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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Estudo Físico-químico Comparativo de Sistemas Nanoestruturados Contendo
Indometacina ou seu Éster Etílico e Avaliação in vivo da Atividade
Antiedematogênica
LETÍCIA CRUZ
Porto Alegre, 2005
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http://www.livrosgratis.com.br
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i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Estudo Físico-químico Comparativo de Sistemas Nanoestruturados Contendo
Indometacina ou seu Éster Etílico e Avaliação in vivo da Atividade
Antiedematogênica
Dissertação apresentada por Letícia Cruz para
obtenção do GRAU DE MESTRE em Ciências
Farmacêuticas
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Raffin Pohlmann
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ii
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 02 de março de 2005,
pela Comissão Examinadora constituída por:
Profa. Dra. Célia Gervásio M. Chaves
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profa. Dra. Clarisse Maria Sartori Piatnicki
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profa. Dra. Vera Lúcia Eiffler Lima
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Bibliotecária Responsável:
Margarida Maria C. F. Ferreira – CRB10/480
C957e Cruz, Letícia
Estudo físico-químico comparativo de sistemas
nanoestruturados contendo indometacina ou seu éster etílico e
avaliação in vivo da atividade antiedematogênica / Letícia Cruz –
Porto Alegre: UFRGS, 2005 – ix, 114p.: il., gráf., tab.
Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia.
Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1.Nanopartículas. 2.Indometacina. 3.Éster etílico de
indometacina. 4. Poliéster. I. Pohlmann, Adriana Raffin. II. Título.
CDU: 615.453.4:541.6
iii
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Adriana R. Pohlmann por sua orientação dedicada, paciência e
confiança. Sobretudo, aos ensinamentos transmitidos e oportunidades concedidas.
À Profa. Dra. Sílvia Guterres pela atenção e interesse dispensados ao longo
deste trabalho e por sua orientação valiosa na avaliação da atividade
antiedematogênica.
À Profa. Dra. Elfrides Schapoval por sua colaboração dedicada no ensaio
antiedematogênico. À Profa. Dra. Miriam Appel pelo auxílio prestado nesse ensaio.
À Profa. Dra. Teresa Dalla Costa pela grande colaboração na parte de
modelagem matemática dos resultados.
Aos colegas e amigos do laboratório 405 e do grupo de pesquisa pela
amizade e auxílios prestados: Marilúcia, Lali, Sandra, Scheila, Ruy, Renata, Valéria,
Helen, Graziela, Ana Elisa, Marta, Leandro, Letícia Colomé, Bibiana, Clarissa
Bettoni, Clarissa Xavier, Cristiane, Daniela, Eduardo, Érico, Rodrigo Freddo, Gislane,
Tassiana, Vanessa, Maria, Fernanda, Letícia Sias, Alessandro, Eliezer, Rodrigo
Fortunato, Vitória, Deise e Letícia Ghiggi.
Em especial, à Sandra Haas, Helen Pedroni e Graziela Mezzalira por seus
valiosos auxílios.
Ao Leonardo Soares pela amizade e por suas importantes contribuições.
Aos meus pais, Rosane e Gerson, pela formação que me propiciaram, pelo
carinho, apoio e incentivos constantes.
Às minhas irmãs, Ana, Andréa, Alessandra, Laura e Luciana pelo carinho,
amizade e companheirismo.
À Nádia por seu incentivo e amizade, e ao Gilberto, por seu inestimável
auxílio.
Ao Cristiano por seu amor, compreensão e apoio incondicional.
À CAPES, órgão financiador da bolsa de estudos para o desenvolvimento
deste trabalho. À FAPERGS, CNPq e Rede Nanobiotec CNPq/MCT pelo apoio
financeiro recebido ao longo deste trabalho.
iv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 01
2 OBJETIVOS....................................................................................................... 03
2. 1 Objetivos Gerais ............................................................................................. 03
2. 2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 03
3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................. 05
3. 1 Caracterização Físico-química de Nanopartículas ......................................... 05
3. 2 Mecanismos de Associação do Fármaco ....................................................... 08
3. 3 Modelos de Estrutura de Nanopartículas........................................................ 10
3. 4 Liberação de Fármacos a partir de Sistemas Nanoparticulados .................... 15
3. 4. 1 Teoria da Difusão e Modelos Matemáticos................................................. 16
3. 4. 2 Perfil da Liberação de Fármacos em Nanopartículas................................. 19
3. 5 Atividade Antiedematogência ......................................................................... 23
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 26
4. 1 Materiais......................................................................................................... 26
4. 1. 1 Matérias-primas.......................................................................................... 26
4. 1. 2 Aparelhos e Equipamentos......................................................................... 27
4. 1. 3 Solventes e Outros Materiais...................................................................... 28
4. 1. 4 Avaliação Biológica..................................................................................... 29
4. 2 Métodos.......................................................................................................... 29
4. 2. 1 Obtenção do Éster Etílico de Indometacina................................................ 29
4. 2. 2 Método Analítico......................................................................................... 30
4. 2. 3 Preparação dos Sistemas Nanoestruturados ............................................. 31
4. 2. 4 Caracterização Físico-química dos Sistemas Nanoestruturados ............... 32
4. 2. 4. 1 Determinação do pH............................................................................... 32
4. 2. 4. 2 Determinação do Diâmetro Hidrodinâmico das Partículas ..................... 33
4. 2. 4. 3 Teor de Sonda (IndOH ou IndOEt) nas Formulações............................. 33
4. 2. 5 Diluição das Suspensões da Nanocápsulas com Etanol............................ 34
4. 2. 6 Medida do Diâmetro da Nanocápsula após Adição de Quantidades
Crescentes de Etanol.................................................................................. 34
4. 2. 7 Hidrólise das Sondas em Meio Alcalino...................................................... 34
4. 2. 8 Medidas de Diâmetro de Partícula Durante a Reação de Hidrólise ........... 35
v
4. 2. 9 Modelagem Matemática dos Perfis Cinéticos............................................. 35
4. 2. 10 Edema de Pata de Rato Induzido por Carragenina .................................. 36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 38
5. 1 Obtenção do Éster Etílico de Indometacina.................................................... 38
5. 2 Validação do Método Analítico ....................................................................... 39
5. 2. 1 Indometacina .............................................................................................. 39
5. 2. 2 Éster Etílico de Indometacina ..................................................................... 41
5. 3 Formas de Associação da Indometacina nos Sistemas Nanoestruturados.... 42
5. 3. 1 Suspensões de Nanocápsulas ................................................................... 42
5. 3. 2 Diluição das Suspensões de Nanocápsulas com Etanol............................ 42
5. 3. 3 Medida do Diâmetro das Nanocápsulas após Adição de Quantidades
Crescentes de Etanol.................................................................................. 43
5. 3. 4 Reações de Hidrólise Alcalina.................................................................... 45
5. 3. 5 Determinação do Diâmetro das Nanocápsulas Durante a Reação de
Hidrólise...................................................................................................... 48
5. 3. 6 Suspensões de Nanoesferas e Nanoemulsão............................................ 49
5. 4 Influência da Concentração do Polímero na Difusão do IndOEt..................... 53
5. 5 Modelagem Matemática dos Perfis Cinéticos................................................. 54
5. 5. 1 Estudo Comparativo de Nanocápsulas, Nanoesferas e Nanoemulsão ...... 54
5. 5. 2 Estudo da Influência da Concentração do Polímero na Difusão do IndOEt
Associado a Nanocápsulas......................................................................... 65
5. 5. 3 Modelagem Matemática dos Perfis Cinéticos Segundo o Modelo da Lei da
Potência...................................................................................................... 71
5. 6 Atividade Antiedematogênica ......................................................................... 81
6 CONCLUSÕES.................................................................................................. 86
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 89
8 ANEXOS ........................................................................................................... 95
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Formas de associação da substância ativa às nanopartículas........ 07
FIGURA 2 Curva de calibração da indometacina ............................................. 39
FIGURA 3 Determinação da quantidade adsorvida usando etanol .................. 43
FIGURA 4 Efeito da adição de etanol nas suspensões de nanocápsulas ........ 44
FIGURA 5 Perfil cinético da hidrólise da IndOH e do IndOEt em solução ........ 46
FIGURA 6 Perfil cinético da hidrólise da IndOH e do IndOEt em
nanocápsulas .................................................................................. 47
FIGURA 7 Diâmetro e polidispersão das nanocápsulas contendo IndOH
durante a hidrólise........................................................................... 48
FIGURA 8 Diâmetro e polidispersão das nanocápsulas contendo IndOEt
durante a hidrólise........................................................................... 49
FIGURA 9 Perfis cinéticos da hidrólise da IndOH em nanoesferas e
nanoemulsão................................................................................... 50
FIGURA 10 Perfis cinéticos da hidrólise do IndOEt em nanoesferas e
nanoemulsão................................................................................... 51
FIGURA 11 Diâmetro e polidispersão da nanoemulsão contendo IndOH
durante a hidrólise........................................................................... 52
FIGURA 12 Diâmetro e polidispersão das nanoesferas contendo IndOH
durante a hidrólise........................................................................... 52
FIGURA 13 Modelagem monoexponencial de nanocápsulas e solução
contendo IndOH.............................................................................. 56
FIGURA 14 Modelagem monoexponencial do IndOEt em NS e NE................... 56
FIGURA 15 Hidrólise alcalina da indometacina .................................................. 57
FIGURA 16 Modelagem monoexponencial do IndOEt em solução .................... 59
FIGURA 17 Modelagem mono e biexponencial para NC100.............................. 61
FIGURA 18 Modelagem mono e biexponencial para NE.................................... 62
FIGURA 19 Modelagem mono e biexponencial para NS.................................... 63
FIGURA 20 Formas de associação do IndOEt em NC, NS e NE ....................... 65
FIGURA 21 Modelagem mono e biexponencial para NC80................................ 67
FIGURA 22 Modelagem mono e biexponencial para NC60................................ 68
FIGURA 23 Modelagem mono e biexponencial para NC40................................ 69
vii
FIGURA 24 Modelagem mono e biexponencial para NC20................................ 70
FIGURA 25 Modelagem da Lei da Potência para NC100................................... 72
FIGURA 26 Modelagem da Lei da Potência para NC80..................................... 73
FIGURA 27 Modelagem da Lei da Potência para NC60..................................... 74
FIGURA 28 Modelagem da Lei da Potência para NC40..................................... 75
FIGURA 29 Modelagem da Lei da Potência para NC20..................................... 76
FIGURA 30 Modelagem da Lei da Potência para NE......................................... 77
FIGURA 31 Modelagem da Lei da Potência para NS......................................... 78
FIGURA 32 Diâmetro e polidispersão de NC80.................................................. 79
FIGURA 33 Diâmetro e polidispersão de NC60.................................................. 79
FIGURA 34 Diâmetro e polidispersão de NC40.................................................. 80
FIGURA 35 Diâmetro e polidispersão de NC20.................................................. 80
FIGURA 36 Dispersão do IndOEt nas nanoestruturas........................................ 81
FIGURA 37 Aumento do volume das patas dos ratos tratados com
NC-IndOEt....................................................................................... 82
FIGURA 38 Aumento do volume das patas dos ratos tratados com
NS-IndOEt....................................................................................... 83
FIGURA 39 Aumento do volume das patas dos ratos tratados com
NE-IndOEt....................................................................................... 83
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Mecanismo de liberação do fármaco a partir de sistemas
poliméricos de diferentes geometrias.............................................. 19
TABELA 2 Composição quali e quantitativa das formulações .......................... 31
TABELA 3 Coeficientes de correlação das curvas de calibração ..................... 40
TABELA 4 Exatidão do método analítico .......................................................... 40
TABELA 5 Coeficientes de variação intra e inter-dia do método analítico ........ 41
TABELA 6 Características físico-químicas das nanocápsulas.......................... 42
TABELA 7 Características físico-químicas das nanoesferas e nanoemulsão... 50
TABELA 8 Características físico-químicas das nanocápsulas com
diferentes concentrações de polímero............................................. 53
TABELA 9 Tempo de consumo total do IndOEt................................................ 54
TABELA 10 Modelagem monoexponencial para IndOH ..................................... 55
TABELA 11 Modelagem monoexponencial para o IndOEt em solução .............. 58
TABELA 12 Modelagem matemática para o IndOEt em nanocápsulas.............. 60
TABELA 13 Modelagem matemática para o IndOEt em nanoemulsão............... 62
TABELA 14 Modelagem matemática para o IndOEt em nanoesferas ................ 63
TABELA 15 Modelagem matemática para o IndOEt em NC80........................... 66
TABELA 16 Modelagem matemática para o IndOEt em NC60........................... 67
TABELA 17 Modelagem matemática para o IndOEt em NC40........................... 68
TABELA 18 Modelagem matemática para o IndOEt em NC20........................... 69
TABELA 19 Modelagem da Lei da Potência para NC100................................... 71
TABELA 20 Modelagem da Lei da Potência para NC80..................................... 72
TABELA 21 Modelagem da Lei da Potência para NC60..................................... 73
TABELA 22 Modelagem da Lei da Potência para NC40..................................... 74
TABELA 23 Modelagem da Lei da Potência para NC20..................................... 75
TABELA 24 Modelagem da Lei da Potência para NE......................................... 76
TABELA 25 Modelagem da Lei da Potência para NS......................................... 77
TABELA 26 Expoentes de liberação das nanoestruturas .................................. 79
TABELA 27 Atividade antiedematogênica do IndOEt associado aos
nanocarreadores............................................................................. 82
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
IndOH Indometacina
IndOEt Éster etílico de indometacina
NC Nanocápsulas
NS Nanoesferas
NE Nanoemulsão
NC-IndOEt Nanocápsulas contendo éster etílico de indometacina
NS-IndOEt Nanoesferas contendo éster etílico de indometacina
NE-IndOEt Nanoemulsão contendo éster etílico de indometacina
NC100 Formulação de nanocápsula com 10,0 mg/mL de poli(-caprolactona)
NC80 Formulação de nanocápsula com 8,0 mg/mL de poli(-caprolactona)
NC60 Formulação de nanocápsula com 6,0 mg/mL de poli(-caprolactona)
NC40 Formulação de nanocápsula com 4,0 mg/mL de poli(-caprolactona)
NC20 Formulação de nanocápsula com 2,0 mg/mL de poli(-caprolactona)
x
RESUMO
Nanocápsulas (NC), nanoesferas (NS) e nanoemulsão (NE) são propostas na
literatura como carreadores submicrométricos de fármacos. Os objetivos deste
trabalho são realizar um estudo comparativo para diferenciar o comportamento
cinético desses sistemas e avaliar a influência da espessura da parede polimérica
das NC no perfil de liberação de um modelo lipofílico de fármaco a partir de diversas
formulações preparadas com diferentes concentrações de poli(-caprolactona)
(PCL). Com esse propósito, o éster etílico de indometacina (IndOEt) foi associado a
cada sistema e a sua hidrólise alcalina foi realizada para simular uma condição sink.
As suspensões aquosas foram tratadas com solução aquosa de NaOH e a
modelagem matemática dos perfis de consumo do IndOEt foi realizada. Uma vez
que os derivados éster de indometacina têm sido relatados como inibidores seletivos
da ciclooxigenase-2, também constitui objetivo deste trabalho avaliar a atividade
antiedematogênica em ratos do IndOEt associado aos nanocarreadores através da
inibição do edema em pata de rato induzido por carragenina. O IndOEt apresentou
consumo total em 24 horas para NC, 12 horas para NS e 8 horas para NE. A
modelagem matemática demonstrou que os perfis cinéticos apresentaram uma fase
de liberação rápida, com tempo de meia-vida de 5,9, 4,4 e 2,7 minutos, e uma fase
de liberação sustentada com tempos de meia-vida de 288,8, 87,7 e 147,5 minutos,
respectivamente. Comparando-se os resultados, as NC apresentaram os maiores
tempos de meia-vida para o modelo lipofílico de fármaco associado aos
nanocarreadores. Para todas as formulações preparadas com diferentes
concentrações de PCL, a modelagem matemática dos perfis demonstrou que quanto
menor a concentração de polímero empregada, mais rápido é o consumo do éster.
Para todos os sistemas estudados, um ajuste satisfatório dos dados experimentais
ao modelo da Lei das Potências foi obtido. A incorporação do IndOEt em NC e NS
apresentou atividade antiedematogênica após a administração oral das formulações.
Por outro lado, a associação do IndOEt na NE não inibiu o edema induzido pela
carragenina.
Palavras-chave: nanopartículas, nanocápsulas, indometacina, hidrólise alcalina,
poliéster, poli(epsilon-caprolactona), éster etílico de indometacina.
xi
Comparative physico-chemical study of nanostructured systems containing
indomethacin or its ethyl ester and in vivo evaluation of antiedematogenic
activity
Nanocapsules (NC), nanospheres (NS) and nanoemulsion (NE) are proposed in the
literature as submicronic drug carriers. The aims of this work were to carry out a
comparative study to differentiate the kinetic behavior of these systems and evaluate
the influence of the thickness of the polymeric wall of NC on the release profile of
lipophilic model of drug from several formulations prepared using different
concentrations of poly(-caprolactona) (PCL). With this purpose, the indomethacin
ethyl ester (IndOEt) was entrapped within each system and its alkaline hydrolysis
were carried out to simulate a sink condition. The aqueous suspensions were treated
with NaOH aqueous solution and the consumption profiles of the indomethacin ethyl
ester due to its alkaline hydrolysis were mathematically modeled. Since the ester
derivatives of indomethacin have been described as selective cyclooxygenase-2
inhibitors, the antiedematogenic activity in rats of the nanocarriers containing IndOEt
by inhibition of acute edema produced by injection of carrageenin was also carried
out. The total disappearance of IndOEt from each reaction was 24 h for NC, 12 h for
NE and 8 h for NS. Mathematical modeling of the disappearance of the ester was
conducted, showing that the burst phases presented half-life times of 5,9, 4,4 and 2,7
min, and the sustained phase half-life times were 288,8, 87,7 and 147,5 min,
respectively. Comparing the data, nanocapsules presented the highest half-life times
for a lipophilic model of drug entrapped within the nanocarriers. For all formulations
prepared using different concentrations of PCL, mathematical modeling of the
profiles showed that as lower the polymer concentration was used as faster the
consumption of the ester was observed. For all systems, a satisfactory agreement
between Power Law and experimental data was found. The incorporation of IndOEt
in NC and NS exhibit antiedematogenic activity following oral administration. On the
other hand, the incorporation of IndOEt in NE did not inhibit carrageenin-induced
edema.
Key words: nanoparticles, nanocapsules, indomethacin, alkaline hydrolisis, polyester,
poly(epsilon-caprolactona), indomethacin ethyl ester.
1
1 INTRODUÇÃO
Os sistemas nanoestruturados apresentam dimensões situadas entre 10 e
1000 nm e diferem entre si de acordo com a composição qualitativa e organização
em nível molecular (COUVREUR et al, 1995). As nanocápsulas são formadas por
um invólucro polimérico disposto ao redor de um núcleo oleoso, enquanto que as
nanoesferas são sistemas matriciais, constituídos de polímero. As nanoemulsões
são emulsões submicrométricas, nas quais uma dispersão líquido-líquido é
estabilizada por agregados de tensoativo (MAGENHEIM e BENITA, 1991;
LANGEVIN, 1992).
Nos últimos anos, esses sistemas nanoestruturados têm sido investigados em
estudos fundamentais e aplicados para verificar a possibilidade de serem utilizados
como carreadores de fármacos (SCHAFFAZICK et al., 2003). Este interesse reflete a
necessidade de liberação do fármaco em áreas específicas do corpo, objetivando,
principalmente, aumentar o índice terapêutico e diminuir efeitos colaterais
(BARRATT, 2000; HANS e LOWMAN, 2002). Além desses benefícios, as
nanoestruturas também são potencialmente capazes de proteger o fármaco frente à
degradação enzimática, química ou imunológica (BARRATT, 2000).
O comportamento in vivo desses sistemas está relacionado com suas
características físico-químicas, sendo, desta forma, importante estabelecer modelos
de estruturas e elucidar a forma de associação do fármaco às nanoestruturas para
compreensão do seu comportamento biológico (SCHAFFAZICK et al., 2003). No
entanto, a caracterização físico-química desses sistemas é tecnicamente difícil de
ser realizada devido ao tamanho reduzido das partículas (MAGENHEIM e BENITA,
1991).
2
A maioria dos métodos empregados para analisar as nanoestruturas
determinam o estado físico e a natureza química dos componentes do sistema.
Técnicas como a espectroscopia nas regiões do infravermelho e visível são muito
sensíveis na detecção dos componentes químicos, entretanto, falham na
determinação de detalhes estruturais. Métodos de análise térmica como a
calorimetria diferencial exploratória permitem a identificação dos estados de fase e
suas correspondentes transições, mas não fornecem informação detalhada a
respeito da natureza química das fases individuais. A análise através de microscopia
eletrônica freqüentemente é prejudicada por possíveis artefatos e a microscopia
óptica é inadequada quando aplicada a estruturas submicrométricas (MAYER et al.,
2002).
Em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa (POHLMANN et al.,
2002; GUTERRES et al., 2000) foram propostos modelos tanto de organização
molecular de nanopartículas, quanto de organização micelar em suspensões
poliméricas. Estudos comparativos, caracterizando-se nanocápsulas, nanoesferas e
nanoemulsão, foram realizados com base nas propriedades de liberação de modelos
de fármaco a partir desses carreadores (LOPES et al., 2000; SOARES, 2003).
Dentre esses estudos, o uso de um derivado lipofílico não-ionizável de indometacina
(SOARES, 2003) foi proposto como sonda de uma reação interfacial de hidrólise
alcalina, simulando uma condição sink de liberação. Desta forma, o presente
trabalho tem como objetivo diferenciar o comportamento de liberação do modelo de
substância lipofílica a partir de nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão, assim
como demonstrar a influência da parede polimérica das nanocápsulas na liberação
da sonda lipofílica. Uma vez que a sonda escolhida, o éster etílico de indometacina,
foi descrita como inibidor seletivo de ciclooxigenase-2 (KALGUTKAR et al., 2000),
também constitui objetivo deste trabalho a avaliação biológica in vivo da atividade
antiedematogênica do éster etílico de indometacina associado aos nanocarreadores.
3
2 OBJETIVOS
2. 1 OBJETIVO GERAL
O trabalho tem como objetivos determinar a forma de associação da
indometacina e de seu éster etílico em nanocápsulas preparadas com poli(-
caprolactona) e mistura de triglicerídeos dos ácidos caprílico/cáprico, avaliar a
influência da concentração de poli(-caprolactona) no perfil cinético de consumo do
éster etílico de indometacina, assim como diferenciar os sistemas nanocápsulas,
nanoesferas e nanoemulsão através da modelagem matemática dos perfis cinéticos
da difusão do éster etílico de indometacina. Para tanto, as reações de hidrólise
alcalina da indometacina ou de seu éster etílico, propostos como sonda, serão
utilizadas para caracterizar diferentes formulações de nanocápsulas, assim como
para propor modelos da forma de associação das sondas aos sistemas através do
estudo cinético do consumo dos substratos.
2. 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Preparar suspensões nanoestruturadas (nanocápsulas, nanoesferas e
nanoemulsão), contendo indometacina ou éster etílico de indometacina,
através dos métodos de nanoprecipitação da poli(-caprolactona) e
emulsificação espontânea;
4
- Preparar suspensões de nanocápsulas, empregando diferentes
concentrações de poli(-caprolactona);
- Caracterizar as formulações quanto ao teor da sonda (indometacina ou
seu éster etílico), pH da formulação, diâmetro hidrodinâmico e perfil
cinético de consumo da sonda frente ao tratamento com solução aquosa
de NaOH;
- Estudar o comportamento físico-químico de nanocápsulas de poli(-
caprolactona) contendo indometacina ou seu éster etílico frente a adição
de etanol nas suspensões;
- Determinar a velocidade de consumo da sonda frente ao tratamento dos
sistemas nanoestruturados com solução aquosa de NaOH, seguido de
modelagem matemática dos dados experimentais;
- Avaliar a atividade antiedematogênica em ratos do éster etílico de
indometacina associado a nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão.
5
3 REVISÃO DA LITERATURA
3. 1 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE NANOPARTÍCULAS
A determinação de parâmetros físico-químicos das suspensões de
nanopartículas é importante para a proposição de modelos de suas organizações
em nível molecular. Tal caracterização é tecnicamente difícil de ser realizada, devido
ao tamanho reduzido das partículas (inferior a 1 m) (MAGENHEIN e BENITA,
1991). A avaliação físico-química desses sistemas só é possível mediante a
combinação de diversas técnicas de análise, sendo estas, principalmente: a análise
morfológica e a distribuição do tamanho das partículas, a determinação do potencial
zeta e do pH, a determinação da concentração de fármaco associado às
nanoestruturas e a cinética de liberação do fármaco (LEGRAND et al., 1999;
COUVREUR et al., 2002; SCHAFFAZICK et al., 2003).
A observação direta de nanopartículas é realizada através de métodos de
microscopia eletrônica, tais como a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a
microscopia eletrônica de transmissão (MET). Essas técnicas têm sido empregadas
na obtenção de informações relativas à forma e ao tamanho das nanopartículas. A
MET permite também diferenciar nanocápsulas e nanoesferas, assim como já foi
relatada a determinação da espessura da parede das nanocápsulas através dessa
técnica (ROLLOT et al., 1986; QUINTANAR-GUERRERO et al., 1998).
Para a determinação da distribuição do tamanho das nanoestruturas o
método mais indicado é a espectroscopia de correlação de fótons (PCS). Esta
técnica fornece medidas rápidas e acuradas para a determinação de partículas com
tamanho de 5 nm a 5m (LEGRAND et al., 1999) indicando a largura de distribuição
6
de tamanho, o que é fundamental para a caracterização das formulações. A
microscopia eletrônica também permite a obtenção de informações relativas ao
tamanho das nanopartículas, com a vantagem de fornecer uma imagem da partícula
isolada do meio, enquanto que a PCS determina o raio hidrodinâmico das partículas
em suspensão (HOFFMANN et al., 1997; COUVREUR et al., 2002).
Quanto à caracterização da superfície das nanopartículas, um método muito
empregado envolve a medida do potencial zeta, o qual reflete o potencial da
superfície da partícula. As nanopartículas usualmente apresentam um potencial zeta
diferente de zero, o que conduz a sistemas relativamente estáveis. O potencial zeta
é uma boa aproximação do potencial de superfície que é decorrente da dissociação
de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas
presentes no meio aquoso da dispersão (LEGRAND et al., 1999; COUVREUR et al.,
2002).
Através do monitoramento do pH das suspensões de nanopartículas, em
função do tempo, informações relevantes sobre a estabilidade destes sistemas
podem ser obtidas. Alterações do pH podem ser indícios de degradação do polímero
ou ionização de grupos carboxílicos presentes no polímero (LEGRAND et al., 1999;
SCHAFFAZICK et al., 2003).
A determinação do teor de fármaco contido em nanopartículas é dificultada
pela necessidade de separação da fração livre de fármaco daquela parcela
incorporada (SOPPIMATH et al., 2001). Uma técnica de separação bastante
utilizada é a ultracentrifugação, na qual a concentração de fármaco livre, presente na
suspensão, é determinada no sobrenadante, após a centrifugação (MARCHAL-
HEUSSLER et al., 1990). O teor total de fármaco é determinado pela completa
dissolução das nanopartículas em solvente adequado. Desta forma, a quantidade de
fármaco associado às nanoestruturas é calculada pela diferença entre as
concentrações de fármaco total e livre (SCHAFFAZICK et al., 2003). Outra técnica
empregada é a ultrafiltração-centrifugação, na qual uma membrana de porosidade
de corte de 10 kDa é empregada para separar parte da fase aquosa dispersante da
suspensão coloidal (LOSA et al., 1993; GUTERRES et al., 1995). A concentração
7
livre é determinada no ultrafiltrado e a fração de fármaco associada às
nanoestruturas é calculada também pela diferença das concentrações total e livre.
As nanopartículas poliméricas podem ser distinguidas em dois tipos:
nanocápsulas, que são formadas por um invólucro polimérico disposto ao redor de
um núcleo oleoso; e nanoesferas, que são sistemas matriciais constituídos de
polímero (MAGENHEIM e BENITA, 1991; SCHAFFAZICK et al., 2003). A substância
ativa pode estar molecularmente dispersa ou retida na matriz polimérica das
nanoesferas e, no caso das nanocápsulas, o fármaco pode estar adsorvido na
parede polimérica, ou disperso por toda a partícula (Figura 1).
Figura 1. Formas de associação da substância ativa às nanopartículas. (a) adsorvida
ou molecularmente dispersa na matriz (nanoesferas), (b) retida na matriz
(nanoesferas), (c) adsorvida na parede polimérica (nanocápsulas), (d) dispersa na
partícula (nanocápsulas).
Para uma caracterização completa, os sistemas nanoestruturados contendo
fármacos são submetidos à determinação da cinética de liberação in vitro do
fármaco a partir das nanopartículas. Diferentes comportamentos cinéticos são
esperados para um fármaco dissolvido no núcleo oleoso da nanocápsula ou
simplesmente retido ou adsorvido em sua parede polimérica (SOARES, 2003). Duas
técnicas são empregadas para a separação do fármaco dissolvido no meio das
nanopartículas dispersas: a difusão em bolsas de diálise (EL SAMALIGY et al.,
(a) (b) (c)
(d)
8
1986) e a separação baseada na ultracentrifugação ou na ultrafiltração-centrifugação
(MAGENHEIN e BENITA, 1991; GUTERRES et al., 1995).
As informações obtidas através de uma caracterização físico-química dos
sistemas nanoparticulados podem levar à proposição de modelos, que descrevam a
organização molecular destes sistemas, bem como a elucidação do mecanismo de
associação dos fármacos a estas nanopartículas (SCHAFFAZICK et al., 2003).
3. 2 MECANISMOS DE ASSOCIAÇÃO DO FÁRMACO
A determinação dos mecanismos de associação de fármacos às
nanoestruturas é fundamental para a compreensão do comportamento das
nanopartículas, uma vez que o estado físico do fármaco e do polímero influenciam
nas características de liberação in vitro e in vivo do fármaco (LEROUEIL-LE
VERGER et al., 1998; SOARES, 2003). Muitas técnicas têm sido desenvolvidas e
empregadas no estudo da forma como os fármacos estão associados a estas
nanoestruturas. Neste contexto, os métodos termo-analíticos, como a calorimetria
diferencial exploratória e a termogravimetria, têm demonstrado grande
aplicabilidade. Outras técnicas combinadas também muito utilizadas nesses estudos
incluem a difração de raios-X, estudos de adsorção e/ou taxa de associação do
fármaco às nanopartículas, espectroscopia na região do infravermelho,
determinação do potencial zeta e do perfil de liberação in vitro, e, ainda, o uso de
sondas fluorescentes (SOPPIMATH et al., 2001; SCHAFFAZICK et al., 2003).
Em um estudo onde o isradipino foi associado a nanoesferas de poli(-
caprolactona) (PCL), poli(D,L-lactídeo) (PLA) ou poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo)
(PLAGA) foi observado através de calorimetria diferencial exploratória e difração de
raios-X que o fármaco encontrava-se na forma amorfa ou molecularmente disperso
na matriz polimérica das nanoesferas (LEROUEIL-LE VERGER et al., 1998). Por
análise termogravimétrica e calorimetria diferencial exploratória, GAMISANS e
colaboradores (1999) determinaram a dispersão molecular do flurbiprofeno em
nanoesferas preparadas com PCL pela técnica de nanoprecipitação. DAI e
colaboradores (2004) estudaram a forma de associação da ciclosporina A em
9
nanoesferas sensíveis ao pH preparadas com diversos copolímeros do poli(ácido
metacrílico-co-metacrilato de metila). Através de estudos de difração de raios-X foi
constatada a dispersão molecular da ciclosporina A na matriz polimérica das
nanoesferas. Os autores também utilizaram a técnica de espectroscopia de raios-X
fotoeletrônica e demonstraram a localização do fármaco na superfície da
nanopartícula.
CALVO e colaboradores (1996) demonstraram através das técnicas de
calorimetria diferencial exploratória e difração de raios-X que a indometacina está
molecularmente dispersa na matriz polimérica das nanoesferas de PCL, resultado
também obtido para nanocápsulas. Através das técnicas de calorimetria diferencial
exploratória e difração de raios-X, também foi constatado que o diclofenaco sódico
está molecularmente disperso em nanocápsulas preparadas com uréia-formaldeído
(KULKARNI et al., 2000).
ABOUBAKAR e colaboradores (1999) prepararam nanocápsulas de
poli(cianoacrilato de iso-butila) e Miglyol 812N
contendo insulina (peptídeo
hidrossolúvel) pelo método de polimerização interfacial. A taxa de insulina associada
às nanocápsulas foi calculada após a separação destas do meio dispersante por
ultracentrifugação. A taxa de associação foi de 90% para a formulação contendo 0,5
mg/mL de insulina. O potencial zeta de nanocápsulas contendo insulina e de
nanocápsulas sem o fármaco foi determinado com a finalidade de verificar-se
diferenças ou não, podendo a insulina estar encapsulada no núcleo oleoso ou
simplesmente adsorvida na superfície polimérica. Os resultados obtidos mostraram
potenciais zeta idênticos (-19 mV) para as duas formulações, sugerindo que a
superfície das nanocápsulas com insulina tenha a mesma composição das
nanocápsulas sem o fármaco. Isto reforçou a hipótese de que a insulina estaria
encapsulada no núcleo oleoso. Esta idéia foi confirmada pelo fato de que o potencial
zeta aumentou de –19 mV para –10 mV, quando 0,5 mg/mL de insulina foram
incubados em suspensão de nanocápsulas, inicialmente preparadas sem o fármaco.
Neste caso, os autores consideraram que a insulina estaria adsorvida na superfície
das nanocápsulas, quando a associação do fármaco é realizada por incubação.
10
FERRANTI e colaboradores (1999) avaliaram o perfil de liberação in vitro de
nanocápsulas de PCL contendo primidona como fármaco encapsulado e álcool
benzílico como núcleo oleoso. As amostras de nanocápsulas foram colocadas em
meio gástrico simulado (pH 1,25) ou em meio intestinal simulado (pH 7,4). Os perfis
de liberação das nanocápsulas contendo primidona foram comparados aos perfis de
liberação de uma solução padrão de primidona em álcool benzílico, utilizada como
controle. Após 8 horas do início do experimento, 100 % da primidona contida na
solução controle foi liberada. Para o mesmo tempo, o percentual de primidona
liberado a partir das nanocápsulas foi de 76,0 1,4 % (pH 7,4) e de 83,0 4,5 % (pH
1,25). A quantidade de primidona liberada das nanocápsulas foi significativamente
menor em comparação ao controle. Para explicar tal fato, os autores sugeriram que
ocorra uma interação entre o fármaco e o polímero. A rápida liberação do fármaco,
durante a primeira hora, sugere que uma parte da primidona estaria adsorvida na
superfície das nanocápsulas.
Em um estudo realizado em nosso laboratório (LOPES et al., 2000) foi
avaliado o mecanismo de associação da etionamida a nanocápsulas e nanoesferas
de Eudragit S90
através de seus perfis de liberação. As suspensões
nanoestruturadas foram preparadas pelo método de nanoprecipitação, sendo o
fármaco adicionado antes da formação das nanopartículas (incorporação) ou por
incubação, adicionado após a preparação das nanopartículas. Foi observada a
liberação rápida e total do fármaco a partir das formulações obtidas por incubação e
liberação de 80 % e de 90% a partir das nanopartículas preparadas por
incorporação. Desta forma, os autores consideraram que a adsorção na superfície
das nanopartículas é o mecanismo preferencial de incorporação do fármaco. Esta
adsorção seria decorrência da formação de um sal entre o ácido conjugado da
etionamida e os ânions carboxilato do polímero.
3. 3 MODELOS DE ESTRUTURA DE NANOPARTÍCULAS
As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão têm sido
muito utilizadas para observar a morfologia, tamanho e estrutura das nanopartículas
(SCHAFFAZICK et al., 2003). A MET combinada com a técnica de criofratura
11
fornece informações úteis sobre a estrutura de nanocápsulas, ressaltando a parede
polimérica e a cavidade oleosa, e permitindo estimar a espessura da parede
polimérica (COUVREUR et al., 2002).
EL SAMALIGY e colaboradores (1986) prepararam nanocápsulas de
poli(cianoacrilato de alquila) contendo doxorrubicina. Através de MEV observaram
que as nanocápsulas possuíam formato esférico. Além disso, verificaram que o
aumento da quantidade de monômero utilizada, traduzia-se no aumento da
espessura da camada polimérica das estruturas.
Nanocápsulas (contendo Miglyol 812
como núcleo oleoso) e nanoesferas
preparadas com poli(cianoacrilato de iso-butila) foram submetidas à criofratura e
analisadas por MET. De acordo com os autores, foram observadas uma estrutura
polimérica sólida e granular para as nanoesferas e uma fina (cerca de 5,0 nm) e
irregular parede polimérica ao redor do núcleo oleoso das nanocápsulas (ROLLOT
et al., 1986). Por outro lado, AL KHOURI e colaboradores (1986) estimaram através
de MET que a espessura da parede polimérica de nanocápsulas de
poli(cianoacrilato de iso-butila) possuía 3,0 nm e, por meio de MEV, observaram que
o invólucro das nanocápsulas era liso e uniforme. Para nanocápsulas preparadas
com PCL e Miglyol 812
contendo indometacina, GUINEBRETIÉRE e colaboradores
(2002), através de MET, estimaram a espessura da parede polimérica das
nanocápsulas em 1,5 a 2,0 nm.
DAI e colaboradores (2004) prepararam nanoesferas sensíveis ao pH
contendo ciclosporina A formuladas com diversos copolímeros do poli(ácido
metacrílico-co-metacrilato de metila) e analisaram suas propriedades morfológicas
por MET. As partículas apresentaram-se como esferas sólidas não-agregadas,
enquanto que a superfície não se mostrou lisa e uniforme. Esta característica foi
relacionada com a presença de moléculas de ciclosporina A adsorvidas na superfície
do polímero, fato que foi confirmado pela espectroscopia de raio-X fotoeletrônica.
Medidas de potencial zeta são freqüentemente empregadas para caracterizar
a superfície das nanopartículas (SOPPIMATH et al., 2001). Um trabalho que
exemplifica a utilização desta técnica, é o realizado por CALVO e colaboradores
(1996). Os autores observaram os efeitos da composição de diferentes carreadores
12
nanoestruturados (nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão) sobre os valores do
potencial zeta. Foi verificado que a presença da fase oleosa (Miglyol 840
), nas
nanocápsulas e nanoemulsão, conferiu um potencial zeta mais negativo em relação
à ausência da mesma, no caso das nanoesferas. A similaridade dos resultados
obtidos para nanocápsulas e nanoemulsão sugeriu que a parede polimérica (PCL)
formada ao redor das gotículas de óleo não seria uma parede consistente, mas um
fino filme polimérico. Por outro lado, baseados na similaridade dos valores de
potencial zeta de nanocápsulas e nanoemulsão, LOSA e colaboradores (1993)
consideraram que o polímero que reveste a gota de óleo é uma parede descontínua,
sendo a natureza do óleo o principal fator que determina o potencial superficial da
partícula.
MOSQUEIRA e colaboradores (2000) avaliaram a influência da composição
nas características físico-químicas e estruturais de nanocápsulas de PLA,
preparadas pela técnica de nanoprecipitação de polímero pré-formado. Para avaliar
a influência da natureza da fase oleosa, formulações de nanocápsulas foram
preparadas com os seguintes óleos: Miglyol 810
, Miglyol 812
, Miglyol 829
,
Miglyol 840
, oleato de etila, óleo de soja, óleo mineral e dodecano. Os valores de
potencial zeta (-55 6 mV) não mudaram significativamente em função da natureza
do núcleo oleoso, sugerindo que o óleo não está localizado na interface, mas
completamente encapsulado pelo polímero. A influência da massa molar do
polímero nos valores de potencial zeta foi também avaliada nesse estudo. As
formulações foram preparadas com e sem lecitina (fosfatidilcolina usada como
tensoativo). Na ausência de lecitina, os grupos carboxila terminais das cadeias de
PLA influenciaram o potencial zeta: PLA
9KDa
(-27 mV), PLA
91KDa
(-17 mV), PLA
251KDa
(-7 mV). Quanto maior a massa molar do polímero, menor é a influência no potencial
superficial, pois há menor concentração de grupamentos carboxílicos na superfície.
Por outro lado, os resultados indicaram que a massa molar do polímero exerceu
pouca influência nos valores de potencial zeta de nanocápsulas preparadas com
lecitina: PLA
9KDa
(-40 mV), PLA
91KDa
(-39 mV), PLA
251KDa
(-38 mV). Estes resultados
levaram os autores a concluir que provavelmente o polímero está encoberto pela
lecitina (um fosfolipídeo) e que seus grupos fosfato determinaram o potencial zeta
das nanocápsulas.
13
Uma outra técnica que recentemente têm sido estudada para caracterizar a
estrutura das nanopartículas, especialmente nanocápsulas, é a espectroscopia de
ressonância magnética nuclear. Esta técnica é capaz de detectar simultaneamente a
natureza química e a mobilidade dos componentes do sistema. Esta característica
permite determinar as difusões rotacionais dos componentes da dispersão. Além
disso, pela observação das propriedades de difusão lateral é possível diferenciar
componentes encapsulados de componentes da fase externa (MAYER, 2002).
MAYER e colaboradores (2002) avaliaram a aplicabilidade da espectroscopia
de ressonância magnética nuclear na análise estrutural de nanocápsulas de
poli(cianoacrilato de n-butila), contendo Miglyol 812
, preparadas pelo método de
polimerização in situ. A análise foi realizada após a formação das nanocápsulas,
mas antes da evaporação do solvente orgânico (etanol). O modelo proposto foi
definido como sendo uma fase externa contendo água, etanol e tensoativo,
separada da fase interna por uma parede de poli(cianoacrilato de n-butila) com o
triglicerídeo (Miglyol 812
) e o tensoativo adsorvidos. A fase interna contém
triglicerídeo e etanol.
Em um outro trabalho, a formulação descrita acima foi preparada pelo método
de polimerização interfacial, sob condições clássicas e sob condições ácidas
(método modificado), e estudada pela espectroscopia de ressonância magnética
nuclear com aplicação de gradientes de campo pulsado. As análises foram
realizadas após a formação das nanocápsulas, mas antes da evaporação do etanol.
Em ambos os tipos de formulações, as cavidades internas foram observadas como
esferas com diâmetro interior próximo ao tamanho da nanocápsula e livre de
obstruções que afetem a difusão do conteúdo líquido. Para estudar a permeabilidade
da parede das nanocápsulas, o benzeno foi adicionado nos sistemas preparados
pelos métodos clássico e modificado. Enquanto que as moléculas de benzeno em
uma dispersão preparada pelo método modificado permanecem na cavidade oleosa
por um período médio de 70 ms, o tempo de residência correspondente para as
nanocápsulas preparadas pelo método clássico foi quase o dobro (130 ms). A
diferença na permeabilidade está de acordo com um estudo anterior dos autores
(WOHLGEMUTH et al., 2000), onde a espessura da parede de nanocápsulas de
poli(cianoacrilato de iso-butila) foi determinada por experimentos de gradiente de
14
densidade como sendo de 2,3 e 3,1 nm para os métodos modificado e clássico,
respectivamente. Sendo assim, os autores concluíram que a maior permeabilidade
das nanocápsulas preparadas pelo método modificado é conseqüência de uma
parede com menor espessura. Em ambas as formulações os tempos de residência
observados para o benzeno são muito maiores do que o tempo observado para o
etanol (6 ms) em trabalho anterior (MAYER et al., 2002). Os autores relacionaram
esse fato a diferenças de tamanho e polaridade das moléculas de benzeno e etanol
(WOHLGEMUTH e MAYER, 2003).
CAUCHETIER e colaboradores (2003) calcularam a espessura da parede
polimérica de nanocápsulas contendo atovaquona, preparadas com benzoato de
benzila e três diferentes polímeros: PCL, PLA ou PLGA. Os valores teóricos para a
espessura da parede polimérica foram determinados baseados na hipótese de que o
polímero é o único componente da parede das nanocápsulas. A aproximação
matemática forneceu um valor próximo a 20 nm para os três polímeros. Entretanto,
em um trabalho realizado em nosso grupo de pesquisa, GUTERRES e
colaboradores (2000) demonstraram que o benzoato de benzila não é apropriado
para formular nanocápsulas de PCL ou de PLA. Através de testes de
inchamento/dissolução de filmes destes polímeros, os autores comprovaram que o
benzoato de benzila é capaz de dissolver ambos os polímeros. Desta maneira, os
sistemas formados utilizando-se PCL ou PLA e benzoato de benzila, não se
adaptariam ao conceito de nanocápsula, uma vez que para a formação destas
estruturas vesiculares o fator mais importante é a insolubilidade do polímero tanto na
fase aquosa quanto no núcleo oleoso (GALLARDO et al., 1993; LEGRAND et al.,
1999). Nesse caso, foi proposto que as estruturas formadas seriam do tipo micelar.
Em um trabalho realizado em nosso grupo de pesquisa, POHLMANN e
colaboradores (2002) propuseram um modelo de estrutura para nanoesferas,
preparadas com PCL e monoestearato de sorbitano. Utilizando a técnica de
espalhamento de luz dinâmico, os autores realizaram um estudo comparativo entre
nanocápsulas e nanoesferas de PCL preparadas por nanoprecipitação. Como
tensoativos foram utilizados o polissorbato 80 (alto EHL) e o monoestearato de
sorbitano (baixo EHL). Para formulação das nanocápsulas, o óleo mineral foi
empregado como núcleo oleoso. O experimento forneceu valores negativos para o
15
coeficiente virial k
D
para as formulações de nanocápsulas e nanoesferas,
demonstrando uma baixa interação destas com a fase aquosa. Com fins
comparativos, foi preparada uma outra formulação de nanoesferas sem o tensoativo
lipofílico (monoestearato de sorbitano). Os resultados mostraram um valor de k
D
positivo para esta formulação. A ausência de interação de nanocápsulas e
nanoesferas com a água foi atribuída à presença do monoestearato de sorbitano
disperso no polímero. A comparação dos sistemas nanoestruturados baseada em
suas propriedades dinâmicas permitiu aos autores sugerir que as suspensões de
nanoesferas preparadas com PCL e monoestearato de sorbitano, são um sistema
bifásico onde o monoestearato de sorbitano estaria disperso na matriz polimérica.
Este modelo foi baseado em trabalho anterior do grupo (MÜLLER et al., 2001), onde
medidas de calorimetria diferencial exploratória foram realizadas para suspensões
de nanoesferas preparadas com PCL e monoestearato de sorbitano, mostrando que
ambos os materiais constituem um sistema bifásico.
3. 4 LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS A PARTIR DE SISTEMAS
NANOPARTICULADOS
Os estudos de liberação in vitro de fármacos determinam a fração do fármaco
liberada das nanoestruturas em função do tempo. A caracterização do perfil de
liberação do fármaco pode fornecer informações quanto à estrutura do sistema, o
mecanismo envolvido no processo de liberação, a interação fármaco-carreador e,
ainda, podem ser utilizados como controle de qualidade (WASHINGTON, 1990).
A liberação do fármaco a partir das nanopartículas depende da dessorção do
fármaco da superfície das partículas, da difusão do fármaco através da matriz das
nanoesferas, da difusão através da parede polimérica das nanocápsulas, da erosão
da matriz polimérica ou da combinação dos processos de difusão e erosão
(SOPPIMATH et al., 2001).
16
3. 4 .1 Teoria da Difusão e Modelos Matemáticos
A difusão é um fenômeno que está relacionado ao transporte de massa de
moléculas individuais através de uma barreira ou espaço livre. Este processo é
movido por um gradiente de concentração e está relacionado ao movimento
aleatório das moléculas (movimento browniano) (MARTIN et al., 1993; NETZ e
ORTEGA, 2002).
De acordo com a Primeira Lei de Fick, o fluxo J de uma substância é
proporcional ao gradiente de concentração dc/dx, sendo a constante de
proporcionalidade o coeficiente de difusão D, que está relacionado à mobilidade da
substância (Equação 1).
dx
dc
DJ .
(Equação 1)
O sinal negativo indica que o fluxo de matéria ocorre no sentido no qual a
concentração é menor. O coeficiente de difusão D não pode ser considerado
propriamente uma constante, uma vez que depende da temperatura, pressão,
propriedades do solvente, natureza química e concentração do difusante,
principalmente quando este está em concentrações elevadas (MARTIN et al., 1993).
O fenômeno da difusão pode ser visto como um processo no qual a
concentração tende a se igualar em todos os pontos do sistema com o passar do
tempo. A variação da concentração em função do tempo é descrita pela Segunda
Lei de Fick (Equação 2), a qual afirma que a variação da concentração com o tempo,
em um dado ponto do sistema, é igual à variação do gradiente de concentração,
multiplicada pelo respectivo coeficiente de difusão (NETZ e ORTEGA, 2002):
x
c
D
xt
c
(Equação 2)
17
Através da modelagem matemática pode-se avaliar a aproximação de pontos
experimentais a um modelo descrito pela comparação estatística de parâmetros
calculados (O’HARA et al., 1998). Os principais modelos matemáticos estudados
para explicar os perfis de liberação baseados em processos de difusão são o de
Higuchi e o de Korsmeyer-Peppas (SIEPMANN e PEPPAS, 2001).
Higuchi desenvolveu diversos modelos teóricos para estudar a liberação de
fármacos solúveis e pouco solúveis incorporados em matrizes sólidas e semi-sólidas
(COSTA e LOBO, 2001). A equação de Higuchi (Equação 3) foi inicialmente
empregada para sistemas planares, sendo depois modificada para considerar
diferentes geometrias dos sistemas matriciais (HIGUCHI, 1963).
tcccDQft
ss
0
2
(Equação 3)
Onde Q é a quantidade de fármaco liberado no tempo t por unidade de área,
D é o coeficiente de difusão da substância na matriz, c
0
é a concentração inicial da
substância e c
s
é a solubilidade da substância na matriz.
É possível resumir o modelo de Higuchi à seguinte expressão (Equação 4):
t
K
H
ft
(Equação 4)
onde K
H
é a constante de dissolução de Higuchi que descreve a liberação do
fármaco como um processo baseado na lei de Fick, linearmente proporcional à raiz
quadrada do tempo (COSTA e LOBO, 2001; SIEPMANN e PEPPAS, 2001).
A aplicação do modelo de Higuchi segue alguns postulados: a) a
concentração inicial da substância no sistema deve ser muito maior que sua
solubilidade no meio; b) a análise matemática é baseada em uma difusão uni-
dimensional; c) a substância é considerada em estado molecularmente disperso,
com partículas muito menores em diâmetro do que a espessura do sistema; d) a
18
dissolução do polímero carreador é negligenciável; e e) a difusibilidade da
substância é constante (SIEPMANN e PEPPAS, 2001).
O modelo de Korsmeyer-Peppas, também chamado Lei da Potência, foi
desenvolvido por KORSMEYER e colaboradores (1983) e RITGER e PEPPAS
(1987). Esse modelo relaciona a liberação do fármaco com o tempo através da
seguinte equação:
n
at
t
f
(Equação 5)
onde a é uma constante que incorpora características estruturais e
geométricas da forma farmacêutica, n é o expoente de liberação, indicativo do
mecanismo de liberação do fármaco, e a função de t é M
t
/M
(liberação fracional do
fármaco).
Foi desenvolvida uma forma modificada da Equação 5 (FORD et al., 1987)
para considerar o tempo de latência (tempo para o início da liberação do fármaco):
n
t
lta
M
M
1
(Equação 6)
onde, M
é a quantidade de fármaco no estado de equilíbrio; M
i
é a
quantidade de fármaco difundido no tempo t, e l é o tempo de latência.
Quando ocorre o efeito de liberação abrupta inicial (b) a equação acima
transforma-se em (RITGER e PEPPAS, 1987):
bat
M
M
n
t
1
(Equação 7)
19
A equação de Higuchi representa um caso especial da Lei da Potência
quando n = 0,5. Peppas e colaboradores (1985) foram os primeiros a introduzir o uso
e as limitações desta equação. Os autores utilizaram o valor de n para caracterizar
diferentes mecanismos de liberação. Para difusão fickiana, o valor de n é 0,5.
Quando o valor de n é 1,0, corresponde a um modelo não-fickiano Caso II. Para
valores de n entre 0,5 e 1,0, o modelo é dito não-fickiano do tipo transporte anômalo.
Os valores de n acima definidos correspondem a um sistema matricial planar.
Quando outras geometrias como cilindros e esferas são consideradas, esses valores
sofrem modificações (Tabela 1).
Tabela 1. Mecanismo de liberação do fármaco a partir de sistemas poliméricos de
liberação controlada de diferentes geometrias.
Expoente de liberação (n)
Mecanismo de liberação do
fármaco
Filmes Cilindros Esferas
0,5 0,45 0,43 Difusão fickiana
0,5< n <1,0 0,45< n <0,89 0,43< n <0,85 Transporte anômalo
1,0 0,89 0,85 Transporte caso II
> 1,0 > 0,89 > 0,85 Transporte Super-caso II
3. 4. 2 Perfil de Liberação de Fármacos em Nanopartículas
Segundo SOPPIMATH e colaboradores (2001), o perfil de liberação do
fármaco a partir das nanopartículas é dependente da natureza do sistema de
liberação. No caso de sistemas matriciais, como as nanoesferas, a liberação de
fármacos a partir destes sistemas têm demonstrado seguir cinética de primeira
ordem, freqüentemente atribuída à difusão do fármaco a partir da matriz polimérica
20
para o meio e/ou à erosão do sistema matricial, liberando o fármaco (FRESTA et al.,
1995; POLAKOVIC et al., 1999). No caso das nanocápsulas (sistema de liberação
de fármacos do tipo reservatório), o fármaco está envolto pelo polímero e a liberação
ocorre pela difusão do fármaco através da barreira polimérica o que, teoricamente,
descreve cinética de ordem zero (SOPPIMATH et al., 2001).
Em 1996, CALVO e colaboradores estudaram a penetração corneal da
indometacina, utilizando três sistemas nanoestruturados, nanoesferas e
nanocápsulas preparadas com PCL e nanoemulsão (utilizando Miglyol 840
como
fase oleosa), e determinaram os respectivos perfis de liberação. Os perfis obtidos
foram muito similares para todas as formulações. Os resultados demonstraram que
85 % da indometacina difundiu a partir do sistema nanoestruturado no período de 2
horas e praticamente todo o fármaco foi liberado em 4 horas. Além da rápida
liberação, a similaridade dos perfis de liberação obtidos para as nanocápsulas e
nanoemulsão evidenciou que o revestimento do polímero das nanocápsulas não
exerceu função no processo de liberação. Assim, os autores propuseram que, para
estas formulações, somente a partição do fármaco entre o óleo e o meio aquoso
externo afetou a liberação. Este mecanismo de liberação foi reforçado pelo fato de
que o principal fator controlador da liberação da indometacina foi o volume do meio
aquoso: a indometacina foi liberada mais rapidamente e completamente do seu vetor
quando há uma maior diluição, mas a mesma não é liberada quando as suspensões
não são diluídas.
SANTOS-MAGALHÃES e colaboradores (2000) observaram perfis de
liberação similares para nanocápsulas de PLAGA e nanoemulsão contendo
penicilina G benzatina. A liberação de penicilina G benzatina a partir da
nanoemulsão foi ligeiramente mais lenta devido a diferenças na natureza da fase
oleosa dos dois vetores nanoestruturados. Na preparação das nanocápsulas foi
usado óleo de girassol e na nanoemulsão foi usado Miglyol 812
. Assumindo que o
processo cinético é governado pelo coeficiente de partição óleo/água, os autores
sugeriram que a diferença nos valores de força iônica e constante dielétrica dos
óleos poderia explicar as diferenças observadas nos perfis de liberação da penicilina
G benzatina a partir das nanocápsulas e da nanoemulsão.
21
POLAKOVIC e colaboradores (1999) estudaram o mecanismo de liberação da
lidocaína contida em nanoesferas de PLA através de modelagem matemática. O
fármaco foi incorporado em três diferentes formulações de nanoesferas, variando o
tamanho de partícula (aproximadamente 250 a 820 nm) e a taxa de fármaco
incorporado (cerca de 7 a 32 % v/v). A taxa de liberação nestes sistemas esteve
relacionada com a concentração de fármaco incorporada e demonstrou ser mais
rápida em partículas pequenas com menor concentração de lidocaína. Dois
modelos, difusão e dissolução foram estudados para descrever os dados
experimentais da liberação da lidocaína (meio de dissolução pH 7,4) e identificar o
mecanismo de liberação das formulações com diferentes concentrações de fármaco.
A modelagem dos resultados mostrou que nas formulações com concentrações
maiores, a dissolução dos cristais de fármaco poderia ser a etapa limitante da
liberação. Por outro lado, a liberação do fármaco foi controlada por difusão nas
formulações com concentrações menores de lidocaína, onde o fármaco estava
totalmente disperso na matriz.
O mecanismo de liberação do isradipino contido em nanoesferas preparadas
pelo método de nanoprecipitação foi estudado por LEROUEIL-LE VERGER e
colaboradores (1998). Foram preparadas formulações com os polímeros PLA e
PLAGA. Dois tipos de PLAGA foram utilizados: PLA85GA15, que contém 85 % de
lactídeo e 15 % de glicolídeo, e PLA50GA50, que contém quantidades iguais de
lactídeo e glicolídeo. Para avaliar a liberação do isradipino foi empregada a técnica
de difusão em saco de diálise. Em pH gástrico (pH 1,3) e pH intestinal (pH 6,8) as
suspensões coloidais exibiram um perfil de liberação sustentada. Em pH 1,3 os
perfis foram similares para todas as formulações de nanoesferas durante as
primeiras 14 horas. Após este período, cerca de 40 % do isradipino foi liberado.
Durante as primeiras 24 horas, os perfis de liberação não diferiram
significativamente e o percentual de fármaco liberado foi cerca de 50 %. Após 72
horas, os percentuais de isradipino liberado foram de 60, 80 e 85 % para
PLA50GA50, PLA85GA15 e PLA, respectivamente. Em pH 6,8, o percentual de
isradipino liberado foi de 100 % para PLA85GA15 e PLA e 90 % para PLA50GA50.
Para explicar a diferença nos percentuais de isradipino liberado, a perda relativa de
massa molecular de cada polímero foi calculada. PLA85GA15 e PLA apresentaram
22
uma pequena perda de massa molecular (aproximadamente 10 %), que foi
significativamente maior que a perda para PLA50GA50 (2 %). Estes resultados
levaram os autores a concluir que a liberação do fármaco foi produto dos
mecanismos de difusão e erosão, sendo esta última menos significativa para a
formulação de PLA50GA50.
HU e colaboradores (2002) prepararam nanoesferas de quitosana-poli(ácido
acrílico) contendo o peptídeo da seda. O mecanismo de liberação do peptídeo a
partir das nanoesferas foi estudado através da técnica de difusão em sacos de
diálise em diferentes valores de pH. Uma liberação inicial rápida do peptídeo
seguida por uma fase lenta ocorreu em pH 4,5 e 7,4. Além disso, a formulação
promoveu uma liberação contínua do peptídeo por 10 dias. Por outro lado, em pH
2,0 e 3,0, a liberação do peptídeo foi muito rápida e cerca de 90 % do peptídeo
incorporado foi liberado das nanoesferas em 25 horas. Estes resultados mostraram
que a liberação do peptídeo da seda a partir das nanoesferas de quitosana-
poli(ácido acrílico) foi dependente do pH do meio de liberação. O perfil de liberação
em pH 4,5 apresentou a razão de liberação mais lenta, e em pH 2,0, a formulação
de nanoesferas quase não apresentou propriedades de liberação sustentada. Isto foi
explicado pelo fato de que a liberação do peptídeo depende do inchamento das
nanoesferas. Em pH 4,5, o inchamento é limitado, e o peptídeo não pode ser
liberado das nanoesferas facilmente. Entretanto, em pH 7,4 as nanoesferas incham
em maior extensão, resultando em liberação mais rápida do peptídeo. Em condições
fortemente ácidas (pH < 4,0), as nanoesferas são dissolvidas rapidamente, levando
a uma liberação rápida do peptídeo.
O perfil de liberação do 4-nitroanisol a partir de nanocápsulas e nanoesferas
de PLA, estas últimas contendo hexano como núcleo oleoso, foi avaliado através da
técnica de difusão em saco de diálise em pH 7,0 (ROMERO-CANO e VINCENT,
2002). As nanocápsulas foram formuladas pela preparação prévia de uma emulsão
óleo em água, onde a fase oleosa consistiu de PLA, 4-nitroanisol, diclorometano,
hexano e acetona, e a fase aquosa foi formada por uma solução de poli(álcool
vinílico) (agente emulsificante) em água. A fase aquosa foi mantida sob agitação a
12000 rpm e a fase oleosa foi adicionada sobre esta durante 60 segundos para
formação da emulsão. A emulsão resultante foi mantida sob agitação por 1 hora.
23
Após, uma solução aquosa de poli(álcool vinílico) a 2 % foi adicionada à emulsão. A
emulsão diluída foi mantida sob agitação durante a noite. Após esse período, o
resíduo de diclorometano e acetona foi removido sob pressão reduzida e, então,
ocorreu a precipitação do polímero ao redor da gota de óleo. No caso das
nanoesferas, dois tipos de estruturas foram preparadas. No primeiro tipo (I), a
formulação foi preparada da mesma forma que as nanocápsulas, mas o hexano foi
removido sob pressão reduzida juntamente com o diclorometano e a acetona. As
nanoesferas formadas concentraram o fármaco no centro da matriz. O segundo tipo
(II) foi preparado da mesma forma, mas omitindo o hexano da formulação. Nesse
caso, o fármaco permaneceu homogeneamente disperso na matriz. Além disso, as
três formulações foram preparadas com 1,5 ou 2,5 g de PLA. Todas as formulações
apresentaram um perfil bifásico, sendo a liberação do fármaco explicada pelo
mecanismo de difusão. A liberação do 4-nitroanisol seguiu uma relação linear com a
raiz quadrada do tempo na primeira metade da curva de liberação, demonstrando
um bom ajuste dos dados ao modelo de Higuchi. Através da determinação do
coeficiente de difusão D, foi observada uma liberação mais rápida do fármaco a
partir das nanocápsulas preparadas com menor quantidade de polímero. Os autores
relacionaram esta diferença com a espessura da parede da nanocápsula,
considerando que uma maior concentração de polímero conduz à formação de uma
parede mais espessa, o que tornaria a difusão mais lenta. Para as formulações de
nanoesferas os valores do coeficiente de difusão foram similares.
3. 5 ATIVIDADE ANTIEDEMATOGÊNICA
A inflamação é caracterizada por uma resposta multifatorial essencial para a
manutenção da homeostase celular diante de uma lesão tissular ou infecção. Este
processo fisiológico envolve uma ação coordenada entre o sistema imunológico e o
tecido no qual ocorreu a lesão (WOO, 2000; KUMMER e COELHO, 2002).
O processo inflamatório é desencadeado pela liberação de mediadores
químicos originados nos tecidos lesados e nas células migratórias. Dentre os
principais mediadores figuram a histamina, as proteases plasmáticas, os metabólitos
do ácido araquidônico (prostaglandinas, tromboxano A2 e leucotrienos), o fator
24
ativador de plaquetas, as interleucinas, o óxido nítrico, os constituintes lisossômicos
do leucócitos e os radicais livres derivados do oxigênio (CALIXTO et al., 2000).
Na literatura são relatadas diversas metodologias para a avaliação da
atividade antiinflamatória, entre as quais: o edema de pata de rato induzido por
carragenina, bradicinina, dextrana ou histamina, a pleurisia induzida por carragenina,
a lesão granulomatosa induzida por “pellet” de algodão e o aumento da
concentração sérica de glicoproteína ácida -1, que pode ser determinado por
imunoensaio (FERNÁNDEZ-URRUSUNO et al., 1995).
Dentre os métodos relatados acima, o edema de pata de rato induzido por
carragenina figura como uma das metodologias mais comumente empregadas para
avaliação da atividade antiinflamatória. Essa técnica baseia-se na capacidade de
uma substância em inibir o edema produzido na pata traseira do rato por injeção de
um agente flogístico, neste caso, a carragenina (WINTER et al., 1962).
Nanoesferas preparadas com PLA contendo dexametasona, um
antiinflamatório esteróide, demonstraram atividade antiedematogênica avaliada por
edema de pata de rato induzido por carragenina semelhante à formulação comercial
de dexametasona (Decadron
), na dose de 30 g/Kg (BECK et al., 2003).
AMMOURY e colaboradores (1993) prepararam nanocápsulas de PLA
contendo indometacina, um atiinflamatório não-esteróide, e avaliaram a atividade
antiedematogênica deste fármaco nanoencapsulado pela técnica de edema de pata
de rato induzido por carragenina. Neste estudo, três doses de indometacina foram
testadas: 2,5, 5,0 e 10,0 mg/Kg. Os resultados mostraram que a incorporação da
indometacina nas nanocápsulas não alterou sua atividade antiinflamatória, uma vez
que os perfis de inibição do edema observados foram similares aos das soluções
aquosas. No entanto, somente para a dose de 2,5 mg/Kg o efeito da inibição do
edema foi significativamente mais pronunciado para a indometacina associada às
nanocápsulas do que para a solução aquosa.
Em outro estudo, foi avaliada a atividade antiinflamatória da indometacina
associada a nanocápsulas de poli(cianoacrilato de iso-butila) utilizando a mesma
metodologia. Os resultados mostraram que a indometacina nanoencapsulada
25
apresentou atividade antiinflamatória aumentada em 10 vezes quando foram
comparadas as doses de 3 mg/Kg de indometacina livre e 0,3 mg/Kg de
indometacina nanoencapsulada (GÜRSOY et al., 1989).
KALGUTKAR e colaboradores (2000) sintetizaram uma série de amidas e
ésteres derivados da indometacina. Algumas dessas moléculas são capazes de se
ligar fortemente à enzima ciclooxigenase-2 (cox-2), mas não à ciclooxigenase-1
(cox-1). A inibição seletiva da cox-2 foi demonstrada in vitro através do uso da
enzima humana purificada. A esterificação da indometacina com ésteres alifáticos
aumentou a inibição da cox-2, mas diminui o efeito sobre a cox-1, sendo que esta
inibição aumenta com o aumento da cadeia alquílica. Ésteres aromáticos também
apresentam inibição seletiva da cox-2, assim como as amidas primárias e
secundárias. Por outro lado, amidas terciárias e cíclicas não apresentaram efeito
inibitório sobre a cox-2. Dentre esses derivados, as amidas 2-feniletílica e a 4-
acetamidofenílica foram avaliadas no ensaio de edema de pata de rato induzido por
carragenina, exibindo atividade antiedematogênica
1
.
1
KALGUTKAR, A. S.; CREWS, B. C.; ROWLINSON, S. W.; MARNETT, A. B.;
KOZAK, K. R.; REMMEL, R. P.; MARNETT, L. J. Biochemically Based Design of
Cyclooxygenase (COX-2) Inhibitors. Facile Conversion of Nonsteroidal
Antiinflammatory Drugs to Potent and High Selective COX-2 Inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 2000 apud KALGUTKAR, A. S.; MARNETT, A. B.; CREWS, B. C.;
REMMEL, R. P. Ester and Amide Derivatives of the Nonsteroidal Anti-inflammatory
Drug, Indomethacin, as Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitors. Journal of Medicinal
Chemistry, v. 43, p. 2860-2870, 2000.
26
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4. 1 MATERIAIS
4. 1. 1 Matérias-primas
Substância ativa: Indometacina (Sigma - St. Louis, EUA)
Polímero: Poli(-caprolactona) (PCL)
w
M
= 60000 (Aldrich -
Strasbourg, França)
Tensoativos:
- Baixo índice EHL: Monoestearato de sorbitano (Span 60
)
(Delaware - Porto Alegre - Brasil)
- Alto índice EHL: Polissorbato 80 (Tween 80
) (Delaware - Porto
Alegre - Brasil)
Fase oleosa: Triglicerídeo caprílico/cáprico:
- Miglyol 810
(Hulls - Puteaux, França)
- Brasquim - Porto Alegre - Brasil
27
4. 1. 2 Aparelhos e Equipamentos
Evaporador rotatório (Büchi - Alemanha)
Bomba de vácuo V-500 (Büchi Vac
- Alemanha)
Potenciômetro B474 (Micronal - São Paulo, Brasil)
Agitador Certomat MV (Vitaris – Alemanha)
Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (Central Analítica -
Faculdade de Farmácia - UFRGS):
- Injetor S-200 (Perkin-Elmer – Boston, EUA)
- Detector UV-VIS S-200 (Perkin-Elmer – Boston, EUA)
- Bomba S-200 (Perkin-Elmer – Boston, EUA)
Espectrômetro de auto-correlação laser (Central Analítica - Instituto de
Química - UFRGS):
- Fonte de luz laser: íons He-Ne, 35Mw,
0
= 632,8nm, modelo 127
(Spectra-Physics - California, EUA)
- Goniômetro: BI-200M, versão 2.0 (Brookhaven Instruments - Nova
York, EUA)
- Correlacionador digital: BI-9000AT (Brookhaven Instruments -
Nova York, EUA)
- Detector: BI9863 (Brookhaven Instruments - Nova York, EUA)
Centrífuga 4K15 (Sigma - Alemanha)
Banho Termostatizado (Ika - EH4 - Rio de Janeiro, Brasil)
Equipamento para determinação do ponto de fusão (Reichert - Nova
York, EUA)
28
Hidropletismômetro (Ugo Basile – Comério, Itália)
Espectrômetro VXR-200 ou YH-300 (Instituto de Química - UFRGS)
(Varian - Palo Alto, EUA)
4. 1. 3 Solventes e Outros Materiais
Acetonitrila grau CLAE (Omnisolv - Charlotte, EUA)
Acetona (Nuclear - São Paulo - Brasil e Quimex - Porto Alegre, Brasil)
Água destilada
Água Milli-Q (Destilador/deionizador Milliq-Q
- Millipore - Billerica,
EUA)
Álcool etílico (Nuclear - São Paulo, Brasil)
Ácido acético (Synth - Diadema, Brasil)
Ácido clorídrico (Nuclear - São Paulo, Brasil)
Hidróxido de sódio (Merck – Frankfurt, Alemanha)
Diclorometano (Nuclear - São Paulo, Brasil)
Bicarbonato de sódio (Merck – Frankfurt, Alemanha)
4-(N, N-dimetilamino)piridina (DMAP) (Sigma - St. Louis, EUA)
Diciclohexilcarbodiimida (DCC) (Sigma - St. Louis, EUA)
Acetato de etila (Quimex - Porto Alegre, Brasil)
Ciclohexano (Quimex - Porto Alegre, Brasil)
Membrana 0,45 m (Millipore - Billerica, EUA)
Sílica para enchimento de pré-coluna LiChrsorb RP-18 (Merck -
Frankfurt, Alemanha)
29
Coluna (Nova-Pack C
18
, 150 mm, 3,9 mm, 4 m) (Waters - Milford,
EUA)
Os solventes e reagentes líquidos foram adquiridos em grau analítico ou
cromatográfico e utilizados como recebidos.
4. 1. 4 Avaliação Biológica
Foram utilizados ratos Wistar, machos, pesando entre 180 a 200 g,
provindos do biotério da Fundação Estadual de Produção e Pesquisa
em Saúde (FEPPS).
Carragenina (Sigma - St. Louis, EUA)
4. 2 MÉTODOS
4. 2. 1 Obtenção do Éster Etílico de Indometacina
2
A síntese do éster etílico de indometacina (IndOEt) segue a metodologia
descrita por KALGUTKAR e colaboradores (2000) com pequenas adaptações. Em
uma solução de indometacina (IndOH) (5,0 mmol) em etanol (20 mL) foi adicionado
0,2 mmol de DMAP. A solução foi resfriada a 0
o
C em um balão sob argônio e, após
10 minutos, foi adicionado DCC (5,0 mmol). A reação permaneceu à temperatura de
0
o
C por mais 30 minutos e, então, foi mantida à temperatura ambiente por 16 horas.
A reação foi acompanhada por cromatografia em camada delgada.
Ao final da reação o excesso de solvente foi evaporado sob pressão reduzida.
O resíduo foi dissolvido em diclorometano (30 mL) e a suspensão foi filtrada. O
filtrado foi lavado com solução aquosa saturada de NaHCO
3
(3 x 10 mL) e o
precipitado de diciclohexiluréia foi descartado. A fase orgânica foi seca com MgSO
4
anidro, filtrada e o solvente foi evaporado. O produto foi purificado através de coluna
cromatográfica (sílica-gel 60, 70-230 mesh), empregando uma mistura de acetato de
2
O IndOEt foi sintetizado por Leonardo U. Soares em seu trabalho de mestrado realizado no PPG-
Química (UFRGS).
30
etila e ciclohexano (1:1 v/v) como eluente. O éster foi obtido com 80 % de
rendimento, após purificação.
O ponto de fusão não corrigido do IndOEt foi determinado em equipamento de
ponto de fusão em bloco situando-se na faixa de 82 - 83
o
C.
As análises de ressonância magnética nuclear (RMN) foram realizadas em
Espectrômetro Varian (VXR-200 ou YH-300) à temperatura ambiente, usando o
tetrametilsilano (TMS) como padrão interno.
RMN do
1
H 200 MHz (, ppm) CDCl
3
: 7,66 e 7,46 (AB, 2H + 2H, ArH p-
clorobenzoila), 6,97 (d, 1H J = 2,5 Hz, H-4); 6,87 (d, 1H J = 9,0 Hz, H-7); 6,67 (dd,
1H J = 9,0 e 2,5 Hz, H-6); 4,16 (q, 2H J = 7,1 Hz, OCH
2
), 3,84 (s, 3H, OCH
3
); 3,65 (s,
2H, CH
2
); 2,38 (s, 3H, CH
3
); 1,27 (t, 3H J = 7,1 Hz, CH
3
CH
2
O).
RMN do
13
C 75 MHz (APT, , ppm) CDCl
3
: 170,9 (CO-éster); 168,3 (CO-
amida); 156,0, 139,2, 135,9, 134,0, 130,8, 130,7 e 112,7 (7 x Cq); 131,1 e 129,1 (4 x
CH p-clorobenzoila); 114,9, 111,6 e 101,3 (3 x CH indol); 61,0 (OCH
2
); 55,7 (OCH
3
);
30,4 (CH
2
); 14,2 e 13,3 (CH
3
e CH
3
CH
2
).
4. 2. 2 Método Analítico
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi o método empregado
para a quantificação da IndOH e de seu éster nas formulações preparadas e durante
as reações de hidrólise alcalina (perfis cinéticos).
A fase móvel empregada foi preparada com acetonitrila/água (70:30 v/v),
tendo seu pH aparente ajustado em 5,0 com ácido acético a 10 % e medido em
potenciômetro. O fluxo empregado foi de 0,7 mL/min e o volume de injeção foi de 20
L. Tanto a IndOH como seu éster etílico foram detectados em 267 nm.
A validação da metodologia foi realizada segundo as recomendações da
International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceutical for Human Use (ICH,1996). Os parâmetros avaliados
foram a linearidade, a exatidão, a repetibilidade, a precisão intermediária e o limite
31
de quantificação. Esses parâmetros foram determinados pela análise de três curvas
de calibração e amostras de nanocápsulas a cada dia, durante três dias
consecutivos. A solução-mãe foi preparada a partir da massa exata de
aproximadamente 25,0 mg de IndOH diluída em 50 mL de acetonitrila. A partir da
solução-mãe as curvas foram preparadas nas seguintes concentrações: 1,0, 2,0,
5,0, 10,0, 15,0, 20,0 e 25,0 g/mL. As amostras de nanocápsulas foram preparadas
a partir de soluções-mãe distintas daquela da curva de calibração. À estas amostras
foram adicionadas quantidades de indometacina resultando nas concentrações 3,0,
12,0 e 17,0 g/mL, sendo determinado o percentual de IndOH recuperado a partir
destas amostras acrescidas de fármaco.
4. 2. 3 Preparação dos Sistemas Nanoestruturados
As suspensões de nanocápsulas (NC), nanoesferas (NS) e nanoemulsão
(NE) foram preparadas empregando-se a composição de fases descrita na Tabela 2.
Tabela 2. Composição quali e quantitativa das formulações.
Componentes Quantidade NC NS NE
Água destilada 53 mL X X X
Fase
Aquosa
Polissorbato 80 0,0770 g X X X
Acetona 27 mL X X X
Monoestearato de sorbitano 0,0770 g X X X
Poli(-caprolactona) 0,1000 g X X
Triglicerídeo dos ácidos
caprílico/cáprico
0,330 mL X X
Fase
Orgânica
IndOH ou IndOEt 0,0100 g X X X
As suspensões de NC foram preparadas pelo método de deposição interfacial
de polímeros pré-formados (FESSI et al., 1989). Primeiramente, foi preparada a fase
orgânica contendo o óleo (triglicerídeo dos ácidos caprílico/cáprico), o tensoativo de
baixo EHL (monoestearato de sorbitano), o polímero (PCL), a substância a ser
32
encapsulada (IndOH ou IndOEt) e acetona. Esta foi mantida sob agitação e
aquecimento a 40
o
C. Em um frasco separado, o polissorbato 80 (tensoativo de
elevado EHL) foi disperso em água, permanecendo sob agitação à temperatura
ambiente. Após a completa dissolução dos componentes de ambas as fases, a fase
orgânica foi vertida lentamente sobre a fase aquosa através de um funil. A
suspensão resultante foi mantida sob agitação moderada por 10 minutos, à
temperatura ambiente. A suspensão foi concentrada a um volume final de 10 mL em
evaporador rotatório, para eliminação do solvente orgânico e concentração da água
para um ajuste da concentração final de IndOH ou de seu éster a 1,0 mg/mL em
balão volumétrico. Para a preparação de NS procedeu-se da mesma forma descrita
para as NC, omitindo-se o óleo da composição (método de nanoprecipitação). A NE
foi preparada através da emulsificação espontânea conforme descrito para NC,
omitindo-se o polímero. As formulações foram preparadas em triplicatas.
Em paralelo, foram preparadas formulações de NC contendo IndOEt, com
diferentes concentrações de polímero, variando em um gradiente de PCL de 8,0
mg/mL (NC80), 6,0 mg/mL (NC60), 4,0 mg/mL (NC40), 2,0 mg/mL (NC20) e 0,0
mg/mL (NE).
4. 2. 4 Caracterização Físico-Química dos Sistemas Nanoestruturados
4. 2. 4. 1 Determinação do pH
O pH das formulações foi determinado mediante a utilização de
potenciômetro, calibrado com soluções-tampão de valores de pH 4,0 e 7,0. Este
parâmetro foi determinado a partir das suspensões mantidas à temperatura
ambiente, após a preparação. Foram realizadas três determinações para cada
formulação.
33
4. 2. 4. 2 Determinação do Diâmetro Hidrodinâmico das Partículas
A avaliação do diâmetro e distribuição do diâmetro das nanopartículas foi
realizada por espalhamento de luz dinâmico (PCS), por análise da luz espalhada em
ângulo fixo de 90
o
à temperatura ambiente (20
o
C). As medidas foram realizadas em
espectrômetro de auto-correlação laser Brookheaven, sendo as amostras diluídas
500 vezes. Os resultados representam a média de três determinações.
4. 2. 4. 3 Teor de Sonda (IndOH ou IndOEt) nas Formulações
As suspensões contendo 1,0 mg/mL de IndOH ou do IndOEt foram tratadas
com acetonitrila para a dissolução de todos os componentes da formulação. Foram
transferidas alíquotas de 100 L a um balão volumétrico de 10 mL e o volume
completado com acetonitrila. A solução foi filtrada (Millipore, 0,45 m) e o teor de
sonda foi determinado pelo método de CLAE. Os resultados foram expressos em
teor total de IndOH ou IndOEt (mg/mL) e representam a média de triplicata de
amostra para cada suspensão.
4. 2. 5 Diluição das Suspensões de Nanocápsulas com Etanol
Uma alíquota de suspensão de NC foi diluída em etanol na proporção de
1:100 (v/v). Após 3 minutos de agitação, a amostra foi centrifugada (10 minutos,
5000 rpm). A IndOH ou o seu éster foram determinados nos correspondentes
sobrenadantes por CLAE. As medidas foram realizadas em duplicatas de três
amostras de cada formulação preparada com a IndOH ou com o IndOEt. O
sedimento resultante da centrifugação foi analisado por ressonância magnética
nuclear de
1
H (200 MHz; acetona-d
6
) e teve seu ponto de fusão determinado
(método do bloco aquecido).
34
4. 2. 6 Medida do Diâmetro das Nanocápsulas após Adição de Quantidades
Crescentes de Etanol
A medida do diâmetro de NC contendo IndOEt ou IndOH, após adição de
volumes crescentes de etanol, foi acompanhada por PCS, conforme descrito no item
4. 2. 4. 2.
Foi medido inicialmente o diâmetro das NC antes da adição de etanol, através
da diluição de 100 L da suspensão até o volume de 50 mL com água. Foram
adicionados, então, na mesma solução (5,0 mL), volumes crescentes de etanol (de
0,1 mL até 27,3 mL), sendo que, após cada adição, o diâmetro efetivo de partícula
foi novamente medido. As medidas foram realizadas em triplicata de amostra para
cada suspensão.
4. 2. 7 Hidrólise das Sondas em Meio Alcalino
As reações de hidrólise alcalina da IndOH e de seu éster associados às
nanopartículas foram realizadas à temperatura de 37
o
C por adição de 2 mL de cada
formulação em 8 mL de solução aquosa de NaOH 0,05 M. Alíquotas (300 L) foram
coletadas entre 5 minutos e 1440 minutos para o IndOEt e entre 0,5 minuto e 2
minutos para a IndOH e tratadas com 5 L de HCl 2,5 M, seguido de diluição com
1,2 mL de acetonitrila. Após centrifugação a 12000 rpm por 5 minutos, os
sobrenadantes foram analisados por CLAE observando-se o desaparecimento do
substrato. As reações foram realizadas em triplicata.
Com fins comparativos, foram realizadas reações de hidrólise alcalina das
sondas em solução de acetonitrila (1,0 mg/mL), seguindo a mesma metodologia.
35
4. 2. 8 Medidas de Diâmetro de Partícula Durante a Reação de Hidrólise
As suspensões de nanopartículas contendo as sondas foram analisadas
quanto à variação do seu diâmetro durante a reação de hidrólise alcalina. As
medidas de diâmetro de partícula em função do tempo foram acompanhadas por
PCS.
Do meio reacional descrito no item 4. 2. 7 foram coletadas, em intervalos de
tempo pré-estabelecidos, alíquotas de 100 L e diluídas até o volume de 10 mL com
água, procedendo-se as medidas conforme descrito no item 4. 2. 4. 2.
4. 2. 9 Modelagem Matemática dos Perfis Cinéticos
Com a finalidade de explicar os perfis cinéticos obtidos a partir das reações
das sondas associadas aos sistemas nanoestruturados foi aplicado o modelo da Lei
da Potência (Equação 5). A modelagem matemática dos resultados cinéticos
segundo a equação da Lei das Potências permitiu a obtenção dos parâmetros a e n,
que caracterizaram os sistemas quanto as suas características estruturais e
geométricas e o mecanismo de liberação das sondas.
A descrição matemática das curvas cinéticas foi realizada pelo ajuste dos
dados experimentais aos modelos monoexponencial (Equação 8) e biexponencial
(Equação 9).
kt
eCC
0
tktk
beaeC
21
(Equação 8) (Equação 9)
Onde: C é a concentração da sonda no tempo t;
C
0
é a concentração inicial da sonda;
k é a constante cinética observada;
a e b são as concentrações iniciais de sonda;
k
1
e k
2
são constantes cinéticas observadas.
36
A modelagem dos perfis cinéticos experimentais foi realizada através do
programa Micromath Scientist
, realizando a comparação dos modelos entre si com
base nos seguintes parâmetros: critério de seleção do modelo (MSC), maior
coeficiente de correlação e melhor ajuste gráfico.
4. 2. 10 Edema de Pata de Rato Induzido por Carragenina
3
A atividade antiedematogênica do IndOEt associado a NC, NS e NE foi
avaliada pelo método de edema de pata de rato induzido por carragenina, utilizando
a metodologia descrita por WINTER e colaboradores (1962). O parecer de
aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (UFRGS) encontra-se no anexo.
Para o experimento, os ratos utilizados, com peso entre 180-200 g, foram
divididos em oito grupos:
- Grupo controle positivo: tratado com dispersão aquosa de indometacina
(1 mg/mL) em polissorbato 80 (1 %), na dose de 10 mg/Kg, v. o. (n = 10).
- Grupo controle negativo A: tratado com água destilada, v. o. (n = 9).
- Grupos controle negativo B: tratados com as suspensões de NC (n = 8),
NS (n = 6) e NE (n = 8) na ausência do IndOEt, v. o.
- Grupos teste: tratados com as formulações de NC (n = 8), NS (n = 10) e
NE (n = 8) contendo o IndOEt (1 mg/mL), na dose de 10 mg/Kg, v. o.
Os animais foram levemente sedados com éter etílico para administração das
formulações por via oral através de uma sonda, uma hora antes da indução do
edema. Após, os animais foram anestesiados pela via intraperitoneal, com
pentobarbital sódico, na dose de 40 mg/Kg de peso corporal e o edema foi induzido
na aponevrose subplantar na pata traseira direita dos ratos, através da injeção de
0,1 mL de solução de carragenina em salina (7,5 mg/mL). A pata esquerda serviu de
3
A avaliação da atividade antiedematogênica foi realizada no Laboratório de Controle de Qualidade
da Faculdade de Farmácia (UFRGS), sob a supervisão da Profa. Dra. Elfrides Schapoval e
colaboração da Profa. Dra. Sílvia Guterres.
37
controle, através da injeção de 0,1 mL de solução salina. O volume das patas foi
medido em triplicata em hidropletismômetro 1, 2, 3 e 4 horas após a injeção do
agente flogístico. Os resultados de redução de edema foram calculados em relação
ao aumento percentual do volume das patas dos animais controle e tratados. A
atividade antiedematogênica das formulações contendo IndOEt foi expressa como
percentual de redução do edema, em relação aos grupos controle.
Os resultados foram expressos como média erro padrão da média (e. p. m.)
e analisados estatisticamente pelo teste “t” de Student.
38
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5. 1 OBTENÇÃO DO ÉSTER ETÍLICO DE INDOMETACINA
A preparação do IndOEt consistiu na ativação da IndOH com DCC, que forma um
intermediário com bom grupo abandonador. Após a ativação da função ácido
carboxílico, a condensação com etanol (usado como reagente em excesso e como
solvente) produziu o éster (Esquema 1). O rendimento do produto purificado foi de
80 % e a pureza foi avaliada por CLAE, tendo sido estimada em 99,24 0,04 %. O
espectro de RMN do
1
H apresentou sinais em 4,16 e 1,27 ppm, correspondentes ao
grupo etoxila, e no espectro de RMN de
13
C (APT), foram observados sinais em
170,9 ppm e 61,0 ppm atribuídos à carbonila do éster e ao CH
2
do grupo etoxila,
respectivamente. Os deslocamentos químicos () são relativos ao tetrametilsilano.
0 °C, 0.5 h
r.t., 16 h
21
N
CH
3
O
CH
3
COOCH
2
CH
3
Cl
O
C
DCC/DMAP
CH
3
CH
2
OH
N
CH
3
O
CH
3
COOH
Cl
O
C
Esquema 1. Síntese do éster etílico de indometacina.
0
o
C, 0,5 h
t.a., 16 h
Indometacina Éster Etílico de Indometacina
39
5. 2 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
5. 2. 1 Indometacina
A validação de uma metodologia analítica deve garantir, por meio de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados (ICH, 1996; BRASIL, 2003). Foram
selecionados os seguintes parâmetros para a validação das curvas-padrão:
linearidade, exatidão, repetibilidade, precisão intermediária e limite de quantificação.
A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar
que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito
na amostra, dentro de um intervalo especificado.
A média das nove curvas de calibração da IndOH em acetonitrila, na faixa de
concentração de 1,0 a 25,0 g/mL, pode ser visualizada na Figura 2. O valor de F
(7,63) da ANOVA da regressão foi maior que o F tabelado (4,04) para = 0,01,
indicando a existência de relação linear entre a variáveis relacionadas. Da mesma
forma, os coeficientes de correlação (r) das curvas intra e inter-dias apresentaram
valores acima de 0,99, estando de acordo com o que é preconizado pelo ICH (1996)
(Tabela 3).
Figura 2. Média das nove curvas de calibração da IndOH em acetonitrila.
y = 108843x - 22976
R
2
= 0,9993
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 102030
Concentração de IndOH (
g/mL)
área IndOH
40
Tabela 3. Coeficientes de correlação (r) das curvas de calibração da IndOH.
Dia de
validação
Curva 1 Curva 2 Curva 3 Inter-dias
1 0,9988 0,9991 0,9996
0,9992 0,0004
2 0,9996 0,9992 0,9995
0,9994 0,0002
3 0,9994 0,9991 0,9996
0,9994 0,0003
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos
pelo método em estudo em relação ao valor adotado como verdadeiro. Foram
preparadas amostras NC acrescidas de IndOH nas concentrações de 3,0, 12,0 e
17,0 g/mL para avaliar esse parâmetro. Para todas as amostras o percentual de
fármaco recuperado foi de 100 %, estando de acordo com os padrões estipulados
pelo ICH (1996) (Tabela 4).
Tabela 4. Avaliação da exatidão do método analítico de doseamento da IndOH.
Concentração
de IndOH
(g/mL)
Dia 1
Conc. DP
(exatidão %)
Dia 2
Conc. DP
(exatidão %)
Dia 3
Conc. DP
(exatidão %)
3,0
3,0 0,1
(100,0 %)
3,0 0,1
(100,0 %)
3,0 0,0
(100,0 %)
12,0
12,0 0,0
(100,0 %)
12,0 0,1
(100,0 %)
12,0 0,0
(100,0 %)
17,0
17,0 0,0
(100,0 %)
17,0 0,1
(100,0 %)
17,0 0,1
(100,0 %)
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma
série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A
repetibilidade (precisão intra-dia) é a concordância dos resultados dentro de um
curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. A precisão
intermediária é a concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas
obtidos em dias diferentes.
Os dados de repetibilidade, expressos pelos coeficientes de variação intra-
dia, e os dados de precisão intermediária, expressos pelos coeficientes de variação
41
inter-dia, foram obtidos através da análise das mesmas amostras de NC batizadas
com IndOH e apresentaram valores abaixo de 2 %.
Tabela 5. Avaliação dos coeficientes de variação intra e inter-dia do método analítico
de doseamento da IndOH.
Concentração
de IndOH
(g/mL)
Dia 1
CV %
Dia 2
CV%
Dia 3
CV%
Inter-dia
CV %
3,0 1,7 1,3 1,0 0,7
12,0 0,3 0,5 0,3 0,3
17,0 0,1 0,3 0,3 0,1
Os resultados referentes aos testes de exatidão, repetibilidade e precisão
intermediária e os coeficientes de correlação obtidos das curvas de calibração
apresentaram-se adequados, permitindo considerar validado o método para
doseamento da IndOH na faixa de concentração de 1,0 a 25,0 g/mL.
O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra
que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas.
O ponto da curva de calibração referente à concentração de 1,0 g/mL foi
considerado o limite de quantificação do método analítico, uma vez que apresentou
coeficiente de variação aceitável (abaixo de 2 %). A concentração de 0,5 g/mL foi
testada e forneceu um coeficiente de variação de 21,5 %, sendo, portanto,
inadequado para o propósito.
5. 2. 2 Éster etílico de indometacina
A validação do método de quantificação do IndOEt foi realizada por SOARES
(2003). A curva de calibração foi obtida na faixa de 1,0 a 25,0 g/mL, com
coeficiente de correlação 0,9995. As amostras de controle de qualidade com
concentrações de 3,0 12,0 e 17,0 g/mL apresentaram exatidão de 104,78 %, 99,42
% e 100,20 %, respectivamente. Os dados de repetibilidade e precisão intermediária
foram obtidos a partir das mesmas amostras de controle de qualidade e
apresentaram coeficientes de variação abaixo de 2 %.
42
5. 3 FORMAS DE ASSOCIAÇÃO DA INDOMETACINA NOS SISTEMAS
NANOESTRUTURADOS
5. 3. 1 Suspensões de Nanocápsulas
Após a preparação, as suspensões de NC apresentaram aspecto
macroscopicamente homogêneo, com diâmetros de partícula inferiores a 300 nm.
Os valores de pH foram de 5,07 0,03 e 5,31 0,06, para as formulações contendo
IndOH e IndOEt, respectivamente, e as concentrações de IndOH e IndOEt foram
próximas de 1,0 mg/mL (Tabela 6).
Tabela 6. Características físico-químicas das formulações de NC.
Formulação Diâmetro (nm)
a
±
DP
pH ± DP teor ± DP (mg/mL)
NC-IndOH 288 ± 9 5,07 ± 0,03 0,98 ± 0,01
NC-IndOEt 278 ± 29 5,31 ± 0,06 0,98 ± 0,01
a
Amplitude de distribuição < 62 nm.
A taxa de associação da IndOH foi considerada correspondente ao teor total,
uma vez que foi anteriormente demonstrado para essa formulação que 100 % da
IndOH está associada às NC (O’BACH, 2002). A concentração do IndOEt associado
às NC também foi considerada correspondente ao teor total, pois foi determinado
por SOARES (2003) que a solubilidade do IndOEt em água é menor do que 1,0
g/mL, e que não há estabilização de nanocristais de éster nas suspensões pela
ação dos tensoativos.
5. 3. 2 Diluição das Suspensões de Nanocápsulas com Etanol
Com o objetivo de diferenciar a adsorção no polímero da dissolução no núcleo
oleoso das NC como forma de associação da IndOH e de seu éster, foi realizada a
diluição das suspensões de NC com etanol. Considerando que o etanol solubiliza a
IndOH ou o IndOEt, e não dissolve o polímero, a fração adsorvida na matriz
43
polimérica de IndOH ou de seu éster poderia ser extraída por este solvente (Figura
3). Desta forma, uma liberação inicial rápida (efeito burst) poderia ser diferente para
a IndOH, quando comparada com o IndOEt devido às suas diferentes solubilidades
no óleo, e, conseqüentemente, diferentes concentrações na superfície da partícula.
No entanto, os resultados mostraram uma liberação de 97,0 0,6 % para IndOH e
98,7 4,8 % para o IndOEt. Desta forma, ambas as substâncias (IndOH e seu éster)
poderiam estar adsorvidas no polímero (superfície da partícula) ou elas poderiam ter
sido completamente liberadas das NC, após diluição das suspensões com etanol.
Figura 3. Representação esquemática da estratégia de determinação da
concentração de IndOH ou de IndOEt adsorvida na parede polimérica usando etanol
como solvente.
5. 3. 3 Medida do Diâmetro das Nanocápsulas após Adição de Quantidades
Crescentes de Etanol
Com o objetivo de verificar o comportamento das suspensões (NC-IndOH e NC-
IndOEt) em presença de etanol, foram realizadas análises de PCS após a adição de
alíquotas de etanol nas suspensões. Os resultados (Figura 4) mostraram um
aumento no tamanho de partícula de 274 4 nm para 622 17 nm para NC-IndOH e
285 14 nm para 622 25 nm para NC-IndOEt, após adição de 3,3 mL de etanol,
seguido por um decréscimo até 360 15 nm e 370 3 nm, respectivamente, após
Etanol
44
adição de 27,3 mL deste solvente. Esses resultados sugerem a permeação do
etanol através da parede polimérica das NC durante a adição de etanol nas
suspensões. O aumento do tamanho de partícula poderia estar relacionado com a
difusão do etanol a partir da fase externa aquosa para a fase interna das NC,
enquanto que o decréscimo poderia estar relacionado com a difusão do etanol da
fase interna para o meio externo. Após a adição de 5 mL de etanol, conduzindo a
uma proporção de etanol e água de 1:1 (v/v) (Figura 4), a fase interna poderia
difundir para o meio externo ocasionando o decréscimo do tamanho de partícula em
cada adição do solvente, devido a afinidade da fase interna pelo solvente orgânico.
Após a adição de 23 mL, os sistemas apresentaram diâmetro de partícula constante.
Figura 4. Efeito da adição de etanol nas suspensões de nanocápsulas contendo
IndOH ou IndOEt.
De acordo com a literatura (MAYER et al., 2002), quando o etanol é usado
como solvente na preparação de NC de poli(cianoacrilato de n-butila) pelo método
de polimerização in situ, contendo um triglicerídeo (Mygliol 812
), após a formação
das NC mas antes da evaporação do solvente, as moléculas de etanol difundem
através da parede polimérica, em um tempo de meia-vida do etanol encapsulado de
aproximadamente 6 ms.
A respeito do experimento de diluição das suspensões de NC com etanol, se
as fases interna e externa de cada sistema estão em equilíbrio e a centrifugação
200
300
400
500
600
700
0 5 10 15 20 25 30
Etanol (mL)
Diâmetro de partícula (nm)
NC-IndOH
NC-IndOEt
45
promove a agregação do polímero, o sobrenadante poderia conter, além da IndOH e
de seu éster, o óleo e os dois tensoativos. Neste caso, o sedimento poderia ser
constituído apenas de polímero.
Com o objetivo de verificar a composição dos sedimentos após adição de
etanol e centrifugação, cada uma das formulações (NC-IndOH e NC-IndOEt) teve
seu sedimento separado do sobrenadante e este foi seco (dessecador) para
análises de ponto de fusão e RMN. O faixa de fusão de ambos os sedimentos foi de
58-60
o
C, correspondendo aos valores de ponto de fusão da PCL e do
monoestearato de sorbitano. Com a finalidade de determinar a estrutura química dos
sedimentos, análises de RMN foram realizadas. O espectro (RMN do
1
H) apresentou
dois tripletes em 4,05 ppm e 2,30 ppm, integrando dois prótons cada um, e dois
multipletes em 1,62 ppm e 1,41 ppm, integrando quatro e dois prótons,
respectivamente (Anexo). Essas análises confirmaram que o polímero (PCL) é o
único componente do sedimento. Neste caso, todos os componentes, exceto o
polímero, foram dissolvidos pelo etanol após a diluição, e a centrifugação promoveu
a agregação do polímero.
O experimento baseado na diluição das suspensões com etanol [1:100(v/v)],
seguido de centrifugação, promoveu a total liberação da IndOH ou de seu éster a
partir das NC. Os resultados mostraram que o emprego desta abordagem não foi
adequada para diferenciar a forma de associação da IndOH ou de seu éster em NC.
5. 3. 4 Reações de Hidrólise Alcalina
Com o objetivo de diferenciar a forma de associação da IndOH em NC, foram
comparados os perfis cinéticos de hidrólise das funções amida e éster da IndOH e
do IndOEt por catálise alcalina. Se a IndOH e o IndOEt estão dissolvidos no óleo das
NC, poderia ser esperado um comportamento difusivo de ambos quando tratados
com solução aquosa de NaOH. Essa abordagem foi baseada na baixa afinidade do
polímero pela fase aquosa das suspensões (POHLMANN et al., 2002). Nesse caso,
a reação poderia ocorrer na interface partícula/água e a taxa de hidrólise poderia ser
46
correspondente à difusão das moléculas a partir da fase interna para a interface,
simulando-se uma liberação em condição sink.
A hidrólise da IndOH e do IndOEt (1 mg/mL) em solução de acetonitrila foi
determinada pela adição em cada formulação de uma solução aquosa de NaOH
(0,05 M) e o desaparecimento do substrato foi determinado por CLAE (Figura 5).
Figura 5. Perfil cinético da hidrólise da IndOH e do IndOEt em solução de
acetonitrila.
Após 1 e 2 minutos, a IndOH e o IndOEt foram totalmente hidrolisados,
respectivamente. Por outro lado, quando as suspensões correspondentes de NC
foram tratadas com NaOH, a IndOH foi totalmente consumida em 2 minutos,
enquanto que para a reação do IndOEt associado a NC a totalidade do éster foi
consumida ao final de 24 horas (Figura 6).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
00,511,52
tempo (min)
Concentração (mg/mL)
Solução-IndOH
Solução-IndOEt
47
Figura 6. Perfil cinético da hidrólise da IndOH e do IndOEt em nanocápsulas.
Para explicar porque a hidrólise do IndOEt foi muito mais lenta quando
comparada com a IndOH duas hipóteses foram levantadas. A primeira hipótese foi
considerar que a IndOH estaria adsorvida no polímero e, pelo menos, uma parte do
IndOEt foi dissolvido no óleo das NC. O tratamento das suspensões com NaOH
poderia promover a liberação total da IndOH pela formação do sal (solúvel em água)
e a amida poderia ser hidrolisada em solução. Por outro lado, a taxa de hidrólise do
éster poderia ser determinada pela sua difusão a partir da fase interna para a
interface e/ou pela erosão das NC. As NC hidrofóbicas (PCL) poderiam sofrer uma
erosão diferenciada pela presença da IndOH (um ácido) ou pela presença do IndOEt
(um éster). No caso da IndOH, a taxa de erosão poderia ser mais rápida e a
formação do sal, que é solúvel em água, poderia facilitar a hidrólise da amida. Para
determinar a influência da solução aquosa de NaOH no diâmetro de partícula,
realizou-se a determinação da média do diâmetro e polidispersão durante o
experimento de hidrólise alcalina da IndOH e do IndOEt.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 500 1000 1500
tempo (min)
[mg/mL]
NC-IndOEt
0,0
0,3
0,6
0,9
1, 2
0 0,5 1 1,5 2
tempo (min)
NC-IndOH
48
5. 3. 5 Determinação do Diâmetro das Nanocápsulas Durante a Hidrólise
Alcalina
Para verificar a integridade das NC em cada sistema, após a adição de
solução aquosa de NaOH, os tamanhos de partícula e as polidispersões foram
determinados. Como a hidrólise da IndOH em meio alcalino foi muito rápida, o
experimento foi conduzido até 30 minutos. Para o experimento envolvendo NC
contendo IndOEt, a determinação do diâmetro durante a hidrólise foi realizada até 24
horas. Durante a hidrólise alcalina, as NC contendo IndOH apresentaram diâmetros
de partícula constantes de 264 10 nm (polidispersão de 0,1021) (Figura 7), e as
NC contendo IndOEt apresentaram tamanhos de partícula de 259 7 nm
(polidispersão de 0,1005) (Figura 8). Os tamanhos de partícula constantes durante
as reações de hidrólise demonstraram que as NC não foram dissolvidas e nem o
polímero sofreu inchamento com a água durante o contato com a solução aquosa de
NaOH. Além disso, a determinação da polidispersão, que é um indicativo da
heterogeneidade de tamanho da população de partículas que compõe os sistema,
demonstrou que a formulação manteve constante sua polidispersão.
Figura 7. Diâmetro efetivo e polidispersão das NC contendo IndOH durante a
hidrólise alcalina.
0
50
100
150
200
250
300
0 500 1000 1500
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 500 1000 1500
tempo (min)
polidispersão
49
Figura 8. Diâmetro efetivo e polidispersão das NC contendo IndOEt durante a
hidrólise alcalina.
De acordo com esses resultados, a hipótese de erosão foi refutada, sugerindo
que a reação é determinada pela difusão. A adsorção foi admitida como modelo de
associação da IndOH em NC. Sendo assim, a IndOH está adsorvida no polímero e a
adição de NaOH promoveu sua rápida liberação pela formação do sal
correspondente. O produto dissolvido é rapidamente hidrolisado pelo excesso de
NaOH. Por outro lado, o IndOEt estaria distribuído no óleo e na parede das NC.
5. 3. 6 Suspensões de Nanoesferas e Nanoemulsão
Com fins comparativos, foi realizada a caracterização de NS e NE para
determinação da forma de associação da IndOH e do IndOEt nestas formulações.
As formulações apresentaram-se monodispersas, com diâmetros de partícula entre
174 e 288 nm. Os valores de pH situaram-se entre 4,90 e 5,22. O doseamento das
suspensões recém preparadas mostrou teor de IndOH ou de IndOEt próximo de 1,0
mg/mL para todas as formulações (Tabela 7).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1, 0
0 500 1000 1500
tempo (min)
0
50
10 0
15 0
200
250
300
0 500 1000 1500
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm)
50
Tabela 7. Características físico-químicas das formulações de NS e NE.
Formulação Diâmetro (nm)
a
±
DP
pH ± DP Teor ± DP
(mg/mL)
NS-IndOH 174 ± 3 4,90 ± 0,01 0,98 ± 0,01
NS-IndOEt 208 ± 9 5,22 ± 0,07 0,99 ± 0,01
NE-IndOH 236 ± 17 4,94 ± 0,03 0,99 ± 0,01
NE-IndOEt 250 ± 9 5,18 ± 0,07 0,99 ± 0,01
a
Polidispersões < 0,2.
A hidrólise alcalina da IndOH associada a NS e NE também demonstrou o
consumo total do fármaco em 2 minutos de reação (Figura 9), demonstrando um
perfil cinético similar dos dois sistemas ao da NC.
Figura 9. Perfis cinéticos da hidrólise da IndOH em nanoesferas e nanoemulsão.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 0,5 1 1,5 2
tempo (min)
Concentração (mg/mL
)
NE-IndOH
NS-IndOH
51
Quanto aos resultados da hidrólise do IndOEt em NS e NE
4
, estes também
mostraram uma velocidade de hidrólise muito mais lenta, quando comparada com a
hidrólise da IndOH associada a esses sistemas. Para as NS, o consumo total do
IndOEt foi em 450 minutos, enquanto que para a NE o consumo total foi em 750
minutos (Figura 10).
Figura 10. Perfil cinético da hidrólise do IndOEt em NS e NE.
O mesmo experimento de medida de diâmetro de partícula durante a reação
de hidrólise alcalina feito para NC foi realizado para NS e NE, demonstrando
também a manutenção do diâmetro de partícula desses sistemas durante a hidrólise.
Para NE contendo IndOH o diâmetro de partícula foi de 229 9 nm (polidispersão de
0,1064) (Figura 11), e para NS contendo IndOH o diâmetro de partícula foi de 167
8 nm (polidispersão de 0,1068) (Figura 12).
4
Dados experimentais obtidos por Leonardo U. Soares em seu trabalho de mestrado no PPG-
Química (UFRGS).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 200 400 600 800
tempo (min)
Concentração (mg/mL
)
NE-IndOEt
NS-IndOEt
52
Figura 11. Diâmetro efetivo e polidispersão da nanoemulsão contendo IndOH
durante a hidrólise alcalina.
Figura 12. Diâmetro efetivo e polidispersão das nanoesferas contendo IndOH
durante a hidrólise alcalina.
O experimento para determinação do diâmetro de NE e NS contendo IndOEt
durante a hidrólise também demonstrou a manutenção do diâmetro efetivo das
nanoestruturas e os gráficos de polidispersão indicaram que os sistemas são
0
50
100
150
200
250
300
0102030
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 102030
tempo (min)
polidispersão
0
50
100
150
200
250
300
0102030
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0102030
tempo (min)
polidispersão
53
monomodais de distribuição estreita, e se mantêm assim durante todo o tempo de
reação
5
.
De acordo com os dados experimentais, pode-se concluir que, independente
da natureza do sistema nanoestruturado, a IndOH está preferencialmente localizada
na interface partícula (gotícula)/água, enquanto que o IndOEt estaria disperso ou
dissolvido no interior das partículas.
5. 4 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO POLÍMERO NA DIFUSÃO DO
IndOEt
Para avaliar a influência da concentração de PCL na difusão do IndOEt foram
preparadas NC com concentrações variáveis de 8 a 2 mg/mL de polímero. Todas as
formulações apresentaram aspecto homogêneo, com tamanhos de partícula
inferiores a 300 nm, teor de IndOEt próximo a 1,0 mg/mL e valores de pH entre 5,44
e 5,04 (Tabela 8).
Tabela 8. Características físico-químicas das formulações de nanocápsulas com
diferentes concentrações de polímero.
Formulação
Diâmetro (nm)
a
± DP pH ± DP [IndOEt] (mg/mL) ± DP
NC80 286 ± 21 5,44 ± 0,19 0,99 ± 0,02
NC60 244 ± 3 5,34 ± 0,21 1,01 ± 0,01
NC40 239 ± 24 5,22 ± 0,01 0,99 ± 0,01
NC20 245 ± 5 5,04 ± 0,10 0,99 ± 0,02
a
Polidispersão < 0,2.
A hidrólise alcalina do IndOEt associado a NC80, NC60, NC40 e NC20 foi
acompanhada entre 5 e 1440 minutos. Através da análise dos perfis cinéticos
dessas formulações e comparando estes perfis com a hidrólise do IndOEt em NC
com 10,0 mg/mL de PCL (NC100) e com NE (formulação sem polímero) pode-se
5
Dados experimentais obtidos por Leonardo U. Soares em seu trabalho de mestrado realizado no
PPG-Química (UFRGS).
54
observar diferenças nos sistemas estudados, uma vez que o consumo total do éster
ocorreu em diferentes tempos (Tabela 9).
Tabela 9. Tempo de consumo total do IndOEt.
NC100 NC80 NC60 NC40 NC20 NE
Tempo de consumo
(min)
1440 1440 1290 1290 1110 750
Os resultados demonstraram que concentração de polímero influencia no
tempo de hidrólise do IndOEt, sendo este menor nas formulações com menor
concentração de PCL.
5. 5 MODELAGEM MATEMÁTICA DOS PERFIS CINÉTICOS
5. 5. 1 Estudo Comparativo de Nanocápsulas, Nanoesferas e Nanoemulsão
A partir dos resultados obtidos das reações de hidrólise da IndOH e do IndOEt
em solução de acetonitrila e associados às suspensões nanoestruturadas, foi
realizado um estudo comparativo entre NC, NS e NE baseado na modelagem
matemática dos perfis de hidrólise alcalina. A descrição matemática das curvas
cinéticas foi realizada pelo ajuste dos pontos experimentais aos modelos
monoexponencial (Equação 8) e biexponencial (Equação 9).
No experimento com a IndOH em solução de acetonitrila a modelagem foi
realizada para os pontos experimentais até 45 segundos. Para as formulações de
NC, NS e NE realizou-se a modelagem de todos os pontos obtidos até 60 segundos.
Os pontos obtidos além dos tempos mencionados acima apresentaram consumo
total da IndOH ou concentrações inferiores ao limite de quantificação do método
analítico. O melhor ajuste gráfico foi para a equação monoexponencial, o que está
de acordo com a condição experimental de excesso de NaOH, podendo-se
considerar a reação em fase homogênea como uma reação de pseudo-primeira
ordem.
55
A modelagem matemática pelo programa Micromath Scientist
forneceu a
constante cinética observada do processo k e o coeficiente de correlação r (Tabela
10). A hidrólise alcalina da IndOH em solução forneceu a constante cinética
observada k = 2,7080 0,0125 min
-1
e r = 0,9975 0,0008. A hidrólise alcalina da
IndOH em NC forneceu a constante cinética observada k = 1,2880 0,0636 min
-1
e
coeficiente de correlação r = 0,9968 0,0009. Em NS, o valor de k foi de 1,5620
0,0874 min
-1
e o valor de r foi de 0,9965 0,0005. Para NE obteve-se constante
cinética observada k = 1,5380 0,0128 min
-1
e coeficiente de correlação r = 0,9941
0,0046. A hidrólise da IndOH em solução foi aproximadamente 2 vezes mais
rápida quando comparada com as suspensões coloidais. Isto está de acordo com os
perfis cinéticos demonstrados anteriormente (Figuras 5, 6 e 9), onde o consumo total
da IndOH em solução ocorre em 1 minuto, e em 2 minutos quando a IndOH está
associada às nanoestruturas. O ajuste dos pontos experimentais ao modelo
calculado é apresentado nas Figura 13 e 14. A reação interfacial da IndOH
associada às nanoestruturas é determinada pela dessorção do fármaco através de
sua ionização pela ação do hidróxido de sódio. Após a ionização, ocorre a formação
do sal sódico de IndOH, e este em solução sofre hidrólise da função amida
(Esquema 2 e Figura 15).
Tabela 10. Parâmetros da modelagem matemática da hidrólise da IndOH utilizando
a equação monoexponencial.
k (min
-1
) média DP r média DP
Solução 1
2,7120 0,9969
Solução 2
2,6940 2,7080 0,0125 0,9984 0,9975 0,0008
Solução 3
2,7180 0,9973
NC 1
1,3560 0,9958
NC 2
1,2300 1,2880 0,0636 0,9975 0,9968 0,0009
NC 3
1,2780 0,9971
NS 1
1,5900 0,9965
NS 2
1,4640 1,5620 0,0874 0,9970 0,9965 0,0005
NS 3
1,6320 0,9961
NE 1
1,6860 0,9905
NE 2
1,4700 1,5380 0,0128 0,9925 0,9941 0,0046
NE 3
1,4580 0,9993
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
56
Figura 13. Modelagem da equação monoexponencial para solução e NC contendo
IndOH (ordenadas em mg/mL).
Figura 14. Modelagem da equação monoexponencial para NS e NE contendo
IndOH (ordenadas em mg/mL).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 30 60 90 120 150 180
NE-IndOH - monoexponencial
tempo (s)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 30 60 90 120 150 180
NS-IndOH - monoexponencial
tempo (s)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 30 60 90 120 150 18
0
NC-IndOH - monoexponencial
tempo (s)
0 30 60 90 120 150 180
tempo (s)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Solução-IndOH - monoexponencial
57
Esquema 2. Hidrólise alcalina da IndOH.
Figura 15. Representação esquemática da hidrólise alcalina da IndOH. a) a IndOH
encontra-se adsorvida na superfície da partícula; b) a adição de NaOH promove uma
rápida liberação da IndOH pela formação do sal; c) o excesso de NaOH catalisa a
hidrólise do fármaco solúvel, fornecendo os produtos 3-acetato-5-metóxi-2-metilindol
de sódio (P1) e 4-clorobenzoato de sódio (P2).
N
C H
3
O
C H
3
COOH
C l
O
C
NaOH
(interface)
N
CH
3
O
CH
3
C O O
-
+
N
a
Cl
O
C
N
C H
3
O
C H
3
C O O
-
+
N
a
C l
O
C
NaOH
(aq)
N
CH
3
O
CH
3
COO
-+
N
a
H
C O
O
-
+
N
a
C l
+
P1
P2
R C O O
-
R C O O H
R C O O H
R C O O H
H
2
O
H
3
O
+
H
2
O
H
2
O
H
2
O
H
2
O
H
3
O
+
H
2
O
R COOH
RCOOH
R COOH
RCOO
-
RC O O
-
H
2
O
H
2
O
H
2
O
N
aOH
R C O O
-
RCOO
-
R C O O
-
H
2
O
H
2
O
R C O O
-
R CO O
-
R C O O
-
N
aOH
H
2
O
H
2
O
H
2
O
R C O O
-
H
2
O
H
2
O
H
2
O
H
2
O
P1
P2
P1
P1
P1
P2
P2
P2
a b
c
IndOH = R-COOH
58
Com base nos resultados obtidos nas reações de hidrólise do IndOEt em
solução de acetonitrila e associado às suspensões nanoestruturadas, é proposto um
estudo comparativo entre os sistemas coloidais baseado na modelagem matemática
dos perfis de hidrólise alcalina. A descrição matemática das curvas cinéticas foi
realizada pelo ajuste dos dados experimentais aos modelos monoexponencial e
biexponencial.
Para o experimento de hidrólise do IndOEt em solução, a modelagem foi
realizada até 1 minuto de reação, enquanto que para os experimentos com NC, NE
e NS modelou-se todos os pontos obtidos até os tempos de 1290, 750 e 450
minutos, respectivamente. Os pontos obtidos além dos tempos mencionados acima
apresentaram consumo total do IndOEt ou concentrações inferiores ao limite de
quantificação do método analítico.
O perfil de hidrólise do IndOEt em solução foi ajustado segundo o modelo
monoexponencial, que descreve cinética química de pseudo-primeira ordem,
estando de acordo com as condições experimentais, ou seja, a hidrólise realizada
com excesso de NaOH. A modelagem matemática forneceu a constante cinética
observada k = 1,6400 0,0061 min
-1
e o coeficiente de correlação r = 0,9983
0,0013 (Tabela 11). O ajuste dos pontos experimentais ao modelo calculado é
apresentado na Figura 16.
Tabela 11. Parâmetros da modelagem matemática para o IndOEt em solução
utilizando a equação monoexponencial.
Solução 1 Solução 2 Solução 3 média DP
k (min
-1
)
1,6860 1,5720 1,6620 1,6400 0,0061
r
0,9981 0,9996 0,9971 0,9983 0,0013
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
59
Figura 16. Modelagem da equação monoexponencial para o IndOEt em solução
(ordenada em mg/mL).
Os perfis cinéticos da hidrólise alcalina do IndOEt associado a NC, NS e NE
foram modelados segundo os modelos monoexponencial, que fornece uma
constante cinética para o processo, e biexponencial, constituído de dois termos
monoexponenciais, fornecendo duas constantes cinéticas. Para a escolha do
modelo matemático que melhor se ajusta aos pontos experimentais foram
observados os melhores ajustes gráficos, assim como os maiores coeficientes de
correlação e valores de critério de seleção do modelo (MSC) obtidos. As constantes
cinéticas e os parâmetros calculados para o experimento de hidrólise do IndOEt
associado a NC estão reunidos na Tabela 12.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Solução-IndOEt - monoexponencial
tempo (s)
0 30 60 90 120 150 180
60
Tabela 12. Parâmetros da modelagem matemática do perfil de hidrólise do IndOEt
associado a NC.
Monoexponencial
NC 1 NC 2 NC 3 média DP
k (min
-1
)
0,0024 0,0028 0,0030 0,0027 0,0003
r
0,9980 0,9981 0,9973 0,9978 0,0004
MSC
4,9529 4,4665 3,8982 4,4392 0,5279
Biexponencial NC 1 NC 2 NC 3 média DP
k
1
(min
-1
)
0,1072 0,1131 0,1325 0,1176 0,0132
k
2
(min
-1
)
0,0022 0,0025 0,0026 0,0024 0,0002
a (mg/mL)
0,0255 0,0480 0,0774 0,0503 0,0260
b (mg/mL)
0,9612 0,9333 0,9065 0,9337 0,0274
r
0,9982 0,9984 0,9976 0,9981 0,0004
MSC
5,2647 5,3594 4,8358 5,1533 0,2790
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
O modelo biexponencial apresentou coeficiente de correlação r = 0,9981
0,0004 e MSC = 5,1533 0,2790, sendo superiores aos valores obtidos para o
modelo monoexponencial. Pela comparação destes valores, além da análise gráfica
dos ajustes (Figura 17), o modelo escolhido para descrever matematicamente a
hidrólise do IndOEt em NC é o biexponencial. Esse modelo forneceu duas
constantes cinéticas observadas, k
1
= 0,1176 0,0132 min
-1
e k
2
= 0,0024 0,0002
min
-1
, e valores para os parâmetros a e b de 0,0503 0,0260 mg/mL e 0,9337
0,0274 mg/mL, respectivamente.
61
Figura 17. Modelagem das equações mono e biexponencial para NC contendo
IndOEt (ordenadas em mg/mL).
Para o experimento com NE, o modelo selecionado também foi o
biexponencial. De acordo com a Tabela 13 os valores de coeficiente de correlação e
MSC foram de 0,9989 0,0001 e 5,4201 0,2130, respectivamente. Os gráficos
obtidos estão representados na Figura 18. Os valores obtidos para as constantes
cinéticas observadas foram k
1
= 0,2528 0,0768 min
-1
e k
2
= 0,0047 0,0001 min
-1
,
e os valores obtidos para os parâmetros a e b foram 0,1630 0,0139 mg/mL e
0,8394 0,0007 mg/mL, respectivamente.
0 200 400 600 800 1200 1400
tempo (min)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
NC100 - Monoexponencial
1.0
1000
0 200 400 600 800 1200 1400
tempo (min)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
NC100 - Biexponencial
1.0
1000
62
Tabela 13. Parâmetros da modelagem matemática do perfil de hidrólise do IndOEt
associado a NE.
Monoexponencial
NE 1 NE 2 média DP
k (min
-1
)
0,0060 0,0060 0,0060 0,0000
r
0,9955 0,9935 0,9945 0,0014
MSC
3,1884 3,1238 3,1561 0,0457
Biexponencial NE 1 NE 2 média DP
k
1
(min
-1
)
0,1985 0,3071 0,2528 0,0768
k
2
(min
-1
)
0,0046 0,0047 0,0047 0,0001
a (mg/mL)
0,1531 0,1728 0,1630 0,0139
b (mg/mL)
0,8389 0,8399 0,8394 0,0007
r
0,9990 0,9988 0,9989 0,0001
MSC
5,5707 5,2695 5,4201 0,2130
DP = desvio padrão referente à duplicata de lote.
Figura 18. Modelagem das equações mono e biexponencial para NE (ordenadas
em mg/mL).
Os resultados da modelagem matemática para o experimento com NS
também indicaram um melhor ajuste dos dados experimentais ao modelo
biexponencial (Tabela 14). Os valores de coeficiente de correlação e MSC obtidos
para o modelo biexponencial foram de 0,9990 0,0001 e 5,9209 0,7435,
respectivamente. O ajuste gráfico dos pontos experimentais ao modelo calculado
está representado na Figura 19. Quanto aos valores obtidos para as constantes
NE - monoexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 140
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NE - biexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
63
cinéticas observadas k
1
e k
2
, estes foram de 0,1581 0,0552 min
-1
e 0,0079
0,0006 min
-1
, respectivamente. Para os parâmetros a e b, os valores obtidos foram
de 0,1259 0,0078 mg/mL e 0,8717 0,0267 mg/mL, respectivamente.
Tabela 14. Parâmetros da modelagem matemática do perfil de hidrólise do IndOEt
associado a NS.
Monoexponencial
NS 1 NS 2 média DP
k (min
-1
)
0,0090 0,0096 0,0093 0,0004
r
0,9967 0,9977 0,9972 0,0007
MSC
3,8012 4,4331 4,1172 0,4468
Biexponencial NS 1 NS 2 média DP
k
1
(min
-1
)
0,1191 0,1971 0,1581 0,0552
k
2
(min
-1
)
0,0074 0,0083 0,0079 0,0006
a (mg/mL)
0,1314 0,1204 0,1259 0,0078
b (mg/mL)
0,8528 0,8906 0,8717 0,0267
r
0,9989 0,9990 0,9990 0,0001
MSC
5,3951 6,4466 5,9209 0,7435
DP = desvio padrão referente à duplicata de lote.
Figura 19. Modelagem das equações mono e biexponencial para NS (ordenadas
em mg/mL).
NS - monoexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 140
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0.0
0.2
0.4
0.6
1.0
1.2
NS - biexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 140
0
0.8
64
Pela comparação dos modelos entre si, o perfil cinético da hidrólise alcalina
do IndOEt associado aos três sistemas coloidais é descrito pela equação
biexponencial. A fase rápida está relacionada ao consumo da porção adsorvida e a
fase lenta está relacionada ao consumo da porção dispersa no interior das
nanoestruturas, que difundem até a interface para sofrer a hidrólise.
Desta maneira, pode ser observado que a presença do polímero diminui a
velocidade da fase rápida, sendo o consumo da porção adsorvida do IndOEt na NE
(k
1
= 0,2528 0,0768 min
-1
) mais rápido quando comparado a NC (k
1
= 0,1176
0,0132 min
-1
) e a NS (k
1
= 0,1581 0,0552 min
-1
). Por outro lado, quando os dois
sistemas poliméricos são comparados, o que se observa é a reação mais rápida do
IndOEt adsorvido nas NS, provavelmente, devido à grande área superficial e
porosidade da matriz polimérica.
Quanto à constante k
2
, relacionada à difusão do IndOEt até a interface
partícula/água, pode-se observar que este processo é mais rápido em NS (k
2
=
0,0079 0,0006 min
-1
), devido a sua estrutura porosa, que propicia uma grande área
superficial ao sistema, em relação a NC (k
2
= 0,0024 0,0002 min
-1
) e NE (k
2
=
0,0047 0,0001 min
-1
).
A fase de liberação rápida (burst) apresentou tempos de meia-vida de 5,9, 4,4
e 2,7 minutos para NC, NS e NE e a fase de liberação sustentada apresentou
tempos de meia-vida de 288,8, 87,7 and 147,5 minutos, respectivamente. A
presença do polímero aumentou o tempo de meia-vida da fase rápida, enquanto que
a presença do óleo aumentou o tempo de meia-vida da fase sustentada. Pela
comparação dos resultados, as NC apresentaram os maiores tempos de meia-vida
para o IndOEt associado aos nanocarreadores.
No que se refere à interpretação dos parâmetros a e b, estes foram
considerados como sendo correspondentes às concentrações do IndOEt nas
pseudo-fases de cada sistema. Para NC, os parâmetros calculados a e b foram
0,0503 0,0260 mg/mL e 0,9337 0,0274 mg/mL, respectivamente. Isto sugere
uma concentração inicial de IndOEt na interface partícula/água de 0,05 mg/mL e no
interior da partícula de 0,93 mg/mL. No caso das NS, os parâmetros a e b
65
apresentaram valores de 0,1259 0,0078 mg/mL e 0,8717 0,0267 mg/mL,
respectivamente. Em relação à NE, os parâmetros calculados foram: a = 0,1630
0,0139 mg/mL e b = 0,8394 0,0007 mg/mL, sugerindo que o IndOEt está disperso
por toda a gotícula, com uma concentração inicial de éster na interface gotícula/água
de 0,16 mg/mL. Considerando-se os dados obtidos, assim como a concentração de
saturação do IndOEt no triglicerídeo (4,13 mg/mL) (SOARES, 2003), pode-se propor
que o IndOEt esteja retido nas nanoestruturas (Figura 20).
Figura 20. Formas de associação do IndOEt em NC, NS e NE.
Uma vez que a constante cinética observada (k
2
) para o consumo do IndOEt a
partir da NE é o dobro da constante k
2
observada para o consumo a partir de NC,
propõe-se que o polímero possa exercer uma barreira para a difusão do IndOEt até
a interface.
5. 5. 2 Estudo da Influência da Concentração do Polímero na Difusão do IndOEt
Associado a Nanocápsulas
Para estudar matematicamente os perfis cinéticos obtidos da hidrólise do
IndOEt associado NC80, NC60, NC40 e NC20 também foi realizada a modelagem
das curvas para os modelos monoexponencial e biexponencial, seguindo os
mesmos critérios de seleção da equação que melhor descreve os dados
experimentais.
Para o experimento com NC80 realizou-se a modelagem de todos os pontos
obtidos até o tempo de 1290 minutos, enquanto que para os experimentos com
NC60 e NC40 utilizou-se todos os pontos até 1110 minutos e para o experimento
66
com NC20 os pontos foram modelados até 930 minutos. Os pontos além dos tempos
mencionados acima apresentaram concentrações inferiores ao limite de
quantificação do método analítico. Em todos os casos, o modelo selecionado para
descrever o comportamento matemático das curvas foi o biexponencial.
Para as NC80 preparadas com 20 % a menos de polímero foram obtidas as
seguintes constantes cinéticas observadas: k
1
= 0,0325 0,0105 min
-1
e k
2
= 0,0025
0,0001 min
-1
. Os parâmetros a e b apresentaram valores de 0,1059 0,0357
mg/mL e 0,8834 0,0537 mg/mL (Tabela 15). O ajuste gráfico dos dados
experimentais ao modelo calculado está apresentado na Figura 21.
Tabela 15. Parâmetros dos modelos mono e biexponencial para a hidrólise alcalina
do IndOEt associado a NC80.
Monoexp. NC80-1 NC80-2 NC80-3 média DP
k (min
-1
)
0,0028 0,0034 0,0028 0,0030 0,0003
r
0,9982 0,9960 0,9975 0,9972 0,0011
MSC
5,0338 3,5383 4,5162 4,3628 0,7595
Biexp. NC80-1 NC80-2 NC80-3 média DP
k1 (min
-1
)
0,0431 0,0321 0,0222 0,0325 0,0105
k2 (min
-1
)
0,0025 0,0025 0,0024 0,0025 0,0001
a (mg/mL)
0,0802 0,1467 0,0909 0,1059 0,0357
b (mg/mL)
0,9293 0,8244 0,8964 0,8834 0,0537
r
0,9990 0,9989 0,9984 0,9988 0,0003
MSC
5,6877 5,6596 5,2870 5,5448 0,2237
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
67
Figura 21. Modelagens das equações mono e biexponencial para NC80 (ordenadas
em mg/mL).
Para a formulação NC60, os valores dos parâmetros calculados foram: a =
0,0470 0,0157 mg/mL e b = 0,9615 0,0057 mg/mL, e os valores das constantes
cinéticas observadas foram: k
1
= 0,1604 0,0392 min
-1
e k
2
= 0,0027 0,0003 min
-1
(Tabela 16). A Figura 22 ilustra o ajuste gráfico do modelo aos pontos experimentais.
Tabela 16. Parâmetros dos modelos mono e biexponencial para a hidrólise alcalina
do IndOEt associado a NC60.
Monoexp. NC60-1 NC60-2 NC60-3 média DP
k (min
-1
)
0,0033 0,0027 0,0027 0,0029 0,0003
r
0,9976 0,9983 0,9961 0,9973 0,0011
MSC
4,8669 5,1641 4,5317 4,8542 0,3164
Biexp. NC60-1 NC60-2 NC60-3 média DP
k1 (min
-1
)
0,1632 0,1198 0,1981 0,1604 0,0392
k2 (min
-1
)
0,0031 0,0025 0,0026 0,0027 0,0003
a (mg/mL)
0,0516 0,0296 0,0599 0,0470 0,0157
b (mg/mL)
0,9552 0,9663 0,9631 0,9615 0,0057
r
0,9979 0,9984 0,9965 0,9976 0,0010
MSC
4,9759 5,2334 4,4426 4,8840 0,4033
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
0 200 600 800 1000 1200 140
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
tempo (min)
NC80 - monoexponencial
400
0 200 400 600 800 1000 1200
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC80 - biexponencial
tempo (min)
140
0
68
Figura 22. Modelagens das equações mono e biexponencial para NC60 (ordenadas
em mg/mL).
De acordo com a Tabela 17, a NC40 preparada com 4 mg/mL de PCL
apresentou constantes cinéticas observadas k
1
= 0,1854 0,0288 min
-1
e k
2
=
0,0032 0,0005 min
-1
, e valores obtidos para os parâmetros a e b de 0,1359
0,0286 mg/mL e 0,8505 0,0283 mg/mL, respectivamente. Na Figura 23 estão
representados os gráficos obtidos na modelagem das equações.
Tabela 17. Parâmetros dos modelos mono e biexponencial para a hidrólise alcalina
do IndOEt associado a NC40.
Monoexp. NC40-1 NC40-2 NC40-3 média DP
k (min
-1
)
0,0041 0,0038 0,0045 0,0041 0,0004
r
0,9952 0,9910 0,9957 0,9940 0,0026
MSC
3,0388 2,8161 3,6167 3,1572 0,4132
Biexp. NC40-1 NC40-2 NC40-3 média DP
k1 (min
-1
)
0,1566 0,1854 0,2141 0,1854 0,0288
k2 (min
-1
)
0,0031 0,0028 0,0037 0,0032 0,0005
a (mg/mL)
0,1340 0,1654 0,1082 0,1359 0,0286
b (mg/mL)
0,8390 0,8297 0,8827 0,8505 0,0283
r
0,9988 0,9980 0,9973 0,9980 0,0008
MSC
5,5434 5,1555 4,7079 5,1356 0,4181
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 200 400 600 800 1200 1400
tempo (min)
1000
NC60 - monoexponencial
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC60 - biexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1200 14001000
69
Figura 23. Modelagens das equações mono e biexponencial para NC40 (ordenadas
em mg/mL).
Para a formulação NC20, obteve-se constantes cinéticas observadas: k
1
=
0,1966 0,0647 min
-1
e
k
2
= 0,0036 0,0001 min
-1
, enquanto que os parâmetros
calculados apresentaram foram os seguintes: a = 0,1100 0,0398 mg/mL e b =
0,8698 0,0189 mg/mL (Tabela 18). A Figura 24 apresenta o gráfico que ilustra o
ajuste dos pontos experimentais aos modelos testados.
Tabela 18. Parâmetros dos modelos mono e biexponencial para a hidrólise alcalina
do IndOEt associado a NC20.
Monoexp. NC20-1 NC20-2 NC20-3 média DP
k (min
-1
)
0,0047 0,0042 0,0043 0,0044 0,0003
r
0,9918 0,9954 0,9950 0,9941 0,0020
MSC
2,9649 3,3462 3,4770 3,2627 0,2661
Biexp. NC20-1 NC20-2 NC20-3 média DP
k1 (min
-1
)
0,2613 0,1966 0,1319 0,1966 0,0647
k2 (min
-1
)
0,0037 0,0035 0,0035 0,0036 0,0001
a (mg/mL)
0,1430 0,0658 0,1212 0,1100 0,0398
b (mg/mL)
0,8498 0,8874 0,8723 0,8698 0,0189
r
0,9963 0,9975 0,9972 0,9970 0,0006
MSC
4,3656 4,8969 4,6303 4,6309 0,2657
DP = desvio padrão referente à triplicata de lote.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC40 - monoexponencial
tempo (min)
0 200 600 800 1000 1200 140
0
400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
tempo (min)
0 200 600 800 1000 1200 140
0
NC40 - biexponencial
400
70
Figura 24. Modelagens das equações mono e biexponencial para NC20 (ordenadas
em mg/mL).
Os resultados mostraram um aumento no valor da constante k
1
com a
diminuição da concentração de polímero na formulação. Desta forma, o aumento da
velocidade de consumo do IndOEt adsorvido está relacionado com a espessura da
parede polimérica da NC: quanto menor a concentração de polímero na formulação,
menos espessa é a parede. Da mesma forma, pode-se observar um aumento no
valor de k
2
com a diminuição da concentração de polímero na formulação, o que
está relacionado com difusão mais rápida do éster a partir do núcleo oleoso para a
interface da partícula.
Quanto aos parâmetros a e b, pode-se dizer que 5 a 15 % do IndOEt está
adsorvido e/ou disperso na superfície polimérica e que a maior parte do éster (85 a
95 %) está retida no núcleo oleoso das NC.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC20 - monoexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1200 140
0
1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC20 - biexponencial
tempo (min)
0 200 400 600 800 1200 14001000
71
5. 5. 3 Modelagem Matemática dos Perfis Cinéticos Segundo o Modelo da Lei
da Potência
A Lei da Potência é um modelo semi-empírico desenvolvido com base nas
leis de Fick para estudar a liberação de fármacos a partir de sistemas poliméricos.
Os perfis cinéticos da hidrólise alcalina do IndOEt associado aos sistemas
nanoestruturados foram avaliados segundo a equação desse modelo (Equação 5)
através da modelagem matemática dos dados experimentais.
A modelagem permitiu a obtenção das curvas f
t
em função do tempo e os
parâmetros a e n, que correspondem à constante que incorpora as modificações
estruturais e as características geométricas do sistema e o expoente de liberação
difusional, relacionado ao mecanismo de liberação do fármaco, respectivamente.
Para a formulação de NC preparada com 10 mg/mL de PCL (NC100), os
pontos experimentais foram modelados até 1290 minutos e obteve-se o coeficiente
de correlação r = 0,9882 0,0007 e valores de a e n de 0,0306 0,0084 e 0,4959
0,0380, respectivamente (Tabela 19). O gráfico obtido para o perfil médio está
apresentado na Figura 25.
Tabela 19. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NC100.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 Lote 3 MD
DP
a
0,0225 0,0300 0,0392 0,0306 0,0084
n
0,5333 0,4972 0,4573 0,4959 0,0380
r
0,9890 0,9879 0,9876 0,9882 0,0007
MSC
3,5452 3,4278 3,4185 3,4638 0,0706
72
Figura 25. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a
NC100 ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
Para NC80, a curva calculada até o ponto de 1290 minutos teve um bom
ajuste aos pontos experimentais, sendo o coeficiente de correlação r = 0,9896
0,0012. Os valores de a e n calculados foram de 0,0398 0,0070 e 0,4581 0,0229,
respectivamente. Os valores individuais para a modelagem em triplicata e o gráfico
obtido para o perfil médio são apresentados na Tabela 20 e na Figura 26.
Tabela 20. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NC80.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 Lote 3 MD DP
a
0,0367 0,0478 0,0349 0,0398 0,0070
n
0,4681 0,4319 0,4744 0,4581 0,0229
r
0,9883 0,9898 0,9906 0,9896 0,0012
MSC
3,4653 3,5790 3,6866 3,5770 0,1107
NC100
0 400 600 800 1000 1200 140
0
tempo (min)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
200
73
Figura 26. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a NC80
ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
Nas formulações de NC preparadas com 6 mg/mL de PCL os dados
experimentais foram ajustados ao modelo até o tempo de 1110 minutos. O
coeficiente de correlação fornecido pela modelagem foi r = 0,9876 0,0019 e os
parâmetros obtidos para esta formulação foram a = 0,0305 0,0064 e n = 0,5034
0,0283. Os dados individuais são apresentados na Tabela 21 e o gráfico obtido pode
ser visualizado na Figura 27.
Tabela 21. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NC60.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 Lote 3 MD DP
a
0,0365 0,0238 0,0312 0,0305 0,0064
n
0,4799 0,5348 0,4955 0,5034 0,0283
r
0,9854 0,9891 0,9883 0,9876 0,0019
MSC
3,2396 3,5214 3,4721 3,4110 0,1505
0 200 400 600 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC80
tempo (min)
800
74
Figura 27. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a NC60
ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
Para a formulação NC40, os dados experimentais também foram ajustados
até o tempo de 1110 minutos e os parâmetros foram a = 0,0648 0,0042 e n =
0,3975 0,0066, com coeficiente de correlação r = 0,9886 0,0047 (Tabela 22). O
gráfico desta modelagem pode ser visualizado na Figura 28.
Tabela 22. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NC40.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 Lote 3 MD DP
a
0,0619 0,0629 0,0696 0,0648 0,0042
n
0,4032 0,3991 0,3903 0,3975 0,0066
r
0,9902 0,9924 0,9833 0,9886 0,0047
MSC
3,6586 3,9417 3,1246 3,5750 0,4149
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC60
tempo (min)
0 200 400 600 800 1000 14001200
75
Figura 28. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a NC40
ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
Os dados experimentais foram modelados até o ponto de 930 minutos para a
formulação NC20. O coeficiente de correlação obtido apresentou valor 0,9880
0,0018, enquanto que os parâmetros a e n apresentaram valores de 0,0580 0,0118
e 0,4250 0,0309, respectivamente. Os valores individuais e o gráfico obtido são
apresentados na Tabela 23 e na Figura 29.
Tabela 23. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NC20.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 Lote 3 MD DP
a
0,0699 0,0463 0,0578 0,0580 0,0118
n
0,3955 0,4572 0,4222 0,4250 0,0309
r
0,9874 0,9865 0,9900 0,9880 0,0018
MSC
3,4134 3,3459 3,6201 3,4598 0,1429
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
NC40
tempo (min)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
1.0
76
Figura 29. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a NC20
ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
A modelagem dos dados experimentais da NE foi realizada até o tempo de
750 minutos e obteve-se coeficiente de correlação r = 0,9936 0,0003 e valores de
a = 0,0580 0,0118 e n = 0,4250 0,0309 (Tabela 24). O gráfico obtido é
apresentado na Figura 30.
Tabela 24. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NE.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 MD DP
a
0,0717 0,0812 0,0765 0,0067
n
0,4117 0,3915 0,4016 0,0143
r
0,9938 0,9934 0,9936 0,0003
MSC
3,9815 3,9877 3,9846 0,0044
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NC20
tempo (min)
0 200 600 800 1000 1200 140
0
400
77
Figura 30. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a NE
ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
Finalmente, para NS, o ajuste ao modelo da Lei da Potência foi realizado até
450 minutos e apresentou coeficiente de correlação r = 0,9881 0,0019 e
parâmetros a = 0,0943 0,0074 e n = 0,3949 0,0117 (Tabela 25). O gráfico desta
modelagem é apresentado na Figura 31.
Tabela 25. Parâmetros da modelagem matemática utilizando a Lei da Potência para
a hidrólise alcalina do IndOEt em NS.
Parâmetro
Lote 1 Lote 2 MD DP
a
0,0890 0,0995 0,0943 0,0074
n
0,4031 0,3866 0,3949 0,0117
r
0,9894 0,9867 0,9881 0,0019
MSC
3,4675 3,2431 3,3553 0,1587
0 200 400 600 800 1400
tempo (min)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NE
12001000
78
Figura 31. Ajuste dos dados experimentais da hidrólise do IndOEt associado a NS
ao modelo da Lei da Potência (ordenadas em f
t
).
Para todos os sistemas estudados observou-se um ajuste satisfatório dos
dados experimentais ao modelo da Lei da Potência, através de coeficientes de
correlação próximos de 0,99. Os expoentes de liberação obtidos para NC40, NC20,
NE e NS apresentaram valores próximos de 0,43 (Tabela 26), o que indica a difusão
fickiana da sonda molecular a partir de uma matriz de geometria esférica. As
formulações NC100, NC80 e NC60 apresentaram valores de expoentes de liberação
acima de 0,43, o que indicaria um fenômeno de transporte anômalo para sistemas
de geometria esférica, que está relacionado com a sobreposição dos mecanismos
de liberação controlados por difusão e pelo inchamento do sistema. No entanto, tal
afirmação é refutada pelos resultados obtidos nos experimentos onde foram
determinados os diâmetros de partícula durante a reação de hidrólise alcalina. Os
resultados obtidos nesse experimento demonstraram a manutenção do diâmetro
efetivo das nanoestruturas durante o consumo do IndOEt e os dados de
polidispersão indicaram que todos os sistemas mantêm constantes as polidispersões
durante todo o tempo de reação (Figuras 32, 33, 34 e 35).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
NS
tempo (min)
0 200 400 600 800 1200 14001000
79
Tabela 26. Expoente de liberação (n) para os sistemas nanoestruturados estudados.
NC100 NC80 NC60 NC40 NC20 NE NS
n
0,4959 0,4581 0,5034 0,3975 0,4250 0,4016 0,3949
Figura 32. Diâmetro efetivo e polidispersão das NC80 contendo IndOEt durante a
hidrólise alcalina.
Figura 33. Diâmetro efetivo e polidispersão das NC60 contendo IndOEt durante a
hidrólise alcalina.
0
50
100
150
200
250
300
0 500 1000 1500
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 500 1000 1500
tempo (min)
polidispersão
0
50
100
150
200
250
300
0 500 1000 1500
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 500 1000 1500
tempo (min)
polidispersão
80
Figura 34. Diâmetro efetivo e polidispersão das NC40 contendo IndOEt durante a
hidrólise alcalina.
Figura 35. Diâmetro efetivo e polidispersão das NC20 contendo IndOEt durante a
hidrólise alcalina.
Desta forma, esse experimento descarta a hipótese de inchamento ou ainda
erosão dos sistemas nanoestruturados, reforçando a idéia de que a difusão da
sonda controla a velocidade da reação. A variação dos valores de n para as
formulações NC60, NC80 e NC100 frente aos preconizados pelo modelo de
Korsmeyer-Peppas pode ser devido à influência da parede polimérica, podendo-se
admitir a difusão da sonda através de um filme. A variação de 0 a 10 mg/mL na
concentração de PCL nas formulações levou à formação de NC com espessuras de
parede intermediárias entre as formulações de NE e NC100. Em todas as
formulações, o IndOEt encontra-se retido nas nanoestruturas (Figura 36).
0
50
100
150
200
250
300
0 500 1000 1500
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 500 1000 1500
tempo (min)
polidispersão
0
50
100
150
200
250
300
0 500 1000 1500
tempo (min)
diâmetro efetivo (nm)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 500 1000 1500
tempo (min)
polidispersão
81
NE NC20 NC40 NC60 NC80 NC100
Figura 36. Representação esquemática da dispersão do IndOEt nas nanoestruturas.
5. 6 EDEMA DE PATA DE RATO INDUZIDO POR CARRAGENINA
Considerando que os ésteres alifáticos de IndOH apresentaram atividade
antiinflamatória seletiva para a cox-2 in vitro (KALGUTKAR et al., 2000) e, ainda,
que o IndOEt apresenta solubilidade em meio aquoso e fluidos biológicos menor que
1,0 g/mL (SOARES, 2003), propõe-se a avaliação da atividade antiedematogênica
in vivo desse éster associado a NC, NS e NE.
Com base nas doses de IndOH utilizadas em outros estudos de avaliação da
atividade antiedematogênica, a dose de IndOEt testada foi de 10,0 mg/Kg de peso
corporal (AMMOURY et al., 1993).
Os efeitos da administração oral do IndOEt associado aos nanocarreadores
na inibição da formação do edema em pata de rato induzido pela carragenina,
podem ser observados na Tabela 27 e os aumentos dos volumes dos edemas das
patas de ratos podem ser observados, graficamente, nas Figuras 37, 38 e 39.
82
Tabela 27. Atividade antiedematogênica do IndOEt associado aos nanocarreadores.
Aumento do volume das patas e.p.m.
(% inibição)
Grupo 1
a
hora 2
a
hora 3
a
hora 4
a
hora
Controle A
1,25 0,25 2,34 0,21 1,39 0,31 0,66 0,30
Controle B – NC
0,92 0,34
(26,57)
2,39 0,44
(-2,09)
1,29 0,35
(6,93)
0,61 0,18
(8,33)
Controle B – NE
0,69 0,08
(45,12)
1,80 0,33
(23,02)
0,99 0,14
(28,95)
0,70 0,07
(-6,31)
Controle B – NS
0,90 0,28
(27,94)
2,05 0,09
(12,25)
0,80 0,16
(42,27)
0,42 0,08
(37,12)
NC-IndOEt
0,73 0,09
(41,86)
0,89 0,29
*
(62,12)
0,40 0,25
*
(71,11)
0,42 0,28
(36,74)
NE-IndOEt
0,47 0,11
*
(62,44)
1,75 0,19
(25,15)
0,82 0,14
(41,31)
0,52 0,08
(21,78)
NS-IndOEt
0,01 0,14*
(99,20)
0,94 0,29*
(59,89)
0,02 0,14*
(98,42)
-0,12 0,07*
(117,88)
Indometacina
0,08 0,16
*
(93,43)
0,20 0,14
*
(91,63)
-0,16 0,13
*
(111,52)
-0,21 0,12
*
(131,99)
Os valores representam a média de 6 a 10 animais.
*
p < 0,05
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0246
tempo (h)
aumento do volume (mL)
Controle A
Controle B
NC-IndOEt
Indometac i
na
Figura 37. Aumento do volume (mL) das patas dos ratos tratados com NC-IndOEt e
respectivos controles.
83
Figura 38. Aumento do volume (mL) das patas dos ratos tratados com NS-IndOEt e
respectivos controles.
Figura 39. Aumento do volume (mL) das patas dos ratos tratados com NE-IndOEt e
respectivos controles.
De acordo com os resultados apresentados pode-se observar que a
formulação NE-IndOEt não inibiu significativamente o edema induzido pela
carragenina. No entanto, as formulações NC-IndOEt e NS-IndOEt apresentaram
inibição significativa do edema, sendo que a primeira formulação apresentou inibição
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
01234
tempo (h)
aumento do volume (mL
)
Controle A
Controle B
NE-IndOEt
Indometacina
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
01234
tempo (h)
aumento do volume (mL
)
Controle A
Controle B
NS-IndOEt
Indometacina
84
significativa a partir da segunda hora, atingindo 62,12 % de inibição, e a segunda,
inibiu significativamente o edema a partir da primeira hora, atingindo 99,20 % de
inibição.
Esses resultados demonstram a importância da presença do polímero nas
formulações de NC e NS, visto que não foi observado efeito antiedematogênico após
administração oral do IndOEt associado à NE. A ausência de efeito farmacológico da
formulação NE-IndOEt foi atribuída a uma desestruturação do nanocarreador no
trato gastrointestinal, provavelmente pela presença do sais biliares. No caso das NC
e NS, o polímero promove a estabilização das formulações no trato gastrointestinal,
prevenindo a desestruturação do carreador.
Os resultados positivos neste ensaio para as formulações de NC e NS
demonstram as potencialidades destes nanocarreadores em promover a
administração oral do IndOEt. Considerando que o éster é insolúvel em água ou em
fluidos biológicos e que a sua nanodispersão é instável, as nanopartículas
propiciaram a absorção do éster, uma vez que foi observado efeito farmacológico.
De acordo com a literatura, duas hipóteses são levantadas para esclarecer de que
modo as NC e NS promoveram a absorção do IndOEt. A primeira explicação
consiste em considerar que a PCL possui propriedades bioadesivas, resultando em
um aumento do contato da partícula com as paredes do intestino e,
conseqüentemente, facilitando a transferência do IndOEt pelas células absortivas. A
segunda hipótese assume que ocorre a translocação das nanopartículas pela
barreira gastrointestinal através das placas de Peyer e estas acessam o sistema
linfático mesentérico e a circulação sanguínea (APRAHAMIAN et al., 1987;
AMMOURY et al., 1993).
O edema de pata de rato induzido por carragenina avalia apenas um dos
parâmetros da inflamação, tornando-se necessária a realização de outros ensaios
farmacológicos para a avaliação da atividade antiinflamatória do IndOEt, como a
indução de pleurisia e determinação do número de células no exsudato pleural e a
lesão granulomatosa induzida por “pellet” de algodão. A partir dos resultados obtidos
com esse experimento, abre-se a perspectiva de novos trabalhos que tenham como
objetivos determinar qual forma do IndOEt está atuando, ou seja, se o éster possui
85
atividade antiinflamatória, ou se ele é hidrolisado e libera a indometacina, e
esclarecer de que modo as NC e NS promoveram a absorção do IndOEt.
86
6 CONCLUSÕES
As suspensões de nanocápsulas e nanoesferas de poli(-caprolactona) e a
nanoemulsão contendo indometacina ou éster etílico de indometacina preparadas
pelo método de nanoprecipitação da poli(-caprolactona) ou emulsificação
espontânea apresentaram diâmetro de partícula inferior a 300 nm, pH na faixa de
4,5 a 5,5 e teores totais de sonda próximos a 1mg/mL.
As suspensões de nanocápsulas preparadas com diferentes concentrações
de poli(-caprolactona), variando entre 8 mg/mL e 2 mg/mL, exibiram as mesmas
características apresentadas acima.
A estratégia de emprego de um solvente do fármaco e, simultaneamente,
não-solvente do polímero não foi adequada para diferenciar a quantidade de
indometacina ou seu éster etílico adsorvida no polímero da quantidade dissolvida no
óleo das nanocápsulas. O experimento baseado na diluição das suspensões com
etanol [1:100(v/v)], seguido de centrifugação, promoveu a total liberação da
indometacina ou de seu éster a partir das nanocápsulas.
A hidrólise alcalina da indometacina e do éster etílico em solução de
acetonitrila ocorreu em 1 e 2 minutos, respectivamente. Por outro lado, quando as
sondas foram associadas às nanocápsulas, o consumo total ocorreu em 2 minutos e
24 horas, respectivamente.
A hidrólise alcalina da indometacina associada a nanoesferas e nanoemulsão
também demonstrou o consumo total do fármaco em 2 minutos de reação,
87
demonstrando um perfil cinético similar dos dois sistemas ao da nanocápsula. Por
outro lado, quando o éster etílico de indometacina foi associado a esses sistemas, o
consumo total ocorreu em 8 e 12 horas, respectivamente.
A determinação do diâmetro das nanoestruturas durante a hidrólise alcalina
demonstrou que as partículas não foram dissolvidas e nem o polímero sofreu
inchamento com a água durante o contato com a solução aquosa de NaOH. De
acordo com esses resultados, a hipótese de erosão foi refutada, sugerindo que a
reação é determinada pela difusão.
A hidrólise alcalina das sondas permitiu concluir que, independente da
natureza do sistema nanoestruturado, a indometacina está preferencialmente
localizada na interface partícula (gotícula)/água, enquanto que o éster etílico de
indometacina estaria retido no interior das partículas.
A modelagem matemática da indometacina em solução e associada aos
nanocarreadores mostrou um ajuste dos perfis cinéticos ao modelo
monoexponencial. A hidrólise alcalina da indometacina em solução forneceu a
constante cinética observada k = 2,7080 0,0125 min
-1
. A hidrólise alcalina da
indometacina associada à nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão forneceu as
constantes cinéticas observadas k = 1,2880 0,0636 min
-1
, k = 1,5620 0,0874
min
-1
e k = 1,5380 0,0128 min
-1
, respectivamente.
A modelagem matemática dos perfis de consumo do éster etílico de
indometacina permitiu concluir que a hidrólise do éster em solução é descrita pelo
modelo monoexponencial, com constante cinética observada k = 1,6400 0,0061
min
-1
. Para as nanoestruturas o modelo selecionado foi o biexponencial que
descreve o processo difusivo controlado por duas constantes, sendo para os três
sistemas, k
1
maior que k
2
.
Os perfis cinéticos de hidrólise do éster etílico de indometacina associado a
nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão apresentaram uma fase de liberação
rápida, com tempo de meia-vida de 5,9, 4,4 e 2,7 minutos, e uma fase de liberação
sustentada com tempos de meia-vida de 288,8, 87,7 e 147,5 minutos,
respectivamente.
88
O estudo da influência da concentração de poli(-caprolactona) na difusão do
éster etílico de indometacina associado a nanocápsulas demonstrou que quanto
menor a concentração de polímero empregada, mais rápido é o consumo do éster.
O consumo total da sonda ocorreu em 24 horas, para a nanocápsula preparada com
8,0 mg/mL de polímero, em 21,5 horas, para as nanocápsulas preparadas com 6,0 e
4,0 mg/mL de polímero e 18,5 horas, para nanocápsula preparada com 2,0 mg/mL
de polímero.
A modelagem matemática mostrou um ajuste dos dados ao modelo
biexponencial. As constantes cinéticas observadas k
1
e k
2
foram relacionadas aos
processos de dessorção e difusão do éster a partir das nanoestruturas. Pode ser
observado que as constantes cinéticas diminuem com o aumento da concentração
de polímero (k
1
diminui de 0,2528 0,0768 para 0,1176 0,0132 min
-1
e k
2
diminui
de 0,0047 0,0001 para 0,0024 0,0002 min
-1
). As concentrações de éster para os
processos de dessorção (a) e difusão (b) foram calculadas baseadas no modelo
biexponencial. Os valores de a variaram entre 0,05 e 0,16 mg/mL e os valores de b
variaram entre 0,84 e 0,96 mg/mL.
Para todos os sistemas estudados observou-se um ajuste satisfatório dos
dados experimentais ao modelo da Lei da Potência, através de coeficientes de
correlação próximos de 0,99. Os expoentes de liberação obtidos para os sistemas
estudados apresentaram valores entre 0,39 e 0,50, descrevendo o processo de
difusão fickiana da sonda a partir de um sistema de geometria esférica.
Os efeitos da administração oral do IndOEt associado aos nanocarreadores
demonstraram atividade antiedematogênica frente ao ensaio de edema de pata de
rato induzido por carragenina na dose de 10 mg/Kg somente para as formulações de
nanocápsulas e nanoesferas, as quais inibiram significativamente o edema.
89
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ANEXOS
Espectro de RMN de
1
H da poli(-caprolactona) em CD
3
COCD
3
.
Cromatograma da Indometacina em solução de acetonitrila*.
Cromatograma do éster etílico de indometacina em solução de acetonitrila*.
*Fase móvel: acetonitrila/água (70:30 v/v), pH aparente: 5,0; Fluxo: 0,7 mL/min;
Volume de injeção: 20 L; Detecção: 267 nm.
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