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RODRIGO JULIANO OLIVEIRA
Mecanismos de ação e efeito protetor de danos no DNA
do polissacarídeo β-glucana em testes in vitro e in vivo
Londrina
2006
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RODRIGO JULIANO OLIVEIRA
Mecanismos de ação e efeito protetor de danos no DNA
do polissacarídeo β-glucana em testes in vitro e in vivo
Dissertação apresentada ao curso de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani
Londrina
2006
2
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RODRIGO JULIANO OLIVEIRA
Mecanismos de ação e efeito protetor de danos no DNA
do polissacarídeo β-glucana em testes in vitro e in vivo
Dissertação apresentada ao curso de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª. Drª. Veronica Elisa Pimenta
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
Profª. Drª. Ilce Mara de Syllus Cólus
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
3
Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
O48m Oliveira, Rodrigo Juliano.
Mecanismos de ação e efeito protetor de danos no DNA de polissa-
carídeo β-glucana em testes in vitro e in vivo / Rodrigo Juliano
Oliveira. – Londrina, 2006.
179f. : il.
Orientador: Mário Sergio Mantovani.
Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Univer-
sidade Estadual de Londrina, 2006.
Inclui bibliografias.
1. Ácido desoxirribonucleico – Teses. 2. Polissacarídeos – Teses. 3.
Antimutagênese – Teses. 4. Genética molecular – Teses. I. Mantovani,
Mário Sérgio. II.Universidade Estadual de Londrina. III. Título.
CDU 575.1
4
DEDICATÓRIA
5
AOS MEUS PAIS: SONIA E WAGNER
Mãezinha,
Foi tão fácil fazer as outras dedicatórias... A monografia de bacharelado, a de
licenciatura e a de pós-graduação... Em todas existia mais uma figura que com a senhora
me ajudar a seguir sempre em frente.
Recordo-me hoje de todas as dificuldades enfrentadas. Lembro-me do dia em
que vocês foram me levar à rodoviária e o quanto chorei quando deixei a casa paterna.
Sentia que ali, com você e com o Pai, ficava toda uma vida.
Os primeiros tempos foram de muita dor. Mas, depois entendi que o meu destino
era seguir... Era tomar conta da maior herança que os pais podem deixar para os seus
filhos: os estudos.
No entanto, no meio desta grande corrida nós perdemos alguém muito
importante. Este ano, que está se findando, foi o de maiores transformações para todos
nós. Lembro-me que no meio de tantas outras sempre existia uma coisa que não se
alterava... Acontecesse o quê acontecesse sabia que era só pegar o telefone e pedir
socorro que a senhora e o pai estavam sempre prontos a ajudar.
Num domingo destes, que se passou isso deixou de ser verdade. Hoje o Pai não
está mais conosco. Ou está. Não sei... O que sei é que apesar de tudo não me sinto
sozinho.
Uma amiga que sempre esteve comigo neste ano, tão difícil, diz que durante a
noite eu ainda chamo por ele. Engraçado que eu nunca me lembro dos meus sonhos.
Mas, no meio deste espanto eu agradeço a Deus por ter me dado a solidez de nossa
família porque foi por isso que consegui trilhar todos os caminhos até aqui.
Hoje encerra mais uma etapa. Aquela que principalmente a senhora, o Pai e eu
sonhamos desde novembro de 2003. Desta forma dedico à senhora e a ele esta
dissertação e aproveito para agradecer O AMOR QUE TRANSPÔS INCÓLUME
ETAPAS TÃO DIFÍCEIS.
6
A DEUS
Hoje ainda não consigo precisar o quanto me fez forte para chegar até aqui. Mas,
agradeço a cada uma das dificuldades e pela capacidade de acreditar que todas elas
foram para o meu crescimento. Faltam-me palavras, por isso escolho estas que já se
fazem tão conhecidas:
NENHUM CAMINHO É TÃO LONGO QUANDO SE LEVA UM AMIGO...
Mas às vezes me pergunto:
“Meu Deus, meu Deus, porque me abandonastes?
(Mt 27,46)”
No entanto, a resposta é rápida.
“... Jesus não se deixa vencer pela dor; como que por uma alquimia divina, Ele
transforma a dor em amor, em vida...
Neste sofrimento eu te amo, Jesus Abandonado. És tu que, assumindo como tua
a minha dor, vens me visitar. Então eu te quero, te abraço!”
Chiara Lubic
Março/2005.
7
AGRADECIMENTOS
8
Ao Mestre Prof. Dr. MÁRIO SÉRGIO MANTOVANI,
Lembro-me ainda daquela sexta-feira quando estive aqui pela primeira vez e na
qual lhe pedi a oportunidade de concorrer à vaga do mestrado. Quando voltei para casa
fiquei pensando se realmente teria a oportunidade de desfrutar destes dois anos de
convivência. Quando saí da prova pensei não ter passado. Mas, para minha surpresa no
ano de 2004 estava aqui sob sua orientação.
Confesso que não foi simples mudar de área e sempre tinha a dúvida se eu iria
corresponder às suas expectativas. Aprendi muito neste período seja com a convivência
com o pesquisador ou com o amigo.
Gostaria de agradecer por acreditar em mim, me encorajar, me fazer refletir e me
apoiar quando disse querer fazer a integração entre a genética toxicológica e a biologia
do desenvolvimento, minha antiga área de pesquisa.
“Nós sempre temos tendência de ver coisas que não existem,
e ficar cegos para as grandes lições que estão diante dos nossos olhos.”
De o Diário de um Mago
Assim, agradeço pelos ensinamentos até o momento e espero que continue a
aprender muito com o senhor durante o Doutorado o qual certamente iniciaremos logo.
À Professora Dra. LÚCIA REGINA RIBEIRO,
Pelo apoio incondicional no início desta nova fase: o doutorado.
À Professora Dra.
MARIA JOSÉ SPARÇA SALLES DE FARIA,
“Para atingir seu sonho, o guereiro da luz precisa de uma vontade firme e de uma
imensa capacidade de entrega. Embora tenha um objetivo, nem sempre o caminho pra
atingí-lo é aquele que se imagina.”
De Manual do Guereiro da Luz
9
Assim, gostaria de agradecer por acreditar nos meus objetivos e auxiliar-me a
encontrar o caminho correto. Obrigado pelos conselhos, pela amizade e por ter me
recebido em seu laboratório para que pudesse concretizar parte de meu sonho.
Aos meus irmãos ELKA, ADRIANO, LUCIANO,
Muitas são as divergências, os sonhos tão diferentes. Porém, uma coisa é comum
a dedicação de cada um de vocês para que eu chegasse até aqui. Obrigado pelas
renúncias que tiveram que fazer para que nossos pais pudessem me ajudar a realizar
mais este sonho. Vocês são e sempre serão parte deste sonho agora já sonhado.
À
ADRIANE E VICTÓRIA,
Drica, obrigado por ter vindo fazer parte de nossa família. E mais uma vez
obrigado pela dom da vida de Victória. Obrigado ainda por acreditar no meu potencial,
ser tão disprendida e por isso ter me ajudado tanto nestes anos que estou fora de casa.
Vitória, obrigado por ter amadurecido tão depressa e por ter divido as alegrais e
dificuldades destes últimos tempos. Obrigado pela cumplicidade e pela solidariedade.
Aos meus familiares, na magnífica pessoa da minha
VÓ MAURA,
Todos vocês sabem que contribuíram para minha formação. Mas, aproveito a
oportunidade de agradecer-lhe na pessoa da vó. Obrigado por mais este ano de
convivência e auxílios constantes. Nunca mais me esquecerei desta pessoa amiga que
descobri na senhora. Desculpe-me por ter sido um neto tão arredio nos primeiros
tempos.
À amiga
BEATRIZ ALVES ALMEIDA,
Você já deve estar cansada de ler ou de ouvir isso. Mas, eu não me canso.
Obrigado por me fazer entender que um dia precisamos deixar a casa paterna para
alcançarmos os nossos objetivos e concretizarmos os sonhos. Enfim, que precisamos
seguir o desígnio que Deus nos propõe.
10
À irmã CLISIA MARA CARREIRA,
Dizer-te o quê meu grande Amor? Você sabe que fez e que faz parte da minha
vida. Os momentos são tantos que nem conseguiria listá-los. Obrigado por ajudar-me, a
saber, para onde caminhar e por entender-me e apoiar-me em todas as circunstâncias.
Sei que este ano fiquei em falta com você. Mas, prometo ser mais atencioso e quero que
nossas vidas voltem a ser eternos espetáculos de luzes e danças. Enfim, nascemos para a
dança, para as luzes, para o calor humano. Nossas vidas acadêmicas, na verdade, são
apenas os passatempos preferidos. Continue brilhando como sempre.
Às famílias
CANÔNICO e CARREIRA,
A minha adaptação no Paraná foi muito facilitada porque todos vocês
acolheram-me como se eu realmente fosse um membro da família e até hoje me sinto
neto, filho, primo. Enfim, um membro destas famílias que de forma tão especial me
acompanharam nestes dois anos. Mãe Deise, obrigado pelo carinho. Obrigado pela
presença na qualificação.
Às irmãs
ARIANE FERNANDA DA SILVA e RENATA MATUO,
Meninas é tão difícil dizer o quê cada uma de vocês representa para mim... Mas,
vou tentar...
“O caminho ao triunfo torna-se solitário, porque a maioria dos homens não está
disposta a enfrentar e vencer os obstáculos que se escondem nele. A capacidade de dar
esse último passo, quando estás esgotado, é qualidade que separa os ganhadores dos
demais corredores.”.
Vocês me ajudaram a vencer. Empuraram-me para dar os últimos passos. Re,
obrigado por todas ajudas e auxílios. Ari, obrigado pela presença constante, por todos os
momentos, aflições e felicidades compartilhadas. Saibam que possuem raízes em meu
coração e que daqui jamais sairão.
11
À ANA CAROLINA DOS SANTOS LOURENÇO, TATIANE YUMI
NAKAMURA KANNO e VÉSSIA DA SILVA LEITE,
Obrigado pela ajuda incondicional. Obrigado por tão bem me receberem no
grupo de pesquisa de Reprodução Animal. Cada uma de vocês possui uma característica
que as tornam especiais. Mas, com uma coisa em comum: a capacidade de se doar aos
amigos.
Aos amigos dos primeiros dias
ALINE POERSCH, MARILANDA
FERREIRA BELLINI e LEONARDO NEVES CABRIOTI,
Pelo auxílio nos primeiros passos no Laboratório de Mutagênese in vitro. Mari,
obrigado pelos sorrisos diários e que me ajudaram a superar os períodos de adaptação.
Pena que hoje não está mais conosco. Mas, continuo torcendo por você. Aline, por
sempre me encorajar e me ajudar em tantas decisões difíceis. Obrigado por me
acomapanhar e estar presente até hoje.
À amiga
MARIANA BERTOLOTTI ALVES PEREIRA,
Obrigado pelos muitos momentos compartilhados. Pelas imensas ajudar no RU e
pelo desprendimento e dedicação demonstrado em todos os dias destes dois anos.
À unidade GEN de Londrina nas pessoas de
DOMINGOS, GEISON, LUCAS
e
LUÍS ÂNGELO,
Pelo companheirismo e total apoio neste período em Londrina. Pelas
experiências compartilhadas e pela vida sempre doada.
Às professoras
ANA LÚCIA DIAS e LÚCIA GIULIANO CAETANO,
Pela compreensão, momentos de desabafos e auxílios nestes dois anos.
12
À professora ROSÂNGELA MARIA PINTO MOREIRA,
Pelos auxílios nas análises estatísticas.
À professora
LEDA MARIA KOELBLINGER SODRÉ,
Pelas conversas e conselhos no início do curso.
Às professoras
ANA LÚCIA DIAS, BERENICE QUINZANI JORDÃO,
ILCE MARA DE SYLLUS CÓLUS E VERONICA ELISA PIMENTA,
Por aceitarem participar de minhas bancas de qualificação e defesa de
dissertação de mestrado. Pelas contribuições para a redação final dos artigos.
Aos amigos
DÁRIO, MELISSA E SUELI,
Pelas ajudas incessantes. Pelos socorros nas autoclavegens no material e nos
apuros para compreender os direitos de deveres de um mestrando. Pelo ombro amigo na
hora dos choros e das dificuldades. Pelos conselhos e cumplicidade.
À
CAPES, CNPq E FUNDAÇÃO ARAUCÁIA : Pela bolsa de estudo e
pelo finaciamento do projeto de pesquisa.
Ao PROGRAMA DE MESTRADO EM GENÉTICA:
Pelas oportunidades proporcionadas e pela formação a mim doada.
Aos amigos do MESTRADO e do DEPARTAMENTO de BIOLGIA
GERAL: Discentes, Docentes e Funcionários.
13
RESUMO
OLIVEIRA, Rodrigo Juliano. Mecanismos de ação e efeito protetor de danos no DNA
do polissacarídeo β-glucana em testes in vitro e in vivo. 2005. 179p. Dissertação
(Mestrado em Genética e Biologia Molecular) – Universidade Estadual de Londrina –
PR.
Atualmente, um grande número de substâncias que contaminam o ambiente são
advindas de ações antropogênicas e estão relacionadas ao aparecimento de
14
patologias crônicas como o câncer. Muitos medicamentos usados em diferentes
terapias alopáticas não possuem uma adequada avaliação e por isso observam-se
diferentes efeitos colaterais, dentre eles alterações nas moléculas de DNA que podem
também relacionar-se ao aparecimento de cânceres. Frente a estes fatos e aos estilos
de vida, faz-se cada vez mais necessário a identificação de substâncias com potencial
quimiopreventivo. Devido à possibilidade de a dieta controlar e modular várias funções
orgânicas e contribuir para a manutenção da saúde humana, reduzindo o risco de
aparecimento de patologias, este estudo teve por objetivo avaliar o mecanismo de
ação do polissacarídeo de β-glucana, constituinte de alimentos funcionais, bem como
compreender seus efeitos como um agente antigenotóxico, antimutagênico e a sua
capacidade de preservação da viabilidade celular em testes in vitro em células CHO-
k1, CHO-xrs5 e HTC. Em sistemas-teste in vivo, camundongos Swiss (Mus musculus),
pretendeu-se avaliar a influência da β-glucana no desempenho reprodutivo e
desenvolvimento da prole, assim como verificar sua capacidade preventiva em danos
mutagênicos, teratogênicos e em alterações na performance reprodutiva causados por
exposição à ciclofosfamida. A presente pesquisa demonstrou que independentemente
da origem da β-glucana, extraída de cevada ou Saccharomyces cerevisiae, esta
possui tanto atividade por desmutagênese como por bioantimutagênese frente a
agentes indutores de danos de ação direta e indireta. A avaliação dos diferentes
protocolos e das porcentagens de redução de danos em células proficientes em
metabolismo permite sugerir que o polissacarídeo em questão possui uma menor
eficiência em bioantimutagênese. Assim, os experimentos realizados com células
deficientes em reparo, CHO-xrs5, confirmam esta hipótese. Faz-se ainda necessário
relatar que a β-glucana melhora o índice de viabilidade celular, prevenindo eventos de
apoptose, e que a eficiência e determinação do mecanismo de ação estão sujeitos a
variações quando comparadas as duas linhagens celulares, visto que em HTC,
sistema metabolizador, o polissacarídeo em estudo pode ter sua eficiência
quimiopreventiva diminuída, podendo levar a conclusões errôneas a respeito de seu
mecanismo de ação. Os estudos in vivo indicam que a β-glucana foi eficiente em
prevenir danos clastogênicos tanto em fêmeas prenhes como não prenhes. Demonstrou
ainda que as fêmeas grávidas parecem ser mais susceptíveis aos danos genéticos. Já os
efeitos teratogênicos não foram prevenidos de forma eficiente. No entanto, apesar da β-
glucana não ter prevenido as malformações ela mostrou-se muito eficiente no aumento
da viabilidade fetal e redução das taxas de perdas pós-implantacional e reabsorção
demonstrando-se assim uma melhora da performance reprodutiva. Assim, verifica-se
que a β-glucana possui baixo potencial na prevenção de malformações, mas quando
presente em alimentos, confere a este características nutracêuticas, podendo participar
da suplementação de dietas ou talvez compor um novo fármaco a ser utilizado na
prevenção de danos genéticos e como adjuvante nas quimioterapias às quais pacientes
oncológicos são submetidos.
15
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................................1
1. 1. Alimentos Funcionais.......................................................................................................................4
1.2. Caracterização das Atividades da β-Glucana ....................................................................................7
1.3. Aspectos da Antimutagênese...........................................................................................................14
1.4. Cultura de Células ...........................................................................................................................17
1.5. Ensaios Biológicos in vitro..............................................................................................................20
1.5.1. Ensaio do Micronúcleo com Bloqueio de Citocinese...............................................................20
1.5.2. Ensaio do Cometa.....................................................................................................................21
1.5.3. Ensaio de Viabilidade Celular ..................................................................................................23
1.6. Sistemas-teste in vivo......................................................................................................................24
1.6.1. Ensaio do Micronúcleo em Sangue Periférico..........................................................................26
1.6.2. Ensaio de Teratogenicidade......................................................................................................27
1.6.2.1 Obtenção dos Fetos e Avaliação da Performance Reprodutiva..............................................28
1.6.2.2. Exame dos Fetos para a Detecção de Anormalidades Externas, Viscerais e Esqueléticas ....29
2. OBJETIVOS...........................................................................................................................................30
2.1. Objetivo Geral.................................................................................................................................30
2.2. Objetivos Específicos......................................................................................................................30
3. ARTIGO 1..............................................................................................................................................32
Resumo...................................................................................................................................................34
1. Introdução...........................................................................................................................................35
2. Material e Métodos.............................................................................................................................37
2.1. Agentes Químicos............................................................................................................................37
2.2. Linhagens Celulares....................................................................................................................37
2.3. Teste de Micronúcleo em Células Binucleadas...........................................................................38
2.4. Análises das Lâminas e Estatística..............................................................................................40
3. Resultados ..........................................................................................................................................41
4. Discussão............................................................................................................................................43
5. Referências:........................................................................................................................................50
4. ARTIGO 2..............................................................................................................................................58
Resumo...................................................................................................................................................59
1. Intodução............................................................................................................................................61
2. Material e Métodos.............................................................................................................................62
2.1. Agente indutor de danos no DNA................................................................................................62
2.2. Extração das
β
-glucanas.............................................................................................................62
2.3. Linhagem Celular........................................................................................................................63
2.4. Teste de micronúcleo com bloqueio de citocinese.......................................................................64
2.5. Teste do cometa...........................................................................................................................66
2.6. Cálculo da Porcentagem de Redução de Danos .........................................................................68
2.7. Teste de Viabilidade Celular.......................................................................................................69
3. Resultados ..........................................................................................................................................70
4. Discussão............................................................................................................................................74
5. Referência:..........................................................................................................................................84
5. ARTIGO 3..............................................................................................................................................93
1. Introdução...........................................................................................................................................96
2. Material e Métodos.............................................................................................................................97
2.1. Agente indutor de danos no DNA e teratógeno...........................................................................97
2.2. Extração e preparação da
β
-glucana..........................................................................................98
2.3. Animais e delineamento experimental.........................................................................................98
2.4. Ensaio de teratogenicidade.........................................................................................................99
2.5. Ensaio do micronúcleo em sangue periférico............................................................................101
3. Resultados ........................................................................................................................................103
3.1. Ensaio de teratogenicidade.......................................................................................................103
3.2. Ensaio do micronúcleo em sangue periférico............................................................................107
4. Discussão..........................................................................................................................................109
5. Referência:........................................................................................................................................117
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...............................................................................................................138
7. REFERÊNCIAS ...............................................................................................................................141
ANEXOS..................................................................................................................................................162
Anexo 1 - Manuscript Submission for CELL BIOLOGY AND TOXICOLOGY ...............................163
Anexo 02 - Manuscript Submission for TOXICOLOGY IN VITRO ..................................................168
Anexo 03 - Manuscript Submission for REPRODUCTIVE TOXICOLOGY......................................174
17
1. INTRODUÇÃO
O grande número de substâncias que contaminam o ambiente em que vivemos
são advindas das ações antropogênicas e verifica-se um aumento crescente dos resíduos
industriais, agronômicos, domésticos e urbanos decorrentes do desenvolvimento das
sociedades modernas. Os compostos químicos, físicos, poluição e agitação da vida
moderna apresentam riscos potenciais para a saúde humana e estes podem assumir
características benéficas, neutras ou prejudiciais quando da interação com os
organismos vivos.
A genética toxicológica, com o uso de diversos sistemas-teste lança um olhar
crítico sobre compostos que podem causar efeitos prejudiciais ao homem e outros seres
vivos. Desta forma, esta ciência tem um importante papel na identificação de agentes
genotóxicos e protetores.
A triagem de produtos químicos e amostras ambientais têm em ensaios
microbianos uma rotina de fácil execução e grande utilidade (RABELLO-GAY et al.,
1991). Os testes de mutagenicidade de muitas substâncias em microrganismos
apresentam boa correlação com seu potencial carcinogênico em animais superiores e
oferecem vantagens quanto ao custo e rapidez, mas essa associação pode ser falha, em
alguns casos, devido à simplicidade e estrutura dos microrganismos e à capacidade
metabólica dos sistemas. Assim, em geral, são mais relevantes os ensaios in vivo e in
vitro, os quais são capazes de detectar mutações e alterações cromossômicas, usando
plantas, insetos e mamíferos, inclusive o homem (BRUSICK, 1987).
Segundo Brusick (1987) os ensaios mais usados para a avaliação da indução de
mutações e danos cromossômicos são aqueles que utilizam células de mamíferos, como
por exemplo, células de linfoma de ratos, V79 (pulmão de hamster Chinês) ou CHO
(ovário de hamster Chinês). Testes in vitro permitem avaliações de indução de danos no
DNA como alterações cromossômicas, trocas entre cromátides irmãs, mutações gênicas
e micronúcleos, dentre outros. Dentre os testes in vivo pode-se citar o ensaio do letal
dominante, alterações cromossômicas, micronúcleos e mutações em locus específico
(BRUSICK, 1987).
Os estudos na área de mutagênese têm por objetivo, na sua grande maioria, fazer
uma correlação entre os resultados obtidos e os possíveis efeitos causados ao homem e
este fato faz dos sistemas-teste com mamíferos os mais aceitáveis. No entanto, sistemas
com outros animais, vegetais e microrganismos podem ser indicados segundo a
finalidade do estudo, do tipo de material a ser avaliado e das condições laboratoriais
existentes (BRUSICK, 1987).
Em princípio, os pesquisadores reconheceram que a carcinogenicidade e
mutagenicidade dos agentes químicos estavam correlacionadas, uma vez que a maioria
dos carcinógenos químicos pode interagir com o material genético. Estudos
apresentavam informações suficientes sugerindo que o câncer pode ser induzido por um
evento mutacional (AMES et al., 1973; VOGEL, 1982), o qual é responsável pela
ativação de proto-oncogenes e inativação de genes supressores tumorais (McKELVEY-
MARTIN et al., 1998).
Os proto-oncogenes são genes que estão envolvidos em funções celulares
normais, mas que são equivalentes a oncogenes carregados por alguns retrovírus. Em
certos casos, mutações ou a ativação aberrante dos mesmos, na célula, está associada à
formação de tumores. A ativação de um oncogene representa um evento de ganho de
função, no qual um proto-oncogene celular é ativado inapropriadamente. Isto pode
envolver uma modificação mutacional da proteína, uma ativação constitutiva da
2
expressão do gene, a sua superexpressão ou a falha na inativação da sua expressão no
momento adequado (LEWIN, 2001).
Os supressores tumorais são detectados por deleções ou outras mutações
inativadoras que são tumorigênicas. A evidência mais convincente da natureza destes
genes é fornecida por certos cânceres hereditários, que se desenvolvem em pacientes
que perderam ambos os alelos e, portanto, não possuem um gene ativo. Uma mutação
em um supressor pode representar uma perda de função em genes que normalmente
impõem alguns limites ao ciclo celular ou ao crescimento celular (LEWIN, 2001).
Agentes químicos ambientais são importantes fatores tanto em termos de
desenvolvimento como de prevenção do câncer. O fato de eventos mutagênicos serem
de grande importância em carcinogenicidade sugere que certos cânceres humanos
podem ser prevenidos pela identificação de agentes mutagênicos no ambiente
(FERRARI, 1991). Também, atualmente, existe um grande interesse na identificação de
substâncias presentes no meio que possuem atividade protetora contra o câncer a fim de
resguardar as gerações futuras. Desta forma, as pesquisas em mutagênese destacam-se e
os testes genéticos tornam-se cada vez mais úteis no rastreamento de agentes com
potencial oncogênico e mutagênico, demonstrando que é cada vez mais urgente a
utilização de métodos confiáveis capazes de detectar e medir danos causados no DNA
(FERRARI, 1991), bem como estabelecer possibilidades de proteção e/ou redução
desses.
3
1. 1. Alimentos Funcionais
Diversos estudos, investigações epidemiológicas e experimentos in vivo e in
vitro, demonstram que existe uma associação inversamente proporcional entre o
consumo de frutas e verduras ricas em ácido ascórbico, fitoestrógenos e carotenóides,
por exemplo, e o risco de desenvolvimento de cânceres e outras patologias (FLAGG et
al., 1995; WEISBURGER, 1999; ZHANG et al., 1999; WEISBURGER, 2000;
FERRARI, 2001; FERRARI & TORRES, 2002).
O principal grupo de agentes inibidores da carcinogênese é representado por
antioxidantes, bloqueadores de radicais livres. Além destes há os indutores da morte
celular, inibidores enzimáticos (inibidores das enzimas do citocromo P450), inibidores
da angiogênese, antagonistas de fatores de crescimento, hormônios e agentes
reparadores de lesões do DNA (KLEINER, 1997; KELLOFF et al., 1999).
Os antioxidantes são substâncias que, mesmo presentes em baixas
concentrações, são capazes de atrasar ou inibir as taxas de oxidação (MAXWELL,
1995; SIES, 1999). A classificação mais utilizada para estas substâncias é a que as
divide em dois sistemas: enzimático, composto pelas enzimas produzidas no organismo
e não enzimático, composto pelas vitaminas e outros compostos naturais tais como
flavonóides, licopenos e bilirrubinas (SIES, 1999).
Ferrari & Torres (2002) descreveram várias substâncias com efeitos
antimutagênicos, tais como: ácido fólico, cálcio, catequinas, fenitil-isotiocianatos,
indole-3-carbinol, isoflavonóides, limoneno, vitamina D, E, selênio, retinóides e
reserveratrole. O ácido fólico, presente principalmente no espinafre, brócolis e alface,
está descrito como capaz de auxiliar no reparo de lesões do DNA. O cálcio, encontrado
principalmente nos derivados do leite, possui a capacidade de induzir apoptose e liga-se
aos ácidos biliares que são agentes ativos na produção de radicais livres. As catequinas,
4
encontradas nos chás verdes e preto, promovem inibição do citocromo P450 e da
cicloxigenase, promovem ainda inibição de angiogênese, induzem apoptose de células
tumorais, em especial as prostáticas. Os limonenos, presentes, principalmente, nas frutas
cítricas, possuem atividade inibitória da enzima farnesil-transferase que age na ativação
de proto-oncogenes. A vitamina D que induz apoptose e diferenciação celular está
presente em óleos e gorduras vegetais. No entanto, esta atividade esta intimamente
relacionada à exposição ao sol. A vitamina E e o selênio apresentam propriedades
semelhantes e são capazes de promover imunoestimulação e diminuição das espécies de
oxigênio reativas. A vitamina E é vastamente encontrada em óleos e gorduras, já o
selênio em vegetais verdes cultivados em solos ricos neste elemento. Os retinóides
promovem inibição da enzima tumoral ornitina-descarboxilase (ODC), do Fator de
crescimento insulina símile (IGF-I) e da angiogênese, além de ativar apoptose pela
indução das caspases e inibição da telomerase, e indução de diferenciação do Fator de
crescimento transformante-β (TGF-β). Os reserveratroles são encontrados nas cascas de
uvas, sucos e vinhos tintos. Estes compostos causam indução de morte de células
cancerígenas e inibição da interação de hormônios androgênicos com seus receptores
em células de câncer prostático, principalmente (FERRARI & TORRES, 2002).
Os antioxidantes agem em três linhas de defesa orgânica contra as espécies de
oxigênio reativas: (I) prevenção, que se caracteriza pela proteção contra formação das
substâncias agresssoras; (II) interceptação de raticais livres, os quais uma vez formados
iniciam suas atividades de danificação do DNA (KONG & LILLEHEI, 1998; SANTOS
& CRUZ, 2001); (III) quando a prevenção e interceptação não foram efetivas e os
subprodutos da atividade dos radicais livres estão sendo continuamente formados em
baixas quantidades, podendo se acumular no organismo, há a necessidade dos mesmos
serem encaminhados à excreção pelas enzimas de detoxicificação ao mesmo tempo que
5
os mesmos antioxidantes modulem o sistema de reparo de DNA das células que estão
sendo atacadas.
Os alimentos que possuem agentes antioxidantes constituem um dos principais
grupos de alimentos com propriedades funcionais, conhecidos também como
nutracêuticos ou fármaco-alimentos (FERRARI & TORRES, 2002).
O conceito de alimentos funcionais provém da hipótese de que a dieta alimentar
possa controlar e modular várias funções orgânicas, contribuindo para a manutenção da
saúde e reduzindo o risco do aparecimento de patologias (BORGES, 2001).
Os alimentos funcionais possuem marcadores biológicos de sua função no
organismo. Estes marcadores são, por exemplo, aumento do número de bactérias não-
patogênicas no organismo, as quais auxiliam na digestão e absorção de nutrientes,
aumento da tolerância à lactose e imunoestimulação (BORGES, 2001).
Para que um alimento seja classificado como funcional ele deve: (I) exercer efeito
metabólico ou fisiológico que contribua para a saúde física e para a redução do risco de
desenvolvimento de doenças crônicas, (II) fazer parte da alimentação usual, (III) possuir
efeitos positivos obtidos através de quantidades não tóxicas que devem persistir mesmo
após a suspensão de ingestão e (IV) não deve ser utilizado com o intuito de tratar ou
curar doenças (MILNER, 1999).
Os alimentos funcionais podem ser subdividos em: probiótiocos, prebióticos e
simbióticos. Os prebióticos são alimentos que não sofrem hidrólise ou absorção no
intestino delgado; quando atingem o cólon, devem ser metabolizados seletivamente por
um número limitado de bactérias benéficas e devem ser capazes de induzir efeito
fisiológico que seja importante para a saúde. Os probióticos foram definidos como
organismos vivos que quando ingeridos promovem efeito benéfico no balanço da flora
6
bacteriana intestinal e na saúde do hospedeiro. Os simbióticos são aqueles alimentos
que reúnem todas as características já mencionadas (GIBSON, 1999).
A partir deste momento será dispensada uma maior atenção aos prebióticos visto
que a literatura pertinente permite a classificação da cevada e da Saccharomyces
cerevisiae, sendo esta última não-viva, fonte de β-glucana que será objeto de estudo
deste trabalho, nesta categoria. Embora nenhum trabalho que detalhe este aspecto da
cevada, Saccharomyces cerevisiae ou deste polissacarídeo tenha sido encontrado, a
prática nutricional permite essa inferência (comunicação pessoal
1
).
1.2. Caracterização das Atividades da β-Glucana
Segundo Raymundo (2004) as maiores fontes de β-glucana são a aveia, cevada, e
cogumelos como o mitake e o shiitake. Apesar destes alimentos não serem tão comuns
na dieta dos brasileiros a sua introdução é possível. Os cogumelos, em especial, são
característicos da culinária japonesa e possuem um alto custo o quê pode inviabilizar a
sua utilização. No entanto, a cevada e a aveia possuem custos mais acessíveis e não
necessariamente compõem pratos sofisticados.
Os cereais, em especial, cevada e aveia, são considerados alimentos de baixo
custo, de fácil preparo e altamente nutritivos e podem compor pães, massas, biscoitos e
tortas. Quando transformados em farelos podem ser utilizados no enriquecimento de
molhos, iogurtes, e outros alimentos líquidos e pastosos em geral.
As β-glucanas não são degradadas pelas enzimas humanas, o quê lhes confere
propriedades de fibras alimentares. O maior interesse nestas fibras é devido ao seu
1
Clisia Mara Carreira. Mestre em Nutrição Clínica em Doenças Tropicais pela Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP.
Professora responsável pelas disciplinas de Fisiopatologia da Nutrição e Dietoterapia e Avaliação Nutricional do Centro
Universitário Filadélfia de Londrina – UNIFIL.
7
efeito protetor hipocolesterolêmico comprovado, reduzindo risco de doenças crônicas.
A cevada contém altos níveis de fibras alimentares, principalmente β-glucanas que
apesar de pouco consumida no Brasil, existem vários cultivares sendo desenvolvidos, os
quais possuem características nutricionais desconhecidas e necessitam de estudos
futuros (SOARES et al., 2000).
Apesar de evidências de atividades relacionadas ao consumo de β-glucana e outras
fibras alimentares percebe-se que na verdade não são os compostos isolados e ingeridos
sob a forma de suplementos que diminuem o risco de câncer, mas sim uma dieta rica em
substâncias anticarcinogênicas, incluindo novos compostos recentemente isolados, que
ainda se encontram em estudo. No entanto, o isolamento de compostos e os testes que
avaliem a efetividade dos mesmos se faz necessário para que a comunidade científica
possa predizer seus efeitos antimutagênicos e/ou anticarcinogênicos.
As β-glucanas são polissacarídeos presentes na parede celular de alguns
microrganismos, dentre eles as bactérias e fungos. Alguns cereais tais como a cevada e
aveia são, também, ricos nesta substância. A extração de β-glucanas para a utilização
terapêutica é geralmente feita a partir da levedura Saccharomyces cerevisiae e do fungo
Lentinula edodes; e os produtos têm sido comercializados como Betafectin® e
Lentinan®, respectivamente (CISNEROS et al., 1996; ZIMMERMAN et al., 1998;
TURNBULL et al., 1999; MASIHI, 2000).
A β-glucana é um dos componentes presentes em maior quantidade nas paredes
celulares e constituem-se de um esqueleto central linear de moléculas de D-glicose
ligadas na posição β-(1→3) contendo cadeias laterais de glicose (ligação β-1→6) de
tamanhos variados que ocorrem em diferentes intervalos ao longo do esqueleto central
(DI LUZIO et al., 1979). A localização deste polissacarídeo se faz na camada
intermediária da parede celular das leveduras, adjacente à membrana plasmática, e sua
8
função é manter a rigidez e a forma da célula (SANDULA et al., 1995). Outras β-
glucanas que têm sua origem em cereais, como a cevada, são polissacarídeos de
resíduos de glicose com ligações β(1→3) e β(1→4) (TOHAMY et al., 2003).
As β-glucanas agem por meio da estimulação do sistema imune do hospedeiro
exercendo um efeito benéfico sobre uma variedade de infecções de origem bacteriana
(TZIANABOS & CISNEROS, 1996), viral (REYNOLDS et al., 1980), fúngica
(MEIRA et al., 1996) e parasitária (HOLBROOK et al., 1981). Este composto também
está descrito como modulador tanto da imunidade humoral quanto da celular
(PATCHEN & MAC VITTIE, 1983; SOLTÝS et al., 1994; FALCH et al., 2000;
TOKUNAKA et al., 2000; TAKAHASHI et al., 2001; KUBALA et al., 2003); sua
eficiência está comprovada em infecções, tumores (MAEDA et al., 1996; KOGAN et
al., 2002) e como estimulador da hematopoiese (PATCHEN & MAC VITTIE, 1985;
HOFER & POSPISIL, 1997). Existem relatos a respeito da ativação de macrófagos
(TSIAPALI et al., 2001), neutrófilos (RANKIN et al., 1990) e células Natural Killer
(DI RENZO et al., 1991), sendo considerada uma candidata promissora como agente
imunoestimulatório para pacientes imunocomprometidos ou infectados com bactérias
multidroga-resistentes.
Além das propriedades anteriormente descritas as β-glucanas despertam o
interesse de pesquisadores na área de genética especialmente na subárea de mutagênese.
Estudos recentes tanto in vivo quanto in vitro demonstram sua eficácia significativa na
prevenção de efeitos mutagênicos causados por agentes tais como o peróxido de
hidrogênio (SLAMENOVA et al, 2003), doxorrubicina (LIN et al., 2004) e
ciclofosfamida (CHORVATOVICOVA et al., 1996; CHORVATOVICOVA et al.,
1998; TOHAMY et al., 2003).
9
Alguns tipos de β-glucanas já estão licenciados para o uso terapêutico no Japão e
foram utilizadas como adjuvantes na terapia anti-tumoral (KANENO et al., 1989).
Estudos experimentais demonstraram que o lentinam pode ser protetor em
infecções causadas por Listeria, Mycobacterium tuberculosis e vírus influenza
(MASIHI, 2000).
Utilizando glucana derivada do Saccharomyces cerevisiae para o tratamento de
infecção por Staphylococcus aureus resistentes a antibióticos em ratos, Liang et al.
(1998) observaram que a glucana auxilia na eliminação da bactéria e que este evento é
seguido de um aumento de monócitos e neutrófilos, bem como, por uma potencialização
da atividade antimicrobiana. Em outro estudo, Kaiser & Kernodle (1998), utilizaram a
β-glucana associada ou não a antibióticos para tratamento de animais infectados por
Staphylococcus aureus, e puderam verificar que a associação da glucana e o antibiótico
(cefazolin) demonstraram de 8 a 20 vezes mais eficiência quando comparado aos
animais que receberam somente o antibiótico.
A capacidade da β-glucana em induzir resistência inespecífica e específica em
patologias infecciosas em camundongos foi analisada por Reynolds et al. (1980) e estes
observaram que o pré-tratamento, mas não o pós-tratamento, determinava um aumento
na sobrevida de camundongos expostos ao vírus da encefalomielite eqüina venezuelana.
Ainda dados deste mesmo grupo de pesquisadores demonstram que o pré-tratamento de
camundongos com β-glucana por via intravenosa determina aumento na resistência à
exposição destes animais à cepa virulenta, Francisella tularensis, quando os resultados
eram comparados com o protocolo onde os animais recebiam a glucana via intranasal.
Mas, para os estudos com cepas de Pseudomonas pseudomallei estes resultados
mostraram-se invertidos, ou seja, a via que demonstrou maior eficácia foi a intranasal.
Este grupo ainda demonstrou que a vacina da encefalomielite eqüina venezuelana
10
associada à β-glucana era mais protetora, para camundongos e macacos, do que a vacina
sem adjuvante.
Meira et al. (1996) demonstraram que a associação de β-glucana a anti-fúngicos
específicos no tratamento da paracoccidioidomicose possibilita uma melhor resposta à
terapia devido ao efeito imunoestimulador da glucana sobre o sistema imunológico.
Segundo estes pesquisadores um grupo de nove pacientes em estágio avançado da
doença foram tratados com anti-fúngico específico e nestes a β-glucana foi utilizada
como imunoestimulante. Os resultados deste grupo foram comparados com um outro
grupo composto por oito pacientes que se encontrava em estágio da doença menos
avançado e que receberam somente o anti-fúngico. A análise dos resultados clínicos
permitiu verificar que dentre os primeiros pacientes apenas um apresentou recaída e no
segundo grupo foram cinco casos. Valores da taxa de sedimentação de eritrócitos
mostraram uma diferença significativa entre os pacientes do primeiro grupo quando
foram comparados os níveis de pós e pré-tratamento. Verificou-se também a redução
significativa de anticorpos séricos para Paracoccidiodomicose brasiliensis nos pacientes
que se encontravam em estágio avançado da doença quando estes foram analisados no
período pós-tratamento. O teste intradérmico com fitohemaglutinina mostrou aumento
significativo de positividade entre pacientes do primeiro grupo quando comparados nas
fases de pós- e pré-tratamento. Os níveis séricos de Fator de necrose tumoral α (TNF-α)
também foram significativamente altos nos pacientes do primeiro grupo durante o
tratamento.
Estudos na área de infecção parasitológica, de Yun et al. (1998), demonstraram
que a administração de β-glucanas, em camundongos infectados por Eimeria
vermiformes, aumenta a resistência destes animais devido à modulação tanto da resposta
inespecífica quanto da específica. Outro estudo, Soltýs et al. (1996), investigaram o
11
efeito da β-glucana associada com imunoglobulinas e zinco na resposta mitogênica de
linfócitos, níveis de anticorpos e recuperação das larvas em camundongos infectados
por Toxocara canis e observaram que a β-glucana restaurou parcialmente a resposta das
células T e B aos mitógenos e que não houve um aumento do nível de anticorpos
circulantes específicos. A comparação do número de larvas encontradas nos músculos
dos animais demonstrou uma redução naqueles que receberam a β-glucana.
Os estudos de Di Luzio et al. (1979) demonstraram que duas preparações de β-
glucanas extraídas de Saccharomyces cerevisiae, uma solúvel e outra particulada, foram
capazes de causar uma redução significativa no crescimento de carcinomas mamários e
em melanomas B16. Estes mesmos extratos foram também eficientes em aumentar a
sobrevida de camundongos, A/J e C57BL/6J, com implante tumoral subcutâneo.
Preparações similares de β-glucana solúvel e particulada também foram testadas quanto
à estimulação da hematopoiese por Hofer & Pospisil (1997) e neste estudo demonstrou-
se que a administração, de β-glucana solúvel e particulada, vinte e quatro horas antes ou
após vários regimes de irradiação com doses subletais foi capaz de estimular a
hematopoiese. Dados deste mesmo estudo também relatam que a sobrevida dos
camundongos foi aumentada no grupo que recebeu as preparações de β-glucana. Assim,
os autores sugeriram que o estímulo da hematopoiese pela administração da β-glucana é
o principal mecanismo que confere proteção contra os efeitos da radiação.
Estudos in vivo realizados por Chorvatovicová et al. (1996 e 1998), relatam a
eficiência da β-glucana, de baixo peso molecular – 0,89 x 10
5
, em prevenir os efeitos
mutagênicos da ciclofosfamida. Em um dos estudos (CHORVATOVICOVÁ et al.,
1996) os pesquisadores administraram duas doses de ciclofosfamida (80 mg/kg peso
corpóreo, intraperitoneal - i.p.) com um intervalo de 24 horas. A β-glucana foi
administrada em duas concentrações, 100,0 ou 200,0 mg/kg peso corpóreo, por duas
12
vias: i.p. 24 horas antes da ciclofosfamida e intravenosa (i.v.) 1 e 2 horas anteriores às
injeções do agente mutagênico. Outros dois grupos de animais foram tratados oralmente
com a β-glucana na concentração de 100,0 mg/kg peso corpóreo anteriormente às
administrações de ciclofosfamida. Os danos causados pelo agente mutagênico e os
efeitos protetores da β-glucana foram analisados através do ensaio do micronúcleo
realizado em células da medula óssea e observou-se que as três formas de administração
da glucana (i.p., i,v. e v.o.) mostraram-se eficazes na prevenção dos efeitos
clastogênicos da ciclofosfamida. Os autores relatam ainda que a ação protetora das vias
intraperitoneal e intravenosa são dose-dependentes, logo, houve uma maior eficácia
naqueles animais que receberam a maior dose (200,0 mg/kg peso corpóreo). No entanto,
o efeito protetor foi observado, de modo significativo, em todos os grupos. Outro
trabalho deste mesmo grupo (CHORVATOVICOVÁ et al.,1998) relata testes com uma
outra β-glucana, também de baixo peso molecular – 0,19 x 10
5
, onde se desenvolveu um
protocolo muito semelhante ao anteriormente citado, excetuando o grupo que recebeu a
glucana i.v. Neste estudo os autores também relatam efeito antimutagênico da β-glucana
tanto na administração v.o. quanto na i.p..
Os efeitos antigenotóxicos da glucana também foram demonstrados por Tohamy
et al. (2003) em camundongos que receberam ciclofosfamida, doxorrubicina e
cisplatina. Estes estudiosos relatam que camundongos que receberam 2,5 mg/kg peso
corpóreo de ciclofosfamida, 12,0 mg/kg peso corpóreo de doxorrubicina e 5,0 mg/kg
peso corpóreo de cisplatina (i.p.) quando comparados àqueles que foram pré-tratados
com 100 mg/kg peso corpóreo de β-glucana (i.p.) apresentaram uma redução de 41,1,
26,9 e 57,7% de aberrações cromossômicas em medula óssea e 44,4, 55,0 e 57,1% em
espermatogônias, respectivamente. Estes autores sugerem que o efeito protetor da β-
glucana deve ser atribuído à sua capacidade de capturar os radicais livres produzidos
13
quando da biotransformação destas três drogas antineoplásicas estudadas. O índice
mitótico também foi estudado e este dado demonstrou que a β-glucana foi capaz de
estimular a hematopoiese reestabelecendo a atividade mitótica das células da medula
óssea uma vez que esta função havia sido suprimida pelas drogas.
Estudos in vitro de Slamenová et al. (2003) demonstraram que três diferentes
glucanas (Carboxymethyil glucan - CM-G; Sulfoethyl glucan - SE-G;
Carboxymethylchitin-glucan - CM-CG), foram eficientes em prevenir as lesões no DNA
em cultura da linhagem de células pulmonares de hamster Chinês (V79) sendo a
quantificação dos danos realizada através do ensaio do cometa. A maior eficiência foi
demonstrada pela CM-CG, seguida pela SE-G e por fim a CM-G. Neste trabalho os
autores relatam o efeito da β-glucana pela sua capacidade de reagir com os radicais OH
-
liberados pela biotransformação do peróxido de hidrogênio.
1.3. Aspectos da Antimutagênese
Os mesmos ensaios biológicos utilizados para determinação de substâncias com
potencial mutagênico e/ou carcinogênico podem ser empregados para identificar
agentes antimugênicos e anticarcinogênicos. A pesquisa por agentes que possam reduzir
a freqüência de alterações no DNA tem se mostrado promissora e com importantes
implicações nas práticas terapêutica devido à possibilidade da redução da taxa de
mutações e conseqüente redução na incidência de câncer.
Qualquer sustância capaz de reduzir a freqüência de mutações espontâneas ou
induzidas, independentemente do mecanismo de ação, é considerada antimutagênica.
Posteriormente, as mesmas podem ser classificadas como bio-antimutagênicas ou
desmutagênicas (GRÜTER et al., 1990; WATERS et al., 1990).
14
As substâncias bioantimutagênicas atuam como moduladoras do reparo e
replicação do DNA. Agem em nível celular aumentando a fidelidade na replicação,
estimulando o reparo livre de erro ou ainda inibindo os sistemas de reparo sujeitos a
erro (HARTMAN & SHANKEL, 1990; DE FLORA, 1998; SIMIC et al., 1998).
Substâncias desmutagênicas são capazes de inativar um agente mutagênico e
caracterizam-se pela atuação do composto diretamente no agente mutagênico, ou em
seus precursores, inativando-os química ou enzimaticamente (KADA & SHIMOI, 1987;
HARTMAN & SHANKEL, 1990; FERGUSON, 1994; DE FLORA, 1998).
Os anticarcinogênicos são substâncias capazes de impedir, retardar ou reduzir o
surgimento ou desenvolvimento de tumores e podem ser classificados em substâncias
que inibem: (I) a formação de agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos a partir de
precursores; (II) a chegada do carcinógeno às células específicas, também denominados
agentes de bloqueio; (III) a expressão de características malignas, também chamados de
agentes supressores (KURODA & HARA, 1999).
O uso diário de compostos antimutagênicos e anticarcinogênicos, futuramente,
será o procedimento mais efetivo para prevenir o câncer e as doenças genéticas
humanas. Dentre as maneiras de prevenir ou reduzir a mutagênese pode-se citar os
compostos químicos que agem no reparo de DNA ou no metabolismo do agente
mutagênico, sendo, desse modo, antimutágenos efetivos. Estes compostos possuem
efeitos freqüentemente específicos para certas classes de mutágenos e/ou certos
sistemas-teste (MALUF & ERDTMANN, 2003). Ao uso diário de produtos
antimutagênicos ou anticancerígenos dá-se o nome de quimioprevenção (GOMES et al.,
1996; SURH et al., 1996). Para a quimioprevenção faz-se necessário o uso de agentes
quimiopreventivos, os quais devem apresentar as seguintes características: pouco ou
15
nenhum efeito colateral, alta eficácia, possibilitar a administração por via oral, ter um
mecanismo de ação conhecido e ser de baixo custo (FERGUSON, 1994).
Dentre os estudos da área de mutagênese o potencial quimiopreventivo de uma
substância é testado confrontando o suposto antimutagênico com uma substância
sabidamente mutagênica, e então se deve observar uma redução das lesões produzidas
no DNA (LUIZ, 2002).
A atividade antimutagênica foi demonstrada em frutas e vegetais (KADA et al.,
1985). Várias substâncias obtidas a partir de fontes naturais são isoladas, identificadas e
alguns dos mecanismos de sua atividade estão em fase de esclarecimentos. A N-acetil-I-
cisteína, ácido p-aminobenzóico (PABA), isotiocianetos aromáticos, clorofilas e
derivados, glutationa, vitamina C, vitmanina E, vitamina A, flavonóides, ácidos graxos,
fibras dietéticas são algumas das substâncias antimutagênicas conhecidas e encontradas
na dieta (GEBHART, 1974; AMES, 1983; AMES, 1986; HARTMAN & SHANKEL,
1990; ODIN, 1997; LOHMAN et al., 2001).
Estudos epidemiológicos corroboram estes dados citados anteriormente, uma vez
que há um grande volume de evidências associadas a dados obtidos a partir de estudos
in vitro e in vivo, que apontam para a estreita relação entre constituintes da dieta e o
risco de desenvolvimento de determinados tipos de cânceres. De modo geral, vegetais,
frutas, fibras e alguns micronutrientes diminuem a incidência de câncer; enquanto
gorduras, excesso de calorias e consumo de álcool aumentam o risco de
desenvolvimento de patologias. Porém, o fato dos alimentos serem misturas complexas
dificulta a interpretação dos resultados, assim como a interpretação das diferenças
interindividuais ocorridas (ANDRADE et al., 2003). Mesmo assim, no setor alimentar,
os cogumelos comestíveis são bastante pesquisados em relação à sua capacidade
mutagênica, antimutagênica e antitumoral. Algumas espécies como o Lentinula edodes,
16
Craterellus cornucopioides, Agaricus abruptibulbus, Cantharellus cibarius, Lactarius
lilacinus, Lyophyllum connatum, Xerocomus chrysenteron e o Agaricus blasiliensis
(=Agaricus blazei ss. Heinemann) já demonstraram atividade antimutagênica (GRÜTER
et al., 1991; LOHMAN et al., 2001; MENOLI et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002;
BELLINI et al., 2003; LUIZ et al., 2003a; LUIZ et al., 2003b; GUTERREZ et al., 2004;
BELLINI et al., 2005; MACHADO et al., 2005).
Ainda que sejam observadas inconsistências e que a interpretação dos dados
sobre dieta e atividade antimutagênica e/ou anticarcinogênica sejam ainda
contraditórias, existe a certeza de que a dieta alimentar está diretamente relacionada
com a maior ou menor ocorrência de câncer, o quê estimula a continuidade dos estudos.
Em outros casos, ainda se faz necessário testar algumas substâncias que podem ser
extraídas de componentes da dieta como é o caso das β-glucanas que deixam indícios de
possuir uma ação efetiva.
1.4. Cultura de Células
Sistemas-teste de curta duração são amplamente utilizados na detecção de
agentes mutagênicos ou antimutagênicos ambientais (KURODA et al., 1992). Dentre
estes sistemas destacam-se as culturas de células de mamíferos in vitro, como a cultura
de linfócitos humanos e as linhagens celulares provenientes de hamster Chinês
(TAKAHASHI, 2003).
Estes sistemas-teste apresentam vantagens tais como: facilidade de padronização
das condições experimentais como a densidade populacional, pH, temperatura,
composição do meio de cultivo e outras; possibilidade de aplicação do tratamento em
17
qualquer fase do ciclo celular, além de serem ensaios econômicos e de boa
reprodutibilidade; o material é relativamente uniforme em seus requisitos metabólicos e
em seu comportamento; a organização dos cromossomos e do seu DNA é a mesma das
células in vivo (RABELLO-GAY et al., 1991; RODRIGUES, 1991).
Nos testes realizados com células de mamíferos as células V79 e CHO-k1 são
freqüentemente utilizadas. A avaliação dos danos causados por diferentes xenobióticos
é feita principalmente através das técnicas de micronúcleo (JOHNSTON et al., 1997;
MILLER et al., 1997; ALVES et al., 2000), cometa (OLIVE et al., 1992; KLAUDE et
al., 1996; FRIEAUFF et al., 2001), alterações cromossômicas (SASAKI et al., 1994;
MATSUOKA et al., 1997; ALVES et al., 2000) e trocas entre cromátides irmãs
(CORTÉS et al., 1994). Estas células apresentam algumas vantagens como: facilidade
de crescimento em cultivo; pequeno número de cromossomos; ciclo celular curto (10 a
12 horas) e fornecem uma alta freqüência de metáfases analisáveis. Porém algumas
desvantagens também são encontradas: cariótipo variável (21 cromossomos ± 1);
geralmente formam populações celulares não sincrônicas; apresentam uma considerável
heterogeneidade nos tempos de ciclo celular e são células transformadas (PRESTON et
al., 1997).
A mutagênese também é estudada em células deficientes em mecanismos de
reparo, como é o caso da mutante xrs5 da linhagem CHO (SAKAMOTO-HOJO &
TAKAHASHI, 1991; JOHNSTON et al., 1997). Esta célula apresenta deficiência na
reunião de quebras de fita dupla, devido à não produção da proteína Ku80, envolvida no
reparo de junções de extremidades não homólogas – Non-homologous end joining -
NHEJ (JOHNSTON et al.,1998). Células mutantes deficientes em reparo de fita dupla
são suscetíveis à radiação X, mas apresentam sensibilidade cruzada com a bleomicina e
com agentes alquilantes. Estudos citogenéticos demonstram que estas linhagens
18
celulares apresentam uma maior quantidade de alterações cromossômicas espontâneas e
a freqüência de alterações induzidas por agentes, como o metilmetanosulfonato, é bem
maior quando comparada com as linhagens selvagens, principalmente na freqüência de
quebras cromatídicas (STOPPER et al., 1997).
In vitro as células V79, CHO-K
1
e CHO-xrs5, dentre outras, são cultivadas na
forma de cultura de adesão em monocamada, utilizando um meio de cultivo como fonte
de nutrientes com acréscimo de soro bovino fetal, para o fornecimento de fatores
indutores de mitose. Nestas condições as células podem ser liberadas dos frascos de
cultivo através de uma enzima proteolítica (tripsina) e transportadas para novos frascos
de cultivo, onde poderão ser mantidas em crescimento ou serem submetidas aos
tratamentos conforme o protocolo e o teste a ser empregado (LUIZ, 2002).
A maioria das linhagens celulares utilizadas em ensaios in vitro não tem
capacidade de metabolização de drogas, havendo a necessidade, portanto, da adição de
sistemas endógenos de metabolização, como a S9 (fração microssomal de fígado de
ratos tratados com Aroclor 1254) (GALLOWAY et al., 1994 apud TAKAHASHI, 2003;
PRESTON, 1997). No entanto, algumas linhagens como a CRO22-HTC (hepatoma de
ratos) são células metabolizadoras e as suas culturas são padronizadas em protocolos
experimentais.
19
1.5. Ensaios Biológicos in vitro
1.5.1. Ensaio do Micronúcleo com Bloqueio de Citocinese
O teste de micronúcleo in vitro evoluiu rapidamente na área de genética
toxicológica por ser um método simples e útil na avaliação de vários tipos de danos
citogenéticos. O teste do micronúcelo sofreu várias modificações inovadoras em seu
protocolo e este fato aponta para uma ampliação da sua aplicabilidade (SALVADORI et
al., 2003).
Matter & Schimid (1971) estabeleceram o teste do micronúcleo em células de
medula óssea de camundongos. Somente em 1976 este mesmo teste foi desenvolvido in
vitro por Heddle e nesta proposta este autor trabalhava com cultura de linfócitos
periféricos humanos e a aplicabilidade do teste era para detecção de agentes
carcinogênicos.
Os micronúcleos são pequenos corpos contendo DNA, localizados no
citoplasma. Aparecem na telófase e são resultados de fragmentos acêntricos, originados
de quebra isocromatídica ou cromatídica, ou de disfunções no fuso mitótico que leva à
formação de micronúcleos que contem cromossomos inteiros. Desta forma, podem ser
gerados por agentes clastogênicos ou aneugênicos. Pode haver um ou mais por célula, e
tais corpúsculos não devem apresentar qualquer conexão estrutural com o núcleo
principal (RABELLO-GAY et al., 1991; MERSCH et al., 1996; KRISCH-VOLDERS
& FENECH, 2001).
A aplicação do bloqueio da citocinese, com a citocalasina-B, permite identificar
células que tenham passado por um ciclo de mitose após o tratamento in vitro. Esta
variação técnica transformou o teste do micronúcleo em uma ferramenta útil na triagem
de danos genéticos (FENECH & MORLEY, 1985). A citocalasina-B é um potente
20
inibidor dos microfilamentos de actina, impedindo a polimerização dos mesmos na
placa equatorial formada no final da telófase, desta forma observa-se uma cariocinese
com ausência de citocinese.
1.5.2. Ensaio do Cometa
O teste do cometa visa evidenciar a corrida de fragmentos de DNA em relação
ao núcleo principal, quando este é submetido a uma corrente eletroforética, produzindo
figuras semelhantes a cometas. Os primeiros pesquisadores que utilizavam a
quantificação direta do DNA em células individuais foram Rydenberg & Johanson em
1978. Östling & Johanson em 1984 incluíram no teste a eletroforese em pH semineutro
(pH 9,5), o que permitiu um aumento quanto à sensibilidade do teste (apud TICE,
1995). A eletroforese em pH alcalino (pH > 13) foi introduzida por Singh et al. (1988) e
transformou o ensaio do cometa em uma técnica de grande importância na detecção de
quebras no DNA e de danos em sítios álcali-lábies, in vivo e in vitro.
A técnica do cometa é um método rápido, simples e sensível para quantificar
danos genéticos em um pequeno número de células, sendo particularmente importante
na detecção de diferenças intercelulares, quanto aos danos ao DNA e no reparo, em
praticamente qualquer célula eucariótica onde seja possível obter uma suspensão
celular, mesmo com uma amostragem bastante pequena. Além disso, os resultados
podem ser obtidos em um único dia e o custo para a realização da técnica é
relativamente baixo. A sensibilidade do teste do ensaio cometa em detectar danos em
células individuais é comparável a outros métodos que avaliam danos em uma
população de células (OLIVE et al., 1992; FAIRBAIRN et al., 1995; RIBAS, 1995;
21
ROSS et al., 1995; TICE, 1995; KLAUDE et al., 1996; ANDERSON et al., 1998; TICE
et al., 2000; FRIEAUFF et al., 2001).
Devido a todos estes motivos o teste do cometa é empregado na avaliação de
danos no DNA promovidos por agentes físicos e químicos, no monitoramento ambiental
e até mesmo na área clínica (ANDERSON & PLEWA, 1998).
De maneira geral, o teste envolve a deposição de células em agarose, sobre uma
lâmina de vidro para microscopia, seguido de lise, desnaturação do DNA e eletroforese
em pH alcalino (pH > 13), e finalmente a análise dos cometas gerados pelo DNA
fragmentado. Embora o teste seja amplamente aplicado, as técnicas de isolamento
celular e condições do experimento variam consideravelmente. Muitas variáveis
técnicas podem afetar a sensibilidade do teste, tais como a natureza química e o
mecanismo de ação do agente mutagênico, a concentração e quantidade de agarose de
baixo ponto de fusão, composição da solução de lise, tempo de lise, tempo de
desnaturação alcalina do DNA, composição e temperatura do tampão de eletroforese, as
condições de corrida, a coloração do DNA, entre outros (OLIVE et al., 1992; SPEIT &
HERTMANN, 1999).
Os cometas gerados pela técnica podem ser analisados visualmente
(KOBAYASHI, 1995), utilizando-se coloração com um agente intercalante
fluorescente: o Brometo de Etídio, e um microscópio de fluorescência. Desta forma os
cometas poderão ser classificados em:
classe 0 – nucleóides não danificados e que não
apresentam cauda;
classe 1 – nucleóides com cauda menor que o diâmetro do nucleóide;
classe 2 – nucleóides com cauda de tamanho ente 1 a 2 vezes o diâmetro do nucleóide;
classe 3 – nucleóides com cauda 2 vezes maior que o diâmetro do nucleóide. Nucleóides
de células apoptóticas, que se apresentam totalmente fragmentados geralmente não são
contabilizados (SPEIT et al., 1996).
22
1.5.3. Ensaio de Viabilidade Celular
A técnica para avaliação da viabilidade celular descrita por McGahon et al.
(1995), emprega uma coloração diferencial com Laranja de Acridina e Brometo de
Etídio para a determinação de células viáveis e inviáveis.
A utilização destes dois corantes anteriormente citados permite a identificação
de células em apoptose, tanto no estágio inicial como final, com base na integridade da
membrana plasmática.
Quando o Laranja de Acridina se intercala no DNA, proporciona coloração
verde sob microscopia de fluorescência. Este corante também se liga ao RNA, mas
como não se intercala, o RNA é corado em vermelho-alaranjado. Assim, uma célula
viável apresenta um núcleo esverdeado e um citoplasma vermelho. O Brometo de Etídio
penetra somente em células mortas. Este corante também se intercala no DNA, dando
uma aparência alaranjada, mas se liga fracamente ao RNA, o qual pode aparecer
ligeiramente vermelho (POERSCH, 2005).
Assim, células vivas com membrana funcional têm uma coloração verde
uniforme em seu núcleo. Células em apoptose inicial com membrana funcional, mas
com fragmentação de seu DNA, mostram uma coloração verde no núcleo e citoplasma,
sendo visível uma marginalização do seu conteúdo nuclear. Células em apoptose final
apresentam áreas coradas em alaranjado tanto no citoplasma como nos locais onde a
cromatina está condensada no núcleo, o que as distingue de células necróticas, que têm
uma coloração alaranjada uniforme no núcleo (POERSCH, 2005).
23
1.6. Sistemas-teste in vivo
Sistemas de cultura de células de mamíferos possuem importante e significativa
utilização na detecção de mutagênese e antimutagênese ambiental com testes rápidos,
sendo um excelente sistema de triagem de substâncias. Nestes sistemas, a
mutagenicidade de alguns carcinógenos que são negativos em testes de mutagenicidade
microbiana, pode ser detectada através de alterações cromossômicas, troca entre
cromátides irmãs e outros. No entanto, os resultados obtidos de testes realizados in vitro
não podem ser extrapolados para tecidos humanos, os quais possuem sistemas
específicos de ativação e inativação metabólica para substâncias pré-carcinogênicas.
Deve-se então ainda levar em consideração as particularidades dos mecanismos de
absorção, acumulação e eliminação de xenobióticos, e o grande número das possíveis
interações entre as centenas ou milhares de compostos, os quais, in vivo, poderão levar a
efeitos aditivos, sinergísticos ou antagônicos, que não podem ser simuladas em teste in
vitro. No entanto, o sistema in vitro tem se mostrado eficiente na detecção de agentes
ambientais mutagênicos e antimutagênicos, apesar dos experimentos com animais vivos
reproduzirem com maior semelhança as condições humanas (KURODA et al., 1992).
Além das adversidades anteriormente mencionadas o resultado positivo in vitro
não é garantia da positividade in vivo, mas serve como uma alerta da periculosidade do
xenobiótico testado. O sistema in vitro é de grande importância por fornecer dados
fundamentais sobre a ação de substâncias testadas, como clastogênica, aneugênica, ação
direta ou indireta sobre o DNA e nível de toxicidade (TAKAHASHI, 2003).
Para se identificar a carcinogenicidade de substâncias químicas, in vivo, há dois
tipos básicos de estudo: os co-epidemiológicos, que enfocam populações humanas e os
experimentais, que se utilizam particularmente de roedores (IARC, 1986; IARC, 1987;
HUFF et al., 1991; CAMARGO, 1994). Os dois tipos de estudo caracterizam-se por ter
24
como parâmetro final de análise o desenvolvimento do câncer propriamente dito. No
entanto, quando estudos clínicos identificam um agente cancerígeno, o pior já
aconteceu, ou seja, os grupos humanos estudados já foram atingidos pelo efeito nocivo
do xenobiótico. Assim, os estudos experimentais com roedores são os verdadeiros testes
prospectivos, aos quais os agentes químicos devem ser submetidos antes de serem
utilizados em qualquer atividade humana. Existem outros testes, que podem sugerir o
potencial cancerígeno de um composto, como os testes de mutagenicidade (ZEIGER,
1987; ISHIDATE et al., 1988; ASHBY & TENNANT, 1991; RABELLO-GAY, 1991).
Porém, o quê estes testes de fato analisam é a genotoxicidade do agente, ou seja, sua
toxicidade aos cromossomos ou ao DNA. Estes ensaios são aceitos como preditivos de
carcinogenicidade devido à íntima relação que existe entre os potenciais mutagênicos e
cancerígenos dos compostos químicos (CAMARGO et al., 1994).
Dentre os testes experimentais in vivo, utilizando roedores, mais aceitos por
agências internacionais para predizer carcinogenicidade de um produto tem-se os testes:
(I) longa duração in vivo para detecção de carcerígenos; (II) carcinogênese de múltiplas
etapas e cancerígenos químicos; (III) média duração in vivo para detecção de
cancerígenos, (IV) média duração in vivo para detecção da carcinogenicidade em
múltiplos órgãos (CAMARGO et al., 1994).
No entanto, na referida pesquisa somente foram utilizados testes que avaliam
genotoxicidade e teratogenicidade.
25
1.6.1. Ensaio do Micronúcleo em Sangue Periférico
Micronúcleos são freqüentemente usados para quantificar a exposição a agentes
químicos ou físicos (Tucker & Preston, 1996), sendo um procedimento importante e
sugerido, por agências de pesquisa da área de genética toxicológica, na avaliação da
capacidade cancerígena de um composto (Krishna et al., 2000).
Para a realização do teste do micronúcleo in vivo os tipos celulares mais
utilizados são as células do sistema hematopoiético, isto é, linfócitos periféricos e
eritrócitos (Tucker e Preston, 1996).
Uma técnica amplamente utilizada é aquela que utiliza preparações a partir de
medula óssea. De acordo com Schmid (1975) sugere-se que os micronúcleos sejam
avaliados em hemáceas jovens, pois quando os eritroblastos expelem seus núcleos e se
transformam em eritrócitos, os micronúcleos permanecem no citoplasma, onde são
facilmente identificados devido à sua morfologia arredondada e coloração
características. No entanto, Hayashi et al. (1990) descreveram a técnica de micronúcleo
em sangue periférico pela coloração com Laranja de Acridina. Este corante ao se
intercalar com moléculas de DNA e após ser submetido à radiação ultra-violeta emite
uma fluorescência de cor amarela. Já quando se liga ao RNA, sem a capacidade de se
intercalar, a fluorescência emitida é vermelha. Essas propriedades permitem a
identificação dos reticulócitos, eritrócitos jovens ricos em RNA em nível
citoplasmático, que se coram em vermelho pela presença desse ácido nucléico. Os
micronúcleos que por sua vez possuem DNA em sua constituição coram-se em amarelo
e se encontram no meio ou nas bordas das regiões coradas em vermelho.
De acordo com Kishi et al. (1992), estudos comparativos entre a técnica
convencional, em medula óssea, corada por Giemsa, e a técnica que utiliza pré-
coloração com Laranja de Acridina demonstram uma boa correlação. Logo ambas as
26
técnicas mostram-se adequadas para este tipo de avaliação. Porém, a técnica de sangue
periférico apresenta uma vantagem: um mesmo animal poder fornecer várias amostras
de material, sem a necessidade de sacrifício do mesmo (CSGMT, 1992). Este fato
permite que o perfil da freqüência de micronúcleos possa ser avaliado para um mesmo
animal ao longo de um tratamento agudo, subcrônico e crônico, além de possibilitar o
estudo da recuperação deste mesmo indivíduo após a suspensão das administrações das
drogas-teste. Em geral o modelo experimental mais utilizado para avaliação de
micronúcleos em sangue periférico é o camundongo visto que o baço de ratos e seres
humanos, principalmente, possui a propriedade de sequestar células micronucleadas da
corrente sanguínea.
1.6.2. Ensaio de Teratogenicidade
Eventos mutagênicos e teratogênicos estão relacionados, uma vez que ambos
decorrem de alterações fixadas no DNA. Estas alterações levam à mudanças no padrão
da expressão gênica que acarretam fenótipos adversos provenientes de alterações,
principalmente, nos eventos de mitose envolvidos nos processos de crescimento,
morfogênese e diferenciação celular entendidos aqui como maturação dos processos
fisiológicos.
Os fatores genéticos constituem a causa mais comum de malformações
congênitas, sendo responsáveis por cerca de um terço dos casos na espécie humana
(MOORE & PERSAUD, 2004). Estimativas da incidência das causas de malformações
congênitas primárias destacam as aberrações cromossômicas como responsáveis por 6-
7%; genes mutantes por 7-8%; fatores ambientais por 7-10%; herança multifatorial por
20-25%; e 50-60% de etiologia desconhecida (CONNOR & FERGUSON-SMITH,
27
1987; PERSUAD, 1990; THOMPSON et al., 1991). No entanto, é provável que a
maioria das crianças com malformações congênitas de etiologia desconhecida tenha
algum distúrbio genético (MOORE & PERSAUD, 2004). Assim, percebe-se que é cada
vez mais importante desenvolver e/ou utilizar sistemas-teste que possibilitem a
avaliação de susbstâncias com potencial teratogênico, bem como aquelas que são
capazes de prevenir o desenvolvimento adverso da prole de mamíferos por possuírem
capacidade de prevenir danos no DNA.
1.6.2.1 Obtenção dos Fetos e Avaliação da Performance Reprodutiva
Para a obtenção dos fetos e avaliação dos defeitos estruturais e perdas
gestacionais a gravidez deve ser interrompida no décimo sétimo dia de gestação, em
camundongos. Assim, realizar-se-á a pesagem, e a laparotomia, uma vez que recém-
nascidos malformados, ou com pouca viabilidade, são freqüentemente canibalizados
pelas genitoras. As vísceras maternas são analisadas, durante a laparotomia, para
possível detecção de anormalidades macroscópicas. Em seguida, faz-se a histerectomia
e posteriormente a onfalectomia (OLIVEIRA, 2001).
Frente a estes procedimentos são registrados os seguintes dados: número de
sítios de implantação, presença de reabsorções precoces ou tardias, número de fetos
vivos e mortos, peso do útero com fetos, peso de cada feto, pesos placentários, dentre
outros. A partir destes dados calcula-se os parâmetros relativos à performance
reprodutiva: taxa de perdas pós-implantação, taxa de reabsorção, índice placentário,
adequação da idade materna ao tempo de gestação e outros (OLIVEIRA, 2001).
28
1.6.2.2. Exame dos Fetos para a Detecção de Anormalidades
Externas, Viscerais e Esqueléticas
Os fetos, depois de retirados do útero, são inspecionados sistematicamente, para
certificar de que estejam vivos ou mortos e para a verificação de possíveis anomalias
estruturais externas. Em seguida, as malformações devem ser classificadas e para isso os
estudos de Taylor (1986) são vastamente utilizados por pesquisadores da área.
Após a classficação das anormalidades estruturais externas a prole é dividida em
duas metades, sendo uma delas destinada à análise visceral e a outra à análise
esquelética.
Trabalhos clássicos orientam estas análises em teratogênese. Para a visceral faz-
se, geralmente, a combinação de cortes/microdissecção propostos por Barrow & Taylor
(1969) para o estudo de tórax e abdômen, e cortes estratégicos propostos por Wilson
(1965) para o estudo da cabeça. A classificação das anomalias viscerais geralmente é
baseada, principalmente, nos trabalhos de Taylor (1986) e Manson & Kang (1994).
Para a análise esquelética os fetos são preparados pelo método de diafanização e
coloração de alizarina (coloração de ossos), segundo os procedimentos descritos por
Kochhar (1973). Os fetos após diafanizados são avaliados e classificados segundo as
descrições de Taylor (1986).
29
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O presente estudo teve por objetivo avaliar o mecanismo de ação e possíveis
efeitos mutagênicos, genotóxicos e protetores de danos no DNA do polissacarídeo β-
glucana em testes in vitro e in vivo.
2.2. Objetivos Específicos
Investigar os potenciais genotóxico e antigenotóxico do polissacarídeo β-glucana
em testes in vitro.
Avaliar os potenciais mutagênico e antimutagênico do polissacarídeo β-glucana
em testes in vitro e in vivo.
Investigar o mecanismo de ação do polissacarídeo β-glucana, de duas diferentes
origens, cevada e Saccharomyces cerevisiae, através da utilização de metodologias in
vitro pelo teste do micronúcleo.
Estudar a interferência da metabolização na investigação do mecanismo de ação
do polissacaríedo β-glucana em testes in vitro com as linhagens celulares CHO-k1 e
HTC.
Estudar a interferência da metabolização no efeito quimioprotetor, do
polissacaríedo β-glucana, em testes in vitro com as linhagens celulares CHO-k1 e HTC.
Estudar o mecanismo de ação por bioantimutagênese do polissacarídeo β-
glucana através de teste in vitro com linhagem celular deficiente em reparo (CHO-xrs5).
Estudar o efeito citotóxico do polissacarídeo β-glucana e sua capacidade de
prevenir eventos apoptóticos e necróticos através do teste de viabilidade celular in vitro.
30
Avaliar a capacidade do polissacarídeo β-glucana de interferir no desempenho
reprodutivo de fêmeas de camundongos Swiss (Mus musculus).
Investigar a capacidade do polissacarídeo β-glucana de causar desenvolvimento
adverso na prole de fêmeas de camundongos Swiss (Mus musculus).
Avaliar a capacidade do polissacarídeo β-glucana em melhorar o desempenho
reprodutivo de fêmeas de camundongos Swiss (Mus musculus).
Investigar a capacidade do polissacarídeo β-glucana de prevenir efeitos
teratogênicos na prole de fêmeas de camundongos Swiss (Mus musculus).
Verificar se fêmeas grávidas de camundongos Swiss (Mus musculus) possuem
susceptibilidade diferenciada a danos mutagênicos causados por ciclofosfamida e/ou
possui resposta diferenciada à capacidade da β-glucana em prevenir os mesmos.
31
3. ARTIGO 1
Avaliação da atividade antimutagênica do polissacarídeo β-
Glucana, extraída da cevada, no ensaio do micronúcleo nas
linhagens celulares CHO-k1 e HTC
Artigo a ser submetido à Revista Cell Biology and Toxicology
32
Avaliação da atividade antimutagênica do polissacarídeo β-glucana, extraída da cevada,
no ensaio do micronúcleo nas linhagens celulares CHO-k1 e HTC
Rodrigo Juliano Oliveira
1
, Lúcia Regina Ribeiro
2
, Ariane Fernanda da Silva
1
, Renata
Matuo
1
, Mário Sérgio Mantovani
1
*
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina (UEL). Londrina
(PR), Brasil
2
Departamento de Biologia Celular, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Rio
Claro (SP), Brasil
*Autor correspondente:
Telefone: +55 43-3371 4417; Fax: +55 43-3371 4527
e-mail: biom[email protected]
33
Resumo
Diante da necessidade de identificação de novos agentes antimutagênicos e da
determinação do mecanismo de ação dos mesmos, o presente trabalho avaliou o
mecanismo de ação do polissacarídeo β-glucana em teste de antimutagenicidade,
através do ensaio do micronúcleo, nas linhagens celulares não metabolizadora, CHO-k1,
e metabolizadora, HTC. Os experimentos de mutagenicidade foram realizados com três
diferentes doses de β-glucana (5,0, 10,0 e 20,0µg/mL) sendo que somente a maior dose
apresentou atividade mutagênica. Nos experimentos de antimutagenicidade fez-se a
associação das mesmas doses de β-glucana com dois agentes mutagênicos,
metilmetanosulfonato e 2-aminoantraceno, em quatro diferentes protocolos: pré-
tratamento, tratamento simultâneo (simples e com pré-incubação) e pós-tratamento. Os
resultados indicaram que o polissacarídeo β-glucana possui capacidade
quimiopreventiva para os dois tipos celulares e que o protocolo de tratamento
simultâneo simples apresentou uma melhor eficiência. A avaliação dos diferentes
protocolos e das porcentagens de redução de danos permite sugerir que a β-glucana
possui atividade tanto desmutagênica como bioantimutagênica, sendo esta última de
menor eficiência. Faz-se necessário ainda relatar que a eficiência e determinação do
mecanismo de ação estão sujeitas a variações quando comparadas as duas linhagens
celulares visto que em HTC, sistema metabolizador, o polissacarídeo em estudo tem sua
eficiência quimiopreventiva diminuída o quê pode levar a conclusões errôneas a
respeito de seu mecanismo de ação.
Palavras-chave: β-glucana, células HTC, células CHO-k1, mecanismo de ação,
antimutagênese
34
1. Introdução
O grande número de substâncias que atualmente contaminam o ambiente são
advindas de ações antropogênicas. Desta forma, verifica-se um aumento crescente de
resíduos industriais, agronômicos, domésticos e urbanos decorrentes do
desenvolvimento das sociedades modernas. Compostos químicos, físicos e poluição,
principalmente, apresentam-se como riscos potenciais para a saúde humana e por isso
despertam a atenção de diferentes áreas de pesquisa.
Diversos estudos demonstram uma associação inversamente proporcional entre o
consumo de verduras e frutas e o desenvolvimento de doenças crônicas como o câncer
(Fergurson, 1994; Flagg et al., 1995)
Dentre os alimentos que podem compor uma dieta balanceada e que possuem a
capacidade de prevenir o desenvolvimento de câncer estão os alimentos funcionais. O
conceito desses provém da hipótese de que a dieta alimentar possa controlar e modular
várias funções orgânicas, contribuindo para a manutenção da saúde e reduzindo o risco
do aparecimento de patologias (Borges, 2001).
Para que um alimento seja classificado como funcional, ele deve exercer efeito
metabólico ou fisiológico que contribua para a saúde física e para a redução do risco de
desenvolvimento de doenças; fazer parte da alimentação usual; possuir efeitos positivos
obtidos através de quantidades não tóxicas que devem persistir mesmo após a suspensão
da ingestão e não devem ser utilizados com o intuito de tratar ou curar doenças (Milner,
1999).
Os alimentos funcionais do tipo prebióticos são aqueles que não sofrem hidrólise
ou absorção no intestino delgado; quando atingem o cólon, devem ser metabolizados
seletivamente por um número limitado de bactérias benéficas e devem ser capazes de
induzir efeito fisiológico que seja importante para a saúde (Gibson, 1999). As fibras
35
alimentares, em geral, se enquadram nessa descrição assim como a cevada da qual se
originou a β-glucana que é objeto de estudo desta pesquisa.
As glucanas são polissacarídeos formados por um esqueleto linear de moléculas
de D-glicose ligadas na posição β-(1→3) contendo cadeias laterais de glicose (ligação
β-1→6) de tamanhos variados que ocorrem em diferentes intervalos ao longo do
esqueleto central (Di Luzio et al., 1979). A β-glucana, extraída de cevada, é um
polissacarídeo de resíduos de glicose com ligações β(1→3) e β(1→4) (Tohamy et al.,
2003).
Dentre os marcadores biológicos das glucanas pode-se citar a estimulação do
sistema imune frente às infecções bacterianas (Tzianabos and Cisneros, 1996), virais
(Reynolds et al., 1980), fúngicas (Meira et al., 1996) e parasitárias (Holbrook et al.,
1981); modulação da imunidade humoral e celular (Falch et al., 2000); estimulação da
hematopoiese (Hofer and Pospisil, 1997); ativação de macrófagos (Tsiapali et al., 2001)
e neutrófilos (Rankin et al., 1990).
Além destes, estudos in vivo e in vitro, demonstram sua eficácia na prevenção de
efeitos mutagênicos causados por agentes tais como o peróxido de hidrogênio
(Slamenová et al., 2003), doxorrubicina (Lin et al., 2004) e ciclofosfamida (Tohamy et
al., 2003). No entanto, faz-se ainda necessários novos estudos para uma melhor
compreensão do mecanismo de ação deste polissacarídeo. Frente a este fato, o presente
trabalho investigou o mecanismo de ação do polissacarídeo β-glucana, originária da
cevada, em teste de antimutagenicidade utilizando o ensaio do micronúcleo na presença
e ausência de metabolização, nas linhagens celulares HTC e CHO-k1, respectivamente.
36
2. Material e Métodos
2.1. Agentes Químicos
Para a indução de danos no DNA na linhagem celular CHO-k1, utilizou-se o
agente alquilante, de ação direta, metilmetanosulfonato – MMS (Merck), na
concentração final de 37,6µg/mL. Em HTC utilizou-se a mesma concentração de MMS
e um segundo agente, de ação indireta, 2-aminoantraceno – 2AA (Acros), na
concentração final de 1,0µg/mL.
A β-D-Glucana (Sigma) originária da cevada, foi testada nas concentrações de 5,
10 e 20µg/mL de meio de cultura, denominadas β
1
, β
2
e β
3
, respectivamente.
2.2. Linhagens Celulares
A linhagem celular de ovário de hamster Chinês, CHO-k1 (selvagem), utilizada
nesse estudo foi fornecida pelo Laboratório de Mutagênese da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade Estadual de São Paulo – USP, pela Profa. Dra. Catarina
Satie Takahashi. A linhagem celular de tecido de hepatoma de Rattus norvegicus, HTC,
foi adquirida no Banco de Células do Rio de Janeiro (UFRJ). As células foram
cultivadas em 5,0 mL de meio de cultura DMEM/F12 (Gibco), suplementado com 10%
de soro bovino fetal – SBF (Gibco). O cultivo celular se deu em estufa do tipo BOD a
37ºC, sistema de monocamada, em frasco de 25cm
2
, em concentração inicial de 1,0 x
10
6
células. Nestas condições, o tempo de ciclo celular é de aproximadamente 12 e 24
horas para CHO-k1 e HTC, respectivamente.
37
2.3. Teste de Micronúcleo em Células Binucleadas
Na avaliação da mutagenicidade, para as duas linhagens celulares, as células
foram cultivadas por dois ciclos completos (24 horas para CHO-k1 e 48 horas para
HTC). Fez-se a lavagem das culturas, por 2 vezes, com PBS. A seguir acrescentou-se
5,0 mL de meio de cultura, livre de soro bovino fetal, ao qual foram adicionadas as
substâncias testes em tratamento de pulso de 3 horas. Nesse experimento, fez-se os
seguintes tratamentos: a. Controle; b. Agente Indutor de Danos – MMS; c – Agente
Indutor de Danos – 2AA; d., e., f. β-Glucana em três diferentes concentrações (β
1
–
5,0µg/mL; β
2
– 10,0µg/mL; β
3
– 20,0µg/mL). Ao término deste período, as culturas
foram novamente lavadas com PBS, por 2 vezes; acrescentou-se então 5,0 mL de meio
de cultura completo, seguido de citocalasina-B (Cyt-B – Sigma) na concentração de
3,0µg/mL por 17 horas para a linhagem celular CHO-k1 e 30 horas para HTC. O agente
indutor de danos 2AA somente foi utilizado em cultura de células HTC, visto que este
precisa ser metabolizado para causar danos ao DNA.
Para a antimutagenicidade realizou-se os protocolos de pré-tratamento,
tratamento simultâneo (simples e com pré-incubação) e pós-tratamento. Para todos os
protocolos estabeleceu-se os seguintes tratamentos: a. Controle; b. Agente Indutor de
Danos – MMS; c. Agente Indutor de Danos – 2AA; d. MMS + β-glucanas; e. 2AA + β-
glucanas. Assim como nos experimentos de mutagenicidade, a indução de danos foi
sempre feita em meio de cultura livre de soro bovino fetal e as lavagens foram
realizadas com PBS, por 2 vezes, antes e depois da indução de danos. A concentração
de citocalasina-B foi mantida. Os experimentos com células CHO-k1 e HTC totalizaram
um período de 44 e 81 horas de cultura, respectivamente; divididos das seguintes
formas:
38
(I) Pré-tratamento – as células CHO-k1 foram cultivadas por 7 horas, em seguida
acrescentaram-se as β-glucanas ao meio de cultivo por outras 17 horas. Após este
período as culturas foram lavadas, acrescentou-se meio de cultivo livre de soro bovino
fetal e procedeu-se o tratamento de pulso (3 horas) com MMS. As culturas foram
lavadas novamente e acrescentou-se meio de cultura completo e citocalasina-B
permanecendo por outras 17 horas. Para as células HTC procedeu-se da mesma forma
sendo alterados somente os tempos e foi acrescido o agente indutor de danos 2AA.
Desta forma, as células foram cultivadas por 18 horas, o pré-tratamento se deu por 30
horas. A indução de danos se fez em tratamento de pulso com MMS e 2AA (3 horas) e
as culturas continuaram em crescimento por 30 horas com citocalasina-B;
(II) Simultâneo – as células foram cultivadas por dois ciclos completos (24 horas
para CHO-k1 e 48 horas para HTC). Fez-se a lavagem das culturas com PBS. A seguir
acrescentou-se meio de cultura, livre de soro bovino fetal, ao qual foram adicionados os
agentes indutores de danos (MMS ou 2AA) associados com as β-glucanas, em
tratamento de pulso (3 horas). Ao término deste período as culturas foram novamente
lavadas e acrescentou-se, novamente, meio de cultura completo mais citocalasina-B por
17 horas para a linhagem celular CHO-k1 e 30 horas para HTC;
(III) Simultâneo com pré-incubação – para esta fase do experimento procedeu-se
como descrito no item anterior. No entanto, os volumes a serem transferidos para as
culturas foram pré-incubados por 1 hora em estufa do tipo BOD a 37ºC;
(IV) Pós-tratamento – as células foram cultivadas por dois ciclos completos.
Procedeu-se a lavagem e indução de danos em tratamento de pulso (3 horas) com MMS
e 2AA, em meio de cultura livre de soro bovino fetal. Após este período as células
foram lavadas e juntamente com o meio de cultura completo e a citocalasina-B
39
acrescentou-se as β-glucanas por um período de 17 e 30 horas para CHO-k1 e HTC,
respectivamente.
A colheita foi realizada transferindo-se o meio de cultura para um tubo cônico de
centrífuga. Em seguida lavou-se as culturas, 2 vezes com 5,0 mL de PBS, sendo os
primeiros 5,0 mL de PBS reservados junto ao meio de cultivo e o segundo desprezado.
Tripsinizou-se as células com 500,0µL de Tripsina-EDTA (0,025%) por um tempo
máximo de 2 minutos. A ação da tripsina foi inativada com adição de meio de cultura
anteriormente reservado. A solução foi centrifugada, por 5 minutos, a 26226,5g.
Retirou-se o sobrenadante deixando no tubo somente 1,5mL aos quais acrescentou-se
1,5 mL de citrato de sódio (1%) e uma gota de formaldeído a 40%. Ressuspendeu-se o
pellet e centrifugou-se novamente nas mesmas condições anteriormente descritas. O
sobrenadante foi descartado e acrescentou-se 5,0 mL de fixador metanol-ácido acético
(3:1). O pellet foi novamente ressuspendido e a solução centrifugada. Em seguida,
desprezou-se o sobrenadante e acrescentou-se cerca de 0,5 mL de fixador e
homogeneizou-se. Esta solução foi utilizada para a preparação das lâminas. As lâminas
utilizadas para a montagem foram previamente lavadas e mantidas em água destilada à
4ºC. A solução foi pingada em lâminas contendo um filme de água, em seguidas foram
secas ao ar livre e posteriormente coradas com Giemsa 5%.
2.4. Análises das Lâminas e Estatística
Foram realizadas três repetições independentes para cada tratamento, em cada
teste. Os critérios para seleção de células binucleadas foram: (I) limites nucleares
distinguíveis ao microscópio óptico; (II) núcleos com tamanhos semelhantes, coloração
padrão e de mesma intensidade; (III) núcleos principais podendo estar próximos, mas
40
não sobrepostos e bem delimitados; (IV) limites citoplasmáticos distinguíveis das
células adjacentes. O micronúcleo, por sua vez, presente nas células binucleadas, não
deveria ter tamanho superior a 1/3 dos núcleos principais além de possuir coloração
padrão e não ser refringente.
Analisou-se 6000 células binucleadas por tratamento, sendo
2000/tratamento/repetição e a análise estatística foi realizada usando o teste do Qui-
quadrado (p<0,05).
A porcentagem de redução dos danos do agente mutagênico pela β-glucana foi
calculada através do número de células com danos observados com os agentes indutores
de danos (MMS ou 2AA) menos o número de células com danos observados no
tratamento de antigenotoxicidade x 100, dividido pelo número de células com danos
observado com o agente indutor de dano menos o número de células com danos do
controle.
3. Resultados
A Tabela 01 apresenta a freqüência, número máximo e mínimo, média e desvio
padrão referentes ao ensaio do micronúcleo, na avaliação da mutagenicidade. A análise
estatística demonstrou que, tanto para a linhagem celular CHO-k1 como para HTC, a β
3
mostrou-se mutagênica, diferentemente das duas menores doses avaliadas (β
1
e β
2
).
As Tabelas 02 a 05 contêm os dados referentes aos experimentos de
antimutagenicidade nos quatro diferentes protocolos (pré-tratamento, simultâneo
simples, simultâneo com pré-incubação e pós-tratamento). As tabelas apresentam a
freqüência, número mínimo e máximo, média, desvio padrão de micronúcleos e
porcentagem de redução de danos obtidas.
41
No protocolo de pré-tratamento (Tabela 02), as associações demonstraram
eficiência para as três diferentes doses de β-glucanas testadas em CHO-k1 em relação
ao MMS. No entanto, em HTC, o mesmo não foi verificado. Os danos causados pelo
MMS somente foram prevenidos pela dose mais alta (β3). Para o agente de ação
indireta somente a menor dose (β
1
) não foi eficiente na prevenção.
O tratamento simultâneo simples (Tabela 03) demonstrou diferenças
estatisticamente significativas para todas as associações realizadas. A dose mais
eficiente em CHO-k1 foi a β
3
. No entanto, quando o mesmo experimento foi realizado
com HTC a β
1
foi a que demonstrou uma melhor eficácia. Com o agente de ação
indireta, em HTC, verificou-se que a β
3
foi a mais eficiente.
No tratamento simultâneo com pré-incubação (Tabela 04) a β
2
mostrou-se a
mais eficiente para o agente indutor de danos de ação direta (MMS), em ambas as
células. No entanto, para o agente indireto (2AA), em HTC, β1 e β2 apresentaram
praticamente a mesma eficiência e β3 uma melhor capacidade protetora.
O pós-tratamento (Tabela 05) demonstrou que β2 e β3 foram eficientes na
prevenção de danos causados pelo MMS em CHO-k1 e somente a β3 foi eficiente em
HTC. Em relação ao 2AA nenhuma β-glucana foi eficiente em prevenir os danos.
Verifica-se assim que o protocolo de tratamento simultâneo simples apresentou
maior eficiência quimiopreventiva quando comparado aos demais. Este fato indicou a
necessidade de conhecer qual a porcentagem de incremento ou decréscimo desta taxa
(Tabela 06). Os cálculos foram feitos dividindo a porcentagem de redução para as
diferentes glucanas no protocolo simultâneo pelos correspondentes tratamentos nos
demais protocolos x 100 e o valor encontrado foi subtraído de 100.
42
4. Discussão
Metodologias in vitro são adequadas para a verificação de mecanismos de ação,
além de oferecer uma melhor padronização das etapas experimentais bem como,
possibilitar a manipulação ou introdução de variáveis desejadas, como tempo de
tratamento, tipos de associações e outros. Dentre as metodologias in vitro a utilização de
células de mamíferos pode permitir a correlação com possíveis efeitos em seres
humanos (Brusick, 1987).
Atualmente existe o interesse na identificação de substâncias presentes no meio
que possuem atividade protetora contra mutações, a fim de resguardar as gerações
futuras. Neste estudo foram obtidos dados com diferentes protocolos de indução de
danos ao DNA e quimioproteção, verificando a freqüência de micronúcleos, frente a
dois agentes alquilantes e suas associações com a β-glucana de cevada, em três
diferentes concentrações.
A avaliação da mutagenicidade das três diferentes doses de β-glucana permitiu
verificar que somente o tratamento com a dose mais alta (β
3
) apresentou aumento no
número de micronúcleos nos dois tipos celulares. Este achado, em uma primeira análise,
indica a exclusão desta ou de doses mais altas em futuros estudos que utilizem sistemas
de cultura com as linhagens celulares CHO-k1 e HTC, podendo sugerir algum tipo de
toxicidade. No entanto, é necessária uma avaliação biológica mais criteriosa desta
informação, uma vez que se verifica que a média de micronúcleos encontrada para os
controles foi muito baixa podendo assim interferir na análise estatística. Além disso, em
outros trabalhos (Bellini et al., 2005) foi possível encontrar valores de micronúcleos em
tratamentos controles bastante semelhantes ao encontrado em nossos tratamentos com
β
3
. A β-glucana também poderia ter como efeito protetor o aumento da viablidade
celular por impedir a ocorrência de eventos apoptóticos. Assim, acredita-se que devido a
43
este efeito biológico uma cultura tratada pelo polissacarídeo em estudo poderia
apresentar uma maior freqüência de micronúcleos não por este ser mutagênico, mas pela
sua capacidade de aumentar a viabilidade celular o quê indica a preservação inclusive
de células com danos genéticos que podem ser verificados através do teste do
micronúcleo (dados não publicados).
Segundo Fenech et al. (1999) os eventos de apoptose atuam na eliminação de
células micronucleadas, reduzindo, portanto, a freqüência de células com danos
clastogênicos. Vukicevic et al. (2004) por sua vez apresentam duas considerações
distintas entre si a este respeito. Na primeira delas os autores dizem que uma alta
freqüência de células em apoptose pode relacionar-se a outros danos genéticos que não
resultariam na formação de micronúcleos, e assim não elevariam a sua freqüência. Por
outro lado, um aumento na freqüência de micronúcleos e índices de apoptose normais
poderiam ser explicados pela indução de supressão apoptótica nas células
micronucleadas, tornado-se estas necróticas antes mesmo de passarem pela mitose.
O protocolo de pré-tratamento demonstrou eficiência para as três diferentes
doses em CHO-k1. Já em HTC a eficácia foi verificada somente na maior dose. Este
fato pode sugerir que a exposição da β-glucana ao sistema de cultura metabolizadora,
por um tempo mais longo (30 horas), possa ter propiciado degradação da estrutura do
polissacarídeo o que viria diminuir a sua eficiência no controle de eventos que
danificariam o DNA. Quando são analisados os resultados com o agente de danos
indireto, 2AA, verifica-se que somente a menor dose não apresentou eficácia. Este fato
pode permitir supor que apesar da constante metabolização que a β-glucana estava
exposta ainda havia quantidade de polissacarídeos suficientes, no meio intracelular, nas
duas maiores concentrações, para reagir com os metabólitos que estavam sendo
44
formados pela degradação do 2AA, os quais seriam os responsáveis pelas alterações nas
moléculas de DNA.
No protocolo de tratamento simultâneo simples verificou-se que todas as
associações realizadas foram eficientes na quimioprevenção. A porcentagem de redução
de danos foi aumentada em relação ao protocolo de pré-tratamento e este fato pode
sugerir que a interação entre os agentes causadores de danos e quimiopreventivos
possam se iniciar ainda no meio extracelular. Desta forma, uma possível inativação do
MMS ou 2AA no meio extracelular induziria uma menor eficácia na produção de danos
no DNA. Além desta possibilidade pode-se pensar que a interiorização dos agentes
químicos, mutagênicos e antimutagênicos, aconteceram ao mesmo tempo e este fato
propiciaria uma melhor capacidade de interação destes neste novo ambiente.
O protocolo de tratamento simultâneo com pré-incubação em CHO-k1
apresentou uma redução de danos mais alta quando comparada ao protocolo simultâneo
simples. Este fato indicaria que as moléculas de MMS poderiam ter sido inativadas de
forma ainda mais eficiente no momento de pré-incubação, sugerindo que a complexação
do agente indutor com o polissacarídeo de β-glucana é uma ação eficaz na prevenção de
danos, em apoio à hipótese anterior. No entanto, quando esta mesma pré-incubação foi
realizada e tratou-se as culturas de células HTC a eficiência apresentou uma redução
expressiva em relação ao tipo celular CHO-k1. Nenhuma menção a este fato foi
encontrada na literatura consultada. Mas, uma suposição plausível seria que a
metabolização dos compostos formados pela interação MMS+β-glucana ou 2AA+β-
glucana teria produzido compostos capazes de induzir danos no DNA, os quais
potencializariam os efeitos dos agentes mutagênicos, e que não foram eficientemente
impedidos de agir pelas glucanas que ainda estavam livres na solução ou no meio
intracelular. Outra hipótese seria que os metabólitos produzidos a partir dos agentes
45
indutores de danos complexados com a β-glucana seriam incapazes de promover a
atividade antimutagênica. Necessita-se ainda pensar se esta associação impede a
metabolização. Portanto esses dados sugerem um maior aprofundamento na
complexação e metabolização das β-glucanas associadas a agentes químicos.
O pós-tratamento demonstrou uma menor eficácia nos dois tipos celulares
estudados quando comparados aos protocolos de tratamento simultâneo,
independentemente do tipo do agente indutor de danos. Mas, devido à eficiência ainda
encontrada na linhagem celular CHO-k1, acredita-se que a β-glucana possuiria uma
capacidade de auxiliar na eficiência de reparo do DNA.
Diante desta análise nota-se que com os pré- e pós-tratamentos pode-se inferir
uma maior interferência da capacidade metabólica da linhagem celular HTC na
prevenção de danos ao DNA, talvez devido ao maior tempo de exposição da β-glucana
a este sistema.
Existem basicamente duas classes de substâncias protetoras do DNA, as de
mecanismo desmutagênico e as de bioantimutagênico (Kada et al., 1982). Substâncias
desmutagênicas são aquelas capazes de impedir a ação dos agentes indutores de danos,
principalmente por adsorção dos mesmos, portanto agem no meio extracelular,
preferencialmente. Já os agentes bioantimutagênicos são aqueles capazes de atuar na
prevenção da lesão ou no reparo do DNA, agindo no interior da célula. (Kada and
Shimoi, 1987). De Flora (1998) ainda diz que as substâncias bioantimutagênicas atuam
como moduladoras do reparo e replicação do DNA; ou estimulando o reparo livre de
erro em danos no DNA; ou inibindo os sistemas de reparo sujeitos a erro.
Na tentativa de elucidar os mecanismos de ação de moléculas ou compostos
químicos em antimutagenicidade, faz-se necessário o uso de diferentes protocolos de
tratamento (Flagg et al., 1995). Dos diferentes protocolos propostos pela literatura o
46
presente trabalho utilizou três: pré-tratamento, simultâneo com duas variações (simples
e com pré-incubação) e pós-tratamento.
Considerando que o protocolo de tratamento simultâneo simples indique tanto a
atividade desmutagênica como bioantimutagênica; o simultâneo pré-incubação uma
atividade desmutagênica; e que o pré-tratamento e o pós-tratamento indiquem uma
atividade, preferencialmente, bioantimutagênica; a análise do experimento com CHO-k1
permite inferir que o mecanismo de ação do polissacarídeo β-glucana é do tipo tanto
desmutagênico como bioantimutagênico. Se verificada a porcentagem de redução de
danos pode-se inferir ainda que a ação por bioantimutagênese é menor quando
comparada com a desmutagênese.
Para os experimentos com HTC, nos quais as células foram tratadas com MMS,
o mesmo raciocínio foi verificado, ou seja, pode-se inferir os mecanismos de
desmutagênese e bioantimutagênese . No entanto, a capacidade metabólica da linhagem
celular parece interferir neste processo visto que as duas menores doses perdem sua
eficiência nos protocolos de pré- e pós-tratamento. O protocolo simultâneo com pré-
incubação apresenta uma ineficiência de β
1
e β
3
, demonstrando a eficiência somente da
dose intermediária. Nos experimentos com 2AA, este raciocínio não pode ser mantido
visto que não foi verificada nenhuma eficiência no protocolo de pós-tratamento. Este
fato sugere que o polissacarídeo de β-glucana não agiria pelo mecanismo de
bioantimutagênese em células metabolizadoras. Este fato demonstra a necessidade de
maiores e melhores esclarecimentos do papel protetor desses polissacarídeos. No
entanto, pelos dados apresentados, assume-se que o polissacarídeo de β-glucana possua
os dois tipos de mecanismo de ação, com uma melhor eficiência em desmutagênese
quando analisada a porcentagem de redução de danos.
47
Corrobora a hipótese de desmutagênese o trabalho de Slameñová et al. (2003)
que investigou o efeito protetor de três diferentes extratos de glucana, em três diferentes
concentrações, em danos induzidos por peróxido de hidrogênio e azul de metileno na
presença de luz visível. Este estudo demonstrou que o pré-tratamento com as glucanas
foi eficiente em prevenir os efeitos genotóxicos através do ensaio do cometa em células
V79.
Nos últimos anos aumentou a aceitação de que substâncias derivadas de
produtos naturais possuam uma atividade antimutagênica e/ou anticarcinogênica. Ainda
nota-se que estes agentes podem manifestar efeitos quimiopreventivos ou
radiopreventivos e estes resultados podem ser mensurados, por exemplo, através de
ação benéfica na recuperação da hematopoiese e também do sistema imune de pacientes
expostos a estes tratamentos ou sujeitos à infecções oportunitas (Rankin et al., 1990).
Patchen et al. (1987) verificaram efeitos benéficos quando utilizaram β-glucana
em animais submetidos à radiação. De acordo com seu estudo, a melhora não se deve
somente à regeneração hematopoiética, mas os autores supõem que a glucana é capaz de
inativar os radicais livres que poderiam causar danos ao organismo em teste, fato este
também descrito no trabalho de Chorvatovicová (1991).
Diante deste relato pode-se inferir que a β-glucana teria atividade semelhante a
agentes antioxidantes. Os agentes antioxidantes compõem o principal grupo de
inibidores da carcinogênese visto que são bloqueadores de radicais livres. Além destes,
são também inibidores da carcinogênese, os indutores de morte celular, inibidores
enzimáticos e das enzimas do citocromo P450, inibidores da angiogênese, antagonistas
de fatores de crescimento e agentes reparadores de lesões do DNA (Kleiner, 1997;
Kelloff et al., 1999).
48
Os antioxidantes são substâncias que, mesmo presentes em baixas
concentrações, são capazes de atrasar ou inibir as taxas de oxidação (Maxwell, 1995;
Sies, 1999). A classificação mais utilizada para estas substâncias é a que as divide em
dois sistemas: enzimático, composto pelas enzimas produzidas no organismo; e não
enzimático, composto pelas vitaminas, flavonóides, licopenos, bilirrubinas (Sies, 1999)
e onde, possivelmente, pode ser enquadrada a β-glucana.
Os alimentos contendo agentes antioxidantes constituem um dos principais
grupos de alimentos com propriedades funcionais, conhecidos também como
nutracêuticos ou fármaco-alimentos (Ferrari and Torres, 2002).
As glucanas estão presentes, principalmente, na cevada, aveia e cogumelos,
mitake e shiitake (Raymundo, 2004). Apesar destes alimentos não serem comuns na
dieta da maioria das populações, a sua introdução é possível. Excluindo-se os
cogumelos que são característicos da culinária japonesa e que possuem alto custo, a
cevada, aveia e outros cereais possuem custos acessíveis e não necessariamente
compõem pratos sofisticados. Desta forma, os cereais, considerados de baixo custo, de
fácil preparo e altamente nutritivos podem compor pães, massas, biscoitos, tortas e
farelos, que podem ser utilizados no enriquecimento de molhos, iogurtes e outros
alimentos líquidos e pastosos, que após estudos mais criteriosos da sua relação com a
possível prevenção de cânceres, poderão fazer parte de dietas balanceadas em um futuro
próximo.
Ainda é prematura a finalização dos estudos com respeito ao mecanismo de ação
do polissacarídeo β-glucana, bem como a sua indicação ou contra-indicação na
quimioprevenção. Fazem-se necessários estudos bioquímicos que demonstrem melhor a
estrutura do polissacarídeo em estudo e a sua interação com os agentes indutores de
danos ao DNA, a fim de se esclarecer como realmente se efetiva a sua capacidade
49
desmutagênica. Necessita-se, também, de um melhor entendimento de como este
polissacarídeo pode interagir com o DNA ou com as enzimas envolvidas na replicação e
no reparo do mesmo, para que se possa discutir sua capacidade bioantimutagênica, além
de saber se β-glucanas de diferentes origens possuem o mesmo mecanismo de ação e
eficácia na prevenção de danos ao DNA.
Agradecimentos:
Esta pesquisa obteve apoio financeiro da CAPES, CNPq e Fundação Araucária.
Agredecimentos a Dr. A. Levya e senhorita A.F. Silva pelo auxílio com a língua
Inglesa e edição do manuscrito.
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Tabela 01 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média e desvio padrão referentes ao ensaio do micronúcleo, na avaliação da mutagenicidade, em tratamentos de pulso de 3 horas:
Tipo Celular
CHO-k1 HTC
Tratamento
Dose
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número mínimo e
máximo MN (MN
por 6000 células)
Média ± D.P.
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número mínimo e
máximo MN (MN
por 6000 células)
Média ± D.P.
Controle 13 3 – 5
4,33 ± 1,16
32 7 – 14
10,67 ± 3,51
MMS 37,6µg/mL 121 36 – 44
40,33 ± 4,04
a
*
170 54 – 61
56,67 ± 3,79
a
*
2AA
5,0µg/ml
NA
NA NA 77 21 – 29
25,67 ± 4,16
a
*
5,0µg/ml
16 3 – 7
5,33 ± 2,08
a
40 11 – 17
13,33 ± 3,21
a
β-Glucana 10,0µg/ml
13 4 – 5
4,33 ± 0,58
a
46 12 – 20
15,33 ± 4,16
a
20,0µg/ml
28 7 – 11
9,33 ± 2,08
a
*
55 16 – 21
18,33 ± 2,52
a
*
a
Comparado estatisticamente com o Controle; *diferença estatisticamente significativa (Teste: Qui-quadrado; p<0,05); NA – Não aplicado.
Tabela 02 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média, desvio padrão e porcentagem de redução de danos referentes ao ensaio do micronúcleo na avaliação da antimutagenicidade segundo o
protocolo de pré-tratamento:
Tipo Celular
CHO-k1 HTC
Tratamento
Dose
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número
mínimo e
máximo MN
(MN por 6000
células))
Média ± D.P.
Porcentagem
de Redução de
Danos (%)
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número mínimo
e máximo MN
(MN por 6000
células)
Média ± D.P.
Porcentagem de
Redução de
Danos (%)
Controle 11 3 – 4
3,67 ± 0,58
29 7 – 14
9,67 ± 3,77
MMS 37,6µg/mL 117 37 – 42
39,00 ± 2,65
a
*
105 30 – 43
35,00 ± 7,00
a
*
2AA
5,0µg/ml
NA NA NA 67 17 – 26
22,33 ± 4,73
a
*
5.0µg/ml
77 25 – 26
25,67 ± 0,58
b
*
37,7 91 27 – 32
30,33 ± 2,89
b
18.4
10,0µg/ml
68 17 – 28
22,67 ± 5,51
b
*
46,2 83 26 – 30
27,67 ± 2,08
b
29.0
β-Glucana +
MMS
20,0µg/ml
75 21 - 29
25,00 ± 4,00
b
*
39,6 58 18 – 20
19,33 ± 1,16
b
*
61.8
5,0µg/ml
NA NA NA NA 52 12 – 20
17,33 ± 4,62
c
39.5
10,0µg/ml
NA NA NA NA 42 10 – 16
14,00 ± 3,46
c
*
65.8
β-Glucana +
2AA
20,0µg/ml
NA NA NA NA 30 9 - 12
10,00 ± 1,73
c
*
97.4
a
Comparado estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com o MMS;
c
Comparado estatisticamente com o 2AA; *diferença estatisticamente significativa (Teste: Qui-quadrado; p<0,05); NA –
Não aplicado.
54
Tabela 03 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média, desvio padrão e porcentagem de redução de danos referentes ao ensaio do micronúcleo na avaliação da antimutagenicidade segundo o
protocolo simultâneo simples:
Tipo Celular
CHO-k1 HTC
Tratamento
Dose
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número
mínimo e
máximo MN
(MN por 6000
células))
Média ± D.P.
Porcentagem
de Redução de
Danos (%)
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número
mímino e
máximo MN
(MN por 6000
células)
Média ± D.P.
Porcentagem de
Redução de
Danos (%)
Controle 13 3 – 5
4,33 ± 1,16
32 7 – 14
10,67 ± 3,51
MMS 37,6µg/mL 121 36 – 44
40,33 ± 4,04
a
*
170 54 – 61
56,67 ± 3,79
a
*
2AA
5.0µg/ml
NA NA NA 77 21 – 29
25,67 ± 4,16
a
*
5.0µg/ml
53 17 – 20
17,67 ± 2,08
b
*
63 48 13 – 19
16,00 ± 3,00
b
*
88,4
10.0µg/ml
47 13 – 18
15,67 ± 2,52
b
*
68,5 76 19 – 30
25,33 ± 5,67
b
*
68,1
β-Glucana +
MMS
20.0µg/ml
42 9 - 17
14,00 ± 4,36
b
*
73,1 66 18 – 26
22,00 ± 4,00
b
*
75,4
5.0µg/ml
NA NA NA NA 24 6 – 11
8,00 ± 2,65
c
*
117,8
10.0µg/ml
NA NA NA NA 21 5 – 8
7,00 ± 1,73
c
*
124,4
β-Glucana +
2AA
20.0µg/ml
NA NA NA NA 21 6 – 8
7,00 ± 1,00
c
*
124,4
a
Comparado estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com o MMS;
c
Comparado estatisticamente com o 2AA; *diferença estatisticamente significativa (Teste: Qui-quadrado; p<0,05); NA –
Não aplicado.
55
Tabela 04 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média, desvio padrão e porcentagem de redução de danos referentes ao ensaio do micronúcleo na avaliação da antimutagenicidade segundo o
protocolo simultâneo com pré-incubação:
Tipo Celular
CHO-k1 HTC
Tratamento
Dose
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número
mínimo e
máximo MN
(MN por 6000
células))
Média ± D.P.
Porcentagem
de Redução de
Danos (%)
Freqüência
MN (MN por
6000 células)
Númeromínimo e
máximo MN
(MN por 6000
células)
Média ± D.P.
Porcentagem de
Redução de
Danos (%)
Controle 17 5 – 7
5,67 ± 1,16
26 8 – 9
8,67 ± 0,58
MMS 37,6µg/mL 107 32 – 41
35,67 ± 4,73
a
*
125 34 – 57
41,67 ± 13,28
a
*
2AA
5.0µg/ml
NA NA NA 63 16 – 28
21,00 ± 6,25
a
*
5.0µg/ml
39 10 – 16
13,00 ± 3,00
b
*
75,5 107 26 – 36
32,33 ± 5,51
b
28,3
10.0µg/ml
29 7 – 14
9,67 ± 3,79
b
*
86,7 82 23 – 36
27,33 ± 7,51
b
*
43,8
β-Glucana +
MMS
20.0µg/ml
33 9 – 12
11,00 ± 1,73
b
*
82,2 96 21 – 50
32,00 ± 15,72
b
29,3
5.0µg/ml
NA NA NA NA 40 9 – 18
13,33 ± 4,51
c
*
62,2
10.0µg/ml
NA NA NA NA 40 11 – 16
13,33 ± 2,52
c
*
62,2
β-Glucana +
2AA
20.0µg/ml
NA NA NA NA 24 7 – 10
8,00 ± 1,73
c
*
105,4
a
Comparado estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com o MMS;
c
Comparado estatisticamente com o 2AA; *diferença estatisticamente significativa (Teste: Qui-quadrado; p<0,05); NA –
Não aplicado.
56
57
Tabela 05 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média, desvio padrão e porcentagem de redução de danos referentes ao ensaio do micronúcleo na avaliação da antimutagenicidade segundo o
protocolo de pós-tratamento:
Tipo Celular
CHO-k1 HTC
Tratamento
Dose
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número
mínimo e
máximo MN
(MN por 6000
células))
Média ± D.P.
Porcentagem
de Redução de
Danos (%)
Freqüência MN
(MN por 6000
células)
Número
mínimo e
máximo MN
(MN por 6000
células)
Média ± D.P.
Porcentagem de
Redução de
Danos (%)
Controle 19 5 – 9
6,33 ± 2,31
24 4 – 11
8,00 ± 3,61
MMS 37,6µg/mL 116 35 – 42
39,67 ± 3,51
a
*
122 35 – 45
40,67 ± 5,13
a
*
2AA
5.0µg/ml
NA NA NA 55 18 – 19
18,33 ± 0,58
a
*
5.0µg/ml
101 31 – 36
33,67 ± 2,52
b
15,5 111 33 – 45
37,00 ± 6,93
b
11,2
10.0µg/ml
68 18 – 26
22,67 ± 4,16
b
*
49,5 110 34 – 41
36,67 ± 3,79
b
12,3
β-Glucana +
MMS
20.0µg/ml
77 23 – 29
25,67 ± 3,06
b
*
40,2 73 21 – 29
24,33 ± 4,16
b
*
50,0
5.0µg/ml
NA NA NA NA 43 12 – 17
14,33 ± 2,52
c
38,7
10.0µg/ml
NA NA NA NA 44 13 – 16
14,67 ± 1,53
c
35,5
β-Glucana +
2AA
20.0µg/ml
NA NA NA NA 40 12 – 15
13,33 ± 1,53
c
48,4
a
Comparado estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com o MMS;
c
Comparado estatisticamente com o 2AA; *diferença estatisticamente significativa (Teste: Qui-quadrado; p<0,05); NA –
Não aplicado.
Tabela 06 – Porcentagem de incremento ou decréscimo da atividade antimutagência da β-glucana dos diferentes protocolos experimentais comparados ao protocolo simultâneo:
Tipos Celulares
CHO-k1 HTC
Protocolos de Tratamento
Tratamento
Dose de
β-glucana
Pré Pré-incubação Pós Pré Pré-incubação Pós
5.0µg/ml
-40.2 +19.8 -75.4 -79.2 -68.0 -87.3
10.0µg/ml
-32.5
+26.6 -27.7 -57.4 -35.7 -81.9
β-Glucana +
MMS
20.0µg/ml
-45.8 +12.5 -45.0 -18.0 -61.1 -33.7
5.0µg/ml
NA NA NA -66.5 -47.2 -67.1
10.0µg/ml
NA NA NA -47.1 -50.0 -71.5
β-Glucana +
2AA
20.0µg/ml
NA NA NA -54.6 -50.8 -77.4
NA – Não aplicado
4. ARTIGO 2
Avaliação do efeito protetor da β-Glucana, extraída da
Saccharomyces cerevisiae, no dano do DNA e viabilidade celular
(necrose e apoptose) em células CHO do tipo selvagem (k1) e
deficiente em reparo (xrs5)
Artigo a ser submetido à Revista Toxicology in vitro
58
Avaliação do efeito protetor da β-glucana, extraída da Saccharomyces cerevisiae, no dano
do DNA e viabilidade cellular (necrose e apoptose) em células CHO do tipo selvagem (k1)
e deficiente em reparo (xrs5)
Rodrigo Juliano Oliveira
1
, Lúcia Regina Ribeiro
2
, Renata Matuo
1
, Ariane Fernanda da
Silva
1
, Hevenilton José Matiazi
3
, Mário Sérgio Mantovani
1
*
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina (UEL). Londrina
(PR), Brasil
2
Departamento de Biologia Celular, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Rio Claro
(SP), Brasil
3
Laboratório de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos, Universidade Estadual de
Londrina (UEL). Londrina (PR), Brasil
*Autor correspondente:
Telefone: +55 43-3371 4417; Fax: +55 43-3371 4527
e-mail: biom[email protected]
59
Resumo
Um grande número de alimentos funcionais, que possuem a β-glucana em sua composição,
demonstra correlação com a prevenção do desenvolvimento de câncer e de outras
patologias crônicas. A descrição de seu mecanismo de ação, bem como a compreensão de
seus efeitos como um agente antigenotóxico, anticlastogênico e sua capacidade de
preservação da viabilidade celular são objetivos desse estudo, no qual utilizou-se das
células CHO das linhagens k1 e xrs5. O teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese
indicou que as diferentes doses de β-glucana testadas (5,0, 10,0, 20,0 e 40,0 µg/ml) não
apresentaram efeitos clastogênicos. Na linhagem celular CHO-k1 pode-se observar efeito
quimiopreventivo em todos os protocolos testados: pré-tratamento, simultâneo simples e
com pré-incubação e pós-tratamento, indicando os mecanismos de ação por desmutagênese
e bioantimutagênese. Porém, sendo este último com menor eficácia. Já para a linhagem
celular deficiente em reparo CHO-xrs5, a β-glucana não apresentou atividade protetora no
pós-tratamento sugerindo assim a hipótese de bioantimutagênese. No ensaio do cometa em
células CHO-k1, a β-glucana não apresentou efeito tanto genotóxico como antigenotóxico.
Os testes de viabilidade celular indicam que a β-glucana melhora o índice de viabilidade
celular, em ambas as linhagens, prevenindo eventos de apoptose. Estes dados estimulam o
uso da β-glucana, bem como, sugerem que quando este polissacarídeo está presente em
alimentos daria a estes características nutracêuticas podendo participar da suplementação de
dietas ou talvez compor um novo fármaco de origem natural.
Palavras-chave: β-glucana, células CHO-k1, células CHO-xrs5, mecanismo de ação,
antimutagênese
60
1. Intodução
Estudos apontam que o aumento da ingestão de alimentos naturais está diretamente
relacionado à diminuição do risco do desenvolvimento de cânceres e de outras patologias
(Weisburger, 2000; Ferrari and Torres, 2002). Diante deste fato, as pesquisas em genética
toxicológica visam avaliar os efeitos genotóxicos e clastogênicos de xenobióticos, bem
como encontrar novas substâncias com efeitos quimioprotetores e que possam amenizar os
efeitos adversos daqueles.
Dentre os componentes destas dietas estão alguns produtos que compõem a classe
das fibras alimentares como os cereais, principalmente aveia e cevada, os cogumelos, as
algas e as leveduras. Em geral, as fibras podem ser fontes de β-glucana. A β-glucana é um
dos componentes presentes em maior quantidade nas paredes celulares de diversos
organismos. No caso dos fungos constitui-se de um esqueleto central linear, de moléculas
de D-glicose ligadas na posição β-(1→3), contendo cadeias laterais que possuem no seu
interior ligações β-1→6 de tamanhos variados e que ocorrem em diferentes intervalos ao
longo do esqueleto central. A localização deste polissacarídeo se faz na camada
intermediária da parede celular de leveduras a qual é adjacente à membrana plasmática e
sua função é manter a rigidez e forma celular (Sandula et al., 1995).
Dentre outras funções da β-glucana está sua capacidade antigenotóxica frente a
agentes indutores de danos no DNA, tais como peróxido de hidrogênio (Slamenová et al.,
2003), ciclofosfamida (Tohamy et al., 2003) e doxorrubicina (Lin et al., 2004).
Mesmo diante da constatação da eficácia da β-glucana frente a estes danos, o
mecanismo de ação deste polissacarídeo ainda não está totalmente esclarecido, sendo
necessários novos estudos. O presente trabalho descreveu o mecanismo de ação do
61
polissacarídeo β-glucana, extraído de Saccharomyces cerevisiae, em teste de
antigenotoxicidade, antimutagenicidade e viabilidade celular em células de ovário de
hamster chinês (CHO) do tipo selvagem (k1) e deficiente em reparo (xrs5) por meio do
ensaio do micronúcleo com bloqueio de citocinese, ensaio do cometa e viabilidade celular,
pela coloração diferencial com Laranja de Acridina e Brometo de Etídeo, em diferentes
protocolos experimentais: tratamentos simultâneos simples, tratamentos simultâneos após
pré-incubação, pré-tratamentos e pós-tratamentos.
2. Material e Métodos
2.1. Agente indutor de danos no DNA
Para a indução de danos no DNA, utilizou-se o agente alquilante, de ação direta,
Metilmetanosulfonato – MMS (Merck) diluído em solução tampão fosfato (PBS), livre de
Ca
2+
e Mg
+2
, pH 7,4, estéril. A concentração final no ensaio do micronúcleo foi de
37,6µg/mL na linhagem CHO-k1. Já para a linhagem CHO-xrs5 foi utilizada uma
concentração final de 18,8µg/mL. Para o teste do cometa, a concentração final de MMS foi
de 4,23µg/mL em ambas as linhagens.
2.2. Extração das
β
-glucanas
Os polissacarídeos de β-glucana, testados neste estudo, foram extraídos de
Saccharomyces cerevisiae e cedidos pelo Dr. Hevenilton José Matiazi, do Laboratório de
62
Tecnologia de Alimentos e Medicamentos do Centro de Ciências dos Alimentos da
Universidade Estadual de Londrina – PR.
A extração das β-glucanas com cadeias principais contendo ligações β-(1→3) e
ramificações laterais com ligações β-(1→6) foi realizada através da autólise de
Saccharomyces cerevisiae. A parede celular foi separada através de centrifugação em 6500
g/8min e tratada à quente (70°C em 5 horas) em meio alcalino com NaOH (10%), lavada e
centrifugada três vezes e secada em estufa a 40°C. Foi realizada análise em RMN
(cromatografia por ressonância magnética nuclear), comprovando a presença de (1,3 e 1,6)
β-D-glucan com pureza de 85% e em seguida fez-se a solubilização da glucana, utilizando
DMSO (dimetil sulfóxido) mais uréia 8M, na proporção de 100mL:60g. Acrescentou-se em
banho-maria 100mL de DMSO com 10mL de ácido sulfúrico concentrado, permanecendo
em agitação por 4 horas a 100ºC. Fez-se então a diálise com aproximadamente 100L de
água ultra-pura (Milli-Q). Concentrou-se a solução em um evaporador rotativo a 40ºC para
a posterior liofilização.
A solução do agente antimutagênico, β-Glucana, foi preparada em PBS e utilizada
nas concentrações finais, em cultura de 5,0, 10,0, 20,0 e 40,0µg/mL; neste trabalho
denominadas β
1
, β
2
, β
3
e β
4
, respectivamente.
2.3. Linhagem Celular
As linhagens celulares de ovário de hamster Chinês (CHO) do tipo selvagem (k1) e
deficientes no mecanismo de reparo de fita dupla de DNA (xrs5), utilizadas nesse estudo
foram fornecidas pelo Laboratório de Mutagênese da Faculdade de Medicina de Ribeirão
63
Preto, Universidade Estadual de São Paulo – USP, pela Profa. Dra. Catarina Satie
Takahashi. Para os testes de micronúcleo as células foram cultivadas em 5,0 mL de meio de
cultura DMEM/F12 (Gibco), suplementado com 10% de soro bovino fetal – SBF (Gibco).
O cultivo celular se deu em estufa do tipo BOD a 37ºC, sistema de monocamada, em frasco
de 25cm
2
. Para o teste do cometa as células foram cultivadas em tubos para cultura de
células e tecidos superfície plana (110mm x 16mm) com 2,5mL de meio de cultura segundo
as especificações descritas anteriormente. Nestas condições, o tempo de ciclo celular é de
aproximadamente 12 horas para as duas linhagens celulares. Para ambos os experimentos
os frascos foram montados com 1,0 x 10
6
células.
2.4. Teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese
Na avaliação da mutagenicidade, com a linhagem celular CHO-k1, as células foram
cultivadas por dois ciclos completos (24 horas) e tratadas por 3 horas em meio de cultivo
livre de soro bovino fetal. Os tratamentos realizados foram: a. controle; b. MMS; e c. β-
Glucana em quatro diferentes concentrações (β
1
, β
2
, β
3
, e β
4
). Ao término deste período, as
culturas foram lavadas com PBS (2 vezes), acrescentou-se meio de cultura suplementado e
citocalasina-B (Cyt-B – Sigma) na concentração de 3µg/mL permanecendo por 17 horas.
Para a antimutagenicidade na qual a β-glucana (β
1
, β
2
, β
3
, e β
4
) foi associada ao
MMS realizou-se os protocolos de pré-tratamento, tratamento simultâneo simples,
tratamento simultâneo após pré-incubação e pós-tratamento da seguinte maneira:
(I) Pré-tratamento – as células CHO-k1 foram cultivadas por 7 horas, em seguida
acrescentou-se as β-glucanas ao meio de cultivo por outras 17 horas. Acrescentou-se meio
64
de cultivo não suplementado e procedeu-se o tratamento por 3 horas com MMS (tratamento
de pulso – 3 horas). Acrescentou-se meio de cultura suplementado e citocalasina-B,
permanecendo em cultivo por 17 horas. Antes e depois de cada procedimento as células
foram lavadas com PBS;
(II) Simultâneo simples – as células foram cultivadas por dois ciclos completos (24
horas). A seguir foi adicionado MMS associado com as β-glucanas, em tratamento por 3
horas, em meio não suplementado. Acrescentou-se meio de cultura suplementado e
citocalasina-B para cultivo por 17 horas. Antes e depois de cada procedimento as células
foram lavadas com PBS;
(III) Simultâneo após pré-incubação – para esta fase do experimento procedeu-se o
mesmo protocolo do tratamento simultâneo como descrito no item anterior. No entanto,
antes do tratamento das culturas as soluções de tratamento (MMS+β-glucanas) foram pré-
incubados por 1 hora em estufa a 37ºC. Antes e depois de cada procedimento as células
foram lavadas com PBS;
(IV) Pós-tratamento – as células foram cultivadas por dois ciclos completos (24
horas). Então as células foram tratadas por 3 horas com MMS. Após este período o
tratamento foi retirado e as células foram incubadas com β-glucanas em meio suplementado
acrescido de citocalasina-B, por um período de 17 horas. Antes e depois de cada
procedimento as células foram lavadas com PBS.
Para os testes de mutagenicidade e antimutagenicidade com a linhagem celular
CHO-xrs5 realizou-se os seguintes tratamentos: a. controle; b. MMS; c. β
4
; e d. MMS + β
4.
Os protocolos utilizados foram o simultâneo e o pós-tratamento.
65
A colheita das células foi realizada com tripsina-EDTA (0,025%) com posterior
hipotonização rápida com citrato de sódio (1%) e uma gota de formaldeído a 40%. A
fixação foi realizada com metanol-ácido acético (3:1) e as lâminas foram coradas com
Giemsa 5%.
Foram realizadas três repetições independentes para cada tratamento, em cada teste.
Os critérios para seleção de células binucleadas foram: (I) delimitações nucleares intactas;
(II) núcleos com tamanhos semelhantes, coloração padrão e de mesma intensidade; (III)
núcleos principais podendo estar próximos, mas não sobrepostos e com limites nucleares
distinguíveis; (IV) o limite citoplasmático da célula binucleada intacta, e com limite
citoplasmático distinguível das células adjacentes. O micronúcleo, por sua vez, presente nas
células binucleadas, não deveria ter tamanho superior a 1/3 dos núcleos principais além de
possuir coloração padrão e não ser refringente.
Analisou-se 6000 células binucleadas por tratamento, sendo
2000/tratamento/repetição. A análise estatística foi realizada usando o teste do Qui-
quadrado (p<0,05).
2.5. Teste do cometa
Para a realização do teste do cometa as células CHO-k1 foram cultivadas por dois
ciclos completos (24h) antes dos tratamentos. Os tratamentos foram realizados em meio
não suplementado.
Na avaliação da genotoxicidade fez-se os seguintes tratamentos: a. controle; b.
MMS; e c. β-Glucanas (β
1
; β
2
; β
3
; e β
4
). Os tratamentos foram realizados por 3 horas. Após
66
este período as culturas foram colhidas. Para a avaliação da antigenotoxicidade fez-se as
associações do MMS com as quatro diferentes concentrações de β-glucana. Os protocolos
utilizados foram: (I) Simultâneo simples – onde o MMS e a β-glucana foram adicionados
ao mesmo tempo às culturas e (II) Simultâneo com pré-incubação – onde o MMS e a β-
glucana, nas diferentes concentrações, foram incubados a 37ºC, por 1 hora antes de serem
adicionados às culturas. A colheita foi realizada após os tratamentos.
Para o procedimento de colheita, o meio de cultura com tratamento foi descartado,
as células foram tripsinizadas (tripsina-EDTA, 0,025%), centrifugadas e obtida a suspensão
celular em 0,5mL de meio de cultura. Para a montagem das lâminas depositou-se 20,0µL de
suspensão celular com 120,0µL de agarose LPM (1,5%), a 37ºC, em lâmina pré-coberta
com agarose normal (5%) e estas foram recobertas por lamínula de vidro e resfriadas a 4ºC
por 20 minutos. Após a remoção das lamínulas, as lâminas foram imersas em solução de
lise, recentemente preparada, composta por 89,0mL de estoque de lise (2,5M NaCl,
100,0mM EDTA, 10,0mM Tris, pH 10,0 corrigido com NaOH sólido, 890,0 mL de água
destilada e 1% de laurilsarcosinato de sódio), 1,0 mL de Triton X -100 (Merck) e 10,0 mL
de DMSO. A lise se deu por 1 hora, à temperatura de 4ºC, protegida da luz. Em seguida, as
lâminas foram encaminhadas para a cuba de eletroforese com tampão pH>13,0 (300,0mM
NaOH e 1,0mM EDTA, preparado a partir de uma solução estoque de NaOH 10,0N e
EDTA 200,0mM pH10,0) a 4ºC por 20 minutos para a denaturação do DNA. A eletroforese
foi realizada à 25,0V e 300,0mA (1,25V/cm). Posteriormente, as lâminas foram
neutralizadas com tampão pH 7,5 (0,4M Tris-HCl) durante 3 ciclos de 5 minutos, secas ao
ar livre, fixadas em álcool etílico absoluto por 10 minutos e guardadas para leitura a
posteriori. Para coloração, as lâminas foram cobertas com 100,0µL de Brometo de Etídeo
67
(20,0µg/mL) e lamínula. O material foi avaliado em microscópio de fluorescência (Nikon)
no aumento de 40x, com filtro de excitação 420-490nm e filtro de barreira 520nm.
Foram analisadas visualmente 100 células por tratamento, classificando-se os
cometas em: (classe 0) células não danificadas que não apresentam cauda; (classe 1) células
com cauda menor que o diâmetro do nucleóide; (classe 2) células com cauda de tamanho
entre 1 e 2 vezes o diâmetro do nucleóide; (classe 3) células com cauda maior que 2 vezes o
diâmetro do nucleóide. Células apoptóticas, que apresentam nucleóide totalmente
fragmentado, não foram contabilizadas. O escore total foi calculado pela somatória dos
valores resultantes da multiplicação do total de células observadas em cada classe de lesão
a qual pertenciam pelo valor da classe. A análise estatística foi realizada usando o teste t-
Student (p<0,05).
2.6. Cálculo da Porcentagem de Redução de Danos
A porcentagem de redução dos danos do agente mutagênico e/ou genotóxico pela β-
glucana foi calculada através da média do número de células com danos observadas no
tratamento com o agente indutor de danos (MMS) menos o número de células com danos
observadas no tratamento de antimutagenicidade e/ou antigenotoxicidade x 100, dividido
pelo número de células com danos observadas no tratamento com o agente indutor de dano,
menos o número de células com danos do controle.
68
2.7. Teste de Viabilidade Celular
A técnica para detecção da viabilidade celular, índice de apoptose e de necrose foi a
de coloração diferencial, com Laranja de Acridina e Brometo de Etídeo, em microscopia de
fluorescência.
As lâminas foram preparadas utilizando-se uma alíquota de 50,0µL de suspensão
celular, obtida no teste do micronúcleo para a linhagem celular CHO-xrs5 e no teste do
cometa para a linhagem celular CHO-k1, anteriormente descritos, e 2,0µL de corante
(100,0µg/mL de Laranja de Acridina e 100,0µg/mL de Brometo de Etídeo, ambos diluídos
em PBS). Foram analisadas 200 células por repetição em microscópio Nikon, em objetiva
de 60 vezes, com filtros para fluorescência (515-560nm).
A classificação das células foi realizada segundo a descrição: (I) células vivas com
membrana funcional possuem coloração verde uniforme em seu núcleo; (II) células em
apoptose inicial com membrana funcional, mas com fragmentação de DNA, demostram
uma coloração verde no núcleo e citoplasma, sendo visível uma marginalização do seu
conteúdo nuclear; (III) células em apoptose final apresentam áreas coradas em alaranjado,
tanto no citoplasma como nos locais onde a cromatina está condensada no núcleo, o que as
distingue de células necróticas; (IV) células necróticas têm coloração alaranjada uniforme
no núcleo.
O índice de viabilidade celular foi calculado pela relação do número de células
normais x 100 e o número de células analisadas. Para o índice de apoptose, calculou-se a
relação entre a soma de células em apoptose inicial e final x 100 e o número de células
analisadas. Já para o índice de necrose, fez-se a relação entre o número de células
69
necróticas x 100 e o número de células analisadas. A análise estatística foi realizada através
do teste t-Student (p<0,05).
3. Resultados
A freqüência, número mínimo e máximo, média, desvio padrão e porcentagem de
redução de danos referentes ao ensaio do micronúcleo na linhagem celular CHO-k1 estão
apresentados na Tabela 01.
A análise estatística dos testes de mutagenicidade demonstrou que as quatro
diferentes doses de β-glucana não apresentaram efeito clastogênico e a freqüência de
micronúcleos foi próxima daquela verificada no controle.
As associações em pré-tratamento demonstraram eficiência quimiopreventiva para
todas as doses de β-glucanas testadas e a porcentagem de redução de danos variou de 35,0 a
57,3.
No tratamento simultâneo simples verificou-se que β
1
e β
2
não foram efetivas na
prevenção dos danos clastogênicos causados pelo MMS. Desta forma, somente β
3
e β
4
apresentaram atividade anticlastogênica, com porcentagens de redução de danos de 53,0 e
55,6%, respectivamente. No entanto, o tratamento simultâneo após pré-incubação
aumentou a eficiência das β-glucanas. Neste protocolo, assim como em pré-tratamento, as
quatro doses testadas foram eficientes na prevenção aos danos no DNA. As porcentagens
de redução de danos verificadas foram de 51,3, 42,7, 56,4 e 47,9% para β
1
, β
2
, β
3
e β
4
,
respectivamente.
70
O protocolo de pós-tratamento demonstrou que β
2
, β
3
e β
4
foram eficientes na
redução da frequência de micronúcleos e as porcentagens de redução de danos foram,
respectivamente, 37,6, 31,6 e 34,2%.
Em nenhum dos protocolos anteriormente mencionados foi verificada uma
correlação dose-resposta.
Uma visão geral dos dados referentes ao ensaio do micronúcleo em CHO-k1
demonstra que a eficiência das diferentes doses nos diferentes protocolos de tratamento
sofreu variações consideráveis. No entanto, o protocolo de tratamento simultâneo após pré-
incubação foi o que demonstrou melhores resultados quimiopreventivos. E o protocolo que
apresentou menor eficiência, com relação à porcentagem de redução de danos, foi o de pós-
tratamento. Estas considerações podem ser observadas na Tabela 02, a qual apresenta a
porcentagem de incremento ou decréscimo da porcentagem de redução de danos ao DNA.
O cálculo deste parâmetro foi realizado dividindo-se a porcentagem de redução de danos
das diferentes β-glucanas no protocolo simultâneo com pré-incubação, que demonstrou a
melhor eficiência, pelos correspondentes tratamentos nos demais protocolos x 100,
subtraindo-se o valor encontrado de 100. Assim, pode-se demonstrar que o protocolo de
tratamento simultâneo com pré-incubação foi o mais eficiente para todas as doses testadas e
em todos os protocolos, excetuando-se para β
2
no pré-tratamento e para a β
4
no tratamento
simultâneo simples.
A Tabela 03 apresenta a freqüência de células lesionadas, distribuição entre as
classes de danos e escore referentes aos testes de genotoxicidade e antigenotoxicidade, nos
protocolos simultâneo simples e simultâneo após pré-incubação, no ensaio do cometa na
71
linhagem celular CHO-k1. A análise estatística demonstrou que nenhuma das quatro
diferentes concentrações de β-glucana testadas apresentou efeitos genotóxicos.
A avaliação das associações entre o MMS e as glucanas demonstrou que em
nenhum dos protocolos, tratamento simultâneo ou simultâneo após pré-incubação, houve
efeito quimiopreventivo.
A Tabela 04 demonstra a freqüência de células normais, em apoptose inicial, final e
necrose na linhagem celular CHO-k1. Encontram-se também transcritos os índices de
viabilidade celular, apoptose e necrose.
A análise estatística demonstrou que os tratamentos de pulso (3 horas) com as
quatro doses de β-glucana não provocaram alterações nos índices de viabilidade celular,
apoptose e necrose. Os índices de viabilidade celular para as β-glucanas foram semelhantes
ao controle e variaram de 66,8 a 71,3 para β
3
e β
1
, respectivamente.
O protocolo de tratamento simultâneo simples demonstrou que a β-glucana, nas
quatro diferentes concentrações, possui capacidade de alterar o índice de viabilidade
celular, aumentando-o de forma estatisticamente significativa. O aumento da viabilidade
celular está diretamente correlacionado à capacidade da β-glucana em diminuir o índice de
apoptose, o qual, também, se mostrou estatisticamente significativo quando comparado ao
agente indutor de danos. Os índices de viabilidade celular foram próximos aos daqueles
encontrados nos tratamentos de pulso para as β-glucanas e no controle. A variação
observada foi de 61,6 para a associação do MMS com β
2
a 66,5 para a associação com β
3
.
A análise do índice de necrose demonstra que nos tratamentos simultâneos simples houve
um aumento geral. No entanto, somente a β
1
demonstrou um aumento estatisticamente
significativo.
72
O protocolo de tratamento simultâneo após pré-incubação apresenta resultados de
maior eficiência do que os do simultâneo em relação ao índice de viabilidade celular. E as
variações observadas foram entre 63,0 e 80,6 para β
1
e β
2
, respectivamente. Novamente o
aumento do índice de viabilidade celular demonstra-se diretamente relacionado à
capacidade da β-glucana em diminuir o índice de apoptose, o qual, por sua vez, também
apresentou diferenças estatisticamente significativas quando comparado ao agente indutor
de danos. Apesar das quatro concentrações de β-glucana elevarem o índice de necrose, este
aumento não foi estatisticamente significativo para nenhuma das doses.
A freqüência, número mínimo e máximo, média, desvio padrão e porcentagem de
redução de danos referentes aos ensaios do micronúcleo nos testes de mutagenicidade e
antimutagenicidade em células do tipo CHO-xrs5 estão apresentados na Tabela 05.
A avaliação da mutagenicidade com a β-glucana de maior dose utilizada neste
estudo, β
4
, não apresentou atividade clastogênica. E a sua associação ao MMS demonstrou
efeito quimiopreventivo no protocolo de tratamento simultâneo simples. Já no protocolo de
pós-tratamento não foi verificada nenhuma capacidade de proteção ao DNA. A
porcentagem de redução de danos foi de 39,7 e 2,96% para os protocolos de tratamento
simultâneo simples e pós-tratamento, respectivamente.
A Tabela 06 apresenta os dados referentes aos índices de viabilidade celular,
apoptose e necrose referentes ao ensaio com CHO-xrs5. Também estão presentes a
freqüência de células normais, em apoptose inicial e final e necrose.
A análise permitiu verificar que a β
4
provocou uma diminuição no índice de
viabilidade celular e um aumento no índice de apoptose de forma estatisticamente
siginificativa. Já o índice de necrose foi igual a zero.
73
As associações da β-glucana com o MMS, nos protocolos de tratamento simultâneo
e pós-tratamento demonstraram um aumento significativo no índice de viabilidade celular
relacionado a um decréscimo do índice de apoptose. No entanto, a maior eficiência foi
observada no protocolo de tratamento simultâneo simples. Em ambos os protocolos de
tratamento não foram encontradas células em necrose.
A Tabela 07 apresenta um sumário dos resultados referentes aos ensaios do
micronúcleo nas duas linhagens celulares. A análise destes dados permite inferir que o
polissacarídeo de β-glucana possui atividade tanto por desmutagênese como por
bioantimutagênese, visto que a linhagem celular CHO-k1 indicou atividade protetora em
todos os protocolos testados. A porcentagem de redução de danos foi menor no protocolo
de pós-tratamento. Diante deste fato fez-se a avaliação da linhagem celular deficiente em
reparo (CHO-xrs5), para que se pudesse confirmar ou não a hipótese de bioantimutagênese.
4. Discussão
Estudos já realizados na área de câncer e genética toxicológica apontam alguns
marcadores biológicos importantes. Preparações de glucanas, extraídas de Saccharomyces
cerevisiae, foram capazes de causar redução significativa no crescimento de carcinomas
mamários e em melanomas B16. Estes mesmos extratos foram também eficientes em
aumentar a sobrevida de camundongos A/J e C57BL/6J com implante tumoral subcutâneo
(Di Luzio et al., 1979).
Estudos in vivo relatam a eficiência da β-glucana, de baixo peso molecular, em
prevenir efeitos mutagênicos quando os animais foram expostos à ciclofosfamida. Estes
74
estudos mediram a capacidade anticlastogênica da β-glucana através do ensaio do
micronúcleo em células da medula óssea de camundongos (Chorvatovicová et al., 1996;
Chorvatovicová et al., 1998).
Um estudo de genotoxicidade in vitro relata a eficácia de β-glucanas em prevenir
danos genotóxicos causados em fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79) pelo
peróxido de hidrogênio (Slamenová et al., 2003).
No presente trabalho foi utilizado o metilmetanosulfonato (MMS) como o agente
indutor de danos no DNA. Esta substância é classificada como um agente alquilante e os
danos causados por ele envolvem a transferência de grupos metil para as bases nitrogenadas
do DNA, levando a pareamentos de bases alterados que podem introduzir transições,
transversões e mudanças de matriz de leitura, além da capacidade de induzir quebras
cromossômicas, uma vez que alguns agentes alquilantes, particularmente os disfuncionais,
possuem a capacidade de se intercalar nos filamentos e/ou nas moléculas de DNA (Snustad
and Simmons, 2001).
Na presente pesquisa quatro diferentes doses de β-glucana foram testadas quanto à
sua capacidade antigenotóxica, anticlastogênica e no aumento da viabilidade celular em
sistemas de culturas de células CHO-k1 e CHO-xrs5. No entanto, antes de avaliar estes
efeitos, foi realizada uma avaliação das suas capacidades genotóxica, clastogênica e
indutora de apoptose e necrose nestas mesmas culturas.
As quatro diferentes doses de β-glucana testadas em CHO-k1 não apresentaram
capacidade de induzir danos do tipo clastogênico e/ou genotóxico medidos pelos ensaios de
micronúcleo e cometa, respectivamente. As mesmas doses também não provocaram
diminuição do índice de viabilidade celular e/ou aumento dos índices de apoptose e
75
necrose. Na linhagem CHO-xrs5 foi testada somente a maior dose de β-glucana, e também
neste sistema não houve alteração nos mesmos parâmetros analisados.
Na avaliação da anticlastogenicidade em células CHO-k1, o protocolo de pré-
tratamento demonstrou que todas as doses testadas apresentaram eficiência
quimiopreventiva. O protocolo de tratamento simultâneo simples indicou efeito preventivo
somente nas duas doses mais altas e a porcentagem de redução destas mostrou um discreto
aumento em relação às mesmas doses no protocolo de pré-tratamento. Este fato pode
sugerir que a interação entre os agentes clastogênico e anticlastogênico possa se iniciar
ainda no meio extracelular e prosseguir após se encontrarem no meio intracelular, e desta
forma seria verificada uma menor biodisponibilidade de MMS que poderiam causar danos
às moléculas de DNA, tanto no caso do pré-tratamento como com as maiores doses de β-
glucana no tratamento simultâneo simples.
O protocolo de tratamento simultâneo após pré-incubação indica que todas as doses
apresentaram-se eficientes na prevenção dos danos clastogênicos. Apesar das duas doses
não efetivas em tratamento simultâneo simples (β
1
e β
2
) apresentarem agora uma
efetividade estatisticamente significativa, as porcentagens de redução não diferem de forma
discrepante, ou seja, os valores encontram-se ainda relativamente próximos. Este fato pode
sugerir que as moléculas de MMS foram inativadas de forma mais eficiente no tratamento
da pré-incubação, como se a β-glucana, uma vez no interior da célula, se ligasse ao MMS
para realizar uma inativação química ou induzisse a célula a estar melhor preparada para
evitar os danos no DNA durante a replicação.
O pós-tratamento demonstrou que somente a menor dose não foi eficiente na
prevenção aos danos. Ainda que a porcentagem de redução de danos tenha sido menor
76
neste protocolo quando comparada a todos os outros, este fato pode sugerir que a β-glucana
possa atuar na célula após a indução do dano pelo MMS, talvez com alguma função
estimuladora no sistema de reparo do DNA.
Segundo Kada et al. (1982,) existem dois tipos de substâncias protetoras do DNA,
as que agem por desmutagênese, e aquelas que agem por bioantimutagênese. As
substâncias desmutagênicas são capazes de impedir a ação dos agentes indutores de danos,
principalmente por adsorção aos mesmos. Já as bioantimutagênicas, em geral, atuam como
moduladoras do reparo e replicação do DNA (Kada and Shimoi, 1987; De Flora, 1998).
Logo, na tentativa de elucidar o mecanismo de ação do polissacarídeo β-glucana, utilizou-
se de protocolos descritos pela literatura pertinente: pré-tratamento, tratamento simultâneo
simples e após pré-incubação e pós-tratamento (De Flora, 1998).
Diante dos dados obtidos nesta pesquisa, pode-se supor que o mecanismo de ação
do polissacarídeo β-glucana seja tanto por desmutagênse como por bioantimutagênese
sendo este último de menor eficiência devido apresentar uma menor porcentagem de
redução de danos em pós-tratamento. Este fato deixa dúvidas em relação à possibilidade de
se afirmar ou não a eficiência do polissacarídeo por bioantimutagênese. Para auxiliar no
esclarecimento desta questão, na presente pesquisa decidiu-se utilizar a linhagem celular
CHO-xrs5, deficiente em reparo, para verificar se a β-glucana estaria realmente agindo por
este meio.
Os resultados dos protocolos de tratamento simultâneo simples e pós-tratamento
com esta segunda linhagem celular demonstraram que, mesmo sendo deficiente em reparo,
as células submetidas ao primeiro protocolo mostraram diferença estatisticamente
significativa quando comparados ao agente indutor de danos, o quê sugere o mecanismo de
77
ação por desmutagênese. No entanto, os resultados obtidos no pós-tratamento não
apresentaram nenhuma eficiência antimutagênica da β-glucana visto que este protocolo
avalia a indução de mecanismo de reparo, e esta linhagem celular é deficiente no mesmo.
O tratamento simultâneo simples na linhagem celular CHO-k1, com a dose mais alta
de β-glucana, apresentou uma porcentagem de redução de danos igual a 55,6%. Já na
linhagem celular CHO-xrs5, esta porcentagem foi menor (39,7%). Percebe-se então uma
diferença de aproximadamente 15,9% na eficiência quimiopreventiva das linhagens
celulares. Este fato sugere que a deficiência no reparo possa ser a responsável por este
decréscimo, visto que um dano clastogênico, causado em exposição simultânea a um agente
clastogênico e outro anticlastogênico, possa ser reparado a posteriori. Esta relação tão direta
talvez não seja totalmente adequada, visto que as doses de MMS usadas para esta
comparação não foram as mesmas. A dose de exposição da segunda linhagem celular é de
50% da utilizada para a CHO-k1, o que pode sugerir uma menor indução de danos. Porém,
pôde-se notar em experimentos pilotos, dados não apresentados, que a exposição à mesma
concentração de MMS causava um alto índice de morte celular e atraso no índice mitótico,
impossibilitando-se, assim, a contagem das 2000 células binucleadas/tratamento. Nota-se,
então, que a linhagem celular CHO-xrs5 é mais susceptível a danos causados pelo agente
alquilante, e talvez este fato promova uma compensação indireta da menor dose utilizada.
Auxiliam no entendimento deste fato trabalhos citogenéticos que demonstram que
linhagens celulares deficientes em reparo apresentam maior quantidade de danos
clastogênicos espontâneos e que danos induzidos por agentes, como o MMS, são bem
maiores quando comparados às linhagens selvagens (Stopper et al., 1997).
78
O protocolo de pós-tratamento em CHO-k1 demonstrou uma porcentagem de
redução de danos de 34,2%, com a β
4
e nesta mesma dose para CHO-xrs5 observou-se uma
porcentagem de redução de danos de 2,96%. Este fato demonstra uma diferença de cerca de
31,2% na eficiência. Assim, fica claro que a porcentagem de redução de danos na segunda
linhagem, além de não ser estatisticamente significativa, é muito baixa, o quê pode sugerir
que não houve nenhuma ação por bioantimutagênse. Desta forma, esta ausência de ação
corrobora a hipótese de mecanismo de ação por bioantimutagênese proposta para a
linhagem celular CHO-k1.
Estudos indicam que a carcinogenicidade e a mutagenicidade são dois processos que
estão relacionados uma vez que muitos carcinógenos químicos podem interagir com o
material genético. Assim, partindo-se do princípio que um câncer possa ser induzido por
um evento mutacional (Ames et al., 1973; Vogel, 1982), pode-se pensar na utilização das β-
glucanas como agentes anticancerígenos e/ou antimutagênicos.
Estudos descrevem a atividade anticancerígena da β-glucana, e alguns desses
polissacarídeos extraídos de fungos, têm sido utilizados clinicamente no Japão (Kaneno et
al., 1989). Segundo Charvatovicová et al. (1998) seria importante estudar nestas terapias a
administração concomitante da β-glucana e da ciclofosfamida, quimioterápico, para que se
demonstrasse a possiblidade daquela em diminuir os efeitos adversos da quimioterapia. No
entanto, ainda são muito controversos os princípios moleculares e bioquímicos que
envolvem a atividade antitumoral, antimutagênica e imunoestimulatória das diferentes β-
glucanas (Kishida et al., 1992; Saitô et al., 1991; Demleitner et al., 1992). Neste contexto,
esta pesquisa contribui para o entendimento do mecanismo de ação do polissacarídeo β-
glucana em suas atividades anticlastogênicas. Logo, a elucidação da ação deste
79
polissacarídeo por desmutagênese e bioantimutagênese pode auxiliar na conduta de novas
terapias em carcinogênese.
O ensaio do cometa demonstrou que as quatro diferentes concentrações de β-
glucana não apresentam atividade genotóxica. No entanto, quando estas mesmas doses de
β-glucana foram associadas ao agente indutor de danos, MMS, nenhum efeito
antigenotóxico foi evidenciado. A literatura indica que, em protocolos de tratamento
simultâneo com pré-incubação de β-glucanas com peróxido de hidrogênio e azul de
metileno, em células V79 (fibroblasto de pulmão de hamster Chinês), foram verificados
efeitos antigenotóxicos (Slamenová et al., 2003). Mas os dados da presente pesquisa não
demonstraram eficiência. Faz-se necessário dizer que apesar dos dois estudos utilizarem β-
glucanas de mesma origem, Saccharomyces cerevisiae, a forma de extração foi diferente,
fato que dificulta a discussão dos dados. Outro fato ainda a ser considerado é a diferença
das linhagens celulares testadas, visto que estas podem possuir respostas diferentes aos
agentes em teste. Uma outra questão a ser considerada é a eficiência de danos causados por
formas reativas de oxigênio e aqueles causados por um agente alquilante, já que este último
apresenta uma maior eficiência. Assim, este fato demonstra que a eficiência da β-glucana
poderia ser mais facilmente detectada em um protocolo que utilizasse como agente indutor
de danos um agente que apresente características menos genotóxicas.
O fato anteriormente descrito pode criar questionamentos a respeito da real
atividade e eficiência da β-glucana em quimioprevenção. Assim, faz-se necessário pensar
que os dois testes apresentados até o momento avaliam danos diferentes. O teste do
micronúcleo quantifica danos citogenéticos, ou seja, eventos mutacionais já fixados no
80
genoma celular (Salvadori et al., 2003); já o teste do cometa indica danos genotóxicos, que
podem ou não se tornar mutações.
O teste de viabilidade celular, em células CHO-k1, demonstrou que as quatro
diferentes doses de β-glucanas não interferiram nos índices de viabilidade celular, apoptose
e necrose, quando comparados aos controles. Quando as associações foram realizadas nos
protocolos de tratamento simultâneo simples ou com pré-incubação, verificou-se que as β-
glucanas foram eficazes em diminuir o índice de apoptose e desta forma aumentar o índice
de viabilidade celular. Apenas uma exceção foi verificada: a associação da β-glucana na
menor dose em protocolo de tratamento simultâneo simples, apesar de permitir este
raciocínio, também provocou o aumento do índice de necrose de forma estatisticamente
significativa.
Segundo Fenech et al. (1999) os eventos de apoptose atuam na eliminação de
células micronucleadas, reduzindo, portanto, a freqüência de células com danos
clastogênicos. Vukicevic et al. (2004), por sua vez apresentam duas considerações distintas
entre si a este respeito. Na primeira delas os autores dizem que uma alta freqüência de
células em apoptose pode relacionar-se a outros danos genéticos que não resultariam na
formação de micronúcleos, e assim não elevariam a sua freqüência. Por outro lado, um
aumento na freqüência de micronúcleos e índices de apoptose normais poderiam ser
explicados pela indução de supressão apoptótica nas células micronucleadas, tornando-se
estas necróticas antes mesmo de passarem pela mitose.
Esta última hipótese pode auxiliar no entendimento dos resultados encontrados
nesta pesquisa, já que nos protocolos de tratamento simultâneo simples e com pré-
incubação, observou-se um aumento na freqüência de micronúcleos sem importantes
81
alterações no índice de apoptose quando comparados ao controle. Contribui ainda para este
entendimento o aumento do índice de necrose observado em todos os tratamentos, apesar
dos mesmos não terem apresentado grandes elevações em seus números, excetuando-se a
menor dose da β-glucana no protocolo de tratamento simultâneo.
O teste de viabilidade celular também foi realizado com a linhagem celular CHO-
xrs5, utilizando-se os protocolos de tratamento simultâneo e pós-tratamento, visto que estes
eram os dois protocolos indicados para a confirmação do mecanismo de ação do
polissacarídeo em estudo. Assim, pode-se perceber que, quando se faz a comparação dos
índices de viabilidade celular, apoptose e necrose, nas duas linhagens celulares, o primeiro
deles não sofre uma grande variação, já que foi de 65,5% para o tipo k1 e 54,7% para o tipo
xrs5. No entanto, para o índice de apoptose em xrs-5, verifica-se um valor que é quase o
dobro daquele encontrado em k1, ou seja, os valores passam de 24,0 para 45,3%. Já o
índice de necrose diminui cerca de 10 vezes. Desta forma, neste experimento não se
verifica a mesma hipótese proposta para k1, pois o índice de apoptose não permaneceu
próximo ao do controle. No protocolo de pós-tratamento verificou-se que a β-glucana foi
eficiente em prevenir os danos causados pelo MMS, já que o índice de viabilidade celular
aumentou quando comparado ao MMS e o de apoptose diminuiu. No entanto, estes dois
parâmetros demonstram valores menores do que aqueles observados no protocolo
simultâneo simples, demonstrando assim a melhor eficiência do protocolo de pós-
tratamento.
Desta forma, a pesquisa de Fenech et al. (1999) é a que melhor auxilia na explicação
destes dados, ou seja, o aumento de células em apoptose poderia estar diretamente
82
relacionado à eliminação de células micronucleadas, o quê traria a redução de células com
danos clastogênicos.
Porém, apesar de haver diferentes pesquisas que possam corroborar os dados
encontrados neste estudo, não se pode fechar o assunto a respeito da relação entre
micronúcleos e índice de apoptose, sendo necessários novos estudos que auxiliem na
compreensão destes processos e suas relações.
Assim, diante dos dados apresentados, a presente pesquisa permite inferir que o
polissacarídeo β-glucana possui um mecanismo de ação tanto por desmutagênese quanto
por bioantimutagênese, sendo este último em menor proporção. Esta determinação do
mecanismo de ação poderá gerar modificações em condutas terapêuticas frente a
tratamentos quimioterápicos, já que em um futuro próximo a β-glucana poderá se tornar um
adjuvante importante na quimioterapia por ser capaz de diminuir os efeitos adversos da
mesma, como é o caso dos efeitos clastogênicos.
O fato da β-glucana não ter apresentado nenhum dano genotóxico e/ou clastogênico
permite sugerir o consumo da mesma, já que ela faz parte da composição de diferentes
alimentos funcionais que compõem parte da dieta de uma parcela da população.
E diante de uma possível comprovação da eficiência deste polissacarídeo em
prevenir danos genéticos em seres humanos e/ou a comprovação da mesma na melhoria da
qualidade de vida de pessoas que possuem câncer ou que estão passando por processos de
quimioterapia; a β-glucana poderá ser utilizada em larga escala na suplementação,
principalmente, de pães e farináceos, que são de baixo custo e estão disponíveis para uma
maior parcela da população. Ou ainda, esta substância poderá sair da classe de alimentos
83
funcionais e se tornar um fármaco, de origem natural, que poderá ser utilizado na forma de
cápsula e/ou soluções administradas por diferentes vias.
Agradecimentos:
Esta pesquisa obteve apoio financeiro da CAPES, CNPq e Fundação Araucária.
Agredecimentos a Dr. A. Levya e senhorita A.F. Silva pelo auxílio com a língua
Inglesa e edição do manuscrito.
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86
Tabela 01 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média, desvio padrão e
porcentagem de redução de danos referentes aos ensaios do micronúcleo nos testes de
mutagenicidade e antimutagenicidade em células CHO-k1:
Protocolo
Tratamento
Dose
Freqüência
de MN
1
Números
mínimo e
máximo
2
X ± DP
% redução
de danos
Mutagenicidade
Controle 15 4 – 6
5.00 ± 1.00
-
MMS
37,6 µg/ml
132
a
* 36 – 50
44.00 ± 7.21
-
5.0 µg/ml
9
a
3 – 3
3.00 ± 0.00
-
10.0 µg/ml
12
a
3 – 5
4.00 ± 1.00
-
20.0 µg/ml
18
a
4 – 7
6.00 ± 1.73
-
Tratamento
de Pulso
β-Glucana
40.0 µg/ml
14
a
3 – 6
4.67 ± 1.53
-
Antimutagenicidade
5.0 µg/ml
91
b
24 – 35
30.33 ± 5.69
35.0
10.0 µg/ml
65
b
* 18 – 24
21.67 ± 3.21
57.3
20.0 µg/ml
76
b
* 21 – 29
25.33 ± 4.04
47.9
Pré-
Tratamento
β-Glucana +
MMS
40.0 µg/ml
81
b
* 26 – 29
27.00 ± 1.73
43.6
5.0 µg/ml
109
b
32 – 43
36.33 ± 5.86
19.7
10.0 µg/ml
105
b
31 – 40
35.00 ± 4.58
23.1
20.0 µg/ml
70
b
* 21 – 27
23.33 ± 3.21
53.0
Simultâneo
β-Glucana +
MMS
40.0 µg/ml
67
b
* 21 – 25
22.33 ± 2.31
55.6
5.0 µg/ml
72
b
* 20 – 28
24.00 ± 4.00
51.3
10.0 µg/ml
82
b
* 25 – 29
27.33 ± 2.08
42.7
20.0 µg/ml
66
b
* 26 – 26
22.00 ± 5.29
56.4
Simultâneo
com Pré-
Incubação
β-Glucana +
MMS
40.0 µg/ml
76
b
* 24 – 28
25.33 ± 2.31
47.9
5.0 µg/ml
111
b
32 – 46
37.00 ± 7.81
17.9
10.0 µg/ml
88
b
* 26 – 32
29.33 ± 3.05
37.6
20.0 µg/ml
95
b
* 26 – 38
31.67 ± 6.03
31.6
Pós-
Tratamento
β-Glucana +
MMS
40.0 µg/ml
92
b
* 24 – 35
30.67 ± 5.86
34.2
1
Freqüência de MN (micronúcleo) por 6000 células analisadas;
2
Números mínimo e máximo de MN por 6000
células analisadas; X – Valores Médios; DP – Desvio Padrão; MMS – Metilmetanosulfonato;
a
Comparado
estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com MMS; *diferença estatisticamente
significativa (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
87
Tabela 02 – Porcentagem de incremento ou decréscimo da atividade antimutagênica da β-
glucana nos diferentes protocolos experimentais comparados ao protocolo de tratamento
simultâneo com pré-incubação:
Protocolos Tratamento
Dose de β-Glucana
(µg/ml)
Pré-tratamento Simultâneo
Simples
Pós-tratamento
5.0 -31.8 -61.6 -61.5
10.0 +34.2 -45.9 -11.9
20.0 -15.1 -6.00 -44.0
β-Glucana + MMS
40.0 -9.00 +16.1 -28.6
88
Tabela 03 – Freqüência de células lesionadas, distribuição entre as classes de danos e
escore referentes aos testes de genotoxicidade e antigenotoxicidade nos protocolos
simultâneos simples e com pré-incubação, ensaio do cometa em células CHO-k1 (Valores
Médios ± Desvio Padrão):
Classes do Cometa Tratamento Total
1
0 1 2 3
Escore
Genotoxicidade
Controle
15.7±7.4 81.0±5.6 12,7± 6.4 2.0±1.0 1.0±1.0 19.7±8.6
MMS
95.7±3.2
a
* 4,3±3.2 79.0±12.5 14.0±12.3 2,7±2.3 115.0±16.4
β
1
21.0±9.5
a
79.0±9.5 18,7±9.1 2.0±1.7 0,3±0.58 23.7±11.0
β
2
25.0±8.0
a
75.0±8.0 23,3±7.8 1.0±1.0 0,7±1.1 27.3±9.1
β
3
20.7±4.0
a
79,3±4.0 19.0±6.6 1,7±2.9 0.0±0.0 21.0±3.6
β
4
20.0±8.7
a
80.0±8.7 18,3±9.2 1,3±1.5 0,3±0.6 22.0±7.9
Antigenotoxicidade
Protocolo de Tratamento Simultâneo Simples
MMS + β
1
93.0±7.5
b
7.0±7.5 64.0±12.1 26,7±10.6 2,3±2.5 124.3±18.0
MMS + β
2
90.3±8.1
b
9,7±8.1 80.0±12.1 7,7±5.5 2,7±1.5 103.3±5.5
MMS + β
3
94.7±5.0
b
5,3±5.0 78.0±3.0 14,3±4.0 2,3±4.0 114.7±11.1
MMS + β
4
95.3±1.5
b
4,7±1.5 83,3±11.6 7,3±4.2 4,7±6.4 112.0±15.7
Protocolo de Tratamento Simultâneo com Pré-Incubação
MMS + β
1
99.7±0.6
b
0,3±0.6 86,7±12.7 11,3±11.1 1,7±2.1 114.3±15.6
MMS + β
2
93.0±5.2
b
7.0±5.2 82,7±7.6 10.0±2.6 0,3±0.6 103.7±4.2
MMS + β
3
98.0±2.0
b
2.0±2.0 91,3±3.8 5,7±4.7 1.0±1.0 105,7±8.6
MMS + β
4
98.7±1.5
b
1,3±1.5 89,3±4.9 8,3±5.5 1.0±1.0 109.0±8.7
1
Número total de células lesionadas; MMS – Metilmetanosulfonato na concentração de 4,23µg/mL; β
1
, β
2
, β
3
,
β
4
- β-Glucana nas concentrações de 5.0, 10.0, 20.0 e 40.0 µg/ml, respectivamente;
a
Comparado
estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com MMS; *Diferença estatisticamente
significativa (Teste: t-Student; p<0,05).
89
Tabela 04 – Freqüência de células normais, em apoptose inicial, apoptose final, necrose,
índice de viabilidade celular, apoptose e necrose referentes aos protocolos de tratamento de
pulso, simultâneo simples e com pré-incubação em células CHO-k1 (Valores Médios ±
Desvio Padrão):
Classificação dos Tipos Celulares
Tratamento
Normais Apoptose
Inicial
Apoptose
Final
Necrose
IVC
1
IA
2
IN
3
Tratamento de Pulso (3h)
Controle
153,7±11.0 28.0±19.7 6,7±2.5 11,7±18.5
76.8 17.3 5.9
MMS
43.0±23.3 133,7±19.1 13,7±3.8 9,7±9.0
21.5
a
* 73.6
a
* 4.9
a
β
1
142,7±8.4 40.0±9.6 9,7±18.9 7,7±9.0
71.3
a
24.8
a
3.9
a
β
2
138.0±9.2 42,7±14.4 6,3±3.0 13.0±11.5
69.0
a
24.5
a
6.5
a
β
3
133,7±23.2 47.0±11.5 3.0±2.6 16,3±12.7
66.8
a
25.0
a
8.2
a
β
4
135,7±11.9 32,7±23.5 2,3±1.1 29,3±13.9
67.8
a
17.5
a
14.7
a
Tratamento Simultâneo Simples
MMS + β
1
132,3±6.7 25,3±17.0 2.0±2.0 40,3±8.5
66.2
b
* 13.7
b
* 20.1
b
*
MMS + β
2
123,3±19.9 59,7±23.5 4,3±2.9 12,7±9.1
61.6
b
* 32.0
b
* 6.4
b
MMS + β
3
133.0±15.6 39.0±11.1 3.0±4.4 25.0±14.0
66.5
b
* 21.0
b
* 12.5
b
MMS + β
4
131.0±7.2 41,7±9.6 6,3±2.3 21.0±10.4
65.5
b
* 24.0
b
* 10.5
b
Tratamento Simultâneo com Pré-Incubação
MMS + β
1
126.0±17.6 49.0±31.9 1,7±1.1 23,3±21.8
63.0
b
* 25.3
b
* 11.7
b
MMS + β
2
161,3±23.6 26,3±11.9 0.0±0.0 12,3±16.3
80.6
b
* 13.2
b
* 6.2
b
MMS + β
3
146.0±43.7 26,3±9.3 2,3±2.5 15,3±21.4
78.0
b
* 14.3
b
* 7.7
b
MMS + β
4
156,0±26.7 29,7±29.8 0,3±0.6 21,3±26.6
74.3
b
* 15.0
b
* 10.7
b
1
Índice de viabilidade celular;
2
Índice de Apoptose;
3
Índice de Necrose; MMS – Metilmetanosulfonato na
concentração de 4,23µg/mL; β
1
, β
2
, β
3
, β
4
- β-Glucana nas concentrações de 5.0, 10.0, 20.0 e 40.0 µg/ml,
respectivamente;
a
Comparado estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com MMS;
*Diferença estatisticamente significativa (Teste: t-Student; p<0,05).
90
Tabela 05 – Freqüência, variação (número mínimo e máximo), média, desvio padrão e
porcentagem de redução de danos referentes aos ensaios do micronúcleo nos testes de
mutagenicidade e antimutagenicidade em células CHO-xrs5:
Protocolo
Tratamento
Dose
Freqüência
de MN
1
Número
mínimo e
máximo
2
X ± DP
% redução
de danos
Mutagenicidade
Controle 21 5 – 8
7.00±1.73
-
MMS
18,8µg/mL
89
a
* 26 – 32
29.67±3.21
-
Tratamento
de Pulso
β-Glucana 40.0 µg/ml
32
a
10 – 11
10.67±0.58
-
Antimutagenicidade
Tratamaneto
Simultâneo
β-Glucana +
MMS
40.0 µg/ml
62
b
* 20 – 21
20.67±0.58
39.7
Pós-
Tratamento
β-Glucana +
MMS
40.0 µg/ml
87
b
24 – 34
29.00±5.00
2.96
1
Freqüência de MN (micronúcleo) por 6000 células analisadas;
2
Número mínimo e máximo de MN por 6000
células analisadas; X – Valores Médios; DP – Desvio Padrão; MMS – Metil-metano-sulfonato;
a
Comparado
estatisticamente com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com MMS; *diferença estatisticamente
significativa (Teste: Qui-quadrado).
91
Tabela 06 – Freqüência de células normais, em apoptose inicial, apoptose final, necrose,
índice de viabilidade celular e índice de apoptose referentes à mutagenicidade e
antimutagenicidade nos protocolos de tratamento simultâneo simples e pós-tratamento em
células CHO-xrs-5 (Valores Médios ± Desvio Padrão):
Classificação dos Tipos Celulares
Tratamento
Normais Apoptose
Inicial
Apoptose
Final
Necrose
IVC
1
IA
2
IN
3
Tratamento de Pulso (3h)
Controle
175,3±8.1 18,7±3.0 5.0±4.4 1.0±1.0
87.7 11.8 0.50
MMS
18.0±5.2 167,7±7.8 13,7±10.2 0,7±0.6
9.00
a
* 90.7
a
* 0.30
a
β
4
157.0±2.6 37,3±0.58 5,7±2.9 0.0±0.0
78.5
a
* 21.5
a
* 0.00
a
Tratamento Simultâneo Simples
MMS + β
4
109,3±17.6 81,3±15.3 9,3±10.1 0.0±0.0
54.7
b
* 45.3
b
* 0.00
b
Pós-tratamento
MMS + β
4
61.0±23.6 137,3±22.7 1,7±2.9 0.0±0.0
30.5
b
* 69.5
b
* 0.00
b
1
Índice de viabilidade celular;
2
Índice de Apoptose;
3
Índice de Necrose; MMS – Metilmetanosulfonato na
concentração de 18,8µg/mL; β
4
- β-Glucana na concentração de 40.0 µg/ml;
a
Comparado estatisticamente
com o Controle;
b
Comparado estatisticamente com MMS; *Diferença estatisticamente significativa (Teste: t-
Student).
Tabela 07 – Sumário dos resultados referentes aos ensaios do micronúcleo nas duas
linhagens celulares:
Protocolo de Tratamento Tratamento
Dose (µg/ml)
Pré Simultâneo Pré-incubação Pós
Tipo Celular – CHO-k1
5.0 - - + -
10.0 + - + +
20.0 + + + +
MMS +
β-Glucana
40.0 + + + +
Tipo Celular – CHO-xrs5
5.0 NA NA NA NA
10.0 NA NA NA NA
20.0 NA NA NA NA
MMS +
β-Glucana
40.0 NA + NA -
NA – Não aplicado
92
5. ARTIGO 3
Efeitos do polissacarídeo β-glucana na clastogenicidade e
teratogenicidade causadas pela exposição aguda à ciclofosfamida em
camundongos
Artigo a ser submetido à Revista Reproductive Toxicology
93
Efeitos do polissacarídeo β-glucana na clastogenicidade e teratogenicidade causadas pela
exposição aguda à ciclofosfamida em camundongos
Rodrigo Juliano Oliveira
1
, Maria José Sparça Salles de Faria
1
, Ariane Fernanda da Silva
1
,
Ana Carolina dos Santos Lourenço
1
, Tatiane Yumi Nakamura Kanno
1
, Gabriele Antico
Freiria
1
, Hevenilton José Matiazi
2
, Mário Sérgio Mantovani
1
*
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina (UEL). Londrina
(PR), Brasil
2
Laboratório de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos, Universidade Estadual de
Londrina (UEL). Londrina (PR), Brasil
*Autor correspondente:
Telefone: +55 43-3371 4417; Fax: +55 43-3371 4527
e-mail: biom[email protected]
94
Resumo
Alterações que podem levar ao desenvolvimento do câncer podem também estar
relacionadas ao desenvolvimento adverso da prole de animais experimentais. Alguns
alimentos funcionais, que possuem na sua constituição o polissacarídeo β-glucana, estão
descritos como eficientes na prevenção de danos clastogênicos. Diante deste fato a presente
pesquisa teve por objetivo avaliar a eficiência deste polímero de açúcar no controle de
danos mutagênicos e teratogênicos. Dois lotes de fêmeas, prenhes e não prenhes, foram
avaliados. A análise dos resultados indicou que a β-glucana foi eficiente em prevenir danos
clastogênicos tanto em fêmeas prenhes como nas não prenhes. Demonstrou ainda que as
fêmeas grávidas parecem ser mais susceptíveis aos danos mutagênicos. No entanto, os
efeitos teratogênicos não foram prevenidos de forma eficiente, mas uma tendência à
redução da taxa de malformações foi evidenciada. Outro resultado importante foi que
apesar da β-glucana não ter prevenido as malformações ela mostrou-se muito eficiente no
aumento da viabilidade fetal e redução das taxas de perda pós-implantacional e reabsorção
demonstrando assim uma melhora do desempenho reprodutivo das fêmeas. No entanto,
verifica-se que a β-glucana possui baixo potencial na prevenção de malformações, mas é
uma forte candidata a ser utilizada na prevenção de danos genéticos e como adjuvante nas
quimioterapias às quais pacientes oncológicos são submetidos.
Palavras-chave: β-glucana, ciclofosfamida, teratogenicidade, antimutagenicidade.
95
1. Introdução
Eventos mutagênicos e teratogênicos estão relacionados, uma vez que ambos
decorrem de alterações fixadas no DNA. Estas alterações levam a mudanças no padrão da
expressão gênica que acarretam fenótipos adversos provenientes de alterações,
principalmente, nos eventos de mitose envolvidos nos processos de crescimento,
morfogênese e diferenciação celular, entendidos aqui como maturação dos processos
fisiológicos.
Os fatores genéticos constituem a causa mais comum de malformações congênitas,
sendo responsáveis por cerca de um terço dos casos na espécie humana [1]. Estimativas da
incidência das causas de malformações congênitas primárias destacam as aberrações
cromossômicas como responsáveis por 6-7%, genes mutantes por 7-8%, fatores ambientais
por 7-10%, herança multifatorial por 20-25% e 50-60% de etiologia desconhecida [2-4]. No
entanto, é provável que a maioria das crianças com malformações congênitas de etiologia
desconhecida tenha algum distúrbio genético [1].
Além da associação entre eventos mutagênicos e teratogênicos pode-se ainda inferir
que esses se relacionam com outros eventos capazes de iniciar o desenvolvimento de
cânceres. Relacionados estes três processos biológicos entende-se que o aumento crescente
de resíduos industriais, agronômicos, domésticos e urbanos, advindos de ações
antropogênicas, pode relacionar-se ao aumento de tais eventos nas populações humanas.
Assim, tornam-se cada vez mais necessários testes genéticos que possam medir os riscos
impostos às populações e que possibilitem encontrar agentes naturais e/ou artificiais
capazes de minimizar e/ou impedir estes danos.
Como vários estudos indicam uma associação inversamente proporcional entre o
consumo de verduras e frutas e o desenvolvimento de doenças crônicas como o câncer
96
[5,6], é importante testar substâncias presentes neste tipo de dieta, para se determinar a
relevância desses compostos, na prevenção de efeitos mutagênicos e/ou teratogênicos.
O polissacarídeo β-glucana, objeto de estudo da presente pesquisa, é um polímero
de D-glicose que possui em seu esqueleto linear central ligações na posição β-(1→3). Este
polissacarídeo possui ainda ramificações contendo ligações β-(1→6) [7].
Nenhuma referência da utilização de β-glucana em testes de prevenção de
teratogenicidade foi encontrada na literatura consultada. No entanto, estudos destacam sua
capacidade de prevenção de danos clastogênicos e genotóxicos frente à ciclofosfamida,
cisplatina, doxorrubicina e peróxido de hidrogênio [8-10]. Diante disso, o objetivo do
presente trabalho foi avaliar o efeito da β-glucana na prevenção da teratogenicidade
causada por exposição aguda à ciclofosfamida e a sua capacidade antimutagênica em
fêmeas prenhes e não prenhes.
2. Material e Métodos
2.1. Agente indutor de danos no DNA e teratógeno
Para a indução de danos no DNA e teratogênese utilizou-se o agente alquilante, de
ação indireta, ciclofosfamida (Sigma), na concentração final de 20,0mg/Kg de peso
corpóreo (via intraperitoneal, i.p.), diluído em solução tampão fosfato (PBS), livre de Ca
+2
e Mg
+2
, pH 7,4. Este quimioterápico e imunossupressor tem sua ativação realizada
principalmente no fígado e seus metabólitos provocam potente ação mutagênica e
teratogênica.
97
2.2. Extração e preparação da
β
-glucana
As β-glucanas foram extraídas por autólise de Saccharomyces cerevisiae. Este
polissacarídeo possui cadeias principais formadas por moléculas de D-glicose unidas por
ligações do tipo β-(1→3) com ramificações laterais onde estão presentes ligações do tipo β-
(1→6). A parede celular foi separada através de centrifugação em 6500 g/8min e tratada à
quente (70°C em 5 horas) em meio alcalino com NaOH (10%), lavada e centrifugada três
vezes e finalmente secada em estufa a 40°C. Foi realizada análise em RMN (cromatografia
por ressonância magnética nuclear), comprovando-se a presença de (1,3 e 1,6) β-D-glucana
com pureza de 85% e, em seguida, solubilizando-se a glucana, utilizando-se DMSO
(dimetil sulfóxido) mais uréia 8,0M, na proporção de 100,0mL:60,0g. Levou-se ao banho-
maria, acrescentando-se 100,0mL de DMSO com 10,0mL de ácido sulfúrico concentrado e
permanecendo em agitação por 4 horas a 100ºC. Fez-se então a diálise com
aproximadamente 100,0L de água ultra-pura (Milli-Q) e concentrou-se a solução em um
evaporador rotativo a 40ºC para a posterior liofilização.
A solução de β-glucana foi preparada em PBS livre de Ca
+2
e Mg
+2
, pH 7,4 e estéril.
A concentração final utilizada foi de 150,0mg/Kg de peso corpóreo (i.p.).
2.3. Animais e delineamento experimental
Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus) de ambos os sexos (60
fêmeas e 20 machos), em idade reprodutiva, com peso médio de 30g, provenientes do
Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina. O experimento foi conduzido no
Biotério Setorial do Departamento de Biologia Geral. Os animais foram mantidos em caixa
98
de polipropileno, em dupla no caso das fêmeas e isolados no caso dos machos. Passaram
por um período mínimo de adaptação correspondente a sete dias. A luminosidade e
temperatura foram controladas, para tanto utilizou-se fotoperíodo de doze horas (12 horas
de claro: 12 horas de escuro) com temperatura mantendo-se em torno de 22±2ºC. A
alimentação foi constituída de água filtrada e ração comercial, ad libitum.
As fêmeas foram dividas em dois lotes. O primeiro deles composto por 40 animais
que foram submetidos ao cruzamento overnight, na proporção de 1 macho: 2 fêmeas, para
avaliação da teratogenicidade, mutagenicidade e antimutagenicidade. A detecção da
prenhez foi feita através da observação do plug vaginal, sendo este dia considerado o dia
zero de gestação. O segundo lote foi composto por 20 fêmeas, não prenhes, que serviram
para o estudo de mutagenicidade e antimutagenicidade da β-glucana.
2.4. Ensaio de teratogenicidade
O primeiro lote, de fêmeas prenhes (n=40), foi subdividido em 4 grupos
experimentais (n=10).
Os animais do grupo controle (Grupo 01) receberam PBS, livre de Ca
+2
e Mg
+2
, pH
7,4 e estéril, no volume de 0,1mL/10,0g de peso corpóreo, via intraperitoneal (i.p.), no 9º,
10º e 11º dias gestacionais. Os animais do grupo ciclofosfamida (Grupo 02) receberam este
quimioterápico na concentração de 20,0mg/kg de peso corpóreo (i.p.) no 10º dia
gestacional. Os animais do grupo β-glucana (Grupo 03) receberam este polissacarídeo no
9º, 10º e 11º dias gestacionais na concentração de 150,0mg/kg de peso corpóreo (i.p.). Já os
animais pertencentes ao grupo associado (Grupo 04) receberam 150,0mg/kg de peso
99
corpóreo (i.p.) de β-glucana, nos 9º, 10º e 11º dias gestacionais, e 20,0mg/kg de peso
corpóreo de (i.p.) de ciclofosfamida no 10º dia gestacional.
O período gestacional prolongou-se até o 17º dia, quando as fêmeas foram
submetidas à eutanásia, por deslocamento cervical, para a realização das laparatomias, já
que recém-nascidos malformados ou com baixa viabilidade são freqüentemente
canibalizados pelas genitoras.
Para avaliação de possíveis efeitos materno-tóxicos foram inspecionadas as vísceras
para detecção de anormalidades macroscópicas. Em seguida, coletou-se e pesou-se o
pulmão, coração, fígado e rins.
Procedeu-se, então, a histerectomia e onfalectomia, registrando-se número de sítios
de implantação, presença de reabsorções, número de fetos vivos e mortos, peso fetal e
placentário. Fez-se ainda uma análise sistemática para detecção de malformações externas e
sexagem. Com estes dados calculou-se os parâmetros relativos à fertilidade: Taxa de
reabsorção (nº de reabsorções x 100 / nº de implantações); Taxa de perdas pós-
implantacional (nº de implantações – nº de fetos vivos x 100 / nº de implantações); Índice
placentário (peso placentário / peso fetal); Taxa de malformações externas (nº de fetos
malformados x 100 / nº fetos analisados).
Fez-se também a adequação do peso à idade da prenhez segundo a metodologia de
Calderon [11]. Para este autor, os fetos podem ser classificados como: fetos com peso
adequado para a idade de prenhez (PAIP) – peso compreendido entre a média de peso dos
fetos do grupo controle mais ou menos o desvio padrão; fetos de baixo peso para a idade de
prenhez (BPIP) – peso corporal inferior à média de peso dos fetos do grupo controle menos
o desvio padrão deste mesmo grupo; fetos acima do peso para a idade de prenhez (APIP) –
100
peso corporal superior à média do peso dos fetos do grupo controle mais o desvio padrão
deste mesmo grupo.
A prole dos grupos foi divida, aleatoriamente, em dois subgrupos compostos cada
um por 50% da ninhada. O primeiro foi fixado em solução de Bodian’s e destinado à
análise visceral. Esta análise fez-se através de cortes/microdissecção proposta por Barrow
& Taylor [12] para o estudo de tórax e abdômen e pelos cortes estratégicos propostos por
Wilson [13] para estudo de cabeça. A classificação das alterações viscerais baseou-se,
principalmente, nos trabalhos de Taylor [14] e Manson & Kang [15] e alterações propostas
por Oliveira [16]. O segundo subgrupo foi destinado à análise esquelética através da técnica
de Alizarina red descrita por Staples & Schnell [17]. Os exames das vísceras e esqueletos
fetais foram realizados em lupa estereomicroscópica. Para a comparação dos resultados
quantitativos foram utilizados testes paramétricos e não paramétricos (ANOVA, Kruskal-
Wallis e Qui-quadrado), conforme a natureza da distribuição dos dados. Os dados
qualitativos e as freqüências obtidas, conforme recomenda a literatura especializada
[18,19], tiveram a ninhada utilizada como unidade-base. Em todos os casos, quando
p<0,05, a diferença foi considerada estatisticamente significativa.
2.5. Ensaio do micronúcleo em sangue periférico
Os grupos experimentais, do primeiro lote, foram submetidos à coleta de sangue
periférico, para avaliação de mutagenicidade e antimutagenicidade, através de punção da
veia caudal em 4 diferentes momentos. As coletas de sangue designadas pelos momentos
T0, T1, T2 e T3 foram realizadas no 9º, 10º, 11º e 12º dias gestacionais, respectivamente.
As coletas aconteceram sempre antes da administração das drogas (tratamentos).
101
O segundo lote, de fêmeas não prenhes (n=20), foi subdividido em 4 grupos
experimentais (n=5) e os tratamentos realizados foram idênticos àqueles descritos para o
lote anterior. Estes animais foram submetidos à coleta de sangue periférico, para avaliação
de mutagenicidade e antimutagenicidade, através da punção da veia caudal em 4 diferentes
momentos com intervalos de 24 horas (T0, T1, T2 e T3) realizados em 4 dias consecutivos
sempre antes da administração das drogas.
Para a avaliação da mutagenicidade e antimutagenicidade utilizou-se a técnica de
micronúcleo em sangue periférico descrita por Hayashi et al. [20]. Para tanto, uma gota de
sangue periférico foi depositada em uma lâmina previamente preparada com uma camada
de Laranja de Acridina (1,0 mg/mL). Cobriu-se a mesma com uma lâmínula e estas
permaneceram em freezer (-20ºC) por um período mínimo de 48 horas. A análise das
lâminas foi realizada em microscópio de fluorescência, combinando luz azul (488nm) e
filtro alaranjado, em objetiva de 100 vezes.
Analisou-se 2000 células/animal e a estatística foi realizada usando o teste do Qui-
quadrado (p<0,05).
A porcentagem de redução dos danos do agente mutagênico pela β-glucana foi
calculada através da média do número de células com danos observadas no grupo tratado
com o agente indutor de danos (ciclofosfamida) menos o número de células com danos
observadas no tratamento de antimutagenicidade (β-glucana + ciclofosfamida) x 100,
dividido pelo número de células com danos observadas no grupo tratado com o agente
indutor de dano menos o número de células com danos do grupo controle (PBS).
102
3. Resultados
3.1. Ensaio de teratogenicidade
Na Tabela 01 verifica-se o peso inicial, peso final e ganho de peso durante o período
de tratamento. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi encontrada entre os
grupos nos dois diferentes lotes de animais (fêmeas prenhes e não prenhes).
O peso de órgãos como coração, pulmões, fígado e rins das fêmeas referentes ao
lote 01 (animais prenhes) estão apresentados na Tabela 02. A análise destes dados indicou
diferença estatisticamente significativa somente para fígado, sendo observado diminuição
na média do peso dos fígados dos animais que receberam a ciclofosfamida (grupo 02).
A Tabela 03 apresenta os parâmetros relativos à fertilidade e desenvolvimento fetal.
A análise estatística demonstrou que não houve diferenças significativas para o número de
implantes, número de fetos vivos, razão sexual e índice placentário.
A análise da viabilidade fetal demonstrou redução no grupo que recebeu
ciclofosfamida (grupo 02) em relação ao grupo controle (grupo 01), e a associação da β-
glucana a este quimioterápico (grupo 04) auxiliou no aumento desta. A administração da β-
glucana promoveu um acréscimo de aproximadamente 26,5% na viabilidade fetal
observada com a ciclofosfamida, e esta expressiva porcentagem iguala o grupo 04 ao grupo
controle (grupo 01). Verificou-se ainda que a administração da β-glucana, isoladamente,
não interfere nos resultados deste parâmetro.
O mesmo raciocínio desenvolvido para a viabilidade fetal foi verificado também
para as taxas de perdas pós-implantacionais e de reabsorção, ou seja, a ciclofosfamida
causou um aumento das referidas taxas e a associação da β-glucana ao quimioterápico
demonstrou uma melhora destes parâmetros.
103
O peso da placenta apresentou-se diminuído no grupo 02 em relação aos demais. O
peso e o comprimento fetal mostraram-se diminuídos nos dois grupos que receberam a
ciclofosfamida, independentemente da associação da β-glucana. A análise da adequação do
peso à idade de prenhez demonstrou que os dois grupos que receberam ciclofosfamida
apresentaram fetos de baixo peso para a idade gestacional. Já os fetos do grupo 03 não
sofreram nenhuma alteração neste parâmetro. Auxiliam na compreensão deste fato os
comprimentos dos fetos os quais também se mostraram alterados somente naqueles grupos
que receberam a ciclofosfamida isolada ou associada à β-glucana.
Na Tabela 04 estão apresentadas as anormalidades externas e variações encontradas
em polo cefálico. A análise dos dados demonstra que a β-glucana não causou nenhuma
alteração na progênie das fêmeas tratadas com este polissacarídeo, segundo o protocolo
estabelecido. No entanto, a associação desta à ciclofosfamida não demonstra diferenças
estatisticamente significativas quando comparada à ciclofosfamida. Verifica-se somente
uma tendência à redução das porcentagens de malformações, tanto em olhos (grupo 02 =
90,2%; grupo 04 = 58,8%) como naquelas relacionadas às alterações da porção mais
proximal da calota craniana (grupo 02 = 75,4%; grupo 04 = 45,8%). A associação da β-
glucana à ciclofosfamida também demonstrou redução da porcentagem de alterações em
maxila, mandíbula e língua (grupo 02 = 72,9%; grupo 04 = 53,1%), e um aumento de
alterações em fendas lábio-palatais (grupo 02 = 5,00% ; grupo 04 = 9,26%). Para as
alterações de orelha verificaram-se valores semelhantes (grupo 02 = 38,7%; grupo 04 =
38,4%).
As alterações de membros, anteriores e posteriores, e cauda estão apresentadas na
Tabela 05. Nesta, verifica-se que as alterações de cauda ocorreram em freqüências
104
semelhantes entre os grupos 02 e 04 (grupo 02 = 24,6%; grupo 04 = 26,6%). No entanto,
para as alterações de membros verificou-se uma redução entre estes grupos (membros
anteriores: grupo 02 = 100%; grupo 04 = 72,1%; membros posteriores: grupo 02 = 93,7%;
grupo 04 = 64,5%). Porém, estas diferenças não são estatisticamente significativas.
A Tabela 06 apresenta os dados referentes às anormalidades e variações encontradas
em número de dedos de patas anteriores e posteriores na prole dos diferentes grupos
experimentais. A administração de β-glucana não promoveu alteração nos parâmetros
analisados. A associação da β-glucana à ciclofosfamida não provocou alterações entre este
grupo e aquele que recebeu somente a ciclofosfamida em relação às patas anteriores. No
entanto, para patas posteriores, verificou-se um aumento das alterações no grupo associado
(grupo 04) quando este foi comparado àquele que recebeu somente a ciclofosfamida (grupo
02).
Na Tabela 07 estão apresentados os dados referentes às alterações viscerais em polo
cefálico no seu terço superior. Quando da análise dos ventrículos cerebrais, pode-se
verificar que os laterais apresentaram alterações em todos os grupos experimentais,
variando de 43,7% no grupo 03 à 95,0% no grupo 02. Os resultados ainda demonstram que
a associação da β-glucana com a ciclosfosfamida não foi eficiente em reduzir os danos
causados por este quimioterápico. Os resultados referentes aos terceiro e quarto ventrículos
foram idênticos. Verificou-se que as alterações menos importantes aconteceram no grupo
03 e que a associação da β-glucana e a ciclofosfamida não foi eficiente em diminuir os
danos causados por este último composto. Quanto às malformações oculares, verifica-se
uma redução de cerca de 40% quando se faz a associação da β-glucana com a
ciclofosfamida, porém esta redução não foi estatisticamente significativa.
105
Na Tabela 08 pode-se verificar os dados referentes a alterações toráxicas e
urogenitais. As alterações cardíacas somente foram verificadas na prole das fêmeas tratadas
com β-glucana. No entanto, estas alterações não se apresentaram de forma estatisticamente
significativas. Rins em ferradura somente foram observados em um animal do grupo 04. Os
megauretéres puderam ser encontrados em todos os grupos, exceto no controle (grupo 01).
As maiores ocorrências foram no grupo 02, seguido pelos grupos 04 e 03. Diferenças
estatisticamente significativas foram encontradas entre os grupos 01 e 02 e entre 02 e 04. A
hidronefrose foi evidenciada em todos os grupos e diferenças estatisticamente significativas
foram verificadas entre os grupos 01 e 02 e 02 e 04. Neste último caso, nota-se que a β-
glucana foi eficiente na prevenção das malformações. As agenesias renal e gonadal foram
verificadas somente no grupo 04. No entanto, estas ocorrências não foram estatisticamente
significativas.
Nas Tabelas 09 e 10 estão apresentados os dados referentes às anormalidades
esqueléticas observadas na caixa craniana. A análise estatística demonstrou que a
associação da β-glucana à ciclofosfamida não foi eficiente em prevenir os danos causados
por esse quimioterápico. Para todos os parâmentros analisados verificou-se um aumento na
média da porcentagem de malformações, excetuando-se anormalidades em mandíbula,
frontal e interparietal. Nas anormalidades observadas no osso nasal, pôde-se verificar um
aumento da média da porcentagem de alterações, já que essa passou de 30,7% no grupo 02
para 83,8% no grupo 04.
Os dados referentes a alterações de ossos da região toráxica estão apresentados na
Tabela 11. Em todas as análises realizadas o grupo que recebeu a β-glucana isoladamente,
grupo 03, não apresentou malformações. No entanto, a análise de esterno demonstrou
106
diferença estatisticamente signifcativa entre os grupos 01 e 03. A análise também
demonstrou que a β-glucana foi capaz de prevenir danos em clavícula, ou seja, encontrou-
se diferença estatisticamente significativa entre os grupos 02 e 04. Para os outros
parâmetros não houve diferenças estatisticamente significativas. Para alterações de costela
e escápula também se verificou uma tendência à redução das malformações.
Nas Tabelas 12 e 13 verificou-se que a β-glucana não foi eficiente na prevenção de
nenhum tipo de dano em membros, superiores e inferiores. No entanto, observou-se uma
importante redução das malformações em pelve, visto que a média da porcentagem de
malformações passou de 90,0% no grupo 02 para 52,5% no grupo 04.
3.2. Ensaio do micronúcleo em sangue periférico
A Tabela 14 apresenta a freqüência, média, desvio padrão e porcentagem de redução
de danos referentes ao teste do micronúcleo em sangue periférico. A análise estatística para
o primeiro lote (fêmeas prenhes) demonstrou diferença significativa na freqüência de
micronúcleos, em T2 e T3, quando comparados os grupos 01 e 02, assim como quando
comparados os grupos 02 e 04. Neste último caso verificaram-se porcentagens de redução
de danos de 54,2 e 63,4% para os momentos T2 e T3, respectivamente. Estes dados
demonstram a eficiência da β-glucana na prevenção de danos clastogênicos. Verificou-se
ainda uma redução considerável na freqüência de micronúcleos no momento T2 no grupo
03 quando comparado ao grupo 01.
A análise do segundo lote (fêmeas não prenhes) demonstrou que houve diferença
estatisticamente significativa quando comparada a freqüência basal de micronúcleos entre
107
os grupos 01 e 03 no momento T0. Da mesma forma que no lote anteriormente analisado,
verificaram-se diferenças significativas entre os grupos 01 e 02, e 02 e 04 nos momentos T2
e T3. Neste caso, as porcentagens de redução de danos para os momentos T2 e T3 foram de
60,4 e 42,6%, respectivamente.
A Figura 01 apresenta o comportamento da freqüência de micronúcleos ao longo
dos dias de tratamento no lote de fêmeas prenhes. Nesta análise verificou-se um aumento
da freqüência de micronúcleos no grupo 02 (tratado com ciclofosfamida) após o T1, e esta
freqüência continuou aumentando até o final da análise (T3). No grupo 04, verificou-se que
a associação da β-glucana à ciclofosfamida foi eficiente na redução da freqüência de
micronúcleos. No gráfico esta evidência foi verificada pela linha do grupo 04, que se
manteve sempre abaixo da do grupo 02. Já quando se fez a análise da β-glucana,
isoladamente, pôde-se verificar que a administração das duas doses deste polissacarídeo
levou a uma redução dos níveis basais de micronúcleos, visto que a linha apresentou-se
abaixo da do grupo 01 (controle).
A análise da Figura 02 demonstra o comportamento da freqüência de micronúcleos
ao longo dos dias de tratamento no lote de fêmeas não prenhes. Como na análise anterior,
verifica-se que a associação da β-glucana à ciclofosfamida promoveu uma redução da
freqüência de micronúcleos. Porém, neste grupo, a administração da β-glucana sozinha não
reduziu os níveis basais de danos ao DNA.
Na Figura 03 está apresentada a comparação da freqüência de micronúcleos
entre os dois diferentes lotes, fêmeas prenhes e não prenhes, durante o período
experimental. A análise de T0 demonstra que o nível basal da freqüência de micronúcleos
em todos os grupos experimentais, independentemente da gestação, era semelhante. A
108
administração de ciclofosfamida, que pode ser avaliada em T2 e T3, demonstra uma maior
susceptibilidade do lote de fêmeas prenhes em comparação com as não prenhes. A maior
susceptibilidade a danos no DNA pode novamente ser verificada entre as fêmeas prenhes
para o tratamento no qual se faz a associação de ciclofosfamida e β-glucana no momento
T2.
4. Discussão
Este estudo demonstra a eficácia da β-glucana na prevenção de danos clastogênicos,
ou seja, um efeito antimutagênico. No entanto, a avaliação na prevenção da
teratogenicidade não demonstrou eficiência apesar da melhora do desempenho reprodutivo
de fêmeas.
Diferentes protocolos foram desenvolvidos para a prevenção de teratogenicidade
induzida por ciclofosfamida e efeitos preventivos foram encontrados em proles que tiveram
suas genitoras tratadas com extrato de sangue bovino livre de proteínas, conhecido como
Solcoseryl [21]; β-ionona nas doses de 250,0, 500,0, 750,0 e 1000,0mg/kg de peso corpóreo
[22]; e Indole-3-carbinol na dose de 100,00mg/kg de peso corpóreo, v.o. [23].
O presente protocolo utilizou fêmeas expostas ao quimiopreventivo por um período
de 3 dias e a exposição ao quimioterápico deu-se somente no segundo dia. Assim
pretendeu-se, neste protocolo experimental, conciliar um pré-tratamento, tratamento
simultâneo e pós-tratamento da β-glucana em relação à ciclofosfamida. Escolheu-se esta
forma de administração devido a estudos in vitro, do mesmo grupo de pesquisa, dados não
apresentados, indicarem que este polímero de D-glicose possui atividade antimutagênica,
109
sendo o mecanismo de ação caracterizado tanto por desmutagênese quanto por
bioantimutagênese. Desta forma, este protocolo permitiria uma melhor efetividade na
prevenção da teratogênese e dos efeitos mutagênicos.
A análise de micronúcleos, em T0, demonstrou que não havia diferenças
estatisticamente significativas no nível basal de ocorrência destes, exceto para o grupo 03
do lote de fêmeas não prenhes. No entanto, observações clínicas tais como salivação
excessiva, diarréia, vômito, hemorragia, pêlos eriçados, mucosas ressecadas, dentre outras;
acompanhamento do ganho de peso; consumos de ração e de água; foram avaliados durante
todo o período de adaptação dos animais e não demonstraram nenhuma alteração que
pudesse justificar esta maior ocorrência de micronúcleos basais no grupo 03 do lote 02.
Após a coleta de sangue, os animais receberam as primeiras doses de β-glucana ou veículo.
A análise de T1, 24 horas após a primeira administração, permitiu verificar o efeito da β-
glucana nos grupos 03 e 04. E neste momento observou-se que não houve nenhuma
alteração significativa na freqüência de micronúcleos entre os diferentes grupos dos dois
lotes que pudesse indicar efeitos tóxicos da β-glucana. Porém, o grupo 03 do lote de fêmeas
não prenhes, que no momento T0 possuía uma freqüência basal aumentada, igualou-se aos
demais no momento T1. Após esta coleta, os animais receberam uma nova dose de β-
glucana associada ou não à ciclofosfamida. Assim, no momento T2, pôde-se avaliar a
capacidade da β-glucana em prevenir os danos mutagênicos causados pela ciclofosfamida,
quando se verificou uma porcentagem de redução de danos de 54,2% e 60,4% para o lote
de fêmeas prenhes e não prenhes, respectivamente. Após esta coleta os animais voltaram a
receber a última dose de quimiopreventivo e a análise de T3 demonstrou porcentagem de
redução de danos de 63,4% e 42,6%.
110
As porcentagens de redução de danos não mostraram um comportamento uniforme.
Para as fêmeas prenhes houve um aumento de 9,2 na porcentagem de redução de danos. Já
para as fêmeas não prenhes houve uma redução de 17,8 na mesma porcentagem.
As figuras apresentadas a respeito do comportamento da freqüência de
micronúcleos ao longo dos dias de tratamento demonstram os resultados esperados, ou seja,
a redução de danos quando da administração da β-glucana associada à ciclofosfamida. No
lote de fêmeas prenhes foi possível verificar uma redução considerável da freqüência de
micronúcleos basais, apesar desta não ser estatisticamente significativa, no grupo que
recebeu somente a β-glucana. Esta condição sugere novos estudos a respeito da
possibilidade deste polissacarídeo ser utilizado na suplementação de dietas a fim de
diminuir riscos, basais e/ou induzidos, do desenvolvimento do câncer. Esta possibilidade
pode ser reforçada pela verificação da ausência de danos mutagênicos causados pela dose
testada segundo este protocolo. Outro fato interessante a ser mencionado é que β-glucanas,
extraídas de fungos, têm sido utilizadas clinicamente no Japão desde a década de 80 na
prevenção de cânceres [24]. Charvatovicová et al. [25] ainda indicam a importância de se
estudar a administração deste polímero de açúcar concomitantemente aos procedimentos de
quimioterapias, devido à possibilidade da redução de efeitos adversos desta prática
terapêutica. No entanto, ainda são muito controversos os princípios moleculares e
bioquímicos envolvidos na atividade antitumoral, antimutagênica e imunoestimulatória das
diferentes β-glucanas [26-28].
Quando se compara a freqüência de micronúcleos entre os dois grupos (fêmeas
prenhes e não prenhes) verifica-se que a freqüência basal é semelhante. No entanto, as
diferenças estatisticamente significativas verificadas nos grupos 02 e 04 em T2 e T3
111
sugerem uma maior susceptibilidade das fêmeas grávidas frente à indução de micronúcleos.
Uma hipótese a ser aventada é que o estado de gravidez leva o organismo materno a uma
condição de maior atividade metabólica, e, por conseguinte, a uma maior atividade
hepática. Outro fato a ser considerado são as alterações hormonais decorrentes da gravidez.
Assim, diante destas duas constatações, faz-se necessário compreender um pouco mais da
relação entre aumento de metabolismo, estado de gravidez e enzimas responsáveis pela
degradação de xenobióticos.
Frente à todas estas informações e analisando-se a comparação de peso de órgãos,
do grupo de fêmeas prenhes, verificou-se que somente houve alteração no peso do fígado
dos animais que receberam a ciclofosfamida. O esperado era que houvesse uma relação
entre o aumento da massa hepática e um aumento da capacidade metabólica do organismo
decorrente do tratamento com o antineoplásico, talvez pelo aumento de retículo
endoplasmático. No entanto, o quê se verificou, na realidade, foi uma diminuição do peso
do órgão. Contudo, pode-se sugerir que o tratamento agudo utilizado nesta pesquisa e a
avaliação do peso dos órgãos determinado em um tempo relativamente curto, 8 dias após a
administração, implique no fato do organismo ainda não ter se recuperado de parte das
influências causadas pela administração do quimioterápico. Assim, a inibição da
proliferação celular associada a um aumento dos índices de apoptose pode explicar a
redução de peso do fígado.
Muitos xenobióticos que desempenham papel importante na etiologia de doenças
podem ser ativados ou inativados por enzimas polimórficas [29]. Uma vez que muitos
agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos necessitam de ativação metabólica antes de se
ligarem ao DNA, ao RNA e às proteínas [30], as variações nos processos de ativação e
detoxificação de compostos químicos e drogas desempenham papel crucial na tumorigênese
112
ambiental [31]. Portanto, a quantidade final efetiva de carcinógenos produzida, depende da
ação competitiva entre os mecanismos de ativação e detoxificação, envolvendo as enzimas
que tomam parte nessas vias bioquímicas [32]. Além disso, pode-se sugerir que a β-glucana
possa ter uma atividade auxiliar ou complementar ao sistema de metabolização de drogas
na célula e por isso também facilitariam a excreção dos produtos o que viria a diminuir os
danos causados por estes no organismo em estudo.
Na presente pesquisa pôde-se observar ainda que a redução do peso do fígado não
se repetiu no grupo que recebeu a associação entre a β-glucana e a ciclofosfamida. Assim, a
administração deste polissacarídeo parece ter interferido em tal efeito biológico reduzindo o
número de moléculas tóxicas de ciclofosfamida que atuariam nas células hepáticas. Além
disso, a administração deste polissacarídeo interferiu no efeito biológico da ciclofosfamida
exercendo uma atividade na redução da freqüência de micronúcleos verificada para os dois
lotes de fêmeas, nos momentos T2 e T3.
Corrobora a hipótese anterior o trabalho de Slameñová et al. [8] onde investigaram
o efeito protetor de três diferentes extratos de β-glucana, em três diferentes concentrações,
em danos induzidos por peróxido de hidrogênio e azul de metileno na presença de luz
visível demostrando o efeito antioxidante. O estudo de Patchen et al. [33] indica efeitos
benéficos quando utilizaram β-glucana em animais submetidos à radiação. De acordo com
seu estudo, a melhora não se deve somente à regeneração hematopoiética, mas também à
capacidade deste polissacarídeo de inativar radicais livres, que poderiam causar danos ao
organismo em teste. Estes resultados também estão em concordância com o trabalho de
Chorvatovicová [34].
113
A metabolização da ciclofosfamida pelo sistema enzimático citocromo P450 tem
como produto a 4-hidroxiciclofosfamida, a qual é degradada, espontaneamente, a mustarda
fosforamida e acroleina [35]. A mustarda fosforamida é um conhecido agente alquilante
envolvido em processos citotóxicos e com propriedades teratogênicas. A acroleina, por sua
vez, está descrita como um potente agente embriotóxico [35,36]. Assim, podemos dizer que
os metabólitos da ciclofosfamida produzem efeitos adversos no desempenho reprodutivo da
fêmea e no desenvolvimento de sua prole. O presente trabalho permitiu verificar que não
houve diferenças significativas para o número de implantes, número de fetos vivos, razão
sexual e índice placentário. Como os tratamentos aconteceram somente em uma parte do
período de organogênese, não era esperada nenhuma alteração no número de implantes,
fato que foi verificado. Nenhuma descrição foi encontrada, na literatura pesquisada, onde
fossem relatadas alterações em diferenciação sexual e exposição à ciclofosfamida e/ ou β-
glucana.
O peso placentário mostrou-se diminuído no grupo 02 em relação aos demais. No
entanto, o índice placentário não demonstrou esta diferença. Estudos indicam aumento do
peso placentário em ratas diabéticas [37-40]. Os efeitos do diabetes materno sobre a
arquitetura e o fluxo placentários [41] sugerem que o feto desenvolve-se em regime de
hipóxia e má nutrição. O aumento da placenta favoreceria o aporte de oxigênio e nutrientes,
aumentando a superfície de troca materno-fetal. Contudo, no presente experimento, não foi
observado um aumento do índice placentário nos grupos em relação ao controle. Mas
observou-se uma drástica redução do peso placentário no grupo que recebeu somente a
ciclofosfamida. Durante os procedimentos de onfalectomia verificou-se que o aporte
sangüíneo era muito reduzido nos fetos que tiveram suas genitoras tratadas somente com
114
ciclofosfamida ou associada a β-glucana (dados não apresentados). Estes fatos podem
sugerir uma má nutrição fetal não relacionada ao aumento do índice placentário, fatos que
não são corroborados pela literatura já apresentada. No entanto, corrobora esta inferência de
má nutrição a diminuição estatisticamente significativa verificada no peso e comprimento
fetal destes dois grupos experimentais. Ainda reforça este achado o estudo da adequação do
peso à idade gestacional, que demonstrou que a administração da ciclofosfamida,
independentemente da β-glucana, foi a responsável pelos fetos coletados que apresentaram-
se com baixo peso para a idade de prenhez. Assim, estes dados sugerem que a β-glucana
não teve nenhuma interferência nestes parâmetros.
Em uma visão geral, observou-se que a β-glucana não foi eficiente em prevenir as
malformações externas, apesar de apresentar uma tendência à redução. Exceções foram
verificadas somente em membros anteriores e posteriores.
Os estudos de malformações viscerais indicam que no polo cefálico a associação da
β-glucana foi eficiente em prevenir alterações de ventrículos laterais e que a administração
deste polissacarídeo, isoladamente, foi capaz de prevenir a ocorrência basal de alterações
em terceiro e quarto ventrículos cerebrais.
A análise de tórax demonstrou que somente o grupo tratado com β-glucana, isolada,
apresentou alterações cardíacas. Apesar de uma pequena porcentagem de alterações, talvez
resida aqui a necessidade de novas pesquisas nesta área para averiguar se a utilização deste
composto está realmente relacionado a uma diminuição das cavidades ventriculares e ao
espessamento da parede das câmaras cardíacas, já que estas foram as alterações verificadas.
Por outro lado, a análise da região urogenital demonstra prevenção da ocorrência de
megaureteres e hidronefrose. Alterações tais como rim em ferradura, agenesia renal e
115
gonadal só foram encontradas no grupo que recebeu a ciclofosfamida e a β-glucana. A
análise esquelética demonstrou prevenção de alterações somente em mandíbula, clavícula e
pelve.
Apesar destes resultados, o estudo deste polímero de D-glicose apresentou um dado
interessante e de grande valia, ou seja, a administração da β-glucana foi eficiente em
aumentar a viabilidade fetal, elevando-a a valores muito similares aos do controle negativo,
bem como foi capaz de reduzir as taxas de perda pós-implantacional e de reabsorção. Estes
dados demonstram assim que a β-glucana promoveu uma melhora significativa no
desempenho reprodutivo destas fêmeas.
Outros estudos relatam que os efeitos teratogênicos causados pela ciclofosfamida
podem ser atenuados quando um tratamento com substâncias que inibem as cascatas
metabólicas é utilizado. Algumas dessas substâncias são, por exemplo, a β-ionona e Indole-
3-Carbionol [22,23]. Assim, a presente pesquisa pode sugerir que apesar dos efeitos
anticlastogênicos evidenciados, a efetividade da β-glucana em inibir as vias metabólicas
que envolvem a CYP e/ou sua capacidade em se ligar à ciclofosfamida, aos seus
metabólitos e/ou de quelar radicais livres ocorreu de forma eficiente no organismo materno,
mas não nos embriões. Contudo, ainda não temos dados que indiquem se a β-glucana,
metabolizada ou não, foi capaz de atravessar, de forma eficiente e suficiente, a barreira
placentária para inativar os processos desencadeados pela ciclofosfamida nos embriões.
Assim, os presentes relatos indicam que a β-glucana possui baixo potencial na
prevenção da teratogênese. No entanto, esta parece ser um efetivo polissacarídeo na
proteção de danos ao material genético. O fato da administração deste polissacarídeo não
estar relacionada ao aparecimento de efeitos adversos e sim à redução basal da freqüência
116
de micronúcleos a coloca como um fator na prevenção de carcinogênese, assim como a se
tornar um adjuvante nos tratamentos quimioterápicos, visto que a terapia nutricional com
antioxidantes concomitante à administração de drogas antineoplásicas apresenta vários
benefícios ao tratamento de pacientes oncológicos, resultando em menores efeitos
colaterais e permitindo que a continuidade do tratamento empregado não seja prejudicada.
Agradecimentos:
Esta pesquisa obteve apoio financeiro da CAPES, CNPq e Fundação Araucária.
Agredecimentos a Dr. A. Levya e as senhoritas T.Y.N. Kanno e A.C.S. Lourenço
pelo auxílio com a língua Inglesa e edição do manuscrito.
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122
Tabela 01 – Peso inicial, final e ganho de peso durante o período de tratamento.
Fêmeas prenhes Fêmeas não prenhes Tratamento
PI PF GP PI PF GP
Grupo 01
36.08±5,49
a
40,44±6,87
a
4,37±2,55
a
34,18±4,79
a
37,41±5,85
a
3,22±3.11
a
Grupo 02
35,55±3,88
a
39,08±4,62
a
3,54±1,91
a
35,59± 6,96
a
36,41±8,12
a
0,82±2,43
a
Grupo 03
35,23±4,09
a
38,06±4,67
a
2,82±2,00
a
33,77±2,10
a
36,91±2,99
a
3,14±1,51
a
Grupo 04
37,74±4,55
a
39,58±5,04
a
2,11±2,80
a
31,78±3,55
a
32,92±3,00
a
1,14±0,87
a
Legenda: PI – peso inicial; PF – peso final; GP – ganho de peso (PF – PI). Letras diferentes indicam diferença
estatisticamente significativa. (Teste: Análise de Variância / Tukey; p<0,05).
Tabela 02 – Peso dos órgãos das fêmeas ao final do período gestacional.
Peso (g) Tratamento
Coração
1
Pulmões
2
Fígado
2
Rins
2
Grupo 01
0,20±0,05
a
0,21±0,03
a
2,61±0,64
a
0,41±0,08
a
Grupo 02
0,17±0,04
a
0,29±0,31
a
2,01±0,30
b
0,41±0,11
a
Grupo 03
0,20±0,04
a
0,22±0,02
a
2,60±0,40
a
0,42±0,08
a
Grupo 04
0,19±0,05
a
0,22±0,05
a
2,58±0,43
a
0,39±0,06
a
Legenda: Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa. (Teste:
1
Kruskal-Wallis / Dunn;
2
Análise de
Variância / Tukey; p<0,05).
123
Tabela 03 – Parâmetros relativos à fertilidade e desenvolvimento fetal.
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Nº de implantes
1
11,10±3,31
a
12,80±3,26
a
10,30±3,65
a
12,90±2,78
a
Fetos vivos
1
8,90±3,28
a
4,50±3,84
a
8,00±3,13
a
7,70±4,97
a
Viabilidade fetal
1
100,0±0,00
a
65,71±44,29
b
100,00±0,00
a,b
92,20±17,16
a,b
TPPI
2
8,68±14,84
a
70,56±33,57
b
16,89±18,20
a
31,70±36,17
a,b
TR
2
8,68±14,84
a
62,34±32,40
b
16,13±16,96
a
30,96±35,71
a,b
Razão Sexual
2
71,7±87,9
a
62,5±75,0
a
98,7±101,4
a
90,7±69,3
a
PP (g)
1
0,12±0,02
a
0,04±0,01
b
0,12±0,02
a
0,11±0,16
a,b
IP
2
0,08±0,02
a
0,07±0,01
a
0,09±0,01
a
0,09±0,01
a
Peso fetal (g)
1
1,44±0,19
a
0.65±0,04
b
1,38±0,15
a
0,67±0,11
b
CF (cm)
1
2,59±0,18
a
1,61±0,09
b
2,56±0,13
a
1,61±0,14
b
APIP
BPIP PAIP BPIP
Legenda: Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significativa. TPPI – Taxa de perdas pós-implantacionais;
TR – Taxa de reabsorção; PP – Peso placentário; IP – Índice placentário; CF – Comprimento fetal; APIP – Adequação do
peso à idade de prenhez; PAIP – recém nascidos de peso adequado para a idade de prenhez; BPIP – recém nascidos com
baixo peso para a idade de prenhez. (Teste:
1
Análise de Variância / Tukey;
2
Kruskal-Wallis / Dunn; p<0,05).
124
Tabela 04 – Anormalidades externas e variações encontradas em polo cefálico na prole dos diferentes grupos
experimentais:
Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Polo cefálico – Terço superior
Parâmetros
Cabeça
Número de Fetos Analisados
42 13 38 35
Número de Fetos Normais
42 4 38 17
Leve
0 0 0 0
Moderada
0 1 0 1
Exencefalia
Severa
0 2 0 6
Acrania Real
0 0 0 6
Displasia Ectodérmica
0 6 0 8
Freq. Total de Malformações
0 9
a
* 0 18
b
%MF
0,00±0,00 75,4±17,5 0,00±0,00 45,8±43,8
Olhos
Unilateral
0 0 0 3
Exoftalmia
Bilateral
0 8 0 19
Unilateral
0 1 0 5
Aberto
Bilateral
0 2 0 3
Freq. Total de Malformações
0 11
a
* 0 27
b
%MF
0,00±0,00 90,2±20,0 0,00±0,00 58,8±35,6
Polo cefálico – Terço inferior
Normal
42 6 38 24
Orelha
BI
0 7
a
* 0 11
b
%MF
0,00±0,00 38,7±44,8 0,00±0,00 38,4±40,6
Normal
42 4 38 20
Mandíbula e
Maxila Retrom
0 9
a
* 0 15
b
%MF
0,00±0,00 72,9±35,6 0,00±0,00 53,1±28,3
Normal
42 12 38 35
Unilateral
0 1 0 2
Fenda Lábio-
Palatal
Bilateral
0 0 0 2
Freq. Total de Malformações
0 1
a
0 4
b
%MF
0,00±0,00 5,00±10,0 0,00±0,00 9,26±18,8
Normal
42 4 38 20
Língua
Protusa
0 9
a
* 0 15
b
%MF
0,00±0,00 72,9±35,6 0,00±0,00 53,1±28,3
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; BI – Baixa
implantação de orelha; Retrom - Retromicrognatismo. ªComparado estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02); *Diferença estatisticamente significativa. (Teste:
Qui-quadrado; p<0,05).
125
Tabela 05 – Anormalidades externas e variações encontradas em membros anteriores, posteriores e cauda na
prole dos diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Membros Anteriores
Número de Fetos Analisados
42 13 38 35
Número de Fetos Normais
42 0 38 12
Amelia
0 2 0 9
Focomelia
0 10 0 11
Membros
Anteriores
RPA
0 1 0 5
Freq. Total de Malformações
0 13
a
* 0 23
b
*
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 72,1±29,2
Membros Posteriores
Número de Fetos Normais
42 1 38 16
Amelia
0 0 0 2
Focomelia
0 11 0 14
Membros
Posteriores
RPP
0 2 0 5
Freq. Total de Malformações
0 12
a
* 0 19
b
*
%MF
0,00±0,00 93,7±12,5 0,00±0,00 64,5±35,3
Cauda
Número de Fetos Normais
42 9 38 30
Cauda Enrolada
0 4
a
* 0 5
b
%MF
0,00±0,00 24,6±17,5 0,00±0,00 26,6±38,7
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; RPA –
Retroversão de pata anterior; RPP – Retroversão de pata posterior. ªComparado estatisticamente com o controle (Grupo
01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02); *Diferença estatisticamente significativa.
(Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
126
Tabela 06 – Anormalidades externas e variações encontradas em número de dedos de patas anteriores e
posteriores na prole dos diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Patas Anteriores
Pata Anterior Direita
Número de Fetos Analisados
42 13 38 35
Normais
42 5 38 14
Oligodactilia
0 7 0 21
Número de dedos
Polidactilia
0 1 0 0
Sindactilia
0 5 0 8
Freq. Total de Malformações
0 8
a
* 0 21
b
%MF
0,00±0,00 80,4±14,2 0,00±0,00 77,8±26,2
Pata Anterior Esquerda
Normais
42 5 38 15
Oligodactilia
0 8 0 20
Número de dedos
Polidactilia
0 0 0 0
Sindactilia
0 5 0 11
Freq. Total de Malformações
0 8
a
* 0 20
b
%MF
0,00±0,00 80,4±14,2 0,00±0,00 76,2±26,1
Patas Posteriores
Pata Posterior Direita
Normais
42 7 38 17
Oligodactilia
0 0 0 4
Número de dedos
Polidactilia
0 6 0 14
Sindactilia
0 6 0 17
Freq. Total de Malformações
0 6
a
* 0 18
b
%MF
0,00±0,00 65,8±29,9 0,00±0,00 72,5±29,7
Pata Posterior Esquerda
Normais
42 8 38 19
Oligodactilia
0 0 0 3
Número de dedos
Polidactilia
0 5 0 13
Sindactilia
0 5 0 18
Freq. Total de Malformações
0 5
a
* 0 16
b
%MF
0,00±0,00 60,8±28,3 0,00±0,00 69,5±30,9
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; ªComparado
estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02);
*Diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
127
Tabela 07 – Anormalidades viscerais e variações encontradas em polo cefálico, terço superior, na prole dos
diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Cérebro – Hidrocefalia
Número de Fetos Analisados
42 13 38 35
Número de Fetos Normais
19 1 29 8
Leve
10 0 1 0
Moderado
8 2 8 4
Ventrículos
Laterais
Severo
5 10 0 23
Freq. Total de Malformações
23 12
a
* 9
a
* 27
b
*
%MF
58,4±25,8 95,0±10,0 43,7±37,3 80,2±24,5
Número de Fetos Normais
33 1 37 8
Leve
2 0 0 0
Moderado
3 2 1 3
Terceiro
Ventrículo
Severo
4 10 0 24
Freq. Total de Malformações
9 12
a
* 1
a
* 27
b
%MF
30,0±40,5 95,0±10,0 3,33±10,5 80,2±24,5
Número de Fetos Normais
33 1 35 8
Leve
2 0 0 0
Moderado
3 2 3 3
Quarto
Ventrículo
Severo
4 10 0 24
Freq. Total de Malformações
9 12
a
* 3
a
27
b
%MF
30,4±40,5 95,0±10,0 20,0±32,2 80,2±24,5
Olhos
Número de Fetos Normais
42 12 38 34
Microftalmia
0 1
a
0 1
b
%MF
0,00±0,00 6,25±12,5 0,00±0,00 3,70±11,1
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; ªComparado
estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02);
*Diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
128
Tabela 08 – Anormalidades viscerais e variações encontradas nas regiões torácica e urogenital na prole dos
diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Região Toráxica
Número de Fetos Analisados
42 13 38 35
Normal
42 13 36 35
Coração
Cardiomeg.
0 0 2
a
0
%MF
0,00±0,00 0,00±0,00 3,67±7,78 0,00±0,00
Região Urogenital
Normal
42 13 38 34
Rins – Anat.
Externa Rim Ferrad.
0 0
a
0 1
b
%MF
0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 1,39±4,14
Normal
42 3 36 28
Ureteres
Megauret.
0 10
a
* 2
a
7
b
*
%MF
0,00±0,00 81,7±21,3 3,67±7,78 10,3±20,6
Normal
40 1 32 12
Rins – Anat.
Interna Hidronefrose
2 12
a
* 6
a
23
b
*
%MF
2,86±9,04 91,7±16,6 16,0±27,1 54,6±37,1
Número de Fetos Normais
42 13 38 32
Agenesia Renal
0 0 0 3
b
%MF
0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 20,4±35,1
Número de Fetos Normais
42 13 38 34
Agenesia Gonadal
0 0 0 1
b
%MF
0,00±0,00 0,00±0,00 0,00±0,00 5,56±16,7
Legenda: %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; Cardiomeg – Cardiomegalia; Anat. –
Anatomia; Rim Ferrad. – Rim em ferradura; Megauret. – Megauretéres; ªComparado estatisticamente com o controle
(Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02); *Diferença estatisticamente
significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
129
Tabela 09 – Anormalidades esqueléticas e variações encontradas em mandíbula, maxila, Pterigóide,
Basosfenóide, Hióide, Bulba timpânica e Basoccipital na prole dos diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Número de Fetos Analisados
46 20 42 39
Normal
46 14 42 8
Irregular
0 1 0 31
Mandíbula
Oss. Red.
0 5 0 0
Freq. Total de Malformações
0 6
a
* 0 31
b
*
%MF
0,00±0,00 82,5±32,2 0,00±0,00 78,7±28,3
Normal
46 11 42 13
Irregular
0 8 42 26
Maxila
Oss. Red.
0 1 0 0
Freq. Total de Malformações
0 9
a
* 0 26
b
%MF
0,00±0,00 63,6±41,3 0,00±0,00 80,5±30,0
Normal
46 5 42 5
Irregular
0 7 0 10
Pterigóide
Ausente
0 8 0 24
Freq. Total de Malformações
0 15
a
* 0 34
b
%MF
0,00±0,00 88,6±30,2 0,00±0,00 98,2±5,06
Normal
46 2 42 5
Irregular
0 9 0 11
Basosfenóide
Ausente
0 9 0 9
Freq. Total de Malformações
0 18
a
* 0 34
b
%MF
0,00±0,00 91,7±14,3 0,00±0,00 95,9±11,7
Normal
46 1 42 3
Reduzido
0 1 0 0
Hióide
Ausente
0 18 0 36
Freq. Total de Malformações
0 19
a
* 0 36
b
%MF
0,00±0,00 95,3±12,5 0,00±0,00 100±0,00
Normal
46 1 42 3
Irregular
0 2 0 0
Bulba Timpânica
Ausente
0 17 0 36
0
Freq. Total de Malformações
0 19
a
* 0 36
b
%MF
0,00±0,00 96,4±9,40 0,00±0,00 98,2±5,06
Normal
46 2 42 4
Irregular
0 4 0 9
Basoccipital
Ausente
0 14 0 26
Freq. Total de Malformações
0 18
a
* 0 35
b
%MF
0,00±0,00 91,7±14,3 0,00±0,00 100±0,00
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; Oss. Red. –
Ossificação Reduzida; ªComparado estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o
agente indutor de danos (Grupo 02); *Diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
130
Tabela 10 – Anormalidades esqueléticas e variações encontradas em Exoccipital, Nasal, Zigomático, Frontal,
Parietal, Interparietal e Supraoccipital na prole dos diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Número de Fetos Analisados
46 20 42 39
Normal
46 2 0 4
Irregular
0 1 0 2
Exoccipital
Ausente
0 17 0 33
Freq. Total de Malformações
0 18
a
* 0 35
b
%MF
0,00±0,00 91,7±14,3 0,00±0,00 100±0,00
Normal
46 13 42 26
Irregular
0 4 0 0
Nasal
Ausente
0 3 0 13
Freq. Total de Malformações
0 7
a
* 0 13
b
%MF
0,00±0,00 30,7±36,8 0,00±0,00 83,8±31,1
Normal
46 3 42 7
Irregular
0 5 0 12
Zigomático
Ausente
0 12 0 20
Freq. Total de Malformações
0 17
a
* 0 32
b
%MF
0,00±0,00 88,1±15,0 0,00±0,00 94,6±15,2
Normal
46 2 42 4
Exencefalia
0 5 0 31
Irregular
0 10 0 4
Frontal
Ausente
0 3 0 0
Freq. Total de Malformações
0 18
a
* 0 35
b
%MF
0,00±0,00 95,3±12,5 0,00±0,00 83,6±30,3
Normal
46 0 42 0
Exencefalia
0 5 0 35
Irregular
0 6 0 6
Parietal
Ausente
0 9 0 2
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 96,4±9,50 0,00±0,00 100±0,00
Normal
46 1 42 6
Irregular
0 6 0 5
Interparietal
Ausente
0 13 0 28
Freq. Total de Malformações
0 19
a
* 0 33
b
%MF
0,00±0,00 96,4±9,45 0,00±0,00 96,4±10,1
Normal
46 1 42 0
Irregular
0 8 0 13
Supraoccipital
Ausente
0 11 0 26
Freq. Total de Malformações
0 19
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 96,4±9,45 0,00±0,00 100±0,00
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; ªComparado
estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02);
*Diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
131
Tabela 11 – Anormalidades esqueléticas e variações encontradas em esterno, vértebras, costelas, clavícula e
escápulas na prole dos diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Número de Fetos Analisados
46 20 42 39
Normal
46 1 35 0
Nº Est. Anor.
0 3 7 4
Est. Oss. Red.
0 1 0 5
Est. Desal.
0 5 0 1
Est. Fund.
0 10 0 23
Esterno
Ausentes
0 0 0 6
Freq. Total de Malformações
0 19
a
* 7
a
* 39
b
%MF
0,00±0,00 96,4±9,45 17,5±33,4 100±0,00
Normal
46 8 42 9
Nº Vert. Anor.
0 2 0 0
Vert. Desal.
0 1 0 3
Vert. Irregular
0 9 0 13
Vértebras
Vert. Fund
0 0 0 14
Freq. Total de Malformações
0 12
a
* 0 30
b
%MF
0,00±0,00 85,0±30,1 0,00±0,00 92,5±21,2
Normal
46 1 42 6
Nº Cost. Anor.
0 12 0 28
Rudimentar
0 3 0 5
Costelas
Ausentes
0 4 0 0
Freq. Total de Malformações
0 19
a
* 0 33
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 98,2±5,06
Normal
46 2 42 17
Irregular
0 4 0 9
Clavícula
Ausente
0 13 0 13
Freq. Total de Malformações
0 18
a
* 0 22
b
*
%MF
0,00±0,00 91,7±14,3 0,00±0,00 84,1±32,1
Normal
46 0 42 8
Irregular
0 10 0 27
Escápula
Ausente
0 10 0 4
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 31
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 96,9±8,84
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; Nº Est. Anor. –
Número de esternebras anormais; Est. Oss. Red. – Esternebras com ossificação reduzida; Est. Desal. – Esternebra
desalinhada; Est. Fund. – Esternebras Fundidas; Nº Vert. Anor. – Número de vértebras anormais; Vert. Desal – Vértebras
desalinhadas; Vert. Fund. – Vértebras Fundidas; Nº Cost. Anor. – Número de costelas anormais; ªComparado
estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02);
*Diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
132
Tabela 12 – Anormalidades esqueléticas e variações encontradas em membros superiores na prole dos
diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Número de Fetos Analisados
46 20 42 39
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Symmelia
0 13 / 12 0 / 0 30 /30
Irregular
0 3 / 2 0 / 0 9 / 9
Amelia
0 1 / 2 0 / 0 0 / 0
Rádio, Úmero e
Ulna
Ausência
0 2 / 3 0 / 0 0 / 0
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Normal (D / E)
46 3 / 3 42 / 42 7 / 7
Anormal
0 9 / 9 0 / 0 17 / 17
Metacarpos
Ausência
0 7 / 7 0 / 0 15 / 15
Freq. Total de Malformações
0 17
a
* 0 32
b
%MF
0,00±0,00 98,2±4,72 0,00±0,00 100±0,00
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Anormal
0 12 / 12 0 / 0 16 / 16
Falanges
Proximais
Ausência
0 8 / 8 0 / 0 23 / 23
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Anormal
0 12 / 12 0 / 0 0 / 0
Irregular
0 1 / 1 0 / 0 0 / 0
Falanges Distais
Ausência
0 16 / 16 0 / 0 39 / 39
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; (D / E) – Direito /
Esquerdo; ªComparado estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de
danos (Grupo 02); *Diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
133
134
Tabela 13 – Anormalidades esqueléticas e variações encontradas em pelve e membros inferiores na prole dos
diferentes grupos experimentais:
Parâmetros Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04
Número de Fetos Analisados
46 20 42 39
Normal
46 6 0 29
Oss. Red.
0 2 0 0
Irregular
0 0 0 1
Aus. 1 ou +
0 4 0 3
Íleo, Ísquio e
Púbis
Ausência
0 7 0 6
Freq. Total de Malformações
0 14
a
* 0 10b*
%MF
0,00±0,00 90,0±19,1 0,00±0,00 52,5±51,2
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Symmelia
0 1 / 1 0 / 0 15 / 15
Fusão
0 8 / 9 0 / 0 3 / 4
Os. Red. 1 ou +
0 1 / 3 0 / 0 0 / 0
Tíbia, Fíbula e
Fêmur
Aus. 1 ou +
0 10 / 7 0 / 0 21 / 20
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Anormal
0 18 / 18 0 / 0 39 / 39
Metatarsos
Ausência
0 2 / 2 0 / 0 0 / 0
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Anormal
0 15 / 15 0 / 0 3 / 3
Falanges
Proximais
Ausência
0 5 / 5 0 / 0 36 / 36
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Normal (D / E)
46 0 / 0 42 / 42 0 / 0
Anormal
0 5 / 5 0 / 0 3 / 3
Falanges Distais
Ausência
0 15 / 15 0 / 0 36 / 36
Freq. Total de Malformações
0 20
a
* 0 39
b
%MF
0,00±0,00 100±0,00 0,00±0,00 100±0,00
Legenda: Freq. – Freqüência; %MF – Valor médio da porcentagem de malformações ± Desvio padrão; (D / E) – Direito /
Esquerdo; Oss. Red. – Ossificação Reduzida; Aus. 1 ou + - Ausência de 1 ou + ossos; Oss. Red. 1 ou + - Ossificação
Reduzida de 1 ou + ossos; ªComparado estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o
agente indutor de danos (Grupo 02); *Significa diferença estatisticamente significativa. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
135
Tabela 14 – Freqüência, média, desvio padrão e porcentagem de redução de danos referentes ao teste de micronúcleos em sangue periférico.
Freqüência de Micronúcleo
Média ± Desvio Padrão
%RD Tratamento
T0 T1 T2 T3 T0 T1 T2 T3 T2 T3
Fêmeas prenhes
Grupo 01
62 78 87 86
6,20±2,30 7,80±2,90 8,70±5,01 8,60±3,44
- -
Grupo02
61
a
71
a
362
a
* 414
a
*
6,10±2,60 7,10±2,13 36,20±10,44 41,40 14,54
- -
Grupo 03
71
a
60
a
56
a
* 90
a
7,10±2,92 6,00±3,77 5,60±3,44 9,00±2,11
- -
Grupo 04
54
b
49
b
213
b
* 206
b
*
5,40±3,41 4,90±3,75 21,30±11,67 20,60±6,57
54,2 63,4
Fêmeas não prenhes
±
Grupo 01
24 37 31 40
4,80±0,84 7,40±2,41 6,20±4,66 8,00±4,69
- -
Grupo02
26
a
31
a
127
a
* 108
a
*
5,20±4,44 6,20±2,86 25,4±16,95 21,6±6,88
- -
Grupo 03
46
a
* 22
a
29
a
45
a
9,20±2,17 4,40±2,07 5,80±1,64 9,00±5,00
- -
Grupo 04
29
b
33
b
69
b
* 79
b
*
5,80±2,59 6,60±2,19 13,8±6,46 15,80±3,70
60,4 42,6
Legenda:
a
Comparado estatisticamente com o controle (Grupo 01);
b
Comparado estatisticamente com o agente indutor de danos (Grupo 02); *diferença estatisticamente
significativa. Momentos T0, T1, T2 e T3: coletas de sangue realizadas no 9º, 10º, 11º e 12º dias gestacionais, respectivamente. %RD – porcentagem de redução de danos. (Teste:
Qui-quadrado; p<0,05).
0
20
40
60
T0 T1 T2 T3
Momentos de Coleta de Sangue Periférico
Freqüência Média d
e
Micronúcleos
G1 G2 G3 G4
136
Figura 01 – Comportamento da freqüência de micronúcleos ao longo dos dias de tratamento no lote de fêmeas
prenhes. Valores médios ± Desvio padrão.
Momentos T0, T1, T2 e T3 coletas de sangue realizadas no 9º, 10º, 11º e
12º dias gestacionais, respectivamente. G1 – Grupo 01; G2 – Grupo 02; G3 – Grupo 03 e G4 – Grupo 04.
Figura 02 – Comportamento da freqüência de micronúcleos ao longo dos dias de tratamento no lote de fêmeas
não prenhes. Valores médios ± Desvio padrão.
Momentos T0, T1, T2 e T3 coletas de sangue realizadas em dias
coincidentes com o 9º, 10º, 11º e 12º dias gestacionais das fêmeas do lote anterior, respectivamente. G1 – Grupo 01; G2 –
Grupo 02; G3 – Grupo 03 e G4 – Grupo 04.
0
20
40
60
T0 T1 T2 T3
Momentos de Coleta de Sangue Periférico
Freqüência Média d
e
Micronúcleos
G1 G2 G3 G4
0
10
20
30
40
50
60
G1
T0
G2 G3 G4 G1
T1
G2 G3 G4 G1
T2
G2 G3 G4 G1
T3
G2 G3 G4
Grupos Experimentais e Tempos de Coleta
Freqüência Média de Micronúcleo
s
*
*
*
137
Figura 03 – Comparação da freqüência de micronúcleos entre os dois diferentes lotes, fêmeas prenhes e não
prenhes, durante o período experimental:
Legenda: Barras pretas – fêmeas prenhes; barras brancas – fêmeas não
prenhes. Momentos T0, T1, T2 e T3 coletas de sangue realizadas no 9º, 10º, 11º e 12º dias gestacionais das fêmeas do lote
01 e em dias coincidentes no lote de fêmeas não prenhes (lote 02), respectivamente. G1 – Grupo 01; G2 – Grupo 02; G3 –
Grupo 03 e G4 – Grupo 04. *Diferenças estatisticamente significativas. (Teste: Qui-quadrado; p<0,05).
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante aos resultados apresentados considera-se que o polissacarídeo β-glucana:
9 Não apresenta potencial genotóxico em sistema-teste in vitro;
9 Não apresenta potencial mutagênico em sistemas-teste in vitro e in vivo,
excetuando a dose de 20,0µg/mL em sistema de cultura tratadas com β-
glucana originária da cevada;
9 Possui capacidade quimiopreventiva em relação tanto a agentes de ação
direta como indireta in vitro e in vivo;
9 De acordo com os protocolos testados, in vitro, possui mecanismo de ação
tanto por desmutagênese como por bioantimutagênese;
9 Assume-se que independentemente da origem da β-glucana, cevada ou
Saccharomyces cerevisiae, ela possue o mesmo mecanismo de ação e
capacidade quimiopreventiva semelhante;
9 Sistema-teste in vitro proficiente em metabolização (células HTC)
demonstra que tanto o mecanismo de ação quanto a capacidade
quimiopreventiva do polissacarídeo sofre interferência deste processo
biológico;
9 A metabolização da β-glucana pelas células HTC indica redução da sua
capacidade quimiopreventiva e ineficiência no protocolo de pós-tratamento.
Assim, este fato cria dúvidas a respeito da real atividade bioantimutagênica
do polissacarídeo em estudo;
9 Os estudos realizados com CHO-xrs5 confirmam a atividade do
polissacarídeo por bioantimutagênese;
138
9 Os testes de viabilidade celular indicam que a β-glucana melhora o índice de
viabilidade celular devido sua capacidade de prevenir eventos de apoptose;
9 O teste do cometa indica que a β-glucana não possui atividade
antigenotóxica em sistema-teste in vitro com a linhagem celular CHO-k1;
9 De acordo com os estudos in vivo a β-glucana não interfere na performance
reprodutiva de camundongos fêmeas Swiss (Mus musculus) e no
desenvolvimento da sua prole;
9 Quando associada à ciclofosfamida apresenta uma boa capacidade
antimutagênica em fêmeas grávidas e não grávidas independentemente das
fêmeas grávidas se apresentarem mais susceptíveis a danos induzidos por
este quimioterápico;
9 Os efeitos teratogênicos induzidos por exposição aguda à ciclofosfamida não
foram prevenidos de forma eficiente pela β-glucana, fato que indica baixo
potencial na prevenção de malformações. No entanto, observou-se aumento
da viabilidade fetal e redução das taxas de perda pós-implantacional e
reabsorção demonstrando assim uma melhora do desempenho reprodutivo
das fêmeas.
Diante de uma possível comprovação da eficiência desta molécula em prevenir
danos genéticos em seres humanos e/ou a comprovação da mesma na melhoria da
qualidade de vida de pessoas que possuem câncer ou que estão passando por processos de
quimioterapia; a β-glucana poderá ser utilizada em larga escala na suplementação,
principalmente, de pães e farináceos, que são de baixo custo e estão disponíveis para uma
maior parcela da população. Ou ainda, esta substância poderá sair da classe de alimentos
139
funcionais e se tornar um fármaco, que poderá ser utilizado na forma de cápsula e/ou
soluções administradas por diferentes vias.
Ainda é prematura a finalização dos estudos com respeito ao mecanismo de ação do
polissacarídeo β-glucana, bem como a sua indicação ou contra-indicação na
quimioprevenção. Fazem-se necessários estudos bioquímicos que demonstrem melhor a
estrutura do polissacarídeo em estudo e a sua interação com os agentes indutores de danos
ao DNA, a fim de se esclarecer como realmente se efetiva a sua capacidade desmutagênica.
Necessita-se, também, de um melhor entendimento de como este polissacarídeo pode
interagir com o DNA ou com as enzimas envolvidas na replicação e no reparo do mesmo,
para que se possa discutir sua capacidade bioantimutagênica.
No entanto, considera-se que a β-glucana é uma forte candidata a ser utilizada na
prevenção de danos genéticos e como adjuvante nas quimioterapias às quais pacientes
oncológicos são submetidos.
140
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ANEXOS
162
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• Council of biology editors style manual. A guide for authors, editors and publishers in the
biological sciences, 4th edn., Bethesda MD: Council of Biology Editors; 1978.
• O‘Connor M, Woodford FP, eds. Writing scientific papers in English, Amsterdam:
Elsevier; 1976.
• Reynolds L, Simmonds D. Presentation of data in science.
Publications, slides, posters, overhead projectors, tapeslides, television. The Hague:
Martinus Nijhoff; 1983.
164
Abbreviations and units
Only SI units and abbreviations should be used although some quantities may be given in
common units, e.g. mmHg. Abbreviations should be defined in full as mentioned above
under item 2. Whenever in doubt use SI (Systéme International) units.
Acknowledgements
To assistants, grants, funding bodies etc. Please make sure that any persons acknowledged
consent to their names appearing.
References
• References should be cited according to the author/date (Harvard) system, i.e. (Smith,
1993; Smith and Jones, 1993; Smith et al, 1993a).
Citations of personal communications and unpublished data should be avoided unless
absolutely necessary. When used, such citations should appear in the text only, e.g. ’(E.D.
Smith, personal communication)‘, and not in the reference list.
• Abbreviate titles of periodicals according to the style of Index Medicus.
• References should be listed in alphabetical order and styled according to the following
examples (Vancouver style):
Chapter in book: Bauer RB. Mechanical compression of the vertebral arteries. In: Berguer
R, Bauer RD, eds. Vertebrobasilar arterial occlusive disease: medical and surgical
management. New York: Raven Press; 1984: 45-71.
Article in periodical: Du Doulay G, Shar SH, Currie JC, Logue V. The mechanism of
hydromyelia in Chiari type 1 malformations. Br J Radiol. 1974; 74: 579-87.
Book: Cohen J. Statistical power analysis for the behavioral sciences. Revised edn. New
York: Academic Press; 1977: 217-48.
Do not use italics in titles of articles or books.
Figures
All photographs, graphs and diagrams should be referred to as a 'Figure' and they should be
numbered consecutively (1, 2, etc.). Multi-part figures ought to be labeled with lower case
letters (a, b, etc.). Please insert keys and scale bars directly in the figures. Relatively small
text and great variation in text sizes within figures should be avoided as figures are often
reduced in size.
Figures may be sized to fit approximately within the column(s) of the journal.
165
Provide a detailed legend (without abbreviations) to each figure, refer to the figure in the
text and note its approximate location in the margin. Please place the legends in the
manuscript after the references.
Tables
Each table should be numbered consecutively (1, 2, etc.). In tables, footnotes are preferable
to long explanatory material in either the heading or body of the table. Such explanatory
footnotes, identified by superscript letters, should be placed immediately below the table.
Please provide a caption (without abbreviations) to each table, refer to the table in the text
and note its approximate location in the margin. Finally, please place the tables after the
figure legends in the manuscript.
Colour Illustrations
Up to two (2) colour pages (irrespective of the number of individual figures on them) will
be published free of charge if the Editor and Referees consider this essential. Additional
colour pages will be charged accordingly.
Proofs
Proofs will be sent to the corresponding author by e-mail (if no e-mail address is available
or appears to be out of order, proofs will be sent by regular mail).
Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours.
Please do not make any corrections to the PDF file.
Minor corrections (+/- 10) should be sent as an e-mail attachment to:
[email protected]. Always quote the four-letter journal code and article
number and the PIPS No. from your proof in the subject field of your e-mail.
Extensive corrections must be clearly marked on a printout of the PDF file and should be
sent by first-class mail (airmail overseas).
Offprints
Ordering information for offprints will be sent with the proofs.
Page charges
No page charges are levied for this journal.
Springer Open Choice
In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal
and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription),
Springer now provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer
Open Choice article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in
166
addition is made available publicly through Springers online platform SpringerLink. To
publish via Springer Open Choice, upon acceptance please visit
www.springeronline.com/openchoice to complete the relevant order form and provide the
required payment information. Payment must be received in full before publication or
articles will publish as regular subscription-model articles. We regret that Springer Open
Choice cannot be ordered for published articles.
Additional Information
Cell Biology and Toxicology
Springer
P.O. Box 17
3300 AA Dordrecht
The Netherlands
Fax: +31-78-6576254
http://www.springeronline.com
167
Anexo 02 - Manuscript Submission for TOXICOLOGY IN VITRO
GeneralInformation
The Journal's main purpose will be the publication of papers reporting and interpreting
original toxicological research involving the application or development of in vitro
techniques. Brief Communications documenting important new findings warranting
expeditious publication will also be considered, as will concise interpretativeReviews of
toxicological topics of contemporary significance. Letters to the Editor will be limited to
comments on contributions already published in the Journal; if a letter is accepted, a
response (for simultaneous publication) will be invited from the authors of the original
contribution.
Submission of a paper will be held to imply that it reports original unpublished research,
that it is not under consideration for publication elsewhere, that all authors approve of the
submission, and that, if accepted for Toxicology in Vitro, it will not be published again,
either in English or in any other language, without the Editors' consent.
Conflict of Interest and Source of Funding. A conflict of interest exists when an author
or the author's institution has a financial or other relationship with other people or
organizations that may inappropriately influence the author's actions. All submissions to
Toxicology in Vitro must include disclosure of all relationships that could be viewed as
presenting a potential conflict of interest. Toxicology in Vitro may use such information as
a basis for editorial decisions and may publish such disclosures if they are believed to be
important to readers in judging the article.
Conflict of Interest Statements for Authors. At the end of the text, under a subheading
"Conflict of Interest Statement", all authors must disclose any financial, personal, or their
relationships with other people or organizations within 3 years of beginning the work
submitted that could inappropriately influence the work submitted. Examples of conflicts
include employment, consultancies, stock ownership, honoraria, paid expert testimony,
patent applications/registrations, and grants. If there are no conflicts of interest, authors
should state that there are none. Investigators should disclose potential conflicts to
participants in clinical trials and other studies and should state in the manuscript whether
they have done so. Toxicology in Vitro may decide not to publish on the basis of a declared
conflict, such as the financial interest of an author in a company (or its competitors) that
makes a product discussed in the paper.
168
Role of the Funding Source. All sources of funding should be declared as an
acknowledgment at the end of the text. Authors must also describe the role of the study
sponsor(s), if any, in a study design; in the collection, analysis, and interpretation of data; in
the writing of the report; and in the decision to submit the paper for publication. If the study
sponsor(s) had no such involvement, the authors should so state.
Manuscript Submission
Manuscripts must be submitted for review via the Internet through the Author Gateway on
the Elsevier website (
http://authors.elsevier.com ). Submissions that are e-mailed, or
mailed, to the editors will not be considered. Questions about submissions may be directed
to the appropriate editor.
Americas and Canada:
[email protected]
Europe: [email protected]
All other areas of the world: [email protected]
Language Editing: International Science Editing and Asia Science Editing can provide
English language and copyediting services to authors who want to publish in scientific,
technical and medical journals and need assistance before they submit their article or before
it is accepted for publication. Authors can contact these services directly: International
Science Editing (
http://www.internationalscienceediting.com ) and Asia Science Editing
(
http://www.asiascienceediting.com ) or, for more information about language editing
services, please contact authorsupport@elsevier.com who will be happy to deal with any
questions.
Please note Elsevier neither endorses nor takes responsibility for any products, goods
or services offered by outside vendors through our services or in any advertising. For
more information please refer to our terms and conditions
(
http://authors.elsevier.com/terms_and_conditions.html).
Manuscript Format
Manuscripts should be written in clear and concise English; incomprehensible submissions
will be returned to authors for revision. All pages must be numbered, including the Title
Page, which should carry the title of the paper, the surnames and initials of the authors, the
names and address of the institutions where the work was done (with the affiliation of each
author clearly indicated) and a short running title not exceeding 45 letters and spaces. Titles
consisting of declarative or interrogative sentences are not acceptable.
169
Revised versions
The medium of submission for revised papers is electronically through the Author Gateway
on the Elsevier website ( http://authors.elsevier.com/toxinvit ). Figures should be
submitted as original high quality files of a standard graphics program. Revised versions
should be returned within 3 months of the first date of decision. Failure to do so will result
in any resubmission being treated as a new version and will therefore carry a new date of
receipt.
Address
Authors' full names, academic or professional affiliations and addresses should be included
on the first page. The name and complete address and e-mail address of the author to whom
any correspondence is to be sent should be given.
Manuscripts of original papers should be organized into the following sections, each
commencing on a separate sheet:
Abstract-a self-contained summary of the objectives, results and significance of the study,
not exceeding 200 words. Uninformative sentences such as "the significance of the results
is discussed" are not acceptable.
Introduction-a concise and clear statement on the background, purposes and significance of
the work.
Materials and Methods-a detailed description of the experimental design and of any new or
improved methods. Well-established methods and techniques may be identified by
reference only.
Results-presented concisely with the aid of tables or figures where appropriate. Duplication
between this section and the Discussion must be avoided.
Discussion-a succinct interpretation of the data. Extensive literature reviews and highly
speculative comments are discouraged.
Acknowledgements-providing recognition of sources of funding and donations of materials,
and including any thanks the authors may wish to accord for advisory, technical or other
assistance, since authorship should be limited to those who have made a major contribution
to the study and to the preparation of the paper. Authors are advised to obtain approval for
the wording of any acknowledgement from those whose help is noted.
References-listed strictly in alphabetical order and including the names of all authors of the
cited work. References to published papers should provide authors' names and initials, year
170
of publication, full title of the paper, title of the journal (in full), volume number, and the
first and last page numbers of the paper:
e.g. Wright, A., Cowie, H., Gormley, I.P., Davies, J.M.G., 1986. The in vitro cytotoxicity
of asbestos fibres: 1. P388D1 cells. American Journal of Industrial Medicine 9, 371-384.
References to books should include authors' names and initials, year of publication, title,
edition, appropriate page number(s) and name and location of the Publisher:
e.g. Foussereau, J., Benezra, C., Maibach M., 1982. Occuptational Contact Dermatitis.
Clinical and Chemical Aspects. Munksgaard, Copenhagen, p. 227.
For multi-author books, the names and initials of the relevant authors, year of publication,
title of the relevant chapter, title of the book, names and initials of all editors, numbers of
first and last pages of the cited chapter and name and location of the Publisher should be
given:
e.g. Mather, J.P., Phillips, D.M., 1984. Primary culture of testicular somatic cells. In:
Barnes, D.W., Sirbasku, D.A., Sato, G.H. (Eds.), Methods for Serum-free Culture of Cells
of the Endocrine System. Alan R. Liss, New York, pp. 29-45.
Citations of references in the text should give the surname(s) of the author(s), together with
the year of publication. For references with more than two authors, the name of the first
followed by et al. should be cited. For papers with the same author(s) and year, the
references should be distinguished in the text and reference list by the letters a, b etc.
following the year (but still in alphabetical order). Authors names must not be typed in
upper case letters in either text or reference list.
References may be listed if they are in press , but the journal that hasaccepted the paper for
publication must be identified. Submitted papers or papers in preparation should not be
listed; such work should be mentioned in the text only, as 'unpublished data' or 'personal
communication' (with surnames, initials and year).
These sections should be followed by the tables in numerical order, each on a separate
sheet, and finally by a typed list of the legends to the figures (see below).
Tables and Figures
These should be intelligible without reference to the text and should be planned to fit the
page size of the Journal. Tables and figures should be numbered, in arabic numerals, in the
171
sequence in which they are mentioned in the text. The same data may not be reproduced in
both a table and a figure. Each table must have a title and on each column there should be a
heading that clearly identifies the data therein. Each figure should be in one of the
following preferred formats: TIFF, JPEG, PDF, and EPS. Please refer to
http://www.elsevier.com/locate/artwork for detailed instructions on preparing electronic
artwork. No information that can be included in the legend should appear on the figure and
the following standard symbols are preferred for line drawings: (closed triangle), (open
triangle), (closed square), (open square), (closed circle), (open circle), (open circle with a
dot in the middle), +, (open diamond). The legends for photomicrographs must state the
staining method and magnification. Authors should bear in mind that the figures they
submit may be subjected to photographic reduction. The cost for illustrations in colour will
be the responsibility of the contributor(s) (an estimate may be obtained from the Editorial
Offices). If figures that have already been published under copyright are to be reproduced
in the Journal (e.g. in reviews), copies of letters from the first publisher and the original
author giving permission for such reproduction must always accompany the submitted
manuscript.
Footnotes
These should include the definitions of any abbreviations used in the text and any author's
current address, if different from that on the title page. Other footnotes, as distinct from
literature references, should be avoided in the text as far as possible. When they are
essential, they should be identified by the symbols * † ‡ § ¶ in that order.
All the footnotes except those for tables should be typed on a separate sheet, with an
indication of the manuscript page to which the footnote refer.
Nomenclature
The metric system is the standard for all measurements. Test chemicals and enzymes must
be clearly identified, wherever possible with the aid of CAS Registry and EC numbers.
Abbreviations
These should be used sparingly; they should be defined when first used in the paper but
also listed in alphabetical order under Abbreviations as a footnote to the title page (see
above).
172
Proof reading
Proofs will be supplied electronically for the author to check for typesetting accuracy. Only
printer's errors may be corrected; no changes to the original manuscript will be allowed at
this stage.
Toxicology in Vitro has no page charges.
Reprints
A total of 25 reprints of each paper will be provided free of charge. Additional copies may
be ordered at prices shown on the reprint order form which will be sent to the author.
US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting (" Public Access") policy.
Elsevier facilitates author response to the NIH voluntary posting request (referred to as the
NIH "Public Access Policy"; see
http://www.nih.gov/about/publicaccess/index.htm) by
posting the peer-reviewed author's manuscript directly to PubMed Central on request from
the author, 12 months after formal publication. Upon notification from Elsevier of
acceptance, we will ask you to confirm via e-mail (by e-mailing us
at
[email protected] ) that your work has received NIH funding and that you
intend to respond to the NIH policy request, along with your NIH award number to
facilitate processing. Upon such confirmation, Elsevier will submit to PubMed Central on
your behalf a version of your manuscript that will include peer-review comments, for
posting 12 months after formal publication. This will ensure that you will have responded
fully to the NIH request policy. There will be no need for you to post your manuscript
directly with PubMed Central, and any such posting is prohibited.
173
Anexo 03 - Manuscript Submission for REPRODUCTIVE TOXICOLOGY
Manuscripts are accepted for consideration with the understanding that they have not been
published elsewhere except in abstract form and are not concurrently under review
elsewhere.
Online submission of papers
Authors are requested to submit their manuscripts electronically, by using the EESubmit
submission tool at
http://www205.ees.elsevier.com/rtx/. After registration, authors will be
asked to upload their article, an extra copy of the abstract, and associated artwork. The
submission tool will generate a PDF file to be used for the reviewing process. The
submission tool generates an automatic reply, which incorporates the manuscript number
for future correspondence.
Offline submission of papers
For those authors unable to submit their manuscript electronically, manuscripts should be
sent in triplicate to the editorial office closest to the contributor:
Dr Thomas B. Knudsen,University of Louisville, Birth Defects Center, Room 301, 501
South Preston Street, Louisville, KY 40202, USA. Tel.: (+1) 502 852 7507 or -4128; Fax
(+1) 502 852 4702;
Dr. W.S. Webster, Department of Anatomy, University of Sydney, N.S.W. 2006,
Australia.
Full-length papers should be submitted in English with an abstract briefly summarizing the
essential contents. The original manuscript (including figure captions and references) and 2
complete copies of the manuscript and figures should be submitted with one set of camera-
ready figures or photographs (original artwork or glossy prints). Manuscripts should be
accompanied by (a) a cover letter including the name, address, E-Mail Address, FAX
number, and phone number of the author to whom correspondence should be sent; (b)
copies of any published reports that may duplicate material in the submitted manuscript;
and (c) written permission of author(s), and publisher(s) to use any previously published
174
material (figures, tables, or quotations of more than 100 words). Authors should retain an
additional copy of the manuscript and figures for their own files. Upon acceptance of a
manuscript for publication, a copyright transfer will be sent to the author(s). This transfer
must be signed and dated by all authors and returned to the Editor-in-Chief. The
corresponding author of each article will receive 25 complimentary reprints.
Letters to the Editor. Letters dealing with published articles or matters of interest to the
reproductive toxicology field are invited. Letters should be short (not more than 400
words), typed double-spaced, and should include references where appropriate. Where a
published article is involved, the original author(s) will be invited to submit a response.
Reviews and Book Reviews. Authors are invited to submit suggestions for subject reviews
and book reviews to the Editorial Office. Please contact the Editorial Office before
beginning work on review articles.
MANUSCRIPT PREPARATION
The journal generally conforms to the CBE Style Manual (5th ed.) by Council of Biology
Editors, Inc. (Council of Biology Editors, Inc., Bethesda, MD 20814 USA; 1983). Organize
the manuscript in the order indicated below, with each component beginning on a separate
page and with a running title and page number typed in the upper right-hand corner of each
page.
Submission on Disk after Acceptance for Publication. Elsevier now publishes all
manuscripts using electronic production methods and strongly encourages submission on
disk. Please send the electronic files of your article along with the hardcopy of the accepted
version. To ensure fast and easy processing of your submission, please adhere to the
following guidelines:
1. Save text and graphics on separate disks.
2. Label all disks with your name, a short version of the article title, the journal to be
published in, and the filenames. Please also include details of the software and
platform (PC, Mac, UNIX etc) used to create your files.
3. Ensure that the files on the disk match the hardcopy exactly. In cases of a
discrepancy, the hardcopy version will be used as the definitive version.
175
Electronic Submission of Artwork and Graphic files. The following are preferred
formats: TIFF (1-bit for line art, 8-bit for greyscale, and 24 (32)-bit for colour images) and
EPS (PS or PDF). You may also supply in the following native formats: Adobe
Photoshop
®
, Adobe Illustrator
®
, CorelDRAW
®
, Macromedia
®
FreeHand
®
and CS
ChemDraw
®
. Bitmap and vector graphics should be supplied separately together with
instructions on the composition of the image. All graphic files must be submitted in
sufficiently high resolution (300 x 300 dpi for grayscale or colour images and 1000 X 1000
dpi for line art) to allow for printing. All fonts used in studio created artwork must be either
"embedded" in the file or supplied separately. For further details please see
http://www.elsevier.com/locate/authorartwork .
Title Page. Page 1 should include: (a) the title of the article; (b) the authors' full names
(First name, middle initial(s), surname); (c) affiliations (the name of department (if any),
institution, city, and state or county where the work was done), indicating which authors are
associated with which affiliations; (d) acknowledgments of grant support and of individuals
who were of direct help in the preparation of the study; (e) the name, address, E-Mail
Address, FAX number, and telephone number of the author to whom reprint requests are to
be sent; and (f) running title (not more than 30 spaces).
Abstract and Key Words. Page 2 should include the title of the article followed by the
abstract, which should have no more than 150 words. The abstract should state the purpose
of the study, basic procedures, most important findings, and principal conclusions, with an
emphasis on the new aspects of the study. Following the abstract, list 8 key words or
phrases for indexing. Abstracts are not used in review articles.
Text. All manuscripts should be typed on one side of the paper, double-spaced, with wide
margins. Papers should be organized in the following format: Introduction, Materials and
Methods, Results, Discussion, Acknowledgments, References. Review articles may be
organized without these headings and will be edited to correspond to our standard format.
References. Type references double-spaced in Vancouver numbered style (number them
consecutively in the order in which they are first mentioned in the text, not alphabetically).
Identify references in the text, tables, and legends by arabic numerals typed in parentheses.
References with 7 or more authors may be truncated, using the first 3 names with et al.
Examples of reference style are as follows:
176
Journal:
[3] Kao J, Brown NA, Schmid B, Goulding EH, Fabro S. Teratogenicity of valproic acid: in
vivo and in vitro investigations. Teratogenesis Carcinog Mutagen. 1981;1:367?83.
Contribution to a book:
[7] Scialli AR, Fabro S. The toxicokinetics of anesthetics and analgesics during labor and
delivery. In: Scanlon JW, ed. Perinatal anesthesia. Boston: Blackwell Scientific
Publications; 1985:1?26.
Book:
[4] Fabro S, Scialli AR, eds. Drug and chemical action in pregnancy. New York: Marcel
Dekker; 1986.
Letter:
[5] Fabro S, Brown NA. Teratogenic potential of anticonvulsants [letter]. N Engl J Med.
1979;300:1280?1.
Footnotes. Footnotes should be indicated in text by *, [
], etc., but should be typed at the
end of the reference list and keyed to the appropriate manuscript page.
Tables. Every table and every column should be provided with an explanatory heading,
with units of measure clearly indicated. The same data should not be reproduced in both
tables and figures.
Figures. Figures should be professionally drawn and photographed. Three prints of each
should be submitted as glossy, highcontrast, black-and-white photographs. Photographs of
tissues, cells, or subcellular components should be included when they are essential. Use a
label on the back of each figure to indicate the article's title and the top of the figure. Do not
write directly on the back of the photographs. Do not trim, mount, clip, or staple the
illustrations. Securely package all artwork in a protective envelope.
Figure Legends. Legends should be typed double-spaced and numbered with arabic
numerals corresponding to the illustrations and submitted on a separate page. When
symbols, arrows, numbers, or letters are used to identify parts of the illustrations, each
177
should be explained clearly in the legend. For photomicrographs, the internal scale markers
should be defined and the method of staining should be given. If the figure has been
previously published, a credit line should be included and a permission letter supplied by
the authors.
Author enquiries: For enquiries relating to the submission of articles (including electronic
submission where available) please visit the Author Gateway from Elsevier Science at
http://authors.elsevier.com . The Author Gateway also provides the facility to track
accepted articles and set up e-mail alerts to inform you of when an article's status has
changed, as well as detailed artwork guidelines, copyright information, frequently asked
questions and more.
Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those relating
to proofs, are provided after registration of an article for publication.
Author corrections: Elsevier will do everything possible to get your article corrected and
published as quickly and accurately as possible. Therefore, it is important to ensure that all
of your corrections are sent back to us in ONE communication. Subsequent corrections will
not be possible, so please ensure your first sending is complete.
English language help service: Upon request, Elsevier will direct authors to an agent who
can check and improve the English of their paper (before submission). Please contact
[email protected] for further information.
US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting (" Public Access") policy.
Elsevier facilitates author response to the NIH voluntary posting request (referred to as the
NIH "Public Access Policy"; see
http://www.nih.gov/about/publicaccess/index.htm) by
posting the peer-reviewed author's manuscript directly to PubMed Central on request from
the author, 12 months after formal publication. Upon notification from Elsevier of
acceptance, we will ask you to confirm via e-mail (by e-mailing us at
[email protected] ) that your work has received NIH funding and that you
intend to respond to the NIH policy request, along with your NIH award number to
facilitate processing. Upon such confirmation, Elsevier will submit to PubMed Central on
your behalf a version of your manuscript that will include peer-review comments, for
posting 12 months after formal publication. This will ensure that you will have responded
178
fully to the NIH request policy. There will be no need for you to post your manuscript
directly with PubMed Central, and any such posting is prohibited.
179
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