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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
CONTROLE DE Alternaria solani EM TOMATEIRO (Lycopersicon
esculentum) COM ÓLEOS ESSENCIAIS
CARLOS LUIZ MILHOMEM DE ABREU
Engenheiro Agrônomo
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP -
Campus de Botucatu, para obtenção do
Título de Doutor em Agronomia –
Horticultura.
BOTUCATU-SP
Fevereiro - 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
CONTROLE DE Alternaria solani EM TOMATEIRO (Lycopersicon
esculentum) COM ÓLEOS ESSENCIAIS
CARLOS LUIZ MILHOMEM DE ABREU
ORIENTADOR: PROF. DR. FRANCISCO LUIZ ARAÚJO CÂMARA
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP -
Campus de Botucatu, para obtenção
do Título de Doutor em Agronomia –
Horticultura.
BOTUCATU-SP
Fevereiro - 2006
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III
“A terra que absorve a chuva que cai,
produz erva útil para aqueles que a
cultivam sob a benção de Deus”.
HEBREUS 6:7
IV
Dedico este trabalho a meus filhos Juliana,
Danilo e Patrícia; meus pais: Eustáquio e
Ivanildes; irmãos: Raquel, Lucia, Regina,
Éster, Aparecida, Epitácio, Fábio, Clóvis “in
memória” e Eudes; cunhados: Sizenando,
Sidney, Pedro, Jésus, Jesus, Lucineide.
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por estar presente na minha vida e ter abençoado a
todos nós envolvidos na realização desse trabalho.
À EMPAER-MT pela liberação para o curso de Doutorado.
À Eliane Castilho de Carvalho de Abreu, mãe de meus filhos, pelo
carinho, incentivo e apoio.
Ao Professor Dr. Francisco Luiz Araújo Câmara, pelo acolhimento,
amizade e orientação.
Ao professor Dr. Edson Luiz Furtado, pelo apoio na execução desse
trabalho e atenção e amizade.
À professora Drª Márcia Ortiz Mayo Marques pela colaboração na
análise dos óleos essenciais.
Aos professores Dr. Lin Chau Ming e Drª Rumy Goto, Dr. Ismael,
Drª Regina e Drª Sarita pela atenção, compreensão e espírito profissional.
À colega Mariana Zatarim pela convivência, amizade e apoio nos
dias difíceis.
Ao colega Chrystian Iezid Maia e Almeida pela convivência,
amizade e colaboração nas análises estatísticas.
Às secretárias Elizabete, Rosemeire e todos funcionários do
Departamento de Produção Vegetal – Setores de Horticultura e Defesa Fitossanitária.
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da F. C. A - UNESP-
Botucatu, pelo carinho e atenção.
Aos colegas gratidão, pelos momentos alegres e tristes vividos e
proporcionados pelo curso de pós-graduação.
À FAPESP pela concessão de recursos financeiros para realização
desse trabalho.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo.
Às famílias: Didi Baldini , Antônio Benedicto, Takao, Mitsu Hino e
todos agricultores da Associação dos Produtores Orgânicos de Botucatu-SP, pela
convivência.
VI
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS ............................................................................................... VIII
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ IX
RESUMO..................................................................................................................... 1
ABSTRACT................................................................................................................ 2
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... 3
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 5
2.1 Aspectos da doença...................................................................................... 5
2.2 O patógeno................................................................................................... 6
2.3 Óleos essenciais no controle de doenças de plantas.................................... 7
2.3.1 Eucalyptus citriodora Hook........................................................... 10
2.3.2 Cinnamomum zeylanicum Breym.................................................... 11
2.3.3 Citrus [(Citrus limon (Linn.) Osbeck) e Citrus sinensis var.
dulcis.] (Linn.) Osbeck)............................................................................
12
2.3.4 Cymbopogon citratus Staph............................................................ 13
2.3.5 Cymbopogon Martini Staph............................................................. 15
2.3.6 Melaleuca alternifolia Cheel........................................................... 16
2.3.7 Mentha piperita L............................................................................ 16
2.3.8 Piper hispidinervium ( C.DC.)........................................................ 17
2.3.9 Rosmarinus officinalis L................................................................. 18
2.3.10 Syzygium aromaticum Merril et Perry 18
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 20
3.1 Local de execução....................................................................................... 20
3.2 Obtenção e manutenção de isolados............................................................ 20
3.3 Obtenção de conídios................................................................................... 21
3.4 Óleos essenciais e sua composição.............................................................. 21
3.5 Avaliação “in vitro” do crescimento micelial do isolado de Alternaria
solani sob ação dos óleos essenciais.................................................................. 22
VII
3.6 Avaliação “in vitro” da germinação de conídios de isolado de Alternaria
solani sob ação de óleos essenciais................................................................... 23
3.7 Controle de Alternaria solani em tomateiro em ambiente protegido com
uso de óleos essenciais de plantas...................................................................... 24
3.8 Controle de Alternaria solani em tomateiro cultivado a campo com uso
de óleos essenciais............................................................................................. 25
3.9 Vida útil pós-colheita de frutos de tomateiro cultivado a campo com uso
de óleos essenciais para controle de Alternaria solani....................................... 26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 27
4.1. Óleos essenciais e sua composição.............................................................. 27
4.2 Avaliação “in vitro” do crescimento micelial de Alternaria solani sob
ação dos óleos essenciais.................................................................................... 30
4.3 Avaliação “in vitro” da germinação de conídios de Alternaria solani sob
ação de óleos essenciais...................................................................................... 39
4.4 Controle de Alternaria solani em tomateiro em ambiente protegido com
uso de óleos essenciais....................................................................................... 41
4.5 Controle de Alternaria solani em tomateiro cultivado a campo com uso
de óleos essenciais.............................................................................................. 43
4.6 Vida útil pós-colheita de frutos de tomateiro cultivado a campo com uso
de óleos essenciais para controle de Alternaria solani...................................... 48
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................. 53
6 CONCLUSÕES...................................................................................................... 55
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 56
8 APENDICE........................................................................................................... 67
VIII
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 Resultados das análises dos óleos essenciais. Botucatu-SP. 2003............ 28
Tabela 2 Coeficientes angulares do crescimento micelial de Alternaria solani “in
vitro”, sob efeito de diferentes óleos essenciais e suas concentrações.
Botucatu, 2003. ........................................................................................ 30
Tabela 3 Coeficientes angulares do crescimento micelial de Alternaria solani “in
vitro”, sob efeito de diferentes óleos essenciais e suas concentrações.
Botucatu, 2003. ........................................................................................ 38
Tabela 4 Germinação de conídios de Alternaria solani “in vitro” sob ação dos
óleos essenciais. Botucatu-SP, 2003. ........................................................ 39
Tabela 5 Folhas e folíolos com sintomas de A. solani em tomateiro cv. Santa
Clara, cultivados em vasos, sob ambiente protegido, tratado com
diferentes óleos essenciais e concentrações, avaliados aos 57 dias após
transplantio. Botucatu-SP, 2003. ............................................................. 41
Tabela 6 Produção de frutos (kg/parcelas) e índice de doenças, de tomateiro c.v.
Rio Grande cultivado a campo, sob aplicação de óleos essenciais para
controle da Alternaria solani. Botucatu-SP, 2005. .................................. 44
Tabela 7 Porcentagem de frutos descartados de tomateiro tratados com óleos
essenciais no controle de Alternaria solani, armazenados à temperatura
ambiente. Botucatu, 2005. ....................................................................... 49
Tabela 8 Análise química do solo do local do experimento a campo. Botucatu,
2004. ....................................................................................................... 68
Tabela 9 Dados climáticos registrados na Fazenda Experimental Lageado no
período de 17/10/2004 a 0/01/2005. Botucatu-SP, 2005. ........................ 69
IX
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Coeficientes angulares para crescimento micelial de Alternaria solani
sob efeitos de óleos essenciais. Botucatu, 2003. .....................................
32, 33,
34
Figura 2 Óleos essenciais e suas concentrações na inibição total do micélio de A.
solani. Botucatu, 2003. ........................................................................... 36, 37
Figura 3 Efeitos dos óleos essenciais e TM + C (tiofanato metílico +
chlorothalonil) no controle da Alternaria solani do tomateiro cultivado
a campo.Botucatu, 2005. ......................................................................... 45
Figura 4 Conservação pós-colheita de frutos de tomateiro cultivado a campo,
tratadas com TM + C (tiofanato metílico + chlorothalonil) e óleos
essenciais, para controle de Alternaria solani. Botucatu, 2005. ............. 50
1
CONTROLE DE Alternaria solani EM TOMATEIRO (Lycopersicon esculentum)
COM ÓLEOS ESSENCIAIS
Autor: CARLOS LUIZ MILHOMEM DE ABREU
Orientador: Prof. Dr. FRANCISCO LUIZ ARAÚJO CÂMARA
RESUMO
O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) é uma das principais hortaliças de valor
econômico no mundo e é a segunda solanácea mais cultivada, sendo superada apenas pela
batata. Essa espécie está sujeita a várias doenças que comprometem seu desenvolvimento, e
dentre ela está a pinta preta, provocada pela ação do fungo Alternaria solani (ELL. &
Martin) Jones & Grout. É a doença mais freqüente nos cultivos de tomate oque resulta no
uso indiscriminado de defensivos agrícolas com alta toxicidade, comprometendo a
qualidade do alimento. Neste contexto, estudou-se a ação inibitória dos óleos essenciais de
diversas espécies de plantas no desenvolvimento fungo Alternaria solani, “in vitro”, e no
controle da pinta preta em tomateiro cultivado. Na avaliação “in vitro”, os óleos essenciais
das espécies Cinnamomum zeylanicum, Cymbopogon citratus e Syzygium aromaticum
inibiram totalmente o crescimento micelial e a germinação dos conídios a partir da
concentração 750 μL/L
-1
; Eucalyptus citriodora e Melaleuca alternifolia a partir da
concentração de 2000 μL/L
-1
, e Mentha piperita na concentração de 5000 μL/L
-1
. No
tomate cultivado em ambiente protegido, os óleos essenciais de Cinnamomum zeylanicum,
Cymbopogon martini, Cymbopogon citratus e Syzygium aromaticum, aplicados de forma
preventiva, em intervalos de 3 dias, inibiram a doença na planta a partir de 750 μL/L
-1
, e
Eucalyptus citriodora a 5000 μL/L
-1
. No cultivo a campo, os óleos essenciais de Eucalyptus
citriodora, Cinnamomum zeylanicum e Cymbopogon citratus inibiram a doença, mas não
foram tão eficientes quanto o fungicida tiofanato metílico + chlorothalonil. Os frutos do
tomateiro cultivado a campo submetido a pulverizações com óleos essenciais e o fungicida
para controle de A. solani apresentaram maior vida útil pós-colheita, em ambiente natural.
Palavras-chave: doenças fúngicas, manejo alternativo, agroecologia.
2
CONTROL OF Alternaria solani IN TOMATO (Lycopersicon esculentum) USING
ESSENTIAL OILS.
Author: CARLOS LUIZ MILHOMEM DE ABREU
Adsiver: Prof. Dr. FRANCISCO LUIZ ARAÚJO CÂMARA
ABSTRACT
Lycopersicon esculentum Mill is one of the main vegetable crop with economic value in the
world and is the second solanacea cultivated, being surpassed only for the potato. This
species is vulnerable to some diseases that compromise its development, and among them
here is the black dot, caused by Alternaria solani fungi (ELL. & Martin) Jones & Grout.
This disease is the most usual in tomato crop, and as a consequence, results in the abusive
use of agricultural defensives with high toxicity. In this context, it was studied inibitory
action of essential oils of several species of plants in the development of Alternaria solani,
"in vitro", and in the control of the black dot in cultivated tomato. In the evaluation "in
vitro", the essential oil of species Cinnamomum zeylanicum, Cymbopogon martini,
Cymbopogon citratus and Syzygium aromaticum totally inhibited the micelial growth and
the germination of the conidia at concentration 750 µL/L
-1
; Eucaliptus citriodora and
Melaleuca alternifolia at the concentration of 2000 µL/L
-1
, and Mentha piperita at
5000µL/L
-1
. In the tomato cultivated protection, the essential oil of Cinnamomum
zeylanicum, Cymbopogon martini, Cymbopogon citratus and Syzygium aromaticum,
applied in a preventive form, in intervals of 3 days, inhibited the symptom in the plant at
750 µL/L
-1
, and the Eucaliptus citriodora 5000 µL/L
-1
. In field condictions the essential
oils of Eucaliptus citriodora, Cinnamomum zeylanicum and Cymbopogon citratus inhibited
the symptons, but werenit so efficient as fungicide methylic tiofanate + chlorothalonil. The
fruits harvested in field experiment which sumitted to sprayings with essential oil and the
fungicide control, presented greater post-harvest,shelft life in the natural storage.
Keywords: fungi diseases, alternative management, agroecology.
3
1
INTRODUÇÃO
O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) é uma das principais
hortaliças de valor econômico no mundo e é a segunda solanácea mais cultivada, sendo
superada apenas pela batata.
A espécie está sujeita a várias doenças que comprometem seu
desenvolvimento, e dentre elas está a pinta preta causada pelo fungo Alternaria solani
(ELL. & Martin) Jones & Grout, que se caracteriza como a doença mais freqüente em
cultivos de diversas regiões brasileiras.
A doença ocorre em plantas de cultivares e híbridos com baixos
níveis de resistência. Toda a parte aérea da planta pode ser afetada em qualquer idade, mas
por ocasião da colheita, quando os frutos encontram-se em diferentes estágios de
desenvolvimento, botões florais, frutos verdes e maduros, sua ação é maior.
Para o controle desta doença, um conjunto de medidas pode ser
usado, como tratamento de sementes com fungicidas, rotação de culturas com poáceas,
escolha de local evitando as áreas de baixadas, adubação equilibrada, uso de matéria
orgânica e pulverizações preventivas com fungicidas, à base de mancozeb e chlorotalonil,
dentre outros, com intervalo de aplicação de 3 a 7 dias. Esta prática, todavia, coloca em
4
risco a saúde do agricultor e do consumidor, quando não são obedecidos os períodos de
carência, uma vez que o tomate é colhido diariamente.
Novas alternativas devem ser estudadas, visando à conservação do
meio ambiente e à qualidade de vida dos consumidores e trabalhadores, com práticas de
controle de doenças com uso de produtos ou substâncias naturais, objetivando otimizar a
produção de alimentos saudáveis, de alta qualidade e menor impacto ao meio ambiente.
As pesquisas com o uso de substâncias orgânicas vegetais para o
controle de pragas e doenças na agricultura e pecuária intensificaram-se no mundo inteiro,
dentro do novo enfoque de desenvolvimento tecnológico que se tem proposto para a
exploração agrícola, revendo e revelando novos conceitos de sustentabilidade.
Esse trabalho teve por objetivo estudar a ação inibitória dos óleos
essenciais de diversas espécies de plantas no desenvolvimento do fungo Alternaria solani,
“in vitro” e no controle da pinta preta em tomateiro cultivado.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos da doença
A pinta preta, causada por Alternaria solani (ELL. & Martin) Jones
& Grout, ocorre com freqüência em tomateiro, atacando as hastes, folhas e frutos
(DUARTE; ALBUQUERQUE, 1971; CHOI; PARK, 1982; TELLO MARQUINA; De La
VEGA, 1995, KUROZAWA; PAVAN, 1997). A doença se manifesta com sintomas de
lesões foliares necróticas, pardo-escuras, com anéis concêntricos e bordos definidos que
ocorrem isoladamente ou em grupos, também podendo ocorrer ou não halo clorótico. Nos
caules e pecíolos podem ocorrer lesões alongadas e deprimidas, sendo que manchas pardas
ocorrem também nos pecíolos, cálices das flores e frutos contaminados (GARBOR; WIEB,
1997). Os sintomas nos frutos são manchas escuras, deprimidas e com anéis concêntricos,
localizadas na região do pedúnculo (MAFFIA et al., 1980, DATAR; MAYEE, 1981;
MIZUBUTI; BRONMONCHENKEL, 1996). As sementes podem ser infectadas por A.
solani, quando na fase de produção de mudas e a doença pode manifestar-se na pré e pós-
emergência das plântulas, com podridão e anelamento do colo, tombamento e morte
6
prematura, ainda no estádio de plantas jovens (WALKER, 1965, TELLO MARQUINA; De
LA VEGA, 1995).
O estágio avançado da doença é caracterizado pela redução da área
foliar e do vigor da planta, com quebra das hastes, queda dos frutos e morte das plantas
(SHERF; MACNAB, 1986, VALE et al., 2000). A idade da planta e o início da frutificação
predispõem a planta a vulnerabilidade, de forma que os sintomas começam a manifestar-se
a princípio nas folhas mais velhas, e posteriormente, nas demais partes das plantas
(DOUGLAS; PAVEK, 1972; MESSIAEN et al., 1995). Tokeshi; Carvalho (1980) e Hooker
(1981) relatam que embora o patógeno ataque com maior intensidade os tecidos mais
velhos, a doença pode ocorrer em qualquer idade da planta.
A pinta preta, quando estabelecida num cultivo comercial de
tomateiro, causa grandes prejuízos econômicos devido à agressividade com que se
desenvolve, prejudicando a qualidade dos frutos e, conseqüentemente, o rendimento da
lavoura (DIAZ CARRASCO et al., 1977; DOROZHIN; INVANYUK, 1979; JONES et al.,
1993).
2.2 O patógeno
O fungo Alternaria solani, agente causal da pinta preta foi
verificado pela primeira vez infestando a planta da batata em 1882, em New Jersey - EUA
(ELLIS; MARTIN, 1882), mas os relatos da confirmação como agente patogênico
ocorreram em 1896 (VALE et al., 2000).
Na bibliografia consultada são verificados vários sinônimos com
relação ao fungo: Alternaria solani (Soraue), (1896); Spirridesmium solani var. varians
vanha (1904), Alternaria porri (Ell.) Neerg. f. sp. solani (Ell. & Martin) Neerg. (1945) e
Alternaria dauci (Khün) Groves & Sholko f. sp. solani (Ell. & Martin) Neerg. (1945),
(WALKER, 1965).
Os isolados de A. solani proveniente de tomateiro, segundo
Fancelli (1991), devem ser denominados de Alternaria solani f. sp. Lycopersici devido às
diferencias culturais, eletroforéticas, serológicas e de especificidade entre isolados oriundos
de batata e tomateiro.
7
È um fungo mitospórico, pois possui conídios com 150 a 300 µM
de comprimento e 15 a 19 µM de largura, individuais ou raramente catenulados, retos ou
levemente curvo, corpo oblongo ou elipsoidal e afina-se em direção ao ápice, com bico
comprido, sinuoso ou ramificado com 2,5 a 5,0 µM de comprimento. Possui uma coloração
parda, ouro claro ou palha, geralmente apresentam 9 a 11 septos transversais. Nos
conidióferos septados retos ou sinuosos que ocorrem isolados ou em grupos, com 6 a 10
µM de diâmetro e 100 a 110 µM de comprimento, onde estão inseridos os conídios, da qual
possui a mesma coloração (ELLIS, 197; HOOKER, 1981).
Na população de A.solani em tomateiro é característico a
heterogeneidade morfológica quanto a coloração do micélio, presença ou ausência de
esporulação em condições artificiais, produção de pigmentos em meio de cultura
(DOROZHIN; INVANYUK, 1979).
A baixa capacidade de esporulação ou a ausência é uma
característica comum em A. solani. Diferentes métodos são indicados para induzir
esporulação com variação de luz (CHARLTON, 1953; HONDA; YUNOK, 1981;
STEVENSON; PENNYPACKER, 1988), ferimentos do micélio (LUKENS, 1960),
temperaturas (SINGH, 1967), idades das colônias (PRASAD; DUTT, 1975) e meios de
cultura (SHAHIN; SHEPARD, 1979).
O meio de cultura V8 associada com o uso da luz negra, ferimento
do micélio, temperatura de 18ºC e fotoperíodo de 12 horas com luz negra foi o método que
Tofoli; Kurozawa (1993) conseguiu para obter uma boa esporulação de A. solani.
2.3 Óleos essenciais no controle de doenças de plantas
Óleos essenciais são substâncias obtidas de partes de plantas por
meio de destilação por arraste de vapor d’água, segundo definição da ISO (International
Standard Organization). Seus constituintes são complexos e variáveis, como os
hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres,
éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e compostos de
enxofre, dentre os quais destacam-se aqueles de baixo peso molecular, como os
8
monoterpenos com 10 carbonos e sesquiterpenos com 15 carbonos. Possuem características
peculiares odoríferas, lipofílicas, líquidas, e voláteis, conhecidos também como óleos
voláteis, óleos etéreos ou essências, apresentam-se em diferentes concentrações, ocorrendo
sempre um composto majoritário, e outros em menores quantidades (SIMÕES et al., 1999;
SIMÕES; SPITZER, 2000 e DORAN; BROPHY, 1990).
As espécies de plantas com óleos essenciais em quantidades relativas
são denominadas de plantas aromáticas. Os óleos são localizados, nas plantas, em células
diferenciadas como as células secretoras externas e internas. Todas as estruturas secretoras
externas são da epiderme e suas modificações, pêlos glandulares ou tricomas excretores. A
produção do óleo nas estruturas secretoras internas se acumula entre as células do tecido
parenquimático, e podem se diferenciar para glândulas lisígenas e esquizolisígenas, e
podem transformar-se em canais oleíferos (HAAGEN-SMIT, citado por SAITO;
SCRAMIN, 2000).
A utilização dos óleos essenciais vem de tempos remotos, e
segundo Buchbauer et al. (1992), na época da Rainha Cleópatra do Egito, eram aplicados
tanto em Medicina, como para fins de desinfestação de ambiente. Entretanto, segundo
Carvalho (2003), os compostos aromáticos começaram a ser comercializados na Idade
Média, quando os muçulmanos introduziram o processo de destilação.
Consagrados pela sua importância econômica na utilização em
indústrias alimentícias, cosméticas e farmacêuticas, no final do século passado, começaram
a surgir muitos estudos com óleos essenciais para uso como conservantes em alimentos
processados, devido à conscientização ecológica e reivindicações dos consumidores,
entidades não governamentais e órgãos oficiais, para substituição dos preservativos
químicos sintéticos. Com isso, a indústria alimentícia começou a adotar alternativas
naturais para manutenção ou aumento da vida de prateleira dos produtos, com as ervas e
seus óleos essenciais, por possuírem atividade antimicrobiana (NYCHAS, 1995).
Também o uso indiscriminado e incorreto de defensivos agrícolas
nos ambientes rural e urbano, vem causando prejuízos aos ecossistemas, e tem motivado o
desenvolvimento de métodos e produtos alternativos no controle de doenças de plantas, em
que os óleos essenciais têm potencial (FERNANDES, 2000).
9
Piper et al. (2001) relatam que a ação dos óleos essenciais e suas
substâncias em contato com os microorganismos promovem a permeabilidade das células,
causando vazão dos seus constituintes.
Os componentes fenólicos dos óleos essenciais têm sido utilizados
no processo da atividade antimicrobiana, e alguns são classificados como substâncias de
reconhecimento de proteção (GRAS), e usados preventivamente nos alimentos para inativar
o crescimento das bactérias contaminantes. Esses compostos podem interagir com
fosfolipídios da membrana das células, causando aumento da permeabilidade e vazamento
dos constituintes vitais intracelulares ou prejudicando as enzimas do sistema bacteriano
(SINGH, et al, 2002).
De acordo com os estudos os óleos essenciais afetam a integridade
da membrana das células, como o óleo de “tea tree” (Melaleuca alternifolia), causando
dano à membrana de Candida albicans, e que os óleos e seus componentes têm rompido a
permeabilidade da membrana das células de leveduras (BARD et al. 1988; COX et al.,
2000).
Em outras investigações (MUCCIARELLI et al., 2001), notou-se
que terpernóides promoveram grande inibição da respiração da raiz de pepino, sugerindo
que a inibição era provavelmente devido à interação com a parede celular e membrana
plasmática.
As interações dos terpenóides com a membrana plasmática
causaram a inativação de uma série de respostas fisiológicas via transdução do fluxo
intracelular (KOMBRINK; SOMSSICH,1995). A interação dos terpenos permite alterar a
permeabilidade iônica e fluxos através da membrana plasmática, possibilitando a reação
oxidativa em sistemas de células de plantas após tratamentos elicitores (NÜRNBERGER et
al.,1994).
Os óleos essenciais também são conhecidos pelas características
antioxidantes naturais, atuando na peroxidase, e por isso vem sendo muito estudados para
serem utilizados na mistura dos alimentos, visando ao aumento do tempo útil de prateleira.
O conhecimento das condições naturais de como essas enzimas reagem com os oxidantes
naturais é importante no desenvolvimento das condições de estocagem, aumentando a
sobrevida dos produtos hortícolas minimamente processados (PONCE et al, 2004).
10
2.3.1 Eucalyptus citriodora Hook
O eucalipto citriodora, espécie pertencente à família Mytaceae,
tem como centro de origem a Austrália, é remédio dos nativos como poderoso antisséptico,
para aliviar tosse e resfriados e outras afecções respiratórias, usado nas misturas com outros
medicamentos. A planta está disseminada por todos os continentes, principalmente por suas
múltiplas utilidades: madeira, na indústria de celulose e química pela qualidade do óleo
essencial como aromatizante.
Os óleos essenciais de eucalipto são compostos formados pela
complexa mistura de componentes orgânicos voláteis, freqüentemente envolvendo de 50 a
100, deles ou até mais componentes isolados, e apresentando grupos químicos como:
hidrocarbonetos, alcoóis, aldeídos, cetonas, ácidos e ésteres. Em geral, os óleos essenciais
são constituídos de terpenos mais complexos, como o citronelal e o cineol; outros
constituintes da essência incluídos na porcentagem de 20 a 30 % são: α-pineno, piperitona,
felandreno, butiraldeído, hexanal (CHARLES; SIMON, 1990).
Estudo da composição química e da atividade antibacteriana do
óleo essencial das folhas do Eucalyptus citriodora, mostrou rendimento de 0,3%, e que os
metabólitos secundários encontrados foram o Citronellal ( 72,7), Citronellol ( 6,3%) ,
Eugenol (3,5%), Caryophyllene ( 2,6%), α-Pinene ( 2,3%), Citronellyl acetate (2,3%), b-
Pinene (1,7 %), α-Terpenyl acetate (1,5%), cis-Linalool oxide (1,3%), 1,8-Cineole (1,2%),
α-Terpineol (0,7%), Myrcene (0,6%), Methyleugenol (0,6%), Camphene (0,3%), γ-
Terpinene (0,3%) e Linalool ( 0,1%), e, que o óleo essencial mostrou-se eficiente na
inibição micelial de 77% entre 22 bactérias avaliadas (CIMANGA et al, 2002).
Trabalhando diferentes espécies de eucalipto (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis e E.
citriodora.) na inibição micelial “in vitro” de Fusarium oxysporum Schlecht., Bipolaris
sorokiniana Shoemaker e Botrytis cinerea Pers., Salgado et al (2003) concluíram que todas
as espécies tiveram efeitos fungistáticos nas concentrações de 500 mg/kg, mas o
Eucalyptus urophylla obteve o melhor desempenho, e isso foi atribuído à presença do
composto globulol.
11
2.3.2 Cinnamomum zeylanicum Breyn
A canela, espécie da família Lauraceae é considerada entre as
especiarias, uma das mais antigas no oriente; misturada com outros produtos servia para
embalsamamento de cadáveres. É essencialmente utilizada como especiaria, na indústria de
doces, na composição dos aromatizantes para bebidas e na produção de incenso. Na
medicina tradicional é estimulante, eupéptica, carminativa e antidiarréica. O óleo essencial
da canela é de alta qualidade e bastante valorizado. O rendimento de óleo da casca está em
torno de 2%, e das folhas 1%. A composição do óleo essencial é muito variável, de 60 a
90% de aldeído cinâmico e 10% de eugenol na casca e 10% de aldeído cinâmico e 60 a
95% de eugenol nas folhas. A produção mundial da canela no ano de 1991 foi de 57.080
toneladas, tendo como maiores produtores a Indonésia (22.000 t), China (21.000 t) e Sri-
Lanka (10.500 ) (ALBUQUEQUE, 1989)
Ouattara et al. (1997), ressaltam que o óleo essencial de
Cinnamomum zeylanicum tem efeito inibidor da deterioração de alimentos por organismos.
Como têm demonstrado Singh et al. (1995) em seus trabalhos, o óleo da casca tem
propriedades fungitóxicas contra micoses do aparelho respiratório e Aspergillus niger, e
contra A fumigatus, A. nidulans e A. flavus. Montes-Belmont e Carvajal (1998),
adicionando óleo de canela a sementes de milho contra A. flavus, observaram inibição no
crescimento do fungo e que os dois componentes do óleo, cinnamaldehidos e o eugenol
também demonstraram propriedades inibitórias contra o fungo.
Trabalhos que mostram atividade antimicrobiana do óleo da folha
de C. zeylanicum Bl., Hili et al. (1997) têm comprovado atividade antibacteriana contra três
bactérias e quatro raças de leveduras. Esses resultados têm demonstrado que o óleo da folha
inibe completamente o crescimento da E. coli, S. aureus e P. aeruginosa, na concentração
de 500 ug/mL. Outro trabalho mostra que o MICs (concentração mínima para inibições) de
C. zeylanicum para controle de E. coli e S. aureus foi de 0,05 e 0,04%, respectivamente
(SMITH-PALMER et al., 1998).
Wilson et al. (1997), avaliando óleos essenciais e extratos de
vegetais sobre Botrytis cinerea observaram que os extratos de Allium e de Capsicum, e
12
óleos essenciais de Cymbopogon, Thymus e de Cynamomum apresentaram maior ação
fungicida, e apresentaram, como constituintes em maiores freqüências, o d-limoneno,
cineol e b- mirceno. Da mesma forma, Caccioni e Guizzardi (1994), avaliando os
monoterpenos sobre a ação inibitória em fungos verificaram que as substâncias E-anetol, p-
anialdepido, carvacrol, carvone, 1,8-cineol, limoneno, mirceno, α-felandrreno, e α-pineno
inibiram a germinação dos fungos Botrytis cinerea, Monilia laxa, Mucor piriformis,
Penicillium digitatum, Penicillium italicum, P. expansum e Rhizopus stolonifer, mas que
dentre eles, o carvacrol destacou-se dos demais na concentração de 125 ppm, inibindo o
crescimento micelial de todos os patógenos, com exceção de P. italicum, e nesta mesma
concentração inibiu o crescimento dos esporos de M. laxa, M. piriformis e R. stolonifer.
2.3.3 Citrus [(Citrus limon (Linn.) Osbeck) e Citrus sinensis var. dulcis.] (Linn.)
Osbeck)
O limoeiro e a laranja doce, espécies pertencentes à família
Rutaceae, originárias das regiões tropicais e subtropicais da Ásia e do arquipélago Malaio,
estendem-se desde a Índia, norte da China, Nova Guiné até Austrália. É uma espécie
cultivada em todos os continentes e foi introduzida na América pelos portugueses e
espanhóis. Conhecida na medicina popular como planta milagrosa na cura ou prevenção de
mais de 150 enfermidades, uma das maiores fontes de vitamina C e, segundo Albuquerque
(1989), o seu suco serve para combater a acidez estomacal, além de ser diurético,
antiescorbuto, anti-reumático, antidiarréico, adstringente e febrífugo.
Norman et al. (1967) e McCalley; Torres-Grifol (1992) têm
demonstrado que os danos nas laranjas liberam grande quantidade de terpeno do óleo
constituinte da casca de frutos sadios. Presume-se que o conídio do Penicillium spp. se
mantém impossibilitado de germinar ao entrar em contato com o óleo essencial,
desempenhando importante papel no processo patogênico.
Os óleos essenciais de Citrus estão presentes nos frutos em grandes
quantidades. Penicillium digitatum (Pers.) Sacc. e Penicillium italicum Whem, que são
patógenos nocivos na pós-colheita dos frutos cítricos, infectam os frutos com ocorrência de
pequenas manchas na casca durante a colheita e processamento. Lesões na casca podem
13
acarretar o rompimento das glândulas, provocando evasão dos os óleos essenciais e
favorecendo o crescimento dos patógenos.
Estudos realizados por Caccioni et al. (1998), com óleos essenciais
de Citrus sinensis, Citrus aurantium, Citrus deliciosa, Citrus paradisi, Citrus limon e
híbridos Citrange no controle dos fungos de pós-colheita Penicillium italicum e P.
digitatum, mostraram que existem respostas variáveis entre os óleos dessas espécies, sendo
que os de citrange (Carrizo e Troyer) e o de limão (Femminelo), foram os que
apresentaram maior eficiência. Embora o limoneno seja o principal componente dos citros,
variando de 60,20 a 95,29%, não houve correlação positiva entre quantidade de limoneno e
inibição do fungo, e sim na quantidade de monoterpenos. Os óleos de Citrus sinensis foram
os que apresentaram menor eficiência.
2.3.4 Cymbopogon citratus Staph
O capim limão, espécie pertencente à família Poaceae, é originário
da Índia e bastante difundido no Brasil, pelo seu uso na medicina popular e no plantio em
curvas de nível e cordões de contorno para prevenção da erosão.
A aplicação do óleo essencial de Cymbopogon citratus (capim
limão) como opção no controle fitossanitário vem sendo estudada em vários trabalhos.
Onawunmi; Ogunlana (1986), estudando em laboratório o uso do óleo como bactericida,
observaram que é eficiente na inibição das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Devi et al. (1982) observaram efeito letal no desenvolvimento micelial de Rhizoctonia
solani, e quando utilizaram doses de 0,4% de concentração de óleo em C. flexuosus, a
germinação de esclerócios foi completamente inibida.
Pauli; Knobloch (1987) e Mishra; Dubey (1994) demonstraram que
o C. citratus tem propriedades antifúngicas e bactericidas, juntamente com o Thymus
vulgaris, e é comumente usado para temperos de alimentos. Mishra; Dubey (1994),
avaliando o efeito do óleo essencial de C. citratus contra o crescimento micelial de
Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus e Aspergifllus fumigatus, observaram a
14
efetividade contra germinação conidial e crescimento radial dos três fungos, nas
concentrações de 800, 1000 e 1200 ppm.
Nguefack et al. (2004) avaliando o efeito do óleo essencial do C.
citratus no crescimento micelial de fungos “in vitro”, observaram que o óleo reduziu em
64% o desenvolvimento de F. moniliforme na concentração de 200 ppm, A. flavus em 48%
e A. fumigatus em 77% na concentração de 500 ppm. O controle total ocorreu a 300 ppm
para F. moniliforme e 1200 ppm para A. flavus e A. fumigatus.
Cimanga et al. (2002) estudando a composição química e a
atividade antibacteriana dos óleos essenciais de algumas plantas medicinais aromáticas que
se desenvolvem na Republica Democrática do Congo, verificaram que a concentração do
óleo de Cympobogon citratus foi de 0,3%, e que os metabólitos secundários encontrados
em maiores quantidades foram o gerenial (32,7%), nerol (12,5%), neryl acetate ( 6,3%),
borneol ( 3,7%), limoneno (3,1%), mirceno, (3,5%), a-pineno (1,1%), camphene (0,9%),
aromandendrene (0,6%), terpin-4-ol (0,5%), eugenol (0,3%), citronellal (0.2%), linalool
(0,2%), 1,8-Cineole (0,2%) e geranyl acetate (0,1%), e foi constatado que o óleo foi efetivo
no controle das bactérias Citrobacter diversus 1, e mostrou-se eficiente no controle de 77%
de 22 bactérias avaliadas.
Singh et al. (1980), avaliando o óleo essencial de C. martini, C.
oliveri, C. citratus, Trachyspermun ammi e Ocimum kelmandescherium, na concentração de
1%, encontraram eficiência contra o fungo Helminthosporium oryzae, e até mais promissor
que alguns fungicidas sintéticos recomendados.
Adegoke; Adesola (1996), também observaram o efeito do óleo
essencial de C. citratus, sobre os fungos A . flavus, A . fumigatus, Macrophomina phaseoli,
Penicillium, e algumas bactérias (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginos, Pseudomonas
fluorescens, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus), agentes de biodeterioração de
milho e caupi armazenados. Baratta et al. (1988) obtiveram as mesmas respostas.
Shukla et al. (1985) trabalhando com óleos essenciais de Carum
copticum e Cymbopogon citratus, em batata, observaram que houve redução em 100% de
efetividade dos vírus “X” e “Y” da batata, na diluição de 4:1.000.
Trabalhos com aplicação de extrato de C. citratus, em pós-colheita
de repolho, mostram o controle total da podridão mole causada pela Erwinia carotovora pv.
15
carotovora ( ACEDO et al.,1999).
Sweelam (1990), aplicando exudatos de “marigold” (Tagetes
erecta), C. citratus e Aloe arborecens em tomate no controle do nematóide Meloidogyne
javanica, verificou que aos 60 dias após a inoculação, a população foi reduzida para 69,5;
64,8 e 55,4%, respectivamente, bem próximo dos resultados conseguidos com o inseticida
sintético fenamiphós que proporcionou um controle de 87,9%.
Estudando o controle de doenças pós-colheita em mamão, Palhano
et al. (2004) afirmam que o controle do Colletotrichum gloeosporioides é eficiente com alta
pressão hidrostática a 350 MPa por 30 minutos; com a aplicação de 0,75 mg/L de citral e
óleo essencial de capim limão, a pressão hidrostática foi reduzida para 150 MPa por 30
minutos.
2.3.5 Cymbopogon Martini Staph
A palma-rosa, uma espécie da família Lamiaceae, tem como
origem a Índia e é muito conhecida por seu emprego na medicina popular e pela
importância do seu óleo essencial no comércio mundial por ter ação antifúngica, e o
geraniol o principio ativo responsável por esta (BARD et al.,1988). Segundo Delespaul et
al. (2000), esse óleo tem ação fungistática contra Aspergillus niger, Chaetomium globosum
e Penicillium funiculosum.
Segundo Sahoo & Dutta (1982), o geraniol como componente mais
importante do C. martinii var. moita, pode variar de 38 a 97% de concentração, de acordo
com as seleções varietais que ocorrem dentro da variedade.
Verificando a ação do óleo essencial de palma-rosa contra três
espécies de Aspergillus (A . flavus, A . fumigatus e A . parasiticus), nas doses de 3.000,
2.000 e 900 ppm, respectivamente, Misra et al. (1988) observaram um efeito fungitóxico
sobre todas as espécies, e investigando os componentes químicos do óleo essencial,
descobriram que o geraniol é o maior constituinte.
Prashar et al. (2003), estudando o óleo essencial de C. martini em
Saccharomyces cerevisiae, observaram que a concentração de 0,1% do produto promoveu
16
totalmente o crescimento da levedura. Analisando a composição verificaram que continha
65% de geraniol e 20% de acetato de geranyl.
2.3.6 Melaleuca alternifolia Cheel.
A “tea tree”, espécie pertencente à família Myrtaceae, nativa da
Austrália, é uma tradicional planta medicinal utilizada pelos aborígines daquele continente.
O óleo essencial de “tea tree” é conhecido como um dos mais
importantes antissépticos naturais no combate a bactérias e fungos, e usado em dores
agudas, picadas, queimaduras, feridas e uma série de infecções.
Ponce et al. (2003), analisando o poder antimicrobiano do óleo
essencial da Melaleuca alternifolia constataram que a concentração de 0,05 – 0,08 mL/100
mL, foi o suficiente para inibição do crescimento de bactérias pelo método mínimo de
concentração.
Trabalhos com óleos essenciais no controle de estirpes de E. coli,
executados por Moreira et al. (2005) mostram que o óleo de “tea tree” apresentou média
eficiência na inibição da bactéria, necessitando de 0,5 a 0,6 mL/100mL.
2.3.7 Mentha piperita L.
A menta ou hortelã-pimenta, espécie pertencente à família
Lamiaceae, tem como origem a Europa, na região do Mediterrâneo. É tida como um híbrido
das espécies Mentha spicata L., M. aquatica L., M. longifolia Huds. e M. rotundifolia
Huds. O óleo essencial da planta é empregado na indústria farmacêutica, no tratamento de
problemas gastrintestinais e respiratórios, em produtos de higiene bucal, como flavorizante,
aditivo em alimentos, carminativa, eupéptica, espasmolitico e apresenta ação microbiana
(SIMÕES; SPITZER, 2000).
Tassou et al. (2000), avaliando o efeito de diferentes
concentrações de óleo essencial de menta (M. piperita) no crescimento e sobrevivência das
bactérias Salmonella enteritidis e Staphylococcus aureus no caldo de nutrientes, usando de
17
método de cálculo de viabilidade e medida de condutância, verificam que o óleo essencial
de menta a 1,2% reduz a viabilidade total das duas bactérias.
Rech et al. (2000) analisando a composição química do óleo
essencial de M. piperita cultivada em Caxias do Sul-RS, Montevideu-Uruguai, Campinas-
SP e Cuneo-Italia, verificaram que os principais componentes, em quantidades, são mentol
com concentração de 44,9, 46,6; 29,6; 42,6%, a mentona 20,6; 29,4; 11,8 e 26,2%, o
mentofurano 3,5; 2,4, 19,8, 4,4 e o acetato de metila com 2,3, 2,4, 16,1 e 1,7, mostrando
uma variação de conteúdo por local de origem dos materiais, mas com grande discrepância
no conteúdo de componentes para a menta cultivada em Campinas.
Singh et al. (1993) demonstraram “in vitro” o efeito fungicida e
fungistático do óleo essencial de menta sobre 23 espécies de microorganismos, entre elas
Alternaria sp, Curvalaria lunata, Fusarium moniliforme, F. solani e Rhizoctonia
bataticola; os autores usaram concentrações que variam de 500 a 10.000 mg/mL de óleo de
menta nos respectivos meios de cultura, e observaram inibição de 100% do crescimento
micelial, a partir de 2.000 mg/mL.
Em estudos feitos com 11 óleos essenciais de espécies aromáticas
para inibição da bactéria Bacillus cereus em cenoura processada, o óleo de canela foi o
mais eficiente, na dosagem de 5 uL/100m l caldo de cenoura, sendo que o alecrim foi
eficiente na dose de 35, menta 50, cravo 35, sassafrás 40 (VALERO; SALMERÓN, 2003).
2.3.8 Piper hispidinervium ( C.DC.)
A espécie Piper hispidinervium, conhecida como pimenta longa,
espécie da família Piperaceae, de ocorrência no estado do Acre, desenvolve-se em áreas
degradadas onde algumas populações apresentam o óleo essencial safrol, de grande
utilidade nas indústrias, sendo a principal espécie com potencial para substituir o sassafrás,
espécie em extinção, que por muito tempo foi a principal opção como fonte de safrol no sul
do Brasil.
Segundo Maia et al. (1987), a pimenta longa produz de 3 a 4% de
óleo essencial, do qual o safrol é o principal composto com 90 a 94%, e é utilizado como
agente de fragrância e sinergismo com inseticidas e herbicidas biodegradáveis.
18
2.3.9 Rosmarinus officinalis L.
O alecrim, planta da família Labiatae, originária do litoral dos
países em volta do Mar Mediterrâneo, é muito utilizada como medicinal e principalmente
aromática. Testes feitos com o óleo essencial de alecrim (0,5%) em meio BHI Agar
promoveu a inibição do crescimento da Listeria monocytogenes, e foi constatado que
somente o α-pineno tem efeito antilisterial. A adição de 1% de óleo essencial de alecrim em
lingüiça, carne de porco ou fígado antes do cozimento, atrasa o crescimento listerial quando
armazenados sob refrigeração (PANDIT; SHELEF, 1994)
Trabalhos com óleos essenciais no controle de estirpes de E. coli,
executados por Moreira et al. (2005) concluíram que o óleo de alecrim apresentou baixa
eficiência na inibição da bactéria, necessitando de 0,6 a 0,7 mL/100mL, quando comparado
com o óleo de cravo que apresentou a melhor eficiência a 0,25 a 0,30 mL/100mL.
Em estudos realizados com óleo essencial de alecrim no controle
de Botrytis cinerea, Fusarium solani var. coeruleum e Clavibacter michiganensis
subsp.michiganensis “in vitro”, Daferera et al. (2003), verificaram que nas concentrações
estudadas não houve bom desempenho na inibição desses microorganismos, pois só a partir
de 606 e 668 μg/mL ocorreu redução de 50% do crescimento micelial dos fungos B.
cineria e Fusarium, respectivamente. Eucaliptol (31,5%) e borneol (14.2%) foram os
componentes encontrados em maior concentração no óleo.
2.3.10 Syzygium aromaticum Merril et Perry
O cravo, da família Myrtaceae, originária da Malásia, sempre foi
valorizado no mercado das especiarias, e algumas referências afirmam ser conhecida na
Europa e Egito desde século IV a.C. A principal utilização do cravo é como especiaria, na
culinária ou na indústria alimentícia com aromatizante de molhos e outros produtos. Na
Indonésia o maior consumo do cravo é na confecção de cigarros e é tão elevado que o país
não é auto-suficiente. Um subproduto do cravo, de grande importância no mercado é o óleo
essencial, sendo o eugenol como principal componente, muito valorizado na indústria
19
farmacêutica e perfumaria. Segundo Formácase e Kubecza, citados por Mendes Ferrão
(1993), o eugenol representa 84,4% dos componentes do óleo essencial.
Analisando o poder antimicrobiano do óleo essencial do Syzygium
aromaticum, Ponce et al. (2003), constataram que a concentração de 0,04 a 0,05 mL/100
mL, foi suficiente para inibição do crescimento de bactérias pelo método mínimo de
concentração.
Souza et al. (2004), trabalhando com óleo essencial de Syzygium
aromaticum, nas concentrações de 200; 400; 600 e 800 µg/mL., para inibição de Rhizopus
sp.; Penicillium spp., Eurotium repens e Aspergillus niger, isolados de pães envelhecidos,
observaram que o óleo essencial da canela inibiu completamente o desenvolvimento dos
fungos a partir da primeira concentração.
Óleo essencial de cravo a 250 μg/mL foi inibidor do
desenvolvimento e da produção de toxina de Aspergillus parasiticus, ao passo que o
eugenol, principal constituinte desse óleo essencial, apresentou efeito inibidor a 125 μg/mL,
segundo Bullerman et al. (1977).
Em investigações feitas com 11 óleos essenciais de espécies
aromáticas para inibição da bactéria Bacillus cereus em cenoura processada, o óleo de
canela foi o mais eficiente, na dosagem de 5 µL/100mL em caldo de cenoura, sendo que o
alecrim foi eficiente na dose de 35µL/100mL, menta 50µL/100mL, cravo 35µL/100mL,
sassafrás 40µL/100mL (VALERO; SALMERÓN, 2003).
Trabalhos com óleos essenciais no controle de estirpes de E. coli,
executados por Moreira et al. (2005) mostram que o óleo de cravo apresentou alta
eficiência na inibição da bactéria, necessitando de 0,25 a 0,03 mL/100mL.
O carvacrol, outro componente metabólito secundário do óleo
essencial de cravo tem sido investigado por seu efeito bactericida mostrando evidência
significativa de função antioxidante (SCHAUENBERG; PARIS,1977).
Assim, a literatura citada demonstra que há várias possibilidades
do uso de óleos no controle fitossanitário.
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local de execução
O presente trabalho foi desenvolvido na Fazenda Experimental
Lageado, no Departamento de Produção Vegetal, Setores de Defesa Fitossanitária, e de
Horticultura, Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, localizada no município de
Botucatu, Estado de São Paulo.
3.2 Obtenção e manutenção de isolados
O fungo utilizado no trabalho foi obtido de tomateiro com sintomas
de pinta preta, em propriedades rurais no município de Botucatu-SP, e isolado no
laboratório de Micologia e Fitopatologia Florestal do Departamento de Produção Vegetal
da Faculdade de Ciências Agronômicas/UNESP/Botucatu-SP. As características
morfológicas dos conídios e sua disposição permitiram concluir que se tratava de
Alternaria solani.
21
3.3 Obtenção de conídios
A metodologia utilizada para a obtenção de conídios de A. solani,
para os experimentos, foi a mesma adotada por Töfoli; Kurozawa (1993), com cultivo do
isolado em placas contendo meio de cultura V8 (200 mL), de suco V8 Campbell, 4 g de
CaCO
3
, 12 g de ágar e água destilada para completar 1000 mL, por 7 a 10 dias no escuro a
25°C. Outra metodologia utilizada para obtenção de conídio foi a desenvolvida por Shahin;
Shepard (1979), com o cultivo do isolado em placas de Petri contendo o meio de cultura 40
g de CaCO
3,
20 g de Agar e 20 g de sacarose e água destilada para completar 1000 mL. As
placas foram mantidas por 72 horas em BOD à temperatura de 18º C na ausência de luz,
depois submetidas à raspagem do micélio com auxílio de pincel e água destilados estéreis, e
repetidos a cada 24 horas.
3.4 Óleos essenciais e sua composição
Foram utilizados os óleos essenciais das seguintes espécies:
Cymbopogon citratus (capim limão), Eucaliptus citriodora (eucalipto), Piper spidinervium
(pimenta longa), Cymbopogon martini (palma-rosa), Rosmarinus officinalis (alecrim),
Syzygium aromaticum (cravo), Cinnamomum zeylanicum (canela), Mentha piperita
(menta), Citrus limonum (limão), Citrus sinensis var. dulcis (laranja doce) e Melaleuca
alternifolia (“tea tree”), todos adquiridos na Bioessência Produtos Naturais Ltda, localizada
no município de Barra Bonita – SP.
As caracterizações fitoquímicas dos óleos essenciais foram
realizadas no Centro de Genética, Biologia Molecular e Fitoquímica do Instituto
Agronômico de Campinas, em Campinas - SP.
A análise foi realizada em cromatógrafo gasoso acoplado a
espectrômetro de massas (CG-EM), marca Shimazdu modelo QP-5000 dotado de coluna
capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm), gás de arraste Hélio (fluxo 1,0 mL/min.), injetor
a 240ºC e detector a 230ºC na seguinte programação: 50ºC(5’) – até 160ºC, 3ºC por
22
minuto; 160ºC – 220ºC, 10ºC por minuto, split 1/35. A diluição utilizada foi de 2 mg de
óleo em 1 mL de Acetato de etila e injetado 1 μL. Para a identificação das substâncias
comparou-se os resultados obtidos com o banco de dados do sistema CG-EM (Nist. 62
Libr.) e literatura (MCLAFFERTY et al., 1989), determinando-se o Índice de Retenção de
Kovats, comparando os mesmos com os da literatura (ADAMS, 1995).
Os óleos essenciais foram submetidos à avaliação contra o fungo A.
solani seguindo as etapas:
- Avaliação “in vitro” do efeito dos óleos e suas concentrações na
inibição do crescimento micelial e inibição da germinação dos conídios. Este procedimento
é muito prático, rápido, de baixo custo e pode avaliar maior quantidade de tipos de óleos, se
comparado ao teste em plantas cultivadas em ambiente aberto, onde as condições são
totalmente instáveis.
- Os óleos essenciais utilizados para testes contra A. solani em
tomateiro cultivado em ambiente protegido foram aqueles que apresentaram efeitos
inibitórios nas condições de laboratórios.
- Para avaliação dos óleos no controle da A. solani em tomateiro
cultivado a campo, foram escolhidos aqueles que apresentaram efeitos positivos nas
menores concentrações, com menores preços, encontrados em abundância no mercado
regional, e os óleos originários de espécies cujos metabólitos secundários eram diferentes.
3.5 Avaliação “in vitro” do crescimento micelial do isolado de A. solani sob ação dos
óleos essenciais
O experimento foi realizado no período de 30 de outubro a 09 de
novembro de 2003 no Laboratório de Patologia Florestal do Setor de Defesa Fitossanitária
do Departamento de Produção Vegetal. Foram utilizados os óleos essenciais das seguintes
espécies: Cymbopogon citratus (capim limão), Eucaliptus citriodora (eucalipto), Piper
spidinervium (pimenta longa), Cymbopogon martini (palma-rosa), Rosmarinus officinalis
(alecrim), Syzygium aromaticum (cravo), Cinnamomum zeylanicum (canela), Mentha
piperita (menta), Citrus limonum (limão), Citrus sinensis var. dulcis (laranja doce) e
Melaleuca alternifolia (“tea tree”), nas concentrações de 0, 250, 500, 750, 1000 e 5000
23
μL/L
-1
. Os óleos de Melaleuca alternifolia, Mentha piperita e Eucaliptus citriodora foram
avaliados nas concentrações de 0, 1000, 2000, 3000, 4000 e 5000 μL/L
-1
. Cada óleo foi
misturado com o detergente Twin 80 na proporção de 1:1 e adicionados ao meio de cultura
BDA, após autoclavagem e antes de vertê-lo em placas (9 cm de diâmetro). A repicagem
para o meio BDA, contendo os tratamentos, foi feita pela retirada de discos de 0,5 cm de
diâmetro do isolado dos bordos de colônias com 7 dias de idade e transferidos para o centro
das placas. Após as repicagens, as placas foram mantidas em câmara tipo BOD, em
ambiente escuro, à temperatura de 25º C por 8 a 10 dias.
A avaliação foi realizada por medição diária dos diâmetros (mm)
das colônias em dois sentidos perpendiculares entre si, tomando-se como valor de
crescimento a média das duas medidas. O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 11 x 5, ou seja, 11 óleos, 5 concentrações e 5
repetições, sendo cada repetição representada por uma placa. Os resultados foram
submetidos ao teste de paralelismo e de intercepto, contrastados pelo teste de média de
Scott-Knott, a 5 % de probabilidade.
3.6 Avaliação “in vitro” da germinação de conídios de isolado de Alternaria solani sob
ação de óleos essenciais
O experimento foi realizado no período de 11 a 13 de dezembro de
2003, no Laboratório de Micologia e Patologia Florestal do Setor de Defesa Vegetal do
Departamento de Produção Vegetal.
Os testes “in vitro” da ação de óleos essenciais de plantas sobre a
germinação de conídios de isolados de A. solani ocorreram em meio agar a 2% em água,
nas concentrações de 0, 250, 500, 750, 1000 μL/L dos óleos essenciais de C. citratus
(capim limão), C. martini (palma-rosa), S. aromaticum (cravo), C. zeylanicum (canela) e E.
citriodora (eucalipto). Os óleos foram incorporados após autoclavagem antes de vertê-los
sobre a lâmina de vidro dentro de placas, com o auxilio de uma pipeta. Após a gelatinização
dos meios, as laminas receberam a deposição de 10 μL de uma suspensão contendo 10
3
conídios/μL de A. solani. As placas foram mantidas em câmara tipo BOD por 24 horas a
25
o
C e ausência de luz, e avaliados em microscópio ótico, quanto à inibição da germinação
24
dos conídios. Foram considerados conídios germinados aqueles que apresentaram tubos
germinativos superiores ao comprimento do conídio analisado (NEELY, 1978). O
delineamento foi o inteiramente casualizado em fatorial 5 x 5, sendo 5 óleos e 5
concentrações, com 3 repetições. Os dados foram transformados em porcentagem de
inibição da germinação de conídios, submetidos à análise de variância e ao teste de médias
Scott-Knott a 5 % de probabilidade.
3.7 Controle de Alternaria solani em tomateiro em ambiente protegido com uso de
óleos essenciais
O experimento foi realizado no Setor de Defesa Vegetal do
Departamento de Produção Vegetal.
Em condições de casa telada com cobertura plástica, a cultivar
Santa Clara de tomateiro foi semeada em 20 de janeiro de 2004, em bandejas de isopor com
128 células contendo substratos indicados para tomate, e conduzidos com irrigações diárias.
No dia 09 de fevereiro foram transplantadas duas mudas por vaso com capacidade de 6
litros contendo terra, areia e substrato Biomega, na proporção de 1:1:1, e mais 10 kg do
adubo fórmula 4-14-08 por m
3
. As plantas foram conduzidas na casa telada e a irrigação foi
feita por aspersão com 5 mm de lâmina de água diariamente, e a adubação de cobertura
com 3g de N, semanalmente. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado
em esquema fatorial 5x4, sendo 5 espécies (C. citratus, E. citriodora, C. martini, S.
aromaticum, C. zeylanicum) em 4 concentrações (0, 500, 750 1000 μL.L
-1
), com exceção
para o E. citriodora que foi de 0, 750, 1000 e 5000 μL.L
-1
, com 6 repetições por
tratamento. Para que houvesse perfeita mistura do óleo com a água, primeiro foi misturado
com o detergente Twin 80 na proporção de 1:1. Os óleos essenciais foram aplicados
sistematicamente de 3 em 3 dias, pelo método de pulverização utilizando pulverizador
costal manual, protegendo as parcelas com plástico no momento da aplicação. Um dia antes
do início da aplicação dos óleos essenciais as plantas foram inoculadas com uma suspensão
de 10
4
conídios/µL de A. solani, e repetida por duas vezes em dias seguidos.
25
As avaliações foram feitas aos 57 dias do transplantio. Os dados
coletados foram número de folhas e de folíolos, transformados em porcentagem e
analisados por variância, e a comparação das médias pelo teste de Scott-Knott a 5%.
3.8 Controle de Alternaria solani em tomateiro cultivado a campo com uso de óleos
essenciais
O experimento foi realizado no Setor de Horticultura do
Departamento de Produção Vegetal.
As mudas de tomateiro (cv. Rio Grande, crescimento determinado)
foram produzidas em bandejas de isopor com 128 células contendo substratos indicados
para tomate, em casa-de-vegetação, com semeio em 17 de setembro de 2004, e 30 dias após
as mudas foram transplantadas para o campo. Para efeito de adubação, amostra de solo para
análise foi coletada na camada de 0 a 20 cm profundidade na área, antes da instalação do
experimento, e submetida à análise físico-química, no Laboratório de Fertilidade do Solo da
Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu (Tabela 8). A adubação de plantio foi
feita com 400 g de esterco de gado curtido e 30 g da fórmula 4-14-08, por cova. A irrigação
foi feita por aspersão, quando foi necessário uma vez que o experimento foi conduzido na
época das chuvas e calor, conforme verificado na Tabela 9 (precipitação, temperaturas
máximas e mínimas, e umidade relativa do ar). O delineamento foi em blocos ao acaso, em
fatorial 5 x 2 x 4, com óleos de 3 espécies (C. citratus, C. zeylanicum, E. citriodora e o
fungicida tiofanato metílico + chlorothalonil (TM+C) 2000 µL/L
-1
), 2 intervalos ( 3 e 6
dias) de aplicações e 4 concentrações (0, 1000, 3000 e 5000 µL/L
-1
e 0, 3000, 5000 e 7000
µL/L
-1
para E. citriodora), com 4 repetições, com 12 plantas por parcela e 4 plantas úteis.
Após 8 dias de transplante as plantas foram pulverizadas com os óleos nas devidas
concentrações de 3 em 3 dias, e de 6 em 6 dias. Para homogeneizar com a água, os óleos
essenciais foram misturados com o detergente Twin 80 na proporção de 1:1 e aplicados por
pulverização utilizando pulverizador costal manual. Um dia antes do início da aplicação
dos óleos essenciais, as plantas foram inoculadas com uma suspensão de 10
4
conídios/mL
de A. solani , por 3 vezes, de dois em dois dias por pulverizador costal na planta toda.
26
No experimento foram adotados todos os tratos culturais
recomendados (capinas, adubações, manejo de pragas, etc.) para o cultivo do tomateiro
rasteiro. Os dados coletados em 4 de janeiro de 2005 foram de produção total de frutos,
porcentagem de frutos comerciais e índice de doenças. Para índice de doenças foi feita
avaliação visual e atribuindo notas de 1 para plantas sem sintomas e até 10 para plantas
completamente atacada pela pinta preta. Os dados foram submetidos à análise de variância
e contrastados pelo teste de Scott-Knott a 5%.
3.9 Vida útil pós-colheita de frutos de tomateiro cultivado a campo com uso de óleos
essenciais para controle de Alternaria solani
O experimento foi realizado entre os dias 10 e 30 de janeiro de
2005, no Setor de Horticultura do Departamento de Produção Vegetal.
De cada tratamento do experimento anterior (3.7), foram colhidos
os frutos comerciais e selecionados uniformemente pela cor (na mudança de cor verde para
vermelha) e colocados em bandeja de isopor, contendo 6 frutos em cada bandeja,
armazenados à temperatura ambiente, variando entre médias mínimas de 23º C e médias
máximas de 28º C no período. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado
em esquema fatorial 11 x 2, onde foram considerados como tratamentos, os óleos de C.
citratus e C. zeylanicum concentrações (1000, 3000 e 5000 µL/L
-1
), E. citriodora (3000,
5000 e 7000 µL/L
-1
), o fungicida tiofanato metílico + chlorothalonil (TM+C) (2000 µL/L
-1
)
e a testemunha sem aplicação de produtos, com 2 intervalos ( 3 e 6 dias) de aplicações e 3
repetições . As leituras foram feitas aos 5, 10, 15 e 20 dias observando-se o estado de
conservação dos frutos, descartando-se os deteriorados, murchos e atacados por doenças.
Os dados foram submetidos à análise de variância e contrastados pelo teste de Scott-
Knott a 5%.
27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Óleos essenciais e sua composição
Na avaliação da composição dos 11 óleos essenciais em estudo,
conforme Tabela 1, pode-se verificar que as espécies contêm números variáveis de
constituintes, com alguns óleos apresentando número mínimo de substâncias, como ocorreu
com o Citrus sinensis var. dulcis, 3 componentes, Cymbopogon martini, 5 componentes,
Syzygium aramaticum 5 componentes e outros óleos com maior quantidade de substâncias,
como nas espécies Melaleuca alternifolia,17 componentes, Cinnamomum zeylanicum, 18
componentes e Mentha piperita com 20 componentes. Observa-se que apesar da quantidade
variável das substâncias, sempre uma ou duas prevalecem em maior quantidade nos óleos
essenciais. Esses resultados conferem com os citados por Simões et al. (1999); Simões;
Spitzer (2000) e Doran; Brophy, (1990), quando comentam que nos óleos essenciais ocorre
sempre um ou mais composto majoritário, e outros em menores quantidades.
28
Tabela 1. Resultados das análises dos óleos essenciais. Botucatu-SP. 2003
Espécie Picos Substâncias (%) Espécie Picos Substâncias (%)
1 alfa-pineno 22.23
1 alfa-pineno 0.45
Rosmarinus
officinalis
2 canfeno 10.63
Eucalyptus
citriodora
2 beta-pineno 0.68
3 beta-pineno 4.76 3 limoneno 0.33
4 3-octanona 0.44 4 1,8-cineol 1.51
5 mirceno 2.39 7 isopulegol 5.18
6 orto-cimeno 1.87 8 citronelal 74.74
7 limoneno 5.51 9 isso-isopulegol 4.33
8 1,8-cineol 25.51 11 citronelol 6.26
9 linalol 0.92 12 geraniol 2.96
11 cânfora 18.64 13 acetato de
citronelila
1.24
12 borneol 2.48 14 acetato de geranila 0.28
13
Alfa-terpineol
1.40 15 trans-cariofileno 0.72
14 acetato de bornila 1.80
Total 98.68
15
trans-cariofileno
1.15 1 alfa-pineno 2.32
Total 99.73
2 sabineno 0.41
1 eugenol 82.55
Melaleuca
alternifolia
3 beta-pineno 0.80
Syzygium
aramaticum
2 Alfa-copaeno 0.59 4 mirceno 0.82
3 trans-cariofileno 11.98 5 delta-3-careno 0.34
4 Alfa-humuleno 1.74 6 alfa-terpineno 7.51
5
acetato de eugenila
3.13 7 orto-cimeno 4.38
Total 99.99
8 limoneno 1.69
1 canfeno 1.02 9 1,8-cineol 5.25
2 6-metil-5-hepten-
2-ona
1.28 10 gama-terpineno 18.16
Cymbopogon
citratus
3 linalol 0.82 11 terpinoleno 2.84
4 citronelal 0.25 12 4-terpineol 46.74
5 isomentol 1.81 13 alfa-terpineol 3.43
6 nerol 0.45 14 trans-cariofileno 0.37
7 neral 34.34 15 aromadendreno 1.00
8 geraniol 3.52 16 alfa-selineno 1.27
9 geranial 46.91 17 gama-cadineno 0.99
10 acetato de
geranila
6.30
Total 98.32
11 alfa-trans-
bergamoteno
0.85
Total 97.55
Continuação.........
29
Continuação.............Tabela 1. Resultados das análises dos óleos essenciais. Botucatu-SP. 2003
Espécie Picos Substâncias (%) Espécie Picos Substâncias (%)
1 trans-ocimeno 1.45 1 alfa-pineno 0.52
Cymbopogon
martini
2 geraniol 86.98
Citrus sinensis
var. dulcis
2 mirceno 2.27
3 geranial 0.41 3 limoneno 96.86
4 acetato de
geranila
9.03
Total 99.65
5 trans-cariofileno 0.63 1 alfa-pineno 0.60
Total 98.50
2 sabineno 0.38
1 alfa-pineno 1.24
Mentha
piperita
3 beta-pineno 1.12
Cinnamomum
zeylanicum
2 canfeno 0.40 4 mirceno 0.12
3 beta-pineno 0.47 5 3-octanol 0.25
4 alfa-felandreno 1.32 6 ortho-cymeno 0.25
5 orto-cimeno 1.11 7 limoneno 1.79
6 beta-felandreno 1.10 8 1,8-cineol 7.03
7 linalol 3.58 9 trans-beta-ocimeno 0.25
8 alfa-terpineol 0.36 10 gamma-terpineno 0.70
9 trans-
cinalmadeído
0.77 11 mentona 22.54
10 safrol 1.25 12 meta-acetato cresol 6.39
11 eugenol 73.45 13 neo-mentol 2.88
12 alfa-copaeno 0.75 14 mentol 45.18
13 Cis-cariofileno 4.67 15 n.d. 0.72
14
cis-acetato de
cinamila
2.11 16 isomentol 0.47
18
benzoato de
benzila
2.92 17 pulegone 1.55
Total 95.44
18 acetato de mentil 5.97
Citrus limon
1 tricicleno 0.33 19 trans-cariofileno 1.21
2 alfa-pineno 1.61 20 gamma-muuroleno 0.59
3 beta-pineno 1.75
Total 98,19
4 mirceno 10.69 1 alfa-pineno 0.35
5 gama-2-careno 1.98
Piper
hispidinervium
2 mirceno 0.18
6 para-cimeno 0.28 3 delta-3-careno 0.41
7 limoneno 72.49 4 orto-cimeno 0.14
8 gama-terpineno 8.06 5 limoneno 0.21
9 terpinoleno 0.28 6 cis-ocimeno 0.35
10 neral 0.49 7 trans-ocimeno 0.88
11 geranial 0.89 8 terpinoleno 2.37
12
alfa-trans-
bergamoteno
0.36 9 safrol 93.85
Total 99.21
10 trans-cariofileno 0.30
11 bicliclogermocreno 0.62
12 pentadecano 0.25
Total 99.91
30
4.2 Avaliação “in vitro” do crescimento micelial de Alternaria solani sob ação dos
óleos essenciais
Os óleos essenciais influenciaram de maneira diferenciada o
crescimento micelial de A. solani, quando comparados entre si, considerando-se diferentes
concentrações (Tabelas 2 e 3) e representados na Figura 1 e 2.
Nas comparações entre os óleos essenciais na concentração de 250
μL/L
-1
, os óleos das espécies M. alternifolia, Citrus limon, C. sinensis var. dulcis, R.
officinalis e M. piperita formam um primeiro grupo que menos inibiu o fungo, com valores
de inibição de 12,5% inferior ao segundo grupo (C. citratus, P. hispidinervium e C.
martini) e 23,6% inferior ao terceiro grupo (E. citriodora, C. zeylanicum e S. aromaticum),
com diferenças estatísticas entre estes grupos.
Na concentração de 500 μL/L
-1
, o óleo de C. zeylanicum, foi o que
mais inibiu o fungo, 53% em relação aos do grupo formado por C. martini, C. citratus e S.
aromaticum, 66% aos do terceiro grupo (P. hispidinervium e C. sinensis v. dulcis), e
Tabela 2. Coeficientes angulares do crescimento micelial de Alternaria solani “in vitro”,
sob efeito de diferentes óleos essenciais e suas concentrações. Botucatu, 2003.
------------------------Concentrações (μL. L
–1
) ------------------------
Espécies/Óleos
0 250 500 750 1000
Média
R
2
Rosmarinus officinalis
10,47 Aa 9,29 Aa 9,63 Aa 9,59 Aa 10,02 Aa 0,94
Syzygium aromaticum
10,47 Aa 7,46 Cb 6,37 Cc 0,00 Dd 0,00 Dd 0,96
Cymbopogon citratus
10,47 Aa 8,44 Bb 6,30 Cc 0,00 Dd 0,00 Dd 0,94
Eucalyptus citriodora
10,47 Aa 7,85 Cb 10,17 Aa 9,46 Aa 9,35 Aa 0,93
Melaleuca alternifolia
10,47 Aa 10,25 Aa 10,28 Aa 8,61 Bb 6,44 Cc 0,95
Cymbopogon martini
10,47 Aa 8,86 Bb 6,00 Cc 0,00 Dd 0,00 Dd 0,96
Cinnamomum zeylanicum
10,47 Aa 7,36 Cb 2,91 Dc 0,00 Dd 0,00 Dd 0,94
Citrus limon
10,47 Aa 10,22 Aa 9,91 Aa 9,69 Aa 10,13 Aa 0,95
Mentha piperita
10,47 Aa 9,84 Aa 9,71 Aa 8,22 Bb 6,02 Cc 0,97
Citrus sinensis v. dulcis 10,47 Aa 9,91 Aa 8,77 Bb 9,97 Aa 9,73 Aa 0,96
Piper spidinervium
10,47 Aa 8,63 Bc 8,42 Bc 9,39 Ab 8,18 Bc 0,97
C.V. (10,80)
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas não
diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
31
70% em relação ao grupo R. officinali,s M. piperita, C. limonum, E. citriodora e M.
alternifolia que se apresentaram como os menos eficientes na inibição do fungo.
Aos 750 μL/L
-1
, o grupo dos óleos de C. zeylanicum, C. martini, C.
citratus e S. aromaticum inibiu totalmente o crescimento micelial. O grupo de M. piperita e
M. alternifolia tiveram 13% de eficiência em relação ao grupo de P. hispidinervrum, E.
citriodora, R. officinalis, C. limon e C. sinensis var. dulcis que foram os menos eficientes.
Na concentração de 1000 μL/L
-1
, o grupo dos óleos de C.
zeylanicum, C. martini, C. citratus e S. aromaticum continuaram a inibir totalmente o
crescimento micelial, enquanto que o grupo de M. piperita e M. alternifolia, foram 23%
mais eficientes que P. hispidinervium e 37% mais que o grupo das espécies de C. limon, R.
officinalis, C. cinensis var. dulsis e E. citriodora que menos inibiram o crescimento do
fungo.
Na figura 1 (A a L) , os resultados estão representados em valores
de coeficientes angulares, mostrando ângulos dos valores das linhas em relação ao eixo de
X, como resposta do fungo A. solani aos óleos, pela leitura diária do crescimento micelial
pelo período de 8 dias. Quanto mais os óleos inibem o crescimento micelial, mais as linhas
de tendências de respostas ficam paralelas ao eixo de X, e, quando os valores de
crescimento micelial for 0, as linhas de respostas estão sobrepostas ao eixo X.
Na comparação dos valores médios entre as concentrações 0 a
1000 μL/L
-1
, dos óleos essenciais, as espécies R. officinalis e C. limon, C. sinensis var.
dulcis, E. citriodora não inibiram o crescimento micelial, não apresentando diferença
estatística significativa, com exceção de E. citriodora e C. sinensis var. dulcis que
apresentaram diferenças nas concentrações de 250 e 500 μL/L
-1
, respectivamente. Os dados
de P. hispidinervium oscilaram quanto a inibição micelial entre as concentrações porém,
com tendência de inibição à medida que se aproximou de 1000 μL/L
-1
. O grupo das
espécies de M. alternifolia e M. piperita com o mesmo comportamento de inibição micelial,
com diferença significativa entre as concentrações a partir de 750 μL/L
-1
, mas não inibiu
totalmente o fungo a 1000 μL/L
-1
. O grupo das espécies S. aromaticum, C. citratus, C.
martini, e C. zeylanicum (Figura 1 B, C, D, E), que foi eficiente na inibição total
32
Figura 1. Coeficientes angulares para crescimento micelial de Alternaria solani sob efeitos
de óleos essenciais. Botucatu, 2003.
Continua...........
A -
Rosmarinus officinalis
-2
0
2
4
6
8
10
12
012345678
Crescimento micelial
(mm)
B -
Sygygium aromaticum
-13
-10
-7
-4
-1
2
5
8
11
14
012345678
C
- Cymbopogon citratus
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
012345678
Dias
Crescimento micelial
(mm)
750 e 1000 μL.L-1
Linear (0 μL.L-1)
Linear (250 μL.L-1)
Linear (500 μL.L-1)
D -
Eucalyptus citriodora
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
012345678
Dias
33
Figura 1. continuação.
Continua..........
E -
Melaleuca alternifolia
-10
-5
0
5
10
15
012345678
Crescimento micelial
(mm)
F -
Cymbopogon martini
-10
-5
0
5
10
15
02468
H
- Citrus limon
-2
0
2
4
6
8
10
12
012345678
Dias
G
-
Cinnamomum zeylanicum
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
012345678
Dias
Crescimento micelial (mm)
Linear (0 μL.L-1)
Linear (250 μL.L-1)
Linear (500 μL.L-1)
(750 e 1000 μL.L-1)
34
Figura 1. Continuação.
I -
Citrus sinensis var. dulcis
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
012345678
Crescimento micelial
(mm)
J
-
Mentha piperita
-15
-10
-5
0
5
10
15
012345678
Dias
Crescimento micelial
(mm)
Linear (0 μL.L-1)
Linear (250 μL.L-1)
Linear (500 μL.L-1)
Linear (750 μL.L-1)
Linear (1000 μL.L-1)
L
- Piper hispidinervium
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
012345678
Dias
35
do micélio, apresentou as mesmas tendências de comportamento, à medida que se
aumentou as concentrações, com diminuição do crescimento do fungo a partir de 250 μL/L
-
1
, com semelhanças de valores estatísticos e paralisação total do crescimento micelial a
partir de 750 μL/L
-1
.
Na concentração de 1000 μL/L
-1
os óleos de M. piperita e M.
alternifolia (Tabela 3) inibiram em 66% o crescimento micelial de A. solani em relação ao
de E. citriodora. Na concentração de 2000 μL/L
-1
os óleos de E. citriodora e M.
alternifolia a inibição micelial foi total, em M. piperita a inibição foi 40%, seguidos de
29,6% em 3000 μL/L
-1
, 24,7% em 4000 μL/L
-1
, e inibiu totalmente o fungo na
concentração de 5000 μL/L
-1
.
Entre concentrações para cada óleo, as três espécies apresentaram
diferenças estatísticas entre 0 e 1000 μL/L
-1
, com inibição micelial de 10,7% para E.
citriodora, 42% para M. piperita e 38% para M. alternifolia. Já a partir da concentração de
2000 μL/L
-1
, os óleos de E. citriodora e M. alternifolia (Figura 1 F e H) inibiram
totalmente o micélio do fungo, enquanto que a M. piperita inibiu em 32% em relação à
concentração anterior, 27% para 3000 μL/L
-1
e 16% para 4000 μL/L
-1
. Somente na
concentração de 5000 μL/L
-1
a M. piperita (Figura 1 G) inibiu totalmente o fungo.
Esses resultados estão em conformidade com trabalhos de Bullerman
et al. (1997) que mostraram que o óleo essencial de S. aromaticum tem propriedade
inibitória sobre o fungo Aspergillus parasiticus a partir da concentração de 125 μg/mL e
com inibição total a 200 μg/mL. Souza et al. (2004) verificaram que S. aromaticum e C.
zeylanicum foram eficientes na inibição micelial dos fungos Rhizopus sp, Penicillium sp,
Eurotpium repens e Aspergillus niger, nas concentrações de 200 a 800 μg/mL, e que o
segundo óleo inibiu totalmente o fungo na primeira concentração. Outros trabalhos com
óleo essencial de C. zeylanicum mostraram a eficiência em inibir outros fungos. Singh et al.
(1995), verificaram a inibição de A. niger, A. fumigatus, A. nidulans e A. flavus e, Montes-
Belmont; Carvajal (1998) também observaram a eficiência do óleo na inibição de A. flavus
em sementes de milho, como o efeito inibitório do óleo em Botrytis cinerea (Wilson et
al.,1997).
36
Continuação.............
A - Testemunha B -
Syzygium aromaticum -
750 μL.L
-1
C -
Cymbopogon citratus -
750 μL.L
-1
D -
Cymbopogon martini -
750 μL.L
-1
Fi
g
ura 2.
Ó
leos essenciais e suas concentrações na inibição total do micélio de
Alternaria
solani
. Botucatu, 2003.
37
Figura 2. Continuação.
E -
Cinnamomum ze
y
lanicum -
750 μL.
L
-
1
F -
Eucalyptus citriodora -
2.000 μL.
L
-
1
G –
Mentha piperita
- 5.000 μL.L
-1
H –
Melaleuca alternifolia
-
2.000 μL.L
-1
38
O efeito positivo do óleo essencial de Cymbopogon citratus na
inibição de A. solani confere com estudos de Devi et al. (1982) que observaram efeito letal
do mesmo óleo contra o crescimento micelial do Rhizoctonia solani, e a mesma reação letal
contra Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus e A. fumigatus foram constatadas por
Mishra; Dubey (1994). Quanto ao Cymbopogon martini, também se confirma, neste
trabalho, o que foi observado por Singh et al. (1980), quando constataram que esse óleo e o
de C. citratus na concentração de 1% foi eficiente contra Helminthosporium oryzae, e até
mais eficiente que os fungicidas sintéticos. Com relação a E. citriodora, que inibiu o
micélio de A. solani, Salgado et al. (2003) também obtiveram efeitos fungistáticos na
concentração de 500mg/kg, “in vitro” quando utilizaram óleos essenciais de diversas
espécies de Eucalyptus nos micélios dos fungos Fusarium oxysporum Schlecht., Bipolaris
sorokiniana Shoemaker e Botrytis cinerea Pers, mas Eucaliptus urophylla apresentou-se
mais eficiente que as outras espécies, inclusive em relação ao E. citriodora. Sobre M.
alternifolia, a efetividade na inibição do crescimento micelial de A. solani não é novidade,
pois esse óleo essencial tem sido utilizado com muita propriedade na medicina humana
para controle de fungos e bactérias. Estirpes de E. coli foram inibidas pelo óleo na
concentração de 0,5 a 0,6 mL/100 mL, segundo estudos feitos por Moreira et al. (2005).
Quanto a M. piperita, outros estudos afirmam o seu poder antimicrobiano e em relação ao
controle de fungos fitopatogênicos, Singh et al. (2003) observaram que nas concentrações a
partir de 2000 mg/mL, o óleo essencial foi letal aos fungos Alternaria sp., Curvalaria
lunata, Fusarium miniliforme, F. solani e Rhizoctonia batatícula.
Tabela 3. Coeficientes angulares do crescimento micelial de Alternaria solani “in vitro”,
sob efeito de diferentes óleos essenciais e suas concentrações. Botucatu, 2003.
------------------------------Concentrações (μL. L
–1
) ----------------------
Óleos
0 1000 2000 3000 4000 5000
R
2
Eucalyptus citriodora
10,47Aa 9,34Ab 0,00Bc 0,00Bc 0,00Bc 0,00Ac 0,95
Mentha piperita
10,47Aa 6,01Bb 4,09Ac 2,96Ad 2,47Ad 0,00Ae 0,95
Melaleuca alternifolia
10,47Aa 6,43Bb 0,00Bc 0,00Bc 0,00Bc 0,00Ac 0,94
C.V (14,48)
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas não
diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
39
Os óleos essenciais das espécies de C. limon, C. sinensis var. dulcis
não apresentaram efeitos de inibição total do crescimento micelial do fungo A. solani. Esses
resultados estão de acordo com outros estudos em que esses óleos são pouco eficientes na
inibição de microorganismos, ou tenham especificidade por algum fungo ou bactéria
(NORMAN et al. 1967, McCALLEY; TORRES-GRIFOL, 1992). Quanto ao óleo de R.
officinalis, segundo estudos conduzidos por diversos autores, também não é um bom
produto para inibição do desenvolvimento de microorganismos, pois necessitaria de alta
concentração para tornar-se eficiente. Para redução de 50% do crescimento micelial de B.
cinerea e Fusarium solani foram necessários 606 e 668 μg/ml do óleo de R. officinalis
(DAFERERA et al., 2003). Moreira et al. (2005) verificaram que para inibição da bactéria
E. coli, foram necessários 0,6 a 0,7 mL/100mL, enquanto que o S. aromaticum inibiu a
bactéria na concentração de 0,25 a 0,30 mL/100mL. Sobre o óleo essencial de P.
hispidinervrum, a sua eficiência como agente antimicrobiano não tem sido verificada, e
segundo Maia et al. (1987), essa espécie não apresenta eficiência devido à não constatação
de componentes secundários específicos para tal.
4.3 Avaliação “in vitro” da germinação de conídios de Alternaria solani sob ação de
óleos essenciais
Analisando-se os conídios de Alternaria solani, verificou-se que os
óleos essenciais promoveram resultados variados entre as espécies e entre concentrações,
mas com tendências de inibição da germinação dos conídios semelhantes aos apresentados
para crescimento micelial (Tabela 4).
Tabela 4. Germinação de conídios de Alternaria solani “in vitro” sob ação dos óleos
essenciais. Botucatu-SP, 2003.
--------------------------Concentrações (μL. L
–1
)-------------------
Óleos 0 250 500 750 1000 5000
-------------------------Conídios germinados (%)-------------------
Syzygium aromaticum
100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 0,0 Ab 0,0 Ab 0,0 Ab
Cymbopogon citratus
100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 0,0 Ab 0,0 Ab 0,0 Ab
Cymbopogon martini
100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 0,0 Ab 0,0 Ab 0,0 Ab
Cinnamomum zeylanicum
100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 0,0 Ab 0,0 Ab 0,0 Ab
Eucalyptus citriodora
100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 100,0Aa 0,0 Ab
(CV) = 0,023%
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
40
Nas comparações entre óleos essenciais, verificou-se que nas
concentrações 0, 250 e 500 μL/L
-1
, as espécies de S. aromaticum C. citratus, C. martini,
C. zeylanicum e E. citriodora não apresentaram diferenças estatísticas entre si, pois os
mesmos não promoveram inibição da germinação, apresentando 100% de conídios
germinados. Já a partir das concentrações de 750, 1000 e 5000 μL/L
-1
, todos os óleos
proporcionaram inibição total da germinação dos conídios, não diferindo estatisticamente
entre si, com exceção de E. citriodora que apresentou diferenças em relação aos outros
óleos nas concentrações de 750 e 1000 μL/L
-1
. Nas concentrações de 5000 μL/L
-1
todos os
óleos apresentaram os mesmos resultados, inibindo totalmente a germinação dos conídios
de A. solani.
Avaliando-se as concentrações para cada óleo essencial, os
resultados foram semelhantes para S. aromaticum C. citratus, C. martini, C. zeylanicum,
para os quais houve 100% de germinação conidial de 0 a 500 μL/L
-1
, mas a partir da
concentração de 750, 1000 e 5000 μL/L
-
1 os óleos proporcionaram inibição total dos
conídios. Para o E. citriodora, nas concentrações de 0, 250, 500, 750 e 1000 μL/L
-1
houve
também 100% de germinação conidial, e, somente na concentração de 5000 μL/L
-1
esse
óleo promoveu inibição total dos conídios do fungo.
A inibição da germinação conidial é fundamental no controle da
doença, pois essa estrutura é o ponto de partida para propagação e sobrevivência dos
fungos, principalmente quando o ambiente está inadequado para desenvolvimento dos
mesmos. Para sucesso da utilização de um óleo essencial como fungicida é preciso que ele
iniba não apenas as hifas de um fungo, mas também a germinação dos conídios. Alguns
trabalhos com óleos essenciais têm abordado a eficiência na inibição conidial. Estudos
conduzidos por Caccioni; Guizzardi (1994) mostraram que as mesmas concentrações dos
óleos de C. zeylanicum e Cymbopogon sp. que inibiram o crescimento micelial, também
inibiram os esporos de Monilinia laxa, Mucor piriformes e Rhizopus stolonifer. Da mesma
forma, o óleo essencial de C. citratus nas concentrações de 800, 1000 e 1200 ppm nos
fungos Fusaruim moniliforme, Aspergillus flavus e Aspergillus fumigatus inibiram tanto o
crescimento micelial como a germinação conidial (MISHRA; DUBEY, 1994). Estas
informações estão de acordo com demais resultados conseguidos para A. solani, em que as
concentrações dos óleos essenciais que inibiram os crescimentos miceliais, também
41
inibiram a germinação dos conídios.
4.4 Controle de Alternaria solani em tomateiro em ambiente protegido com uso de
óleos essenciais
As avaliações das lesões das folhas do tomateiro por A. solani,
mostraram que os óleos essenciais são promissores no controle da doença (Tabela 5).
Tabela 5. Folhas e folíolos com sintomas de Alternaria solani em tomateiro cv. Santa Clara,
cultivados em vasos, sob ambiente protegido, tratado com diferentes óleos essenciais e
concentrações, avaliados aos 57 dias após transplantio. Botucatu-SP, 2003.
---------------------Concentrações (μL. L
–1
)--------------------------
Óleos 1
2
3 4
-----------------------Folhas doentes (%) ---------------------------
Cinnamomum zeylanicum
100,0 Aa 96,29 Aa 78,76 Ab 9,92 Ac
Cymbopogon citratus
100,0 Aa 94,44 Aa 76,65 Ab 10,48 Ac
Syzygium aromaticum
100,0 Aa 97,91 Aa 77,08 Ab 10,41 Ac
Eucalyptus citriodora*
100,0 Aa 100,0 Aa 41,17 Bb 00,00 Bc
Cymbopogon martini
100,0 Aa 84,52 Bb 33,30 Bc 00,00 Bd
(C.V) = 11,07
-------------------------Folíolos doentes (%) ----------------------
Cinnamomum zeylanicum
80,69 Aa 59,81 Cb 30,67 Bc 04,06 Bd
Cymbopogon citratus
80,69 Aa 80,87 Aa 68,43 Ab 11,10 Ac
Syzygium aromaticum
80,69 Aa 80,25 Aa 72,50 Ab 06,94 Ac
Eucalyptus citriodora*
80,69 Aa 70,21 Bb 11,47 Cc 00,00 Bd
Cymbopogon martini
80,69 Aa 17,93 Db 12,61 Cb 00,00 Bc
(C.V) = 11,93
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).
Concentração 1 = 0, 2 = 500, 3 = 750 e 4 = 5.000 μL.L
-1
.
* Concentração 1 = 0, 2 = 750, 3 = 1000 e 4 = 5.000 μL.L
-1
A ação dos óleos essenciais na inibição da A. solani pode ser
detectada já na concentração 2 , com o C. martini inibindo em 13% a doença nas folhas, em
relação à média dos demais óleos. Na concentração 3, o grupo formado por C. martini e E.
citriodora superou em 52% o grupo de C. zeylanicum, C. citratus e S. aromaticum. Para
concentração 4, C. martini e E. citriodora promoveram a inibição total da A. solani nas
42
folhas, superando os demais óleos que apresentaram médias de 10% de folhas lesionadas
pelo fungo.
Na comparação das porcentagens de folhas doentes em relação às
concentrações dos óleos, C. zeylanicum, C. citratus e S. aromaticum apresentaram as
mesmas tendências de inibição das doenças à medida que foram aumentando as
concentrações, não diferindo estatisticamente as concentrações 1 para 2, mas, diminuindo
em 23% para concentração 3, e 90% na concentração 4. Quanto ao óleo de E. citriodora,
não houve diferenças entre as concentrações 1 e 2, mas para 3 a inibição foi de 59% e
100% para concentração 4. Em relação ao C. martini, houve diferenças em 15% da
concentração 1 para 2, 66% para 3 e 100% de inibição para a 4.
Comparando os óleos essenciais para folíolos doentes, na
concentração 2, o óleo essencial de C. martini foi 70% mais eficiente que C. zeylanicum,
75% em relação a E. citriodora e 79% mais eficiente que o grupo de C. citratus e S.
aromaticum. Na concentração 3 o grupo de E. citriodora e C. martini foi 60% mais
eficiente que C. zeylanicum e 83% mais eficiente que o grupo do C. citratus e S.
aromaticum. Para a concentração 4, o grupo de E. citriodora e C. martini apresentou
inibição total de folíolos doentes, mas não significativamente diferente de C. zeylanicum,
enquanto que o grupo de C. citratus e S. aromaticum apresentou 8% de folíolos doentes a
mais que os outros.
Na avaliação de folíolos doentes entre as concentrações de óleos, à
medida que se aumentou as concentrações, houve tendência de diminuição da incidência da
doença, com os óleos essenciais C. citratus e S. aromaticum não apresentando diferenças
entre as concentrações 1 e 2, mas para a concentração 3 houve redução de 12%, enquanto
que para concentração 4 a redução foi 90%. C. zeylanicum apresentou diferença de 26%
entre a concentração 1 para 2, 62% para concentração 3 e 95% de inibição para folíolos
doentes. O E. citriodora apresentou diferença entre a concentração 1 para 2 em 12%, para
concentração 3 a porcentagem de inibição da doença nos folíolos foram para 86% e de
100% para concentração 4. Para C. martini, a diferença entre a concentração 1 para 2 foi
grande, chegando a 78%, não ocorrendo diferenças entre a concentração 2 e 3, e chegando a
100% de inibição para a concentração 4.
43
Os resultados apresentados demonstraram que os óleos essenciais
foram eficientes na inibição da A. solani nas folhas do tomateiro cultivado em ambiente
protegido. Esses resultados talvez sejam inéditos, pois não foram encontrados, na literatura,
trabalhos semelhantes, com o uso desses tipos de óleos na aplicação em plantas para
controle de doenças, devido ao fato de que os óleos essenciais são bastantes voláteis e com
alta facilidade de oxidação quando em contato com o ar. O fato das aplicações terem sido
feitas de 3 em 3 dias, e em ambiente protegido serem mais estáveis, pode ser uma
justificativa para esta ocorrência.
4.5 Controle de Alternaria solani em tomateiro cultivado a campo com uso de óleos
essenciais
Avaliando-se a produção de frutos, porcentagens de frutos
comerciais e índice de doenças, verificaram-se diferenças entre tratamentos com óleos
essenciais no controle da A. solani (Tabela 6, Figura 3).
Quando se analisa a produção de frutos por parcela, para a
concentração 1 no intervalo de aplicação de 3 dias, verifica-se que o tratamento com o
fungicida TM + C foi superior em 37% ao grupo E. citriodora e C. zeylanicum, e 48% ao
grupo testemunha e C. citratus. Entre os dois grupos a diferença é de 25%. No intervalo de
aplicação de 6 dias o fungicida foi superior em 50% ao grupo formado pelos óleos e à
testemunha.
Na concentração 2 e intervalo de aplicação de 3 dias, o fungicida foi
superior em 23% o grupo de óleos essenciais e 55% em relação a testemunha. Para o
intervalo de aplicação de 6 dias a produção de frutos de tomate das parcela tratada com o
fungicida foi 40% ao grupo formado pelos óleos e a testemunha.
Para a concentração 3 e no intervalo de aplicação de 3 dias, a
produção de frutos, na parcela tratada com o fungicida TM + C foi 37% superior ao grupo
dos óleos essenciais e, o grupo dos óleos foi 27% superior à testemunha. No intervalo de
aplicação de 6 dias, os resultados dos óleos essenciais e testemunha foram semelhantes
entre si, mas 43% inferiores ao do fungicida.
44
Tabela 6. Produção de frutos (kg/parcelas) e índice de doenças, de tomateiro c.v. Rio Grande
cultivado a campo, sob aplicação de óleos essenciais para controle de Alternaria solani.
Botucatu-SP, 2005.
----------------------------------Concentração μL/L
-1
--------------------
1 2 3
Produtos -----------------------Intervalos de aplicação (dias)----------------
3 6 3 6 3 6
Produção total (kg)
Eucalyptus citriodora*
6,45 Ba1 4,04 Bb2 7,35 Ba1 5,99 Ba2 7,17 Ba1 4,81 Bb2
Cinnamomum zeylanicum
7,18 Ba1 4,61 Bb2 7,43 Ba2 5,70 Ba1 6,21 Bb1 5,91 Ba1
Cymbopogon citratus
5,40 Cb1 4,81 Ba1 7,01 Ba1 5,15 Ba2 6,64 Ba1 5,20 Ba2
TM + C PM 10,7 Aa1 9,07 Aa2 10,7 Aa1 9,07 Aa2 10,7 Aa1 9,07 Aa2
Testemunha 4,88 Ca1 4,88 Ba1 4,88 Ca1 4,88 Ba1 4,88 Ca1 4,88 Ba1
C.V.(10,18)
Frutos comerciais (%)
Eucalyptus citriodora*
54,3 Ba1 47,2 Aa1 51,8 Ba1 43,3 Aa1 57,1 Ba1 51,0 Aa1
Cinnamomum zeylanicum
44,6 Cc1 42,2 Aa1 53,3 Bb1 40,2 Aa2 62,3 Ba1 47,8 Aa2
C. citratus
45,9 Cb1 40,8 Ab1 50,7 Bb1 39,0 Ab2 56,9 Ba1 52,4 Aa1
TM + C PM 74,8 Aa1 48,4 Aa2 74,9 Aa1 48,4 Aa2 74,8 Aa1 48,4 Aa2
Testemunha 38,8 Ca1 38,7 Aa1 38,7 Ca1 38,7 Aa1 38,7 Ca1 38,7 Ba1
C.V. (12,11)
Índice de doenças
Eucalyptus citriodora*
7,45 Ca1 8,90 Aa2 6,62 Bb1 8,77 Ba2 5,00 Bc1 7,87 Cb2
Cinnamomum zeylanicum
8,00 Ba1 9,00 Aa2 7,00 Bb1 8,62 Bb2 5,37 Bc1 8,35 Bb2
C. citratus
8,12 Ba1 9,20 Aa2 7,17 Bb1 8,72 Bb2 5,50 Bc1 8,50 Bb2
TM + C PM 1,00 Da1 1,00 Ba1 1,00 Ca1 1,00 Ca1 1,00 Ca1 1,00 Da1
Testemunha 9,50 Aa1 9,50 Aa1 9,50 Aa1 9,50 Aa1 9,50 Aa1 9,50 Aa1
C.V.(5,31)
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas, minúsculas nas linhas e números
nas linhas (entre intervalos das concentrações) não diferem entre si pelo teste de Sckott-Knott
(p<0,5). Concentração 1= 1000, 2 = 3000 e 3 = 5000 μL/L
-1
.
*Concentração 1= 3000, 2 = 5000 e 3 = 7000 μL/L
-1
Quando se comparam os intervalos de aplicações de 3 dias entre cada
concentração, na produção total de frutos para E. citriodora, os valores apresentaram-se
semelhantes, mas para o intervalo de aplicação de 6 dias a concentração 2 foi 26% superior
às outras duas. Para o óleo de C. zeylanicum, os intervalos de aplicação 3 dias das
concentrações 1 e 2 foram 15% superiores ao da concentração 3, e, para intervalos de 6 dias
não houve diferença entre as concentrações. No óleo essencial de C. citratus, os intervalos
de aplicações de 3 dias das concentrações 2 e 3, foram 20% superiores ao da concentração
1, mas para os intervalos de 6 dias não houve diferença entre as concentrações.
45
Produção total
0
2
4
6
8
10
12
C1 INT 3 C1 INT 6 C2 INT 3 C2 INT 6 C3 INT 3 C3 INT 6
(Kg/parcela)
Frutos comerciais
0
10
20
30
40
50
60
70
80
C1 INT 3 C1 INT 6 C2 INT 3 C2 INT 6 C3 INT 3 C3 INT 6
(%)
Indice de doenças
0
2
4
6
8
10
C 1 IN T 3 C 1 IN T 6 C 2 IN T 3 C 2 IN T 6 C 3 IN T 3 C 3 IN T 6
Tratamentos
(%)
Eucalyptus citriodora Cinnamo mum zeylanicum
Cymbopogon citratus TM +C
Testemunha
C1, C2, C3 = Concentrações de 1.000, 2.000 e 3.000 µL/L-¹ (3.000,
5.000 e 7. 000 µL/L-¹ p/ Eucalyptus citriodora).
INT3 e INT6 = Intervalos de aplicações de 3 e 6 dias.
Figura 3
. Efeitos dos óleos essenciais e TM + C (tiofanato metílico +
chlorothalonil) no controle de
Alternaria solani
do tomateiro cultivado a
campo.Botucatu, 2005.
46
Quando se avaliou a produção de frutos entre intervalos de
aplicações dentro de cada concentração, todos os intervalos de aplicação de 3 dias foram
superiores aos intervalos de 6 dias, tanto para os óleos essenciais quanto para o fungicida,
com exceção para a concentração 3 de C. zeylanicum, e concentração 1 para C. citratus.
Na análise de porcentagem de frutos comerciais, concentração 1 e
intervalo de aplicação de 3 dias, o fungicida TM + C foi 27% superior ao E. citriodora e
42% ao grupo formado por C. zeylanicum, C. citratus e testemunha. A diferença entre E.
citriodora para o grupo é de 20%. Para intervalo de aplicação de 6 dias os óleos essenciais,
testemunha e fungicida não apresentaram diferenças entre si.
Na concentração 2 de óleos essenciais, com intervalo de aplicações
de 3 dias, a porcentagem de frutos comerciais para o tratamento com fungicida foi 30%
superior ao grupo dos óleos essenciais e 48% da testemunha, enquanto que a diferença
entre os óleos e testemunha foi de 25%. Para o intervalo de aplicações de 6 dias não houve
diferenças entre os tratamentos.
Para concentração 3 e intervalo de aplicação de 3 dias, a
porcentagem de frutos comerciais foram de 22% superior ao grupo de óleos essenciais e
48% da testemunha, enquanto que o a diferença entre os óleos e testemunha foi de 34%.
Para o intervalo de aplicação de 6 dias não houve diferença entre os óleos e fungicida, mas
estes foram 23% superiores à testemunha.
Na análise entre os mesmos intervalos de aplicações de cada
concentração, para porcentagem de frutos comerciais, o óleo de E. citriodora não
apresentou diferenças entre intervalos de 3 e 6 dias. Para C. zeylanicum o intervalo de
aplicação de 3 dias da concentração 3 foi 15% superior ao da concentração 2, 29% em
relação ao da concentração 1, e para intervalo de 6 dias não houve diferenças. Em relação a
C. citratus, o intervalo de 3 dias da concentração 3 foi 15% superior aos da concentração 1
e 2, como também ocorreu entre intervalos de aplicações de 6 dias, mas com diferenças de
30%.
Na avaliação de porcentagem de frutos comerciais, entre intervalos
de aplicações dentro de cada concentração, no E. citriodora não houve diferenças entre os
intervalos de aplicações de 3 e 6 dias. Para C. zeylanicum apenas na concentração 1 não
houve diferença entre intervalo, mas na concentração 2 o intervalo 3 foi 25% superior ao
47
intervalo de aplicação 6 e 24% superior na concentração 3. Para C. citratus, somente na
concentração 2 o intervalo de aplicação 3 foi superior ao de 6, em 23%. Para o fungicida o
intervalo de aplicação de 3 dias foi superior ao de 6, em 35%.
Avaliando o índice de doenças nas plantas do tomateiro na
concentração 1 e intervalo de aplicação de 3 dias, o fungicida TM + C obteve o mais baixo
índice de doença, superior a todos os outros tratamentos, diferentes de E. citriodora, do
grupo C. zeylanicum e C. citratus, e a testemunha com maior valor. No intervalo de
aplicação de 6 dias, o fungicida manteve o mais baixo índice de doença nas plantas, mas
entre os óleos e testemunha não houve diferença estatística.
Na concentração 2 e intervalo de aplicação de 3 dias os óleos
essenciais foram semelhantes entre si, mas diferentes da testemunha, com o fungicida sendo
a referência no controle da doença. No intervalo de aplicação de 6 dias houve as mesmas
tendências ocorridas no intervalo 3.
Na concentração 3 e intervalo de aplicação de 3 dias, houve índices
de doenças diferenças entre os óleos e a testemunha, com o fungicida mantendo baixo
índice. Para o intervalo de 6 dias, o fungicida apresentou o mais baixo índice da doença,
seguido de E. citriodora, o grupo dos óleos essenciais de C. zeylanicum, C. citratus e a
testemunha com o mais alto índice da doença nas plantas.
Avaliou-se o índice de doenças para os mesmos intervalos de
aplicações; no E. citriodora o intervalo de aplicação de 3 dias da concentração 3 foi
superior ao da concentração 2, que foi superior ao da concentração 1, com as mesmas
tendências para os óleos de C. zeylanicum e C. citratus.
Na avaliação do índice de doenças entre intervalos de aplicação
dentro de cada concentração e óleos essenciais, houve diferenças significativas entre os
intervalos de aplicações de 3 para de 6 dias.
Os resultados apresentados demonstraram que os óleos essenciais
mesmo não sendo tão eficientes quanto ao fungicida TM + C, apresentaram níveis de
proteção às plantas do tomateiro, sendo produtos promissões para o controle da A. solani,
no cultivo a campo. Na Figura 3, verifica-se que em todas as concentrações estudadas, os
intervalos de aplicações de 3 dias promoveram respostas superiores aos intervalos de 6 dias,
tanto para produção total de frutos, como para porcentagens de frutos comerciais e índices
48
de doenças das plantas do tomateiro. Quanto mais se aumentou as concentrações, as
respostas foram mais positivas, com a concentração 3 nos intervalos de 3 dias
proporcionando os melhores valores.
4.6 Vida útil pós-colheita de frutos de tomateiro cultivado a campo com uso de óleos
essenciais para controle de Alternaria solani
Pelos resultados da Tabela 7 e Figura 4, pode-se observar que os
óleos essenciais aumentaram a vida útil pós-colheita dos frutos de tomateiro.
A avaliação dos frutos de tomate aos 5 dias, nos intervalos de
aplicações de 3 dias, mostrou que o grupo formado pelo fungicida TM + C e os óleos
essenciais de E. citriodora (7000 μL/L
-1
), C. zeylanicum (5000 μL/L
-1
) e C. citratus (1000 e
5000 μL/L
-1
) proporcionaram as menores quantidades de frutos descartados ou
deteriorados, sendo 63% melhor que o formado pela testemunha e os óleos essenciais de E.
citriodora (3000 e 5000 μL/L
-1
), C. zeylanicum (1000 e 2000 μL/L
-1
) e C. citratus (3000
μL/L
-1
). Nos intervalos de 6 dias o grupo do fungicida, óleos essenciais de E. citriodora
(1000 e 5000 μL/L
-1
), C. zeylanicum (3000 e 5000 μL/L
-1
) e C. citratus (1000 e 5000
μL/L
-1
) inibiram a deterioração dos frutos em 52% em relação ao grupo da testemunha, e os
óleos essenciais de E. citriodora (7000 μL/L
-1
), C. zeylanicum (1000 μL/L
-1
) e C. citratus
(5000 μL/L
-1
).
Para a avaliação dos frutos aos 10 dias de armazenamento, nos
intervalos de aplicações de 3 dias, o grupo do fungicida e os óleos essenciais de E.
citriodora (7000 μL/L
-1
), C. zeylanicum (3000 e 5000 μL/L
-1
) e C. citratus (1000 e 5000
μL/L
-1
) inibiu a deterioração dos frutos em 38% em relação ao grupo da testemunha e aos
óleos essenciais de E. citriodora (3000 e 5000 μL/L
-1
), C. zeylanicum (1000 μL/L
-1
) e C.
citratus (3000 μL/L
-1
). Nos intervos de aplicações de 6 dias, o grupo do fungicida e os
óleos essenciais E. citriodora (3000 μL/L
-1
) e C. citratus (5000 μL/L
-1
) inibiram em 24%
49
Tabela 7. Porcentagem de frutos descartados de tomateiro tratados com óleos essenciais no controle de Alternaria solani, armazenados
à temperatura ambiente. Botucatu, 2005.
---------------------------------------Tempo de armazenamento (dias) -----------------------------
5 10 15 20
---------------------------------------Intervalos de aplicações (dias)---------------------------------
Produtos
Concentrações
(μL.L
-1
)
3 6 3 6 3 6 3 6
Eucalyptus citriodora 3.000
29,18 Aa 20,85 Ba 70,75 Aa 54,22 Ba 70,85 Ba 100,0 Ab 100,0 Aa 100,0 Aa
Eucalyptus citriodora 5.000
20,82 Aa 25,05 Ba 62,57 Aa 83,35 Aa 79,22 Aa 100,0 Aa 95,85 Aa 100,0 Aa
Eucalyptus citriodora 7.000
12,50 Bb 33,35 Aa 50,00 Ba 87,50 Ab 62,50 Ba 100,0 Ab 87,47 Aa 100,0 Aa
Cinnamomum zeylanicum 1.000
25,02 Aa 33,35 Aa 70,90 Aa 79,20 Aa 87,55 Aa 100,0 Aa 95,85 Aa 100,0 Aa
Cinnamomum zeylanicum 3.000
20,87 Aa 12,52 Ba 54,22 Ba 79,20 Ab 66,70 Ba 100,0 Ab 95,85 Aa 100,0 Aa
Cinnamomum zeylanicum 5.000
8,35 Ba 8,325 Ba 50,05 Ba 79,20 Ab 66,72 Ba 100,0 Ab 83,35 Aa 100,0 Aa
Cymbopogon citratus 1.000
12,50 Ba 25,00 Ba 54,22 Ba 79,15 Ab 75,05 Aa 100,0 Ab 95,85 Aa 100,0 Aa
Cymbopogon citratus 3.000
29,17 Aa 37,52 Aa 62,52 Aa 75,02 Aa 75,02 Aa 100,0 Ab 87,55 Aa 100,0 Aa
Cymbopogon citratus 5.000
12,52 Ba 16,67 Ba 33,40 Ba 66,70 Bb 58,40 Ba 100,0 Ab 91,70 Aa 100,0 Aa
TM + C PM
2.000
4,17 Ba 12,50 Ba 33,35 Ba 66,67 Bb 45,85 Ba 100,0 Ab 75,02 Aa 100,0 Aa
Testemunha
0.000
37,52 Aa 41,70 Aa 100,0 Aa 100,0 Aa 100,0 Aa 100,0 Aa 100,0 Aa 100,0 Aa
C.V. (23,86)
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott
(p<0,05).
50
Fi
g
ura 4.
Conservação pós-colheita de frutos de tomateiro cultivado a campo, tratadas
com TM + C (tiofanato metílico + chlorothalonil) e óleos essenciais, para controle de
A
lternaria solani.
Botucatu, 2005.
Cinnamomum zeylanicum
0
20
40
60
80
100
Frutos deteriorados(%)
Eucalyptus citriodora
0
20
40
60
80
100
TM+C Testemunha 3.000 μL/L-1 5.000 μL/L-1 7.000 μL/L-1
Cymbopogon citratus
0
20
40
60
80
100
36363636
5101520
Intervalos de aplicações/Tempo de duração pós-colheita (Dias)
TM+C Testemunha 1.000 μL/L-1 3.000 μL/L-1 5.000 μL/L-1
51
em relação ao grupo da testemunha e os outros óleos e suas respectivas concentrações
Aos 15 dias de armazenamento, nos intervalos de aplicações de 3
dias, o grupo de fungicida e os óleos essenciais E. citriodora (3000 e 7000 μL/L
-1
), C.
zeylanicum (3000 e 5000 μL/L
-1
) e C. citratus (5000 μL/L
-1
) inibiram em 25% a
deterioração dos frutos em relação ao grupo da testemunha e E. citriodora (3000 μL/L
-1
),
C. zeylanicum (1000 μL/L
-1
) e C. citratus (1000 e 3000 μL/L
-1
). No intervalo de aplicações
de 6 dias, todos os tratamentos apresentaram 100% de frutos deteriorados.
Aos 20 dias de armazenamento, para os intervalos de aplicações de
3 dias não houve diferença estatística entre os tratamentos, com deterioração de frutos
aproximando-se dos 100%.
Na figura 4, verifica-se que tanto o fungicida TM + C, na
concentração de 2000 μg/L
-1
, como os óleos essenciais de E. citriodora, C. zeylanicum e C.
citratus, nas suas 3 concentrações aumentaram a vida útil dos frutos do tomateiro,
principalmente a partir dos 10 dias de armazenamento quando os frutos oriundos de plantas
não tratadas tiveram 100% dos frutos deteriorados e impróprios para comercialização. Isso
pode ser devido à presença de resíduos de fungicidas ou de óleos que impedem o
desenvolvimento de microorganismos que aceleram a decomposição dos frutos, a exemplo
de A. solani e outros. Também no Gráfico 3, os resultados mostram que as aplicações dos
produtos nos intervalos de 3 dias aumentaram de forma diferenciada a conservação dos
frutos em relação às aplicações de 6 dias. Isso fica mais evidente a partir dos 10 dias, e se
confirma aos 15 dias, quando todos os tratamentos dos intervalos de 6 dias apresentaram
100% de deterioração e os tratamentos dos intervalos de aplicações de 3 dias ainda
apresentavam frutos sadios.
O prolongamento da vida útil pós-colheita dos frutos do tomateiro
armazenados em ambiente natural, pode ser devido à ação dos óleos essenciais e ao
fungicida contra a A. solani e aos outros microorganismos relacionados com os frutos.
Segundo Tokeshi; Carvalho (1980), existem uma série de microorganismos entre fungos e
bactérias que causam apodrecimento em frutos maduros, dentre eles os fungos P. infestans,
A. solani, B. cinerea, Phoma destructiva, Colletotrichum phomoides, Rhizoctonia solani, e
entre outros, mas que o controle das podridões está na dependência direta do controle das
doenças no campo. A utilização dos óleos essenciais em doenças de pós-colheita tem sido
52
estudada; por exemplo, óleo essencial de C. citratus aplicado na concentração de 0,75 mg/L
com pressão hidrostática de 150 MPa por 30 minutos em frutos de mamão foi o suficiente
para controlar o fungo Colletotrichum gloeosporioides (PALHANO et al., 2004).
Os resultados encontrados neste trabalho confirmam que os óleos
essenciais de E. citriodora, C. zeylanicum, S. aromaticum, C. martini, C. citratus, M.
piperita e M. alternifolia apresentaram efeitos inibitórios contra fungos como observado em
outras bibliografias, e agora em A. solani. Isso se deve aos componentes existentes nos
óleos.
Alguns trabalhos mostram efeitos letais dos compostos metabólitos
em microorganismos: o eugenol, componente de C. zeylanicum e S. aromaticum, inibiu o
crescimento de Aspergillus flavus em sementes de milho (MONTES-BELMONT;
CARVAJAL, 1998); Delespaul et al. (2000), apontam que o geraniol, principal componente
do C. martini foi o responsável pela ação fungistática contra Aspergillus niger,
Chaetomium globosum e Penicillium funiculosum; e assim, muitos outros exemplos são
citados dos componentes desses óleos utilizados para inibição de microorganismos,
principalmente em alimentos processados.
53
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os óleos essenciais de C. citratus, C. martini, S. aromaticum, e C.
zeylanicum, inibiram “in vitro” o desenvolvimento micelial e conidial de A. solani a partir
da menor concentração de 750 μL/L
-1
, o E. citriodora e M. alternifolia na concentração
intermediária (2000 μL/L
-1
) e a M. piperita inibiu o fungo na maior concentração estudada,
(5000 μL/L
-1
), tornando-se promissores para uso no controle da pinta preta do tomateiro.
Quanto aos óleos que foram estudados para o controle da A. solani
em tomate cultivado em vasos, sob ambiente protegido, em aplicações sistemáticas de 3 em
3 dias, as espécies C. citratus e C. zeylanicum foram eficientes no controle da doença,
inibindo o desenvolvimento das lesões das folhas das plantas nas concentrações a partir de
750 μL/L
-1
, e o óleo essencial de E. citriodora apresentando o melhor desempenho na
maior concentração, 5000 μL/L
-1
.
Na utilização dos óleos essenciais de E. citriodora, C. citratus e C.
zeylanicum para controle da doença do tomateiro cultivado a campo, os óleos essenciais,
mesmo em suas concentrações mais altas não apresentaram a mesma eficiência para a
54
inibição do desenvolvimento do fungo, quando comparados com o fungicida tiofanato
metílico + chlorothalonil.
Na avaliação pós-colheita dos frutos do experimento de campo, os
frutos de tomate das parcelas tratadas com os óleos essenciais e o fungicida apresentaram
maior tempo de conservação em ambiente natural, quando comparados com a testemunha.
Considerando que os óleos essenciais apresentaram efeitos inibidores
no desenvolvimento da A. solani, nos testes “in vitro”, no cultivo do tomateiro em ambiente
protegido e a campo, esses óleos têm grandes perspectivas para uso como defensivos
agrícolas para controle de doenças. Entretanto, novos estudos devem ser efetuados para
averiguar sua eficiência em tomateiro cultivado, em propriedades que fazem uso de
métodos agroecológicos, onde o meio é mais equilibrado.
Por ter características de alta volatibilidade, estudos com óleos
essenciais devem ser intensificados para se desenvolver tecnologias para sua estabilização.
É importante persistir nesta busca porque os óleos essenciais são produtos naturais, que têm
potencial para substituírem defensivos agrícolas sintéticos, pois são de fácil degradação no
meio ambiente e baixa toxicidade ao ser humano.
Os óleos essenciais de S. aromaticum e M. piperita, embora
apresentem eficiência na inibição da A. solani, são produtos muito caros e podem tornar-se
economicamente inviáveis como defensivos agrícolas.
55
6 CONCLUSÕES
- Os óleos essenciais de Cymbopogon citratus (capim limão),
Eucalyptus citriodora (eucalipto), Cinnamomum zeylanicum (canela), são alternativa
sustentável no controle da Altenaria solani, embora menos eficientes que o fungicida
tiofanato metílico + chlorothalonil no controle da pinta preta do tomateiro cultivado a
campo.
- A eficiência dos óleos essenciais como fungicidas em campo, será
aumentada com tecnologias que reduzam sua volatibilidade.
- Os óleos essenciais e o fungicida tiofanato metílico + chlorothalonil
quando aplicados no controle da pinta preta no campo, aumentam a conservação pós-
colheita dos frutos de tomate.
56
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67
8 APÊNDICE
68
Tabela 8. Análise química do solo do local do experimento a campo. Botucatu, 2004.
pH M.O P Al
+3
H+Al
K Ca Mg SB CTC V
CaCl
2
g.kg
-1
mg/d
m3
------------------mmol
c
/dm
-3
--------------------- (%)
6,9 27 40 --- 10 2,7 126 58 187 197 95
Micronutrientes
Boro Cobre Ferro Manganês Zinco
-------------------------------------------mg dm
-3
-----------------------------------------------
0,12 3,3 20 9,1 3,4
69
Tabela 9. Dados climáticos registrados na Fazenda Experimental Lageado no período de
17/10/2004 a 0/01/2005. Botucatu-SP, 2005.
DATA
T. máxima
Dia (°C)
T. mínima
Dia (°C)
Precipitação
(mm)
U. Relativa
(%)
17/10/04 16,2 23,4 9,2 66
18/10/04 17 26 6,7 68
19/10/04 17,8 24,6 0 67
20/10/04 13,2 23,2 0 59
21/10/04 12,6 25,4 0 56
22/10/04 15,2 26,6 0 57
23/10/04 17,4 23,4 5,5 58
24/10/04 17,8 21,2 9,5 59
25/10/04 18,2 22 15,5 62
26/10/04 16 26,8 0 59
27/10/04 15 28 0 47
28/10/04 13 23,2 0 52
29/10/04 11,6 27,8 0 60
30/10/04 16 30,4 0 53
31/10/04 21,6 31 0 49
01/11/04 17,8 26,4 0 61
02/11/04 16,8 30,2 0 62
03/11/04 18 31,4 11 54
04/11/04 18,2 26 1 57
05/11/04 18,6 27 0 58
06/11/04 20,4 29 0 58
07/11/04 15,4 20,6 0 61
08/11/04 14,2 25,6 0 63
09/11/04 15,4 29,4 0 57
10/11/04 17 30,2 33 53
11/11/04 18,8 22,2 1,7 59
12/11/04 14,8 24,8 0 49
13/11/04 14,4 25,6 0 45
14/11/04 14,2 26,8 0 51
15/11/04 15,8 25,2 7,5 60
16/11/04 17,4 21,8 2 64
17/11/04 19 25 6,5 64
18/11/04 18,8 25,6 3,7 64
19/11/04 18,6 25 9,2 64
20/11/04 16 25,8 0 61
21/11/04 13,6 25 0 53
22/11/04 13 26,4 0 52
23/11/04 14,8 29,4 0 47
Continua....................
70
Tabela 9. Continuação
DATA
T. máxima
Dia (°C)
T. mínima
Dia (°C)
Precipitação
(mm)
U. Relativa
(%)
24/11/04 17,6 31,4 0 43
25/11/04 20 32,6 0 39
26/11/04 20,4 32,4 0 41
27/11/04 21,4 30,6 1 47
28/11/04 19 27 12,5 56
29/11/04 17,6 26,2 0 59
30/11/04 15,4 26,6 0 57
01/12/04 15,8 27,8 0 57
02/12/04 17 27,6 0 60
03/12/04 17,2 25 3 67
04/12/04 18 31,2 4 58
05/12/04 17,8 30,2 0 50
06/12/04 20,4 31 1,5 53
07/12/04 19,4 28,2 0 56
08/12/04 18,8 27,4 9,5 57
09/12/04 18,8 25 4,7 58
10/12/04 17,4 24,4 2,2 58
11/12/04 15,8 24,6 0 56
12/12/04 15 25,4 0 54
13/12/04 14,2 28,6 0 48
14/12/04 18 29,4 0 42
15/12/04 15,8 32 0 43
16/12/04 18,8 31,2 0 43
17/12/04 21 30,4 15,5 43
18/12/04 18 28,2 3,2 43
19/12/04 19,4 29 46,7 43
20/12/04 19,6 29,6 13,5 51
21/12/04 17,8 21,2 2,7 54
22/12/04 15 20 20,3 54
23/12/04 14,2 21 0 54
24/12/04 16,2 27,6 0 53
25/12/04 17 29,6 9,3 52
26/12/04 19 23 10,3 54
27/12/04 17,8 27,6 0 55
28/12/04 18,2 29,4 0 48
29/12/04 17,8 31 0 43
30/12/04 18,6 32,2 0 41
31/12/04 20 31,2 11,5 43
Continua...........
71
Tabela 9. Continuação.
DATA
T. máxima
Dia (°C)
T. mínima
Dia (°C)
Precipitação
(mm)
U. Relativa
(%)
01/01/05 19,6 31 0 43
02/01/05 18,8 30,4 0 43
03/01/05 18,6 27 26 53
04/01/05 18,4 22,4 9,7 56
05/01/05 19 25,2 11 56
06/01/05 19,8 27 0 56
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