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KÁTIA FERNANDA GOBBI
CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS, DIGESTIBILIDADE IN VITRO E DEGRADAÇÃO
DE TECIDOS FOLIARES DE FENO DE Brachiaria decumbens Stapf. TRATADO
COM URÉIA
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-graduação em
Zootecnia, para obtenção do título de
“Magister Scientiae”.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2004
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KÁTIA FERNANDA GOBBI
CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS, DIGESTIBILIDADE IN VITRO E DEGRADAÇÃO
DE TECIDOS FOLIARES DE FENO DE Brachiaria decumbens Stapf. TRATADO
COM URÉIA.
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-graduação em
Zootecnia, para obtenção do título de
“Magister Scientiae”.
Aprovada: 19 de fevereiro de 2004.
________________________ ___________________________
Prof. Odilon Gomes Pereira Prof
a
. Marília Contin Ventrella
(Conselheiro) (Conselheira)
____________________________ _________________________
Prof. Augusto César de Queiroz Prof. Ricardo Andrade Reis
______________________
Prof. Rasmo Garcia
(Orientador)
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Aos meus pais e meus irmãos
Aos meus avós
Aos meus tios Ivan e Elaine
Ao Américo, por tudo de bom.
Dedico
ii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Zootecnia, pela
oportunidade de realização do curso.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudo.
Ao professor Rasmo Garcia, pela orientação, amizade e disponibilidade
durante a realização desse trabalho, todo meu respeito e admiração.
Ao Professor Odilon Gomes Pereira, pelos conselhos, sugestões e
amizade.
À Professora Marília Contin Ventrella, pela ajuda valiosa, paciência e
amizade.
Aos professores Augusto César Queiroz e Ricardo Andrade Reis pela
disponibilidade e pelas sugestões.
Aos amigos Fernando e Daíse pelo apoio e amizade sempre presentes.
Aos amigos Fernanda e Acyr pela disponibilidade e amizade.
À minha irmã Valéria e ao meu amigo Dalton pela amizade, pelas horas
de estudo e pelos churrascos.
Aos estudantes e Professores do Laboratório de Anatomia Vegetal, pela
recepção, ensinamentos e convivência agradável.
Aos funcionários do Laboratório de Nutrição Animal e do Laboratório de
Anatomia Vegetal pelo auxílio na condução das análises laboratoriais.
a
À Daniela e a Prof . Catarina do laboratório de Micorrizas – BIOAGRO,
pela oportunidade de uso do criomicrótomo, pelos ensinamentos e
disponibilidade.
Aos bolsistas de Iniciação Científica Rafael e Beatriz, pela amizade e pelo
auxílio.
iii
Aos amigos e colegas Ciane, Karina, Camila, Ana Paula, Karla, Samuel
(Pelanca), Fernando (Velô), Elenice, Lincoln, Tiago, Dawson, Gelson, Patrícia,
Fernanda, Mário, Bruno, Eduardo, Aloísio, pela convivência e pelos bons
momentos.
Aos meus primos e “irmãos” Fabiana e Márcio, pelos momentos de
alegria.
À minha tia Sirlei, pela ajuda valiosa.
Aos meus avós João e Adélia Palharini, pelo exemplo de vida e por
estarem sempre dispostos a ajudar.
Aos meus nonos Ludovico e Angelina Gobbi, saudade para sempre.
Aos meus tios Elaine e Ivan, pela oportunidade da realização de um
sonho e pelo exemplo de vida, toda minha gratidão e admiração.
Aos meus pais Lonito e Orilde e aos meus irmãos Fábio e Ronaldo,
obrigado por tudo.
Ao Américo, por estar sempre presente mesmo estando longe, pelo
exemplo de persistência e superação e por me tornar uma pessoa melhor.
iv
BIOGRAFIA
KÁTIA FERNANDA GOBBI, filha de Lonito Luiz Gobbi e Orilde Maria
Gobbi, nasceu em Não-Me-Toque, Rio Grande do Sul, em 03 de março de
1978.
Em maio de 2002, graduou-se em Zootecnia pela Universidade Federal de
Viçosa.
Em abril de 2002, iniciou o Programa de Mestrado em Zootecnia na
Universidade Federal de Viçosa, concentrando seus estudos na área de
Forragicultura e Pastagem, defendendo tese em fevereiro de 2004.
v
ÍNDICE
Página
RESUMO.................................................................................................... viii
ABSTRACT................................................................................................ x
INTRODUÇÃO........................................................................................... 1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 13
Composição Químico-bromatológica e Digestibilidade In Vitro do
Feno de Brachiaria decumbens Stapf. Tratado com Uréia.................. 19
Resumo...................................................................................................... 19
Abstract...................................................................................................... 20
Introdução.................................................................................................. 21
Material e Métodos..................................................................................... 22
Resultados e Discussão............................................................................. 24
Conclusões................................................................................................. 30
Referências Bibliográficas.......................................................................... 31
Degradação de Tecidos Foliares de Feno de Brachiaria decumbens
Stapf. Tratado com Uréia e Submetido à Digestão In
Vitro...........................................................................................................
34
Resumo...................................................................................................... 34
Abstract...................................................................................................... 36
Introdução.................................................................................................. 37
Material e Métodos..................................................................................... 39
vi
Resultados e Discussão............................................................................. 42
Conclusões................................................................................................. 51
Referências Bibliográficas.......................................................................... 52
CONCLUSÕES GERAIS........................................................................... 54
vii
RESUMO
GOBBI, Kátia Fernanda, M.S., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de
2004. Características químicas, digestibilidade in vitro e degradação de
tecidos foliares do feno de Brachiaria decumbens Stapf. tratado com
uréia. Orientador: Rasmo Garcia. Conselheiros: Odilon Gomes Pereira e
Marília Contin Ventrella.
O experimento foi conduzido no Departamento de Zootecnia da
Universidade Federal de Viçosa com o objetivo de avaliar as características
químicas, a digestibilidade in vitro e a degradação de tecidos foliares do feno
de Brachiaria decumbens Stapf. (capim-braquiária) tratado com diferentes
níveis de uréia. O feno de capim-braquiária colhido no estádio de pós-
florescimento foi tratado com seis níveis de uréia (0, 2, 4, 6, 8 ou 10%) com
base na MS. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente
casualizado, com três repetições. A uréia foi dissolvida em quantidade
suficiente de água, para elevar o teor de umidade do feno para 30%. O feno
tratado foi armazenado em sacos plásticos (2 kg/saco) vedados, por 35 dias e,
após abertura foram coletadas amostras para as análises laboratoriais.
Verificou-se que os teores de nitrogênio total (NT) aumentaram linearmente em
função dos níveis crescentes de uréia. Os teores de nitrogênio insolúvel em
detergente neutro (NIDN) aumentaram em função dos níveis de uréia,
enquanto os teores de nitrogênio insolúvel em detergente ácido não foram
alterados pelo tratamento com uréia. Os teores de NIDN e NIDA em relação ao
nitrogênio total (NIDN/NT e NIDA/NT), reduziram linearmente em função dos
níveis de uréia, demonstrando aumento nos teores de nitrogênio disponível. A
adição de uréia promoveu redução nos teores de fibra em detergente neutro
(FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e celulose. Os teores de hemicelulose
e lignina não foram alterados pelo tratamento com uréia. A digestibilidade “in
vitro” da matéria seca (DIVMS) aumentou, com efeito quadrático dos níveis
viii
crescentes de uréia, estimando-se digestibilidade máxima de 68,9% para o
nível de 7% de uréia. Para a avaliação da degradação dos tecidos foliares
utilizou-se o feno tratado com 0, 2, 4 ou 8% de uréia, submetido à diferentes
tempos de digestão in vitro (0, 6, 12, 24 ou 72 horas), adotando-se um
delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 5 , com três
repetições. Coletou-se a primeira folha completamente expandida, contada a
partir do ápice do perfilho. Foram retiradas porções de aproximadamente 2mm
da região mediana da lâmina foliar. Estes segmentos foram secionados
transversalmente em micrótomo de gelo obtendo-se seções de 20 µm de
espessura. As seções foram montadas em fita adesiva dupla-face, previamente
aderida à lâmina de microscópio. As lâminas contendo as seções foram
colocadas em tubos contendo uma mistura de solução tampão e líquido ruminal
na proporção 2:1, submetidas à digestão in vitro e retiradas nos tempos pré-
estabelecidos. As seções foram então coradas e fotografadas e estimou-se a
proporção de cada tecido na seção transversal das lâminas foliares. Verificou-
se que o feno tratado com uréia apresentou a menor proporção de tecidos na
seção transversal da lâmina foliar, demonstrando que o tratamento foi eficiente
em causar a desestruturação da parede celular, facilitando o acesso dos
microorganismos ruminais e aumentando a digestão dos tecidos. O feno
tratado com 8% de uréia e submetido à 24 ou 72 horas de digestão apresentou
a menor proporção de tecidos com parede celular espessa e lignificada como
bainha do feixe vascular (BFV) e esclerênquima. O tratamento com uréia
também reduziu o tempo necessário para degradação dos tecidos, verificando-
se que o feno tratado com uréia e submetido à 12 horas de digestão
apresentou a mesma proporção de tecidos remanescentes observada no feno
não-tratado e submetido à 24 ou 72 horas de digestão. Os tecidos que
apresentaram a menor degradação após a digestão foram epiderme e feixe
vascular lignificado, não sofrendo modificações significativas causadas pelo
tratamento com uréia ou pelos tempos de digestão.
ix
ABSTRACT
GOBBI, Kátia Fernanda, M.S., Universidade Federal de Viçosa, February,
2004. Chemical and anatomical characteristics and digestibility of
Brachiaria decumbens Stapf. hay treated with different levels of urea.
Adviser: Rasmo Garcia. Committee Members: Odilon Gomes Pereira and
Marília Contin Ventrella.
The experiment was conducted at the Animal Science Department of the
Federal University of Viçosa to evaluate the histo-chemical characteristics and
digestibility of Brachiaria decumbens Stapf. (Signal grass) hay treated with
different urea levels. In the trial, 2kg portions of hay were reconstituted with
water to get final forage moisture concentration of 30%, and treated with urea at
0, 2, 4, 6, 8, or 10% of the forage dry matter. A completely randomized design
with three replicates was used. The material was stored in plastic bags
(2kg/plastic bag) for 35 days, and after plastic bag opening, samples were
collected for laboratory analysis. Hay total nitrogen (TN) concentration
increased linearly with increasing urea level. The chemical treatment with urea
increased neutral detergent insoluble nitrogen (NDIN), whereas acid detergent
insoluble nitrogen (ADIN) was not affected. The NDIN/total nitrogen and
ADIN/total nitrogen ratios decreased with increasing urea level. The neutral
detergent fibre (NDF), acid detergent fibre (ADF) and cellulose contents
decreased due to ammoniation with urea. The hemicellulose and lignin contents
were no affected with urea treatment. The in vitro dry matter digestibility
(IVDMD) had a quadratic response to the increasing urea level reaching the
maximum digestibility of 68,9% at the 7% urea level. The experiment also
evaluated the effects of treatment with urea at 0, 2, 4 or 8% of the forage dry
matter on the leaf tissues degradation of Signal grass hay submitted to different
times of in vitro digestion (0, 6, 12, 24 or 72 hours). A completely randomized
design in a 4 x 5 factorial arrangement with three replicates was used. For
x
histological analysis the tiller first leaf completely expanded was collected and
segments (2mm) were cut from the center portions of leaf blades. The
segments were sectioned 20µm thick on a criomicrotome and the sections were
dropped in a microscope slide mounted with transparent double-stick tape. The
slides were transfered to jars with rumen fluid inoculum and than were removed
at selected digestion times. The sections were stained, photographed and
tissue percentages were estimated. The urea-treated hay seemed the smaller
proportion of tissue measured in the transversal section of leaf blades,
displayed that urea treatment was efficient in disrupt cell wall structure
enhanced microbial degradation. The hay treated with urea 8% and submitted
to in vitro digestion for 24 or 72 hours showed the smallest proportion of tissues
with thick and lignified cell walls like parenchyma bundle sheath (PBS) and
sclerenchyma. The urea treatment reduced too the period of time necessary to
tissues degradation. The urea-treated hay submitted to in vitro digestion for 12
hours showed the same proportion of remaining tissues found to untreated hay
submitted to 24 or 72 hours of in vitro digestion. The epidermis and lignified
vascular tissue showed the smallest degradation after in vitro digestion.
xi
INTRODUÇÃO
A maior parte do território brasileiro apresenta condições climáticas
definidas por uma estação chuvosa, na qual se concentra 75 a 85% da
produção de plantas forrageiras, e uma estação seca que responde por apenas
15 a 25% da produção forrageira anual.
A grande produção das forrageiras no período chuvoso, muitas vezes, é
sub-utilizada e parte acaba sendo perdida, enquanto que no período seco do
ano ocorre escassez de forragem para alimentação dos rebanhos. No entanto,
para que os animais mantenham bons níveis de produção ao longo do ano, faz-
se necessário o uso de volumosos de qualidade também no período seco, uma
vez que as exigências nutricionais dos animais permanecem as mesmas
durante todo ano.
A fenação pode ser uma boa opção para o aproveitamento do excesso de
forragem produzido no período chuvoso. No entanto, esta prática encontra
como obstáculo adequar o estádio de desenvolvimento ideal da forrageira, ou
seja, a produção máxima com elevado valor nutritivo, às condições apropriadas
para rápida desidratação do material (Burns, 1978; Seiffert, 1988). Com o
intuito de contornar os problemas climáticos que limitam os processos de
conservação, muitas vezes, opta-se pelo corte da forrageira no período de
outono, quando diminui o risco de chuvas. Entretanto, nessa época do ano,
geralmente ocorre queda acentuada no valor nutritivo das gramíneas
forrageiras tropicais em decorrência do florescimento (Reis et al., 2002).
Os fenos produzidos a partir de gramíneas de clima tropical, colhidas no
estádio de pós-florescimento, bem como as palhadas obtidas após a colheita
de grãos de cereais e sementes de gramíneas forrageiras, são alimentos
essencialmente energéticos, de baixo teor protéico e mineral, baixa
digestibilidade e baixo consumo voluntário.
1
Apesar de estes produtos serem considerados uma boa alternativa para a
alimentação dos rebanhos no período de escassez de forragem, geralmente,
eles possuem características que limitam o seu aproveitamento pelos animais,
podendo-se citar: elevado conteúdo de parede celular, alto teor de fibra em
detergente neutro e fibra em detergente ácido, teor elevado de lignina, baixa
disponibilidade de compostos nitrogenados e baixa digestibilidade da matéria
seca.
Segundo Van Soest et al. (1983), a matéria seca de uma planta forrageira
pode ser dividida em duas frações, sendo uma totalmente digestível (conteúdo
celular) e outra denominada constituinte da parede celular cuja digestibilidade é
variável.
Os animais ruminantes, ao longo de sua evolução, desenvolveram a
habilidade de utilizar as plantas como sua única fonte de nutrientes (Hofmann,
1989). Estes animais utilizam a forragem através de uma relação simbiótica
com microorganismos capazes de fermentar os polissacarídeos da parede
celular. No entanto, a baixa digestibilidade, a alta concentração de parede
celular e a lignificação acentuada nas forrageiras colhidas após o florescimento
limitam a disponibilidade de energia para os animais que consomem dietas
com elevada proporção de forragem (Wilson, 1993).
A parede celular é uma mistura complexa de polissacarídeos e outros
polímeros que são produzidos pela célula formando uma estrutura organizada,
unidos por ligações covalentes e não covalentes. A parede também contém
proteínas estruturais, enzimas, polímeros fenólicos e outras substâncias que
modificam as características estruturais da mesma (Taiz & Zeiger, 1998 ).
Do ponto de vista nutricional, a parede celular é a principal fonte de
energia para os ruminantes em todo mundo. Essa compreende 20 a 80% do
peso seco de forrageiras e é composta, principalmente, por hemicelulose,
pectina, celulose e lignina. Portanto, maximizar o ganho de energia a partir da
parede celular é importante para aumentar a eficiência da produção animal
(Wilson, 1994).
A parede celular é composta por três camadas distintas. A lamela média,
formada por substâncias pécticas, é a camada mais externa e divide as
paredes de células contíguas, exercendo uma função cimentante entre as
células (Brett & Waldron, 1996). A parede primária, depositada internamente à
lamela média, é formada por microfibrilas de celulose embebidas em uma
2
matriz amorfa composta por polissacarídeos como as hemiceluloses e as
pectinas. A parede secundária, interna à parede primária, é constituída por três
camadas (S1, S2 e S3), que se distinguem pela diferente orientação das
microfibrilas de celulose (Wilson, 1993).
O espessamento da parede celular e a deposição de lignina ocorrem da
região da parede primária em direção ao lúmen celular. A concentração de
lignina é maior na lamela média e parede primária, mas devido a sua
espessura a parede secundária contém a maior parte da lignina presente na
planta (Wilson, 1993).
O conteúdo de parede celular (CPC) de uma forrageira é nutricionalmente
importante, pois alimentos com alto CPC apresentam menor digestibilidade e
menor consumo pelos ruminantes (Minson, 1990). Os tipos de ligações que
formam os polissacarídeos, a espessura da parede e a deposição de lignina
são fatores que podem aumentar sua resistência e, em conseqüência, reduzir a
disponibilidade de sua energia para os ruminantes (Wilson, 1994).
A lignina, depois da celulose, é a substância orgânica mais importante
presente na planta. Esta, é um polímero de fenilpropanóides bastante
complexo. O ácido p-cumárico e o ácido ferrúlico são os principais
componentes da lignina e podem estabelecer diferentes propriedades a este
polímero ( Taiz & Zeiger, 1998).
A deposição de lignina reduz a porosidade efetiva da parede primária
aumentando sua resistência ao ataque dos microorganismos ruminais. A
progressiva retirada da água associada à parede, durante a lignificação, faz
com que a parede celular se converta de uma estrutura hidrofílica para uma
fortemente hidrofóbica, afetando a capacidade enzimática dos
microorganismos em degradar a parede celular (Chesson, 1993).
O CPC das forrageiras pode apresentar digestibilidade variando entre 30
e 60%. Entre os diferentes tipos celulares que compõe os tecidos da planta,
essa digestibilidade da parede celular pode variar de 0 a 100%, de acordo com
a composição desta parede (Wilson, 1994).
O CPC é maior em gramíneas com metabolismo fotossintético C4, e em
materiais colhidos em estádio avançado de maturação. O incremento na
maturidade de um pasto ou de uma folha individual, geralmente, leva ao
aumento no CPC e, conseqüentemente, a redução na digestibilidade desse
material, devido ao aumento na espessura e lignificação da parede celular, e a
3
redução no conteúdo de proteína e outros componentes solúveis das células
(Wilson, 1994).
As observações histológicas permitem avaliar mais claramente as
características da parede celular e sua influência sobre a qualidade nutritiva
dos alimentos, tanto em relação a baixa digestibilidade da forragem (Akin,
1989), quanto à dificuldade de quebra das partículas (Wilson, 1991).
Os tecidos que compõe a planta são constituídos por um conjunto de
células com características químicas e estruturais próprias, desempenhando
mesma função. Cada tecido possui composição química e física diretamente
relacionada à sua função na planta. Tecidos designados à sustentação da
planta possuem células densamente agrupadas, com paredes espessas e
lignificadas. Por outro lado, tecidos relacionados ao processo de assimilação
do carbono são ricos em cloroplastos e apresentam células com parede
delgada e não lignificada ( Mauseth, 1988; Fahn, 1985; Wilson, 1993).
Os principais tipos de tecidos que compõe a estrutura das gramíneas são:
epiderme, parênquima clorofiliano e incolor (mesofilo), bainha do feixe vascular,
tecido vascular (xilema e floema) e esclerênquima.
Os tecidos da lâmina foliar são diferenciados em tecidos condutores
(feixes vasculares), formados pelas células do xilema e do floema, em tecido
de suporte ou sustentação, o esclerênquima, que, em folhas de gramíneas,
está frequentemente associado aos feixes vasculares e, em tecido
assimilatório, formado pelas células do parênquima clorofiliano. Ambas as
superfícies da folha são cobertas pela epiderme, que por sua vez, é coberta na
face exterior pela cutícula.
A proporção dos tipos celulares com parede celular delgada ou espessa,
geralmente, é responsável pelas diferenças no CPC e digestibilidade entre os
diferentes tecidos e espécies. Estas proporções são mensuradas como a
porcentagem de área ocupada pelos diferentes tecidos em seções transversais
do material estudado (Wilson, 1994).
Os tipos celulares com parede celular secundária espessa, encontrados
no tecido vascular, esclerênquima e bainha do feixe vascular (BFV), são os
principais responsáveis pela baixa qualidade nutricional da forragem. Estes
tecidos apresentam células densamente agrupadas e, portanto, sua pequena
contribuição na área total dos tecidos, encobre seu grande efeito sobre a
qualidade da forragem. Eles formam blocos multicelulares sólidos, os quais
4
compreendem grandes partículas no rúmen, sendo, freqüentemente, pouco
digeridos devido a lignificação e dificuldade de acesso dos microorganismos
ruminais à superfície da parede celular (Wilson, 1994).
Quando as células que formam um tecido possuem apenas paredes
celulares primárias delgadas, como no mesofilo, floema e parênquima
fundamental, o alto CPC na forragem não representa um problema para sua
qualidade nutritiva. Esses tipos celulares não são lignificados e são facilmente
fragmentados em pequenas partículas (Wilson, 1991) apresentando,
geralmente, uma digestão rápida e completa (Chesson et al., 1986).
De acordo com a facilidade de digestão de suas paredes, os tipos
celulares podem ser classificados como segue: mesofilo, floema, BFV,
esclerênquima, epiderme, e feixe vascular lignificado (xilema + bainha de
mestoma) (Akin, 1989; Wilson, 1993).
As características da parede celular associadas com a estrutura
anatômica da planta, influenciam a facilidade de rompimento físico da forragem
por meio da mastigação e digestão, e o tamanho e forma das partículas
resultantes, as quais podem influenciar a taxa de passagem pelo rúmen e o
consumo do alimento pelo animal (Akin, 1989).
Quando a estrutura do tecido vegetal é mantida após a ingestão pelo
animal, o acesso dos microorganismos às células pode ser prejudicado devido
a forte junção das células contíguas, que impede a separação das mesmas
durante a digestão e, consequentemente, o acesso das bactérias à superfície
externa da parede de algumas partículas. Assim, a digestão fica restrita à
superfície interna da parede secundária, via lúmen das células que foram
abertas pela mastigação ou corte. O processo de digestão requer a adesão das
bactérias à superfície celular, sendo que as enzimas liberadas pelos
microorganismos agem apenas na superfície imediatamente adjacente, e a
proporção do total de parede digerida por unidade de tempo será mais
influenciada pela espessura da parede ( Wilson, 1997).
É importante estabelecer a diferença entre os termos parede celular e
fibra, que freqüentemente são utilizados como sinônimos nas discussões sobre
a qualidade da forragem. A parede celular, como já foi citado, é uma estrutura
biológica complexa constituída por muitas moléculas diferentes, cuja
biossíntese é controlada por enzimas e regulada por genes (Iiyama et al.,
1993).
5
A fibra em detergente neutro (FDN) e a fibra em detergente ácido (FDA),
são produtos analíticos que possuem características nutricionais que
descrevem aqueles componentes da forragem que possuem baixa solubilidade
em solventes específicos e são relativamente menos digestíveis que o amido.
A extração com detergente neutro separa os materiais da planta em
componentes celulares solúveis (açúcares, proteínas, amido, lipídios), os quais
são praticamente 100% digestíveis, e na FDN ou parede celular, a qual é
parcialmente digerida. A FDN é constituída, basicamente por celulose,
hemicelulose, lignina, proteínas da parede celular e minerais. A extração com
detergente ácido solubiliza a hemicelulose, e o produto restante é conhecido
como FDA, constituído por celulose, lignina, proteínas da parede e minerais
insolúveis (Wilson, 1994).
Nos estudos de anatomia vegetal o termo fibra é usado para designar
células longas, com extremidades afiladas, encontradas em tecidos de
sustentação como o esclerênquima e o tecido vascular lignificado. Essas
células apresentam parede celular secundária espessada, freqüentemente
lignificada (Mauseth, 1988; Fahn, 1995).
A organização estrutural ou a anatomia dos órgãos da planta, e seus
tecidos constituintes, além de influenciar o consumo pelo efeito que produzem
sobre a facilidade de fragmentação das partículas da forrageira, a natureza das
partículas produzidas e sua taxa de passagem pelo rúmen, influenciam
também na digestibilidade da parede celular, proporcionando maior ou menor
acessibilidade de seus polissacarídeos aos microorganismos do rúmen
(Wilson, 1993 ).
Portanto, para que os fenos de plantas colhidas no estádio de pós
florescimento, bem como outros sub-produtos agroindustriais, possam ser
utilizados na alimentação dos ruminantes de forma eficiente, deve-se buscar
alternativas que permitam aumentar o valor nutritivo desses materiais e seu
aproveitamento pelos animais, de forma que sejam minimizados os problemas
já mencionados como: elevado conteúdo de parede celular, alto teor de fibra,
baixa disponibilidade de compostos nitrogenados, alto teor de lignina e baixa
digestibilidade da matéria seca.
Nos últimos anos vêm se desenvolvendo diversos tipos de tratamentos
químicos, físicos e biológicos que têm por objetivo melhorar as características
desses volumosos para que possam ser melhor aproveitados pelos ruminantes.
6
Dentre as diferentes alternativas para o tratamento químico de volumosos,
a amonização, utilizando-se amônia anidra ou uréia, vem promovendo
resultados bastante satisfatórios (Dias-da-Silva & Sundstol, 1986; Brown &
Adjei, 1995; Sarmento et al., 1999; Reis et al., 2001; Granzin & Dryden, 2003 ).
Em trabalhos realizados mais recentemente a uréia vem surgindo como
uma alternativa para amonização de volumosos, por ser considerada um
produto de alta disponibilidade, menos perigoso à intoxicação humana e, na
maioria das vezes, menos oneroso que a amônia anidra (Sarmento, 1999),
além de o processo de aplicação ser mais fácil.
A uréia (NH CONH
2 2
) é um sólido cristalino produzido a partir da amônia e
do dióxido de carbono. Contém aproximadamente 45% de nitrogênio, e
necessita de umidade e da presença da enzima urease para que possa ser
transformada em amônia.
De modo geral, duas teorias explicam o efeito da amônia sobre os
constituintes da parede celular de forragens. A primeira, denominada
amonólise, baseia-se no rompimento de ligações éster entre moléculas de
hemicelulose e entre hemicelulose e lignina, por ação direta da amônia,
resultando na formação de amida (Tarkov & Feist, 1969). A segunda teoria
envolve uma hidrólise alcalina resultante da reação entre o hidróxido de
amônio, formado pela alta afinidade entre a amônia e a água, e as ligações do
tipo éster da parede celular (Buettner et al., 1982).
Dentre os principais efeitos da ação da amônia sobre as forragens de
baixo valor nutritivo, destaca-se a desestruturação do complexo formado pelos
componentes da fibra (celulose, hemicelulose, lignina) oferecendo aos
microorganismos maior área de exposição, aumentando o grau de utilização da
fração fibrosa. Outro efeito marcante da amonização é o aumento no teor dos
compostos nitrogenados, que geralmente é baixo e limita o crescimento do
microrganismos ruminais (Garcia & Neiva, 1994).
Segundo Coelho da Silva (1984), os teores de proteína bruta dos resíduos
fibrosos, na maioria das vezes, não chegam a atender a metade das exigências
dos ruminantes, em regime de engorda, com desempenho baixo a moderado.
De acordo com Van Soest (1994), os compostos nitrogenados provenientes da
amonização podem contribuir para o aumento da digestibilidade dos alimentos
fibrosos, por suprir a deficiência de nitrogênio no rúmen.
7
Inúmeros trabalhos de pesquisa, realizados com diferentes tipos de
alimentos, têm constatado aumentos nos teores de nitrogênio após a
amonização desses materiais (Reis et al., 1990; Paiva et al., 1995a; Ballet et
al., 1997; Souza et al., 2001; Granzin & Dryden, 2003). Mas apesar de esses
trabalhos relatarem aumentos expressivos no conteúdo de compostos
nitrogenados de forragens amonizadas, a retenção do nitrogênio adicionado
sofre grande variação, o que pode ser atribuído aos diversos fatores que
influenciam o processo de amonização como : níveis de aplicação, períodos de
amonização, temperatura ambiente, umidade e qualidade do material.
Uma vez que os compostos nitrogenados são retidos por meio de uma
reação da amônia com a água dos materiais tratados e, ou, de uma reação de
amonólise, a retenção de nitrogênio seria, portanto, limitada primeiramente pelo
teor de umidade do material, bem como pelo número de ligações ésteres
susceptíveis à reação de amonólise (Cardoso, 2000).
Schneider & Flachowsky (1990) constataram melhoria na retenção do
nitrogênio adicionado a palha de trigo, quando o conteúdo de umidade foi
elevado de 12 para 30 %. Dryden & Leng (1986) relataram que parte do
nitrogênio adicionado via amonização é dissolvida no conteúdo de água livre
das forragens e outra permanece ionicamente ligada aos ânions presentes no
material. Assim, a quantidade de nitrogênio que permanece retido, após
aeração do material tratado, dependerá do número de sítios de ligação e do
conteúdo de umidade, e não do nível de aplicação de amônia.
O aproveitamento do nitrogênio não-protéico (NNP) na síntese de
proteína microbiana irá depender da forma em que esse nitrogênio se encontra
retido nos volumosos amonizados. Nestes volumosos tratados, o nitrogênio (N)
pode estar retido sob diferentes formas, sendo as mais importantes em termos
nutricionais, o N solúvel em água, o N amoniacal (N-NH3), o N retido na fração
insolúvel em detergente neutro (NIDN), e o N insolúvel em detergente ácido
(NIDA) (Reis, 1997). Uma vez que o nitrogênio solúvel em água e o nitrogênio
amoniacal podem ser facilmente assimilados pelos microorganismos ruminais,
o que determinará a disponibilidade total de nitrogênio para o animal será a
disponibilidade do nitrogênio ligado a parede celular (Gordon & Chesson,
1983).
O sistema de avaliação de dietas para ruminantes proposto por Fox et al.,
(1990), denominado “Cornell Net Carbohydrate and Protein System” (CNCPS),
8
propõe a divisão dos compostos nitrogenados do alimento em três frações,
denominadas A, B e C, em função de sua disponibilidade para os
microorganismos do rúmen.
A fração A, corresponde ao nitrogênio proveniente da amônia, peptídeos
e aminoácidos, constituindo toda a proteína solúvel do alimento e sendo
considerada de disponibilidade rápida.
A fração B é subdividida nas frações B1, B2 e B3, de acordo com as taxas
de degradação das diferentes formas do nitrogênio que compõem a proteína
verdadeira do alimento.
A fração B1 corresponde a proteína que apresenta rápida degradação no
rúmen e equivale a quase toda a proteína solúvel das forrageiras. A fração B2
é a proteína verdadeira que apresenta velocidade média de degradação no
rúmen (Sniffen et al., 1992). A proteína associada a parede celular, equivalente
a fração B3, apresenta degradação lenta, e parte escapa à degradação
ruminal. Analiticamente esta fração B3 corresponde ao nitrogênio insolúvel em
detergente neutro (NIDN) menos o nitrogênio insolúvel em detergente ácido
(NIDA).
A proteína indisponível, fração C, corresponde ao nitrogênio insolúvel em
detergente ácido (NIDA). Esta fração equivale a proteína associada à lignina,
complexos proteína-tanino e produtos da reação de Maillard que são altamente
resistentes à ação enzimática.
A importância de se conhecer os teores de NIDA dos alimentos, baseia-se
no fato de que os compostos nitrogenados presentes nesta forma são
indisponíveis para o animal (Sniffen et al., 1992).
Podem ocorrer aumentos nos teores de NIDN e NIDA das forragens,
quando amonizadas, reduzindo a disponibilidade de nitrogênio total nesses
materiais (Van Soest & Mason, 1991).
O efeito da amonização sobre a fração fibrosa dos volumosos tratados
tem mostrado algumas contradições. A fração da FDN, normalmente, diminui,
em razão da solubilização parcial da hemicelulose (Birkelo et al., 1986; Ferreira
et al., 1990; Oliveros et al., 1993; Rosa et al., 1998; Cañeque et al., 1998;
Granzin & Dryden, 2003), mas em alguns casos estes efeitos não são relatados
(Glenn, 1990; Bem Salem et al., 1994; Djibrillou et al., 1998). Quanto aos
teores de FDA, celulose e lignina apesar de a maioria dos trabalhos mostrarem
a não alteração destes componentes (Reis et al., 1990a,b; Bem Salem et al.,
9
1994; Paiva et al., 1995b; Moreira et al., 1996; Pires et al., 1996; Reis et al.,
1998b), alguns relatam diminuição nos teores de FDA (Hai & Singh, 1994;
Reddy et al., 1993), celulose (Grossi et al., 1993; Pires et al., 1998) e lignina
(Pereira et al., 1993; Reddy et al., 1993; Brown & Adjei, 1995; Reis et al.,
1998a). Já outros trabalhos têm indicado aumentos nos teores de FDA
(Teixeira, 1990; Grossi et al., 1993; Neiva et al., 1998) celulose (Givens et al.,
1988; Teixeira, 1990; Reis et al., 1993) e lignina (Givens et al., 1988).
Os aumentos no conteúdo de FDA, celulose e lignina em volumosos
tratados com amônia podem ser resultantes do efeito de concentração causado
pela diminuição de um ou mais constituintes da parede celular (Givens et al.,
1988). Os aumentos nos teores de FDA e lignina também podem ocorrer
devido à reação de Maillard e, ou, devido à retenção de nitrogênio nestas
frações (Van Soest & Mason, 1991; Goto et al., 1993)
Segundo Fahmy & Klopfenstain (1994), o acréscimo da fração FDA tem
sido atribuído ao nitrogênio adicionado, que se apresenta, em parte, na forma
de NIDA. Quando se observa diminuição da FDA, parte da lignina pode ter sido
solubilizada.
De acordo com Leal et al. (1994), a redução no conteúdo de FDA da
palhada tratada com amônia pode estar associada com a solubilização da
lignina e da celulose, que ocorre devido ao decréscimo da cristalinidade da
celulose, além da sua expansão e saponificação das ligações ésteres entre
lignina e hemicelulose.
A lignina e os ácidos fenólicos esterificados são os principais fatores
químicos que limitam a digestão ruminal dos constituintes da parede celular. O
mecanismo pelo qual a lignina exerce efeito negativo na degradação da parede
celular ainda não foi completamente elucidado, contudo, parte do seu efeito é
atribuído a uma proteção física dos polissacarídeos à hidrólise enzimática
(Jung, 1989). Os ácidos fenólicos, principalmente p-cumárico e ferrúlico, além
de promoverem a ligação entre hemicelulose e lignina, também fazem ligações
cruzadas entre polissacarídeos, aumentando a rigidez estrutural e reduzindo a
taxa de degradação destes polissacarídeos (Jung & Deetz, 1993). Os possíveis
mecanismos que promovem o incremento da degradabilidade de materiais
amonizados incluem, a liberação dos ácidos fenólicos da parede celular e a
solubilização da lignina acompanhada pela clivagem das ligações éster nos
complexos lignina-polissacarídeos (Chesson, 1988).
10
Goto et al. (1993) observaram que a amônia fragiliza as estruturas
internas e externas da parede celular, afetando os conteúdos de ácidos
fenólicos e grupos acetil dos polissacarídeos da parede celular e facilitando o
acesso de microorganismos do rúmen a parede celular.
A suposição de que as forragens amonizadas propiciariam melhores
condições para a colonização de microorganismos ruminais foi confirmada por
Silva & Orskov (1988). Nessa pesquisa, a palhada amonizada apresentou
maior degradabilidade in situ e maior número de bactérias celulolíticas aderidas
à parede celular que a não tratada.
Segundo Goto & Yokoe (1996), existem dois efeitos distintos que, juntos,
atuam aumentando a degradabilidade de palhadas tratadas com amônia. O
primeiro, diz respeito a amônia agindo como um álcali e promovendo pequenos
rompimentos nos interpolímeros que ligam estruturas contendo ligações do tipo
éster. Isso resultaria em rompimento da estrutura da parede celular e aumento
na sua hidratação. O segundo, refere-se à habilidade da amônia formar
complexos com a celulose, reduzindo sua cristalinidade, através do
rompimento de pontes de hidrogênio; aumentando a sua fragilidade; e
proporcionando melhor digestão enzimática. Esses fatores, em conjunto,
promovem fragmentação mais rápida do material ingerido e melhoram a
eficiência dos microorganismos no ataque às partículas de alimento.
As técnicas de anatomia vegetal podem ser usadas para avaliar a
estrutura dos tecidos da planta e a digestão de plantas forrageiras, de forma a
elucidar os fatores que afetam a degradação da forragem pelos
microorganismos ruminais (Akin, 1979). Inúmeros trabalhos de pesquisa,
utilizando diferentes tipos de plantas forrageiras, relacionam as características
anatômicas das plantas com sua degradação pelos microorganismos ruminais
(Hanna et al., 1973; Akin & Burdick, 1975; Wilson et al., 1983; Akin, 1989; Brito
et al., 1997; Ventrella et al., 1997; Paciullo et al., 2001)
Apesar de o entendimento sobre as características anatômicas e
histológicas das plantas forrageiras ser de fundamental importância para
garantir seu melhor aproveitamento pelo animal, bem como para explicar o
efeito de alguns tratamentos químicos, como a amonização, na melhoria da
qualidade dos volumosos tratados, existem poucos trabalhos de pesquisa que
avaliam estas características, em conjunto com as características químico-
bromatológicas das forrageiras (Goto et al., 1993; Leal et al., 1994; Goto &
11
Yokoe, 1996; Shen et al., 1999). Além disso, a maioria dos trabalhos
relacionados a este assunto são, geralmente, realizados utilizando-se
gramíneas de clima temperado (C3), que por sua vez, possuem características
bastante distintas das gramíneas de clima tropical, que predominam em nosso
país.
Sendo assim, pode-se perceber a importância e necessidade da
integração entre os estudos histo-anatômicos e químico-bromatológicos na
definição de propostas mais eficazes com relação ao tratamento de forragens
de baixa qualidade, proporcionando seu melhor aproveitamento pelos
ruminantes.
Este trabalho foi descrito na forma de dois artigos científicos elaborados
de acordo com as normas da Revista Brasileira de Zootecnia.
12
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18
Composição Químico-bromatológica e Digestibilidade In Vitro do Feno de
Brachiaria decumbens Stapf. Tratado com Uréia
RESUMO – Avaliaram-se os efeitos da adição de uréia em níveis
crescentes, sobre a composição químico-bromatológica e digestibilidade in vitro
da matéria seca (DIVMS) do feno de capim-braquiária colhido no estádio de
pós-florescimento. O feno de capim-braquiária com 89% de matéria seca (MS)
foi tratado com seis níveis de uréia (0, 2, 4, 6, 8 e 10%) com base na MS. A
uréia foi dissolvida em quantidade suficiente de água, para elevar o teor de
umidade do feno para 30%. O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, com três repetições. O feno tratado foi armazenado
em sacos plásticos (2 kg/saco) vedados, por 35 dias e, após abertura foram
coletadas amostras para as análises laboratoriais. Verificou-se que o teor de
nitrogênio total (NT) aumentou linearmente em função dos níveis crescentes de
uréia. O teor de nitrogênio insolúvel em detergente neutro (NIDN) apresentou
comportamento quadrático, estimando-se valor máximo de 0,56%, referente ao
nível de 6,67% de uréia, enquanto o teor de nitrogênio insolúvel em detergente
ácido (NIDA) não foi alterado pelo tratamento com uréia. Os teores de NIDN e
NIDA em relação ao nitrogênio total (NIDN/NT e NIDA/NT), tiveram redução
linear em função dos níveis crescentes de uréia, demonstrando aumento nos
teores de nitrogênio disponível no material amonizado. A adição de uréia
promoveu redução no teor de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em
detergente ácido (FDA) e celulose. Os teores de hemicelulose e lignina não
foram alterados pelo tratamento com uréia. A digestibilidade in vitro da matéria
seca (DIVMS) foi influenciada de forma quadrática pelos níveis de uréia,
estimando-se valor máximo de 68,9% para o nível de 7,15% de uréia. A
amonização com uréia alterou a composição química e a digestibilidade do
feno de capim-braquiária, melhorando o valor nutritivo do material tratado,
demonstrando ser esta uma boa alternativa para obtenção de forragem de
qualidade durante a estação seca do ano.
Palavras-chave: amonização, digestibilidade, NIDA, NIDN, nitrogênio total
parede celular.
19
Bromatological Composition and In Vitro Digestibility of Brachiaria
decumbens Stapf. Hay Treated with Urea
ABSTRACT – An experiment was conducted to evaluate the effects of urea
treatment on the chemical-bromatologic compounds and in vitro dry matter
digestibility (IVDMD) of Signal grass hay (Brachiaria decumbens Stapf.). In the
trial, 2kg portions of hay were reconstituted with water to get final forage
moisture concentration of 30%, and treated with urea at 0, 2, 4, 6, 8, and 10%
of the forage dry matter. A completely randomized design with three replicates
was used. The material was stored in plastic bags (2kg/plastic bag) for 35 days,
and after plastic bag opening, samples were collected to chemical analysis. Hay
total nitrogen (TN) concentration increased linearly with increasing urea level.
The chemical treatment with urea increased neutral detergent insoluble nitrogen
(NDIN), whereas acid detergent insoluble nitrogen (ADIN) was not affected. The
NDIN/total nitrogen and ADIN/total nitrogen ratios decreased with increasing
urea level. The neutral detergent fibre (NDF), acid detergent fibre (ADF) and
cellulose contents decreased due to ammoniation with urea. The hemicellulose
and lignin contents were no affected with urea treatment. The in vitro dry matter
digestibility (IVDMD) had a quadratic response to the increasing urea level
reaching the maximum digestibility of 68,9% at the 7,15% urea level. Urea
ammoniation altered the chemical composition and digestibility of the Signal
grass hay, improving the nutritive value of forage and providing an option for
forage quality improvement during the dry season.
Keywords: ADIN, ammoniation, cell wall, digestibility, NDIN, total nitrogen.
20
Introdução
A maior parte do território brasileiro apresenta condições climáticas
definidas por uma estação chuvosa, na qual se concentra 75 a 85% da
produção das plantas forrageiras, e uma estação seca, que responde por
apenas 15 a 25% da produção forrageira anual.
A grande produção das forrageiras no período chuvoso, muitas vezes, é
sub-utilizada e parte acaba sendo perdida, enquanto que no período seco do
ano ocorre escassez de forragem para alimentação dos rebanhos. No entanto,
para que os animais mantenham bons níveis de produção ao longo do ano, faz-
se necessário o uso de volumosos de qualidade também no período seco, uma
vez que as exigências nutricionais dos animais permanecem as mesmas
durante todo ano.
A fenação pode ser uma boa opção para o aproveitamento do excesso de
forragem produzida no período chuvoso. No entanto, essa prática encontra
como obstáculo adequar o estádio de desenvolvimento ideal da forrageira, ou
seja, a produção máxima com elevado valor nutritivo, às condições apropriadas
para rápida desidratação do material (Burns, 1978; Seiffert, 1988). Dessa
forma, com o intuito de contornar os problemas climáticos que limitam os
processos de conservação, muitas vezes, opta-se pelo corte da forrageira no
período de outono, quando diminui o risco de chuvas. Entretanto, nesta época
do ano, geralmente ocorre queda acentuada no valor nutritivo das gramíneas
forrageiras tropicais em decorrência do florescimento (Reis et al., 2002).
Os fenos produzidos a partir de gramíneas de clima tropical colhidas no
estádio de pós-florescimento, bem como as palhadas obtidas após a colheita
de grãos de cereais e sementes de gramíneas forrageiras, são alimentos
essencialmente energéticos, de baixo teor protéico e mineral, baixa
digestibilidade e baixo consumo voluntário.
Apesar de esses produtos serem considerados uma alternativa para a
alimentação dos rebanhos no período de escassez de forragem, eles possuem
características que limitam seu aproveitamento pelos animais, podendo-se
citar: o elevado conteúdo de parede celular, alto teor de fibra (FDN, FDA), teor
elevado de lignina, baixa disponibilidade de compostos nitrogenados e baixa
digestibilidade da matéria seca.
21
Para que esses volumosos de baixa qualidade, possam ser utilizados de
forma eficiente na alimentação de ruminantes, deve-se buscar alternativas que
permitam aumentar seu valor nutritivo e seu aproveitamento pelos animais, de
modo que sejam minimizados os problemas mencionados anteriormente.
Nos últimos anos vêm se desenvolvendo diversos tipos de tratamentos
químicos, físicos e biológicos que têm por objetivo melhorar as características
desses volumosos para que possam ser melhor aproveitados pelos ruminantes.
Dentre as diferentes alternativas para o tratamento químico de volumosos,
a amonização, utilizando-se uréia como fonte de amônia, vem promovendo
resultados bastante satisfatórios (Sarmento et al., 1999; Reis et al., 2001a,b,c;
Granzin & Dryden, 2003 ). O uso da uréia para o tratamento químico de
volumosos vem se firmando como uma alternativa viável, por se tratar de um
produto com grande disponibilidade no mercado, fácil de ser aplicado, menos
perigoso à intoxicação humana e, na maioria das vezes, menos oneroso que a
amônia anidra.
Diversos resultados de pesquisa têm mostrado que o tratamento de
volumosos de baixa qualidade, utilizando-se fontes de amônia, pode melhorar a
qualidade desses produtos, elevando de forma significativa seu valor nutritivo e
conseqüentemente seu consumo e aproveitamento pelos animais (Dias-da-
Silva & Sundstol, 1986; Brown & Adjei, 1995; Cardoso, 2000; Reis et al., 2001;
Granzin & Dryden, 2003 ). No entanto, os resultados obtidos são bastante
variáveis.
Sendo assim, conduziu-se esse experimento, objetivando-se avaliar as
alterações na composição químico-bromatológica do feno de capim-braquiária
(Brachiaria decumbens Stapf.), tratado com diferentes níveis de uréia.
Material e Métodos
O Experimento foi conduzido nas dependências do Departamento de
Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em Viçosa-MG, no
período de 12 de dezembro de 2002 a 16 de janeiro de 2003. As análises
laboratoriais foram realizadas nos Laboratórios de Nutrição Animal e de
Forragicultura do Departamento de Zootecnia da UFV.
O feno foi produzido com o capim-braquiária, colhido no estádio de pós-
florescimento. Este foi tratado com os seguintes níveis de uréia: 0 (controle), 2,
22
4, 6, 8 e 10%, na base da matéria seca. A composição químico-bromatológica
do feno de capim-braquiária utilizado no ensaio experimental encontra-se na
Tabela 1.
Tabela 1. Composição químico-bromatológica do feno de capim-braquiária
utilizado no ensaio experimental.
Item %
Matéria Seca 85,4
Nitrogênio Total (%MS) 0,87
NIDN /NT 48,8
NIDA /NT 24,8
FDN (%MS) 87,8
FDA (%MS) 49,7
Hemicelulose (%MS) 36,1
Celulose (%MS) 38,4
Lignina (%MS) 10,2
DIVMS 54,0
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com
seis tratamentos e três repetições.
O feno tratado ou não com uréia foi acondicionado em sacos plásticos
etiquetados, vedados e armazenados em galpão coberto.
As quantidades de uréia utilizadas para amonização do feno foram
calculadas de acordo com a quantidade de feno a ser tratado (2 kg feno/saco)
e com o teor de matéria seca do material. A uréia foi dissolvida em quantidade
suficiente de água para elevar o teor de umidade do feno para 30%. Procedeu-
se a distribuição da mesma sobre as camadas de feno, dentro dos sacos, com
auxílio de um regador.
O material tratado foi armazenado em galpão coberto por 35 dias e ao
final deste período, os sacos foram abertos e submetidos a um período de
aeração de 24 horas, para que a amônia que não reagiu com o material fosse
eliminada.
A coleta de amostras de cada tratamento foi feita após a homogeneização
do material contido em cada saco, sendo em seguida acondicionadas em
23
sacos plásticos e armazenadas em congelador. As amostras utilizadas nas
análises químico-bromatológicas não sofreram pré-secagem em estufa,
evitando-se assim, a perda de nitrogênio. Estas foram colocadas em sacos
plásticos e congeladas em nitrogênio líquido, sendo imediatamente moídas em
moinho com peneira de 1mm. As amostras moídas foram acondicionadas em
recipientes com tampa, etiquetados e armazenados em geladeira.
Foram determinados os teores de matéria seca (MS), nitrogênio total
(NT), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA),
lignina, hemicelulose, celulose, nitrogênio insolúvel em detergente ácido (NIDA)
e nitrogênio insolúvel em detergente neutro (NIDN), além da digestibilidade “in
vitro” da matéria seca, segundo metodologias descritas por Silva e Queiroz
(2002).
Os resultados obtidos foram interpretados estatisticamente por meio de
análises de variância e de regressão. Os modelos que melhor explicaram o
comportamento das variáveis, foram escolhidos com base no coeficiente de
determinação ajustado; pela significância da regressão e da falta de
ajustamento, testados pelo teste F; pela significância dos coeficientes de
regressão, testada pelo teste “t” adotando-se o nível de 1% de probabilidade.
As análises estatísticas foram realizadas, utilizando-se os procedimentos
de modelos lineares gerais (GLM) e de regressão (REG) do Sistema para
Análises Estatísticas SAS (1990).
Resultados e Discussão
Os teores percentuais médios de nitrogênio total (NT), nitrogênio insolúvel
em detergente neutro (NIDN), nitrogênio insolúvel em detergente ácido (NIDA)
e NIDN e NIDA em relação ao nitrogênio total (NIDN/NT e NIDA/NT), do feno
de capim-braquiária tratado com diferentes níveis de uréia, juntamente com
suas equações de regressão e coeficientes de determinação, são
apresentados na Tabela 2.
O teor de nitrogênio total do feno cresceu linearmente (P<0,001) com o
incremento dos níveis de uréia (Tabela 2). Isto pode ser explicado pelo fato de
ter-se adicionado ao feno, níveis crescentes de nitrogênio não-protéico (NNP).
Aumentos nos teores de NT para níveis crescentes de uréia, também foram
encontrados nos trabalhos realizados por Brown & Adjei (1995), Cândido et al.
24
(1999) e Granzin & Dryden (2003), com feno de capim-colonião, bagaço de
cana e capim de rhodes, respectivamente.
É importante considerar que o teor de NT do feno não tratado com uréia é
baixo (0,86%), sendo considerado inadequado para suprir os requerimentos
nutricionais dos ruminantes em produção (Van Soest, 1984). Portanto, o
tratamento do feno com uréia, e o conseqüente aumento no teor de NT, pode
contribuir para suprir esta necessidade de nitrogênio para síntese microbiana e,
ou, reduzir a necessidade de uma fonte suplementar de nitrogênio para o
rebanho.
Foi observado efeito (P<0,001) dos níveis de uréia sobre os teores de
nitrogênio insolúvel em detergente neutro (NIDN), cujos dados ajustaram-se a
um modelo quadrático (Tabela 2), estimando-se valor máximo de 0,56%, para
fenos tratados com 6,67% de uréia. Constata-se pois, que a aplicação de uréia
pode aumentar a retenção de nitrogênio na parede celular. Por outro lado, não
observou-se efeito de níveis de uréia sobre o teor de NIDA, registrando-se
valor médio de 0,24%.
Tabela 2. Valores observados de nitrogênio total (NT), nitrogênio insolúvel em
detergente neutro (NIDN), nitrogênio insolúvel em detergente ácido
(NIDA) e NIDN e NIDA em relação ao nitrogênio total (NIDN/NT e
NIDA/NT), juntamente com suas respectivas equações de regressão
e coeficientes de determinação, ajustadas em função dos níveis de
uréia (U).
Nível de uréia (%)
Item
Equação de regressão
0 2 4 6 8 10
NT
1
0,87 1,62 2,29 2,99 3,92 4,03
Ŷ = 0,9513 + 0,3330***U (r
2
=0,98)
NIDN
1
2
0,42 0,49 0,56 0,56 0,54 0,54
Ŷ = 0,4301 + 0,0387***U – 0,0029***U (R
2
=0,93)
NIDA
1
0,21 0,23 0,25 0,26 0,26 0,22
Ŷ = 0,24
NIDN/NT 48,8 30,7 24,6 18,5 14,1 13,6
Ŷ = 41,6164 – 3,3153***U (r
2
=0,84)
NIDA/NT 24,8 14,4 11,0 8,8 6,6 5,5
Ŷ = 20,5858 – 1,7439***U (r
2
=0,79)
1
valores observados, expressos em %MS
*** significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste “t”
25
Granzin & Dryden (2003), utilizando capim-de-rhodes tratado com 0, 2, 4,
6 e 8% de uréia com base na MS, também não verificaram efeito da uréia
sobre os teores de NIDA do capim. Isto sugere que o nitrogênio dosado foi
pouco retido na porção insolúvel em detergente ácido (celulose e lignina), ou
ainda, que ocorreu uma solubilização parcial destes compostos, sendo
importante considerar que os compostos nitrogenados presentes na forma de
NIDA, são indisponíveis para os animais (Sniffen et al., 1992).
A relação NIDN/NT e NIDA/NT diminuiu (P<0,001) em resposta a
amonização com uréia e os dados ajustaram-se a modelos lineares (Tabela 2).
Ao se estimar a quantidade de nitrogênio disponível (ND), correspondente
a soma das frações A, B1 e B3 no sistema de avaliação de dietas para
ruminantes, proposto por Fox et al. (1990), encontraram-se os valores médios
de 0,44; 1,13; 1,73; 2,43; 3,38 e 3,49 para os níveis de 0; 2; 4; 6; 8 e 10% de
uréia, respectivamente. As frações A, B1 e B2 equivalem ao N-NH3, peptídeos
e aminoácidos (A), proteína verdadeira rapidamente degradada no rúmen (B1)
e proteína verdadeira com velocidade média de degradação ruminal (B2). O
aumento gradual no teor de ND em função dos níveis de uréia, evidencia que a
adição de nitrogênio não-protéico (NNP) promoveu diluição dos conteúdos de
NIDN e NIDA, tendo como conseqüência um aumento na disponibilidade de
nitrogênio para os microorganismos ruminais.
Campos (1995), Reis et al. (1998, 2001c) e Souza et al.(2001), obtiveram
resultados semelhantes, evidenciando os efeitos positivos da amonização
sobre a fração nitrogenada dos volumosos tratados.
Os teores médios de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em
detergente ácido (FDA), hemicelulose, celulose e lignina do feno de capim-
braquiária tratado com uréia, e suas respectivas equações de regressão
encontram-se na Tabela 3.
O teor de FDN do feno foi influenciado de forma quadrática (P<0,01),
pelos níveis de uréia (Tabela 3), estimando-se valor mínimo de 81,0% para o
nível de 9,05% de uréia. Esta redução nos teores de FDN, pode ser atribuída
ao fato de ocorrer solubilização parcial da fração hemicelulose da parede
celular (Van Soest et al., 1984).
Nos trabalhos conduzidos por Reis et al. (2001b), Fernandes et al.(2002)
e Granzin & Dryden (2003), com amonização de fenos de gramíneas tropicais,
feno de capim-braquiária, e capim-de-rhodes, respectivamente, também
26
observo-se redução nos teores de FDN devido ao tratamento dos volumosos
com uréia.
Tabela 3. Teores médios de fibra em detergente neutro (FDN), fibra em
detergente ácido (FDA), hemicelulose (HEM), celulose (CEL) e
lignina do feno e suas respectivas equações de regressão, ajustadas
em função dos níveis de uréia (U).
Nível de uréia (%)
Item
Equação de regressão
0 2 4 6 8 10
FDN
1
87,7 86,3 84,2 80,5 80,1 81,3
Ŷ = 88,4638 – 1,6381***U + 0,0905**U
2
(R
2
=0,92)
FDA
1
49,7 49,0 45,5 45,6 44,5 43,9
Ŷ = 49,4134 – 0,6096***U (r
2
=0,89)
HEM
1
38,0 37,3 38,6 35,0 35,7 37,4
Ŷ = 37,0
CEL
1
38,4 38,2 36,1 35,5 35,0 34,6
Ŷ = 38,3777 – 0,4125***U (r
2
=0,91)
Lignina
1
10,2 10,2 8,9 8,8 8,8 8,3
Ŷ = 9,2
1
valores observados, expressos em %MS
*** significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste “t”
** significativo a 1% de probabilidade pelo teste “t”
Em relação aos teores de hemicelulose, não foi observado efeito de níveis
de uréia, estimando-se valor médio de 37,0%. No entanto, boa parte dos
estudos sobre a amonização de volumosos com uréia tem registrado
diminuição nos teores dessa fração da parede celular (Brown & Adjei, 1995;
Rosa et al. 1998, Reis et al. 2001b). Uma justificativa para este comportamento
da hemicelulose, pode ser o fato de a mesma ser calculada a partir da
diferença entre os teores de FDN e FDA, uma vez que as curvas de redução de
FDN e FDA apresentaram comportamento diferenciado (quadrático e linear,
respectivamente), em relação aos tratamentos com uréia. A Figura 1 apresenta
as curvas de resposta dos teores de FDN, FDA e hemicelulose do feno, em
função dos níveis de uréia.
Os teores de FDA e celulose foram reduzidos linearmente (P<0,001) em
função dos níveis de uréia. Esse comportamento pode ser justificado pelo fato
de que quando materiais fibrosos são tratados com produtos alcalinos, como a
uréia, as ligações intermoleculares, mais especificamente as pontes de
hidrogênio, entre as moléculas de celulose, se rompem, solubilizando parte
27
deste componente da parede celular (Van Soest, 1994). Segundo Klopfenstein
et al. (1978), a redução no conteúdo de FDA nos materiais amonizados está
associada com a solubilização de lignina e celulose, presumidamente como um
resultado da redução da cristalinidade da celulose e também devido a sua
expansão e saponificação das ligações éster entre lignina e hemicelulose.
30
40
50
60
70
80
90
0246810
Níveis de Uréia (%MS)
Teores Percentuais (%MS)
FDN
FDA
HEM
Figura 1. Estimativas de teores médios de fibra em detergente neutro (FDN),
fibra em detergente ácido (FDA) e hemicelulose (HEM), do feno de
capim braquiária, em função dos níveis de uréia.
Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Reddy et al. (1993)
Hai Singh et al. (1994) e Leal et al. (1994), que observaram redução nos teores
de FDA de feno de sorgo, palhada de aveia e palhada de sorgo,
respectivamente, tratados com fontes de amônia. Já Fahmy e Klopfenstein
(1994), Leal et al. (1994) e Shen et al. (1998) também relataram redução no
teor de celulose de volumosos amonizados.
A exemplo da hemicelulose, o teor de lignina não foi influenciado pelos
níveis de uréia, registrando-se valor médio de 9,2% (Tabela 3). Shen et al.
(1998), Souza et al. (2001) e Reis et al. (2001b), também não detectaram efeito
da amonização sobre o teor de lignina. No entanto, as respostas do teor de
lignina de volumosos em relação a amonização é bastante variável e
contraditória.
28
É importante considerar, que as respostas à amonização de volumosos
variam em função de diversos fatores, como o conteúdo de umidade do
material tratado e características químicas da planta (Van Soest, 1994).
A digestibilidade in vitro foi influenciada de forma quadrática (P<0,001)
pelos níveis de uréia, estimando-se valor máximo de 68,9% para o nível de
7,15% de uréia, conforme a equação de regressão Ŷ = 54,0025 + 4,1916***U –
0,2931***U
2
(r
2
=0,99).
Os aumentos na DIVMS de materiais amonizados devem-se à ação da
amônia sobre os constituintes da parede celular. A amônia pode agir sobre as
moléculas de hemicelulose promovendo o rompimento de ligações e a
solubilização parcial deste componente, facilitando a ação dos microrganismos
ruminais sobre a parede celular (Klopfenstein, 1978). Além disso, existe a
possibilidade de a amônia promover o rompimento das pontes de hidrogênio
entre as moléculas de celulose, promovendo sua solubilização parcial (Van
Soest, 1994), e entre as moléculas de celulose e hemicelulose, permitindo uma
hidratação mais rápida e eficiente da parede celular, facilitando o acesso dos
microrganismos ruminais e aumentando a digestão (Berger et al., 1994).
Cabe salientar que no presente estudo, a amonização do feno promoveu
uma solubilização parcial dos constituintes da parede celular, o que,
provavelmente, resultou em incremento no conteúdo de carboidratos
prontamente digestíveis (Van Soest, 1994). A amonização do feno também
promoveu um aumento no conteúdo de nitrogênio disponível, o que por sua vez
também favorece a ação dos microrganismos ruminais, aumentando a
digestibilidade do feno.
Para determinação da DIVMS do feno, utilizou-se a técnica proposta por
Tilley & Terry (1963), que considera como digerida a porção não recuperada
após as etapas de fermentação e digestão com pepsina ácida. Portanto é
importante salientar que no presente estudo não ocorreu solubilização
significativa da lignina, bem como não se detectou a formação de produtos da
reação de Maillard (o teor de NIDA não foi alterado), os quais seriam
considerados como digeridos pela técnica da digestão “in vitro”, promovendo
uma superestimativa dos valores de digestibilidade (Van Soest & Mason,
1991).
29
Conclusões
A amonização via uréia proporcionou melhoria no valor nutritivo do feno
de capim-braquiária, o que pode ser comprovado pela elevação no teor de
nitrogênio disponível e na DIVMS, bem como pela redução dos conteúdos de
FDN e FDA, e das relações NIDN/NT e NIDA/NT.
Recomenda-se a adição de 7% de uréia (base da MS), visto que esse
nível proporcionou máxima digestibilidade in vitro da matéria seca.
30
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33
Degradação de tecidos foliares de feno de Brachiaria decumbens Stapf.
tratado com uréia e submetido a digestão in vitro.
RESUMO – Avaliou-se a degradação de tecidos foliares do feno de capim-
braquiária tratado com diferentes níveis de uréia (0, 2, 4 e 8% base da MS) e
submetido à diferentes tempos de digestão in vitro (0, 6, 12, 24 e 72 horas). O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, num arranjo
fatorial 4 x 5 com três repetições. O feno tratado ou não com uréia foi
armazenado em sacos plásticos (2kg feno/saco) por 35 dias e, após abertura
foram coletadas amostras para as análises anatômicas. Coletou-se a primeira
folha completamente expandida, contada a partir do ápice do perfilho. Foram
retirados segmentos de aproximadamente 2mm da porção mediana da lâmina
foliar, os quais foram secionados transversalmente em micrótomo de gelo
obtendo-se seções de 20 µm de espessura. As seções foram montadas em fita
adesiva dupla-face, previamente aderida à lâmina de microscópio. As lâminas
contendo as seções foram colocadas em tubos contendo uma mistura de
solução tampão e líquido ruminal na proporção 2:1, submetidas à digestão in
vitro e retiradas nos tempos pré-estabelecidos. As seções foram então coradas
e fotografadas e estimou-se a proporção de cada tecido na seção transversal
das lâminas foliares. Verificou-se que o feno tratado com uréia apresentou
menor proporção de tecidos na seção transversal da lâmina foliar,
demonstrando que o tratamento promoveu a desestruturação da parede
celular, facilitando o acesso dos microorganismos ruminais e aumentando a
digestão dos tecidos. O feno tratado com 8% de uréia e submetido à 24 ou 72
horas de digestão apresentou a menor proporção de tecidos com parede
celular espessa e lignificada como bainha do feixe vascular (BFV) e
esclerênquima. A amonização também reduziu o tempo necessário para
degradação dos tecidos, verificando-se que o feno tratado com uréia e
submetido à 12 horas de digestão apresentou a mesma proporção de tecidos
remanescentes observada no feno não-tratado e submetido à 24 ou 72 horas
de digestão. Os tecidos que apresentaram a menor degradação após a
digestão foram epiderme e feixe vascular lignificado, não sofrendo
modificações significativas causadas pelo tratamento com uréia ou pelos
tempos de digestão.
34
Palavras – chave: amonização, Brachiaria decumbens Stapf., digestibilidade,
análises histológicas, microscopia de luz.
35
Leaf tissues degradation of Brachiaria decumbens Stapf. hay treated with
urea and submitted to in vitro digestion.
ABSTRACT – The experiment was conducted to determine the effects of
treatment with urea at 0, 2, 4 or 8% of the forage dry matter on the leaf tissues
degradation of Signal grass hay submitted to different times of in vitro digestion
(0, 6, 12, 24 or 72 hours). A completely randomized design in a 4 x 5 factorial
arrangement with three replicates was used. The material was stored in plastic
bags (2kg hay/plastic bag) for 35 days and after plastic bags opening, samples
were collected for histological analysis. The first leaf completely expanded was
collected and segments (2mm) were cut from the center portions of leaf blades.
The segments were sectioned 20µm thick on a criomicrotome and the sections
were dropped in a microscope slide mounted with transparent double-stick tape.
The slides were transferred to jars with rumen fluid inoculum and then were
removed at selected digestion times. The sections were stained, photographed
and tissue percentages were estimated. The urea-treated hay presented the
smaller proportion of tissue measured in the transversal section of leaf blades,
displayed that urea treatment was efficient in disrupting cell wall structure
enhancing microbial degradation. The hay treated with urea 8% and submitted
to in vitro digestion for 24 or 72 hours showed the smallest proportion of tissues
with thick and lignified cell walls like parenchyma bundle sheath (PBS) and
sclerenchyma. The urea treatment also reduced the period of time necessary to
tissues degradation. The urea-treated hay submitted to in vitro digestion for 12
hours showed the same proportion of remaining tissues found to untreated hay
submitted to 24 or 72 hours of in vitro digestion. The epidermis and lignified
vascular tissue showed the smallest degradation after in vitro digestion.
Knowledge about histological changes of feeds may help to understand how
different fractions, tissues and cell walls respond to urea treatment.
Keywords: ammoniation, Brachiaria decumbens Stapf., digestibility, histological
analysis, light microscopy.
36
Introdução
Os fenos produzidos a partir de gramíneas de clima tropical, colhidas no
estádio de pós-florescimento, bem como as palhadas, obtidas após a colheita
de grãos de cereais e sementes de gramíneas forrageiras, são alimentos
essencialmente energéticos, de baixo teor protéico e mineral, baixa
digestibilidade e baixo consumo voluntário.
Apesar de estes produtos serem considerados uma boa alternativa para
a alimentação dos rebanhos no período de escassez de forragem, geralmente,
possuem características que limitam o seu aproveitamento pelos animais.
Dentre essas características pode-se citar o elevado conteúdo de parede
celular, alto teor de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente
ácido (FDA), teor elevado de lignina, baixa disponibilidade de compostos
nitrogenados e baixa digestibilidade da matéria seca (Reis & Rodrigues, 1993).
A parede celular consiste de uma mistura complexa de polissacarídeos e
outros polímeros que são produzidos pela célula formando uma estrutura
organizada, unidos por uma mistura de ligações covalentes e não covalentes. A
parede também contém proteínas estruturais, enzimas, polímeros fenólicos e
outras substâncias que modificam as características estruturais da mesma
(Taiz & Zeiger, 1998 ).
Do ponto de vista nutricional, a parede celular pode ser considerada a
principal fonte de energia para os ruminantes em todo mundo. Esta
compreende 20 a 80% do peso seco da forragem e é composta,
principalmente, de hemicelulose, pectina, celulose e lignina. Portanto,
maximizar o ganho de energia a partir da parede celular é importante para
aumentar a eficiência da produção animal (Wilson, 1994).
A parede celular é composta por três camadas distintas. A lamela média,
formada por substâncias pécticas, é a camada mais externa e divide as
paredes de células contíguas, exercendo uma função cimentante entre as
células (Brett & Waldron, 1996). A parede primária, depositada internamente à
lamela média, é formada por microfibrilas de celulose embebidas em uma
matriz amorfa composta por polissacarídeos como as hemiceluloses e as
pectinas. A parede secundária, interna à parede primária, é constituída por três
camadas (S1, S2 e S3), que se distinguem pela diferente orientação das
microfibrilas de celulose (Wilson, 1993).
37
O espessamento da parede celular e a deposição de lignina ocorrem da
região da parede primária em direção ao lúmen celular. A concentração de
lignina é maior na lamela média e na parede primária, mas devido a sua
espessura a parede secundária contém a maior parte da lignina presente na
planta (Wilson, 1993).
O conteúdo de parede celular (CPC) de uma forrageira é nutricionalmente
importante, pois os alimentos com alto CPC apresentam menor digestibilidade
e menor consumo pelos ruminantes (Minson, 1990). Além disso, os tipos de
ligações que formam os polissacarídeos, a espessura da parede e a deposição
de lignina são fatores que podem aumentar sua resistência e, em
conseqüência, reduzir a disponibilidade de sua energia para os ruminantes
(Wilson, 1994).
Os principais tipos de tecidos que compõem a estrutura das gramíneas
são: epiderme, parênquima clorofiliano e fundamental (mesofilo), bainha do
feixe vascular, tecido vascular (xilema e floema) e esclerênquima (Wilson,
1994).
Trabalhos realizados com gramíneas forrageiras submetidas à digestão in
vitro, demonstraram que os diferentes tecidos da planta apresentam taxas de
digestão diferenciada. De acordo com sua facilidade de digestão eles podem
ser classificados, em ordem decrescente, como segue: mesofilo, floema,
bainha do feixe vascular, epiderme, esclerênquima e tecido vascular lignificado
(Akin, 1989; Wilson, 1993).
Em geral, as células do mesofilo e as do floema, com parede celular
primária delgada, são rapidamente digeridas (Akin et al., 1983; Chesson et al.,
1986). As células da epiderme e da bainha do feixe vascular são reconhecidas
como de digestão lenta e parcial (Akin, 1989). Por outro lado, tecidos como o
esclerênquima e o xilema, que apresentam parede celular secundária espessa
e lignificada, são muito pouco digeridos (Akin, 1989; Wilson, 1993).
A estrutura anatômica característica de gramíneas do tipo C4, como
aquelas do gênero Brachiaria, com elevada proporção de tecido vascular
lignificado, de esclerênquima e de bainha do feixe vascular, compromete o
valor nutritivo destas plantas (Wilson,1997).
O tratamento de volumosos de baixa qualidade nutricional com produtos
químicos fontes de amônia, como a uréia, tem sido estudado como uma
38
alternativa para melhorar o valor nutricional e a digestibilidade desses
materiais, permitindo seu melhor aproveitamento pelos ruminantes.
Segundo Goto & Yokoe (1996), existem dois efeitos distintos que, juntos,
podem explicar a ação da amônia sobre a estrutura dos tecidos vegetais
aumentando a degradabilidade do material tratado. O primeiro diz respeito a
amônia agindo como um álcali e promovendo rompimentos nos interpolímeros
que ligam estruturas contendo ligações do tipo éster. Isso resultaria em
rompimento da estrutura da parede celular e aumento na sua hidratação. O
segundo, refere-se à habilidade da amônia formar complexos com a celulose,
reduzindo sua cristalinidade, através do rompimento de pontes de hidrogênio;
aumentando sua fragilidade; e proporcionando melhor digestão enzimática.
Esses fatores, em conjunto, promovem fragmentação mais rápida do material
ingerido e melhoram a eficiência dos microorganismos ruminais no ataque às
partículas do alimento.
As técnicas de anatomia vegetal podem ser utilizadas para avaliar a
estrutura da planta e o comportamento dos tecidos submetidos à digestão,
complementando as informações obtidas nas análises bromatológicas
convencionais, de forma a elucidar os fatores que afetam a degradação das
forrageiras pelos microorganismos ruminais. Além disso, a avaliação anatômica
da degradação dos tecidos vegetais submetidos à digestão, pode contribuir
para explicar o efeito de alguns tratamentos químicos, como a amonização, na
melhoria da qualidade dos volumosos tratados.
Com esse trabalho objetivou-se avaliar a degradação de tecidos foliares
do feno de capim-braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.) tratado com
diferentes níveis de uréia e submetido à digestão in vitro.
Material e Métodos
O experimento foi conduzido nas dependências do Departamento de
Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em Viçosa-MG, no
período de 12 de dezembro de 2002 a 16 de janeiro de 2003. As análises
laboratoriais foram realizadas no Laboratório de Anatomia Vegetal do
Departamento de Biologia Vegetal e no Laboratório de Nutrição Animal do
Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa.
39
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 4 x 5 (quatro níveis de uréia e cinco períodos de incubação),
com três repetições.
O feno foi produzido com o capim-braquiária, colhido no estádio de pós-
florescimento.
Os tratamentos utilizados foram a amonização do feno com 0, 2, 4 ou 8%
de uréia, com base na matéria seca, e os tempos de incubação de 0, 6, 12, 24
ou 72 horas, para avaliação da digestão in vitro dos diferentes tecidos da
planta.
O feno tratado ou não com uréia foi acondicionado em sacos plásticos
etiquetados, vedados e armazenados em galpão coberto. As quantidades de
uréia utilizadas para amonização do feno foram calculadas de acordo com a
quantidade de feno a ser tratado (2 kg feno/saco) e com o teor de matéria seca
do material. A uréia foi dissolvida em quantidade suficiente de água para elevar
o teor de umidade do feno para 30%. A solução de uréia foi distribuída sobre as
camadas de feno, dentro do saco, com o auxílio de um regador.
O material tratado foi armazenado por 35 dias e ao final deste período, os
sacos foram abertos e submetidos a um período de aeração de 24 horas, para
que a amônia que não reagiu com o material fosse eliminada.
Em seguida procedeu-se a coleta de amostras destinadas às avaliações
histológicas, após a homogeneização do material. Coletou-se a primeira folha
completamente expandida, contada a partir do ápice do perfilho. Para cada
unidade experimental, foram coletadas dez lâminas foliares que,
posteriormente, foram congeladas em nitrogênio líquido, embaladas em sacos
plásticos e armazenadas em congelador.
As lâminas foliares foram descongeladas e retiradas porções de
aproximadamente 2mm de comprimento na região mediana das mesmas. Em
seguida, estas porções de lâmina foliar foram colocadas em solução de
sacarose 2,3M por 12 horas, para crioproteção. Estas foram seccionadas
transversalmente com 20 µm de espessura em micrótomo de congelamento.
Aproximadamente 12 seções de cada unidade experimental foram montadas
em fita adesiva dupla-face, previamente aderida às lâminas histológicas (Akin,
1982).
O ensaio de digestibilidade in vitro foi realizado de acordo com a técnica
proposta por Tilley & Terry (1963), com modificações sugeridas por Akin
40
(1982). As lâminas histológicas com os cortes foram colocadas em tubos de
vidro (2 lâminas/tubo), contendo uma mistura de solução tampão de McDougall
e líquido ruminal na proporção 2:1, sob condição de anaerobiose. No
tratamento sem digestão (SD), as lâminas foram mantidas em tubos contendo
apenas a solução tampão de McDougall, até o final do ensaio de digestibilidade
(Akin et al., 1973).
Ao final de cada período de digestão, as lâminas foram retiradas dos
tubos e lavadas em água destilada. Os cortes foram corados com azul de astra
e fucsina básica e as lâminas cobertas com lamínula, utilizando-se gelatina
glicerinada como meio de montagem.
Foram obtidas imagens digitalizadas das seções transversais de lâmina
foliar, através de câmera filmadora analógica acoplada a um fotomicroscópio.
Para evidenciar os sítios de lignificação da folha, foram obtidas imagens
utilizando-se a luz polarizada.
A área de cada tecido remanescente, assim como as medidas lineares,
após a digestão in vitro das seções transversais, foram calculadas através do
programa computacional Image – Pro Plus.
Na seção transversal da lâmina foliar, numa região compreendida entre
dois feixes vasculares de primeira ordem, foram determinadas as seguintes
características anatômicas: área do mesofilo (parênquima clorofiliano e incolor
+ células biliformes), da epiderme da face adaxial, da epiderme da face abaxial,
do tecido vascular lignificado (xilema + fibras associadas), do floema e do
esclerênquima e o comprimento (µm) das paredes externa, radial e interna das
células da bainha do feixe vascular. Os dados de área foram transformados em
porcentagem, em relação à área total da seção transversal.
Os dados referentes à proporção de tecidos remanescentes nas seções
transversais das lâminas foliares, após a digestão in vitro, foram submetidos à
análise estatística, utilizando-se o método multivariado de Análise de
Componentes Principais (Sneath & Sokal, 1973), procurando-se agrupar os
tratamentos de acordo com seu grau de similaridade.
A Análise de Componentes Principais (ACP) é usada para a avaliação das
interrelações de um grande número de variáveis, com o objetivo de condensar
as informações mais importantes em um número pequeno de variáveis, com
perda mínima de informações. Assim, a ACP permite verificar a capacidade
discriminatória das variáveis originais no processo de formação dos
41
agrupamentos, sendo empregada para reduzir o conjunto de indicadores a
duas novas variáveis não correlacionadas, que são os componentes principais,
indicados por Y e Y .
1 2
A análise estatística foi realizada utilizando-se os procedimentos de
análise de componentes principais (PRINCOMP) do sistema para análises
estatísticas SAS (1990).
Resultados e Discussão
Na Figura 1A podem ser observados os tecidos avaliados na seção
transversal da lâmina foliar do feno de capim-braquiária. Na Figura 1B, a
imagem da seção transversal da lâmina foliar foi obtida utilizando-se luz
polarizada, que evidencia os sítios de lignificação nos tecidos, principalmente
do tecido vascular e do esclerênquima, em destaque nas áreas mais claras da
referida figura.
As paredes celulares espessas e lignificadas, observadas nas células do
xilema, esclerênquima e bainha do feixe vascular têm como característica
marcante a grande resistência à degradação microbiana no rúmen (Akin,
1989). Esses tecidos formam uma barreira estrutural à digestão, sendo pouco
digeridos devido à lignificação e a dificuldade de acesso dos microorganismos
ruminais à superfície da parede celular (Wilson, 1994).
Os valores médios da proporção de tecidos avaliados na seção
transversal da lâmina foliar nos diferentes níveis de uréia e tempos de digestão
in vitro, encontram-se na Tabela 1. Pode-se observar a tendência de redução
na proporção de tecidos foliares em função dos níveis de uréia e dos tempos
de digestão.
A Figura 2 apresenta um perfil da configuração anatômica das seções
transversais da folha do feno de capim-braquiária tratado com diferentes níveis
de uréia e submetido à diferentes tempos de digestão in vitro. Observa-se que
ocorreu aumento na degradação dos tecidos em função dos tempos de
digestão e dos níveis de uréia.
Na Figura 3 encontra-se um perfil das seções transversais de folhas cujas
imagens foram obtidas utilizando-se luz polarizada. Observa-se que os tecidos
42
EAD
BFVi
BFVr
TVL
BFVe
FLO
MES
ESC
EAB
A
B
Figura 1. Seção transversal da lâmina foliar do feno de capim-braquiária
com as indicações dos tecidos mensurados (A) evidenciando
as áreas de maior lignificação nos tecidos através da luz
polarizada (B). Mesofilo (MES); Floema (FLO); Tecido vascular
lignificado (TVL); Esclerênquima (ESC); Epiderme adaxial
(EAD); Epiderme abaxial (EAB); parede externa da célula da
bainha do feixe vascular (BFVe); parede interna da célula da
bainha do feixe vascular (BFVi); parede radial da célula da
bainha do feixe vascular (BFVr).
43
44
Tabela 1. Valores médios observados da proporção de tecidos remanescentes na seção transversal de lâminas foliares de feno de
capim-braquiária tratado com diferentes níveis de uréia e submetido à diferentes tempos de digestão in vitro. Mesofilo (MES);
floema (FLO); tecido vascular lignificado (TVL); esclerênquima (ESC); epiderme da face abaxial (EAB); epiderme da face
adaxial (EAD); paredes externa, interna e radial da bainha do feixe vascular (BFVe, BFVi, BFVr).
Tratamentos
MES
(
%
)
FLO
(
%
)
TVL
(
%
)
ESC
(
%
)
EAB
(
%
)
EAD
(
%
)
BFVe
(µ
m
)
BFVi
(µ
m
)
BFVr
(µ
m
)
Uréia (%)
Digestão
(horas)
0
SD
1
49,86 2,21 5,64 8,55 6,15 3,27 2,47 1,37 1,03
0 6
4674 1,61 5,48 7,55 5,94 2,52 2,33 1,29 0,98
0 12
16,81 0,00 5,27 6,04 6,34 2,11 2,37 1,26 0,87
0 24
5,73 0,00 5,45 3,46 6,27 1,53 1,70 0,84 0,38
0 72
7,41 0,00 4,96 2,76 5,97 1,52 1,52 0,90 0,38
2 SD
50,88 1,65 4,83 6,64 6,23 4,15 2,35 1,14 0,96
2 6
47,57 1,35 4,39 5,42 6,10 4,35 2,44 1,22 0,87
2 12
17,46 0,00 3,96 3,67 5,06 3,06 1,59 1,17 0,76
2 24
7,75 0,00 3,88 1,65 3,84 2,31 1,57 0,66 0,41
2 72
3,47 0,00 3,67 1,00 4,01 2,41 1,37 0,45 0,36
4 SD
50,63 1,85 4,31 6,75 5,40 4,25 2,39 1,14 0,98
4 6
48,81 1,40 4,61 6,61 5,60 4,21 2,34 1,16 0,99
4 12
16,85 0,00 4,04 2,68 5,25 2,91 2,29 1,02 0,88
4 24
9,66 0,00 3,73 0,92 4,36 2,36 1,68 0,57 0,37
4 72
5,28 0,00 3,40 1,11 3,45 2,34 1,36 0,48 0,26
8 SD
47,63 1,97 4,78 7,80 6,08 4,23 2,50 1,23 1,03
8 6
45,32 0,88 4,63 7,55 5,99 4,26 2,54 1,28 0,92
8 12
13,08 0,00 3,92 5,07 4,76 2,83 1,43 0,76 0,48
8 24
8,09 0,00 3,34 1,08 2,52 1,69 1,13 0,36 0,19
8 72
2,16 0,00 3,17 1,33 1,74 1,54 0,91 0,25 0,12
1
sem digestão
1 2 3 4
5
6 7 8 9
10
11 12 13 14
15
16
17
18
19
20
Figura 2. Seções transversais da lâmina foliar do feno de capim-braquiária tratado com diferentes níveis de uréia e
submetido à diferentes tempos de digestão in vitro. 1 – controle (C) sem digestão (SD); 2 - C 6h; 3 – C 12h; 4
- C 24h; 5 - C 72h; 6 – Uréia (U) 2% SD; 7 – U2% 6h; 8 – U2% 12h; 9 – U2% 24h; 10 – U2% 72h; 11- U4%
SD; 12 – U4% 6h; 13 – U4% 12h; 14 – Uréia 4% 24h; 15 – U4% 72h; 16 – U8% SD; 17 – U8% 6h; 18 – U8%
12h; 19 – U8% 24h; 20 – U8% 72h. (h = horas de digestão)
45
12345
6 7 8 9 10
11
12
13 14 15
16 17 18 19 20
Figura 3. Seções transversais da lâmina foliar do feno de capim-braquiária tratado com diferentes níveis de uréia e submetido à
diferentes tempos de digestão, fotografadas com luz polarizada indicando os sítios de lignificação, denotados pelas áreas
mais claras e brilhantes. 1 – controle (C) sem digestão (SD); 2 - C 6h; 3 - C 12h; 4 - C 24h; 5 – C 72h; 6 – Uréia (U) 2% SD; 7
– U2% 6h; 8 – U2% 12h; 9 – U2% 24h; 10 – U2% 72h; 11- U4% SD; 12 – U4% 6h; 13 – U4% 12h; 14 – U4% 24h; 15 – U4%
72h; 16 – U8% SD; 17 – U8% 6h; 18 – U8% 12h; 19 – U8% 24h; 20 – U8% 72h. (h = horas)
46
com maior grau de lignificação, como o tecido vascular, esclerênquima e
bainha do feixe vascular, aparecem como áreas mais claras e brilhantes.
Percebe-se também que de acordo com o aumento dos níveis de uréia e dos
tempos de digestão in vitro, ocorreu redução na proporção desses tecidos. Isto
demonstra a degradação em tecidos como o esclerênquima e a bainha do feixe
vascular, a qual é evidenciada pela menor intensidade ou pela ausência de
brilho nestes tecidos.
As correlações entre as nove variáveis originais (características
anatômicas) e os dois primeiros componentes principais (Y e Y
1 2
), resultantes
da análise de componentes principais são apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2. Correlações entre as nove variáveis originais referentes à anatomia
da seção transversal da lâmina foliar do feno de capim-braquiária, e
os dois primeiros componentes principais (Y e Y
1 2
). Porcentagem de
informação retida e acumulada em Y e Y
1 2
, e ordenação das
variáveis quanto ao seu poder discriminatório.
Y Y
Variáveis Ordem Ordem
1 2
Mesofilo (%) 0,934 5 -0,305 5
Floema (%) 0,857 6 -0,307 4
Tecido vascular lignificado (%) 0,751 9 0,615 1
Esclerênquima(%) 0,947 4 0,013 8
Epiderme da face abaxial (%) 0,845 7 0,446 3
Epiderme da face adaxial (%) 0,785 8 -0,542 2
Parede interna das células da
bainha do feixe vascular (µm)
0,954 2 0,011 9
Parede externa das células da
bainha do feixe vascular
(µm) 0,948 3 0,189 6
Parede radial das células da bainha
do feixe vascular (µm)
0,962 1 -0,071 7
Informação Retida (%)
79,27 12,22
Informação Acumulada (%)
79,27 91,49
Devido ao alto valor da informação retida em Y
1
(79,27%), esse primeiro
componente principal foi suficiente para explicar a contribuição das variáveis
47
originais analisadas, para as três repetições dos vinte tratamentos estudados.
Para o segundo componente principal (Y
2
), a análise dos dados da Tabela 2
revela que a informação retida de 12,22%, cujo valor é considerado baixo e,
torna este segundo componente desprezível para explicar a contribuição das
variáveis originais analisadas nos diferentes tratamentos estudados.
Para o componente principal Y1 as variáveis com maior poder
discriminatório, em ordem decrescente de importância foram: comprimento das
paredes radial, interna e externa das células da bainha do feixe vascular; área
do esclerênquima; área do mesofilo; área do floema; área da epiderme da face
abaxial; área da epiderme da face adaxial e área do tecido vascular lignificado.
O maior poder discriminatório observado para o comprimento de parede
das células da bainha do feixe vascular (BFV) e para a área de esclerênquima,
indica que essas variáveis foram as que apresentaram a maior variação em
função dos tratamentos, sendo seu comportamento utilizado para a
interpretação dos resultados obtidos no ensaio experimental.
A interpretação da dispersão gráfica dos componentes principais,
observada na Figura 4, possibilita a formação de grupos entre os tratamentos
que apresentam a maior similaridade quanto às características dos tecidos na
seção transversal da lâmina foliar, como segue: Grupo I – constituído pelo
material não tratado ou tratado com 2, 4, e 8% de uréia , não submetido à
digestão ou submetido à 6 horas de digestão in vitro; Grupo II – constituído
pelo material tratado com 2, 4 e 8% de uréia, submetido à 24 ou 72 horas de
digestão in vitro; Grupo III – constituído pelo material não tratado com uréia e
submetido aos tempos de 12, 24 e 72 horas de digestão e pelo material tratado
com 2, 4 e 8% de uréia submetido à 12 horas de digestão in vitro.
Utilizando-se o componente principal Y1, observa-se que para o grupo I,
independente do nível de uréia, até seis horas de digestão há grande
quantidade de tecidos remanescentes nas seções transversais de folha,
principalmente, parede celular da bainha do feixe vascular (BFV) e
esclerênquima, uma vez que estas variáveis apresentam elevado coeficiente
de correlação. Com seis horas de incubação a degradação dos tecidos é
mínima, observando-se apenas o início da degradação em tecidos com células
de parede primária delgada como o floema e mesofilo (Akin, 1973).
Na Figura 4, observando-se o grupo II, constata-se que todos os
tratamentos com pelo menos 2% de uréia, a partir de 24 horas de digestão
48
Figura 4. Dispersão gráfica dos níveis de uréia e dos tempos de digestão in
vitro do feno de capim-braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.),
utilizando-se os dois componentes principais (Y1 e Y2), para o
conjunto de nove variáveis referentes à anatomia da seção
transversal da lâmina foliar. Níveis de uréia e tempos de digestão: 1
– controle (C) sem digestão (SD); 2 – C 6h; 3 – C 12 h; 4 – C 24 h; 5
– C 72 h; 6 - U2% SD; 7 – U2% 6 h; 8 – U2% 12 h; 9 – U2% 24 h;
10 – U2% 72 h; 11 – U4% SD; 12 – U4% 6 h; 13 – U4% 12 h; 14 –
U4% 24 h; 15 – U4% 72 h; 16 – U8% SD; 17 – U8% 6 h; 18 - U8%
12 h; 19 – U8% 24 h; 20 - U8% 72 h. (h = horas de digestão)
apresentaram grande degradação dos tecidos. Verifica-se que a maior taxa de
degradação, principalmente das paredes das células da BFV e do
esclerênquima, ocorreu nos tratamentos com 8% de uréia. Isso sugere que a
amônia produzida a partir da uréia promoveu uma fragilização da parede
celular dos tecidos aumentando a degradação dos mesmos.
A amônia, quando utilizada no tratamento de volumosos, caracteriza-se
por promover uma desestruturação da parede celular através do rompimento
de ligações entre os polissacarídeos e entre estes e a lignina, aumentando a
hidratação e a fragilidade da parede. Essa desestruturação facilitaria o acesso
dos microrganismos ruminais à superfície da parede celular, aumentando a
degradação dos tecidos no rúmen e o aproveitamento dos alimentos pelos
animais (Goto & Yokoe, 1996). Este efeito da amônia pode explicar em parte o
aumento da digestão de tecidos com parede celular espessa e lignificada como
49
o esclerênquima e as células da bainha do feixe vascular, observado no feno
tratado com uréia.
Outro ponto que deve ser considerado é o fato de que as gramíneas do
tipo C4, como o capim-braquiária, apresentam uma alta eficiência de uso do
nitrogênio, o que implica num baixo teor de proteína nas plantas. Este baixo
teor de proteína, geralmente, é insuficiente para suprir as exigências dos
microrganismos ruminais e garantir sua máxima eficiência (Wilson & Hattesley,
1983). A uréia é considerada uma fonte de nitrogênio não-protéico e seu uso
no tratamento do feno de capim-braquiária também pode ter contribuído para
suprir as necessidades dos microrganismos ruminais, aumentando sua
eficiência na digestão dos tecidos.
As células da BFV contêm grande proporção de proteína e amido, sendo
consideradas uma fonte importante de compostos facilmente digestíveis nas
gramíneas tropicais. Estas células concentram a maior parte da enzima RUDP
carboxilase (rubisco), a qual representa aproximadamente 50% da proteína
solúvel nas folhas de gramíneas C4 (Wilson, 1997). A desestruturação da
parede celular das células da BFV, causada pelo tratamento com uréia, pode
contribuir para a disponibilização dos compostos facilmente digestíveis contidos
nestas células, para os microorganismos ruminais.
A fragilização da parede celular e o aumento significativo da
digestibilidade in vitro do material amonizado também foram observados por
Leal et al. (1994) e Goto et al. (1993), trabalhando com palhada de sorgo e de
cevada, respectivamente. Shen et al. (1999), trabalhando com palhada de arroz
tratada com uréia, verificaram que a amonização promoveu a expansão do
parênquima e o rompimento parcial da parede celular do tecido vascular,
contribuindo para a melhoria da digestibilidade da palhada.
Os tratamentos que compõem o grupo III (Figura 3), apresentaram
quantidade intermediária de tecidos remanescentes após a digestão in vitro. Os
tempos de 12 horas de digestão para o material tratado com 2, 4 e 8% de uréia
e de 12, 24 e 72 horas para o material não tratado, não foram suficientes para
garantir uma degradação efetiva dos tecidos, principalmente esclerênquima e
bainha do feixe vascular.
Pela observação do grupo III também pode-se concluir que o tratamento
com uréia contribuiu para diminuir o tempo necessário para a degradação dos
tecidos. Com 12 horas de digestão a degradação do material tratado com uréia
50
foi equivalente à degradação do material não tratado, submetido à 24 ou 72
horas de digestão. Isso pode ser justificado pela fragilização da parede celular
promovida pela amônia, facilitando o acesso dos microrganismos ruminais,
aumentando a colonização microbiana sobre os tecidos (Goto et al.,1993).
Na Tabela 2, observando-se o componente principal Y1 pode-se perceber
que as variáveis com menor poder discriminatório foram a epiderme e o tecido
vascular lignificado. Estes tecidos apresentaram menor degradação durante o
ensaio de digestibilidade, não sofrendo modificações significativas causadas
pelo tratamento com uréia ou pelos tempos de digestão. O tecido vascular
lignificado, possui células com parede secundária espessa e bastante
lignificada, o que dificulta sua degradação pelos microorganismos ruminais
(Akin, 1989; Wilson, 1993). As paredes tangenciais externas das células
epidérmicas tornam-se espessas e lignificadas em plantas maduras, sendo
totalmente cobertas pela cutícula. Estas características, podem fazer com que
a superfície externa da epiderme seja impenetrável aos microrganismos
ruminais, impedindo sua degradação.
Conclusões
O tratamento do feno de capim-braquiária com uréia afetou a estrutura da
parede celular de tecidos como a bainha do feixe vascular e esclerênquima,
aumentando a disponibilidade dos polissacarídeos da parede celular,
facilitando o acesso dos microorganismos ruminais e aumentando a digestão
desses tecidos, bem como reduziu o tempo necessário para sua degradação.
51
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4
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1983.
53
CONCLUSÕES GERAIS
A amonização via uréia proporcionou melhoria no valor nutritivo do feno
de capim-braquiária, o que pode ser comprovado pela elevação nos teores de
PB e DIVMS, bem como pela redução dos conteúdos de FDN e FDA, e das
relações NIDN/NT e NIDA/NT.
Recomenda-se a adição de 7% de uréia (base da MS), visto que esse
nível proporcionou máxima digestibilidade in vitro da matéria seca.
O tratamento do feno de capim-braquiária com uréia afetou a estrutura da
parede celular de tecidos como a bainha do feixe vascular e esclerênquima e
reduziu o tempo necessário para sua degradação.
54
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