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LUCIANA JANJOPPI
EXPRESSÃO DE RNAm DO RECEPTOR DE VITAMINA D NA
FORMAÇÃO HIPOCAMPAL DE RATOS SUBMETIDOS AO
MODELO DE EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL INDUZIDO POR
PILOCARPINA
SÃO PAULO
2006
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo –
Escola Paulista de Medicina para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
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LUCIANA JANJOPPI
EXPRESSÃO DE RNAm DO RECEPTOR DE VITAMINA D NA
FORMAÇÃO HIPOCAMPAL DE RATOS SUBMETIDOS AO
MODELO DE EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL INDUZIDO POR
PILOCARPINA
ORIENTADOR: Prof. Dr. Ricardo Mario Arida
CO-ORIENTADORA: Dra. Maria Lúcia Hirata Katayama (FMUSP)
SÃO PAULO
2006
Tese apresentada à Universidade Federal de
São
Paulo –
Escola Paulista de Medicina para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA
Chefe de Departamento:
Profa. Dra. Débora Amado Scerni
Coordenadora do Curso de Pós-graduação:
Prof. Dra. Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti
LUCIANA JANJOPPI
EXPRESSÃO DE RNAm DO RECEPTOR DE VITAMINA D NA
FORMAÇÃO HIPOCAMPAL DE RATOS SUBMETIDOS AO
MODELO DE EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL INDUZIDO POR
PILOCARPINA
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti
Profa. Dra. Marly de Albuquerque
Profa. Dra. Roberta Monterazzo Cysneiros
SUPLENTE
Profa. Dra. Vanessa Costhek Abílio
Aprovada em: / /
Esta tese foi realizada na disciplina de Neurologia Experimental,
Departamento de Neurologia e Neurocirurgia da Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina, durante o curso de pós-
graduação em neurologia. Auxílio financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES e
PRONEX. Luciana Janjoppi foi bolsista CAPES.
À Deus, aos meus pais e ao meu irmão que me aconselham ou
simplesmente estão presentes naqueles momentos em que palavras não
têm o menor sentido.
Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ricardo Mario Arida, pela oportunidade, estímulo, confiança,
apoio e respeito ao meu trabalho e pela brilhante orientação.
À Dra. Maria Lúcia Hirata Katayama, pela co-orientação e inestimável
ajuda, valorizando em muito este trabalho com seus conhecimentos na área de
Biologia Molecular.
Ao Prof. Dr. Fulvio Alexandre Scorza e à Profa. Dra. Roberta Monterazzo
Cysneiros, pela colaboração sempre que necessário, além do inestimável saber
científico.
Ao Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro pelo seu brilhante conhecimento
científico e exemplo de profissionalismo.
A todos os alunos do departamento de Neurologia pela amizade e que
sempre estiveram dispostos a ajudar.
À amiga Aline Priscila Pansani, pela valiosa colaboração durante o
desenvolvimento deste trabalho.
A todos os docentes e funcionários do departamento de Neurologia,
especialmente ao Marco Aurélio Gonzaga.
À Profa. Dra. Mitzi Brentani por permitir a realização de parte dos
experimentos no Laboratório de Oncologia Experimental da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo.
A todos os alunos, docentes e funcionários do Laboratório de Oncologia
Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, pela
disponibilização do laboratório e equipamentos, além da convivência profissional
e amistosa durante a realização deste trabalho.
Às biólogas e amigas: Cíntia Milani, Lilian Barbeta e Ticiana Benvenuti pela
gentileza, auxilio, profissionalismo e empenho na realização de algumas práticas
laboratoriais.
Às amigas: Andrezza Sossai, Carla de Oliveira e Thays Cabral, por me
receberem com carinho e atenção, além de estarem sempre me fazendo sorrir.
Ao Ricardo Henrique Marques por ter me apresentado ao mundo científico.
Aos meus pais, Antônio e Irani, e ao meu irmão Fabiano, pelo apoio,
compreensão e paciência durante esta fase da minha vida, e que sempre
acreditaram e oraram por mim.
SUMÁRIO
Dedicatória.............................................................................................................vi
Agradecimentos....................................................................................................vii
Lista de Tabelas e Gráfico....................................................................................xi
Lista de Figuras....................................................................................................xii
Lista de Abreviaturas..........................................................................................xiii
Resumo.................................................................................................................xv
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................1
1.1 Epilepsia...........................................................................................................2
1.2 Classificação das Epilepsias..........................................................................3
1.3 Epilepsia do Lobo Temporal...........................................................................4
1.4 Modelos Experimentais de Epilepsia.............................................................6
1.5 Modelo da Pilocarpina.....................................................................................7
1.6 Vitamina D.........................................................................................................9
1.7 Receptor de Vitamina D.................................................................................10
1.8 Vitamina D, Receptor de Vitamina D e Sistema Nervoso Central..............12
1.9 Vitamina D, Receptor de Vitamina D e Epilepsia........................................13
2 OBJETIVO..........................................................................................................15
3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................17
3.1 Modelo Experimental de Epilepsia...............................................................18
3.2 Extração do RNA Total..................................................................................19
3.3 Tratamento do RNA Total com DNase.........................................................21
3.4 Reação de Transcriptase Reversa (RT) para Obtenção de cDNA.............22
3.5 Seleção e Desenho dos Oligonucleotídeos Iniciadores.............................22
3.6 Reação em Cadeia da Polimerização (PCR) em Tempo Real....................24
3.6.1 Amostra Referência (Rim) e Controle Negativo.......................................28
3.7 Análise Estatística.........................................................................................28
4 RESULTADOS...................................................................................................29
4.1 Alterações comportamentais observadas no modelo de epilepsia
induzida pela pilocarpina....................................................................................30
4.2 Extração de RNA Total..................................................................................31
4.3 Tratamento do RNA Total com DNase.........................................................31
4.4 Amostras de cDNA.........................................................................................32
4.5 RT-PCR em Tempo Real e Escolha do Normalizador Adequado..............33
5 DISCUSSÃO.......................................................................................................38
6 CONCLUSÃO.....................................................................................................44
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................46
Abstract.................................................................................................................66
LISTA DE TABELAS E GRÁFICO
Tabela 1 - Descrição dos genes selecionados para o estudo...............................23
Tabela 2 - Demonstra concentração média de cDNA (µg/µL) em cada grupo......32
Gráfico 1 - Demonstra os valores da expressão relativa de RNAm do VDR nos
diferentes grupos de animais submetidos ao modelo da PILO..............................37
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação do teste de eficiência dos primers...............................24
Figura 2 - Representação das amostras de RNAs................................................31
Figura 3 - Representação das amostras de RNAs tratadas com o reagente
DNAse/RNAse Free...............................................................................................32
Figura 4 - Curva de quantificação demonstrando a expressão gênica do VDR e
do GAPDH proveniente da região hipocampal de ratos........................................34
Figura 5 - Curva de quantificação demonstrando a expressão gênica do GAPDH
proveniente de tecido renal de ratos......................................................................34
Figura 6 - Curva de quantificação demonstrando a expressão gênica do VDR
proveniente de tecido renal de ratos......................................................................35
Figura 7 - Curva de desnaturação demonstrando a expressão gênica do VDR e
do GAPDH na região hipocampal de ratos............................................................35
Figura 8 - Curva de desnaturação demonstrando a expressão gênica do GAPDH
em tecido renal de ratos.........................................................................................36
Figura 9 - Curva de desnaturação demonstrando a expressão gênica do VDR em
tecido renal de ratos...............................................................................................36
LISTA DE ABREVIATURAS
Ach – acetilcolina
cDNA – ácido desoxirribonucléico complementar
Ct – ciclo do threshold
CA – corno de Amon (cornus Ammonis)
ºC – graus Celsius
DEPC – dietilpirocarbonato
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP – desoxiribonucleotídeos
DTT – ditiotreitol
ELT – epilepsia do lobo temporal
EDTA - ácido etileno diamino tetracético
GABA
A
– ácido gama amino-butírico tipo A
GLU – glutamato
g – grama
ILAE – International League Against Epilepsy
i.p. – intra peritoneal
M – molar
ml – mililitro
mM – milimolar
ng – nanograma
nM – nanomolar
NMDA – N-metil-D-aspartato
pb – pares de bases
PCR – reação em cadeia de polimerase
pH – potencial hidrogeniônico
PTZ – pentilenotetrazol
r.p.m – rotações por minuto
RNA – ácido ribonucléico
RT – transcrição reversa
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro
RNAsin – inibidor de RNA
SE – status epilepticus
SNC – sistema nervoso central
TE - 10mM Tris HCl, 1mM EDTA
U – unidade
UV – luz ultravioleta
VD – vitamina D
VDR – receptor de vitamina D
µg – microgramas
µl – microlitros
µM – micromolar
RESUMO
A vitamina D (VD), um hormônio esteróide com diversas funções no
Sistema Nervoso Central (SNC), produz inúmeros efeitos fisiológicos através de
respostas genômicas mediadas pelo seu receptor (VDR). Estudos clínicos e
experimentais mostram uma associação entre disfunções da VD e epilepsia.
Nesse sentido, o objetivo de nosso trabalho foi analisar a expressão relativa de
RNAm do VDR na formação hipocampal de ratos nos três períodos do modelo de
epilepsia do lobo temporal induzido pela pilocarpina. Ratos machos, da raça
Wistar, foram divididos aleatoriamente em 5 grupos: 1- ratos controle (Grupo
CTRL), 2- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados após 4 horas de
status epilepticus (Grupo SE), 3- ratos que receberam pilocarpina e foram
sacrificados 7 dias após status epilepticus (Grupo SIL 7 dias) 4- ratos que
receberam pilocarpina e foram sacrificados 14 dias após status epilepticus (Grupo
SIL 14 dias) 5- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 60 dias após
a primeira crise espontânea (Grupo Crônico). A expressão relativa de RNAm do
VDR foi determinada através da técnica do RT-PCR em tempo real. Nossos
resultados demonstraram um aumento da expressão relativa de RNAm do VDR
nos grupos SIL 7 dias, SIL 14 dias e Crônico, respectivamente (0,060 ± 0,024;
0,052 ± 0,035; 0,085 ± 0,055) quando comparado com os animais do grupo CTRL
e SE, respectivamente (0,019 ± 0,017; 0,019 ± 0,025). Nossos resultados
sugerem que o VDR é um possível candidato a na participação do processo de
epileptogênese no modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina em ratos.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epilepsia
O termo epilepsia se refere a um distúrbio da atividade cerebral
caracterizada pela ocorrência periódica e espontânea de atividade elétrica
altamente sincronizada, acompanhada de manifestações comportamentais
(MCNAMARA, 1994). Portanto, a epilepsia não é uma doença específica ou uma
única síndrome, ela representa um grupo complexo de distúrbios decorrentes de
funções cerebrais alteradas que podem ser secundárias a um grande número de
processos patológicos (GUERREIRO et al., 2000). Acredita-se que dos novos
casos de epilepsia a cada ano, 30-40% dos pacientes serão refratários às atuais
terapias farmacológicas e conseqüentemente apresentarão crises recorrentes
pelo resto de suas vidas (KWAN & SANDER, 2004).
As crises epilépticas são fenômenos clínicos transitórios, decorrentes da
descarga excessiva e sincronizada da rede neuronal. Essas crises podem surgir
espontaneamente ou ser desencadeadas por situações como: febre, distúrbio
eletrolítico, intoxicação, doenças degenerativas e alterações vasculares (PEDLEY
et al., 2000).
Aproximadamente 70% dos pacientes com epilepsia controlam as crises
usando os fármacos disponíveis no mercado atualmente. Mas uma porcentagem
significativa em que predominam indivíduos com lesões focais, não consegue
controlá-las com medicamentos, como é o caso da epilepsia do lobo temporal
(YACUBIAN, 2004).
Estudos da prevalência e da incidência das epilepsias encontrados na
literatura apresentam índices com grande variabilidade. Têm sido descritos
valores para prevalência entre 0,9 e 57 casos / 1.000 habitantes e para a
incidência entre 26 e 190 casos / 100.000 habitantes, porém essas variações são
resultantes de problemas metodológicos durante as investigações, que vão desde
as definições adotadas de epilepsia até a fonte de obtenção dos dados
(MCNAMARA, 1994; JALLON et al., 1997).
No Brasil, a prevalência da epilepsia é de 18,6 por 1.000 habitantes
(BORGES et al., 2004). Além disso, estudo recente aponta que aproximadamente
50% da população com epilepsia de duas grandes cidades do Estado de São
Paulo não vêm sendo tratadas adequadamente e estudos epidemiológicos futuros
devem explorar os motivos desta lacuna de tratamento (NORONHA et al., 2004).
A alta incidência e prevalência das epilepsias provocam repercussões nos
aspectos sócio-econômicos (OSUNTOKUN et al., 1987), a medida em que
aumentam os custos econômicos diretos (provenientes dos gastos médicos:
drogas, hospitalizações) e indiretos da doença (perda de produção econômica por
desemprego, licença médica ou morte prematura) (ROBINSON, 1993).
1.2 Classificação das Epilepsias
HENRI GASTAUT, em 1969, propôs a primeira classificação das crises
epilépticas, baseada em critérios clínicos, eletrencefalográficos, substrato
anatômico, etiologia e idade de ocorrência das crises, mas com a introdução de
novas técnicas, exigiu-se a revisão dessa classificação proposta por Gastaut,
culminando na Classificação Internacional das Crises Epilépticas (COMISSION,
1981).
Segundo a classificação das síndromes epilépticas da Liga Internacional
Contra a Epilepsia (ILAE), as crises estão divididas em generalizadas e parciais,
de acordo com a região cortical de origem e com a presença ou não de alteração
de consciência durante o episódio. As crises generalizadas são aquelas nas quais
as descargas epilépticas envolvem ambos os hemisférios cerebrais
simultaneamente, desde o início da crise, enquanto que, nas crises parciais, a
atividade epiléptica está limitada a uma área focal do cérebro. As crises
generalizadas são ainda divididas em tônico-clônica primariamente generalizadas,
tônico-clônica secundariamente generalizadas, de ausência, mioclônica, tônica,
atônica e crises clônicas. As crises parciais são divididas em parcial simples e
parcial complexa (de acordo com a preservação ou alteração da consciência). As
crises parciais simples podem ser subdivididas em motoras, sensitivo ou
sensoriais, vegetativas ou autonômicas e psíquicas. As crises parciais complexas
podem não apresentar automatismos, ou cursar com automatismos simples,
complexos ou posturas distônicas (ILAE, 1981; ILAE, 1989). Ainda, de acordo
com as classificações de 1981 e 1989, quanto à etiologia, as crises e as
síndromes epilépticas podem ser sintomáticas, idiopáticas ou criptogênicas.
Muitos avanços ocorreram na área da epileptologia, desde que as
classificações de 1981 e 1989 foram adotadas, principalmente devido aos
avanços das técnicas de imagem (ressonância magnética), vídeo-
eletroencefalografia e a uma melhor compreensão das bases neuroquímicas e
genéticas da epilepsia. Tais mudanças motivaram a revisão do sistema de
classificação. De acordo com a proposição da ILAE de 2001, ENGEL (2001a)
mostra que a classificação é uma lista dos diferentes tipos de crises que são
agora considerados entidades diagnósticas. As crises epilépticas foram então
dividas em três subgrupos: 1) crises isoladas ou auto-limitadas (crises
generalizadas ou crises focais), 2) crises contínuas, configurando o status
epilepticus - SE (SE generalizado ou SE focal) e 3) crises reflexas, onde os
fatores precipitantes podem desencadear crises focais ou generalizadas. Esta
proposta ocorreu devido à necessidade de um sistema mais abrangente que
viabilizasse a categorização das epilepsias sob vários aspectos (ENGEL, 2001b).
Em 2005, a ILAE propôs novas definições para os termos crise epiléptica e
epilepsia, visando expressar o significado e as características essenciais desses
dois termos. De acordo com a nova proposição, crise epiléptica é uma ocorrência
transitória de sinais e/ou sintomas devido à atividade anormal excessiva ou
atividade neuronal sincrônica no cérebro. Enquanto o termo epilepsia é um
distúrbio do cérebro caracterizado pela predisposição em gerar crises epilépticas
em condições neurobiológicas, psicológicas, cognitivas e sociais dessa condição.
Além disso, a definição de epilepsia requer a ocorrência de pelo menos uma crise
epiléptica (FISHER et al., 2005).
1.3 Epilepsia do Lobo Temporal
Os dados epidemiológicos mostram que a forma mais comum de síndrome
epiléptica é a epilepsia do lobo temporal (ELT), ocorrendo em cerca de 40% de
todos os casos de epilepsias (HAUSER E KURLAND, 1975), sendo a forma mais
comum de epilepsia em adultos (WALCZAK, 1995) e apresentando geralmente
história de convulsão febril (FRENCH, 1993).
A ELT é responsável por crises parciais complexas (HAUSER E
KURKLAND, 1975), com correlação clínico-eletroencefalográfica bem definida,
originadas nas estruturas límbicas temporais mesiais (epilepsia mesial temporal)
ou na convexidade do lobo temporal (neocortical). O substrato patológico mais
freqüentemente encontrado é a esclerose mesial hipocampal que ocorre em 65%
dos casos de ELT (MATHERN ET AL., 1997). No entanto, outras estruturas
também estão envolvidas, como a amígdala, o giro parahipocampal e o córtex
entorrinal (GLOOR, 1991). Outras alterações estruturais também podem ser
encontradas isoladamente ou em associação com a esclerose hipocampal como:
tumores, displasias, calcificações, malformações vasculares, entre outras
(KUZNIECKY et al., 1987; HO et al., 1998).
A esclerose hipocampal refere-se a uma perda acentuada de neurônios
hilares e células piramidais no Corno de Ammon (CA), nas subregiões de CA1,
CA3, e regiões do giro denteado do hipocampo (BRUTON, 1988; MELDRUM et
al., 1992), com relativa preservação das células granulares e neurônios piramidais
de CA2, (MOURITZEN-DAM,1980; BABB et al., 1984; BABB E BROWN, 1987),
acompanhada de gliose (WOLF E WIESTLER, 1993) e atrofia da formação
hipocampal.
Durante o fenômeno epiléptico há um aumento na liberação de
aminoácidos excitatórios, o que pode causar morte neuronal por excitotoxicidade
(NAFFAH-MAZZACORATTI, 2002). Os neurônios mais sensíveis são, portanto,
aqueles que apresentam grande quantidade de receptores para os aminoácidos
excitatórios, como ocorre nas subáreas hipocampais CA1 e CA3. A ativação
prolongada de receptores glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) e
excessivo acumulo de cálcio intracelular são as bases para lesão citotóxica e
posterior perda de populações de neurônios vulneráveis (KALB, 1995).
Para um melhor entendimento do estudo das epilepsias se fez necessária à
busca por modelos experimentais, que são ferramentas extremamente valiosas
no estudo da prevenção, diagnóstico e tratamento das doenças e síndromes
epilépticas (AVANZINI, 1995).
1.4 Modelos Experimentais de Epilepsia
No decorrer dos anos, estudos se intensificaram na tentativa de elucidar os
mecanismos envolvidos no fenômeno epiléptico. O que permitiu um importante
avanço nestes estudos foi o desenvolvimento de modelos experimentais em
animais de laboratório, que mimetizassem os vários tipos de epilepsias,
permitindo assim, a escolha adequada para o estudo em questão.
O modelo experimental deve representar com fidelidade um fenômeno
epiléptico, devendo demonstrar a presença de atividade epileptiforme nos
registros eletrencefalográficos; apresentar clinicamente uma sintomatologia
semelhante àquela observada durante uma crise epiléptica e, a histopatologia,
apresentar alterações morfológicas idênticas às observadas em tecido epiléptico
humano.
Os vários modelos experimentais de epilepsia descritos na literatura podem
ser classificados em preparações agudas (crises únicas e não espontâneas) e
crônicas (crises recorrentes e registros eletrencefalógraficos que podem
evidenciar anormalidades elétricas intercríticas espontâneas) (PURPURA et al.,
1972; FISHER, 1989). Os modelos que têm atraído maior interesse são os
crônicos, por mimetizarem com maior fidelidade os mecanismos fisiopatológicos
envolvidos na epilepsia humana.
Para um melhor entendimento do estudo das epilepsias utilizamos o
modelo induzido pela administração de pilocarpina (PILO) (modelo crônico), que
mimetiza com fidedignidade a epilepsia do lobo temporal em humanos.
1.5 Modelo da Pilocarpina
A acetilcolina (Ach), as substâncias inibidoras da acetilcolinesterase, bem
como os análogos da Ach são agentes epileptogênicos efetivos quando
administrados intracerebralmente (CAVALHEIRO et al., 1983; TURSKI et al.,
1983) ou sistemicamente (TURSKI et al., 1983).
A importância dos mecanismos colinérgicos na epilepsia foi proposta em
torno do século XIX, mas foi no século XX que a pilocarpina (PILO), um alcalóide
de origem vegetal extraído das folhas do Pilocarpus pennatifolius e do Pilocarpus
jaborandi, que atua nos receptores colinérgicos muscarínicos, foi descrita por
TURSKI et al. em 1983.
A PILO pode facilmente atravessar a barreira hematoencefálica tornando
possível sua administração por via periférica (CAVALHEIRO et al., 1991). A
injeção de altas doses de PILO (300 a 400 mg/Kg) por via intraperitonial (i.p.),
produz alterações comportamentais e eletrográficas indicativas de atividade
epiléptica, que se iniciam nas estruturas límbicas, tanto em ratos (TURSKI et al.,
1983; LEITE et al., 1990) quanto em camundongos (TURSKI et al., 1984;
CAVALHEIRO et al., 1996). Estas alterações evoluem progressivamente para
crises generalizadas atingindo o estado de mal epiléptico, que por sua vez,
produz alterações patológicas cerebrais difusas (TURSKI et al., 1983 e 1984).
As alterações comportamentais produzidas pela administração
intraperitoneal de PILO, são dependentes da dose e do tempo. Imediatamente
após a injeção de doses subconvulsivantes de PILO (100 e 200 mg/kg), os
animais ficam imóveis, com suas patas recolhidas e as orelhas voltadas para trás
e coladas ao corpo. Este período precede à segunda fase na qual predominam
automatismos faciais. Em seguida (aproximadamente 2 horas), os animais
recuperam os padrões normais de comportamento pré-droga.
Na dose de 350 a 380 mg/kg, estas atividades motoras são mais intensas e
persistem aproximadamente por 30 minutos após a injeção. Após esse período,
os animais apresentam crises motoras límbicas, com intensa salivação, “rearing”
(o animal permanece em pé apresentando clonias dos membros anteriores
apoiado sobre as patas posteriores) e crises tônico-clônicas generalizadas. Tais
crises recorrem a cada 2-8 minutos e evoluem para o estado de mal epiléptico
(50-60 minutos após a injeção de PILO), perdurando em média 10 h (SE). As
primeiras 24 horas após a injeção da PILO caracterizam o período agudo do
modelo. Em seguida os animais recuperam gradativamente suas condições pré-
droga, sem crises e sem alterações comportamentais aparentes, caracterizando o
período silencioso do modelo. Este período pode durar de 4 a 44 dias (média de
14 ± 3.0 dias). Após este período, todos os animais sobreviventes passam a exibir
crises epilépticas espontâneas e recorrentes que caracterizam o período crônico.
Durante este período, os animais apresentam de 2 a 15 episódios críticos por mês
(média de 2 a 3 crises por semana). Entretanto, um estudo mais recente mostra
uma variação maior da freqüência de crises epilépticas no período crônico do
modelo da PILO (ARIDA et al., 1999). As crises espontâneas são caracterizadas
por automatismos faciais, clonias dos membros anteriores com elevação do corpo
sobre os membros posteriores e perda de equilíbrio com convulsões
generalizadas (CAVALHEIRO et al., 1991).
Da mesma forma que as alterações comportamentais, as alterações
eletrencefalográficas induzidas pela injeção i.p. de PILO são dependentes da
dose e do tempo. Dois a cinco minutos após a injeção da droga na dose de 100,
200 ou 350/380 mg/kg, a atividade eletrográfica normal de base é substituída por
uma atividade rápida de baixa voltagem no córtex e na amígdala, enquanto que
no hipocampo aparece um ritmo teta regular de 6-7 Hz. Após os primeiros 10
minutos, esta atividade é substituída por uma atividade rápida de alta voltagem
com espículas no hipocampo. A atividade com espículas difundem-se para o
córtex e progride para crises eletrográficas. Animais que recebem doses de 100 a
200 mg/kg de PILO continuam a mostrar estes tipos de alterações eletrográficas
por mais ou menos 2 horas após a administração da droga. Animais que recebem
350/380 mg/kg de PILO desenvolvem crises eletrográficas. Estas manifestações
epilépticas se iniciam ao redor dos primeiros 30 minutos após a injeção da droga.
As primeiras alterações eletrográficas surgem no hipocampo e rapidamente se
difundem para a amígdala e córtex. Períodos ictais recorrem a cada 3-5 minutos e
em aproximadamente 1 hora, a atividade eletrográfica evolui progressivamente
para o estado de mal epiléptico (SE). Este padrão de alteração do
eletroencefalograma (EEG) perdura por 7-8 horas e é seguido por progressiva
normalização, sendo que 48 horas após a administração da droga, o traçado
eletrencefalográfico pode ser considerado normal (TURSKI et al., 1983). Nas
primeiras crises espontâneas, as alterações eletrencefalográficas são
caracterizadas por atividade paroxística localizada somente no hipocampo sem
alterações nos registros corticais. As crises subseqüentes mostram uma difusão
gradual da atividade paroxística do hipocampo para o córtex, com eventos ictais
de longa duração. As crises espontâneas são então caracterizadas por um trem
de espículas no hipocampo seguido pela mesma atividade no córtex. Esta
atividade eletrográfica dura em torno de 60 segundos e é substituída por uma
atividade de base deprimida com espículas interictais freqüentes.
1.6 Vitamina D
As vitaminas são micronutrientes essenciais exigidos pelo organismo em
pequenas quantidades para um funcionamento metabólico normal do corpo
.
A
vitamina D (VD) é, ao mesmo tempo, uma vitamina e um hormônio esteroíde, cuja
função é a manutenção da concentração plasmática de cálcio e o metabolismo
ósseo no organismo humano (REICHEL et al, 1989).
Em 1919, MELLANBY constatou que o óleo de fígado de bacalhau possuía
atividade anti-raquitismo, denominando a substância ativa desse medicamento
como VD, e não a vitamina A como se acreditava. Somente em 1932 a VD foi
quimicamente caracterizada e a partir de então, tem sido classificada de acordo
com sua estrutura química em diferentes compostos análogos, tais como: VD2,
VD3, VD4, VD5 e VD6 (MELLANBY, 1919 apud MACDONALD; DOWD;
HAUSSLER, 1994). As diferenças estruturais desses compostos baseiam-se em
modificações nos anéis C e D e no lado da cadeia da vitamina que sofre essa
alteração. Devido a suas características bioquímicas, as atenções têm sido
focadas, quase que exclusivamente, na lipossolúvel vitamina D3 (colecalciferol) e
seus análogos (HAUSSLER et al., 1995), que circulam principalmente ligados a
uma globulina, uma Proteína Ligadora da Vitamina D (DBP), que transporta estas
moléculas hidrofóbicas a vários órgãos-alvo (HOLICK, 1995).
A VD pode ser obtida da dieta (óleo de peixe, gema de ovo, cogumelos e
leite fortificado) ou sintetizada na pele a partir do 7-dehidrocolesterol através da
ação dos raios ultravioleta (UV), sendo então transportada para o fígado, onde
sofre uma hidroxilação na posição 25 pela ação da enzima 25-hidroxilase,
transformando-se em 25-hidroxivitamina D3. Esta por sua vez, é transportada
para o rim onde sofrerá a segunda hidroxilação pela ação da enzima 1-
hidroxilase, produzindo a forma final do hormônio ativo 1,25-dihidroxivitamina D3
(1,25-(OH)
2
D
3
), o qual, por sua vez, promoverá ações no intestino, ossos e rim,
importantes para a homeostase do cálcio. O metabolismo se dá através da ação
da enzima 24-hidroxilase, a qual é controlada pela própria VD, criando-se assim
um mecanismo de atenuação à resposta hormonal e reduzindo os níveis de VD
quando estes se encontram elevados (BROWN, 1999).
1.7 Receptor de Vitamina D
Em 1969, HAUSSLER E NORMAN identificaram uma proteína nuclear, de
peso molecular 50 KDa, que foi caracterizada como sendo o receptor da VD
(VDR). A demonstração de que esta proteína formava um complexo firmemente
associado a determinados locais na cromatina celular, análogos ao sítio de outros
hormônios, consolidou a sua posição como membro de uma superfamília que
englobam também os receptores esteroídes, tireoidianos e receptores do ácido
retinóico (KRISHNAN & FELDMAN, 1991; KLIEWER et al., 1992).
A ação da VD ocorre pela via genômica, mediada através de seu receptor
nuclear, que tem a função de fator de transcrição. O VDR é membro da família de
receptores nucleares que compreende também os receptores de ácido retinóico
forma all-trans (RAR), ou forma 9-cis (RXR) e o receptor de hormônio tireoidiano
(T3R). O VDR, na forma de homodímeros ou heterodímeros com outros membros
da família, liga-se a elementos de resposta à vitamina D (VDRE), que são
caracterizadas pela presença de seqüências repetidas na forma direta de
hexâmeros AGGTCA, ou seqüências relacionadas, separadas por 3 nucleotídeos.
O VDR, na presença de vitamina D, controla a transcrição de genes que
contenham VDRE, que interagirá com o promotor de genes alvos para iniciar a
transcrição. Entre esses genes estão os genes 24-hidroxilase (OHYAMA et al.,
1994), β
3
integrina (CAO et al., 1993), c-fos (SCHRADER et al., 1997), p21
WAF1/CIP1
(LIU et al., 1996) e IGFBP3 (PENG et al., 2004). A expressão de
proteínas em sistemas eucarióticos e a clonagem do VDR nas várias espécies,
como em humanos (BAKER et al., 1988), ratos (BURMESTER et al., 1988),
camundongos (KAMEI et al., 1995
)
, galinhas (LU et al., 1997) e sapos da espécie
Xenopus laevis (LI et al., 1997), permitiram a demarcação de seus domínios
estruturais. Analisando-se esses domínios, observam-se regiões de ligação ao
DNA, extremamente conservadas, apresentando grande homologia com os
demais receptores desta grande família de receptores nucleares. Essa região
contém duas estruturas em forma de alças, mantidas por átomos de zinco,
denominadas dedos de zinco. Esse segmento direciona a especificidade da
ligação ao DNA, a dimerização e o controle da transcrição, e é muito semelhante
em organização aos encontrados nos demais membros desta superfamília de
receptores, embora as estruturas e funções desses hormônios sejam
completamente diferentes (HAUSSLER, 1995).
Além do VDR nuclear, postula-se a existência de um VDR de membrana
que seria responsável por ações mais rápidas (NORMAN et al., 2001; YAMADA et
al., 2001). Eles agiriam através da abertura de canais de cloro e das proteínas
ativadoras de mitoses (mitogen activated protein / MAP-kinases). As MAP-kinases
pertencem à família das proteínas-quinases, mais especificamente serinas e
treoninas-quinases, e podem ser ativadas pela fosforilação de seu resíduo de
tirosina, o que induz a citodiferenciação através de segundos mensageiros
(NORMAN et al., 2001).
Receptores de vitamina D são encontrados praticamente em todos os
tecidos, como rim, cérebro, ilhotas pancreáticas, osso, musculatura esquelética,
intestino, pele, paratireóide, hipófise, mama, linfócitos e monócitos (BRAIDMAN &
ANDERSON, 1985).
1.8 Vitamina D, Receptor de Vitamina D e Sistema Nervoso Central
A VD pode ser considerada como um hormônio neuroativo importante para
o desenvolvimento e manutenção de estruturas neuronais no SNC (WALBERT et
al., 2001). Vários estudos sugerem os efeitos neuroprotetores da VD em modelos
de excitotoxicidade (BREWER et al., 2001), encefalomielite (GARCION et al.,
1997), inflamação (GARCION et al., 1998) e exposição a neurotoxinas (SHINPO
et al., 2000; WANG et al., 2001). Os processos envolvendo a neuroproteção
mediada pela VD ainda não foram completamente elucidados, entretanto
mecanismos envolvendo a estimulação da produção de neutrofinas (RIAZ et al.,
1999), a inibição da produção de óxido nítrico (GARCION et al., 1997 e 1998) ou
a indução de proteínas ligantes de cálcio (de VIRAGH et al., 1989) têm sido
propostos.
Recentemente, disfunções da VD têm sido sugeridas em vários distúrbios,
como: Esclerose múltipla, Esquizofrenia, Alzheimer, Ansiedade, Depressão
(CARSWELL, 1997; GARCION et al., 2002; KALUEFF et al., 2004a; KALUEFF et
al., 2004b) e Epilepsia (SIEGEL, 1984).
A deficiência de VD no período pré-natal provoca alterações no
desenvolvimento cerebral (aumento no tamanho do cérebro, ampliação dos
ventrículos, redução na expressão do fator de crescimento neuronal (NGF) e
aumento da proliferação celular) (EYLES et al., 2003). Os efeitos causados pela
deficiência pré-natal de VD em camundongos nocaute durante o desenvolvimento
cerebral persistem até a idade adulta mesmo depois que os níveis de VD são
normalizados. Estes efeitos observados fornecem um mecanismo biológico
plausível para a ação de distúrbios comportamentais no início da idade adulta
(MCGRATH et al., 2004).
Alguns estudos mostram a expressão do VDR no cérebro de ratos
(CLEMENS et al., 1988, PRUFER, 1999), de hamster (MUSIOL, 1992) e de
animais em desenvolvimento (VEENSTRA et al., 1998; BURKET, 2003). Estudos
em ratos (PRUFER et al., 1999) e hamsters (MUSIOL et. al., 1992) mostram uma
distribuição de VDR nas regiões do córtex temporal, orbital, giro do cíngulo,
tálamo, núcleo accumbens, amígdala, sistema olfatório, e em neurônios
piramidais das subáreas hipocampais de CA1, CA2, CA3 e giro denteado
(PRUFER et. al., 1999), sugerindo uma ação funcional para este receptor
(LANGUB et al., 2001).
No cérebro humano a distribuição do VDR apresenta similaridade ao
encontrado em ratos, como no córtex préfrontal, giro do cíngulo, tálamo,
hipotálamo, amígdala, nas subáreas hipocampais CA1, CA2, CA3 e giro denteado
(EYLES et al., 2005).
1.9 Vitamina D, Receptor de Vitamina D e Epilepsia
Vários estudos têm evidenciado a associação entre VD e epilepsia. O
estudo pioneiro de SIEGEL et al. (1984) demonstrou aumento no limiar das crises
epilépticas depois de estimulação elétrica no hipocampo de ratos entre 5 a 10
minutos após o tratamento com a forma ativa da VD, (1,25(OH)
2
D
3
), tanto por
injeção intravenosa como por administração intrahipocampal, sugerindo uma
possível ação anticonvulsivante desse hormônio.
A VD induz a síntese de proteínas ligantes de cálcio, como a parvalbumina,
diminuindo a excitotoxicidade da célula neuronal (de VIRAGH et al., 1989).
Durante este processo de excitotoxicidade, várias enzimas são ativadas pelo
cálcio, e algumas passam a agir como segundos mensageiros, como o óxido
nítrico sintetase (NOS) (GARTHWAITE et al., 1989). Nesse sentido, sabemos que
o estresse oxidativo induzido pela crise convulsiva leva a um aumento dos níveis
de NOS. Conseqüentemente, a VD é capaz de provocar um aumento dos níveis
de glutationa, o que sugere uma função antioxidante desse hormônio no encéfalo
(GARCION et al., 1996).
Além disso, baixos níveis de VD resultam em hipocalcemia capaz de
induzir a crises epilépticas (CARSWELL, 1997; GARCION et al., 2002). O
tratamento crônico com drogas antiepilépticas (DAE) pode também prejudicar a
homeostase mineral, que leva a hipocalcemia e reduz os níveis de VD no plasma,
causando um aumento de crises epilépticas em alguns pacientes (OFFERMANN
et al., 1979; ALI et al., 2004).
Experimentos com camundongos nocaute para VDR demonstraram um
curto período de latência para início das crises epilépticas induzidas por
pentilenetetrazol (PTZ) e um aumento na mortalidade destes animais (KALUEFF
et al., 2006). Outro estudo mostrou uma redução na severidade das crises
epilépticas (longa latência, curta duração) e baixa mortalidade em camundongos
tratados com VD 40 minutos antes da injeção de PTZ (KALUEFF, 2005). Além
disso, estudos “in vitro” utilizando células hipocampais de ratos, demonstraram
que o tratamento com VD diminui a densidade de canais de cálcio do tipo L,
protegendo contra insultos excitotóxicos (BREWER et al., 2001).
Embora a função clássica de controlar a homeostase do cálcio fora do SNC
seja bem conhecida, a VD com suas funções mediadas pelo VDR tem
demonstrado múltiplas funções no tecido nervoso. Entretanto, ainda pouco se
conhece sobre sua função e a expressão de seu receptor no processo
epileptogênico.
2 OBJETIVO
O presente estudo teve como objetivo analisar a expressão relativa de
RNAm do VDR na formação hipocampal de ratos durante os períodos agudo,
silencioso e crônico do modelo de epilepsia do lobo temporal induzido pela PILO.
3 MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal de São Paulo (Escola Paulista de Medicina) – UNIFESP,
sob processo nº 1066/05, e posterior aprovação do Comitê de Ética para Análise
de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo - HC-FMUSP, sob processo nº 485/06.
Para a realização deste trabalho utilizamos ratos machos da raça Wistar,
adultos, pesando entre 200 e 280g no início dos experimentos. Os animais
utilizados foram provenientes do biotério central da UNIFESP, e mantidos no
biotério do laboratório de Neurologia Experimental durante todo o período
experimental para obtenção de animais com epilepsia. Os animais foram alojados
em grupo de até cinco ratos, em gaiolas apropriadas, onde tinham livre acesso a
água e comida. As condições do nosso biotério obedecem a um ciclo claro-escuro
de 12 horas (claro: 07:00-19:00), sendo a temperatura ambiente mantida
constante entre 21 e 22 °C.
Após aclimatação no biotério, os animais foram divididos aleatoriamente
em 5 grupos: 1- ratos controle (Grupo CTRL), 2- ratos que receberam PILO e
foram sacrificados 4 horas após o SE (Grupo SE), 3- ratos que receberam PILO e
foram sacrificados 7 dias após o SE (Grupo silencioso 7 dias – SIL 7D), 4- ratos
que receberam PILO e foram sacrificados 14 dias após o SE (Grupo silencioso
14 dias – SIL 14D) e 5- ratos que receberam PILO e foram sacrificados 60 dias
após a primeira crise espontânea, período crônico do modelo (Grupo Crônico).
3.1 Modelo Experimental de Epilepsia
Para obtenção de animais com epilepsia foi utilizado o modelo da PILO
(TURSKI et al., 1983). Os animais foram previamente administrados com metil-
escopolamina (Sigma) (1mg/kg, subcutânea.), 30 minutos antes da administração
da PILO (Sigma, St. Lowis, Millstone) (350 mg/kg, i.p.), com a finalidade de
minimizar os efeitos colinérgicos periféricos provocados pela droga. Após 4 horas
do início do SE, este foi interrompido mediante administração de diazepam
(5mg/kg, i.p.), um benzodiazepínico, com a finalidade de minimizar as crises
comportamentais.
Para detecção das crises espontâneas e recorrentes e formação do grupo
crônico, os animais foram separados individualmente em cones e levados à sala
de vídeo-monitoração, nas mesmas condições ambientais do biotério e
observados 24 horas até a detecção da primeira crise espontânea.
3.2 Extração do RNA Total
Após a retirada dos tecidos de interesse, hipocampo e rim, através de
decapitação dos animais, o material foi armazenado à temperatura de -80º C até a
data da extração do RNA. O RNA total foi extraído dos tecidos de interesse e
criopreservado pelo método de CHOMEZYNSKI & SACCHI (1987), usando o
reagente Trizol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, USA) de acordo com as
instruções do fabricante, o processo de extração de RNA consiste em quatro
fases:
1) Fase de separação do RNA: Aproximadamente 100 mg de tecido
congelado foi pulverizado com Termovac (Telcolab Corporation) em nitrogênio
líquido e colocado em um microtubo juntamente com 1,5 ml de Trizol sendo
homogeneizado por inversão. Incubou-se as amostras por 10 minutos na
temperatura ambiente, centrifugou-se a 12.000 rpm por 15 minutos a 4ºC, sendo
em seguida adicionado 200µL de clorofórmio, depois, as amostras foram agitadas
e mantidas à temperatura ambiente por 10 minutos, logo após, foram submetidas
a centrifugação a 12.000 rpm por 15 minutos a 4ºC. A fase aquosa foi transferida
para um tubo novo, evitando-se a interfase.
2) Fase de precipitação do RNA: Foi adicionado ao sobrenadante (já em
outro tubo) 500µL de álcool isopropílico, homogeneizado por inversão e mantido
no freezer à –20ºC por um período de 12 horas.
3) Fase de lavagem: Após esse período, centrifugamos novamente as
amostras (15 minutos/12000rpm/4ºC), descartamos o sobrenadante preservando
o material precipitado, que foi ressuspendido em 1ml de etanol (75%), seguidos
de 10 minutos de centrifugação a 12.000 rpm a 4ºC.
4) Dissolução do RNA: Desprezou-se o sobrenadante, preservando o
precipitado (onde está contido o RNA), deixando os tubos abertos e invertidos
sobre papel absorvente. Adicionamos 20µL de H
2
O deionizada tratada com
dietilpirocarbonato (DEPC) (Merck, Alemanha), que constitui um forte inibidor de
ribonuclease, sendo essa quantidade suficiente para diluir o pellet de RNA. Dessa
solução final, foram retirados 1µL para leitura em espectrofotômetro e 1µL para a
eletroforese em gel de agarose.
Avaliação da concentração e grau de pureza das amostras de RNA por
espectrofotometria:
A avaliação da concentração e grau de pureza das amostras de RNA foram
feitas em uma solução com 1µL da amostra de RNA extraído com 199µL de H
2
O
miliQ, para obter uma referência utilizou-se um tubo com H
2
O DEPEC (1µL) e
H
2
O miliQ (199µL). A leitura no espectrofotômetro Gene Quant pro (Amersham
Bioscience, Cambridge, Sweden) foi determinada através da leitura da
absorbância, em comprimento de onda de 260nm e 280nm, este aparelho emite
ondas de luz que, após atravessarem a solução, ou seja, quanto menos luz for
captada pelo foto-detector, maior é a concentração da amostra. A relação entre
as leituras obtidas com ondas de 260nm e 280nm (260/280) deve ser entre 1,7 e
2,0; quando obtemos RNA com alto grau de pureza.
Eletroforese em gel de agarose de RNA extraído:
A qualidade do RNA extraído foi controlada por eletroforese em gel de
agarose a 1%, contendo MOPS 1x e 5,1% de formaldeído, verificando, assim a
integridade das bandas de RNA ribossômico 18S e 28S, que indicam e confirmam
a presença de RNA. As amostras de RNA foram preparadas com 5µL de tampão
de aplicação para RNA, 1µL de brometo de etídio e 1µL do RNA extraído,
enquanto que o gel foi feito com 0,25g de agarose diluída em 21,75ml de H
2
O
miliQ, 2,5ml de MOPS 10x e 1,5ml de formaldeído a 37%. A corrida eletroforética
em gel de agarose foi realizada em tampão MOPS 1x e voltagem de 60 volts a
temperatura ambiente.
3.3 Tratamento do RNA Total com DNase
A partir de 10µg de RNA total seu volume final foi acertado para 50µL com
TE (10mM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH 8,0) (Gibco BRL, Grand Island, USA) sendo
então adicionado: 1µL de MgCl
2
1M (Invitrogen Life Technologies); 1µL de DTT
(0,1M) (Invitrogen); 1µL de DNAse/RNAse Free (10U/µl) (Roche, Mannheim,
Alemanha); 2µL RNasin (40U/µl) (Promega, Madison, USA) para inibir o RNA, e
45µL de TE. Incubou-se as amostras a 37ºC por 10 minutos, adicionou-se em
seguida 2µL da proteinase K (2mg/ml), incubando-se as amostras a 37ºC por 30
minutos. Adicionamos: 2,5µL de EDTA (0,5M), 12,5µL de acetato de sódio (3M pH
5,4), 2,5µL de SDS (10%), 7,5µL de H
2
O MiliQ e 100µL H
2
O DEPEC. Para retirar
DNA e outras proteínas remanescentes foram acrescentados 114µL de fenol (pH
5,0) e 114µL de clorofórmio, agitamos essa mistura por 15 segundos, as amostras
foram submetidas à centrifugação de 12.000 rpm por 15 minutos a 4ºC,
recuperou-se o sobrenadante, o qual foi transferido para um novo microtubo,
acrescentamos 250µL de álcool isopropílico e o mesmo volume de NaCl (250mM)
com a finalidade de precipitar o RNA. Este material foi armazenado a temperatura
de -20ºC por aproximadamente 18 horas. Após esse período, as amostras foram
centrifugadas a 12.000 rpm a 4ºC por 15 minutos, desprezou-se o sobrenadante e
foi adicionado 1ml de etanol (75%), para lavagem do pellet, sendo então,
centrifugado novamente a 12.000 rpm a 4ºC por 15 minutos. Em seguida,
desprezamos o sobrenadante, deixamos os tubos invertidos sobre papel
absorvente, e ressuspendemos com 20µL de H
2
O DEPC.
O RNA total foi tratado com DNAse/RNAse Free com a finalidade de se
evitar contaminação com qualquer tipo de DNA remanescente, a integridade e
qualidade do RNA após este tratamento, foi determinada da mesma forma que
para a extração de RNA total, foram controladas por eletroforese em gel de
agarose 1% coradas com brometo de etídio e a concentração de absorbância
realizada por espectrofotometria.
3.4 Reação de Transcriptase Reversa (RT) para obtenção de cDNA
Foram coletados volumes que correspondem a 4µg de RNA tratado com
DNAse/RNAse Free e acrescentado H
2
O contendo solução inibidora DEPC para
um volume final de 10µL. A esta solução foi adicionado 2µL de hexâmeros
iniciadores na concentração de 0,5µg/µL (Amersham biosciences, Piscataway,
NJ) a mistura foi incubada a 70ºC por 10 minutos, para romper qualquer estrutura
secundária que poderia ter sido formada, e colocada imediatamente no gelo por 2
minutos após incubação inicial. Foram adicionados: 4µL do tampão 5X First
Strand Buffer (Invitrogen, Brasil), 2µL de desoxirribonucleotídeos trifosfatados
(dATP, dGTP, dCTP e dTTP - dNTPs) a concentração de 2,5mM (Gibco, BRL) e
1µL de ditiotreitol (DTT) a concentração de 0,1M (Invitrogen, Brasil), que age na
desnaturação da cadeia molde. Foi realizada nova incubação a 55ºC por 10
minutos. Logo após, foi adicionado 1µL da enzima Superscript III Reverse
Transcriptase 200U/µl (Invitrogen, Brasil) seguida por aquecimento a 55ºC por 1
hora. Após 1 hora de tratamento com a referida enzima à temperatura foi elevada
para 70ºC por 15 minutos para inativação da enzima. A síntese da primeira fita de
cDNA obtida foi estocada a -20ºC até a amplificação por meio da Reação em
Cadeia da Polimerização (PCR) em Tempo Real.
A análise da concentração do cDNA obtido também foi realizada através de
espectrofotometria, sendo a relação ideal de 1,7 até 2,0. A análise da qualidade e
integridade foi feita por eletroforese em gel de agarose a 2%.
3.5 Seleção e Desenho dos Oligonucleotídeos Iniciadores (primers)
Foram selecionados três genes (específicos para rato) para este estudo,
sendo eles: o receptor de vitamina D (VDR) gene de interesse, o gliceraldeído-3-
fosfato dehidrogenase (GAPDH) (BOSS et al., 2005; FERON et al., 2005) e o
hipoxantina guanina fosforibosiltransferase (HPRT) (MANN & BABB, 2005; Del
SIGNORE et al., 2006) foram utilizados como genes constitutivos, isto é, genes
cuja expressão não apresentem variação, sendo utilizados para avaliação da
qualidade da reação como normalizadores internos (Tabela 1).
Os oligonucleotídeos foram desenhados a partir da seqüência de RNAm
dos genes a serem estudados. As seqüências dos genes foram adquiridas pelo
site www.ncbi.nem.nih.gov/nucleotide. Para a montagem do mapa gênico da
seqüência de genes escolhida foi utilizado o software localizado no endereço
eletrônico www.genome.ucsc.Edu/cgi.bin/hgbeat. Uma vez tendo o mapa gênico
do gene de interesse pode-se conhecer a localização numérica exata dos íntrons
e éxons, e assim, houve o planejamento da melhor localização para se desenhar
o primer (próximo da região 3’ e primers entre íntrons com tamanho maior de
1000 pb (pares de base). Para evitar a amplificação de genes que possuem
homologia de outras seqüências gênicas, foi utilizado o software BLAST onde se
analisou toda a seqüência gênica dos genes selecionados, e só foram utilizadas
aquelas com alta similaridade ao gene de interesse.
As seqüências de oligonucleotídeos (primers) para amplificação dos
genes selecionados foram obtidas a partir do software Primer3. Para análise da
qualidade dos primers foi utilizado o software OLIGOTECH com finalidade de
evitar a possibilidade da formação de estruturas secundárias entre as próprias
fitas de oligonucleotídeos.
Tabela 1 – Seqüência e descrição dos genes selecionados para o estudo.
Gene
Seqüência gênica
Tamanho do
produto de
cDNA
Código
de acesso
VDR
(primer right) 5’ GTC TGC AGC GTG TTG GAT AG 3’
(primer left) 5’ TGA TCG AGC CCC TCA TAA AG 3’
157 pb NM_017058
GAPDH
(primer right) 5’ ACG CCA GTA GAC TCC ACG AC 3’
(primer left) 5’ ATG ACT CTA CCC ACG GCA AG 3’
178 pb X02231
HPRT
(primer right) 5’ CCG CTG TCT TTT AGG CTT TG 3’
(primer left) 5’ CTG GTG AAA AGG ACC TCT CG 3’
169 pb NM_012583
3.6 Reação em Cadeia da Polimerização (PCR) em Tempo Real
A reação de RT-PCR em tempo real foi realizada em um termociclador
Rotor Gene RG-3000 (Corbett Research, 2004). A obtenção e a análise dos
dados foi realizada pelo software Rotor Gene 6.0 criado pela Corbett Research.
Entretanto, antes de iniciarmos os experimentos de quantificação realizamos uma
padronização do método para análise da expressão do VDR, GAPDH e HPRT,
que envolveu: o teste de eficiência de amplificação dos primers, e a determinação
da quantidade de cDNA molde.
Para determinar a eficiência de amplificação dos primers foram realizadas
curvas de amplificação utilizando quantidades conhecidas de cDNA em cada
reação. A partir da leitura feita na etapa de Transcriptase Reversa (RT) para
obtenção de cDNA, foram realizadas diluições seriadas: 1000 ng/µL; 500 ng/µL;
250 ng/µL e 125 ng/µL. Ao final da reação foi verificada a relação entre a
quantidade inicial de amostra e o numero de ciclos obtidos em uma determinada
fluorescência (Ct). Espera-se, que a cada ciclo dobre a quantidade de produto
formado (2 Ct). Tendo definido o nível de fluorescência e coletado o numero de
ciclos necessários para amplificar quantidades diferentes de cDNA inicial, é
possível correlacionar estes dois fatores. A inclinação da reta (slope) obtido
determina a eficiência de amplificação da reação. O ideal é que a reação
apresente 100% de eficiência (duplicação dos produtos de PCR a cada ciclo) ou
com variações de 10% para mais ou menos. Por meio destas análises foi possível
determinar a melhor quantidade de amostra para os primers desenhados. (Figura
1).
Figura 1 – Representação do teste de eficiência dos primers.
Assim, a técnica de PCR em tempo real foi realizada utilizando-se, para um
volume final de 20 µL: 1µL de cDNA de cada amostra, 0,6µL de cada primer à
concentração de 10mM, 8,95µL de H
2
O ultra pura, 3µL de 10X PCR Buffer
(Invitrogen, Brasil), 1,2µL de MgCl
2
a concentração de 50mM (Invitrogen, Brasil),
2,4µL de dNTP’s a concentração de 2,5mM, 1,5µL de DMSO (Dynal Biotech ASA,
Oslo, Norway), 0,45µL de taq platinum DNA polimerase (5U/µL) (Invitrogen,
Brasil) e 0,3µL de SYBR Green.
As condições determinadas para a reação foram: 40 ciclos, 10 minutos à
95ºC (aquecimento inicial), 15 segundos à 95ºC (desnaturação), 60 segundos à
60ºC (anelamento) e 60 segundos à 72ºC (extensão), estas condições foram
determinadas para os três primers desenhados.
Esta PCR avalia o acúmulo do produto na fase logarítmica da reação de
amplificação, o qual está diretamente relacionado à quantidade de molde
existente no início da reação, sendo atualmente considerado um método bastante
preciso e reprodutível para a quantificação da expressão gênica.
Utilizamos o sistema de detecção por SYBR Green, que se baseia no uso
de uma molécula fluorescente, denominada SYBR Green Ι, que quando
intercalada à dupla fita da DNA, passa a ser detectável (WALKER, 2002). Durante
os ciclos iniciais da reação de PCR, o sinal de fluorescência emitido pelo SYBR
Green
Ι
é fraco para ser detectado, isto é, não ultrapassa o sinal de fluorescência
de fundo. Entretanto, no decorrer dos ciclos da reação de PCR, há o aumento do
produto amplificado e conseqüentemente o aumento do sinal de emissão de
fluorescência, passando a ser detectável, sendo assim os valores são
quantificados depois de um número fixo de ciclos, o que representa a quantidade
final de cada produto acumulado, diferente da reação de PCR convencional
(GINZINGER, 2002). A metodologia que utiliza o SYBR Green
Ι
exige cuidadosa
padronização, uma vez que este fluorócromo se intercala a qualquer molécula de
dupla fita presente na reação. A especificidade da detecção de fluorescência com
SYBR Green
Ι
pode ser comprometida pela formação de dímeros de
oligonucleotídeos, pela concentração inadequada de oligonucleotídeos e pela
formação de produtos de amplificação inespecíficos. Todos estes fatores levam à
formação de moléculas de dupla fita não esperadas, as quais incorporam o SYBR
Green
Ι
e têm sua fluorescência registrada.
Neste método de detecção, a confirmação de especificidade da
amplificação é realizada por meio da análise da curva de desnaturação ou melting
curve. Nesta curva, analisa-se a fluorescência das amostras em relação ao
aumento contínuo da temperatura, o que possibilita determinar a temperatura de
fusão ou melting temperature (Tm) de cada fragmento, resultante da reação de
amplificação. Cada fragmento amplificado possui um Tm específico, o que
permite a diferenciação entre os produtos resultantes.
Durante a reação, a fluorescência aumenta a cada novo ciclo de
polimerização e atinge um limiar (threshold), no qual todas as amostras podem
ser comparadas. Este limiar corresponde ao momento utilizado para análise da
fluorescência. Este é um ponto definido pelo pesquisador e obrigatoriamente deve
estar na faixa em que a quantidade de fluorescência gerada pela amplificação das
amostras torna-se significativamente maior que a fluorescência da base
(background). O limiar é definido na fase exponencial da reação de PCR, quando
a quantidade de produto formada traduz de forma satisfatória a concentração
inicial de fitas molde (cDNA) amplificadas pela reação. O ciclo exato no qual o
limiar de fluorescência é definido denomina-se ciclo limiar (Ct: threshold cycle).
Amostras mais concentradas (com maior número de fitas molde iniciais) atingem
o limiar mais precocemente e mostram valores de Ct mais baixos. Quando a
eficiência da reação de PCR está próxima de 100%, o número de cópias geradas
aumenta de forma exponencial, dobrando a cada ciclo da reação.
O número de fitas-molde presentes no ínicio da reação pode ser calculado
a partir do Ct. Assim, a equação Nf=No(1+E)ⁿ descreve a amplificação
exponencial de PCR, onde Nf é o número de fita-molde em um determinado ciclo
da reação, No é o número de fita molde inicial, E é a eficiência de amplificação da
reação e n é o número de ciclos.
Considerando que a eficiência da reação seja de 100% (log E=1) que n
seja um ponto escolhido da amplificação idêntico, a todas amostras, poderemos
obter o número de fitas-molde presentes no inicio da reação, com a equação:
No= Nf x 2
–C
T
.
A análise da expressão gênica por meio de PCR em tempo real usado em
nosso estudo representa uma quantificação relativa dos genes de interesse, uma
vez que requer um controle endógeno, ou seja, um gene cuja expressão não
apresente variação estatisticamente significativa entre as amostras analisadas.
A quantificação relativa por PCR em tempo real para uma determinada
amostra é dada pela relação do Ct do gene de interesse (i) e o Ct do controle
endógeno (e). Assim temos:
Nfi=Noi x 2
–Cti
(gene de interesse)
Nfe=Noe x 2
–Cte
(gene endógeno)
Sendo que Nfi/Nfe é a quantidade normalizada de moléculas do gene de
interesse em relação ao número de moléculas do controle endógeno que iremos
chamar de X, e Nfe e Nfi uma constante que nomeamos por K, a equação fica:
X=K. 2
-∆Ct.
A quantificação relativa da expressão gênica é usada para descrever
mudanças na expressão de um gene de interesse em um grupo de amostras em
relação a um grupo de referência. Assim o valor de X é medido em duas
diferentes condições, logo dividimos a condição A pela condição B e obtemos
2-
∆∆Ct
, como mostra equação a seguir (LIVAK, 2001):
Este método foi usado em nosso estudo para determinar os níveis de
expressão relativa do VDR.
3.6.1 Amostra Referência (Rim) e Controle Negativo
Já está bem estabelecido na literatura a existência do VDR em tecido renal
(BRAIDMAN & ANDERSON, 1985), sendo que o rim é o local para síntese da
forma ativa da VD (FRASER & KODICEK, 1970), em decorrência a estes fatos,
utilizamos os rins do grupo controle, retirados logo após decapitação dos animais
através de uma incisão na caixa torácica, os quais passaram por todos os
procedimentos experimentais desde a extração de RNA total até a PCR em tempo
real, sendo estas amostras utilizadas como referência para calcularmos o ∆∆Ct.
Para excluir a possibilidade de contaminação, utilizamos uma reação com
ausência de cDNA (template) que foi usada como controle negativo. As amostras
experimentais, referência e controle negativo para um mesmo gene foram
realizados a partir da mesma mistura de reagentes.
3.7 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram analisados com o software SPSS (SPSS Inc.,
Chicago, IL, U.S.A) com o teste Kruskal Wallis seguido pelo teste Mann-Whitney
U.
4 RESULTADOS
4.1 Alterações comportamentais observadas no modelo de epilepsia
induzida pela pilocarpina
Período Agudo - Após administração de PILO, os animais apresentaram
automatismos faciais, salivação moderada, acinesia e tremores generalizados.
Após 20-25 minutos da injeção, estes comportamentos progrediram, originando
crises motoras límbicas, salivação intensa, clonias de patas dianteiras apoiadas
sobre as patas posteriores, e finalmente quedas. Estas crises motoras
começaram aproximadamente 30 minutos após a injeção, e recorreram a cada 2-
8 minutos, culminando em estado de mal epiléptico dentro de 50-60 minutos,
período no qual os animais tornaram-se irresponsivos aos estímulos ambientais,
retornando gradativamente a seu comportamento normal dentro de 24 horas.
Esse período foi caracterizado pela ocorrência de crises límbicas que cresceram
em complexidade e alastramento levando o animal ao SE (LEITE et al., 1990).
Período Silencioso - Este período foi caracterizado pela normalização do
EEG e das alterações comportamentais que aparecem no período agudo,
caracterizando uma fase livre de crises, que durou em média 18 dias após injeção
da PILO.
Período Crônico - O período crônico foi caracterizado pelo aparecimento
da primeira crise espontânea dos animais, os quais passaram a apresentar crises
espontâneas e recorrentes. Inicialmente, os animais se apresentaram imóveis
com os olhos fixos e discreta movimentação das vibrissas. A seguir, apareceram
movimentos mastigatórios, piscamento e eventual salivação seguidos por abalos
clônicos de um ou dos dois membros anteriores. A esse comportamento
observou-se elevação do corpo com apoio nas patas posteriores
concomitantemente a clonias das patas anteriores, para finalmente apresentarem
perda do equilíbrio postural e convulsão tônico-clônico generalizada, com duração
aproximada de 40 a 60 segundos. Com o término da crise, o animal se manteve
imóvel e qualquer tentativa de manuseio ou estímulo táctil exibiram intensa
atividade motora.
4.2 Extração de RNA Total
No gel de agarose (1%) observamos amostras representativas de RNAs
retiradas da região hipocampal dos cinco diferentes grupos estudados, assim
como a representação das amostras de RNAs obtidas da retirada do rim (amostra
referência) do grupo controle, nas quais visualizamos as bandas correspondentes
aos RNAs ribossomais 28S e 18S (Figura 2).
Figura 2 – Representação das amostras de RNAs.
4.3 Tratamento do RNA Total com DNase
Observamos as mesmas amostras representativas de RNAs obtidas na
etapa de extração de RNA total, porém tratadas com DNAse/RNAse Free (Roche
Mannheim, Germany) a fim de evitar qualquer tipo de contaminação com DNA
remanescente, demonstrado pela ausência de material na região do “slot” no gel
de agarose (1%), o qual visualizamos as bandas correspondentes aos RNAs
ribossomais 28S e 18S. As amostras consideradas de boa qualidade foram
utilizadas na obtenção da reação de transcriptase reversa (RT) para a síntese do
cDNA (Figura 3).
CTRL SE
SIL 7d SIL 14d Crônico Rim
28 S
18 S
Figura 3 – Representação das amostras de RNAs tratadas com o reagente
DNAse/RNAse Free.
4.4 Amostras de cDNA
Após o tratamento com o reagente DNAse/RNAse Free (Roche Mannheim,
Germany) foi sintetizada a primeira fita de cDNA, a relação da espectrofotometria
com comprimento de onda de 260nm e 280nm de todas as amostras variaram de
1,7 a 2,0, o que nos atestou a boa qualidade dos cDNAs. Esta leitura permitiu o
cálculo da concentração média de cDNA (tabela 2).
Tabela 2. Concentração média de cDNA em µg/µl.
Grupos cDNA (µg/µL)
CTRL (n=8) 1,48
SE (n=7) 1,77
SIL 7D (n=8) 1,90
SIL 14D (n=8) 1,99
Crônico (n=8) 1,70
Rim (n=8) 1,60
18 S
28 S
CTRL SE SIL 7d SIL 14d Crônico Rim
4.5 RT-PCR em Tempo Real e Escolha do Normalizador Adequado
Padronizou-se a reação de PCR em tempo real, utilizando-se a primeira fita
de cDNA obtida das amostras, para avaliar a expressão de RNAm do VDR, do
GAPDH e do HPRT. Analisamos ambos os controles internos para escolha do
normalizador adequado, e após calculo pelo método ∆∆Ct optamos pelo GAPDH,
o qual apresentou valores mais homogêneos quando comparado ao HPRT.
As reações foram feitas em duplicatas e os resultados dos Cts das
duplicatas demonstraram-se satisfatórios, pois a diferença entre eles não
ultrapassou 1,5. A curva de quantificação, em todos os ensaios, demonstra que:
as curvas no eixo X denotam o número de ciclos de amplificação e no eixo Y a
intensidade de fluorescência. O limiar de detecção de fluorescência está
associado à expressão do gene alvo. Apenas as amostras do controle negativo
permaneceram com emissão de fluorescência no limiar, as demais apresentaram
fluorescência detectável (Figuras 4, 5 e 6).
A curva de desnaturação se revelou adequada, pois demonstrou um único
pico de Tm, resultante de um único produto, mostrando a especificidade da
reação. A curva de desnaturação, em todos os ensaios, demonstra que: após o
término da reação, uma etapa de dissociação é realizada para visualizar a
cinética de dissociação dos produtos amplificados. Aumenta-se a temperatura de
forma linear e a fluorescência de cada amostra é representada graficamente. O
eixo X mostra a temperatura e o eixo Y à intensidade da fluorescência. O pico de
fluorescência emitida pelas amostras indica a temperatura ideal para a
dissociação dos fragmentos amplificados (Figuras 7, 8 e 9). Todas as figuras são
representativas do ensaio de RT-PCR em tempo real com os devidos genes
selecionados para este estudo.
Figura 4
-
Curva de quantificação demonstrando a expressão gênica
do VDR e do GAPDH proveniente da região hipocampal de ratos.
GAPDH
VDR
Figura 5
-
Curva de quantificação demonstrando a expressão gênica do
GAPDH em tecido renal de ratos controles.
Figura 6
-
Curva de quantificação demonstrando a expressão gênica do
VDR proveniente de tecido renal de ratos controles.
Figura 7
-
Curva de desnaturação demonstrando a expressão gênica do
VDR e do GAPDH na região hipocampal de ratos.
O pico de fluorescência emitida pelas amostras com VDR encontra-se entre os
valores de 86°C e 90°C. O pico de fluorescência emitida pelas amostras com
GAPDH encontra-se entre os valores de 85°C e 89°C.
GAPDH VDR
Figura 9
-
Curva de desnaturação demonstrando a expressão gênica do
VDR em tecido renal de ratos. O pico de fluorescência emitida pelas amostras
encontra-se entre os valores de 85°C e 91°C.
Figura 8
-
Curva de desnaturação demonstrando a expressão gênica do
GAPDH em tecido renal de ratos. O pico de fluorescência emitida pelas
amostras encontra-se entre os valores de 84°C e 90°C.
O método comparativo C
T
(∆∆C
T
) foi usado para quantificar a expressão do
gene de interesse (VDR) e a expressão relativa foi calculada como 2
-∆∆CT
. A
expressão relativa do VDR foi normalizada pelo gene GAPDH, e a expressão
gênica de cada amostra foi depois comparada com a expressão da amostra
referência (rim).
Nossos resultados demonstraram uma maior expressão de RNAm do VDR
dos animais dos grupos SIL 7D (0,060 ± 0,024), SIL 14D (0,052 ± 0,035) e
Crônico (0,085 ± 0,055), quando comparados com os animais do grupo CTRL
(0,019 ± 0,017). Não foram observadas alterações estatisticamente significantes
nos animais do grupo SE (0,019 ± 0,025) quando comparado aos animais do
grupo CTRL. Entretanto, ocorreu uma diminuição estatisticamente significante do
grupo SE em relação aos grupos SIL 7D, SIL 14D e Crônico (Gráfico 1).
Gráfico 1 - Valores da expressão relativa de RNAm do VDR nos diferentes
grupos de animais submetidos ao modelo da PILO. Os valores são expressos
como média ± desvio padrão. *Estatisticamente significante em relação ao grupo
CTRL. **Estatisticamente significante em relação ao grupo SE. (p ≤ 0,05).
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
CTRL SE SIL 7D SIL 14D Crônico
**
*
**
*
**
*
5 DISCUSSÃO
Vários estudos têm sugerido uma associação entre VD e epilepsia
(KALUEFF, 2005 e 2006). Entretanto, poucos trabalhos analisaram a expressão
do VDR durante o processo epileptogênico. Nesse sentido, o objetivo deste
estudo foi analisar a expressão relativa de RNAm do VDR na formação
hipocampal de ratos em diferentes períodos do modelo de epilepsia induzido pela
PILO. Os resultados de nosso estudo demonstraram uma maior expressão de
RNAm do VDR em animais no período silencioso e crônico do modelo da PILO.
Em humanos, baixos níveis de VD provocam hipocalcemia que induz crises
epilépticas devido a hiperexitabilidade da membrana neuronal. Desta forma, o
tratamento da hipocalcelmia com VD e cálcio tem sido utilizada para reduzir as
crises epilépticas nestes pacientes (GUPTA E GROVER, 1977). Ao mesmo
tempo, já está bem estabelecido que o tratamento crônico com drogas
antiepilépticas diminui a homeostase mineral em pacientes com epilepsia, levando
a uma hipocalcemia e redução dos níveis plasmáticos de VD, o qual pode induzir
crises epilépticas (ALI et al., 2004; DREZNER, 2004). Um dos primeiros estudos
que associaram o efeito da VD na epilepsia mostrou que altas doses de VD
reduziram significativamente o número de crises epilépticas em pacientes com
epilepsia e este efeito não estava relacionado a alterações séricas de cálcio e
magnésio (CHRISTIANSEN et al., 1974).
Paralelamente aos estudos clínicos, estudos experimentais também têm
mostrado um efeito anticonvulsivante desse hormônio no SNC. Efeitos
anticonvulsivantes diretos de 1,25-D, um metabólito ativo da VD, têm sido
demonstrado em vários modelos experimentais de epilepsia, confirmando o papel
da VD/VDR nesta síndrome neurológica (SIEGEL et al., 1984; KALUEFF et al.,
2005). O estudo pioneiro de SIEGEL et al. (1984) mostrou um aumento do limiar
das crises em ratos após estimulação elétrica no hipocampo, 5 a 10 min depois
da administração i.v. de 1,25-D. Em outro estudo, o tratamento de 1,25 (OH)2D3
(s.c), administrado 40 minutos antes da aplicação de PTZ, reduziu a severidade
das crises, porém, os efeitos antiepilépticos observados desapareceram 3 horas
após a sua aplicação (KALUEFF et al., 2005). Subseqüentemente, TETICH et al.
(2005), observou que o tratamento com PRI-2191 (um análogo da VD com baixa
atividade calcêmica) por um período de 8 dias antes da administração de PILO,
não exibiu efeito significativo nas alterações comportamentais causadas pela
aplicação da droga. Entretanto, a análise histológica demonstrou preservação na
área CA1 do hipocampo, contrastando com a alta eficácia “in vitro” (TETICH et al.,
2003; TETICH et al., 2004).
Apesar destes estudos mostrarem uma possível ação protetora da VD na
epilepsia, poucos estudos têm analisado a expressão do VDR durante a
epileptogênese. Um estudo com cultura de neurônios corticais que receberam
tratamento crônico de VD3 e que posteriormente foram expostos ao glutamato por
2 horas, mostrou uma redução na morte neuronal e um aumento do RNAm do
VDR, sendo que essa maior expressão do receptor foi significativa apenas nos
períodos tardios (12 e 24 horas) da exposição ao glutamato dentre os diversos
períodos analisados (2, 6, 12 e 24 horas) (TANIURA et al., 2006). KALUEFF et al.
(2006), utilizando o modelo de epilepsia induzida por PTZ em camundongos
nocautes de VDR, observou um aumentou significativo da mortalidade nesses
animais e na susceptibilidade às crises epilépticas, indicando um possível
envolvimento do VDR e da VD nesses processos.
Em nosso estudo, uma maior expressão de RNAm do VDR foi observada
no período silencioso e crônico do modelo da PILO. Possivelmente o aumento da
expressão do VDR nestes animais pode estar associado a um processo de
neuroplasticidade. Em mamíferos, o processo de neurogênese (umas das formas
de neuroplasticidade) ocorre principalmente em duas regiões; na zona
subgranular do giro denteado e na zona subventricular (RAKIC, 2002), regiões
que expressam o VDR (VEENSTRA et al., 1998). A lesão induzida pelas crises
epilépticas leva a várias formas de plasticidade no giro denteado do roedor adulto,
como reorganização sináptica, ativação de astrócitos, remodulação dendrítica e
dispersão das células granulares (PARENT & LOWENSTEIN, 1997). As crises
prolongadas estimulam a neurogênese nas células do giro denteado e a
plasticidade da rede hipocampal associada a epileptogênese pode levar a
conecções aberrantes formadas por novos neurônios no giro denteado. PARENT
et al. (1997), utilizando o modelo experimental de ELT induzido pela PILO
demonstraram um aumento da proliferação celular na zona subgranular do giro
denteado. A atividade proliferativa nesta região aumentou 3 dias após o SE e
permaneceu elevada até o décimo terceiro dia após o episódio inicial de SE, o
que corresponde ao período silencioso do modelo da PILO. Comparativamente,
nossos achados condizem com os resultados acima, visto que encontramos uma
aumento da expressão de RNAm do VDR 7 e 14 dias após o SE, assim como
durante o período crônico do modelo. Desta maneira, o aumento da expressão
do VDR durante estes períodos do modelo da PILO, poderia estar relacionada a
uma tentativa do SNC em aumentar os mecanismos de proteção, caracterizando
um processo de neuroproteção endógena após um insulto cerebral agudo.
Como citado anteriormente, embora os mecanismos envolvendo as ações
da VD e do VDR no SNC sejam pouco conhecidos, pressupõe-se que a alteração
da homeostase do cálcio neuronal pode estar envolvida. Estudos têm
demonstrado que o hipocampo apresenta uma maior vulnerabilidade a agressões
quando comparado a outras estruturas cerebrais, e isto pode ser conseqüência de
suas características celulares, com a expressão diferencial de receptores e
proteínas (MELLO & COVOLLAN, 1998). O aumento na concentração de cálcio
intracelular, principalmente pelos canais de cálcio do tipo L, tem sido apontado
como o provável responsável pela lesão de neurônios seletivamente vulneráveis.
Estudo com células hipocampais de ratos demonstrou que o tratamento com VD
diminui a densidade dos canais de cálcio do tipo L (LANDFIELD, 1998), os níveis
de RNAm das subunidades formadoras desses canais (BREWER, 2001), além de
aumentar os níveis de glutationa intracelular (GARCION, 2002), protegendo
assim, contra a excitotoxicidade. Em concordância com esta hipótese, um estudo
recente mostrou que tratamento com VD3 foi capaz de aumentar a produção de
NGF e o crescimento de neuritos em cultura de neurônios hipocampais (BROWN
et al., 2003).
Outros mecanismos fisiológicos também poderiam explicar nossos
achados. Por exemplo, tem sido recentemente sugerido que uma correlação
positiva da VD com a expressão das subunidades alfa 1 e alfa 4 dos receptores
GABAa (FERÓN et al., 2005). No estudo de KALUEFF et al. (2006), foi observado
um aumento na susceptibilidade às crises epilépticas após a aplicação de PTZ em
camundongos nocautes de VDR. Uma vez que o PTZ age via receptores GABAa
(MEDINA et al., 2001; SIEGHART & SPERK, 2002; KALUEFF et al., 2004c), uma
possível relação poderia existir entre aumento das crises em camundongos
nocaute para VDR e o sistema GABAérgico alterado.
A visão de que uma deficiência GABAérgica seria um dos fatores
determinantes da atividade epiléptica se apoia em parte, na observação do
mecanismo de ação de algumas drogas antiepilépticas, que tem sua ação
biológica facilitando a ação do GABA,
aumentando assim a condutância ao ion Cl
–
e acentuando a hiperpolarização induzida por este neurotransmissor. No modelo
experimental de epilepsia induzido por pilocarpina, CAVALHEIRO et al. (1994)
verificaram aumento da concentração do GABA hipocampal durante o estado de
mal epiléptico e com uma profunda diminuição na fase silenciosa. Portanto, o
aumento da expressão do VDR na fase silenciosa e crônica do modelo da PILO
poderiam justificar um aumento da ativação do sistema GABAérgico.
Tem sido também proposto que a VD estimula a expressão das proteínas
ligantes de cálcio, como a parvalbumina e a calbindina (GARCION et al., 2002;
KALUEFF et al., 2004a), também conhecidas em exercer efeitos antiepilépticos
(LERANTH & RIBAK, 1991). Uma redução da expressão de calbindina D9K foi
demonstrada no cérebro de camundongos VDR nocaute (LI et al., 1998). Uma vez
que a ligação entre mecanismos antiepilépticos e de neuroprotecão já são
conhecidos (HALASZ & RASONYI, 2004), e que o VDR está envolvido em
múltiplos mecanismos de neuroprotecão (CARSWELL, 1997; GARCION et al.,
2002; KALUEFF et al., 2004a), o aumento da expressão de VDR nos animais
submetidos ao modelo da PILO poderia estar associado a um mecanismo
compensatório contra o insulto epiléptico.
Portanto, o aumento na expressão de VDR pode ser um fenômeno
neuroplástico em busca de uma maior proteção frente ao fenômeno excitotóxico,
sugerindo que as regiões envolvidas no processo epileptogênico tentam
restabelecer a homeostase celular através da super expressão de RNAm do VDR,
com o intuito de otimizar a captação da VD endógena.
Com base nos resultados apresentados no presente estudo, podemos
sugerir o VDR como um possível candidato na participação do processo de
epileptogênese no modelo de epilepsia induzido pela PILO. Porém, outros
estudos são necessários na tentativa de compreender os mecanismos envolvidos
nesta possível ação neuroplástica. Sendo assim, futuras pesquisas nesta área
são de fundamental importância para o desenvolvimento de melhores estratégias
terapêuticas nas epilepsias, visto as características neuroprotetoras da VD.
6 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que:
1. Houve um aumento na expressão relativa de RNAm do VDR na formação
hipocampal nos períodos silencioso e crônico no modelo de ELT induzido
por PILO em ratos;
2. Não houve diferença na expressão relativa de RNAm do VDR do grupo
controle em relação ao grupo SE;
3. O aumento da expressão de VDR nos animais submetidos ao modelo da
PILO pode estar associado a um mecanismo compensatório contra o
insulto epiléptico.
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ABSTRACT
Vitamin D, is a steroid hormone with multiple functions in the central
nervous system (CNS), producing numerous physiological effects mediated by its
receptor (VDR). Clinical and experimental studies have shown a link between VD
dysfunction and epilepsy. In these lines, the purpose of our work was to analyze
the relative expression of VDR mRNA in the hippocampal formation of rats during
the three periods of the pilocarpine-induced epilepsy. Wistar male rats were
divided into five groups: 1- control rats (CTRL group), 2 – rats that received
pilocarpine and were killed 4 hr after the status epilepticus (SE group), 3 - rats that
received pilocarpine and were killed 7 days after the status epilepticus (SIL 7 days
group), 4 - rats that received pilocarpine and were killed 14 days after the status
epilepticus (SIL 14 days group), 5 - rats that received pilocarpine and were killed
60 days after the first spontaneous seizure, (chronic group). The relative
expression of the VDR mRNA was determined through real-time PCR technique.
Our results showed an increase of the relative expression of the VDR mRNA in the
SIL 7 days, SIL 14 days and chronic groups respectively (0,060 ± 0,024; 0,052 ±
0,035; 0,085 ± 0,055) when compared with the CTRL and SE groups (0,019 ±
0,017; 0,019 ± 0,025). These data suggest the VDR as a possible candidate
participating in the epileptogenesis process of the pilocarpine model of epilepsy.
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