinação do ergosterol na biomassa
fúngica pode ser realizada por espectrofotometria ultravioleta e infravermelha,
associadas a métodos cromatográficos como camada delgada, liquida de alto
desempenho e gasosa
(54).
O objetivo desse trabalho foi determinar, in vivo, através da quantificação de
ergosterol, a proteção oferecida pelo óleo essencial de M. piperita contra os fungos
presentes em ração para suínos armazenada e avaliar a estabilidade desse óleo a
diferentes temperaturas (4ºC e 25ºC) de armazenamento.
29
2- Materiais e métodos
2.1. Materiais e reagentes
As folhas de M. piperita (16 kg), lote MENI09/02, de origem polonesa, foram
adquiridas da Santos Flora Comércio de Ervas Ltda São Paulo-SP-Brasil em março de
2005. A ração foi adquirida no comércio de produtos agrícolas da cidade de Viçosa-Mg.
Todos os reagentes utilizados eram de grau analítico.
2.2 - Extração do óleo essencial:
O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação de 200 g de folhas, secas à
sombra, de M. piperita, sendo que cada 1 L de hidrolato foi extraído por 2 vezes com
100 mL de diclorometano. A fase orgânica, seca com sulfato de magnésio anidro, foi
filtrada e seu solvente evaporado em evaporador rotatório à temperatura de 35ºC.
2.3 - Avaliação da estabilidade do óleo essencial
Para avaliar a estabilidade do óleo essencial, a diferentes temperaturas, utilizou-
se da adição de um padrão interno com o objetivo de comparar a área dos principais
picos do óleo essencial com a área desse padrão, antes e após o armazenamento. Para
isso, 1 mL de uma solução a 5 mg/mL do óleo essencial recém extraído em
diclorometano foi analisada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massas (CG-EM), utilizando-se 50 µL de uma solução de nonano em diclorometano a
10 mg/mL como padrão interno. Quantidades iguais de 500 mg desse óleo foram
adicionados a 2 ampolas de 1 mL, sendo estas congeladas em nitrogênio líquido e
vedadas a fogo de maçarico. Uma delas foi guardada em geladeira a 4º C e a outra à
temperatura ambiente (25º C), sendo ambas protegidas contra a luz.
Selecionaram–se os 8 principais compostos do óleo essencial,para fazer a
comparação entre áreas: 1,8-cineol, mentona, neomentol, mentol, carvona, acetato de
mentila, trans-cariofileno e viridiflorol. Esses principais componentes do óleo essencial,
foram identificados através do índice de Kováts (IK), calculados por uma interpolação
relativa dos tempos de retenção de uma série de n-alcanos (de 7 a 26 carbonos) em
comparação com dados da literatura (40) e dos espectros de massas dos compostos com
dados da biblioteca do CG-EM (Wiley 7).
30
O índice de retenção de Kováts expressa o número de átomos de carbono,
multiplicado por 100, de um alcano hipotético de cadeia normal que teria um tempo de
retenção ajustado idêntico ao do pico de interesse quando analisado sob condições
idênticas.
Utilizou-se a equação 1 para o cálculo do índice de retenção de Kováts (IK).
100 [(log t´
R
X) - [(log t´
R
Z)]
IK = 100 Z +
(log t´
R
Z + 1) - (log t´
R
Z)
(equação 1)
Onde:
X, o composto de interesse;
t´
R
X, o tempo de retenção ajustado de X;
Z, o número de átomos de carbono do hidrocarboneto com tempo de retenção
imediatamente anterior ao tempo de retenção de X;
t´
R
Z, o tempo de retenção ajustado de Z;
t´
R
Z + 1, o tempo de retenção ajustado do hidrocarboneto com tempo de retenção
imediatamente posterior ao tempo de retenção de X;
Após 90 dias foram preparadas soluções a 5 mg/mL do óleo essencial em
diclorometano de cada uma das amostras armazenadas. e a 1 mL de cada acrescentados
50 µL de uma solução de nonano em diclorometano a 10 mg/mL como padrão interno
para serem analisadas no CG-EM.
A avaliação da estabilidade foi feita pela comparação entre as razões de
área de cada um dos principais picos dos componentes do óleo essencial, antes e depois
de armazenado, pela área do pico do padrão interno (C9). A porcentagem de degradação
foi calculada pela fórmula seguinte:
100
][
][][
x
RA
RARA
CA
CDCA
−
Onde, [RA
CA
] = Razão de área do componente antes do armazenamento
[RA
CD
] = Razão de área do componente após o armazenamento à
temperatura de 4ºC ou 25ºC.
31
2.4- - Eliminação de ácaros da ração
A ração foi congelada por 96 horas para eliminação de possíveis ácaros.
2.5 - Avaliação da umidade inicial da ração:
Seis amostras da ração foram pesadas e colocadas em uma estufa a 105
o
C por
24h Deixou-se esfriar em dessecador e quando atingiram a temperatura ambiente foram
repesadas e tiveram suas umidades calculadas. A média desses valores foi utilizada
como a umidade inicial da ração.
2.6 Avaliação da contaminação fúngica da ração:
A análise da contaminação fúngica da ração foi realizada em laboratório, pela
inoculação de uma suspensão aquosa de esporos presentes na ração em meio de cultura
e pela medida de ergosterol na ração através de análise por CG-EM. Os fungos
presentes na ração não foram identificados.
2.7 - Avaliação do controle fúngico pelo óleo essencial:
A avaliação foi feita com óleo na concentração de 0,2%. O controle fúngico em
ração para suínos à base de milho foi avaliado mês a mês nas umidades de 13%, 15% e
18%, durante três meses consecutivos. A ração, cuja umidade inicial era de 13%, foi
levada às outras umidades de avaliação acrescentando-se água. Para a umidade normal
utilizou-se metanol como meio para que o óleo fosse pulverizado, nas outras duas
umidades o óleo foi emulsificado com tween 20 (0,2% v/v) na própria água utilizada
para atingir-se a umidade desejada.
O óleo (1,3 g) foi aplicado homogeneamente a 650 g de ração utilizando-se uma
misturadora e pistola automática. Todos os testes foram feitos em 3 amostragens para
cada mês de análise e em três repetições para cada umidade, sendo 50 g de cada amostra
colocados em frascos de vidro, vedados com um filme de PVC transparente e mantidos
em incubadora à temperatura de 25ºC. A cada mês era avaliada, indiretamente, a massa
fúngica na ração através da quantificação de ergosterol por CG-EM. Com base nesta
avaliação, calculou-se a atividade antifúngica em termos de porcentagem de redução do
ergosterol acumulado segundo a fórmula:
32
100
][
][][
x
Ec
EtEc
−
Onde, [Ec] = Concentração de ergosterol na amostra de ração controle
[Et] = Concentração de ergosterol na amostra de ração tratada
2.8 - Extração do ergosterol:
Em
frascos de vidro foram colocados 25 g da ração de cada amostra, foram
adicionados 85 mL de metanol, aquecidos em banho-maria na temperatura de 50ºC, sob
agitação, durante 2 minutos. A mistura foi filtrada em papel Whatman n
o
1 e a ração foi
ressuspendida em 85 mL de metanol, aquecida e filtrada novamente. Os filtrados foram
reunidos e saponificados com 25 g de NaOH e 85 mL de etanol sob fervura em banho-
maria a 75ºC durante 40 minutos, após atingir a temperatura ambiente, acrescentou-se
165 mL de água a mistura que foi transferida para um funil de separação de 1L, sendo
em seguida extraída com hexano por duas vezes (2 x 85 mL). Os extratos foram
combinados e concentrados até aproximadamente 2 mL em evaporador rotatório à
temperatura de 35ºC, transferidos para frascos de 4 mL, levados à secura utilizando-se
fluxo de N
2
. As amostras foram ressuspendidas em 3 mL de diclorometano,
homogeneizadas e centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos. Um volume de 1 mL foi
retirado para análise.
2.8.1 - Identificação e quantificação do ergosterol :
O ergosterol foi identificado nas amostras através de seu tempo de retenção
comparado com autêntico padrão, sendo 1 µL da amostra injetado no CG-EM e
monitorado através do modo MSI. A quantificação foi realizada através de padronização
externa, baseado em uma curva linear de calibração (r
2
= 0,9992) de 7 pontos (figura 1),
preparada com padrão de ergosterol recristalizado com pureza de 89% em
concentrações entre 0,99 e 100 ng/μL.
Foram feitos três brancos para cada mês de avaliação utilizando-se o mesmo
método e reagentes utilizados para a extração do ergosterol da ração.
33
2.9 - Instrumentação
As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo a gás
(Shimadzu, CG- 17A) com detector de ionização em chama (DIC), auto-injetor
(Shimadzu, AOC-17); coluna de sílica fundida revestida com fase estacionária DB-5,
(30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, J & W Scientific), temperatura
inicial 60°C, isotérmico por 1 min, aumento de 3°C/min até atingir 240°C,
permanecendo isotérmico por 9 min. Nitrogênio foi utilizado como gás de arraste, fluxo
de 1,33 mL/min; temperatura do injetor 220°C; temperatura do detector 240°C; modo
de injeção Split, na razão 1:20. Utilizou-se, também, um cromatógrafo a gás acoplado a
um espectrômetro de massas (CG-EM), (Shimadzu, QP 5000); injetor automático
(Shimadzu, AOC-17); coluna capilar de sílica fundida revestida com fase estacionária
Equity
TM
-5 (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 μm de espessura do filme, Supelco),
temperatura inicial 150°C, aumento de 15°C/min até atingir 280°C, permanecendo
isotérmico por 22 min.; hélio ultrapuro foi usado como gás de arraste, fluxo de 1,5
mL/min; temperatura do injetor 260ºC; temperatura da interface 280ºC; modo de
injeção Splitless; modo de ionização impacto de elétrons (70 eV); operando no modo de
Monitoramento Seletivo de Íons (MSI), cujos íons monitorados foram m/z 55, m/z 69,
m/z 143.
2.9.1- Análise estatística:
Na análise de dados foi utilizada a técnica estatística de análise fatorial (3
x 3 x 2), num delineamento inteiramente casualizado, com três repetições, realizadas
com auxílio do Sistema para Análises Estatísticas e Genéticas (SAEG), versão 5.0 (39),
Os dados foram submetidos à análise de variância e as concentrações de ergosterol,
obtidas em cada tratamento, foram comparadas por meio do teste de Tukey a 5% de
probabilidade. A análise de variância foi seguida da escolha das curvas que melhor
representassem a dependência da concentração de ergosterol com o tempo, para as três
porcentagens de umidades utilizadas e da aplicação do teste F nos coeficientes da
equação para detectar significância em nível de 5%.
34
3. Resultados
O óleo essencial de M. piperita foi obtido a partir de folhas secas em rendimento
de 0,6%. Os principais componentes do óleo essencial, aqui identificados, eram
monoterpenos, sendo que o principal deles é o mentol (42,61%), seguido da mentona
(6,31%), neomentol (5,34%), carvona (4,37%) e acetato de mentila (3,32%) e em
menores quantidades outros monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos em proporções
semelhantes a determinações anteriores (51).
A comparação entre as razões de áreas dos principais componentes do óleo
essencial (área relativa do pico componente/área relativa do pico do nonano) indicou o
mentol como o composto mais estável, quando armazenado à temperatura de 25ºC, em
relação aos outros componentes analisados. Quando comparado o óleo armazenado a
4ºC com o armazenado a 25ºC, o neomentol se mostrou como o mais estável a essas
diferentes temperaturas. A carvona foi o composto mais sensível a essas diferenças de
temperatura, mostrando-se muito mais estável a temperatura de 4ºC. O trans-
cariofileno, à temperatura ambiente, foi o que revelou a maior diferença entre a sua
quantidade inicial e a final na amostra. Os compostos do óleo armazenado em geladeira
que mais se degradaram foram a mentona e o 1,8-cineol. A tabela 1
mostra a
porcentagem de degradação de cada um desses compostos, assim como, as razões de
áreas, entre os principais compostos analisados e o padrão interno, obtidas antes e após
o armazenamento do óleo essencial de M. piperita sob diferentes temperaturas (4ºC e à
temperatura ambiente, 25ºC). Os principais componentes do óleo essencial, como um
todo, mostraram-se bem mais estáveis à temperatura mais baixa (4ºC). A figura 2
mostra a porcentagem dos compostos no óleo essencial de M. piperita antes e depois de
armazenados.
A figura 3 mostra o espectro de massas do ergosterol onde se observa os
principais picos, m/z 41, m/z 43, m/z 55, m/z 69, m/z 81, m/z 91, m/z 105, m/z 119, m/z
143, m/z 157. Dentre esses foram selecionados três para serem monitorados pelo
aparelho no modo de monitoramento seletivo de íons (MSI), m/z 55, m/z 69, m/z 143.
Apesar de existirem outros picos com intensidades maiores que o m/z 143, eram picos
comuns ou que coincidiam com picos de outros compostos existentes na ração e que
saiam muito próximo aos picos do composto monitorado (ergosterol). A figura 4 mostra
um cromatograma típico de uma amostra monitorada no modo MSI, onde os íons
monitorados aparecem destacados.
35
A ração apresentou umidade de 13% e já se encontrava contaminada com
fungos. As concentrações de ergosterol, nas amostras quantificadas, ficaram entre 0,01 e
11,44 μg/g de ração, conforme mostra a tabela 2.
Um experimento realizado in vitro, mostrou que o óleo essencial de M. piperita,
apresentou boa atividade antifúngica contra os fungos A. flavus, A. ochraceous, A.
niger, A. glaucus, F. oxysporum, F. semitectum, C. musae e C. gloeosporioides, sendo
que na concentração de 0,2%, ao quinto dia de avaliação, ele só não inibiu totalmente o
crescimento micelial do A. glaucus (51). Baseando-se o controle fúngico em ração pela
redução do teor de ergosterol, o óleo essencial de M. piperita, na concentração de 0,2%,
apresentou uma boa atividade sobre os fungos presentes na ração, conforme mostra a
figura 5
. Na umidade inicial da ração, 13%, o controle foi de 95,8% no primeiro mês,
caindo para 83,9% no segundo mês e para 75,3% no último mês de análise. Na umidade
de 15% o controle foi de 86,4% no primeiro mês, 91,0% no segundo mês e 48,6% no
último. Na umidade de 18% o controle foi de 86,1% no primeiro mês, 46,7% no
segundo mês e 51,0% no último mês de análise.
A análise estatística dos dados revelou pelo teste F que há significância em nível
de 5% entre os fatores: concentração de ergosterol, umidade e tempo. A aplicação do
teste de médias de Tukey a 5% levou em consideração a interação entre os três fatores
citados anteriormente, cujos resultados são apresentados na tabela 2, na qual as letras
maiúsculas se referem as médias de concentração de ergosterol nas amostras tratadas e
sem tratamento (testemunha) pelo óleo essencial numa mesma umidade e período de
tempo e as letras minúsculas as médias de concentração de ergosterol para as amostras
tratadas e para as sem tratamento nas diferentes umidades e num mesmo período de
tempo. As médias das concentrações de ergosterol em μg/g de ração, tabela 2,
revelaram, com base no teste de médias de Tukey a 5%, que não houve diferença
significativa, no primeiro mês de análise, entre as concentrações de ergosterol nas
amostras de ração tratada e sem tratamento pelo óleo essencial de M. piperita nas
umidades de 13 e 15%, havendo diferença significativa apenas na umidade de 18%. No
segundo e terceiro meses de análise, não houve diferença significativa entre as
concentrações de ergosterol nas amostras de ração tratada e sem tratamento apenas para
o tratamento a 13% de umidade. Nessa mesma análise, a comparação entre as médias,
em um mesmo período e em diferentes umidades, revelou para a ração sem tratamento
(testemunha) que no primeiro mês de análise não há diferença significativa entre a
concentração de ergosterol nas umidades de 13 e 15%, havendo diferença entres essas
36
duas e a concentração de ergosterol na umidade de 18%. No segundo e terceiro meses
de análise houve diferença significativa entre as concentrações médias de ergosterol
para as três umidades. O teste de Tukey a 5% revelou que, no primeiro mês, não há
diferença entre as médias de concentração de ergosterol para a ração tratada pelo óleo
essencial. No segundo mês não houve diferença significativa entre a concentração de
ergosterol nas umidades 13 e 15%, havendo diferença significativa entre a concentração
de ergosterol na umidade de 18% e essas duas outras umidades. No terceiro mês houve
diferença significativa entre as concentrações de ergosterol nas três umidades. A tabela
3, mostra a equação ajustada para cálculo da concentração de ergosterol em função do
tempo para a ração tratada e sem tratamento (testemunha) nas umidades de 13, 15 e
18%.
37
4- Discussão:
A freqüente mudança na composição química do óleo essencial leva a mudanças
drásticas no valor comercial do óleo essencial, causando conseqüente perda de renda
(26). Estudos realizados com extratos e óleos de folhas de M. piperita mostram que a
quantidade dos principais terpenos dessa espécie pode variar com a idade e local de
origem da planta (42, 43), mas nada relatam sobre a estabilidade desses compostos.
Este presente estudo, além de avaliar a estabilidade do óleo essencial e o seu
potencial fungicida in vivo, serve também para ratificar a utilidade da quantificação do
ergosterol como um método para determinar o crescimento fúngico em alimentos.
Segundo dados da literatura a concentração dos compostos em óleo essencial de
M. piperita está entre 30-81,1% para o mentol, 2,9-5,9% para o neomentol, 5,8-33%
para a mentona, 0,1- 5,5% para o acetato de mentila (26, 27, 33, 35) e 0,60-23,42% para
a carvona (16, 30). Martins et al. (41) não detectaram o mentol no óleo essencial das
partes aéreas de M. piperita, detectando como composto principal o acetato de linalila
(72%). Duarte et al. (16) também não detectaram a presença de mentol em sua análise,
detectando como composto principal o linalol (51%).
Neste estudo, para a avaliação da estabilidade dos principais componentes do
óleo esssencial de M. piperita, foi necessária a adição de uma quantidade definida de
um padrão interno às amostras analisadas para que pudesse ser feita a comparação entre
as razões de áreas (área relativa do pico do componente/área relativa do pico nonano)
obtidas antes e após o armazenamento, visto que, a concentração do mesmo seria
constante. Se houvesse variação nessa concentração devido a erros experimentais, essa
seria bem semelhante para todas as amostras, pois foi utilizada a mesma metodologia.
Então, variações nas áreas dos picos durante análise, devidas à sensibilidade do
aparelho, seriam repassadas às áreas de todos os picos da mesma forma. Logo, a adição
do padrão foi de fundamental importância para essa comparação. De acordo com a
tabela 1, os óleos armazenados em geladeira e à temperatura ambiente, quando
comparados com o óleo essencial antes do armazenamento, mostram uma diminuição
nas razões de áreas entre seus componentes e o nonano quanto maior a temperatura de
armazenamento, o que revela que houve uma degradação dos compostos avaliados.
Pela análise do teor de ergosterol nas amostras, pelo modo MSI, pode-se
comprovar que a ração tratada com óleo essencial na concentração de 0,2% teve um
menor nível de desenvolvimento fúngico. Os níveis de ergosterol obtidos pela análise
no aparelho de CG-EM, mostraram que as amostras de ração, naturalmente
38
contaminadas, que sofreram tratamento pelo óleo essencial, eram menos vulneráveis ao
ataque fúngico nas umidades mais baixas (13 e 15%). O aumento da umidade favoreceu
o crescimento fúngico nas rações avaliadas, porém, não teve efeito significativo no
potencial de inibição do óleo no primeiro mês, que se manteve elevado. No penúltimo
mês de avaliação houve uma significativa diferença entre os tratamentos das umidades
13 e 15% em relação a umidade de 18%. A ração, ao ser adquirida, apresentava nível
médio de ergosterol de 5,0 x 10
-2
µg/g de ração e quando aumentada a umidade para
18% e incubada durante três meses, apresentou nível médio de ergosterol de 11,44 μg/g
de ração.
A baixa concentração de ergosterol na ração tratada pelo óleo essencial mostra a
real atividade desse na inibição do crescimento fúngico e conforme Seitz & Pomeranz
(55), grãos de milho saudáveis possuem geralmente concentrações de ergosterol
inferiores a 3 µg/g. A concentração de ergosterol encontrada no último mês de análise
só foi superior a esse valor na ração tratada que possuía umidade de 18%.
O óleo essencial de M. piperita apresentou atividade de 100% para a maioria dos
fungos in vitro, a 0,2% (51), porém, houve uma diminuição nessa atividade in vivo.
Alguns autores discutem que a menor atividade dos óleos essenciais in vivo pode ser
devida às interações dos compostos ativos presentes, conhecidos por serem lipofílicos,
com os componentes dos alimentos, como proteínas e lipídeos, o que faz com que esta
atividade diminua (17, 56).
Neste experimento, a diminuição dessa atividade é atribuída não só a essas
interações, mas, também, a diminuição dos compostos ativos do óleo essencial com o
passar do tempo. A tabela 2 mostra que com o aumento do tempo de armazenamento o
teor de ergosterol nas amostras tratadas pelo óleo essencial de M. piperita foi
aumentado em relação à testemunha. Esse aumento indica uma diminuição gradativa da
eficiência do óleo essencial em controlar o crescimento fúngico. Essa diminuição de
atividade pode estar relacionada a diminuição da mentona que segundo Edris e Farrag
(27), aumenta a atividade do mentol, principal constituinte ativo desse óleo. Neste
presente trabalho, mesmo quando o óleo foi hermeticamente fechado e armazenado à
temperatura ambiente ao abrigo de luz, a mentona e o mentol tiveram significativas
diminuições de concentração.
A utilização do MSI para a determinação do teor de ergosterol é necessária, visto
que, a concentração de ergosterol nas amostras analisadas é baixa. A comparação da
atividade do óleo essencial com outros dados da literatura, às vezes, se torna difícil,
39
devido às diferentes constituições dos óleos essenciais mesmo em plantas de mesma
espécie e as diferentes metodologias aplicadas na extração.
40
ANEXOS:
Y = 6,144 x 10
-5
X - 0,1442
R
2
= 0,9992
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000
Resposta do detector/ 10
6
Concentração de ergosterol (ng/µL)
Figura 1 – Curva padrão do ergosterol obtida através da injeção de soluções de
ergosterol em DCM (concentrações de 0,990; 2,439; 4,762; 16,670; 33,330; 50,00;
100,00 ng/μL) no CG-EM, operando no modo de Monitoramento Seletivo de Íons
(MSI), cujos íons monitorados foram m/z 55, m/z 69, m/z 143.
0
,
2 0
,
4 0
,
6 0
,
8 1
,
0 1
,
2 1
,
4 1
,
6 1
,
8
41
Tabela 1 – Porcentagem degradada dos oito principais compostos do óleo essencial de Mentha piperita L. após o armazenamento por 90 dias em
geladeira (4
o
C) e à temperatura ambiente (25
o
C). e razão entre as áreas de cada um deles e a área do padrão interno (nonano), antes e após o
armazenamento.
Razão entre a área do pico do composto e a área do pico do padrão
interno (nonano) obtidos por cromatografia gasosa
Degradação do composto (%)
Composto IK*
Inicial Depois de armazenado por 90 dias Depois de armazenado por 90 dias
4ºC 25ºC 4ºC 25ºC
1,8-Cineol
1033
0,31 0,26 0,25 18,9 21,3
Mentona
1154
0,89 0,73 0,67 20,8 33,1
Neomentol
1165
0,75 0,68 0,67 10,3 12,6
Mentol
1173
5,98 5,69 5,37 5,1 11,3
Carvona
1242
0,61 0,60 0,50 2,8 22,4
Acetato de mentila
1294
0,47 0,40 0,38 16,5 22,1
trans-Cariofileno
1418
0,27 0,23 0,18 17,8 46,9
Viridiflorol
1590
0,28 0,26 0,24 6,5 17,4
* Índice de retenção de Kováts, Adams, 1995 (37).
42
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1
,
8
-
Cineol
Ment
o
na
Ne
o
mentol
Mentol
Ca
rv
o
n
a
Ac
eta
to
de
men
t
il
a
trans
-
C
a
rio
f
ilen
o
Viridi
f
l
o
rol
(%)
Antes do armazenamento
Armazenado em geladeira
Armazenado à temperatura ambiente
Figura 2 – Porcentagem dos principais compostos presentes no óleo essencial de Mentha
piperita L. (1,8-cineol, mentona, neomentol, mentol, carvona, acetato de mentila, trans-
cariofileno e viridiflorol) antes do armazenamento e após o armazenamento por 90 dias em
geladeira (4
o
C) e à temperatura ambiente (25
o
C).
Figura 3 – Espectro de massas do padrão de ergosterol.
Intensidade relativa (%)
43
Figura 4 – Cromatograma de íons parciais típico da amostra do extrato da ração
armazenada por 90 dias (repetição 3, umidade 18%, contaminada com fungos) tratada
com óleo essencial de Mentha piperita L. a 0,2%, obtido por CG-EM. Coluna capilar de
sílica fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25
μm de espessura do filme, Supelco) revestida
com fase estacionária Equity
TM
-5. Programação de temperatura: 150°C, aumento de
15°C/min até atingir 280°C (22 min); fluxo do gás de arraste (hélio ultrapuro) de 1,5
mL/min; temperatura do injetor 260ºC; temperatura da interface 280ºC; modo de
injeção Splitless; modo de ionização impacto de elétrons (70 eV); operando no modo
MSI. Íons monitorados: m/z 55, m/z 69, m/z 143. O número 1 se refere aos picos
relativos aos íons monitorados do ergosterol.
Resposta do detector
44
Tabela 2 – Concentração média de ergosterol em µg/g de ração encontrada nas amostras de
rações, analisadas por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM), com
umidade com umidade de 13, 15 e 18%, armazenadas durante 30, 60 e 90 dias, com e sem
tratamento do óleo essencial de Mentha piperita L. na concentração de 0,2%.
Tempo
(dias)
Umidade da ração
(%)
Concentração média de ergosterol em μg/g de
ração*
Ração sem tratamento
(testemunha)
Ração tratada
13
0,15 Ab 0,01 Aa
15
0,27 Ab 0,04 Aa
30
18
1,21 Aa 0,17 Ba
13
0,29 Ac 0,05 Ab
15
1,19 Ab 0,11 Bb
60
18
6,28 Aa 3,35 Ba
13
0,37 Ac 0,09 Ac
15
1,74 Ab 0,90 Bb
90
18
11,44 Aa 5,61 Ba
*Média de três repetições. As médias seguidas pela mesma letra maiúscula na mesma
linha ou minúscula na mesma coluna e período de tempo não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade. A concentração média de ergosterol na ração
inicial com umidade de 13% foi de
0,05 μg/g de ração.
Figura 5 – Porcentagem de redução do ergosterol acumulado em ração à base de milho,
obtido pelo óleo essencial na concentração de 0,2%, nas umidades de 13%, 15% e 18%,
no período 30, 60 e 90 dias de armazenamento a 25
o
C.
Redução do ergosterol acumulado
(%)
Período de armazenamento
umidade de 13%
umidade de 15%
umidade de 18%
45
Tabela 3 - Equações ajustadas para cálculo da concentração de ergosterol em função do tempo para as rações com umidades de 13, 15 e 18%,
com e sem tratamento pelo óleo essencial de M. piperita a 0,2%.
UMIDADE FATOR EQUAÇÕES AJUSTADAS R
2
13% Testemunha C = - 0,302930 x 10
-4
T
2
+ 0,723372 x 10
-2
T – 0,382700 x 10
-1
0,9144
13% Óleo essencial C = 0,260407 x 10
-5
T
2
+ 0,109074 x 10
-2
T – 0,286580 x 10
-1
0,9747
15% Testemunha C = - 0,204469 x 10
-3
T
2
+ 0,489727 x 10
-1
T – 1,00837 0,9882
15% Óleo essencial C = 0,398522 x 10
-3
T
2
– 0,335233 x 10
-1
T + 0,684766 0,9944
18% Testemunha C = 0,558722 x 10
-4
T
2
+ 0,163674 T – 3,74565 0,9950
18% Óleo essencial C = - 0,505619 x 10
-3
T
2
+ 0,151404T – 3,91778 0,9333
46
CONCLUSÕES GERAIS
As análises cromatográficas possibilitaram a identificação de 57 compostos no
óleo essencial de M. piperita e mostraram que eles são, em sua maior parte,
monoterpenos e que o mentol é o principal componente desse óleo essencial.
Através da avaliação da atividade antifúngica, in vitro, pelo ensaio “poison
food”, foi possível comprovar que o óleo essencial apresenta efeito inibitório sobre o
crescimento micelial dos fungos, A. flavus, A. ochraceous, A. niger, A. glaucus, F.
oxysporum, F. semitectum, C. musae e C. gloeosporioides.
Utilizando-se da quantificação de ergosterol por CG-EM operado no modo MSI
foi possível avaliar e comprovar o potencial do óleo essencial em controlar a
contaminação fúngica em ração armazenada.
O fracionamento do óleo essencial e a avaliação in vitro do potencial antifúngico
das subfrações ativas, apontaram o mentol como um dos componentes responsáveis pela
atividade antifúngica do óleo essencial, porém, foi possível perceber que além dele,
existem outros compostos com potencial antifúngico presentes nesse óleo.
Pela avaliação da estabilidade do óleo essencial de M. piperita foi possível
demonstrar que os seus principais compostos não são estáveis ao armazenamento, por
90 dias, em geladeira a 4ºC, e é muito menos estável à temperatura ambiente. Essa
análise pôde provar que houve consideráveis diferenças entre a porcentagem inicial
desses compostos e a porcentagem deles após o armazenamento Através dessa avaliação
foi possível perceber que o trans-cariofileno foi o composto mais instável à temperatura
ambiente e a mentona e o 1,8-cineol os mais instáveis em geladeira. Além disso, essa
avaliação mostrou que o óleo essencial como um todo é bem mais estável à temperatura
mais baixa.
Enfim, estudos mais elaborados são necessários para sabermos se a utilização do
óleo de M. piperita ou de alguns de seus componentes é uma alternativa segura e viável
para o controle de fungos.
47
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