( PDF ) Avaliação do perfil psicofarmacológico de psicolatina isolada de Psychotria umbellata (Rubiaceae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Avaliação do perfil psicofarmacológico de psicolatina isolada de

Psychotria umbellata (Rubiaceae)

FERNANDA LIMA BOTH

PORTO ALEGRE, 2005

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Avaliação do perfil psicofarmacológico de psicolatina isolada de

Psychotria umbellata (Rubiaceae)

Tese apresentada por Fernanda Lima Both

para obtenção do TÍTULO DE DOUTOR

em Ciências Farmacêuticas

Orientadora: Profa. Dra. Elaine Elisabetsky

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Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, em nível de

Doutorado – Produção e Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos – da Faculdade

de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 03.10.2005,

pela Banca Examinadora constituída por:

Profa. Dr. Carla Dalmaz

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Profa. Dr. Ionara Rodrigues Siqueira

Universidade Integrada do Vale do Taquari

Profa. Dr. Tânia Alves Amador

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Profa. Dr. Thereza Christina Monteiro de Lima Nogueira

Universidade Federal de Santa Catarina

Profa. Dr. Vera Maria Steffen

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

B749a Both, Fernanda Lima

Avaliação do perfil psicofarmacológico de psicolatina isolada

dePsychotria umbellata (Rubiaceae)/ Fernanda Lima Both – Porto

Alegre: UFRGS, 2005. – 133 p.: il., gráf., tab.

Tese (doutorado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Curso de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas.

1. Psychotria umbellata. 2. psicolatina. 3. alcalóides indólicos. 4.

receptores serotonérgicos. 5. receptores glutamatérgicos. I. Elisabetsky,

Elaine.II. Título

CDU: 615.214:582.972

Bibliotecárias responsáveis: Margarida Maria Cordeiro F. Ferreira – CRB10/480

Este trabalho foi desenvolvido com a orientação da Profa. Dra. Elaine

Elisabetsky, no Laboratório de Etnofarmacologia do Instituto de Ciências Básicas da

Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. A pesquisa foi financiada

pelo CNPq.

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, Solange, a Tatiana, Marcos, Vó, a distância não foi suficiente para

diminuir o apoio, o carinho nas horas complicadas e, principalmente, o amor;

Ao meu pai, Agostinho, que sempre me incentivou, me deu apoio e compreensão

em todas as horas;

Ao meu noivo Eduardo e Henrique, os dois homens da minha pequena família, que

sempre me deram força para continuar o meu caminho;

À Elaine Elisabetsky, pela orientação, apoio, estímulo e compreensão nos meus

maus momentos;

À Mirna por ter me proporcionado ser bolsista do Departamento e, assim, seguir

meus estudos na Pós Graduação;

À amigona, parceira Adri, que durante estes anos foi muito mais que colega de

trabalho;

Ao paciente Ângelo, excelente amigo e colega de trabalho, sempre ajudando e

quebrando meus "galhos" no computador, me ensinando as coisas mais simples;

À Lisi, amiga e bolsista de Iniciação Científica, que participou em diferentes etapas

deste “nosso” trabalho;

A todas as “mulheres” do Laboratório de Etnofarmaco, Eliane, Juliana, Viviane,

Greice, Sabrina, Bárbara, Valquíria, Natália, Pauline, pela amizade, apoio e carinho;

Aos professores do Departamento de Farmacologia;

Às funcionárias do Programa de Pós-Graduação em da Farmácia pelo auxílio;

Aos cidadões brasileiros que pagam seus impostos e que contribuem para a

formação de novos profissionais nas universidades públicas.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS

...................................................................................................................................vi

LISTA DE TABELAS..............................................................................................xi

LISTA DE ABREVIATURAS

...................................................................................................................................xi

RESUMO.................................................................................................................xiv

ABSTRACT

...................................................................................................................................xv

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................1

1.1. CONTRIBUIÇÃO DA FLORA PARA A FARMACOLOGIA.........................1

1.2 ALCALÓIDES INDÓLICOS ..............................................................................4

1.2.1 ASPECTOS QUÍMICOS ..................................................................................4

1.2.2 PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS.......................................................9

1.2.2.1 SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL..............................................9

1.2.2.2 COMO ANALGÉSICOS E ANTIINFLAMATÓRIOS...............................12

1.2.2.3 NO TRATAMENTO DE CÂNCER.............................................................13

1.2.2.4 COMO ANTIOXIDANTES E NEUROPTOTETORES..............................13

1.3. O GÊNERO Psychotria.....................................................................................16

1.3.1 Psychotria umbelata (Vell.) ............................................................................20

1.4 TRANSTORNOS MENTAIS............................................................................21

1.4.1. ANSIEDADE: BASES NEURAIS, FARMACOTERAPIA E MODELOS

COMPORTAMENTAIS..........................................................................................23

1.4.2. DEPRESSÃO: BASES NEURAIS, FARMACOTERAPIA E MODELOS

COMPORTAMENTAIS..........................................................................................26

1.4.3. ESQUIZOFRENIA: BASES NEURAIS, FARMACOTERAPIA E MODELOS

COMPORTAMENTAIS..........................................................................................30

2. HIPÓTESE DE TRABALHO............................................................................36

3. OBJETIVOS.......................................................................................................38

3.1. OBJETIVO GERAL..........................................................................................38

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................38

4. ARTIGOS CIENTÍFICOS................................................................................41

4.1. PSYCHOPHARMACOLOGICAL PROFILE OF THE ALKALOID

PSYCHOLLATINE AS A 5HT

2A/C

SEROTONIN MODULATOR. Journal of

Natural Products, v. 68, n. 3, p. 374-380, 2005.....................................................41

4.1.1. INTRODUÇÃO..............................................................................................41

4.1.2. OBJETIVOS...................................................................................................42

4.1.3. ARTIGO.........................................................................................................43

4.2.

ROLE OF GLUTAMATE AND DOPAMINE RECEPTORS IN THE

PSYCHOPHARMACOLOGICAL PROFILE OF THE INDOLE ALKALOID

PSYCHOLLATINE.

Journal of Natural Products, in

press...................................................................50

4.2.1. INTRODUÇÃO..............................................................................................50

4.2.2. OBJETIVOS...................................................................................................52

4.2.3. ARTIGO..........................................................................................................53

4.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E PRÓ-OXIDANTE DO ALCALÓIDE

INDOL-MONOTERPÊNICO PSICOLATINA ISOLADO DE

Psychotria

umbellata

. (a ser submetido para Life Science, anexo 2)..........................................69

4.3.1. INTRODUÇÃO..............................................................................................69

4.3.2. OBJETIVOS...................................................................................................70

4.4. TOXICIDADE AGUDA INDUZIDA PELO ALCALÓIDE INDOL-

MONOTERPÊNICO PSICOLATINA ISOLADO DE Psychotria umbellata Vell.

(submetido à Toxicon, anexo 3)...............................................................................71

4.4.1. INTRODUÇÃO..............................................................................................71

4.4.2. OBJETIVOS...................................................................................................71

5. DISCUSSÃO .......................................................................................................72

6. CONCLUSÕES...................................................................................................83

7. REFERÊNCIAS .................................................................................................86

8. ANEXOS............................................................................................................103

ANEXO 1 Antioxidative and Prooxidative Activity of the Indolmonoterpene

Alkaloid Psychollatine from Psychotria umbellate. Fernanda L. Both,

Ionara R. Siqueira, Vitor A. Kerber, Amélia T. Henriques and Elaine

Elisabetsky. Life Science, to be submitted, 2005.

ANEXO 2 Acute Toxicity Induced by Psychollatine, an Indole

Monoterpene Alkaloid, Isolated from Psychotria umbellata Fernanda L.

Both, Lisiane Meneghini, Vitor A. Kerber, Amélia T. Henriques and Elaine

Elisabetsky. Toxicon, submitted, 2005.

LISTA DE FIGURAS

Páginas

INTRODUÇÃO

Figura 1- Biossíntese dos alcalóides indol-monoterpênicos...............................................5

Figura 2 - Estruturas moleculares dos diversos tipos de alcalóides formados...........7

Figura 3 - Tipos de alcalóides indol-monoterpênicos a partir da condensação

de secologanina com sua amina correspondente ........................................7

Figura 4 - Estrutura molecular de psicolatina ...........................................................21

ARTIGOS CIENTÍFICOS

ARTIGO 4.1

Figura 1 - Effects of psychollatine in the hole-board test. Number of head-dips

(a), number of squares crosses (b), and rearings

(c)………………………………………………………………………..44

Figura 2 - Effects of psychollatine and antagonists (picrotoxin and ritanserin) in

the hole-board test. Number of head-dips (a), number of squares

crosses (b), and number of rearings

(c)………………………………………………………………………..45

Figura 3 - Effects of diazepam and psychollatine on the behavior of mice in

the light-dark test. Latency of the first entry (a) and amount of time

spent by mice in the light area (b)............................................................45

Figura 4 - Effects of diazepam and psychollatine on the behavior of mice in the

light-dark test with antagonists. Latency of the first entry (a) and

amount of time spent by mice in the light area (b).................................45

Figura 5 - Effects of benzodiazepine (diazepam), psychollatine, and

respective vehicle (PPG and saline) on potentiation of barbiturate sleeping

tim..............................................................................................................46

Figura 6 - Effects of benzodiazepine (diazepam), psychollatine, and

respective vehicle (PPG and saline) on spontaneous locomotor activity.46

Figura 7 - Effects of diazepam, phenobarbital and psychollatine

on PTZ-induced convulsions...................................................................46

Figura 8 - Effects of imipramine, fluoxetine, MK-801 and psychollatine on

time of immobility in forced swimming test ...........................................46

Figura 9 - Effects of scopolamine and psychollatine on the oxotremorine-

induced tremor ......................................................................................46

Figura 10 - Effect of psychollatine given ip 30min prior to training (A)

and immediately posttraining (B) on test performance of adult mice

trained in step-down inhibitory avoidance (0.3mA footshock, 24h

training-test interval)................................................................................47

ARTIGO 4.2

Figura 1 - Effect of psychollatine on spontaneous locomotion (2a) and

MK-801-induced hyperlocomotion

(2b)……………………………………………………………………….59

Figura 2 - Effect of psychollatine and classical antipsychotic chlorpromazine

on amphetamine-induced lethality in grouped

mice………………………………………………………………………61

Figura 3 - Effect of psychollatine, classical antipsychotic chlorpromazine and MK-

801 on apomorphine-induced climbing behavior in

mice………………………………………………………………………62

DISCUSSÃO

Figura 1- Interação entre o sistema serotonérgico e

dopaminérgico…………………............................................................74

Figura 2 - Interação entre o sistema glutamatérgico e

dopaminérgico………………................................................................76

Figura 3 - Interação entre o sistema serotonérgico e

glutamatérgico…………………............................................................78

Figura 4 - Possíveis mecanismos de ação de

psicolatina……………………………...................................................81

Figura 5 - Possíveis atividades farmacológicas e mecanismos de ação de

psicolatina...............................................................................................81

ANEXOS

ARTIGO 4.3

Figura 1- Molecular structure of psychollatine and

serotonin………………………………………………………...ANEXO 1

Figura 2 - Effects of psychollatine on free radical content, using DCFH-DA as a

probe in brain areas, cortex (cx) and hippocampi

(hc)……………………………………………………………...ANEXO 1

Figura 3 - Effects of psychollatine on total antioxidant reactivity (TAR) levels

from cortex (cx) and hippocampi (hc) from saline and psychollatine 7.5

and 30

mg/kg………………………………….....................................ANEXO 1

Figura 4 - Effects of psychollatine on lipid peroxidation assay

(TBARS)………………………………………………………ANEXO 1

Figura 5 - Contents of tyrosine in brain structures, cortex (cx) and

hippocampi (hc) from saline and psychollatine (PSY) 7.5

and 30

mg/kg…………………………………………………………..ANEXO 1

Figura 6 - Contents of tryptophan in brain structures, cortex (cx)

and hippocampi (hc) from saline and psychollatine (PSY) 7.5

and

30mg/kg…………………………………………………………ANEXO 1

LISTA DE TABELAS

Páginas

INTRODUÇÃO

Tabela 1- Alcalóides indólicos economicamente importantes para a

indústria farmacêutica e seus usos terapêuticos....................................15

ARTIGOS CIENTÍFICOS

ARTIGO 4.2

Tabela 1- Effect of psycholatine against NMDA-induced

seizures………………………………………………………………58

ANEXOS

ARTIGO 4.4

Tabela 1 – Toxicity signs following i.p. administration of psychollatine or

saline

mice………………………………………………………..........ANEXO 2

Tabela 2 - Cumulative death during the period of 24h following the

i.p. administration of psychollatine or saline to

mice……………………………………………….…………....ANEXO 2

Tabela 3 - Ptose scores following i.p. administration of psychollatine or saline

to mice…………………………………………………………ANEXO 2

Tabela 4 - Locomotor activity scores following i.p. administration of

psychollatine or saline to

mice…………...……………………………………………….ANEXO 2

LISTA DE ABREVIATURAS

Acetilcolina

AINES

Antiinflamatórios não esteroidais

AMPA Ácido

-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico

CID Classificação estatística internacional de doenças

DA Dopamina

DCF Conteúdo de radicais livres

DMT Dimetiltriptamina

ECG Eletroencefalograma

GABA Ácido gama-amino butírico

5-HIAA Ácido 5-hidroxiindolacético

5-HT Serotonina

IMAOs Inibidores da monoaminooxidase

ISRSs Inibidores da recaptação de serotonina

LSD Ácido lisérgico

LTP Potencial de longa duração

MAO Monoaminooxidase

MK-801 Dizocilpina

NA Noradrenalina

NMDA

N-Metil-D-Aspartato

NMR Núcleo magno da rafe

OMS Organização Mundial da Saúde

PCP Fenciclidina

RNS Espécies reativas de nitrogênio

ROS Espécies reativas de oxigênio

SNC Sistema nervoso central

TAR Reatividade antioxidante total

TBARs Ensaio de Peroxidação lipídica

TCAs Antidepressivos tricíclicos

TIR Oxidação dos resíduos de tirosina

TRI Oxidação dos resíduos de triptofano

RESUMO

Palavras chave: Psychotria umbellata, psicolatina, ansiolítico, antidepressivo,

antipsicótico, antioxidante, receptores NMDA, 5-HT

2A/C

, DA.

Estudos prévios mostraram que psicolatina (o alcalóide indol-

monoterpênico, isolado de Psychotria umbellata (Vell.)) possui moderada atividade

analgésica em modelos experimentais de dor que envolvem a participação de

receptores opióides e glutamatérgicos do tipo NMDA. Visto que a psicolatina

encontra-se em grande quantidade nesta espécie, e que receptores NMDA estão

envolvidos em uma grande variedade de processos, incluindo memória, plasticidade

neural, ansiedade e depressão, este estudo buscou avaliar o perfil

psicofarmacológico de psicolatina, bem como seus efeitos centrais ou interações

com alguns sistemas neurotransmissores como receptores glutamatérgicos NMDA,

serotonérgico (5-HT), dopaminérgico (DA), gabaérgico (GABA) e colinérgico

(Ach). Em dois modelos comportamentais de ansiedade, a psicolatina mostrou

atividade ansiolítica revertida pela administração prévia de ritanserina (antagonista

serotonérgico 5-HT

2A/C

), sendo, portanto, esta ação relacionada à modulação destes

receptores. A psicolatina não parece interferir com receptores GABAérgicos, já que

a atividade ansiolítica não foi revertida por picrotoxina e também porque a

psicolatina não mostrou atividade anticonvulsivante no modelo das convulsões

induzidas por pentilenotetrazol. A psicolatina também apresentou atividade

antidepressiva e amnésica, atividades que também estão relacionadas à modulação

de receptores serotonérgicos. Além disso, a psicolatina protege animais das

convulsões induzidas por NMDA, além de reverter a hiperlocomoção induzida por

dizocilpina, sugerindo que o mecanismo de ação de psicolatina também envolve o

glutamato. A inibição do comportamento de escalada induzida por apomorfina e a

proteção à letalidade induzida por anfetamina podem ser resultantes da modulação

indireta de receptores dopaminérgicos exercida pelo glutamato e pela serotonina. A

psicolatina modifica diferentemente o estado oxidativo basal em distintas áreas

cerebrais de camundongos; aumentando a capacidade antioxidante total no

hipocampo e no córtex, mas a formação de radicais livres sendo reduzida apenas no

córtex. Esses resultados são consistentes com o relato de atividade antioxidante de

derivados indólicos. A psicolatina administrada agudamente por via oral não

apresentou nenhum sinal de toxicidade até 1g/kg; por via intraperitoneal, sinais de

toxicidade só estão presentes em doses bem maiores do que as que apresentam os

efeitos acima mencionados. Conclui-se que a psicolatina apresenta um padrão

psicofarmacológico semelhante a drogas que modulam receptores NMDA e 5-HT,

os quais tem papel proeminente em diversos distúrbios psiquiátricos e neurológicos.

Assim, o presente estudo reforça a idéia de que este alcalóide indol-monoterpênico

pode ser explorado como modelo estrutural para o desenvolvimento de drogas que

atuem nestes subtipos de receptores.

ABSTRACT

Psychotria umbellata: psychopharmacological profile of psychollatine alkaloid.

Key words: Psychotria umbellata, psychollatine, anxiolytic, antidepressive,

antipsychotic, antioxidant, NMDA, 5-HT

2A/C

, DA receptors.

We have previously shown that psychollatine, an indole monoterpene

alkaloid, isolated from Psychotria umbellata (Vell.) possess mild analgesic activity

in experimental pain models involving the participation of opioid and NMDA

glutamate receptors. Considering that psyschollatine is abundant in this plant species

and that NMDA receptors are involved in a number of neuronal processes, including

memory, neural plasticity, anxiety and depression, this study aimed to understand

the psychopharmacological profile of psychollatine, as well as its central effects or

interactions with some neurotransmitter systems like glutamatergic NMDA,

serotonergic (5-HT), dopaminergic (DA), gabaergic (GABA) and cholinergic (Ach)

receptors. Psychollatine presented anxiolytic activities in two behavioral models of

anxiety; the activity being reversed by previous administration of 5-HT

2A/C

serotonergic antagonist (ritanserin), suggesting the participation of these receptors.

Psychollatine does not seem to interfere with GABAergic receptors, given the

anxiolytic activity was not prevented by picrotoxin and that psyhollatine did not act

as anticonvulsant against pentilenetetrazol. Psychollatine also presented

antidepressant and amnesic activities, both effects related to serotonergic receptors.

Psychollatine protects mice against NMDA induced convulsions, and prevents

dizocilpine-induced hyperlocomotion, suggesting that its mechanism of action also

involve glutamate. The inhibition of apomorphine-induced climbing and protection

of amphetamine-induced lethality by psychollatine may be the result of an indirect

modulation of dopaminergic neurons exerted by glutamate and serotonin.

Psychollatine differently alters the oxidative stress in distinct mice brain regions;

psychollatine increased the total antioxidant capacity in hippocampus and cortex,

but the production of free radical was reduced only in the cortex. These results are

consistent with reports of antioxidant activity of indole derivatives. The acute oral

administration of psychollatine does not induce toxicity up to 1g/kg;

intraperitoneally, and signs of toxicity are present in doses bigger than those

inducing the effects above mentioned. In conclusion, psychollatine presents a

psychopharmacological profile compatible to drugs that modulate serotonin and

glutamate NMDA receptors, neurotransmitters known to have a prominent role in

diverse psychiatric and neurologic disorders. Therefore, the study reinforces the idea

that this monoterpene indol alkaloid can be further explored as a structural model for

developing drugs that modulate these receptors.

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONTRIBUIÇÃO DA FLORA PARA A FARMACOLOGIA

Desde os primórdios da civilização, com as práticas nômades e,

posteriormente com o advento e desenvolvimento da agricultura que permitiu a

fixação de grupos populacionais em determinadas regiões não precisando recorrer às

migrações para a sobrevivência; o manejo do meio ambiente permitiu ao homem

adquirir uma relação muito intensa com as plantas, não apenas para a obtenção

constante de alimento para suprir as necessidades básicas da população ou de

material para abrigo temporário, mas também utilizando sua intuição e inteligência

passou a diferenciar as diversas espécies vegetais que eram tóxicas, medicinais ou

alimentícias (ENGELKE, 2003).

Além da identificação, desenvolveram técnicas de extração e

conservação de partes de plantas, como folhas e raízes. A utilização de plantas

medicinais como fonte de alívio para doenças pode ser percebida em documentos

de civilizações muito antigas na China, Índia e Europa. Acredita-se, portanto, que

as farmacopéias tradicionais foram elaboradas ao longo de muitos séculos de

experimentação (ELISABETSKY;

SETZER,1985) onde o conhecimento empírico

acumulado foi preservado e transmitido às futuras gerações.

O reino vegetal é muito rico em compostos químicos, que podem ser

produtos de desvios nas rotas biossintéticas. Estes compostos chamados de

metabólitos secundários, como taninos e alcalóides, muitas vezes possuem função

defensiva agindo como repelentes aos predadores (fungos, insetos, vírus), por

serem indigestos, ou mesmo tóxicos. Metabólitos secundários podem, igualmente,

auxiliar na competição de espécies por ambientes comuns ou também ajudar na

reprodução vegetal com atrativo aos polinizadores (ELISABETSKY;

SHANLEY,1994). A biogênese destes compostos está sob controle genético, mas

deve-se considerar que fatores ambientais, como o tipo de solo, época de ano e

estágio de desenvolvimento do vegetal influenciam na produção e acumulação dos

metabólitos secundários (BEGON et al., 1987; HARBORNE, 1990).

Com isto, o reino vegetal tem sido reconhecido como um manancial

de novas substâncias com potencial terapêutico. Os primeiros isolamentos de

princípios ativos datam do século XIX, sendo atualmente observada a existência de

inúmeros medicamentos derivados de plantas (HAMBURGER;

HOSTETTMANN,1991; CURTIS-PRIOR et al.,1999).

O uso de plantas medicinais brasileiras por populações indígenas foi

descrito por descobridores portugueses em 1500 (PETROVICK et al. 1999), sendo

ainda amplamente comum no Brasil, tanto no meio rural quanto urbano. Este fato é

bastante propício tendo em vista que o Brasil é rico em recurso genético e, devido

a diferenças climáticas, desenvolvem-se aqui diversas formações vegetais (Floresta

Amazônica, Floresta Atlântica, Cerrado entre outras). Igualmente observa-se do

ponto de vista cultural, que o desenvolvimento do conhecimento a respeito destas

plantas medicinais deve-se ao conjunto da sabedoria tradicional das populações

indígenas destacando o guaraná (Paullinia cupana H.B.K., Sapindaceae) ou

contribuições trazidas por povos imigrantes da Europa (camomila, Matricaria

chamomilla L., Asteraceae), Ásia (confrei, Symphytum officinale L., Boroginaceae)

e África (erva-guiné, Petiveria alliacea L., Phytolaccaceae; SIMÕES et al., 1995).

A Organização Mundial da Saúde estima que 65-80% da população

mundial utiliza, de algum modo, plantas tradicionais para suprir as necessidades de

assistência médica primária. Já que não há hospitais adequados e médicos

treinados, a destruição da floresta acarreta a extinção da fonte primária de saúde

destas populações (BALICK, 1990; CALIXTO, 2000).

Igualmente, observa-se que um grande número de pessoas nos

países desenvolvidos estão usando terapias alternativas como, por exemplo,

produtos fitoterápicos como preventivos ou auxiliares no tratamento de doenças

(YAMADA, 1998).

São inúmeros os compostos extraídos de plantas usados na

terapêutica ou derivados da molécula natural com estrutura remodelada dando

origem a um composto com maior atividade. Conforme FARNSWORTH (1990),

os medicamentos derivados de plantas mais utilizadas na medicina contemporânea

são (em ordem alfabética): atropina, bromelina, cafeína, quimopapaína, codeína,

deslanosídeo, digitoxina, digoxina, emetina, efedrina, morfina, papaverina,

fisostigmina, pilocarpina, quinidina, quinina, reserpina, escopolamina, teofilina,

tubocurarina, vimblastina e vincristina. Com base no uso e no papel inestimável

que estas drogas tem no alívio do sofrimento humano, justifica-se a continuidade

de pesquisas que busquem novas e melhores drogas derivadas de plantas.

Muitas drogas originárias de plantas são usadas sem modificações

estruturais (por exemplo, os alcalóides vinblastina e vincristina extraídos de

Catharantus roseus L. Don, Apocinaceae). Compostos extraídos de plantas

também têm sido uma fonte de matéria-prima para medicamentos semi-sintéticos.

Além disso, compostos tais como, mescalina, os canabinóides, ioimbina, forskolina

e muitos outros agentes derivados de plantas são importantes ferramentas em

farmacologia e bioquímica (FARNSWORTH, 1990).

Em um estudo realizado por O´NEILL (1998), identificou-se as 20

substâncias mais vendidas no mundo em 1995, sendo que 11 destes produtos

listados continham um ingrediente ativo com uma estrutura baseada em

componentes encontrados na natureza; este grupo de medicamentos contribuiu com

16,53 bilhões de dólares no mercado farmacêutico mundial. Mesmo assim, o

potencial das plantas superiores como fonte de novos medicamentos ainda é pouco

explorado.

1.2 ALCALÓIDES INDÓLICOS

1.2.1 ASPECTOS QUÍMICOS

Os alcalóides são um vasto grupo de metabólitos secundários,

possuindo uma variedade estrutural comparável a dos terpenóides. Representam

cerca de 20 % das substâncias naturais (taninos, flavonóides) e são extremamente

importantes nas áreas da indústria química e farmacêutica (BRUNETON, 1993).

No reino vegetal, os alcalóides encontram-se distribuídos em diversas

famílias, destacando-se Apocinaceae, Solanaceae, Papaveraceae, Loganiaceae e

Rubiaceae. Juntamente com Apocinaceae e Loganiaceae, a família Rubiaceae se

caracteriza pela produção de alcalóides indólicos, isoquinolínicos; com raras

exceções em Apocinaceae, as Rubiaceae são as únicas plantas com a capacidade de

rearranjar o cromóforo indólico originando estruturas quinolínicas (PELLETIER,

1970).

Os compostos indólicos são uma extensa família de compostos

presentes em bactérias, plantas e animais. Geralmente, estes compostos estão

relacionados com o metabolismo do triptofano e apresentam substituições em

diferentes posições do anel indólico (CANO et al., 2003). Os alcalóides indólicos

possuem um anel indólico em sua estrutura, uma versátil estrutura heterocíclica

descoberta em 1866, e encontrada em um considerável número de produtos

medicinais derivados de plantas (WILLIAMS, 2001). Nos animais, os compostos

indólicos mais significantes são aqueles relacionados com a melatonina, um hormônio

que é sintetizado a partir da serotonina (5-HT) pela glândula pineal de vertebrados,

incluindo humanos (CANO et al., 2003).

A principal característica dos alcalóides indol-monoterpênicos é sua

origem biossintética comum. Todos os compostos conhecidos provêm de um

precursor único: a estrictosidina produzida pela condensação de uma molécula de

triptamina com um aldeído terpênico, o secologanosídeo, elaborado via geraniol, a

partir das moléculas do ácido mevalônico (Fig. 1; BRUNETON, 1991).

Figura 1: Biossíntese dos alcalóides indol-monoterpênicos

A condensação do iridóide secologanina (1) com um aminoácido, ou

sua amina correspondente, gera uma grande variedade de alcalóides (Fig. 2). A

família Rubiaceae pode condensar secologanina com: tiramina (2) produzindo

alcalóides isoquinolínicos do tipo emetina (3); triptamina (4), formando alcalóides

indol-monoterpênicos derivados da estrictosidina (5); L-triptofano (6), formando

alcalóides indol-carboxílicos como a carboxi-corinantina (7). Além disso, também

podem condensar a secologanina com uma unidade triptamínica e uma tiramínica

formando alcalóides diméricos, como a tubulosina (8), ou duas unidades

triptamínicas formando alcalóides do grupo das roxburginas (9) (BRUNETON,

1991).

Figura 2: Estruturas moleculares dos diversos tipos de alcalóides formados a partir

da condensação de secologanina com sua amina correspondente.

Os alcalóides indol-monoterpênicos originam-se principalmente pela

hidrólise da estrictosidina, levando a três tipos principais (Fig. 3): tipo I – corinano

(10), tipo II – ibogano (11) e pseudoapidospermano (12) e tipo III – apidospermano

(13).

Figura 3: Tipos de alcalóides indol-monoterpênicos

Nas Rubiaceas, 37 dos 500 gêneros que compõe esta família sintetizam

alcalóides. Dos 37 gêneros que produzem alcalóides, 22 sintetizam indol-

monoterpenos. Devido a sua importância terapêutica, estas substâncias são as mais

profundamente investigadas quanto à rota de formação. Este estudo tem sido feito

utilizando-se culturas de células de C. roseus em suspensão (BRUNETON, 1991).

O grupo de alcalóides derivados do triptofano é sem dúvida o grupo de

alcalóides de maior amplitude. Esse grupo começou a ser estudado com mais atenção

a partir do isolamento de reserpina, um composto anti-hipertensivo e tranqüilizante,

de Rauwolfia serpentina Benth. (Apocinaceae) e pelas propriedades antitumorais de

alcalóides isolados de C. roseus (BRUNETON, 1991).

Apesar do triptofano ser o precursor de quase todos os alcalóides

indólicos, raramente é o único; assim, segundo a natureza do fragmento que origina

o restante da molécula, os alcalóides se diferenciarão em β-carbolínicos, alcalóides

derivados do esere (eserina e fisostigmina), alcalóides derivados da ergolina e

alcalóides indol-monoterpênicos (BRUNETON, 1991).

Estes alcalóides, que incorporam em C

-C

uma unidade derivada do

geraniol, se limitam a oito famílias botânicas e quase todas as estruturas descritas

são analisadas a partir de três famílias de Gamopétalas: Apocinaceae, Loganiaceae e

Rubiaceae. Este grupo inclui alcalóides em que o reagrupamento tardio substitui o

núcleo quinoleínico no lugar do indólico (BRUNETON, 1991).

Esquematicamente pode-se agrupar a maioria dos alcalóides indólicos

conhecidos em quatro esqueletos base: corinanteano, estricnano, aspidospermano e

ibogano, sendo que os quatro derivam da estrictosidina. A partir desses quatro esqueletos

fundamentais se conhecem muitas dezenas de variações (BRUNETON, 1991).

Nas Rubiáceas, o secologanosídeo pode combinar-se com:

- duas moléculas de dopamina (DA) (ex.: emetina);

- uma molécula de dopamina e uma molécula de triptamina (ex.:

tubulosina);

- uma molécula de triptofano (ex.: alcalóides da Adina);

- duas moléculas de triptamina (ex.: roxburginas).

- uma molécula de triptamina, que é o caso mais comum. Neste caso

formam-se alcalóides do tipo Ia (ioimbanos, heteroioimbanos) como nas

Apocinaceas e nas Loganiaceas.

Conhecem-se mais de 1.000 alcalóides pertencentes às três famílias

acima citadas, e sua diversidade estrutural é assombrosa apesar de todos

apresentarem uma estreita afinidade biossintética (BRUNETON, 1991).

1.2.2 PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS

1.2.2.1 SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL

A maioria dos alcalóides indólicos derivados da triptamina e os β-

carbolínicos possuem propriedades alucinógenas e estão classificados dentro da

classe dos psicodislépticos. Um dos exemplos mais bem conhecidos é a bebida

conhecida como Ayahuasca preparada a partir de Banisteriopsis caapi Spr. ex

Briesb. (Malpighiaceae) juntamente com uma mistura de várias plantas, sendo a

mais conhecida Psychotria viridis Ruiz et Pavón (Rubiaceae). Os principais

componentes de B. caapi são alcalóides indólicos β-carbolínicos conhecidos como

harmina e harmalina, que são potentes inibidores da monoamino-oxidase A (MAO-

A). Como inibidores da MAO, os β-carbolínicos aumentam os níveis cerebrais de

serotonina e os efeitos sedativos obtidos com altas doses de β-carbolínicos podem

resultar do bloqueio da deaminação da serotonina (McKENNA, 2004). A ação

primária dos β-carbolínicos na bebida é a sua inibição da MAO periférica, a qual

protege a dimetiltriptamina – DMT (um dos compostos de P. viridis) da degradação

periférica, tornando-a ativa por via oral. Assim, os princípios ativos de uma planta

(β-carbolínicos) são utilizados para possibilitar a atividade oral dos princípios

psicoativos de outra planta (DMT) (McKENNA, 2004).

Substâncias β-carbolínicas exercem uma grande variedade de efeitos

neurofarmacológicos e biológicos. Além de serem inibidores competitivos, seletivos

e reversíveis da MAO-A; os β-carbolínicos inibem competitivamente a recaptação

de 5-HT, DA, adrenalina e noradrenalina em sinaptossomas, interferindo com a

biossíntese das aminas biogênicas. Além disso, esses compostos também possuem a

capacidade de ligarem-se a receptores benzodiazepínicos, provavelmente atuando

como agonistas inversos, produzindo crises epilépticas, as quais são revertidas por

diazepam (McKENNA et al., 2004).

Além dos alcalóides β-carbolínicos, outros alcalóides indólicos como

psilocina e psilocibina isolados de Psilocybe sp. também são alucinógenos

(BRUNETON, 1991).

Além disso, β-carbolinas são alcalóides indólicos tricíclicos que estão

intimamente relacionados com triptaminas, tanto biossintéticamente quanto

farmacologicamente (McKENNA et al., 2004). Para muitos autores, a maioria dos

compostos alucinógenos citados acima tem em comum uma relação estrutural com

serotonina e teriam um efeito de agonista competitivo sobre receptores específicos

para serotonina (BRUNETON, 1991).

Várias outras plantas possuem alcalóides indólicos que apresentam

ações farmacológicas sobre o SNC. Passiflora incarnata L. e Passiflora edulis L.

(Passifloraceae), nativa das áreas tropicais quentes da América, são exemplos de

plantas medicinais conhecidas por possuirem alcalóides indólicos como harmano,

harmina, harmalina, harmol e harmalol. Suas partes aéreas são tradicionalmente

utilizadas para o tratamento de ansiedade, insônia, dor e neuralgia (SOULIMANI et

al., 1997). Estudos comportamentais foram realizados, tanto em ratos como em

camundongos, utilizando extratos etanólico (P. edulis), aquoso e metanólico (P.

incarnata), demonstrando ação ansiolítica e sedativa. No entanto, parece que os

alcalóides indólicos, que tem por característica a inibição da MAO, ficam sendo

caracterizados como os principais constituintes bioativos, enquanto que os

flavonóides (como crisina) possuindo papel depressor sobre o SNC (DHAWAN et

al., 2004).

Outra planta que apresenta atividade no SNC é Tabernanthe iboga

Baillon (Apocinaceae). Preparações de raízes de iboga têm sido usadas há séculos

por nativos do Gabão (África), tanto na medicina tradicional quanto em rituais

religiosos, como estimulantes e afrodisíacos (GOUTAREL et al., 1993) e, durante

anos, foi comercializada na França como Lambèrene

, uma preparação indicada

como estimulante físico e mental. A partir das raízes deste arbusto africano, isolou-

se um alcalóide indólico psicoativo chamado ibogaína que apresenta suposta

atividade antiaditiva para várias drogas de abuso (psicoestimulantes, opióides). A

eficácia de ibogaína no tratamento da dependência de opióides e cocaína em

humanos foi confirmada em estudos pré-clínicos por pesquisadores americanos,

canadenses e holandeses (LOTSOF, 1995).

Na Nigéria, o alcalóide indólico alstonina é o componente principal de

um remédio preparado à base de plantas e tradicionalmente usado para tratar

transtornos mentais (COSTA-CAMPOS et al., 1999). Em diversos modelos

comportamentais em camundongos (catalepsia por haloperidol, letalidade por

anfetamina e estereotipia por anfetamina e apomorfina) a alstonina apresentou

propriedades antipsicóticas com perfil semelhante aos antipsicóticos atípicos

(clozapina e sulpiride) (COSTA-CAMPOS et al., 1998). Além disso, este alcalóide

também apresentou atividade ansiolítica em modelos comportamentais (BOURIN et

al., 2001; COSTA-CAMPOS et al., 2004).

A Rauwolfia serpentina é utilizada na medicina Ayurvédica no

tratamento de diarréias e como antitérmico. Também é utilizada nas picadas de

serpentes e no tratamento de transtornos mentais e epilepsias. Dentre os alcalóides

desta planta destacam-se a reserpina, a ajmalina e a ajmalicina, a alstonina e a

serpentina (BRUNETON, 1991).

A Reserpina é um anti-hipertensivo e neuroléptico. A sua atividade

deve-se a depleção de noradrenalina nas fibras simpáticas pós-ganglionares do SNA

e SNC e a inibição da recaptação desse neurotransmissor. Ajmalicina é um

alcalóide que pode ser extraído de várias espécies do gênero Catharanthus, podendo

ser utilizada sozinha ou em associação com outras drogas para o tratamento de

distúrbios comportamentais, psíquicos e vasculares cerebrais (BRUNETON, 1991).

Algumas espécies do gênero Strychnos como Nux vomica ou Strychnos

nux-vomica L. (Loganiaceae) contém estricnina, um potente estimulante do sistema

nervoso central e convulsivante, que estimula os centros respiratórios e

cardiovasculares, provocando hipertensão e bradicardia (BRUNETON, 1991).

1.2.2.2 COMO ANALGÉSICOS E ANTIINFLAMATÓRIOS

Outras plantas contendo alcalóides indólicos e utilizadas

tradicionalmente como analgésicos e/ou antiinflamatório incluem a Uncaria

tomentosa (Willd.) DC. (Rubiaceae), a Mitragyna speciosa Korth (Rubiaceae) e o

Gelsemium sempervirens L. (Loganiaceae).

A Uncaria tomentosa, comumente conhecida como “unha-de-gato”, é

uma planta medicinal da floresta amazônica muito utilizada por indígenas para o

tratamento de inflamação crônica, incluindo artrite (PISCOYA et al., 2001). No

Peru, sua casca tem sido tradicionalmente usada no tratamento de várias doenças,

como infecções virais, câncer, úlceras gástricas, artrite e outros distúrbios

inflamatórios (AGUILAR et al., 2002). As ações farmacológicas da “unha-de-gato”

incluem propriedades antioxidantes, atividade anti-inflamatória, imunomoduladora,

citoprotetora, propriedades antimutagênicas e efeito anti-hipertensivo, bem como na

prevenção de isquemia cerebral (WILLIAMS, 2001).

A Mitragyna speciosa é utilizada popularmente na tradição Thai como

analgésico. A Mitraginina, seu principal alcalóide, bem como seus derivados

sintéticos, exibem atividade analgésica mediada por receptores opióides, com a

participação dos receptores µ, δ e κ (TAKAYAMA et al., 2002).

A tintura de Gelsemium sempervirens, por sua vez, é utilizada como

analgésica e antiespasmódica. Essa tintura contém o alcalóide indol-monoterpênico

conhecido como sempervirina. O extrato dessa planta também é associado ao de

Valeriana sp. para o tratamento de “angústia e palpitações” (BRUNETON, 1991).

1.2.2.3 NO TRATAMENTO DE CÂNCER

Apesar de todas as interessantes atividades farmacológicas acima

relatadas, sem dúvida um dos maiores impactos de fármacos derivados de plantas foi

provavelmente na área antitumoral, onde alcalóides indólicos, como vinblastina e

vincristina isolados de C. roseus e seus derivados sintéticos, são hoje utilizados no

tratamento de diversos tipos de câncer, melhorando dramaticamente a eficácia da

quimioterapia (RASKIN et al., 2002).

1.2.3.4 COMO ANTIOXIDANTES E NEUROPROTETORES

Além de atividade antitumoral, outros estudos demonstraram que a

produção de alcalóides em culturas celulares de C. roseus apresentaram atividade

antioxidante (LEMÉNAGER et al., 2004).

Os compostos indólicos também interferem com as espécies reativas

de oxigênio criando um grupo farmacológico e químico distinto (STOLC, 1999).

Assim, a vincamina, outro alcalóide indólico isolado de C. roseus é

utilizado no tratamento de acidentes vasculares cerebrais e traumatismos cranianos

devido ao aumento do fluxo sanguíneo cerebral (BRUNETON, 1991).

A Vinpocetina, um derivado sintético da vincamina, originalmente

descrita como um vasodilatador cerebral, possui um efeito neuroprotetor em vários

modelos experimentais, reduzindo a lesão neuronal que ocorre em condições de

hipóxia ou isquemia. Este composto reduz em leitos cerebrais a viscosidade do

sangue e a agregação plaquetária. Além disso, a vinpocetina apresenta efeitos

protetores em relação à morte celular induzida por várias excitotoxinas e inibe a

citotoxicidade do glutamato em neurônios cerebrocorticais, além de possuir

propriedades anticonvulsivantes importantes (PEREIRA et al., 2003). Sua ação

protetora está relacionada com a inibição de canais de Na

voltagem-dependentes e

com a inibição indireta dos processos moleculares iniciados pelo aumento dos

níveis de Ca

intracelular (TRETTER; ADAM-VIZI, 1998). Além disso,

demonstrou-se que a vinpocetina atenua a resposta ao NMDA em oócitos, reduz a

ligação do AMPA a membranas corticais, inibe a liberação de acetilcolina

estimulada por aminoácidos excitatórios e protege os neurônios cerebrocorticais da

excitotoxicidade (KANEKO et al., 1991).

A Vinpocetina atenua a toxicidade induzida pelos peptídeos sintéticos

da proteína β-amilóide em linhagens celulares, mantendo a capacidade redutora

celular e protegendo da acumulação de espécies reativas de oxigênio. Esta atividade

protetora da vinpocetina em relação à toxicidade induzida pelos peptídeos da β-

amilóide parece resultar da sua capacidade antioxidante capaz de neutralizar radicais

livres e a peroxidação lipídica (PEREIRA et al., 2003). A Stobadina, outro

composto indólico sintético (composto β- carbolínico), possui pronunciadas ações

antioxidantes ou seqüestradoras de radicais

(

STOLC

, 1999).

Os fármacos antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) como

indometacina e etadolaco são derivados indólicos e tem similaridade estrutural com

os derivados indólicos endógenos como melatonina, serotonina, triptamina e

triptofano. Estes compostos bloqueiam a síntese de prostaglandinas por inibição não

seletiva da ciclooxigenase 1 e 2 (COX-1 e COX-2). No entanto, tem sido sugerido

que a atividade antiinflamatória dos AINES possa ser parcialmente devido a sua

habilidade de seqüestrar espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sendo que este

efeito antioxidante também foi observado com vários outros derivados indólicos

sintéticos (FERNANDES et al., 2004).

Vários outros alcalóides indólicos economicamente importantes,

usados diretamente ou como precursores de medicamentos pela indústria

farmacêutica, podem ser vistos na tabela 1.

Tabela 1: Alcalóides indólicos economicamente importantes para a indústria

farmacêutica e seus usos terapêuticos:

Alcalóides Fonte Uso(s) terapêutico(s) Referência(s)

Camptotencina

Camptotheca

acuminata Decne

(Nyssaceae)

Antineoplásico

Siram, et al.,

2005

Fisostigmina

Physostigma

venenosum Balfor

(Fabaceae)

Colinérgico

Zhao, et al., 2004

Reserpina

Rauwolfia serpentina L.

(Apocinaceae)

Anti-hipertensivo,

psicotrópico

Brunetton, 1991

Yoimbina

Pausinystalia yoimbe

K. (Rubiaceae)

Afrodisíaco Brunetton, 1991

Vimblasatina e

Vincristina

Catharantus roseus L.

Don (Apocinaceae)

Antineoplásico

Raskin, et al.,

2002

Ibogaína

Tabernanthe iboga

Antiaditivo Lotsof, 1995

Assim, pode-se observar que os compostos indólicos são encontrados

em uma grande variedade de plantas e utilizados pela população para uma grande

variedade de objetivos. Muitos deles encontrando-se em uso clínico e outros estão

sendo pesquisados para o tratamento de diversas patologias.

1.3 O GÊNERO Psychotria

A subfamília Rubioideae é distribuída em 15 tribos, sendo que a

Psychotrieae é a maior delas, com aproximadamente 50 gêneros e ampla

distribuição em toda a zona tropical (LIBOT et al., 1987). A tribo Psychotriae faz

parte de ecossistemas de todos os tipos de matas do Rio Grande do Sul,

principalmente de matas tropicais, e está representada por espécies de hábito

predominantemente arbustivo e, menos freqüentemente, por espécies de hábito

arbóreo e herbáceo (SMITH; DOWNS, 1956).

Pertencente à tribo Psychotrieae, o gênero Psychotria tem 1400

espécies descritas (WITHERUP et al., 1994), das quais possivelmente 800 são

válidas. A classificação do gênero é difícil e não há certezas em relação aos limites

genéricos. O gênero Psychotria está estreitamente relacionado ao gênero

Palicourea, com o qual muitas das espécies têm sido unidas. Também apresenta

grande analogia com Calycodendron e Calycosia (LOPES, 1998). A maior

controvérsia é encontrada quanto à distinção entre os gêneros Cephaelis e

Psychotria. Alguns autores como ROBBRECHT (1988) separam estes dois

gêneros, enquanto que outros como TAYLOR (1997) não encontram evidências

suficientes para considerar Cephaelis como gênero distinto. TAYLOR (1997)

inclui a maior parte das espécies antes consideradas Cephaelis em Psychotria,

algumas em Palicourea, e raras em Faramea, Rudgea, Geophila, Ixora e

Pagamea. O gênero Cephaelis (sensu ROBBRECHT, 1988) produz alcalóides

tetraidroisoquinolino-monoterpênicos, cujo aminoácido de origem é a tirosina,

sendo o único gênero da tribo Psychotriae a sintetizar este tipo de alcalóide

(HEMINGWAY; PHILLIPSON, 1980).

O gênero Psychotria é constituído de dois subgêneros principais:

Psychotria e Heteropsychotria, os quais têm sido combinados, pois a diferenciação

das numerosas espécies é difícil. Em Cephaelis ocorre a formação de alcalóides

isoquinolínicos do tipo emetina; no entanto, os alcalóides característicos da tribo

Psychotrieae são os poli-indolínicos não iridóidicos, os quais não foram

encontrados no subgênero Heteropsychotria. A partir destas observações,

consideram-se que os alcalóides poderão mostrar-se úteis como marcadores

quimiotaxonômicos (LOPES, 1998).

O gênero Psychotria é conhecido pela presença de alcalóides cujo

aminoácido de origem é o triptofano. Estes são, na maior parte, indol não-

iridóidicos, com destaque no grupo dos triptamínicos (NN-dimetiltriptamina, N-

metiltriptamina), poli-indólicos (chimonantina, meso-chimonantina, hodgkinsina,

psicotridina, iso-psicotridina A, B e C, quadrigemina A, B e C) ou derivados metil-

triptamínicos e β-carbolinas (tetraidro-β-carbolina) (RIVIER; LINDGREN, 1972;

HEMINGWAY; PHILIPSON, 1980), não havendo relação com monoterpenos.

Uma exceção é a espécie Psychotria correae (Dwyer & MV Hayden) & CM

Taylor que produz alcalóides indol-iridóidicos, derivados da estrictosidina.

Igualmente, a espécie P. leiocarpa Cham. et Schlecht produz N, β-D-

glicopiranosilvincosamida, um alcalóide indol-iridóidico, N-glicosilado (VAN DE

SANTOS, 1999).

No outro gênero estreitamente relacionado, Palicourea, além de

alcalóides polindólicos isolados em P. fendleri Standl., P. domingensis Jacq. e P.

alpina Sw. também foram encontrados alcalóides indol-monoterpênicos tipo

estrictosidina em P. alpina e P. marcgravii Muell. Arg., todos derivados do

triptofano (KERBER, 1999). As espécies de Palicourea apresentam alcalóides

polipirrolidinoindólicos e derivados da estrictosidina, sendo todos esses

biossintetizados a partir do aminoácido triptofano (VAN DE SANTOS, 1999).

Para algumas espécies, tais como a P. granadensis Benth e P.

tomentosa (Aubl.) Müll. Arg. , foi relatada a presença de emetina (WILLAMAN;

SCHUBERT, 1961), o que indica um grupo com características comuns. Por outro

lado, P. correae (Cephaelis correae sensu ROBBRECHT, 1988) e Cephaelis

dichroa (Psychotria dichroa Standl., sensu TAYLOR, 1997) aparentam possuir

uma maior proximidade com Palicourea pela produção de alcalóides tipo indol-

monoterpêno.

Um estudo sistemático mais aprofundado das espécies de Psychotria,

Palicourea e Cephaelis, considerando características anatomo-fisiológicas

acompanhadas de dados químicos, especialmente a produção de alcalóides, poderia

eventualmente eliminar as exceções encontradas e contribuir para uma melhor

definição taxonômica dos gêneros da tribo Psychotriae (KERBER, 1999).

Em um estudo taxonômico da tribo Psychotrieae no Estado do Rio

Grande do Sul, DILLENBURG e PORTO (1985) constataram a presença de dez

espécies do gênero Psychotria: P. carthagenensis Jacq., P. birotula Smith &

Downs mut. char., P. myriantha Müll. Arg., P. leiocarpa Cham. et Schlecht., P.

nitidula Cham. et Schlecht., P. brachyceras Müll. Arg., P. tenerior (Cham.) Mull.

Arg., P. brachypoda (Mull. Arg.) Britton, P. kleinni Smith & Downs e P. suterella

Mull. Arg. Ocorrem no interior das matas fazendo parte do estrato inferior das

florestas, apresentam o caráter esciófito e seletivo-hignófito, ou seja, ocorrem em

locais sombreados e preferem solos relativamente úmidos.

A revisão sobre a química destes gêneros mostrou uma certa

variedade de substâncias, predominando os alcalóides, em especial do tipo

polindólico, indol-monoterpenos e tetraidroisoquinolinomonoterpenos.

Os estudos etnofarmacológicos abrangem 10% das espécies de

Psychotria conhecidas e foram realizados com plantas de diferentes origens

geográficas, mostrando que elas são utilizadas na medicina tradicional para uma

grande variedade de indicações terapêuticas (ADJIBADÉ, 1989; LEAL;

ELISABETSKY, 1996b). Os mais freqüentes usos internos referem-se a afecções

do aparelho reprodutor feminino, além do emprego como auxiliar no pré- e pós-

parto, doenças dos brônquios e distúrbios gastrintestinais. Quanto ao uso externo,

têm sido relatado usos em afecções cutâneas, "tumores", úlceras, distúrbios

oculares, como cataplasmas e banhos no tratamento de febre e em casos de dores

de cabeça e dores de ouvido (ADJIBADÉ, 1989; LAGIS et al., 1993; PERRY,

1980). Não parecem existir padrões de indicações terapêuticas regionais, exceto

quanto a Psychotria da América do Sul, usada como aditivo a bebidas

alucinógenas (LEAL, 1994).

A presença de alcalóides e outras substâncias bioativas no gênero

Psychotria têm despertado grande interesse. No Brasil, principalmente, a pesquisa

desse gênero foi motivada pelo uso de duas espécies, P. viridis e P.

carthagenensis, junto com o decocto de B. caapi, na preparação do daime, uma

bebida alucinógena, utilizada para fins religiosos e medicinal pelos caboclos da

Amazônia (McKENNA et al., 1984; LIWSYZ et al., 1992).

A análise de P. viridis, permitiu caracterizar a dimetil-triptamina e

traços de metil-triptamina (RIVIER; LINGREEN, 1972). Curiosamente, folhas de

P. carthagenensis não apresentaram alcalóides, sugerindo que a sua atividade na

bebida (daime) seja devida a outras substâncias não identificadas (LEAL;

ELISABETSKY, 1996a), ou que houve problemas na identificação feita na década

de 70.

A Psychotria colorata (Willd., ex R & S) Müell. Arg. (VEROTTA et

al., 1998) é tradicionalmente usada como analgésica por caboclos da Amazônia

(ELISABETSKY; CASTILHOS, 1990; ELISABETSKY et al., 1995). Extratos da

espécie foram avaliados em testes comportamentais (testes nociceptivos térmicos e

não-térmicos), e o extrato alcaloídico das flores demonstrou atividade analgésica

dose-dependente e reversível por naloxona. Mostrou-se dessa forma que há uma

base racional para o uso de P. colorata como um analgésico caseiro

(ELISABETSKY et al., 1995).

Investigações fitoquímicas realizadas com o extrato alcaloídico de

folhas e flores de P. colorata levaram à identificação de isocalicantina, calicantina,

quadrigemina C e 3a(R), 3a’(R)-dideidroisocalicantina, quimonantina, hodgkinsina

e psicotridina (ELISABETSKY et al., 1997; VEROTTA et al., 1998). Estudos in

vivo (placa quente e retirada da cauda ao estímulo térmico) e in vitro (binding)

demonstraram que hodgkinsina apresenta atividade analgésica com duplo

mecanismo de ação: a ativação de receptores opiáceos e o antagonismo de

receptores glutamatérgicos N- Metil-D-Aspartato (NMDA) (AMADOR et al.,

2000). A psicotridina, também mostrou atividade analgésica, porém envolvendo

apenas os receptores glutamatérgicos

NMDA (AMADOR et al., 2001). Esses

dados justificaram a continuidade da busca por novos compostos analgésicos em

espécies de Psychotria, numa abordagem que associa a etnofarmacologia com a

quimiotaxonomia (ELISABETSKY et al, 1997).

Outras espécies de Psychotria nativas do Estado do Rio Grande do

Sul (P. leiocarpa, P. myriantha, P. suterella, P. brachyceras, P. umbellata Vell. e

P. carthagenensis) foram investigadas quanto a toxicidade e ao efeito analgésico

(extratos etanólicos) em camundongos. Na avaliação da analgesia, por retirada da

cauda ao estímulo térmico, o extrato de P. umbellata foi o único a apresentar

atividade dose-dependente e reversível por naloxona (LEAL, 1994; LEAL;

ELISABETSKY, 1996b).

1.3.1 Psychotria umbellata (Vell.)

Psychotria umbellata Vell. é o nome correto para as espécies

referidas na literatura como Palicourea brachypoda (Muell. Arg.) Smith et Downs

(SMITH; DOWNS, 1956) ou Psychotria brachypoda (Muell. Arg.) Britton

(DILLENBURG; PORTO, 1985). A espécie é um arbusto, 1-3 m de altura,

crescendo no interior de florestas tropicais e subtropicais do Brasil (SMITH;

DOWNS, 1956). Estende-se de Minas Gerais até o Rio Grande do Sul, onde ela é

restrita à região costal mais ao norte, no limite sul da chamada Floresta Tropical

Atlântica (DILLENBURG; PORTO, 1985). Segundo os botânicos Marcos Sobral

(Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRGS) e Gert

Hatschbach (Museu Botânico Municipal de Curitiba – PR) esta espécie muitas

vezes é descrita como Palicourea umbellata sendo considerada limítrofe entre os

gêneros.

As substâncias isoladas de P. umbellata apresentam padrão de

espectro RMN do

H típicos para alcalóides indol-monoterpênicos. No entanto, os

alcalóides encontrados em P. umbellata não apresentam a característica vinila

terminal; em seu lugar, apresentam uma dupla ligação interna a um anel pentânico,

sugerindo a condensação de um iridóide do tipo geniposídeo com a triptamina,

resultando no isolamento da substância inédita denominada psicolatina, encontrada

majoritariamente nas folhas secas (~ 1,3% m/m) (KERBER, 1999).

Além de psicolatina (Figura 4), também foram isolados outros três

alcalóides, porém em bem menor quantidade: 3,4-deidro-18,19-β-epoxi-15,20-epi-

umbelatina (0,024% m/m da planta seca), N –[1-(2-α-hidroxipropil)]-umbelatina

(0,043% m/m da planta seca) e N –[1-(2-β-hidroxipropil)]-umbelatina (0,029%

m/m da planta seca).

OGlu

COOC

Figura 4: Estrutura molecular de psicolatina

1.4 TRANSTORNOS MENTAIS

Os Transtornos Mentais, alguns referidos como Doenças ou Distúrbios

Mentais, abrangem todos os tipos de doenças que afetam a mente. Alterações do

pensamento (em sua forma, velocidade, conteúdo, etc), delírios, alucinações,

alterações do humor, com depressão, euforia ou irritabilidade, liberação de

agressividade, incapacidade de execução de tarefas cotidianas e, principalmente, a

não-percepção da sua própria doença são as principais manifestações dos transtornos

mentais (GARFIELD, 2003). Essas manifestações podem ocorrer de forma súbita ou

lenta, ocasionalmente acompanhadas de alterações motoras, como incoordenação

dos movimentos dos olhos ou dos membros.

Podem ser classificados como Transtornos Mentais a esquizofrenia, a

depressão, transtornos de ansiedade e os transtornos relacionados ao uso de

substâncias psicoativas. Os transtornos mentais podem ser gerados por alterações

genéticas, pressões ambientais, desequilíbrios bioquímicos, intoxicações, infecções

ou, geralmente, por combinação desses fatores. O levantamento da Organização

Mundial da Saúde (OMS) acentua o peso da pobreza, expressa por meio do

desemprego, do baixo nível de educação e de privações de toda a ordem, como

outros fatores. Porém, qualquer estresse externo intenso, como guerras, ou ligados às

condições de trabalho, como tensão, angústia, competitividade ou rejeição, quando

excessivas e duradouras favorecem o surgimento dos distúrbios mentais

(ALARCON; AGUILAR-GAXIOLA, 2000; DEMYTTENAERE et al., 2004).

A incidência destas doenças é bastante alta no mundo, incluindo o

Brasil (GOLDBERG; LECRUBIER, 1995). Os transtornos mentais afetam homens

e mulheres de várias idades, ricos e pobres, áreas urbanas ou rurais, e a idéia de que

distúrbios mentais são problemas restritos a áreas industrializadas e relativamente

ricas é bastante equivocada (PATEL; KLEINMAN, 2003).

Recentes dados da OMS mostram que condições neuropsiquiátricas

que abrangem alguns distúrbios mentais têm uma prevalência global de cerca de

12% dos adultos (OMS, 2001). Estima-se que 450 milhões de pessoas no mundo

sofram de afecções neuropsiquiátricas. Quando se consideram todos os transtornos

incluídos na Classificação Estatística Internacional de Doenças e Problemas

Correlatos de Saúde da OMS (CID-10), as taxas de prevalência são ainda maiores:

pesquisas mostram que mais de 25% da população, tanto de países desenvolvidos

como em desenvolvimento, apresentam um ou mais transtornos mentais e

comportamentais (REGIER et al. 2002; WELLS et al. 1989; ALMEIDA FILHO et

al. 1997), sendo que a prevalência geral de Transtornos Mentais é,

aproximadamente, a mesma no sexo masculino e no feminino.

Na América Latina um dos maiores problemas é a falta de acesso a

medicamentos ou a tratamentos, mais do que a prevalência elevada dos distúrbios

psiquiátricos (DEMYTTENAERE et al., 2004). Os dados sobre o Brasil ainda são

incompletos, porém sugerem que a prevalência de problemas psiquiátricos deve

situar-se mais próxima dos 26% dos Estados Unidos do que dos 8,8% do Japão

(ANDRADE et al., 2003).

Estudos apontam que a maior barreira ao tratamento não é a

perspectiva de discriminação, mas sim os custos dos medicamentos, consultas e

exames ou da locomoção até os centros de atendimento médico. No Brasil, que tem

na depressão o distúrbio mental mais comum, sendo metade dos casos crônicos, os

custos com medicamentos tornam-se um empecilho ao tratamento (WANG et al.,

2003, 2004; DE ALMEIDA-FLECK et al., 2005).

1.4.1 ANSIEDADE: BASES NEURAIS, FARMACOTERAPIA E MODELOS

COMPORTAMENTAIS

Ansiedade é um dos distúrbios psiquiátricos mais comuns e custa aos

Estados Unidos mais que a depressão. Os distúrbios de ansiedade mais prevalentes

são o distúrbio de ansiedade generalizada, o transtorno obsessivo-compulsivo, o

distúrbio de estresse pós-traumático, o de ansiedade social, as fobias e ataques de

pânico. No entanto, menos de um terço da população recebe tratamento adequado,

e 43% das pessoas com distúrbios de ansiedade também são depressivas ou fazem

uso de algum tipo de droga de abuso (JONES; BLACKBURN, 2002). Além disso,

os agentes ansiolíticos estão entre as substâncias prescritas com maior freqüência e

utilizadas regularmente por mais de 10% da população na maioria dos países

desenvolvidos (RANG et al., 2001).

Os medicamentos comumente utilizados para tratar a ansiedade

incluem benzodiazepínicos ou antidepressivos que atuam e/ou modulam a

atividade do ácido-gama-amino-butírico (GABA), da serotonina (5-HT) e/ou

antagonistas dos receptores β-adrenérgicos (BENEYTEZ, et al., 1998).

Os benzodiazepínicos, atuando através da modulação positiva dos

receptores GABA

e facilitando a abertura dos canais de cloreto,

têm sua eficácia

estabelecida no tratamento da ansiedade e da insônia. Embora relativamente

seguros no tratamento de ansiedade patológica, os benzodiazepínicos possuem um

número considerável de efeitos colaterais que incluem sedação, ataxia,

relaxamento muscular, perda de memória, potenciação dos efeitos do álcool e

barbitúricos e desenvolvimento de tolerância e dependência, além de um

significativo potencial para o abuso (KELLEY et al., 2003, GRIEBEL et al.,

1997).

Além das vias do GABA, muitos outros transmissores e

moduladores foram implicados na ansiedade e nos distúrbios do pânico,

particularmente a serotonina. A serotonina tem sido implicada em vários

distúrbios psiquiátricos e neurológicos, incluindo ansiedade (BENEYTEZ, et al.,

1998). Ao longo dos anos o efeito ansiolítico de fármacos que atuam em

receptores serotonérgicos 5-HT

, 5-HT

tem sido revelado tanto em

modelos comportamentais condicionados, quanto em modelos etológicos

(BOURIN et al., 2001). A buspirona, um potente agonista nos receptores 5-HT

usada no tratamento de ansiedade crônica, não causa sedação e possui pouco

potencial para abuso. No entanto, sua eficácia tem sido questionada, além de ser

ineficaz no controle dos episódios de pânico (BENEYTEZ, et al., 1998).

Além dos agonistas 5-HT

, os fármacos que atuam sobre outros

receptores de serotonina também podem ser úteis como agentes ansiolíticos. Os

inibidores da recaptação de 5-HT, como a fluoxetina, bem como os inibidores

mistos da captação de 5-HT/noradrenalina, que são utilizados principalmente como

agentes antidepressivos, também são eficazes em alguns distúrbios de ansiedade,

bem como nos episódios de pânico (RANG et al., 2001).

Os antagonistas dos receptores β-adrenérgicos, como o propranolol,

são utilizados no tratamento de algumas formas de ansiedade, particularmente

quando os sintomas físicos são incômodos, como sudorese, tremor e taquicardia.

Entretanto, sua eficácia depende mais do bloqueio das respostas simpáticas

periféricas do que de qualquer efeito central (RANG et al., 2001).

Em animais, medo e aversão resultam em inibição comportamental,

que ocorre em resposta a acontecimentos ambientais que são novos (RANG et al.,

2001). Essa inibição comportamental pode assumir a forma de imobilidade. Para

avaliar a ansiedade em roedores, em geral os animais são expostos a condições

ansiogênicas: ambiente novo (labirinto em cruz elevado, interação social, campo

aberto, placa perfurada, claro-escuro) ou situações de conflito (teste de punição de

Vogel) (MALMBERG-AIELLO et al., 2002). Tais procedimentos tem sido usados

para estudar as propriedades ansiolíticas de uma grande variedade de compostos,

especialmente benzodiazepínicos.

A novidade de uma situação desconhecida pode provocar ansiedade

e/ou medo. Tais estados podem ser avaliados pela intensidade de

comportamentos em camundongos em uma área desconhecida, quantidade de

consumo de comida desconhecida ou pela interação social com animais estranhos

(HASCÖET; BOURIN, 1998).

O teste da placa perfurada (hole-board model) tem sido usado para

avaliar as propriedades ansiolíticas/ansiogênicas de fármacos (TAKEDA et al.,

1998). Este modelo tem a vantagem de permitir medir concomitantemente

atividade exploratória (número de espreitamentos) e atividade locomotora, sendo

útil para avaliar efeitos sedativos (FILE; PELLOW, 1985; TAKEDA et al., 1998).

O teste de claro-escuro (light/dark test) é baseado no conflito entre a

tendência natural dos camundongos de explorar um novo ambiente e a aversão dos

roedores por espaços muito iluminados. Neste modelo, cinco parâmetros são

avaliados para acessar o perfil ansiolítico de novos fármacos: a latência para o

primeiro cruzamento do compartimento claro para o escuro, o número de

cruzamentos entre os dois compartimentos (exploração), movimento dentro de

cada compartimento, o tempo de permanência no lado claro ou escuro e o número

de levantamentos (rearing) (LEPICARD et al., 2000). A administração de

fármacos ansiolíticos leva a um aumento do tempo de permanência na área clara,

aumento do número de levantamentos e cruzamentos, e um aumento na latência do

primeiro cruzamento do claro para o escuro (GARD et al., 2001). O número de

cruzamentos entre os dois compartimentos é o parâmetro mais controverso, a

latência para o primeiro cruzamento, muitas vezes é difícil de avaliar, porém o

tempo de permanência no compartimento claro parece ser o melhor parâmetro para

avaliar as propriedades ansiolíticas (HASCÖET; BOURIN, 1998). O teste de

claro-escuro tem se mostrado extremamente útil para avaliar uma série de

compostos ansiolíticos, incluíndo esteróides neuroativos (GARD et al., 2001), e

ligantes de receptor 5-HT

(GRIEBEL et al., 1997).

1.4.2 DEPRESSÃO: BASES NEURAIS, FARMACOTERAPIA E MODELOS

COMPORTAMENTAIS

O estudo de medicamentos antidepressivos possui uma enorme

relevância uma vez que os distúrbios depressivos são doenças psiquiátricas

heterogêneas, acompanhadas de muitos problemas físicos, mentais e emocionais, e

possuem alta prevalência na comunidade geral. Supõe-se que cerca de 6% da

população encontra-se em um estado de depressão (prevalência do momento), e

aproximadamente 10 % da população desenvolverá a depressão ao longo da vida

(prevalência ao longo da vida). Ocorre prevalentemente entre os 30 e 60 anos,

principalmente em mulheres e estima-se que apenas um quarto dos deprimidos

procurará ajuda médica de pessoal especializado (HOLLISTER, 1994;

KOROLKOVAS, 1994; FRY, 1987; ZANINI; OGA, 1985).

A diferenciação entre os sintomas que configuram um quadro

patológico depressivo muitas vezes é difícil de ser realizada. As características

individuais variam muito de paciente para paciente, tornando difícil o diagnóstico.

É necessário primariamente separar um distúrbio depressivo (patológico) da reação

de tristeza normal do indivíduo a algum fator desencadeante "corriqueiro" da vida,

como a perda de um ente querido, uma separação, a perda de emprego, etc. Essa

"depressão" será auto-limitada, e com o tempo, a ajuda de familiares a amigos, será

superada e involuirá (ZANINI; OGA, 1985).

Antidepressivos são fármacos intensamente utilizados na terapêutica,

e possuem um amplo espectro de aplicações clínicas. São usados como

tranqüilizantes, na profilaxia de dor crônica, na síndrome do pânico, na bulimia

nervosa, no distúrbio obsessivo-compulsivo e, principalmente, nos tratamentos dos

distúrbios depressivos (COQUOZ et al., 1991; DOMINGUEZ, 1992).

O tratamento farmacológico com antidepressivos tem por objetivo

melhorar o humor dos pacientes deprimidos, assim como seus estados mentais.

Eles diminuem a intensidade dos sintomas depressivos e aceleram a velocidade de

normalização do paciente (KOROLKOVAS, 1994).

A categoria de fármacos utilizada como antidepressivos engloba os

chamados antidepressivos "clássicos", que são os Tricíclicos (TCAs) e os

Inibidores da Monoaminoxidase (IMAOs), e os chamados antidepressivos

"atípicos" ou os de "segunda geração", que são os Inibidores Seletivos da

Recaptação da Serotonina (ISRSs) e outros fármacos heterogêneos

(KOROLKOVAS, 1994).

As bases neuroquímicas que explicam os distúrbios depressivos não

estão totalmente elucidadas. Várias teorias foram propostas baseadas nos

mecanismos de ação dos antidepressivos, sendo que a hipótese catecolaminérgica

postulava que um déficit de noradrenalina (NA) no SNC era o responsável pela

depressão; assim, a ação dos antidepressivos estaria relacionada à capacidade de

aumentar a oferta de NA na fenda sináptica, por diminuição da recaptação

(antidepressivos tricíclicos) ou por inibição da degradação (IMAOs). Entretanto,

essa teoria foi contestada com base em várias observações. Alguns fármacos são

potentes bloqueadores da recaptação de NA (como a cocaína e anfetaminas),

porém não são antidepressivos eficazes. Além disso, a inibição da recaptação da

NA ocorre algumas horas após a ingestão dos antidepressivos, porém a resposta

terapêutica leva semanas para começar (GRAEFF, 1989; KETY, 1970; MORENO;

MORENO, 1995; ORLAND; SALTMAN, 1989; ROTH, 1995).

Enquanto os pesquisadores norte-americanos defendiam a hipótese

noradrenérgica, os europeus atribuíam as doenças afetivas a distúrbios

serotonérgicos. A hipótese das indolaminas postulava que um déficit funcional no

neurotransmissor 5-HT produziria sintomas depressivos, e que os antidepressivos

agiriam aumentando a atividade da serotonina através da inibição da recaptação da

mesma. Essa hipótese foi também contestada com as mesmas bases que a

noradrenérgica (GRAEFF, 1989; MORENO; MORENO, 1995; ORLAND;

SALTMAN, 1989; ROTH, 1995).

Nos últimos anos, os pesquisadores chegaram ao consenso de que a

depressão é um distúrbio heterogêneo, caracterizado por um complexo número de

alterações em vários sistemas de receptores e neurotransmissores do SNC. Tal

conclusão tem resultado em inúmeras hipóteses sobre a sensibilidade dos

receptores, que sugerem que o tratamento com antidepressivos, a longo prazo,

pode reduzir a sensibilidade de certos receptores (β

ou α

-adrenérgicos e 5-HT)

ou aumentar a sensibilidade de outros receptores (5-HT

) e estas alterações

podem estar relacionadas aos mecanismos de ação e aos efeitos terapêuticos dos

tratamentos com antidepressivos. Especificamente essas mudanças no SNC

parecem consistir em alterações pré-sinápticas na síntese, liberação, metabolismo e

ou captação de neurotransmissores, bem como nos receptores pós-sinápticos,

transdução (proteína G), segundos mensageiros (ciclases e sistema

fosfatidilinositol) e ou irregularidades no transporte de íons. Disfunções em outros

sistemas neurohumorais (dopamina, acetilcolina, neuropeptídeos) também são

apontados como responsáveis pela gênese dos distúrbios depressivos (GRAEFF,

1989; LEONARD, 1992; MORENO; MORENO, 1995; ORLAND; SALTMAN,

1989; ROTH, 1995).

Sabe-se que as ações farmacológicas dos tricíclicos vão além da

inibição da recaptação da NA e da 5-HT. Eles provocam também efeitos adversos

relacionados a inibição dos receptores α-adrenérgicos (o que causa hipotensão

postural, alterações do eletroencefalograma), inibição dos receptores muscarínicos

de acetilcolina (o que provoca efeitos anticolinérgicos como boca seca, alterações

de acomodação visual, retenção urinária, diminuição do peristaltismo e

taquicardia). A sedação, que era atribuída somente a efeitos serotonérgicos e

anticolinérgicos, também pode ser atribuída às ações anti-histamínicas (H

) dos

tricíclicos. Uma explicação para a afinidade a esses receptores seria a semelhança

estrutural dos tricíclicos com os antipsicóticos fenotiazínicos. No entanto, eles não

bloqueiam os receptores de dopamina, não causando sintomas extra-piramidais

(GRAEFF, 1989; HOLLISTER, 1994; KOROLKOVAS, 1994; SCHATZBERG;

COLE, 1993). Esses compostos vieram substituir os inibidores da

monoaminoxidase com sucesso, principalmente devido a menor toxicidade e maior

segurança em relação a esses (BALDESSARINI, 1996; HOLLISTER, 1994).

Devido aos efeitos colaterais indesejáveis dos antidepressivos

clássicos acima mencionados, foram desenvolvidas pesquisas a fim de encontrar

medicamentos mais efetivos e eficazes para o tratamento da depressão. No final da

década de 1980, foi lançada há 30 anos pelo laboratório Eli Lilly, a fluoxetina

(Prozac®), um novo fármaco que prometia as vantagens esperadas. A categoria de

fármacos antidepressivos foi então ampliada assustadoramente com a introdução

na terapêutica de vários compostos novos nos últimos anos. Designou-se os

mesmos como sendo antidepressivos "atípicos", que englobam fármacos com uma

maior seletividade de ação em um determinado sistema, os Inibidores Seletivos da

Recaptação da Serotonina (ISRSs), cujos principais exemplos são sertralina,

fluoxetina, fluvoxamina, paroxetina e citalopram, e outros, que são fármacos

heterogêneos quanto aos mecanismos de ação e também em relação às suas

estruturas, como mianserina, maprotilina, amoxapina, tradozona e bupropiona

(CHETLEY, 1994; LEONARD, 1992).

Os ISRSs são pouco tóxicos em sobredosagens, e estas, quando

ocorrem, dificilmente levam à letalidade, causando como sintomas principais,

tremores, tonturas, náuseas, dores abdominais e bradicardia (CHETLEY, 1994;

WILDE, 1993). Os principais efeitos colaterais relatados para os ISRSs estão

relacionados às conseqüências causadas pelo aumento nos níveis de 5-HT, cujos

principais constam de distúrbios gastrintestinais, como náusea e diarréias e de

distúrbios nervosos, como agitação, insônia, sonolência, ansiedade, dores de

cabeça, anorexia, tonturas, tremores e disfunções sexuais. Estes efeitos variam em

incidência conforme o ISRSs, e não foram totalmente elucidados os mecanismos

farmacológicos envolvidos (CHETLEY, 1994; WILDE, 1993).

Recentemente, muita atenção tem sido devotada para o sistema

glutamatérgico e para antagonistas de receptor NMDA em particular (ROGÓZ et al.,

2002). Propriedades antidepressivas para estes compostos foram sugeridas há 10

anos, indicando que o complexo do receptor NMDA esteja envolvido na patogênese

da depressão; compostos que reduzam a transmissão nestes receptores, como

antagonistas competitivos e não-competitivos do receptor NMDA mostraram efeito

antidepressivo tanto em testes pré-clínicos como clínicos (MANTOVANI et al.,

2003).

O quadro depressivo é difícil de ser mimetizado em animais. No

entanto, existem vários modelos comportamentais preditivos para avaliar novas drogas

com potencial atividade antidepressiva. Tanto o teste de nado forçado como o teste de

suspensão da cauda são amplamente aceitos como modelos de depressão, e são

utilizados para estudar novas drogas antidepressivas, já que eles são sensíveis para

todas as principais classes de drogas antidepressivas incluindo tricíclicos, ISRSs,

inibidores da MAO e atípicos, como antagonistas de receptor NMDA (ROSA et al.,

2003).

1.4.3 ESQUIZOFRENIA: BASES NEURAIS, FARMACOTERAPIA E

MODELOS COMPORTAMENTAIS

Esquizofrenia é um transtorno psiquiátrico grave, descrita pela

primeira vez como "dementia praecox" por Kraepelin, em 1919, e que começa

tipicamente perto do fim da adolescência ou no início da idade adulta. A

esquizofrenia é a mais freqüente das psicoses caracterizando-se por distúrbios do

pensamento como delírios de perseguição e a perda das conexões lógicas de idéias,

distúrbios da percepção (acompanhada principalmente por alucinações auditivas),

emoções embotadas ou impróprias a uma dada situação, excessiva timidez e

isolamento social, e mesmo alterações na motricidade (como agitação ou, ao

contrário, imobilidade; ANDREASSEN, 1997).

Na esquizofrenia a primeira hipótese levantada a respeito de uma

disfunção neuroquímica foi a dopaminérgica, na década de 50, basicamente em

função do mecanismo de ação dos antipsicóticos então disponíveis (MATTHYSE,

1973). Dada a predominante localização de terminais dopaminérgicos e de

receptores D

em regiões subcorticais; como o estriado e o núcleo accumbens, a

clássica hipótese dopaminérgica da esquizofrenia concentrou interesse

principalmente nestas regiões subcorticais (CARLSSON; LINDQVIST, 1963).

A visão atual predominante sobre esta hipótese é de que o sistema

dopaminérgico na esquizofrenia pode estar caracterizado por um desequilíbrio

cortical/subcortical. Neste desequilíbrio projeções de dopamina subcortical

mesolímbica poderiam estar hiperativas, resultando numa hiperestimulação de

receptores D

e sintomas positivos, enquanto que as projeções de dopamina

mesocortical para o córtex pré-frontal poderiam estar hipoativas, resultando numa

hipoestimulação de receptores D

, sintomas negativos e comprometimento cognitivo

(ABI-DARGHAM; MOORE, 2003).

Uma forte evidência que reforça a hipótese dopaminérgica é de que

drogas que liberam dopamina, como a anfetamina, produzem distúrbios

comportamentais semelhantes ao comportamento de pacientes esquizofrênicos.

Entretanto, é improvável a hipótese de que um único neurotransmissor seja capaz de

explicar as bases biológicas de cada uma das mais heterogêneas formas da

esquizofrenia (HIETALA; SYVALAHTI, 1996). Como a anfetamina interfere não

só na transmissão dopaminérgica, como também na transmissão de noradrenalina,

induzindo um aumento da atividade noradrenérgica, levantou-se a hipótese de que

poderia também ocorrer uma hiperatividade noradrenégica na esquizofrenia. Essa

hipótese tem sido corroborada por um aumento nos níveis de noradrenalina

encontrado no fluido cerebroespinhal de cérebros de esquizofrênicos analisados pós-

mortem, principalmente nos tipos paranóico ou com sintomas predominantemente

negativos (KEMALI et al., 1982). Também foram constatados níveis elevados de

noradrenalina em fluido cerebroespinhal de esquizofrênicos que receberam

tratamento com haloperidol (YAMAMOTO et al., 1994).

A hipótese de que a psicose induzida pelo ácido lisérgico (LSD) e a

psicose esquizofrênica são relacionadas a uma disfunção no sistema serotoninérgico

central, formulada na década de 50 por WOOLLEY e SHAW (1957), foi a primeira

teoria testável na psiquiatria biológica. O interesse na relação entre serotonina e

esquizofrenia tem crescido à medida que se descobriu que os agentes que atuam

bloqueando receptores serotonérgicos tais como clozapina, olanzapina e risperidona,

exercem efeitos terapêuticos nesta doença (IQBAL; VAN PRAAG, 1995). Esses

antipsicóticos atípicos têm significantes efeitos não apenas sobre subtipos de

receptores serotonérgicos (5-HT

2A/C

, 5-HT

and 5-HT

), mas também sobre receptores

dopaminérgicos, α

-adrenérgicos, histaminérgicos, muscarínicos e receptores

glutamatérgicos NMDA (SHIM et al., 1999; SVENSSON, 2000; BREESE et al.,

2002).

Uma hipótese mais recente sobre as bases bioquímicas da

esquizofrenia propõe uma hipofunção do sistema transmissor glutamatérgico na

patofisiologia desta doença. Esta hipótese se baseia em várias evidências de dados

neuroquímicos obtidos em humanos assim como observações clínicas. Um exemplo

destas evidências é a ação psicotomimética de drogas que bloqueiam receptores

glutamatérgicos do tipo NMDA, que sugere uma associação entre psicose e

glutamato. Alguns destes fármacos, como a fenciclidina e cetamina, causam

sintomas psicóticos muito semelhantes aos sintomas esquizofrênicos, até mesmo

sintomas negativos (OLNEY; FARBER, 1995).

Outra hipótese atual é a de que a patofisiologia da esquizofrenia possa

estar associada a várias alterações bioquímicas que resultariam numa hipofunção

adenosinérgica. Adenosina é um neuromodulador do sistema purinérgico que

modula negativamente a atividade de diversos neurotransmissores como a dopamina

e o glutamato (BRUNDEGE; DUNWIDDIE, 1997). Os receptores de adenosina do

tipo A

quando ativados inibem a liberação de glutamato e dopamina, e inibem a

atividade neuronal através de hiperpolarização pré-sináptica. Através da ativação

dos receptores do tipo A

, a adenosina possui um importante efeito modulador sobre

a transmissão dopaminérgica (FERRÉ, 1997). Estudos comportamentais pré-clínicos

demonstraram que agonistas dos receptores adenosinérgicos do tipo A

produzem

importantes efeitos anticonvulsivantes, ansiolíticos, sedativos e antipsicóticos

(BRUNDEGE; DUNWIDDIE, 1997), enquanto que agonistas dos receptores do tipo

apresentam um perfil psicofarmacológico particularmente semelhante a

antipsicótico (FERRÉ, 1997; RIMONDINI et al., 1997). A partir destes dados foi

proposto por LARA e SOUZA (2000) que alterações envolvendo o sistema

purinérgico, mais especificamente uma redução da atividade adenosinérgica,

poderiam estar implicadas na fisiopatologia da esquizofrenia.

A esquizofrenia é uma doença para a qual devem ser levadas em conta

todas as abordagens terapêuticas relevantes. Idealmente a terapia farmacológica

deve estar sempre associada à terapia psicossocial com objetivo de treinamento de

habilidades para facilitar a vida em sociedade e aumentar a capacidade de trabalho

(SHIRAKAWA et al., 2001).

A descoberta dos primeiros fármacos antipsicóticos em 1952 é o

marco da psicofarmacologia contemporânea. Os primeiros medicamentos usados

para o tratamento da esquizofrenia são hoje os chamados antipsicóticos clássicos,

também conhecidos como neurolépticos (RANG et al., 2001).

Esses compostos, sendo haloperidol e clorpromazina alguns exemplos,

têm como mecanismo de ação principal o bloqueio dos receptores dopaminérgicos,

principalmente os do tipo D

. Poucos psiquiatras discutem o valor desses agentes no

controle dos sintomas positivos da doença, pois em grande parte dos casos, são

eficazes em prevenir a reincidência dos sintomas psicóticos (KAPUR; MAMO,

2003). Porém, a maioria dos antipsicóticos desenvolvidos antes da década de 80

induz graves efeitos extrapiramidais, como parkinsonismo, distonias, acatisia e

discinesia tardia, em até 75% dos pacientes (KEEPERS et al., 1983). Além disso,

esses antipsicóticos apresentam pouco ou nenhum efeito no controle de sintomas

negativos primários (KANE; MAYERHOFF, 1989).

Novos fármacos antipsicóticos foram desenvolvidos nas últimas duas

décadas com perfil clínico diferente dos agentes clássicos e com menos efeitos

adversos. Esses novos fármacos são denominados de atípicos, sendo a sulpirida,

clozapina, olanzapina, risperidona e quetiapina alguns exemplos (RANG et al.,

2001). Antipsicóticos atípicos são compostos que têm pequena propensão a induzir

efeitos extrapiramidais e apresentam efeitos sobre os sintomas negativos que os

agentes clássicos não afetam (MELTZER, 1995). Soma-se a essas características, a

superioridade dos antipsicóticos atípicos em tratar os pacientes refratários, sendo

esta a sua principal característica (BELMAKER; BERSUDSKY, 2003). Outra

característica é a de que os atípicos não aumentam os níveis de prolactina, como

fazem os clássicos, tampouco induzem a chamada síndrome neuroléptica. Porém, os

antipsicóticos atípicos não estão livres de induzir efeitos adversos. Estes

cartacterizam-se por sedação, hipotensão ortostática, ganho de peso e distúrbios

sexuais (SHIRAKAWA et al., 2001). Além desses, a clozapina provoca

agranulocitose em 3-5% dos pacientes, com grave risco de morte (BHANJI et al.,

2003).

Existem vários modelos comportamentais para selecionar novos

fármacos antipsicóticos típicos e atípicos. A maioria das drogas utilizadas mimetiza

tanto sintomas positivos da doença por aumentar os níveis de DA diretamente

(apomorfina) ou indiretamente (anfetamina) e negativos da doença por bloquear

receptores dopaminérgicos (haloperidol).

No teste de letalidade induzido por anfetamina, o aumento da

letalidade em animais agrupados é prevenido por antipsicóticos (típicos e atípicos),

mas não por tranqüilizantes (ex. barbitúricos e benzodiazepínicos) (BOURIN et al.,

1986). A eficácia de antipsicóticos neste modelo está relacionada a sua habilidade

em bloquear receptores D

(BOURIN et al., 1986; GIFFORD et al., 2000; BALL et

al., 2003), uma característica comum para todos os fármacos antipsicóticos efetivos.

O antagonismo da escalada induzida por apomorfina é um dos testes

mais utilizados para predizer propriedades antagonistas dopaminérgicas in vivo

(COSTENTIN et al., 1975; PROTAIS et al., 1976; KIM et al., 1999). Camundongos

tratados com apomorfina, um agonista misto D

que estimula receptores

dopaminérgicos pós-sinápticos no estriado, tendem a adotar uma posição vertical ao

longo das barras da gaiola (BATTISTI et al., 2000); comportamento este mediado

pela ativação de receptores D1 e D2 (MOORE; AXTON, 1988).

2. HIPÓTESE DE TRABALHO

Em estudos anteriores, psicolatina apresentou moderada atividade

analgésica dose-dependente e parcialmente reversível por naloxona utilizando

modelos de dor induzidos por estímulos térmicos (teste da placa quente e teste da

retirada da cauda ao estímulo térmico) e químicos (capsaicina e formalina). Os

resultados desse trabalho sugeriram que psicolatina possui um duplo mecanismo de

ação, envolvendo a ativação de receptores opióides e o antagonismo de receptor

glutamatérgico NMDA. A co-administração de psicolatina com MK-801 em doses

não efetivas per se produz um efeito semelhante as doses analgésicas

administradas isoladamente, demonstrando que essas drogas quando co-

administradas tem efeito sinérgico potencializando suas ações (BOTH, 2001,

BOTH et al., 2002).

O receptor glutamatérgico NMDA está amplamente distribuído no

sistema nervoso e há evidências abundantes que este receptor tenha importante

papel em grande número de processos fisiológicos e patológicos. Dentre os

processos que envolvem o receptor NMDA incluem-se desenvolvimento,

aprendizagem e memória, plasticidade, dor (PERKINS; DRAY, 1996), ansiedade

(FILE, 1996) e depressão (MANTOVANI et al., 2003). Uma disfunção deste

sistema pode levar a vários distúrbios neurológicos, incluindo epilepsia

(MELDRUM, 1990; DINGLEDINE et al., 1991) e doenças neurodegenerativas

como a Doença de Huntington e a Doença de Alzheimer (GRENNAMYRE et al.,

1985; PROCTER et al., 1988).

Sendo a psicolatina um alcalóide abundante na natureza, com

estrutura química nova e peculiar e biologicamente ativo, justifica-se dar

continuidade à investigação de sua atividade biológica, especialmente a

relacionada com antagonismo de receptores NMDA (N-Metil-D-Aspartato), bem

como outros importantes receptores que modulam diversas atividades do sistema

nervoso central (SNC), como receptores serotonérgicos (5-HT), dopaminérgicos

(DA), gabaérgicos (GABA) e colinérgicos (Ach).

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Esse estudo teve como objetivo geral dar continuidade à investigação do

perfil psicofarmacológico de psicolatina, contribuindo para o esclarecimento da

participação dos sistemas serotoninérgico, glutamatérgico, dopaminérgico,

gabaérgico e colinérgico em seu mecanismo de ação, para que futuramente, tais

interações possam servir como modelo estrutural e de mecanismo de ação para o

desenvolvimento de drogas para os diversos distúrbios comportamentais.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

I) Verificar os efeitos de psicolatina nos modelos comportamentais de placa

perfurada e claro/escuro, usados para detecção de atividade ansiolítica.

II) Averiguar o mecanismo de ação do efeito ansiolítico de psicolatina, investigando

sua interação com antagonistas serotoninérgicos e GABAérgicos nos modelos da

placa perfurada e claro/escuro.

III) Verificar o efeito de psicolatina no modelo comportamental do nado forçado,

usado na detecção de atividade antidepressiva.

IV) Avaliar o possível efeito de psicolatina no teste de proteção de convulsões

induzidas por pentilenotetrazol (PTZ).

V) Avaliar a o efeito de psicolatina sobre a sedação utilizando o teste de potenciação

do sono barbitúrico.

VI) Verificar a interferência de psicolatina com a locomoção dos animais através do

teste de atividade locomotora espontânea.

VII) Investigar os efeitos de psicolatina sobre a modulação da memória de curta e

longa duração nos processos de aquisição, consolidação e evocação usando o

paradigma de esquiva inibitória.

VIII) Investigar os efeitos de psicolatina sobre o sistema colinérgico no teste de

tremor induzido por oxotremorina.

IX) Investigar o efeito de psicolatina sobre comportamentos modulados pelo sistema

glutamatérgico, por meio do modelo de hiperlocomoção induzida por MK-801 e de

convulsão induzida por NMDA.

X) Avaliar a interferência de psicolatina sobre o comportamento modulado pelo

sistema dopaminérgico, por meio do modelo de letalidade induzida por anfetamina e

por meio do comportamento de escalada induzida por apomorfina.

XI) Verificar a DL50 e sinais de toxicidade aguda em animais tratados com

psicolatina.

XII) Além da avaliação de uma possível interferência de psicolatina sobre os vários

sistemas de neurotransmissores do SNC utilizando modelos comportamentais,

também se buscou avaliar o efeito de psicolatina sobre os parâmetros de estresse

oxidativo utilizando o conteúdo de radicias livres (DCF), a reatividade antioxidante

total (TAR), o ensaio de peroxidação lipídica (TBARS) e a oxidação dos resíduos de

triptofano (TRI) e tirosina (TIR) no córtex e hipocampo já que inúmeros compostos

indólicos possuem atividade antioxidante e neuroprotetora.

4 ARTIGOS CIENTÍFICOS

4.1 Perfil Psicofarmacológico do Alcalóide Psicolatina como Modulador

Serotonérgico 5HT

2A/C

(J. Nat. Prod., v. 68, n. 3, p. 374-380, 2005).

4.1.1 INTRODUÇÃO

Estudos anteriores mostraram que psicolatina apresenta moderada

atividade analgésica dose-dependente. O mecanismo de ação parece ser a ativação

de receptores opióides e o antagonismo de receptores NMDA (BOTH et al., 2002).

Atualmente existem várias evidências da relação entre o sistema

opióide e o sistema glutamatérgico (WIESENFELD-HALLIN, 1998). Diversos

estudos examinaram o envolvimento de receptores NMDA no desenvolvimento de

tolerância e dependência a opióides. Antagonistas NMDA co-administrados com

morfina reduzem a tolerância ao efeito analgésico (TRUJILLO;

AKIL,

1991;

BEN-

ELIYAHU, 1992;

ELLIOTT

et al,

1999;

PRICE

et al.,

2000).

Antagonistas de receptor NMDA também podem modular a renovação

das monoaminas no SNC e esta ação pode ser a responsável pelas propriedades

antidepressivas dos antagonistas NMDA (SKOLNICK, 1999). Foi demonstrado, por

exemplo, que MK-801 aumenta a liberação e influencia a renovação de serotonina

em várias regiões cerebrais, incluindo hipocampo e estriado (YAN et al., 1997).

Além disso, os efeitos psicoestimulantes e psicotomiméticos de MK-801 e

fenciclidina (PCP) são atenuados por antagonistas específicos de receptores 5-HT

e 5-HT

, sugerindo que 5-HT está envolvido no comportamento estereotipado

produzido por MK-801. Além do receptor 5-HT

, um grande número de estudos

indica que MK-801 também pode influenciar outros receptores serotonérgicos.

Tanto o aumento na densidade de receptores 5-HT

depois de uma única

administração de MK-801, quanto o aumento do RNAm de receptores 5-HT

e 5-

foram demonstrados (WEDZONY et al., 2000).

Por este alcalóide apresentar atividade biológica e a participação de

receptores NMDA a avaliação de seu perfil psicofarmacológico, bem como a

participação de outros receptores, como serotonina torna-se interessante.

4.1.2 OBJETIVOS

Este trabalho teve, portanto, o objetivo de avaliar os efeitos de

psicolatina sobre diversos modelos comportamentais envolvendo a participação de

receptores serotonérgicos e GABAérgicos.

Psychopharmacological profile of the alkaloid psychollatine as a 5HT2

A/C

serotonin modulator.

Fernanda L. Both

1,2

, Lisiane Meneghini

, Vitor A. Kerber

, Amélia T. Henriques

and

Elaine Elisabetsky*

1,2

1Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande

do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil;

2 Laboratório de Etnofarmacologia, Departamento de Farmacologia, Universidade Federal

do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil;

3 Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR, Brazil

Address correspondence to: Elaine Elisabetsky, Caixa Postal 5072, 90041-970, Porto

Alegre, RS, Brazil. Tel/Fax: (+)55 51 3316 3121; E-mail: elisasky@vortex.ufrgs.br

Abstract

Behavioural effects of psychollatine, a new glycoside indole monoterpene alkaloid isolated

from Psychotria umbellata, was investigated in models of anxiety, depression, memory,

tremor and sedation related to 5-HT and/or GABA neurotransmission. The GABA

antagonist picrotoxin and the 5-HT2 antagonist ritanserin were used to examine the role of

GABA and 5-HT2 receptors in psychollatine-induced effects. In the light/dark and hole-

board models of anxiety, diazepam (0.75 mg/kg) and psychollatine (7.5 and 15 mg/kg)

showed anxiolytic-like effect at doses that do not increase sleeping time nor alter

spontaneous locomotor activity. The anxiolytic effect of psychollatine was prevented by

prior administration of ritanserin, but not of picrotoxin, indicating that 5-HT2 but not

GABA receptors are implicated. In the forced swimming model of depression,

psychollatine (3 and 7.5 mg/kg) effects were comparable to the antidepressants imipramine

(15 mg/kg) and fluoxetine (20 mg/kg). Psychollatine suppressed oxotremorine-induced

tremors in all doses. In the step-down learning paradigm, diazepam (0.85 mg/kg), MK-801

(0.15 mg/kg) and psychollatine 100 mg/kg impaired the acquisition of learning and

memory consolidation, without interfering with retrieval. It is concluded that psychollatine

is a bioactive alkaloid and that its effects at the central nervous system involve serotonergic

5HT2

receptors.

Introduction

Since its discovery over 50 years ago, serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-

HT) has been a long-standing target of intense research, in both academia and the

pharmaceutical industry

. Current efforts focus on the identification of more potent and

selective ligands for different receptor subtypes, aiming to enhance drug treatments with

fewer side effects for a variety of disorders

, as well as understanding the diverse role of

serotonin in the fine-tuning of various body functions. 5-HT has been shown to have a

multitude of different physiological actions, and this is not surprising given the nature of

the 5-HT neuronal system and the variety of different 5-HT receptors

. Currently, seven

families of 5-HT receptors have been recognized

While early research on 5-HT was focused on its functions in peripheral

tissues, a large proportion of current research exploit 5-HT pharmacology for therapeutic

benefit associated with CNS functions

. 5-HT neurons originate in the hindbrain in a

relatively circumscribed area, but send projections to most parts of the brain

. Furthermore,

5-HT is known to interact with other neurotransmitter systems, the literature being

particularly rich regarding interactions between 5-HT and dopamine, and 5-HT and

glutamate systems

4,1

The discovery of the selective 5-HT reuptake inhibitors represented an

incremental step in the development of antidepressant drugs, and they are now the drugs of

choice in treating depression

. Moreover, it has been long accepted that the regulation of

fear and anxiety is strongly associated with the central γ-aminobutyric acid (

GABA

) and

serotonergic (5-HT) systems

. A substantial amount of data has been accumulated on the

role of various serotonin receptor subtypes in anxiety. Anxiolytic-like effects of drugs

targeting serotonin 5-HT

, 5-HT

receptors have been revealed by conditioned

procedures as well as ethological-based models

. Antagonism of the 5-HT

receptor also

induces anxiolytic effects in various models of anxiety, and selective 5-HT

antagonists

such as ondansetron and zacopride have anxiolytic profiles in rodents and potential clinical

application in the treatment of generalized anxiety and panic disorders

7,8

. Recently,

however, the significance of other neurotransmitters systems (such as cholinergic,

dopaminergic and glutamatergic) in modulating emotional behavior has received attention

Serotonergic projections arising from the raphe nuclei innervate limbic

(amygdala and hippocampus) and cortical areas known to be involved with cognition and

processing of emotional events

. 5-HT1 and 5-HT2 receptors are present in areas

associated with learning and memory processes

11,12

, although there is no consensus on the

effects of enhancing or lessening setotonergic activity on mnemonic processes; differences

in tasks and receptor sub-types appear to be relevant for any given outcome

10, 11,12, 13

OGlu

COOC

Psychollatine 5-hydroxytryptamine (serotonin)

Psychollatine (formerly known as umbellatine) is an indol-monoterpene

alkaloid (isolated from Psychotria umbellata Vell., Rubiaceae) structurally related to

serotonin. The present study was undertaken to further investigate the

psychopharmacological profile of psychollatine, by using the mouse light/dark and hole-

board models, forced swimming test, step-down inhibitory avoidance and oxotremorine-

induce tremors. Locomotion, barbiturate sleeping time and anticonvulsant activity (PTZ)

were also examined. The role of 5-HT and GABA receptors in psychollatine mode of

action were further evaluated.

Results and Discussion

In evolutionary terms, 5-HT is one of the oldest neurotransmitters and has

been implicated in the etiology of numerous disease states

. Serotonin has been implicated

in the regulation of nociception, motor behavior, endocrine secretions, cardiovascular

function, appetite, as well as in several psychiatric and neurological disorders

Furthermore, 5-HT has been suggested to play a significant role in cognitive processes

11, 15

The 5-HT

and 5HT

2A/C

receptor subtypes are especially relevant in this discussion, given

its implication in both anxiety and depression

14, 16

as well as with learning and memory

processes

Diverse physiological and behavioral effects consequent to the stimulation of

5-HT

and 5-HT

2A/C

receptors have been reported

; for instance ritanserin, a non-selective

5-HT

2A/2C

receptor antagonist, was shown to be effective in improving several anxiety

disorders, including panic and generalized anxiety

. Increased 5-HT activity in the brain

(e.g., through agonists RU-24969 and mCPP) has been shown to induce spatial learning

deficits, while decreased activity (e.g., antagonists ketanserin and ritanserin) improve

consolidation of spatial discrimination, suggesting that drugs that stimulate or block the 5-

and/or 5-HT

2A/2C

receptors impaired or enhanced spatial learning, respectively

Nevertheless, ritanserin and mianserin were shown to be prejudicial in conditioned eye

blink in rabbits

, while ritanserin impaired elevated T-maze inhibitory avoidance in rats

suggesting differential roles of serotonin receptors in diverse learning paradigms.

Hole-board: The hole-board model is used to identify and evaluate the

anxiolytic/anxiogenic properties of drugs

20 .

As expected diazepam 0.75 mg/kg increased the

number of head-dips (F

(2,50)

= 51.14; P ≤0.01), crossings (F

(2,50)

= 89.93; P ≤ 0.01) and

rearings (F

(2,50)

= 10.91; P ≤0.01) (Fig. 2a, 2b and 2c respectively). Psychollatine 7.5 and

15 mg/kg also increased the number of head-dips (F

(5,85)

= 30.73; P ≤0.01), crossings (F

(5,85)

= 17.57; P ≤ 0.01) and rearings (F

(5,85)

= 12.99; P ≤0.05) (Fig. 1a, 1b and 1c

respectively). The highest psychollatine dose (200 mg/kg) significantly reduced the number

of head-dips and crossings (P ≤0.01) (Fig. 1a and 1b). None of the treated groups

significantly differed from controls regarding latency to the first head-dip (data not shown).

Pre treatment with picrotoxin reversed the effects of diazepam (Fig. 2a, 2b and 2c) but not

those of psychollatine in this model; pre treatment with ritanserin reversed the effects of

psychollatine on head-dips (F

(2,27)

= 20.52; P ≤0.01), crossings (F

(2,27)

= 8.12; P ≤0.01)

and rearings (F

(2,27)

= 6.27; P ≤0.01) (Fig. 2a, 2b and 2c).

Figure 1a

100

SAL

PPG 10%

0.75

SY 15

SY 30

PSY

PSY 200

N head-dips (hd)

Figure 1b

100

10%

PSY 7.5

PSY 30

SY 100

PSY 200

N squares crossed

Figure 1c

SAL

10%

Y 7.5

PSY

100

PSY

200

N rearing

Figure 1. Effects of psychollatine in the hole-board test. Number of head-dips (a), number

of squares crosses (b) and number of rearings (c). SAL, saline; PPG 10%, propylene glycol

10%; DZP 0.75, diazepam 0.75 mg/kg; PSY 7.5, 15, 30, 100 and 200, psychollatine 7.5, 15,

30, 100 and 200 mg/kg. Each column represents the mean ± SEM (N = 15). ANOVA * =

P<0.05 and ** = P<0.01 compared with controls.

Figure 2a

100

SAL+SAL

SAL

PPG

SAL+

ZP0.75

O+

CRO

DZP

L+

N+

SAL

SAL+PSY7.

PICRO+PSY7.5

N+P

7.5

N head-dips (hd)

Figure 2b

100

L+

SAL+PPG

AL+DZP

PICR

SAL

N+SA

L+

SY7

RO+P

Y7.5

RITAN+P

Y7.5

N squares crossed

Figure 2c

SAL+S

L+PPG

L+

ZP0.

SAL

DZP

L+

DMSO

N+

SAL+PSY7.5

PICRO+P

Y7.

N+

SY7.5

N rearing

Figure 2. Effects of psychollatine and antagonists (picrotoxin and ritanserin) in the hole-

board test. Number of head-dips (a), number of squares crosses (b) and number of rearings

(c). SAL, saline; PPG, propylene glycol 10%; DMSO, Dimethyl sulphoxide; DZP 0.75,

diazepam 0.75 mg/kg; PSY 7.5, psychollatine 7.5 mg/kg; PICRO, picrotoxin 1 mg/kg;

RITAN, ritanserin 2 mg/kg. Each column represents the mean ± SEM (N = 8-14). ANOVA

* = P<0.05 and ** = P <0.01 compared with controls.

Results from hole-board show that diazepam and psychollatine have a clear

and consistent effect (increased number) on head-dipping behavior (the key parameter), at

doses that did not produce sedation. The effects of diazepam were prevented by pre

treatment with the

GABA

antagonist picrotoxin, whereas the effects of psychollatine were

antagonized by the 5HT

2A/C

antagonist ritanserin.

Light-dark model: The light/dark model is a widely accepted animal model of anxiety

Diazepam 0.85 mg/kg significantly lengthened (F

(2,60)

= 12.14, P≤0.01) the time spent in

the lighted compartment, as well as the latency (F

(2,60)

= 16.86, P≤0.01) to the first entry in

the dark compartment (Fig. 3a and 3b). Likewise, psychollatine 7.5 mg/kg increased the

time (F

(5,114)

= 6.51, P≤0.05) spent in the light area, and the latency (F

(5,114)

= 11.64,

P≤0.01) to the first entry in the dark compartment (Fig. 3a and 3b). No significant

differences were seen in the number of transitions between compartments among the

various groups (data not shown). Pre treatment with picrotoxin reversed the effects of

diazepam, but not those of psychollatine (Fig. 4a and 4b). Pre treatment with ritanserin

reversed the effects of psychollatine on the time spent in the light area (F

(2,22)

= 7.45; P

≤0.01) and the latency to the first entry in the dark compartment (F

(2,22)

= 2.32, P ≤0.05)

(Fig. 4a and 4b).

Figure 3a

PPG10

DZP

7.5

PSY 15

Latency (sec)

Figure 3b

100

150

10%

DZP 0.85

PSY 7.

SY 15

PSY 30

Time spent in light area (sec)

Figure 3. Effects of diazepam and psychollatine on the behavior of mice in the light-dark

test. Latency of the first entry (a) and the amount of time spent by mice in the light area (b).

SAL, saline; PPG, propylene glycol 10%; DZP 0.85, diazepam 0.85 mg/kg; PSY 7.5,15 and

30; psychollatine 7.5, 15 and 30 mg/kg. Each column represents the mean ± SEM (N = 19-

22). ANOVA * = P <0.05 and ** = P <0.01 compared with controls.

Figure 4a

L+

SAL+

L+

PICRO

O+SA

N+SA

SAL+

PICRO+PSY7.5

Latency (sec)

Figure 4b

100

120

140

SAL+SAL

L+

SAL+DZP0.85

RO+SAL

DZP

RITAN+SAL

SAL+PSY7.5

PICRO

RITAN+PSY7

Time spent in light area (sec)

Figure 4. Effects of diazepam and psychollatine on the behavior of mice in the light-dark

test with antagonists. Latency of the first entry (a) and the amount of time spent by mice in

the light area (b). SAL, saline; PPG, propylene glycol 10%; DMSO, Dimethyl sulphoxide;

DZO 0.85, diazepam 0.85 mg/kg; PSY 7.5, psychollatine 7.5 mg/kg; PICRO, picrotoxin 1

mg/kg; RITAN, ritanserin 2 mg/kg. Each column represents the mean ± SEM (N = 8-10).

ANOVA * = P <0.05 and ** = P <0.01 compared with controls.

In the light/dark model, results were consistent with those obtained with

hole-board. Diazepam and psychollatine behaved as anxiolytics, markedly increasing the

time spent in the lit box. Again, the effects of diazepam were prevented by pre treatment

with the

GABA

antagonist picrotoxin, whereas the effects of psychollatine were antagonized

by the 5HT

2A/C

antagonist ritanserin. This data suggests that 5-HT

receptors are involved

in the anxiolytic properties of psychollatine. This result is consistent with the fact that

psychollatine and serotonin are structurally related.

Potentiation of barbiturate sleeping time and Spontaneous locomotor activity: In order to

check distinguish anxiolytic activity from general sedation, the following experiments were

conducted. Psychollatine 100 mg/kg (F

(5,59)

= 6,55, P ≤0.01) and diazepam 2 mg/kg (F

(2,29)

= 45.19, P ≤0.01) increased pentobarbital-induced sleeping time (Fig. 5). As can be seen in

Fig 6, saline, psychollatine (3, 7.5, 10 and 30 mg/kg), diazepam (0.75 and 0.85 mg/kg) did

not interfere with the spontaneous locomotion, whereas psychollatine 100 mg/kg reduced

locomotion [F

(5,78)

=10.427 , P< 0.01].

120

150

180

210

SAL

Y 3.0

Y 7.5

Sleeping time (min)

Figure 5. Effects of benzodiazepine (Diazepam), psychollatine, and respective vehicle

(PPG and saline) on potentiation of barbiturate sleeping time. SAL, saline; PPG, propylene

glycol 10%; DZP 2.0, diazepam 2 mg/kg; PSY 3.0, 7.5, 10, 30 and 100, psychollatine 3,

7.5, 10, 30 and 100 mg/kg. Each column represents the mean ± SEM (N = 9-12). ANOVA

* = P <0.05 and ** = P <0.01 compared with controls.

100

150

200

250

300

PPG10%

DZP0.75

DZP0.

3.0

PSY

7.5

PSY 10

PSY 30

100

Locomotor activity (sec)

Figure 6. Effects of benzodiazepine (Diazepam), psychollatine, and respective vehicle

(PPG and saline) on spontaneous locomotor activity. SAL, saline; PPG, propylene glycol

10%; DZP 0.75 and 0.85, diazepam 0.75 and 0.85 mg/kg; PSY 3.0, 7.5, 10, 30 and 100,

psychollatine 3, 7.5, 10, 30 and 100 mg/kg. Each column represents the mean ± SEM (N =

9-12). ANOVA * = P <0.05 and ** = P <0.01 compared with controls.

Higher doses of psychollatine induces sedative effects, including

potentiation of barbiturate sleeping time (100 mg/kg), marked inhibition of spontaneous

ambulation (100 mg/kg), and deficits in rota-rod performance (200 mg/kg)

. Sedative

doses are distinctly separated from the anxiolytic dose-range (7.5 – 15 mg/kg).

PTZ induced convulsions: As can be seen at Fig. 7, 100% and 90% of control animals

(saline and PPG, respectively) presented seizures within 60 min after PTZ treatment. Both

diazepam 0.8 mg/kg (10%, P≤0.05) and phenobarbital 20 mg/kg (0 %, P≤0.05) protected

mice from PTZ convulsions, whereas psychollatine was devoid of effect.

100

% of seizuring

animals

SAL

PPG10%

DZP0,8

PHENO20

PSY 3.0

PSY 7.5

PSY 10

PSY 30

PSY 100

Figure 7. Effects of diazepam, phenobarbital and psychollatine on PTZ-induced

convulsions. SAL, saline, PPG, propylene glycol 10%; DZP 0.8, diazepam 0.8 mg/kg;

PHENO 20, phenobarbital 20 mg/kg, PSY 3.0, 7.5, 10, 30 and 100, psychollatine 3, 7.5, 10,

30 and 100 mg/kg. N = 10. Fischer * = P <0.05 and ** = P <0.01 compared with controls.

The facts that psychollatine does not behave as anticonvulsant against

pentylenetetrazole, nor has its anxiolytic effects altered by pre treatment with picrotoxin,

suggest that GABA receptors do not play a significant role in the behavioral effects of

psychollatine.

As discussed above, in addition to anxiety, the serotonergic system has been

implicated in the modulation of depression

14,16

and cognition

11,12, 15

. Consequently,

psychollatine effects were evaluated in the following relevant models.

Forced swimming test: Psychollatine at doses of 3 (48.88±12.73 s) and 7.5 mg/kg

(56.41±7.22 s) significantly (P<0.05) decreased the duration of immobility when compared

with saline (112.53±6.73 s). Higher doses (10 and 30 mg/kg) of psychollatine were devoid

of effect. MK-801 0.15 mg/kg (33.36±3.94 s), imipramine 15 mg/kg (46.05±9.43 s) and

fluoxetine 20 mg/kg (57.61±10.88 s) also reduced (P<0.05) the duration of immobility

(Fig. 8).

100

120

140

amine

MK-

801

oxet

SY 3.

7.5

PSY

PSY 30

Immobility time (sec)

Figure 8. Effects of imipramine, fluoxetine, MK-801 and psychollatine on time of

immobility in forced swimming test. PSY 3.0, 7.5, 10 and 30= psychollatine 3, 7.5, 10 and

30 mg/kg. Each column represents the mean ± S.E.M. (N=10). ANOVA* = P <0.05

compared with saline.

Psychollatine (at doses that do not affect locomotion), as well as fluoxetine

and imipramine, significantly reduced the total duration of immobility in the forced

swimming test in mice, commonly used to predict clinical efficacy of several

antidepressants

Oxotremorine-induced tremors: Oxotremorine is a potent muscarinic agonist, and its

tremorigenic activity seems to be primarily mediated through central cholinergic

stimulation

. Psychollatine at 3 mg/kg (7 [6-9] ), 7.5 mg/kg (7 [6-9]), 10 mg/kg (6.5 [2-

9.25]), 30 mg/kg (5.5 [3.75-7]) and 100 mg/kg (8[5.75-9]), and scopolamine 3 mg/kg (0 [0-

0]) suppress tremors in oxotremorine-treated mice when compared with saline (10 [9-

11.5]). The effect of psychollatine was not dose-dependent (Fig. 9).

SAL+SAL

SAL+

opol

ami

e+OXO

AL+P

SY3.

SAL+

SY7.

L+

PSY10

SAL+

Y30

AL+

PSY100

Tremor scores

Figure 9. Effects of scopolamine and psychollatine on the oxotremorine-induced tremor.

Scopolamine 3 mg/kg; OXO, oxotremorine 0.5 mg/kh; PSY 3.0, 7.5, 10, 30 and 100,

psychollatine 3, 7.5, 10, 30 and 100 mg/kg. Each column represents the median

(interquartile ranges) of training (light columns) or test (dark columns) session latencies **

P <0.01 significant difference compared with saline + oxotremorine in Mann-Whitney U

test, following Kruskal-Wallis.

Step-down inhibitory avoidance:

Short term memory (STM): Diazepam 0.85 mg/kg (9.65 s[3.05-31.55]), MK-801 0.15

mg/kg (8.4 s[2.85-14.32]) and only the higher psychollatine dose (100 mg/kg) (6.8 s[3.85-

17]) significantly reduced (P<0.01) the latency during aquisition testing when compared

with saline (29.2 s[8.4-137]) (Figure 10a). When tested for effects in memory retention

diazepam 0.85 mg/kg (8.3 s[7.2-15.5]), MK-801 0.15 mg/kg (16.5 s[8.2-22.6]) and

psychollatine 3 mg/kg (11.8 s[5-21.9]), 7.5 mg/kg (9.6 s[4.45-19.37]), 10 mg/kg (11.55

s[4.87-19.92] and 30 mg/kg (12.8 s[4.47-34.17] also caused a significant (P<0.01)

reduction in step-down latency when compared with saline (21.4 s[12.3-80]) (Figure 10b).

No one treatment induced differences in retrieval (data not shown).

Figure 10a

100

150

200

250

300

350

DZP0

PSY3.0

100

Latency (sec)

TRAINING

STM

LTM

***

** **

Figure 10. Effect of psychollatine given ip 30min prior to training (A) and immediately

posttraining (B) on test performance of adult mice trained in step-down inhibitory

avoidance (0.3mA footshock, 24h training-test interval). N=20 per group. Each column

represents the median (interquartile ranges) of training (light columns) or test (dark

columns) session latencies, for long term memory (LTM) and short term memory (STM).*

P <0.05, ** P <0.01 significant difference compared with controls in Mann-Whitney U test,

following Kruskal-Wallis.

Long term memory (LTM): Diazepam 0.85 mg/kg (4.75 s[3-16.32]), MK-801 0.15 mg/kg

(6 s[2.42-9.95]) and psychollatine 7.5 mg/kg (13.4 s[5.12-25.72] and 100 mg/kg (5 s[2.3-

17.57]) significantly reduced (P<0.01) the latency during acquisition testing when

compared with saline (33.2 s[13-114.6]) (Figure 10a). When tested for effects in memory

retention diazepam 0.85 mg/kg (5.4 s[3-9.10]), MK-801 0.15 mg/kg (6.2 s[3.1-12.70]) and

psychollatine 7.5 mg/kg (13.1 s[3.02-90.325]) and 100 mg/kg (9.5 s[3.225-100.175] also

caused a significant (P<0.01) reduction in step-down latency when compared with saline

(50.3 s[18.20-156.3]) (Figure 10b). No differences in retrieval were found after treatments

data not shown).

Figure 10b

100

120

140

160

180

200

SAL

DZP0.85

MK-8010.

Y3.

SY7.5

Y10

PSY100

Latency (sec)

TRAINING

STM

LTM

It has been suggested that cross talk between central serotonergic and

cholinergic systems play a critical role in mnemonic processes

. The hippocampal

cholinergic tone may be modulated via 5-HT

receptor, the serotonin 5-HT1

agonist 8-

OH-DPAT stimulates the release of acetylcholine in the hippocampus

, and fluoxetine

reverses scopolamine-induced cognitive deficit

. Several reports have indicated that

tryciclic antidepressants, including clomipramine and imipramine, as well as selective

serotonin reuptake inhibitors, like paroxetine, inhibit oxotremorine-induced tremor

, and

this anticholinergic activity may be responsible for the antidepressants unwanted side

effects in memory

. The overall effect of agents that primarily interfere with serotonergic

receptors on the cholinergic system is, therefore, intricate. In the case of psychollatine, its

effects on oxotremorine-induced tremors and memory suggest an overall depression of

cholinergic transmission. The possibility that psychollatine-induced amnesia is the result of

its modulation of serotonin per se can not be ruled out at this point.

It has been accepted that changes in the serotonergic transmission can

interfere with learning acquisition and memory consolidation; in fact, the brain structures

implicated in learning and memory processes contain a large number of 5-HT receptors, as

well as other neurotransmission systems

. Tryciclic antidepressants such as imipramine

and amitryptiline, but not the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine, have been

reported to induce amnesia in passive avoidance and maze performance in mice

In this study psychollatine impaired acquisition and consolidation memory processes in the

step-down inhibitory avoidance, without affecting memory retrieval. This pattern is

compatible with those obtained with 5-HT agonists

and antagonists

, muscarinic

antagonists

, and NMDA glutamate antagonists

as described in many studies. The data

here presented suggest that psychollatine interferes with serotonergic transmission and

possibly with the cholinergic systems. Considering the previously reported analgesic effect

of psychollatine in the capsaicin model, and its synergism with MK-801, a potential role of

NMDA receptors in psychollatine amnesic effect has to be taken into account

Complete pictures of the molecular mechanism underlying the effects of

psychollatine as anxiolytic, antidepressive and amnesic remain to be elucidated. However,

this study adds to the idea that the indole monoterpene alkaloid psychollatine deserves

further investigation as a useful template to develop selective sub-types ligands for 5-HT

receptors.

Experimental Section

General Experimental Procedure

Diazepam, sodium pentobarbital, ritanserin, picrotoxin, phenobarbital and propylene glycol

(PPG) were acquired from Sigma; dimethyl sulphoxide (DMSO) from Delaware;

pentylenetetrazol (PTZ) from Knoll A.G-Ludwingshafen/Rheno; MK-801 was acquired

from RBI. Drugs and vehicles were administered intraperitoneally, except for PTZ given

subcutaneously, always as 0.1 mL/ 10g of body weight. Diazepam (0.75, 0.85 and 2 mg/kg)

was suspended in propylene glycol 10% (v/v). Ritanserin (2.0 mg/kg) was suspended in

DMSO 10% (v/v). Psychollatine (3, 7.5, 10, 30, 100 and 200 mg/kg) was solubilized in

one or a few drops (20-60 µL) of HCl (1N), the final volume completed with saline and the

pH adjusted (7.0) with a few drops of NaOH (1N). Sodium pentobarbital (40 mg/kg), PTZ

(88 mg/kg), phenobarbital (20 mg/kg), picrotoxin (1.0 mg/kg), MK-801 (0.15 and 0.25

mg/kg), scopolamine (3 mg/kg) and oxotremorine (0.5 mg/kg) were diluted in saline.

Control groups received saline (NaCl 0.9%), PPG (10%) or DMSO (10%) as appropriate.

Psychotria umbellata Vell.(Rubiaceae) leaves were collected and identificated by Gert

Hatchbach, in February 1995; a voucher (MBM 48571) has been deposited at the herbarium

of the Museu Botânico Municipal de Curitiba (PR, Brazil).

Dried leaves (100g) were extracted with EtOH at room temperature 3-times, each for a

week. The extract was concentrated under vacuum at 40°C to a dark green syrup. The syrup

was dissolved in HCl 2% (0.5L) and partitioned with CH

. The acid solution was

alkalinized with NH

OH 25% until pH = 10 and extracted with CH

. From the CH

extract 954 mg of a colorless amorphous compound was precipitated. Purity of the

compound was checked by TLC with silica gel 60F254 (CHCl

:MeOH/NH

vapor - 85:15 -

Rf = 0.2) and HPLC (column: NOVAPACK C18 150 mm x 3.9 mm - Waters; MeOH:H

0 -

50:50 as eluent and a Photo Diode Array as detector; Rt = 2.13 min).

Animals. Experiments were performed with male adult mice (CF1), acquired from

Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) with 2 months of age.

Animals were maintained in our owns facilities (22°±1°C, 12 h light/dark cycle, free access

to food [Nuvilab CR1] and water) for at least two weeks before experiments. All

procedures were carried out according to institutional policies on experimental animal

handling.

Hole-board model. The hole-board apparatus (Ugo Basile, Italy) consisted of a grey

Perspex panel (40x40x40 cm, 2.2 cm thick) with 16 equidistant holes (3 cm in diameter) in

the floor. Photocells below the surface of the holes provided measures of the number of

head-dips. The board was positioned 15 cm above the table and divided (with black water-

resistant marker) in 16 squares of 10x10 cm. The method was adapted from Takeda et al.

(1998)

. Mice were transported to the dimly lit laboratory at least 1 h prior to testing. The

animals were divided into ten groups (N = 15) and treatments (saline, PPG, DMSO,

diazepam and psychollatine) administered intraperitoneally 30 min prior to the testing.

After 30 min each animal was individually placed in the center of the board (facing away

from the observer) and the following parameters were noted for 5 min: the latency to the

first head-dip measured using a stopwatch; number of head-dips; the number of rearings

and spontaneous movements (number of squares crossed with all four paws). To verify the

influence of the different receptors, the antagonists ritanserin and picrotoxin were

administered 30 min before psychollatine (7.5mg/kg). Statistical analysis involved an initial

one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Student Newman Keuls (SNK) test.

Light/dark model. This model of anxiety was based on that described by Misslin et al.

(1989)

and consists of an open-topped rectangular box (48 x 29 x 46 cm high), divided

into a small (19 x 29 cm) and a large (29 x 29 cm) area. The mice could move from one box

to the other through an open door ( 7 x 7 cm) between the two boxes. The small

compartment was painted black and provided only with room illumination, whereas the

larger compartment was painted white and brightly illuminated with a 60-W (400lx) light

source. Mice were transported to the experimental room, lit by a single dim red light, at

least 1 h prior to testing. The animals were divided into ten groups (N = 8-15) and

treatments (saline, PPG, DMSO, diazepam and psychollatine) administered

intraperitoneally 30 min prior to testing. After 30 min each animal was individually placed

in the center of the illuminated box, facing the entrance to the dark box and the following

parameters were noted for 5 min: the latency of the first crossing, the amount of time spent

in the light area, and total number of crossings from one compartment to the other. To

verify the influence of the different receptors, ritanserin and picrotoxin were administered

30 min before psychollatine (7.5mg/kg). Statistical analysis involved an initial one-way

analysis of variance (ANOVA), followed by Student Newman Keuls (SNK) test.

PTZ induced convulsions. Mice were divided in five groups (n=10) and test drugs (saline,

PPG, diazepam, phenobarbital and psychollatine) were given IP. After 30 min mice

received PTZ (88 mg/kg s.c.). Following PTZ injection, animals were individually placed

in transparent acrylic chambers (20 x 20 x 20 cm) and observed during 60 minutes for the

presence of clonic convulsions lasting more than 3 seconds

. Data was analysed through

the Fisher´s exact test.

Potentiation of barbiturate sleeping time. Thirty minutes after treatment with saline, PPG,

diazepam and psychollatine (3 - 100 mg/kg) groups of eight mice (N=9-12) were treated IP

with 40 mg/kg of sodium pentobarbital. The sleeping time (time elapsed between loss and

recuperation of righting reflex) was recorded. The adopted criterion for recuperation of

righting reflex was that animals have to regain their normal posture for three consecutive

times when challenged to remain on their backs

. Statistical analysis involved an initial

one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Student Newman Keuls (SNK) test.

Spontaneous locomotor activity. The method was adapted from Creese et al. (1976)

Activity cages (Albarsch Electronic Equipment, 45 x 25 x 20 cm) equipped with 3 parallels

photocells automatically record number of crossings. Animals were individually habituated

to an activity cage for 10 minutes before receiving the following treatments (n=10-16):

saline, psychollatine (3 - 100 mg/kg) and diazepam (0.75 and 0.85 mg/kg). 30 minutes after

treatments the animals returned to the activity cages and crossings were recorded for 15

min. Statistical analysis involved an initial one-way analysis of variance (ANOVA),

followed by Student Newman Keuls (SNK).

Forced swimming test. We followed the method of Porsolt et al (1977)

as modified by

Sunal et al. (1994)

. Mice were individually forced to swim in an open cylindrical

container (diameter 30 cm, height 25 cm), containing 20 cm of water at 25 ± 1 °C for 6

min. The duration of immobility was recorded during the last 4 min of the 6 min testing

period. After vigorous activity, swimming attempts cease and the animal adopts a

characteristic immobile posture. A mouse is judged to be immobile when it floats in an

upright position and makes only small movements to keep its head above water. At the end

of the session mice were removed and dried with a towel. Statistical analysis involved an

initial one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Student Newman Keuls (SNK)

test.

Oxotremorine-induced tremors. Saline, scopolamine and psychollatine (3, 7.5, 10, 30 and

100 mg/kg) were administered i.p. to mice 30 minutes before an oxotremorine (0.5 mg/kg)

injection. For observation, mice were individually placed in transparent acrylic cages (20 x

20 x 20 cm) immediately after oxotremorine administration; tremors was scored visually at

5 min intervals for 30 min using the following a rating scale: 0 = no tremors, 1 =

intermittent moderate tremors, and 2 = continuous severe tremors. Data is expressed as the

total sum scores obtained in 30 min

and are expressed as median (interquartile ranges).

Data were analyzed by Kruskal-Wallis non-parametric analysis of variance; comparisons

between groups were run using Mann-Whitney U-test (two-tailed).

Step-down inhibitory avoidance. The test used was adapted from Netto and Izquierdo

(1985)

and from Maurice et al. (1994)

. Mice were habituated in the dim lighted room

for at least 30 minutes before the experiments. The inhibitory avoidance training apparatus

was a plastic box with 30 x 30x 40cm, with a platform (5 x 5 x 4 cm) fixed in the center of

the grid floor. Each mouse was placed on the platform and the latency to step-down (four

paws on the grid), was automatically recorded in training and test sessions. In the training

session, the mouse received a 0.3 mA scrambled foot shock for 15 s, upon stepping down.

Animals exhibiting step down latencies greater than 30 s in training were excluded from

experiments; less than 5% of the animals met this exclusion criterion. The test session was

performed 24h later, with the same procedure except that no shock was administered after

stepping down; an upper cut-off time of 300 s was set.

Drugs (saline, PPG 10%, MK-801, diazepam or psychollatine) were administered

intraperitoneally (ip) as follows: 30 min before training, to evaluate effects on task

acquisition (in this case no exclusion criteria was applied); immediately after training, to

evaluate effects on memory consolidation and 30 min before testing, to assess memory

retrieval. The step-down latencies are expressed as median (interquartile ranges). Data were

analyzed by Kruskal-Wallis non-parametric analysis of variance; comparisons between

groups were run using Mann-Whitney U-test (two-tailed). Comparisons between training

and test sessions within each group were made by the Wilcoxon test. Spearman-rank

correlation coefficient was used to check dose-effect associations.

Acknowledgements

This study was supported by grants from CNPq (EE, ATH and FLB), and financial support

from CNPq and PROPESQ.

References and Notes

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4.2 Papel dos Receptores Glutamatérgicos e Dopaminérgicos no Perfil

Psicofarmacológico do Alcalóide Indol-monoterpênico Psicolatina (J. Nat. Prod.,

in press).

4.2.1 INTRODUÇÃO

O glutamato é um importante neurotransmissor excitatório e está

envolvido não somente na transmissão sináptica rápida, mas também no

desenvolvimento e manutenção de potenciais de longa duração (LTP), diretamente

associados aos processos de maturação cerebral, aprendizado e memória,

considerados como exemplos de plasticidade sináptica (GREENAMYRE; PORTER,

1994; LIPTON; ROSENBERG, 1994; MELDRUM, 1994; AMADIO et al., 2004).

Além disso, existem vários estudos implicando os receptores NMDA na patogênese

dos distúrbios afetivos, como ansiedade e depressão (ADAMEC et al., 1999; ROSA

et al., 2003), dor (PERKINS; DRAY, 1996), além de ter papel central na isquemia

hipóxica, epilepsia (LATYSHEVA; RAYEVSKY, 2003) e distúrbios

neurodegenerativos (Doença de Huntington, Parkinson, Alzheimer, etc;

SCHWARCZ; MELDRUM, 1985).

O atual entendimento sobre a esquizofrenia admite que dopamina não

é o único neurotransmissor em desequilíbrio e que outros neurotransmissores

(noradrenalina, serotonina, acetilcolina, glutamato e GABA) podem contribuir

significativamente na expressão deste distúrbio (CARLSSOM et al., 1999). De

acordo com esta observação, além das doenças neurológicas neurodegenerativas, das

desordens afetivas e do desenvolvimento da epileptogênese, o sistema

glutamatérgico também está envolvido na esquizofrenia. Acredita-se que a

esquizofrenia tenha um componente neurodesenvolvimental, resultando em

anormalidades no desenvolvimento cerebral e, particularmente, na maturação do

sistema glutamatérgico (LATYSHEVA; RAYEVSKY, 2003), crucial para a

sinalização axonal durante o crescimento (RAKIC et al., 1994).

Pacientes esquizofrênicos apresentam acentuado déficit cognitivo,

sendo que este depende, em parte, da plasticidade neuronal mediada pelos receptores

glutamatérgicos do tipo NMDA (DAW et al., 1993). Além disso, os receptores

NMDA podem ser importantes no processo que leva a um bloqueio sináptico visto

em adolescentes, idade de início da esquizofrenia (FEINBERG, 1990). Também na

esquizofrenia verifica-se uma redução da matéria cinzenta em várias regiões do

cérebro e tem sido sugerido que esta redução pode ser resultado da neurotoxicidade

mediada pelos receptores NMDA (ZIPURSKY et al., 1992).

Muitos dos comportamentos observados com antagonistas de receptor

NMDA podem ser resultado do cross talk destes fármacos com vários sistemas

neurotransmissores. Drogas antagonistas NMDA induzem um desequilíbrio

dopaminérgico semelhante ao padrão visto na esquizofrenia, e isto é possível já que

há uma interação entre os sistemas dopaminérgico e glutamatérgico (BRESSAN;

PILOWSKY, 2003). A liberação de DA no estriado está sob influência tônica

excitatória de glutamato. Foi demonstrado que o aumento dos níveis extracelulares

de glutamato induzido por um bloqueador da recaptação de glutamato no núcleo

acumbens produziu uma redução da liberação de DA na mesma região cerebral;

sendo a redução dependente de receptores NMDA. Alguns resultados têm

demonstrado que antagonistas NMDA, como PCP e MK-801, aumentam a liberação

de DA no núcleo acumbens, estimulam a atividade da maioria dos neurônios

dopaminérgicos mesolímbicos dentro da área tegmental ventral (RADA et al.,

2003).

Antagonistas não competitivos do receptor NMDA, tal como MK-801,

produzem hiperatividade locomotora, comportamento estereotipado e ataxia em

roedores. Tanto a hiperatividade quanto o comportamento estereotipado podem ser

abolidos por depleção de DA das vesículas neuronais por reserpina ou pela

administração de antagonistas dopaminérgicos, indicando que os principais efeitos

comportamentais de MK-801 são dependentes de DA (YAN et al.,1997).

4.2.2 OBJETIVOS

Considerando as propriedades farmacológicas identificadas para

psicolatina, que parecem envolver a participação de NMDA, e a importância deste

receptor, este trabalho teve por objetivo investigar os efeitos de psicolatina em

modelos comportamentais relacionados a receptores glutamatérgicos e

dopaminérgicos.

Role of Glutamate and Dopamine Receptors in the Psychopharmacological

Profile of the Indole Alkaloid Psychollatine

Fernanda L. Both,

†,‡

Lisiane Meneghini,

‡

Vitor A. Kerber,

Amélia T. Henriques,

†

and Elaine Elisabetsky,*

†,‡

Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil; Laboratório de Etnofarmacologia,

Departamento de Farmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,

Porto Alegre/RS, Brazil;

Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR, Brazil

*Author to whom correspondence should be addressed. Tel/Fax: 55 51 3316 3121.

E-mail: [email protected]

Dedicated to Dr. Norman R. Farnsworth of the University of Illinois at Chicago for

his pioneering work on bioactive natural products.

†

Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul

‡

Laboratório de Etnofarmacologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Universidade Federal do Paraná

Abstract

Psychollatine (1), a new glycoside indole monoterpene alkaloid isolated from

Psychotria umbellata, has shown an interesting psychopharmacological profile. This

study aimed to investigate the role of NMDA glutamate and dopamine receptors in

mediating the properties of 1. Psychollatine (1) was assessed for NMDA-induced

seizures, MK-801 induced hyperlocomotion, amphetamine-induced lethality, and

apomorphine-induced climbing behavior in mice. Psychollatine (1) (100 mg/kg) and

MK-801 (0.3 mg/kg) prevented NMDA-induced seizures (P <0.01), while 1 (100

mg/kg) attenuated the MK-801-induced hyperlocomotion (P <0.05). Compound 1 (3

and 10 mg/kg), as well as chlorpromazine (4 mg/kg) prevented amphetamine-

induced lethality (P <0.05). Finally, 1 (10 mg/kg) (P <0.05), MK-801 (0.2 mg/kg)

(P <0.01), and chlorpromazine (4 mg/kg) (P <0.01) attenuated apomorphine-

induced climbing behavior. The present results strongly support the involvement of

NMDA glutamate receptors in the mode of action of psychollatine (1).

Introduction

There are a number of reasons to investigate drugs that modulate

NMDA glutamate receptors. The role of N-methyl-

-aspartate (NMDA) glutamate

receptors is recognized as being crucial in synaptic plasticity and long-term

potentiation, neurophysiological processes thought to underline learning and

memory.

1,2

Additionally, a growing body of evidence suggests the antagonism of the

NMDA receptor as a potential mechanism of action for anxiolytic

3,4

and

antidepressant drugs.

5-7

Moreover, dizocilpine (MK-801) (a potent and selective

non-competitive antagonist of NMDA receptors)

has been shown to interfere with

the development of tolerance and behavioral responses induced by a variety of drugs

of abuse including cocaine,

morphine,

nicotine,

diazepam,

and ethanol.

NMDA receptors have also been implicated in a variety of neuropathological

conditions including ischemia, epilepsy, various neurodegenerative diseases, and

psychiatric illness, including schizophrenia.

2,13

Along with the older and revised dopamine (DA) hypothesis of

schizophrenia, a hypoglutamatergic state is one of the major current explanatory

hypotheses for the pathophysiology of this psychiatric condition.

14,15

The

hypoglutamatergic hypothesis originated from the observation that non-competitive

NMDA antagonists such as phencyclidine (PCP), ketamine, and MK-801, in

elevated doses, mimic schizophrenia in volunteers, and exacerbate symptoms in

schizophrenic patients.

The DA hypothesis suggests that patients with

schizophrenia have elevated levels of dopaminergic neurotransmission, congruent

with the observation that all drugs effective in treating schizophrenia share the

common feature of blocking dopamine D

receptors to some extent.

However, the

dysfunction of dopamine may occur only in a subpopulation of patients suffering

from this heterogeneous disorder.

The current understanding of schizophrenia allows for the fact that

dopamine is not the only malfunctioning neurotransmitter, and that other

neurotransmitters (e.g., noradrenaline, serotonin, acetylcholine, glutamate and

GABA) may likewise present aberrant behavior.

DA neurons seem to be physiologically regulated by glutamatergic neurons.

15,19

Systemic or local administration of PCP or MK-801 severely disrupts the afferent

regulation of midbrain DA neuronal activity, and largely alters the functioning of,

for instance, the mesocortical and mesolimbic DA neurons.

14,18

Several other studies

have shown that MK-801 indirectly stimulates DA release and turnover in the brain,

and such increased DA states are thought to mediate the conditioned place

preference effects of MK-801;

the same reasoning would apply to the complex

behavioral syndrome characterized by increased locomotion, stereotypy, and

impaired motor coordination that follows MK-801 administration to rodents.

All

these effects are attenuated by D

and D

2/3

agonists or antagonists that inhibit

DAergic activity either through presynaptic or postsynaptic mechanisms.

20,22

However, some studies provide data that non-dopaminergic systems

mediate the actions of NMDA antagonists,

23-25

pointing to the involvement of

neurotransmitter systems other than dopamine in the central properties of NMDA

antagonists. In fact, in various brain regions, including the prefrontal cortex, the

hippocampus and the raphe, NMDA antagonism stimulates serotonin (5-HT)

turnover and release more consistently than the modulation of dopaminergic

activity, demonstrating a close relationship of NMDA with serotonergic

activity.

15,18,26,27

The psychotomimetic effects of NMDA antagonists can also be

attenuated or blocked by partial 5-HT

agonists, and selective 5-HT

antagonists.

It has been proposed that NMDA antagonists induce serotonin release, which in turn

activates 5-HT

receptors on glutamatergic neurons in the cortex, resulting in

glutamate release.

25,27

This direct link between the serotonergic and glutamatergic

systems is thought to be the basis for the observed decreased sensitization to NMDA

antagonists for a persistent period after cessation of chronic exposure to

antipsychotics.

The genus Psychotria L. (Rubiaceae) has been subjected to

considerable prior chemical and pharmacological investigation, revealing the

presence of bioactive alkaloids.

28-31

Psychollatine (formerly known as umbellatine 1)

is an indole-monoterpene alkaloid, isolated from Psychotria umbellata Vell.

(Rubiaceae).

Psychollatine exhibits psychopharmacological activities, including

mild analgesic effects against a number of algogenic stimuli,

and anxiolytic,

antidepressive, and amnesic effects

in mice models; these data indicate that this

compound modulates different neurotransmitter systems, including NMDA, opioid

and 5-HT

2A/C

receptors.

The present study has further investigated the role of NMDA and

dopamine receptors in the mode of action of psychollatine (1), through the analysis

its effects on NMDA-induced seizures, MK-801-induced hyperlocomotion,

apomorphine-induced climbing, and amphetamine-induced lethality in grouped

mice.

Results and Discussion

Newer atypical antipsychotic agents, such as clozapine, olanzapine,

and risperidone, have significant effects not only on dopamine receptor subtypes,

but also on serotonergic receptors (5-HT

2A/C

, 5-HT

and 5-HT

), α

-adrenergic,

histaminergic, muscarinic, and NMDA glutamate receptors.

13-15

Accordingly, there

is ample evidence that in addition to dopamine and serotonin receptors, other

neurotransmitter systems, such as adrenergic and cholinergic, are also involved in

the behavioral psychotomimetic syndrome induced by NMDA antagonists.

26,35

Adding to previously observed effects,

this study shows that psychollatine (1)

interferes with behaviors known to be mediated by glutamate NMDA and dopamine

central receptors.

NMDA-induced Seizures. Psychollatine (1, 100 mg/kg) and MK-801 (0.3 mg/kg)

reduced the incidence of NMDA seizures. A significant delay in seizure onset was

observed only in mice treated with the intermediate dose (75 mg/kg) of 1 (P < 0.05)

(Table 1). Psychollatine 75 and 100 mg/kg, and MK-801 0.3 mg/kg, significantly

protected mice from NMDA-induced fatal seizures (P <0.01).These results

suggested a moderate but significant antagonist effect of 1 on NMDA receptors.

Table 1

Effect of psychollatine against NMDA-induced seizures

Treatment (mg/kg)+ NMDA (15

Seizures

Incidence

Seizure Latency

(s)

Fatality Incidenc

Saline 16/22

540±84.14

15/22

MK-801 (0.3) 7/21##

360±32.07

0/21##

Psychollatine (50) 12/22

850±115.32

9/22

Psychollatine (75) 10/20

1020±146.15*

6/20##

Psychollatine (100) 7/19##

857.14±133.34

6/19##

Latencies are expressed as mean ± SE.** P < 0.01, * P < 0.05 vs. the control group

(ANOVA); ## P< 0.01 vs. the control group, Fischer´s Exact Test.

MK-801-induced Hyperactivity. The stimulant properties of MK-801 on

locomotion have been accepted as a glutamatergic hypofunction animal model of

psychosis that seems to be of clinical relevance, and may be of value in the search

for new antipsychotic agents.

Typical and atypical antypsychotic agents inhibit

MK-801-induced locomotion.

16,36,37

Our data demonstrate that psychollatine (1) at

7.5 mg/kg [F

(2,40)

= 3.9, P < 0.05] and 10 mg/kg [F

(2,39)

= 8.7, P < 0.05] significantly

reduced MK-801-induced hiperlocomotion [F

(2,40)

= 19.3, P < 0.05] at doses that per

se had no effect on locomotion.

Compound 1 at 100 mg/kg [F

(2,38)

= 10.1, P

<0.05] prevented MK-801-induced hyperactivity (Fig. 1b), and significantly

reduced locomotion on its own (Fig. 1a).

The analgesic effects of psychollatine (1) and its synergistic action

with MK-801 against capsaicin-induced pain suggested that 1 acts as a NMDA

antagonist.

The present results may also be understood as a consequence of

NMDA antagonism, since acute and chronic administration of NMDA antagonists

facilitate glutamate release,

38-41

thus minimizing some NMDA antagonist related

behaviors.

It has been suggested that glutamate is released as a compensatory

response to NMDA blockade; the released glutamate, by acting at non-NMDA

receptors, cause changes in behaviors elicited by NMDA antagonists.

15,38

Although

GABA receptors have been previously shown to be irrelevant for psychollatine (1)

effects, the possibility that

1 reverses MK801-induced hyperlocomotion by acting

in low doses as a partial NMDA agonist can not be ruled out.

100

150

200

250

300

SAL 1 (7.5) 1 (10) 1 (100)

Locomotor activity (counts)

100

150

200

250

300

350

400

450

L+S

SAL+MK-801

)+MK

801

10)+M

K-

801

1(1

00)

+MK

MK-801-induced hyperlocomotion

(counts)

Figure 1. Effect of psychollatine (1) on spontaneous locomotion (1a), and on MK-

801-induced hyperlocomotion (1b). SAL, saline 0.9%; dosages in mg/kg are

indicated after the treatments. Each column represents the mean ± SEM (N = 9-12).

* = P < 0.05 compared with SAL+SAL, and # P <0.05 compared with SAL+MK-

801, ANOVA/SNK.

An alternative interpretation of these results is an indirect

modulation of DA and 5-HT receptors via psychollatine (1) NMDA antagonism.

It has been demonstrated that the motor stimulatory effects of PCP or MK-801 may

be understood as the result of an increased nigrostriatal dopaminergic tone.

It was

also verified that the NMDA antagonist-induced hyperactivity is mediated via 5-

receptor activation, and 5-HT

receptor antagonists (like clozapine and

ritanserin), are effective in preventing NMDA-induced hyperlocomotion.

14,42,43

has been suggested that these serotonergic antagonists could specifically restore the

impaired burst firing in mesocortical neurons caused by systemic administration of

psychotomimetic NMDA- antagonists (such as PCP and MK-801) attenuating the

locomotor activity.

14,36,42

In fact, we have previously reported that 1 acts as a

5HT

2A/C

modulator, with patterns compatible with mixed agonist or inverse

agonist.

Therefore, a direct psychollatine (1) action as a serotonin modulator as

the basis for reducing NMDA-induced hyperlocomotion should not be ruled out.

Protection of Lethality Induced by Amphetamine in Grouped Mice. The

increased lethality induced by amphetamine in grouped mice is prevented by

antipsychotics (older and atypical), but not tranquilizers (e.g., barbiturates and

benzodiazepines).

The effectiveness of antipsychotics in this model is related to

their ability to block D

receptors,

44-46

a common feature to all effective

antipsychotic medication. As it can be seen in Figure 2 chlorpromazine was active,

whereas diazepam inactive. Psychollatine (1, 3 and 10 mg/kg) significantly

protected grouped mice from amphetamine-induced lethality, whereas 30 and 100

mg/kg were ineffective (Fig. 2), indicating that this alkaloid may interfere with

dopamine receptors in lower doses. The lack of effect of higher doses of 1 needs

further clarification, but bell shaped dose-responses curves have been previously

observed with dopamine and amphetamine related behaviors.

47-49

100

Lethality (%)

12345678

SAL PPG DZP CHLOR

1 1 1 1

10% (0.8) (4.0) (3.0) (10) (30) (100)

Figure 2. Effect of psychollatine (1) and chlorpromazine on amphetamine-induced

lethality in grouped mice. PPG10%, propylene glycol; DZP, diazepam; CHLORP,

chlorpromazine; dosages in mg/kg are indicated after the treatments. N = 10. * = P

< 0.05 compared with controls, Fischer.

Apomorphine-induced Climbing. Antagonism of apomorphine-induced climbing

is one of the most widely used tests to predict dopamine antagonist properties in

vivo.

21,50,51

Mice treated with apomorphine, a mixed D

agonist that stimulates

postsynaptic dopamine receptors in the striatum, tend to adopt a vertical position

along the walls of the cage;

the behavior is thought to be mediated by D

and D

activation.

As expected, chlorpromazine (4 mg/kg) inhibited apomorphine-

induced climbing behavior (0[0 - 1], P <0.01), when compared to control group (8[6

- 9], P <0.01) (Fig. 3). Psychollatine (1, 10 mg/kg) and MK-801 (0.2 mg/kg)

inhibited apomorphine-induced climbing behavior (5.5[3.25 - 7] P <0.05, 2[1 - 3] P

<0.01, respectively), although to a lesser extent in comparison with chlorpromazine.

Psychollatine inhibition of apomorphine-induced climbing could result from D

dopaminergic antagonism, but also by a dopaminergic modulation via glutamate

NMDA receptors.

The effect of compound 1 was not dose-dependent, conceivably

related to an optimal level of NMDA antagonism relevant for post synaptic

dopamine receptor antagonism.

AL+SAL

SALINE

MK-8010.2

HLOR4.0

(

)

1 (10)

(

)

1 (100)

Climbing Scores

Figure 3. Effect of psychollatine (1), chlorpromazine, and MK-801 on apomorphine-

induced climbing behavior in mice. SAL+SAL = saline+saline; SAL,

saline+apomorphine; CHLORP, chlorpromazine+apomorphine; dosages in mg/kg

are indicated after the treatments. N = 11-14. ** P <0.05 and *P < 0.01 compared

with saline+apomorphine, Mann-Whitney/Kruskal-Wallis.

In recent years, cross talk among glutamate, 5-HT, and DA systems

have been well documented.

20,27,54-56

Considering the current and previously

reported results,

33,34

the overall data suggest that the behavioral effects of

psychollatine (1) are related to its interference with the NMDA, 5-HT and DA

receptor cross talk. Undoubtedly, binding studies would be useful to further clarify

the molecular mechanism of psychollatine (1) and its complex dose-effect pattern.

Given that interactions at multiple receptors (D

5-HT

α1-adrenoceptor, NMDA)

seem to be the key factors that vary the effectiveness of novel atypical agents in

negative symptoms of schizophrenia as well as minimum extra pyramidal adverse

effects,

it can be argued that psychollatine (1) is a potential antipsychotic.

Nevertheless, its general profile indicates few advantages compared to known drugs

(e.g., an amnesic effect). However, this study supports the further investigation of

the indole monoterpene alkaloid psychollatine (1) as an interesting template for the

development of new psychoactive drugs.

Experimental Section

General Experimental Procedures. Diazepam (DZP), N-methyl-

-aspartate

(NMDA), and propylene glycol (PPG) were acquired from Sigma; MK-801 was

acquired from RBI (USA). Drugs and vehicles were administered intraperitoneally

(i.p.), except for apomorphine given subcutaneously (s.c.), as 0.1 mL/ 10g of body

weight. Diazepam (0.8 mg/kg) was suspended in propylene glycol 10% (v/v).

Psychollatine (1, 3 - 100 mg/kg) was solubilized in one or a few drops (20-60 µL) of

HCl (1 N); the final volume was adjusted with saline, and the pH adjusted (7.0) with

a few drops of NaOH (1 N). NMDA (150 mg/kg), MK-801 (0.2 - 0.3 mg/kg),

amphetamine (12.5 mg/kg), chlorpromazine (4.0 mg/kg), and apomorphine (2

mg/kg) were diluted in saline. Control groups received saline (NaCl 0.9%) or PPG

(10%) as appropriate.

Plant Material. Psychotria umbellata Vell. (Rubiaceae) leaves were collected at

Torres (Rio Grande do Sul, Brazil) in February 2003; voucher material (MBM

48571) has been deposited at the herbarium of the Museu Botânico Municipal de

Curitiba (PR, Brazil).

Extraction and Isolation. The procedures used for isolating psychollatine (1) were

detailed elsewhere;

1 exhibited physical and spectroscopic data consistent with

literature values.

32,34

Animals. Experiments were performed with male adult mice (CF1), acquired from

Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) at 2 months of age.

Animals were maintained in our own facilities [22±1 °C, 12 h light/dark cycle, free

access to food (Nuvilab CR1) and water] for at least two weeks before the

experiments. All procedures were carried out according to institutional policies on

experimental animal handling.

NMDA-Induced Seizures. NMDA was administered at 150 mg/kg (i.p.). MK-801

0.3 mg/kg, saline and psychollatine (1, 50, 75 and 100 mg/kg) were given i.p. 30

min before the administration of NMDA. Immediately after administration of the

NMDA, animals were individually placed in acrylic cages, and the occurrence of

seizure observed for 30 min. A full seizure was recorded when clonic movements of

the limbs were observed, accompanied by loss of righting reflex. The presence of

convulsions, latency to the first convulsive episode, and lethality were noted.

Each

experimental group consisted of at least 10 animals. Fisher´s exact test was used for

statistical analysis.

MK-801-induced Hyperactivity. The method was adapted from Ninan and

Kulkarni.

Locomotion activity was measured by using activity cages. Mice (n=10-

25) were treated with saline or psychollatine (1, 7.5, 10 and 100 mg/kg), and 30 min

later received MK-801 (0.25 mg/kg). Thirty minutes after MK-801 administration,

mice were placed individually in the activity cages, and the motor activity was

recorded for 5 min, starting 2 min after the mice were placed in the cage. Statistical

analysis involved an initial one-way analysis of variance (ANOVA), followed by

Student Newman Keuls (SNK).

Protection of Lethality by Amphetamine in Grouped Mice. Mice were divided in

groups of 10, and received amphetamine (12.5 mg/kg, i.p) before being placed in

small boxes (19.0 x 9.0 x 9.5 cm). Chlorpromazine (4 mg/kg) and psychollatine (1, 3

– 100 mg/kg) were given i.p. 30 min before amphetamine. Lethality was noted 24 h

after amphetamine administration.

Fisher´s exact test was used for statistical

analysis.

Apomorphine-induced Climbing Behavior. The method was adapted from Pinsky

et al.

Saline (0.9%), MK-801 (0.2 mg/kg), chlorpromazine (4.0 mg/kg) and

psychollatine (1, 3 - 100 mg/kg were administered (i.p.) to mice (n=11-14) 30 min

before the injection of apomorphine 2 mg/kg (s.c.). Immediately after being injected

with apomorphine, the mice were placed individually into cylindrical individual

cages (diameter, 12 cm; heigh, 14 cm) with the floor and wall consisting of metal

bars (0.2 cm diameter; separated by 1-cm gaps). Climbing behavior was measured

by an observer at 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min after apomorphine administration.

Climbing behavior was scored for 1 min during the observation periods, and the

highest rating observed during this 1-min was used in the calculations. Scores were

as follows: four paws on the floor (0 point), fore-feet holding the wall at 45° (1

point), fore-feet holding the wall at 90° (2 points), and all four paws holding the wall

(3 points), with a maximum of 18 points. The scores are expressed as median

(interquartile ranges), and analyzed by Kruskal-Wallis followed by Mann-Whitney

U-test (two-tailed).

Acknowledgment. This study was supported by grants from CNPq (E.E., A.T.H.,

and F.L.B.), and financial support from CNPq.

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4.3 Atividade Antioxidante e Pró-oxidante do Alcalóide Indol-Monoterpênico

Psicolatina Isolado de

Psychotria umbellata (

a ser submetido para Life Science).

4.3.1 INTRODUÇÃO

Espécies reativas de oxigênio ou reactive oxygen species (ROS) e

espécies reativas de nitrogênio ou reactive nitrogen species (

RNS)

são produzidas

durante o metabolismo normal, especialmente durante a respiração celular

(FERNANDES et al., 2004, EL-SHERBINY et al., 2003). A superprodução

contínua de ROS e de NOS, e/ou a redução das defesas antioxidantes (estresse

oxidativo) pode induzir dano cerebral, tanto diretamente através da interação e

destruição das proteínas celulares, lipídios e DNA, ou indiretamente por afetar as

vias de sinalização celular normais e regulação gênica (LI et al., 2002, SUN et al.,

2002). Este dano contínuo contribui para o desenvolvimento de diversas doenças

crônicas do sistema nervoso central, como derrame, neurotrauma e isquemias

cerebrais crônicas (EL-SHERBINY et al., 2003).

Vários produtos podem desempenhar um importante papel dentro

deste contexto em dois aspectos: aumentando a atividade dos recursos antioxidantes

celulares originais ou neutralizando os radicais livres

(SUN et al., 2002).

Entre os

compostos que interferem com os efeitos das ROS, os derivados indólicos

constituem um grupo farmacológico e químico distinto (STOLC, 1999).

Dentre os alcalóides indólicos usados em terapia, talvez os mais

conhecidos sejam vimblastina e vincristina. Amplamente utilizados no tratamento de

diversos tipos de câncer (RASKIN et al., 2002). Além da atividade antitumoral,

outros estudos demonstraram que alcalóides produzidos em culturas de Catharantus

apresentaram atividade antioxidante (LEMÉNAGER et al., 2004).

Derivados sintéticos do alcalóide vincamina, como a vimpocetina,

possuem efeito neuroprotetor em vários modelos experimentais. A vimpocetina

apresenta efeitos protetores em relação à morte celular induzida por várias

excitotoxinas e inibe a citotoxicidade do glutamato em neurônios cerebrocorticais

(PEREIRA et al., 2003).

Triptofano, serotonina e melatonina, derivados indólicos comuns em

tecidos biológicos (WÖLFLER et al., 1999), são potentes seqüestradores de radicais

hidroxil (STOLC, 1999; CANO et al., 2003).

Devidos aos efeitos antioxidantes e neuroprotetores de alcalóides

indólicos, tanto derivados de plantas como de animais, tornou-se interessante avaliar

o efeito de psicolatina quanto ao seu potencial antioxidante.

4.3.2. OBJETIVOS

Este trabalho teve por objetivo avaliar os possíveis efeitos

antioxidantes de psicolatina sobre diversos parâmetros de estresse oxidativo.

Para tanto, foram utilizados o conteúdo de radicias livres (DCF), a

reatividade antioxidante total (TAR), o ensaio de peroxidação lipídica (TBARS) e a

oxidação dos resíduos de triptofano (TRI) e tirosina (TIR) no córtex e hipocampo de

camundongos tratados com psicolatina (vide anexo 1).

4.4 Toxicidade Aguda Induzida pelo Alcalóide Indol-Monoterpênico Psicolatina

Isolado de

Psychotria umbellata Vell.

(submetido à Toxicon, 2005).

4.4.1 INTRODUÇÃO

Alguns medicamentos fitoterápicos têm uma longa história que resulta

da soma de conhecimentos e experiências em diferentes culturas onde têm sido

usados para manutenção da saúde, assim como para a prevenção, diagnóstico e

tratamento de doenças físicas e mentais (WHEELWRIGHT, 1994). Entretanto, no

Brasil, os dados existentes são insuficientes para garantir a qualidade, eficácia e

segurança da grande maioria dos nossos fitoterápicos (FERREIRA, 1998;

CALIXTO, 2000). A idéia de que o “natural não faz mal” é falsa e prejudicial à

população desinformada. As plantas contêm centenas de constituintes, alguns dos

quais são altamente tóxicos. Portanto, mesmo que os efeitos colaterais dos

fitomedicamentos sejam menos freqüentes e graves do que os medicamentos

sintéticos, ensaios devem ser realizados para confirmar a sua segurança (MORAES

et al., 2003).

O ensaio de toxicidade aguda é uma etapa inicial para a avaliação do

perfil toxicológico de produtos naturais, podendo sugerir o mecanismo de toxicidade

envolvido na absorção dos mesmos pela via sistêmica e oral. Este ensaio é

indispensável para o estabelecimento de doses a serem utilizadas em estudos

subcrônicos (PERES et al., 2003).

4.4.2. OBJETIVOS

Este trabalho teve por objetivo verificar a DL50 e sinais de toxicidade

aguda em animais tratados com psicolatina (vide anexo 2).

5 DISCUSSÃO

Desde os tempos mais antigos o reino vegetal tem sido reconhecido

como uma fonte de novas substâncias terapêuticas. Atualmente observa-se a

existência de medicamentos derivados de plantas, sendo formulados a partir da

molécula natural, da remodelação da sua estrutura ou como fonte de matéria-prima

para medicamentos semi-sintéticos dando origem a compostos com maior atividade

terapêutica (HAMBURGER;

HOSTETTMANN,1991; CURTIS-PRIOR et

al.,1999). Além disso, os compostos extraídos de plantas representam importantes

ferramentas em farmacologia e bioquímica (FARNSWORTH, 1990).

Por essa razão, pela grande importância que as plantas tem no alívio do

sofrimento humano causado por diversas doenças e também baseado em dados de

1995 que mostram que nos 11 produtos mais vendidos, pelo menos um ingrediente

ativo com estrutura baseada em componentes na natureza era encontrado, justifica-

se a continuidade de pesquisas que busquem novas e melhores drogas derivadas de

plantas.

A psicolatina é um alcalóide indol-monoterpênico isolado de

Psychotria umbellata. Assim como outros alcalóides isolados de Psychotria, como a

hodgkinsina e a psicotridina (AMADOR et al., 2000, 2001), a psicolatina apresentou

atividade analgésica dose-dependente em modelos de dor induzida por estímulos

térmicos (placa quente e teste da retirada da cauda ao estímulo térmico) e químicos

(capsaicina e formalina). Embora a atividade analgésica seja moderada e em doses

próximas as que causam sinais de toxicidade, o mecanismo de ação despertou

interesse já que parece envolver a ativação de receptores opiáceos e o antagonismo

de receptores glutamatérgicos NMDA (BOTH et al., 2002).

O glutamato está implicado em muitas das ações relacionadas à

serotonina (5-HT), principalmente na patogênese dos distúrbios afetivos, tais como

ansiedade e depressão (ADAMEC et al., 1999; ROSA et al., 2003). Processos

como aprendizado e memória também implicam a participação do glutamato

(AMADIO et al., 2004), além de 5-HT (MENESES; HONG, 1997; LIANG, 1999),

sendo os subtipos de receptores 5-HT

e 5HT

2A/C

especialmente relevantes nesta

discussão (FLETCHER et al., 1996; BENEYTEZ et al., 1998; KHALIFA, 2003).

Considerando a importância dos receptores glutamatérgico e

serotonérgico e ao fato de ser este alcalóide de fácil obtenção, esse trabalho teve o

objetivo de complementar o perfil psicofarmacológico de psicolatina bem como dar

início à elucidação de seus possíveis mecanismos de ação.

Considerando que o efeito ansiolítico da psicolatina em dois modelos

comportamentais (teste da placa perfurada e claro/escuro) foi revertido por

administração prévia de ritanserina (antagonista dos subtipos de receptores

serotonérgicos 5-HT

2A/C

; ver artigo científico, 4.1), parece claro que estes receptores

estão implicados nesta propriedade de psicolatina. Receptores serotonérgicos

também podem estar implicados na atividade antidepressiva observada em animais

tratados com psicolatina (modelo de nado forçado), e ainda indiretamente modular a

função dopaminérgica explicando o resultado obtido no teste da letalidade induzida

por anfetamina em animais agrupados e escalada por induzida por apomorfina

(artigo científico, 4.2 e figura 1).

A modulação indireta de serotonina sobre o sistema dopaminérgico

pode ser explicada através de diversos estudos. Apesar de todos concordarem que a

função dopaminérgica mesencefálica é crítica para um funcionamento normal do

cérebro e que está bem estabelecido o controle do sistema serotonérgico sobre a

atividade de neurônios dopaminérgicos; existem dados controversos na literatura,

aonde a influência de serotonina em neurônios dopaminérgicos, parece ser

específica dependendo da via neuronal considerada. ALEX et al. (2005) mostraram

que agonistas inversos e antagonistas de 5-HT

injetados diretamente no estriado e

córtex pré-frontal aumentam a liberação de dopamina no estriado, mas não no córtex

pré-frontal; os autores sugerem que receptores 5-HT

do estriado inibem a liberação

de dopamina na via nigroestriatal. No entanto, DI MATTEO et al. (2002),

investigando o papel de antagonistas 5-HT

no controle de funções dopaminérgicas,

mostraram claramente que estes antagonistas aumentam a liberação de dopamina na

área mesocorticolímbica. A administração de agonistas inversos 5-HT

também

aumenta a liberação de dopamina no córtex pré-frontal (GOBERT et al., 2000;

PEHEK et al., 2001; MELTZER, 2003). Outros autores mostram que a liberação de

dopamina induzida por antagonistas serotonérgicos no córtex pré-frontal é também

dependente de receptores 5HT

(CHUNG et al., 2004; BONACORSO et al., 2002).

Recentemente, mostrou-se que a liberação de dopamina em neurônios

mesencefálicos está permanentemente sob o controle de receptores 5TH

que

exerceriam esta função constitutivamente (DEURWAERDÈRE et al., 2004; figura

1).

Figura 1: Interação entre o sistema serotonérgico e dopaminérgico.

Antagonistas ou

agonistas

inversos 5-

HT2A/C

liberação de DA

Explicaria a atenuação da

escalada induzida por

apomorfina e a letalidade

por anfetamina

liberação de DA está sob controle de receptores 5-H

O aumento da letalidade induzida por anfetamina, fármaco que atua

pré-sinapticamente para aumentar a transmissão dopaminérgica, é prevenida por

antipsicóticos, mas não por tranquilizantes (e.x., barbitúricos e benzodiazrpínicos)

(BOURIN et al., 1986; BATTISTI et al., 2000). A psicolatina, assim como a

clorpromazina, preveniram significativamnete a letalidade (artigo científico, 4.2). A

habilidade de psicolatina em reduzir a letalidade pode ser explicada pela sua

modulação sobre receptores 5-HT, NMDA e dopaminérgicos, visto que este efeito

preventivo está relacionado à habilidade de antipsicóticos em bloquear receptores D

(BOURIN et al., 1986; figura 1 e 2).

O antagonismo do comportamento de escalada induzida por apomorfina é

um dos testes mais utilizados como preditivo de propriedades antagonistas

dopaminérgicas in vivo (KIM et al., 1999). Neste teste, apomorfina, agonista misto

, diretamente ativa receptores dopaminérgicos pós-sinápticos no estriado

(BATTISTI et al., 2000). A psicolatina reduziu o comportamento de escalada

sugerindo antagonismo de receptores dopaminérgicos e/ou uma modulação

glutamatérgica e 5-HT da função dopaminérgica em receptores pós sinápticos D

(artigo científico, 4.2 e figura 1 e 2).

A modulação da função glutamatérgica sobre o sistema dopaminérgico

também pode ser entendido como o resultado de um antagonismo dos receptores

NMDA (MOGHADDAM et al., 1997; BREESE et al., 2002) pela psicolatina,

sugerido pela analgesia no teste de capsaicina, onde a psicolatina apresentou

sinergismo de ação com MK-801 e pelo bloqueio de convulsões induzidas por

NMDA.

Como visto no artigo científico 4.2, a psicolatina reduziu o

aparecimento de convulsões induzidas por NMDA. Além disso, a psicolatina, bem

como MK-801 protegeram os animais da morte em comparação com o grupo

controle. A psicolatina em doses menores reduziu a hiperlocomoção induzida por

MK-801 e na maior dose preveniu a hiperatividade (artigo científico, 4.2).

Este alcalóide preveniu comportamentos que são mediados por

receptores glutamatérgicos NMDA e dopaminérgicos no sistema nervoso central. Os

efeitos de psicolatina no teste de convulsões induzidos por NMDA sugerem um

moderado, porém significante efeito antagonista de psicolatina sobre receptores NMDA.

A modulação da função glutamatérgica sobre o sistema dopaminérgico

que explicaria alguns dos efeitos de psicolatina apóiam-se em dados de literatura que

demonstram que uma única dose de MK-801 tem ação antidopaminérgica,

resultando na inibição do comportamento de escalada induzida por apomorfina

(agonista dopaminérgico D

e D

; KIM et al., 1996). Embora se saiba que o

glutamato tem papel facilitador pré-sináptico em terminais dopaminérgicos

induzindo a liberação de DA (CARLSSON; CARLSSON, 1990), o fato de

antagonistas NMDA bloquearem o comportamento de escalada induzida por

agonista dopaminérgico sugere que glutamato possa também modular a função

dopaminérgica em nível pós sináptico (KIM et al., 1996).

Figura 2: Interação entre o sistema glutamatérgico e dopaminérgico.

ntagonistas NMDA

(MK-801)

ação antidopaminérgica

O comportamento de

escalada induzido por

apomorfina e letalidade por

anfetamina

Vários estudos demonstram que a administração aguda e crônica de

antagonistas NMDA também facilitam a liberação de glutamato minimizando a

locomoção e comportamentos estereotipados induzidos por MK-801, por uma

resposta compensatória ao bloqueio dos receptores NMDA (MOGHADDAM et al.,

1997; BREESE et al., 2002). O efeito de psicolatina em inibir o comportamento de

hipelocomoção induzido por MK-801 em doses que sozinhas não tem efeito sobre a

atividade locomotora (BOTH et al., 2005) pode ser devido a este fator.

Estes resultados sobre a hiperlocomoção induzida por MK-801

sugerem que além da participação direta de receptores NMDA, outros receptores

também podem estar envolvidos, como receptores dopaminérgicos e

serotoninérgicos (BOTH et al., 2005), visto que tem sido demonstrado que os efeitos

estimulatórios de fenciclidina (PCP) ou MK-801 podem ser explicados pela

desinibição do tônus dopaminérgico nigrestriatal direta ou indiretamente (MOHN et

al., 1999). Além disso, outros estudos verificaram que a hiperatividade induzida por

antagonistas NMDA é mediada via ativação de receptores 5-HT-

(SMITH et al.,

1999; SVENSSON, 2000; figura 3), sugerindo que sistemas não-dopaminérgicos

também estão implicados nas ações de antagonistas NMDA (CARLSSON et al.,

2000; MAREK et al., 2000).

Os efeitos psicoestimulantes e psicotomiméticos de antagonistas

NMDA (MK-801 e PCP) também podem ser atenuados ou bloqueados por agonistas

parciais 5-HT

e antagonistas seletivos 5-HT

(YAN et al., 1997, SMITH et al.,

1999; SVENSSON, 2000). Em várias regiões cerebrais (incluindo córtex pré-frontal,

hipocampo, estriado e rafe) antagonistas NMDA estimulam a liberação e o turn-over

de serotonina mais consistentemente do que a modulação da atividade

dopaminérgica (LÖSCHER et al., 1991; YAN et al., 1997; CARLSSOM et al.,

1999; BREESE et al., 2002). Foi sugerido que esta modulação da função

serotonérgica seria a responsável pelas propriedades antidepressivas de antagonistas

NMDA (SKOLNICK, 1999). Por sua vez, também tem sido proposto que a liberação

de serotonina induzida por antagonistas NMDA ativaria receptores 5-HT

neurônios glutamatérgicos no córtex resultando na liberação de glutamato (MAREK

et al., 2000). Assim se entenderia porque agonistas 5-HT

diminuem os efeitos

psicotomiméticos de antagonistas NMDA (ARVANOV; WANG, 1998). Esta relação

direta e complexa entre os sistemas serotonérgico e glutamatérgico parece ser a base

para a redução da sensibilidade a antagonistas NMDA observada por longos

períodos após a retirada de antipsicóticos ingeridos cronicamente (BREESE et

al., 2002; figura 3).

Figura 3: Interação entre o sistema serotonérgico e glutamatérgico.

Não existe consenso sobre os efeitos da atividade serotonérgica

quanto aos processos de aprendizado e memória; diferenças nos modelos e

subtipos de receptores parecem ser relevantes na compreensão de muitos

resultados encontrados na literatura (MENESES; HONG, 1997; MISANE ;

ÖGREN, 2000; SOLANA-FIGUEROA et al., 2002; KHALIFA, 2003). No

ntagonistas ou

agonistas

arciais 5-H

Efeito psicotomimético e

psicoestimulante de MK-801 e

PCP

Estimulam a liberação

turn-over

de 5-HT

tivaria receptores 5-H

receptores glutamatérgicos

no córtex

Libera

glutamato

entanto, a amnésia induzida pela psicolatina (artigo científico, 4.1) é compatível

com antagonismo NMDA (ROULLET et al., 2001; HLINÁK; KREJCÍ, 2002;

BARDGETT et al., 2003), assim como com uma atividade anticolinérgica

sugerida pela reversão de tremores induzidos por oxotremorina pela psicolatina

(artigo científico, 4.1). Uma moderada atividade analgésica, atividade ansiolítica,

amnésica e antimuscarínica são aspectos procurados em drogas pré-anestésicas.

Como pode ser observado no artigo científico 4.3 (anexo 1), a psicolatina

alterou vários parâmetros do estresse oxidativo em diferentes regiões cerebrais. A

reatividade antioxidante total (TAR) é um índice útil da capacidade de uma dada

amostra em modular os danos associados ao aumento da produção de radicais livres

(LISSI et al., 1992), já que determina a qualidade de antioxidantes presentes em uma

amostra (LISSI, 1995; DESMARCHELIER et al., 1997). É importante notar que a

psicolatina aumentou a capacidade antioxidante total no córtex e hipocampo; no entanto

a formação de radicais livres (DCF) foi reduzida apenas no córtex. Ao contrário, no

hipocampo foi observado um aumento significante nos níveis de DCF com a maior

dose de psicolatina. Esse efeito pró-oxidante pode ser conseqüente à liberação de

glutamato resultante do antagonismo de receptores 5HT

pela psicolatina. Acredita-

se que o aumento de radicais livres prejudica o potencial de longa duração (LTP) no

hipocampo (McGAHON et al., 1999) e contribui com o déficit cognitivo

relacionado à idade (HALLIWELL, 1992; RÁDAK et al., 2001). O aumento nos

níveis de DCF no hipocampo induzido por psicolatina pode ser relevante para a

propriedade amnésica verificada em esquiva inibitória (BOTH et al., 2005).

O paradigma que dominou o século XIX entendia doenças como o

resultado de etiologias específicas, com o corolário de terapias específicas

preferencialmente com drogas com único mecanismo de ação. Ao contrário, o

conceito atual entende doenças não como eventos e sim como processos. A

probabilidade de uma doença se expressar depende não só de uma causa, mas sim de

vários fatores determinantes, que por sua vez são influenciados pelas múltiplas e

concomitantes exposições a diversas variáveis relevantes (VINEIS; PORTA, 1996

)

Na maior parte das vezes, há no mínimo a interação de fatores geneticamente

determinados com as variáveis ambientais (hábitos, dieta, atividade física, exposição a

toxinas e poluentes, etc).

Quanto ao sistema nervoso central (SNC), na última década o

entendimento do mecanismo de ação de drogas psicotrópicas evoluiu da modulação

de um sistema neurotransmissor (ou receptor específico) para o de múltiplas e

repetidas interferências no SNC. Assim, o efeito terapêutico dessas drogas resultaria

destas múltiplas interferências que em conjunto modificam o estado funcional do

trato neuronal ou área em questão (HYMAN; NESTLER, 1996)

Com a

constatação

de que os antipsicóticos atípicos mostram um efeito terapêutico superior aos

clássicos, e interferem com receptores pertencentes a diversos sistemas de

neurotrasmissão, o cross talk (modulação mútua) entre os vários sistemas cerebrais,

a modulação indireta de receptores e as vantagens de interferir com múltiplos alvos

relevantes a um dado distúrbio tem mudado o paradigma de drogas e terapias no

SNC (TRUDEAU, 2004). É bem estabelecido o cross talk entre aminoácidos

excitatórios e os sistemas serotonérgico e dopaminérgico; a literatura é

particularmente rica de dados que subsidiam a interação entre serotonina (5-HT) e

dopamina (DA), entre glutamato e dopamina e entre serotonina e glutamato

(JONES; BLACKBURN, 2002; COOK et al., 2004; BREESE et al., 2002).

Os dados obtidos através de modelos comportamentais demonstram

que psicolatina administrada sistemicamente possui clara ação farmacológica. A

psicolatina apresentou propriedades ansiolítica, antidepressiva, amnésica, além de

interferir com comportamentos modulados por dopamina (Figura 5). Cabe lembrar

que alguns dos modelos comportamentais usados neste estudo são comumente

empregados em programas de desenvolvimento de novas drogas por terem valor

preditivo quanto a propriedades terapêuticas em humanos.

Como falado no início dessa discussão, o entendimento do mecanismo

de ação de drogas que atuam sobre o SNC evoluiu da modulação de um único

sistema neurotransmissor ou único receptor para o de múltiplas e repetidas

interferências no SNC – cross-talk. De acordo com os resultados deste trabalho, os

efeitos de psicolatina são compatíveis com a literatura no que se refere às interações

entre serotonina e dopamina e glutamato e dopamina, bem como aquelas que se

referem entre a interação de serotonina e glutamato (Figura 5).

Resumidamente pode-se dizer que os efeitos farmacológicos

apresentados por psicolatina em diversos modelos comportamentais são compatíveis

com antagonistas serononérgicos ou agonistas inversos 5-HT

2A/C

e com antagonistas

NMDA (Figura 4 e 5). A modulação de psicolatina sobre receptores dopaminérgicos

parece ser indireta via receptores 5-HT e NMDA. A participação de receptores

GABAérgicos não parece ser significativa, já que a administração prévia de

picrotoxina não influencia a atividade ansiolítica de psicolatina, que também não

bloqueia convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ).

Modula

Figura 4: Possíveis mecanismos de ação de psicolatina.

Modula receptores

serotoné

icos 5-HT

Psicolatina

Modula receptores

lutamatér

icos NMD

ntagonista ou Agonista inverso

5-HT

2A/C

ntagonista de receptor NMDA

Atividade ansiolítica

Figura 5: Possíveis atividades farmacológicas e mecanismos de ação de psicolatina.

Em conjunto, estes estudos reforçam a idéia de que o alcalóide indol-

monoterpênico psicolatina pode ser explorado como modelo estrutural para o

desenvolvimento de medicamentos ou fármacos que atuem em subtipos de

receptores NMDA e 5-HT. Fármacos com este mecanismo de ação tem sido

sugeridos como pré-anestésicos, antipsicóticos, e ainda para o tratamento do mal de

Parkinson. Para tanto, o estudo do perfil psicofarmacológico de psicolatina poderia

ser complementado através de outros modelos comportamentais tais como catalepsia

induzida por haloperidol, estereotipia induzida por anfetamina, estereotipia induzida

por MK-801; cabe ainda verificar a influência deste alcalóide na tolerância e

dependência à morfina. Estudos neuroquímicos são também necessários para

esclarecer o mecanismo de ação de psicolatina, especialmente analisando a interação

deste composto com os sistemas serotonérgico, dopaminérgico e glutamatérgico. O

conjunto de correlatos neuroquímicos e perfil comportamental permitiriam uma

melhor definição do mecanismo de ação, da aplicabilidade e da relevância da

5-H

2A/C

(psicolatina)

Atividade amnésica

Anta

onistas

NMDA

sicolatina

)

Atividade antidepressiva

Atividade anticonvuslivante

Inibi

ão da letalidade por anfetamina

e escalada por apomorfina

(-)

(-) mesolimbica

(+)

lutamato

Hiperlocomo

ão por MK-801

(-)

modulação concomitante destes receptores no desenvolvimento de drogas

psicoativas.

6 CONCLUSÕES

A psicolatina promove, em camundongos, vários efeitos farmacológicos

relacionados ao sistema nervoso central, incluindo:

• Atividade ansiolítica, nos modelos de claro/escuro e placa perfurada,

dependente de receptores serotonérgicos 5-HT

2A/C

;

• Atividade anticonvulsivante, em convulsões induzidas por NMDA,

mas não por pentilenotetrazol;

• Atividade antidepressiva no modelo de modelo de nado forçado;

• Atividade amnésica no teste de esquiva inibitória;

• Atividade antipsicótica, prevenindo a letalidade induzida por

anfetamina em animais agrupados, a hiperlocomoção induzida por

MK-801 e o comportamento de escalada induzido por apomorfina;

• as doses tóxicas de psicolatina são bem superiores às que apresentam

as atividades acima.

Estes efeitos psicofarmacológicos parecem estar relacionados com:

• Modulação de receptores setotonérgicos 5HT

2A/C

;

• Bloqueio de receptores NMDA.

Os receptores gabaérgicos não parecem relevantes para atividade da

psicolatina, mas os receptores dopaminérgicos podem ser indiretamente modulados

pelas ações em NMDA e 5HT

2A/C

. Além disso, a psicolatina bloqueia tremores

induzidos por oxotremorina, sugerindo atividade anticolinérgica.

Quanto à avaliação dos efeitos de psicolatina nos parâmetros de estresse

oxidativo, verificou-se:

• Aumento da reatividade antioxidante total no hipocampo e córtex;

• Aumento do conteúdo de radicias livres (DCF) no hipocampo e

redução no córtex;

• Ausência de efeito quanto à peroxidação lipídica (TBARS),

oxidação dos resíduos de triptofano (TRI) e tirosina (TIR) no

hipocampo e no córtex.

Os resultados sugerem que, assim como outros compostos indólicos, a

psicolatina pode reduzir o dano induzido por situações de estresse oxidativo. As

diferenças na modulação do estado oxidativo observadas em diferentes estruturas

cerebrais pode ser explicada por diferenças no estado oxidativo basal dessas áreas,

ou por uma distribuição diferencial de psicolatina.

É improvável que o perfil psicofarmacológico de psicolatina possa ser

resultado de sua modulação num único sistema neurotrasmissor, mas pode-se

concluir que este composto apresenta um padrão semelhante a drogas que modulam

receptores NMDA e 5-HT. O tipo de modulação que a psicolatina exerce nestes

receptores só pode ser definitivamente esclarecida por estudos neuroquímicos, mas é

compatível com antagonistas e agonistas inversos de 5-HT (ZANGROSSI et al.,

2001), ou antagonistas glutamatérgicos NMDA (HLINÁK; KREJCÍ, 2002).

Este trabalho demonstra a importância de estudos farmacológicos de

produtos naturais na descoberta de compostos com mecanismo de ação

farmacológica diferenciado. O termo Psychotria, que empresta o nome a toda a tribo

Psychotriae, é aparentemente o resultado de uma transformação arbitrária feita por

Lineaus, do nome Psychotrophum (PETIT, 1964). Psychotrophum, o nome dado por

Browne, em 1756 é composto das duas palavras gregas: psyche=alma e

trophos=alimento (DILLENBURG; PORTO, 1985). Somando-se ao considerável

corpo de dados farmacológicos conhecidos com extratos e compostos isolados de

espécies do gênero Psychotria, os efeitos psicofarmacológicos aqui relatados para

psicolatina não apenas reforçam o interesse nos alcalóides encontrados neste gênero;

como também confirmam a adequação de sua denominação.

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8 ANEXOS

ANEXO 1

Antioxidative and prooxidative properties of the indole monoterpene alkaloid

psychollatine.

Fernanda L. Both

a,b

, Ionara R. Siqueira

, Vitor A. Kerber

, Amélia T. Henriques

and

Elaine Elisabetsky*

a,b

Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil;

Laboratório de Etnofarmacologia, Departamento de Farmacologia, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil;

Centro Universitário UNIVATES, Lajeado, RS, Brazil.

Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR, Brazil

*Corresponding author: Tel/Fax: (+)55 51 33163121.

E-mail address: elaine.elisabetsky@gmail.com. Caixa Postal 5072, 90041-970,

Porto Alegre, RS, Brazil.

Abstract

The aim of this study was to evaluate the in vivo antioxidant effect of

psychollatine. Adult male mice were treated (i.p.) with saline or psychollatine (7.5

and 30 mg/kg), and the hippocampi and cerebral cortex dissected out 30 min latter to

measure free radicals content, damage to macromolecules and total antioxidant

capacity. Psychollatine administration reduced free radicals level in the cortex,

however, paradoxically, increased in hippocampus the high dose group, as well as

increased the total antioxidant capacity in hippocampus and cortex. However,

psychollatine was devoid of effects on lipid peroxidation and on oxidation of

proteins in both brain structures cerebral cortex and hippocampus. The study

suggests that psychollatine is able to modify the cellular antioxidant network

efficacy in the brain, ultimately reducing the damage in oxidative stress conditions.

Keywords: Psychotria umbellata, psychollatine, antioxidant activity, indolic

alkaloid, brain

Introduction

Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) are

produced during normal metabolism, specially by cellular respiration (Fernandes et

al., 2004, El-Sherbiny et al., 2003). The continuous overproduction of ROS and

RNS, and/or the decrease in antioxidant defenses (oxidative stress) may induce

cerebral damage, either directly by interacting and destroying cellular proteins,

lipids and DNA, or indirectly by affecting normal cellular signaling pathway and

gene regulation (Li et al., 2002, Sun et al., 2002). This continuous damage

contributes to the development of several chronic diseases of the nervous system,

such as stroke, neurotrauma and chronic brain ischemia (El-Sherbiny et al., 2003).

Various products can play an important role within this context in two

aspects: enhancing the activity of original cellular antioxidants resources or by

neutraling free radicals (Sun et al., 2002). Among the compounds interfering with

the effects of ROS, indole derivatives constitute a distinct chemical and

pharmacological group (Stolc, 1999).

Indoles are related to the metabolism of tryptophan and present substitutions

in different positions of the indolic ring (Fig. 1) (Cano et al., 2003, Williams, 2001).

In animals, a most significant group of indolic compounds is that related with

melatonin. Besides playing a hormonal role, melatonin has been extensively studied

as a potent scavenger of hydroxyl radical, peroxinitrite and hypochlorous acid, as

well as singlet oxygen quencher (Cano et al., 2003, Stolc, 1999) exhibiting distinct

antioxidant features in vitro as well as in vivo (Reiter, 1998).

5-hydroxytryptamine (serotonin), another indole derivative, exhibits a wide

range of physiological actions. Serotonin is also reported to protect biological

tissues against radiation injury, to interact with or to scavenge ROS generated by

ionizing radiation, and act as antioxidant in lipid system, although behaving as pro-

oxidants in a non-lipid systems (Stolc, 1999).

Other important indolic compounds are the plant indole alkaloids

vinblastine, vincristine, vincamin and camptothecin isolated from Catharanthus

roseus L. Don. Vinpocetine, a derived synthetic of the alkaloid vincamin, possesses

antioxidant activity capable to reduce the formation of ROS and lipid peroxidation

(Pereira et al., 2003). Other synthetic indolic compound (beta carboline compound),

stobadine, is an agent with remarkable antioxidant or radical scavenging actions

(Stolc, 1999).

It has been suggested that the anti-inflammatory activity of nonsteroidal

anti-inflammatory drugs, like indomethacin, also indole derivatives, may be partly

attributed to its ability to scavenge ROS and RNS (Fernandes et al., 2004).

Psychollatine is an indol-monoterpene alkaloid (isolated from Psychotria

umbellata Vell., Rubiaceae) structurally related to serotonin (Fig. 1). Three alkaloids

have been identified in this species, psychollatine being the major one (nearly 1.3%

w/w of the dry plant). We have previously reported that psychollatine (formerly

known as umbellatine) possess mild analgesic and anti-inflammatory activity against

a number of algogenic stimuli suggesting the participation of opioid and NMDA

glutamate receptors (Both et al., 2002) and anxiolytic, sedative, antidepressives and

amnesic possibly involving the participation of 5-HT

2A/C

receptors (Both et al.,

2005).

Considering that indoles demonstrate antioxidant activity and that

psychollatine possess multiple mechanism of action, including a involvement with

NMDA receptors, which may be implicated with neuroprotectant activity, the

present study was undertaken to further investigate the in vivo antioxidative

properties of psychollatine.

Serotonin Psychollatine

COOC

Glc-O

Figure1. Molecular structure of psychollatine and serotonin

Material and Methods

Plant material

Psychotria umbellata Vell.(Rubiaceae) leaves were collected at Torres (Rio Grande

do Sul, Brazil) in 2003; voucher material (MBM 48571) has been deposited at the

herbarium of the Museu Botânico Municipal de Curitiba (PR, Brazil).

Alkaloid isolation

Dried leaves (100g) were extracted 3-times with EtOH at room temperature, each

for a week. The extract was concentrated under vacuum at 40°C resulting in dark

green syrup. The syrup was dissolved in HCl 2% (0.5l) and partitioned with CH

The acid solution was alkalinized with NH

OH 25% until pH = 10 and extracted

with CH

. From the CH

extract 954 mg of a colorless amorphous compound

was precipitated. Purity of the compound was checked by TLC with silica gel

60F254 (CHCl

:MeOH/NH

vapor - 85:15 - Rf = 0.2) and HPLC (column:

NOVAPACK C18 150 mm x 3.9 mm - Waters; MeOH:H

0 - 50:50 as eluent and a

Photo Diode Array as detector; Rt = 2.13 min).

Chemicals

Thiobarbituric acid and Trolox were obtained from Merck, ABAP was obtained

from Wako Chemicals USA, Inc., 2’-7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA),

2’-7’-dichlorofluorescein (DCF), trichloroacetic acid (TCA), phenylmethylsulfonyl

fluoride (PMSF), 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione (luminol), and H

stock solution were purchased from Sigma Chemical Co.

Animals and psychollatine administration

Experiments were performed with male adult mice (CF1), acquired from Fundação

Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) with 2 months of age. Animals

were maintained in our owns facilities (22°±1°C, 12 h light/dark cycle, free access

to food [Nuvilab CR1] and water) for at least two weeks before experiments. All

procedures were carried out according to institutional policies on experimental

animal handling. Saline 0.9% or psychollatine 7.5 or 30 mg/kg were administered

intraperitoneally (0.1 ml/10g); this dose was chosen because it proved to present

anxiolytic and analgesic (when co-administrated with MK-801) activity in previous

studies (Both et al., 2002; Both et al., 2005).

Preparation of brain samples

Mice were decapitated 30 min after drug administration; the brain was quickly

excised and placed on ice-cold glass plate. Hippocampi and cerebral cortex were

dissected out, weighted, instantaneously placed in liquid nitrogen and stored at -

C until experimental day. Brain tissues were homogenized in 10 vol. of ice-cold

phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) containing KCl (140 mM), EDTA (1 mM) and

phenylmethylsulfonyl fluoride (1 mM). The homogenate was centrifuged at 960xg

for 10 min to remove nuclei and cell debris; the supernatant was used for the assays.

All steps were carried out at 4

Free radical content

To assess free radicals levels we used 2’-7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-

DA) as a probe. An aliquot of the sample was incubated with DCFH-DA (100 µM)

at 37

C for 30 min; the reaction mixture was concluded at 4

C. The formation of the

oxidized fluorescent derivative (DCF) was monitored at excitation and emission

wavelengths of 488 nm 525 nm, respectively, using a fluorescence

spectrophotometer (Hitachi F-2000). Free radicals content was quantified using a

DCF standard curve and results were expressed as pmol of DCF formed/mg protein.

All procedures were performed in the dark, and blanks containing DCFH-DA (no

homogenate) and homogenate (no DCFH-DA) were processed for measurement of

autofluorescence (Driver et al., 2000; Sriram et al., 1997).

Lipid peroxidation assay

The evaluation of formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) was

based on Buege and Aust (1978). Sample aliquots were incubated with 10%

trichloroacetic acid (TCA) and 0.67% thiobarbituric acid (TBA). The mixture was

heated on a boiling water bath for 30 min, an equal volume of n-butanol added and

the final mixture centrifuged; the organic phase was collected for fluorescence

measurements, at excitation and emission wavelengths of 515 and 553 nm,

respectively (Bromont et al., 1989). 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMP) was used

as standard. Results are reported as pmol MDA /mg protein.

Oxidation of protein tryptophan residues (TRI)

Samples were solubilized in sodium dodecyl sulfate (SDS) at final concentration of

0.1%. The intrinsic tryptophan fluorescence was determined at excitation and

emission wavelengths of 280 and 345 nm, respectively, using a fluorescence

spectrophotometer Hitachi F-2000 (Gusow et al., 2002).

Oxidation of protein tyrosine residues (TIR)

Samples were solubilized in SDS at final concentration of 0.1%. The intrinsic

tyrosine fluorescence was determined at excitation and emission wavelengths of 277

and 320 nm, respectively (Bondy, 1996).

Total Antioxidant Reactivity (TAR) Assay

The TAR assay is based on luminol-enhanced chemiluminescence (CL) induced by

an azo initiator (Lissi et al., 1992; Lissi et al., 1995; Desmarchelier, 1997). The

reaction mixture contained 2 mM ABAP and 6 mM luminol in glycine buffer. TAR

values were determined by assessing the initial decrease of luminescence calculated

as the ratio “Io/I”, where “Io” is the CL in the absence of additives, and “I” is the CL

after the addition of 20 nM Trolox or samples (1 µl). TAR values were expressed as

equivalents of Trolox concentration per mg of protein.

Protein Assay

The total protein concentration was determined using the method described by

Bradford (1976) with bovine serum albumin as the standard.

Statistical analysis

Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) with post hoc

analysis by the Duncan’s multiple range test. Differences were considered

significant when P ≤ 0.05. Results are expressed as mean ± standard error mean

(SEM).

Results

A single i.p. administration of psychollatine 7.5 or 30 mg/kg induced

changes in several indexes of oxidative stress; different patterns were found at

different brain regions.

A significant decrease in free radicals levels (DCF formation) was observed

in the frontal cortex with psychollatine 7.5 mg/kg and 30 mg/kg (F

(2,14)

= 0.028;

P<0.05) (Fig 2). The TAR levels increased in the frontal cortex with psychollatine

7.5 mg/kg and 30 mg/kg (F

(2,16)

=0.048; P<0.05) (Fig. 3).

A significant increase in free radicals levels (DCF formation) was observed

in the hippocampus with psychollatine 30 mg/kg (F

(2,18)

=0.003; P<0.05) (Fig 2). The

TAR was increased in hippocampus (F

(2,16)

=0.052; P<0.05) with psychollatine 7.5

mg/kg (Fig. 3).

No changes in lipoperoxidation (TBARS levels), TIR and TRI levels were

observed in the hippocampus and in the cortex with all doses tested (Fig. 4, 5 and 6)

respectively.

hc cx

pmol DCF fprmed/mg protei

SALINE

PSY7.5

PSY30

Figure 2. Effects of psychollatine on free radical content, using DCFH-DA as a

probe in brain areas, frontal cortex (cx) and hippocampi (hc). Data expressed as

mean + SEM. N= 5-6. ANOVA/Duncan, *P<0.05 compared with saline.

100

120

140

160

hc cx

pmol TAR formed/mg protein

SALINE

PSY7.5

PSY30

Figure 3. Effects of psychollatine on total antioxidant reactivity (TAR) levels from

frontal cortex (cx) and hippocampi (hc) from saline and psychollatine 7.5 and 30

mg/kg. Data expressed as mean +

SEM. N=7-8. ANOVA/Duncan, *P<0.05

compared with saline.

100

120

140

160

hc cx

% control

SALINE

PSY 7 .5

PSY 3 0

Figure 4. Effects of psychollatine on lipid peroxidation assay (TBARS). Results are

expressed as percentage of control. N= 7-8. ANOVA/Duncan.

100

120

140

hc cx

% control

SALINE

PSY7.5

PSY30

Figure 5. Tyrosine contents in cortex (cx) and hippocampus (hc) from mice treated

with saline and psychollatine. Results are expressed as percentage of control. N= 7-

8. ANOVA/Duncan.

100

120

140

hc cx

% control

SALINE

PSY7.5

PSY30

Figure 6. Contents of tryptophan in brain strucutures, cortex (cx) and hippocampi

(hc) from saline and psychollatine (PSY) 7.5 and 30 mg/kg. Results are expressed as

percentage of control. N= 7-8. ANOVA/Duncan.

Discussion

Indole derivatives, e.g. melatonin, β-carbolines are thought to have great

potential to be used in the prevention and/or treatment of numerous neurological

diseases. Moreover, they may serve as model compounds in further search for a new

generation of powerful and safe neuroprotectants (Stolc, 1999).

We found that psychollatine, an indole monoterpene alkaloid, alters various

oxidative stress parameters. Psychollatine increased the total antioxidant capacity in

hippocampus and cortex as evaluated by the TAR assay. It is important to note that

TAR measurements determine the quality (conferred by reactivity) of antioxidants

present in the sample (Lissi, 1995, Desmarchelier, 1997). The TAR levels were

significantly augmented in frontal cortex with both doses (approximately 40 and

55% with 7.5 and 30 mg/kg, respectively) and in hippocampus (by 70%) only with

the lower dose (7.5 mg/kg). TAR can be considered an useful index of the capacity

of a given sample to modulate the damage associated with an enhanced production

of free radicals (Lissi et al. 1992). Therefore, the effect of psychollatine on TAR

levels in important brain areas might be relevant to protect from oxidative events

and the consequent damage to lipids and proteins. It is important to note that the

higher dose of psychollatine induced a large increase in DCF formed, consequently

in favor of a strong oxidative stress; conversely protein and lipid damage did not

accompany the enhanced free radicals content.

Although antioxidant reactivity of both brain areas was increased by acute

treatment with psychollatine, the DCF formation was found to be reduced only in

the cortex. Interestingly, we observed a significantly increase on DCF levels in

hippocampus from animals treated with the higher dose of psychollatine (30 mg/kg)

with a concomitant reduction of TAR levels compared to those observed with the

dose 7.5 mg/kg. The increase DCF levels in hippocampus, a structure that plays an

important role in cognitive function, was consistent with our recent finding that this

dose impaired both acquisition and consolidation in the step-down inhibitory

avoidance test (Both et al., 2005). It has been previously suggested that increases in

free radical content contribute with age-related deficit in cognition (Halliwell, 1992;

Rádak et al., 2000) and impairment in hippocampal long-term potentiation (LTP)

(McGahon et al., 1999).

The formation of free radicals in rat hippocampus after acute NMDA

infusion was prevented by specific NMDA-receptor antagonists (Pepicelli et al.,

2002). Nonetheless, there are evidences that sub-anesthetic doses of NMDA

antagonists induce hypermetabolic and hyperglutamatergic states (Kurumaji and

McCulloch, 1990). Various mechanisms may contribute to this apparent paradox of

sub-anesthetic doses of NMDA antagonist, usually regarded as neuroprotective

agents, inducing a neurotoxic hyperglutamatergic state: sub-anesthetic doses of

NMDA antagonists stimulate glutamate release in the prefrontal cortex

(Moghaddam et al., 1997; Moghaddam and Adams, 1998), and hippocampus

(Grunze et al, 1996); NMDA antagonists preferentially attenuate the activity of the

inhibitory interneurons in the hippocampus, resulting in freeing pyramidal neurons

and increased firing of these neurons, therefore enhancing glutamate release (Grunze

et al, 1996).

Hyperactivity of glutamatergic pyramidal neurons induced by NMDA

antagonists seem to result in activation of non-NMDA glutamate receptor including

AMPA and kainate receptors (Liu et al., 2002; Patel and McCulloch, 1995); in fact,

AMPA/kainate antagonist completely block prefrontal cortical pyramidal neurons

activation induced by 5-HT

receptor (Aghajanian and Marek, 1997).

In this study, a similar picture was observed with psychollatine: an

apparently NMDA antagonist (Both et al., 2002), increasing hippocampal radical

free content. The observed amnesic effects of psychollatine (Both et al, 2005),

observed with the same doses that result in oxidative stress (evaluated ex vivo) may

be at least in part associated with a hyperglutamatergic effect, given that

psychollatine may lead to impairments in the information-processing capacity of

cortical circuits by acting as NMDA antagonist. The neurotoxic effects (amnesic and

prooxidative action) at higher doses of psychollatine may reflect its capacity to

induce glutamate release as discussed above.

Antioxidants can demonstrate both antioxidant and prooxidant properties;

however, a prooxidant activity requires a relatively high concentration of the

compounds (Azam et al., 2003). Consistent with this pattern, psychollatine, as other

indole antioxidants (Stolc, 1999), exhibited prooxidant action with higher doses.

The markers of basal oxidative damage to macromolecules (TBARS as

index of lipid peroxidation, and tyrosine and tryptophan residue levels, as protein

damage indexes) were not affected by acute treatment with psychollatine. However,

the decline in free radical levels, and the increase on total antioxidant reactivity may

indicate that psychollatine treatment can improve the protective defenses and reduce

the oxidative damage in situations of oxidative stress.

Additionally, the analgesic and anti-inflammatory activity of psychollatine

in the capsaicin and formalin models (Both et al., 2002) may be related to its

antioxidant properties.

The anti-inflammatory activity of compounds can be due to synergistic

effect of various mechanisms of action, as pro-inflammatory enzyme inhibitors,

corticoid-like effects and/or antioxidant effect (Schinella et al., 2002). Free radicals

seem to have an important role in the inflammatory process, since free radicals

produced by phagocyte cells are implicated in the activation of nuclear factor κB,

which induces the transcription of inflammatory cytocines and cyclo-oxigenase

(Winrow et al., 1993, Sahnoun et al., 1998).

At this point, the exact mechanism(s) by which psychollatine modulates

oxidative stress exerts its antioxidant activities are unknown. The distinct

modulation of oxidative status observed in different brain structures can be

associated with particularities in the basal oxidative status of different brain areas

(Candelario-Jalil et al., 2001) and/or differential distribution of psychollatine.

Improving antioxidant defenses seems to be another interesting approach for

treating neurodegenerative disorders (Nikolov and Richardson, 1998). It is clear that

additional works must be performed, including ischemia models, to evaluate the

potential of psychollatine as a neuroprotective agent.

Conclusions

The present study indicates that psychollatine, an indole alkaloid isolated

from Psychotria umbellata, modify basal oxidative status in distinct mice brain

areas. Our results are consistent with previous studies reporting neuroprotection and

prooxidative action by indole derivatives (Stolc, 1999).

Acknowledgements

This study was supported by grants from CNPq (EE, ATH and FLB), and

financial support from CNPq and PROPESQ.

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ANEXO 2

Acute toxicity induced by the indole monoterpene alkaloid psychollatine

isolated from Psychotria umbellate Vell.

Fernanda L. Both

a,b

, Lisiane Meneghini

, Vitor A. Kerber

, Amélia T. Henriques

and Elaine Elisabetsky

a,b,*

Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil;

Laboratório de Etnofarmacologia, Departamento de Farmacologia, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre/RS, Brazil;

Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba/PR, Brazil

*Corresponding author: Tel/Fax: (+)55 51 3316 3121.Caixa Postal 5072, 90041-

970, Porto Alegre, RS, Brazil.

E-mail address: [email protected]

Abstract

Psychollatine is an indole monoterpene alkaloid, isolated from Psychotria

umbellate Vell. (Rubiaceae). The acute toxicity and LD50 of psychollatine were

determined from 0 to 360 min, and 24 hours after its intraperitoneal administration

(325 - 500 mg/kg) to adult male mice. Each animal was observed for immediate

signs of toxicity up to 6h, and for death up to 24h. Parameter considered for toxicity

included salivation, diarrhea, tremor, seizures, reaction to stimulus, abdominal

constriction, ptose, and motor activity. The acute LD50 with intraperitoneal

administration was found to be 375.57 mg/kg (95%confidence limits = 345.06 –

408.76; correlation coefficient = 0.955), with no deaths or signs of toxicity with

1g/kg per os. It is concluded that toxic doses of psychollatine are much higher than

those of pharmacologic interest.

Keywords: Psychotria umbellate; psychollatine; LD

; mice, acute toxicity.

Introduction

Due to its extensive use in traditional systems of medicine and the presence

of bioactive alkaloids (Adjibade et al, 1992; Leal and Elisabetsky, 1996), the genus

Psychotria L. (Rubiaceae) has been subjected to a considerable amount of chemical

and pharmacological investigation (Both et al, 2002a; Kerber et al., 2001, Schultes

and Raffauf, 1990; Amador et al., 2000, 2001; Leal and Elisabetsky, 1995; Verotta

et al., 2002). A number of pyrrolidinoindoline alkaloids have been isolated from P.

oleoides, P. lyciiflora (Jannic et al., 1999), P. forsteriana (Adjibadé et al., 1992),

and P. colorata (Verotta et al., 1998). Isolated from P. colorata, hodgkinsine and

psychotridine present analgesic activity implicating the opioid and glutamatergic

systems (Amador et al., 2000, 2001).

Psychollatine (formerly known as umbellatine) is an indole monoterpene

alkaloid, isolated from Psychotria umbellata Vell. In previous studies psychollatine

was found to possess mild analgesic activity against a number of algogenic stimuli,

indicating the participation of opioid and NMDA glutamate receptors (Both et al.,

2002b). Recent findings demonstrate that psychollatine also possess anxiolytic,

antidepressive and amnesic effects indicating the participation of 5-HT

2A/C

receptors

(Both et al., 2005).

The present study was carried out in order to determinate the acute toxicity

and LD50 of psychollatine administered intraperitonealy to adult male mice.

Psychotria umbellata Vell.(Rubiaceae) leaves were collected at Torres (Rio

Grande do Sul, Brazil) in 2003; voucher material (MBM 48571) has been deposited

at the herbarium of the Museu Botânico Municipal de Curitiba (PR, Brazil).

Dried leaves (100g) were extracted with EtOH at room temperature 3-times,

each for a week. The extract was concentrated under vacuum at 40°C to a dark green

syrup. The syrup was dissolved in 2% HCl (0.5L) and partitioned with CH

. The

acid solution was alkalinized with 25% ammonia solution until pH = 10 and

extracted with CH

. From the CH

extract 954 mg of a colorless amorphous

compound was precipitated. Purity of the compound was checked by TLC with

silica gel 60F254 (CHCl

:MeOH/NH

vapor - 85:15 - Rf = 0.2) and HPLC (column:

NOVAPACK C18 150 mm x 3.9 mm - Waters; MeOH:H

0 - 50:50 as eluent and a

Photo Diode Array as detector; Rt = 2.13 min).

The experiments were performed with male adult mice (CF1), acquired

from Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) with 2 months

of age. Animals were maintained in our owns facilities (22°±1°C, 12 h light/dark

cycle, free access to food [Nuvilab CR1] and water) for at least two weeks before

experiments. All procedures were carried out according to institutional policies on

experimental animal handling. Six groups of five or ten animals were treated i.p.

with saline 0.9% or different doses of psychollatine (325, 350, 400, 450 or 500

mg/kg). The various solutions of psychollatine were prepared by adding one or a

few drops (20-60 µL) of HCl (1N), the final volume was adjusted with saline and

the pH adjusted (7.0) with a few drops of NaOH (1N).

Each animal was observed for one minute at 0, 15, 30, 60, 120, 240, 360

min and 24h after dosing, for characterization of behavioural profile (locomotor

activity), neurological symptoms (reaction to stimulus), autonomic peculiarities

(optical signs, secretory signs, general signs), in general accepted to reflect the toxic

potential of a substance given to the animals. Moreover, number of deaths at 24h

was noted.

Data are shown as cumulative frequency of death and/or toxicity signs. The

LD50, 95% confidence limits and correlation index were calculated by the Litchfield

and Wilcoxon method (computer software: LETAL.EXE, US. 1.3. FKS, 1991).

Statistical analysis for toxic effects (salivation, diarrhea, tremor, seizures, reaction to

stimulus and abdominal constriction) was done by chi-square test. Ptose and

locomotion scores were analysed by Mann-Whitney U test, following Kruskal-

Wallis. Statistical significance was set at P<0.05 (Zar, 1999). Ptoses was scored for

1 min during the observation periods, and the highest rating observed during the

observation period was used in the calculations. Scores were as follows: normal (0

point), slight (1 point), medium (2 points), and intense (3 points) with a maximum of

24 points. The locomotor activity scores were as follows: low activity (1 point),

medium (2 points) and intense (3 points). To determine LD50, mice were injected

with psychollatine 325, 350, 400 or 450 mg/kg. The LD50 determined by probit test

for each intraperitoneal dose was 375.57 mg/kg (95%confidence limits = 345.06 –

408.76; correlation coefficient = 0.955). Among all parameters of toxicity analyzed

(salivation, diarrhea, tremor, seizures, reaction to stimulus and abdominal

constriction) only the dose of 500 mg/kg reduced the reaction to stimulus

immediately after administration (P<0.01) (Table 1). Death occurred in all

psychollatine dose-groups until 120 min post dosing (Table 2). The percentage of

death that occurred in the groups treated with psychollatine 450 and 500 mg/kg were

90 and 100%, respectively and were significantly different from control (0.002 and

0.008, respectively). Correlation analysis using Spearman test showed that this

effect is dose-dependent (r = 0.987, p<0.01). In the evaluation of ptose scores

psychollatine 450 mg/kg (1[0-1]) and 500 mg/kg (1[1-1]) were significantly

different from control (P = 0.003 for all doses) (Table 3). In the assessment of

locomotor activity psychollatine 400 mg/kg (5[1.75-6.5]), 450 mg/kg 1[0-1]) and

500 mg/kg (1[1-1]) were also significantly different from control (P = 0.01, 0.01

and 0.003, respectively) (Table 4).

As observed in table 1, all doses of psychollatine presented some degree of

toxic signs (tremor and seizures). Only psychollatine 500 mg/kg exhibited the

reaction to stimulus reduced immediately after i.p. administration. The LD50

(379.85 mg/kg), as well as, all doses of psychollatine that induced death are well

distant from that doses that present biological activities (Both et al., 2002, Both et

al., 2005) which range from 7.5 – 200 mg/kg. Signs of toxicity, as expressed by

altered scores (decreased in comparison to control group) of ptosis and locomotion

were observed in the mice with 400, 450 and 500 mg/kg. No deaths or signs of

toxicity were observed with animals that received psychollatine per os (0.4 - 1g/kg)

(data not shown).

Although Psychotria umbellate has no reported traditional uses, the

evaluation of acute toxicity and LD50 are important considering the relevant

pshychollatine psychopharmacology profile (analgesic, anxiolytic, antidepressive,

antioxidant and amnesic), and its apparent modulating of different neurotransmitter

systems including NMDA, opioid and 5-HT. Psychollatine modulation of serotonin

5-HT

2A/C

receptors is of special interest given the important role of these receptors in

a diversity of relevant psychoactivities, and this study shows that the wide gap

between active and toxic doses should be considered when launching

structure/activity studies.

Acknowledgements

This study was supported by grants from CNPq (EE, ATH and FLB), and

financial support from CNPq and PROPESQ.

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Table 1. Toxicity signs following i.p. administration of psychollatine or saline to mice

Time (min)

Dose

(mg/kg)

0 15 30 60 120 240 360

Salivation

0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

325 10 0/10 0/10 0/9 0/8 0/8 0/8 0/8

350 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

400 10 0/10 0/10 0/8 0/7 0/6 0/5 0/5

450 10 0/10 0/6 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

500 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Diarrhea

0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

325 10 0/10 0/10 0/9 0/8 0/8 0/8 0/8

350 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

400 10 0/10 0/10 0/8 0/7 0/6 0/5 0/5

450 10 0/10 0/6 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

500 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Tremor

0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

325 10 1/10 3/10 3/9 1/8 1/8 0/8 0/8

350 5 1/5 3/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

400 10 0/10 1/10 0/8 1/7 1/6 1/5 1/5

450 10 4/10 3/6** 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

500 5 3/5** 4/5** 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Seizures

0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

325 10 0/10 0/10 0/9 0/8 0/8 0/8 0/8

350 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

400 10 0/10 0/10 0/8 0/7 0/6 0/5 0/5

450 10 0/10 0/6 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

500 5 0/5 2/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Reaction to stimulus

0 5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5

325 10 10/10 10/10 9/9 8/8 8/8 8/8 8/8

350 5 5/5 5/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

400 10 10/10 10/10 7/8 6/7 5/6 5/5 5/5

450 10 10/10 6/6 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1

500 5 0/5** 0/5** 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Abdominal constriction

0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

325 10 0/10 0/10 0/9 0/8 0/8 0/8 0/8

350 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

400 10 0/10 0/10 0/8 0/7 0/6 0/5 0/5

450 10 0/6 0/6 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

500 5 0/5 0/5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0

Values indicate the number of animals with the toxic effect/total number of animals remaining alive. N= 5-10.

Significantly different from control group (P<0.01) by chi-square test.

Table 2. Cumulative death during the period of 24h following the i.p. administration of

psychollatine or saline to mice.

Time (min) Cumulative

Dose

(mg/kg)

0 15 30 60 120 240 360 24 Death in 24h (%)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

325 0 1 2 2 2 2 2 2 20

350 0 5 5 5 5 5 5 5 100**

400 0 2 3 4 5 5 5 5 50

450 4 9 9 9 9 9 9 9 90**

500 0 5 5 5 5 5 5 5 100**

Values indicate the number of dead animals. N = 5 (psychollatine 350 and 500 mg/kg) =10

(psychollatine 325, 400 and 450 mg/kg)

Significantly different from control group (P<0.01)

Correlation analysis using Spearman test showed that this effect is dose-dependent (r

= 0.987, p<0.01).

Table 3. Ptose scores following i.p. administration of psychollatine or saline to mice

Ptose scores

Dose

(mg/kg)

N Median Percentile

Percentile

0 5 6 6 6

325 10 11 5 13

350 5 1** 1 1

400 10 6.5 2 13

450 10 1** 0 1

500 5 1** 1 1

P <0.01 significant difference compared with saline in Mann-Whitney U test, following

Kruskal-Wallis.

Table 4. Locomotor activity scores following i.p. administration of psychollatine or saline

to mice

Locomotor activity scores

Dose

(mg/kg)

N Median Percentile

Percentile

0 5 12 12 12

325 10 7.5 5.25 13.25

350 5 1** 1 1

400 10 5** 1.75 6.5

450 10 1** 0 1

500 5 1** 1 1

P <0.01 significant difference compared with saline in Mann-Whitney U test, following

Kruskal-Wallis.

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