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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DAS TÉCNICAS DE CULTIVO
MICROBIOLÓGICO E SOROAGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM
CARTÃO COM E SEM 2-MERCAPTOETANOL NO
DIAGNÓSTICO DA BRUCELOSE CANINA
VANESSA RIESZ SALGADO
BOTUCATU – SP
Agosto 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO DAS TÉCNICAS DE CULTIVO
MICROBIOLÓGICO E SOROAGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM
CARTÃO COM E SEM 2-MERCAPTOETANOL NO
DIAGNÓSTICO DA BRUCELOSE CANINA
VANESSA RIESZ SALGADO
Dissertação apresentada junto ao
Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária para obtenção do
título de Mestra
Orientadora: Profa. Dra. Jane Megid
BOTUCATU – SP
Agosto 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Salgado, Vanessa Riesz.
Avaliação das técnicas de cultivo microbiológico e soroaglutinação rápida
em cartão com e sem 2-Mercaptoetanol no diagnóstico da Brucelose Canina /
Vanessa Riesz Salgado. – 2006.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2006.
Orientador: Jane Megid
Assunto CAPES: 50502034
1. Cão - Doenças 2. Brucelose canina - Diagnóstico - Estudos
experimentais
CDD 636.70896957
Palavras-chave: Brucella canis; Cão; Cultivo microbiológico; Diagnóstico;
Sorologia
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos e amados pais, Paulo Regis Salgado e Marisa
Riesz Salgado, que há 26 anos me deram à vida e até hoje cuidam de mim,
com carinho e dedicação. Vocês me ofereceram oportunidades de estudo
excelentes, ensinamentos de vida e de fé em Deus, princípios de respeito e
educação com o próximo. Vocês estão sempre ao meu lado, partilhando dos
momentos mais alegres e me confortando nos momentos mais difíceis da
minha vida. Por causa de vocês e de seus esforços, pude concluir mais uma
etapa em minha vida, por isso dedico este trabalho a vocês, como forma de
agradecimento e reconhecimento por tudo que vocês fizeram e fazem por mim.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de demonstrar aqui minha sincera gratidão a todos aqueles que
colaboraram de alguma maneira com esta dissertação, pois sem essas
“ajudas” não conseguiria realizar esse trabalho.
A Deus, pela vida maravilhosa e oportunidades que me oferece todos os
dias.
A minha Família (pais, irmão, avós e cachorros), que estão sempre ao me lado
me dando força para seguir em frente. Obrigada pela confiança, apoio e
oportunidade. Obrigada pelos latidos, lambidas e abanadas de rabo!!!!
A minha orientadora Professora Dra. Jane Megid que me conhece desde a
residência e vem acompanhando minha vida profissional, que me deu a
oportunidade de trabalhar com um tema tão fascinante como a Brucella canis,
meu agradecimento pela orientação, pelos conselhos profissionais e pela
oportunidade de realizar um sonho.
A grande amiga Lara Borges Keid do Laboratório de Biologia Molecular do
VPS–FMVZ–USP, que com tanta boa vontade me ensinou tudo que sabia
sobre o isolamento e PCR de Brucella canis, que gentilmente me cedeu
contatos de proprietários de canis e me ajudou em muitas das coletas
realizadas para este trabalho e nos repiques dos materiais, que muitas vezes
me emprestou materiais e me ajudou a solucionar dificuldades, com muito
carinho agradeço todos seus ensinamentos, toda sua ajuda, sua amizade e
companheirismo, serei eternamente grata a você.
Ao Professor Dr. Silvio Arruda Vasconcellos do Laboratório de Zoonoses
Bacterianas – VPS – USP por tão gentilmente ter me aberto às portas do seu
laboratório para que eu pudesse processar as culturas desse experimento, meu
muito obrigada.
Ao professor Adalberto José Crocci, do Departamento de Bioestatística,
obrigada por todo auxílio, colaboração e orientação na análise estatística, seus
conselhos foram fundamentais.
A grande amiga Adriana Cortez do Laboratório de Biologia Molecular do VPS–
FMVZ–USP, que me pacientemente me ensinou e ajudou quando eu estava
desesperada sem saber como começar as PCRs e depois de começado
quando nada parecia dar certo, obrigado pela persistência em fazer as coisas
funcionarem, por não me deixar desistir na primeira dificuldade, não tenho
palavras para agradecer os ensinamentos e todo apoio.
Ao técnico José Jairo Zucari do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde
Pública, pela amizade, pelas horas de desabafo, pela ajuda na eutanásia e
necropsia dos cãezinhos (horas tão duras para mim!!!), muito obrigada pelo
apoio e companheirismo.
As técnicas Zenaide e Gisele do Laboratório de Zoonoses Bacterianas – VPS
– USP por tão gentilmente me acolherem no laboratório e me ajudaram,
arrumando os lugares na estufa para eu processar as culturas, ajudando a
preparar os meios de cultura, meu muito obrigada pela ajuda, pelas conversas
e pela convivência pacífica.
Ao meu namorado José Charl Noujaim (“Corvo”) que mesmo longe me deu
força e carinho, teve paciência com meus “chiliques” ao telefone e me
incentivou a seguir em frente.
Aos meus amigos do laboratório Danielle Bastos Araújo, Nair Cavalcanti de
Lira, Cristiane Nozaki, Carla Cristina Guimarães Moraes e Francisco
Feliciano Júnior do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública,
com carinho especial, agradeço o companheirismo, a amizade, a colaboração,
as palavras de apoio e incentivo.
A todos os amigos e amigas do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde
Pública, Joel Grinspan, Taís Fukuta da Cruz, Welligton Borges da Silva
(“Liguitto”), Amanda Keller Siqueira (“Man”), Liliane Dantas (“Lili”), Rodrigo
Costa Silva e André Peres Barbosa de Castro (Zoonoses), Acácia
(“Fuinha”), Juliana (“Jú” da Zoonoses), Karina Rasquel (“kaká”), Camile
Bermejo Andreo, Aparecida Vitória Gonçalves de Souza (“Xuxu”), Cátia
Voss, Simone , Ana Paula Contente (“Rendeira”), Camila (“Melete”), Marta,
Janaina Biotto (“Cruz-Credo”), Marcela Mendes Ribeiro (“Bernenta”) e
Juliano Hoffmannn (Zoonoses), Valquíria e Luciano (Planejamento) e todos
os outros que me apoiaram nessa trajetória, sempre serei grata à ajuda direta
ou indireta na realização desse trabalho, à convivência no dia-dia, à torcida
para que tudo desse certo e as palavras de carinho nos momentos difíceis.
Aos amigos e amigas do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e
Saúde Animal – VPS – USP, Flávia Morato, Amani, Paty (“Pink”) e Pancho
(do Laboratório de Zoonoses Bacterianas), Nanci do Rosário Vieira, Renata
Pucci, Letície, Nicole e Alessandra (do LABMAS), Cristina Brito, Leandro
Moretti, Daniel Aguiar e Tatiane Ueno (que foram de Botucatu e agora estão
no VPS), Sílvio (da Parasitárias), Alessandra (da Higiene), Iara e muitos
outros que calorosamente me acolheram nos meses em que eu passei na USP
cursando disciplina e colhendo amostras para o experimento, obrigada pelos
momentos de descontração e às demonstrações de amizade.
Aos professores, Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes, Prof. Ass. Dr. Marcio
Garcia Ribeiro, Prof. Dr. Hélio Langoni, Prof. Ass. Dr. Paulo Francisco
Domingues e Prof. Dr. José Rafael Modolo por todos os ensinamentos,
atenção nos momentos de dúvidas, pela confiança prestada e convivência
prazerosa.
Aos funcionários José Wanderlei Forlin e Sérgio Fávero (da secretária),
Rodrigo Carreira e “PARDAL” (enfermeiros da MI), Adriana (“Adri” da
lavagem), Mércia, Rita e Dora (da limpeza), do Departamento de Higiene
Veterinária e Saúde Pública que sempre ajudaram na emissão de ofícios,
solicitação de serviços, envio de fax, preparação de material, no cuidado com a
alimentação e limpeza das acomodações dos cãezinhos do experimento e
limpando com esmero nossos laboratórios, meu muito obrigada a todos vocês.
À seção de Pós Graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
– UNESP, Campus de Botucatu, nas pessoas dos funcionários Denise A.
Fioravante Garcia, Maria Regina T. Forlin e Maria A. Manuel, por serem
sempre atenciosas e prestativas.
Às funcionárias da Biblioteca Rosemary Cristina da Silva, Meire e Selma
Maria da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, obrigada pelas
correções das referências e confecção da ficha catolográfica.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (“FAPESP”)
pela confiança e apoio financeiro fornecido para a realização desse trabalho.
SUMÁRIO
PÁGINA
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 9
LISTA DE TABELAS 10
LISTA DE FIGURAS 16
RESUMO 18
ABSTRACT 19
1.
INTRODUÇÃO 20
2.
REVISÃO DE LITERATURA 24
3.
OBJETIVOS 36
3.1. GERAL 37
3.2. ESPECÍFICOS 37
4.
MATERIAL E MÉTODOS 38
4.1. MATERIAL 39
4.1.1. Animais 39
4.1.2. Espécimes Clínicos 39
4.1.3. Meios de Cultura para Isolamento e Identificação
Bacteriana
41
4.1.4. Antígenos 41
4.2. MÉTODOS 42
4.2.1. Isolamento e Identificação Bacteriana 42
4.2.2. Pesquisa de Anticorpos Anti – Brucella canis 44
PÁGINA
4.2.2.1. Prova de Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) 44
4.2.2.2. Prova de Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2–
Mercaptoetanol (SAR-2ME)
44
4.3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 45
4.3.1. Localização e período da coleta 45
4.3.2. Colheita dos espécimes clínicos 46
4.3.3. Processamento dos espécimes clínicos 47
4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 48
5.
RESULTADOS 49
6.
DISCUSSÃO 87
7.
CONCLUSÕES 101
8.
REFERÊNCIAS 103
9.
ANEXOS 116
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% – por cento
o
C – graus Celsius
2–ME – dois mercaptoetanol
µL – microlitros
µm – micrometros
B.canis – Brucella canis
cm – centímetros
CO
2
– dióxido de carbono
ELISA – ensaio imunoenzimático
et al. – e colaboradores
H
2
S – sulfeto de hidrogênio
IDGA – imunodifusão em gel de ágar
IDGA-2ME – prova de imunodifusão em gel de ágar em soros tratados pelo 2–
mercaptoetanol
IgM – imunoglobulina M
L – litro
LPS – lipopolissacarídeo
mg – miligrama
mL – mililitro
M – Molar
SAL – teste de soroaglutinação lenta em tubo
SAL-2ME – teste de soroaglutinação lenta em tubo em soros tratados pelo 2–
mercaptoetanol
SAR – prova de soroaglutinação rápida em cartão
SAR-2ME – prova de soroaglutinação rápida em cartão em soros tratados pelo
2–mercaptoetanol
SIM – Sulfide Indol Motility Agar
TSI – Triple Sugar Iron Agar
UI – unidades internacionais
Visto ter seu uso consagrado na literatura técnica, algumas abreviaturas
seguem as iniciais de sua grafia no idioma inglês.
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1
Distribuição dos isolamentos de Brucella canis em 71
cães positivos no cultivo microbiológico, segundo o
sexo e os diferentes materiais cultivados para o
isolamento
52
TABELA 2
Proporção e porcentagem de resultados positivos
segundo o sexo e a técnica diagnóstica aplicada aos
cães examinados para o diagnóstico da brucelose
canina
54
TABELA 3
Proporção e porcentagem de resultados positivos
segundo a condição clínica e a técnica diagnóstica
aplicada aos cães examinados para o diagnóstico da
brucelose canina
55
TABELA 4
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis
56
TABELA 5
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico geral para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis
57
TABELA 6
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico geral no Canil A para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis
58
Página
TABELA 7
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico geral no Canil B para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis
59
TABELA 8
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico de sangue para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis
60
TABELA 9
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico de urina para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cadelas
61
TABELA 10
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico de urina para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cães machos
62
TABELA 11
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico de swab vaginal para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cadelas
63
TABELA 12
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico de swab prepucial para o diagnóstico
da brucelose canina por B. canis em cães machos
64
TABELA 13
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo
microbiológico de sêmen para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cães machos
65
Página
TABELA 14
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) e de cultivo microbiológico
geral para o diagnóstico da brucelose canina por B.
canis
66
TABELA 15
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) e de cultivo microbiológico
de sangue para o diagnóstico da brucelose canina por
B. canis
67
TABELA 16
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) e de cultivo microbiológico
de urina para o diagnóstico da brucelose canina por B.
canis em cadelas
68
TABELA 17
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) e de cultivo microbiológico
de urina para o diagnóstico da brucelose canina por B.
canis em cães machos
69
TABELA 18
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (2ME–SAR) e de cultivo microbiológico
de swab vaginal para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis em cadelas
70
Página
TABELA 19
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) e de cultivo microbiológico
de swab prepucial para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis em cães machos
71
TABELA 20
Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR–2ME) e de cultivo microbiológico
de sêmen para o diagnóstico da brucelose canina por
B. canis em cães machos
72
TABELA 21
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sangue e de cultivo
microbiológico global para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis
73
TABELA 22
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sangue e de cultivo
microbiológico de urina para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cadelas
74
TABELA 23
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sangue e de cultivo
microbiológico de urina para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cães machos
75
TABELA 24
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sangue e de cultivo
microbiológico de swab vaginal para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cadelas
76
Página
TABELA 25
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sangue e de cultivo
microbiológico de swab prepucial para o diagnóstico
da brucelose canina por B. canis em cães machos
77
TABELA 26
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sangue e de cultivo
microbiológico de sêmen para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cães machos
78
TABELA 27
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de urina e de cultivo
microbiológico global para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis
79
TABELA 28
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de urina e de cultivo
microbiológico de swab vaginal para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cadelas
80
TABELA 29
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de urina e de cultivo
microbiológico de swab prepucial para o diagnóstico
da brucelose canina por B. canis em cães machos
81
TABELA 30
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de urina e de cultivo
microbiológico de sêmen para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cães machos
82
TABELA 31
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de swab vaginal e de cultivo
microbiológico geral para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis em cadelas
83
Página
TABELA 32
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de swab prepucial e de cultivo
microbiológico geral para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis em cães machos
84
TABELA 33
Resultados comparativos obtidos nas provas de
cultivo microbiológico de sêmen e cultivo
microbiológico geral para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis em cães machos
85
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1 -
Sangue colhido assepticamente da veia jugular
para realização do cultivo microbiológico
40
FIGURA 2 -
Sangue acondicionado em frascos estéreis com
citrato de sódio para o transporte ao laboratório
40
FIGURA 3 -
Urina colhida assepticamente por cistocentese
para realização do cultivo microbiológico
40
FIGURA 4 -
Swab vaginal colhido de maneira asséptica para
realização do cultivo microbiológico
40
FIGURA 5 -
Swab acondicionado em frascos estéreis com
caldo fosfato triptose acrescido de antibióticos
para o transporte ao laboratório
40
FIGURA 6 -
Kit comercial D-Tec
®
CB (Canine Brucellosis
Antibody Kit Test), utilizado na prova de
Soroaglutinação rápida e Soroaglutinação rápida
com 2-Mercaptoetanol. Composto por soro
controle positivo (frasco A), antígeno (frasco B),
solução de 2-Mercaptoetanol (frasco C), pipetas e
bastões para homogeneização dos soros e cartões
para realização dos testes.
43
FIGURA 7 -
Tubos de cultura grandes (4) contendo 10mL de
caldo fosfato triptose e materiais processados
para isolamento de B.canis e tubos falcon (2)
utilizados para o transporte de swabs vaginais,
prepuciais e sêmen
43
FIGURA 8 -
Ágar triptose mostrando o isolamento de Brucella
canis de amostra de urina de fêmea
51
Página
FIGURA 9 -
Ágar TSI e Citrato Simmons demonstrando,
respectivamente, ausência de fermentação de
açúcares e utilização do citrato
51
FIGURA 10-
Ágar SIM e Gelatina demonstrando,
respectivamente, ausência de motilidade,
produção de H
2
S e indol e liquefação da gelatina
negativa
51
FIGURA 11-
Caldo Uréia e Nitrato inoculados com B. canis
frente a caldos padrões não inoculados
demonstrando, respectivamente, redução positiva
da uréia e nitrato.
51
SALGADO, V. R. Avaliação das técnicas de Cultivo Microbiológico e
Soroaglutinação Rápida em Cartão com e sem 2-Mercaptoetanol no
diagnóstico da brucelose canina. Botucatu, 2006, 121p. Dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Julio Mesquita Filho”.
Botucatu – São Paulo.
RESUMO
A brucelose canina causada pela Brucella canis (B. canis) é uma das principais
causas infecciosas de desordens reprodutivas em cães. O presente trabalho
teve como objetivo comparar as técnicas de Cultivo Microbiológico e
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) com e sem o emprego de 2-
Mercaptoetanol (2-ME) no diagnóstico da brucelose canina. Adicionalmente
foram avaliados sangue, urina, swab vaginal, prepucial e sêmen como
materiais a serem processados no diagnóstico microbiológico. Foram avaliados
236 cães quanto à infecção por B. canis, muitos com histórico de problemas
reprodutivos, dos quais 24,2% resultaram positivos na SAR, 10,2% na SAR-
2ME, 28% na hemocultura, 9,2% na urocultura, 2,1% na cultura de swab
vaginal, 13,6% na cultura dos swabs prepuciais e 28,6% no cultivo de sêmen.
Dos 71 animais positivos no cultivo microbiológico, 92,9% apresentaram-se
positivos na hemocultura. Nos demais materiais foram obtidos percentuais
menores. A sensibilidade relativa da SAR resultou em 66,2% e a especificidade
relativa 93,9%. A SAR-2ME apresentou sensibilidade relativa de 29,5% com
ligeiro aumento na especificidade relativa 98,2%. Quando associados SAR e
hemocultura foram observados 97,6% e 93,9% de sensibilidade e
especificidade, respectivamente. Os resultados sugerem a utilização associada
da SAR à hemocultura sem realização em paralelo com 2-ME.
Palavras chave: Brucella canis; diagnóstico; cultivo microbiológico; sorologia,
cão.
SALGADO, V. R. Evaluation of Bacteriological Cultures and Rapid Slide
Agglutination Test with and without 2-Mercaptoethanol in diagnosis of
canine brucellosis. Botucatu, 2006, 121p. Masters dissertation – School of
Veterinary Medicine and Animal Science, Campus of Botucatu, “Julio
Mesquita Filho” Sao Paulo State University. Botucatu, Sao Paulo.
ABSTRACT
Canine brucellosis caused by Brucella canis (B. canis) is one of the major
infectious causes of reproductive disorders in dogs. The present study aimed to
compare the performance of bacteriological methods and Rapid Slide
Agglutination Test (RSAT) with or without 2-Mercaptoethanol (2-ME) in canine
brucellosis diagnosis. Additionally, blood, urine, vaginal and prepucial swabs
and semen were evaluated regarding their use in bacteriological diagnostic.
Two hundred thirty six dogs, many of them showing reproductive problems,
were submitted to investigation for diagnosis of B. canis infection. Among them,
24.2% were positive in RSAT, 10.2% 2ME-RSAT, 28% blood culture, 9.2%
urine culture, 2.1% vaginal swab culture, 13.6% prepucial swab culture and
28.6% semen culture. Among the 71 positive dogs in bacteriological culture,
92.9% were positive in blood culture. The percentage of positivity was variable
in others samples. The relative sensitivity of RSAT was 66.2% and the relative
specificity was 93.9%. The 2ME-RSAT presented lower sensitivity 29.5% and
greater specificity 98.2%. The use of blood culture and RSAT associated
presented 97.6% e 93.9% of sensibility and specificity, respectively. These
results suggest that RSAT should be used with blood cultures independently of
the use of 2ME-RSAT.
Key Words: Brucella canis; diagnosis; bacteriological culture; serology, dog.
21
1. INTRODUÇÃO
O presente trabalho, ao enfocar a brucelose canina, busca destacar a
importância do aperfeiçoamento dos métodos diagnósticos, no sentido de
minimizar a doença e seus respectivos efeitos epidemiológicos e econômicos,
em especial nos canis comerciais, além de considerar a saúde pública.
A brucelose é uma enfermidade infecto-contagiosa crônica que acomete
canídeos domésticos, silvestres e o homem (ACHA & SZYFRES, 2001).
Causada pela Brucella canis (B. canis), um pequeno cocobacilo, Gram
negativo, isolado pela primeira vez em 1966, nos Estados Unidos, por
Carmichael, em tecidos placentários e fetais de cadelas da raça beagle com
histórico de abortamento e infertilidade (CARMICHAEL, 1966).
A brucelose canina está distribuída mundialmente, tendo sido relatada
em diversos países do continente americano, europeu, e da Ásia
(CARMICHAEL & GREENE, 1998), dentre eles Estados Unidos (CARMICHAEL
& KENNY, 1968), Canadá (FORBES & PANTEKOEK, 1988), México
(FLORES–CASTRO et al, 1977), Argentina (MYERS & VARELA–DIAS, 1980),
Chile (BORIE et al., 2002), Tchecoslováquia (SEBEK et al., 1976), Inglaterra
(TAYLOR, 1980), Alemanha (WEBER et al., 1981), Espanha (MATEU DE
ANTONIO & MARTIN, 1993), Itália (EBANI et al., 2003), Japão (UEDA et al.,
1974b) e Turquia (Öncel et al., 2005).
No Brasil, a brucelose canina foi descrita pela primeira vez em 1977 por
Godoy e colaboradores, no estado de Minas Gerais, quando isolaram a
bactéria de uma cadela com histórico de abortamento e reagente a prova de
soroaglutinação lenta (SAL) (GODOY et al., 1977). Desde então, a doença tem
sido referenciada em diversos levantamentos soro-epidemiológicos e em
descrições de isolamento do agente (FERNANDES et al., 1976-7; VARGAS et
al., 1996; GOMES et al., 1999; MEGID et al., 2002; FERREIRA et al., 2003;
KEID et al., 2004).
O primeiro inquérito sorológico em cães foi realizado por Sandoval et al.
(1976), na cidade de São Paulo, os quais observaram 3,61% de positivos com
título igual ou superior a 200, utilizando a prova de SAL. Pela mesma técnica,
22
Wald & Fernandes (1976-7), em Porto Alegre, constataram 11,97% de
aglutinações positivas, nesta mesma titulação.
Posteriormente, Germano et al. (1987) encontraram prevalência de 5,4%
utilizando a prova de soroaglutinação rápida em placa com 2–mercaptoetanol
(SAR-2ME), em cães da cidade de Campinas e Cortes et al. (1988),
encontraram 7,5% de positivos, na prova de imunodifusão em gel de ágar
(IDGA), em cães errantes da cidade de São Paulo.
Inquérito sorológico para brucelose canina no planalto catarinense
revelou 31% de reagentes a prova de Soroaglutinação Rápida em Cartão
(SAR), sendo 9% confirmados pela SAL (SCHLEMPER & VAZ, 1990). Foi
relatada por meio da IDGA soroprevalência de 37%, na Bahia, no distrito de
Monte Gordo (MELO et al., 1997/98). Prevalência de 25,7% foi encontrada pela
IDGA nos cães das cidades do Rio de Janeiro e Niterói (MAIA et al., 1999).
Carvalho et al. (2000) analisando a ocorrência de cães reagentes a B. canis,
pela IDGA, no Pará, encontraram 45,3% de positivos, sendo o maior percentual
de positivos observado entre os cães domiciliados (53,8%).
Almeida et al. (2001) encontraram 4,9% de soroprevalência para
brucelose canina, na cidade de Alfenas– MG, analisando 102 animais
atendidos no hospital veterinário da Unifenas. Em Belo Horizonte–MG foi
encontrada prevalência de 4,8% pela IDGA (SOUZA et al., 2002).
Moraes et al. (2002) realizaram estudo da prevalência da infecção, em
cães da microrregião da Serra de Botucatu, observando 0,84% de animais
positivos, empregando a SAR-2ME e IDGA-2ME. Azevedo et al. (2003)
investigando a prevalência da brucelose canina, em cães do município de
Santana de Parnaíba, encontraram 2,2% de positivos nas provas de IDGA e
Fixação de Complemento (FC). Almeida et al. (2004) avaliaram a prevalência
da brucelose canina por B. canis em Alfenas–MG e encontraram 14,2% de
positivos na IDGA, em 635 amostras de soro avaliadas.
Os levantamentos sobre a prevalência da infecção são variáveis,
dependendo da área geográfica e do tipo de teste aplicado (GOMES et al.,
1999). Entretanto, as maiores porcentagens da infecção, provavelmente,
ocorrem entre cães utilizados para reprodução em grandes canis comerciais
23
(BARTON, 1977), uma vez que a brucelose canina é uma das principais
doenças infecciosas de caráter reprodutivo em cães (KEID et al., 2004).
Quando introduzida a uma população confinada, geralmente se
dissemina rapidamente resultando em perdas econômicas importantes e risco
para a saúde pública (KEID et al., 2004).
Os animais infectados geralmente, apresentam sérias alterações
reprodutivas. Nas fêmeas predominam os abortamentos, e nos machos as
orquites, epididimites e infertilidade. A linfadenopatia e discoespondilite são
menos freqüentes e podem ocorrer em ambos os sexos (JOHNSON &
WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1993; WANKE, 2004).
Pode ser grande o número de animais que permanecem assintomáticos,
mesmo estando infectados, atuando como fontes de infecção potenciais para
outros animais (JOHNSON & WALKER, 1992; KEID et al., 2004; WANKE,
2004).
O diagnóstico da brucelose canina é bastante difícil, devido à flutuação
de títulos de anticorpos séricos, e os diferentes métodos usados para detectá-
los (WANKE, 2004). Alguns testes sorológicos apresentam o inconveniente de
erros na interpretação, em decorrência da reatividade cruzada com outros
microrganismos. Como conseqüência da inacurácia dos testes sorológicos, a
cultura é o método definitivo para confirmação do diagnóstico. Entretanto, cães
cronicamente infectados podem apresentar resultados falso-negativos no teste
(JOHNSON & WALKER, 1992).
Finalmente, considerando a importância econômica da doença em canis
comerciais, as particularidades do seu diagnóstico, e os riscos para a
população humana, que mantém contato cada vez mais próximo com os cães,
o escopo deste trabalho foi comparar os métodos microbiológicos e
sorológicos, rotineiramente, utilizados no diagnóstico da brucelose canina por
B. canis, explicitando os aspectos positivos e negativos desses procedimentos
e verificando se a combinação deles apresenta resultados mais efetivos no
diagnóstico da doença.
25
2. REVISÃO DE LITERATURA
A brucelose canina é uma enfermidade infecto-contagiosa crônica,
causada pela B. canis, reconhecido como pequeno (1,0–1,5 µm) cocobacilo,
Gram negativo, aeróbico, imóvel, não esporulado e não encapsulado, que se
distingue de outros do gênero Brucella, por apresentar colônias com morfologia
rugosa e aspecto mucóide, e características bioquímicas próprias (MOORE,
1969; CORRÊA & CORRÊA, 1992; CARMICHAEL & SHIN, 1996;
CARMICHAEL & GREENE, 1998; WANKE, 2004).
O caráter zoonótico da doença foi primeiramente constatado em 1968
por Carmichael e colaboradores, em acidentes laboratoriais (MOORE, 1969;
GODOY et al., 1979; LARSSON, 1980). A doença manifesta-se no homem
semelhante ao estado gripal, porém de longa duração, associado a sintomas
de hipertermia, sudorese noturna, calafrios, mialgias, insônia, linfadenopatia,
mal estar, fadiga, perda de peso e lesões orais (SWENSON et al., 1972;
MUNFORD et al., 1975; GODOY et al., 1979; RUMLEY, et al., 1986;
GONZÁLEZ et al., 2004; LUCERO, et al., 2005).
A infecção humana causada pela B. canis geralmente é decorrente do
contato com cadelas que apresentaram abortamento (GREENE, 1995). Pode
acometer veterinários, tratadores e proprietários que se infectam pelo contato
estreito com animais doentes (MOORE & GUPTA, 1970; CARMICHAEL, 1976;
CURRIER et al., 1982).
Monroe et al. (1975) examinando a presença de anticorpos contra B.
canis em diferentes grupos da população, expostos ao contato com cães,
encontraram as maiores taxas de sororeagentes entre os veterinários. Fonseca
et al. (1999) também examinaram soros humanos e encontraram 14,6% de
amostras reagentes para B. canis, sendo 11,2% dos positivos em donas de
casa que provavelmente se infectaram pelo contato com animais de estimação.
A brucelose canina está amplamente disseminada nos canis comerciais,
devido ao desconhecimento dos criadores, que freqüentemente introduzem
animais para cobertura, sem antes conhecer seu status sanitário e, também,
em face ao caráter insidioso da enfermidade, uma vez que os animais
26
infectados freqüentemente se apresentam clinicamente normais
(CARMICHAEL & KENNEY, 1968; MOORE, 1969; GONZÁLEZ et al., 2004).
Vargas et al. (1996) relataram a ocorrência de 72,7% animais reagentes
a IDGA em um canil na cidade de Uruguaiana–RS. O percentual de ocorrência
de brucelose em quatro canis comerciais, com histórico de animais
apresentando abortamentos, nascimentos prematuros e mortalidade em
neonatos, foi avaliado pela prova de IDGA variando de 4,6 a 57,1% (MEGID et
al.,1999).
Em canil com histórico de problemas reprodutivos no Rio de Janeiro,
encontraram-se 50% dos animais positivos a IDGA e em 25% dos animais
isolou-se B. canis na hemocultura (FERREIRA et al., 2003). Cães provenientes
de 12 canis do estado de São Paulo foram submetidos a provas laboratoriais
de IDGA e hemocultura para o diagnóstico da infecção por B. canis, resultando
positivos a IDGA 33,9% dos animais e na hemocultura 14% dos 171 cães
avaliados (KEID et al., 2004).
A brucelose é uma das enfermidades de maior importância para os
criadores, em virtude da rápida disseminação da doença em populações
confinadas e as perdas econômicas decorrentes das alterações reprodutivas e
da eliminação de animais de alto valor zootécnico. Não há alternativas para o
controle da doença senão a eliminação dos animais doentes, uma vez que o
tratamento pode ser difícil, oneroso e contra-indicado por ser pouco eficiente
(BARTON, 1977; BORIE et al., 2002; GONZÁLEZ et al., 2004; WANKE, 2004).
Nos cães, as principais portas de entrada da bactéria compreendem
principalmente as mucosas oronasal, genital e conjuntival (CURRIER et al.,
1982; CARMICHAEL & JOUBERT, 1988; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
Infecções experimentais já foram induzidas pelas vias intravenosa, subcutânea,
intraperitoneal e intravaginal (SERIKAWA & MURAGUCHI, 1979; MEYER,
1983).
A infecção oral é a mais freqüente e a dose mínima infectante por esta
via é de cerca 10
6
microrganismos, enquanto a dose mínima infectante por via
conjuntival é 10
4
a 10
5
microrganismos. A dose infectante mínima por via
venérea é desconhecida (JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL &
JOUBERT, 1988; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
27
A transmissão ocorre, geralmente, pela ingestão ou inalação de
microorganismos presentes em tecidos fetais abortados, descargas vaginais do
parto ou do abortamento, assim como em urina. A transmissão venérea pode
ocorrer tanto do macho para a fêmea, devido à eliminação do agente no
sêmen, quanto da forma inversa, uma vez que as descargas vaginais de
fêmeas infectadas durante o estro também possuem altas concentrações do
microorganismo (MOORE & GUPTA, 1970; CARMICHAEL & GREENE, 1993;
JOHNSON & WALKER, 1992; MIRANDA et al, 2005).
A eliminação pelo sêmen é decorrente da presença de microrganismos
na próstata e no epidídimo. A quantidade de bactérias isoladas a partir do
sêmen em cães infectados é alta nas primeiras seis a oito semanas pós-
infecção. Entretanto, a eliminação intermitente do organismo em baixas
concentrações, foi relatada por até 60 semanas pós-infecção, podendo
continuar por até dois anos (CARMICHAEL & GREENE, 1993; JOHNSON &
WALKER, 1992).
Diferentes estudos sugeriram taxas de isolamento da bactéria três vezes
maiores na urina de machos do que de fêmeas. A estreita relação anatômica
entre a próstata, o epidídimo e a vesícula urinária poderia explicar a presença
de maior número de organismos presentes na urina de machos infectados,
comparativamente as fêmeas. Desse modo, os machos assumem maior risco
na transmissão da infecção pela urina. Mas, a urina de machos e fêmeas é
potencialmente infectante, quando existe contato estreito e prolongado entre os
animais (MOORE, 1969; SERIKAWA et al., 1978; CARMICHAEL & JOUBERT,
1988; JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
As fêmeas podem, também, excretar as brucelas pelo leite, ainda que
em pequena concentração e com pouca importância na infecção dos filhotes,
uma vez que normalmente, estes animais já foram infectados intra-
uterinamente (CARMICHAEL & GREENE, 1998). Contrariamente, Johnson &
Walker (1992) consideram o leite como importante via de transmissão,
decorrente do potencial de dispersão do microrganismo no meio ambiente.
A transmissão da bactéria por fômites, utilização de vaginoscópio e
seringas contaminadas, assim como da realização de transfusões sanguíneas
e inseminações artificiais, com sangue ou sêmen de animais infectados, já
foram relatadas (CARMICHAEL & GREENE, 1998).
28
Após a penetração no organismo, o agente é fagocitado por macrófagos
ou outras células fagocitárias, transportado para órgãos genitais e linfonodos,
desenvolvendo linfadenopatia transitória. No interior dos leucócitos realiza
bacteremia e se dissemina por via hematógena para os outros sistemas do
organismo (JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
Após a bacteremia, títulos de anticorpos persistentes e não protetores
contra B. canis começam a ser detectados. Entretanto, parecem ter pouca
influência sobre a bacteremia e o número de microrganismos encontrados nos
tecidos (CARMICHAEL & GRENNE, 1998; WANKE, 2004).
A brucelose canina manifesta-se por bacteremia prolongada, sem
ocorrência de febre, com início uma a quatro semanas depois da infecção,
persistindo por no mínimo seis meses e de forma intermitente pode durar até
64 meses ou mais (CURRIER et al., 1982; WANKE, 2004). Durante esta fase, o
agente poderá ser encontrado em diversos órgãos do sistema reticular,
incluindo linfonodos, fígado, baço, medula óssea, assim como no sistema
reprodutivo. Mesmo sendo uma doença sistêmica, raramente cães adultos
manifestam sinais clínicos sistêmicos severos, sendo o principal problema à
ocorrência de prejuízos no desempenho reprodutivo (JOHNSON & WALKER,
1992).
A B. canis infecta o útero nas fêmeas prenhes e coloniza as células
epiteliais placentárias, resultando em morte embrionária ou fetal, abortamentos
tardios no terço final da gestação, podendo ocorrer retenção de placenta e/ou
corrimento vaginal persistente. Algumas fêmeas podem apresentar vários
abortamentos consecutivos. Em alguns casos, podem levar a gestação a termo
com nascimento de natimortos, filhotes fracos que morrem em poucos dias, ou
filhotes aparentemente sadios, exceto pela bacteremia persistente e o
enfartamento de linfonodos, que geralmente é o único sinal clínico da infecção
até a maturidade sexual (CARMICHAEL & KENNY, 1968; MOORE, 1969;
CARMICHAEL & KENNY, 1970; CURRIER, et al., 1982; JOHNSON &
WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1998; WANKE, 2004).
Carmichael (1990) relatou que as fêmeas que apresentaram
abortamento por B. canis podem apresentar partos subseqüentes normais em
85% dos casos. As cadelas infectadas não prenhes comumente não mostram
29
sinais de infecção, mas podem eliminar o microrganismo na urina e secreções
vaginais por período de tempo variável (JOHNSON & WALKER, 1992).
As manifestações clínicas de brucelose mais freqüentes nos machos,
são as epididimites e prostatites severas. A epididimite desenvolve-se cerca de
cinco semanas pós-infecção. Durante a fase aguda da doença, o testículo e o
epidídimo aumentam de tamanho, e este último torna-se sensível devido à
presença de fluido serosanguinolento na túnica albugínea. O epidídimo diminui
de tamanho na fase crônica da infecção, apresentando consistência firme e
geralmente há atrofia epididimária (JOHNSON & WALKER, 1992;
CARMICHAEL & GREENE, 1993, WANKE, 2004).
A dermatite e o edema escrotal são resultados do hábito freqüente de
lamber o escroto. Orquites e aumento dos testículos raramente ocorrem na
fase aguda, mas os machos cronicamente infectados desenvolvem atrofia
testicular uni ou bilateral (JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL &
GREENE, 1993, WANKE, 2004).
Danos testiculares desenvolvidos pela ação direta da bactéria, iniciam
uma resposta auto-imune contra os espermatozóides e determinam distúrbios
na espermatogênese, alterações da morfologia e redução na motilidade dos
espermatozóides, presença de células inflamatórias e redução de volume do
ejaculado. Acredita-se que este fenômeno auto-imune, esteja envolvido na
patogenia da esterilidade, que geralmente ocorre nas infecções crônicas.
Independentemente do desenvolvimento da esterilidade, os cães continuam
excretando a bactéria no fluido seminal (SERIKAWA et al., 1984, LARSSON et
al., 1984a; JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1993,
WANKE, 2004).
Ocasionalmente, B. canis infecta outros tecidos além do linforeticular e
reprodutivo, podendo ocorrer hepato e esplenomegalia, uveítes,
discoespondilites, osteomielites, meningites, glomerulonefrites e dermatites
piogranulomatosas (HENDERSON et al., 1974; FERNANDES et al., 1976-7;
SAEGUSA et al., 1977; JOHNSON & WALKER, 1992; KERWIN et al., 1992;
CARMICHAEL & GREENE, 1998; DZIEZYC, 2000; SOUZA et al., 2003).
A presença dos sinais clínicos é sugestiva da infecção, mas o único
método definitivo para o diagnóstico da brucelose em cães, é o isolamento
bacteriano do agente que fornece diagnóstico definitivo quando a bactéria é
30
isolada. Entretanto, é demorado, e resultados negativos na cultura, decorrentes
de pequena quantidade de microorganismos viáveis ou contaminação da
amostra, não eliminam a possibilidade de infecção (CARMICHAEL & BRUNER,
1968; MOORE, 1969; MOORE & GUPTA, 1970; FLORES-CASTRO &
CARMICHAEL, 1978; NICOLETTI & CHASE, 1987; WANKE, 2004).
O microorganismo pode ser isolado a partir da cultura do sangue,
aspirado de medula óssea, sêmen, secreção vaginal, urina, leite, humor
aquoso, órgãos como o fígado, baço, linfonodos, útero, ovário, próstata,
epidídimo, testículo ou ainda líquido amniótico, placenta, rins, fígado, baço,
pulmão e fluidos pleurais de fetos abortados (CARMICHAEL & BRUNER, 1968;
UEDA et al., 1974a; NICOLETTI & CHASE, 1987; FLORES-CASTRO &
CARMICHAEL, 1978, JOHNSON & WALKER, 1992, WANKE, 2004).
O sangue é a melhor amostra a ser cultivada na tentativa de isolamento,
uma vez que nos cães a bacteremia é prolongada. Após uma a quatro
semanas da infecção, o agente já pode ser isolado na hemocultura, persistindo
por no mínimo seis meses e de forma intermitente pode durar até 64 meses ou
mais. Porém, em animais cronicamente infectados a bacteremia pode estar
ausente impossibilitando o isolamento (CARMICHAEL & BRUNER, 1968;
MOORE, 1969; CARMICHAEL & KENNY, 1970; MOORE & GUPTA, 1970;
FLORES-CASTRO & CARMICHAEL, 1978; NICOLETTI & CHASE, 1987;
JOHNSON & WALKER, 1992, WANKE, 2004).
As culturas de urina e sêmen podem ser úteis para o diagnóstico, mas
se colhidas isoladamente não são confiáveis, uma vez que um resultado
negativo não exclui a possibilidade de infecção (GREENE, 1995).
A eliminação da bactéria pela urina tem início uma a quatro semanas
depois do início da bacteremia e persiste por pelo menos 18 semanas.
Portanto, as tentativas de isolamento da urina neste período geralmente
produzem resultado positivo (SERIWAKA & MURAGUCHI, 1979; JOHNSON &
WALKER, 1992).
A cultura de sêmen realizada entre três e onze semanas pós-infecção
revela quantidade muito elevada de microorganismos. Depois de 12 semanas a
quantidade de microorganismos eliminados começa a diminuir até tornar-se
praticamente negativa após 60 semanas (JOHNSON & WALKER, 1992).
31
A cultura da descarga vaginal no período imediatamente após o
abortamento ou durante o estro é o mais indicado para tentativa de isolamento
do agente nas cadelas (JOHNSON & WALKER, 1992), uma vez que estas
descargas podem conter elevadas concentrações da bactéria por até seis
semanas pós-abortamento (CARMICHAEL & KENNY, 1970; CARMICHAEL &
GREENE, 1998).
Keid (2001) concluiu que o cultivo de sêmen e swab vaginal não
apresentam valor para o diagnóstico laboratorial da brucelose canina por B.
canis visto que foi pequeno o número de isolamentos obtidos nestes materiais.
Embora o isolamento do microrganismo possibilite o diagnóstico
definitivo, caracteriza-se como método que consome muito tempo e por isso
pouco prático como teste de rotina em animais assintomáticos. O sucesso do
diagnóstico ainda depende da escolha do material a ser cultivado (NELSON &
COUTO, 2001). Em função das dificuldades do isolamento do agente,
diferentes tipos de diagnósticos sorológicos foram desenvolvidos, variando em
sensibilidade, especificidade e complexidade (WANKE, 2004).
Alta correlação entre as provas sorológicas e o diagnóstico
bacteriológico da brucelose canina foi sugerida por vários autores (MOORE,
1969; UEDA et al., 1974a, CARMICHAEL & GREENE, 1993). Pela rapidez e
facilidade de realização, o sorodiagnóstico é freqüentemente o primeiro
utilizado no diagnóstico. Entretanto, estes testes são passíveis de erros de
interpretação, resultados falso-positivos ou falso-negativos, dependendo do
estágio da doença, antígeno ou método utilizado (GREENE, 1995; JOHNSON
& WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1993, WANKE, 2004).
Anticorpos não protetores, produzidos contra antígenos da parede
celular e do citoplasma da B. canis, podem ser detectados com 8 a 12
semanas pós-infecção. Os títulos de anticorpos permanecem altos enquanto
persiste a bacteremia. Quando a bacteremia torna-se intermitente, os títulos de
anticorpos declinam e podem tornar-se duvidosos ou negativos, enquanto o
microrganismo ainda persiste nos tecidos. Em alguns casos, há flutuações nos
títulos de anticorpos na presença ou na ausência de bacteremia (JOHNSON &
WALKER, 1992).
Resultados falso-positivos podem acontecer em decorrência da
reatividade cruzada com outros microrganismos, uma vez que alguns
32
determinantes antigênicos da parede celular da B. canis podem ser
semelhantes aos de Brucella ovis, Brucella abortus, espécies mucóides de
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus sp, e Bordetella bronchiseptica.
(JOHNSON & WALKER, 1992; GREENE, 1995; CARMICHAEL & SHIN, 1996).
Resultados falso-negativos podem ocorrer nas primeiras quatro
semanas pós-infecção uma vez os testes falham em detectar os anticorpos
produzidos nesta fase e em outras fases da doença, por flutuações nos títulos
de anticorpos (JOHNSON & WALKER, 1992; MEGID et al., 2000).
Os testes sorológicos que detectam anticorpos produzidos contra
antígenos de parede celular são a Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e
a prova lenta em tubo (SAL).
O diagnóstico sorológico da brucelose canina, realizado através da SAL,
apresenta certas limitações para sua utilização rotineira em clinicas, como a
necessidade de a mistura teste ser incubada a 50-52
ο
C durante 48 horas
(CARMICHAEL,1969).
George & Carmichael (1978) desenvolveram e padronizaram um teste
de aglutinação rápida (SAR) para detecção da brucelose canina, com culturas
mortas de Brucella ovis. O teste está baseado na existência de identidade
antigênica entre as duas espécies rugosas de Brucella (canis e ovis). A SAR,
além de rápida, é sensível e costuma ser utilizada como procedimento de
triagem, por detectar anticorpos precocemente, com aproximadamente seis
semanas após o início da bacteremia, até um período máximo de três meses
após a mesma (GEORGE & CARMICHAEL, 1978; JOHNSON & WALKER,
1992).
É considerada altamente acurada na identificação dos cães não
infectados, existindo alta correlação entre teste negativo e ausência de
infecção. Como outras bactérias podem ter determinantes antigênicos
semelhantes aos da B. canis, podem ocorrer resultados falso-positivos, por
reações cruzadas com anticorpos produzidos contra estes microrganismos
(CARMICHAEL, 1969; JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL &
GREENE, 1993; GREENE, 1995; CARMICHAEL & SHIN, 1996).
A SAR foi modificada, visando diminuir a ocorrência das reações falso-
positivas. Desta forma, os soros reagentes a SAR, passaram a ser tratados
33
pelo 2-Mercaptoetanol, que destrói as pontes dissulfídicas das imunoglobulinas
da classe IgM, desnaturando-as. A molécula de IgM produzida no início da
infecção, tem maior característica de aglutinação não-específica. Mediante sua
inativação os resultados da prova tornam-se aparentemente mais específicos
sem perda de sensibilidade (BADAKHSH et al., 1982). A SAR-2ME começa a
detectar anticorpos com aproximadamente 8 a 12 semanas após a infecção e
persiste positivo por três meses após o término da bacteremia (JOHNSON &
WALKER, 1992).
Carmichael & Joubert (1987) padronizaram um teste rápido de
aglutinação com uma cepa variante de B. canis menos mucóide (B. canis M -).
Como vantagens esse novo teste apresenta maior especificidade, uma vez que
as taxas de resultados falso-positivos diminuem em mais de 50% com o
antígeno antigo, para aproximadamente 10% com a utilização do novo.
Outro método sorológico bastante utilizado é a Imunodifusão em Gel de
Ágar (IDGA), que ao contrário da SAR não apresenta facilidade de realização,
pois necessita de preparação prévia dos reagentes, sendo a interpretação dos
resultados também mais complexa. A IDGA pode ser realizada com antígeno
de parede celular (LPS) ou citoplasmático de B. ovis, este último, segundo
Nicoletti & Chase (1987), é bastante útil para a confirmação dos resultados
sorológicos obtidos na SAR e na SAL, apresentando elevada concordância
com os exames bacteriológicos.
A IDGA utilizando antígenos de parede celular é mais específica do que
a SAR-2ME, mas ainda mantém a possibilidade de ocorrência de reações
cruzadas. Os títulos começam a ser detectados apenas entre 8 e 12 semanas
pós-infecção, persiste positiva por até quatro meses após o término da
bacteremia (JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & SHIN, 1996).
A IDGA empregando antígenos citoplasmáticos é o teste sorológico mais
específico para a infecção por B. canis, já que esse antígeno é comum apenas
entre as bactérias do gênero Brucella. Contudo, a sensibilidade é baixa do
início da 8
a
até a 12
a
semana de infecção. A reação precipitante decorrente da
presença de anticorpos contra B. canis tem sido demonstrada até 36 meses
após a bacteremia ter cessado. Este aspecto é uma das maiores vantagens do
teste de IDGA com a utilização do antígeno citoplasmático (ZOHA &
34
CARMICHAEL, 1982; CARMICHAEL, 1990; JOHNSON & WALKER, 1992;
BERTHELOT & GARIN-BASTUJI, 1993).
Flores-Castro e Carmichael (1978) avaliaram 411 amostras de soros
caninos, das quais 53% foram reagentes a SAR, 21% a SAL, 19% a SAL-2ME
e 25% a IDGA. Foi alta a porcentagem de animais soropositivos na SAR, que
não puderam ser confirmados com os resultados dos outros testes, próxima a
60%, assim sugeriu-se que esta técnica pode ser utilizada como método de
triagem, visto que os soros reagentes nas outras provas foram reagentes
também a SAR.
Adicionalmente, observaram que todos os soros que apresentavam
linhas de identidade parcial com os soros de referência na IDGA,
freqüentemente, resultaram reagentes também em outras provas sorológicas.
Assim, como um único soro apresentou diferentes resultados dependendo da
prova sorológica utilizada, concluiu-se que isso poderia ser bastante
contraditório para o diagnóstico da doença (FLORES-CASTRO E
CARMICHAEL, 1978).
A IDGA apresentou alta sensibilidade e baixa especificidade quando
comparativamente a hemocultura no diagnóstico da brucelose canina num
estudo conduzido em 96 cães e sugeriu-se que esta pode ser encarada como
teste de triagem da infecção por B. canis. Neste mesmo estudo a IDGA-2ME
apresentou baixa sensibilidade e especificidade em relação a hemocultura e
portanto conclui-se que os resultados positivos na IDGA-2ME podem ser
aceitos como confirmatórios, mas nos negativos persiste a suspeita de infecção
(KEID, 2001).
Testes de ELISA foram desenvolvidos tanto para detecção de anticorpos
de parede celular como citoplasmáticos contra B. canis, mas ainda não estão
disponíveis comercialmente. Á exemplo da IDGA com antígenos protéicos
citoplasmáticos, os resultados positivos com o ELISA são altamente
específicos para anticorpos de qualquer espécie do gênero Brucella. O teste
também é muito sensível (WANKE, 2004). Outros métodos como a fixação de
complemento e contra-imuno-eletroforese foram desenvolvidos mas sua
utilização está restrita a pesquisas (MYERS & VARELA-DIAZ, 1980;
AZEVEDO et al., 2004; WANKE, 2004).
35
Pelas características de especificidade moderada da sorologia e da
baixa sensibilidade do isolamento, nenhum deles é, sozinho, adequado para o
diagnóstico de todos os casos de brucelose (FLORES-CASTRO &
CARMICHAEL, 1978). Desta maneira é interessante associá-los e tentar
descobrir em que fase da doença o animal se encontra, uma vez que em cada
fase haverá maior probabilidade da bactéria ser isolada em determinada
amostra (JOHNSON & WALKER, 1992).
37
3. OBJETIVOS
Em vista da literatura consultada e das dificuldades enfrentadas no
diagnóstico da brucelose canina por B. canis, o presente trabalho tem os
seguintes objetivos:
3.1. GERAL
Avaliar os métodos laboratoriais de cultivo microbiológico e
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) com e sem o emprego de 2-
Mercaptoetanol (2-ME), rotineiramente, utilizados no diagnóstico da brucelose
canina por B.canis.
3.2. ESPECÍFICOS
3.2.1. Avaliar as técnicas de Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR)
com e sem o emprego de 2-Mercaptoetanol (2-ME) como testes de triagem no
diagnóstico da brucelose canina;
3.2.2. Avaliar sangue, urina, swab vaginal, prepucial e sêmen como
espécimes clínicos a serem processados para o diagnóstico bacteriológico da
brucelose canina; e
3.2.3. Avaliar a associação dos métodos sorológicos e de cultivo para o
diagnóstico da brucelose canina.
39
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
4.1.1. ANIMAIS
No estudo foram utilizados 236 cães, sendo 47 machos e 189 fêmeas,
de diferentes raças e idades (Anexo A), destes dois haviam sido atendidos no
Serviço de Enfermidades Infecciosas dos Animais Domésticos da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu, e os demais pertenciam
a cinco diferentes canis, localizados no estado de São Paulo.
4.1.2. ESPÉCIMES CLÍNICOS
Os espécimes clínicos processados para o diagnóstico da brucelose
canina foram soro, sangue, urina, swab vaginal, swab prepucial e sêmen. O
sangue foi colhido assepticamente por venopunção da veia jugular e
acondicionado em tubos a vácuo estéreis contendo citrato de sódio para
realização do cultivo bacteriológico (Figura 1 e 2). Outra alíquota do sangue foi
mantida em tubo estéril sem anticoagulante para obtenção de soro.
A urina foi obtida por cistocentese (Figura 3) e transportada ao
laboratório na própria seringa de coleta. O sêmen foi obtido através de
manipulação do pênis e acondicionado em frascos estéreis. O fluido vaginal ou
prepucial, destinado ao cultivo microbiológico, foi colhido em swab estéril
introduzido de maneira asséptica na vagina (Figura 4) ou prepúcio e
imediatamente acondicionado em tubos contendo caldo fosfato triptose
acrescido de antibióticos (Figura 5) para evitar a multiplicação de
contaminantes.
Todos os materiais foram transportados ao laboratório sob refrigeração a
4°C, onde foram imediatamente realizadas as provas de cultivo microbiológico.
Os soros foram mantidos congelados a -20°C até a realização das provas
sorológicas.
40
Figura 1
. Sangue colhido assepticamente
da veia jugular para realização do cultivo
microbiológico
Figura 2.
Sangue acondicionado
em frascos estéreis com citrato de
sódio para o transporte ao
laboratório
Figura 3
. Urina colhida assepticamente
por cistocentese para realização do cultivo
microbiológico
Figura 4
. Swab vaginal colhido de
maneira asséptica para realização do
cultivo microbiológico
Figura 5.
Swab acondicionado
em frasco estéril com caldo
fosfato triptose acrescido de
antibióticos para o transporte ao
laboratório
41
4.1.3. MEIOS DE CULTURA PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÂO
BACTERIANA
Para o isolamento da B. canis foram utilizados o Caldo Fosfato Triptose
(Tryptose Broth – DIFCO) e o Ágar Triptose (VETEC) ou Tryptose Agar Base
(DIFCO) como descrito por Keid (2001) e Moraes (2005). Paralelamente, os
materiais foram semeados em Agar MacConkey (DIFCO).
Caldos e meios seletivos foram empregados respectivamente para
transporte dos swabs vaginal e prepucial e no processamento dos swabs e
semens, uma vez que estes materiais podem estar contaminados por outros
agentes exógenos que dificultam o isolamento de B. canis. Estes meios
seletivos foram confeccionados agregando-se ao Caldo Fosfato Triptose ou ao
Ágar Triptose os antibióticos Bacitracina 7500UI/L (Inlab), Polimixina B
1800UI/L (Inlab) e Ciclohexamida 30mg/L (ALTON et al., 1976; KEID, 2001).
Para a identificação bioquímica das colônias isoladas foram utilizados
caldo nitrato (Nitrate Broth – DIFCO), SIM (Sulfide Indol Motility- BBL), TSI
(Triple Sugar Iron Agar – DIFCO), Citrato de Simmons (Simmons Citrate Agar –
DIFCO), caldo uréia (Urea Broth – DIFCO), gelatina, caldo nutriente (DIFCO) e
soluções de Tionina e Fucsina básica a 1%.
4.1.4. ANTÍGENOS
Na realização das provas Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR-2ME), foi
utilizado como antígeno uma suspensão de Brucella ovis inativada e corada
com Rosa de Bengala produzido pela Pitmam–Moore, EUA (Symbiotics
Corporation – San Diego – USA), comercializado com o nome D-Tec
CB
(Figura 6), adquirido através da Interteck Internacional Importação e
Exportação Ltda.
42
4.2. MÉTODOS
4.2.1. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
O isolamento bacteriano em sangue, urina, swab vaginal, swab prepucial
e sêmen, foi realizado segundo o protocolo adaptado de KEID (2001).
Cerca de 2mL sangue foi acrescido a tubos de cultura contendo 10mL
de Caldo Fosfato Triptose (Figura 7), permanecendo por 30 dias incubados a
37ºC em aerobiose. A cada cinco dias, por um período máximo de 30 dias,
procedeu-se o repique do caldo para placas contendo Ágar Triptose. Cerca de
1,5mL de urina foi acondicionada em tubos contendo 10 mL de caldo Fosfato
Triptose acrescido de antibióticos, permanecendo por cinco dias incubadas a
37ºC em aerobiose. A cada 24 horas, por cinco dias consecutivos, procedeu-se
o repique do caldo em placas contendo Ágar Triptose.
Os swabs vaginais e prepuciais, assim como os semens foram
semeados em placas contendo Ágar Triptose acrescido de antibiótico. As
placas de cultura foram incubadas a 37ºC em aerobiose até a observação do
crescimento de colônias ou por no máximo 7 dias.
Após o isolamento, a identificação bacteriana das colônias resultantes
foi realizada com base nas características morfo-tintoriais do microrganismo,
por meio da coloração de Gram, e bioquímicas considerando como critério
ausência da necessidade de CO
2
, crescimento em ágar MacConckey,
utilização de citrato, fermentação de açúcares, liquefação da gelatina, produção
de H
2
S, motilidade e indol; e positividade para redução de nitratos, hidrólise da
uréia, oxidase e catalase. Adicionalmente foi avaliada a multiplicação do agente
na presença de diferentes concentrações de tionina (1:25.000, 1:50.000 e
1:100.000) e fucsina básica (1:50.000 e 1:100.000) (CARMICHAEL &
BRUNER, 1968; ALTON et al, 1976; FLORES-CASTRO et al., 1977).
43
Figura 6.
Kit comercial D-Tec
®
CB (Canine Brucellosis Antibody Kit
Test), utilizado na prova de Soroaglutinação rápida e Soroaglutinação
rápida com 2-Mercaptoetanol. Composto por soro controle positivo
(frasco A), antígeno (frasco B), solução de 2-Mercaptoetanol (frasco
C), pipetas e bastões para homogeneização dos soros e cartões para
realização dos testes
Figura 7.
Tubos de cultura grandes (4) contendo 10mL de caldo fosfato
triptose e materiais processados para isolamento de B.canis e tubos
falcon (2) utilizados para o transporte de swabs vaginais, prepuciais e
sêmen
44
4.2.2. PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI – Brucella Canis
4.2.2.1. Prova de Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR)
A prova de Soroaglutinação Rápida em Cartão foi realizada segundo as
recomendações do fabricante do produto. Desta forma 30 µL do antígeno
foram adicionados a 30µL do soro e homogeneizados por 10 segundos
formando um circulo de aproximadamente dois cm de diâmetro, após o que
foram mantidos em repouso por dois minutos. Ao final do tempo da reação,
considerou-se positiva a presença de grumos e negativa a ausência. Os soros
com positivos nesta prova foram reavaliados na prova de SAR-2ME.
4.2.2.2. Prova de Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-
Mercaptoetanol (SAR-2ME)
O tratamento do soro consistiu na adição de volumes iguais da solução
de 2-Mercaptoetanol (2ME) ao soro que apresentou aglutinação. A cada 30 µL
do soro adicionou-se 30 µL de uma solução a 0,2M de 2ME, homogeneizada e
mantida em repouso por 15 minutos, em temperatura ambiente, após o que foi
submetida ao mesmo procedimento realizado para SAR, sendo considerado
para positivo e negativo, respectivamente a presença e ausência de grumos.
45
4.3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
4. 3.1. LOCALIZAÇÃO E PERÍODO DA COLETA
Os espécimes clínicos foram colhidos de Julho de 2004 a Março de
2006, de cães adultos, de diversas raças, procedentes de cinco canis, três
comerciais e dois não comerciais, sendo um deles do Hospital Veterinário da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e de animais atendidos no
Serviço de Enfermidades Infecciosas dos Animais Domésticos – FMVZ –
UNESP – Botucatu.
Em dois dos canis comerciais, identificados respectivamente por A e B,
vários animais apresentavam alterações reprodutivas, relatadas em torno de
seis meses antes do início das coletas, sendo por isso considerados suspeitos
da infecção por B. canis. Nestes dois canis, aliado ao fator aglomeração dos
animais, constatou-se o hábito comum de venda de cobertura, sem medidas
diagnósticas prévias.
No terceiro canil comercial, identificado por C, e nos outros dois canis
não comerciais, identificados respectivamente por D e E, os animais não
apresentavam qualquer sintomatologia da enfermidade e por isso foram
considerados canis aparentemente “livres” da infecção.
No canil A, selecionado para nossa pesquisa pelo histórico de um surto
de abortamentos, foram avaliados 70 animais (8 machos e 62 fêmeas). O surto
teve iniciou após a ocorrência de abortamento em uma cadela, que aconteceu
num espaço comum, onde todos os animais estavam mantidos,
temporariamente, uma vez que haviam sido removidas as grades de separação
das acomodações, que separavam os animais por raça e sexo. Após o contato
com os materiais provenientes do aborto da cadela, muitas outras fêmeas
abortaram também neste mesmo espaço coletivo.
O canil B, onde foram estudados 114 animais (32 machos e 82 fêmeas),
foi incluído no estudo também por histórico de abortamento nas fêmeas. O
canil criava diversas raças que eram mantidas em espaços físicos diferentes,
mas o proprietário tinha por hábito soltar, em horários diversos do dia, os
46
animais de todas as raças, sendo que todos eles compartilhavam algumas
dependências comuns.
O canil C, onde foram estudados 14 animais (2 machos e 12 fêmeas), foi
incluído como “livre” de infecção na análise procedida, uma vez que os cães
possuíam acomodações individuais, a introdução de novos animais só ocorria
após a realização de testes sorológicos negativos para brucelose e não era
procedimento o empréstimo ou recebimento de animais para acasalamento.
O canil D, onde foram avaliados 14 animais (3 machos e 11 fêmeas),
pertence ao Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia – UNESP, Campus Botucatu. Composto por pequenas salas com
solários próprios e separados entre si, local onde os animais eram mantidos em
pares ou trios. Identificou-se a castração da maioria dos animais considerado o
intuito de experimentação e não de reprodução do citado canil.
No canil E, onde foram avaliados 22 animais (1 macho e 21 fêmeas), os
mesmos eram mantidos, dentro de um espaço comum e, como não havia
finalidade comercial, a maioria dos animais também era castrada.
Foram avaliados 2 animais, uma fêmea e um macho, ambos atendidos
no Serviço de Enfermidades Infecciosas dos Animais, sendo incluídos no
estudo uma vez que a fêmea apresentou histórico sugestivo da enfermidade,
parto de ninhada aparentemente normal seguido de óbito e o macho era
contactante.
4.3.2. COLHEITA DOS ESPÉCIMES CLÍNICOS
Antes da colheita os animais foram submetidos a anamnese e exame
físico, investigando-se, nas fêmeas, o período estral, a ocorrência de
abortamento, secreção vaginal, falhas na concepção, linfadenopatia,
discoespondilite e uveíte. Nos machos foram investigados principalmente a
presença de dermatite escrotal, alterações de volume ou consistência no
testículo e epidídimo, infertilidade, linfadenopatia, discoespondilite e uveíte.
Em seguida foi colhido sangue, urina, swab vaginal das fêmeas e
preferencialmente sêmen dos machos e, na impossibilidade, por qualquer
motivo, da colheita de sêmen, este era substituído pelo swab prepucial.
47
Baseado na sintomatologia, os animais foram divididos em dois grupos,
um com 53 animais (49 fêmeas e 4 machos), composto pelos que
apresentaram algum dos sintomas descritos anteriormente e o outro com 183
animais (140 fêmeas e 43 machos), composto por cães que não apresentavam
nenhuma sintomatologia.
4.3.3. PROCESSAMENTO DOS ESPÉCIMES CLÍNICOS
O cultivo microbiológico dos espécimes clínicos para isolamento
bacteriano foi processado no Laboratório de Imunodiagnóstico Aplicado nas
Enfermidades Infecciosas dos Animais, FMVZ-UNESP, Campus Botucatu, SP
e no Laboratório de Zoonoses Bacterianas, VPS-USP, São Paulo.
A SAR foi realizada em todos os soros obtidos, enquanto a SAR-2ME foi
conduzida apenas nos soros que resultaram positivos na SAR. Alguns animais
negativos a SAR com resultado positivo no cultivo microbiológico foram
reavaliados após 30 dias, tanto nas provas sorológicas como na bacteriologia.
A SAR e SAR-2ME foram realizadas no Laboratório de
Imunodiagnóstico Aplicado nas Enfermidades Infecciosas dos Animais, FMVZ-
UNESP, Campus Botucatu, SP.
48
4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
As proporções de resultados positivos obtidos nos diferentes materiais e
protocolos utilizados para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis foram
comparados pelo teste de Mc Nemar com o programa Sigma Stat (SYSTAT,
2002). Os métodos propostos foram avaliados dois a dois em amostras
pareadas através do cálculo do coeficiente de concordância Kappa (K) com o
programa Win Episcope 2.0 (BLAS, et al., 2006).
As proporções de resultados positivos em amostras independentes
foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado com o programa Sigma Stat
adotando-se o nível de significância de 5% de probabilidade (ZAR, 1996).
A sensibilidade relativa das técnicas laboratoriais empregadas foi
calculada tendo como padrão os resultados obtidos no cultivo microbiológico. O
coeficiente de concordância Kappa também foi utilizado para comparar a
concordâncias das técnicas com o padrão adotado.
Considerando que o estudo foi realizado em canis com porcentagem de
positividade variável, calcularam-se os valores preditivos positivos (VPP) e
negativos (VPN) nos canis infectados estudados também tendo como padrão
os resultados do cultivo microbiológico de todos os materiais colhidos,
considerado como cultivo microbiológico geral.
Visto que a combinação de dois ou mais testes melhora a eficiência do
diagnóstico (SOARES & SIQUEIRA, 2002) foi avaliada a utilização paralela da
hemocultura às provas de soroaglutinação rápida no diagnóstico da brucelose
canina. O cálculo da sensibilidade e especificidade destes testes associados foi
efetuado com o programa Win Episcope 2.0 (BLAS, et al., 2006).
50
5. RESULTADOS
Foram estudados 236 cães, 189 (80%) fêmeas e 47 (20%) machos,
quanto à infecção por B. canis. Todos os animais pertencentes aos três canis
considerados “livres” da infecção resultaram negativos tanto nos exames
sorológicos como no cultivo microbiológico geral. Resultaram positivos no
isolamento bacteriano 71 (30,1%) animais, dos quais 58 (30,7%) fêmeas e 13
(27,6%) machos, pertencentes aos canis considerados infectados.
Os isolados identificados como B. canis foram observados no Agar
Triptose, após 72 horas de incubação a 37ºC, em aerobiose, como colônias
pequenas e delicadas, de bordos arredondados e bem definidos, não
hemolíticas, translúcidas e brilhantes (Figura 8). Em Agar MacConckey não se
observou o crescimento de colônias similares.
A bacterioscopia revelou cocobacilos, delicados, Gram negativos, que
apresentaram como características bioquímicas (Figuras 9 a 11) ausência de
utilização de citrato, fermentação de açúcares, liquefação da gelatina, produção
de H
2
S, motilidade e indol; e positividade na redução de nitratos, hidrólise da
uréia em 15 minutos, oxidase e catalase. Foi observado crescimento na
presença de tionina nas concentrações 1:25.000, 1:50.000 e 1:100.000 e de
fucsina básica na concentração 1:100.000, sendo que apenas 7/97 (7,2%)
isolados apresentaram crescimento em concentrações 1:50.000 de fucsina
básica, concentração esta que, geralmente, é inibitória para as cepas de B.
canis semelhantes à RM 666. Dos 97 isolados, 18 (18,5%) apresentaram
variação da capacidade de reduzir nitratos.
51
Figura 8.
Ágar triptose mostrando o
isolamento de Brucella canis de
amostra de urina de fêmea
Fi
gura 9
.
Ágar TSI e Citrato
Simmons demonstrando, res-
pectivamente, ausência de
fermentação de açúcares e
utilização do citrato
Figura 10
.
Ágar SIM e Gelatina
demonstrando, respectivamente,
ausência de motilidade, produção de
H
2
S e indol e liquefação da gelatina
negativa.
Figura 11
.
Caldo Uréia e Nitrato
inoculados com B. canis frente a
caldos padrões não inoculados
demonstrando, respectivamente,
redução positivas da uréia e
nitrato
52
MACHOS
FÊMEAS
POSITIVOS
POSITIVAS
TOTAL
2 45 47
2 2 4
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 7 7
0 4 4
0 0 0
2 0 2
0 0 0
1 0 1
0 0 0
0 0 0
2 0 2
4 0 4
13
58
71
TOTAL
MATERIAL
URINA E SÊMEN
SANGUE, URINA E SWAB VAGINAL
SANGUE, URINA E SWAB PREPUCIAL
SANGUE, URINA E SÊMEN
SANGUE E SWAB PREPUCIAL
SANGUE E SÊMEN
URINA E SWAB VAGINAL
URINA E SWAB PREPUCIAL
SÊMEN
SANGUE E URINA
SANGUE E SWAB VAGINAL
SANGUE
URINA
SWAB VAGINAL
SWAB PREPUCIAL
Dos 71 animais positivos no cultivo microbiológico foram obtidos 97
isolamentos, uma vez que alguns animais apresentaram isolamento da bactéria
em mais de um material analisado, como demonstra a tabela 1.
Tabela 1– Distribuição dos isolamentos de Brucella canis em 71 cães
positivos no cultivo microbiológico, segundo o sexo e os diferentes
materiais cultivados para o isolamento. Botucatu, 2006.
53
Dentre os materiais avaliados no cultivo microbiológico, o sangue foi o
que demonstrou maior facilidade para isolamento bacteriano, uma vez que a
bactéria era obtida, geralmente, a partir do segundo repique em placa e
dificilmente este material encontrava-se contaminado.
A urina, embora tenha demonstrado facilidade para isolamento
bacteriano, obtido geralmente, a partir do segundo ou terceiro repique em
placa, apresentou em algumas situações, agentes contaminantes que
dificultaram a avaliação acurada, observados principalmente em fêmeas, e
raramente em machos.
Principalmente a cultura dos swabs vaginais e prepuciais e,
eventualmente, dos semens, foram bastante laboriosos, uma vez que de
maneira freqüente apresentaram o isolamento de contaminantes, obrigando à
avaliação diária, em busca de colônias suspeitas e visando o repique das
mesmas, antes de apresentarem seu crescimento suplantado pelos
contaminantes.
Dos animais estudados 57/236 (24,2%) resultaram positivos a SAR, 49
(25,9%) fêmeas e oito (17%) machos. Na SAR–2ME resultaram positivos
24/236 (10,2%), 21 (11,1%) fêmeas e três (6,4%) machos. Foram positivos na
hemocultura 66/236 (28%), 56 (29,6%) fêmeas e 10 (21,3%) machos; na
urocultura 18/196 (9,2%), nove (5,7%) fêmeas e nove (23,7%) machos; na
cultura de swab vaginal 4/189 (2,1%) fêmeas, na cultura de swab prepucial
3/22 (13,6%) machos e no cultivo de sêmen 6/21 (28,6%) machos, como
demonstrado na tabela 2.
A proporção de machos e fêmeas positivas, nos diferentes materiais,
está apresentada na tabela 2 não tendo sido observada diferença significativa
nas provas de SAR, SAR–2ME e cultura de sangue quando comparados
machos e fêmeas.
No entanto, houve diferença significativa na proporção de resultados
positivos quando comparada à cultura de urina de machos e fêmeas, assim
como a proporção de machos positivos no cultivo de sêmen ou swab prepucial,
comparativamente ao swab vaginal em fêmeas positivas.
54
TÉCNICA
SAR
SAR-2ME
SANGUE
URINA
SWAB
VAGINAL, PREPUCIAL
OU SÊMEN
SEXO
MACHOS
8/47 a 3/47 a 10/47 a 9/38 a 9/43 a
17,0% 6,4% 21,3% 23,7% 20,9%
FÊMEAS
49/189 a 21/189 a 56/189 a 9/158 b 4/189 b
25,9% 11,1% 29,6% 5,7% 2,1%
TOTAL
57/236.
24/236.
66/236.
18/196.
13/232.
24,2%
10,2%
28,0%
9,2%
5,6%
(p=0,277) (p=0,490) (p=0,337) (p=0,002) (p<0,001)
CULTIVO MICRO BIOLÓGICOSOROLOGIA
Tabela 2– Proporção e porcentagem de resultados positivos segundo o
sexo e a técnica diagnóstica aplicada aos cães examinados para o
diagnóstico da brucelose canina. Botucatu, 2006.
Dos 236 cães analisados foram encontrados 53 (22,5%) sintomáticos,
sendo 49 (92,5%) fêmeas e 4 (7,5%) machos. Dentre os sintomáticos,
resultaram positivos na SAR 28 (52,8%), dos quais foram confirmados na
SAR–2ME 11 (20,8%) e resultaram positivos ao cultivo microbiológico 39
(73,5%) animais.
Nas fêmeas os principais sintomas observados foram abortamentos no
terço final da gestação em 36 (73,5%) cadelas, falhas reprodutivas em 7
(14,3%), partos de ninhadas fracas cujos filhotes morreram em poucos dias em
4 (8,2%), linfadenopatia em 4 (8,2%) e nascimento de natimortos em outras 2
(4, 1%) cadelas.
Nos machos, durante o exame clínico, observou-se em um dos animais
aumento dos testículos; outro cão apresentou aumento e alteração de
consistência do testículo; aumento do testículo e epidídimo foi observado em
um terceiro macho e um quarto animal apresentou calcificação no epidídimo.
55
TÉCNICA
SAR
SAR-2ME
SANGUE
URINA
SWAB
SWAB
SÊMEN
VAGINAL
PREPUCIAL
SINTOMAS
PRESENTE (+)
28/53 a 11/53 a 37/53 a 10/46 a 2/49 a 0/1 a 1/3 a
52,8% 20,8% 69,8% 21,7% 4,1% 0,0% 33,3%
AUSENTE (-)
29/183 b 13/183 b 29/183 b 8/150 b 2/140 a 3/21 a 5/18 a
15,8% 7,1% 15,8% 5,3% 1,4% 14,1% 27,7%
(p<0,001) (p=0,008) (p<0,001) (p=0,002) (p=0,593) (p=0,278) (p=0,622)
CULTIVO MICROBIOLÓGICOSOROLOGIA
Os demais 183 (77,5%) animais eram assintomáticos. Dentre eles 29
(15,8%) cães foram positivos na SAR, dos quais 13 (7,1%) foram confirmados
na SAR-2ME. Dos assintomáticos ainda resultaram positivos ao isolamento 32
(17,5%) animais.
Não se observou diferença significativa de resultados positivos no cultivo
microbiológico de swab vaginal, prepucial e sêmen, nos animais que
apresentavam ou não sintomas. Entretanto, foi observada significativa
diferença nas proporções de resultados positivos nas provas de SAR, SAR–
2ME e cultivo microbiológico de sangue e urina entre os grupos estudados. Os
valores observados estão demonstrados na tabela 3.
Tabela 3– Proporção e porcentagem de resultados positivos segundo a
condição clínica e a técnica diagnóstica aplicada aos cães examinados
para o diagnóstico da brucelose canina. Botucatu, 2006.
56
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 24 33
57 (24,2%)
NEGATIVO 0 179
179 (75,8%)
TOTAL
24 (10,2%)
212 (89,8%)
236 (100%)
p<0,001
Kappa 0,525 (concordância: moderada)
SAR-2ME
A comparação entre as provas de SAR e SAR–2ME é apresentada na
tabela 4. Resultaram positivos na SAR 57 (24,2%) animais, dos quais 24
(10,2%) foram confirmados na SAR–2ME, demonstrando ser estatisticamente
significante. Outros 33 (57,9%) animais positivos à SAR e resultaram negativos
na SAR-2ME. Foram negativos em ambas as provas 179 (75,8%) animais. A
concordância encontrada entre as provas foi moderada.
Tabela 4– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e Soroaglutinação Rápida em
Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis. Botucatu, 2006.
57
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 47 10
57 (24,2%)
NEGATIVO 24 155
179 (75,8%)
TOTAL
71 (30%)
165(70%)
236 (100%)
p<0,026
Kappa 0,637 (concordância: moderada)
CULTIVO MICROBIÓLOGICO
Sensibilidade Relativa 66,2%
Especificidade Relativa 94,1%
A comparação entre as provas de SAR e cultivo microbiológico geral,
dos vários materiais processados, é apresentada na tabela 5. Resultaram
positivos na SAR 57 (24,2%) animais, destes 47 (82,5%) foram positivos e 10
(17,5%) negativos no cultivo. Dos 179 (75,8%) animais que resultaram
negativos na SAR, 24 (13,4%) foram positivos na cultura. Foram negativos em
ambos os testes 155 (65,7%) animais. Observou-se diferença significativa na
proporção de positivos na SAR e no cultivo, sendo observada moderada
concordância entre as provas. A sensibilidade e a especificidade relativa da
SAR foram calculadas respectivamente em 66,2% e 94,1%.
Tabela 5– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico
geral para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis. Botucatu, 2006.
58
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 29 9
38 (54,3%)
NEGATIVO 4 28
32 (45,7%)
TOTAL
33 (47,1%)
37(52,9%)
70 (100%)
Kappa 0,630 (concordância: moderada)
Valor Preditivo Negativo 87,5%
Sensibilidade Relativa 87,9%
Especificidade Relativa 75,7%
Prevalência Verdadeira 47,1%
Valor Preditivo Positivo 76,3%
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
A comparação entre as provas de SAR e cultivo microbiológico geral,
dos vários materiais processados no Canil A, está apresentada na tabela 6.
Resultaram positivos na SAR 38 (54,3%) animais, dos quais 29 (76,3%) foram
positivos e 9 (23,7%) negativos na cultura. Dos 32 (45,7%) animais que
resultaram negativos na SAR, 4 (12,5%) foram positivos na cultura. Foram
negativos em ambos os testes 28 (40%) animais. A concordância entre as
provas foi moderada. A sensibilidade e a especificidade relativa da SAR foram
calculadas, respectivamente, em 87,9% e 75,7%. O valor preditivo positivo
(VPP) da SAR resultou em 76,3% e valor preditivo negativo (VPN) em 87,5%.
Tabela 6– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico
geral no Canil A para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis.
Botucatu, 2006.
59
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 17 1
18 (15,8%)
NEGATIVO 20 76
96 (84,2%)
TOTAL
37 (32,5%)
77(67,5%)
114 (100%)
Kappa 0,515 (concordância: moderada)
Prevalência Verdadeira 32,5%
Valor Preditivo Positivo 94,4%
Valor Preditivo Negativo 79,2%
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 45,9%
Especificidade Relativa 98,7%
A comparação entre as provas de SAR e cultivo microbiológico geral,
dos vários materiais processados no Canil B, está demonstrada na tabela 7.
Resultaram positivos na SAR 18 (15,8%) animais, dos quais 17 (94,4%) foram
positivos e 1 (5,6%) negativo na cultura. Dos 96 (84,2%) animais que
resultaram negativos na SAR, 20 (20,8%) foram positivos na cultura.
Resultaram negativos em ambos os testes 76 (79,2%) animais. A concordância
entre as provas foi moderada. A sensibilidade e a especificidade relativa da
SAR foram calculadas respectivamente em 45,9 e 98,7%. O VPP e o VPN
foram calculados, respectivamente, em 94,4% e 79,2%.
Tabela 7– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico
geral no Canil B para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis.
Botucatu, 2006.
60
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 47 10
57 (24,2%)
NEGATIVO 19 160
179 (75,8%)
TOTAL
66 (28%)
170 (72%)
236 (100%)
p=0,137
Kappa 0,682 (concordância: moderada)
CULTIVO SANGUE
Os resultados obtidos nas provas de SAR e cultivo microbiológico de
sangue são apresentados na tabela 8. Resultaram positivos na SAR 57
(24,2%) animais, dos quais 47 (82,5%) foram positivos e 10 (17,5%) negativos
na hemocultura. Dos 179 (75,8%) negativos na SAR, 19 (10,6%) foram
positivos na hemocultura e 160 (67,8%) animais foram negativos em ambas as
provas. A concordância entre as provas foi moderada, não sendo observada
diferença significativa na proporção de positivos na SAR e hemocultura.
Tabela 8– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico de
sangue para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis. Botucatu,
2006.
61
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 5 36
41 (25,9%)
NEGATIVO 4 113
117 (74,1%)
TOTAL
9 (5,7%)
149 (94,3%)
158 (100%)
p<0,001
Kappa 0,118 (concordância: fraca)
CULTIVO URINA
A comparação entre os resultados das provas de SAR e cultivo
microbiológico de urina em fêmeas está apresentada na tabela 9. Resultaram
positivas na SAR 41 (25,9%) fêmeas, das quais 5 (12,2%) foram positivas e 36
(87,8%) negativas no isolamento em urina. Das 117 (74,1%) fêmeas negativas
na SAR, 4 (3,4%) foram positivas no isolamento e 113 (71,5%) fêmeas foram
negativas em ambos os testes. A concordância entre as provas foi fraca. A
proporção de fêmeas positivas na SAR diferiu significativamente ao cultivo de
urina.
Tabela 9– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico de
urina para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cadelas.
Botucatu, 2006.
62
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 6 2
8 (21%)
NEGATIVO 3 27
30 (79%)
TOTAL
9 (23,7%)
29 (76,3%)
38 (100%)
p=1,00
Kappa 0,622 (concordância: moderada)
CULTIVO URINA
Na tabela 10 estão apresentados os resultados comparativos obtidos
nas provas de SAR e cultivo microbiológico de urina em machos. Resultaram
positivos na SAR 8 (21%) cães, dos quais 6 (75%) foram positivos e 2 (25%)
negativos na cultura de urina. Dos 30 (79%) negativos na SAR, 3 (10%)
apresentaram isolamento em urina e 27 (71,1%) animais foram negativos em
ambas as provas. A concordância entre as provas foi moderada, não sendo
observada diferença significativa na proporção de machos positivos na SAR
frente ao cultivo de urina.
Tabela 10– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico de
urina para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães
machos. Botucatu, 2006.
63
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 4 45
49 (25,9%)
NEGATIVO 0 140
140 (74,1%)
TOTAL
4 (2,1%)
185 (97,9%)
189 (100%)
p<0,001
Kappa 0,116 (concordância: fraca)
CULTIVO SWAB VAGINAL
São apresentados na tabela 11 os resultados das provas de SAR e
cultivo microbiológico de swab vaginal em fêmeas. Resultaram positivas na
SAR 49 (25,9%) fêmeas, das quais 4 (8,2%) foram positivas e 45 (91,8%)
negativas na cultura de swab vaginal. Foram negativas em ambas as provas
140 (74,1%) cadelas. Das fêmeas em estro não se obteve isolamento em swab
vaginal. A concordância entre as provas foi fraca, sendo observada diferença
significativa na proporção de fêmeas positivas na SAR comparativamente ao
cultivo de swab vaginal.
Tabela 11– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico de
swab vaginal para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em
cadelas. Botucatu, 2006.
64
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 2 0
2 (9,1%)
NEGATIVO 1 19
20 (90,9%)
TOTAL
3 (13,6%)
19 (86,4%)
22 (100%)
p=1,00
Kappa 0,776 (concordância: boa)
CULTIVO SWAB PREPUCIAL
A comparação entre as provas de SAR e cultivo microbiológico de swab
prepucial em machos é apresentada na tabela 12. Os 2 cães positivos na SAR
foram positivos também na cultura de swab prepucial. Dos 20 (90,9%) que
resultaram negativos na SAR, 1 (5%) foi positivo na cultura de swab prepucial e
19 (86,4%) cães foram negativos em ambas as provas. A concordância entre
as provas foi boa. A proporção de machos positivos na SAR e no cultivo
microbiológico de swab prepucial não diferiu significativamente.
Tabela 12– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico de
swab prepucial para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em
cães machos. Botucatu, 2006.
65
SAR
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 4 2
6 (28,6%)
NEGATIVO 2 13
15 (71,4%)
TOTAL
6 (28,6%)
15 (71,4%)
21 (100%)
p=0,617
Kappa 0,533 (concordância: moderada)
CULTIVO SÊMEN
Os resultados comparativos observados nas provas de SAR e cultivo
microbiológico de sêmen em machos estão apresentados na tabela 13.
Resultaram positivos na SAR 6 (28,6%) machos, dos quais 4 (66,7%) foram
positivos e 2 (33,3%) negativos na cultura de sêmen. Dos 15 (71,4%) negativos
na SAR, 2 (13,3%) foram positivos na cultura de sêmen e 13 (61,9%) machos
foram negativos nas duas provas. A concordância entre as provas foi
moderada, não havendo diferença significativa na proporção de machos
positivos na SAR e no cultivo microbiológico de sêmen.
Tabela 13– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão (SAR) e de cultivo microbiológico de
sêmen para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães
machos. Botucatu, 2006.
66
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 21 3
24 (10,2%)
NEGATIVO 50 162
212 (89,8%)
TOTAL
71 (30%)
165(70%)
236 (100%)
p<0,001
Kappa 0,342 (concordância: fraca)
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 29,5%
Especificidade Relativa 98,2%
A comparação entre os resultados das provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico geral dos vários materiais processados, está apresentada na
tabela 14. Resultaram positivos na SAR–2ME 24 (10,2%) animais, dos quais 21
(87,5%) foram positivos e 3 (12,5%) negativos no cultivo microbiológico. Dos
212 (89,8%) negativos na SAR–2ME, 50 (23,6%) foram positivos ao isolamento
e 162 (68,6%) animais foram negativos em ambas as provas. A concordância
entre as provas foi fraca, sendo observada diferença significativa na proporção
de positivos na SAR–2ME e no cultivo. A sensibilidade e a especificidade
relativa da SAR–2ME foram calculadas respectivamente em 29,5% e 98,2%.
Tabela 14– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico geral para o diagnóstico da brucelose canina
por B. canis. Botucatu, 2006.
67
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 21 3
24 (10,2%)
NEGATIVO 45 167
212 (89,8%)
TOTAL
66 (28%)
170 (72%)
236 (100%)
p<0,001
Kappa 0, 373 (concordância: fraca)
CULTIVO SANGUE
A comparação entre os resultados das provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico de sangue é apresentada na tabela 15. Resultaram positivos na
SAR–2ME 24 (10,2%) animais, dos quais 21 (87,5%) foram positivos e 3
(12,5%) negativos na hemocultura. Dos 212 (89,8%) animais que resultaram
negativos na SAR–2ME, 45 (21,2%) foram positivos na hemocultura e 167
(70,8%) animais foram negativos em ambas as provas. A concordância entre
as provas foi fraca, sendo observada diferença significativa na proporção de
positivos na SAR–2ME e no cultivo de sangue.
Tabela 15– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico de sangue para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis. Botucatu, 2006.
68
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 4 13
17 (10,8%)
NEGATIVO 5 136
141 (89,2%)
TOTAL
9 (5,7%)
149 (94,3%)
158 (100%)
p=0,099
Kappa 0,252 (concordância: fraca)
CULTIVO URINA
Os resultados comparativos das provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico de urina em fêmeas estão apresentados na tabela 16.
Resultaram positivas na SAR–2ME 17 (10,8%) fêmeas, das quais 4 (23,5%)
foram positivas e 13 (76,5%) negativas na cultura de urina. Das 141 (89,2%)
fêmeas negativas na SAR–2ME, 5 (3,5%) foram positivas na urocultura e 136
(86,1%) foram negativas em ambas as provas. A concordância entre as provas
foi fraca, não sendo observada diferença significativa na proporção de positivos
na SAR–2ME e no cultivo de urina.
Tabela 16– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico de urina para o diagnóstico da brucelose canina
por B. canis em cadelas. Botucatu, 2006.
69
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 2 1
3 (7,9%)
NEGATIVO 7 28
35 (92,1%)
TOTAL
9 (23,7%)
29 (76,3%)
38 (100%)
p=0,077
Kappa 0,244 (concordância: fraca)
CULTIVO URINA
Na tabela 17 estão apresentados os resultados comparativos entre os
resultados das provas de SAR–2ME e cultivo microbiológico de urina em
machos. Resultaram positivos na SAR–2ME 3 (7,9%) machos, dos quais 2
(66,7%) foram positivos e 1 (33,3%) negativo na urocultura. Dos 35 (92, 1%)
machos negativos na SAR–2ME, 7 (20%) resultaram positivos na urocultura e
28 (73,7%) negativos em ambas as técnicas. A concordância entre as provas
foi fraca, não sendo observada diferença significativa na proporção de machos
positivos na SAR–2ME e no cultivo de urina.
Tabela 17– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico de urina para o diagnóstico da brucelose canina
por B. canis em cães machos. Botucatu, 2006.
70
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 2 19
21 (11,1% )
NEGATIVO 2 166
168 (88,9%)
TOTAL
4 (2,1%)
185 (97,9%)
189 (100%)
p<0,001
Kappa 0,129 (concordância: fraca)
CULTIVO SWAB VAGINAL
Os resultados comparativos entre as provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico de swab vaginal em fêmeas estão apresentados na tabela 18.
Resultaram positivas na SAR–2ME 21 (11,1%) fêmeas, das quais 2 (9,5%)
foram positivas e 19 (90,5%) negativas na cultura de swab vaginal. Das 168
(88,9%) fêmeas negativas na SAR–2ME, 2 (1,2%) foram positivas na cultura de
swab vaginal e 166 (87,9%) animais foram negativas em ambas as técnicas. A
concordância entre as provas foi fraca. A proporção de fêmeas positivas na
SAR–2ME e no cultivo de swab vaginal diferiu significativamente.
Tabela 18– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico de swab vaginal para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cadelas. Botucatu, 2006.
71
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 0 0
0 (0%)
NEGATIVO 3 19
22 (100%)
TOTAL
3 (13,6%)
19 (86,4%)
22 (100%)
p=0,248
Kappa 0,00 (não há concordância)
CULTIVO SWAB PREPUCIAL
A comparação dos resultados obtidos nas provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico de swab prepucial em machos está apresentada na tabela 19.
Nenhum dos 22 machos avaliados resultou positivo na SAR–2ME; 3 (13,6%)
resultaram positivos na cultura de swab prepucial e 19 (86,4%) resultaram
negativos em ambas as provas. Não houve concordância entre as provas. A
proporção de machos positivos na SAR–2ME e no cultivo microbiológico de
swab prepucial não diferiu significativamente.
Tabela 19– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico de swab prepucial para o diagnóstico da
brucelose canina por B. canis em cães machos. Botucatu, 2006.
72
SAR-2ME
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 2 0
2 (9,5%)
NEGATIVO 4 15
19 (90,5%)
TOTAL
6 (28,6%)
15 (71,4%)
21 (100%)
p=0,134
Kappa 0,417 (concordância: moderada)
CULTIVO SÊMEN
Os resultados comparativos obtidos nas provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico de sêmen em machos estão apresentados na tabela 20. De 21
cães avaliados, 2 (9,5%) resultaram cães que resultaram positivos na SAR–
2ME e também na cultura de sêmen. Dos 19 (90,5%) negativos na SAR–2ME,
4 (21,1%) foram positivos na cultura de swab vaginal e 15 (71,4%) animais
foram negativos em ambas as técnicas. A concordância entre as provas foi
moderada. A proporção de machos positivos na SAR–2ME e no cultivo
microbiológico de sêmen não diferiu significativamente.
Tabela 20– Resultados comparativos obtidos nas provas de
Soroaglutinação Rápida em Cartão com 2-Mercaptoetanol (SAR–2ME) e
de cultivo microbiológico de sêmen para o diagnóstico da brucelose
canina por B. canis em cães machos. Botucatu, 2006.
73
CULTIVO
SANGUE
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 66 0
66 (28%)
NEGATIVO 5 165
170 (72%)
TOTAL
71 (30%)
165 (70%)
236 (100%)
p=0,074
Kappa 0,945 (concordância: boa)
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 92,9%
Os resultados comparativos da cultura de sangue frente aos da cultura
geral dos vários materiais processados é apresentada tabela 21. Todos os 66
(28%) animais positivos no cultivo geral resultaram positivos também na
hemocultura. Dos 170 (72%) negativos na hemocultura, 5 (2,9%) resultaram
positivos no cultivo geral de outros materiais processados e 165 (69,9%)
animais foram negativos nos dois testes. A concordância entre as provas foi
boa. A proporção de positivos na cultura de sangue e na cultura geral não
diferiu significativamente. A sensibilidade relativa da hemocultura foi calculada
em 92,9%.
Tabela 21– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sangue e de cultivo microbiológico global para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis. Botucatu, 2006.
74
CULTIVO
SANGUE
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 7 39
46 (29,1%)
NEGATIVO 2 110
112 (70,9%)
TOTAL
9 (5,7%)
149 (94,3%)
158 (100%)
p<0,001
Kappa 0,176 (concordância: fraca)
CULTIVO URINA
A comparação entre os resultados do cultivo de sangue e de urina em
fêmeas está apresentada na tabela 22. Resultaram positivas na hemocultura
46 (29,1%) fêmeas, das quais 7 (15,2%) foram positivas e 39 (84,8%)
negativas na urocultura. Das 112 (70,9%) negativas na hemocultura, 2 (1,8%)
foram positivas na cultura de urina e 110 (69,6%) cadelas foram negativas em
ambos os testes. A concordância entre as provas foi fraca. A proporção de
fêmeas positivas na cultura de sangue e de urina diferiu significativamente.
Tabela 22 – Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sangue e de cultivo microbiológico de urina para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cadelas. Botucatu, 2006.
75
CULTIVO
SANGUE
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 6 3
9 (23,7%)
NEGATIVO 3 26
29 (76,3%)
TOTAL
9 (23,7%)
29 (76,3%)
38 (100%)
p<0,683
Kappa 0,563 (concordância: moderada)
CULTIVO URINA
Os resultados comparativos obtidos na cultura de sangue e de urina em
machos estão apresentados na tabela 23. Resultaram positivos na hemocultura
9 (23,7%) machos, dos quais 6 (66,7%) foram positivos e 3 (33,3%) negativos
na cultura de urina. Dos 29 (76,3%) machos negativos na hemocultura, 3
(10,3%) resultaram positivos na cultura de urina e 26 (68,4%) animais foram
negativos em ambos os testes. A concordância entre as provas foi moderada,
sendo que a proporção de machos positivos na cultura de sangue e de urina
não diferiu significativamente.
Tabela 23– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sangue e de cultivo microbiológico de urina para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos. Botucatu,
2006.
76
CULTIVO
SANGUE
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 4 52
56 (29,6%)
NEGATIVO 0 133
133 (70,4%)
TOTAL
4 (2,1%)
185 (97,9%)
189 (100%)
p<0,001
Kappa 0,098 (concordância: fraca)
CULTIVO SWAB VAGINAL
A comparação dos resultados obtidos no cultivo microbiológico de
sangue e de swab vaginal em fêmeas, está apresentada na tabela 24.
Resultaram positivas na hemocultura 56 fêmeas, das quais 4 (7,1%) foram
positivas e 52 (92,9%) negativas na cultura de swab vaginal. Das 133 (70,4%)
negativas na hemocultura todas foram negativas também na cultura de swab
vaginal A concordância entre as provas foi fraca sendo que a proporção de
fêmeas positivas na cultura de sangue e de swab vaginal diferiu
significativamente.
Tabela 24– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sangue e de cultivo microbiológico de swab vaginal
para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cadelas.
Botucatu, 2006.
77
CULTIVO
SANGUE
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 2 2
4 (18,2%)
NEGATIVO 1 17
18 (81,8%)
TOTAL
3 (13,6%)
19 (86,4%)
22 (100%)
p=1,00
Kappa 0,492 (concordância: moderada)
CULTIVO SWAB PREPUCIAL
Os resultados comparativos observados na cultura de sangue e de swab
prepucial em machos estão apresentados na tabela 25. Resultaram positivos
na hemocultura 4 (18,2%) machos, dos quais 2 (50%) foram positivos e 2
(50%) negativos na cultura de swab prepucial. Dos 18 animais negativos na
hemocultura apenas 1 (5,6%) apresentou isolamento na cultura de swab
prepucial e os outros 17 (77,3%) foram negativos nas duas provas. A
concordância entre as provas foi moderada, não sendo observada diferença
significativa na proporção de machos positivos na cultura de sangue e swab
prepucial.
Tabela 25– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sangue e de cultivo microbiológico de swab prepucial
para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos.
Botucatu, 2006.
78
CULTIVO
SANGUE
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 6 2
8 (38,1%)
NEGATIVO 0 13
13 (61,9%)
TOTAL
6 (28,6%)
15 (71,4%)
21 (100%)
p=0,48
Kappa 0,788 (concordância: boa)
CULTIVO SÊMEN
A comparação entre os resultados obtidos no cultivo microbiológico de
sangue e de sêmen em machos está apresentada na tabela 26. Resultaram
positivos na hemocultura 8 (38,1%) machos, dos quais 6 (75%) foram positivos
e 2 (25%) negativos na cultura de sêmen. Dos 13 (61,9%) negativos na
hemocultura nenhum foi positivo na cultura de sêmen. A concordância entre as
provas foi boa sendo que as proporções de machos positivos no cultivo
microbiológico de sangue de sêmen não diferiram significativamente.
Tabela 26– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sangue e de cultivo microbiológico de sêmen para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos. Botucatu,
2006.
79
CULTIVO
URINA
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 18 0
18 (9,2%)
NEGATIVO 42 136
178 (90,8%)
TOTAL
60 (30,6%)
136 (69,4%)
196 (100%)
p<0,001
Kappa 0,373 (concordância fraca)
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 30%
Na tabela 27 estão apresentados os resultados comparativos entre o
cultivo microbiológico de urina e o cultivo microbiológico geral, de todos os
materiais cultivados. Todos os animais positivos na urocultura 18 (9,2%)
resultaram positivos também no cultivo microbiológico geral. Dos 178 (90,8%)
animais negativos na cultura de urina, 42 (23,6%) foram positivos no cultivo
microbiológico geral de outros materiais e 136 (69,4%) animais foram negativos
nas duas provas. A concordância entre as provas foi fraca sendo significativa a
diferença observada na proporção de positivos na cultura de urina e no cultivo
geral. A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de urina foi calculada
em 30%.
Tabela 27– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de urina e de cultivo microbiológico global para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis. Botucatu, 2006.
80
CULTIVO
URINA
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 0 9
9 (5,7%)
NEGATIVO 4 145
149 (94,3%)
TOTAL
4 (2,5%)
154 (97,5%)
158 (100%)
p=0,267
Kappa -0,036 (não há concordância)
CULTIVO SWAB VAGINAL
A comparação entre os resultados da cultura de urina e de swab vaginal
em fêmeas está apresentada na tabela 28. Resultaram positivas na cultura de
urina 9 (5,7%) fêmeas, das quais nenhuma foi positiva na cultura de swab
vaginal. Das 149 (94,3%) fêmeas negativas na cultura de urina, 4 (2,7%)
tiveram isolamento na cultura de swab vaginal e 145 (91,8%) cadelas foram
negativas em ambas as provas. Não houve concordância entre as provas e
também não foi observada diferença significativa na proporção de fêmeas
positivas na cultura de urina e de swab vaginal.
Tabela 28– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de urina e de cultivo microbiológico de swab vaginal para
o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cadelas. Botucatu,
2006.
81
CULTIVO
URINA
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 3 2
5 (29,4%)
NEGATIVO 0 12
12 (70,6%)
TOTAL
3 (17,6%)
14 (82,4%)
17 (100%)
p=0,48
Kappa 0,679 (concordância: moderada)
CULTIVO SWAB PREPUCIAL
A comparação entre os resultados de cultura de urina e cultura de swab
prepucial em machos é apresentada na tabela 29. Resultaram positivos na
cultura de urina 5 (29,4%) machos, dos quais 3 (60%) foram positivos e 2
(40%) negativos na cultura de swab prepucial. Dos 12 (70,6%) animais
negativos na cultura de urina todos foram negativos também na cultura de
swab prepucial. A concordância entre as provas foi moderada, não foi
observada diferença significativa na proporção de machos positivos na cultura
de urina e de swab prepucial.
Tabela 29– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de urina e de cultivo microbiológico de swab prepucial
para o diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos.
Botucatu, 2006.
82
CULTIVO
URINA
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 4 2
6 (35,3%)
NEGATIVO 1 10
11 (64,7%)
TOTAL
5 (29,4%)
12 (70,6%)
17 (100%)
p=1,00
Kappa 0,598 (concordância: moderada)
CULTIVO SÊMEN
Os resultados comparativos entre o cultivo microbiológico de urina e o
cultivo microbiológico de sêmen em machos estão apresentados na tabela 30.
Resultaram positivos na urocultura 6 (35,3%) machos, dos quais 4 (66,7%)
foram positivos e 2 (33,3%) negativos na cultura de sêmen. Dos 11 (64,7%)
machos negativos na urocultura, 1 (9,1%) foi positivo na cultura de sêmen e 10
(83,3%) machos foram negativos em ambas as provas. A concordância entre
as provas foi moderada e as proporções de machos positivos no cultivo
microbiológico de urina e de sêmen não diferiram significativamente
Tabela 30– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de urina e de cultivo microbiológico de sêmen para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos. Botucatu,
2006.
83
CULTIVO
S.VAGINAL
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 4 0
4 (2,1%)
NEGATIVO 54 131
185 (97,9%)
TOTAL
58 (30,7%)
131 (69,3%)
189 (100%)
p<0,001
Kappa 0,093 (concordância: fraca)
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 6,9%
A comparação entre o cultivo microbiológico de swab vaginal em fêmeas
e o cultivo microbiológico geral de todos os materiais processados está
apresentada na tabela 31. Resultaram positivas no swab vaginal 4 (2,1%)
cadelas, destas todas foram positivas no cultivo microbiológico geral. Das 185
(97,9%) fêmeas negativas no swab vaginal, 54 (29,2%) foram positivas na
cultura geral dos outros materiais processados e 131 (69,3%) cadelas foram
negativas nas duas provas. A concordância entre as provas foi fraca, sendo
observada diferença significativa entre as proporções de fêmeas positivas no
cultivo microbiológico de swab vaginal e no cultivo microbiológico geral. A
sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de swab vaginal foi calculada em
6,9%.
Tabela 31– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de swab vaginal e de cultivo microbiológico geral para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cadelas. São Paulo,
2006.
84
CULTIVO
S. PREPUCIAL
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 3 0
3 (13,6%)
NEGATIVO 3 16
19 (86,4%)
TOTAL
6 (27,3%)
16 (72,7%)
22 (100%)
p=0,248
Kappa 0,593 (concordância: moderada)
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 50%
A comparação entre o cultivo microbiológico de swab prepucial e o
cultivo microbiológico geral de todos os materiais processados em machos está
apresentada na tabela 32. Resultaram positivos no swab prepucial 3 (13,6%)
machos, dos quais todos foram positivos no cultivo microbiológico. Dos 19
(86,4%) machos negativos na cultura de swab prepucial, 3 (15,8%) foram
positivos no cultivo geral e 16 (72,7%) foram negativos em ambas as provas. A
concordância entre as provas foi moderada, sendo que a proporção de machos
positivos no cultivo microbiológico de swab prepucial e no cultivo microbiológico
geral não diferiu significativamente. A sensibilidade relativa do cultivo
microbiológico de swab prepucial foi calculada em 50%.
Tabela 32– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de swab prepucial e de cultivo microbiológico geral para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos. Botucatu,
2006.
85
CULTIVO
SÊMEN
POSITIVO NEGATIVO
TOTAL
POSITIVO 6 0
6 (28,6%)
NEGATIVO 3 12
15 (71,4%)
TOTAL
9 (42,9%)
12 (57,1%)
21 (100%)
p=0,248
Kappa 0,696 (concordância: moderada)
CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Sensibilidade Relativa 66,7%
A comparação entre os resultados do cultivo microbiológico de sêmen e
do cultivo microbiológico geral de todos os materiais processados em machos,
está apresentada na tabela 33. Resultaram positivos na cultura de sêmen 6
(28,6%) machos, dos quais todos foram positivos no cultivo microbiológico. Dos
15 (71,4%) negativos na cultura de sêmen, 3 (20%) foram positivos no cultivo
microbiológico e 12 (57,1%) animais foram negativos em ambos os testes. A
concordância entre as provas foi moderada e não houve diferença significativa
entre as proporções de machos positivos no cultivo microbiológico de sêmen e
no cultivo microbiológico geral. A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico
de sêmen foi calculada em 66,7%.
Tabela 33– Resultados comparativos obtidos nas provas de cultivo
microbiológico de sêmen e cultivo microbiológico geral para o
diagnóstico da brucelose canina por B. canis em cães machos. Botucatu,
2006.
86
Visto que no diagnóstico da brucelose canina, assim como para muitas
outras enfermidades, não existe um teste perfeito que com certeza determina a
presença ou ausência da doença, determinamos os valores de sensibilidade e
especificidade de um teste associando em paralelo a SAR e a hemocultura.
Neste tipo de associação o resultado do teste foi considerado positivo, quando
pelo menos um dos testes apresentou resultado positivo. Esse tipo de
combinação é de grande utilidade quando se necessita de uma abordagem
rápida, como o diagnóstico da doença para retirada de um animal do canil
visando à sanidade dos demais. Os valores de sensibilidade e a especificidade
desse novo teste combinado foram calculados, respectivamente, em 97,6% e
93,9%.
88
6. DISCUSSÃO
Não foi observado, neste experimento, diferença significativa na
proporção de machos e fêmeas positivas na SAR, SAR-2ME e hemocultura. A
ausência de diferença na freqüência de machos e fêmeas sororeagentes para
B. canis já havia sido observada por Almeida et al. (2004), Souza et al. (2002),
Germano et al. (1987) e Hubbert at al. (1980) sendo utilizado pelos dois
primeiros autores as técnicas de IDGA e pelos outros, respectivamente, a SAR
e a SAR e SAL-2ME. Estes resultados são reforçados, adicionalmente, por
Azevedo et al. (2003) e Moraes et al. (2002) que concluíram não existir
predisposição de sexo quanto ao risco de infecção pela B. canis, estando
ambos, machos e fêmeas, igualmente expostos ao risco de infecção.
Observou-se, no entanto, diferença significativa na proporção de
machos e fêmeas positivas na cultura de urina, assim como na proporção de
machos positivos no cultivo de sêmen e swab prepucial frente às fêmeas
positivas no cultivo de swab vaginal, sendo maior a proporção de machos
positivos, tanto na urina quanto no swab prepucial ou sêmen.
Estas observações estão em concordância com Moore & Kakuk (1969),
ao sugerirem que a bactéria foi isolada mais freqüentemente na urina de
machos do que das fêmeas naturalmente infectadas, podendo ser explicada
pela infecção persistente da B. canis na próstata e epidídimo, e resultando em
eliminação da bactéria de modo intermitente, juntamente com o fluído seminal.
Adicionalmente, a estreita relação anatômica entre a próstata, o epidídimo e a
vesícula urinária poderiam explicar a presença de um número maior de
organismos presentes na urina de machos infectados do que nas fêmeas
(CARMICHAEL & JOUBERT, 1988; JOHNSON & WALKER, 1992;
CARMICHAEL & GREENE, 1998).
O encontro de animais positivos tanto na cultura de sêmen como de
urina é justificável por dois aspectos, a infecção persistente da próstata e
epidídimo pela B. canis, que resulta na sua eliminação intermitente junto com o
fluído seminal e, paralelamente, pela estreita relação anatômica entre a
próstata, o epidídimo e a vesícula urinária, que permitiram o isolamento, com
89
facilidade, da bactéria na urina de machos infectados (JOHNSON & WALKER,
1992; CARMICHAEl & GREENE, 1998).
As concordâncias do sêmen, moderada e boa, quando comparados
respectivamente à SAR e a hemocultura, ocorreram provavelmente em virtude
da B. canis começar a ser isolada no sêmen nas primeiras seis a oito semanas
depois da infecção (CARMICHAEL & GREENE, 1998; NELSON & COUTO,
2001) persistindo por até dois anos, período este no qual a bactéria está
realizando bacteremia, que persiste por seis meses, podendo prolongar-se por
até cerca de cinco anos (WANKE, 2004).
Os isolamentos da bactéria em swab prepucial coincidentemente com os
isolamentos em urina sugerem que provavelmente o isolamento da B. canis em
swabs de prepúcio, seja decorrente da contaminação do prepúcio com o
agente presente na urina, já que durante a micção geralmente os animais não
expõem o pênis.
A contaminação do prepúcio pelo sêmen é menos provável, pois
normalmente o macho expõe o pênis durante a ejaculação. Essa observação é
nítida no animal 90 (Anexo) onde foram colhidos tanto swab prepucial como
sêmen e obteve-se isolamento da bactéria na urina e swab prepucial
concomitantemente, mas não no sêmen. Segundo essas observações o swab
prepucial parece não se prestar para estabelecer um paralelo com a colheita de
sêmen, mas estudos complementares são necessários para maiores
esclarecimentos nesse sentido.
Os resultados deste trabalho denotam que a cultura de urina, em
machos, apresentou efetividade semelhante à hemocultura e à SAR no
diagnóstico da doença. As porcentagens de isolamento na cultura de urina
podem ter sido semelhantes às encontradas no sangue e na SAR uma vez que
a excreção urinária da bactéria começa poucas semanas após a bacteremia e
continua por pelo menos três meses (SERIKAWA & MURAGUCHI, 1979;
CARMICHAEL & GREENE, 1998).
As porcentagens de isolamento na urocultura também podem ter sido
semelhantes às encontradas na SAR uma vez que nos animais estudados
foram encontrados apenas três suspeitos de encontrar-se na fase crônica da
infecção, período em que os títulos aglutinantes séricos podem decrescer uma
90
vez que o agente fica localizado na próstata e não realiza bacteremia
(CARMICHAEL & GREENE, 1998; SERIKAWA et al., 1978)
O menor percentual de fêmeas positivas na cultura de urina frente aos
machos também pode ser explicado pela propensão destas as infecções do
trato urinário (BARSANTI, 1998), assim freqüentemente as amostras de urina
das fêmeas podem estar contaminadas com outros microrganismos
(SERIKAWA et al., 1978) e mascarar o isolamento da B. canis, fato este
confirmado nas observações, uma vez que, com freqüência, foi observado o
crescimento de colônias contaminantes no cultivo de urina das fêmeas, assim
como no cultivo dos swabs vaginais.
A concordância da SAR e da hemocultura com a urocultura em fêmeas
foi baixa. A SAR e a hemocultura detectaram quantidade maior de fêmeas
positivas do que a urocultura, sugerindo que a eliminação da B. canis na urina
da fêmea é um evento bem menos importante do que no macho, uma vez que
não apresentam infecção persistente (MOORE & KOKUK, 1969; CARMICHAEL
& GREENE, 1998).
Não se observou concordância entre a cultura de urina e a cultura de
swab vaginal em fêmeas, visto que nenhuma das cadelas positivas na
urocultura foi positiva na cultura de swab vaginal e vice-versa, podendo-se
deduzir que a eliminação da bactéria na urina e nos fluidos vaginais pareçam
ser eventos independentes.
Nesta pesquisa foram encontrados somente quatro isolamentos da
bactéria em 189 swabs vaginais analisados, sendo três obtidos logo após o
abortamento.
O baixo percentual de isolamento da bactéria a partir deste material,
comparado à quantidade de fêmeas positivas na SAR ou na hemocultura, pode
ser explicado pelo fato de terem sido estudadas fêmeas em todas as fases do
ciclo estral, independentemente da presença de secreção vaginal, do histórico
de abortamento ou parto recente. Estas observações sugerem que mesmo
quando existe infecção do útero pela B. canis, a eliminação bacteriana através
do fluido vaginal deve ocorrer apenas por algumas semanas após o parto ou
abortamento. Tal afirmativa também foi assinalada por Carmichael & Kenny
(1968), ao isolarem a B. canis em macerados de tecidos uterinos e de cistos
91
endometriais de cadelas infectadas, sem igual resultado da parte anterior da
vagina, na ausência de secreção vaginal.
Massari et al. (2004) citaram que várias tentativas de isolamento da
bactéria, a partir de descargas vaginais, mostraram-se infrutíferas, mesmo em
animais sabidamente infectados.
Adicionalmente, já foi demonstrado que a cultura de swab vaginal de
cadelas com ausência de secreção, freqüentemente, não contém a bactéria
(MOORE, 1969; CARMICHAEL & JOUBERT, 1988;). Também já foi ressaltado
que a eliminação da bactéria ocorre nas descargas vaginais de fêmeas
infectadas durante algumas semanas após o abortamento ou durante o estro
(CARMICHAEL & JOUBERT, 1988; JOHNSON & WALKER, 1992). De forma
contraria a estes autores, não se observou nos animais estados o isolamento
da bactéria no swab vaginal das fêmeas em estro.
Carmichael & Greene (1998) também sugeriram que o útero de fêmeas
não prenhes e em diestro, pode ser um ambiente hostil ao crescimento da
bactéria, o que poderia justificar o baixo percentual de isolamento observado
neste experimento.
Dentre os animais utilizados, foram observados 22,5% apresentando
sintomas, principalmente, da esfera reprodutiva. Resultados semelhantes foram
observados por Keid et al. (2004) que encontraram 22,8% de animais
clinicamente sintomáticos ao avaliar 171 cães, provenientes de 12 canis
comerciais do estado de São Paulo. Os sintomas observados, neste
experimento, caracterizados principalmente por abortamentos em fêmeas e
alterações testiculares e de epidídimo em machos, coincidem com os descritos
em outros países (MOORE, 1969; CARMICHAEL & KENNY, 1970; HUBBERT
et al., 1980; CURRIER, 1982).
Adicionalmente, não foi observada associação entre a presença de
sinais clínicos e resultados positivos na cultura do swab vaginal, prepucial e
sêmen, aspectos similares relatados por Keid (2001), que também não
encontrou associação estatística da presença de sintomatologia clínica e
resultados positivos no cultivo de sêmen e swab vaginal.
No entanto, os resultados do presente estudo demonstraram associação
estatística da sintomatologia clínica com resultados positivos na SAR, SAR-
2ME, cultivo microbiológico de sangue e urina, aspectos apontados também
92
por Keid (2001), que revelou associação estatística entre sintomatologia e
resultados positivos nos testes de IDGA-2ME e hemocultura.
Um dos principais sintomas observados por esta pesquisa nas fêmeas
foi o abortamento, aspecto discordante de Azevedo et al. (2003) que não
encontraram associação estatística entre a ocorrência de abortamentos e a
soropositividade para B. canis. Provavelmente, estes autores não encontraram
a referida associação, por terem conduzido o estudo em uma amostra
aleatória, de animais do município de Santana do Parnaíba, e analisado
pequeno número de animais que apresentavam problemas reprodutivos. Ao
contrário, o presente estudo foi conduzido em canis comerciais, com muitos
animais apresentando histórico de abortamentos, infertilidade e nascimento de
ninhadas fracas ou natimortos (AZEVEDO et al., 2003).
De maneira similar a Hubbert et al. (1980) e Keid (2001), sugere-se
existir relação entre as alterações clínicas e a suspeita de infecção, devendo
esta ser confirmada por métodos sorológicos e bacteriológicos (GREENE,
1995; JOHNSON & WALKER, 1992, CARMICHAEL & SHIN, 1996).
Outro aspecto importante observado foi a presença de animais
assintomáticos positivos tanto na sorologia como na bacteriologia, constatação
esta já relatada, mas que deve ser enfatizada uma vez que estes animais
assintomáticos normalmente não são investigados e podem permanecer no
canil, como fontes de infecção potenciais para outros cães e para o homem
(JOHNSON & WALKER, 1992; MASSARI et al., 2004; KEID et al, 2004).
A comparação entre as provas de SAR e SAR-2ME demonstrou
concordância moderada, pois dos 57 (24,2%) positivos na SAR, a SAR-2ME
confirmou 24 (42,1%) animais. A presença de animais positivos na prova de
SAR, que resultaram negativos na SAR-2ME pode ser conseqüência da
diminuição do título sorológico em duas vezes, em função do tratamento dos
soros pelo 2-ME, como relatado previamente por Carmichael (1976) e Flores-
Castro & Carmichael (1978) ou pela detecção de animais em fase inicial de
infecção que só apresentam IgM, as quais são destruídas por ação do 2-ME
(JOHNSON & WALKER, 1992).
As porcentagens de positivos obtidas na SAR e SAR-2ME no trabalho
foram inferiores as obtidas por Vargas et al. (1996), que observaram 72,7% de
positivos na IDGA e por Keid (2001) que observou na IDGA 44,8% de
93
soropositivos e 1,2% na 2ME–IDGA, em amostras de animais procedentes de
canis comerciais e atendidos no Hospital Veterinário da USP.
Já Azevedo et al. (2004) observaram porcentagens superiores às deste
trabalho, utilizando IDGA (48,75%) e IDGA-2ME (18,75%) em 80 soros caninos
colhidos durante a campanha de vacinação anti-rábica de Santana de
Parnaíba, assim como Keid at al. (2004) que avaliando 171 cães provenientes
de canis comerciais, também relataram porcentagens superiores de positivos
na IDGA (33,9%).
O percentual de animais com sorologia positiva apresentado neste
estudo, no entanto, é concordante com Megid et al. (1999) que revelaram
soropositividades, variando de 4,6% a 57,1%, pela prova de IDGA em quatro
diferentes canis comerciais.
As diferentes soropositividades obtidas pelos autores citados podem ser
justificadas pela variação da população estudada e pelos métodos sorológicos
empregados nas diferentes pesquisas, que diferem em sensibilidade e
especificidade.
A comparação entre as provas de SAR e cultivo microbiológico geral
demonstrou concordância moderada. Dos 57 animais que resultaram positivos
na SAR, obteve-se isolamento positivo em 47 (82,5%), sugerindo que grande
parte dos animais positivos na SAR está realmente infectada.
De outro modo, não se verificou isolamento em 10 (17,5%) dos 57
animais positivos na SAR, sendo que tal fato pode ser justificado por reações
inespecíficas falso-positivas, decorrentes da reatividade cruzada com outros
microrganismos (CARMICHAEL, 1976; JOHNSON & WALKER, 1992),
Entretanto, como pertenciam a canis onde o manejo reprodutivo é precário e
com casos confirmados da doença, é possível que estes animais estivessem
realmente infectados, mas não tenham sido detectados na cultura (KEID et al.,
2004).
Dos 179 animais negativos na SAR obteve-se 24 (13,4%) positivos no
cultivo microbiológico geral, destes 18 (75%) apresentaram a bactéria
exclusivamente em sangue, dois (8,3%) animais apresentaram em sangue e
urina, três (12,5%) exclusivamente em urina e um (4,1%) em urina e swab
prepucial.
94
O isolamento do agente a partir de hemocultura de animais negativos na
SAR pode indicar fase inicial de infecção, uma vez que nesta fase a
hemocultura parece ser mais sensível que as provas sorológicas.
A hemocultura é capaz de detectar a bactéria duas a quatro semanas
após a infecção, período no qual a SAR pode ter resultado negativo
(CARMICHAEL & SHIN, 1996; GREENE, 1998). Entretanto, todos os animais
com hemocultura positiva e SAR negativa foram reavaliados transcorridos 30
dias do primeiro teste e muitos continuaram negativos na SAR, sugerindo não
início de infecção, mas ocorrência de flutuações nos títulos de anticorpos,
mesmo durante a bacteremia (JOHNSON & WALKER, 1992).
Os relatos de que altos níveis de anticorpos circulantes são mantidos
durante a bacteremia (CARMICHAEL & KENNY, 1968; JOHNSON & WALKER,
1992) contrastam com os resultados deste trabalho, uma vez que foram
encontrados animais positivos na hemocultura que resultaram negativos na
SAR.
Megid et al. (2000) avaliando 12 cães naturalmente infectados por B.
canis por um período de nove meses, também verificaram desaparecimento ou
diminuição nos títulos sorológicos e flutuação de resultados positivos e
negativos na IDGA, sendo esta flutuação justificada como conseqüência da
bacteremia intermitente, com persistência do agente nos tecidos infectados.
O isolamento positivo somente em urina e/ou swab prepucial em cinco
(20,8%) dos 24 animais negativos na SAR pode indicar uma infecção crônica.
Esta possibilidade se justifica pelos relatos de isolamento de B. canis em
sêmen de animais com infecções crônicas, os quais apresentavam baixos
títulos nas provas sorológicas, decorrentes da localização do agente na
próstata e testículos após a bacteremia (MOORE & KAKUK, 1969; FLORES-
CASTRO et al, 1977; WOOLEY et al, 1978; JOHNSON & WALKER, 1992;
MIRANDA et al., 2005).
O percentual de falso-positivos encontrados (17,5%) neste trabalho
difere de Carmichael & Joubert (1987), Carmichael & Shin (1996) e Wank
(2004), que relataram percentuais próximos a 50%. Esta diferença pode ser
justificada pelo fato da maioria dos autores terem classificado os animais em
positivos ou negativos somente por comparação entre provas sorológicas, não
tendo sido realizado cultivo microbiológico.
95
O percentual de animais falso-negativos na SAR (13,4%) encontrado
neste experimento difere também, e foi superior ao observado por outros
autores (ZOHA & CARMICHAEL, 1982; NICOLETTI & CHASE, 1987;
JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & SHIN, 1996).
O maior percentual observado pode ser justificado pela presença de
animais em fase crônica de doença, que como citado anteriormente, resultaram
negativos na SAR, mas apresentaram isolamento da bactéria em urina e/ou
swab prepucial, aspecto observado por Flores-Castro et al. (1977) e Wooley et
al. (1978) que relataram resultados negativos na SAR e em outras provas
sorológicas, em animais com infecções crônicas, que apresentaram isolamento
de B. canis dos testículos, epidídimo e próstata. Adicionalmente, Flores-Castro
& Carmichael (1978), comparando os métodos sorológicos de SAR, SAL, SAL-
2ME e IDGA no diagnóstico da brucelose canina também encontraram 1 (0,2%)
animal negativo a SAR e positivo à SAL-2ME e IDGA, em 411 analisados
sugerindo infecção crônica neste animal.
Resultados falso-negativos também foram observados neste
experimento, em animais negativos a SAR que apresentaram isolamento da
bactéria em hemocultura, fato este observado por Larsson et al. (1984b) que
encontraram animais experimentalmente infectados com B. canis, positivos na
hemocultura e que não apresentaram reação na SAL, e por outros autores que
também demonstraram cães experimentalmente infectados com Brucella
abortus, confirmados no isolamento e negativos em provas de aglutinação,
como a SAL, SAL-2ME e Rivanol (MÓLNAR et al., 2001).
Foi observada neste experimento uma diminuição acentuada na
sensibilidade da SAR-2ME frente o cultivo, a qual pode ser explicada pela ação
do 2-Mercaptoetanol (2ME), que pode diminuir o título sorológico em duas
vezes, como observado por Carmichael (1976) e Flores-Castro & Carmichael
(1978). Estes últimos observaram que títulos positivos de 200 detectáveis na
SAL, demoravam um período de tempo maior para serem observados na prova
de SAL-2ME. O 2-ME também desnatura IgMs, predominantes na fase inicial
da doença, dificultando o diagnóstico de animais nesta fase da infecção
(JOHNSON & WALKER, 1992).
96
Keid (2001) também observou diminuição sensibilidade (35,7%) e
aumento na especificidade (98,7%) na IDGA-2ME se comparada com a
sensibilidade e especificidade da IDGA, respectivamente, 85,7% e 62,2%.
Os resultados deste trabalho e os de Keid (2001) diferem de Badakhsh
et al (1982) e Carmichael & Shin (1996), ao afirmarem que o 2-ME permite o
aumento da especificidade da prova sem redução de sua sensibilidade. A
explicação para tal diminuição de sensibilidade observada nos estudos, não
observada por Badakhsh et al (1982) e Carmichael & Shin (1996), talvez possa
ser reflexo da população estudada, que neste caso parece ser constituída de
animais na fase inicial da doença e animais já apresentando flutuações nos
títulos de anticorpos.
A concordância entre a SAR-2ME e o cultivo de sangue, urina e swab
vaginal foi fraca e muito inferior às concordâncias observadas na comparação
com a SAR. A comparação entre a SAR-2ME e o cultivo de swab prepucial
sequer apresentou concordância.
Acredita-se que a concordância entre os testes diminuiu sensivelmente,
pela ação do 2-Mercaptoetanol (2ME) sobre as imunoglobulinas da classe “M”,
limitando a utilização do teste no diagnóstico de animais na fase inicial da
doença, quando esta imunoglobulina é predominante, ou ainda pela diminuição
do título sorológico, após a diluição dos soros com o 2-ME (CARMICHAEL,
1976).
A hemocultura demonstrou boa sensibilidade relativa, uma vez que
resultaram positivos na hemocultura 66 (92,9%) animais dos 71 (30%) positivos
na cultura geral de todos os materiais. Estes resultados corroboram com a
literatura que afirma ser o sangue a melhor amostra a ser cultivada na tentativa
de isolamento da bactéria, uma vez que nos cães a bacteremia é prolongada
(CARMICHAEL & BRUNER, 1968; MOORE, 1969; CARMICHAEL & KENNY,
1970; MOORE & GUPTA, 1970; FLORES-CASTRO & CARMICHAEL, 1978;
NICOLETTI & CHASE, 1987; JOHNSON & WALKER, 1992).
Embora vários materiais possam ser utilizados na detecção da B. canis,
o sangue é referido como o melhor, pelo fato deste material raramente se
encontrar contaminado e fornecer resultados positivos nas infecções agudas,
mesmo quando níveis de anticorpos no soro, ainda não são detectáveis
97
(CARMICHAEL & KENNY, 1970; JOHNSON & WALKER, 1992; KEID et al.,
2004; WANKE, 2004).
Resultaram positivos na hemocultura 66 (28%) animais, dos quais a
SAR detectou 47 (71,2%), resultando os demais 19 (28,8%) animais negativos
a SAR. Dez (17,5%) animais positivos na SAR resultaram negativos na
hemocultura. George & Carmichael (1978) sugeriram que a SAR é acurada na
detecção de anticorpos contra B. canis por aproximadamente seis semanas
após o início da bacteremia, persistindo positiva por até três meses após seu
término (JOHNSON & WALKER, 1992). Os resultados falso-negativos na SAR
em animais com hemocultura positiva, como discutido anteriormente, poderiam
ser decorrentes de infecção inicial, mas como todos os animais foram
reavaliados, sem alteração nos resultados da SAR, acredita-se que possam ter
ocorrido por flutuação nos títulos de anticorpos mesmo durante a bacteremia,
como observaram Johnson & Walker (1996) e Megid et al. (2000).
Como o sucesso na hemocultura depende do tempo decorrido desde a
infecção, da não realização de uma antibioticoterapia prévia e da viabilidade do
microrganismo, os resultados positivos observados na SAR em animais com
isolamento negativo, não excluem a possibilidade de infecção (JOHNSON &
WALKER, 1992; RUIZ, 1997; KEID et al., 2004).
Os resultados obtidos por Keid et al. (2004), no que se refere ao
percentual de animais positivos na hemocultura (14,03%), diferiram dos
resultados do presente trabalho. O menor percentual de hemocultura positiva
obtido nesse estudo pode ter decorrido da utilização de canis com animais
cronicamente infectados que apresentaram resultado negativo na hemocultura.
O cultivo microbiológico de urina apresentou baixa sensibilidade relativa
(30%), aspecto concordante com Greene (1995) que sugeriu que as culturas de
urina são úteis para o diagnóstico se associadas a outros métodos mais
sensíveis, uma vez que se colhidos isoladamente não são confiáveis pela baixa
sensibilidade das técnicas.
A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de swab vaginal foi 6,9%.
Nas observações deste trabalho a cultura do fluido vaginal revelou ter validade
no diagnóstico da infecção, apenas no período após o abortamento, uma vez
que dos quatro isolamentos obtidos, três ocorreram após abortamento, aspecto
concordante com Johnson & Walker (1992), que sugeriu ser um material
98
importante para a cultura após o abortamento, assim como uma importante via
de eliminação da bactéria, capaz de transmitir a infecção a outros animais e ao
homem.
A cultura do fluido prepucial mostrou-se relativamente interessante, uma
vez que apresentou sensibilidade relativa de 50%. O inconveniente na cultura
desse material é a grande quantidade de contaminantes que pode mascarar o
lento isolamento da B. canis. Não foi encontrado relatos da utilização deste
material para diagnóstico da B. canis em machos, dificultando a discussão
desses dados comparativamente a estudos similares.
A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de sêmen foi calculada
em 66,7%. O sêmen apresentou uma porcentagem alta de isolamentos não
diferindo estatisticamente da SAR e apresentando boa correlação com a
hemocultura, aspecto discordante de Keid (2001), que encontrou correlações
fracas. Uma vez que neste experimento foi avaliado um pequeno número de
machos e considerando outros resultados descritos, torna-se mais seguro a
utilização da cultura de sêmen se associada a outros métodos mais sensíveis,
visto que resultados negativos, quando colhida isoladamente, não são
confiáveis (GREENE, 1995).
Nos 97 isolamentos obtidos nesse trabalho foram observadas
características morfológicas e bioquímicas semelhantes às obtidas por
Fernandes et al (1976-7), Godoy et al. (1977), Vargas et al.(1996), Gomes et al.
(1999) e Keid et al. (2004).
Houve discordância dos isolamentos obtidos com os realizados por
Riecke & Rhoades (1975), Larsson & Costa (1980) e Forbes & Pantekoek
(1988) no tocante a produção de H
2
S, os quais relataram que após alguns dias
de incubação suas culturas foram capazes de produzir de H
2
S, o que não foi
observado nos 97 isolamentos obtidos neste trabalho.
No tocante a redução de nitratos, dezoito (18,5%) dos 97 isolados
obtidos não apresentaram tal capacidade. Flores-Castro & Carmichael (1986)
observaram comportamento semelhante, quando analisaram o comportamento
bioquímico 28 cepas de B. canis isoladas de campo frente à cepa referência
RM 666 de B. canis.
Flores-Castro et al. (1977) observaram, além das diferenças bioquímicas
relativas à redução de nitrato em cepas isoladas no México, outra diferença
99
destas estirpes em relação à multiplicação da bactéria na presença de fucsina
básica nas concentrações 1:25.000 e 1:50.000, normalmente inibitórias. No
tocante ao crescimento da bactéria na presença do corante fucsina básica, o
presente trabalho obteve apenas sete (7,2%) isolados apresentando
crescimento na concentração 1:50.000 de fucsina básica, geralmente inibitória
para as cepas semelhantes à cepa RM 666 de Brucella canis. Keid et al. (2004)
obteve 18 (75%) de 24 isolados resistentes a fucsina nesta concentração,
aspecto também observado por Forbes & Pantekoek (1988) em cepas isoladas
no Canadá.
A SAR apresentou sensibilidade e especificidade distintas nos dois canis
experimentais estudados (A e B).
No canil A, a SAR apresentou boa sensibilidade (87,9%) e
especificidade (75,7%), para ser utilizada no screening dos infectados.
No canil B, o teste apresentou sensibilidade (45,9%) bastante reduzida,
com ótima especificidade (98,7%), e seria prejudicial para um programa de
saneamento se tivesse sido utilizado, isoladamente, como teste de triagem,
visto que vários animais negativos a SAR, porém infectados, ficariam sem
diagnóstico, permanecendo como fontes de infecção no canil.
As prevalências da doença também diferiram nos dois locais, sendo
maior no canil A (47,1%) do que no B (32,5%). O VPP da SAR também diferiu
para os dois canis e foi maior no canil B uma vez que a especificidade do teste
neste canil foi maior.
As diferenças na qualidade intrínseca do teste podem ser explicadas
com base na evolução da doença. Aparentemente, o canil A encontrava-se
com maior quantidade de animais na fase aguda da infecção, diagnosticados
predominantemente pela SAR. Contrariamente no canil B, identificaram-se
muitos animais apresentando flutuações nos títulos de anticorpos, que
resultaram negativos na SAR, mesmo com hemocultura positiva, além de cinco
animais na fase crônica da infecção, que também resultaram negativos na
SAR, com isolamento da bactéria na urina e no swab prepucial.
Assim, estes resultados sugerem que a SAR, não deve ser utilizada
sozinha como teste de triagem, pois a baixa sensibilidade do teste nas fases
mais crônicas da infecção pode dificultar bastante o diagnóstico.
100
Os valores de sensibilidade e a especificidade da associação da SAR à
hemocultura, demonstraram aumento considerável da sensibilidade relativa do
teste sorológico, comparativamente ao uso isolado, reforçando a afirmação de
Soares e Siqueira (2002) de que a combinação de dois ou mais testes melhora
a eficiência do diagnóstico.
O tratamento dos soros positivos a SAR com 2-Mercaptoetanol parece
ser um procedimento dispensável no diagnóstico, uma vez que a SAR-2ME
apresentou sensibilidade muito baixa e não serve como teste confirmatório,
pois não elimina todas as possibilidades de reações inespecíficas (JOHNSON
& WALKER, 1992; BERTHELOT & GARIN–BASTUJI, 1993), podendo ser, com
vantagem, substituída pela hemocultura, que se mostrou bastante sensível na
detecção e confirmação dos positivos, devendo-se ressaltar, no entanto, que a
hemocultura pode apresentar resultados insatisfatórios, principalmente nos
casos crônicos da infecção.
A cultura de urina demonstrou baixa sensibilidade no diagnóstico da
doença, sobretudo nas fêmeas. Em machos seu desempenho foi satisfatório e
comparável à hemocultura, sugerindo-se, entretanto, seu uso associado à
hemocultura no diagnóstico confirmatório das infecções, principalmente em
machos.
A cultura de swab vaginal apresentou sensibilidade muito baixa e parece
mostrar resultados satisfatórios, apenas no diagnóstico microbiológico das
fêmeas, por algumas semanas após o parto ou abortamento. Em outras
condições o cultivo deste material parece estar fadado ao insucesso.
102
7. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos na presente pesquisa e embasados pela literatura
consultada, permitiram chegar às conclusões que se seguem:
A soroaglutinação rápida, embora apresente praticidade e
facilidade de execução, apresentou falsos negativos possibilitando a
manutenção de animais como fontes de infecção;
A soroaglutinação rápida com 2-ME, embora apresentando boa
especificidade, demonstrou baixa sensibilidade, não recomendando sua
utilização como teste confirmatório da SAR;
A hemocultura demonstrou elevada sensibilidade para o
diagnóstico da brucelose canina, inclusive quando aplicada como método
isolado;
A associação da hemocultura a soroaglutinação rápida
demonstrou elevada sensibilidade, indicando a sua utilização como método
diagnóstico da enfermidade;
A utilização de sêmen e swab prepucial, para o cultivo
microbiológico, podem ser realizadas, desde que associadas à hemocultura no
diagnóstico confirmatório das infecções;
A cultura de urina demonstrou baixa sensibilidade no diagnóstico
da doença, sobretudo nas fêmeas, podendo ser utilizada principalmente para
machos, desde que associada à hemocultura no diagnóstico confirmatório da
infecção;
A cultura de swab vaginal apresentou baixa sensibilidade,
sugerindo a sua utilização especialmente para fêmeas imediatamente após o
parto ou abortamento.
104
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117
Sexo
SAR
SAR 2-ME
Sangue
Urina
Swab
Sêmen
1
Fêmea York
Negativa
NR
2
Fêmea Schnauzer
Positiva
Positiva
Brucella
Brucella
3
Fêmea Poodle
Positiva
Negativa
Brucella
4
Fêmea Poodle
Negativa
NR
5
Fêmea Maltes
Negativa
NR
6
Fêmea Maltes
Positiva
Positiva
Brucella
7
Fêmea York
Negativa
NR
8
Fêmea Poodle
Positiva
Negativa
9
Fêmea Maltes
Positiva
Positiva
Brucella
10
Fêmea Maltes
Positiva
Negativa
11
Fêmea Maltes
Negativa
NR
12
Fêmea Maltes
Positiva
Positiva
Brucella
13
Fêmea Poodle
Negativa
NR
14
Fêmea York
Negativa
NR
15
Fêmea York
Negativa
NR
16
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
17
Fêmea Poodle
Negativa
NR
18
Fêmea York
Positiva
Negativa
19
Macho York
Negativo
NR
20
Macho Schnauzer
Positivo
Positivo
Brucella
Brucella
Brucella
21
Macho Schnauser
Negativo
NR
Brucella
Brucella
22
Macho Schnauzer
Positivo
Negativo
Brucella
Brucella
Brucella
23
Macho Schnauzer
Positivo
Positivo
Brucella
24
Macho York
Negativo
NR
25
Macho Maltes
Negativo
NR
26
Fêmea Schnauzer
Positiva
Negativa
Brucella
27
Macho Maltes
Positivo
Negativo
28
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
29
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
30
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
31
Fêmea Schtzu
Positiva
Negativa
Brucella
32
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
33
Fêmea Schnauzer
Positiva
Negativa
Brucella
34
Fêmea York
Positiva
Positiva
Brucella
35
Fêmea Poodle
Positiva
Negativa
Brucella
36
Fêmea Schnauzer
Positiva
Positiva
Brucella
37
Fêmea York
Positiva
Negativa
38
Fêmea Schnauzer
Positiva
Negativa
Brucella
39
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
Brucella
40
Fêmea Schnauzer
Positiva
Positiva
Brucella
41
Fêmea Schnauzer
Positiva
Positiva
Brucella
42
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
43
Fêmea Schnauzer
Positiva
Negativa
Brucella
44
Fêmea Poodle
Positiva
Positiva
Brucella
45
Fêmea Schnauzer
Positiva
Negativa
Brucella
46
Fêmea Poodle
Negativa
NR
47
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
48
Fêmea Maltes
Negativa
NR
49
Fêmea Maltes
Negativa
NR
50
Fêmea Schtzu
Positiva
Positiva
Brucella
CULTURA
Raça
SOROLOGIA
9. ANEXOS
Anexo A – Cães examinados para infecção por B. canis segundo sexo,
raça, técnica realizada e resultado.
118
Sexo
SAR
SAR 2-ME
Sangue
Urina
Swab
Sêmen
51
Fêmea Maltes
Negativa
NR
52
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
53
Fêmea York
Positiva
Positiva
Brucella
Brucella
54
Fêmea York
Negativa
NR
55
Fêmea York
Positiva
Positiva
56
Fêmea York
Negativa
NR
57
Fêmea Maltes
Positiva
Positiva
Brucella
58
Fêmea Maltes
Negativa
NR
59
Fêmea Poodle
Negativa
NR
60
Fêmea Maltes
Negativa
NR
61
Fêmea Schtzu
Positiva
Negativa
62
Fêmea Poodle
Positiva
Positiva
63
Fêmea Poodle
Negativa
NR
64
Fêmea Maltes
Positiva
Negativa
Brucella
Brucella
65
Fêmea York
Negativa
NR
66
Fêmea Maltes
Negativa
NR
67
Fêmea Maltes
Positiva
Negativa
Brucella
68
Fêmea Maltes
Negativa
NR
69
Fêmea Maltes
Positiva
Positiva
70
Fêmea Maltes
Negativa
NR
71
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
72
Fêmea York
Negativa
NR
73
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
74
Fêmea York
Negativa
NR
75
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
76
Macho Poodle
Negativo
NR
Brucella
Brucella
77
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
78
Fêmea Lhasa
Positiva
Negativa
Brucella
79
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
Brucella
80
Macho Lhasa
Negativo
NR
Brucella
81
Macho Lhasa
Negativo
NR
82
Macho Lhasa
Negativo
NR
83
Macho Schnauzer
Negativo
NR
84
Macho Schnauzer
Positivo
Negativo
Brucella
Brucella
Brucella
85
Macho Schnauzer
Negativo
NR
86
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
Brucella
87
Macho Bichón
Negativo
NR
88
Macho Bichón
Negativo
NR
Brucella
89
Macho Schnauzer
Negativo
NR
90
Macho West
Positivo
Negativo
Brucella
Brucella
Brucella
91
Fêmea West
Negativa
NR
92
Fêmea West
Negativa
NR
93
Macho York
Positivo
Negativo
Brucella
Brucella
Brucella
94
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
95
Fêmea Lhasa
Positiva
Positiva
Brucella
96
Fêmea York
Positivo
Negativa
Brucella
97
Macho York
Negativo
NR
98
Fêmea
Chow Chow
Negativa
NR
99
Macho Boxer
Negativo
NR
100
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
CULTURASOROLOGIA
Raça
Anexo A – Cães examinados para infecção por B. canis segundo sexo,
raça, técnica realizada e resultado (continuação).
119
Sexo
SAR
SAR 2-ME
Sangue
Urina
Swab
Sêmen
101
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
Brucella
102
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
103
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
Brucella
104
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
Brucella
105
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
106
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
107
Fêmea Bichón
Negativa
NR
108
Fêmea Bichón
Negativa
NR
109
Fêmea Bichón
Negativa
NR
110
Fêmea Poodle
Negativa
NR
111
Fêmea Maltês
Negativa
NR
112
Fêmea Maltês
Negativa
NR
113
Fêmea Poodle
Negativa
NR
114
Fêmea Poodle
Negativa
NR
115
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
116
Macho Shih Tzu
Negativo
NR
117
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
118
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
119
Fêmea Maltês
Negativa
NR
120
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
121
Macho Schnauzer
Negativo
NR
122
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
123
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
Brucella
124
Fêmea Maltês
Negativa
NR
125
Fêmea Lulu
Negativa
NR
126
Fêmea Poodle
Negativa
NR
127
Fêmea Lhasa
Negativa
NR
128
Fêmea Lhasa
Negativa
NR
129
Fêmea Lhasa
Negativa
NR
130
Fêmea Labrador
Positiva
Positiva
Brucella
Brucella
131
Fêmea Lhasa
Negativa
NR
132
Macho Maltês
Negativo
NR
133
Macho York
Negativo
NR
134
Macho Labrador
Negativo
NR
135
Fêmea Labrador
Negativa
NR
Brucella
136
Fêmea Labrador
Positiva
Negativa
137
Fêmea Labrador
Positiva
Positiva
Brucella
Brucella
138
Fêmea Labrador
Negativa
NR
Brucella
139
Fêmea Labrador
Negativa
NR
140
Fêmea Labrador
Negativa
NR
141
Fêmea Labrador
Positiva
Positiva
Brucella
142
Macho Labrador
Negativo
NR
Brucella
143
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
144
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
145
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
146
Fêmea York
Positiva
Negativa
Brucella
Brucella
147
Fêmea Lhasa
Negativa
NR
148
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
149
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
150
Macho Lhasa
Negativo
NR
Raça
SOROLOGIA CULTURA
Anexo A – Cães examinados para infecção por B. canis segundo sexo,
raça, técnica realizada e resultado (continuação).
120
Sexo
SAR
SAR 2-ME
Sangue
Urina
Swab
Sêmen
151
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
152
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
153
Fêmea Shih Tzu
Negativa
NR
154
Fêmea
Chow Chow
Negativa
NR
155
Macho
Chow Chow
Negativo
NR
156
Macho
Chow Chow
Negativo
NR
157
Macho
Chow Chow
Negativo
NR
158
Fêmea Poodle
Negativa
NR
159
Fêmea Poodle
Negativa
NR
160
Macho Poodle
Negativo
NR
161
Macho Basset
Negativo
NR
Brucella
Brucella
162
Macho Basset
Negativo
NR
163
Macho Golden
Negativo
NR
164
Macho Border
Negativo
NR
165
Macho Border
Positivo
Positivo
Brucella
Brucella
Brucella
166
Fêmea York
Negativa
NR
167
Fêmea Beagle
Negativa
NR
168
Macho Schnauzer
Negativo
NR
169
Fêmea Schnauzer
Negativa
NR
170
Macho Schnauzer
Negativo
NR
171
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
172
Fêmea York
Negativa
NR
173
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
174
Fêmea York
Negativa
NR
Brucella
175
Fêmea Basset
Negativa
NR
176
Fêmea Basset
Negativa
NR
177
Fêmea Basset
Negativa
NR
178
Fêmea Basset
Positiva
Positiva
Brucella
Brucella
179
Fêmea Basset
Negativa
NR
180
Fêmea Setter
Negativa
NR
181
Fêmea Setter
Negativa
NR
Brucella
182
Fêmea Basset
Positiva
Negativa
Brucella
183
Fêmea Basset
Positiva
Positiva
Brucella
Brucella
184
Fêmea Basset
Negativa
NR
185
Macho srd
Negativo
NR
186
Fêmea
srd
Positiva
Negativa
Brucella
187
Fêmea Maltês
Negativa
NR
188
Fêmea Maltês
Negativa
NR
189
Macho Maltês
Negativo
NR
190
Fêmea Maltês
Negativa
NR
191
Macho Maltês
Negativo
NR
192
Fêmea Maltês
Negativa
NR
193
Fêmea Maltês
Negativa
NR
194
Fêmea Maltês
Negativa
NR
195
Fêmea Maltês
Negativa
NR
196
Fêmea Maltês
Negativa
NR
197
Fêmea Maltês
Negativa
NR
198
Fêmea Maltês
Negativa
NR
199
Fêmea Maltês
Negativa
NR
200
Fêmea Maltês
Negativa
NR
Raça
SOROLOGIA CULTURA
Anexo A – Cães examinados para infecção por B. canis segundo sexo,
raça, técnica realizada e resultado (continuação).
121
Sexo
SAR
SAR 2-ME
Sangue
Urina
Swab
Sêmen
201
Fêmea srd
Negativa
NR
202
Fêmea srd
Negativa
NR
203
Fêmea srd
Negativa
NR
204
Macho srd
Negativo
NR
205
Fêmea srd
Negativa
NR
206
Macho srd
Negativo
NR
207
Fêmea srd
Negativa
NR
208
Fêmea srd
Negativa
NR
209
Fêmea srd
Negativa
NR
210
Fêmea srd
Negativa
NR
211
Fêmea srd
Negativa
NR
212
Macho srd
Negativo
NR
213
Fêmea srd
Negativa
NR
214
Fêmea srd
Negativa
NR
215
Fêmea srd
Negativa
NR
216
Fêmea srd
Negativa
NR
217
Fêmea srd
Negativa
NR
218
Fêmea srd
Negativa
NR
219
Fêmea srd
Negativa
NR
220
Fêmea srd
Negativa
NR
221
Fêmea srd
Negativa
NR
222
Fêmea srd
Negativa
NR
223
Fêmea srd
Negativa
NR
224
Fêmea srd
Negativa
NR
225
Fêmea srd
Negativa
NR
226
Fêmea srd
Negativa
NR
227
Fêmea srd
Negativa
NR
228
Fêmea srd
Negativa
NR
229
Fêmea srd
Negativa
NR
230
Macho srd
Negativo
NR
231
Fêmea srd
Negativa
NR
232
Fêmea srd
Negativa
NR
233
Fêmea srd
Negativa
NR
234
Fêmea srd
Negativa
NR
235
Fêmea srd
Negativa
NR
236
Fêmea srd
Negativa
NR
Raça
SOROLOGIA CULTURA
Anexo A – Cães examinados para infecção por B. canis segundo sexo,
raça, técnica realizada e resultado (continuação).
I
Cultivo Microbiológico e Soroaglutinação Rápida em Cartão no diagnóstico da
Brucelose Canina*
Vanessa Riesz Salgado
1
, Jane Megid
2
, Lara Borges Keid
3
, Nair Cavalcanti de Lira
4
RESUMO
Cães pertencentes a cinco canis comerciais foram submetidos à avaliação clínica e as
provas laboratoriais de Cultivo Microbiológico e Soroaglutinação Rápida em Cartão
(SAR), com e sem o emprego de 2-Mercaptoetanol (2-ME), para o diagnóstico da
infecção por Brucella canis (B. canis). Adicionalmente, foram avaliados sangue, urina,
swab vaginal, prepucial e sêmen no diagnóstico microbiológico. Dos 236 animais
avaliados, 24,2% resultaram positivos na SAR, 10,2% na SAR-2ME e 30% no cultivo
microbiológico. Dos animais positivos no cultivo microbiológico 92,9% apresentaram-
se positivos na hemocultura. Nos demais materiais processados foram obtidos
percentuais menores de isolamento. A sensibilidade e a especificidade relativa da
SAR resultaram, respectivamente, em 66,2% e 93,9%. A SAR-2ME apresentou menor
sensibilidade relativa (29,5%) com ligeiro aumento na especificidade relativa (98,2%).
A utilização da prova de SAR em associação com a hemocultura apresentou 97,6% e
93,9% de sensibilidade e especificidade, respectivamente, sugerindo que a SAR seja
utilizada associada à hemocultura sem realização em paralelo com 2-ME.
Palavras chave: Brucella canis; diagnóstico; cultivo microbiológico; sorologia, cão.
Abstract
Bacteriological Cultures and Rapid Slide Agglutination Test with and without 2-
Mercaptoethanol in canine brucellosis diagnosis
Dogs from commercial breeding kennels were submitted to clinical investigation and
laboratorial tests of bacteriological cultures and Rapid Slide Agglutination Test (RSAT)
with and without 2-Mercaptoethanol (2ME) for diagnosis of Brucella canis (B. canis)
1
Mestranda, DHVSP – FMVZ – UNESP – Botucatu, SP. CP 560, CEP 18618-000, E-mail :
vanessasalgado@hotmail.com
2
Profa. Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais Domésticos, DHVSP – FMVZ – UNESP –
Botucatu, SP. CP 560, CEP 18618-000, E-mail: [email protected]r
3
Doutoranda, VPS – FMVZ – USP, Av. Prof. Dr. Orlando Marques Paiva, 87, CEP 05508-000, São Paulo –
SP, E-mail:larakeid@yahoo.com.br
4
Doutoranda, DHVSP – FMVZ – UNESP – Botucatu, SP. CP 560, CEP 18618-000, E-mail:
II
infection. Additionally, blood, urine, vaginal and prepucial swabs and semen were
evaluated regarding their use in bacteriological diagnostic. Two hundred thirty six dogs
were submitted to investigation for diagnosis of B. canis infection. Among them, 24.2%
were positive in RSAT, 10.2% 2ME-RSAT and 30% in bacteriological culture. Among
the positives in bacteriological culture, 92.9% were positive in blood culture. The
percentage of positive isolation was variable in others samples. The relative sensitivity
and specificity of RSAT was, respectively 66.2% and 93.9%. The 2ME-RSAT
presented lower relative sensitivity 29.5% and greater relative specificity 98.2%. The
use of blood culture and RSAT associated presented 97.6% e 93.9% of sensibility and
specificity, respectively; suggesting that RSAT should be used with blood cultures
independently of the use of 2ME-RSAT.
Key Words: Brucella canis; diagnosis; bacteriological culture; serology, dog.
INTRODUÇÃO
A brucelose canina causada pela Brucella canis (B. canis) é uma das principais
causas infecciosas de desordens reprodutivas em canídeos domésticos e silvestres
(KEID et al., 2004; ACHA & SZYFRES, 2001).
A doença está mundialmente distribuída (CARMICHAEL & GREENE, 1998). No
Brasil, após a primeira descrição (GODOY et al. 1977), tem sido referenciada em
relatos de isolamento do agente (FERNANDES et al., 1976-7; VARGAS et al., 1996;
GOMES et al., 1999; MEGID et al., 2002; FERREIRA et al., 2003. KEID et al., 2004) e
levantamentos soro-epidemiológicos, (SANDOVAL et al., 1976; WALD &
FERNANDES, 1976-7; GERMANO et al., 1987; CORTES et al, 1988; SOUZA et al.,
2002; MORAES et al., 2002; AZEVEDO et al., 2003 ALMEIDA et al., 2004) com
prevalências variáveis, dependendo do tipo de teste aplicado e da área geográfica
estudada (GOMES et al., 1999).
As maiores prevalências da doença provavelmente ocorrem entre os cães
utilizados para reprodução em canis comerciais. A brucelose é uma das enfermidades
de maior importância para os criadores, visto a rápida disseminação da doença em
populações confinadas, as perdas econômicas decorrentes das alterações
reprodutivas e da eliminação de animais de alto valor zootécnico, além do risco para a
saúde pública (BARTON, 1977; BORIE et al., 2002; GONZÁLEZ et al., 2004; KEID et
al., 2004; WANKE, 2004).
A ampla disseminação da doença nos canis comerciais parece ocorrer devido
ao desconhecimento dos criadores, que freqüentemente introduzem animais para
III
cobertura, sem antes conhecer seu status sanitário e, também, em face ao caráter
insidioso da enfermidade, uma vez que os animais infectados freqüentemente se
apresentam clinicamente normais (CARMICHAEL & KENNEY, 1968; MOORE, 1969;
GONZÁLEZ et al., 2004).
Os cães infectados raramente manifestam sinais sistêmicos severos, assim
pode ser grande o número de animais que permanecem assintomáticos, atuando
como fontes de infecção potenciais para outros animais (JOHNSON & WALKER,
1992; KEID et al., 2004; WANKE, 2004). Quando presentes, os sinais clínicos
predominantes nas fêmeas são os abortamentos. Nos machos são comuns orquites,
epididimites, prostatites severas e até infertilidade (CARMICHAEL & GREENE, 1993;
WANKE, 2004).
O diagnóstico da brucelose canina é bastante difícil, mesmo na ocorrência de
sinais clínicos. Os testes sorológicos, são os mais usados, entretanto, estão sujeitos a
erros de interpretação. Dessa maneira, o cultivo microbiológico é um dos únicos
métodos definitivos para confirmação do diagnóstico (WANKE, 2004).
O isolamento do agente é definitivo quando a bactéria é isolada, entretanto é
um método que consome muito tempo, não sendo prático como teste de rotina em
animais assintomáticos. Resultados negativos também não eliminam a possibilidade
de infecção, visto que o sucesso no isolamento implica na escolha correta do material
a ser cultivado (CARMICHAEL & BRUNER, 1968; MOORE, 1969; CARMICHAEL &
KENNY, 1970; MOORE & GUPTA, 1970).
O sangue é a melhor amostra a ser cultivada, visto que raramente encontra-se
contaminado, revela resultados positivos já nas primeiras semanas pós-infecção
quando as provas sorológicas ainda produzem resultados negativos, além de a
bacteremia ser prolongada nos cães FLORES-CASTRO & CARMICHAEL, 1978;
CURRIER et al., 1982; NICOLETTI & CHASE, 1987; UEDA et al., 1974; WANKE,
2004).
As culturas de urina e sêmen podem ser úteis para o diagnóstico, mas se
colhidas isoladamente não são confiáveis, visto que resultados negativos não
descartam a possibilidade de infecção (GREENE, 1995).
A cultura da descarga vaginal é a mais indicada para isolamento do agente,
durante o estro ou no período imediatamente após o abortamento (CARMICHAEL &
JOUBERT, 1988; JOHNSON & WALKER, 1992), uma vez que pode conter elevada
concentração da bactéria por semanas após o abortamento (CARMICHAEL & KENNY,
1970; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
IV
Pela rapidez e facilidade de realização, a sorologia geralmente, é utilizada na
triagem das infecções e na verificação do status sanitário de animais de canil. Os
testes sorológicos variam em sensibilidade, especificidade e complexidade, e ainda
apresentam o inconveniente de erros de interpretação, dependendo do estágio da
doença, antígeno ou método utilizado (GREENE, 1995; JOHNSON & WALKER, 1992;
CARMICHAEL & GREENE, 1993, WANKE, 2004).
Resultados falso-positivos podem ocorrer em decorrência da reatividade
cruzada com anticorpos produzidos contra outros microorganismos (JOHNSON &
WALKER, 1992; GREENE, 1995; CARMICHAEL & SHIN, 1996). Resultados falso-
negativos são esperados nas primeiras quatro semanas pós-infecção, uma vez os
testes falham em detectar os anticorpos produzidos nesta fase e, em outras fases da
doença por flutuações nos títulos de anticorpos (JOHNSON & WALKER, 1992; MEGID
et al., 2000).
A soroaglutinação rápida (SAR), além rápida é sensível, detecta anticorpos
precocemente, com aproximadamente seis semanas após o início da bacteremia,
persistindo positiva por três meses após a mesma (GEORGE & CARMICHAEL, 1978;
JOHNSON & WALKER, 1992).
É considerada altamente acurada na identificação dos cães não infectados,
existindo alta correlação entre um teste negativo e ausência de infecção. Resultados
falso-positivos podem ocorrer visto que anticorpos produzidos contra antígenos de
parede celular de outras bactérias podem ser detectados no teste (CARMICHAEL,
1969; JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1993; GREENE,
1995; CARMICHAEL & SHIN, 1996).
Visando diminuir a ocorrência das reações falso-positivas na SAR, os soros
reagentes passaram a ser tratados pelo 2-Mercaptoetanol (2-ME). A SAR-2ME detecta
anticorpos com aproximadamente oito a doze semanas pós-infecção e persiste
positivo por três meses após o término da bacteremia (JOHNSON & WALKER, 1992).
Considerando a importância econômica da doença em canis comerciais, as
particularidades do seu diagnóstico, e os riscos para a população humana, que
mantém contato cada vez mais estreito com os cães, o objetivo deste trabalho foi
comparar os métodos laboratoriais rotineiramente utilizados no diagnóstico da
brucelose canina por B. canis, utilizando a SAR, com e sem o 2-ME, como testes de
triagem e o cultivo microbiológico de diferentes espécimes clínicos com vistas ao
diagnóstico bacteriológico da brucelose canina. Também se comparou a associação
dos métodos sorológicos e de cultivo para o diagnóstico da brucelose canina.
V
MATERIAL E MÉTODOS
ANIMAIS
O estudo foi conduzido em 47 machos e 189 fêmeas, de diferentes raças e
idades, pertencentes a cinco diferentes canis, localizados no estado de São Paulo. Os
animais foram submetidos à anamnese e exame físico, e baseado na sintomatologia,
foram divididos em dois grupos, um composto pelos animais sintomáticos e o outro por
cães assintomáticos.
COLHEITA E PROCESSAMENTO DOS ESPÉCIMES CLÍNICOS
SORO
O soro, obtido por centrifugação do sangue, foi submetido às provas SAR e
SAR-2ME, com o Kit comercial D-Tec
CB (Symbiotics Corporation – San Diego –
USA). Na SAR procedeu-se à reação de 30 µL do antígeno frente a 30µL do soro por
dois minutos com o cartão em repouso. Considerou-se positiva a presença de grumos
e negativa a ausência. Os soros que resultaram positivos, foram reavaliados pela
SAR-2ME, após o tratamento do soro com volumes iguais da solução 2ME
(BADAKHSH et al., 1982).
SANGUE
O sangue colhido assepticamente por venopunção da jugular, foi
acondicionado em tubos a vácuo estéreis contendo citrato de sódio. O cultivo
microbiológico foi realizado segundo Keid (2001), inoculando 2mL sangue a tubos de
cultura contendo 10mL de Caldo Fosfato Triptose, permanecendo por 30 dias
incubados a 37ºC em aerobiose. A cada cinco dias, por um período máximo de 30
dias, procedeu-se o repique do caldo para placas contendo Ágar Triptose.
URINA
A urina foi obtida por cistocentese, e 1,5mL foi acondicionada em tubos
contendo 10mL de caldo Fosfato Triptose acrescido dos antibióticos, Bacitracina
VI
7500UI/L (Inlab), Polimixina B 1800UI/L (Inlab) e Ciclohexamida 30mg/L (ALTON et
al.,1976), permanecendo por cinco dias incubados a 37ºC em aerobiose. Durante
cinco dias consecutivos, procedeu-se o repique do caldo em placas contendo Ágar
Triptose.
SÊMEN, SWAB PREPUCIAL E VAGINAL
O sêmen obtido através de manipulação do pênis foi acondicionado em frascos
estéreis. Na impossibilidade da colheita deste, era substituído pelo swab prepucial,
sendo o processamento deste semelhante ao swab vaginal. Os swabs foram colhidos
e imediatamente acondicionados em tubos contendo caldo fosfato triptose acrescido
dos antibióticos descritos.
Os swabs e o sêmen foram diretamente semeados em placas contendo Ágar
Triptose acrescido de antibiótico. As placas de cultura foram incubadas a 37ºC em
aerobiose até a observação do crescimento de colônias ou por no máximo sete dias.
IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
A identificação das colônias obtidas foi realizada com base nas características
morfo-tintoriais e bioquímicas sendo considerado como critério ausência da
necessidade de CO
2
, crescimento em ágar MacConckey, utilização de citrato,
fermentação de açúcares, liquefação da gelatina, produção de H
2
S, motilidade e indol;
e positividade para redução de nitratos, hidrólise da uréia, oxidase e catalase.
Adicionalmente, foi avaliado o crescimento do agente na presença de diferentes
concentrações de tionina (1:25.000, 1:50.000 e 1:100.000) e fucsina básica (1:50.000
e 1:100.000) (ALTON et al, 1976; CARMICHAEL & BRUNER, 1968; FLORES-
CASTRO et al., 1977).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foram comparados pelo teste de Mc Nemar com o programa Sigma Stat
(SYSTAT, 2002), as proporções de resultados positivos em amostras pareadas
obtidos nas diferentes técnicas e materiais utilizados para o diagnóstico da brucelose
canina (ZAR, 1996). A sensibilidade e a especificidade relativa destas técnicas
também foram calculadas tendo-se como padrão os resultados obtidos no cultivo
microbiológico de todos os materiais, denominado geral. Os métodos foram avaliados
VII
dois a dois, através do cálculo do coeficiente de concordância Kappa (K) com o
programa Win Episcope 2.0 (BLAS et al., 2006).
As proporções resultados positivos nos grupos de machos e fêmeas, e animais
sintomáticos e asssintomáticos, obtidos nos diferentes métodos avaliados, foram
comparadas pelo teste de Qui-quadrado, com o programa Sigma Stat adotando-se o
nível de significância de 5% de probabilidade (ZAR, 1996).
Foi avaliada a associação em paralela da hemocultura e SAR no diagnóstico
da brucelose canina (SOARES & SIQUEIRA, 2002). O cálculo da sensibilidade e
especificidade destes testes associados foi efetuado com o programa Win Episcope
2.0 (BLAS, et al., 2006).
RESULTADOS
Foram avaliados 236 cães quanto à infecção por B. canis, dos quais 57
(24,2%) resultaram positivos na SAR, 24 (10,2%) resultaram positivos na SAR–2ME e
71 (30%) resultaram positivos no isolamento bacteriano. As porcentagens de animais
positivos nos diferentes materiais cultivados estão apresentadas na tabela 1.
Dos cães analisados foram encontrados 53 (22,5%) sintomáticos. Os demais
183 (77,5%) animais eram assintomáticos, a proporção de animais sintomáticos ou
não, positivos nas diferentes técnicas e materiais processados para o diagnóstico da
brucelose canina está demonstrada na tabela 1.
Tabela 1 – Proporção e porcentagem de resultados positivos segundo a condição
clínica e a técnica diagnóstica aplicada aos cães examinados para o
diagnóstico da brucelose canina. Botucatu, 2006.
TÉCNICA
SAR
SAR-2ME
SANGUE
URINA
SWAB SWAB
SÊMEN
VAGINAL
PREPUCIAL
SINTOMAS
PRESENTE (+)
28/53 a 11/53 a 37/53 a 10/46 a 2/49 a 0/1 a 1/3 a
52,8% 20,8% 69,8% 21,7% 4,1% 0,0% 33,3%
AUSENTE (-)
29/183 b 13/183 b 29/183 b 8/150 b 2/140 a 3/21 a 5/18 a
15,8% 7,1% 15,8% 5,3% 1,4% 14,1% 27,7%
TOTAL
57/236. 24/236. 66/236. 18/196. 4/189. 3/22. 6/21.
24,2% 10,2% 28,0% 9,2% 2,1% 13,6% 28,6%
(p<0,001) (p=0,008) (p<0,001) (p=0,002) (p=0,593) (p=0,278) (p=0,622)
CULTIVO MICROBIOLÓGICOSOROLOGIA
VIII
Nas fêmeas os principais sintomas observados foram abortamentos no terço
final da gestação em 36 (73,5%) cadelas, falhas reprodutivas em sete (14,3%), partos
de ninhadas fracas cujos filhotes morreram em poucos dias em quatro (8,2%),
linfadenopatia em quatro (8,2%) e nascimento de natimortos em outras duas (4, 1%)
cadelas.
Nos machos observou-se em um dos animais aumento dos testículos; outro
cão apresentou aumento e alteração de consistência do testículo; aumento do
testículo e epidídimo foi observado em um terceiro macho e um quarto animal
apresentou calcificação no epidídimo.
Como demonstrado na tabela 1, não se observou diferença significativa de
resultados positivos no cultivo microbiológico de swab vaginal, prepucial e sêmen,
entre os animais que apresentavam ou não sintomas, entretanto ela foi observada de
maneira significativa nas proporções de resultados positivos nas provas de SAR,
SAR–2ME e cultivo microbiológico de sangue e urina entre os grupos estudados.
Não foi observada diferença significativa na proporção de positivos nas provas
de SAR, SAR–2ME e hemocultura, quando comparados machos e fêmeas. No
entanto, esta foi observada de maneira significativa na proporção de resultados
positivos quando comparada à cultura de urina de machos e fêmeas, assim como, a
proporção de machos positivos no cultivo de sêmen e swab prepucial,
comparativamente ao swab vaginal em fêmeas positivas, como demonstrado na tabela
2.
Tabela 2 – Proporção e porcentagem de resultados positivos segundo o sexo e a
técnica diagnóstica aplicada aos cães examinados para o diagnóstico da
brucelose canina. Botucatu, 2006.
TÉCNICA
SAR
SAR-2ME
SANGUE
URINA
SWAB
VAGINAL, PREPUCIAL
OU SÊMEN
SEXO
MACHOS
8/47 a 3/47 a 10/47 a 9/38 a 9/43 a
17,0% 6,4% 21,3% 23,7% 20,9%
FÊMEAS
49/189 a 21/189 a 56/189 a 9/158 b 4/189 b
25,9% 11,1% 29,6% 5,7% 2,1%
TOTAL
57/236.
24/236.
66/236.
18/196.
13/232.
24,2%
10,2%
28,0%
9,2%
5,6%
(p=0,277) (p=0,490) (p=0,337) (p=0,002) (p<0,001)
CULTIVO MICRO BIOLÓGICOSOROLOGIA
IX
Os resultados comparativos das provas de SAR e SAR–2ME revelaram
concordância moderada (Kappa 0,525). Resultaram positivos na SAR 57 (24,2%)
animais, dos quais 24 (10,2%) foram confirmados na SAR–2ME, demonstrando ser
estatisticamente significante (X
2
=31,03, p<0,001). Outros 33 (57,9%) animais positivos
à SAR e resultaram negativos na SAR-2ME.
A comparação entre as provas de SAR e cultivo microbiológico geral, revelou
concordância moderada (Kappa 0,637). Resultaram positivos na SAR 57 (24,2%)
animais, destes 47 (82,5%) foram positivos e 10 (17,5%) negativos no cultivo. Dos 179
(75,8%) animais que resultaram negativos na SAR, 24 (13,4%) foram positivos na
cultura. Não se observou diferença significativa na proporção de positivos na SAR e
no cultivo microbiológico geral (X
2
=4,97, p=0,026). A sensibilidade e a especificidade
relativa da SAR foram calculadas respectivamente em 66,2% e 94,1%.
A comparação dos resultados obtidos nas provas de SAR–2ME e cultivo
microbiológico geral revelou concordância fraca (Kappa 0,342). Resultaram positivos
na SAR–2ME 24 (10,2%) animais, dos quais 21 (87,5%) foram positivos e três (12,5%)
negativos no cultivo microbiológico. Dos 212 (89,8%) negativos na SAR–2ME, 50
(23,6%) foram positivos ao isolamento, sendo observada diferença significativa na
proporção de positivos na SAR–2ME e no cultivo (X
2
=39,93, p<0,0001). A
sensibilidade e a especificidade relativa da SAR–2ME foram calculadas
respectivamente em 29,5% e 98,2%.
Os resultados comparativos da hemocultura frente aos da cultura geral
revelaram concordância boa (Kappa 0,945). Resultaram positivos na hemocultura 66
(28%) cães. Dos 170 (72%) negativos na hemocultura, cinco (2,9%) resultaram
positivos no cultivo geral de outros materiais processados. A proporção de positivos na
cultura de sangue e na cultura geral não diferiu significativamente (X
2
=3,20, p=0,074).
A sensibilidade relativa da hemocultura foi calculada em 92,9%.
Os resultados comparativos da urocultura frente ao cultivo microbiológico geral
revelaram concordância fraca. Resultaram positivos na urocultura 18 (9,2%) cães. Dos
178 (90,8%) animais negativos na urocultura, 42 (23,6%) foram positivos no cultivo
microbiológico geral de outros materiais. Foi observada diferença significativa na
proporção de positivos na urucultura e no cultivo geral (X
2
=40,02, p<0,001). A
sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de urina foi calculada em 30%.
A comparação entre o cultivo microbiológico de swab vaginal em fêmeas e o
cultivo microbiológico geral de todos os materiais processados revelou concordância
fraca (Kappa 0,093). Resultaram positivas no swab vaginal quatro (2,1%) cadelas. Das
185 (97,9%) fêmeas negativas no swab vaginal, 54 (29,2%) foram positivas na cultura
geral dos outros materiais processados. Foi observada diferença significativa entre as
X
proporções de fêmeas positivas no cultivo microbiológico de swab vaginal e no cultivo
microbiológico geral (X
2
=52,01, p<0,001). A sensibilidade relativa do cultivo
microbiológico de swab vaginal foi calculada em 6,9%.
Os resultados comparativos do cultivo microbiológico de swab prepucial e o
cultivo microbiológico geral revelaram concordância moderada (Kappa 0,593).
Resultaram positivos na cultura de swab prepucial três (13,6%) machos. Dos 19
(86,4%) machos negativos na cultura deste material, três (15,8%) foram positivos no
cultivo geral. A proporção de machos positivos no cultivo microbiológico de swab
prepucial e no cultivo microbiológico geral não diferiu significativamente (X
2
=1,33,
p=0,248). A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de swab prepucial foi
calculada em 50%.
A comparação entre os resultados do cultivo microbiológico de sêmen e do
cultivo microbiológico geral revelou concordância moderada (Kappa 0,696).
Resultaram positivos na cultura de sêmen seis (28,6%) machos. Dos 15 (71,4%)
negativos na cultura deste material, três (20%) foram positivos no cultivo
microbiológico. Não foi observada diferença significativa entre as proporções de
machos positivos no cultivo microbiológico de sêmen e no cultivo microbiológico geral
(X
2
=1,33, p=0,248). A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de sêmen foi
calculada em 66,7%.
Visto que a SAR demonstrou moderada sensibilidade quando utilizada
isoladamente no diagnóstico da brucelose canina, determinaram-se os valores de
sensibilidade e especificidade de um teste associando em paralelo a SAR e a
hemocultura, respectivamente, em 97,6% e 93,9%.
DISCUSSÃO
A ausência de diferença na proporção de machos e fêmeas sororeagentes
para B. canis já havia sido observada por Almeida et al. (2004), Souza et al. (2002) e
Germano et al. (1987). Estes resultados são reforçados, adicionalmente, por Azevedo
et al (2003) e Moraes et al. (2002) que concluíram não existir predisposição de sexo
quanto ao risco de infecção pela B. canis, estando machos e fêmeas, igualmente
expostos ao risco de infecção.
A diferença significativa observada na proporção de machos e fêmeas positivas
na cultura de urina, assim como na proporção de machos positivos no cultivo de
sêmen e swab prepucial frente às fêmeas positivas no cultivo de swab vaginal está em
concordância com Moore & Kakuk (1969), ao sugerirem que a bactéria foi isolada mais
freqüentemente na urina de machos comparativamente as fêmeas naturalmente
XI
infectadas. Esta hipótese pode ser explicada pela infecção persistente da B. canis na
próstata e epidídimo, e resultando em eliminação da bactéria de modo intermitente,
juntamente com o fluído seminal.
Adicionalmente, a estreita relação anatômica entre a próstata, o epidídimo e a
vesícula urinária poderia explicar a presença de um número maior de machos
infectados eliminando a bactéria na urina do que nas fêmeas (CARMICHAEL &
JOUBERT, 1988; JOHNSON & WALKER, 1992; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
O menor percentual de fêmeas positivas na cultura de urina frente aos machos
pode ser explicado pela propensão destas as infecções do trato urinário (BARSANTI,
1998), assim freqüentemente as amostras de urina das fêmeas podem estar
contaminadas com outros microrganismos (SERIKAWA et al., 1978) e mascarar o
isolamento da B. canis.
O baixo percentual de isolamento da bactéria a partir do swab vaginal, pode
ser explicado pelo fato de terem sido estudadas fêmeas em todas as fases do ciclo
estral, independentemente da presença de secreção vaginal, do histórico de
abortamento ou parto recente.
Adicionalmente, já foi demonstrado que a cultura de swab vaginal de cadelas
com ausência de secreção vaginal, freqüentemente não contém a bactéria (MOORE,
1969; CARMICHAEL & JOUBERT, 1988).
Também foi ressaltado que a eliminação da bactéria ocorre nas descargas
vaginais de fêmeas infectadas durante algumas semanas após o abortamento ou
durante o estro (CARMICHAEL & JOUBERT, 1988; JOHNSON & WALKER, 1992). De
forma diferenciada destes autores, a pesquisa desenvolvida não observou o
isolamento da bactéria no swab vaginal das fêmeas em estro.
Carmichael & Greene (1998) também sugeriram que o útero de fêmeas não
prenhes e em diestro, pode ser um ambiente hostil ao crescimento da bactéria, o que
poderia justificar o baixo percentual de isolamento observado neste experimento.
No que se refere aos animais sintomáticos, foram observados resultados
semelhantes aos de Keid et al. (2004) que encontraram 22,8% de animais
clinicamente sintomáticos ao avaliar cães pertencentes a canis comerciais.
Os sintomas observados, neste experimento, caracterizados principalmente por
abortamentos em fêmeas e alterações testiculares e de epidídimo em machos,
coincidem com os descritos por Moore, 1969; Carmichael & Kenny, 1970; Hubbert et
al., 1980; Currier, 1982.
Os resultados deste experimento demonstraram associação estatística da
sintomatologia clínica com resultados positivos na SAR, SAR-2ME, cultivo
microbiológico de sangue e urina, aspectos apontados, também por Keid (2001) que
XII
revelou associação estatística entre sintomatologia e resultados positivos nos testes
de IDGA-2ME e hemocultura.
Um dos principais sintomas observados por esta pesquisa nas fêmeas foi o
abortamento, aspecto discordante de Azevedo et al. (2003) que não encontraram
associação estatística entre a ocorrência de abortamentos e a soropositividade para B.
canis. Provavelmente, estes autores não encontraram a referida associação, por terem
conduzido o estudo em uma amostra aleatória, de animais do município de Santana
do Parnaíba, e analisado pequeno número de animais que apresentavam problemas
reprodutivos, enquanto este estudo foi conduzido em canis comerciais, com muitos
animais apresentando histórico de abortamentos, infertilidade e nascimento de
ninhadas fracas ou natimortos (AZEVEDO et al., 2003).
Portanto, assim como Hubbert et al. (1980) e Keid (2001), os resultados
sugerem existir correlação entre as alterações clínicas e a suspeita de infecção,
devendo esta ser confirmada por métodos sorológicos e bacteriológicos (GREENE,
1995; JOHNSON & WALKER, 1992, CARMICHAEL & SHIN, 1996).
As porcentagens de positivos obtidas na SAR e SAR-2ME no trabalho foram
inferiores as obtidas por Vargas et al. (1996) e por Keid (2001) que observaram
respectivamente 72,7% e 44,8% de soropositivos na IDGA em animais pertencentes a
canis comerciais. Azevedo et al (2004) também observaram porcentagens superiores
às deste trabalho, utilizando IDGA (48,75%) e IDGA-2ME (18,75%) em 80 soros
caninos colhidos durante a campanha de vacinação anti-rábica de Santana de
Parnaíba. O percentual de animais com sorologia positiva apresentado neste estudo,
no entanto, é concordante com Megid et al. (1999) que revelaram soropositividades,
variando de 4,6% a 57,1%, pela prova de IDGA em quatro diferentes canis comerciais.
As diferentes soropositividades obtidas pelos autores citados podem ser
explicadas pela variação da população estudada e pelos métodos sorológicos
empregados nas diferentes pesquisas, que diferem em sensibilidade e especificidade.
A presença de animais positivos na prova de SAR, que resultaram negativos na
SAR-2ME pode ser conseqüência da diminuição do título sorológico em duas vezes,
em função do tratamento dos soros pelo 2-ME, como relatado previamente por
Carmichael (1976) e Flores-Castro & Carmichael (1978) ou pela detecção de animais
em fase inicial de infecção que só apresentam IgM, as quais são destruídas por ação
do 2-ME (JOHNSON & WALKER, 1992).
Dos animais positivos a SAR, obteve-se em 82,5% isolamento da bactéria,
sugerindo que grande parte dos animais positivos na SAR está realmente infectada.
Não se verificou isolamento em 17,5% dos animais positivos na SAR, podendo tal fato
ser justificado por reações inespecíficas falso-positivas, decorrentes da reatividade
XIII
cruzada com outros microorganismos (CARMICHAEL, 1976; JOHNSON & WALKER,
1992). Entretanto, como pertenciam a canis onde o manejo reprodutivo é precário e
com casos confirmados da doença, é possível que estes animais estivessem
realmente infectados, mas não tenham sido detectados na cultura (KEID et al., 2004).
Dos animais negativos na SAR obteve-se 13,4% positivos no cultivo
microbiológico, destes 75% apresentaram a bactéria exclusivamente em sangue, 8,3%
apresentaram em sangue e urina, 12,5% exclusivamente em urina e 4,1% em urina e
swab prepucial.
O isolamento do agente a partir de hemocultura de animais negativos na SAR
pode indicar fase inicial de infecção, uma vez que nesta fase a hemocultura parece ser
mais sensível que as provas sorológicas. A hemocultura é capaz de detectar a
bactéria duas a quatro semanas após a infecção, período no qual a SAR pode ter
resultado negativo (CARMICHAEL & SHIN, 1996; CARMICHAEL & GREENE, 1998).
Entretanto, todos os animais com hemocultura positiva e SAR negativa foram
reavaliados transcorridos 30 dias do primeiro teste e muitos continuaram negativos na
SAR, sugerindo não início de infecção, mas ocorrência de flutuações nos títulos de
anticorpos, mesmo durante a bacteremia (JOHNSON & WALKER, 1992), como
verificado por Megid et al. (2000).
O isolamento positivo somente em urina e/ou swab prepucial dos animais
negativos na SAR pode indicar infecção crônica. Esta possibilidade se justifica pelos
relatos de isolamento de B. canis em sêmen de animais com infecções crônicas, os
quais apresentavam baixos títulos nas provas sorológicas, decorrentes da localização
do agente na próstata e testículos após a bacteremia (MOORE & KAKUK, 1969;
FLORES-CASTRO et al, 1977; WOOLEY et al, 1978; JOHNSON & WALKER, 1992).
O percentual de falso-positivos na SAR (17,5%) encontrados neste trabalho
difere de vários autores, que relataram percentuais próximos a 50% (CARMICHAEL &
JOUBERT, 1988; CARMICHAEL & SHIN, 1996; WANKE, 2004). Esta diferença pode
ser justificada pelo fato da maioria dos autores terem classificado os animais em
positivos ou negativos, somente por comparação entre provas sorológicas, não tendo
sido realizado cultivo microbiológico.
O percentual de animais falso-negativos na SAR (13,4%) encontrado neste
experimento, também foi superior ao observado por outros autores (ZOHA &
CARMICHAEL, 1982; NICOLETTI & CHASE, 1987; JOHNSON & WALKER, 1992;
CARMICHAEL & SHIN, 1996), podendo ser justificado pela presença de animais em
fase crônica de doença, que como citado anteriormente, resultaram negativos na SAR,
mas apresentaram isolamento da bactéria em urina e/ou swab prepucial, aspecto
XIV
observado por Flores-Castro et al. (1977), Wooley et al. (1978) e Flores-Castro &
Carmichael (1978).
Outros resultados falso-negativos observados neste experimento, ocorreram
em animais negativos a SAR que apresentaram isolamento da bactéria em
hemocultura, fato este observado por Larsson et al. (1984) em animais
experimentalmente infectados com B. canis, positivos na hemocultura e que não
apresentaram reação na SAL. Cães experimentalmente infectados com Brucella
abortus, confirmados no isolamento apresentaram-se negativos em provas de
aglutinação, como a SAL, SAL-2ME e Rivanol (MÓLNAR et al., 2001).
Foi observada neste experimento diminuição acentuada na sensibilidade da
SAR-2ME frente ao cultivo, a qual pode ser explicada pela ação do 2ME, que pode
diminuir o título sorológico em duas vezes, como observado por Carmichael (1976) e
Flores-Castro & Carmichael (1978). O 2-ME também pode desnaturar IgMs,
predominantes na fase inicial da doença, dificultando o diagnóstico de animais nesta
fase da infecção (JOHNSON & WALKER, 1992).
Os resultados deste trabalho diferem de Badakhsh et al (1982) e Carmichael &
Shin (1996), ao afirmarem que o 2-ME permite o aumento da especificidade da prova
sem redução de sua sensibilidade. A diminuição de sensibilidade observada nos
estudos, não observada por Badakhsh et al (1982) e Carmichael & Shin (1996) talvez
possa ser reflexo da população estudada, que neste caso parece ser constituída de
animais na fase inicial da doença e animais já apresentando flutuações nos títulos de
anticorpos.
A hemocultura demonstrou boa sensibilidade relativa, uma vez que resultaram
positivos na hemocultura 92,9% dos positivos no cultivo microbiológico geral. Estes
resultados corroboram com a literatura que afirma ser o sangue a melhor amostra a
ser cultivada na tentativa de isolamento da bactéria, uma vez que nos cães a
bacteremia é prolongada (CARMICHAEL & BRUNER, 1968; MOORE, 1969;
CARMICHAEL & KENNY, 1970; MOORE & GUPTA, 1970; FLORES-CASTRO &
CARMICHAEL, 1978).
Embora vários materiais possam ser utilizados na detecção da B. canis, o
sangue é referido como o melhor, pelo fato deste material raramente se encontrar
contaminado e fornecer resultados positivos nas infecções agudas, mesmo quando
níveis de anticorpos no soro, ainda não são detectáveis (CARMICHAEL & KENNY,
1970; JOHNSON & WALKER, 1992; KEID et al., 2004; WANKE, 2004).
O cultivo microbiológico de urina apresentou baixa sensibilidade relativa (30%),
aspecto concordante com Greene (1995) que sugeriu que as culturas de urina são
XV
úteis para o diagnóstico se associadas a outros métodos mais sensíveis, uma vez que
se colhidos isoladamente não são confiáveis pela baixa sensibilidade das técnicas.
A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de swab vaginal foi 6,9%. Nas
observações deste trabalho a cultura do fluido vaginal revelou ter validade no
diagnóstico da infecção, apenas no período após o abortamento, uma vez que dos
quatro isolamentos obtidos, três ocorreram após abortamento, aspecto concordante
com Johnson & Walker (1992), que sugeriu ser um material importante para a cultura
após o abortamento, assim como uma importante via de eliminação da bactéria, capaz
de transmitir a infecção a outros animais.
A cultura do fluido prepucial mostrou-se relativamente interessante, uma vez
que apresentou sensibilidade relativa de 50%. O inconveniente na cultura desse
material é a grande quantidade de contaminantes que pode mascarar o lento
isolamento da B. canis.
A sensibilidade relativa do cultivo microbiológico de sêmen foi calculada em
66,7%. O sêmen apresentou uma porcentagem alta de isolamentos aspecto
discordante de Keid (2001), que encontrou poucos isolamentos.
Nos isolamentos obtidos nesse trabalho foram observadas características
morfológicas e bioquímicas semelhantes às obtidas por Fernandes et al (1976-7),
Godoy et al. (1977), Vargas et al. (1996), Gomes et al. (1999) e Keid et al. (2004).
Houve discordância dos isolamentos obtidos com os realizados por Riecke &
Rhoades (1975), Larson & Costa (1980) e Forbes & Pantekoek (1988) no tocante a
produção de H
2
S. Estes autores relataram que após alguns dias de incubação suas
culturas foram capazes de produzir de H
2
S o que não foi observado nos 97
isolamentos obtidos neste trabalho.
No tocante a capacidade de reduzir nitratos, dezoito (18,5%) dos isolados
obtidos foram incapazes de reduzi-lo. Flores-Castro & Carmichael (1986) observaram
comportamento semelhante, quando analisaram o comportamento bioquímico 28
cepas de B. canis isoladas campo frente à cepa referência RM 666 de B. canis.
CONCLUSÕES
A SAR apresentou sensibilidade (66,2%) moderada, com boa especificidade
(94,1%), e seria prejudicial para um programa de saneamento se tivesse sido utilizado,
isoladamente, como teste de triagem, visto que vários animais negativos a SAR,
porém infectados, ficariam sem diagnóstico e atuando como fontes de infecção no
canil. Assim, sugere-se que a SAR, não deva ser utilizada sozinha como teste de
XVI
triagem, pois a baixa sensibilidade do teste nas fases mais crônicas da infecção pode
dificultar bastante o diagnóstico.
Os valores de sensibilidade e a especificidade da associação da SAR à
hemocultura, demonstraram aumento considerável da sensibilidade relativa do teste
sorológico, comparativamente ao seu uso isolado, reforçando que a combinação
destes testes melhora a eficiência do diagnóstico.
O tratamento dos soros positivos a SAR com 2–ME parece ser um
procedimento dispensável no diagnóstico, uma vez que a SAR-2ME apresentou
sensibilidade muito baixa e não serve como teste confirmatório, pois não elimina todas
as possibilidades de reações inespecíficas, podendo ser, com vantagem, substituída
pela hemocultura.
A cultura de urina demonstrou baixa sensibilidade no diagnóstico da doença,
sobretudo nas fêmeas. Em machos seu desempenho foi satisfatório, sugerindo-se,
entretanto, seu uso associado à hemocultura no diagnóstico confirmatório das
infecções, principalmente em machos.
A cultura do fluido prepucial e do sêmen demonstraram moderada
sensibilidade, podendo ser utilizadas associadas a outros métodos mais sensíveis,
visto que resultados negativos, quando colhida isoladamente, não são confiáveis.
A cultura de swab vaginal apresentou uma sensibilidade muito baixa e parece
mostrar resultados satisfatórios, apenas no diagnóstico microbiológico das fêmeas, por
algumas semanas após o parto ou abortamento.
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