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Emerson Ticona Fioretto
Aumento no número de neurônios seguido de hipertrofia neuronal
pode ser mecanismo de compensação para perda neuronal resultante
da remoção unilateral do gânglio cervical cranial em ovinos
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Departamento:
Departamento de Cirurgia
Área de concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres
Orientador:
Prof. Dr. Antonio Augusto Coppi Maciel
Ribeiro
São Paulo
2006
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Fioretto, E.T.
2
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
Cidade Universitária "Armando de Salles Oliveira"
PARECER
Interessado: Emerson Fioretto
Assunto: Protocolo de experimentação adotado em experimento animal.
A Comissão de Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo, após analisar o projeto sob o número
589/2004, intitulado: "Avaliação clínica e morfológica da ganglionectomia
unilateral do gânglio cervical cranial de ovinos usando método de
quantificação do "Fractionator físico" e do "Double Disector físico", no
qual foram utilizadas 09 ovelhas, sob responsabilidade do Prof. Dr. Antonio
Augusto Coppi Maciel Ribeiro, constatou que o mesmo foi realizado de
acordo com os princípios de bioética, adotados por esta Comissão.
São Paulo, 15 de fevereiro de 2005
Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87 - 05508-000 - Cid. Univ. "Armando de Salles
Oliveira"
Fones: (011) 3091-7671/3091L7676 Fax: (011) 3032-2224
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Fioretto, E.T.
3
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: FIORETTO, Emerson Ticona
Título: Aumento no número de neurônios seguido de hipertrofia neuronal pode ser mecanismo de
compensação para perda neuronal resultante da remoção unilateral do gânglio cervical cranial
em ovinos
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para a obtenção do título
de Doutor em Ciências
Data: ___/___/___
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________ Instituição: _______________
Assinatura: _______________________________ Julgamento: _______________
Prof. Dr. _______________________________ Instituição: _______________
Assinatura: _______________________________ Julgamento: _______________
Prof. Dr. _______________________________ Instituição: _______________
Assinatura: _______________________________ Julgamento: _______________
Prof. Dr. _______________________________ Instituição: _______________
Assinatura: _______________________________ Julgamento: _______________
Prof. Dr. _______________________________ Instituição: _______________
Assinatura: _______________________________ Julgamento: _______________
Fioretto, E.T.
4
Dedicatórias
Fioretto, E.T.
5
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, À minha mãe,
Valdir Fioretto Yolanda
Ticona Fioretto
Quando nasci
meu pai
sempre se fez
presente para
aplaudir meus
últimos
lucros.
Quando me ia
fazendo
maior, era
uma figura
que me
ensinava a
diferença
entre o mau e
o bem.
Na juventude,
era a
autoridade
que orientava
os limites
para os
desejos.
Teus braços
sempre se
abrem quando
preciso um
abraço.
Teu coração
sabe
compreender
quando
preciso uma
amiga.
Teus olhos
sensíveis se
endurecem
quando
preciso uma
lição.
Tua força e
teu amor me
dirigiram
pela
vida e
me deram as
asas que
Fioretto, E.T.
6
À minha mais profunda amiga,
Ana Rita de Lima
Amigo é aquela preciosa jóia ou
pedra rara, difícil de encontrar
,
mas
encontrada nos momentos mais
inesperados de nossas vidas,
ou nos
lugares mais surpreendentes e sempre
quando mais necessitamos dele!
Assi
m encontrei você que participa
da minha, divide os meus sonhos e
anseios e fortalece minhas virtudes
nos momentos de fraqueza. Ensinaste-
me a calma e a paciência dos tempos.
Fioretto, E.T.
7
Agradecimentos
Fioretto, E.T.
8
AGRADECIMENTO
É difícil saber como agradecer as pessoas que me apoiaram e se doaram para a conclusão
deste trabalho, pois a gratidão é infinita. Ajudaram-me pela amizade, pelo questionamento
científico, pelo desafio, por suas habilidades em alguma etapa e por muitos outros motivos.
Agradeço a todos pelo carinho dedicado a este trabalho.
Fioretto, E.T.
9
Obrigado Senhor pela sabedoria para descobrir o correto, pela vontade em elegê-lo e pela
força para fazer que fosse duradouro. Por meu passado, presente e futuro guia-me para
encontrar a serenidade para aceitar as coisas que não posso mudar e dai-me coragem para
mudar àquelas que posso e principalmente sabedoria para distingui-las.
Agradeço aos animais que apesar dos olhares aflitos, extraír-lhes a essência, roubar-lhes a
liberdade e usufruir seus corpos, não acreditem que este sacrifício foi em vão, que não foi
grato e que não foi sentida a sua dor. Foi com amor e respeito realizado. Hoje agradeço
àqueles que se doaram sem compreender que suas vidas renasciam.
Agradeço à FAPESP pelo apoio e financiamento deste projeto.
Agradeço à Universidade São Paulo pela acolhida em seu seio estudantil e científico.
Agradeço à Prof.ª Maria Angélica Miglino pelo apoio ao desenvolvimento deste trabalho para
que fosse alcançado no período necessário.
Agradeço ao Prof. Antonio Augusto Coppi Maciel Ribeiro, meu orientador, pelos anos de
trabalho em seu laboratório e pelos frutos colhidos por minha dedicação à pesquisa ao seu
lado.
Á Prof.ª Sheila Canevese Rahal, ao Professores Julio Cesar Balieiro, Alexandre Serocum
Borges, Carlos Roberto Teixeira que me acolheram em suas instituições, participaram
ativamente dos trabalhos e mesmo em seus momentos particulares sempre estenderam suas
mãos-amigas à minha pessoa. Fica aqui minha eterna gratidão.
Um abraço especial ao meu amigo Guilherme José Bolzani de Campos Ferreira (Mamão)
pelo apoio e ajuda nos momentos de catástrofes informáticas.
Agradeço aos amigos de laboratório, Ana Rita, André, Cauê, Fernando, Procássia, Renato,
Samanta, Silvio, Tais, Victor, Wanderley e aos agregados aos trabalhos Érika, Guilherme,
Rosa e Vivian pelos momentos de descontração das responsabilidades do dia a dia.
Fioretto, E.T.
10
Aos meus amigos de outros mares, agradeço a paciência devido à minha ausência, pelo
respeito e incentivo ao meu trabalho, pelas palavras, pelas descontrações e por quando se
fizeram necessários para que eu alcançasse os objetivos desta meta.
“Um verdadeiro amigo é alguém que te conhece tal como és, compreende onde tens estado,
acompanha-te em teus lucros e teus fracassos, celebra tuas alegrias, compartilha tua dor e
jamais o julga por seus erros.”
Aos colegas, que não posso nomear todos, para não cometer a indelicadeza de omitir nomes,
com o sonho alcançado, agradeço sua dedicação, contribuição e principalmente compreensão
pelos momentos difíceis e exaltação nas horas de alegria do caminho. Graças ao seu apoio
incondicional, as etapas foram superadas e os objetivos alcançados.
Aos funcionários, talvez eu tenha representado mais um na mesma rotina, mas a convivência
nos tornou amigos. Deixo meu agradecimento a todos pela sua dedicação e pelos momentos
profissionais e pessoais divididos.
Fioretto, E.T.
11
“Ter verdadeiro sucesso
na vida é:
Rir muito e muitas vezes
Ganhar o respeito de
pessoas inteligentes
Gozar do carinho das
crianças
Ganhar o reconhecimento
de pessoas qualificadas
Saber suportar a
traição de falsos amigos
Apreciar a beleza
Procurar o melhor nos
demais
Deixar o mundo um pouco
melhor de como o
Fioretto, E.T.
12
encontraste - com um
filho são, um jardim
bonito ou uma pessoa
mais feliz
Saber que ao menos
alguém viveu melhor
graças a ti.” (Anônimo)
Fioretto, E.T.
13
RESUMO
FIORETTO, Aumento no número de neurônios seguido de hipertrofia neuronal pode ser mecanismo de
compensação para perda neuronal resultante da remoção unilateral do gânglio cervical cranial em
ovinos. [Neuronal number increase followed by neuronal hypertrophy may be a compensation
mechanism for neuronal loss as a result of unilateral remotion of cranial cervical ganglion in sheep].
2006. 102 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
O sistema nervoso simpático é escassamente descrito em livros na anatomia veterinária e encontra-se
pouca informação a respeito de seu funcionamento em grandes mamíferos. O conceito atual da estrutura
e função dos gânglios simpáticos deriva de estudos desenvolvidos no gânglio cervical superior (GCC)
em animais de laboratório, devido ao seu grande tamanho, facilidade de acesso e multiplicidade de
território de inervação nestas espécies. A ganglionectomia unilateral do GCC causou condição
patológica associada à síndrome de Horner com sinais associados à anisocoria, enoftalmia, ptose e
hipertermia de orelha. Aplicando-se métodos estereológicos, objetivamos investigar a neuroplasticidade
do G CC em condições de exigência funcional em diferentes períodos de tempo. A neuroplasticidade
foi investigada em vista dos aspectos morfoquantitativos, tamanho e número total de neurônios.
Objetivou-se encontrar variação, ou não, no tamanho dos neurônios, na densidade neuronal, no número
de neurônios secundários à ganglionectomia unilateral do GCC. Alterações macroscópicas revelaram
um aumento médio de 8%, 3% e 11% em comprimento, largura e espessura para os gânglios operados
no grupo I. Para o grupo II encontraram-se aumentos em 4% para comprimento e largura e 5% em
espessura, enquanto que para o grupo III, 29% de aumento foram encontrados para comprimento, 4%
em largura e 7% em espessura. Os gânglios controle e operados apresentaram diferença significativa (p
= 0,0001) na densidade neuronal (Nv). Os gânglios operados apresentaram diminuição na densidade
neuronal em média de 89% para o grupo I, 65% para o grupo II e 47% para o grupo III. Esta redução
reflete a distribuição heterogênea dos neurônios no gânglio operado. Um aumento no volume neuronal
Fioretto, E.T.
14
global foi significativamente detectado (p = 0,0001), o gânglio operado apresentou aumentos médios de
13% para o grupo I, 24% para o grupo II e 29% para o grupo III, sugestivo de maior exigência funcional
em resposta à ganglionectomia. O numero total de neurônios apresentou diferenças significativas (p =
0,0514) e dois efeitos distinto nos gânglios operados. No grupo I observou-se um aumento de 3% no
numero total de neurônios enquanto que uma redução foi determinada para os grupos II (8%) e III
(20%). A avaliação global dos resultados leva-nos a inferir duas hipóteses associadas e consecutivas: 1)
a hipertrofia neuronal estaria associada a um mecanismo compensatório para a re-inervação
contralateral sendo que a maior exigência funcional poderia levar estes neurônios à morte, seguido de
hipertrofia de tecido não-neuronal cicatricial refletido na diminuição da densidade neuronal; 2) a
hipertrofia neuronal estaria associada a um mecanismo compensatório à morte celular determinada pela
maior exigência funcional. As alterações quantitativas principais secundárias à ganglionectomia
unilateral do GCC no gânglio remanescente estão associadas à: perda significativa no número total de
neurônios a partir da 8ª semana de evolução da doença, perda significativa na densidade neuronal a
partir da 8ª semana e aumento significativo na área e volume neuronal.
Palavras chave: Gânglio Cervical Cranial. Ganglionectomia. Estereologia. Perda neuronal.
Síndrome de Horner.
Fioretto, E.T.
15
ABSTRACT
FIORETTO, Neuronal number increase followed by neuronal hypertrophy may be a compensation
mechanism for neuronal loss as a result of unilateral remotion of cranial cervical ganglion in sheep.
[Aumento no número de neurônios seguido de hipertrofia neuronal pode ser mecanismo de
compensação para perda neuronal resultante da remoção unilateral do gânglio cervical cranial em
ovinos]. 2006. 102 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
The sympathetic nervous system is briefly described in veterinary anatomy text-books and there is little
information so far concerning its function in large mammal species. The current concept of the structure
and function of the sympathetic ganglia is derived from studies on the cranial cervical ganglia (CCG)
carried out in laboratory animals due to very attractive characteristics of CCG in these species such as
large size, accessibility and multiplicity of target organs. The CCG unilateral ganglionectomy caused a
pathological condition associated with Horner’s syndrome which includes anisocoria, enophtalmos,
ptosis and increase in the temperature of ear as a result of peripheral vasodilatation. Using stereology-
designed methods, we aimed to study CCG neuroplasticity under experimental functional overloading
along distinct periods of time. Neuroplasticity was investigated according to morphoquantitative aspects,
mostly size and total number of neurons. We wanted to find out whether or not neuron size, numerical
density and nerve cell numbers would vary as a result of CCG ganglionectomy. Gross anatomic
differences were considered to the increase in the operated ganglia, means of 8%, 3% and 11% for
length, width and thickness, respetively in the group I. For group II it was encountered means increases
of 4% for length and width and 5% in thickness. Group III showed means values of 29% increase in
length, 4% in width and 7% in thickness. Control and operated sheep CCG revealed significant
difference (p=0.0001) in the neuronal density (Nv). The operated ganglia revealed reduction in the
neuronal density of 89% for group I, 65% for group II and 47% for group III. This reduction in the
operated ganglia reflects its inhomogeneous distribution of neurons. An increase in the global neuronal
Fioretto, E.T.
16
volume was significantly detected (p= 0.0001), the operated ganglia showed increases in the means of
13% for group I, 24% for group II and 29% for group III, suggesting a functional overload response for
the unilateral ganglionectomy. The total number of neurons presented significant differences (p =
0.0514) and two distinct effects in the operated ganglia. In the group I, an increase of 3% was
encountered meanwhile reduction in the total number was associated to groups II (8%) and group III
(20%). An overlook of the results suggests two consecutive and associated hypotheses: 1) the
hypertrophy of neurons would be associated to a compensatory mechanism for contralateral re-
innervation although the functional overload would drive these neurons to cellular death, followed by
hypertrophy of non-neuronal tissue as reflected in the neuronal density; 2) the neuronal hypertrophy
would be associated to a compensatory mechanism to cellular death caused by the functional overload
The main quantitative changes in the remaining ganglia are: Significant loss in the total number of
neurons from the 8
th
week of evoloution of the disease; Significant decrease in the numerical density
(Nv) from the 8
th
week and significant increase in both neuron area and neuron volume.
Key words: Cranial Cervical Ganglion. Ganglionectomy. Stereological design. Neuronal loss.
Horner’s syndrome.
Fioretto, E.T.
17
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Fotomacrografias seqüenciais representando as etapas da ganglionectomia
unilateral esquerda do GCC (gânglio cervical cranial) de um ovino. Em A
observa-se o posicionamento da cabeça do animal. Em B visualiza-se a
incisão ventrolateral. Em C observamos o osso epihióide (seta branca). Em
D representa-se o momento de extração do gcc (seta cheia)...............................60
Figura 2 – Fotografia do plano nasal de um ovino ilustrando a ausência da sudorese no
hemi-plano nasal esquerdo (cabeças de setas cheias) após a ganglionectomia
unilateral do GCC (gânglio cervical cranial) enquanto no hemi-plano nasal
direito observa-se o aspecto brilhante da sudorese (cabeças de setas vazias). ....62
Figura 3 – Fotografia da face de um ovino demonstrando a ptose da pálpebra superior
(traço) presente após a ganglionectomia unilateral do GCC (gânglio cervical
cranial). posicionaram-se dois traços (amarelos - dois centímetros) idênticos
entre os pontos mais côncavos da mucosa palpebral superior e inferior em
ambos os olhos. Observa-se a diferença de altura da pálpebra superior
esquerda para o traço em comparação à direita, caracterizando a ptose no
olho esquerdo.......................................................................................................63
Figura 4 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado após a ganglionectomia unilateral (controle)
do grupo I. Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A) está sob
a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes na
secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas
indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do
disector é de 12µm. Observa-se distribuição homogênea dos neurônios no
gânglio controle. Técnica de coloração: azul de toluidina. Escala de barra:
25 µm...................................................................................................................68
Figura 5 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado duas semanas (grupo I) após ganglionectomia
unilateral (operado). Nesta montagem observa-se que a secção referencia
(A) está sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam
presentes na secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que
setas brancas indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a
altura do disector é de 12µm. Observa-se distribuição heterogênea dos
neurônios no gânglio operado. Técnica de coloração: azul de toluidina.
Escala de barra: 25 µm ........................................................................................69
Figura 6 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado após a ganglionectomia unilateral (controle)
do grupo II. Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A) está
sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes na
secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas
indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do
Fioretto, E.T.
18
disector é de 12µm. Observa-se distribuição homogênea dos neurônios no
gânglio controle. Técnica de coloração: azul de toluidina. Escala de barra:
25 µm...................................................................................................................70
Figura 7 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado sete semanas (grupo II) após ganglionectomia
unilateral (operado). Nesta montagem observa-se que a secção referencia
(A) está sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam
presentes na secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que
setas brancas indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a
altura do disector é de 12µm. Observa-se distribuição heterogênea dos
neurônios no gânglio operado. Técnica de coloração: azul de toluidina.
Escala de barra: 25 µm ........................................................................................71
Figura 8 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado após a ganglionectomia unilateral (controle)
do grupo III. Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A) está
sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes na
secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas
indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do
disector é de 12µm. Observa-se distribuição homogênea dos neurônios no
gânglio controle. Técnica de coloração: azul de toluidina. Escala de barra:
25 µm...................................................................................................................72
Figura 9 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado doze semanas (grupo III) após
ganglionectomia unilateral (operado). Nesta montagem observa-se que a
secção referencia (A) está sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios
que estavam presentes na secção de referência e desapareceram na look-up,
ao passo que setas brancas indicam neurônios presentes nas duas secções.
Nota-se que a altura do disector é de 12µm. Observa-se distribuição
heterogênea dos neurônios no gânglio operado. Técnica de coloração: azul
de toluidina. Escala de barra: 25 µm ...................................................................73
Gráfico1– Gráfico descreve as estimativas das médias individuais para a área do
núcleo (µm
2
), área do corpo celular (µm
2
), volume neuronal (µm
3
), Nv
(neurônios.mm
-
3) e N (número total de neurônios) no gânglio cervical
cranial (GCC) de ovinos avaliados em três diferentes períodos pós-
operatórios: 2 semanas (gI); 7 semanas (gII) e 12 semanas (gIII). Círculos
(o) representam estimativas individuais e barras horizontais (-) assinalam
médias dentro de cada grupo de acordo com o tratamento empregado:
controle e operado, São Paulo – 2006 .................................................................81
Fioretto, E.T.
19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Representação do número de “disectors” e numero total de perfis neuronais
encontrados em cada animal de cada grupo – São Paulo, 2006 ..........................54
Tabela 2 – Representação dos dados macromorfométricos do gcc obtidos durante o ato
cirúrgico e abate dos animais, São Paulo – 2006.................................................60
Tabela 3 – Representação dos dados obtidos de observação clínica para a grupo I
durante o período pós cirúrgico, São Paulo, 2006...............................................64
Tabela 4 – Representação dos dados obtidos de observação clínica para a grupo II
durante o período pós cirúrgico, São Paulo, 2006...............................................65
Tabela 5 – Representação dos dados obtidos de observação clínica para a grupo III
durante o período pós cirúrgico, São Paulo, 2006...............................................66
Tabela 6 – Representação das medias dos resultados obtidos para as áreas do núcleo e
corpo celular e volume do neurônio de gânglios controle e operados de
ovinos avaliados em diferentes períodos após a ganglionectomia unilateral
do gcc, São Paulo, 2006.......................................................................................79
Tabela 7 - Representação da estimativa de neurônios mm
-3
e a estimativa do número
total de neurônios do gcc de ovinos controle e tratados avaliados em
diferentes épocas após a ganglionectomia unilateral. São Paulo, 2006...............80
Fioretto, E.T.
20
SUMÁRIO
1 INTRODUCÃO ......................................................................................................23
2 OBJETIVOS...........................................................................................................28
3 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................30
3.1 LOCALIZACÃO E DISTRIBUICÃO.....................................................................30
3.2 MICROESTRUTURA E ULTRAESTRUTURA....................................................33
3.3 REMOCÃO EXPERIMENTAL DE GÂNGLIOS SIMPÁTICOS
(GANGLIONECTOMIA E SUAS ALTERAÇÕES) ..............................................36
3.4 ESTUDOS MORFOMÉTRICO E ESTEREOLÓGICO..........................................39
4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................44
4.1 MATERIAL .............................................................................................................44
4.2 MÉTODOS...............................................................................................................45
4.2.1. Anatomia Macroscópica...........................................................................................45
4.2.1.1 Estudo piloto............................................................................................................45
4.2.1.2 Técnica Operatória..................................................................................................46
4.2.2 Estudo clínico...........................................................................................................47
4.2.3 Microscopia de luz de cortes semi-finos ..................................................................49
4.2.4 Estudo estereológico.................................................................................................51
4.2.4.1 Estimativa do número total de neurônios ganglionares obtida pelo
método "Physical Fractionator" ............................................................................51
4.2.4.2 Estimativa da densidade numérica (Nv) pelo método do "Two way
physical Disector" ...................................................................................................53
4.2.4.3 Estimativa global do volume neuronal .....................................................................55
4.2.5 Estudo Morfométrico (Tamanho dos neurônios ganglionares)................................56
4.2.5.1 Área Seccional do corpo celular e núcleo neuronal..............................................56
Fioretto, E.T.
21
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................................57
5 RESULTADOS.......................................................................................................59
5.1. ANATOMIA MACROSCÓPICA E TECNICA CIRÚRGICA...............................59
5.2. ANÁLISE CLÍNICA................................................................................................61
5.3. MICROESTRUTURA .............................................................................................67
5.4 ESTUDO ESTEREOLÓGICO.................................................................................74
5.4.1 Densidade neuronal e número total de neurônios ....................................................74
5.4.2 Estimativa global do volume neuronal.....................................................................75
5.5 ESTUDO MORFOMÉTRICO.................................................................................77
5.5.1 Área seccional do núcleo neuronal...........................................................................77
5.5.2 Área seccional do corpo celular neuronal ................................................................78
6 DISCUSSÃO...........................................................................................................83
6.1 TÉCNICA OPERATÓRIA ......................................................................................83
6.2 ANATOMIA MACROSCÓPICA............................................................................84
6.3 ESTUDO CLÍNICO.................................................................................................85
6.4. MICROESTRUTURA .............................................................................................86
6.5 ESTUDO ESTEREOLÓGICO.................................................................................87
6.5.1 Densidade Neuronal .................................................................................................88
6.5.2 Número total de neurônios .......................................................................................89
6.5.3 Estimativa global do volume neuronal.....................................................................91
6.6 ESTUDO MORFOMETRICO.................................................................................92
6.6.1 Área seccional do núcleo neuronal...........................................................................92
6.6.2 Área do corpo celular neuronal ................................................................................93
7 CONCLUSÕES ......................................................................................................95
REFERÊNCIAS .....................................................................................................97
Fioretto, E.T.
22
Introdução
Fioretto, E.T.
23
1 INTRODUCÃO
Classicamente o Sistema Nervoso Autônomo (SNA) é definido como um sistema
eferente de transmissão de impulsos do Sistema Nervoso Central (SNC) aos órgãos
periféricos, sendo constituído por um arranjo extenso de gânglios e nervos, sendo estes
gânglios classificados segundo sua localização anatômica em paravertebral, pré-vertebral,
paravisceral e intramural. Os gânglios paravertebrais arranjam-se em duas cadeias simpáticas
dispostas em ambos os lados da coluna vertebral e comunicam-se com o SNC via ramos
comunicantes brancos conectando-se à medula espinhal (BAKEWELL, 1995; GABELLA,
2004).
Os efeitos do SNA vinculam-se ao controle do ritmo cardíaco, constrição e dilatação de
vasos sanguíneos, contração e relaxamento de musculatura lisa de vários órgãos, acomodação
visual, regulagem das secreções exócrinas e endócrinas do corpo entre outras. Os nervos
autônomos compõem-se por fibras eferentes e aferentes. Reporta-se a existência de fibras
autônomas aferentes, ou seja, responsáveis pela transmissão dos impulsos da periferia para o
SNC, relacionadas à mediação da sensação de algumas vísceras, à regulação vasomotora e
aos reflexos respiratórios, tais como, os baro e quimioreceptores no seio carotídeo e no arco
aórtico (BAKEWELL, 1995).
Quanto ao papel fisiológico, reporta-se que, os gânglios simpáticos representam locais
de interação sináptica, não sendo apenas estações simples de retransmissão, mas locais de
convergência, facilitação e inibição de impulsos nervosos (ECCLES, 1935; MATTHEWS,
1983).
No pescoço, o tronco simpático cervical situa-se dorsalmente ao nervo vago e próximo
à artéria carótida comum, ventralmente ao processo transverso e músculos pré-vertebrais.
Fioretto, E.T.
24
Destacam-se dois gânglios: gânglio cervical superior (GCS) ou cervical cranial (GCC) e
gânglio cervical inferior, geralmente fusionado aos primeiros gânglios torácicos (gânglio
estrelado). Às vezes um gânglio mediano pode estar presente (BALJET; DRUKKER, 1979;
HEDGER; WEBBER, 1976).
O conhecimento atual sobre a estrutura e função dos gânglios simpáticos é derivado
principalmente de estudos histofisiológicos realizados nos gânglios cervicais craniais (GCC)
em animais de laboratório devido ao seu grande tamanho, facilidade de acesso nestes animais
e multiplicidade de seus órgãos alvos. Este gânglio tem sido escolhido devido a sua
população celular distinta e funções bem definidas (DAIL; BARTON, 1983; FLEET; BELL,
1991).
Estudos relacionados à topografia funcional reportam que o GCC apresenta populações
de neurônios especificamente direcionadas à inervação da pineal, íris, membrana nictante,
músculo de Müller, glândula submandibular, tireóide, língua, mucosa oral, pele da face, pele
da orelha e pele do pescoço (FLEET; BELL, 1991).
Além da abordagem sobre a população de neurônios do GCC, a microvascularização
foi também investigada. As observações microscópicas revelaram que o GCC recebe sangue
arterial proveniente de duas a três pequenas artérias do lado mediano da artéria carótida
externa e pequenos ramos da artéria carótida comum. Outros estudos a respeito da
microvascularização de gânglios simpáticos mostraram, em ratos senis e jovens, uma relação
constante entre neurônios e micro vasos no GCC (BAKER et al., 1989; CHUNHABUNDIT
et al., 1993).
Relatos da interação do GCC e seu território alvo demonstram controle sobre a
mineralização óssea. O metabolismo ósseo é dependente das linhagens osteoblásticas e
osteoclásticas, sendo esta última célula a principal responsável pela síntese e degradação do
osteóide e subseqüente desmineralização sofrendo influência de vários fatores locais ou
sistêmico sendo o sistema nervoso autônomo um de seus fatores reguladores. O efeito da
Fioretto, E.T.
25
ganglionectomia cervical unilateral em ratos sob a mineralização óssea e na densidade da
mandíbula foi investigada demonstrando-se relação entre a simpatectomia deste gânglio e
alterações qualitativas na modelagem e remodelagem do osso. (APPENZELLER, 1990;
LADZIESKY et al., 2000)
Com relação à simpatectomia do gânglio cervical cranial (GCC), Soinila e Eranko
(1983) afirmam que o GCC é um órgão simétrico permitindo-se submeter um dos gânglios a
experimento enquanto o contra lateral pode ser mantido como controle.
Em estudo estereológico da substância negra em humanos, o número total de neurônios
melanina-positivos e negativos foram estimados em 28 homens com idade entre 19 e 92 anos
por meio do emprego de "disector" óptico. Encontrou-se significativo decréscimo no número
total de neurônios melanina-positivos em função da idade, em contrapartida, considerou-se
um achado inesperado a verificação do aumento de tamanho dos neurônios contendo
melanina. Apesar de a literatura reportar a hipertrofia neuronal estando relacionada a um
efeito do envelhecimento, ligado a degeneração e necrose da própria célula, os autores não
descartam a possibilidade de a hipertrofia de algumas células nervosas estarem associados a
um mecanismo compensatório da perda neuronal adjacente, uma vez que o déficit-motor
comumente observado em idosos apresentar-se de natureza mais limitada em comparação
com a quantidade de tecido neuronal perdido (CABELLO et al., 2002).
Alterações associadas à região cervical podem desencadear disfunções simpáticas
generalizadas com a participação direta ou indireta do GCC em mamíferos humanos e não
humanos. A ganglionectomia do GCC é uma técnica cirúrgica capaz de mimetizar síndromes
na propositura de modelos para estudá-las.
Uma disfunção específica é a Síndrome de Horner representada por um grupo de sinais
clínicos resultante na alteração da inervação simpática do olho e estruturas adjacentes. Estes
sinais incluem anisocoria, enoftalmia e protrusão de terceira pálpebra, ptose e aumento da
temperatura da face como resultado da vasodilatação periférica. Há relatos desta síndrome em
Fioretto, E.T.
26
cães da raça Golden Retriever, entretanto os autores não confirmam haver uma maior
predisposição racial. Não obstante, encontram-se relatos da síndrome de Horner em humanos
causada por tumores benigno e maligno, representando 60% de casos. Outra condição
associada à esta síndrome são as hemorragias que impedem a provisão vascular ao GCC
(BELL et al., 2001; BOYDELL, 1995; SKARDA et al., 1985).
A espécie ovina foi contemplada neste projeto, pois sua criação no estado de São Paulo
tem apresentado amplo desenvolvimento na exploração agroindustrial havendo, portanto,
grande interesse no melhor entendimento do manejo produtivo e clínico dos animais. Apesar
dos inúmeros estudos realizados nesta espécie, não são encontrados artigos detalhados
descrevendo a inervação simpática de estruturas cefálicas. O GCC foi descrito em animais de
laboratório como uma estrutura com amplo sítio de inervação simpática na cabeça e
conhecido envolvimento no controle de vários órgãos. O conhecimento do número total de
neurônios, sua plasticidade e distribuição ao longo do órgão e sob condições de sobrecarga
metabólica proverão bases morfológicas para futuras pesquisas comparativas em
neuroanatomia, neurofisiologia, neuroendocrinologia, além de promover dados substanciais
para a neurologia clínica em animais de produção.
Portanto, este estudo visa estabelecer parâmetros macro e microestruturais do GCC na
espécie ovina, bem como estimar o tamanho e o número total de neurônios no GCC em
animais submetidos a sobrecarga funcional, determinada pela ganglionectomia unilateral, e
correlacioná-los aos achados neuroclínicos visando fornecer subsídios à Neurologia
Veterinária, especialmente no que tange ao diagnóstico e tratamento das simpatopatias como
a síndrome de Horner.
Fioretto, E.T.
27
Objetivos
Fioretto, E.T.
28
2 OBJETIVOS
Neste estudo, a simpatectomia unilateral do gânglio cervical cranial (GCC) avaliará
comparativamente possíveis alterações morfoquantitativas decorrentes da ganglionectomia
unilateral com conseqüente sobrecarga funcional do GCC remanescente, incluindo hipertrofia
neuronal e modificação no número total de neurônios ganglionares.
Sendo assim, os seguintes aspectos serão avaliados comparativamente entre gânglios
controle e tratados:
1) Morfologia geral de neurônios ganglionares.
2) Organização geral do tecido conjuntivo ganglionar.
3) Densidade neuronal.
4) Número total dos neurônios ganglionares.
5)Tamanho dos neurônios.
A clínica neurológica associada à simpatectomia será investigada visando:
6) O aparecimento de sintomas específicos relacionados à síndrome de Horner.
Fioretto, E.T.
29
Revisão de
Literatura
Fioretto, E.T.
30
3 REVISÃO DE LITERATURA
A literatura consultada para embasamento científico é discriminada nesta seção dividas
em capítulos pertinentes a cada item de relevância para a condução desta pesquisa.
3.1 LOCALIZACÃO E DISTRIBUICÃO
O sistema nervoso simpático de ruminantes é escassamente descrito em tratados de
anatomia veterinária quanto ao seu aspecto funcional. No intuito de prover informações para
a exposição e exame do sistema nervoso simpático cervical encontrou-se na literatura
pesquisa realizada sobre a abordagem cirúrgica lateral do GCC de ovinos utilizando-se nove
cordeiros castrados (2-3 meses) (APPLETON; WAITES, 1957).
Macroscopicamente, estudos anatômicos foram desenvolvidos em camelos no qual se
demonstrou o GCC como uma estrutura bem desenvolvida, com média de 15-20 mm em
comprimento, 4-6 mm em largura e 3 mm de espessura, situado na superfície rostrolateral do
músculo longo do pescoço, ventral ao músculo esterno-mastóideo e recoberto pela glândula
salivar mandibular. Os ramos nervosos do GCC incluíram o nervo carótico interno que se
dirigia em direção à bula timpânica formando o plexo carótico interno; o nervo carótico
externo consistindo em dois ramos que terminavam junto ao seio carótico e o outro ramo se
unia ao plexo carótico comum; e o nervo jugular, junto com algumas fibras que conectava o
gânglio ao glossofaríngeo, vago, hipoglosso e primeiro nervos cervicais (SHENG et al.,
1988).
Estudos em ratos, cães, felinos e eqüinos afirmaram que o GCC apresentava aparência
Fioretto, E.T.
31
fusiforme situado dorsal à bifurcação da artéria carótida. Foram observadas algumas fibras
nervosas deixando o gânglio e seguindo a artéria carótida interna e a artéria carótida externa
(CASTRO, 2001; DE ABREU, 2002; FIORETTO, 2002; HEDGER; WEBER, 1976).
O GCC situava-se profundamente à bula timpânica e nervos cranianos IX, X, XI e XII.
A maioria dos ramos ganglionares se ramifica ao deixar o GCC enviando ramos para as
artérias carótida externa e interna, para o gânglio vagal inferior, o nervo laríngeo superior e
para os nervos cervicais, além de prover os ramos cardíacos e tireóideos. Em humanos,
anormalidades simpáticas funcionais a partir de injúrias no nervo de laríngeo superior durante
cirurgia da tiróide foram descritas. Não obstante, uma complexa arborização é descrita em
humanos e está presente entre o gânglio cervical inferior do nervo vago e o GCC
(BRAUEUCKER, 1923; CANNIZZARO et al., 1991; FICK, 1926; HOFFMAN, 1957;
SIWE, 1931; STROMBERG, 1993; ZERILLI et al., 1994).
Historicamente o GCC tem sido objeto de estudo, pois é usado como modelo de
investigação de problemas neurobiológicos. Por meio da implantação de neurotraçadores em
ratos foram estudadas as características das fibras pós-ganglionares do GCC projetada às
glândulas submandibular, olhos e glândula pineal. Nas áreas medianas do gânglio os corpos
de neurônios que se projetavam à glândula submandibular eram maiores, os projetados ao
olho eram menores e à glândula pineal tinham tamanho intermediário. Os neurônios que se
projetavam à glândula submandibular foram achados ao longo do gânglio, enquanto foram
localizadas populações que se projetavam ao olho e pineal apenas nos quadrantes rostrais
(LUEBKE; WRIGHT, 1992).
Quanto ao território de inervação foi referido que o gânglio cervical cranial provê
inervação a pineal por meio do nervo carótico interno, e para a tiróide e paratireóide pelo
nervo carótico externo. Após ganglionectomia cervical superior acompanhou-se depressão de
LH, FSH, TSH, GH e aumento em ATCH e prolactina. Os autores afirmaram que o GCC por
meio dos nervos caróticos age como caminho paralelo de comunicação do cérebro com o
Fioretto, E.T.
32
sistema endócrino (CARDINALI; STERN, 1994; KENNY, 1961).
A artéria tireóidea superior foi suprida por ramos provindos do GCC, enquanto a
glândula tireóidea foi inervada por um ramo distinto do nervo laríngeo externo, assim sendo,
encontram-se muitos relatos do risco de dano nervoso durante o tratamento cirúrgico para
carcinoma da tiróide e durante linfadenectomia cervical, particularmente na inervação da
laringe (JONES et al., 1994; SUGENOYA et al., 1993). Outro exemplo da complexidade do
território de inervação do GCC foi descrito entre o mesmo e o nervo vago sendo um exemplo
raro de comunicação presente em 113 cadáveres de indivíduos adultos da raça japonesa
(SATO; SATO; 1997).
Fioretto, E.T.
33
3.2 MICROESTRUTURA E ULTRAESTRUTURA
Por meio de estudos realizados em microscopia de luz em diversas espécies como em
caninos, felinos e eqüinos, descreveu-se que o gânglio cervical cranial (GCC) é composto em
seu interior por agrupamentos de corpos de neurônios, delimitados por septos de tecido
conjuntivo emitidos pela cápsula ganglionar, caracterizando-o como um complexo ganglionar
arranjado em "lojas". No interior do GCC ainda relatou-se a presença de outras células, tais
como as células intensamente fluorescentes (SIF) ou células contendo grânulos, células de
Schwann, fibroblastos, alguns mastócitos e estruturas como fibras mielínicas e amielínicas
(CASTRO, 2001; DE ABREU, 2002; FIORETTO, 2002).
As células contendo grânulos presentes no GCC foram examinadas à microscopia de
luz e eletrônica. Descreveram-se estas células distribuídas espaçadamente, em agrupamentos
pequenos de cerca de 2-5 células envoltos por células satélites e de disposição pericapilar.
Evidências sugeriram que estas células continham catecolaminas, provavelmente
noradrenalina ou análogos a dopamina. As células contendo grânulos podiam ser
classificadas como inter-neurônios que recebiam impulsos das fibras pré-ganglionares e
transmitiam aos pequenos nervos ao longo do gânglio (WILLIAMS; PALEY, 1969).
Baseado nos critérios morfológicos estabelecidos para sinapses, as células SIF foram
consideradas como pós-sinápticas em sinapses do tipo 1 e pré-sináptica em sinapses do tipo
2, correspondendo-se a sinapses aferente e eferente, respectivamente (MATTHEWS;
RAISMAN, 1969; PAPPAS; WAXMAN, 1972; SIEGRIST et al., 1968; e YOKOTA, 1973).
Experimentos realizados no GCC revelaram a predominância de sinapses do tipo 2
entre axônios e células SIF, sendo apenas algumas observações discriminadas entre dendritos
e células SIF. Sinapses do tipo 1 ocorreram em um número pequeno de axônios que também
Fioretto, E.T.
34
continham sinapses do tipo 2. Assim, alguns segmentos de um axônio eram pré-sinápticos às
células SIF e outros segmentos eram pós-sinápticos. Como um único axônio formou
predominantemente sinapses tipo 2 com muitas células SIF nos GCC e nodoso afirmou-se
que a direção principal de transmissão foi das células SIF em direção aos axônios (KONDO,
1977).
Duas possíveis explicações foram tomadas para a origem dos axônios reconstruídos no
GCC. Uma de origem extra ganglionar advindas dos axônios no tronco simpático cervical
que alcançaram o gânglio. Outra de origem intra-ganglionar provindas de axônios colaterais
recorrentes de células ganglionares. A separação do tronco pré-ganglionar resultou em
degeneração da maioria dos perfis neuronais justapostos às células SIF (MATTHEWS;
OSTBERG, 1973). Então, seria possível que estes axônios originavam-se dos presentes no
tronco pré-ganglionar. Isto sugeriu que alguns axônios no tronco podem conduzir impulsos
sensitivos das células SIF. Uma interpretação semelhante tinha sido apresentada após
resultados obtidos em estudos fisiológicos (RIKER; SZRENIAWSKI, 1959; VOLLE;
KOELLE, 1961).
Experimentos demonstraram que gânglios simpáticos continham dois derivados
adrenérgicos da crista neural: neurônios principais e pequenas células intensamente
fluorescentes (SIF). Os mecanismos de desenvolvimento responsável para a geração destas
duas células in vivo não foram bem determinados. O possível desenvolvimento e relações de
linhagem diferenciando neurônios principais e células SIF foram investigadas sob
microscopia de luz, empregando-se técnicas de fluorescência por meio de anticorpos contra
tirosina hidroxilase (TH) e histofluorescência à catecolamina, a investigação combinou ainda
exames ultraestruturais do GCC em período embrionário e pós-natal. Quase todas as células
intensamente fluorescentes observadas foram encontradas justapostas à capilares dentro do
gânglio. Estas células embrionárias intensamente fluorescentes foram maiores do que as
células SIF observadas no pós-natal. Exame ultraestrutural dos gânglios em desenvolvimento
Fioretto, E.T.
35
confirmou que as células contendo numerosas e grandes vesículas denso-coradas (LDCVS)
era uma característica proeminente dos gânglios que também continham células intensamente
fluorescentes. Além disso, algumas células embrionárias que contêm LDCVS eram mitóticas.
Subseqüentemente, células similares às células SIF maduras localizavam-se próximo a vasos
sanguíneos onde podiam receber outros sinais como glicocorticóides. Este esquema sugeriu
ser a diferenciação de neurônios principais e células SIF regulada independentemente, e que a
habilidade de células SIF para converter-se em neurônios principais observada in vitro pode
não responder pela geração de neurônios in vivo (HALL; LANDIS, 1991).
Fioretto, E.T.
36
3.3 REMOCÃO EXPERIMENTAL DE GÂNGLIOS SIMPÁTICOS
(GANGLIONECTOMIA E SUAS ALTERAÇÕES)
As técnicas da ganglionectomia unilateral ou bilateral do GCC (gânglio cervical
cranial) são aplicadas, em sua maior parte em animais de laboratório, para estudos da atuação
do controle do sistema nervosos autônomo sobre os órgãos alvo ou para avaliar o
comportamento do próprio gânglio contralateral remanescente.
A ganglionectomia unilateral do GCC e técnica de "sham operation" foram realizadas
em ratos no intuito de se avaliar os efeitos da divisão pré-ganglionar do nervo sobre o peso do
gânglio, sobre o volume, o número e a densidade celular de neurônios principais e células não
neuronais. A divisão pré-ganglionar unilateral do nervo causou, no lado esquerdo operado;
uma perda significante de peso e volume do gânglio devido à diminuição no número de
células não neuronais, enquanto nenhuma mudança significativa aconteceu no gânglio intacto
direito. A ganglionectomia unilateral esquerda causou aumento significativo no peso, no
número e densidade das células não neuronais no gânglio contralateral, porém o número e a
densidade das células de neurônios principais e as células intensamente fluorescentes não
eram afetadas pela operação. Os achados sugeriram que o desenvolvimento normal das
células satélites ganglionares requer a presença normal da inervação. Além disso, a
ganglionectomia unilateral induziu maior proliferação de células satélite contralateralmente,
possivelmente causando aumento na atividade do gânglio contralateral (SOINILA;
ERÀNKO, 1983).
Apesar dos numerosos estudos em várias espécies, o papel fisiológico dos nervos
simpáticos na acomodação e dinâmica do humor aquoso em primatas permanece obscuro. A
ganglionectomia unilateral do gânglio cervical cranial no macaco induziu parcial, mas não
Fioretto, E.T.
37
completa denervação simpática ocular avaliada por meio de microscopia eletrônica, imuno-
histoquímica (tirosina hidroxilase) e reações de fluorescência a catecolamina. Com base em
critérios clínicos, farmacológicos, e morfológicos a ganglionectomia diminuiu, mas não
eliminou uniformemente a inervação pós-ganglionar simpática do olho. Provavelmente
alguns neurônios do GCC permaneceram no coto proximal do tronco simpático, ou o olho de
macaco "cynomolgus" recebe inervação simpática adicional do contralateral, ou a porção
anterior do olho do macaco "cynomolgus" recebe inervação simpática adicional de fontes
diferentes do gânglio cervical superior (HUBBARD et al., 1999; ROBINSON; KAUFMAN,
1992; TAMM et al., 1997).
Estudos prévios indicaram que a simpatectomia regional do GCC conduziu à alterações
qualitativas relacionadas à absorção óssea. Após a ganglionectomia unilateral, o peso da
mandíbula ipsilateral aumentou, e sua densidade mineral diminuiu. Este efeito foi
presumivelmente dependente da privação crônica de neurotransmissores adrenérgicos em
nível local. Resumindo, a modelação e remodelação óssea são processos altamente regulados
no esqueleto de mamíferos. A perda do controle deste processo pode conduzir a várias
doenças ósseas (por exemplo, osteogênese imperfeita). Um possível mecanismo para tal
controle delicado estaria relacionado à inervação simpática presente em todo periósteo
(LADZIESKY et al., 2000).
O homotransplante do gânglio pélvico para a parede da bexiga foi realizado em ratos
adultos a fim de investigar a capacidade regenerativa dos neurônios autônomos periféricos
numa eventual perda neuronal buscando testar a habilidade de crescimento dos axônios em
nervos diferentes ou de formar novas sinapses com neurônios diferentes. O gânglio pélvico
direito transplantado para a bexiga foi avaliado com dois dias, uma semana, cinco semanas,
sete semanas, dois meses e quatro meses após a cirurgia. Observou-se que o homotransplante
dos neurônios pélvicos para a bexiga obteve alta taxa de sucesso, em termos de sobrevivência
manutenção da estrutura, crescimento, re-conexão, transmissão neural além de exibirem
Fioretto, E.T.
38
habilidades regenerativas (GABELLA; UVELLIUS, 1998).
Paresia óculo-simpática ou síndrome de Horner é o resultado de qualquer lesão que
interrompa a neurotransmissão do hipotálamo para o olho. A síndrome consiste em miose,
ptose, enoftalmia aparente, anidrose, e dilatação vascular ipsilateral à lesão. A inervação
simpática do olho consiste num sistema tri-ordenado. O neurônio de primeira-ordem
originado nos núcleos póstero-lateral do hipotálamo. As fibras de segunda-ordem saem da
coluna pelas raízes ventrais de C8, TI, e T2 e ascendem no tronco simpático. O curso das
fibras segue pelos primeiro gânglio torácico e cervical inferior que freqüentemente
apresentam-se fundidos formando o gânglio estrelado. Os neurônios de segunda-ordem
continuam pela alça subclávia, e terminam no GCC. Os neurônios de terceira-ordem saem do
GCC e ascendem ao longo do curso das artérias carótida interna e externa. Ramos oftálmicos
entram na fissura orbital superior e inervam o músculo elevador da pálpebra superior e o
músculo dilatador da pupila (GHAFIR, Y.; ART, T.; LEKEUX, P. 1996; KISCH, 1951).
Entre as possíveis etiologias de síndrome de Horner em pacientes humanos estão os
tumores malignos (câncer broncogênico, linfoma de Hodkin, câncer de tiróide, sarcoma,
metástases); tumores benignos (Schwannoma, tumor de corpo carotídeo, adenoma de tiróide);
vascular (cefaléia, enxaqueca, arterite, dissecação da artéria carótida); infeccioso (Doença de
Lyme, herpes); traumático (danos por objetos penetrantes no pescoço, deslocamento da
coluna cervical, trauma ao nascimento); iatrogênico (tubo de toracotomia, acesso venoso
central, tireoidectomia e angiografia da artéria carótida). Com a exceção de "bypass" da
artéria coronária e procedimentos que envolvam o rompimento intencional do gânglio
estrelado, a síndrome de Homer é uma complicação rara secundária ao tratamento cirúrgico.
A diversidade de resultados físicos, embora patognomônicos, pode estar clinicamente oculto
e a persistência da paresia óculo-simpática poderia ser variável, não obstante, declarou-se que
se faz necessário à observação de danos de inervação simpática seguidos de disfunções do
pescoço (BELL et al., 2001).
Fioretto, E.T.
39
3.4 ESTUDOS MORFOMÉTRICO E ESTEREOLÓGICO
A estimativa do número de neurônios no GCC de ratos foi calculada e processada pelos
métodos de correção de Abercrombie (1946) indicando estabilidade da população neuronal
no primeiro mês (neonatal) em cerca de 35000 neurônios e de correção de Hendry (1976)
demonstrando aumentos de menos de 20000 à 45000 neurônios na primeira semana mantidos
até o fim do estudo. Prévios estudos histoquímicos indicaram que havia pequena ou nenhuma
degeneração celular durante o 1° mês de vida (DAVIES, 1978).
Neurônios e células da glia do GCC de ovinos foram estudados morfometricamente à
microscopia de luz e eletrônica. Foram utilizados dois carneiros com cerca de 40 kg e
constatou-se que a área do corpo celular variava entre 165 a 2500 µm2 com diâmetro
correspondente de 14-56 µm e volume celular de 1600 a 93000 um3. A distribuição do
tamanho das células apresentou-se de modo uniforme com predominância de células
pequenas, não havendo variações nas diferentes porções do gânglio (GABELLA et al., 1988).
O número total de neurônios e células da glia em pacientes esquizofrênicos e controle
foram estimados com o emprego de técnicas estereológicas aleatórias e não seletivas
("unbiased"): "disector" e "fractionator". Neste estudo, os autores demonstram que as técnicas
estereológicas empregadas podem estimar de maneira correta o número de partículas de
interesse rapidamente e de forma mais acurada em contradição às técnicas seletivas
("biased") aplicadas até àquele momento e descritas na literatura (PAKKENBERG;
GUNDERSEN, 1988).
O uso de contagem por meio da técnica estereológica do "fractionator" foi efetuado
para a estimativa do número de células de Purkinje a partir do peso cerebelar. Reportou-se
que para a obtenção da estimativa do número total de células de Purkinje ou qualquer outra
Fioretto, E.T.
40
célula dever-se-ia empregar uma amostragem tridimensional, ou seja, pela verificação
volumétrica. A literatura define que não é possível efetivar-se uma amostragem apenas no
plano bidimensional sem haver a interferência ou seletividade ("bias") de alguns parâmetros
como tamanho da partícula, forma, orientação no espaço, efeitos do corte e distorções de
processamento (CRUZ-ORIVE, 1987; GUNDERSEN, 1986; MAYHEW, 1991b). A maior
eficiência nos métodos de pares paralelos de cortes ("disector", "fractionator") já havia sido
previamente discutida, pois são métodos independentes de qualquer tipo de seletividade de
parâmetros ("bias") quanto a forma, tamanho e, ou distribuição das partículas (STERIO,
1984; GUNDERSEN, 1986; MAYHEW, 1991b). A relação do número total de neurônios em
função do peso cerebelar fora obtido por meio aplicação da fórmula de regressão linear
determinada pela equação N= 68600W
0,695
, pela qual pode-se determinar o número total de
células de Purkinje em outras espécies conhecendo-se o peso cerebelar, entretanto o autor
afirma a necessidade de reaplicação do método em outras espécies (MAYHEW, 1991a).
A hipertrofia neuronal no gânglio pélvico de ratos foi estudada quantitativamente com
base em 250 a 400 secções consecutivas com 1 µm de espessura. As secções foram
fotografadas e o perfil neuronal foi mensurado. O volume neuronal aumentou em média 83%,
os neurônios menores diminuíram e os maiores aumentaram (GABELLA et al., 1992).
Estudos morfométricos avaliaram os efeitos da descentralização ou da ganglionectomia
contralateral na hipertrofia do gânglio pélvico induzida por obstrução da bexiga urinária de
ratos. O volume dos neurônios foi estimado presumindo-se que os neurônios apresentavam
forma esférica. Os resultados revelaram que a ganglionectomia em si não induziu hipertrofia
na bexiga, com havia sido reportado por Gabella et al. (1992). A ganglionectomia do gânglio
pélvico foi seguida de redução da inervação da bexiga de aproximadamente de 75%
ipsilateral e 25% contralateral. Não foram observadas evidencias de células nervosas em
divisão ou degeneração e observou-se mitose de células da glia (GABELLA; UVELLIUS,
1993).
Fioretto, E.T.
41
No estudo do homotransplante do gânglio pélvico para a parede da bexiga em ratos
adultos, analisaram-se os resultados no segundo dia, uma semana, três semanas, cinco
semanas e quatro meses de pós-operatório. Em dois dias havia presença de neurônios
distendidos com perfil nuclear medindo em tomo de 466 um2 e em três semanas perfis de
327 µm2. Ultraestruturalmente, os neurônios apresentavam-se idênticos ao grupo controle.
Uma semana após a cirurgia, os neurônios não estavam mais distendidos e a maioria tinha
similaridade em tamanho ao grupo controle, porém um pequeno grupo de neurônios
demonstrava sinais avançados de degeneração. Em geral, a arquitetura original do gânglio
manteve-se preservada com dois a quatro meses após a cirurgia e o neurópilo foi composto
por inúmeros axônios pequenos com aproximadamente 0,3 a 0,9 µm de diâmetro. Alterações
de regressão de alguns neurônios na porção mais profunda do gânglio foram observadas nos
primeiros dias, entretanto, estes mesmos sinais de degeneração tomavam-se raros ao longo do
desenvolvimento. O experimento demonstrou sucesso quanto à sobrevivência neuronal, a re-
vascularização do gânglio e a manutenção da estrutura neuronal (GABELLA; UVELLIUS,
1998).
Em extenso trabalho de revisão sobre as técnicas estereológicas uniformemente
aleatórias aplicadas à quantificação de neurônios do gânglio da raiz dorsal e estudo de
tamanho e sobrevivência celular definiram que a estimativa do número de células baseia-se
centralmente no princípio do "disector" (STERIO, 1984) sendo óptico ou físico e para a
amostragem do material pode-se utilizar o método "fractionator". O autor afirma que até o
momento, nenhum estudo foi capaz de demonstrar diferenças antiméricas quanto à
quantificação do número de neurônios do gânglio dorsal. A escolha de um antímero como
controle de seu contralateral é possível, visto ser a variação antimérica menor que a variação
entre animais (TANDRUP, 2004).
A estimativa do número total de neurônios do GCS foi reportada em três espécies: o
rato, a capivara e o cavalo. Os resultados obtidos usando o princípio do "disector" físico
Fioretto, E.T.
42
associado ao método de Cavalieri, demonstrou 18.800, 1.520,000 e 3.390.000 neurônios no
GCS de ratos, capivaras e eqüinos, respectivamente (RIBEIRO et al., 2004).
Fioretto, E.T.
43
Materiais e Métodos
Fioretto, E.T.
44
4 MATERIAL E MÉTODOS
O material utilizado e os métodos empregados nesta investigação são descritos neste
capítulo.
4.1 MATERIAIS
Nove ovinos, machos com 4 meses de idade e peso médio de 15 kg da raça Santa Inês e
obtidos junto ao plantel particular em associação ao Departamento de Cirurgia e
Anestesiologia da Univesidade Estadual Paulista, campus Botucatu, foram utilizados neste
estudo.
Estes animais foram divididos em três grupos distintos em relação ao tempo de
avaliação: Grupo I - 3 animais - duas semanas após o procedimento cirúrgico; Grupo II - 3
animais - sete semanas após o procedimento cirúrgico e Grupo III - 3 animais - doze semanas
após o procedimento cirúrgico.
Fioretto, E.T.
45
4.2 MÉTODOS
Os métodos empregados nesta investigação são descritos em itens separados para
melhor compreensão das etapas efetuadas em cada fase pertinente da pesquisa.
4.2.1. Anatomia Macroscópica
O estudo macroscópico está descrito em itens separados visando um melhor
entendimento da pesquisa.
4.2.1.1 Estudo piloto
O estudo piloto foi realizado empregando-se 4 animais, 4 meses de idade, com peso
variando de 14 kg a 17 kg (peso médio 15,5 kg) visando a padronização da técnica cirúrgica,
anestésica e pós-operatória. Uma vez determinada a melhor abordagem cirúrgica e as terapias
adotou-se como padrão em todos os grupos subseqüentes.
Fioretto, E.T.
46
4.2.1.2 Técnica Operatória
Em um primeiro momento, os animais foram submetidos a procedimento anestésico
para a coleta do gânglio cervical cranial (GCC) esquerdo (ganglionectomia unilateral) que
serviu como controle. Depois de duas (grupo I), sete (grupo II) ou doze semanas (grupo III)
após este primeiro procedimento, os animais foram eutanasiados para a coleta do gânglio
contralateral remanescente que foi identificado nos resultados como gânglio operado.
Como medicação pré-anestésica utilizou-se associação de Acepromazina 0,2% (0,1
mg/kg) e Tartarato de butorfanol 1% (0,3 mg/kg) aplicados via intramuscular. Aguardado o
tempo de relaxamento do animal procedemos à administração intravenosa de Hidrocloridrato
de ketamina l0% e diazepan 0,5% associadas na proporção 1:1 perfazendo dose 0,15 ml/kg
como medicação de indução anestésica. O animal foi entubado, com sonda endotraqueal e a
manutenção anestésica promovida com a utilização de Halotano e ventilação assistida.
A abordagem da região cervical foi promovida por cuidadosa dissecação cirúrgica. Para
o estudo macroscópico, optou-se pelo acesso ventro-lateral, sendo a incisão realizada na pele
desde o 1/3 proximal do ramo da mandíbula até a base da orelha externa.
Depois da incisão da pele, seguiu-se a divulsão do tecido subcutâneo, expondo o
músculo platisma. Em um plano médio de dissecação identificou-se a veia jugular externa,
tecido adiposo e glândula parótida. No plano profundo de dissecação, após o afastamento da
veia jugular externa, foi possível identificar a bainha carotídea. Acompanhando-se a bainha
carotídea em direção a porção proximal do pescoço, próximo à base da orelha, identificou-se
o músculo júgulo-hióide e porção final do osso epihióide que recobriam a bainha carotídea.
Promoveu-se então a incisão do músculo e afastamento do osso epihióide, revelando-se o
gânglio cervical cranial (GCC). Após a coleta, os gânglios foram medidos com base em seu
Fioretto, E.T.
47
eixo longo (comprimento), eixo curto (largura) e eixo de profundidade (espessura) usando-se
um paquímetro eletrônico digital (Digimess®).
A recuperação clínica e o período pós-operatório foram conduzidos por meio de
aplicação de medicação antibiótica, Ampicilina Benzatina 500mg - 20mg/kg - IM por 5 dias,
antiinflamatória Fluxinin meglumine (Banamine®) - 0,5mg/kg por 3 dias e analgésica
utilizando-se de Dipirona sódica (Vetalgin®) - 5ml - IM por 3 dias. Os animais foram
mantidos em baias para o acompanhamento da evolução dos sinais clínicos.
4.2.2 Estudo clínico
Os seguintes sinais clínicos forma avaliados, temperatura da face, temperatura de
orelha, ocorrência de ptose e miose. Quando algum destes sinais clínicos esteve alterado, foi
então avaliada a sua intensidade por meio de "+" (cruzes) e o símbolo "N" foi utilizado para
representar o estado normal do animal. A sudorese do plano nasal foi representada por "P"
quando presente e pelo sinal "-" (negativo) quando ausente.
A avaliação da ptose foi documentada em um animal por meio da colocação, em
programa de computador Photoshop CS®, de duas barras amarelas sobre os olhos direito e
esquerdo estendendo-se do ponto mais côncavo da conjuntiva pálpebra inferior para a
superior. A miose foi avaliada de modo visual em todos os animais. A documentação
fotográfica deste resultado clínico foi realizada em ambiente com baixa luminosidade, uma
vez que a diferença torna-se pouco perceptível quando o diâmetro pupilar é avaliado em
ambiente com luminosidade normal, devido à interferência do reflexo pupilar em resposta a
luz ambiente tornando a diferença no tamanho pupilar quase imperceptível.
Para a padronização da nomenclatura anatômica das estruturas anatômicas descritivas
empregou-se, sempre que possível, os termos preconizados pelo International Committe On
Fioretto, E.T.
48
Veterinary Gross Anatomical Nomenclature (2005) por meio da Nômina Anatômica,
Histológica e Embriológica Veterinária.
Fioretto, E.T.
49
4.2.3 Microscopia de luz de cortes semi-finos
Foram feitos dois procedimentos distintos no que tange à fixação dos gânglios dos
animais em função do ato cirúrgico e suas peculiaridades.
Os gânglios coletados no momento cirúrgico (ganglionectomia) foram fixados por meio
de imersão em solução de glutaraldeído 5% e formoldeído 1% (solução de Karnovsky
modificada) em solução tampão cacodilato de sódio (pH 7,4) (0,125M). Os gânglios
coletados após a eutanásia do animal foram submetidos à lavagem dos circuitos arterial e
venoso com solução específica de lavagem (solução de tampão fosfato salina e heparina a
1%) e perfundidos com solução de Karnovsky modificado à temperatura de 15ºC utilizando-
se a artéria carótida comum direita. Depois de retirados do animal, estes gânglios
permaneceram imersos na mesma solução fixadora.
Para o processamento histológico, o material foi lavado em solução tampão cacodilato
de sódio. Os segmentos foram acondicionados em frascos escuros, protegidos da luz e pós-
fixados com solução de tetróxido de ósmio 2% (Sigma®) por 90 minutos à temperatura
ambiente. O material sofreu segunda lavagem em tampão cacodilato de sódio e água
destilada por três vezes durante um tempo máximo de trinta minutos e foi contrastado com
solução aquosa saturada de acetato de uranila (Reagen®) por 90 minutos à temperatura
ambiente ao abrigo da luz.
A desidratação do material foi realizada em série crescente de etanóis (50%, 70%, 80%,
90%, 95% durante dez minutos cada) e duas trocas em álcool absoluto durante 10 minutos
cada. Na etapa final da desidratação, os espécimes foram imersos em óxido de propileno
(Aldrich®) (duas etapas de cinco minutos cada) e então embebidos em solução de óxido de
propileno e Resina Araldite 502 (Polyscience Inc®), na proporção 9:1, e mantido sobre
Fioretto, E.T.
50
agitação constante por 10 minutos. O material foi então colocado em óxido de propileno e
resina araldite (1:1) por 1 hora sob agitação constante, seguindo-se a troca de concentração de
óxido propileno e resina araldite na proporção (1:9) mantidos sob mesma condição por 12
horas e resina araldite pura por 8 horas. A seguir, o material foi colocado em nova solução
pura de Araldite por 12 horas e finalmente em nova resina pura por 2 a 3 dias em estufa (60°
a 70°C).
Depois da trimagem do bloco, o material foi cortado usando o ultramicrótromo Leica®
Ultracut UCT, com navalha de vidro para a microscopia de luz (2 µm) (cortes semi-finos). Os
cortes foram secos em placa térmica (Leica®) e corados com solução de azul de toluidina
alcoólica 1 %. A montagem das lâminas foi feita com a aplicação de camada fina de resina
araldite sob lamínula.
Fioretto, E.T.
51
4.2.4 Estudo estereológico
Os métodos quantitativos empregados no estudo estereológico são descritos a seguir.
4.2.4.1 Estimativa do número total de neurônios ganglionares obtida pelo método
"Physical Fractionator"
O embasamento teórico no que tange ao método do "Physical Fractionator" pode ser
depreendido a partir de Coggeshall e Lekan (1996), Gundersen et al., (1988); Howard e Reed
(2004), Mayhew (1988), Mayhew (1991b), e Mayhew e Gundersen (1996).
Para o grupo I, os gânglios foram cortados transversalmente formando uma série de
fragmentos que foram considerados sistematicamente, uniforme e aleatoriamente a uma
fração (f1=1/2) entre eles. O primeiro fragmento foi seccionado ortogonalmente fornecendo
assim um número de fragmentos menores que foram novamente escolhidos sistematicamente
examinando-se uma fração determinada (f2=1/2). Os fragmentos selecionados foram
seccionados mais uma vez seguindo-se a mesma regra utilizada e novos fragmentos menores
foram obtidos e selecionados a uma fração (f3=1/3). Devido ao extenso número de blocos
embebidos obtidos, estabeleceu-se um fracionamento f4 igual a 1/2 e o primeiro bloco foi
escolhido aleatoriamente entre 1 e 2. Posteriormente estabeleceu-se uma quinta fração f5
igual a 1/150 selecionada para a contagem via “fractionator”.
Para o grupo II aplicou-se os fracionamentos acima descrito, sendo que posteriormente
à fração f5, numerosas lâminas foram obtidas e uma fração f6 igual a 1/2 foi empregada para
selecionar as lâminas que participariam da amostragem. Para o grupo III aplicou-se os
Fioretto, E.T.
52
fracionamentos f1, f2, f3 e f4 descritos para o grupo I.
O procedimento do "physical fractionator" implica na contagem dos perfis neuronais
(Q
-
) (transects), o qual foi obtido por meio da aplicação do método do disector físico
(STERlO, 1984) A fórmula do "fractionator" empregada foi:
N = Q x f1 x f2 x f3 x f4
N = número total de neurônios ganglionares
Q
-
= número total de perfis neuronais contados
f = fracionamentos considerados no esquema de amostragem
(f1, f2, f3 e f4)
Fioretto, E.T.
53
4.2.4.2 Estimativa da densidade numérica (Nv) pelo método do "Two way physical
Disector"
Para um suporte metodológico vide Howard e Reed (2004), Mayhew e Gundeersen
(1996), Pakkenberg e Gundersen (1988), Pover e Coggeshall (1991).
Para a quantificação dos perfis neuronais, os blocos de material pré-selecionados foram
cortados seriadamente com dois micrômetros e foram coletados um total de 30 (trinta) cortes
que foram a seguir montados em lâminas cobertas com lamínula. A seguir, escolheu-se um
intervalo k = 250 que determina a distância entre as "reference-section" e a escolha da
primeira "reference-section" foi determinada sistemática e aleatoriamente entre 1-250.
Duas secções idênticas - "reference” e “look up", separadas 12 µm entre si foram
analisadas por meio de uma área pré-determinada por um sistema-teste colocado sobre a tela
de um computador. O sistema teste adotado para o gânglio controle contava com seis
quadros com 4979,68 µm
2
cada, enquanto, o sistema teste aplicado para o gânglio tratado
contava com oito quadros com mesmo tamanho. O sistema teste adotado em ambos os casos
era sobreposto a imagem capturada pelo software de análise de imagem Leica QWin (Leica
Microsystem Imaging Solution Ltd, Cambridge, UK)., na tela de um computador.
Nas duas secções analisadas, foram identificados os mesmos neurônios ganglionares e,
considerando-se apenas uma das secções, no caso a "reference section" foram contados os
neurônios (Q
-
) que estavam presentes na mesma e não apareciam na outra secção analisada
(Q-). Para um exemplo numérico, determinou-se aleatoriamente, segundo tabela de números
aleatórios, que a secção de número 17 seria considerada como a primeira "reference-section"
do primeiro "disector", sendo a sua "look up" a secção 23 (destaca-se que a distância entre a
"reference-section" e a sua "look-up section" era de 12 µm). Como encremento empregou-se
Fioretto, E.T.
54
o método "two-way disector", sendo agora a secção 23 considerada como a "reference
section" e a 17 como a "look-up". O próximo "disector" a ser considerado foi o 267-273,
aplicando-se o intervalo k de maneira sistemática e uniforme até o término do bloco. O
número de “disectors” aplicados nos gânglios controle e operados e seus respectivos números
de perfis neuronais (Q
-
) encontrados para cada animal são descritos na tabela 1.
Tabela 1 – Representação do número de “disectors” e numero total de perfis neuronais
encontrados em cada animal de cada grupo – São Paulo, 2006
O método do "disector" forneceu a densidade numérica que é a razão entre o número total de
partículas, em nosso caso, neurônios do GCC, e o volume referencia total e foi determinada
pela formula:
O coeficiente de erro empregado para o número total de neurônios foi estimado pela
seguinte fórmula: CE = 1/√∑Q- e o coeficiente de variação intra-grupo foi expresso pela
fórmula CV = Desvio padrão / média. A precisão das estimativas em cada animal é indicada
pelo coeficiente do erro (CE).
Grupo
I II III
Animais 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Disectors
272 240 304 224 144 128 132 252 216
Gânglio
Controle
Q
-
126 115 109 68 37 37 50 72 100
Disectors
252 240 168 132 96 96 320 384 320
Gânglio
Operado
Q
-
161 149 110 70 41 43 49 71 82
Nv = _________
Σ
Q
-
Σ
t x a
Q
-
-
quantidade de perfis (transects)
t
–
altura do “disector”
a
–
área teste utilizada
t x a
–
volume de cada “disector”
Fioretto, E.T.
55
4.2.4.3 Estimativa global do volume neuronal
A estimativa global do volume de cada neurônio foi obtida pelo n
Princípio de Cavalieri (RIBEIRO, et al., 2004). A somatória das áreas seccionas do perfil
neuronal foi multiplicado pela espessura média do corte histológico, ou seja, 2 µm
empregando-se a fórmula V = T x ∑A, onde V = volume, T = distancia entre as secções e
∑A = somatória das áreas seccionais. O coeficiente de erro (CE) para a estimativa do volume
neuronal, foi obtido empregando-se a seguinte fórmula: {(1 / ∑ A) x [1/12 x (3A - 4B + C)]}
e o coeficiente de variação intra-grupo foi expresso pela fórmula CV = Desvio padrão /
média. A precisão de estimativas individuais é indicada pelo coeficiente do erro (CE).
Fioretto, E.T.
56
4.2.5 Estudo Morfométrico (Tamanho dos neurônios ganglionares)
O estudo morfométrico está apresentado em itens como se segue.
4.2.5.1 Área Seccional do corpo celular e núcleo neuronal
As secções seriadas, cada uma com espessura de 2 µm (micrômetros) obtidas para a
aplicação dos métodos estereológicos foram igualmente consideradas para a morfometria.
Adotou-se como início a mesma secção de referência utilizada para o disector, ou seja, a
secção 17, assim aplicou-se um plano de exclusão tridimensional superior de 2 cortes, no
intuito de aumentar a eficiência da amostragem. Deste modo considerou-se o corte 19 para o
início dos trabalhos morfométricos. A mesma área teste aplicada anteriormente no método do
"two-way disector" em cada gânglio foi reaplicada neste nível a fim de se obter os perfis
neuronais que seriam considerados e outros que seriam descartados, respeitando-se as regras
de inclusão e exclusão.
Os seguintes parâmetros foram analisados em cada neurônio ganglionar: áreas
seccional neuronal e nuclear. Para esta finalidade utilizamos o software de processamento e
análise de imagem Leica
®
QWin (Leica Microsystem Imaging Solution Ltd, Cambridge,
UK).
Fioretto, E.T.
57
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os parâmetros morfoquantitativos, morfométricos (área seccional do corpo celular e do
núcleo) e estereológicos (volume neuronal, densidade neuronal e número total de neurônios
foram analisados por meio do teste de F (ANOVA “two way cross-classification”). No caso
de valores significativos estes foram submetidos ao teste t de Student (SAS, 2005).
Fioretto, E.T.
58
Resultados
Fioretto, E.T.
59
5 RESULTADOS
Os resultados encontrados nesta pesquisa são discorridos em tópicos.
5.1. ANATOMIA MACROSCÓPICA E TECNICA CIRÚRGICA
Nos nove animais submetidos à ganglionectomia unilateral do gânglio cervical cranial
(FIGURA 1), este localizava-se na região mais proximal do pescoço, ventralmente ao nervo
vago e a artéria carótida interna. Dados referentes à macromorfometria do GCC controle e
operado são descritos na Tabela 2.
Fioretto, E.T.
60
Figura 1 – Fotomacrografias seqüenciais representando as etapas da ganglionectomia
unilateral esquerda do GCC (gânglio cervical cranial) de um ovino. Em A
observa-se o posicionamento da cabeça do animal. Em B visualiza-se a incisão
ventrolateral. Em C observamos o osso epihióide (seta branca). Em D
representa-se o momento de extração do GCC (seta cheia)
Tabela 2 – Representação dos dados macromorfométricos do GCC obtidos durante o ato
cirúrgico e eutanásia, São Paulo – 2006
Gânglio Esquerdo
(Controle)
Gânglio Direito
(Tratado)
Grupo Animal
Comprimento
(mm)
Largura
(mm)
Espessura
(mm)
Comprimento
(mm)
Largura
(mm)
Espessura
(mm)
1
5,57 3,20 2,60 8,58 4,34 2,92
2
6,10 4,21 2,69 7,69 4,22 2,92
GI
3
7,07 4,48 2,39 7,32 3,53 2,42
4
7,11 4,42 3,42 7,41 4,51 3,52
5
7,02 4,27 3,12 7,35 4,73 3,44
GII
6
7,08 4,36 3,36 7,41 4,48 3,48
7
7,94 5,71 3,85 8,60 6,08 4,09
8
7,13 4,11 3,09 7,67 4,40 3,58
GIII
9
7,09 4,36 2,86 7,87 4,23 3,28
Fioretto, E.T.
61
5.2. ANÁLISE CLÍNICA
Promoveu-se a análise da evolução do quadro clínico de cada animal de cada grupo
durante o período pós-cirúrgico conforme previamente descrito em material e métodos. A
análise clínica foi feita durante o período pós-cirúrgico de cada grupo: o grupo I por duas
semanas, o grupo II por 7 semanas e finalmente doze semanas de avaliação para o grupo III.
Os sinais clínicos secundários à ganglionectomia esperados e analisados foram temperaturas
da face e da orelha, sudorese do muflo, presença de ptose, presença de miose.
Durante o período trans-operatório foi possível observar o aumento na temperatura da
orelha esquerda em todos os animais. O aumento da temperatura foi um sinal clínico
persistente por todas as semanas avaliadas nos amimais dos grupos I e II, duas e sete semanas
respectivamente, nos animais do grupo III (doze semanas) o sinal clínico persistiu até a 8ª
semana.
O aumento de temperatura da face dos noves ovinos operados demonstrou-se discreta e
persistente por apenas duas semanas, retornando aos patamares normais após este período.
Além da discreta hipertermia da face, não se observou aumento da sudorese na face dos
ovinos. O efeito da ganglionectomia unilateral do GCC sobre o controle simpático da
sudorese foi avaliado através da observação de gotículas sob o plano naso-labial dos animais.
A ausência de sudorese (Figura 2) no plano naso-labial persistiu até a segunda semana nos
animais dos grupos I e III, diferindo dos animais do grupo II, no qual, observou-se a
persistência por quatro semanas.
Os sintomas da cirurgia experimental incluíram a presença de miose do lado esquerdo
em todos os animais por 2 semanas. A ptose da pálpebra superior (Figura 3) foi observada em
todas as semanas do grupo I, grupo II e dois animais do grupo III. Apenas em um animals do
Fioretto, E.T.
62
grupo III observou-se normalidade na posição da pálpebra superior a partir da 8ª semana.
Assim sendo, os resultados da avaliação clínica por grupo são representados nas tabelas
2, 3 e 4 sendo grupo I, II e III respectivamente. Ainda foram registrados anisocoria presente
(Figura 2), ausência de sudorese do nariz (Figura 3).
Figura 2 – Fotografia do plano nasal de um ovino ilustrando a ausência da sudorese no
hemi-plano nasal esquerdo (cabeças de setas cheias) após a ganglionectomia
unilateral do GCC (gânglio cervical cranial) enquanto no hemi-plano nasal
direito observa-se o aspecto brilhante da sudorese (cabeças de setas vazias).
Fioretto, E.T.
63
Figura 3 – Fotografia da face de um ovino demonstrando a ptose da pálpebra superior (traço)
presente após a ganglionectomia unilateral do GCC (gânglio cervical cranial).
Posicionaram-se dois traços (dois centímetros) idênticos entre os pontos mais
côncavos da mucosa palpebral superior e inferior em ambos os olhos. Observa-
se a diferença de altura da pálpebra superior esquerda para o traço (cabeça de
seta) em comparação à direita, caracterizando a ptose no olho esquerdo.
Fioretto, E.T.
64
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
+ / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P - / P P / P -+ / P -+ / P -+ / P -+ / P
Ptose palpebral
+ / N + / N + / N N / N + / N + / N + / - + / N
Miose
P / N
P / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
+ / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P - / P - / P - / P - / P - / P - / P
Ptose palpebral
+ / N + / N + / N + / N + / N + / N + / - + / N
Miose
P / N
P / N
P / N
P / N
-+ / N
-+ / N
-+ / N
-+ / N
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
+ / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P - / P - / P -+ / P -+ / P -+ / P -+ / P
Ptose palpebral
+ / N + / N + / N + / N + / N + / N + / - + / N
Miose
P / N
P / N
N / N
-+ / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Controle / Operado
Controle / Operado
Controle / Operado
Animal
3
Animal
2
Grupo I (2 semanas)
Animal
1
Tabela 3 – Representação dos dados obtidos de observação clínica para a grupo I durante o
período pós cirúrgico, São Paulo, 2006
Fioretto, E.T.
65
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N
+ / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
TºC orelha
++ / N
++ / N
++ / N
+ / N
++ / N
++ / N
+ / N + / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P
- / P
- / P
- / P
- / P
-+ / P
P / P
-+ / P
-+ / P
-+ / P
-+ / P
-+ / P
-+ / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
Ptose palpebral
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Miose
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N
+ / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
TºC orelha
+ / N
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
+ / N + / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P - / P - / P - / P - / P P / P -+ / P -+ / P -+ / P - / P -+ / P -+ / P P / P P / P P / P P / P P / P
Ptose palpebral
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
-+ / N
N / N
N / N
Miose
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
+ / N + / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P - / P - / P - / P - / P -+ / P - / P - / P -+ / P -+ / P -+ / P -+ / P P / P P / P P / P P / P P / P
Ptose palpebral
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
Miose
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
P / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Controle / Operado
Controle / Operado
Controle / Operado
Grupo II (7 semanas)
Animal
1
Animal
2
Animal
3
Tabela 4 – Representação dos dados obtidos de observação clínica para a grupo II durante o
período pós cirúrgico, São Paulo, 2006
Fioretto, E.T.
66
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N
N / N
N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
++ / N
+ / N + / N + / N + / N + / N + / - + / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P -+ / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P
Ptose palpebral
N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
Miose
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
+ / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
++ / N
++ / N
+ / N + / N + / N N / N + / N + / N + / N + / N + / - + / N + / N + / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P
- / P
- / P
-+ / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
P / P
Ptose palpebral
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
+ / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Miose
N / P
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Sinal Clínico
/Gânglio
TºC face
N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
TºC orelha
++ / N
++ / N
++ / N
+ / N + / N N / N N / N N / N N / N N / N - / - N / N N / N N / N N / N N / N N / N N / N
Sudorese muflo
- / P - / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P P / P
Ptose palpebral
+ / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N + / N
Miose
N / N
P / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
N / N
Grupo III (12 semanas)
Animal
1
Animal
2
Animal
3
Controle / Operado
Controle / Operado
Controle / Operado
Tabela 5 – Representação dos dados obtidos de observação clínica para a grupo III durante o
período pós cirúrgico, São Paulo, 2006
Fioretto, E.T.
67
5.3. MICROESTRUTURA
A análise qualitativa da microestrutura do GCS direito (controle) e esquerdo (pós
ganglionectomia) revelaram arranjos estruturais distintos entre os antímeros. Assim,
observouse que enquanto no gânglio controle os neurônios apresentavam uma distribuição
homogênea, o gânglio tratado (direito) apresentou uma distribuição mais heterogênea, sendo
possível identificar agrupamentos de neurônios delimitados e separados por tecido conjuntivo
notoriamente mais desenvolvido que do gânglio controle (Figuras 4, 5, 6, 7, 8 e 9).
Fioretto, E.T.
68
Figura 4 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado após a ganglionectomia unilateral (controle) do
grupo I. Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A) está sob a
look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes na secção
de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas indicam
neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do disector é de
12µm. Observa-se distribuição homogênea dos neurônios no gânglio controle
Técnica de coloração: Azul de Toluidina. Escala de barra: 25 µm
Grupo I - Gânglio Controle
A
B
Fioretto, E.T.
69
Figura 5 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado duas semanas (grupo I) após ganglionectomia
unilateral (operado). Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A)
está sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes
na secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas
indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do disector
é de 12µm. Observa-se distribuição heterogênea dos neurônios no gânglio
operado. Técnica de coloração: Azul de Toluidina. Escala de barra: 25 µm
Grupo I - Gânglio Operado
A
B
Fioretto, E.T.
70
Figura 6 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado após a ganglionectomia unilateral (controle) do
grupo II. Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A) está sob a
look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes na secção
de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas indicam
neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do disector é de
12µm. Observa-se distribuição homogênea dos neurônios no gânglio controle
Técnica de coloração: Azul de Toluidina. Escala de barra: 25
µm
Grupo II - Gânglio Controle
A
B
Fioretto, E.T.
71
Figura 7 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado sete semanas (grupo II) após ganglionectomia
unilateral (operado). Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A)
está sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes
na secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas
indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do disector
é de 12µm. Observa-se distribuição heterogênea dos neurônios no gânglio
operado. Técnica de coloração: Azul de Toluidina. Escala de barra: 25
µm
Grupo II - Gânglio Operado
A
B
Fioretto, E.T.
72
Figura 8 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado após a ganglionectomia unilateral (controle) do
grupo III. Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A) está sob a
look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes na secção
de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas indicam
neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do disector é de
12µm. Observa-se distribuição homogênea dos neurônios no gânglio controle
Técnica de coloração: Azul de Toluidina. Escala de barra: 25
µm
Grupo III - Gânglio Controle
A
B
Fioretto, E.T.
73
Figura 9 – Fotomicrografias ilustrando um disector aplicado no GCC (gânglio cervical
cranial) de um ovino avaliado doze semanas (grupo III) após ganglionectomia
unilateral (operado). Nesta montagem observa-se que a secção referencia (A)
está sob a look-up (B). Setas pretas indicam neurônios que estavam presentes
na secção de referência e desapareceram na look-up, ao passo que setas brancas
indicam neurônios presentes nas duas secções. Nota-se que a altura do disector
é de 12µm. Observa-se distribuição heterogênea dos neurônios no gânglio
operado. Técnica de coloração: Azul de Toluidina. Escala de barra: 25 µm
Grupo III - Gânglio Operado
A
B
Fioretto, E.T.
74
5.4 ESTUDO ESTEREOLÓGICO
Os resultados encontrados no estudo estereológico são descritos em itens a seguir.
5.4.1 Densidade neuronal e número total de neurônios
A densidade neuronal (número de neurônios mm
-3
) apresentou variação entre 4.781 a
7.747 para o gânglio controle do grupo I, enquanto que para o gânglio operado encontramos
valores entre 2.562 a 4.288. Para o grupo II, valores entre 7.147 e 8.874 foram encontrados
no gânglio controle e entre 4.299 e 5.080 no gânglio operado. O grupo III revelou números de
10.389 a 10.957 e entre 6.000 a 8.018 para gânglios controle e operado, respectivamente.
A análise estatística entre os grupos I, II e III realizada por meio do Teste F (ANOVA
“two way cross-classification”) demonstrou haver diferença significativa, (p = 0,0001), do
efeito do tratamento dentro de cada grupo. A seguir, o Test t de Student revelou efeitos
significativos para o grupo I (duas semanas) (p = 0,0031). Para o grupo II encontrou-se (p =
0,0025) e para o grupo III (p = 0,0015). Adicionalmente, o teste F detectou diferença
significativa para o efeito semana (p = 0,0016) entre os grupos. Mais especificamente, o teste
t de Student demonstrou haver diferença significativa (p = 0,0019) para este mesmo efeito
nos gânglios controle entre a 2ª e a 12ª semana e entre a 7ª e a 12ª semana (p = 0,0143). Os
gânglios operados sofreram efeitos significativos entre a 2ª e a 12ª semana (p = 0,0012) e
entre a 7ª e a 12ª semana (p = 0,0107).
O número total de neurônios no GCC de ovinos estimado para o grupo I foi de 180.000
a 360.000 no gânglio controle e entre 176.400 a 295.200 no gânglio operado. Para o grupo II,
Fioretto, E.T.
75
o gânglio controle continha entre 259.200 a 504.000 neurônios, enquanto que estimativas
entre 266.400 a 489.600 foram obtidos para o gânglio operado. O grupo III apresentou
valores entre 330.000 a 483.000 para o gânglio controle e entre 327.000 a 378.000 para o
gânglio operado. A densidade neuronal (Nv) e o número total de neurônios (N) calculados de
cada animal e as médias dos grupos estão representadas na tabela 6 e representados no
gráfico 1.
A metanálise entre os grupos I, II e III por meio do Teste F (ANOVA “two way cross-
classification”) demonstrou haver efeito significativo (p = 0,0514) dentro de cada grupo. Em
continuidade o teste t de Student demonstrou que o efeito do tratamento ocorreu mais
especificamente no grupo III (12 semanas) (p = 0,0166).
Não foram observados efeitos significativos da semana (p = 0,3835) bem como da
interação semana e tratamento (p = 0.0995) nos três grupos de estudo.
Estimativas das médias individuais de densidade neuronal (Nv) e número total de
neurônios (N) bem como suas respectivas médias e coeficientes de variação são apresentados
na tabela 7 e gráfico 1.
5.4.2 Estimativa global do volume neuronal
A estimativa do volume celular dos neurônios apresentou valores entre 1.546,0 µm
3
a
19.840,8 µm
3
e entre 1.631,5 µm
3
a 32.741,8 µm
3
para os gânglios controle e operado do
grupo I, respectivamente. Para o grupo II foram encontrados valores de 1.506.7 µm
3
a
25.938,8 µm
3
para o gânglio controle e entre 1.538,5 µm
3
a 24.537,1 µm
3
para o gânglio
operado. Valores entre 1.545,6 µm
3
a 32.462,5 µm
3
e entre 1.516,6 µm
3
a 29.923,9 µm
3
foram calculados para os gânglios controle e tratado do grupo III, respectivamente. Os
valores médios do volume celular em cada animal assim como as médias e coeficientes de
Fioretto, E.T.
76
variação intra-grupos são descritos na tabela 6 e representados no gráfico 1.
A análise estatística entre os grupos I, II e III conduzida por meio do Teste F (ANOVA
“two way cross-classification”) demonstrou diferença significativa (p < 0,0001), quanto ao
efeito do tratamento, ou seja, diferença entre controle e operado dentro de cada grupo. Em
continuidade o Test t de Student revelou significância para o tratamento no grupo I (duas
semanas) (p = 0,0215). Para o grupo II encontrou-se (p = 0,0091) e para o grupo III, (p =
0,0013). O teste F não detectou diferença significativa para o efeito semana entre os gânglios
controle e operado isoladamente. No entanto, o teste t de Student demonstrou haver diferença
significativa (p = 0,0415), para este efeito sobre os gânglios operados entre a 7ª e a 12ª
semanas.
Fioretto, E.T.
77
5.5 ESTUDO MORFOMÉTRICO
A seguir são descritos as estimativas dos parâmetros morfométricos avaliados.
5.5.1 Área seccional do núcleo neuronal
No grupo I a área seccional do núcleo variou de 40,3µm
2
a 261,5 µm
2
para o gânglio
controle e 23,5 µm
2
a 304,6 µm
2
para o gânglio operado. A área do núcleo neuronal para o
grupo II variou de 17,8 µm
2
a 228,5 µm
2
e de 27,0 µm
2
a 235,7 µm
2
, respectivamente para os
gânglios controle e operados, enquanto que para o grupo III encontraram-se valores entre
24,6 µm
2
e 201,2 µm
2
para o gânglio controle e entre 30,8 µm
2
e 215,8 µm
2
para o gânglio
operado. A média dos valores de áreas do núcleo de cada animal e dos grupos são descritos
na tabela 5 e representados no gráfico 1.
A comparação entre os grupos I, II e III avaliados pelo método estatístico, Teste F
(ANOVA “two way cross-classification”) demonstrou não haver diferença significativa
quanto ao efeito do tratamento, ou seja, diferença entre controle e operado dentro de cada
grupo; e ainda não houve diferença significativa no efeito das semanas tanto nos gânglios
controle como operados, ou seja, não se encontrou variação significativa nos resultados
destes gânglios nas diferentes semanas avaliadas. De igual forma, não houve efeito
significativo da interação semana e tratamento em todos os grupos de estudo.
Fioretto, E.T.
78
5.5.2 Área seccional do corpo celular neuronal
A estimativa da área do corpo celular do gânglio controle do grupo I variou entre 169,5
µm
2
e 1.172,2 µm
2
e entre 116,2 µm
2
e 1.782,5 µm
2
para o gânglio operado. O grupo II
apresentou valores de 128,9 µm
2
a 1.478,4 µm
2
e entre 155,3 µm
2
e 1.580,2 µm
2
para os
gânglios controle e operado, respectivamente. Já para o grupo III a variação foi de 119,1 µm
2
a 1.715,1 µm
2
para o gânglio controle e entre 185,9 µm
2
e 2.040,5 µm
2
para o gânglio
operado. As médias dos valores das áreas seccionais neuronal e nuclear em cada animal,
assim como, as médias e os coeficientes de variação intra-grupos são descritos na tabela 5 e
representados no gráfico 1.
A comparação entre os grupos I, II e III avaliados pelo método estatístico, Teste F
(ANOVA “two way cross-classification”) demonstrou haver diferença significativa (p =
0,0006), quanto ao efeito do tratamento para todos os grupos. Posteriormente, o Test t de
Student demonstrou valores significativos para o efeito tratamento para o grupo I (duas
semanas) (p = 0,0121) na comparação entre gânglios controle e operado. Para o grupo II
encontrou-se p = 0,0104 e para o grupo III, p = 0,0066.
Fioretto, E.T.
79
Tabela 6 – Representação das estimativas das médias individuais para a área seccional de
núcleo e corpo celular (µm
2
) e para volume neuronal (µm
3
) e seus respectivos
coeficientes de erro (CE) no gânglio cervical cranial (GCC) de ovinos avaliados
em três diferentes períodos pós-operatórios: 2 semanas (GI); 7 semanas (GII) e 12
semanas (GIII). São apresentadas ainda estimativas de média e coeficiente de
variação dentro de cada grupo de estudo, São Paulo, 2006
Área
(µm
2
) Volume
global
(µm
3
)
GCC*
Núcleo CV
♦
Corpo celular CV
♦
Neurônio CV
♦
CE
♠
Controle
107,7 -- 517,5 -- 7.508,6 -- 0,1
Animal 1
Operado
100,2 -- 549,4 -- 8.437,7 -- 0,1
Controle
108,9 -- 572,5 -- 7.456,0 -- 0,1
Animal 2
Operado
111,6 -- 604,1 -- 8.453,3 -- 0,1
Controle
101,3 -- 482,7 -- 6.768,9 -- 0,1
Animal 3
Operado
108,3 -- 654,5 -- 8.971,4 -- 0,1
Controle
102,4 0,4
535,2
0,3
7.252,1 0,5 --
G I
02
semanas
Média
Operado
107,0 0,6
626,5
0,4
8.265,2 0,6 --
Controle
105,2 -- 442,4 -- 6.023,3 -- 0,1
Animal 1
Operado
98,1 -- 582,3 -- 6.029,6 -- 0,1
Controle
95,2 -- 519,6 -- 6.333,9 -- 0,1
Animal 2
Operado
110,4 -- 612,2 -- 8.179,5 -- 0,1
Controle
103,1 -- 553,4 -- 7.373,2 -- 0,1
Animal 3
Operado
92,2 -- 602,5 -- 7.910,9 -- 0,1
Controle
101,1
0,7 534,7 0,4 6.607,6 0,6 --
G II
07
semanas
Média
Operado
99,4 0,7
628,2 0,4 8.204,7 0,7 --
Controle
95,8 -- 499,0 -- 6.023,9 -- 0,1
Animal 1
Operado
98,7 -- 623,5 -- 7.967,4 -- 0,1
Controle
99,0 -- 562,9 -- 6.973,8 -- 0,1
Animal 2
Operado
110,0 -- 757,0 -- 11.181,3 -- 0,1
Controle
114,1 -- 576,1 -- 8.779,9 -- 0,1
Animal 3
Operado
113,4 -- 592,5 -- 9.005,5 -- 0,1
Controle
105,9 0,6 570,8 0,4 7.229,5 0,7 --
G III
12
semanas
Média
Operado
106,7 0,5
651,3 0,4 9.374,3 0,6 --
* GCC: Gânglio Cervical Cranial
♦
Coeficiente de Variação: CV = Desvio padrão/média
♠
Coeficiente de Erro: CE (volume) = 1 x [1/12 (3A – 4B + C)]
∑ A
Fioretto, E.T.
80
Tabela 7 - Representação das estimativas das médias individuais para a estimativa de
neurônios.mm
-3
e para estimativa de número total neurônios (N) e seus
respectivos coeficientes de erro (CE) no gânglio cervical cranial (GCC) de ovinos
avaliados em três diferentes períodos pós-operatórios: 2 semanas (GI); 7 semanas
(GII) e 12 semanas (GIII). São apresentadas ainda estimativas de média e
coeficiente de variação dentro de cada grupo de estudo, São Paulo, 2006
Nv
1
CV
♦
N
2
CV
♦
CE
♠
CCG
Controle
6.338 -- 180.000 -- 0,1
Animal 1
Operado
2.562 -- 176.400 -- 0,1
Controle
4.781 -- 259.200 -- 0,1
Animal 2
Operado
3.094 -- 255.600 -- 0,1
Controle
7.747 -- 360.000 -- 0,1
Animal 3
Operado
4.288 -- 295.200 -- 0,1
Controle
6.289 0,24 266.400 0,3 --
G I
02
semanas
Média
Operado
3.314 0,27 242.400 0,2 --
Controle
8.874 -- 504.000 -- 0,1
Animal 1
Operado
5.080 -- 489.600 -- 0,1
Controle
7.147 -- 295.200 -- 0,1
Animal 2
Operado
4.299 -- 266.400 -- 0,1
Controle
7.495 -- 309.600 -- 0,1
Animal 3
Operado
4.837 -- 266.400 -- 0,1
Controle
7.839
0,12 369.600
0,3 --
G II
07
semanas
Média
Operado
4.739
0,08 340.800
0,3 --
Controle
10.692 -- 483.000 -- 0,1
Animal 1
Operado
7.752 -- 378.000 -- 0,1
Controle
10.389 -- 447.000 -- 0,1
Animal 2
Operado
8.018 -- 345.000 -- 0,1
Controle
10.957 -- 330.000 -- 0,1
Animal 3
Operado
6.000 -- 327.000 -- 0,1
Controle
10.679
0,03 420.000
0,1 --
G III
12
semanas
Média
Operado
7.257
0,15 350.000
0,1 --
1
Nv: Numero de neurônios mm
-3
2
N: número total de neurônios
♦
Coeficiente de Variação: CV(Nv) e CV (N) = Desvio padrão/média
♠
Coeficiente de Erro: CE (N) = 1/√∑Q
-
Fioretto, E.T.
81
Gráfico 1 – Gráfico descreve as estimativas das médias individuais
para a área do núcleo (µm
2
), área do corpo celular
(µm
2
), volume neuronal (µm
3
), Nv (neurônios.mm
-
3) e
N (número total de neurônios) no gânglio cervical
cranial (GCC) de ovinos avaliados em três diferentes
períodos pós-operatórios: 2 semanas (GI); 7 semanas
(GII) e 12 semanas (GIII). Círculos (o) representam
estimativas individuais e barras horizontais (-) assinalam
médias dentro de cada grupo de acordo com o
tratamento empregado: controle e operado, São Paulo –
2006
60
90
120
Área do núcleo (µm
2
)
400
600
800
Área do corpo celular (µm
2
)
6000
8000
10000
12000
Volume neuronal (µm
3
)
1000
4000
7000
10000
13000
Nv (neurons mm
-3
)
Grupo I
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Controle Operado
N (número total de neurônios)
Grupo II
Controle Operado
Grupo III
Controle Operado
Fioretto, E.T.
82
Discussão
Fioretto, E.T.
83
6 DISCUSSÃO
A discussão foi apresentada nos seguintes tópicos:
6.1 TÉCNICA OPERATÓRIA
A abordagem cirúrgica descrita por Appleton e Waites (1957) efetuando acesso
cirúrgico pelo processo zigomático, no ponto médio entre o ângulo do olho e a base da
orelha, continuando paralelamente ao ramo da mandíbula até a altura da cartilagem tireóidea
foi considerada muito ampla, uma vez que, em nosso estudo, efetuando-se uma abordagem
mínima foi possível identificar o gânglio cervical cranial (GCC) e estruturas próximas. A
abordagem cirúrgica cervical ventro-lateral do GCC e estruturas vizinhas em ovinos foi
promovida com sucesso e livre de fatalidades nos períodos per, trans e pós-operatório. Como
conseqüência da ganglionectomia unilateral do GCC, foram observados sinais clínicos da
síndrome de Horner.
Fioretto, E.T.
84
6.2 ANATOMIA MACROSCÓPICA
A literatura consultada reporta que o GCC em diversas espécies encontra-se situado
próximo à bulla timpânica, ventralmente ao Atlas e em íntima relação com a artéria carótida
interna, conforme Baljet e Drukker (1979); Castro (2001); De Abreu (2002); Fioretto (2002);
Hedger e Webber (1976), Williams e Paley (1969). Em nosso estudo não foram encontrados
dados de relevância sobre a alteração de posicionamento do GCC em ovinos, sendo sua
topografia semelhante à descrita por Appleton e Waites (1957), tanto nos gânglios operados
como nos controles. Não obstante, salientamos que a ganglionectomia unilateral promovida
no antímero esquerdo aparentemente não desencadeou nova acomodação espacial do gânglio
remanescente (GCC direito) devido ao aumento de suas dimensões (comprimento, largura e
espessura).
No grupo I observou-se um aumento médio de 8% do gânglio operado em relação ao
controle quanto ao comprimento do gânglio, 3% quanto à largura e no que tange à espessura
verificaram-se aumentos médios em 11%. Para o grupo II encontrou-se a hipertrofia do
gânglio operado em relação ao gânglio controle em média de 4% para comprimento, 4% para
largura e 5% em espessura. Quanto ao grupo III foram calculados valores médios de 29% de
aumento para comprimento do gânglio, 4% de aumento para largura e em espessura do
gânglio aumento médio em 7% para o gânglio operado.
Fioretto, E.T.
85
6.3 ESTUDO CLÍNICO
A análise clínica secundária à ganglionectomia unilateral do GCS realizada em ovinos
mostrou que este procedimento cirúrgico desencadeou a Síndrome de Homer iatrogênica.
Esta síndrome provoca alterações específicas quanto à temperatura da face, sudorese,
presença de ptose e miose, conforme reportado por Bell et al., (2001); Boydell, (1995);
Kisch, (1951); Skarda et al., (1985). A síndrome de Horner em grandes animais foi relatada
por Smith e Mayhew (1977) em um experimento utilizando eqüinos, bovinos, caprinos e
ovinos aplicando-se diferentes tipos de simpatectomia na região cervical incluindo-se a
ganglionectomia do GCC direito. Após a cirurgia os animais foram observados quanto aos
déficits neurológicos e oftálmicos por períodos diferentes.
A síndrome de Horner desenvolvida em ovinos, no presente estudo, com o
envolvimento do gânglio cervical cranial (GCC) demonstrou-se clinicamente menos severa
em comparação com outras espécies como os caninos que apresentam significativa ptose
palpebral como descrito por Boydell (1995) e eqüinos que demonstram nítido descontrole da
temperatura da face e pescoço conforme os relatos de Smith e Mayhew (1977) e Ghafir, Art e
Lekeux (1996).
Em ovinos a hipertermia da face parece ser um sinal impreciso para a avaliação da
doença, entretanto, o diagnóstico da síndrome de Horner pode ser determinado através da
observação da alteração da orelha, ipslateral à lesão, persistente por doze semanas.
Outros sintomas relevância clínica foram a ausência de sudorese ipslateral à lesão
persistente por quatro semanas e a presença de ptose palpebral por oito semanas.
Os sintomas clínicos da Síndrome de Horner mais evidentes foram a hipertermia da
orelha esquerda e ausência de sudorese no plano hemi-nasal esquerdo.
Fioretto, E.T.
86
6.4. MICROESTRUTURA
A análise histológica qualitativa do GCC esquerdo (controle) e direito (operado)
revelou arranjos estruturais distintos entre os antímeros. Conforme a literatura, Castro (2001);
De Abreu (2002); Fioretto (2002); Matthews; Raisman (1969); Pappas; Waxman, (1972);
Williams; Paley (1969) e Yokota (1973), os neurônios do GCC estão distribuídos ao longo de
toda a sua extensão formando amplos agrupamentos delimitados por septos de tecido
conjuntivo. A descrição clássica da arquitetura do GCC foi observada nos gânglios controle,
contudo, o gânglio operado (direito) apresentou alteração quanto à disposição do tecido
conjuntivo distribuído em seu interior. Assim, observou-se que no gânglio operado sua
distribuição foi heterogênea, sendo possível identificar agrupamentos de neurônios
delimitados e separados por septos de tecido conjuntivo, visíveis em relação ao gânglio
controle.
Fioretto, E.T.
87
6.5 ESTUDO ESTEREOLÓGICO
Previamente ao inicio da discussão dos parâmetros encontrados nesta investigação, faz-
se necessário salientarmos que a literatura não apresenta dados estereológicos na espécie
ovina e a maior parte dos resultados encontrados à respeito de animais de laboratório
relacionam-se à aplicação de métodos quantitativos morfométricos (não estereológicos) com
exceção de Popken e Farel (1997) e Santer (1991) que aplicam métodos estereológicos em
seus estudos. Particularmente, encontramos na espécie ovina Gabella et al (1988) relacionado
à citoarquitetura do GCC em ovinos, contudo não se relaciona a abordagem estereológica.
A confiabilidade dos dados encontrados sem a utilização de métodos estereológicos
deve ser considerada com extrema cautela, uma vez que tais dados, usualmente, envolvem a
extrapolação de dados obtidos bidimensionalmente para o plano tridimensional e algumas
hipóteses são assumidas a respeito da forma, orientação e distribuição das partículas a serem
quantificadas, além da aplicação de vários fatores de correção.
De outra forma os métodos tridimensionais baseados em delineamento estereológico
aplicados nesta pesquisa não dependem da orientação, distribuição e forma das partículas a
serem quantificadas conforme amplamente difundido na literatura (GUNDERSEN et al.,
1999; MAYHEW, 1991b; WEST, 1993).
Esta mesma crítica aos métodos bidimensionais já havia sido aventada por diversos
pesquisadores como Hof e Schmitz (2002), Howard e Reed, (2004), Mayhew e Gundersen
(1996), Pakkenberg e Gundersen (1988), Pover e Coggeshall (1991), Ribeiro, Davis e
Gabella (2004), Schmitz e Hof (2005) e Sterio (1984), que pertencem à tese da Estereologia
conhecida como pós-Gundersen ou pós-disector. A discussão estereológica foi dividida em
capítulos para a melhor compreensão das inferências encontradas.
Fioretto, E.T.
88
6.5.1 Densidade Neuronal (Nv)
Optou-se por melhorar a acurácia da técnica de quantificação por meio da adoção de
sistemas testes singulares para cada gânglio considerado de acordo com o padrão de
distribuição dos neurônios ganglionares. Desta maneira, considerou-se um sistema teste
composto por seis áreas para o gânglio controle (distribuição homogênea) e outro sistema
teste com oito áreas para o gânglio operado (distribuição heterogênea). Vale ainda ressaltar
que a área de cada "frame" do sistema teste era idêntica. Deste modo, ao avaliarmos os dados
referentes à densidade neuronal, número de neurônios em um determinado volume referência,
observamos o efeito da ganglionectomia em cada grupo do experimento. Os gânglios
operados apresentaram uma redução na densidade numérica (89%, 65% e 47% para os
grupos I, II e III, respectivamente). Essa diferença entre controle e operados reflete a
distribuição heterogênea dos neurônios descrito no estudo da microscopia de luz de cortes
semi-finos. Apesar do tecido conjuntivo não ter sido quantificado, assim como o tecido não
neuronal intraganglionar, os dados qualitativos sugerem que o tecido conjuntivo estava mais
densamente arranjado ocasionando uma distribuição mais esparsa e heterogênea dos
neurônios ganglionares. A relação entre o aumento do tamanho dos neurônios (área do corpo
celular, volume) e alterações na densidade numérica e número total de neurônios são
discutidos adiante.
Fioretto, E.T.
89
6.5.2 Número total de neurônios
A ganglionectomia unilateral ocasionou dois efeitos distintos no GCC; o grupo I (2
semanas) apresentou um aumento de 3% nos gânglios operados podendo estar relacionada a
uma proliferação inicial compensatória à falta de inervação contralateral, entretanto a
confirmação desta proliferação neuronal depende da utilização de marcadores específicos
(mitose) a fim de se confirmar a hipótese deste aumento estar relacionado ao incremento da
área do núcleo neuronal observado para o grupo I, como um dos fenômenos pré-mitoticos no
ciclo celular. O segundo efeito da ganglionectomia refere-se aos grupos II e III que
apresentaram perda neuronal de cerca de 8% e 20%, respectivamente, sendo no grupo III
onde se notou o efeito mais significativo desta perda neuronal quando comparado ao grupo I.
Neste caso, o uso de marcadores apoptóticos auxiliaria a esclarecer se esta perda neuronal
estaria associada a apoptose.
Quando os dois eventos (número e tamanho celular) são avaliados no seu conjunto,
duas hipóteses podem estar relacionadas: primariamente pode-se sugerir uma hipertrofia
vicariante dos neurônios do gânglio operado como parte do mecanismo compensatório para
re-inervação contralateral, ou seja, o neurônio aumentaria devido à sobrecarga funcional
imposta pelo aumento do território a ser inervado. Não obstante, a maior exigência funcional
destes neurônios pode levá-los à morte celular, e a seguir à hipertrofia do tecido não neuronal
cicatricial, situação esta que se reflete na diminuição da densidade neuronal (Nv) nos
gânglios operados e na diminuição do número total de neurônios, conforme observado no
grupo II (sete semanas) e mais significativamente no grupo III (doze semanas). Como
segunda hipótese, sugere-se que a hipertrofia neuronal possa estar relacionada a um
mecanismo compensatório à morte celular advindo da maior exigência funcional conforme
Fioretto, E.T.
90
proposto por Cabello et al. (2002) para o efeito do envelhecimento no cérebro de humanos,
sendo que a investigação da morte celular poderia explicar o aumento do núcleo observado
no grupo III, uma vez que em situações de maior exigência funcional encontra-se a
hipertrofia nuclear antecedendo os efeitos apoptóticos (cariólise). Vale ressaltar que o grupo
III apresentou o maior índice de perda neuronal.
Como propositura para estudos futuros, a investigação de uma possível inervação
cruzada seria necessária (empregando-se injeção de neurotraçadores retrógrados no território
ganglionar esquerdo e anterógrados no gânglio cervical cranial direito) para testar a hipótese
de que a maior sobrecarga funcional e maior produção de fatores de crescimento - NGF
“nerve growth factor” imposta ao GCC direito (inervação cruzada) ocasionaria proliferação
de três eventos distintos e consecutivos: proliferação celular, hipertrofia neuronal seguida de
morte celular.
No presente estágio, podemos apenas sugerir a existência de uma inervação
contralateral suportada pela melhora do quadro clínico durante o período pós-operatório em
todos os grupos de estudo. Secundariamente, também podemos inferir que as alterações
morfoquantitativas celulares secundárias à ganglionectomia unilateral do GCC estabelecem-
se a partir da 8ª semana, período em que observamos significativa perda neuronal (grupo III).
Fioretto, E.T.
91
6.5.3 Estimativa global do volume neuronal
Soinila e Ërankö (1983) descreveram não haver diferença significativa em termos de
peso, volume, número e densidade entre os gânglios controle e operados em seu experimento
desenvolvido no rato. É necessário salientarmos que o método empregado não era
estereológico e para o cálculo empregou-se fatores de correção como a fórmula de Floderus e
o método de Abercrombie (ABERCROMBIE, 1946) que dependem de hipóteses geométricas
o que os tornam não acurados.
Gabella, Trig e McPhail (1988) relataram que os neurônios encontrados no GCC de
ratos tinham um volume de 1600 µm
3
a 93.000 µm
3
e a distribuição das células era unimodal
prevalecendo os neurônios pequenos. Os autores referiram que o amplo espectro na variação
do tamanho dos neurônios possa estar relacionado ao território de inervação destes neurônios,
ou seja, neurônios maiores estariam inervando maior quantidade de órgãos alvo.
Através da aplicação de um método com delineamento estereológico em nosso estudo,
encontramos que os neurônios dos gânglios operados aumentaram em média 13% para o
grupo I, 24% no grupo II e 29% para o grupo III. O aumento do volume dos neurônios sugere
uma sobrecarga funcional provavelmente relacionada a uma tentativa do organismo em
promover a reinervação simpática contralateral cruzada perdida pela ganglionectomia. A
relação entre o aumento do tamanho dos neurônios (área do corpo celular, volume) são
discutidas em associação às alterações na densidade numérica e número total de neurônios.
Fioretto, E.T.
92
6.6 ESTUDO MORFOMETRICO
A discussão referente ao estudo morfométrico será dividida em itens para melhor
compreensão
6.6.1 Área seccional do núcleo neuronal
A ganglionectomia unilateral do GCC não causou alterações significativas nas áreas do
núcleo neuronal do GCC de ovinos em todos os grupos estudados. Entretanto, vale a pena
salientar que, em média, no grupo I (duas semanas) observa-se o aumento da área do núcleo
em 4%, o que pode sugerir uma resposta do organismo promovendo uma hipertrofia nuclear
que poderia preceder uma mitose celular como mecanismo compensatório para a sobrecarga
funcional imposta ao gânglio remanescente..
O grupo III, também, demonstrou aumento da área do núcleo de 7% entre os gânglios
operados e controle, entretanto neste grupo, acreditamos no estabelecimento de uma resposta
à maior exigência funcional dos neurônios seguida de morte celular sendo necessária
investigação de processos apoptóticos para testar esta hipótese. A discussão detalhada deste
resultado encontrado será feita em conjunto com o numero total de neurônios encontrados
para este grupo. A diferença de ponto de vista entre os aumentos apresentados entre o grupo I
e o grupo III ainda deve-se ao fato das áreas do núcleo do grupo III terem se apresentado
75% maiores que os do grupo I, o que poderia refletir a maior adaptabilidade dos neurônios
do grupo III em relação ao grupo I pelo tempo de análise entre os grupos. Estas hipóteses
também são discutidas em associação às alterações no número total de neurônios.
Fioretto, E.T.
93
6.6.2 Área do corpo celular neuronal
Moriyama, Shimada e Goto (1995) em um estudo utilizando secções seriadas do
gânglio cervical cranial em ratos (empregando-se amostragem semi-aleatória e aplicação de
método de correção de Abercrombie, portanto método não estereológico) descreveram a
presença de neurônios pequenos no GCC com áreas em torno de 367 µm
2
. Gabella, Trig e
McPhail (1988) relataram que os neurônios presentes no GCC de ratos variavam em tamanho
entre 165 µm
2
a 2500 µm
2
. Estes autores sugeriram que os neurônios maiores possam ser
responsáveis por inervarem uma maior quantidade de órgãos-alvo.
Em nosso estudo, aplicando-se métodos com delineamento estereológico, encontramos
que os neurônios dos gânglios controle tinham para o grupo I em média 535,2µm
2
(169,5 µm
2
a 1.172 µm
2
), no grupo II, média de 534,7 µm
2
(128,9 µm
2
a 1.478 µm
2
) e no grupo III,
média de 570,8 µm
2
(119,1 µm
2
a 1.715,1 µm
2
). No gânglio operado, os neurônios
apresentaram-se maiores que os gânglios controle em 0,17x em média para os grupos I e II e
em média de 0,14x para o grupo III.
Este aumento encontrado no gânglio operado em relação ao gânglio controle foi
considerado estatisticamente significativo em cada um dos grupos avaliados permitindo-nos
sugerir que a hipertrofia dos neurônios do gânglio operado atue de forma compensatória pela
falta de inervação contralateral. O maior nível de significância (0,0066) fora encontrado no
grupo III (12 semanas), onde os animais apresentaram aumentos de 0,14x em média dos
gânglios operados em relação ao controle. Este aumento mais significativo foi correlacionado
então aos resultados obtidos para volume do neurônio e número total de neurônios para este
grupo e sua interação discutida no capitulo referente ao número total de neurônios.
Fioretto, E.T.
94
Conclusões
Fioretto, E.T.
95
7 CONCLUSÕES
Com base no delineamento estereológico estocástico empregado no presente estudo,
julgamos poder concluir:
1) A ganglionectomia unilateral do gânglio cervical cranial em ovinos é uma técnica
confiável e realizável para mimetizar os sinais de síndrome de Horner.
2) A hipertermia da orelha foi facilmente diagnosticada em todos os grupos de estudo
sendo um sinal importante para o diagnóstico clínico da doença, juntamente com a presença
de ptose até a 8ª semana.
3) A ganglionectomia unilateral ocasionaria uma seqüência de eventos
morfoquantitativos celulares na seguinte ordem proposta:
3.1) Proliferação celular no gânglio cervical cranial remanescente.
3.2) Hipertrofia neuronal (núcleo e corpo celular).
3.3) Perda neuronal a partir da terceira semana, sendo mais acentuada a partir da oitava
semana.
4) Devido aos achados morfoquantitativos expressos em 3, estudos futuros devem
abranger dois aspectos:
4.1) Comprovar a possibilidade de maior produção de NGF “nerve growth factor” pelo
território denervado.
4.2) Comprovar a probabilidade da inervação cruzada a partir do proposto em 4.1.
Fioretto, E.T.
96
Referências
Fioretto, E.T.
97
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