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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
CARACTERIZAÇÃO DO MECANISMO FOTOSSINTÉTICO E
ASPECTOS RELACIONADOS À FLORAÇÃO DE Artemisia annua L.
JOSÉ ABRAMO MARCHESE
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da Unesp - Campus de Botucatu,
para obtenção do título de Doutor em
Agronomia - Área de Concentração em
Horticultura.
BOTUCATU-SP
Fevereiro - 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
CARACTERIZAÇÃO DO MECANISMO FOTOSSINTÉTICO E
ASPECTOS RELACIONADOS À FLORAÇÃO DE Artemisia annua L.
JOSÉ ABRAMO MARCHESE
Engenheiro Agrônomo
Orientador: Prof. Dr. Fernando Broetto
Co-orientadora: Dra. Rita M. Moraes
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da Unesp - Campus de Botucatu,
para obtenção do título de Doutor em
Agronomia - Área de Concentração em
Horticultura.
BOTUCATU - SP
Fevereiro – 2006
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TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO
UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP)
Marchese, José Abramo, 1967-
M316c Caracterização do mecanismo fotossintético e aspectos
relacionados à floração de Artemisia annua L. / José Abra-
mo Marchese. – Botucatu : [s.n.], 2006.
xiii, 68 f. : il. color., gráfs., tabs.
Tese (Doutorado) -Universidade Estadual Paulista, Fa-
culdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2005
Orientador: Fernando Broetto
Co-orientador: Rita Maria Moraes
Inclui bibliografia.
1. Fotossíntese. 2. Carbono - Isótopos. 3. Fotoperiodismo
vegetal. 4. Plantas – Efeito da temperatura. 5. Artemísia
- Floração. I. Broetto, Fernando. II. Moraes, Rita Maria.
III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Fi-
lho” (Campus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronômi-
cas. III. Título.
IV
OFERECIMENTOS
Aos milhões de seres humanos,
principalmente as crianças africanas,
que já morreram por causa da malária....
Aos milhões de seres humanos,
principalmente as crianças africanas,
que estão morrendo por causa da malária....
Aos milhões de seres humanos,
principalmente as crianças africanas,
que infelizmente,
ainda vão morrer por causa da malária....
Ofereço
V
AGRADECIMENTOS
A Deus, por mostrar que perseverar no bem é sinônimo de boa
colheita, e por sempre permitir um recomeço;
À minha mãe, Leda Marchese, exemplo de vida, viúva, mãe de quatro
filhos, pelo apoio e educação;
À minha esposa, Cristine, por ser paciente, companheira e estar ao
meu lado nos momentos difíceis e nos agradáveis da nossa vida, e, principalmente, pelo amor
dedicado a mim e nossas filhas;
Às minhas crianças, Cibele, Amanda e Julia, motivo do meu viver;
Aos meus irmãos, Victor Hugo, Adriana e Nelsa Alessandra, pela
amizade;
À Universidade Tecnológica Federal do Paraná, por ter concedido
licença para eu cursar o doutorado;
À Pós-Graduação em Agronomia – Horticultura da FCA/UNESP, pela
oportunidade de cursar o doutorado;
À CAPES/PICDT, pela concessão da bolsa de estudos e
financiamento;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Broetto, pela amizade,
orientação, confiança e liberdade de expressão das minhas idéias;
Aos docentes da PPG em Agronomia – Horticultura, em especial aos
Professores Dr. Lin Chau Ming, Dra. Rumy Goto e Dr. João Domingos Rodrigues, pelas
contribuições, amizade, confiança e momentos de descontração;
Ao CPQBA/UNICAMP, especialmente a Dra. Vera Lúcia Garcia
Rehder, pela amizade e auxílio na execução deste trabalho;
À Dra. Rita Maria Moraes, pelo apoio, amizade e auxílio na revisão e
discussão deste trabalho;
Aos Professores Dr. Carlos Ducatti, Dr. Antonio Rodella e Dra.
Marília Ventrella, pelo apoio nos experimentos;
VI
Aos funcionários da Seção de Horticultura, especialmente a Rosimeire,
e as Sras. Ana e Neusa, pelo apoio e amizade;
À acadêmica Patrícia Fernandes Vendramini e aos funcionários do
Centro de Isótopos Estáveis Ambientais do IBB/UNESP, Evandro e Cibele, pela amizade e
auxílio na execução deste trabalho;
Aos agrônomos Rodrigo Lira e Ângela Tedesco, egressos do curso de
Agronomia da UTFPR (ex-bolsistas PIBIC/CNPq) pelo auxílio na execução deste trabalho;
Aos colegas da FCA, Mirian Baptista Stefanini, Maria Izabel
Radomski, Francisco Celio Maia Chaves, Ari de Freitas Hidalgo, Magnólia Aparecida Silva da
Silva, Marcos Paron, Polyana Aparecida Ehlert, Marcelo Leonardo, Ieoshua katz, Deborah
Beniacar Castro Hermínio, Magali Regina, Santino Seabra Jünior, Valdemir Antonio Laura,
Milena Andréa Curitiba Pilla, Raquel de Souza Mattana, Crystian Iezid Maia de Almeida,
Sílvio César Pantano, Roselaine Facanali, Marco Antonio Tecchio, Luís Felipe Villani
Purquerio, Cristiane Porto Viegas Guerreiro, Lenita Lima Haber, Clayton Debiasi, Luciana
Maestro Borges, Luciana Costa Lima, Carlos Luiz Milhomem de Abreu, Cristiaini Kano, Fábio
Bechelli Tonin, Rerison Catarino da Hora, Evelize de Fátima Saraiva David, Elisangela Clarete
Camili, Cássia Regina Yuriko Ide Vieira, Ernesto Oliveira Serra Pinto, Haydée Siqueira
Santos, Ulise Ramon Arias Bazan, Rosa de Belem Alves, Ary Gertes Carneiro Junior, Maria
dos Anjos Gonçalves Costa, Maria Aparecida Ribeiro Vieira, pelo companherismo nos
momentos de amizade, estudo, trabalho e lazer;
Enfim, agradeço a todos aqueles que direta ou indiretamente
contribuiram para a realização deste trabalho.
VII
SUMÁRIO
Página
1 RESUMO ............................................................................................................................ 01
2 SUMMARY ........................................................................................................................ 03
3 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA............................................................. 05
4 JUSTIFICATIVAS.............................................................................................................. 16
5 OBJETIVOS......................................................................................................................... 18
6 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................. 19
6.1 Experimentos com isótopos de carbono e anatomia foliar para identificar o mecanismo
fotossintético de A. annua .................................................................................................... 19
6.2 Experimentos em câmara fotoperiódica para o estudo da fisiologia da floração do
genótipo CPQBA 2/39X1V de A. annua.............................................................................. 22
6.2.1 Experimento 01 (primavera/verão).......................................................................... 22
6.2.2 Experimento 02 (outono/inverno) ........................................................................... 23
6.3 Experimentos com aplicação exógena de artemisinina.................................................. 26
6.3 Experimento em campo para definição da época de plantio e fisiologia da floração do
genótipo CPQBA 2/39X1V de A. annua.............................................................................. 27
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 33
7.1 Experimentos com isótopos de carbono e anatomia foliar para identificar o mecanismo
fotossintético de A. annua. ................................................................................................... 33
7.2 Experimentos em câmara fotoperiódica para o estudo da fisiologia da floração do
genótipo CPQBA 2/39X1V.................................................................................................. 37
7.3 Experimento em campo para definição da época de plantio e fisiologia da floração do
genótipo CPQBA 2/39X1V.................................................................................................. 48
8 CONCLUSÕES.................................................................................................................... 59
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 61
VIII
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
1 Relação das datas e temperaturas das geadas ocorridas nos anos de 2000 e
2001, na área onde foi instalado o experimento em Pato Branco - PR
(26011’S e 52036’W – 760 m alt.)
29
2
Valor médio da composição isotópica de carbono (δ
13
C)
PDB
, para A. annua
(genótipo CPQBA 2/39x1V)
34
3 Efeito de distintos fotoperíodos na indução da floração (emissão dos botões
florais) em plantas de dois genótipos de A. annua chinês e vietnã) cultivados
na primavera/verão
38
4 Efeito de distintos fotoperíodos e temperaturas na indução da floração
(emissão dos botões florais) em plantas do genótipo vietnã de A. annua
cultivadas em primavera/verão e outono/inverno
38
5 Datas de plantio, transplante e florescimento do genótipo 2/39x1V de A.
annua em Pato Branco-PR, Brasil (26
0
07’S e 52
0
41’W – 760 m alt.)
50
6 Efeito de diferentes épocas de transplante na produção de artemisinina,
rendimento da fitomassa seca e razão folha/caule no genótipo CPQBA
2/39x1V de A. annua
53
7 Comparação dos dados de rendimento de fitomassa e artemisinina obtidos
em Pato Branco-PR (26
0
07’S e 52
0
41’W – 760m alt.) e Campinas-SP
(22
0
47’S e 47
0
06’W – 606m alt.) para o genótipo CPQBA 2/39x1V de A.
annua
56
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
1 Endemicidade da malária no mundo segundo a organização mundial de
saúde (WHO, 2005)
6
2 Casos de malária reportados no Brasil no período 1990-2003, segundo a
Organização Mundial de Saúde – OMS (WHO, 2005)
7
3 Artemisinina e alguns de seus derivados semi-sintéticos antimaláricos
(TARANTO et al., 2005)
9
4 Ao fundo, plantas do acesso CPQBA 2/39x1V de Artemisia annua L.
cultivadas no CPQBA/UNICAMP, Campinas-SP (22
0
47’S, 47
0
06’W, alt.
606 m).
11
5 Folhas secas de A. annua sendo moídas em moinho criogênico a -196
0
C
(A); adição de amostras finamente moídas em cápsulas de estanho (B);
espectrômetro de massas acoplado a um analisador elemental (C)
20
6 Câmaras fotoperiódicas individuais com temporizador para fotoperíodo
usadas nos experimentos para determinar o fotoperíodo indutivo e o número
de ciclos fotoindutivos aproximados para os genótipos chinês e vietnã de
A.annua. UTFPR, Pato Branco-PR, 2000
24
7 Temperaturas máxima e mínima diárias no período de realização dos
experimento primavera/verão e outono/inverno. UTFPR, Pato Branco-PR
(26
0
11’S e 52
0
36’W – 760 m alt.)
25
8 Temperaturas máxima e mínima (
0
C) diárias no período de realização do
experimento (18/08/00 a 09/08/01) em Pato Branco, PR. Fonte: IAPAR
28
9 Médias mensais de precipitação e temperaturas máx. e mín. no período de
realização do experimento (18/08/00 a 09/08/01) em Pato Branco – PR.
Fonte: IAPAR
28
10 Detalhe de uma das parcelas do experimento em campo para definição da
época de plantio e fisiologia da floração do acesso CPQBA 2/39x1V. B -
Detalhe do processamento das plantas após a colheita e previamente a
secagem. UTFPR, Pato Branco-PR, 2000.
30
11 Conversão de artemisinina em Q260, segundo ZHAO & ZENG (1986) 32
12 Corte transversal de folha de A. annua com teste com Xylidine Ponceau
para proteínas totais. Celulas do parênquima paliçádico (CPP); células do
parênquima esponjoso (CPE); bainha vascular (BV); células da bainha
vascular (CBV); epiderme adaxial (EAD); epiderme abaxial (EAB);
cloroplastos (C). **Verifica-se a presença de cloroplastos em todo o
parênquima clorofiliano (CPP e CPE) e a *ausência destas estruturas nas
células da bainha vascular (CBV)
35
13 Corte transversal de folha de A. annua com teste PAS (Ácido
periódico/reagente de Shiff) para carboidratos totais. Células do
parênquima paliçádico (CPP); células do parênquima esponjoso (CPE);
bainha vascular (BV); celulas da bainha vascular (CBV); epiderme adaxial
36
X
(EAD); epiderme abaxial (EAB); estômato (EST); amido (A). **Verifica-se
a presença de grãos de amido em todo o parênquima clorofiliano (CPP e
CPE) e a *ausência destas estruturas nas células da bainha vascular (CBV)
14 Efeito de diferentes fotoperíodos no comprimento do caule e número de
entrenós dos genótipos vietnã (A) e chinês (B) de A. annua cultivados em
temperaturas médias de 37ºC (máx.) e 19ºC (mín.) durante a
primavera/verão. IF = início do florescimento (emissão dos botões florais).
DAT = dias após o transplante
40
15 Efeito de diferentes fotoperíodos no comprimento do caule e número de
entrenós do genótipo vietnã de A. annua cultivado em temperaturas médias
de 37ºC (máx.) e 19ºC (mín.) durante a primavera/verão (A) e 29ºC (máx.) e
13ºC (mín.) durante o outono/inverno (B). IF = início do florescimento
(emissão dos botões florais). DAT = dias após o transplante
41
16 Efeito de dias curtos (dados agrupados dos tratamentos com 7, 9, 11 horas
de luz) e dias longos (dados agrupados dos tratamentos com 13, 15 e 17
horas de luz) no comprimento do caule dos genótipos vietnã (A) e chinês
(B) de A. annua cultivados em temperaturas médias de 37ºC (máx.) e 19ºC
(mín.) durante a primavera/verão. IF = início do florescimento (emissão dos
botões florais). DAT = dias após o transplante
42
17 Efeito de dias curtos (dados agrupados dos tratamentos com 7, 9, 11 horas
de luz) e dias longos (dados agrupados dos tratamentos com 13, 15 e 17
horas de luz) no comprimento do caule e número de entrenós do genótipo
vietnã de A. annua cultivado em temperaturas médias de 37ºC (máx.) e 19ºC
(mín.) durante a primavera/verão (A) e 29ºC (máx.) e 13ºC (mín.) durante o
outono (B). IF = início do florescimento (emissão dos botões florais). DAT
= dias após o transplante
43
18 Efeito de dias curtos (dados agrupados dos tratamentos com 7, 9, 11 horas
de luz) e dias longos (dados agrupados dos tratamentos com 13, 15 e 17
horas de luz) no teor de artemisinina do genótipo vietnã de A. annua
cultivado em temperaturas médias de 29ºC (máx.) e 13ºC (mín.) durante o
outono/inverno. IF = início do florescimento (função da média de ciclos
fotoindutivos dos tratamentos 7, 9, 11 horas de luz). DAT = dias após o
transplante
46
19 Influência de diferentes concentrações de artemisinina no número de
entrenós e no comprimento do caule de plantas dos genótipos CPQBA
3MxPOP (A) e vietnã (B) de A. annua cultivados em dias curtos
47
20 Fotoperíodo anual em Pato Branco-PR, Brasil (latitude 26º07' S, longitude
52º41' W, altitude de 760m) e caracterização do florescimento de A. annua
(CPQBA 2/39x1V). FI = fotoperíodo indutivo; TP = transplante para o
campo; FL = emissão do botão floral; CF = número de ciclos fotoindutivos
49
21 Médias das temperaturas médias mensais em Campinas-SP (22
0
47’S e
47
0
06’W – 606m alt.) e Pato Branco-PR (26
0
07’S e 52
0
41’W – 760m alt.).
Fonte: IAPAR, 1994; CIIAGRO/IAC, 2005
51
22 Rendimento da fitomassa seca e artemisinina, razão folha/caule e teor de
artemisinina do genótipo CPQBA 2/39x1V de A. annua em função de
diferentes datas de plantio: 23/09/2000 (165 DAT) ; 20/11/2000 (111 DAT);
54
XI
16/01/2001 (63 DAT); 07/02/2001 (41 DAT); 05/03/2001 (28 DAT);
10/07/2001 (31 DAT)
23 Épocas de plantio (primavera) e colheita (outono) em função do fotoperíodo
anual em diferentes locais de cultivo de A. annua nos hemisférios Sul (5
0
S =
Teresina-PI; 22
0
S = Campinas-SP; 26
0
S = Pato Branco-PR; 43
0
S =
Tasmania, Australia) e Norte (47
0
N = Bulgária; 40
0
N = West Lafayette, IN,
EUA e 26
0
N = Lucknow, India). Fonte: GALAMBOZI (1980); LAUGHLIN
(1993); MAGALHÃES et al. (2004); HAIDER et al. (2004); KUMAR et al.
(2004); FERREIRA et al. (2005)
55
1
1 RESUMO
Artemisia annua L. (Asteraceae) é uma planta herbácea altamente
aromática, nativa da Ásia e aclimatada no Brasil. As folhas são fonte abundante de
artemisinina, uma lactona sesquiterpênica que, conjuntamente aos seus derivados semi-
sintéticos, apresentam ação efetiva contra as cepas resistentes das espécies de Plasmodium
causadoras da malária. Os objetivos deste trabalho foram identificar o mecanismo
fotossintético e avaliar o efeito de diferentes condições de temperatura e fotoperíodo no
crescimento e desenvolvimento do acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua. Para identificar o
mecanismo fotossintético foram realizados experimentos para determinar composição dos
isótopos do carbono (δ‰
13
C) e a anatomia foliar associada a testes histoquímicos. Para avaliar
o efeito da temperatura e fotoperíodo no crescimento e desenvolvimento de A. annua foram
realizados dois experimentos em câmaras fotoperiódicas (o primeiro com temperaturas médias
máx. de 37ºC e mín. de 19ºC e o segundo com máx. de 29ºC e mín. de 13ºC) e um
experimento com 6 épocas de plantio em campo no município de Pato Branco-PR (26º11' S,
52º36' W e 760 m de altitude), sul do Brasil. Um último experimento realizado, foi a aplicação
exógena de artemisinina em plantas de A. annua para verificar o papel da molécula na indução
do florescimento. Como resultados, A. annua apresentou uma δ‰
13
C = - 31.76 ± 0.07, valor
típico de espécies com mecanismo fotossintético C
3
, que apresentam em média valores de
2
δ‰
13
C = - 28. Os estudos da anatomia foliar e testes histoquímicos confirmaram os resultados
encontrados para a δ‰
13
C, onde, a despeito da existência de células parenquimáticas
formando um anel ao redor do feixe vascular, estas não apresentaram cloroplastos e amido,
confirmando ser A. annua uma espécie de mecanismo fotossintético C
3
. A aplicação exógena
de artemisinina não induziu as plantas de A. annua ao florescimento e esse resultado sugere
que a molécula de artemisinina não está diretamente relacionada com a indução floral na
espécie, ainda que o acúmulo da artemisinina ocorra nas fases de pré-floração e floração. Nos
experimentos em casa de vegetação, uma das principais observações para o acesso 2/39x1V
foi uma forte interação entre fotoperíodo e temperatura na indução ao florescimento das
plantas testadas, onde as temperaturas menores ocorridas no experimento outono, máx. de
29ºC e mín. de 13ºC, induziram a um maior florescimento nas plantas dos tratamentos com
dias curtos, em detrimento daquelas submetidas às temperaturas maiores no experimento
primavera/verão, com máx. de 37ºC e mín. de19ºC. Pode-se afirmar que os clones do acesso
2/39x1V apresentaram um comportamento fotoperiódico de Planta de Dias Curtos qualitativa
ou absoluta com requerimento de baixas temperaturas ou vernalização para ter seu
florescimento acelerado. No experimento em campo, o número de ciclos fotoindutivos
encontrado para o acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua foi de aproximadamente 28 ciclos ou
4 semanas e o fotoperíodo indutivo aproximado foi de 13,07 horas, que ocorreu na data de
07/02/2001 em Pato Branco-PR. A época de plantio que alcançou significativamente os
maiores rendimentos de fitomassa e artemisinina foi a 1ª época, 23/09/2000, 165 dias do
transplante até a colheita. Estes resultados determinaram que o transplante de mudas para o
campo em Pato Branco-PR, deve ser feito prioritariamente no último decêndio de setembro ou
no início de outubro - começo da primavera - para se alcançar um maior rendimento de massa
seca de folhas e artemisinina. Não recomenda-se o plantio nos dois primeiros decêndios de
setembro devido ao fato de estarem ocorrendo geadas extemporâneas na região sudoeste do
Paraná.
________________________
Palavras-chave: fotossíntese C3 e C4; discriminação isotópica; épocas de plantio;
fotoperiodismo; termoperiodismo; florescimento.
3
CHARACTERIZATION OF PHOTOSYNTHETIC MECHANISM AND THE
FLOWERING ASPECTS OF Artemisia annua L. Botucatu, 2006. 68p. Tese
(Doutorado em Agronomia/Horticultura) - Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista.
Author: JOSÉ ABRAMO MARCHESE
Adviser: FERNANDO BROETTO
Co-Adviser: RITA M. MORAES
2 SUMMARY
Leaves of Artemisia annua L. are a plentiful source of artemisinin, a
drug with proven effectiveness against malaria. One of the objectives of this work was to
identify the photosynthetic type of A. annua through studies of the carbon isotope composition
(δ‰
13
C) and the leaf anatomy. We also verified the growth and development of the CPQBA
2/39x1V accession under moist subtropical climate. Two experiments were carried out in
greenhouse using photoperiodic chambers. The plants were submitted to photoperiods of 7, 9,
11, 13, 15 and 17 h, in two natural conditions of temperature: spring/summer (maximum of
37ºC and minimum of 19ºC) and autumn/winter (maximum of 29ºC and minimum of 13ºC).
Another experiment with different planting dates at field was carried out in Pato Branco, PR
(26º11' S, 52º36' W and 760 m), Southern part of Brazil. The last experiment was the
application of artemisinin (0, 500, 5000, and 10000 mg L
-1
) in A. annua plants to verify the
role of the molecule on the flowering induction. A. annua presented a δ‰
13
C = - 31.76 ± 0.07,
what characterizes it as typical species with a C
3
photosynthetic mechanism, with an average
of δ‰
13
C = - 28, while C
4
species possess an average of δ‰
13
C = - 14. The study of A. annua
leaf anatomy confirms the results of δ‰
13
C, where, in spite of the existence of parenchymatic
cells forming a different sheath surrounding of the vascular tissue, these cells do not have
chloroplast or starch. These features do not describe the Kranz anatomy typical of C
4
species.
The application of artemisinin did not induce the flowering of A. annua at any of the
concentrations used. The results suggest that the accumulation of the artemisinin in the pre-
4
flowering and flowering phases in A. annua is not the physiological signal of floral induction
in this species. One of the main observations verified in both experiments carried out in
photoperiodic chambers with the CPQBA 2/39x1V accession, was a strong interaction
between photoperiod and temperature in the flowering induction, where the lower
temperatures during in the autumn/winter experiment (maximum of 29ºC and minimum of
13ºC) induced a larger number of flowered plants in the short day treatment (7, 9 and 11 h), in
detriment of those submitted to the higher temperatures in the spring/summer experiment
(maximum of 37ºC and minimum of 19ºC). It can be affirmed that the 2/39x1V accession
clones presented a photoperiodic behavior of Short-Day Plants (qualitative or absolute) with
low temperature or vernalization requirement to have their flowering accelerated. In field
experiment, the critical or inductive photoperiod was approximately 13.07 h (02/07/2001) and
the plants flowered about 28 days after submitted to the inductive photoperiod. The best
transplanting date was the first, 09/23/2000, 165 days from the transplant to harvest (50% bud
initiation). These results identify the end of September through beginning of October (spring)
as ideal season to transplant A. annua seedlings to field in Pato Branco-PR. Transplanting A.
annua in the beginning of September or earlier is not recommended due the occurrence of late
frost in Pato Branco-PR region.
________________________
Keywords: C
3
and C
4
plants; isotope discrimination; Kranz anatomy; photosynthesis;
transplanting date; photoperiodism; thermoperiodism; flowering.
5
3 INTRODUÇÃO
Em termos de morbidade e mortalidade, a malária é a mais importante
doença parasitária humana e apresenta um sério impacto na saúde e economia do mundo
tropical (MUELLER et al., 2000; WHO, 2005). A estimativa mundial de ocorrência da doença
é da ordem de 300 milhões de casos clínicos por ano e a mortalidade causada pela malária é
superior a 1 milhão de mortes/ano, principalmente crianças. Mais de 3,2 bilhões de pessoas no
mundo, em 107 países e territórios vivem sob o risco da doença, que pode matar em questão
de horas. Para cada 10 casos de malária reportados, 9 ocorrem na África tropical, região
considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como a de mais alto endemismo da
doença no mundo (Figura 1) (WHO, 2005).
Nas Américas, segundo a OMS, ocorre a transmissão de malária em 9
países que compartem a região da selva amazônica, e em 8 países da América Central e Caribe
(WHO, 2005). Em 2004, os Estados membros da Organização Pan-Americana da Saúde
(OPAS) indicaram que dos calculados 865 milhões de habitantes das Américas,
aproximadamente 250 milhões vivem em zonas de risco ecológico de transmissão da malária,
que continua sendo um problema de saúde pública na região, com transmissão registrada em
21 dos Estados membros da OPAS (OPAS, 2005).
No Brasil, em 1996, foram reportados aproximadamente 450 mil casos
clínicos da doença (80% na região amazônica), 100 mil a menos que nos anos anteriores, com
6
aproximadamente 13.500 óbitos. O Brasil apresentou uma redução de 53,6% dos casos de
malária em 2001 quando comparado com o ano de 2000, com 40,1% (388.658) dos casos da
doença nas Américas, sendo a Amazônia responsável por 99,6% dos casos no país. Para os
anos de 2002 e 2003 o número de casos no Brasil foi de 349.873 (menor número dos últimos
10 anos) e 379.551, respectivamente (Figura 2). Todavia, apesar da redução dos casos da
doença a partir de 2001, o número de mortes aumentou significativamente em 2003, 30.000
óbitos, comparando-se com 1996, 13.500 óbitos. Infelizmente, o Brasil ocupa a incômoda
posição de líder em casos de malária nas Américas (OPS, 2001; OPS, 2002; OPAS, 2005;
WHO, 2005).
Figura 1. Endemicidade da malária no mundo segundo a organização mundial de saúde
(WHO, 2005)
Apesar desse crescimento de mais de 1.000% nos casos de malária
num espaço de tempo de menos de duas décadas, a doença desapareceu virtualmente na
7
porção extra-Amazônica do país, onde se concentra a quase totalidade da população. Quando o
Brasil iniciou ações sistemáticas de controle da malária, no início da década de 1950, a imensa
maioria dos casos de malária do país ocorria fora da região Amazônica, então virtualmente
despovoada. Ao longo de vinte anos, a malária foi eliminada da região costeira do país e das
áreas urbanas, restando alguns focos remanescentes, muitos de provável origem zoonótica, nas
áreas de mata atlântica da região Sudeste. A malária da Amazônia torna-se representativa
numericamente a partir da década de 1970, quando essa região passa a ser povoada por
migrantes do Sul, Sudeste e Nordeste do país, em busca de trabalho nas obras de infra-
estrutura (hidrelétricas, rodovias, projetos de mineração), no garimpo, na extração de madeira
e nos projetos agropecuários. O crescimento da doença na Amazônia foi resultado da
inexistência de um projeto específico de controle (SILVA, 2003).
Ano
1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004
Casos de malária reportados
(x 1000)
0
100
200
300
400
500
600
700
Figura 2. Casos de malária reportados no Brasil no período 1990-2003, segundo a
Organização Mundial de Saúde – OMS (WHO, 2005)
8
A malária humana é causada por protozoários parasitas do gênero
Plasmodium e o vetor que transmite os parasitas é a fêmea do mosquito Anopheles (WHO,
2005). Muitos são os fatores que contribuiram e contribuem para o aumento alarmante dos
casos de malária no mundo, dentre eles, podem ser citados as mudanças climáticas, a
deterioração dos serviços de saúde locais, problemas econômicos, conflitos armados, redução
nos fundos de combate a doença, etc. Todavia, a resistência do mosquito Anopheles aos
inseticidas e o aparecimento de cepas do Plasmodium, principalmente do P. falciparum,
resistentes às drogas para o combate da malária, particularmente a cloroquina, são os fatores
que mais colaboram para o crescimento dos casos clínicos e mortes causadas pela doença
(KLAYMAN, 1985; BUTLER et al., 1997; WHO, 2005). Durante os anos 90 em algumas
partes do Saara, na África, a morte de crianças causada pela malária chegou a duplicar. A
malária também ressurgiu na Ásia (central e sudoeste) e Leste Europeu (WHO, 2005).
A estimativa mundial atual dos custos para suportar as ações de
combate a malária estão na ordem de US$ 3,2 bilhões por ano considerando apenas os 82
países com maior incidência da doença (US$ 1,9 bilhões para a África e US$ 1,2 bilhões para
os outros países). Porém, somente uma fração desta soma está disponível (WHO, 2005).
Recentemente, o fundo global de combate a AIDS, tuberculose e malária (GFATM), começou
a financiar recursos para o combate da malária, liberando mais de US$ 200 milhões entre
2003–2004, e já está aprovado para o biênio 2005–2006 um montante de US$ 881 milhões.
Todavia, os governos locais são responsáveis pela maior parte do financiamento ao combate
da doença (71% do total dos fundos na África, 80% na Asia, e 96% nas Américas), impedindo
uma ação efetiva dos países mais pobres no combate à malária. O Brasil não obteve sucesso na
aprovação de recursos junto ao GFATM e o governo federal é o responsável pelas campanhas
de combate a malária (WHO, 2005).
Com o aumento da resistência do parasita, há uma necessidade urgente
de alternativas seguras para as drogas que estão perdendo eficácia. Até o momento, a melhor
alternativa para o tratamento da malária grave, causada pelo P. falciparum, é a utilização dos
derivados semi-sintéticos da artemisinina (Figura3), um produto natural extraído da planta
Artemisia annua L. (Asteraceae), que demonstra comprovada eficácia no controle das cepas de
P. falciparum resistentes às múltiplas drogas, além de apresentar pouco ou nenhum efeito
9
colateral (KLAYMAN, 1985; LUO & SHEN 1987; BALINT 2001; WHO, 2005; ENSERINK,
2005).
A terapia combinada com artemisinina (TCA) é o tratamento mais
efetivo contra a malária causada pelo P. falciparum, porém é de 10 a 20 vezes mais caro que a
terapia com cloroquina. A demanda por TCA aumentou rapidamente desde que GFATM
iniciou o apoio financeiro aos países atingidos pela enfermidade (WHO, 2005; ENSERINK,
2005). Temendo a resistência demonstrada contra a cloroquina (80%) e sulfadoxina–
pirimetamina (20%) pelo P. falciparum, 8 dos 9 países amazônicos, exceto Brasil,
modificaram recentemente suas políticas farmacêuticas para tratar a malária falciparum com
TCA (WHO, 2005).
Figura 3. Artemisinina e alguns de seus derivados semi-sintéticos antimaláricos (TARANTO
et al., 2005).
Recentemente, um grupo de pesquisadores da Universidade de
Nebrasca, EUA, anunciou a síntese de um composto chamado OZ177 baseado na molécula de
O
O
H
O
H
O
O
O
O
H
H
O
O
OH
O
O
H
H
O
O
OMe
O
O
H
H
O
O
OEt
O
O
H
H
O
O
OCOCH
2
CH
2
COONa
O
O
H
H
O
O
O
1
2
3
4
5
5a
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
14
12a
Artemisinina
Diidroartemisinina
Arteméter
Arteéter
Artesunato de sódio Artemisiteno
10
artemisinina, que apresentou bons resultados em testes in vitro e em animais, e encontra-se na
fase de testes clínicos (VENNERSTROM et al., 2004; ENSERINK, 2005). Existe a
possibilidade deste sintético estar disponível no mercado em 4-5 anos (2010-11) e sua
utilização poderá ser parte da terapia combinada com artemisinina (TCA) (ENSERINK,
2005).
A. annua é utilizada há séculos na medicina tradicional chinesa, para o
tratamento de febre e malária (KLAYMAN, 1985; SIMON et al., 1990), e em 1971, químicos
chineses isolaram a artemisinina ou qinghaosu (em chinês: su = de extrato e qing hau = erva
verde) (Figura 3), descrevendo-a como uma lactona sesquiterpênica que possui um grupo
endoperóxido-1,2,4-trioxano e, diferentemente de outros antimaláricos, não possui nitrogênio
na sua estrutura. O composto tem sido usado com sucesso em milhares de pacientes na China,
incluindo aqueles acometidos com ambas as cepas do P. falciparum, a resistente e a sensível à
cloroquina (KLAYMAN, 1985). Desde seu isolamento, vários derivados da artemisinina
foram sintetizados, obtendo-se substâncias mais ou menos ativas do que a artemisinina. Entre
os derivados mais comuns estão o diidroartemisinina (DQHS), arteméter, artemisiteno e
artesunato de sódio (Figura 3), todos contendo o grupamento peróxido. Estes compostos foram
denominados de endoperóxidos de primeira geração e são empregados na quimioterapia da
malária na Tailândia, Vietnã, Brasil e China, onde a resistência ao parasita é comum
(MESHNICK et al., 1996). Derivados desprovidos de ligação peróxido, tal como a
deoxiartemisinina, embora com estrutura geral bastante similar à artemisinina, são
completamente inativos (KLAYMAN 1985).
A síntese química da artemisinina é complexa, envolvendo inúmeras
etapas e apresentando baixos rendimentos (CHAN et al., 1995; GELDRE et al., 1997).
Corroborando, os baixos rendimentos via cultivo de células e tecidos (DELABAYS et al.,
2001) e os altos custos da síntese da molécula tornam o isolamento a partir da planta de A.
annua a melhor forma para obtenção da droga (WOERDENBAG et al., 1991; FERREIRA &
JANICK, 1996; GELDRE et al., 1997; DELABAYS et al., 2001). Os maiores fornecedores
mundiais são a China e o Vietnã (ENSERINK, 2005).
A. annua é uma planta herbácea altamente aromática, pertencente à
família Asteraceae, com hábito de crescimento determinado e altura variando entre 0,8 e 2,0
metros (Figura 4) (FERREIRA & JANICK, 1996). Por ser aromática, a espécie também é
11
utilizada comercialmente na perfumaria e cosmética (GALAMBOSI, 1980; JAIN et al., 1996).
A planta reproduz-se naturalmente por fecundação cruzada e multiplica-se por sementes, além
de propagar-se vegetativamente com facilidade (MAGALHÃES, 1996).
A. annua ocorre naturalmente como parte da vegetação das planícies
ao norte das províncias de Chadar e Suiyuan (40
0
N e 109
0
E), região de clima temperado na
China, entre 1000 e 1500 metros de altitude (GALAMBOSI, 1980; GELDRE et al., 1997;
BAGCHI et al., 1997b; FERREIRA et al., 2005). No Brasil, a introdução da A. annua ocorreu
em 1987, por pesquisadores do CPQBA/UNICAMP (FIGUEIRA, 1995). Atualmente, através
de seleção para aumentar a fitomassa e o teor de artemisinina, o programa de melhoramento de
A. annua do CPQBA/UNICAMP conta com materiais selecionados que chegam a produzir 25
kg ha
-1
da molécula, enquanto que nas populações base, o rendimento é apenas de 5 kg ha
-1
(MAGALHÃES et al., 1997).
Figura 4. Ao fundo, plantas do acesso CPQBA 2/39x1V de Artemisia annua L. cultivadas no
CPQBA/UNICAMP em Campinas-SP (22
0
47’S, 47
0
06’W, alt. 606 m).
12
Com relação à distribuição da artemisinina na planta, a parte aérea,
principalmente folhas e inflorescências, apresenta as maiores concentrações de artemisinina,
com baixas concentrações nos caules e nenhuma artemisinina na raiz e pólen. O conteúdo da
molécula é de 4 a 11 vezes maior nas inflorescências que nas folhas (FERREIRA & JANICK,
1996). Em pré-floração, CHARLES et al. (1990) encontraram 88,9% da artemisinina total da
planta nas folhas, estando os 11,1% restantes presentes nas gemas florais. Segundo
FERREIRA (1994), os tricomas glandulares que ocorrem nas folhas, caules e flores são os
prováveis sítios de acumulação de artemisinina em A. annua.
Há controvérsias na literatura sobre qual a fase fenológica da planta
em que ocorre maior acúmulo de artemisinina. Alguns autores afirmam que o maior acúmulo
da molécula ocorre na fase de pré-floração (ACTON et al., 1985; LIERSCH et al., 1986;
WOERDENBAG et al., 1991), enquanto outros reportam que o pico ocorre durante a floração
(PRAS et al., 1991; MORALES et al., 1993; FERREIRA, 1994; LAUGHLIN, 1995;
FERREIRA & JANICK, 1996).
Segundo MORALES et al. (1993) a concentração máxima de
artemisinina aparenta estar mais diretamente relacionada com o fotoperíodo específico, do que
com o estádio específico de desenvolvimento da planta.
O fato de o maior acúmulo do sesquiterpeno artemisinina ocorrer
quando as plantas estão nas fases de pré-floração e floração, sugere que a molécula, de alguma
maneira, possa estar envolvida com a indução do florescimento nesta espécie, apresentando
possível atividade hormonal.
A literatura indica uma grande variedade de funções fisiológicas para
os sesquiterpenos nas plantas, entre elas atividade reguladora de crescimento e aleloquímica
(HARBORNE, 1993; DEY & HARBORNE, 1997). ABDIN et al. (2002) relatam vários
experimentos em que substâncias reguladoras de crescimento como ácido indolacético, ácido
giberélico (GA
3
), triacontanol e clormequat foram testadas em A. annua, todavia, nenhuma
apresentou efeito indutor ao florescimento. ZHANG et al. (2005) relatam que a aplicação
exógena de GA
3
em A. annua não induziu seu florescimento, mas aumentou
significativamente o teor de artemisinina. DUKE et al. (1987), CHEN & LEATHER (1990) e
BAGCHI et al. (1997a) e DAYAN et al. (1999) encontraram atividade reguladora de
crescimento e/ou fitotóxica em diferentes espécies vegetais para a molécula de artemisinina,
13
seus precursores e derivados semi-sintéticos. Uma das limitações ao cultivo comercial de A.
annua é o ciclo da espécie, que pode tornar-se longo devido à dependência de dias curtos para
o florescimento, principalmente em latitudes maiores que 25º S, como é o caso do sul do
Brasil. Portanto, estudos relativos à descoberta de substâncias indutoras ao florescimento de A.
annua seriam bem vindos para auxiliar no manejo agrícola da espécie.
A. annua demonstra sensibilidade ao comprimento do dia e floresce
aproximadamente duas semanas após ser submetida ao fotoperíodo indutivo (FI) (FERREIRA,
1994; ZHANG et al., 2005). Plantas sensíveis à duração do fotoperíodo têm seu
desenvolvimento condicionado ao FI (MARCHESE & FIGUEIRA, 2005). A literatura relata
diferentes fotoperíodos críticos para induzir a floração em A. annua: 11 horas
(MAGALHÃES, 1996); 13,5 horas (FERREIRA et al., 1995); 13,2 horas (BAGCHI et al.,
1997b) e 12 a 14 horas (GELDRE et al., 1997). Segundo CHEN & ZHANG (1987),
MAGALHÃES (1996), MARCHESE (1999) e MARCHESE & REHDER (2001),
divergências no comportamento fisiológico desta espécie em relação à influência de fatores
ambientais sugerem que seu comportamento não é padrão, sendo variável para diferentes
genótipos.
Em resposta à indução ao florescimento sob condições de dias curtos
(fotoperíodo indutivo), ocorre um rápido aumendo na altura e no número de entrenós em
plantas de A. annua. Na fase de floração, há uma interrupção no crescimento em altura e no
incremento de entrenós, além de uma redução na produção de órgãos vegetativos, devido à
conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo. No final do florescimento as
plantas redirecionam seus assimilados para a formação de sementes, iniciando a fase de
senescência. Por outro lado, na ausência da indução floral em condições de dias longos
(fotoperíodo não indutivo), o crescimento em altura e a produção de entrenós são lineares e a
planta vegeta indefinidamente (FERREIRA et al., 1995).
FERREIRA et al. (1995) conduzindo experimentos (40º21’N) com
plantas de uma população proveniente da China, afirmam que A.annua é considerada uma
espécie com comportamento de Planta de Dias Curtos (PDC), classificação dada àquelas
plantas que florescem quando o comprimento do dia é inferior ao fotoperíodo crítico ou
indutivo. Todavia, MAGALHÃES (1996) e MAGALHÃES et al. (1997) em observações
feitas em campo (22º48’S), relataram que plantas provenientes de sementes do acesso CPQBA
14
2/39x1V, acesso melhorado a partir de uma população de plantas do Vietnã, permaneceram
vegetativas em fotoperíodos acima de 13 horas e abaixo de 11 horas, e floresceram em um
fotoperíodo entre 11 e 13 horas, o que sugere um comportamento de Plantas de Dias
Intermediários (PDI), classificação dada àquelas plantas que florescem dentro de uma faixa de
comprimento do dia, não florescendo acima ou abaixo dos limites superior e inferior desta
faixa.
A despeito dos estudos existentes sobre fatores do ambiente afetando a
produção de biomassa e de artemisinina (CHEN & ZHANG, 1987; FERREIRA et al., 1995,
MARCHESE, 1999; MARCHESE & REHDER, 2001), pouca informação relacionada à
fisiologia de A. annua é encontrada na literatura. Devido à importância da planta como única
fonte de artemisinina economicamente viável, em muitos países com ocorrência de casos de
malária, existem esforços na introdução e aclimatação de A. annua (MUELLER et al., 2000),
visando seu cultivo comercial para a produção de fitofármacos ou para o uso como
fitoterápico. No caso da introdução de uma espécie exótica, como A. annua, o conhecimento
do mecanismo fotossintético é fundamental para seu cultivo. Em geral, plantas com
mecanismo fotossintético C
4
são melhores adaptadas a climas quentes, enquanto que plantas
C
3
adaptam-se melhor em climas mais amenos (LOOMIS & CONNOR, 1992; RUDALL,
1994; HALL & RAO, 1999; KÖRNER & BAZZAZ, 1996; LAMBERS et al., 1998;
LAWLOR, 2001). Nao há na literatura nenhuma informação disponível sobre o mecanismo
fotossintético da A. annua.
As rotas metabólicas da fotossíntese são altamente conservadas. A
maioria das plantas apresentam tipo fotossintético C
3
, onde o primeiro produto estável da
fotossíntese é 3-fosfoglicerato, um composto de três carbonos. Uma segunda rota metabólica
que possibilita a fixação do CO
2
, ocorre nas plantas C
4
, onde inicialmente há a fixação do
carbono nas células do mesofilo formando o oxaloacetato, um composto de quatro carbonos.
Nas plantas C
4
o oxaloacetato é convertido para malato ou aspartato, que em seguida se
difundem nas células da bainha vascular que rodeiam o feixe vascular, onde são
descarboxilados, fornecendo uma alta concentração de CO
2
para a enzima ribulose-1,5-
bifosfato carboxilase/oxidase (RUBISCO). Plantas superiores C
4
apresentam modificações
anatômicas e bioquímicas, mas não está claro qual dessas modificações ocorreu primeiro.
Algumas espécies que possuem características de plantas C
3
e C
4
, são classificadas como
15
plantas intermediárias C
3
-C
4
, e podem representar um estágio transitório na evolução da
fotossíntese C
3
para C
4
(VON CAEMMERER, 1992; LAWLOR, 2001; HIBBERD &
QUICK, 2002).
Técnicas que estudam a composição isotópica da biomassa das plantas
são consideradas simples e eficazes para a determinacao do tipo/mecanismo fotossintético
quando esse é desconhecido em uma espécie vegetal (FARQUHAR et al., 1989).
As plantas fracionam os isótopos do carbono durante a fotossíntese. O
dióxido de carbono (CO
2
) na atmosfera terrestre é composto de diferentes isótopos do
carbono. A maioria dos isótopos do carbono são
12
CO
2
(98,9 átomos %) e somente 1,1 átomos
% da quantidade total do CO
2
atmosférico é
13
CO
2
, enquanto a menor fração (10
-10
átomos %)
é da espécie radioativa
14
CO
2
. A pesquisa em ecofisiologia moderna faz uso abundante do fato
de que a composição isotópica da biomassa das plantas difere daquela da atmosfera. Há um
especial interesse nas diferenças da composição isotópica do carbono (δ‰
13
C) entre as
plantas, provocadas pelas diferentes rotas fotossintéticas (LAMBERS et al., 1998).
As propriedades químicas do
13
CO
2
são idênticas aquelas do
12
CO
2
,
mas devido a pequena diferença de massa (2,3%), as plantas usam menos
13
CO
2
do que o
12
CO
2
. Plantas C
3
(δ‰
13
C ≅ -28 ‰) discriminam mais
13
CO
2
do que as plantas C
4
(δ‰
13
C ≅ -
14 ‰). O maior passo da discriminação isotópica é a reação de carboxilação da fotossíntese,
catalisada pela ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (RUBISCO), a primeira enzima a
fixar o CO
2
nas plantas C
3
, que possui um valor de discriminação intrínseca (Δ
13
C) de -30 ‰.
Por outro lado, a fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase, a primeira enzima que fixa o CO
2
em
plantas C
4
, apresenta um menor efeito de discriminação isotópica (Δ
13
C = -2 to 5,7 ‰)
(STERNBERG et al., 1984; FARQUHAR et al., 1989; O’LEARY et al., 1992; O’LEARY,
1993; LAMBERS et al., 1998; CONDON et al., 2002).
Estudos anatômicos e técnicas histoquímicas também contribuem para
a determinação do tipo/mecanismo fotossintético das espécies vegetais. Existem diferenças na
antomia foliar entre plantas C
3
e C
4
. Cortes transversais de uma típica folha C
3
, revelam a
presença de cloroplastos e grãos de amido apenas nas células do mesofilo. Em contraste, uma
típica folha C
4
apresenta cloroplastos em ambas as células, do mesofilo e da bainha que
envolve o feixe vascular (MAUSETH, 1988; RUDALL, 1994; LAWLOR, 2001).
16
4 JUSTIFICATIVA
O Brasil é o país que apresenta o maior índice de casos de malária das
Américas (OPS, 2001; OPS, 2002; WHO, 2005) e com o aumento da resistência do parasita
causador da doença, há uma necessidade urgente de alternativas seguras para as drogas que
estão perdendo eficácia. Neste momento, a melhor alternativa para o tratamento da malária,
causada pelo P. falciparum, é a terapia combinada com artemisinina (TCA) (WHO, 2005;
ENSERINK, 2005).
A síntese química da artemisinina é complexa, envolvendo inúmeras
etapas e apresentando baixos rendimentos (CHAN et al., 1995; GELDRE et al., 1997).
Corroborando, os baixos rendimentos via cultivo de células e tecidos (DELABAYS et al.,
2001) e os altos custos da síntese da molécula tornam o isolamento a partir da planta de
A.annua a melhor forma para obtenção da droga (WOERDENBAG et al., 1991; FERREIRA
& JANICK, 1996; GELDRE et al., 1997; DELABAYS et al., 2001).
A demanda por TCA aumentou rapidamente desde que GFATM
iniciou o apoio financeiro aos países atingidos pela enfermidade (WHO, 2005), mas por uma
cruel ironia, apesar do recurso disponível, a Organização Mundial da Saúde (OMS) não
conseguiu entregar em tempo metade das 60 milhões de doses do medicamento programado
para o início de 2005, devido ao insucesso dos produtores chineses e vietnamitas em formecer
17
a matéria prima (folhas de A. annua) demandada pela empresa NOVARTIS, fornecedora da
OMS (ENSERINK, 2005). Uma outra variável que poderá em breve provocar um aumento na
demanda por artemisinina, foi a recente descoberta de atividade anti-câncer para a molécula
(POSNER et al, 1999; SINGH & LAI, 2004; EFFERTH, 2005),
O CPQBA/UNICAMP está patenteando o processo de extração de
artemisinina e a derivatização em artesunato de sódio foi otimizada podendo ser usada em
escala piloto ou industrial. Algumas indústrias farmacêuticas nacionais estão demonstrando
interesse na locação ou compra da patente da UNICAMP para fabricarem fármacos derivados
da artemisinina, uma vez que o Ministério da Saúde está demandando lotes deste anti-
malárico, que até o momento são importados da China.
O centro de origem da A. annua é a China, em regiões de clima
subtropical e temperado, similares aos do Sul do Brasil. Com o cultivo do acesso CPQBA
2/39x1V de A. annua, no sudoeste do Paraná, informações relativas ao comportamento de A.
annua diante de distintos fotoperíodos e épocas de plantio serão obtidas, fornecendo subsídios
para que se possa otimizar a produção de fitomassa e dos teores de artemisinina, adequando a
época de plantio com o fotoperíodo da região. A. annua pode tornar-se uma nova opção para o
pequeno produtor diversificar a renda em sua propriedade, comercializando a produção para a
indústria farmacêutica, uma vez que existe demanda nacional e internacional para a matéria
prima da espécie.
18
5 OBJETIVOS
Classificar o mecanismo fotossintético de A. annua através de estudos
da composição dos isótopos do carbono (δ‰
13
C) e da anatomia foliar.
Avaliar em casa de vegetação o efeito de diferentes concentrações de
artemisinina, aplicadas exógenamente, na indução do florescimento de A. annua.
Verificar em casa de vegetação, o efeito de diferentes condições de
temperatura e fotoperíodo no florescimento das plantas do acesso CPQBA 2/39x1V de
A.annua com parentais provenientes do Vietnã, comparando-as com outro acesso cujos
parentais são originários da China, acesso estudado por FERREIRA et al. (1995).
Determinar em casa de vegetação e em campo, o fotoperíodo indutivo
e o número de ciclos fotoindutivos aproximados para o acesso CPQBA 2/39x1V de A.annua.
Verificar os efeitos de diferentes épocas de plantio e da interação
fotoperíodo versus temperatura, no crescimento, desenvolvimento e produção de artemisinina
no acesso CPQBA 2/39x1V de A.annua.
Determinar a melhor época de plantio do acesso CPQBA 2/39x1V em
Pato Branco – Pr.
19
6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Experimentos com isótopos de carbono e anatomia foliar para identificar o
mecanismo fotossintético de A. annua.
O material vegetal utilizado foram as folhas de plantas do acesso
CPQBA 2/39x1V, desenvolvido pelo programa de melhoramento do Centro de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas
(CPQBA/UNICAMP).
Os estudos da composição isotópica do carbono (δ‰
13
C) da A. annua
foram realizados no Centro de Isótopos Estáveis do Instituto de Biociências da UNESP,
Campus de Botucatu. Amostras de folhas de A. annua foram secas a 80
0
C até peso constante
em estufa com circulação de ar e moídas finamente em moinho criogênico (Spex-modelo 6700
freezer/mill) à temperatura de -196
0
C (Figura 5-A). Após isto, alguns microgramas da amostra
finamente moída foram adicionados em cápsulas de estanho em triplicata (Figura 5-B) e
analisadas em um espectrômetro de massas DELTA-S (Finnigan Mat) acoplado ao analisador
elementar EA-1108-CHN (Figura 5-C) para a determinação da razão isotópica R (R =
13
CO
2
/
12
CO
2
) com erro de análise da ordem de 0,2‰. A composição isotópica do carbono
20
(δ‰
13
C) é a medida da razão
13
C/
12
C em uma amostra de planta dividida pela medida da razão
13
C/
12
C padrão PDB. Desta forma,
δ‰
13
C = [(R
p
/R
s
) – 1] x 1000
onde R
p
é a razão do isótopo pesado sobre o leve (
13
C/
12
C) mensurada na amostra vegetal e R
s
é a razão do padrão (PDB). O padrão internacional utilizado é o fóssil belemnite da formação
calcária Pee Dee (PDB) na Carolina do Sul/EUA. Como os valores numéricos das diferenças
são pequenas, costuma-se multiplicar a expressão por 1000, obtendo-se a terminologia em
delta per mil (δ‰). Amostras de material vegetal contemporâneo apresentam valores
negativos de δ‰
13
C porque a razão
13
C/
12
C na atmosfera é menor do que o padrão
internacional Pee Dee belemnite (PDB), além de também ocorrer discriminação contra
13
C
pelas plantas durante os processos de absorção e fixação de CO
2
na fotossíntese (O’LEARY et
al., 1992; O’LEARY, 1993; CONDON et al., 2002; DAWSON et al., 2002).
Figura 5. Folhas secas de A. annua sendo moídas em moinho criogênico a -196
0
C (A); adição
de amostras finamente moídas em cápsulas de estanho (B); espectrômetro de massas acoplado
a um analisador elemental (C).
A
B
C
A
B
C
21
O equipamento espectrômetro de massas ioniza moléculas gasosas e
separa os feixes de íons em um espectro de massas de acordo com a relação massa/carga
(q/m), utilizando campo elétrico e magnético. As abundâncias relativas (concentrações) das
moléculas isotópicas de diferentes massa/carga são determinadas pelas medidas das correntes
elétricas geradas por estes feixes iônicos separados (CRISS, 1999; EHLERINGER et al.,
2000).
Os estudos de anatomia foliar/testes histoquímicos foram realizados
em cooperação com o Departamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de Viçosa,
MG.
Porções da região mediana de folhas de A. annua foram fixadas em
FAA
50
e armazenadas em etanol 70% (JOHANSEN, 1940). As amostras foram desidratadas
em série etílica progressiva e embebidas em glicol-metacrilato (Historesin-Leica®) de acordo
com as recomendações do fabricante (GERRITS, 1991). O material emblocado foi seccionado
transversalmente em micrótomo rotativo com 8µm de espessura e corado com azul de
toluidina (O’BRIEN et al., 1964; RUZIN, 1999) para metacromasia. Para a análise de
proteínas, os cortes foram corados com Xylidine Ponceau (XP) pH 2,5 (VIDAL, 1977), onde a
coloração vermelha indica a presença de enzimas, como a ribulose-1,5-bifosfato
carboxilase/oxigenase (RUBISCO), presente nos cloroplastos. Mais de 50% do nitrogênio
presente nas plantas herbáceas encontra-se na maquinaria fotossintética e deste total a maior
parte é contituinte da enzima RUBISCO (CHAPMAN & BARRETO, 1997; DIETZ &
HARRIS, 1997; LAMBERS et al., 1998).
Para a detecção de polissacarídeos, incluindo amido, o material foi
submetido ao ácido periódico/reagente de Schiff (PAS) (PEARSE, 1968; O’BRIEN &
MCCULLY, 1981). Este teste baseia-se na oxidação, pela ação do ácido periódico, dos grupos
1,2-gicol dos resíduos de glicose constituintes das macromoléculas glicídicas. Para cada
resíduo de glicose formam-se duas funções aldeído, em conseqüência da quebra da ligação
entre os carbonos portadores de radicais –OH. Os grupos carbonilos assim formados dão
origem, em presença do reagente de Schiff, a um produto de condensação magenta. Todas as
lâminas foram montadas com resina sintética (Permount®) e lamínula, para observação em
microscópio de luz.
22
6.2 Experimentos em câmaras fotoperiódicas para o estudo da fisiologia da floração
de A. annua.
Os experimentos foram conduzidos em câmaras fotoperiódicas (Figura
6), localizadas dentro de estufa plástica, na Universidade Tecnológica Federal do Paraná -
UTFPR, em Pato Branco/PR, Brasil (26º11' S, 52º36' W e 760 m de altitude).
6.2.1 Experimento 01 (primavera/verão)
O primeiro experimento foi conduzido no período entre 20/10/1999 e
15/02/2000 (primavera/verão). Foram utilizados clones de dois acessos de A. annua com
origens geográficas diferentes. O acesso CPQBA 2/39x1V foi denominado para este
experimento “vietnã”, devido aos parentais serem originários de uma população de plantas do
Vietnã, segundo MAGALHÃES et al. (1997), e um segundo acesso denominado “chinês”,
proveniente de um acesso da China, cedido pelo Horticulture and Landscape Architecture
Department at Purdue University, USA, que foi utilizado nos experimentos de Ferreira et al.
(1995). Os clones foram obtidos por estacas provenientes de uma única planta mãe de cada
acesso, cultivados inicialmente em tubetes e mantidos em condição de fotoperíodo de 15 horas
para evitar o florescimento das mesmas até atingirem a altura de 30 cm (fase de alongamento,
estádio B da escala de DELABAYS (1997), quando foram transplantadas para vasos contendo
3000 cm
3
de substrato (solo acrescido de composto orgânico). Os vasos foram dispostos em
bandejas e foi fornecida água por sub-irrigação. Foram separados 06 grupos de 30 plantas com
30 cm de altura selecionadas ao acaso e submetidos a seis diferentes condições de fotoperíodo
(7, 9, 11, 13, 15 e 17 horas de luz). Os tratamentos receberam 7 horas de luz natural e a
extensão do fotoperíodo foi feita em câmaras fotoperiódicas individualizadas (Figura 6), por
meio de lâmpada fluorescente 40 W (1,6 μmol m
-2
s
-1
) e outra incandescente de 100 W (1,6
μmol m
-2
s
-1
), acionadas por computador, fornecendo uma densidade de fluxo de fótons de
aproximadamente 3,5 μmol m
-2
s
-1
. Durante 56 dias, diariamente, eram identificadas as plantas
que floresceram (iniciaram a a emissão dos botões florais). Semanalmente, em 6 plantas
aleatoriamente escolhidas e marcadas nos diferentes tratamentos foram avaliados o
comprimento do caule (da base ao ápice) e o número de brotações laterais ou de entrenós
23
(brotações vegetativas e florais do caule principal). Durante o experimento, as temperaturas
médias diárias foram: máxima de 37ºC e mínima de 19ºC (Figura 7).
6.2.2 Experimento 02 (outono)
Em face aos resultados observados no experimento 01 e a hipótese da
temperatura ambiente estar influenciando o florescimento das plantas, outro experimento foi
conduzido no mesmo local, somente com o acesso vietnã (CPQBA 2/39x1V), no período de
29/02/2000 a 26/06/2000 (outono). Durante 56 dias, em 6 plantas de cada tratamento, foram
verificadas as mesmas variáveis de avaliação do primeiro experimento. Em adição,
semanalmente, foram colhidas aleatoriamente 02 plantas de cada tratamento, para a
determinação do teor de artemisinina na massa seca de folhas (mg g
-1
). Estas plantas foram
cortadas rente aos vasos e colocadas para secar até peso constante em estufa com circulação de
ar a uma temperatura de 35ºC, de acordo com FIGUEIRA & SARTORATO (1997), que
sugerem temperaturas de no máximo 40ºC para a secagem de A. annua. A determinação dos
teores de artemisinina nas folhas foi feita no Laboratório de Síntese Química do CPQBA-
UNICAMP, através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção no
ultravioleta (CLAE-UV), descrita por MARCHESE (1999) e detalhada no ítem 6.3. As
temperaturas médias diárias foram: máxima de 29ºC e mínima de 13ºC (Figura 7).
24
Figura 6. Câmaras fotoperiódicas individuais com temporizador para fotoperíodo usadas nos
experimentos para determinar o fotoperíodo indutivo e o número de ciclos fotoindutivos
aproximados para os acessos chinês e vietnã de A.annua. UTFPR, Pato Branco-PR, 2000.
25
primavera/verão
Temperatura
0
C
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T máx.
T mín.
20/10/99 15/02/00
Temperatura
0
C
0
10
20
30
40
50
T máx.
T mín.
outono/inverno
29/02/00
26/06/00
Datas
Figura 7. Temperaturas máxima e mínima diárias no período de realização dos experimento
primavera/verão e outono. UTFPR, Pato Branco-PR (26
0
11’S e 52
0
36’W – 760 m alt.).
26
6.2.3 Experimentos com aplicação exógena de artemisinina
Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação no
Departamento de Produção Vegetal da FCA/UNESP, em Botucatu-SP (22
0
51’ latitude sul;
48
0
26’ a oeste de Greenwich, em uma altitude 786 m). Foram utilizadas sementes dos acessos
CPQBA 2/39x1V e 3MxPOP de A.annua, e a semeadura foi feita em bandejas de 72 células
contendo substrato orgânico Plantmax
®
, em 25/04/2002. O transplantio das mudas foi feito em
09/07/2002, para vasos com capacidade de 0,5 L, contendo uma mistura de Plantmax
®
e terra
de subsolo (1:1). Durante o experimento, as plantas permaneceram sob fotoperíodo natural de
11-12 horas, com adição de 4 horas de luz artificial, para impedir a indução natural do
florescimento das mesmas, cujo fotoperíodo indutivo é de aproximadamente 13 horas. As
temperaturas médias foram de 27,1
0
C (máxima)
e 16,7
0
C (mínima). Foram testados dois
acessos de A. annua em dois experimentos independentes (um experimento para cada acesso),
onde as plantas foram pulverizadas com quatro diferentes concentrações de artemisinina (0,
500, 5000 e 10000 mg L
-1
). Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado,
com oito repetições, sendo que uma planta foi considerada uma repetição. Os cristais de
artemisinina utilizados foram purificados na Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica do
CPQBA-UNICAMP (teor de pureza = 98%; ponto de fusão = 154-155
0
C e solubilidade em
etanol 96% = 29,1 g L
-1
). A artemisinina foi pré-dissolvida em etanol P.A. (dosagem min.
96%) e diluída em água destilada. Adicionou-se à calda o espalhante adesivo não iônico nonil
fenoxi poli (etilenoxi) etanol, na concentração de 0,2% (v/v).
Em 22/08/2002, quando as plantas se encontravam no estadio B
(alongamento) da escala fenológica descrita por Delabays (1997), foram feitas as aplicações
dos tratamentos com um pulverizador costal pressurizado (pressão constante de 2 bar), a uma
vazão de 0,216 L min
-1
. Foi utilizado um bico Twinjet
®
TJ60-11002VS e grupos de oito
plantas de cada tratamento receberam um volume de calda aproximado de 0,108 L, durante 30
s. A partir de 17/07/2002 até 03/10/2002 (final do experimento), de dois em dois dias, foram
avaliados a altura e o número de entrenós das plantas, bem como o número de plantas
florescidas.
27
6.3 Experimento em campo para definição da época de plantio e fisiologia da
floração do acesso CPQBA 2/39X1V
O experimento foi conduzido em campo nos anos de 2000 e 2001, na
estação experimental do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), localizado na cidade de
Pato Branco – PR, em latitude 26º07' S, longitude 52º41' W, altitude de 760m e clima
subtropical úmido (Cfa), segundo classificação de Köppen.
Foram utilizados clones do acesso CPQBA 2/39x1V desenvolvido pelo
programa de melhoramento de A.annua do CPQBA-UNICAMP. Os clones foram obtidos por
estacas provenientes de uma única planta de aproximadamente 01 ano, mantida em condição
de fotoperíodo de 15 horas em estufa (a luz natural foi complementada com luz artificial), para
evitar o florescimento da mesma. As estacas foram plantadas em tubetes contendo substrato
orgânico, e ficaram enraizando em estufa por aproximadamente 30 dias. Os tratamentos foram
06 diferentes épocas de plantio e tranplante (ver Tabela 5). Cada repetição ou parcela
experimental foi constituída de 25 plantas, com espaçamento entre plantas de 0,6 m na linha
de plantio e 1 m nas entre linhas.
A análise do solo apresentou os seguintes resultados: M.O. - 40,21 g
dm
-3
; Ca - 4,9; Ca+Mg - 7,44; K – 0,33 cmol(+) dm
-3
; P – 6,49 mg dm
-3
; pH 5,2; V(%) 62,75.
Os dados climatológicos foram coletados junto a estação climatológica do Instituto
Agronômico do Paraná (IAPAR), localizada a 50 m da área onde o experimento foi instalado,
e são apresentados nas figuras 8 e 9. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao
acaso. As médias das repetições nos tratamentos foram submetidas a análise de variância e
análise de regressão nos programas SYSTAT
®
11 e SigmaPlot
®
9.0, respectivamente.
Diariamente, foram avaliados o número de plantas que iniciaram a
emissão dos botões florais. As 09 plantas centrais de cada tratamento, descartadas às das
bordaduras, foram colhidas para a determinação da massa seca de folha e caules, relação
folha/caule e teor de artemisinina na massa seca de folhas (mg g
-1
) quando 50% das plantas da
parcela iniciaram a a emissão dos botões florais (Figura 10). Estas plantas foram cortadas
rente ao solo e colocadas para secar até peso constante em estufa com circulação de ar a uma
temperatura de ± 35ºC, de acordo com FIGUEIRA & SARTORATO (1997), que sugerem
temperaturas de no máximo 40ºC para a secagem de A. annua.
28
Data
01-Aug-00 01-Dec-00 01-Apr-01 01-Aug-01
Temperatura (
0
C)
-10
0
10
20
30
40
máximas
mínimas
Figura 8. Temperaturas máxima e mínima (
0
C) diárias no período de realização do
experimento (18/08/00 a 09/08/01) em Pato Branco, PR. Fonte: IAPAR.
Jul/00
Data
Temperatura (
0
C)
0
5
10
15
20
25
30
Precipitação (mm)
0
5
10
15
20
25
30
T máx.
T mín.
precipitação
Nov/00
Jul/01
Mar/01
Figura 9. Médias mensais de precipitação e temperaturas máx. e mín. no período de
realização do experimento (18/08/00 a 09/08/01) em Pato Branco – PR. Fonte: IAPAR.
29
Tabela 1. Relação das datas e temperaturas das geadas ocorridas nos anos de 2000 e 2001, na
área onde foi instalado o experimento em Pato Branco - PR (26
0
11’S e 52
0
36’W – 760 m alt.).
Datas Temperaturas na relva (
0
C)
28/05/2000 -2,001
29/05/2000 -1,201
22/06/2000 -3,803
23/06/2000 -1,201
13/07/2000 -8,403
14/07/2000 -9,803
16/07/2000 -4,402
17/07/2000 -11,203
18/07/2000 -5,002
20/07/2000 -9,803
21/07/2000 -7,002
24/07/2000 -5,402
25/07/2000 -1,801
26/07/2000 -1,601
29/08/2000 -0,201
21/06/2001 -3,002
22/06/2001 -3,802
23/06/2001 -1,801
28/06/2001 -0,801
13/07/2001 -1,601
28/07/2001 -5,803
29/07/2001 -0,201
16/09/2001 -0,801
17/09/2001 -4,002
Fonte: IAPAR.
30
Figura 10. A - Detalhe de uma das parcelas do experimento em campo para definição da
época de plantio e fisiologia da floração do acesso CPQBA 2/39x1V. B - Detalhe do
processamento das plantas após a colheita e previamente a secagem. UTFPR, Pato Branco-PR,
2000.
A
B
A
B
31
A determinação dos teores de artemisinina nas folhas foi feita através
da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção no ultravioleta (CLAE-
UV), descrita por MARCHESE et al.(2001) e adaptada de ZHAO & ZHENG (1986). A
técnica CLAE-UV é considerada sensível e seletiva para análises quantitativas de artemisinina
(MARCHESE et al., 2001). Este método utiliza inicialmente um tratamento pré-coluna da
artemisinina, com solução alcalina, para a produção do composto Q292, que é transformado
em meio ácido para Q260, este último perfeitamente detectável em ultravioleta (Figura 11).
Aproximadamente 100 mg de folhas finamente moídas em moinho de facas foram extraídas
com 5 mL de solução de extração contendo acetonitrila, mais 0,5 mg mL
-1
de acetofenona,
usada como padrão interno. A extração foi feita em um ultra-dispersor por 30 segundos a
20.000 RPM, seguida de uma centrifugação a 3200 g por 6 minutos. Para a derivatização da
artemisinina (Figura 11), foram adicionadas em um tubo de reação, alíquotas (em duplicata)
de 1,0 mL de cada extrato, 1,0 mL de EtOH 95% e 4,0 mL de solução aquosa de NaOH 0,2%.
Os tubos foram fechados com tampas de borracha e a mistura foi aquecida a 40
o
C durante
exatos 15 minutos (com agitação magnética), para depois ser rapidamente resfriada em banho
de gelo e neutralizada com a adição de 4 mL de ácido acético 0,1 M. Para a derivatização dos
padrões de artemisinina, foi substituído 1,0 mL de EtOH 95% por 1 mL da solução de
extração. Três diferentes concentrações de artemisinina foram utilizadas como padrão,
respectivamente, 0,04; 0,2 e 1,0 mg de artemisinina por mL de EtOH 95%. Anteriormente à
injeção, a mistura foi filtrada em filtro GVWP 0,22 μm.
O equipamento utilizado para dosar o Q260, foi um cromatógrafo
líquido de alta pressão, com injeção manual e um compartimento de aquecimento para a
coluna, onde a temperatura foi mantida a 47
o
C. A separação foi efetuada em uma coluna
C18/4μm/3,9 x 150 mm. Como fase móvel, foi utilizada uma solução de tampão fosfato 10
mM mais acetonitrila, numa proporção de 80:20, com uma vazão de 1,0 mL minuto
-1
. Nestas
condições, o tempo de retenção para Q260 foi de aproximadamente 3 minutos e para o padrão
interno acetofenona de aproximadamente 8,5 minutos. O tempo necessário para a análise de
cada amostra, foi de aproximadamente 50 minutos, já que após a detecção de Q260 e
acetofenona, o fluxo da fase móvel foi mantido por mais 40 min, limpando a coluna para a
análise subsequente. A detecção foi feita no modo absorbância, em um comprimento de onda
32
de 260nm, através de um detector ultravioleta universal. O volume de amostra injetado foi de
10μL. O teor de artemisinina foi avaliado por comparação da área dos picos dos padrões com
os das amostras.
Figura 11. Conversão de artemisinina em Q260, segundo ZHAO & ZENG (1986).
O
O
CH
3
CH
3
O
H
3
C
O
O
H
H
A
RTEMISININA
CH
3
COO
-
H
H
3
C
O
-
OO
H
3
C
CH
3
COOHH
3
C
O
Q
292
260
Q
OH
-
H
+
OH
-
33
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1 Experimentos com isótopos de carbono e anatomia foliar para identificar o
mecanismo fotossintético de A. annua.
A. annua apresentou uma δ
13
C = -31,76 ± 0,07‰ (Tabela 2), resultado
que a caracteriza como uma típica espécie de mecanismo fotossintético C
3
, classe de plantas
que apresentam valores médios para δ
13
C de - 28‰, enquanto espécies com mecanismo
fotossintético C
4
apresentam valores médios de δ
13
C = -14‰ (STERNBERG et al., 1984;
FARQUHAR et al., 1989; O’LEARY et al., 1992; O’LEARY, 1993; LAMBERS et al., 1998;
CONDON et al., 2002). A razão (R)
13
C/
12
C na massa seca de espécies C
3
é o resultado da
discriminação contra o carbono pesado
13
C durante vários processos. Esses processos incluem
discriminação que ocorre durante a difusão do
13
CO
2
através dos estômatos; discriminação
pela enzima RUBISCO durante o processo de carboxilação da ribulose-1,5-bifosfato no
primeiro produto da fotossíntese 2-carboxi-3-cetoarabinitol-1,5-bifosfato e algumas perdas
associadas com fracionamento do
13
C durante o metabolismo e (possivelmente) respiração
(CONDON et al., 2002).
34
Tabela 2. Valor médio da composição isotópica de carbono (δ
13
C)
PDB
, para A. annua (acesso
CPQBA 2/39x1V).
amostra
(δ‰
13
C)
PDB
01 -31,69
02 - 31,82
03 -31,78
*media
- 31,76 ± 0,07
*Média ± desvio padrão da média.
As análises da anatomia foliar de A. annua confirmaram os resultados
da δ
13
C de que a espécie possui mecanismo fotossintético C
3
, e apesar de terem sido
verificadas células parenquimáticas envolvendo o tecido vascular, não foi observada a
presença de proteínas/cloroplastos ou grãos de amido nas referidas células, condição
necessária para uma espécie ser considerada C
4
(Figuras 12 e 13). A folha é anfiestomática
(pode apresentar estômatos em ambas as faces, adaxial e abaxial) e o mesofilo é dorsiventral,
com uma pequena diferenciação entre os parênquimas paliçádico e lacunoso. Foi verificada a
presença de grãos de amido e cloroplastos em toda a extensão do mesofilo das folhas de A.
annua (Figuras 12 e 13), o que indica que não há uma área específica para a produção
daquelas, como ocorre nas células Kranz ou células da bainha do feixe vascular, dotadas de
cloroplastos e encontradas somente nas plantas C
4
(MAUSETH, 1988; RUDALL, 1994;
LAWLOR, 2001).
Todavia, verifica-se nas figuras 12 e 13 a existência de uma evidente
bainha de células envolvendo o feixe vascular e uma pequena diferenciação das células do
mesofilo, porém, a anatomia Kranz consiste em uma camada de células que obrigatoriamente
contém grandes cloroplastos e amido (MAUSETH, 1988; RUDALL, 1994).
Os resultados da δ
13
C e a ausência de cloroplastos e grãos amido nas
células parenquimáticas envolvendo o tecido vascular confirmam que a espécie A. annua
possui um mecanismo fotossintético C
3
.
35
Figura 12. Corte transversal de folha de A. annua com teste com Xylidine Ponceau para
proteínas totais. Celulas do parênquima paliçádico (CPP); células do parênquima esponjoso
(CPE); bainha vascular (BV); células da bainha vascular (CBV); epiderme adaxial (EAD);
epiderme abaxial (EAB); cloroplastos (C). **Verifica-se a presença de cloroplastos em todo o
parênquima clorofiliano (CPP e CPE) e a *ausência destas estruturas nas células da bainha
vascular (CBV).
BV
50 µm
*CBV
**CPP
**CPE
EAD
EAB
C
C
CC
BV
50 µm50 µm
*CBV
**CPP
**CPE
EAD
EAB
C
C
CC
36
Figura 13. Corte transversal de folha de A. annua com teste PAS (Ácido periódico/reagente
de Shiff) para carboidratos totais. Células do parênquima paliçádico (CPP); células do
parênquima esponjoso (CPE); bainha vascular (BV); celulas da bainha vascular (CBV);
epiderme adaxial (EAD); epiderme abaxial (EAB); estômato (EST); amido (A). **Verifica-se
a presença de grãos de amido em todo o parênquima clorofiliano (CPP e CPE) e a *ausência
destas estruturas nas células da bainha vascular (CBV).
EAD
EST
*CBV
BV
EAB
**CPP
**CPE
A
A
A
A
25 µm
EAD
EST
*CBV
BV
EAB
**CPP
**CPE
A
A
A
A
25 µm25 µm
37
7.2 Experimentos em câmaras fotoperiódicas para o estudo da fisiologia da floração
de A. annua.
No experimento primavera/verão (Tabela 3), 100% das plantas do
acesso chinês iniciaram a emissão dos botões florais aproximadamente duas semanas (média
de 14,75 ciclos fotoindutivos) após serem submetidas aos tratamentos 7, 9, 11 e 13 horas de
luz. Todavia, para os tratamentos 15 e 17 horas de luz, não se observou a emissão de botões
florais durante todo o período em que as plantas ficaram submetidas aos tratamentos (56 dias),
o que classifica o acesso chinês como uma planta de dias curtos. Estes dados estão de acordo
com aqueles encontrados por FERREIRA et al. (1995) usando o mesmo material.
Para as plantas do acesso vietnã no experimento primavera/verão
(Tabela 3), os resultados foram diferentes daqueles encontrados para o acesso chinês, onde um
percentual relativamente menor de plantas emitiram botões florais, mas só a partir da quarta
semana (média de 29,3 ciclos fotoindutivos), com 33,3%, 33,3% e 16,7% de florescimento
para os tratamentos 7, 9 e 11 horas de luz, respectivamente. Nos tratamentos 13, 15 e 17 horas
de luz, nenhuma planta floresceu. Quando o experimento foi repetido somente com o acesso
vietnã no outono (Tabela 4), verificou-se que a partir da quinta semana (média de 36,6 ciclos
fotoindutivos), 100% das plantas dos tratamentos 7 e 9 horas floresceram, enquanto que no
tratamento 11 horas, 83,33% das plantas floresceram, observando-se um percentual de
florescimento bem maior que o apresentado pelo mesmo acesso quando o experimento foi
realizado na primavera/verão. Já, nos tratamentos 13, 15 e 17 horas de luz, nenhuma das
plantas floresceram, uma típica resposta de planta de dias curtos.
Considerando-se todos os tratamentos com dias curtos e ambas as
épocas em que os experimentos foram conduzidos, o número médio de ciclos fotoindutivos
necessários para o acesso vietnã florescer é aproximadamente 32 ciclos ou dias (Tabelas 3 e
4).
Para o acesso vietnã, independentemente da época em que os
experimentos foram realizados, o fotoperíodo crítico encontra-se entre 11 e 13 horas (Tabelas
3 e 4). Já, para o acesso chinês, o fotoperíodo crítico encontra-se entre 13 e 15 horas (Tabela
3). Estes dados também estão de acordo com aqueles encontrados por FERREIRA et al.
(1995).
38
Tabela 3. Efeito de distintos fotoperíodos na indução da floração (emissão dos botões florais)
em plantas de dois acessos de A. annua (chinês e vietnã) cultivados na primavera/verão
1
.
nº ciclos fotoindutivos (24 horas)
necessários para indução floral
% de plantas florescidas ao término
do experimento
Fotoperíodo
(horas)
chinês vietnã chinês vietnã
7 14 30 100 33,3
9 14 24 100 33,3
11 14 34 100 16,7
13 17 - 100 -
15 - - - -
17 - - - -
1
Temperaturas médias de cultivo: máxima de 37ºC e mínima de 19ºC.
Tabela 4. Efeito de distintos fotoperíodos e temperaturas na indução da floração (emissão dos
botões florais)em plantas do acesso vietnã de A. annua cultivadas em primavera/verão e
outono.
nº ciclos fotoindutivos (24 horas)
necessários para indução floral
% de plantas florescidas ao término
do experimento
Fotoperíodo
(horas)
primavera/verão
1
outono
2
primavera/verão
1
outono
2
7 30 34 33,3 100
9 24 32 33,3 100
11 34 44 16,7 83,33
13 - - - -
15 - - - -
17 - - - -
1
Temperaturas médias de cultivo: máxima de 37ºC e mínima de 19ºC.
2
Temperaturas médias de cultivo: máxima de 29ºC e mínima de 13ºC.
Um rápido aumendo no número de entrenós e comprimento do caule é
verificado em A. annua quando ocorre a indução floral, após a planta receber a quantidade
necessária de ciclos fotoindutivos para florescer (FERREIRA et al., 1995). Já na fase de
floração, há uma interrupção no crescimento em altura, no incremento de entrenós e na
produção de órgãos vegetativos, devido à conversão do meristema apical de vegetativo para
39
reprodutivo. Nesse aspecto, as diferenças são acentuadas entre os dois materiais utilizados,
verificando-se para o acesso chinês sob dias curtos que o aumento dos entrenós e do
comprimento do caule inicia com aproximadamente duas semanas e na quarta semana já
percebe-se a interrupção no crescimento em altura e do incremento de entrenós (Figura 14-B).
Para o acesso vietnã, tanto nos experimentos primavera/verão como no outono (Figura 15), o
rápido aumendo dos entrenós e do comprimento do caule para os tratamentos sob dias curtos,
inicia-se aproximadamente com 4 semanas e a interrupção do crescimento aproximadamente
com 6 semanas. Para ambos os acessos e épocas (primavera/verão e outono), nos tratamentos
com dias longos as curvas de crescimento para comprimento de caule e número de entrenós
apresentaram tendências lineares e as plantas ficaram vegetando até o término do experimento
(Figuras 14 e 15). Com os dados agrupados em dias curtos e longos na primavera/verão
(Figura 16), há uma percepção melhor e verifica-se nas curvas de crescimento sob dias curtos
uma defasagem de duas semanas entre os dois acessos, tanto para o o rápido aumendo de
entrenós e altura, quanto para a parada no crescimento. Esses resultados suportam aqueles
encontrados para número de ciclos fotoindutivos, onde verifica-se que o acesso vietnã
necessita do dobro de ciclos fotoindutivos do acesso chinês para começar a florescer (Tabela
3).
Observando apenas o acesso vietnã nos experimentos realizados na
primavera/verão e no outono, quando os dados foram agrupados em dias curtos e longos
(Figura 17), o rápido aumendo dos entrenós e do comprimento do caule nos tratamentos com
dias curtos ficou mais evidente, mas não percebeu-se diferença nas curvas de crescimento
entre as duas épocas, o que era de se esperar devido ao número de plantas florescidas ter sido
maior no outono (Tabela 4).
FERREIRA et al. (1995) alertam para o fato de que algumas plantas
propagadas por sementes em seus experimentos, sob um fotoperíodo de 8 horas, apresentaram
o fenômeno de juvenilidade, só vindo a florescer após dois meses, quando atingiram a fase
adulta. Todavia, em nossos experimentos trabalhamos com estacas de plantas adultas, para
ambos os acessos, o que inviabiliza a existência de juvenilidade nos clones e reforça a
existência de diferenças entre os acessos para o número de ciclos fotoindutivos e fotoperíodo
indutivo.
40
0 102030405060
7 horas
9 horas
11 horas
13 horas
15 horas
17 horas
0 102030405060
número de entrenós
10
20
30
40
50
60
70
comprimento do caule (cm)
20
40
60
80
100
120
140
IF
IF
IF
IF
(A)
(A)
(B)
(B)
DAT
Figura 14. Efeito de diferentes fotoperíodos no comprimento do caule e numero de entrenós
dos acessos vietnã (A) e chinês (B) de A. annua cultivados em temperaturas médias de 37ºC
(máx.) e 19ºC (mín.) durante a primavera/verão. IF = início do florescimento
(emissão dos
botões florais). DAT = dias após o transplante.
41
0 102030405060
DAT
0 102030405060
número de entrenós
10
20
30
40
50
60
70
comprimento do caule (cm)
20
40
60
80
100
120
140
(B)(A)
(A) (B)
IF
IF
IF
IF
7 horas
9 horas
11 horas
13 horas
15 horas
17 horas
Figura 15. Efeito de diferentes fotoperíodos no comprimento do caule e numero de entrenós
do acesso vietnã de A. annua cultivado em temperaturas médias de 37ºC (máx.) e 19ºC (mín.)
durante a primavera/verão (A) e 29ºC (máx.) e 13ºC (mín.) durante o outono (B). IF = início
do florescimento (emissão dos botões florais). DAT = dias após o transplante.
42
DAT
0 1020304050600 102030405060
número de entrenós
10
20
30
40
50
60
70
DIAS CURTOS
DIAS LONGOS
comprimento do caule (cm)
20
40
60
80
100
120
140
(A)
(A)
(B)
(B)
IF
IF
IF
IF
Figura 16. Efeito de dias curtos (dados agrupados dos tratamentos com 7, 9, 11 horas de luz) e
dias longos (dados agrupados dos tratamentos com 13, 15 e 17 horas de luz) no comprimento
do caule dos acessos vietnã (A) e chinês (B) de A. annua cultivados em temperaturas médias
de 37ºC (máx.) e 19ºC (mín.) durante a primavera/verão. IF = início do florescimento (emissão
dos botões florais
). DAT = dias após o transplante.
43
20
40
60
80
100
120
140
DAT
0 102030405060
comprimento do caule (cm)
20
40
60
80
100
120
140
número de entrenós
10
20
30
40
50
60
70
DAT
0 102030405060
20
30
40
50
60
70
DIAS CURTOS
DIAS LONGOS
(A)
(A)
(B)
(B)
IF
IF
IF
IF
Figura 17. Efeito de dias curtos (dados agrupados dos tratamentos com 7, 9, 11 horas de luz) e
dias longos (dados agrupados dos tratamentos com 13, 15 e 17 horas de luz) no comprimento
do caule e número de entrenós do acesso vietnã de A. annua cultivado em temperaturas médias
de 37ºC (máx.) e 19ºC (mín.) durante a primavera/verão (A) e 29ºC (máx.) e 13ºC (mín.)
durante o outono (B). IF = início do florescimento (emissão dos botões florais). DAT = dias
após o transplante.
44
Os resultados encontrados neste estudo demonstraram que há uma
variação na resposta ao ambiente e no comportamento fisiológico entre populações de A.
annua oriundas de diferentes regiões geográficas. CHEN & ZHANG (1987), MAGALHÃES
(1996) e MARCHESE (1999), estudando o efeito da temperatura na produção de artemisinina,
sugerem que o comportamento da espécie A. annua não é padrão, sendo variável para
diferentes genótipos. WALLAART et al. (2000) sugerem a existência de quimiotipos de A.
annua em função da origem geográfica.
Uma das principais observações verificadas em ambos os
experimentos conduzidos com o acesso vietnã foi uma forte interação entre fotoperíodo e
temperatura na indução ao florescimento das plantas testadas, onde as temperaturas menores
ocorridas no experimento outono (máxima de 29ºC e mínima de 13ºC) induziram a um maior
florescimento nas plantas dos tratamentos com dias curtos (7, 9 e 11 horas), em detrimento
daquelas submetidas às temperaturas maiores no experimento primavera/verão (máxima de
37ºC e mínima de19ºC) (Tabela 4).
Pode-se afirmar que os clones do acesso vietnã (CPQBA 2/39x1V)
apresentaram um comportamento fotoperiódico de Planta de Dias Curtos qualitativa ou
absoluta (não floresce na ausência do fotoperíodo indutivo), com requerimento de baixas
temperaturas para ter seu florescimento acelerado. O acesso vietnã apresentou um hábito de
crescimento determinado, pois a partir da indução floral nos tratamentos com dias curtos,
observou-se uma interrupção no crescimento em altura e no incremento de entrenós (Figura
17), além de uma redução na produção dos órgãos vegetativos e rápida senescência destes,
devido à conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo. Esse comportamento é
padrão em plantas que possuem hábito de crescimento ou florescimento determinado
(LOOMIS & CONNOR, 1992).
Também, foi observado um decréscimo acentuado no teor de
artemisinina nas folhas das plantas submetidas a dias curtos no experimento outono, na 4ª
semana após o início do florescimento (Figura 18). Rápido decréscimo no conteúdo de
artemisinina durante a fase reprodutiva também foi verificado por WANG et al., (2004) e
LAUGHLIN (1993). Essa informação sugere que não se deve aguardar muito tempo após o
início da floração para proceder a colheita de A. annua. Em dias curtos, a maior concentração
45
de artemisinina foi oservada três semanas após o florescimento, sendo este o momento
adequado para ae colheita (Figura 18).
Uma hipótese que poderia explicar os resultados descritos acima, onde
as temperaturas menores induziram a um maior florescimento nas plantas dos tratamentos com
dias curtos em detrimento daquelas submetidas as temperaturas maiores, seria que em plantas
submetidas a temperaturas menores, ocorre uma maior produção de artemisinina (FERREIRA,
1994; MAGALHÃES, 1996; FERREIRA et al., 1995; WALLAART et al., 2000) e o
aumento no teor da molécula pode induzir a um aumento na quantidade de plantas florescidas.
É fato conhecido que o maior teor de artemisinina em A. annua ocorre quando as plantas
encontram-se nas fases de pré-floração e floração (PRAS et al., 1991; MORALES et al., 1993;
FERREIRA, 1994; LAUGHLIN, 1995; FERREIRA & JANICK, 1996) (ver Figura 18), o que
sugere que a molécula possa estar de alguma forma relacionada com a indução da floração na
espécie. Corroborando com essa hipótese, WALLAART et al. (2000) verificaram que plantas
originárias do Vietnã apresentaram um teor de artemisinina muito maior quando estas foram
submetidas a condições de baixas temperaturas, o que não foi observado em plantas
provenientes de populações da China.
Para confirmar a hipótese descrita acima, foi feita a aplicação exógena
de artemisinina no acesso vietnã e em um segundo acesso, CPQBA 3MxPOP, cujos parentais
também são provenientes do Vietnã. Como resultado, a aplicação exógena de artemisinina não
induziu ao florescimento e não provocou rápido aumendo na altura e no número de entrenós
das plantas de ambos os acessos de A. annua testados, em nenhuma das concentrações
utilizadas, e as curvas de crescimento para comprimento de caule e número de entrenós foram
lineares, ficando as plantas vegetando até o término do experimento (Figura 19). Dando
suporte a esses resultados, WANG et al. (2004) não observaram relação direta entre
florescimento e biossíntese de artemisinina, comparando plantas de A. annua transformadas
geneticamente (que tiveram inserido em seu genoma o fator promotor de florescimento fpf1
de Arabidopsis thaliana) e não-tranformadas. Sob as mesmas condições de dias curtos não
foram observadas diferenças no conteúdo de artemisinina entre plantas trangênicas florescidas
e não-transgênicas vegetativas. As plantas transgênicas tiveram seu florescimento antecipado
em duas semanas quando comparadas as não-transgênicas.
46
Esses resultados sugerem que a molécula de artemisinina pode não está
diretamente relacionada com a indução floral na espécie, ainda que o acúmulo da artemisinina
ocorra nas fases de pré-floração e floração.
DAT
0 102030405060
Artemisinina (% na MS)
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
DC - Dias Curtos
DL - Dias Longos
IF
Figura 18. Efeito de dias curtos (dados agrupados dos tratamentos com 7, 9, 11 horas de luz)
e dias longos (dados agrupados dos tratamentos com 13, 15 e 17 horas de luz) no teor de
artemisinina do acesso vietnã de A. annua cultivado em temperaturas médias de 29ºC (máx.) e
13ºC (mín.) durante o outono. IF = início do florescimento (função da média de ciclos
fotoindutivos dos tratamentos 7, 9, 11 horas de luz). DAT = dias após o transplante.
47
DAT
0 20406080100
número de entrenós
10
20
30
40
50
0 20406080100
comprimento do caule (cm)
20
30
40
50
60
70
10
20
30
40
50
0 mg L
-1
500 mg L
-1
5000 mg L
-1
10000 mg L
-1
20
30
40
50
60
70
(A)
(A)
(B)(B)
DAT
0 mg L
-1
500 mg L
-1
5000 mg L
-1
10000 mg L
-1
Figura 19. Influência de diferentes concentrações de artemisinina no número de entrenós e no
comprimento do caule de plantas dos acessos CPQBA 3MxPOP (A) e vietnã (B) de A. annua
cultivados em dias curtos.
48
7.3 Experimento em campo para definição da época de plantio e fisiologia da
floração do acesso CPQBA 2/39X1V
O número de ciclos fotoindutivos (CF) encontrado no experimento em
campo para o acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua foi de aproximadamente 28 ciclos (dias)
(Figura 20), muito próximo do número médio de CF de 32 dias encontrado nos experimentos
em câmaras fotoperiódicas. Se observar a 5ª época de plantio (Tabela 5 e Figura 20), verifica-
se que a mesma foi levada ao campo em março, período em que as épocas anteriores estavam
florescendo, ou seja, dentro do período fotoindutivo. Então, para calcular o número de CF
necessários para o florescimento do acesso 2/39x1V, basta determinar o número de dias
existentes entre a data do transplante em campo da 5ª época e a data do seu florescimento
(Tabela 5 e Figura 20), que foi de 28 dias ou 28 ciclos fotoindutivos. Esse resultado é diferente
daquele encontrado por FERREIRA (1994) e largamente reportado na literatura, em que A.
annua floresce aproximadamente 14 dias após ser submetida ao fotoperíodo indutivo (FI).
Esse resultado comprova que não existe um padrão nas respostas de A. annua ao ambiente,
sendo variável para diferentes genótipos.
Uma vez encontrado o número CF = 28, basta verificar a data do
florescimento da 1ª época, subtrair 28 dias, e encontra-se o FI para o acesso CPQBA 2/39x1V
de A. annua, que ocorreu aproximadamente na data de 07/02/2001, cujo comprimento do dia
foi de 13,07 horas, ou seja, FI = 13,07 horas (Figura 20). Também, verificou-se que as plantas
floresceram abaixo do fotoperíodo indutivo, confirmando os dados dos experimentos em
câmaras fotoperiódicas de que o acesso vietnã (CPQBA 2/39x1V) é uma planta de dias curtos
(PDC) (Tabela 5). O valor do FI próximo de 13,07 horas suporta aquele encontrado em
câmaras fotoperiódicas, que mostraram um FI para o acesso CPQBA 2/39x1V entre 11-13
horas (Tabela 4). BAGCHI et al. (1997b) em experimento conduzido em Lucknow, India
(Latitude 26,5
0
N), em 1994/95, relatam que fotoperíodos entre 11-13h promoveram um rápido
crescimento das plantas e que o FI para A. annua foi em média 13,2 horas, muito similar ao de
Pato Branco-PR. FERREIRA (1994) reporta um FI de 13,5 h em experimento de campo
realizado em West Lafayette, IN, EUA (Latitude 40
0
N).
49
Figura 20. Fotoperíodo anual em Pato Branco-PR, Brasil (latitude 26º07' S, longitude 52º41'
W, altitude de 760m) e caracterização do florescimento de A. annua (CPQBA 2/39x1V). FI =
fotoperíodo indutivo; TP = transplante para o campo; FL = emissão do botão floral; CF =
número de ciclos fotoindutivos.
MAGALHÃES et al. (1997) cultivando o mesmo acesso CPQBA
2/39x1V, observaram em campo que as plantas permaneceram vegetativas em fotoperíodos
acima de 13 horas e abaixo de 11 horas, e floresceram em um fotoperíodo entre 11 e 13 horas,
o que sugere um comportamento de Plantas de Dias Intermediários (PDI). Essa afirmação é
questionável, pois MAGALHÃES et al. (1997) relatam que seus experimentos foram
conduzidos em campo no município de Campinas-SP (lat. 22
0
48’S), onde o menor fotoperíodo
é observado no solstício de inverno, e não é inferior 10,6 horas. Para afirmar que as plantas do
acesso CPQBA 2/39x1V não florescem abaixo de 11 horas, os autores deveriam ter elaborado
0 100 200 300
0
2
8
10
12
14
16
FL 5ª época
01/04/01
FL 1ª época
06/03/01
FI 13,07h
07/02/01
TP 5ª época
05/03/01
Dias Julianos
Fotoperíodo (horas)
Cálculo CF e FI
CF = dias entre TP 5ª época e FL 5ª época
CF = 28 dias
FI = data FL 1ª época - CF
FI = 13,07h (fotoperíodo em 07/02/01)
0 100 200 300
0
2
8
10
12
14
16
FL 5ª época
01/04/01
FL 1ª época
06/03/01
FI 13,07h
07/02/01
TP 5ª época
05/03/01
Dias Julianos
Fotoperíodo (horas)
Cálculo CF e FI
CF = dias entre TP 5ª época e FL 5ª época
CF = 28 dias
FI = data FL 1ª época - CF
FI = 13,07h (fotoperíodo em 07/02/01)
50
um experimento com câmaras fotoperiódicas, nos moldes dos apresentados nesta tese,
testando o acesso em fotoperíodos menores do que 11 horas.
Tabela 5. Datas de plantio, transplante e florescimento do acesso 2/39x1V de A. annua em
Pato Branco-PR, Brasil (26
0
07’S e 52
0
41’W – 760 m alt.).
Data 1ª época 2ª época 3ª época 4ª época 5ª época 6ª época
08/2000
P 18 --- --- --- --- ---
09/2000
T 23 --- --- --- --- ---
10/2000
--- P 21 --- --- --- ---
11/2000
--- T 20 P 25 --- --- ---
12/2000
--- --- --- P 15 --- ---
01/2001
--- --- T 16 --- P 20 ---
02/2001
--- --- --- T 07 --- ---
03/2001
F 06 F 10 F 19 F 19 T 05 ---
04/2001
--- --- --- --- F 01 ---
05/2001
--- --- --- --- --- P 15
06/2001
--- --- --- --- --- ---
07/2001
--- --- --- --- --- T 10
08/2001
--- --- --- --- --- F 09
P = data de plantio das estacas; T = data do transplante para o campo; F = data em que 50%
das plantas iniciaram o florescimento, também a data da colheita.
Porém, dos resultados encontrados por MAGALHÃES et al. (1997),
chama atenção o fato de que as plantas foram transplantadas para o campo em abril de 1996,
durante o fotoperíodo indutivo, e permaneceram vegetativas até o aparecimento dos botões
florais em 06/12/96, momento da colheita. O atraso no florescimento encontrado por
MAGALHÃES et al. (1997) para o acesso CPQBA 2/39x1V, provavelmente, é uma resposta
às temperaturas mais elevadas que ocorrem no período outono no clima intertropical de
Campinas-SP, em comparação com as temperaturas no mesmo período observadas em Pato
51
Branco-PR (Figura 21). Na Tabela 5, verifica-se que não houve atraso no florescimento para
5ª e 6ª épocas em Pato Branco, cujos transplantes foram feitos sob fotoperíodo indutivo no
outono. Os resultados dos experimentos em campo de Campinas-SP (MAGALHÃES et al.,
1997) e Pato Branco-PR, suportam os resultados encontrados nos estudos com câmaras
fotoperiódicas sobre a necessidade de baixas temperaturas para acelerar o florescimento do
acesso CPQBA 2/39x1V (Tabela 4).
Meses
JFMAMJJASOND
Temperaturas média (
0
C)
12
14
16
18
20
22
24
26
Campinas-SP
Pato Branco-PR
Figura 21. Médias das temperaturas médias mensais em Campinas-SP (22
0
47’S e 47
0
06’W –
606m alt.) e Pato Branco-PR (26
0
07’S e 52
0
41’W – 760m alt.). Fonte: IAPAR, 1994;
CIIAGRO/IAC, 2005.
A informação de que o FI para o acesso CPQBA 2/39x1V em Pato
Branco-PR ocorre na primeira quinzena de janeiro e o florescimento e colheita em março
(Tabela 5), permite inferir sobre época ideal de plantio deste material. Uma vez que o maior
52
acúmulo da artemisinina ocorre nas fases de pré-floração ou floração (Figura 18) e que
aproximadamente 90% da artemisinina total da planta está nas folhas, deve-se escolher uma
data de plantio o mais distante possível do período indutível ao florescimento, para que as
plantas possam vegetar ao máximo, e acumular biomassa foliar e artemisinina. Devido à
espécie ser de hábito determinado, após o florescimento há uma rápida senescência e
decrécimo do teor de artemisinina, devendo-se colher as plantas logo no início do
florescimento (Figura 18).
Com relação ao rendimento de massa seca de folhas, caules, folhas +
caules e produção de artemisinina para o acesso CPQBA 2/39x1V, a época de plantio que
alcançou significativamente os maiores rendimentos foi a 1ª época (Tabela 6 e Figura 22),
devido ao maior tempo de permanência das plantas no campo antes do florescimento, 165 dias
do transplante até a colheita, 23/09/2000 à 06/03/2001, respectivamente. As plantas que foram
transplantadas em 20/11/00, 16/01/01 e 07/02/01, respectivamente 2ª, 3ª e 4ª épocas, acabaram
florescendo em março (final do verão), junto com as da 1ª época, e consequentemente
permaneceram menos tempo vegetando no campo e apresentaram rendimentos de fitomassa e
artemisinina menores. Já, as plantas das 5ª e 6ª épocas ficaram de 4 a 5 semanas sob
fotoperíodo indutivo no campo, floresceram rapidamente, e apresentaram os menores
rendimentos de todo o experimento (Tabela 6 e Figura 22).
Estes resultados determinam que o transplante de mudas para o campo
deve ser feito prioritariamente no último decêndio de setembro ou no início de outubro
(começo da primavera), para alcançar um maior rendimento de massa seca de folhas e
artemisinina. Não recomenda-se o plantio nos dois primeiros decêndios de setembro devido ao
fato de estarem ocorrendo geadas extemporâneas na região de Pato Branco-PR (Tabela 1).
Plantas da 6ª época, transplantadas em 10/07/01 e colhidas em 09/08/01, apresentaram
sintomas de queima devido às geadas ocorridas no período (Tabela 1).
LAUGHLIN (1993) realizou experimento similar na Tasmania,
Australia (Latitude 42
0
S), usando um acesso iugoslavo, e encontrou resultados muito similares
aos de Pato Branco, compararando transplantes na primavera, 28/10 e 28/11, com transplante
no verão, 21/12. Todas as épocas de plantio floresceram em março de 1989 (outono), e a
maior produção de fitomassa e artemisinina foi encontrada no transplante de outubro. Em
experimento realizado em Campinas-SP (Latitude 23
0
S) no período 2000/2001,
53
MAGALHÃES et al. (2004) encontraram resultado semelhantes aos do Paraná para época de
colheita, com as plantas sendo colhidas em março (início do outono).
Tabela 6. Efeito de diferentes épocas de transplante na produção de artemisinina, rendimento
da fitomassa seca e razão folha/caule no acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua .
---
2
Artemisinina ---
2
MS folhas
2
MS caules
2
MS total
Épocas de
transplante
1
DAT
% MS --------------------------- Kg ha
-1
--------------------------
2
Razão
Folha/caule
23/09/00
165 0,99 A 30,38 A 3.045,1 A 14.974,9 A 18.020,0 A 0,21 B
20/11/00
111 1,05 A 17,20 B 1.643,9 B 5.383,2 B 7.027,1 B 0,32 B
16/01/01
63 0,81 B 4,55 C 561,3 C 864,8 C 1.426,1 C 0,67 B
07/02/01
41 0,53 C 0,87 C 161,5 C 186,9 C 348,4 C 0,87 B
05/03/01
28 0,55 C 0,10 C 20,9 C 14,6 C 35,6 C 1,46 A
10/07/01
31 0,50 C 0,22 C 39,6 C 32,1 C 71,7 C 1,35 A
1
DAT = dias após o transplante; ** Valores seguidos da mesma letra maiúscula na coluna não
diferem significativamente entre si pelo teste de Bonferroni a 5%.
Alguns experimentos conduzidos no hemisfério Norte, também
apresentaram resultados similares aos de Pato Branco. Em um dos primeiros experimentos
agronômicos de A. annua reportados, realizado na Bulgária entre 1975 e 1978, GALAMBOZI
(1980) recomenda o plantio da espécie no final de março e início de abril, primavera no
hemisfério Norte. HAIDER et al. (2004) em experimento conduzido em Lucknow, India
(Latitude 26,5
0
N), em 2001, relatam o início do florescimento para 5 diferentes épocas de
plantio em 12 de outubro (início do outono), enquanto KUMAR et al. (2004) conduzindo
experimento no mesmo local em 2001, com a cultivar Jeevan-raksha, relata o florescimento
das plantas no final de agosto. Baseando-se nos resultados reportados nos experimentos com
A. annua em ambos os hemisférios, pode-se generalizar que a estação ideal de plantio é a
primavera, e que a colheita durante florescimento deve ocorrer no outono. A Figura 23 é uma
síntese destas informações.
54
20 40 60 80 100 120 140 160 180
MS total
(kg ha
-1
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
Dias após o transplante - DAT
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Razão
folha/talo
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Artemisinina
(% na MS)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
20 40 60 80 100 120 140 160 180
MS de folhas
(kg ha
-1
)
-1000
0
1000
2000
3000
4000
y = 1.3292x - 42.526
R
2
= 0.9607
p < 0.0001
y = 0.0001x2 - 0.0276x + 2.0416
R
2
= 0,8739
p < 0.0001
y = -5E-05x2 + 0.014x + 0.1297
R
2
= 0.9193
p < 0.0001
y = 0.0497x2 - 3.0523x + 49.059
R
2
= 0.9436
p < 0.0001
20 40 60 80 100 120 140 160 180
MS de talos
(kg ha
-1
)
-5000
0
5000
10000
15000
20000
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Artemisinina
(kg ha
-1
)
-10
0
10
20
30
40
y = 0.8283x2 - 50.871x + 817.64
R
2
= 0.9436
p < 0.0001
y = 0.2262x - 7.6664
R
2
= 0.9604
p < 0.0001
Figura 22. Rendimento da fitomassa seca e artemisinina, razão folha/caule e teor de
artemisinina do acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua em função de diferentes datas de
plantio: 23/09/2000 (165 DAT) ; 20/11/2000 (111 DAT); 16/01/2001 (63 DAT); 07/02/2001
(41 DAT); 05/03/2001 (28 DAT); 10/07/2001 (31 DAT).
55
Figura 23. Épocas de plantio (primavera) e colheita (outono) em função do fotoperíodo anual
em diferentes locais de cultivo de A. annua nos hemisférios Sul (5
0
S = Teresina-PI; 22
0
S =
Campinas-SP; 26
0
S = Pato Branco-PR; 43
0
S = Tasmania, Australia) e Norte (47
0
N = Bulgária;
40
0
N = West Lafayette, IN, EUA e 26
0
N = Lucknow, India). Fonte: GALAMBOZI (1980);
LAUGHLIN (1993); MAGALHÃES et al. (2004); HAIDER et al. (2004); KUMAR et al.
(2004); FERREIRA et al. (2005).
As plantas da 1ª época, que passaram mais tempo vegetando no campo
(165 dias), apresentaram uma razão folha/caule menor (0,21) devido ao aumento no peso do
caule, em face da lignificação dos tecidos de sustentação (Tabela 6 e Figura 22).
MAGALHÃES et al. (1999) encontraram em Campinas-SP, uma razão folha/caule de 0,20 em
plantas do acesso CPQBA 2/39x1V, que permaneceram 163 dias no campo, praticamente
igual aquela encontrada no experimento em Pato Branco-PR. Esses valores sugerem um
padrão genético para essa característica, sem efeito do ambiente. A razão folha/caule é um
característica importante no processamento industrial de A. annua, uma vez que o caule
jan feb mar apr may jun jul aug sep oct nov dec
8
10
12
14
16
26
0
S
26
0
N
05
0
S
40
0
N
47
0
N
43
0
S
22
0
S
PRIMAVERA
hemisfério Norte
PRIMAVERA
hemisfério Sul
OUTONO
hemisfério Sul
OUTONO
hemisfério Norte
P
L
A
N
T
I
O
P
L
A
N
T
I
O
C
O
L
H
E
I
T
A
C
O
L
H
E
I
T
A
Meses
Fotoperíodo (h)
jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez
jan feb mar apr may jun jul aug sep oct nov dec
8
10
12
14
16
26
0
S
26
0
N
05
0
S
40
0
N
47
0
N
43
0
S
22
0
S
PRIMAVERA
hemisfério Norte
PRIMAVERA
hemisfério Sul
OUTONO
hemisfério Sul
OUTONO
hemisfério Norte
P
L
A
N
T
I
O
P
L
A
N
T
I
O
C
O
L
H
E
I
T
A
C
O
L
H
E
I
T
A
Meses
Fotoperíodo (h)
jan feb mar apr may jun jul aug sep oct nov dec
8
10
12
14
16
26
0
S
26
0
N
05
0
S
40
0
N
47
0
N
43
0
S
22
0
S
PRIMAVERA
hemisfério Norte
PRIMAVERA
hemisfério Sul
OUTONO
hemisfério Sul
OUTONO
hemisfério Norte
P
L
A
N
T
I
O
P
L
A
N
T
I
O
C
O
L
H
E
I
T
A
C
O
L
H
E
I
T
A
Meses
Fotoperíodo (h)
jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez
56
contém ceras que dificultam o isolamento e a purificação da artemisinina. Quanto maior a
razão, menor é a quantidade de caules, facilitando a extração da artemisinina e precursores.
KUMAR et al. (2004) relata para a cv. Jeevan-raksha razões folha/caule de 0,61 e 0,51, para
155 e 180 dias após o transplante, respectivamente. Esta é uma importante característica a ser
observada num programa de melhoramento de A. annua.
Com relação ao teor de artemisinina na massa seca de folhas para as
diferentes épocas de plantio, a 1ª e a 2ª épocas foram significativamente superiores às outras
(Tabela 6 e Figura 22), comprovando ser o teor de artemisinina função da ontogenia. Essa
informação já é corrente na lieratura (MORALES et al., 1993; FERREIRA et al., 2005).
Embora não tenha sido planejado um ensaio nacional para A. annua, o
acesso CPQBA 2/39x1V foi cultivado durante anos em Campinas-SP, e os resultados podem
ser comparados com Pato Branco-PR, embora os anos agrícolas tenham sido diferentes.
Conforme pode-se observar na Tabela 7, há uma superioridade de 32%
no rendimento de massa seca de folhas em Pato Branco (26
0
07’S) quando comparado com
Campinas (22
0
47’S), o que representa um incremento de quase 1 ton ha
-1
. A diferença se
mantém próxima a 30% se compararmos o rendimento de artemisinina de 30,38 kg ha
-1
em
Pato Branco contra 21,38 kg ha
-1
em Campinas. O ciclo das plantas foi praticamente o mesmo,
165 dias para Pato Branco e 163 dias para Campinas.
Tabela 7. Comparação dos dados de rendimento de fitomassa e artemisinina obtidos em Pato
Branco-PR (26
0
07’S e 52
0
41’W – 760m alt.) e Campinas-SP (22
0
47’S e 47
0
06’W – 606m alt.)
para o acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua .
Localidade
1
DAT
Ano
agrícola
MS folha
(kg ha
-1
)
%
artemisinina
Artemisinina
(kg ha
-1
)
Pato Branco-PR
165 2000/2001 3.045,10 0,99 30,38
2
Campinas-SP 163 1996/1997 2.056,05 1,04 21,38
1
DAT = dias após o transplante;
2
MAGALHÃES et al. (1999).
57
A resposta para esta diferença de rendimento em um mesmo acesso de
A. annua, reside, possivelmente, na fisiologia da espécie e nas diferenças de temperatura entre
as localidades em questão. Conforme descrito no ítem 7.1, A. annua é uma espécie com
metabolismo fotossintético tipo C
3
. Em geral, as espécies C
3
adaptam-se melhor em climas
mais amenos, e isso ocorre porque em altas temperaturas as reações de oxigenação da enzima
RUBISCO aumentam proporcionalmente as reações de carboxilação, devido ao decrécimo da
solubilidade do CO
2
e um efeito na cinética da enzima (ex., K
m
e V
máx
). Esse fenômeno
fisiológico é denominado fotorespiração, cujo efeito na assimilação líquida de carbono é
desprezível nas plantas C
4
, mas muito importante nas plantas C
3
, quando estas são cultivadas
em localidades de menores latitudes e altitudes, com elevada temperatura. No processo
fotorespiratório a enzima RUBISCO atua como oxigenase, acoplando em seu sítio ativo uma
molécula de O
2
, ao invés de CO
2
, e nas subsequentes reações ocorre a perda líquida de um
CO
2
. Isso quer dizer que aumentos significativos na fotorrespiração diminuem a assimilação
de CO
2
nas plantas C
3
, com consequente perda de rendimento em fitomassa (LOOMIS &
CONNOR, 1992; RUDALL, 1994; HALL & RAO, 1995; KÖRNER & BAZZAZ, 1996;
LAMBERS et al., 1998; LAWLOR, 2001).
As temperaturas médias mensais maiores que ocorrem em Campinas-
SP (Figura 21), provocam um aumento da fotorrespiração no acesso 2/39x1V e possivelmente
são responsáveis pela diferença de rendimento de biomassa, e consequentemente de
artemisinina, observado em favor de Pato Branco-PR (Tabela 7). MARCHESE & REHDER
(2001) conduzindo experimentos em câmara de crescimento observaram um aumento de
fitomassa para o acesso 2/39x1V na amplitude térmica de 11/20ºC (noite/dia) comparada com
18/28ºC, sugerindo que temperaturas menores afetam positivamente a produção de A. annua.
O maior rendimento de artemisinina observado em Pato Branco parece
estar mais associado aos ganhos em biomassa foliar do que ao teor de artemisinina nas folhas,
que foi similar em ambas as localidades, aproximadamente 1% (Tabela 7).
FERREIRA et al. (2005) sugere que baixas temperaturas aumentam o
teor de artemisinina nas folhas. FERREIRA (1994) encontrou diferenças no teor de
artemisinina em plantas cultivadas em épocas distintas, atribuindo a variação ao efeito da
temperatura, sugerindo que altas temperaturas reduzem o teor de artemisinina em A. annua.
Todavia, MARCHESE & REHDER (2001) conduzindo experimentos em câmara de
58
crescimento observaram que o teor de artemisinina para o acesso 2/39x1V de A. annua
apresentou maior teor de artemisinina na amplitude térmica de 18/28ºC (noite/dia) do que o
tratamento 11/20ºC, sugerindo que temperaturas maiores induzem um aumento no teor de
artemisinina nas folhas. Estes resultados estão de acordo com os encontrados por CHEN &
ZHANG (1987), onde plantas de A. annua submetidas à temperatura de 30 ± 0,5ºC,
apresentaram um aumento significativo no teor de artemisinina em relação às temperaturas de
25 ± 1ºC ou 28 ± 0,5ºC.
MAGALHÃES (1996) em experimento comparando diferentes
acessos, realizado em câmara de crescimento, observou que temperaturas entre 22ºC e 26ºC
induziram um teor de artemisinina maior que temperaturas entre 25ºC e 31ºC. Todavia, o mais
importante a se considerar é o relato de que este comportamento não foi padrão para todos os
acessos testados. Além do mais, o decréscimo nos teores de artemisinina, em conseqüência da
maior temperatura ambiente foi compensado por aumento da biomassa foliar, resultando em
rendimentos de artemisinina por planta, semelhantes, nas duas faixas de temperatura.
Tais divergências levam a concluir que o comportamento desta espécie
em relação à influência da temperatura no teor de artemisinina na fitomassa não é padrão,
sendo variável para diferentes genótipos, e que o rendimento de artemisinina (kg ha
-1
)
realmente parece estar mais associado aos ganhos em biomassa foliar do que ao teor de
artemisinina nas folhas.
A maior produtividade de A. annua em temperaturas amenas não
inviabiliza o cultivo da espécie nas latitudes menores dos trópicos, região onde ocorre o maior
número de casos de malária, e sugere-se para tal que o cultivo seja fomentado em locais de
grande altitude, com temperaturas menores.
59
8 CONCLUSÕES
Os resultados da composição isotópica do carbono (δ
13
C = -31,76 ±
0,07‰) e a ausência de cloroplastos e grãos amido nas células parenquimáticas envolvendo o
tecido vascular das folhas confirmam que A. annua possui um mecanismo fotossintético do
tipo C
3
.
A aplicação exógena de artemisinina não induziu as plantas de A.
annua ao florescimento e esse resultado sugere que a molécula de artemisinina não está
diretamente relacionada com a indução floral na espécie.
Nos experimentos em câmara fotoperiódica, uma das principais
observações verificadas em ambos os experimentos conduzidos com o acesso CPQBA
2/39x1V foi uma interação entre fotoperíodo e temperatura na indução ao florescimento das
plantas testadas, onde as temperaturas menores ocorridas no experimento outono, máximo de
29ºC e mínimimo de 13ºC, induziram maior florescimento nas plantas dos tratamentos com
dias curtos, em detrimento daquelas submetidas as temperaturas maiores no experimento
primavera/verão, com máximo de 37ºC e mínimo de19ºC.
Considerando-se todos os tratamentos com dias curtos e ambas as
épocas em que os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, o número médio de
ciclos fotoindutivos necessários para o acesso CPQBA 2/39x1V florescer foi de
60
aproximadamente 32 ciclos. O fotoperíodo indutivo em casa de vegetação foi encontrado no
intervalo dos tratamentos 11 e 13 horas.
Pode-se afirmar que os clones do acesso CPQBA 2/39x1V
apresentaram um comportamento fotoperiódico de Planta de Dias Curtos qualitativa ou
absoluta com requerimento de baixas temperaturas para ter seu florescimento acelerado.
No experimento em campo, o número de ciclos fotoindutivos
encontrado para o acesso CPQBA 2/39x1V de A. annua foi de aproximadamente 28 ciclos ou
4 semanas e o fotoperíodo indutivo aproximado foi de 13,07 horas, que ocorreu na data de
07/02/2001 em Pato Branco-PR.
A época de plantio que alcançou significativamente os maiores
rendimentos de fitomassa e artemisinina foi a 1ª época, devido ao maior tempo de
permanência das plantas no campo antes do florescimento, 165 dias do transplante até a
colheita, 23/09/2000 a 06/03/2001. Estes resultados determinaram que o transplante de mudas
para o campo em Pato Branco-PR, deve ser feito prioritariamente no último decêndio de
setembro ou no início de outubro - começo da primavera - para se alcançar um maior
rendimento de massa seca de folhas e artemisinina. Não recomenda-se o plantio nos dois
primeiros decêndios de setembro devido ao fato de estarem ocorrendo geadas extemporâneas
na região sudoeste do Paraná.
Os rendimentos de fitomassa e artemisinina encontrados em Pato
Branco-PR foram superiores aqueles encontrados para o mesmo acesso 2/39x1V por
MAGALHÃES et al. (1999) em Campinas-SP. O teor de artemisinina na biomassa foliar do
acesso não variou nos dois locais de cultivo, sugerindo que o rendimento de artemisinina (kg
ha
-1
) está mais associado aos ganhos em biomassa foliar provocados pelas temperaturas mais
amenas no sudoeste do Paraná.
61
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