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LUIS CARLOS GRANEMANN
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO SÊMEN EQÜINO COLHIDO COM VAGINA
ARTIFICIAL E POR LAVADO INTRALUMINAL DA CAUDA DO EPIDÍDIMO
PÓS
-
ORQUIECTOMIA
CURITIBA
2006
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LUIS CARLOS GRANEMANN
AVALIAÇÃO COMPARATIVA
DO SÊMEN EQÜINO COLHIDO COM VAGINA
ARTIFICIAL E POR LAVADO INTRALUMINAL DA CAUDA DO EPIDÍDIMO
PÓS
-
ORQUIECTOMIA
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias, Curso de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias,
Setor de Ciências Agrárias, Universidade
Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Romildo R. Weiss
CURITIBA
2006
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ii
Dedico este trabalho aos meus pais, Alfredo e
Dorilda, e ao meu avô Luiz (
in memoriam)
, que
apoiaram e incentivaram a realização de meus
sonhos.
iii
AGRADEÇO...
A Deus, por me guiar, proteger e dar saúde para conquistar os objetivos
almejados.
À minha família, em especial aos meus pais Alfredo e Dorilda, pelo apoio e
confiança.
À minha namorada, Cheila, pelo amor, carinho e apoio nos momentos bons
e ruins.
Ao professor, orientador e amigo Romildo R. Weiss, pela oportunidade,
confiança e dedicação para a realização deste sonho.
A todos os colegas, professores e funcionários do Hospital Veterinário e da
Pós
-graduação da UFPR, que contribuíram de alguma maneira para a realização
deste experimento.
A colega e Médica Veterinária Priscila, com a qual partilhei todas as alegrias,
tristezas e dificuldades da parceria para a realização desse projeto.
Ao colega Fábio da Cunha pela ajuda e esclarecimento das dúvidas.
Aos animais, em especial a égua Paloma, que permaneceu nos auxiliando
do início ao fim do experimento.
iv
SUMÁRIO
LIST
A
DE
TABELAS
................................
................................
................................
...
vi
LISTA
DE
FIGURAS
................................................................................................
...
vii
RESUMO
....................................................................................................................
viii
ABSTRACT
................................................................................................
..................
ix
1.
INTRODUÇÃO
................................................................................................
........
1
2.
LITERATURA
................................................................................................
.........
3
2.1
ESPERMATOGÊNESE E MA
TURAÇÃO DOS
ESPERMATOZÓIDES
..............
3
2.2
COLHEITA DE ESPERMAT
OZÓIDES DO EPIDÍDIMO
................................
......
7
2.3
AVALIAÇÃO DO SÊMEN
................................................................
...................
11
3.
MATERIAL E MÉTODOS
................................
................................
.....................
14
3.1
LOCAL
................................................................................................................
14
3.2
ANIMAIS
................................
................................
................................
.............
14
3.3
COLHEITA DE SÊMEN CO
M VAGINA ARTIFICIAL
................................
.........
15
3.4
AVALIAÇÃO DO SÊMEN R
ECÉM
-
COLHIDO
................................
...................
15
3.5
ORQUIECTOMIA EQÜINA
................................
................................
.................
17
3.6
TÉCNICA DE
COLHEITA DOS ESPERMA
TOZÓIDES DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO
................................
................................
................................
.........
18
3.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA
....................................................................................
22
4.
RESULTADOS
................................................................................................
......
24
4.1
AVALIAÇÃO MORFOFISIO
LÓGICA DO SÊMEN COLH
IDO COM VAGINA
ARTIFICIAL
........................................................................................................
24
4.2
AVALIAÇÃO COMPARATIV
A DO SÊMEN COLHIDO C
OM VAGINA
ARTIFICIAL E DOS ESP
ERMATOZÓIDES COLHIDO
S DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO DOS GARANH
ÕES
........................................................................
25
4.2.1 M
otilidade e Vigor
................................................................
..............................
25
4
.2.2 N
úmero Total de Espermatozóides
................................................................
..
.30
4.2.3 E
spermatozóides Morfologicamente Deformados e Defeitos de Acrossoma
..
33
5.
DISCUSSÃO
................................
................................
................................
.........
36
5.1
COLHEITA DOS ESPERMA
TOZÓIDES EPIDIDIMAIS
....................................
36
5.2
MOTILIDADE E VIGOR
................................................................
......................
37
5.3
NÚMERO TOTAL DE ESPE
RMATOZÓIDES RECUPERAD
OS
.......................
39
v
5.4
ESPERMATOZÓIDES MORF
OLOGICAMENTE DEFORMA
DOS E DEFEITOS
DE ACROSSOMA
................................................................
..............................
40
6.
CONCLUSÃO
........................................................................................................
42
APÊNDICES
................................................................................................
...............
43
REFERÊNCIAS
....
......................................................................................................
44
vi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
- IDENTIFICAÇÃO DA RAÇA E IDADE DOS ANIMAIS UTILIZADOS
NO EXPERIMENTO
................................
................................
.............
14
TABELA 2
- CARACTERÍSTICAS DO SÊMEN COLHIDO COM VAGINA
ARTIFICIAL DOS GARANHÕES
................................
.........................
25
TA
BELA 3
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA MOTILIDADE E VIGOR DOS
ESPERMATOZÓIDES COLHIDOS COM VAGINA ARTIFICIAL E DA
CAUDA DO EPIDÍDIMO DOS GARANHÕES EM FUNÇÃO DO
TEMPO
................................
................................
................................
.
26
TABELA 4
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA MOTILIDADE E VIGOR DOS
ESPERMATOZÓIDES DOS GARANHÕES NO MOMENTO DA
COLHEITA DA CAUDA DO EPIDÍDIMO (0 HORA) E UMA HORA
APÓS A COLHEITA (1 HORA)
............................................................
28
TABELA 5
- COMPARAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE ESPERMATOZÓIDES
(BILHÕES) COLHIDOS COM A VAGINA ARTIFICIAL E DA CAUDA
DO EPIDÍDIMO DOS GARANHÕES
....................................................
30
TABELA 6
- COMPARAÇÃO DA MÉDIA DO NÚMERO TOTAL DE
ESPERMATOZÓIDES (BILHÕES) COLHIDOS COM A VAGINA
ARTIFICIAL E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DOS GARANHÕES
........
31
TAB
ELA 7
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO PORCENTUAL DE
ESPERMATOZÓIDES MORFOLOGICAMENTE DEFORMADOS
(EMD) E DE DEFEITOS DE ACROSSOMA (DA)
................................
34
vii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
-
FOT
OS DE ALGUNS ANIMAIS UTILIZADOS NO EXPERIMENTO
...
15
FIGURA 2
-
COMPLEXO
TESTÍCULO
-CAUDA DO EPIDÍDIMO DO GARANHÃO
SEPARADOS
........................................................................................
19
FIGU
RA 3
- TECIDO CONECTIVO QUE RECOBRE A CAUDA DO
EPIDÍDIMO
DO GARANHÃO
................................................................
...................
20
FIGURA 4
-
DISSECAÇÃO DA CAUDA
DO EPIDÍDIMO DO GARA
NHÃO
............
20
FIGURA 5
- TAMANHO DE UM SEGMENTO DISSECADO DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO DO GARANHÃ
O
................................
...............................
21
FIGURA 6
- LAVAGEM DE UM SEGMENTO DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE
GARANHÃO
................................
................................
.........................
22
FIGURA 7
- AVALIAÇÃO DO DECRÉSCIMO DA MOTILIDADE (%) DOS
ESPERMATOZÓIDES COLHIDOS DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DOS
GARANHÕES EM FUNÇÃO
DO TEMPO PÓS
-
ORQUIECTMIA.........
27
FIGURA 8
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA MOTILIDADE (%) NO MOMENTO
DA COLHEITA DOS ESPERMATOZÓIDES DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO DOS GARANHÕES (INICIAL) E UMA HORA APÓS (1
HORA)
................................................................................................
..
29
FIGURA 9
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO VIGOR NO MOMENTO DA
COLHEITA DOS ESPERMATOZÓIDES DA CAUDA DO EPIDÍDIMO
DOS GARANHÕES (INICI
AL) E UMA HORA APÓS
(1 HORA)
..........
29
FIGURA 10
- COMPARAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE ESPERMATOZ
ÓIDES
(BILHÕES) COLHIDOS COM A VAGINA ARTIFICIAL E DA CAUDA
DO EPIDÍDIMO DOS GAR
ANHÕES
....................................................
32
FIGURA 11
- COMPARAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE ESPERMATOZ
ÓIDES
(BILHÕES) COLHIDOS DA CAUDA DO EPIDÍDIMO ESQUERDO E
DIREITO DOS GARANHÕE
S
................................
..............................
32
FIGURA 12
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO PORCENTUAL DE
ESPERMATOZÓIDES
MORFOLOGICAMENTE DEF
ORMADOS
(EMD) E DE DEFEITOS DE ACROSSOMA (DA) EM FUNÇÃO DO
TEMPO PÓS
-
ORQUIECTOM
IA DOS GARANHÕES
..........................
35
viii
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a diminuição da viabilidade das células
espermáticas colhidas da cauda do epidídimo de garanhões em função do tempo
pós
-orquiectomia (6-30 horas) comparando-os com os espermatozóides colhidos
com vagina artificial. Após orquiectomia os testículos foram armazenados a
temperatura ambiente (18-25ºC). Os espermatozóides epididimais foram obtidos
através de dissecação da cauda do epidídimo e lavagem com diluente Botu-
Crio®, e
submetidos à avaliação de motilidade, vigor, número total de espermatozóides,
alterações totais e de acrossoma, sendo estes parâmetros comparados com os
espermatozóides colhidos com vagina artificial. A motilidade e vigor diminuíram
significativamente 12 horas pós-orquiectomia, o número total de espermatozóides
recuperados do epidídimo foi significativamente superior aos colhidos com a vagina
artifi
cial. Os espermatozóides morfologicamente deformados e com defeitos de
acrossoma tiveram aumento significativo após 18 e 24 horas respectivamente. A
colheita de espermatozóides da cauda do epidídimo mostrou-se viável por até 24
horas após a orquiectomia do
s animais.
Palavras
-
chave: espermatozóide, epidídimo, garanhão
ix
ABSTRACT
The main purpose of this study was to evaluate decreased viability of spermatic cell
collected from the epididymal tail of stallions concerning post-
orchiectomy period (6
30 hours) compared to sperm collected through artificial vagina. Following
orchiectomy, testes were stored at room temperature (18
25ºC). Epididymal
sperms have been obtained through dissection of epididymal tail and washing with
diluent Botu-
Crio
®, and submitted to motility, strength, total number of sperms,
overall and acrosome total changes evaluation, being that these parameters
compared to artificial vagina-collected sperms. Motility and strength significantly
decreased 12 hours post-orchiectomy, the total number of epididymal recovered
sperms was significantly higher than the ones collected through artificial vagina.
Sperms showing morphological malformation and acrosome defective significantly
increased after 18 and 24 hours, respectively. The epididymal tail sperm collection
has shown to be viable up to 24 hours post
-
orchiectomy.
Key
-
words: sperm, epididymis, stallion.
1.
INTRODUÇÃO
A primeira inseminação artificial realizada na espécie eqüina ocorreu
aproximadamente em 1322 a.C., quando um chefe árabe, usou de artifícios,
impregnando um chumaço de algodão com as secreções de uma égua em cio.
Aproximando
-se do melhor garanhão da tribo rival, conseguiu excitá-lo com as
secreções da fêmea e obteve uma ejaculação. O sêmen foi colhido sobre
outro
chumaço de algodão, o qual, foi introduzido na vagina de uma égua no estro,
ocorrendo posteriormente o nascimento de um potro.
O reprodutor, como um dos fatores imprescindíveis na cadeia da produção
animal, deve apresentar eficiente potencial de fertilidade in vitro e in vivo , que
varia de indivíduo para indivíduo em função da qualidade do sêmen (BARTH e OKO,
1989).
Ao longo dos anos as técnicas de colheita de sêmen para eqüinos foram
desenvolvidas e aperfeiçoadas, desde a massagem das ampolas dos ductos
deferentes, camisa peniana, vagina artificial, esponja, colheita direta da cavidade
vaginal ou uterina, mas nenhum protocolo para a colheita de sêmen do epidídimo de
garanhão é descrito, que é uma biotecnologia importante para a reprodução eqüina.
A morte inesperada de animais de alto valor genético ou até mesmo de
animais sem mérito genético, mas com interesse em preservar ou dar continuidade a
sua genética, pode ocorrer em todas as espécies e em todos os tipos de criações,
desde as mais simples até as mais tecnificadas. É importante saber que animais
podem ir a óbito inesperadamente e longe dos laboratórios onde as amostras de
sêmen podem ser processadas e armazenadas.
Os eqüinos possuem grande fragilidade do trato gastrointestinal, sendo este
um dos principais fatores que podem levar os garanhões a óbito inesperadamente,
além de que em sua maioria, apresentam um temperamento agressivo e, com isto,
são predispostos a traumatismos e acidentes inesperados. Não só a morte pode
comprometer a vida reprodutiva de um animal, mas acidentes, que impossibilitem a
realização da cópula ou colheita de seu sêmen.
A recuperação pós-morte de espermatozóides viáveis do epidídimo é uma
técnica importante para obter reservas genéticas de animais geneticamente valios
os
ou de machos de espécies ameaçadas de extinção.
2
Os espermatozóides, para realizarem sua função de fecundar o ovócito,
devem se apresentar morfológica e funcionalmente normais, características
originadas no testículo (espermatogênese) (NISHIMUNE e OKABE, 1993) e
completadas na passagem pelo epidídimo (maturação) e no contato com as
secreções das glândulas anexas.
Com o incremento da inseminação artificial em eqüinos, o processo de
diluição, criopreservação e descongelamento do sêmen, na presença ou não do
plasma seminal, é possível minimizar as perdas de material genético quando um
animal de grande valor genético for a óbito e dele não possuir material genético
anteriormente criopreservado.
O presente experimento objetivou aperfeiçoar a técnica de colheita de
espermatozóides da cauda do epidídimo de garanhão, avaliar e comparar o número
total de espermatozóides colhidos e o decréscimo da viabilidade dos mesmos em
função do tempo pós-orquiectomia, tendo como parâmetros para comparação o
sêmen colhido com
a vagina artificial, avaliado após a diluição em diluente.
3
2.
LITERATURA
Para preservar a genética dos animais domésticos e futuras gerações de
animais selvagens, faz-se necessário manter os animais vivos ou manter suas
células germinativas, espermatozóides, oócitos e embriões criopreservados
(KIKUCHI
et al
., 1999).
Durante a década passada, observou-se o surgimento de diversas
biotecnologias reprodutivas, algumas dessas biotecnologias já foram incorporadas
na reprodução eqüina, outras ainda deverão ser incorporadas mais lentamente e
algumas não serão incorporadas. Para que estas tecnologias sejam aceitas e
utilizadas prontamente na atividade eqüina, elas dependem do sucesso da
tecnologia, do comportamento dos criadores e veterinários e do custo benefício da
tecnologia. Dentre as tecnologias pode-se citar a citometria de fluxo, a inseminação
artificial com dose reduzida, a sexagem de espermatozóides, os avanços e
aprimoramento das técnicas de congelamento de sêmen e injeção
intracitoplasmática
de espermatozóide (SQUIRES, 2005).
O processo de fusão e fecundação é uma conseqüência da perfeita
interação de mensagens emitidas pelo germoplasma masculino e feminino para a
formação do embrião. Mas para isso, é necessária a funcionalidade estrutural e
bioquímica da célula desde a sua formação até a maturação, cujo processo é
denominado espermatogênese (JOHNSON
et al.,
2000).
2.1
ESPERMATOGÊNESE E MA
TURAÇÃO DOS ESPERMAT
OZÓIDES
A espermatogênese nos mamíferos é um processo cíclico de multiplicação e
difere
nciação celular em que as células primordiais ou espermatogônias passam por
complexas transformações a nível celular e molecular até a formação de
espermatozóides maduros (SHIVAJI
et al
., 1990).
Segundo JOHNSON et al. (1997) a espermatogênese é um longo,
mas
ordenado processo em que espermatozóides são produzidos nos túbulos
seminíferos, e é dividida em três fases: a fase proliferativa em que a célula primária
diplóide, a espermatogônia, passa por repetidas divisões mitóticas para dar origem
4
aos espermatócitos; a fase meiótica em que o material genético do espermatócito
recombina e segrega para formar a célula haplóide redonda ou espermátide; e a
fase espermiogênica em que a espermátide sofre a diferenciação que dará origem a
espermátides alongadas, de núcleo condensado e flagelo espécie-específico, ou
espermatozóide que será liberado para o epidídimo. Para que esta última fase
ocorra, as espermátides sofrem uma série de transformações que incluem a
formação do complexo de Golgi, da cabeça, do acrosoma e a aquisição da
capacidade de fertilizar o ovócito.
A espermiogênese é a diferenciação morfológica das espermátides em
espermatozóides. Estas espermátides contêm uma cabeça aerodinâmica com
enzimas penetrativas e um núcleo condensado que carrega o genoma masculino e
uma cauda responsável pela motilidade (JOHNSON, 1991).
A fase em que ocorrem as maiores transformações morfológicas
(condensação, alongamento da forma) do núcleo e da membrana é a fase
acrossômica. Esta fase é seguida da maturação do espermatozóide, em que se
finaliza a forma da cabeça e condensação da cromatina, a formação da cauda e do
pescoço, originando o espermatozóide (BARTH e OKO, 1989).
O acrossoma se constitui, tanto na membrana interna como externa, num
carreador de proteínas, adquiridas na sua formação e, após, na maturação,
imprescindíveis para a interação do espermatozóide e zona pelúcida, reação
acrossômica, fusão e penetração no ovócito (NISHIMUNE e OKABE, 1993).
Portanto, a integridade do acrossoma no processo de fecundação é fundame
ntal
para ocorrer à fusão espermatozóide
-
ovócito.
No final da espermiogênese as células espermáticas já possuidoras de
flagelo, porém ainda imóveis e inférteis, são liberadas para o lúmen dos túbulos
seminíferos pela ação das células de Sertoli. A movimentação destas células é
proporcionada pelos fluídos secretados pelas células de Sertoli e pelo movimento
contrátil exercido pelas substâncias contidas na cápsula testicular e camada
muscular dos túbulos seminíferos (BARTH e OKO, 1989).
Os túbulos seminíferos constituem cerca de 70% do volume do testículo
eqüino (JOHNSON, 1991). Estes são conectados à cabeça do epidídimo pela
rete
testis
, formada por pequenos ductos eferentes dentro dos quais ocorre a absorção
dos fluídos oriundos da rete testis e o aparecimento de secreções contendo
5
antígenos e proteínas, ambos necessários ao estabelecimento da motilidade
espermática. Portanto, para alcançarem a cabeça do epidídimo os espermatozóides
transitam pelos ductos eferentes, movimento este realizado com o auxílio
das
células epiteliais ciliadas e pela contração da musculatura lisa das paredes dos
próprios ductos (BRANDT
et al
., 1978).
A cromatina nuclear é definitivamente condensada durante o trânsito pelo
epidídimo. Quando há alteração na estrutura nuclear por fatores mecânicos e
químicos, há aumento na habilidade de fecundação e de manter o desenvolvimento
embrionário. Portanto, tanto os eventos da espermatogênese quanto à maturação
pós
-testicular são necessários para a competência das células espermáticas
(BEDFOR
D, 1994).
O espermatozóide liberado pelo testículo ao alcançar o epidídimo ainda não
possui habilidade de se movimentar, de reconhecer e fecundar o ovócito,
necessitando submeter-se a transformações ao longo do epidídimo para
potencializar a função de form
ar o zigoto.
O epidídimo, do Grego
epi
(dentro)
e didymoi (germinativo ou testículo), é
um órgão alongado, localizado na superfície do testículo. Ele é monotubular,
enrolado em espiral, que transporta os espermatozóides dos vasos eferentes para
os vasos deferentes (SULLIVAN et al., 2005). O epidídimo, anatomicamente pode
ser dividido em três segmentos: iniciando com a cabeça, onde o espermatozóide
adquire motilidade progressiva; corpo que o habilita a fecundar; e segmento final, a
cauda, local de armazenamento. As células epididimais são especializadas não só
em criar o ambiente para amadurecer o espermatozóide, mas também para realizar
a proteção imunológica (SHIVAJI, 1988).
Nos mamíferos, o epidídimo possui múltiplas funções: reabsorção dos
fluídos dos túbulos seminíferos, promovendo a concentração do sêmen, transporte
dos espermatozóides, eliminação dos espermatozóides defeituosos, maturação e
armazenamento dos espermatozóides, que é bem ilustrado pelo fato de que os
espermatozóides ejaculados sobrevivem por 24 horas ou mais fora do epidídimo, e
são mantidos vivos por mais de 15 dias na cauda do epidídimo. Esta funcionalidade
é baseada na manutenção do metabolismo com baixa atividade, prevenindo a
ativação prematura dos espermatozóides; durante o período de armazenamento o
epidídimo acumula espermatozóides suficientes para a cópula. O volume da cauda
6
do epidídimo reflete a capacidade de armazenamento de espermatozóides do
macho. Em touros e garanhões o número de espermatozóides armazenados na
cauda do epidídimo pode ser suficiente para até 10 ejaculados sucessivos
dependendo da idade, tamanho e atividade reprodutiva do animal (BEDFORD,
1994).
A maturação espermática é a função mais estudada do epidídimo. Trabalhos
demonstram que espermatozóides coletados da cabeça do epidídimo são incapazes
de fertilização quando usados para inseminação artificial ou fertilização in vitro
(HORAN e BEDFORD, 1972). Na maioria das espécies, os espermatozóides têm
que alcançar a porção final do corpo do epidídimo para adquirir potencial de
fertilização. A aquisição da habilidade de fertilização durante o trânsito epididimal
define o conceito de maturação espermática. Muitas características bioquímicas são
modificadas durante o trânsito epididimal, incluindo a condensação da cromati
na,
trocas de fosfolipídeos e colesterol, modificações na composição das proteínas da
superfície da membrana plasmática (DACHEUX e PAQUIGNON, 1980).
A síntese de proteínas e secreções epididimais no lúmen é regulada por
andrógenos testiculares, que variam de um segmento para outro do epidídimo. Isto
resulta numa mistura complexa de proteínas epididimais interagindo com o
espermatozóide no lúmen do epidídimo. O processo de maturação dos
espermatozóides depende de uma seqüência de modificações espermáticas
re
sultantes da interação da superfície do espermatozóide com diferentes fluídos
intraluminais (RODRIGUEZ
et al.,
2001).
O período de tempo para uma espermatogônia ser convertida em um
espermatozóide incorporado dentro do lúmen do túbulo seminífero é de 55-
57
dias
no garanhão. Esse processo de liberação das espermátides no lúmen do túbulo
seminífero é chamado de espermiação. Aproximadamente 9 dias são necessários
para o transporte dos espermatozóides através do sistema de ductos,
conseqüentemente, uma população nova de espermatozóides pode ser ejaculada
após 64-66 dias. Um ejaculado é, conseqüentemente, um composto dos eventos
que ocorreram nos dois meses anteriores que influenciaram a espermatogênese
quando os espermatozóides estavam sendo formados, e subseqüentemente o seu
transporte e maturação através do sistema de ductos (AMANN, 1993; LOVE, 2002).
7
Bilhões de espermatozóides são produzidos a cada dia (16 milhões de
espermatozóides por grama de tecido testicular por dia no garanhão). Muitas das
células produzidas são defeituosas e são eliminadas através de apoptose e
fagocitose pelas células de Sertoli, e outras são eliminadas no ejaculado
(HENINGER
et a
l., 2004).
2.2
COLHEITA DE ESPERMAT
OZÓIDES DO EPIDÍDIMO
A colheita de espermatozóides epididimais pode ser a última chance para
assegurar a preservação do material genético após lesão ou morte do reprodutor.
Estudos têm demonstrado que espermatozóides epididimais podem ser usados na
inseminação artificial, fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática de
esp
ermatozóides com resultados satisfatórios (JAMES
et al.
, 2002).
A recuperação pós-morte de espermatozóides epididimais é benéfica,
principalmente, para as espécies com dificuldade para coletar seu sêmen
in vivo
, em
animais ameaçados de extinção ou animais que podem ir a óbito inesperadamente.
Recuperar e criopreservar espermatozóides epididimais pode ser benéfico para
salvar o germoplasma desses animais (WILDT
et al
., 1986).
A primeira dificuldade na utilização dos espermatozóides epididimais é a
obtenção dos espermatozóides da cauda do epidídimo. Muitos métodos de
recuperação são descritos e variam dependendo do autor e da espécie animal. No
caso dos pequenos animais devido ao tamanho do epidídimo, o método de
preferência (flutuação) consiste em cortar ou fatiar a cauda do epidídimo e deixar
repousar em um meio gelatinoso, desta maneira, os espermatozóides migram para o
meio e são recuperados através de filtração (YU e LEIBO, 2002). Esta técnica
também é usada para obter amostras de espermatozóides de grandes animais
(HISHINUMA
et al
., 2003).
Uma técnica similar consiste em fazer numerosos cortes na cauda do
epidídimo e pressionar suavemente a cauda e coletar os espermatozóides por
extravasamento (KAABI et al., 2003). Outra possibilidade é usar uma agulha e
perfurar os túbulos (BARTELS et al., 2000). KISHIKAWA et al. (1999), utilizaram
8
pinças para comprimir a cauda do epidídimo de ratos e recuperar os
espermatozóides.
Outro método consiste em promover um fluxo retrógrado na cauda do
epidídimo aplicando pressão nos vasos deferentes até que o conteúdo da cauda
saia através de um corte feito na junção com o corpo do epidídimo (GARDE et al
.,
1994). A pressão é gerada com uma seringa, que injeta ar ou algum líquido não
prejudicial aos espermatozóides ou algum tipo de diluente (LAMBRECHTS et al
.,
1999; COMIZZOLI
et al
., 2001).
MARTINEZ
-
PASTOR
et al. (2006), demonstraram que a colheita de
espermatozóides da cauda do epidídimo através do fluxo retrógrado é a técnica mais
indicada, pois as amostras obtidas são menos contaminadas e de melhor qualidade
seminal em relação aos outros métodos. Possui a limitação de ser usada para
grandes animais devido ao tamanho do epidídimo e ser mais complexa que as
outras técnicas.
A recuperação pós-morte de espermatozóides epididimais tem sido utilizada
em várias espécies de cervídeos selvagens, tendo os espermatozóides recuperados
ótima capacidade de fertilização (ASHER
et al
., 2000).
Quando colhemos espermatozóides epididimais, estes não contêm o plasma
seminal, que além de dar volume ao ejaculado, contém substâncias que aumentam
a sobrevida do espermatozóide no trato genital feminino (KATILA
et al.,
2002).
BRIZ
et al.
(1996), observaram as malformações espermáticas em diferentes
regiões do epidídimo (cabeça, corpo e cauda) de varrões sexualmente maduros a
fim de determinar a origem das malformações e observaram que existem diferenças
entre a freqüência de alguns tipos de malformações e a região de origem no
epidídimo, já algumas malformações são distribuídas uniformemente ao longo do
epidídimo. As malformações de origem secundária aumentam na cauda do
epidídimo, e as de origem primária, com exceção da cauda dobrada, são constantes
ao longo do epidídimo.
MARTINEZ
-
PASTOR
et al
.
(2005b), pesquisaram os efeitos do tempo pós-
morte (até 4 dias) sobre os espermatozóides epididimais, resfriados a 5°C, de
caprinos e observaram uma boa qualidade seminal (motilidade e defeitos
espermáticos) por até 72 horas, permitindo o seu uso em programas de inseminação
artificial.
9
KAABI
et al. (2003), estudaram os efeitos do intervalo entre a morte do
animal e a recuperação dos espermatozóides da cauda do epidídimo, armazenados
à temperatura ambiente e a 5°C de carneiros (0, 24 e 48 horas), sobre a qualidade e
capacidade de fertilização dos espermatozóides. Eles observaram que as amostras
se mantiveram viáveis por até 24, 48 horas após a morte dos animais para os
epidídimos armazenados a temperatura ambiente e resfriados respectivamente,
entretanto a qualidade diminuía significativamente após esses períodos. Epi
dídimos
armazenados a 5°C tinham melhor motilidade e menos formas anormais do que os
armazenados a temperatura ambiente por mais de 24 horas. A capacidade de
fertilização dos espermatozóides obtidos da cauda do epidídimo até 24 horas pós-
morte foi semelhan
te a do ejaculado.
MARTINEZ
-
PASTOR
et al. (2005a), demonstraram os efeitos do tempo pós-
morte sobre a motilidade dos espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo
armazenados a 5°C de cervídeos e de cabritos. Observaram que muitos parâmetros
são correlacionados negativamente com o tempo pós-morte, mas a motilidade é o
mais afetado, sendo que ela se manteve em níveis aceitáveis por até 48 horas.
PRUNEDA
et al. (2005), estudaram os efeitos da alta freqüência de colheita
de sêmen no processo de maturação dos espermatozóides ejaculados e de
espermatozóides obtidos em diferentes regiões do epidídimo de varrões e
observaram que a alta freqüência de colheita afetou a motilidade dos
espermatozóides e a presença de gotas citoplasmáticas dos espermatozóides ao
longo
do epidídimo. A motilidade aumentou de 12% na cabeça do epidídimo para
82% na cauda, aproximando-se dos 90% do ejaculado. Cerca de 90% dos
espermatozóides da cabeça do epidídimo tinham gota citoplasmática e essa
porcentagem diminuía à medida que transitava
m pelo epidídimo.
KIKUCHI
et al. (1998), pesquisaram a influência do tempo pós-morte na
motilidade e capacidade de fertilização in vitro de espermatozóides epididimais de
cachaços orquectomizados, sendo os espermatozóides criopreservados logo após a
orqui
ectomia, 24, 48 e 72 horas após, sendo mantidos resfriados a 4°C, tendo como
grupo controle espermatozóides ejaculados criopreservados. A motilidade dos
espermatozóides criopreservados até 48 horas pós-orquiectomia não diferiu do
grupo controle, já a capacidade de fertilização foi significativamente menor, com boa
viabilidade nos espermatozóides criopreservados até 24 horas.
10
SAID
et al
.
(2003), observaram que oócitos que receberam injeção
intracitoplasmática de espermatozóides epididimais e de ejaculados de ratos,
tiveram taxa de fertilização e desenvolvimento embrionário semelhantes.
Existem diferenças nas características entre o sêmen ejaculado e os
espermatozóides da cauda do epidídimo de touros, sendo que o primeiro possui
maior motilidade, motilidade progressiva e vigor. Também existem diferenças nos
parâmetros entre dois epidídimos de um mesmo animal (GOOVAERTS
et al.,
2006).
MARTINS
et al. (2003), observaram que a concentração de
espermatozóides recuperados da cauda do epidídimo de cães é semelhante àq
uelas
descritas, para a espécie, no ejaculado.
HORN
et al. (2002), avaliaram a intensidade da redução de células
espermáticas defeituosas ao longo do epidídimo de touros e constataram redução
significativa no percentual de gota citoplasmática proximal, distal e no total de
defeitos ao longo do epidídimo de touros com espermatogênese normal.
SILVA
et al. (2003), comparando o sêmen ejaculado e os espermatozóides
da cauda do epidídimo de touros nelore, observaram que a motilidade total dos
espermatozóides do ejaculado era significativamente maior do que a do epidídimo,
já os espermatozóides do epidídimo apresentaram uma maior porcentagem de
alterações espermáticas, com um elevado número de gotas citoplasmática distal e
proximal.
MOGHADAM
et al. (2005), demonstraram que a motilidade dos
espermatozóides epididimais não tem efeito sobre a taxa de fecundação na
fertilização
in vitro
ou injeção intacitoplasmática de espermatozóides.
MOORE e AKHONDI (1996), observaram que não existem diferenças nos
parâmetros de
motilidade dos espermatozóides recuperados de regiões equivalentes
da cauda do epidídimo esquerdo e direito ou de diferentes regiões da cauda do
epidídimo esquerdo e direito de ratos.
SOLER
et al. (2003), demonstraram os efeitos da viabilidade e fertilidade de
espermatozóides epididimais criopreservados de cervídeos, descongelados em
diferentes protocolos de descongelamento (37ºC por 20 segundos; 60ºC por 8
segundos; 70ºC por 5 segundos), observando que o primeiro protocolo de
descongelamento é o mais ade
quado.
11
Espermatozóides epididimais de bovinos africanos podem ser recuperados
pós
-morte e criopreservados com sucesso. A proporção de espermatozóides viáveis
e com acrossoma intacto não foi alterada nos espermatozóides criopreservados
quando comparados aos
coletados no epidídimo (HERRICK
et al.
, 2004).
KATO
et al. (2002), colheram espermatozóides da cauda do epidídimo de
ratos e avaliaram sua motilidade e integridade do acrossoma, 1, 3 e 5 horas, pós-
orquiectomia e observaram queda significativa da motilidade após 5 horas e
nenhuma alteração significativa da integridade acrossômica.
BRUEMMER et al
.
(2002), observaram que não existem diferenças
significativas na motilidade de espermatozóides epididimais de garanhões, avaliados
logo após a orquiectomia e 24 horas depois, desde que, o epidídimo seja mantido
resfriado a 5ºC.
JAMES
et al. (2002), demonstraram que espermatozóides epididimais
viáveis de garanhões podem ser colhidos por até 96 horas pós-morte, desde que,
sejam mantidos resfriados a 4ºC.
Os espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo de garanhões têm
motilidade semelhante a dos espermatozóides ejaculados, entretanto, têm fertilidade
menor. Os espermatozóides epididimais precisam ser adicionados ao plasma
seminal ou outro diluente para melhorar a capacidade de fertilização (TIPLADY
et
al.,
2002).
MORRIS
et al.
(2002), inseminaram éguas com espermatozóides epididimais
a fresco com e sem plasma seminal e criopreservados com e sem plasma seminal,
obtendo taxas de gestação de 56%, 36%, 21% e 17% respe
ctivamente.
AURICH
et al. (2002), demonstraram não haver alteração na porcentagem
de espermatozóides móveis e normais em diferentes raças de eqüinos, pois estes
parâmetros não são afetados pelo tamanho do testículo e sim pela função do
parênquima testicu
lar.
2.3
AVALIAÇÃO DO SÊMEN
A avaliação do sêmen é classicamente realizada considerando-se os
aspectos macroscópicos, microscópicos e físicos. Volume, coloração, viscosidade e
12
aspecto do sêmen são os parâmetros macroscópicos avaliados. Motilidade, vigor,
co
ncentração e morfologia são os parâmetros microscópicos avaliados (SILVA,
2000).
A motilidade diz respeito ao porcentual de espermatozóides móveis numa
amostra, enquanto o vigor refere-se à força de deslocamento, em uma escala de 0 a
5, onde 0 significa espermatozóides sem motilidade e 5, espermatozóides com
deslocamento rápido e contínua progressão para adiante. Para determinação
desses parâmetros o método mais usual, porém menos preciso, é o da avaliação
subjetiva em microscopia óptica, com aumento de 100 a 400 vezes (SEAGER e
PLATZ, 1977).
Apesar de a motilidade espermática ser o parâmetro mais utilizado na
avaliação do sêmen, em algumas condições, pode ocorrer baixa capacidade
fecundante com elevada motilidade espermática, devido a alterações principalmente
no acrossoma (ENGLAND, 1993).
A concentração representa o número de espermatozóides por milímetro
(mm³) ou centímetro (cm³) cúbico no ejaculado. O procedimento mais comum para
se obter a concentração espermática consiste na contagem das células na c
âmara
de Neubauer ou de Toma Nova, podendo ainda ser utilizada a espectrofotometria e
o
Micro
-
cell
-
counter
(COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 1998).
A concentração espermática pode apresentar variação, tanto entre raças,
como num mesmo animal, dependendo da freqüência de utilização desse macho
para reprodução (SILVA, 2003).
Para avaliação das características morfológicas dos espermatozóides
poderão ser utilizados esfregaços corados ou preparação úmida, em microscópio de
contraste de fase. Como complemento é estimulado o uso de métodos de coloração
específicas para determinadas partes do espermatozóide, como por exemplo,
acrossoma (coloração pelo vermelho Congo), (CBRA,1998).
BLOM (1977) descreve duas categorias morfológicas para os defeitos dos
esperm
atozóides: primários, que ocorrem durante a espermatogênese,
representando uma falha da espermatogênese; e secundários que ocorrem durante
o trânsito pelos ductos, representando falhas na maturação. Os defeitos primários,
portanto são defeitos testiculares e os secundários ocorrem na maturação,
armazenamento, transporte ou até mesmo na manipulação do sêmen.
13
Na espécie eqüina, o total de defeitos entre primários e secundários, não
deve ultrapassar 30% (COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 1998).
14
3.
MATER
IAL E MÉTODOS
3.1
LOCAL
O experimento foi realizado no Hospital Veterinário da Universidade Federal
do Paraná, localizado no Setor de Ciências Agrárias, Curitiba, Paraná.
3.2
ANIMAIS
Foram utilizados 19 epidídimos de 10 garanhões (figura 1), com idade entre
24
a 90 meses, de varias raças (tabela 1), oriundos de criatórios de Curitiba e
Região Metropolitana. Os animais utilizados no experimento foram alojados no
Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, em baias individuais,
recebendo ração seca co
mercial
1
e volumoso três vezes ao dia e água ad libitum
.
Quando chegaram ao hospital veterinário receberam vacina contra tétano,
leptospirose e raiva.
TABELA
1
IDENTIFICAÇÃO DA RAÇA E IDADE DOS ANIMAIS UTILIZADOS NO
EXPERIMENTO
Identificação/Garanhão
Raça
Idade (meses)
1
Lusitana
28
2
Pônei
40
3
Pônei
40
4
Crioula
60
5
Crioula
40
6
Puro Sangue Inglês
24
7
Puro Sangue Inglês
60
8
Quarto de Milha
48
9
Appaloosa
48
10
Appaloosa
90
1
Níveis de garantia: proteína bruta
-
13%; fibras totais
-
10%; umidade
-
13%; cálcio
1,5%;
fósforo
0,5%.
15
FIGURA
1 -
FO
TOS DE ALGUNS ANIMAIS UTILIZADOS NO EXPE
RIMENTO
Os garanhões foram submetidos a exame andrológico prévio, sendo incluídos
no experimento os animais que atenderam os requisitos mínimos descritos no
Manual de Andrologia do Colégio Brasileiro d
e Reprodução Animal (1998) (Apêndice
1)
.
3.3
COLHEITA DE SÊMEN CO
M VAGINA ARTIFICIAL
A colheita de sêmen foi realizada em intervalos semanais, com vagina
artificial modelo Hannover, sendo realizada no mínimo duas colheitas de cada
garanhão antes da orquiecto
mia.
3.4
AVALIAÇÃO DO SÊMEN R
ECÉM
-
COLHIDO
Após a colheita do sêmen, o ejaculado foi filtrado, o volume mensurado por
visualização direta do sêmen em copo coletor graduado, e registrado o volume em
mililitros (mL) e feita avaliação da motilidade e vigor. Em seguida o sêmen foi
submetido ao processo de centrifugação (5.000 rotações por minuto, durante 10
16
minutos), sendo separado os espermatozóides do plasma seminal (sobrenadante), e
a porção de sêmen recuperada, misturada a 10 ml de diluente Botu-
Crio
pré-
aqu
ecido (37
C).
Logo após a diluição uma gota de sêmen misturada ao diluente foi colocada
em uma lâmina e coberta por uma lamínula, ambas de vidro, pré-aquecidas a 37
C,
para avaliação da motilidade dos espermatozóides, realizada em microscopia
óptica
2
, em aumento de 200 vezes, e registrada em dados porcentuais. A
determinação da intensidade do movimento dos espermatozóides (vigor) foi também
realizada em microscopia óptica, em aumento de 200 vezes, atribuindo-se escala de
0 a 5, entre os valores mínimos e m
áximos observados, respectivamente.
Os parâmetros motilidade e vigor dos espermatozóides colhidos com a vagina
artificial foram submetidos à avaliação imediata e uma hora depois de serem
misturados ao diluente, para observar se o meio diluente alterava est
es parâmetros.
A avaliação da concentração espermática (mm³) foi realizada em câmara de
Toma Nova, utilizando-se sêmen diluído na proporção de 0,05 ml de sêmen para 10
ml de solução formol salina a 1% (1:100).
O número total de espermatozóides no ejaculado foi obtido multiplicando-se a
concentração espermática (mm³) pelo volume de sêmen ejaculado.
Para avaliação das patologias espermáticas e integridade de acrossoma foi
feito um esfregaço delgado com os espermatozóides diluídos e feito a coloração de
CEROVS
KY (1976), (Apêndice 2). A porcentagem de alterações espermáticas e a
integridade de acrossoma foram obtidas pela contagem de 100 células espermáticas
em microscópio de contraste de fase
3
em objetiva de imersão.
As alterações espermáticas consideradas na avaliação foram: defeitos
maiores, menores e totais, conforme o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
(1998).
2
Olympus
BH
-
2
Japão.
3
Olympus
-
BX41TF
-
Japão
17
3.5
ORQUIECTOMIA EQÜINA
Uma semana após a última colheita de sêmen utilizando-se a vagina
artificial, os garanhões foram submetidos a orquiectomia bilateral. Sendo de
temperamento dócil, os procedimentos cirúrgicos foram realizados com os animais
em estação.
Decorridos 20 a 30 minutos da tranquilização com acepromazina 1% (0,05
mg/Kg/IV), os animais foram encaminhados à sala de preparação onde se efetuou a
anti
-sepsia com iodo-
polivinil
-pirrolidona do campo cirúrgico. Com 10 ml de lidocaína
procedeu
-se a infiltração no escroto, a um centímetro lateralmente a rafe mediana,
completando
-se a anestesia com aplicação intratesticular e no cordão espermát
ico,
logo acima do local demarcado para a emasculação.
Na seqüência após ter sido realizada a incisão de 7 a 10 centímetros
(dependendo do tamanho do testículo) sobre o escroto, a um centímetro
lateralmente a rafe mediana, prosseguiu-se com a abertura da túnica dartos e da
fáscia escrotal. Por meio de compressão digital entre polegar e o indicador, o
testículo emergiu e efetuou-se a incisão da túnica comum (ou vaginal parietal) ao
longo do pólo caudal testicular e cordão espermático. Prossegui-se tracionando o
testículo, o que facilitou o deslocamento entre este, o cordão vascular espermático, o
ducto deferente, o músculo cremáster externo e a túnica comum.
Para finalizar a orquiectomia, efetuou-se a hemostasia do cordão
espermático por compressão, durante cinco minutos, com o auxílio do emasculador
de Chassaignhac. O mesmo procedimento, durante 3 minutos, foi aplicado no
músculo cremáster. Durante a preensão do cordão espermático com o emasculador,
evitou
-se a inclusão de tecidos circunjacentes, que poderiam prejudicar o
estiramento e compressão dos vasos e, conseqüentemente, a hemostasia. Além
disso, a rafe mediana foi ressecada para facilitar a drenagem e evitar a formação de
seroma.
Para concluir a gonadectomia, repetiu
-
se o procedimento no testículo con
tra
-
lateral.
Durante o período pós-operatório, diariamente a ferida cirúrgica foi tratada
com iodo-
polivinil
-pirrolidona, durante 7 dias. Além disso, foi administrado 7 milhões
18
de unidades internacionais de benzipenicilina procaína mais diidroestreptomicina a
cada 24 horas durante 5 dias.
3.6
TÉCNICA DE COLHEITA
DOS ESPERMATOZÓIDES
DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO
Neste experimento, imediatamente após a orquiectomia, os testículos
ficaram armazenados separadamente em sacos plásticos abertos, a temperatura
ambiente (18-
25
C), até o momento da manipulação, sendo os quatro testículos dos
dois primeiros garanhões armazenados por seis horas para depois serem
manipulados, os quatro testículos seguintes ficaram armazenados por 12 horas para
depois serem manipulados. O tempo para a colheita e avaliação dos
espermatozóides de cada grupo foi aumentado gradativamente de 6 em 6 horas,
até
30 horas pós
-
orquiectomia.
Para a colheita dos espermatozóides da cauda do epidídimo, o complexo
testículo
-epidídimo foi separado em duas partes: testículo e cauda do epidídimo
(figura 2), sendo feita uma lavagem da cauda do epidídimo com soro fisiológico pré-
aquecido (37
C)
, para remoção do sangue.
19
1
FIGURA
2 - COMPLEXO TESTÍCULO-CAUDA DO EPIDÍDIMO DO GARANHÃO
SEPARA
DOS
1
-
Testículo; 2
Cauda do epidídimo
A técnica de colheita de espermatozóides da cauda de epidídimo pelo
método de GARDE et al. (1994), consiste em injetar diluente no ducto deferente e
recuperá
-lo através de um corte na junção do corpo com a cauda do epidídimo, esta
técnica foi modificada neste experimento, sendo a colheita dos espermatozóides da
cauda do epidídimo realizada da seguinte maneira:
O tecido conjuntivo que recobre a cauda do epidídimo (figura 3) foi removido
com
uma tesoura cirúrgica e pinças hemostáticas, sendo dissecado cuidadosamente
para evitar o rompimento dos vasos sanguíneos e do ducto epididimário.
20
FIGURA
3 - TECIDO CONECTIVO QUE RECOBRE A CAUDA DO EPIDÍDIMO DO
GARANHÃO
1
-
Tecido conectivo
Após a remoção dos tecidos que envolvem o epidídimo, foram desfeitos os
contornos do ducto epididimário, que formam a cauda do mesmo conforme
demonstra a figura 4.
FIGURA
4 -
DISSE
CAÇÃO DA CAUDA DO EP
IDÍDIMO DO GARANHÃO
21
Em seguida o ducto epididimário foi segmentado em três partes para facilitar
a lavagem e colheita dos espermatozóides, tendo cada segmento de 20 a 40
centímetros (figura 5), dependendo do tamanho da cauda do epidí
dimo.
FIGURA
5 - TAMANHO DE UM SEGMENTO DISSECADO DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO DO GARANHÃ
O
*Segmento com 40 centímetros
Para realização da lavagem uma das extremidades do segmento foi pinçada,
para evitar o extravasamento dos espermatozóides, mantendo o segmento
estendido na posição vertical, sobre um filtro acoplado a um copo coletor pré-
aquecido (37
C),
sendo o diluente injetado no lúmen do mesmo, com auxílio de uma
seringa e agulha (0,45 X 13), imediatamente abaixo do local pinçado, fazendo com
que os espermatozóides fossem carreados pelo diluente e recuperados na outra
extremidade, como demonstra a figura 6.
22
FIGURA
6 - LAVAGEM DE UM SEGMENTO DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE
GARANHÃO
Após a lavagem do último segmento, os espermatozóides dos três
segmentos (misturados) foram submetidos aos mesmos parâmetros de avaliação do
sêmen obtido com a vagina artificial.
A lavagem foi feita com o mesmo diluente utilizado no sêmen colhido com a
vagina artificial (
Botu
-Crio®, pré-aquecido a 37 C). Para lavagem de cada cauda do
epidídimo do garanhão foram utilizados 10 mL de diluente, divididos entre os três
segmentos.
A motilidade e o vigor foram avaliados imediatamente e uma hora depois da
colheita dos espermatozói
des.
3.7
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados de motilidade, vigor, número total de espermatozóides,
espermatozóides morfologicamente deformados e defeitos de acrossoma foram
submetidos à análise de variância inteiramente casualisado com 6 tratamentos e 4
rep
etições, com aplicação do teste de Tukey para comparação de médias.
Os parâmetros avaliados dos espermatozóides, uma hora após a diluição,
colhidos com a vagina artificial foram utilizados como grupo controle (0 hora) para
23
avaliação comparativa da diminuição da viabilidade dos espermatozóides
epididimais em função do tempo pós
-
orquiectomia.
24
4.
RESULTADOS
4.1
AVALIAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA DO SÊMEN COLHIDO COM VAGINA
ARTIFICIAL
Na tabela 2 são apresentados os resultados das características seminais
dos animais i
ncluídos no experimento.
Pode
-se observar na tabela 2 que as características seminais descritas para
motilidade e o vigor dos garanhões utilizados neste experimento, colhidos com
vagina artificial, estavam condizentes com os parâmetros considerados normai
s para
a espécie eqüina (Apêndice 1), sendo a variação da motilidade de 70 para 80%
entre os garanhões, bem como, a variação de 1 ponto para o vigor, na escala de 0 a
5.
Observa
-se na tabela 2, que houve variação no número total de
espermatozóides colhidos, sendo que os garanhões 1 e 6 apresentaram número
total de espermatozóides inferior por estarem no grupo de animais com idade inferior
a 30 meses, os garanhões 2 e 3 por serem pôneis e o garanhão 5 por ser
criptorquida.
Quanto ao porcentual de espermatozóides morfologicamente deformados
(EMD), houve uma variação de 16 a 42% (as deformações mais comuns foram
encontradas na cabeça e peça intermediária) entre os garanhões. Quanto às
alterações de acrossoma, podemos observar que os garanhões apresentaram
def
ormações de 3 a 6%.
A motilidade e o vigor dos espermatozóides colhidos com a vagina artificial
não apresentaram variação nas avaliações realizadas no momento da diluição e
uma hora depois.
25
TABELA 2 - CARACTERÍSTICAS DO S
ÊMEN
COLHIDO COM VAGINA
ARTIFICIAL DOS GARAN
HÕES
Características Seminais
Garanhões
Motilidade %
Vigor (0
-
5)
Número Total de
Espermatozóides
(bilhões)
* EMD %
Defeitos de
Acrossoma
%
01
75%
4
7,3
20
3
02
80%
4
5,1
22
3
03
75%
4
5,4
16
4
04
80%
5
31,9
19
4
05
75%
4
4,9
20
4
06
70%
4
1,95
42
6
07
80%
5
13,5
23
3
08
80%
5
14,5
21
4
09
80%
4
28
18
4
10
80%
5
35,2
18
5
*EMD: espermatozóides morfologicamente deformados
*Características seminais dos garanhões, referentes à colheita com vagina artificia
l sete dias antes
da orquiectomia
4.2
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO SÊMEN COLHIDO COM VAGINA
ARTIFICIAL E DOS ESPERMATOZÓIDES COLHIDOS DA CAUDA DO
EPIDÍDIMO DOS GARANH
ÕES
A colheita dos espermatozóides da cauda do epidídimo dos garanhões pela
modificação da téc
nica de GARDE
et al.
(1994), foi realizada de maneira rápida, sem
dificuldades e com ausência de outros tipos celulares com os espermatozóides.
4.2.1
Motilidade e Vigor
Quanto à avaliação comparativa da motilidade e do vigor dos
espermatozóides colhidos da cauda dos epidídimos (armazenados a temperatura
ambiente nos grupos 6, 12, 18, 24 e 30 horas pós-orquiectomia), pode-se observar
na tabela 3, que as avaliações realizadas 6 e 12 horas pós-orquiectomia não
apresentaram diferença significativa (p>0,005) em relação aos espermatozóides
colhidos com a vagina artificial. Quanto às avaliações realizadas 18, 24 e 30 horas
26
pós
-orquiectomia, observou-se diminuição significativa (p<0,005) da motilidade e do
vigor entre os grupos e relativo à vagina artificial.
TABELA 3 - AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA MOTILIDADE E VIGOR DOS
ESPERMATOZÓIDES COLHIDOS COM VAGINA ARTIFICIAL E DA
CAUDA DO EPIDÍDIMO DOS GARANHÕES EM FUNÇÃO DO
TEMPO
Motilidade
Vigor
n
Média* X
Desvio
Padrão
C.V.**
Média* X
Desvio
Padrão
C
.V.**
Vagina Artificial
--
80%
a 0
0%
4 a
0
0%
Epidídimos
6 horas
4
80% a
0
0%
4 a
0
0%
Epidídimos
12 horas
4
70% a
0,08
11,6%
4 a
0
0%
Epidídimos
18 horas
4
60% b
0,08
11,6%
3 b
0
0%
Epidídimos
24 horas
4
30% c
0,04
13,6%
2 c
0
0%
Epidídimos
30 ho
ras
3
0% d
0
0%
0 d
0
0%
* As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si (p<0,05) pelo teste de
Tukey.
**C.V= Coeficiente de Variação
A figura 7 demonstra o declínio da motilidade dos espermatozóides colhidos
da cauda do epidídimo em diferentes horários pós-orquiectomia. Pode-se observar
que até 18 horas pós-orquiectomia a motilidade decrescia em uma proporção menos
intensa a cada 6 horas, e a partir das 18 horas o decréscimo da motilidade foi mais
intenso entre os grupos.
27
FIGURA
7 - AVALIAÇÃO DO DECRÉSCIMO DA MOTILIDADE (%) DOS
ESPERMATOZÓIDES COLHIDOS DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DOS
GARANHÕES EM FUNÇÃO
DO TEMPO PÓS
-
ORQUIECTMIA
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
6
12 18 24 30
Tempo (horas)
Motilidade
Epididimo
A tabela 4 apresenta os resultados comparativos da motilidade e vigor dos
espermatozóides avaliados no momento da colheita da cauda do epidídimo e
avaliados uma hora após repousarem no diluente.
Observou
-
se um aumento significativo (p<0,05) da motilidade uma hora após
a adição de diluente nos grupos de 6, 12, 18, 24 horas pós-orquiectomia, o grupo 30
horas não apresentou diferença entre a motilidade no momento da colheita e uma
hora depois. Com relação ao vigor os grupos 6, 12, 18, 24 horas pós-
orquiectomia
apresentaram melhora significativa do vigor. O grupo 30 horas não apresentou
alteração.
28
TABELA 4 - AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA MOTILIDADE E VIGOR DOS
ESPERMATOZÓIDES DOS GARANHÕES NO MOMENTO DA
COLHEITA DA CAUDA DO EPIDÍDIMO (0 HORA) E UMA HORA APÓS
A COLHEITA (1 HORA)
Médias
Tempo (horas)
Epidídimos (n)
Motilidade (%) / Vigor 0
hora
Motilidade (%) / Vigor 1
hora
6 4
70 / 4 a
80 / 4 b
12
4
65 / 3 a
70 / 4 b
18
4
50 / 2 a
60 / 3 b
24
4
20 / 1 a
30 / 2 b
30
3
0 a
0 a
* As médias seguidas de letras diferentes na mesma linha diferem entre si (p<0,05) pelo teste de
Tukey.
As figuras 8 e 9 apresentam as diferenças da motilidade e vigor
respectivamente, no momento da colheita dos espermatozóides da cauda do
epidídimo e uma hora depois.
29
FIGURA
8 - AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA MOTILIDADE (%)
NO MOMENTO DA
COLHEITA DOS ESPERMATOZÓIDES DA CAUDA DO EPIDÍDIMO
DOS GARANHÕES (INICI
AL) E UMA HORA APÓS
(1 HORA)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Vagina Artificial
6h
12h 18h
24h
30h
Motilidade (%) Inicial
Motilidade (%) 1 hora
FIGURA
9 - AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO VIGOR NO MOMENTO DA
COLHEITA DOS ESPERMATOZÓIDES DA CAUDA DO EPIDÍDIMO
DOS GARANHÕES (INICI
AL) E UMA HORA APÓS
(1 HORA)
0
1
2
3
4
5
6 horas
12 horas
18 horas
24 horas
30 horas
Vigor inicial
Vigor 1 hora
30
4.2.2
Número Total de Espermatozóides
O número total de espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo nã
o
está relacionado com o tempo pós-orquiectomia mas são apresentados de forma
individual para cada garanhão na tabela 5.
Na tabela 5 pode-se observar que o número total de espermatozóides
colhidos da cauda de ambos os epidídimos de um mesmo garanhão ou apenas de
um dos epidídimos é significativamente (p<0,05) superior ao número total de
espermatozóides colhidos com a vagina artificial, com exceção dos garanhões 1 e 6
pela pouca idade (menos de 30 meses).
TABELA
5 - COMPARAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE ESPER
MATOZÓIDES
(BILHÕES) COLHIDOS COM A VAGINA ARTIFICIAL E DA CAUDA
DO EPIDÍDIMO DOS GAR
ANHÕES
Número Total de Espermatozóides (bilhões)
Garanhões
Vagina
Artificial
Epidídimo
Esquerdo
Epidídimo Direito
Epidídimo Esquerdo +
Epidídimo Dire
ito
1
7,3
7,6
5,3
12,9
2
5,1
17,1
11,7
28,8
3
5,4
17,6
9,2
26,8
4
31,9
55,5
57,6
113,1
5
4,9
21,8
*
21,8
6
1,95
5,8
0,7
6,5
7
13,5
28
24
52
8
14,5
19
16
35
9
28
35,7
21,6
57,3
10
35,2
57,3
40,8
98,1
*O garanhão 5 era criptorquida
A tabela 6 apresenta a média do número total de espermatozóides de todos
os garanhões colhidos com vagina artificial, epidídimos esquerdos, direitos e de
ambos os epidídimos.
31
Verifica
-se que a média do número total de espermatozóides colhidos tanto
na cauda do epidídimo esquerdo quanto direito foi significativamente (p<0,05) maior
do que os colhidos com vagina artificial, e que o epidídimo esquerdo apresentou
número total de espermatozóides colhidos significativamente superior (p<0,05) ao
epidídimo direito.
TABELA 6 - COMPARAÇÃO DA MÉDIA DO NÚMERO TOTAL DE
ESPERMATOZÓIDES (BILHÕES) COLHIDOS COM A VAGINA
ARTIFICIAL E DA CAUD
A DO EPIDÍDIMO DOS G
ARANHÕES
Média* (X) do Número Total de Espermatozóides (bilhões)
Garanhões (n)
Vagina
Artificial
Epi
dídimo
Esquerdo
Epidídimo Direito
Epidídimo Esquerdo +
Direito
10
14,7 a
26,5 b
20,7 c
47,2 d
* As médias seguidas de letras diferentes na mesma linha diferem entre si (p<0,05) pelo teste de
Tukey.
A figura 10 representa a comparação média do número total de
espermatozóides colhidos com vagina artificial, dos epidídimos esquerdos, direitos e
de todos os epidídimos.
A figura 11 representa a comparação média do número total de
espermatozóides colhidos dos epidídimos esquerdos e direitos dos garanhões.
32
FIGURA
10
- COMPARAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE ESPERMATOZ
ÓIDES
(BILHÕES) COLHIDOS COM A VAGINA ARTIFICIAL E DA CAUDA
DO EPIDÍDIMO DOS GAR
ANHÕES
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Vagina Artificial
Epidídimos
Esquerdos
Epidídimos Direitos
Total Epidídimos
Número Total de
Espermatozóides
FIGURA
11
- COMPARAÇÃO DO NÚMERO TOTAL DE ESPERMATOZÓIDE
S
(BILHÕES) COLHIDOS DA CAUDA DO EPIDÍDIMO ESQUERDO E
DIREITO DOS GARANHÕE
S
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 6 7 8 9
10
Garanhão
Epididimo
esquerdo
Epididimo direito
33
4.2.3
Espermatozóides Morfologicamente Deformados e Defeitos de Acrossoma
Na tabela 7 podemos observar que não houve diferença significa
tiva
(p>0,05) entre o número de espermatozóides morfologicamente deformados
colhidos com vagina artificial e os grupos 6 e 18 horas pós-orquiectomia, já os
grupos 12, 24 e 30 horas apresentaram aumento significativo (p<0,05) das
deformações em relação à va
gina artificial.
Nos grupos colhidos com vagina artificial e da cauda do epidídimo 6 e 18
horas pós-orquiectomia o porcentual de alterações na cabeça dos espermatozóides
(sendo a cabeça estreita a deformação mais comum) foi de 10%, 10% e 11%
respectivament
e, e 12% de deformações na peça intermediária e principal (a clave
de sol foi a deformação mais comum) nos três grupos; já nos grupos 12 e 24 horas
pós
-orquiectomia o porcentual de alterações da cabeça dos espermatozóides foi de
13% e 11% respectivamente (
cabeça estreita e deformada a alteração mais comum);
na peça intermediária, principal e terminal o porcentual foi de 11% e 13%
respectivamente (clave de sol e gota citoplasmática foram os defeitos mais comuns);
o grupo 30 horas apresentou 12% de alterações na cabeça dos espermatozóides
(deformação da cabeça foi a alteração mais comum); 15% de defeitos na peça
intermediária, principal e terminal (clave de sol enrolada as alterações mais comuns).
Ainda na tabela 7 podemos observar que os defeitos de acrossoma não
apresentaram diferença significativa (p>0,05) entre os grupos analisados 6, 12 e 18
horas pós-orquiectomia em relação à vagina artificial, apresentando aumento
significativo (p<0,05) somente os grupos 24 e 30 horas (ausência e edema de
acrossoma fora
m as alterações mais comuns).
34
TABELA 7 - AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO PORCENTUAL DE
ESPERMATOZÓIDES MORFOLOGICAMENTE DEFORMADOS (EMD)
E DE DEFEITOS DE ACR
OSSOMA (DA)
EMD (%)
DA (%)
Origem dos Espermatozóides
Média*
X
Desvio
Pa
drão
C. V.**
Média*
X
Desvio
Padrão
C. V.**
Vagina Artificial
21a
0
0%
3 a
0
0%
Epidídimo 6 horas (n=4)
22 a
0,81
3,7%
3 a
0,81
20,4%
Epidídimo 12 horas (n=4)
24 b
1,63
6,8%
4 a
0,81
20,4%
Epidídimo 18 horas (n=4)
23 a
1,63
6,8%
5 a
0,81
20,4%
Epidídi
mo 24 horas (n=4)
24 b
0,81
3,4%
7 b
0,81
11,6%
Epidídimo 30 horas (n=3)
27 c
0,81
3,0%
8 b
0
0%
As médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si (p<0,05) pelo teste de
Tukey.
**C.V.= Coeficiente de Variação
A figura 12 representa a porcentagem de espermatozóides
morfologicamente deformados e os defeitos de acrossoma em função do tempo pós-
orquiectomia.
35
FIGURA
12
- AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO PORCENTUAL DE
ESPERMATOZÓIDES MORFOLOGICAMENTE DEFORM
ADOS
(EMD) E DE DEFEITOS DE ACROSSOMA (DA) EM FUNÇÃO DO
TEMPO PÓS
-
ORQUIECTOMIA DOS GAR
ANHÕES
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
Vagina Artificial
6 horas
12 horas 18 horas
24 horas
30 horas
Espermatozóides Morfológicamente Deformados (%)
Defeitos de Acrossoma (%)
36
5.
DISCUSSÃO
Todos os animais utilizados neste experimento apresentaram fertilidade
normal para a espécie eqüina quanto aos valores seminais obtidos com a vagina
artificial estando de acordo com os padrões do Colégio Brasileiro de Reprodução
(1998) e com os valores encontrados por LIMONE
et
al.
(2002) e MORRIS et al.
(2002).
Muitos trabalhos relatam os efeitos do tempo pós-morte sobre os
espermatozóides epididimais armazenados a temperatura de 5ºC, mas nenhum é
descrito com epidídimos de garanhão armazenados a temperatura ambiente, não
existindo, na espécie eqüina, parâmetros para comparação com o presente
experimento.
5.1
COL
HEITA DOS ESPERMATOZ
ÓIDES EPIDIDIMAIS
Os espermatozóides epididimais foram colhidos sem dificuldades, através da
modificação da técnica de Garde et al. (1994), sendo a lavagem com diluente dos
túbulos epididimais segmentados em três partes uma técnica eficiente, pois as
amostras obtidas foram de boa qualidade, sem células contaminantes, com número
total de espermatozóides significativamente superior aos colhidos com a vagina
artificial, sendo a colheita dos espermatozóides da cauda do epidídimo dos
garanhõ
es realizada de modo rápido e fácil, devido ao calibre dos ductos
epididimais, sem que as alterações teciduais que ocorrem em função do tempo pós-
orquiectomia dificultassem a colheita.
A injeção de diluente (LAMBRECHTS et al., 1999) para promover o fluxo
espermático para o exterior do ducto é mais eficiente do que a injeção de ar
(KIKUCHI
et al., 1998), além dos espermatozóides serem carreados com maior
facilidade e segurança, por saírem diluídos dos túbulos.
MARTINEZ
-
PASTOR
et al. (2006), comparam os métodos de colheita de
espermatozóides da cauda do epidídimo através da lavagem com diluente e método
da flutuação em meio diluente, obtendo concentração de 6,4 e 4,9 bilhões de
espermatozóides respectivamente e, em 79% das amostras, obtidas por lavagem
37
estav
am livres de outros tipos de células, contra 100% de amostras contaminadas
com outras células pelo método de flutuação. Durante a avaliação das amostras de
espermatozóides obtidos pelo método de lavagem neste experimento, não foram
observadas outras célula
s contaminantes.
5.2
MOTILIDADE E VIGOR
A motilidade e o vigor inicial dos espermatozóides colhidos com vagina
artificial foram maiores do que a dos espermatozóides colhidos da cauda do
epidídimo, diferença essa que pode ser atribuída a vários fatores. Os
espermatozóides adquirem movimento e completam quase totalmente o processo de
maturação na cauda do epidídimo. Nesses processos os espermatozóides sofrem
modificações químicas e estruturais responsáveis tanto pela maturação como pelo
início do movimento das células espermáticas. Como o processo de formação e
liberação dos espermatozóides ocorre de forma cíclica, provavelmente nas colheitas
foram obtidas populações de espermatozóides em vários estágios de maturação
(BARTH e OKO, 1989), fato que poderia explicar a menor motilidade e vigor dos
espermatozóides epididimais. Os espermatozóides colhidos com a vagina artificial
foram diluídos inicialmente em plasma seminal que é o meio diluente ideal para eles,
e após a centrifugação foram separados do mesmo e misturados ao diluente, já os
da cauda do epidídimo foram diluídos somente em diluente artificial que simulavam o
plasma seminal.
A melhora da motilidade e vigor dos espermatozóides epididimais após uma
hora no diluente é atribuída ao fato de quando os esperma
tozóides são recuperados,
eles estão concentrados e na ausência do plasma seminal que, além da função de
transporte, sustenta e melhora a motilidade inicial após a ejaculação, aumentando a
longevidade dos espermatozóides segundo TIPLADY et al. (2002). KATI
LA
et al.
(2002), demonstraram que espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo tinham
sua motilidade total, progressiva e vigor melhorados 15 minutos após a adição de
plasma seminal, papel este realizado pelo diluente Botu-Crio® em nosso
experimento, fornecendo um meio nutritivo ativando os espermatozóides para
fertilização.
38
Os valores da motilidade e vigor dos espermatozóides epididimais até 18
horas pós-orquiectomia foram semelhantes aos da vagina artificial e aos trabalhos
de BRUEMMER et al.
(2002);
JAMES
et al. (2002); KATILA et al
.
(2002) e TIPLADY
et al. (2002), trabalhando com espermatozóides recuperados de epidídimos
armazenados a 4ºC de garanhões.
Como esperado, observou-se um declínio da qualidade espermática com o
aumento do tempo pós-
orquiec
tomia, tendo como limite de viabilidade próximo das
24 horas pós-orquiectomia. Este decréscimo não é devido somente ao
envelhecimento e esgotamento metabólico dos espermatozóides, mas também
inerente ao processo de degeneração tecidual pós
-
morte.
Todos os epidídimos após 18 horas forneceram espermatozóides com
qualidade muito inferior à obtida com a vagina artificial.
SONGSASEN
et al
.
(1998),
trabalhando com ratos demonstraram que as degenerações dos túbulos epididimais
começam afetar os espermatozóides epididimais próximo das 18 horas pós-
morte,
tempo condizente com os valores encontrados neste experimento, pois a partir das
18 horas ocorreu diminuição acentuada da qualidade dos espermatozóides
epididimais.
O limite de 18 horas para a colheita de espermatozóides de epidídimos
armazenados a temperatura ambiente com motilidade e vigor semelhantes ao da
vagina artificial é muito inferior ao encontrado por JAMES et al. (2002) em
garanhões, GARDE et al. (1998) em cervídeos, SANKAI et al. (2001) em ratos e YU
e
LEIBO (2002) em cães, que recuperaram espermatozóides epididimais viáveis por
até 96 horas pós-morte. Estes valores são muito superiores aos encontrados em
nosso experimento, porque eles mantiveram os epidídimos refrigerados a 5ºC após
a morte do animal. A temperatura mais baixa retarda o processo de degeneração e
diminui o metabolismo dos espermatozóides, mantendo
-
os vivos por mais tempo.
MARTINEZ
-
PASTOR
et al. (2005 a), relataram que não existe diferença na
motilidade dos espermatozóides ejaculados e de epidídimos armazenados a 5ºC de
cervídeos por até 48 horas.
CHRISTIAN
et al
.
(1993) e KISHIKAWA et al
.
(1999) em ratos, GARDE
et al
.
(1994) em caprinos, KAABI et al. (2003) em ovinos, demonstraram que
espermatozóides epididimais viáveis podem ser recuperados de epidídimos
39
armazenados a temperatura ambiente por até 24 horas, valores estes, próximos aos
encontrados em nosso experimento.
5.3
NÚMERO TOTAL DE ESPE
RMATOZÓIDES RECUPERA
DOS
O número total de espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo, através
da
técnica de fluxo retrógrado modificada, foi muito superior aos encontrados no
sêmen colhido com a vagina artificial, justificando que a cauda do epidídimo possui a
função de armazenamento, sendo liberados em cada ejaculação uma parcela dos
espermatozóides
epididimais (SULLIVAN et al., 2005; JOHNSON et al., 2000). Os
espermatozóides obtidos da cauda do epidídimo não estavam diluídos com as
secreções liberadas durante a ejaculação, fato este, que explica a alta concentração
de espermatozóides.
A avaliação do número total de espermatozóides colhidos da cauda do
epidídimo corrobora com os valores relatados por BEDFORD (1994), observando
que dependendo do tamanho da cauda do epidídimo, idade e atividade sexual, um
garanhão pode armazenar na cauda do epidídimo espermatozóides suficientes para
até dez ejaculados consecutivos, justificando os garanhões 2 e 3 terem um menor
número de espermatozóides, pelo seu tamanho (pôneis) e aos garanhões 1 e 6 pela
sua pouca idade (28 e 24 meses respectivamente). Os garanhões que obtiveram
maior diferença entre o número total de espermatozóides colhidos da cauda do
epidídimo e com a vagina artificial, tinham os testículos maiores por serem mais
velhos (mais de 40 meses) ou com histórico de atividade sexual anterior ao
experimento
.
O fato de 9 dos 10 garanhões utilizados no experimento apresentarem maior
número total de espermatozóides recuperados do testículo esquerdo em relação ao
direito não é relatado em nenhum trabalho. Este fato pode ser resultado da pouca
idade dos garanhões e inatividade sexual (CARD, 2005), já que o único garanhão
que apresentou mais espermatozóides no testículo direito tinha atividade reprodutiva
anterior ao experimento.
40
5.4
ESPERMATOZÓIDES MORFOLÓGICAMENTE DEFORMADOS E DEFEITOS
DE ACROSSOMA
Não houve relação entre o tempo pós-orquiectomia e a porcentagem de
espermatozóides morfologicamente deformados até 18 horas, fato também relatado
por PASTOR
-
MARTINEZ
et al.
(2005b) em ruminantes, KATO
et al
. (2002) em ratos;
MARTINS
et al. (2003) em cães; SOLER et al. (2003) em cervídeos; TIPLADY et al.
(2002) e JAMES et al. (2002) em garanhões, sendo todos os espermatozóides
recuperados de epidídimos resfriados a 5ºC.
A média elevada de espermatozóides morfologicamente deformados no
grupo 12 horas pós-orquiectomia ocorreu devido ao epidídimo direito do garanhão 6,
que havia sofrido processo de deiscência testicular recente, mantendo a
porcentagem de espermatozóides morfologicamente deformados elevada até o
desenvolvimento completo da gônada (CARD, 2005).
O aumento dos espermatozóides morfologicamente deformados 18 horas
pós
-orquiectomia está relacionado com a decomposição tecidual, diminuição do pH
e exaustão metabólica dos espermatozóides, aumentando as deformações de
origem secundária, estando de acordo com os resultados obtidos por BRIZ et al
.
(1996).
Com relação aos defeitos de acrossoma houve um aumento da porcentagem
de defeitos em função do tempo após 18 horas. Como o acrossoma possui uma
membrana sensível e é repleto de enzimas e o tempo pós-morte pode alterar esta
composição, aumentando os defeitos de acrossoma CARD (2005).
KATILA
et al
.
(2002) em garanhões; MARTINEZ-
PASTOR
et al. (2006) em
cervídeos e KIKUCHI
et al.
(1998) em ratos obtiveram diferenças na porcentagem de
acrossomas normais do ejaculado e epidídimo, fato que é explicado pelo processo
de criopreservação ao qual foram submetidos os espermatozóides.
KAABI
et al.
(2003) relatam que a integridade do acrossoma é mais afetada nos espermatozóides
armazenados a temperatura ambiente do que nos armazenad
os a 5ºC.
A freqüência das alterações espermáticas do ejaculado e dos
espermatozóides da cauda do epidídimo aumenta quando os animais são
submetidos a uma alta freqüência de coleta de sêmen, devido ao pouco tempo que
os espermatozóides permanecem no ducto epididimário, necessário para sua
41
maturação. Esta alta freqüência também altera a absorção/secreção dos fluídos
epididimais, alterando o balanço das proteínas e íons que interferem no processo de
maturação (PRUNEDA et al., 2005). Os defeitos acima da média do garanhão 6 não
foram decorrentes de exaustão espermática e sim pela imaturidade sexual conforme
relata CARD (2005).
42
6.
CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos neste experimento para avaliação
comparativa da viabilidade dos espermatozóides colhidos da cauda do epidídimo em
função do tempo pós-orquiectomia em relação aos colhidos com a vagina artificial
concluiu
-
se que:
- A colheita de espermatozóides da cauda do epidídimo através da
modificação da técnica de GARDE et al,
(1994),
pôde ser realizada de
maneira rápida e eficiente.
- Espermatozóides viáveis foram colhidos da cauda de epidídimos
armazenados a temperatura ambiente, de garanhões, por até 24 horas
pós
-
orquiectomia.
- A motilidade e o vigor foram os parâmetros que tiveram maior influência
do t
empo pós
-
orquiectomia.
-
O número total de espermatozóides colhidos da cauda de apenas um dos
epidídimos do mesmo garanhão foi significativamente superior ao
número total de espermatozóides colhido com vagina artificial em 94%
dos epidídimos.
43
APÊN
DICES
Apêndice 1
- Características seminais desejáveis para efeito de seleção de
garanhões segundo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998).
Variável
Valores Médios
Motilidade espermática
70%
Vigor
3
N° total de espermatozóides
200 milhões / dose
inseminante
Espermatozóides normais
70%
Apêndice 2
-
Coloração pelo Vermelho Congo (CEROVSKY, 1976).
1
preparar 100 ml de solução aquosa saturada de vermelho congo;
2
- preparar 100 ml de solução aquosa a 0.5% de violeta de genciana;
-
fazer esfregaço delgado com sêmen fresco e secar ao ar;
-
imergir a lâmina na solução de vermelho congo por um minuto;
- lavar em água corrente suavemente e secar ao ar;
-
imergir na solução de violeta de genciana por 30 segundos;
-
lavar em água corrente suavemente e secar ao
ar;
44
REFERÊNCIAS
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p.658
-
673,
1993.
ASHER, G.W.; BERG, D.K.; EVANS, G. Storage of semen and artificial insemination
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v.62, p.195
-
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heterozygosity in Austrian draught horse stallions.
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, v.58, p.393-
396,
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BARTELS, P.; LUBBE, K.; KILIAN, I.; FRIEDMANN, Y. DYK, G.; MORTIMER, D. In
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BEDFORD, J.M. The status and the state of the human epididymis.
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