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Ronaldo de Jesus Costa
Avaliação in vitro do potencial mutagênico de Bidens
pilosa Liné (picão – preto) e de Mikania glomerata
Sprengel (guaco) por meio de ensaio do cometa e teste
de micronúcleo
Londrina
2006
Instituto Agronômico do Paraná
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Universidade Estadual de Londrina
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Ronaldo de Jesus Costa
Avaliação in vitro do potencial mutagênico de Bidens
pilosa Liné (picão – preto) e de Mikania glomerata
Sprengel (guaco) por meio de ensaio do cometa e teste
de micronúcleo
Orientadora: Profª. Drª. Berenice Quinzani Jordão
Londrina
2006
Dissertação apresentada ao curso
de Pós-graduação em Genética e
Biologia Molecular, da
Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial
para obtenção de título de Mestre.
Agradecimentos
Agradeço à minha orientadora Profa. Dra. Berenice Quinzani
Jordão, pela oportunidade oferecida.
Ao Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani pelas aulas, atenção
prestada e auxílio durante a pesquisa, e à Prof.ª Doutoranda Andréia
Diniz, pela colaboração e pelo trabalho em conjunto.
Ao Programa de Mestrado em Genética e Biologia Molecular da
Universidade Estadual de Londrina pelas condições necessárias ao
desenvolvimento do trabalho; aos professores do Programa pelos
ensinamentos fornecidos, bem como aos membros da banca, Profa.
Dra. Ilce Mara e Dra. Verônica, pela colaboração prestada.
Aos técnicos de laboratório Dário e Mellissa e à secretária
Sueli, pela ajuda e orientação prestadas.
Aos colegas de laboratório, pela colaboração, em particular aos
colegas José Pedro Angeli, Marilanda Bellini e Rodrigo Juliano de
Oliveira pelos importantes socorros nos momentos de dúvidas.
À CAPES, pelo financiamento deste trabalho.
Aos colegas da farmácia, Sr. Valdinei, Sr. Carlos Roberto e à
gerente Irene Taque, pela compreensão nos freqüentes atrasos e nos
dias de sair um pouco mais cedo.
Agradeço, de forma especial, àqueles que contribuíram de
forma diferencial para minha formação como pessoa:
- ao Prof. Dr. Paulo Roberto Haidamus de Oliveira Bastos e Prof.
Flávio Dantas da UFMS, pelo companheirismo e orientação na busca
pela essência da profissão farmacêutica; e
- ao Sensei Rubens de Almeida, pelo exemplo de força de vontade.
Agradeço muito aos meus irmãos Ricardo e Rafael, que
sempre deram apoio, a minha irmã Rosana, por sempre atender aos
prazos expirados para envio de documentos, e agradeço
principalmente a meus pais, Batista e Venina por terem se
tornado uma motivação constante para sempre continuar o
caminho.
COSTA, Ronaldo J. Avaliação in vitro do potencial mutagênico de
Bidens pilosa Liné (picão-preto) e de Mikania glomerata Sprengel
(guaco), por meio de ensaio do cometa e teste de micronúcleo. 2006.
94p. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) -
Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR.
RESUMO
O consumo de Bidens pilosa Liné (picão-preto) e de Mikania
glomerata Sprengel (guaco) na forma de chás ocorre com freqüência
na sociedade, principalmente em casos de icterícia e de afecções de
vias aéreas superiores, respectivamente. Para verificar a possível
capacidade destas duas plantas de induzir danos ao DNA, foram
utilizados o ensaio do cometa (SCGE) e o teste de micronúcleo (MN)
em células metabolizadoras de hepatoma de Ratus norvergicus
(HTC), testando-se chás preparados na forma de infuso tanto para
guaco (IM) quanto para picão-preto (IB). Testou-se também macerado
de folhas de guaco em etanol 80% (MM80) e decocto de picão-preto
(DB). Para a escolha das concentrações a serem testadas,
considerou-se a dose de ingestão diária recomendada (IDR) para
cada planta. As doses utilizadas de todas as soluções teste
basearam-se em valores de 50, 100 e 200% da IDR. Também foi
usada a dose de 400% da IDR no caso de MM80, para comparação
de resultados. A quantificação de cumarina em IM e MM80 foi
realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – UV - CLAE-
UV. Os dados obtidos pelo teste do cometa demonstraram que ambas
as plantas causaram genotoxicidade, na maioria dos tratamentos. Das
soluções testadas em MN, somente IM40 (200% da IDR) induziu
mutagenicidade. Os resultados indicaram danos ao DNA mais
acentuados para as doses mais altas. Os resultados com o ensaio do
cometa também sugerem diferença significativa na composição
química entre as duas formas extrativas de guaco, diferença esta
confirmada pela cromatografia. Contudo, os efeitos apresentados por
IM e MM80 demonstraram não ter relação direta com a quantidade de
cumarina. No caso do picão-preto, o decocto apresentou
genotoxicidade menor do que a infusão, sugerindo também distinção
na composição química das duas formas de chás desta planta,
provavelmente causada pelo tempo prolongado de exposição à alta
temperatura, durante o processo de decocção. As informações
obtidas demonstraram que, mesmo possuindo diversas propriedades
terapêuticas, tanto M. glomerata quanto B. pilosa não estão isentas de
induzir efeitos adversos sobre o DNA, o que alerta para a necessidade
de cuidados na utilização destas plantas como fitoterápicos. A relação
dose utilizada/efeito observado sugere, por sua vez, que a ingestão de
grandes quantidades de chás destas plantas pode tornar-se
prejudicial ao material genético. A forma de preparo do fitoterápico
também tem importância para este efeito. Assim, estudos adicionais
se fazem necessários a fim de esclarecer sobre quais as condições de
uso que oferecem a melhor relação benefício X risco à saúde da
população.
Palavras-chave: mutagenicidade, Célula HTC, Mikania glomerata,
Bidens pilosa, ensaio do cometa, micronúcleo.
Evaluation in vitro of the mutagenic potential of Bidens pilosa Liné
(“picão-preto”) and of Mikania glomerata Sprengel (“guaco”), by means
of comet assay and micronucleus test. 2006. 94p. (Master Work in
Genetics and Molecular Biology) - State University of Londrina-PR.
ABSTRACT
The consumption of Bidens pilosa Liné (“picão-preto”) and of
Mikania glomerata Sprengel (“guaco”) in the form of teas occurs with
frequency in the society, mainly in cases of jaundice and affections of
superior respiratory ways, respectively. To verify the potential capacity
of these two plants to induce damages to the DNA, the assay of the
comet (SCGE) and the test of micronucleus (MN) had been used in
hepatic metabolizing cells of Ratus norvergicus (HTC), testing teas
prepared in the form of infusion of Mikania glomerata (IM) and Bidens
pilosa (IB). It was also tested macerated of leaves of Mikania
glomerata in ethanol 80% (MM80) and decoction of Bidens pilosa
(DB). For the choice of the concentrations to be tested, it was
considered the recommended daily ingestion dose (IDR) for each
plant. The doses used of all the solutions test had been based on
values of 50, 100 e 200% of the IDR. Also the dose of 400% of the
IDR, in the MM80 case, was used for comparison of results. The
coumarin quantification in IM and MM80 was carried through High
Efficiency Liquid Chromatography - UV - CLAE-UV. The data obtained
for the test of the comet had demonstrated that both the plants had
caused genotoxicity, in the majority of the treatments. Over all
solutions tested in MN, only IM40 (200% of the IDR) induced
mutagenicity. The results indicated damages to the DNA more
accented for the highest doses. The results with the comet assay also
suggest significant difference in the chemical composition between the
two extractive forms of Mikania glomerata, difference this confirmed by
the chromatography. However, the effects presented by IM and MM80
demonstrated not to have direct relation with the amount of coumarin.
In the case of Bidens pilosa, decoction presented lesser genotoxicity
of that the infusion, also suggesting distinction in the chemical
composition of both forms of teas of this plant, probably caused for the
long time of exposition to high temperature during the decoction
process. The gotten information demonstrate that, still that possessing
diverse therapeutical properties, as much M. glomerata how much B.
pilosa can be to induce adverse effects on the DNA, what alert for the
necessity of cares in the use of these plants as phytoterapic agents.
The relation used dose / observed effect suggests, in turn, that the
ingestion of great amounts of teas of these plants can become harmful
to the genetic material. The form of preparation of them also is
important for this effect. Thus, supplementary studies are necessary in
order to clarify on which conditions of use these plants could offer the
best relation benefit X risk to the population health.
Key words: mutagenicity, HTC cells, Mikania glomerata, Bidens pilosa,
comet assay, micronucleous.
Relação de figuras
1 Introdução
1.1 Figura 01 - Classes de cometa em núcleos de células HTC
corados com brometo de etídio (2μg/mL). Aumento de
1000X..................................................................................................10
1.2 Figura 02 – Representação esquemática de formação de
micronúcleo. Células binucleadas coradas com corante de Rosenfeld
em aumento de 400X..........................................................................15
1.3 Figura 03 – Bidens pilosa Liné (foto obtida de
www.plantamed.com.br). ....................................................................17
1.4 Figura 04 – Figura 04 - Estrutura química da quercetina (U.S.
department of health and human services, 1992)...................…........17
1.5 Figura 05 - Folhas de Mikania glomerata Sprengel (foto extraída
de www.plantamed.com.br) ................................................................20
1.6 Figura 06 – Estrutura química da cumarina (US department of
health and human service, 1993)…………………………………….….21
2 Artigo
2.1 Figura 1 - Freqüência média de células HTC com cometa obtida
nos controles: tampão fosfato (PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e
etanol 80% (EtOH 80) e nos tratamentos: infuso de M.glomerata (IM),
macerado de M. glomerata em etanol 80% (MM80), infuso de B.
pilosa (IB) e decocto de B. pilosa (DB), em diferentes
concentrações.....................................................................................53
2.2 Figura 2 - Número médio de células HTC com cometa e
respectivos escores médios obtidos nos controles: tampão fosfato
(PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e etanol 80% (EtOH80) e nos
tratamentos: infuso de M. glomerata (IM), macerado de M. glomerata
em etanol 80% (MM80), infuso de B. pilosa (IB) e decocto de B. pilosa
(DB), em diferentes concentrações.....................................................54
2.3 Figura 3 – Escores médios obtidos nos controles: tampão fosfato
(PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e etanol 80% (EtOH 80) e nos
tratamentos: infuso de M.glomerata (IM), macerado de M. glomerata
em etanol 80% (MM80), infuso de B. pilosa (IB) e decocto de B. pilosa
(DB), em diferentes concentrações.....................................................55
2.4 Figura 4 - Número médio de células HTC com MN obtido nos
controles: tampão fosfato (PBS), metilmetanosulfonato (MMS), etanol
80% (EtOH 80) e nos tratamentos: infuso de M.glomerata (IM),
macerado de M. glomerata em etanol 80% (MM80), infuso de B.
pilosa (IB) e decocto de B. pilosa (DB), em diferentes
concentrações.....................................................................................55
2.5 Figura 5 – Comparação entre as médias dos resultados obtidos no
teste do cometa e no teste do micronúcleo para os controles: tampão
fosfato (PBS) e metilmetanosulfonato (MMS) - e tratamentos: infuso
de M. glomerata (IM), macerado de M. glomerata em etanol 80%
(MM80), infuso de B. pilosa (IB) e decocto de B. pilosa (DB),
aplicados em diferentes concentrações..............................................56
2.6 Figura 6 - Cromatogramas de infuso de M. glomerata (IM) e
macerado de M. glomerata em etanol a 80% (MM80) obtidos por
cromatografia líquida de alta eficiência - UV (CLAE - UV)..................57
Relação de tabelas
1 Introdução
1.1 TABELA I. Componentes isolados de extratos de Bidens pilosa
(LASTRA VALDES, 2001)...................................................................19
2 Artigo
2.1 Tabela I – Médias de células com cometa e de células com
micronúcleo obtidas nos tratamentos-controles e nos tratamentos com
infuso e macerado etanólico de Mikania glomerata Sprengel e infuso e
decocto de Bidens pilosa Liné, em células HTC.................................51
2.2 Tabela II – Concentração final de cumarina presente nas soluções
usadas nos tratamentos in vitro com infuso e macerado em etanol
80% de Mikania glomerata Sprengel..................................................52
Sumário
1 – Introdução....................................................................................01
1.1 – Mutagenicidade....................................................................04
1.2 – Teste do Cometa..................................................................07
1.3 – Teste do Micronúcleo .........................................................11
1.4 – Plantas utilizadas
1.4.1 - Picão Preto (Bidens pilosa Liné).................................16
1.4.2 – Guaco (Mikania glomerata Sprengel).........................20
1.4.3 – Preparação dos extratos testados
1.4.3.1 – Infusão..............................................................22
1.4.3.2 – Decocção..........................................................23
1.4.3.3 – Maceração........................................................24
1.4.4 – Quantificação de cumarina.........................................25
2 – Justificativa..................................................................................26
3 – Objetivos
3.1 – Gerais..............................................................................28
3.2 – Específicos.....................................................................29
4 – Artigo............................................................................................30
4.1 – Resumo.................................................................................31
4.2 – Abstract................................................................................33
4.3 – Introdução............................................................................35
4.4 – Materiais e métodos
4.4.1 – Cultura celular..............................................................38
4.4.2 – Extratos testados.........................................................39
4.4.3 – Quantificação de cumarina.........................................41
4.4.4 – Teste do cometa...........................................................42
4.4.5 – Teste do micronúcleo (MN).........................................45
4.4.6 – Análise estatística........................................................46
4.4.7 – Resultados....................................................................47
4.4.7 – Discussão.....................................................................58
4.4.8 – Considerações finais...................................................66
4.4.9 – Referências bibliográficas...........................................67
5 - Referências bibliográficas..........................................................72
Introdução
Sabemos que o homem é exposto constantemente a agentes
químicos através de alimentos e medicamentos, incluindo aqueles
usados em medicina popular (OLIVEIRA et al., 2002).
A utilização de determinadas plantas no combate a doenças é
um costume comum em nossa sociedade. Essa medicina alternativa,
sobretudo no Brasil, é utilizada em larga escala, até porque essa
prática remonta a períodos pré-descobrimento, onde os índios,
grandes detentores do conhecimento do poder de cura pela natureza,
faziam da floresta sua farmácia.
Além disso, há uma mescla com o conhecimento e plantas
trazidos pelos colonizadores, tanto que, segundo Corrêa Junior et al.
(1994) e Martins et al. (1995), a maior parte das espécies medicinais
cultivadas no Brasil é de espécies exóticas, heliófitas e domesticadas
em seus ecossistemas naturais.
O Brasil conta com a maior diversidade genética vegetal do
mundo, com um total estimado entre 350.000 e 550.000 espécies, das
quais apenas 55.000 estão catalogadas (SIMÕES et al., 2001).
Sabendo-se que cada espécie desconhecida pode vir a ser um
medicamento importante (e conseqüentemente um produto lucrativo)
não é nenhuma surpresa que o interesse de empresas farmacêuticas
esteja voltado para essa área. Segundo Farias et al. (1994), várias
empresas nacionais vêm empregando matéria-prima vegetal
diretamente na elaboração de seus medicamentos.
Contudo, na utilização popular, seja como fitoterapia, seja na
dieta, na maioria das vezes não se tem avaliação apropriada dessas
plantas, comprovando a eficácia no tratamento ou possíveis efeitos
adversos causados por elas (SILVEIRA E SÁ et al., 2003).
Desse ponto de vista, o estudo das plantas mais utilizadas pela
população se faz de extrema importância para o tratamento ou
mesmo prevenção de inúmeras doenças.
Dentre todas as possíveis patologias, um dos grandes focos da
sociedade científica está na busca por substâncias que possam
auxiliar no tratamento ou diminuir os riscos de desenvolver
neoplasias, um dos grandes males da sociedade moderna.
O descobrimento de produtos naturais que possam reduzir a
taxa de mutações fatalmente diminuiria a incidência de câncer, pois o
homem poderia aumentar a utilização de determinados agentes
encontrados na dieta por exemplo, e procurar alimentos com potencial
protetor (WATERS et al.,1990). Além disso, a possibilidade de evitar a
utilização de plantas com potencial mutagênico seria de grande
importância para a sociedade.
A genética toxicológica é uma das áreas da ciência que tem se
dedicado à pesquisa das propriedades genotóxicas e mutagênicas de
agentes aos quais os organismos estão expostos, fazendo uso de
diversos ensaios que avaliam o dano que estes podem vir a causar ao
DNA na presença ou ausência de sistemas de metabolização.
Dentre os ensaios realizados, os testes in vitro e in vivo, em
plantas, insetos ou mamíferos são mais relevantes que os realizados
em microrganismos, uma vez que a simplicidade estrutural desses
últimos pode dificultar a extrapolação dos resultados para animais
superiores.
Assim, a avaliação e o rastreamento de agentes com potencial
mutagênico se fazem muito importantes nas condições atuais de vida
humana. Ferrari (1991) já alertava, na época, ser cada vez mais
urgente a utilização de métodos confiáveis capazes de detectar e
medir o dano no DNA, bem como estabelecer possibilidades de
proteção ou redução desses efeitos.
1.1 Mutagenicidade
O termo mutação refere-se a qualquer súbita mudança herdável
no genótipo de um organismo (SIMMONS e SNUSTAD, 2001). Este
conceito provém da observação de que muitas das alterações do
DNA, ou mutações, passam despercebidas, uma vez que não
implicam em mudanças detectáveis na atividade metabólica da célula
ou do organismo ou, podem determinar a morte celular e, assim,
também não são detectáveis. Quando não é letal para a própria
célula, a mutação pode propagar-se pelo corpo em crescimento
(mutação somática) ou transmitir-se às gerações seguintes (mutação
germinativa) (RABELLO-GAY et al., 1991). Tais alterações podem ser
classificadas como microlesões (substituição de bases – transições e
transversões) ou macrolesões (deleções, inserções ou translocações)
(SIMMONS e SNUSTAD, 2001).
Os eventos mutacionais envolvendo células somáticas e
reprodutoras podem levar a várias doenças, incluindo as doenças
genéticas, a efeitos teratogênicos e a desordens herdáveis. Em
particular, a relação entre mutações somáticas e o câncer é grande, já
que alterações específicas no DNA e nos cromossomos estão
intimamente relacionadas com os processos de carcinogênese
(TROSKO, 1995). Segundo Ribeiro et al. (2003), uma célula, depois
de passar por várias divisões, poderá acumular mutações que, se em
grande número, poderão levar à perda do controle de sua divisão e,
assim, determinar o aparecimento de neoplasias.
Os agentes causadores de danos no DNA podem ser
classificados, segundo Brusick (1987) como S-dependentes (ex:
mitomicina – C, metilmetanosulfonato), quando os danos causados
são visualizados citogeneticamente somente após a fase de síntese
do DNA do ciclo celular e como S-independentes (ex. bleomicina), no
caso dos danos serem visíveis independentemente da fase de
síntese. Além disso, ressalta também que há substâncias que atuam
de maneira direta, sem necessidade de metabolização prévia pelo
organismo (ex. mitomicina-C, metilmetanosulfonato) e substâncias
que só atuam como danificantes de DNA após metabolização (ex.
ciclofosfamida e 2 amino antraceno).
Ressalta-se também que o mesmo agente mutagênico pode
produzir espectro mutagênico diferente em organismos também
diferentes (GATEHOUSE, 1990). Para uma avaliação do espectro
toxicológico de compostos químicos e medicamentos, são utilizados,
rotineiramente, testes de toxicidade genética. Tal avaliação não é uma
medida direta de carcinogenicidade, mas é usada como um indicador
para o câncer, em função do acúmulo de dados que sugerem que a
mutagenicidade é um prognóstico razoável para a carcinogenicidade
(RIBEIRO et al., 2003).
Por outro lado, muitas substâncias endógenas, usualmente
obtidas em alimentos ou sintetizadas pelas células, possuem alguma
atividade inibitória contra elementos mutagênicos ambientais naturais
ou artificiais que, muitas vezes, induzem aumento de freqüência de
oncogênese. (ODIN, 1997).
Tendo em vista que os agentes mutagênicos estão direta ou
indiretamente ligados a carcinogênese (TRICHOPOULOU et al.,
1995), a possibilidade de inativá-los ou inibir sua síntese através de
substâncias de fácil acesso à população abre um leque muito grande
de possibilidades no que se refere à redução do número de casos de
neoplasias, na diminuição do tempo ou mesmo no aumento da
eficácia do tratamento das pessoas acometidas com esse tipo de
patologia.
1.2 Teste do Cometa
O potencial mutagênico de xenobióticos pode se avaliado
através de ensaios in vitro desde que obedeçam a critérios básicos
como: sensibilidade para revelar com facilidade e precisão estatística
mesmo um pequeno defeito mutagênico; reprodutibilidade e
capacidade para avaliar eventos genéticos que possam estar
diretamente relacionados ao homem, fornecendo uma estimativa de
risco ou nível de segurança para a população exposta (RABELLO-
GAY et al., 1991).
O teste do cometa, também conhecido como eletroforese de gel
de células individuais (single cell gel eletrophoresis – SCGE) ou
eletroforese de microgel (MGE), por ter características desejáveis
para qualquer experimento - baixo custo, confiabilidade, sensibilidade
e simplicidade de realizar - foi introduzido pela primeira vez por
Östling e Johanson em 1984, como uma técnica para a visualização
direta de danos no DNA em células individuais sob condições neutras
de eletroforese (FAIRBAIN e O’NEIL., 1996).
Esse teste em condições de pH neutro detecta somente a
presença de quebras de cadeia dupla no DNA, sendo, portanto,
limitado para estudos que envolvem radiação e compostos químicos
radiomiméticos. Assim sendo, o teste em pH alcalino oferece maior
sensibilidade para detectar danos no material genético (TICE, 1995),
pois consegue detectar quebras de fitas simples de DNA em virtude
da abertura das fitas duplas neste pH.
As células com danos no DNA apresentam uma migração de
DNA nuclear, em direção ao ânodo, produzindo imagens que se
assemelham a de um cometa, de onde foi originado o nome do
ensaio. Sob condições alcalinas, as quebras de fitas simples e os
sítios álcali-lábeis tornam-se visíveis, onde a quantidade de migração
do DNA, identificada por um rastro ou cauda (daí o nome do teste),
indica a quantidade de DNA danificado na célula (SINGH et al., 1988).
A migração é quantificada pela coloração com um corante
fluorescente como o brometo de etídio e medida pela intensidade de
fluorescência através de um microscópio de fluorescência.
Os cometas gerados pela técnica podem ser então analisados
visualmente (KOBAYASHI, 1995). Desta forma, conforme mostra a
figura 1, as células poderão ser classificadas em:
- classe 0 – com núcleos não danificados e que não
apresentam cauda;
- classe 1 – com núcleos com cauda menor que o
diâmetro do núcleo;
- classe 2 – núcleos com cauda de tamanho entre 1 e 2
vezes o diâmetro do núcleo;
- classe 3 – núcleos com cauda que possui mais de 2
vezes o tamanho do núcleo.
Núcleos de células apoptóticas, que se apresentam totalmente
fragmentados, geralmente não são contabilizados (SPEIT et al.,
1996).
Embora o teste seja amplamente aplicado, as técnicas de
isolamento celular e as condições do experimento nas quais os testes
são conduzidos, variam consideravelmente. Muitas variáveis técnicas
podem afetar a sensibilidade do teste, tais como a natureza química e
o mecanismo de ação do agente mutagênico, a concentração e
quantidade de agarose de baixo ponto de fusão (LMP), a composição
da solução de lise e tempo de lise, o tempo de desnaturação alcalina
do DNA. Também são fatores que interferem nos resultados dos
testes: composição e temperatura do tampão de eletroforese e as
condições de corrida, coloração do DNA, entre outros (OLIVE et al.,
1992; SPEIT et al., 1996).
Figura 01 - Classes de cometa em núcleos de células HTC corados
com brometo de etídio (2μg/mL). Aumento de 1000X.
Cometa classe 0
Cometa classe 1
Cometa classe 2
Cometa classe 3
Núcleo apoptótico
1.3 Teste do Micronúcleo
Tratando-se de um teste que verifica a presença de pequena
massa nuclear delimitada fora do núcleo da célula, o teste do
micronúcleo (MN), criado por Matter e Schmid (1971) em células de
medula óssea de camundongos, teve sua versão in vitro introduzida
por Heddle em 1976.
Por tratar-se de um teste simples para avaliar danos
citogenéticos, este ensaio evoluiu rapidamente, sofrendo contínuas
inovações (RIBEIRO et al., 2003).
O MN se forma na telófase da mitose ou meiose, quando o
envoltório nuclear é reconstituído ao redor dos cromossomos das
células filhas. Micronúcleos são resultantes de fragmentos de
cromossomos (originados de quebra cromatídica ou isocromatídica –
efeito clastogênico) que se perderam do núcleo principal, ou são
originados por disfunções no fuso mitótico – efeito aneugênico
(RABELLO-GAY et al., 1991; MERSH et al., 1996; FENECH, 2000;
KIRSCH-VOLDERS e FENECH, 2001), provavelmente pela falta,
defeito nos centrômeros ou por algum mecanismo falho que permite
aos cromossomos a distribuição incorreta após a anáfase (FENECH,
2000).
O tamanho do micronúcleo permite inferir sobre o mecanismo
que o originou. Grandes micronúcleos conteriam cromossomos
inteiros, em decorrência de falha no fuso mitótico, enquanto
micronúcleos menores poderiam se originar a partir de fragmentos de
cromossomos (TUCKER E PRESTON, 1996).
Deve-se ressaltar que micronúcleos são expressos somente
após um ciclo de divisão celular, sendo seu número dependente da
proporção de células que está se dividindo. Desta forma, a
comparação da freqüência de micronúcleos entre populações de
células em divisão só seria segura quando a cinética de divisão
nuclear, após o dano ao DNA, fosse idêntica.
Pensando nisso, Fenech e Moley descreveram, em 1985, a
versão do ensaio utilizando células binucleadas (MNCB), obtidas
aplicando-se o bloqueio de citocinese, que permite identificar células
que tenham passado por um ciclo de mitose após o tratamento
(Figura 02). Isso possibilita identificar os micronúcleos gerados pela
substância teste (aqueles em células binucleadas, pois
obrigatoriamente passaram por um ciclo celular) e os ocasionados
antes do tratamento (MN em células mononucleadas).
Esta variação é uma das metodologias mais utilizadas
atualmente, empregando-se citocalasina-B (cyt-B) como inibidor de
citocinese. A cyt-B é extraída do fungo Helminthosporum
dermatoideum, tratando-se de um inibidor da polimerização dos
microfilamentos de actina na placa equatorial formada no final da
telófase e, conseqüentemente provoca ausência de citocinese
(FENECH, 1997).
A utilização de bloqueador de citocinese oferece, contudo,
algumas desvantagens, de acordo com Ribeiro et al. (2003):
- torna o teste efetivo somente para populações de células em
divisão;
- não detecta não-disjunção meiótica;
- não detecta rearranjos cromossômicos;
- não possibilita o conhecimento do tipo de aberração que
originou o MN;
- a cyt-B pode interferir na detecção de compostos que também
inibem a citocinese ou a polimerização dos microfilamentos.
É importante ressaltar que Phelps et al. (2002) e Garriot et al.
(2002) comprovaram que a cyt-B não induz formação de MN, além de
sugerir que sua utilização gera resultados mais confiáveis, pois
garante que as células estavam em divisão durante o tratamento
testado.
Durante a análise, as células binucleadas observadas devem
obedecer alguns critérios (FENECH, 1997):
• núcleos devem apresentar delimitação nuclear intacta e
estar situados no mesmo limite citoplasmático;
• núcleos devem apresentar tamanhos semelhantes,
coloração padrão e de mesma intensidade;
• os dois núcleos principais podem estar ligados por uma
ponte nucleoplasmática, desde que a largura não seja
maior que ¼ do diâmetro nuclear maior;
• os núcleos principais podem estar próximos, mas não
devem estar sobrepostos, e os limites nucleares devem
ser distinguíveis;
• o limite citoplasmático da célula binucleada deve estar
intacto, e ser distinguível do limite citoplasmático das
células adjacentes.
Os micronúcleos, por sua vez, devem apresentar as seguintes
características, segundo Ferrari (1991), Titenko-Holland et al. (1997) e
Fenech (2000):
• forma arredondada ou ovalada;
• cor e textura semelhantes às do núcleo principal;
• estar no mesmo plano e não estar ligado ao núcleo
principal;
• tamanho entre 1/16 e 1/3 do tamanho do núcleo
principal;
• não ser birrefringente.
Com relação ao número de células analisadas, Garriot et al.
(2002) sugerem ser necessária a contagem de 2000 células
binucleadas por tratamento, devido à possibilidade de distribuição não
uniforme sobre a lâmina.
Figura 02 – Representação esquemática de formação de micronúcleo.
Células binucleadas coradas com corante de Rosenfeld em aumento de
400X
1.4 Plantas utilizadas
1.4.1 Picão Preto (Bidens pilosa Liné)
O picão – preto (Bidens pilosa L.), erva medicinal da família
Asteraceae, possui altura entre 30-100cm, com flores amarelas
(ABAJO et al., 2004), conforme representada na Figura 03. Esta
planta tem ampla dispersão nos trópicos e sub-trópicos, desde o nível
do mar até cerca de 3000m de altitude (BALLARD, 1986). Por onde
ocorre ela é adotada como fitoterápico, sendo preferido o uso das
folhas (VASQUES et al., 1986), principalmente na solução de
problemas hepáticos (hepatite e icterícia), além de laringites, dores de
cabeça e desordens digestivas (ABAJO et al., 2004). Contudo, na
medicina popular, a planta é utilizada inteira, exceto as raízes.
Por tratar-se de uma planta amplamente utilizada e conhecida,
inúmeros estudos químicos já foram realizados (CHANG-JUNG et al.,
2001), destacando-se aqueles sobre atividades antioxidantes
(KUSANO et al., 2003). Entre estes estudos incluem-se os que
realizaram isolamento de componentes principais a partir de extratos,
conforme relacionados na Tabela I.
Figura 04 - Estrutura química da quercetina (U.S. department of health
and human services, 1992).
Compostos polifenólicos têm demonstrado atividade
antinflamatória e antioxidante em modelos biológicos (RICE-EVANS et
al., 1996). A própria quercetina, em virtude de sua capacidade
antioxidante, demonstrou anticarcinogenicidade em estudos animais.
In vitro, promoveu proteção ao DNA de linfócitos humanos em
tratamento com peróxido de hidrogênio através do teste do cometa
(DUTHIE et al., 1997). Contudo, Bidens pilosa possui diversas outras
substâncias já definidas quimicamente (ABAJO et al., 2004 e YI-MING
et al., 2004), mas com efeitos ainda não relatados.
Oliveira et al. (2004) confirmaram propriedade antimalárica in
vitro do extrato etanólico, por possuir atividade contra Plasmodium
falciparum, sendo esta atividade relacionada à presença de
poliacetileno e flavonóides. Efeitos hipotensivos também foram
confirmados em ratos por Dimo et al. (2003), utilizando extratos de
folhas. Alvarez et al. (1999) comprovaram atividade gástrica anti-
secretória do extrato etanólico.
TABELA I. Componentes isolados de extratos de Bidens pilosa (LASTRA
VALDES, 2001)
COMPONENTE (%) ATIVIDADE BIOLÓGICA
Extrato com éter de
petróleo
Fenilheptatrina 0,003
antimicrobiana, fungicida, anti-helmíntica,
antiprotozoária, cercaricida
ácido linoléico 0,005 bacteriostático, fungicida
ácido a - linolênico 0,006 bacteriostático, fungicida
Esqualeno 0,008 bacteriostático, fungicida
Friedelina 0,007
antiinflamatório, anticonvulsivante,
fungistático
Friedelan-3-b-ol 0,004 antiinflamatório, anticonvulsivante
Estigmasterol,
b-sitosterol,campestrol
0,003 antibacteriano
triglicerideos 0,4
n-alcanos 0,03 antibacteriana
Extrato metanólico
luteolina 7-O-b-D- 0,005 antiinflamatório
glucopiranosídeo
quercetina 3-O-b-D- 0,01 antiinflamatório
glucopiranosídeo
quercetina 3-O-b-D-
0,006 antiinflamatório
galactopiranosídeo
Extrato metanol / água
quercetina 3-o-b-D 0,02 antiinflamatório
Contudo, não foram encontrados dados a respeito de atividade
genotóxica e/ou mutagênica da planta, nas formas mais ingeridas pela
população, seja em infuso ou em decocto.
1.4.2 Guaco (Mikania glomerata Sprengel)
O guaco é uma trepadeira sublenhosa, perene, de grande porte,
com folhas obtusas na base, de forma quase deltóide, cor verde
escura e flores brancas reunidas em capítulos congestionados,
atingindo ramificações entre 2 e 2,5m (Figura 05). Ela ocorre em
praticamente todos os países da América do Sul e Central tendo
ampla distribuição no Brasil e sendo suas folhas muito utilizadas pela
população.
Figura 05 - Folhas de Mikania glomerata Sprengel (foto extraída de
www.plantamed.com.br).
Segundo Botsaris (1995), esta planta facilita a fluidificação dos
exsudatos traqueobrônquicos estimulando sua secreções de maneira
que possam ser mais facilmente expulsos pelo reflexo da tosse. Atua
relaxando a musculatura lisa das vias aéreas, principalmente
brônquios. A principal substância responsável por esse efeito é a
cumarina, bem conhecida e definida quimicamente (OLIVEIRA et al.,
1993; CABRAL et al., 2001), conforme representada na Figura 06:
Figura 06 – Estrutura química da cumarina (US department of health
and human service, 1993).
Estudos apontam as cumarinas como potenciais substâncias
para o tratamento de câncer (LIN et al., 1996), inclusive por inibir o
crescimento e provocar a morte de diversas linhagens de células
tumorais, o que reforça a necessidade de estudos toxicológicos sobre
elas (FÁTIMA et al., 2005).
Fierro et al. (1999) e Holetz et al. (2002) sugerem, ainda,
atividade antifúngica, antimicrobiana, antialérgica e antiinflamatória.
Também possui acentuado efeito antiofídico, principalmente contra
veneno crotálico (cascavéis – Crotalus durissimus terrificus), segundo
Maiorano et al. (2005).
Folhas de guaco em extrato etanólico também comprovaram
atividade antialérgica, por inibição de infiltração granulocítica
estimulada por antígeno, além de impedir degranulação mastocitária
antígeno induzida (FIERRO et al., 1999).
Esta planta, assim como o picão-preto, já passou por diversos
estudos fitoquímicos, onde foram encontrados: ácido caurenóico,
estigmasterol, flavonóides, cumarina (SILVEIRA E SÁ et al., 2003)
além de sesquiterpenos (VILEGAS et al., 1997) e guacosídeos.
Da mesma forma que observado com o picão-preto, não foram
encontrados relatos sobre possível mutagenicidade relacionada ao
infuso ou decocto desta planta.
1.4.3 Preparação dos extratos testados
1.4.3.1 Infusão
Infusão é uma forma extrativa que consiste em lançar sobre
uma droga água fervente, mantendo-se o sólido e o líquido em
contato, encerrados em recipiente fechado durante certo tempo
(SIMÕES et al., 2001). É uma técnica aplicada, principalmente, a
substâncias de estrutura branda, constituída por tecidos
comparativamente moles (folhas, flores, inflorescências) (PRISTA et
al., 1981). As infusões utilizadas no presente trabalho foram obtidas
adicionando-se 1000mL de água ultrapurificada (milliQ) a 96ºC em
50g de folhas de M. glomerata ou 50g de planta inteira, sem raízes,
de B. pilosa, previamente picadas, procedendo-se filtração simples
após 45 minutos de repouso em recipiente fechado (FARMACOPÉIA
PORTUGUESA, 1997) e protegido da luz.
1.4.3.2 Decocção
Esta forma extrativa, segundo Prista et al. (1981), caracteriza-
se por manter o sólido em contato com um líquido solvente em
ebulição durante certo tempo. Costuma ser usada em casos restritos,
com drogas muito compactadas e de natureza lenhosa (caule, casca,
raízes e sementes) (SIMÕES et al., 2001). Produto da decocção, o
decocto utilizado no presente trabalho foi preparado a partir da fervura
de 100g de planta inteira, sem raízes, em 1500mL de água ultrapura
(milliQ), até o volume final de 1000mL, procedendo-se, em seguida, a
filtração simples (FARMACOPÉIA PORTUGUESA, 1997).
1.4.3.3 Maceração
O termo maceração designa a operação na qual a extração da
matéria-prima vegetal é realizada em recipiente fechado, em diversas
temperaturas, durante um período prolongado (horas ou dias), sob
agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator (SIMÕES et
al., 2001). Líquidos muito voláteis são raramente utilizados. Contudo,
não se recomenda o uso de água ou misturas hidroalcoólicas com
concentrações de etanol inferiores a 20% devido à possibilidade de
contaminação microbiana. O macerado utilizado neste trabalho foi
obtido após 24h de maceração simples das folhas, em proporção
planta:solvente 1:5 (m/V) e fornecido pela Profa. Andréa Diniz, do
Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos (TAM) do
Centro de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Estadual de
Londrina (UEL).
1.4.4 Quantificação de cumarina
A quantificação de cumarina contida no infuso e no macerado de
M. glomerata em etanol 80% foi realizado por meio de cromatografia
líquida de alta eficiência - ultravioleta (CLAE-UV), conforme método
descrito por Celeghini et al. (2001). As análises foram realizadas em
cromatógrafo líquido (Shimadzu), bomba modelo LC6A, detector por
ultra-violeta, e integrador modelo C-R6A, injetor manual Rheodyne
modelo 7125 com alça dosadora de 20 µl, coluna analítica Shim-Pack
ODC-18 (4,6 x 250mm, 5µm), pré-coluna RP-18 (Lichrospher 100, 5
µm, 4 x 4mm, Merck), utilizando-se acetonitrila e água como solventes
da fase móvel. Os solventes foram filtrados através de membrana
(HVHP) e desaerados em banho de ultrassom. A fase móvel foi eluída
em fluxo de 0,7mL/min, em sistema isocrático acetonitrila: água (40:60
v/v). A detecção foi realizada a 274nm.
A metodologia foi validada nos parâmetros de linearidade,
recuperação, repetibilidade e precisão intermediária.
2 - Justificativa
A exposição do homem a agentes mutagênicos tem
aumentado consideravelmente desde a revolução industrial, seja pelo
aumento de poluentes lançados no meio, seja pela modificação dos
hábitos alimentares ou mesmo pelo ritmo de vida altamente
estressante levado pelas pessoas.
A interação desses agentes aliada à suscetibilidade genética
de cada indivíduo apresenta-se como um fator poderoso de
desenvolvimento de mutações no DNA celular, podendo gerar assim
processos cancerígenos. Uma prova disso é o número crescente de
casos de câncer relatados nas últimas décadas.
Desta forma, conhecer a propriedade mutagênica das
substâncias ingeridas ou utilizadas pela população constitui um
importante meio de prevenção do desenvolvimento do câncer. Além
disso, a descoberta de substâncias capazes de combater essa
patologia, ou mesmo o maior conhecimento sobre seus mecanismos
de ação, certamente irá contribuir para melhora na expectativa de vida
dos pacientes acometidos, podendo, em última instância, resultar em
cura definitiva.
O presente trabalho avalia o potencial mutagênico de duas
plantas muito utilizadas pela população brasileira e mundial para fins
terapêuticos: o picão-preto (Bidens pilosa Liné) e o guaco (Mikania
glomerata Sprengel), que, apesar de terem sido alvos de diversos
estudos fitoquímicos, não o foram, até o presente, nessa área de
mutagênese.
Assim sendo, esta pesquisa pode contribuir para o
conhecimento de efeitos genotóxicos dos chás das plantas medicinais
estudadas, ou mesmo, revelar potenciais mutagênicos antes não
conhecidos, colaborando assim para o acúmulo de informações e
conseqüentemente com a avaliação de perigo genético para a
população, o qual, se possível, deve ser minimizado.
3 - Objetivos
A utilização de plantas visando à cura de processos patológicos
é comum, sobretudo na medicina popular brasileira, onde a
transmissão dos conhecimentos indígenas e dos colonizadores fez
desse procedimento uma terapia muito confiável pela população. O
consumo de picão-preto (Bidens pilosa Liné) e de guaco (Mikania
glomerata Sprengel), na forma de chás, ocorre com freqüência em
nossa sociedade. Como os efeitos dessas duas plantas relacionados
à possibilidade indutora de mutagênese ainda não foram esclarecidos
cientificamente, o presente trabalho tem por base os seguintes
objetivos:
Gerais
Investigar os efeitos genotóxicos, in vitro, de extratos das
plantas picão-preto (Bidens pilosa Liné) e guaco (Mikania glomerata
Sprengel), em cultura de células de hepatoma de rato (HTC - sigla do
termo inglês Hepatoma Tissue Culture), por meio dos testes de
cometa e de micronúcleo.
Específicos
Avaliar a capacidade dos extratos de Bidens pilosa L.
preparados na forma de infuso e decocto e aplicados em diferentes
concentrações, em induzir danos no material genético de células HTC,
por meio dos testes de cometa e de micronúcleo.
Avaliar os efeitos genotóxicos e mutagênicos de infusão e
extrato etanólico de Mikania glomerata Sprengel., aplicados em
diferentes concentrações, em células HTC em cultivo, por meio dos
testes de cometa e micronúcleo.
Analisar e comparar os efeitos das duas formas extrativas de
cada planta, buscando verificar se há uma forma mais prejudicial ao
DNA, bem como apontar causas prováveis para possíveis diferenças.
Tomando por base as doses sugeridas para consumo humano,
avaliar o potencial genotóxico de diferentes concentrações dos
extratos in vitro.
“Avaliação in vitro do potencial mutagênico de Bidens pilosa
Liné e de Mikania glomerata Sprengel, por meio de ensaio do
cometa e teste de micronúcleo”
Ronaldo de Jesus Costa ª, Berenice Quinzani Jordão ª, Mário Sérgio
Mantovani.ª, Andréia Diniz
b.
a
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Campus
Universitário, Caixa Postal 6001, 86.051-990 - Londrina, PR, Brasil.
b
Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos, Universidade
Estadual de Londrina, Campus Universitário, Caixa Postal 6001, 86.051-990 -
Londrina, PR, Brasil.
Artigo a ser submetido à Revista Journal of Ethnopharmacology -
Elsevier
Resumo
O consumo de Bidens pilosa Liné e de Mikania glomerata Sprengel na
forma de chás ocorre com freqüência na sociedade, principalmente
em casos de icterícia e de afecções de vias aéreas superiores,
respectivamente. Para averiguar a capacidade destes chás em induzir
danos ao DNA e efeitos clastogênicos ou aneugênicos, foram
utilizados o ensaio do cometa (single-cell gel electrophoresis –SCGE-
assay) e o teste de micronúcleo (MN), in vitro, em células
metabolizadoras de hepatoma de Rattus norvegicus (células HTC). Os
chás testados tiveram diferentes formas de preparo: infuso de guaco –
Mikania glomerata (IM) e de Bidens pilosa (IB), macerado de M.
glomerata em etanol 80% (MM80) e decocto de Bidens pilosa (DB).
As concentrações utilizadas para infuso e decocto foram 10, 20 e
40μL/mL de meio de cultura. O extrato etanólico foi testado em doses
de 2,5, 5, 10 e 20μL/mL de meio de cultura. A quantidade de cumarina
presente em IM e MM80 foi determinada por cromatografia líquida de
alta eficiência – UV (CLAE-UV). Metilmetanosulfonato (MMS) foi
utilizado como controle positivo, tampão fosfato (PBS pH 7,4) como
controle negativo e etanol 80% como controle do solvente. O teste do
cometa demonstrou genotoxicidade para ambas as plantas, na
maioria dos tratamentos. Os efeitos de IM e MM80 não demonstraram
relação direta com a quantidade de cumarina presente em cada
amostra. No teste do micronúcleo, somente IM 40μL/mL diferiu do
controle negativo, demonstrando mutagenicidade. Os resultados
indicaram danos ao DNA mais significativos em doses mais elevadas,
sugerindo cuidados na utilização fitoterápica destas plantas.
Abstract
The use of Bidens pilosa Liné and Mikania glomerata Sprengel in the
form of teas occurs with frequency in the society, mainly in cases of
jaundice and affection of superior aerial ways, respectively. The
capacity of these teas in inducing DNA-damages and clastogenic or
aneugenic effects was examined in vitro, using the comet assay or
single-cell gel electrophoresis (SCGE) assay and the micronucleus
test (MN), in Hepatoma Tissue Culture cells (HTC) of Rattus
norvegicus (metabolically competent cells). The tested teas had
different forms of preparation: infusion of guaco - Mikania glomerata
(IM) and Bidens pilosa (IB), Macerated leaves of Mikania glomerata in
ethanol 80% (MM80) and decoction of Bidens pilosa (DB). The
concentrations used for infusion and decoction were 10, 20 and
40μL/mL of culture medium. The ethanolic extract was tested in doses
of 2.5, 5, 10 and 20μL/mL of culture medium. The quantity of coumarin
in IM e MM80 was determined by high efficiency liquid
chromatography – UV (HELC-UV). Methyl methanesulfonate (MMS)
was used as positive control; phosphate-buffered solution (PBS pH
7,4) was the negative control and ethanol 80% the solvent control. The
comet assay demonstrated to genotoxicity for both the plants, in the
majority of the treatments. The IM and MM80 effects did not show
direct relationship with the coumarin quantity present in each sample.
In the micronucleus test, only IM 40μL/mL differed from the negative
control, demonstrating its mutagenicity. The results indicated damages
to the DNA most significant in higher doses, suggesting careful use of
these plants in phytotherapy.
Introdução
A utilização de determinadas plantas no combate a doenças é
um costume comum na sociedade humana. Contudo, na utilização
popular, seja como fitoterapia, seja na dieta, na maioria das vezes não
se tem comprovação da eficácia no tratamento ou avaliação
apropriada dos possíveis efeitos adversos causados (SILVEIRA E SÁ
et al., 2003). Ferrari (1991) alerta para a utilização de métodos
confiáveis capazes de detectar e medir o dano no DNA, bem como de
estabelecer possibilidades de proteção ou redução desses efeitos.
O picão – preto (Bidens pilosa Liné), da família Asteraceae,
possui altura entre 30-100cm e flores amarelas (ABAJO et al., 2004);
tem ampla dispersão nos trópicos e sub-trópicos, desde o nível do
mar até cerca de 3000m de altitude (BALLARD, 1986). Por onde
ocorre é adotado como fitoterápico, em especial em desordens
hepáticas (hepatite e icterícia) (VASQUES et al., 1986). Segundo
Brandão et al. (1998), o chá é adotado na medicina popular como
antiinflamatório, diurético, anti-reumático, antidiabético. Ainda mostra
alta atividade bactericida (RABE e VAN STADEN, 1997), bem como
efeitos antioxidantes e imunomodulatórios (ABAJO et al., 2004), além
de atividade antimalárica (BRANDÃO et al., 1997 e OLIVEIRA et al.,
2004). É rico em quercetina (HOFFMANN E HÖLZL, 1989 e LASTRA
VALDES, 2001) e outros compostos polifenólicos (RICE-EVANS et al.,
1996), que podem ser responsáveis pelas atividades antioxidantes
observadas (VAN ACKER et al., 1996).
O guaco (Mikania glomerata Sprengel, Compositae) é uma
planta do tipo cipó-trepadeira, com folhas opostas, simples, ovais e
acuminadas e flores brancas em forma de pequenos capítulos
longipedunculados. Originário da América do Sul, ele ocorre em todo
o continente, estendendo-se até alguns países da América Central. A
planta é utilizada principalmente como expectorante no tratamento de
afecções respiratórias, promovendo a fluidificação dos exsudatos
traqueobrônquicos (BOTSARIS, 1995). Ela possui atividades
antifúngica, antimicrobiana, antialérgica e antiinflamatória (FIERRO et
al., 1999; HOLETZ et al., 2002), além de acentuado efeito antiofídico
(MAIORANO et al., 2005). Estudos apontam as cumarinas, um de
seus princípios ativos (OLIVEIRA et al., 1993; CABRAL et al., 2001),
como potenciais substâncias para o tratamento de câncer (LIN et al.,
1996), inclusive por inibir o crescimento e provocar a morte de
diversas linhagens de células tumorais, o que reforça a necessidade
de estudos toxicológicos sobre elas (FÁTIMA et al., 2005).
Contudo, da mesma forma que observado com o picão-preto,
não são encontrados relatos sobre possíveis efeitos genotóxicos e
mutagênicos do guaco relacionados às formas mais consumidas pela
população, os chás.
Sendo assim, este trabalho procurou avaliar o potencial de
indução de danos ao DNA destas duas plantas, M. glomera Sprengel
e B. pilosa Liné, in vitro, usando chás preparados tanto por infusão,
decocção ou maceração em etanol 80%, tomando como base de
cálculo as dosagens que são recomendadas para o consumo diário
humano.
Materiais e métodos
Cultura celular
No presente estudo, células de hepatoma de rato (Rattus
norvegicus) -células HTC – adquiridas do Banco de Células do Rio de
Janeiro, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - foram cultivadas
em monocamada aderida a frascos de cultura estéreis, de 25cm
2
para
o teste do micronúcleo e em tubos de cultura de 2,5mL para o teste do
cometa. Para o cultivo utilizou-se o meio de cultura D-MEM-F12
(GibcoBRL), suplementado com 10% de soro bovino fetal – SBF
(Gibco). A incubação foi feita a 37ºC em estufa tipo BOD e, nestas
condições, um ciclo celular teve duração de cerca de 24h. As células
foram redistribuídas em sub-culturas, onde cresciam por cerca de 3~4
dias até se estabilizarem no meio de cultura. Quantidade fixa de
células para cada tipo de ensaio foi então distribuída nos frascos de
cultura, onde permanecia por pelo menos um ciclo celular completo
antes de receber os tratamentos experimentais.
Extratos testados
Quatro extratos foram testados, três dos quais em forma de
chás das plantas in natura, preparados segundo a Farmacopéia
Portuguesa 6ed. (1997), a saber: a) infuso de Bidens pilosa Liné (IB),
b) decocto de Bidens pilosa Liné (DB), obtidos a partir da planta inteira
sem raízes; c) infuso Mikania glomerata Sprengel (IM),, obtida das
folhas e d) um extrato alcoólico M. glomerata, preparado por
maceração simples em etanol 80% (M80) a partir de folhas.
Das soluções testadas neste trabalho, o infuso foi obtido
adicionando-se 1000mL de água ultrapurificada (milliQ) à temperatura
de 96ºC em 50g das folhas levemente picadas e filtrando-se, por
filtração simples, após 45 minutos. O decocto, por sua vez, foi
preparado a partir da fervura, de 100g de planta em 1500mL de água
ultrapurificada (milliQ), por cerca de 1 hora, tempo necessário para
ocorrer a redução até o volume final de 1000mL, procedendo-se em
seguida à filtração simples. O extrato etanólico foi obtido após 24h de
maceração simples das folhas, em etanol 80% (uma vez que esta foi a
diluição mais efetiva para extração de cumarinas), em proporção
planta:solvente de 1:5 (m/V) e fornecido pela Profa. Andréa Diniz, do
Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos (TAM) do
Centro de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Estadual de
Londrina (UEL). Estas soluções-teste foram armazenadas a uma
temperatura de 20ºC negativos.
As concentrações utilizadas de infuso e decocto, no teste do MN
foram de 20 e de 40μL/mL de meio de cultura. Já no ensaio do
cometa, estas foram de 10, 20 e 40μL/mL de meio. Estas três
concentrações foram calculadas tomando por base os índices de 50,
100 e 200% da dose de ingestão diária recomendada (IDR) para
consumo de infusão e decocto (IDR= 250mL 4 vezes ao dia para uma
pessoa de 70kg).
O macerado em etanol 80%, contudo, por ter sido elaborado
com uma proporção planta:solvente quatro vezes maior que os chás,
no ensaio do cometa foi testado em doses finais 4 vezes menores:
2,5, 5 e 10μL/mL de meio de cultura, alem da dose de 20μL/mL para
fins comparativos. No teste do MN, as únicas concentrações utilizadas
para este extrato foram as de 5 e 10μL/mL de meio.
Como indutor de danos (controle positivo) utilizou-se o agente
alquilante e clastogênico metilmetanossulfonato (MMS), a diferentes
concentrações, conforme o ensaio biológico. Como controle negativo
utilizou-se tampão fosfato, PBS (do inglês: phosphate-buffered
solution) livre de Ca
++
e Mg
++
, pH 7,4, a 30μL/mL de meio de cultura,
ou o controle de solvente etanol 80%, nas concentrações finais de
10μL/mL e 20μL/mL de meio de cultura.
Quantificação de cumarina
A quantificação de cumarina contida na infusão e no extrato
etanólico de Mikania glomerata Sprengel foi realizado por meio de
cromatografia líquida de alta eficiência - ultravioleta (CLAE-UV),
conforme método descrito por Celeghini et al. (2001). As análises
foram realizadas em cromatógrafo líquido (Shimadzu), bomba modelo
LC6A, detector por ultra-violeta, e integrador modelo C-R6A, injetor
manual Rheodyne modelo 7125 com alça dosadora de 20µl, coluna
analítica Shim-Pack ODC-18 (4,6 x 250mm, 5µm), pré-coluna RP-18
(Lichrospher 100, 5µm, 4 x 4mm, Merck), utilizando-se acetonitrila e
água como solventes da fase móvel. Os solventes foram filtrados
através de membrana (HVHP) e desaerados em banho de ultrassom.
A fase móvel foi eluída em fluxo de 0,7mL/min, em sistema isocrático
acetonitrila:água (40:60; v/v). A detecção foi realizada a 274nm.
A metodologia foi validada nos parâmetros de linearidade,
recuperação, reprodutibilidade e precisão intermediária.
Teste do cometa
Aproximadamente 0,5x10
5
células HTC previamente
estabilizadas como descrito anteriormente foram distribuídas e
incubadas em tubos de cultura contendo 2,5mL de meio de cultura
enriquecido com soro bovino fetal, por 24h. O tratamento com as
soluções teste foi efetuado nas concentrações de 10, 20 e 40μL/mL
no caso dos chás e de 2,5, 5, 10, e 20 μL/mL do extrato etanólico.
Utilizou-se MMS como controle positivo, na concentração final de
90µM e PBS (pH 7,4) como controle negativo, na concentração final
de 30μL/mL. Como controle do solvente utilizou-se etanol 80% nas
concentrações finais de 10 e 20μL/mL, para averiguar possível
interferência do etanol nos resultados do macerado de M. glomerata
em etanol 80%. Após 2h de tratamento, as células foram colhidas,
usando tripsina a 0,025%, centrifugadas e ressuspendidas em meio
de cultura. Posteriormente, seguiu-se o protocolo de Speit &
Hartmann (1999).
Após a colheita, 20μL da suspensão celular foram
homogeneizados com 120μL de agarose de baixo ponto de fusão
(LMP) a 0,5% e mantida a 37ºC. A mistura foi distribuída sobre
lâminas de microscopia, pré-gelatinizadas com agarose de ponto de
fusão normal a 1,5%. As lâminas foram cobertas com lamínula e
mantidas sob resfriamento a 4ºC para solidificação do gel. Depois de
20 minutos, as lamínulas foram retiradas e as lâminas imersas em
solução de lise gelada [89mL de solução estoque (solução aquosa
2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris-EDTA, NaOH qsp pH10,
laurilsarcosinato de sódio a 1%) com adição de 1mL de Triton X-100 e
10mL de DMSO], em recipiente protegido da luz por 24 horas, sob
refrigeração, para lise das membranas celulares. As lâminas foram
então dispostas em cuba de eletroforese, cobertas com tampão para
eletroforese (300mM NaOH e 1mM EDTA, a pH>13), mantidas no
escuro, em banho de gelo a aproximadamente 4ºC para desnaturação
alcalina do DNA, por 20 minutos. Realizou-se então a corrida de
eletroforese a 300mA e 1,6V/cm por mais 20minutos. As lâminas
foram neutralizadas com tampão Tris-HCl 0,4M, pH7,5, em três ciclos
de cerca de 5 minutos cada um, secas ao ar e fixadas em etanol
absoluto por 10 minutos. Então, foram armazenadas em refrigerador.
As lâminas foram coradas no momento da análise com 100μL de
brometo de etídio 2μg/mL e cobertas com lamínulas. A leitura foi feita
em microscópio de fluorescência usando filtro de excitação com λ ~
420-490ηm e filtro de barreira de 590ηm em aumento de 400 vezes.
Com base nos critérios estabelecidos por Kobayashi et al., (1995),
analisou-se 100 núcleos por lâmina classificando-os em: classe 0
(ausência de cauda); classe 1 (cauda com até uma vez o diâmetro do
núcleo do cometa); classe 2 (cauda com até duas vezes o diâmetro do
núcleo do cometa); classe 3 (cauda com mais de 2 vezes o diâmetro
do núcleo do cometa). Células apoptóticas não foram contabilizadas
na análise (SPEIT et al., 1996). Em 300 células analisadas por
tratamento, foi calculado o escore médio de danos multiplicando-se o
número de células com dano observado em cada classe de dano pelo
valor da classe, nas três repetições, de acordo com a fórmula:
Escore médio = Σ ( 0 x n
0
) + (1 x n
1
) + (2 x n
2
) + (3 x n
3
),
3
onde n= número de células em cada classe de dano
Teste do micronúcleo (MN)
Para o teste do MN, as células previamente estabilizadas foram
incubadas em meio de cultura completo por 1,5 ciclo celular (36h),
que foi seguido, logo após a troca do meio de cultura e a lavagem
com 5mL de tampão PBS pH 7,4, do tratamento por 4h com as
substâncias-teste: chás (infuso e decocto) das duas plantas nas
concentrações de 20 e 40μL/mL de meio e extrato alcoólico de
Mikania glomerata a 5 e 10μL/mL de meio. Também foram dados os
tratamentos com as soluções de 30μL/mL de PBS como controle
negativo e de MMS a 0,3mM como controle positivo. O meio de
cultura foi então trocado novamente por meio fresco, após nova
lavagem das células com 5mL de PBS por duas vezes para retirada
de qualquer resquício de substância-teste. Adicionou-se então
10μL/mL de citocalasina-B (300μL/mL) ao meio fresco e prosseguiu-
se a incubação por mais 20h, para obtenção de células binucleadas,
conforme descreve Fenech (1997). A colheita das células e o preparo
das lâminas foi feita segundo Salvadori et al. (1993). Para coloração
utilizou-se corante de Rosenfeld (May Grunwald 0,053%, 0,097%
Giemsa em metanol). Os critérios utilizados para análise foram os
estabelecidos por Fenech (2000). Os tratamentos foram realizados em
triplicata, em experimentos independentes e em cada lâmina foram
analisadas 2000 células binucleadas (GARRIOT et al., 2002).
Análise estatística
Para a análise estatística dos dados realizou-se ANAVA entre
todos os resultados de cada ensaio e aplicou-se o teste de DUNNET
de médias, comparando o número médio de células com dano, tanto
no teste do cometa como no teste de micronúcleo, obtido dos
experimentos em triplicata, com o número médio obtido nos controles
PBS ou MMS. O nível de probabilidade admitido foi de 5% de
significância (p < 0,05).
Resultados
Os resultados obtidos com todas as formas de extratos das
duas plantas avaliadas pelos ensaios biológicos aplicados, Cometa e
MN, são mostrados na Tabela I.
Em primeiro lugar, analisando os resultados do ensaio do
cometa, observa-se que a infusão de guaco Mikania glomerata
Spreng. (IM) não induziu danos estatisticamente significativos ao DNA
no tratamento IM10, mas apresentou-se genotóxica nas doses IM20 e
IM40 (calculadas considerando as proporções de 100 e 200% da dose
de ingestão recomendada - IDR), ressaltando a ocorrência de um
efeito dose-dependente (Figura 1).
Por sua vez, o macerado de M. glomerata em etanol 80%
(MM80) não apresentou diferença estatisticamente significativa em
relação ao controle nas doses de MM80 2,5 e MM80 5, mas
apresentou genotoxicidade nos tratamentos MM80 10 e MM80 20, ou
seja, quando usado em doses muito altas (calculadas com base em
200 e 400% da IDR). Os tratamentos-controle com etanol a 80% não
diferiram estatisticamente do controle negativo com PBS.
No caso do picão-preto (Bidens pilosa L.), por sua vez, a
freqüência de células com danos induzida pelo infuso diferiu
estatisticamente do controle nas três dosagens testadas. Este
potencial genotóxico de IB mostrou efeito dose-resposta evidente,
tendo o tratamento IB40 produzido resultados muito semelhantes aos
do MMS (Figuras 1 e 2). A outra forma estudada desta planta, o
decocto, também mostrou-se genotóxica nas três concentrações
testadas. Contudo, verifica-se, pelo número de células danificadas e
pelo escore de dano (Figuras 2 e 3), que esse efeito ocorreu em
níveis inferiores aos do infuso (IB). Ainda por meio do ensaio do
cometa, é possível observar que o escore de dano foi elevado com as
mais altas concentrações, tanto do guaco (IM, MM80) quanto do
picão-preto (IB), a ponto de MM80 20 e IB40 chegarem a apresentar
escores maiores que o do próprio MMS (Figura 3). Este escore
aumentado reflete um deslocamento havido do número de células
com dano para as classes de danos mais altas, como mostrado na
Tabela I.
Em segundo lugar, no teste de micronúcleo, foram testadas
somente as dosagens mais altas (20 e 40μL/mL de meio de cultura),
tanto para M. glomerata quanto para B. pilosa, referenciadas em 100
e 200% da IDR. Os resultados demonstraram que, de todos os
tratamentos efetuados, somente o tratamento IM40 diferiu do controle
negativo. Todos os demais tratamentos não apresentaram potencial
mutagênico. De fato, verifica-se tanto na Figura 4 como na Figura 5
que IM40 foi o único tratamento que apresentou um aumento
significativo da média de células com MN.
Comparando os resultados obtidos entre os dois ensaios
(Figura 5), verifica-se que as respostas positivas obtidas no ensaio do
cometa foram bem mais acentuadas do que as obtidas no teste do
MN. À exceção do tratamento IM40, que mostrou um pico na linha de
células com MN, todos os demais tratamentos e concentrações
apresentaram uma resposta bem distinta ao do controle positivo
(MMS) no teste do MN, diferentemente da resposta obtida com o
ensaio do cometa.
Efetuando-se a comparação entre dose utilizada e efeitos
causados no teste do cometa, nota-se, exceto para DB, que quanto
maior a dose utilizada maior a genotoxicidade causada, seja em
número de células com cometa (Figura 1) seja em escore médio de
danos causados (Figura 3), demonstrando assim, efeitos diretamente
relacionados à dose testada (Figura 2). Este efeito teve relação
aproximadamente linear para IM, enquanto que para MM80 e IB a
relação foi quase exponencial, quando a dosagem mais alta, apesar
de ser igual ao dobro da anterior, causou efeito cerca de cinco vezes
maior. No teste de micronúcleo, o único tratamento que diferiu do
controle foi IM40 (Figura 4), a maior dosagem testada do infuso,
demonstrando, mais uma vez, correlação entre dose utilizada e efeito
nocivo causado.
Com relação ao doseamento de cumarina, o sistema por
cromatografia líquida de alta eficiência – UV (CLAE - UV) demonstrou
ser adequado em todos os parâmetros validados, com sensibilidade e
reprodutibilidade adequadas para o controle de qualidade de M.
glomerata (CELEGHINI et al., 2001).
Neste sistema, a análise do infuso (IM) e do macerado de
Mikania glomerata Sprengel em etanol 80% (MM80) mostrou uma
concentração de cumarina de 27,26μg/mL e 1500μg/μL,
respectivamente, o que permite determinar a quantidade de cumarina
presente em cada concentração testada (Tabela II). Os
cromatogramas (Figura 6) revelaram diversos picos divergentes entre
as duas soluções, tendo o macerado apresentado uma quantidade
maior de picos que o infuso. O pico da cumarina em IM foi de 9,331
minutos, enquanto que, em MM80 o pico ficou em 8,680 minutos.
Tabela I – Médias de células com cometa e de células com
micronúcleo obtidas nos tratamentos-controles e nos tratamentos com
infuso e macerado etanólico de Mikania glomerata Sprengel e infuso e
decocto de Bidens pilosa Liné, em células HTC.
Tratamento
(μL/mL)
Média de
células com
cometa ± DP
Classes de Cometa Escore de
danos
Média de
células com MN
± DP
0 1 2 3
PBS 7,7 ± 1,5 92,7 5,7 1,7 - 9,0 8,3 ± 1,2
MMS 99,0 ± 1,2 0,7 50,7 41,0 8,3 158,3 42,7 ± 3,1*
EtOH 80º 10 11,6 ± 2,5 88,3 9,7 2,0 - 13,7 -
EtOH 80º 20 11,7 ± 0,0 88,3 9,7 1,7 0,3 14,0 -
IM10 11,3 ± 4,6 89,3 11,0 - - 11,7 -
IM20 17,0 ± 5,0* 83,0 14,7 2,0 0,3 19,7 11,0 ± 1,7
IM40 31,7± 6,5* 68,3 29,7 2,0 - 33,7 14,7± 1,2*
MM80 2,5 8,0 ± 2,0 92,0 6,0 2,0 - 10,0 -
MM80 05 9,7 ± 1,5 90,3 7,7 2,0 - 11,7 11,7 ± 2,1
MM80 10 35,3 ± 1,5* 64,7 30,3 4,7 0,3 40,3 11,7 ± 1,5
MM80 20 99,3 ± 0,6* 0,3 18,3 76,0 5,3 186,3 -
IB10 18,3 ± 5,5* 81,7 17,3 1,0 - 19,3 -
IB20 39,3 ± 6,7* 60,7 32,3 5,0 2,0 48,3 11,7 ± 1,5
IB40 98,7 ± 2,3* 1,3 27,3 48,3 23,0 193,0 11,7 ± 0,6
DB10 19,3± 2,5* 80,7 19,0 0,3 - 19,7 -
DB20 17,0 ± 2,6* 83,0 16,0 1,0 - 17,7 9,0 ± 1,0
DB40 23,7 ± 3,0* 76,0 23,3 0,7 - 24,7 8,7 ± 0,6
PBS- tampão fosfato; MMS – metilmetanosulfonato; EtOH 80 – etanol 80%; IM – infuso de M. glomerata;
MM 80 – macerado de M. glomerata em etanol 80%; IB – infuso de B. pilosa; DB – decocto de B. pilosa;
DP - desvio padrão; MN – micronúcleo; * - diferença significativa em relação ao PBS a 5% de significância.
IM – Infusão de M. glomerata; MM80 – macerado de M. glomerata em
etanol 80%
Tratamento
(μL/mL)
Concentração final de cumarina
(μg/mL)
IM10 0,2726
IM20 0,5452
IM40 1,0904
MM80 2,5 3,78
MM80 5 7,5
MM80 10 15,0
MM80 20 30,0
Tabela II – Concentração final de cumarina presente nas soluções
usadas nos tratamentos in vitro com infuso e macerado em etanol 80%
de Mikania glomerata Sprengel
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
n.º médio de células com cometa
PBS
MMS
EtOH80
IM
MM80
IB
DB
tratamentos/
controles
Controles
2,5μL/mL
5μL/mL
10μL/mL
20μL/mL
40μL/mL
Figura 1 - Freqüência média de células HTC com cometa, obtida nos
controles: tampão fosfato (PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e
etanol 80% (EtOH 80) e nos tratamentos: infuso de M. glomerata
(IM), macerado de M. glomerata em etanol 80% (MM80), infuso de B.
pilosa (IB) e decocto de B. pilosa (DB), em diferentes concentrações.
0
20
40
60
80
100
PBS
MMS
EtOH 20
EtOH 40
IM 10
IM 20
IM 40
MM80 2,5
MM80 5
MM80 10
MM80 20
IB10
IB20
IB40
DB10
DB20
DB40
Tratamentos/controles
n.º médio de células com cometa
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Escore médio no teste do cometa
n.º médio de células com cometa
escore médio no teste do cometa
Figura 2 - Número médio de células HTC com cometa e respectivos escores médios obtidos nos controles:
tampão fosfato (PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e etanol 80% (EtOH80) e nos tratamentos: infuso de M.
glomerata (IM), macerado de M. glomerata em etanol 80% (MM80), infuso de B. pilosa (IB) e decocto de B.
pilosa (DB), em diferentes concentrações.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
escore médio
PBS
MMS
IM
MM80
IB
DB
Tratamentos/
controles
Controles
2,5μL/mL
5μL/mL
10μL/mL
20μL/mL
40μL/mL
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
n.º médio de células com MN
PBS
MMS
IM
MM80
IB
DB
tratamentos/
controles
Controles
05μL/mL
10μL/mL
20μL/mL
40μL/mL
Figura 3 – Escores médios obtidos nos controles: tampão fosfato
(PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e etanol 80% (EtOH 80) e nos
tratamentos: infuso de M.glomerata (IM), macerado de M. glomerata
em etanol 80% (MM80), infuso de B. pilosa (IB) e decocto de B. pilosa
(DB), em diferentes concentrações.
Figura 4 - Número médio de células HTC com MN obtido nos controles:
tampão fosfato (PBS), metilmetanosulfonato (MMS) e etanol 80%
(EtOH 80) e nos tratamentos: infuso de M. glomerata (IM), macerado
de M. glomerata em etanol 80% (MM80), infuso de B. pilosa (IB) e
decocto de B. pilosa (DB), em diferentes concentrações.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
PBS
MMS
IM20
IM40
MM80 5
MM80 10
IB20
IB40
DB20
DB40
Tratamentos/controles
n.º médio de células com cometa
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
n.º médio de células com micronúcleo
n.ºmédio de células com cometa
n.º médio de células com MN
Figura 5 – Comparação entre as médias dos resultados obtidos no teste do cometa e no teste do micronúcleo
para os controles: tampão fosfato (PBS) e metilmetanosulfonato (MMS) - e tratamentos: infuso de M.
glomerata (IM), macerado de M. glomerata em etanol 80% (MM80), infuso de B. pilosa (IB) e decocto de B.
pilosa (DB), aplicados em diferentes concentrações.
Figura 6. – Cromatogramas de infuso de M. glomerata (IM) e macerado de M. glomerata em etanol a 80%
(MM80) obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência-UV (CLAE-UV).
mV
0,00
200,00
400,00
600,00
Minutes
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
2,866
3,109
4,066
4,624
4,898
9,331
mV
0,00
100,00
200,00
300,00
Minutes
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
1,668
2,200
2,333
2,809
2,993
3,373
4,010
4,514
4,732
5,517
8,680
Cromatograma de infuso de M. glomerata Sprengel (IM) por CLAE-UV
Cromatograma de macerado de M. glomerata Sprengel em etanol 80% (MM80) por CLAE-UV
Discussão
Nas condições de avaliação utilizadas no presente estudo, as
duas plantas averiguadas, guaco (Mikania glomerata Sprengel) e
picão–preto (Bidens pilosa Liné) demonstraram genotoxicidade pelo
teste do cometa.
No caso de M. glomerata, ainda que o aumento de
genotoxicidade observado com o uso de sua infusão não tenha se
dado exatamente na mesma proporção do aumento da dose, esta
resposta foi dose-dependente. O macerado em etanol 80%, por sua
vez, assim como ocorreu com a infusão, apresentou genotoxicidade
nas doses mais elevadas. Este efeito genotóxico observado em MM80
certamente foi devido apenas às substâncias extraídas das folhas de
guaco, uma vez que ficou demonstrado que a diluição em etanol 80,
usado como controle de solvente, não causou genotoxicidade.
Comparando dosagens equivalentes de infuso e de macerado
de M. glomerata, ou seja, IM20 e MM80 5, ambos correspondentes ao
valor assumido como 100% da IDR, observou-se que as respostas
não foram as mesmas, sendo o primeiro genotóxico e o segundo não
genotóxico. Este resultado sugere que há diferenças na composição
química entre as duas formas extrativas utilizadas.
Pelas análises realizadas por cromatografia, foi demonstrado
que a quantidade de cumarina contida no macerado em etanol 80% é
cerca de 55 vezes maior que no infuso das folhas de M. glomerata. Os
picos de cumarina entre as duas formas extrativas analisadas
mostraram diferença de 0,651 minutos, ainda que esta diferença
possa ser aceitável para esse tipo de análise, em decorrência de uma
possível variação na climatização do laboratório entre uma análise e
outra.
Conforme apresentado pelos cromatogramas, onde ocorreu
uma quantidade diferente de picos para cada solução testada, pode-
se constatar que a concentração dos componentes das duas soluções
é realmente distinta. Contudo, apesar do cromatograma do macerado
apresentar maior concentração de cumarina e um maior número de
picos - e conseqüentemente, maior variedade de substâncias
componentes - que o cromatograma do infuso, IM apresentou
genotoxicidade na dose correspondente a 100% da IDR (IM 20),
enquanto MM80 só apresentou tal efeito a partir da dose de 200% da
IDR (MM80 10).
77
Em razão de ter sido empregada, neste estudo, uma linhagem
celular que possui propriedades metabolizadoras (HTC) próprias de
células de fígado de mamíferos, pode-se admitir que tanto essa
contradição observada entre concentração e efeito como as
diferenças entre os resultados obtidos tenham sido causadas não
somente pelos componentes detectados nos chás, mas também
causadas por substâncias resultantes da metabolização celular das
substâncias químicas presentes nestes chás.
Ainda corroboram esta hipótese as observações de que IM10
apresentou resultados estatisticamente iguais a MM80 2,5 e MM80 5,
apesar de estes últimos possuírem quantidade de cumarina,
respectivamente, 13,76 e 27,5 vezes maior que aquele. Por sua vez,
MM80 20, apresentou também uma quantidade de cumarina 27,5
vezes maior que IM40. Entretanto, comparando-se os respectivos
escores médios, a quantidade de dano que provocou foi muito
superior à quantidade causada por IM40. Neste mesmo teste do
cometa, ainda observou-se que, mesmo com uma quantidade de
cumarina 13,76 vezes maior, MM80 10 causou danos semelhantes ao
provocado por IM40. A mesma diferença de cumarina foi encontrada
entre MM80 5 e IM20. Contudo, neste caso, a maior genotoxicidade
78
foi apresentada justamente pelo tratamento com menor quantidade
dessa substância (IM20).
Por outro lado, no teste do micronúcleo, o único resultado que
diferiu estatisticamente do controle PBS foi IM40. Neste teste, nem
MM80 10, que apresenta quantidade de cumarina 13,76 maior, nem
IM20, com quantidade de cumarina 2 vezes menor que IM40,
apresentaram danos significativos.
Desta forma, com base nestes resultados, pode-se inferir que
a quantidade de cumarina nas amostras não interferiu na quantidade
de danos observada tanto no teste do cometa como no teste do
micronúcleo. Deve-se assim admitir que outras substâncias podem ter
sido responsáveis por produzir esses efeitos. Vale lembrar que pode
haver ainda, tanto no infuso quanto no macerado em etanol 80%,
substâncias não detectadas pelo método cromatográfico empregado,
ou por não absorverem luz UV ou por absorverem luz UV com
comprimento de onda diferente do utilizado no presente estudo.
Apesar de observações anteriores de que cumarinas presentes
nas folhas in natura de M. glomerata são potenciais substâncias para
o tratamento de câncer (LIN et al., 1996) com relatada atividade
antitumoral (FÁTIMA et al, 2005), verificou-se neste trabalho que a
79
cumarina presente no chá não foi a responsável direta pelas
atividades genotóxica ou mutagênica demonstradas neste sistema,
além disso também não houve indicação de que ela possua
propriedade protetora contra danos induzidos pelo MMS no material
genético de células HTC.
Com relação ao Bidens pilosa, a genotoxicidade do infuso nas
três dosagens usadas no teste do cometa mostrou evidente relação
dose-resposta, tanto em número de células danificadas quanto no
escore de cometas, o que demonstra aumento acentuado na
qualidade do dano ocorrido. O decocto apresentou genotoxicidade,
mas com efeitos mais brandos se comparados à respectiva dosagem
da infusão, além de não demonstrar uma relação de dose-
dependência. A menor genotoxicidade do decocto em relação à do
infuso, especialmente nas duas concentrações mais elevadas, sugere
distinção na composição química das duas formas de chás obtidos
desta planta. Esta sugestão está amparada por Simões et al. (2001)
que defendem que a decocção é uma técnica a ser empregada em
número restrito de drogas, dado que muitos dos princípios ativos
nelas existentes são alterados por um aquecimento prolongado.
80
Assim, para B. pilosa admite-se que a maior temperatura
empregada na preparação do decocto pode ter provocado
desnaturação ou inativação de algum princípio ativo da planta,
causando assim diminuição de seu efeito. Por outro lado, para M.
glomerata, uma vez que os cromatogramas de IM e MM80
demonstraram que a concentração de substâncias extraídas no
primeiro foi muito inferior ao encontrado no segundo, admite-se que a
maceração em etanol 80% é um processo mais eficiente para
extração daquelas substâncias que absorvem UV no comprimento de
onda utilizado na técnica de CLAE-UV.
Desta forma, pode-se sugerir que a diferença de genotoxicidade
observada no teste do cometa, seja entre IM e MM80 seja entre IB e
DB, demonstra a capacidade diferenciada de extração das técnicas
empregadas.
No caso do estudo de B. pilosa pelo teste do micronúcleo,
dentre as soluções testadas, nenhuma diferiu do resultado obtido no
controle negativo. Mesmo IB40, que demonstrou grande
genotoxicidade, teve resultado não significativo neste teste.
Considerando que neste teste o único tratamento que causou
diferenças significativas do controle PBS foi IM40 pode-se sugerir que
81
os danos causados pelo infuso de Bidens pilosa (IB) têm natureza
diferente dos causados pelo infuso de M. glomerata (IM). Valentin-
Severin et al. (2003) ressaltam que a diferença entre os testes do
cometa e do MN consiste basicamente na variação do tipo de
alteração detectada no DNA: teste do cometa detecta lesões primárias
no DNA, freqüentemente reparáveis, enquanto teste do MN detecta
lesões irreparáveis. Os danos detectados no teste de cometa, em pH
alcalino, são principalmente quebras de fita simples, além de quebras
de fita dupla, lesões álcali-lábeis e excisões indiretas promovidas por
enzimas de reparo (VAMVAKAS e VOCK, 1997; SINGH et al., 1988 e
LOPEZ e VALVERDE, 1999). Assim, o infuso de Mikania glomerata
(guaco) poderia estar causando danos não recuperáveis pelo sistema
de reparo celular (SIMMONS e SNUSTAD, 2001) enquanto os danos
induzidos pelo infuso de Bidens pilosa seriam reparáveis pela célula,
com o que se poderia, inclusive, inferir que estes seriam
principalmente quebras de fitas simples do DNA.
Apesar de ser reconhecida a presença de compostos fenólicos
em Bidens pilosa, importantes na prevenção de diversas doenças
(ROSE e KASUN, 2002), em especial a presença de quercetina, uma
substância polifenólica com comprovada ação antioxidante in vivo e in
vitro (WILMS et al, 2005 e DUTHIE et al., 1997) e atividade
82
anticarcinogênica (VAN ACKER et al., 1996), verificou-se neste
trabalho que os chás desta planta mostraram atividade genotóxica.
Estas observações permitem sugerir que as formas extrativas
utilizadas no presente estudo possuem, em sua composição,
princípios ativos que neutralizaram os efeitos protetores da
quercetina, no caso de Bidens pilosa. Simões et al. (2001) postulam
que as condições de produção podem alterar a concentração das
substâncias ativas, e por conseqüência, o efeito, a eficácia e a
segurança terapêutica dos produtos fitoterápicos. Além disso, pode-se
admitir ter ocorrido, durante a produção das formas extrativas
testadas, além da inativação de princípios ativos, o surgimento de
outras substâncias com efeitos danosos ao material genético, pois
segundo Jagerstad e Skog (2005), o processamento de alimentos e o
cozimento a altas temperaturas têm demonstrado gerar vários tipos de
substâncias genotóxicas.
Desta forma, os resultados do presente trabalho sugerem
cuidados na utilização dessas plantas em preparações de consumo
oral, uma vez que indicaram que nas doses mais elevadas (referentes
a doses acima da IDR) ocorrem danos ao DNA mais significativos.
83
Considerações finais
As informações obtidas no presente estudo demonstram que,
mesmo com diversas propriedades terapêuticas, tanto M. glomerata
quanto B. pilosa não estão isentas de efeitos nocivos, o que levanta a
necessidade de cuidados na utilização das mesmas como
fitoterápicos. A relação dose utilizada/efeito observado sugere, por
sua vez, que a ingestão de grandes quantidades destas formas
extrativas pode tornar-se prejudicial do ponto de vista genético,
sobretudo para células já submetidas a uma condição de estresse,
como no caso de algum processo patológico instalado, caso esses em
que se costuma utilizar fitoterápicos na tentativa de cura.
Assim, convém ressaltar que, conforme demonstrado, a escolha
da forma de preparo do fitoterápico tem uma importância muito
relevante tanto no efeito desejado quando no efeito adverso sobre o
DNA.
A necessidade de estudos adicionais se faz presente, a fim de
esclarecer sobre quais seriam as condições de uso que poderiam
oferecer os benefícios das propriedades terapêuticas dessas plantas
sem colocar em risco a saúde da população humana.
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