( PDF ) Estudo fitoquímico de citrus: resistência a xylella fastidiosa e interação com oncometopia facialis

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ESTUDO FITOQUÍMICO DE CITRUS:

RESISTÊNCIA A XYLELLA FASTIDIOSA E

INTERAÇÃO COM ONCOMETOPIA FACIALIS

PATRÍCIA VERARDI ABDELNUR

Orientadora :

Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva.

*Bolsista FAPESP

São Carlos – SP

2006

Dissertação apresentada ao programa de

pós- graduação em Química como parte

dos requisitos à obtenção do Título de

Mestre em Ciências, na área

Concentração Química Orgânica.

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária da UFSCar

A135ef

Abdelnur, Patrícia Verardi.

Estudo fitoquímico de Citrus: resistência a Xylella

fastidiosa e interação com Oncometopia facialis / Patrícia

Verardi Abdelnur. -- São Carlos : UFSCar, 2006.

275 p.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

Carlos, 2006.

1. Produtos naturais. 2. Ensaios biológicos. 3.

Fitoquímica. 4. Clorose Variegadas Citros. 5. Limão cravo. I.

Título.

CDD: 547.3 (20

)

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AOS MEUS PAIS POR TUDO! SEMPRE PARTICIPANDO DA MINHA VIDA:

INCENTIVANDO, TORCENDO, ACREDITANDO E NUNCA MEDINDO

ESFORÇOS PARA A REALIZAÇÃO DOS MEUS SONHOS.

A MINHAS IRMÃS QUE ESTIVERAM AO MEU LADO

EM TODOS OS MOMENTOS.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva, por todos

ensinamentos transmitidos, pela orientação, confiança, amizade e excelente

convivência;

Aos Profs. Drs. João B. Fernandes, Paulo C. Vieira, Edson R. Filho pela

contribuição dada a este trabalho;

Aos Profs. Drs. Giba, Arlene e Quézia, pela disponibilidade de seus laboratórios e

colaboração na realização deste trabalho;

À Dra. Alessandra Alves de Souza pela forte contribuição e ensinamentos

transmitidos nos ensaios biológicos, pela ótima convivência e amizade;

À Carolina Munari Rodigues por toda contribuição nos ensaios e pela amizade;

Aos Drs. Marcos A. Machado e Sérgio A. Carvalho pela prestatividade e

disponibilidade do laboratório e materiais necessários para a realização do

trabalho;

Ao Dr. Pedro T. Yamamoto e Juliana Coelho pela receptibilidade e disponibilidade

de materiais necessários para o desenvolvimento do trabalho;

À doutoranda Gláucia pela essencial ajuda nas análises quimiométricas, e por

toda sua prestatividade;

À todos os colegas do PN, especialmente aos amigos Alan, Cebolinha, Djalma, Gi,

Karine, Márcio, Moacir, Paty Marinho, Paty Braga, Paty Loira, Simone, Sebastião,

Thiago e Tati;

À todos os colegas e amigos dos laboratórios de LSPN, CLAE, LERCI, Massas.

À Sheylla Susan pela imensa amizade, carinho, prestatividade e colaboração na

realização deste trabalho;

A minhas amigas Kiria, Karina, Rafaela e Erida por tornar minha vida em São

Carlos extremamente agradável, estando presente em todos os momentos, felizes

ou tristes, e pela forte amizade;

Aos meus pais, Elisa e Reinaldo, que estiveram sempre do meu lado, pela

educação, carinho, apoio e luta para que meus objetivos fossem alcançados;

A minhas irmãs, Priscila e Elisinha, por estarem sempre presente em minha vida;

A toda minha Família que sempre esteve unida e torcendo por mim em todos os

momentos;

Ao Elder por estar ao meu lado sempre incentivando e apoiando em cada decisão

por todos estes anos;

À FAPESP pela concessão da bolsa;

À Deus por estar ao lado, sempre me protegendo;

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

ABREVIATURA E SÍMBOLOS

AcOEt Acetato de Etila

BOD Biological Oxigen Demand

CAR/PDMS Carboxen Polimetilsiloxano

CC Cromatografia em Camada

CCL Caule do C. limonia

CCDC Cromatrografia em Camada Delgada Comparativa

CDCl

Clorofórmio Deuterado

CG-MS Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas

CLAE-R Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa

CLS C. limonia sem sintomas de CVC

COSY Correlation Spectroscopy

O Acetona Deuterada

CRS C. reticulata sem sintomas de CVC

CSC C. sinensis sobre C. limonia com sintomas de CVC

CSS C. sinensis sobre C. limonia sem sintomas de CVC

CVC Clorose Variegada dos Citros

CW/DVB Carbowax Divinilbenzeno

d Dubleto

dd Duplo Dubleto

DCM Diclorometano

DI Diâmetro da Coluna

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

ES- Electrospray no Modo Negativo

FCL Folha do C. limonia

Fundecitrus Fundo de Defesa da Citricultura

GC-EAD Cromatografia Gasosa Acoplada à Detecção Eletroantenográfica

h Altura da Coluna

HMBC Heteronuclear Multiplete Bond Correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HS HeadSpace

Hz Hertz

IAC Instituto Agronômico de Campinas

IR Índice de Retenção de Kovats

J Constante de Acoplamento

m Multipleto

MeOH Metanol

MHz Mega-Hertz

MIC Minimum Inhibitory Concentration

m/z Massa sobre Carga

P Porcentagem Relativa

PDMS/DVB Polimetilsiloxano Divinilbenzeno

s Singleto

sl Singleto largo

SPME Solid Phase Micro-Extraction

t Tripleto

t Tempo

T Temperatura

R1C Raiz Terminal do C. limonia

R2C Raiz do C. limonia

R1E Raiz Terminal do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia

R2E Raiz do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

Xf Xylella fastidiosa

Deslocamento Químico em Partes por Milhão

iii

LISTA DE TABELAS

TABELA 3.1. Divisão das plantas C. limonia e C. sinensis sobre C. limonia, extratos

obtidos e suas respectivas massas...............................................................................

TABELA 3.2. Dados de RMN H

(CDCl

200 MHz) e C

(CDCl

200 MHz) da

cumarina C1 em comparação com os dados da literatura............................................

TABELA 3.3. Dados de RMN H

(CDCl

200 MHz) e C

(CDCl

200 MHz) da

cumarina C2 em comparação com os dados da literatura............................................

TABELA 3.4. Dados de RMN H

(CDCl

200 MHz) da cumarina C3 em comparação

com os dados da literatura............................................................................................

TABELA 3.5. Dados de RMN H

das cumarinas C4 e C5 em comparação com os

dados das cumarinas A, C e D......................................................................................

TABELA 3.6. Dados de RMN

C da estrutura proposta C e das cumarinas isoladas

C4 e C5.........................................................................................................................

TABELA 3.7. Dados do espectro de RMN

H para as estruturas D, G e H obtidos da

literatura........................................................................................................................

TABELA 3.8. Dados do espectro de RMN

para as estruturas D, G e H obtidos da

literatura........................................................................................................................

TABELA 3.9. Dados de RMN H

(400 MHz) das cumarinas C4 e C5........................... 76

TABELA 3.10. Dados do espectro de RMN

H para o composto C5, e para as

estruturas I e J obtidos pela literatura...........................................................................

TABELA 3.11. Dados do espectro de RMN

C para o composto C5, e para as

estruturas I e J obtidos pela literatura...........................................................................

TABELA 3.12. Dados de RMN H

e RMN C

(CDCl

400 MHz) da cumarina C6........ 91

TABELA 3.13. Dados de RMN H

(400 MHz) e RMN C

(400 MHz) da cumarina C8

em comparação com os dados da literatura.................................................................

104

TABELA 3.14. Dados de RMN H

(200 MHz) da cumarina C9 em comparação com

os dados da literatura....................................................................................................

111

TABELA 3.15. Valores de RMN

C (400 MHz) obtidos pelas correlações

apresentadas no espectro de HMBC e no HSQC.........................................................

114

TABELA 3.16. Dados de RMN H

e RMN C

(CDCl

400 MHz) da cumarina C10...... 120

TABELA 3.17. Dados de RMN H

(CDCl

400 MHz) da cumarina C3.......................... 123

TABELA 3.18. Dados de RMN H

O, 400 MHz) da cumarina C11 em

comparação com os dados da literatura.......................................................................

129

TABELA 3.19. Dados de RMN

C (C

O, 400 MHz) da cumarina C11 em

comparação com os dados da literatura.......................................................................

130

TABELA 3.20. Dados de RMN

H (200 MHz) obtidos experimentalmente e pela

literatura do flavonóide (F1)..........................................................................................

135

TABELA 3.21. Correlações obtidas do HSQC para o flavonóide F1............................ 136

TABELA 3.22. Correlações obtidas do HMQC para o flavonóide F1............................ 137

TABELA 3.23. Dados obtidos para os carbonos da molécula a partir das correlações

obtidas por HMBC e HSQC e comparadas com a literatura.........................................

138

TABELA 3.24. Dados de RMN H

(400 MHz) do flavanóide F2 comparados com os

dados da literatura.........................................................................................................

142

TABELA 3.25. Correlações obtidas pelo espectro de NOESY do flavanóide F2.......... 143

TABELA 3.26. Dados obtidos de RMN

C (200 MHZ) da mistura de Sitosterol,

Estigmasterol e Campesterol em comparação com a literatura....................................

151

TABELA 4.1. Reagentes e suas concentrações necessárias para preparar um

determinado volume do meio PW.................................................................................

156

TABELA 4.2. Volumes retirados da solução estoque e a correspondente

concentração final.........................................................................................................

159

TABELA 4.3. Colônias observadas nas diferentes concentrações de substâncias

ensaiadas contra Xyllela fastidiosa na Fase Estacionária............................................

165

TABELA 4.4. Colônias observadas com a Xylella fastidiosa na Fase Exponencial e

no início da Fase Estacionária......................................................................................

168

TABELA 4.5. Colônias observadas nas diferentes concentrações de substâncias

ensaiadas contra Xyllela fastidiosa na Fase Exponencial.............................................

169

TABELA 4.6. MICs das substâncias ensaiadas frente a Xylella fastidiosa................... 172

TABELA 5.1. Condições de condicionamento para as fibras utilizadas........................ 178

TABELA 5.2. Número de carbonos de cada hidrocarboneto e seus respectivos

tempos de retenção obtidos a partir da injeção por seringa e por fibra (PDMS/DVB)..

184

TABELA 5.3. Compostos voláteis identificados no C. sinensis sobre C. limonia sem

ter sido submetido às cigarrinhas..................................................................................

188

TABELA 5.4. Compostos voláteis identificados na planta 0 h após a inserção das

cigarrinhas.....................................................................................................................

190

TABELA 5.5. Compostos voláteis identificados na planta 24 h após a inserção das

cigarrinhas.....................................................................................................................

193

TABELA 5.6. Compostos voláteis identificados na planta 48 h após a inserção das

cigarrinhas.....................................................................................................................

195

TABELA 5.7. Compostos voláteis identificados na planta 0 h após a remoção das

cigarrinhas.....................................................................................................................

197

TABELA 5.8. Compostos voláteis identificados na planta 24 h após a remoção das

cigarrinhas.....................................................................................................................

198

TABELA 5.9. Compostos voláteis identificados na planta 48 h após a remoção das

cigarrinhas.....................................................................................................................

200

TABELA 5.10. Porcentagens das componentes principais do sistema (voláteis

extraídos de C. sinensis sobre C. limonia) sem pré-processamento............................

203

TABELA 5.11. Porcentagens das componentes principais do sistema (voláteis

extraídos de C. sinensis sobre C. limonia) com pré-processamento............................

208

TABELA 5.12. Áreas dos picos dos compostos importantes na separação dos

grupos 1, 2 e 3, observados na análise quimiométrica.................................................

212

TABELA 5.13. Porcentagens relativas dos picos dos compostos importantes na

separação dos grupos (1, 2 e 3) observados na análise quimiométrica.......................

213

TABELA 5.14. Compostos identificados no óleo essencial das folhas de C. sinensis

sobre C. limonia sem ter sido submetido às cigarrinhas...............................................

220

TABELA 5.15. Compostos identificados no óleo essencial das folhas de C. sinensis

sobre C. limonia após a remoção das cigarrinhas........................................................

222

TABELA 5.16. Porcentagens das componentes principais do sistema (óleos

essências extraídos de C. sinensis sobre C. limonia) com pré-processamento...........

224

TABELA 5.17. Extratos analisados, e suas respectivas áreas dos picos e tempos de

retenção........................................................................................................................

238

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1. Laranja Pêra (copa) enxertada sobre Limão Cravo (porta-enxerto)........ 3

FIGURA 1.2. Frutos sadios ao lado de frutos de tamanho reduzido devido à CVC..... 10

FIGURA 1.3. Folhas com manchas amareladas, características de CVC.................... 12

FIGURA 1.4. Plantas com sintomas da CVC................................................................ 12

FIGURA 1.5. Vasos do xilema obstruído por células e Células de X. fastidiosa.......... 13

FIGURA 1.6. Imagens de X. fastidiosa por microscopia eletrônica.............................. 16

FIGURA 1.7. Cigarrinhas transmissores de CVC......................................................... 17

FIGURA 1.8. Zoneamento citrícola considerado no levantamento de CVC em 2005

no Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro..................................................

FIGURA 1.9. Muda Sadia - A base para um pomar sem CVC..................................... 24

FIGURA 1.10. Poda de ramos doentes em plantas com mais de 2 anos..................... 24

FIGURA 1.11. Armadilhas utilizadas na captura de cigarrinhas vetores de CVC:

Aramadilha adesiva amarela, armadilha com cigarrinhas capturadas e puçá..............

FIGURA 1.12. Interação Citrus/X. fastidiosa/Cigarrinhas............................................. 27

FIGURA 3.1. Metodologia utilizada no Estudo Fitoquímico: extração, purificação e

identificação das substâncias isoladas.........................................................................

FIGURA 3.2. Substâncias isoladas da raiz terminal de C. limonia............................... 58

FIGURA 3.3. Estrutura da cumarina Xantiletina............................................................ 59

FIGURA 3.4. Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1....................... 61

FIGURA 3.5. Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1. 61

FIGURA 3.6. Espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1...................... 62

FIGURA 3.7. Ampliação do espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1 62

FIGURA 3.8. Estrutura da cumarina Seselina............................................................... 63

FIGURA 3.9. Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C2....................... 65

FIGURA 3.10. Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina

C2..................................................................................................................................

FIGURA 3.11. Espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C2.................... 66

FIGURA 3.12. Ampliação do espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) da cumarina

C2..................................................................................................................................

vii

FIGURA 3.13. Estrutura da cumarina Xantoxiletina...................................................... 67

FIGURA 3.14. Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C3..................... 68

FIGURA 3.15. Estrutura da trans-Kelactona................................................................. 75

FIGURA 3.16. Estrutura da trans-Decursidinol............................................................. 79

FIGURA 3.17. Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina C4..................... 81

FIGURA 3.18. Ampliação do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C4..................................................................................................................................

FIGURA 3.19. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C4..................... 82

FIGURA 3.20. Ampliação do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C4..................................................................................................................................

FIGURA 3.21. Espectro de RMN

C (C

O, 400 MHz) da cumarina C4.....................

FIGURA 3.22. Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina C5..................... 84

FIGURA 3.23. Ampliação do Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C5..................................................................................................................................

FIGURA 3.24. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C5..................... 85

FIGURA 3.25. Ampliação A do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C5..................................................................................................................................

FIGURA 3.26. Ampliação B do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C5..................................................................................................................................

FIGURA 3.27. Espectro de RMN

C (C

O, 200 MHz) da cumarina C5................... 86

FIGURA 3.28. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) da cumarina C5....................... 87

FIGURA 3.29. Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) da cumarina C5....................... 87

FIGURA 3.30. Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) da cumarina C5........................ 88

FIGURA 3.31. Deslocamentos químicos de

C da cumarina C6................................. 90

FIGURA 3.32. Estrutura da Escopoletina...................................................................... 91

FIGURA 3.33. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6..................... 92

FIGURA 3.34. Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C6..................................................................................................................................

FIGURA 3.35. Espectro de RMN

C (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.................... 93

FIGURA 3.36. Espectro de HSQC (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6........................ 93

FIGURA 3.37. Espectro de HMBC (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6........................ 94

viii

FIGURA 3.38. Espectro de COSY (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6........................ 94

FIGURA 3.39. Espectro de NOESY (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6...................... 95

FIGURA 3.40. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6..................... 96

FIGURA 3.41. Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C7..................... 97

FIGURA 3.42. Espectro de Massas (ES-) dos íons de m/z 191,3 (M-H) da fração A... 98

FIGURA 3.43. Espectro de Massas (ES-) dos íons de m/z 191,3 (M-H) da fração B... 98

FIGURA 3.44. Espectro de Massas (ES-) dos íons de m/z 191,3 (M-H) da fração C... 99

FIGURA 3.45. Estrutura da Isoescopoletina................................................................. 102

FIGURA 3.46. Deslocamentos químicos dos carbonos da cumarina C8...................... 106

FIGURA 3.47. Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina C8..................... 107

FIGURA 3.48. Ampliação A do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C8..................................................................................................................................

107

FIGURA 3.49. Ampliação B do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C8..................................................................................................................................

108

FIGURA 3.50. Espectro de RMN

C (C

O, 400 MHz) da cumarina C8................... 108

FIGURA 3.51. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) da cumarina C8....................... 109

FIGURA 3.52. Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) da cumarina C8....................... 109

FIGURA 3.53. Espectro de NOESY (C

O, 400 MHz) da cumarina C8..................... 110

FIGURA 3.54. Estrutura da Demetilsuberosina............................................................ 114

FIGURA 3.55. Espectro de RMN

H (C

O, 200 MHz) da cumarina C9..................... 115

FIGURA 3.56. Ampliação do espectro de RMN

H (C

O, 200 MHz) da cumarina

C9..................................................................................................................................

115

FIGURA 3.57. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) da cumarina C9....................... 116

FIGURA 3.58. Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) da cumarina C9....................... 116

FIGURA 3.59. Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) da cumarina C9........................ 117

FIGURA 3.60. Estrutura da cumarina Clausarina......................................................... 121

FIGURA 3.61. Estrutura da cumarina Xantoxiletina...................................................... 123

FIGURA 3.62. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10....... 124

FIGURA 3.63. Ampliação A do espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) das

cumarinas C3 e C10......................................................................................................

124

FIGURA 3.64. Ampliação B do espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) das

cumarinas C3 e C10......................................................................................................

125

FIGURA 3.65. Espectro de RMN

C (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10...... 125

FIGURA 3.66. Espectro de HSQC (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.......... 126

FIGURA 3.67. Espectro de HMBC (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.......... 126

FIGURA 3.68. Espectro de COSY (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.......... 127

FIGURA 3.69. Estrutura proposta para a cumarina C11............................................... 128

FIGURA 3.70. Estrutura da Cumarina C11 identificada................................................ 131

FIGURA 3.71. Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11......

131

FIGURA 3.72. Ampliação do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) das cumarinas

C5 e C11.......................................................................................................................

132

FIGURA 3.73. Espectro de RMN

C (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11.....

132

FIGURA 3.74. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e

C11................................................................................................................................

133

FIGURA 3.75. Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e

C11.............................................................................................................................

133

FIGURA 3.76. Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e

C11................................................................................................................................

134

FIGURA 3.77. Correlações observadas pelo HMBC para o flavonóide F1................... 138

FIGURA 3.78. Estrutura da flavona isolada (F1) e seus respectivos valores de RMN

C comparados com a literatura...................................................................................

139

FIGURA 3.79. Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) do flavonóide F1................... 139

FIGURA 3.80. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) do flavonóide F1...................... 140

FIGURA 3.81. Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) do flavonóide F1...................... 140

FIGURA 3.82. Correlações obtidas pelo NOESY do flavanóide F2.............................. 143

FIGURA 3.83. Correlações obtidas pelo HMBC que determina a estrutura do

flavanóide F2.................................................................................................................

144

FIGURA 3.84. Correlações obtidas pelo HMBC do flavanóide F2................................ 145

FIGURA 3.85. Estrutura da Lupinifolina........................................................................ 145

FIGURA 3.86. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2.................... 147

FIGURA 3.87. Espectro de RMN

C (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2................... 147

FIGURA 3.88. Espectro de NOESY (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2..................... 148

FIGURA 3.89. Espectro de HMQC (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2...................... 148

FIGURA 3.90. Espectro de massas do flavonóide F2................................................... 149

FIGURA 3.91. Cromatograma da mistura dos três esteróides (E1, E2 e E3)............... 152

FIGURA 3.92. Espectro de Massas do esteróide E1.................................................... 152

FIGURA 3.93. Espectro de Massas do esteróide E2.................................................... 152

FIGURA 3.94. Espectro de Massas do esteróide E3.................................................... 153

FIGURA 3.95. Estruturas químicas do Sitosterol, Estigmasterol e Campesterol.......... 153

FIGURA 3.96. Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) dos esteróides E1, E2 e E3... 154

FIGURA 3.97. Espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) dos esteróides E1, E2 e E3.. 154

FIGURA 4.1. Placa com a solução de Xylella fastidiosa e as substâncias ensaiadas

nas diferentes concentrações.......................................................................................

160

FIGURA 4.2. a- Placas de Petri com as substâncias ensaiadas (Xantiletina,

Seselina, Limonia e Flavona 1, nas concentrações de 1000 µg/mL) e o controle........

161

FIGURA 4.2. b- Placas de Petri com a Xantiletina nas concentrações 1000, 500 e

300 µg/mL, respectivamente.........................................................................................

161

FIGURA 4.3. Fluxograma da metodologia empregada nos ensaios bactericida

contra X. fastidiosa........................................................................................................

162

FIGURA 4.4. Crescimento de X. fastidiosa em diferentes meios líquidos: A) Medida

da concentração total de proteína, B) Medida por Densidade ótica (OD) a A600 nm..

164

FIGURA 4.5. MIC da 3’,4’,5’,5,7-pentametoxiflavona (Flavona 1), Limonina,

Xantiletina e Seselina contra a X. fastidiosa no início da Fase Estacionária................

166

FIGURA 4.6. Concentrações utilizadas, em mg/mL, no experimento para

comparação das fases de crescimento da X. fastidiosa...............................................

168

FIGURA 4.7. MIC do Ácido Anacárdico, Rauanina, 3’-(1’,1’-dimetilalil)-

isoescopoletina (C1), metiléter-graveliferona (C2), Hesperidina, Odoratol,

Catequina, 7,8,3’,4’-tetrametóxi-6,5-(2’’,2’’-dimetilpirano) flavona (Flavona 2),

Gedunina, Odoratona, Azadirachtina,ensaiadas contra a X. fastidiosa na Fase

Exponencial...................................................................................................................

171

FIGURA 4.8. Análise da expressão e purificação da proteína Xylellaina em E. coli:

Purificação da Xylellaina por cromatografia de afinidade em resina de níquel.............

173

FIGURA 4.9. Algumas das substâncias ensaiadas frente a enzima Xylellaina............ 174

FIGURA 5.1. Cromatogramas das fibras PDMS/DVB, CW/DVB e CAR/PDMS

quando expostas durante sete horas a plantas enxertadas C. sinensis sobre C.

limonia...........................................................................................................................

179

FIGURA 5.2. Cromatogramas da fibra PDMS/DVB quando expostas a plantas

enxertadas C. sinensis sobre C. limonia em diferentes tempos...................................

182

FIGURA 5.3. Cromatograma dos hidrocarbonetos injetados diretamente por seringa. 183

FIGURA 5.4. Cromatograma dos hidrocarbonetos injetados após serem adsorvidos

pela fibra PDMS/DVB....................................................................................................

184

FIGURA 5.5a. Sistema utilizado para extração de voláteis: cuba e fibra...................... 185

FIGURA 5.5b. CG-EM utilizado para análise dos voláteis extraídos............................ 185

FIGURA 5.6. Sistema utilizado para extração de óleos essenciais por arraste a

vapor: Aparelho tipo Clevenger modificado..................................................................

186

FIGURA 5.7. Espectro de Massas teórico do 2-etil-1-hexanol......................................

216

FIGURA 5.8. Espectro de Massas experimental do 2-etil-1-hexanol............................ 217

FIGURA 5.9. Ampliação do Espectro de Massas experimental do 2-etil-1-hexanol.....

217

FIGURA 5.10. Espectro de Massas experimental do composto com IR = 1907...........

218

FIGURA 5.11. Espectro de Massas experimental do composto com IR = 1859...........

219

FIGURA 5.12. Estrutura da Hesperidina.......................................................................

232

FIGURA 5.13. Cromatograma obtido a partir da injeção do padrão de hesperidina

200 µg/mL................................................................................................................

234

FIGURA 5.14. Cromatograma obtido a partir da injeção do padrão de hesperidina 50

µg/mL............................................................................................................................

234

FIGURA 5.15. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSC (A)............ 235

FIGURA 5.16.Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSC (B)............. 235

FIGURA 5.17. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSS (A)............ 236

FIGURA 5.18. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSS (B)............. 236

FIGURA 5.19. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CRS (A)............. 236

FIGURA 5.20. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CRS (B)............. 237

FIGURA 5.21. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CLS (A)............. 237

FIGURA 5.22. Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CLS (B)............. 237

xii

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1.1. Incidência de CVC em 2005 no Estado de São Paulo e parte do

Triângulo Mineiro...........................................................................................................

GRÁFICO 1.2. Incidência de CVC por zona em 2005 no Estado de São Paulo e

parte do Triângulo Mineiro............................................................................................

GRÁFICO 1.3. Incidência de CVC por idade em 2005 no Estado de São Paulo e

parte do Triângulo Mineiro............................................................................................

GRÁFICO 1.4. Comparação da incidência de CVC por idade no período de 1996 -

2005 no Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro.........................................

GRÁFICO 1.5. Comparação da incidência de CVC apresentando os diferentes

níveis de sintomas no período de 1996-2005 no Estado de São Paulo e parte do

Triângulo Mineiro...........................................................................................................

GRÁFICO 1.6. Comparação da incidência de CVC no período de 1996-2005 no

Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro.......................................................

GRÁFICO 5.1. Gráfico de scores de todas as amostras dos voláteis de C. sinensis

sobre C. limonia (PC1 x PC2, 97,88 e 1,09 %, respectivamente).................................

203

GRÁFICO 5.2. Gráfico de loadings de todas as amostras dos voláteis C. sinensis

sobre C. limonia (PC1 x PC2, 97,88 e 1,09 %, respectivamente).................................

204

GRÁFICO 5.3. Gráfico de scores de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC3, 97,88 e 0,51 %, respectivamente)...........................................

205

GRÁFICO 5.4. Gráfico de loadings de todas amostras dos voláteis C. sinensis

sobre C. limonia (PC1 x PC3, 97,88 e 0,51 %, respectivamente).................................

206

GRÁFICO 5.5. Gráfico do poder de modelagem de todas as variáveis dos voláteis

C. sinensis sobre C. limonia, obtido para a análise de PCA sem nenhum pré-

processamento..............................................................................................................

207

GRÁFICO 5.6. Gráfico de HCA de todas amostras com índice de similaridade 0,385. 207

GRÁFICO 5.7. Gráfico de scores de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC2, 38,18 e 21,65 %, respectivamente).........................................

209

GRÁFICO 5.8. Gráfico de loadings de todas amostras dos voláteis C. sinensis

sobre C. limonia (PC1 x PC2, 38,18 e 21,65 %, respectivamente).............................

209

xiii

GRÁFICO 5.9. Gráfico de scores de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC3, 38,18 e 8,70 %, respectivamente)...........................................

210

GRÁFICO 5.10. Gráfico de loadings de todas amostras dos voláteis (PC1 x PC3,

38,18 e 8,70 %, respectivamente).................................................................................

211

GRÁFICO 5.11. Gráfico do poder de modelagem de todas as variáveis dos voláteis,

obtidos a partir do pré-processamento autoescalado...................................................

211

GRÁFICO 5.12. Gráfico de scores de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC3, 33,84 e 19,31 %, respectivamente).................

225

GRÁFICO 5.13. Gráfico de loadings de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC3, 33,84 e 19,31 %, respectivamente).................

226

GRÁFICO 5.14. Gráfico de scores de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC2, 33,84 e 28,74 %, respectivamente).................

227

GRÁFICO 5.15. Gráfico de loadings de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC2, 33,84 e 28,74 %, respectivamente).................

228

GRÁFICO 5.16. Gráfico do poder de modelagem de todas as variáveis dos óleos

essenciais de C. sinensis sobre C. limonia...................................................................

228

GRÁFICO 5.17. Gráfico de HCA de todas amostras com índice de similaridade

0,385.............................................................................................................................

229

xiv

LISTA DE ESQUEMAS

ESQUEMA 3.1. Preparação de Extratos....................................................................... 37

ESQUEMA 3.2. Fracionamento do extrato hexânico da raiz terminal de C.limonia

até a obtenção das substâncias....................................................................................

ESQUEMA 3.3. Fracionamento de todo o extrato diclorometânico-hexânico............... 50

ESQUEMA 3.4. Fracionamento do extrato diclorometânico-hexânico até a obtenção

das substâncias isoladas..............................................................................................

ESQUEMA 3.5. Fracionamento do extrato metanólico até a obtenção das

substâncias isoladas.....................................................................................................

ESQUEMA 3.6. Proposta de fragmentação das cumarinas 6-metoxi-7-

hidroxicumarina (C6) e 6-hidroxi-7-metoxicumarina (C7).............................................

101

ESQUEMA 5.1. Etapas desenvolvidas no experimento interação planta-cigarrinha.... 177

ESQUEMA 5.2. Proposta de fragmentação do 2-etil-1-hexanol................................... 216

ESQUEMA 5.3. Proposta de fragmentação do composto com IR = 1907....................

218

ESQUEMA 5.4. Proposta de fragmentação do composto com IR = 1859....................

219

ESQUEMA 5.5. Fluxograma da metodologia empregada para análise comparativa

do teor de Hesperidina em diferentes espécies de Citrus.............................................

233

RESUMO

ESTUDO FITOQUÍMICO DE CITRUS, SUA RESISTÊNCIA A XYLELLA

FASTIDIOSA E SUA INTERAÇÃO COM ONCOMETOPIA FACIALIS - Neste

trabalho estão descritas dezesseis substâncias isoladas de C. limonia: xantiletina,

seselina, xantoxiletina, trans-kelactona, trans-decursidinol, junosmarina

escopoletina, isoescopoletina, demetilsuberosina, xantoarnol, clausarina,

limonianina, 5,4’-diidróxi-6-(3”’-metil-2”’-butenil)-2”,2”-dimetilpirano(5’’,6’’-7,8)

flavanona, β-sitosterol, estigmasterol e campesterol; sendo uma destacada, a 5,4’-

diidróxi-6-(3”’-metil-2”’-butenil)-2”,2”-dimetilpirano(5’’,6’’-7,8) flavanona, por ser

inédita na literatura; e duas, a trans-kelactona e trans-decursidinol, não isoladas

anteriormente em plantas da família Rutaceae, apenas na família Apiaceae. Uma

comparação entre os constituintes químicos isolados da parte superior e inferior

da planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia e do C. limonia não enxertado foi

realizada, indicando que a planta enxertada possui um processo de translocação

metabólita. São relatadas as Concentrações Mínimas Inibitórias de diversas

substâncias, todas isoladas de plantas da família Rutaceae, contra a bactéria

causal da Clorose Variegada dos Citros, Xylella fastidiosa. As classes promissoras

foram as piranocumarinas e flavanonas, sendo a Xantiletina e a Catequina, com

MIC igual a 1,0 mg/mL. Foi realizado um estudo de interação planta-inseto, o qual

indicou que a planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia apresenta uma

alteração na composição química dos seus voláteis e em seus óleos essenciais

quando em contato com as cigarrinhas Oncometopia facialis, pertencentes a

família Cicadellidae, as quais são transmissores de Xylella fastidiosa,

correspondendo a uma resposta da planta ao ataque. A modificação dos

constituintes químicos e suas porcentagens foi mais perceptível nos voláteis do

que nos óleos essenciais das plantas. A planta enxertada também sofreu uma

alteração em um metabólito secundário, a Hesperidina, quando foi feita a análise

do teor desta substância em diferentes espécies de Citrus, C. limonia sem CVC,

C. reticulata sem CVC, C. sinensis sobre C. limonia com e sem CVC. O C. limonia

foi a espécie que apresentou menor quantidade de Hesperidina e C. sinensis

xvi

sobre C. limonia foi o que apresentou o maior teor. O estudo comparativo da

quantidade de Hesperidina da planta enxertada com e sem sintomas de CVC

indicou que esta possui uma maior quantidade da substância quando doente,

correspondendo a uma alteração metabólita que ocorre na planta quando

infectada pela bactéria.

xvii

ABSTRACT

PHYTOCHEMICAL STUDY OF CITRUS, THE RESISTENCE TO XYLELLA

FASTIDIOSA AND INTERACTION WITH ONCOMETOPIA FACIALIS – This work

describes sixteen substances isolated by C. limonia: xanthyletin, seselin,

xanthoxyletin, trans-kellactone, trans-decursidinol, junosmarin, scopoletin,

isoscopoletin, demethylsuberosin, xanthoarnol, clausarin, limonianin, 5,4’-

dihydroxy-6-(3”’-methyl-2”’-buthenyl)-2”,2”-dimethylpyrano(5”,6”-7,8)flavanone, β-

sitosterol, estigmasterol e campesterol. Three of them are especially important:

5,4’-dihydroxy-6-(3”’-methyl-2”’-buthenyl)-2”,2”-dimethylpyrano(5”,6”-7,8)flavanone

that was unknown in the literacy, trans-kellactone and trans-decursidinol that

weren’t found previously in the Rutaceae family but at Apiaceae family. The

chemical constituents isolated by the upper and low parts from the grafted plant (C.

sinensis on C. limonia) and from ungrafted C. limonia were compared. It indicated

that the grafted plant has a metabolic translocation process. The Minimum

Inhibitory Concentration of many substances isolated from plants of Rutaceae

family was related. The test was against the bacteria Xylella fastidiosa that causes

Citrus Variegated Chlorosis. The successful classes the pyranocoumarins and

flavones whose MIC was 1,0 mg/mL. We have studied the plant-insect interaction

and discovered that the grafted plant (C. sinensis on C. limonia) undergoes

chemical alteration of the volatile compounds and essential oils when it is in

contact with the sharpshooter. The sharpshooters Oncometopia facialis belongs to

the Cicadellidae family and carries the Xylella fastidiosa. This chemical alteration

was greater in the volatile compounds than in the essential oils of the plants.

Different amounts of Hesperidin were found in the grafted plant when different

species of Citrus were analized: C. limonia without CVC, C. reticulata without CVC,

C. sinensis on C. limonia with and without CVC. The C. limonia presented the

lower amount of the secondary metabolic and the C. sinensis on C. limonia

presents the higher amount. The higher amounts of Hesperidin were found in sick

plants witch corresponds the metabolic alteration that occurs when the plant is

infected by the bacteria.

xviii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................1

1.1. CITRICULTURA BRASILEIRA..................................................................................................2

1.2. CITRUS LIMONIA.....................................................................................................................3

1.3. FAMÍLIA RUTACEAE................................................................................................................4

1.4. ESTUDO INICIAL DO ENXERTO DE C. SINENSIS SOBRE C. LIMONIA...............................5

1.4.1. Compostos isolados da parte superior do enxerto.......................................................6

1.4.2. Compostos isolados da parte inferior do enxerto.........................................................7

1.5. DOENÇAS CITRÍCOLAS..........................................................................................................9

1.6. CLOROSE VARIEGADA DOS CITROS (CVC)........................................................................9

1.7. XYLELLA FASTIDIOSA..........................................................................................................12

1.8. CIGARRINHAS VETORES.....................................................................................................17

1.9. NÍVEIS DE INCIDÊNCIA DE CVC..........................................................................................18

1.10. FORMAS DE MANEJO DA CVC..........................................................................................23

1.10.1. Obtenção de mudas sadias......................................................................................23

1.10.2. Poda ou erradicação de plantas infectadas.............................................................24

1.10.3. Monitoramento e controle de cigarrinhas.................................................................25

1.10.3.1. Métodos de monitoramento............................................................................25

1.10.3.2. Controle químico............................................................................................25

1.11. INTERAÇÃO CITRUS/XYLELLA FASTIDIOSA/CIGARRINHA............................................26

1.12. ANÁLISE DE COMPOSTOS VOLÁTEIS DE PLANTAS.......................................................28

1.10.1. Headspace-SPME....................................................................................................28

1.10.1. Arraste à vapor.........................................................................................................28

2. OBJETIVOS.......................................................................................................30

3. CAPÍTULO 1: ESTUDO FITOQUÍMICO DO CITRUS LIMONIA.......................33

3.1 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.......................................................................................34

3.1.1 Materiais e métodos....................................................................................................34

xix

3.1.1.1 Métodos utilizados para o fracionamento e isolamento das substâncias..........34

3.1.1.2 Métodos instrumentais para a identificação e/ou elucidação estruturais...........35

3.1.2 Preparação dos extratos brutos..................................................................................35

3.1.3 Fracionamento dos extratos........................................................................................37

3.1.3.1 Extrato hexânico da R1C...................................................................................38

3.1.3.2 Extrato hexânico e diclorometânico da R1C......................................................39

3.1.3.3 Extrato metanólico da R1C................................................................................52

3.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................................56

3.2.1. Deteminação estrutural dos compostos isolados.......................................................56

3.2.1.1 Deteminação estrutural da Cumarina C1...........................................................59

3.2.1.2 Deteminação estrutural da Cumarina C2...........................................................63

3.2.1.3 Deteminação estrutural da Cumarina C3...........................................................67

3.2.1.4 Deteminação estrutural da Cumarina C4 e C5..................................................69

3.2.1.5 Deteminação estrutural da Cumarina C6...........................................................89

3.2.1.6 Deteminação estrutural da Cumarina C7...........................................................96

3.2.1.7 Deteminação estrutural da Cumarina C8.........................................................103

3.2.1.8 Deteminação estrutural da Cumarina C9.........................................................111

3.2.1.9 Deteminação estrutural da Cumarina C10.......................................................118

3.2.1.10 Deteminação estrutural da Cumarina C11.....................................................128

3.2.1.11 Deteminação estrutural do Flavonóide F1.....................................................135

3.2.1.12 Deteminação estrutural do Flavonóide F2.....................................................141

3.2.1.13 Deteminação estrutural dos Esteróides E1, E2 e E3.....................................150

4. CAPÍTULO 2: ENSAIOS BIOLÓGICOS..........................................................155

4.1. ENSAIOS BACTERICIDAS CONTRA A XYLELLA FASTIDIOSA........................................156

4.1.1. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.......................................................................156

4.1.1.1 Preparação dos Meios de Cultivo....................................................................156

4.1.1.2 Ensaios das substâncias contra Xylella fastidiosa...........................................158

4.1.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................163

4.1.2.1 Ensaios contra Xylella fatidiosa em diferentes fases de crescimento.............163

4.1.2.1.1 Ensaios contra Xylella fatidiosa no início da Fase Estacionária.........164

4.1.2.1.2 Ensaios contra Xylella fastidiosa na Fase Exponencial e no início da

FaseEstacionária.................................................................................167

4.1.2.1.3 Ensaios contra Xylella fastidiosa na Fase Exponencial......................169

4.2. ENSAIOS BIOLÓGICOS CONTRA A ENZIMA XYLELLAINA..............................................173

5. CAPÍTULO 3: INTERAÇÃO PLANTA – XYLELLA FASTIDIOSA –

ONCOMETOPIA FACIALIS.................................................................................175

5.1. EXPERIMENTO INTERAÇÃO PLANTA – CIGARRINHA....................................................176

5.1.1 Procedimento Experimental......................................................................................176

5.1.1.1 Determinação da Fibra Ideal............................................................................178

5.1.1.2 Determinação do Tempo de Exposição Ideal..................................................180

5.1.1.3 Determinação do tempo de retenção de uma série de hidrocarbonetos.........183

5.1.1.4 Extração e Identificação dos Compostos Voláteis...........................................185

5.1.1.5 Extração e Identificação dos Óleos Essenciais...............................................186

5.2.1 Resultados e Discussão............................................................................................187

5.2.1.1 Compostos Voláteis obtidos do C. sinensis sobre C. limonia..........................187

5.2.1.1.1 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia sem ter sido

submetido às cigarrinhas.......................................................................187

5.2.1.1.2 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia com

cigarrinhas.............................................................................................190

5.2.1.1.2.1 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia logo após

a inserção das cigarrinhas...........................................................190

5.2.1.1.2.2 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia 24 horas

após a inserção das cigarrinhas..................................................192

5.2.1.1.2.3 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia 48 horas

após a inserção das cigarrinhas..................................................194

5.2.1.1.3 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia após a remoção

das cigarrinhas......................................................................................196

5.2.1.1.2.1 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia logo após

a remoção das cigarrinhas...........................................................197

5.2.1.1.2.2 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia 24 horas

após a remoção das cigarrinhas..................................................198

5.2.1.1.2.3 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia 48 horas

após a remoção das cigarrinhas..................................................200

5.2.1.1.4. Análise Quimiométria dos dados de CG-EM dos Compostos Voláteis de

C. sinensis sobre C. limonia..................................................................202

5.2.1.1.5. Identificação dos Compostos Majoritários.............................................215

5.2.1.2 Óleos essências extraídos C. sinensis sobre C. limonia.................................220

5.2.1.2.1 Óleos essências identificados no C. sinensis sobre C. limonia sem ter

sido submetido às cigarrinhas...............................................................................220

5.2.1.2.2 Óleos essências identificados no C. sinensis sobre C. limonia após a

remoção das cigarrinhas......................................................................................222

5.2.1.2.3 Análise Quimiométria dos dados de CG-EM dos Óleos Essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia........................................................................224

xxi

5.2. EXPERIMENTO INTERAÇÃO PLANTA – XYLELLA FASTIDIOSA.....................................231

5.2.1. Determinação de Hesperidina em diferentes espécies de Citrus.............................231

5.2.2 Procedimento Experimental......................................................................................231

5.2.2.1 Extração e Isolamento das amostras...............................................................231

5.2.2.2 Análise das amostras por CLAE......................................................................232

5.2.3 Resultados e Discussão............................................................................................234

5.2.3.1 Análise dos cromatogramas obtidos................................................................234

6. CONCLUSÃO...................................................................................................240

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................244

8. ANEXO.............................................................................................................253

Introdução

1. INTRODUÇÃO

Introdução

1.1. Citricultura Brasileira

O Brasil é atualmente o maior produtor mundial de citros, correspondendo a

25,1% da plantação mundial, seguido pelos Estados Unidos, com 16,4% (Food and

Agriculture Organization, 2003). A cultura encontra-se disseminada por todo o

território nacional, com grande importância econômica e social para diversos

estados onde se situa entre as dez principais culturas: São Paulo, Sergipe, Rio de

Janeiro, Minas Gerais, Rio Grande do Sul e Bahia (RODRIGUEZ et al., 1991). As

maiores plantações são de laranja (Citrus sinensis, 66%), tangerina (C. reticulata,

15,4%), toranja (C. paradisi, 8,5%) e o limão (C. limon, 6,8%); as menores

plantações (3,3%) são de lima (C. aurantifolia), cidra (C. medica) e alguns híbridos.

Os citros podem ser propagados por quatro métodos: sementes, alporquia,

estaquia e enxertia, sendo este último o mais utilizado por apresentar algumas

vantagens, entre as quais pode-se citar a uniformidade das mudas, uma vez que os

porta-enxertos utilizados são poliembriônicos; precocidade no início de produção e

aumento na produtividade; além de obter-se mudas praticamente idênticas à planta-

mãe (ANDRADE et al., 2003). Assim, atualmente, a concepção no processo de

produção de mudas cítricas, associada às novas tecnologias do manejo da cultura,

inclui-se a diversificação do uso de porta-enxertos.

As plantas enxertadas são constituídas por duas partes: copa (parte superior)

e porta-enxerto (parte inferior), os quais são provenientes de pé francos distintos. Há

uma grande variedade de plantas enxertadas, devido às diversas combinações de

copa / porta-enxertos possíveis. A laranja ‘Pêra’ enxertada sobre o limão ‘Cravo’

(Figura 1.1, p.3) é a planta mais utilizada na citricultura brasileira nos últimos anos

(JUNIOR et al., 2004).

Introdução

FIGURA 1.1: Laranja Pêra (copa) enxertada sobre Limão Cravo (porta-enxerto).

As principais características que um porta-enxerto deve apresentar são:

resistência a pragas e doenças das raízes; compatibilidade com as principais copas

comerciais; alta produção de frutos e com ótima qualidade dos mesmos; adaptação

às condições de solo e clima da área onde será empregado (devendo ser adaptável

às mais diferentes situações); grande quantidade de sementes; alta taxa de

poliembrionia; facilidade de propagação e enxertia sobre as principais copas

comerciais; vigor adequado à indução de bom pegamento dos frutos e de boa

maturação; imunidade total ou alta resistência aos patógenos e pragas de

importância econômica, incluindo viroses destrutivas e declínios (ANDRADE et al.,

2003).

1.2. Citrus limonia

O limão ‘Cravo’ (C. limonia), também conhecido pelos nomes de Rosa, Bravo,

Vinagre, Vermelho, é praticamente o único porta-enxerto sobre o qual foi construída

a citricultura brasileira; representando em 99,1% das plantações citrícolas na década

de 70, no entanto, esta porcentagem reduziu a 82,9% em 2004 (JUNIOR et al.,

2004). A principal inconveniência da utilização de um único porta-enxerto já foi

demonstrada pela virose Tristeza que, na década de 40, destruiu quase toda a

citricultura brasileira, então apoiada sobre o porta-enxerto laranja azeda. Uma nova

doença, o Declínio dos Citrus, constatada na década de 70, causou a morte de

milhares de plantas enxertadas sobre o limão cravo. A pesquisa e a experimentação

vêm mostrando que a utilização de outros porta-enxertos, como as tangerinas

Porta-

enxerto

Introdução

‘Cleópatra’, ‘Sunki’ e o ‘Trifoliata’, permitem obter frutos de melhor qualidade e

maturação mais tardia que podem resultar em benefícios financeiros ao produtor

(RODRIGUEZ et al., 1991).

A razão pela preferência ao limão ‘Cravo’ é sua produtividade alta e precoce,

uma vez que plantas enxertadas em limão cravo geralmente têm boas safras a partir

dos três anos de idade. Talvez o maior responsável pelo desempenho deste porta-

enxerto seja sua resistência à seca, já que mais de 90% de nossa citricultura

depende das chuvas para o suprimento de água, e estiagens de 60 a 120 dias

durante a florada são comuns. Até os dias atuais nenhum outro porta-enxerto

estudado foi encontrado para substituir totalmente o limão ‘Cravo’, pois nenhum

apresentou-se tão resistente a seca. O limão ‘Cravo’ é resistente à Tristeza, mas

suscetível a outras doenças como Exocortis, Xiloporose, Gomose e Declínio.

Plantas enxertadas com limão ‘Cravo’ apresentam ótimo vigor, adaptando-se

bem aos tipos mais comuns de solos, onde podem ter performance excelente com

complementação nutricional. As frutas produzidas em plantas sobre este porta-

enxerto são de bom tamanho, mas têm qualidade média quanto à concentração de

açúcares. O limão ‘Cravo’ induz maturidade precoce das frutas, permitindo

aproveitamento maior dos preços melhores do início da safra. Conclui-se, portanto,

que seus defeitos não são limitantes e as vantagens da sua utilização explicam sua

preferência na citricultura até os dias de hoje.

1.3. Família Rutaceae

O gênero Citrus é uma planta classificada na família Rutaceae, ordem

Rutales. Segundo a classificação de Dahlgren, Rutales é constituída pelas famílias

Rutaceae, Meliaceae, Cneoraceae, Simaroubaceae e Burseraceae. É uma das

fontes mais ricas e diversas de metabólitos secundários em Angiospermas.

A quimiossistemática desta família tem sido revisada por Silva et al. 1988

baseando-se principalmente nos alcalóides derivados do ácido antranílico,

cumarinas e limonóides. Os gêneros da família Rutaceae já foram classificados de

acordo com suas características morfológicas e químicas, mas existem ainda

controvérsias sobre o posicionamento taxonômico de alguns gêneros, estimulando o

estudo de espécies ainda não investigadas. (SILVA et al., 1988).

Introdução

Citrus é o gênero mais importante da família e seu perfil químico corresponde

ao da subfamília a que pertence, Citroideae. O C. limonia, estudado neste trabalho,

é caracterizado por uma proliferação total de cumarinas e limonóides, mas uma

escassez em número e diversidade nos alcalóides do ácido antranílico.

1.4. Estudo inicial do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia

Visando completar o conhecimento químico de enxertos e entender melhor

sobre o mecanismo dos mesmos, o grupo de Produtos Naturais (PN) da UFSCar

vem estudando enxertos que atinjam o estágio adulto em um tempo bem menor,

pois isto facilita os estudos durante o desenvolvimento do mesmo. O limão cravo

torna mais precoce o florescimento e a frutificação, em geral 1 ano. Assim, iniciou-se

o estudo pelo enxerto de C. sinensis (laranja pêra) sobre C. limonia (limão cravo).

Dois alunos de doutorado do grupo estudaram a raiz, o porta-enxerto e a

parte superior do enxerto separadamente. Neste estudo isolou-se e identificou-se

um grande número de metabólitos secundários. O estudo da parte superior levou ao

isolamento quase que exclusivamente de flavonóides. Apenas duas cumarinas

foram isoladas, xantiletina, das folhas e caule, e xantoxiletina, apenas no caule. Um

limonóide, limonina, foi encontrado nas folhas. O triterpeno friedelina foi obtido nas

folhas e caule. Os esteróides comuns em planta, β-sitosterol, estigmasterol,

campesterol e 3-β-glicopiranosilsitosterol, também foram isolados do caule.

Introdução

1.4.1. Compostos isolados da parte superior do enxerto

 Flavonóides:

OMe

MeO

OMe

(Folhas e Caule)

R: OMe, R

: OMe, R

: OH, R

: OMe, R

: H (folhas)

R: OMe, R

:H, R

: OMe, R

: OMe (folhas e caule)

R: OMe, R

:H, R

: OMe, R

: H (folhas)

R: OMe, R

: OMe, R

: H (folhas e caule)

R: OMe, R

: OMe, R

: H, R

: OMe, R

: OMe (folhas e caule)

R: OMe, R

: OMe, R

: OMe (folhas e caule)

 Cumarinas:

xantiletina (folhas e caule) xantoxiletina (caule)

 Limonóide e Triterpeno:

Limonina (folhas) Friedelina (folhas e caule)

OOO

OMe

OOO

Introdução

O porta-enxerto da copa se assemelha à parte superior, caracterizado por

vários flavonóides, porém, um piranoflavonóide só apareceu nesta parte

correspondente ao limão de origem. Quanto as cumarinas, aqui só foram

encontrados xantiletina, xantoxiletina e angelical. Contudo, o estudo do porta-

enxerto ainda não está concluído.

(porta-enxerto)

O interessante é que nas raízes a classe de maior representatividade foi a

cumarina. Apenas dois limonóide, limonina e acetato de limonina, foram

encontrados.

Ao contrário da parte superior, apenas um flavonóide foi localizado, uma

flavanona. Os esteróides comuns em planta, β-sitosterol, estigmasterol e

campesterol também foram identificados nas raízes.

1.4.2. Compostos isolados da parte inferior do enxerto

 Cumarinas:

suberosina (raízes) xantiletina (raízes) xantoxiletina (raízes)

angelical (raízes) (raízes) clausarina (raízes)

OOH

OOMeO

OOO

OMe

OOO

OOMeO

Introdução

OOO

oxanordentina (raízes)

OMeO O

(E)-7-metóxi-6-(3-hidróxi-3-metil-1-butenil)-2H-1-benzopiran-2-ona (raízes)

(Z)-7-metóxi-6-(3-hidróxi-3-metil-1-butenil)-2H-1-benzopiran-2-ona (raízes)

 Flavonóide:

lupnifolina (raízes)

 Limonóides:

limonina (raízes) acetato de limonina (raízes)

OAc

OH O

Introdução

A composição química obtida de cada parte do enxerto parece ser distinta. O

interessante é que no porta-enxerto e nas raízes foram isolados piranoflavonóides,

os quais não aparecem na parte superior. Analisando todos os constituintes da parte

superior, parece que a reação de prenilação só ocorre nas raízes e porta-enxerto do

enxerto.

Na parte superior só foram encontrados dois compostos prenilados, as

cumarinas xantiletina e xantoxiletina. A piranocumarina xantiletina foi isolada em

grande quantidade (g) nas raízes e apenas em pequenas quantidades (mg) nas

partes superiores. Esta observação leva a inferir que a reação de prenilação só

ocorre nas raízes e as duas cumarinas teriam sido translocadas para as partes

superiores, aparecendo no porta-enxerto e no enxerto originário da laranja.

1.5. Doenças Citrícolas

A cultura de citros é um alvo constante de inúmeras pragas e doenças, que,

encontrando condições favoráveis ao seu desenvolvimento são capazes de causar

danos irreversíveis. A quantidade e a qualidade das frutas cítricas são

freqüentemente ameaçadas devido aos danos deixados na planta, que dependendo

da intensidade do ataque, pode torná-la improdutiva ou levar à sua erradicação. As

principais doenças e pragas que afetam a citricultura brasileira são: Cancro Cítrico,

Clorose Variegada dos Citros (CVC), Declínio, Gomose de Phytophthora, Greening,

Leprose dos Citros, Mancha Alternaria, Morte Súbita dos Citros (MSC), Pinta Preta,

Podridão Floral dos Citros, Rubelose, Tristeza – Citrus Tristeza Virus (CTV).

1.6. Clorose Variegada dos Citros (CVC)

Desde que a Clorose Variegada dos Citros foi encontrada, esta vem

constituindo a mais importante doença citrícola no Brasil. Seu progresso se tem

dado de tal maneira que só encontra precedente na epidemia da tristeza dos citros

ocorrida na década dos quarenta. Em 1994, estimava-se que 26 % das laranjeiras

do Estado de São Paulo apresentavam sintomas; em 1997, este número já havia

subido para 34%, e 44% em 2004 (LARANJEIRA et al., 2005).

A CVC, também conhecida como “amarelinho dos citros”, foi observada pela

primeira vez em 1987, no município de Macaubal - SP, atacando as principais

Introdução

variedades de laranja doce (C. sinensis L. Osbeck), independentemente do porta-

enxerto utilizado (ROSSETI et al., 1990). Como em geral acontece quando se

descreve a ocorrência de doenças em plantas pela primeira vez, as datas

referenciadas indicam a constatação de um problema que provavelmente já ocorria

muito tempo antes de ser detectado. Até agora, já foi relatada a ocorrência do

patógeno em praticamente todas as regiões onde os citros são explorados

comercialmente. A CVC ataca todas as variedades de citros comerciais. As regiões

mais afetadas pela doença até hoje são o Triângulo Mineiro e do Norte e Noroeste

do Estado de São Paulo, no entanto, a doença já está presente em quase todas as

áreas citrícolas do país, com intensidades diferentes.

O agente causal desta doença é uma bactéria gram-negativa denominada X.

fastidiosa que tem como preferência infectar os vasos do xilema da planta. Restrita

ao xilema da planta, a bactéria provoca o entupimento dos vasos responsáveis por

levar água e nutrientes da raiz para a copa da planta. A produção do pomar afetado

cai rapidamente, os frutos ficam duros, pequenos e amadurecem precocemente. A

perda de peso do fruto pode chegar a 75%. A Figura 1.2 mostra a redução dos frutos

quando a planta está com CVC.

FIGURA 1.2: Frutos sadios ao lado de frutos de tamanho reduzido devido à CVC.

(Fonte: www. fundecitrus.com.br, proteome.ibi.unicamp.br)

A transmissão da bactéria se dá através das cigarrinhas da família

Cicadellinea (DALLA et al., 2002; LOPES et al., 1996; ROBERTO et al., 2000;

SWALLOW et al., 1985; VET et al., 1983; YAMAMOTO et al., 2001). Até o momento,

não se constatou a transmissão mecânica da X. fastidiosa a partir de instrumentos

cortantes. Sabe-se, porém, que a bacteria pode ser transmitida por enxertia de

borbulhas infectadas e que a doença pode ser perpetuada da mesma forma ou por

garfagem de ramos afetados (PARRA et al., 2005).

Introdução

Estima-se que a CVC é responsável por níveis de danos econômicos no

Brasil, em cerca de cem milhões de dólares anuais. Embora até o momento só

existam estimativas, pesquisadores fazem alguns alertas: a erradicação de uma

planta com até dois anos de idade pode significar uma perda entre US$ 5,00 e US$

6,00, além do atraso na produção após replantio e desuniformidade do pomar, o que

levará a mais gastos; deverá ocorrer um aumento de cerca de 40 % no custo da

produção por hectare, equivalente a um custo de US$ 14,00 por planta; os testes

feitos pelos próprios citricultores e novos resultados de pesquisa poderão ajudar a

diminuir os novos custos (LARANJEIRA et al., 2005). Os prejuízos causados

poderiam ser ainda maiores não fosse a adoção de medidas conjuntas de controle

pelos produtores.

O volume que representa nas exportações, a extensão em área ocupada e o

número de empregos diretos e indiretos gerados pelo setor citrícola, associados à

rapidez com que a doença se disseminou para os grandes centros produtores de

laranja, provavelmente através de mudas contaminadas (TUBELIS et al., 1992), têm

feito da CVC o problema mais estudado e, de longe, com maior volume de

publicações a respeito.

Levantamentos conduzidos a partir de 1996 mostram que sua incidência na

área nobre da citricultura, que compreende 850 mil hectares localizados em 367

municípios das regiões sul, central, norte e noroeste de São Paulo e sul do triângulo

mineiro (AYRES et al., 2000), tem-se mantido em níveis médios superiores a 30 %

(www.fundecitrus.com.br). A redução na produção de plantas afetadas pode chegar

a 67 e 80 %, respectivamente, no número e peso de frutos normais por planta

(AYRES et al., 2000).

As plantas com CVC apresentam sintomas característicos: folhas com

manchas amareladas (Figura 1.4, p.12) e frutos miúdos (Figura 1.3, p.12). Os

primeiros sintomas são vistos nas folhas, passam posteriormente para os frutos e

acabam afetando toda a planta. Os primeiros sintomas da Clorose Variegada dos

Citros aparecem nas folhas maduras da copa; em folhas novas, mesmo de plantas

severamente afetadas, não há manifestação da doença. Surgem pequenas manchas

amareladas, espalhadas na parte lisa da folha (frente) e que correspondem a lesões

de cor palha nas costas, essas manchas evoluem para lesões de cor palha dos dois

lados da folha. Com o avanço da CVC, observa-se a desfolha dos ramos mais altos

da planta, locais mais atacados pelas cigarrinhas. No início, pode-se observar

Introdução

poucos ramos com frutos pequenos, já em estágio avançado, toda a planta produz

frutos miúdos. Quanto mais nova a planta infectada, mais rapidamente ela será

totalmente afetada. Com o agravamento da doença, os frutos ficam queimados pelo

sol, com tamanho reduzido, endurecido e com maturação precoce. Nesse estágio,

são imprestáveis para o comércio.

FIGURA 1.3: Folhas com manchas amareladas, características de CVC. (Fonte:

www.fundecitrus.com.br)

FIGURA 1.4: Plantas com sintomas da CVC. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

1.7. Xylella fastidiosa

No Brasil, a bactéria X. fastidiosa tem causado muita preocupação,

principalmente nos últimos 15 anos, e sido alvo de vários estudos, como o que

resultou no seqüenciamento completo de seu genoma (SIMPSON et al., 2000), por

ser o agente causal de doenças de diversas culturas de importância econômica,

como alfafa, ameixeira, laranjeira, videira, pessegueiro e algumas plantas

ornamentais. Esta bactéria é responsável pela Doença de Pierce, a qual ataca

videiras, e pela Clorose Variegada dos Citros (CVC ou amarelinho), a qual é uma

das mais importantes doenças citrícola do Brasil, gerando prejuízos econômicos ao

país.

Diferentemente da grande maioria das bactérias fitopatogênicas, a bactéria X.

fastidiosa é um microrganismo de difícil cultivo em meios de cultura e se limita ao

Introdução

xilema das plantas infectadas (Figura 1.5) e aparelho bucal dos insetos vetores, as

cigarrinhas (PURCELL e HOPKINS, 1996). É através desse grupo de insetos que,

no campo, a bactéria é transmitida de uma planta à outra (LOPES et al., 1996,

ROBERTO et al., 1996, FUNDECITRUS, 1999, KRÜGNER et al., 1998,

YAMAMOTO et al., 2002).

FIGURA 1.5: Vasos do xilema obstruído por células e Células de X. fastidiosa.

(Fonte: www.fundecitrus.com.br; www.citrolima.com.br)

Os mecanismos pelos quais a X. fastidiosa causa a doença nas plantas não

estão esclarecidos ainda, apesar dos esforços feitos neste sentido com base no

conhecimento das seqüências de todos os genes que compõem o genoma do

agente da CVC (programa Genoma Funcional da X. fastidiosa - Fapesp). A maneira

que X. fastidiosa coloniza o xilema, o que é facilmente observável em imagens feitas

com microscopia eletrônica (LOPES et al., 2000, CHAGAS et al., 1992, ROSSETI et

al., 1990, ALVES et al., 2003) e óptica, (QUEIROZ-VOLTAN et al., 1999) e as

sintomatologias manifestadas por plantas afetadas, sugerem, no entanto, que os

danos resultam principalmente de um bloqueio no fluxo da água do solo para as

partes aéreas das plantas e de um constante desvio de nutrientes. Plantas afetadas

apresentam sintomas de deficiência hídrica (murchamento de folhas), principalmente

nas horas mais quentes do dia e independente do nível de encharcamento do solo,

sintomas de deficiência mineral (particularmente zinco) e redução no crescimento da

copa e no tamanho dos frutos que em citros se tornam impróprios para o consumo in

natura ou comercialização. Em geral, plantas de citros afetadas pela bactéria não

chegam a morrer, mas a vida útil das plantações costuma ser bastante reduzida.

Estudos feitos com a bactéria que ataca videira nos Estados Unidos

demonstraram que aquela linhagem de X. fastidiosa apresenta ampla gama de

hospedeiros entre plantas invasoras e nativas (PURCELL e HOPKINS, 1996,

FREITAG et al., 1951, HOPKINS e ADLERS, 1988, RAJU et al., 1983). Suspeitou-se

Introdução

que o mesmo poderia estar ocorrendo com as linhagens de citros no Brasil. Isto foi

confirmado através de levantamentos de campo (TRAVENSOLO e LEITE 1996,

LOPES et al., 2003) e/ou experimentos de inoculação artificial onde essas linhagens,

depois de crescidas em meios de cultura, foram injetadas nas principais espécies de

plantas invasoras encontradas no campo (LOPES et al., 2003). No caso de citros,

onde este estudo foi mais abrangente, incluindo testes de transmissão com vetores,

suspeitou-se que tais hospedeiros poderiam servir de reservatório natural do

patógeno para as plantas cultivadas, contribuindo assim para o aumento da

epidemia, como ocorre com a linhagem que ataca as videiras. Esta hipótese foi, no

entanto, praticamente descartada ao se considerar diversos fatores relacionados à

resposta das invasoras à inoculação e ao comportamento dos vetores no campo. As

plantas inoculadas apresentaram alta resistência à colonização pelo patógeno,

impedindo que este atinja altas populações nos vasos do xilema, reduzindo

consideravelmente suas chances de ser adquirido pelos vetores e ser transmitido

das invasoras para os citros (LOPES et al., 2003). Quanto aos vetores, embora em

levantamentos de campo tenha sido detectada a presença de cigarrinhas de

invasoras em citros e de cigarrinhas de citros em invasoras (GRAVENA et al., 1998),

este número é pequeno, mostrando que deve haver preferência desses insetos por

fontes de alimento, o que também reduz as chances de transmitirem X. fastidiosa

entre invasoras e citros e vice versa (LOPES et al., 2003). Os resultados obtidos

com esse estudo ajudam a explicar as observações de campo sobre o avanço da

CVC no espaço e no tempo as quais indicam que as plantas de citros infectadas se

constituem nas principais fontes de inóculo para as plantas cítricas (LARANJEIRA et

al., 2000). Diferentemente da maioria das doenças de plantas, a resistência genética

contra X. fastidiosa não tem sido explorada com sucesso nessas culturas. Isto se

deve a inexistência de variedades com níveis satisfatórios de resistência e com boa

aceitação comercial que possam substituir os materiais suscetíveis atualmente

plantados ou ao fato de, por falta de estudos, materiais resistentes não terem sido

ainda detectados.

Em citros, logo após a primeira descrição da doença e antes mesmo da causa

ter sido comprovada em condições experimentais, levantamentos de campo

indicavam que todas as variedades de laranjas doces cultivadas, sendo as principais

a Pêra Rio, Natal, Hamlim e Valência, eram suscetíveis à doença. As tangerinas

Ponkan e tangor Murcote, os limões e a lima ácida Tahiti, de maior expressão

Introdução

comercial, por não manifestarem os sintomas típicos da CVC foram caracterizados

como resistentes. Estes resultados foram confirmados mais recentemente em estudo

de campo onde foram avaliados diversos híbridos e espécies dos gêneros Citrus,

Fortunela e Poncirus (LARANJEIRA et al., 1998). Neste estudo, também foram

observadas diferenças consideráveis no nível de resistência dentro do grupo das

laranjas doces que poderia ser explorado comercialmente. É possível que os

materiais que não apresentaram sintomas da CVC sejam tolerantes à doença, ou

seja, permitindo o crescimento do patógeno em seus tecidos, como observado com

a tangerina Cravo e Ponkan por LI et al. (1996) e MACHADO et al. (1997), porém,

não expressando qualquer sintomatologia ou perda de produção. Estas plantas

poderiam, no entanto, contribuir para o avanço da CVC nas variedades suscetíveis

atuando como fontes de inóculo veiculados pelas cigarrinhas.

Na verdade, a reação dos citros à infecção pela X. fastidiosa ainda não foi

devidamente caracterizada. Isto se deve à dificuldade que ainda se tem em

reproduzir em níveis satisfatórios, sob condições experimentais, os sintomas das

doenças observados no campo. Enquanto que em hospedeiros alternativos como o

tabaco, inoculações artificiais de X. fastidiosa dos citros e cafeeiro resultam, após

períodos relativamente curtos de incubação, em sintomas foliares claros e

inconfundíveis, expressos pela maioria senão por todas as plantas inoculadas

(ALVES et al., 2003, LOPES et al., 2000, 2001 e 2002), em citros a situação tem

sido muito diferente. Ainda em citros, a inexistência de um método de inoculação

que envolvesse o uso de cultura pura e padronizada do patógeno levou alguns

pesquisadores a utilizar a enxertia de borbulhas sadias em plantas doentes

(MACHADO et al., 1997) ou a enxertia de ramos doentes em plantas sadias (LI et

al., 1996, JAIMES et al., 2002) para estudo de resistência varietal. Os resultados não

foram, no entanto, muito satisfatórios. Baixo índice de pegamento e crescimento não

uniforme do enxerto, longo tempo para aparecimento ou remissão de sintomas, falta

de reprodutibilidade nos resultados obtidos entre laboratórios ou entre dados

experimentais com os verificados no campo, foram os principais problemas

enfrentados (LARANJEIRA et al., 1998, MACHADO et al., 1997, JAIMES et al.,

2002). As causas podem ser várias como efeito do porta-enxerto, incompatibilidade

enxerto/porta enxerto, debilidade do ramo doente dificultando o seu pegamento na

planta sadia, e variação na quantidade e na qualidade do inóculo, neste caso

influenciado pelo número de vasos colonizados, que pode ser diferente entre ramos

Introdução

dentro de uma mesma planta e entre plantas, e pela viabilidade das células de X.

fastidiosa presentes nos ramos ou nas plantas doentes. A reação de diversos clones

e variedades também foi avaliada sob condições naturais de infecção (LARANJEIRA

et al., 1998). Inconsistências nos resultados de algumas variedades com os

verificados sob condições experimentais (MACHADO et al., 1997), como

mencionado, também foram observadas. Também aqui a causa pode ter sido

variação na quantidade de inóculo que as plantas receberam em função do método

de inoculação empregado e da não preferência dos insetos vetores por algumas das

variedades estudadas (LARANJEIRA et al., 1998).

Dada a importância econômica das culturas dos citros e as perdas que as

doenças causadas pela X. fastidiosa vêm causando para os setores envolvidos, foi

necessário empreendimento de esforços visando um conhecimento mais

aprofundado de vários aspectos desses patossistemas de forma que medidas de

controle mais apropriadas sejam desenvolvidas. A Figura 1.6 mostra diversas

imagens da X. fastidiosa observadas em Microscopia Eletrônica.

FIGURA 1.6: Imagens de X. fastidiosa por Microscopia Eletrônica. (Fonte:

watson.fapesp.br, proteome.ibi.unicamp.br, www.ibm.fcav.unesp.br)

Introdução

1.8. Cigarrinhas vetores

As cigarrinhas são insetos sugadores, pertencentes à ordem Hemiptera

(subordem Auchenorrhyncha), e podem se alimentar em vários tecidos vegetais,

principalmente no sistema vascular dos citros. Existem muitas espécies de diversos

grupos taxonômicos de cigarrinhas que ocorrem em pomares de laranja. A maioria

das espécies habita a vegetação rasteira dos pomares e pertence a família

Cicadellidae, dentro da qual se destacam as subfamílias Cicadellinae,

Delcephalinae, Gyponinae e Agalliinae. Embora algumas espécies possam sugar

volumes signiicativos de seiva das plantas cítricas, os danos diretos resultantes da

alimentação têm pouca importância econômica. Atualmente, são consideradas

pragas-chaves em citros apenas algumas espécies da subfamília Cicadellinae, por

serem vetoras da bactéria X. fastidiosa, que é o agente causal da CVC (PARRA et

al., 2005). Comprovou-se que sob condições experimentais, com maior ou menor

eficiência, onze espécies de cigarrinhas são transmissoras (Figura 1.7): Acrogonia

sp., Dilobopterus costalimai, Oncometopia facialis, Bucephalogonia xanthophis e

Plesiommata corniculata, Acrogonia virescens, Ferrariana trivittata, Homalodisca

ignorata, Macugonalia leucomelas, Parathona gratiosa e Sonesima grossa (PARRA

et al., 2005, YAMAMOTO et al., 2002).

FIGURA 1.7: Cigarrinhas transmissores de CVC. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

Acrogonia

trina

Oncometopia

facialis

Bucephalogonia

xantho

his

Dilobopterus

costalima

Plesiommata

corniculata

Macugonalia

leucomelas

Sonesimia

rossa

Ferrariana

trivittata

Acrogonia

virescens

Parathona

ratiosa

Homalodisca

ignorata

Introdução

Ao se alimentarem no xilema de árvores contaminadas, as cigarrinhas

adquirem a bactéria e passam a transmiti-la para outras plantas sadias. Entre as

medidas mais importantes de manejo da CVC está o controle de cigarrinhas no

pomar. As principais cigarrinhas vetoras, A. citriba, B. xanthophis, D. costalimai e O.

facialis, o reconhecimento delas pode ser realizado através de suas características

de coloração e tamanho.

As cigarrinhas estudadas neste trabalho são pertencentes a Oncometopia

facialis (tribo Proconiini); quando adultas geralmente medem de 11 a 12 mm, tendo

coloração marrom-arroxeada, as asas são marrons, com áreas douradas e parte

apical transparente e a cabeça tem uma mancha escura característica na face

frontal. Os ovos são colocados endofiticamente a face abaxial das folhas, dispostos

em fileira, sendo recobertos por um material pulverulentro claro. As ninfas recém-

eclodidas são escuras, tornando-se mais claras com o decorrer do desenvolvimento.

Os adultos são encontrados em brotações ou em ramos mais desenvolvidos de

árvores cítricas, alimentando-se na parte mais madura desses ramos (PARRA et al.,

2005).

1.9. Níveis de Incidência de CVC

Desde 1996, a Fundecitrus realiza anualmente um levantamento para retratar

a incidência da Clorose Variegada dos Citros (CVC) nas quatro principais variedades

de laranja (Pera Rio, Valência, Natal e Hamlin). O levantamento é realizado nos

meses que antecedem a colheita e são consideradas as zonas Norte, Noroeste,

Oeste, Centro e Sul, conforme o mapa abaixo.

Introdução

FIGURA 1.8: Zoneamento citrícola considerado no levantamento de CVC em 2005

no Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro. (Fonte:

www.fundecitrus.com.br)

Pode-se verificar que a região norte do Estado de São Paulo e parte do

Triângulo Mineiro são as que apresentam maior incidência de CVC (Figura 1.8).

O Gráfico 1.1 apresenta os diferentes níveis de sintomas e porcentagem de

plantas sadias de acordo com o levantamento realizado em 2005, ou seja,

aproximadamente 44% da plantação total apresentam plantas infectadas.

Nível 1 - plantas com sintomas restritos às folhas.

Nível 2 - plantas com sintomas foliares e frutos miúdos; a distribuição desses frutos de tamanho

reduzido pode ocorrer em parte da copa da planta assim como em toda ela.

GRÁFICO 1.1: Incidência de CVC em 2005 no Estado de São Paulo e parte do

Triângulo Mineiro. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

Introdução

O Gráfico 1.2 apresenta os diferentes níveis de sintomas observados nas

zonas Norte, Noroeste, Centro, Sul e Oeste de acordo com o levantamento realizado

em 2005, e representa as porcentagens com os diferentes níveis de sintomas.

Nível 1 - plantas com sintomas restritos às folhas.

Nível 2 - plantas com sintomas foliares e frutos miúdos; a distribuição desses frutos de tamanho

reduzido pode ocorrer em parte da copa da planta assim como em toda ela.

GRÁFICO 1.2: Incidência de CVC por zona em 2005 no Estado de São Paulo e

parte do Triângulo Mineiro. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

A região que apresenta maior incidência de CVC é a região norte do Estado

de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro e, com exceção da região Sul, as demais

regiões apresentam um maior percentual nas plantas com sintomas em nível 2, e

isto demonstra que, uma vez a planta contaminada, ela passa a ficar totalmente

infectada, tanto suas folhas como seus frutos, ou seja, a doença se alastra por toda

planta.

O Gráfico 1.3, p.21, apresenta os diferentes níveis de sintomas observados

em plantas com diferentes idades: entre 0 a 2 anos, 3 a 5 anos, 6 a 10 anos e mais

que 10 anos, de acordo com o levantamento realizado em 2005.

Introdução

Nível 1 - plantas com sintomas restritos às folhas.

Nível 2 - plantas com sintomas foliares e frutos miúdos; a distribuição desses frutos de tamanho

reduzido pode ocorrer em parte da copa da planta assim como em toda ela.

GRÁFICO 1.3: Incidência de CVC por idade em 2005 no Estado de São Paulo e

parte do Triângulo Mineiro. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

Pode-se verificar que plantas com idades entre 6 a 10 são as mais infectadas

pela doença.

Os gráficos a seguir apresentam a incidência total de CVC levantada em cada

ano, a comparação da incidência de CVC no período de acordo com os níveis de

sintomas e a idade das plantas.

GRÁFICO 1.4: Comparação da incidência de CVC por idade no período de 1996-

2005 no Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro.( Fonte:

www.fundecitrus.com.br)

Introdução

Nível 1 - plantas com sintomas restritos às folhas.

Nível 2 - plantas com sintomas foliares e frutos miúdos; a distribuição desses frutos de tamanho

reduzido pode ocorrer em parte da copa da planta assim como em toda ela.

GRÁFICO 1.5: Comparação da incidência de CVC apresentando os diferentes níveis

de sintomas no período de 1996-2005 no Estado de São Paulo e parte do Triângulo

Mineiro. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

GRÁFICO 1.6: Comparação da incidência de CVC no período de 1996-2005 no

Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro. (Fonte: www.fundecitrus.com.br)

A partir destes gráficos e comparando-se os levamentos realizados no

decorrer dos anos pode-se verificar que houve um aumento constante na incidência

Introdução

de CVC desde 2000. Nos últimos anos, de 2004 a 2005, houve um pequeno

decréscimo, porém praticamente insignificante, podendo-se concluir que os métodos

de controle da CVC não estão sendo eficazes, ou seja, são necessários

empreendimentos para descoberta de novas formas de controle da doença.

1.10. Formas de Manejo da CVC

A bactéria X. fastidiosa é transmitida e disseminada nos pomares por insetos

vetores. Como ainda não há uma forma específica de controle à X. fastidiosa, os

citricultores implantam em seus pomares as estratégias de manejo da doença. O

manejo da CVC exige cuidados e dedicação por parte do citricultor e está baseado

em três estratégias: implantação de pomares com mudas sadias para evitar a

introdução do patógeno; poda de ramos com sintomas iniciais em plantas com mais

de dois anos; erradicação de plantas abaixo dessa idade; e controle químico do

vetor, as cigarrinhas. Além dessas medidas, é importante manter os tratos culturais

exigidos pelo pomar. Deve-se ressaltar que nenhuma das medidas de convivência

tem eficiência isoladamente (FUNDECITRUS, 2003, YAMAMOTO et al., 2001).

Atualmente, existe norma governamental que, a partir de janeiro de 2003,

proíbe a comercialização em todo o estado de São Paulo de mudas que não tenham

sido produzidas em viveiros telados totalmente livres de insetos (FUNDECITRUS,

2003a). Esta exigência deverá contribuir a médio e longo prazo para uma redução

da incidência da CVC.

1.10.1. Obtenção de Mudas sadias

Para que o citricultor não corra o risco de levar a bactéria X. fastidiosa para a

sua propriedade e nem perca a árvore antes que ela comece a produzir, é indicado

que sejam adquiridas mudas que estejam livres da doença (Figura 1.9, p.24).

Recomenda-se que verifique se o viveiro adota todas as medidas de segurança que

garantem a produção de mudas sadias. Elas devem ser compradas em viveiros

certificados, que respeitam uma série de regras sanitárias estabelecidas pela

Secretaria da Agricultura do Estado de São Paulo. O citricultor precisa dobrar a

vigilância na época da colheita, quando se aumenta o trânsito de equipamentos,

veículos e frutos por todo o estado.

Introdução

FIGURA 1.9: Muda Sadia - A base para um pomar sem CVC. (Fonte:

www.fundecitrus.com.br)

1.10.2. Poda ou Erradicação de plantas infectadas

Essa é uma das mais importantes medidas de controle da CVC. A poda

(Figura 1.10) e, em alguns casos a erradicação, evita a proliferação da bactéria na

planta e elimina as fontes de inóculo, nas quais as cigarrinhas poderiam adquirir a

bactéria e posteriormente transmiti-la. O sucesso da poda ocorre principalmente nos

sintomas iniciais da doença. Os melhores resultados são obtidos em pomares com

poucas árvores contaminadas. Árvores com sintomas severos apresentam a bactéria

distribuída pela planta, chegando até o tronco. Nesses casos, a poda não é eficaz e

deve-se fazer a erradicação da planta.

FIGURA 1.10: Poda de ramos doentes em plantas com mais de 2 anos. (Fonte:

www.fundecitrus.com.br)

Introdução

1.10.3. Monitoramento e controle de cigarrinhas

Em anos chuvosos as cigarrinhas aparecem na primavera e, em anos secos,

surgem mais tarde, no verão. No meio do ano, quando se inicia a seca, elas

começam a sumir dos pomares.

1.10.3.1. Métodos de Monitoramento

Existem vários métodos de amostragem da população de cigarrinhas, entre

eles: armadilha adesiva amarela, observação visual e por rede entomológica (puçá),

as quais estão ilustradas na Figura 1.11. As armadilhas amarelas atraem as

cigarrinhas pela cor, quando elas entram chocam-se, são captadas, pois ficam

retidas pela cola presente.

Em qualquer dos casos é necessário treinamento para identificar as

cigarrinhas que transmitem a doença. O número de plantas inspecionadas deve

corresponder a 1% ou 2% do pomar, em locais bem definidos. Deve-se escolher

plantas que apresentem vegetações intensas, que são as preferidas pelas

cigarrinhas.

FIGURA 1.11. Armadilhas utilizadas na captura de cigarrinhas vetores de CVC:

Aramadilha adesiva amarela, armadilha com cigarrinhas capturadas e puçá. (Fonte:

www.fundecitrus.com.br)

1.10.3.2. Controle químico

É recomendado que seja feito quando for constatado 10% das plantas de um

talhão com cigarrinhas, independente da espécie. Deve-se fazer o controle até as

plantas atingirem 6 anos. É aconselhado monitoramentos e pulverizações periódicas

Introdução

em talhões mais velhos, que estão próximos a talhões novos. A mesma

recomendação vale para locais próximos a matas naturais e baixadas.

Em plantas com até três anos de idade, pode-se aplicar inseticidas sistêmicos

no início e final do período das águas, com aplicações de inseticidas de contato

durante a seca. Caso se opte pela utilização somente de inseticidas de contato no

controle do vetor, é recomendada a aplicação mensal do período das águas e, a

cada dois meses, durante a seca. Se os pomares forem mais velhos, a

recomendação dos técnicos para o controle é basear as aplicações de acordo com a

população de cigarrinhas.

As pulverizações devem ser criteriosas. O uso indiscriminado de produtos

químicos elimina os inimigos naturais que, sozinhos, são responsáveis pelo controle

de 40% da população de cigarrinhas e podem causar surtos de pragas secundárias.

A partir destes dados, verifica-se que não há uma forma eficaz de controle a

CVC e sim métodos de prevenção, ou seja, quando a planta contrai a doença, se

esta não for controlada rapidamente é necessário erradicá-la. Isto gera grandes

prejuízos ao produtor, pois ele perde além de todo o investimento realizado, como

plantio, mudas, água, fertilizantes, entre outros; os frutos que seriam vendidos e

gerariam lucros, sendo necessário replantar novamente e esperar um tempo maior

para obter o retorno financeiro.

1.11. Interação Citrus/Xylella fastidiosa/Cigarrinha

Há uma correlação entre citros, bactéria e cigarrinha: a cigarrinha se alimenta

da seiva dos citros, no entanto, se a planta estiver infectada, a bactéria é transferida

para o aparelho bucal do inseto, o qual, ao se alimentar de outra planta, acaba

transmitindo o patógeno, e no caso se a planta for sadia, ela passa a conter a

doença. Esta interação esta ilustrada na Figura 1.12, p.27.

Introdução

FIGURA 1.12. Interação Citrus / X. fastidiosa / Cigarrinhas.

Há dados na literatura relatando a presença de cristais em forma de ráfides

(agulhas) no lúmen de alguns vasos do xilema em plantas com sintomas de CVC

quando analisadas por MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura). Análises em

plantas com inoculação natural mostraram que estes cristais se formavam no lúmen

a partir das pontuações, indicando que nos mesmos se originavam de células do

parênquima do xilema e que, possivelmente, tais cristais sejam de hesperidina, um

glicosídio comum em plantas de laranjeira (GOTTARDI et al., 2004). A presença de

cristais dendríticos de hesperidina já havia sido verificada anteriormente com o

emprego da luz polarizada, utilizando-se um fotomicroscópio óptico (QUEIROZ-

VOLTAN et al., 1999). A presença dos cristais sugere uma resposta da planta a um

possível ataque desta bactéria (GOTTARDI et al., 2004).

Há necessidade de estudos para verificar se realmente o cristal encontrado é

a hesperidina e se há um aumento na quantidade do mesmo em plantas infectadas

por CVC, para uma melhor compreensão e comprovação de que a planta tem uma

resposta frente à infecção. É provável que ocorra uma alteração nos metabólitos

secundários da planta quando em contato com agentes vetores ou quando infectada

pela bactéria.

X. fatidiosa

mbiente

Oncometo

ia facialis

Introdução

1.12. Análise de compostos voláteis de plantas

1.12.1. Headspace - SPME

Durante a década passada, a microextração por fase sólida foi amplamente

utilizada para extração de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras

biológicas, ambientais e alimentícias. A SPME (Solid Phase Micro-Extraction) é um

procedimento de amostragem simples, rápido e livre de solventes, no qual as

amostras presentes na fase líquida (amostragem por imersão direta) ou fase gasosa

(amostragem Headspace) são absorvidas por uma fibra com sílica fundida. O

Headspace SPME (HS-SPME) em combinação com cromatografia gasosa (CG) e

cromatrografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) tem sido

amplamente utilizado na análise de aromas (KIM et al., 2003).

A SPME oferece várias vantagens, sobretudo dinâmica na técnica de

amostragem headspace usada em investigações prévias. Em particular, SPME

requer poucas amostras e um tempo muito curto de análise, o qual pode minimizar a

formação de artefatos devido aos danos da planta e contaminações ou perdas de

compostos (FLAMINI et al., 2003). Esta técnica pode ser usada para verificar a

interação inseto-planta, adquirindo informações referentes à resposta desta quando

em contato com agentes vetores. Tal experimento não danifica a planta, obtendo-se

um resultado próximo do real.

1.12.2. Arraste à vapor

A destilação por arraste a vapor é empregada para destilar substâncias que

se decompõem nas proximidades de seus pontos de ebulição e que são insolúveis

em água ou nos seus vapores de arraste. Esta operação baseia-se no fato de que,

numa mistura de líquidos imiscíveis, o ponto de ebulição será a temperatura na qual

a soma das pressões parciais dos vapores é igual à da atmosfera, o que constitui

uma decorrência da leia das pressões parciais de Dalton. Se, em geral, o arraste se

faz com vapor d’água, a destilação, à pressão atmosférica, resultará na separação

do componente de ponto de ebulição mais alto, a uma temperatura inferior a 100ºC.

Por outro lado, quando uma mistura de dois líquidos imiscíveis é destilada, o ponto

de ebulição da mistura permanece constante até que um dos componentes tenha

Introdução

sido separado, já que a pressão total do vapor independe das quantidades relativas

dos componentes. O ponto de ebulição, a partir daí, eleva-se rapidamente, até

atingir o do líquido remanescente. O vapor que se separa de tal mistura contém os

componentes na mesma proporção, em volume, que suas pressões de vapor

relativas.

Os óleos voláteis possuem tensão de vapor mais elevada que a da água,

sendo, por isso, arrastados pelo vapor d'água. Em pequena escala, emprega-se o

aparelho de Clevenger. Esse procedimento, embora clássico, pode levar à formação

de artefatos em função da alta temperatura empregada. Preferencialmente, esse

método é utilizado na extração de óleos de plantas frescas.

Os óleos essenciais de citros têm sido usados para criar aromas artificiais e

fragrâncias há muitos anos (UMANO et al., 2002). Eles são materiais aromatizantes

de importância comercial, sendo utilizados nas indústrias de bebidas, confeitarias,

farmacêuticas, cosméticas e perfumarias. A qualidade e refrescância dos óleos de

citros são as maiores considerações pertinentes para seu valor e suas aplicações

(NJOROGE et al.,1996). O aroma de frescor da laranja é derivado a uma mistura

complexa contendo ácidos e compostos voláteis.

Compostos voláteis são especialmente importantes para o aroma de citros e

inclui álcoois, aldeídos, ésteres e hidrocarbonetos. O efeito de um dado volátil no

aroma pode ser fortemente modificado por compostos não voláteis, bem como a

partir de efeitos sinergísticos de outros compostos (OBENLAND et al., 1999). A

demanda mundial para óleos essências, especialmente de citros, tem aumentado

durante os anos (CHOI et al., 2000), sendo o Brasil atualmente o maior exportador

de óleos essenciais de citros.

2. OBJETIVOS

Objetivos

Este trabalho teve como objetivo principal estudar metabólitos secundários

com potencial inseticida ou efeito antimicrobiano para X. fastidiosa visando o

controle da CVC, a qual é uma das doenças mais importantes da citricultura

brasileira e com isto tem gerado muitos prejuízos a diversos setores. Vários

métodos podem ser empregados, como controle da bactéria causal da doença (X.

fastidiosa), dos agentes transmissores da bactéria (Cigarrinhas), e a realização de

um diagnóstico mais rápido da doença, o que facilita o controle e erradicação da

mesma.

Para alcançar tal objetivo foram determinados então outros objetivos

específicos:

a) Isolamento e elucidação estrutural de metabólitos secundários de C. limonia

(limão cravo) visando ampliar o conhecimento da química da família

Rutaceae;

b) A busca de substâncias com potencial inibitório frente a X. fastidiosa e a

sua enzima “Xylellaina”. A partir de ensaios com substâncias isoladas do C.

limonia, devido este não manifestar os sintomas típicos da CVC e com isto

ser caracterizado como resistente à bactéria X. fastidiosa; e a partir de

ensaios com outras substâncias isoladas de plantas pertencentes à família

Rutaceae, uma vez que várias destas são citadas na literatura

apresentando ótimas atividades biológicas;

c) Análise da interação planta-inseto verificando se há uma resposta da planta

frente a insetos vetores, a partir da extração e identificação de compostos

presentes nos óleos essenciais e de compostos voláteis da planta

enxertada C. sinensis sobre C. limonia submetida a diferentes condições

com e sem a presença de cigarrinhas vetores da CVC. Com estas

informações buscar novas alternativas para o controle das cigarrinhas

Objetivos

vetores, uma vez que a eliminação dos agentes transmissores é uma

medida utilizada para o controle da CVC;

d) Determinar o teor de Hesperidina em diferentes espécies de citros com e

sem sintomas de CVC para verificar se realmente há uma resposta da

planta frente à infecção manifestada por modificações em seus metabólitos

secundários, e conhecer a resposta de uma planta suscetível comparada a

uma resistente a X. fastidiosa quando infectada pela doença.

3. CAPÍTULO 1:

ESTUDO FITOQUÍMICO DO C. LIMONIA

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.1. Procedimento Experimental

3.1.1. Materiais e Métodos

3.1.1.1. Métodos utilizados para o fracionamento e isolamento das

substâncias

a) Fracionamentos por Cromatografia em Coluna (CC), utilizando as seguintes fases

estacionárias:

• Sílica (230-400 Mesh ASTM);

• Sílica 60 (70-230 Mesh ASTM);

• Sílica 60G PF254 (70-230 Mesh ASTM);

• Sephadex LH-20.

b) Separação de misturas de substâncias via a Cromatografia em Camada Delgada

Preparativa (CCDP) utilizando:

• Sílica gel (5-25 µ);

• Sílica gel 60.

c) Separação de misturas de substâncias via a Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE), utilizando os cromatógrafos:

• Shimadzu modelo LC-1OAD (condições analíticas);

• Shimadzu modelo LC-8A (condições preparativas);

• Shimadzu modelo LC-6AD (condições preparativas com válvula de reciclo e

“loop” de 2 mL);

Com os seguintes detectores:

• Espectrofotômetro UV-VIS. Modelo SPD-GAV, Shimadzu para CLAE-R;

• Detector de índice de refração Shimadzu VIR-6AV para CLAE-R.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

d) Solventes utilizados no fracionamento e identificação dos compostos:

• Solventes comerciais destilados no DQ – UFSCar;

• Solventes grau HPLC da JTB;

• Solventes deuterados da Merk e Aldrich.

3.1.1.2. Métodos instrumentais utilizados para a identificação e/ou

elucidação estruturas

a) Ressonância Magnética Nuclear (RMN), utilizando as técnicas RMN de

H e

COSY, HMBC, HSQC, NOESY, via os seguintes aparelhos:

• DRX 400 Bruker (9,4 Tesla) e ARX 200 Bruker (4,7 Tesla).

b) Espectrometria de Massas, utilizando-se os seguintes aparelhos:

• Cromatógrafo de fase gasosa Shimadzu GC-17A, equipado com uma coluna

, L = 30 m, DI = 0,32 mm e filme = 0,25 µm acoplado ao espectrômetro de

massas de baixa resolução HP – 2576

•

Cromatógrafo de fase gasosa acoplado ao espectrômetro de massas de baixa

resolução Shimadzu GC-MS QP5000, equipado com coluna HP1, L = 25 m,

= 0,20 mm e filme = 0,25 µm

• Espectrômetro de Massas ESI-MS e DCI-MS de baixa resolução VG Platform

II (Fisons).

3.1.2. Preparação dos Extratos Brutos

O material vegetal foi coletado na Estação Experimental de Citricultura do

Instituto Agronômico de Campinas, cuja fazenda experimental encontra-se em

Cordeirópolis - SP. Inicialmente foram separados em raiz terminal, raiz, caule, folhas

do C. limonia; raiz terminal e raiz do enxerto C. sinensis sobre C. limonia, e

posteriormente empacotados. Após seco em estufa de circulação a 40°C, cada parte

da planta foi triturada em um moinho tipo Willey e em seguida pesada para a

Estudo Fitoquímico do C. limonia

obtenção de suas massas, as quais foram: Raiz terminal - 715,5 g; Raiz - 631,2 g;

Folhas - 387,1 g; Caule - 1738,1g; Raiz terminal do enxerto - 509,2 g; Raiz do

enxerto - 466,9 g. Os códigos de cada material coletado, os extratos obtidos e as

massas correspondentes a cada extrato estão relacionados na Tabela 3.1.

TABELA 3.1: Divisão das plantas C. limonia e C. sinensis sobre C. limonia, extratos

obtidos e suas respectivas massas.

Órgão da planta Código Extratos Massa do extrato (g)

Raiz terminal

do C. limonia

R1C

7,9392

5,7372

13,7204

Raiz

do C. limonia

R2C

11,2395

10,4279

16,7202

Caule

do C. limonia

CCL

17,4547

6,7823

34,5471

Folhas

do C. limonia

FCL

4,5269

5,8883

19,4152

Raiz terminal

do C. sinensis sobre

C. limonia

R1E

3,2745

12,9198

14,3882

Raiz

do C. sinensis sobre

C. limonia

R2E

5,7362

7,6037

17,6471

H: extrato hexânico; D: extrato diclorometânico; M: extrato metanólico

Os extratos foram obtidos a partir da maceração por cinco dias do material

moído com solventes orgânicos em ordem crescente de polaridade: Hexano,

Diclorometano (DCM) e Metanol, durante três vezes consecutivas; como mostrado

no Esquema 3.1, p.37.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

ESQUEMA 3.1: Preparação de Extratos.

Material Vegetal

Extrato Hexânico

Torta

Extrato Diclorometânico

Torta

Extrato Metanólico

TortaExtrato Hidrometanólico

a) Maceração com Hexano por cinco dias por três vezes;

b) Maceração com DCM por cinco dias por três vezes;

c) Maceração com Metanol por cinco dias por três vezes;

d) Maceração com mistura de Água/Metanol na proporção de 1:1 por cinco dias por duas vezes.

Obteve-se um total de 18 extratos conforme mostrado na tabela 3.1 (p. 36) e

todos foram concentrados, após sua maceração, em evaporador rotativo. Trabalhou-

se com os extratos hexânico, diclorometânico e metanólico da raiz terminal de C.

limonia (R1C); os demais extratos serão posteriormente trabalhados por outros

alunos.

3.1.3. Fracionamento dos Extratos

O extrato hexânico da raiz terminal de C. limonia (R1C) apresentou cristais,

os quais foram removidos e fracionados separadamente. Logo após, os extratos

hexânico e diclorometânico da R1C foram submetidos à Cromatografia em Camada

Delgada Comparativa (CCDC), com fase móvel Hexano: Acetato de Etila nas

proporções: 9,5 : 0,5; 8,0 : 2,0; 6,0 : 4,0; 1,0 : 1,0; os resultados obtidos foram muito

semelhantes, indicando que os compostos presentes nos dois extratos eram

similares, então resolveu-se unir os dois extratos e trabalhar com eles agrupados.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.1.3.1. Extrato Hexânico da R1C

Observou-se a formação de cristais neste extrato, então os separou e

submeteu-os à Cromatografia em Coluna (CC). A massa obtida de cristais foi 0,0681

g, sendo aplicada em uma coluna de sílica gel (230-400 Mesh) (PC1), com diâmetro

interno (DI) 2,0 cm e altura (h) 45,0 cm, eluída com: Hexano: Acetato de Etila (9,5 :

0,5), Hexano: Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano: Acetato de Etila (6,0 : 4,0). Foram

obtidas 28 frações [PC1,1-28], as quais foram agrupadas de acordo a análise por

CCDC.

A partir da análise dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN),

H e

C - 200 MHZ, identificou-se duas cumarinas distintas nas frações PC1-2 (C2)

e PC1-4 (C1) e uma mistura de três esteróides PC1-1 (E1, E2 e E3). A seguir

encontra-se um esquema dos diversos fracionamentos do extrato hexânico até a

obtenção das substâncias identificadas (Esquema 3.2).

ESQUEMA 3.2: Fracionamento do extrato hexânico da raiz terminal de C. limonia

até a obtenção das substâncias.

Extrato Hexânico

7,9392g

Cristal

PC1

Cumarina C2

PC1-2

Esteróides E1, E2 e

RAIZ C. limonia (R1C)

Cumarina C1

PC1-4

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.1.3.2. Extrato Hexânico e Diclorometânico da R1C

Inicialmente, partiu-se de uma massa de 715,5 g da raiz terminal do C.

limonia seca e triturada. Os extratos hexânico e diclorometânico da R1C foram

comparados por CCDC e agrupados por apresentarem manchas com R

(fator de

retenção) semelhantes. Obteve-se 13,6764 g deste extrato, o qual foi submetido a

uma coluna Sephadex LH-20 (PC2) com DI 4,00 cm e h 130 cm, eluída com DCM :

MeOH 1:1, fornecendo 15 frações [PC2,1-15], as quais foram submetidas a outros

refracionamentos.

A escolha inicial de qual fração ser trabalhada ocorria a partir de uma análise

inicial de RMN,

H - 200 MHz, porém as demais frações não são descartadas devido

ao mascaramento de sinais ocorrentes às vezes no espectro de RMN. Este

procedimento foi freqüentemente utilizado em todo trabalho.

 Refracionamentos da fração PC2:

> A fração PC2-6 (m = 0,9966 g) foi submetida à Cromatografia em Coluna

(CC): Sephadex LH-20 (PC2.1), DI 2,5 cm x h 100 cm, eluída com Metanol 100%.

Foram obtidas 22 frações [F2.1,1-22], as quais foram agrupadas de acordo a análise

por CCDC. Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas

posteriormente.

> A fração PC2-8 (m = 0,0463 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC2.2), DI 2,5 cm x h 22 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano : Acetato

de Etila (9,5 : 0,5), Hexano : Acetato de Etila (9,0 :1,0), Hexano : Acetato de Etila

(8,5 : 1,5), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de Etila (7,0 : 3,0),

Hexano : Acetato de Etila (1,0 : 1,0) , Metanol (100%). Obteve-se 155 frações, as

quais foram reunidas por CCDC, segundo a sua similaridade em Rf, em 17 frações

[PC2.2, 1-17]. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos

interessantes em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2-4 (m = 3,5196 g) foi submetida à CC: Sephadex LH-20

(PC2.3), DI 2,5 cm x h 118 cm, eluída com: Metanol : DCM (1,0 : 1,0). Obteve-se 6

frações [PC2.3, 1-6], as quais foram agrupadas de acordo a análise por CCDC.

Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas posteriormente.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

> A fração PC2-9 (m = 0,0364 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC2.4), DI 2,5 cm x h 61 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano : Acetato

de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de Etila

(7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 : 1,0) ,

Acetato de Etila (1,0 : 1,0), Acetato de Etila: Metanol (1,0 : 1,0) e Metanol (100%).

Obteve-se 18 frações [PC2.4, 1-18], as quais foram agrupadas de acordo a análise

por CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos

interessantes em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

 Refracionamentos da fração PC2.1:

> A fração PC2.1-7 (m = 0,0374 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC2.1.1), DI 1.0 cm x h 40 cm, eluída com: Hexano: Acetona (9,0 : 1,0),

Hexano: Acetona (8,0 : 2,0), Hexano: Acetona (7,0 : 3,0), Hexano: Acetona (6,0 :

4,0), Hexano: Acetona (1,0 :1,0), Acetona (100%), Acetona: Metanol (1,0 : 1,0) e

Metanol (100%). Obteve-se 56 frações, as quais foram unidas em 12 outras

[PC2.1.1, 1-12] de acordo as semelhanças apresentada na análise por CCDC.

Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas posteriormente.

> A fração PC2.1-4 (m = 0,0781 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC2.1.2), DI 2,0 cm x h 35 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano : DCM

(9,0 : 1,0), Hexano : DCM (8,0 : 2,0), Hexano : DCM (7,0 : 3,0), Hexano : DCM (6,0 :

4,0), Hexano : DCM (1,0 : 1,0), Hexano : DCM (100%), DCM : Metanol (9,0 : 1,0),

DCM : Metanol (8,0 : 2,0), DCM : Metanol (7,0 : 3,0), DCM : Metanol (6,0 : 4,0), DCM

RAIZ C.Limon (R1C)

Extrato Dicloro-

Hexânico

PC2

PC2.1 PC2.2 PC2.3 PC2.4

Estudo Fitoquímico do C. limonia

: Metanol (1,0 : 1,0) e Metanol (100%). Obteve-se 36 frações, as quais foram

reunidas em 18 frações [PC2.1.2, 1-18], de acordo a similaridade em R

apresentada na análise por CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram

compostos interessantes em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.1-6 (m = 0,4135 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC2.1.3), DI 2,5 cm x h 26,5 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (9,5 : 0,5), Hexano : Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de

Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de Etila (7,0 : 3,0), Hexano: Acetato de Etila (6,0 :

4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 : 1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila :

Metanol (9,0 : 1,0), Acetato de Etila : Metanol (8,0 : 2,0), Acetato de Etila : Metanol

(1,0 : 1,0) e Metanol (100%). Obteve-se 100 frações, as quais foram reunidas por

CCDC, segundo a sua similaridade em Rf, em 24 outras [PC2.1.3, 1-24]. Através dos

espectros de RMN

H, identificou-se na fração PC2.1.3-10 uma flavanona (flavonóide

F2) e nas frações PC2.1.3-4, PC2.1.3-7, PC2.1.3-17, PC2.1.3-19 quatro cumarinas,

sendo duas delas a C1 (PC2.1.3-7) e a C2 (PC2.1.3-4), as quais já haviam sido

isoladas anteriormente na fração 1, e outras duas, C4 (PC2.1.3-17) e C5 (PC2.1.3-

19), não isoladas até o momento.

> A fração PC2.1-8 (m = 0,0182 g) foi submetida à Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência em fase reversa (CLAE-R) (PC2.1.4), utilizando uma coluna C18

(ODS - octadecilsilano), DI 2,0 cm x h 25,0 cm, eluída com: Metanol : Água (7,0 :

3,0), em uma vazão de fluxo de 5 ml/min, loop 2.000 µL, realizando reciclo na

coluna. Obteve-se 14 frações [PC2.1.4, 1-14H], as frações foram agrupadas de

acordo a análise por CCDC. A partir dos dados de RMN 400 MHz (1D e 2D),

verificou-se que a fração PC2.1.4-13H correspondia ao flavonóide F1.

 Refracionamento da fração PC2.1.1:

> A fração PC2.1.1-5 (m = 16,1 mg) foi submetida à CLAE-R (PC2.1.1.1),

utilizando uma coluna fenil, DI 2,5 cm x h 50,0 cm, eluída com: Metanol : Água (7,0 :

PC2.1

PC2.1.1 PC2.1.2 PC2.1.3 PC2.1.4

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3,0), em uma vazão de fluxo de 2 mL/min, loop 400 µL, realizando reciclo na coluna.

Obteve-se 5 frações [PC2.1.1.1, 1-5H], as frações foram agrupadas de acordo com a

CCDC. Através dos espectros de RMN

H 200 MHz, identificou-se na fração

PC2.1.1.1-4 novamente o flavonóide F2.

> A fração PC2.1.1-4 (m = 9,1 mg) foi submetida à CCDC (PC2.1.1.2),

utilizando uma coluna de sílica, DI 1,5 cm x h 14,0 cm, eluída com: Hexano :

Isopropanol (9,5 : 0,5), em uma vazão de fluxo de 2 mL/min, loop 400 µL,

comprimento de onda: 265 e 354 nm. Obteve-se 4 frações [PC2.1.1.2, 1-4], as

frações foram agrupadas de acordo com a CCDC. Estas foram descartadas, pois

não apresentaram compostos interessantes em quantidades suficientes para outros

refracionamentos.

 Refracionamento da fração PC2.1.1.1:

> A fração PC2.1.1.1-2H (m = 2,3 mg) foi submetida à CLAE-R (PC2.1.1.1.1),

utilizando uma coluna C18, DI 2,0 cm x h 25,0 cm, eluída com: Metanol : Água (7,0 :

3,0) em uma vazão de fluxo de 5 mL/min, loop 2000 µL, realizando reciclo na coluna.

Obteve-se 6 frações [PC2.1.1.1.1, 1-6H], as frações foram agrupadas de acordo

com a análise realizada por CCDC. Estas foram descartadas, pois não

apresentaram compostos interessantes em quantidades suficientes para outros

refracionamentos.

 Refracionamento da fração PC2.1.3:

> A fração PC2.1.3-11 (m = 0,0067 g) foi submetida à CLAE-R (PC2.1.3.1),

utilizando uma coluna fenil, DI 2,5 cm x h 50,0 cm, eluída com: Metanol : Água (7,0 :

3,0), em uma vazão de fluxo de 2 mL/min, loop 400 µL, realizando reciclo na coluna.

PC2.1.1

PC2.1.1.1 PC2.1.1.2

PC2.1.1.1.1

Estudo Fitoquímico do C. limonia

Obteve-se 9 frações [PC2.1.3.1, 1-9H], as quais foram agrupadas de acordo a

análise por CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos

interessantes em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.1.3-5 (m = 26.6 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC2.1.3.2), DI 2,0 cm x h 23,0 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de

Etila (6,0 : 4,0), Acetato de Etila : Metanol (9,0 : 1,0), Acetato de Etila : Metanol (1,0 :

1,0) e Metanol (100%). Obteve-se 17 frações, as quais foram reunidas em 11

frações [PC2.1.3.2,1-11], após análise de CCDC. Através do espectro de RMN

H da

fração PC2.1.3.2-2, verificou-se que esta substância era uma cumarina, C2, a qual já

havua sido isolada anteriormente.

> A fração PC2.1.3-16 (m = 16,0 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC2.1.3.3), DI 1,5 cm x h 14,0 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (9,5 : 0,5), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de

Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 :

1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 : 1,0), Metanol (100%).

Obteve-se 24 frações, as quais foram reunidas em 15 outras [PC2.1.3.3,1-15] por

análise da CCDC. A partir da análise do espectro de RMN

H da subfração

PC2.1.3.3-9, identificou-se a cumarina C6.

> A fração F2.1.3-15 (m = 128,5 mg) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.1.3.4), DI 2,0 cm x h 54,0 cm, eluída com Metanol. Obteve-se 11 frações, as

quais foram reunidas em 7 frações [PC2.1.3.4,1-7] por análise de CCDC. Estas

foram descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes em

quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.1.3-13 (m = 50,0 mg) foi submetida à CLAE-R (PC2.1.3.5),

utilizando uma coluna fenil, DI 2,5 cm x h 50,0 cm, eluída com: Metanol : Água (7,0 :

3,0), em uma vazão de fluxo de 2 mL/min, comprimento de onda 254 e 365 nm.

Primeiramente, fez-se a corrida pelo modo analítico e para isto utilizou-se um loop

de 20 µL, em seguida utilizou-se o modo preparativo com um loop de 400 µL. Foram

necessárias 5 injeções, pois caso contrário haveria possibilidade de saturar a

coluna, devido a quantidade de amostra injetada. Obteve-se 7 frações [PC2.1.3.5, 1-

7], as quais foram agrupadas de acordo a análise por CCDC. Estas foram

descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes em quantidades

suficientes para outros refracionamentos.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

> A fração PC2.1.3-20 (m = 54,2 mg) foi submetida à Cromatografia em

Camada Delgada Preparativa (CCDP) (PC2.1.3.6), placa 20 cm x 20 cm, fase móvel:

Hexano: Acetato de Etila 8,0 : 2,0. Obteve-se 2 manchas distintas, as quais foram

removidas da placa e filtradas separadamente [PC2.1.3.6,1-2]. Estas foram

descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes em quantidades

suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.1.3-10 (m = 8,1 mg) foi submetida à CCDP (PC2.1.3.7), placa

20 cm x 20 cm, fase móvel: Hexano : Acetato de Etila (9,0 : 1,0). Obteve-se 4

manchas distintas, as quais foram removidas da placa e filtradas separadamente

[PC2.1.3.7,1-4]. Foram realizadas duas aplicações da amostra na placa preparativa,

para que não houvesse saturação da mesma. A partir da análise dos espectros de

RMN

H verificou-se que a fração PC2.1.3.7-3 correspondia ao flavonóide F2

purificado.

 Refracionamento da fração PC2.1.3.2:

> A fração PC2.1.3.2-2 (m = 22,9 mg) foi submetida à CCDP (PC2.1.3.2.1),

placa 20 cm x 20 cm, fase móvel: Hexano : Acetato de Etila (7,0 : 3,0). Foi realizada

duas aplicações. Obteve-se 3 manchas distintas em cada aplicação, as quais foram

removidas da placa e filtradas [PC2.1.3.1,1-3]. Através do espectro de RMN

H da

fração PC2.1.3.2.1-2, verificou-se que esta correspondia a cumarina C2 purificada.

> A fração PC2.1.3.2-3 (m = 3,7 mg) foi submetida à CLAE-R (PC2.1.3.2.2),

utilizando uma coluna C18 preparativa, DI 2,0 cm x h 25,0 cm, eluída com: Metanol :

Água (6:4), com uma vazão de fluxo de 5 mL/min, loop 1000 µL, realizando reciclo

na coluna, usando os comprimentos de onda 217 e 254 nm. Obteve-se 4 frações

[PC2.1.3.2.2, 1-4], as frações foram agrupadas de acordo com a análise realizada

PC2.1.3

PC2.1.3.1

PC2.1.3.2

PC2.1.3.3

PC2.1.3.4

PC2.1.3.5

PC2.1.3.6

PC2.1.3.7

Estudo Fitoquímico do C. limonia

por CCDC. Através do espectro de RMN

H da fração PC2.1.3.2.2-1, verificou-se

que esta correspondia a cumarina C2 purificada.

 Refracionamento da fração PC2.3:

> A fração F2.3-4 (m = 1,0173 g) foi submetida à CC: Coluna Sephadex LH-

20, (PC2.3.1), DI 2,5 cm x h 101,5 cm, eluída com DCM : Metanol (1:1). Obteve-se

20 frações, as quais foram reunidas em 12 frações [PC2.3.1,1-12] por análise de

CCDC. Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas posteriormente.

> A fração F2.3-5 (m = 0,0441 g) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.3.2), DI 3,2 cm x h 64,0 cm, eluída com DCM : Metanol (1:1). Obteve-se 15

frações, as quais foram reunidas em 8 frações [PC2.3.2,1-8] por análise de CCDC.

Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas posteriormente.

 Refracionamento da fração PC2.3.2:

> A fração PC2.3.2-3 (m = 9,4 mg) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.3.2.1), DI 2,0 cm x h 55,0 cm, eluída com Metanol 100%. Obteve-se 20

frações, as quais foram reunidas em 6 outras [PC2.3.2.1,1-6] por análise de CCDC.

Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas posteriormente.

 Refracionamento da fração PC2.3.2.1:

> A fração PC2.3.2.1-1 (m = 7,1 mg) foi submetida à CLAE-R (PC23-

2.3.2.1.1), utilizando uma coluna polimérica, DI 2,5 cm x h 50 cm, eluída com

Metanol : DCM (9:1), em uma vazão de fluxo de 2 mL/min, loop 1000 µL, realizando

reciclo na coluna. Obteve-se 3 frações [PC2.3.2.1.1, 1-3], as quais foram agrupadas

de acordo com a análise realizada por CCDC. Estas foram descartadas, pois não

PC2.1.3.2

PC2.1.3.2.1 PC2.1.3.2.2

Estudo Fitoquímico do C. limonia

apresentaram compostos interessantes em quantidades suficientes para outros

refracionamentos.

 Refracionamento da fração PC2.3.1:

> A fração PC2.3.1-7 (m = 49,8 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC2.3.1.1), DI 2,5 cm x h 28,0 cm, eluída com Hexano 100%, Hexano :

Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de

Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 :

1,0), Acetato de Etila 100%, Acetato de Etila: Metanol (1,0 : 1,0) e Metanol 100%.

Obteve-se 26 frações, as quais foram reunidas em 12 outras [PC2.3.1.1,1-12] por

análise de CCDC. A partir da análise dos espectros obtidos por RMN (1D e 2D)

verificou-se que a fração PC2.3.1.1-4 correspondia a cumarina C8.

> A fração PC2.3.1-9 (m = 0,2652 g) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.3.1.2), DI 3,0 cm x h 55,0 cm, eluída com Metanol 100%. Obteve-se 40

frações, as quais foram reunidas em 13 outras [PC2.3.1.2,1-13] por análise de

CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes

em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.3.1-9 (cristais solúveis em DCM e insolúveis em Metanol com

m = 0,0678 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400 Mesh), (PC2.3.1.3), DI 2,5 cm

x h 35,0 cm, eluída com Hexano 100%, Hexano : Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano

: Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato

de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 : 1,0), Acetato de Etila 100%,

Acetato de Etila: Metanol (1,0 : 1,0) e Metanol 100%. Obteve-se 17 frações, as quais

foram reunidas em 12 outras [PC2.3.1.3,1-12] por análise de CCDC. Estas foram

PC2.3

PC2.3.2 PC2.3.1

PC2.3.2.1 PC2.3.2.1.1

Estudo Fitoquímico do C. limonia

descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes em quantidades

suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.3.1-8 (m = 0,538 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC2.3.1.4), DI 3,0 cm x h 40,0 cm. Eluída com Hexano 100%, Hexano :

Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de

Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 :

1,0), Acetato de Etila 100%, Acetato de Etila : Metanol (9,0 : 1,0), Acetato de Etila :

Metanol (8,0 : 2,0), Acetato de Etila: Metanol (7,0 : 3,0), Acetato de Etila: Metanol

(6,0 : 4,0), Acetato de Etila: Metanol (1,0 : 1,0) e Metanol 100%. Obteve-se 44

frações, as quais foram reunidas em 21 outras [PC2.3.1.4,1-21] por análise de

CCDC. Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas posteriormente.

 Refracionamento da fração PC 2.3.1.1:

> A fração PC2.3.1.1-2 (m = 9,4 mg) foi submetida à CCDP (PC2.3.1.1.1), 20

cm x 20 cm, eluída com Hexano : Acetato de Etila (9,0 : 1,0). Obteve-se 3 manchas

distintas, as quais foram removidas da placa e filtradas [PC2.3.1.1.1,1-3]. Através

dos espectros de RMN 200MHz, identificou-se na fração PC2.3.1.1.1-2 a cumarina

C1 e na fração PC2.3.1.1.1-1 a cumarina C2.

 Refracionamento da fração PC2.3.1.4:

> A fração PC2.3.1.4-4 (m = 62,0 mg) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.3.1.4.1), DI 3,0 cm x h 48,0 cm, eluída com Metanol DCM (1:1). Obteve-se 3

frações [PC2.3.1.4.1,1-3] por análise de CCDC. Estas foram descartadas, pois não

PC2.3.1

PC2.3.1.1

PC2.3.1.2 PC2.3.1.3

PC2.3.1.4

PC2.3.1.1.1

Estudo Fitoquímico do C. limonia

apresentaram compostos interessantes em quantidades suficientes para outros

refracionamentos.

> A fração PC2.3.1.4-11 (m = 27,3 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-

400 Mesh) (PC2.3.1.4.2), DI 2,0 cm x h 31,0 cm, eluída com Hexano 100%, Hexano

: Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato

de Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila

(1,0 : 1,0), Acetato de Etila 100%, Acetato de Etila : MeOH (1,0 : 1,0) e MeOH 100%.

Obteve-se 19 frações, as quais foram reunidas em 12 outras [PC2.3.1.4.2,1-12] por

análise de CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos

interessantes em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.3.1.4-12 (m = 1,0189 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-

400 Mesh), (PC2.3.1.4.3), DI 3,0 cm x h 45,0 cm. Eluída com Hexano 100%, Hexano

: Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato

de Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila

(1,0 : 1,0), Acetato de Etila 100%, Acetato de Etila: Metanol (1,0 : 1,0) e Metanol

100%. Obteve-se 9 frações, as quais foram reunidas em 4 outras [PC2.3.1.4.3,1-4]

por análise de CCDC. Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas

posteriormente.

> A fração PC2.3.1.4-6 (m = 0,1005 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-

400 Mesh), (PC2.3.1.4.4), DI 2,5 cm x h 37,0 cm, eluída com Hexano 100%, Hexano

: Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato

de Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila

(1,0 : 1,0), Acetato de Etila 100%, Acetato de Etila : Metanol (1:1) e Metanol 100%.

Obteve-se 28 frações, as quais foram reunidas em 14 outras [PC2.3.1.4.4,1-14] por

análise de CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos

interessantes em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.3.1.4-10 (m = 8,5 mg) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.3.1.4.5), DI 2,0 cm x h 53,0 cm, eluída com Metanol: DCM (1:1). Obteve-se 8

frações, as quais foram reunidas em 3 outras [PC4.3.1.4.5,3-8] por análise de

CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes

em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.3.1.4-12 (m = 10,3 g) foi submetida à CC: Sephadex LH-20,

(PC2.3.1.4.6), DI 2,5 cm x h 37,0 cm, eluída com Metanol : DCM (1:1). Obteve-se 5

frações, as quais foram reunidas em 4 outras [PC2.3.1.4.6,1-4] por análise de

Estudo Fitoquímico do C. limonia

CCDC. Estas foram descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes

em quantidades suficientes para outros refracionamentos.

> A fração PC2.3.1.4-5 (m = 10,8 mg) foi submetida à CLAE-R (PC2.3.1.4.7),

modo analítico, utilizando uma coluna fenil, DI 0,46 cm x h 25,0 cm, eluída com

Metanol : Água (7,0 : 3,0) em uma vazão de fluxo de 0,25 mL/min, loop 200 µL.

Posteriormente, realizou-se a CLAE-R no modo preparativo, sob mesmas

condições, porém utilizando-se uma coluna fenil, DI 0,60 cm x h 25,0 cm. Foram

realizadas 5 injeções, das quais obteve-se 16 frações [PC2.3.1.4.7, 1-16], as quais

foram agrupadas de acordo com a análise realizada por CCDC. Através dos

espectros de RMN

H, identificou-se na fração PC2.3.1.4.7-16 a cumarina C2 e na

fração PC2.3.1.4.7-14 a cumarina C3.

> A fração PC2.3.1.4-16 (m = 26,8 mg) foi submetida à CLAE-R

(PC2.3.1.4.8), modo analítico, utilizando uma coluna fenil, DI 0,46 cm x h 25,0 cm,

eluída com: Metanol : Água (7,0 : 3,0), num fluxo de 0,25 mL/min, loop 200 µL.

Posteriormente, realizou-se a CLAE-R no modo preparativo, sob mesmas

condições, porém utilizando-se uma coluna fenil, DI 0,60 cm x h 25,0 cm. Foram

realizadas 3 injeções, das quais obteve-se 4 frações [PC2.3.1.4.8, 1-4], as quais

foram agrupadas de acordo com a análise realizada por CCDC. Estas foram

descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes em quantidades

suficientes para outros refracionamentos.

 Refracionamento da fração PC2.3.1.4.3:

> A fração PC2.3.1.4.3-4 (m = 63,4 mg) foi submetida à CLAE-R

(PC2.3.1.4.3.1), modo analítico, utilizando uma coluna fenil, DI 0,46 cm x h 25,0 cm,

eluída com: Metanol : Água (7,0 : 3,0), em uma vazão de fluxo de 0,25 mL/min, loop

PC2.3.1.4

PC2.3.1.4.1

PC2.3.1.4.2

PC2.3.1.4.3 PC2.3.1.4.6

PC2.3.1.4.7

PC2.3.1.4.8

PC2.3.1.4.4 PC2.3.1.4.5

Estudo Fitoquímico do C. limonia

200 µL. Posteriormente, realizou-se a CLAE-R no modo preparativo, sob as

mesmas condições, porém utilizando-se uma coluna fenil, DI 0,60 cm x h 25,0 cm.

Foram realizadas 6 injeções, das quais obteve-se 3 frações [PC2.3.1.4.3.1, 1-3], as

quais foram agrupadas de acordo com a análise realizada por CCDC. Estas foram

descartadas, pois não apresentaram compostos interessantes em quantidades

suficientes para outros refracionamentos.

O Esquema 3.3 representa todos os fracionamentos e refracionamentos

realizados do extrato R1C.

ESQUEMA 3.3: Fracionamento de todo o extrato diclorometânico-hexânico.

RAIZ

C. Limonia

(R1C)

Extrato Diclorometânico-Hexânico

PC2

PC2.1 PC2.2 PC2.3 PC2.4

PC2.1.1 PC2.1.2 PC2.1.4

PC2.1.1.1 PC2.1.1.2

PC2.1.1.1.1

PC2.1.3.6

PC2.1.3.7

PC2.3.2 PC2.3.1

PC2.3.2.1

PC2.3.2.1.1

PC2.3.1.3

PC2.3.1.2

PC2.3.1.4.1

PC2.3.1.4

PC2.3.1.4.2

PC2.3.1.4.4

PC2.3.1.4.3

PC2.3.1.4.6

PC2.3.1.4.7

PC2.3.1.4.8

PC2.3.1.4.5

PC2.3.1.1 PC2.3.1.1.1

PC2.1.3.1

PC2.1.3.3

PC2.1.3.4 PC2.1.3.5

PC2.1.3.2

PC2.1.3.2.1 PC2.1.3.2.2

PC2.3.1.4.3.1

PC2.1.3

Estudo Fitoquímico do C. limonia

O Esquema 3.4 mostra os refracionamentos realizados até a obtenção das

substâncias isoladas.

ESQUEMA 3.4: Fracionamento do extrato diclorometânico-hexânico até a obtenção

das substâncias isoladas.

Cumarina C2

Flavonóide 01

PC2.3.1.4.1.7

Cumarina C3

PC2

Extrato hexano-

dicloro

PC2.1

PC2.1.3

Cumarina C1

Cumarina C2 Cumarina C4

Cumarina C5

Flavonóide F2

PC2.1.3.3

Cumarina C6

PC2.1.4

Flavonóide F1

PC2.1.1 PC2.1.1.1

Flavonóide F2

uro

PC2.1.3.2

PC2.1.3.7

PC2.3 PC2.3.1

PC2.3.1.4

PC2.3.1.1

PC2.3.1.1.1

Cumarina C1

Cumarina C2

Cumarina C8

PC2.1.3.2

Cumarina C2

ura

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.1.3.3. Extrato Metanólico da R1C

O extrato metanólico da raiz terminal de C.limonia (m = 13,7204 g) foi

submetido à um fracionamento, utilizando-se uma coluna de Sephadex LH-20,

(PC3), com DI 4,5 cm x h 130,0 cm, a qual foi eluída com: Metanol (100%),

Metanol:DCM (1:1) e DCM (100%). Obteve-se 61 frações, as quais foram reunidas

em 3 outras (PC3,1-3) após a análise de CCDC.

 Refracionamento da fração PC3:

> A fração PC3-2 (m = 0,6203 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh) (PC3.1), DI 3,5 cm x h 22,5 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (9,5 : 0,5), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de

Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 :

1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 : 1,0), Metanol (100%).

Obteve-se 41 outras, as quais foram reunidas em 24 frações [F16,1-24] por análise

de CCDC. Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas

posteriormente.

 Refracionamento da coluna PC3.1:

> A fração PC3.1-22 (m = 12,6 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC3.1.1), DI 2,5 cm x h 9,5 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (1,0 : 1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 :

1,0), Metanol (100%). Obteve-se 41 frações, as quais foram reunidas em 23 outras

devido à análise de CCDC. Através dos espectros de RMN 200 MHz, e

espectrometria de massas, identificou-se nas frações PC3.1.1-7 e PC3.1.1-4 a

cumarina C7.

> A fração PC3.1-4 (m = 55,3 mg) foi submetida à CCDP (PC3.1.2), 20 cm x

20 cm, eluída com Hexano : Acetato de Etila (9,0 : 1,0). Obteve-se 4 manchas

distintas, as quais foram removidas da placa e filtradas [PC3.1.2,1-3]. Através dos

espectros de RMN 200MHz, identificou-se na fração PC3.1.2-2 a cumarina C1.

> A fração PC3.1-11 (m = 0,3097 g) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC3.1.3), DI 2,5 cm x h 38,0 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Estudo Fitoquímico do C. limonia

Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de

Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 :

1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 : 1,0), Metanol (100%).

Obteve-se 26 frações, as quais foram reunidas em 13 outras [PC3.1.3,1-13] devido à

análise de CCDC. Algumas destas foram descartadas e outras refracionadas

posteriormente.

> A fração PC3.1-5 (m = 42,1 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC3.1.4), DI 2,0 cm x h 30,0 cm. Eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (9,0 : 1,0), Hexano : Acetato de Etila (8,0 : 2,0), Hexano : Acetato de

Etila (7,0 : 3,0), Hexano : Acetato de Etila (6,0 : 4,0), Hexano : Acetato de Etila (1,0 :

1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 : 1,0), Metanol (100%).

Obteve-se 32 frações, as quais foram reunidas em 12 outras [PC3.1.4,1-12] devido à

análise de CCDC. A partir da análise de RMN (1D e 2D) verificou-se que a fração

PC3.1.4-3 correspondia a cumarina C9 e que a fração PC3.1.4-9 referia-se as

cumarinas C5 e C11.

 Refracionamento da fração PC3.1.3:

> A fração PC3.1.3-7 (m = 51,6 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC3.1.3.1), DI 2,0 cm x h 38,0 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (1,0 : 1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 :

1,0), Metanol (100%). Obteve-se 24 frações, as quais foram reunidas em 17 outras

[PC3.1.3.1,1-17] devido à análise de CCDC. Estas foram descartadas, pois não

apresentaram compostos interessantes em quantidades suficientes para outros

refracionamentos.

> A fração PC3.1.3-9 (m = 44,3 mg) foi submetida à CC: Sílica gel (230-400

Mesh), (PC3.1.3.2), DI 2,0 cm x h 42,5 cm, eluída com: Hexano (100%), Hexano :

Acetato de Etila (1,0 : 1,0), Acetato de Etila (100%), Acetato de Etila : Metanol (1,0 :

1,0), Metanol (100%). Obteve-se 10 frações, as quais foram reunidas em 7 outras

[PC3.1.3.2,1-7] devido à análise de CCDC. Estas foram descartadas, pois não

apresentaram compostos interessantes em quantidades suficientes para outros

refracionamentos.

O Esquema 3.5, p.54, representa todo o fracionamento realizado no extrato

metanólico de R1C até a obtenção das substâncias.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

ESQUEMA 3.5: Fracionamento do extrato metanólico até a obtenção das

substâncias isoladas.

Toda a metodologia empregada no estudo fitoquímico, desde a coleta do

material vegetal até a identificação das substâncias, está ilustrada na Figura 3.1 (p.

55).

RAIZ C. limonia (R1C)

Extrato Metanólico

PC3

PC3.1

PC3.1.1

Cumarina

PC3.1.2 PC3.1.4 PC3.1.3 PC3.1.3.1

PC3.1.3.2

Cumarina

C5 e C11

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.1: Metodologia utilizada no Estudo Fitoquímico: extração, purificação e

identificação das substâncias isoladas.

;

CCDP

CLAE

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2. Resultados e Discussão

3.2.1. Determinação Estrutural dos Compostos Isolados

Foram isolados e identificados estruturalmente dezesseis compostos da raiz

do C. limonia (Figura 3.2), sendo onze cumarinas: xantiletina (C1), seselina (C2),

xantoxiletina (C3), 8-diidroxipiranocumarina: trans-kelactona (C4), 6-

diidropiranoxicumarina: trans-decursidinol (C5), 6-metóxi-7-hidroxicumarina:

escopoletina (C6), 6-hidróxi-7-metoxicumarina: isoescopoletina (C7), Éster

kellactona: junosmarina (C8), 6-prenil-7-hidroxicumarina: demetilsuberosina (C9),

clausarina (C10) e 3-hidróxi-2-(1-hidróxi-1-metiléter)-2,3-dihidrofurano[3,2-g]cromen-

7-ona: xantoarnol (C11); dois flavonóides, sendo uma flavona: 4’,5-dihidroxi-

2’’2’’dimetilpirano (5”,6”:7,8)flavona: limonianina (F1) e uma flavanona: 5,4’-diidróxi-

6-(3”’-metil-2”’-butenil)-2”,2”-dimetilpirano(5’’,6’’:7,8)(flavanona (F2); e três

esteróides, β-sitosterol (E1), estigmasterol (E2) e campesterol (E3).

OOO

OMe

OOO

Xantiletina (C1) Seselina (C2) Xantoxiletina (C3)

OOO

trans-Kelactona (C4) trans-Decursidinol (C5)

Estudo Fitoquímico do C. limonia

OOHO

MeO

Escopoletina (C6) Isoescopoletina (C7)

Junosmarina (C8) Clausarina (C10)

HO O

Demetilsuberosina (C9) Xantoarnol (C11)

Limonianina (F1)

5,4’-diidróxi-6-(3”’-metil-2”’-butenil)-7,8-(2”,2”-dimetilpirano)flavanona (F2)

OH O

Estudo Fitoquímico do C. limonia

Sitosterol (E1) Estigmasterol (E2)

Campesterol (E3)

FIGURA 3.2: Substâncias isoladas da raiz terminal de C. limonia.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2.1.1. Determinação estrutural da Cumarina C1

Foi isolado 15,7 mg da cumarina C1 na subfração PC1-4. Analisando-se o

espectro de RMN

H (Figura 3.4, p.61), observa-se os sinais característicos de

cumarinas, como a presença de dois dubletos com deslocamentos químicos (δ) 7,57

(J = 9,4 Hz, 1H) e 6,21 (J = 9,4 Hz, 1H) referentes aos sinais dos hidrogênios H-4 e

H-3, respectivamente. O sinal de H-4 encontra-se menos blindado (campo mais

alto), devido a conjugação da ligação dupla com a carboxila da lactona.

A presença de dois dubletos em δ 6,33 (J = 10,0 Hz, 1H) e δ 5,67 (J = 10,0

Hz, 1H), e de um singleto em δ 1,46 (6H), são característicos de um anel pirano. O

sinal do H-3’ (δ 5,67) apresenta-se mais blindado, pois há conjugação dos pares de

elétrons do sistema aromático com a ligação dupla do anel pirano. Pode-se dizer

que este anel encontra-se nas posições 6 e 7, devido à presença de dois singletos

com δ 6,71 (1H) e δ 7,03 (1H), referentes aos sinais dos hidrogênios 8 e 5,

respectivamente. O sinal do H-8 é o mais blindado, pois encontra-se vizinho a dois

carbonos contendo oxigênio como substituinte. Os sinais observados no espectro de

hidrogênio foram comparados com a literatura

(STECK, 1971), conforme ilustrado na

Tabela 3.2, p.60.

Realizou-se o experimento de RMN C

(Figura 3.6, p.62), onde atribui-se os

deslocamentos químicos de cada sinal ao carbono correspondente e verificou-se

que os sinais observados são bem próximos aos encontrados na literatura (STECK,

1971). Com estes dados pode-se concluir que a cumarina isolada corresponde a

Xantiletina.

OOO

FIGURA 3.3: Estrutura da cumarina Xantiletina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.2: Dados de RMN H

(CDCl

, 200 MHz) e C

(CDCl

, 200 MHz) da

cumarina C1 em comparação com os dados da literatura.

Posição

δH

J (Hz)

δC δ

J* (Hz)

δC*

2 - - 161,1 - - 161,2

3 6,21 (d) 9,4 131,2 6,22 (d) 9,2 131,2

4 7,57 (d) 9,4 143,3 7,59 (d) 9,2 143,4

4a - - 112,7 - - 112,7

5 7,03 (s) - 124,7 7,05 (s) - 124,8

6 - - 118,5 - - 118,5

7 - - 156,8 - - 156,8

8 6,71 (s) - 120,7 6,72 (s) - 120,8

8a - - 155,4 - - 155,4

2’ - - 77,6 - - 77,7

3’ 5,67 (d) 10,0 104,3 5,69 (d) 9,6 104,4

4’ 6,33 (d) 10,0 112,9 6,34 (d) 9,6 113,0

5’ - 6’ 1,46 (s) - 28,3 1,46 (s) - 28,3

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura (STECK, 1971).

A partir da comparação dos espectros de RMN

H da cumarina C1 e das

frações PC2.1.3-7, PC2.3.1.1.1-2, PC3.1-4M, PC3.1.2-4M, concluiu-se que todas

estas correspondem a Xantiletina, totalizando 0,2922 g desta cumarina, a qual já

havia sido isolada anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C.

limonia.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.4: Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1.

FIGURA 3.5: Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.6: Espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1.

FIGURA 3.7: Ampliação do espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C1.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2.1.2. Determinação estrutural da Cumarina C2

Obteve-se 4,0 mg da cumarina C2 na subfração PC1-2 e, a partir do espectro

de RMN

H (Figura 3.9, p.65), verificou-se os sinais de dois dubletos em δ 7,58 (J =

9,6 Hz, 1H) e δ 6,20 (J = 9,6 Hz, 1H), referentes aos hidrogênios H-4 e H-3,

respectivamente, os quais são característicos de cumarina. Observou-se também os

sinais característicos do anel pirano, dois dubletos em δ 6,86 (J = 10,0 Hz, 1H) e δ

5,71 (J = 10,0 Hz, 1H); e um singleto em δ 1,45 (6 H). A presença de dois dubletos

em δ 7,19 (H-5, 1H) e δ 6,70 (H-6, 1H) com constante “orto” J = 8,4 Hz, sugerem que

o anel pirano encontra-se na posição 7 e 8. Comparou-se os sinais no espectro de

hidrogênio com a literatura (AHMAD, 1984), os quais encontram-se ilustrados na

Tabela 3.3, p.64.

Realizou-se o experimento de RMN

C (Figura 3.11, p.66), onde os sinais

observados foram bem próximos aos relatados na literatura (Tabela 3.3, p.64). Com

estes dados pode-se concluir que a cumarina isolada corresponde a Seselina.

OOO

FIGURA 3.8: Estrutura da cumarina Seselina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.3: Dados de RMN H

(CDCl

, 200 MHz) e C

(CDCl

, 200 MHz) da

cumarina C2 em comparação com os dados da literatura.

Posição

δH

J (Hz)

δC δ

(Hz)

δC*

2 - - 161,0 - - 161,1

3 6,20 (d) 9,6 130,7 6,23 (d) 9,6 130,7

4 7,58 (d) 9,6 143,9 7,60 (d) 9,6 143,9

4a - - 109,3 - - 109,4

5 7,19 (d) 8,4 127,7 7,21 (d) 8,4 127,7

6 6,70 (d) 8,4 115,0 6,72 (d) 8,4 115,0

7 - - 156,3 - - 156,4

8 - - - - - 122,6

8a - - 150,1 - - 150,1

2’ - - 77,6 - - 77,6

3’ 5,71 (d) 10,0 112,6 5,73 (d) 10,0 112,6

4’ 6,86 (d) 10,0 113,5 6,89 (d) 10,0 113,5

5’-6’ 1,45 (s) - 28,1 1,48 (s) - 28,1

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura (AHMAD, 1984).

Comparando-se o espectro de RMN

H da cumarina C2 com os

espectros das frações PC2.1.3-4, PC2.1.3.2-2, PC2.3.1.4.4-2, PC2.3.1.4.7-16 e

PC3.1.2-1M, concluiu-se que todas estas frações correspondem a mesma

cumarina, portanto, isolou-se um total de 129,4 mg de seselina. . Esta substância

não havia sido isolada anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C.

limonia.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.9: Espectro de RMN

H (CDCl

, 200MHz) da cumarina C2.

FIGURA 3.10: Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 200MHz) da cumarina C2.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.11: Espectro de RMN

C (CDCl

, 200MHz) da cumarina C2.

FIGURA 3.12: Ampliação do espectro de RMN

C (CDCl

, 200MHz) da cumarina

C2.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2.1.3. Determinação estrutural da Cumarina C3

Foi isolado 0,8 mg da cumarina C3 na subfração PC2.3.1.4.7-14. A partir do

espectro de RMN

H (Figura 3.14, p.68) observa-se alguns sinais característicos das

cumarinas, como a presença de dois dubletos em δ 7,83 (J = 10,0 Hz, 1H) e δ 6,19

(J = 10,0 Hz, 1H), referentes aos hidrogênios H-4 e H-3, respectivamente.

A presença de dois dubletos em δ 6,56 (J = 10,0 Hz, 1H) e δ 5,69 (J = 10,0

Hz, 1H), e de um singleto em δ 1,45 (6H), são característicos de um anel pirano.

Pode-se dizer que este anel encontra-se nas posições 6 e 7, devido à presença de

um singleto com δ 6,54 referente ao H 8 e a um outro singleto, integrando para três

hidrogênios, com δ 3,85 característico de uma metoxila, a qual encontra-se na

posição 5. O sinal em δ 6,54 foi atribuído ao H-8 por comparação com os dados da

Xantoxiletina, onde este deslocamento é mais blindado em relação a H-5. Os sinais

observados no espectro de hidrogênio foram comparados com a literatura, conforme

ilustrado na Tabela 3.4, p.68, e indicaram a presença da Xantoxiletina, a qual já

havia sido isolada anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C.

limonia.

OOO

OMe

FIGURA 3.13: Estrutura da cumarina Xantoxiletina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.4: Dados de RMN H

(CDCl

, 200 MHz) da cumarina C3 em comparação

com os dados da literatura.

Posição

δH

J (Hz)

J* (Hz)

3 6,19 (d) 10,0 6,19 (d) 9,5

4 7,83 (d) 10,0 7,86 (d) 9,5

5 (OMe) 3,85 (s) - 3,86 (s) -

8 6,55 (s) - 6,56 (s) -

3’ 5,69 (d) 10,0 5,71 (d) 10,2

4’ 6,56 (d) 10,0 6,51 (d) 10,2

5’-6’ 1,45 (s) - 1,46 (s) -

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura (VRKOC, 1972).

FIGURA 3.14: Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da Xantoxiletina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2.1.4. Determinação estrutural da Cumarina C4 e da Cumarina C5

A cumarina C4 foi isolada na subfração PC2.1.3-17 e apresentou uma

quantidade de massa correspondente a 4,3 mg. O espectro de RMN

H (Figura 3.17,

p.81), utilizando-se como solvente CDCl

, apresentou sinais característicos de

cumarinas, como os dois dubletos em δ 7,67 (J = 9,5 Hz, 1H) e δ 6,26 (J = 9,5 Hz,

1H), referentes aos hidrogênios H-4 e H-3. Observou-se também a presença de dois

dubletos em δ 7,32 e δ 6,79 com constante de acoplamento “orto” J = 8,6 Hz,

referentes aos hidrogênios 5 e 6, os quais conferem uma cumarina substituída nas

posições 7 e 8.

A cumarina C5 foi obtida em pequena quantidade (m = 3,6 mg) na subfração

PC2.1.3-19. O espectro de RMN

H (Figura 3.22, p.84) referente a esta cumarina,

usando-se como solvente C

O, mostrou os dois dubletos característicos de

cumarinas em δ 8,02 (J = 9,4 Hz, 1H) e δ 6,31 (J = 9,4 Hz, 1H), referentes aos H-4 e

H-3. Observou-se também a presença de dois singletos em δ 7,85 e δ 6,75,

referentes aos H-8 e H-5, respectivamente, o que indica que a cumarina contém

substituintes na posição 6 e 7. Conforme ilustrado na figura seguinte.

OOR

Os demais sinais observados no espectro de RMN

H indicam que os

substituintes R

e R

, presentes em ambas cumarina, podem corresponder aos

grupamentos 1’,2’,3’-trihidroxi-3’-metilbutil e grupo hidroxila; anel diidropirano; ou

anel diidrofurano. Fazendo-se o espectro de massas, seria possível prever se o

grupo substituinte refere-se a um sistema aberto ou um fechado, pois quando se

fecha o anel a partir do substituinte aberto (-CH(OH)CH(OH)C(CH

)

OH) há uma

Estudo Fitoquímico do C. limonia

perda de dois hidrogênios, ou seja, haveria perda de unidades de massa do pico do

íon molecular. Porém, não se realizou este experimento, pois a quantidade do

composto isolada era muito pequena, e esta técnica destrói a molécula para

identificá-la, e com isso haveria perda de massa dos compostos; portanto, utilizou-se

a técnica de RMN 1 e 2D, a qual não é destrutiva.

Com estas informações e dados, seis cumarinas diferentes podem ser

atribuídas: quatro com a cadeia lateral fechada, duas nas posições 6 e 7 e duas nas

posições 7 e 8; e duas cumarinas com cadeia lateral aberta (uma na posição 6 e

outra na posição 8) e um grupo hidroxila na posição 7 (cumarinas A, B, C, D, E e F).

A seguir encontra-se as seis cumarinas propostas (três angulares e três lineares) e

uma tabela com os respectivos deslocamentos químicos dos três tipos de

substituintes diferentes (cumarinas A, C e D’) (Wu et al., 1994; Vilegas et al., 1993;

Toro et al., 1997). O modelo D não foi encontrado na literatura, assim comparou-se

com os dados da estrutura D’.

OOOH

OOO

Estrutura A Estrutura B

OOO

MeO

Estrutura C Estrutura D Estrutura D’

OOHO

Estrutura E Estrutura F

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.5: Dados de RMN H

das cumarinas C4 e C5 em comparação com os

dados das cumarinas A, C e D’.

δ, J(Hz)

D’

δ, J(Hz)

6,25

(d, J = 9,0)

6,25

(d, J = 9,5)

6,28

(d, J = 9,3)

6,26

(d, J = 9,5)

6,31

(d, J = 9.4)

7,67

(d, J = 9,0)

8,00

(d, J = 9,5)

7,64

(d, J = 9,3)

7,67

(d, J = 9,5)

8,02

(d, J = 9.4)

5 7,64 (s) 7,65 (s) 6,81 (s)

7,32

(d, J = 8,6)

7,85 (s)

6 - - -

6,79

(d, J = 8,6)

8 6,79 (s) 6,91 (s) - - 6,75 (s)

1’

5,46

(dl, J = 2,7)

- - - -

2´

3,48

(dd, J = 7,5,

0,9)

- - - -

3’ -

4,32

(d, J = 6,0)

3,86

(d, J = 6,9)

3,85

(d, J = 6,9)

3,69

(d, J = 8,6)

4’ -

5.26

(dd, J = 6.0)

4,99

(d, J = 6,9)

4,98

(d, J = 6,9)

4.70

(d, J = 8.6)

5’ 1.37 (s) 1.31 (s) 1,35 (s) 1,30 (s) 1.36 (s)

6’ 1.46 (s) 1.35 (s) 1,58 (s) 1,53 (s) 1.58 (s)

1’- OH

3.70

(d, J = 2.7)

- - - -

2’- OH

2.49

(d, J = 7.5)

- - - -

3’- OH 2.35 (s)

6.06

(d, J = 6.0)

- - -

4’- OH - 4.86(s) - - -

OMe 3,90 (s) - - - -

Solvente utilizado: CDCl

Solvente utilizado: C

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.6: Dados de RMN

C da estrutura proposta C e das cumarinas isoladas

C4 e C5.

C *C *C4

*C5

2 160.4 157.2 156.9

3 111.9 112.6 103.9

4 144.8 145.2 144.6

5 125.7 129.2 129.6

6 128.5 114.9 123.7

7 162.8 161.1 160.9

8 97.8 112.4 103.7

9 156.2 155.8 155.8

10 112.8 112.9 113.6

2’ 91.9 79.4 80.9

3’ 71.0 74.4 76.0

4’ 70.1 65.7 69.0

5’ 26.9 24.9 24.6

6’ 26.5 23.4 19.9

*Solvente utilizado: C

A partir da comparação dos espectros de RMN

C (Tabela 3.6) das

substâncias (C4, C5 e C), conclui-se que a substância isolada C5 não corresponde a

estrutura C, pois o espectro obtido não contém o sinal em δ 91,9 correspondente ao

C- 2´ do anel diidrofurano. Apesar da estrutura F não ser encontrada na literatura,

por comparação, pode-se dizer que o composto C4 não possui a estrutura F, pois

também não apresenta no espectro de RMN

C um deslocamento próximo a 91,9.

A estrutura A apresentou na literatura (Wu et al., 1994) apenas o espectro de

RMN

H; não se encontrou os dados do espectro de RMN

C. A referência cita para

o H-1´ um deslocamento químico δ 5,46 (dl, J = 2,7 Hz) e para o H-2’ δ 3,48 (dd, J =

7,5 e 0,9 Hz). No entanto, comparando-se com os dois isômeros isolados

(compostos C4 e C5), o composto C4 possui um sinal em δ 4,98 (d, J = 6,9 Hz) e

outro em δ 3,85 (d, J = 6,9 Hz); e o composto C5 possui um sinal em δ 4,70 (d, J =

8,6 Hz) e outro em δ 3,69 (d, J = 8,6 Hz). A partir destas observações, conclui-se

que ambos compostos isolados não possuem um sistema aberto devido ao

Estudo Fitoquímico do C. limonia

deslocamento correspondente ao H-1’ na estrutura A apresentar uma desblindagem

maior. Como os grupos R1 e R2 são idênticos para as estruturas A e E, os dados de

RMN

H também devem ser; portanto, a substância C5 não deve corresponder a

esta estrutura E. Assim, sugere-se a presença do anel 3´,4´-diidroxidiidropirano

linear para a cumarina C5 (estrutura B) e angular para a cumarina C4.

OOO

8-diidropiranocumarina (C4) 6-diidropiranocumarina (C5)

Há dados na literatura referentes a duas diidroxidiidropirano cumarinas

angulares com estereoquímica distintas, conforme ilustrado na figura abaixo e na

Tabela 3.7, p.74.

OOO

MeO

OOO

Estrutura D’ Estrutura G Estrutura H

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.7: Dados do espectro de RMN

H para as estruturas D, G e H obtidos da

literatura.

C4*

δ, J(Hz)

D’*

δ, J(Hz)

6,26

(d, J = 9,5)

6,28

(d, J = 9,3)

6,26

(d, J = 9,5)

6,26

(d, J = 9,5)

7,67

(d, J = 9,5)

7,64

(d, J = 9,3)

7,67

(d, J = 9,5)

7,67

(d, J = 9,5)

7,32

(d, J = 8,6)

6,81 (s)

7,32

(d, J = 8,6)

7,34

(d, J = 8,6)

6,79

(d, J = 8,6)

6,79

(d, J = 8,6)

6,81

(d, J = 8,6)

6- OMe - 3,89 (s) - -

3´

3,85

(d, J = 6,9)

3,86

(d, J = 6,9)

3,86

(d, J = 6,6)

3,88

(dd, J = 5,0, 6,0)

4´

4,98

(d, J = 6,9)

4,99

(d, J = 6,9)

5,11

(d, J = 6,6)

5,22

(d, J = 5,0)

5´ 1,30 (s) 1,35 (s) 1,31 (s) 1,41 (s)

6´ 1,53 (s) 1,58 (s) 1,53 (s) 1,47 (s)

* Solvente utilizado: CDCl

3 .

Literatura: TORO et al., 1997; IKESHIRO et al., 1992.

TABELA 3.8: Dados do espectro de RMN

para as estruturas D, G e H obtidos da

literatura.

C4** D* G* H*

2 161,1 162,5 161,5 161,2

3 112,6 112,8 112,0 112,1

4 145,2 143,9 144,4 144,3

5 129,2 108,1 128,4 128,6

6 114,9 146,3 114,8 114,9

7 157,2 153,3 156,4 156,6

8 112,4 111,5 111,8 111,1

9 155,8 151,5 154,3 154,6

10 112,9 112,9 112,5 112,2

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.8: Dados do espectro de RMN

para as estruturas D, G e H obtidos da

literatura - Continuação.

2´ 79,4 79,8 79,5 79,1

3´ 74,4 74,7 74,8 71,2

4´ 65,7 66,9 66,4 61,1

5´ 24,9 25,4 25,4 25,3

6´ 23,4 19,9 20,3 21,6

6- OME - 56,5 - -

*Solvente utilizado: CDCl

Solvente utilizado: C

O. Literatura: TORO et al., 1997;

IKESHIRO et al., 1992.

Comparando-se os dados de RMN

C da cumarina C4 (angular) com aqueles

publicados para as estruturas D’, G e H (Tabela 3.8), verifica-se uma maior

proximidade aos dados de D’ e G, principalmente a constante de acoplamento dos

hidrogênios 3’ e 4’ com J próximo a 6,9 Hz e não a 5,0 Hz (estrutura H), indicando

que estes hidrogênios do composto C4 são trans um ao outro.

A estrutura de C4 está indicada na Figura 3.15, no entanto, a conformação

anti é relativa, uma vez que, somente dados de RMN

H e

C não fornecem a

configuração absoluta, para determiná-la é necessário outros experimentos.

OOO

FIGURA 3.15: Estrutura da trans-kelactona.

Os espectros de RMN

H da C4 e C5 foram obtidos em CDCl

em um

aparelho de 400 MHz (Figuras 3.19, p.82, e 3.24, p.85, respectivamente). Porém,

verificou-se que estas cumarinas não apresentavam boa solubilidade em CDCl

Assim, visando dissolver uma maior quantidade para se obter um espectro de RMN

C, preparou-se as amostras em C

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.9: Dados de RMN H

(400 MHz) das cumarinas C4 e C5.

H C4

6.26

(d, J = 9.5)

6.16

(d, J = 9.6Hz)

6.23

(d, J = 9.5)

6.31

(d, J = 9.4)

7.67

(d, J = 9.5)

7.85

(d, J = 9.6Hz)

7,63

(d, J = 9.5)

8.02

(d, J = 9.4)

7.32

(d, J = 8,6)

7.44

(d, J = 8,6)

7.61 (s) 7.85 (s)

6.79

(d, J = 8,6)

6,72

(d, J = 8,6)

- -

8 - - 6.73 (s) 6.75 (s)

3’

3.85

(d, J = 6.9)

3,78

(d, J = 3,0)

3.65

(d, J = 8.9)

3.69

(d, J = 8.6)

4’

4,98

(d, J = 6,9)

4,94

(d, J = 3,0)

4.63

(d, J = 8.9)

4.70

(d, J = 8.6)

5’ 1,30 (s) 1.36 (s) 1.33 (s) 1.36 (s)

6’ 1,53 (s) 1.43 (s) 1.54 (s) 1.58 (s)

*Solvente utilizado: CDCl

Solvente utilizado: C

Quando verifica-se os deslocamentos químicos dos espectros de RMN

(Tabela 3.9) das duas cumarinas nos diferentes solventes, verifica-se uma pequena

alteração nos valores, o que é comum ao modificar o solvente utilizado no

experimento. Porém, um fato interessante foi observado para a cumarina C4, pois

houve uma grande alteração no valor das constantes de acoplamento dos

hidrogênios H-3’ e H-4’ quando trocou-se o solvente de CDCl

(J = 6,9 Hz) para a

O (J = 3,0 Hz). Não é comum ocorrer uma modificação tão relevante quando se

modifica o solvente.

Esta cumarina pode apresentar duas conformações, os hidrogênios nas

posições 3’ e 4’ podem estar trans di-equatoriais ou trans di-axiais um em relação ao

outro. Quando os hidrogênios estão trans di-axiais, a constante de acoplamento é

maior (aproximadamente J = 6,9 Hz), porém quando estão trans di-equatoriais esta

constante é próxima a J = 3,0 Hz. A energia necessária para que a molécula altere

sua conformação é relativamente baixa, por isto a molécula possui um equilíbrio, o

Estudo Fitoquímico do C. limonia

qual pode ser deslocado para ambos os lados. Como a cumarina é linear (C4), o

hidrogênio da hidroxila na posição 4’ faz “Ligação Hidrogênio” com o oxigênio da

lactona formando um anel de 6 membros estável. A partir do modelo molecular,

verifica-se que a conformação trans di-axiais dos hidrogênios é a mais estável para

esta molécula, por isto quando se utiliza clorofórmio como solvente, a constante dos

hidrogênios é J = 6,9 Hz.

OOO

Porém, quando se altera o solvente para a acetona, esta faz “Ligação

Hidrogênio” com a hidroxila da posição 3’ e portanto desloca o equilíbrio para a

molécula com conformação trans di-equatoriais, pois nesta conformação a hidroxila

encontra-se na posição pseudo-axial, portanto acomoda melhor o grupo (acetona)

deixando a molécula mais estável, e com isto a constante detectada passa a ser J =

3,0 Hz.

Solvente CDCl

J = 6,9

Equilibrio deslocado para esta conformação

Acetona J = 3

Equilíbrio deslocado para esta conformaçã

Para verificar se a alteração nas constantes de acoplamento não ocorreu

decorrente a alguma degradação da molécula, realizou-se novamente o experimento

de RMN

H da cumarina C4 utilizando como solvente CDCl

. Os valores obtidos

foram similares ao primeiro experimento com este solvente, ou seja, as constantes

de acoplamento dos H-3’ e H-4’ foram J = 6,9 Hz, o que reforça a hipótese sugerida

acima.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

Foram encontrados na literatura (KONG et al., 2000) dados referentes a duas

diidroxidiidropirano cumarinas lineares com estereoquímica distintas, conforme

ilustrado na figura abaixo e na Tabela 3.10.

OOO

Estrutura I Estrutura J

TABELA 3.10: Dados do espectro de RMN

H para o composto C5, e para as

estruturas I e J obtidos pela literatura.

H C5**

I** J***

3 6,31 (d, J = 9.4) 6,40 (d, J = 9,5) 6,23 (d, J = 9,5)

4 8,02 (d, J = 9.4) 8,05 (d, J = 9,5) 8,01 (d, J = 9,5)

5 7,85 (s) 7,88 (s) 7,73 (s)

8 6,75 (s) 6,88 (s) 6,67 (s)

3’ 3,69 (d, J = 8.6) 3,72 (d, J = 8,5) 3,63 (d, J = 3,5)

4’ 4,70 (d, J = 8.6) 4,73 (d, J = 8,5) 4,73 (d, J = 3,5)

5’ 1,36 (s) 1,43 (s) 1,25 (s)

6’ 1,58 (s) 1,67 (s) 1,40 (s)

** Solvente CD

OD, ***Solvente DMSO. Literatura: KONG et al., 2000.

TABELA 3.11: Dados do espectro de RMN

C para o composto C5, e para as

estruturas I e J obtidos pela literatura.

C C5

I** J***

2 160,9 163,5 161,4

3 113,6 113,7 113,1

4 144,6 146,0 144,4

5 129,6 129,7 129,0

Estudo Fitoquímico do C. limonia

6 123,7 124,5 123,8

7 156,9 157,9 156,5

8 103,7 104,8 103,6

9 155,8 156,4 154,9

10 113,9 114,5 112,7

2’ 80,9 81,7 81,0

3’ 76,0 76,6 75,4

4’ 69,0 69,6 68,5

5’ 19,9 20,0 20,0

6’ 24,6 27,3 27,3

** Solvente CD

OD, ***Solvente DMSO. Literatura: KONG et al., 2000.

O composto C5, assim como a cumarina C4, também apresenta dois centros

quirais (posições 3’ e 4’), ou seja, a molécula pode apresentar duas estereoquímicas

diferentes: cis ou trans. O que define a estereoquímica do composto é a constante

de acoplamento dos hidrogênios; quando estes encontram-se cis, a constante de

acoplamento é menor do que quando estão trans. A partir dos dados de RMN

obtido da cumarina isolada C5, verifica-se que os hidrogênios 3’ e 4’ apresentam J =

8,6 Hz, ou seja, a cumarina C5 apresenta estrutura similar ao compostos I, e

portanto possui configuração relativa trans (Figura 3.16).

OOO

FIGURA 3.16: Estrutura da trans-Decursidinol.

Realizou-se os experimentos de RMN 2D: HMBC, HSQC e COSY para a

cumarina C5 visando confirmar a estrutura proposta. O experimento de COSY

(Figura 3.30, p.88) apresentou as seguintes correlações: H-4 com H-3; H-4’ com H-

3’; H3-6’ com H3-5’. O espectro de HSQC (Figura 3.28, p.87) mostra os

deslocamentos dos carbonos ligados diretamente aos hidrogênios, ou seja, a partir

deste pode-se determinar todos os valores de

C ligados aos hidrogênios da

Estudo Fitoquímico do C. limonia

molécula: H-4 (δ 144,6), H-5 (δ 129,6), H-8 (δ 103,7), H-3 (δ 113,6), H-4’ (δ 69,0), H-

3’ (δ 76,0), H3-6’ e H3-5’ (δ 24,6 e δ 19,9).

A partir do espectro de HMBC (Figura 3.29, p.87), o qual apresenta

correlações entre H e C a três ligações, pode verificar a correlação dos H-4, H-5 e H-

8 com o carbono em δ 155,8, o qual corresponde, portanto, ao carbono 9. O H-4

correlaciona-se com o carbono em δ 160,9, referindo-se ao C2. O H-4 apresenta

correlação ainda com o C5; o H-5 correlaciona-se com o C4.

OOO

Observa-se ainda a correlação entre o H-8 com o C6 e com o C9; e dos H-8 e

H-3 com o carbono em δ 115,0, o qual corresponde ao C10. O H-3 correlacionou-se

a J 1, ou seja, com o carbono diretamente ligado (C3).

OOO

O H-4’ correlacionou-se com o C3’ e C6; o H-3’ correlacionou-se com C4’, C5’

e C6’. Os hidrogênios metílicos e o H-3’ apresentaram correlação com um sinal em δ

80,9, correspondendo ao C2’. Além desta correlação, os hidrogênios H3-5’ e H3-6’

correlacionaram-se entre si e com o C3’.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

Com estas informações, pode-se confirmar os dados comparados com a

literatura, descritos anteriormente, e comprovar que a cumarina C5 é a trans-

Decursidinol.

As cumarinas C4 e C5 não haviam sido isoladas anteriormente das raízes do

enxerto de C. sinensis sobre C. limonia, e segundo levantamento bibliográfico, elas

são inéditas em Citrus e na família Rutaceae; ambas foram isoladas apenas de

Umbeliferae (Apiaceae) (Peucedanum japonicum e Peucedanum decursivum). Um

estudo mais detalhado sobre a estereoquímica dos dióis tanto na estrutura C4

(angular), quanto na C5 (linear) seria necessário para a determinação da

configuração absoluta das moléculas.

FIGURA 3.17: Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina C4.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.18: Ampliação do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C4.

FIGURA 3.19: Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C4.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.20. Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C4.

FIGURA 3.21: Espectro de RMN

C (C

O, 400 MHz) da cumarina C4.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.22: Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina C5.

FIGURA 3.23: Ampliação do Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C5.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.24: Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C5.

FIGURA 3.25: Ampliação A do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C5.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.26: Ampliação B do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C5.

FIGURA 3.27: Espectro de RMN

C (C

O, 200 MHz) da cumarina C5.

200 150 100 50

Acetone-d6

19.867

24.620

28.636

29.407

29.800

30.177

30.570

30.947

69.007

76.056

80.957

103.691

103.920

113.624

123.737

129.146

129.605

144.587

155.815

156.896

160.912

206.184

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.28: Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) da cumarina C5.

FIGURA 3.29: Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) da cumarina C5.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.30: Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) da cumarina C5.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2.1.5. Determinação estrutural da Cumarina C6

A cumarina C6 foi isolada nas subfrações PC2.1.3.3-9 e apresentou uma

massa correspondente a 32,4 mg. Realizou-se para esta amostra experimentos de

RMN 1D (

H e

C) e experimentos de RMN 2D (HMBC, HSQC, NOESY e COSY).

No espectro de RMN

H (Figura 3.33, p.92) observou-se a presença de dois

dubletos em δ 6,28 (J = 9,50 Hz, 1H) e δ 7,61 (J = 9,50 Hz, 1H), referentes aos

hidrogênios H-3 e H-4 respectivamente, característicos de cumarinas. Notou-se

também a presença de dois singletos em δ 6,85 e δ 6,92 correspondentes aos

hidrogênios 5 e 8 e um singleto em δ 3,96 correspondente a uma metoxila.

Os dados não permitem propor a posição exata da metoxila e da hodroxila,

portanto a estrutura proposta para a cumarina pode ser:

OOHO

MeO

OOMeO

A análise do espectro de NOESY (Figura 3.39, p.95) forneceu as seguintes

correlações: δ

H-5

6,85 e δ

OMe

3,96, δ

H-4

7,61 e δ

H-3

6,28, δ

H-3

6,28 e δ

H-4

7,61, δ

H-5

6,85

e δ

H-4

7,61. Através da correlação observada entre o δ

H-5

e o δ

OMe

, pode-se concluir

que a metoxila está na posição 6 e a hidroxila está em 7.

MeO

A partir do espectro de HSQC (Figura 3.36, p.93) pode-se correlacionar os

valores dos deslocamentos químicos de hidrogênio (δ

) com os valores dos

deslocamentos químicos de carbono (δ

) ligados diretamente. Então, os valores de

obtidos foram os seguintes: δ

C-3

113,5, δ

C-4

143,2, δ

C-5

107,5, δ

C-8

103,2 e δ

C-OMe

56,4.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

Com todos os dados obtidos e com o espectro de HMBC (Figura 3.37, p.94)

verificou-se que o H-4 correlaciona-se com δ

161,4, δ

150,3 e δ

107,5 (H-5). A

partir disto e das correlações obtidas pelo HSQC, confirma-se que o δ

C-5

107,5 é o

H-5

6,85 e conseqüentemente que o δ

C-8

103,2 é o δ

H-8

6,2. Observou-se também

através do HMBC as correlações do H-3 com o δ

111,5, do H-5 com o δ

149,7, do

H-8 com o δ

149,7 e com o δ

111,5 e da OMe com o δ

144,0.

Com a análise do espectro de RMN

C (Figura 3.35, p.93), verifica-se que a

molécula possui realmente 10 carbonos, os quais possuem deslocamentos químicos

em 56,4 (OMe), 103,2 (H-8), 107,5 (H-5), 111,5, 113,5 (H-3), 143,2 (H-4), 144,0,

149,7, 150,3 e 161,4. Pode-se dizer que o carbono em δ 161,4 é o lactônico (posição

2), pois é o mais desblindado. O carbono em δ 150,3 corresponde ao C-9, pois

também encontra-se bastante desblindado devido à presença de um oxigênio

adjacente. O carbono em δ 111,5 foi atribuído ao C-10, pois se correlaciona via

HMBC com o H-8 e o H-3, como visto acima. Como a metoxila correlaciona-se com

o carbono em δ 144,0, este foi atribuído ao C-6. Portanto o carbono em δ

149,7

corresponde ao C-7.

Assim, a estrutura da cumarina obtida com os valores dos carbonos

determinados é a seguinte:

111

144

149

150

161

OOHO

MeO

103

107

143

113

FIGURA 3.31: Deslocamentos químicos de

C da cumarina C6.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

TABELA 3.12: Dados de RMN H

e RMN C

(CDCl

400 MHz) da cumarina C6.

Posição

, J (Hz)

2 - 161,4

3 6,28 (d, J = 9,5) 113,5

4 7,61 (d, J = 9,5) 143,2

5 6,85 (s) 107,5

OMe 3,96 (s) 56,4

7 - 149,7

8 6,92 (s) 103,2

9 - 150,3

10 - 111,5

O espectro de COSY (Figura 3.38, p.94) mostrou apenas as correlações dos

hidrogênios H-3 e H-4, o que era esperado, uma vez que estes são os únicos

hidrogênios vizinhos da molécula. Através destas correlações e das análises feitas

anteriormente dos outros espectros, pode-se concluir que a estrutura da cumarina

C6 isolada é a Escopoletina (Figura 3.32). Esta substância não havia sido isolada

anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia.

OOHO

MeO

FIGURA 3.32: Estrutura da Escopoletina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.33: Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

FIGURA 3.34: Ampliação do espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina

C6.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.35: Espectro de RMN

C (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

FIGURA 3.36: Espectro de HSQC (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.37: Espectro de HMBC (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

FIGURA 3.38: Espectro de COSY (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.39: Espectro de NOESY (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

3.2.1.6. Determinação estrutural da Cumarina C7

Os espectros de RMN

H das frações PC3.1.1-4M (Figura 3.40) e PC3.1.1-7M

(Figura 3.41, p.97) são bastante similar ao da PC2.1.3.3-9 (6-metóxi-7-

hidroxicumarina), no entanto, não se pode dizer que correspondem a mesma

cumarina, uma vez que as posições da hidroxila em 7 e da metoxila em 6 nesta

molécula, podem estar invertidas, e isto não é observado no espectro de RMN

Para tal distinção, é necessário utilizar outras técnicas de RMN, como NOESY e

HMBC, conforme foi citado anteriormente, ou então, Espectrometria de Massas de

cada fração, pois provavelmente a cumarina 6-metóxi-7-hidroxicumarina irá se

fragmentar diferentemente da 6-hidróxi-7-metoxicumarina e, portanto, o espectro

resultante terá picos distintos e com intensidades diferentes.

FIGURA 3.40: Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) da cumarina C6.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

FIGURA 3.41: Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) da cumarina C7.

Então, para saber quais das cumarinas correspondia as frações PC3.1.1-4M e

PC3.1.1-7M, e para comprovar, por meio de mais uma técnica, que a fração

PC2.1.3.3-9 é a 6-metóxi-7-hidroxicumarina, realizou-se experimentos de

Espectrometria de Massas para estas frações.

Foi realizado para cada fração o experimento de Electrospray modo negativo

(ES-), uma vez que, a molécula possui hidrogênios ácidos, ou seja, são facilmente

removidos, não sendo necessário, portanto, energia de colisão muita forte, a qual

pode ocasionar uma destruição total da molécula. Fez-se experimentos de íons

obtidos a partir do íon de m/z 191 de cada fração (Figuras 3.42, p.98, 3.43, p.98 e

3.44, p.99), para que se possa obter fragmentos da molécula, e com isto suas

informações estruturais, e conseqüentemente verificar qual sua estrutura química.

Neste caso, o experimento de full-scan não é relevante, pois este mostra apenas

qual a massa da molécula, e isto já se sabe. Variou-se a energia de colisão, para

comparar-se as diferenças nas fragmentações, pois alguns picos aparecem apenas

com energias muito baixas (fragmentos moleculares fáceis de formar), enquanto que

outros aparecem com energias muita alta (fragmentos moleculares difíceis de

formar). A seguir estão mostrados os Espectros de Massas obtidos para cada

Estudo Fitoquímico do C. limonia

fração: PC2.1.3.3-9 (A), PC3.1.1-4M (B) e PC3.1.1-7M (C), utilizando-se energias de

colisão de 30 a 5 eV e o full-scan.

02/12/04

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250

m/z

100

verardi_PC159filhos191_25eV 60 (0.548) Daughters of 191ES-

3.32e4

104.0

91.2

90.9

51.4

79.2

64.9

63.5

67.0

89.1

91.5

103.8

104.5

148.1

120.1

107.2

147.9

135.2

133.2

145.2

163.2

148.5

162.8

161.0

176.1

175.6

176.5

verardi_PC159filhos191_20eV 47 (0.436) Daughters of 191ES-

5.65e4

163.2

162.9

148.2

104.2

91.4

79.2

51.3

95.1

147.6

119.1107.4

135.2

148.5

161.3

176.0

163.5

175.8

191.3

verardi_PC159filhos191_15eV 61 (0.558) Daughters of 191ES-

9.12e4

176.1

163.2

148.5

104.0

91.3

79.0

95.1

135.2

107.2

119.1

163.5

191.1

190.7

verardi_PC159filhos191_10eV 56 (0.514) Daughters of 191ES-

1.63e5

191.1

176.1

162.9

176.5

verardi_PC159filhos191_5eV 34 (0.323) Daughters of 191ES-

1.96e5

191.3

190.9

176.1

verardiPC159 38 (0.359) Scan ES-

5.61e6

245.1

62.4

191.2

62.5

89.4

69.1

190.6

177.2

112.9

97.1

136.5 161.0

189.2

205.2

221.3

243.5

231.5

FIGURA 3.42: Espectro de Massas (ES-) dos íons de m/z 191,3 (M-H) da fração A.

02/12/04

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250

m/z

100

verardi_F174filhos191_20eV 101 (0.906) Daughters of 191ES-

2.93e5

176.0

148.2

104.2

120.2

verardi_F174filhos191_15eV 42 (0.393) Daughters of 191ES-

4.73e5

176.2

148.2

104.1

191.1

verardi_F174filhos191_10eV 32 (0.305) Daughters of 191ES-

2.97e5

176.3

148.4

191.2

verardi_F174filhos191_5eV 87 (0.783) Daughters of 191ES-

4.55e5

191.2

176.3

verardi_F174 45 (0.420) Scan ES-

2.12e7

191.2

62.2

176.2

89.0

245.1

FIGURA 3.43: Espectro de Massas (ES-) dos íons de m/z 191,3 (M-H) da fração B.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

02/12/04

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250

m/z

100

verardi_F177filhos191_20eV 47 (0.436) Daughters of 191ES-

1.63e4

176.1

104.2

148.1

120.3

verardi_F177filhos191_15eV 44 (0.409) Daughters of 191ES-

1.76e5

176.3

148.4

103.9

176.4

190.9

verardi_F177filhos191_10eV 50 (0.462) Daughters of 191ES-

1.21e5

176.2

147.9

191.2

190.8

190.6

verardi_F177filhos191_5eV 87 (0.784) Daughters of 191ES-

1.55e5

191.1

190.9

176.2

191.4

verardi_F177 78 (0.706) Scan ES-

1.12e7

62.2

62.5

191.2

89.4

175.9 237.1

FIGURA 3.44: Espectro de Massas (ES-) dos íons de m/z 191,3 (M-H) da fração C.

Observa-se que os espectros das frações B (Figura 3.43, p.98) e C (Figura

3.44) são muito parecidos em número e intensidade dos fragmentos, mesmo em

diferentes energias de colisão, com isto podemos inferir que ambas frações

correspondem a mesma cumarina. Os espectros da fração A possuem alguns pico

semelhantes as demais, no entanto apresenta o pico com m/z 163, 135 e 91, os

quais não são observados nos espectros das demais frações. Com isto, há uma

evidência de que são cumarinas distintas, uma vez que os espectros possuem picos

diferentes. Então se propôs os fragmentos moleculares de cada cumarina e as

fragmentações que as diferenciam (Esquema 3.6, p.100 e 101).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

100

m/z 163

-CO

MeO

m/z 191

m/z 192

MeO

HO OO

MeO

-H

m/z 191

MeO

-CO

-CH

MeO

m/z 163

MeO

m/z 163

m/z 163 m/z 148

m/z 135

m/z 120

-CO

m/z 148

m/z 147

m/z 91

-O=C=C=O

-H

-CH

-CO

m/z 176 100%

MeO

m/z 148

m/z 104

-CO

m/z 192

m/z 191

Estudo Fitoquímico do C. limonia

101

m/z 148

MeO

m/z 191

MeO

m/z 192

-H

-CH

m/z 176

m/z 120

m/z 148

-CO

m/z 148

m/z 104

m/z 176 100%

-CO

MeO

-H

m/z 191

MeO

-CH

-CO

m/z 148

ESQUEMA 3.6: Proposta de fragmentação das cumarinas 6-metoxi-7-

hidroxicumarina (C6) e 6-hidroxi-7-metoxicumarina (C7).

Verifica-se que a cumarina C6 quando perde um próton, estabiliza melhor a

carga negativa devido a conjugação até o oxigênio presente na lactona, e após

sucessivas migrações da carga há perda de CO fornecendo o íon de m/z 163. Já a

cumarina C7 conjuga a carga negativa somente no sitema aromático do anel, porém

a perda da metila radicalar é favorecida, pois o radical migra até o oxigênio da

lactona, gerando um ânion-radicalar estável, o qual, por mecanismos similares ao da

cumarina C6, perde CO; no entanto, gera-se o íon de m/z 148 e não o m/z 163, uma

vez que teve a perda inicial da metila radicalar. A cumarina C7 não apresenta o íon

com m/z 135, uma vez que este provém do íon m/z 163, o mecanisno está indicado

no Esquema 3.6. A partir do m/z 148 da cumarina C6, há uma perda de um

hidrogênio radicalar, devido a estabilização de um radical da molécula, e

Estudo Fitoquímico do C. limonia

102

conseqüentemente a perda de um ceteno gerando o íon m/z 91. No entanto, no caso

da cumarina C7, não há como perder um hidrogênio radicalar para estabilizar o

radical do íon m/z 148, não ocorrendo a formação do íon m/z 91, como mostrado a

seguir.

-O=C=C=O

m/z 91

m/z 148

m/z 147

-H

Os três íons m/z 163, 135 e 91, são os íons diagnósticos capazes de

distinguir entre estas duas cumarinas isoméricas (6-metóxi-7-hidroxicumarina e 6-

hidróxi-7-metoxicumarina).

Com estas observações e propostas de fragmentações pode-se confirmar que

a fração A é correspondente a cumarina 6-metóxi-7-hidróxicumarina e que as

frações B e C correspondem ao seu isômero, 6-hidroxi-7-metoxicumarina.

Assim, obteve-se um outro composto, o qual não havia sido isolado

anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia, com massa

igual a 3,7 mg: a 6-hidróxi-7-metoxicumarina - Isoescopoletina (C7), a qual está

ilustrada a seguir (Figura 3.45).

OOMeO

FIGURA 3.45: Estrutura da Isoescopoletina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

103

3.2.1.7. Determinação estrutural da Cumarina C8

Foram isoladas 3,3 mg da cumarina C8 na subfração PC2.3.1.1-4.

Analisando-se o espectro de RMN

H (Figura 3.47, p.107), observa-se sinais

característicos das cumarinas, como a presença de dois dubletos em δ 7,91 (J = 9,5

Hz, 1H) e δ 6,22 (J = 9,5 Hz, 1H), estes sinais são referentes aos hidrogênios H-4 e

H-3 respectivamente.

A presença de outros dois dubletos em δ 7,55 (J = 8,7 Hz, 1H) e δ 6,83 (J =

8,7 Hz, 1H), refere-se aos hidrogênios H-5 e H-6 respectivamente. O espectro ainda

indicou outros dois singleto em δ 1,54 (3H) e δ 1,41 (3H), referentes a duas metilas

em 4’ e 5’; e dois dubletos em δ 5,16 (J = 2,8 Hz, 1H) e δ 4,97 (J = 2,8 Hz, 1H),

referentes aos H-3’ e H-4’, respectivamente. No entanto, estes valores de

deslocamentos químicos e de constantes de acoplamento indicam a presença de um

diol.

OOO

A molécula, no entanto, apresenta, além dos sinais discutidos, um dubleto

com deslocamento químico em δ 2,21 (J = 6,8 Hz, 2H), referente ao hidrogênio H-2’’;

dois dubletos em δ 0,89 (J = 6,6 Hz, 3H) e δ 0,90 (J = 6,6 Hz, 3H), os quais são

característicos de um grupo isovaleril. O multipleto referente ao hidrogênio H-3’’ não

foi observado, pois este estava bem próximo ao do sinal do solvente (C

O).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

104

Com estes dados, verifica-se que a molécula é uma piranocumarina angular e

que possui nas posições 3’ e 4’ uma hidroxila e um éster; porém, não se sabe qual a

posição exata de cada grupo. Portanto, realizou-se, além do experimento de RMN

H 400 MHz, os experimentos de RMN

C, HSQC, HMBC e COSY.

A partir das correlações observadas no HSQC (Figura 3.51, p.109), o qual

mostra a correlação do hidrogênio com o carbono ligado diretamente, atribui-se os

sinais dos carbonos correspondentes (Tabela 3.13).

TABELA 3.13: Dados de RMN H

O, 400 MHz) e RMN C

O, 400 MHz)

da cumarina C8 em comparação com os dados da literatura*.

J (Hz)

δ*

J* (Hz)

3 6,22 (d) 9,5 6,26 (d) 9,5 113,2

4 7,91 (d) 9,5 7,66 (d) 9,5 145,0

5 7,55 (d) 8,7 7,35 (d) 8,6 130,5

6 6,83 (d) 8,7 6,82 (d) 8,6 115,0

3´ 5,16 (d) 2,8 5,21 (d) 3,7 74,5

4´ 4,97 (d) 2,8 5,02 (d) 3,7 62,4

5´ 1,41 (s) - 1,38 (s) - 25,1

6´ 1,54 (s) - 1,48 (s) - 24,2

2’’ 2,21 (d) 6,8 2,22 (d) 6,3 43,6

4’’, 5’’ 0,90 (d) 6,6 0,94 (d) 6,6 22,5

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura

(JU - ICHI et al., 1986).

O experimento de HMBC (Figura 3.52, p.109), o qual apresenta correlações

até três ligações na molécula, mostrou as seguintes correlações:

H-3 (δ 6,22) e H-6 (δ 6,83) com um sinal em δ 113,3, o qual somente pode

corresponder ao C-10, uma vez que este é o único carbono na molécula que pode

correlacionar-se até três ligações com os H-3 e H-6.

H-4 (δ 7,91) com δ 130,5 (H-5), δ 155,7 (H-9), δ 160,8 (H-2); o H-5 (δ 7,55)

com δ 145,0 (H-4), δ 156,8 (H-7), δ 155,7 (H-9); o H-3 (δ 6,22) com o δ 113,3 (H-10),

δ 160,8 (H-2); o H-6’ (δ 1,54) com o δ 24,2 (H-6’), δ 74,5 (H-3’); o H-5’ (δ 1,41) com o

δ 25,1 (H-5’), δ 74,5 (H-3’); o H-4’ (δ 4,97) com o δ 74,5 (H-3’).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

105

OOO

H-2’’ (δ 2,20) com o δ 22,5 (H-4’’ e H-5’’), δ 26,3 (H-3’’), δ 172,2 (H-1’’); o H-4’’

e H-5’’ (δ 0,90) com o δ 22,5 (H-4’’ e H-5’’), δ 26,3 (H-3’’) e δ 43,5 (H-2’’);

H-3’ (δ 5,16) com o δ 62,4 (H-4’), δ 172,2 (H-1’’), e esta correlação do H-3’

com o H-1’’, determina a posição do éster na molécula; como este experimento

mostra a correlação de, no máximo, três ligações, o éster somente pode estar na

posição 3’, e conseqüentemente a hidroxila encontra-se na posição 4’. Com isto

determina-se que a molécula isolada é a isovalerilkelactona, conhecida também

como Junosmarina.

O experimento de COSY (Figura 3.53, p.110) mostrou as correlações do H-4

(δ 7,91) com o H-3 (δ 6,23); o H-5 (δ 7,55) com o H-6 (δ 6,83); o H-3’ (δ 5,16) com o

H-4’ (δ 4,97); o H-2’’ (δ 2,20) com os H-4’’ e H-5’’ (δ 0,90); o H-3’’ (δ 2,10) com os H-

Estudo Fitoquímico do C. limonia

106

4’’ e H-5’’ (δ 0,90); as quais são totalmente possíveis e plausíveis para a estrutura

proposta.

Com todos experimentos, pode-se atribuir todos os sinais de carbono da

molécula, mesmo dos carbonos não ligados diretamente a hidrogênio. Os carbonos

estão mostrados na Figura 3.46.

160

113

145

130

115

156

111

155

113

172

FIGURA 3.46: Deslocamentos químicos dos carbonos da cumarina C8

A partir do conjunto de dados e informações adquiridas, pode-se dizer que a

cumarina isolada é o éster Isovalerilkelactona: Junosmarina, a qual não havia sido

isolada anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

107

FIGURA 3.47. Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina C8.

FIGURA 3.48. Ampliação A do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C8.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

108

FIGURA 3.49. Ampliação B do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) da cumarina

C8.

FIGURA 3.50. Espectro de RMN

C (C

O, 400 MHz) da cumarina C8.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

109

FIGURA 3.51. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) da cumarina C8.

FIGURA 3.52. Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) da cumarina C8.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

110

FIGURA 3.53. Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) da cumarina C8.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

111

3.2.1.8. Determinação estrutural da Cumarina C9

Foram isoladas 2,0 mg da cumarina C9 na subfração PC3.1.4-3. Analisando-

se o espectro de RMN

H (Figura 3.55, p.115), observa-se alguns sinais

característicos das cumarinas, ou seja, dois dubletos em δ 7,82 (J = 9,5 Hz, 1H) e δ

6,12 (J = 9,5 Hz, 1H), referentes aos hidrogênios H-4 e H-3, respectivamente.

A presença de um tripleto em δ 5,34 (J = 7,4 Hz, 1H), de um dubleto em δ

3,33 (J = 7,4 Hz, 2H), e dois singletos em δ 1,71 (3H) e δ 1,72 (3H), sugere que a

molécula contém um grupo prenila em alguma posição. Os sinais de dois singletos

em δ 7,34 (1H) e δ 6,76 (1H) correspondem aos hidrogênios 5 e 8 respectivamente.

Com isto, pode-se afirmar que o grupo prenila encontra-se na posição 6.

Falta verificar se há uma metoxila ou uma hidroxila na posição 7, para isto

integrou-se um sinal característico de metoxila em δ 3,74 presente no espectro e

obteve-se um valor correspondente a um hidrogênio, no entanto o valor deveria

corresponder a três hidrogênios. Então concluiu-se que esta molécula contém uma

hidroxila na posição 7, e que o sinal aparentemente de uma metoxila deve ser

proveniente de impurezas presente na amostra. Os sinais observados no espectro

de hidrogênio foram comparados com a literatura, conforme ilustrado na Tabela

3.14.

TABELA 3.14: Dados de RMN H

(200 MHz) da cumarina C9 em comparação com

os dados da literatura.

J (Hz)

(Hz)

4 7,82 (d) 9,5 7,66 (d) 9,5

3 6,12 (d) 9,5 6,24 (d) 9,5

5 7,34 (s) - 7,47 (s) -

8 6,76 (s) - 7,05 (s) -

1´ 3,33 (d) 7,4 3,37 (d) 7,5

2´ 5,34 (t) 7,4 5,32 (d) 7,5

4´ 1,71 (s) - 1,74 (s) -

5´ 1,72 (s) - 1,78 (s) -

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura

(VRKOC, 1972).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

112

Realizou-se experimentos de RMN 2D (COSY, HSQC e HMBC), para

comprovação da estrutura proposta. O experimento de RMN

C não foi realizado,

uma vez que a substância encontrava-se em uma quantidade muito pequena, e isto

demanda um tempo de máquina grande. Como esta molécula é conhecida na

literatura, não se achou necessário a realização do experimento de RMN

C, pois

no experimento de HSQC e HMBC obtém-se os valores de

C aproximados, e

pode-se confirmar estes por comparação com a literatura.

No experimento de COSY (Figura 3.59, p.117), observou-se as seguintes

correlações: o sinal em δ 7,82 (H-4) com o sinal em δ 6,12 (H-3); o sinal em δ 5,34

(H-2´) com o sinal em δ 3,33 (H-1´); o sinal em δ 5,34 (H-2´) com os sinais em δ 1,72

e δ 1,71 (H-4’ e H-5’); o sinal em δ 3,33 (H-1´) com os sinais em δ 1,72 e δ 1,71 (H-4’

e H-5’).

Com o experimento de HSQC (Figura 3.57, p.116), atribuiu-se os sinais

aproximados de cada carbono e depois comparou-se com a literatura. A partir do

experimento de HMBC (Figura 3.58, p.116) pode-se notar as seguintes correlações:

- O hidrogênio em δ 145 (H-4) correlacionou-se com os hidrogênios em δ 130

(H-5), δ 155 (H-9) e δ 163 (H-2);

163

145

114

130

129

123

132

155

103

160

113

OHO O

- O hidrogênio em δ 113 (H-3) correlacionou-se com os hidrogênios em δ 114

(H-10) e δ 163 (H-2);

- O hidrogênio em δ 103 (H-8) correlacionou-se com os hidrogênios em δ 114

(H-10), δ 129 (H-6), δ 155 (H-9) e δ 160 (H-7);

163

145

114

130

129

123

132

155

103

160

113

OHO O

Estudo Fitoquímico do C. limonia

113

- O hidrogênio em δ 130 (H-5) correlacionou-se com os hidrogênios em δ 29

(H-1’), δ 145 (H-4), δ 155 (H-9) e δ 160 (H-7);

163

145

114

130

129

123

132

155

103

160

113

OHO O

- Os hidrogênios em δ 29 (H-1’) correlacionaram-se com os hidrogênios em δ

123 (H-2’), δ 129 (H-6), δ 130 (H-5), δ 132 (H-3’’) e δ 160 (H-7);

- Os hidrogênios em δ 26 (H-4’,5’) correlacionaram-se com os hidrogênios em

δ 26 (H-4’,5’), δ 123 (H-2’’), e δ 132 (H-3’).

163

145

114

130

129

123

132

155

103

160

113

OHO O

A partir destes dados pode-se atribuir valores a todos carbonos presentes na

molécula e compará-los com a literatura. E pode-se verificar que as correlações

obtidas estão totalmente coerentes com a molécula proposta.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

114

TABELA 3.15: Valores de RMN

C (200 MHz) obtidos pelas correlações

apresentadas no espectro de HMBC e no HSQC.

Posição na molécula

δC δC*

2 ~ 163 162,0

3 ~ 113 112,7

4 ~ 145 143,7

5 ~ 130 128,4

6 ~ 129 129,0

7 ~ 160 158,5

8 ~ 103 103,3

9 ~ 155 153,5

10 ~ 114 112,8

1’ ~ 29 28,7

2’ ~ 123 120,9

3’ ~ 132 130,1

4’-5’ ~ 26 25,8

*valores obtidos pela literatura (MACIAS et al., 1989).

Com estes experimentos conclui-se que a cumarina C9 é realmente a 6-

prenil-7-hidroxicumarina (demetilsuberosina). A suberosina foi isolada anteriormente

das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia, no entanto esta cumarina não.

OHO O

FIGURA 3.54: Estrutura da Demetilsuberosina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

115

FIGURA 3.55. Espectro de RMN

H (C

O, 200 MHz) da cumarina C9.

FIGURA 3.56. Ampliação do espectro de RMN

H (C

O, 200 MHz) da cumarina

C9.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

116

FIGURA 3.57. Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) da cumarina C9.

FIGURA 3.58.Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) da cumarina C9.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

117

FIGURA 3.59. Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) da cumarina C9.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

118

3.2.1.9. Determinação estrutural da Cumarina C10

Foram isoladas 5,8 mg de uma mistura da cumarina C10 com a cumarina C3

(Xantoxiletina) na subfração PC2.3.1.4-5. Analisando-se o espectro de RMN

(Figura 3.62, p.124), observa-se sinais idênticos aos da cumarina Xantoxiletina e

outros sinais distintos. Sabe-se que se trata de uma mistura e não de um dímero,

uma vez que a integral dos sinais da Xantoxiletina encontram-se três vezes menor

que a integral dos sinais referentes a cumarina C10.

Após detectado que uma das moléculas é a Xantoxiletina, analisou-se os

demais sinais para identificar a outra cumarina. Inicialmente, verificou-se a presença

de três duplos dubletos em δ 6,30 (dd, J = 17,4 Hz e 10,6 Hz, 1H), δ 4,86 (dd, J =

10,6 Hz e 1,2 Hz, 1H) e δ 4,93 (dd, J = 17,4 Hz e 1,2 Hz, 1H), os quais

correspondem as posições 2’ e 3’, respectivamente, de um grupo prenila modificado.

O espectro de HSQC (Figura 3.66, p.126) mostrou a correlação do sinal em δ

6,30 com o sinal em δ 150,1 e dos sinais em δ 4,86 e δ 4,93 com o sinal em δ 107,9.

A partir do espectro de HMBC (Figura 3.67, p.126), verifica-se que o sinal em δ 4,86

correlacionou-se com o sinal em δ 40,9; o sinal em δ 4,93 com os sinais em δ 40,9 e

δ 150,1; o sinal em δ 6,30 com os sinais em δ 40,9 e δ 29,4. Observou-se a

correlação de um singleto em δ 1,63 (6H) com um sinal em δ 150,1, δ 115,5, δ 40,9 e

δ 29,4. O espectro de HSQC correlacionou este sinal com o sinal em δ 29,4. A partir

destes dados determina-se que a molécula contém um grupo prenila modificado e

atribui-se os valores dos carbonos de cada posição.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

119

Analisando-se ainda o espectro de RMN

H, nota-se a presença de três duplo

dubletos em δ 6,19 (dd, J = 17,4 Hz e 10,7 Hz, 1H), δ 5,07 (dd, J = 10,7 Hz e 1,1 Hz,

1H) e δ 5,09 (dd, J = 17,4 Hz e 1,1 Hz, 1H), e um singleto em δ 1,42 (6H). A partir do

espectro de HSQC, observa-se a correlação do sinal em δ 6,19 com o sinal em δ

145,6; dos sinais em δ 5,07 e δ 5,09 com o sinal em δ 111,9; e do sinal em δ 1,42

com o sinal em δ 26,1. O espectro de HMBC mostra a correlação do sinal em δ 6,19

com os sinais em δ 40,2 e δ 26,1; e os sinais em δ 5,07 e δ 5,09 correlacionam-se

com os mesmos sinais (em δ 145,6 e δ 40,2). Estes dados comprovam a presença

de outro grupo prenila modificado na molécula e determina os valores de cada

carbono presente na molécula.

O singleto em δ 7,86 correspondente a posição 4, apresentou correlação com

o sinal em δ 132,9 no espectro de HSQC. No espectro de HMBC, este mesmo sinal

correlacionou-se com os sinais δ 159,8 (característico de lactona), δ 153,3, δ 146,2, δ

129,1 e δ 40,2. O sinal em δ 40,2 foi atribuído a posição 1’’ do segundo grupamento

prenila identificado acima, ou seja, este encontra-se na posição 3.

159

132

A partir do espectro de RMN

H, observa-se a presença de um grupo pirano,

devido aos sinais característicos: um singleto em δ 1,47 (6H); dois dubletos em δ

6,52 (d, J = 9,9 Hz) e δ 5,67 (d, J = 9,9 Hz), os quais apresentam correlação com os

sinais em δ 27,2, δ 115,1 e δ 129,8, respectivamente, no espectro de HSQC.

Verifica-se no espectro de HMBC a correlação do sinal em δ 6,52 com os

sinais em δ 146,2, δ 154,7, δ 105,8, δ 77,8. Como o sinal em δ 132,9 (H-4) também

Estudo Fitoquímico do C. limonia

120

apresentou correlação com o sinal em δ 146,2, este corresponde a posição 5. O

sinal em δ 5,67 apresentou correlação com os sinais em δ 105,8, δ 77,8 e δ 27,2.

OOO

132

115

O outro grupamento prenila encontra-se na posição 8, uma vez que o sinal

em δ 1,63 apresentou correlação com o sinal em δ 115,5, conforme citado

anteriormente. Com este conjunto de dados determinou se a estrutura da molécula

inteira, bem como todos os valores dos sinais de hidrogênio e carbono e comparou-

os com os valores citados na literatura (Takemura, 1996).

TABELA 3.16: Dados de RMN H

e RMN C

(CDCl

400 MHz) da cumarina C10.

, J (Hz) δ*

, J (Hz)

159,8 - 160,8 -

129,1 - 128,5 -

132,9 7,86 (s) 134,2 7,85 (s)

4ª

103,9 - 104,4 -

146,2 - 147,0 -

105,8 - 106,4 -

154,7 - 155,1 -

115,5 - 115,2 -

8ª

153,3 - 153,2 -

77,8 - 79,9 -

9-Me

27,2 1,47 (s) 27,3 1,47 (s)

129,8 5,67 (d, 9,9) 129,3 5,67 (d, 9,8)

115,1 6,52 (d, 9,9) 115,8 6,50 (d, 9,8)

1’

40,9 - 40,9 -

1’-Me

29,4 1,63 (s) 29,5 1,63 (s)

Estudo Fitoquímico do C. limonia

121

TABELA 3.16: Dados de RMN H

e RMN C

(CDCl

400 MHz) da cumarina C10 -

Continuação.

2’

150,1

6,30 (dd, 17,4,

10,6)

150,1

6,29 (dd, 17,6,

10,5)

3’

107,9

4,93 (dd, 17,4,

1,2)

4,86 (dd, 10,6,

1,2)

107,9

4,93 (dd, 17,6,

1,2)

4,85 (dd, 10,5,

1,2)

1’’

40,2 - 40,2 -

1’’-Me

26,1 1,42 (s) 26,2 1,43 (s)

2’’

145,6

6,19 (dd, 17,4,

10,7)

145,6

6,18 (dd, 17,6,

10,5)

3’’

111,9

5,09 (dd, 17,4,

1,1 )

5,07 (dd, 10,7,

1,1)

111,9

5,11 (dd, 17,6,

1,0 )

5,07 (dd, 10,5,

1,0)

Assim, conclui-se que a cumarina C10 é a clausarina. Esta cumarina foi

isolada anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia.

FIGURA 3.60: Estrutura da cumarina Clausarina.

Os demais sinais presentes nos espectros são referentes a uma outra

cumarina, a xantoxiletina, a qual já havia sido isolada. No entanto, anteriormente,

não havia sido realizado experimentos de HSQC, HMBC e RMN

C, os quais foram

obtidos para esta mistura. A partir destes dados pode-se confirmar se a cumarina

Estudo Fitoquímico do C. limonia

122

era realmente a proposta e pode-se obter os valores de cada carbono presente na

molécula. A análise do espectro de RMN

H (Figura 3.62, p.124) mostra os sinais

característicos de cumarinas, ou seja, dois dubletos em δ 7,98 (d, J = 9,6 Hz, 1H) e

em δ 6,14 (d, J = 9,6 Hz, 1H) correspondentes aos hidrogênios 4 e 3,

respectivamente. No espectro de HSQC (Figura 3.66, p.126) verificou-se as

correlações do sinal em δ 7,98 (H-4) com o sinal em δ 139,1 e do sinal em δ 6,14 (H-

3) com o sinal em δ 110,3. O espectro de HMBC (Figura 3.67, p.126) mostrou a

correlação do sinal em δ 7,98 (H-4) com os sinais em δ 153,3 e δ 161,0, e do sinal

em δ 6,14 (H-3) com os sinais em δ 161,0 e δ 103,9.

103

153

161

110

139

Observa-se ainda a presença dos sinais característicos do anel pirano, um

dubleto em δ 6,77 (d, J = 10,0 Hz, 1H), um dubleto em δ 5,57 (d, J = 10,0 Hz, 1H) e

um singleto em δ 1,46 (6H), referentes aos H-4’, H-3’, H5’ e H-6”, respectivamente;

os quais correlacionaram-se, no experimento de HSQC, com os sinais em δ 114,9, δ

127,6 e δ 28,1. A análise do espectro de HMBC mostra a correlação do sinal em δ

6,77 (H-4’) com os sinais em δ 78,0; do sinal em δ 5,57 (H-3’) com os sinais em δ

102,6 e δ 78,0.

OMe

114

127

157

102

Por fim, o espectro de RMN

H apresentou um singleto em δ 6,24 e um

singleto intenso em δ 3,88 (3H), os quais indicam a presença de um hidrogênio e

uma metoxila (OCH

), respectivamente. O sinal em δ 3,88 correlacionou-se com o

sinal em δ 56,0, no experimento de HSQC e o sinal em δ 6,24 com o sinal em δ 95,4.

No entanto, não se sabe em qual posição da molécula (5 ou 8) estes grupos

encontram-se. A partir do experimento de HMBC, pode-se verificar que o sinal em δ

6,24 correlaciona-se com os sinais em δ 157,5 e δ 103,9, portanto ele só pode

Estudo Fitoquímico do C. limonia

123

corresponder ao H-8; a metoxila, por sua vez, encontra-se na posição 5 e

apresentou correlação apenas com um sinal em δ 56,0 (J-1).

OOO

OMe

156

103

157

A partir destes dados pode-se atribuir todos os carbonos à molécula e pode-

se concluir que a cumarina isolada em mistura com a clausarina é a Xantoxiletina.

OOO

OMe

FIGURA 3.61: Estrutura da cumarina Xantoxiletina.

TABELA 3.17: Dados de RMN H

(CDCl

400 MHz) da cumarina C3.

Posição

δH

J (Hz)

δC δ

J* (Hz)

2 - - 161,0 - -

3 6,14 (d) 9,6 110,3 6,19 (d) 9,5

4 7,98 (d) 9,6 139,1 7,86 (d) 9,5

4a - - 103,9 - -

5 (OMe) 3,88 (s) - 156,5 3,86 (s) -

6 - - 102,6 - -

7 - - 157,5 - -

8 6,24 (s) - 95,4 6,56 (s) -

8a - - 153,3 - -

2’ - - 78,0 - -

3’ 5,57 (d) 10,0 127,6 5,71 (d) 10,2

4’ 6,77 (d) 10,0 114,9 6,51 (d) 10,2

5’-6’ 1,46 (s) - 28,1 1,46 (s) -

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura (VRKOC, 1972); δ

são os deslocamentos químicos obtidos pela literatura

(WU, 1983).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

124

FIGURA 3.62. Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.

FIGURA 3.63. Ampliação A do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) das

cumarinas C3 e C10.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

125

FIGURA 3.64. Ampliação B do Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) das

cumarinas C3 e C10.

FIGURA 3.65. Espectro de RMN

C (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

126

FIGURA 3.66. Espectro de HSQC (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.

FIGURA 3.67.Espectro de HMBC (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

127

FIGURA 3.68. Espectro de COSY (CDCl

, 400 MHz) das cumarinas C3 e C10.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

128

3.2.1.10. Determinação estrutural da Cumarina C11

A cumarina C11 foi identificada em mistura com a cumarina C5 (trans-

decursidinol) na subfração PC2.3.1.4-5, em uma quantidade de massa igual a 2,0

mg. A mistura foi observada, uma vez que alguns sinais do espectro de RMN

(Figura 3.71, p.131) eram idênticos aos da cumarina C5.

Após detectado que uma das moléculas é a trans-decursidinol, analisou-se os

demais sinais presentes no espectro e verificou-se que a outra substância presente

é uma cumarina. Isto foi observado, uma vez que o espectro apresentou os sinais

característicos desta classe, como a presença dos dubletos em δ 7,91 (J = 9,5 Hz,

1H) e em δ 6,19 (J = 9,5 Hz, 1H), correspondente aos H-4 e H-3. Obser

vou-se ainda a presença de singletos em δ 7,62 (1H) e δ 6,71 (1H), referentes

aos H-5 e H-8, o que indica que a cumarina está substituída nas posições 6 e 7.

O espectro apresentou dois dubletos em δ 5,46 (J = 4,2 Hz, 1H) e em δ 4,41

(J = 4,2 Hz, 1H) e dois singletos em δ 1,28 (3H) e em δ 1,29 (3H), os quais

correspondem a duas metilas. Como estes dois dubletos não apresentam os

deslocamentos químicos e constantes de acoplamento próximos aos dos dubletos

referentes ao grupo pirano hidroxilado (H-3’ e H-4’), então sabe-se que a molécula

não contém este grupo e com isto não corresponde a cumarina C5.

Sugere-se que o grupo substituinte seja a prenila formando um anel de 5

membros. Com isto, os dubletos em δ 5,46 e em δ 4,41 correspondem ao H-3’ e H-

2’, respectivamente; e a estrutura proposta está representada a seguir.

FIGURA 3.69: Estrutura proposta para a cumarina C11.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

129

TABELA 3.18: Dados de RMN H

O, 400 MHz) da cumarina C11 em

comparação com os dados da literatura.

J (Hz)

δ*

J* (Hz)

3 6,19 (d, J = 9,5) 6,18 (d, J = 9,1)

4 7,91 (d, J = 9,5) 7,91 (d, J = 9,1)

5 7,62 (s) 7,62 (s)

6 - - - -

8 6,71 (s) 6,71 (s)

2’ 4,41 (d, J = 4,2) 4,41 (d, J = 4,3)

3’ 5,46 (d, J = 4,2) 5,46 (d, J = 4,3)

5’ 1,28 (s) 1,28 (s)

6’ 1,29 (s) 1,29 (s)

Foram realizados experimentos de RMN 2D (HSQC, HMBC e COSY) para

verificar se a molécula realmente corresponde a cumarina proposta.

O experimento de HSQC (Figura 3.74, p.133) mostrou a correlação dos

hidrogênios e os carbono ligados diretamente, e a partir disto, obteve-se os

deslocamentos químicos de alguns carbonos da molécula: C-4 em δ 143,7; C-5 em δ

127,9; C-8 em δ 96,9; C-3 em δ 111,3; C-3’ em δ 70,7; C-2’ em δ 98,3; C-5’ em δ

24,4 e C-6’ em δ 25,7. A partir do experimento de COSY (Figura 3.76, p.134)

verificou-se que o H-4 correlaciona-se com o H-3 e que o H-2’ correlaciona-se com o

H-3’.

Com o espectro de HMBC (Figura 3.75, p.133) atribuiu-se mais alguns

deslocamentos químicos de carbonos da molécula. Observou-se que o H-4 e o H-5

apresentam correlação com um sinal em δ 157,0, o qual corresponde, portanto, ao

carbono 9. O H-4 correlacionou-se com um sinal em δ 159,7, referente ao carbono

lactônico da posição 2. O H-5 correlaciona-se com um sinal em δ 164,0, o qual

corresponde ao carbono fenólico 7. O H-3 correlaciona-se um sinal em δ 112,2,

referente ao carbono da posição 10. O espectro apresentou ainda a correlação das

metilas (5’’ e 6’’) com os sinais em 74,6 e em δ 98,3, os quais correspondem aos

carbonos 4’ e 2’, respectivamente. O único carbono que não apresentou correlação

nenhuma nos experimentos foi o C6, no entanto, a partir da literatura (ZOU et al.,

Estudo Fitoquímico do C. limonia

130

2004) e do espectro de RMN

C (Figura 3.73, p.132), verificou-se que o sinal

correspondente a este carbono encontra-se em δ 124,6. Todos os carbonos

atribuídos para molécula, e a comparação com os dados da literatura (ZOU et al.,

2004) encontram-se na Tabela 3.19.

TABELA 3.19: Dados de RMN

C (C

O, 400 MHz) da cumarina C11 em

comparação com os dados da literatura.

δ*

2 161,0 160,1

3 111,3 111,9

4 143,7 144,2

5 127,9 128,4

6 124,6 125,1

7 164,0 163,7

8 96,9 97,4

9 157,0 156,7

10 112,2 112,9

2’ 98,3 98,9

3’ 70,7 70,2

4’ 74,6 71,3

5’ 24,4 25,0

6’ 25,7 25,0

Verificou-se na literatura (ZOU et al., 2004) que esta molécula com

configuração relativa cis e trans apresenta J = 6,7 Hz e J = 4,3 Hz, respectivamente.

Como a substância isolada apresentou J = 4,2 Hz, ela deve possui configuração

relativa trans. A partir de todos os dados, verificou-se que molécula identificada em

mistura com a cumarina C5 apresenta sinais próximos a (2’S,3’S)-3’-hidróxi-2’-(1-

hidróxi-1-metiléter)-2’,3’-dihidrofurano[3,2-g]cromen-7-ona, conhecida como

Xantoarnol (Figura 3.70, p.131), no entanto, não foi realizado nenhum experimento

que confirme a estereoquímica absoluta da molécula. Esta cumarina não havia sido

isolada anteriormente das raízes do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

131

FIGURA 3.70: Estrutura da Cumarina C11 identificada.

FIGURA 3.71: Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

132

FIGURA 3.72: Ampliação do espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) das cumarinas

C5 e C11.

FIGURA 3.73: Espectro de RMN

C (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

133

FIGURA 3.74: Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11.

FIGURA 3.75: Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

134

FIGURA 3.76: Espectro de COSY (C

O, 400 MHz) das cumarinas C5 e C11.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

135

3.2.1.11. Determinação estrutural do flavonóide F1

Obteve-se 0,9 mg de um composto na fração PC2.1.4-13, o qual, a partir de

dados de RMN

H, mostrou-se um flavonóide devido à presença de alguns sinais

característicos. No entanto, para determinar sua estrutura completa foi necessário a

realização de experimentos RMN 2D (HMBC e HSQC).

O espectro de RMN

H (Figura 3.79, p.139) apresentou um singleto em δ

13,12, o qual corresponde a uma hidroxila quelada, sinal este característico de

flavonóides. Também se verificou a presença de dois dubletos em δ 7,99 (J = 8,4 Hz,

2H) e δ 7,05 (J = 8,4 Hz, 2H), os quais foram atribuídos aos hidrogênios H-2’, H-6’ e

H-3’, H-5’ respectivamente. Observou-se sinais característicos do anel pirano, ou

seja, dois dubletos em δ 6,92 (J = 10,0Hz, 1H) e δ 5,78 (J = 10,0Hz, 1H), os quais

correspondem aos prótons vinílicos H-4” e H-3” respectivamente, um singleto em δ

1,47 (6H), correspondente a duas metilas na posição 2’’. Ainda faltava correlacionar

os sinais em δ 6,70 e 6,18 com os hidrogênios H-3 e H-8, bem como determinar se o

anel pirano fecha na posição 6 ou 8. Para tanto foi necessário os experimentos de

RMN 2D HMBC e HSQC.

TABELA 3.20: Dados de RMN

H (200 MHz) obtidos experimentalmente e pela

literatura do flavonóide (F1).

Posição J (Hz)

J* (Hz)

5-OH - 13,12 (s) - -

4” (J = 10,0) 6,92 (d) 6,96 (d) (J = 10,0)

3” (J = 10,0) 5,78 (d) 5,79 (d) (J = 10,0)

2 Me - 1,47 (s) 1,51 (s) -

2’, 6’ (J = 8,4) 7,99 (d) 8,01 (d) (J = 8,0)

3’, 5’ (J = 8,4) 7,05 (d) 7,10 (d) (J = 8,0)

3 - 6,70 (d) 6,70 (s) -

6 ou 8 - 6,18 (s) 6,24 (s) -

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura (CHANG et al., 1990).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

136

A partir do experimento de HSQC (Figura 3.80, p.140), o qual oferece a

correlação do hidrogênio e o carbono diretamente ligados, pode-se verificar que os

hidrogênios 2’ e 6’ correspondem ao δ 123,9, enquanto que os hidrogênios 3’ e 5’ ao

δ 111,5. Os carbonos 3’ e 5’ encontram-se com um deslocamento químico menor,

pois estão mais blindados, uma vez que há uma conjugação do par de elétrons do

oxigênio da hidroxila com a dupla ligação do anel aromático e com isto as posições

“orto” a hidroxila (3’ e 5’) possuem uma maior densidade eletrônica do que as

posições meta (2’ e 6’).

O hidrogênio 4” está correlacionado ao carbono em δ 109,9, e o hidrogênio 3”

ao carbono em δ 123,2. As duas metilas estão correlacionadas com o carbono em δ

22,7. O hidrogênio em δ 6,70 correlaciona-se ao δ 98,6 e o hidrogênio em δ 6,18 ao

δ 94,8. A tabela abaixo mostra as correlações obtidas no espectro de 2D (HSQC).

TABELA 3.21: Correlações obtidas do HSQC para o flavonóide F1.

Posição

δH δC δC*

2’, 6’ 8,01 128,4 127,7

3’, 5’ 7,06 117,0 116,0

4” 6,93 114,4 114,4

3” 5,79 128,4 127,2

Me 1,48 28,0 27,8

δ 6,70

6,70 102,0 103,0

δ 6,18

6,18 100,1 99,5

δH e δC: deslocamentos químicos dos hidrogênios e carbonos diretamente

correlacionados (Chang et al., 1990).

Fez-se necessário o experimento de 2D HMBC (Figura 3.81, p.140), o qual

correlaciona hidrogênios e carbonos ligados a estes com até 3 ligações. A partir do

espectro obtido deste experimento, observou-se a correlação dos hidrogênios 2’ e 6’

com os carbonos em δ 161,9, δ 164,8 e δ 128,4, sendo esta última correlação a

mesma apresentada no HSQC, ou seja, correspondente ao carbono diretamente

ligado a estes hidrogênios.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

137

Os hidrogênios 3’ e 5’ correlacionaram-se aos carbonos em δ 122,9 e δ 117,0,

o qual corresponde àqueles ligados diretamente a estes hidrogênios (C3’ e 5’). O

sinal de hidrogênio em δ 6,70 apresentou correlação com os sinais em δ 105,6 e δ

164,8. O sinal em δ 164,8 também se correlacionou com os hidrogênios 2’ e 6’, com

isto pôde-se afirmar que o hidrogênio em δ 6,70 corresponde ao H-3 e δ 164,8 ao C-

No entanto, o sinal em δ 6,20 ainda resta ser atribuído ao H-6 ou 8. Este

hidrogênio apresentou correlação com os carbonos em δ 105,6 e δ 102,0 (sinal

apresentado também no HSQC). A hidroxila quelada também apresentou correlação

com o sinal em δ 102,0, com isto conseguiu-se determinar a molécula total, ou seja,

o sinal em δ 6,20 corresponde ao H-6 e δ 102,0 ao C-6

Outros dados ainda foram observados neste espectro e, portanto, atribuiu-se

os deslocamentos químicos de todos carbonos da molécula. A hidroxila quelada

apresentou ainda correlação com os carbonos em δ 100,1, δ 105,6 e δ 161,9. Os

hidrogênios 4” e 3” correlacionaram-se com o carbono em δ 78,7.

TABELA 3.22: Correlações obtidas do HMQC para o flavonóide F1.

Posição C

C correlacionados em até 3

ligações

2’, 6’ 128,4 128,4; 161,9; 164,8

3’, 5’ 117,0 117,0; 122,9

4” 114,4 78,6

3” 128,4 78,6

Me 28,0 28,0; 78,6; 128,4

3 102,0 105,6; 164,8

6 100,1 102,0; 105,6

OH quelada 151,4 100,1; 102,0; 105,6; 161,9

Estudo Fitoquímico do C. limonia

138

OH O

FIGURA 3.77: Correlações observadas pelo HMBC para o flavonóide F1.

TABELA 3.23: Dados obtidos para os carbonos da molécula a partir das correlações

obtidas por HMBC e HSQC e comparadas com a literatura.

Posição C C*

4 - 189,1

2 164,8 163,8

9 e 7 159,4 161,1

4’ 161,9 158,9

5 161,0 151,4

2’ e 6’ 128,4 127,7

3” 128,4 127,2

1’ 122,9 121,4

3’ e 5’ 117,0 116,0

4” 114,4 114,4

8 102,0 104,7

3 102,0 103,0

10 105,6 101,0

6 100,1 99,5

2” 78,6 77,6

Me 28,0 27,8

* Literatura: CHANG et al., 1990.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

139

A figura abaixo mostra o flavonóide identificado com os respectivos sinais de

cada carbono obtidos por HSQC e HMBC e pela literatura (CHANG et al., 1990),

respectivamente.

159

114

125

120

162

103

OH O

159

103

125

109

158

116

127

121

163

103

OH O

101

161

104

127

114

FIGURA 3.78: Estrutura da flavona isolada (F1) e seus respectivos valores de RMN

C comparados com a literatura.

Esta flavonóide não foi isolada anteriormente das raízes do enxerto de C.

sinensis sobre C. limonia.

FIGURA 3.79: Espectro de RMN

H (C

O, 400 MHz) do flavonóide F1.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

140

FIGURA 3.80: Espectro de HSQC (C

O, 400 MHz) do flavonóide F1.

FIGURA 3.81: Espectro de HMBC (C

O, 400 MHz) do flavonóide F1.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

141

3.2.1.12. Determinação estrutural do flavonóide F2

Obteve-se 10,1 mg do flavonóide F2 nas subfrações PC2.1.3-10, PC2.1.1.1-4

e PC2.1.3.7-3. Para sua determinação estrutural analisou-se os espectros de RMN

C, NOESY e HMBC, pois apenas o espectro de

H não foi suficiente para a

determinação do composto.

Verificou-se, primeiramente, os sinais característicos do anel pirano, ou seja,

dois dubletos em δ 6,63 (J = 10,0 Hz, 1H) e 5,50 (J = 10,0 Hz, 1H), referentes aos

hidrogênios H- 3” e H- 4” e um singleto em δ 1,45 (6H), referentes às duas metilas

equivalentes nas posições 5”e 6”.

O espectro de RMN

H (Figura 3.86, p.147) revelou, também, a presença de

uma hidroxila quelada em δ 12,25, indicando esta estar na posição 5, três duplo-

dubletos, um em δ 5,34 (J = 3,0Hz e 12,7Hz), referente ao H-2, outro em δ 2,80 (J =

3,0 e 17,0 Hz), referente ao H-3a e outro em δ 3,04 (J = 12,7 e 17,0 Hz), referente ao

H-3b.

A presença de dois dubletos em δ 7,32 (J = 8,5 Hz, 2H) e 6,88 (J = 8,5 Hz,

2H), respectivamente, foram atribuídos aos H-2’,6’e H-3’,5’, respectivamente. Os

hidrogênios equivalentes H-3’e H-5’ encontram-se mais blindados, devido a maior

proximidade à hidroxila.

Observou-se, ainda, a presença de uma prenila devido a alguns sinais

característicos, como um dubleto em δ 3,21 (J = 7,4 Hz, 2H), referentes a dois

hidrogênios na posição 1”’, um tripleto em δ 5,15 (J = 7,4 Hz, 1H), referente ao

hidrogênio na posição 2”’ e um singleto em δ 1,65 (6H), ou seja, referentes às duas

metilas equivalentes nas posições 4”’ e 5”’.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

142

TABELA 3.24: Dados de RMN H

(400 MHz) do flavanóide F2 comparados com os

dados da literatura.

J (Hz)

(Hz)

5-OH 12,25 (s) - 12,20 (s) -

2’e 6’ 7,32 (d) 8,5 7,28 (d) 8,5

3’e 5’ 6,88 (d) 8,5 6,84 (d) 8,5

4” 6,63 (d) 10,0 6,63 (d) 10,0

3” 5,50 (d) 10,0 5,48 (d) 10,0

2 5,34 (dd) 3,0 e 12,7 5,30 (dd) 3,3 e 12,7

3a 3,04 (dd) 12,7 e 17,0 3,03 (dd) 12,7 e 17,3

3b 2,80 (dd) 3,0 e 17,0 2,78 (dd) 3,3 e 17,3

2”’ 5,15 (t) 7,4 5,14 (t) 7,0

1”’ 3,21 (d) 7,4 3,20 (d) 7,0

4”’ e 5”’ 1,65 (s) - 1,64 (s) -

5”e 6” 1,45 (s) - 1,44 (s) -

e J

são os deslocamentos químicos e constantes de acoplamento obtidos da

literatura

(SMALBERGER et al., 1974).

A posição do anel pirano e da prenila foram determinados na molécula a partir

dos experimentos realizados de RMN 2D 400 MHz.

A partir do espectro de NOESY (Figura 3.88, p.148), pode-se determinar a

estrutura da flavanona, devido a correlação entre a hidroxila quelada (em δ 12,25) e

os hidrogênios equivalentes H 4”’ e H 5”’ (em δ 1,65) e a correlação entre os

hidrogênios equivalentes H 2’ e H 6’ (em δ 7,32) e o hidrogênio H-4” (em δ 6,63).

Para que sejam observadas estas correlações, a prenila somente pode estar na

posição 6, e o anel pirano na posição 7-8 (Figura 3.82, p.143). Outras correlações

foram atribuídas para a confirmação da estrutura do flavonóide F2 e estão

demonstradas na Tabela 3.25, p.143.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

143

FIGURA 3.82: Correlações obtidas pelo NOESY do flavonóide F2.

TABELA 3.25: Correlações obtidas pelo espectro de NOESY do flavanóide F2.

Hidrogênios Correlação

5 – 4”’,5”’ 12,25 – 1,65

2’,6’ – 4” 7,32 - 6,63

3’,5’ – 2’,6’ 6,88 – 7,32

4” – 3” 6,63 – 5,50

3” – 5”,6” 5,50 – 1,40

2 – 3ª 5,34 – 2,80

2”’ – 4”’,5”’ 5,15 – 1,65

1”’ – 4”’,5”’ 3,21 – 1,65

3b – 3a 3,04 – 2,80

3a - 4”’,5”’ 2,80 – 1,65

3a - 3b 2,80 – 3,04

3a - 2 2,80 – 5,34

4”’,5”’ – 1”’ 1,65 – 3,21

4”’,5”’ – 2”’ 1,65 – 5,15

5”,6” – 3” 1,45 – 5,50

Fez-se também espectros de RMN C

(Figura 3.87, p.147) e HMBC (Figura

3.89, p.148) para a confirmação da estrutura proposta. Os dados de HMBC

correlacionam a interação entre os hidrogênios e carbonos separados por 3

ligações. Com isto a partir da análise do espectro tem-se que o hidrogênio presente

Estudo Fitoquímico do C. limonia

144

na hidroxila em δ 12,25 (H5) correlaciona-se com os carbonos em δ 155,8 (C5),

102,6 (C10). Este carbono (δ 108,6) correlaciona-se com o hidrogênio em δ 3,21

(H1”’), ou seja, com um hidrogênio da prenila, e, portanto, esta somente pode estar

na posição 6 da molécula, e o carbono em δ 108,6 corresponde ao C-6. O espectro

apresentou, ainda, a correlação do hidrogênio em δ 5,50 (H3”), o qual pertence ao

anel pirano, com o carbono em δ 102,8, sendo o C-8, confirmando a posição do anel

pirano. Com isto, a estrutura foi determinada.

FIGURA 3.83: Correlações obtidas pelo HMBC que determina a estrutura do

flavanóide F2.

Outras correlações foram observadas no espectro de HMBC e estão

coerentes com a estrutura obtida: os hidrogênios em δ 7,32 (H2’e H6’)

correlacionam-se com os carbonos em δ 78,0 (C2), δ 127,7 (C2’e C6’), e δ 156,6

(C4’); enquanto que os hidrogênios em δ 6,88 (H3’e H5’) correlacionam-se com os

carbonos em δ 115,5 (C3’e C5’), δ 127,7 (C2’e C6’) e δ 156,5 (C4’). Já o hidrogênio

em δ 2,80 (H3a) correlaciona-se com o carbono em δ 196,4 (C4) e o hidrogênio em δ

3,04 (H3b) com o carbono em δ 196,4 (C4). Observou-se também as correlações

presentes no anel pirano, ou seja, a correlação do hidrogênio em δ 6,63 (H4”) com o

carbono em δ 78,4 (C2”); a correlação do hidrogênio em δ 5,50 (H3”) com o carbono

em δ 78,4 (C2”); e a correlação dos hidrogênios equivalentes em δ 1,45 (H5” e H6”)

com os carbonos em δ 78,4 (C2”) e δ 125,9 (C3”).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

145

Além destas correlações citadas até o momento, pode-se também obter as

correlações referentes ao grupamento prenila. As quais foram correlação do

hidrogênio em δ 3,21 (H1”’), com os carbonos em δ 122,4 (C2”’), δ 131,0 (C3”’) e δ

159,3 (C7); a correlação dos hidrogênios equivalentes em δ 1,65 ( H4”’e H5”’) com

os carbonos em δ 122,4 (C2”’) e δ 131,0 (C3”’). Estas correlações estão melhor

representadas na Figura 3.84.

FIGURA 3.84: Correlações obtidas pelo HMBC do flavanóide F2.

Os carbonos foram atribuídos de acordo com as correlações obtidas nos

experimentos para a Lupinifolina.

FIGURA 3.85: Estrutura da Lupinifolina.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

146

Então, seguem-se os carbonos e seus respectivos deslocamentos químicos

(em δ, ppm) presentes no espectro e na molécula: C2-78,0; C3-43,2; C4-196,4; C5-

155,8; C6-108,6; C7-159,3; C8-102,8; C9-159,8; C10-102,6; C1’-131,0; C2’-127,7;

C3’-115,5; C4’-156,5; C5’115,4; C6’-127,7; C2”-78,4; C3”-125,9; C4”-115,6; C5”-

28,4; C6”-28,3; C1”’-21,4; C2”’-122,4; C3”’-131,0; C4”’-25,7; C5”’-25,7.

Com todos estes dados e valores atribuídos conclui-se que a flavanona

isolada é realmente a proposta, e não há dados referentes a ela na literatura, sendo

inédita.

O espectro de RMN

H da fração F11.4 possui valores de deslocamento

químico muito próximos ao da fração F8.10, podemos portanto dizer que ambas

referem-se a mesma flavanona. Se a flavanona da fração F11.4 possui o anel pirano

nas posições 7 e 8 e o grupo prenila na posição 6, sendo assim diferente da F8.10,

os espectros de RMN

H não apresentariam todos os deslocamentos químicos muito

próximos, haveria alguns em valores distintos.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

147

FIGURA 3.86: Espectro de RMN

H (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2.

FIGURA 3.87: Espectro de RMN

C (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

148

FIGURA 3.88: Espectro de NOESY (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2.

FIGURA 3.89: Espectro de HMQC (CDCl

, 400 MHz) do flavonóide F2.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

149

Realizou-se o experimento de massas para o composto F2, para que se

obtivesse uma melhor comprovação de sua estrutura (Figura 3.90).

A partir do espectro obtido, verificou-se o pico do íon molecular em m/z 407, o

qual era esperado uma vez que a flavanona proposta possui massa molecular 406

g/mol e que o mecanismo de ionização utilizado neste experimento foi ionização

química [M+H]

. Como o intuito era apenas comprovar a substância proposta,

realizou-se apenas o experimento de full–scan para determinar a massa molecular.

E, pode-se concluir que a flavanona isolada é realmente a 5,4’-diidróxi-6-(3”’-metil-

2”’-butenil)-2”,2”-dimetilpirano(5’’,6’’-7,8)flavanona proposta anteriormente.

FIGURA 3.90: Espectro de massas do flavonóide F2.

20/05/04

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540

m/z

100

PatriciaverardiPC832 102 (1.551) Scan AP+

2.01e7

359. 6

331.5

313. 5

267.3

239. 6

229.3

285.3

303.5

313. 7

331.8

341.6

341. 8

359.8

381.6

507.7

407. 5

Estudo Fitoquímico do C. limonia

150

3.2.1.13. Determinação estrutural dos Esteróides E1, E2 e E3

Os fitoestereóides, por apresentarem propriedades físico-químicas

semelhantes, normalmente estão presentes em uma mistura de difícil separação. Os

mais comuns são β-sitosterol, campesterol e estigmasterol. Isolou-se 3,5 mg da

mistura destes três compostos a partir do extrato dicloro-hexânico da raiz de C.

limonia. Para tal identificação, realizou-se experimentos de RMN 1D (

H e

C) e

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-MS) e comparou-

se os dados com a literatura (ALAM, 1996).

A análise do espectro de RMN

H (Figura 3.96, p.154) mostrou um dubleto

largo em δ 5,34, com constante de acoplamento de 5,04 Hz, o qual corresponde ao

sinal do hidrogênio olefínico ligado ao carbono 6; o multipleto em δ 3,51 corresponde

ao sinal do hidrogênio ligado ao carbono 3; e os sinais em δ 0,65 - δ 2,30 referem-se

aos sinais dos hidrogênios ligados aos carbonos metílicos, metilênicos e metínicos.

Estes sinais confirmam a presença do β-sitosterol.

A presença do estigmasterol foi caracterizada pelos sinais de dois duplo

dubletos, em δ 5,03, com J = 15,4 Hz e J = 8,0 Hz, referente ao hidrogênio ligado ao

carbono olefínico da posição 23; e em δ 5,11, com J = 15,4 Hz e J = 8,0 Hz,

correspondente ao hidrogênio ligado ao carbono olefínico da posição 22.

O espectro de RMN

C (Figura 3.97, p.154) mostrou um sinal em δ 71,9

referente ao carbono carbinólico da posição 3; dois sinais em δ 143,4 e δ 122,2,

correspondentes aos carbonos 5 e 6, respectivamente; e dois sinais em δ 129,2 e δ

138,4 referentes aos carbonos 23 e 22, respectivamente. Estes sinais comprovam a

presença do Sitosterol e do Estigmasterol, portanto, foi necessário a análise por

CG/EM para verificar se havia apenas estes dois compostos na mistura, ou se havia

ainda a presença de outros esteróides.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

151

TABELA 3.26: Dados obtidos de RMN

C (200 MHz) da mistura de Sitosterol,

Estigmasterol e Campesterol em comparação com a literatura.

Posição

C δ*

1 37,2 37,2

2 33,8 33,9

3 71,9 72,9

4 39,3 39,7

5 143,4 140,3

6 122,2 122,1

7 31,7 31,9

8 30,8 31,8

9 50,5 50,1

10 36,4 36,1

11 20,4 21,2

12 40,1 40,4

13 42,1 42,3

14 56,6 56,7

15 24,6 24,2

16 28,5 28,2

17 56,2 56,0

18 11,9 11,9

19 19,6 19,3

20 36,7 36,7

21 18,8 18,7

22 138,4 138,2

23 129,2 129,3

24 29,5 29,1

25 31,9 31,8

26 19,7 19,8

27 19,2 19,0

28 23,6 23,0

29 12,2 11,8

Literatura: ALAM, 1996.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

152

A rampa utilizada para a obtenção do cromatograma foi 100-1-7-250-20. O

cromatograma obtido apresentou 3 picos intensos (Figura 3.91), e a partir dos

espectros de massas correspondentes de cada pico (Figura 3.92, 3.93 e 3.94, p.

153), pode-se confirmar que os esteróides em mistura referem-se ao Sitosterol (E1),

Estigmasterol (E2) e Campesterol (E3).

FIGURA 3.91: Cromatograma da mistura dos três esteróides (E1, E2 e E3).

FIGURA 3.92: Espectro de Massas do esteróide E1.

FIGURA 3.93: Espectro de Massas do esteróide E2.

Estudo Fitoquímico do C. limonia

153

FIGURA 3.94: Espectro de Massas do esteróide E3.

Abaixo, encontra-se ilustrado os três esteróides identificados em mistura.

2221

(E2)

(E1)

(E3)

FIGURA 3.95: Estruturas químicas do Sitosterol (E1), Estigmasterol (E2) e

Campesterol (E3).

Estudo Fitoquímico do C. limonia

154

FIGURA 3.96: Espectro de RMN

H (CDCl

, 200 MHz) dos esteróides E1, E2 e E3.

FIGURA 3.97: Espectro de RMN

C (CDCl

, 200 MHz) dos esteróides E1, E2 e E3.

4. CAPÍTULO 2:

ENSAIOS BIOLÓGICOS

Ensaios biológicos

156

4.1. Ensaios Bactericidas contra a Xylella fastidiosa

Os ensaios foram realizados no Centro APTA Citros ‘Sylvio Moreira’, situado

na cidade de Cordeirópolis - S.P., com a colaboração da professora Dr

. Alessandra

Alves de Souza. Utilizou-se meio PW líquido para o cultivo da bactéria e realizou-se

experimentos com a bactéria no início da fase estacionária (após 10 dias de

crescimento) e exponencial (após 5 dias de crescimento). A solução preparada

contendo bactéria e substância ensaiada foi plaqueada em Placas de Petri contendo

meio PW sólido. A avaliação da inibição do crescimento bacteriano foi realizada

visualmente. A concentração mínima inibitória (MIC) foi considerada quando, no

máximo, uma colônia foi obtida após plaqueamento da cultura não diluída.

4.1.1 Procedimento Experimental

4.1.1.1. Preparação dos meios de cultivo

Inicialmente, preparou-se o meio de cultura PW (líquido e sólido) para a X.

fastidiosa, segundo o protocolo de Davis et al., 1981 (Tabela 4.1). Adicionou-se a

quantidade específica de cada reagente de acordo com a quantidade total de meio

necessário.

TABELA 4.1: Reagentes e suas concentrações necessárias para preparar um

determinado volume do meio PW.

P/ 1000 mL

Meio

P/ 200 mL

Meio

P/ 150 mL

Meio

P/ 100 mL

Meio

Phytone peptone 4,00 g 0,80 g 0,60 g 0,40 g

Trypticase peptone 1,00 g 0,20 g 0,15 g 0,10 g

Hemin chloride (0,1%)

10,00 mL 2,00 mL 1,50 mL 1,00 mL

Phenol red (0,2%)

10,00 mL 2,00 mL 1,50 mL 1,00 mL

HPO

1,20 g 0,24 g 0,18 g 0,12 g

1,00 g 0,20 g 0,15 g 0,10 g

MgSO

O 0,40 g 0,08 g 0,06 g 0,04 g

Agar 12,00 g 2,40 g 1,80 g 1,20 g

O destilada 800 mL 164 mL 125 mL 92 mL

Ensaios biológicos

157

Preparou-se Phenol Red 0,2% a partir da adição de 0,2 g de Phenol Red e 10

gotas de NaOH 20% em 100 mL de H

O; e Hemin Cloride 0,1% a partir da adição de

0,1 g Hemin Cloride (Sigma H-1652) e 0,2 g NaOH em 100 mL H

O. Os outros

reagentes foram obtidos comercialmente. Autoclavou-se a mistura por 20 minutos a

120

C e adicionou-se Glutamina 4% e BSA 10% esterelizado.

Foi necessária uma grande quantidade de meio líquido e sólido para a

realização dos experimentos, portanto, preparava-se 1000 mL de cada um toda vez

que realizava-se os ensaios.

• Preparação de 1000 mL de meio sólido:

Em um frasco grande, adicionou-se, primeiramente, 500 mL de H

O destilada.

Em seguida, colocou-se 4,0 g de Phytone peptone (BBL 4311906), 1,0 g de

Trypticase peptone (BBL 4311921), 1,2 g de K

HPO

, 1,0 g de KH

, 0,4 g de

MgSO

O e 12,0 g de Ágar. Então, sob agitação mecânica, adicionou-se 10 mL de

Hemin chloride (0,1%) e 10 mL de Phenol red (0,2%), após a solução ter ficado

homogênea completou-se até 800 mL com água destilada. Colocou-se o meio para

autoclavar e, enquanto isso, preparou-se a solução de BSA e Glutamina.

Para o preparo da Glutamina 4% adicionou-se em um erlenmeyer 4 g de

Glutamina (Sigma G-5763) e 100 mL de H

O autoclavada e deixou-o sob agitação

até que todo reagente se dissolvesse. Para o BSA, adicionou-se em outro

erlenmeyer 6 g de BSA fração V (Sigma A-9418) e 100 mL de H

O autoclavada e

deixou-se em banho-maria (50-55

C) até que todo reagente se dissolvesse. Após

autoclavado o meio sólido, resfriou-se um pouco e depois inseriu-se o BSA e a

Glutamina através de um filtro. Por fim, verteu-se o meio em placas de Petri com

meio PW sólido e deixou-as aberta por alguns minutos para que o vapor liberado

evaporasse. Não se pode resfriar muito o meio sólido antes de verter, pois este

solidifica rapidamente. Fechou-se as placas e vedou-as. (1000 mL de meio resultou

em aproximadamente 23 placas de Petri).

• Preparação de 1000 mL de meio líquido:

Os reagentes utilizados para se preparar o meio líquido foram os mesmos

utilizados para preparar o meio sólido, porém no meio liquido não se usa o Ágar,

Ensaios biológicos

158

pois é este o responsável por “solidificar” o meio. O procedimento realizado foi

semelhante, porém em vez de autoclavar em um único frasco como no meio sólido,

dividiu-se a solução em 10 erlenmeyer contendo 80 mL e depois que todos foram

autoclavados, adicionou-se 10 mL de BSA e 10 mL de Glutamina em cada

erlenmeyer.

Ambos meios são preparados com o máximo de cautela, toda vidraria usada

é autoclavada, o meio é autoclavado, e toda preparação do meio é executada dentro

de um fluxo próprio e próximo ao fogo, uma vez que este meio é facilmente

contaminável devido ser um meio rico e não conter nenhum antibiótico que possa

matar os outros microrganismos, exceto a X. fastidiosa. No entanto, o meio líquido é

mais facilmente contaminado que o meio sólido, pois há um maior mauseio e

transferência de vidrarias. Após este procedimento os meios ficaram sob

“quarentena”, que na verdade são apenas alguns dias (aproximadamente 14 dias)

para verificar se não houve contaminação. O meio líquido foi utilizado para cultivar a

bactéria, enquanto que o meio sólido foi utilizado para plaquear a solução contendo

meio X. fastidiosa e a substância a ser ensaiada e, portanto, verificar se a bactéria

se desenvolveu com a substância em questão.

Preparados os meios de cultivo, colocou-se a bactéria para crescer no meio

líquido. Nos primeiros dias, a bactéria se encontra na fase exponencial, nesta fase a

bactéria está em estado de multiplicação celular. Aproximadamente no décimo dia,

a bactéria encontra-se no início da fase estacionária, ou seja, é neste estágio que a

bactéria está mais resistente, pois está em sua maior população. A partir deste

estágio, ela pára de se multiplicar e conseqüentemente começa a morrer.

4.1.1.2. Ensaios das Substâncias contra Xylella fastidiosa

Os experimentos foram realizados utilizando-se a bactéria no início da fase

estacionária, e com o decorrer dos mesmos utilizou-se a bactéria na fase

exponencial para comparação dos resultados.

Primeiramente, preparou-se a solução estoque (5 mg/mL) das substâncias a

serem ensaiadas utilizando-se como solvente DMSO:H

O (1:1). Calculou-se a

quantidade de solução estoque necessária para a obtenção da concentração final

utilizando-se 100 µL da bactéria.

Ensaios biológicos

159

Ci.Vi = Cf.Vf

• Ci.Vi = Cf. (0,1+Vi)

5,0 mg/mL. Vi = 0,4 mg/mL . (0,1 mL + Vi)

Vi = 8,7 µL  Para uma concentração de 0,4 mg/mL deve-se usar

8,7 µL da solução estoque (5,0 mg/mL)

• Ci.Vi = Cf. (0,1+Vi)

5,0 mg/mL. Vi = 2,0 mg/mL . (0,1 mL + Vi)

Vi = 67,0 µL  Para uma concentração de 2,0 mg/mL deve-se usar

67,0 µL da solução estoque (5,0 mg/mL)

Os cálculos para as outras concentrações foram semelhantes ao descrito

acima e estão indicados na Tabela 4.2.

TABELA 4.2: Volumes retirados da solução estoque e a correspondente

concentração final.

Volume Solução Estoque (µL)

Concentração ensaiada (mg/mL)

8,7 0,4

25,0 1,0

31,6 1,2

35,0 1,3

39,0 1,4

43,0 1,5

47,0 1,6

51,0 1,7

56,0 1,8

67,0 2,0

Então retirou-se uma alíquota correspondente da solução estoque e colocou-a

em um poço da placa contendo 100 µL da bactéria em meio líquido (Figura 4.1).

Ensaios biológicos

160

Deixou-se as substâncias e bactéria em contato por 24 horas na BOD (Biological

Oxigen Demand).

1 2 3 4 5 6

FIGURA 4.1: Placa com a solução de X. fastidiosa e as substâncias ensaiadas nas

diferentes concentrações.

Após este período, plaqueou-se 100 µL destas soluções em placas de Petri e

colocou-as na BOD. A partir de 15 dias observou-se se a bactéria cresceu na

concentração correspondente ou se esta foi inibida (Figura 4.2, p.161). Quando a

bactéria foi totalmente inibida determinou-se a MIC para a substância ensaiada.

Os experimentos foram feitos em triplicata, para obtenção de um resultado

confiável e reprodutível. Em todos os experimentos fez-se o branco, ou seja,

colocou-se em um poço o solvente (DMSO:H

O - 1:1), a bactéria e depois plaqueou-

se, para verificar se o solvente não inibia o desenvolvimento desta última. Em outro

poço adicionou-se apenas a bactéria e plaqueou-se para confirmar a viabilidade

celular.

Ensaios biológicos

161

a b

FIGURA 4.2: a- Placas de Petri com as substâncias ensaiadas (Xantiletina, Seselina,

Limonia e Flavona 1, nas concentrações de 1000 µg/mL) e o controle; b- Placas de

Petri com a Xantiletina nas concentrações 1000, 500 e 300 µg/mL, respectivamente.

Quando há inibição da bactéria, além de não aparecerem colônias das

mesmas, a placa permanece amarelada e não se torna vermelha como no caso em

que cresce a bactéria, pois não há uma mudança do pH do meio. Quando se altera o

pH do meio, a cor amarelada passa a avermelhada. Então, por exemplo, a partir das

placas mostradas na Figura 4.2, pode-se verificar que nas concentrações de 1

mg/mL, todos os compostos ensaiados inibiram a bactéria, exceto o controle.

Iniciou-se os experimentos utilizando-se uma ampla faixa de concentração de

0,1 µg/mL a 500,0 µg/mL da substância, uma vez que não havia descrito na

literatura ensaios de substâncias isoladas de produtos naturais frente a X. fastidiosa.

A partir dos resultados obtidos foi alterando-se as concentrações (aumentando e

diminuindo) até a determinação da MIC de cada substância. Toda a metodologia

empregada no ensaio biológico está representada na Figura 4.3, p. 162.

Ensaios biológicos

162

FIGURA 4.3: Fluxograma da metodologia empregada nos ensaios bactericida contra

X. fastidiosa.

Bactéria

Meio PW líquido

Fase Exponencial ou

Estacionária

Biofilme e

Planctônico

Substância

Placas de Petri

Meio PW sólido

Ensaios biológicos

163

4.1.2. Resultados e Discussões

4.1.2.1 Ensaios contra Xylella fastidiosa em diferentes fases de

crescimento

Não há atualmente um método eficaz e comercial disponível para o controle da

bactéria X. fastidiosa, agente causal da Clorose Variegada dos Citros (CVC) e de

outras doenças, como por exemplo, a Doença de Pierce. Esta bactéria tem causado

enormes prejuízos tanto para a citricultura brasileira, como para outras diversas

culturas distribuídas mundialmente.

Iniciou-se, então, estudos para a obtenção de substâncias naturais com alto

potencial bactericida, as quais não são agressoras ao meio ambiente e ao ser

humano. No entanto, não há dados na literatura sobre ensaios contra X. fastidiosa

com substâncias naturais, então, primeiramente ensaiou-se substâncias que

estavam disponíveis em grande quantidade e que são fáceis de se isolar, caso fosse

necessário posteriormente mais quantidade das mesmas para os ensaios.

A X. fastidiosa é uma bactéria de difícil cultivo em meios. O meio ideal para seu

crescimento é rico em nutrientes, e por isto é facilmente contaminado por demais

microrganismos, como fungo, o que dificulta os ensaios. Um trabalho citado na

literatura (Campanharo, et.al., 2003) compara o crescimento da bactéria em

diferentes meios e demonstra que, independente deste, a X. fastidiosa possui três

fases de crescimento: Fase lag, na qual bactéria ainda não se multiplica; Fase log

(exponencial), onde a bactéria se multiplica, aumentando sua população; e Fase

estacionária, na qual a bactéria pára de se multiplicar. Nos ensaios realizados foi

utilizada a bactéria cultivada em meio PW líquido; a partir da Figura 4.4, p. 164,

verifica-se que, para este meio, a bactéria nas primeiras 24 horas de crescimento

encontra-se na Fase lag; do 1º ao 10º dia na Fase log e a partir do 10º dia na Fase

estacionária.

Ensaios biológicos

164

FIGURA 4.4: Crescimento de X. fastidiosa em diferentes meios líquidos: A) Medida

da concentração total de proteína, B) Medida por Densidade ótica (OD) a A600 nm.

(Fonte: )

4.1.2.1.1. Ensaios contra a Xylella fastidiosa no início da Fase

Estacionária

Os primeiros ensaios foram realizados utilizando-se quatro substâncias: um

flavonóide - 3’,4’,5’,5,7-pentametoxiflavona (Flavona 1), um limonóide (Limonina),

duas cumarinas (Xantiletina e Seselina); e a bactéria no início da Fase Estacionária

(10 dias de crescimento após inoculação). Estas substâncias são facilmente obtidas

por métodos de extrações convencionais, e além disto, as duas cumarinas foram

isolados em grande quantidade do C. limonia, o qual é resistente a CVC, como

comentado na introdução. Ou seja, é um indício que estes compostos possam

apresentar alguma atividade inibitória considerável frente a X. fastidiosa e estarem

Fase la

Fase lo

Fase estacionária

Ensaios biológicos

165

contribuindo possivelmente com a resistência à bactéria. O limonóide foi isolado em

grande quantidade do enxerto de C. sinensis sobre C. limonia e o flavonóide,

embora não isolado deste último, apresenta grande semelhança estrutural com os

flavonóides isolados da parte superior desta planta. Com isto, os ensaios

preliminares foram realizados utilizando-se substâncias isoladas (ou semelhantes às

isoladas) de Citrus.

Realizou-se ensaios com diversas concentrações das substâncias, as quais

estão descritas na Tabela 4.3, até que a bactéria fosse totalmente inibida.

TABELA 4.3: Colônias observadas nas diferentes concentrações de substâncias

ensaiadas contra X. fastidiosa na Fase Estacionária.

C mg/mL Flavona 1 Limonina Xantiletina Seselina

0,001 +++ ++ ++ ++

0,005 +++ ++ ++ ++

0,010 +++ + ++ ++

0,015 +++ + + ++

0,020 ++ ++ + ++

0,050 +++ ++ + N

0,400 ++ ++ + +

0,500 + + + +

0,600 + + +* +

0,700 X X N +

0,800 X X N +

0,900 X X +* N

1,000 + + - +

1,100 X X - +

1,200 + + - +

1,300 X X - N

1,400 - + - -

1,500 - X - -

1,600 - - - -

1,700 X - X X

Ensaios biológicos

166

TABELA 4.3: Colônias observadas nas diferentes concentrações de substâncias

ensaiadas contra X. fastidiosa na Fase Estacionária - Continuação.

1,800 - - - -

2,000 - - - -

4,000 N - - -

+++: Crescimento intenso, semelhante ao controle; ++: Redução parcial do crescimento; +: Redução

do crescimento, visualização de colônias isoladas; +

: Redução quase total de crescimento; -: Não

cresceu bactéria; N: não determinado, X: não foi realizado experimento.

A partir destes resultados pode-se determinar a MIC de cada substância

(Figura 4.5):

MeO

OMe

Flavona 1: MIC = 1,4 mg/mL Limonina: MIC = 1,6 mg/mL

OOO OOO

Xantiletina: MIC = 1,0 mg/mL Seselina: MIC = 1,4 mg/mL

FIGURA 4.5: MIC da 3’,4’,5’,5,7-pentametoxiflavona (Flavona 1), Limonina,

Xantiletina e Seselina contra a X. fastidiosa no início da Fase Estacionária.

Ensaios biológicos

167

4.1.2.1.2. Ensaios contra Xylella fastidiosa na Fase Exponencial e

no início da Fase Estacionária

Os ensaios iniciais foram realizados com a bactéria no início da Fase

Estacionária, pois é citado na literatura que é nesta fase que a bactéria encontra-se

em maior densidade celular e por isto mais resistente. Então seria interessante a

inibição da bactéria nesta fase, pois a MIC determinada seria suficiente para inibir a

bactéria em qualquer uma das fases. No entanto, resolveu-se fazer os ensaios em

ambas as fases para verificar se as mudanças nas MICs são discrepantes ou

discretas. As concentrações utilizadas para o experimento foram 0,5, 0,6, 1,0 e 2,0

mg/mL.

Antes de iniciar o experimento, mediu-se o OD

600nm

de cada meio para

verificar qual a fase em que as bactérias se encontravam em cada meio. Um meio

apresentou OD

600nm

igual a 0,080 (Meio 1), e o outro OD

600nm

igual a 0,281 (Meio 2).

Comparando-se os dados com a literatura, verifica-se que no primeiro meio as

bactérias encontram-se na Fase Exponencial (5 dias após a inoculação) e no

segundo elas estão no início da Fase Estacionária (10 dias após a inoculação). Fez-

se então os experimentos (Figura 4.6, p.168) utilizando-se primeiramente a bactéria

na Fase Exponencial (Meio 1) e posteriormente no início da Fase Estacionária (Meio

2).

Ensaios biológicos

168

1 2 3 4 5 6

FIGURA 4.6: Concentrações utilizadas, em mg/mL, no experimento para

comparação das fases de crescimento da X. fastidiosa.

Obteve-se o seguinte resultado nas placas (Tabela 4.4):

TABELA 4.4: Colônias observadas com a X. fastidiosa na Fase Exponencial e no

início da Fase Estacionária.

C mg/mL

(Fase Exponencial)

C mg/mL

(Fase Estacionária)

Substância

Ensaiada

0,5 0,6 1,0 2,0 0,5 0,6 1,0 2,0

Flavona 1

+ N + - + + +

Limonina

N N N - + + + -

Xantiletina

+ + + - + +

- -

Seselina

+ + + - + + - -

+: Redução do crescimento, visualização de colônias isoladas; +

: Redução quase total de

crescimento; -: Não cresceu bactéria; N: não determinado.

Pode-se verificar que os resultados são relativamente próximos e que,

portanto não há diferenças discrepantes entre as duas fases. No entanto, é mais

interessante realizar os ensaios com a Fase Exponencial, já que o tempo necessário

0,5

0,6

1,0

2,0

Controle

Ensaios biológicos

169

para que a bactéria atinja esta fase é menor (5 dias) do que o necessário para atingir

o início da Fase Estacionária (10 dias), ou seja, consegue-se fazer um número maior

de ensaios em um tempo menor, o que torna o experimento mais prático. A partir

destes dados começou-se a realizar os experimentos utilizando-se apenas a Fase

Exponencial.

4.1.2.1.3. Ensaios contra a Xylella fastidiosa na Fase Exponencial

Continuou-se os ensaios com diferentes substâncias visando obter compostos

cada vez mais potentes, por isto utilizou-se uma ampla variedade das mesmas

pertencentes a diversas classes, como cumarinas, flavonóides, limonóides, porém

todas isoladas de diferentes plantas da família Rutaceae, uma vez que esta família

possui uma gama de compostos com atividades biológicas. Realizou-se ensaios

com substâncias: Odoratol (ODL), Azadirachtina (AZ), Hesperidina (HS), Ácido

Anacárdico (AC), Rauianina (RAU), 3’-(1’,1’-dimetilalil)-isoescopoletina (C1),

metiléter-graveliferona (C2), 7,8,3’,4’-tetrametóxi-6,5-(2’’,2’’-dimetilpirano)flavona

(FLA2), Catequina (CAT), Gedunina (GED) e Odoratona (ODN). O resultado obtido

está ilustrado na Tabela 4.5.

TABELA 4.5: Colônias observadas nas diferentes concentrações de substâncias

ensaiadas contra X. fastidiosa na Fase Exponencial.

C mg/mL ODL AZ HS AC RAU C1 C2 FLA2 CAT GED ODN

0,4 + + + X + + + + N + N

1,0 + N N X + + + + - + +

1,1 X X X X X X X X - + -

1,2 X X X X + X X +* - +* -

1,3 X X X X + X X - N - -

1,4 X X X X +* X X N - - -

1,5 X X X X - X X X X - -

1,6 - + +* + - + N - - - -

1,7 - X + - X X X X X X X

1,8 N X N N X X X X X X X

2,0 - X - N - + N - - - -

+: Redução do crescimento, visualização de colônias isoladas; +

: Redução quase total de

crescimento; -: Não cresceu bactéria; N: não determinado, X: não foi realizado experimento.

Ensaios biológicos

170

Com estes experimentos, determinou-se a MIC de algumas substâncias e

verificou-se para outras que a MIC está muito maior que a última concentração

ensaiada (Figura 4.7), não sendo interessante determiná-lo, pois deseja-se obter

MIC cada vez menores, ou seja, substâncias com maiores potenciais de inibição

contra X. fastidiosa.

OH O

OOO

Ácido Anacárdico: MIC = 1,7 mg/mL Raunina: MIC = 1,5 mg/mL

MeO OOMeO

C1: MIC = 2,0 mg/mL C2: MIC = 2,0 mg/mL

rha-glyO

OCH

OAc

Hesperidina: MIC = 2,0 mg/mL Gedunina: MIC = 1,3 mg/mL

Ensaios biológicos

171

OCH

Catequina: MIC = 1,0 mg/mL Flavona 2: MIC = 1,3 mg/mL

Odoratol: MIC = 1,8 mg/mL Odoratona: MIC = 1,1 mg/mL

Azadirachtina: MIC >> 1,6 mg/mL

FIGURA 4.7: MIC do Ácido Anacárdico, Rauanina, 3’-(1’,1’-dimetilalil)-

isoescopoletina (C1), metiléter-graveliferona (C2), Hesperidina, Odoratol, Catequina,

7,8,3’,4’-tetrametóxi-6,5-(2’’,2’’-dimetilpirano) flavona (Flavona 2), Gedunina,

Odoratona, Azadirachtina,ensaiadas contra a X. fastidiosa na Fase Exponencial.

AcO

OOC

Ensaios biológicos

172

Ao total foram determinados as MICs de 15 substâncias, todos estão listados

em ordem crescente na Tabela 4.6. As substâncias que apresentaram uma menor

MIC, ou seja, um maior potencial inibitório foram a Xantiletina e a Catequina.

TABELA 4.6: MICs das substâncias ensaiadas frente a X. fastidiosa.

Substância Ensaiada MIC (mg/mL)

Xantiletina 1,0

Catequina 1,0

Odoratona 1,1

Gedunina 1,3

7,8,3’,4’-tetrametóxi-6,5-(2’’,2’’-

dimetilpirano) flavona

1,3

Seselina 1,4

3’,4’,5’,5,7-pentametoxiflavona 1,4

Raunina 1,5

Limonina 1,6

Ácido Jasmônico 1,7

Odoratol 1,8

Hesperidina 2,0

3’-(1’,1’-dimetilalil)-isoescopoletina

〉 2,0

Metiléter-graveliferona

〉 2,0

Azadirachtina

>> 1,6

Ensaios biológicos

173

4.2. Ensaios biológicos de inibição da enzima Xylellaina

O genoma completo da X. fastidiosa foi publicado recentemente (SIMPSON et

al., 2000). Analisando o genoma pose-se identificar um gene que codifica uma,

ainda não caracterizada, cisteíno protease (MW de aprox. 30 kDa), similar à

papaína, talvez envolvida na patogenicidade da X. fastidiosa. A expressão

recombinante e purificação desta proteína, a qual denominou-se “Xylellaina”, foram

realizadas no laboratório de Biologia da UFSCar (Figura 4.8). Testes de atividade

utilizando substratos fluorescentes e inibidores específicos para cisteíno proteases

foram realizados e mostraram que a proteína é realmente uma cisteíno protease. A

Xylellaina recombinante é mais ativa em pHs ácidos, dependente de Dithioerythritol

(DTE) ou Dithiothreito (DTT) e foi eficientemente inibida por E-64 e cistatinas. Desde

que cisteíno proteases são utilizadas por patógenos para invasão de plantas, talvez

a inibição da Xylellaina possa ser uma boa opção para prevenir a invasão da planta

pela X. fastidiosa.

FIGURA 4.8:

Análise da expressão e purificação da proteína Xylellaina em E. coli:

Purificação da Xylellaina por cromatografia de afinidade em resina de níquel. A seta

indica a proteína expressa.

Ensaios biológicos

174

Foram realizados alguns ensaios de compostos naturais contra a Xylellaina e

verificou-se que a cumarina Xantiletina, a qual é encontrada em grande quantidade

nas raízes de C. limonia, inibiu a atividade da enzima em 80% a uma concentração

de 3 µg/mL. A pirano cumarina angular 5-metóxi-seselina mostrou-se um pouco

menos ativa, inibindo a atividade da enzima em 70% a uma concentração de

5µg/mL. A isopimpinellina, mostrou-se um inibidor fraco, com um valor de 40% a

uma concentração de 5 µg/mL (Figura 4.9).

OOO

OMe

OOO

OMe

xantiletina 5-metóxi-seselina isopimpenellina

FIGURA 4.9: Algumas das substâncias ensaiadas frente a enzima Xylellaina.

Estes resultados indicam que as cumarinas, principalmente as

piranocumarinas, possuem uma boa atividade frente a enzima da X. fastidiosa, e isto

também foi observado nos ensaios realizados frente a bactéria, onde esta classe de

substâncias foram as que apresentaram um melhor potencial inibitório. A cumarina

Xantiletina foi a substância ensaiada que apresentou maior potencial inibitório frente

a bactéria X. fastidiosa e sua enzima Xylellaina.

5. CAPÍTULO 3:

INTERAÇÃO PLANTA –

XYLELLA FASTIDIOSA –

ONCOMETOPIA FACIALIS

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

176

5.1 Experimento Interação Planta - Cigarrinha

O estudo da interação Planta - Cigarrinha foi realizado a partir de plantas

enxertadas C. sinensis sobre C. limonia e cigarrinhas da espécie Oncometopia

facialis, uma vez que estas plantas são suscetíveis a CVC e estas cigarrinhas são

transmissores da doença.

5.1.1. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

O experimento consistiu na análise dos óleos essenciais e dos constituintes

voláteis da planta com e sem a presença de cigarrinhas para verificar se haveria

uma resposta química da planta frente ao vetor da X. fastidiosa. Foram feitas três

condições diferentes de análise:

• condição 1 – planta sem ter sido submetida às cigarrinhas

• condição 2 – planta com cigarrinhas

• condição 3 – planta após removida as cigarrinhas

Realizou-se o seguinte experimento em triplicata, para maior confiabilidade e

reprodutibilidade dos resultados:

Partiu-se de 6 amostras de plantas enxertadas;

Extraiu-se os óleos essenciais de três plantas (a1, a2 e a3);

Extraiu-se os constituintes voláteis das outras três (b1, b2 e b3);

Colocou-se as cigarrinhas em contato com estas três últimas (b1, b2 e b3) e

extraiu-se os voláteis em diferentes intervalos de tempo, visando observar se o

tempo de permanência das cigarrinhas altera os voláteis da planta:

• condição 2a: Extração logo após a inserção das cigarrinhas

• condição 2b: Extração 24 horas após a inserção das cigarrinhas

• condição 2c: Extração 48 horas após a inserção das cigarrinhas

Removeu-se as cigarrinhas destas três plantas (b1, b2 e b3), extraiu-se os

voláteis em diferentes intervalos de tempo:

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

177

• condição 3a: Extração logo após a remoção das cigarrinhas

• condição 3b: Extração 24 horas após a remoção das cigarrinhas

• condição 3c: Extração 48 horas após a remoção das cigarrinhas

Por fim, extraiu-se os óleos essenciais das plantas (b1, b2 e b3), após 24

horas da última extração dos voláteis, ou seja, 72 horas após a remoção das

cigarrinhas.

ESQUEMA 5.1: Etapas desenvolvidas no experimento interação planta-cigarrinha.

Para a realização da extração dos voláteis foi necessário, inicialmente,

determinar a condição ideal de análise. Portanto, otimizou-se alguns parâmetros,

como a fibra ideal para a extração dos voláteis, o tempo ideal de exposição da

mesma e a injeção de hidrocarbonetos conhecidos para posterior identificação dos

compostos.

6 plantas

C. sinensis sobre C. limonia

3 plantas (a1,a2 e a3)

Óleo essencial -

Condição 1

3 plantas (b1,b2 e b3)

Headspace –

Condição 1

3 plantas com cigarrinhas

Headspace –

Condição 2

3 plantas retirada cigarrinhas

Headspace –

Condição 3

3 plantas

Óleo essencial -

Condição 3

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

178

5.1.1.1. Determinação da Fibra Ideal

Foram testadas três tipos de fibra: CW/DVB – Carbowax Divinilbenzeno 65

µm (laranja), PDMS/DVB – Polimetilsiloxano Divinilbenzeno 65 µm (azul), e

CAR/PDMS - Carboxen Polimetilsiloxano 75 µm (preta). Condicionou-as antes de

iniciar o experimento em um cromatógrafo a gás utilizando condições específicas

catalogadas para cada fibra (Tabela 5.1).

TABELA 5.1: Condições de condicionamento para as fibras utilizadas.

Fibra*

T injetor

(

T coluna

(

T detector

(

t condicionamento

(min)

CAR/PDMS 250 260 270 100

CW/DVB 220 260 270 30

PDMS/DVB 250 260 270 30

* Supelco.

Inseriu-se as três fibras em um sistema fechado contendo três plantas

enxertadas, e deixou-se expostas por sete horas. Após este período, injetou-se as

fibras diretamente em um Cromatógrafo a Gás acoplado a um Espectrômetro de

Massas (CG-EM), aparelho Shimadzu QP 5000, sob as seguintes condições:

• temperatura do injetor: 250

• temperatura do detector: 280

• coluna: DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25µm);

• rampa: 50/3-5/150/10/260/10;

• pressão da cabeça da coluna:100 kPa;

• fluxo de gás: 1,6 mL/min (à 60

C);

• tempo entre as varreduras: 0,50 s;

• intervalo de massas: 40,5 a 500 uma;

Os cromatogramas obtidos para as diferentes fibras estão apresentados a

seguir (Figura 5.1, p. 179).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

179

• PDMS/DVB (Fibra Azul)

• CW/DVB (Fibra Laranja)

• CAR/PDMS (Fibra Preta)

FIGURA 5.1: Cromatogramas das fibras PDMS/DVB, CW/DVB e CAR/PDMS

quando expostas durante sete horas a plantas enxertadas C. sinensis sobre C.

limonia.

Observando-se os três cromatogramas, verifica-se que a fibra CAR/PDMS foi

a que apresentou uma pior adsorção dos compostos e o cromatograma encontrou-

se com péssima resolução. As fibras PDMS/DVB e CW/DVB apresentaram

cromatogramas muito similares, no entanto, a fibra laranja adsorveu poucos

compostos com tempo de retenção abaixo de 20 minutos. Portanto, determinou-se a

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

180

fibra PDMS/DVB como ideal para este experimento, pois esta adsorveu um número

maior de compostos voláteis quando comparada às outras nas mesmas condições.

5.1.1.2. Determinação do Tempo de Exposição Ideal

Utilizando-se a fibra ideal, PDMS/DVB, variou-se o tempo de exposição da

mesma, em um sistema fechado contendo três plantas para a verificação de um

tempo ideal para o experimento. Os tempos de exposição testados para a fibra

foram 1, 3, 6, 9, 10, 12, 14, 18, 22 e 24 horas. As fibras foram injetadas diretamente

em um CG-EM sob as mesmas condições utilizadas anteriormente (Seção 5.1.1.1, p.

177). Os cromatogramas obtidos estão indicados a seguir.

1 hora

3 horas

6 horas

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

181

9 horas

10 horas

12 horas

14 horas

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

182

18 horas

22 horas

24 horas

FIGURA 5.2: Cromatogramas da fibra PDMS/DVB quando expostas a plantas

enxertadas C. sinensis sobre C. limonia em diferentes tempos.

Verificou-se que para estas condições empregadas, o tempo de exposição de

3 horas é o tempo ideal, uma vez que a partir deste a fibra começa a ficar saturada,

não apresentando uma grande alteração nos constituintes adsorvidos e detectados.

Além disto, o interesse é identificar os compostos mais voláteis, e, portanto, os que

são liberados primeiramente pela planta, e com isto muitas horas de adsorção não

são satisfatórias para o experimento.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

183

5.1.1.3. Determinação do tempo de retenção de uma série de

hidrocarbonetos

Injetou-se uma série de hidrocarbonetos conhecidos,

C9/10/12/14/16/18/20/22/24/26/28, para posterior identificação dos compostos, a

partir do cálculo do Índice de Kovats. Foram realizados dois tipos de injeção:

• Injeção da mistura de hidrocarbonetos por meio de uma seringa para

posterior identificação dos óleos essenciais.

• Injeção da fibra (HS-SPME) contendo a mistura de hidrocarbonetos para

posterior identificação dos voláteis.

Realizou-se estes dois procedimentos de injeção para a obtenção de

resultados mais exatos, uma vez que esperava-se que o tempo de retenção dos

hidrocarbonetos deveria ser diferente quando injetados diretamente ou quando

injetados pela fibra. Pois, neste último caso, além dos compostos precisarem

volatilizar no CG para serem analisados por EM, é necessário primeiramente a

desorção dos compostos da fibra. No entanto, quando se injeta diretamente pela

seringa deve-se considerar que o tempo para a volatilização dos compostos é maior

devido à presença de solventes, no entanto no caso dos compostos presentes na

fibra, estes encontram-se livres de solvente. Devido a estes fatores, não é possível

prever em qual dos dois modos de injeções os compostos terão maior ou menor

tempo de retenção.

A seguir, encontram-se os cromatogramas para ambas injeções e a tabela

com os tempos de retenção dos picos e os hidrocarbonetos correspondentes.

FIGURA 5.3: Cromatograma dos hidrocarbonetos injetados diretamente por seringa.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

184

FIGURA 5.4: Cromatograma dos hidrocarbonetos injetados após serem adsorvidos

pela fibra PDMS/DVB.

TABELA 5.2: Número de carbonos de cada hidrocarboneto e seus respectivos

tempos de retenção obtidos a partir da injeção por seringa e por fibra (PDMS/DVB).

Número de Carbonos

Tempo de retenção (min.)

injeção seringa

Tempo de retenção (min.)

injeção fibra

9 4,762 4,542

10 7,510 7,297

12 13,992 13,701

14 19,459 19,477

16 23,906 23,929

18 27,294 27,297

20 29,692 29,662

22 31,704 31,700

24 33,511 33,524

26 35,356 35,400

28 37,907 37,967

A partir dos resultados pode-se observar que não há uma linearidade nos

resultados, ou seja, não se pode afirmar que quando há injeção por um tipo

específico, os tempos se deslocam para um mesmo sentido, isto é devido ao

tamanho das moléculas de cada hidrocarboneto ser variável. Para moléculas

pequenas, as quais são mais voláteis, o tempo de desorção da fibra é menor que o

tempo para volatilização do solvente, gerando tempos de retenção menores. Já para

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

185

moléculas maiores, o tempo de desorção da fibra é maior que a volatilização do

solvente, resultando assim em tempos de retenção maiores. Com isto, há uma

variação nos tempos de retenção obtidos nas diferentes injeções, e, portanto os

resultados tornam-se mais exatos e precisos quando se utiliza os hidrocarbonetos

extraídos e injetados nas mesmas condições que os compostos analisados.

5.1.1.4. Extração e Identificação dos Compostos Voláteis

Determinada as condições ideais para a fibra, iniciou-se a extração e

identificação dos voláteis da planta para cada condição estipulada: condição 1, 2 e

3, respectivamente. Realizou-se a extração dos compostos voláteis a partir da

inserção de fibra de Carboxen Polimetilsiloxano (CAR/PDMS) com poros de 75µm,

em um sistema fechado, o qual continha a planta enxertada (Figura 5.5a), sob as

diferentes condições. Os voláteis foram extraídos em triplicata para cada condição e

o sistema onde foram inseridas as fibras continha três amostras de plantas

enxertadas, para que se obtivesse um resultado populacional e não único.

Deixou-se a fibra neste sistema por 3 horas, e então a injetou em um CG-EM

(Figura 5.5b), com as mesmas condições descritas anteriormente (Seção 5.1.1.1, p.

177). Em seguida, injetou-se uma série de hidrocarbonetos conhecidos extraídos

também por HS-SPME, porém utilizando um sistema minimizado. Calculou-se o

Índice de Kovats para cada pico presente em cada cromatograma e comparou-se os

espectros de massas dos mesmos com a literatura; a partir destes dados em

conjunto, determinou-se os constituintes voláteis para cada condição estipulada.

a b

FIGURA 5.5: a: Sistema utilizado para extração de voláteis: cuba e fibra; b: CG-EM

utilizado para análise dos voláteis extraídos.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

186

5.1.1.5. Extração e Identificação dos Óleos Essenciais

Extraiu-se os óleos essenciais das folhas das plantas, submetidas nas

condições 1 e 3, respectivamente, a partir da técnica de extração por arraste a vapor

d’água, utilizando um aparelho tipo Clevenger modificado (Figura 5.6). Inicialmente,

montou-se o sistema de extração com o aparelho tipo Clevenger, uma manta de

aquecimento e um balão de 500 mL de duas bocas. Em uma das saídas do balão,

adaptou-se um termômetro e uma rolha, para que a temperatura fosse controlada e

mantida a 100

C. Adicionou-se água destilada até a metade do balão, ou seja, até o

nível da manta, e 10 g de folhas previamente picadas. Antes de começar a aquecer

o sistema, adicionou-se éter de petróleo no extrator para que todo composto

volatilizado permanecesse miscível ao óleo e não retornasse ao balão e nem saísse

do sistema, para evitar a perda do mesmo. O sistema foi mantido em refluxo a 100

por uma hora. Após coletado, o óleo foi mantido em um congelador para que não

houvesse evaporação do mesmo.

Extraídos os óleos, injetou-se cada um separadamente no CG-EM, sob as

mesmas condições citadas anteriormente (seção 5.1.1.1, p.177). Injetou-se,

também, uma série de hidrocarbonetos conhecidos. A partir do cálculo do Índice de

Kovats de cada pico presente em cada cromatograma e da comparação dos

espectros de massas dos mesmos com a literatura, determinou-se os constituintes

químicos de cada óleo essencial extraído nas diferentes condições realizadas.

FIGURA 5.6: Sistema utilizado para extração de óleos essenciais por arraste a

vapor: Aparelho tipo Clevenger modificado.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

187

5.2.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.2.1.1. Compostos voláteis obtidos do C. sinensis sobre C. limonia

A seguir encontram-se os tempos de retenção dos picos observados nos

cromatogramas obtidos pelas extrações dos voláteis nas diferentes condições.

Obteve-se a média dos tempos das replicatas, e aplicou-se a equação de Van Den

Dool e Kratz, que considera o tempo de retenção de cada composto, e os tempos de

retenção e os números de carbono dos hidrocarbonetos injetados no CG:

IR= 100.N. (t

-t

n-1

) + 100.C

n-1

-t

n-1

)

IR = índice de retenção de Kovats

N = C

n-1

= número de carbonos do n-alcano que elui após a substância analisada

n-1

= número de carbonos do n-alcano que elui antes a substância analisada

= tempo de retenção da substância analisada

= tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância analisada

n-1

= tempo de retenção do n-alcano que elui antes da substância analisada

Com isto, determinou-se o índice de retenção de Kovats para cada pico. Os

compostos foram identificados, comparando-se seu índice e seu espectro de massa

com a literatura (ADAMS, 2001).

5.2.1.1.1 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

sem ter sido submetida às cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia sem ter sido submetida às cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

188

TABELA 5.3. Compostos voláteis identificados no C. sinensis sobre C. limonia sem

ter sido submetido às cigarrinhas.

tr 1(3h2) tr 1(3h3) tr 1(3h4) tr M IR M

Composto

5,762 5,771 5,766 5,766 944 ni ni

6,917 6,926 6,918 6,920 986 ni ni

7,209 7,224 7,225 7,219 997 1002 (∆-2)-careno

8,021 8,027 8,027 8,025 1023 ni ni

9,125 9,932 9,033 9,363 1065 1065 Acetofenona

9,985 9,998 9,991 9,991 1084 ni ni

10,313 10,326 10,319 10,319 1094 1101 Nonanal (n)

10,896 - 10,908 10,902 1113 1122 Ácido etil hexanóico

11,688 11,688 11,688 11,688 1137 ni ni

11,992 12,017 12,002 12,004 1147 1162 Nonen-1-al (2Z)

13,396 - 13,403 13,400 1191 1202 Decanal-dn

13,754 - 13,766 13,760 1202 ni ni

- - 16,173 16,173 1286 1300 Tridecano (n)

16,631 16,637 16,632 16,633 1301 ni ni

18,921 18,93 18,931 18,927 1381 1400 Tetradecano (n)

19,126 19,342 19,137 19,202 1390 1409 Dodecanal

21,547 21,552 21,553 21,551 1493 1516 Tridecanona (2)

23,639 23,644 23,645 23,643 1587 ni ni

23,913 23,917 23,914 23,915 1599 1600 Hexadecano (n)

24,149 - 24,149 24,149 1613 ni ni

24,423 24,434 24,382 24,413 1629 ni ni

24,846 24,851 24,796 24,831 1654 ni ni

25,263 25,267 25,275 25,268 1680 ni ni

25,826 25,753 25,832 25,804 1711 ni ni

- 27,233 27,231 27,232 1796 1800 Octadecano (n)

27,45 27,567 27,452 27,490 1816 1774 Pentadecanol (n)

27,993 27,995 27,988 27,992 1859 ni ni

28,3 28,342 28,302 28,315 1886 ni ni

28,583 28,509 28,585 28,559 1907 ni ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

189

TABELA 5.3. Compostos voláteis identificados no C. sinensis sobre C. limonia sem

ter sido submetido às cigarrinhas - Continuação.

28,992 29,153 29,145 29,097 1952 ni ni

30,654 30,786 30,662 30,701 2102 ni ni

32,042 32,028 32,028 32,033 2237 ni ni

32,681 - 32,684 32,683 2308 ni ni

33,272 33,292 - 33,282 2373 ni ni

33,466 33,477 33,468 33,470 2394 ni ni

34,124 34,135 34,133 34,131 2465 ni ni

34,266 34,277 34,271 34,271 2480 ni ni

34,458 34,461 34,463 34,461 2500 ni ni

34,853 34,86 34,875 34,863 2543 ni ni

35,081 35,085 35,084 35,083 2566 ni ni

35,269 35,278 - 35,273 2586 ni ni

35,376 - 35,381 35,378 2598 ni ni

- 35,517 35,508 35,513 2609 ni ni

35,865 35,878 35,871 35,871 2637 ni ni

37,658 37,669 37,672 37,666 2777 ni ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio

calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats de ADAMS, 2001 (IR

). 1(3h2) – Experimento

realizado sem cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a primeira replicata;

1(3h3) – Experimento realizado sem cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema,

sendo a segunda replicata; 1(3h4) – Experimento realizado sem cigarrinhas, com 3 horas de

exposição da fibra no sistema, sendo a terceira replicata; ni- não identificados.

No total detectou-se 45 compostos, no entanto, identificou-se apenas 13

compostos, uma vez que alguns deles não apresentaram espectros de massas

semelhantes aos descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de

massas obtidos nos experimentos em triplicata e todos foram semelhantes,

independente dos compostos terem sido identificados ou não, ou seja, os

constituintes voláteis presentes na planta enxertada planta sem ter sido submetida

às cigarrinhas são estes apresentados, porém alguns não estão descritos na

literatura.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

190

O número de compostos não identificados foi relativamente alto, pois o livro

utilizado para a comparação do índice de Kovats e os espectros de massa (Adams,

2001) foi elaborado para identificação de compostos presentes em óleos essenciais

e não para compostos mais voláteis como foi o caso deste experimento. É esperado

que os compostos voláteis sejam diferentes dos presentes em óleos essenciais.

Esta observação repetiu-se em todos os experimentos com voláteis.

5.2.1.1.2 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

com cigarrinhas

A extração dos voláteis das plantas foi realizada com C. sinensis sobre C.

limonia com cigarrinhas, 0 horas, 24 horas e 48 horas após a inserção das mesmas.

5.2.1.1.2.1 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

logo após a inserção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia 0 horas após a presença das cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

TABELA 5.4: Compostos voláteis identificados na planta 0h após a inserção das

cigarrinhas.

tr2a(3h2) tr2a(3h3) tr2a(3h4) tr M IR M

Composto

4,562 4,557 4,556 4,558 901 909 Butilpropanoato

4,975 4,971 4,967 4,971 916 ni ni

5,757 5,752 5,748 5,752 944 ni ni

6,243 6,236 6,234 6,238 962 975 Sabineno

6,921 6,907 6,905 6,911 986 ni ni

7,21 7,285 7,282 7,259 999 1002 ∆-2-Careno

8,004 7,997 7,996 7,999 1022 ni ni

8,455 8,454 8,451 8,453 1036 ni ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

191

TABELA 5.4: Compostos voláteis identificados na planta 0h após a inserção das

cigarrinhas - Continuação.

- 8,821 8,825 8,823 1048 ni ni

9,98 9,983 9,98 9,981 1084 ni ni

- 10,166 10,161 10,164 1090 ni ni

10,304 10,306 10,303 10,304 1094 1101 Nonanal (n)

11,676 11,675 11,674 11,675 1137 ni ni

11,992 11,994 11,991 11,992 1147 1149 Nonen-1-al (2Z)

12,517 12,525 12,517 12,520 1163 1181 Naftaleno

13,384 13,392 13,387 13,388 1190 1202 Decanal-dn

16,158 16,163 16,155 16,159 1285 1300 Tridecano (n)

- 16,619 16,618 16,619 1301 ni ni

- 18,919 18,912 18,916 1381 1400 Tetradecano (n)

21,529 21,533 21,542 21,535 1492 1496 Tridecanona (2)

23,63 23,636 23,63 23,632 1587 ni ni

23,917 23,906 23,909 23,911 1599 1600 Hexadecano (n)

24,427 24,43 24,431 24,429 1630 ni ni

24,692 24,838 24,834 24,788 1651 ni ni

- 25,825 25,82 25,823 1712 ni ni

27,187 27,24 27,235 27,221 1795 1800 Octadecano (n)

27,974 27,994 27,987 27,985 1858 ni ni

28,517 28,52 28,525 28,521 1904 1900 Nonadecano (n)

29,131 29,151 29,147 29,143 1956 ni ni

33,292 33,272 33,269 33,278 2373 ni ni

33,457 33,469 33,466 33,464 2393 ni ni

34,146 34,133 34,129 34,136 2467 ni ni

- - 34,275 34,275 2482 ni ni

34,467 34,46 34,458 34,462 2500 ni ni

34,867 34,856 34,853 34,859 2542 ni ni

35,075 35,078 35,077 35,077 2566 ni ni

35,267 35,269 35,269 35,268 2586 ni ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

192

TABELA 5.4: Compostos voláteis identificados na planta 0h após a inserção das

cigarrinhas - Continuação.

- 35,500 35,483 35,491 2607 ni ni

35,858 35,875 35,86 35,864 2636 ni ni

37,656 37,663 37,654 37,658 2776 ni ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio

calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). 2a(3h2) – Experimento

realizado 0 h após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a

primeira replicata; 2a(3h3) – Experimento realizado 0 h após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas

de exposição da fibra no sistema, sendo a segunda replicata; 2a(3h4) – Experimento realizado 0 h

após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a terceira

replicata; ni- não identificados.

No total detectou-se 40 compostos, no entanto identificou-se apenas 13, uma

vez que alguns deles não apresentaram espectros de massas semelhantes aos

descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de massas obtidos nos

experimentos em triplicata e todos foram semelhantes, independente dos compostos

terem sido identificados ou não.

5.2.1.1.2.2 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

24 horas após a inserção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia 24 horas após a inserção das cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

193

TABELA 5.5: Compostos voláteis identificados na planta 24 h após a inserção das

cigarrinhas.

tr2b(3hi) tr2b(3hii) tr2b(3hiii) tr M IR M

Composto

4,568 4,563 4,57 4,567 901 901 Butilpropanoato

5,757 5,759 5,753 5,756 944 ni ni

- 6,246 6,247 6,246 962 975 Sabineno

6,921 6,906 6,907 6,911 986 ni ni

7,216 7,203 - 7,209 997 1002 ∆-2-Careno

8,003 7,999 7,999 8,000 1022 ni ni

8,542 8,558 8,475 8,525 1038 ni ni

9,989 9,992 9,988 9,990 1084 ni ni

10,309 10,314 10,311 10,311 1094 1101 Nonanal

11,669 11,671 11,67 11,670 1137 ni ni

12 12,008 12,003 12,004 1147 1149 Nonen-1-al (2Z)

- 13,402 13,4 13,401 1191 1202 Decanal-dn

- - 16,172 16,172 1286 1300 Tridecano (n)

16,626 - 16,622 16,624 1301 ni ni

18,919 18,922 18,919 18,920 1381 1400 Tetradecano (n)

21,539 21,535 21,537 21,537 1493 1496 Tridecanona (2)

23,632 23,575 23,634 23,614 1586 ni ni

23,9 23,899 23,886 23,895 1598

1600

Hexadecano (n)

24,375 24,442 24,426 24,414 1629 ni ni

24,838 - 24,858 24,848 1655 ni ni

25,823 25,827 25,823 25,824 1713 ni ni

27,23 27,238 27,236 27,235 1796 1800 Octadecano (n)

27,986 27,994 27,988 27,989 1859 ni ni

28,514 28,521 28,584 28,540 1905 1900 Nonadecano (n)

29,145 29,153 29,149 29,149 1957 ni ni

30,725 30,659 30,654 30,679 2100 ni ni

32,633 32,683 32,684 32,667 2306 ni ni

33,27 33,275 33,269 33,271 2372 ni ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

194

TABELA 5.5: Compostos voláteis identificados na planta 24 h após a inserção das

cigarrinhas – Continuação.

33,466 33,468 33,467 33,467 2394 ni ni

34,124 34,133 34,125 34,127 2466 ni ni

34,275 34,269 34,267 34,270 2482 ni ni

34,455 34,458 34,457 34,457 2499 ni ni

34,858 34,866 34,861 34,862 2543 ni ni

35,145 35,089 35,08 35,105 2569 ni ni

35,269 35,269 35,275 35,271 2586 ni ni

35,408 35,418 35,492 35,439 2603 ni ni

35,861 35,875 35,86 35,865 2636 ni ni

37,662 - 37,639 37,651 2775 ni ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio

calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). 2b(3hi) – Experimento realizado

24 h após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a primeira

replicata; 2b(3hii) – Experimento realizado 24 h após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas de

exposição da fibra no sistema, sendo a segunda replicata; 2b(3hiii) – Experimento realizado 24 h

após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a terceira

replicata; ni- não identificados.

No total detectou-se 38 compostos, no entanto identificou-se apenas 12, uma

vez que alguns deles não apresentaram espectros de massas semelhantes aos

descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de massas obtidos nos

experimentos em triplicata e todos foram semelhantes, independente dos compostos

terem sido identificados ou não.

5.2.1.1.2.3 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

48 horas após a inserção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia 48 horas após a inserção das cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

195

TABELA 5.6: Compostos voláteis identificados na planta 48 h após a inserção das

cigarrinhas.

tr2c(3hiv) tr2c(3hvi) tr M IR M

Composto

4,592 - 4,592 902 909 Butilpropanoato

4,99 - 4,990 916 ni Ni

5,819 5,753 5,786 945 ni Ni

6,246 6,238 6,242 962 975 Sabineno

6,913 6,907 6,910 986 ni Ni

7,295 7,288 7,292 1000 1002 ∆-2-careno

7,999 7,995 7,997 1022 ni ni

8,535 8,531 8,533 1039 ni ni

8,831 8,817 8,824 1048 ni ni

9,991 9,99 9,991 1084 ni ni

10,171 - 10,171 1090 ni ni

10,325 10,313 10,319 1094 1101 Nonanal (n)

11,677 11,67 11,674 1137 ni ni

12,008 12,011 12,010 1147 1149 Nonen-1-al (2Z)

13,401 13,406 13,404 1191 1202 Decanal-dn

16,175 - 16,175 1286 1300 Tridecano (n)

16,631 16,628 16,630 1301 ni ni

18,927 - 18,927 1381 1400 Tetradecano (n)

21,529 21,528 21,529 1492 1496 Tridecanona (2)

23,634 23,637 23,636 1587 ni ni

23,9 23,902 23,901 1599 1600 Hexadecano (n)

- 24,433 24,433 1630 ni ni

24,839 - 24,839 1654 ni ni

25,825 25,83 25,828 1713 ni ni

27,224 - 27,224 1796 1800 Octadecano (n)

27,985 27,998 27,992 1859 ni ni

28,502 - 28,502 1902 1900 Nonadecano (n)

29,14 29,155 29,148 1957 ni ni

33,27 - 33,270 2372 ni ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

196

TABELA 5.6: Compostos voláteis identificados na planta 48 h após a inserção das

cigarrinhas - Continuação.

33,475 - 33,475 2395 ni ni

34,122 34,135 34,129 2464 ni ni

34,265 - 34,265 2479 ni ni

34,453 34,465 34,459 2500 ni ni

34,745 34,725 34,735 2529 ni ni

34,854 34,857 34,856 2542 ni ni

35,077 35,083 35,080 2566 ni ni

35,271 - 35,271 2586 ni ni

35,498 35,417 35,458 2605 ni ni

35,864 35,865 35,865 2636 ni ni

37,661 38,008 37,835 2790 ni ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio

calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). 2c(3hiv) – Experimento

realizado 48 h após a inserção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo

a primeira replicata; 2b(3hvi) – Experimento realizado 48 h após a inserção das cigarrinhas, com 3

horas de exposição da fibra no sistema, sendo a segunda replicata; ni- não identificados.

No total detectou-se 40 compostos, no entanto identificou-se apenas 12, uma

vez que alguns deles não apresentaram espectros de massas semelhantes aos

descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de massas obtidos nos

experimentos em triplicata e todos foram semelhantes, independente dos compostos

terem sido identificados ou não.

5.2.1.1.3 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

após a remoção das cigarrinhas

A extração dos voláteis das plantas foi realizada com C. sinensis sobre C.

limonia após removidas as cigarrinhas, 0 horas, 24 horas e 48 horas após a

remoção das mesmas.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

197

5.2.1.1.3.1 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

logo após a remoção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia 0 horas após a retirada das cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

TABELA 5.7: Compostos voláteis identificados na planta 0 h após a remoção das

cigarrinhas.

tr3a(3h2) tr3a(3h3) tr3a(3h4) tr M IR M

Composto

5,761 5,737 5,749 5,749 944 - ni

- 6,225 6,233 6,229 961 975 Sabineno

- - 6,9 6,900 986 - ni

- 7,279 7,308 7,294 1000 1002 (∆-2)-careno

7,997 7,973 7,986 7,985 1021 - ni

10,323 10,301 10,311 10,312 1094 1101 Nonanal (n)

11,679 11,656 11,665 11,667 1136 - ni

- 15,271 15,289 15,280 1255 - ni

- 16,608 16,617 16,613 1599 1600 Hexadecano (n)

- 23,888 23,912 23,900 1629 - ni

- 24,414 24,423 24,419 1712 - ni

25,823 25,822 25,807 25,817 1859 - ni

27,996 27,983 27,987 27,989 1957 - ni

29,159 29,142 - 29,151 2372 - ni

- 33,268 33,272 33,270 2466 - ni

34,179 34,123 34,133 34,145 2479 - ni

34,274 34,258 34,275 34,269 2500 - ni

34,47 34,456 34,462 34,463 2636 - ni

35,865 35,851 35,86 35,859 2776 - ni

37,663 - 37,66 37,654 - ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio calculado (IR M) e Índice de

Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). 3a(3h2) – Experimento realizado 0 h após a remoção das cigarrinhas, com 3 horas de

exposição da fibra no sistema, sendo a primeira replicata; 3a(3h3) – Experimento realizado 0 h após a remoção das

cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a segunda replicata; 3a(3h4) – Experimento realizado 0 h

após a remoção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a terceira replicata; ni- não

identificados.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

198

No total detectou-se 19 compostos, no entanto identificou-se apenas 4, uma

vez que alguns deles não apresentaram espectros de massas semelhantes aos

descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de massas obtidos nos

experimentos em triplicata e todos foram semelhantes, independente dos compostos

terem sido identificados ou não.

5.2.1.1.3.2 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

24 horas após a remoção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia 24 horas após a retirada das cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

TABELA 5.8: Compostos voláteis identificados na planta 24 h após a remoção das

cigarrinhas.

tr3b(3hi) tr3b(3hii) tr M IR

MÉDIA

Composto

5,308 - 5,308 928 - ni

5,754 5,748 5,751 944 - ni

6,246 6,234 6,240 962 975 Sabineno

6,917 6,904 6,911 986 ni

7,29 7,281 7,286 1000 1002 (∆-2)-careno

8,028 7,998 8,013 1022 - ni

9,113 9,125 9,119 1057 - ni

9,994 9,981 9,988 1084 - ni

10,315 10,304 10,310 1094 1101 Nonanal (n)

10,897 - 10,897 1112 1122

Ácido etil

hexanóico

11,679 11,67 11,675 1137 - ni

12,01 11,998 12,004 1147 1149

Nonen-1-al

(2Z)

- 13,246 13,246 1186 - ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

199

TABELA 5.8: Compostos voláteis identificados na planta 24 h após a remoção das

cigarrinhas – Continuação.

13,403 13,389 13,396 1190 1202 Decanal-dn

15,292 15,287 15,290 1255 - ni

- 16,177 16,177 1286 1300 Tridecano (n)

16,63 16,62 16,625 1301 - ni

18,921 18,919 18,920 1381 1400 Tetradecano (n)

21,101 - 21,101 1473 - ni

21,525 - 21,525 1492 1496 Tridecanona (2)

23,892 23,902 23,897 1599 1600 Hexadecano (n)

24,43 24,375 24,403 1628 - ni

25,824 25,821 25,823 1712 - ni

27,236 27,236 27,236 1796 1800 Octadecano (n)

27,987 27,985 27,986 1858 - ni

28,3 - 28,300 1885 - ni

29,149 29,139 29,144 1956 - ni

30,652 - 30,652 2097 - ni

32,023 - 32,023 2235 - ni

33,27 - 33,270 2372 - ni

33,468 - 33,468 2394 - ni

34,134 - 34,134 2465 - ni

34,275 - 34,275 2480 - ni

34,463 - 34,463 2500 - ni

37,662 - 37,662 2776 - ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio

calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). 3b(3hi) – Experimento realizado

24 h após a remoção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a

primeira replicata; 3b(3hii) – Experimento realizado 24 h após a remoção das cigarrinhas, com 3

horas de exposição da fibra no sistema, sendo a segunda replicata, ni- não identificados.

No total detectou-se 35 compostos, no entanto, identificou-se apenas 11, uma

vez que alguns deles não apresentaram espectros de massas semelhantes aos

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

200

descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de massas obtidos nos

experimentos em triplicata e todos foram semelhantes, independente dos compostos

terem sido identificados ou não.

5.2.1.1.3.3 Compostos identificados no C. sinensis sobre C. limonia

48 horas após a remoção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos voláteis do C. sinensis sobre C.

limonia 48 horas após a retirada das cigarrinhas por HS-SPME, e identificou-se os

mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em comparação com a

literatura (ADAMS, 2001).

TABELA 5.9: Compostos voláteis identificados na planta 48 h após a remoção das

cigarrinhas.

tr(3hiv) tr(3hv) tr(3hvi) t(3hvii) tr M IR M

Composto

5,764 5,765 5,76 5,757 5,761 944 - ni

6,254 6,254 6,251 6,244 6,251 962 975 Sabineno

6,925 6,917 6,921 6,914 6,919 986 - ni

- 7,299 7,296 7,295 7,297 1000 1002 (∆-2)-careno

8,031 8,039 8,031 8,019 8,030 1023 - ni

9,090 9,105 9,099 9,125 9,105 1057 - ni

9,983 - 9,987 9,991 9,987 1084 - ni

10,313 10,320 10,313 10,316 10,315 1094 1101 Nonanal (n)

- 10,900 10,898 10,878 10,892 1112 1122

Ácido etil

hexanóico

11,683 11,687 11,674 11,681 11,681 1137 - ni

11,996 12,024 12,001 - 12,007 1147 1149 Nonen-1-al (2Z)

16,633 16,633 16,623 16,632 16,630 1301 - ni

18,923 - 18,921 18,925 18,923 1381 1400 Tetradecano (n)

21,113 21,111 - 21,108 21,111 1473 - ni

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

201

TABELA 5.9: Compostos voláteis identificados na planta 48 h após a remoção das

cigarrinhas - Continuação.

23,902 - 23,875 23,895 23,891 1598 1600 Hexadecano (n)

24,422 - 24,45 24,434 24,435 1630 - ni

25,829 25,834 25,818 25,833 25,827 1713 - ni

27,245 27,250 27,23 27,247 27,243 1796 1800 Octadecano (n)

27,995 27,998 27,981 27,995 27,992 1858 - ni

29,150 29,155 29,138 29,152 29,149 1956 - ni

- 30,664 30,65 30,653 30,656 2097 - ni

- - 32,019 32,027 32,023 2235 - ni

- - 33,266 33,272 33,269 2372 - ni

33,469 33,470 33,463 33,468 33,467 2394 - ni

34,134 34,134 34,12 34,134 34,130 2464 - ni

- 34,275 34,275 - 34,275 2480 - ni

34,466 34,467 34,455 34,464 34,463 2500 - ni

35,873 35,866 35,858 35,864 35,865 2636 - ni

37,668 - 37,653 37,660 37,660 2776 - ni

Tempo de retenção (tr); Tempo de retenção médio (tr M); Índice de Retenção de Kovats médio

calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). 3c(3hiv) – Experimento

realizado 48 h após a remoção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo

a primeira replicata; 3c(3hv) – Experimento realizado 48 h após a remoção das cigarrinhas, com 3

horas de exposição da fibra no sistema, sendo a segunda replicata; 3c(3hvi) – Experimento realizado

48 h após a remoção das cigarrinhas, com 3 horas de exposição da fibra no sistema, sendo a terceira

replicata; 3c(3hvii) – Experimento realizado 48 h após a remoção das cigarrinhas, com 3 horas de

exposição da fibra no sistema, sendo a quarta replicata, ni- não identificados.

No total detectou-se 31 compostos, no entanto identificou-se apenas 9, uma

vez que alguns destes não apresentaram espectros de massas semelhantes aos

descritos na literatura. Comparou-se todos os espectros de massas obtidos nos

experimentos em triplicata e todos foram semelhantes, independente dos compostos

terem sido identificados ou não.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

202

5.2.1.1.4. Análise Quimiométrica dos dados de CG-EM dos

Compostos Voláteis de C. sinensis sobre C. limonia

Para uma melhor visualização e interpretação dos dados obtidos nos

experimentos com os voláteis, utilizou-se à técnica de Quimiometria, a qual vem

sendo amplamente aplicada em diversas áreas visando planejar ou selecionar

experimentos de forma otimizada e fornecer o máximo de informação química com a

análise dos dados obtidos. O programa utilizado para este tratamento estatístico foi

o Pirouette versão 2.02, da Infometrix.

Inicialmente, montou-se uma matriz com as áreas dos picos dos

cromatogramas, obtidos nas diferentes condições, relacionando os seus índices de

Kovats. A matriz gerada apresentou dezessete linhas e sessenta colunas,

correspondentes às amostras e às variáveis, respectivamente. Ao total foram

analisadas sete amostras em replicatas.

A análise de componentes principais (PCA – Principal Components Analysis)

foi realizada utilizando um número máximo de componentes principais igual a 10,

onde nenhum pré-processamento foi empregado, aplicando-se apenas a

normalização dos dados. Com estes parâmetros, verificou-se que a componente

principal 1 (PC1) apresentou quase 98% da informação total do sistema, o que é

muito bom; então utilizou-se posto 3, ou seja, considerou-se as informações obtidas

até PC3, pois com esse número de componentes principais tem-se toda a

informação relevante sobre o sistema, correspondendo a quase 99,5% da

informação total (Tabela 5.10, p.203).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

203

TABELA 5.10: Porcentagens das componentes principais do sistema (voláteis

extraídos de C. sinensis sobre C. limonia) sem pré-processamento.

Variância Porcentagem Porcentagem Cumulativa

PC1

166404.28125 97.88487 97.88487

PC2

1845.67749 1.08569 98.97057

PC3

866.69928 0.50982 99.48039

PC4

263.60513 0.15506 99.63545

PC5

213.68086 0.12569 99.76115

PC6

189.79399 0.11164 99.87279

PC7

55.44279 0.03261 99.90540

PC8

39.72471 0.02337 99.92877

PC9

35.06353 0.02063 99.94939

PC10

31.06989 0.01828 99.96767

O gráfico de scores de PC1xPC2 obtido (98,97% de informação total do

sistema) está apresentado no gráfico 5.1, a seguir.

GRÁFICO 5.1: Gráfico de scores de todas as amostras dos voláteis de C. sinensis

sobre C. limonia (PC1 x PC2, 97,88 e 1,09 %, respectivamente).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

204

A partir do gráfico pode-se verificar que as replicatas estão próximas em

todas condições e que há uma diferença nas plantas quando estão nas diferentes

condições; principalmente comparando-se sem ter sido submetidas às cigarrinhas

(condição 1) e na presença ou após a remoção da mesmas (condições 2 e 3,

respectivamente). Com isto, pode-se verificar que a planta tem uma modificação em

seus voláteis, composição e quantidade exalada, logo quando se coloca as

cigarrinhas em contato (0 horas). Observa-se também que após a remoção das

cigarrinhas (Condição 3), a planta não retorna ao seu estado anterior ao ataque

(Condição 1), ela sofre outra alteração, distinta da condição 2.

A partir do gráfico de loadings de PC1XPC2 (Gráfico 5.2), o qual indica as

variáveis importantes para a discriminação, pode-se notar que o composto com IK =

1907 é o maior responsável pela distinção da condição 1, e que o composto com IK

= 1022 é o responsável pela distinção das condições 2 e 3. Os compostos com IK =

2100, 2466, 2306 e 1859 também são importantes para a descriminação dos grupos.

GRÁFICO 5.2: Gráfico de loadings de todas as amostras dos voláteis C. sinensis

sobre C. limonia (PC1 x PC2, 97,88 e 1,09 %, respectivamente).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

205

Analisou-se também os dados considerando-se PC1XPC3 (Gráfico 5.3), o

que corresponde a 98,39 % da informação total do sistema, para verificar a resposta

quimiométrica obtida em uma outra dimensão espacial.

GRÁFICO 5.3: Gráfico de scores de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC3, 97,88 e 0,51 %, respectivamente).

Observa-se novamente uma similaridade entre as replicatas e uma distinção

entre as três condições, reforçando que a planta sofre modificações com a presença

das cigarrinhas, como citado anteriormente. Outra observação interessante

apresentada nos dois gráficos (5.1 e 5.3) é que os grupos 1, 2 e 3 estão bem

separados, no entanto, os subgrupos 2a e 2b estão agrupados, o que demonstra

que não há grandes variações nos voláteis da planta quando as cigarrinhas estão

em contato por 0 horas (Condição 2a) ou por 24 horas (Condição 2b); porém a

condição 2c está próxima à condição 3a o que está coerente, uma vez que a

primeira foi coletada 48 horas após a inserção das cigarrinhas, e a segunda logo

após a remoção das cigarrinhas. As condições 3b e 3c também não apresentaram

grandes diferenças, concluindo que não há uma grande variação nos voláteis da

planta 24 horas ou 48 horas após a remoção das cigarrinhas.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

206

No gráfico de loadings de PC1XPC3 (Gráfico 5.4) observou-se os mesmos

resultados que no gráfico PC1XPC2, no entanto, verificou-se também que os

compostos com IK = 1137, 2466, 1859 e 1094 são responsáveis por deslocar as

condições 2a e 2b para cima.

GRÁFICO 5.4: Gráfico de loadings de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC3, 97,88 e 0,51 %, respectivamente).

O gráfico do poder de modelagem indica a habilidade da variável em modelar

a informação contida nos dados, ou seja, o poder de modelagem varia entre zero e

um, indicando que quanto mais alto for esse valor mais relevante é a variável. No

presente trabalho, o gráfico de poder de modelagem mostra quais os índices de

Kovats são os mais importantes para os agrupamentos, desta forma, observa-se que

os compostos com IK = 1022, 1094, 1137, 1859, 1907, 2100, 2306 e 2466,

destacados anteriormente pelos gráficos de loadings, encontram-se entre as

variáveis com maior poder de modelagem, contribuindo para os agrupamentos das

diversas condições.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

207

GRÁFICO 5.5: Gráfico do poder de modelagem de todas as variáveis dos voláteis C.

sinensis sobre C. limonia, obtido para a análise de PCA sem nenhum pré-

processamento.

Outra análise realizada, sob as mesmas condições descritas, foi a Análise

Hierárquica dos Agrupamentos (HCA – Hierarchical Clusters Analysis), a qual indica

a similaridade entre os grupos (Gráfico 5.6).

GRÁFICO 5.6: Gráfico de HCA de todas amostras com índice de similaridade 0,385.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

208

O gráfico de HCA mostrou a similaridade das replicatas de todas condições e

a distinção entre as condições 1, 2 e 3. A condição 2c está inclusa no grupo da

condição 3, uma vez que é similar a condição 3a, conforme já observado

anteriormente.

Realizou-se outra análise com os mesmos parâmetros que as anteriores, no

entanto, agora utilizando pré-processamento autoescalado, para verificar se há

alteração nos resultados. Quando se utiliza o pré-processamento autoescalado

consideram-se todas as intensidades dos picos como informações importantes, e

não apenas as majoritárias, como no caso da análise sem pré-processamento.

Utilizou-se posto 6 (informações obtidas até PC6), o que corresponde a 83,35% da

informação total do sistema (Tabela 5.11).

TABELA 5.11: Porcentagens das componentes principais do sistema (voláteis

extraídos de C. sinensis sobre C. limonia) com pré-processamento.

Variância Porcentagem Porcentagem Cumulativa

PC1

366.51480 38.17863 38.17863

PC2

207.89069 21.65528 59.83391

PC3

83.49155 8.69704 68.53094

PC4

60.32357 6.28371 74.81465

PC5

43.46993 4.52812 79.34277

PC6

38.45486 4.00571 83.34849

PC7

36.17560 3.76829 87.11678

PC8

29.52071 3.07507 90.19185

PC9

24.15252 2.51589 92.70773

PC10

20.01783 2.08519 94.79292

Obteve-se o gráfico de scores e o gráfico de loadings de PC1xPC2 (59,83%

de informação total do sistema), os quais estão apresentados a seguir.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

209

GRÁFICO 5.7: Gráfico de scores de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC2, 38,18 e 21,65 %, respectivamente).

GRÁFICO 5.8: Gráfico de loadings de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC2, 38,18 e 21,65 %, respectivamente).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

210

O resultado obtido no gráfico de scores foi o mesmo observado quando não

se fez nenhum pré-processamento, no entanto, o gráfico de loadings apesar de

apresentar os mesmos resultados para os índices de Kovats IK = 1022 e 1907,

mostrou mais índices de Kovats importantes para os agrupamentos, pois esta

análise considera também picos menos intensos.

Para verificar a resposta quimiométrica obtida por uma outra dimensão

espacial, adquiriu-se o gráfico de PC1XPC3 (Gráfico 5.9), o que corresponde a

46,57 % da informação total do sistema.

GRÁFICO 5.9: Gráfico de scores de todas amostras dos voláteis C. sinensis sobre

C. limonia (PC1 x PC3, 38,18 e 8,70 %, respectivamente).

Os resultados são muito similares aos obtidos anteriormente. O gráfico de

loadings de PC1XPC3 dos índices de Kovats (Gráfico 5.10), correspondente a

46,88% da informação total, relata resultados próximos aos do gráfico PC1XPC2.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

211

GRÁFICO 5.10: Gráfico de loadings de todas amostras dos voláteis (PC1 x PC3,

38,18 e 8,70 %, respectivamente).

O gráfico do poder de modelagem (Gráfico 5.11) demonstrou um maior

número de compostos com informações consideráveis e importantes em relação ao

anterior obtido sem pré-processamento.

GRÁFICO 5.11: Gráfico do poder de modelagem de todas as variáveis dos voláteis,

obtidos a partir do pré-processamento autoescalado.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

212

Com todas estas análises quimiométricas, verifica-se que os resultados foram

muito coerentes e similares entre si. Comprova-se que a planta realmente sofre

alteração quando em contato com as cigarrinhas, e após a remoção das mesmas

não retornam ao seu estado inicial (antes do ataque), mesmo após 48 horas sem a

presença dos vetores. A planta sofreu grande alteração logo quando adiciona-se

cigarrinhas ao meio, porém não sofre uma alteração tão abrupta logo após a

remoção das mesmas.

Os compostos que apresentaram maior importância e influência na separação

dos grupos foram os compostos com IK = 1022, 1094, 1137, 1859, 1907, 2100, 2306

e 2466. As áreas destes picos estão listadas na Tabela 5.12.

TABELA 5.12: Áreas dos picos dos compostos importantes na separação dos

grupos 1, 2 e 3, observados na análise quimiométrica.

Área

IK 1 2a 2b 2c 3a 3b 3c

1022

31035037 20629663 18778202 22222573 19106711 53738158 69991884

1094

1925364 1679794 1225946 960561 313686 1307622 1278884

1137

533969 460178 2278589 849125 478090 631977 533007

1859

2324668 1376538 1591389 1209153 512804 1170085 1127564

1907

91867595 - - - - - -

2100

3008270 404307 594618 - - 364646 266794

2306

1924392 - 216456 - - - 926352

2466

2996005 1769940 1468408 1237992 428171 494778 776044

1: C. sinensis sobre C. limonia sem sofrer nenhuma alteração; 2a: C. sinensis sobre C. limonia logo

após a inserção das cigarrinhas; 2b: C. sinensis sobre C. limonia 24 horas após a inserção das

cigarrinhas; 2c: C. sinensis sobre C. limonia 48 horas após a inserção das cigarrinhas; 3a: C. sinensis

sobre C. limonia logo após a remoção das cigarrinhas; 3b: C. sinensis sobre C. limonia 24 horas após

a remoção das cigarrinhas; 3c: C. sinensis sobre C. limonia 48 horas após a remoção das cigarrinhas.

Para verificar se houve um aumento ou uma diminuição na quantidade dos

compostos nas diferentes condições, adotou o pico majoritário da condição 1 (IK =

1022) como 100%, e toda a análise comparativa foi realizada em relação a esta

condição, uma vez que, corresponde a planta sem ter sido submetida aos vetores.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

213

As porcentagens relativas dos demais compostos estão apresentadas na

Tabela 5.13.

TABELA 5.13: Porcentagens relativas dos picos dos compostos importantes na

separação dos grupos (1, 2 e 3) observados na análise quimiométrica.

Porcentagem (%)

IK 1 2a 2b 2c 3a 3b 3c

1022

100,00 66,47 60,51 71,60 61,56 173,15 225,50

1094

6,20 5,40 3,95 3,09 1,01 4,20 4,10

1137

1,72 1,48 7,34 2,73 1,54 2,04 1,72

1859

7,49 4,43 5,13 3,89 1,65 3,77 3,63

1907

29,60 - - - - - -

2100

9,69 1,30 1,91 - - 1,17 0,86

2306

6,20 - 0,70 - - - 2,98

2466

9,65 5,70 4,73 3,99 1,38 1,59 2,50

1: C. sinensis sobre C. limonia sem sofrer nenhuma alteração; 2a: C. sinensis sobre C. limonia logo

após a inserção das cigarrinhas; 2b: C. sinensis sobre C. limonia 24 horas após a inserção das

cigarrinhas; 2c: C. sinensis sobre C. limonia 48 horas após a inserção das cigarrinhas; 3a: C. sinensis

sobre C. limonia logo após a remoção das cigarrinhas; 3b: C. sinensis sobre C. limonia 24 horas após

a remoção das cigarrinhas; 3c: C. sinensis sobre C. limonia 48 horas após a remoção das cigarrinhas.

Deve-se notar que a resposta da planta logo após a remoção das cigarrinhas

está mais próxima daquela após 48 horas em contato com estes vetores do que 24

horas após a remoção dos mesmos, isto ocorre, uma vez que, a planta nesta

condição comporta-se como se estivesse ainda com a presença das cigarrinhas.

Verificou-se que o composto com IK = 1137 teve um aumento considerável

em seu percentual na condição 2b, ou seja, após 24 horas em contato com as

cigarrinhas, mas depois decresce e permanece praticamente o mesmo. Isto indica

que a planta libera este composto em maior quantidade em resposta ao ataque pelo

inseto. Este ao ferir a planta afeta seu metabolismo, o qual envolve uma rede

metabólica em equilíbrio. Para não afetar processos vitais para a planta (como

síntese proteica), ela retorna ao equilíbrio metabólico variando seus constituintes

secundários. A planta varia a concentração de alguns constituintes presentes e/ou

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

214

sintetiza outros. Estes compostos em maior concentração ou novos podem servir

como alomônios para inseto. Como a cigarrinha é um predador de Citrus, estes

compostos podem servir como alomônios de agregação, ou seja, indicando a

presença de alimento e atraindo um número maior destes insetos no campo. Estes

efeitos serão avaliados em trabalhos futuros.

Os compostos com IK = 1094, 1859, 2100, 2306, 2466 diminuem seu

percentual até a condição 3a, indicando que a permanência das cigarrinhas faz com

que a planta pare de liberá-los. O composto com IK = 1022, apresenta um

decréscimo de aproximadamente 35 % quando a planta entra em contato com as

cigarrinhas, porém aumenta quase 75 %, em relação a condição 1, e continua

aumentando consideravelmente seu percentual, após a remoção das cigarrinhas.

Quando compostos são liberados em grande quantidade após a remoção dos

vetores, pode ser um sinalizador para que o seu metabolismo retorne ao equilíbrio.

O composto com IK = 1907 pára totalmente de ser exalado pela planta logo

após a inserção dos vetores e mesmo após a remoção dos mesmos. Quando a

planta diminui ou pára de liberar um composto, sugere-se que estes compostos

sejam os responsáveis por atrair os vetores, então eles não são mais exalados,

como um mecanismo de defesa da planta, para que outros insetos não sejam mais

atraídos.

As duas alterações mais discrepantes observadas foram as últimas discutidas

(IK = 1022 e 1907), devido seus valores de percentuais serem os mais altos. Destes

compostos relevantes, o único que foi identificado por comparação com a literatura

foi o com IK =1094 (nonanal); os demais não foram encontrados.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

215

5.2.1.1.5 Identificação dos compostos majoritários

O composto majoritário presente em todas as condições foi o composto com

IR = 1022. No entanto, este não foi identificado a partir da comparação do seu índice

de Kovats e seu espectro de massas com os dados presentes na literatura (Adams,

2001). Então analisou-se o seu espectro de massas e a partir das fragmentações

atribuídas foi proposto que o composto obtido é o 2-etil-1-hexanol (Esquema 5.2).

- H

m/z 112 0,9%

2-etil-1-hexanol (m/z 130)

- H

CCHCH

m/z 70 14,2%

2-etil-1-hexanol (m/z 130)

-H

m/z 98 2,2%

- MeOH

m/z 83 11,6%

2-etil-1-hexanol (m/z 130)

- CH

m/z 98 2,2%

m/z 55 30,3%

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

216

m/z 98 2,2%

m/z 55 30,3%

- CH

m/z 57 100%

- H

m/z 58 4,4%

- CH

m/z 57 100%

2-etil-1-hexanol (m/z 130)

ESQUEMA 5.2: Proposta de fragmentação do 2-etil-1-hexanol.

Fez-se então a simulação do espectro de massas deste composto (Figura

5.7), e o espectro foi muito similar ao obtido experimentalmente (Figura 5.8, p.217).

FIGURA 5.7: Espectro de Massas teórico (Spectral Database System for Organic

Compounds) do 2-etil-1-hexanol.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

217

FIGURA 5.8: Espectro de Massas experimental do 2-etil-1-hexanol.

FIGURA 5.9: Ampliação do Espectro de Massas experimental do 2-etil-1-hexanol.

Além disto, comparou-se os dados com a biblioteca fornecida pelo

equipamento e os resultados conferiram com os demais. A partir deste conjunto de

informações, conseguiu-se identificar que o composto com IR = 1022 é o 2-etil-1-

hexanol.

O composto com IR = 1907 foi o segundo composto majoritário quando a

planta não havia sido submetida à presença de cigarrinhas, e teve uma modificação

muito abrupta e interessante, pois não foi mais liberado nas demais condições, ou

seja, após a inserção das cigarrinhas no sistema. Este composto não foi identificado

a partir da comparação de seu índice de Kovats e espectro de massas com a

literatura. No entanto, a análise de seu espectro de massas (Figura 5.10, p.218)

sugeriu-se algumas fragmentações, indicando que o composto corresponde ao

indicado no Esquema 5.3, p.218.

O composto com IR = 1859 também não foi encontrado na literatura, mas a

partir de seu espectro de massas (Figura 5.11, p.219) e de algumas propostas de

fragmentações, sugeriu-se como sendo o indicado no Esquema 5.4, p.219. Os

espectros de massas simulados para estas propostas não foram encontrados no

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

218

banco de dados (Spectral Database System for Organic Compounds), e com isto

não se pode comprovar quais os compostos, apenas sugere-se tais hipóteses.

m/z 69 0,9%

m/z 119

m/z 188

m/z 120

m/z 84 0,8%

m/z 69 0,9%

m/z 84 0,8%

-CH

OOH

-2 H

m/z 120

m/z 58 100%

m/z 87

OHHO

m/z 59 3,6%

-CO

-H

OHO

m/z 87

-CH

m/z 105

OHHO

m/z 119 0,6%

m/z 120

-H

ESQUEMA 5.3: Proposta de fragmentação do composto com IR = 1907.

FIGURA 5.10: Espectro de Massas experimental do composto com IR = 1907.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

219

-H

m/z 147 1,2%

m/z 148 1,4%

-H

m/z 149 100%

-H

m/z 57 52,1%

m/z 167 2,8%

-H

m/z 223 4,8%m/z 224

ESQUEMA 5.4: Proposta de fragmentação do composto com IR = 1859.

FIGURA 5.11: Espectro de Massas experimental do composto com IR = 1859.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

220

5.2.1.2. Óleos essenciais extraídos de C. sinensis sobre C. limonia

Os óleos essenciais das folhas das plantas enxertadas foram extraídos, em

triplicata, utilizando-se a técnica de arraste a vapor. A identificação dos compostos

presentes nos óleos foi realizada a partir do Índice de retenção de Kovats e dos

espectros de massas de cada pico comparados com a literatura (Adams, 2001). A

equação empregada no cálculo do índice foi a equação de Van Den Dool e Kratz, a

mesma utilizada para os voláteis, no entanto, os tempos de retenção dos

hidrocarbonetos, neste caso, foi o obtido a partir da injeção direta da seringa (Seção

5.1.1.3, p.183).

5.2.1.2.1. Óleos essências identificados no C. sinensis sobre C.

limonia sem ter sido submetida às cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos óleos essenciais do C. sinensis

sobre C. limonia sem ter sido submetida às cigarrinhas através da técnica de araste

à vapor, e identificou-se os mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats

em comparação com a literatura (ADAMS, 2001).

TABELA 5.14: Compostos identificados no óleo essencial das folhas de C. sinensis

sobre C. limonia sem ter sido submetido às cigarrinhas.

OEPPA

OEPPB

OEPPC

IR M

Composto

5,002 4,987 4,982 4,990 908 930 α-tujeno

5,159 5,148 5,144 5,150 914 939 α-pineno

5,533 5,517 5,509 5,520 928 - ni

6,279 6,281 6,248 6,269 955 975 sabineno

6,822 6,813 6,8 6,812 975 991 mirceno

7,314 7,313 7,285 7,304 993 1002 ∆-2-careno

7,555 7,547 7,542 7,548 1001 1017 α-terpineno

- 7,782 7,771 7,777 1008 1025 p-cimeno

7,931 7,926 7,906 7,921 1013 1029 limoneno

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

221

TABELA 5.14: Compostos identificados no óleo essencial das folhas de C. sinensis

sobre C. limonia sem ter sido submetido às cigarrinhas - Continuação.

8,233 8,221 8,217 8,224 1022 1037 (Z)-β-ocimeno

8,55 8,548 8,526 8,541 1032 1050 (E)-β-ocimeno

8,831 8,822 8,814 8,822 1040 1060 γ-terpineno

9,669 9,664 9,653 9,662 1066 1089 terpinoleno

10,197 10,201 10,168 10,189 1083 1097 linalool

11,771 11,796 11,751 11,773 1132 1153 citronelal

12,506 12,508 12,508 12,507 1154 1177 terpinen-4-ol

12,956 13,01 13,117 13,028 1170 1189 α-terpineol

14,329 14,342 14,299 14,323 1212 1238 neral

15,198 15,23 15,176 15,201 1244 1267 geranial

16,706 16,717 - 16,712 1299 1325 Metil-decanoato

17,518 17,532 17,525 17,525 1329 1353 Citronelil acetato

17,77 17,79 17,777 17,779 1339 1362 neril acetato

18,311 18,321 18,318 18,317 1358 1381 geranil acetato

18,534 18,55 18,542 18,542 1366 1391 β-elemeno

19,248 19,266 19,257 19,257 1393 1419 (E)-cariofileno

20,171 20,194 20,185 20,183 1433 1455 α-humuleno

25,584 25,612 25,604 25,600 1700 1700 β-sinensal

26,463 26,487 26,516 26,489 1752 1757 α- sinensal

- 27,719 27,718 27,719 1835 - ni

27,967 27,989 28,003 27,986 1858 - ni

28,233 28,265 28,265 28,254 1880 - ni

31,102 31,137 31,144 31,128 2143 - ni

31,825 31,853 31,863 31,847 2384 - ni

Tempo de retenção (tr – min.); Tempo de retenção médio (tr M – min.); Índice de Retenção de Kovats

médio calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). OEPPA – Experimento

realizado sem a presença de cigarrinhas, sendo a primeira replicata; OEPPB – Experimento realizado

sem a presença de cigarrinhas, sendo a segunda replicata; OEPPC – Experimento realizado sem a

presença de cigarrinhas, sendo a terceira replicata; ni- não identificados.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

222

Nota-se que foram identificados 27 compostos presentes no óleo essencial

das folhas da planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia sem esta ter sido

submetida às cigarrinhas, sendo o sabineno o composto majoritário do óleo, seguido

do ∆-2-careno. No total detectou-se 33 compostos, porém seis destes não foram

identificados, uma vez que não apresentaram espectros de massas semelhantes

aos descritos na literatura.

5.2.1.2.2. Óleos essências identificados no C. sinensis sobre C.

limonia após a remoção das cigarrinhas

Realizou-se o experimento de extração dos óleos essenciais do C. sinensis

sobre C. limonia após a remoção das cigarrinhas através da técnica de araste à

vapor, e identificou-se os mesmos por CG-EM através de seus índices de Kovats em

comparação com a literatura (ADAMS, 2001).

TABELA 5.15: Compostos identificados no óleo essencial das folhas de C. sinensis

sobre C. limonia após a remoção das cigarrinhas.

OEPCA

OEPCB

OEPCC

IR M

Composto

5,001 5,013 5,006 5,007 909 930 α-tujeno

5,16 5,171 5,164 5,165 915 939 α-pineno

5,536 5,551 5,54 5,542 928 - ni

6,265 6,332 6,286 6,294 956 975 sabineno

6,818 6,846 6,828 6,831 975 991 mirceno

7,303 7,359 7,318 7,327 993 1002 ∆-2-careno

7,554 7,571 7,562 7,562 1002 1017 α-terpineno

7,789 - 7,798 7,794 1009 1025 p-cimeno

7,921 7,968 7,937 7,942 1013 1029 limoneno

8,232 8,247 8,238 8,239 1022 1037 (Z)-β-ocimeno

8,539 8,593 8,552 8,561 1032 1050 (E)-β-ocimeno

8,827 8,847 8,835 8,836 1041 1060 γ-terpineno

9,665 9,684 9,673 9,674 1067 1088 terpinoleno

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

223

TABELA 5.15: Compostos identificados no óleo essencial das folhas de C. sinensis

sobre C. limonia após a remoção das cigarrinhas - Continuação.

10,177 10,235 10,192 10,201 1083 1097 linalool

11,754 11,821 11,778 11,784 1132 1153 citronelal

12,498 12,518 12,508 12,508 1154 1177 terpinen-4-ol

12,958 12,964 12,96 12,961 1168 1189 α-terpineol

- 13,972 13,952 13,962 1199 1230 nerol

14,301 14,378 14,319 14,333 1212 1238 neral

15,181 15,275 15,196 15,217 1245 1267 geranial

17,512 17,522 17,522 17,519 1329 1353 citronelil acetato

17,759 17,775 17,774 17,769 1338 1362 neril acetato

18,302 18,314 18,318 18,311 1358 1381 geranil acetato

18,514 18,54 18,529 18,528 1366 1391 β-elemeno

19,234 19,252 19,25 19,245 1392 1419 (E)-cariofileno

20,162 20,208 20,173 20,181 1432 1455 α-humuleno

25,575 25,597 25,585 25,586 1699 1700 β-sinensal

26,66 26,462 26,472 26,531 1755 1757 α- sinensal

27,751 27,636 27,695 27,694 1833 - ni

27,955 27,967 27,975 27,966 1856 - ni

28,23 28,242 28,236 28,236 1879 - ni

31,128 31,104 31,109 31,114 2141 - ni

34,388 34,373 34,378 34,380 2494 - ni

Tempo de retenção (tr – min.); Tempo de retenção médio (tr M – min.); Índice de Retenção de Kovats

médio calculado (IR M) e Índice de Retenção de Kovats ADAMS, 2001 (IR

). OEPCA – Experimento

realizado após a remoção de cigarrinhas, sendo a primeira replicata; OEPCB – Experimento realizado

após a remoção de cigarrinhas, sendo a segunda replicata; OEPCC – Experimento realizado após a

remoção de cigarrinhas, sendo a terceira replicata; ni- não identificados.

Identificou-se 27 compostos presentes no óleo essencial das folhas da planta

enxertada C. sinensis sobre C. limonia sob a Condição 3, sendo o sabineno o

composto majoritário, seguido do ∆-2-careno. No total detectou-se 33 compostos,

no entanto seis destes são foram identificados, pois não apresentaram espectros de

massas semelhantes aos descritos na literatura.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

224

5.2.1.2.3. Análise Quimiométrica dos dados de CG-EM dos Óleos

Essenciais de C. sinensis sobre C. limonia

Para uma melhor visualização e interpretação dos dados utilizou-se a técnica

de Quimiometria, com o programa Pirouette versão 2.02, da Infometrix. A matriz de

dados foi gerada com as áreas dos picos dos cromatogramas dos óleos essenciais

obtidos nas diferentes condições, apresentando-se 6 linhas e 36 colunas,

correspondentes às duas amostras em replicatas e às variáveis, respectivamente.

A análise quimiométrica foi realizada utilizando um número máximo de

componentes principais igual a 5, com pré-processamento autoescalado e

normalização dos dados. Com estes parâmetros, verificou-se que a PC1 apresentou

33,8 % da informação total do sistema; utilizou-se posto 5 para considerar todas

informações fornecidas (Tabela 5.16).

TABELA 5.16: Porcentagens das componentes principais do sistema (óleos

essências extraídos de C. sinensis sobre C. limonia) com pré-processamento.

Variância Porcentagem Porcentagem Cumulativa

PC1

59.22814 33.84465 33.84465

PC2

50.28913 28.73665 62.58130

PC3

33.79891 19.31366 81.89496

PC4

19.72628 11.27216 93.16711

PC5

11.95754 6.83288 99.99999

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

225

O gráfico de scores de PC1xPC3 (53,15 % de informação total do sistema)

está apresentado a seguir.

GRÁFICO 5.12: Gráfico de scores de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC3, 33,84 e 19,31 %, respectivamente).

O gráfico apresentou agrupamentos distintos para cada condição, separando-

as em dois grupos, com proximidade das replicatas, no entanto, deve-se notar que

neste caso, a escala do eixo y está mais próxima que no caso dos experimentos

com os voláteis, o que indica que não há grande diferença nas duas condições

empregadas.

A partir do gráfico de loadings de PC1XPC3 (Gráfico 5.13, p. 226), observou-

se que diferentemente dos experimentos com voláteis, não há apenas poucos

compostos que fazem a distinção de cada condição e sim um grande número

destes. Verificou-se, também, que os compostos com IK = 1299, 2384, 1199 e 2494

são alguns dos responsáveis pela distinção das amostras, sendo os dois primeiros

responsáveis pelos óleos essenciais da planta enxertada sem ter sido submetida à

presença de cigarrinhas (OEPP) estarem na parte superior e direita, e os dois

últimos responsáveis pelos óleos essenciais do enxerto após a remoção dos vetores

(OEPC) estarem na parte esquerda inferior no gráfico 5.12.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

226

GRÁFICO 5.13: Gráfico de loadings de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC3, 33,84 e 19,31 %, respectivamente).

Analisou-se os dados considerando-se PC1XPC2 (Gráfico 5.14, p. 227), o

que corresponde a 62,58 % da informação total do sistema, para verificar se as

observações eram semelhantes.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

227

GRÁFICO 5.14: Gráfico de scores de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC2, 33,84 e 28,74 %, respectivamente).

Observa-se, novamente, a separação dos dois grupos e a similaridade entre

as replicatas, porém, novamente verifica-se que a escala no eixo y é menor que as

obtidas nos experimentos com voláteis.

A partir do gráfico de loadings de PC1XPC2 (Gráfico 5.15, p. 228) observou-

se os mesmos resultados que o gráfico PC1XPC3. Neste caso, os compostos com

IK = 1199 e 2494 deslocam as amotras oepc para o lado esquerdo, enquanto os

compostos com IK = 1299 e 2384 são os responsáveis pelas amostras oepp estarem

deslocadas para o lado direito do gráfico de PC1xPC2.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

228

GRÁFICO 5.15: Gráfico de loadings de todas amostras dos óleos essenciais de C.

sinensis sobre C. limonia (PC1 x PC2, 33,84 e 28,74 %, respectivamente).

O gráfico do poder de modelagem mostrou que todos as variáveis

apresentam mesma importância na distinção das condições.

GRÁFICO 5.16: Gráfico do poder de modelagem de todas as variáveis dos óleos

essenciais de C. sinensis sobre C. limonia.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

229

Os compostos com IK = 1199, 1299, 2384 e 2494 foram uns dos mais

importantes para a distinção dos óleos essenciais das plantas nas diferentes

condições. Quando observa-se os cromatogramas das diferentes amostras, verifica-

se que os compostos com IK = 1199 (nerol) e 2494 (ni) estão presentes apenas

quando a planta foi submetida a cigarrinhas (condição 3); e os compostos com IK =

1299 (metildecanoato) e 2384 (ni) estão presentes apenas na planta sem ter tido

contato com as cigarrinhas condição 1; o que justifica a discriminação obtida com as

análises quimiométricas.

A Análise Hierárquica dos Agrupamentos (HCA) mostra que os compostos

estão separados nas diferentes condições, e que suas replicatas estão agrupadas,

com exceção da 1ª triplicata do óleo essencial extraído da planta sem ser submetida

as cigarrinhas (oepp1), a qual apresentou um comportamento um pouco diferente

das demais replicatas, podendo ser considerado um “desvio” (outlier).

GRÁFICO 5.17: Gráfico de HCA de todas amostras com índice de similaridade

0,385.

A partir de todas estas análises quimiométricas, observa-se que os resultados

obtidos com os óleos essências da planta sem a presença das cigarrinhas e após a

remoção das mesmas não foi tão evidente com no caso dos voláteis das plantas.

Isto ocorre, pois quando o óleo essencial é extraído da planta pela técnica de arraste

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

230

à vapor, não se extrai apenas os voláteis e sim compostos mais polares que são

“arrastados” pela água; no caso dos compostos coletados por HeadSpace – SPME,

estes são necessariamente voláteis, pois precisam volatilizar até a fibra acoplada no

recipiente para serem adsorvidos. Isto é muito interessante, pois demonstra que a

planta tem uma modificação química perceptível apenas em seus voláteis e não em

seu óleo essencial.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

231

5.2 Experimento Interação Planta – Xylella fastidiosa

5.2.1. Determinação de Hesperidina em diferentes espécies de

Citrus

Há dados na literatura, conforme mencionado na introdução, que sugerem

uma resposta da planta quando infectada pela bactéria X. fastidiosa através do

aumento na quantidade de um metabólito secundário que ela mesma produz, a

Hesperidina. No entanto, esta observação trata-se apenas de uma suposição, não é

comprovado se há um acréscimo considerável da substância quando a planta está

infectada, e se realmente a substância é a Hesperidina. Então, foram realizados

experimentos de análise de teor de Hesperidina, utilizando-se a técnica de CLAE

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), em diversas espécies de Citrus com e

sem sintomas de CVC para comprovar tais hipóteses.

5.2.2. Procedimento Experimental

Analisou-se as espécies: C. limonia sem sintomas de CVC (CLS); C. sinensis

sobre C. limonia com sintomas de CVC (CSC); C. sinensis sobre C. limonia sem

sintomas de CVC (CSS); C. reticulata sem sintomas de CVC (CRS); as quais foram

coletadas do Centro APTA Citros “Sylvio Moreira”. Foram analisados separadamente

os extratos dos pecíolos das plantas, uma vez que é descrito na literatura que este é

o local na planta onde se armazena uma maior quantidade de Hesperidina.

A otimização das condições de extração, de isolamento e de análise é

necessária para a obtenção de um resultado satisfatório. Todas as etapas do

experimento foram realizadas em duplicata para uma maior confiabilidade e

reprodutibilidade dos dados.

5.2.2.1. Extração e Isolamento das Amostras

Triturou-se 47,0 mg de pecíolos da planta e colocou-se em um tubo Falcon

com 1 mL de MeOH com alto grau de pureza. Agitou-se por 30 segundos e logo

após centrifugou-se a 10.000 rpm, por 15 minutos, a 20

C. Retirou-se a parte líquida

e secou-a. Repetiu-se este procedimento por mais duas vezes.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

232

Realizou-se o isolamento a partir da técnica de SPE (Extração por Fase

Sólida), utilizando-se cartuchos de Cyano (Bakerbond spe 7021-01). Dissolveu-se a

amostra em 2 mL de hexano e passou-a pelo cartucho pré-condicionado com

hexano. Passou-se 5 mL de hexano para que toda substância solúvel em hexano

fosse removida do cartucho. Essa fração coletada foi descartada, pois contêm

apenas interferentes e não a substância de interesse. Por fim, dissolveu-se o

restante da amostra em 1 mL de MeOH e passou-a no cartucho. Passou-se mais

600 µL de MeOH. Secou-se a amostra, para posterior análise. Esta fração deve

conter a Hesperidina (Figura 5.12), um flavonóide polar e que apresenta duas

unidades de açúcares em sua molécula.

rha-glyO

OCH

FIGURA 5.12: Estrutura da Hesperidina.

5.2.2.2. Análise das Amostras por CLAE

Cada fração obtida foi dissolvida em 500 µL de MeOH e colocada em um

frasco para análise por injeção automática, evitando-se assim, erros devido a injeção

não uniforme, e com isto a obtenção de um resultado mais preciso.

As condições otimizadas utilizadas para análise por CLAE foram: fase

estacionária: coluna semi-preparativa C18- phenomenex: gemini (150 x 4,60mm / 5

µm) e um holder com pré-filtro, fase móvel: H

O:MeOH:ACN (67,0:21,1:11,9), vazão

de fluxo: 1 mL/min, volume da injeção: 20 µL, comprimentos de onda: 282 nm.

Nestas condições o padrão de Hesperidina (Aldrich) apresentou um pico em

aproximadamente 13 minutos após a injeção.

Inicialmente condicionou-se a coluna para que não houvesse desvios nos

resultados. As injeções foram programadas para 30 minutos de corrida, 10 minutos

de limpeza e 12 minutos para recondicionamento da coluna. Injetou-se a série de

extratos coletados, um branco contendo o solvente em que foi dissolvida a amostra

(MeOH), e o padrão nas concentrações de 50 e 200 µg/mL.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

233

A seguir está representado um esquema de toda metodologia otimizada para

a análise do teor de Hesperidina em diferentes espécies de citros.

ESQUEMA 5.5: Fluxograma da metodologia empregada para análise comparativa

do teor de Hesperidina em diferentes espécies de Citrus.

Picado e

Triturado

Extrato

SPE

Cartucho

HPLC

Extrato

Pré-

urificado

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

234

5.2.3. Resultados e Discussão

5.2.3.1. Análise dos cromatogramas obtidos

A primeira análise foi realizada injetando-se o padrão de Hesperidina em duas

diferentes concentrações: 200 µg/mL e 50 µg/mL; os cromatogramas obtidos (eixo x

= Abs e eixo y = minutos) estão mostrados nas Figuras 5.13 e 5.14,

respectivamente. Observa-se que o cromatograma do padrão injetado em maior

concentração possui o pico da Hesperidina com maior área, o que é coerente, pois

contém uma maior quantidade da mesma. A partir das ferramentas do software,

obteve-se o tempo de retenção do pico da Hesperidina dos padrões injetados.

FIGURA 5.13: Cromatograma obtido a partir da injeção do padrão de Hesperidina

200 µg/mL.

FIGURA 5.14: Cromatograma obtido a partir da injeção do padrão de Hesperidina 50

µg/mL.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

235

Injetou-se o extrato pré-purificado do C. sinensis sobre C. limonia com

sintomas de CVC e obteve-se os cromatogramas contendo o pico próximo a 12,9

minutos de corrida cromatográfica (Figura 5.15 e 5.16), o qual, devido a comparação

com o tempo pico do padrão, corresponde a Hesperidina.

a b

FIGURA 5.15: Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSC (A).

a b

FIGURA 5.16: Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSC (B):

Os extratos analisados do C. sinensis sobre C. limonia sem sintomas de CVC

apresentaram também o pico correspondente a Hesperidina, próximo a 13,2 minutos

de corrida cromatográfica (Figura 5.17 e 5.18, p. 236); porém as áreas dos picos da

Hesperidina foram bem menores comparando-se com as dos C. sinensis sobre C.

limonia doentes.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

236

a b

FIGURA 5.17: Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSS (A).

a b

FIGURA 5.18: Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CSS (B).

Os extratos de C. reticulata sem a bactéria apresentaram o pico referente a

Hesperidina, próximo a 13,2 minutos de corrida cromatográfica (Figura 5.19 e 5.20,

p. 237). A área foi relativamente próxima a do extrato de C. sinensis sobre C. limonia

sadia.

a b

FIGURA 5.19: Cromatograma total (a) e ampliado (b) de injeção de CRS (A).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

237

a b

FIGURA 5.20: Cromatograma total (a) e ampliado (b) de injeção de CRS (B).

O extrato do C. limonia sem sintomas de CVC apresentou o pico de

Hesperidina em aproximadamente 13,1 minutos de corrida cromatográfica. As áreas

dos picos dos extratos referentes a esta planta foram bem menores que as dos

demais extratos.

a b

FIGURA 5.21: Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CLS (A).

a b

FIGURA 5.22: Cromatograma total (a) e ampliado (b) da injeção de CLS (B).

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

238

Pode-se verificar que todos os extratos apresentaram o pico referente a

Hesperidina; e para comprovar se houve um aumento ou diminuição de quantidade,

obteve-se, a partir do software do equipamento, a área de cada pico referente a

substância de interesse em cada fração e calculou-se a área relativa entre elas.

Como os experimentos foram realizados em replicatas, calculou-se a média dos

tempos de retenção e das áreas dos picos dos extratos semelhantes (Tabela 5.17).

TABELA 5.17: Extratos analisados, e suas respectivas áreas dos picos e tempos de

retenção.

Extrato Área do Pico Tempo de retenção

C. sinensis sobre C. limonia com

bactéria (A)

11.777.376 12,880

C. sinensis sobre C. limonia com

bactéria (B)

11.462.249 12,982

C. sinensis sobre C. limonia com

bactéria (Média)

11.619.812,5 12,931

C. sinensis sobre C. limonia sem

bactéria (A)

9.709.505 13,219

C. sinensis sobre C. limonia sem

bactéria (B)

5.166.934 13,258

C. sinensis sobre C. limonia sem

bactéria (Média)

7.537.152,3 13,226

C. reticulata sem bactéria (A) 6.649.392 13,286

C. reticulata sem bactéria (B) 8.011.598 13,054

C. reticulata sem bactéria (Média) 7.330.495 13,170

C. limonia sem bactéria (A) 415.316 12,959

C. limonia sem bactéria (B) 446.201 13,139

C. limonia sem bactéria (Média) 430.758,5 13,049

A partir das áreas obtidas de cada extrato, verificou-se que há uma alteração

na quantidade de Hesperidina nas diferentes espécies de citros, uma vez que cada

espécie analisada, sem sintomas da doença, apresentou uma quantidade diferente

da substância. O extrato do C. limonia foi o que conteve menor teor de Hesperidina.

Interação Planta – X. fatidiosa – O. facialis

239

E os extratos de C. sinensis sobre C. limonia sem bactéria e de C. reticulata

apresentaram um teor de Hesperidina próximos.

Quando considera-se o extrato da planta doente (C. sinensis sobre C. limonia

com bactéria), nota-se que esta apresentou maior teor de Hesperidina, pois o pico

referente a esta substância foi o que mostrou uma maior área.

Uma análise comparativa foi realizada utilizando-se as áreas médias de cada

extrato. Considerou-se a área média do C. sinensis sobre C. limonia com bactéria

como ponto de comparação, pois esta é a planta que apresenta diferença em

relação às outras:

A partir desta análise comparativa, pode-se dizer que realmente o C. sinensis

sobre C. limonia com bactéria apresentou uma maior quantidade Hesperidina em

relação ao C. sinensis sobre C. limonia sem bactéria, aproximadamente 35% a mais;

e entre todos os extratos analisados o C. limonia foi o que apresentou menor teor de

Hesperidina, apenas 4% da quantidade que o C. sinensis sobre C. limonia com

sintoma. Estes resultados estão coerentes e compatíveis com a análise visual

realizada anteriormente considerando apenas a absorbância dos picos.

CSS = 7.537.152,3 = 0,65 x 100% = 65 %

CSC 11.619.812,5

CRS = 7.330.495 = 0,63 x 100% = 63 %

CSC 11.619.812,5

CLS = 430.758,5 = 0,04 x 100% = 4 %

CSC 11.619.812,5

Conclusão

241

O estudo fitoquímico das raízes de C. limonia proporcionou o isolamento

e identificação de 16 metábolitos secundários: as cumarinas, escopoletina,

isoescopoletina, demetilsuberosina, clausarina, xantoarnol; as

piranocumarinas, xantiletina, seselina, xantoxiletina, trans-kelactona, trans-

decursidinol, junosmarina; os piranoflavonóides, limonianina e 5,4’-diidróxi-6-

(3”’-metil-2”’-butenil)-2”,2”-dimetilpirano(5’’,6’’-7,8)flavanona; e os esteróides β-

sitosterol, estigmasterol e campesterol. As cumarinas trans-kelactona e trans-

decursidinol, não são comuns em Citrus e na família Rutaceae, sendo relatada

pela literatura apenas na família Apiaceae. A 5,4’-diidróxi-6-(3”’-metil-2”’-

butenil)-2”,2”-dimetilpirano(5’’,6’’-7,8)flavanona é uma flavanona inédita. Este

estudo fitoquímico do C. limonia contribuiu para a ampliação do conhecimento

químico da família Rutaceae, ajudando na compreensão e classificação do

gênero.

Verificou-se que o perfil químico das raízes de C. limonia é muito similar

ao das raízes de C. sinensis sobre C. limonia, principalmente devido a grande

quantidade de cumarinas e de substâncias preniladas isoladas. No entanto,

quando compara-se estes perfis químicos com a parte superior da planta

enxertada, correspondente a C. sinensis, observa-se uma grande distinção

entre os metabólitos secundários, uma vez que esta possui uma grande

quantidade de compostos não prenilados e poucas cumarinas.

As únicas substâncias isoladas em comum nas diferentes plantas foram

as piranocumarinas Xantiletina e Xantoxiletina. Porém, estas foram isoladas em

quantidades ínfimas na parte superior da planta enxertada e em grande

quantidade na parte inferior desta última e da planta não enxertada. Isto é

muito interessante, pois sugere que a planta enxertada não produza estas

substâncias e sim que ocorre um mecanismo de translocação de metabólitos

secundários da parte inferior para a parte superior da planta enxertada.

Estudos enzimáticos vêm sendo realizados a fim de comprovar tal hipótese.

Os ensaios contra o agente causal da CVC, X. fastidiosa, possibilitou a

determinação da MIC de diversas classes de substâncias químicas, como

cumarinas, limonóides e flavonóides, isoladas de produtos naturais, as quais

ainda não haviam sido ensaiadas. Verificou-se que não há grande variação na

inibição da bactéria quando esta encontra-se na fase exponencial ou no início

da fase estacionária; sugerindo a utilização da fase exponencial para estes

Conclusão

242

ensaios, uma vez que obtém-se resultados com maior rapidez, o que favorece

a dinâmica dos experimentos.

As substâncias que apresentaram maior potencial inibitório foram a

Catequina e a Xantiletina, sendo esta última isolada em grande quantidade de

C. limonia, o que sugere estar associada ao mecanismo de resistência deste

frente a CVC, uma vez que é isolada em pouquíssima quantidade do C.

sinensis sobre C. limonia, o qual é suscetível a doença. Pode-se concluir que

as piranocumarinas e as flavanonas são classes promissoras contra X.

fastidiosa.

A análise comparativa de Hesperidina em diferentes espécies de citros

determinou quantidades próximas de Hesperidina em C. sinensis sem CVC e

em C. reticulata sem CVC; o C. limonia foi o gênero que apresentou menor teor

de Hesperidina. Verificou-se que há um aumento no teor deste flavonóide

glicosilado em plantas de C. sinensis sobre C. limonia contendo a CVC quando

comparadas com estas sadias, o que mostra uma resposta das mesmas frente

a infecção; esclarecendo o que estava duvidoso na literatura e comprovando

algumas hipóteses sugeridas. A partir da quantidade de Hesperidina que uma

planta possui pode-se também detectar se esta possui ou não a bactéria,

possibilitando um método alternativo de diagnóstico da doença.

O estudo de interação planta / inseto mostrou que a planta tem uma

resposta nítida quando em contato com cigarrinhas transmissoras de CVC,

alterando seus voláteis emitidos, e que esta não retorna aos seus componentes

químicos iniciais, mesmo após 48 horas da remoção dos vetores.

Há compostos voláteis que são exalados em maior quantidade quando

em contato com as cigarrinhas, indicando que a planta libera-os em resposta

ao ataque pelo inseto, alterando seu metabolismo. Para não afetar seus

processos vitais, ela retorna ao equilíbrio metabólico variando seus

constituintes secundários, aumentando suas concentrações ou sintetizando

novos; estes podem servir como alomônios de agregação, indicando a

presença de alimento e atraindo um número maior destes insetos no campo.

Alguns voláteis são exalados em maior quantidade após a remoção das

cigarrinhas, assim como o 2-etil-1-hexanol, agindo como um sinalizador para

que o seu metabolismo possa retornar ao equilíbrio. Outros páram de ser

liberados, ou diminuem de percentual, como observado para o composto com

Conclusão

243

IK = 1907, sendo um mecanismo de defesa da planta contra as cigarrinhas,

não atraindo mais agentes vetores. Isto sugere que estes últimos atraem os

insetos e, portanto, possam ser utilizados como cairômonios, proporcionando

um método ecologicamente correto, o qual não agride o meio ambiente e nem

o ser humano, no controle de cigarrinhas nos pomares, diferentemente dos

inseticidas utilizados atualmente. Esta é uma nova alternativa no controle da

CVC, uma vez que eliminando os vetores, a doença não será mais transmitida.

Houve também uma alteração nos compostos identificados nos óleos

essenciais da planta em diferentes condições, no entanto, não foi tão

pronunciada como nos casos dos voláteis.

A análise quimiométrica foi fundamental para a obtenção de resultados

claros e confiáveis, mostrando que todas as replicatas e experimentos estavam

coerentes, podendo-se concluir que a planta realmente sofre modificações,

principalmente em seus voláteis quando atacada por um agente, neste caso a

cigarrinha vetor da CVC. Pode-se dizer também que a técnica de HS-SPME

além de muito rápida, prática, livre de solventes e não destrutiva é altamente

aplicável e reprodutível para experimentos com plantas e insetos, e juntamente

com a quimiometria pode fornecer resultados muito interessantes do ponto de

vista ecológico e econômico.

Como conclusão geral, este trabalho indicou novas perspectivas para o

controle da CVC até então não utilizadas, como a inibição direta do

microrganismo causal da doença a partir de produtos naturais e a utilização de

métodos ecologicamente corretos na eliminação dos agentes vetores e um

método alternativo de diagnóstico para plantas com esta doença.

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(5), 1761-1770.

Anexo:

Cromatogramas obtidos sob as diferentes condições empregadas no experimento

interação planta-inseto

Anexo

254

1. Cromatogramas obtidos em replicata (1-3h2 e 1-3h4) dos compostos

voláteis extraídos da planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia sem

sofrer nenhuma alteração:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-3h2).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-

3h2), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-3h4).

Anexo

255

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-

3h4), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Anexo

256

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (1-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

2. Cromatogramas obtidos em replicata (2a-3h3 e 2a-3h4) dos compostos

voláteis extraídos da planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia logo após

a inserção de cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2a-3h3).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2a-3h3), 0 a 20

de altitude e de 0 a 50 min.

Anexo

257

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2a-3h4).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2a-3h4), 0 a 20

de altitude e de 0 a 50 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (2a-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (2a-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Anexo

258

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (2a-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração (2a-

3h4), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

Anexo

259

3. Cromatogramas obtidos em triplicata (2b-3hi, 2b-3hii e 2b-3hiii) dos

compostos voláteis extraídos da planta enxertada C. sinensis sobre C.

limonia 24 horas após a inserção das cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2b-3hi)

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2b-3hi), 0 a

20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2b-3hii).

Anexo

260

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2b-3hii), 0 a

20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2b-3hiii).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2b-3hiii), 0 a

20 de altitude e de 0 a 50 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2b-3hiii), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Anexo

261

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2b-3hiii), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2b-3hiii), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2b-3hiii), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

Anexo

262

4. Cromatograma obtido (2c-3vi) dos compostos voláteis extraídos da planta

enxertada C. sinensis sobre C. 48 horas após a inserção das cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (

2c-3vi).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas com as cigarrinhas (2c-3vi), 0 a

20 de altitude e de 0 a 50 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2c-3vi), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Anexo

263

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2c-3vi), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2c-3vi), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas sem sofrer nenhuma alteração

(

2c-3vi), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

Anexo

264

5. Cromatogramas obtidos em triplicata (3a-3h2, 3a-3h3 e 3a-3h4) dos

compostos voláteis extraídos da planta enxertada C. sinensis sobre C.

limonia logo após a remoção de cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas (3a-3h2).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h2), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas (3a-3h3).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h3), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Anexo

265

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas (3a-3h4).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h4), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h4), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h4), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Anexo

266

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h4), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após a remoção das cigarrinhas

(3a-3h4), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

Anexo

267

6. Cromatogramas obtidos em replicata (3b-3i e 3b3ii) dos compostos

voláteis extraídos da planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia 24 horas

após a remoção de cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das cigarrinhas (3b-3i).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das

cigarrinhas (3b-3i), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das cigarrinhas (3b-3ii).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das

cigarrinhas (3b-3ii), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Anexo

268

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das

cigarrinhas (3b-3ii), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das

cigarrinhas (3b-3ii), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das

cigarrinhas (3b-3ii), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 24 h da remoção das

cigarrinhas (3b-3ii), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

Anexo

269

7. Cromatogramas obtidos em replicata (3c-3hiv, 3c-3hv, 3c-3hvi e 3c-3hvii)

dos compostos voláteis extraídos da planta enxertada C. sinensis sobre C.

limonia 48 horas após a remoção de cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das cigarrinhas (3c-3hiv).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hiv), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das cigarrinhas (3c-3hv).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hv), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Anexo

270

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das cigarrinhas (3c-3hvi).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hvi), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das cigarrinhas (3c-3hvii).

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hvii), 0 a 20 de altitude e de 0 a 50 min.

Anexo

271

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hvii), 0 a 10 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hvii), 0 a 10 de altitude e de 20 a 30 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hvii), 0 a 10 de altitude e de 30 a 40 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos das plantas após 48 h da remoção das

cigarrinhas (3c-3hvii), 0 a 10 de altitude e de 40 a 60 min.

Anexo

272

8. Cromatogramas obtidos em triplicata (oepp1, oepp2 e oepp3) dos

compostos extraídos dos óleos essenciais da planta enxertada C. sinensis

sobre C. limonia sem sofrer nenhuma alteração:

Cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas com as cigarrinhas (oepp1).

Cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas com as cigarrinhas (oepp2).

Cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas com as cigarrinhas (oepp3).

Anexo

273

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas sem sofrer

nenhuma alteração (oepp3), 0 a 20 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas sem sofrer

nenhuma alteração (oepp3), 0 a 20 de altitude e de 20 a 40 min.

Anexo

274

9. Cromatogramas obtidos em triplicata (oepc1, oepc2 e oepc3) dos

compostos extraídos dos óleos essenciais da planta enxertada C. sinensis

sobre C. após a remoção das cigarrinhas:

Cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas com as cigarrinhas (oepc1).

Cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas com as cigarrinhas (oepc2).

Cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas com as cigarrinhas (oepc3).

Anexo

275

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas após

removidas as cigarrinhas (oepc3), 0 a 20 de altitude e de 0 a 20 min.

Ampliação do cromatograma dos voláteis extraídos dos óleos essenciais das plantas sem após

removidas as cigarrinhas (oepc3), 0 a 20 de altitude e de 20 a 40 min.

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