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MARCIA PEREZ DOS SANTOS CABRERA
ESTUDO DA CONFORMAÇÃO E ATIVIDADE LÍTICA DE PEPTÍDEOS
ANTIMICROBIANOS DE VESPAS
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
2006
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MARCIA PEREZ DOS SANTOS CABRERA
ESTUDO DA CONFORMAÇÃO E ATIVIDADE LÍTICA DE PEPTÍDEOS
ANTIMICROBIANOS DE VESPAS
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
2006
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biofísica Molecular do
Departamento de Física do Instituto de
Biologia, Letras e Ciências Exatas da
Universidade Estadual Paulista para
obtenção do título de doutor.
Orientador: Prof. Dr. João Ruggiero Neto
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Dos Santos Cabrera, Marcia Perez.
Estudos da conformação e atividade lítica de peptídeos
antimicrobianos de vespas / Marcia Perez Dos Santos Cabrera. - São José
do Rio Preto : [s.n.], 2006.
127 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: João Ruggiero Neto
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Biofísica . 2. Peptídios de vespa. 3. Peptídios antimicrobianos. 4.
Mastoparano. 5. Lipossomos. 6. Atividade lítica. I. Ruggiero Neto,
João.
II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras
e Ciências Exatas. III. Título.
CDU – 577.32
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. João Ruggiero Neto, pelos ensinamentos, pela orientação segura, pela
dedicação e disponibilidades constantes, mas principalmente pela acolhida e pelo
reconhecimento. Que nosso trabalho em conjunto ainda nos traga mais satisfações. Muito
obrigada.
Ao Prof. Dr. José Rogerto Ruggiero, pelos ensinamentos, pelo convívio amistoso e
pela colaboração.
Ao coordenador da pós-graduação, Prof. Dr. Jorge Chahine, pelo apoio e dedicação
à solução das dificuldades em relação às bolsas CAPES e CNPq.
Aos professores do Departamento de Física, e ao Prof. Dr. Johnny Rizzieri Olivieri,
meu primeiro orientador, pelos ensinamentos e pelo agradável convívio.
Aos professores e funcionários do Departamento de Química e Ciências Ambientais,
em especial à Profa. Dra. Ieda Pastre Fertonani, pela disponibilização de seus laboratórios
e equipamentos.
Aos colaboradores Dr. Katsuhiro Konno do Instituto Butantan, CAT-CEPID, Dr.
Mário Sérgio Palma e Bibiana Monson de Souza, do IB, UNESP, Rio Claro pelas amostras
de peptídeos.
À Profa. Iolanda Midea Cuccovia, do Instituto de Química da USP, pela atenção e
colaboração, por toda ajuda e pelos ensinamentos importantes, sem os quais este trabalho
não teria sido possível.
Aos meus pais Antonio e Nena, os maiores exemplos de grandeza de alma em minha
vida, por toda dedicação a mim e ao meu filho. Agradeço a vocês por toda ajuda, pelo apoio
incondicional e pela participação ativa em todos os momentos e, à Deus, pela sua existência.
Ao meu marido Martins, por toda dedicação a mim e ao nosso filho, pelo amor e
respeito, pela cumplicidade, pela amizade, por ter me conduzido à pós-graduação, por ter
tornado possível mais esta realização.
Ao meu filho Tomaz, o maior presente que Deus me deu, pelo seu amor, seu carinho,
sua alegria, seu companheirismo.
Aos meus irmãos, Silvia e Toninho, pela harmonia e união que vivemos.
A todos os meus familiares e amigos, especialmente à tia Teresa e tio Zeca e à amiga
Deise que foram, em muitos momentos, um apoio imprescindível.
À Mariliza, que esteve presente a cada dia durante mais de quatro anos, com seu
trabalho, me ajudando a cuidar da casa e da família.
À amiga Sabrina Thaís Broggio Costa, pelo carinho, por suas atitudes exemplares,
por toda preocupação, ajuda, incentivo; pela alegria e descontração de inúmeros momentos,
e pelas orações: elas foram ouvidas.
Aos colegas do Departamento de Física, em especial aos amigos Sidney, Priscilla,
Norma, Marisa, Leandro e Marcio, pela amizade, respeito, ajuda e pelos bons momentos.
Agradeço muito a vocês e à Fernanda Costa e Aline do GOU pelas aulas para o Tomaz:
quem faz pelo meu filho, faz duplamente por mim.
À secretária da pós-graduação, Rosemar, e aos funcionários do Departamento de
Física, Ilva, Rose, Paulinho, Barbosa e Marcelino pela eficiência, disposição e ajuda em
todos os momentos.
Á CAPES e CNPq pelo suporte financeiro para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
ABREVIAÇÕES
....................................................................................................................
ÍNDICE DE FIGURAS
.........................................................................................................
ÍNDICE DE TABELAS
.........................................................................................................
RESUMO
................................................................................................................................
ABSTRACT
............................................................................................................................
1.
INTRODUÇÃO
......................................................................................................................
1
2.
REVISÃO DA LITERATURA
.............................................................................................
4
2.1
Atividade biológica ..................................................................................................................
4
2.1.1
Mastoparanos ...........................................................................................................................
7
2.2
Seletividade dos peptídeos antimicrobianos ............................................................................
8
2.2.1
Influência da composição, arquitetura e energia da membrana ...............................................
9
2.2.2
Influência dos lipopolissacarídeos (LPS) e da membrana externa das bactérias .....................
10
2.3
Modulação da atividade na membrana e correlação com a atividade biológica .....................
11
2.3.1
A conformação helicoidal .......................................................................................................
11
2.3.2
Aspectos estruturais .................................................................................................................
12
2.4
Mecanismos de ação de peptídeos antimicrobianos ................................................................
20
2.5
Potencial de uso terapêutico ...................................................................................................
24
3.
OBJETIVOS
..........................................................................................................................
26
4.
MATERIAIS e MÉTODOS
..................................................................................................
27
4.1
Materiais ..................................................................................................................................
27
4.2
Métodos ...................................................................................................................................
27
4.2.1
Preparação de vesículas ...........................................................................................................
27
4.2.1.1
Preparação de vesículas unilamelares, pequenas (SUVs) ........................................................
28
4.2.1.2
Preparação de vesículas unilamelares, grandes (LUVs) ..........................................................
28
4.2.1.3
Análise da concentração de fosfolipídeos em vesículas ..........................................................
29
4.2.2
Medidas por dicroísmo circular (CD) ......................................................................................
29
4.2.3
Experimentos de vazamento de vesículas por fluorimetria .....................................................
31
5.
RESULTADOS e DISCUSSÃO
.............................................................................................
33
5.1
EMP-AF ...................................................................................................................................
34
5.2
Eumenitin .................................................................................................................................
41
5.3
EMP-EM1, -EM2, -EM3, EM4................................................................................................
45
5.4
Polybia MP1 ............................................................................................................................
53
5.5
Anoplin ....................................................................................................................................
59
5.6
Decoralin ..................................................................................................................................
65
5.7
Comentários Gerais ..................................................................................................................
73
6.
CONSIDERAÇÕES FINAIS e CONCLUSÕES
.................................................................
80
7.
REFERÊNCIAS
.....................................................................................................................
82
8.
APÊNDICE – Publicações
.....................................................................................................
89
8.1
dos Santos Cabrera, M. P., de Souza, B. M., Fontana, R., Konno, K., Palma, M. S., de
Azevedo Jr., W. F., Ruggiero Neto, J. (2004) Conformation and lytic activity of Eumenine
Mastoparan: a new antimicrobial peptide from wasp venom. J. Peptide Res. 64, 95-103.
8.2
Konno, K., Hisada, M., Naoki, H., Itagaki, Y., Fontana, R., Rangel, M., Oliveira, J. S., dos
Santos Cabrera, M. P., Ruggiero Neto, J., Hide, I., Nakata, Y., Yasuhara, T., Nakajima, T.
Eumenitin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the solitary eumenine wasp
Eumenes rubronotatus. Available online DOI link:
http://dx.doi.org/10.1016/j.peptides.2006.04.013
8.3
dos Santos Cabrera, M. P., Broggio, S. T., Sforça, M. L., Konno, K., Palma, M. S., Fadel,
V., de Azevedo Jr., W. F., Pertinhez, T. A., Spisni, A., Ruggiero, J. R., Ruggiero Neto, J.
(2006) Structure and lytic activity of Anoplin, a short chain antimicrobial peptide from
solitary wasp venom (em preparação).
ABREVIAÇÕES
λ
comprimento de onda MP-X Mastoparano X
µ
momento hidrofóbico PA ácido fosfatídico
τ
constante de tempo (tau)
PAM peptídeo antimicrobiano
ANP
ANP-OH
Anoplin
Anoplin carboxilado
PC fosfatidilcolina
CC concentração crítica
PCCL 7030
vesícula composta por 70% PC e 30%
CL, mol/mol
CD dicroísmo circular
PCCL 4060
vesícula composta por 40% PC e 60%
PG, mol/mol
c
f
concentração de peptídeo não
associado
PCPG 7030
vesícula composta por 70% PC e 30%
PG, mol/mol
CL cardiolipina
PCPG 4060
vesícula composta por 40% PC e 60%
PG, mol/mol
cmc concentração micelar crítica [Pep] concentração molar de peptídeo
CTACl cloreto de alquiltrimetilamônio PG fosfatidilglicerol
DEC Decoralin P/L ou L/P razão molar entre concentrações de
peptídeo e lipídeo ou entre
concentrações de lipídeo e peptídeo
DEC-NH
2
Decoralin amidado PS fosfatidilserina
EM1~4 Eumenes micado 1 a 4 Q carga líquida
EMP-AF Eumenine mastoparano-AF r Grau de associação
EUM Eumenitin rc estrutura aleatória ou randômica
f
H
fração de hélice-
α
RMN ressonância magnética nuclear
<H> hidrofobicidade média SDS dodecilsulfato de sódio
[Lip] concentração molar de lipídeo SUV vesícula unilamelar pequena
lpc lisofosfatidilcolina T
C
temperatura de transição de fase do
lipídeo
lpg lisofosfatidilglicerol TFE trifluoroetanol
LPS lipopolissacarídeo
% V
% vazamento
LUV vesícula unilamelar grande
% V
max.
constante % vazamento máximo
MIC concentração inibitória mínima
MP Mastoparano
MP1 Polybia MP1
MP-B Mastoparano B
ÍNDICE DE FIGURAS
1
Representação esquemática dos parâmetros que podem afetar a estruturação dos PAMs helicoidais (Tossi
et al., 2000).
12
2
Representação esquemática dos modelos propostos para o mecanismo de ação dos PAMs helicoidais
(Tossi et al., 2000).
21
3 Modelos de poro (a) barril e (b) toroidal de acordo com Huang, 2000.
23
4
Espectros de CD de EMP-AF a 10
µ
M, 25
o
C em diversos ambientes.
35
5
Dependência do teor de hélice-
α
(f
H
) a 25
o
C, pH 7,5 com (a) concentração de peptídeo e (b) razão L/P
em vesículas PC.
36
6
Cinética do vazamento de vesículas PC (150
µ
M) e PCPG 7030 (95
µ
M) causado pela interação com
EMP-AF, a 25
o
C.
37
7
Curvas de dose-resposta a 25
o
C para EMP-AF em (a) 150
µ
M PC e (b) 90
µ
M PCPG 7030, com
diferentes tempos de contato.
39
8
Espectros de CD de Eumenitin a 8.5
µ
M, 25
o
C, em diferentes ambientes.
41
9
(a) Dependência do teor de hélice-
α
(f
H
), com a razão L/P para Eumenitin em diferentes concentrações.
(b) Partição (
r
) ou razão entre as concentrações de peptídeo ligado e lipídeo, PCPG 7030, em função da
concentração de peptídeo livre.
42
10
Curvas de dose-resposta, a 25
o
C, para Eumenitin em vesículas aniônicas e em vesículas zwitteriônicas.
44
11
Espectros de CD dos peptídeos da série EMP-EM1~4, sendo (a) EM1, (b) EM2, (c) EM3, e (d) EM4, em
diferentes ambientes, a 25
o
C.
46
12
47
13
Curvas de dose-resposta, a 25
o
C, para EM1 e EM2 (a) e para EM3 e EM4 (b) em PCPG 7030 23
µ
M
(símbolos cheios) e 33
µ
M (símbolos vazados), após 3 minutos de contato.
48
14
Curvas de dose-resposta, a 25
o
C, para EM1, EM2, EM3 e EM4, em PC 54
µ
M com 5 minutos de contato.
49
15
(a) Gráfico da constante de tempo (
τ
) da cinética de vazamento induzido por EM1 (preto), EM2
(vermelho), EM3 (verde) e EM4 (azul) em vesículas aniônicas, PCPG 7030, em função da concentração
P/L mínima. (b) idem para vesículas zwitteriônicas, PC.
50
16
Cinética do vazamento induzido por EM1~4 em vesículas (a) 54
µ
M PC e (b) 23
µ
M PCPG 7030, na
presença de CTACl em concentrações equimolares em relação aos peptídeos, a 25
o
C.
51
17
Cinética da interação de peptídeos catiônicos, EMP-AF e EM3, a 5
µ
M com vesículas PC 11
µ
M, na
ausência e na presença de surfactante aniônico, SDS a 165
µ
M, a 25
o
C.
52
18
Espectros de CD de MP1 a 20
µ
M, 25
o
C: (a) em ambientes anisotrópicos e (b) na presença de vesículas.
53
19
Espectros de fluorescência de MP1, a 25
o
C, na presença de tampão Tris e na presença de vesículas PC.
55
20
56
(a) Espectros de CD, a 25
o
C, de EMP-EM1 (preto), EMP-EM2 (vermelho), EMP-EM3, (verde) e
EMP-EM4 (azul) em CTACl 2,8 mM.
(b) Dependência do teor de hélice-
α
(f
H
) dos peptídeos (
■
) EM1, (
●
) EM2, (
▲
) EM3 e (
▼
) EM4
com a razão entre as concentrações de lipídeo e peptídeo (L / P).
(a) Cinética do vazamento de vesículas induzido pela interação com MP1 5
µ
M, 25
o
C, em (
◆
) PC,
(
▲
) PCPG 7030, (
❏
) PCCL 7030, (
❍
) PCCL 4060, e a 20
µ
M em (
■
) PCCL 7030 (
●
) PCCL 4060.
(b) % Vazamento máximo (símbolos cheios) e constante de tempo (
τ
, símbolos vazados) obtidos pelo
ajuste da curva de cinética de MP1 para as mesmas vesículas nas respectivas razões [Pep]/[Lip].
21
Curvas de dose-resposta para MP1, após 5 minutos de contato, em função da concentração de peptídeo (a)
e da razão L/P (b) em vesículas zwitteriônicas e aniônicas, a 25
o
C.
57
22
Espectros de CD, a 25
o
C, de (a) Anoplin-NH
2
e (b) Anoplin-OH a 10
µ
M, em diferentes ambientes.
59
23
61
24
% vazamento induzido por (a) Anoplin-NH
2
e (b) Anoplin-OH em vesículas aniônicas, a 25
o
C.
62
25
63
26
64
27
Espectros de CD a 25
o
C de Decoralin (a) e de Decoralin-NH
2
(b) a 8.5
µ
M, em diferentes ambientes.
65
28
Espectros de CD a 25
o
C de Decoralin e Decoralin-NH
2
a 8.5
µ
M em vesículas zwitteriônicas e aniônicas.
66
29
66
30
Projeções helicoidais dos peptídeos DEC e ANP mostrando suas possíveis estruturas anfipáticas e ângulos
polares.
68
31
69
32
70
33
Comparativo de vazamento induzido por peptídeos de cadeia curta em vesículas PCPG 7030, 90
µ
M,
após 5 e após 20 minutos de contato. ANPs na concentração de 15
µ
M e os demais a 10
µ
M.
71
34
(a) Gráfico da relação entre hidrofobicidade média e elipticidade em meio SDS 8 mM.
(b) Gráfico da relação entre hidrofobicidade média e momento hidrofóbico.
(c) Gráfico da relação entre elipticidade em meio SDS 8 mM e momento hidrofóbico.
74
74
75
35
Gráfico da constante de tempo (
τ
) observada nos vazamentos induzidos pelos peptídeos líticos em
vesículas aniônicas, PCPG 7030, em função da concentração P/L mínima em que as respectivas curvas da
cinética foram ajustadas.
76
36
(a) Gráfico da relação entre hidrofobicidade média (<H>)dos peptídeos (dados da Tabela 11) e o produto
τ
x P/L. (b) idem entre momento hidrofóbico (
µ
) e
τ
x P/L. (c) idem entre fração de hélice-
α
(f
H
) e o
produto
τ
x P/L. (d) idem entre ângulo da face polar (
φ
) e
τ
x P/L. (e) idem entre a concentração inibitória
mínima (MIC) dos peptídeos para bactérias Gram-positivas (símbolos cheios) e Gram-negativas
(símbolos vazados) e o produto
τ
x P/L. (f) idem entre ângulo da face polar (
φ
) e o momento hidrofóbico
(
µ
).
77
78
79
Dependência da fração de hélice-
α
de Anoplin-NH
2
(
▲
) e de Anoplin-OH (
∆∆
) com a concentração
de SDS; (b) Dependência da fração de hélice-
α
com a concentração de Anoplin-NH
2
em tampão PBC,
pH 7,5 (
■
) e em solução tamponada de SDS 8 mM (
●
) comparativamente a Anoplin-OH em tampão
(
) e em SDS (
❍
).
(c) Dependência da fração de hélice-
α
com a razão molar entre as concentrações de lipídeo e peptídeo
([Lip]/[Pep]) para Anoplin- NH
2
a 10
µ
M (
■
), 20
µ
M (
▲
) e 25
µ
M (
▼
) em vesículas PCPG 7030.
(a) Cinética do vazamento de vesículas PCPG 4060 a 120
µ
M induzido por 5
µ
M e 20
µ
M de
Anoplin-NH
2
(
■
) e Anoplin-OH (
▲
); (b) idem em 150
µ
M PC para Anoplin-NH
2
e Anoplin-OH.
Curvas de dose-resposta para Anoplin-NH
2
(
■
) e Anoplin-OH (
●
) após 15 minutos de contato, em
função da concentração de peptídeo, em vesículas PCPG 7030 90
µ
M.
(a) Espectros de CD de DEC-NH
2
obtidos variando-se a concentração de peptídeo entre 0,1 e 30
µ
M e
mostrando o ponto isodicróico em 203 nm. (b) Gráfico da elipticidade molar ([
Θ
222
]) em água (
●
) e
em SDS 8 mM (
■
) em função da concentração.
Curvas de dose-resposta para (a) Decoralin (b) Decoralin-NH
2
em vesículas
■
PCPG 7030,
●
PCPG
4060,
▲
PCCL 7030,
▼
PCCL 4060 e
★
PC.
Gráfico da constante de tempo (
τ
) observada nos vazamentos induzidos por DEC (
■
) e DEC-NH
2
(
●
), em vesículas PCPG 7030 (preto), PCPG4060 (vermelho), PCCL7030 (verde), PCCL4060 (azul)
e PC (azul claro) e, símbolos cheios) em função da concentração P/L mínima em que as respectivas
curvas da cinética foram ajustadas.
ÍNDICE DE TABELAS
1 Seqüência primária e Peso Molecular dos peptídeos estudados.
33
2
Características estruturais de EMP-AF e seus análogos, inclusive fração de hélice-
α
, em diversos
ambientes, a 10
µ
M.
35
3
Constantes V
max
e
τ
obtidas para as cinéticas de interação de EMP-AF, a 25
o
C, em vesículas PCPG
7030 90
µ
M e PC 150
µ
M.
38
4
% Vazamento (%V)
de vesículas zwitteriônicas (PC) e aniônicas (PCPG 7030) induzido por EMP-AF e
seus análogos, a 25
o
C, após diferentes tempos de contato (em segundos).
38
5
Propriedades estruturais de Eumenitin (8.5
µ
M) em comparação a EMP-AF (10
µ
M), e suas respectivas
frações de hélice-
α
(f
H
) em diferentes ambientes.
42
6
Constantes % V
max
e
τ
obtidas para a cinética da interação do Eumenitin em vesículas PCPG 7030 e PC.
43
7
Propriedades estruturais de EMP-EM1~4 (10
µ
M) em comparação a eumenitin (8,5
µ
M) e EMP-AF (10
µ
M), e suas respectivas frações de hélice-
α
(f
H
).
48
8
Características estruturais de MP1, inclusive fração de hélice-
α
, em diversos ambientes, a 20
µ
M,
comparativamente a EMP-AF, MP-B e MP-X.
54
9
Elipticidade molar ([
Θ
]
222
, deg cm
2
/dmol) em 222 nm e correspondente fração de hélice-
α
para ANP-
NH
2
e ANP-OH a 20
µ
M (f
H
) e a 10
µ
M (f
H10
), em diferentes ambientes.
60
10
Comparativo da fração de hélice
α
(f
H
) de Decoralin e seu análogo, a 8,5
µ
M, com outros peptídeos
curtos a 10
µ
M, em diferentes condições.
67
73
11 Características estruturais e atividade biológica dos peptídeos.
RESUMO
Neste trabalho estudamos a conformação em ambientes anisotrópicos e a atividade lítica em
vesículas aniônicas e zwitteriônicas de um conjunto de peptídeos biologicamente ativos, extraídos de
veneno de vespas solitárias, que se caracterizam por usar seus venenos para paralisar as presas com as
quais alimentam suas larvas. Esses peptídeos que são desgranuladores de mastócitos, apresentam
atividade antimicrobiana e a maioria deles não é hemolítica. Possuem entre 10 e 15 resíduos, são
catiônicos, com alta proporção de resíduos carregados e polares, e são lineares e helicoidais em meios
miméticos de membranas. Buscamos correlacionar a atividade lítica em vesículas de diferentes
composições, analisada em experimentos de fluorimetria, às mudanças conformacionais, induzidas
por diferentes ambientes miméticos, monitoradas por dicroísmo circular, complementando com a
análise das características físico-químicas como comprimento da cadeia, amidação do terminal-C,
carga líquida, influências no macrodipolo da hélice, hidrofobicidade, momento hidrofóbico e ângulo
polar. Observamos que estes peptídeos apresentam intensa atividade em membranas modelo,
interagem preferencialmente com bicamadas aniônicas, e sua atividade lítica acontece de modo
cooperativo tanto em vesículas aniônicas como nas zwitteriônicas. Com exceção de Anoplin, todos os
peptídeos com ação antimicrobiana apresentam curvas de dose-resposta que mostram uma
dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Isso sugere que esses peptídeos se acumulam
na superfície da vesícula até atingir uma concentração crítica, além da qual o vazamento aumenta
cooperativamente. De uma forma geral os peptídeos mais eficientes como antimicrobianos, são
também aqueles caracterizados pela maior eficiência em permeabilizar vesículas aniônicas do tipo
PCPG 7030 e por baixas razões limite P/L. Essas características nos levam a sugerir que a atividade
lítica dos peptídeos deste estudo provavelmente acontece por um mecanismo semelhante ao descrito
no modelo do poro toroidal. E ainda, que os peptídeos líticos e antimicrobianos estudados interagem
preferencialmente com a região das cabeças dos fosfolipídeos, formando poros cuja estrutura mista,
lipídeo / peptídeo expõe os resíduos polares e carregados ao solvente aquoso.
Palavras-chave: Peptídios de veneno de vespa. Peptídios antimicrobianos. Mastoparano. Lipossomos.
Atividade lítica. Dicroísmo circular
ABSTRACT
Solitary wasps use their venoms to paralise prays to feed their larvae. A set of biologically
active peptides, obtained from these venoms, have been investigated in relation to the conformational
changes they undergo in anisotropic environments and their lytic activity on zwitterionic and anionic
vesicles. These peptides are mast cell degranulators, present antimicrobial activities and most of them
are not hemolytic. They are cationic, their chain length are 10 to 15 residues long, with high
hydrophilic / hydrophobic ratio; they are linear and helical in membrane mimetic environments. We
searched correlation between the lytic activity in vesicles of different compositions, monitored in
fluorimetric experiments, and conformational changes, induced by varied mimetic media, monitored
by circular dichroism. The results have been also correlated with peptides’ physical-chemical
parameters such as chain length, amidated or carboxylated C-terminal, net charge, influences on the
helix macrodipole, hydrophobicity, hydrophobic moment and polar angle. We observed that these
peptides present intense activity on model membranes, they interact preferentially with anionic
bilayers, and their lytic activity is a cooperative process either in anionic or in zwitterionic vesicles.
Exception made to Anoplin, all the other peptides that have antimicrobial activity present in their
dose-response curves a sigmoidal dependence with the peptide concentration. This fact suggests that
these peptides accumulate on the vesicles surface until they reach a threshold concentration, beyond
which leakage increases cooperatively. As a general rule, the most efficient antimicrobial peptides are
also those characterized by efficient permeabilization of anionic vesicles, namely PCPG 7030 and by
small threshold P/L ratios. These features make us suggest that the lytic activity of the peptides in this
study probably takes place through a mechanism similar to that described in the toroidal pore model.
Moreover, these lytic and antimicrobial peptides interact preferentially with phospholipids head group
region, forming pores whose mixed structures are made of lipids and peptides, with polar residues
being exposed to the aqueous solvent.
Key words: Wasp venom peptides. Antimicrobial peptides. Mastoparan. Lipossomes. Lytic activity.
Circular dichroism.
1
1. INTRODUÇÃO
Nos organismos multicelulares o sistema imunológico inato é responsável pela forma mais
rápida de resposta para controlar o surgimento de infecções. Ele se baseia na habilidade inerente das
espécies em discriminar seus próprios constituintes dos agressores e é relativamente inespecífico
(Hancock & Diamond, 2000). Peptídeos antimicrobianos de todas as espécies desde plantas até
mamíferos são integrantes desse sistema (Zasloff, 2002; Andreu & Rivas, 1998; Matsuzaki, 1999a e
2001; Shay, 1995, Epand & Vogel, 1999). A grande maioria foi encontrada em células epiteliais
contribuindo para a defesa dos organismos nesta primeira barreira (Zasloff, 2002). Um único animal
pode possuir diferentes tipos de peptídeos e isso sugere que seus espectros antimicrobianos sejam
complementares, que eles possam agir em sinergia, e que sejam produzidos naqueles tecidos onde
sejam mais necessários e eficientes (Hancock & Diamond, 2000).
Centenas de peptídeos antimicrobianos já foram isolados e independentemente da sua origem,
perfil de atividades biológicas e variabilidade estrutural eles apresentam diversas características
comuns: são constituídos por menos de 60 resíduos de aminoácidos, geralmente aminoácidos L,
possuem carga líquida positiva em pH fisiológico, são anfipáticos e a grande maioria apresenta algum
tipo de atividade sobre membranas. Estudos realizados tanto em organismos vivos como em
membranas modelo indicaram que os peptídeos antimicrobianos aumentam a permeabilidade da
membrana plasmática e que existe correlação direta entre efeito antibiótico e de permeabilização
(Andreu & Rivas, 1998). Tanto interações eletrostáticas como efeitos hidrofóbicos foram
reconhecidos como determinantes desses processos.
Embora possam ocorrer interações com receptores na membrana, o alvo dos peptídeos
antimicrobianos são os fosfolipídeos constituintes dessa mesma membrana (Yeaman & Yount, 2003;
Papo & Shai, 2003b), através de mecanismo que não é ainda completamente compreendido. A
interação entre peptídeos antimicrobianos e fosfolipídeos da membrana que causa sua desestruturação,
levando à lise da célula, se revela bastante vantajosa, pois a constituição lipídica da membrana foi
conservada durante a evolução (Zasloff, 2002; Yeaman & Yount, 2003), além de apresentar
significativa diferença entre microrganismos e células de eucariotos. Isso dificulta o desenvolvimento
de mecanismos de resistência pelos microrganismos (Zasloff, 2002). Não é difícil assim imaginar as
possibilidades vislumbradas de se empregar peptídeos antimicrobianos em antibioticoterapia,
principalmente em face do surgimento de novas cepas, de maior virulência, resistentes aos
antibióticos convencionais (Powers & Hancock, 2003; Yeaman & Yount, 2003).
Três modelos foram propostos para explicar a atividade lítica destes peptídeos por Matzusaki
(1999) e Shai (1999) e por Huang (2000). Embora apresentem diferenças fundamentais entre si, estes
modelos podem ser sintetizados em um único modelo, como segue: o peptídeo liga-se, inicialmente, à
superfície externa da membrana onde assume a conformação helicoidal, tendo o eixo da hélice
2
orientado paralelamente à bicamada. Nesta situação o peptídeo acumula na superfície externa da
membrana até alcançar uma concentração crítica. Acima desta concentração ocorre a atividade lítica
através da formação de poros toroidais transientes (Matsuzaki, 1999) e/ou de rompimento da
bicamada (Shay, 1999). Ao atingir a concentração crítica, a orientação dos peptídeos em relação à
bicamada muda e eles se orientam perpendicularmente a ela e formam poros toroidais ou poros com
estrutura de barril (“barrel stave”, Huang, 2000). Observa-se que a concentração crítica para
desencadear a atividade lítica é fortemente dependente dos lipídeos que compõem a membrana. Esta
dependência está relacionada às características elásticas da bicamada (módulos de flexão e de
compressibilidade) e à morfologia desses lipídeos da membrana (Harroun et al., 1999; Huang, 2000;
Chen et al. 2003).
Compreender as razões pelas quais alguns peptídeos antimicrobianos, eliminam patógenos
sem atingir as células do hospedeiro e por que cada um deles tem seu espectro particular de efeitos
antibióticos vem sendo a força motriz da maioria dos estudos nessa área. Pesquisas dirigidas à
composição e arquitetura da membrana fosfolipídica correm paralelamente aos estudos da influência
das características estruturais dos peptídeos e esses são os caminhos que se apresentam para tentarmos
melhorar a seletividade desses possíveis sucedâneos aos antibióticos convencionais.
Neste trabalho estudamos a conformação em ambientes anisotrópicos e a atividade lítica em
vesículas aniônicas e zwitteriônicas de um conjunto de peptídios biologicamente ativos, extraídos de
veneno de vespas solitárias, que se caracterizam por usar seus venenos para paralisar as presas com as
quais alimentam suas larvas. Esses peptídios que são desgranuladores de mastócitos, apresentam
atividade antimicrobiana e a maioria deles não é hemolítica. Possuem entre 10 e 15 resíduos, são
lineares, e de estrutura aleatória em meio aquoso. Nossa proposta é entender quais características
físico-químicas desses peptídeos, incluindo-se dentre elas a elipticidade, são importantes para
atividade lítica e para a seletividade em relação a membranas zwitteriônicas e aniônicas; e quais as
possíveis relações dessas características e da eficiência de permeabilização de vesículas com a
atividade antimicrobiana em relação a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A cada dia cresce
o número de novos peptídeos antimicrobianos que são encontrados em todos os tipos de organismos,
o que levou a alguns estudos de sistematização (Andreu & Rivas, 1998; Epand & Vogel, 1999), em
geral baseados em classificações de acordo com a estrutura secundária ou pelo mecanismo de ação; se
por um lado muitos desses peptídeos apresentam alta homologia em suas seqüências primárias, por
outro lado, pequenas alterações nessas seqüências parecem conduzir a atividades biológicas
diferentes, mais ou menos seletivas ou interessantes para aplicação em antibioticoterapia. Buscamos,
assim, uma forma de analisar e entender essas pequenas diferenças.
Para isso estudamos por Dicroísmo Circular as mudanças conformacionais geradas por
diferentes ambientes miméticos de membranas, tais como misturas TFE/água, soluções monomérica e
micelar de SDS, e em vesículas zwitteriônicas e aniônicas. Os resultados de elipticidade foram
analisados e comparados entre os peptídeos deste estudo, considerando-se também os seguintes
3
parâmetros físico-químicos que os caracterizam: observamos a influência do tipo e número de
resíduos na seqüência primária, a influência da natureza do terminal-C, amidado ou carboxilado, do
número e distribuição de resíduos carregados e a somatória desses efeitos no macrodipolo da hélice.
Buscamos, ainda, correlacionar a atividade lítica em vesículas de diferentes composições, analisada
em experimentos de espectroscopia de fluorescência, aos resultados obtidos nas análises
conformacionais e, ambos, à hidrofobicidade média, à anfipaticidade estimada pelo cálculo do
momento hidrofóbico, à extensão da face (ângulo) polar na hélice anfipática, e à atividade
antimicrobiana. Esses parâmetros têm sido objeto de extensos estudos que procuram estabelecer
conexões entre estrutura, atividade biológica e possíveis mecanismos de ação desses peptídios (Dathe
et al., 2002), visando o desenho de novas drogas com ação antibacteriana, menos susceptíveis ao
desenvolvimento de resistência.
4
2. REVISÃO DA LITERATURA
O objetivo desta pequena revisão é construir um cenário básico onde as atividades biológicas
dos peptídeos antimicrobianos helicoidais possam ser discutidas sob o enfoque de suas características
físico-químicas e da sua forma única de interagir com membranas, que resulta ao mesmo tempo em
um modo de ação não-específico (independente de receptores), mas altamente seletivo.
2.1 Atividade biológica
Peptídeos antimicrobianos (PAMs) constituem um universo em contínua expansão, como se
pode verificar consultando os bancos de dados
http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm
e
http://aps.unmc.edu/AP/main.html
, e para essa expansão toda sorte de seres vivos parecem
contribuir. O que mais chama a atenção e explica o crescente interesse é a impressionante variedade
de atividades já descritas, além da ação antimicrobiana (Tossi et al., 2000), que ao diferenciar-se
entre os organismos aumenta a especificidade e efetividade das respostas do sistema imune (Hancock
& Diamond, 2000). PAMs são ativos em vivo com amplo espectro para bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas, e fungos, em baixas concentrações, tanto em condições de baixa ou alta força iônica;
eles agem rapidamente, são bons agentes quimiotáticos, neutralizam lipopolissacarídeos de
membranas bacterianas com atividade antiendotóxica, e em combinação com antibióticos podem agir
sinergicamente (Scott et al., 1999; Zasloff, 2002; Yeaman & Yount, 2003), participam do sistema
imunológico inato, inclusive de respostas inflamatórias (Hancock & Diamond, 2000; Hoffmann et al.,
1999), promovem a cicatrização, possuem ação antiparasita, anti-câncer e antivírus com envelopes
(Powers & Hancock, 2003). Eles interferem com o acesso de patógenos a receptores nas células
hospedeiras e recrutam leucócitos aos locais infectados (Yeaman & Yount, 2003). Apresentam efeitos
colaterais limitados (Brogden et al., 2003) e não induzem resistência facilmente (Zasloff, 2002).
Numa mesma espécie de organismo foram encontradas diferentes classes de PAMs, incluindo
diversos análogos. As razões para essa variedade sugerem que seu campo de ação possa ser
complementar, agindo em sinergia entre si contra os microrganismos, e sendo produzidos localmente
por diferentes tipos de células (Hancock & Diamond, 2000). Sinergia e produção localizada pode ser
a forma de limitar a toxicidade às células hospedeiras, diminuir as concentrações inibitórias, agir em
sinergia com os constituintes do micro-ambiente e melhorar a eficiência (Yeaman & Yount, 2003).
Explicações sobre as razões pelas quais um único peptídeo não poderia ser capaz de eliminar
diferentes microrganismos podem estar no arsenal de lipídeos que compõem as membranas (Yeaman
& Yount, 2003).
O fato de aminoácidos hidrofóbicos serem os principais constituintes dos PAMs sugere que a
interação com a membrana bacteriana anfipática seja parte de seu mecanismo de ação. A conservação
do caráter catiônico desses peptídeos, ao longo da evolução dos organismos de todas as espécies,
evidencia também a importância das interações eletrostáticas para promover o primeiro contato e
5
modular as forças de ligação e a dinâmica subsequente. Forças eletrostáticas são as de maior alcance e
resíduos como Lisina e Arginina podem orientar suas cargas para as cabeças aniônicas dos
fosfolipídeos das membranas externas das bactérias. O conjunto de forças eletrostáticas que
direcionam a interação é complementado pelo potencial transmembranar negativo, inerente à maioria
dos patógenos bacterianos (Yeaman & Yount, 2003).
Evidências sobre a forma como os PAMs eliminam microrganismos sem afetar as células
hospedeiras apontam para diversas possibilidades, mas, claramente, a maioria delas está ligada a
características da membrana bacteriana que diferenciam sua susceptibilidade (Andreu & Rivas, 1998),
tais como: o potencial transmembranar que sofre despolarização, a composição que leva à ruptura
com vazamento subsequente do conteúdo celular, a arquitetura passível de perturbações na
distribuição dos lipídeos da bicamada (Yeaman & Yount, 2003), todos essas características
conduzindo a falhas nas funções da membrana; e ainda, o início de processos que degradam a parede
celular e a internalização do peptídeo propiciando o ataque às estruturas celulares (Scott et al., 1999).
No entanto, há também muitas evidências de outros mecanismos de ação que conduzem à morte
celular e que não estão diretamente ligados à integridade da membrana (Powers & Hancock, 2003;
Yeaman & Yount, 2003; Park, et al., 2000; Andreu & Rivas, 1998). A carga negativa relativamente
alta dos ácidos nucleicos os tornam alvos para os peptídeos catiônicos (Yeaman & Yount, 2003).
A base para a seletividade dos PAMs em relação às membranas bacterianas parecem ser a
composição lipídica, em geral aniônica, característica das camadas externas dessas membranas, e a
existência de um significativo potencial elétrico transmembranar (negativo, orientado para dentro, de -
130 a -150 mV) que o diferencia das membranas de eucariotos (Hancock, 1997; Matsuzaki et al.,
1999b). Peptídeos que não são catiônicos, como a alameticina, são menos seletivos entre células de
bactérias e de mamíferos. Baixo nível de fosfolipídeos aniônicos, próximo daquele encontrado em
eucariotos já foi relacionado à resistência de algumas bactérias aos PAMs (Andreu & Rivas, 1998;
Zasloff, 2002; Yeaman & Yount, 2003). Também a maior susceptibilidade de células tumorais à ação
antibiótica de alguns peptídeos foi atribuída a uma maior exposição de resíduos de fosfatidilserina
(Andreu & Rivas, 1998). Variações provocadas no nível de colesterol de eritrócitos resultaram numa
relação inversa entre os níveis de esterol e a susceptibilidade aos PAMs (Andreu & Rivas, 1998).
Entretanto, suas atividades são também afetadas por diferentes condições existentes em vivo,
incluindo altas concentrações de cátions mono- e divalentes, poliânions, como heparina, plasma,
lipopolissacarídeos (LPS), resíduos de ácido siálico e proteases (Andreu & Rivas, 1998).
Ainda assim, a maioria das atividades biológicas desses peptídeos está associada às
características das membranas:
1. Infecções causadas por bactérias Gram-negativas introduzem toxinas no sangue devido à
liberação de um componente da membrana externa, a endotoxina, ou lipopolissacarídeo. Sua
toxicidade está contida na porção denominada lipídeo A do LPS. Peptídeos antimicrobianos
catiônicos constituem uma alternativa para superar a infecção e a septicemia devido a sua capacidade
6
de ligação ao LPS. Embora os PAMs não sejam tão potentes como algumas drogas antibióticas
recentes, eles apresentam vantagens potenciais, incluindo o aumento da atividade dessas drogas e a
habilidade em bloquear a endotoxemia (Scott et al., 1999).
2. Peptídeos com atividade antifúngica, freqüentemente encontrados em plantas, são
relativamente ricos em aminoácidos polares, não carregados, e, curiosamente, os esteróis que ocorrem
principalmente em membranas eucarióticas, também são encontrados em fungos, mas não em
bactérias (Yeaman & Yount, 2003).
3. A hemólise compreende duas etapas, uma de ligação e outra de lise. DeGrado et al. (1982)
mostroram que a melitina, um peptídeo hemolítico e antimicrobiano do veneno de abelha, causa uma
liberação bifásica de hemoglobina dos eritrócitos: a primeira, uma liberação rápida e parcial efetuada
pelos peptídeos ligados à superfície dos eritrócitos, acoplada à penetração da melitina à membrana e,
uma segunda fase, mais lenta da liberação dos conteúdos citoplasmáticos, causada pela forma
dimérica da melitina ligada à membrana.
4. PAMs como magaininas, defensinas, NK-lisinas, BMAP-27 e BMAP-28 mostraram ser
ativos em células tumorais de mamíferos (Risso et al., 1998). BMAPs são peptídeos de origem bovina
da família das catelicidinas, cuja natureza catiônica lhes permite interagir com lipídeos negativamente
carregados ou com proteínas de membranas, ou com resíduos siálicos. BMAPs apresentam
seletividade a células alteradas ou em proliferação contra células em repouso e causam a morte
programada de linhas de células humanas alteradas e de linfócitos ativados. Disparar o mecanismo de
apoptose pode ser uma forma de eliminar células indesejadas (Risso et al., 1998).
5. A ação antiparasita dos PAMs é bem representada pelo seu efeito leishmanicida.
Temporinas são exemplos de PAMs que agem tanto nos estágios da
Leishmania
em insetos como em
mamíferos. Esta última forma, os promastigotos, são envolvidos por uma camada de glicocalix,
composta predominantemente por lipofosfoglicanas, uma molécula aniônica ligada à membrana por
glicosilfosfatidilinositol. Embora as temporinas sejam pouco capazes de ultrapassar a camada de LPS
das bactérias Gram-negativas, elas conseguem atravessar a camada de glicocalix e atingir a membrana
da Leishmania (Mangoni et al., 2005). Outros PAMs como indolicidina, híbridos curtos de cecropina-
melitina e dermaseptinas que também são leishmanicidas parecem agir por outros mecanismos.
Dermaseptinas DS3 e DS4 são ativos contra
Plasmodium falciparum
de uma maneira especialmente
seletiva: em células infectadas eles interagem diretamente com o parasita intracelular e em células não
infectadas eles permanecem ligados à membrana plasmática dos eritrócitos. DS3 não é hemolítico e
DS4 é hemolítico, correspondentemente, DS3 não permeabiliza vesículas PC e DS4 sim. Ambos são
igualmente eficientes em permeabilizar vesículas aniônicas (Ghosh et al., 1997).
PAMs também são reconhecidos como parte integrante do sistema imunológico desde plantas
até mamíferos (Zasloff, 2002; Andreu & Rivas, 1998; Matsuzaki, 1999a e 2001; Shay, 1995, Epand &
Vogel, 1999), desde que Boman et al., em 1981, os encontrou na traça
Hyalophora cecropia
.
(Hoffmann et al., 1999; Nordahl et al., 2004). Eles estão envolvidos em reações inflamatórias agudas
7
que são parte das defesas imunológicas, incluindo liberação de agentes inflamatórios pela lise de
células bacterianas, desgranulação de mastócitos e liberação de histamina, e aumento da quimiotaxia
(Zasloff, 2002).
2.1.1 Mastoparanos
Mastoparanos são peptídeos desgranuladores de mastócitos (Argiolas & Pisano, 1983; Hirai et
al., 1979; Nakajima et al., 1986; Katsu et al., 1990; Mendes et al., 2005), extraídos de insetos da
família
Vespidae
(Nakajima, 1986), que além de serem antimicrobianos apresentam uma ampla
variedade de atividades biológicas, tais como: ação hemolítica (Argiolas & Pisano, 1983; Nakajima et
al., 1986; Konno et al., 2000; Mendes et al., 2005 e 2004), aumento da ação quimiotática para
macrofagos humanos e leucócitos polimorfonucleares (Souza et al., 2005; Nakajima et al., 1986),
ligação à calmodulina (Nakajima et al., 1986), regulação da proteína G (Higashijima, T. et al., 1990),
estimulação da fosfolipase A
2
(Argiolas & Pisano, 1983) e da fosfolipase C (Katsu et al., 1990), e
permeabilização de bicamadas planares a cátions (Katsu et al., 1990; Nakajima et al., 1986;).
A classe dos mastoparanos foi assim denominada devido ao seu primeiro alvo reconhecido, os
mastócitos. Estes e os basófilos são parte do sistema imunológico e responsáveis pelas reações
alérgicas (Ivanova et al., 2001; Triggiani et al., 2000). Como parte deste sistema eles reagem
defendendo contra infecções por bactérias ou parasitas, mas também estão envolvidos em algumas
desordens cardiovasculares, neurológicas e gastrointestinais (Triggiani, et al., 2000). Quando
acionados os mastócitos liberam substâncias como a histamina dos basófilos, serotonina das
plaquetas, catecolaminas e ácidos adenílicos de células adrenais, citocinas e produtos recém
produzidos como prostaglandina D
2
, leucotrieno C
4
e hidroxi-ácidos graxos. (Engels et al., 1997;
Nakajima et al., 1986).
Mastoparanos estão entre os constituintes dos venenos de vespas da ordem
Hymenoptera
(Nakajima et al., 1986). Eles facilitam a ação da fosfolipase purificada, que causa mudanças na
composição fosfolipídica da membrana e está associada à desgranulação de mastócitos. Fosfolipases
que preferencialmente hidrolisam fosfatidilcolina (PC), provocam a desgranulação em células RBL-
2H3, uma linhagem de mastócitos de mucosa (Ivanova et al., 2001).
Mastoparanos regulam as funções da proteína G de uma maneira semelhante à dos receptores.
Eles ligam-se a sítios negativamente carregados da proteína G (Higashijima et al., 1990). Apresentam
ainda forte afinidade por fosfolipídeos, assumindo uma conformação ordenada ao se ligarem a eles
nas membranas das células-alvo. Assim, estes peptídeos podem assumir uma orientação adequada em
relação às moléculas da proteína G e com isso aumentando a sua concentração efetiva na superfície da
membrana, próximo às moléculas dos receptores. Os efeitos de ativação pelos mastoparanos são
seletivos dentre as proteínas G (Wakamatsu, 1992).
Mastoparanos são peptídeos antimicrobianos catiônicos, com cerca de 14 aminoácidos, ricos
em resíduos hidrofóbicos e a maioria deles apresenta o terminal-C amidado. Usualmente assumem
8
uma conformação helicoidal anfipática quando interagem com ambientes também anfipáticos. As
Tabelas 1 e 11 (capítulo Resultados) mostram as seqüências primárias e algumas características
estruturais dos mastoparanos discutidos neste trabalho.
2.2 Seletividade de peptídeos antimicrobianos
Experimentos de ligação de PAMs, compostos exclusivamente por aminoácidos D ou L, a
membranas enfatizam o conceito de um mecanismo de ação independente de um receptor
estereoespecífico (Wade et al., 1990; Oren & Shai, 1997; Papo & Shai, 2005; Braunstein et al., 2004).
Observações sobre a maneira como peptídeos nativos exercem sua ação
in vivo
, comparada
com suas atividades
in vitro
, chamaram a atenção para o fato de que algumas vezes estes efeito são
muito mais intensos do que aqueles e vice-versa (Shai, 1999; Tossi et al., 2000; Dathe & Wieprecht,
1999; Matsuzaki, 1999a; Yeaman & Yount , 2003). A razão fundamental está na extensão em que os
PAMs podem distinguir patógenos de células hospedeiras, o que certamente está ligado a estruturas e
funções inerentes a ambos tipos de células, tais como diversidade de composição, afinidade
eletrostática, transição conformacional dos peptídeos e estado energético das células-alvo, os quais
podem promover ou retardar os efeitos. Além disso, a seletividade pode estar ligada também à
expressão localizada em determinados tecidos, e ao controle sinérgico, positivo ou negativo,
juntamente com outros PAMs ou constituintes do microambiente (Yeaman & Yount, 2003). Peptídeos
serão menos danosos a tecidos sensíveis do hospedeiro, se eles estiverem presentes apenas no local e
no momento da necessidade. Um exemplo é a presença de PAMs potentes, menos seletivos e em
concentrações relativamente altas dentro de fagócitos. Pelo processo de fagocitose os patógenos são
internalizados nos fagócitos; a desgranulação dessas organelas é potencialmente perigosa para o
hospedeiro, mas a eliminação interna de células patogênicas pode ser muito eficiente (Yeaman &
Yount , 2003).
A seqüência primária dos PAMs e as características dos terminais-N e -C definem aspectos
físico-químicos – como carga líquida, anfipaticidade, hidrofobicidade – e sua configuração
tridimensional. Assim, alterações na seqüência primária podem ter forte influência na estrutura como
um todo, afetando sua ligação a membranas, as mudanças conformacionais e o perfil de atividades
biológicas (Dathe & Wieprecht, 1999). Esses aspectos são específicos de cada peptídeo na mesma
medida em que torna distinta cada interação de um peptídeo com diferentes patógenos. A estrutura
secundária dos PAMs, assim como a sua ausência, também se acredita que contribua para a
seletividade. Peptídeos cujas análises espectroscópicas, por dicroísmo circular (CD) ou ressonância
magnética nuclear (RMN), apresentam um perfil característico de estrutura desordenada, mudam sua
conformação quando se ligam a membranas naturais ou membranas miméticas. Mudanças
conformacionais, por exemplo, para hélice-
α
(dos Santos Cabrera et al., 2004), folha-
β
, auto-
associação ou oligomerização (Ghosh et al., 1997) mostraram ser dependentes do ambiente da
membrana e como tal funcionar seletivamente (Yeaman & Yount, 2003). Huang et al. (2000) chamou
9
atenção para o fato de que cada peptídeo tem seu próprio espectro de atividade biológica, e isso não
pode ser apenas resultante de diferenças nas ligações eletrostáticas ou no potencial
transmembranar.
Ele e seus colaboradores mostraram ainda que a susceptibilidade da bicamada depende de uma razão
limite entre as concentrações de peptídeo e fosfolipídeo (P/L) que conduz à lise, e que por sua vez,
depende da composição lipídica dessa bicamada (Huang, 2000; Chen et al., 2002; Heller et al., 1998;
Ludtke et al., 1994; Huang & Wu, 1991; Lee et al., 2005).
A importância da carga líqüida positiva, característica dos PAMs em pH fisiológico, para seu
modo seletivo de ação, se evidencia quando consideramos que membranas bacterianas apresentam um
gradiente eletroquímico significativamente maior que as células de eucariotos. Este fato e o caráter,
em geral, aniônico da camada mais externa dessas membranas compõem o conjunto de interações
eletrostáticas que guiam a ação seletiva dos PAMs em relação a seus alvos.
2.2.1 Influência da composição, arquitetura e energia da membrana
A bicamada fosfolipídica forma a estrutura básica de todas as biomembranas, as quais
apresentam um domínio hidrofóbico e um hidrofílico. As diferenças entre membranas celulares
procarióticas e eucarióticas estão principalmente relacionadas à sua composição. Fosfatidilcolina, seu
análogo esfingomielina (SM), e fosfatidiletanolamina (PE) são componentes zwitteriônicos que
predominam nas membranas celulares eucarióticas, assim como os esteróis, colesterol e ergesterol,
que em altas concentrações estabilizam a bicamada (Allende & McIntosh, 2003; Lohner & Prenner,
1999; Matsuzaki et al.,1995a), por aumentarem o ordenamento das cadeias acílicas e a espessura da
bicamada (Killian, 1992). Membranas celulares de mamíferos, exceto humanos, são freqüentemente
ricas em SM e pobres em PE. Ao contrário, a camada externa das membranas celulares procarióticas
tende a ser composta predominantemente por fosfolipídeos aniônicos como fosfatidilglicerol (PG),
seu dímero, a cardiolipina (CL) e fosfatidilserina (PS), que são praticamente ausentes em membranas
de mamíferos (Yeaman & Yount, 2003; Lohner & Prenner, 1999; Matsuzaki, 1998a). Em resumo, a
camada externa das membranas celulares bacterianas tende a ser fortemente negativa e aquelas de
mamíferos são em geral eletricamente neutras, constituindo-se um dos fatores que definem a
seletividade dos PAMs.
O formato das moléculas de fosfolipídeos influencia seu empacotamento e a curvatura
espontânea das bicamadas. Moléculas de forma cilíndrica como PC tendem a formar estruturas
estáveis em bicamadas; moléculas de formato cônico como lisofosfatidilcolina (LPC) ou
dodecilsulfato de sódio (SDS), com a área da cabeça polar maior que a área da sessão transversal das
cadeias acílicas, tendem a formar soluções micelares, com uma superfície de curvatura convexa
positiva; moléculas de formato cuneiforme como PE tendem a formar superfícies com curvatura
côncava, negativa, denominada fase hexagonal reversa. A energia de curvatura determina sua
formação. Assim, duas forças opostas agem, curvatura e empacotamento (Lindblom & Rilfors, 1989;
Killian, 1992). A área das cabeças polares é afetada pela hidratação e interações inter- e
10
intramoleculares, enquanto a área dos hidrocarbonetos é afetada pelo comprimento e grau de
insaturação das cadeias, e pela temperatura que promove ordenamento ou desordenamento em suas
terminações. O peptídeo linear gramicidina interage fortemente com vesículas PC e praticamente não
interage com PE. Embora ambos fosfolipídeos sejam zwitteriônicos, as diferenças foram atribuídas à
natureza das cabeças polares e ao empacotamento desses lipídeos (Killian, 1992). A adição de
peptídeos pode estabilizar ou não o balanço entre curvatura e empacotamento. Esse balanço também
permite o rearranjo de membranas biológicas em importantes processos como encapsulamento e
fusão.
A distribuição de fosfolipídeos entre as camadas interna e externa da bicamada constitui sua
arquitetura. Diferenças sutis em cada monocamada como na estequiometria da composição de
fosfolipídeos, na saturação das cadeias lipídicas, e na distribuição assimétrica influenciam a fluidez, a
transição de fase, a distribuição de carga e a anfipaticidade de todo o sistema e, consequentemente, a
forma e a intensidade como os PAMs interagirão com a membrana. Estudos focalizando as fases das
membranas e a composição lipídica indicaram o papel de lipídeos específicos na função normal da
membrana, especialmente de lipídeos do tipo não formador de bicamadas como PE (Powers &
Hancock, 2003).
A distribuição assimétrica de carga na bicamada e gradientes eletroquímicos através da
membrana que dependem do fluxo de prótons, criam um potencial transmembranar. Células de
mamíferos normais apresentam uma diferença de potencial através da membrana na faixa de -90 a -
110 mV, contrastando com células bacterianas cuja diferença de potencial varia com a fase de
crescimento na faixa de -130 a -150 mV na fase logarítmica. Essa importante diferença entre células
de mamíferos e microbianas inclui-se entre os orientadores da toxicidade seletiva e foi denominada
“self-promoted uptake” (Hancock, 1997).
2.2.2 Influência dos lipopolissacarídeos (LPS) e da membrana externa das bactérias
As superfícies externas de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas apresentam alta
densidade de cargas negativas. Nas primeiras as membranas são ricas em ácidos teicóicos e
teicurônicos formando uma parede de peptidoglicanos em múltiplas camadas. As membranas
citoplasmáticas das bactérias Gram-negativas possuem um envoltório externo composto de
lipopolissacarídeos negativamente carregados que consistem de uma cadeia de polissacarídios
covalentemente ligada ao lipídeo A, o qual é responsável por efeitos tóxicos adicionais em infecções
(choque endotóxico) causadas por este tipo de bactérias. O primeiro componente é hidrofílico e
densamente empacotado, e a outra parte é hidrofóbica, aniônica, com seis cadeias de ácidos graxos
por molécula, mantidas juntas, em parte, por cátions divalentes (Scott et al., 1999; Papo & Shai, 2005;
Epand & Vogel, 1999). Essa membrana externa é considerada uma barreira e a ela se atribui uma
atividade antimicrobiana inferior de alguns peptídeos (Allende & McIntosh, 2003; Oren & Shai,
1997; Papo & Shai, 2005; Zhang et al., 2001; Bechinger, 1999). Scott et al.(1999), trabalhando com
11
peptídeos helicoidais híbridos de cecropina (da traça de seda) e melitina (do veneno de abelha)
encontrou que alguns análogos com boas atividades antimicrobianas e antiendotóxicas também
possuíam maior afinidade de ligação de LPS. Contrariamente, Papo & Shai (2005) trabalhando com
LPS de diferentes fontes e dodecapeptídeos helicoidais sintéticos não encontraram correlação direta
entre ligação a bicamadas de LPS e despolarização de membranas citoplasmáticas, com eliminação de
bactérias Gram-negativas, embora exista correlação entre atividade biológica e eficiência de
permeabilização de bicamadas de LPS. Nesses estudos mostrou-se a alta capacidade de ligação de
peptídeos a LPS; em princípio, LPS na forma ligada pode ter sua ação tóxica neutralizada e essa é a
base da atividade antiendotóxica dos PAMs.
2.3 Modulação da atividade na membrana e correlação com a atividade biológica
Uma correlação direta entre o efeito antibiótico e a habilidade em permeabilizar membranas,
tanto em organismos vivos como em sistemas modelo, vem sendo encontrada para a maioria dos
PAMs, como defensinas, magaininas, cecropinas, bactenecinas ou dermaseptinas (Andreu e Rivas,
1998). Alguns casos de mecanismos de ação não-líticos foram descritos (Powers & Hancock, 2003;
Yeaman & Yount, 2003; Park et al., 2000). Estudos da interação peptídeo-lipídeo mostraram que a
inserção do peptídeo e as modificações no empacotamento da membrana estão correlacionados com
as interações hidrofóbicas entre eles, e que as interações eletrostáticas estão correlacionadas à ligação
e perturbação da superfície da bicamada, à desativação do poro, à translocação para a camada interna
e à ruptura do potencial transmembranar, todos conduzindo à lise da membrana, ao vazamento do
conteúdo celular e à morte celular (Kiyota et al., 1999; Park et al., 1995; Dathe et al., 1996).
Parâmetros estruturais e o efeito de suas modificações vêm sendo estudados em função do seu papel
modulador na seletividade e atividade dos PAMs (Yeaman & Yount, 2003; Giangaspero et al. (2001);
Wieprecht et al., 1997a).
2.3.1 A conformação helicoidal
Dentre os PAMs mais estudados a maioria é helicoidal, como melitina, magainina e
mastoparanos, apresenta atividade lítica e forma poros em membranas e vesículas (DeGrado et al.,
1982, Matsuzaki et al., 1997b, 1995b e 1996a; Whiles et al., 2001). A hélice-
α
é termodinamicamente
favorecida em ambientes de membrana, pois permite a formação de ligações de hidrogênio
intramoleculares entre os grupos amida e carbonila da cadeia peptídica. Além disso, promove
interações de van der Waals favoráveis entre as cadeias laterais da hélice-
α
e os fosfolipídeos das
membranas (Deber & Li, 1995).
Peptídeos antimicrobianos helicoidais são em geral lineares, possuem menos de 40 resíduos
na cadeia, não contém resíduos de cisteína e algumas vezes apresentam uma dobra no meio da cadeia.
Quando assumem a estrutura em hélice-
α
tornam-se anfipáticos (ou anfifílicos). Esse aspecto
12
estrutural tem um importante papel na ligação de peptídeos a membranas ou superfícies também
anfipáticas. De acordo com DeGrado et al. (1982), hélices-
α
, como motivos estruturais, foram
primeiramente demonstradas em apolipoproteínas da lipoproteína-3 de alta densidade do plasma
humano; elas intercalam entre as cabeças polares dos fosfolipídeos da superfície das monocamadas, as
quais envolvem o centro lipídico feito de triglicerídios e colesterol, estabilizando-o.
2.3.2 Aspectos estruturais
Apesar de serem produzidos por uma vasta gama de organismos, os PAMs compartilham
padrões estruturais muito semelhantes, os quais são conhecidos por sua interdependência. Os mais
importantes serão discutidos individualmente quando possível. A Figura 1 ilustra algumas das
características estruturais que serão discutidas:
Figura 1: Representação esquemática dos parâmetros que podem afetar a estruturação dos PAMs
helicoidais (Tossi et al., 2000).
2.3.2.1
Seqüência primária e comprimento da cadeia.
Em peptídeos de cadeia curta as características
de alguns resíduos de aminoácidos crescem em importância. Gly aumenta a flexibilidade da cadeia
principal e favorece dobras desta (Andreu et al., 1992). Pro também é responsável por dobras na
cadeia principal, entretanto sua cadeia lateral é quase rígida. Uma dobra causada por Pro na posição
11 em buforina II, um PAM de 21 resíduos, é considerada responsável pela habilidade deste peptídeo
em penetrar células (Park et al., 2000). Val. Ile e Leu possuem cadeias laterais maiores, ramificadas e
mais rígidas. Phe, Trp e Tyr apresentam flexibilidade restrita da cadeia lateral. Trp é levemente polar
devido aos seu anel indol heterocíclico, e tem preferência por posições na interface polar/apolar
(Schulz & Schirmer, 1978).
Resíduos polares não carregados como Ser e Thr, com seus grupos hidroxila, e Asn e Gln,
com suas amidas ácidas, estão freqüentemente envolvidos em ligações de hidrogênio. O grupo
face polar
13
hidroxila polar de Tyr participa de fortes ligações de hidrogênio. Os resíduos carregados
negativamente, como Asp e Glu, assim como os positivamente, Lys e Arg, podem se involver em
ligações salinas. Cadeias laterais de Lys e Arg são longas, flexíveis e hidrofóbicas, exceto nas
terminações (Schulz & Schirmer, 1978).
Giangaspero et al. (2001) e Tossi et al. (2000) analisaram mais de 150 seqüências de PAMs,
entre 16 e 40 resíduos na cadeia, produzidos por várias espécies, de insetos a mamíferos, limitando
aos primeiros 20 resíduos a partir do terminal-N, e encontraram um padrão no tipo de resíduos –
carregados, polares ou hidrofóbicos – de acordo com suas posições médias na cadeia. Foi observada
conservação significativa para Gly nas posições 1, 7 e 14, e para Lys na posição 8. Gly 1 foi
encontrado em 70% dos peptídeos pesquisados no banco de dados AMSDb (Tossi et al., 2000) e já
havia sido considerado um resíduo que favorece a estrutura em hélice quando encontrado na posição 1
(Rohl & Baldwin, 1998). Resíduos alifáticos grandes foram encontrados formando a face hidrofóbica,
e resíduos menores, como Ala, aparecem ao centro ou na região do terminal-C; resíduos aromáticos
são raros, mas aparecem no terminal-N. Lys é o resíduo polar mais comum, seguindo por Ser na
posição 4. Dessa forma eles propuseram o seguinte modelo:
Gly - H - H - ±±/np - +/np - H - X/Gly - ±±/np - X - H - ±±/np - +/np - H - H/Gly - +/np - + - H - X –
onde os resíduos indicados como H são hidrofóbicos, + são positivos, - são negativos, np são polares
neutros, e X quando nenhum tipo de resíduo predomina na posição. Eles também encontraram que de
40 a 60% dos resíduos nas seqüências examinadas são hidrofóbicos.
O comprimento da cadeia nem sempre é pré-requisito para a atividade de peptídeos
helicoidais, pois ação antimicrobiana já foi detectada em peptídeos com apenas 10 resíduos (Konno et
al., 2001). Experimentos com deleção e/ou hibridização de cadeias peptídicas conduziram a resultados
variados; alguns dos híbridos de cecropina-melitina com 30 a 60% de redução da cadeia apresentaram
a mesma atividade antibacteriana que o peptídeo de partida com 26 resíduos (Andreu et al., 1992).
Redução de 30% no comprimento da cadeia de EMP-AF aboliu a atividade antibacteriana (dos Santos
Cabrera et al., 2004). Blondelle & Houghten (1992) mostraram que peptídeos sintéticos com cadeia
de 11 a 17 resíduos exibiram maior atividade antibacteriana do que os análogos menores (até 8
resíduos) ou aqueles mais longos (até 22 resíduos). PAMs de cadeia curta, muito ativos são
considerados modelos de balanço adequado entre carga elevada, teor de hélice, hidrofobicidade
adequada e número correto de resíduos grandes alifáticos (Giangaspero et al., 2001).
2.3.2.2
Terminais-N e -C. As características dos terminais-N e -C são relativamente mais importantes
para o teor helicoidal e para as atividades biológicas dos peptídeos de cadeia curta do que para outros
tipos de peptídeos de cadeias mais longas (Scholtz et al., 1991), com vários exemplos na literatura. A
adição de uma amina ao terminal-N de pequenos congêneres de SMAP-29 (um peptídeo encontrado
nas células mielóides da medula óssea de ovelhas) aumentou suas atividades antimicrobianas; o grupo
carboxila do terminal-C de cecropina-1 é determinante para sua atividade contra bactérias Gram-
14
negativas (Brogden et al., 2003); a amidação do mesmo C-terminal em EMP-AF é necessária para a
ação antimicrobiana (dos Santos Cabrera et al., 2004; Sforça et al., 2004).
A amidação é provavelmente a mais freqüente modificação pós-translacional que ocorre em
uma ampla variedade de peptídeos; ela envolve a descarboxilação oxidativa de um resíduo de glicina
adicional. Isto previne a clivagem por carboxipeptidases, permite a acomodação do terminal-C, que
deixa de ser negativamente carregado, em um ambiente não polar (Andreu & Rivas, 1998; Schulz &
Schirmer, 1978), e provê uma ligação de hidrogênio a mais para a formação de hélices-
α
(Sforça et
al., 2004). A correlação entre amidação e atividade biológica varia de peptídeo para peptídeo: em
alguns casos as formas amidadas ou não-amidadas não diferem substancialmente, mas em outros
casos, a atividade pode ser significativamente modificada. Em diversos casos, análogos de peptídeos
nativos que não são originalmente amidados apresentam atividade antimicrobiana aumentada (Shalev
et al., 2002; Sitaram & Nagaraj, 1999; Andreu & Rivas, 1998).
Uma modificação comum do grupo amino do terminal-N é a acetilação ou formilação ou
mesmo a conversão de um glutamato do terminal-N em um grupo carbonilpirrolidona, como ocorre
em venenos de cobras. Essas modificações que alteram a carga do terminal-N podem evitar o ataque
por aminopeptidases ou facilitar a introdução do terminal-N em um ambiente apolar (Schulz &
Schirmer, 1978).
2.3.2.3
Macrodipolo da hélice e cargas.
A presença de resíduos eletricamente carregados e polares ao
longo da cadeia peptídica proporciona diferentes possibilidades de interação eletrostática, cujos
efeitos na estabilização ou desestabilização da hélice são dependentes das suas posições relativas na
cadeia (Shoemaker et al., 1985). Cada unidade peptídica tem um momento de dipolo de 3,5 D (1,155
x 10
-29
Cm); em uma hélice-
α
a somatória dos dipolos dos grupos amida individuais, que estão
alinhados quase paralelamente ao eixo da hélice, constitui o dipolo da hélice. Valores de até 5 D
podem ser teoricamente alcançados com contribuições adicionais das ligações de hidrogênio que
formam a hélice-
α
. O significativo campo elétrico de uma hélice-
α
é, portanto, gerado pelo
macrodipolo que vai do polo negativo no terminal-C ao polo positivo no terminal-N (Hol et al., 1978),
e esse campo depende da constante dielétrica do solvente (Joshi & Meier, 1996). Os seguintes efeitos
foram atribuídos à influência geral do macrodipolo da hélice: resíduos positivamente carregados,
quando situados próximos ao terminal-N (posição 2), parecem ser responsáveis por regiões
desestruturadas (Park et al., 2000; dos Santos Cabrera et al., 2004). Assim como um resíduo Glu,
negativamente carregado, próximo ao terminal-C carboxilado, parece instabilizar um segmento
helicoidal no peptídeo Seminalplasmina, a deleção de uma Arg junto ao terminal-C amidado de
indolicidina está relacionado à diminuição de atividades antimicrobianas e antifúngicas (Sitaram &
Nagaraj, 1999). Por outro lado, Marqusee & Baldwin (1987) mostraram, em peptídeos projetados, que
a presença de um Glu no terminal-N e de uma Lys no terminal-C facilita a formação da hélice por
interações favoráveis entre as cargas e o dipolo da hélice; num outro exemplo, Park et al., 2000
15
mostraram que uma modificação que trouxe um resíduo Arg para a primeira posição resultou em um
PAM mais eficiente que o peptídeo de origem. Em resumo, resíduos negativamente carregados
próximos ao terminal-N da hélice, assim como resíduos positivamente carregados próximos ao
terminal-C, favorecem as interações eletrostáticas com o dipolo da hélice (Shoemaker et al., 1985;
Marqusee et al., 1989; Lyu et al., 1990; Deber & Li, 1995; Strop et al., 2000), e o aumento da
helipticidade do peptídeo (Scholtz et al., 1993). O estado de ionização dos resíduos carregados
também influencia a tendência de formação da hélice, aumentando sua estabilidade quando os
resíduos carregados estão nas posições
i, i
+ 3 ou
i, i
+ 4, e quando a interação é entre resíduos não-
ionizados e ionizados nas posições
i, i
+1 ou
i, i
+2 (Scholtz et al., 1993). Esses fatos indicam que a
influência no macrodipolo da hélice depende da posição dos resíduos carregados.
Uma carga líquida variando entre +2 e +9 (Yeaman & Yount, 2003) ou de +4 a +6 (Tossi et
al., 2000; Giangaspero et al., 2001) é uma característica comum entre PAMs e alguns deles, como
melitina e buforina II, possuem um domínio catiônico definido. Cationicidade vem sendo considerada
essencial para a atividade biológica, embora o número de cargas positivas requeridas para essa
atividade varie de caso para caso (Sitaram & Nagaraj, 1999; Andreu & Rivas, 1998). A ação de
peptídeos catiônicos em membranas de patógenos negativamente carregadas se inicia com a interação
eletrostática entre eles; consequentemente, um aumento de cargas positivas no peptídeo deveria
aumentar a atividade antimicrobiana (Matsuzaki et al., 1997a; Dathe et al., 1997; Andreu & Rivas,
1998;). Entretanto, alta densidade de carga pode acarretar outros efeitos como repulsão entre
monômeros de peptídeo, o que limitaria a quantidade de peptídeo ligada ou desestabilizaria estruturas
de poro pela proximidade desses monômeros. Em qualquer caso, o mecanismo de ação pode ser
afetado.
De acordo com Dathe et al. (2001), o aumento do número de cargas positivas, dentro de
certos limites, em análogos de magainina 2, com a manutenção das demais características estruturais,
produziu aumento da atividade antimicrobiana. Além desses limites a atividade antimicrobiana
diminuiu e surgiu atividade hemolítica; adicionalmente, peptídeos com alta cationicidade (+7)
destruíram a integridade da camada externa de LPS em bactérias Gram-negativas. Outro exemplo
semelhante foi observado em SPF, um segmento de 13 resíduos de aminoácidos do peptídeo
seminalplasmina (SPLN): este segmento teve sua atividade antimicrobiana aumentada em cinco
vezes, com amplo espectro, quando sua carga foi aumentada de +1 para +3, porém a inclusão de duas
cargas positivas adicionais não melhorou sua ação antimicrobiana (Sitaram & Nagaraj, 1999). Uma
redução de +5 para +3 na carga de peptídeos sintéticos com 19 resíduos também reduziu
significativamente a atividade antimicrobiana, mas um aumento até +8 reduziu o espectro
antimicrobiano e aumentou a atividade contra fungos; isto foi atribuído a uma redução do conteúdo
helicoidal do análogo com carga +8 em relação a aquele com +5 (Giangaspero et al., 2001). Um
mínimo de carga ao redor de +2 foi sugerido como necessário para a seletividade dos PAMs (Yeaman
& Yount, 2003), por facilitar a interação inicial com membranas microbianas, transições na orientação
16
(formação de poro) e translocação de peptídeos para a membrana citoplasmática, além de favorecer o
deslocamento de cátions ligados a membranas (Yeaman &Yount, 2003; Matsuzaki, 1998a; Andreu &
Rivas, 1998).
2.3.2.4
Propensão helicoidal e elipticidade.
O enovelamento em hélice de uma seqüência de
aminoácidos é um processo cooperativo (Rohl & Baldwin, 1998), caracterizado pelos parâmetros de
Zimm-Bragg,
σ
e
s
, respectivamente definidos como fator de nucleação e constante de propagação
(Chou & Fasman, 1974; Gans et al., 1991). Cada resíduo de aminoácido tem suas próprias
preferências conformacionais, e na seqüência, a somatória dessas preferências conduz à estabilização
ou não da hélice-
α
(O’Neil, & DeGrado,1990), dependendo do comprimento da cadeia (Marqusee et
al., 1989; Gans et al., 1991), de restrições conformacionais estéricas das cadeias laterais (Deber & Li,
1995) e do ambiente (Blondelle et al., 1997; Waterhous & Johnson, 1994; Zhong & Johnson, 1992).
Alguns autores reconheceram que o equilíbrio hélice-coil dos resíduos de aminoácidos pode
ser afetado por diferentes grupos vizinhos e pelo ambiente não aquoso, resultante do confinamento de
alguns resíduos na estrutura terciária de uma proteína, ou ocasionado por interações não locais (Chou
& Fasman, 1974; Waterhous & Johnson, 1994; Marqusee et al., 1989). Por exemplo, Val e Ile
apresentam alta propensão pela conformação em folha-
β
, de acordo com o método de Chou &
Fasman (1974), porém eles são freqüentemente encontrados em PAMs helicoidais e em segmentos
helicoidais de proteínas de membrana, sugerindo, como proposto por Waterhous & Johnson (1994),
que as características do ambiente como solvente podem suplantar a propensão intrínseca da
seqüência. Deber & Li (1995) propuseram uma escala de propensão helicoidal baseada em medidas
de elipticidade (CD) de um peptídeo “hospedeiro” de 20 resíduos, projetado para ser um modelo de
proteína de membrana, e onde a influência da hidrofobicidade dos resíduos também foi considerada.
Foram usados os seguintes meios aniônicos em tampão pH 7,0: solução micelar 10 mM de SDS,
solução micelar 5 mM de lisofosfatidilglicerol (lpg) e vesículas 10 mM de
dimiristoilfosfatidilglicerol; e ainda, foi determinada a variação no comprimento de onda de emissão
da máxima fluorescência do único resíduo de Trp na seqüência, indicando que o segmento central do
peptídeo interage efetivamente com o interior hidrofóbico de micelas de SDS. Nos três ambientes
testados obteve-se a seguinte ordem decrescente de propensão helicoidal:
Ile>Leu>Val>Met>Phe> Ala>Gln>Tyr> Thr>Ser> Asn>Gly>Pro
que é bastante semelhante à ordem de hidrofobicidade decrescente dos resíduos, de acordo com a
escala proposta por Eisenberg et al. (1984):
Ile>Phe>Val>Leu>Met>Ala>Gly>Tyr>Pro>Thr>Ser>Asn>Gln
Em SDS micelar, os resíduos Ile e Val que são ramificados no carbono
β
estão entre os mais fortes
formadores de hélice. Além disso, eles calcularam a energia livre de formação da hélice relativa a Pro,
a qual confirma sua escala de propensão.
17
Um estudo semelhante, conduzido por Blondelle et al. (1997), avaliou sistematicamente a
propensão helicoidal de 19 aminoácidos naturais (exceto histidina, por problemas na obtenção do
peptídeo) em meio aquoso tamponado, em SDS abaixo da cmc, considerado um meio mimético do
interior de proteínas, em SDS acima da cmc e em micelas mistas de lisofosfatidilcolina e
lisofosfatidilglicerol (lpc/lpg), considerados miméticos de membranas. Nesse estudo 9 aminoácidos
apresentaram propensão para conformação em folha-
β
em meio SDS abaixo da cmc; dentre eles os
peptídeos contendo Ala, Cys, Val e Tyr apresentaram mais de 85% de conformação em folha-
β
e Gly
55%. Como o peptídeo hospedeiro projetado não posui um segmento flexível que permitisse uma
dobra na cadeia, os autores sugerem que essa conformação resulte de interações intermoleculares ou
de interações entre a seqüência de resíduos de alanina do hospedeiro e as moléculas monoméricas de
SDS, funcionando como um molde. Nos meios micelares de SDS e de lpc/lpg os 19 aminoácidos
apresentam propensão helicoidal, o que pode ser explicado pela estabilização dessa conformação
devido ao aumento das ligações de hidrogênio intramoleculares no ambiente lipofílico do interior das
micelas. Foram determinados, também, valores de elipticidade semelhantes para os diferentes
resíduos nos dois ambientes sugerindo que as interações hidrofóbicas entre peptídeos e cadeias
acílicas sejam responsáveis pela indução da conformação em hélice-
α
. Em meio SDS micelar a
propensão helicoidal decresce na seguinte ordem:
Arg>Lys>Gln>Glu>Asn>Leu>Ile>Met>Ala>Asp>Tyr>Val>Gly>Thr>Cys>Trp>Ser>Phe>Pro
Observa-se que nesse ambiente os resíduos carregados apresentam maior propensão helicoidal que os
resíduos hidrofóbicos; isso reflete a contribuição das interações eletrostáticas entre os grupos
carregados e as cabeças aniônicas do SDS que podem facilitar a acomodação das porções hidrofóbicas
das cadeias laterais junto às caudas hidrofóbicas de SDS. Observa-se também que dentre os resíduos
carregados e polares a propensão helicoidal decresce com o comprimento das cadeias laterais, e
portanto com a hidrofobicidade dessas cadeias. Nessa escala a hidrofobicidade intrínseca dos
aminoácidos tem um efeito menor na propensão helicoidal. As diferenças entre esta escala e aquela
proposta por Deber & Li (1995) é atribuída às diferenças na cadeia do peptídeo hospedeiro que
produzem ambientes locais diferenciados.
O enovelamento em hélice parece ser um importante mecanismo da ação antimicrobiana, pois
peptídeos helicoidais predominam no universo dos PAMs (Tossi et al., 2000). A elipticidade é
decorrente da seqüência primária dos resíduos de aminoácidos (Deber & Li, 1995; Rohl & Baldwin,
1998) e da sua interação com o ambiente (Blondelle et al., 1997), que inclui a formação de ligações
de hidrogênio na cadeia peptídica e interações de van der Waals e hidrofóbicas, contribuindo para a
estabilidade da hélice (O’Neil & DeGrado, 1990). Em uma hélice-
α
, a formação do maior número
possível de ligações de hidrogênio entre resíduos da cadeia peptídica favorece que o peptídeo busque
as porções apolares da membrana (Eisenberg et al., 1984).
18
O teor helicoidal influencia a atividade do peptídeo em membranas negativamente carregadas,
assim como em membranas zwitteriônicas; a redução da elipticidade pela perturbação da face
hidrofílica mostrou ser negativa para o espectro de atividade antimicrobiana, entretanto, o aumento do
teor helicoidal de uma estrutura já bem ordenada não resulta em eficiência antimicrobiana adicional
(Giangaspero et al., 2001). De acordo com Dathe & Wieprecht (1999) e Giangaspero et al. (2001), a
maior elipticidade correlaciona-se com aumento da atividade em relação a membranas zwitteriônicas.
Resultados obtidos com peptídeos modelo sugeriram que a elipticidade é mais importante para a
atividade do peptídeo em membranas zwitteriônicas do que para a permeabilização daquelas
negativamente carregadas (Dathe et al., 1996).
2.3.2.5
Anfipaticidade e momento hidrofóbico.
A hélice-
α
anfipática é a estrutura mais comum entre
os PAMs, ideal para interagir com membranas biológicas igualmente anfipáticas. A anfipaticidade
reflete a possibilidade que uma seqüência possui para formar domínios hidrofóbicos e hidrofílicos,
bem estruturados, em faces opostas. Segundo Eisenberg et al. (1984) o momento hidrofóbico
representa uma medida quantitativa da anfipaticidade e é dado por:
(
)
(
)
2
/
1
2
1
2
1
cos
N
n
H
n
sin
H
N
n
n
N
n
n
H
+
=
∑
∑
=
=
δ
δ
µ
,
onde
H
n
é a hidrofobicidade do n-ésimo resíduo e
δ
é 100
º
, assumindo que 100% das cadeias laterais
projetam-se perpendicularmente ao eixo da hélice em intervalos regulares de 100
o
, isto é, como uma
hélice-
α
ideal.
Uma pesquisa entre os PAMs mostrou que o momento hidrofóbico, assim calculado, varia de
0,45 a 0,60 (Giangaspero et al., 2001; Tossi et al., 2000). Em peptídeos modelo e magainina, Dathe et
al. (1997 e 2002) mostrou que o aumento do momento hidrofóbico resulta em aumento significativo
das atividades de permeabilização de vesículas e hemolítica. Pathak et al. (1985) sugeriram que
anfipaticidade seria mais importante que hidrofobicidade ou teor helicoidal para a atividade
antimicrobiana. Entretanto, Dathe et al. (2002) trabalhando com peptídeos modelo do tipo KLA,
projetados para que cada um de seus parâmetros físico-químicos variasse isoladamente, afetando
minimamente os demais, mostrou que o aumento do momento hidrofóbico parece ter apenas efeitos
restritos na eficiência de permeabilização de vesículas aniônicas; porém, em bicamadas
zwitteriônicas, onde as interações eletrostáticas peptído-lipídeo são minimizadas, momentos
hidrofóbicos maiores resultam em aumento significativo da atividade de permeabilização.
2.3.2.6
Hidrofobicidade média.
É a medida da afinidade de um peptídeo pela região das cadeias
acílicas dos fosfolipídeos de uma membrana, calculada como a média aritmética das hidrofobicidades
dos resíduos de aminoácidos da cadeia peptídica, segundo a escala de consenso de hidrofobicidades
19
proposta por Eisenberg et al. (1984). Em meio aquoso, as regiões hidrofóbicas das cadeias peptídicas
não fazem ligações de hidrogênio com a água; isso cria regiões de volume excluído onde a ausência
de água permite a atração entre grupos apolares, originando interações hidrofóbicas (Lum et al.,
1999). Deber e Li (1995) encontraram que o teor helicoidal de um peptídeo em ambientes que
mimetizam aquele das membranas é diretamente proporcional à hidrofobicidade; eles mostraram que
resíduos alifáticos grandes como Ile e Val estabilizam a conformação helicoidal através de interações
hidrofóbicas favoráveis entre as cadeias laterais. A hidrofobicidade é necessária para a efetiva
permeabilização da membrana, entretanto, níveis elevados favorecem tanto as interações com
vesículas zwitteriônicas como com as aniônicas, afetando a seletividade em membranas bacterianas
(Wieprecht et al., 1997a; Tossi et al., 2000; Yeaman & Yount, 2003). Blondelle e Houghten (1992)
estabeleceram boas correlações entre diminuição da hidrofobicidade e aumento da atividade
antimicrobiana, e entre diminuição da hidrofobicidade e diminuição da atividade hemolítica,
trabalhando com peptídeos projetados. Wieprecht et al. (1997a) investigaram o efeito de se variar a
hidrofobicidade de análogos de magainina em relação a conseqüências para a ligação a membranas e
permeabilização de vesículas; em vesículas 100% PG, níveis médios de hidrofobicidade não afetam a
ligação e permeabilização porém, níveis mais altos de hidrofobicidade aumentam fortemente tanto a
afinidade do peptídeo como a permeabilização de vesículas feitas de PC e PG, na razão 3:1.
A hidrofobicidade mostrou ser um importante fator modulador da atividade antibacteriana,
pois em níveis muito baixos pode abolir essa atividade, em níveis altos acarreta aumento da atividade
hemolítica, em níveis extremamente altos pode causar agregação e precipitação e ainda, em níveis
intermediários torna mais eficientes as variações do momento hidrofóbico e aumenta a especificidade
para bactérias Gram-positivas (Dathe et al., 1997, 1999).
2.3.2.7
Ângulo polar.
É uma avaliação da extensão da face hidrofílica em relação à face hidrofóbica
de um peptídeo quanto ele assume a conformação anfipática helicoidal. Entre os PAMs de várias
fontes, o ângulo polar foi estimado como variando entre 160 e 220
o
, de acordo com suas projeções
helicoidais no plano perpendicular ao eixo da hélice (Giangaspero et al., 2001; Tossi et al., 2000).
Wieprecht et al. (1997b) mostrou que aumentando o ângulo polar, aumenta a afinidade de ligação,
mas diminui a eficiência de permeabilização de análogos de magainina em vesículas PG. Em
vesículas PCPG (3:1) e PC a eficiência de permeabilização aumenta com o ângulo polar e também
aumentam as atividades antibacteriana e hemolítica. A mesma tendência foi estabelecida por Kiyota et
al. (1996), trabalhando com peptídeos modelo Leu/Lys em bicamadas PC e eritrócitos humanos,
embora nesses experimentos a carga não foi mantida constante entre os análogos estudados. Além
disso, através de medidas de fluorescência de um único resíduo de Trp, na ausência e na presença de
cloreto de guanidina (um desnaturante), eles mostraram que em vesículas aniônicas (PCPG 3:1),
peptídeos com menor face polar penetram profundamente com suas regiões hidrofóbicas no centro da
bicamada, e os peptídeos com maior face hidrofílica interagem superficialmente com a região lipídica
20
central ou apenas com a região das cabeças polares dos lipídeos aniônicos, próxima à superfície,
resultando na não formação de canais ou poros (Kitamura et al., 1999). Blondelle e Houghten (1992)
mostraram que uma face hidrofóbica limitada de 5 resíduos contíguos permitiu a um peptídeo modelo
interagir com os lipídeos da parede celular de bactérias apresentando maior atividade antimicrobiana
que um outro análogo com uma face hidrofóbica maior. Dathe et al. (2002), usando peptídeos modelo
do tipo KLA e vesículas, distinguiu duas classes de análogos: aqueles com ângulo polar menor, que
mostraram alta afinidade, mas moderada eficiência de permeabilização de bicamadas e outros
análogos com ângulos polares
≥
140
o
, que apresentam menor afinidade e muito mais eficiência de
permeabilização. A reduzida eficiência de permeabilização de membranas por peptídeos com ângulos
polares maiores foi atribuída à menor probabilidade de formação de poros ou sua maior instabilidade,
resultante de repulsão eletrostática entre hélices próximas (Wieprecht et al., 1997b; Dathe et al., 2002;
Dathe & Wieprecht, 1999).
2.4 Mecanismos de ação de peptídeos antimicrobianos
A mesma seqüência de passos parece caracterizar o mecanismo de ação dos PAMs catiônicos,
independente de sua fonte, composição ou conformação, resumidamente ilustrada na Figura 2. Eles
iniciam a interação como conseqüência da sua cationicidade inerente e do potencial transmembranar
(internamente negativo), também inerente às células alvo. A atração eletrostática e a partição
hidrofóbica freqüentemente agem em conjunto para promover as associações entre lipídeos e
peptídeos (Deber & Li, 1995). Na superfície das membranas, as interações eletrostáticas de
relativamente longo alcance são as primeiras a serem estabelecidas entre resíduos de aminoácidos
catiônicos, como Lys e Arg, e os grupos fosfato negativamente carregados da membrana celular alvo,
mas as interações hidrofóbicas são responsáveis pela incorporação na fase lipídica (Ito et al., 1993).
Em solução aquosa muitos peptídeos não apresentam estrutura ordenada; mas, com a ligação à
membrana, estabelecem-se ligações de hidrogênio intramoleculares que promovem a mudança
conformacional.
A concentração de peptídeo na superfície da membrana aumenta à medida que outras
moléculas de peptídeo são atraídas, ligam-se e enovelam-se, até alcançar uma razão limite entre as
concentrações de peptídeo e lipídeo (P/L), isto é, o nível de peptídeos acumulados necessário para
provocar sua imersão na bicamada lipídica (Ludtke et al., 1994; Huang, 2000). Peptídeos com
domínios hidrofílicos e hidrofóbicos bem definidos podem orientar-se uns em relação aos outros ou
em relação a domínios semelhantes na membrana, influenciando a concentração limite P/L. Da
mesma forma, a composição fosfolipídica da membrana, sua fluidez, tamanho e carga da cabeça
polar, e o potencial transmembranar negativo influenciarão a orientação do peptídeo (paralela ou
normal) em relação à superfície da membrana e a profundidade de inserção no centro da bicamada
(Matsuzaki et al., 1994).
21
Figura 2: Representação esquemática dos modelos propostos para o mecanismo de ação dos PAMs
helicoidais (Tossi et al., 2000). (A) Atração eletrostática à superfície aniônica dos microrganismos.
(B) Passagem através da membrana externa e/ou da camada de peptidoglicanos. (C) Atração
eletrostática aos fosfolipidios aniônicos da membrana citoplasmática, (D) Transição conformacional,
inserção e acumulação na membrana. (E) Formação do poro toroidal e translocação do peptídeo. (F)
Mecanismo carpete de permeabilização de membrana. (G) Formação do poro barril.
Em princípio, se a permeabilização de uma membrana é esperada, o comprimento do peptídeo
na sua forma helicoidal deveria ser compatível com a espessura da mesma, que no caso de membrana
bacteriana é da ordem de 30 Å. Alguns PAMs, como cecropinas (Andreu et al., 1992) e gramicidinas
(Killian, 1992) são conhecidos por sua conformação helicoidal ser suficientemente longa e flexível
para atravessar as bicamadas; entretanto, outros PAMs de cadeias curtas, com 10 a 15 resíduos, são
claramente mais curtos e indicam a existência de outros mecanismos para superar a diferença de
comprimento. Alguns autores (Siligardi & Drake, 1995; Andreu et al., 1992) consideram a
possibilidade de que peptídeos com dobras na estrutura poderiam alongar-se, ou outros poderiam
adotar conformações do tipo hélice 3
10
ou P
II
, que são estruturas helicoidais mais longas que a hélice-
α
; outros autores (Killian, 1992) consideraram que os lipídeos poderiam adaptar-se por um efeito de
afundamento da membrana. Mais recentemente mostrou-se que em concentrações de peptídeo abaixo
da concentração limite necessária para a lise, ocorre uma redução da espessura da membrana, que
seria provavelmente proporcional à concentração de peptídeo e que foi denominada de efeito de
afinamento da membrana (Ludtke et al., 1995; Wu et al., 1995; Heller et al., 2000; Chen et al., 2002 e
2003). Esse afinamento é resultado de um aumento na área da membrana que se determinou ser da
22
mesma ordem do tamanho molecular do peptídeo (Wu et al., 1995; Ludtke et al., 1995; Heller et al.,
2000).
Esses achados levaram à concepção do modelo de poro toroidal (ou
wormhole mechanism).
Peptídeos helicoidais ligados com seus eixos paralelos à superfície da bicamada causarão uma
expansão lateral na região das cabeças das moléculas de fosfolipídeos. Como o volume total das
cadeias é constante, isto fará com que a membrana se torne mais fina no local da ligação. O acúmulo
de moléculas de peptídeo induz um afinamento da membrana, enquanto a energia de inserção não
supere a soma da energia de ligação mais a energia de compressão (Ludtke et al., 1995) ou a tensão
superficial (Huang et al., 2004). Acima da concentração limite para lise, os peptídeos inativos,
paralelamente ligados à superfície, mudarão para um estado ativo, de inserção através da membrana,
devido ao excessivo custo energético de deformação da membrana (Heller et al., 2000). Mostrou-se
também que acima desta concentração limite, a membrana recupera sua espessura original, e o
pareamento hidrofóbico entre o peptídeo e o lipídeo muda, possivelmente devido à formação de um
poro através da membrana ou um poro toroidal (Figura 3b). Neste tipo de poro, a bicamada se dobrará
e as moléculas de peptídeo revestirão sua superfície interna, empacotadas juntamente com as cadeias
lipídicas (Heller et al., 2000); uma importante restrição deste modelo é que nele o peptídeo deve estar
sempre associado às cabeças dos fosfolipídeos e nunca com a região das cadeias acílicas (Huang,
2000). A concentração limite de peptídeo apresentou-se dependente também da composição da
bicamada. Apenas no estado inserido do peptídeo é que múltiplos poros foram identificados (Huang,
2000).
Brochard-Wyart e colaboradores (Puech et al., 2004; Brochard-Wyart et al., 2000) estudaram
a formação de poros espontâneos induzidos por estresse em vesículas gigantes, procurando entender
as contribuições da tensão superficial e da tensão de linha. Resumidamente, um poro é o resultado de
um excesso de tensão superficial na membrana, que pode ser criada tanto por forte iluminação, como
por eletroporação ou adição de surfactantes. Poros transientes se abrem devido a um excesso de
tensão superficial em relação à tensão de linha e se fecham quando esta supera a primeira. Esses
conceitos desenvolvidos para o caso da formação de poro sob estresse luminoso foram estendidos
para a análise do mecanismo da formação de poros pelos PAMs por Huang et al. (2004); a tensão
superficial é criada pela área adicional ocupada pelos peptídeos ligados na região das cabeças polares
da camada externa; o efeito de afinamento da membrana foi atribuído à sobreposição das áreas
deformadas causada pela ligação de várias moléculas de peptídeos, um efeito de múltiplas moléculas
(Lee et al., 2005); a inserção de peptídeos (paralelamente ao plano normal em relação à superfície da
membrana), a abertura do poro e o vazamento do conteúdo da vesícula reduzem a tensão superficial.
A tensão de linha pode assim superar a tensão superficial reduzida e fechar o poro. A concentração
limite para a formação do poro está correlacionada à curvatura espontânea dos lipídeos (Lee et al.,
2005) e ao módulo de compressibilidade (Allende et al., 2005).
23
Figura 3: Modelos de poro (a) barril e (b) toroidal de acordo com Huang, 2000.
(a)
Monômeros de alameticina são representados por cilindros com ~11Å de diâmetro; azul e rosa
representam respectivamente as faces hidrofílica e hidrofóbica do peptídeo. O diâmetro do poro é
de ~18Å. A molécula de lipídeo está representada por uma cabeça oval e duas caudas.
(b)
Monômeros de magainina estão representados por cilindros vermelhos embebidos na região das
cabeças dos fosfolipídeos, representada pela superfície azulada. Esta se dobra continuamente de
cima para baixo. O diâmetro do poro é de ~30Å.
Experimentos realizados por Matsuzaki e seu grupo (1994, 1995b, 1996b, 1997b, 1998a e b)
focalizaram principalmente as etapas subseqüentes à formação do poro. Com o fechamento do poro
alguns peptídeos são transferidos para a camada interna da membrana, por um mecanismo
denominado translocação. Dessa forma, as camadas internas e externas tornam-se contínuas e as
moléculas de lipídeo podem mover-se entre ambos lados em um rápido "flip-flop", pois a estrutura do
poro é bastante instável. Este mecanismo redistribui as moléculas de peptídeo entre as camadas, e a
velocidade de formação de poro é reduzida, desativando o processo. O poro foi redefinido como uma
perturbação estrutural ou defeito no empacotamento lipídico, que é devido a formação de um
"complexo supramolecular peptídeo-lipídeo". Este mecanismo foi proposto para os peptídeos
magainina, melitina e mastoparano X, em vesículas aniônicas (Matsuzaki et al., 1996b e a; 1997b) e
posteriormente estendido aos peptídeos temporin B e temporin L (Zhao et al., 2002).
A formação de poro ou canal através da membrana também pode ser descrita por outro
mecanismo, denominado "barril" ou feixe de hélices (Figura 3a). A principal característica deste tipo
de poro é que nele, peptídeos helicoidais revestem completamente a superfície interna do poro, com
suas superfícies hidrofóbicas interagindo diretamente entre si e com as cadeias acílicas dos
fosfolipídeos, e suas superfícies hidrofílicas voltadas para o canal aberto. Alamethicina e gramicidina
são os peptídeos estudados que formam este tipo de poro. Eles possuem pequena carga catiônica, o
que contribui para a estabilidade do poro, e alta hidrofobicidade, favorecendo interações tanto com
bicamadas zwitteriônicas, como com aniônicas. Este mecanismo não exclui o anterior, onde um
acúmulo de peptídeos, inicialmente ligados paralelamente ao plano da membrana é necessário para
a
b
24
que ocorra a inserção, após atingir a concentração limite. As diferenças são a forma como os
peptídeos interagem uns com os outros, inserindo-se pelo menos como dímeros, e a forma como
interagem com o centro lipídico da bicamada, e revestem o poro aberto (Oren & Shai, 1998;
Bechinger, 1999; Huang, 2000).
Ainda um outro mecanismo, denominado poro transiente, foi desenvolvido quase
paralelamente ao mecanismo do poro toroidal; eles diferem pelo fato de que neste a ocorrência de
poros é eventual e a inserção dos peptídeos, que inicialmente estão ligados paralelamente à superfície
da bicamada, romperá sua curvatura, conduzindo à micelização da membrana (Oren & Shai, 1998).
Essa forma de desintegrar a membrana foi associada a efeitos semelhantes aos de um detergente,
porque solutos contidos internamente são liberados independentemente de seu tamanho (Ladokhin &
White, 2001; Bechinger, 1999).
É preciso salientar que esses modelos foram construídos sobre evidências indiretas da
formação do poro, baseados na semelhança entre o padrão de difração de nêutrons obtido para
gramicidina e aqueles obtidos para alameticina e magainina, onde água deuterada foi usada para dar o
contraste necessário à observação dos poros. E, ainda, estes só puderam ser observados nas condições
em que os peptídeos encontravam-se no estado ativo, ou seja, perpendiculamente ao plano da
bicamada. De uma forma geral os poros já detectados por este meio apresentam diâmetro de no
mínimo 20 Å, e foram observados em concentrações equivalentes à metade do necessário para
eliminar 50% das bactérias, conforme ensaios de ação antibacteriana (Huang, 2000).
2.5 Potencial de uso terapêutico
Dentre os obstáculos naturais à ação dos PAMs estão a inativação causada pelo plasma e seus
componentes e pelas barreiras de oligossacarídios como a camada de peptidoglicanos nas bactérias, a
matriz extracelular das células de eucariotos, ou os oligossacarídios aniônicos como a heparina; há
ainda a inativação pelos LPS das bactérias Gram-negativas, a proteólise do peptídeo e o baixo teor de
fosfolipídeos aniônicos de algumas bactérias (Andreu & Rivas, 1998). O principal argumento a favor
das pequenas chances de uma bactéria desenvolver resistência aos PAMs é seu alvo principal, a
membrana celular. Um microrganismo teria de mudar significativamente a composição e/ou a
organização de seus lipídeos para desenvolver resistência. Uma outra possibilidade seria a destruição
do PAM por uma protease microbiana; isso requereria a destruição seletiva do PAM e não dos
constituintes protéicos da célula (Zasloff, 2000). Ainda de acordo com esse autor (2002), as cepas
mais virulentas de bactérias com que nos deparamos atualmente podem representar a forma de
resistência que a maioria dos microrganismos podem desenvolver a um custo viável.
A pele é a primeira barreira a proteger os seres vivos de um ambiente ofensivo, e muitos
PAMs foram nela encontrados. Assim o maior progresso na área provém do desenvolvimento de
agentes de uso tópico, devido à relativa segurança desse tipo de terapia em comparação com a
administração sistêmica de novas drogas de uso prolongado (Zasloff, 2002). PAMs podem ser
25
administrados via contato com mucosas para promover respostas do sistema imune como nas vacinas,
em profilaxia ou em terapia (Brogden et al., 2003). Lazarev et al. (2004) mostraram que através da
administração por aerosol de um vetor plasmídico expressando os genes de um PAM, pode-se realizar
prevenção e tratamento de infecções por mycoplasma em granjas avícolas, evitando-se os efeitos
colaterais da exposição sistêmica e controlando a ação citotóxica (Lazarev et al., 2004).
Outros campos promissores para aplicação dos PAMs são as infecções buco-dentais, onde as
defesas naturais estão baseadas em peptídeos da saliva ricos em Histidina, as infecções oculares, e em
agentes espermicidas, combinando atividades antibiótica e contraceptiva. Formas alternativas de
terapia poderão surgir do fato que os PAMs aumentam ou reconstituem a potência de antibióticos
atuais em vivo (Yeaman & Yount, 2003; Zasloff, 2002), ou baseadas na habilidade dos PAMs em
ativar PAMs endógenos e ainda considerando seu potencial de ação sinérgica (Yeaman & Yount,
2003; Hancock & Diamond, 2000; Scott et al., 1999; Zasloff, 2002).
26
3. OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho é estudar o mecanismo da atividade de peptídeos
antimicrobianos, extraídos de vespas, cujas cadeias são relativamente curtas (10 a 15 resíduos), e sua
seletividade, em membranas modelo, baseado no interesse do emprego dessas substâncias como
sucedâneos ou coadjuvantes na antibioticoterapia.
Os principais objetivos são:
1.
Investigar a atividade lítica e a seletividade dos peptídeos EMP-AF, Eumenitin, Eumenes
micado, Polybia MP1, Anoplin e Decoralin e de seus análogos em membranas modelo de
diferentes composições.
2.
Investigar as mudanças conformacionais provocadas por diferentes tipos de ambientes nesses
peptídeos.
3.
Estabelecer correlações entre as características estruturais, os dados de atividade biológica, a
atividade lítica e os modelos mais aceitos para explicar seu mecanismo de ação.
27
4. MATERIAIS e MÉTODOS
4.1 Materiais
Peptídeos sintéticos
: EMP-AF, EMP-AF1, EMP-AF2, EMP-AF3, Anoplin, Anoplin-OH, Eumenitin,
Decoralin e Decoralin-OH, Eumenes micado -EM1, -EM2, -EM3 e -EM4 foram gentilmente
fornecidos pelo Dr. K. Konno, Instituto Butantan, São Paulo, com grau de pureza acima de 95%,
determinado por HPLC e MALDI-MS.
Polybia Paulista MP1, gentilmente fornecido pelo Prof. Dr. M. S. Palma, IB – UNESP, Rio Claro, SP,
com grau de pureza acima de 95% .
Lipídeos
: L-
α
-Fosfatidilcolina (PC) ou L-
α
-lecitina, PM=760,09, obtida a partir da gema de ovo; L-
α
-Fosfatidil-DL-glicerol (PG), PM=771, obtido a partir da lecitina de gema de ovo, cardiolipina ou
difosfatidilglicerol, (CL) de coração de boi foram adquiridos da Sigma, e usados diretamente. As
concentrações dos fosfolipídeos presentes nas preparações de vesículas foram determinadas pela
análise de fósforo segundo o método de Rouser et al. (1970) no laboratório da Prof. Iolanda Cuccovia,
no IQUSP, São Paulo.
Outros
: carboxifluoresceína (CF) 99% de pureza e tampão Tris (tris(hidroximetil)amino-metano)
adquiridos da Sigma, assim como os componentes do tampão PBC 1 mM, preparado a partir de ácido
bórico, citrato de sódio di-hidratado, e fosfato de potássio monobásico, anidro; dodecilsulfato de sódio
(SDS) e colunas Sephadex G 25 M, PD-10 adquiridas da Amersham Pharmacia; clorofórmio,
Na
2
EDTA, fluoreto de Sódio (NaF), trifluoroetanol (TFE), Triton X-100, adquiridos da Merck.
Demais reagentes comuns de laboratório foram adquiridos com qualidade p.a. ou grau
espectrofotométrico. Foi utilizada apenas água milli-Q ou deionizada e duplamente destilada em
equipamento de vidro com condutividade 3
µ
S.
4.2 Métodos
4.2.1 Preparação de vesículas
Quantidades necessárias à obtenção de 1 mL de vesículas, na concentração inicial de 10
mM em fosfolipídeos totais, foram depositadas a partir de uma solução em clorofórmio, como filmes
finos sobres as paredes de tubos de vidro de fundo arredondado, evaporando o solvente sob fluxo
de N
2
. O filme resultante foi então totalmente seco sob vácuo, durante três horas, no mínimo. Este
filme consiste de bicamadas empilhadas. Vesículas multilamelares (MLVs) são produzidas a partir de
tais filmes pela adição de tampão. A seguir os tubos foram agitados em vórtex por 2 min e 30 s, para
promover o descolamento das bicamadas das paredes do tubo, as quais devem ficar totalmente limpas;
28
a dispersão em meio aquoso e a agitação devem ocorrer em temperatura acima da T
C
, o que no caso
dos fosfolipídeos usados pode ser feito em temperatura ambiente.
4.2.1.1 Preparação de vesículas unilamelares, pequenas (SUVs)
Nos experimentos de dicroísmo circular (CD), o tampão utilizado foi 1 mL de Tris/H
3
BO
3
5
mM contendo 0,5 mM de Na
2
EDTA, pH 7,5 ou igual volume de tampão PBC 1 mM, no mesmo pH,
para obtenção das vesículas. Após agitação em vórtex, como descrito acima, a suspensão foi
submetida à agitação em sonicador de ponta de titânio (Sonicador Virsonic 475, Virtis Co., Inc., NY)
por 50 minutos, na potência 2, em banho de água e gelo e sob fluxo de N
2
, para evitar o aquecimento
e a oxidação dos fosfolipídeos. Para remover restos de titânio a suspensão foi centrifugada a 14000
rpm em centrífuga de bancada (Eppendorf Centrifuge 5417C), durante 6 minutos. O sobrenadante
dessa suspensão, de aspecto quase transparente e com brilho azulado, foi mantido sob refrigeração e
usado dentro de um período de no máximo 24 h.
Foram preparadas vesículas zwitteriônicas, contendo 100% PC (PC), e aniônicas, contendo
70% PC e 30% PG, mol/mol (PCPG 7030).
4.2.1.2 Preparação de vesículas unilamelares, grandes (LUVs)
O procedimento inicial de preparação de filmes de fosfolipídeos é o mesmo que o descrito no
ítem 4.2.1. A suspensão de LUVs foi obtida pela adição de 0.75 mL de solução do corante
fluorescente Carboxifluoresceína 0,025M, em tampão Tris/HCl 10 mM contendo 1 mM de
Na
2
EDTA, e pH acertado em 7,5 para os experimentos de liberação de conteúdo de vesículas. A
seguir a suspensão foi igualmente agitada em vórtex por 2 min e 30 s e depois submetida à agitação
em sonicador de ponta de titânio por 5 minutos, na potência 2, em banho de água e gelo. Após a
centrifugação, como indicado em 4.2.1.1, a fração sobrenadante foi submetida à extrusão
(equipamento Avanti Mini-Extruder), através de membrana dupla de policarbonato de 0,2
µ
m
(Nuclepore Track-etch Membrane, Whatman Nuclepore, PCMB 19 mm 0,2
µ
m) num total de 11
extrusões lentas. Após descanso de uma hora, a suspensão foi submetida à filtração em gel em
coluna Sephadex G 25 M, PD-10. Esta coluna foi previamente equilibrada com solução 0,15 M NaCl,
em tampão Tris/HCl 10 mM, 1 mM Na
2
EDTA e as vesículas foram eluídas com a mesma solução. A
suspensão de aspecto levemente túrbido e de cor alaranjado, sem brilho fluorescente, foi mantida sob
refrigeração e usada dentro de um período de 72 horas.
Foram preparadas vesículas zwitteriônicas, contendo 100% PC (PC), e aniônicas, nas razões
molares 70% PC e 30% PG (PCPG 7030), 40% PC e 60% PG (PCPG 4060), 70% PC e 30% CL
(PCCL 7030), e 40% PC e 60% CL (PCCL 4060).
29
4.4.1.3 Análise da concentração de fosfolipídeos em vesículas
A concentração de fosfolipídeos ou lipídeos em vesículas foi determinada pela análise de
fósforo baseada na metodologia proposta por Rouser et al. (1970). Uma alíquota da suspensão de
vesículas, contendo aproximadamente 50 picomoles de P, foi transferida para um tubo de ensaio
Pyrex
, longo, e seca em estufa em temperatura acima de 120
o
C. A seguir a amostra foi digerida
durante 60 minutos em um bloco metálico de aquecimento a 180
o
C e na presença de 0,4 mL de ácido
perclorórico concentrado p.a. A amostra depois de mineralizada e resfriada foi tratada com os
seguintes reagentes, pela ordem: 1 mL de água desmineralizada ou milli-Q, 0,4 mL de molibdato de
amônio 1,25% p/v, e 0,4 mL de ácido ascórbico a 3% p/v, recém-preparado. Após cada adição o
conteúdo do tubo é homogeneizado em vórtex e ao final levado a um banho-maria fervente por 5
minutos para desenvolvimento da cor azul característica. Um branco de reagentes e uma curva de
calibração preparada com 5 alíquotas de uma solução padrão de KH
2
PO
4
(PM 136,09) 1 mM, (conterá
1 nmol/
µ
L) na faixa de 0 a 100 picomoles de P, são conduzidos paralelamente. Após resfriadas, as
amostras e os padrões, até a temperatura ambiente, foram feitas as leituras de absorbância das amostra
sem 797 nm, contra o branco de reagentes, usado como referência.
4.2.2 Medidas por dicroísmo circular (CD)
4.2.2.1 Condições
Espectros de CD foram obtidos na faixa de comprimento de onda de 190 a 260 nm, usando
um espectropolarímetro Jasco-710 (Tokyo, Japan), acoplado a um banho termostático
Neslab
RTE111
. O instrumento é rotineiramente calibrado usando ácido d-10 canforsulfônico. Os espectros
são obtidos a 25
o
C, usando-se cubetas de quartzo de 0.5 cm de caminho óptico, tomando-se a média
de 4 a 6 espectros por determinação. Os parâmetros do instrumento foram fixados em: velocidade
(scan speed) 20 nm/min, largura de banda (bandwidth) 1.0 nm, tempo de resposta (response) 0.5 s e
0.1 nm de resolução (resolution). Linhas de base são obtidas para cada sistema de solvente, tomando-
se um espectro a mais, além daqueles necessários à medida da amostra em questão.
A elipticidade medida em cada determinação,
θ
(mdeg), é corrigida em função de diluição,
quando for necessário, e da respectiva linha de base. Esses dados são, então, convertidos em
elipticidade molar média por resíduo, [
Θ
] (deg cm
2
/dmol), pela relação:
[
Θ
] (deg cm
2
/dmol) = 100
θ
/ (
l c n
), 1
onde
l
é o caminho óptico em cm,
c
é a concentração em mM e
n
é o número de resíduos do peptídeo.
A fração helicoidal é determinada de acordo com o método proposto por Rohl e Baldwin
(1998), assumindo um modelo de dois estados, isto é, o peptídeo apenas existe em dois estados, hélice
30
ou coil, e tomando-se a elipticidade molar observada em 222 nm, [
Θ
]
obs
222
, usando a seguinte
equação:
onde [
Θ
]
C
222
é a elipticidade molar para o peptídeo em random coil, corrigida para sua dependência
com a temperatura,
T
(em
o
C) pela relação:
[
Θ
]
C
222
= 640 – 45
T
3
e [
Θ
]
H
222
é a elipticidade molar para a estrutura totalmente helicoidal, igualmente corrigida em função
da temperatura, e em função da máxima elipticidade possível, sendo:
[
Θ
]
H
222
= (-42500 + 125
T
) (1 –
x
/
n
) 4
onde
n
é o número de resíduos na cadeia peptídica, e
x
é o número de grupos carbonila da cadeia
peptídica que não estão envolvidos na formação de pontes de hidrogênio. Como os resíduos na
primeira e na última volta da hélice não podem apresentar seus grupos NH e CO, respectivamente,
ligados por pontes de hidrogênio ao restante da hélice,
x
= 3 para peptídeos com terminal C amidado e
x
= 4 para aqueles carboxilados, correspondendo ao número de carbonilas do peptídeo não ligadas
numa hélice completa (Rohl & Baldwin, 1998).
4.2.2.2 Análise conformacional
A estrutura secundária assumida pelos peptídeos foi determinada em vários ambientes, em
água, em tampão Tris/ H
3
BO
3
5 mM, em TFE 40%, em solução de SDS a 165
µ
M, abaixo da
concentração micelar crítica, (cmc), e acima desta a 8 mM, em suspensão de vesículas zwitteriônicas,
PC, e aniônicas, PCPG 7030. Uma alíquota da solução estoque do peptídeo foi adicionada à cubeta e
homogeneizada com a quantidade necessária do solvente para completar 1 mL. Os espectros foram
obtidos e tratados conforme indicado anteriormente.
Todos os peptídeos deste estudo não apresentam estrutura ordenada em água e tampão,
caracterizada por expressivo dicroísmo negativo ao redor de 200 nm. Em ambientes como os usados
nestes experimentos todos os peptídeos apresentam espectros caracterizados por dois mínimos de
absorção em 222 nm e 208 nm e um máximo em 190 nm.
31
4.2.2.3 Experimentos de titulação de peptídeos em vesículas
Alíquotas da suspensão de vesículas são adicionadas sucessivamente à uma solução do
peptídeo em tampão. Este procedimento é repetido para no mínimo 3 diferentes concentrações de
peptídeo. A associação com a bicamada lipídica é avaliada pela variação na elipticidade molar em 222
nm, em relação ao valor inicial ([
Θ
]
0
222
), antes da adição de vesículas. O sinal em 250 ou 260 nm foi
tomado como referência para corrigir possíveis mudanças da linha de base e, ainda, um fator de
correção empírico, obtido por Hellmann e Schwarz (1998), que depende da concentração de vesículas
e do caminho óptico foi aplicado para evitar efeitos de espalhamento. A variação da elipticidade
molar foi determinada na respectiva razão entre as concentrações de lipídeo e peptídeo. Desses dados
construíram-se isotermas de associação e, pela relação de conservação de massa,
[Pep] =
r
[Lip] +
c
f
5
foram encontradas a razão entre as concentrações de peptídeo associado e de lipídeo (
r
), ou seja o
grau de associação, e a concentração de peptídeo não associado (
c
f
), de acordo com o procedimento
descrito por Schwarz e Blochmann (1993). A ligação entre peptídeos e vesículas é considerada
inespecífica, no sentido de não haver um sítio de ligação específico e de ser dirigido principalmente
por forças eletrostáticas e interações hidrofóbicas, também não específicas. Assim essa associação é
tratada como um processo de partição. Essa ligação é na verdade o resultado de efeitos de solvatação
do peptídeo pela vesícula, um grande agregado supramolecular. No equilíbrio, esse sistema é
caracterizado termodinamicamente pela sua isoterma de associação, que implica diretamente na
relação entre peptídeo ligado por quantidade de lipídeo e quantidade de ligante livre, que é avaliada
de uma forma independente de modelos (Schwarz, 2000).
4.2.3 Experimentos de vazamento de vesículas por fluorimetria
4.2.3.1 Condições
Espectros de emissão de fluorescência foram obtidos no fluorímetro Hitachi F4500
(Spectronic Inc., Rochester, NY), junto ao Departamento de Química do IBILCE, UNESP.
A supressão da fluorescência da carboxifluoresceína e sua liberação foram usados como
marcadores do processo de permeabilização de vesículas. Espectros de emissão de fluorescência ao
longo do tempo foram obtidos em 520 nm, com abertura de fenda de 2,5 nm, durante intervalos de
interação variáveis, entre 15 e 30 minutos, dependendo da intensidade da interação. A amostra foi
excitada em 490 nm, com abertura de fenda de 5,0 nm e tensão na fotomultiplicadora de 700 V. Em
intervalos regulares o % de CF liberado é calculado como:
32
% vazamento = 100 x (
F
-
F
0
)/ (
F
100
-
F
0
) 6
onde
F
é a intensidade de fluorescência medida (em unidades arbitrárias),
F
0
corresponde à
intensidade de fluorescência das LUVs intactas e
F
100
é a intensidade de fluorescência após liberação
total do conteúdo das vesículas.
As curvas que caracterizam a cinética de vazamento foram ajustadas usando o programa
Origin 7.0 com a relação:
% vazamento = V
max
(1 - exp(-t/
τ
)) 7
onde V
max
representa o vazamento máximo (no estado de equilíbrio), t é o tempo decorrido após a
adição do peptídeo e
τ
(tau) é a constante de tempo em segundos. De acordo com Allende et al.
(2005), V
max
está relacionado ao número de canais ou poros e sua condutância, e
τ
está relacionado à
velocidade de formação desses canais ou poros. Romano-Fontes et al. (2000) demonstraram que
τ
,
sendo o inverso da constante de velocidade de vazamento, é proporcional ao inverso do coeficiente de
permeabilidade da membrana e é diretamente proporcional do raio da vesícula.
4.2.3.2 Medidas da atividade lítica dos peptídeos
Alíquotas da suspensão de vesículas são adicionadas sob agitação à cubeta de quartzo de 1
cm de caminho ótico, contendo a solução do peptídeo em estudo, em tampão Tris/HCl 10 mM, 1 mM
Na
2
EDTA e 0,15 M de NaCl, pH 7,5. Após o período de contato necessário para atingir uma
intensidade de fluorescência estável, adicionam-se 20
µ
L do detergente Triton X-100 a 10%, para se
obter a intensidade de fluorescência máxima da CF encapsulada. Todos as medidas foram realizadas
a 25
o
C.
Resultados e Discussão
33
5. RESULTADOS e DISCUSSÃO
Todos os peptídios estudados foram extraídos do veneno de vespas solitárias encontradas no Japão,
exceto Polybia MP1 que provém do veneno de vespa social encontrada no Brasil. Todos são catiônicos,
helicoidais, antimicrobianos e apresentam de 20 a 50% de resíduos polares ou carregados na estrutura.
A Tabela 1 apresenta suas seqüências primárias e as de alguns outros peptídios, cujos dados da literatura
foram usados como referência.
Tabela 1.
Seqüência primária e Peso Molecular dos peptídios estudados; em azul, resíduos positivamente
carregados; vermelho, negativamente carregados; verde, polares, sem carga.
Anoplin
Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-
NH
2
1152
Anoplin-OH
Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-
OH
1138
Decoralin
Ser-Leu-Leu-Ser-Leu-Ile-Arg-Lys-Leu-Ile-Thr-
OH
1239
Decoralin-NH
2
Ser-Leu-Leu-Ser-Leu-Ile-Arg-Lys-Leu-Ile-Thr-
NH
2
1254
EMP-AF
Ile-Asn-Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Ile-Ile-Lys-Ser-Leu-
NH
2
1521
EMP-AF 1
Ile-Asn-Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Ile-Ile-Lys-Ser-Leu-
OH
1506
EMP-AF 2
Leu-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Ile-Ile-Lys-Ser-Leu-
NH
2
1181
EMP-AF 3
Leu-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Ile-Ile-Lys-Ser-Leu-
OH
1166
EMP-EM1
Leu-Lys-Leu-Met-Gly-Ile-Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Ala-Leu-
NH
2
1480
EMP-EM2
Leu-Lys-Leu-Leu-Gly-Ile-Val-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Ala-Ile-
NH
2
1462
EMP-EM3
Phe-Asp-Ile-Gly-Ile-Ile-Ile-Lys-Lys-Val-Val-Ser-Gly-Leu-
NH
2
1499
EMP-EM4
Phe-Asp-Leu-Gly-Ile-Ile-Ile-Lys-Lys-Val-Val-Ser-Gly-Leu-
NH
2
1499
Eumenitin
Leu-Asn-Leu-Lys-Gly-Ile-Phe-Lys-Lys-Val-Ala-Ser-Leu-Leu-Thr-
OH
1628
Polybia MP1
Ile-Asp-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Asp-Ala-Ala-Lys-Gln-Ile-Leu-
NH
2
1652
MP*
Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-
NH
2
1477
MP-B*
Leu-Lys-Leu-Lys-Ser-Ile-Val-Ser-Trp-Ala-Lys-Lys-Val-Leu-
NH
2
1610
MP-X*
Ile-Asn-Trp-Lys-Gly-Ile-Ala-Ala-Met-Ala-Lys-Lys-Leu-Leu-
NH
2
1554
Melittin*
Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-
Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-
Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-
NH
2
Magainin*
Gly-Ile-Gly-
Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-
Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-COOH
(*) peptídios cujos dados da literatura foram usados como referência.
Resultados e Discussão
34
5.1 EMP-AF
É um peptídeo da família dos mastoparanos, extraído dos veneno da vespa solitária
Anterhynchium
flavomarginatum micado
; apresenta atividade antimicrobiana, seletiva para bactérias Gram-positivas,
hemolítica e de degranulação de mastócitos. EMP-AF, ou eumenine mastoparano-AF, é o principal
peptídeo que compõe o veneno extraído da vespa solitária
Anterhynchium flavomarginatum micado
.
Além do EMP-AF, outros três análogos, EMP-AF 1~3 foram isolados da mesma fonte, provavelmente
devido à digestão enzimática ocorrida durante a estocagem e procedimentos de dissecação (Konno et
al., 2000). Esses análogos não apresentam atividade hemolítica nem de degranulação de mastócitos; o
análogo carboxilado apresenta atividade antimicrobiana bastante reduzida e os demais análogos de cadeia
curta perdem a atividade antimicrobiana.
Análise conformacional por Dicroísmo Circular
Os espectros de CD de EMP-AF mostrados na Figura 4, em água e em tampão Tris/HCl são
característicos de uma estrutura secundária desordenada que passa a ter características de uma estrutura em
hélice-
α
em ambientes que mimetizam a anisotropia e a hidrofobicidade das membranas, como em micelas
de SDS 8 mM, em contato com vesículas aniônicas, PCPG 7030, e em TFE a 40%, um solvente indutor de
estruturas secundárias, por promover o fortalecimento das pontes de hidrogênio do peptídeo nesse meio
(Luo & Baldwin, 1997). Em contato com vesículas zwitteriônicas o espectro obtido desvia-se ligeiramente
do espectro característico de random coil, mas na condição deste experimento, também não é característico
de uma estrutura helicoidal. Em SDS abaixo da cmc, o espectro sugere interação entre as cadeias
peptídicas, pois suas características são indicativas de que nesse ambiente parte das moléculas assumem a
estrutura em hélice-
α
, mas parte das moléculas assumem estruturas em folha-
β
ou dobras (turns). Em
concentrações abaixo da cmc, a solução de SDS é reconhecida como indutora de estruturas em folha-
β
(Zhong & Johnson, 1992; Waterhous & Johnson, 1994; Blondelle et al., 1997); resíduos centrais da cadeia
como Ala, Gly e Ser apresentam propensão para conformação em folhas-
β
nesse ambiente. Ainda segundo
Blondelle et al. (1997), considera-se que essa conformação seja conseqüência de um alinhamento
hidrofóbico entre os resíduos não polares do peptídeo e as cadeias alquílicas do SDS, estabilizadas pelas
interações eletrostáticas dos resíduos positivamente carregados com os grupos sulfonato do SDS.
A Tabela 2 mostra os valores da fração de hélice-
α
(
f
H
) obtidos para EMP-AF e seus análogos,
correlacionados aos valores de carga líquida (Q), hidrofobicidade (H) e momento hidrofóbico (
µ
). Esses
resultados indicam que o teor de hélice-
α
depende do ambiente, do tipo de terminal-C, amidado ou
carboxilado e do comprimento da cadeia peptídica. A propensão helicoidal dos resíduos que compõem
essas cadeias aumenta em ambientes que mimetizam membranas, em relação à propensão helicoidal em
água (Deber & Li, 1995; Blondelle et al., 1997; Rohl & Baldwin, 1998;). Assim, a maior propensão
helicoidal dos resíduos observada nesses ambientes contribui para o aumento da fração helicoidal. A
modificação do terminal-C, originalmente amidado para carboxilado, introduz uma carga negativa no polo
Resultados e Discussão
35
negativo do macrodipolo da hélice, desestabilizando a estrutura em todos os ambientes testados. Isto
porque uma ponte de hidrogênio deixa de existir entre o grupo amida do terminal-C e a carbonila do
resíduo Ile10 (Sforça et al., 2004). Um outro efeito importante a ser considerado nos análogos truncados
EMP-AF2 e -AF3 é a presença de um resíduo positivamente carregado de Lys na posição 2, muito
próximo do polo positivo do macrodipolo da hélice, que desfavorece a estabilidade da hélice-
α
(Creighton, 1993; Shoemaker et al., 1985).
Figura 4: Espectros de CD de EMP-AF a 10
µ
M, 25
o
C : (a) em (
) água, (
) TFE 40%, (...) SDS 165
µ
M, (
---
) SDS 8 mM; (b) espectros na presença de (
) tampão, (...) vesículas PC e (
) vesículas PCPG
7030, respectivamente nas relações L/P de 6,3:1 e 2,6:1.
Tabela 2. Características estruturais de EMP-AF e seus análogos, inclusive fração de hélice-
α
, em diversos
ambientes, a 10
µ
M.
f
H
Q
1
H
µ
TFE
2
SDS
3
PCPG
4
PC
5
EMP-AF +4 0,051 0,341 0,545 0,721 0,731 0,162
EMP-AF1 +3 0,051 0,341 0,222 0,293 0,278 rc
EMP-AF2 +4 0,009 0,423 0,143 0,097 0,136 rc
EMP-AF3 +3 0,009 0,423 0,131 0,097 rc rc
1
inclui uma carga adicional relativa ao terminal-C amidado;
2
40% TFE;
3
8.0 mM SDS;
4
razão L/P = 2,6:1;
5
razão L/P = 6,3:1; rc = random coil.
190
200
210
220
230
240
250
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
a
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
água
TFE 40%
SDS 165
µµ
M
SDS 8 mM
190
200
210
220
230
240
250
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
b
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
tampão Tris
26.4
µµ
M PCPG 70:30
62.8
µµ
M PC
λλ
(nm)
Resultados e Discussão
36
A importância da interação eletrostática na estabilização da conformação helicoidal é revelada pela
diferença observada na fração de hélice-
α
entre vesículas aniônicas e zwitteriônicas, como também foi
observado para outros peptídeos catiônicos (Dathe et al., 2001; Blondelle et al., 1999). Porém, a fração de
hélice-
α
aumenta significativamente em vesículas zwitteriônicas em função da concentração de lipídeo
para o EMP-AF, atingindo cerca de 53%, numa relação L/P de 150:1, o que não acontece com o EMP-
AF1, como mostra a Figura 5. Esse aumento na fração helicoidal aparentemente não pode ser atribuído a
um processo de agregação, pois o teor helicoidal independe da concentração dos peptídeos (Waterhous &
Johnson, 1994). A Figura 5 também indica que EMP-AF só se encontrará totalmente ligado em vesículas
zwitteriônicas a partir da relação L/P de 60:1, (Dathe et al., 2001), enquanto em vesículas aniônicas a
relação P/L é cerca de 20 vezes menor. Isso indica a menor afinidade de ligação de EMP-AF com
vesículas zwitteriônicas do que com vesículas aniônicas, como já identificado para outros mastoparanos
(Schwarz & Blochmann, 1993; Hellmann & Schwarz, 1998). O teor helicoidal de EMP-AF em vesículas
PC na relação L/P de 150:1 é praticamente o mesmo encontrado em TFE 40%, sugerindo que nesse
ambiente o efeito hidrofóbico é o responsável pela estabilidade conformacional (Blondelle et al., 1997).
Figura 5: Dependência do teor de hélice-
α
(f
H
), a 25
o
C, pH 7,5 com (a) concentração de peptídeo e com
(b) a razão L/P em vesículas PC.
O terminal-C carboxilado de EMP-AF1 é responsável pela menor elipticidade desse peptídeo,
segundo resultados de análise estrutural por RMN (Sforça et al., 2004). Além do efeito devido à mudança
no macrodipolo da hélice, nesse análogo não existe a possibilidade de formação da ponte de hidrogênio
entre a amida do terminal-C e a carbonila da Leu10, como acontece com EMP-AF. Porém, a ausência da
0
20
40
60
80
100
120
140
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
b
f
H
[Lip]/[Pep]
EMP-AF
EMP-AF1
8
10
12
14
16
18
20
22
24
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
a
f
H
[Pep] (
µµ
M)
EMP-AF/PC 1:150
EMP-AF1/PC 1:60
Resultados e Discussão
37
interação eletrostática entre EMP-AF1 e as cabeças zwitteriônicas das vesículas PC parece ser mais
importante que o efeito do macrodipolo da hélice para o grau de elipticidade nesse ambiente.
Análise da atividade lítica
A Figura 6 ilustra o processo de lise em vesículas PC e PCPG 7030 por EMP-AF. Em 10
minutos de contato e numa relação L/P de 9:1, EMP-AF induziu liberação praticamente completa do
conteúdo das vesículas PCPG 7030, enquanto menos de 50% do conteúdo das vesículas PC, foi liberado
no mesmo intervalo de tempo, na razão 15:1. De uma forma geral, essas curvas exemplificam o perfil da
cinética que encontramos para EMP-AF e os demais peptídeos deste estudo: em baixas concentrações de
peptídeo, as curvas não são exponenciais, em concentrações intermediárias as curvas são mono-
exponenciais, ajustadas pela equação 7, e em concentrações mais altas, são necessárias duas exponenciais
para ajustá-las matematicamente (% vazamento = V
max1
(1 - exp(-t/
τ
1
)) + V
max2
(1-exp(-t/
τ
2
))), embora esta
forma não corresponda a um modelo físico já estudado. O ajuste foi considerado adequado quando o
coeficiente de correlação é maior do que 97%. As curvas da cinética de vazamento em vesículas PC 15
µ
M
(não mostrado) e PCPG 7030 10
µ
M (Figura 6) com EMP-AF são exemplos de processos em duas etapas,
a fase inicial de liberação rápida, seguida de uma fase lenta, de liberação desacelerada, que se ajustam
desta última forma. Para as concentrações de peptídeo de 3,75 e 5
µ
M em PCPG 7030 e 10
µ
M em PC o
ajuste adequado é aquele dado pela equação 7.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0
20
40
60
80
100
% vazamento
tempo (segundos)
Figura 6: Cinética do vazamento de vesículas PC (150
µ
M) e PCPG 7030 (90
µ
M) causado pela
interação com EMP-AF nas concentrações de (
■
) 3,75
µ
M e (
●
) 10
µ
M, para vesículas PC e (
)
3,75
µ
M e (
❍
) 10
µ
M, para vesículas PCPG 7030.
Resultados e Discussão
38
A Tabela 3 mostra algumas constantes de vazamento máximo, V
max
, e de tempo,
τ
, obtidas pelo
ajuste das curvas de cinética com a equação 7 ou pela soma de duas exponenciais. Estas constantes são
dependentes da relação P/L, no entanto as constantes de tempo mostraram-se mais sensíveis à essa relação
P/L do que %V
max
.
Tabela 3: Constantes %V
max
e
τ
obtidas para as cinéticas de interação de EMP-AF, a 25
o
C, em vesículas
PCPG 7030 90
µ
M e PC 150
µ
M.
[Pep] (
µ
M)
P/L %V
max1
%V
max2
τ
1
(s)
τ
2
(s)
PC 10 0,0667 70,9 - 538 -
15 0,1 66,3 34,7 116 3000
PCPG 7030
3,75 0,0417 70,4 - 926 -
5 0,0556 73,9 - 467 -
7,5 0,0833 55,0 42,0 91 856
10 0,111 46,4 46,5 25 296
EMP-AF1 e os análogos de cadeia mais curta são muito menos eficientes em induzir o vazamento
das vesículas aniônicas e zwitteriônicas nas mesmas condições de EMP-AF, conforme indica a Tabela 4.
No caso de EMP-AF2 e EMP-AF3 isso pode ser atribuído ao menor comprimento da cadeia, à menor
hidrofobicidade e à menor elipticidade, mas não ao tipo de terminal-C, já que ambos apresentam
comportamentos semelhantes em ambos tipos de vesículas. Nesses peptídeos e também em EMP-AF1 a
menor capacidade de liberação de conteúdo das vesículas parece estar diretamente ligada à menor
elipticidade e às interferências com o macrodipolo da hélice geradas pela remoção do grupo amida do
terminal-C em EMP-AF1 e, em EMP-AF2 e -AF3 pela proximidade da Lys2 ao terminal-N. A eficiência
de permeabilização de vesículas tanto aniônicas quanto zwitteriônicas está diretamente relacionada à
fração de hélice-
α
de EMP-AF e seus análogos nessas vesículas.
Tabela 4. % Vazamento (%V) de vesículas zwitteriônicas (PC) e aniônicas (PCPG 7030) induzido por
EMP-AF e seus análogos, a 25
o
C, após diferentes tempos de contato (em segundos).
%V
300
PCPG 7030
%V
300
PC
%V
600
PCPG 7030
%V
600
PC
%V
1200
PCPG 7030
%V
1200
PC
EMP-AF
0.86 0.29 0.87
0.48
0.93
0.63
EMP-AF1 0.042 0.014 0.052 <0.02 0.055 <0.03
EMP-AF2 <0.03 <0.01 <0.04 <0.02
EMP-AF3 <0.04 <0.01 <0.04 <0.02
Resultados e Discussão
39
A eficiência de permeabilização de vesículas por EMP-AF apresentou-se diretamente dependente
do caráter iônico da bicamada lipídica, da mesma forma como encontrado em relação ao teor helicoidal.
Mostrou-se, ainda, também dependente da relação L/P. Observou-se uma dependência sigmoidal da curva
de dose-resposta (% vazamento) com a concentração de peptídeo, conforme mostra a Figura 7 para
vesículas PC (a) e PCPG 7030 (b).
Esse tipo de dependência sigmoidal é característico de processos cooperativos e mostra a
existência de uma concentração crítica de peptídeo necessária à indução de vazamento das vesículas.
Comportamento semelhante foi observado para outros peptídeos que formam poros toroidais em vesículas
PCPG 7030, como mastoparano X (Matsuzaki, 1996a) e, em vesículas zwitteriônicas, para melitina (Yang
et al., 2001). Modelos desenvolvidos por Huang e Matsuzaki para o poro toroidal (Huang, 2000; Chen,
2003; Matsuzaki, 1999a) e por Shai para o mecanismo carpete ou detergente (Oren & Shai, 1998) para
explicar o mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos partem de um acúmulo de moléculas do
peptídeo na superfície da membrana para início do processo lítico. A concentração crítica (CC) ou limite
para induzir a lise das vesículas é da ordem de 5
µ
M em vesículas PC e de 2
µ
M em PCPG 7030; se todas
as moléculas de peptídeo estivessem efetiva e uniformente ligadas à superfície das vesículas, teríamos que
a razão crítica L/P seria de 30 ou 45 moléculas de lipídeo por molécula de peptídeo, respectivamente. Esse
pequeno acúmulo de moléculas de EMP-AF, suficiente para induzir poros que resultam em vazamento,
sugere que a intensa acumulação descrita no mecanismo tipo “carpete” não seria necessária (Oren & Shai,
1998).
O processo cooperativo de vazamento de vesículas foi observado para o peptídeo com maior
conteúdo helicoidal e essas características mostraram-se diretamente relacionadas à maior eficiência
0
2
4
6
8
10
0
20
40
60
80
100
% vazamento
[ Pep ] (
µµΜΜ
)
b
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
20
40
60
80
100
% vazamento
[ Pep ] (
µµ
M )
a
Figura 7: Curvas de dose-resposta para EMP-AF em (a) 150
µ
M PC e (b) 90
µ
M PCPG 7030, com
tempos de contato de (
■■
) 5, (
●●
) 10 e (
▲▲
) 30 em (a) ou 20 minutos em (b). Desvio padrão
≤
1,0%.
Resultados e Discussão
40
antimicrobiana de EMP-AF em relação aos seus análogos. Também a ação hemolítica mostrou-se
diretamente relacionada ao teor de hélice-
α
e à eficiência de permeabilização de vesículas zwitteriônicas
de EMP-AF e seus análogos.
Os análogos truncados EMP-AF2 e EMP-AF3 têm sua hidrofobicidade significativamente
reduzida como conseqüência da remoção dos três resíduos iniciais; isto pode contribuir para torná-los
menos eficazes em interagir com membranas, mas não pode ser considerado determinante, pois outros
peptídeos igualmente curtos, como Anoplin e Decoralin e que possuem hidrofobicidade ainda menor são
bastante ativos.
Resultados e Discussão
41
5.2 Eumenitin
É um peptídeo da família dos mastoparanos, extraído dos veneno da vespa solitária
Eumenes
rubronotatus
; inibe a atividade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, não apresenta atividade
hemolítica em relação a eritrócitos humanos e estimula apenas moderadamente a desgranulação de
mastócitos. Eumenitin é o principal componente extraído do saco venomial dessa espécie. Sua seqüência
primária com 15 resíduos, um a mais do que EMP-AF e MP, apresenta alto grau de homologia com esses
peptídeos porém, contrariamente a eles, eumenitin não possui o terminal-C amidado. Esses dados já foram
publicados (vide Apêndice).
Análise conformacional por Dicroísmo Circular
Os espectros de CD de eumenitin em água, em tampão Tris/HCl, pH 7,5, e em contato com
vesículas PC confirmam a ausência de estrutura secundária nesses ambientes (Figura 8). Como descrito
para EMP-AF, em presença de TFE 40%, SDS 8 mM ou vesículas aniônicas de PCPG 7030 o peptídeo
assume uma estrutura característica de hélice-
α
. A elipticidade em SDS acima da cmc e em vesículas
aniônicas pode ser atribuída ao fato de que o ambiente lipofílico e anisotrópico das micelas e vesículas
favorecem as ligações de hidrogênio intramoleculares; as interações hidrofóbicas dos resíduos apolares
também são favorecidas e os resíduos carregados, como a Lys, não sofrerão repulsão entre si e poderão
afundar suas cadeias laterais hidrofóbicas junto às caudas hidrofóbicas do SDS, (Blondelle et al., 1997).
Em SDS abaixo da cmc, eumenitin apresenta um espectro que se desvia ligeiramente do espectro
característico de uma hélice-
α
, podendo indicar uma pequena proporção de moléculas em estruturas
diferentes desta, associadas ao SDS monomérico, ou uma pequena n-merização do peptídeo nesse
ambiente, uma vez que a razão [
Θ
]
222
/ [
Θ
]
208
é maior que 1 (Blondelle et al., 1997).
Figura 8:
Espectros de CD de eumenitin a 8.5
µ
M, 25
o
C, em diferentes ambientes: (a) (
) água, (
) TFE
40%, (
) SDS 165
µ
M, (
) SDS 8 mM; (b) (
) tampão Tris pH 7,5, (
) vesículas PC e (
) vesículas
PCPG 7030, respectivamente nas relações L/P de 6,3:1 e 2,6:1.
190
200
210
220
230
240
250
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
b
190
200
210
220
230
240
250
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
a
Resultados e Discussão
42
A Tabela 5 resume as características estruturais de eumenitin em comparação a EMP-AF,
incluindo seu teor de hélice-
α
nos vários ambientes. O grau de elipticidade de eumenitin mostrou ser
dependente da natureza iônica dos fosfolipídeos. No experimento de titulação de peptídeo com vesículas
observamos que as zwitteriônicas induziram apenas um pequeno aumento no teor de hélice-
α
, mesmo em
concentrações mais altas de peptídeo e de lipídeo; a Figura 9a mostra que esse pequeno teor independe da
concentração de lipídeo e de peptídeo. Entretanto, vesículas aniônicas induziram expressivo teor
helicoidal, da mesma ordem de grandeza que o observado em SDS acima da cmc, e a fração de hélice-
α
calculada é fortemente dependente da relação L/P até uma relação de 20:1, conforme indica a Figura 9a.
Tabela 5.
Propriedades estruturais de Eumenitin (8.5
µ
M) em comparação a EMP-AF (10
µ
M), e suas
respectivas frações de hélice-
α
(
f
H
) em diferentes ambientes.
f
H
Q
1
H
µ
TFE
2
SDS
3
PCPG
4
PC
5
Eumenitin +3 0,002 0,265 0,43 0,50 0,45/0,72 0,07/0,11
EMP-AF +4 0,051 0,342 0,545 0,721 0,731 0,162
1
inclui uma carga adicional relativa ao terminal-C amidado;
2
40% TFE;
3
> 8.0 mM SDS;
4
razão L/P = 2,6:1 e 53:1;
5
razão L/P = 6,3:1e 38:1
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
r
[Pep]
livre
(
µµ
M)
b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
f
H
[Lip]/[Pep]
a
Figura 9: (a) Dependência do teor de hélice-
α
(f
H
) com a razão L/P para eumenitin nas
concentrações de (
■
) 10
µ
M, (
●
) 15
µ
M, (
▲
) 20
µ
M e (
) 25
µ
M em PCPG 7030 , e (
❍
) 10
µ
M
em PC. (b) Constante de associação (
r
) ou razão entre as concentrações de peptídeo ligado e lipídeo
total, PCPG 7030, em função da concentração de peptídeo livre, de acordo com a equação 5.
Resultados e Discussão
43
A partir das isotermas de ligação de eumenitin em vesículas PCPG 7030 determinamos os valores
de
r
, a razão entre as concentrações de peptídeo associado às vesículas e de lipídeo total, e
c
f
, a
concentração de peptídeo livre, que descrevem o equilíbrio de partição dessa interação (equação 5); a
Figura 9b mostra a relação entre eles e indica que existe uma alta afinidade nessa ligação. Resultados de
r
e
c
f
bastante semelhantes a estes foram encontrados para mastoparano X em vesículas PC (Hellmann &
Schwarz, 1998) e para magainina em vesículas fortemente anionicas PC/LPS 5050 (Matsuzaki, 1999b).
Para mastoparano em vesículas PC o valor de
r
é cerca de 10 vezes menor (Schwarz & Blochmann, 1993).
A razão entre
r
e
c
f
fornece o coeficiente de partição que é de (1,16
±
0,05).10
4
M
-1
.
A baixa hidrofobicidade de eumenitin certamente contribui para sua baixa afinidade em relação às
vesículas PC, mas a forte interação com as membranas aniônicas tornam esse peptídeo altamente seletivo.
Entretanto, o fato de sua cadeia possuir um resíduo a mais que EMP-AF parece não contribuir para seu
teor helicoidal. Excepcionalmente entre os peptídeos de vespa solitária estudados, eumenitin, em sua forma
nativa, não apresenta o terminal-C amidado. Assim, se compararmos o desempenho de eumenitin com
EMP-AF1, ambos com terminal-C carboxilado, observaremos uma grande diferença, que provavelmente
resulta das características da sua seqüência primária, mas principalmente de sua maior elipticidade.
Análise da atividade lítica
A atividade lítica de eumenitin em vesículas PCPG 7030 e em vesículas PC foi avaliada durante 30
minutos de contato, em diferentes concentrações do peptídeo. O ajuste das isotermas de vazamento
mostrou que o processo é semelhante ao descrito para EMP-AF em vesículas aniônicas, ou seja, não-
exponencial em baixas concentrações, exponencial, descrito pela equação 7 nas concentrações
intermediárias e, nas concentrações acima de 1,25
µ
M, passível de ajuste com uma soma de exponenciais.
No entanto, em vesículas zwitteriônicas, o processo é significativamente mais lento e dependente de uma
relação P/L cerca de 20 vezes maior (Tabela 6).
Tabela 6. Constantes % V
max
e
τ
obtidas para a cinética da interação do Eumenitin em vesículas PCPG
7030 e PC.
[Pep] (
µ
M)
P/L % V
max
τ
(s)
PCPG 7030 1,25 0,0379 93,0 275
PC 75 0,778 87,8 787
Os gráficos de vazamento em função da concentração de peptídeo (Figura 10) indicam que o
processo de liberação do conteúdo de vesículas por eumenitin em vesículas PCPG 7030 é também
Resultados e Discussão
44
cooperativo. Porém, em vesículas zwitteriônicas parece não haver cooperatividade, provavelmente devido
à baixa velocidade do processo.
Em vesículas aniônicas eumenitin causou um vazamento de conteúdo de mais de 90% em um
minuto, na concentração de 4
µ
M, mostrando uma eficiência de permeabilização significativamente maior
do que a verificada com EMP-AF, que na mesma concentração atingiu apenas 30% em 5 minutos. A
concentração limite necessária à indução do vazamento é menor que 1
µ
M, também inferior à encontrada
para EMP-AF. Em vesículas PC foi necessária uma concentração pelo menos 10 vezes maior de eumenitin
para induzir a liberação do conteúdo das vesículas, num processo bifásico, mas bem mais lento e de baixa
cooperatividade. Essas observações assinalam a importância das membranas eletricamente negativas para a
seletividade de eumenitin.
O baixo teor helicoidal e a pequena eficiência de permeabilização de vesículas zwitteriônicas estão
diretamente correlacionados à baixa atividade hemolítica de eumenitin, assim como o expressivo teor de
hélice-
α
e a eficiente permeabilização de vesículas aniônicas correlacionam-se à atividade antimicrobiana
desse peptídeo. Semelhantemente a EMP-AF em vesículas aniônicas, o processo lítico é cooperativo e, da
mesma forma, o mecanismo de formação de poro descrito como tipo “carpete” (Shai, 1999) parece não se
aplicar ao caso de eumenitin, já que a indução de vazamento acontece em concentrações bastante baixas,
da ordem de 50 moléculas de lipídeo por molécula de peptídeo.
0
1
2
3
4
5
6
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
20
40
60
80
100
% vazamento
[ Pep ] (
µµ
M)
Figura 10: Curvas de dose-resposta para eumenitin em vesículas aniônicas (à esquerda, linhas
contínuas) e em vesículas zwitteriônicas (à direita, linhas pontilhadas). O percentual de vazamento
está apresentado para os tempos de contato de (
■
) 1 min. e (
●
) 3 min. em 60
µ
M PCPG (70:30), e
(
▼
) 1 min. e (
▲
) 30 min em 100
µ
M PC. Desvio padrão
≤
1,5% calculado a partir de 5 repetições.
Resultados e Discussão
45
5.3 EMP-EM1~4
Esta série de peptídeos (EMP-EM1, EMP-EM2, EMP-EM3 e EMP-EM4) da família dos mastoparanos
foi extraída do saco venomial da vespa solitária
Eumenes micado
, onde os quatro análogos ocorrem
simultaneamente. Isso sugere uma possível sinergia entre eles. Semelhantemente a eumenitin, EM1 e EM2
inibem a atividade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas com espectros e eficiência comparáveis,
enquanto EM3 e EM4 não apresentam atividade antimicrobiana. Nenhum dos quatro peptídeos desta série
apresenta significativa atividade hemolítica. EM3 e EM4 estimulam apenas moderadamente a
degranulação de mastócitos, da mesma forma que eumenitin, porém EM1 e EM2 são mais ativos. Suas
seqüências primárias possuem 14 resíduos, terminal-C amidado e apresentam alto grau de homologia em
relação a EMP-AF e eumenitin. EM3 e EM4 são únicos entre os peptídeos de vespa solitária estudados por
apresentarem um resíduo negativamente carregado (Asp) na posição 2. Esses dados ainda não foram
submetidos à publicação e foram gentilmente cedidos pelo Dr. K. Konno do Instituto Butantan (CAT-
CEPID) .
Análise conformacional por Dicroísmo Circular
Os espectros obtidos por CD dos peptídeos da série EM1~EM4 estão apresentados na Figura 11.
Em água e tampão Tris/borato pH 7,5, esses peptídeos apresentam espectro característico de estruturas
aleatórias (random coil), exibindo uma banda dicróica negativa entre 197 e 199 nm. A dissolução desses
peptídeos em TFE 40% ou SDS 8 mM resultam em estruturas cujos espectros são característicos de hélice-
α
, exibindo bandas negativas em 208 e 222 nm e uma banda positiva entre 191 e 193 nm. A razão entre as
elipticidades observadas em 222 nm e 208 nm ([
Θ
]
222
/ [
Θ
208
] é menor que 1, sinalizando que nesses
ambientes os peptídeos apresentam-se como monômeros (Blondelle et al., 1997). Em meio SDS 165
µ
M,
esses peptídeos dividem-se em dois grupos, EM1 e EM2 cujos espectros de CD são também característicos
de hélice-
α
, e EM3 e EM4 que nessa condição apresentam espectros indicativos de dobras (turns) ou
folhas-
β
, com uma única banda negativa ao redor de 220 e 223 nm e uma banda positiva entre 196 e 197
nm. Em meio SDS monomérico, os estudos de propensão helicoidal conduzidos por Blondelle et al.
(1997), indicam que os resíduos Phe, Gly, Val e Ser, que correspondem a aproximadamente 40% dos
resíduos desses peptídeos, apresentam propensão para conformação em folhas-
β
.
Para avaliar o papel das interações eletrostáticas na conformação desses peptídeos obtivemos seus
espectros também em um meio catiônico, constituído por uma solução de cloreto de trimetilcetilamônio
(CTACl) a 2,8 mM, acima da concentração micelar crítica. Esses espectros mostrados na Figura 12,
apresentam uma relação sinal/ruído pior que em SDS, embora tenham sido obtidos nas mesmas condições
dos espectros anteriores; os espectros de EM3 e EM4 são característicos da conformação em hélice-
α
monomérica. Essa pequena estruturação helicoidal, que não se obtém para EM1 e EM2, parece ser o
resultado da interação dos resíduos Asp 2 com a superfície catiônica das micelas, pois uma ponte salina
Resultados e Discussão
46
entre esse resíduo e Lys 8 (i, i + 6) seria menos provável. Isso evidencia o papel modulador da presença de
cargas negativas nesses peptídeos e reforça a idéia de um possível sinergismo entre as ações desse
peptídeos, expandindo o espectro de ação da mistura em relação aos componentes isolados.
Figura 11: Espectros de CD dos peptídeos da série EMP-EM1~4, a 25
o
C, sendo (a) EM1, (b) EM2, (c)
EM3, e (d) EM4, em (
)água , (
) TFE 40%, (
) SDS 165
µ
M e (
) SDS 8 mM.
190
200
210
220
230
240
250
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
c
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
água
TFE 40%
SDS 165
µµ
M
SDS 8 mM
190
200
210
220
230
240
250
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
d
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
água
TFE 40%
SDS 165
µµ
M
SDS 8 mM
190
200
210
220
230
240
250
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
a
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
água
TFE 40%
SDS 165
µµ
M
SDS 8 mM
190
200
210
220
230
240
250
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
b
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
água
TFE 40%
SDS 165
µµ
M
SDS 8 mM
Resultados e Discussão
47
As isotermas de associação dos peptídeos EM1~4 com vesículas PC estão mostradas na Figura
12b. Baixa fração de hélice-
α
é induzida nesses peptídeos em interação com vesículas zwitteriônicas, o
que está bem correlacionado à ausência de atividade hemolítica. Isso sugere que as maiores elipticidades
observadas em meios aniônicos são o resultado da maior importância das interações eletrostáticas na
determinação da estrutura secundária.
A Tabela 7 reúne os resultados de CD a outros parâmetros estruturais, destes peptídeos, de
eumenitin e EMP-AF. Os quatro peptídeos apresentam momentos hidrofóbicos semelhantes, comparáveis
a eumenitin, no entanto, este, com carga líquida intermediária e hidrofobicidade bastante menor, apresenta
fração de hélice-
α
superior a todos eles, exceto EM4. A série EMP-EM1~4 apresenta as maiores
hidrofobicidades médias dentre os peptídeos estudados, sem contudo apresentarem atividade hemolítica.
Os quatro peptídeos apresentam um resíduo carregado na posição 2, sendo que EM1 e EM2 apresentam
uma Lys e EM3 e EM4 um Asp; isso faz com que os dois primeiros apresentem uma carga líquida mais
alta que os demais, e que provavelmente é responsável pela sua atividade antimicrobiana (Dathe et al.,
2001). A diferença entre os teores helicoidais de EM3 e EM4, tanto em TFE como em SDS, refletem a
influência de uma única diferença na seqüência primária desses peptídeos, na posição 3. A presença de
uma Ile em EM3 provavelmente causa um impedimento estérico ao equilíbrio hélice-coil desse peptídeo.
190
200
210
220
230
240
250
260
270
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
a
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/ dmol)
λλ
(nm)
EM1
EM2
EM3
EM4
0
10
20
30
40
50
60
70
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
b
EM1
EM2
EM3
EM4
f
H
[Lip] / [Pep]
Figura 12a: Espectros de CD a 25
o
C, de EMP-EM1 (
), EMP-EM2 (
), EMP-EM3, (
) e EMP-
EM4 (
) em CTACl 2,8 mM.
Figura 12b: Dependência do teor de hélice-
α
(f
H
) dos peptídeos (
■
) EM1, (
●
) EM2, (
▲
) EM3 e
(
▼
) EM4 com a razão entre as concentrações de PC e peptídeo (L / P).
Resultados e Discussão
48
Tabela 7. Propriedades estruturais de EMP-EM1~4 (10
µ
M) em comparação a eumenitin (8,5
µ
M) e EMP-
AF (10
µ
M), e suas respectivas frações de hélice-
α
(
f
H
).
f
H
Q
1
H
µ
TFE
2
SDS
3
CTACl
4
PC
EMP-EM1 +4 0,104 0,258 0,305 0,332 <0,02 0,105
5
EMP-EM2 +4 0,138 0,278 0,367 0,407 <0,02 <0,03
5
EMP-EM3 +2 0,163 0,251 0,324 0,361 0,137 <0,03
5
EMP-EM4 +2 0,149 0,238 0,482 0,539 0,246 0,260
6
Eumenitin +3 0,002 0,265 0,43 0,50 nd 0,11
5
EMP-AF +4 0,051 0,342 0,55 0,72 nd 0,16
1
inclui uma carga adicional relativa ao terminal-C amidado;
2
40% TFE;
3
> 8.0 mM SDS;
4
2,8 mM CTACl;
5
razão L/P = 38:1;
6
razão L/P = 57:1; nd = não determinado.
Análise da atividade lítica
A atividade lítica dos peptídeos da série EMP-EM1~4 em vesículas PCPG 7030 foi avaliada
durante 20 minutos de contato, e em vesículas PC durante 30 minutos, com diferentes concentrações de
peptídeo. As Figuras 13 e 14 mostram as curvas de dose-resposta obtidas, considerando % vazamento após
3 e 5 minutos de contato, respectivamente. Esses gráficos indicam que o processo de liberação do conteúdo
de vesículas por EM1~4 é cooperativo, assim como encontrado para EMP-AF e Eumenitin.
Figura 13: Curvas de dose-resposta, a 25
o
C, para EM1 e EM2 (a) e para EM3 e EM4 (b) em PCPG 7030
23
µ
M (símbolos cheios) e 33
µ
M (símbolos vazados), após 3 minutos de contato.
0
2
4
6
8
10
0
20
40
60
80
100
a
% vazamento
[Pep] (
µµ
M)
EM1 / 23
µµ
M
EM2 / 23
µµ
M
EM1 / 33
µµ
M
EM2 / 33
µµ
M
0
2
4
6
8
10
0
20
40
60
80
100
b
% vazamento
[Pep] (
µµ
M)
EM3 / 23
µµ
M
EM4 / 23
µµ
M
EM3 / 33
µµ
M
EM4 / 33
µµ
M
Resultados e Discussão
49
A concentração crítica (Figura 13) que induz o vazamento em vesículas PCPG 7030 é da ordem de
1
µ
M, em baixa concentração de vesículas (23
µ
M, Figura 13a) e aumenta para cerca de 1,5
µ
M no caso
de EM1 e EM2 ou cerca de 2,5 a 3
µ
M no caso de EM3 e EM4, quando a concentração de vesículas
aumenta (33
µ
M, Figura 13b).
Na Figura 14 os gráficos apresentam o % vazamento de vesículas PC, após 5 minutos de contato,
em função da concentração dos peptídeos. A concentração limite que desencadeia o processo de liberação
do conteúdo dessas vesículas é maior do que para as vesículas aniônicas, da ordem de 4 a 15
µ
M
dependendo do peptídeo em 54
µ
M de lipídeo, sendo que EM3, requer a menor concentração para induzir
o processo de vazamento. Em tempos de contato de 30 minutos, os quatro peptídeos atingem 80 a 90% de
vazamento, nas concentrações mais elevadas em que foram testados. Em concentração mais elevada de
lipídeo, 96
µ
M, as concentrações limite de peptídeo aumentam para cerca de 12 a 15
µ
M.
Figura 14: Curvas de dose-resposta a 25
o
C, em vesículas PC 54
µ
M para EM1, EM2, EM3 e EM4, com 5
minutos de contato.
O ajuste das isotermas de vazamento (equação 7), tanto em vesículas aniônicas como
zwitteriônicas, também mostrou que o processo é semelhante ao descrito para EMP-AF, que as constantes
de tempo são inversamente dependentes da razão P/L (Figura 15a e b) e que são mais sensíveis a ela do
que a constante % V
max
. Dois experimentos independentes foram realizados e com isso obtivemos no
mínimo uma curva por experimento onde o ajuste se mostrou adequado. Considerando que os peptídeos
mais eficientes na permeabilização de vesículas são aqueles onde a menor relação P/L está associada aos
menores valores da constante de tempo,
τ
, observa-se na Figura 15a que a eficiência de permeabilização de
vesículas aniônicas segue a seguinte ordem decrescente EM2>EM1>EM3=EM4, que está bem
correlacionada às respectivas atividades antimicrobianas. Comparativamente aos demais peptídeos
estudados EM2 é equivalente a EMP-AF e inferior a Eumenitin e MP1 (Figura 35). Entretanto, em
0
5
10
15
20
25
0
20
40
60
80
100
% vazamento
[Pep] (
µµ
M)
EM1
EM2
EM3
EM4
Resultados e Discussão
50
vesículas PC, o vazamento induzido pelos peptídeos da série EM1~4 é significativamente mais lento e
dependente de uma relação P/L cerca de 2 a 4 vezes maior.
Figura 15: (a) Gráfico da constante de tempo (
τ
) da cinética de vazamento induzido por EM1 (preto), EM2
(vermelho), EM3 (verde) e EM4 (azul) em vesículas aniônicas, PCPG 7030, em função da concentração
P/L mínima em que as respectivas curvas da cinética foram ajustadas. (b) idem para vesículas
zwitteriônicas, PC.
A eficiência de permeabilização das vesículas zwitteriônicas segue uma ordem decrescente
diferente, sendo EM3>EM2 >>EM1=EM4. A diferença de concentração em que a permeabilização de
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
τ τ
( s)
[ Pep ] / [ Lip ]
a
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
τ τ
( s )
[ Pep ] / [Lip ]
b
Resultados e Discussão
51
ambos tipos de vesícula acontece garante a seletividade de EM1 e EM2 em relação às vesículas aniônicas.
Porém, EM3 e EM4 não apresentam seletividade em relação a essas vesículas.
Devido às interações observadas em micelas catiônicas de CTACl (Figura 13a), realizamos alguns
experimentos de vazamento de vesículas aniônicas e zwitteriônicas na presença de quantidades
equimolares entre peptídeo e CTACl. Nessas concentrações, muito menores que a cmc, o surfactante é
monomérico. As figuras 16a e b mostram a cinética do processo de vazamento, em vesículas PC e PCPG
7030, respectivamente. O surfactante ao interagir isoladamente com as vesículas provoca um pequeno
vazamento de 7% em vesículas PC, que permanece constante ao longo de 40 minutos, e de 5 a 9% em
vesículas PCPG 7030, ao longo de 20 minutos de contato. Esses valores são muito menores que os
encontrados para qualquer um dos quatro peptídeos da série EM1~4 nas mesmas vesículas. A interação
conjunta entre peptídeo e surfactante praticamente extingue a permeabilização das vesículas aniônicas
pelos quatro peptídeos e reduz significativamente a fração de CF liberada das vesículas zwitteriônicas. A
presença do surfactante catiônico provavelmente compete com os peptídeos pelas regiões próximas às
cargas negativas das vesículas, impedindo ou repelindo a ligação destes com a superfície da membrana. Da
mesma forma, no caso das vesículas zwitteriônicas, o surfactante provavelmente se liga às vesículas e
reduz a afinidade dos peptídeos pela superfície da bicamada.
0
500
1000
0
2
4
6
8
10
b
% vazamento
tempo (segundos)
0
500
1000
1500
2000
2500
0
2
4
6
8
10
12
14
16
a
% vazamento
tempo (segundos)
Figura 16: Cinética do vazamento, a 25
o
C, induzido por EM1~4 com vesículas (a) 54
µ
M PC e (b)
23
µ
M PCPG 7030, na presença de CTACl em concentrações equimolares em relação aos
peptídeos, sendo em (a) e (b) respectivamente (■) EM1 a 12,5 e 10
µ
M, (●) EM2 a 10 e 1,25
µ
M,
(▲) EM3 a 10 e 5
µ
M, (▼) EM4 a 10 e 5
µ
M, e (◆) CTACl a 12,5
µ
M.
Resultados e Discussão
52
Em um outro experimento observamos a cinética da permeabilização de vesículas PC por EMP-AF
e por EM3, ambos na concentração de 5
µ
M, na presença e na ausência de 165
µ
M de SDS em
comparação à ação isolada do surfactante (Figura 17). Nesta concentração, muito abaixo da cmc, SDS
apresenta-se monomérico, contudo induz expressiva quantidade de estrutura secundária em ambos
peptídeos (Figuras 4 e 11c, respectivamente). O que se observa é um significativo aumento da eficiência de
permeabilização dessas vesículas por ambos peptídeos, embora o surfactante isolado cause um vazamento
inferior a 10% em 20 minutos de contato.
A associação de surfactantes tem ação sinérgica positiva ou negativa na permeabilização de
vesículas zwitteriônicas por peptídeos catiônicos dependendo de seu caráter iônico: tensoativos catiônicos
apresentam sinergia negativa e vice-versa.
0
500
1000
1500
2000
2500
0
20
40
60
80
100
% vazamento
tempo (s)
Figura 17: Cinética da interação, a 25
o
C, de peptídeos catiônicos a 5
µ
M com vesículas PC a 11
µ
M, sendo (
■
,
❒
) EMP-AF e (
●
,
❍
) EM3, respectivamente na ausência (símbolos cheios) e na
presença (símbolos vazados) de surfactante aniônico (
◆
) SDS a 165
µ
M.
Resultados e Discussão
53
5.4 Polybia-MP1 (MP1)
É um peptídio da família dos mastoparanos, extraído do veneno da vespa social
Polybia paulista
,
com catorze resíduos na cadeia peptídica; apresenta potente ação antimicrobiana contra bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas, não é hemolítico em eritrócitos de ratos, é desgranulador de mastócitos, e
quimiotático para leucócitos polimorfonucleados (PMNL). Ocorre conjuntamente com outro peptídio de
doze resíduos, denominado Polybia-CP, com atividade semelhante, mas que não desgranula mastócitos e é
seletivo para bactérias Gram-positivas (Souza et al., 2005), e ainda, ocorre com outros dois peptídios
quimiotáticos e inflamatórios, mas não antimicrobianos, cujo N-terminal é acetilado (Ribeiro et al., 2004).
Análise conformacional por Dicroísmo Circular
As figuras 18a e b mostram os espectros de MP1 a 20
µ
M, em diferentes ambientes. Em água e
tampão Tris/borato os espectros são compatíveis com uma estrutura desordenada, e passam a ser
característicos de hélice-
α
monomérica ([
Θ
]
222
/ [
Θ
208
]< 1) nos demais ambientes testados, apresentando
inclusive um ponto isodicróico em 196 nm (Figura 18a), característico da existência de estruturas em
apenas dois estados, aleatória e helicoidal (Rohl & Baldwin, 1998). Chuang et al. (1996) e McDowell et al.
(1985) apresentam espectros de CD de MP-B em TFE 40% e MP-X em TFE 70%, respectivamente, que
também são característicos de hélice-
α
monomérica, com um ponto isodicróico ao redor de 200 nm. A
presença de 150 mM NaF, no tampão Tris/ borato, aumentando a força iônica do meio, alterou o espectro
de CD de MP1 em relação ao seu espectro em água, e também o espectro em meio de vesículas PC,
mostrando aumento de intensidade das bandas dicróicas em 222 e 208 nm (Figura 18b).
Figura 18: Espectros de CD de MP1 a 20
µ
M, 25
o
C : (a) em (
) água, (
) TFE 40%, (
) SDS 165
µ
M,
(
) SDS 8 mM; (b) espectros na presença de (
) tampão Tris pH 7,5, (
) vesículas PC, (
....
) vesículas
PC com adição de 150 mM NaF, (
....
) vesículas
PCPG 7030, respectivamente nas relações L/P de 15:1,
12:1 e 11:1.
190
200
210
220
230
240
250
260
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
a
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/ dmol)
λλ
(nm)
água
SDS 165
µµ
M
TFE 40 %
SDS 8 mM
190
200
210
220
230
240
250
260
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
b
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
λλ
(nm)
tampão Tris
PC
PC + 150
µµ
M NaF
PCPG 7030
Resultados e Discussão
54
Isto não ocorreu com mastoparano-X, cujo espectro de CD em água, característico de estruturas
aleatórias, não se alterou pela presença de até 0,5 M de tampão fosfato em pH 7,0 (McDowell et al, 1985),
nem o teor de hélice-
α
, em vesículas zwitteriônicas, pela variação de NaCl na faixa de 0,1 a 0,4 M
(Schwarz & Blochmann, 1993). Com MP ocorreu alteração em sentido inverso, ou seja, a elipticidade em
vesículas zwitteriônicas decresceu em função do aumento da concentração salina entre 0 e 0,4 M de NaCl
(Schwarz & Blochmann, 1993). MP1 e MP-X possuem seqüências primárias bastante semelhantes (Tabela
1), principalmente na região do terminal-N; a diferença mais marcante entre elas é o maior número de
resíduos carregados e polares (6 contra 4). Dentre eles, a presença de resíduos negativamente carregados
em MP1 que podem estabelecer pontes salinas com os resíduos positivamente carregados, ou um maior
número de ligações de hidrogênio com a cadeia principal, em ambientes onde houvesse menor solvatação
desses resíduos polares pela água. A influência das interações eletrostáticas na conformação de MP1
também pode ser observada comparando-se o maior teor helicoidal em SDS, o meio mais densamente
carregado, com o teor helicoidal em vesículas aniônicas, que por sua vez, é maior que em vesículas
zwitteriônicas.
Comparando-se também as seqüências primárias (Tabela 1) de MP1 e MP-B observa-se uma
semelhança estrutural acentuada entre elas, quanto ao posicionamento dos resíduos carregados e polares,
intercalados por resíduos apolares de dimensões semelhantes. A Tabela 8 mostra outras semelhanças
estruturais entre MP1, MP-B e MP-X, todos mastoparanos de vespa social. Apesar da diferença no valor
da carga líquida, MP1 e MP-B apresentam hidrofobicidade negativa e momento hidrofóbico da mesma
ordem. A elipticidade de MP1 e MP-B (Park et al., 1995) em vesículas PCPG 7030 e em vesículas PC
também é bastante semelhante, em condições similares de razão L/P.
Tabela 8. Características estruturais de MP1, inclusive fração de hélice-
α
, em diversos ambientes, a 20
µ
M, comparativamente a EMP-AF, MP-B e MP-X.
f
H
Q H
µ
40% TFE SDS
1
PCPG PC
MP1 +2 -0,108 0,297 0,427 0,413 0,399
2
0,177
3
EMP-AF +4 0,051 0,341 0,545 0,721 0,731
4
0,162
5
MP-B +5 -0,064 0,270 0,497
6
- 0,366
7
0,165
7
MP-X +4
0,009 0,209 0,61
8
- - 0,61
9
1
8.0 mM SDS;
2
razão L/P = 11:1;
3
razão L/P = 15:1;
4
razão L/P = 2,6:1;
5
razão L/P = 6,3:1;
6
calculado a partir de Chuang et al., 1996;
7
calculado a partir de Park et al., 1995, na razão L/P = 10:1;
8
calculado a partir de McDowell et al., 1985 em 70% TFE;
9
calculado a partir de Schwarz &
Blochmann, 1993.
Resultados e Discussão
55
Espectros de fluorescência de Trp obtidos para MP1 a 10
µ
M em SUV PC a 53
µ
M, indicam que
MP1 não penetra na membrana, pois a fluorescência do Trp não apresenta nem intensidade aumentada,
nem deslocamento para as regiões de menor comprimento de onda, característicos desse resíduo em meios
mais hidrofóbicos (figura 19). Contrariamente, os espectros de fluorescência de MP-X que também possui
um resíduo Trp na posição 3, sugerem que ele penetra em meio mais hidrofóbico, mas se localiza próximo
à superfície da vesícula (Matsuzaki et al., 1996a). A menor interação de MP1 com vesículas zwitteriônicas
é compatível com a baixa atividade hemolítica deste peptídio (Souza et al., 2005); já MP-B que é mais
hemolítico que MP, penetra no core hidrofóbico de vesículas DPPC a partir da relação L/P = 24:1, como
indicado pelo aumento da intensidade e deslocamento da fluorescência do resíduo de Trp para menores
comprimentos de onda (Park et al., 1995). Essa diferença de comportamento entre peptídios tão
semelhantes poderia ser explicada pelo maior número de cargas positivas de MP-B, o maior dentre os
mastoparanos de vespas sociais comumente estudadas (Park et al., 1995) e que é também o maior dentre os
mastoparanos de vespas solitárias já identificados (K. Konno, comunicação pessoal). Segundo Dathe et al.
(2001), existe uma relação direta entre o aumento do número de cargas positivas, além de certos limites, e
o aparecimento de atividade hemolítica. MP-B é mais hemolítico que MP, e este é 10 vezes mais
hemolítico que EMP-AF (Konno et al., 2000), mas ambos, MP-B e EMP-AF, apresentam o mesmo teor de
hélice-
α
, confirmando a tendência de maior caráter hemolítico para peptídios com cationicidade acima da
média. Nesse sentido a maior seletividade de MP1 em relação a MP-B e EMP-AF pode ser atribuída à sua
menor carga líquida.
Figura 19: Espectros de fluorescência de MP1 10
µ
M, a 25
o
C, na presença de tampão Tris, pH 7,5 (traço
preto) e na presença de vesículas PC 53
µ
M (traço vermelho).
300
350
400
450
500
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
a
fluorescência (unidades arbitrárias)
λλ
(nm)
Tris
PC
MP1 (
λλ
max.
=354 nm)
MP1/ PC (
λλ
max.
=353,2 nm)
Resultados e Discussão
56
Análise da atividade lítica
A atividade lítica de MP1 foi estudada em vesículas zwitteriônicas (PC) e em diferentes
composições lipídicas aniônicas, PCPG 7030, PCCL 7030 e PCCL 4060. A camada externa da membrana
de bactérias é caracterizada por uma alta densidade de carga negativa e interações eletrostáticas são
reconhecidamente determinantes da ligação entre peptídios e membranas (Yeaman & Yount, 2003; Lohner
& Prenner, 1999). Para mimetizar essas características das membranas bacterianas, usamos PG e CL,
variando a densidade de carga negativa da bicamada. A cardiolipina é uma forma dimérica de
fosfatidilglicerol, com 4 grupos alquílicos e duas cargas negativas, uma em cada grupo fosfato. A Figura
20a ilustra o processo de permeabilização. Em 5 minutos de contato e numa relação L/P de 20:1 ou 12,5:1,
MP1 induziu liberação quase completa do conteúdo das vesículas PCPG 7030 ou PCCL 7030,
respectivamente, enquanto cerca de 50% do conteúdo das vesículas PC e das PCCL 4060 foi liberado no
mesmo intervalo de tempo, nas razões 25:1 e 7,5:1. Essas curvas da cinética de vazamento são
características de processos em duas etapas, com uma fase inicial de liberação rápida, seguida de uma fase
lenta, de liberação desacelerada, bastante semelhante ao verificado para EMP-AF em vesículas PCPG
7030; as constantes de tempo (
τ
) e valores de vazamento máximo (V
max
) estão indicadas na Figura 20b.
EMP-AF, entretanto, demonstrou ser mais eficiente do que MP1, pois sua eficiência ocorreu em uma
relação L/P de 10:1, enquanto para MP1 essa relação variou entre 4 a 5:1.
0
5
10
15
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
a
% vazamento
tempo (minutos)
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% vazamento máximo
[Pep] / [Lip]
0
100
200
300
400
500
600
b
ττ
( s )
Figura 20a: Cinética do vazamento de vesículas causado pela interação com MP1 a 5
µ
M em (
◆
) PC,
(
▲
) PCPG 7030, (
❏
) PCCL 7030, (
❍
) PCCL 4060, e a 20
µ
M em (
■
) PCCL 7030 (
●
) PCCL 4060.
Figura 20b: % Vazamento máximo (símbolos cheios) e constante de tempo (
τ
, símbolos vazados)
obtidos pelo ajuste da curva de cinética de MP1 para as mesmas vesículas nas respectivas razões entre
as concentrações molares de peptídio e lipídio (razão [Pep]/[Lip]).
Resultados e Discussão
57
A inclusão de fosfolipídios aniônicos, tanto PG como CL, em vesículas PC afeta principalmente
τ
,
que está ligada `a velocidade de formação de aberturas na bicamada, muito mais do que V
max
, que está
relacionada ao número de aberturas ou à condutância dessas aberturas (Allende et al., 2005). Isso
demonstra também a interação preferencial de MP1 com vesículas aniônicas, pois nestas
τ
é
significativamente menor do que para vesículas zwitteriônicas. A eficiência de permeabilização de
vesículas segundo sua composição se deu na seguinte ordem decrescente: PCPG 7030 > PCCL 7030
>>PC ou PCPG 7030>PCCL 7030 >>PCCL4060.
As curvas de dose-resposta para MP1 estão apresentadas na Figura 21 e indicam um processo
cooperativo para todos os tipos de vesículas testadas. As doses que induzem o vazamento de vesículas PC
e PCPG 7030 são da ordem de 1
µ
M, enquanto nas vesículas PCCL essa concentração limite aumenta para
10
µ
M, para um tempo de contato de 5
minutos. Esses resultados estão bem correlacionados aos
encontrados por Matsuzaki et al. (1998b), mostrando que magainina permeabiliza mais eficientemente
vesículas contendo o fosfolipídio aniônico PG do que aquelas que contém outros fosfolipídios aniônicos
como PS, PA ou CL. Como os experimentos foram realizados em diferentes concentrações de
fosfolipídios, é mais adequado observar a dependência do % vazamento com a razão P/L (Figura 21b), que
evidencia a forte dependência da eficiência de permeabilização com a quantidade de lipídio. A fase rápida
do processo de vazamento é induzido em vesículas PCPG 7030 e PC a partir da relação P/L de 1:40,
enquanto em vesículas PCCL 7030 essa relação é de
1:30 e de 1:15 em PCCL 4060.
0
5
10
15
20
25
30
0
20
40
60
80
100
a
% vazamento
[Pep] (
µµ
M)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0
20
40
60
80
100
b
% vazamento
[Pep]/ [Lip]
Figura 21: Curvas de dose-resposta para MP1, após 5 minutos de contato, em função da
concentração de peptídio (a) e da razão L/P (b) em vesículas zwitterionicas, (
◆
) PC, e aniônicas (
▲
)
PCPG 7030 (
■
) PCCL 7030 (
●
) PCCL 4060.
Resultados e Discussão
58
Embora as interações eletrostáticas determinem a seletividade de MP1 a vesículas aniônicas, a
eficiência de permeabilização de MP1 nas vesículas estudadas parece depender também de outros
parâmetros além da quantidade de cargas negativas: nos três tipos de vesículas aniônicas estudadas, a
densidade de carga negativa segue a seguinte ordem decrescente: PCCL 4060 > PCCL 7030 > PCPG 7030,
cada uma apresentando praticamente o dobro de cargas negativas em relação à seguinte. Porém, a
eficiência de permeabilização segue a ordem inversa. A membrana externa das bactérias Gram-negativas,
assim como as cabeças polares das micelas de SDS, apresentam densidade de carga negativa maior que em
vesículas 100% PG (Dathe et al., 2002 e 1996), que por sua vez terá maior densidade de carga que as
misturas PCPG e PCCL estudadas. Se a interação eletrostática é responsável pela ligação de MP1 às
bicamadas aniônicas, poderíamos esperar que vesículas contendo CL, que é quase duas vezes mais
negativamente carregada do que PG, deveriam favorecer a ligação do peptídio e com isso apresentar um
vazamento maior; porém, a presença de CL causa um efeito de estabilização em bicamadas PC (Schlame
et al., 2000), por induzir curvatura espontânea negativa em bicamadas (Allende et al., 2005), e agindo
contrariamente aos peptídios catiônicos que induzem curvatura positiva.
Isto explica porque as vesículas PCCL 7030 e PCCL 4060 requerem maiores concentrações de
MP1 - um peptídio com carga líquida relativamente baixa
- do que as membranas PC isoladamente ou a
mistura PCPG 7030 para induzir um vazamento expressivo. Nas vesículas PCCL 7030, onde MP1
apresenta eficiência de permeabilização semelhante à que ocorre em vesículas PCPG 7030, parece haver
uma certa compensação de efeitos entre maior interação eletrostática e um certo grau de curvatura
negativa; em PCCL 4060 o efeito da curvatura negativa prevalece. Em membranas de eucariotos que
contém colesterol, efeito similar de estabilização deve colaborar para que MP1 não apresente atividade
hemolítica; neste caso, porém, o efeito é devido a um aumento nos módulos de compressibilidade e de
flexão da bicamada provocados pela presença de colesterol (Allende et al., 2005).
Dados obtidos por Matsuzaki et al. (1996a), da atividade lítica de MP-X em vesículas PCPG 9505
e PCPG 7030, indicam forte preferência pelas vesículas mais densamente carregadas e maior eficiência de
permeabilização de MP-X nas vesículas PCPG7030 do que observamos com MP1. MP-X tem uma
concentração limite da ordem de 1:100 e produz 70% de vazamento em vesículas PCPG 7030 em 5
minutos de contato, na relação P/L = 0,025, num processo também cooperativo, enquanto MP1 inicia sua
fase rápida nessa concentração.
A presença de fosfolipídios negativamente carregados nas vesículas, como em PCPG 7030,
aumenta a interação de MP1 (Figura 20b e 21), verificada pelo aumento de vazamento em relação a
vesículas PC e, semelhantemente ao encontrado com MP-X (Matsuzaki et al., 1996a), confirmando a
importância das interações eletrostáticas. Porém, a presença da CL provavelmente obstruiu a inserção mais
profunda de MP-X nas vesículas que continham esse fosfolipídio aniônico (De Kroon, et al.1991), assim
como também encontramos que vesículas contendo CL apresentam menor vazamento que aquelas que
contém PG. Isto mostra que a eficiência de permeabilização depende tanto da presença de lipídios
negativamente carregados quanto da composição desses lipídios.
Resultados e Discussão
59
5.5 Anoplin (ANP)
É um dos menores peptídeos antimicrobianos naturais já encontrados. Trata-se de um decapeptídeo
cujo terminal-C é amidado, e foi isolado a partir do veneno da vespa
Anoplius samariensis
; apresenta
atividades antimicrobiana e de desgranulação de mastócitos, sem ser hemolítico (Konno et al., 2001).
Essas atividades biológicas são abolidas pela simples desamidação de seu terminal-C, que produz o
análogo denominado Anoplin-OH (ANP-OH, K. Konno, comunicação pessoal). Resultados anteriores
[Konno et al., 2001; Ifrah et al., 2005] sugeriram que a seqüência primária e provavelmente a estrutura
secundária adotada na interação com membranas biológicas são importantes para modular as atividades
biológicas.
Análise conformacional por Dicroísmo Circular
Anoplin-NH
2
apresenta espectros característicos de estruturas randômicas em água, tampão PBC
1 mM e Tris/borato pH 7,5, e em contato com vesículas zwitteriônicas (PC). Em ambientes aniônicos
como vesículas PCPG 7030 ou SDS abaixo e acima da concentração micelar crítica, e também em TFE
40%, seus espectros são característicos de estruturas secundárias helicoidais, com duas bandas dicróicas
em 208 e 222 nm, como mostrado na Figura 22a. O mesmo tipo de transição foi observado para Anoplin-
OH, porém apresentando teores de hélice-
α
um pouco inferiores (Figura 22b). Ambos peptídeos
apresentam menor ellipticidade em TFE 40% do que em SDS. A Tabela 9 apresenta um resumo desses
resultados e outros obtidos a 20
µ
M de peptídeo.
Figura 22: Espectros de CD de (a) Anoplin-NH
2
e (b) Anoplin-OH a 10
µ
M, em (
) água ou tampão Tris,
(
) TFE 40%, (
) SDS 165
µ
M, (
) SDS 8 mM; (
....
) 63
µ
M vesículas PC, (
) e 26
µ
M vesículas
PCPG 7030.
190
200
210
220
230
240
250
-15000
-10000
-5000
0
5000
10000
15000
20000
25000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
b
b
190
200
210
220
230
240
250
-15000
-10000
-5000
0
5000
10000
15000
20000
25000
λλ
(nm)
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
tampão Tris
26
µµ
M PCPG 7030
63
µµ
M PC
TFE 40%
SDS 165
µµ
M
SDS 8 mM
a
Resultados e Discussão
60
Diferenças de teor helicoidal de um mesmo peptídeo em função de diferentes solventes são
comuns na literatura (Zhong & Johnson, 1992; Waterhous & Johnson, 1994; Deber & Li, 1995; Park et al.,
1995; Blondelle et al., 1997). Isso indica uma estrutura flexível (Siligardi & Drake, 1995), que pode
interagir com uma maior variedade de membranas (Tossi et al., 2000); por outro lado, Pathak et al. (1995)
consideram que essas medidas não representam a estrutura secundária do peptídeo na membrana, mas
indicam a tendência relativa de um peptídeo em assumir uma conformação em hélice-
α
.
Tabela 9: Elipticidade molar ([
Θ
]
222
, deg cm
2
/dmol) em 222 nm e correspondente fração de hélice-
α
para
ANP-NH
2
e ANP-OH a 20
µ
M (
f
H
) e a 10
µ
M (
f
H10
), em diferentes ambientes.
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
[
Θ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
f
H
f
H10
[
Θ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
f
H
f
H10
Água -1209,69 rc rc -1548,57 rc rc
SDS 8 mM -13306,9 0,474 0,259 -10129,50 0,417 0,247
Tampão PBC -1137,92 rc - -1138,40 rc -
SDS 8 mM/tampão -8649,60 0,302 - -7762,81 0,315 -
TFE 40% - - 0,237 - - 0,113
PC -1195,88 rc rc -697,782 rc -
PCPG 7030 -8124,95 0,282 0,212 -7231,21 0,293 -
rc = estrutura randômica
Embora a razão entre as elipticidades observadas em 222 nm e 208 nm seja menor que 1,
sinalizando que nesses ambientes os peptídeos apresentam-se como monômeros (Blondelle et al., 1997),
encontramos diferentes teores de hélice-
α
dependendo da concentração de peptídeo em que as medidas
foram realizadas, o que poderia sugerir um processo de agregação. Devido ao pequeno comprimento de
Anoplin-NH
2
, sua atividade também poderia ser atribuída a um processo de agregação. Para verificar esse
aspecto, determinamos a variação da fração de hélice-
α
em função da concentração de SDS (Figura 23a) e
também em função da concentração de peptídeo (Figura 23b). A fração de hélice-
α
independe da
concentração de SDS acima da cmc. Também não foi detectada nenhuma dependência com a concentração
de peptídeo na presença isolada de tampão PBC, porém em solução tamponada de SDS 8 mM, existe uma
certa dependência para Anoplin-NH
2
, em concentrações inferiores a 20
µ
M. A adição de 150 mM de NaF,
juntamente com a solução tamponada de SDS, também não alterou esse perfil de dependência em relação à
concentração, e a fração helicoidal também não se alterou significativamente. Assim, assumimos que a
conformação helicoidal foi estabilizada nessas condições (Chuang et al., 1996) e que os peptídeos estão
presentes na forma monomérica (Blondelle et al., 1997; Deber & Li, 1995; Zhong & Johnson, 1992;
Marqusee et al., 1989) na faixa de concentração entre 20 a 100
µ
M nesses ambientes.
Quando verificamos a dependência da fração helicoidal com a concentração de peptídeo em
vesículas PCPG 7030, encontramos que na faixa entre 5 e 25
µ
M de Anoplin-NH
2
a dependência existe,
Resultados e Discussão
61
como indicado na Figura 23c. Curiosamente a 25
µ
M o peptídeo apresenta menor fração de hélice-
α
; isso
já havia sido observado para o peptídeo MP em vesículas PC (Schwarz & Blochmann, 1993). Esses
autores concluíram que a estabilidade da estrutura secundária dependia da força iônica do meio; Wieprecht
et al. (1997a) e Dathe et al. (2001) sugeriram, em situação semelhante, que o conjunto estrutural
lipídeo/peptído pode ter atingido um máximo em seu processo de ligação, ou ainda, que interações
eletrostáticas repulsivas passem a acontecer entre resíduos positivamente carregados, acima de uma
determinada concentração de peptídeo (Schwarz & Blochmann, 1993). Em qualquer caso, a
susceptibilidade da estrutura secundária de ANP-NH
2
e ANP-OH em relação às interações eletrostáticas
com o ambiente ficou demonstrada.
Análise da atividade lítica
A permeabilização de bicamadas induzida por Anoplin-NH
2
e Anoplin-OH foi investigada
acompanhando-se a liberação de CF contida em vesículas zwitteriônicas, PC, e aniônicas, PCPG (7030 e
4060) e PCCL (7030 e 4060). PG e CL foram usados para mimetizar as propriedades aniônicas das
membranas bacterianas, variando-se pela composição, a densidade de carga negativa da bicamada.
Anoplin-NH
2
(Figura 24a) e Anoplin-OH (Figura 24b) na concentração de 5
µ
M e com até 20
minutos de contato induziram menos de 10% de vazamento de CF de todas as vesículas aniônicas testadas.
0
20
40
60
80
100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
f
H
[Lip]/[Pep]
c
0
10
20
30
40
50
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0
20
40
60
80
100
a
f
H
concentação
SDS (mM)
b
[ Pep ] (
µµ
M)
Figure 23: (a) Dependência da fração de hélice
α
de Anoplin-NH
2
(
▲
) e de Anoplin-OH (
∆∆
) com a
concentração de SDS; (b) Dependência da fração de hélice-
α
com a concentração de Anoplin-NH
2
em tampão PBC, pH 7,5 (
■
) e em solução tamponada de SDS 8 mM (
●
) comparativamente a
Anoplin-OH em tampão (
) e em SDS (
❍
). (c) Dependência da fração de hélice
α
com a razão
molar entre as concentrações de lipídeo e peptídeo ([Lip]/[Pep]) para Anoplin- NH
2
a 10
µ
M (
■
),
20
µ
M (
▲
) e 25
µ
M (
▼
) em vesículas PCPG 7030.
Resultados e Discussão
62
Mesmo na concentração de 20
µ
M esses peptídeos não causaram maior permeabilização, para um tempo
de contato de 5 minutos. Nessa concentração e considerando-se um tempo de contato de 20 minutos,
ocorreu um incremento significativo. Entretanto, com exceção da cinética de interação com vesículas
PCPG 4060, das demais não é possível inferir que haja cooperatividade no processo ainda que o aumento
da concentração dos lipídeos aniônicos, PG ou CL, na composição das vesículas esteja diretamente
correlacionado ao aumento de vazamento.
Figura 24: % vazamento causado por (a) Anoplin-NH
2
e (b) Anoplin-OH em vesículas aniônicas em 5
minutos de contato (barras hachuradas) e 20 minutos (barras lisas).
A Figura 25 ilustra as cinéticas de vazamento de vesículas (a) PCPG 4060 e (b) PC de Anoplin-
NH
2
e Anoplin-OH. O perfil da cinética que se observa para ambos peptídeos a 5
µ
M em vesículas PCPG
4060 é o mesmo que se observa nas demais vesículas aniônicas, mesmo aumentando-se a concentração dos
peptídeos até 20
µ
M. Este comportamento não era esperado para Anoplin-NH
2
, um peptídeo
antimicrobiano, apesar do pequeno comprimento da sua cadeia. Porém, em 20
µ
M e com 20 minutos de
contato, condições menos rígidas do que as praticadas em testes de ação antimicrobiana, ambos peptídeos,
mas especialmente Anoplin-OH, apresentam uma cinética de vazamento diferenciada: esta
permeabilização da bicamada é comparável àquela de outros peptídeos antimicrobianos que possuem
maiores cadeias (dos Santos Cabrera et al., 2004; Matsuzaki et al., 1995b; DeGrado et al., 1982). Também
inesperado é o fato de que a forma carboxilada causou maior vazamento do que a forma amidada, pois
com outros peptídeos estudados, como EMP-AF, a forma amidada se apresentou mais eficiente. Em
vesículas PC, como ilustrado na Figura 25b, Anoplin-OH também provocou uma maior permeabilização.
0
5
10
15
20
% vazamento
concentração de peptídio (
µµ
M)
100
µ
M pcpg 7030
250
µ
M pccl 7030
120
µ
M pcpg 4060
150
µ
M pccl 4060
5
20
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
% vazamento
concentração de peptídio (
µµ
M)
b
5
20
Resultados e Discussão
63
De forma geral, ambos peptídeos causam vazamento igualmente pequeno, tanto em vesículas
zwitteriônicas como aniônicas, quando em baixa concentração; em maiores concentrações o vazamento é
correspondentemente maior, o que sugere um processo cooperativo, que no entanto não pode ser
confirmado, devido à mínima extensão do vazamento, como indicado no exemplo da Figura 26. É comum
na literatura associar vazamento de vesículas com a perturbação exercida pelo peptídeo na região central
da bicamada (Dathe et al., 2001); nesse sentido poderíamos considerar que ambos Anoplins interagem
minimamente com essa região.
Como a única diferença entre esses peptídeos é a natureza do terminal-C, a maioria de suas
características físico-químicas são as mesmas, e as diferenças na atividade biológica poderiam ser
atribuídas à diferença na carga líquida ou ao efeito do macrodipolo da hélice. O fato de Anoplin-NH
2
apresentar atividade antimicrobiana e de não termos observado expressivo vazamento nos diversos tipos de
vesículas testadas sugere que ele exerça sua atividade por um mecanismo não-lítico, onde a extensão das
interações hidrofóbicas é limitada. Dentre os peptídeos antimicrobianos de veneno de vespa estudados,
Anoplin é o único para o qual o mecanismo lítico não pode ser demonstrado.
0
5
10
15
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
a
% vazamento
tempo (minutos)
0
10
20
30
40
50
60
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
3,75
µµ
M
10
µµ
M
15
µµ
M
20
µµ
M
b
% vazamento
tempo (minutos)
Figura 25: (a) Cinética do vazamento de vesículas PCPG 4060 a 120
µ
M causado por 5
µ
M (em
preto) e 20
µ
M (em vermelho) de Anoplin-NH
2
(
■
) e Anoplin-OH (
▲
); (b) idem em 150
µ
M PC
para Anoplin-NH
2
(em preto) e Anoplin-OH (em vermelho). Desvio padrão <1% indicado para
ambos peptídeos na concentração de 20
µ
M.
Resultados e Discussão
64
0
5
10
15
20
25
30
0
1
2
3
4
5
6
7
8
% Vazamento após 15 min.
concentração de peptídio (
µµ
M)
Figura 26: Curvas de dose-resposta para Anoplin-NH
2
(
■
) e Anoplin-OH (
●
) após 15 minutos de
contato, em função da concentração de peptídeo, em vesículas PCPG 7030 a 90
µ
M.
Resultados e Discussão
65
5.6 Decoralin (DEC)
É um peptídeo de onze resíduos, que ocorre naturalmente na forma não amidada e é o principal
componente peptídico extraído do veneno da vespa solitária
Oreumenes decoratus
; possui atividade
antimicrobiana e de desgranulação de mastócitos, mas não é hemolítico. Sua seqüência primária apresenta
alta homologia em relação a Anoplin, praticamente conservando a seqüência dos últimos seis resíduos de
aminoácidos na região do terminal-C (Tabela 1). A amidação deste produz o análogo Decoralin-NH
2
(DEC-NH
2
) com atividade antimicrobiana aumentada e sem atividade hemolítica. Esses dados ainda não
foram submetidos à publicação e foram gentilmente cedidos pelo Dr. K. Konno do Instituto Butantan
(CAT-CEPID) .
Análise Conformacional por Dicroísmo Circular
As figuras 27a
, 27b e 28 apresentam os espectros de CD de ambos peptídeos, adquiridos a 8,5
µ
M.
Em água e em tampão Tris, pH 7,5 eles indicam estruturas desordenadas. Os ambientes anisotrópicos
como soluções de TFE, micelas de SDS e vesículas aniônicas de PCPG 7030 induziram em ambos
peptídeos duas bandas dicróicas negativas a 208 e 222 nm características de estrutura helicoidal. Porém,
em vesículas PC o espectro de ambos peptídeos se diferenciam: DEC-NH
2
apresenta as mesmas bandas,
mas com intensidade reduzida e o espectro de DEC é característico de estrutura aleatória.
Figura 27: Espectros de CD de Decoralin (a) e de Decoralin-NH
2
(b) a 8.5
µ
M, em (
) água, (
) TFE
40%, (
) SDS 165
µ
M, (
) SDS 8 mM.
A titulação de soluções de DEC-NH
2
na faixa de 0,1 a 30
µ
M com solução de SDS 8 mM mostrou
a existência de um ponto isodicróico ao redor de 203 nm (Figura 29a). Isto é indicativo de que o peptídeo
existe nesse meio em apenas dois estados, um helicoidal e o outro desordenado (Gans et al., 1991; Scholtz
190
200
210
220
230
240
250
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
a
190
200
210
220
230
240
250
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
b
Resultados e Discussão
66
et al., 1991). A independência entre elipticidade molar ([
Θ
222
]) em água e em SDS 8 mM (Figura 29b) em
relação à concentração de peptídeo indica que nessas condições ele apresenta-se na forma monomérica.
Figura 28: Espectros de CD de Decoralin e Decoralin-NH
2
a 8,5
µ
M, 25
o
C, em tampão (
—
) e na presença
de 63
µ
M PC para DEC (
) e DEC-NH
2
(
) e de 26
µ
M PCPG 7030 para DEC (
....
) e DEC-NH
2
( ).
190
200
210
220
230
240
250
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/dmol)
λλ
(nm)
190
200
210
220
230
240
250
-40
-20
0
20
40
60
80
a
cd (deg)
λλ
(nm)
0.1
µµ
M
1.2
µµ
M
3.0
µµ
M
6.0
µµ
M
10
µµ
M
15
µµ
M
20
µ
M
30
µ
M
0
5
10
15
20
25
30
35
-20000
-18000
-16000
-14000
-12000
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
[
ΘΘ
]
222
(deg cm
2
/ dmol)
concentração de peptídio (
µµ
M)
Figura 29: (a) Espectros de CD de DEC-NH
2
obtidos variando-se a concentração de peptídeo entre
0,1 e 30
µ
M e mostrando o ponto isodicróico em 203 nm. (b) Gráfico da elipticidade molar ([
Θ
222
])
em água (
●
) e em SDS 8 mM (
■
) em função da concentração, indicativo de que nessa faixa o
peptídeo apresenta-se monomérico.
Resultados e Discussão
67
Os valores das frações de hélice-
α
(
f
H
)
estimados para DEC e DEC-NH
2
nas diferentes condições
testadas estão apresentados na Tabela 10, em comparação a outros peptídeos de cadeia curta como ANP-
NH
2
, ANP-OH, EMP-AF2 e EMP-AF3. Independentemente do ambiente considerado, DECs apresentam
teores helicoidais significativamente maiores que os demais peptídeos. Para cada peptídeo este teor
depende do ambiente, e também da propensidade helicoidal individual dos resíduos. A maioria das escalas
de propensidade conhecidas, em TFE (Rohl & Baldwin, 1998), SDS micelar (Blondelle et al., 1997) e
vesículas aniônicas (Deber & Li, 1995), indica que todos os resíduos que compõem DEC, assim como os
demais peptídeos curtos, apresentam propensidade helicoidal aumentada nesses ambientes. Assim, o maior
teor helicoidal observado nesses meios, em relação ao tampão ou à água , poderia ser atribuído ao aumento
da propensidade helicoidal de cada resíduo e o mesmo aumento poderia ser esperado em condições
fisiológicas.
Tabela 10. Comparativo da fração de hélice
α
(
f
H
) de Decoralin e seu análogo, a 8,5
µ
M, com outros
peptídeos curtos a 10
µ
M, em diferentes condições.
f
H
TFE
1
SDS
2
PCPG
3
PC
4
DEC 0,385 0,500 0,453 rc
DEC-NH
2
0,593 0,650 0,570 0,154
ANP-NH
2
0,237 0,259 0,212 rc
ANP-OH 0,113 0,247 - -
EMP-AF2 0,143 0,097 0,136 rc
EMP-AF3 0,131 0,097 rc rc
1
40% TFE;
2
> 8.0 mM SDS;
3
P/L ratio = 1:2.6;
4
P/L ratio = 1:6.3.
No entanto, outros fatores devem ser também considerados. Primeiro, os efeitos atribuídos aos
terminais-N e -C, que seriam negligenciáveis em longos polipeptídeos, afetam substancialmente os
peptídeos menores (Scholtz et al., 1991). Este aspecto é mostrado na Tabela 10: a contribuição do
terminal-C amidado na estabilização da estrutura helicoidal. Também se observou nos estudos por RMN
com EMP-AF (Sforça et al., 2004) que a amidação do terminal-C forneceu uma ponte de hidrogênio
adicional entre o grupo amida e a carbonila da Leu 10, estabilizando a estrutura helicoidal. O aumento da
fração helicoidal observado em DEC-NH
2
em relação à forma carboxilada, em TFE, SDS e vesículas
PCPG parece ser consistente com um efeito semelhante na estabilidade.
Resultados e Discussão
68
Segundo, o macrodipolo da hélice: em EMP-AF2 e -AF3, há um resíduo Lys na posição 2,
próximo ao polo positivo do macrodipolo da hélice que contribui com um efeito de desestabilização da
hélice (Hol et al., 1978; Creighton, 1993; Shoemaker et al., 1985), enquanto nos Decoralins há um resíduo
polar, não carregado, Ser, na posição 1 favorecendo a estabilidade da hélice. De acordo com Deber & Li
(1995), estudos por RMN revelaram que Ser, um resíduo com efeito promotor de hélice junto ao terminal-
N (Rohl & Baldwin, 1998), estabiliza a conformação helicoidal de um peptídeo modelo por formar uma
ligação de hidrogênio com a cadeia lateral de um resíduo Glu, situado três posições à frente na direção do
terminal C. Um efeito semelhante é possível em Decs entre o resíduo Ser na posição inicial do terminal N
e o outro resíduo Ser da posição 4.
Terceiro, a posição relativa dos resíduos ao longo da seqüência, especialmente Ser e Thr, cujos
grupos hidroxila nas cadeias laterais também estão disponíveis para ligações de hidrogênio; observando-se
a projeção helicoidal de Dec (Figura 31), esses resíduos estariam na face hidrofílica, assim como os
resíduos positivamente carregados Lys e Arg,, favorecendo a estrutura anfipática do peptídeo e resultando
numa face polar com ângulo relativamente pequeno. O ângulo polar em ANP em meio não carregado
como TFE/água foi estimado por simulações de DM como sendo da ordem de 160
º
, praticamente o mesmo
observado na projeção da hélice ideal. A figura 30 indica que a hélice ideal de DEC poderia formar um
ângulo polar menor, da ordem de 100
o
.
Figura 30: Projeções helicoidais dos peptídeos DEC e ANP mostrando suas possíveis estruturas anfipáticas
e ângulos polares.
Para os Decoralins, cuja seqüência primária conta com 5 resíduos carregados ou polares, a maior
proporção de resíduos hidrofílicos entre os peptídeos estudados, o ambiente aniônico, de SDS ou vesículas
PCPG 7030, favorece a conformação em hélice-
α
, sugerindo que as interações eletrostáticas são
importantes na estabilização da estrutura secundária. Entretanto, observou-se que a fração helicoidal de
DEC-NH
2
em vesículas PC aumenta significativamente atingindo cerca de 43% em altas concentrações de
lipídeo (P/L=1:96), enquanto DEC e ANPs apresentam espectros característicos de estruturas aleatórias até
a relação P/L ao redor de 1:30. Este fato sugere que dentre os efeitos da amidação do terminal-C de DEC
DEC
ANP
Resultados e Discussão
69
há também uma redução de seletividade. Efeito semelhante da amidação foi observado com EMP-AF e
EMP-AF1 (Figura 5) e indicam a limitada ligação desses peptídeos às vesículas zwitteriônicas.
Embora exista alta homologia entre as seqüências primárias desses peptídeos de cadeia curta,
parece não haver correlação entre o número de cargas ou o comprimento da cadeia com o teor de hélice-
α
.
O fato de que em vesículas zwitteriônicas esses peptídeos, exceto DEC-NH
2
, apresentem-se
desestruturados correlaciona-se bem com a ausência de atividade hemolítica. Da mesma forma, o maior
teor helicoidal de DEC-NH
2
em relação a ANP-NH
2
e EMP-AF2 também correlaciona-se bem com sua
maior eficiência antimicrobiana.
Análise da atividade lítica
A permeabilização de membranas induzida pelos dois análagos, DEC e DEC-NH
2
foi investigada
em experimentos de liberação de CF a partir de vesículas zwitteriônicas PC e aniônicas com as seguintes
composições: PCPG 7030, PCPG 4060, PCCL 7030 e PCCL 4060 como mostra a Figura 31. Verifica-se
também para estes peptídeos de cadeia curta que existe uma dependência sigmoidal da atividade lítica em
função da concentração de peptídeo. Isto indica um processo cooperativo e sugere a existência de uma
concentração crítica de peptídeo na superfície da vesícula, necessária para induzir o vazamento.
Comportamento semelhante foi observado para outros mastoparanos (Matsuzaki et al., 1996a) e melitina
(Yang et al., 2001), assim como comportamentos pouco líticos foram observados para ANPs e EMP-AF2 e
-AF3.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
0
20
40
60
80
100
a
% vazamento após 5 minutos
concentração de peptídio (
µµ
M)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
0
20
40
60
80
100
b
% vazamento após 5 minutos
concentração de peptídio (
µµ
M)
Figura 31: Curvas de dose-resposta para (a) Decoralin (b) Decoralin-NH
2
em vesículas (
■
) PCPG 7030
90
µ
M, (
●
) PCPG 4060 117
µ
M, (
▲
) PCCL 7030 250
µ
M, (
▼
) PCCL 4060 150
µ
M e (
★
) PC 150
µ
M
(10 minutos).
Resultados e Discussão
70
Decoralins são bastante eficientes em baixas concentrações, sendo que a forma carboxilada é mais
seletiva para vesículas aniônicas mais densamente carregadas; em vesículas PC e PCPG 7030, DEC é
significativamente menos eficiente que DEC-NH
2
, porém em vesículas com maior densidade de carga
negativa esta situação se inverte. Esta mesma tendência foi observada com os peptídeos ANP-NH
2
e ANP-
OH em relação às vesículas PCPG7030 e PCPG4060. A eficiência desses peptídeos em induzir vazamento
é também fortemente dependente da composição das vesículas: naquelas onde o fosfolipídeo aniônico PG
foi substituído por CL a concentração limite para induzir vazamento tende a aumentar.
A Figura 32 mostra valores da constante de tempo,
τ
, resultado do ajuste das isotermas de
vazamento, pela equação 7, em vesículas aniônicas para ambos peptídeos e em vesículas zwitteriônicas
apenas para DEC-NH
2
, pois DEC é pouco lítico para esse tipo de vesícula. Quando o ajuste das isotermas
foi possível para diferentes razões P/L de um mesmo tipo de vesícula, os valores de
τ
, que são ligados à
taxa de formação de poros, mostraram-se mais sensíveis ao aumento da razão P/L do que o %V
max
,
semelhantemente ao já descrito para EMP-AF e para a série EM1~4. Ambos DECs interagem
preferencialmente com as vesículas PCPG4060 e PCCL7030, cujas densidades de carga negativa são
semelhantes. Novamente, considerando que a menor razão P/L associada ao menor valor de
τ
, indica a
maior eficiência de um peptídeo em permeabilizar um certo tipo de vesícula, observa-se na Figura 32 que
DEC é quase tão eficiente em vesículas PCPG4060 como em PCCL 7030, apesar de CL induzir curvatura
negativa em bicamadas lipídicas (Allende et al., 2005), enquanto a forma amidada é um pouco mais
eficiente na vesícula que contém PG.
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0
100
200
300
400
500
600
700
ττ
(s)
[ Pep ] / [ Lip ]
DEC
PCPG7030
PCPG4060
PCCL7030
PCCL4060
DEC-NH
2
PC
PCPG7030
PCPG4060
PCCL7030
PCCL4060
Figura 32: Gráfico da constante de tempo (
τ
) observada nos vazamentos induzidos por DEC (
■
) e DEC-
NH
2
(
●
), em vesículas PCPG 7030 (preto), PCPG4060 (vermelho), PCCL7030 (verde), PCCL4060
(azul) e PC (azul claro) e, símbolos cheios) em função da concentração P/L mínima em que as
respectivas curvas da cinética foram ajustadas.
Resultados e Discussão
71
A eficiência de permeabilização de vesículas aniônicas não está tão bem correlacionada às suas
atividades antimicrobianas, já que a forma amidada é bastante mais eficiente do que a forma nativa.
Comparativamente ao que ocorre com EMP-AF2, -AF3, ANP-NH
2
e ANP-OH, que induzem
menos de 10% de vazamento após 30 minutos de contato em condições semelhantes, ambas formas de
DEC induzem rápido e extenso vazamento em vesículas PCPG7030, como mostra a Figura 33. Em
vesículas PCPG4060, DEC apresenta maior vazamento, com a metade da concentração e DEC-NH
2
apresenta praticamente o mesmo vazamento percentual; ambos ANPs, mas especialmente a forma
carboxilada, também apresentam maior vazamento neste tipo de vesícula, ou seja as formas carboxiladas
de ANP e DEC apresentam maior seletividade pelas vesículas mais densamente carregadas do que os
análogos amidados. Dentre os peptídeos de cadeia curta estudados DECs são os que apresentam maior
atividade lítica, comparável a peptídeos de cadeia mais longa, como EMP-AF, Eumenitin e MP1. A
amidação do terminal-C, tornou DEC menos seletivo, embora mais eficiente como peptídeo
antimicrobiano.
Figura 33: Comparativo de vazamento induzido por peptídeos de cadeia curta em vesículas PCPG 7030, 90
µ
M, após 5 e após 20 minutos de contato. ANPs na concentração de 15
µ
M e os demais a 10
µ
M. Em
vermelho, vesículas PCPG4060 120
µ
M, 5 minutos de contato para DEC 5
µ
M (liso) e DEC-NH
2
10
µ
M
(hachurado em preto) e 20 minutos de contato para ANP e ANP-OH (hachurados em branco), ambos a 20
µ
M.
O alto grau de homologia entre as seqüências desses três peptídeos de cadeia curta, DEC, ANP e
EMP-AF2 contrasta com o conjunto das respectivas atividades lítica e biológica tão diferentes. Isso sugere
que a posição e/ou a proporção relativa entre resíduos apolares e polares seja um fator importante (Kiyota
et al., 1996; Deber & Li, 1995), além da carga líqüida, e mais do que a hidrofobicidade média.
Giangaspero et al. (2001) e Tossi et al. (2000) propuseram um padrão seqüencial para peptídeos
Resultados e Discussão
72
antimicrobianos lineares, baseado em observações de centenas de seqüências estudadas, onde os resíduos
indicados como H são hidrofóbicos, + são positivos, - são negativos, np são polares neutros, e X quando
nenhum tipo de resíduo predomina na posição:
Gly - H - H -
±±
/np - +/np - H - X/Gly -
±±
/np - X - H -
±±
/np - +/np - H - H/Gly - +/np - + - H - X –
A seqüência primária de DECs e ANPs (Tabela 1) acompanha esse padrão, enquanto a seqüência de EMP-
AF2 se afasta do modelo, o que condiz com o fato deste peptídeo não ser antimicrobiano. O baixo teor
helicoidal de EMP-AF2 e -AF3 em todos os ambientes testados deve ser principalmente atribuído à
desestabilização do macrodipolo da hélice causada pela distribuição das cargas.
Os três peptídeos apresentaram espectros de CD característicos da conformação helicoidal, em
maior ou menor grau, dependendo do ambiente mimético testado. Nestes as formas amidadas dos três
peptídeos apresentaram maior teor helioidal do que as respectivas formas carboxiladas, estando a
elipticidade bem correlacionada à atividade antimicrobiana. A eficiência de permeabilização de vesículas
aniônicas e zwitteriônicas pelos Decoralins também apresenta-se diretamente correlacionada ao teor
helicoidal nessas vesículas. Assim, modificações na atividade lítica e na seletividade causadas pela
amidação de DEC podem ser atribuídas a variações na afinidade com a bicamada.
Resultados e Discussão
73
5.7
Comentários Gerais
A análise das características conformacionais e da atividade lítica dos peptídeos deste estudo em
função de seus parâmetros físico-químicos indica algumas tendências importantes. A Tabela 11 resume as
características analisadas desses peptídeos e daqueles freqüentemente citados como referência; as Figuras
34a, b e c mostram as correlações encontradas entre esses parâmetros físico-químicos.
Tabela 11. Características estruturais e atividade biológica dos peptídeos. N, Q, <H>,
µ
,
Φ
,
f
H
, RMN /MD,
Hem., Gram+, Gram- e Refs. correspondem, respectivamente, a número de resíduos, carga líquida,
hidrofobicidade média, momento hidrofóbico, ângulo polar pela hélice ideal, fração de hélice-
α
determinada em SDS 8 mM, disponibilidade de dados estruturais por RMN ou Dinâmica Molecular,
atividade hemolítica, atividade antimicrobiana (
µ
M) contra bactérias Gram+ (
S. aureus
ATCC 6538) e
contra Gram- (E. coli ATCC 25922) e respectivas referências.
Peptídeos
N Q <H>
µµ ΦΦ
f
H
RMN /
DM
Hem. Gram+ Gram -
Refs.
Anoplin
10
+4 -0,113 0,366
166
o
0,474 sim não 43,4 17,4 1
Anoplin-OH
10
+3 -0,113 0,366 0,417 sim não >88 >88
Decoralin
11
+2 0,028 0,393 114
o
0,510 não 40,4 80,7
Decoralin-NH
2
11
+3 0,028 0,393 0,620 não 3,99 7,97
EM-1
14
+4 0,104 0,258 122
o
0,332 não 34 6,8
EM-2
14
+4 0,138 0,278 120
o
0,407 não 17 3,4
EM-3
14
+2 0,163 0,251 117
o
0,361 não >67 >67
EM-4
14
+2 0,149 0,238 116
o
0,539 não >67 >67
EMP-AF
14
+4 0,051 0,342
67
o
0,721 sim sim 3,3 33 2
EMP-AF1
14
+3 0,051 0,342 0,293 sim não 66,4 16,6 2
EMP-AF2
11
+4 0,009 0,423 0,097 não >85 >85 2
EMP-AF3
11
+3 0,009 0,423 0,065 não >86 >86 2
Eumenitin-OH
15
+3 0,002 0,265 143
o
0,500 não >60 6 3
MP-I
14
+2 -0,108 0,297
90
o
0,413 DM não 9,1 4,8 4
MP
14
+4 0,046 0,221 100
o
0,380 sim sim nd nd
MP-B
14
+5 -0,064 0,270 180
o
0,497*
sim sim nd nd
MP-X
14
+4 0,009 0,209
90
o
0,614*
sim sim nd nd
nd = não disponível; *em TFE 40% e 70% respectivamente; em negrito valores obtidos a partir de dados
de DM (Broggio Costa, S. T., 2006); Refs. (1) Konno, K. et al., 2001; (2) dos Santos Cabrera et al., 2004;
(3) vide Apêndice 8.2; (4) Souza et al., 2005.
A Figura 34a mostra uma limitada correlação entre o teor helicoidal e a hidrofobicidade média dos
peptídeos amidados, se excluirmos do grupo o EMP-AF2 e os EMP-EM1~4. Nesses peptídeos a posição 2
é ocupada por um resíduo carregado, positivo em EMP-AF2 e em EM1 e EM2, próximos do polo positivo
do macrodipolo da hélice. Nos peptídeos EM1~4 há ainda dois resíduos Gly, limitando a porção central da
Resultados e Discussão
74
cadeia peptídica. Essas características reconhecidamente interferem na elipticidade. Em TFE 40% se
observou a mesma tendência, com a mesma discrepância, porém para um teor helicoidal inferior de todos
os peptídeos analisados. Segundo Deber & Li (1995), o fato de se encontrarem as mesmas relações entre
teor helicoidal e hidrofobicidade em sistemas zwitteriônicos e aniônicos enfatiza a importância das
interações hidrofóbicas entre peptídeos e ambiente dirigindo a formação da hélice.
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
f
H
<H>
ANP
DEC-NH
2
EM1
EM2
EM3
EM4
EMP-AF
EMP-AF2
EUM
MP1
MP
MP-B
MP-X
a
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
µµ
<H>
ANP
DEC-NH
2
EM1
EM2
EM3
EM4
EMP-AF
EMP-AF2
EUM
MP1
MP
MP-B
MP-X
b
Resultados e Discussão
75
A Figura 34b mostra uma correlação inversa entre o momento hidrofóbico e a hidrofobicidade
média dos peptídeos amidados. Essa mesma tendência de redução de
µ
em função do aumento de <H> é
encontrada no gráfico de momento hidrofóbico de proteínas de membrana e de superfície, proposto por
Eisenberg et al. (1984).
Figura 34: (a) Gráfico da relação entre hidrofobicidade média e elipticidade em meio SDS 8 mM.
(b) Gráfico da relação entre hidrofobicidade média e momento hidrofóbico.
(c) Gráfico da relação entre elipticidade em meio SDS 8 mM e momento hidrofóbico.
Obs.: Os dados de elipticidade de MP-B e MP-X foram obtidos em misturas TFE/água.
A Figura 34c mostra a correlação entre momento hidrofóbico, uma medida da anfipaticidade do
peptídeo, e a fração helicoidal em SDS micelar; foram excluídos os peptídeos MP-B e MP-X para os quais
não dispomos da elipticidade nesse meio.
O ângulo polar dos peptídeos deste estudo foi estimado com base nas projeções das respectivas
hélices ideais, assumindo que 100% das cadeias laterais projetam-se perpendicularmente ao eixo da hélice
em intervalos regulares de 100
o
. Os valores em negrito na Tabela 11 foram obtidos em simulações por
Dinâmica Molecular em meio TFE 30% e em alguns casos são próximos daqueles obtidos pela projeção da
hélice ideal (Broggio Costa, 2006). No entanto, comparações entre ângulos polares de um mesmo peptídeo
(Anoplin) obtido em diferentes ambientes, tais como TFE 30% e SDS micelar, mostraram que a interação
das cargas positivas do peptídeo com as cabeças polares negativas de SDS podem causar reduções
significativas na dimensão da face polar.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,200
0,225
0,250
0,275
0,300
0,325
0,350
0,375
0,400
µµ
f
H
ANP
DEC-NH
2
EM1
EM2
EM3
EM4
EMP-AF
EUM
MP1
MP
c
Resultados e Discussão
76
O ajuste de várias curvas da cinética de vazamento de vesículas por um mesmo peptídeo mostrou
que
τ
é inversamente dependente da relação P/L, como mostra, por exemplo a Figura 15. A Figura 35
compara as constantes de tempo dos peptídeos, cujas cinéticas de vazamento foram ajustadas ao modelo
monoexponencial descrito pela equação 7, em função da razão molar entre as concentrações de peptídeo e
lipídeo PCPG7030 em que a curva da cinética foi obtida. Esse gráfico indica a eficiência relativa desses
peptídeos em induzir o vazamento nesse tipo de vesícula e correlaciona-se bem com os dados de atividade
antimicrobiana da Tabela 11. Peptídeos que não apresentam ação antimicrobiana apresentam maiores
relações P/L.
Figura 35: Gráfico da constante de tempo (
τ
) observada nos vazamentos induzidos pelos peptídeos líticos
em vesículas aniônicas, PCPG 7030, em função da concentração P/L mínima em que as respectivas curvas
da cinética foram ajustadas.
As Figuras 36a a f correlacionam as características físico-químicas e a atividade antimicrobiana à
constante de tempo (
τ
) multiplicada pela relação P/L em que a mesma constante foi obtida.
As correlações entre
τ
x P/L e hidrofobicidade (<H>) e entre
τ
x P/L e elipticidade (
f
H
) são diretas
(Figuras 36a e c), assim como já encontrado para
f
H
x <H> (Figura 34a). Novamente o conjunto dos
peptídeos EM1~4 não se correlacionam bem quando o parâmetro analisado é a elipticidade. O parâmetro
µ
correlaciona-se inversamente com
τ
x P/L (Figura 36b), da mesma forma como encontrado para
µ
x <H>
(Figura 34b). A Figura 36d sugere uma limitada correlação inversa entre o ângulo da face polar (
φ
) e
τ
x
P/L; entretanto, a literatura indica que quanto menor
φ
, maior a eficiência em permeabilizar vesículas
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0
100
200
300
400
500
600
τ τ
(s)
[Pep] / [Lip]
EM1
EM2
EM3
EM4
EUM
EMP-AF
DEC
DEC-NH
2
MP1
Resultados e Discussão
77
aniônicas (Dathe et al., 2002; Wieprecht et al., 1997b). Além disso, dados de RMN de Anoplin e
simulações de DM (dos Santos Cabrera et al., 2006, dados não publicados, vide Apêndice 8.3) mostraram
que o ângulo polar é dependente das interações eletrostáticas do peptídeo com o meio; por isso, sugerimos
que as correlações com o ângulo polar só possam ser adequadamente analisadas se baseadas em dados
estruturais como aqueles de RMN ou DM.
Figura 36: (a) Gráfico da correlação entre hidrofobicidade média (<H>)dos peptídeos (dados da Tabela 11)
e o produto
τ
x P/L. (b) idem entre momento hidrofóbico (
µ
) e
τ
x P/L.
10
20
30
40
50
60
70
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
<H>
ττ
x P/L
EM1
EM2
EM3
EM4
EUM
EMP-AF
DEC
DEC-NH
2
MP1
a
10
20
30
40
50
60
70
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
µµ
ττ
x P/L
EM1
EM2
EM3
EM4
EUM
EMP-AF
DEC
DEC-NH
2
MP1
b
Resultados e Discussão
78
Figura 36: (c) Gráfico da correlação entre fração de hélice-
α
(
f
H
) dos peptídeos (dados da Tabela 11) e o
produto
τ
x P/L. (d) idem entre ângulo da face polar (
φ
) e
τ
x P/L.
As Figuras 36e e f apresentam as correlações obtidas entre as MIC para bactérias Gram-positivas
(símbolos cheios) e Gram-negativas (símbolos vazados), conforme os dados da Tabela 11, e
τ
x P/L ou
µ
,
respectivamente. Com exceção de EMP-AF e Decoralins, todos os peptídios deste estudo apresentam
seletividade para bactérias Gram-negativas, porém os peptídeos MP1 e EM2, praticamente não apresentam
essa seletividade; observa-se que os menores valores de MIC correspondem também aos menores valores
de
τ
x P/L.
10
20
30
40
50
60
70
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
ττ
x P/L
f
H
EM1
EM2
EM3
EM4
EUM
EMP-AF
DEC
DEC-NH
2
MP1
c
10
20
30
40
50
60
70
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
φφ
ττ
x P/L
EM1
EM2
EM3
EM4
EUM
EMP-AF
DEC
DEC-NH
2
MP1
d
Resultados e Discussão
79
Figura 36: (e) Gráfico da correlação entre a concentração inibitória mínima (MIC) dos peptídeos para
bactérias Gram-positivas (símbolos cheios) e Gram-negativas (símbolos vazados), a partir dos dados da
Tabela 11, e o produto
τ
x P/L. (f) idem entre ângulo da face polar (
φ
) e o momento hidrofóbico (
µ
).
A Figura 36f sugere que a correlação entre MIC e o momento hidrofóbico,
µ
, seja direta ou inversa
dependendo se a bactéria seja Gram-positiva ou Gram-negativa, respectivamente. Os peptídeos pouco
seletivos, MP1 e EM2, situam-se, no gráfico, na região do cruzamento dessas duas tendências.
Comparando esta figura à Figura 35, observa-se que os peptídeos com ação antimicrobiana mais eficiente
pelos dados da Tabela10, são também aqueles em que
τ
corresponde aos menores valores da razão P/L.
0
10
20
30
40
50
60
70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
M I C (
µµ
M)
ττ
x P/L
EM1
EM2
EM3
EM4
EUM
EMP-AF
DEC
DEC-NH
2
MP1
■
Gram +
❑
Gram -
e
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0
10
20
30
40
50
60
■
Gram +
---
❑
---
Gram -
M I C (
µµ
M)
µµ
EM1
EM2
EUM
EMP-AF
DEC-NH
2
MP1
f
80
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS e CONCLUSÕES
6.1 Atividade lítica dos peptídeos antimicrobianos
Experimentos de vazamento de vesículas revelaram que os peptídeos com ação antimicrobiana
EMP-AF, Eumenitin, EM1, EM2, MP1 e Decoralins apresentam intensa atividade em membranas
modelo. Anoplin é exceção, um peptídeo antimicrobiano, pouco lítico apenas em concentrações
relativamente altas, em vesículas zwitteriônicas e aniônicas de diferentes composições. EM3 e EM4
também são exceções, pois são bastante ativos, mas desprovidos de ação antibacteriana. Apenas EMP-
AF apresenta alguma atividade hemolítica, mesmo assim todos, exceto Anoplin e DEC, causam
expressivo vazamento em vesículas zwitteriônicas PC. Apesar disso, todos eles interagem
preferencialmente com bicamadas aniônicas, em conseqüência de sua carga líquida positiva (Matsuzaki
et al., 1995a; Matsuzaki, 1998a). As menores razões limite P/L e as menores constantes de tempo,
τ
,
obtidas nos experimentos de vazamento, evidenciam essa seletividade (Tabelas 3 e 6; Figuras 15 e 20b).
A constante de tempo,
τ
, que está ligada à taxa de formação de poros, é inversamente dependente da
razão P/L e bastante sensível a pequenas variações desta. Entretanto, a constante %V
max
, ligada ao
número de poros abertos ou à sua condutância, varia bem menos e é menos susceptível às variações da
razão P/L. Isso sugere que quanto maior P/L, para um mesmo peptídeo e um mesmo tipo de vesícula,
poros semelhantes se formarão mais rapidamente, porém não permanecerão mais tempo abertos do que
aqueles formados em menores razões P/L. Entretanto, no caso da melitina, em vesículas PCPG 9010,
Matsuzaki et al. (1997b) encontraram que o tamanho do poro depende da razão P/L. Qualitativamente é
interessante notar que a atividade lítica acontece de modo cooperativo tanto em vesículas aniônicas
como nas zwitteriônicas e, em um processo predominantemente caracterizado pela equação 7, para
todos os peptídeos. Outras composições lipídicas aniônicas foram testadas, onde a densidade de carga
negativa foi aumentada, ou pelo aumento da proporção de PG ou pela substituição deste por CL. Com
exceção de DEC-NH
2
, verificou-se que o aumento da carga líquida reduz
τ
. Entretanto, as vesículas
contendo CL tiveram a razão P/L limite aumentada, indicando que as propriedades elásticas das
bicamadas também podem definir a seletividade.
Com exceção de Anoplin, todos os peptídeos que apresentam ação antimicrobiana apresentam
curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Isso
sugere que esses peptídeos se acumulam na superfície da vesícula até atingir uma concentração crítica,
além da qual o vazamento aumenta cooperativamente. A acumulação de peptídeo para induzir o
vazamento é uma característica importante do modelo proposto por Matsuzaki, Shai e Huang (MSH)
(Matsuzaki, 1999a; Oren & Shai, 1998; Huang, 2000; Chen et al., 2003) para explicar o mecanismo de
ação de peptídeos que formam poros.
81
De uma forma geral os peptídeos mais eficientes como antimicrobianos, pelos dados da Tabela
11, são também aqueles caracterizados pela maior eficiência em permeabilizar vesículas aniônicas do
tipo PCPG 7030 e por baixas razões limite P/L, verificadas nas curvas de dose-resposta, indicando que a
ruptura das bicamadas não poderia ser descrita pelo modelo carpete (Oren & Shai, 1998) de formação
de poro que se baseia no recobrimento da superfície da vesícula por moléculas de peptídeo. O modelo
barril foi comprovado para peptídeos com baixa carga positiva, como a alameticina (Bechinger, 1999) e
a gramicidina (Killian, 1992), e cujas cadeias são suficientes para atravessar a bicamada lipídica. Os
peptídeos do presente estudo apresentam alta densidade de carga positiva e possuem no máximo 15
resíduos, que mesmo em sua conformação mais estendida não são suficientemente longos. Assim, a
atividade lítica dos peptídeos deste estudo provavelmente acontece por um mecanismo semelhante ao
descrito no modelo do poro toroidal. A atividade hemolítica de alguns peptídeos tem sido atribuída à
interação com o centro hidrofóbico das bicamadas. Os peptídeos deste estudo não são hemolíticos ou
apresentam pequena atividade hemolítica, além disso são altamente catiônicos, o que não favorece sua
interação direta com as regiões hidrofóbicas. Por esses motivos é possível sugerir que os peptídeos
líticos e antimicrobianos estudados interagem preferencialmente com a região das cabeças dos
fosfolipídeos, formando poros cuja estrutura mista, lipídeo / peptídeo expõe os resíduos polares e
carregados ao solvente aquoso.
6.2 As mudanças conformacionais
Os peptídeos deste estudo são lineares e apresentam conformação aleatória em água e tampão
pH 7,5. Enquanto a fase aquosa desestabiliza a estrutura secundária por competir pela formação de
ligações de hidrogênio com a cadeia principal, a formação de hélices na interface água/membrana é
termodinamicamente favorecida. Em meios anisotrópicos que mimetizam membranas celulares tais
como, misturas TFE/água, soluções micelares de SDS e vesículas aniônicas eles estruturam-se em
hélice-
α
. Em vesículas zwitteriônicas, ANP, DEC, EMP-AF1~3 e EUM também apresentam
conformações aleatórias; em geral, peptídeos que são menos hidrofóbicos terão maior tendência em
particionar na fase aquosa, como indicado pela ausência de estrutura secundária em vesículas PC (Deber
& Li, 1995). Porém, outros fatores podem modular essa tendência, pois DEC-NH
2
e MP1 apresentam
um pequeno teor helicoidal em vesículas PC. Todos os peptídeos apresentaram maior teor helicoidal em
SDS do que em TFE; isto significa que as interações hidrofóbicas determinam a elipticidade, mas esta é
modulada pelas interações eletrostáticas proporcionadas pela polaridade do meio. A elipticidade
também é influenciada pela relação P/L, sugerindo que a afinidade entre peptídeo e lipídeo também
afeta a transição conformacional.
Embora não se observe nenhuma correlação geral entre carga líquida e elipticidade, os peptídeos
amidados apresentaram maior teor helicoidal que seus análogos carboxilados, sinalizando a influência
82
do macrodipolo da hélice. Além disso, não se observa uma correlação geral entre elipticidade e
atividade antimicrobiana, embora dentre os peptídeos de cadeia mais curta, com 10 a 11 resíduos, DEC-
NH
2
, o mais helicoidal, é também o mais ativo.
Por outro lado, os peptídeos mais eficientes na
permeabilização de vesículas e também como antimicrobianos são aqueles que apresentam
hidrofobicidade média negativa ou pouco positiva. Já a influência do momento hidrofóbico é mais
evidente na seletividade dos peptídeos em sua ação sobre bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas:
peptídeos mais seletivos para bactérias Gram+, são aqueles de maior momento hidrofóbico.
83
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Conformation and lytic
activity of eumenine
mastoparan: a new
antimicrobial peptide from
wasp venom
M.P. dos Santos Cabrera
B.M. de Souza
R. Fontana
K. Konno
M.S. Palma
W.F. de Azevedo Jr
J. Ruggiero Neto
Authors' affiliations:
M.P. dos Santos Cabrera, W.F. de Azevedo Jr and
J. Ruggiero Neto, Departmento de Fı
´
sica, Instituto
de Biocie
ˆ
ncias, Letras e Cie
ˆ
ncias Exatas, UNESP,
Sa˜o Jose
´
do Rio Preto, SP 15054-000, Brazil
B.M. de Souza and M.S. Palma, Centro de Estudos
de Insetos Sociais/Departamento of Biologia,
Instituto de Biocie
ˆ
ncias, UNESP, Rio Claro, SP
13560-000, Brazil; Institute for Immunological
Investigations (iii) – CNPq/MCT
R. Fontana, Universidade de Santa Cruz, Ilhe
´
us,
BA, Brazil
K. Konno, M.S. Palma, W.F. de Azevedo Jr and
J. Ruggiero Neto, Centro de Toxinologia Aplicada,
Instituto Butantan, Sa˜o Paulo, SP 05503-900,
Brazil
Correspondence to:
J. Ruggiero Neto
Departamento de Fı
´
sica
IBILCE-UNESP
15054-000 Sa˜o Jose
´
do Rio Preto (SP)
Brazil
Tel.: 55 17 221 2248
Fax: 55 17 221 2247
E-mail: [email protected]
Key words: amphiphilic helix; antimicrobial peptide; eumenine
mastoparan; membrane permeation; wasp venom
Abstract: Eumenine mastoparan-AF (EMP-AF) is a novel membrane
active tetradecapeptide recently isolated from the venom of
solitary wasp, Anterhynchium flavomarginatum micado. It was
reported previously that EMP-AF peptide presented low cytolytic
activities in human erythrocytes and in RBL-2H3 mast cells. In the
present work, we observed that this peptide is able to permeate
anionic liposomes, and in less extension also the neutral ones. We
present evidences showing that the permeation ability is well
correlated with the amount of helical conformation assumed by
the peptides in these environments. This peptide also showed a
broad-spectrum inhibitory activity against Gram-positive and
Gram-negative bacteria. The permeability of liposomes and the
antibiotic effect showed a significant reduction when C-terminus
was deamidated (in acidic form). The removal of the three first
amino acid residues from the N-terminus rendered the peptide
inactive both in liposomes and in bacteria. The results suggest that
the mechanism of action involves a threshold in the accumulation
of the peptide at level of cell membrane.
Abbreviations: CD, circular dichroism; CF, caroboxyfluoresceine;
CFU, colony forming units; CMC, critical micelle concentration;
EDTA, ethylenediaminetetracetic acid; ELISA, enzyme-linked
immunosorbent assay; EMP-AF, eumenine mastoparan –
Antherichium flavomarginatomicado; ESI-MS, electrospray
ionization mass spectrometry; Fmoc, N-9-fluorophenyl
metoxycarbonyl; LUV, Large unilamellar vesicle; MALDI-TOF-MS,
matrix assisted laser desorption ionization time of fly mass
spectrometry; MIC, minimum inhibitory concentration; MP,
mastoparan; MP-B, mastoparan B; MP-X, mastoparan X; PC,
phosphatidylcoline; PG, phosphatidylglycerol; SUV, small
unilamellar vesicle.
Dates:
Received 10 November 2003
Revised 23 December 2003
Accepted 29 April 2004
To cite this article:
dos Santos Cabrera, M.P., de Souza, B.M., Fontana, R.,
Konno, K., Palma, M.S., de Azevedo Jr , W.F., & Ruggiero
Neto, J. Conformation and lytic activity of eumenine
mastoparan: a new antimicrobial peptide from wasp
venom.
J. Peptide Res., 2004, 64, 95–103.
Copyright Blackwell Munksgaard, 2004
95
Introduction
Antimicrobial peptides are used for many organisms from
plants to mammals as part of their host defense systems
(1–6). The biological activity of these peptides is centered in
the lysis and permeation of the cell membrane and, as a
consequence, their molecular targets are the lipids con-
stituents of the cell membrane.
Different mechanisms are currently known to explain
the mechanism of action of antibacterial peptides: (i) in
the barrel-stave model peptide monomers associate and
form a bundle of helices embedded in the membrane,
forming a transmembrane channel ( 7,8); (ii) in the Ôcarpet-
likeÕ model the peptides act like detergents, forming
eventually toroidal pores (1,9). In both models the phys-
ico-chemical properties of peptides, such as: length, charge
distribution, net charge, volume, amphipathicity and
oligomeric state in solution, play essential roles in peptide
interactions with the membrane surface and/or with the
membrane core. These peptides can differ significantly in
their primary sequences, length and structures; they may
be linear, or cyclic because of the existence of disulfide
bridges. Some adopt an a-helical, b-sheet or even a com-
bination of both structures (10); despite this, most of these
peptides seem to adopt an amphiphatic arrangement, with
the hydrophobic and charged faces, arranged in opposite
positions, when in contact with the bacterial membrane.
Bacterial membrane presents the outermost leaflet rich in
negatively charged phospholipids, while the external sur-
face of animal cells are predominantly composed of neutral
phospholipid (5). Besides the zwitterionic lipids the animal
cells present high concentration of cholesterol, which acts
stabilizing the bilayer (1,11). The lipid composition of the
cell membranes has been shown to be of paramount
importance to determine the selectivity of peptide perme-
abilization activity. An important aspect of the antimicro-
bial peptides is the presence of positively charged residues
distributed along the peptide chain in order to generate an
amphipathic structure. The presence of these charged
groups generally renders the peptide more active against
bacteria. On the contrary, due to the unfavourable interac-
tion of these peptides with neutral bilayer added to the
stabilizing effect of the cholesterol present in these mem-
branes, most of these peptides are practically inactive in
mammal cells. However, some cationic peptides, produced
in general in sac venom of animals, such as mastoparan
(MP) and melittin have been shown to be active in both
types of membranes (6).
Eumenine mastoparan-AF (EMP-AF) is the main peptide
component of the venom extract from the solitary wasp,
Anterhynchium flavomarginatum micado (12). Like other
mastoparans, EMP-AF is a tetradecapeptide rich in hydro-
phobic and basic amino acids, presenting amidated C-ter-
minus. Three analogues, EMP-AF1, 2 and 3 were occasionally
isolated from the venom extract probably because of enzy-
matic action during storage of collected wasps and dissection
procedure. These analogues present either unprotected
C-terminus (EMP-AF1) or a removal of three first amino acid
residues in the N-terminus with amidated C-terminus
(EMP-AF2) or still unprotected C-terminus (EMP-AF3)(12).
Compared with MP, EMP-AF conserved the sequence of
the first three amino acid residues at N-terminal region,
while seven of 11 remaining amino acid residues are com-
mon (Fig. 1). The presence of three lysines and seven
hydrophobic residues suggest an amphiphilic nature for this
family of peptides, which was confirmed by their helical
wheel projection (12). MP and mastoparan X (MP-X) are
random coil in aqueous solution and adopt helical confor-
mation, like many other membrane-binding peptides do, in
presence of organic solvents, micelles or phospholipid ves-
icles (13,14). MP and mastoparan B (MP-B) present consid-
erable antimicrobial activity against Gram-positive
microorganisms (13 ) and enhance phospholipase A
2
activity
(15). Similar to other peptides extracted from animal ven-
oms, like melittin, they are haemolytic and stimulate his-
tamine secretion from mast cells (6).
Haemolytic and mast cell degranulation activities of
EMP-AF and its analogues were previously investigated by
using synthetic peptides (12). MP was 10 times more lytic
to human erythrocytes than EMP-AF, while EMP-AF ana-
logues showed virtually no haemolytic activity. A similar
behaviour was also observed for degranulation activity on
RBL-2H3 cells. Contrasting with this result, however, EMP-
AF and its analogues were shown to be very potent mast
cell degranulators on rat peritoneal mast cells.
These previous results have suggested that the primary
sequence and probably the secondary structure adopted at
Figure 1. Amino acid sequences of the eumenine mastoparan-AF
(EM-AF), its analogues EMP-AF1–3, mastoparan (MP), mastoparan B
(MP-B), and mastoparan X (MP-X).
Cabrera et al. Conformation and lytic activity of EMP-AF
96 J. Peptide Res. 64, 2004 / 95–103
level of biological membranes are very important to modu-
late their biological activities. In the present work, we have
correlated conformational analysis of EMP-AF and its ana-
logues both to dye leakage experiments from neutral and
charged vesicles and to antimicrobial activity, aiming to
understand the molecular mechanisms involved with their
biological activities. The conformational analysis of EMP-
AF and its analogues were carried out by circular dichroism
(CD) under different environments mimicking biological
membranes by using neutral and anionic vesicles.
Materials and Methods
Peptide synthesis and purification
The peptides were synthesized by stepwise manual solid-
phase synthesis using N-9-fluorophenylmethoxycarbonyl
(Fmoc) strategy. The crude products were purified by
reverse-phase high-performance liquid chromatography
(HPLC), and the homogeneity and sequence were accessed
by analytical HPLC and mass spectrometry (MALDI-TOF-
MS and ESI-MS).
Vesicle preparation
The l-a-phosphatidylcholine (PC) liposomes composed
respectively by PC and PCPG (70 : 30; 70% l-a-phosphat-
idylcholine and 30% l-a-phosphatidyl-dl-glycerol) have
been prepared. Phospholipids dissolved in chloroform have
been dried under N
2
flux on round bottom flasks. The lipid
film was completely dried under vacuum for at least 3 h and
afterwards hydrated with 1 mLTris buffer (Tris/H
3
BO
3
5 mm, 1 mm Na
2
EDTA, pH 7.5 for CD experiments or with
Tris/HCl 10 mm, 150 mm NaCl, 1 mm Na
2
EDTA, pH 7.5,
containing carboxyfluorescein (CF) 25 mm for fluorescence
experiments. In both preparations, the final lipid concentra-
tion was around 10 mm. The suspension was sonicated under
N
2
flux, in ice/water bath, for 25 min, to produce small
unilamellar vesicles (SUVs), necessary for the CD measure-
ments or, 5 min, to produce large unilamellar vesicles (LUVs)
used in dye release experiments. Titanium debris has been
removed by centrifugation. Dye-entrapped LUVs were sep-
arated from free dye by gel filtration on a Sephadex G25M
column. Finally they have been submitted to 11 times
extrusion through two stacked 0.2 lm polycarbonate filters.
All vesicles were used within 48 h of preparation. The lipid
concentration was determined by phosphorus analysis (16).
Circular dichroism measurements
The CD spectra were measured over the range of
190–250 nm, using a Jasco-710 spectropolarimeter (Tokyo,
Japan). The instrument was calibrated using d-10-
camphorsulfonic acid. Spectra were collected from 190 to
250 nm at 25 °C using cells with a path length of 0.5 cm,
and averaged over four scans. Data points were recorded at a
scan speed of 20 nm/min, bandwidth of 1.0 nm, 0.5 s
response and 0.1 nm resolution. Following baseline cor-
rection, the observed ellipticity, h (mdeg) was converted to
mean residue ellipticity [Q] (deg cm
2
/dmol), using the
relationship [Q] ¼ 100h/(lcn) where ÔlÕ is the path length in
centimetres, ÔcÕ is peptide millimolar concentration, and ÔnÕ
the number of residues in the peptide. Assuming a two-
state model the observed mean residue ellipticity at 222 nm
(H
obs
222
) was converted in a-helix fraction (f
H
) using the
method proposed by Rohl and Baldwin (17) and described
previously (18). Investigation of the binding mechanism of
EMP-AF and -AF1 has been carried out adding successive
amounts of vesicles to 10 lm peptide solution in Tris buf-
fer, ranging from 10 : 1 to 150 : 1 lipid to peptide (L/P)
molar ratio. The a-helix fractions measured at 222 nm have
been calculated as indicated above.
Dye leakage
A volume of fresh LUV suspension was injected into a cu-
vette containing magnetically stirred peptide solutions of
different concentrations to give final volume of 1.0 mL. CF
release from the vesicles was monitored at 520 nm (excited
at 490 nm) on a Hitachi Fluorometer F4500 (Tokyo, Japan) by
measuring the decrease in self-quenching at 25 °C. Percent-
age of dye leakage was determined after regular time inter-
vals, and calculated with the equation: %leakage ¼
100 · (F ) F
0
)/(F
100
) F
0
), where F is the observed fluores-
cence intensity, F
0
and F
100
corresponds to the fluorescence
intensities in the absence of peptides and to 100% leakage
was determined by the addition of 10 lLof10% Triton X-100.
Antimicrobial activity (determination of minimal inhibitory
concentration)
The microorganisms used were: Staphylococcus aureus
(ATCC 6538, ATCC 25923). Staphylococcus saprophyticus
(clinical species), Staphylococcus epidermidis (clinical spe-
cies), Bacillus subtilis (CCT 2471), Bacillus thuringiensis
Cabrera et al. Conformation and lytic activity of EMP-AF
J. Peptide Res. 64, 2004 / 95–103 97
(wild species), Acinetobacter sp. (wild species), Escherichia
coli (CCT 1371, ATCC 25922), Enterobacter cloacae (ATCC
23355), Pseudomonas mirabilis (clinical species), Pneumo-
neas aeruginosa (ATCC 15442), and Candida albicans
(UMP). Serial dilution of peptide was prepared in sterilized
water. Aliquots were placed in enzyme-linked immuno-
sorbent assay (ELISA) microplates containing Mu
¨
eler-
Hinton broth in a final volume of 200 lL. The mixture was
completed by inoculation of 10 lL of bacterial culture
growing in logarithmic-phase of microorganism as monit-
ored by the absorbance at 600 nm. The final cells number
(1 · 10
5
/mL) was determined by plate counting. The plates
were incubated at 35 °C and aliquots of 10 lL were removed
both at the beginning of assay and after overnight incuba-
tion, and then plated in Mu
¨
eler-Hinton agar. The number of
colony-forming units (CFU) was determined. The results
were expressed as inhibition percentage of CFU against a
control; this control was obtained in each situation by
counting the number of microorganisms introduced into the
plate in the absence of peptide.
Results
Conformational investigation: CD spectroscopy
The secondary structure of EMP-AF and analogues were
determined by CD spectroscopy. CD spectra of EMP-AF in
water or Tris buffer confirm an unordered conformation of
the peptides. In 40% trifluoroethanol (TFE), sodium dodecyl
sulphate (SDS) above the critical micelle concentration
(CMC) (approximately 8 mm) and liposomes, shown in the
Fig. 2A,B, the presence of two negative dichroic bands at
208 and 222 nm is consistent with the formation of a-helix.
The values of the a-helix fraction (f
H
) estimated for EMP-AF
and analogues in these conditions are presented in the
Table 1. These values show that f
H
of each peptide depend
on the environment and on the peptide length. The poten-
tial of the peptide to adopt helical conformation is
dependent on the individual helix propensity of the residues
and on the environment. Different scales of helical pro-
pensity have been measured in different environments: TFE
(17), micellar SDS (19) and anionic vesicles (20). Independ-
ently of the propensity scale used, all the residues compo-
sing EMP-AF and analogues (I, N, L, K, A, G and S), have
their helical propensity increased TFE, micellar SDS and
anionic vesicles. Even the low helix inductor serine and the
helix breaker glycine (21) have their helical propensities
strongly increased. In this way, the high helical fraction
observed in these environments, compared with buffer,
could be attributed to the increase in the residue helical
propensity.
190 200 210 220 230 240 250
–40
000
-20
000
0
20
000
40
000
60
000
[Θ]
222
(deg cm
2
/dmol)
[
Θ]
222
(deg cm
2
/dmol)
λ (nm)
λ (nm)
Water
40% TFE
165 µM SDS
8 mM SDS
190 200 210 220 230 240 250
–40
000
–20
000
0
20
000
40
000
60
000
80
000
Buffer
26.4µM PCPG 70:30
62.8µM PC
Figure 2. Circular dichroism (CD) spectra of the eumenine mastoparan-
AF (EMP-AF). Spectra were recorded with 10 lmof peptide at 25 °Cin
the following conditions: (A) aqueous buffer (——), in the presence of
40% trifluoroethanol (TFE; - - -) and in 165 lm sodium dodecyl sulphate
(SDS; ÁÁÁÁÁÁ)and10 mm SDS (-
Æ
-
Æ
-) below and above CMC. (B) In the
presence of (——) buffer, (ÁÁÁÁÁÁ) 26.4 lml-a-phosphatidylcholine/l-a-
phosphatidyl-dl-glycerol (PC/PG; 70 : 30)and(-
Æ
-
Æ
-
Æ
-
Æ
) 62.8 lm PC lipo-
somes.
Table 1. a-Helix fraction (f
H
) of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF)
and analogues in different conditions
TFE
a
SDS
b
PCPG
c
PC
d
EMP-AF 0.54 0.72 0.73 0.16
EMP-AF1 0.22 0.29 0.28 0.06
EMP-AF2 0.14 0.28 0.14 0.04
EMP-AF3 0.13 0.06 0.10 0.06
a. 40% trifluoroethanol (TFE).
b. >8.0 m
M sodium dodecyl sulphate (SDS).
c. P/L ratio ¼ 1 : 2.6; PCPG,
L-a-phosphat-
idylcholine and
L-a-phosphatidyl-DL-glycerol.
d. P/L ratio ¼ 1 : 6.3.
Cabrera et al. Conformation and lytic activity of EMP-AF
98 J. Peptide Res. 64, 2004 / 95–103
The values displayed in the Table 1, also, strongly sup-
port that the modifications in the wild-type peptide to
produce the three analogues have pronounced effect in the
helix fraction. The deamidation of the C-terminus of this
peptide giving rise to EMP-AF1, introduces a negative
charge in the negative pole of the helix macrodipole,
destabilizing the helical structure (22,23). The difference in
the helix fraction observed for EMP-AF and EMP-AF1 ,in
TFE and PC/PG vesicles seem to be consistent with this
destabilizing effect. The removal of three residues at the
N-terminus, forming the analogue EMP-AF2, decreases the
chain length and consequently the number of possible car-
bonyl to amide hydrogen bonds in the peptide backbone,
rendering the secondary structure less stable. Besides this
effect, the basic residue Lys5 is brought near to the positive
pole of the helix macrodipole that also presents a helix
destabilizing effect (22,23). Further, deamidation of this
analogue producing EMP-AF3 destabilizes the helix com-
pared with EMP-AF2 as exposed above. In this way, the
decrease in the a-helix fraction observed for the peptides
from EMP-AF through EMP-AF3 is compatible with the
helix destabilization effect induced by the unfavourable
interaction which occurs when a side chain electrical
charge interact with a pole of the helical macrodipole with
the same signal.
Table 1 also suggests that the electrostatic interaction
and the peptide length play important role in stabilizing the
helical conformation. In micellar SDS and anionic vesicles
the fractions of a-helix measured are well correlated with
these parameters. The importance of the electrostatic
interaction is more clearly observed when one compares the
amount of secondary structure for anionic and neutral
vesicles. Longer peptides in neutral vesicles were observed
to have only approximately 20% of the a-helix fraction
observed in anionic one, while for shorter analogues this
reduction is lessened. It was observed that the a-helix
fraction of EMP-AF in PC vesicles increases reaching 53%
at high lipid concentration (P/L ¼ 1 : 150). In this P/L
concentration ratio EMP-AF1 tends to maintain its low
helical level.
Leakage experiments
The membrane permeating activity induced by peptides
was investigated through the release of CF from PC and
PCPG LUVs. EMP-AF induced almost complete leakage in
anionic vesicles within 10 min at P/L 1 : 10. At the same
peptide concentration (10 lm), however, <50% CF was re-
leased from neutral (PC) liposomes. The higher lytic activ-
ity in anionic vesicles is in very good agreement with the
results obtained for MP-X (24) and for other cationic pep-
tides (25) Reducing EMP-AF concentration to 3.75 lm only
50% leakage was observed in PCPG vesicles while leakage
was drastically reduced (approximately 5%) in neutral ves-
icles. Below 30 min contact time, no significant differences
were observed for the shorter peptides interacting with the
two types of vesicles (data not shown). The efficiency of the
wild-type peptide to induce dye leakage from vesicles was
strongly dependent not only on the liposome surface charge
density but also on the peptide to lipid concentration ratio
(P/L). For longer peptides, the presence of the carboxyl
group in the C-terminus (EMP-AF1) strongly reduced the
efficiency of leakage for both types of liposomes. The effi-
ciency to leakage anionic liposomes is lower for EMP-AF2
and -AF3 than for EMP-AF1. Both shorter peptides almost
did not induce dye release from zwitterionic liposomes. For
these shorter peptides the deamidation of the C-terminus
seem to have a minor importance for the lytic activity in
vesicles.
We have found a sigmoidal concentration dependence for
the dye leakage activity of EMP-AF as shown in Fig. 3A,B.
This behaviour was observed for both types of vesicles (PC
and PCPG). The sigmoidal dependence indicates a cooper-
ative process and suggests the existence of a critical peptide
concentration in the vesicle surface to induce leakage.
Similar behaviour was observed for MPs (24) and other pore-
forming peptides such as melittin (26). A nonsigmoidal
0
46810121416
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Leakage (%)
Peptide concentration (µM)
Figure 3. Leakage of the fluorescent probe carboxyfluore scein from (A)
l-a-phosphatidylcholine (PC) and (B) PC/l-a-phosphatidyl-dl-glycerol
(PG) (7 : 3, w/w) liposomes induced by eumenine mastoparan-AF (EMP-
AF). Percentage leakage was plotted within
5,
•
15 and 25 min.
Lipid concentration 100 lm.
Cabrera et al. Conformation and lytic activity of EMP-AF
J. Peptide Res. 64, 2004 / 95–103 99
dose–response curve was observed for EMP-AF3 in PCPG
vesicles. The leakage efficiency of this peptide decreases
with the increase in the peptide concentration as shown in
Fig. 4. At the higher peptide concentration almost no
leakage was observed when compared with EMP-AF. It is
remarkable that the leakage efficiency in both types of
liposomes is well correlated with the a-helix fraction of the
peptide in the vesicles.
Antimicrobial activities
The antimicrobial activities of EMP-AF and its analogues
are summarized in Table 2. EMP-AF is far more effective
against most types of bacteria than EMP-AF1–3 either on
Gram-positive bacterial strains or on Gram-negative one.
These experiments showed that the potency of EMP-AF is
higher for Gram-positive bacteria, in good agreement with
the results obtained for MP (27). It can also be seen that
EMP-AF1 (same chain length, carboxylated C-terminus)
shows significantly lower bactericidal action than the
amidated C-terminus, EMP-AF as also observed for other
deamidated peptides ( 28,29). The shorter peptides EMP-AF2
and -AF3 present only a marginal antimicrobial activity,
independent of the nature of their C-terminus.
Discussion
The CD spectra of EMP-AF in an environment mimicking
the hydrophobicity and anisotropy of a bilayer are charac-
teristic of helical conformation. This was observed for mi-
cellar SDS and also for vesicles. The amount of helical
0246810121416
0
20
40
60
80
100
Leakage (%)
Peptide concentration (µM)
0
0246810
20
40
60
80
100
Leakage (%)
Peptide concentration (µM)
Figure 4. Leakage of the fluorescent probe carboxyfluorescein from
l-a-phosphatidylcholine/l-a-phosphatidyl- dl-glycerol (PC/PG; 7 : 3,
w/w) liposomes induced by eumenine mastoparan-AF (EMP-AF).
Percentage leakage was plotted within 5, • 15 and 25 min. Lipid
concentration 100 lm.
Table 2. Antimicrobial activity of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF) and its analogues, minimal inhibitory concentration (MIC)
Microorganism
MIC (lg/mL)
EMP-AF EMP-AF1 EMP-AF2 EMP-AF3
Staphylococcus aureus ATCC 6538 5 100 >100 >100
Staphylococcus aureus ATCC 25923 – 10 >100 >100
Staphylococcus saprophyticus (CS) 5 25 >100 >100
Staphylococcus epidermidis (CS) 5 50 >100 >100
Staphylococcus subtilis CCT 2471 40 100 >100 >100
Escherichia coli CCT 1371 20 50 >100 >100
Escherichia coli ATCC 25922 50 25 >100 >100
Pseudomonas aerugisosa ATCC 15442 20 100 >100 >100
Candida albicans – >100 >100 >100
Cabrera et al. Conformation and lytic activity of EMP-AF
100 J. Peptide Res. 64, 2004 / 95–103
conformation was observed to be dependent on the presence
of charged groups both in SDS and in PC/PG vesicles, as
observed for other cationic peptides ( 25,30), emphasizing
the importance of the electrostatic interactions besides the
hydrophobic contacts. In these environments, the helical
propensities of the residues that compose the peptides are
higher than in buffer increasing the helical content of the
peptides (19,20,30). However, the comparison of the f
H
for
the four peptides studied, for a given medium, suggests that,
besides the electrostatic interaction, the state of the C-ter-
minal is very important for both the helix stability and the
lytic activity of the peptides. The presence of a negative
charge in the negative pole of the helix macro-dipole,
because of deamidation, as well as the presence of the Lys5 ,
as a result of the removal of three residues, near its positive
pole destabilize the helix in TFE and in the anionic envi-
ronment studied. In addition to the effect of helical macro-
dipole, it is noteworthy that protection of the C-terminus
showed to have another stabilizing effect on the helical
conformation because of an extra hydrogen bonding
between the amide group and L13 carbonyl in the peptide
backbone as was observed from the nuclear magnetic res-
onance (NMR) structure (31). The absence of charged head
group in lipid bilayer, however, seems to be more important
than the helical propensity and helix macro-dipole effect to
determine the a-helix fraction in neutral liposomes. The
helical conformation in zwitterionic vesicles is only
achieved in higher lipid to peptide ratio (150 : 1), indicating
that EMP-AF presents lower binding affinity to neutral than
to anionic vesicles. This behaviour is similar to other cat-
ionic peptides (32–34).
In this way, the lower helical fraction of EMP-AF in PC
vesicles is related to the lower affinity to this vesicles be-
cause of the absence of electrostatic interaction between
the peptide and the phospholipid bilayer. The helical frac-
tion for EMP-AF2 and -AF3 in TFE is similar to that ob-
served for EMP-AF in PC vesicles, however, this lower f
H
in
TFE for shorter peptides would be attributed to the chain
length and to the effects of helix macro-dipole in destabil-
izing the helical conformation.
The permeating efficiency of the peptides studied in
anionic and neutral liposomes are well correlated with their
helical content in these vesicles. The dose–response curves
for EMP-AF in neutral vesicles (Fig. 3A,B) showed that the
percentage of dye leakage induced by EMP-AF presents a
sigmoidal dependence on the peptide concentration. This
dependence of the dose–response curve suggests that the
peptides accumulate in the vesicle till to achieve a crit-
ical concentration beyond which the leakage increases
cooperatively. The peptide accumulation to induce leakage
has been shown to be an important aspect in the current
model proposed by Matsuzaki, Shai and Huang (MSH)
(1, 7–9) to explain the mechanism of action of the pore-
forming antimicrobial peptides.
The dose–response curve for shorter peptide, EMP-AF3,
even in anionic vesicles, Fig. 4, shows that the increase in
peptide concentration leads to the reduction in the perme-
ating activity in vesicles, in opposition to that observed for
EMP-AF. It is remarkable that although the leakage ob-
served in the Fig. 4 is very low it is higher than the
experimental error (approximately 2% averaged from three
measurements). Thus, the tendency to reduce the leakage
to zero, when the peptide concentration is increased to
15 lm, indicates the absence of a sigmoidal dose–response
curve. This behaviour suggests that for shorter peptides, at
least in the same concentration range used for EMP-AF,
there is no peptide accumulation in vesicle surface or that if
it takes place it should be nonlytic.
It is noteworthy that the cooperative leakage processes
in liposomes were observed for peptides with high helical
contents in these vesicles. This found reinforces the cor-
relation between helical conformation and the lytic
activity and evidence its importance on the mechanism of
action of these peptides. Thus, the higher helical content
in anionic vesicles and the higher efficiency to leakage
these vesicles observed for EMP-AF were well correlated
with its antimicrobial activity. The reduced haemolytic
activity of this peptide (12) is also well correlated with its
lower preference for neutral vesicles. Interestingly, in spite
of the presence of charged lipopolysaccharides in the bac-
terial wall and sialic acid content glycoprotein in eryth-
rocytes, it was observed a good correlation between lytic
activity in membrane models and in biological cells.
Deamidation of the C-terminus (EMP-AF1) reduces its
antimicrobial potency while the haemolytic activity is
suppressed (12) in good agreement with the lytic and
helical content in zwitterionic vesicles.
The shorter analogues EMP-AF2 and -AF3 were virtually
inactive in human erythrocytes, in RBL-2H 3 mast cell and
in bacteria. These observations are well correlated with its
lower helical content in both anionic and zwitterionic
vesicles and also to its reduced leakage efficiency displaying
a nonsigmoidal dose–response curve.
The EMP-AF and EMP-AF1 present lower haemolytic
activity than MP in human erythrocytes as well as lower
degranulating activity in RBL-2H3 cells (12). In contrast
EMP-AF, its deamidated analogue and MP present similar
potency in rat peritoneal mast cell. The selectivity to these
Cabrera et al. Conformation and lytic activity of EMP-AF
J. Peptide Res. 64, 2004 / 95–103 101
cells could be due to its lipid composition. It was observed
that some peptides are selective for erythrocytes of different
species as reported by Huang et al.(7). However, if the lipid
constituents of cell membrane for these mast cells were not
different, the increased activity in rat peritoneal mast cell
could be attributed to the presence of a specific receptor in
these cells (35–38).
Acknowledgements: Authors are grateful to Prof. Iolanda Cucco-
via (Chemistry Institute, University of Sa
˜
o Paulo) for her personal
help with all matters related to liposomes preparation and analy-
sis. WFA (CNPq, 300851/98-7) and MSP (CNPq, 500079/90-0) are
researchers for the Brazilian Council for Scientific and Technolo-
gical Development. This work was supported in part by CAPES,
FAPESP Brazilian agencies and CAT-CEPID.
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Eumenitin, a novel antimicrobial peptide from the venom
of the solitary eumenine wasp Eumenes rubronotatus
Katsuhiro Konno
a,
*
, Miki Hisada
b
, Hideo Naoki
c
, Yasuhiro Itagaki
d
,
Renato Fontana
e
, Marisa Rangel
a
, Joacir Stolarz Oliveira
a
,
Marcia Perez dos Santos Cabrera
f
, Joa˜ o Ruggiero Neto
a,f
, Izumi Hide
g
,
Yoshihiro Nakata
g
, Tadashi Yasuhara
h
, Terumi Nakajima
i
a
Center for Applied Toxinology, Butantan Institute, Sa
˜
o Paulo, SP 05503-900, Brazil
b
Suntory Institute for Bioorganic Research, Shimamoto, Osaka 618-8503, Japan
c
Tropical Technology Center Ltd., Gushikawa, Okinawa 904-2234, Japan
d
Department of Chemistry, Columbia University, New York, NY 10027, USA
e
Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz, Ilhe
´
us, BA 45650-000, Brazil
f
Department of Physics, Institute of Biosciences, Letters, and Exact Sciences, Sa
˜
o Paulo State University Sa
˜
o Jose
´
do Rio Preto,
SP 15054-000, Brazil
g
Department of Pharmacology, Graduate School of Biomedical Sciences, Hiroshima University, Hiroshima 734-8553, Japan
h
Department of Nutrition, Junior College of Agriculture, Tokyo University of Agriculture, Setagaya, Tokyo 156-8502, Japan
i
Hoshi University, Shinagawa, Tokyo 142-8501, Japan
peptides xxx (2006) xxx–xxx
article info
Article history:
Received 19 July 2005
Received in revised form
8 April 2006
Accepted 19 April 2006
Keywords:
Eumenitin
Solitary wasp venom
Antimicrobial peptide
Cationic linear a-helical peptide
Amphipathic a-helix structure
Abbreviations:
MALDI-TOF MS, matrix assisted
laser desorption/ionization time-
of-flight mass spectrometry
CPY, carboxypeptidase Y
APM, aminopeptidase M
PSD, post-source decay
abstract
A novel antimicrobial peptide, eumenitin, was isolated from the venom of the solitary
eumenine wasp Eumenes rubronotatus. The sequence of eumenitin, Leu–Asn–Leu–Lys–Gly–
Ile–Phe–Lys–Lys–Val–Ala–Ser–Leu–Leu–Thr, was mostly analyzed by mass spectrometry
together with Edman degradation, and corroborated by solid-phase synthesis. This peptide
has characteristic features of cationic linear a-helical antimicrobial peptides, and therefore,
can be predicted to adopt an amphipathic a-helix secondary structure. In fact, the CD
spectra of eumenitin in the presence of TFE or SDS showed a high content of a-helical
conformation. Eumenitin exhibited inhibitory activity against both Gram-positive and
Gram-negative bacteria, and moderately stimulated degranulation from the rat peritoneal
mast cells and the RBL-2H3 cells, but showed no hemolytic activity against human ery-
throcytes. This antimicrobial peptide in the eumenine wasp venom may play a role in
preventing potential infection by microorganisms during prey consumption by their larvae.
# 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
* Corresponding author. Tel.: +55 11 3726 1024; fax: +55 11 3726 1024.
E-mail address: kk-gon@butantan.gov.br (K. Konno).
available at www.sciencedirect.com
journal homepage: www.elsevier.com/locate/peptides
0196-9781/$ – see front matter # 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.peptides.2006.04.013
PEP-66774; No of Pages 8
1. Introduction
Antimicrobial peptides are widely found in plants, insects,
amphibians and mammals, playing an important role in
innate immune systems and host defense mechanisms. They
have attracted much attention as a novel class of antibiotics,
in particular for antibiotic-resistant pathogens, because of
their action mechanism of non-selective interaction with cell
surface membranes of microbes [1,2,7,27]. In most cases,
antimicrobial peptides are produced when challenged by
microbes, but recent studies demonstrated that they are also
contained in arthropod venoms, and may play a role for
preventing potential infection [15,24].
We have recently surveyed bioactive substances in
sol itary wasp venom, in particular neurotoxins, because
the venom is used for paralyzi ng their preys. As a conse-
quence, we i ndeed isolated novel peptide neurotoxins
[10,11,14], but also f ound antimicrobial peptides. Anoplin,
the first antimicrobial peptide to be found in solitary wasp
venom, was isolated from the Anoplius samariensis venom and
showed both antimicrobial and mast cell degranulating
activity [13]. This peptide is the smallest among the linear
a-helical antimicrobial peptides ever found in natural
sources, composed of 10 amino acids with amphiphi lic
property. Eumenine mastoparan-AF (EMP-AF) is a mast cell
degranulating peptid e isolated from the venom of the
eumenine wasp Anterhynchium flavomarginatum micado [12].
This peptide belongs to the mastoparan family of cytolytic
peptides found in various social wasp venoms, and shows
als o potent antibacterial activity [21]. Thus, our recent studies
indicated that solitary wasp venoms may be a rich source of
bioactive peptides, peptid e neurotoxi ns and an timicrobial
peptides, as well as oth er arthropod venoms.
A further survey of solitary wasp venom components led to
the isolation of another linear a-helical antimicrobial peptide
designated eumenitin from the venom of the eumenine wasp
Eumenes rubronotatus. Reported herein are the isolation,
structural analysis including the secondary structure by
circular dichroism (CD), lytic activity by dye leakage from
vesicles and biological activities of eumenitin.
2. Materials and methods
2.1. Purification
Female wasps of Eumenes rubronotatus were collected at
Sagamiko, Ibaraki, and Kyoto in Japan. The collected speci-
mens were immediately frozen by dry ice and kept at À75 8C
until use. The venom sacs were dissected immediately after
thawed and lyophilized.
Forty five lyophilized venom sacs were extracted (5 Â 1ml)
with 1:1 acetonitrile–water containing 0.1% TFA (CH
3
CN/H
2
O/
0.1% TFA) and the extracts were subjected to reverse-phase
HPLC (Waters Associates, Milford, MA, USA) using CAPCELL
PAK C
18
,10Â 250 mm (SHISEIDO Co., Ltd., Tokyo, Japan) with
linear gradient from 5% to 95% CH
3
CN/H
2
O/0.1% TFA at a flow
rate of 2.5 ml/min over 30 min (Fig. 1A) to give eumenitin
eluted at 21.5 min.
2.2. Mass spectrometry
All mass spectra were acquired on a Voyager Elite MALDI-
TOFMS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) equipped
with a delayed extraction source and 337 nm pulsed nitrogen
peptides xxx (2006) xxx–xxx2
CID, collision-induced dissociation
CD, circular dichroism
TFE, trifluoroethanol
SDS, sodium dodecylsulfate
HEPES, (N-[2-hydroxyethyl]
piperazine-N
0
-[2-ethanesulfdonic
acid]
PBS, phosphate buffered saline
Fig. 1 – (A) Fractionation of venom extracts of Eumenes
rubronotatus by reverse-phase HPLC using CAPCELL PAK
C
18
(10 Â 250 mm) with linear gradient of 5–95% CH
3
CN/
H
2
O/0.1% TFA over 30 min at flow rate of 2.5 ml/min. UV
absorption was monitored at 215 nm. (B) The MALDI-TOF
MS of eumenitin obtained from the major peak at 21.5 min
in Fig. 1A.
laser. The accelerating voltage was 20 kV. Argon gas was used
for the CID/PSD experiment. A Matrix, a-cyano-4-hydroxy-
cinnamic acid (Aldrich) was prepared at a concentration of
10 mg/ml in 1:1 CH
3
CN/0.1%TFA. The sample (0.5 ml) dropped
onto the MALDI sample plate was added to the matrix (0.5 ml)
and allowed to dry at room temperature. The instrument was
externally calibrated on a mixture of des–Arg
1
–bradykinin (m/z
904.47, monoisotopic) and hACTH 18–39 ( m/z 2465.29, mono-
isotopic; 2466.71, average).
2.3. Amino acid sequencing
On-plate exopeptidase digestion was applied for peptide
ladder sequencing. Carboxypeptidase Y (CPY, pH 6.0, Sequa-
zyme kit from Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was
used for C-terminal sequencing, and N-terminal sequencing
was performed by using aminopeptidase M (APM, pH 7.5,
2.5 mg/ml from Boehringer–Mannheim, Indianapolis, IN).
An aqueous solution of peptide (0.5 ml) and an enzyme
(0.5 ml) were mixed on the sample plate, and after 7 min
incubation at room temperature, a matrix solution (0.5 mlof
saturated solution of a-cyano-4-hydroxy cinnamic acid in 1:
1CH
3
CN/H
2
O/0.1% TFA) was added and air dried for MALDI-
TOF MS analysis.
Automated Edman degradation was performed by a gas-
phase protein sequencer PPSQ-10 (Shimadzu Corp., Kyoto,
Japan).
2.4. Peptide synthesis
Peptide was synthesized by stepwise solid-phase method using
N-9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) chemistry with Fmoc-
Thr(tBu)-NovaSyn
1
TGA resin (Nova Biochem.) on a Shimadzu
PSSM-8 peptide synthesizer (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). All
Fmoc-L-amino acids were purchased from Nova Biochem. The
side chain protective groups were tert-butyloxycarbonyl (t-Boc)
for Lys, trityl (Trt) for Asn, and tert-butyl (t-Bu) for Ser and Thr.
Cleavage of the peptide from the resin was achieved by
treatment with a mixture of TFA/anisole/1,2-ethanedithiol
(94:5:1, by volume) using 10 ml/g resin at room temperature
for2 h.After removal of theresinby filtrationand washingtwice
with TFA, the combined filtrate was added dropwise to diethyl
ether at 0 8C and then centrifuged at 3000 rpm for 10 min. Thus
obtained crude synthetic peptide was purified by semiprepara-
tive reverse-phase HPLC using CAPCELL PAK C
18
,10Â 250 mm
with isocratic elution of 40% CH
3
CN/H
2
O/0.1% TFA at a flow
rate of 2.5 ml/min. The homogeneity and the sequence
was confirmed by MALDI-TOF MS. The HPLC elution profile of
the synthetic peptide was identical with that of the natural
peptide.
2.5. Vesicle preparation
Lipids: L-a-phosphatidylcholine (PC) and L-a-phosphatidyl-DL-
glycerol (PG) and carboxyfluorescein (CF) were purchased from
Sigma–Aldrich Co (S. Louis, MO); 2,2,2, trifluoroethanol (TFE),
tris(hydroxymethyl)amino-methane (Tris) and triton X-100
from Merck (Darmstadt, Germany) and SDS and PD-10
disposable columns from Pharmacia Fine Chem. (Upsalla,
Sweden). Water used was deionized and quartz distilled.
LUVs, large unilamellar vesicles, and SUVs, small unilamel-
larvesicles, eithermade of PC(100%phosphatidylcholine)orPC/
PG 70:30 (70% phosphatidylcholine and 30% phosphatidyl-
DL-
glycerol) were prepared as previously described [21]. Briefly, dry
lipid films have been hydrated with 1 ml Tris buffer (Tris/H
3
BO
3
5mM,1mMNa
2
EDTA, pH 7.5 in CD experiments or Tris/HCl
10 mM,1 mMEDTA, 0.025 M CF inleakageexperiments)to givea
final lipid concentration below 10 mM. After vortex mixing to
produce multilamelar vesicles (MLVs), the mixtures were
sonicated using a titanium tip sonicator (Virsonic Sonicator
475, Virtis Co, NY) under N
2
flux, in ice/water bath for 50 min, to
produce SUVs for CD measurements, or 5 min to produce LUVs
for leakage experiments. Titanium debris have been removed
by centrifugation (Eppendorf table centrifuge, 5 min,
13,900 rpm). SUVs were used as obtained within the same
day. LUVs were further extruded through two stacked 0.2 mm
polycarbonate films and separated from non-entrapped CF
through gel filtration on a PD-10 disposable gel filtration
column. LUVs were used within 48 h of preparation. The lipid
concentration was determined by phosphorus analysis using
the method proposed by Rouser et al. [20].
2.6. Circular dichroism (CD) measurements
CD spectra were measured over the range 190–250 nm, using a
Jasco-710 spectropolarimeter (JASCO International Co. Ltd.,
Tokyo, Japan) coupled to a Neslab RTE111 circulating water
bath. The instrument was calibrated using d-10-camphorsul-
fonic acid.Spectra were obtained at 25 8C using cellswith a path
length of 0.5 cm. Peptides were dissolved in water and CD
spectra were collected at 8.5 mM concentration. Data points
were recorded at a scan speed of 20 nm/min, bandwidth of
1.0 nm, 0.5 s response and 0.1 nm resolution. Three repeat
scans were accumulated to make up the final averaged spectra.
Following baseline correction, the observed ellipticity, u (mdeg)
was converted to mean residue ellipticity [Q](degcm
2
/dmol),
using the relationship [Q] = 100u/(lcn) where ‘‘l’’ is the path
length in centimeters, ‘‘c’’ is peptide milimolar concentration,
and ‘‘n’’ the number of residues in the peptide. The a-helix
fractions were determined as described previously [13].
2.7. Dye leakage
Aliquots of LUV suspension were added to 1 cm quartz
cuvettes containing magnetically stirred peptide solutions
to give a final volume of 1 ml. Release of CF from LUVs causes
decrease in its self-quenching that was followed with a Hitachi
Fluorometer F4500 (Tokyo, Japan) at 520 nm (excited at
490 nm) during 20 or 30 min for PCPG or PC LUVs respectively
at 25 8C. 100% leakage (F
100
) is determined by adding 20 ml
Triton X-100 10% solution. At regular intervals % leakage is
calculated as 100 Â (F À F
0
)/(F
100
À F
0
), where F is the measured
fluorescence intensity and F
0
corresponds to the fluorescent
intensity of intact LUVs.
2.8. Mast cell degranulation activity (b-hexosaminidase
assay)
Mast cells were obtained by peritoneal lavage of large (>300 g)
Sprague-Dawley rats. The mast cells were isolated from
peptides xxx (2006) xxx–xxx 3
containing cell types by centrifugation through a cushion of
Percoll as previously described [8], washed twice by resuspen-
sion and centrifugation, and finally suspended in a HEPES
buffer which comprised of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM
MgCl
2
, 1.8 mM CaCl
2
, 20 mM HEPES, 1 mg/ml BSA and 1 mg/ml
glucose (pH 7.4).
RBL-2H3 cells were grown in RPMI 1640 supplemented with
10% fetal calf serum and 100 U/ml penicillin/100 mg/ml
streptomycin solution. The cells were cultured in 96-well
plate (5 Â 10
4
cells/0.1 ml/well) in growth media in preparation
for degranulation assay.
Degranulation was determined by measuring the release of
the granule marker, N-acetyl-b-
D-glucosaminidase (b-hexosa-
minidase), which co-localizes with histamine, as previously
described [8]. The cells were incubated with various concen-
tration of the peptide for 15 min at 37 8C, and then the cells
were quenched by addition of 0.15 ml of ice-cold HEPES buffer.
After centrifugation, the supernatants were sampled for b-
hexosaminidase assay. Briefly, 50 ml of samples of the medium
and 50 ml of the substrate, 5 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-b-
D-
glucosaminide (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0.2 M
citrate, pH 4.5, were incubated in 96 well plates to yield the
chromophore, p-nitrophenol. The absorbance of the colored
product was assessed at 405 nm using a microtiter plate
reader. The values for b-hexosaminidase released in the
medium were expressed as the percentage of total b-
hexosaminidase, which was determined in the cells lysed in
0.1% Triton X-100.
2.9. Hemolytic assay
Hemolytic assay was performed as previously described [18]
with slight modification. Human blood was obtained from
healthy donors at the Vital Brasil Hospital in Butantan
Institute. Blood samples drawn to obtain erythrocytes for
subsequent use as target cells were collected in anticoagulant
(Alsever’s old solution, containing, in mM, 114 citrate, 27
glucose and 72 NaCl, pH 6.1). Erythrocytes were washed three
times, resuspended at 2% in PBS and incubated with sample
for 30 min at 37 8C. Background or total cell lysis was evaluated
by incubation of erythrocytes with PBS or Triton X-100 (0.5%),
respectively. After incubation, unlysed cells were spun down
and the absorbance of the supernatant was measured at 414
and 540 nm and expressed as percentage of lysis.
2.10. Antimicrobial activity (Determination of minimal
inhibitory concentration, MIC)
The microorganisms used were: Staphylococcus aureus (ATCC
6538), S. aureus (ATCC 25923), S. saprophyticus (clinical species),
S. epidermidis (clinical species), Bacillus subtilis (CCT 2471), B.
thuringiensis (wild species), Echerichia coli (CCT 1371), E. coli
(ATCC 25922), Enterobacter cloacae (ATCC 23355), Proteus
mirabilis (clinical species), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
15442).
Serial dilution of peptide was prepared in sterilized water.
Aliquots were placed in ELISA microplates containing Mu
¨
eler-
Hinton broth (Difco) in a final volume of 200 ml. The mixture
was completed by inoculation of 10 ml of bacterial culture
growing in logarithmic-phase of microorganism as monitored
by the UV absorbance at 600 nm. The final cells number
(1 Â 10
5
/ml) was determined by plate counting.
The plates were incubated at 35 8C and aliquots of 10 ml
were removed both at the beginning of assay and after
overnight incubation, and then plated in Mu
¨
eler-Hinton agar.
The number of colony-forming units was determined. The
results were expressed as inhibition percentage of colony-
forming units against a control; this control was obtained in
each situation by counting the number of microorganisms
introduced into the plate in the absence of peptide.
3. Results
3.1. Purification and sequence determination
The venom extracts of E. rubronotatus were subjected to
reverse-phase HPLC, and t he purity and complexity of each
fraction was examined by MALDI-TOF MS. The HPLC profile
was rather s imple, giving only several intense peaks (Fig. 1A).
The MALDI-TOF MS analysis revealed that the mass range for
the components was up to m/z 5000. The major fraction e luted
at 21.5 min showed high purity with a protonated molecular
ion peak at m/z 1644.9 (MH
+
, monoisotopic, Fig. 1B). The
molecular weight and chromatographic behavior suggested
this component to be a peptide, which we designated
eumenitin.
The sequence of the peptide was mostly analyzed by mass
spectrometry together with Edman degradation. The MALDI-
TOF MS analyses with the combined use of enzymatic ladder
sequencing and CID/PSD spectra led to a full sequence [9].
Ladder sequencing of the purified peptide by carboxypepti-
dase Y (CPY) digestion showed the C-terminal sequence to be
A–S–I/L–I/L–T. Similarly, ladder sequencing by aminopepti-
dase M (APM) digestion revealed the N-terminal sequence as I/
L–N–I/L–K/Q–G–I/L–F. The sequence of unidentified residues
with 355 mass units, was K/Q–K/Q–V according to the CID/PSD
analysis of intact peptide and the ladder peptide lacking five C-
terminal residues. Three K residues were revealed by the
acetylation of the intact peptide leading to a mass shift of
168 mass units. L and I residues at the 3 and 6 positions were
differentiated by w and d ions pattern. Thus, the peptide
sequence I/L-N-L–K–G–I–F–K–K–V–A–S–I/L–I/L–T was deduced,
which is consistent with the MH
+
peak at m/z 1644.9. Edman
degradation determined the remaining three I/L residues, and
accordingly, the full sequence of eumenitin was determined to
be L–N–L–K–G–I–F–K–K–V–A–S–L–L–T. The solid-phase synth-
esis of this peptide using Fmoc-L-amino acids and the HPLC
comparison of the synthetic specimen with the natural
peptide finally corroborated the sequence.
3.2. CD spectral analyses of secondary structure
The chemical features of eumenitin, rich in hydrophobic and
basic amino acids with no disulfide bond, are characteristic of
cationic linear amphiphilic peptides [2,7,24], in particular,
quite similar to those of EMP-AF, a mast cell degranulating and
antibacterial peptide, which we have recently found in
another solitary wasp venom [12,21]. As shown in Fig. 2, these
two peptides are highly homologous, but an important
peptides xxx (2006) xxx–xxx4
difference is that eumenitin is not amidated, but instead has
one more amino acid residue (Thr) in the C-terminus.
This class of peptides has been known to adopt an
amphipathic a-helical conformation, showing amphiphilic
character under appropriate conditions. The amphipaticity in
these peptides has been considered essential for their
biological activities [16,23,27]. In fact, the sequence of
eumenitin can be predicted to adopt an amphipathic a-helical
conformation as depicted in Fig. 3. In this view, all the
hydrophilic amino acid residues, K
4
,K
8
,K
9
,N
2
,S
12
and T
15
, are
located on one side, whereas the hydrophobic amino acid
residues, L
3
,L
13
,L
14
,I
6
,F
7
,V
10
and A
11
, are on the other side of
the helix. Consequently, eumenitin can be classified into
cationic linear a-helical amphipathic peptides.
CD spectroscopic investigation of eumenitin in water and
in Tris buffer, confirms the absence of secondary structure as
seen in Fig. 4. However, in the presence of TFE (data not
shown) or SDS the two negative dichroic bands, at 208 and
222 nm, indicate a significant amount of a-helical structure;
spectra obtained in both environments are very similar.
Table 1 summarizes data obtained in CD analysis of eumenitin
in comparison with EMP-AF, another mastoparan-like peptide
and correlate these data with their structural features, such as
net charge (Q), mean hydrophobicity (H) and mean hydro-
phobic moment (m).
In the presence of vesicles the conformation of eumenitin
was shown to be dependent on the type of lipids used in the
liposomes. Zwitterionic (PC) liposomes induce only a small
change in the CD spectra of this peptide. At low peptide
concentration (8.5 mM), the a-helix fraction estimated was only
slightly higher than that observed in buffer and even at higher
peptide (22 mM) concentration the helical fraction did not
increasesignificantly(seeTable1). Anionicliposomes,however,
inducehigheramountofa-helix.The amountof a-helixinduced
in this peptide by PCPG liposomes is of the same magnitude
order as observed with SDS above the critical micelle concen-
tration(cmc).Moreover,higherlipidandpeptideconcentrations
have induced considerable higher a-helical amounts, reaching
72% at 0.94 mM lipid concentration and 20 mMeumenitin.
3.3. Lytic activity in liposomes
Dye release from anionic PCPG (70:30) or zwitterionic PC
liposomes, due to the presence of different eumenitin
concentrations, was monitored up to 30 min. These experi-
ments showed that, in anionic vesicles, more than 90% dye
was released in one minute using 4 mM eumenitin. However,
with zwitterionic liposomes, the same leakage level was
achieved at a higher peptide concentration of 75 mM and in
30 min contact time (Fig. 5), indicating a great preference for
charged membranes. The expressive lytic activity observed in
anionic liposomes in contrast to the much lower activity on
the zwitterionic type has also been found in other masto-
paran-like peptides as EMP-AFs and mastoparan-X [21,17].A
sigmoidal dependence of the dye leakage with the peptide
concentration observed in anionic vesicles indicates a
cooperative process, similar to that observed for other pore-
forming peptides such as melittin and mastoparans [26,17].In
neutral vesicles the dose response curve evidences a low
cooperative process. The critical peptide concentration
($15 mM) to induce leakage in these vesicles is much higher
than that observed for anionic liposomes ($1 mM). These
aspects evidence the great selectivity to anionic membranes.
peptides xxx (2006) xxx–xxx 5
Fig. 2 – Amino acid sequences of anoplin, EMP-AF,
mastoparan and eumenitin.
Fig. 3 – Predicted amphiphilic a-helical structure of
eumenitin. In this perpendicular view of the helix, the
hydrophilic Lys, Ser, Thr and Asn residues are located on
one side and the hydrophobic Ala, Ile, Leu, Val and Phe
residues on the other side of the helix.
Fig. 4 – CD spectra of eumenitin (8.5 mM) showing
unordered conformations in water (—) and in the presence
of 63 mMPC(ÁÁÁ), and showing a-helical characteristic
spectra in the presence of 8.0 mM SDS (- - -), and of 26 mM
PCPG (
).
3.4. Biological activities
The biological activities of eumenitin were investigated using
the synthetic peptide. The results of the antimicrobial activity
are summarized in Table 2. Eumenitin showed potent and
broad-spectrum antimicrobial activity against both Gram-
positive and Gram-negative bacteria to a similar extent. This
profile is in contrast to that of EMP-AF, which is more selective
to Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria [21].
Fig. 6 shows the results of the mast cell degranulation
activity. As expected, eumenitin stimulated the degranulation
both from the rat peritoneal mast cells and the RBL-2H3 cells,
but the potency was much lower than that of mastoparan. It is
also much lower than EMP-AF, since the potency of EMP-AF is
comparable to that of mastoparan [12].
In human erythrocytes, eumenitin showed a very weak
hemolytic activity, inducing only 20% of hemolysis at the
extremely high concentration of 1 mM (n = 3, data not shown).
This concentration is approximately 100–150 times higher
than that used in antibacterial assay. In contrast, both
mastoparan and EMP-AF have been reported to show
significant hemolytic activity [12].
Thus, in spite of having high homology, the biological
activity profile of eumenitin was somewhat different from
those of mastoparan and EMP-AF.
4. Discussion
We have isolated and characterized a new antimicrobial
peptide, eumenitin, from the venom of the solitary eumenine
wasp Eumenes rubronotatus. Solitary eumenine wasps exclu-
sively prey on caterpillars with their venoms, paralyzing the
preysto feed theirlarvae.Therefore,we initiallyexpectedto find
neurotoxins from this venom, but instead a major component
was an antimicrobial peptide. Antimicrobial peptides are
widely found in plants, insects, amphibians and mammals,
playing an important role in innate immune systems and host
defense mechanisms [1,2,7,27]. In most cases, the antimicrobial
peptides are produced when challenged by microbes, but they
are also present in arthropod venoms [15,24]; for example,
lycotoxins in the venom of the wolf spider Lycosa carolinencis [25]
and IsCTs from the scorpion Opisthacanthus madagascariensis
[3,4], and even inRoyalJelly of honey bees Apis mellifera, jelleines
[6]. In case of solitary wasp venom, we have already found
antimicrobial peptides from two species; EMP-AF from Ante-
rhynchium flavomarginatum micado and anoplin from Anoplius
samariensis [12,13,21]. Thus, our studies indicated that anti-
microbial peptides might be widely contained in solitary wasp
peptides xxx (2006) xxx–xxx6
Table 1 – Structural properties of eumenitin (8.5 mM) in comparison to EMP-AF (10 mM), and their a-helix fraction ( f
H
)in
different conditions
Net charge
*
Mean
hydrophobicity
*
Mean hydrophobic
moment
f
H
QH m TFE
a
SDS
b
PCPG
c
PC
d
Eumenitin +3 0.232 0.407 0.43 0.50 0.45/0.72 0.07/0.11
EMP-AF +4 0.310 0.535 0.55 0.72 0.73 0.16
a
40% TFE.
b
>8.0 mM SDS.
c
P/L ratio = 1:2.6 and 1:53.
d
P/L ratio = 1:6.3 and 1:38.
*
According to Eisenberg et al. (1984), normalized consensus scale [5].
Fig. 5 – Leakage of the fluorescent probe CF from PCPG (left
side, straight lines) and PC liposomes (right side, dashed
lines) induced by eumenitin. Percent leakage was plotted
within (&) 1 min. and (*) 3 min. in 60 mM PCPG (7:3), and
within (!) 1 min. and (~) 30 min in 100 mM PC liposomes
(1 mM = 1.6 mg/mL; error bars are relative to 5 repetitions).
Table 2 – Antimicrobial activity of eumenitin
Microorganism MIC (mM)
Gram-positive
Staphylococcus aureus ATCC 6538 >60
Staphylococcus aureus ATCC 25923 6
Staphylococcus saprophytius (CS) 6
Staphylococcus epidermius (CS) >60
Bacillus subtilis CCT 2471 60
Bacillus thuringiensis (WT) >60
Gram-negative
Escherichia coli CCT 1371 6
Escherichia coli ATCC 25922 6
Escherichia cloacae ATCC 23355 >60
Proteus mirabilis (CS) >60
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 30
*MIC: Minimum inhibitory concentration.
venoms, playing a role in preventing potential infection.
However, they might play another role in the venom toxicity,
which is remained to be investigated.
The amino acid sequence of eumenitin, rich in hydrophobic
andbasicamino acidswithnodisulfidebond,ischaracteristic of
cationic linear a-helical amphipathic peptides, commonly
found in other wasp venom peptides: mastoparan, EMP-AF,
and anoplin. In fact, the CD spectra of eumenitin in TFE or in
anisotropic membrane-mimicking environments, such as SDS
and in anionic liposomes, showed a high content of a-helical
conformation. However, in contrast to those mentioned wasp
venom peptides, eumenitin is not C-terminally amidated, and
instead, has an extra amino acid residue (Thr). We have studied
the consequence of C-terminal amidation of EMP-AF by means
of NMR and molecular dynamics, and concluded that the C-
terminal amidation stabilizes the a-helical conformation,
leading to the enhanced potency of biological activity through
the cell membrane [22]. This study showed an extra hydrogen
bond between the amide group in the C-terminus and the Ile
11
carbonyl group of the backbone. In addition to this stabilizing
effect, the C-terminal amidation provides an extra electrical
charge to EMP-AF. Thesefactors are absent in eumenitin, which
in consequence, has lower helical content than EMP-AF in
anionic and zwitterionic liposomes.
The biological activity profile of eumenitin is somewhat
different from that of EMP-AF in spite of having similar primary
structures. Eumenitin shows antibacterial activity against both
Gram-positive and Gram-negative bacteria to a similar extent,
whereas EMP-AF is rather selective to Gram-positive bacteria
[21]. In mast cell degranulating activity, EMP-AF is much more
potent than eumenitin. Eumenitin is virtually non-hemolytic,
butEMP-AF is significantly active.The differencemay,at leastin
part, come from the C-terminal structure, amidated or not, as
discussed above. The comparison between these peptides,
however, should take into account other structural features
besides C-terminal amidation and electrical charges. These
features are related principally to the average hydrophobicity
andhydrophobic moment,sincetheir polar facesare subtended
by approximately the same angles. Eumenitin presents lower
mean hydrophobic moment and mean hydrophobicity than
EMP-AF (Table 1, [5]). These parameters would probably
contribute to a lower helical content in zwitterionic vesicles
and, more interestingly, to lower lytic activity in these vesicles.
The lytic activity of eumenitin in liposomes is well correlated to
their biological activities. The mast cell degranulating activity
was shown to be dependent of membrane receptors [17,19,26].
The reduced mast cell degranulating activity in eumenitin
suggests that the helical content and the helical macrodipole
should be important factors in the mechanism of molecular
recognition of peptide and mast cell receptors. The lytic
experiments in zwitterionic liposomes suggest that the lower
hydrophobicity and hydrophobic moment modulate the hemo-
lytic activity.
Due to the drug-resistance by pathogenic bacteria, anti-
microbial peptides have attracted much attention as a new
type of antibiotics. Since the antimicrobial activity of these
peptides is induced by the interaction with the cell surface
membrane, drug-resistance would be hardly developed. The
new peptide, eumenitin, may serve as not only a novel tool for
investigating the mechanism of action of antimicrobial
peptides, but also a lead for new antibiotic agents.
Acknowledgements
We are grateful to Drs. Soˆichi Yamane (Ibaraki University) and
Akira Endo (Ritsumeikan University) for the collection and
identification of wasps and their invaluable discussions. This
work was supported in part by the State of Sa
˜
o Paulo Research
Foundation (FAPESP) and a grant from the Research for the
Future Program from the Japan Society for the Promotion of
Science (JSPS).
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Fig. 6 – Degranulation activity in rat peritoneal mast cells
(A) and RBL-2H3 cells (B). (*) eumenitin; (*) mastoparan
(control). The activity was determined by measuring the
release of the granule marker b-hexosaminidase which
co-localizes with histamine, and the values for b-
hexosaminidase released in the medium were expressed
as the percentage of total b-hexpsaminidase, which was
determined in the cells lysed in 0.1% Triton X-100. Data
are the mean W SEM (n = 3).
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Structure and lytic activity of Anoplin, a short chain antimicrobial
peptide from solitary wasp venom
Marcia Perez dos Santos Cabrera
a
, cabrera.marcia@gmail.com
Sabrina Thais Broggio
a
, sabroggio@yahoo.com.br
Maurício L. Sforça
b,1
, sforca@click21.com.br
Katsuhiro Konno
c
, kk-gon@butantan.gov.br
Mario Sérgio Palma
d
, mspalma@rc.unesp.br
Valmir Fadel
a
, valmir@ibilce.unesp.br
Walter F. de Azevedo Jr.
a,c,2
, walter.junior@pucrs.br
Thelma A. Pertinhez
b,3
, thelma@unipr.it
Alberto Spisni
b,e,3
, aspin@unipr.it
José Roberto Ruggiero
a
, zerug@ibilce.unesp.br
João Ruggiero Neto
a,c
*, joao@ibilce.unesp.br
a
Department of Physics, IBILCE, UNESP, R: Cristóvão Colombo, 2265, 15054-000 S. José do
Rio Preto, SP, Brazil.
b
CeBiME, Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, C.P. 6192, 13084-971 Campinas, SP,
Brasil.
c
CAT CEPID, Center for Applied Toxinology, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil, 1500 - CEP
05503-900 São Paulo, SP, Brazil.
d
Center of Study of Social Insects, Department of Biology, Institute of Biosciences, UNESP,
Rio Claro, SP, Brazil.
e
Department of Experimental Medicine, Sect Chemistry and Structural Biochemistry, University
of Parma, Italy.
*Corresponding author. Tel. +55 17 3221 2248, Fax: +55 17 3221 2247
e-mail address: joao@ibilce.unesp.br
Present address:
1
2
PUCRS-Faculdade de Biociências, Av. Ipiranga, 6681. 90619-900 Porto Alegre, RS, Brazil
3
Department of Experimental Medicine, Sect Chemistry and Structural Biochemistry,
University of Parma, Italy.
Abstract
In this work we studied the mode of action of Anoplin, an antimicrobial, helical decapeptide
from wasp venom. We related its lytic activity on vesicles with the structures determined by
NMR in SDS micelles and by Molecular Dynamics Simulations (MD) in TFE/water mixtures.
We have searched the correlation between the lytic activity and structural parameters. We
propose to estimate parameters as the angle subtended by the polar face and the hydrophobic
moment of the helical stretch from NMR and MD structures. The solvation profile due to
amphipathic molecules around the hydrophobic and charged groups of these peptides has also
been analyzed. This analysis has shown that this procedure helps to establish part of the
searched correlations, however the unusual behavior observed for the carboxylated form of the
peptide, specially in its lytic activity in highly charged vesicles, can not be well understood at
the moment with the present data.
Key words
Antimicrobial peptide, wasp venom, NMR structure, Molecular Dynamics, polar angle
Abbreviations
Circular Dichroism, CD; Molecular Dynamics, MD; critical micellar concentration, cmc; large
unilamellar vesicles, LUVs; small unilamellar vesicles, SUVs; sodium dodecyl sulfate, SDS;
trifluoroethanol, TFE; Phosphate:Borate:Citrate buffer, PBC buffer; carboxyfluorescein, CF; L-
α
-phosphatidylcholine, PC; L-
α
-phosphatidyl-DL-glycerol, PG; cardiolipin, CL; Simple Point
Charge, SPC;
α
-helix fraction, f
H
; lipid to peptide ratio, Lip/Pep; root mean square fluctuation,
RMSF; run integration number, RIN.
1. Introduction
The decapeptide Anoplin (ANP), GLLKRIKTLL, is among the smallest naturally
occurring antimicrobial peptides. The amidated C-terminus form (ANP-NH
2
), isolated from the
venom sac of pompilid wasps Anoplius samariensis, presents antimicrobial and mast cell
degranulating activity, being non-hemolytic [27]. Its synthetic C-terminus carboxylated analog,
Anoplin-OH (ANP-OH) is also non hemolytic and lost the antimicrobial and mast cell
degranulating activities. These results made us believe that the biological activity is centered in
the membrane lipids. The outer leaflet of the bacterial membrane is, in general, negatively
charged while in mammals it is electrically neutral [30]. Cationicity and amphipathic character
of most antimicrobial peptides emphasize the importance of the electrostatic interaction to drive
contacts with vesicles or cells, and to modulate binding forces and subsequent activity.
Previous results [27, 23] have also suggested that, besides the peptide net charge, the primary
sequence and probably the secondary structure adopted upon contact with biological membranes
are very important to modulate its biological activities.
Since the unique difference between these peptides is the nature of the C-terminus we studied
the lytic activity of Anoplin-NH
2
and Anoplin-OH through dye leakage experiments of charged
and non-charged vesicles. We related these results with their structures in sodium dodecyl
sulfate (SDS) micelles and TFE/water mixture obtained by NMR and molecular dynamics (MD)
simulations respectively. The aim of the MD study was to compare the conformational changes
that occur when both peptides are submitted to a non-charged environment, with amphipathic
characteristics, like mixtures of trifluoroethanol and water (TFE/water). Circular dichroism
(CD) complemented the conformational analysis, also in the presence of zwitterionic and
anionic vesicles. We have searched correlations between the lytic activity of both peptides in
vesicles and their net charge,
α
-helical content and the angle subtended by the polar face.
Instead of using the helical wheel projection, we propose to estimate the polar angle and the
hydrophobic moment of the helical stretch obtained from NMR and MD structures in SDS and
TFE/water respectively. We have also searched for water and TFE clusters around the
hydrophobic and charged groups of these peptides. It has been shown, in the last ten years, that
permeabilization efficiency is, in general, correlated with some physicochemical characteristics
of antimicrobial peptides [11,14, 12], such as: net charge [13], hydrophobicity [44], helicity,
hydrophobic moment and the angle subtended by the polar face [42, 45]; and also to the
characteristics of the bilayer as compressibility and bending modulus and spontaneous curvature
radius [1, 28, 31].
.
2. Materials and methods
2.1 Peptide synthesis and purification
The peptides were synthesized as described by Konno et. al. [27] by step-wise manual solid-
phase synthesis using N-9-fluorophenylmethoxycarbonyl (Fmoc) strategy. The crude products
were purified by reverse-phase HPLC, and the homogeneity and sequence were accessed by
analytical HPLC and mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-MS).
2.2 Vesicle preparation
Lipids and carboxyfluorescein (CF) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Zwitterionic lipid film composed by pure L-
α
-phosphatidylcholine (PC) and negatively charged
lipid mixtures made of PC and either L-
α
-phosphatidyl-DL-glycerol (PG) or cardiolipin (CL)
have been prepared at the following molar ratios: PCPG 70:30, PCPG 40:60, PCCL 70:30 and
PCCL 40:60. Small unilamellar vesicles (SUVs) for CD measurements and large unilamellar
vesicles (LUVs) for dye leakage measurements have been prepared as detailed described
elsewhere [18]. Shortly, lipid films were hydrated either with Tris/H
3
BO
3
5 mM, 0.5 mM
Na
2
EDTA, pH 7.5 for CD experiments, or Tris/HCl 10 mM, 150 mM NaCl, 1mM Na
2
EDTA,
pH 7.5, containing 25 mM CF for fluorescence experiments. 50 min sonication for CD
measurements and 5 min for fluorescence measurements produced respectively SUVs or LUVs,
which have been used respectively within 24 hours and 48 hours of preparation. The lipid
concentration was determined by phosphorus analysis [39].
2.3 Circular dichroism measurements
CD spectra were measured at several peptide concentrations either in 1 mM PBC buffer, pH 7.5,
or in buffered sodium dodecylsulfate (SDS) solution above the critical micellar concentration
(cmc) at 8 mM, with and without the adding of 150 mM NaF, or in the presence of anionic
PCPG 70:30 SUVs. The measurement was carried out over the range of 198-260 nm, using a
Jasco-710 spectropolarimeter (Tokyo, Japan). The instrument was calibrated using d-10-
camphorsulfonic acid. Spectra have been acquired at 25
°
C using 0.5 cm path length cell, and
averaged over six scans; measurement parameters, baseline correction and ellipticity calculation
as indicated elsewhere [18]. Assuming a two state model the observed mean residue ellipticity
at 222 nm (
obs
222
Θ
) was converted into
α
-helix fraction (
f
H
) using the method proposed by Rohl
and Baldwin [38] and previously described [27].
2.4 NMR spectroscopy and molecular modelling
The samples for NMR measurements were prepared by dissolving the peptides in a 200 mM
SDS perdeutered aqueous solution containing 5% of D
2
O to yield a concentration of 0.8 mM,
pH= 4.5. All two dimensional
1
H-NMR experiments were carried out on a Varian Unity 500
spectrometer operating at 499.730 MHz for
1
H frequency, at a temperature of 30
o
C. To assign
the peptide resonance peaks, standard methods were used including Double Quantum-Filtered
(DQF)-COSY, Total Correlation Spectroscopy (TOCSY) and Nuclear Overhauser Enhancement
Spectroscopy (NOESY) experiments. The TOCSY spectra were acquired using a DIPSI spin-
lock sequence at a field strength of 10 kHz and spin-lock evolution time of 85 ms. NOESY
spectra with 200 and 300 ms mixing time were recorded. All two-dimensional experiments were
acquired in the phase-sensitive mode using the method States et. al [41].The spectra width was
typically 6000 Hz and 512
τ
1
increments
with 56 transients of 2048 complex points for each
free induction decay were recorded, except for DQF-COSY, which 1024
τ
1
experiments were
collected each with 40 transients of 8192 complex points.
Data were processed on a Silicon Graphics Octane workstation using the
nmrPIPE/nmrVIEW [16] Software. To obtain distance constraints, cross-peaks volumes were
estimated from the 300 ms NOESY spectra. The NOE calibration was made using the Median
Methods in the NMRVEW software. The lower bound were set to 1.8 Å.
The 3D structure of ANP-NH
2
and ANP-OH was computed using the simulated
annealing methods [21] in the DYANA refine module, and energy minimized by using the
DISCOVER (BYOSYM Technologies Inc., San Diego, CA.) software package, together with
the INSIGHT II [24] as graphic interface.
2.6 Dye Leakage
A volume of fresh LUV suspension was injected into a cuvette containing magnetically stirred
peptide solutions either at 5.0 or at 20
µ
M, to give a final volume of 1.0 ml. These peptide
concentrations represent the range of interest as determined in previous antimicrobial activity
tests [27,23]. CF release from the vesicles was monitored at 520 nm (excited at 490 nm) on a
Hitachi Fluorometer F4500 (Tokio, Japan) by measuring the decrease in self-quenching at 25
°
C.
Percent of dye leakage was determined after regular time intervals, and calculated as indicated
in dos Santos Cabrera et al. [18]. 100 % leakage fluorescence has been corrected for the
corresponding dilution factor.
2.7 MD simulations
MD simulations of the peptides were carried out in a triclinc box
containing trifluoroethanol
(TFE) in water (~ 30% v/v). Systems were made up of 205 TFE molecules, 1902 water
molecules and 4 chlorine (Cl
-
) counterions, which neutralize 4 positive charges in ANP-NH
2
,
and 3 Cl
-
counterions, which neutralize ANP-OH net charge. In both cases the N-termini were
treated as a positively charged group (NH
3
+
); ANP-OH C-terminus was treated as a
carboxylated group, negatively charged (COO
-
). The calculations were carried out using
GROMOS 96 force field [43]; model SPC (Simple Point Charge – [6]) was used for water; for
TFE molecules, the model and simulations conditions were applied as proposed by Fioroni et al.
[19]. Systems optimization was carried out in 8000 steps conjugate gradient and a steepest
descent cycle was performed every 500 steps. Position restriction dynamics, for solvent and ions
relaxation ran for 1 ns, with a 2 fs-time step for the integration of movement equations.
Afterwards constraints have been removed and the systems underwent 8 ns of MD simulations.
Periodic boundary conditions have been imposed in the systems simulations with a cutoff radius
of 1.4 nm. The LINCS [22] algorithm was used to constraint all bond lengths and SETTLE [35]
to constraint water geometry. Simulations ran in the canonical ensemble (n, P, T) 300 K and 1
atm. Temperature and pressure were modulated using coupling techniques [4] with coupling and
isothermal compressibility constants of 0.01 ps (solvent and peptide) and 6.5 x 10
-5
bar
-1
,
respectively. Long range electrostatic interactions were treated using Particle Mesh Ewald
method [10,8]. For Lennard-Jones interactions the cutoff radius was 1.4 nm. The atomic
positions were recorded every 1.0 ps throughout each trajectory. MD calculations and trajectory
analysis were made using the facilities of the GROMACS package [29].
The strategy for the MD studies of ANP-NH
2
and its analogue in TFE/water mixture
(70:30 v/v) was to use the one of the 20 structures determined from NMR experiments with
ANP-NH
2
in SDS. Two 8 ns MD simulations have been carried out: in the first, we kept the
original C-terminus amidated chain and in the second, only the C-terminus had the amide group
extracted, remaining a negatively charged carboxyl group; this strategy allows for a clearer
visualization of the conformational changes induced by the environment substitution.
3. Results
3.1 CD spectroscopy
CD experimental results are summarized in Table 1. It shows that in water or PBC buffer at
physiological pH, and zwitterionic vesicles ANP-NH
2
and ANP-OH are random coil. In 30%
TFE/water, SDS micelles and anionic phospholipid vesicles, both the amidated and
carboxylated forms of the peptide showed CD spectra with two negative dichroic bands
centered at 208 and 222 nm, characteristic of helical structure. The higher
α
-helix fractions
determined are 24% in 30% TFE, 30% in buffered SDS 8 mM, 28% in PCPG 7030 for the
amidated form, while for the carboxylated form, they were smaller just in 30% TFE. These
results are in good agreement with previous ones [27]. The
α
-helix fractions were
approximately independent of the peptide concentration in TFE and SDS ruling out any
aggregation process in those environments.
However, when checking the concentration dependence of the helical content in PCPG
7030 vesicles, we found out that the
α
-helical content of ANP-NH
2
varies with the lipid to
peptide molar ratio (Lip/Pep) until the ratio of 25:1, suggesting lower binding levels of the
peptides to these vesicles.
3.2 NMR Spectroscopy
Sequential resonance assignments was performed based on the combined use of two
dimensional TOCSY and NOESY.
The
3
J
NH
α
-coupling constants were estimated from the residual intensity of the antiphase
cross-peak in the DQF-COSY experiment and the chemical shifts for all residues together with
the NH-
α
CH coupling constants (
3
J
HN-
α
). Figure 1 displays the plot of the residual chemical
shifts deviations for the
α
-protons resonances. As can be seen, from residue L2 to L9, they are
all negative and intense, at least between residues 2 to 8, for ANP-NH
2
, thus suggesting the
existence of a helical segment extending over this region. In the case of ANP-OH this is true
from residues 2 to 7.
The summary of the interresidue NOEs for the peptide is reported in Figure 2. In fact,
the medium range (i,i+3) and (i,i+4) NOEs together with the intense NH-NH (i,i+1) indicate an
helical folding spanning residues 3 to 10, for the ANOPLIN-NH
2
and 2 to 10 for the
ANOPLIN-OH.
3.3 Molecular Modeling
A total of 135 distance constraints containing 25 medium range constraints were collected and
taken into account for structure calculation using DYANA [21]. The calculation with the
carboxylated peptide used 128 distance constraints with 25 medium range constraints.
Out of 100 structures that were generated, 40 structures based on the minimum target
function (0.13 ± 0.02 Å
2
for ANP-NH
2
and 0.27 ± 0.02 Å
2
, for ANP-OH) were energy
minimized using the DISCOVER program. After minimization, 20 structures were selected
based on the low residual distance violation of backbone showing a RMSD for all residues
equal to 0.14 ± 0.06 Å for ANP-NH
2
and 0.18 ± 0.08 Å for ANP-OH and were used to represent
the solution three-dimensional structure of the peptides in 200 mM SDS at 30
o
C and pH 4.5 as
shown in Figure 3. Table 2 shows the statistic results of RMSD and PROCHECK-NMR
showing 100% of the PHI and PSI angles are in the most favored region.
3.4 Leakage experiments
The membrane permeating activity induced by ANP-NH
2
and ANP-OH was investigated
through the release of CF from zwitterionic PC, and the anionic PCPG (70:30 and 40:60) and
PCCL (70:30 and 40:60) LUVs.
Both peptides at 5
µ
M and until 20 min contact time induced less than 10% CF release
from PC and from all anionic vesicles tested (data not shown). Even when the peptide
concentration was increased to 10
µ
M for PC vesicles and 20
µ
M for anionic vesicles, the dye
released fraction did not increase significantly within 5 minutes, as displayed in Figure 4a; due
to this low lytic activity it was not possible to establish if there is some kind of cooperativity in
the dose response curve. Exception is made to PCPG 4060 vesicles, displayed in Figure 4b,
whose lytic activity is indicative of a cooperative process. The example shown in detail of
Figure 4b was obtained with 120
µ
M PCPG 4060 and 20
µ
M peptide concentration. The low
leakage efficiency observed for both peptides in anionic vesicles and even in PCPG 4060 at 5
µ
M peptide concentration could not be attributed just to the peptide´s length. Other short chain
antimicrobial peptide studied in our group (dos Santos Cabrera, PhD thesis, 2006), like the less
charged undecapeptide Decoralin (SLLSLIRKLIT), presents high permeabilizing efficiency in
PCPG 7030 vesicles. Nevertheless, the increase of PG or CL ratio in the vesicles composition,
which increases the negative charge density, is directly related to the leakage increase. It should
be noted that cardiolipin (CL) is a dimeric form of phosphatidylglycerol, with four acyl chains
and two negative charges, one at each phosphate group.
3.5
Molecular dynamics simulations and trajectory analysis
.
Figure 5 shows the Root Mean Square Fluctuation (RMSF) plot for both peptides, i.e.,
how much each residue of the average structure deviates from the starting structure. ANP-NH
2
keeps the initial helical structure with a slight displacement of some residues at the N- and C-
terminus. Its analogue, ANP-OH, undergoes a marked conformational change during the initial
400ps, with a significant decrease of its helical content at the residues 8, 9 and 10; the starting
α
-helix comprised residues Leu 3 to Leu 10 and it rapidly changed to Leu 2 till Lys 7. These
conformational changes are well correlated with the helical content differences already found in
NMR and CD experiments and with the abolishment of the biological activities of Anoplin-OH.
Analyzing the hydrogen bonding characteristic of
α
-helix in ANP-NH
2
, we observed
that the distance of 0.3 nm between the electronegative atoms involved is maintained throughout
the MD simulations, except that between O from Gly 1 and N from Arg 5. The hydrogen bond
between the O from Lys 7 and the NH
2
of the C-terminus, on the other hand, fluctuates, forming
distorsions of
helical structure commented above.
The NMR chain structures of both peptides show an amphipathic
α
-helix with the polar
face subtending an angle of approximately 70
o
for the amidated peptide and 110
o
for the
carboxylated form. This angle is centered in the helix axis and defined by the charged groups of
the residues, located at the hydrophobic-hydrophilic interface. Although ANP-NH
2
maintains
the starting helical conformation throughout the MD simulations in TFE/water, we found out
that the side-chains of the charged residues are placed at different positions on the polar face,
which increased the polar angle to approximately 160
o
(Figure 6a). The polar face of ANP-OH
is rather different due to the unfolding of a significant portion of the helical C-terminus, that
moved residues Leu 9 and Leu 10 to the polar face of the peptide structure and subtending an
angle of 170
o
as displayed in Figure 6b. The estimate of these angles has been obtained from the
average structure of the final 3 ns of the simulation time.
Integrating the pair radial distribution function (RDF), g(r), from 5 to 8 ns time interval,
we obtained the running integration number (RIN), n(r), that indicates the number of molecules
around a certain atom or group previously selected. We have chosen the center of mass of the
Fluor atoms of TFE (F) and water (W) for the apolar and polar parts of the solvent,
respectively. This analysis has been used to look into the distribution of water and TFE
molecules around the peptide chains and build up a scenery of their preferences in an uncharged
environment.
Figure 7 shows the solvation profile found around N- and C- termini. The positively
charged N-terminus is equally solvated for both peptides, i.e., the number of water molecules is
greater than the number of TFE molecules at the same radius (Figure 7, panel a). This finding
agrees with the fact that the N-terminus is unfolded for both peptides, presenting larger
conformational freedom. It is exposed to the bulk solvent, as either indicated by the NMR
results obtained in SDS micelles or the MD results obtained in TFE/water mixtures. Figure 7,
panel b, displays the solvation analysis of the C-termini of ANP-NH
2
and ANP-OH.
Considering the radius between 0.25 and 0.3 nm, there are 4-fold more water around the
carboxyl group of ANP-OH (negatively charged) than around the amide group (polar, positive)
of ANP-NH
2
.
Residues Leu 9 and Leu 10 have been selected among hydrophobic residues to look into
their solvation differences, due to the marked conformational transition they undergone, when
comparing MD final chains for ANP-NH
2
e ANP-OH (Figures 4 and 5). These simulations
show that Leu 9 kept its position at the hydrophobic-hydrophilic interface in ANP-NH
2
while it
moved to the polar region in ANP-OH. Figure 7a displays RIN for Leu 9, which is the same for
both peptides, despite of the conformational changes. F and W numbers are coincident, however
if we take into account that the volume occupied by one TFE molecule is equivalent to the
volume of 4 water molecules, we can assume that solvation by TFE prevails at the end of the
side-chain. Leu 10 is kept at the center of the hydrophobic face in Anoplin-NH
2
, and its
solvation profile is in accordance with its location, as presented in Figure 7b, since the RIN of
TFE prevails. Contrasting, ANP-OH is predominantly surrounded by water molecules (Figure
7c), corresponding to the final Leu 10 location in the hydrophilic face.
Considering the positively charged residues (Lys 4, Arg 5 and Lys 7) and the polar
residue, Thr 8, RIN curves have been examined and are similar to each other and also between
both peptides, showing the relative abundance of water molecules at 10:1 ratio at 0.4 nm radius.
No hydrogen bonding has been found among side chains of charged and polar residues and
among these residues and the backbone of both peptides, emphasizing the environment
influence as the determinant of the secondary structure.
Table 3 summarizes the structural characteristics of ANPs, as obtained from
calculations based on NMR and MD data. Using the program HELANAL [3] applied to the
coordinates of NMR and MD structures, the average twist angle has been calculated. It was then
used in the hydrophobic moment calculation, according to Eisenberg consensus scale [17],
considering the helical stretches obtained for each peptide in the charged and non-charged
mimetic environments. The highly anionic charged environment deviated the twist angle to
values above the theoretical of 100
o
, elongating the helix and the non-charged TFE environment
caused the opposite effect. These differences caused an increase in the hydrophobic moment in
relation to the theoretical value of 0.366 for both peptides in both conditions tested. Also the
size of the helical stretch seems to have reduced influence on the antimicrobial and hemolytic
activities of both peptides.
4. Discussion
CD results have shown that the amount of helical structure found for anoplin and its
carboxylated analogue is strongly dependent on the environment as had been observed for other
antimicrobial peptides[,]. While in buffer and in
low; in the presence of TFE or anionic micelles or vesicles this fraction increases being
proportional to the amount of charged groups in the case of anionic environment. The SDS
micelles provides to ANP-NH
2
strong electrostatic interaction at the micelle surface, near the
charged head groups of SDS, with minimal spatial separation of its three negatively charged
residues and the charged N-terminal, forming symmetrical and well defined structures (Figure
3). In these structures the hydrophobic groups could be hidden from the hydrophilic
environment, i.e., inside the micellar core [7].This condition might equally stabilize both forms
of the peptide in a highly helical amphipathic structure.
Besides the effect of charged groups, the potential of the peptide to adopt helical
conformation is dependent also on the individual helix propensities of the residues in a given
environment [18, 7, 15, 38]. All the residues that compose these peptides have been shown to
present higher helical propensities in TFE, SDS micelles and anionic phospholipid vesicles [7].
Anoplin and its carboxylated analog, in SDS solution and in PCPG 7030 vesicles, both at
buffered pH 7.5, presented lower helical content as determined in CD experiments, in relation to
that found in NMR and also in the MD studies. A similar apparent discrepancy was reported by
Sforça et al. (2004) for EMP-AF [40] and by Chuang et al. (1996) for MP-B [9]: they also found
a significantly lower helical content through CD than through NMR in 40% TFE.
The MD simulations carried out in a hydrophobic solvent (TFE/water) with Anoplin-
NH
2
showed the presence of clusters of TFE around the peptide. The clusters are near the
hydrophobic face in very good agreement with the results obtained by Johnston et al. [26]. The
solvation profile showed the withdrawal of water molecules from the backbone and from the
hydrophobic region. The hydrogen bonds between the backbone atoms are protected from water
competition and the hydrophobic region remains clustered by TFE molecules (Figure 6, panels a
and b), thermodynamically favoring the
α
-helix. Although the helical structure is maintained,
the charged groups are mutually repelled. It is important to emphasize the dependence of the
polar angle with the environment. For Anoplin-NH
2
this angle is ~70
o
and ~160
o
, obtained,
respectively, from NMR structure in micellar SDS and from MD simulations in 30% TFE. The
presence of a negative charge at the C-terminus in Anoplin-OH introduces repulsive interactions
with negatively charged SDS micelles and makes its polar face broader (~110
o
and ~170
o
) than
that of the amidated form of the peptide.
In hydrophobic environment (TFE) which should be more similar to zwitterionic
vesicles, the polar face broadens and leakage experiments in these vesicles showed higher dye
release compared to that observed for mildly charged ones (PCPG70:30). Similar results have
been obtained by Wieprecht et al. (1997) [45] in PC vesicles; they found out that peptides with
larger polar angle (140
o
-180
o
) are more active than those with smaller polar angle (80-120
o
).
Surprisingly, for anoplins, we did not observe the same correlation between helical fraction and
lytic efficiency as observed for other peptides. PC vesicles do not induce helical conformation,
although some leakage has been observed, while in PCPG (70:30) the peptide is more structured
but with lower leakage. We have observed, however, that the carboxylated form is more
efficient in the lysis of neutral vesicles which correlates well with the observation from the MD
simulations that the polar angle is larger than that found for its amidated form.
Considering that the anionic vesicles studied provide less negatively charged
environments than SDS, but more charged than TFE/water, we could expect that the polar angle
in these environments would approximately vary within the range from ~70
o
to ~160
o
for
Anoplin-NH
2
and within 110
o
to 170
o
for Anoplin-OH. Both forms of the peptide presented
lower permeabilizing efficiency on anionic PCPG 7030 than in neutral PC vesicles. However
when the amount of charged groups increased by substitution of PG by cardiolipin (30%) or
increasing PG ratio to 60% the lytic activity has increased. Despite of the higher amount of
anionic groups in PCCL vesicles, leakage from these vesicles was also not expressive; this
could be due to cardiolipin, which is known to induce negative spontaneous curvature on
bilayers [1], acting contrarily to cationic peptides that induce positive curvature. Interestingly
this data emphasizes the importance of membrane curvature for leakage similar to what is
observed for a pore forming peptide.
A comparison of the lytic activities of both forms of the peptide in anionic vesicles
PCPG (40:60), however, shows an unexpected result. The less charged peptide, the carboxylated
form, is more efficient than the amidated one. For other lytic peptides, with similar physico-
chemical characteristics the C-terminus amidation contributes not only with the extra charge but
also stabilizes the helical conformation. These features, in association with a narrow hydrophilic
face, have been shown to contribute for higher lytic activity in anionic vesicles [,,].
Consequently, for the carboxylated form, one would expect reduced dye release from anionic
vesicles. This unexpected behavior in the leakage of anionic vesicles can not be attributed to
the anoplin chain length. We have observed that the amidated form of an undecapeptide is much
more efficient in dye release from anionic vesicles than the carboxylated form (manuscript in
preparation). Notwithstanding the reduced lytic activity of the amidated form in anionic
vesicles it presents antimicrobial activity comparable to peptides whose mode of action supports
the toroidal pore model [47]. These results suggests that the presence of lipopolysaccharides in
the microbial membrane is important to the high antimicrobial activity of anoplin-NH2 is good
agreement with the observations for other peptides [42, 36]. In the same way, although these
peptides are not hemolytic, the correlation between PC vesicles permeabilization and hemolysis
has to take into account that the cholesterol content in erythrocytes increases the stability of
membranes and hampers its permeabilization [34]. Other non-hemolytic peptides like magainin
and PGLa also permeate PC vesicles [42].
Acknowledgements
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Table 1: Molar ellipticity ([
Θ
]
222
, deg cm
2
/dmol) at 222 nm and corresponding
α
-helix fraction
(f
H
) for both peptides at 20
µ
M in different environments.
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
[
Θ
]
222
(degcm
2
/dmol)
f
H
[
Θ
]
222
(degcm
2
/dmol)
f
H
Tris buffer -1137.92 rc -1138.40 rc
SDS 8 mM/buffer -8649.60 0.302 -7762.81 0.315
PC -1195.88 rc -697.782 rc
PCPG 7030 -8124.95 0.282 -7231.21 0.293
rc = random coil
Table 2: Structure statistics for the ensemble of 20 Anoplin-NH
2
and Anoplin-OH structures.
PROCHECK – NMR Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
Most favored region (%) 100 100
Additionally allowed region (%) 0 0
Generously allowed region (%) 0 0
Disallowed region (%) 0 0
RMSD
a
Backbone (all) 0.14 ± 0.06 0.18 ± 0.08
Backbone (residues 3-10) 0.04 ± 0.02 0.14 ± 0.03
Heavy atoms (all) 0.45 ± 0.19 0.82 ± 0.11
Heavy atoms (residues 3-10) 0.45 ± 0.16 0.52 ± 0.17
a
Root mean square deviation from pairwise comparison between all the structures (Å).
Table 3: Structural characteristics of ANPs, as obtained from NMR and MD data. The average
twist angle has been calculated with HELANAL [3] and used in the hydrophobic moment
calculation, according to Eisenberg consensus scale [17].
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
SDS (NMR) TFE (MD) SDS (NMR) TFE (MD)
helix residues 3 - 10 2 - 10 2 -10 2 – 7
average twist angle
105
o
±
9
o
97
o
±
2
o
103
o
±
5
o
91
o
±
12
o
hydrophobic moment 0.458 0.406 0.427 0.447
polar angle 70
o
160
o
110
o
170
o
Figure 1: Chemical shift deviations for the
α
CH protons of Anoplin-NH
2
and Anoplin-OH (0.8
mM) in 200 mM SDS at 30
o
C. The chemical shift differences were calculated by subtracting the
observed value of the peptide from the random coil shifts given in the literature (Wishart, 1992).
Figure 2: Summary of the sequential and medium-range NOE connectivities for (a) Anoplin-
NH
2
(b) Anoplin-OH. The intensities of the observed NOEs are represented by the thickness of
lines and were classified as strong, medium and weak, corresponding to upper bound constraints
of 2.5, 3.5 and 5 Å, respectively.
Figure 3: Superposition of final 20 calculated structures of the Anoplin-NH
2
and Anoplin-OH,
based on the minimum pairwise RMSD (0.45 ± 0.16 Å, and 0.52 ± 0.17 Å, respectively) of the
peptide heavy atoms spanning residues 3 to 10, displaying the hydrophobic amino acids in black
and the charged in blue, in the right. The C-terminus is shown at the bottom.
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
Figure 4(a): % CF leakage caused by Anoplin-NH
2
and Anoplin-OH on zwitterionic PC
vesicles at 10
µ
M concentration, and on anionic vesicles at 20
µ
M. Lip/Pep ratio varied from 50
to 5. (b) % CF leakage on PCPG 4060 at 20
µ
M peptide and 120
µ
M lipid concentration.
Contact time 5 minutes shown in hatched bars and 20 minutes contact time (no pattern). Error
bars are shown for both peptides with PCPG 7030 vesicles and PCPG 4060.
Figure 5: Root Mean Square Fluctuation (RMSF) plot, obtained from MD simulations, for
Anoplin-NH
2
in black and Anoplin-OH in gray.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
0.36
RMSF(nm)
Residue
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
a
% CF leakage
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
PC
PCPG 7030
PCCL 7030
PCCL 4060
PCPG 4060
0
10
20
30
40
50
60
70
80
b
Anoplin-NH
2
Anoplin-OH
Figure 6: Anoplin-NH
2
(panel a) and Anoplin-OH (panel b) helical structures, projected on the
normal plane to the helix axis, showing the polar angle between charged groups of Lys 7 and
Arg 5. Side-chains of all hydrophobic residues, especially Leu 9 and Leu 10 are shown in black.
Charged and polar residues are shown in blue. Structures as obtained from MD simulations in
30% TFE.
a)
b)
K 7
K 4
R 5
T 8
N
-
terminus
L 9
L 10
K 7
K 4
R 5
T 8
N
-
terminus
L 9
L 10
K 7
K 4
R 5
T 8
N
-
terminus
L 9
L 10
K 7
K 4
R 5
T 8
N
-
terminus
L 9
L 10
Figure 7: Running integration numbers (RIN), n(r), of the pair radial distribution function
(RDF) derived from MD simulations for Anoplin-NH
2
and Anoplin-OH. Panel (a) shows RIN
for the N-terminus of Anoplin-NH
2
, with NH
3
-F in gray and NH
3
-W in black. Panel (b) shows
RIN for the C-termini of both peptides: Anoplin-NH
2
(straight lines), NH
2
-F in gray and NH
2
-W
in black, and Anoplin-OH (dash lines), O
-
-F in gray and O
-
-W in black.
Figure 8, panel a: RIN for the side-chain of Leu 9 with F (in gray) and W (in black) for
Anoplin-NH
2
, which is equal to Anoplin-OH. Panel b: RIN for the side-chain of Leu 10 for
Anoplin-NH
2
with F (in gray) and W (in black). Panel c: same as panel b for Anoplin-OH.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
2
4
6
8
10
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
2
4
6
8
10
a
n (r)
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