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MÔNICA CRISTINA ZANDONÁ MELEIRO
A influência do estresse experimentado por cavalos de corrida, em
determinados momentos de sua rotina, sobre a função imune in vitro
SÃO PAULO
2006
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MÔNICA CRISTINA ZANDONÁ MELEIRO
A influência do estresse experimentado por cavalos de corrida, em
determinados momentos de sua rotina, sobre a função imune in vitro
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para a obtenção do
título de Doutor em Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de Concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres
Orientadora:
Profa. Dra. Irvênia Luiza de Santis Prada
São Paulo
2006
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FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome da autora: ZANDONA MELEIRO, Mônica Cristina
Título: A influência do estresse experimentado por cavalos de corrida, em
determinados momentos de sua rotina, sobre a função imune in vitro
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para a obtenção do
título de Doutor em Ciências
São Paulo, ___/___/______
Banca Examinadora
Prof. Dr. Instituição:
Assinatura: Julgamento:
Prof. Dr. Instituição:
Assinatura: Julgamento:
Prof. Dr. Instituição:
Assinatura: Julgamento:
Prof. Dr. Instituição:
Assinatura: Julgamento:
Prof. Dr. Instituição:
Assinatura: Julgamento:
Dedico esta tese
Aos meus avós, Zélia (in memorian), Ricieri (in memorian), Zelinda e
Antônio (in memorian), pela sorte da convivência, pelo carinho e aconchego,
Aos meus pais Elisabet e Osvaldo, pelo amor, pelo cuidado, pelo exemplo,
pela educação e confiança,
Aos meus irmãos Ricieri e César, pela eterna proteção, pelo carinho e pelo
respeito,
Aos meus padrinhos Cleide e Roque (in memorian) e ao meu primo
Alessandro, pelo incentivo, pelo afeto e preocupação,
Ao Júlio, pelo amor, pela amizade, pelo respeito e pela compreensão, que
aprendemos a cultivar em todos esses anos.
E aos belos e pacientes cavalos...
Azul da Guanabara, Belo da Guanabara, Bigorrilho, Condesir, Double
Cash, Ecstasy, El Belezon, Emdiadesol, Empire of Sun, Encanto de Birigui,
Espoleta, Eternidade, Expertise, Face Lifting, Fantástico Carter, Fanzoca,
Federada, Forewell to Arms, Fruit De La Passion, Galanteador, Genthry, Gigi da
Guanabara, Guardrail, Hot Willie, Imigrante Latino, Infinito Desejo, Intenta,
Internética, Isola Di Capri, Jagunço, Juma da Guanabara, Ketter, King Wish,
Leme da Guanabara, Lucky Dance, Luna da Guanabara, Mac Bright, Mimo da
Guanabara, Navegantes, Necka, Noctlúcio, Oportunitas, Pan Comido, Pegador,
Peri da Guanabara, Pericoloso, Piaggia, Pontocom, Popó da Guanabara,
Quimilagrosa, Raloocaí, Russianballet, Tequila Anis, Textura, Tupi da
Guanabara, Ubatã Faighter, Velásquez, Xambuia
AGRADECIMENTOS
Esta tese não teria sido possível sem a ajuda de um grande número de pessoas e espero
conseguir traduzir minha gratidão a todos que tiveram participação na sua realização, de
forma direta ou não.
Devo muito às instituições Universidade de São Paulo e Jockey Club de São Paulo que
me forneceram condições e apoio indispensáveis para a execução deste trabalho.
Agradeço à Prof
a
. Dra. Irvênia Luiza de Santis Prada, pela orientação, pela
confiança, pela paciência e por ter me dado a oportunidade de dividir momentos difíceis com
uma pessoa tão querida e admirada pela sua postura pessoal e profissional, desde a minha
graduação. Agradeço por permitir-me escolher trabalhar com a espécie eqüina, que sempre me
despertou um grande interesse, e por apresenta-me às pessoas certas, no momento certo,
contatos imprescindíveis que simplificaram muito o meu percurso.
Ao Dr. Thiago Salles Gomes pela proposta do trabalho, pelo crédito e pelas
pertinentes perguntas e sugestões, que direcionaram o processo de confecção do trabalho
escrito. Agradeço também sua compreensão nos momentos em que a Cris esteve ausente,
enquanto me orientava no laboratório.
À Dra. Cristina de Oliveira Massoco Salles Gomes pelas inúmeras sugestões,
pela paciência, pela co-orientação, por seu incansável interesse, por estar sempre disposta a
compartilhar conhecimento, experiência, tempo e, como se isto não bastasse, material de
laboratório. Agradeço, ainda, por ter sido a maior incentivadora para concretização deste
trabalho e por efetuar o providencial contato com o Departamento de Patologia da FMVZ-
USP. Obrigada pela amizade, pelo carinho e por entender meu “priming”.
Ao Dr. André Anzanello T. A. Carrascoza, pelas sugestões no planejamento do
projeto, pelo contato com os proprietários, os treinadores, os gerentes, os tratadores, bem como
outros colegas médicos veterinários, e, mais ainda, por tornar muito fácil para mim o convívio
com todas estas pessoas. Agradeço a confiança e a permissão de utilizar os cavalos que se
encontravam sob sua responsabilidade. Obrigada, ainda, por dedicar seu tempo, sua paciência
e por fornecer todas as informações necessárias a respeito dos animais.
À Dra. Maria Lourdes dos Santos, coordenadora da Divisão de Assistência
Veterinária do JCSP pela receptividade e credibilidade no trabalho. A convivência com sua
equipe tornou a espera entre os páreos bastante agradável e divertida.
Ao Dr. Regis Pio Monteiro da Silva, chefe do setor de coleta de material biológico
do Departamento de Controle e Pesquisa Antidopagem pelo acesso ao material dos cavalos
encaminhados ao anti-dopping, e, principalmente, pela paciência e confiança.
À Prof
a
. Dra. Maria Angélica Miglino pela oportunidade e pela dedicação na
condução do Programa de Pós-graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres,
do VCI.
Ao Prof. Dr. José Roberto Kfouri Junior pelo crédito, pela forma acolhedora que
recebe seus pós-graduandos, pelo respeito e pela complacência que teve diante dos meus
horários e contratempos, enquanto estive sob sua orientação.
Ao Prof. Dr. Pedro Primo Bombonato pelas advertências, pela percepção criteriosa
do texto e pelas sugestões que auxiliaram na confecção do trabalho escrito.
À Prof
a
. Dra. Paula de Carvalho Papa pela amizade, pelos sábios conselhos de
convivência, pela confiança e abertura que oferece aos seus pós-graduandos e que estendeu a
mim, em momentos bastante oportunos.
Ao Prof. Dr. Luís Carlos de Sá Rocha, do VPT, pela credibilidade e por permitir a
utilização do Laboratório de Farmacologia Aplicada e Toxicologia.
À Dra. Adele Caterino de Araújo, pela revisão do trabalho escrito, pelas sugestões,
pela amizade e, principalmente, pelo entusiasmo que sempre transmitiu em relação à pesquisa
científica e que continua a contagiar quem tem a sorte de conhecê-la.
Aos professores, colegas de pós-graduação e funcionários do VCI pelo agradável
convívio e companheirismo.
Ao Maicon Barbosa da Silva e à Jaqueline Martins de Santana pela dedicação,
pela constante atenção aos procedimentos burocráticos e pela forma afetuosa com que tratam
os pós-graduandos do departamento.
À Laura Artoni pelo carinho, pelo apoio, pela amizade e confiança.
Alexandre Lourenço, César Augusto Dinola, e Jefferson Victor Russo pela
convivência agradável e pela compreensão da priorização dada a este trabalho, quando se fez
necessário.
À Monica Akemi Sato pela paciência, pelo convívio, pelo auxílio nas desafiantes
aulas de bioquímica e pelas sugestões de estatística e inglês.
À Sandra Mayumi Nishi pela amizade, pela paciência e pelo apoio nos momentos de
incerteza, além da ajuda imprescindível e prontidão nos cálculos estatísticos.
À Sandra Kitamura pelo convívio, pelas sugestões na apresentação dos resultados e
pela execução da etapa final análise estatística.
Aos pós-graduandos do VPT pela acolhida; em especial, Glaucie Jussilane Alves,
RenatoCouto de Moraes e Mônica Sakai pelo auxílio em importantes etapas e por me
ensinarem valiosos “atalhos”.
Aos funcionários do Laboratório de Farmacologia Aplicada e Toxicologia do VPT:
Magali Caetano de Souza, Priscila Sales Correa e Ricardo Batista de Souza, que
estiveram sempre presentes e tornaram o trabalho mais simples e descontraído.
À Priscila Viau Furtado, do Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento
de Reprodução Animal da FMVZ-USP pela paciência e pela realização dos testes de dosagem
da concentração sérica de cortisol.
A todos os funcionários do JCSP, em especial, aos enfermeiros Antônio de Carvalho,
Francisco Soares Pereira, Josivaldo Macedo e Rogério Puig Prado, pelo convívio e
respeito.
Aos proprietários, aos treinadores, aos gerentes e aos tratadores, pela confiança.
Às secretárias Cláudia Lima, Dayse Maria Alves Flexa, Joana Ferreira e Sandra
Marceo do serviço de Pós-graduação e à bibliotecária Elza Maria Faquim da Biblioteca
Virginie Buff D’Apice da FMVZ-USP pela paciência, presteza e orientação dos procedimentos
administrativos.
À seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, onde aprendi sobre a vida
profissional, da perseverança diante da escassez de recursos e da ética necessária para que haja
ciência.
“Um quadro nunca é terminado – ele
simplesmente pára em lugares interessantes”
Paul Gardner
RESUMO
ZANDONÁ MELEIRO, M. C. A influência do estresse experimentado por cavalos
de corrida, em determinados momentos de sua rotina, sobre a função imune in
vitro. [Influence of stress on in vitro immune function in Thoroughbred racehorses].
2006. 108 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
Embora os cavalos apresentem características excepcionais frente a situações de
estresse na natureza, foi considerada a possibilidade do cavalo de corrida ser
submetido, por vezes, a alguma situação de estresse, que afetasse sua saúde e
bem estar. Foram verificadas alterações do número e da função de populações
celulares implicadas com a defesa, principalmente neutrófilos e linfócitos. Trinta
cavalos de corrida da raça puro-sangue inglês, locados no Jockey Club de São
Paulo, na cidade de São Paulo foram utilizados. Os animais foram divididos em dois
grupos e as amostras de sangue foram coletadas em momentos diferentes da rotina
dos animais. No grupo I, foram coletadas amostras onze dias antes da corrida (-
11d), imediatamente após a corrida (0d), um dia após a corrida (+1d), dois dias após
a corrida (+2d) e três dias após a corrida (+3d). Enquanto, no grupo II as amostras
foram coletadas oito dias antes da corrida (-8d), imediatamente após a corrida (0d),
um dia após a corrida (+1d) e cinco dias após a corrida (+5d). Foram realizados
ensaios de fagocitose e burst oxidativo dos neutrófilos, determinação de cortisol
sérico, ensaios de apoptose, linfoproliferação e hemograma. A função de fagocitose,
tanto em porcentagem, quanto em intensidade, mostrou-se diminuída nas amostras
coletadas imediatamente após a corrida, nos dois grupos de animais. Os valores
médios de burst oxidativo das amostras coletadas imediatamente após a corrida, dos
animais do grupo I apresentaram-se diminuídos. Não foram encontradas diferenças
estatísticas significantes entre os resultados obtidos em relação às células
apoptóticas, quando os diferentes momentos foram comparados; o mesmo ocorreu
quando foi realizado o confronto dos valores de do ensaio de linfoproliferação. Os
valores médios dos níveis séricos de cortisol apresentaram-se aumentados no
momento imediatamente após a corrida, em relação aos valores dos outros
momentos, nos dois grupos de animais. Quanto aos dados de hemograma, houve
aumento do número percentual de neutrófilos no momento imediatamente após a
corrida quando foi realizada comparação com os demais momentos. Nos cavalos
estudados, ainda que tenha sido encontrada uma diminuição transitória na função
dos neutrófilos, a função adaptativa não chegou a ser acometida, que sugere que,
embora se constitua em um exercício de alta intensidade, a fugacidade da corrida
acabe por evitar danos maiores, em animais bem condicionados e adaptados a
situações de estresse.
Palavras-chave: Função imune. Cortisol. Exercício de alta intensidade. Estresse. Cavalos de corrida.
ABSTRACT
ZANDONÁ MELEIRO, M. C. Influence of stress on in vitro immune function in
Thoroughbred racehorses. [A influência do estresse experimentado por cavalos de
corrida, em determinados momentos de sua rotina, sobre a função imune in vitro].
2006. 108 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
Although the horses can present exceptional responses during stress situations in
the nature, it was raised the possibility that racehorses under certain stress
conditions could develop changes that may affect their health and welfare.
Alterations of the number and function of cells that are involved with the defense
response, mainly neutrophils and lymphocytes populations were verified. Thirty
Thoroughbred racehorses housed at the Jockey Club de São Paulo, in São Paulo,
Brazil, were used in the present study. The animals were divided in two groups and
blood samples were collected at different moments of their routine. In group I, the
samples were collected eleven days before race (-11d), immediately after race (0d),
one day (+1d), two days (+2d) and three days after race (+3d). In the group II, the
samples were collected eight days before race (-8d), immediately after race (0d), one
day (+1d) and five days after race (+5d). Phagocytosis assay and oxidative burst
activity of neutrophils, serum cortisol determination, apoptosis and lymphocyte
proliferation assay and haematology tests were performed. The percentage and
intensity of phagocytosis functions decreased in samples collected immediately after
race, in the two groups of animals. The mean values of oxidative burst activity of
samples collected immediately after race, from animals of group I also decreased.
Statistically significant differences between the results weren’t obtained in relation to
the apoptotic cells, when compared on different moments and the same occurred in
relation to the lymphocyte proliferation values. The mean values of serum cortisol
levels increased at the moment immediately after race when compared with the
values of the other moments, in both groups of animals. In relation to the
haematologycal values, the percentage of neutrophils was increased at the moment
immediately after race when compared with the other moments. Even though the
transitory reduction in the neutrophils function has occurred, the adaptive function
was not impaired, which suggest that, in spite of the high intensity of this exercise,
the short-term race can prevent further damages in well-conditioned and stress-
adapted animals.
Key words: Immune function. Cortisol. High intensity exercise. Stress. Racehorses.
LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1 Fluxograma representativo do ensaio de fagocitose ........... 48
Figura 4.2 Fluxograma representativo do ensaio do burst oxidativo .... 50
Figura 4.3 Fluxograma representativo do ensaio de apoptose ............. 51
Figura 4.4 Fluxograma representativo do preparo das células e
cultura in vitro do ensaio de linfoproliferação ....................... 54
Figura A1 Esquema do módulo de treinamento A ................................ 104
Figura A2 Esquema da citometria de fluxo ........................................... 105
Figura A3 Esquema da interação entre sistema nervoso, sistema
endócrino e sistema imune .................................................. 106
Figura A4 Esquema dos mecanismos moleculares dos efeitos dos
glicocorticóides sobre a função da célula imune ................. 108
LISTA DE QUADROS
Quadro 4.1 Momentos de colheita determinados em relação ao dia da
corrida, nos dois grupos de cavalos .................................... 57
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 5.1 Representação dos dados de citometria de fluxo dos
leucócitos do sangue periférico dos cavalos participantes
do estudo, após lise dos eritrócitos, em um dot
plot........................................................................................ 61
Gráfico 5.2.A Valores referentes aos resultados de porcentagem de
fagocitose realizada pelos neutrófilos das amostras dos
animais do grupo I (1 a 15)................................................... 64
Gráfico 5.2.B Valores referentes aos resultados de porcentagem de
fagocitose realizada pelos neutrófilos das amostras dos
animais do grupo II (16 a 30)................................................ 64
Gráfico 5.2.C Valores de intensidade de fagocitose dos neutrófilos,
expressos em intensidade média de fluorescência das
amostras dos animais do grupo I (1 a 15)............................ 64
Gráfico 5.2.D Valores de intensidade de fagocitose dos neutrófilos,
expressos em intensidade média de fluorescência das
amostras dos animais do grupo II (16 a 30)......................... 64
Gráfico 5.2.E Valores obtidos no ensaio de burst oxidativo expressos em
intensidade média de fluorescência em escala logarítmica
dos neutrófilos das amostras dos animais do grupo I (1 a
15)......................................................................................... 64
Gráfico 5.2.F Valores obtidos no ensaio de burst oxidativo expressos em
intensidade média de fluorescência em escala logarítmica
dos neutrófilos das amostras dos animais do grupo II (16 a
30)......................................................................................... 64
Gráfico 5.3 Representação dos valores médios do total de células
apoptóticas encontradas nas amostras dos animais do
grupo II (16 a 30), nos diferentes momentos de
colheita.................................................................................. 68
Gráfico 5.4 Representação dos dados de citometria de fluxo, em um
dot plot, dos leucócitos mononucleares do sangue
periférico dos cavalos participantes do estudo, após
cultura de 72h....................................................................... 69
Gráfico 5.5 Histograma da fluorescência do CFSE (diacetato de
carboxifluoresceína) dos linfócitos do sangue periférico
eqüino após cultura de 72h, sem utilização de mitógenos
(controle)............................................................................... 70
Gráfico 5.6 Histograma da fluorescência do CFSE (diacetato de
carboxifluoresceína) dos linfócitos do sangue periférico
eqüino após cultura de 72h, com utilização de
concanavalina A.................................................................... 71
Gráfico 5.7 Representação dos resultados de hemograma referentes à
contagem do número relativo (%) de neutrófilos (Nø) nos
diferentes momentos de colheita.......................................... 74
Gráfico 5.8 Representação dos resultados de hemograma referentes à
contagem do número relativo (%) de linfócitos (Lø) nos
diferentes momentos de colheita.......................................... 74
Gráfico 5.9 Representação dos valores médios de níveis séricos de
cortisol das amostras provenientes dos animais 1 a 15,
obtidos nos diferentes momentos de colheita....................... 78
Gráfico 5.10
Representação dos valores médios de níveis séricos de cortisol
das amostras provenientes dos animais 16 a 30, obtidos nos
diferentes momentos de colheita...................................................
78
LISTA DE TABELAS
Tabela 5.1 Valores representativos da média ± desvio-padrão da
porcentagem de células que realizaram fagocitose e da
intensidade do processo das amostras coletadas dos
animais do grupo I (1 a 15) .................................................. 63
Tabela 5.2 Valores representativos da média ± desvio-padrão da
porcentagem de células que realizaram fagocitose e da
intensidade do processo das amostras coletadas dos
animais do grupo II (16 a 30) ............................................... 63
Tabela 5.3 Valores representativos da média ± desvio-padrão do burst
oxidativo realizado com amostras coletadas dos animais
do grupo I (1 a 15)................................................... 66
Tabela 5.4 Valores representativos da média ± desvio-padrão do burst
oxidativo realizado com amostras coletadas dos animais
do grupo II (16 a 30) ............................................... 66
Tabela 5.5 Valores representativos da média ± desvio-padrão dos
resultados do ensaio de apoptose realizado com amostras
coletadas dos animais do grupo II (16 a 30) ........................ 68
Tabela 5.6 Valores representativos da média ± desvio-padrão dos
resultados do ensaio de linfoproliferação realizado com
amostras coletadas dos animais do grupo II (16 a 30) ........ 72
Tabela 5.7 Valores representativos da média ± desvio-padrão dos
resultados do hemograma realizado com amostras
coletadas dos animais do grupo II (16 a 30) ........................ 75
Tabela 5.8 Valores representativos da média ± desvio-padrão da
concentração sérica de cortisol em amostras coletadas
dos animais do grupo I (1 a 15) ........................................... 77
Tabela 5.9 Valores representativos da média ± desvio-padrão da
concentração sérica de cortisol em amostras coletadas
dos animais do grupo II (16 a 30) ........................................ 77
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Contagem do número relativo (porcentagem)
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
AIF Fator indutor de apoptose
AMPK Proteína-quinase A ativada por adenosina monofosfato
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina 5’trifosfato
Bø Basófilos
CFSE Carboxifluoresceína
CFR Fator liberador de corticotrofina
CMSP Células mononucleares do sangue periférico
ConA Concanavalina A, lectina da Conavalia ensiformis
CR Receptor para componente do sistema complemento
DAV Divisão de Assistência Veterinária
DCFH-DA 2,7 Diacetato de diclorofluoresceína
DNA Ácido desoxirribonucléico
EDTA Ácido etileno diaminotetracetato sódico
Eø Eosinófilos
Fc Fragmento da molécula de anticorpo resultante da digestão pela
papaína
FITC Isotiocianato de fluoresceína
GM-CSF Fator estimulador de colônias de monócitos e granulócitos
Hb Hemoglobina
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution
HCM Hemoglobina corpuscular média
Hct Volume globular (hematócrito)
He Hemácias
HPA Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
IFN Interferon
IL Interleucina
JCSP Jockey Club de São Paulo
LDH Laboratório de Dosagens Hormonais
Leu Número total de leucócitos
Lø Linfócitos
MCHC Concentração hemoglobínica corpuscular média
Mø Macrófagos
NFκB
Fator nuclear de transcrição
Nø Neutrófilos
PBS Solução salina tamponada
PHA Fitohemaglutinina
PI Iodeto de propídeo
PSI Puro sangue inglês
PWM
Pokeweed
R-10 Meio RPMI acrescido de 10% de soro fetal eqüino
SaPi Staphylococcus aureus marcadas com iodeto de propídeo
SFE Soro fetal eqüino
SNS Sistema nervoso simpático
TGF Fator transformador de crescimento
TNF Fator de necrose tumoral
VCM Volume corpuscular médio
LISTA DE SÍMBOLOS
µg
micrograma
µL
microlitro
Ca
2+
íons cálcio
CO
2
dióxido de carbono
dL decilitro
g (centrífuga)
m metro
mL mililitros
mM milimolar
ºC graus Celsius
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ...................................................................................... 25
2
REVISÃO DE LITERATURA ................................................................ 29
3
OBJETIVOS .......................................................................................... 42
4
MATERIAL E MÉTODO ........................................................................ 43
4.1
LOCAL .................................................................................................. 43
4.2
ANIMAIS ................................................................................................ 43
4.2.1
Módulo de treinamento A ...................................................................... 45
4.3
COLETA DAS AMOSTRAS ................................................................... 46
4.4
ENSAIO DE FAGOCITOSE .................................................................. 47
4.5
ENSAIO DO BURST OXIDATIVO ......................................................... 49
4.6
ENSAIO DE APOPTOSE ...................................................................... 50
4.7
ENSAIO DE LINFOPROLIFERAÇÃO ................................................... 52
4.7.1
Preparo das células ............................................................................... 52
4.7.2
Cultura in vitro ....................................................................................... 55
4.8
CITOMETRIA DE FLUXO ..................................................................... 55
4.9
HEMOGRAMA ....................................................................................... 56
4.10
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE CORTISOL .... 57
4.11
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ..................................................... 57
4.12
ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................... 59
5
RESULTADOS ...................................................................................... 60
5.1
PREPARAÇÃO CELULAR E CITOMETRIA DE FLUXO PARA OS
ENSAIOS DE FAGOCITOSE, BURST OXIDATIVO E APOPTOSE ..... 60
5.1.1
Ensaio de Fagocitose ............................................................................ 61
5.1.2
Ensaio do Burst Oxidativo ..................................................................... 65
5.1.3
Ensaio de Apoptose .............................................................................. 67
5.2
ENSAIO DE LINFOPROLIFERAÇÃO ................................................... 69
5.3
HEMOGRAMA ....................................................................................... 72
5.4
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE CORTISOL .... 75
6
DISCUSSÃO ......................................................................................... 79
7
CONCLUSÕES ..................................................................................... 95
REFERÊNCIAS ..................................................................................... 96
APÊNDICES .......................................................................................... 103
ANEXOS ............................................................................................... 105
“A coisa mais bonita que podemos experimentar
é o mistério”
Albert Einstein
25
1 INTRODUÇÃO
Particularmente bem projetados para um exercício de alta intensidade, os
cavalos sempre se apresentaram na natureza como atletas singulares, com
capacidade de prover um esforço explosivo na fuga de seus predadores. Desde o
final da Idade Média, na Inglaterra, esta característica tem sido explorada através de
corridas de cavalos.
Com a concepção do Jockey Club inglês, em 1750, iniciou-se a importação de
garanhões árabes e bérberes que, junto às éguas inglesas de batalha, fixaram os
pilares da criação da raça Thoroughbred ou puro-sangue inglês de corridas
(BARCELLOS, 2002).
Embora os cavalos apresentem características excepcionais, como a
capacidade de aumentar seu consumo de oxigênio e sua ventilação muito
rapidamente, quando necessário; ou mesmo de contrair o baço ao início do exercício
e dobrar sua capacidade de transporte de oxigênio sangüíneo; ou ainda, de
suportarem uma hipóxia arterial, e, por vezes, até mesmo hipercapnia, durante um
grande esforço, no momento em que foram designados à competição, acabaram por
serem submetidos a situações de estresse, que não ocorreriam, nem de maneira
crônica, no ambiente selvagem.
Eles permanecem confinados durante grande parte do tempo e submetidos a
uma rotina de exercícios pré-estabelecida. Frente a este cenário, característica de
grandes centros de treinamento, considerou-se a possibilidade do cavalo de corrida
experimentar, por vezes, alguma situação de estresse, que acabasse por afetar sua
saúde e bem estar, e, conseqüentemente, sua performance.
26
Diante do conhecimento da interação entre as respostas do sistema
neuroendócrino e do sistema imunológico (BESEDOVSKY et al., 1983), e da
reconhecida suscetibilidade de cavalos de corridas a infecções respiratórias, surgiu a
preocupação de se verificar o status em que se encontravam alguns componentes
sangüíneos - solúveis e celulares - implicados com a capacidade de defesa dos
cavalos frente a eventuais adversidades, em resposta ao exercício que praticavam
no seu dia-a-dia.
O sistema imune tem como função principal restabelecer a homeostasia
através de vários mecanismos de defesa. De acordo com suas características
funcionais, os componentes deste sistema podem ser classificados em duas
categorias principais: inatos e adaptativos ou adquiridos. Os primeiros respondem a
estímulos de maneira pouco específica frente aos antígenos e estão sempre
presentes em níveis basais. Os segundos atuam de modo altamente específico, com
indução de memória (PIER et al., 2004).
Perante a prontidão do neutrófilo polimorfonuclear e seu importante papel na
defesa não-específica do hospedeiro, através da fagocitose de patógenos e da
síntese de citocinas, e, somando-se a isto, a constatação de que o exercício é capaz
de influenciar direta e indiretamente a função e a distribuição destas células no
organismo (PYNE, 1994), optou-se, neste trabalho, por avaliar a atividade de
englobamento de antígenos e a ação microbicida desta população celular,
respectivamente atividade fagocítica e de burst oxidativo, nas amostras coletadas
dos cavalos de corrida. A citometria de fluxo, metodologia que permite averiguar a
atividade das células através da realização de ensaios simultâneos e com uma
pequena quantidade de material, foi o instrumento escolhido para esta análise. Além
de permitir a avaliação da cinética celular de um grande número de células de forma
27
rápida e individual, o uso de anticorpos monoclonais marcados com substância
fluorescente, com especificidade para antígenos de superfície celular, torna
desnecessária a etapa de separação das células, que poderia consumir tempo e
alterar sua função (Anexo A).
Ainda com o uso de citometria de fluxo, pretendeu-se avaliar a resposta
proliferativa de linfócitos frente a mitógenos, a fim de se verificar a capacidade
funcional desta população em resposta a diferentes intensidades de exercício, uma
vez que a atividade física é capaz de induzir um estado semelhante a uma resposta
inflamatória deflagrada por um antígeno.
Também em relação aos linfócitos, com o propósito de investigar a regulação
da resposta desencadeada frente ao exercício, foram incluídos neste estudo,
ensaios de apoptose, principal mecanismo responsável por regular a homeostase do
sistema imune, ao promover o término da sua ativação.
A determinação do cortisol sérico e a realização de hemograma foram
consideradas relevantes, uma vez que o exercício promove, nos eqüinos, um
aumento da concentração deste hormônio no plasma e alteração do número total de
determinados grupos celulares (HODGSON; ROSE, 1994).
O fato de se utilizar o cavalo no seu contexto habitual, neste estudo, foi
sugerido em um momento oportuno, quando muito do conhecimento atual, no que se
refere à resposta fisiológica ao exercício em eqüinos, consiste no resultado de
estudos da avaliação de funções de diferentes sistemas corpóreos diante de um
exercício controlado, praticado sobre esteiras ergométricas. O exercício realizado
em tais aparelhos constitui-se em um método artificial que traz muitas vantagens
para um sistema de treinamento; porém, os dados obtidos desta forma não devem
ser extrapolados para um evento competitivo, uma vez que não há reprodução dos
28
efeitos do movimento do ar, da superfície do solo, do impacto e do controle de
posicionamento exercido pelo jóquei no momento em que os animais são
exercitados sobre a grama ou a areia e, tampouco, de eventuais alterações
comportamentais produzidas por estímulos provenientes do ambiente ou da própria
competição.
Com a intenção de verificar as condições em que se encontravam alguns
componentes sangüíneos - relacionados com potencial de defesa - diante do
estímulo do exercício, foram utilizadas amostras de sangue periférico, provenientes
de eqüinos atletas locados no Jockey Club de São Paulo, em determinados
momentos de sua rotina, representados como períodos em que foram submetidos a
diferentes distâncias e intensidades de exercício. Tais amostras foram destinadas
aos ensaios de fagocitose, de burst oxidativo, de apoptose e linfoproliferação, bem
como à determinação da concentração de cortisol e à realização do hemograma.
29
2 REVISÃO DE LITERATURA
No momento em que se realiza um retrospecto da literatura científica a
respeito dos efeitos do exercício sobre o sistema imune, encontram-se artigos que,
aparentemente, apresentam resultados paradoxais. Ao verificar estas publicações, o
que se nota, é que a maneira como o exercício afeta o sistema imune depende de
vários fatores, como a função imune analisada, a duração e a intensidade do
exercício, bem como o momento da mensuração da função imune em relação à
prática física.
Em geral, em seres humanos, o exercício de alta intensidade, com uma
duração curta, causa uma imunossupressão transitória, com tendência a exacerbar
conforme aumentam a intensidade e a duração do exercício. Já, o treinamento
moderado está tipicamente associado a um aumento da resposta imune e uma
melhora da resistência à doença (FERRY et al., 1990; KENDAL et al., 1990;
MACNEIL et al., 1991; NIEMAN et al., 1989; NIEMAN et al., 1990; NIEMAN et al.,
1992; PEDERSEN et al., 1988).
Em várias espécies, incluindo a eqüina, o exercício provoca mudanças no
número e na distribuição de leucócitos circulantes. A leucocitose está entre as
respostas mais consistentes frente ao exercício e, de forma geral, ocorre após todos
os tipos de exercício (FIELD et al., 1991; KEAST et al., 1988; MCCARTHY; DALE,
1988). A magnitude da leucocitose tende a aumentar com a intensidade e a duração
do exercício, e diminuir com um melhor estado de condicionamento (GIMENEZ et
al., 1986; MCCARTHY; DALE, 1988). É freqüente que a leucocitose observada em
associação com o exercício de alta intensidade seja bifásica, com uma mobilização
30
inicial dos linfócitos, seguida dos neutrófilos e monócitos (MCCARTHY; DALE,
1988). Normalmente, o número de leucócitos retorna aos níveis basais dentro de
vinte e quatro horas ou menos. Durante a recuperação, o número total de linfócitos
chega aos valores pré-exercício antes dos neutrófilos, o que resulta em um aumento
da taxa neutrófilo:linfócito (N:L). Em alguns casos, o número de linfócitos pode
chegar a assumir valores inferiores aos níveis basais, antes de alcançá-los (HINES
et al., 1996).
Em um experimento realizado em cavalos sob treinamento, as alterações
encontradas na taxa N:L frente ao exercício apresentaram-se similares às variações
ocorridas nesta taxa após administração de ACTH
1-24
. Esta observação levou os
autores do trabalho a concluir que as modificações da taxa N:L poderiam ser
utilizadas como um índice da atividade adrenocortical em cavalos adultos
(ROSSDALE et al., 1982).
Ao vivenciarem uma situação real, como participantes de uma corrida, ou em
uma rápida sessão de treinamento, cavalos Thoroughbred condicionados
apresentaram um aumento inicial no número de linfócitos associado a um declínio na
taxa N:L, que foi seguido de um aumento no número de neutrófilos e na taxa N:L
durante a recuperação (SNOW et al., 1983).
Quando submetidos a um exercício de alta intensidade, durante um período
breve, sobre esteira, cavalos Thoroughbred tiveram um aumento significante na
contagem de leucócitos totais, na contagem de neutrófilos e na taxa N:L, em
amostras coletadas de quatro a seis horas após o exercício. Estas observações
31
foram feitas tanto em animais condicionados (CHURCH et al., 1987 apud HINES et
al., 1996)
1
, quanto em não condicionados (WONG et al., 1992).
Em exercícios com duração prolongada, como ocorre em provas de enduro, o
número de neutrófilos apresentou-se aumentado logo após o término da prova,
contudo, houve também um declínio significante no número de linfócitos (CARLSON
et al., 1976; HINES et al., 1994 apud HINES et al., 1996)
2
. Uma neutrofilia
significante foi também encontrada em amostras coletadas de cavalos
condicionados, após uma hora e após um dia de participação em um enduro de
oitenta quilômetros. Nas amostras coletadas três dias após o evento, os valores já
haviam retornado ao normal. Foi encontrada uma diminuição do número de linfócitos
em todas as amostras coletadas após o término da prova, que foi mais evidente nas
amostras coletadas depois de uma hora (ROBSON et al., 2003).
Ao se avaliar o número total de leucócitos em cavalos não condicionados, que
passaram por um período de treinamento, não foram demonstradas alterações
significativas sobre seus valores basais, ou seja, os valores encontrados ao repouso
antes e após o treinamento (ROSE; HODGSON, 1982; SNOW et al., 1983).
Além da observação de mudanças em relação ao número de leucócitos
circulantes, ao se consultar vários artigos, notam-se também alterações na função
destas células. A maior parte das investigações teve como foco a imunidade inata, já
que estas respostas iniciais frente aos patógenos desempenham um papel central
na resistência à doença e no desenvolvimento subseqüente da resposta imune
adaptativa ou específica. Uma atenção preferencial foi destinada à avaliação da
1 CHURCH, D.B.; EVANS, D.L.; LEWIS, D.R. The effect of exercise on plasma
adrenocorticotrophin, cortisol and insulin in the horse and adaptations with training. In: GILLESPIE,
J.R.; ROBINSON, N.E. Equine Exercise Physiology. Davis: ICEEP, 1987. p. 506-515.
2 HINES, M.T.; LEROUX, A.J.; SCHOTT, H.C. Changes in lymphocyte subpopulations
following prolonged exercise in horses. Proceedings of the 12
th
Annual Veterinary Medical Forum, San
Francisco, 1994, p. 1016.
32
função do neutrófilo e da célula natural killer (NK) (WONG et al., 1992; HOROHOV et
al., 1996).
Os neutrófilos representam a principal subclasse de granulócitos, em termos
de número de células circulantes, bem como de importância quanto à capacidade de
realizar fagocitose. Possuem núcleo multilobulado e seu citoplasma contém três
tipos de grânulos, onde ocorre armazenamento de enzimas. Sua membrana
plasmática caracteriza-se por um conjunto de moléculas de superfície que incluem
moléculas de adesão, receptores para porção Fc de imunoglobulinas e receptores
para complemento. Assim, a fagocitose é facilitada quando os alvos fagocíticos
estão ligados a proteínas do complemento ou anticorpos presentes no soro do
hospedeiro (PIER, 2004).
A fagocitose constitui um processo pelo qual uma célula pode internalizar e
digerir material particulado. Em mamíferos, este mecanismo está implicado com a
defesa contra agentes infecciosos, o remodelamento dos órgãos no
desenvolvimento embrionário, a reparação tecidual após uma lesão e a remoção de
células senescentes. Como suas funções são essenciais para sobrevivência e
homeostasia, há uma complexa rede de sinalização envolvida para regulação deste
processo (PAUL, 2003).
Quando os neutrófilos fagocitam partículas, o fagossomo funde com o
lisossomo e produz uma estrutura denominada fagolisossomo. Os grânulos de
estoque fundem-se ao fagolisossomo e o material englobado é degradado. Há
liberação de defensinas, enzimas que tornam a membrana de patógenos permeável;
e oxidases, que geram espécies reativas de oxigênio (ERO), que destroem os
patógenos, em um processo referido como burst oxidativo. Os neutrófilos produzem
citocinas com função pró-inflamatória, como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8; e citocinas
33
que modulam as atividades de linfócitos T e B, como o antagonista do receptor de
IL-1 e TGF-β (PIER, 2004).
Em cavalos não condicionados, submetidos a um treinamento intenso de
quatro a sete semanas, com o objetivo de participarem de um enduro de três dias,
percebeu-se uma diminuição da função fagocítica dos neutrófilos para valores
menores que os encontrados antes do início do programa ou em um treinamento
leve - tanto no período de repouso quanto no pós-exercício - em amostras coletadas
semanalmente, nas diferentes fases do treinamento. A atividade de burst oxidativo
destas células, no entanto, permaneceu inalterada (BUSCHMANN; BAUMANN,
1991).
Ainda em cavalos não condicionados, submetidos a exercícios de alta
intensidade, por períodos curtos (seis minutos de exercício ao passo, ao trote e
canter, seguidos de dois a quatro minutos e meio de exercício de alta velocidade),
sobre esteiras, houve uma diminuição transitória da atividade de burst oxidativo e do
índice quimiotático dos neutrófilos, após vinte e quatro horas da execução do
exercício (WONG et al., 1992); enquanto, em um outro experimento, foi encontrada
também uma inibição significativa da atividade do burst oxidativo, já aos trinta
minutos após a realização do exercício (ADAMSON, 1994 apud HINES, 1996)
3
.
A avaliação de neutrófilos de sangue periférico eqüino, com a utilização de
citometria de fluxo, foi realizada inicialmente com a utilização de beads (FOERSTER;
WOLF, 1990) ou de leveduras, marcados com substância fluorescente
(JOHANNISSON et al., 1995). O uso de espécies bacterianas conhecidas,
combinadas à substância fluorescente, foi estabelecido mais tarde em ensaios de
3 HINES, M.T.; LEROUX, A.J.; SCHOTT, H.C. Changes in lymphocyte subpopulations
following prolonged exercise in horses. Proceedings of the 12
th
Annual Veterinary Medical Forum, San
Francisco, 1994, p. 1016.
34
sangue periférico eqüino, com o propósito de aumentar a importância dos achados
experimentais no entendimento de eventos relacionados com a patogênese de
doenças (RAIDAL et al., 1998).
A atividade do burst oxidativo, estimulada pela fagocitose ou por estímulos
solúveis, promove um aumento no consumo de oxigênio não-mitocondrial e a
geração de metabólitos reativos do oxigênio. Dentro das células fagocíticas, estas
substâncias são importantes para destruição de microrganismos ingeridos. Nas
células não-fagocíticas, o metabolismo oxidativo aumentado é indicativo de ativação
celular. Os métodos de citometria de fluxo para a determinação do burst oxidativo
têm como base a mensuração das reações oxidativas intracelulares, de forma
individual. As células são permeadas por uma substância precursora não-
fluorescente, que é oxidada pelos componentes do burst oxidativo, a um produto
fluorescente (ADAMSON; SLOCOMBE 1995).
Com o uso de citometria de fluxo, cavalos Standardbred não condicionados,
sujeitos a um exercício de intensidade moderada, sobre esteira, mostraram a função
de fagocitose e a resposta de burst oxidativo aumentadas; enquanto os que foram
submetidos a um exercício de alta intensidade apresentaram um decréscimo
transitório e um aumento subseqüente na capacidade de fagocitose das células. A
atividade de burst oxidativo dos neutrófilos foi significantemente reduzida por seis
horas após o exercício e o retorno aos valores pré-exercícios ocorreu vinte e duas
horas pós-exercício (RAIDAL et al., 2000).
Alterações na atividade de burst oxidativo também estiveram presentes em
cavalos condicionados que participaram de uma prova de enduro de oitenta
quilômetros, com amostras coletadas antes, durante e após o término da prova.
35
Houve diminuição significativa da atividade de burst oxidativo após a prova, inclusive
na última amostra, coletada três dias após o evento (ROBSON et al., 2003).
Recentemente, com a utilização de técnicas mais simples que a citometria de
fluxo, foi realizada avaliação da função imunológica não específica (aderência,
quimiotaxia, fagocitose e testes de metabolismo oxidativo), em amostras de cavalos
não condicionados de raças diferentes (anglo-árabe e hispano-árabe), após um
período curto de exercício de intensidade moderada, em uma área de transição
aeróbica-anaeróbica, realizado sobre esteira. Não houve mudanças significativas na
resposta imune não específica, quando foram confrontados os valores encontrados
nas duas raças, em amostras coletadas antes e dentro de um minuto após o
exercício (ESCRIBANO et al., 2005a).
Em uma comparação entre cavalos condicionados e não condicionados frente
a um exercício de intensidade moderada, mostrou-se que o metabolismo oxidativo
dos neutrófilos foi maior no grupo condicionado que no outro, tanto antes quanto
imediatamente após o exercício. Foram também notadas diferenças quanto à
fagocitose destas células, os cavalos condicionados apresentaram valores médios
maiores de índice de fagocitose, porcentagem de fagocitose e eficiência de
fagocitose no estágio de recuperação e um aumento na porcentagem de fagocitose
imediatamente após o exercício, quando comparados aos não condicionados
(ESCRIBANO et al., 2005b).
Em relação à avaliação da resposta adaptativa frente ao exercício, a principal
forma de realização tem sido a mensuração da resposta proliferativa de linfócitos em
resposta a mitógenos e antígenos.
Os linfócitos são morfologicamente as células mais simples e funcionalmente
as mais distintas células do sistema imune. São as células efetoras da imunidade
36
adaptativa ou adquirida e podem ser subdivididas de acordo com suas moléculas de
superfície e sua função. Após haver reconhecimento do seu antígeno cognato,
entram em processo de ativação e proliferação e diferenciam-se em células efetoras
ou células de memória (PIER, 2004).
Com a utilização de cavalos condicionados, submetidos a um exercício de
alta intensidade, encontrou-se uma supressão da resposta proliferativa de linfócitos
com uso de mitógeno concanavalina A (ConA) e fitohemaglutinina (PHA) (KURCZ et
al., 1988). Em outra publicação, em cavalos não condicionados não foram
encontradas alterações na resposta dos linfócitos a mitógenos PHA, ConA ou
pokeweed (PWM) após exercício de mesma classificação quanto à intensidade
(WONG et al., 1992). Outro grupo de pesquisadores encontrou uma diminuição na
resposta proliferativa de linfócitos a PWM e vírus da influenza eqüina; e descreveu
utilizar condições semelhantes, ou seja, cavalos não condicionados e exercício de
alta intensidade (KEADLE et al., 1993). Estas variações foram relacionadas a
eventuais diferenças na condição de treinamento dos animais, no protocolo de
exercício e, mesmo, na sua intensidade, quando confrontadas em artigo de revisão
(HINES et al., 1996).
Um decréscimo consistente na proliferação de linfócitos foi observado durante
a execução de um exercício de alta intensidade, em cavalos que participaram de um
evento de três dias, independente do estado de treinamento. Não foram encontradas
alterações na responsividade de linfócitos ao repouso como um resultado de
treinamento intensivo (BUSCHMANN; BAUMANN 1991).
Cavalos Thoroughbred, condicionados, que participaram de corridas tiveram
uma redução significante da resposta de linfoproliferação frente a mitógenos PHA,
37
ConA e PWM, após um período de doze a dezesseis horas do término do evento
(NESSE et al., 2002).
Em um teste da capacidade proliferativa de linfócitos, obtidos do sangue
periférico de cavalos condicionados, foi encontrada uma diminuição da resposta
diante da estimulação com ConA, após realização de um exercício físico de
intensidade submáxima, sobre esteiras (CHIARADIA et al., 2005).
Acredita-se, porém, que mais importante que as observações e os resultados
encontrados nos diversos trabalhos, esteja a tentativa de se correlacionar variações
da função imune mensuradas in vitro e uma maior suscetibilidade à doença in vivo
(HOROHOV, 2003).
Observações feitas em cavalos Thoroughbred não condicionados, sujeitos a
um exercício de alta intensidade sobre esteira, indicaram que as respostas imunes in
vitro desencadeadas frente ao vírus da influenza eqüina e a PWM foram fortemente
inibidas. Segundo os autores, isto poderia ser interpretado como uma suscetibilidade
aumentada à infecção viral caso houvesse exposição ao vírus, na natureza, durante
ou após este tipo de exercício (KEADLE et al., 1993).
Dois artigos bastante interessantes, apresentados a seguir, discutem o
aumento da susceptibilidade frente a uma infecção experimental em animais que
foram submetidos a exercício de alta intensidade e programas de imunização.
Pôneis não condicionados submetidos a um protocolo rigoroso de exercício
sobre esteiras, seis semanas após serem imunizados com duas doses de vacina
comercial contendo vírus da influenza eqüina, foram suscetíveis à infecção
experimental pelo vírus da influenza eqüina. Os controles não exercitados foram
protegidos. Antes do início do programa de exercícios, os valores médios das
respostas de proliferação dos pôneis que seriam exercitados e dos pôneis
38
pertencentes ao grupo controle não foram significantemente diferentes. Porém, após
cinco dias de exercícios, o grupo de animais exercitados exibiu uma supressão
significante da resposta proliferativa quando os valores encontrados foram
comparados aos seus valores pré-exercícios e aos do grupo controle (FOLSOM et
al., 2001).
Também com utilização de pôneis não condicionados, sujeitos a um programa
de exercícios de alta intensidade por cinco dias e, em seguida, imunizados com uma
dose de vacina intranasal com vírus da influenza eqüina, promoveu-se um desafio
com cepa viral homóloga, três meses após o processo de imunização. O exercício
causou uma imunossupressão, indicada por uma diminuição na proliferação de
linfócitos em resposta ao PWM. Porém, após o desafio, somente os controles, não
imunizados e não exercitados apresentaram sinais de infecção (LUNN et al., 2001),
o que colocou em discussão mais uma variável: a via de administração e, mesmo, o
tipo de vacina administrado.
Os mecanismos responsáveis por mudanças no número e na função dos
leucócitos não são simples; no entanto, credita-se grande parte destas alterações à
modulação neuroendócrina. Para manter a homeostasia sob o estresse do exercício,
o sistema nervoso autônomo e o sistema endócrino desempenham um papel
importante na mobilização dos estoques de energia e no controle da homeostasia
cardiovascular e do equilíbrio hídrico, com a finalidade de estabelecer uma função
bem coordenada do sistema nervoso, respiratório, cardiovascular e músculo-
esquelético. Para acomodar o grande aumento na demanda de energia e oxigênio
do trabalho muscular, e, permitir a dissipação de produtos do metabolismo e do calor
durante um exercício de alta intensidade, ocorrem processos iniciados e controlados
por fatores neurais, hormônios, peptídeos vasoativos liberados pelos músculos e
39
condições de hipóxia. Um aumento na liberação do oxigênio para o trabalho
muscular é feito através da ativação do sistema nervoso simpático e pelo eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal. Ocorre um aumento rápido na circulação de ACTH,
epinefrina, norepinefrina e cortisol, daí serem hormônios utilizados na avaliação do
estresse induzido pelo exercício (HYYPPÄ, 2005).
Uma atenção particular têm sido conferida às concentrações de cortisol
aumentadas na circulação após um exercício de alta intensidade ou após exercício
de longa duração, em cavalos (CHURCH et al., 1987 apud HINES et al., 1996
4
;
GOLLAND et al., 1999; HOROHOV et al., 1999; KEADLE et al., 1993; KURCZ et al.,
1988; LASSOURD et al., 1996; NAGATA et al., 1999; NESSE et al., 2002; ROBSON
et al., 2003; SNOW; ROSE, 1981; WONG et al., 1992).
No âmbito bioquímico, o exercício intenso pode produzir um desequilíbrio
entre a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a defesa antioxidante, e
promover um ambiente de estresse oxidativo no organismo (URSO; CLARKSON,
2003). O treinamento está associado a uma regulação positiva dos mecanismos de
depleção dos radicais livres. Em um estudo na espécie humana, demonstrou-se que
a intensidade de um exercício afeta o estado de óxido-redução e os processos de
apoptose dos linfócitos.
Apoptose ou morte celular programada é uma forma de destruição celular
deflagrada através de mecanismos internos altamente regulados. Pode ocorrer em
estados fisiológicos e patológicos. É caracterizada por condensação do núcleo e do
citoplasma. A membrana plasmática permanece inicialmente intacta, a ativação das
caspases leva a uma transição do potencial de membrana da mitocôndria,
4 CHURCH, D.B.; EVANS, D.L.; LEWIS, D.R. The effect of exercise on plasma
adrenocorticotrophin, cortisol and insulin in the horse and adaptations with training. In: GILLESPIE,
J.R.; ROBINSON, N.E. Equine Exercise Physiology. Davis: ICEEP, 1987. p. 506-515.
40
acompanhada por mudanças intracelulares nos íons cálcio e pH. Após a perda do
potencial de membrana da mitocôndria, as bombas de transporte da membrana
lisossomal perdem sua função. Neste estado, a célula passa o ponto irreversível,
ocorre ativação de endonucleases e há uma redistribuição dos fosfolipídeos de
membrana. Finalmente, a célula se desintegra em corpos apoptóticos. Os fagócitos
identificam estas células e removem-nas, porém não há desenvolvimento de reação
inflamatória (DARZYNKIEWICZ et al., 1992, 1994, 1997; GORCZYCA et al., 1998;
VERMES; HAANEN, 1994).
Apoptose pode resultar de uma via intrínseca ou extrínseca. A via intrínseca
envolve a liberação do citocromo c da mitocôndria, que estimula uma cascata que
eventualmente induz ativação de caspase-9 e resulta em apoptose. A via extrínseca
pode ser induzida por receptores de superfície, como do fator de necrose tumoral, de
linfotoxinas e o FasL. Estas proteínas podem recrutar outras proteínas efetoras que
resultam na ativação de caspase-8.
Os neurônios, e talvez outras células possuem uma outra via para a
autodestruição, que não acontece através de caspases, e sim, por intermédio de um
fator indutor de apoptose (AIF), uma proteína localizada no espaço existente entre a
membrana interna e a externa da mitocôndria, que quando liberada, migra até o
núcleo, liga-se ao DNA e promove sua destruição.
As técnicas para identificar, quantificar e caracterizar apoptose são
numerosas, mas a citometria de fluxo é a metodologia de escolha para estudar a
cascata apoptótica em relação ao tipo celular, a via deflagradora e tempo (VERMES
et al., 2000).
Um exercício severo tende a diminuir a quantidade de glutationa, um
antioxidante, e aumentar a exposição de fosfatidilserina e a fragmentação de DNA,
41
induzidas pelo estresse oxidativo; enquanto, o exercício de intensidade moderada,
pode aumentar a concentração de glutationa e reduzir a peroxidação de lipídeos,
bem como atenuar o dano celular induzido pelo estresse oxidativo (WANG; HUANG,
2005). Ainda em seres humanos, ao se comparar atletas com um bom
condicionamento e atletas pouco condicionados, só houve indução de morte celular
nos linfócitos do segundo grupo (MOOREN et al., 2004).
Os mecanismos responsáveis pelas adaptações que ocorrem em um
indivíduo, diante do estímulo do exercício, e sua influência sobre o sistema imune,
ainda não foram identificados por completo. É visível a dificuldade de comparação
entre os diversos experimentos, uma vez que não há uma padronização das
condições entre eles.
42
3 OBJETIVOS
Das várias publicações sobre exercício e função imune em eqüinos, poucas
se referem aos cavalos de corrida em seu modus vivendi. Desta forma, para a
realização deste trabalho, foram selecionados diferentes momentos da rotina dos
animais - antes e após participação em corridas - com os principais objetivos:
Ω Verificar alterações do número de populações celulares implicadas
com a defesa, principalmente neutrófilos e linfócitos
Ω Avaliar mudanças na função in vitro de neutrófilos através de ensaios
de fagocitose e de burst oxidativo
Ω Observar alteração na proliferação de linfócitos diante de estímulos
antigênicos in vitro
Ω Verificar ocorrência de linfócitos em processo de apoptose
Ω Identificar mudanças na concentração de cortisol sérico
A intenção de se realizar este estudo foi de apresentar aos colegas médicos
veterinários algumas alterações moleculares e celulares que eventualmente possam
acometer os eqüinos atletas submetidos a diferentes intensidades de exercício e
propor considerações, a fim de que estes animais não sofram uma sobrecarga de
estímulos que possa vir a comprometer sua resposta imune e seu desempenho
atlético.
43
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 LOCAL
O material biológico destinado aos ensaios de fagocitose, de burst oxidativo, de
apoptose e linfoproliferação foi processado no Laboratório de Farmacologia Aplicada
e Toxicologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP), localizado na cidade de São
Paulo, SP. No Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de
Reprodução Animal da FMVZ-USP, São Paulo, SP, foi realizada a dosagem da
concentração de cortisol sérico e no Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias
PADDOCK, São Paulo, SP foram realizados os hemogramas.
4.2 ANIMAIS
Foram utilizados trinta animais da espécie eqüina, da raça puro sangue inglês
(PSI), condicionados, com idade entre dois e seis anos, que foram divididos em dois
grupos (1 a 15 e 16 a 30), com momentos de coleta de amostras distintos. Os
animais foram escolhidos, ao acaso, dentro de um grupo que apresentava grande
probabilidade de inscrição na corrida da semana subseqüente, segundo o treinador
e o médico veterinário responsáveis (Apêndice A).
44
Os cavalos foram mantidos em cocheiras individuais sob condições naturais
de luminosidade, temperatura e umidade. A dieta básica dos eqüinos atletas, de
peso médio de 475 Kg, consistia em fornecimento sistemático em dois eventos
diários (às 10:00h e às 18:00h) de:
Ω Água ad libitum (consumo médio diário estimado em 8% do peso vivo,
equivalendo a aproximadamente 40 L/ dia)
Ω Mistura de feno de alfafa e feno de capim coast-cross, na proporção de
2:1 com peso médio diário estimado em 1,5% do peso vivo de cada
animal (4,5 Kg de feno de alfafa para 2,5 Kg de feno de capim)
Ω Combinação de ração concentrada hipercalórica e aveia achatada na
proporção média de 1: 1,5, enriquecida com sal mineral, vitaminas e
eletrólitos (5 a 6 Kg de ração para 7 a 8 Kg de aveia)
Uma vez que se encontravam locados nas dependências do Jockey Club de
São Paulo (JCSP), os animais eram submetidos a um controle sanitário freqüente,
realizado em âmbito populacional, por toda vila hípica e centros de treinamento
associados, através de esquemas imunoprofiláticos, com vacinações estratégicas
para as principais enfermidades infecciosas da espécie eqüina como herpesvirose,
influenza, encefalomielite, raiva, adenite e tétano, determinado pela Divisão de
Assistência Veterinária (DAV) do JCSP. O controle de endoparasitoses era
conduzido mediante prescrição também sistemática, com periodicidade variável, de
drogas parasiticidas, sob a responsabilidade dos médicos veterinários contratados
pelo stud ou coudelaria.
Houve permissão para coleta de material no dia da corrida por parte da DAV e
pelo Departamento de Controle e Pesquisa Antidopagem do JCSP.
45
Os eqüinos atletas que compuseram o estudo não pertenciam a um único
proprietário, nem eram treinados pelo mesmo profissional. De acordo com as
similaridades dos protocolos de treinamento e preparação atlética, instituídos pelos
respectivos treinadores, os animais foram agrupados (Apêndice A), e foi
estabelecido um módulo de treinamento de quatro semanas, ao se considerar que
os cavalos correm, em média, uma vez ao mês. Algumas variações adotadas por
determinados treinadores também foram descritas, embora não tenham sido
consideradas relevantes na análise dos resultados (Apêndice B).
4.2.1 Módulo de Treinamento (Sistema tradicional de treinamento para cavalos PSI
no Brasil) – A (Figura A, Apêndice B)
Ω Exercícios diários matinais, que consistem em passo, trote e galope
suaves, conduzidos por jóquei ou cotejador montados, em distâncias
que variam entre 500 e 4000 m - nos dias dois, três, seis, nove, doze,
treze, dezoito, dezenove, vinte, vinte e três, vinte e seis e vinte e sete
Ω Exercícios semanais fortes, que consistem de galope intenso
conduzido apenas por jóquei montado:
o Na distância exata da competição, denominado “trabalho forte
de distância”, normalmente aos sábados - nos dias sete e vinte
e um
46
o Na metade da distância exata da competição, denominado
“apronto de velocidade”, normalmente às quartas-feiras - nos
dias quatro, dez e vinte e quatro
Ω Períodos de repouso de exercícios em pista, nos dias subseqüentes
aos dias com realização de exercícios fortes de distância e velocidade -
nos dias um, cinco, oito, onze, vinte e dois e vinte e cinco - e nos três
primeiros dias subseqüentes à corrida - nos dias quinze, dezesseis e
dezessete
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS
As amostras foram coletadas por venopunção (veia jugular) em tubos
Vacutainers (Becton Dickinson, USA) contendo heparina sódica; contendo ácido
etileno diaminotetracetato sódico (EDTA); e tubos sem anticoagulante.
O material do tubo com heparina sódica foi utilizado para o ensaio de
fagocitose e burst oxidativo; o material do tubo contendo EDTA foi utilizado para os
ensaios de apoptose, linfoproliferação e hemograma; enquanto do tubo sem
anticoagulante obteve-se o soro para determinação de cortisol sérico.
As amostras foram mantidas em recipiente com gelo durante seu transporte
até o laboratório.
Uma vez que os páreos eram iniciados entre 13:00 e 19:00h, houve a
preocupação de realizar a coleta das amostras dos outros momentos em horários
semelhantes, devido à variação da concentração do cortisol sangüíneo ao longo do
47
dia, com valores mais altos no período da manhã e mais baixos no final da tarde
(ZOLOVICK et al., 1966).
4.4 ENSAIO DE FAGOCITOSE
A fagocitose foi determinada pelo uso do método proposto por Hasui et al.,
(1989).
Foram utilizados, em tubo de polipropileno, 100 µL de sangue total com
heparina sódica
(2) Figura 4.1
, adicionados 100 µL de uma solução de bactérias da espécie
Staphylococcus aureus (aproximadamente 2,4 x 10
9
bactérias) marcada com iodedo
de propídeo, e PBS q.s.p. 1,0 mL. Procedeu-se à incubação a 37 ºC, em banho-
maria sob agitação, por 20 minutos
(3) Figura 4.1
. A reação foi interrompida através da
adição de 2,0 mL de solução gelada de EDTA (3 mM)
(4) Figura 4.1
. Em seguida, as
amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 250 g
(5) Figura 4.1
. O sobrenadante foi
desprezado e os eritrócitos foram removidos por lise hipotônica. A lise foi realizada
pela adição de 2,0 mL de uma solução de NaCl 0,2 %, em cada amostra, por 20
segundos. Imediatamente após este tempo, adicionou-se 2,0 mL de uma solução de
NaCl 1,6% com a finalidade de se restaurar a isotonicidade
(6) Figura 4.1
. As amostras foram
então centrifugadas por 10 minutos a 250 g e a lise foi repetida
(7) Figura 4.1
. Os botões
celulares obtidos foram ressuspensos com a adição de 500 µL de uma solução de
PBS
(8) Figura 4.1
e levados ao citômetro para análise
(9) Figura 4.1
.
Foi calculado o percentual de células que fagocitaram o S. aureus marcado
(porcentagem de neutrófilos que fagocitaram bactérias) como segue: número de
48
neutrófilos fluorescentes dividido pelo número total destas células, multiplicadas por
100.
A magnitude da fagocitose (quantidade de bactérias fagocitadas por célula) foi
registrada pelo do valor da média geométrica da intensidade de fluorescência
emitida pela população de neutrófilos.
Figura 4.1 – Fluxograma representativo do ensaio de fagocitose
37ºc
20 minutos
Adição de
2 mL de
EDTA à
reação
1
2
3
4
5
6
7
8
amostra sg
c/ heparina
sódica
100 µL de
amostra
100µL sg
+
100µL S. aureus - PI
+
PBS qsp 1 mL
Centrifugação po
r
10 minutos 250g
Lise hipotônica
(2x)
1. NaCl 0,2%
2. NaCl 1,6%
Centrifugação po
r
10 minutos 250g
Adição de 500µL
PBS
9
CITOMETRIA DE
FLUXO
49
4.5 ENSAIO DO BURST OXIDATIVO
A capacidade de neutrófilos do sangue periférico em liberar espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio durante a destruição de bactérias foi avaliada pela utilização
de métodos descritos por Hasui et al., (1989). Foram adicionados, em tubo de
polipropileno, 100 µL de sangue total com heparina sódica
(2) Figura 4.2
, adicionados 100 µL
de uma solução de bactérias da espécie Staphylococcus aureus (aproximadamente
2,4 x 10
9
bactérias) marcada com iodedo de propídeo, 200 µL de solução de
diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA 0,3 mM) e PBS q.s.p. 1,0 mL. Procedeu-
se à incubação a 37 ºC, em banho-maria sob agitação, por 20 minutos
(3) Figura 4.2
. A
reação foi interrompida através da adição de 2,0 mL de solução gelada de EDTA (3
mM)
(4) Figura 4.2
. Em seguida, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 250 g
(5) Figura
4.2
. O sobrenadante foi desprezado e os eritrócitos foram removidos por lise
hipotônica. A lise foi realizada pela adição de 2,0 mL de uma solução de NaCl 0,2%,
em cada amostra, por 20 segundos. Imediatamente após este tempo, adicionou-se
2,0 mL de uma solução de NaCl 1,6% com a finalidade de se restaurar a
isotonicidade
(6) Figura 4.2
. As amostras foram então centrifugadas por 10 minutos a 250 g e
a lise foi repetida
(7) Figura 4.2
. Os botões celulares obtidos foram ressuspensos com a
adição de 500 µL de uma solução de PBS e levados ao citômetro para análise
(8) Figura 4.2
.
A magnitude do burst oxidativo foi avaliada por citometria de fluxo
(9) Figura 4.2
.
50
Figura 4.2 – Fluxograma representativo do ensaio do burst oxidativo
4.6 ENSAIO DE APOPTOSE
Para a detecção do fenômeno de apoptose e distinção de células apoptóticas
das necróticas, foi utilizada uma técnica que associa um indicador do estágio inicial
de apoptose, a anexina V marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC), e um
mensurador da integridade da membrana plasmática, que discrimina células vivas e
mortas, o iodeto de propídeo (PI).
Foram colocados 100 µL de sangue total com EDTA em tubo de
polipropileno
(2) Figura 4.3
e procedeu-se, inicialmente, à remoção dos eritrócitos por lise
hipotônica. A lise foi realizada pela adição de 2,0 mL de uma solução de NaCl 0,2%,
em cada amostra, por 20 segundos. Imediatamente após este tempo, adicionou-se
37ºc
20 minutos
Adição de
2 mL de
EDTA à
reação
1
2
3
4
5
6
7
8
amostra sg
c/ heparina
sódica
100 µL de
amostra
100µL sg
+
100µL S. aureus - PI
+
200µL DCFH
+
PBS qsp 1 mL
Centrifugação po
r
10 minutos 250g
Lise hipotônica
(2x)
1. NaCl 0,2%
2. NaCl 1,6%
Centrifugação po
r
10 minutos 250g
Adição de 500µL
PBS
9
CITOMETRIA DE
FLUXO
51
2,0 mL de uma solução de NaCl 1,6% com a finalidade de se restaurar a
isotonicidade
(3) Figura 4.3
. As amostras foram então centrifugadas por 10 minutos a 250 g e
a lise foi repetida
(4) Figura 4.3
. Os botões celulares obtidos foram então utilizados para o
ensaio de apoptose
(5) Figura 4.3
. Foram adicionados 100 µL de anexina V-FITC diluída em
tampão de ligação (1:1500) e 40 µL de PI diluído em PBS (100 µg/mL)
(6) Figura 4.3
. A
reação foi incubada à temperatura ambiente, na ausência de luz, por 20 minutos
(7) Figura
4.3
. Em seguida, foram adicionados 400 µL de tampão de ligação
(8) Figura 4.3
e,
imediatamente, procedeu-se à análise das amostras por citometria de fluxo
(9) Figura 4.3
.
Figura 4.3 – Fluxograma representativo do ensaio de apoptose
1
2
3
4
5
6
7
8
amostra sg
c/ EDTA
100 µL de
amostra
Centrifugação po
r
10 minutos 250g
Lise hipotônica
(2x)
1. NaCl 0,2%
2. NaCl 1,6%
20 minuto à
temperatura
ambiente, na
ausência de luz
Adição de 400µL
Tampão de
9
CITOMETRIA DE
FLUXO
Botão
celular
Botão celular + 100µL
anexina FITC + 40 µL PI
52
4.7 ENSAIO DE LINFOPROLIFERAÇÃO
4.7.1 Preparo das células
As células mononucleares circulantes no sangue periférico foram separadas
por meio de gradiente de densidade. Para este processo, foram utilizados 5,0 mL de
sangue total em tubos com EDTA, que foram diluídos e homogeneizados em 4,0 mL
de HBSS estéril (Hank’s Balanced Salt Solution, Gibco, EUA)
(2) Figura 4.4
e colocados,
delicadamente, sobre 4,0 mL da solução para separação de linfócitos (Ficoll-
Paque
TM
PLUS – Amersham; Lymphocyte isolation sterile solution), em tubo cônico
(3)
Figura 4.4
. Procedeu-se à centrifugação das amostras a 18 ºC, 2100 rpm, por 30 minutos,
no break (Centrífuga Eppendorf 5810R), com obtenção de um “anel” de células
mononucleares (seta)
(4,5) Figura 4.4
. As células recuperadas foram lavadas em HBSS
(6) Figura 4.4
e centrifugadas a 4 ºC, 250 g, por 10 minutos, duas vezes
(7) Figura 4.4
, e ressuspensas em
5,0 mL de meio R-10 (RPMI + 10% de soro eqüino). As amostras foram colocadas
em placa de cultura com seis wells (cada amostra em um well) e incubadas a 5 % de
CO
2
, a 37 ºC, por um período aproximado de 2 horas para que os monócitos se
aderissem ao fundo da placa
(8) Figura 4.4
.
Após este período, as células em solução foram colocadas em tubos cônicos,
procedeu-se à contagem das mesmas
(9) Figura 4.4
. A determinação do número total de
células e a estimativa da porcentagem de células vivas foram feitas por microscopia
óptica, com utilização de hemocitômetros de Neubauer e corante Azul de Trypan.
53
Foi realizada centrifugação a 4 ºC, 250 g, por 10 minutos da solução com
células
(10) Figura 4.4
. O sobrenadante foi desprezado e as células ressuspensas em 1,0 mL
de meio RPMI, adicionado de 1,0 µL de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE 0,25
µM), um corante vital, que é dividido com fidelidade remarcada entre as células-
filhas, por oito a dez gerações. Em seguida, foi realizada incubação a 5 % de CO
2
, a
37 ºC, por 20 minutos
(11) Figura 4.4
. Após este período, procedeu-se à centrifugação a 4 ºC,
250 g, por 10 minutos
(12) Figura 4.4
e as células foram ressuspensas em 1,0 mL de R-10.
Houve ajuste do número de células para 2,0 x 10
6
em 2,0 mL
(14) Figura 4.4
(adaptado de
CHEN et al., 2003).
54
Figura 4.4 – Fluxograma representativo do preparo das células para o ensaio
de linfoproliferação
Células recuperadas
lavadas 2x em HBSS
1
2
3
4
5
6
7
8
amostra sg
c/ EDTA
5 mL de
amostra +
4 mL de
HBSS
Centrifugação po
r
30 minutos a
Amostra colocada
sobre 4 mL de
solução de
separação
Botão
ressuspenso em
5 mL de meio
RPMI c/ 10% de
Soro Fetal
Eqüino
Incubação por 2
horas a 37ºC a
5% de CO2 em
p
laca de cultura
Botão celular obtido após
centrifugação por 10
minutos 250
g
a 4ºC
10
Células
colocadas em
cubos cônicos
Procedeu-se à
contagem das
células
Células colocadas em
cultura: 1,0x106 células
(controle e células com
adição de
Concanavalina A)
Leitura da proliferação
realizada após 72h de
incubação a 37ºC e 5%
de CO2
Centrifugação
por 10
minutos a
250g a 4ºC
Retirada do
sobrenadante e
botão celular
ressuspenso em 5
mL de meio RPMI
com 10% de Soro
Fetal Eqüino
Incubação por 2
horas a 37ºC a 5%
de CO2 em
p
laca de
11
9
12 13
14 15
Centrifugação
por 10
minutos 250g
a 4ºC
Células
ressuspensas em 1
mL de R-10
Ajuste do número de
células em 2,0x10
6
em 2 mL
CITOMETRIA DE
FLUXO
55
4.7.2 Cultura in vitro
Para a avaliação da atividade dos linfócitos, estes foram incubados em meio
R-10 a 1,0 x 10
6
por well, em triplicata, e estimulados com Concanavalina A (Sigma,
5 µg/mL), a 5 % de CO
2,
, a 37 ºC, por 72 horas
(14) Figura 4.4
. Ao término do período de
incubação, procedeu-se à análise das amostras por citometria de fluxo
(15) Figura 4.4
.
4.8 CITOMETRIA DE FLUXO
Foi utilizado citômetro de fluxo (Becton Dickinson Immunocytometry System,
San Jose, CA, USA) conectado a um computador (Macintosh Apple, CA, USA).
Utilizou-se o programa Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry System, San
Jose, CA, USA) e os dados foram coletados de 10.000 eventos para a análise do
burst oxidativo, da fagocitose e apoptose; enquanto, para a linfoproliferação, foram
coletados 50.000 eventos. As subpopulações celulares foram reconhecidas por meio
das propriedades forward scatter e side scatter (FSC e SSC) das mesmas,
respectivamente, tamanho e granulosidade. Foram utilizados os dados de neutrófilos
para análise dos ensaios do burst oxidativo e da fagocitose, já, para os ensaios de
apoptose e linfoproliferação, foram selecionados os dados de linfócitos. As outras
subpopulações foram excluídas por meio da análise de gates. Os resultados de
fluorescência foram gravados em uma escala logarítmica. A fluorescência verde do
diclorofluoresceína (DCFH), do isotiocianato de fluoresceína (FITC) e da CFSE foi
56
mensurada a 530±30 nm (detector FL1) e a fluorescência vermelha do iodeto de
propídeo (PI) foi mensurada a 585±42 nm (FL2). A quantificação da capacidade de
fagocitose, assim como as análises de burst oxidativo e de apoptose foram
estimadas pela porcentagem de células e pela intensidade média de fluorescência
por célula emitida pelo PI, pelo DCFH e pela FITC, respectivamente. A porcentagem
de linfoproliferação foi calculada ao se considerar o número de células que emitiram
a fluorescência mais baixa até o limite mínimo de detecção de fluorescência do
aparelho depois de subtraído a fluorescência do controle. Desta forma, foi
estabelecida uma proporção de células positivas. As fluorescências do PI, do DCFH
e da FITC foram analisadas com utilização de compensação de fluorescências para
correção de quaisquer interferências de sinais emitidos pelos mesmos.
4.9 HEMOGRAMA
O hemograma foi realizado pelo Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias
PADDOCK, São Paulo, SP. Foram realizados: contagem do número total de
leucócitos (Leu); contagem do número relativo (%) de neutrófilos (Nø); contagem do
número relativo (%) linfócitos (Lø); contagem do número relativo (%) monócitos
(Mø); contagem do número relativo (%) eosinófilos (Eø); contagem do número
relativo (%) basófilos (Bø); número total de eritrócitos (He); concentração de
hemoglobina (Hb); volume globular (Hct); volume corpuscular médio (VCM);
hemoglobina corpuscular média (HCM); e concentração hemoglobínica corpuscular
média (MCHC).
57
4.10 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE CORTISOL
O cortisol foi determinado por meio de radioimunoensaio de competição (kit
comercial Coat-A-Count/ DPC MEDLAB) realizado no Laboratório de Dosagens
Hormonais (LDH) do Departamento de Reprodução Animal da FMVZ-USP, São
Paulo, SP.
O limite de detecção do cortisol foi de 0,04 µg/dL, os coeficientes de variação
intra-ensaios ficaram abaixo de 10 % e os coeficientes de variação inter-ensaios
ficaram entre 0,33 % e 1,42 %.
4.11 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
As amostras de sangue foram obtidas em momentos distintos:
MOMENTO -11d: onze dias antes do dia da corrida
MOMENTO 0d: dia da corrida
MOMENTO +1d: um dia após o dia da corrida
MOMENTO +2d: dois dias após o dia da corrida
GRUPO I
MOMENTO +3d: três dias após o dia da corrida
MOMENTO -9d: nove dias antes da corrida
MOMENTO 0d: dia da corrida
MOMENTO +1d: um dia após o dia da corrida
GRUPO II
MOMENTO +5d: cinco dias após o dia da corrida
Quadro 4.1 – Momentos de coleta determinados em relação ao dia da corrida, nos dois
grupos de cavalos
58
Para os ensaios de fagocitose, burst oxidativo e determinação da
concentração de cortisol sérico, foram utilizadas amostras dos dois grupos de
animais (Quadro 4.1), nos momentos de -11d a +5d; enquanto para os ensaios de
linfoproliferação, apoptose de linfócitos e hemograma, realizados com os animais do
grupo II, as amostras foram obtidas nos momentos -9d, 0d, +1d e +5d. Os grupos,
compostos por quinze animais cada estão descritos no apêndice A.
A escolha dos animais foi realizada ao acaso, diante da possibilidade de
inscrição do animal como participante de um páreo. Houve descarte de muitas
amostras, quando o animal não tinha sua inscrição efetuada por motivos distintos.
De acordo com o regimento
1
do JCSP, uma vez que o animal estivesse
inscrito em uma prova, não havia mais permissão para a realização de qualquer tipo
de procedimento invasivo. Caso isto fosse constatado após avaliação veterinária,
realizada pouco antes do início do páreo, a retirada do animal seria determinada.
Isto impossibilitou a coleta de amostras durante a semana que precede a corrida ou
mesmo no dia do evento, antes da prova.
A mudança do protocolo de coleta para o grupo II foi criada com o propósito
de diminuir o intervalo entre o dia de coleta referido como um dia de realização de
exercício de intensidade menor (-11d) e o dia da corrida (0d), e aumentar o intervalo
entre a amostra coletada no dia da corrida e as que representariam os dias de
recuperação (+1d, +2d e +3d)
1
O regimento do JCSP foi estabelecido de acordo com o Código Nacional de Corridas, segundo
Ministério da Agricultura da República Federativa do Brasil.
59
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Antes da aplicação da análise estatística destinada a possibilitar a
interpretação dos resultados obtidos, procurou-se verificar, através do teste de
Bartlet, qual tipo de teste paramétrico ou não-paramétrico, seria o mais adequado
para cada situação experimental.
Foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguida pelos testes de comparações
múltiplas de Tukey-Kramer para detecção de possíveis diferenças entre os
resultados encontrados nos distintos momentos de coleta. Estes testes encontram-
se inseridos no software JMP, versão 5.0.1.2 (SAS Institute, 2003).
60
5 RESULTADOS
5.1 PREPARAÇÃO CELULAR E CITOMETRIA DE FLUXO PARA OS ENSAIOS DE
FAGOCITOSE, BURST OXIDATIVO E APOPTOSE
A análise dos dados obtidos com o uso da técnica de citometria de fluxo pela
utilização do programa Cell Quest Pro (Becton Dickinson Immunocytometry System,
San Jose, CA, USA) demonstrou regiões com populações celulares distintas. Para
os ensaios de fagocitose e burst oxidativo foi utilizado o grupo de células localizado
na região ou gate 1 (R1), referente à população de neutrófilos, enquanto, as células
situadas na região ou gate 2 (R2), que concentrava os linfócitos, foram utilizadas
para o ensaio de apoptose. No gate 3 (R3) estava localizada a população de
monócitos (Gráfico 5.1).
Embora os grupos de animais tenham sido formados ao acaso, a análise dos
resultados dos ensaios de fagocitose, burst oxidativo e determinação de cortisol
sérico, do momento imediatamente após a corrida e do momento um dia após a
corrida - momentos comuns aos dois grupos - mostraram diferença significante
estatisticamente, com p<0,0001, o que impossibilitou a análise dos dados em
conjunto.
61
D cavalo 3.009
0 200 400 600 800 1000
FSC-Height
R4
Gráfico 5.1 – Representação dos dados de citometria de fluxo dos leucócitos do sangue
periférico dos cavalos participantes do estudo, após lise dos eritrócitos, em
um dot plot. As populações celulares foram identificadas de acordo com
seus perfis forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC), que indicam
tamanho versus granulosidade e complexidade das células. R1 corresponde
ao gate de neutrófilos; R2, de linfócitos e R3 de monócitos
5.1.1 Ensaio de Fagocitose
Houve uma diminuição dos valores de porcentagem de fagocitose dos
neutrófilos nas amostras coletadas dos animais do grupo I, de 1 a 15, imediatamente
após a corrida, quando comparadas às do momento um dia após a corrida. A tabela
5.1 mostra os valores médios, desvios-padrão e a significância estatística
considerada. O gráfico 5.2.A ilustra a diferença encontrada.
Em relação à intensidade de fagocitose - que representou quantas partículas
de bactérias foram fagocitadas - foi encontrada diferença estatística significante
R3
R1
R2
62
entre os valores obtidos nos diferentes momentos. O momento imediatamente após
a corrida e o momento três dias após a corrida apresentaram menores valores que o
momento onze dias antes da corrida e o momento um dia após a corrida (Tabela 5.1
e Gráfico 5.2.C).
Quanto aos animais 16 a 30, um decréscimo nos valores de porcentagem de
fagocitose dos neutrófilos também foi encontrado imediatamente após a corrida,
quando comparado aos outros momentos estudados oito dias antes da corrida, um
dia após a corrida e cinco dias após a corrida, com significância estatística (Tabela
5.2 e Gráfico 5.2.B).
Em relação aos valores de intensidade de fagocitose, os valores médios
obtidos das amostras coletadas no momento imediatamente após a corrida foram
menores que os encontrados no momento um dia após a corrida e cinco dias após a
corrida, que por sua vez foram menores que os valores encontrados no momento
oito dias antes da corrida (Tabela 5.2 e Gráfico 5.2.D)
63
Tabela 5.1 – Os valores representam a média ± o desvio-padrão da porcentagem de células que realizaram a fagocitose e da intensidade de
fagocitose, com amostras de sangue coletadas dos animais do grupo I (1 a 15) nos momentos identificados como 11 dias antes
da corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida, 2 dias após a corrida e 3 dias após a corrida. Diferença
estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo I 11d antes 0d corrida 1d após 2d após 3d após significância
% fagocitose 75,8 ± 26,0 ab 49,9 ± 27,8 b 87,1 ± 18,9 a 76,7 ± 24,9 ab 67,3 ± 24,8 ab p<0,029
intensidade
26,9 ± 15,4 a 16,3 ± 4,3 b 33,2 ± 3,9 a 23,7 ± 11,8 ab 15,0 ± 3,3 b p<0,0001
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida
Tabela 5.2 - Os valores representam a média ± o desvio-padrão da porcentagem de células que realizaram a fagocitose e da intensidade de
fagocitose, com amostras de sangue coletadas dos animais do grupo II (16 a 30) nos momentos identificados como 8 dias antes
da corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a corrida. Diferença estatística segundo teste de
Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo II 8d antes 0d corrida 1d após 5d após significância
% fagocitose 97,4 ± 1,2 a 66,4 ± 19,5 b 86,9 ± 13,6 a 97,8 ± 1,1 a p<0,0001
intensidade
57,8 ± 9,1 a 27,0 ± 4,8 c 42,6 ± 11,7 b 47,9 ± 4,4 b p<0,0001
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida
64
Gráfico 5.2 – A e B: dados referentes aos resultados de porcentagem de fagocitose
realizada pelos neutrófilos das amostras dos animais do grupo I (1 a 15) (A)
e do grupo II (16 a 30) (B); C e D: valores de intensidade de fagocitose
expressos em intensidade média de fluorescência, unidade arbitrária que
representa uma média geométrica do número de bactérias destruídas por
neutrófilos das amostras dos animais do grupo I (C) e do grupo II (D); E e F:
valores obtidos no ensaio de burst oxidativo expressos em intensidade
média de fluorescência em escala logarítmica dos neutrófilos das amostras
dos animais do grupo I (E) e do grupo II (F). Diferença estatística
representada por letras distintas, segundo teste de Tukey-Kramer -
Beltsville 2003. Nos animais do grupo I foram utilizados os momentos de
coleta -11d, corrida, +1d, +2d e +3d (11dias antes da corrida,
imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida, 2 dias após a corrida e
3 dias após a corrida). Nos animais do grupo II os momentos de coleta
utilizados foram -8d, corrida, +1d, e +5d (8 dias antes da corrida,
imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a corrida)
B
b
A
a
D C
b
b
c
F E
-11d 0d +1d +2d +3d
0
25
50
75
100
% fagocitose
-11d 0d +1d +2d +3d
0
10
20
30
40
intensidade de fagocitose
-11d 0d +1d +2d +3d
0
500
1000
1500
burst oxidativo
-8d 0d +1d +5d
0
25
50
75
100
% fagocitose
-8d 0d +1d +5d
0
25
50
75
intensidade de fagocitose
-8d 0d +1d +5d
0
250
500
750
burst oxidativo
b
a
a
a
b
b
a
a
b
b
65
5.1.2 Ensaio do Burst Oxidativo
Os valores médios encontrados no ensaio de burst oxidativo para os
neutrófilos das amostras obtidas dos animais 1 a 15 estão representados na tabela
5.3 e no gráfico 5.2.E. Houve uma diminuição dos valores das amostras coletadas
imediatamente após a corrida e o momento três dias após a corrida, em relação aos
momentos referidos como onze dias antes da corrida e dois dias após a corrida.
Quanto aos valores obtidos no ensaio de burst oxidativo quando da utilização
de amostras coletadas dos animais 16 a 30, não foram apresentadas diferenças
estatisticamente significantes (Tabela 5.4 e Gráfico 5.2.F).
66
Tabela 5.3 - Os valores representam a média ± o desvio-padrão do burst oxidativo realizado com amostras de sangue coletadas dos animais do
grupo I (1 a 15) nos momentos denominados como 11 dias antes da corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida, 2
dias após a corrida e 3 dias após a corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo I 11d antes 0d corrida 1d após 2d após 3d após significância
p<0,0001596,3 ± 231,6 b524,2 ± 248,9 b 844,1 ± 256,6 ab 1057,6 ± 253,1 a
Burst
oxidativo
1136,4 ± 407,2 a
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida
Tabela 5.4 - Os valores representam a média ± o desvio-padrão do burst oxidativo realizado com amostras de sangue coletadas dos animais do
grupo II (16 a 30) nos momentos identificados como 8 dias antes da corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5
dias após a corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo II 8d antes 0d corrida 1d após 5d após significância
p>0,4367,4 ± 345,2 a 302,0 ± 169,0 a 514,2 ± 217,7 a
Burst
oxidativo
356,6 ± 123,1 a
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida
67
5.1.3 Ensaio de apoptose
Para a análise de apoptose foram utilizadas as células situadas na região
demarcada pelo gate 1 (R1) (Gráfico 5.1).
A tabela 5.5 mostra as médias e os desvio-padrão relativos ao ensaio de
apoptose realizado com as amostras provenientes dos animais do grupo II. Não foi
demonstrada diferença estatística significante entre os valores de células
apoptóticas, nos diferentes momentos de coleta (Gráfico 5.3).
Houve diferença estatística significante em relação aos valores de células
necróticas. Foram encontrados valores maiores no momento identificado como oito
dias antes da corrida, quando comparados ao momento imediatamente após a
corrida. Houve também o encontro de valores menores nos momentos denominados
um dia após a corrida e cinco dias após a corrida, ao serem comparados com o
momento imediatamente após a corrida. Quanto às células viáveis, valores maiores
foram encontrados no momento definido como cinco dias após a corrida; enquanto,
valores menores foram observados no momento oito dias antes da corrida, quando
comparados ao momento imediatamente após a corrida e ao momento um dia após
a corrida (Tabela 5.5).
68
Gráfico 5.3 – Representação dos valores médios do total de células apoptóticas encontradas
nos diferentes momentos de coleta definidos como 8 dias antes da corrida,
imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a corrida, nas
amostras dos animais 16 a 30, segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville
2003
Tabela 5.5 – Os valores representam a média ± o desvio-padrão dos resultados do ensaio
de apoptose realizado com amostras de sangue coletadas dos animais do
grupo II (16 a 30) nos momentos identificados como 8 dias antes da corrida,
imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a corrida.
Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo II 8d antes 0d corrida 1d após 5d após significância
apoptose 0,56 ± 0,61 a 0,53 ± 0,55 a 0,38 ± 0,39 a 0,25 ± 0,23 a p>0,5
necrose
0,89 ± 0,28 a 0,57 ± 0,58 ab 0,31 ± 0,17 b 0,23 ± 0,15 b p<0,001
células viáveis
98,6 ± 0,6 b 98,7 ± 0,7 ab 99,3 ± 0,5 ab 99,4 ± 0,4 a p<0,009
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida
-8d 0d +1d +5d
0.00
0.25
0.50
0.75
apoptose
69
5.2 ENSAIO DE LINFOPROLIFERAÇÃO
O gráfico 5.4 mostra o gate utilizado para selecionar a população de linfócitos,
dentro da população de mononucleares colocada em cultura, a ser analisada após o
ensaio de linfoproliferação.
Gráfico 5.4 - Representação dos dados de citometria de fluxo, em um dot plot, dos
leucócitos mononucleares do sangue periférico dos cavalos participantes do
estudo, após cultura de 72h. As populações celulares foram identificadas de
acordo com seus perfis forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC), que
indicam tamanho versus granulosidade e complexidade das células. R4
corresponde ao gate de linfócitos
A cinética do ensaio de proliferação da população de linfócitos foi analisada
através da utilização de histogramas.
O gráfico 5.5 representa a cinética do tubo controle (sem utilização de
mitógenos como estímulo). A fluorescência apresentada pelas células estava
R4
70
distribuída de forma homogênea, uma indicação de ausência de divisão celular.
Foram utilizados marcadores (M) acima dos picos para quantificar os eventos em
cada ciclo de divisão celular.
A representação da cinética do ensaio de linfoproliferação após a utilização
de concanavalina A (ConA) como estímulo encontra-se no gráfico 5.6. Após o
estímulo das células com ConA, foram identificadas algumas séries de divisão diante
da perda de intensidade de fluorescência em algumas células respondedoras.
Algumas células-filhas apresentaram níveis basais de fluorescência. Também foram
utilizados marcadores (M) acima dos picos para quantificar os eventos em cada ciclo
de divisão celular. Os dados foram utilizados para construção da tabela 5.6. Não foi
encontrada diferença estatisticamente significativa quando foi realizada a
comparação dos valores encontrados nos diferentes momentos de coleta.
controle 2.050
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H
M1
M2
Gráfico 5.5 – Histograma da fluorescência do CFSE (diacetato de carboxifluoresceína) dos
linfócitos do sangue periférico eqüino após cultura de 72h a 5% de CO
2
e
37ºC sem utilização de mitógenos (controle). M1 e M2 representam os
marcadores utilizados para enumerar os eventos em cada ciclo de divisão
71
conc1 an2.054
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
FL1-H
M1
M2
Gráfico 5.6 – Histograma da fluorescência do CFSE (diacetato de carboxifluoresceína) dos
linfócitos do sangue periférico eqüino após cultura de 72h a 5% de CO
2
e
37ºC com utilização de concanavalina A. M1 e M2 representam os
marcadores utilizados para enumerar os eventos em cada ciclo de divisão
72
Tabela 5.6 – Os valores representam a média ± desvio-padrão dos resultados de
linfoproliferação realizado com amostras de sangue coletadas dos animais
do grupo II (16 a 30) nos momentos identificados como 8 dias antes da
corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a
corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville
2003
grupo II 8d antes 0d corrida 1d após 5d após significância
p>0,230,9 ± 4,0 a 28,4 ± 4,5 a 29,8 ± 3,3 a 30,8 ± 3,6 a
Linfoproliferação
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida
5.3 HEMOGRAMA
Os dados de hemograma encontrados nos momentos estabelecidos para a
coleta de amostras do grupo II (animais de 16 a 30) foram reunidos na tabela 5.6.
Foram encontrados valores aumentados em relação ao número percentual de
neutrófilos no momento imediatamente após a corrida quando foi realizada
comparação com os demais momentos (Gráfico 5.7).
Quanto aos valores do número percentual de linfócitos, encontraram-se
aumentados no momento cinco dias após a corrida, quando comparados aos outros
(Gráfico 5.8).
Outros dados que apresentaram diferença significativa entre os valores
médios provenientes da coleta de momentos distintos, comparados entre si, foram
referentes ao eritrograma, mais especificamente número total de eritrócitos (He);
73
concentração de hemoglobina (Hb); volume globular (Hct); volume corpuscular
médio (VCM); hemoglobina corpuscular média (HCM); e concentração
hemoglobínica corpuscular média (MCHC).
74
Gráfico 5.7 – Representação dos valores médios referentes à contagem do número relativo
(%) de neutrófilos (Nø) nos diferentes momentos de coleta definidos como 8
dias antes da corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5
dias após a corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer -
Beltsville 2003
Gráfico 5.8 – Representação dos valores médios referentes à contagem do número relativo
(%) de linfócitos (Lø) nos diferentes momentos de coleta definidos como 8 dias
antes da corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias
após a corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer -
Beltsville 2003
-8d 0d +1d +5d
0
25
50
75
% neutrófilos
a
-8d 0d +1d +5d
0
25
50
75
% linfócitos
b
75
Tabela 5.7 – Valores representam a média ± o desvio-padrão dos resultados do hemograma
dos eqüinos que participaram do estudo: contagem do número total de leucócitos
(Leu); contagem do número relativo (%) de neutrófilos (Nø); contagem do número
relativo (%) linfócitos (Lø); contagem do número relativo (%) monócitos (Mø);
contagem do número (%) eosinófilos (Eø); contagem do número relativo (%)
basófilos (Bø); número total de eritrócitos (He); concentração de hemoglobina
(Hb); volume globular (Hct); volume corpuscular médio (VCM); hemoglobina
corpuscular média (HCM); e concentração hemoglobínica corpuscular média
(MCHC) nos diferentes momentos de coleta definidos como 8 dias antes da
corrida, imediatamente após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a
corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo II
Hemograma
Leu (10
3
/mL)
7927 ± 1389 a 9547 ± 1640 a 8793 ± 1677 a 8473 ± 2253 a p>0,09
NØ (%)
46,4 ± 2,3 b 49,5 ± 2,9 a 46,2 ± 2,4 b 46,1 ± 3,3 b p<0,003
LØ (%)
51,7 ± 2,4 a 49,7 ± 2,9 a 51,7 ± 2,5 a 52,0 ± 3,2 b p>0,09
MØ (%)
0,0 a 0,0 a 1,0 a 0,0 a p>0,2
EØ (%)
1,33 ± 0,48 a 1,06 ± 0,26 a 1,33 ± 0,19 a 1,53 ± 0,52 a p>0,06
BØ (%)
0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a p>0,2
He (x10
3
)
10378 ± 643,6 b 13021,3 ± 1066 a 11231,3 ± 993,3 b 10658,6 ± 886,2 b p<0,0001
Hb (g/ dL)
14,6 ± 0,8 b 17,5 ± 1,3 a 15,3 ± 0,9 b 14,8 ± 0,9 b p<0,0001
Hct (%)
43,5 ± 3,1 b 57,7 ± 6,7 a 46,7 ± 3,8 b 44,6 ± 3,8 b p<0,0001
VCM
41,9 ± 0,7 b 44,2 ± 2,3 a 41,6 ± 0,7 b 41,8 ± 0,6 b p<0,0001
HCM
13,9 ± 0,2 a 13,5 ± 0,3 b 13,7 ± 0,4 ab 13,9 ± 0,3 a p<0,001
CHCM
33,3 ± 0,7 a 30,5 ± 1,6 b 32,8 ± 0,6 a 33,3 ± 0,8 a p<0,0001
significância8d antes 0d corrida 1d após 5d após
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a
corrida
5.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE CORTISOL
A tabela 5.8 representa os valores médios e o desvio-padrão dos níveis
séricos de cortisol presentes no soro dos animais do grupo I. Os valores médios
foram encontrados aumentados no momento imediatamente após a corrida, quando
comparados aos valores dos outros momentos (Gráfico 5.9).
76
A tabela 5.9 mostra os valores de concentração sérica de cortisol obtidos das
amostras dos animais do grupo II, nos diferentes momentos de coleta. Também
foram encontrados valores médios aumentados nas amostras coletadas
imediatamente após a corrida, quando comparados aos demais (Gráfico 5.10).
77
Tabela 5.8 – Os valores representam a média ± desvio-padrão da concentração sérica de cortisol em amostras de sangue
coletadas dos animais do grupo I (1 a 15) nos momentos determinados como 11 dias antes da corrida, imediatamente
após a corrida, 1 dia após a corrida, 2 dias após a corrida e 3 dias após a corrida. Diferença estatística segundo teste
de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
grupo I 11d antes 0d corrida 1d após 2d após 3d após significância
p<0,00012,5 ± 0,6 b2,7 ± 1,1 b2,07 ± 0,5 b 8,6 ± 1,9 a 3,6 ± 1,2 b
Cortisol
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida; cortisol expresso em µg/dL
Tabela 5.9 - Os valores representam a média ± desvio-padrão da concentração sérica de cortisol em amostras de sangue coletadas
dos animais do grupo II (16 a 30) nos momentos determinados como 8 dias antes da corrida, imediatamente após a
corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville
2003
grupo II 8d antes 0d corrida 1d após 5d após significância
p<0,000110,8 ± 1,9 a 3,7 ± 1,0 b 4,5 ± 1,2 b
Cortisol
3,7 ± 1,3 b
1
Letras distintas na mesma linha indicam diferença estatística significante entre os resultados, 0d = imediatamente após a corrida; cortisol expresso em µg/dL
78
Gráfico 5.9 – Representação dos valores médios de níveis séricos de cortisol das amostras
provenientes dos animais do grupo I (1 a 15), encontrados nos diferentes
momentos de coleta definidos como 11 dias antes da corrida, imediatamente
após a corrida, 1 dia após a corrida, 2 dias após a corrida e 3 dias após a
corrida. Diferença estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
Gráfico 5.10 – Representação dos valores médios de níveis séricos de cortisol das amostras
provenientes dos animais do grupo II (16 a 30), encontrados nos diferentes
momentos de coleta definidos como 8 dias antes da corrida, imediatamente
após a corrida, 1 dia após a corrida e 5 dias após a corrida. Diferença
estatística segundo teste de Tukey-Kramer - Beltsville 2003
-11d 0d +1d +2d +3d
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
cortisol
a
-8d 0d +1d +5d
0
5
10
15
cortisol
a
79
6 DISCUSSÃO
Os cavalos atletas quando executam um exercício de alta intensidade
experimentam algumas situações decorrentes do próprio processo de adaptação
fisiológica, induzido pela atividade física. Conhecidas como estresses endógenos,
estas situações incluem as mudanças que ocorrem devido ao trabalho das células
musculares; o estresse oxidativo gerado pelo metabolismo do oxigênio; as
alterações na pressão sangüínea e o estresse mecânico induzido pelo fluxo de ar
sobre vasos pulmonares e vias aéreas. Outras situações às quais também estão
expostos são as relacionadas aos riscos ambientais, denominadas estresses
exógenos (ART; LEKEUX 2005).
Neste trabalho, estas diferentes situações de estresse não foram
identificadas, tampouco avaliadas de forma particular, o que se procurou foi verificar
a influência do seu conjunto, sobre a função imune in vitro de alguns componentes
sangüíneos, em determinados momentos da rotina destes cavalos.
Na tentativa de reunir os resultados dos ensaios de fagocitose, burst oxidativo
e determinação do cortisol sérico, executados com amostras coletadas nos dois
grupos de animais, nos diferentes momentos, foi realizada uma análise preliminar
através da comparação dos resultados obtidos das amostras coletadas
imediatamente após a corrida (momento 0d). Porém, diante do encontro de diferença
estatística significante entre estes dados (teste de Tukey-Kramer; p<0,0001), o
agrupamento tornou-se impossível. Isto talvez se deva ao fato de o grupo II constituir
um grupo mais coeso em termos de categoria de páreo, uma vez que a maioria dos
80
animais era participante de páreos classificados como Grande Prêmio, o que
significa que apresentavam ao menos uma vitória no seu histórico (Apêndice A).
Mesmo diante do conhecimento de que os programas de treinamento podem
minimizar alterações induzidas por alguns estresses endógenos e exógenos, o fato
de haver uma ocorrência maior de quadros respiratórios em animais de esporte
(BURRELL et al., 1996; CHRISTLEY et al., 2000; WOOD et al., 2005) - quando
comparados a animais destinados a outras atividades - sugere que a intensidade do
exercício e/ ou o modo de vida a que são submetidos possam afetar a capacidade
de resistência destes cavalos aos microrganismos, em determinados momentos.
Para entender o que ocorre com o metabolismo de um cavalo durante a
execução de um exercício e tentar encontrar seu vínculo com a função imune, é
providencial que se visualize a seqüência de organização responsável pela
manutenção da vida. É interessante que se tenha em mente o conjunto das
inúmeras células, que se reúne em tecidos, que, por sua vez, estruturam-se em
órgãos especializados e exigem uma grande integração, em níveis bioquímicos,
entre moléculas efetoras e receptores.
A visão tradicional da regulação do sistema imune destaca os fatores
moleculares e celulares dentro do próprio sistema como os moduladores principais
da função imune e da doença. Entretanto, um número enorme de evidências indica
que fatores externos ao sistema imune, como hormônios, neuropeptídeos e
neurotransmissores, derivados do sistema endócrino e nervoso desempenham um
papel fisiológico importante em todos os níveis da regulação da função imune. Esta
modulação externa é determinante na condição de suscetibilidade e resistência às
doenças infecciosas. Da mesma forma, fatores imunológicos regulam o sistema
nervoso, desde o âmbito molecular até o sistema como um todo (PAUL, 2003).
81
O controle do sistema nervoso sobre o sistema imune acontece em vários
planos, através de diferentes rotas anatômicas e moléculas. Em conjunto, o eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e o sistema nervoso simpático (SNS) regulam o
sistema imune através dos efeitos de neurormônios, neuropeptídeos e
neurotransmissores, mediados por receptores. Outros componentes do sistema
nervoso – inclusive o sistema nervoso parassimpático e o sistema nervoso periférico
– também fornecem uma regulação do sistema imune, através de mecanismos
similares, mediados por receptores, em uma esfera regional (STERNBERG, 1997).
Durante um exercício de alta intensidade, com o objetivo de acomodar o
grande aumento que acontece na demanda de energia e oxigênio para o trabalho
muscular e permitir a dissipação de produtos do metabolismo e do calor, ocorrem
diversos processos iniciados e controlados por fatores neurais, hormônios, condição
de hipóxia e peptídeos vasoativos liberados pelos músculos (HYYPPÄ, 2005). Os
músculos esqueléticos necessitam aumentar o aporte de glicose e ácidos graxos
livres para gerar adenosina 5’trifosfato (ATP) e rapidamente repor a reserva de
glicogênio. A concentração de ATP nos músculos estriados, só é capaz de fornecer
energia para um segundo ou dois, de atividade muscular intensa. Um reservatório
adicional de energia é constituído por fosfocreatina (FC), presente em concentrações
três a cinco vezes maiores que as do ATP. Este suprimento imediato de energia,
denominado sistema ATP-FC, é suficiente para esforços máximos e pouco
duradouros, de seis a oito segundos e sua utilização é um processo estritamente
anaeróbico (EATON, 1994; MARZZOCO; TORRES, 1999).
A continuidade do trabalho muscular exige energia derivada de outras fontes.
O próximo suprimento é fornecido pelo glicogênio muscular, cuja degradação é
estimulada pela liberação de Ca
2+
- que desencadeia a contração - ou por
82
adrenalina, que tem seus níveis aumentados durante o exercício. A energia desta
fase provém da degradação da glicose, originada do glicogênio, com produção de
lactato. Esta via, denominada glicólise anaeróbica, é utilizada para exercícios
intensos com duração de um a dois minutos (EATON, 1994; MARZZOCO; TORRES,
1999).
Assim, o exercício de intensidade máxima requer uma contribuição
substancial das vias bioenergéticas anaeróbicas, embora, de acordo com sua
duração, grande parte da energia possa ser fornecida por meios aeróbicos (EATON,
1994; HODGSON; ROSE 1994).
No caso dos cavalos utilizados neste estudo, os páreos dos quais
participaram, tiveram variação na distância entre 1.400 e 2.400 m, faixa em que se
considera haver uma combinação de fornecimento energético anaeróbico e aeróbico
(EATON 1994). O tempo médio de duração dos páreos de 1.400 m foi 1’25”403,
enquanto os páreos de 2.400 m duraram, em média, 2’29”595 (Apêndice A).
À medida que os sistemas respiratório e circulatório são ativados, a
contribuição da glicólise anaeróbica é substituída pela oxidação aeróbica.
Paralelamente, o fornecimento de ácidos graxos para o sistema muscular aumenta,
em virtude da ação da adrenalina (MARZZOCO; TORRES, 1999) e da interleucina-6
(IL-6) (BRUUNSGAARD, 2005) sobre o tecido adiposo.
Uma melhora na liberação do oxigênio para o trabalho muscular é feita
através da ativação do sistema nervoso simpático e do eixo HPA. Há um aumento
rápido na circulação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), adrenalina,
noradrenalina e cortisol (HYYPPÄ, 2005).
Na ativação do eixo HPA, os hormônios glicocorticóides constituem as
moléculas efetoras finais, que, de forma geral, quando liberadas, têm como principal
83
efeito, durante o exercício, aumentar a gliconeogênese hepática e induzir a lipólise,
para prover combustível a um exercício submáximo prolongado (IRVINE, 1983).
Estes hormônios, no entanto, funcionam como uma retroalimentação negativa do
sistema imune, ou seja, suprimem sua função (PAUL, 2003).
Os níveis de cortisol sérico, de fato, aparecem aumentados nas amostras
obtidas dos dois grupos de cavalos estudados, coletadas logo após a corrida,
quando comparados aos resultados das amostras coletadas nos outros momentos
(Tabelas 5.8 e 5.9 e Gráficos 5.9 e 5.10). Ocasião que coincide com uma queda na
função dos neutrófilos, que sugere que, dentro do intervalo em que as amostras
foram coletadas, este tenha sido de fato o momento de maior estresse para os
animais (Tabelas 5.1 e 5.2 e Gráficos 5.2.A, 5.2.B, 5.2.C, 5.2.D, 5.2.E e 5.2.F).
Os níveis fisiológicos destes hormônios são controlados através da secreção
de uma cascata de hormônios, que é iniciada pela secreção de hormônio liberador
de corticotrofina (CRH) dos núcleos paraventriculares do hipotálamo. O CRH é o
principal hormônio de estresse do sistema nervoso central e os neurônios dos
núcleos paraventriculares estão intimamente conectados a muitos outros centros de
estresse do cérebro, inclusive o sistema noradrenérgico do tronco cerebral. Estes
centros recebem sinais de todas as partes do cérebro. Ou seja, através destes
trajetos, os níveis de glicocorticóides estão relacionados com flutuações de
estímulos ambientais, físicos, psicológicos e fisiológicos (Anexo B). Os efeitos dos
hormônios glicocorticóides na imunidade ocorrem através das interações destas
substâncias com receptores hormonais intracelulares e do estímulo da síntese de
proteínas específicas (PAUL, 2003) (Anexo C).
Em concentrações aumentadas, denominadas farmacológicas, que podem
ocorrer naturalmente ou por administração artificial, os glicocorticóides suprimem
84
tanto a resposta imune inata quanto a adaptativa; enquanto, em concentrações
fisiológicas, não são totalmente imunossupressores, ao invés disto, há uma troca no
padrão das respostas imunes. Os efeitos resultantes na imunidade incluem
supressão de imunidade humoral e celular, com supressão de produção de
anticorpos frente a uma imunização e hipersensibilidade do tipo tardia. Além disso,
os glicocorticóides afetam o tráfego de células do sistema imune através de efeitos
sobre a permeabilidade vascular, quimiotaxia e expressão de moléculas de adesão.
Ainda, alteram a ativação das células do sistema imune, sua diferenciação, sua
maturação e têm influência no mecanismo de apoptose (PAUL, 2003).
Embora não se tenha realizado dosagem de citocinas neste trabalho, uma vez
que as células do sistema imune utilizam estas moléculas como forma de
comunicação, vale ressaltar que os glicocorticóides também influenciam a produção
destas proteínas biologicamente ativas. Em geral, regulam de forma positiva as
citocinas antinflamatórias, e, de forma negativa, as citocinas pró-inflamatórias; ou
seja, estimulam interleucina-4 e interleucina-10 (IL-4 e IL-10), e suprimem
interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-11,
interleucina-12, fator de necrose tumoral-α, interferon-γ e fator estimulador de
colônias de monócitos e granulócitos (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, TNF-α, IFN-
γ, e GM-CSF). Estes efeitos são mediados principalmente pela repressão da
transcrição do fator nuclear de transcrição que, nos linfócitos B, controla a expressão
das cadeias kappa (κ) para formação das moléculas de imunoglobulinas (NFκB)
(BALDWIN, 1996; GHOSH et al., 1998; MCKAY; CIDLOWSKI, 2000).
Ainda, quando se faz referência a citocinas, é importante destacar o papel
fundamental exercido pelas citocinas pleiomórficas, que funcionam não somente
como sinalizadores para a função imune, mas também como reguladores do sistema
85
endócrino, do metabolismo, do sistema de coagulação e da função cerebral
(FEBBRAIO; PEDERSEN 2002). Os níveis de citocinas circulantes in vivo são
influenciados de forma significante por contribuições provenientes de células que
não pertencem ao sistema imune, como adipócitos, células musculares esqueléticas
e células endoteliais (MOHAMED-ALI et al., 1997). Ao lado da descoberta do tecido
adiposo como um importante órgão endócrino (GUERRE-MILLO, 2004; KERSHAW;
FLIER, 2004), foi demonstrado que durante o trabalho muscular, o músculo
esquelético produz e libera citocinas para a circulação (FEBBRAIO; PEDERSEN,
2002).
Quando da realização de um exercício de alta intensidade, em um curto
período de tempo, os níveis plasmáticos de IL-6 aumentam exponencialmente -
cerca de cem vezes - de forma imediata e independentemente da ocorrência de
lesões musculares, com declínio total no período pós-exercício. O aumento de IL-6 é
decorrente da contração muscular. As evidências que dão suporte à hipótese de que
o músculo esquelético é a principal fonte de IL-6 durante o exercício não-traumático
constituem-se no encontro de níveis aumentados de transcrição, de RNA-
mensageiro e destas proteínas dentro das fibras musculares. Pequenas quantidades
de IL-6 podem ser produzidas pelo tecido adiposo, pelo cérebro e pelo tecido
peritendíneo, de forma concomitante. A resposta de IL-6 é seguida de elevações nos
níveis de marcadores inflamatórios na resposta de fase aguda. Assim, a atividade
física está associada a uma resposta sistêmica de citocinas, comparável aos níveis
observados durante infecções graves, que difere, porém, em relação aos níveis de
TNFα e IL-1β da resposta clássica de fase aguda encontrada em infecções
sistêmicas. Estas citocinas, quando presentes, encontram-se em concentrações
mínimas em modelos de exercício não-traumático (BRUUNSGAARD, 2005).
86
A IL-6 funciona como um sensor energético no músculo, é liberada quando o
conteúdo local de glicogênio está baixo, portanto é possível que grandes
quantidades de IL-6 derivadas dos músculos ajam na circulação como hormônios,
com o objetivo de mobilizar substrato extracelular e/ ou aumentar substrato liberado
durante o exercício (PEDERSEN et al., 2003). A IL-6 induz um aumento da lipólise e
oxidação de lipídeos sem causar triacilglicerolemia, segundo trabalhos experimentais
realizado em seres humanos (PEDERSEN et al., 2005; VAN HALL et al., 2003). A
expressão de RNA-m de IL-6, induzida pelo exercício, no tecido adiposo é mais
pronunciada no período de recuperação, mas não mostra a mesma relação
aumentada como no músculo esquelético durante a atividade física e esta resposta
é menor conforme há ingestão de carboidrato (KELLER et al., 2003). Existe também
a sugestão de que a IL-6 influencie a homeostase da glicose durante o exercício de
alta intensidade, o que implica em um novo entendimento do papel da IL-6 na
produção de glicose e seu clearence (BRUUNSGAARD, 2005).
A IL-6 pode ativar uma proteína denominada proteína-quinase A que é
ativada por adenosina monofosfato (daí sua abreviação, AMPK) no tecido muscular
e adiposo, ou seja, a IL-6 contribui para um aumento da atividade da AMPK nestes
tecidos em resposta ao exercício. Esta ativação, que pode decorrer de mudanças no
estado de energia da célula ou pela exposição a hormônios como adiponectina,
leptina e catecolaminas, estimula vários processos que aumentam a geração de
ATP, que incluem a oxidação de ácidos graxos, o transporte de glicose no músculo
cardíaco e no músculo esquelético, bem como a glicólise no coração e nos
leucócitos. A AMPK é ativada no músculo esquelético durante as contrações, o que
tem sido considerado como uma contribuição a muitas das mudanças no
87
metabolismo do combustível muscular em relação à atividade física (KELLY et al.,
2004).
Subseqüentemente à liberação de IL-6, ocorre um aumento de IL-10 e IL-1Ra
na circulação em relação ao exercício (OSTROWSKI et al., 1999). Embora IL-6 seja
freqüentemente classificada como uma citocina pró-inflamatória, ela também possui
efeitos antinflamatórios e imunossupressivos, conforme ela estimula o eixo hipófise-
adrenal, inibe a síntese de TNF-α, estimula a produção de IL-10 e IL-1Ra, e induz a
expressão de receptores TNF pelos neutrófilos (TILG et al., 1997). Desta forma, a
resposta antinflamatória, que inclui níveis elevados de IL-10, IL-1Ra, receptores TNF
e ativação do eixo hipófise-adrenal, poderia ser elicitada por IL-6 sistêmica, derivada
do músculo durante o exercício.
Ainda com relação aos glicocorticóides, a função e a ativação dos neutrófilos,
que abrange quimiotaxia, adesão, transmigração, apoptose e fagocitose também
podem ser influenciadas (GOULDING et al., 1998). Efeito demonstrado nos dois
grupos de animais deste estudo, tanto em relação à porcentagem de fagocitose,
quanto à intensidade deste processo, ao se considerar quantas partículas de
bactéria foram fagocitadas pelas células, de forma individual (Tabelas 5.1 e 5.2 e
Gráficos 5.2.A, 5.2.B, 5.2.C e 5.2.D). Embora estes efeitos possam ocorrer através
da regulação de muitas citocinas, a lipocortina-1 ou anexina-1 - molécula
antinflamatória que é expressa em células do sistema imune e do sistema
neuroendócrino - tem um papel importante sobre os neutrófilos. Doses
farmacológicas ou de estresse suprimem a ativação e a migração dos neutrófilos,
enquanto aumentam seu número através da inibição de apoptose (PAUL, 2003).
Um aumento do número relativo de neutrófilos foi verificado nas amostras
coletadas imediatamente após a corrida através do hemograma (Tabela e Gráfico
88
5.7). Segundo alguns trabalhos, um aumento inicial ocorre principalmente devido à
mobilização de neutrófilos segmentados marginados, induzida pela liberação de
catecolaminas, enquanto um aumento tardio resulta da mobilização de neutrófilos da
medula óssea para a circulação, como resultado de uma liberação induzida pelo
aumento dos níveis de cortisol plasmático (PYNE, 1994).
Quanto à taxa neutrófilo/ linfócito, que não mostrou diferença estatisticamente
significante em relação aos outros momentos, embora estivesse um pouco
aumentada logo após a corrida, talvez pudesse ser interpretada como um reflexo do
status de condicionamento dos animais do grupo II, o que só poderia ser confirmado
diante da possibilidade de comparação de todos os momentos com um grupo
sabidamente menos condicionado.
O exercício, portanto, parece resultar em uma ativação inicial de neutrófilos
com uma resposta variável nas funções efetoras, como a atividade fagocítica e a
capacidade de burst oxidativo, na dependência da intensidade da atividade física
praticada (PEDERSEN; HOFFMAN-GOETZ, 2000).
Após vinte e quatro horas da corrida, a atividade fagocítica dos neutrófilos
mostrou valores próximos aos encontrados nas amostras coletadas de onze a nove
dias antes do evento, tanto nos cavalos pertencentes ao grupo I quanto nos do
grupo II. Já, em relação à atividade de burst oxidativo isto só pode ser observado no
primeiro grupo.
Estes dados corroboram com resultados, encontrados em um trabalho
realizado na espécie humana, em que foi feita a comparação da capacidade
oxidativa de neutrófilos de atletas frente a exercícios de atividade moderada e de
alta intensidade. Foi encontrada uma diminuição inicial da atividade de neutrófilos
nas duas situações, com uma supressão continuada frente ao exercício de alta
89
intensidade, enquanto frente ao exercício de intensidade moderada ocorria um
aumento da capacidade dos neutrófilos em algumas horas pós-exercício (PYNE et
al., 1994).
A causa da supressão da função fagocítica é, provavelmente, multifatorial,
mas pode ser atribuída em parte ao aumento do cortisol plasmático imediatamente
após a corrida. Experimentos in vitro demostraram uma diminuição da mobilização
da expressão de receptores para componentes do sistema complemento, CR1 e
CR3 (FORSLID; HAD, 1982). Ainda, a função neutrofílica diminuída pode refletir uma
maior porcentagem de neutrófilos imaturos vindos da medula óssea para a
circulação (PYNE, 1994). Estas células podem ser mais ativas (LEW, 1990), mas
com uma capacidade fagocítica e microbicida menor (YANG; HILL, 1991).
Tem sido sugerido também, que os neutrófilos, após terem sido ativados pelo
estímulo do exercício, apresentam uma capacidade reduzida de produzir e liberar
radicais livres diante de uma estimulação subseqüente. Cães anestesiados foram
utilizados para testar esta teoria em estudos que examinaram a sobrevivência e a
atividade de neutrófilos pré-estimulados in vitro e in vivo. Os autores concluíram que
os neutrófilos pré-estimulados diminuíram sua capacidade de produzir e/ou liberar
radicais livres derivados do oxigênio frente a uma subseqüente estimulação com
zimosan, embora esta atividade fosse gradualmente recuperada com o tempo.
Notaram também que os neutrófilos não eram destruídos quando estimulados a
liberarem radicais livres derivados do oxigênio (PRASAD et al., 1991).
A possível extrapolação destes dados para o modelo eqüino pode oferecer
alguma reflexão a respeito de como os aumentos observados na incidência e
gravidade de quadros respiratórios após períodos de exercício de alta intensidade
podem ocorrer. Como se pode notar, a atividade fagocítica pode retornar em pouco
90
tempo ao normal, no entanto, é prudente imaginar que em uma situação em que os
cavalos sejam submetidos a um número maior de sessões de treinamento de alta
intensidade, por exemplo, em períodos que antecedem uma prova importante, possa
haver uma proporção significante de seus neutrófilos circulantes sob um estado
refratário.
Algo que não deve ser subestimado é que após o início do exercício há um
grande incremento na função respiratória. Este evento pode envolver uma ampliação
na ventilação de cerca de 100 L/minuto, encontrada em um estado de repouso para
1800 L/minuto durante o exercício de alta intensidade. O fluxo de ar pode
representar algo muito maior com a progressão da atividade física (HODGSON;
ROSE, 1994), o que acaba por expor em demasia a superfície da mucosa
respiratória aos antígenos ambientais. Neste momento, a integridade da função das
células da imunidade inata é imprescindível.
Em relação aos linfócitos, uma resposta esperada, frente à execução de um
exercício de alta intensidade, é uma supressão da linfoproliferação diante do
estímulo por mitógenos. Este resultado não foi encontrado, quando comparado aos
outros momentos. Como este ensaio só foi realizado com amostras coletadas dos
animais do grupo II, casualmente um grupo em que a maioria era participante de
grandes prêmios, este fato poderia ser atribuído ao status de treinamento destes
animais, como sugerido por alguns autores (FOLSOM, 2001; KEADLE et al., 1993)
ou talvez, uma melhor adaptação ao estresse. Esta última suposição foi colocada em
referência a um trabalho de investigação dos efeitos do desmame sobre a resposta
de estresse psicológico e a resposta proliferativa de linfócitos, tanto das éguas
quanto dos potros. Foram utilizados dois protocolos de desmame. Metade dos potros
foi desmamada na presença de um companheiro, enquanto a outra metade
91
permaneceu sozinha. A concentração de cortisol plasmático apresentou-se elevada
tanto nas éguas quanto nos potros dos dois grupos. Interessantemente, a imunidade
celular encontrava-se deprimida nas éguas e nos potros do grupo que foi
desmamado junto a um companheiro. Os potros desmamados sozinhos não
apresentaram função imune deprimida, mesmo diante do elevado nível de cortisol
sérico. O que os autores concluíram foi que a situação do desmame em pares foi
mais estressante (MALINOWSKI et al., 1990).
Cabe aqui um comentário emitido pelos autores de um trabalho sobre os
efeitos da corrida sobre a linfoproliferação. No protocolo de coleta, as amostras
referidas como anteriores à corrida eram coletadas na manhã anterior ao dia da
corrida ou na manhã do próprio dia da corrida. Algumas amostras coletadas na
manhã em que seria realizada a corrida foram excluídas pelo fato de apresentarem
valores aumentados de cortisol horas antes do início da prova, atribuídos ao
estresse psicológico (NESSE et al., 2002).
Quanto ao número de células apoptóticas, neste trabalho, não houve
diferença estatística entre os valores encontrados, muito provavelmente por não ter
ocorrido grandes danos às células, o que pode sugerir que os animais tenham
alcançado um bom estado de condicionamento frente ao estresse. O ensaio de
apoptose que foi realizado é considerado bastante sensível na medida em que a
anexina V é um marcador precoce de células apoptóticas, que se liga à
fosfatidilserina exposta na superfície destas células (KOOPMAN et al., 1994).
Os mecanismos responsáveis pelo processo de apoptose relacionado ao
exercício ainda são desconhecidos. As mudanças metabólicas e hormonais têm sido
reportadas como indutoras de apoptose em experimentos in vitro. A alteração na
concentração de cálcio citosólico, que ocorre durante o exercício, também pode
92
representar uma via de deflagração de apoptose (MOOREN et al., 2002). As
modificações que acontecem no estado de óxido-redução podem significar um outro
caminho importante (KO et al., 2000). Há também evidências que o processo de
apoptose possa ser induzido por uma via alternativa, durante o exercício, como
mudanças na expressão do receptor CD95 (Fas/ APO-1) (MOOREN et al., 2002).
A geração de radicais livres e espécies reativas do oxigênio aumentam
durante o exercício e parece haver uma ponte entre a liberação de espécies reativas
do oxigênio e os sinais de cálcio na indução de apoptose (KO et al., 2000).
O treinamento promove um aumento da expressão de mecanismos que
degradam radicais, portanto diminuem o dano celular induzido pelo exercício
(UMEGAKI et al., 1998).
No que se refere à série eritrocítica, o encontro de valores aumentados foi
condizente com os dados encontrados na literatura. Diante da exigência do trabalho
muscular, o cavalo libera na circulação, eritrócitos armazenados em seu baço, de
maneira substancial. Esta reserva é tal que a concentração de oxigênio sangüíneo
pode aumentar de cerca de 180 mL/L ao repouso para 280 mL/L em resposta a um
exercício máximo, que está associada com um aumento no hematócrito de cerca de
0,40 L/L ao repouso para mais de 0,60 L/L no exercício máximo (ART; LEKEUX,
2005; HODGSON; ROSE, 1994).
Diante de cavalos condicionados, alguns efeitos decorrentes do treinamento
já comprovados devem ser considerados, como as adaptações de natureza
anabólica - a massa protéica muscular aumenta como um resultado do treinamento -
e variações no padrão enzimático. Os mecanismos envolvidos nestes efeitos do
treinamento ainda não são bem compreendidos. Parece haver o envolvimento de
mecanismos neuroendócrinos tanto na resposta a exercícios agudos quanto nas
93
adaptações frente a treinamentos crônicos. Devido a efeitos de treinamento sobre os
receptores podem ocorrer mudanças representativas nas taxas de secreção
hormonal que não são necessariamente requeridas. Alguns estudos têm
estabelecido correlação entre respostas endócrinas e efeitos do treinamento em
cavalos, com alguns resultados conflitantes (HYYPPÄ, 2005).
É de se esperar, portanto, que haja adaptações frente ao treinamento que
atinjam a função imune, no entanto, o tipo de adaptação ainda não foi elucidado
devido, principalmente, à dificuldade de comparação e interpretação dos diferentes
protocolos de estudo. Desta forma, existem mais questões que respostas quando se
tenta explicar a influência do exercício sobre o sistema imune. Além das várias rotas
bioquímicas que deverão ser descobertas para tal entendimento, não se pode
esquecer da interferência dos fatores genéticos e de diferenças no tipo e intensidade
de exercício utilizados no treinamento.
Na realidade, o que se conhece são partes de uma grande rede que conecta
o sistema nervoso, o sistema endócrino e o sistema imune. Dentro destas
interações, o estudo da fisiologia do exercício aparece como uma área bastante
interessante e desafiante. Não se sabe afirmar a respeito de uma freqüência ou
intensidade ótima, da duração ideal do treinamento para se encontrar um melhor
desempenho; nem mesmo sobre os requerimentos nutricionais ideais para se
otimizar a performance atlética.
Nos cavalos estudados, ainda que tenha sido encontrada uma diminuição
transitória na função dos neutrófilos, a função adaptativa não chegou a ser
acometida. De acordo com o médico veterinário responsável, estes animais não
apresentaram sinais clínicos de doença durante a vigência deste estudo. Parece
sugerir que, embora se constitua em um exercício de alta intensidade, talvez a
94
fugacidade da corrida acabe por evitar danos maiores. Ainda que não tenha sido o
propósito do trabalho avaliar o esquema de treinamento dos animais, diante dos
resultados obtidos, ele pode ser considerado um modelo validado.
Compete ainda uma sugestão. Diante da observação de que o dia da corrida
representa um momento de grande desafio para o cavalo atleta - o que acarreta em
uma diminuição da função imune - seria prudente alertar os médicos veterinários
responsáveis para a realização de um acompanhamento clínico mais rigoroso destes
animais nos dias subseqüentes às provas. Ainda, quanto aos procedimentos de
imunização, o ideal seria que fossem executados durante um período cujo número
de provas fosse menor, porém frente ao contínuo programa de eventos ao longo do
ano, sugere-se que os animais sejam resguardados ao menos por cinco a sete dias
após a corrida para tais práticas.
95
7 CONCLUSÕES
Ω O aumento do número percentual de neutrófilos, no hemograma, diante
da influência do aumento de cortisol sérico, denota a integração dos
sistemas neuroendócrino e imune
Ω A diminuição transitória encontrada na função in vitro de neutrófilos
através de ensaios de fagocitose e de burst oxidativo revela a ativação
das células da imunidade inata diante da situação de estresse induzida
pelo exercício
Ω A ausência de alteração nos valores de proliferação de linfócitos diante
de estímulos antigênicos in vitro sugere que a imunidade adaptativa
não tenha sido afetada
Ω Da mesma forma, a ausência de encontro de linfócitos em processo de
apoptose sugere não ter ocorrido grandes danos às células da
imunidade específica
Ω Os valores encontrados no hemograma, em relação à série eritrocítica
demonstram a adaptação dos cavalos frente à exigência do trabalho
realizado durante o exercício
96
REFERÊNCIAS
1
ADAMSON, E. J.; SLOCOMBE, R. F. Flow cytometric studies of equine phagocytes
following strenuous exercise. Equine Veterinary Journal, v. 18 p. 37-42, 1995.
supplement.
ALMAWI, W. Y.; MELEMEDJIAN, O. K. Molecular mechanisms of glucocorticoid
antiproliferative effects: antagonism of transcription factor activity by glucocorticoid
receptor. Journal of Leucocyte Biology, v. 71, p. 9-15, 2002.
ART, T.; LEKEUX, P. Exercise-induced physiological adjustments to stressful
conditions in sports horses. Livestock Production Science, v. 92, p. 101-111, 2005.
BALDWIN JR, A.S. The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and
insights. Annual Review of Immunology, v. 14, p. 649-683, 1996.
BARCELLOS, S. Cavalos de corrida - Uma alegria eterna, Rio de Janeiro: Ed.
Topbooks, 2002. 281 p.
BESEDOVSKY, H.; DELRAY, A.; SORKIN, E.; DA PRADA, M.; BURRI, R.;
HONNEGER, C. The immune response evokes changes in brain noradrenergic
neurons. Science, v. 221, p. 564-566, 1983.
BRUUNSGAARD, H. Physical activity and modulation of systemic low-level
inflammation. Journal of Leukocyte Biology, v. 78, p. 819-835, 2005.
BURRELL, M. H.; WOOD, J. L. N.; WHITWELL, K. E.; CHANTER, N.;
MACKINTOSH, M. E.; MUMFORD, J. A. Respiratory disease in thoroughbred horses
in training: the relationships between disease and viruses, bacteria and environment.
Veterinary Record, v. 139, n. 18, p. 308-313, 1996.
BUSCHMANN, H.; BAUMANN, M. Alterations of cellular immune response during
intensive training of event horses. Zentralbl Veterinarmed B, v. 38, n. 2, p. 90-94,
1991.
CARLSON, G. P.; OCEAN, P. O.; HARROLD, D. Clinicopathologic alterations in
normal and exhausted endurance horses. Theriogenology, v. 6, p. 93-103, 1976.
CHEN, J. C.; CHANG, M. L.; MUENCH, M. O. A kinetic study of the murine mixed
lymphocyte reaction by 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester labeling.
Journal of Immunological Methods, v. 279, p. 123-133, 2003.
CHIARADIA, E.; GAITI, A.; TERRACINA, L.; AVELLINI, L. Effect of submaximal
exercise on horse homocysteinaemia: possible implications for immune cells.
Research in Veterinary Science, v. 79, p. 9-14, 2005.
CHRISTLEY, R. M.; ROSE, R. J.; HODGSON, D. R.; REID, S. W.; EVANS, S.;
BAILEY, C.; HODGSON, J. L. Attitudes of Australian veterinarians about the cause
and treatment of lower-respiratory-tract disease in racehorses. Preventive
Veterinary Medicine, v. 46, p. 149-159, 2000.
1 Conforme as diretrizes para apresentação de dissertações e teses na Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. 4 ed. São Paulo: FMVZ-USP, 2003. 84p.
97
COENEN, M. Exercise and stress: impact on adaptive processes involving water and
electrolytes. Livestock Production Science, v. 92, p. 131-145, 2005.
DARZYNKIEWICZ, Z.; BRUNO, S.; DEL BINO, G.; GORCZYCA, W.; HOTZ, M. A.;
LASSOTA, P.; TRAGANOS, F. Features of apoptotic cells measured by flow
cytometry. Cytometry, v. 13, p. 795, 1992.
DARZYNKIEWICZ, Z; JUAN, G.; LI, X. GORCZYCA, W.; MURAKAMI, T.;
TRAGANOS, F. Cytometry in cell necrobiology: analysis of apoptosis and accidental
cell death (necrosis). Cytometry, v. 27, p. 1, 1997.
DARZYNKIEWICZ, Z; LI, X.; GONG, J. Assays of cell viability: discrimination of cells
dying by apoptosis. Methods in Cell Biology, v. 41, p. 15, 1994.
EATON, M. D. Energetics and performance. In: HODGSON, D. R.; ROSE, R. J. The
Athletic horse: principles and practice of equine sports medicine. Philadelphia:
W.B. Saunders, 1994. p. 49-61.
ESCRIBANO, B. M.; CASTEJÓN, F. M.; VIVO, R.; AGÜERA, S.; AGÜERA, E. I.;
RUBIO, M.D. Nonspecific immune response of peripheral blood neutrophils in two
horse breeds (Anglo-Arabian and Spanish-Arabian):response to exercise.
Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases. v. 28, p. 145-
154, 2005a.
ESCRIBANO, B. M.; CASTEJÓN, F. M.; VIVO, R.; SANTISTEBAN, R.; AGÜERA, E.
I.; RUBIO, M. D. Effects of Training on Phagocytic and Oxidative Metabolism of
Peripheral Neutrophils in Horses Exercised in the Aerobic-Anaerobic Transition Area.
Veterinary Research Communications, v. 29, p. 149-158, 2005b.
FEBBRAIO, M. A.; PEDERSEN, B. K. Muscle-derived interleukin-6 mechanisms for
activation and possible biological roles. FASEB Journal, v. 16, p. 1335-1347, 2002.
FERRY, A.; PICARD, F.; DUVALLET, A; WEILL, B.; RIEU, M. Changes in blood
leucocyte populations induced by acute maximal and chronic submaximal exercise.
European Journal of Applied Physiology, v. 59, n. 6, p. 435-442, 1990.
FIELD, C. J.; GOUGEON, R.; MARLISS, E. B. Circulating mononuclear cell numbers
and function during intense exercise and recovery. Journal of Applied Physiology,
v. 71, p. 1089-1097, 1991.
FOERSTER, R. J.; WOLF, G. Phagocytosis of opsonised fluorescent microspheres
by equine polymorphonuclear leucocytes. Journal of Veterinary Medicine B, v. 37,
p. 481-490, 1990.
FOLSOM, R. W.; LITTLEFIELD-CHABAUD, M. A.; FRENCH, D. D.; POURCIAU, S.
S.; MISTRIC, L.; HOROHOV, D. W. Exercise alters the immune response to equine
influenza virus and increases susceptibility to infection. Equine Veterinary Journal,
v. 33, p. 664-669, 2001.
FORSLID, J.; HED, J. In vitro effect of hydrocortisone on the attachment and
ingestion phases of immunoglobulin G- and complement component 3b-mediated
phagocytosis by human neutrophils. Infection and Immunity, v. 38, p. 811-816,
1982.
GHOSH, S.; MAY, M. J.; KOOP, E. B. NF-kappa B and Re1 proteins: evolutionarily
conserved mediators of immune responses. Annual Review of Immunology, v. 16,
p. 225-260, 1998.
98
GIMENEZ, M.; MOHAN-KUMAR, T.; HUMBERT, J. C.; DE TALANCE, N.; BUISINE,
J. Leukocyte, lymphocyte and platelet response to dynamic exercise. Duration or
intensity effect? European Journal of Applied Physiology, v. 55, n. 5, p. 465-470,
1986.
GOLLAND, L. C.; EVANS, D. L.; STONE, G. M.; TYLER-MCGOWAN, C. M.;
HODGSON, D. R.; ROSE, R. J. Plasma cortisol and β-endorphin concentrations in
trained and over-trained standardbred racehorses. European Journal of
Physiology, v. 439, p. 11-17, 1999.
GORCZYCA, W.; MELAMED, M. R.; DARZYNKIEWICZ, Z. Analysis of apoptosis by
flow cytometry. Methods in Molecular Biology, v. 91, p. 217-238, 1998.
GOULDING, N. J.; EUZGER, H. S.; BUTT, S. K.; PERRETTI, M. Novel pathways for
glucocorticoid effects on neutrophils in chronic inflammation. Inflammation
Research , v. 47, p. 158-165, 1998. supplement 3.
GUERRE-MILLO, M. Adipose tissue and adipokines: for better or worse. Diabetes
and Metabolism, v. 30, p. 13-19, 2004.
HASUI, M.; HIRABAYASHI, I.; KOBAYASHI, Y. Simultaneous measurement by flow
cytometry of phagocytosis and hydrogen peroxide production of neutrophils in whole
blood. Journal of Immunological Methods, v. 117, p. 53-58, 1989.
HINES, M. T.; SCHOTT II, H. C.; BAYLY, W. M.; LEROUX, A.J. Exercise and
immunity: a review with emphasis on the horse. Journal of Veterinary Internal
Medicine, v. 10, n. 5, p. 280-289, 1996.
HODGSON, D. R.; ROSE, R. J. The Athletic horse: principles and practice of
equine sports medicine. Philadelphia: W. B. Saunders,1994. 497 p.
HOROHOV, D. W. Is exercise bad for the immune system? Equine Veterinary
Journal, v. 35, n. 2, p. 113-116, 2003.
HOROHOV, D. W; DIMOCK, A.; GUIRNALDA, P.; FOLSOM, R. W.; McKEEVER, K.
H.; MALINOWSKI, K. Effect of exercise on the immune response of young and old
horses. American Journal of Veterinary Research, v. 60, p. 643-647, 1999.
HOROHOV, D. W.; KEADLE, T. L.; POURCIAU, S. S.; LITTLEFIELD-CHABAUD, M.
A.; KAMERLING, S. G.; KEOWEN, M. L.; FRENCH, D. D.; MELROSE, P. A.
Mechanism of exercise-induced augmentation of lymphokine actived killer (LAK) cell
activity in the horse. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 53, p. 221-
233, 1996.
HYYPPÄ, S. Endocrinal responses in exercising horses. Livestock Production
Science, v. 92, p. 113-121, 2005.
JMP. User’s guide. Cary: SAS Institute, 2002.
JOHANNISSON, A.; GRO-NDAHL, G.; DEMMERS, S.; JENSEN-WAERN, M. Flow-
cytometric studies on the phagocytic capacities of equine neutrophils. Acta
Veterinary Scandinavia, v. 36, p. 553-562, 1995.
KEADLE, T. L.; POURCIAU, S. S.; MELROSE, P. A.; KAMERLING, S. G.;
HOROHOV, D. W. Acute exercise stress modulates immune function in unfit horses.
Journal of Equine Veterinary Science, v. 13, p. 4-9, 1993.
KEAST, D.; CAMERON, K.; MORTON, A. R. Exercise and the immune response.
Sports Medicine, v. 5, p. 248-267, 1988.
99
KELLER, C.; KELLER, P.; MARSHAL, S.; PEDERSEN, B. K. IL-6 gene expression in
human adipose tissue in response to exercise – effect of carbohydrate ingestion.
Journal of Physiology, v. 550, p. 927-931, 2003.
KELLY, M.; KELLER, C.; AVILUCEA, P. R.; KELLER, P.; LUO, Z.; XIANG, X.;
GIRALT, M.; HIDALGO, J.; SAHA, A. K.; PEDERSEN, B. K.; RUDERMAN, N. B.
AMPK activity is diminished in tissues of IL-6 knockout mice: the effect of exercise.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 320, p. 449-454,
2004.
KENDALL, A.; HOFFMAN-GOETZ, L.; HOUSTON, M.; MacNEIL, B.; ARUMUGAM,
Y. Exercise and blood lymphocyte subset responses: intensity, duration and subject
fitness effects. Journal of Applied Physiology, v. 69, n. 1, p. 251-260, 1990.
KERSHAW, E. E.; FLIER, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. Journal of
Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 89, p. 2548-2556, 2004.
KO, S.; KWORK, T. T.; FUNG, K. P.; CHOY, Y. M.; LEE, C. Y.; KONG, S. K. Slow
rise of Ca
2+
and slow release of reactive oxygen species are two cross-talked events
important in tumor necrosis factor-α-mediated apoptosis. Free Radical Research, v.
33, p. 295-304, 2000.
KOOPMAN, G.; REUTELINGSPERGER, C. P.; KUIJTEN, G. A.; KEEHNEN, R. M.;
PALS, S. T.; VAN OERS, M. H. Annexin V for flow cytometric detection of
phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, v. 84, p.
1415-1420, 1994.
KURCZ, E. V.; LAWRENCE, L. M.; KELLEY, K. W.; MILLER, P. A. The effect of
intense exercise on the cell-mediated immune response of horses. Equine Nutrition
and Physiology Society, v. 8, p. 237-239, 1988.
LASSOURD, V.; GAYRARD, V.; LAROUTE, V.; ALVINERIE, M.; BERNARD, P.;
COURTOT, D.; TOUTAIN, P. L. Cortisol disposition and production rate in horses
during rest and exercise. American Journal of Physiology, v. 271, p. 25-33, 1996.
LEW, P. D. Receptors and intracellular signaling in human neutrophils. American
Review of Respiratory Disease, v. 141, S127-S131, 1990.
LUNN, D. P.; HUSSEY, S.; SEBING, R.; RUSHLOW, K. E.; RADECKI, S. V.;
WHITAKER-DOWLING, P.; YOUNGNER, J. S.; CHAMBERS, T. M.; HOLLAND JR.,
R. E.; HOROHOV, D. W. Safety, efficacy, and immunogenicity of a modified-live
equine influenza virus vaccine in ponies after induction of exercise-induced
immunosuppression. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.
218, p. 900-906, 2001.
MACNEIL, B.; HOFFMAN-GOETZ, L.; KENDALL, A; HOUSTON, M.; ARUMUGAM,
Y. Lymphocyte proliferation responses after exercise in men: fitness, intensity and
duration effects. Journal of Applied Physiology, v. 70, n. 1, p. 179-185, 1991.
MALINOWSKI, K.; HALLQUIST, N. A.; HELYAR, L.; SHERMAN, A. R.; SCANES, C.
G. Effect of different separation protocols between mares and foals on plasma
cortisol in cell-mediated immune response. Journal of Equine Veterinary Science,
v. 10, p. 363-368, 1990.
MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioquímica básica. Rio de Janeiro: Editora
Guanabara Koogan, 1999. 360 p.
100
MCCARTHY, D. A.; DALE, M. M. The leucocytosis of exercise: a review and model.
Sports Medicine, v. 6, p. 333-363, 1988.
MCKAY, L. I.; CIDLOWSKI, J. A. CBP (CREB binding protein) integrates NF-kappa B
(nuclear factor-kappa B) and glucocorticoid receptor physical interactions and
antagonism. Molecular Endocrinology, v. 14, p. 1222-1234, 2000.
MOHAMED-ALI, V.; GOODRICK, S.; RAWESH, A.; KATZ, D. R.; MILES, J. M.;
YUDKIN, J. S.; KLEIN, S.; COPPACK, S. W. Subcutaneous adipose tissue releases
interleukin-6, but not tumor necrosis factor-α, in vivo. Journal of Clinical
Endocrinology & Metabolism, v. 82, p. 4196-4200, 1997.
MOOREN, F. C.; BLÖMING, D.; LECHTERMANN, A.; LERCH, M. M.; VÖLKER, K.
Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. Journal of Applied
Physiology, v. 93, p. 147-153, 2002.
MOOREN, F. C.; LECHTERMANN, A.; VÖLKER, K. Exercise-induced apoptosis of
lymphocytes depends on training status, Medicine & Science in Sports & Exercise
v. 36, p. 1476-1483, 2004.
NAGATA, S.; TAKEDA, F.; KUROSAWA, M.; MIMA, K.; HIGARA, A.; KAI, M.; TAYA,
K. Plasma adrenocorticotropin, cortisol and cathecolamines response to various
exercises. Equine Veterinary Journal, p. 570-574, 1999. supplement 30.
NESSE, L. L; JOHANSEN, G. L.; BLOM, A. K. Effects of racing on lymphocyte
proliferation in horses. American Journal of Veterinary Research, v. 63, p. 528-
530, 2002.
NIEMAN, D. C.; HENSON, D. A.; JOHNSON, R.; LEBECK, L.; DAVIS, J. M.;
NEHLSEN-CANNARELLA, S. L. Effects of brief, heavy exertion on circulating
lymphocyte subpopulations and proliferative response. Medicine & Science in
Sports & Exercise, v. 24, n. 12, p. 1339-1345, 1992.
NIEMAN, D. C.; JOHANSSEN, L. M.; LEE, J. W.; ARABATZIS, K. Infectious
episodes in runners before and after the Los Angeles Marathon. Journal of Sports
Medicine and Physical Fitness, v. 30, n. 3, p. 316-328, 1990.
OSTROWSKI, K.; ROHDE, T.; ASP, S.; SCHJERLING, P.; PEDERSEN, B. K. Pro-
and anti-inflammatory cytokine balance in strenuous exercise in humans. Journal of
Physiology, v. 515, p. 287-291, 1999.
PAUL, W. E (Ed.). Fundamental immunology, USA: Lippincott Williams & Wilkins,
2003. 1701 p.
PEDERSEN, B. K.; HOFFMAN-GOETZ, L. Exercise and the immune system:
regulation, integration, and adaptation. Physiological Reviews, v. 80, p. 1055-1081,
2000.
PEDERSEN, B. K.; STEENSBERG, A.; FISCHER, C.; KELLER, C.; KELLER, P.;
PLOMGAARD, P.; FEBBRAIO, M.; SALTIN, B. Searching for the exercise factor: is
IL-6 a candidate? Journal of Muscle Research and Cell Motility, v. 24, p. 113-119,
2003.
PEDERSEN, B. K.; TVEDE, N.; HANSEN, F. R.; ANDERSEN, V.; BENDIX, T.;
BENDIXEN, G.; BENDTZEN, K.; GALBO, H.; HAAHR, P. M.; KLARLUND, K.
Modulation of natural killer cell activity in peripheral blood by physical exercise.
Scandinavian Journal of Immunology, v. 27, n. 6, p. 673-678, 1988.
101
PETERSEN, E. W.; CAREY, A. L.; SACHETTI, M.; STEINBERG, G. R.; MACAULAY,
S. L.; FEBBRAIO, M.; PEDERSEN, B. K. Acute IL-6 treatment increases fatty acid
turnover in elderly humans in vivo and in tissue culture in vitro. American Journal of
Physiology: Endocrinology and Metabolism, v. 288, p. E155-E162, 2005.
PIER, G. B.; LYCZAK, J. B.; WETZLER, L. M. Immunology, Infection, and
Immunity, Washington: ASM Press, 2004. 718 p.
PRASAD, K.; CHAUDHARY, A. K.; KALRA, J. Oxygen-derived free radicals
producing activity and survival of activated polymorphonuclear leukocytes. Molecular
and Cellular Biochemistry, v. 103, p. 51-62, 1991.
PYNE, D. B. Regulation of neutrophil function during exercise. Sports Medicine, v.
17, p. 245-258, 1994.
RAIDAL, S. L.; BAILEY, G. D.; LOVE, D. N. The flow cytometric evaluation of
phagocytosis by equine peripheral blood neutrophils and pulmonary alveolar
macrophages. The Veterinary Journal, v. 156, p. 107-116, 1998.
RAIDAL, S. L.; LOVE, D. N.; BAILEY, G. D.; ROSE, R. J. Effect of single bouts of
moderate and high intensity exercise and training on equine peripheral blood
neutrophil function. Research in Veterinary Science, v. 68, p. 141-6, 2000.
REICHE, E. M. V.; NUNES, S. O. V.; MORIMOTO, H. K. Stress, depression, the
immune system, and cancer. The Lancet, v. 5, p. 617-625, 2004.
ROBSON, P.; ALSTON, T.; MYBURGH, K. Prolonged suppression of the innate
immune system in the horse following an 80 km endurance race. Equine Veterinary
Journal, v. 35, p. 133-137, 2003.
ROSE, R. J.; HODGSON; D. R. Haematological and plasma biochemical parameters
in endurance horses during training. Equine Veterinary Journal, v. 14, p. 144-148,
1982.
ROSSDALE, P. D.; BURGUEZ, P. N.; CASH, R. S. Changes in blood neutrophil/
lymphocyte ratio related to adrenocortical function in the horse. Equine Veterinary
Journal, v. 14, n. 4, p. 293-298, 1982.
SNOW, D. H.; RICKETTS, S. W.; MASON, D. K. Haematological response to racing
and training exercise in Thoroughbred horses, with particular reference to the
leucocyte response. Equine Veterinary Journal, v. 15, n. 2, p. 149-154, 1983.
SNOW, D. H.; ROSE, R. Hormonal changes associated with long distance exercise.
Equine Veterinary Journal, v. 13, p. 195-197, 1981.
STERNBERG, E. M. Neural-immune interactions in health and disease. The Journal
of Clinical Investigation, v. 100, p. 2641-2647, 1997.
TARRANT, J. M. The role of flow cytometry in companion animal diagnostic
medicine. The Veterinary Journal, v. 170, p. 278-288, 2005
TILG, H.; DINARELLO, C. A.; MIER, J. W. IL-6 and APPs: anti-inflammatory and
immunosuppressive mediators. Immunology Today, v. 18, p. 428-432, 1997.
UMEGAKI, K.; HIGUCHI, M.; INOUE, K.; ESASHI, T. Influence of one bout of
intensive running on lymphocyte micronucleus frequencies in endurance-trained and
untrained men. International Journal of Sports Medicine, v. 19, p. 581-585, 1998.
102
VAN HALL, G.; STEENSBERG, A.; SACHETTI, M.; FISCHER, C.; KELLER, C.;
SCHJERLING, P.; HISCOCK, N.; MOLLER, K.; SALTIN, B.; FEBBRAIO, M. A.;
PEDERSEN, B. K. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans.
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 88, p. 3005-3010, 2003.
VERMES, I.; HAANEN, C. Apoptosis and programmed cell death in health and
disease. Advances in Clinical Chemistry, v. 31, p. 177, 1994.
VERMES, I.; HAANEN, C.; REUTSLINGSPERGER, C. Flow cytometry of apoptotic
cell death. Journal of Immunological Methods, v. 243, p. 167-190, 2000.
WANG, J. S.; HUANG, Y. H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis
induced by oxidative stress in men. European Journal of Applied Physiology, v.
95, p. 290-297, 2005.
WEBSTER, J. I.; TONELLI, L.; STERNBERG, E. M. Neuroendocrine regulation of
immunity. Annual Review of Immunology, v. 20, p. 125-163, 2002.
WONG, C. W.; SMITH, S. E.; THONG, Y. H.; OPDEBEECK, J. P.; THORNTON, J. R.
Effects of exercise stress on various immune functions in horses. American Journal
of Veterinary Research, v. 53, p. 1414-1417, 1992.
WONG, C. W.; THOMPSON, H. L.; THONG, Y. H.; THORNTON, J. R. Effect of
strenuous exercise stress on chemiluminescence response of equine alveolar
macrophages. Equine Veterinary Journal, v. 22, p. 33-35, 1990.
WOOD, J. L. N.; NEWTON, J. R.; CHANTER, N.; MUMFORD, J. A. Association
between respiratory diseases and bacterial and viral infections in British racehorses.
Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n.1, p. 120-126, 2005.
WOODS, J. A.; DAVIS, J. M.; SMITH, J. A.; NIEMAN, D. C. Exercise and cellular
innate immune function. Medicine & Science in Sports & Exercise, v. 31, p. 57-66,
1999.
YANG, K. D.; HILL, H. R. Neutrophil function disorders: pathophysiology, prevention,
and therapy. Journal of Pediatrics, v. 119, p. 343-354, 1991.
ZOLOVICK, A.; UPSON, D. W.; ELEFTHERIOU, B. E. Diurnal variation in plasma
gluco-corticosteroid levels in the horse (Equus caballus). Journal of Endocrinology,
v. 35, n. 3, p. 249-253, 1966.
103
APÊNDICES
APÊNDICE A - Dados dos animais quanto a sexo, idade (em anos), distância da
corrida (em metros), tipo de pista, categoria do páreo, colocação do
animal na chegada, dia do evento e tipo de treinamento a que o
animal foi submetido
animais sexo idade distância tipo categoria do páreo colocação
data do
evento
1
treina-
mento
1. F 2 1.400 grama potrancas de 2 anos sem vitória 7
o
02/05/04
A*
2. M 4 1.600 areia produtos de 3 anos ou mais 5
o
02/05/04
A**
3. F 3 1.400 grama potrancas de 3 anos sem vitória 8
o
02/05/04
A
4. F 3 1.800 grama
2
misto 3
o
16/05/04
A
5. M 4 1.600 grama Grande Prêmio (produtos de 3 anos ou mais) 12
o
16/05/04
A
6. M 3 2.400 grama Grande Prêmio (produtos de 3 anos ou mais) 2
o
16/05/04
A
7. F 3 1.800 grama potrancas de 3 anos sem mais de 1 vitória 10
o
16/05/04
A
8. F 3 1.800 grama potrancas de 3 anos sem mais de 1 vitória 9
o
16/05/04
A
9. M 4 1.500 areia
3
produtos de 4 a 6 anos 2
o
12/06/04
A
10. M 5 1.600 areia
4
misto 7
o
12/06/04
A*
11. M 2 1.500 grama produtos de 2 anos s/ vitória 2º 13/06/04
A
12. M 3 1.400 areia produtos de 3 anos s/ vitória 2
o
18/06/04
A*
13. F 5 2.000 areia Grande Prêmio (produtos de 4 anos ou mais) 4
o
18/06/04
A
14. F 3 1.500 grama potrancas de 3 anos s/ vitória 2
o
18/06/04
A*
15. F 3 1.500 grama potrancas de 3 anos s/ vitória 1
o
18/06/04
A
16. M 5 1.400 grama produtos de 4 anos ou mais 1
o
27/08/05
A*
17. F 3 1.400 grama potrancas de 3 anos com até 1 vitória 4
o
27/08/05
A**
18. F 3 1.400 grama potrancas de 3 anos s/ vitória 7
o
27/08/05
A*
19. M 3 1.400 grama produtos de 3 anos s/ vitória 7
o
28/08/05
A
20. M 3 1.600 grama Grande Prêmio (produtos de 3 anos) 3
o
03/09/05
A
21. M 3 1.600 grama Grande Prêmio (produtos de 3 anos) 4
o
03/09/05
A
22. M 5 2.400 areia Grande Prêmio (produtos de 4 anos ou mais) 5
o
04/09/05
A
23. M 4 2.400 areia Grande Prêmio (produtos de 4 anos ou mais) 1
o
04/09/05
A
24. M 6 2.400 areia Grande Prêmio (produtos de 4 anos ou mais) 6
o
04/09/05
A*
25. F 3 2.000 grama produtos de 3 anos com até 1 vitória 8º 08/10/05
A
26. F 3 2.000 grama Grande Prêmio (potrancas de 3 anos) 4º 08/10/05
A
27. M 4 2.400 grama Grande Prêmio (produtos de 4 anos ou mais) 3º 08/10/05
A
28. M 3 2.000 grama Grande Prêmio (produtos de 3 anos) 10º 08/10/05
A
29. M 3 2.000 grama Grande Prêmio (produtos de 3 anos) 3º 08/10/05
A
30. M 4 2.400 grama Grande Prêmio (produtos de 4 anos ou mais) 9º 08/10/05
A
Fonte: Programas Oficiais das corridas do Hipódromo Paulistano – JCSP – Cidade Jardim, nas datas referidas
Variação do tempo médio de corrida (em minutos): de 1’25”403 (nos páreos de 1.400 m) a 2’29”595 (nos páreos de 2.400 m)
1: sistemas de treinamento esquematizados no APÊNDICE B (A, A* e A**)
2: éguas de 3 anos s/ mais de 3 vitórias, de 4 anos s/ mais de 4 vitórias, de 5 anos s/ mais de 6 vitórias, de 6 anos s/ mais de 8 vitórias e de 7 anos s/ mais de 9
vitórias
3: produtos de mais de 4 anos s/ de 1 vitória, de 5 anos s/ mais de 2 vitórias e de 6 anos s/ mais de 4 vitórias
4: produtos de 3 anos s/ mais de 2 vitórias, 4 anos s/ mais de 3 vitórias, de 5 anos s/ mais de 5 vitórias, de 6 anos s/ mais de 7 vitórias e mais anos s/ mais de 8
vitórias
104
APÊNDICE B – Módulos de Treinamento A, A* e A**
MÓDULO DE TREINAMENTO – A (Sistema tradicional de treinamento para cavalos
PSI no Brasil) – A
1234567
8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18 19 20 21
22 23 24 25 26 27 28
Períodos de repouso de exercício na raia
Exercícios diários matinais (passo, trote e galope suaves)
Apronto de velocidade (metade da distância da corrida)
Trabalho forte de distância (distância da corrida)
Corrida
Figura A1 – Esquema do módulo de treinamento disposto em vinte e oito dias
MÓDULO DE TREINAMENTO - A*
A diferença em relação ao treinamento A é que os “aprontos de velocidade”,
exercícios fortes, não são realizados.
MÓDULO DE TREINAMENTO - A**
A diferença básica com o treinamento A é que o exercício forte de distância é
conduzido em sessão única, 14 dias antes da corrida, e o “apronto de velocidade” é também
conduzido em sessão única, sete dias antes da corrida. Neste grupo, aos exercícios diários
matinais, esporadicamente, são acrescentadas sessões diárias de natação em piscina
hípica, em distâncias de 50 a 500m.
Diante da similaridade entre os tipos de treinamento e do pequeno número de
animais pertencentes aos treinamentos A* e A**, em relação ao treinamento A, esta
diferença não foi considerada na apresentação dos resultados.
105
ANEXOS
ANEXO A - CITOMETRIA DE FLUXO
Figura A2 - Esquema da citometria de fluxo (TARRANT et al. 2005). As células são
atravessadas pelo laser no fluxo celular. A luz dispersa é coletada por
detectores posicionados em diferentes angulações, menores (forward scatter,
FSC) e maiores (side scatter, SSC) que mensuram as propriedades físicas da
célula, respectivamente, tamanho e granulosidade/ complexidade da célula
Laser
Fluxo celular
Lentes
coletoras de
fluorescência
detector FSC
detector SSC
detector de
fluorescência
Espelhos
dicróicos
detector de
fluorescência
106
ANEXO B - INTERAÇÕES ENTRE SISTEMA NERVOSO, SISTEMA ENDÓCRINO E
SISTEMA IMUNE
Figura A3 - Interações entre sistema nervoso, sistema endócrino e sistema imune. ADH
hormônio antidiurético; ACTH hormônio corticotrófico; CRF hormônio liberador
de corticotrofina; TSH hormônio estimulante da tireóide. Adaptado de REICH et
al. 2004 e COENEN 2005
Várias condições que rompem o equilíbrio metabólico, induzem a uma resposta
endócrina. Sinais gerados pelo trato gastrointestinal ou pelo tecido nervoso central
estimulam a comunicação com a glândula hipófise. O estresse mental dispara o eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal de forma bastante eficiente –fenômeno descrito em animais
selvagens – mas pode resultar em doença ou morte, principalmente devido a uma
depressão da competência imune. O mesmo princípio é aplicado quando o estresse
Hipotálamo
Núcleos paraventriculares
Stress
Córtex adrenal
Sistema Nervoso
Simpático
Medula adrenal
Sistema Imune
Glicocorticóides
Trato Gastrointestinal
Sinais centrais
Hipoglicemia
Outros sinais (ex. dor)
Centros
termoreguladores
p
eriférico e central
Posterior
ADH
rins
Anterior
ACTH, TSH
etc
Adrenal Tireóide
+
/
-
Norepinefrina -
Norepinefrina +
+
-
-
+
+
A
rginina vasopressina +
CRF+
A
CTH+
A
rginina vasopressina +
CRF+
Tronco cerebral
Locus coeruleus
Sistema noradrenérgico
Norepinefrina +
Hipófise
107
metabólico é induzido, como ocorre durante o exercício. Várias condições, que incluem o
aumento do requerimento de energia e a diminuição do suprimento energético durante um
determinado período de tempo, são caracterizados por um aumento dos níveis de cortisol
(COENEN 2005). O controle da concentração dos hormônios glicocorticóides é feito através
da secreção de uma cascata de hormônios iniciada pela secreção do hormônio liberador de
corticotrofina (CRH) dos núcleos paraventriculares do hipotálamo, dentro do sistema de
vasos porta-hipofisário, o que resulta na secreção de hormônio adreno-corticotrófico (ACTH)
da glândula hipófise, na sua porção anterior, e estimula a secreção de cortisol do córtex da
supra-renal. Os neurônios dos núcleos paraventriculares estão intimamente conectados a
muitos outros centros de estresse do cérebro, inclusive o sistema noradrenérgico do tronco
cerebral. Estes centros recebem sinais de todas as partes do cérebro (PAUL 2003).
108
ANEXO C - LIGAÇÃO DOS GLICOCORTICÓIDES A SEUS RECEPTORES
INTRACELULARES
Figura A4 - Diagrama esquemático dos mecanismos moleculares dos efeitos de
glicocorticóides sobre a função da célula imune. Adaptado de WEBSTER et
al. 2002 apud PAUL 1003. Hsp90 (heat shock protein); I
κBα inibidor de
NF
κB1; NFκB1 fator nuclear de transcrição que controla a expressão de
cadeias κ das imunoglobulinas nos linfócitos B
Os receptores dos glicocorticóides são proteínas intracelulares que se apresentam
como um complexo de alto peso molecular, que contém a proteína Hsp-90 (
heat shock
protein
). Quando o hormônio se fixa no receptor, a proteína Hsp-90 é liberada e o complexo
receptor-hormônio é translocado para o núcleo, dimerizado, liga-se ao DNA. Dependendo do
gene-alvo, os receptores ativados podem estimular – transativação – ou inibir –
transrepressão – a transcrição gênica (ALMAWI et al 2002)
Legenda
Glicocorticóides............................
Receptor de
glicocorticóide+Hsp90....................
Hsp90.........................................
Glicocorticóde + receptor.........
c-Jun...........................................
c-Fos...........................................
IκBα............................................
NFκB1 + ReIA.............................
Imunoestimulador + receptor...
Rna -M
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