( PDF ) Expressão dos genes de receptores de glicocorticóides GRa e B e dos fatores de transcrição AP-1 e NFkB em pacientes com polipose nasossinusal: avaliação de mecanismos de resistência ao corticoste

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

EXPRESSÃO DOS GENES DE RECEPTORES DE

GLICOCORTICÓIDES GRα

αα

α E β

ββ

β E DOS FATORES DE

TRANSCRIÇÃO AP-1 E NFκ

κκ

κB EM PACIENTES COM

POLIPOSE NASOSSINUSAL: AVALIAÇÃO DE MECANISMOS

DE RESISTÊNCIA AO CORTICOSTERÓIDE.

FABIANA CARDOSO PEREIRA VALERA

Ribeirão Preto

2006

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

EXPRESSÃO DOS GENES DE RECEPTORES DE

GLICOCORTICÓIDES GRα

αα

α E β

ββ

β E DOS FATORES DE

TRANSCRIÇÃO AP-1 E NFκ

κκ

κB EM PACIENTES COM

POLIPOSE NASOSSINUSAL: AVALIAÇÃO DE MECANISMOS

DE RESISTÊNCIA AO CORTICOSTERÓIDE.

Aluna: Fabiana Cardoso Pereira Valera

Orientadora: Profa. Dra. Wilma T. Anselmo-Lima

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo, para a obtenção do título de Doutor em Medicina, Área de

Morfofisiologia de Estruturas Faciais.

Ribeirão Preto

2006

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Valera, Fabiana Cardoso Pereira

Expressão dos genes de receptores de glicocorticóides GRα e β e d

os fatores

de transcrição AP-1 e NFκ

B em pacientes com polipose nasossinusal:

Avaliação de mecanismos de resistência ao corticosteróide.

Ribeirão Preto, 2006.

92p.: il.; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/USP – Programa: Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de

Cabeça e Pescoço – Depto. de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia

de Cabeça e Pescoço.

Orientadora: Anselmo-Lima, Wilma T.

Polipose nasossinusal, 2. Citocinas, 3. Fatores de transcrição, 4. Receptores

de corticóide, 5. Corticóide tópico.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, que com muita dedicação criaram suas filhas, nos

apoiando em todos os momentos das nossas vidas, sempre com muito

carinho, amizade e amor. Esta dedicação e este carinho nos

acompanham e nos acompanharão por toda a vida.

Ao Elvis, marido exemplar, que sempre me apoiou e me compreendeu

nos meus projetos de vida, com muito amor e carinho. Mesmo ciente

que este projeto nos tiraria alguns momentos de vida a dois, ele sempre

compreendeu e me incentivou para esta realização pessoal e

profissional. Sem ele, este projeto não teria saído do alicerce.

Ao lindo filho Henrique, que teve que suportar seu “concorrente”,

mesmo sem entender sua importância, e que sempre que me visse no

computador vinha para me retirar de lá ou desligá-lo.

Às minhas irmãs, amigas inseparáveis por toda a vida. A família é muito

importante para uma pessoa, e esta é muito especial para mim, pelos

momentos em que vivemos juntos.

Aos Drs. Juiz Gonzaga Tone e Carlos Scridelli, que me apoiaram de

imediato na idéia da tese, me ajudaram muito na confecção do projeto

de pesquisa, abriram as portas do Laboratório de Oncologia Infantil

para mim e me ensinaram tudo o que sei de Biologia Molecular.

Às colegas do Laboratório de Oncologia Infantil, onde realizei a parte

experimental da tese; graças a elas, em especial à Rosane, Vanessa,

Priscila e Sílvia, que tudo me ensinaram no laboratório, este trabalho

conseguiu ser realizado.

Aos colegas do laboratório de Hematologia, em especial à Amélia,

Gaúcho e Panepucci, que me ajudaram a resolver problemas que

pareciam insolúveis com tanta presteza.

À Cecília Onofre, que em todos os momentos burocráticos me ajudou

com presteza. Sempre muito dedicada a resolver os problemas com

prontidão, sem ela muito teria se comprometido.

Aos secretários do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e

Cirurgia de Cabeça e Pescoço, pela pronta ajuda em todos os

momentos.

Aos colegas Médicos Assistentes, pela enorme amizade e compreensão.

Aos colegas, antigos residentes, em especial Eduardo Tanaka, André

Montenegro, Daniel Küpper e Camila Carneiro, que se tornaram

durante este período de convivência grandes amigos.

Aos residentes, pela compreensão da minha ausência em alguns

períodos.

Aos Docentes, em especial Dr. José Antônio e Dra. Wilma, pela minha

formação acadêmica e por terem me despertado para a pesquisa. Sem

eles, dificilmente teria chegado até este ponto.

Um especial agradecimento à Dra. Wilma, por ter sempre me

incentivado e me instigado a novos conhecimentos e novas fronteiras,

de forma singela, com muita simplicidade e amizade.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP

pelo apoio financeiro para realização dessa pesquisa.

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

SUMMARY

1- INTRODUÇÃO ................................................................................1

2- REVISÃO DE LITERATURA ............................................................5

2.1. Mecanismos Moleculares da PNS ............................................................... 5

2.2. Ação celular das citocinas ....................................................................... 10

2.3. Ação do glicocorticóide na PNS ................................................................ 13

2.4. Ação celular dos GC ................................................................................ 13

2.5. Mecanismos de resistência aos GC........................................................... 18

3- OBJETIVOS .................................................................................22

4- PACIENTES E MÉTODOS .............................................................23

5- RESULTADOS ..............................................................................37

6- DISCUSSÃO .................................................................................60

7- CONCLUSÕES..............................................................................75

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................76

ANEXOS

LISTA DE ABREVIATURAS

AP-1: proteína ativadora-1

b-FGF: fator básico de crescimento de fibroblastos

ECP: proteína catiônica eosinofílica

EDN: neurotoxina derivada do eosinófilo

ELISA: ensaio de imunosorbente ligado a enzima

EPO: peroxidase eosinofílica

GC: glicocorticóide

GM-CSF: fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos

COX-2: ciclooxigenase-2

GR: receptor de glicocorticóide

GRE: elemento responsivo ao glicocorticóide

HAT: histona acetilase

HPA: hipotálamo- pituitária-adrenal

hsp90: proteína de choque ao calor 90

ICAM-1: molécula de adesão intercelular –1

IFN-γ

γγ

γ: interferon γ

IGF-1: fator de crescimento de insulina-1

Iκ

κκ

κB: inibidor de NF-κB

IKK: IκB quinase

IL: interleucina

iNOS: óxido nítrico sintetase induzida

JNK: N-Jun quinase

LPS: lipopolissacárides

MAPK: proteína quinase ativada por mitógenos

MBP: proteína básica maior

MCP-1: proteína quimiotática de macrófagos

MIP-1α

αα

α: proteína inflamatória de macrófago 1α

NEMO: modificador essencial do NF-κB

NF-κ

κκ

κB: fator nuclear kappa B

PAF: fator ativador de plaquetas

PNS: polipose nasossinusal

RANTES: expressão e secreção normal de células T, reguladas por ativação

TGF: fator de crescimento transformador

TNF-α: fator de necrose tumoral-α

VCAM-1: molécula de adesão de células vasculares–1

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: cinética e inter-relação na PNS das principais citocinas,

quimiocinas, moléculas de adesão e fatores de crescimento....................10

Figura 2: coloração de comassie blue 0,25% em gel após eletroforese,

demonstrando distribuição das proteínas por peso molecular................. 30

Figura 3: imagens digitalizadas dos resultados obtidos em Western

Blotting, correspondentes a p65 (A), cFos (B) e GR (C). Em GR, existem

duas bandas, a superior corresponde a GRα e a inferior corresponde a

GRβ. A maior intensidade da banda corresponde a maior concentração

da proteína ............................................................................................41

Figura 4: curva de dispersão e mediana para expressão das proteínas

GRα (A), GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-65 (E) para os

pacientes com polipose nasossinusal antes e após tratamento e para

grupo controle .......................................................................................44

Figura 5: curva de dispersão e mediana para expressão das proteínas

GRα (A), GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-65 (E) para os

grupos maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à

budesonida nasal, antes (I) e após (II) tratamento...................................46

Figura 6: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GUS.......48

Figura 7: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GRα .......48

Figura 8: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GRβ ....... 48

Figura 9: curvas de amplificação e de dissociação para o gene c-Fos......48

Figura 10: curvas de amplificação e de dissociação para o gene p65 ...... 49

Figura 11: curvas de amplificação e de dissociação para o gene TNFα....49

Figura 12: curvas de amplificação e de dissociação para o gene IL-1β ....49

Figura 13: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GM-

CSF .......................................................................................................49

Figura 14: curvas de amplificação e de dissociação para o gene ICAM-1 50

Figura 15: curvas de amplificação e de dissociação para o gene

eotaxina-2..............................................................................................50

Figura 16: curvas de amplificação e de dissociação para o gene b-FGF ..50

Figura 17: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de GRα

(A), GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-65 (E) para os

pacientes com polipose nasossinusal antes e após tratamento e para

grupo controle .......................................................................................54

Figura 18: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de

TNF-α (A), IL-1β (B), GM-CSF (C), ICAM-1 (D), eotaxina-2 (E) e b-FGF (F)

para os pacientes com polipose nasossinusal antes e após tratamento e

para grupo controle................................................................................55

Figura 19: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de GRα

(A), GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-65 (E) para os grupos

maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à budesonida

nasal, antes (I) e após (II) tratamento .....................................................58

Figura 20: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de

TNF-α (A), IL-1β (B), GM-CSF (C), ICAM-1 (D), eotaxina-2 (E) e b-FGF (F)

para os grupos maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à

budesonida nasal, antes (I) e após (II) tratamento...................................59

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: escores clínicos para os pacientes com polipose nasossinusal, antes

e após o tratamento com budesonida nasal..................................................... 37

Tabela 2: índice de melhora clínica (MC) para cada indivíduo e mediana de

MC no estudo ................................................................................................ 39

Tabela 3: variáveis de endoscopia (End), somatória de escores (SE) e

escore tomográfico (TC) para os Grupos G1 (maus respondedores) e G2

(bons respondedores) .............................................................................40

Tabela 4: expressão de proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65 em pacientes

com polipose nasossinusal antes do tratamento e no grupo controle ...... 42

Tabela 5: expressão de proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65 em pacientes

com polipose nasossinusal antes e após tratamento............................... 42

Tabela 6: expressão de proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65 em pacientes

com polipose nasossinusal após tratamento e nos grupo controle........... 43

Tabela 7: expressão das proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p-65 para os

grupos maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à

budesonida, antes e após tratamento .....................................................45

Tabela 8: equações obtidas pela curva padrão para gene estudado ........47

Tabela 9: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p65, TNF-α, IL-1β,

GM-CSF, ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF nos pacientes com polipose

nasossinusal antes do tratamento e no grupo controle ...........................51

Tabela 10: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p65, TNF-α, IL-1β,

GM-CSF, ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF nos pacientes com polipose

nasossinusal antes e após o tratamento.................................................52

Tabela 11: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p65, TNF-α, IL-1β,

GM-CSF, ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF nos pacientes com polipose

nasossinusal após o tratamento e no grupo controle ..............................53

Tabela 12: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p-65, TNF-α, IL-1β,

GM-CSF, ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF para os grupos maus

respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à budesonida, antes e

após tratamento.....................................................................................56

RESUMO

Introdução: A importância das citocinas pró-inflamatórias na polipose

nasossinusal (PNS) ainda é um tópico pouco estudado, assim como sua

importância no prognóstico e na resposta terapêutica. Mecanismos de

resistência aos glicocorticóides especificamente na PNS ainda são muito

pouco conhecidos. Objetivos: Avaliar a resposta clínica e molecular da

PNS ao tratamento com budesonida tópica. Associar esta resposta à

intensidade de expressão das isoformas de receptor de glicocorticóide

(GRα e GRβ) e dos fatores de transcrição NF-κB e AP-1. Pacientes e

Métodos: 20 pacientes com PNS foram tratados com budesonida por 2

meses. Eles foram submetidos a questionário clínico e biópsias dos

pólipos antes e após o tratamento. Foram analisados por Western-

Blotting as proteínas p65, c-fos, GRα e GRβ e por PCR em tempo real a

expressão gênica de IL-1β, TNF-α, ICAM-1, b-FGF, eotaxina-2, GM-CSF,

p65, c-fos, GRα e GRβ. Estes resultados foram comparados a amostras

controles. Resultados: Houve maior expressão nos pacientes com PNS

sem tratamento quando comparados aos controles para as citocinas IL-

1β, eotaxina-2 e b-FGF e para o fator de transcrição p65; GRα esteve

significantemente menos expresso neste grupo. Após o tratamento,

houve diminuição significativa dos sintomas de PNS, associada à

diminuição do tamanho dos pólipos, sendo significantemente maior nos

pacientes com menor extensão tomográfica da PNS ao diagnóstico. Esta

melhora clínica esteve associada à diminuição significativa da expressão

de p65, TNF-α e eotaxina-2. Pacientes com pior resposta clínica (G1)

apresentaram maior expressão de p65, IL-1β, e ICAM-1 ao diagnóstico

quando comparados aos com boa resposta clínica (G2); após o

tratamento, os pacientes do G1 mantiveram alta expressão de IL-1β e

apresentaram maior expressão de GRβ do que pacientes do G2.

Conclusões: as citocinas pró-inflamatórias são importantes na gênese

do processo inflamatório. O GC tópico foi capaz de diminuir a dimensão

dos pólipos nasais, de melhorar parcialmente os sintomas dos pacientes

com PNS e de diminuir a expressão das citocinas, em especial do TNF-α

e da eotaxina-2. A relação entre os receptores de GC GRα/GRβ, assim

como a expressão de fatores de transcrição, em especial o NF-κB

estiveram alterados nos pacientes com PNS. Pacientes com resposta

desfavorável ao tratamento com GC tópico possuem maior expressão de

p65, ICAM-1 e IL-1β ao diagnóstico, e de IL-1β e GRβ após exposição ao

GC.

SUMMARY

Introduction: The role of pro-inflammatory cytokines for the

etiopathogenesis of nasal polyposis (NP) is still few studied, as well as

its importance in prognosis and therapeutic response. Mechanisms of

glucocorticoid (GC) resistance in NP are still unknown. Objectives: To

evaluate the clinical and molecular response of NP to budesonide

treatment. To correlate this response to the expression of glucocorticoid

receptor isoforms (GRα and GRβ) and of NF-κB and AP-1 transcription

factors. Patients and Methods: 20 patients with NP were treated with

budesonide for 2 months. They were submitted to a clinical

questionnaire and to polyp biopsies before and after treatment. The

proteins p65, c-fos, GRα and GRβ were analyzed through Western-

Blotting and the expression of IL-1β, TNF-α, ICAM-1, b-FGF, eotaxine-2,

GM-CSF, p65, c-fos, GRα and GRβ mRNAs through real-time PCR. The

results were compared to control samples. Results: There was higher

expression of the cytokines IL-1β, eotaxine-2 and b-FGF and of the

transcription factor p65 in NP patients without treatment when

compared to controls; GRα was significantly less expressed in this

group. After the treatment, there was significant decrease of symptoms,

associated to reduction of size of polyps, which was significantly higher

in patients with minor tomographic extension of NP at diagnosis. This

improvement was associated to significant reduction in expression of

p65, TNF-α and eotaxine-2. Patients with adverse clinical response (G1)

presented higher expression of p65, IL-1β, and ICAM-1 at diagnosis

when compared to those with clinical response (G2); after treatment, G1

patients maintained elevated expression of IL-1β and presented higher

expression of GRβ than G2 patients. Conclusions: pro-inflammatory

cytokines are important in the etiopathogenesis of the inflammatory

process in NP. Topical GC was capable to reduce the dimension of nasal

polyps, to improve partially the symptoms and to diminish the

expression of inflammatory cytokines, especially TNF-α and eotaxine-2.

The relationship between GC receptor isoforms GRα/GRβ and the

expression of transcription factors (particularly NF-κB) were altered in

patients with NP. Patients with adverse clinical response to topical GC

treatment presented higher expression of p65, ICAM-1 and IL-1β at

diagnosis, and of IL-1β and GRβ after GC treatment.

INTRODUÇÃO

A Polipose Nasossinusal (PNS) é uma doença inflamatória crônica

não neoplásica que acomete a mucosa rinossinusal. Sua prevalência é

de 0,5 a 4% da população em geral (PAWANKAR, 2003), sendo mais

comum em pessoas do sexo masculino e com mais de 40 anos de idade.

Os fatores relacionados à ocorrência da PNS não estão totalmente

esclarecidos, mas sabe-se que a mucosa nasal sofre profundas

transformações em sua histologia: o epitélio nasal torna-se hiperplásico

e com aumento de células caliciformes; a membrana basal encontra-se

espessada; o estroma apresenta edema e aumento de produção de

fibroblastos, associado ao recrutamento de células inflamatórias, como

linfócitos, mastócitos, plasmócitos e, em especial, eosinófilos (LUND et

al., 1998; CARVESACCIO et al., 2000; PAWANKAR, 2003; SOUZA et al.,

2003). A eosinofilia na PNS é, em geral, limitada às vias aéreas, o que

sugere que fatores locais devam estar envolvidos nos mecanismos

patogênicos desta doença.

Dados descritos em literatura consideram a PNS como um

subtipo de rinossinusite crônica (FOKKENS et al., 2005) de causa

multifatorial. Fatores locais como infecção viral, bacteriana ou fúngica,

ou alterações estruturais como desvios de septo e variações anatômicas

do meato médio resultariam em uma resposta inflamatória local, que

seria, em última análise, responsável pelo aparecimento de ulcerações

mucosas com conseqüente prolapso da submucosa, desencadeando

reepitelização e proliferação glandular anormal. A PNS também pode

estar relacionada a algumas doenças sistêmicas, como fibrose cística,

discinesia ciliar e tríade de Samter (FOKKENS et al., 2005).

A eosinofilia apresentada na PNS não é de característica alérgica,

o que contrapõe com a importância dos mecanismos atópicos na

etiopatogenia dos pólipos nasais (BACHERT, 1997; LEE et al., 1998;

NONAKA et al., 1999; YARIKTAS et al., 2005). Assim, acredita-se que a

rinite alérgica apenas acentue os sintomas da PNS, por alterar sua

resposta imune local (FOKKENS et al., 2005). No entanto, Voegels &

Pádua (2005) não observaram diferenças nos sintomas clínicos

observados em pacientes com PNS associada à alergia quando

comparados aos com PNS não alérgica.

Os sintomas clínicos mais prevalentes na PNS são a obstrução

nasal, a anosmia, a rinorréia, a cefaléia e rinossinusites de repetição.

Estes sintomas prejudicam consideravelmente a qualidade de vida do

paciente, conforme já demonstrado por Alobid et al.

(2005).

Considerando-se a alta taxa de recorrência da PNS nos casos

submetidos exclusivamente ao tratamento cirúrgico (em média de 30%),

mesmo com os recursos das mais modernas técnicas operatórias

(TUNCER et al., 2003; VOEGELS & PÁDUA, 2005), o tratamento clínico

vem sendo cada vez mais indicado.

O Consenso Internacional de PNS de 2002

(MLADINA et al.,

2005), o Consenso Europeu sobre Rinossinusites de 2004

(FOKKENS et

al., 2005),

assim como vários autores

(LILHOLDT et al., 1997; BADIA &

LUND, 2001; DONER et al., 2004) preconizam que o glicocorticóide (GC)

tópico deva ser considerado a medicação de escolha no tratamento da

PNS. No entanto, o GC tópico pode não se mostrar eficaz em todos os

casos (PUJOLS ET AL., 2003), quer seja devido a fatores intrínsecos

relacionados à resposta ao GC, à inadequação de ação desta medicação,

em especial em casos com PNS extensa (BADIA & LUND, 2001), ou à

falta de adesão ao tratamento. A taxa de sucesso com o tratamento com

GC tópico nos casos de PNS varia de 60,9 a 80%

(TUNCER et al., 2003;

TOS et al., 1998; LILHOLDT et al., 1997).

Nos pacientes onde os sintomas são intensos ou as exacerbações

são freqüentes, a terapia com GC sistêmicos ou com macrolídeos pode

ser utilizada como terapia coadjuvante à terapia tópica (FOKKENS et

al., 2005); em outros casos, o tratamento cirúrgico (através da cirurgia

endoscópica nasal) poderá ser eficaz na remoção dos pólipos nasais.

Nestes casos, a terapia com GC tópico adjuvante auxiliaria na redução

na taxa de recorrência pós-cirúrgica.

O tratamento clínico tem como objetivo: a melhora da obstrução

nasal e da anosmia, diminuição do tamanho do pólipo nasal e

prevenção (ou diminuição) da recorrência dos sintomas. Para que se

possa alcançar estes objetivos, o GC necessita ser usado por período

prolongado. Os GC tópicos, por serem administrados em microdoses,

altamente lipofílicos e de metabolização hepática, apresentam efeitos

colaterais sistêmicos mínimos, e podem ser administrados

cronicamente com relativa segurança. Dentre os GC tópicos, possuem

ação comprovada na PNS a fluticasona e a budesonida

(BADIA & LUND,

2001; MASTRUZZO et al., 2003; FOKKENS et al., 2005). A

mometasona, apesar da ausência de estudos clínicos randomizados que

comprovem sua eficácia, tem sido cada vez mais utilizada no tratamento

da PNS (LUND et al., 1998; FOKKENS et al., 2005).

A resposta clínica da PNS ao uso de GC é extremamente variável

entre os indivíduos, e mecanismos de resistência ao GC vêm sendo

amplamente estudados em doenças crônicas como colite ulcerativa,

asma (SOUSA et al., 2000) e PNS. O reconhecimento dos mecanismos

moleculares envolvidos na resistência ao uso dos GC poderá ter impacto

direto na terapêutica e evolução a longo prazo dos pacientes com PNS.

REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Mecanismos Moleculares da PNS

As citocinas são proteínas com função reguladora essenciais para

o crescimento, diferenciação e ativação de células imunológicas, tanto

em processos imunes como inflamatórios. Elas influenciam a formação

da PNS por, basicamente, dois mecanismos: estimulação do

crescimento do tecido local (mediado por b-FGF, IGF-1, TGF-α e TGF-β),

e manutenção permanente do estado inflamatório (mediado por IL-1β,

TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-γ, dentre outros) (HENRIKSSON et al.,

2001). O padrão de resposta inflamatória na PNS é misto, com a

presença de citocinas dos tipos Th1 e Th2 (MASTRUZZO et al., 2003). A

complexa interação de citocinas produzidas por células estruturais e

por células inflamatórias leva a um processo inflamatório crônico que,

uma vez iniciado, aparentemente independe do estímulo causal para

sua perpetuação (DENBURG, 1997).

Em revisão de literatura, MIN & LEE (2000) constataram que

vários estudos demonstravam expressões aumentadas de mRNA para

GM-CSF, IL-3, TNFα, MIP-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 e TGFβ em

pólipos nasais quando comparados a mucosa nasal não polipóide.

O processo inflamatório induz as células epiteliais e os

fibroblastos a produzirem TNF-α e IL-1β, que são citocinas pró-

inflamatórias. Após estímulo por estas citocinas, as células estruturais

da mucosa nasal são induzidas a produzir uma variedade de citocinas,

quimiocinas e moléculas de adesão (como GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-5, IL-

6, IL-8, IL-13, IL-12, IL-16, TGF-α, TGF-β, RANTES, eotaxina, eotaxina-

2, ICAM-1 e VCAM-1, além das próprias TNF-α e IL-1β) (BACHERT,

1997; DENBURG, 1997; ADCOCK & CARAMORI, 2001; TAKENO et al.,

2002), que são capazes de recrutar células circulantes, como linfócitos

T, eosinófilos, mastócitos e neutrófilos. Estes, por sua vez, estimulam a

produção de outras citocinas, que vão prolongar e acentuar o processo

inflamatório (DENBURG, 1997). Além disso, TNF-α e IL-1β podem

induzir a produção de receptores para outras citocinas, quimiocinas e

moléculas de adesão, potencializando estas proteínas, como exemplo o

aumento dos receptores para ICAM-1 e VCAM-1 em células endoteliais

(BACHERT, 1997; CALDERÓN et al., 1997).

O TNFα é conhecido por aumentar a migração transendotelial de

eosinófilos, além de estimular a produção dos metabólitos tóxicos do

oxigênio (MIN & LEE, 2000; HENRIKSSON et al., 2001), fibrose do

estroma e espessamento da membrana basal (MIN & LEE, 2000). A

produção de TNFα é estimulada por vários fatores, exemplo das

endotoxinas bacterianas, dos superantígenos, dos produtos virais, do

próprio TNFα, IL-1β, IFNγ, ICAM-1, GM-CSF, TGF-β, lipopolissacárides,

e outros (KRAKAUER et al., 1999).

A IL-1β é secretada por monócitos, células NK, células epiteliais e

fibroblastos. Esta proteína modula a atividade de linfócitos T e B e

aumenta a quimiotaxia, a adesão e a fagocitose de neutrófilos. A IL-1β

contribui ainda para inflamação crônica associada ao pólipo

(HENRIKSSON et al., 2001).

As moléculas de adesão selectina-E, VCAM-1 e ICAM-1 são

potentes recrutadores de células inflamatórias, em especial, dos

eosinófilos, estimulando a migração transendotelial. São produzidas por

células endoteliais, células epiteliais e por fibroblastos em vias aéreas

(SILVESTRI et al., 2002), em especial após estímulo destas células com

TNFα, IL-1β, IFN-γ, eotaxina, ECP e MBP (JAHNSEN et al., 1997;

DONER et al., 2004).

IL-5 e GM-CSF são produzidos em grande quantidade nos pólipos

nasais, principalmente por células epiteliais, células endoteliais,

macrófagos, linfócitos, fibroblastos e por eosinófilos. Elas possuem

papel central no suporte de sobrevivência de eosinófilos e na

proliferação de macrófagos. Estas citocinas são especialmente

importantes por serem produzidas pelos próprios eosinófilos, e por

reduzirem a apoptose e aumentarem a sobrevida e ativação dos mesmos

de forma autócrina (HENRIKSSON et al., 2001; PAWANKAR, 2003;

BACHERT et al., 2002).

RANTES, eotaxina e eotaxina-2 são quimiocinas que induzem

fortemente a migração transendotelial de células inflamatórias em

sentido a um alvo inflamatório. Elas são quimiocinas específicas para

eosinófilos, monócitos, basófilos e linfócitos T, mas não para neutrófilos;

ademais, as eotaxinas são altamente seletivas para eosinófilos

(JAHNSEN et al., 1999; ADCOCK & CARAMORI, 2001). Elas podem ser

produzidas por várias células, dentre elas células epiteliais, células

endoteliais e fibroblastos.

A proliferação de fibroblastos e de células endoteliais também

pode ser estimulada pelo b-FGF, que é uma citocina cuja função é de

extrema importância na hematopoese, na proliferação e diferenciação

celular, na angiogênese e na cicatrização. O b-FGF é, in vivo, mitogênico

para células epiteliais respiratórias (POWERS et al., 1998). Ele é

produzido, no pólipo, por células epiteliais e por células inflamatórias,

em maior quantidade do que na mucosa nasal normal (NORLANDER et

al., 2001).

TGF-β é uma citocina fibrogênica importante, por aumentar o

depósito de colágeno, levando ao aumento da proliferação de

fibroblastos e concomitante diminuição da proliferação de linfócitos.

Inibe também a ação de IL-3, IL-5 e GM-CSF, diminuindo a eosinofilia

por aumento da taxa de apoptose dos eosinófilos (JORDANA &

DOLOVICH, 1997; BACHERT et al., 2000). O fator de crescimento TGF-

β é, na atualidade, reconhecido como modulador da resposta

inflamatória, direcionando a resposta para o padrão Th1 sendo,

portanto, considerado uma citocina anti-inflamatória (MASTRUZZO et

al., 2003).

É interessante observar que as próprias células inflamatórias

produzem citocinas que aumentam seu recrutamento e sua sobrevida.

É o caso dos eosinófilos, que produzem IL-4, IL-5, GM-CSF e TNFα,

além das quimiocinas RANTES, eotaxina e eotaxina-2; e dos mastócitos,

que produzem IL-4, IL-5 e IL-6.

O influxo seletivo de eosinófilos é estimulado pelas citocinas IL-3,

IL-4 e IL-5 e pelas quimiocinas IL-8, RANTES e eotaxina, auxiliadas

pelas citocinas IL-1β e TNFα, que aumentam a migração transendotelial

de células inflamatórias, apesar de não serem específicas para estas

células. O esquema 1 sintetiza as principais citocinas, quimiocinas,

moléculas de adesão e fatores de crescimento, bem como sua cinética e

inter-relação na PNS.

A eosinofilia tecidual ocorre numa fase mais tardia do processo

inflamatório da PNS e, por fim, leva à lesão tecidual, espessamento da

membrana basal, fibrose do estroma, angiogênese e hiperplasia das

células epiteliais e glandulares, por produzir proteínas grânulo-tóxicas e

mediadores lipídicos, como EPO, EDN, ECP e MBP, além de

leucotrienos, PAF e TGF (JORDANA & DOLOVICH, 1997; JAHNSEN et

al., 1999; SHIN et al., 2000; WATANABE et al., 2004).

1β

TNF-α

TGF-α

TGF-β

b-FGF

fibroblastos

RANTES

Eotaxina

Eotaxina-2

recruta

ICAM

VCAM-1

E-selectina

↑ adesão

↑ Eeosinófilos

nos Pólipos

IL-5

GM-CSF

Pólipo Nasal

ECP

MBP

EPO

EDN

leucotrienos

Lesão tecidual

Figura 1: cinética e inter-relação na PNS das principais citocinas,

quimiocinas, moléculas de adesão e fatores de crescimento

2.2. Ação celular das citocinas

Durante o processo inflamatório, a produção de citocinas se dá

através do estímulo da transcrição de vários genes. A transcrição destes

genes é induzida pelos fatores de transcrição, em especial o AP-1 e,

principalmente, o NF-κB. Diversos genes envolvidos nas respostas

inflamatórias possuem sítios que ativam tanto AP-1 como NF-κB

(GONZÁLEZ et al., 2000).

AP-1 é um dímero citoplasmático de produtos proto-oncogênicos,

constituído por membros da família Jun (c-Jun, JunB e JunD) e Fos (c-

Fos, FosB, Fra1 e Fra2). Heterodímeros Fos-Jun são a forma

predominante de AP-1, e possuem alta capacidade transcricional; já

Endotoxinas, Superantígenos

Produtos virais

Citocinas inflamatórias

LPS

Eosinófilos, Linfócitos, Mastócitos

Vaso sanguíneo

homodímeros Jun-Jun também podem ocorrer, mas possuem baixa

capacidade de se ligar ao DNA (ADCOCK & CARAMORI, 2001,

HERMOSO & CIDLOWSKI, 2003; NECELA & CIDLOWSKI, 2004).

Citocinas pró-inflamatórias (como TNF-α, IL-1β, IL-5 e GM-CSF),

oncoproteínas e radiação ultra-violeta ativam JNK e outras quinases,

que vão fosforilar c-Jun, tornando-o mais suscetível a formar dímeros

com c-Fos e ativar AP-1 (TAKAHASHI et al., 2002; NECELA &

CIDLOWSKI, 2004). Quando ativado, o AP-1 passa a possuir alta

capacidade de migração nuclear e ligação ao DNA, induzindo a

expressão de citocinas como IL-4, IL-5 e GM-CSF, bem como de outros

genes pró-inflamatórios (NECELA & CIDLOWSKI, 2004). Além disso,

AP-1 é um importante regulador da proliferação, diferenciação,

transformação e apoptose celular (BLADH et al., 2005).

O aumento da expressão de c-Fos foi observado em pacientes com

asma (ADCOCK & CARAMORI, 2001) e com polipose nasal (BARANIUK

et al., 1998), e está relacionado ao aumento de transcrição de AP-1 e

NF-κB e à resistência ao GC (ADCOCK et al., 1995).

NF-κB é um heterodímero composto por membros das famílias

p50 e p65, que coordena e amplifica a resposta imune e inflamatória,

além da apoptose, do crescimento e da diferenciação celular. Possui

ação fundamental na regulação de genes imunes e inflamatórios

(NECELA & CIDLOWSKI, 2004), e sua ausência é incompatível com a

vida (BARNES & KARIN, 1997). Quando inativado, permanece no

citoplasma associado ao seu inibidor, o IκB.

Estímulos como mitógenos, lipopolissacárides, produtos

bacterianos e virais, citocinas (como IL-1β, TNFα, GM-CSF, IL-2 e IL-

17), linfócitos T e B, estresse oxidativo e radiação ativam a cascata de

quinases, em especial a IKK. Essas induzem a fosforilação com

conseqüente dissociação de IκB, permitindo a translocação nuclear de

NF-κB e sua ação na transcrição gênica (NECELA & CIDLOWSKI, 2004).

Apesar de ambos os componentes poderem se ligar ao DNA, apenas o

p65 é capaz de ativar a transcrição. (SCHEINMAN et al., 1995; ADCOCK

& CARAMORI, 2001). Após ativado, o NF-κB induz à transcrição gênica

de citocinas, de receptores de citocinas, de quimiocinas e de moléculas

de adesão, como IL-1β, TNFα, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ, MIP-1α, MCP-1,

RANTES, eotaxina, GM-CSF, ICAM-1, VCAM-1, E-selectina, P-selectina,

iNOS e proteínas anti-apoptóticas (DE BOSSCHER et al., 2000;

ADCOCK & CARAMORI, 2001; HERMOSO & CIDLOWSKI, 2003;

NECELA & CIDLOWSKI, 2004). Além disso, ele ativa a transcrição de

IκB, que atuaria como atenuador do processo inflamatório mediado por

NF-κB (BARNES & KARIN, 1997).

É importante enfatizar que TNF-α e IL-1β ativam NF-κB, e este

processo é essencial na retroalimentação positiva do processo

inflamatório (ADCOCK & CARAMORI, 2001; HERMOSO & CIDLOWSKI,

2003; HAYASHI et al., 2004).

Níveis aumentados de NF-κB (fração p50) foram observados por

Takeno et al. (2002) em pólipos nasais, e estes níveis se

correlacionaram com o aumento da expressão de algumas citocinas e

quimiocinas, como IL-8, eotaxina e IL-16.

Em especial importância, é a possibilidade dos fatores de

transcrição de interagir fisicamente entre si, inibindo ou amplificando a

atividade transcricional de cada um deles, um efeito conhecido como

ligação cruzada (ADCOCK & CARAMORI, 2001). Muitos genes requerem

a ativação simultânea tanto de AP-1 como de NF-κB, e a resposta a um

fator de transcrição é altamente amplificada na presença de aumento do

outro fator, o que sugere que respostas inflamatórias exacerbadas

necessitariam da ativação de ambos os fatores (STEIN et al., 1993;

ADCOCK & CARAMORI, 2001).

2.3 Ação do glicocorticóide na PNS

Os GC são agentes imunossupressores e anti-inflamatórios

efetivos, produzidos naturalmente na glândula adrenal após estímulo do

eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA). É o principal componente

terapêutico para várias doenças auto-imunes e inflamatórias, a exemplo

da artrite reumatóide, colite ulcerativa, asma e PNS.

Apesar de seu mecanismo de ação não estar completamente

esclarecido, sabe-se que eles bloqueiam a inflamação, suprimem a

ativação do sistema imune, e inibem o crescimento, seja em estudos in

vivo como in vitro (SCHEINMAN et al., 1995). Eles ainda induzem rápida

redistribuição de linfócitos circulantes, aumentam o número de

neutrófilos no sangue e suprimem a ação linfocítica e a transcrição de

citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, GM-

CSF, TNF-α e IFN-γ, de quimiocinas, como RANTES eotaxina e MCP, e

de moléculas de adesão, como ICAM-1 e E-selectina, dentre outros

(DENBURG, 1997; ALMAWI & MELEMEDJIAN, 2002; HAYASHI et al.,

2004). Além disso, os GC estimulam a transcrição de citocinas anti-

inflamatórias, como a anexina-1 e o TGF-β, e de proteínas, como IκB

(ADCOCK & CARAMORI, 2001).

Os efeitos dos GC em vias aéreas, conforme descritos por Adcock

& Caramori (2001), possuem importância particular na inibição de

transcrição de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias e de molélulas

de adesão, incluindo IL-1β, TNFα, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,

IL-8, RANTES, eotaxina, MIP-1, MCP, E-selectina, VCAM-1, ICAM-1,

iNOS, COX-2 e fosfolipase-A2, além de bloquearem a síntese de

receptores para citocinas, como o receptor para IL-2 (ADCOCK &

CARAMORI, 2001; SMOAK & CIDLOWSKI, 2004; BENSON, 2005). Os

GC reduzem ainda consideravelmente a sobrevida de linfócitos T e

eosinófilos, por diminuição de expressão das citocinas GM-CSF, IL-3 e

IL-5 (o que acelera significantemente a apoptose destas células) e por

ativação de genes pró-apoptóticos (ADCOCK & CARAMORI, 2001).

Marx et al. (2002) encontraram diminuição da expressão de GM-

CSF e de TNFα em pólipo nasal após exposição in vitro a GC, apesar

deste efeito não ter sido importante em relação a TNFα. Já Hamilos et

al. (2001) trataram seus pacientes com PNS com fluticasona por um

mês, e observaram diminuição acentuada na expressão de GM-CSF,

mas não de TNFα, após este período.

Jahnsen et al. (1999) demonstraram que, em pacientes com PNS

tratados previamente com prednisona, houve diminuição do número de

eosinófilos nas amostras de pólipos nasais, associada à diminuição de

expressão de eotaxina, eotaxina-2 e RANTES quando comparados aos

pacientes com PNS não tratados previamente.

A fluticasona foi capaz ainda de diminuir a expressão de ICAM-1

em estudos in vitro com fibroblastos isolados de pólipos nasais

(SILVESTRI et al., 2002), mas não de VCAM-1. Neste mesmo estudo, os

autores demonstraram também que a fluticasona foi capaz de diminuir

a proliferação de fibroblastos estimulada por b-FGF de forma dose

dependente.

No entanto, uma preocupação constante no tratamento da PNS é

a necessidade de uso crônico de GC, com seus possíveis efeitos

colaterais, como supressão do eixo HPA, retardo no crescimento

somático, diabete, alteração no metabolismo lipídico, glaucoma,

retenção hídrica, osteoporose, além de complicações neuropsiquiátricas

e infecciosas, o que limita o seu uso prolongado (VANDER BERGHE et

al., 1999; NECELA & CIDLOWSKI, 2004; ROUMESTAN et al., 2004).

2.4. Ação celular dos GC

Os GC, por sua natureza hormonal e lipofílica, atravessam a

membrana celular e ligam-se ao receptor de glicocorticóide (GR) no

citoplasma. O GR é um fator de transcrição, que regula vários genes,

seja positiva ou negativamente. Sua ação ocorre devido ao seu domínio

ligante ao DNA, e leva à ativação ou repressão da transcrição gênica

(SCHEINMAN et al., 1995).

O GR, quando inativo, permanece no citoplasma, ligado a duas

proteínas hsp 90. Quando o GR se liga ao GC, ocorre dissociação das

hsp90, com conseqüente influxo nuclear do complexo GR-GC, que

então pode se ligar ao GRE, ativando ou reprimindo a transcrição.

A formação dos complexos GC-GR-GRE induzem a transcrição de

algumas proteínas, como anexina-1, IκB e TGF-β, todas com

propriedades anti-inflamatórias, de receptor β2-adrenérgico, e de

proteínas indutoras de apoptose (MASTRUZZO et al., 2003; HAYASHI et

al., 2004; NECELA & CIDLOWSKI, 2004); além disso, inibem a

transcrição, por se ligarem a nGRE (ou GRE negativos), que seria

responsável pela supressão do eixo HPA e por alguns mecanismos da

osteoporose (SMOAK & CIDLOWSKI, 2004; BARNES, 2006).

No entanto, a maior habilidade do GC na repressão de genes

imunes e inflamatórios está, sobretudo, relacionada com a inativação de

fatores de transcrição como NF-κB e AP-1, através da interação direta

de GR/GC com estes fatores (BAMBERGER et al., 1995; ADCOCK &

CARAMORI, 2001; PUJOLS et al., 2003). Este mecanismo é conhecido

como reação cruzada antagônica, sendo que GR inibe NF-κB e AP-1, e

de forma mútua estes fatores também inibem GR (ALMAWI &

MELEMEDJIAN, 2002). GR ainda diminui a transcrição de p65,

diminuindo assim a formação de NF-κB (SCHEINMAN, 1995).

Necela & Cidlowski (2004) acreditam que a transativação de genes

anti-inflamatórios tenha importância mínima diante do processo anti-

inflamatório. Barnes (2006) e Roumestan et al. (2004) referem ainda

que este mecanismo dificilmente explicaria a potente ação anti-

inflamatória dos GC, uma vez que poucos são os genes ativados

diretamente por GRE, e que altas concentrações de GC seriam

necessárias para ativar este mecanismo, sendo que na prática clínica

concentrações bem menores já são suficientes para suprimir a

inflamação.

A repressão de vários fatores de transcrição simultaneamente

pelo GC é determinante para a sua potência, e medicamentos que

reprimam apenas um dos fatores de transcrição fatalmente não terão a

eficácia clínica dos GC (STEER et al., 2000; ADCOCK & CARAMORI,

2001; BARNES, 2006).

Acredita-se que a maioria dos efeitos colaterais observados pelos

GC seja mediada via transativação, que necessitam de altas doses de

GC para que ocorram; já os efeitos anti-inflamatórios ocorrem mediados

via inibição dos fatores de transcrição pró-inflamatórios, e baixas

concentrações de GC são suficientes para esta ação (ROUMESTAN et

al., 2004); infelizmente alguns efeitos colaterais também são mediados

por inibição de fatores de transcrição, como maior incidência de

infecção e retardo na cicatrização.

Atualmente, são bem conhecidas duas isoformas de GR,

originadas de um splicing alternativo a partir do mesmo gene (PUJOLS

et al., 2003; ZHOU & CIDLOWSKI, 2005): GRα, que é o predominante, e

que possui alta atividade transcricional, e o GRβ, que difere do GRα por

possuir a mesma capacidade de ligação ao DNA, porém não se liga ao

GC, sendo, portanto, inativo para a transcrição mediada por GC

(BAMBERGER et al., 1995; DE CASTRO et al., 1996).

2.5. Mecanismos de resistência aos GC

O estudo dos mecanismos de resistência ao GC tem importância

na PNS por ser este um importante recurso terapêutico na atualidade. A

compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à ação dos GC,

bem como o desenvolvimento de drogas que aumentem seu poder anti-

inflamatório, diminuam seus efeitos colaterais, ou circunvenham seus

mecanismos de resistência, tornam-se, desta forma, essenciais para a

otimização desta terapêutica.

Como os GC reprimem a transcrição por inibirem

simultaneamente vários fatores de transcrição, e são as únicas drogas a

se utilizarem deste mecanismo, outras drogas, com efeito anti-

inflamatório, como inibidores de NF-κB, de HAT ou de MAPK, não têm

apresentado a mesma potência de ação dos GC. Por outro lado, os GC

dissociados, que possuem ação de inibição dos outros fatores de

transcrição, mas com baixa ação de transcrição mediada por GRE,

aparentemente apresentam, em estudos preliminares, menores efeitos

colaterais do que os GC usuais, mas com ação anti-inflamatória

satisfatória (VANDER BERGHE et al., 1999; SMOAK & CIDLOWSKI,

2004; HAYASHI et al., 2004). Vander Berghe et al. (1999) observaram

que a associação de dexametasona a GC dissociados aumentou

consideravelmente a inibição de NF-κB em culturas de células.

Entretanto, o mais preocupante na terapêutica com GC é a

resistência a esta droga, e Henriksson et al. (2001) referem que 20% dos

pacientes com PNS respondem mal a esta terapia. Esta resistência ao

GC pode estar relacionada ao menor número de GRα, ao maior número

de GRβ, ou à inibição inadequada de fatores de transcrição in situ.

Sabe-se que este aumento de resistência ocorre em algumas doenças

apenas localmente, por exemplo, pessoas asmáticas apresentam

alterações na resposta ao GC apenas em pulmões (ADCOCK &

CARAMORI, 2001; WEBSTER et al., 2001; PUJOLS et al., 2003). Esta

resistência local foi observada na PNS por Xaubet et al. (1994), que

relataram que células epiteliais de pólipos nasais inibem a sobrevida

eosinofílica em menor intensidade do que células epiteliais de mucosa

nasal normal.

Schaaf & Cidlowski (2003) referem que a administração de GC em

linhagens celulares leva à diminuição acentuada (em mais de 50%) de

expressão de GRα. A diminuição de GRα após uso de GC também é

relatada por Corrigan et al. (1991), Sher et al. (1994) e Shahidi et al.

(1999).

O GRβ é expresso em todas as células em proporções diferentes, e

permanece predominantemente no núcleo, mesmo na ausência de

ligante (NECELA & CIDLOWSKI, 2004), e não ativa transcrição após

dimerização GRβ-GC (SCHAAF & CIDLOWSKI, 2003). As células

epiteliais de vias aéreas expressam altas proporções de GRβ, sendo a

relação de mRNA de GRα/GRβ de 300:1 nos pulmões e de 3:1 nas

células epiteliais respiratórias humanas. O aumento de expressão de

GRβ é referido em doenças imuno-mediadas, como colite ulcerativa,

asma resistente a GC, artrite reumatóide e leucemia (LEUNG et al.,

1997; SHAHIDI et al., 1999; HONDA et al., 2000; SOUSA et al., 2000;

SCHAAF & CIDLOWSKI, 2003; NECELA & CIDLOWSKI, 2004).

Algumas citocinas pró-inflamatórias (em especial IL-1 e TNF-α),

além de superantígenos (HAUK et al., 2000) e do próprio GC

(WHORWOOD et al., 2001), induzem a expressão de GRβ (WEBSTER et

al., 2001; NECELA & CIDLOWSKI, 2004; ZHOU & CIDLOWSKI; 2005) e

reprimem a de GRα (ZHOU & CIDLOWSKI, 2005).

GRβ forma heterodímeros GRα-GRβ, que não possuem

capacidade de transcrição (DE CASTRO et al., 1996; GOUGAT et al.,

2002). Desta forma, uma possível expressão aumentada de GRβ poderia

inibir a ação de GRα (ação inibitória dominante), e segundo Bamberger

et al. (1995), a repressão da transcrição gênica mediada por GRα ocorre

em correlação direta com a quantidade de GRβ presente na célula. A

expressão aumentada de GRβ foi referida por Sousa et al. (2000) em

pacientes com asma e por Hamilos et al. (2001) em pacientes com

polipose, sendo associada, em ambos os estudos, à resistência ao GC.

A associação da atividade aumentada dos dois fatores de

transcrição, AP-1 e NF-κB, potencializa a resposta inflamatória e

diminui a sua resposta a inibidores, como GC, podendo ser um outro

possível mecanismo para resistência dos pólipos nasais e da asma aos

GC (SCHEINMAN, 1995; ADCOCK & CARAMORI, 2001; SCHAAF &

CIDLOWSKI, 2003). A explicação mais provável para este fato seria a

inibição direta que tanto AP-1 como NF-κB exercem no GR, diminuindo

sua ação local, e mascarando a repressão mediada pelo GC

(SCHEINMAN, 1995). Além disso, NF-κB induz o aumento seletivo de

produção de GRβ, podendo aumentar a resistência ao GC (WEBSTER et

al., 2001). O aumento de AP-1 esteve relacionado com diminuição da

atividade de GRα, segundo Takahashi et al. (2002).

A associação de GC com outros mediadores anti-inflamatórios

potentes, como inibidores de NF-κB (NEMO), de HAT ou de MAPK,

parece ter especial importância no tratamento de doenças como asma e

PNS, por diminuírem os efeitos colaterais dos GC e potencializarem a

sua ação, diminuindo a resistência a estas drogas. (ADCOCK &

CARAMORI, 2001; HIDESHIMA et al., 2002; DE BOSSCHER et al.,

2003; SMOAK & CIDLOWSKI, 2004).

OBJETIVOS

Este estudo teve por objetivos:

- Avaliar resposta clínica da polipose nasal ao corticóide tópico.

- Avaliar as diferenças de expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β,

TNFα e GM-CSF), quimiocinas (eotaxina-2), moléculas de adesão (ICAM-

1) e fatores de crescimento (b-FGF) entre pacientes com PNS e pacientes

controles.

- Avaliar a resposta molecular ao GC, através da diferença de

expressão de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas, moléculas de

adesão e fatores de crescimento antes e após o tratamento clínico.

- Inferir sobre possíveis mecanismos de resistência ao GC

correlacionados com a baixa resposta clínica em alguns pacientes. Para

isto, foram avaliadas a expressão de mRNA e de proteínas das isoformas

do receptor de GC (GRα e GRβ) e dos fatores de transcrição (AP-1 e

NFκB) nos pacientes com PNS antes e após o tratamento, comparando-

os com controles.

PACIENTES E MÉTODOS

Foram selecionados 20 pacientes com PNS no Ambulatório de

Rinossinusologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo. Foram incluídos pacientes

que apresentassem PNS bilateral e que não fizessem uso de medicações

como anti-histamínicos e GC orais ou tópicos, por um período mínimo

de dois meses antes da admissão do estudo. Os pacientes com história

de doenças associadas, como asma, Tríade de Samter, discinesia ciliar e

fibrose cística foram excluídos do estudo.

Todos os pacientes, após assinarem consentimento informado,

responderam ao questionário clínico (ANEXO 1) e foram submetidos à

nasofibroscopia ambulatorial com biópsia do pólipo, sendo que um

fragmento desta amostra foi lavado com solução salina estéril,

identificado e imediatamente armazenado em nitrogênio líquido, e outro

fragmento foi encaminhado para confirmação anátomo-patológica. Os

pacientes foram ainda submetidos à tomografia computadorizada (TC)

dos seios paranasais, para estadiamento da doença.

Após este procedimento, foi-lhes fornecida gratuitamente a

medicação (budesonida 64mcg). Os pacientes foram orientados a

utilizarem quatro jatos desta medicação por narina por dia por um

período de dois meses; ao final deste período, os pacientes que

utilizaram adequadamente a medicação responderam novamente ao

questionário e foram submetidos à nova biópsia do pólipo, utilizando-se

a mesma metodologia de coleta e armazenamento previamente

descritos. Os pacientes que não utilizaram adequadamente a medicação

ou que associaram outras medicações durante o período estudado

foram excluídos da amostragem.

Para o grupo controle, foram selecionados oito pacientes que não

possuíam sintomas nasais, tampouco alterações à rinoscopia anterior e

à nasofibroscopia. Estes pacientes assinaram consentimento informado

antes de serem submetidos à cirurgia plástica nasal, durante a qual

foram colhidas biópsias de mucosa de concha média nasal, coletadas e

armazenadas conforme anteriormente descrito.

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

HCFMRP-USP e da FMRP-USP, processo número HCRP 10909/2003

(ANEXO 2) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP),

processo número 25000.000240/2004-81 (ANEXO 3).

- Processamento das Amostras:

Todas as amostras selecionadas foram homogeneizadas, e RNA e

proteína foram extraídos através da técnica do Trizol. Nesta técnica, o

pólipo ainda congelado é macerado, ao qual adiciona-se 1ml de Trizol

até se obter consistência líquida. Em seguida, adicionam-se 200µl de

clorofórmio; o tubo é então homogeneizado e centrifugado a 4°C por 15

minutos a 13200rpm. A fração transparente, sobrenadante,

corresponde à fração de RNA, enquanto a fração rósea equivale ao DNA

e à proteína associados.

A fração transparente é transportada para outro tubo, e

adicionam-se 500µl de isopropanol; após, este tubo fica armazenado por

24 horas a -20°C. No dia seguinte, o tubo é então centrifugado a 4°C

por 20 minutos a 13200rpm. O sobrenadante é excluído, adiciona-se

1ml de etanol 75%, e centrifuga-se o tubo a 4°C por 5 minutos a

13200rpm. O sobrenadante é retirado e o pellet residual

(correspondente ao RNA) permanece em temperatura ambiente por

aproximadamente 15 minutos, após ao qual são adicionados 50µl de

água-DEPC. O tubo é então armazenado a -80°C até a realização dos

estudos relacionados ao RNA.

À fração rósea são adicionados 300µl de etanol 100%; o tubo é

então homogeneizado por 3 minutos e após centrifugado a 4°C por 5

minutos a 4000rpm; desta forma, separa-se o sobrenadante

(equivalente à proteína) do pellet (correspondente ao DNA).

O líquido sobrenadante é transferido para outro tubo, ao qual

adicionam-se 750µl de isopropanol; o tubo então permanece em

temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos e é

centrifugado a 4°C por 10 minutos a 13200rpm. O sobrenadante é

retirado e ao pellet adiciona-se 1ml de hidrocloreto de guanidina 0,3M

em etanol 95%; o tubo permanece 20 minutos em temperatura

ambiente, e após é centrifugado a 4°C por 5 minutos a 7500rpm, sendo

então o sobrenadante retirado. O processo da guanidina é repetido por

mais duas vezes. Ao pellet é então adicionado 1ml de etanol 100%; o

tubo é submetido ao vortex, permanece por 20 minutos em temperatura

ambiente, e após é centrifugado a 4°C por 5 minutos a 7500rpm. O

pellet residual é então seco por 5 a 10 minutos em temperatura

ambiente, e em seguida dissolvido em 400µl de SDS 1% até ser

completamente homogeneizado. O tubo é então centrifugado a 4°C por

10 minutos a 10000rpm e o sobrenadante, contendo as proteínas

solúveis, são então transferidas para outro tubo e depois estocadas a -

80°C até estudos finais.

- Western Blotting:

- Dosagem de Proteínas:

A quantificação de proteínas foi realizada através do Método de

Bradford, que teve que ser adaptado devido ao fato das amostras

estarem diluídas em SDS 1%, o que altera a reação para quantificação.

Desta forma, as amostras são diluídas na proporção de 1:100 (10µl de

cada amostra em 1ml de água-MilliQ). Adicionam-se 160µl desta

amostra diluída a 40µl de corante (Protein Assay-Bio Rad), diluído em

água na proporção de 1:4. As amostras são comparadas às amostras

com concentrações de BSA previamente conhecidas, de 1; 2,5; 5; 10 e

20µl/ml. Para padronização adequada desta análise, estas

concentrações de BSA também são diluídas em 10µl de SDS1% + 990µl

de água-MilliQ.

Todas as amostras e as concentrações de BSA são então

analisadas em duplicada no espectofotômetro de luz, a partir da qual

y = 0,0045x + 0,1364

= 0,9856

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 10 20 30 40 50

constrói-se uma curva de padronização de BSA, individual para cada

reação.

Exemplo de curva padrão de BSA:

São fornecidos os pontos referentes à captação espectofotométrica

em cada concentração de BSA estudada. A partir daí, constrói-se uma

linha de tendência, que por sua vez possui uma razão de equivalência

, que idealmente deve ser maior do que 0,90 para que a reação seja

aceitável) e uma equação. A partir desta equação, são calculados os

valores de concentração de proteína para cada amostra, onde y = valor

espectofotométrico e x = concentração. O resultado final é em seguida

multiplicado por 100, devido à diluição realizada anteriormente. Curvas

que obtiveram valores de razão menores do que 0,90 foram descartadas

e as reações todas repetidas.

Após quantificadas, as amostras de proteínas são então

submetidas ao Western Blotting.

- Escolha dos Anticorpos:

São selecionados anticorpos específicos para as proteínas a serem

estudadas, compatíveis com Western Blotting e que reajam a proteínas

humanas. Foram adquiridos anticorpos anti c-Fos (D-1), anti p65 (F-6)

e anti GR (E-20), da Santa Cruz Biotechnology, Inc. Devido ao fato de

não haver anticorpos específicos para GRα e GRβ isolados no mercado,

foi adquirido um anticorpo específico para as duas frações de GR, e elas

foram isoladas entre si através da análise do peso molecular,

respectivamente 95 e 90 kDa.

Para os anticorpos secundários, utilizou-se formas monoclonais

anti-mouse para c-Fos e p65 e policlonais anti-rabbit para GR. Os dois

anticorpos secundários (anti-mouse e anti-rabbit) foram adquiridos da

Amersham Biosciences.

- Eletroforese/Imunodetecção:

Foram confeccionados géis de separação a 10% e de

empilhamento a 4%. Esta concentração para géis de separação é ideal

para as concentrações das proteínas a serem estudadas (62kDa para c-

Fos, 65 kDa para p65, 95 kDa para GRα, e 90 kDa para GRβ), além de

ser capaz de separar de forma eficaz as bandas de 90kDa e 95 kDa,

para estudo dos GRs.

Para géis de separação, são adicionados 8,2ml de água Milli-Q,

5,0ml de 1,5M Tris HCl a pH 8,8, 200µl de SDS 10%, 6,6ml de

Acrilamida-Bis, 200µl de persulfato de amônio 10% e 20µl de TEMED.

Após a polimerização deste gel, adiciona-se o gel de empilhamento. Este

é realizado, adicionando-se 6,1ml de água Milli-Q, 2,5ml de 0,5M Tris

HCl a pH 6,8, 100µl de SDS 10%, 1,3ml de Acrilamida-Bis, 100µl de

persulfato de amônio 10% e 20µl de TEMED.

Após confecção do gel, as proteínas são desnaturadas. Para isto,

a quantidade de 10µg de proteína é diluída em 30µl de tampão de

amostra (composto por 4ml de água Milli-Q, 1ml de 0,5M Tris HCl a pH

6,8, 0,8ml de glicerol, 1,6ml de SDS 10%, 0,4ml de β-mercaptoetanol e

0,2ml de azul bromofenol a 0,05%). As proteínas são então levadas a

95°C por 5 minutos, para desnaturação, e são posteriormente aplicadas

em duplicidade no gel.

O gel com as proteínas é então submetido à eletroforese com

solução de glicina (14,46g) Tris-base (3,03g), SDS 10% (10ml), diluídos

em 1 litro de água, numa corrente de 150V por 1 hora, juntamente com

o marcador de peso molecular, para evidenciar as proteínas em estudo.

Após a eletroforese, as proteínas são transferidas para uma

membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences), através de

eletroforese com solução composta por glicina (11,57g), Tris base

(2,42g), SDS 10% (8ml), etanol 100% (150ml), diluídos em 800ml de

água, numa corrente de 100V por 1 hora.

Figura 2: coloração de comassie blue 0,25% em gel após eletroforese,

demonstrando distribuição das proteínas por peso molecular

A transferência de proteínas é confirmada pela coloração com

Ponceau 0,5% em ácido acético a 1% por 15 minutos. Após

confirmação, as membranas são lavadas e submetidas à

imunodetecção.

Para a imunodetecção, a membrana é lavada com solução

bloqueadora (composta por 0,5g e leite desnatado diluído em 10ml de

TBST a 1%) durante 1 hora. As membranas são então lavadas com

TBST 3 vezes, por 10 minutos cada uma delas.

As membranas são expostas ao anticorpo primário, diluído em

1:1000 por 1 hora, após a qual são lavadas com TBST por 3 vezes, por

10 minutos cada. Depois, elas são expostas ao anticorpo secundário,

diluído em 1:2500 por 1 hora; novas 3 lavagens com TBST são então

realizadas, por 10 minutos cada.

As membranas são então submetidas à marcação radiográfica,

em câmara escura, com o Kit ECL (Amersham Biosciences). Elas

permanecem em contato com esta solução e com o Raio-X por 5

minutos, e após o Raio-X é submetido à revelação.

A leitura de intensidade das bandas para semiquantificação é

realizada por um densitômetro computadorizado (GS 800 Calibrated

Densitometer – BioRad. Hercules/California). As imagens são

digitalizadas e analisadas por software de leitura (Quantity One -

Quantitation Software – BioRad. Hercules/California), sendo analisado

o número de pixels por mm

. Estes números estão diretamente

relacionados à concentração de proteínas marcadas.

- RQ-PCR:

- Confecção de cDNA:

Os cDNAs de todas as amostras foram obtidos a partir de 2 kits: o

Superscript III RNAse H – reverse transcriptase (Invitrogen) e o High

Capacity cDNA arquive kit (Applied Biosystems).

Para a Superscript III, adiciona-se 7µl de RNA da amostra, 1µl de

tampão 10X (500mM Tris, pH 8; 100mM MgCl2), 1 µl de inibidor de

RNAse (RNAse out) e 1µl de DNAse (diluída em 1:10). Esta solução é

incubada por 15 minutos a 37

C, após o qual adiciona-se 1µl de EDTA

25mM para bloqueio da reação; incuba-se a 70

C por 2 minutos para

desnaturação, e ao final adiciona-se 1µl de random primer,

permanecendo por mais 6 minutos a 70

C. Após, a solução é colocada

no gelo, e adiciona-se o Mix II (4µl de tampão de síntese 5X, 2µl de DTT

0,1M, 1µl de dNTP, 1µl de inibidor de RNAse e 1µl de M-MLV, a

transcriptase reversa). Esta solução final é colocada por 1 hora a 37

até confecção do cDNA. Este cDNA foi armazenado em freezer a -20

, e

foi utilizado nas reações com os genes GRα, TNF-α, p65, ICAM-1 e

eotaxina-2.

No entanto, nos estudos pilotos, verificou-se que a eficiência da

RQ-PCR com cDNAs a partir da Superscript para os genes GRβ,

GMCSF, IL-1β, c-Fos e b-FGF, não foi satisfatória, sendo necessária a

utilização do High Capacity cDNA arquive kit. Este kit aprimorou a

qualidade do cDNA obtido, permitindo o estudo adequado de todos os

genes inicialmente propostos. Para a confecção de cDNA com este kit,

adiciona-se 1µl de RNA, 2,5µl de buffer, 1µl de dNTP, 2,5µl de random

primers, 1,25µl de multiscribe e 0,63µl de RNAsin. Esta solução é

colocada a 25

por 10 minutos, seguida de 37

por 120 minutos. Este

cDNA também é armazenado em freezer a –20

até a realização do PCR.

- Seleção de Primers:

Os primers foram selecionados a partir do DNA genômico

(adquirido no programa Esembl: http://www.ensembl.org/index.html) e

construídos através do programa Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi), e foram selecionados de acordo com as

especificações para reação de PCR em tempo real, ou seja, primers com

tamanho máximo de 150 pares de base, concentração de C/G entre 20

e 80%, temperatura de dissociação em torno de 60

e máximo de 2

nucleotídeos C/G na extremidade 3’ do primer. Os primers foram ainda

confeccionados incluindo frações em diferentes exons, no intuito de se

evitar reações cruzadas com o DNA genômico. Após a construção de

cada um dos primers, eles foram conferidos em relação à sua

autenticidade e à sua especificidade para o RNA e para a espécie

humana no programa Blast da PubMed (site:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Desta forma, foram

selecionados como primers:

RNA Primer sense Primer anti-sense

IL-1 beta TCAGCCAATCTTCATTGCA TGGCGAGCTCAGGTACTTCT

TNF alfa CTCTTCTGCCTGCTGCACTT GCCAGAGGGCTGATTAGAGA

GM-CSF CAGCCTCACCAAGCTCAAG TGACAAGCAGAAAGTCCTTCA

Eotaxina-2 CTGTCCAGCAGGAGCACAT CCCTTCTTGGTGGTGAAGAT

b-FGF AGAGCGACCCTCACATCAAG TTCCTTCATAGCCAGGTAACG

ICAM-1 GCCAACCAATGTGCTATTCA GCCAGTTCCACCCGTTCT

c-Fos ACTACCACTCACCCGCAGAC GTGGGAATGAAGTTGGCACT

p65 CCACGAGCTTGTAGGAAAGG CTGGATGCGCTGACTGATAG

GR alfa GAAGGAAACTCCAGCCAGAA TGTTTGGAAGCAATAGTTAAGGA

GR beta GAAGGAAACTCCAGCCAGAA GCCAAGATTGTTGGGATGAA

GUS GAAAATATGTGGTTGGAGAGCTCATT CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA

O GUS foi utilizado como o gene “housekeeping”, ou referência

endógena. Este gene codifica a proteína beta-glicuronidase, e é expresso

e forma semelhante em diferentes tipos de células nucleadas, além de

ser estável e de não sofrerem influência do ciclo celular (VAN DER

VELDEN ETAL., 2003). Como ele está expresso de forma semelhante em

todas as células, é utilizado como controle de validação do material e da

normalização da concentração de cDNAs nas diferentes amostras.

-RQ-PCR:

As reações de RQ-PCR foram realizadas com o kit SYBR Green

PCR Master MIX (Applied Biosystems), que contém SYBR Green dye,

AmpliTaq Gold DNA polimerase, dNTPs (dUTP) referência passiva e

tampão otimizado. Para reação de PCR, são adicionados 10µl de SYBR

Green PCR Master MIX, 4µl de água, 0,5µl de cada primer a ser

estudado (sense e anti-sense) e 5µl de cDNA diluído a 1:10.

As reações são realizadas em duplicata para cada amostra em

placas de polipropileno para 96 reações (ultraAmp 96-well Semi-Skirt

PCR plates, Sorenson BioScience, Inc, EUA) cobertas com adesivos para

microplacas (Adhesive PCR film, ABgene). Após, as placas são

centrifugadas a 25º por 3 minutos a 3000rpm, e então submetidas à

reação.

O estudo de RQ-PCR foi realizado no aparelho Gene Amp 7300

Sequence Detection System (PE Applied Biosystems). A reação de PCR

foi padronizada como se segue: pré-aquecimento a 50º por 2 minutos,

desnaturação a 95º por 10 minutos e 50 ciclos de amplificação e

quantificação (15 segundos a 95º e 60 segundos a 60º), seguidos de um

período de dissociação para análise da curva de dissociação de 60

segundos a 95º.

As reações foram validadas através de uma curva-padrão,

construída para cada um dos genes estudados. Esta curva é calculada a

partir de diferentes diluições de uma mesma amostra (1:10, 1:100 e

1:1000), e é considerada ideal quando o slope aproxima-se de 3,3.

Após obtenção da curva-padrão para cada gene, as amostras

foram estudadas em duplicata, assim como as linhagens celulares

(neste estudo, foram utilizadas a linhagem K562-LUCENA e células de

medula óssea). Para cada amostra, obteve-se uma curva de

amplificação e uma curva de dissociação, que é em geral específica para

cada gene. A uniformização da curva de dissociação em cada gene

estudado é a comprovação da qualidade da reação de RQ-PCR. Produtos

de PCR de um primer específico devem apresentar curvas de

dissociação semelhantes, a uma mesma temperatura. Temperaturas

diferentes de curvas de dissociação indicam a amplificação de produtos

não específicos, como os primer-dimers (dímeros de primer).

A expressão da amostra é calculada por delta-delta-Ct, através da

equação linear:

y = ax + b,

onde y = expressão do gene; a = slope da curva; x = quantificação

obtida pelo RQ-PCR; e b = intercept.

Para normalização dos resultados, são avaliadas as expressões

destes genes também para linhagens, assim como a expressão de GUS

para cada amostra estudada.

Assim, a equação final calibrada se dá como se segue:

Calibração final = valor gene amostra / valor GUS amostra

valor gene linhagem / valor GUS linhagem

- Análise Estatística:

Foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney em todas

as análises, tendo sido considerado estatisticamente significativo o valor

de p<0,05.

RESULTADOS

- Estudo Clínico:

Foram avaliados 20 pacientes com PNS, sendo 16 (80%) do sexo

masculino e 4 (20%) do sexo feminino; a idade variou entre 15 e 69

anos, com média de 44,5 (±15,09) e mediana 42,50.

Com o intuito de se avaliar de forma objetiva a resposta ao

tratamento com GC tópico, os sintomas foram graduados de 0 a 4 e

compilados num questionário aplicado (Anexo 1), de acordo com a

intensidade referida pelo paciente. Estes escores, assim como a

somatória de escores (SE), foram comparados entre si nos momentos

pré e pós-tratamento. Os resultados de médias, desvios padrões e níveis

de significância para cada variável estudada estão demonstrados na

Tabela 1.

Tabela 1: escores clínicos para os pacientes com polipose nasossinusal, antes

e após o tratamento com budesonida nasal.

Variável Pré-tratamento Pós-tratamento p

média mediana P25-P75 média mediana P25-P75

Obstrução nasal 2,80 3,00 2,00-4,00 1,25 1,00 0,00-2,00 0,0011*

Rinorréia post. 2,35 3,00 2,00-3,00 0,85 0,00 0,00-1,00 0,0019*

Cacosmia 0,50 0,00 0,00-0,25 0,25 0,00 0,00-0,00 0,6949

Cefaléia frontal 1,60 2,00 0,75-2,00 0,70 0,00 0,00-1,00 0,017*

Hiposmia 3,30 4,00 3,00-4,00 2,05 2,50 0,00-4,00 0,0214*

Prurido nasal 1,55 1,00 0,00-3,00 0,65 0,00 0,00-1,00 0,1039

Rinorréia ant. 1,50 1,00 0,00-3,00 0,70 0,00 0,00-1,00 0,0431*

Espirros 2,25 2,50 1,75-3,00 0,95 1,00 0,00-1,25 0,0026*

Endoscopia 4,25 4,00 3,75-5,00 2,90 3,00 2,00-4,00 0,0064*

SE 20,10 19,50 17,0-23,5 10,30 8,50 5,75-14,7 <0,0001*

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

SE= soma dos escores

O tratamento com GC foi significantemente eficaz para redução de

todos os sintomas em isolado, com exceção da cacosmia e do prurido

nasal, os quais já demonstravam baixos índices antes do tratamento

(respectivamente, mediana de 0,00 e 1,00), da mesma forma que para

os valores de escore endoscópico. Houve também considerável

diminuição na somatória dos escores (SE) entre pré e pós-tratamento,

de maneira estatisticamente significante.

No entanto, podemos observar que os valores médios após

tratamento ainda foram considerados relativamente altos (mediana de

8,5 para SE pós), o que demonstra que os pacientes ainda persistiam

com algum grau de sintomatologia após o tratamento.

Durante o estudo, todos os pacientes realizaram tomografia

computadorizada de seios paranasais. O grau de acometimento

nasossinusal foi avaliado através do método de Lund & Mackay (1993),

que se faz através de um escore de 0 a 24 pontos, sendo tanto maior o

valor do escore quanto maior for o acometimento nasossinusal pela

PNS. Em relação à TC, o escore médio foi de 15,60 (±5,60) e a mediana

16,00.

Foram ainda comparados os pacientes bons e maus

respondedores ao tratamento clínico, em relação aos valores de escore

de TC e valores de escore, antes do tratamento, de endoscopia nasal

(END) e somatória do escore de sintomas (SE).

Para avaliação da melhora clínica, foi definida uma nova variável,

(MC), onde:

MC = SE pós-tratamento / SE pré-tratamento.

A Tabela 2 demonstra o MC para cada paciente em particular,

assim como a mediana dos valores.

A partir da mediana de MC, foram selecionados dois grupos: G1,

composto por pacientes com valores de MC acima da mediana, e,

portanto apresentaram pior resposta ao GC tópico, e G2, composto por

paciente que tiveram MC abaixo do valor da mediana, considerados os

que tiveram resposta favorável ao tratamento clínico.

Tabela 2: índice de melhora clínica (MC) para cada indivíduo e mediana de

MC no estudo.

paciente MC Grupo

1 0,473684211 1

2 0,518518519 1

3 1,235294118 1

4 0,684210526 1

5 0,260869565 2

6 0,428571429 2

7 0,548387097 1

8 1,111111111 1

9 0,5 1

10 0,411764706 2

11 0,631578947 1

12 0,260869565 2

13 0,238095238 2

14 0,869565217 1

15 0,363636364 2

16 0,32 2

17 0,777777778 1

18 0 2

19 0,192307692 2

20 0,285714286 2

Os pacientes do G1 (maus respondedores ao GC) foram

comparados com os do G2 (bons respondedores) pelo teste de Mann-

Whitney, e os dados estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3: variáveis de endoscopia (End), somatória de escores (SE) e escore

tomográfico (TC) para os Grupos G1 (maus respondedores) e G2 (bons

respondedores).

G1 G2

escores

média

mediana

P25-P75 média

mediana

P25-P75 p

End

4,60 4,50 4,00-5,00 3,90 4,00 3,00-4,75 0,1477

22,00 19,50 19,00-26,0

18,20 19,00 14,25-23,0

0,2262

18,70 19,50 17,25-21,7

12,50 12,50 9,50-15,00

0,014*

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Não houve diferença entre os grupos para os escores endoscópico

e total no pré-tratamento. No entanto, houve diferença estatística entre

os grupos para o escore de TC (19,5 para G1 vs. 12,5 para G2, p<0,05),

demonstrando que pacientes com maior extensão tomográfica da PNS

apresentam pior resposta clínica ao tratamento com GC tópico.

Para análise de biologia molecular, foi adicionado ao estudo um

grupo controle, que foi constituído por oito pacientes submetidos à

rinoplastia, que não possuíam sintomas nasais, tampouco alterações à

endoscopia nasal. Estes pacientes tinham idade entre 18 e 53 anos,

com idade média de 40,3 (±10,23) e mediana 39,76, sendo três do sexo

masculino e cinco do sexo feminino.

- Western Blotting:

As figuras abaixo (Figuras 3a, 3b e 3c) correspondem a imagens

digitalizadas dos resultados de Western Blotting. As intensidades de

banda foram analisadas, e obtiveram-se os dados para análise das

proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65. Os dados comparando estas proteínas

antes e após o tratamento, assim como com o grupo controle, estão

ilustrados nas Tabelas 4, 5 e 6 e na Figura 4.

Figura 3: imagens digitalizadas dos resultados obtidos em Western Blotting,

correspondentes a p65 (A), cFos (B) e GR (C). Em GR, existem duas bandas, a

superior corresponde a GRα e a inferior corresponde a GRβ. A maior

intensidade da banda corresponde a maior concentração da proteína

66KD

97KDA

66KDA

Tabela 4: expressão de proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65 em pacientes com

polipose nasossinusal antes do tratamento e no grupo controle.

Pré-tratamento Controle

média

mediana

P25-P75 média mediana

P25-P75 p

GRα

αα

1,34 0,25 0,11-1,18 3,40 3,09 2,17-4,29 0,0057*

GRβ

ββ

0,50 0,14 0,04-0,49 0,13 0,10 0,07-0,15 0,6718

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

28,51 1,34 0,58-5,78 43,52 37,74 15,5-63,8 0,0096*

c-Fos

2,50 0,97 0,25-2,86 1,66 1,10 0,74-1,61 0,9999

p65

2,26 1,19 0,59-2,7 0,44 0,21 0,13-0,36 0,0039*

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Houve diferença significativa entre os grupos para GRα, relação

GRα/GRβ e p65, com menores valores de GRα (0,25 vs. 3,09, p<0,01) e

de relação GRα/GRβ (1,34 vs. 37,74, p<0,01) e maiores valores de p65

(1,19 vs. 0,21, p<0,005) nos pacientes com PNS sem tratamento do que

no grupo controle.

Tabela 5: expressão de proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65 em pacientes com

polipose nasossinusal antes e após tratamento.

Pré-tratamento Pós-tratamento

média

mediana

P25-P75 média

mediana

P25-P75 p

GRα

αα

1,34 0,25 0,11-1,18 1,54 0,42 0,14-1,97 0,5428

GRβ

ββ

0,50 0,14 0,04-0,49 0,30 0,25 0,10-0,52 0,6554

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

28,51 1,34 0,58-5,78 16,14 1,29 0,53-21,5 0,5609

c-Fos

2,50 0,97 0,25-2,86 2,36 1,00 0,42-3,16 0,8604

p65

2,26 1,19 0,59-2,7 2,02 1,52 1,08-2,75 0,6949

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Não se observou diferença estatística para os valores de expressão

de nenhuma das proteínas estudadas, tampouco da relação GRα/GRβ,

quando comparamos os pacientes antes e após o uso de GC tópico.

Tabela 6: expressão de proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p65 em pacientes com

polipose nasossinusal após tratamento e nos grupo controle.

Pós-tratamento Controle

média

mediana

P25-P75 média mediana

P25-P75 p

GRα

αα

1,54 0,42 0,14-1,97 3,40 3,09 2,17-4,29 0,0114*

GRβ

ββ

0,30 0,25 0,10-0,52 0,13 0,10 0,07-0,15 0,1226

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

16,14 1,29 0,53-21,5 43,52 37,74 15,5-63,8 0,0114*

c-Fos

2,36 1,00 0,42-3,16 1,66 1,10 0,74-1,61 0,9999

p65

2,02 1,52 1,08-2,75 0,44 0,21 0,13-0,36 0,00081*

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Houve diferença significativa entre os grupos para GRα, relação

GRα/GRβ e p65, com menores valores de GRα (0,42 vs. 3,09, p<0,05) e

de relação GRα/GRβ (1,29 vs. 37,74, p<0,05) e maiores valores de p65

(1,52 vs. 0,21, p<0,001) nos pacientes com PNS após tratamento do que

no grupo controle.

pré tto pós tto controle

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

pré tto

pós tto

controle

GR alfa

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

GR beta

pré tto pós tto controle

100

200

300

pré tto

pós tto

controle

Relação GR alfa/ GR beta

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

c-Fos

pré tto pós tto controle

0.0

2.5

5.0

7.5

pré tto

pós tto

controle

p65

Figura 4: curva de dispersão e mediana para expressão das proteínas GRα (A),

GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-65 (E) para os pacientes com

polipose nasossinusal antes e após tratamento e para grupo controle

Os valores de comparação entre o grupo de má resposta ao GC

(G1) com o de evolução melhor (G2) estão ilustrados na Tabela 7 e na

Figura 5.

Tabela 7: expressão das proteínas GRα, GRβ, c-Fos e p-65 para os grupos

maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à budesonida, antes e

após tratamento

Proteína

G1 G2

média

mediana

P25-P75 média

mediana

P25-P75 p

Pré 1,37 0,46 0,18-0,57 1,31 0,17 0,09-2,35 0,6305

GRα

αα

Pós 1,63 0,42 0,28-0,89 1,46 0,39 0,09-2,61 0,6842

Pré 0,37 0,11 0,03-0,49 0,63 0,14 0,05-0,27 0,9705

GRβ

ββ

Pós 0,39 0,48 0,20-0,53 0,21 0,14 0,06-0,26 0,1051

Pré 39,96 1,56 0,42-7,90 17,06 1,34 0,74-4,58 0,8534

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

Pós 15,00

0,93

0,58-18,3 17,28

5,82

0,65-19,2 0,7394

Pré 3,58 2,46 0,78-5,68 1,42 0,50 0,24-1,50 0,1230

c-Fos

Pós 3,51 2,19 0,59-5,31 1,22 0,63 0,37-1,28 0,2476

Pré 1,49 1,06 0,7-1,36 3,03 1,82 0,58-5,94 0,3930

p65

Pós 2,56 2,29 1,37-2,98 1,48 1,20 0,38-2,35 0,1655

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Não houve diferença nas expressões das proteínas entre os

grupos com boa ou má resposta ao tratamento clínico, quer seja antes

ou após o tratamento.

G1 G2

GR alfa pré tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

GR alfa pós tto

G1 G2

GR beta pré tto

G1 G2

GR beta pós tto

G1 G2

100

200

GR alfa/ GR beta pré tto

G1 G2

GR alfa/ GR beta pós tto

G1 G2

c-Fos pré tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

c-Fos pós tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

7.5

p65 pré tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

7.5

p65 pós tto

AI AII

BII

CII

DI DII

EII

Figura 5:

curva de dispersão e mediana para expressão das proteínas

GRα (A), GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-

65 (E) para os

grupos maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à

budesonida nasal, antes (I) e após (II) tratamento

-RQ-PCR:

Foram construídas equações para cada gene, a partir dos valores

obtidos na curva padrão dos mesmos. Estas equações estão descritas

na Tabela 8.

Tabela 8: equações obtidas pela curva padrão para gene estudado.

gene Equação

GUS y = 3,16x + 26,71

GRα

αα

y = 3,55x + 29,96

GRβ

ββ

y = 3,53x + 35,01

c-Fos y = 3,34x + 26,70

p65 y = 3,35x + 29,55

TNF-α

αα

y = 3,43x + 31,96

IL-1β

ββ

y = 3,09x + 34,12

GM-CSF y = 3,41x + 34,34

ICAM-1 y = 3,04x + 31,39

Eotaxina-2 y = 3,24x + 28,82

b-FGF y = 3,32x + 31,75

A análise das amostras para cada primer estudado resultou em

uma curva de amplificação, e uma curva de dissociação, que funciona

como controle da qualidade da reação. As figuras 6 a 16 ilustram

exemplos de cada uma destas curvas para cada primer estudado.

Figura 6: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GUS

Figura 7: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GRα

Figura 8: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GRβ

Figura 9: curvas de amplificação e de dissociação para o gene c-Fos

Figura 10: curvas de amplificação e de dissociação para o gene p65

Figura 11: curvas de amplificação e de dissociação para o gene TNFα

Figura 12: curvas de amplificação e de dissociação para o gene IL-1β

Figura 13: curvas de amplificação e de dissociação para o gene GM-CSF

Figura 14: curvas de amplificação e de dissociação para o gene ICAM-1

Figura 15: curvas de amplificação e de dissociação para o gene eotaxina-2

Figura 16: curvas de amplificação e de dissociação para o gene b-FGF

Os dados comparando a expressão destes genes antes e após o

tratamento, assim como com o grupo controle, estão ilustrados nas

Tabelas 9, 10 e 11 e nas Figuras 17 e 18.

Tabela 9: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p65, TNF-α, IL-1β, GM-CSF,

ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF nos pacientes com polipose nasossinusal antes do

tratamento e no grupo controle.

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Houve diferença estatística para a expressão dos genes GRα, p65,

IL-1β, eotaxina-2 e b-FGF, além da relação GRα/GRβ entre os grupos,

com menor expressão de GRα (0,33 vs. 2,68, p<0,0001) e da relação

GRα/GRβ (0,86 vs. 2,74, p<0,0001), e maior expressão de p65 (0,34 vs.

0,02, p<0,05), IL-1β (0,78 vs. 0,03, p<0,0005), de eotaxina-2 (17,05 vs.

1,27, p<0,05) e de b-FGF (0,15 vs. 0,005, p<0,05) no grupo com PNS

antes do tratamento quando comparado ao grupo controle. Não houve

diferença significativa para a expressão dos demais genes estudados.

Pré-tratamento Controle

gene média mediana

P25-P75 média mediana

P25-P75 p

GRα

αα

25,78 0,33 0,12-0,86 117,85 2,68 1,41-6,02 <0,0001*

GRβ

ββ

58,78 0,49 0,20-2,21 1,81 0,54 0,15-1,02 0,7086

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

87,42 0,86 0,12-1,69 869,92 2,74 2,13-44,46

<0,0001*

c-Fos

55,62 1,00 0,35-4,80 24,26 1,87 0,22-50,32

0,9801

p65

40,33 0,34 0,12-1,09 0,33 0,02 0,01-0,70 0,0487*

TNF-α

αα

145,34 0,44 0,13-9,32 17,64 0,58 0,06-6,77 0,5665

IL-1β

ββ

145,49 0,78 0,15-3,37 0,03 0,03 0,01-0,04 0,0004*

GM-CSF

45,60 0,23 0,10-0,82 0,33 0,14 0,05-0,38 0,2584

ICAM-1

117,61 0,62 0,09-2,25 4,38 0,63 0,03-2,12 0,6005

Eotaxina-2

328,19 17,05 9,70-91,50

31,26 1,27 0,31-24,13

0,0375*

b-FGF

68,52 0,15 0,02-0,68 0,03 0,005 0,002-0,05

0,037*

Tabela 10: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p65, TNF-α, IL-1β, GM-CSF,

ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF nos pacientes com polipose nasossinusal antes e

após o tratamento.

Pré-tratamento Pós-tratamento

gene média

mediana

P25-P75 média mediana P25-P75 p

GRα

αα

25,78 0,33 0,12-0,86 22,8 0,29 0,12-1,67 0,9596

GRβ

ββ

58,78 0,49 0,20-2,21 7,60 0,52 0,13-0,95 0,3721

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

87,42 0,86 0,12-1,69 495,24 0,32 0,13-8,28 0,6073

c-Fos

55,62 1,00 0,35-4,80 27,89 0,51 0,05-12,47

0,4408

p65

40,33 0,34 0,12-1,09 0,39 0,09 0,05-0,23 0,0454*

TNF-α

αα

145,34

0,44 0,13-9,32 7,34 0,09 0,01-1,79 0,0316*

IL-1β

ββ

145,49

0,78 0,15-3,37 15,27 1,60 0,13-4,32 0,6554

GM-CSF

45,60 0,23 0,10-0,82 1,21 0,18 0,05-0,43 0,4094

ICAM-1

117,61

0,62 0,09-2,25 133,51 0,45 0,14-2,68 0,7558

Eotaxina-2

328,19

17,05 9,70-91,50

107,30 3,47 0,59-12,75

0,0239*

b-FGF

68,52 0,15 0,02-0,68 1,88 0,15 0,02-0,68 0,3793

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Houve diferença significativa para a expressão dos genes p65,

TNF-α e eotaxina-2 entre os grupos, com diminuição da expressão de

p65 (0,34 vs. 0,09, p<0,05), TNF-α (0,44 vs. 0,09, p<0,05) e de eotaxina-

2 (17,05 vs. 3,47, p<0,05) após tratamento com GC tópico. Não houve

diferença significativa para a expressão dos outros genes.

Tabela 11: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p65, TNF-α, IL-1β, GM-CSF,

ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF nos pacientes com polipose nasossinusal após o

tratamento e no grupo controle.

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Houve diferença estatisticamente significativa para a expressão

dos genes GRα, e IL-1β, além da relação GRα/GRβ entre os grupos, com

menor expressão de GRα (0,29 vs. 2,68, p=0,0005) e da relação

GRα/GRβ (0,32 vs. 2,74, p=0,0005), e maior expressão de IL-1β (1,60

vs. 0,03, p<0,005) no grupo com PNS após o tratamento quando

comparado ao grupo controle. Não houve diferença estatística para a

expressão dos outros genes.

Pós-tratamento Controle

gene média mediana P25-P75 média mediana

P25-P75 p

GRα

αα

22,8 0,29 0,12-1,67 117,85 2,68 1,41-6,02 0,0005*

GRβ

ββ

7,60 0,52 0,13-0,95 1,81 0,54 0,15-1,02 0,2375

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

495,24 0,32 0,13-8,28 869,92 2,74 2,13-44,46

0,0005*

c-Fos

27,89 0,51 0,05-12,47 24,26 1,87 0,22-50,32

0,8227

p65

0,39 0,09 0,05-0,23 0,33 0,02 0,01-0,70 0,2855

TNF-α

αα

7,34 0,09 0,01-1,79 17,64 0,58 0,06-6,77 0,3811

IL-1β

ββ

15,27 1,60 0,13-4,32 0,03 0,03 0,01-0,04 0,0044*

GM-CSF

1,21 0,18 0,05-0,43 0,33 0,14 0,05-0,38 0,2718

ICAM-1

133,51 0,45 0,14-2,68 4,38 0,63 0,03-2,12 0,8787

Eotaxina-2

107,30 3,47 0,59-12,75 31,26 1,27 0,31-24,13

0,3542

b-FGF

1,88 0,15 0,02-0,68 0,03 0,005 0,002-0,05

0,3466

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

100

150

200

250

500

GR alfa

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

100

125

150

175

1000

GR beta

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

200

700

10000

Relação GR alfa/ GR beta

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

280

800

810

820

830

c-Fos

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

5.4

45 .6

54 5 .6

p65

Figura 17: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de GRα (A),

GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-65 (E) para os pacientes com

polipose nasossinusal antes e após tratamento e para grupo controle

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

200

400

1800

1875

TNF-alfa

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

150

2000

3000

IL-1 beta

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

850

900

GM-CSF

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

2500

2750

ICAM-1

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

100

300

1000

4000

eotaxina-2

pré tto pós tto controle

pré tto

pós tto

controle

1200

1300

b-FGF

Figura 18: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de TNF-α (A),

IL-1β (B), GM-CSF (C), ICAM-1 (D), eotaxina-2 (E) e b-FGF (F) para os

pacientes com polipose nasossinusal antes e após tratamento e para grupo

controle

E F

D C

B A

Foi avaliada ainda a expressão dos genes entre os grupos de pior

(G1) e melhor resposta clínica (G2) após tratamento com GC. Os

resultados podem ser visualizados na Tabela 12 e nas Figuras 19 e 20.

Tabela 12: expressão dos genes GRα, GRβ, c-Fos, p-65, TNF-α, IL-1β, GM-

CSF, ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF para os grupos maus respondedores (G1) e

bons respondedores (G2) à budesonida, antes e após tratamento.

Gene G1 G2

média

mediana

P25-P75 média mediana

P25-P75 p

Pré 1,22 0,34 0,14-1,06 50,34 0,32 0,14-0,82 0,7959

GRα

αα

Pós 1,16 0,34 0,13-1,21 44,43 0,25 0,06-5,33 0,9999

Pré 116,12

0,62 0,27-12,37

1,45 0,44 0,18-1,33 0,5787

GRβ

ββ

Pós 6,96 0,95 0,30-9,47 0,32 0,28 0,09-0,55 0,0433*

Pré 2,43 0,86 0,12-1,42 172,42

0,63 0,13-2,04 0,5288

Relação

GRα

αα

α/GRβ

ββ

Pós 2,38

0,18

0,12-2,48 988,09

3,61

0,28-31,22

0,8206

Pré 108,00

1,22 0,42-18,46

3,24 0,85 0,38-2,54 0,6842

c-Fos

Pós 43,93 1,73 0,07-35,56

11,86 0,12 0,04-3,61 0,4813

Pré 90,24 0,70 0,30-6,61 0,41 0,16 0,05-0,82 0,0433*

p65

Pós 0,23 0,07 0,04-0,12 0,55 0,11 0,07-0,39 0,2176

Pré 60,32 0,45 0,15-2,66 230,35

0,35 0,11-20,50

0,6842

TNF-α

αα

Pós 5,97 0,09 0,05-0,21 8,71 0,14 0,01-3,16 0,9705

Pré 290,33

3,74 0,51-22,30

0,64 0,14 0,05-1,22 0,0232*

IL-1β

ββ

Pós 28,40 4,18 1,20-44,12

1,14 0,42 0,06-1,64 0,0355*

Pré 90,70 0,31 0,11-5,16 0,49 0,20 0,10-0,25 0,3527

GM-CSF

Pós 1,83 0,08 0,03-2,16 0,60 0,28 0,08-0,40 0,4359

Pré 4,36 1,91 0,60-3,90 0,63 0,29 0,04-1,20 0,0433*

ICAM-1

Pós 2,91 0,53 0,13-2,43 264,10

0,45 0,34-2,07 0,7959

Pré 76,22 52,18 10,6-99,23

580,16

17,05 7,59-27,17

0,5288

Eotaxina-2

Pós 15,49 5,40 1,73-12,06

199,10

1,18 0,30-70,76

0,4359

Pré 136,78

0,17 0,13-1,38 0,27 0,06 0,005-0,51

0,1403

b-FGF

Pós 2,59 0,10 0,003-0,82

1,18 0,05 0,001-0,49

0,5964

P25-P75: percentis 25 e 75 nos valores observados; * = significativo

Antes do tratamento, havia maior expressão de p65 (0,70 vs.

0,16, p<0,05), IL1β (3,74 vs. 0,14, p<0,05) e de ICAM-1 (1,91 vs. 0,29,

p<0,05) no grupo com pior prognóstico. Já após o tratamento, houve

maior expressão de GRβ (0,95 vs. 0,28, p<0,05) e de IL-1β (4,18 vs.

0,42, p<0,05) no grupo 1, de pior prognóstico.

G1 G2

450

500

GR alfa pré tto

G1 G2

200

250

GR alfa pós tto

G1 G2

1000

GR beta pré tto

G1 G2

30.0

37.5

GR beta pós tto

G1 G2

1700

GR alfa/ GR beta pré tto

G1 G2

600

5600

GR alfa/ GR beta pós tto

G1 G2

200

700

c-Fos pré tto

G1 G2

250

c-Fos pós tto

G1 G2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

100

600

p65 pré tto

G1 G2

p65 pós tto

Figura 19: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de GR

(A),

GRβ (B), relação GRα/GRβ (C), c-Fos (D) e p-

65 (E) para os grupos maus

respondedores (G1) e bons respondedores (G2) à budesonida nasal, antes (I)

e após (II) tratamento

BII

AII

CII

DII DI

EII

G1 G2

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

250

750

TNF-alfa pré tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

TNF-alfa pós tto

G1 G2

2700

2800

IL-1beta pré tto

G1 G2

250

IL-1beta pós tto

G1 G2

25 00

GM-CSF pré tto

G1 G2

GM-CSF pós tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

ICAM-1 pré tto

G1 G2

2000

2750

ICAM-1 pós tto

G1 G2

100

200

300

400

5750

eotaxina-2 pré tto

G1 G2

100

900

1000

Eotaxina-2 pós tto

G1 G2

0.0

2.5

5.0

1250

1500

b-FGF pré tto

G1 G2

b-FGF pós tto

BII

AII

DII

EII

FII

CII

Figura 20: curva de dispersão e mediana para expressão gênica de TNF-

α (A), IL-1β (B), GM-CSF (C), ICAM-1 (D), eotaxina-2 (E) e b-FGF (F

) para

os grupos maus respondedores (G1) e bons respondedores (G2

) à

budesonida nasal, antes (I) e após (II) tratamento

DISCUSSÃO

Segundo o Consenso Europeu de Rinossinusites e de PNS

(FOKKENS et al., 2005), a introdução do GC tópico melhorou

consideravelmente o tratamento das doenças inflamatórias de vias

aéreas superiores (a exemplo da rinite e a PNS) e inferiores (asma).

Atualmente, esta é a terapia mais preconizada em literatura para a PNS.

No presente estudo, tratamento com budesonida tópica nasal por

dois meses demonstrou-se eficaz na melhora clínica dos pacientes com

PNS, levando à diminuição significativa dos sintomas de obstrução

nasal, rinorréia posterior e anterior, cefaléia/ dor facial, distúrbios de

olfato e espirros, além de diminuição objetiva do tamanho dos pólipos,

avaliada através de endoscopia nasal. Não foi observada melhora

apenas para os sintomas de cacosmia e prurido nasal. Durante o

período avaliado, houve melhora também significativa do conjunto de

sintomas e sinais clínicos dos pacientes, avaliado pela soma dos

escores.

Apesar da melhora importante dos parâmetros clínicos avaliados

durante o estudo, apenas um dos pacientes obteve remissão completa

dos sintomas e regressão total dos pólipos à endoscopia.

Tos et al. (1998), após avaliarem 138 pacientes com PNS em uso

de budesonida por seis semanas, também observaram melhora clínica e

endoscópica da PNS. Entretanto, Lund et al. (1998), em estudo com 10

pacientes com PNS tratados por um período de 12 semanas de

fluticasona, observaram diminuição endoscópica dos pólipos nasais,

sendo que esta diminuição correlacionou-se à melhora de obstrução

nasal, mas não à melhora dos sintomas de rinorréia, prurido, espirros,

cefaléia ou hiposmia.

Por outro lado, Hamilos et al. (1999) compararam 10 pacientes

com PNS tratados com fluticasona (200mcg em cada narina por dia)

durante quatro semanas com 10 pacientes que receberam placebo

durante o mesmo período. Os autores não observaram melhora de

sintomas nos pacientes tratados com GC, apesar de terem observado

diminuição nos parâmetros inflamatórios histológicos, como redução de

eosinófilos e linfócitos CD4+.

Deste modo, apenas Hamilos et al. (1999) não referiram melhora

clínica significante após uso de GC tópico na PNS, apesar de terem

documentado melhora histológica. A diferença dos resultados

observados por estes autores se comparados aos nossos e aos demais

dados de literatura citados provavelmente ocorreu devido ao menor

tempo de observação no estudo de Hamilos et al. (1999), de apenas

quatro semanas.

Não observamos na nossa avaliação correlação entre o grau de

melhora clínica e a extensão endoscópica dos pólipos, tampouco com a

intensidade de todos os sintomas nasais. No entanto, a melhora clínica

foi significantemente menor em pacientes com PNS de maior extensão

ao exame de TC. Este modelo hipotético foi aventado por Badia & Lund

(2001), porém não havia sido suportada por nenhum estudo clínico

prévio.

O aumento das citocinas pró-inflamatórias, de quimiocinas e de

moléculas de adesão é considerado um co-fator importante na gênese e

na perpetuação da PNS (MIN & LEE, 2000; FOKKENS et al., 2005).

Observamos, no estudo com PCR em tempo real, que a expressão

dos genes TNF-α, IL-1β, GM-CSF, ICAM-1, eotaxina-2 e b-FGF esteve

maior nos pacientes com PNS antes do tratamento quando comparados

à mucosa controle de concha média. Estes resultados confirmam a

importância das citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e fatores

de crescimento na gênese da PNS. Entretanto, houve diferença

estatística entre os dois tecidos apenas para os genes IL-1β, eotaxina-2

e b-FGF. IL-1β possui ação fundamental na indução e perpetuação do

processo inflamatório crônico; eotaxina-2 é um potente recrutador

eosinofílico e b-FGF estimula o crescimento de fibroblastos, células que

são potentes produtoras de várias outras citocinas, além de induzirem a

proliferação de estroma na PNS.

Lennard et al. (2000) compararam biópsias de pólipos nasais de

15 pacientes com PNS sem tratamento com nove mucosas nasais

controles por hibridização in situ, e relataram aumento significativo de

expressão de IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-8 nos pólipos nasais quando

comparados à mucosa controle. Hamilos et al. (1999) também referiram

aumento de expressão, por hibridização in situ, de TNF-α e IL-1β em

pólipos nasais quando comparados à mucosa de concha média.

Voegels & Pádua (2005) relataram maior quantidade de IL-1β em

39 pacientes com PNS quando comparados às 11 mucosas controles de

concha média, através do método de ELISA. No entanto, esta diferença

não foi estatisticamente significativa.

Estudos experimentais reforçam a importância das citocinas pró-

inflamatórias IL-1β e TNF-α em processos inflamatórios de vias aéreas:

Nonaka et al. (1999) observaram que a produção de GM-CSF e RANTES

em cultura de fibroblastos nasais foi induzida por IL-1β, seja em pólipos

nasais ou em mucosa de processo unciforme. Já Wilson et al. (1999)

relataram que a expressão de GM-CSF, ICAM-1 e IL-8 foi induzida por

TNF-α, via NF-κB, em células endoteliais respiratórias.

Houve, no atual estudo, aumento das citocinas IL-1β, TNF-α e

GM-CSF, porém este aumento foi significativo apenas para IL-1β.

Lennard et al. (2000) e Hamilos et al. (1999) relataram aumento

significativo de mRNA de IL-1β e TNF-α, mas com técnica semi-

quantitativa (hibridização in situ). Dados relatados por Voegels & Pádua

(2005) também apontam para quantidades aumentadas da proteína IL-

1β em pólipos nasais, apesar dos dados não terem alcançado diferença

estatística.

Jahnsen et al. (1999) observaram, em estudo com PCR semi-

quantitativo, expressão maior das quimiocinas eotaxina, eotaxina-2 e

MCP-4 em 27 pólipos nasais quando comparados à mucosa de concha

inferior de sete pacientes, com especial diferença da expressão de

eotaxina-2. No entanto, eles não observaram alteração de expressão de

RANTES ou MCP-3 entre os grupos estudados. Eles concluem, desta

forma, que eotaxina-2, por ser altamente expressa em pólipos nasais e

virtualmente presente em mucosa nasal controle, deva ter importante

ação no recrutamento eosinofílico observado na PNS.

Shin et al. (2000) também observaram aumento de expressão de

eotaxina em 47 pólipos nasais livres de tratamento quando comparada

à expressão em 15 biópsias de mucosa de concha inferior, analisado

através de PCR em tempo real, diferença esta que foi muito mais

significativa para eotaxina do que para RANTES; desta forma, eles

concluem que a eotaxina deva exercer um papel mais importante do que

RANTES no recrutamento eosinofílico envolvido na PNS. Os autores,

assim como Silvestri et al. (2002), ainda referem que a produção de

eotaxina é induzida por TNF-α e IFN-γ, via NF-κB, e, portanto não

possui relação com processos alérgicos.

Em relação às quimiocinas, observamos aumento significativo de

mRNA de eotaxina-2, resultado semelhante ao observado por Jahnsen

et al. (1999), apesar do uso de metodologia semi-quantitativa. Jahnsen

et al. (1999) e Shin et al. (2000) observaram que a expressão das

eotaxinas é significantemente maior do que RANTES nos pólipos nasais,

e ambos concluem que as eotaxinas são as quimiocinas recrutadoras de

eosinófilos mais importantes na PNS.

Norlander et al. (2001) compararam 17 biópsias de pólipos nasais

com mucosa de concha inferior dos mesmo pacientes por

imunohistoquímica e ELISA, e observaram maior quantidade da

proteína b-FGF em pólipos nasais do que em mucosa controle, tendo

sido ela preferencialmente localizada nas células epiteliais, endoteliais e

inflamatórias. Powers et al. (1998) e Cayé-Thomansen et al. (2004), em

estudos com imunohistoquímica, também relataram quantidade de b-

FGF significantemente maior em pólipos do que em mucosa nasal.

Silvestri et al. (2002) observaram alta expressão de b-FGF em

cultura de fibroblastos de pólipos nasais, e referiram que este aumento

induziria a proliferação celular dos pólipos através de NF-κB.

O fator de crescimento b-FGF teve expressão aumentada em

técnica quantitativa em nosso estudo, resultados concordantes com os

estudos semi-quantitativos para proteínas de Norlander et al. (2001),

Powers et al. (1998) e Cayé-Thomansen et al. (2004), através de

imunohistoquímica.

A molécula de adesão ICAM-1 não esteve significantemente mais

expressa em pólipos livres de tratamento do que na mucosa controle no

presente estudo. Nossos resultados estão de acordo com os de Jahnsen

et al. (1995), que não observaram aumento significativo de expressão de

ICAM-1, mas sim de VCAM-1, em pólipos nasais quando comparados à

mucosa de concha inferior obtida nos mesmos 15 pacientes com PNS.

Entretanto, Symon et al. (1994), Papon et al. (2002) e Zhou et al.

(2004), em estudo com imunohistoquímica, observaram quantidade

significativamente maior da proteína ICAM-1 no pólipo nasal do que em

mucosa controle. O mesmo achado foi observado por Rogala et al

(2000), quando compararam 27 pacientes com PNS sem tratamento por

três meses com 12 mucosas de conchas inferiores, através de ELISA.

Papon et al. (2002) e Silvestri et al. (2002) referem que este aumento de

ICAM-1 é mediado pelo NF-κB e estimulado por TNF-α.

Segundo Adcock & Caramori (2001), o GC inibe a transcrição de

IL-1β, TNF-α, GM-CSF, eotaxina-2 e ICAM-1. Estudos in vitro, com

culturas de pólipos nasais, confirmam a diminuição de expressão de

GM-CSF (MARX ET AL, 2002; WATANABE ET AL, 2004), ICAM-1,

eotaxina e b-FGF (SILVESTRI et al., 2002) após exposição ao GC. No

entanto, Marx et al. (2002) relataram ausência de diferença de

expressão de TNF-α e IL-1β nas culturas de células expostas à

fluticasona.

No atual estudo, após o uso de GC tópico, houve diminuição

importante na expressão do conjunto de genes estudados, com exceção

de ICAM-1. Esta diminuição foi significativa apenas para TNF-α e

eotaxina-2, mas considerável para os outros genes, a ponto dos valores

nos pacientes após tratamento não apresentarem diferença estatística

com os controles em nenhum dos genes, a exceção de IL-1β, que ainda

manteve-se significantemente mais expresso nos pólipos, mesmo após o

tratamento clínico.

Jahnsen et al. (1999) observaram, através de PCR semi-

quantitativo, menor expressão de eotaxina, eotaxina-2 e RANTES, e

menor número de eosinófilos, em 12 pacientes com PNS tratados com

40mg prednisona por dia por sete dias quando comparados a 15

pacientes com PNS sem tratamento.

Bachert et al. (2000) também observaram, através de

imunohistoquímica, diminuição, apesar de não significativa, de eotaxina

em cinco pacientes com PNS tratada com prednisona por quatro

semanas quando comparados a 11 pacientes com PNS não tratada. A

diminuição de eotaxina após tratamento com 21 dias de prednisona

também foi relatada por Woodworth et al. (2004), em estudo prospectivo

realizado em 14 pacientes com PNS, com biópsias colhidas antes e após

tratamento e avaliadas por ELISA.

Hamilos et al. (2001) submeteram 10 pacientes com PNS a

tratamento com fluticasona por quatro semanas, e observaram

diminuição da expressão de GM-CSF, mas não de TNF-α ou de IL-1β,

após o uso de GC. Lennard et al. (2000) realizaram estudo com

imunohistoquímica em 15 pacientes com PNS antes e após tratamento

com 10 dias de prednisona, e também não observaram diminuição de

TNF-α ou de IL-1β.

Doner et al. (2004) estudaram pólipos nasais de 24 pacientes

tratados com budesonida 200mcg por narina por dois meses através de

imunohistoquímica, e relataram diminuição da proteína ICAM-1 após o

tratamento, quando comparado aos valores antes do tratamento; no

entanto, ICAM-1 tratados ainda esteve em maior quantidade nos

pólipos nasais do que em mucosa de concha média.

Yariktas et al. (2005) submeteram 36 pacientes com PNS a

tratamento com mometasona 200mcg por dia por quatro semanas e

referiram diminuição da proteína b-FGF após tratamento, através da

técnica de ELISA.

A diminuição de expressão de eotaxina-2 após uso de GC tópico

observada na presente estudo também foi relatada por Jahnsen et al.

(1999). No entanto, existem várias diferenças entre os estudos, pois os

últimos autores compararam transversalmente pacientes em

tratamento com os sem tratamento, além de terem utilizado GC via oral

para terapia e de terem avaliado seus resultados através de técnica

semi-quantitativa.

A diminuição signficativa de TNF-α por nós observada não foi

evidenciada em nenhum outro estudo. Pelo contrário, tanto Hamilos et

al. (2001) quanto Lennard et al. (2000), em técnicas semi-quantitativas,

não observaram diferença de, respectivamente, mRNA e proteína de

TNF-α nos pacientes após tratamento clínico com GC. Estes mesmos

autores, em concordância com nossos achados, não observaram

diferença de expressão de IL-1β nos pacientes após o tratamento

clínico, o que poderia influenciar na persistência do processo

inflamatório mesmo com o tratamento, justificando remissão apenas

parcial da PNS observada com o uso de GC.

Não observamos diminuição de expressão de ICAM-1 após

tratamento com GC tópico; como esta molécula de adesão está

implicada no recrutamento de eosinófilos, a sua perpetuação pode

sugerir que este seja um dos mecanismos associados à resposta apenas

parcial da PNS ao GC tópico. Estes resultados, no entanto, estão

conflitantes com o estudo de Doner et al. (2004), que observaram

diminuição da proteína ICAM-1 por imunohistoquímica após

tratamento semelhante ao utilizado em nosso estudo, no mesmo

período de avaliação.

Dados relativos à influência do GC na expressão gênica de GM-

CSF e b-FGF na PNS são bastante escassos em literatura. Hamilos et al.

(2001) observaram diminuição de GM-CSF por hibridização in situ e

Yariktas et al. (2005) demonstraram diminuição de b-FGF através de

ELISA. Nosso estudo, no entanto, não observou diferença significativa

de expressão de GM-CSF e b-FGF em pólipos nasais antes e após

tratamento com budesonida. A perpetuação desta citocina e deste fator

de crescimento poderia auxiliar na perpetuação do processo

inflamatório observado na PNS.

Mecanismos de resistência aos GC vêm sendo cada vez mais

estudados. Neste contexto, os receptores de GC possuem ação

fundamental. Segundo Adcock & Caramori (2001), o menor número de

GRα, o maior número de GRβ, ou menor número da relação GRα/GRβ

estariam implicados na resistência ao GC.

No presente estudo, não observamos níveis maiores de GRβ, seja

na expressão gênica ou na concentração de proteínas de pacientes com

PNS não tratados, quando comparados aos controles. Houve,

entretanto, diminuição significativa tanto de mRNA como de proteína de

GRα nos pacientes com PNS não tratados quando comparados aos

controles, dados estes que não foram influenciadas pela administração

do GC.

A diminuição de expressão de GRα após uso de GC foi relatada

em asma por Corrigan et al. (1991) e Sher et al. (1994), em leucemia

linfóide crônica por Shahidi et al. (1999) e em estudo de revisão por

Schaaf & Cidlowski (2003). Li et al. (2005) avaliaram 36 amostras de

pólipos nasais e 31 de mucosa controle através de PCR em tempo real, e

observaram expressão significantemente menor de GRα nos pólipos

nasais quando comparados à mucosa controle.

O aumento de expressão de GRβ foi observado em pacientes com

asma por Sousa et al. (2000) e em pacientes com PNS por Hamilos et al.

(2001) quando comparados aos indivíduos controles, e ambos os

autores associaram este aumento a um possível mecanismo de

resistência ao GC. Hamilos et al. (2001), inclusive, evidenciaram

correlação inversa entre a porcentagem de células inflamatórias que

expressavam GRβ e a resposta ao uso de fluticasona, tendo sido

avaliada a diminuição do número de eosinófilos e linfócitos T no pólipo.

Pujols et al. (2003), em estudo de PCR semi-quantitativo com

extratos de células epiteliais nasais de 27 pacientes com PNS, também

observaram menor relação GRα/GRβ em pólipos nasais do que nas 32

biópsias controles de mucosa de concha nasal, alteração esta ocorrida

devido maior expressão de GRβ.

Não observamos diferença significativa de expressão de GRα ou de

GRβ nos momentos pré e pós tratamento, dados concordantes aos de

Pujols et al. (2003), que referiram que a expressão de GRα ou de GRβ

nos 12 pacientes com PNS não tratados era semelhante à dos 15 com

PNS que estavam em uso de GC, sistêmico ou tópico.

Acreditamos, portanto, que o principal fator relacionado à

resistência de GC em nível de receptores seja a diminuição da relação

GRα/GRβ, que foi observada em nosso estudo, assim como no de Pujols

et al. (2003). Esta diminuição esteve presente no atual estudo devido a

diminuição de GRα, o que concorda com a observação de Li et al.

(2005), através da mesma técnica empregada neste estudo; já Pujols et

al. (2003) não observaram diferença significativa de GRα através de PCR

semi-quantitativo. A maior expressão de GRβ referida por Hamilos et al.

(2001) e por Pujols et al. (2003) em pólipos nasais utilizando técnicas

semi-quantitativas (respectivamente hibridização in situ e PCR semi-

quantitativo) não foi observada em nosso estudo.

Outro fator possivelmente implicado na resistência de GC seria o

aumento de fatores de transcrição, que inibiriam por interação direta o

sítio dos GR, e conseqüentemente diminuiriam a suscetibilidade do

indivíduo ao GC.

No presente estudo, observamos maiores valores de mRNA e de

proteína de p65, fração ativa do NF-κB, nos pacientes com PNS antes do

tratamento, quando comparados aos controles. Os valores de mRNA

diminuíram significantemente após o tratamento, chegando a níveis

próximos aos de mucosa controle. Não observamos diferença entre os

grupos nos valores de c-Fos, a fração ativa de AP-1.

Takeno et al. (2002) estudaram 28 pacientes com PNS, sem

tratamento com GC, através de imunohistoquímica, e observaram

aumento de NF-κB, porém da fração p50, nos pacientes com PNS. Os

autores ainda relataram que o aumento de p50 esteve correlacionado ao

aumento de expressão de IL-8, IL-16 e eotaxina, sugerindo que NF-κB

tenha ação central da perpetuação do processo inflamatório da PNS. No

entanto, seu estudo foi realizado com a fração constitucional de NF-κB,

a p50, e não a que verdadeiramente é induzida pelo processo

inflamatório, a p65. Wilson et al. (1999) relataram aumento de

expressão de p65 em culturas de pólipos nasais em comparação a

culturas de mucosa de concha inferior, através de imunohistoquímica.

Ramis et al. (2000), em estudo com EMSA (electrophoretic mobility

shift assay), não observaram diferenças de expressão de p50 entre 19

pólipos nasais e 13 mucosas de concha inferior, tampouco entre os

pacientes com PNS que estavam sob tratmento (n=12) ou não (n=7) com

GC, tópico ou sistêmico; estes achados provavelmente seriam

explicados pelo fato de ter sido estudada a fração p50 do NF-κB, e não a

p65.

Baraniuk et al. (1998), em estudo com imunohistoquímica e PCR

qualitativo, observaram que a expressão de c-Fos foi mais freqüente em

pacientes com PNS (n=8) sem tratamento com GC quando comparados

à mucosa de concha inferior (n=6). Houve menor expressão,

estatisticamente significante, de c-Fos nos casos de PNS tratados com

beclometasona nasal (n=12) por 12 semanas do que nos casos livres de

tratamento.

Desta forma, observamos maior expressão de p65, fração ativa de

NF-κB, nos pólipos nasais, achado coincidente com o estudo de Wilson

et al. (1999), apesar da avaliação de p65 ter sido qualitativa no estudo

destes autores.

Não se observou aumento significativo de expressão de c-Fos no

atual estudo, o que é conflitante com o estudo de Baraniuk et al. (1998).

No entanto, os autores avaliaram qualitativamente a presença de c-Fos,

e observaram que houve freqüência significativamente maior de c-Fos

em pólipos do que em mucosa controle, e não maior quantidade do

mesmo.

Podemos inferir que o aumento de fatores de transcrição seja

importante co-fator na gênese e perpetuação da PNS, por atuação direta

nos ciclos celulares dos pólipos nasais, e que NF-κB provavelmente

possui ação mais importante do que AP-1 neste processo.

Quando comparamos os pacientes com boa e má resposta ao GC,

observamos que houve maior expressão de mRNA de p65, IL-1β e ICAM-

1 nos pacientes com pior prognóstico no período pré-terapia. Como os

dois primeiros fatores estão altamente relacionados ao início e à

perpetuação do processo inflamatório e o terceiro está relacionado ao

recrutamento de células inflamatórias, podemos supor que a expressão

aumentada destes genes poderia acentuar o processo inflamatório

nestes pólipos, e diminuir a resposta ao GC. O p65 pode ainda interagir

diretamente com GR, além de diminuir sua expressão, reduzindo a

resposta ao GC, o que também explicaria o resultado encontrado.

Após o tratamento, observamos que os pacientes com pior

resposta ao GC apresentaram maior expressão de GRβ e mantiveram

maior expressão de IL-1β do que os bons respondedores. GRβ está

provavelmente relacionado ao aumento de resistência ao GC, enquanto

IL-1β perpetua o processo inflamatório através da ativação de NF-κB, o

que poderia induzir ainda maior resistência ao GC. Podemos sugerir

que pacientes que responderam menos ao GC apresentariam altos

níveis de IL-1β para perpetuar a inflamação crônica, e de GRβ na

tentativa de atenuar os efeitos dos GC.

Existe apenas um estudo prospectivo que correlaciona a

expressão gênica com a melhora clínica do paciente com PNS. Voegels &

Pádua (2005) observaram que pacientes que mantinham altas

concentrações de IL-1β e IL-5 em um período de dezoito meses após

cirurgia (com uso contínuo de GC tópico) foram os que tiveram maior

recorrência da PNS. No entanto, os pacientes haviam sido submetidos

tanto a tratamento cirúrgico como clínico no período, e não podemos

inferir seus resultados em relação apenas à resistência ao GC tópico.

Os resultados atuais, analisados em conjunto, reforçam a

hipótese da importância do p65 na gênese da PNS e no seu

envolvimento com a resistência ao GC, pois sabe-se que o NF-κB é

capaz de induzir o aumento da transcrição de IL-1β, de ICAM-1 e de

GRβ.

A confirmação destes resultados em estudos futuros, assim como

a melhor compreensão dos mecanismos de resistência à GC em nível

molecular, poderão auxiliar no desenvolvimento de terapias adjuvantes

mais específicas e na melhora da qualidade e da eficiência do

tratamento clínico para a PNS.

CONCLUSÕES

A PNS é uma doença inflamatória crônica da mucosa

nasossinusal, e o aumento das citocinas pró-inflamatórias, em especial

o IL-1β, a eotaxina-2 e o b-FGF, demonstram a importância do processo

inflamatório na sua gênese.

O GC tópico foi capaz de diminuir a dimensão dos pólipos nasais

e de melhorar parcialmente os sintomas dos pacientes com PNS; esta

melhora foi mais evidente em pacientes com menor extensão

tomográfica da doença ao diagnóstico.

Em conjunto com a melhora clínica, houve diminuição do padrão

inflamatório, com diminuição da expressão das citocinas, em especial

do TNF-α e da eotaxina-2.

A relação entre os receptores de GC GRα/GRβ, assim como a

expressão de fatores de transcrição, em especial o NF-κB, estiveram

alterados nos pacientes com PNS, e estes genes são possivelmente

potencializadores da resistência dos pólipos nasais ao GC tópico.

Pacientes com resposta desfavorável ao tratamento com GC tópico

possuem maior expressão de p65, ICAM-1 e IL-1β ao diagnóstico, e de

IL-1β e GRβ após exposição ao GC. Estes dados sugerem que o IL-1β, o

p65 e o ICAM-1 sejam importantes fatores prognósticos para o

tratamento, e que o pólipo nasal, após exposição ao GC, pode

desenvolver mecanismos de resistência a ele, como aumento da

expressão de GRβ.

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ANEXO 1

PROTOCOLO POLIPOSE NASOSSINUSAL

Nome:

_______________________________________________

_________

REG:____________________ Idade: _____________

Sexo: ____________

Avaliação Pré Budesonida: (dia / / )

Sintomas: 0: s/ sintomas; 1: sintomas leves; 2: sintomas moderados; 3: sintomas graves;

4: sintomas muito graves

- Obstrução Nasal: 0  1  2  3  4 

- Rinorréia Posterior: 0  1  2  3  4 

- Cacosmia: 0  1  2  3  4 

- Cefaléia: 0  1  2  3  4 

Localização: _________________________________________

- Hiposmia: 0  1  2  3  4 

- Prurido Nasal: 0  1  2  3  4 

- Rinorréia Anterior: 0  1  2  3  4 

- Espirros: 0  1  2  3  4 

Exame

- Endoscopia: polipose graus: 0: não visível; 1: apenas em COM; 2: além de COM, mas

não ocupa toda FN; 3: ocupa toda FN

FNE: 0  1  2  3 

FND: 0  1  2  3 

- Tomografia (dia / / ): 0: s/ espessamento mucoso; 1: espessamento mucoso;

2: opacificação sinusal

Seio Direito Esquerdo

Maxilar

Etmóide anterior

Etmóide posterior

Esfenóide

Frontal

COM

Total

Biópsia pré budesonida dia / /

Avaliação Pós Budesonida: (dia / / )

Sintomas: 0: s/ sintomas; 1: sintomas leves; 2: sintomas moderados; 3: sintomas graves;

4: sintomas muito graves

- Obstrução Nasal: 0  1  2  3  4 

- Rinorréia Posterior: 0  1  2  3  4 

- Cacosmia: 0  1  2  3  4 

- Cefaléia: 0  1  2  3  4 

Localização: ________________________________

- Hiposmia: 0  1  2  3  4 

- Prurido Nasal: 0  1  2  3  4 

- Rinorréia Anterior: 0  1  2  3  4 

- Espirros: 0  1  2  3  4 

Exame

- Endoscopia: polipose graus: 0: não visível; 1: apenas em COM; 2: além de COM, mas

não ocupa toda FN; 3: ocupa toda FN

FNE: 0  1  2  3 

FND: 0  1  2  3 

Biópsia pós budesonida dia / /

ANEXO 2

ANEXO 3

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